(57)【要約】【課題】２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解するゼラチン水性組成物、およびそれに用いられるゼラチン等を提供すること、ならびに前記ゼラチン水性組成物を用いる医療用積層体、その医療用積層体の製造方法および細胞シートの単離方法を提供すること。【解決手段】高分子量成分の含有量が１０〜５０質量％であり、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンまたはその化学修飾体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子量成分の含有量が１０〜５０質量％であり、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンまたはその化学修飾体。
【請求項２】
腱由来コラーゲンに由来する、請求項１に記載のゼラチンまたはその化学修飾体。
【請求項３】
コラーゲンを、０．１〜１０質量％の濃度になるように水に加え、ｐＨを２〜９に調整して、４０〜８０℃の温度範囲で熱変性させることを含む、請求項１に記載のゼラチンまたはその化学修飾体の製造方法。
【請求項４】
コラーゲンが腱由来である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を０．５〜１０質量％で含有する、水性組成物。
【請求項６】
細胞シートと、該細胞シートの片面または両面に接着する請求項１または２に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する１つまたは２つの支持体層とからなる、医療用積層体。
【請求項７】
培養基材上に形成された細胞シートに、請求項１または２に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する液状またはゾル状の水性組成物を被覆し、該液状またはゾル状の水性組成物をゲル化させて支持体層を形成することを含む、請求項６に記載の医療用積層体の製造方法。
【請求項８】
請求項７の方法によって請求項６に記載の医療用積層体を製造し、つづいて前記支持体層を除去することを含む、細胞シートの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ゼラチンまたはその化学修飾体、それを含有する水性組成物および医療用積層体、ならびに医療用積層体の製造方法および細胞シートの単離方法に関する。さらに詳しくは、２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解するゼラチン水性組成物に用いられるゼラチンまたはその化学修飾体、それを含有する水性組成物および医療用積層体、ならびに医療用積層体の製造方法および細胞シートの単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞シート工学の技術を用いた再生医療が注目され、各種の細胞シートの移植が試みられている。細胞シートとしては、単層のシート、同一細胞のシートを積層化したもの、数種の細胞のシートを積層化したもの等が利用されている。例えば、細胞シートを用いて、皮膚、角膜、網膜、心臓病、耳、軟骨、すい臓、肝臓、肺、歯、食道、膀胱等の臨床応用が進められている。
細胞シートは非常に脆弱であり、単離後にシワ、破れなどが生じやすい。培養状態のままで保存および移送すれば、鮮度が保たれるが、培養液の振動を抑えて保存および移送することは容易ではない。そこで、より優れた細胞シートの保存および移送の方法が求められていた。
【０００３】
ゼラチンは皮膚、骨等の熱抽出物であり、変性コラーゲンを主成分としている。化学的にはコラーゲンとほぼ等価であるため、生体適合性に優れ、生体内で分解および吸収される。微粒子、フィルム、カプセル、スポンジ等の成型体がゼラチン水溶液から作製することができ、これらの成型体は再生医療の分野で広く用いられている。ゼラチン水溶液は低温でゲル化し、加温すると融解する性質を有し、食品分野では古くからゼリーとして活用されているが、この温度可逆性のゾル−ゲル転移を医療技術に応用した事例はほとんど無い。
【０００４】
特許文献１には、シート状細胞培養物と、該シート状細胞培養物を支持し、常温で高分子ゲル化可能な生体適合性化合物を含有する支持体層とから本質的になる医療用積層体が記載されている。実施例１には、常温で高分子ゲル化可能な生体適合性化合物としてゼラチンを用いて、４℃でゼラチンを凝固させて積層体を製造し、その後、３７℃に加温してゼラチンを融解させてシート状細胞培養物を得ている。しかし、実施例１で用いているゼラチンは通常の低い融点のゼラチンであり、２５℃等の室温ではゲル化しない。従って、実施例１の方法を用いた場合、細胞や組織を包埋した積層体の保管または移送は、室温よりも低い温度、例えば実施例１に記載された４℃に管理して行うことが必要になる。しかし、このような低温では、細胞や組織の機能は著しく低下するため、積層体から得られる細胞シートは、再生医療に用いるには適していない。
【０００５】
非特許文献１および特許文献２には、６０℃の穏やかな温度でブタ皮膚コラーゲン由来のアテロコラーゲンを熱変性させることで、加水分解された短いペプチドの含有量を減少させた非分解ゼラチン（ＵＣＧ）が開示されている。このＵＣＧの５質量％水溶液は、通常のゼラチンの５質量％水溶液よりも高い３１℃の融点を有し、２５℃で急速にゲル化する（非特許文献１の図２Ｂ）。非特許文献１の図１Ｂには、５質量％ＵＣＧ水溶液が３７℃では溶解しており、２３℃に冷却するとゲル化して、３７℃に昇温すると急激に溶解したことが示されている。従って、このＵＣＧを用いれば、培養温度の３７℃で細胞シートにゼラチンを加えて、２３℃でゲル化させ、生成した細胞シートを移送し、目的地で再び３７℃加温することで、ゼラチンを溶解させて細胞シートを単離することができる。
【０００６】
現在、細胞シート工学で汎用されているＵｐＣｅｌｌ（登録商標：セルシード社）等の細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材は、一定の温度を境に器材表面の性質が疎水性から親水性に可逆的に変化する。細胞の種類によって接着特性が異なるために温度が変わるが、例えば２７℃程度より低い温度にすることで、細胞シートを器材表面から分離して回収することができる。なお、この細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）が用いられているが、非特許文献２に記載の通り、多種類のＰＮＩＰＡＭがあり、そのＰＮＩＰＡＭごとに細胞が接着する温度は変わり得る。この細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材を利用して細胞シートを調製して移送する場合、３７℃等（第１の温度）で同器材上の細胞シートにゾル状態の細胞シート保護材料を加え、２７℃より高い温度（第２の温度）で細胞シートが同器材に接着した状態を保ちながら細胞シート保護材料をゲル化させ、その後、２７℃より低い温度（第３の温度）に冷却して細胞シート保護材料で保護された細胞シートを同器材から分離して、移送し、目的地で再び３７℃（第１の温度）に加温して細胞シートを単離する工程が実用的である。この工程を実現できるような温度可逆性のゾル−ゲル転移をする細胞シート保護材料が望まれているが、いまだに開発されていない。非特許文献１等のＵＣＧは、２７℃以上の温度（第２の温度）では急速にゲル化しないため、上記の細胞シート保護材料として用いることができない。
そこで、２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解する温度可逆性のゾル−ゲル転移をする細胞シート保護材料が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１７２９２５
【特許文献２】特開２０１４−１００１１０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Bioscience and Bioengineering, 118(1), 112-115 (2014)
【非特許文献２】Material Matters(商標), Vol.5, Vo.3, Aldrich刊, p.4-9 (2011.2)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解するゼラチン水性組成物、およびそれに用いられるゼラチン等を提供することにある。また、前記ゼラチン水性組成物を用いる医療用積層体、ならびに医療用積層体の製造方法および細胞シートの単離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、様々な原料を用いて種々の処理操作を行って調製したゼラチンを種々検討した結果、意外にもγ鎖よりも高分子量の成分の含有量が１０〜５０質量％であり、前記高分子量成分の含有量からα鎖よりも低分子量の成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンを５質量％含む水性組成物が、２７℃以上の温度で３０分以内に急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解することを見出して、本発明を完成した。本発明は、以下の通りである。
【００１１】
［１］  高分子量成分の含有量が１０〜５０質量％であり、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンまたはその化学修飾体。
［２］  腱由来コラーゲンに由来する、［１］に記載のゼラチンまたはその化学修飾体。
［３］  コラーゲンを、０．１〜１０質量％の濃度になるように水を加え、ｐＨを２〜９に調整して、４０〜８０℃の温度範囲で熱変性させることを含む、
［１］に記載のゼラチンまたはその化学修飾体の製造方法。
［４］  コラーゲンが腱由来である、［３］に記載の製造方法。
［５］  ［１］または［２］に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を０．５〜１０質量％で含有する、水性組成物。
［６］  細胞シートと、該細胞シートの片面または両面に接着する［１］または［２］に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する１つまたは２つの支持体層とからなる、医療用積層体。
［７］  培養基材上に形成された細胞シートに、［１］または［２］に記載のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する液状またはゾル状の水性組成物を被覆し、該液状またはゾル状の水性組成物をゲル化させて支持体層を形成することを含む、［６］に記載の医療用積層体の製造方法。
［８］  ［７］の方法によって［６］に記載の医療用積層体を製造し、つづいて前記支持体層を除去することを含む、細胞シートの単離方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のゼラチン等と水とを混合して調製されたゼラチン水性組成物は、２７℃以上の温度で３０分以内に急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解する。このゼラチン水性組成物を用いれば、３７℃等（第１の温度）で細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材上の細胞シートにゾル状態のゼラチン水性組成物を加え、２７℃より高い温度（第２の温度）で細胞シートが同器材に接着した状態を保ちながらゼラチン水性組成物をゲル化させ、その後、２７℃より低い温度（第３の温度）に冷却してゼラチン水性組成物で保護された細胞シートを同器材から分離して、移送し、目的地で再び３７℃（第１の温度）に加温して細胞シートを単離することに用いることができる。なお、第３の温度は、２５℃程度の室温でもよく、その温度では細胞シートにダメージを与えることがなく、細胞シートを安定して保管および移送することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンにおける、高分子量成分の含有量とＴｇ−ｍａｘとの関係を示す図である。
【図２】実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンにおける、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値とＴｇ−ｍａｘとの関係を示す図である。
【図３】実施例１６における本発明の水性組成物のゼラチン濃度とＴｇ−ｍａｘとの関係を示す図である。
【図４】実施例１７におけるゼラチンに対するコハク酸無水物との質量比と、サクシニル化された塩基性アミノ酸の置換率との関係を示す図である。
【図５】実施例１８におけるゼラチンの水性組成物のゲル化挙動を示す図である。
【図６】実施例２０における高濃度ゼラチン水性組成物のゲルの様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ゼラチンまたはその化学修飾体
コラーゲンはα鎖と呼ばれるペプチド鎖が３本集まってらせん構造を取っている。コラーゲンに熱分解等の処理を施して得られる通常のゼラチンは、一般に下記の成分が混合した組成物である。
【化１】
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「α鎖」は１本のペプチド鎖であり、「β鎖」は２本のα鎖が結合しており、「γ鎖」は３本のα鎖が結合している。また、α鎖が加水分解して生成される短いペプチドであるα鎖より低分子量の成分「低分子量成分」と、４本以上のα鎖が結合しているγ鎖よりも高分子量の成分「高分子量成分」が存在する。市販のゼラチンには、その調製過程で加水分解が進行して生成される低分子量成分が多量に含まれる。
【００１５】
本発明のゼラチンは、高分子量成分の含有量が１０〜５０質量％であり、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンである。
本発明のゼラチンにおいて、高分子量成分の含有量は１０〜５０質量％であるが、好ましくは１１〜４０質量％が挙げられ、より好ましくは１２〜３５質量％が挙げられ、さらに好ましくは１３〜３０質量％が挙げられ、特に好ましくは１５〜２５質量％が挙げられる。高分子量成分の含有量が５０質量％を超えると、１〜１０質量％ゼラチン水性組成物においてゾルが極めて粘ちょうとなってゲル化もしなくなる。高分子量成分の含有量が１０質量％より少なければ、１〜１０質量％ゼラチン水性組成物が２７℃以上の温度で急速にゲル化しなくなる。
【００１６】
本発明のゼラチンにおいて、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値は０質量％以上であるが、好ましくは２質量％以上が挙げられ、より好ましくは３質量％以上が挙げられ、さらに好ましくは５質量％以上が挙げられ、特に好ましくは８質量％以上が挙げられる。前記の値が、０質量％より低ければ、１〜１０質量％ゼラチン水性組成物が２７℃以上の温度で急速にゲル化しなくなる。
α鎖、β鎖およびγ鎖の含量としては、特に制限はない。α鎖の含有量としては、例えば１０〜５０質量％が挙げられ、好ましくは１５〜４０質量％が挙げられ、より好ましくは２０〜３５質量％が挙げられる。β鎖の含有量としては、例えば１０〜５０質量％が挙げられ、好ましくは１５〜４０質量％が挙げられ、より好ましくは２０〜３５質量％が挙げられる。γ鎖の含有量としては、例えば１０〜５０質量％が挙げられ、好ましくは１５〜４０質量％が挙げられ、より好ましくは２０〜３５質量％が挙げられる。
また、本発明のゼラチンに含まれるアミノ酸におけるヒドロキシプロリンの含有率としては、好ましくは１０％以上が挙げられる。ヒドロキシプロリンの含有量が低くなると、ゼラチン水性組成物の急速にゲル化する温度も低下する。
【００１７】
本発明のゼラチンの化学修飾体としては、例えば本発明のゼラチンのカルボキシル基またはアミノ基が化学修飾されたもの、および本発明のゼラチンのプロリンを水酸化したもの等が挙げられる。カルボキシル基の化学修飾としては、例えばアンモニア、アミン、グリシンメチルエステル等によるアミド化等が挙げられる。アミノ基の化学修飾としては、例えばサクシニル化、フタル化、フマリル化、アセチル化等が挙げられる。ゼラチンのプロリンの水酸化は、例えばゼラチンにプロリル４−ヒドロキシラーゼを作用させることで実施できる。これらの化学修飾に用いられる官能基のうち、アミノ基とカルボキシル基はコラーゲンらせんの外側に向いているため、コラーゲンらせんの部分回復現象であるゼラチンのゲル化現象がこれらの官能基修飾によって阻害されにくい。その結果、高いゲル化温度という本発明の効果を損なわずに、その他種々のゼラチン物性を変えることが可能である。一方、プロリンの水酸化については、コラーゲンらせん内の水素結合に寄与し、ゼラチンゲル化を安定化させる。好ましい化学修飾体としては、導入される側鎖が生体内代謝物質であり、中性での水溶性を高める効果を持つサクシニル化が挙げられる。化学修飾の度合いは、ゼラチンの化学修飾体の物性が所望のものとなるように、適宜、調整することが好ましい。サクシニル化では、ゼラチンに存在するアミノ基のうちの８０％までの修飾では、ゼラチン水性組成物の急速にゲル化する温度はほとんど変化させず、溶解性を上げることができる。より好ましいサクシニル化の割合としては、アミノ基のうち４０〜７０％が挙げられる。
前記の化学修飾は、常法に従って、実施することができる。
【００１８】
２．ゼラチンの製造方法
本発明のゼラチンの原料としては、例えば牛、豚、鶏、ダチョウ、魚等の動物に由来するコラーゲン等が挙げられ、好ましくは牛、豚、鶏、ダチョウ等が挙げられ、より好ましくは豚が挙げられる。これらの動物からコラーゲンを採取する部分としては、皮膚、骨、軟骨、腱、鱗等が挙げられる。これらのうちで腱は高分子量成分が多量に含まれているため好ましい。
本発明のゼラチンは、抽出されたコラーゲンを熱分解により調製することで、高分子量の会合体を多く含み、急速にゲル化する温度が高くなるゼラチンが得られる。原料として用いる抽出されたコラーゲンとしては、アテロコラーゲン、酸抽出コラーゲン、アルカリ処理コラーゲン等を用いることができる。好ましくはアテロコラーゲンが挙げられる。アテロコラーゲンは、例えばペプシン、キモシン、カテプシンＤ、レニン等のタンパク質分解酵素を加えて、Ｎ末端またはＣ末端に存在するテロペプチドを消化することにより調製されたものであり、テロペプチドが除去されているために粘性が低く、取扱いが容易になる。さらに好ましくは腱由来のアテロコラーゲンが挙げられる。
【００１９】
抽出されたコラーゲンを、０．１〜１０質量％の濃度になるように水を加え、特定のｐＨに調整する。コラーゲンの濃度としては、好ましくは０．１５〜５質量％が挙げられ、より好ましくは０．２〜３質量％が挙げられる。ｐＨとしては、例えば２〜９が挙げられ、好ましくは３〜８が挙げられ、より好ましくは４〜７が挙げられる。続いて、この水溶液を例えば４０〜８０℃の温度範囲で５分間〜２４時間保持することで熱変性させる。熱変性温度は、好ましくは４５〜７０℃が挙げられ、より好ましくは５０〜６０℃が挙げられる。熱変性時間は、熱変性温度が低ければ長時間に、高ければ短時間に調整することが好ましい。熱変性時間としては、例えば１５分間〜１５時間が挙げられる。この熱変性によって、コラーゲンのらせん構造が壊れて、高分子量成分、γ鎖、β鎖、α鎖および低分子量成分の混合物が得られる。
【００２０】
熱変性したゼラチン水溶液を乾燥することで、本発明のゼラチンが得られる。乾燥の方法としては、常法に従って行うことができるが、例えば通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。また、得られたゼラチンを常法に従って化学修飾して、化学修飾体とすることができる。
複数のゼラチンまたは高分子量成分、γ鎖、β鎖、α鎖もしくは低分子量成分を適宜混合して、本発明の条件に合致するゼラチン混合物とすることもできる。
【００２１】
３．水性組成物
本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を０．５〜１０質量％となるように水と混合することで、温度可逆性ゾル−ゲル転移を示す水性組成物を得ることができる。本水性組成物は、その使用目的に応じて、濃度を変更することができる。例えば医療用積層体に使用するのであれば、好ましい濃度としては、１〜８質量％が挙げられ、より好ましくは２〜７質量％が挙げられ、さらに好ましくは３〜６質量％が挙げられる。
用いられる水は、その使用目的に応じて任意に選択することができる。例えば医療用積層体に使用するのであれば、水は無菌のものが好ましく、例えば生理食塩水を用いることができる。必要に応じて、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤等の緩衝剤、防腐剤、殺菌剤等の添加物を加えることもできる。
【００２２】
本発明の水性組成物は、２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解する。急速にゲル化する温度として、本発明者らは「実用的な最高ゲル化温度（Ｔｇ−ｍａｘ）」を定義して、本明細書にて用いる。ＵｐＣｅｌｌ（登録商標：セルシード社）等の細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材を２７℃にすると、３０分前後で細胞シートが剥離する場合がある。そこで、Ｔｇ−ｍａｘとは、３０分以内に実用的な硬さ（Ｇ’＝５０Ｐａ）以上になる温度で最高の温度を表す。Ｔｇ−ｍａｘの測定法方法は、後述する。また、ゲルが溶解する温度としては「最低融解温度」を用いる。従って、本発明の水性組成物は、Ｔｇ−ｍａｘが２７℃以上であり、最低融解温度が３２℃以上のものということになる。
本水性組成物の使用目的に応じて、実施例１５に示すように、本発明のゼラチン等に含まれる高分子量成分および低分子量成分等の含有量を調整することで、あるいは実施例１６に示すように、本発明のゼラチン等の濃度を調整することで、本発明の水性組成物のＴｇ−ｍａｘおよび最低融解温度を所望の値に調整することができる。
【００２３】
４．医療用積層体
本発明の医療用積層体は、細胞シートと、該細胞シートの片面または両面に接着する本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する１つまたは２つの支持体層とからなる。
該細胞シートの片面または両面に接着する本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する１つまたは２つの支持体層として、前記３．に記載の水性組成物が用いられる。
【００２４】
細胞シートとしては、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１つの細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。細胞シートの細胞としては、任意の細胞が含まれるが、例えば、筋芽細胞、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、歯根膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。細胞の動物種としては、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット等が挙げられる。
【００２５】
支持体層として用いられる前記３．の水性組成物中の本発明のゼラチンまたはその化学修飾体の含有量としては、例えば１〜１０質量％が挙げられ、好ましくは２〜８質量％が挙げられ、より好ましくは３〜７質量％が挙げられ、さらに好ましくは４〜６質量％が挙げられる。
支持体層は、細胞シートの全体に接着することが好ましいが、細胞シートの一部だけに接着していてもよい。支持体層の厚みとしては、細胞シートを支持できる厚みであれば特に限定されないが、剥離の過程で細胞シートの破損を避ける強度の点から、例えば１〜１０ｍｍが挙げられ、好ましくは２〜７ｍｍが挙げられ、より好ましくは３〜５ｍｍが挙げられる。
本発明において、支持体層は細胞シートの片面または両面に接着しており、強度を有しているため、脆弱な細胞シートを確実に支持することができる。従って、細胞シートを安定して保管および移送できるだけではなく、培養基材からの剥離も容易に行うことができる。
本発明の医療用積層体を室温で７日間程度保管しても、実施例１９に示すように、細胞シート中の細胞の死滅は非常に少ない。このように、死滅が少ないことから、細胞や組織の機能は著しく低下する低温での保管および移送ではなく、室温での保管および移送が可能となる。
【００２６】
５．医療用積層体の製造方法および細胞シートの単離方法
本発明の医療用積層体は、例えば培養基材上に形成された細胞シートに、本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する液状またはゾル状の水性組成物を被覆し、該液状またはゾル状の水性組成物をゲル化させて支持体層を形成することを含む方法で製造することができる。また、細胞シートの両面に支持層を有する医療用積層体は、例えば培養基材上に形成された細胞シートに、本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する液状またはゾル状の水性組成物を被覆し、該液状またはゾル状の水性組成物をゲル化させて第１の支持体層を形成し、続いて前記細胞シートをゲル化した支持体層とともに前記培養基材から分離し、該細胞シートの前記培養基材と接していた面に本発明のゼラチンまたはその化学修飾体を含有する液状またはゾル状の水性組成物を被覆し、該液状またはゾル状の水性組成物をゲル化して第２の支持体層を形成することを含む方法で製造することができる。
【００２７】
細胞シートは通常、培養基材上で形成される。培養基材としては、その上で細胞シートを形成し得るものであれば特に限定されない。刺激、例えば温度や光に応答して物性が変化する材料で培養基材の表面が被覆されていてもよい。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。培養基材として、例えばＵｐＣｅｌｌ（登録商標：セルシード製）の細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材を用いることができる。
細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材を用いれば、３７℃等（第１の温度）で細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材上の細胞シートにゾル状態の本発明の水性組成物を加え、２７℃以上の温度（第２の温度）で細胞シートが同器材に接着した状態を保ちながら本発明の水性組成物をゲル化させ、その後、２７℃より低い温度（第３の温度）に冷却して本発明の水性組成物で保護された細胞シートを同器材から分離して、移送し、目的地で再び３７℃等（第１の温度）に加温して細胞シートを単離することに用いることができる。
【００２８】
細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材を用いる場合について、さらに具体的に説明する。
まず、第１の温度で細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材上の細胞シートにゾル状態の本発明の水性組成物を加える。本発明の水性組成物に含まれる本発明のゼラチンまたはその化学修飾体の含有量としては、例えば１〜１０質量％が挙げられ、好ましくは２〜８質量％が挙げられ、より好ましくは３〜７質量％が挙げられ、さらに好ましくは４〜６質量％が挙げられる。前記３．の液状またはゾル状の水性組成物の量としては、細胞シートを支持できる厚みとなる量が挙げられ、例えば１〜１０ｍｍとなる量が挙げられ、好ましくは２〜７ｍｍとなる量が挙げられ、より好ましくは３〜５ｍｍとなる量が挙げられる。第１の温度としては、例えば、３４〜３８℃が挙げられ、好ましくは３７℃が挙げられる。
【００２９】
続いて、２７℃以上の温度（第２の温度）で細胞シートが同器材に接着した状態を保ちながら本発明の水性組成物をゲル化させる。第２の温度としては、例えば２７〜３２℃が挙げられ、好ましくは２８〜３１℃が挙げられ、より好ましくは２８〜３０℃が挙げられる。固化またはゲル化の時間としては、例えば１０分間〜１時間が挙げられ、好ましくは１５〜３０分間が挙げられる。
その後、２７℃より低い温度（第３の温度）に冷却して本発明の水性組成物で保護された細胞シートを同器材から分離する。第３の温度としては、例えば２０〜２５℃が挙げられる。
得られた片面に本発明の水性組成物を有する医療用積層体は、ピンセット等を用いて表面と裏面をひっくり返して、前記と同様にして、細胞シートの培養基材と接していた面に第２の本発明の水性組成物を形成させて、両面に本発明の水性組成物を有する医療用積層体を製造することもできる。
【００３０】
得られた本発明の水性組成物で保護された細胞シートを、目的地で再び３７℃等（第１の温度）に加温して細胞シートを単離する。第１の温度は、前記の通りである。
本発明の水性組成物を除去した後、必要に応じて水で細胞シートを洗浄することができるが、ゼラチンは生体適合性があるため、細胞シートにゼラチンが多少残存し付着していても、医療に用いる上で支障はない。また、本発明の水性組成物を除去せずに、医療用積層体を生体に直接適用することもできる。直接適用した場合、本発明の水性組成物は生体の体温に伴って溶解され、あるいは生体内の酵素によって分解されるため、そのまま生体中に留めておくか、あるいは医療行為の際に除去することもできる。医療用積層体を生体に直接適用することで、細胞シートを適用するための移植用の治具等を用いる必要がなくなる。
【００３１】
６．ゼラチンのその他の使用
本発明のゼラチンは、前記の細胞シートへの適用の他、その特性に基づいて様々な用途（例えば、培地、食品、化粧品、医薬等）に応用することもできる。
本発明の水性組成物において本発明のゼラチン等の濃度を高めることで、最低融解温度を３７℃以上にすることもできる。その場合、３７℃で融解しないため、細胞をゲル状態の本発明の水性組成物の中に分散させて、そのまま３７℃で培養することができる。また、３７℃でゲル状態を保つことから、細胞を含むゲル状態の本発明の水性組成物を、生体にそのまま移植することもできる。その場合、本発明のゼラチン等は、生体内の酵素によりゆっくりと分解される。
食品としては、例えば即席食品、野菜、果実、消化を活性化する繊維性食品、機能性食品等が挙げられる。化粧品および医薬としては、例えば経皮製剤、内服剤、坐剤、経腟剤等が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例、比較例、評価試験によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例および比較例で調製したゼラチンの水性組成物の評価試験は、下記方法にて実施した。
【００３３】
（ａ）ゼラチン成分の含有量の分析
ゼラチンに含まれる高分子量成分、γ鎖、β鎖、α鎖および低分子量成分の含有量は、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、およびそのデンシトグラムによって解析した。
電気泳動のゲルは、ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル（登録商標：バイオ・ラッド製）を用いた。実施例および比較例のゼラチンを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：和光純薬製）、ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ：和光純薬製）、グリセリン（関東化学製）、トリス緩衝液（和光純薬製）と混合し、試料濃度が１レーンあたり１０μｇになるよう調製し、１００℃で３分間加熱した。試料溶液を各ウェルに１０μＬずつアプライし、プロトコールに記載のある所定の方法によって電気泳動を行った。分子量マーカーとして、プレシジョンＰｌｕｓプロテインブルースタンダード（商標：バイオ・ラッド製）を使用した。また、豚腱由来アテロコラーゲンはＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと、α１、α２、β１１、β１２、γ、高分子量成分からなるため、各成分のピークのコントロールとして用いた。電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ：和光純薬製）を用いて染色を行った。さらに、メタノール（和光純薬製）、酢酸（和光純薬製）、超純水によって調製された脱色液を用いて脱色を行った。
【００３４】
ゼラチンに含まれる高分子量成分、γ鎖、β鎖、α鎖および低分子量成分の含有量の解析に用いたデンシトグラムの取得には、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いた。その手法は以下の通りである。脱色後のゲルをゲルドライヤー（バイオ・ラッド製）で乾燥させ、得られた乾燥体をスキャナーで電子化した。ＩｍａｇｅＪを用いた画像処理により、バックグラウンドを差し引き、泳動バンドの幅に応じてレーンごとに、各バンドの位置と、画素数から算出した輝度をグラフ化したデンシトグラムを作成した。ゲル画像に基づいてデンシトグラム上にベースラインを引き、ピークごとの面積を算出することで各ピーク濃度を定量した。レーン全体の合計面積に対する各バンドの面積比から、ゼラチンに含まれる高分子量成分、γ鎖、β鎖、α鎖および低分子量成分の組成比を算出した。
なお、低分子量成分のバンドとしては、分子量マーカーの１００ｋＤａより低分子量のすべての成分を選択した。α鎖のバンドとしては分子量マーカーの１００ｋＤａから１５０ｋＤａにあるデンシトグラムにおけるピークを選択した。β鎖のバンドとしてはデンシトグラムにおけるβ１１、β１２に相当するピークを選択した。γ鎖のバンドとしてはデンシトグラムにおいてγ鎖に相当するピークを中心に、γ鎖と高分子成分との間の最も深い谷より低分子の成分を含めて選択した。高分子量成分のバンドとしてはデンシトグラムにおいてγ鎖と高分子成分との間の最も深い谷より高分子の成分を選択した。
（参考文献）
・Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.
・Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
【００３５】
（ｂ）Ｔｇ−ｍａｘの測定
動的粘弾性測定装置（Thermo Fisher Scientific製、型式：MARSIII）を使用して測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：シグマアルドリッチ製）を溶媒とし、実施例および比較例のゼラチンから５．０質量％のゼラチン水性組成物を調製して検体とした。５０℃に加温した状態のゼラチン水性組成物を３７℃に加温したダブルコーン型センサー（内径６０ｍｍ、コーン角度１°）に３．０ｍｌ充填し、−１．２℃／分でターゲット温度まで冷却して貯蔵弾性率Ｇ’の変化を追跡した。Ｇ’が５０Ｐａに達するまでの時間を、ターゲット温度を少なくとも３点変えて計測した。縦軸に貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）を、横軸に時間（分）として両者の関係をプロットして最小二乗法で一次の近似式を求め、その近似式から３０分間で５０Ｐａに達する温度をＴｇ−ｍａｘとして算出した。なお、Ｇ’を測定する際の前記動的粘弾性測定は、剪断ひずみ０．０１でのひずみ制御下、周波数１Ｈｚで行った。
【００３６】
（ｃ）最低融解温度の測定
前記（ｂ）と同じ動的粘弾性測定装置を使用して測定した。（ｂ）と同様に調製したゼラチン水性組成物を５０℃に加温した状態で、３７℃に加温したダブルコーン型センサーに３．０ｍｌ充填した。その後、以下に示す測定プロファイルによりゼラチンのゲル化と融解を、ひずみ制御の動的粘弾性測定で追跡した。
（ｉ）温度、３７℃→４℃（−３℃／分）；剪断ひずみ、０．００５；周波数、１Ｈｚ．（ii）温度、４℃（１２０分）；剪断ひずみ、０．００１；周波数、１Ｈｚ．
（iii）温度、４℃→ｘ℃（＋１．２℃／分）；剪断ひずみ、０．０１；周波数、１Ｈｚ．
（iv）温度、ｘ℃（３０分）；剪断ひずみ、０．００５；周波数、１Ｈｚ．
（ｖ）温度、ｘ℃→ｘ+１℃（＋１．２℃／分）；剪断ひずみ、０．００５；周波数、１Ｈｚ．
（vi）プロファイル（iv）と（ｖ）を、＋１℃ずつ段階的に温度上昇するように繰り返す。
このような段階的温度上昇を、温度保持中のＧ’が１Ｐａ未満になるまで行い、その温度を最低融解温度とした。
【００３７】
（ｄ）医療用積層体から単離された細胞の血球計算盤による細胞生存率の評価
細胞の生存率を定量的に評価するために、血球計算盤により生細胞と死細胞を計測した。実施例のゼラチン水性組成物を、緩衝液（Hanks' Balanced Salt Solution：ライフテクノロジーズ製）と混合して、基材濃度が５質量％になるように調製し、温度を３７℃に保温して基材ゾルを調製した。一方、温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）：セルシード製）に、ヒト新生児皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ（理化学研究所バイオリソースセンター提供、リソースＮｏ．ＲＢＲC−ＲＣＢ０２２２）を播種して、オーバーコンフルエントにして、細胞シートを作製した。細胞シートは、３７℃に保温したサーモプレートに静置し、３７℃に保温された緩衝液で洗浄した。ゾル状態のゼラチン水性組成物を、細胞シート表面を覆ったのち、サーモプレートを２７℃に３０分間冷却して、基材ゾルをゲル化させた。細胞シートと一緒に、ゲル状態のゼラチン水性組成物を培養皿から剥がして、細胞シート面を上にして浮遊細胞用培養皿に移した。温度を３７℃に保温したゾル状態のゼラチン水性組成物で、細胞シート面を覆い、医療用積層体を得た。国内における他所への搬送と手術までの保存を想定して、この医療用積層体を室温に１週間静置した。
【００３８】
医療用積層体を室温に１週間静置した後、医療用積層体と等量の１％コラゲナーゼ（和光純薬製）／０．２％トリプシンインヒビター（和光純薬製）緩衝液を加え、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）に移して、３０分間振とうしてゼラチン水性組成物を溶解させた。細胞を分離するために、遠心分離機（himacCR-GIII：日立工機製）により１０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を除去し、緩衝液を加えて遠心して上清を除去することを２回行った後、試料の細胞を回収した。緩衝液に細胞塊を分散させて細胞懸濁液を調製し、懸濁液から１００μｌ採取して、０．４％トリパンブルー染色を行った。染色後の細胞は、カバーガラスをセットした血球計算盤（改良ノイバウエル：サンリード硝子製）に１０μｌ滴下して、トリパンブルーで染色された死細胞と染色されなかった生細胞の数を計測した。細胞の生存率は、値が高いほど好ましく、９０％以上が好ましい。
｛細胞生存率（％）｝＝｛１−（死細胞数）／（生細胞数＋死細胞数）｝×１００
【００３９】
実施例１
ゼラチンの調製
豚腱由来アテロコラーゲンを０．３質量％のｐＨ３．０の水溶液にして、６０℃で０．２５時間、加熱処理した。その後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、凍結乾燥して、実施例１のゼラチンを得た。
【００４０】
実施例２〜１４および比較例１〜７
ゼラチンの調製
実施例１の調製と同様にして、表１に記載の通り、原料、処理時間または処理温度を変更して、実施例２〜１４および比較例１〜５のゼラチンを調製した。
比較例４および５の原料は、販売されているコラーゲンであり、コラーゲンＢＭ（豚皮由来：新田ゼラチン社製）である。
比較例６および７は、販売されているゼラチンであり、それぞれbeMatrix gelatin LS-H（豚皮由来：新田ゼラチン社製）およびゼラチン（豚皮由来：新田ゼラチン社製）である。
【表１】
2017078045.tif 000004
【００４１】
評価試験１
実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンの組成、Ｔｇ−ｍａｘおよび最低融解温度
実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンの組成を分析した。その分析結果を、表２に記す。また、これらのゼラチンを５質量％となるようにリン酸緩衝生理食塩水で溶解した水性組成物のＴｇ−ｍａｘおよび最低融解温度を測定した結果を、表２に記す。
【表２】
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【００４２】
図１に、実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンにおける、高分子量成分の含有量とＴｇ−ｍａｘとの関係を示す。また、図２に、実施例１〜１４および比較例１〜７のゼラチンにおける、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値とＴｇ−ｍａｘとの関係を示す。図１から、高分子量成分の含有量が１０〜５０質量％であるゼラチンは、その５質量％水性組成物のＴｇ−ｍａｘが２７℃以上であり、急速にゲル化することが分かる。また、図２から、高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値が０質量％以上であるゼラチンは、その５質量％水性組成物のＴｇ−ｍａｘが２７℃以上であり、急速にゲル化することが分かる。
表２に記載の通り、実施例２、４および１４のゼラチンの５質量％水性組成物のＴｇ−ｍａｘと最低融解温度は、ほぼ５℃相違している。そこで、これら以外のゼラチンについては最低融解温度の測定はしていないが、Ｔｇ−ｍａｘに５℃を加えたものを最低融解温度の推定値として、表２に記載する。
【００４３】
実施例１５
ゼラチンの混合実験
実施例４のゼラチンと比較例７のゼラチンを１対１（重量比）で混合したゼラチンを用いて、その５質量％ゼラチン水性組成物のＴｇ−ｍａｘを求めた。その結果、Ｔｇ−ｍａｘは、２７．３℃となった。実施例４のゼラチンと比較例７のゼラチンの５質量％水溶液のＴｇ−ｍａｘは、それぞれ３０．８℃および２４．０℃であるため、ほぼその平均値となった。
以上の通り、種類の異なる複数のゼラチンまたは複数のゼラチンの成分を混合することなどによって、高分子量成分の含有量、および高分子量成分の含有量から低分子量成分の含有量を差し引いた値を調整すれば、それらの数値に応じたＴｇ−ｍａｘを有するゼラチンを調製することができることが分かる。
【００４４】
実施例１６
濃度の変化によるＴｇ−ｍａｘの変化
実施例４のゼラチンをリン酸緩衝生理食塩水に溶解させて、３、５および７質量％溶液を調製した。この水溶液のＴｇ−ｍａｘを求めた。濃度とＴｇ−ｍａｘの関係をプロットした図を、図３に示す。実施例４のゼラチンでは、濃度上昇に伴って、Ｔｇ−ｍａｘが上昇した。
【００４５】
実施例１７
ゼラチンのサクシニル化
高分子量成分の含有量が高くなると、ゼラチンの５質量％水性組成物は溶解性が低下することがある。ゼラチンをサクシニル化して、塩基性アミノ酸（リジン）にかさ高いコハク酸を導入すれば、溶解性が高まることが一般的に知られている。そこで、実施例２のゼラチンをサクシニル化した。
氷浴中で１０℃未満に保ったゼラチン原料の０．１％コラーゲン水溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを９〜１０にした。コラーゲン水溶液を攪拌しながら、ペレット状のコハク酸無水物（東京化成製）を少量ずつ投入し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが９〜１０の範囲になるように調節した。所定量のコハク酸無水物をすべて投入し、ｐＨが変化しなくなったところで反応終了とした（反応時間は４時間を超えなかった）。得られた反応液に１Ｎ塩酸を滴下することでｐＨ４近傍にして、サクシニル化コラーゲンを析出させ、遠心分離機（日立工機社製、型式：himacCR-GIII）により４０００ｒｐｍで２０分間遠心して沈殿物を回収した。ｐＨ４の希塩酸に沈殿物を分散させ、再度遠心分離する洗浄操作を２回行った後、濃度が約０．１％になるように沈殿物を純水に分散させ、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨを中性にして沈殿物を溶解させた。得られた水溶液を冷蔵庫内で純水に対して透析し、ゼラチンを原料として用いるサクシニル化コラーゲンを得た。
【００４６】
サクシニル化度を制御するために、以上に述べたコラーゲンのサクシニル化操作を、コハク酸無水物／コラーゲン（ｗ／ｗ）＝０．０５、０．１、０．２、０．５、１、および３と変化させて実施し、実施例１と同様にゼラチンを調製した。反応に用いたゼラチンに対するコハク酸無水物との質量比と、サクシニル化された塩基性アミノ酸の置換率との関係を、図４に示す。この結果から、置換率が９０％で頭打ちになり、それ以上のサクシニル化は容易ではないことが分かる。
前記反応で得られた種々の置換率を有するゼラチンのサクシニル体について、その５質量％水性組成物のＴｇ−ｍａｘを測定する。置換率が４０〜７０％のゼラチンの水性組成物のＴｇ−ｍａｘは、無置換の実施例２のゼラチンの水性組成物と同等である。しかし、置換率が８０％以上のゼラチンの水性組成物のＴｇ−ｍａｘは、無置換の実施例２のゼラチンの水性組成物とＴｇ−ｍａｘよりも低く、置換率がさらに上昇することで、さらにＴｇ−ｍａｘが低下する。
【００４７】
実施例１８
ゼラチンの水性組成物のゲル化挙動
実施例４のゼラチンの５質量％水性組成物を、図５に示す通り、３７℃、３０℃、２４℃および３７℃と温度を変化させて保温した。その時々の貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）を、動的粘弾性測定装置を用いて測定した。保温温度と貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）の挙動を図５に示す。
３０℃で貯蔵弾性率Ｇ’（Ｐａ）が急激に上昇してゲル化し、２４℃まで温度を下げることでゲルの硬さを更に高めることができた。このように形成されたゲルは３７℃で速やかに溶解した。
【００４８】
実施例１９
医療用積層体の調製
温度応答性培養皿でヒト新生児皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢ（理化学研究所バイオリソースセンター提供、リソースＮｏ．ＲＢＲＣ−ＲＣＢ０２２２）をオーバーコンフルエントになるまで培養して細胞シートを調製した。実施例２のゼラチンの５質量％水性組成物を３７℃に加温して、３０℃に保温した細胞シートの上に加えてゲル化させて第１の支持体層を形成させた。続いて細胞シートと第１の支持体層を室温に３０分間静置した後、培養皿から剥がして、表面と裏面を裏返して、裏面にも、同様にして第２の支持体層を形成させた。
一方、比較例６のゼラチンの５質量％水性組成物を３７℃に加温して、３０℃に保温した細胞シートの上に加えたが、３０℃ではゲル化しなかった。そこで、２７℃より低い温度に冷却したところ、ゲル化が生じる前に細胞シートが剥離したため、細胞シートを回収することができなかった。
【００４９】
室温で保存された医療用積層体から単離された細胞の血球計算盤による細胞生存率の評価
実施例１９で調製した医療用積層体を室温に静置して、医療用積層体から細胞を回収し、細胞生存率を測定した結果を表３に記す。３日までは９５％以上の生存率を示し、７日後の９０％以上の生存率を示した。
【表３】
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【００５０】
実施例２０
高濃度ゼラチン水性組成物
実施例４のゼラチンを８質量％によるようにリン酸緩衝生理食塩水で溶解し、２ｍＬを３５ｍｍディッシュに添加した。２０℃で一晩静置してゲル化させた。その後、３７℃にインキュベートし、１日目および４日目に観察をした。また、比較例６のゼラチンを用いて、同様にして２０℃一晩で静置しゲル化させた。その後、３７℃にインキュベートし、１日目に観察をした。両方のゲルの様子を図７に記す。
８質量％の比較例６のゼラチンのゲルは、３７℃で１日目にはゲルが溶解したのに対して、８質量％の実施例４のゼラチンのゲルは、３７℃で４日目でも十分にゲルを維持していることが分かる。この３７℃で融解しない特性を利用すれば、細胞シートへの応用の他に様々な用途（例えば、培地、食品、化粧品、医薬等）に応用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のゼラチンと水とを混合して調製された水性組成物は、２７℃以上の温度で急速にゲル化し、約３２℃以上でゲルが溶解する。前記の効果を利用することで、本発明は細胞シートの保存および移送等に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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