(57)【要約】【課題】検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法を提供する。【解決手段】検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法であって、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを予め混合し、この混合したものと固相に結合した抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定することを特徴とする小分子の免疫学的測定法に関する。手順の変更という簡単な手段で、従来精度良く測定できなかった検体中の小分子を精度良く測定できるため、本発明の方法は産業上きわめて有用な方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法であって、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを予め混合し、この混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定することを特徴とする小分子の免疫学的測定法。
【請求項２】
測定対象の小分子が、ホルモンまたはビタミンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
測定対象の小分子が、アルドステロン、エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオンなどのステロイドホルモンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
高分子物質と高分子物質に特異的に結合する因子の組み合わせが、アビジン−ビオチン、中性アビジン‐ビオチン、ストレプトアビジン‐ビオチン、ＩｇＧ‐プロテインＡ、ＩｇＧ‐プロテインＧ、ＩｇＧ‐プロテインＬ、ヒスチジンタグ配列‐ニッケル、糖鎖−レクチン、またはアプタマー‐アプタマー認識分子のいずれかの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗小分子抗体を担体に直接的または間接的に結合したものを使用する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
高分子物質に結合させる標識が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の小分子は、検体中に存在する蛋白質、脂質などの高分子量物質と特異的又は非特異的に結合していたり、あるいは一定の平衡状態であったりするため、小分子の濃度を正確に精度良く測定するためには、一工夫が必要であった。
そのような工夫の１つとして、特異的結合阻害剤を用いて小分子を前記蛋白質等から遊離する方法があり、たとえば、ステロイドホルモンの特異的結合阻害剤として、グルタミン酸溶液（特許文献１）、８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸又はその塩（特許文献２）、２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸、２−アミノナフタレンスルホン酸、アニリン−２，５−ジスルホン酸、３−アミノ−２，７−ナフタレンジスルホン酸（特許文献３）が報告されている。また、ビタミンＤ代謝産物の特異的結合阻害剤としては、８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩、３‐（アセトニルベンジル）‐４‐ヒドロキシクマリン（特許文献４）、シクロデキストリン、サリチル酸ナトリウム、ＮａＯＨ（特許文献５）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５３−１０１５２１号公報
【特許文献２】特公昭６１−１２５４７号公報
【特許文献３】特許第５３４３８２５号公報
【特許文献４】特許第３７８７１２１号公報
【特許文献５】特許第４１３０９５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、本発明者の検討では、アルドステロンの測定において、特異的阻害剤である８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸を用いて測定を試みたが、実施例に示すように、良好な結果は得られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、発明者は、検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法を開発すべく、鋭意検討を重ねた結果、まったく意外なことに、間接的な標識法である高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子を用いて検体中の小分子を測定する際、予めこれらを混合し、この混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定することで、検体中の小分子を精度良く測定できることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。従って、本発明は以下の発明を提供するものである。
【０００６】
（１）
検体中の小分子を精度良く測定するための免疫学的測定法であって、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを予め混合し、この混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定することを特徴とする小分子の免疫学的測定法。
（２）
測定対象の小分子が、ホルモンまたはビタミンである、上記（１）記載の方法。
（３）
測定対象の小分子が、アルドステロン、エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオンなどのステロイドホルモンである、上記（１）記載の方法。
（４）
高分子物質と高分子物質に特異的に結合する因子の組み合わせが、アビジン−ビオチン、中性アビジン‐ビオチン、ストレプトアビジン‐ビオチン、ＩｇＧ‐プロテインＡ、ＩｇＧ‐プロテインＧ、ＩｇＧ‐プロテインＬ、ヒスチジンタグ配列‐ニッケル、糖鎖−レクチン、またはアプタマー‐アプタマー認識分子のいずれかの組み合わせである、上記（１）記載の方法。
（５）
抗小分子抗体を担体に直接的または間接的に結合したものを使用する、上記（１）記載の方法。
（６）
高分子物質に結合させる標識が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素である上記（１）記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫学的測定で使用する試薬は、高分子物質に結合した標識、高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子及び固相に結合した抗小分子抗体であり、従来の方法と使用する試薬類はまったく同じである。しかしながら、その操作手順が今まで報告されていない手順、すなわち、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを予め混合し、この混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定するという手順に変更するだけ検体中の小分子を精度良く測定できる。
このように、手順の変更という簡単な手段で、従来精度良く測定できなかった検体中の小分子を精度良く測定できるため、本発明の方法は産業上きわめて有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、事前混合なしの２ステップ法における測定結果と阻害剤の効果を示したものである。
【図２】図２は、アルドステロンを直接標識した試薬を用いる１ステップ法による測定結果を示したものである。
【図３】図３は、事前混合した試薬を用いる本発明法による測定結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の特徴は、上述したように、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを予め混合し、この混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定することを特徴とする小分子の免疫学的測定法に関するものである。
【００１０】
本発明で測定対象の検体としては、血液、血清、血漿等の血液検体、あるいは尿検体である。
測定対象の小分子としては、ホルモンまたはビタミンが挙げられ、ホルモンとしては、アルドステロン、エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオンなどのステロイドホルモン、ＡＣＴＨ、アルギニンパソプレッシン、ＰＴＨ、インスリン、オキシトシンなどのペプチドホルモン等が挙げられる。
また、ビタミンとしては、ビタミンＤ、ビタミンＢ１２、などが挙げられる。
【００１１】
測定に使用する標識としては、酵素、蛍光色素、化学発色色素、化学発光基質などを例示できる。酵素をより具体的に例示すれば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ルシフェラーゼなどを挙げることができる。
【００１２】
このような標識の標識法は間接標識法を用いる。間接標識法は、既に公知であり、具体的な組み合わせとしては、アビジン−ビオチン、中性アビジン‐ビオチン、ストレプトアビジン‐ビオチン、ＩｇＧ‐プロテインＡ、ＩｇＧ‐プロテインＧ、ＩｇＧ‐プロテインＬ、ヒスチジンタグ配列‐ニッケル、糖鎖−レクチン、アプタマー‐アプタマー認識分子のいずれかの組み合わせを利用すればよい。
【００１３】
次に、測定に使用する抗体は、測定対象の小分子に対する抗体であればよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体（抗血清）であっても、その断片（（Ｆａｂ‘）２、Ｆａｂなど）であってもかまわない。
【００１４】
このような抗体は、ＢＦ分離のため、好ましくは抗体を担体に直接的または間接的に結合させたものを使用する。
担体としては、チューブ状、ウェル状、粒子状（ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子など）などいずれの形態も使用可能で、材質も測定に応じて適宜選択して使用すればよい。
抗体と担体との結合法は公知であり、常法（物理的結合法、化学的結合法、リンカーな等を用いた完結的結合法など）から適宜選択して実施すればよい。さらに、抗イムノグロブイリン抗体などを用いた間接的な結合法も使用することができる。
【００１５】
本発明は、このような従来公知の試薬を用いて、（１）初めに、高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを混合し、（２）次にこの混合したものと抗小分子抗体を用いて検体中の小分子を測定する２段階の方法からなる。
第１段階の高分子物質に結合した標識と高分子物質に特異的に結合する因子が結合した小分子とを混合する反応は、０〜５０℃、好ましくは５〜３０℃で、混ぜ合わせれば良く、特に一定時間インキュベーションする必要はない。
【００１６】
第２段階の、混合物と抗小分子抗体を用いた検体中の小分子の測定は、対象の小分子で行われている反応条件をそのまま利用すれば良く、細かな条件設定は、小規模試験にて決定することができる。
小分子の定量は、使用した標識で通常利用されている方法（例えば、酵素であれば、吸光度法など）で行うことが可能である。
【実施例】
【００１７】
以下、アルドステロンの実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
【００１８】
試薬の調製
〔各構成試薬の希釈液の調製〕
１％  ウシ血清アルブミン（ギブコ社製）、０．２％  スキムミルク（ベクトン・ディッキンソン社製）、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）、０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０（シグマ社製）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）を用いた。
【００１９】
〔ビオチン化アルドステロンの調製〕
アルドステロン（シグマ社製）とＢｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学社製）を、０．５Ｍ酢酸水溶液とエタノールの混合溶媒中で一晩室温にて撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を追跡し、原料であるアルドステロンの消失を確認した後溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ビオチン化アルドステロンを得た。
【００２０】
〔アルドステロンを直接標識した西洋ワサビペルオキシダーゼの調製〕
アルドステロン（シグマ社製）とカルボキシメトキシルアミンヘミ塩酸塩（ナカライテスク社製）を無水酢酸ナトリウムの存在下エタノール中室温にて４日間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、アルドステロンの３位にカルボキシル基が導入された誘導体を得た。この３位誘導体と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（同仁化学社製）、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を、０．１Ｍ  ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ５．５）中で混合し、４℃にて一晩反応させた。反応液をＰＢＳに対して透析し、アルドステロンを直接標識した西洋ワサビペルオキシダーゼを得た。
【００２１】
〔ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体〕
ストレプトアビジン（和光純薬社製）を、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）に溶解し、ここに２−イミノチオラン塩酸塩を添加し、３０℃にて２時間反応させた。さらにトリ（カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の水溶液を添加し、３７℃にて１時間反応させた後、限外ろ過デバイスＡｍｉｃｏｎ（メルクミリポア社製）により緩衝液を、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０）に交換すると同時に試薬の残骸を取り除き、メルカプト（ＳＨ）基を導入したストレプトアビジンを得た。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．５）に溶解し、ここにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）を添加し、３０℃にて３０分間反応させた後、限外ろ過デバイスＡｍｉｃｏｎ（メルクミリポア社製）により緩衝液を、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０）に交換すると同時に試薬の残骸を取り除き、マレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼを得た。以上により調製したメルカプト基導入ストレプトアビジンとマレイミド基導入西洋ワサビペルオキシダーゼを、モル比が１：５となるように混合し、４℃にて２４時間反応させた。反応液をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００ＨＲ、ＧＥヘルスケア社製）にて精製し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を得た。
【００２２】
〔アルドステロン標準液の調製〕
１．２ｍｇのアルドステロン（シグマ社製）に対して１ｍＬのエタノール（ナカライテスク社製）で溶解しアルドステロンのエタノール溶液を調製した。これをさらに適宜エタノールで希釈し、２４０ｎｍにおける吸光度を測定した。アルドステロンの分子量３６０．４４及び２４０ｎｍにおけるモル吸光係数１５，０００を用いて正確な濃度を算出した。このエタノール溶液を上述の希釈液で希釈し、２，０００ｐｇ／ｍＬの溶液を調製した。さらに、２，０００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液を適宜希釈し、１，０００、５００、２５０、１００、５０、２５ｐｇ／ｍＬのアルドステロン溶液を調製した。これら７種類のアルドステロン溶液と、アルドステロンを含まない希釈液を０ｐｇ／ｍＬとした計８種類の溶液をアルドステロン標準液とした。
【００２３】
〔抗体固相プレートの調製〕
９６ウェルマイクロプレート（サーモサイエンティフィック社製）に、ＰＢＳで５μｇ／ｍＬの濃度に希釈調整したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体（サーモサイエンティフィック社製）を１００μＬ／ウェル分注し、室温にて一晩放置した。ウェル内の液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し吸引除去する操作を計３回行い、ウェルを洗浄した。この後、０．５％スキムミルク、５％スクロース、０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含有するＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し、２時間ブロッキングを行った。最後にブロッキング液を抜き取り、使用時まで４℃にて保存した。
【００２４】
〔管理検体の調製〕
ＥＤＴＡ−２Ｎａプール血漿に、アルドステロンを約８００、４００、２００、１００ｐｇ／ｍＬとなるように添加したものを管理検体とし、分注し使用時まで−８０℃にて凍結保存した。
【００２５】
事前混合なしの２ステップ法における測定（従来法）および阻害剤の効果
（１）目的
アルドステロン及びビオチン化アルドステロンが血漿中の蛋白質と結合し、測定系が影響を受けるかどうか、また特異的結合阻害剤を用いて血漿中の蛋白質からこれらの分子を遊離させ、測定が可能になるかどうかを確認する。このことを、血漿中にアルドステロンを添加したものを用い、これらの測定値が、添加したアルドステロンの量を回収出来ているかを求めるいわゆる添加回収試験により評価する。
【００２６】
（２）方法
標準液を添加した個人血漿検体は、アルドステロン標準液１（０ｐｇ／ｍＬ）、６（５００ｐｇ／ｍＬ）、７（１，０００ｐｇ／ｍＬ）、８（２，０００ｐｇ／ｍＬ）と個人血漿検体を１：９の比で混合し調製した。
抗体固相プレートに、アルドステロン標準液または標準液を添加した個人血漿検体を２５μＬ／ウェル、１０ｆｍｏｌ／ｍＬに希釈調製したビオチン化アルドステロンを１００μＬ／ウェル、４０，０００倍に希釈調製したウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を５０μＬ／ウェル順次添加し、プレートシェーカーにて撹拌しながら２時間室温にて反応させた。この際、ビオチン化アルドステロン溶液に１ｍｇ／ｍＬの８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸（以下ＡＮＳと表記）を含むものと含まないものを用意した。ウェル内の反応液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し吸引除去する操作を計３回行い、ウェルを洗浄した。ウェルの洗浄後、０．５μｇ／ｍＬに希釈調製したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を全てのウェルに１００μＬ／ウェル分注し、３０分間反応させた。ウェル内の反応液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し吸引除去する操作を計３回行い、ウェルを洗浄した。３，３，５，５‐テトラメチルベンジジンを含む発色液を１００μＬ／ウェル分注し、室温にて２０分間発色させた後、０．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。
【００２７】
（３）結果
結果を下記表１、２および図１に示す。
【００２８】
【表１】
2017078656.tif 000002
【００２９】
【表２】
2017078656.tif 000003
【００３０】
考察
まず、標準液の測定における吸光度を見ると、ＡＮＳの有無に関わらず標準液１では十分な吸光度が見られていることから、固相抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体）：ウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体：ビオチン化アルドステロンの３成分よりなる免疫複合体が適切に形成されていることが分かる。またアルドステロン濃度の増大に伴って吸光度が低下していることから、系内に添加されたアルドステロンにより免疫複合体の形成阻害が起こっているものと考えられる。このことは、競合法における抗原の測定そのものであり、標準液の組成においてはアルドステロンの測定が可能であることを意味している（表１および図１）。
【００３１】
しかしながら、標準液を添加した個人血漿検体における吸光度を見ると、アルドステロン添加量の増大に伴う吸光度の低下は見られているものの、標準液と比較して圧倒的に吸光度が低くなっている。標準液８（２，０００ｐｇ／ｍＬ）の測定における吸光度が０．５程度であることから、今回測定された血漿検体はいずれも測定値は２，０００ｐｇ／ｍＬ以上となり、現実的にありえない数値となっている（表２）。
【００３２】
また、反応系内へのＡＮＳ添加の有無に関わらず血漿検体における吸光度は低いことから、ＡＮＳは当初期待していたアルドステロン若しくはビオチン化アルドステロンと血漿中の蛋白質との結合阻害に寄与していないものと考えられる。血漿試料において吸光度が著しく低下していることから、ビオチン化アルドステロンが血漿中の蛋白質と結合し、系内に添加されたウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体と反応出来ていないことが推察される（表２）。
【００３３】
３）アルドステロンを直接標識した試薬を用いる１ステップ法による測定
目的
ビオチン化アルドステロンのような極めて分子量の小さいものが血漿中の蛋白質と結合しウサギ抗アルドステロン抗体が反応しなくなるのであれば、トレーサー分子をより分子量の大きなものに改変すれば抗体との反応性が改善するはずである。そこで、アルドステロンを標識酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼと直接化学的に結合したものをトレーサーとした条件において、測定が可能であるかを調べた。
【００３４】
方法
抗体固相プレートに、アルドステロン標準液または管理検体を２５μＬ／ウェル、１ｐｍｏｌ／ｍＬに希釈調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アルドステロンを１００μＬ／ウェル、４０，０００倍に希釈調製したウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を５０μＬ／ウェル順次添加し、プレートシェーカーにて撹拌しながら２時間室温にて反応させた。ウェル内の反応液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し吸引除去する操作を計３回行い、ウェルを洗浄した。ウェルの洗浄後、３，３，５，５‐テトラメチルベンジジンを含む発色液を１００μＬ／ウェル分注し、室温にて２０分間発色させた後、０．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。
【００３５】
結果
結果を下記表３、４および図２に示す。
【００３６】
【表３】
2017078656.tif 000004
【００３７】
【表４】
2017078656.tif 000005
【００３８】
（４）考察
標準液１の測定における吸光度が２程度あることから、固相抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体）：ウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体：西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アルドステロンの３成分よりなる免疫複合体が適切に形成されていることが分かる。しかしながら、遊離アルドステロン濃度の増大に伴う吸光度の低下傾向がかなり小さく、標準液に含まれるアルドステロンによる競合阻害が起こりにくくなっていることが分かる。すなわち、前述の測定と同じ抗体を同じ希釈倍率で使用しているにも関わらず感度が低下している（表３、図２）。また、管理検体の測定においては、管理検体１及び２については測定値が算出されているものの、想定した値とはかなり乖離がみられる。管理検体３及び４については、得られた吸光度の値が標準液１よりも大きいため、測定値が算出されていない（表４）。これらの原因としては、使用したウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体の性質において、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アルドステロンに対しての反応性とアルドステロンに対しての反応性がかなり違っていて、前者に対する反応性が相対的に高いために、アルドステロンによる競合阻害が起こりにくくなっており、アルドステロン濃度の増大に伴う吸光度の低下傾向が小さくなっているものと推察される。一般に、アルドステロンのような低分子物質に対する抗体の作製においては、それ自身の免疫原性が低いために、低分子を蛋白質のような高分子、例えばウシ血清アルブミンやウシサイログロブリンなどに科学的に結合したものを動物に免疫することで得られている。すなわち低分子そのものに対してよりも、高分子に結合した形をとる抗原物質の方が、抗体の反応性はより高くなる傾向がある。それだけでなく、適切な吸光度を得るために本系では比較的多量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アルドステロンを系内に添加しており、従って遊離アルドステロンによる西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アルドステロンとウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体の結合阻害が起こりにくくなっていることも予想される。
【００３９】
また、管理検体の測定値が想定したものと比較してかなり低値となった原因としては、血漿中の蛋白質とアルドステロンが一部結合し、系内に添加されたウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体と反応出来なくなるためと推察される。
【００４０】
事前混合した試薬を用いる本発明法による測定
目的
ストレプトアビジン‐ビオチンによる結合をアルドステロンと標識酵素の結合に利用してトレーサー分子を調製し、このトレーサーを用いる系について標準液及び血漿試料の測定が可能か調べる。血漿試料については前項２）と同様、血漿中にアルドステロンを添加したものを用い、これらの測定値が、添加したアルドステロンの量を回収出来ているかを求めるいわゆる添加回収試験により評価する。
【００４１】
方法
標準液を添加した個人血漿検体は、アルドステロン標準液１（０ｐｇ／ｍＬ）、６（５００ｐｇ／ｍＬ）、７（１，０００ｐｇ／ｍＬ）、８（２，０００ｐｇ／ｍＬ）と個人血漿検体を１：９の比で混合し調製した。
抗体固相プレートに、アルドステロン標準液または標準液を添加した個人血漿検体を２５μＬ／ウェル、予め混合しておいたトレーサー溶液（０．３ｐｍｏｌ／ｍＬのビオチン化アルドステロン及び０．５μｇ／ｍＬのストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体）を１００μＬ／ウェル、４０，０００倍に希釈調製したウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を５０μＬ／ウェル順次添加し、プレートシェーカーにて撹拌しながら２時間室温にて反応させた。ウェル内の反応液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを３００μＬ／ウェル分注し吸引除去する操作を計３回行い、ウェルを洗浄した。ウェルの洗浄後、３，３，５，５‐テトラメチルベンジジンを含む発色液を１００μＬ／ウェル分注し、室温にて２０分間発色させた後、０．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。
【００４２】
結果
結果を下記表５、６および図３に示す。
【００４３】
【表５】
2017078656.tif 000006
【００４４】
【表６】
2017078656.tif 000007
【００４５】
考察
標準液の測定における吸光度の値より、固相抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体）：ウサギ抗アルドステロンポリクローナル抗体：ビオチン化アルドステロン：ストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体の４成分よりなる免疫複合体が適切に形成されており、さらに遊離のアルドステロンによる免疫反応の競合的阻害が起こっていることが分かる（表５、図３）。さらに血漿試料の吸光度測定値を見ると、これまでのように吸光度の異常な低値もしくは高値傾向は見られず、また血漿試料においてもアルドステロンの添加に伴う吸光度の低下が見られている。標準液における吸光度から標準曲線を作製し、標準液を添加した血漿試料の測定値を算出し、添加したアルドステロン量に対する回収率を計算すると、いずれの添加試料においても回収率は１００％付近となっており、血漿に添加したアルドステロンが標準液と同様に測定出来ていることを示している（図６）。
【図１】
2017078656.tif 000008
【図２】
2017078656.tif 000009
【図３】
2017078656.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月22日(2016.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明で測定対象の検体としては、血液、血清、血漿等の血液検体、あるいは尿検体である。
測定対象の小分子としては、ホルモンまたはビタミンが挙げられ、ホルモンとしては、アルドステロン、エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオンなどのステロイドホルモン、ＡＣＴＨ、アルギニンパソプレッシン、ＰＴＨ、インスリン、オキシトシンなどのペプチドホルモンなどが挙げられる。
また、ビタミンとしては、ビタミンＤ、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
測定に使用する標識としては、酵素、蛍光色素、化学発色色素、化学発光基質などを例示できる。酵素をより具体的に例示すれば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ルシフェラーゼなどを挙げることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
次に、測定に使用する抗体は、測定対象の小分子に対する抗体であればよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体（抗血清）であっても、その断片（（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂなど）であってもかまわない。