(57)【要約】【課題】  本発明は、比活性などの点で優れたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであるEndo-Omの比活性をさらに高めた改変Endo-Omを提供する。【解決手段】  本発明は、構造モデリングによりEndo-Omの活性中心を構成するアミノ酸残基が295番目のトリプトファン（W295）であることを予想し、W295のアミノ酸置換を検討した結果、Endo-Omと比較し、Endo-Omよりもさらに強い比活性を示すW295F改変体と共に、二分岐型複合糖鎖に対してEndo-Omよりも強い活性を示すW295Y改変体を提供することができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）のアミノ酸配列において、配列番号２の295位のトリプトファン(W)残基に相当するアミノ酸残基が、フェニルアラニン(F)残基又はチロシン(Y)残基に置換されたEndo-Om改変体（W295F、W295Y）であって、変異前のEndo-Omと同じ基質特異性を有し、かつ少なくとも複合型糖鎖への比活性が変異前のEndo-Omより向上しているEndo-Om改変体。
【請求項２】
前記Endo-Om改変体の変異前のEndo-Omのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のEndo-Om改変体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のEndo-Om改変体をコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸が導入され、Endo-Om改変体を発現する形質転換体。
【請求項６】
変異前のEndo-Omと同じ基質特異性を有し、かつ少なくとも複合型糖鎖への比活性が変異前のEndo-Omより向上しているEndo-Om改変体の製造方法であって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）のアミノ酸配列において、配列番号２の295位のトリプトファン(W)残基に相当するアミノ酸残基を、フェニルアラニン(F)残基又はチロシン(Y)残基に変異させる置換を行うことを特徴とする、Endo-Om改変体の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のEndo-Om改変体を標的糖タンパク質に作用させる工程を含む、標的糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のEndo-Om改変体を標的アクセプター分子に作用させる工程を含む、アスパラギン結合型糖鎖を標的アクセプター分子に対して転移する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比活性の高い改変エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ及びその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ医薬品の一つとして年々市場規模が増加している抗体医薬の分野で、抗体に薬物を結合させ殺傷する技術（Antibody-drug conjugate）が開発され、いくつかの薬物結合抗体医薬が上市されている。しかしADCは薬物を位置特異的に結合させる技術が確立していないため、薬剤と抗体の比率をコントロール出来ないことが大きな課題となっている。そして、その解決策として、抗体1分子に2箇所ある糖鎖付加部位に薬剤を導入することが検討され始めている（非特許文献１）。
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）は、糖タンパク質のN-結合型糖鎖に作用して糖鎖を切り出す反応に加え、糖鎖を複合糖質などに転移する反応も触媒する酵素であり、従来から糖タンパク質の糖鎖構造の解析、複合糖質糖鎖の修飾、ネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製、糖タンパク質の糖鎖部分の均一化等に広く用いられていたが、最近は、バイオ医薬品の製造における薬物により修飾された糖鎖の導入に対する期待が高まっている。
本発明者らは、以前、メタノール資化性酵母Ogataea minutaから、新規なENGase（Endo-Om）を単離した（特許文献１）。Endo-Omは、Mucor hiemalis由来のENGase（Endo-M）（非特許文献２）と同様、高マンノース型、混成型、複合型のいずれのN-型糖鎖に対しても加水分解活性及び転移活性を発揮することができ、かつ異なる基質特異性を有しており、しかもEndo-Mと比較して高い比活性を有している。そのため、バイオ医薬品の薬物結合糖鎖導入においても、製造コストの観点も含め、比活性の高いEndo-Omの期待が大きい。
ENGaseの産業利用のためには、基質特異性が異なる酵素やより比活性の強い酵素を提供することが望まれる。
そのために、ENGaseに対して変異を導入した改変体を製造することは試みられており、基質特異性を広げる例としては、Endo-MやEndo-Aに変異を導入することにより、糖鎖加水分解活性を抑制させ、糖鎖転移活性を向上させたという報告（非特許文献３〜５）や、Endo-Mにコアフコースが付加した糖鎖の切断能が付加できたという報告（非特許文献６）がある。
しかしながら、いずれもENGaseの比活性を向上させるものではなかった。一般に、酵素の比活性を向上させるためには、酵素の触媒メカニズムを詳細に解析し、関与するアミノ酸残基を同定し、さらに数多くの置換体の作製と評価が必要であるが、ENGaseに対しては計画的に比活性を向上させる検討の報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１３−０５１６０８（WO2013/051608）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Li X,et al.,Angew Chem Int Ed. 2014 53:7179-82.
【非特許文献２】Fujita et al.,(2004)Arch Biochem Biophy.432：p41-49
【非特許文献３】Umekawa M,et al.,J Biol Chem. 2008 Feb 22;283(8):4469-79.
【非特許文献４】Umekawa M, et al., J Biol Chem. 2010 Jan 1;285(1):511-21.
【非特許文献５】Huang W, et al.,Chembiochem. 2010 Jul 5;11(10):1350-5.
【非特許文献６】加藤紀彦等、日本農芸化学会2015年度大会要旨集p.713
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、比活性などの点で優れたENGase であるEndo-Omの比活性をさらに高めた改変ENGaseを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、本発明者らが以前開発したEndo-Om（特許文献１）の活性中心を構成するアミノ酸残基を構造モデリングにより推定し、そのアミノ酸残基のアミノ酸置換を行なうことを考えた。構造モデリングから基質特異性を変化させる例は多く知られているが、一般的には活性を向上させることは容易ではなく、むしろ変異により活性が低下する場合が多い。しかも、Endo-Omに対して構造モデリングを行ったところ（図１）、基質糖鎖と相互作用を示すとされる295位のトリプトファン（W）残基は、触媒残基としてGH85ファミリーに保存されている196位のグルタミン酸（E）残基や194位のアスパラギン（N）残基、231位のチロシン（Y）残基から距離的に離れている上、GH85 ENGaseファミリー内で保存性が低い残基であり、学術的に置換対象にされた例がなく、類縁酵素の研究からも295位のトリプトファン（W）残基が比活性に関与する残基とは類推できない。
したがって、本発明者らは、Endo-Omの295位のW（W295）のアミノ酸置換によって比活性が向上することは全く予測せずに、若干でも基質特異性が広くなる（切断されない糖鎖構造を切断できるようにする）可能性を期待して種々のアミノ酸置換を試したところ、予想外に比活性の高い変異型酵素を取得できた。
【０００７】
具体的には、以下の通りである。
構造モデリングにより特許文献１に開示された酵素（Endo-Om）の活性中心を構成するアミノ酸残基の推定を行い、そのアミノ酸置換を行うことにより、基質特異性や比活性に影響するアミノ酸の推定を行った。その結果、295番目のトリプトファン（W295）は基質となる糖鎖を保持するのに重要であることが予想された。また基質特異性との関連で、Endo-Omが切断できない糖鎖構造と立体障害をおこすことが示唆されたため、アミノ酸置換によって立体障害を抑制できれば基質特異性が広がることが期待された。そこでW295のアミノ酸置換を行なったところ、予想に反し、基質特異性に変化は見られなかったが、変異前の酵素と比較し、各種糖鎖及び糖タンパク質に対し強い活性を示すW295F改変体及び特定の糖鎖に対して強い活性を示すW295Y改変体を単離することができた。特に、W295F改変体における活性の向上はきわめて高いものであった。
また、実際に高マンノース型糖鎖を有するリボヌクレアーゼ（RNase）Bおよび複合型２分岐糖鎖を有するトランスフェリンに対する反応性を確認したところ、同様の傾向が確認できた。
以上の知見を得て、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）のアミノ酸配列において、配列番号２の295位のトリプトファン(W)残基に相当するアミノ酸残基が、フェニルアラニン(F)残基又はチロシン(Y)残基に置換されたEndo-Om改変体（W295F、W295Y）であって、変異前のEndo-Omと同じ基質特異性を有し、かつ少なくとも複合型糖鎖への比活性が変異前のEndo-Omより向上しているEndo-Om改変体。
〔２〕  前記Endo-Om改変体の変異前のEndo-Omのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、前記〔１〕に記載のEndo-Om改変体。
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載のEndo-Om改変体をコードする核酸。
〔４〕  前記〔３〕に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
〔５〕  前記〔３〕に記載の核酸が導入され、Endo-Om改変体を発現する形質転換体。
〔６〕  変異前のEndo-Omと同じ基質特異性を有し、かつ少なくとも複合型糖鎖への比活性が変異前のEndo-Omより向上しているEndo-Om改変体の製造方法であって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）のアミノ酸配列において、配列番号２の295位のトリプトファン(W)残基に相当するアミノ酸残基を、フェニルアラニン(F)残基又はチロシン(Y)残基に変異させる置換を行うことを特徴とする、Endo-Om改変体の製造方法。
〔７〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載のEndo-Om改変体を標的糖タンパク質に作用させる工程を含む、標的糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法。
〔８〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載のEndo-Om改変体を標的アクセプター分子に作用させる工程を含む、アスパラギン結合型糖鎖を標的アクセプター分子に対して転移する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のEndo-Om W295F改変体は、もとのEndo-Omが反応する主要な糖鎖全てに対する比活性が2〜3倍という高い値を示し、特に高マンノース型糖鎖のM9A糖鎖に至っては3倍以上もの比活性の向上を呈した。複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary）に対する比活性も3倍近かった。Endo-Om W295Y改変体の場合は、もとのEndo-Omと比較してEndo-Omなどオリゴマンノース型糖鎖への比活性は0.6〜0.7倍程度まで低下したが、複合型２分岐糖鎖（agalacto biantennary）に対する活性は2.3倍以上という高活性を示した。
これらのEndo-Om改変酵素を用いることで、さらに従来よりも少ない量で糖鎖や糖タンパク質の加水分解が可能となり、製造コストの面で優位な酵素を提供できるようになる。
広範な基質特異性及び高い比活性を有するEndo-Omの基質特異性を変更することなく、比活性、特に複合型糖鎖に対する比活性を高めたEndo-Om改変体を提供できたことから、当該改変酵素自身を糖鎖解析用試薬、薬物結合糖鎖導入用試薬などとして用いるほか、糖鎖解析用、又は糖鎖導入用の標準糖ペプチド組成物や、バイオ医薬品などの糖鎖構造が均一化された組成物を製造するなどの用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ａ：Endo-AおよびEndo-D構造がらのEndo-Omの構造モデリング（SWISS-MODELおよびDeepView使用）。Ｂ： Endo-Aと基質との共結晶の結果を基とした、ピボットモデリング法によるN-型糖鎖（Man3GlcNAc2-Asn）と活性中心との結合予測。
【図２】Endo-OmのGH85 ENGaseファミリー内でのアミノ酸配列保存領域。Endo-OmのW295に保存性がないことがわかる。
【図３】活性測定に用いた各種Endo-Omタンパク質をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、クマシー染色した図。予想分子量が92kDaのEndo-Omがほぼ均一に精製できているのがわかる。
【図４】RNase BおよびトランスフェリンをEndo-Omで処理後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分離しクマシー染色した図。糖鎖の有無でRNase Bやトランスフェリンの移動度が変化することから、これら糖タンパク質に対する各種Endo-Omの活性の強さを比較することができる。図中のアスタリスクはEndo-Hが可視化されたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）
（１−１）エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの作用
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、N-型糖鎖の還元末端に存在するキトビオースの間を加水分解により切断する酵素であり、多くの酵素は、その切り出した糖鎖をアクセプターである糖質や複合糖質に転移する反応を効率よく触媒するトランスグリコシダーゼ活性を同時に有している。
これまでにArthrobacter由来のEndo-A、Streptococcus pneumoniae由来のEndo-D、Flavobacterium由来のEndo-F、Streptomyces plicatus由来のEndo-H、イネ由来のEndo-Os、Mucor hiemalis由来のEndo-M（非特許文献６）などが知られている。
したがって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖構造の解析と共に、複合糖質糖鎖の修飾、ネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製、糖タンパク質の糖鎖部分の均一化等に有用な酵素群である。
【００１２】
（１−２）ENGaseが作用する主要な糖鎖の種類
生体の主要な生理活性を司る主要な糖タンパク質が有している主なN-結合型糖鎖は、基準となる3マンノース型オリゴ糖鎖（M3B）の非還元末端側に結合する糖鎖構造から、高マンノース型(オリゴマンノース型、マンナン型糖鎖)、混成型及び複合型に分類される（Essentials of Glycobiology Chapter 8 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1908/参照)。
高マンノース型(オリゴマンノース型、マンナン型)糖鎖とは、マンノース数が3〜9、主として5〜9のマンノースのみが多数結合したタイプである。具体的には、M3B、M4A、M4B、M5A、M6A、M6B、M6C，M7A、M7B、M7C，M7D、M8A、M8B，M8C、M9A糖鎖が挙げられる。典型的な高マンノース型糖鎖としては、「M5A」と称される「Manα1-3[Manα1-3(Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、「M6B」と称される「Manα1-2Manα1-3[Manα1-3(Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、「M8A」と称される「Manα1-2Manα1-2Manα1-3[Manα1-3(Manα1-2Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、「M9A」と称される「Manα1-2Manα1-2Manα1-3[Manα1-2Manα1-3(Manα1-2Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」がある。
混成型（ハイブリッド型）糖鎖は、オリゴマンノース鎖とN-アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸からなるオリゴ糖とを有する糖鎖である。典型的な混成型糖鎖としては、「hybrid-type」と称される「Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3[Manα1-3(Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、及び「hybrid-type (bisecting GlcNAc)」と称される「GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-4)[Manα1-3(Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」がある。
複合型糖鎖は、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸、フコースを含むN-結合型糖鎖を指し、さらに非還元末端側の分岐数に応じて二分岐型、三分岐型、四分岐型、バイセクティング型に分けられることもある。二分岐型複合型糖鎖としては、「sialyl biantennary」、「asialo biantennary」、「agalacto biantennary」、「agalacto biantennary (bisecting GlcNAc)」型糖鎖、あるいはそれらの一部糖鎖が欠損した構造が挙げられ、三分岐型複合型糖鎖としては、「sialyl (2,6)-branched triantennary」、「asialo (2,6)-branched triantennary」、「agalacto (2,6)-branched triantennary」、「sialyl (2,4)-branched triantennary」、「asialo (2,4)-branched triantennary」、「agalacto (2,4)-branched triantennary」型糖鎖、あるいはそれらの一部糖鎖が欠損した構造が挙げられる。四分岐複合型糖鎖としては、「sialyl tetraantennary」、「asialo tetraantennary」、「agalacto tetraantennary」型糖鎖、あるいはそれらの一部糖鎖が欠損した構造が挙げられる。これらの二分岐、三分岐、四分岐型糖鎖のβ1,4結合マンノースにβ1,4結合でGlcNAcが付加したものをバイセクティング型と称する。典型的な複合型糖鎖としては、
「sialobiantennary」または「sialyl biantennary」と称される「Siaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Siaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、「asialo biantennary」と称される「Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」、及び「agalacto biantennary」と称される「GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-」がある。
【００１３】
一般に、各種ENGaseについて、比活性を評価する場合は通常M3B糖鎖にPA（ピリジルアミノ基）を結合したM3B-PAが用いられ、各分類分けされた糖鎖グループに対する反応性の有無又は活性の強さを評価する場合にはそれぞれの糖鎖グループの代表的な糖鎖にPAを結合させて用いる。高マンノース型糖鎖の場合は、M9A-PA、さらにはM7B-PA、M6B-PA、M5A-PAであり、混成型糖鎖は、hybrid-type-PA、さらにはhybrid-type (bisecting GlcNAc)、及び複合型糖鎖は、agalacto biantennary-PA、さらにはasialo (2,4)-branched triantennary-PAが用いられる。
【００１４】
各種ENGaseが遊離させることができる糖鎖の種類には偏りがあり、この3種類の糖鎖グループ全てに対する反応性が確認されているENGaseの種類は少ない。特に、複合型糖鎖を切断する活性を有すると報告されているのは、Endo-Om以外は、Endo-Mなど数種類しかない。複合型糖鎖の修飾に関しても、従来の知見からみて、トランスグリコシダーゼ活性の基質特異性は分解活性と同一であるから、複合型糖鎖をアクセプターに転移することができるのもこれらの酵素のみしかない。
【００１５】
（１−２）Ogataea minuta由来エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（Endo-Om）について
Endo-Omは、本発明者らが、以前にメタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株から取得されたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１，２）であり、主な酵素学的及び理化学的性質は以下の通りである。（特許文献１）
(1)作用；N-結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する作用と共に、遊離した糖鎖をアクセプター化合物に転移させるトランスグリコシダーゼ活性を有している。 
(2)基質特異性；高マンノース型、混成型と共に、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成し、アクセプター分子に転移させる。ここで、転移させることができるアクセプター分子としては、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。
(3)比活性：Endo-Omは、Endo-Mの13倍という高い比活性およびEndo-Mの55倍という高いVmaxを有している。
(4)各糖鎖への反応性；高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解するが、分岐が4つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。三分岐型糖鎖については、agalacto (2,6)-branched triantennaryは分解できるが、agalacto (2,4)-branched triantennaryは分解できない。特にagalacto biantennary、M3B、M6B、M9A構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
【００１６】
３． Endo-Om改変体
本発明のEndo-Omのアミノ酸変異体であるEndo-Om W295FおよびEndo-Om W295Yは、Endo-Omのアミノ酸配列295位のトリプトファン(W)残基を、フェニルアラニン(F)残基、又はチロシン(Y)残基に変異させた変異酵素であり、大腸菌宿主によって大量生産可能である。
Endo-Omの立体構造モデリング及び基質との結合予測結果からは、295位に位置するWは酵素の比活性には関係せず、専ら基質特異性を決定づけていると想定されたが、その予想は全くはずれ、W295Yのagalacto biantennaryに対する特異性が向上した以外には両者とも変異前のEndo-Omの基質特異性は全く変化させなかった（表１〜３）。
一方、それぞれの基質に対する活性は大きく異なり、Endo-Om W295Fは高マンノース型糖鎖のいずれに対しても、また２分岐複合型糖鎖に対しても活性が2〜3倍以上向上していたのに対し、W295Yでは、高マンノース型糖鎖に対する活性は変異前の酵素活性には及ばないが、二分岐複合型糖鎖に対してはもとのEndo-Omの2.34倍もの比活性を示した。
また、Endo-Omの295Wのアミノ酸変異体W295F及びW295Y以外の他のアミノ酸変異体（W295A,W295E,W295Q）の場合は、いずれも全く酵素活性を示さなかった。
以上のように、本発明において提供されたEndo-Om W295FおよびEndo-Om W295Y変異体は、広い基質特異性を有し、かつ比活性も高いEndo-Omに対して、その基質特異性を変化させずに特に複合型糖鎖に対する比活性を向上さていることから、Endo-Omと同様にバイオ医薬品などへの薬物結合糖鎖導入など幅広い用途が期待でき、しかも高い比活性を有する試薬を安価に提供できる優れた効果が期待できる。
【００１７】
４．Endo-Om改変体の製造方法
本発明の改変体は、Endo-OmをコードするcDNA（例えば配列番号１）を鋳型として、295位のトリプトファン（W）をコードするコドンをフェニルアラニン(F)又はチロシン(Y)のコドンに置換するように設計したPCR用のプライマーを用いて行うことが一般的であるが、公知の点突然変異法を適用することも可能である。本発明の実施例では、特許文献１に記載の大腸菌用発現ベクターあるpOMEA1-6H3F-Endo-OmをテンプレートとしてPCRを行ない、増幅したDNA断片をNdeIおよびNotIで切断し、pET30a（Novagen社）のNdeI-NotI部位に挿入した。
得られたcDNA変異体を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより大量に得ることができる。
大量生産のためには、大腸菌又は酵母を宿主とすることが好ましく、本発明の実施例ではヒートショック法で誘導される大腸菌BL21 (DE3)  pLysS（バイオダイナミクス研究所）を用いたがこれには限定されない。組換えベクターとしては、宿主に適した既知のベクターを用いる。大腸菌用の場合は、pDONR(商標)201、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322、pTAPlus、pDrive、pETBlue-1等の大腸菌プラスミドが汎用されるが、これに限定されない。
また、変異導入前のEndo-Omの産生微生物であるメタノール資化性酵母（Ogataea minuta IFO10746株）も大量生産用宿主として好ましい。適宜、既知の酵母用ベクターを用いて導入し、メタノール誘導を用いた培養法などを適用することにより、本発明の改変体を大量に取得することができる。例えば、（特許文献１）の記載に従ってO.minuta TK10-1-2株を宿主とする本発明の改変体の過剰発現株を製造できる。
組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
本発明の改変体は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を既知の栄養培地、例えばLB培地（Difco）などで培養することによって生産できる。培養温度、培地のpHおよび培養時間などの培養条件は、本発明の改変体が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明の改変体は、上記培養により得られる培養物より、超音波破砕、遠心分離、ろ過などの操作を利用して分離し、単離・精製工程に供する。
単離・精製の方法としては、通常のタンパク質の単離・精製方法を適用することができ、具体的には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなど、及びそれらを組み合わせる方法を挙げることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献及び特許公報中の記載内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【００１９】
（実施例１）In silico解析によるEndo-Omの活性中心を構成するアミノ酸の推定
Endo-OmのN-末端領域（Pro74-Ile377）の立体構造モデリングはEndo-A（PDB ID: 3FHQ）およびEndo-D（PDB ID: 2W92）の構造をもとに、SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org) および DeepView (http://spdbv.vital-it.ch)を用いて行なった（図１Ａ）。続いて、Endo-Aと基質との共結晶の結果を基に、N-型糖鎖（Man3GlcNAc2-Asn）と活性中心との結合予測（フィッティング）をピボットモデリング法により行なった（図１Ｂ）。その結果、計14残基のアミノ酸がEndo-Omの活性中心を構成し、基質と結合するアミノ酸残基であることが予想された。このうち、図１Ｂで右下方向に位置するAsn-194、Glu-196、Tyr-231はGH85 ENGaseファミリーによく保存されているアミノ酸であり、Endo-A、Endo-D、Endo-Mの解析から、N型糖鎖の還元末端の切断部位に存在するキトビオースを認識する残基であることが報告されている。したがって、Endo-Omの糖鎖切断活性に関わるアミノ酸残基もその作用点付近に存在すると考えられる。
一方、その切断作用点からみて反対側のしかも遠い位置に存在するW295は、切断活性には関係せず、専ら基質特異性を決定づけているアミノ酸残基である可能性が考えられる。
Endo-Omはα1,3-結合マンノースにGlcNAcがβ1,2結合した二分岐複合型糖鎖には活性を示すが、α1,3-結合マンノースにβ1,2結合およびβ1,4結合でGlcNAcが2分子結合した三分岐型糖鎖には反応性を示さないことが明らかになっている。糖鎖のフィッティングの結果から、Endo-Omの295番目のトリプトファン（W295）は、基質となるN-型糖鎖のα1,3-結合マンノース、およびそのマンノースにβ1,2結合するN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）残基近傍に位置することが予想された。よって、Endo-Omの基質特異性はW295により規定されていると推定された。
そこで、本発明者らは、Endo-Omの複合糖鎖における基質特異性をさらに広げるために、Endo-Omが切断できない嵩高い三分岐型複合糖鎖でも切断作用点に近づけるように、立体障害となる可能性のあるトリプトファン(W)残基を、より立体障害の少ない官能基を有するアミノ酸残基に置換することを試みた。
【００２０】
（実施例２）大腸菌での組換えEndo-Omの発現
大腸菌でEndo-Om（配列番号１、２）を発現させるため、下記のプラスミドを構築した。Endo-OmのN-末端側に10個のヒスチジン残基が結合するようにするため、
プライマーA：
5’-AAGGAGATATACATATGCATCACCATCACCATCACCATCACCATCACGACTACAAAGACCATGACGG-3’   （配列番号３）及び、
プライマーB：
5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCTCACACCCAAACCTCACTC-3’   （配列番号４）
を合成し、特許文献１にあるpOMEA1-6H3F-Endo-OmをテンプレートとしてPCRを行なった。増幅したDNA断片をNdeIおよびNotIで切断し、pET30a（Novagen社）のNdeI-NotI部位に挿入した。得られたプラスミドをpET30-10H3F-EOmと命名した。
次にQuickChange site-directed mutagenesis kit（Agilent社）を利用してpET30-10H3F-EOmに対して遺伝子変異を導入し、それぞれの変異体発現ベクターを作製した。
変異導入のために、W295Fは、
プライマーC：
5’- GACGTCTTCGGCCGTGGAACGCTGGTT-3’  （配列番号５）および
プライマーD：
5’- ACGGCCGAAGACGTCGTAGCCGACGTA -3’   （配列番号６）を、
W295Yは、
プライマーE：
5’- GACGTCTACGGCCGTGGAACGCTGGTT -3’   （配列番号７）および
プライマーF：
5’- ACGGCCGTAGACGTCGTAGCCGACGTA -3’   （配列番号８）を、
W295Aは、
プライマーG：5’- GACGTCGCCGGCCGTGGAACGCTGGTT -3’  （配列番号９）および
プライマーH：5’- ACGGCCGGCGACGTCGTAGCCGACGTA -3’）  （配列番号１０）を、
W295Qは、
プライマーI：5’- GACGTCCAAGGCCGTGGAACGCTGGTT -3’   （配列番号１１）および
プライマーJ：5’- ACGGCCTTGGACGTCGTAGCCGACGTA -3’  （配列番号１２）を、
W295Eは、
プライマーK：5’- GACGTCGAGGGCCGTGGAACGCTGGTT -3’   （配列番号１３）および
プライマーL：5’- ACGGCCCTCGACGTCGTAGCCGACGTA -3’   （配列番号１４）
を使用した。得られた発現ベクターは大腸菌内で増幅後、DNAシークエンシングを行ない、変異導入を確認した。
それぞれの発現ベクターを利用し、ヒートショック法を用いて大腸菌BL21 (DE3)  pLysS（バイオダイナミクス研究所）の形質転換を行なった。得られた形質転換体を50 μg/mlのカナマイシンと 34 μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培地（Difco）で37℃、一晩培養後、100 ml のOvernight Express Instant LB medium（Merck Millipore）に移し、16℃、2日間培養した。培養後、細胞を遠心して回収し、ストレージバッファー（500 mM 塩化ナトリウム、50 mM イミダゾール、1 mM フッ化フェニルメチルスルホニルを含む20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4 )）に懸濁した。超音波破砕はQ125超音波ホモジナイザー（Qsonica社 ）を用い、破砕条件はAmplitude 40％、1 sec pulse, 4 sec interval を6回繰り返すこととした。破砕液を 4℃、15,000×gで20分間遠心し、不要物を取り除いた。可溶性画分を50 mMのイミダゾールを含むストレージバッファーで平衡化したHisTrap HP (1 mL、GE ヘルスケア)に供し、200 mMのイミダゾールを含むストレージバッファーで洗浄後、500 mMのイミダゾールを含むストレージバッファーでEndo-Omを含む画分を溶出した。得られたW295の各種アミノ酸変異体画分をそれぞれストレージバッファーで透析し、各変異体が均一に精製できていることをSDS-PAGEで確認した（図３）後、-80℃で保存した。
【００２１】
（実施例３）Endo-Omの295番目のトリプトファンの置換体の解析
W295について他のアミノ酸残基へ置換し、酵素活性や基質特異性の変化を解析した。活性測定はPA（ピリジルアミノ）化糖鎖（タカラバイオ社）を利用し特許文献１に記載の方法で行なった。その結果を（表１）に示す。W295A、W295E、W295Qはいずれの基質にも活性を示さなかったのに対し、W295Y、W295Fでは変異導入前のWYと同じ基質に対する活性が存在し、W295Yのagalacto biantennaryに対する特異性を除き、基質特異性を変化させなかったことを確認した。
（表１）の変異導入前のWY、W295F及びW295YのMan3GlcNAc2-PA（M3B）に対する各糖鎖への相対活性を（表２）に示す。
また、（表３）としては、W295F及びW295Yの各糖鎖への活性をWYとの相対活性で示した。
【００２２】
【表１】
2017055675.tif 000002
【００２３】
【表２】
2017055675.tif 000003
【００２４】
【表３】
2017055675.tif 000004
【００２５】
以上の結果、W295Fは、WTと同様の傾向、すなわち高マンノース型糖鎖のうちのM5A及び２分岐複合型糖鎖（agalacto biantennary）は低く、他の高マンノース型糖鎖への活性が高いという傾向はあるものの、２分岐複合型糖鎖も含め、全ての糖鎖への相対活性がWYよりも高まっていることが確認された。一方、W295Yは、WYと比較して２分岐複合型糖鎖の相対活性が高まっているという傾向を示した。そして、W295F及びW295Y以外の他のアミノ酸変異体（W295A,W295E,W295Q）の場合は、いずれも全く活性を示さなかった(表１)。
具体的には、W295F及びW295Yの各糖鎖への相対活性を変異導入前の酵素活性を100%とした場合でみると（表３）、W295Fの場合は、高マンノース型糖鎖及び２分岐複合型糖鎖いずれに対しても2〜3倍以上の高い比活性を示した。W295Yでは、高マンノース型糖鎖に対する活性は変異前の酵素活性には及ばないが、従来型のEndo-Mの比活性値（非特許文献２）と比較すれば遜色はなく、２分岐複合型糖鎖に対してはもとのEndo-Omの2.34倍もの比活性を示し、これは、Endo-Mからは約8倍に相当する。
【００２６】
（実施例４）Endo-Om W295F、W295Yの糖タンパク質に対する反応性
実施例３において、W295F、W295Y変異酵素のPA化糖鎖に対する比活性が少なくとも複合型糖鎖に対して増加していたため、高マンノース型糖鎖を有するリボヌクレアーゼ（RNase）Bおよび複合型糖鎖を有するトランスフェリンに対する反応性を検討した。未変性のRNaseBに対し酵素を反応させた場合、変異導入前の酵素に比べ、W295Fは糖鎖が切断されたRNaseBの割合が増加していた。一方、W295Yでは変異導入前の酵素と同等以下であった。変性したRNaseBについてはいずれの酵素でも糖鎖が切断されたRNaseBが同程度に確認された。
未変性のトランスフェリンについてもW295Fは変異導入前の酵素に比較し、糖鎖が切断されたトランスフェリンの量が増加していた。更にシアリダーゼ処理により非還元末端側のシアル酸を除去してから反応を行なったところ、W295Fではより顕著に糖鎖が切断されたトランスフェリンが増加した。変性後のトランスフェリンに対しては、変異導入前の酵素に比較し、W295F、W295Yはより効率よく糖鎖を切断した。一方シアリダーゼ処理後の変性トランスフェリンに対しては、いずれの酵素も同程度に糖鎖を切断した。以上のことから、変異導入前のEndo-Omに比較し、Endo-Om  W295Fは特に未変性の糖タンパク質のN-型糖鎖を効率よく切断することが確認された（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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