(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え細胞を用いて合成ガスやメタノールからショウブノールを生産する技術の提供。【解決手段】ファルネシル二リン酸合成能を有する組換え細胞であって、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールから選ばれる少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である組換え細胞。（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸及びメタノールから選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である組換え細胞。前記組換え細胞が、合成ガス資化性菌やメチロトローフであり、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からショウブノールを生産させるショウブノールの生産方法。【選択図】図４
2017055702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファルネシル二リン酸合成能を有する組換え細胞であって、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、
一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
一酸化炭素脱水素酵素を有するものである請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
一酸化炭素と水から二酸化炭素及び水素を発生する活性を有するものである請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項５】
Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項６】
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生合成できるメチロトローフである請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項７】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項６に記載の組換え細胞。
【請求項８】
３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が発現する請求項６又は７に記載の組換え細胞。
【請求項９】
Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである請求項６〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記ショウブノール合成酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であるタンパク質からなるものである請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が発現する請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１２】
ファルネシル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路を含む請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である請求項１２に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
組換え細胞の製造方法であって、
ファルネシル二リン酸合成能を有する宿主細胞を提供する第１工程、及び、
前記宿主細胞にショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を導入する第２工程、を包含し、
前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造する組換え細胞の製造方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は、（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、
一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造する請求項１４に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項１６】
前記組換え細胞は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである請求項１４又は１５に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項１７】
前記組換え細胞は、一酸化炭素と水から二酸化炭素及び水素を発生する活性を有するものである請求項１４〜１６のいずれかに記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項１８】
前記組換え細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項１４〜１７のいずれかに記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項１９】
前記組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生合成できるメチロトローフである請求項１４に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２０】
前記組換え細胞が、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項１９に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２１】
３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とを導入する工程をさらに包含し、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現する請求項１９又は２０に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２２】
前記組換え細胞が、Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである請求項１９〜２１のいずれかに記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２３】
前記ショウブノール合成酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であるタンパク質からなるものである請求項１４〜２２のいずれかに記載の組換え細胞の製造方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を導入する工程をさらに包含し、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現する請求項１４〜２３のいずれかに記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２５】
ファルネシル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路を含む請求項２４に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２６】
メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である請求項２５に記載の組換え細胞の製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の組換え細胞又は請求項１４〜２６のいずれかに記載の方法で製造された組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からショウブノールを生産させるショウブノールの生産方法。
【請求項２８】
前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からショウブノールを取得する請求項２７に記載のショウブノールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細胞、組換え細胞の製造方法、並びに、ショウブノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セスキテルペンは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が３分子縮合したファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を生合成前駆体とする、炭素１５個を持つイソプレン則に従う化合物の総称である。セスキテルペンは、現在３０００種類以上のものが知られている。セスキテルペンはバラや柑橘類のような芳香を持ち、香水などにも多用されている。また、生理活性物質としても作用し、医薬品にも用いられている。
【０００３】
セスキテルペンの一種であるショウブノール（Shyobunol）は、香料、化粧品、医薬品およびその中間体、樹脂原料として有用である。
【０００４】
ショウブノールの生合成経路としては、以下の経路が考えられる、まず、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が生合成される。続いて、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素の作用により、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が生合成される。そして、ショウブノール合成酵素の作用によってファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からショウブノールが生合成される。ただし、現在のところショウブノール合成酵素はまだ同定されていない。
【０００５】
合成ガス（Synthesis gas, Syngas）は、廃棄物、天然ガス、及び石炭から高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。合成ガスを起点とする金属触媒によるＣ１ケミストリーの分野では、メタノール、ギ酸、ホルムアルデヒド等の液状の化学品を安価かつ大量に生産するプロセスが開発されている。
【０００６】
そして、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスに含まれており、ほぼ永久的に利用可能である。しかしながら、合成ガスをはじめとするＣ１炭素源とした、微生物による化学品生産の例は、極めて少ないのが現状である。現在のところ、開発が進んでいるのは、合成ガスからのエタノール、２，３−ブタンジオール等の生産のみである。特に、組換え体による合成ガス資化性物の利用に関する報告は少ない。特許文献１には、大腸菌の組換え体によるイソプロパノールの生産技術が開示されている。この技術では、大腸菌に複数のＣＯ代謝酵素遺伝子を導入して合成ガス資化能を付与し、合成ガスからイソプロパノールを生産している。特許文献２には、合成ガス資化性微生物から作製した組換え細胞を用いてイソプレンを生産する技術が記載されている。しかし、いずれの技術もショウブノールを生産するものではない。
【０００７】
また、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物から得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から安価に製造される。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。
【０００８】
メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。
【０００９】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
【００１０】
また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
【００１１】
特許文献３には、メチロトローフから作製した組換え細胞を用いてイソプレンを生産する技術が記載されている。しかし、この技術はショウブノールを生産するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０１１−５０９６９１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０６５２７１号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１０４２０２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記現状に鑑み、本発明は、組換え細胞を用いて合成ガスやメタノールからショウブノールを生産することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、新たに単離されたショウブノール合成酵素をコードする遺伝子を利用した、組換え細胞を用いて合成ガスやメタノールからショウブノールを生産することができる技術を構築した。
【００１５】
本発明の１つの様相は、ファルネシル二リン酸合成能を有する組換え細胞であって、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である組換え細胞である。
【００１６】
ショウブノール合成酵素は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をショウブノールに変換する作用を有する。そして本様相の組換え細胞は、ファルネシル二リン酸合成能を有するものであり、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現する。そして、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である。本様相の組換え細胞は、細胞内で合成されたファルネシル二リン酸を、ショウブノール合成酵素の作用によってショウブノールに変換することができる。すなわち、本様相の組換え細胞によれば、前記したＣ１化合物からショウブノールを生産することができる。
【００１７】
ショウブノール合成酵素の機能的断片とは、ショウブノール合成酵素の部分配列を有するポリペプチドであって、ショウブノール合成酵素の活性（ファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性）を有するものを指す。
【００１８】
ショウブノール合成酵素の具体例としては、後述するベチバー（Vetiveria zizanioides）由来のショウブノール合成酵素が挙げられる。
【００１９】
好ましくは、（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である。
【００２０】
（ｉ）又は（ｉｉ）の機能は、合成ガス資化性微生物が一般的に有しているものである。
【００２１】
好ましくは、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。
【００２２】
好ましくは、一酸化炭素と水から二酸化炭素及び水素を発生する活性を有するものである。
【００２３】
好ましくは、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である。
【００２４】
好ましくは、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生合成できるメチロトローフである。
【００２５】
本様相は、組換え細胞がメチロトローフである態様に相当する。
【００２６】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００２７】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が発現する。
【００２８】
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。
【００２９】
好ましくは、Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである。
【００３０】
好ましくは、前記ショウブノール合成酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であるタンパク質からなるものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
【００３１】
（ａ）のタンパク質は、ベチバー由来のショウブノール合成酵素である。
【００３２】
好ましくは、ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が発現する。
【００３３】
好ましくは、ファルネシル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路を含む。
【００３４】
好ましくは、メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である。
【００３５】
本発明の他の様相は、組換え細胞の製造方法であって、ファルネシル二リン酸合成能を有する宿主細胞を提供する第１工程、及び、前記宿主細胞にショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を導入する第２工程、を包含し、前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造する組換え細胞の製造方法である。
【００３６】
本様相は組換え細胞の製造方法に係るものである。本様相の組換え細胞の製造方法は、ファルネシル二リン酸合成能を有する宿主細胞を提供する第１工程と、前記宿主細胞にショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を導入する第２工程とを包含する。そして、第２工程で導入した遺伝子が宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞、を製造する。本様相によれば、前記したＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造することができる。
【００３７】
好ましくは、前記宿主細胞は、（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造する。
【００３８】
好ましくは、前記組換え細胞は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。
【００３９】
好ましくは、前記組換え細胞は、一酸化炭素と水から二酸化炭素及び水素を発生する活性を有するものである。
【００４０】
好ましくは、前記組換え細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である。
【００４１】
好ましくは、前記組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生合成できるメチロトローフである。
【００４２】
好ましくは、前記組換え細胞が、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００４３】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とを宿主細胞に導入する工程をさらに包含し、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現する。
【００４４】
好ましくは、前記組換え細胞が、Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである。
【００４５】
好ましくは、前記ショウブノール合成酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であるタンパク質からなるものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
【００４６】
好ましくは、ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する工程をさらに包含し、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現する。
【００４７】
好ましくは、ファルネシル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路を含む。
【００４８】
好ましくは、メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である。
【００４９】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞又は上記の方法で製造された組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からショウブノールを生産させるショウブノールの生産方法である。
【００５０】
本様相はショウブノールの生産方法に係るものである。本様相では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物からショウブノールを生産させる。本様相によれば、合成ガスや、メタン、メタノールからショウブノールを生産することができる。
【００５１】
好ましくは、前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からショウブノールを取得する。
【発明の効果】
【００５２】
本発明によれば、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、又はメタノールからショウブノールを生産することができる。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスや、メタノールから、組換え細胞を用いてショウブノールを生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ショウブノールの化学構造とファルネシル二リン酸からの生合成経路を表す説明図である。
【図２】実施例で用いたベチバー（Vetiveria zizanioides）の根と葉を表す写真である。
【図３】ガスクロマトグラフィーの結果を表すクロマトグラムである。
【図４】質量分析の結果を表すマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００５５】
本発明では、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を使用する。ショウブノール合成酵素の例としては、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるショウブノール合成酵素が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質。
【００５６】
配列番号１は、ベチバー（Vetiveria zizanioides）由来のショウブノール合成酵素をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列と、対応のアミノ酸配列である。配列番号２は配列番号１のアミノ酸配列のみを抜粋したものである。すなわち配列番号２は、ベチバー由来のショウブノール合成酵素のアミノ酸配列を表す。
【００５７】
本発明で用いるショウブノール合成酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質を包含する。欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の数は１〜２０個であるが、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００５８】
本発明で用いるショウブノール合成酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するタンパク質を包含する。配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性は８０％以上であるが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００５９】
本発明では、ショウブノール合成酵素の機能的断片をコードする遺伝子を用いることができる。前述のとおり、ショウブノール合成酵素の機能的断片とは、ショウブノール合成酵素の部分配列を有するポリペプチドであって、ショウブノール合成酵素の活性（ファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性）を有するものを指す。例えば、上記ショウブノール合成酵素の断片であって、かつファルネシル二リン酸をショウブノールに変換する活性を有するポリペプチドは、ショウブノール合成酵素の機能的断片である。
【００６０】
図１にショウブノールの化学構造とファルネシル二リン酸からの生合成経路を示す。本発明で用いるショウブノール合成酵素は、図１に示す反応を触媒する。
【００６１】
本発明は、ファルネシル二リン酸合成能を有する組換え細胞であって、ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である組換え細胞を包含する。
また本発明は、組換え細胞の製造方法であって、ファルネシル二リン酸合成能を有する宿主細胞を提供する第１工程、及び、前記宿主細胞にショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子を導入する第２工程、を包含し、前記遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産する組換え細胞を製造する組換え細胞の製造方法を包含する。
【００６２】
宿主細胞に導入される上記遺伝子は、宿主細胞が本来有していない遺伝子、すなわち外因性の遺伝子であってもよいし、宿主細胞が本来有している遺伝子、すなわち内因性の遺伝子であってもよい。後者は所謂セルフクローニングに該当する。
【００６３】
１つの実施形態では、組換え細胞が、（ｉ）非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能、又は（ｉｉ）メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能、を有し、かつ一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生産可能である。例えば、ショウブノール合成酵素遺伝子が導入される宿主細胞が（ｉ）又は（ｉｉ）の機能を有する。（ｉ）と（ｉｉ）の機能は、合成ガス資化性微生物が一般的に備えているものである。以下、この実施形態（第一実施形態）について詳述する。
【００６４】
一般に、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成経路は、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２つに大別される。メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【００６５】
一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
【００６６】
本実施形態で用いる組換え細胞は、さらに、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有するものであることが好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する細胞が好ましい。そのような細胞の例としては、アセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性微生物が挙げられる。
【００６７】
当該嫌気性微生物として、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)等のClostridium属細菌又はMoorella属細菌が代表例として挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明における宿主細胞として好適である。
上記５種のClostridium属細菌又はMoorella属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
【００６８】
Clostridium属細菌、Moorella属細菌以外では、Carboxydocella sporoducens sp. Nov. (Slepova TV. et al., Inter. J. Sys. Evol. Microbiol. 2006, 56, 797-800)、Rhodopseudomonas gelatinosa(Uffen RL, J. Bacteriol. 1983, 155(3), 956-965)、Eubacterium limosum (Roh H. et al., J. Bacteriol. 2011, 193(1), 307-308)，Butyribacterium methylotrophicum (Lynd, LH. Et al., J. Bacteriol. 1983, 153(3), 1415-1423)等の細菌を宿主細胞として用いることができる。
【００６９】
なお、上記した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Oligotropha carboxidovorans (Schubel, U. et al., J. Bacteriol., 1995, 2197-2203)、Bradyrhizobium japonicum (Lorite MJ. Et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(5), 1871-1876)を始め、その他のバクテリア種には酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69 (12), 7257-7265）。好気性水素酸化細菌であるRalsotonia属菌にも酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する (NCBI Gene ID: 4249199, 8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明で用いる宿主細胞を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、もしくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、もしくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００７０】
ショウブノール合成酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものであってもよい。例えば、宿主細胞がClostridium属細菌であれば、Clostridium属細菌のコドン使用頻度の情報を基に、導入する遺伝子のコドンを改変することができる。
【００７１】
本発明の組換え細胞においては、ショウブノール合成酵素遺伝子に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。１つの態様では、ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子がさらに導入されている。
【００７２】
上述のように、ショウブノールの生合成経路としては、まずゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が生合成される。続いて、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素の作用により、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が生合成される。そして、ショウブノール合成酵素の作用によってファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からショウブノールが生合成される。したがって、ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する酵素の例としては、ＧＰＰ合成酵素とＦＰＰ合成酵素がまず挙げられる。
【００７３】
ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する酵素の他の例としては、前述した、ＩＰＰの合成経路であるメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）又は非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）で作用する各酵素が挙げられる。
【００７４】
１つの実施形態では、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子がさらに導入され、メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能をさらに有する。かかる構成によれば、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方からＩＰＰが合成されるので、ＩＰＰ合成能が増強され、結果としてショウブノールの生合成がより効率的に行われる。
【００７５】
上述したように、メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。このうち、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する遺伝子を選択すればよい。これらの遺伝子についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００７６】
なお、メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、原核生物でも見出されている。原核生物でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌では、Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。
細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)。
アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）。
【００７７】
上記メバロン酸経路で作用する酵素群の由来としては特に限定はないが、酵母のメバロン酸経路で作用する酵素群が好ましい。その他、放線菌のメバロン酸経路で作用する酵素群も好ましく採用される。
【００７８】
別の実施形態では、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が細胞内で発現する。本実施形態においても、ＩＰＰ合成能が増強され、結果としてショウブノールの生合成がより効率的に行われる。導入される当該遺伝子は１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
上述したように、非メバロン酸経路で作用する酵素としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
また、非メバロン酸経路で作用する酵素は、宿主細胞以外の由来であることが好ましい。かかる構成により、反応生成物による反応抑制を避けることができる。
これらの遺伝子についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００７９】
メバロン酸経路あるいは非メバロン酸経路で作用するこれらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチド（機能的断片）でもよい。
【００８０】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子（核酸、ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００８１】
宿主細胞がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合について説明すると、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。
【００８２】
なお、Clostridium属細菌への遺伝子導入には、通常、エレクトロポレーション法が使用されるが、遺伝子導入直後の導入された外来プラスミドは制限酵素Cac824I等による分解を受けやすく極めて不安定である。そのため、Bacillus subtilis ファージΦ3T1由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子が保持されたpAN1 (Mermelstein LD et al., Apply. Environ. Microbiol. 1993, 59(4), 1077-1081)を保有する大腸菌、例えばER2275株等で、pIMP1に由来するベクターを一旦増幅し、メチル化処理を行ってから、これを大腸菌から回収しエレクトロポレーションによる形質転換に使用することが好ましい。なお最近では、Cac824I遺伝子が欠損したClostridium acetobuthylicumが開発されており、メチル化処理されていないベクターも安定的に可能である(Dong H. et al., PLoS ONE 2010, 5 (2), e9038)。
【００８３】
Clostridium属細菌における異種遺伝子発現のプロモーターとしては、例えばthl (thiolase)プロモーター(Perret S et al., J. Bacteriol. 2004, 186(1), 253-257)、Dha (glycerol dehydratase)プロモーター(Raynaud C. et al., PNAS 2003, 100(9), 5010-5015)、ptb (phosphotransbutyrylase)プロモーター (Desai RP et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(3), 936-945)、adc (acetoacetate decarboxylase)プロモーター(Lee J et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (5), 1416-1423)等がある。ただし、本発明ではこれらに限定されることなく、宿主細胞等に見出される様々な代謝系のオペロンに使用されているプロモーター領域の配列が使用可能である。
【００８４】
また、ベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数種の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、「ショウブノール合成酵素又はその機能的断片をコードする遺伝子」に加えて、「メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子」や「非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子」を導入する態様が挙げられる。
【００８５】
上記のような外来遺伝子導入に加え、突然変異やゲノムシャッフリングをさらに施すことで、ショウブノールの生産性が格段向上した菌株を育種することも可能である。
【００８６】
本発明においては、外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
【００８７】
他の実施形態では、組換え細胞が、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からショウブノールを生合成できるメチロトローフである。以下、この実施形態（第二実施形態）について詳述する。
【００８８】
上述したように、メチロトローフ（methylotroph）は、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。メチロトローフ細菌は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、メチロトローフ酵母は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
【００８９】
メチロトローフである上記組換え細胞を得るための、宿主細胞と導入遺伝子との組み合わせとしては、以下のものが挙げられる。
【００９０】
１つの例は、宿主細胞がメチロトローフであり、導入遺伝子がショウブノール合成酵素遺伝子である組み合わせである。これは最も基本的な組み合わせである。
【００９１】
宿主細胞が非メチロトローフであっても、必要な遺伝子を導入することによってメチロトローフと同様に扱うことができる。１つの組み合わせの例は、宿主細胞が非メチロトローフであり、導入遺伝子が、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、ショウブノール合成酵素遺伝子である組み合わせである。すなわち、宿主細胞が非メチロトローフであっても、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とを導入することにより、メチロトローフである組換え細胞を得ることができる。
同様の例として、宿主細胞がリブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフであり、導入遺伝子が、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ショウブノール合成酵素遺伝子である組み合わせが挙げられる。
【００９２】
メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
【００９３】
ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子としては、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を用いることができる。
【００９４】
セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
【００９５】
メチロトローフである組換え細胞においては、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase）をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase）をコードする遺伝子とをさらに有することが好ましい。かかる構成により、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。その結果、組換え細胞のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性と資化能を高めることができる。これにより、組換え細胞の培養効率やショウブノールの生産効率を高めることができる。
【００９６】
宿主細胞として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
【００９７】
メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
【００９８】
メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
【００９９】
本発明において、メチロトローフである組換え細胞は、Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものであることが好ましい。
【０１００】
第二実施形態においても、ショウブノール合成酵素遺伝子をはじめとした上記遺伝子に加えて、さらに他の遺伝子が導入されていてもよい。例えば、１つの態様では、ファルネシル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子がさらに導入されている。当該酵素としては、第一実施形態と同様に、ＧＰＰ合成酵素、ＦＰＰ合成酵素、メバロン酸経路で作用する各酵素、非メバロン酸経路で作用する各酵素が挙げられる。
【０１０１】
第二実施形態においても、宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
【０１０２】
例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４−２２９６６２号公報）。一般に、宿主細胞による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
【０１０３】
メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
【０１０４】
Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
【０１０５】
本発明は、上記の組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からショウブノールを生産させるショウブノールの生産方法を包含する。
【０１０６】
好ましくは、前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からショウブノールを取得する。炭素源として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素源として用いることが好ましく、唯一の炭素源であることがより好ましい。
また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に提供することが好ましい。
【０１０７】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。例えば、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
【０１０８】
組換え細胞がClostridium属細菌（絶対嫌気性）の場合には、例えば、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養する。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【０１０９】
組換え細胞に前記のＣ１化合物を単に接触させて、ショウブノールを生産させることもできる。例えば、固定化した組換え細胞に前記Ｃ１化合物を連続的に供給し、ショウブノールを連続的に生産させることができる。本実施形態においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に接触させることが好ましい。
【０１１０】
好ましい実施形態では、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、あるいは二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。すなわち、これらのガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、これらのガスを組換え細胞に接触させて、ガス中の一酸化炭素又は二酸化炭素からショウブノールを生産させる。この場合も、水素はエネルギー源として使用される。
【０１１１】
ギ酸及び／又はメタノールを組換え細胞に提供し、ギ酸及び／又はメタノールからショウブノールを生産することもできる。すなわち、一酸化炭素や二酸化炭素に加えて、もしくは単独で、ギ酸やメタノールを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、ギ酸やメタノールを組換え細胞に接触させることにより、ギ酸やメタノールからもショウブノールを生産することができる。
【０１１２】
組換え体が生合成したショウブノールは、組換え細胞の細胞外に放出されるか、細胞内に蓄積される。本発明においては、いずれのショウブノールを回収してもよく、具体的には、菌体破砕物、培養液（培養上清）、培養系の気相などから回収することができる。好ましくは、細胞外に放出されたショウブノールを回収し、具体的には、培養液（培養上清）や培養系の気相から回収する。
【０１１３】
組換え細胞が偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、ショウブノール生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％(ｖ/ｖ)濃度、酵母の場合は３．０％（v/v）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
【０１１４】
ここで、組換え細胞がアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）を有する場合において、組換え細胞に提供され得る一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールの組み合わせについて説明する。
【０１１５】
アセチルＣｏＡ経路によるアセチルＣｏＡ合成では、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、Corrinoid iron-sulfur protein (CoFeS-P)、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、及びＣＯＤＨの作用による、ＣｏＡ、メチルテトラヒドロ葉酸（methyltetrahydrofolate、［ＣＨ3］−ＴＨＦ)、及びＣＯからのアセチルＣｏＡの合成過程が必須である（Ragsdale SW et al., B.B.R.C. 2008, 1784(12), 1873-1898）。
【０１１６】
一方、Butyribacterium methylotrophicumの培養において、炭素源としてＣＯやＣＯ2以外にギ酸やメタノールを添加することは、ＣＯ代謝すなわち、アセチルＣｏＡ経路のMethyl branchにおけるテトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate）含量、及び、ＣＯ代謝で必要とされるＣＯＤＨ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase、ＦＤＨ）及びヒドロゲナーゼ（hydrogenase）の活性を増大させることが知られている（Kerby R. et al., J. Bacteriol. 1987, 169(12), 5605-5609）。Eubacterium limosum等においても、嫌気条件下ＣＯ2及びメタノールを炭素源とした場合でも、高い増殖を得ることが示されている（Genthner BRS. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53(3), 471-476）。
【０１１７】
これらのメタノールの合成ガス資化性微生物へ影響、及びMoorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticum）及びClostridium ljungdahlii等のゲノム解析(Pierce E. et al., Environ. Microbiol. 2008, 10(10), 2550-2573; Durre P. et al., PNAS 2010, 107(29), 13087-13092)の結果から、これらの微生物種では、図１に示されるようなメタノール経路（methanol pathway）がアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）にメチル基のドナーとして関与することが説明できる。
【０１１８】
また実際に、いくつかのClostridium属菌ではギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）(ＥＣ １．２．１．２／１．２．１．４３：Formate＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ⇔ ＣＯ2＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の正方向の活性（FormateからのＣＯ2形成）が確認されている（Liu CL et al., J. Bacteriol. 1984, 159(1), 375-380; Keamy JJ et al., J. Bacteriol. 1972, 109(1), 152-161)。このことから、これらの株ではＣＯ2やＣＯが欠乏状態にある場合、部分的にメタノール（ＣＨ3ＯＨ）やギ酸（ＨＣＯＯＨ）からＣＯ2の生成方向の反応が働くことができる（図１）。このことは、前述したＣＨ3ＯＨを加えることによる、ギ酸ヒドロゲナーゼ（formatede hydrogenase）活性、及びＣＯＤＨの活性増大の現象 (Kerby R et al., J. Bateriol. 1987, 169(12), 5605-5609)からも説明できる。すなわち、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）もしくはメタノール（ＣＨ3ＯＨ）を唯一の炭素源としても増殖可能である。
【０１１９】
宿主細胞が、元々、ギ酸デヒドロゲナーゼの正方向の活性を有しない株であっても、変異導入、外来遺伝子導入、もしくはゲノムシャッフリングのような遺伝子改変によって、正方向の活性を付与させればよい。
【０１２０】
以上のことから、組換え細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有している場合には、以下のガスや液体を用いて、ショウブノールを生産することができる。
・ＣＯ
・ＣＯ2
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
・ＣＨ3ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
【０１２１】
なお、本発明の組換え細胞について、ショウブノール生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的で培養する場合には、上記Ｃ１化合物（一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、メタン、又はメタノール）を炭素源として用いる必要はない。例えば糖類やグリセリンといった他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
【０１２２】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２３】
本実施例では、ベチバー由来ショウブノール合成酵素遺伝子の塩基配列を決定し、当該遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してショウブノールの生合成を行った。
【０１２４】
（１）ベチバーの転写産物解析およびショウブノール合成酵素遺伝子（VzTPS1）の塩基配列決定
ベチバー（Vetiveria zizanioides）の根および葉組織（図２）を切り取り、液体窒素にて凍結した。ビーズ式破砕装置（FastPrep 24、ＭＰバイオメディカルズ社製）およびFastRNA Pro Green Kit（ＭＰバイオメディカルズ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡについて、Agilent 2100 バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社製）およびAgilent RNA6000ナノキット（アジレント・テクノロジー社製）を用いてRNA Integrity Number（ＲＩＮ）によりＲＮＡ品質を定量的に評価し、ＲＩＮ＝８以上のサンプルを以降の実験に供した。
【０１２５】
根および葉より取得した全ＲＮＡのうち各５μgを北海道システムサイエンス社に提供し、ＲＮＡシーケンス解析、シーケンスデータ混合アセンブル、およびBlastXによる相同性検索を行った。シーケンスおよび混合アセンブルの結果、177,472のコンティグ配列を取得した。これらを相同性検索した結果、Zea maysのterpene synthase 7（Genbank accession DAA38747）と５４％、Aegilops tauschiiの(+)-delta-cadinene synthase（Genbank accession EMT11542）と５２％の相同性を示す遺伝子断片（配列番号１）を見出した。この遺伝子断片をVzTPS1と命名した。VzTPS1は、１５２１ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、５０６アミノ酸残基、分子量５８．３ｋＤａ、およびｐＩ＝５．８と推定されるタンパク質をコードしていた。VzTPS1の推定アミノ酸配列（配列番号２）中には、RxR 、DDxxDといった、多くのテルペン合成酵素に保存されているモチーフが含まれていた。またVzTPS1のＮ末端アミノ酸配列には、色素体移行配列が含まれないことが予想された。
【０１２６】
（２）ショウブノール合成酵素遺伝子（VzTPS1）発現プラスミド（pVzTPS1）の作製
VzTPS1の推定アミノ酸配列（配列番号２）をGenScript社に提供し、大腸菌コドン使用頻度に最適化したVzTPS1遺伝子を人工合成により作製した（配列番号３）。この際、開始メチオニンコドンＡＴＧを含むように制限酵素ＮｄｅＩ認識配列を５’末端に付加し、終止コドン直下に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を付加した。作製した人工合成遺伝子を含むプラスミドをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をpRSFDuet-1プラスミド（Novagen社製）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位に連結した。このプラスミドをpVzTPS1と命名した。
【０１２７】
（３）プラスミドpVzTPS1を用いた大腸菌発現系によるショウブノールの合成
pVzTPS1プラスミドは、Harada H, Yu F, Okamoto S, Kuzuyama T, Utsumi R, Misawa N 2009, 81: 915-925、に記載の方法に従ってｐＡＣ−Ｍｅｖプラスミドと共に大腸菌に導入し、ドデカンを添加した液体培地にて培養、生産および生産物の抽出を行った。抽出したドデカン層１μＬをガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）にて分析を行った結果、pVzTPS1プラスミドを導入した大腸菌由来のサンプルにおいて、対照となるｐＲＳＦＤｕｅｔ−１を導入した大腸菌由来サンプルには見られない新規ピークが複数出現した（図３）。このうち最も大きい保持時間３７．５分のピーク（図２、ピーク１）についてマススペクトル解析を行った結果、このピークがショウブノールのスペクトルと一致することが示された（図４）。
以上の結果より、VzTPS1はファルネシル二リン酸を基質としてショウブノールを特異的に合成する酵素の遺伝子であることが示された。
【実施例２】
【０１２８】
ＭＶＡ経路遺伝子及びショウブノール合成酵素遺伝子が導入された、セリン経路を有するメチロトローフの作製と、組換え体によるメタノールからのショウブノール生産
【０１２９】
本実施例では、セリン経路を有するメチロトローフとしてMethylobacterium extorquens (ATCC 55366)を使用し、本株へVzTPS1遺伝子及び放線菌由来のメバロン酸経路遺伝子クラスタを導入することで、ショウブノールを生産する組換えメチロトローフを作製した。
【０１３０】
実施例１で作製したpVzTPS1プラスミドを鋳型とし、配列番号４と配列番号５で表されるプライマーを使用して、ベチバー由来VzTPS1遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、pT7VzTPSを構築した。
放線菌Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola)のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６と配列番号７で表されるプライマーを使用したＰＣＲによって、S. griseolosporeusのメバロン酸経路酵素群をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号８）を増幅した。このＤＮＡ断片には、Mevalonate kinase、Mevalonate diphosphate decarboxylase、Phosphomevalonate kinase、IPP isomerase、HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR)、及びHMG-CoA synthaseをコードする遺伝子クラスタが含まれている。得られた増幅ＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、pT7SMVAを構築した。
【０１３１】
pT7VzTPSよりＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩによってVzTPS1遺伝子を切り出し、広宿主域ベクターであるｐＣＭ８０(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、pC80VzTPSを作製した。pT7SMVAをＫｐｎＩで切断することによって放線菌ＭＶＡ経路遺伝子及びターミネーター配列を含む断片を切り出し、これをpC80VzTPSのＫｐｎＩサイトへ導入し、pC80VzTPSMVAを構築した。発現ベクターpC80VzTPSMVAは、プロモーター下流にVzTPS１遺伝子及び放線菌ＭＶＡ経路酵素遺伝子群を有する。発現ベクターpC80VzTPSMVAをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ME-VzTPSMVA株を得た。コントロールとして、発現ベクターpCM80をエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ME-CM80株を得た。
【０１３２】
ME-VzTPSMVA株又はME-CM80株を、メタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、及びテトラサイクリン１０ｍｇを含む。）２０ｍＬにて、好気的に３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収した全菌体を２０％ドデカン含有の上記合成Ｂ培地４５ｍＬに加え、ブチルゴム栓によって封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中にて３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、ドデカン相を回収し、成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。ＧＣ／ＭＳはGCMS-QP2010Ultra（島津製作所）、カラムはDB-WAX（Agilent Technologies）を用いた。
【０１３３】
その結果、ME-VzTPSMVA株でME-CM80株に比べ、ショウブノールが有意に検出された。以上のことから、セリン経路を有するメチロトローフへ、ＭＶＡ経路遺伝子及び、ショウブノール合成酵素遺伝子を導入することによって、メタノールからの効率的なショウブノールの生産が可能であることが示された。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【配列表】
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