(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚または毛髪のメラニン合成の調節に関する、より具体的には、チロシナーゼの活性を修飾する組成物および方法の提供。【解決手段】皮膚または毛髪をメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（PPT）阻害剤で処理し、メラニンの山現を低下を必要とする哺乳動物の膚又は毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法。少なくとも、１種のＰＰＴ阻外剤が、１種以上のパミルトイル化アミノ酸を含有する１種以上のアミノ酸を用いる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニンの出現の増加を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を増加させる方法であって、該皮膚または毛髪をメラニン増加有効量の少なくとも1種のDHHC2、3、7、15、6、11、17、21、または22阻害剤で処理するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも1種の阻害剤が2-BPである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
皮膚または毛髪をメラニン低下有効量の少なくとも1種のPPT阻害剤で処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法。
【請求項４】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤が、少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも1種の阻害剤がPP1を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1種の阻害剤がPP2を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
皮膚または毛髪をメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドで処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法。
【請求項８】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドが、少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP1を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP2を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を増加させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン増加有効量の少なくとも1種のDHHC2、3、7、15、6、11、17、21、または22阻害剤を含む、前記組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも1種の阻害剤が2-BPである、請求項１１に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１３】
哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の少なくとも1種のPPT阻害剤を含む、前記組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤が少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドを含む、請求項１３に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤がPP1を含む、請求項１４に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤がPP2を含む、請求項１４に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１７】
哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドを含む、前記組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP1を含む、請求項17に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP2を含む、請求項17に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項２０】
付加的な美白活性物質をさらに含む、請求項17に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、2012年12月20日に出願された米国仮出願第61/740,048号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、メラニン合成の調節に関する。より具体的には、本発明は、チロシナーゼの活性を修飾する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術の説明
ヒトの皮膚および毛髪の色素沈着は、世界中の人々の関心事である。一部の例では、上記の願望は、全体的に見てより明るい顔貌を有することである。最も一般的には、人々は、ベースの色に関わらず均一な肌色を有することを望む。全ての人々は、老化の兆候である白髪の出現を遅らせることを望む。
【０００４】
皮膚および毛髪の色素沈着は、メラノサイトと呼ばれる専門の細胞によって制御される。メラノサイトは、その中にメラノソームと呼ばれる細胞小器官を含有し、これがメラニンの形態(黒色ユーメラニンおよび赤色フェオメラニンなど)を産生し、その後メラノサイトがメラニンを皮膚または毛髪中に分配する。メラニンの生合成において最も重要な酵素はチロシナーゼであり、その阻害は、皮膚色を明るくするように設計された大半の市販製品の注目点であった。
【０００５】
チロシナーゼは、リボソームで合成され、ゴルジ体を通ってプレメラノソームに輸送され、その後プレメラノソームに取り込まれる金属タンパク質である。プレメラノソームが成熟すると、チロシナーゼの補因子として銅分子も取り込まれ、pHが上昇して上記酵素にとっての至適pHに達する。その後、成熟メラノソームはメラニンを合成し始める。
【０００６】
チロシナーゼの輸送は、十分には理解されていない。近年、タンパク質のパルミトイル化が、哺乳動物タンパク質の細胞内局在の機構として注目されている(T. Iwanaga, R. Tsutsumi, J. Noritake, Y. Fukata, M. Fukata “Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling, Progress in Lipid Research 48：117-127頁, 2009年；C. Salaun, J. Greaves, L. Chamberlain “The intracellular dynamic of protein palmitoylation” J. Cell Biol. 191：1229-1238頁, 2010年；C. Aicart-Ramos, R. Valero, I. Rodrigues-Crespo “Protein palmitoylation and subcellular trafficking” Bioch. Biophys. Acta 1808：2981-2994頁、2011年において概説されている)。これらの概説のいずれにおいても、チロシナーゼはパルミトイル化の標的として開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Iwanaga, R. Tsutsumi, J. Noritake, Y. Fukata, M. Fukata “Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling, Progress in Lipid Research 48：117-127頁, 2009年
【非特許文献２】C. Salaun, J. Greaves, L. Chamberlain “The intracellular dynamic of protein palmitoylation” J. Cell Biol. 191：1229-1238頁, 2010年
【非特許文献３】C. Aicart-Ramos, R. Valero, I. Rodrigues-Crespo “Protein palmitoylation and subcellular trafficking” Bioch. Biophys. Acta 1808：2981-2994頁 2011年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の1つの態様によれば、メラニンの出現の増加を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を増加させる方法であって、皮膚または毛髪を1種以上のDHHC2、3、7、15、6、11、17、21、または22阻害剤で処理するステップを含む、前記方法が提供される。
【０００９】
本発明の第2の態様によれば、皮膚または毛髪を1種以上のPPT型酵素阻害剤で処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法が提供される。
【００１０】
本発明の第3の態様によれば、皮膚または毛髪を少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドで処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法が提供される。
【００１１】
本発明の第4の態様によれば、哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を増加させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン増加有効量の1種以上のDHHC2、3、7、15、6、11、17、21、または22阻害剤を含む、前記組成物が提供される。
【００１２】
本発明の第5の態様によれば、哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の1種以上のPPT型酵素阻害剤を含む、前記組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第6の態様によれば、哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドを含む、前記組成物が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様および目的は、以下の説明および特許請求の範囲からさらに明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、タンパク質パルミトイル化のサイクルの模式図である。
【００１６】
【図２】図2Aおよび2Bは、パルミトイル化阻害剤(2-BP)がチロシナーゼパルミトイル化に与える影響を示す。
【００１７】
【図３】図3Aおよび3Bは、2-BPがNHEMおよび再構成ヒト皮膚モデルにおけるメラニン合成に与える影響を示す。
【００１８】
【図４】図4Aおよび4Bは、2-BPがチロシナーゼのmRNA発現およびグリコシル化に与える影響を示す。
【００１９】
【図５】図5Aおよび5Bは、2-BPがチロシナーゼの分解に与える影響を示す。
【００２０】
【図６】図6は、2-BPがチロシナーゼのユビキチン化に与える影響を示す。
【００２１】
【図７】図7は、2-BPがチロシナーゼパルミトイル化に与える影響を示す。
【００２２】
【図８】図8は、DHHC(パルミトイル化)ファミリーのタンパク質の図である。
【００２３】
【図９】図9は、チロシナーゼ特異的DHHCのスクリーニングの結果を示す。
【００２４】
【図１０】図10Aおよび10Bは、DHHC2、3、7および15のサイレンシングがMNT-1細胞におけるチロシナーゼパルミトイル化に与える影響を示す。
【００２５】
【図１１Ａ】図11Aは、NHEMにおけるDHHC2、3、7および15-mycの細胞内局在の分析を示す。
【図１１Ｂ】図11Bは、NHEMにおけるDHHC2、3、7および15-mycの細胞内局在の分析を示す。
【００２６】
【図１２】図12Aおよび12Bは、ヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位を示す。
【００２７】
【図１３Ａ】図13Aは、ヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位を示す。
【００２８】
【図１３Ｂ】図13Bは、ヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位を示す。
【００２９】
【図１４】図14A〜14Dは、PP-2およびKAがNHEMにおけるメラニン合成に与える影響を示す。
【００３０】
【図１５】図15は、PP-2およびKAがin vitroにおけるヒトチロシナーゼ(DOPA酸化)活性に与える影響を示す。
【００３１】
【図１６】図16は、PP-2がNHEMにおけるチロシナーゼタンパク質に与える影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の好ましい実施形態の詳細な説明
タンパク質のパルミトイル化またはSアシル化は、多くのタンパク質の局在および活性に影響を与える可逆的翻訳後脂質修飾である。図1に模式的に示されるとおり、パルミトイル化は、パルミトイルアシルトランスフェラーゼ(PAT)によって達成される、パルミチン酸基をタンパク質のシステイン残基に結合させる酵素的過程である。PATはDHHCドメイン(アスパラギン酸-ヒスチジン-ヒスチジン-システインシグネチャーモチーフ)を共有し、哺乳動物細胞においては、各々が独自の基質特異性を有する23個または24個の別個のDHHC含有タンパク質が存在する。DHHC含有タンパク質の標的のコンセンサス配列は、それがシステインを含有するということ以外には知られていない。多数のタンパク質がパルミトイル化されるが、そのリストは未だに完全ではない。DHHC含有タンパク質は主にゴルジ膜中に局在し、ここでこれらのタンパク質は、それら標的タンパク質の合成の直後のパルミトイル化により標的タンパク質の再配置を引き起こす。
【００３３】
パルミトイル化は、細胞質ゾル中に普遍的に存在するアシルタンパク質チオエステラーゼ(APT)およびパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ(PPT)により酵素的に可逆的である。哺乳動物細胞には数種類のAPTが存在するが、PPTは2種しか存在しないと考えられる。パルミトイル化タンパク質はゴルジ体から輸送され、エンドソーム、リソソームまたは細胞膜に付着する。再配置の結果として、パルミトイル化タンパク質は分解される(例えばリソソーム中で)こともあれば、PPTの基質となり、それらの局在を変化させさらに/またはゴルジ体に戻って再パルミトイル化され得る。このようにして、DHHC PATおよびAPT/PPTの相対活性が、タンパク質がゴルジ体の近くにより集中しているかまたはエンドソームもしくは細胞膜に分散しているかの局在を決定する。上記の系は動的であり、タンパク質は常に行ったり来たりして、分解されている。
【００３４】
パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ(PPT1)阻害剤は、Dawsonらにより記載されている(Dawson, G., Schroeder, C., Dawson, P., Palmitoyl:protein thioesterase (PPT1) inhibitors can act as pharmacological chaperones in infantile Batten Disease. Bioch. Biophys. Res. Comm. 395：66-69頁, 2010年)。親油性フルオロフォアNBDのN末端付加を有する阻害剤、CS38(NBD-βAGDap(Pal)VKIKK)は、Dap1(AcGDap(Pal)VKIKK)よりも3倍優れた阻害剤であった。CS38は、2μMのIC50を有する最も強力なペプチド阻害剤であった。標準チオール(CS8：GGC(Pal) VKIKK)のNBD型は、CS38と同程度の阻害活性を有していた。細胞内取り込みを促進するように設計されたTAT様ポリアルギニン(R7)テール(AcGDap(Palm)GGR7)を有する付加ペプチドもまた、強力なPPT1阻害剤(例えばAcGDap(Pal)GG)R)7)であった。VKIKKの任意の切断は、阻害活性を除去した。APTの阻害は、メラニン形成の遮断においてはるかに効果が低かった。
【００３５】
メラニン形成におけるパルミトイル化の役割については実質的には何も知られていない。メラニン形成に影響を与える遺伝子のゲノムワイドスクリーニングにおいて、遺伝子ZDHHC9が、siRNAで阻害するとメラニン形成を低下させる遺伝子として同定された(A. Ganesan, H. Ho, B. Bodemann, S. Petersen, J. Aruri, S. Koshy, Z. Richardson, L. Le, T. Krasieva, M. Roth, P. Farmer, M. White “Genome-wide siRNA functional genomics of pigmentation identifies novel genes and pathways that impact melanogenesis in human cells”。PLOS Genetics 4(12)：e1000298, doi：10.1371/journal.pgen.1000298, 2008年)。このPATに対するsiRNAは、MITF(小眼球症関連転写因子)RNAおよびチロシナーゼタンパク質蓄積を阻害した。チロシナーゼタンパク質のsiRNA阻害は、リソソームのpHを上昇させてタンパク質分解を阻害するバフィロマイシンと共にインキュベーションすることによって逆転された。著者らは、彼らのスクリーニング法によって、メラノソーム輸送/メラノソームタンパク質カーゴの選別に影響を与える新規な遺伝子が同定されることを示唆している。しかし、著者らは、パルミトイル化の阻害がメラニン形成を低下させるはずであると暗示している。実際は、本発明において明らかにされたように、パルミトイル化の一般的な阻害はメラニン形成を増加させ、またPAT DHHC9はチロシナーゼの特異的修飾因子ではない。
【００３６】
Wuらは、メラノレグリン(パルミトイル化形態でメラノサイトからケラチノサイトへのメラニンの移行を妨げるタンパク質)のパルミトイル化について研究した(X. Wu, J. Martina, J. Hammer “Melanoregulin is stably targeted to the melanosome membrane by palmitoylation” Bioch. Biophys. Res. Comm. 426：209-214頁)。パルミトイル化は、メラノレグリンタンパク質をメラノソームに局在化させ、これによりメラノサイトからのメラニンの移動を阻害する。メラノレグリンのパルミトイル化の阻害が、リソソーム、さらに推測によればメラノソームにおけるその蓄積を低下させることが観察された。Wuらは、メラニン形成またはチロシナーゼに関する証拠は全く示していない。
【００３７】
本発明は、チロシナーゼのパルミトイル化/脱パルミトイル化がメラニン形成において役割を果たすという本発明者らによる驚くべき発見にある。より具体的には、本発明者らは、メラノサイトにおけるPAT(パルミトイルアシルトランスフェラーゼまたはDHHC)によるチロシナーゼのパルミトイル化が、メラノソームからのチロシナーゼの輸送を引き起こし、皮膚および毛髪においてメラニンの出現の低下をもたらすことを発見した。本発明者らは、メラノソームから離れるチロシナーゼの改変された局在が、その分解につながると理論付けた。さらに、チロシナーゼパルミトイル化の阻害、すなわちPATの阻害が、恐らくはメラノソームにおけるチロシナーゼの保持、ならびに皮膚および毛髪におけるメラニンの出現の増加をもたらす。PATを阻害する化合物としては、2-ブロモパルミテート(2-BP)が挙げられる。以下の実施例に示されるとおり、本発明者らは、チロシナーゼパルミトイル化に関与するPATはDHHC2、3、7および15であると決定したが、他方、DHHC6、11、17、21および22は弱い親和性を示し、またDHHC9はチロシナーゼをパルミトイル化するとは考えられない。さらに、システイン500をアラニンに変異させるとチロシナーゼのパルミトイル化が遮断されたため、チロシナーゼはこのアミノ酸上でパルミトイル化されることが確認された。
【００３８】
本発明者らはさらに、以下の実施例に示されるとおり、チロシナーゼの脱パルミトイル化に関与するPPT(パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ)の阻害が、チロシナーゼの分解の増加ならびに皮膚および毛髪におけるメラニンの出現の減少をもたらすことを発見した。PPTは、パルミトイル化ペプチド；すなわち、パルミトイル化アミノ酸を含有するペプチドによって阻害される。本発明の目的に有用な代表的なペプチドとして、パルミトイル化ペプチド-1すなわちPP1(100ppmのパルミトイル化ヘキサペプチド(パルミトイル-val-gly-val-ala-pro-glu)を含有する、ポリメタクリル酸グリセリル(および)PEG-8(および)パルミトイルオリゴペプチド、Sederma社からBiopeptide ELとして入手可能)、ならびにパルミトイル化ペプチド2すなわちPP2(アルギニン、ヒスチジン、およびフェニルアラニンからなる500ppmのパルミトイル化トリペプチドを含有する、水(および)ブチレングリコール(および)デキストラン(および)パルミトイルトリペプチド-8、Lucas Meyer Cosmetics社からNeutrazenとして入手可能)が挙げられる。
【００３９】
DHHC、PPTおよび/またはAPTの阻害剤は、単独で、あるいは他の色素沈着の阻害剤または促進剤(例えばヒドロキノン、コウジ酸など)と組み合わせて使用してもよい。これらの阻害剤は、他の化粧品的にまたは皮膚科学的に有用な化合物(例えばサンスクリーン剤、抗炎症剤、ビタミンAおよびその誘導体、ビタミンCおよびその誘導体ならびに他のビタミン、微量鉱物および栄養素)と組み合わせることができる。上記の阻害剤は、皮膚への一般的な送達形態(例えばエマルション、ローション、クリーム、セラム、ハイドロゲル、ポリマー、シリコーンなど)と混合してもよい。上記の阻害剤は、香料、抗菌化合物、保存剤および抗酸化剤と組み合わせることができる。
【実施例】
【００４０】
実施例1−パルミトイル化阻害剤2-BPがチロシナーゼパルミトイル化に与える影響
正常ヒト表皮メラノサイト(NHEM)を、2-ブロモパルミテート(2-BP)と共に24時間インキュベートし、全チロシナーゼを、マウスモノクローナル抗チロシナーゼIgG抗体T311(1：120希釈)を使用したウェスタンブロット(WB)により測定した。全チロシナーゼタンパク質レベルを、チューブリンにより正規化した。パルミトイル化チロシナーゼを、アシル-RACおよびWBによって評価した。図2Aおよび2Bに示される結果は、3回の測定値の平均±SEである。*p<0.05vs. DMSO。
【００４１】
NHEMを様々な濃度の2-BP（パルミトイル化阻害剤）と共にインキュベーションし、DMSO対照と比較したところ、1細胞当たりのチロシナーゼタンパク質の全量の統計的に有意な増加がもたらされた。さらに、全タンパク質の量は増加したが、パルミトイル化チロシナーゼの量は減少した。
【００４２】
実施例2−2-BPがNHEMおよび再構成ヒト皮膚モデルにおけるメラニン合成に与える影響
NHEMを、指示濃度の2-BPで48時間処理した。メラニン含有量(クローズドバー)および細胞数(オープンバー)を測定した。値は、3回の測定値の平均±SEである。*p<0.05 vs. DMSO。細胞ペレットの巨視的写真をデジタルカメラで撮影した(図3A)。再構成ヒト皮膚モデル(アジア種)を、25μMの2-BPと共に17日間インキュベートした。ユーメラニン(EM)およびフェオメラニン(PM)含有量を測定し、以下の式によって計算した。EM=PTCA*25、PM=4-AHP*9。値は3回の測定値の平均±SEである。*p<0.05 vs. DMSO。17日後のヒト皮膚モデルの巨視的写真をデジタルカメラで撮影した(図3B)。
【００４３】
NHEMを様々な濃度の2-BPと共にインキュベーションし、DMSO対照と比較したところ、1細胞当たりのメラニン含有量の統計的に有意な増加がもたらされた。さらに、ヒト皮膚モデルを2-BPと共にインキュベートすると、同様に組織の全メラニン：ユーメラニン(EM)およびフェオメラニン(PM)含有量の統計的に有意な増加がもたらされた。
【００４４】
実施例3−2-BPがチロシナーゼのmRNA発現およびグリコシル化に与える影響
NHEMを、2-BPと共に6時間または24時間培養した。チロシナーゼmRNAレベルを、リアルタイム定量PCRにより分析した。示される結果は、3回の測定値の平均±SEである。*p<0.05 vs. DMSO(図4A)。NHEMを、5μMの2-BPと共に24時間インキュベートした。チロシナーゼの成熟形態および未成熟形態に対するエンドHによるグリコシダーゼ消化処理およびWB分析は、WBにより行った(図4B)。NHEMを2-BPと共にインキュベーションすると、チロシナーゼmRNA発現の減少がもたらされるが、チロシナーゼのグリコシル化には影響を与えないことが観察された。
【００４５】
実施例4−2-BPがチロシナーゼの分解に与える影響
NHEMを、1μg/mlのシクロヘキシミド(タンパク質合成阻害剤)を用いて、さらに10μMの2-BPを用いて(■)または用いずに(◇)4時間処理した。チロシナーゼレベルを、マウスモノクローナル抗チロシナーゼIgG抗体T311(1：120希釈)を用いてWBにより分析した。チロシナーゼのバンド強度を、各条件の内部対照としてのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のバンド強度により正規化した。示される結果は、3回の測定値の平均±SEである。*p<0.05 vs. DMSO(図5Aおよび5B)。
【００４６】
図に示されるとおり、NHEMをシクロヘキシミド(タンパク質合成阻害剤)で処理すると、チロシナーゼレベルが低下する。しかし、インキュベーション培地における2-BPの付加的な存在はシクロヘキシミドの影響を抑制し、2-BPがチロシナーゼの分解を抑制することを示している。
【００４７】
実施例5−2-BPがチロシナーゼのユビキチン化に与える影響
NHEMを、5μMの2-BPで24時間処理した。等タンパク質量の細胞溶解物をチロシナーゼによるIPのために使用し、チロシナーゼのユビキチン化(UB)レベルを、抗UB抗体を用いるWBにより分析した。
【００４８】
図6に示される結果は、2-BPがチロシナーゼのユビキチン化に影響を与えないことを示す。このため、図7に模式的に示されるとおり、2-BPはチロシナーゼ分解を抑制してメラニン合成の活性化をもたらすが、ユビキチンプロテアソーム系はこの現象に関与しないことが観察された。
【００４９】
実施例6−チロシナーゼ特異的DHHCのスクリーニング
本明細書中上記に示されるとおり、PATはDHHCリッチドメインを共有し、遺伝的に保存されたDHHCファミリータンパク質にクラスター化することができる(Tsutsumi R, Fukata Y, Fukata M“Discovery of protein-palmitoylating enzymes”, Eur J Physiol. 2008年9月;456(6):1199-206頁)。これは図8に模式的に示される。これらのDHHCのうちの何れがチロシナーゼパルミトイル化に関与しているかを明らかにするため、HEK293T細胞にチロシナーゼおよび個々のDHHCをトランスフェクトした。[3H]パルミテートで代謝標識した後、タンパク質をSDS-PAGEにより分離した(図9)。上のパネルは抗チロシナーゼ抗体によるWBを示し；下のパネルはオートラジオグラフを示す。DHHC3、7、15はチロシナーゼパルミトイル化に対してそれぞれ強い影響を示し、またDHHC2、6、11、17、21、22はそれぞれ弱い影響を示す。
【００５０】
実施例7−DHHC2、3、7および15のサイレンシングがMNT-1細胞におけるチロシナーゼパルミトイル化に与える影響
DHHC2、3、7および/または15がチロシナーゼパルミトイル化に関与しているか否かを評価するため、本発明者らは、DHHC2、3、7または15のノックダウンがチロシナーゼに与える影響を評価した。MNT-1細胞に、DHHC2、3、7および15に対するsiRNAまたは対照siRNAをトランスフェクトした。3日後、siRNAトランスフェクションを繰り返した。初期トランスフェクションの6日後、チロシナーゼパルミトイル化をアシル-RACおよびWBにより分析した。結果(図10)は、6回の測定値の平均±SEを示す。*p<0.05 vs. DMSO。結果は、DHHC2、3、7および15がチロシナーゼパルミトイル化に関与し得ることを示す。DHHC2および15に対するsiRNAを用いてパルミトイル化チロシナーゼの量で観察された低下は統計的に有意である。
【００５１】
実施例8−NHEMにおけるDHHC2-、3-、7-および15-mycの細胞内局在の分析
mycタグを有するDHHC2、3、7および15でトランスフェクトしたNHEM(アジア種)を抗myc抗体で染色し、さらにまたVti1b(ゴルジ体)またはHMB45(メラノソーム)に対する抗体で標識した。結果を図11Aおよび11Bに示す。DHHC2は、メラノソーム、細胞膜、およびゴルジ体中に局在することが見出された。同様にゴルジ体中に局在することが見出されたのはDHHC7および15である。DHHC3は、小胞体(ER)中に局在することが見出された。
【００５２】
実施例9−ヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位
MNT-1細胞を、野生型チロシナーゼ、または3つの主要システインコドンのうちの1つが変異して以下のようなシステインのアラニンとの置換：C8A、C35AまたはC500Aをもたらす3つのチロシナーゼのうちの1つでトランスフェクトした。48時間後、チロシナーゼのパルミトイル化を、アシル-RACおよびWBにより分析した。図12Aに示される結果は、Cys500のコドン中の変異がチロシナーゼパルミトイル化の喪失をもたらすことを示し、Cys500がヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位であることを示している。図12Bに示されるとおり、ヒトチロシナーゼにおける最も可能性の高いS-パルミトイル化部位のソフトウェアCSS-Palm 3.0による予測は上記の知見を支持する。
【００５３】
実施例10−ヒトチロシナーゼにおけるパルミトイル化部位
HEK293T細胞を、チロシナーゼおよび個々のDHHCでトランスフェクトした。[3H]パルミテートで4時間代謝標識した後、タンパク質をSDS-PAGEによって分離した。図13Aおよび13Bのそれぞれにおいて、上のパネルはオートラジオグラフであり、また下のパネルは抗チロシナーゼ抗体を用いたWB分析を示す。結果は、C500Aの変異を有するチロシナーゼがDHHC2、3、7または15(白色の星印)によりパルミトイル化されなかったことを示し、チロシナーゼのパルミトイル化部位がCys500であるという上記の実施例9の観察結果をさらに支持する。
【００５４】
実施例11−PP2がNHEMにおけるメラニン合成に与える影響
NHEM(アジア種)を、PP2の存在下、2-BPと共にまたは2-BPを伴わずに120時間インキュベートした。PP2は、2-BPで処理した細胞および細胞毒性を有さない2-BPで処理されていない細胞の両方においてメラニン合成を阻害した(図14Aおよび14B)。平均±S.E.(N=3)*p<0.05、vs.対照。
【００５５】
コウジ酸(KA)を陽性対照として使用した。図14Cおよび14Dに示されるとおり、KAは、2-BPで処理した細胞および2-BPで処理されていない細胞の両方においてメラニン合成を穏やかに阻害した。
【００５６】
実施例12−メラニン形成におけるPP2の作用機序：PP2がNHEMにおけるメラニン合成に与える影響
【００５７】
図15に示されるとおり、PP2はin vitroにおけるヒトチロシナーゼ(DOPA酸化)活性を阻害しなかったが、コウジ酸(陽性対照)は、チロシナーゼ活性を用量依存的に阻害した。平均±S.E.(N=4)*p<0.05、vs.対照。
【００５８】
実施例13−メラニン形成におけるPP2の作用機序：PP2がNHEMにおけるチロシナーゼタンパク質レベルに与える影響
【００５９】
NHEMを、PP2の存在下、2-BPと共にまたは2-BPを伴わずに48時間インキュベートした。図16に示されるとおり、PP2は2-BPで処理したヒトNHEM(アジア種)におけるチロシナーゼタンパク質レベルを減少させた。平均±S.E.(N=3)*p<0.05、vs.対照。
【００６０】
本発明は、本明細書中上記に具体的実施形態、特徴および態様に関連して記載されているが、本発明はそのように限定されるものではなく、むしろ実用において他の改変、変形、応用および実施形態に及び、従って全てのかかる他の改変、変形、応用および実施形態は、本発明の精神および範囲内にあるとみなされることが認識されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月14日(2016.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚または毛髪をメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（PPT）阻害剤で処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法。
【請求項２】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤が、少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1種の阻害剤がパルミトイル化ペプチド-1（PP1）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも1種の阻害剤がパルミトイル化ペプチド-2（PP2）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
メラニン低下有効量の少なくとも1種のPPT阻害剤を、更なるメラニン低下成分、サンスクリーン剤、またはこれらの組合せの少なくとも1種と組み合わせて含有する組成物で皮膚または毛髪を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
皮膚または毛髪をメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドで処理することにより、メラニンの出現の低下を必要とする哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる方法。
【請求項７】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドが、少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP1を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP2を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
メラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドを、更なるメラニン低下成分、サンスクリーン剤、またはこれらの組合せの少なくとも1種と組み合わせて含有する組成物で皮膚または毛髪を処理することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の少なくとも1種のPPT阻害剤を含む、前記組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤が少なくとも1種のパルミトイル化アミノ酸を含有する少なくとも1種のペプチドを含む、請求項１１に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤がPP1を含む、請求項１２に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも1種のPPT阻害剤がPP2を含む、請求項１２に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１５】
哺乳動物の皮膚または毛髪におけるメラニンの出現を低下させる化粧品組成物または皮膚科学的組成物であって、化粧品的にまたは皮膚科学的に許容可能なビヒクル中にメラニン低下有効量の少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドを含む、前記組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP1を含む、請求項１５に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも1種のパルミトイル化ペプチドがPP2を含む、請求項１５に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項１８】
付加的な美白活性物質をさらに含む、請求項１５に記載の化粧品組成物または皮膚科学的組成物。
【外国語明細書】
2017078074000001.pdf