(57)【要約】【課題】偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で発育させるための、長期的な保存に適した、すなわち充分な品質保持期間が確保された培地を提供すること、および同培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を簡便に検出する方法を提供すること。【解決手段】基礎培地に還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を含んでなる、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための長期保存性培地、および同培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を検出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を基礎培地に含んでなる、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための長期保存性培地。
【請求項２】
ジチオスレイトールの濃度が０．０７５〜１．５ｇ／Ｌであり、および、アスコルビン酸の濃度が０．０７５〜３．６ｇ／Ｌである、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに含む、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌである、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
グリシン、硫酸マグネシウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の第１発育支持剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
グリシンの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、硫酸マグネシウムの濃度が０．０１〜１．０ｇ／Ｌであり、および、炭酸水素ナトリウムの濃度が０．５〜４．０ｇ／Ｌである、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
アルギニン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウムおよび溶性デンプンからなる群から選択される少なくとも１種の第２発育支持剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８】
アルギニンの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０１〜１．０ｇ／Ｌであり、ピルビン酸ナトリウムの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、および、溶性デンプンの濃度が１．０〜８．０ｇ／Ｌである、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
基礎培地に、サイクロセリン、セファロスポリン系抗菌剤、グリコペプチド系抗菌剤、ジアミノピリミジン系抗菌剤、ポリエン系抗菌剤、ポリペプチド系抗菌剤およびアミノグリコシド系抗菌剤からなる群から選択される少なくとも１種の抗菌剤が含まれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１０】
セファロスポリン系抗菌剤がセフォキシチンであり、グリコペプチド系抗菌剤がバンコマイシンであり、ジアミノピリミジン系抗菌剤がトリメトプリムであり、ポリエン系抗菌剤がアムホテリシンＢであり、ポリペプチド系抗菌剤がポリミキシンＢであり、および、アミノグリコシド系抗菌剤がゲンタマイシンである、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
半流動培地または液体培地である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培地を用いて、偏性嫌気性菌または微好気性菌を検出する方法。
【請求項１３】
生体試料および／または環境試料を対象とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための長期保存性培地および同培地を用いた偏性嫌気性菌または微好気性菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の原因菌の特定には、培養法が有効な手法の１つである。しかしながら、好気環境で培養できる細菌だけではなく、嫌気環境または微好気環境を必要とする細菌がある。
例えば、偽膜性腸炎の原因菌であるClostridium difficile（以下、C. difficile）は偏性嫌気性菌であり、酸素存在下では発育できないことから、嫌気環境下での培養が必須である。また、食中毒の原因菌であるClostridium perfringens（以下、C. perfringens）およびBacteroides fragilis（以下、B. fragilis）も偏性嫌気性菌であり、嫌気環境下での培養が必須である。消化器疾患に関係があると言われているHelicobacter pylori（以下、H. pylori）は、その培養には嫌気環境は必要ではないが微好気環境下での培養が必須である。
【０００３】
これらの菌は培養検出の必要性が高いにもかかわらず、培養が困難、煩雑であるため、新たな培養による検出方法の開発が進められている。例えば、非特許文献１には、C. difficileを嫌気環境下で培養するための様々な培地が記載され、各培地に含まれる成分の種類またはそれらの組成に依存してC. difficileの検出感度が異なることが記載されている。しかしながら、前記培地を用いたC. difficileの培養には嫌気環境が必要であり、嫌気環境下で培養するための特殊な装置ならびに専門的な知識および技術が必要となることから、同文献に記載の培地を用いたC. difficileの検出方法では、病院などの臨床現場においてC. difficileを簡便に検出することは困難である。
また、非特許文献２にはC. perfringensを、非特許文献３にはB. fragilisを特殊な装置を用いて嫌気環境下で培養することが記載されており、C. perfringensおよびB. fragilisのいずれについても上記のC. difficileの培養と同様に嫌気環境下で培養するための特殊な装置ならびに専門的な知識および技術が必要となる。そして、非特許文献４にはH. pyloriを特殊な装置を用いて微好気環境下で培養することが記載されており、かかる微好気培養のための特殊な装置ならびに専門的な知識および技術が必要となる。
【０００４】
一方、非特許文献５には、還元剤としてチオグリコール酸およびＬ−システインを含む、C. difficileを好気環境下で培養するための培地が記載されている。かかる培地を用いることによって、C. difficileを発育させる際に、嫌気環境下で培養するための特殊な装置ならびに専門的な知識および技術が不要となることから、同培地を用いてC. difficileを簡便に検出することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】沼田昇、吉田菊喜、加藤はる、荒川宜親、「環境中のClostridium difficile汚染の調査法の検討−菌の採取法と分離培地の比較−」、環境感染、Vol.19、no.4、475-482、2004。
【非特許文献２】清水茂雅、堀口明日香、山崎,浩司、川合祐史、「加熱損傷ウェルシュ菌の検出培地の比較と改良」、北大水産彙報、Vol.52、no.2、37-42、2009。
【非特許文献３】R. Bradley Sack、 M. John Albert、 K. Alam、 P.K.B. Neogi、 M. S. Akbar、“Isolation of Enterotoxigenic Bacteroides fragilis from Bangladeshi Children with Diarrhea: a Controlled Study” J. Clin. Microbiol., 32(4):960-963, 1994。
【非特許文献４】神谷茂、田口晴彦、「Helicobacter pylori の分離培養と病原因子の解析」日本細菌学雑誌、Vol.57、no.4、619-655、2002。
【非特許文献５】Cadnum JL, Hurless KN, Deshpande A, Nerandzic MM, Kundrapu S, Donskey CJ, “Sensitive and Selective Culture Medium for Detection of Environmental Clostridium dif?cile Isolates without Requirement for Anaerobic Culture Conditions”J. Clin. Microbiol., 52(9):3259-3263, 2014。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のとおり、非特許文献５には、還元剤としてチオグリコール酸およびＬ−システインを含む、C. difficileを好気環境下で培養するための培地が記載されている一方、同文献には、同培地がその調製から２週間経つと徐々にC. difficileの検出感度が低下することも記載されている。したがって、同培地は長期的な保存に不適であり、充分な品質保持期間を確保することは困難であるといえるため、同培地を製品化して市場に流通させることは現実的ではない。また、同培地はC. difficileを好気環境下で培養するための培地であって、例えばC. perfringensおよびB. fragilisなどの他の偏性嫌気性菌ならびに例えばH. pyloriなどの微好気性菌を好気環境下で培養するための培地は知られていない。
そこで、本発明は、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための、長期的な保存に適した、すなわち充分な品質保持期間が確保された培地を提供すること、および同培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を簡便に検出する方法を提供することを課題とする。
なお、本明細書中において、本発明に係る「偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための長期保存性培地」を単に「本発明の培地」ともいう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を基礎培地に添加することによって、同培地が少なくとも４ヶ月間もの長期間保存できることを初めて見出した。そして上記課題を鑑み、基礎培地において還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を含み、さらに検出対象の偏性嫌気性菌または微好気性菌の各性質を考慮して選択された発育支持剤および／または抗菌剤を含んでなる培地を用いて、例えばC. difficile、C. perfringens、B. fragilisなどの偏性嫌気性菌または例えばH. pyloriなどの微好気性菌を好気環境下で培養することによって、特殊な装置ならびに専門的な知識および技術がなくとも、偏性嫌気性菌または微好気性菌を簡便に培養することを実現し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を基礎培地に含んでなる、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養するための長期保存性培地。
［２］ジチオスレイトールの濃度が０．０７５〜１．５ｇ／Ｌであり、および、アスコルビン酸の濃度が０．０７５〜３．６ｇ／Ｌである、［１］に記載の培地。
［３］還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに含む、［１］または［２］に記載の培地。
［４］トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌである、［３］に記載の培地。
［５］グリシン、硫酸マグネシウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の第１発育支持剤をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の培地。
［６］グリシンの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、硫酸マグネシウムの濃度が０．０１〜１．０ｇ／Ｌであり、および、炭酸水素ナトリウムの濃度が０．５〜４．０ｇ／Ｌである、［５］に記載の培地。
【０００９】
［７］アルギニン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウムおよび溶性デンプンからなる群から選択される少なくとも１種の第２発育支持剤をさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の培地。
［８］アルギニンの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０１〜１．０ｇ／Ｌであり、ピルビン酸ナトリウムの濃度が０．１〜２．０ｇ／Ｌであり、および、溶性デンプンの濃度が１．０〜８．０ｇ／Ｌである、［７］に記載の培地。
［９］基礎培地に、サイクロセリン、セファロスポリン系抗菌剤、グリコペプチド系抗菌剤、ジアミノピリミジン系抗菌剤、ポリエン系抗菌剤、ポリペプチド系抗菌剤およびアミノグリコシド系抗菌剤からなる群から選択される少なくとも１種の抗菌剤が含まれる、［１］〜［８］のいずれかに記載の培地。
［１０］セファロスポリン系抗菌剤がセフォキシチンであり、グリコペプチド系抗菌剤がバンコマイシンであり、ジアミノピリミジン系抗菌剤がトリメトプリムであり、ポリエン系抗菌剤がアムホテリシンＢであり、ポリペプチド系抗菌剤がポリミキシンＢであり、および、アミノグリコシド系抗菌剤がゲンタマイシンである、［９］に記載の培地。
［１１］半流動培地または液体培地である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の培地。
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を検出する方法。
［１３］生体試料および／または環境試料を対象とする、［１２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地は、還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を含むことによって、少なくとも４ヶ月間の長期にわたって保存できることから、充分な品質保持期間を確保することができ、同培地を製品化して市場に流通させることができる。また、同培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養することによって簡便に偏性嫌気性菌または微好気性菌を検出することができる。さらに、同培地に発育支持剤を添加することによって、偏性嫌気性菌または微好気性菌の検出感度を向上させ、偽陰性を防止し、疾患の原因が偏性嫌気性菌または微好気性菌であるか否かを正確に把握して適切な診断を行うことができる。なお、同培地を半流動培地または液体培地とすることによって、偏性嫌気性菌または微好気性菌の培養後に、偏性嫌気性菌または微好気性菌に由来する遺伝子および毒素などを様々な分子生物学的検査に供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、C. difficileを好気環境下で培養する前（ａ）および好気環境下で培養した後（ｂ）の実施例２の培地を示す。菌が発育することで培地が赤色から黄色に変化し、菌の塊が視認できる。
【図２】図２は、製造直後の実施例２の培地（ａ）および比較例２の培地（ｂ）に各菌量のC. difficileを接種し、C. difficileを好気環境下で培養した後のそれぞれの培地を示す。図中の数値は、播種した各菌量（ｃｆｕ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について、本発明の好適な実施態様に基づき、詳細に説明する。
＜本発明の培地＞
本発明の培地は、少なくともペプトン、糖類、塩類および抗菌剤を含み、任意に例えば寒天、酸塩基指示薬、システインなどの還元剤などをさらに含む基礎培地をベースに、還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸もしくはその塩、好ましくはさらに加えてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、を含んでなる、偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で、特殊な装置ならびに専門的な知識および技術を用いずに培養するための長期保存性培地である。
【００１３】
＜偏性嫌気性菌および微好気性菌＞
本発明において、偏性嫌気性菌とは、酸素存在下では発育できない細菌を指し、例えばC. difficile、C. perfringens、B. fragilisなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本発明において、微好気性菌とは、その培養に酸素を必要とするが、大気環境中に存在する酸素濃度よりもはるかに低い濃度の酸素を必要とする細菌を指し、例えばH. pyloriなどが挙げられるが、本発明はこれに限定されない。これら偏性嫌気性菌または微好気性菌には様々な株が存在するが、本発明はこれらに限定されない。
偏性嫌気性菌としては、例えばClostridium属、Bacteroides属などが挙げられ、微好気性菌としては、例えばHelicobacter属などが挙げられる。Clostridium属にはC. difficileおよびC. perfringensが含まれ、Bacteroides属にはB. fragilisが含まれ、Helicobacter属にはH. pyloriが含まれる。
【００１４】
＜好気環境下、嫌気環境下または微好気環境下での培養＞
本発明において、好気環境下での培養とは、孵卵器内などで、嫌気ジャー、嫌気パックおよび／または微好気パックを用いない環境下での培養を指す。偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養することが可能になると、嫌気環境下で培養するための特殊な装置ならびに専門的な知識および技術が不要となることから、偏性嫌気性菌または微好気性菌を簡便に検出することができる。また、本発明において、嫌気環境下での培養とは、孵卵器内などで、嫌気ジャーおよび嫌気パックを用いた環境下での培養を指す。また、本発明において、微好気環境下での培養とは、孵卵器内などで、嫌気ジャーおよび微好気パックを用いた環境下での培養を指す。嫌気パックとしては、例えばアネロパック（登録商標）・ケンキ（三菱ガス化学社製）といった酸素吸収・炭酸ガス発生剤などが挙げられ、例えば嫌気ジャー内を嫌気環境に保つために使用されるものであるのに対し、微好気パックとしては、例えばアネロパック（登録商標）・微好気（三菱ガス化学社製）といった酸素吸収・炭酸ガス発生剤などが挙げられ、例えば嫌気ジャー内を微好気環境に保つために使用されるものである。
【００１５】
＜基礎培地＞
本発明において、ペプトンは、タンパク質をアミノ酸および低分子量のペプチドまで加水分解したものであり、一般的な微生物培養に用いられる基本的な栄養素が含まれるものであればいずれでもよく、１種単独でも２種以上併用してもよい。かかる栄養素は当業者であれば理解できるものである。
本発明に用いる糖類としては、例えば、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースなどの二糖、ならびに、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。
また、塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムおよびタウロコール酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられる抗菌剤は、例えば、セファロスポリン系抗菌剤、グリコペプチド系抗菌剤、ジアミノピリミジン系抗菌剤、ポリエン系抗菌剤、ポリペプチド系抗菌剤、モノバクタム系抗菌剤、オキサセフェム系抗菌剤、アミノグリコシド系抗菌剤、ホスホマイシンおよびサイクロセリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。セファロスポリン系抗菌剤は、セフスロジン、セファクロル、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフジトレン、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソンおよびセフェピムを含み、グリコペプチド系抗菌剤は、バンコマイシンおよびテイコプラニンを含み、ジアミノピリミジン系抗菌剤は、トリメトプリムを含み、ポリエン系抗菌剤は、アムホテリシンＢ、ナイスタチンおよびナタマイシンを含み、ポリペプチド系抗菌剤は、バシトラシン、コリスチンおよびポリミキシンＢを含み、モノバクタム系抗菌剤は、アズトレオナムを含み、オキサセフェム系抗菌剤は、モキサラクタム（ラタモキセフ）を含み、ならびに、アミノグリコシド系抗菌剤は、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ジベカシンおよびアルベカシンを含む。セファロスポリン系抗菌剤、モノバクタム系抗菌剤、オキサセフェム系抗菌剤およびアミノグリコシド系抗菌剤は、例えば抗細菌薬として使用され、ポリエン系抗菌剤は、例えば抗真菌薬として使用される。
【００１７】
本発明に用いられる抗菌剤は、検出対象の細菌の発育に影響を与えずに夾雑菌の発育を特異的に抑制することが可能な抗菌剤を選択することが好ましい。例えば、C. difficileを検出する際はサイクロセリンおよび／またはセフォキシチンを、C. perfringensを検出する際はサイクロセリンを、B. fragilisを検出する際はバンコマイシンおよび／またはゲンタマイシンを、H. pyloriを検出する際はトリメトプリム、バンコマイシンおよび／またはアムホテリシンＢを選択することができる。また、例えば、微好気性菌で、食中毒の原因菌であり、さらにギラン・バレー症候群との関連が疑われ、鶏肉からの感染例が多く報告されている、Campylobacter jejuniを検出する際は、セフォペラゾン、バンコマイシンおよびシクロヘキシミドを選択することができる。微好気性菌で、母子垂直感染を起こし、新生児の致死率が高い細菌性髄膜炎を引き起こすことで知られる、Streptococcus agalactiaeを検出する際は、トリメトプリムおよびアムホテリシンＢを選択することができる。偏性嫌気性菌で、レミエール症候群の原因菌の１つであるFusobacterium necrophorumを検出する際は、エリスロマイシン、バンコマイシンおよびアムホテリシンＢを選択することができる。
【００１８】
基礎培地は、前記のとおり、さらに寒天を含んでもよい。寒天の濃度は、良好な偏性嫌気性菌または微好気性菌の発育支持能および培養後の培養液の取り扱いの簡便さの観点から、０．０〜７．５ｇ／Ｌが好ましく、０．０〜３．０ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０〜１．５ｇ／Ｌが特に好ましい。また、本発明の培地は、半流動培地または液体培地であってもよい。これは、固形培地から偏性嫌気性菌または微好気性菌を回収するよりも、半流動培地または液体培地から同菌を回収する方がより簡便であり、さらに回収した同菌を直接的に様々な分子生物学的検査に供することによって、同菌に由来する遺伝子および／または毒素などを簡便に検出できるためである。特に、本発明の培地は、液体培地であることが好ましい。これは、半流動培地から偏性嫌気性菌または微好気性菌を回収するよりも、液体培地から同菌を回収する方が同菌をより高密度かつ簡便に回収することができ、また回収した同菌を直接的に様々な分子生物学的検査に供することによって、同菌に由来する遺伝子および／または毒素などを半流動体培地よりもさらに簡便に検出できるためである。また、本発明の培地を液体培地とすることによって、該培地を冷凍保存することが可能となり、品質保持期間をさらに延長することも可能になる。
【００１９】
かかる分子生物学的検査は、例えば、免疫学的検査および遺伝子検査などが挙げられ、通常の免疫学的検査および遺伝子検査であればいずれも本発明に採用することができる。免疫学的検査としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法または粒子凝集反応法などが挙げられ、迅速な診断に寄与する観点からイムノクロマト法が好ましい。遺伝子検査としては、ＰＣＲ法など様々な核酸増幅手法による目的の遺伝子もしくは遺伝子断片の増幅、定量および／または検出、または、シークエンス法などによる遺伝子配列の決定などが挙げられる。
【００２０】
基礎培地は、前記のとおり、さらに酸塩基指示薬を含んでもよい。酸塩基指示薬としては、例えば、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、クレゾールレッドなどの中性から塩基性に変色域を有するものが挙げられる。酸塩基指示薬は、視認性の観点から、ニュートラルレッドが好ましい。ニュートラルレッドを含む前記培地は、例えばC. difficile、C. perfringens、B. fragilisなどの偏性嫌気性菌の発育に伴い、同培地のｐＨが中性から塩基性へ変化することによって赤色から黄色に変わるため、かかる色の変化から当該偏性嫌気性菌を簡便に検出することができる。
【００２１】
＜還元剤＞
本発明に用いる還元剤としては、ジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸の他にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩が挙げられ、夾雑菌に対する発育抑制能の観点から、ジチオスレイトールとトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩との組み合わせが好ましい。ジチオスイレトールの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．０７５〜１．５ｇ／Ｌが好ましく、０．１６〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．６〜０．９ｇ／Ｌが特に好ましい。また、アスコルビン酸の濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．０７５〜３．６ｇ／Ｌが好ましく、０．１６〜２．７ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３２〜１．８ｇ／Ｌが特に好ましい。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．１〜２．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２５〜１．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．５〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。また、本発明に用いる還元剤として、前記のものに加え、任意に例えばシステインおよび／またはチオグリコール酸などを基礎培地に添加してもよい。
【００２２】
＜発育支持剤＞
本発明の培地はさらに、発育支持剤を含むことができ、それによって偏性嫌気性菌または微好気性菌の検出感度を向上させることができる。本発明に用いる発育支持剤としては、グリシン、硫酸マグネシウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される第１発育支持剤、ならびに、アルギニン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウムおよび溶性デンプンからなる群から選択される第２発育支持剤が挙げられる。グリシンの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．１〜２．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２５〜１．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．５〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。硫酸マグネシウムの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．０１〜１．０ｇ／Ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０７５〜０．２５ｇ／Ｌが特に好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．５〜４．０ｇ／Ｌが好ましく、０．７５〜３．０ｇ／Ｌがさらに好ましく、１．０〜２．０ｇ／Ｌが特に好ましい。アルギニンの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．１〜２．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２５〜１．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．５〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。亜硫酸ナトリウムの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．０１〜１．０ｇ／Ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０７５〜０．２５ｇ／Ｌが特に好ましい。ピルビン酸ナトリウムの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、０．１〜２．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２５〜１．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．５〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。溶性デンプンの濃度は、偏性嫌気性菌または微好気性菌に対する発育支持能の観点から、１．０〜８．０ｇ／Ｌが好ましく、２．０〜６．０ｇ／Ｌがさらに好ましく、４．０〜５．０ｇ／Ｌが特に好ましい。
【００２３】
＜C. difficileのための本発明の培地の製造方法およびその使用方法＞
本発明の培地を用いて好気環境下で培養し、検出することができるC. difficileは、特定の株に限定されるものではない。本発明の培地は、C. difficileを好気環境下で発育させるための、長期的な保存に適した、すなわち充分な品質保持期間が確保された培地である。
本発明の培地は、通常の培地と同様に、熱に弱いとされている抗菌剤以外の前記各成分を水などに溶解した後に高圧蒸気滅菌してから適切な温度まで冷やし、その後に抗菌剤などを加えることによって製造することができる。試料は、本発明の培地に直接接種することができる。本発明の培地は、２０〜４０℃の温度範囲においてC. difficilを好気環境下で培養することができる。かかる温度範囲は、C. difficilの発育速度の観点から、２５〜３９℃が好ましく、３０〜３９℃がさらに好ましく、３５〜３８℃が特に好ましい。かかる培養は、C. difficileの発育量の観点から、１６〜７２時間行うことが好ましく、１６〜４２時間がさらに好ましく、１８〜３８時間が特に好ましい。本発明の培地の保存の際には、本発明の培地が寒天を含む半流動培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を２〜１０℃で冷蔵して保存することが好ましく、２〜９℃で冷蔵して保存することがさらに好ましく、２〜８℃で冷蔵して保存することが特に好ましい。本発明の培地が液体培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を−４〜−８０℃で冷凍して保存することが好ましく、−４〜−４０℃で冷凍して保存することがさらに好ましく、−１０〜−２０℃で冷凍して保存することが特に好ましい。
【００２４】
＜C. difficileの検出方法＞
本発明のC. difficileの検出方法は、例えばC. difficileが発育することによって本発明の培地中のアミノ酸が消費されｐＨが中性から塩基性へ変化し、酸塩基指示薬が変色することによって、C. difficileを簡便に検出するものである。例えば、本発明の培地に酸塩基指示薬としてニュートラルレッドを使用した場合、ｐＨが中性から塩基性へ変化すると、前記培地は赤色から黄色に変わるため、かかる色の変化からC. difficileを簡便に検出することができる（図１）。
本発明に用いることができる試料としては、ヒトもしくは動物の糞便または肛門周囲もしくは直腸内壁などに由来する生体試料、または病院内の任意の場所、食品、飲料もしくは水道水などに由来する環境試料など、C. difficileが含まれる可能性のある試料であればいずれも対象となり得、好ましくは、採取が簡便である糞便である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒やピペットを用いた方法が多用される。
【００２５】
＜C. difficileに関連する疾患の診断方法＞
本発明は、本発明の培地を前記生体試料に接触させることによって、C. difficileを選択的に増殖させる工程を少なくとも含み、増殖させたC. difficileが産生する毒素（トキシンＡ、Ｂなど）の有無を判定する工程をさらに含む、診断方法あるいは診断の助けとなる情報を提供する方法もまた包含する。かかる方法は、対象試料におけるC. difficile（無毒株を含む場合もある）の有無を選択的に増殖させることによって判定し、疾患の原因がC. difficileであるか否かを診断またはその助けとなる情報を提供することができる。かかる方法は、検体中のC. difficileが産生する毒素を検出する従来の抗原検査方法と比較し、簡便な操作でC. difficileを高感度に検出することができ、その後の毒素の検出の感度を飛躍的に向上させることができる。また、従来の抗原検査方法は検出感度の低さから、検査結果が偽陰性となる可能性があるのに対して、本発明を用いた診断方法は、C. difficileを本発明の培地中で発育させ、高感度に検出することによって、C. difficileの有無を判定し、C. difficileの発育を確認後に上記のトキシンを検出する従来の抗原検査方法を用いることで、上記の糞便を直接検査した場合と異なり培地中で発育したC. difficileが産生した高濃度のトキシンを検査するようになることから、偽陰性を防止しながら毒素を検出することができる。これにより、疾患の原因がC. difficileであるか否かを正確に把握して適切な診断を行うことができる。
【００２６】
また、従来のC. difficile検出培地であるCCFA培地（日本ベクトン・デッキンソン社製）などを用いる方法もあるが、これは検体を該培地に塗抹して特殊な装置ならびに専門的な知識および技術を用いて嫌気環境下で培養し、培地上に発育したC. difficileをエーゼなどで掻き集め、これを希釈液などに懸濁したものを抗原検査にかけるといった操作が必要であり、非常に煩雑である。特に、CCFA培地などに発育したC. difficileのコロニーは掻き取り難く、また、掻き取ったコロニーを希釈液で懸濁し難いことが、操作をより煩雑にしている。一方、本発明の培地を用いた場合は、好気環境下で培養した後の培養液をピペットなどで希釈液に懸濁し、これを抗原検査に用いることから、操作は非常に簡便であり、煩雑なコロニーの掻き取りなどを行う必要がない。
【００２７】
＜C. perfringensのための本発明の培地の製造方法およびその使用方法＞
本発明の培地を用いて好気環境下で培養し、検出することができるC. perfringensは、特定の株に限定されるものではない。本発明の培地は、C. perfringensを好気環境下で発育させるための、長期的な保存に適した、すなわち充分な品質保持期間が確保された培地である。
本発明の培地は、通常の培地と同様に、熱に弱いとされている抗菌剤以外の前記各成分を水などに溶解した後に高圧蒸気滅菌してから適切な温度まで冷やし、その後に抗菌剤などを加えることによって製造することができる。試料は、本発明の培地に直接接種することができる。本発明の培地は、３０〜４０℃の温度範囲においてC. perfringensを好気環境下で培養することができる。かかる温度範囲は、C. perfringensの発育速度の観点から、３２〜３９℃が好ましく、３４〜３９℃がさらに好ましく、３５〜３７℃が特に好ましい。かかる培養は、C. perfringensの発育量の観点から、１６〜７２時間行うことが好ましく、１６〜４２時間がさらに好ましく、１８〜２４時間が特に好ましい。本発明の培地の保存の際には、本発明の培地が寒天を含む半流動培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を２〜１０℃で冷蔵して保存することが好ましく、２〜９℃で冷蔵して保存することがさらに好ましく、２〜８℃で冷蔵して保存することが特に好ましい。本発明の培地が液体培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を−４〜−８０℃で冷凍して保存することが好ましく、−４〜−４０℃で冷凍して保存することがさらに好ましく、−１０〜−２０℃で冷凍して保存することが特に好ましい。
【００２８】
＜C. perfringensの検出方法＞
本発明のC. perfringensの検出方法は、例えばC. perfringensが発育することによって本発明の培地中のアミノ酸が消費されｐＨが中性から塩基性へ変化し、酸塩基指示薬が変色することによって、C. perfringensを簡便に検出するものである。例えば、本発明の培地に酸塩基指示薬としてニュートラルレッドを使用した場合、ｐＨが中性から塩基性へ変化すると、前記培地は赤色から黄色に変わるため、かかる色の変化からC. perfringensを簡便に検出することができる。
本発明に用いることができる試料としては、ヒトもしくは動物の糞便または肛門周囲もしくは直腸内壁などに由来する生体試料、または病院内の任意の場所、食品、飲料もしくは水道水などに由来する環境試料など、C. perfringensが含まれる可能性のある試料であればいずれも対象となり得、好ましくは、採取が簡便である糞便または食品である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００２９】
＜C. perfringensに関連する疾患の診断方法＞
本発明は、本発明の培地を前記生体試料に接触させることによって、C. perfringensを選択的に増殖させる工程を少なくとも含む診断方法あるいは診断の助けとなる情報を提供する方法もまた包含する。かかる方法は、対象試料におけるC. perfringensの有無を判定し、例えば、疾患の原因がC. perfringensであるか否かを診断することができる。
【００３０】
＜B. fragilisのための本発明の培地の製造方法およびその使用方法＞
本発明の培地を用いて好気環境下で培養し、検出することができるB. fragilisは、特定の株に限定されるものではない。本発明の培地は、B. fragilisを好気環境下で発育させるための、長期的な保存に適した、すなわち充分な品質保持期間が確保された培地である。
【００３１】
本発明の培地は、通常の培地と同様に、熱に弱いとされている抗菌剤以外の前記各成分を水などに溶解した後に高圧蒸気滅菌してから適切な温度まで冷やし、その後に抗菌剤などを加えることによって製造することができる。試料は、本発明の培地に直接接種することができる。本発明の培地は、３０〜４０℃の温度範囲においてB. fragilisを好気環境下で培養することができる。かかる温度範囲は、B. fragilisの発育速度の観点から、３２〜３９℃が好ましく、３４〜３９℃がさらに好ましく、３５〜３７℃が特に好ましい。かかる培養は、B. fragilisの発育量の観点から、１６〜７２時間行うことが好ましく、１６〜５０時間がさらに好ましく、３０〜４８時間が特に好ましい。本発明の培地の保存の際には、本発明の培地が寒天を含む半流動培地である場合、長期的な保存の観点から本発明の培地を２〜１０℃で冷蔵して保存することが好ましく、２〜９℃で冷蔵して保存することがさらに好ましく、２〜８℃で冷蔵して保存することが特に好ましい。本発明の培地が液体培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を−４〜−８０℃で冷凍して保存することが好ましく、−４〜−４０℃で冷凍して保存することがさらに好ましく、−１０〜−２０℃で冷凍して保存することが特に好ましい。
【００３２】
＜B. fragilisの検出方法＞
本発明のB. fragilisの検出方法は、例えばB. fragilisが発育することによって本発明の培地中のアミノ酸が消費されｐＨが中性から塩基性へ変化し、酸塩基指示薬が変色することによって、B. fragilisを簡便に検出するものである。例えば、本発明の培地に酸塩基指示薬としてニュートラルレッドを使用した場合、ｐＨが中性から塩基性へ変化すると、前記培地は赤色から黄色に変わるため、かかる色の変化からB. fragilisを簡便に検出することができる。
本発明に用いることができる試料としては、ヒトもしくは動物の糞便または肛門周囲もしくは直腸内壁などに由来する生体試料、または病院内の任意の場所、食品、飲料もしくは水道水などに由来する環境試料など、B. fragilisが含まれる可能性のある試料であればいずれも対象となり得、好ましくは、採取が簡便である糞便または食品である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００３３】
＜B. fragilisに関連する疾患の診断方法＞
本発明は、本発明の培地を前記生体試料に接触させることによって、B. fragilisを選択的に増殖させる工程を少なくとも含む診断方法あるいは診断の助けとなる情報を提供する方法もまた包含する。かかる方法は、対象試料におけるB. fragilisの有無を判定し、例えば、疾患の原因がB. fragilisであるか否かを診断することができる。
【００３４】
＜H. pyloriのための本発明の培地の製造方法およびその使用方法＞
本発明の培地は、通常の培地と同様に、熱に弱いとされている抗菌剤以外の前記各成分を水などに溶解した後に高圧蒸気滅菌してから適切な温度まで冷やし、その後に抗菌剤などを加えることによって製造することができる。試料は、本発明の培地に直接接種することができる。本発明の培地は、３０〜４０℃の温度範囲においてH. pyloriを好気環境下で培養することができる。かかる温度範囲は、H.pyloriの発育速度の観点から、３２〜３９℃が好ましく、３４〜３９℃がさらに好ましく、３５〜３７℃が特に好ましい。かかる培養は、H. pyloriの発育量の観点から、７２〜１９２時間行うことが好ましく、８６〜１９２時間がさらに好ましく、１１０〜１９２時間が特に好ましい。本発明の培地の保存の際には、本発明の培地が寒天を含む半流動培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を２〜１０℃で冷蔵して保存することが好ましく、２〜９℃で冷蔵して保存することがさらに好ましく、２〜８℃で冷蔵して保存することが特に好ましい。本発明の培地が液体培地である場合、長期的な保存の観点から、本発明の培地を−４〜−８０℃で冷凍して保存することが好ましく、−４〜−４０℃で冷凍して保存することがさらに好ましく、−１０〜−２０℃で冷凍して保存することが特に好ましい。
【００３５】
＜H. pyloriの検出方法＞
本発明のH. pyloriの検出方法は、例えばH. pyloriが発育することによって、培地の濁りや菌の塊を視認することで検出できる。
本発明に用いることができる試料としては、ヒトの胃液などに由来する生体試料など、H. pyloriが含まれる可能性のある試料であればいずれも対象となり得る。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００３６】
＜H. pyloriに関連する疾患の診断方法＞
本発明は、本発明の培地を前記生体試料に接触させることによって、H. pyloriを選択的に増殖させる工程を少なくとも含む診断方法あるいは診断の助けとなる情報を提供する方法もまた包含する。かかる方法は、対象試料におけるH. pyloriの有無を判定し、例えば、H. pyloriの除菌療法が必要であるか否かを診断するか、または診断に必要な情報を提供することができる。
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１＞
表１に記載の培地（ただしジチオスレイトールを除く）に対して、表２に記載の各濃度でジチオスレイトールを添加し、培地をそれぞれ製造した。具体的には、表１に記載のペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、該溶液に各濃度でジチオスレイトールを添加した後、１２１℃で１５分間インキュベートした。５０℃まで冷却後、表１に記載の抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に８ｍＬずつ分配した。次に、滅菌生理食塩水にC. difficileを懸濁し、該懸濁液をC. difficileが１×１０５ｃｆｕ程度になるように各培地に接種した。各培地を３７℃で２４時間インキュベートした。C. difficileの発育を、「黄呈色の程度」として４段階（０、赤色のまま；１、わずかに菌の塊が見られた；２、菌の塊が黄色を呈した；３、菌の塊およびその周辺の培地が黄色を呈した）で判定した。判定結果を表２に示す。
【００３８】
【表１】
2017108721.tif 000003
【００３９】
【表２】
2017108721.tif 000004
【００４０】
表２に示されるように、ジチオスレイトールの添加濃度０．０７５〜１．５ｇ／Ｌにおいて菌の塊が見られ、同濃度０．１６〜１．２ｇ／Ｌにおいて菌の塊が黄色を呈し、同濃度０．６ｇ／Ｌおよび０．９ｇ／Ｌにおいて菌の塊およびその周辺の培地が黄色を呈した。したがって、ジチオスレイトールの添加濃度は、C. difficileに対する発育支持能の観点から、０．０７５〜１．５ｇ／Ｌが好ましく、０．１６〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．６〜０．９ｇ／Ｌが特に好ましいことがわかった。
【００４１】
また、表１に記載の培地に対して、表３に記載の各濃度でアスコルビン酸を添加し、培地をそれぞれ製造した。表１に記載のペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、該溶液に各濃度でアスコルビン酸を添加した後、１２１℃で１５分間インキュベートした。５０℃まで冷却後、抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に８ｍＬずつ分配した。次に、滅菌生理食塩水にC. difficileを懸濁し、該懸濁液をC. difficileが１×１０５ｃｆｕ程度になるように各培地に接種した。各培地は３７℃で２４時間インキュベートし、C. difficileの発育を前記の４段階で判定した。判定結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
2017108721.tif 000005
【００４３】
表３に示されるように、アスコルビン酸の添加濃度０．０７５〜３．６ｇ／Ｌにおいて菌の塊が見られ、同濃度０．１６〜２．７ｇ／Ｌにおいて菌の塊が黄色を呈し、同濃度０．３２〜１．８ｇ／Ｌにおいて菌の塊およびその周辺の培地が黄色を呈した。したがって、アスコルビン酸の濃度は、C. difficileに対する発育支持能の観点から、０．０７５〜３．６ｇ／Ｌが好ましく、０．１６〜２．７ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３２〜１．８ｇ／Ｌが特に好ましいことが判明した。
【００４４】
続いて、実施例２〜４および比較例１において、それぞれ培地を製造した。
＜実施例２＞
表４に記載の培地組成を有する実施例２の培地を以下のとおり製造した。ペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、１２１℃で１５分間インキュベートした。５０℃まで冷却後、抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に８ｍＬずつ分配した。
【００４５】
【表４】
2017108721.tif 000006
【００４６】
＜実施例３＞
実施例２において、０．９ｇ／Ｌのジチオスレイトールの代わりに１．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸を用いた以外は実施例２と同様に培地を製造した。
＜実施例４＞
実施例２において、１．０ｇ／Ｌのトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに加えた以外は実施例２と同様に培地を製造した。
【００４７】
＜比較例１＞
実施例２において、０．９ｇ／Ｌのジチオスレイトールの代わりに１．０ｇ／Ｌのチオグリコール酸ナトリウムを用いた以外は実施例２と同様に培地を製造した。
【００４８】
＜比較例２＞
表５に記載の培地組成を有する比較例２の培地（非特許文献５に記載のC. difficileを好気環境下で培養するための培地）を以下のとおり調製した。ペプトン（ペプトンおよび肉ペプトン）、糖類（ブドウ糖およびマンニトール）、塩類（塩化ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウム）、寒天、還元剤（システインおよびチオグリコール酸ナトリウム）、第３発育支持剤（ビタミンＫおよびヘミン）ならびに酸塩基指示薬（ニュートラルレッド）を純水中に撹拌して溶解させ、１２１℃で１５分間インキュベートした。５０℃まで冷却後、滅菌純粋に溶解させたタウロコール酸ナトリウム（塩類）、サイクロセリンおよびセフォキシチン（抗菌剤）ならびにリゾチーム（第３発育支持剤）を添加し撹拌した。その後に蓋付きの容器に分配した。
【００４９】
【表５】
2017108721.tif 000007
【００５０】
＜各培地の保存安定性試験＞
実施例２〜４ならびに比較例１および２の培地をそれぞれ製造後に、２〜８℃で０、０．５、１、２、３または４ヶ月の各期間保存した。かかる保存の後、滅菌生理食塩水にC. difficileを懸濁し、該懸濁液をC. difficileが１×１０6ｃｆｕ程度になるように前記各培地に接種した。実施例２〜４および比較例１の培地を３７℃で２４時間インキュベートし、比較例２の培地は３７℃で７２時間インキュベートした。該インキュベート後、各培地の色および／または菌の塊の有無からC. difficileの発育の有無を判定した。
【００５１】
その結果、表６に示すとおり、０〜４ヶ月間保存した実施例２〜４の培地のいずれにおいてもC. difficileが発育した一方、０．５ヶ月間以上保存した比較例１および２の培地においてはC. difficileは発育しなかった（表６中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。したがって、実施例２〜４の培地は、製造から少なくとも４ヶ月の保存期間を経てもC. difficileの検出感度を保ち、一方、比較例１および２の培地については、製造から０．５ヶ月以上の保存期間が経つとC. difficileの検出感度が失われることがわかった。また、各培地の組成を比較すると、還元剤としてチオグリコール酸ナトリウムを使用するよりも、ジチオスレイトールもしくはアスコルビン酸、またはジチオスレイトールおよびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を使用することによって、C. difficileの検出感度を失うことなく、培地の品質保持期間を顕著に向上できることが示された。
【００５２】
【表６】
2017108721.tif 000008
【００５３】
＜各培地のC. difficile発育支持能試験＞
（１）製造直後の培地
C. difficileを滅菌生理食塩水に懸濁し、該懸濁液をC. difficile が５００、５０、５または０ｃｆｕ程度になるように製造直後の実施例２〜４ならびに比較例１および２の培地にそれぞれ接種した。実施例２〜４および比較例１の培地は３７℃で２４時間インキュベートし、比較例２の培地は３７℃で７２時間インキュベートした。該インキュベート後、各培地の色および／または菌の塊の有無からC. difficileの発育の有無を判定した。
【００５４】
その結果、表７に示すとおり、５００〜５ｃｆｕ接種した実施例２〜４および比較例１の培地のいずれにおいてもC. difficileが発育した一方、比較例２の培地についてはすべての接種菌量においてC. difficileは発育しなかった（表７中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。したがって、実施例２〜４の培地は、比較例２の培地よりも顕著に高いC. difficileの検出感度を有することが示された。また、各培地の組成を比較すると、グリシン、硫酸マグネシウム、アルギニンおよび／または亜硫酸ナトリウムがC. difficileの良好な発育支持剤として働くことが示唆された。
【００５５】
【表７】
2017108721.tif 000009
【００５６】
（２）製造後０．５ヶ月間保存した培地
実施例２〜４ならびに比較例１および２の培地をそれぞれ製造後に２〜８℃で０．５ヶ月間保存した。C. difficileを滅菌生理食塩水に懸濁し、該懸濁液をC. difficileが８００、８０、８、０ｃｆｕ程度になるように前記各培地にそれぞれ接種し、実施例２〜４および比較例１の培地は３７℃で２４時間インキュベートし、比較例２の培地は３７℃で７２時間インキュベートした。その後に培地を視認し、培地の色および／または菌の塊の有無から発育の有無を判定した。
【００５７】
その結果、表８に示すとおり、８００〜８ｃｆｕ接種した実施例２〜４の培地、においてC. difficileは発育した一方、比較例１、２の培地においてはすべての接種菌量においてC. difficileは発育しなかった（表８中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。したがって、実施例２〜４の培地は、比較例１および２の培地よりも顕著に高いC. difficileの検出感度を有することが示された。また、各培地の組成を比較すると、グリシン、硫酸マグネシウム、アルギニンおよび／または亜硫酸ナトリウムが良好なC. difficileの発育支持剤として働くことが示唆された。さらに、実施例２〜４の培地は、数ｃｆｕのC. difficileを発育せしめる性能を有することが示された。
【００５８】
【表８】
2017108721.tif 000010
【００５９】
＜実施例２および比較例２の培地の発育支持能の比較＞
C. difficileを０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で培養した後、得られたコロニーを滅菌生理食塩水に懸濁し、該懸濁液を滅菌生理食塩水にて１０倍ずつ段階希釈した。かかる希釈した懸濁液を、製造直後の実施例２の培地および比較例２の培地ならびに前記ＧＡＭ培地にそれぞれ接種した。実施例２の培地は３７℃で２０時間インキュベートし、比較例２の培地は３７℃で７２時間インキュベートし、前記ＧＡＭ培地は３７℃で嫌気環境下２４時間インキュベートし、該インキュベート後、各培地の色および／または菌の塊の有無からC. difficileの発育の有無を判定した。前記ＧＡＭ培地上に形成されたコロニー数から各接種菌量を求めた。
【００６０】
その結果、表９および図２に示すとおり、３〜３×１０６ｃｆｕを接種した実施例２の培地においてC. difficileが発育した一方で、比較例２の培地については３×１０５および３×１０６の接種菌量においてのみC. difficileが発育した（表９中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。したがって、実施例２の培地は、比較例２の培地よりも顕著に高いC. difficileの検出感度を有することが示された。また、各培地の組成を比較すると、グリシン、硫酸マグネシウム、アルギニンおよび／または亜硫酸ナトリウムがC. difficileの良好な発育支持剤として働くことが示唆された。
【００６１】
【表９】
2017108721.tif 000011
【００６２】
＜各培地における各分離菌株の発育の比較＞
分離菌株を、０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で２４時間培養した。これを滅菌生理食塩水中に、マクファーランド濁度標準液 ０．５相当になるように懸濁したものを試験菌液とした。各試験菌液は、保持液量が１０μＬ相当のディスポーザブルエーゼを用いて培地に穿刺して、製造直後の実施例２〜４および比較例１の培地に接種し、さらに対照培地として０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地に塗抹した。
【００６３】
各菌株を供試し、３７℃で、実施例２〜４の培地および比較例１は好気環境下で２４時間培養し、前記ＧＡＭ培地は嫌気環境下で２４時間培養した。目視による発育を確認した結果を表１０に示す。なお、通性嫌気性菌とは、酸素存在下または酸素非存在下において発育できる菌を指す。
【００６４】
【表１０】
2017108721.tif 000012
【００６５】
C. difficileは全ての培地において発育した一方、E. coli臨床分離株２およびE. aerogenes臨床分離株３は実施例３、比較例１および対照培地において発育した。E. coli臨床分離株２およびE. aerogenes臨床分離株３が発育した実施例２および比較例１の培地は赤色を呈したことから、C. difficileが発育した各培地が呈する黄色とは明確に区別することが可能であった。これは、E. coli臨床分離株２およびE. aerogenes臨床分離株３が発育する際に、糖類が解糖系で代謝されてピルビン酸が生成され、さらにピルビン酸が還元されて乳酸に生成されることによって培地ｐＨが中性から酸性へ変化し、酸塩基指示薬であるニュートラルレッドが赤色のまま変色しなかったことによるものと考えられる。また、ジチオスレイトールを有する実施例２および４の培地においてはE. coli臨床分離株２とE. aerogenes臨床分離株３は発育しなかったことから、ジチオスレイトールは同株に対する発育抑制能を有していることが示唆された。
【００６６】
＜実施例５＞
表１１に記載の培地組成を有する実施例５の培地を以下のとおり製造した。実施例２において、マンニトールの代わりにフルクトースを用い、ジチオスレイトールを０．９ｇ／Ｌの代わりに０．４５ｇ／Ｌ用い、さらに抗菌剤としてセフォキシチンを用いず、サイクロセリンを２５０ｍｇ／Ｌの代わりに４００ｍｇ／Ｌ用いる以外は実施例２と同様に培地を製造した。
具体的には、ペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、１２１℃で１５分間インキュベートした。その後５０℃まで冷却し、抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に８ｍＬずつ分配した。
【００６７】
【表１１】
2017108721.tif 000013
【００６８】
＜実施例６＞
実施例５において、０．４５ｇ／Ｌのジチオスレイトールの代わりに１．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸を用いた以外は実施例５と同様に培地を製造した。
＜実施例７＞
実施例５において、１．０ｇ／Ｌのトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに加えた以外は実施例５と同様に培地を製造した。
【００６９】
＜培地の保存安定性試験＞
実施例５〜７の培地をそれぞれ製造後に、２〜８℃で０、０．５、１、２、３または４ヶ月の各期間保存した。かかる保存の後、滅菌生理食塩水にC. perfringensを懸濁し、該懸濁液をC. perfringensが１×１０3ｃｆｕ程度になるように前記各培地に接種した。各培地を好気環境で２４時間インキュベートした。該インキュベート後、培地の色および／または菌の塊の有無からC. perfringensの発育の有無を判定した。
その結果、表１２に示すとおり、０〜４ヶ月間保存した実施例５〜７の培地のいずれにおいてもC. perfringensが発育した（表中、発育したものを「○」で記す）。したがって、実施例５〜７の培地は、製造から少なくとも４ヶ月の保存期間を経てもC. perfringensの検出感度を保っていることがわかった。
【００７０】
【表１２】
2017108721.tif 000014
【００７１】
＜発育支持能＞
C. perfringensをＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で培養した後、得られたコロニーを滅菌生理食塩水に懸濁し、該懸濁液を滅菌生理食塩水にて１０倍ずつ段階希釈した。かかる希釈した懸濁液を、製造直後の実施例５〜７の培地ならびに前記ＧＡＭ培地にそれぞれ接種した。実施例５〜７の培地は３７℃で２４時間インキュベートし、前記ＧＡＭ培地は３７℃で２４時間インキュベートし、該インキュベート後、培地の色および／または菌の塊の有無からC. perfringensの発育の有無を判定した。前記ＧＡＭ培地上に形成されたコロニー数から各接種菌量を求めた。
その結果、表１３に示すとおり、３〜３×１０６ｃｆｕを接種した実施例５〜７の培地においてC. perfringensが発育した（表中、発育したものを「○」で記す）。したがって、実施例５〜７の培地は、数ｃｆｕのC. perfringensを発育せしめる性能を有することが示された。
【００７２】
【表１３】
2017108721.tif 000015
【００７３】
＜分離菌株を用いた試験＞
分離菌株を、０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で２４時間培養した。これを滅菌生理食塩水中に、マクファーランド濁度標準液 ０．５相当になるように懸濁したものを試験菌液とした。各試験菌液は、保持液量が１０μＬ相当のディスポーザブルエーゼを用いて培地に穿刺して製造直後の実施例５〜７の培地に接種し、また対照培地としての０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地に塗抹した。
【００７４】
各菌株を供試し、３７℃で、実施例５〜７の培地は好気環境下で２４時間培養し、上記ＧＡＭ培地は嫌気環境下で４８時間培養した。目視による発育を確認した結果を表１４（表中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）に示す。
【００７５】
【表１４】
2017108721.tif 000016
【００７６】
＜実施例８＞
表１５に記載の培地組成を有する実施例８の培地を以下のとおり製造した。実施例２において、糖類としてマンニトールの代わりにフルクトースを用い、塩類としてタウロコール酸ナトリウムを加えず、さらに抗菌剤としてサイクロセリンおよびセフォキシチンの代わりにバンコマイシン（５ｍｇ／Ｌ）およびゲンタマイシン（２０ｍｇ／Ｌ）を用いた以外は実施例２と同様に培地を製造した。
具体的には、ペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、１２１℃で１５分間インキュベートした。その後５０℃まで冷却し、抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に８ｍＬずつ分配した。
【００７７】
【表１５】
2017108721.tif 000017
【００７８】
＜実施例９＞
実施例８において、０．９ｇ／Ｌのジチオスレイトールの代わりに１．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸を用いた以外は実施例８と同様に培地を製造した。
＜実施例１０＞
実施例８において、０．５ｇ／Ｌのトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに加えた以外は実施例８と同様に培地を製造した。
【００７９】
＜培地の保存安定性試験＞
実施例８〜１０の培地をそれぞれ製造後に、２〜８℃で０、０．５、１、２、３または４ヶ月の各期間保存した。かかる保存の後、滅菌生理食塩水にB. fragilisを懸濁し、該懸濁液をB. fragilisが１×１０3ｃｆｕ程度になるように前記各培地に接種した。各培地を３７℃で２４時間インキュベートし、培地の色および／または菌の塊の有無からB. fragilisの発育の有無を判定した。
その結果、表１６に示すとおり、０〜４ヶ月間保存した実施例８〜１０の培地のいずれにおいてもB. fragilisが発育した（表中、発育したものを「○」で記す）。したがって、実施例８〜１０の培地は、製造から少なくとも４ヶ月の保存期間を経てもB. fragilisの検出感度を保っていることがわかった。
【００８０】
【表１６】
2017108721.tif 000018
【００８１】
＜発育支持能＞
B. fragilisをＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で培養した後、得られたコロニーを滅菌生理食塩水に懸濁し、該懸濁液を滅菌生理食塩水にて１０倍ずつ段階希釈した。かかる希釈した懸濁液を、製造直後の実施例８〜１０の培地ならびに前記ＧＡＭ培地にそれぞれ接種した。実施例８〜１０の培地は３７℃で２４時間インキュベートし、前記ＧＡＭ培地は３７℃で２４時間インキュベートし、該インキュベート後、培地の色および／または菌の塊の有無からB. fragilisの発育の有無を判定した。前記ＧＡＭ培地上に形成されたコロニー数から各接種菌量を求めた。
その結果、表１７に示すとおり、９〜９×１０６ｃｆｕを接種した実施例８〜１０の培地のいずれにおいてもB. fragilisが発育した（表中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。したがって、実施例８〜１０の培地は、数ｃｆｕのB. fragilisを発育せしめる性能を有することが示された。
【００８２】
【表１７】
2017108721.tif 000019
【００８３】
＜分離菌株を用いた試験＞
分離菌株を、０．５ｇ／Ｌのタウロコール酸を添加したＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で２４時間培養した。これを滅菌生理食塩水中に、マクファーランド濁度標準液 ０．５相当になるように懸濁したものを試験菌液とした。各試験菌液は、保持液量が１０μＬ相当のディスポーザブルエーゼを用いて培地に穿刺して製造直後の実施例８〜１０の培地に接種し、対照培地としてのＧＡＭ培地に各試験菌液を塗抹した。
【００８４】
各菌株を供試し、３７℃で、実施例４〜６の培地は好気環境下で２４時間培養し、上記ＧＡＭ培地は嫌気環境下で４８時間培養した。目視による発育を確認した結果を表１８（表１８中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。に示す
【００８５】
【表１８】
2017108721.tif 000020
【００８６】
実施例１１〜１３のそれぞれにおいて、以下のようにして培地を製造した。
＜実施例１１＞
表１９に記載の培地組成を有する実施例１１の培地を以下のとおり製造した。実施例２において、マンニトールおよびタウロコール酸ナトリウムを加えず、抗菌剤としてサイクロセリンおよびセフォキシチンの代わりにバンコマイシン（５ｍｇ／Ｌ）、トリメトプリム（２．５ｍｇ／Ｌ）およびアムホテリシンＢ（５ｍｇ／Ｌ）を用い、第１発育支持剤としてさらに炭酸水素ナトリウム（１．６ｇ／Ｌ）を、第２発育支持剤としてさらに溶性デンプン（関東化学社製 製品番号：37328-01）（１．０ｇ／Ｌ）を加えた以外は実施例２と同様に培地を製造した。
具体的には、ペプトン、糖類、塩類、寒天、還元剤、発育支持剤および酸塩基指示薬を１０００ｍＬの純水中に撹拌しながら溶解させ、１２１℃で１５分間インキュベートした。その後５０℃まで冷却し、抗菌剤を添加し撹拌して溶解させた後に蓋付きの容器に１４ｍＬずつ分配した。
【００８７】
【表１９】
2017108721.tif 000021
【００８８】
＜実施例１２＞
実施例１１において、０．９ｇ／Ｌのジチオスレイトールの代わりに１．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸を用いた以外は実施例１１と同様に培地を製造した。
＜実施例１３＞
実施例１１において、０．２５ｇ／Ｌのトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩をさらに加えた以外は実施例１１と同様に培地を製造した。
【００８９】
＜培地の保存安定性試験＞
実施例１１〜１３の培地をそれぞれ製造後に、２〜８℃で０、０．５、１、２、３または４ヶ月の各期間保存した。かかる保存の後、滅菌生理食塩水にH. pyloriを懸濁し、該懸濁液をH. pyloriが１×１０5ｃｆｕ程度になるように前記各培地に接種した。実施例１１〜１３の培地は３７℃で７２時間インキュベートし、培地の濁りおよび／または菌の塊の有無からH. pyloriの発育の有無を判定した。
【００９０】
その結果、表２０に示すとおり、０〜４ヶ月間保存した実施例１１〜１３の培地のいずれにおいてもH. pyloriが発育した（表中、発育したものを「○」で記す）。したがって、実施例１１〜１３の培地は、製造から少なくとも４ヶ月の保存期間を経てもH. pyloriの検出感度を保っていることがわかった。
【００９１】
【表２０】
2017108721.tif 000022
【００９２】
＜分離菌株を用いた試験＞
H. pyloriを、ウマ溶血液を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）を用いて、微好気環境下で培養した。他の分離菌株は、ＧＡＭ培地（日水製薬社製）を用いて、嫌気環境下で２４時間培養した。これを滅菌生理食塩水中に、マクファーランド濁度標準液０．５相当になるように懸濁したものを試験菌液とした。各試験菌液は、保持液量が１０μＬ相当のディスポーザブルエーゼを用いて培地に穿刺して製造直後の実施例１１〜１３の培地に接種し、対照培地としてのウマ溶血液を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上に塗抹した。
【００９３】
各菌株を供試し、３７℃で、実施例１１〜１３の培地は好気環境下で７２時間培養し、対照培地は７２時間微好気培養した。目視による発育を確認した結果を表２１に示す（表中、発育したものを「○」で、発育しなかったものを「×」で記す）。この場合の「微好気培養」は、試験菌液を塗沫した対照培地をアネロパック（登録商標）・微好気（三菱ガス化学株式会社製）と共にアネロパック用角型ジャーに封入するという条件で行った。
【００９４】
【表２１】
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【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の培地は、還元剤としてジチオスレイトールおよび／またはアスコルビン酸を含むことによって、少なくとも４ヶ月間もの長期にわたって保存できることから、充分な品質保持期間を確保することができ、同培地を製品化して市場に流通させることができる。また、同培地を用いて偏性嫌気性菌または微好気性菌を好気環境下で培養することによって簡便に偏性嫌気性菌または微好気性菌を検出することができる。さらに、同培地に発育支持剤を添加することによって、偏性嫌気性菌または微好気性菌の検出感度を向上させ、偽陰性を防止し、疾患の原因などが偏性嫌気性菌または微好気性菌であるのか否かを正確に把握して適切な診断を行うことができる。なお、同培地を半流動培地または液体培地とすることによって、偏性嫌気性菌または微好気性菌の培養後に、偏性嫌気性菌または微好気性菌に由来する遺伝子および毒素などを様々な分子生物学的検査に供することもできる。
【図１】
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【図２】
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