(57)【要約】【課題】再生医療材料又は再生美容材料の製造に用いることができる高品質な脂肪幹細胞を、脂肪組織から効率的に検出及び分離する手段を提供すること。【解決手段】ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織から脂肪幹細胞を分離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織から脂肪幹細胞を分離する方法。
【請求項２】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織における脂肪幹細胞を検出する方法。
【請求項３】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織における脂肪幹細胞の品質を評価する方法。
【請求項４】
脂肪幹細胞が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び平滑筋細胞への分化能を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子を含む、脂肪幹細胞の検出又は分離用マーカーのセット。
【請求項６】
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも１種含む、脂肪幹細胞の検出又は分離用キット。
【請求項７】
特異的親和性を有する物質が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
特異的親和性を有する物質が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪幹細胞におけるマーカーの発現を指標として哺乳動物の脂肪組織より多分化能を有する脂肪幹細胞を検出及び分離する方法、ならびに脂肪幹細胞を検出及び分離するためのマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の組織は、傷害若しくは疾患、又は加齢等に伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に
備わる多能性を有した幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・臓器の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。近年、このような幹細胞を応用した、次世代の医療として再生医療に期待が高まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、全ての血液細胞（例えば、赤血球、白血球、リンパ球など）へ分化することから、血液の主要な供給源と考えられている。また、骨髄には、造血幹細胞だけでなく、その他の臓器や組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）に分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１）。さらに、近年、幹細胞は骨髄のほかにも、皮膚、肝臓、膵臓、脂肪等の哺乳動物のあらゆる臓器や組織に存在し、それらの臓器や組織の再生や恒常性維持に大きく関与していることが証明されている（非特許文献２、３、４、５）。これらの幹細胞を再生医療へ利用するためには、まず生体組織から幹細胞を分離し、培養して目的の細胞・臓器への分化誘導を行う必要がある。
【０００４】
現在までに、骨髄、肝臓、膵臓、脂肪などから幹細胞を分離する方法について幾つかの報告がある。従来主流であった方法として、酵素処理などで各臓器から細胞分散液を調製し、遠心操作により幹細胞を分離する方法がある。例えば、Ｖａｎらは、骨髄から調製した細胞分散液から、パーコールグラディエント遠心法により、幹細胞を分離する方法を報告している（非特許文献６）。また、Ｚｕｋらは、同様に脂肪から遠心分離法を用いて幹細胞を分離する方法を報告している（非特許文献７）。しかし、これらの方法では、血液細胞、血管内皮細胞や脂肪組織周囲の細胞などが混入し、幹細胞のみを効率よく分離する技術としては満足いくものではなかった。
【０００５】
そこで、さらに分離効率の高い幹細胞の分離方法として、遠心分離法以外の方法の開発が進められてきた。近年の報告から、各臓器や組織に存在する幹細胞は、特殊なタンパク質をそれぞれ合成していることが明らかにされている。この特殊なタンパク質はマーカータンパク質と呼ばれ、各臓器の幹細胞に特異的なものであり、これを利用することで、幹細胞を同定し、分離する技術の検討が行われている。例えば、Ｒｅｙｅｓらは、骨髄に存在する幹細胞のマーカータンパク質（ＡＣ１３３）を発見し、これを利用することで、幹細胞を分離し、特殊な培養液により培養する技術について報告している（非特許文献８）。また、膵臓に存在する幹細胞のマーカータンパク質（ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９）を利用して膵臓から幹細胞を選択的に分離する方法（特許文献１）、肝臓における幹細胞のマーカータンパク質（Ｉｔｍ２Ａ）をコードするｍＲＮＡを利用することで肝臓から幹細胞を分離・検出する方法（特許文献２）も報告されている。このように、マーカータンパク質を利用することで、幹細胞を選択的に分離することが可能になると考えられている。
【０００６】
しかし、幹細胞におけるマーカータンパク質は、各臓器や組織によって異なっており、これらを全て把握することは困難である。それ故、未だそれぞれの臓器や組織における幹細胞のマーカータンパク質の研究は進んでおらず、効率よく幹細胞を分離できるマーカータンパク質の発見が望まれていた。例えば、脂肪幹細胞のマーカータンパク質としては、ＣＤ２９やＣＤ４４等が知られているが（非特許文献９）、これらのマーカータンパク質では、脂肪幹細胞の検出・分離効率が十分なものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８８３３５号
【特許文献２】特開２００４−１８７６７９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８
【非特許文献６】Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ，１９９７，１０，４５−５０
【非特許文献７】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２００２，１３，４２７９−４２９５
【非特許文献８】Ｒｅｙｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２，１０９，３３７−３４６
【非特許文献９】Ｌｉ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ  （Ｅｎｇｌ）．，２０１３，１２６（８）：１４９１−１４９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、再生医療材料又は再生美容材料の製造に用いることができる高品質な脂肪幹細胞を、脂肪組織から効率的に検出及び分離する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定の膜タンパク質の発現を指標として哺乳動物の脂肪組織から分離した脂肪幹細胞が、未分化性を維持し、かつ、高い分化効率で複数種の細胞に分化することのできる多分化能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織から脂肪幹細胞を分離する方法。
（２）ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織における脂肪幹細胞を検出する方法。
（３）ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として、哺乳動物の脂肪組織における脂肪幹細胞の品質を評価する方法。
（４）脂肪幹細胞が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、及び平滑筋細胞への分化能を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子を含む、脂肪幹細胞の検出又は分離用マーカーのセット。
（６）ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子に対して特異的親和性を有する物質を少なくとも１種含む、脂肪幹細胞の検出又は分離用キット。
（７）特異的親和性を有する物質が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体である、（６）に記載のキット。
（８）特異的親和性を有する物質が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、（６）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、未分化性を維持し、かつ、複数種の細胞に分化することのできる多分化能を有する脂肪幹細胞を効率よく分離することができる。本発明により得られる脂肪幹細胞を培養することにより分化誘導された各種細胞は、再生医療又は再生美容材料として提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれる１種又は２種以上のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子の発現を指標として哺乳動物の脂肪組織から脂肪幹細胞を検出及び分離する方法を提供する。２種以上のマーカータンパク又はそれをコードする遺伝子の発現を指標とする場合は、その数は２種、３種、又は、４種のいずれでもよく、またその組み合わせも限定はされないが、ＡＱＰ１とＮＧＦＲ、ＡＱＰ７とＮＧＦＲ、ＡＱＰ９とＮＧＦＲの組み合わせが好ましい。本明細書において、「マーカー」とは上記のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子（マーカー遺伝子）から構成される群の各々を意味する。
【００１４】
本発明の方法において脂肪幹細胞の分離源となる脂肪組織とは、脂肪細胞から成る結合組織で、主に皮下組織に存在し、エネルギー貯蔵のほか、外界からの物理的衝撃や温度変化に対する身体の保護、ホルモンやサイトカインなどを分泌する働きを有する。細胞の由来は哺乳動物であれば特に限定はされず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられる。本発明の方法により得られた脂肪幹細胞をヒトの治療に用いる場合は、ヒトであることが好ましい。
【００１５】
本発明の方法で分離される脂肪幹細胞は、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲの４種のマーカータンパク質又はそれをコードする遺伝子について、ＡＱＰ１+、ＡＱＰ７+、ＡＱＰ９+、ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ７+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ９+、ＡＱＰ１+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ７+／ＡＱＰ９+、ＡＱＰ７+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ９+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ７+／ＡＱＰ９+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ７+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ９+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ７+／ＡＱＰ９+／ＮＧＦＲ+、ＡＱＰ１+／ＡＱＰ７+／ＡＱＰ９+／ＮＧＦＲ+のいずれかの発現パターンを呈する。
【００１６】
本発明において脂肪幹細胞の分離のためのマーカータンパク質として用いるＡＱＰ１（aquaporin 1：Genbank number: Nucleotide NM_198098.2; Protein NP_932766.1)、ＡＱＰ７（aquaporin 7：Genbank number: Nucleotide NM_001170.1; Protein NP_001161.1)、ＡＱＰ９（aquaporin 9：Genbank number: Nucleotide NM_020980.3; Protein NP_066190.2)、は、MIP(major intrinsic proteins)ファミリーに属する膜タンパク質で、細胞膜に存在し、その細孔（ポア）を介して細胞への水の取り込みに関与する。ＮＧＦＲ（nerve growth factor receptor：Genbank number: Nucleotide NM_002507.3; Protein NP_002498.1)は、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーの膜タンパク質である。ヒトのＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、４、６、及び８にそれぞれ示される。これらのマーカータンパク質は、哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、本発明においては脂肪幹細胞の表面に発現し、その検出及び分離のための指標として用いることができる限り、配列番号２、４、６、及び８の各アミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、そのようなホモログタンパク質も、本発明にいうＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲマーカータンパク質に包含されるものとする。ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲマーカータンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１、３、５、及び７にそれぞれ示される。これらのマーカー遺伝子もまた、脂肪幹細胞の表面に発現し、その検出及び分離のための指標として用いることができる限り、配列番号１、３、５、及び７の各塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であってもよく、そのようなホモログ遺伝子も、本発明にいうＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲ遺伝子に包含されるものとする。
【００１７】
脂肪幹細胞の選別と分離は、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲマーカータンパク質に対して特異的に結合し得る抗体を用いて行うことができる。抗体は、上記のマーカータンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。また抗体は、上記のマーカータンパク質に特異的に結合し得る限り断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)等が挙げられる。
【００１８】
抗体の作製は、上記マーカータンパク質を抗原として、常法により作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離することによって得られる。また、モノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞等）を取り出して骨髄腫細胞と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することによって得られる。また、抗ＡＱＰ１抗体（コスモバイオ社製）、抗ＡＱＰ７抗体（コスモバイオ社製）、抗ＡＱＰ９抗体（コスモバイオ社製）、及び抗ＮＧＦＲ抗体（Ａｃｒｉｓ社製）等の市販品を用いることができる。マーカータンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識すればよい。標識物質は、蛍光色素、放射性同位体、酵素等を使用することができる。また、抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧなどを用いることも可能である。これらの抗体を用いて脂肪幹細胞の選別と分離を行う場合は、後述の蛍光細胞分離法(Fluorescence activated cell sorting :FACS)で行うことができる。
【００１９】
また、生体移植材料の製造に用いる脂肪幹細胞の品質を評価する場合など、脂肪幹細胞の検出又は同定のみを目的とする場合は、細胞より膜タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット法によって行うことができる。また、上記マーカータンパク質をコードする遺伝子（マーカー遺伝子）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを用いる方法によっても行うことができる。上記マーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１、３、５、及び７にそれぞれ示される塩基配列又はその相補配列において連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが挙げられ、オリゴヌクレオチドはマーカー遺伝子増幅のためのプライマーとして、またポリヌクレオチドはマーカー遺伝子の検出のためのプローブとして用いることができる。プライマーの長さは、１５ｂｐ〜５０ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐ、より好ましくは２０ｂｐ〜３０ｂｐが例示できる。またプローブの長さは、１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは５０ｂｐ〜１０００ｂｐ、より好ましくは１００ｂｐ〜５００ｂｐが例示できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、検出を容易にするために、標識物質をつけてもよい。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる蛍光物質、放射性同位体、化学発光物質、酵素、ビオチン等を用いることができる。これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを用いて脂肪幹細胞の検出又は同定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡチップ法、in situ ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
【００２０】
上記のＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体、又は、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、必要な試薬とともにキット化し、脂肪幹細胞の検出又は分離用キットとして提供できる。本発明のキットには、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質に対する抗体の少なくとも１種、及び/又は、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲよりなる群から選ばれるマーカータンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１種を含んでいればよく、その他には、標識物質、検出試薬、二次抗体、緩衝液、洗浄液、使用説明書等が含まれていてもよい。 
【００２１】
抗体を用いてそれぞれのマーカータンパク質を発現する細胞を選別及び分離する方法は、当分野で通常行われている方法で行えばよく、例えば、蛍光細胞分離法(Fluorescence activated cell sorting :FACS)、磁気細胞分離法（Magnetic activated cell sorting：MACS）等が挙げられるが、FACSが好ましい。セルソーター機能を有するフローサイトメーターを用いれば、指定した蛍光を発する特定の細胞のみを分取することが可能である。このような機器として、例えばFACS Aria II（日本ＢＤ社製）、JSAN（ベイバイオサイエンス社製）、MoFlo XDP（ベックマン・コールター社製）等が挙げられ、機器の操作は添付の使用書に従って行うことができる。また、MACSは、マーカータンパク質に対する抗体を磁気ビーズに固定化し、強力な磁石を利用して円筒形容器の内壁に目的とする脂肪幹細胞を精製することができる。固定化する磁気ビーズ試薬としては、一般的なものを用いることができる。例えば、MACS(Miltenyi Biotec社製）、IMag（日本ＢＤ社製）等が挙げられる。
【００２２】
また、上記の抗体を用いる方法以外の方法としては、例えばＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲのプロモーターの下流にＧＦＰ等の蛍光タンパク質の遺伝子を連結したプラスミドを脂肪細胞に導入し、発現した蛍光タンパク質の蛍光強度に基づいてFACSでＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、及びＮＧＦＲ陽性細胞を分離する方法が挙げられる。
【００２３】
本発明において上記マーカーを用いて分離した脂肪幹細胞は「多分化能」を有する。ここで、「多分化能」は、複数種の細胞に分化し得る能力をいい、「多能性」ともいう。本発明において上記マーカーを用いて分離した脂肪幹細胞は、間葉系細胞、例えば、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞（以下、これらの細胞を「分化細胞」という）への分化能を有する。本発明において、「分化細胞」は、細胞集団又は組織の形態であってもよい。
【００２４】
脂肪幹細胞の維持及び分化誘導のための培養方法の条件及び操作は、当該技術分野で常套的な条件及び操作に従って行うことができる。
【００２５】
脂肪幹細胞の分化誘導のための培地には、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、分化誘導の目的とする細胞に応じた分化誘導又は促進因子を少なくとも１種添加した培地が用いられる。脂肪細胞分化誘導因子としては、例えば、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシン（ＩＤＭ）、インスリン（Ｉｎｓ）、トログリタゾン、ビオチン等が挙げられる。骨芽細胞分化誘導因子としては、例えば、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、ハイドロコルチゾン、β-グリセロフォスフェート、アスコルビン酸、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２等が挙げられる。軟骨細胞分化誘導因子としては、例えば、ＴＧＦ−β３、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、アスコルビン酸二リン酸等が挙げられる。平滑筋細胞分化誘導因子としては、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）等が挙げられる。また、上記培地には、細胞の増殖速度を増大させるために、必要に応じて、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）等の増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント等を添加してもよく、また、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）などを添加してもよい。培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
【００２６】
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清（例えば、１０％ＦＢＳ）が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００２７】
目的とする細胞の分化誘導因子を添加した分化誘導用培地は市販されており、これらの市販品の培地を用いてもよい。例えば、脂肪細胞分化誘導用培地としては、脂肪細胞分化誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）、脂肪前駆細胞分化培地：Preadipocyte Differentiation Medium (タカラバイオ社製）、脂肪細胞分化培地ＴＡＤＭ（東洋紡社製）等、骨芽細胞分化誘導用培地としては、骨芽細胞分化誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）、ブレットキット骨芽細胞分化用培地（三光純薬社製）等、軟骨細胞分化誘導用培地としては、軟骨細胞誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）、ブレットキット軟骨細胞分化用培地（三光純薬社製）等、平滑筋細胞分化誘導用培地としては、平滑筋細胞分化誘導用培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）、平滑筋細胞分化培地ＳＭＤＭ(コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。
【００２８】
幹細胞の培養又は幹細胞に分化を促す場合の容器としては、使い捨てのシャーレを使用することが好ましい。なお、培地の交換は１〜３日毎に１回行うことが好ましい。
【００２９】
幹細胞の増殖及び分化誘導のための培養温度は、細胞の由来により異なるが、例えばヒト由来の場合３０℃〜４０℃が好ましく、３６〜３８℃がより好ましい。また、ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％が好ましく、約２〜５％がより好ましい。
【００３０】
目的とする細胞への分化誘導の確認は、分化細胞の種類に応じて公知の方法にて行うことができる。例えば、脂肪細胞への分化誘導確認は、細胞をオイルレッドＯで染色する方法、細胞内のトリグリセリド量を測定する方法、細胞内のペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の発現量を測定する方法等により行うことができる。骨芽細胞への分化誘導確認は、細胞をアルカリフォスファターゼで染色する方法、細胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する方法、細胞内のオステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）の発現量を測定する方法等により行うことができる。軟骨細胞への分化誘導確認は、細胞をアルシアンブルーで染色する方法、細胞内のＣｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ ＩＩの発現量を測定する方法等により行うことができる。平滑筋細胞への分化誘導確認は、平滑筋α-アクチン、平滑筋ミオシン重鎖、カルポニン、ＳＭ２２αの有無を測定する方法等により行うことができる。
【００３１】
本発明において分離した脂肪幹細胞から分化誘導させた分化細胞は、生体組織の損傷や障害の治療や美容を目的とした移植材料として用いることができる。例えば分化細胞が脂肪細胞である場合は、豊胸、乳がん切除後の乳房再建、目元や頬のシワやハリの低下の改善等、分化細胞が骨芽細胞の場合は骨折の治療、低身長・骨変形・脚長差を改善するための骨延長術等、分化細胞が軟骨細胞である場合は、関節軟骨の退化・変性・変形その他の異常に関連する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、肩関節周囲炎、顎関節症など）の治療、平滑筋細胞の場合は、平滑筋細胞の傷害や異常に起因する疾患（例えば、排尿障害（尿漏れ、頻尿、尿閉など）、平滑筋腫、平滑筋肉腫等）の治療への利用が挙げられる。
【００３２】
また、本発明において分離した脂肪幹細胞から分化誘導させた分化細胞を細胞治療に用いる場合には、レシピエントと同種の動物由来の幹細胞を用いることが好ましい。分化細胞の成体への移植方法は、分化細胞の種類によって異なるが、例えば、脂肪細胞を例にすると、生理食塩水や培養液に脂肪細胞を１×１０３〜１×１０７個／ｍＬとなるように調整し、腹腔内や皮下などへ注射やカテーテルなどにより局所注入することにより行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）フローサイトメトリーによる脂肪由来細胞からの幹細胞の分離及び未分化性の評価
（１） フローサイトメトリーによる脂肪由来細胞からの幹細胞の分離
皮膚から分離した脂肪由来細胞と、さらにその脂肪由来細胞から表面タンパク質である
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲを指標として細胞を分離した。本試験では、皮膚から分離した脂肪由来細胞として、市販されているヒト前駆脂肪細胞（ＤＳバイオファーマ社製）を用いた。なお、細胞の増殖には同社市販の培養液としてヒト線維芽細胞増殖培地を用いた。
【００３５】
増殖させたヒト前駆脂肪細胞を、それぞれ５％ＦＢＳ添加ハンクス液（シグマアルドリッチ株式会社製）中で、抗ＡＱＰ１抗体（コスモバイオ社製）、抗ＡＱＰ７抗体（コスモバイオ社製）、抗ＡＱＰ９抗体（コスモバイオ社製）、抗ＮＧＦＲ抗体（Ａｃｒｉｓ社製）と３０分間氷中にて反応させた。反応後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液にて３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及び／又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４で標識した抗ＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ株式会社製）と３０分間氷中にて反応させた。最後に、５％ＦＢＳ添加ハンクス液にて３回洗浄し、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）５μｇ／ｍＬを含む５％ＦＢＳ添加ハンクス液中に細胞を懸濁した。これら蛍光標識した細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（日本ＢＤ社製）にて解析した。ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にした。まず、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）及びＰＩにより、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集魂を除いた部分にゲート（Ｒ１）をかけた。次に、ゲート（Ｒ１）内のＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲ陽性細胞をそれぞれ解析し、さらに染色の組み合わせによりＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲのみが陽性である細胞（以降、ＡＱＰ１＋、ＡＱＰ７＋、ＡＱＰ９＋、ＮＧＦＲ＋細胞と記す）、あるいはＡＱＰ１、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ９とＮＧＦＲとが両方陽性である細胞（以降、ＡＱＰ１＋/ＮＧＦＲ＋、ＡＱＰ７＋/ＮＧＦＲ＋、ＡＱＰ９＋/ＮＧＦＲ＋細胞と記す）にゲートを設定し、それぞれのマーカーを発現している細胞を分離した。なお、本試験では、分離前の雑多細胞群を標準細胞とした。
【００３６】
（２）分離した細胞の未分化性の評価
（１）でＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞について、幹細胞の特性である未分化性の評価を以下のようにして行った。
【００３７】
各細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によって各細胞からＲＮＡを抽出した。２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を実施し、未分化マーカーであるＮａｎｏｇ（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊａｎ；  １７（１）：４２−９．  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｎａｎｏｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｐａｎ  Ｇ，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．）の遺伝子発現量を測定した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
【００３８】
ＮＡＮＯＧ（未分化マーカー）遺伝子用プライマーセット：
ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣ（配列番号９）
ＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号１０）
ＧＡＰＤＨ（内部標準）遺伝子用のプライマーセット：
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号１１）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号１２）
【００３９】
各細胞の未分化性は、分離前の標準細胞におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出したＮＡＮＯＧの遺伝子相対発現量（ＮＡＮＯＧ遺伝子発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量）の値を１．０とし、これに対し、分離後の各細胞におけるＮＡＮＯＧの遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。結果を以下の表１に示す。
【００４０】
【表１】
2017108674.tif 000002
【００４１】
表１に示す通り、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲの発現を指標として脂肪由来細胞から分離した細胞においては、未分化マーカー遺伝子ＮＡＮＯＧの発現が顕著に高いことが示された。また、ＡＱＰ１とＮＧＦＲ、ＡＱＰ７とＮＧＦＲ、ＡＱＰ９とＮＧＦＲを組み合わせて分離した細胞では、より顕著であった。
【００４２】
（実施例２）幹細胞の多分化能の評価
実施例１においてＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を用いて、以下の方法で分化誘導培養を行い、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化誘導の確認を行った。
【００４３】
（１）脂肪細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、脂肪細胞分化誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な脂肪細胞誘導用培地に交換した。脂肪細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドＯ染色により行った。
【００４４】
（２）骨芽細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、骨芽細胞分化誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な骨芽細胞分化誘導用培地に交換した。骨芽細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルカリフォスファターゼ染色により行った。
【００４５】
（３）軟骨細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、軟骨細胞誘導用培地（ＤＳバイオファーマ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な軟骨細胞分化誘導用培地に交換した。軟骨細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルシアンブルー染色により行った。
【００４６】
（４）平滑筋細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａにより分離した各細胞と分離前の標準細胞を、平滑筋細胞分化誘導用培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な平滑筋細胞分化誘導用培地に交換した。平滑筋細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（α―Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎの有無）により行った。
【００４７】
（５）脂肪由来細胞から分離した幹細胞の分化誘導率（％）の評価
ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲをもとに脂肪由来細胞から分離した幹細胞の脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化誘導率を評価した。具体的には、（１）〜（４）の分化誘導確認により、顕微鏡観察にて細胞の分化有無を計測し、その結果をもとに分化誘導率（総細胞数に対する分化した細胞数の割合％）を算出した。細胞の分化誘導率（％）の評価基準は、分化誘導率が１０％未満を「−」、１０％以上２０％未満を「＋」、２０％以上３０％未満を「＋＋」、３０％以上４０％未満を「＋＋＋」、４０％以上５０％未満を「＋＋＋＋」、５０％以上を「＋＋＋＋＋」とした。結果を以下の表２に示す。
【００４８】
【表２】
2017108674.tif 000003
【００４９】
表２に示す通り、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲの発現を指標に分離した細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化誘導率が高く、多分化能を有することが示された。特に、多分化能は、ＮＧＦＲとＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９のいずれかとを組み合わせて分離した細胞において、より高くなることが示された。
【００５０】
以上の試験結果から、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲＩの発現を指標とすることにより、脂肪組織から未分化性を維持し、かつ多分化能の高い幹細胞を分離することが可能であることが示された。また、ＡＱＰ１、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＮＧＦＲは、再生医療材料又は再生美容材料に用いる幹細胞の品質を評価するためのマーカーとしても用いることも可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法により脂肪組織から分離した脂肪幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞への分化能が高く、優れた多分化能を示す。よって、本発明は、上記細胞の障害や損傷の治療を目的とした再生医療材料又は再生美容材料の製造分野において利用できる。
【配列表】
2017108674000001.app