(57)【要約】【課題】簡便かつ迅速な方法で多剤耐性菌を検出すること。【解決手段】  液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いて多剤耐性菌の検出を行う。複数の収容部は、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートであって、前記複数の収容部が、
カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を含む、多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項２】
液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートであって、前記複数の収容部のうちの少なくとも一つが、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容する、
多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項３】
前記液体培地が、ミュラーヒントンブイヨン、NACブイヨン培地、BTB培地、ハートインフュジョンブイヨン培地、普通ブイヨン培地、およびトリプトソイブイヨン培地から選択される請求項１または２に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項４】
カルバペネム系抗菌薬の濃度が１μg/mL以上、アミノ配糖体系抗菌薬の濃度が２μg/m L以上、およびフルオロキノロン系抗菌薬の濃度が０．５μg/mL以上である請求項３に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項５】
カルバペネム系抗菌薬がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム、およびエルタペネムから選ばれる少なくとも一つである請求項１〜４のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項６】
アミノ配糖体系抗菌薬がアミカシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、イセパマイシンおよびアルベカシンから選択される少なくとも一つである請求項１〜４のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項７】
フルオロキノロン系抗菌薬がシプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、ガチフロキサシン、プルリフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシン、およびガレノキサシンから選択される少なくとも一つである請求項１〜４のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項８】
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項９】
トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項１０】
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項１１】
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項１２】
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項１３】
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、
ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、
から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いた多剤耐性菌の検出方法。
【請求項１５】
検出する多剤耐性菌が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターおよび薬剤耐性腸内細菌から選択される少なくとも一つである請求項１４に記載の多剤耐性菌の検出方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを備えた多剤耐性菌検出キット。
【請求項１７】
カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地、
前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬、および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２または３種類の第２の液体培地、および
前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬、および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２または３種類の第３の液体培地
から選ばれる複数の液体培地と、
前記複数の液体培地の各々を収容する収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートと、を備える多剤耐性菌検出キット。
【請求項１８】
検出する多剤耐性菌が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターおよび薬剤耐性腸内細菌から選択される請求項１６または１７に記載の多剤耐性菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性菌スクリーニング用プレート、多剤耐性菌の検出方法、多剤耐性菌検出キットおよび多剤耐性菌スクリーニング用液体培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌薬の使用に伴い、当該抗菌薬に対して耐性を有する細菌が出現するが、この耐性が単一の系統の抗菌薬に限らず、複数の系統の抗菌薬に対して耐性を有する細菌、すなわち多剤耐性菌が出現して来た。この多剤耐性菌は、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬等、異なる系統の抗菌薬に対して耐性を有しており、多剤耐性菌に起因する感染症の治療を困難にしている。
【０００３】
一方、医療機関において、患者が原疾患とは別に、カテーテルやデバイス等を介して新たに罹患した院内感染が重大な問題となって来た。特に、免疫力が低下した患者、未熟児、高齢者等の易感染者は、通常の病原性微生物のみならず、感染力の弱い微生物によっても院内感染を引き起こす可能性がある。それゆえ、この院内感染の原因となる細菌が多剤耐性菌であった場合、その発生を制御することは重要な課題となっている。
【０００４】
そこで、多剤耐性菌の有無を速やかに確認するために、耐性を有する系統の抗菌薬の種類を早急に把握することが重要である。なお、多剤耐性菌には、多剤耐性緑膿菌（MDRP）、多剤耐性アシネトバクター（MDRA）、および薬剤耐性腸内細菌等が知られている。
【０００５】
この多剤耐性菌をスクリーニングする方法として、上記したカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノ配糖体系抗菌薬を含む寒天培地が提案され、本培地に被験試料を接種し、細菌コロニーの形成の有無を観察する方法（特許文献１）が示されている。
【０００６】
しかし、本培地では、培地に含まれる３系統の抗菌薬全てに耐性を有する場合にコロニーが発現し、３剤耐性菌をスクリーニングする目的では有効であるものの、その他の２剤耐性菌および単剤耐性菌をスクリーニングすることは出来ない。
【０００７】
また、３系統の抗菌薬を含有するディスク試験片を寒天培地表面に置いて、ディスク試験片周囲の細菌コロニーの形成の有無を観察し、多剤耐性菌を検出する方法（特許文献２）が提案されている。
【０００８】
しかし、この場合も、ディスクに含有している３系統の抗菌薬すべてに耐性を有する場合にコロニーが形成され、３剤耐性菌しか検出出来ない。
【０００９】
さらに、抗菌薬を含む培地の作製方法として、特許文献３には、NAC寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシン塩酸塩の濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネムを０．０１６ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることが示されている。
【００１０】
しかしながら、上記のいずれの方法も、寒天培地を用いているため、被験試料や検出対象菌種ごとに対応する数の寒天培地を調製しなければならず、操作が煩雑であった。
【００１１】
また、調製した寒天培地を保存する方法としては冷蔵保存が適しているが、その効力を維持する期間は高々四週間程度であった。さらに、一種類の寒天培地もしくはディスク試験片では観察された多剤耐性菌が、３剤耐性菌であるか、２剤耐性菌であるかまたは単剤耐性菌であるかを区別することはできなかった。
【００１２】
一方、MDRPを代表とする多剤耐性菌感染症に対しては、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬による単剤での抗菌薬治療は無効であり、抗菌薬の併用療法が必要となる（非特許文献１）。
【００１３】
そのため、非特許文献２では、MDRP感染症に対して、３剤、２剤および単剤の抗菌薬を組み合わせたプレートを作製し、抗菌薬の組合せによるMIC値の低下の有無を観察して、単剤投与では抗菌薬療法の効果が期待できない抗菌薬の併用効果を判断する方法が示されている。
【００１４】
しかしながら、この方法では多数の被験試料を同時に試験するには煩雑で、多剤耐性菌をスクリーニングする方法には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第5515139号
【特許文献２】特開2012-105643
【特許文献３】特許第4696251号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】化学療法の領域  VOL.23, NO.2, pp.259-264, 2007
【非特許文献２】日本化学療法学会雑誌  VOL.60, NO.4, pp.469-477, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の一つの目的は、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を用いて、簡便かつ迅速に多剤耐性菌を検出できる多剤耐性菌スクリーニング用プレート、検出方法、および検出キットを提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬の複数の組み合わせを用いて、３剤耐性菌、２剤耐性菌、単剤耐性菌および感性菌を区別できる多剤耐性菌スクリーニング用プレート、検出方法、および検出キットを提供することにある。
【００１９】
本発明のまた別の目的は、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬の複数の組み合わせを用いて、長期間安定的に多剤耐性菌を検出できる多剤耐性菌スクリーニング用プレート、検出方法、および検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は以下の通りである。
【００２１】
（１）液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートであって、前記複数の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる、多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２２】
（２）液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートであって、前記複数の収容部のうちの少なくとも一つが、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容する、多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２３】
（３）前記液体培地が、ミュラーヒントンブイヨン、NACブイヨン培地、BTB培地、ハートインフュジョンブイヨン培地、普通ブイヨン培地、およびトリプトソイブイヨン培地から選択される（１）または（２）に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２４】
（４）カルバペネム系抗菌薬の濃度が１μg/mL以上、アミノ配糖体系抗菌薬の濃度が２μg/m L以上、およびフルオロキノロン系抗菌薬の濃度が０．５μg/mL以上である（３）に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２５】
（５）カルバペネム系抗菌薬がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム、およびエルタペネムから選ばれる少なくとも一つである（１）〜（４）のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２６】
（６）アミノ配糖体系抗菌薬がアミカシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、イセパマイシンおよびアルベカシンから選択される少なくとも一つである（１）〜（４）のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２７】
（７）フルオロキノロン系抗菌薬がシプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、ガチフロキサシン、プルリフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシン、およびガレノキサシンから選択される少なくとも一つである（１）〜（４）のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２８】
（８）ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００２９】
（９）トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００３０】
（１０）ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００３１】
（１１）ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００３２】
（１２）ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００３３】
（１３）ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレート。
【００３４】
（１４）（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いた多剤耐性菌の検出方法。
【００３５】
（１５）検出する多剤耐性菌が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターおよび薬剤耐性腸内細菌から選択される少なくとも一つである（１４）に記載の多剤耐性菌の検出方法。
【００３６】
（１６）（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを備えた多剤耐性菌検出キット。
【００３７】
（１７）カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地、前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬、および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２または３種類の第２の液体培地、および前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬、および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２または３種類の第３の液体培地から選ばれる複数の液体培地と、前記複数の液体培地の各々を収容する収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートと、を備える多剤耐性菌検出キット。
【００３８】
（１８）検出する多剤耐性菌が多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターおよび薬剤耐性腸内細菌から選択される（１６）または（１７）に記載の多剤耐性菌検出キット。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレート及び検出方法によれば、一つのプレート上で複数の被験試料を簡便かつ迅速に多剤耐性菌を検出することができる。また、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレート及び検出方法によれば、３剤耐性菌、２剤耐性菌、単剤耐性菌および感性菌を区別することもできる。さらに、本発明の液体培地は長期間安定的に保存できるため、多剤耐性菌を長期間高精度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】抗菌薬としてイミペネム（IPM）、アミカシン（AMK）、およびシプロフロキサシン（CPFX）を用いた場合のプレート上の抗菌薬の配置（μg/mL）を示す。
【図２】抗菌薬としてメロペネム（MEPM）、アミカシン（AMK）、およびシプロフロキサシン（CPFX）を用いた場合のプレート上の抗菌薬の配置（μg/mL）を示す。
【図３】抗菌薬としてイミペネム（IPM）、アミカシン（AMK）、およびレボフロキサシン（LVFX）を用いた場合のプレート上の抗菌薬の配置（μg/mL）を示す。
【図４】抗菌薬としてイミペネム（IPM）、アミカシン（AMK）、およびノルフロキサシン（NFLX）を用いた場合のプレート上の抗菌薬の配置（μg/mL）を示す。
【図５】抗菌薬としてイミペネム（IPM）、ゲンタマイシン（GM）、およびシプロフロキサシン（CPFX）を用いた場合のプレート上の抗菌薬の配置（μg/mL）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明を、発明を限定するものではなく例示としての実施形態にて説明する。
【００４２】
本発明は、液体培地を収容するための複数の収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートであって、複数の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地を収容する第１の収容部と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と、から選ばれる収容部を含む、多剤耐性菌スクリーニング用プレートを包含する。
【００４３】
なお、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地であって、例えばカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含むが抗菌薬の濃度が異なるいずれの液体培地も、第１の液体培地に包含される。
【００４４】
カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含むが、抗菌薬の濃度が異なるいずれの液体培地も、第２の液体培地に包含される。
【００４５】
カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含むが、抗菌薬の濃度が異なるいずれの液体培地も、第３の液体培地に包含される。
【００４６】
多剤耐性菌スクリーニング用プレートとしては、例えば収容部として複数のウエルを備えたプラスチック製プレートが挙げられ、具体的には２４穴プレート、９６穴プレート等のマイクロプレートが挙げられるが、ウエルの数は限定されない。また、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、液体培地を収容した状態で使用時まで冷凍保存することが可能であり、長期安定性を備えている。なお、−７０℃で保存した場合、少なくとも６ヶ月間その効力を失うことは無い。
【００４７】
カルバペネム系抗菌薬としては、イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネム、およびエルタペネムから選ばれる少なくとも一つが挙げられる。
【００４８】
アミノ配糖体系抗菌薬としては、アミカシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、イセパマイシンおよびアルベカシンから選択される少なくとも一つが挙げられる。
【００４９】
フルオロキノロン系抗菌薬としては、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、ガチフロキサシン、プルリフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシン、およびガレノキサシンから選択される少なくとも一つが挙げられる。
【００５０】
一つの実施形態では、上記多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの少なくとも一つが、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの第１の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第２の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の液体培地を収容する。特定の実施形態では、上記の第１および第２の収容部が一列に配置される。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、第１および第２の収容部に収容されたそれぞれの液体培地の抗菌薬を異なる希釈濃度にした液体培地を収容する収容部をさらに備える。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの第１の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第２の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびアミノ配糖体系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第３の収容部が、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第４の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容する。特定の実施形態では、上記の第１〜第４の収容部が一列に配置される。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、第１〜第４の収容部に収容されたそれぞれの液体培地の抗菌薬を異なる希釈濃度にした液体培地を収容する収容部をさらに備える。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの第１の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第２の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２、または３種類の第２の液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第３の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、第１〜第３の収容部に収容されたそれぞれの液体培地の抗菌薬を異なる希釈濃度にした液体培地を収容する収容部をさらに備える。
【００５４】
より特定の実施形態では、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの第１の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第２の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびアミノ配糖体系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第３の収容部が、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第４の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第５の収容部が、カルバペネム系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第６の収容部が、アミノ配糖体系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第７の収容部が、フルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容する。特定の実施形態では、上記の第１〜第７の収容部が一列に配置される。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、第１〜第７の収容部に収容されたそれぞれの液体培地の抗菌薬を異なる希釈濃度にした液体培地を収容する収容部をさらに備える。
【００５５】
別の実施形態では、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートにおいて、複数の収容部のうちの第１の収容部が、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第２の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびアミノ配糖体系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第３の収容部が、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第４の収容部が、カルバペネム系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第５の収容部が、カルバペネム系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第６の収容部が、アミノ配糖体系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第７の収容部が、フルオロキノロン系抗菌薬を含む液体培地を収容し、複数の収容部のうちの第８の収容部が、抗菌薬を含まない液体培地（陽性コントロール）を収容する。特定の実施形態では、上記の第１〜第８の収容部が一列に配置される。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用プレートは、第１〜第８の収容部に収容されたそれぞれの液体培地の抗菌薬を複数の希釈濃度にした液体培地を収容する収容部をさらに備える。
【００５６】
検出される多剤耐性菌は、限定されないが、例えば多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクター、および薬剤耐性腸内細菌等から選択される少なくとも一つが挙げられる。
【００５７】
液体培地としては、培地中には検出対象菌の栄養源と物質、無機塩類等が含まれる。液体培地のpHは、本発明により検出される検出対象菌が発育するpHであれば特に限定されない。そのような液体培地として、例えばミュラーヒントンブイヨン（pH７．２〜７．４）、NACブイヨン培地（pH７．３〜７．７）、BTB培地（pH７．０〜７．６）、ハートインフュジョンブイヨン培地（pH７．２〜７．６）、普通ブイヨン培地（pH６．８〜７．２）、およびトリプトソイブイヨン培地（pH７．１〜７．５）から選択される少なくとも一つが挙げられる。
【００５８】
調合済みの市販の粉末培地を使用する場合、用意した粉末培地を所定量の精製水に溶解し、オートクレーブ等の滅菌処理を行う。調合済みの粉末培地を使用しない場合には、必要な成分（抗菌薬以外の培地成分）を調合した後、精製水に溶解し、（或いは、成分毎に精製水に添加し、溶解し）、オートクレーブ等の滅菌処理を行う。次に、培地が十分に冷めたのを確認した後、各抗菌薬（例えばイミペネム、アミカシン及びシプロフロキサシン）を添加し、撹拌する。続いて、プレートの収容部に培地を分注する。その後、得られたプレートは室温、冷蔵（例えば２〜１０℃）、または冷凍（例えば−４〜−８０℃）で保存される。尚、プレートの作製のための全ての操作は原則として無菌環境下で行う。
【００５９】
カルバペネム系抗菌薬は、カルバペネム骨格を有する化合物を指し、例えばイミペネム（IPM）、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、テビペネムおよびエルタペネムから選ばれる少なくとも一つが挙げられる。なお、抗菌薬によって用いられる薬剤濃度は異なるが、カルバペネム系抗菌薬の濃度は１μg/mL以上が好ましい。カルバペネム系抗菌薬の濃度の上限は特に限定されないが、例えば５１２μg/mL以下であってもよい。
【００６０】
アミノ配糖体系抗菌薬は、アミノ糖を含む配糖体である化合物を指し、例えばアミカシン（AMK）、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、イセパマイシンおよびアルベカシンから選択される少なくとも一つが挙げられる。なお、抗菌薬によって用いられる薬剤濃度は異なるが、アミノ配糖体系抗菌薬の濃度は２μg/mL以上が好ましい。アミノ配糖体系抗菌薬の濃度の上限は特に限定されないが、例えば１０２４μg/mL以下であってもよい。
【００６１】
フルオロキノロン系抗菌薬は、キノロン骨格を有するキノロン系抗菌薬のうち複素環にフッ素を導入したキノロンである化合物を指し、例えばシプロフロキサシン（CPFX）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、レボフロキサシン、パズフロキサシン、ガチフロキサシン、プルリフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシンおよびガレノキサシンから選択される少なくとも一つが挙げられる。なお、抗菌薬によって用いられる薬剤濃度は異なるが、フルオロキノロン系抗菌薬の濃度は０．５μg/mL以上が好ましい。フルオロキノロン系抗菌薬の濃度の上限は特に限定されないが、例えば５１２μg/mL以下であってもよい。
【００６２】
一つの実施形態では、カルバペネム系抗菌薬がメロペネムまたはイミペネム、アミノ配糖体系抗菌薬がアミカシンまたはゲンタマイシン、およびフルオロキノロン系抗菌薬がシプロフロキサシン、レボフロキサシン、またはノルフロキサシンである３剤の組み合わせが用いられる。
【００６３】
上記の抗菌薬の各々の濃度は、例えばCLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）のガイドライン（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing（M100）のＳ（感性：治療効果が期待できる）、Ｉ（中間：投与量により治療効果が期待できる、効果の有無の緩衝域）、Ｒ（耐性：治療効果が期待できない）の濃度、日本化学療法学会のブレイクポイントおよびその近傍の濃度等、抗菌薬の有効性の判断基準となる濃度の全部もしくはその一部を用いて効率良く決定することができる。
【００６４】
多剤耐性菌をMDRPを例に挙げて示す。MDRPは、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬に耐性を示す緑膿菌である。それゆえ、MDRPは本邦で使用可能な抗菌薬のほとんどが無効で、院内感染対策上重要な病原体となっている  
感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律でも、代表的なイミペネム、アミカシン、およびシプロフロキサシンの最小発育阻止濃度（MIC）が単剤でイミペネム≧１６μg/mL、アミカシン≧３２μg/mL、シプロフロキサシン≧４μg/mLのすべてを満たす緑膿菌が３剤耐性菌とされるが、本発明のプレートによれば、３剤耐性菌を検出することができる。また、本発明のプレートによれば、３剤耐性菌、２剤耐性菌、単剤耐性菌および感性菌を区別することもできる。
【００６５】
多剤耐性菌の検出に適したカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬の濃度は、細菌の種類、培地の種類および抗菌薬の組み合わせによって変更し得る。
【００６６】
一つの実施形態では、カルバペネム系抗菌薬の濃度が１μg/mL以上、アミノ配糖体系抗菌薬の濃度が２μg/mL以上、およびフルオロキノロン系抗菌薬の濃度が０．５μg/mL以上である。
【００６７】
（Ｉ）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地と；から選択される少なくとも一つを含む。
【００６８】
（II）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地と；トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；トリプトソイブイヨン培地またはNACブイヨン培地に、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部と；から選択される少なくとも一つを含む。
【００６９】
（III）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のメロペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地と；から選択される少なくとも一つを含む。
【００７０】
（IV）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンを含む第１の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および１μg/mL以上のレボフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地と；から選択される少なくとも一つを含む。 
【００７１】
（Ｖ）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンを含む第１の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、８μg/mL以上のアミカシン、および２μg/mL以上のノルフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地と；から選択される少なくとも一つを含む。
【００７２】
（VI）一つの実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンを含む第１の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される２つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第２の液体培地と；ミュラーヒントンブイヨンに、１μg/mL以上のイミペネム、２μg/mL以上のゲンタマイシン、および０．５μg/mL以上のシプロフロキサシンから選択される１つの抗菌薬を含む１、２、または３種類の第３の液体培地と；から選択される少なくとも一つを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、上記の（Ｉ）〜（VI）において、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、上記の第１の液体培地を含む。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、上記の第１の液体培地と、上記の１、２または３種類の第２の液体培地とを含む。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、上記の第１の液体培地と、上記の１、２または３種類の第３の液体培地とを含む。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、上記の１、２または３種類の第２の液体培地と、上記の１、２または３種類の第３の液体培地とを含む。別の特定の実施形態では、多剤耐性菌スクリーニング用液体培地は、上記の第１の液体培地と、上記の１、２または３種類の第２の液体培地と、上記の１、２、または３種類の第３の液体培地とを含む。
【００７４】
本発明は、上記の多剤耐性菌検出用スクリーニング培地と、かかる多剤耐性菌スクリーニング用液体培地を収容する多剤耐性菌スクリーニング用プレートとを備えた多剤耐性菌検出キットを包含する。
【００７５】
一つの実施形態として、多剤耐性菌検出キットは、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２または３種類の第２の液体培地、およびカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２または３種類の第３の液体培地から選ばれる複数の液体培地と、複数の液体培地の各々を収容する収容部を備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートとを備える。好ましいカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬の組み合わせおよび濃度については上述した通りである。
【００７６】
別の実施形態として、多剤耐性菌検出キットは、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２または３種類の第２の液体培地と、第１の液体培地を収容する第１の収容部と、１、２または３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部とを備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートとを備える。好ましいカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬の組み合わせおよび濃度については上述した通りである。
【００７７】
別の実施形態として、多剤耐性菌検出キットは、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬を含む第１の液体培地と、カルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬およびフルオロキノロン系抗菌薬のうちの２つを含む１、２または３種類の第２の液体培地と、前記カルバペネム系抗菌薬、前記アミノ配糖体系抗菌薬、および前記フルオロキノロン系抗菌薬のうちの１つを含む１、２または３種類の第３の液体培地と、前記第１の液体培地を収容する第１の収容部と、前記１、２または第３種類の第２の液体培地を収容する第２の収容部と、１、２または３種類の第３の液体培地を収容する第３の収容部とを備えた多剤耐性菌スクリーニング用プレートとを備える。好ましいカルバペネム系抗菌薬、アミノ配糖体系抗菌薬、およびフルオロキノロン系抗菌薬の組み合わせおよび濃度については上述した通りである。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用液体培地または多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いた多剤耐性菌の検出方法を包含する。
【００７９】
本発明の検出方法は、本発明の液体培地を用いることによって特徴付けられる。本発明の検出方法の具体的な工程の例を以下に示す。
【００８０】
まず、被験菌の菌懸濁液を調製し、本発明のスクリーニング用培地に被験菌を接種する。
【００８１】
次に、被験菌を接種した培地を被験菌の発育に適した温度条件下（３５±２℃）で所定時間（１６時間〜２４時間）培養する。最後に、培養後の培地を観察し、被験菌の発育の有無を観察する。被験菌が多剤耐性菌の場合、発育が認められる。以上のように、本発明の検出方法は複雑高度な操作を要しない。また、従来の検出方法に比べ、格段に簡便で迅速な検出を可能にする。
【００８２】
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００８３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８４】
実施例１  緑膿菌（P. aeruginosa）を用いた多剤耐性菌スクリーニング用プレートの抗菌薬濃度の検討
（１）試験菌株
P. aeruginosa ２１株を用いた。内訳は、３剤耐性株１４株(No.１−１４)、２剤耐性株６株(No.１５−２０)、感性株１株(No.２１)である。
（２）試験方法
図１に示す配置でミュラーヒントンブイヨン（MHB）（栄研化学株式会社）にイミペネム（IPM）とシプロフロキサシン（CPFX）とアミカシン（AMK）を９６穴マイクロプレートのウエルに分注し、多剤耐性菌スクリーニング用プレートを作製した。なお、作製した多剤耐性菌スクリーニング用プレートは−７０℃で保存し、使用時に融解して用いた。薬剤濃度はP. aeruginosaに対する各薬剤のブレイクポイント濃度（IPM２μg/mL、CPFX１μg/mL、AMK１６μg/mL）を中心として２段階希釈を行った。多剤耐性菌スクリーニング用プレートの各ウエルに試験菌株を約５×１０5CFU/mLとなるように接種し、３５℃±２℃で１８時間培養後の最小発育阻止濃度（MIC）値の判定を行った。
（３）結果
結果を表1に示す。
【００８５】
IPM４μg/mL＋CPFX２μg/mL＋AMK３２μg/mLの組合せの濃度以上の濃度で、３剤耐性株の１４株（No.１−１４）の発育阻止が認められた半面、２剤耐性株の６株の中４株(No.１５−１８)ではIPM２μg/mL＋CPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mLの組合せの濃度で、２剤耐性株の中２株（Ｎｏ．１９−２０）ではIPM１μg/mL＋CPFX０．５μg/mL＋AMK８μg/mLの組合せの濃度で、および感性の１株ではIPM０．２５μg/mL＋CPFX ０．１２μg/mL＋AMK２μg/mLの組合せの濃度で発育阻止が認められた。
【００８６】
すなわち、IPM２μg/mL＋CPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mLのウエルで３剤耐性株は発育し、２剤耐性株および感性株は発育しない。このことから、３剤合剤を用いることにより３剤耐性緑膿菌と２剤耐性緑膿菌および感性株とを判別することが可能であった。
【００８７】
また、IPM４μg/mL＋CPFX２μg/mLの組合せの濃度以上の濃度で、２剤耐性株の中、AMK感性の５株（No.１５−１９）の発育阻止が認められた半面、２剤耐性株の中、IPM感性の１株（No.２０）および感性の１株ではIPM１μg/mL ＋CPFX０．５μg/mLで発育阻止が認められた。
【００８８】
すなわち、IPM２μg/mL＋CPFX１μg/mL以上のウエルでAMK感性の２剤耐性株は発育し、IPM感性の２剤耐性株および感性株は発育しない。このことから、IPMおよびCPFXの２剤合剤を用いることによりIPMおよびCPFXの２剤耐性緑膿菌とIPM感性の２剤耐性緑膿菌および感性株とを判別することが可能であった。
【００８９】
さらに、CPFX２μg/mL＋AMK３２μg/mLの組合せの濃度よりも大きい濃度で、２剤耐性株の中、IPM感性の１株（No.２０）の発育阻止が認められた半面、２剤耐性株の中、AMK感性の５株（No.１５−１９）ではCPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mL以下で、および感性の１株ではCPFX０．１２μg/mL＋AMK２μg/mLで発育阻止が認められた。
【００９０】
すなわち、CPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mLのウエルでIPM感性の２剤耐性株は発育し、AMK感性の２剤耐性株および感性株は発育しない。このことから、AMKおよびCPFXの２剤合剤を用いることによりAMKおよびCPFXの２剤耐性緑膿菌とAMK感性の２剤耐性緑膿菌および感性株とを判別することが可能であった。
【００９１】
このことより、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いることにより、３剤耐性株、２剤耐性株、および感性株を判別することが可能であることが確認された。
【００９２】
【表１】
2017055716.tif 000002
【００９３】
実施例２  試験用培地の異なる多剤耐性菌スクリーニング用プレートの検討
（１）試験菌株
P. aeruginosa  ３剤耐性株１０株(表２および表３：No.１−１０)と、P. aeruginosa以外の各種耐性菌４株（表４：No.１−４）、CLSI精度管理菌株３株(表４：No.５−７)を用いた。
（２）試験方法
ミュラーヒントンブイヨンのかわりにトリプトソイブイヨン培地（栄研化学株式会社）とNACブイヨン培地（栄研化学株式会社）を用い、図1の薬剤濃度で多剤耐性菌スクリーニング用プレートを作製した。実施例１と同様に、多剤耐性菌スクリーニング用プレートの各ウエルに試験菌株を約５×１０5CFU/mLとなるよう接種し、３５±２℃で１８時間培養後の最小発育阻止濃度値の判定を行った。
【００９４】
トリプトソイブイヨン培地は一般的な細菌の培養培地、NACブイヨン培地はP. aeruginosaの選択分離培地である。
（３）結果
結果を表２〜４に示す。
【００９５】
トリプトソイブイヨン培地（表２）では、IPM８〜３２μg/mL＋CPFX４〜１６μg/mL＋AMK６４〜２５６μg/mLで３剤耐性株の１０株の発育阻止が認められた。また、NACブイヨン培地（表３、４）では、IPM４〜１６μg/mL＋CPFX２〜８μg/mL＋AMK３２〜１２８μg/mLで３剤耐性株の１０株の発育阻止が認められた反面、各種耐性菌４株（表４：No.１−４）およびCLSI精度管理菌株３株(表４：No.５−７)の発育はいずれのウエルでも認められなかった。これは、NACブイヨン培地が緑膿菌の選択分離培地であることから、他の菌の発育を抑制したものと考えられる。
【００９６】
このことより、ミュラーヒントンブイヨン以外の培地を基礎培地に用いても本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートで３剤耐性株の検出が可能であることが確認された。
【００９７】
【表２】
2017055716.tif 000003
【００９８】
【表３】
2017055716.tif 000004
【００９９】
【表４】
2017055716.tif 000005
【０１００】
実施例３  多剤耐性菌スクリーニング用プレートに適用出来る抗菌薬の検討
（１）試験菌株
P. aeruginosa ３剤耐性株５株(No.１−５)を用いた。
（２）試験方法
実施例１の試験方法において、カルバペネム系薬剤としてメロペネム（MEPM）、フルオロキノロン系薬剤としてレボフロキサシン（LVFX）またはノルフロキサシン（NFLX）、アミノ配糖体系抗菌薬としてゲンタマイシン（GM）を選択し、多剤耐性菌スクリーニング用プレートを作製した。抗菌薬の配置はそれぞれ図２〜５に示す通りとした。実施例１と同様に、多剤耐性菌スクリーニング用プレートの各ウエルに試験菌株を約５×１０5CFU/mLとなるように接種し、３５±２℃で１８時間培養後のMIC値の判定を行った。
（３）結果
結果を表５−８に示す。
【０１０１】
MEPM、LVFXもしくはNFLX、またはGMを用いた場合でも実施例１と同様の結果が確認され、抗菌薬を換えた本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートで３剤耐性株の検出が可能であることが確認された。
【０１０２】
【表５】
2017055716.tif 000006
【０１０３】
【表６】
2017055716.tif 000007
【０１０４】
【表７】
2017055716.tif 000008
【０１０５】
【表８】
2017055716.tif 000009
【０１０６】
実施例４  アシネトバクター（A.baumannii）を用いた多剤耐性菌スクリーニング用プレートの抗菌薬濃度の検討
（１）試験菌株
A.baumannii ７株を用いた。内訳は、３剤耐性株２株（No.１、２）、２剤耐性株３株（No.３、４、および５）、単剤耐性株２株（No.６、７）である。
（２）試験方法
図1に示す配置でミュラーヒントンブイヨン（MHB）（栄研化学株式会社）にイミペネム（IPM）とシプロフロキサシン（CPFX）とアミカシン（AMK）を96穴マイクロプレートのウエルに分注し、多剤耐性菌スクリーニング用プレートを作製した。なお、作製した多剤耐性菌スクリーニング用プレートは−７０℃で保存し、使用時に融解して用いた。薬剤濃度はA.baumanniiに対する各薬剤のブレイクポイント濃度（IPM２μg/mL、CPFX１μg/mL、AMK １６μg/mL）を中心として２段階希釈を行った。多剤耐性菌スクリーニング用プレートの各ウエルに試験菌株を約５×１０5CFU/mLとなるように接種し、３５℃±２℃で２２時間培養後の最小発育阻止濃度（MIC）値の判定を行った。
（３）結果
結果を表９に示す。
【０１０７】
IPM４μg/mL＋CPFX２μg/mL＋AMK３２μg/mLの組合せの濃度以上の濃度で、３剤耐性株の２株（No.１、２）の発育阻止が認められた半面、２剤耐性株の３株の中２株(No.３、５)ではIPM１μg/mL＋CPFX０．５μg/mL＋AMK８μg/mLの組合せの濃度で、２剤耐性株の中1株（No.４）ではIPM０．２５μg/mL＋CPFX０．１２μg/mL＋AMK２μg/mLの組合せの濃度で、および単剤耐性株の２株ではIPM０．１２〜０．２５μg/mL＋CPFX０．０６〜０．１２μg/mL＋AMK１〜２μg/mLの組合せの濃度で発育阻止が認められた。
【０１０８】
すなわち、IPM２μg/mL＋CPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mL以上のウエルで３剤耐性株は発育し、２剤耐性株および感性株は発育しない。このことから、３剤合剤を用いることにより３剤耐性アシネトバクターと２剤耐性アシネトバクターおよび単剤耐性アシネトバクターとを判別することが可能であった。
【０１０９】
また、IPM４μg/mL＋AMK３２μg/mLの組合せの濃度で、２剤耐性株の中、CPFX感性株（No.３）の発育阻止が認められた半面、その他の２剤耐性株（No.４、５）および単剤耐性株（No. ６、７）ではIPM０．１２〜１μg/mL＋AMK１〜８μg/mLで発育阻止が認められた。
【０１１０】
すなわち、IPM２μg/mL＋AMK１６μg/mLのウエルでCPFX感性の２剤耐性株は発育し、その他の２剤耐性株および単剤耐性株は発育しない。このことから、IPMおよびAMKの２剤合剤を用いることによりCPFX感性の２剤耐性アシネトバクターとその他の２剤耐性アシネトバクターおよび単剤耐性アシネトバクターとを判別することが可能であった。
【０１１１】
また、IPM４μg/mL＋CPFX２μg/mLの組合せの濃度で、２剤耐性株の中、AMK感性株（No.４）の発育阻止が認められた半面、その他の２剤耐性株（No.３、５）および単剤耐性株（No.６、７）ではIPM０．２５〜２μg/mL＋CPFX０．１２〜１μg/mLで発育阻止が認められた。
【０１１２】
すなわち、IPM２μg/mL＋CPFX１μg/mLのウエルでAMK感性の２剤耐性株は発育し、その他の２剤耐性株および単剤耐性株は発育しない。このことから、IPMおよびCPFXの２剤合剤を用いることによりAMK感性の２剤耐性アシネトバクターとその他の２剤耐性アシネトバクターおよび単剤耐性アシネトバクターとを判別することが可能であった。
【０１１３】
さらに、CPFX２μg/mL＋AMK３２μg/mLの組合せの濃度で、２剤耐性株の中、IPM感性株（No.５）の発育阻止が認められた半面、その他の２剤耐性株（No.３、４）および単剤耐性株（No.６、７）ではCPFX０．０６〜０．５μg/mL＋AMK１〜８μg/mLで発育阻止が認められた。
【０１１４】
すなわち、CPFX１μg/mL＋AMK１６μg/mLでIPM感性の２剤耐性株は発育し、その他の２剤耐性株および単剤耐性株は発育しない。このことから、CPFXおよびAMKの２剤合剤を用いることによりIPM感性の２剤耐性アシネトバクターとその他の２剤耐性アシネトバクターおよび単剤耐性アシネトバクターとを判別することが可能であった。
【０１１５】
このことより、本発明の多剤耐性菌スクリーニング用プレートを用いることにより３剤耐性株、２剤耐性株および感性株を判別することが可能であることが確認された。
【０１１６】
【表９】
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【図１】
2017055716.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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