(57)【要約】      （修正有）【課題】ベニクスノキタケ化合物及びその抽出物を神経変性疾病の治療及び予防に用いる薬物の調製に応用する用途の提供。【解決手段】式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表されるベニクスノキタケ化合物2017171644.tif 0000342017171644.tif 000035【選択図】図１Ａ
2017171644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途であって、
前記ベニクスノキタケ化合物は、式（Ｉ）に示し：
【化１】
2017171644.tif 000022
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は
【化２】
2017171644.tif 000023
【化３】
2017171644.tif 000024
或いは
【化４】
2017171644.tif 000025
であることを特徴とする神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途。
【請求項２】
前記化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は
【化５】
2017171644.tif 000026
で、式（ＩＩ）に示す
【化６】
2017171644.tif 000027
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途。
【請求項３】
前記化合物のＲ１はアセチル基、Ｒ２は
【化７】
2017171644.tif 000028
係以式（ＩＩＩ）に示す：
【化８】
2017171644.tif 000029
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途。
【請求項４】
前記化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は
【化９】
2017171644.tif 000030
で、式（ＩＶ）に示す
【化１０】
2017171644.tif 000031
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途。
【請求項５】
前記化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は
【化１１】
2017171644.tif 000032
で、式（Ｖ）に示す：
【化１２】
2017171644.tif 000033
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途。
【請求項６】
神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ抽出物の用途であって、
前記抽出物は、以下のプロセスで抽出され、
ベニクスノキタケ菌絲体、子実体或いは二者の混合物を、１０倍量のアルコールで２回抽出後、合わせて濃縮し、粗抽出物を得て、
前記粗抽出物は前記ベニクスノキタケ抽出物であることを特徴とする神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ抽出物の用途。
【請求項７】
前記粗抽出物をさらに、ジクロロメタン／水  （１：１）で、分配抽出法を３回行い、ジクロロメタン層と水層に分け、
前記ジクロロメタン層は、前記ベニクスノキタケ抽出物であることを特徴とする請求項６に記載の神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ抽出物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はベニクスノキタケから分離される化合物、抽出物及びその用途に関し、特に該化合物及び抽出物を神経変性疾病の治療及び予防に用いる薬物の調製に応用する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベニクスノキタケ（牛樟芝、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）は樟芝、牛樟茸、或いは紅樟芝等とも呼ばれ、ヒナダシタケ目（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、サルノコシカケ科（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）に属する多年生茸類である。台湾に特有の真菌種で、僅成長於台湾の天然記念物である樹種-牛樟樹（Ｃｉｎｎａｍｏｕｍ  ｋａｎｅｈｉｒａｉ  Ｈａｙ）の腐敗して中空となった内壁にのみ生育する。牛樟樹は分布数が極めて少なく、それに加えて盗伐も行われたため、それに寄生しなければ生育できない野生のベニクスノキタケはよりいっそう稀少となっている。しかも、その子実体の成長は非常に緩慢で、さらにその成長期は六月〜十月の間に限られるため、非常に高価である。
【０００３】
ベニクスノキタケの成分においては、トリテルペノイド類化合物に関する研究が最も多い。トリテルペノイド類化合物は、３０個の炭素が結合して六角形或いは五角形を形成する天然化合物の総称である。ベニクスノキタケが具得る苦味は、主にトリテルペノイド類の成分による。１９９５年Ｃｈｅｒｎｇ氏等は、ベニクスノキタケ子実体抽出物中に、エルゴスタン（ｅｒｇｏｓｔａｎｅ）を骨格とするａｎｔｃｉｎ  Ａ、ａｎｔｃｉｎ  Ｂ、ａｎｔｃｉｎ  Ｃという３種の新しいトリテルペノイド類化合物を含むことを発見した。（Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．  １９９５．  Ｔ時間ｅｅ  ｎｅｗ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ５８：３６５-３７１）。Ｃｈｅｎ氏等は、エタノールによりベニクスノキタケ子実体を抽出し、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃという３種のトリテルペノイド類化合物を発見した。（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｗ．  １９９５．  Ｎｅｗ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ，  −ａ  ｆｕｎｇｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｏｎ  Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ５８：１６５５-１６６１）。Ｃｈｉａｎｇ氏等は１９９５年、子実体抽出物中より、別の３種のそれぞれセスキテルペンラクトン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｌａｃｔｏｎｅ）、２種のビスフェノール類派生物の新しいトリテルペノイド類化合物を発見した。これが、ａｎｔｒｏｃｉｎ，４，７-ジメトキシ-５-メチル-１，３-ベンゾジオキソール（４，７-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-５-ｍｅｔｈｙ-１，３-  ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）と２，２'，５，５'-テラメゾキシ-３，４，３'，４'-ビ-メチレンジオキシ-６，６'-ジメチル  ビフェニル（２，２'，５，５'-ｔｅｒａｍｅｔｈｏｘｙ-３，４，３'，４'-ｂｉ-  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ-６，６'-  ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ）である。（Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｗｕ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｕｅｎｇ，  Ｃ．  Ｈ．  １９９５．  Ａ  ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｌａｃｔｏｎｅ，  ｐｈｅｎｙｌ  ａｎｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ３９：６１３-６１６）。  １９９６年には、Ｃｈｅｒｎｇ氏等は、同様の分析方法で、ａｎｔｃｉｎ  Ｅ、ａｎｔｃｉｎ  Ｆ、ｍｅｔｈｙｌ  ａｎｔｃｉｎａｔｅ  Ｇ、ｍｅｔｈｙｌ  ａｎｔｃｉｎａｔｅ  Ｈという４種の新しいトリテルペノイド類化合物を再度発見した。  （Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｈ．，  Ｗｕ，  Ｄ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．  １９９６．  Ｔｒｉｔｅｒｏｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４１：２６３-２６７）Ｙａｎｇ氏等は、エルゴスタンを骨格とするｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｅという２種の新化合物と、ラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）を骨格とする１５  α  _アセチル-デヒドロスルフレン酸（１５  α  -ａｃｅｔｙｌ-ｄｅｈｙｄｒｏｓｕｌｐｈｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、デヒドロエブリコイン酸（ｄｅｈｙｄｒｏｅｂｕｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄ）、デヒドラスルフレン酸（ｄｅｈｙｄｒａｓｕｌｐｈｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）という３種の新化合物を発見した。（Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｗ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｙ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．  １９９６．  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｏｆ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ−ａ  ｆｕｎｇｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｏｎ  Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４１：１３８９-１３９２）。
【０００４】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は一種の神経変性疾病で、脳の萎縮、記憶喪失等症状を引き起こす。アルツハイマー病は、認知症の六〜七割の成因を占めており、進行は遅いが時間とともに確実に悪化する持続性神経機能障害である。２０１０年、世界では２１００万人から３５００万人のアルツハイマー病患者がいるとされ、アルツハイマー病に関連する死亡は、およそ４８．６万例と推計される。先進国では、アルツハイマー病はすでに社会的資本を大きく消費する疾病の一つである。
【０００５】
現在すでに、脳にアミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ-竈，Ａβ）が蓄積することが、アルツハイマー病の主因であることが知られている。Ａβが脳に沈殿すると、酸化圧力と炎症反応を起こし、ニューロンを傷つけ、最終的に記憶学習能力の障害を招く。よって、抗酸化能力とＡＤの予防とは極めて高い相関性がある。ＰＣ-１２細胞は、アルツハイマー病中のＡβが神経細胞を傷つける方式のシミュレーションにしばしば用いられる。ＰＣ-１２神経線維芽細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）の刺激により、神経突起に類似の構造を分化させられ、類似の生理反応を示すため、神経方面の研究に幅広く応用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】台湾特許第１０３１４０５２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記先行技術には欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、合成したＡβを利用し、神経細胞ＰＣ-１２と共に培養し、アルツハイマー病中におけるＡβの神経細胞への障害をシミュレーションにし、ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＡＤ細胞モデルへの影響を検討したベニクスノキタケ化合物及びその抽出物を神経変性疾病の治療及び予防に用いる薬物の調製に応用する用途に関する。
【０００９】
本発明による神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ化合物の用途であって、該ベニクスノキタケ化合物は、式（Ｉ）に示す。
【００１０】
【化１】
2017171644.tif 000003
【００１１】
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は、
【００１２】
【化２】
2017171644.tif 000004
【００１３】
【化３】
2017171644.tif 000005
或いは、
【００１４】
【化４】
2017171644.tif 000006
である。
【００１５】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００１６】
【化５】
2017171644.tif 000007
で、式（ＩＩ）に示す。
【００１７】
【化６】
2017171644.tif 000008
【００１８】
好ましくは、該化合物のＲ１はアセチル基で、Ｒ２は、
【００１９】
【化７】
2017171644.tif 000009
で、式（ＩＩＩ）に示す。
【００２０】
【化８】
2017171644.tif 000010
【００２１】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００２２】
【化９】
2017171644.tif 000011
で、式（ＩＶ）に示す。
【００２３】
【化１０】
2017171644.tif 000012
【００２４】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００２５】
【化１１】
2017171644.tif 000013
で、式（Ｖ）に示す。
【００２６】
【化１２】
2017171644.tif 000014
【００２７】
本発明はさらに神経変性疾病の治療及び予防薬物の調製に用いられるベニクスノキタケ抽出物の用途であって、該抽出物は、以下のプロセスで抽出される。ベニクスノキタケ菌絲体、子実体或いは二者の混合物を、１０倍量のアルコールで２回抽出後、合わせて濃縮し、粗抽出物を得る。該粗抽出物は、該ベニクスノキタケ抽出物である。
【００２８】
好ましくは、該粗抽出物をさらに、ジクロロメタン／水（１：１）で、分配抽出法を３回行い、ジクロロメタン層と水層に分ける。該ジクロロメタン層は、該ベニクスノキタケ抽出物である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明はアルツハイマー病或いはその他神経変性疾病に対して治療及び予防の潜在力を備える。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図２Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図３Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
１．  材料及び方法
１．１  実験薬物
ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）は、蘭亭生物科技有限公司から提供を受け、-２０℃で保存する。
【００３２】
ベニクスノキタケ成分の抽出
ベニクスノキタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）菌絲体、子実体或いは二者の混合物  （１．０  ｋｇ）を１０倍量のアルコールで２回抽出後、合わせて濃縮し、粗抽出物約２３０ｇ  （ＡＮＣＡ）を得る。
粗抽出物をジクロロメタン／水（１：１）により分配抽出法で３回抽出し、ジクロロメタン層約１０２．６ｇ（ＡＮＣＡ-Ｄ）と水層約１２７．４ｇ（ＡＮＣＡ-Ｗ）に分ける。
ジクロロメタン層６．０ｇを取り、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでヘキサン／ジクロロメタン（１：４）、ジクロロメタン、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）の溶媒分離を経て、分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-１、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-２、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-３、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-４の四層に分離する。
上述の四層の取得は、合併ヘキサン／ジクロロメタン（１：４）及びジクロロメタンはＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-１で、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）の溶出液前半部分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-２，メタノール／ジクロロメタン（５：９５）で、溶出液後半部分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-３で、最後はメタノール溶出しＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-４である。
相関材料及び方法は、Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０２，  Ａｐｒｉｌ  ２０１５，  Ｐａｇｅｓ  １１５_１１９を参照されたい。
【００３３】
ベニクスノキタケ化合物Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３
ベニクスノキタケ化合物Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は、本発明人がベニクスノキタケ抽出物中から純化して得られた３個の新しい化合物である。
その純化方法及び構造は、すでに前申請案中に開示したため、ここでは説明しない。
その構造式及びその簡単な情報のみ以下に記載する。
【００３４】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１は無色の液体産物で、分析によりその化合物の分子式はＣ24Ｈ38Ｏ5で、分子量は４０６である。
完全な日本語、及び英文名称は４-ヒドロキシ-２，３-  ジメトキシ-６-メチル-５-（９-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-２，６，１０-シクロドデカトリエン）-２-シクロヘキ、４-ｈｙｄｒｏｘｙ-５-［９-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，１０-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌ-ｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅで、その構造式は式ＩＩに示す：
【００３５】
【化１３】
2017171644.tif 000015
【００３６】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２：は無色の液体産物で、分析による該化合物の分子式はＣ26Ｈ40Ｏ6で、分子量は４４８である。
完全な日本語と英語の名称は４-アセトキシ-２，３-  ジメトキシ-６-メチル-５-（９-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-２，６，１０-シクロドデカトリエン）-２-エノン、４-ａｃｅｔｏｘｙ-５-［９-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，１０-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌ-ｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅである。
その構造式は式ＩＩＩに示す：
【００３７】
【化１４】
2017171644.tif 000016
【００３８】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３：は無色の液体産物で、分析により該化合物の分子式はＣ24Ｈ38Ｏ5で、分子量は４０６である。
完全な日本語と英語の名称は（４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）-４-ヒドロキシ５-［（２Ｅ，６Ｅ，９Ｅ）-１１-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-ドデカ-２，６，９-トリエニル］-２，３-ジメトキシ-６-メチル-シクロヘキサン-２-エノン、（４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）-４-ｈｙｄｒｏｘｙ-５-［（２Ｅ，６Ｅ，９Ｅ）-１１-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，９-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅである。
その構造式は式ＩＶに示す：
【００３９】
【化１５】
2017171644.tif 000017
【００４０】
以上のＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２及びＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は似通った主構造を備える。
その通式は、式Ｉに示す：
【００４１】
【化１６】
2017171644.tif 000018
【００４２】
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は、
【００４３】
【化１７】
2017171644.tif 000019
或いは、
【００４４】
【化１８】
2017171644.tif 000020
である。
【００４５】
上述の３種のベニクスノキタケ化合物の抽出及び純化等に関する詳細情報は、本案発明人の前申請案（例えば台湾特許申請番号１０３１４０５２１）を参照されたい。
該各化合物は、前申請案で、多種の医療効果性を備えることが開示されている。
ここでは、上述の抽出物及び３種の化合物について関連実験を行い、その神経変性疾病に対する影響を試験し、アルツハイマー病等の神経変性疾病に対しても医療潜在力を備えるか否かを研究する。
【００４６】
１．２  細胞培養（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＰＣ-１２神経線維芽細胞は、ラットの副腎髄質の褐色細胞腫の細胞系である。
細胞株（Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、中国科学院上海生命科学研究院細胞資源中心（２０００３１，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から購入する。
【００４７】
１．３  主要試薬
ＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍ，ＷＩＳＥＮＴ；Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＢＳ），ＷＩＳＥＮＴ；Ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （１００Ｘ），Ｂｅｙｏｔｉｍｅ；Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  （ＤＭＳＯ），Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；Ｔｒｙｐｓｉｎ  １：２５０，Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；ＥＤＴＡ  ２Ｎａ，Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （ＰＢＳ），Ｂｅｙｏｔｉｍｅ；ＮＧＦ  ２．５Ｓ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａｍｙｌｏｉｄ  β  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １-４０，Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ９９％，ＴＣＩ；ＣＣＫ-８  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ。
【００４８】
１．４  主要検査機器
ＦｏｒｍａTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ３  Ｗａｔｅｒ  Ｊａｃｋｅｔｅｄ  ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ；ＭＳＣ-ＡｄｖａｎｔａｇｅTM  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ；ＥＮＴＲＩＳ６４-１Ｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂａｌａｎｃｅ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；ＨＨ-４  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ，栄華儀器製造有限公司；ＳＢ２５-１２ＤＴ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｌｅａｎｉｎｇ，新芸超声設備有限公司；ＭＬＳ-３７８０  Ａｕｔｏｃｌａｖｅ，ＳＡＮＹＯ；ＤＨＧ-９４２３Ａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｏｖｅｎ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  ｂｌａｓｔ，三発科学儀器有限公司；Ｂｉｏ-ＭＥＤＩＣＡＬ  ＨＹＣＤ-２８２  Ｕｌｔｒａ-Ｌｏｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒｓ，Ｈａｉｅｒ；Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ-１５Ｒ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ；Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｎｉｋｏｎ；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒｓ，ＴＥＣＡＮ。
【００４９】
２．  実験方法
２．１  ＰＣ-１２神経線維芽細胞株の培養
ＰＣ-１２神経線維芽細胞をＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍ（５％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、１０％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）で、３７℃、５％  ＣＯ２の環境下で培養し、毎週サブカルチャー培養を２回行う。
【００５０】
本研究で行うすべての実験の前に、ＰＣ-１２細胞は先ずマウス顎下腺神経成長因子（ＮＧＦ  ２．５Ｓ，１００ｎｇ／ｍＬ）を含むｍｅｄｉｕｍ上で予め７２時間培養し、ニューロン様細胞に誘導分化させる。
【００５１】
２．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のＰＣ-１２細胞中におけるＩＣ５０滴定実験
ＣＣＫ-８  ａｓｓａｙは、敏感な比色分析を採用し、細胞増殖と細胞毒性試験中において、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙの測定を行うことを許している。
ＣＣＫ-８の検査敏感度は、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ或いはＷＳＴ-１等の他のテトラゾリウムより高い。
高水溶性テトラゾリウムＷＳＴ-８は、細胞中の脱水ルシフェラーゼにより還元される。
こうして、培養基中で溶ける黄色産物（ホルマザン）が得られる。
細胞中の脱水ルシフェラーゼ活性を通して産生したホルマザン染料の量と活細胞数とは正比例する。
【００５２】
ＮＧＦ誘導に対するＰＣ-１２神経モデル優化ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の濃度のため、滴定実験を行い、そのＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０を測定する。
５×１０４個のすでにＮＧＦを用いて処理済みのＰＣ-１２細胞を、９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、勾配希釈の濃度が異なる薬物を加える。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ（０．０６４，０．３２，１．６，８，４０，２００  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（０．０３２，０．１６，０．８，４，２０，１００  μｇ／ｍＬ）で、各ｗｅｌｌのＤＭＳＯ濃さは０．５％を超過せず、２４時間インキュベートする。
処理終了後にＣＣＫ-８  ｓｏｌｕｔｉｏｎを、ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中に入れ、Ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４時間インキュベートする。
Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒｓ  ＯＤ  ４５０ｎｍで各ｗｅｌｌホルマザン産物の濃度を測定し、しかもＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙは対照のパーセンテージを示す。
【００５３】
２．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のβアミロイド誘導ＰＣ-１２細胞生存試験
β-アミロイド１-４０（Ａβ１-４０）を１０ｍｇ／ｍＬで０．１％  （ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中に溶解し、-２０℃で保存し貯蔵液とする。
試験前に、Ａβ１-４０貯蔵液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２５℃下で４８時間凝集する。
【００５４】
ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ，Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３の体外におけるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する治療効果を検証するため、５×１０４個のすでにＮＧＦで処理済みのＰＣ-１２細胞を９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、１０μＭ  Ａβ１-４０希釈液を加えて２４時間処理し、ＡＮＣＡ（５，１０，２０  μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加える。
ＡＮＣＡ-Ｄ（１０，２０，４０  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（２５，５０，１００  μｇ／ｍＬ）をさらに２４時間培養する。
未処理の細胞のＯＤュネをｃｏｎｔｒｏｌとし、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙを計算する。
それは薬物のＡβ１-４０神経細胞毒性に対する抑制率に等しく、％により表示する。
公式は以下の通りである：
【００５５】
【数１】
2017171644.tif 000021
【００５６】
ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ，Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３のＡＤ  細胞モデルに対する予防効果を検証するため、５×１０４個のすでにＮＧＦで処理済みのＰＣ-１２細胞を、９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを、１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、予めＡＮＣＡ（５，１０，２０  μｇ／ｍＬ），ＡＮＣＡ-Ｄ（１０，２０，４０  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（２５，５０，１００  μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加え、２４時間培養し、さらに１０μＭ  Ａβ１-４０希釈液を加えて２４時間処理する。
その後、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ測定を行う。
【００５７】
３．  実験結果
３．１ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す
細胞生存試験を行うことで、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-ＤのＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０は、それぞれ２２．９１、４９μｇ／ｍＬ（図１Ａ〜１Ｂ）と測定された。Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３のＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０はそれぞれ１７８．５、１６８．５、１０５．５μｇ／ｍＬである（図１Ｃ〜１Ｅ）。
【００５８】
３．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のβアミロイド誘導ＰＣ-１２成長に対する影響
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の体外でのアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する治療効果は、細胞生存試験の結果により表示する。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は共にＡβ誘導による損傷を明らかに抑制でき、しかもその細胞存活率を改善できる（図２Ａ〜２Ｅ）。
その内、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄの損傷抑制効果が最良で、次はＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２で、１００  μｇ／ｍＬ、５０  μｇ／ｍＬである時に、顕著な抑制効果を示し、２５  μｇ／ｍＬである時の効果はあまり明確ではない。
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３が１００  μｇ／ｍＬ、５０  μｇ／ｍＬである時には抑制効果を備え、徐々に２５  μｇ／ｍＬまで下がると、効果は不明確となる。
【００５９】
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の体外でのアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する予防効果を、細胞生存試験の結果を通して表示する。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は細胞のＡβ誘導によるニューロン損傷を防止（或いはそのリスク低下）の面で顕著な影響を示す（図３Ａ〜３Ｅ）。ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄの予防効果はやはり非常に顕著で、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１は濃度が１００、５０、２５  μｇ／ｍＬである時には、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄより優れた予防効果を示す。
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の効果は比較的劣る。
各成分が示す効果には差異があり、関係するメカニズムの違いと関係があると思われ、今後さらなる研究を進める。今回の試験で、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３が、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデル中における、βアミロイドによる傷害に対して抑制及び予防の明確な効果を備えることが実証された。
よって、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ抽出物及びＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３化合物は、アルツハイマー病或いはその他神経変性疾病に対して治療及び予防の潜在力を備える。
【００６０】
以上の実施形態から分かるように、本発明が提供するベニクスノキタケ化合物及びその抽出物は、神経変性疾病を治療する薬物への調製用途は確かに産業上の利用価値を備える。
但し、前述した本発明の実施形態は本発明を限定するものではなく、よって、本発明により保護される範囲は後述される特許請求の範囲を基準とする。
【図１Ａ】
2017171644.tif 000036
【図１Ｂ】
2017171644.tif 000037
【図１Ｃ】
2017171644.tif 000038
【図１Ｄ】
2017171644.tif 000039
【図１Ｅ】
2017171644.tif 000040
【図２Ａ】
2017171644.tif 000041
【図２Ｂ】
2017171644.tif 000042
【図２Ｃ】
2017171644.tif 000043
【図２Ｄ】
2017171644.tif 000044
【図２Ｅ】
2017171644.tif 000045
【図３Ａ】
2017171644.tif 000046
【図３Ｂ】
2017171644.tif 000047
【図３Ｃ】
2017171644.tif 000048
【図３Ｄ】
2017171644.tif 000049
【図３Ｅ】
2017171644.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月12日(2017.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はベニクスノキタケから分離される化合物、抽出物及びその医薬組成物に関し、特に該化合物及び抽出物を神経変性疾病の治療及び予防に用いる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベニクスノキタケ（牛樟芝、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）は樟芝、牛樟茸、或いは紅樟芝等とも呼ばれ、ヒナダシタケ目（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）、サルノコシカケ科（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）に属する多年生茸類である。台湾に特有の真菌種で、僅成長於台湾の天然記念物である樹種-牛樟樹（Ｃｉｎｎａｍｏｕｍ  ｋａｎｅｈｉｒａｉ  Ｈａｙ）の腐敗して中空となった内壁にのみ生育する。牛樟樹は分布数が極めて少なく、それに加えて盗伐も行われたため、それに寄生しなければ生育できない野生のベニクスノキタケはよりいっそう稀少となっている。しかも、その子実体の成長は非常に緩慢で、さらにその成長期は六月〜十月の間に限られるため、非常に高価である。
【０００３】
ベニクスノキタケの成分においては、トリテルペノイド類化合物に関する研究が最も多い。トリテルペノイド類化合物は、３０個の炭素が結合して六角形或いは五角形を形成する天然化合物の総称である。ベニクスノキタケが具得る苦味は、主にトリテルペノイド類の成分による。１９９５年Ｃｈｅｒｎｇ氏等は、ベニクスノキタケ子実体抽出物中に、エルゴスタン（ｅｒｇｏｓｔａｎｅ）を骨格とするａｎｔｃｉｎ  Ａ、ａｎｔｃｉｎ  Ｂ、ａｎｔｃｉｎ  Ｃという３種の新しいトリテルペノイド類化合物を含むことを発見した。（Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．  １９９５．  Ｔ時間ｅｅ  ｎｅｗ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ５８：３６５-３７１）。Ｃｈｅｎ氏等は、エタノールによりベニクスノキタケ子実体を抽出し、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ａ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｂ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｃという３種のトリテルペノイド類化合物を発見した。（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｗ．  １９９５．  Ｎｅｗ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ，  −ａ  ｆｕｎｇｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｏｎ  Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ５８：１６５５-１６６１）。Ｃｈｉａｎｇ氏等は１９９５年、子実体抽出物中より、別の３種のそれぞれセスキテルペンラクトン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｌａｃｔｏｎｅ）、２種のビスフェノール類派生物の新しいトリテルペノイド類化合物を発見した。これが、ａｎｔｒｏｃｉｎ，４，７-ジメトキシ-５-メチル-１，３-ベンゾジオキソール（４，７-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-５-ｍｅｔｈｙ-１，３-  ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）と２，２'，５，５'-テラメゾキシ-３，４，３'，４'-ビ-メチレンジオキシ-６，６'-ジメチル  ビフェニル（２，２'，５，５'-ｔｅｒａｍｅｔｈｏｘｙ-３，４，３'，４'-ｂｉ-  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ-６，６'-  ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ）である。（Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｗｕ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｕｅｎｇ，  Ｃ．  Ｈ．  １９９５．  Ａ  ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｌａｃｔｏｎｅ，  ｐｈｅｎｙｌ  ａｎｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ３９：６１３-６１６）。  １９９６年には、Ｃｈｅｒｎｇ氏等は、同様の分析方法で、ａｎｔｃｉｎ  Ｅ、ａｎｔｃｉｎ  Ｆ、ｍｅｔｈｙｌ  ａｎｔｃｉｎａｔｅ  Ｇ、ｍｅｔｈｙｌ  ａｎｔｃｉｎａｔｅ  Ｈという４種の新しいトリテルペノイド類化合物を再度発見した。  （Ｃｈｅｒｎｇ，  Ｉ．  Ｈ．，  Ｗｕ，  Ｄ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｃ．  １９９６．  Ｔｒｉｔｅｒｏｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４１：２６３-２６７）Ｙａｎｇ氏等は、エルゴスタンを骨格とするｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｄ、ｚｈａｎｋｕｉｃ  ａｃｉｄ  Ｅという２種の新化合物と、ラノスタン（ｌａｎｏｓｔａｎｅ）を骨格とする１５  α  _アセチル-デヒドロスルフレン酸（１５  α  -ａｃｅｔｙｌ-ｄｅｈｙｄｒｏｓｕｌｐｈｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、デヒドロエブリコイン酸（ｄｅｈｙｄｒｏｅｂｕｒｉｃｏｉｃ  ａｃｉｄ）、デヒドラスルフレン酸（ｄｅｈｙｄｒａｓｕｌｐｈｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）という３種の新化合物を発見した。（Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｗ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｙ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．  １９９６．  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｏｆ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ−ａ  ｆｕｎｇｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｏｎ  Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４１：１３８９-１３９２）。
【０００４】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は一種の神経変性疾病で、脳の萎縮、記憶喪失等症状を引き起こす。アルツハイマー病は、認知症の六〜七割の成因を占めており、進行は遅いが時間とともに確実に悪化する持続性神経機能障害である。２０１０年、世界では２１００万人から３５００万人のアルツハイマー病患者がいるとされ、アルツハイマー病に関連する死亡は、およそ４８．６万例と推計される。先進国では、アルツハイマー病はすでに社会的資本を大きく消費する疾病の一つである。
【０００５】
現在すでに、脳にアミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ-竈，Ａβ）が蓄積することが、アルツハイマー病の主因であることが知られている。Ａβが脳に沈殿すると、酸化圧力と炎症反応を起こし、ニューロンを傷つけ、最終的に記憶学習能力の障害を招く。よって、抗酸化能力とＡＤの予防とは極めて高い相関性がある。ＰＣ-１２細胞は、アルツハイマー病中のＡβが神経細胞を傷つける方式のシミュレーションにしばしば用いられる。ＰＣ-１２神経線維芽細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）の刺激により、神経突起に類似の構造を分化させられ、類似の生理反応を示すため、神経方面の研究に幅広く応用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】台湾特許第１０３１４０５２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記先行技術には欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、合成したＡβを利用し、神経細胞ＰＣ-１２と共に培養し、アルツハイマー病中におけるＡβの神経細胞への障害をシミュレーションにし、ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＡＤ細胞モデルへの影響を検討した神経変性疾病の治療及び予防に用いる医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明による神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物であって、該ベニクスノキタケ化合物は、式（Ｉ）に示す。
【００１０】
【化１】
2017171644.tif 000051
【００１１】
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は、
【００１２】
【化２】
2017171644.tif 000052
或は、
【００１３】
【化３】
2017171644.tif 000053
である。
【００１４】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００１５】
【化４】
2017171644.tif 000054
で、式（ＩＩ）に示す。
【００１６】
【化５】
2017171644.tif 000055
【００１７】
好ましくは、該化合物のＲ１はアセチル基で、Ｒ２は、
【００１８】
【化６】
2017171644.tif 000056
で、式（ＩＩＩ）に示す。
【００１９】
【化７】
2017171644.tif 000057
【００２０】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００２１】
【化８】
2017171644.tif 000058
で、式（ＩＶ）に示す。
【００２２】
【化９】
2017171644.tif 000059
【００２３】
好ましくは、該化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は、
【００２４】
【化１０】
2017171644.tif 000060
で、式（Ｖ）に示す。
【００２５】
【化１１】
2017171644.tif 000061
【００２６】
本発明はさらに神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物であって、該抽出物は、以下のプロセスで抽出される。ベニクスノキタケ菌絲体、子実体或いは二者の混合物を、１０倍量のアルコールで２回抽出後、合わせて濃縮し、粗抽出物を得る。該粗抽出物は、該ベニクスノキタケ抽出物である。
【００２７】
好ましくは、該粗抽出物をさらに、ジクロロメタン／水（１：１）で、分配抽出法を３回行い、ジクロロメタン層と水層に分ける。該ジクロロメタン層は、該ベニクスノキタケ抽出物である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明はアルツハイマー病或いはその他神経変性疾病に対して治療及び予防の潜在力を備える。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図１Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す。
【図２Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図２Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する治療効果を示す。
【図３Ａ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｂ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｃ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｄ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【図３Ｅ】本発明によるベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の体外におけるＡＤ細胞モデルに対する予防効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
１．  材料及び方法
１．１  実験薬物
ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）は、蘭亭生物科技有限公司から提供を受け、-２０℃で保存する。
【００３１】
ベニクスノキタケ成分の抽出
ベニクスノキタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）菌絲体、子実体或いは二者の混合物  （１．０  ｋｇ）を１０倍量のアルコールで２回抽出後、合わせて濃縮し、粗抽出物約２３０ｇ  （ＡＮＣＡ）を得る。
粗抽出物をジクロロメタン／水（１：１）により分配抽出法で３回抽出し、ジクロロメタン層約１０２．６ｇ（ＡＮＣＡ-Ｄ）と水層約１２７．４ｇ（ＡＮＣＡ-Ｗ）に分ける。
ジクロロメタン層６．０ｇを取り、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでヘキサン／ジクロロメタン（１：４）、ジクロロメタン、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）の溶媒分離を経て、分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-１、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-２、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-３、ＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-４の四層に分離する。
上述の四層の取得は、合併ヘキサン／ジクロロメタン（１：４）及びジクロロメタンはＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-１で、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）の溶出液前半部分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-２，メタノール／ジクロロメタン（５：９５）で、溶出液後半部分はＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-３で、最後はメタノール溶出しＡＮＣＡ-Ｅ-Ｄ-４である。
相関材料及び方法は、Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０２，  Ａｐｒｉｌ  ２０１５，  Ｐａｇｅｓ  １１５_１１９を参照されたい。
【００３２】
ベニクスノキタケ化合物Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３
ベニクスノキタケ化合物Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は、本発明人がベニクスノキタケ抽出物中から純化して得られた３個の新しい化合物である。
その純化方法及び構造は、すでに前申請案中に開示したため、ここでは説明しない。
その構造式及びその簡単な情報のみ以下に記載する。
【００３３】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１は無色の液体産物で、分析によりその化合物の分子式はＣ24Ｈ38Ｏ5で、分子量は４０６である。
完全な日本語、及び英文名称は４-ヒドロキシ-２，３-  ジメトキシ-６-メチル-５-（９-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-２，６，１０-シクロドデカトリエン）-２-シクロヘキ、４-ｈｙｄｒｏｘｙ-５-［９-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，１０-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌ-ｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅで、その構造式は式ＩＩに示す：
【００３４】
【化１２】
2017171644.tif 000062
【００３５】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２：は無色の液体産物で、分析による該化合物の分子式はＣ26Ｈ40Ｏ6で、分子量は４４８である。
完全な日本語と英語の名称は４-アセトキシ-２，３-  ジメトキシ-６-メチル-５-（９-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-２，６，１０-シクロドデカトリエン）-２-エノン、４-ａｃｅｔｏｘｙ-５-［９-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，１０-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌ-ｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅである。
その構造式は式ＩＩＩに示す：
【００３６】
【化１３】
2017171644.tif 000063
【００３７】
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３：は無色の液体産物で、分析により該化合物の分子式はＣ24Ｈ38Ｏ5で、分子量は４０６である。
完全な日本語と英語の名称は（４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）-４-ヒドロキシ５-［（２Ｅ，６Ｅ，９Ｅ）-１１-ヒドロキシ-３，７，１１-トリメチル-ドデカ-２，６，９-トリエニル］-２，３-ジメトキシ-６-メチル-シクロヘキサン-２-エノン、（４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）-４-ｈｙｄｒｏｘｙ-５-［（２Ｅ，６Ｅ，９Ｅ）-１１-ｈｙｄｒｏｘｙ-３，７，１１-ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ-２，６，９-ｔｒｉｅｎｙｌ］-２，３-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-６-ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘ-２-ｅｎｏｎｅである。
その構造式は式ＩＶに示す：
【００３８】
【化１４】
2017171644.tif 000064
【００３９】
以上のＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２及びＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は似通った主構造を備える。
その通式は、式Ｉに示す：
【００４０】
【化１５】
2017171644.tif 000065
【００４１】
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は、
【００４２】
【化１６】
2017171644.tif 000066
或いは、
【００４３】
【化１７】
2017171644.tif 000067
である。
【００４４】
上述の３種のベニクスノキタケ化合物の抽出及び純化等に関する詳細情報は、本案発明人の前申請案（例えば台湾特許申請番号１０３１４０５２１）を参照されたい。
該各化合物は、前申請案で、多種の医療効果性を備えることが開示されている。
ここでは、上述の抽出物及び３種の化合物について関連実験を行い、その神経変性疾病に対する影響を試験し、アルツハイマー病等の神経変性疾病に対しても医療潜在力を備えるか否かを研究する。
【００４５】
１．２  細胞培養（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＰＣ-１２神経線維芽細胞は、ラットの副腎髄質の褐色細胞腫の細胞系である。
細胞株（Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）は、中国科学院上海生命科学研究院細胞資源中心（２０００３１，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から購入する。
【００４６】
１．３  主要試薬
ＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍ，ＷＩＳＥＮＴ；Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＢＳ），ＷＩＳＥＮＴ；Ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （１００Ｘ），Ｂｅｙｏｔｉｍｅ；Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  （ＤＭＳＯ），Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；Ｔｒｙｐｓｉｎ  １：２５０，Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；ＥＤＴＡ  ２Ｎａ，Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ；Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （ＰＢＳ），Ｂｅｙｏｔｉｍｅ；ＮＧＦ  ２．５Ｓ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａｍｙｌｏｉｄ  β  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １-４０，Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ９９％，ＴＣＩ；ＣＣＫ-８  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ。
【００４７】
１．４  主要検査機器
ＦｏｒｍａTM  Ｓｅｒｉｅｓ  ３  Ｗａｔｅｒ  Ｊａｃｋｅｔｅｄ  ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ；ＭＳＣ-ＡｄｖａｎｔａｇｅTM  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ；ＥＮＴＲＩＳ６４-１Ｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂａｌａｎｃｅ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；ＨＨ-４  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ，栄華儀器製造有限公司；ＳＢ２５-１２ＤＴ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｌｅａｎｉｎｇ，新芸超声設備有限公司；ＭＬＳ-３７８０  Ａｕｔｏｃｌａｖｅ，ＳＡＮＹＯ；ＤＨＧ-９４２３Ａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｏｖｅｎ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  ｂｌａｓｔ，三発科学儀器有限公司；Ｂｉｏ-ＭＥＤＩＣＡＬ  ＨＹＣＤ-２８２  Ｕｌｔｒａ-Ｌｏｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒｓ，Ｈａｉｅｒ；Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ-１５Ｒ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ；Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｎｉｋｏｎ；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒｓ，ＴＥＣＡＮ。
【００４８】
２．  実験方法
２．１  ＰＣ-１２神経線維芽細胞株の培養
ＰＣ-１２神経線維芽細胞をＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍ（５％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、１０％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）で、３７℃、５％  ＣＯ２の環境下で培養し、毎週サブカルチャー培養を２回行う。
【００４９】
本研究で行うすべての実験の前に、ＰＣ-１２細胞は先ずマウス顎下腺神経成長因子（ＮＧＦ  ２．５Ｓ，１００ｎｇ／ｍＬ）を含むｍｅｄｉｕｍ上で予め７２時間培養し、ニューロン様細胞に誘導分化させる。
【００５０】
２．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のＰＣ-１２細胞中におけるＩＣ５０滴定実験
ＣＣＫ-８  ａｓｓａｙは、敏感な比色分析を採用し、細胞増殖と細胞毒性試験中において、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙの測定を行うことを許している。
ＣＣＫ-８の検査敏感度は、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ或いはＷＳＴ-１等の他のテトラゾリウムより高い。
高水溶性テトラゾリウムＷＳＴ-８は、細胞中の脱水ルシフェラーゼにより還元される。
こうして、培養基中で溶ける黄色産物（ホルマザン）が得られる。
細胞中の脱水ルシフェラーゼ活性を通して産生したホルマザン染料の量と活細胞数とは正比例する。
【００５１】
ＮＧＦ誘導に対するＰＣ-１２神経モデル優化ベニクスノキタケ抽出物（ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ）及び化合物（Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１，ＬＴ２，ＬＴ３）の濃度のため、滴定実験を行い、そのＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０を測定する。
５×１０４個のすでにＮＧＦを用いて処理済みのＰＣ-１２細胞を、９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、勾配希釈の濃度が異なる薬物を加える。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ（０．０６４，０．３２，１．６，８，４０，２００  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（０．０３２，０．１６，０．８，４，２０，１００  μｇ／ｍＬ）で、各ｗｅｌｌのＤＭＳＯ濃さは０．５％を超過せず、２４時間インキュベートする。
処理終了後にＣＣＫ-８  ｓｏｌｕｔｉｏｎを、ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中に入れ、Ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４時間インキュベートする。
Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒｓ  ＯＤ  ４５０ｎｍで各ｗｅｌｌホルマザン産物の濃度を測定し、しかもＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙは対照のパーセンテージを示す。
【００５２】
２．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のβアミロイド誘導ＰＣ-１２細胞生存試験
β-アミロイド１-４０（Ａβ１-４０）を１０ｍｇ／ｍＬで０．１％  （ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中に溶解し、-２０℃で保存し貯蔵液とする。
試験前に、Ａβ１-４０貯蔵液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２５℃下で４８時間凝集する。
【００５３】
ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ，Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３の体外におけるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する治療効果を検証するため、５×１０４個のすでにＮＧＦで処理済みのＰＣ-１２細胞を９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、１０μＭ  Ａβ１-４０希釈液を加えて２４時間処理し、ＡＮＣＡ（５，１０，２０  μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加える。
ＡＮＣＡ-Ｄ（１０，２０，４０  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（２５，５０，１００  μｇ／ｍＬ）をさらに２４時間培養する。
未処理の細胞のＯＤュネをｃｏｎｔｒｏｌとし、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙを計算する。
それは薬物のＡβ１-４０神経細胞毒性に対する抑制率に等しく、％により表示する。
公式は以下の通りである：
【００５４】
【数１】
2017171644.tif 000068
【００５５】
ＡＮＣＡ，ＡＮＣＡ-Ｄ，Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３のＡＤ  細胞モデルに対する予防効果を検証するため、５×１０４個のすでにＮＧＦで処理済みのＰＣ-１２細胞を、９６-ｗｅｌｌ中で２４時間培養する。
その後ｍｅｄｉｕｍを、１％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２％  ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、２  ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０  Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍに交換し、予めＡＮＣＡ（５，１０，２０  μｇ／ｍＬ），ＡＮＣＡ-Ｄ（１０，２０，４０  μｇ／ｍＬ），Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３（２５，５０，１００  μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加え、２４時間培養し、さらに１０μＭ  Ａβ１-４０希釈液を加えて２４時間処理する。
その後、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ測定を行う。
【００５６】
３．  実験結果
３．１ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のＰＣ-１２細胞成長に対する影響を示す  細胞生存試験を行うことで、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-ＤのＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０は、それぞれ２２．９１、４９μｇ／ｍＬ（図１Ａ〜１Ｂ）と測定された。Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、ＬＴ２、ＬＴ３のＰＣ-１２細胞中のＩＣ５０はそれぞれ１７８．５、１６８．５、１０５．５μｇ／ｍＬである（図１Ｃ〜１Ｅ）。
【００５７】
３．２  ベニクスノキタケ抽出物及び化合物のβアミロイド誘導ＰＣ-１２成長に対する影響
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の体外でのアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する治療効果は、細胞生存試験の結果により表示する。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は共にＡβ誘導による損傷を明らかに抑制でき、しかもその細胞存活率を改善できる（図２Ａ〜２Ｅ）。
その内、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄの損傷抑制効果が最良で、次はＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２で、１００  μｇ／ｍＬ、５０  μｇ／ｍＬである時に、顕著な抑制効果を示し、２５  μｇ／ｍＬである時の効果はあまり明確ではない。
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３が１００  μｇ／ｍＬ、５０  μｇ／ｍＬである時には抑制効果を備え、徐々に２５  μｇ／ｍＬまで下がると、効果は不明確となる。
【００５８】
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の体外でのアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデルに対する予防効果を、細胞生存試験の結果を通して表示する。
ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３は細胞のＡβ誘導によるニューロン損傷を防止（或いはそのリスク低下）の面で顕著な影響を示す（図３Ａ〜３Ｅ）。ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄの予防効果はやはり非常に顕著で、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１は濃度が１００、５０、２５  μｇ／ｍＬである時には、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄより優れた予防効果を示す。
Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３の効果は比較的劣る。
各成分が示す効果には差異があり、関係するメカニズムの違いと関係があると思われ、今後さらなる研究を進める。今回の試験で、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３が、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）細胞モデル中における、βアミロイドによる傷害に対して抑制及び予防の明確な効果を備えることが実証された。
よって、ＡＮＣＡ、ＡＮＣＡ-Ｄ抽出物及びＡｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ１、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ２、Ａｎｔｒｏｃａｍｏｌ  ＬＴ３化合物は、アルツハイマー病或いはその他神経変性疾病に対して治療及び予防の潜在力を備える。
【００５９】
以上の実施形態から分かるように、本発明が提供するベニクスノキタケ化合物及びその抽出物は、神経変性疾病を治療する医薬組成物は確かに産業上の利用価値を備える。
但し、前述した本発明の実施形態は本発明を限定するものではなく、よって、本発明により保護される範囲は後述される特許請求の範囲を基準とする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物であって、
式（Ｉ）に示す化合物を含み、
【化１】
2017171644.tif 000069
その内、Ｒ１は水素或いはアセチル基で、Ｒ２は
【化２】
2017171644.tif 000070
或は
【化３】
2017171644.tif 000071
であることを特徴とする神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は
【化４】
2017171644.tif 000072
で、式（ＩＩ）に示す
【化５】
2017171644.tif 000073
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物のＲ１はアセチル基、Ｒ２は
【化６】
2017171644.tif 000074
係以式（ＩＩＩ）に示す：
【化７】
2017171644.tif 000075
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物のＲ１は水素で、Ｒ２は
【化８】
2017171644.tif 000076
で、式（ＩＶ）に示す
【化９】
2017171644.tif 000077
ことを特徴とする請求項１に記載の神経変性疾病の治療及び予防に用いられる医薬組成物。