(57)【要約】      （修正有）【課題】無機イオンによる妨害がなく、チラミン及び／又はヒスタミンに対して電位応答挙動を示すイオン選択性電極に使用可能な感応膜を提供すること。【解決手段】イオン感応膜のイオノフォアとして、特定の式で表されるホモオキサカリックス［３］アレン誘導体を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオノフォアとして、下記式
【化１】
2017122677.tif 000004
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ６は、水素原子、炭素数１〜１８のアルキル基又は炭素数１〜１８のエステル基の何れかである、
で表されるホモオキサカリックス［３］アレン誘導体を含有することを特徴とするイオン感応膜。
【請求項２】
請求項１記載のイオン感応膜を使用して成り、不揮発性生体アミン類に対して電位応答挙動を示すことを特徴とするイオン選択性電極。
【請求項３】
請求項２記載のイオン選択性電極から成る作用電極、及び参照電極を備えて成ることを特徴とするイオンセンサ。
【請求項４】
請求項１記載のイオン感応膜を電界効果型のトランジスタのゲート部に接続して成り、不揮発性生体アミン類に対して電位応答挙動を形成することを特徴とするイオン選択性電界効果型トランジスタ。
【請求項５】
請求項４記載のイオン選択性電界効果型トランジスタから成る作用電極、及び参照電極を備えて成ることを特徴とするイオンセンサ。
【請求項６】
請求項３又は請求項５記載のイオンセンサを用いて、食品中のチラミン及び／又はヒスタミン量を測定することを特徴とする食品管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不揮発性生体アミン類、特にチラミン及び／又はヒスタミンと理想的な電位応答挙動を形成可能なイオン感応膜、このイオン感応膜から成るイオン選択性電極及びイオンセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品の安全性に対する消費者の意識が高まっており、食品の安全性を数値化（可視化）することによって、食品の鮮度評価による可食期間の延長、ひいては廃棄物を減量することが求められている。
従来より、食品の鮮度評価は、パネラーによる臭いや味覚変化を評価する官能評価法によって行われることが一般的であるが、この官能評価法では、パネラーの熟練度、体調或いは嗜好などに影響を受ける。また食品劣化の評価は、パネラーによる官能評価法では危険であることから実施することは困難である。
【０００３】
このような観点から、食品の鮮度を表すＫ値算出法等、生体アミン等の成分分析を行うことによって食品の鮮度評価が行われている。例えば、魚肉は、腐敗により不揮発性生体アミン類（チラミン、ヒスタミン等）が増加することから、これらを定量分析することによって評価できる。
このような生体アミン類の成分分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（特許文献１）や、酵素反応を利用した酵素電極法（特許文献２）、或いは生体アミンと反応する特定の酵素を用いる方法等が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２１７９２１号公報
【特許文献２】特公平７−５００６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＰＬＣ法による分析は、正確な分析が可能であるが、装置自体が高価であり、測定時間も長く手軽に分析することは困難である。また酵素電極法による分析は、ＨＰＬＣ法に比べ測定時間は短いが、酵素が反応するという性質上、多数回連続測定が難しく、高コストであるという問題がある。
一方、成分分析の方法としてイオン選択性電極法も知られており、無機イオンの定量分析に使用されているが、有機イオンを測定対象にしたイオン選択性電極はほとんど市場には出ておらず、上述したような生体アミン類の分析に使用すると、無機イオンによる妨害が発生し、正確な定量分析を行うことができなかった。
【０００６】
従って本発明の目的は、無機イオンによる妨害がなく、不揮発性生体アミン類、特にチラミン及び／又はヒスタミンに対し理想的な電位応答挙動を示すイオン選択性電極に使用可能なイオン感応膜及びイオン選択性電極を提供することである。
本発明の他の目的は、食品の鮮度評価に使用可能なイオンセンサ及びこのイオンセンサを用いた食品鮮度管理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、イオノフォアとして、下記式（１）
【化１】
2017122677.tif 000002
式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ６は、水素原子、炭素数１〜１８のアルキル基又は炭素数１〜１８のエステル基の何れかである、
ホモオキサカリックス［３］アレン誘導体を含有することを特徴とするイオン感応膜が提供される。
【０００８】
本発明によればまた、上記イオン感応膜を使用して成り、不揮発性生体アミン類、特にチラミン及び／又はヒスタミンに対し電位応答挙動を示すことを特徴とするイオン選択性電極が提供される。
本発明によれば更に、上記イオン選択性電極から成る作用電極、及び参照電極を備えて成るイオンセンサが提供される。
【０００９】
本発明によればまた、上記イオン感応膜を電界効果型のトランジスタのゲート部に接続して成り、不揮発性生体アミン類に対して電位応答挙動を示すことを特徴とするイオン選択性電界効果型トランジスタが提供される。
本発明によれば更に、上記イオン選択性電界効果型トランジスタから成る作用電極、及び参照電極を備えて成ることを特徴とするイオンセンサが提供される。
【００１０】
本発明によれば更に、上記イオンセンサを用いて、食品中のチラミン及び／又はヒスタミン量を測定することを特徴とする食品鮮度管理方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のイオン感応膜においては、イオノフォアとして用いる上記式（１）で表されるホモオキサカリックス［３］アレン誘導体が、カリウムイオン等の無機イオンの妨害を受けることなく、チラミンやヒスタミン等の不揮発性生体アミン類が有する一級アミノ基に基づく１価の陽イオン（Ｒ−ＮＨ３＋）を選択的に捕捉して膜側に移動分配可能であることから、本発明のイオン感応膜をイオンセンサのイオン選択性電極として使用すると、チラミン及び／又はヒスタミン等の１価陽イオンと錯体を形成することによりセンサ膜電位が上昇して、正の電位応答が生じることにより、チラミン及び／又はヒスタミンの濃度を定量的に測定することが可能になる。
また本発明のイオン感応膜は、製造及び取扱いが容易であり、しかも耐久性にも優れているので、チラミンやヒスタミン等の不揮発性生体アミン類を測定するためのイオンセンサのイオン選択性電極に使用することにより、食品中のチラミン及び／又はヒスタミンの濃度を容易且つ低コストで測定することが可能になる。
またこのように食品中のチラミン及び／又はヒスタミン量を低濃度から容易に測定することが可能になったことで、食品の腐敗を初期の段階で検知することが可能であると共に、食品の鮮度評価を数値化することが可能になり、食品の安全性と共に可食期間の適正化を図ることが可能になり、食品廃棄物の減量を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のイオン選択性電極の一例を示す図である。
【図２】本発明のイオン選択性電極を作用電極として用いたイオンセンサの一例を示す図である。
【図３】各イオノフォアによるイオンセンサにより得られた電位応答とチラミン（Ａ）及びヒスタミン（Ｂ）の濃度の電位応答曲線を表す。
【図４】本発明のイオンセンサにより得られた電位応答とチラミン（図中Ｔｙで表す）及びヒスタミン（図中Ｈｉｓで表す）の濃度の電位応答曲線を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（イオン感応膜）
本発明のイオン感応膜は、イオノフォアとして上記式（１）で表されるホモオキサカリックス［３］アレン誘導体を用いることが重要な特徴であり、本発明においてはこのイオノフォアが、カリウムイオンやナトリウムイオン等の妨害を受けることなく、一級アミノ基を有する不揮発性生体アミン類のＲ−ＮＨ３＋イオンと選択的に安定な錯体を形成できることを見出し、不揮発性生体アミン類、特にチラミン及び／又はヒスタミンの定量分析に利用する。
上記式（１）で表されるホモオキサカリックスアレン誘導体におけるＲ１，Ｒ２，Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ４、Ｒ５，Ｒ６は、水素原子、炭素数１〜１８のアルキル基又は炭素数１〜１８のエステル基の何れかであるが、好適には、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６はＣ４Ｈ９である。
本発明のイオン感応膜が選択的に捕捉可能な不揮発性生体アミン類としては、チラミン、ヒスタミン、プトレシン、アグマチン、オルニチン等を例示できるが、本発明に用いるイオノフォアは、特に食品腐敗の指標となるチラミン及び／又はヒスタミンに対して優れた選択性を有している。
【００１４】
本発明のイオン感応膜は、上記イオノフォア、膜材料、可塑剤、及び必要に応じてアニオン性添加塩を用いて、製膜することにより得られる。
本発明のイオン感応膜に使用可能な膜材料としては、これに限定されないが、ポリ塩化ビニル、シリコンゴム、ポリ塩化ビニリデン、ポリウレタンウレア、フォトレジスト、漆等を例示することができるが、特にポリ塩化ビニルを好適に使用することができる。
また可塑剤は、膜材料を可塑化すると共に、イオノフォアを溶解するために配合する。このような可塑剤としては、これに限定されないが、４−ニトロフェニルフェニルエーテル、アジピン酸ビス（１−ブチルペンチル）、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジオクチル、ジオクチルフェニルリン酸、セバシン酸ジオクチル、２−ニトロフェニルフェニルエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、ジベンジルエーテル、デカノール、２−ニトロフェニルドデシルエーテル、２−フルオロ−２’−ニトロジフェニルエーテル等を例示することができ、特に、セバシン酸ジオクチルを好適に使用することができる。
【００１５】
更にアニオン性添加塩は、チラミン又はヒスタミンイオン（Ｒ−ＮＨ３＋）を積極的に移動分配することで感応膜の性能を向上させるために配合する。このようなアニオン性添加塩としては、従来公知のイオン感応膜に使用されるものを使用することができ、これに限定されないが、テトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸カリウム、テトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸ナトリウム、テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸カリウム、テトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸ナトリウム、テトラフェニルホウ酸カリウム、テトラフェニルホウ酸ナトリウム、テトラキス［３，５−ビス（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メトキシー２−プロピル）フェニル］ホウ酸ナトリウム等を例示することができる。
【００１６】
本発明のイオン感応膜は、上述したイオノフォア、膜材料、可塑剤、添加塩等の成分をテトラヒドロフラン等の適量の溶媒に混合、溶解して混合液とする。尚、上記各成分のイオン感応膜中の成分は、用いる化合物の種類によって異なり、一概に規定できないが、以下の範囲であることが好適である。
すなわち、イオノフォアは、感応膜１００重量部に対して１〜１０重量部、特に２〜５重量部で含有されることが好ましい。上記範囲よりもイオノフォアの量が少ないとイオン感応膜が目的のイオンを充分に捕捉することができず、感度が低下するおそれがあり、一方上記範囲よりも多くても経済性に劣るだけで更なる向上は望めない。また、膜材料は感応膜１００重量部に対して２０〜４０重量部、特に２５〜３５重量部で含有されることが好ましい。上記範囲よりも膜材料の量が少ないとイオン感応膜の強度を充分に得ることができず、耐久性が低下するおそれがあり、一方上記範囲よりも多くても経済性に劣るだけで更なる向上は望めない。可塑剤は、感応膜１００重量部に対して２０〜８０重量部、特に５０〜７０重量部の範囲で含有されていることが好ましい。上記範囲よりも可塑剤の量が少ない場合には、製膜性に劣ると共に、イオノフォアの溶解が不十分になり、満足する性能が得られないおそれがあり、一方上記範囲よりも可塑剤の量が多いと、可塑剤の溶出など却って性能が劣るおそれがある。またアニオン性添加塩は、感応膜１００重量部に対して  ０．１〜２重量部の範囲にあることが好ましい。更に必要により使用される溶媒の量は、上記成分が全て溶解する量で使用することが、製膜性の点から好ましい。
【００１７】
調製された混合液を、キャスト法、スプレー塗布、スパッタリング法、ディップ法、スピンオフコート法等、従来公知の方法でガラス板等の基板上に塗布し、溶媒が完全に揮発するまで乾燥させて製膜する。
乾燥条件は用いる膜材料などによって異なり、一概に規定できないが、２５〜４０℃の温度で８〜１６時間乾燥することが望ましい。
製膜されたイオン感応膜は基板から取り外してイオン感応膜として使用できるが、混合液を塗布する基板としてテフロン（登録商標）の多孔質膜等の多孔質膜を用い、多孔質膜と共に使用してもよい。
同様にイオン感応膜をイオン選択性電界効果型トランジスタに使用する場合には、調製された混合液を電界効果型トランジスタのゲート部に塗布することにより、イオン選択性電界効果型トランジスタとすることができる。
イオン感応膜の膜厚は、これに限定されないが、１００〜１０００μｍの範囲にあることが好適である。
【００１８】
（イオン選択性電極）
本発明のイオン感応膜を用いたイオン選択性電極は、少なくともイオン感応膜、内部溶液、内部電極から成っている。
内部電極としては、これに限定されないが、Ａｇ／ＡｇＣｌ、Ｈｇ／Ｈｇ２Ｃｌ２，Ｈｇ／Ｈｇ２ＳＯ４等を例示できるが、特にＡｇ／ＡｇＣｌを好適に使用できる。
また内部溶液としては、これに限定されないが、硝酸銀水溶液、塩化カリウム水溶液、硝酸カルシウム水溶液などの金属塩水溶液や、塩化カリウム水溶液と他の金属塩水溶液の混合溶液等を例示できるが、特に塩化カリウム水溶液を好適に使用できる。
図１は、本発明のイオン感応膜を用いたイオン選択性電極の一例を示す図であり、全体を１で表すイオン選択性電極は、内部溶液２が満たされた支持管３の先端部にイオン感応膜４が取り付けられており、内部溶液２に内部電極５が挿入されている。
【００１９】
（イオンセンサ）
本発明のイオンセンサは、上記イオン選択性電極やイオン選択性電界効果型トランジスタを作用電極として用いる以外は、従来公知のイオンセンサと同様の構成を採用することができる。
図２は本発明のイオン選択性電極１を作用電極として用いた、イオンセンサの一例を示す図であり、電位差計１０の一方に本発明のイオン選択性電極１を用い、他方に参照電極２０を連結する。
本発明のイオンセンサにおいては、従来公知の参照電極を使用することができ、図２に示す具体例においては、先端に多孔質膜２１が設置された外側支持管２２の中に、先端に多孔質膜２３が設置された内側支持管２４が配置された参照電極２０であり、外側支持管２２に外部溶液２５が、内側支持管２４に内部溶液２６が満たされている。内側支持管２４には、内部電極２７が挿入されている。
上記作用電極であるイオン選択性電極１及び参照電極２０の先端を、例えば、チラミン及び／又はヒスタミンを含有する試料液３０に浸漬することにより、試料液中のチラミン及び／又はヒスタミンイオン（Ｒ−ＮＨ３＋）が選択的にイオン感応膜を通過することにより電位応答挙動を示し、電位差計によって電位応答量（ｍＶ）が示される。この電位応答量から、ネルンストの式（下記式（２））を用いて濃度が測定できる。
Ｅ＝Ｅ０＋（０．０５９（Ｖ）／ｎ）ｌｏｇＣ    …（２）
式中、Ｅは電位（Ｖ），Ｅ０は標準電位（Ｖ），ｎは電荷数、Ｃは濃度（Ｍ）をそれぞれ表す。
尚、図４に後述する実施例で作成されたイオンセンサにより測定された電位応答とチラミン（図中、「Ｔｙ」で表す）及びヒスタミン（図中、「Ｈｉｓ」で表す）の濃度の電位応答曲線を表す。この図４から明らかなように、本発明のイオンセンサにおいては、チラミンが１０−６Ｍ程度から、ヒスタミンが１０−４Ｍ程度から電位応答しており、食肉等の初期腐敗におけるチラミンの下限量である１０−４Ｍ以上を確保しており、実用的な濃度範囲を確保していることがわかる。
【００２０】
（食品鮮度評価）
本発明のイオンセンサは、前述したとおり、チラミン等の不揮発性生体アミン類の濃度を定量的に測定することが可能であることから、魚肉等の食品が腐敗することにより増加するチラミンを本発明のイオンセンサを用いて測定することによって、食品鮮度を評価することが可能になる。また、ヒスタミン量を本発明のイオンセンサを用いて測定することによって、食品鮮度の評価に加え、ヒスタミン中毒を予防するための評価が可能になる。
尚、チラミン及びヒスタミンは、酸性〜中性領域でイオン化されるが、魚肉等の食肉は、腐敗が進むと乳酸が増えるため、本発明のイオンセンサは直接魚肉に適用しても、チラミン及び／又はヒスタミンの濃度を測定することができる。
【実施例】
【００２１】
本発明を、次の実験例にて説明する。
＜イオン感応膜およびイオン選択性電極＞
下記の材料を小型ガラス瓶にて、テトラヒドロフラン２ｍＬに溶解した。
１．イオノフォア  ２ｍｇ
２．セバシン酸ジオクチル  ６６ｍｇ
３．ポリ塩化ビニル  ３２ｍｇ
これを直径３ｃｍのシャーレに静かに展開し、そのまま室温（約２５度）で約１０時間放置し、揮発させることで透明なイオン感応膜を作製した。このようにして作製したイオン感応膜の膜厚は、約８００μｍであった。
作製したイオン感応膜をシャーレより直径７ｍｍのパンチで打ち抜き、イオン選択性電極（Ｆｌｕｋａ社製）に固定した。電極内部溶液として０．０１Ｍ塩化カリウム溶液を入れ、イオン選択性電極を作製した（図１参照）。
【００２２】
＜イオンセンサ＞
作製したイオン選択性電極と、参照電極（ＴＯＡ／ＤＫＫ社製、内部液：飽和塩化カリウム溶液、外部液：０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５）を、それぞれ電位差計に連結させ、イオンセンサを作製した。イオン選択性電極と参照電極の先端を試料液に浸漬させ、試料液のチラミン及びヒスタミンの測定を行った（図２参照）。
【００２３】
〔実験例１〜７〕
イオノフォアとして表１に示す材料を用いて、イオン感応膜、イオン選択性電極、イオンセンサを作製した。チラミン、ヒスタミン、カリウム、ナトリウム各試料液は、１０−６Ｍから１０−２Ｍの濃度範囲になるように秤量し、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５にて溶解し作製した。
各イオノフォアを含むイオンセンサにて、各試料溶液の各濃度に対する電位応答をイオンセンサにて測定した。測定結果を図３に示す。
また、この測定結果から電位応答の強さを、下記基準で判断し、結果を表１に示す。
電位応答の強さは、１０−６Ｍから理想的な電位応答を示すものを◎、１０−４Ｍ程度から理想的な電位応答を示すものを○、理想的な電位応答を得られなかったものを△、ほとんど電位の変化が見られなかったものを×とした。理想的な電位応答とは、濃度によって電位応答（ｍＶ）が変化し、上述したネルンストの式にて求める値と近似した挙動を示すものである。チラミンやヒスタミン以外の有機イオンや無機イオンに対して比較的低濃度側（１０−４Ｍ程度）から電位応答を示すイオノフォアは、それらイオンがチラミン等と共存した場合、測定対象であるチラミンに対する電位応答を妨害することとなり、その電位応答は、ネルンストの式にて求める値とは大きく異なってしまい、電位応答の変化が小さかったり、電位の変化が見られない結果となってしまう。
尚、用いた各イオノフォアは、ベンゾー１２−クラウン−４（Ｂ１２Ｃ４）、ベンゾー１５−クラウン−５（Ｂ１５Ｃ５）、ベンゾー１８−クラウン−６（Ｂ１８Ｃ６）、ジベンゾー１８−クラウン−６（ＤＢ１８Ｃ６）、カリックス［４］アレンエステル誘導体（ＣＡ［４］）、カリックス［６］アレンエステル誘導体（ＣＡ［６］）及びホモオキサカリックス［３］アレン誘導体（ＨＣＡ［３］）である。
【００２４】
【表１】
2017122677.tif 000003
【００２５】
表１に示すように、ＨＣＡ［３］をイオノフォアとして用いたイオンセンサは、妨害となる無機イオンの影響を受けず、チラミンに対して理想的な電位応答を得ることが確認できた。
【００２６】
＜チラミン測定＞
チラミンを１０−６Ｍから１０−２Ｍの濃度範囲になるように秤量し、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５にて溶解した。実験例７で作製したイオンセンサにてチラミンに対する電位応答を測定した。結果を図４に示す。
【００２７】
＜ヒスタミン測定＞
ヒスタミンを１０−６Ｍから１０−２Ｍの濃度範囲になるように秤量し、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５にて溶解した。実験例７で作製したイオンセンサにてヒスタミンに対する電位応答を測定した。結果を図４に示す。
【００２８】
図４に示すように、本発明のイオン感応膜より作製したイオンセンサにて、チラミン及びヒスタミンの電位応答を測定することで、電位応答曲線を得ることができる。よって、本発明のイオンセンサを用いると、チラミン及びヒスタミンの濃度を容易に定量測定できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のイオン感応膜は、魚肉等の食肉の腐敗により生成されるチラミン及び／又はヒスタミンを選択的に捕捉できることから、チラミン及び／又はヒスタミンの濃度を容易且つ経済的に定量分析することができ、食品の鮮度評価或いは食品管理に有効に適用することができる。
特にサバ、マグロ、カツオ、アジキ、ブリ等の赤身の魚肉は腐敗によりチラミンやヒスタミンの生成が顕著であることから、本発明のイオンセンサはこれらの鮮度評価に有用である。またこれら魚肉以外にもチーズ等の発酵畜産食品の管理にも有効に適用することができる。
【符号の説明】
【００３０】
１  イオン選択性電極、２  内部溶液、３  支持管、４  イオン感応膜、５  内部電極、１０  電位差計、２０  参照電極、３０  試料液。
【図１】
2017122677.tif 000005
【図２】
2017122677.tif 000006
【図３】
2017122677.tif 000007
【図４】
2017122677.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月14日(2016.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明のイオン感応膜は、魚肉等の食肉の腐敗により生成されるチラミン及び／又はヒスタミンを選択的に捕捉できることから、チラミン及び／又はヒスタミンの濃度を容易且つ経済的に定量分析することができ、食品の鮮度評価或いは食品管理に有効に適用することができる。
特にサバ、マグロ、カツオ、カジキ、ブリ等の赤身の魚肉は腐敗によりチラミンやヒスタミンの生成が顕著であることから、本発明のイオンセンサはこれらの鮮度評価に有用である。またこれら魚肉以外にもチーズ等の発酵畜産食品の管理にも有効に適用することができる。