(57)【要約】【課題】本発明の課題は、異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシの接合型を簡便に判別することである。【解決手段】異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシの接合型を決定する遺伝子座を特定し、この遺伝子座に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ法により増幅・泳動することにより、接合型を決定することができる。本発明によれば、接合型が既知であるテスター株との交雑により接合型を判別する方法と比較して、簡便且つ高い信頼性を持って、異質倍数体酵母であるジゴサッカロミセス属酵母の接合型を判別することが可能である。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異質倍数体酵母に由来する下記（１）または（２）のポリヌクレオチド。
（１）配列表の配列番号１、２、３または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１、２、３または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
異質倍数体酵母がジゴサッカロマイセス属酵母である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ジゴサッカロミセス属酵母がジゴサッカロミセス・ルキシである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
サンプル中に存在するジゴサッカロミセス属酵母がａ型、α型のいずれの接合型を有するか否かを判定する方法であって、ゲノム中の配列番号５で表される領域と配列番号６で表される領域に挟まれた領域に存在するポリヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１、２、３または４のいずれであるかを検出し、
（イ）配列番号１または３のポリヌクレオチド、または配列番号１または３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在すれば、当該酵母の接合型はａ型であると判定し、
（ロ）配列番号２または４のポリヌクレオチド、または配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在すれば、当該酵母の接合型はα型であると判定する工程、
を含む、ジゴサッカロミセス属酵母の接合型を判別する方法。
【請求項５】
検出する方法が、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ断片の長さの判定によるものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列表の配列番号５の塩基配列および配列番号６の塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行なう、請求項５記載の方法。
【請求項７】
サンプル中に存在するジゴサッカロミセス属酵母より抽出されたゲノムＤＮＡ中の請求項１に記載のポリヌクレオチドの存在を検出することを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが食品である、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
食品が醤油または味噌である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来の接合型決定能を有するメイティングタイプライク遺伝子座および該遺伝子座の塩基配列に基づいて設計したプライマーセットを用いたＰＣＲ法による異質倍数体酵母の接合型の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジゴサッカロミセス・ルキシは、醤油、味噌などの食品の生産等において欠くことのできない有用な微生物であり、アルコールをはじめとする各種の香気成分を生成することにより、当該食品に特徴的な香味を付与する役割を担っている。そのため、ジゴサッカロミセス・ルキシの研究は古くから実施されてきた。特に、接合型に関する研究は育種を検討する上で非常に重要であることから、盛んに検討されている。
【０００３】
醤油や味噌のような高食塩濃度から分離されたジゴサッカロミセス・ルキシはヘテロタリックな半数体酵母であると報告されており、異なる接合型を有する株を選択すれば、交雑および胞子形成が可能である（非特許文献１）。一方、近年このような環境から分離されたジゴサッカロミセス・ルキシは、半数体株のジゴサッカロミセス・ルキシと非公式に「ジゴサッカロミセス・シュードルキシ」と呼ばれる株が異種交雑した異質倍数体であることが報告されている（非特許文献２,３，４）。通常、倍数体同士は接合することがないが、上記２つの事実は、異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシが接合において、半数体酵母と同様の振る舞いをすることを示唆している。
【０００４】
酵母の接合型にはａ型とα型の２種があることが知られる。通常、これらの接合型の判定には、既に接合型が既知であるテスター株との交雑により接合型を判別する方法、あるいは性決定遺伝子であるＭＡＴ遺伝子座をターゲットにしたＰＣＲによってａ型とα型とを判別する方法、が用いられる。
【０００５】
前者の方法は、異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシにおいても実施可能であったが、交雑したかどうかの判別に栄養要求性や薬剤耐性の相補性を指標に用いるため、事前に遺伝子組換えや変異誘発処理により少なくとも一方の親株に栄養要求性や薬剤耐性を付与する必要があり、簡便な方法ではない。また、変異処理の途中で本来有していた有用な形質が失われる可能性もあり、育種を考える上で実用的な方法ではなかった。一方、後者の方法は、簡便迅速に接合型を判別可能であるが、異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシにおいてはＭＡＴ遺伝子座が明らかではなく、本方法を用いた接合型の決定はこれまで提供されてこなかった。
【０００６】
酵母の接合型の決定は、異なる有用形質を示す株同士を人為的に交雑させ、両方の有用形質を併せ持つ優良株を効率的に育種する際に必要となる。しかし、上記のように、ＭＡＴ遺伝子座が明らかとなっていない酵母の場合には、従来は遺伝子組換えや変異誘発処理により適当な選抜指標を付与した上でテスター株と交雑するか否かを判別することで、接合型を決定すると言う非常に煩雑な方法しか無かった（特許文献１）。そのため、異なる有用形質を示す株同士を人為的に交雑させ、両方の有用形質を併せ持つ優良株を効率的に育種しようとする場合、ＭＡＴ遺伝子座が不明な酵母では多大な時間がかかり、ジゴサッカロミセス・ルキシなどの異質倍数体を形成するジゴサッカロミセス属酵母においては接合を用いた効率的な育種は困難とされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１６０２８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Haruhiko Mori. Life cycle in heterothallic haploid yeast, Saccharomyces rouxii. J. Ferment. Technol., 1973, 51, 379-392.
【非特許文献２】James SA et al., Molecular evidence for the existence of natural hybrids in the genus Zygosaccharomyces. FEMS yeast res., 2005, 5, 749-755
【非特許文献３】Gordon JL, Wolfe KH (2008) Recent allopolyploid origin of Zygosaccharomyces rouxii strain ATCC 42981. Yeast 25: 449-456.
【非特許文献４】Watanabe, J., K. Uehara, Y. Mogi, 2013 Diversity of mating-type chromosome structures in the yeast Zygosaccharomyces rouxii caused by ectopic exchanges between MAT-like loci. PLoS ONE 8: e62121.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのため本発明者は、異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシのＭＡＴ遺伝子座を決定することにより，簡便な接合型の判別を試みることにした。遺伝子の検出試験は、当業者において広く実施されており、もっとも広く行われている方法としてＰＣＲ法を利用できる。当該方法では、検出対象である遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、該遺伝子に特異性のあるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを作製し、そのＰＣＲプライマーを用いて、検体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、反応生成物として増幅されたＤＮＡ断片を得ることにより、検体中の該遺伝子を検出する方法である。しかしながら、これまでにジゴサッカロミセス属酵母を始めとする異質倍数体酵母からのＭＡＴ遺伝子座の検出に、当該ＰＣＲによる方法を用いた例は知られていなかった。
【００１０】
ＰＣＲ法によりのＭＡＴ遺伝子座の検出試験を行うためには、まず異質倍数体酵母においてＭＡＴ遺伝子座を特定する必要がある。
サッカロミセス・セレビシエにおいて、接合型を決定するタンパク質をコードする遺伝子座（メイティングタイプライク遺伝子座：以下「ＭＴＬ」と表記する場合がある）は３つ存在する。そのうちの２座、ＨＭＬ遺伝子座及びＨＭＲ遺伝子座、は複雑な機構でサイレンシングを受けており、コードされたタンパク質は発現していない（サイレンシングカセット）。残りの１つが活性型となっており、ＭＡＴ遺伝子座と呼ばれる。このＭＡＴ遺伝子座にα型の情報がコードされていれば、α型の細胞となり、ａ型がコードされていればａ型の細胞となる。これら３遺伝子座はまったく同じ配列をコードしているため、どの遺伝子座が活性型のＭＡＴ遺伝子座であるかを決定することは容易ではない。活性型のＭＡＴ遺伝子座が特定されていない酵母においては、ＨＭＬ、ＨＭＲ、ＭＡＴは区別することができないためメイティングタイプライク遺伝子座と表記されることがある。また、異質倍数体であるジゴサッカロミセス属酵母においてＭＴＬがいくつ存在し、そのうち接合型の決定がどの遺伝子座によってなされているかは全く知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、異質倍数体であるジゴサッカロミセス・ルキシには６つのＭＴＬ配列（ＭＴＬ１、２、３、４、５、および６）が存在し、さらに６つのＭＴＬのうち特定の１つが活性型のＭＡＴ遺伝子座であることを明らかにした。つまり、異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシでは、まったく予想外なことに６つのＭＴＬの中のたった一つの遺伝子座によって、接合型が決定されることが明らかになった。
【００１２】
さらに、本発明で明らかとなった活性型のＭＡＴ遺伝子座周辺の塩基配列に基づいて設計および作製したＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシの接合型を判別することに成功し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシの接合型決定遺伝子とそれを用いた効率的な優良株の育種に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、接合型が既知であるテスター株との交雑により接合型を判別する方法と比較して、簡便且つ高い信頼性を持って、異質倍数体酵母であるジゴサッカロミセス属酵母の接合型を判別することが可能である。すなわち、異質倍数体酵母であるジゴサッカロミセス属酵母においても接合による交雑株の取得が可能となり、産業利用する上で有用な形質を示す優良酵母を接合により育種することも可能である。さらに、当該判別済みの酵母を交雑させたとき、交雑が成功したかどうかの判定を簡便に行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は６つのメイティングタイプライク遺伝子座（ＭＴＬ１〜６）のＰＣＲ増幅パターンを表す。図中のａまたはαは、各メイティングタイプライク遺伝子座がａ型かα型かを表す。
【図２】図２は、ＮＢＲＣ１１０９５７接合型変換株の交雑の可否を表す。具体的には、栄養要求性および薬剤耐性を有するＮＢＲＣ１１０９５７親株またはその接合型変換株に対し、非栄養要求性および非薬剤耐性を有するＮＢＲＣ１１０９５７を交雑させ、非栄養要求性で且つ薬剤耐性を有する２倍体株が出現したことを示す。
【図３】図３は、ＮＢＲＣ１１０９５７接合型変換株の各ＭＴＬの遺伝子構造の変化を表す。具体的には、ＰＣＲにより増幅させた各ＭＴＬの遺伝子断片を、任意の制限酵素で処理し、接合型変換前後で切断パターンが異なる否かを示し、ＭＴＬ１のみ接合型変換している。
【図４】図４は各酵母株同士の交雑の可否を表す。具体的には、栄養要求性および薬剤耐性を有する株に対し、非栄養要求性および非薬剤耐性を有する株を交雑させ、非栄養要求性で且つ薬剤耐性を有する２倍体株が出現するか否かを観察する。交雑が生じた場合には酵母が増殖し、白く見える。
【図５】図５はプライマー１とＤのプライマーセットでＰＣＲ解析を行なった際に増幅するＭＴＬ１遺伝子座のＤＮＡ断片を、アガロースゲルで電気泳動することで、各株の接合型が決定可能であることを表す。
【図６】図６は交雑株のＭＴＬ１遺伝子のＰＣＲ増幅断片をアガロースゲルで電気泳動することで、交雑の成否判定が可能であることを表す。
【図７】図７はＭＴＬ１におけるＭＡＴ遺伝子とその周辺部の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、異質倍数体酵母の接合型判別に関するものであり、以下に詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、下記（１）または（２）のポリヌクレオチドからなる、異質倍数体酵母がコードする性決定遺伝子に関するものである。
（１）配列表の配列番号１、２、３または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１、２、３または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
配列表における配列番号１および３で示されるポリヌクレオチドは、接合型がａ型であるときの性決定遺伝子を示す塩基配列であり、配列表における配列番号２および４で示されるポリヌクレオチドは、接合型がα型であるときの性決定遺伝子を示す配列である。
なお本発明において接合型判定の対象とする酵母は異種交雑によって生じた異質倍数体である。しかるに配列番号１と３はいずれもａ型、２と４はいずれもα型を示す性決定遺伝子の塩基配列であり、配列番号１と３、２と４は異種交雑における親株が異なることを示すが、接合型の判定においては、親株がいずれの系統であってもその判定には影響しない。
【００１９】
本発明の異質倍数体酵母とは、異質倍数体のジゴサッカロミセス属酵母であり、食品産業でよく用いられる異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２０】
また本発明は、サンプル中に存在するジゴサッカロミセス属酵母がａ型、α型のいずれの接合型を有するか否かを判定する方法であって、ゲノム中の配列番号５で表される領域と配列番号６で表される領域に挟まれた領域における塩基配列が、配列番号１、２、３または４のいずれであるかを検出し、
（イ）配列番号１または３のポリヌクレオチド、または配列番号１または３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在すれば、当該酵母の接合型はａ型であると判定し、
（ロ）配列番号２または４のポリヌクレオチド、または配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ接合型決定能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在すれば、当該酵母の接合型はα型であると判定する工程、
を含む、ジゴサッカロミセス属酵母の接合型を判別する方法に関するものである。
なお配列番号５および６は、本発明を成す上で明らかになった、活性型ＭＡＴ遺伝子座の上流域および下流域の塩基配列を示している。
【００２１】
配列番号５で表される領域と配列番号６で表される領域に挟まれた領域における塩基配列検出する方法としては、公知の任意の方法を用いればよい。たとえば、下記に説明するような方法でＰＣＲ反応を実施し、得られたＤＮＡ断片の長さをもとにａ型またはα型を判定する方法や、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法によって解読することで、上記１〜４のいずれの配列であるかを特定し、配列番号１まはた３に一致したときにはａ型、配列番号２または４に一致したときにはα型と判定する方法などが挙げられる。
【００２２】
以下、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を解析する方法について詳述する。
本発明ではまず、特定した活性型のＭＡＴ遺伝子座の特異的な配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ターゲットとする配列は、ＭＡＴ遺伝子座およびその周辺の配列であり、且つ、他のサイレンシングカセットと異なる配列であればいかなる領域でもよい。具体的には、たとえば本発明で特定した活性型のＭＡＴ遺伝子座の上流の塩基配列である配列番号５から成る配列中のオリゴヌクレオチドと、３’側から下流の塩基配列である配列番号６から成る配列中の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを設計すればよい。
【００２３】
プライマーの長さ、増幅領域の長さは、いずれも、ＰＣＲ法を行なう際の常法にしたがって任意に設定すればよい。プライマーの長さは１５〜５０ベースに設定するのが好ましく、さらに１５〜３０ベースとするのが特に好ましい。具体的には、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ベースのいずれかであってもよい。また、ＰＣＲで増幅するＤＮＡ断片の長さは任意に設定することが出来るが、簡便に識別するため、２．２から４．６キロベース程度の領域をＰＣＲ法で増幅することが好ましく、さらに２．２〜３キロベースとするのが特に好ましい。具体的には、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００ベースのいずれかであってもよく、それらの値の範囲内であってもよい。
【００２４】
次に、任意の酵母から採取したゲノムＤＮＡ、または各種サンプルを鋳型として、当該活性型ＭＡＴ遺伝子座またはその周辺配列に特異的は配列を有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法で増幅する。ＰＣＲによる増幅は常法に従えばよく、例えばＴＯＹＯＢＯ製のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼなどを利用することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を適当な方法で分離した後、目的のＤＮＡ断片の増幅を確認する。ＤＮＡ断片の分離に用いる方法はいかなる方法でも良く、例えばアガロースゲルやアクリルアミドゲル電気泳動が好ましい。また、増幅したＤＮＡ断片の可視化に用いる方法にも、特に限定はないが、通常のエチジウムブロマイドによる染色が好ましい。
【００２６】
ａ型（配列番号１または３）とα型（配列番号２または４）とでは配列の長さが異なり、α型のほうがａ型に比べておよそ０．３キロベースほど配列が長い。このため、以上の操作を行なった結果として、サンプル酵母より採取したゲノムＤＮＡを鋳型とし、サンプル酵母がａ型の接合型を有する際、ＰＣＲで増幅するとａ型であった場合に増幅されると予想されるＤＮＡ断片の長さである２．２〜４．３キロベースペアのＤＮＡ断片が増幅され、ａ型と判別できる。一方、サンプル酵母α型の接合型を有する際にＰＣＲで増幅すると、ａ型であった場合に増幅されると予想されるＤＮＡ断片の長さよりも約０．３キロベース長いＤＮＡ断片が得られることから、２．５〜４．６キロベースペアのＤＮＡ断片が増幅され、α型と判別できる。好ましくは、接合型未知の酵母の接合型を判別する際には、接合型既知の株をコントロールとして用いＰＣＲを行ない、それによって増幅されるＤＮＡ断片と比較することで、接合型未知の酵母の接合型を判別すればよい。
【００２７】
上記方法により各酵母株の接合型が判別できると、異なる接合型および有用形質を持つ株同士を人為的に交雑させることが可能となり、両方の親株由来の有用形質を併せ持つ優良株を効率的に育種できるようになる。すなわち、煩雑で効率的な育種には不向きの従来法を用いるよりも、格段に早く目的とする優良酵母株を取得することが可能となる。また交雑終了後、交雑が確実に行われたことを確認するために、対象株において上記と同様のＰＣＲ反応を行うと、交雑が成功している場合にはａ型、α型の長さの異なる２種のＤＮＡ断片が両方とも増幅されるため、交雑の成否を判定するためにも本発明の方法は有用である。
【００２８】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００２９】
（実施例）
異質倍数体のジゴサッカロミセス・ルキシにおいて、ＭＴＬの配列は全く知られていなかったため、これらの配列を同定する目的で、独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手可能であるジゴサッカロミセス・ルキシＮＢＲＣ１１０９５７株の全ゲノムシーケンスを実施した。
【００３０】
ゲノムシーケンスはイルミナのＨｉＳｅｑを用いた解析をタカラバイオ株式会社に分析を依頼することにより実施した。納品された約６Ｇｂｐの配列をシーケンスの信頼性を元にトリミング処理を実施し、正確な配列を抽出した。トリミング処理後の配列を元に、ゲノムシーケンスアセンブルソフトウェアであるＰｌａｔａｎｕｓによるアセンブルを実施し、複数のスキャホールドを取得した。酵母のＭＴＬ周辺の遺伝子の並び順の保存性は高いことが知られていることから、アセンブルされたスキャホールドをクエリに半数体のジゴサッカロミセス・ルキシＣＢＳ７３２のゲノムデータベースを探索した。
【００３１】
その結果、ＭＴＬの上流配列に相当すると予想されるスキャホールドおよびＭＴＬの下流配列に相当すると予想されるスキャホールドをそれぞれ６個同定した（計１２個）。ＭＴＬの上下流配列に相当する１２個のスキャホールドに特異的なプライマーを１２本（上流配列に特異的なフォワードプライマー１、２、３、４、５、６、および下流配列に特異的なリバースプライマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）設計し、すべての組合せでＰＣＲ解析を実施した。プライマー１〜６、およびＡ〜Ｆの配列については、配列番号７〜１８にそれぞれ示す。
ＰＣＲ解析の結果、ＮＢＲＣ１１０９５７株では、上記プライマー１とＤ、２とＢ、３とＡ、４とＣ、５とＥ、および６とＦ、の６つの組み合わせで遺伝子断片の増幅が確認された。増幅された６つの遺伝子断片を精製し、サンガーシーケンスで塩基配列を決定した結果、得られた６つの配列は予想通りＭＴＬ様の配列を有することが確認された（ＭＴＬ１、２、３、４、５および６）。
【００３２】
次に、これら６つの配列の中で、どれが活性型のＭＡＴ遺伝子座であるかを確定するため、ジゴサッカロミセス・ルキシＮＢＲＣ１１０９５７以外の他の異質倍数体株（独立行政法人製品評価技術基盤機構にて入手可能なＮＢＲＣ１８７６株、ＮＢＲＣ１８７７株、ＮＢＲＣ０５０５株ならびにＮＢＲＣ０５０６株、およびヤマサ醤油保管株であるＺ１株、１５０１株）も含め、ＰＣＲ解析と交雑実験を実施した。ＰＣＲ解析では、ＮＢＲＣ１１０９５７および他の株全てについて、フォワードプライマー１、２、３、４、５、６、およびリバースプライマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆのすべての組合せでの解析を行った。
【００３３】
その結果、図１に示すとおり、それぞれの酵母株は、各ＭＴＬのＰＣＲ増幅パターンにおいて、
・ＮＢＲＣ１１０９５７、Ｚ１、および１５０１が属するＮＢＲＣ１１０９５７型（１Ｄ、２Ｂ、３Ａ、４Ｃ、５Ｅ、６Ｆのプライマーセットで増幅）と、
・ＮＢＲＣ１８７６、ＮＢＲＣ１８７７、ＮＢＲＣ０５０５、およびＮＢＲＣ０５０６が属するＮＢＲＣ１８７６型（１Ｄ、２Ｄ、３Ｃ、４Ｂ、５Ｅ、６Ｆのプライマーセットで増幅）
の２型に分類された。
【００３４】
公知の異質倍数体でないジゴサッカロミセス・ルキシにおける性決定遺伝子における知見から、α型の性決定遺伝子はａ型の性決定遺伝子より約０．３キロベースほど長いことが知られている。当該知見をもとに上記ＭＴＬの長さおよび配列を調べると、各ＭＴＬがａ型またはα型のどちらをコードしているか、図１に記載されている通り予想できるが、どのプライマーセットで増幅されるＭＴＬが活性型のＭＡＴ遺伝子座で、異質倍数体酵母の接合型を決定しているのかはこの時点では判別できない。
【００３５】
そこで、どのＭＴＬが活性型のＭＡＴ遺伝子座であるかを推定するため、ＮＢＲＣ１１０９５７型のＭＴＬパターンを有するＮＢＲＣ１１０９７５において、接合型が変換された株をスクリーニングし、どのＭＴＬの遺伝子構造が変化しているのか確認した。
【００３６】
具体的にはまず、同じＭＴＬパターンを有し、本来ならば交雑しないと考えられるＮＢＲＣ１１０９５７とＮＢＲＣ１８７７にそれぞれ異なる栄養要求性を付与し、接合用プレートを用いて交雑後、両株の栄養要求性が相補された交雑株を選抜した(図２)。交雑株では親株の接合型が変換されていると考えられる。
そこで、上記交雑の結果をもとに、接合型が変換されている可能性のある株を取得し、各ＭＴＬローカスの遺伝子断片をＰＣＲにより増幅させた。増幅された遺伝子断片を任意の制限酵素で処理し、接合型変換前との切断パターンの違いから、遺伝子構造に変化が生じたＭＴＬローカスを同定した。
【００３７】
その結果、図３に示すとおり、１Ｄのプライマーセットで増幅するＮＢＲＣ１１０９５７のＭＴＬ１ローカスでのみ遺伝子構造が変化しており、ａ型からα型に接合型が変換されていた。以上の遺伝子解析の結果より、ＭＴＬ１にコードされた接合型が異質倍数体酵母の性決定に関与しており、ＭＴＬ１が活性型のＭＡＴ遺伝子座であることが明らかになった。
【００３８】
続いて、各株同士の交雑実験を実施し、１Ｄのプライマーセットで増幅するＭＴＬ１にコードされた接合型が、実際の接合に関与しているのかを確認した。方法としては、栄養要求性および薬剤耐性を有する株に対し、非栄養要求性および非薬剤耐性を有する株を交雑させ、非栄養要求性で且つ薬剤耐性を有する２倍体株が出現するか否かを観察した。
【００３９】
図４に示す交雑実験の結果より、Ｚ１とＮＢＲＣ１８７６の組み合わせでは２倍体が出現しなかったことから、両者は同じ接合型を有するグループであるために交雑できないことが確認された。さらに、ＮＢＲＣ１１０９５７、１５０１、ＮＢＲＣ１８７７、ＮＢＲＣ０５０５、およびＮＢＲＣ０５０６はＮＢＲＣ１８７６と交雑可能であったが、ＮＢＲＣ１１０９５７とは交雑しなかったことから、これらのグループはＮＢＲＣ１８７６やＺ１とは逆の接合型を有するグループであることが確認された。
【００４０】
次に、この交雑実験の結果と各株のＭＴＬ１にコードされた接合型を表１のようにまとめ、ＭＴＬ１の接合型が交雑の可否と同調しているのかを確認した。その結果、表１のとおり、ＭＴＬ１にコードされた接合型が異なる株同士の組み合わせでのみ交雑していたことから、１Ｄのプライマーセットで増幅されたＭＴＬ１が活性型のＭＡＴ遺伝子座であるが明らかになった。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
以上の結果より、１Ｄのプライマーセットで増幅される遺伝子領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、その移動度を確認することで、接合型を簡便に判別することができた（図５）。また、上記の配列情報から、ＭＡＴ遺伝子におけるａ型の塩基配列として配列番号１および３、α型の配列として配列番号２および４に記載の塩基配列情報が得られた。加えて、ＭＡＴ遺伝子の上流域の塩基配列として配列番号５、同下流域の配列として配列番号６に記載の塩基配列情報が得られた。
【００４３】
さらに、接合型の異なる株同士の交雑株を取得し、交雑の成否をＰＣＲ解析により判別可能かどうか検討した。その結果、図６に示すとおり、交雑前の株はａもしくはα由来のＤＮＡ断片が１つのみ増幅されたが、交雑株はａおよびα由来の２つのＤＮＡ断片が増幅された。すなわち、ＰＣＲ解析により、簡便に異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシの接合型の判別および交雑の成否判定が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、食品産業において使用される異質倍数体酵母ジゴサッカロミセス・ルキシのＰＣＲ法による簡便な接合型判別方法および交雑成否判定方法が提供され、本方法を用いれば異質倍数体酵母の効率的な育種が可能となることから、本方法は醸造食品に適した優良株の開発に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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