(57)【要約】【課題】全血に含まれる標的物質を良好に分離し得るゲル電気泳動装置およびゲル電気泳動方法を提供する。【解決手段】ウェル２０、第１バッファータンク３０、支持部、第２バッファータンク５０、第３バッファータンク３０および電源部７０を有するゲル電気泳動装置である。ウェル２０は、全血９０が配置される。支持部は、泳動ゲル２２が載置され、泳動ゲル２２の一端がウェル２０の他端に連通するように設けられる。第３バッファータンク６０は、第３電極６２が配置され、貯留される第３緩衝液６４が泳動ゲル２２における一端と他端との間の中間部位２３に連通するように設けられる。電源部７０は、第１電極３２と第２電極５２とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、泳動ゲル２２に侵入できずにウェル２０の他端に堆積した全血９０に含まれる血球により阻害されると、第１電極３２と第２電極５２とに対する電圧印加を停止し、第２電極５２と第３電極６２とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させる。【選択図】図１１
2017078571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離するためのゲル電気泳動装置であって、
検体として前記全血が配置されるウェルと、
第１電極が配置され、貯留される第１緩衝液が前記ウェルの一端に連通するように設けられる第１バッファータンクと、
泳動ゲルが載置され、前記泳動ゲルの一端が前記ウェルの他端に連通するように設けられる支持部と、
第２電極が配置され、貯留される第２緩衝液が前記泳動ゲルの他端に連通するように設けられる第２バッファータンクと、
第３電極が配置され、貯留される第３緩衝液が前記泳動ゲルにおける一端と他端との間の中間部位に連通するように設けられる第３バッファータンクと、
前記第１〜第３電極に対する電圧印加を制御する電源部と、を有し、
前記電源部は、
前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を停止し、前記第２電極と前記第３電極とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させることを特徴とするゲル電気泳動装置。
【請求項２】
前記泳動ゲルは、前記泳動ゲルの一端側に位置する導入ゲルと、前記泳動ゲルの他端側に位置する分離ゲルと、を有し、
前記導入ゲルは、前記ウェルの他端と連通しており、前記泳動ゲルの前記中間部位を構成し、
前記分離ゲルは、前記第２緩衝液と連通しており
前記導入ゲルのゲル濃度は、前記分離ゲルのゲル濃度より小さいことを特徴とする請求項１に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項３】
前記ウェルの一端と前記第１緩衝液との間に介在される後方ゲルを、さらに有し、
前記後方ゲルは、前記ウェルに配置される前記全血が前記第１緩衝液側に侵入することを抑制することを特徴とする請求項２に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項４】
前記標的物質の分離は、前記標的物質およびレセプターの複合体と、遊離レセプターとの分子量の差により生じる電気泳動の移動度の差に基づいており、
前記レセプターとして、前記標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上が用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項５】
前記標的物質の分子量は１０００〜３００００であることを特徴とする請求項４に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項６】
前記標的物質の分子量は、前記レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項７】
前記第３バッファータンクに配置される第４電極をさらに有し、
前記電源部は、
前記第４電極に対する電圧印加を制御するように構成されており、
前記第１電極と前記第４電極とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第４電極とに対する電圧印加を停止し、前記第２電極と前記第３電極とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲル電気泳動装置。
【請求項８】
全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離するためのゲル電気泳動方法であって、
第１電極が配置される第１バッファータンクに貯留される第１緩衝液が連通する一端と、支持部に載置される泳動ゲルの一端が連通する他端と、を有するウェルに、検体として前記全血を配置し、
前記第１電極と、貯留される第２緩衝液が前記泳動ゲルの他端に連通するように設けられる第２バッファータンクに配置される第２電極と、に対して、電圧印加を実行し、
前記電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を停止し、
前記第２電極と、貯留される第３緩衝液が前記泳動ゲルにおける一端と他端との間の中間部位に連通するように設けられる第３バッファータンクに配置される第３電極と、に対して、電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる
ことを特徴とするゲル電気泳動方法。
【請求項９】
前記泳動ゲルは、前記泳動ゲルの一端側に位置する導入ゲルと、前記泳動ゲルの他端側に位置する分離ゲルと、を有し、
前記導入ゲルは、前記ウェルの他端と連通しており、前記泳動ゲルの前記中間部位を構成し、
前記分離ゲルは、前記第２緩衝液と連通しており
前記導入ゲルのゲル濃度は、前記分離ゲルのゲル濃度より小さいことを特徴とする請求項８に記載のゲル電気泳動方法。
【請求項１０】
前記ウェルの一端と前第１緩衝液との間に介在される後方ゲルを、さらに有し、
前記後方ゲルは、前記ウェルに配置される前記全血が前記第１緩衝液側に侵入することを抑制することを特徴とする請求項９に記載のゲル電気泳動方法。
【請求項１１】
前記標的物質の分離は、前記標的物質およびレセプターの複合体と、遊離レセプターとの分子量の差により生じる電気泳動の移動度の差に基づいており、
前記レセプターとして、前記標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上が用いられることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載のゲル電気泳動方法。
【請求項１２】
前記標的物質の分子量は１０００〜３００００であることを特徴とする請求項１１に記載のゲル電気泳動方法。
【請求項１３】
前記標的物質の分子量は、前記レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であることを特徴とする請求項１１又は請求項１２に記載のゲル電気泳動方法。
【請求項１４】
前記第３バッファータンクには、第４電極がさらに配置されており、
前記第１電極と前記第４電極とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第４電極とに対する電圧印加を停止し、前記第２電極と前記第３電極とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載のゲル電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル電気泳動装置およびゲル電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するペプチドは、疾患により存在量が変化するものがあり、特定の疾患のマーカーとしての利用可能性を有する。例えば、血中Ｃ−ペプチドは、インスリンが合成される前段階の物質であるプロインスリンの構成物質であり、インスリンと同程度の割合で血液中に分泌され、ほとんどが分解されないまま血液中を循環し、尿とともに排出される。このため、血中のＣ−ペプチドを測定し、インスリンの分泌量を把握することにより、疾患を診断することが可能である。
【０００３】
Ｃ−ペプチドのような抗原を測定する方法として、核酸とタンパク質との特異的結合を利用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）が挙げられる（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇａｒｎｅｒ，  Ｍ．Ｍ．及びＲｅｖｚｉｎ，  Ａ．、「特異的ＤＮＡ領域へのタンパク質結合の定量に関するゲル電気泳動法：大腸菌ラクトースオペロン調節システムの構成要素への適用」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：３０４７−３０６０  （１９８１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、核酸をゲル電気泳動させると分子ふるい効果が働き、核酸の分子量に応じた位置にバンドが出現するが、検体として全血を適用とする場合、問題を生じる。例えば、全血を電気泳動させると、全血に含まれる血球がウェルに詰まって電気の流れを妨害し、その結果、電気泳動が阻害されて分離性能が低下する虞が存在する。
【０００６】
本発明は、上記従来技術に伴う課題を解決するためになされたものであり、全血に含まれる標的物質を良好に分離し得るゲル電気泳動装置およびゲル電気泳動方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するための本発明の一様相は、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離するためのゲル電気泳動装置である。前記ゲル電気泳動装置は、検体としての前記全血が配置されるウェルと、第１電極が配置され、貯留される第１緩衝液が前記ウェルの一端に連通するように設けられる第１バッファータンクと、泳動ゲルが載置され、前記泳動ゲルの一端が前記ウェルの他端に連通するように設けられる支持部と、第２電極が配置され、貯留される第２緩衝液が前記泳動ゲルの他端に連通するように設けられる第２バッファータンクと、第３電極が配置され、貯留される第３緩衝液が前記泳動ゲルにおける一端と他端との間の中間部位に連通するように設けられる第３バッファータンクと、前記第１〜第３電極に対する電圧印加を制御する電源部と、を有する。そして、前記電源部は、前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を停止し、前記第２電極と前記第３電極とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させる。
【０００８】
上記目的を達成するための本発明の別の様相は、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離するためのゲル電気泳動方法である。前記ゲル電気泳動方法においては、第１電極が配置される第１バッファータンクに貯留される第１緩衝液が連通する一端と、支持部に載置される泳動ゲルの一端が連通する他端と、を有するウェルに、検体として前記全血を配置し、前記第１電極と、貯留される第２緩衝液が前記泳動ゲルの他端に連通するように設けられる第２バッファータンクに配置される第２電極と、に対して、電圧印加を実行し、前記電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、前記泳動ゲルに侵入できずに前記ウェルの他端に堆積した前記全血に含まれる血球により阻害されると、前記第１電極と前記第２電極とに対する電圧印加を停止し、前記第２電極と、貯留される第３緩衝液が前記泳動ゲルにおける一端と他端との間の中間部位に連通するように設けられる第３バッファータンクに配置される第３電極と、に対して、電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離する際、泳動ゲル内に侵入できない血球の堆積により電気泳動が阻害されると、電圧印加される電極対が、第１および第２電極から第２および第３電極に切り替えられて、電気泳動が再開される。第２電極が配置される第２バッファータンクに貯留される第２緩衝液は、ウェルの逆側に位置する泳動ゲルの他端に連通するように設けられており、また、第３電極が配置される第３バッファータンクに貯留される第３緩衝液が連通している泳動ゲルの中間部位は、電気泳動を阻害する血球が堆積していない。したがって、第２および第３電極の電圧印加機能は、堆積した血球によって干渉されない。そのため、第２および第３電極に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、泳動ゲルに移動（侵入）済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。つまり、全血に含まれる標的物質を良好に分離し得るゲル電気泳動装置およびゲル電気泳動方法を提供することが可能である。
【００１０】
泳動ゲルが、泳動ゲルの一端側に位置する導入ゲルと、泳動ゲルの他端側に位置する分離ゲルと、を有し、導入ゲルが、ウェルの他端と連通しており、泳動ゲルの前記中間部位を構成し、分離ゲルが、第２緩衝液と連通しており、導入ゲルのゲル濃度が、分離ゲルのゲル濃度より小さい場合、血球が堆積して電気泳動を阻害するまでに（第１電極と第２電極とに対する電圧印加を停止するまでに）、全血に含まれる標的物質を、導入ゲル側に効率よく移動させることが可能である。
【００１１】
ウェルの一端と第１緩衝液との間に、後方ゲルを介在させる場合、ウェルに配置される全血が第１緩衝液側に侵入することを抑制することが可能である。
【００１２】
標的物質の分離を、標的物質およびレセプターの複合体と、遊離レセプターとの分子量の差により生じる電気泳動の移動度の差に基づいて行い、かつ、レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる場合、標的物質を高精度で分離および定量することが可能である。
【００１３】
標的物質の分子量は、１０００〜３００００であることが好ましく、この場合、レセプターを２種以上用いた効果がより発揮される。
【００１４】
標的物質の分子量は、レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であることが好ましく、この場合、電気泳動における移動度の差が効果的に生じ、標的物質−レセプターの複合体と、遊離レセプターとを簡便に精度よく分離することが可能である。
【００１５】
電気泳動に適用される電極は３つに限定されず、例えば、第３バッファータンクに、第４電極を配置することも可能である。この場合、電源部は、第４電極に対する電圧印加をさらに制御するように構成されており、第１電極と第４電極とに対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、泳動ゲルに侵入できずにウェルの他端に堆積した全血に含まれる血球により阻害されると、第１電極と第４電極とに対する電圧印加を停止し、第２電極と第３電極とに対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させることによって、標的物質を良好に分離することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動装置を説明するための平面図である。
【図２】図１に示される装置本体部を説明するための斜視図である。
【図３】図１に示される装置本体部を説明するための断面図である。
【図４】図１に示される装置本体部の下部を説明するための斜視図である。
【図５】図１に示される装置本体部の下部を説明するための平面図である。
【図６】全血に含まれる血球による電気泳動の阻害を説明するための概略図である。
【図７】本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動方法を説明するためのフローチャートである。
【図８】図７に示される電極接続工程を説明するための概念図である。
【図９】図７に示される第１電気泳動工程を説明するための概念図である。
【図１０】図７に示される電極変更工程を説明するための概念図である。
【図１１】図７に示される第２電気泳動工程を説明するための概念図である。
【図１２】サンプル１〜４に係る電気泳動写真である。
【図１３】サンプル１に係る電気泳動写真の要部拡大図である。
【図１４】サンプル２に係る電気泳動写真の要部拡大図である。
【図１５】本発明の実施の形態に係る変形例１を説明するための概略図である。
【図１６】変形例１に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図である。
【図１７】本発明の実施の形態に係る変形例２を説明するための概略図である。
【図１８】変形例３に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図である。
【図１９】本発明の実施の形態に係る変形例３を説明するための概略図である。
【図２０】変形例３に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しつつ説明する。
【００１８】
図１は、本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動装置を説明するための平面図、図２および図３は、図１に示される装置本体部を説明するための斜視図および断面図、図４および図５は、図１に示される装置本体部の下部を説明するための斜視図および平面図、図６は、全血に含まれる血球による電気泳動の阻害を説明するための概略図である。
【００１９】
本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動装置１０は、全血に含まれる標的物質を分離するために用いられ、図１〜図５に示されるように、装置本体部１２および電源部７０を有し、装置本体部１２は、ウェル２０、第１バッファータンク３０、支持部４０、第２バッファータンク５０、第３バッファータンク６０を有する。
【００２０】
ウェル２０は、検体としての全血が配置されるセルである（図５参照）。
【００２１】
第１バッファータンク３０は、カソードである第１電極３２が配置され、第１緩衝液３４が貯留される。第１緩衝液は、ウェル２０の一端に連通するように設けられる。
【００２２】
支持部４０は、ウェル２０、泳動ゲル２２および後方ゲル２６が載置されるレーンであり、本実施の形態においては、２つ設置されている（図４および図５参照）。
【００２３】
後方ゲル２６は、ウェル２０の一端と第１緩衝液３４との間に介在され、ウェル２０に配置された全血が、第１緩衝液側（第１バッファータンク側）に侵入することを抑制するために設けられている。後方ゲル２６のゲル濃度は、例えば、４％ゲルである。
【００２４】
泳動ゲル２２は、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離する部材であり、導入ゲル２３および分離ゲル２４を有する。導入ゲル２３は、泳動ゲル２２の一端側に位置し、ウェル２０の他端と連通し、泳動ゲル２２における一端と他端との間の中間部位を構成しており、電気泳動の初期において全血に含まれる標的物質が移動（侵入）する部位である。分離ゲル２４は、泳動ゲル２２の他端側に位置し、第２緩衝液と連通しており、導入ゲル２３に移動（侵入）した標的物質を分離する部位である。導入ゲル２３のゲル濃度は、分離ゲル２４より小さくなるように設定されている。例えば、泳動ゲル２２は、７％ゲルであり、導入ゲル２３は、４％ゲルである。
【００２５】
第２バッファータンク５０は、アノードである第２電極５２が配置され、第２緩衝液５４が貯留される。第２緩衝液５４は、泳動ゲル２２の他端に連通するように設けられる。
【００２６】
第３バッファータンク６０は、第２のカソードである第３電極６２が配置され、第３緩衝液６４が貯留される。また、第３バッファータンク６０は、支持部４０の上方に位置し、貫通孔６６を有する（図１および図３参照）。貫通孔６６は、導入ゲル２３に位置合せされている。したがって、第３緩衝液６４は、貫通孔６６を経由し、導入ゲル２３に連通することとなる。
【００２７】
電源部７０は、第１〜第３電極３２，５２，６２に対する電圧印加を制御するために設けられており、電源７２、電気回路７４およびスイッチング機構７６を有する（図１参照）。電気回路７４は、第１〜第３電極３２，５２，６２が電源７２と接続可能に構成されている。スイッチング機構７６は、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加と、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加とを切り替えるために設けられている。
【００２８】
例えば、印加電圧は５〜２０００Ｖ／ｃｍであり、電気泳動温度は、室温（２０〜２５℃）である。電気泳動時間は、３０〜１８０分であるが、迅速な分離という観点からは、数分〜１０分程度であることが好ましい。
【００２９】
全血９０に含まれる血球９２は、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加を実行すると、導入ゲル２３に向かって泳動する。そのため、電気泳動を開始して例えば３〜４分経過すると、導入ゲル２３内に侵入できない血球９２がウェル２０の他端（ウェル２０と導入ゲル２３との境界）に堆積し（図６参照）、電気の流れを妨害し、その結果、電気泳動が阻害されて分離性能が低下する虞が存在する。
【００３０】
そのため、電源部７０は、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加を実行することによって開始された電気泳動が、堆積した血球９２により阻害されると、スイッチング機構７６を利用して、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加を停止し、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加を実行することによって、電気泳動を再開させるように設定される。
【００３１】
第２電極５２が配置される第２バッファータンク５０に貯留される第２緩衝液５４は、ウェル２０に対して逆側に位置する泳動ゲル２２の他端に、連通するように設けられている。第３電極６２が配置される第３バッファータンク６０に貯留される第３緩衝液６４が連通している導入ゲル（泳動ゲル２２の中間部位）２４には、電気泳動を阻害する血球９２が堆積していない。したがって、第２および第３電極５２，６２の電圧印加機能は、堆積している血球９２によって干渉されず、第２および第３電極５２，６２に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、泳動ゲル２２に移動済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。つまり、全血に含まれる標的物質を良好に分離することが可能である。
【００３２】
なお、導入ゲル２３のゲル濃度は、分離ゲル２４より小さくなるように設定されているため、血球９２が堆積して電気泳動を阻害するまでに（第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加を停止するまでに）、全血９０に含まれる標的物質を、導入ゲル側に効率よく移動させることが可能である。
【００３３】
電気泳動法は、例えば、アガロースゲル電気泳動、パルスフィールド電気泳動（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＰＦＧＥ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＰＡＧＥ）等のゲル電気泳動を適用することが可能である。また、透明性が高く、電気的に中性であることから、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することが好ましい。
【００３４】
第１〜第３緩衝液３４，５４，６４および泳動ゲル２２に使用される緩衝液は、特に限定されず、必要に応じて適宜選択され、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、その塩類等を含有する溶液や、グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、その塩類等を含有する溶液である。具体的な緩衝液は、例えば、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝溶液、ＭＯＳＰ緩衝溶液である。
【００３５】
次に、電気泳動により全血から分離させる標的物質について説明する。
【００３６】
標的物質は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、低分子化合物（好ましくは、分子量が１ｋＤａ以下の低分子化合物）およびこれらの複合体である。本明細書において、タンパク質またはペプチドには、遊離体、リン酸基、メチル基、アセチル基、糖鎖、脂質、ニトリル基等の修飾を受けた修飾体、酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩、核酸と結合している核タンパク質など他の物質と結合しているタンパク質またはペプチドが含まれる。
【００３７】
標的物質の具体例は、インスリン、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチドー１）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、Ｈ−ＦＡＢＰ（心筋型脂肪酸結合タンパク質）、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド）等のタンパク質である。
【００３８】
標的物質が、何らかの疾患に関与するマーカーである場合、臨床検査において非常に有用な手段となる。例えば、標的物質がＣ−ペプチドの場合、疾患として、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などが挙げられる。
【００３９】
Ｃ−ペプチドは、３１個のアミノ酸からなるペプチドであり、インスリン前駆物質であるプロインスリンの構成成分である。Ｃ−ペプチドはプロインスリンがエンドペプチダーゼにより切断されインスリンが血中へ放出される際に、分解産物として同時に放出される。したがって、Ｃ−ペプチドは、インスリンの分泌動態の指標としての役割を果たし、血中Ｃ−ペプチドの動態は糖尿病患者等の内因性インスリンの分泌能を調べるために重要な指標となり得る。したがって、健常者の値と比較し、被験者のＣ−ペプチド量が高ければ、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群などに罹患している可能性があり、被験者のＣ−ペプチド量が低ければ、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などに罹患している可能性があるとの判断を行うことができる。
【００４０】
次に、標的物質の分離および定量について説明する。
【００４１】
標的物質を高精度で分離および定量するため、標的物質に特異的に結合する物質（レセプター）を利用することが可能である。この場合、電気泳動に用いる検体は、標的物質（例えば、抗原）と、標的物質に特異的に結合するレセプター（例えば、抗体）とを結合させる反応（例えば、抗原抗体反応）を行った後の全血であり、標的物質の分離は、標的物質およびレセプターの複合体と、遊離レセプターとの分子量の差により生じる電気泳動の移動度に差に基づいている。電気泳動による標的物質−レセプター複合体の検出は、ヘテロジニアス測定系の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などと比べて非常に簡便な操作で精度よく検出できるため、非常に有用な手段である。
【００４２】
標的物質−レセプター複合体には、すべてのレセプターが標的物質と結合した複合体と、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体と、が存在する。このうち、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体では分子量の差により、複合体と遊離レセプターとを分離できない場合がある。したがって、可能な限りすべてのレセプターが標的物質と結合して複合体を形成することが好ましい。
【００４３】
レセプターは、例えば、抗体、抗原との結合活性を有する抗体の断片（抗体フラグメント）、ＤＮＡアプタマー等の核酸、タンパク質、タンパク質で構成された受容体、バインディングプロテイン、ペプチド、生体レセプター、糖鎖である。抗体または抗体の断片は、標的物質（抗原）との特異的結合性が高いことから、好ましい。
【００４４】
抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体である。抗原への特異的結合性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。
【００４５】
標的物質と、標的物質に特異的に結合するレセプターとは、混合して反応させる。抗原抗体反応の条件を挙げると、反応温度は４〜５０℃、反応時間は５分間〜２４時間である。反応溶媒は、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝溶液、トリシン緩衝液である。なお、例えば、ウェル２０に配置する前の全血にレセプターを添加混合するように構成したり、ウェル２０にレセプターを予め配置しておき、全血をウェル２０に配置する際に混合されるように構成したりすることによって、標的物質とレセプターとを、反応させることが可能である。
【００４６】
一般的に、低分子量の標的物質に比較的大きな分子量を有する（それぞれ別の部位を認識する）レセプターを２種以上結合させた場合、標的物質に結合するレセプター同士が非常に近接した状態となるため、立体的に不安定な状態で、標的物質−レセプター複合体が電気泳動に耐えうる安定性を有していないことが推測される。すなわち、電気泳動の際にレセプターの少なくとも１種が標的物質から外れる可能性がある。この場合、電気泳動で検出される対象としては、１種のレセプターが結合する標的物質となり、レセプター遊離体のシグナルと、１種のレセプターが結合する標的物質のシグナルとが分離できず、標的物質の濃度を精度よく測定できない。
【００４７】
一方、標的物質が低分子量である場合、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識するレセプターを２種以上用いても、標的物質−レセプター複合体が電気泳動の際に安定に存在するため、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを、電気泳動により明確に分離することができる。したがって、標的物質の分子量は、レセプターを２種以上用いた効果をより発揮するという観点からは、１０００〜３００００であることが好ましく、１０００〜１００００であることがより好ましく、１０００〜５０００であることがさらに好ましい。
【００４８】
標的物質の分子量は、レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であるのが好ましい。この場合、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとの分子量の差に基づいて、電気泳動における移動度の差が効果的に生じ、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとを簡便に精度よく分離できるためである。
【００４９】
緩衝液のｐＨは、レセプターが標的物質結合活性を維持しかつ負に帯電する環境下における試薬の安定性、反応性などを考慮すると、中性〜弱塩基性付近つまり６〜９であることが好ましい。
【００５０】
次に、標的物質−レセプター複合体および遊離レセプターを検出する方法を説明する。
【００５１】
電気泳動後の泳動ゲル（分離ゲル）において、標的物質−レセプター複合体および遊離レセプターを検出する方法は、例えば、ゲル染色である。レセプターがタンパク質である場合の染色方法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法、銀染色法や、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製）、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）などの色素を用いた染色法などが挙げられる。
【００５２】
標的物質の定量は、例えば、染色法により得られたバンドの色素のシグナル強度（染色の濃さ）に基づいて実行される。例えば、電気泳動後の染色（例えば、銀染色）の結果より、標的物質−レセプター複合体のバンドが検出される。当該バンドの色素のシグナル強度は、標的物質量に比例する。したがって、予め測定した標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度について、標的物質量との検量線を作成することができ、当該検量線に基づいて、検出された標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度を比較することで、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。バンドの色素のシグナル強度は、ｉｍａｇｅＪ、ＮＩＨｉｍａｇｅ、ＳＣＩＯＮｉｍａｇｅ等の画像解析ソフトウェアによって算出することが可能である。
【００５３】
標的物質の定量は、標識物質を利用して標的物質−レセプター複合体を可視化することに基づいて実行することも可能であり、例えば、標識物質を利用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）等を適用することが可能である。この際、直接法および間接法を適用することが可能である。直接法は、標的物質に直接反応する一次レセプター（例えば、一次抗体）を標識とするものである。間接法は、一次レセプター（例えば、一次抗体）を用いて１度目の標的物質−レセプター結合反応（例えば、抗原抗体反応）を行い、一次レセプター（一次抗体）自体を標的物質（例えば、抗原）とする別のレセプター（二次レセプター）（例えば、抗体（二次抗体））を標識とするものである。
【００５４】
標識に用いられる標識物質は、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（Ｌｉｆｅ社）、Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｏｕｒ（Ａｎａ  ｓｐｅｃ社）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ社）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えばセイヨウペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼまたはフィコエリトリン等の酵素、アクリジニウムエステルなどの化学物質である。
【００５５】
次に、本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動方法を説明する。
【００５６】
図７は、本発明の実施の形態に係るゲル電気泳動方法を説明するためのフローチャート、図８、図９、図１０および図１１は、図７に示される電極接続工程、第１電気泳動工程、電極変更工程および第２電気泳動工程を説明するための概念図である。
【００５７】
本実施の形態に係るゲル電気泳動方法は、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離するために使用され、図７に示されるように、検体配置工程、電極接続工程、第１電気泳動工程、電極変更工程および第２電気泳動工程を有する。
【００５８】
検体配置工程においては、全血９０がウェル２０に配置される。これにより、全血９０は、後方ゲル２６を介して第１緩衝液３４と連通され、泳動ゲル２２（導入ゲル２３および分離ゲル２４）を介して第２緩衝液５４と連通される。
【００５９】
電極接続工程においては、図８に示されるように、スイッチング機構７６が制御され、電源７２と第１および第２電極３２，５２とが接続され、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加が可能に設定される。
【００６０】
第１電気泳動工程においては、図８に示されるように、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加が開始され、全血９０に含まれる標的物質および血球９２は、導入ゲル２３に向かって泳動する。この際、標的物質は、泳動ゲル２２（導入ゲル２３）に移動する一方、血球９２は、ウェル２０の他端（ウェル２０と導入ゲル２３との境界）に堆積し、電気の流れを妨害し、その結果、電気泳動を阻害する（図６参照）。
【００６１】
電極変更工程においては、電気泳動の阻害に対処するため、図１０に示されるように、スイッチング機構７６を制御することにより、電源７２と第１および第２電極３２，５２との接続を解除し、第１および第２電極３２，５２に対する電圧印加を停止し、また、電源７２と第２および第３電極５２，６２とを接続することで、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加が可能に設定される。
【００６２】
第２電気泳動工程においては、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加が開始される。第３電極６２が配置され第３バッファータンク６０に貯留される第３緩衝液６４は、導入ゲル２３に連通しているため、図１１に示されるように、泳動ゲル２２（導入ゲル２３および分離ゲル２４）における電気泳動が正常に再開される。つまり、導入ゲル２３には、電気泳動を阻害する血球９２が堆積していないため、第２および第３電極５２，６２に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、泳動ゲル２２に移動済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。
【００６３】
次に、ゲル電気泳動による標的物質の分離結果を説明する。
【００６４】
図１２は、サンプル１〜４に係る電気泳動写真、図１３および図１４は、サンプル１およびサンプル２に係る電気泳動写真の要部拡大図である。
【００６５】
標的物質は、全血に含まれるＣ−ｐｅｐｔｉｄｅである。全血は、空腹時のものであり、６μＬを使用した。
【００６６】
サンプル１およびサンプル２は、本実施の形態に係り、電気泳動の途中において、電極対を第１および第２電極から第２および第３電極に切り替えて、電気泳動を再開した点で共通であるが、サンプル１は、全血を検体としてそのまま適用し、サンプル２は、全血に含まれるＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ濃度を、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ標品（和光純薬工業株式会社）を添加することで、＋２．４ｎｇ／ｍＬ上昇するように調整している。
【００６７】
サンプル３およびサンプル４は、比較例に係り、電極対の切り替えを行っていない点で共通であるが、サンプル３は、全血を検体としてそのまま適用し、サンプル４は、全血に含まれるＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ濃度を、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ標品（和光純薬工業株式会社）を添加することで、＋２．４ｎｇ／ｍＬ上昇するように調整している。
【００６８】
可視化は、Ａｎｔｉ−ｈ−Ｃｐｅｐｔｉｄｅ９１０１（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）に蛍光物質ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（エムエステクノ株式会社）を標識して実施し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）イメージングシステム（エムエステクノ株式会社）によって検出した。
【００６９】
図１２に示されるように、比較例に係るサンプル３およびサンプル４においては、泳動像が乱れており、複合体バンドや未反応の標識抗体バンドが良好に分離されなかった。一方、本実施の形態に係るサンプル１においては、図１３に明確に示されるように、未反応の標識抗体バンドが良好に分離されている。また、本実施の形態に係るサンプル２においては、図１４に明確に示されるように、複合体バンドおよび未反応の標識抗体バンドが良好に分離されている。これにより、電気泳動の途中において電極対を切り替えることが、全血の分析に有効であることが示された。
【００７０】
次に、本実施の形態に係る変形例１〜３を順次説明する。
【００７１】
図１５は、本発明の実施の形態に係る変形例１を説明するための概略図、図１６は、変形例１に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図、図１７は、本発明の実施の形態に係る変形例２を説明するための概略図、図１８は、変形例３に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図である。
【００７２】
第３電極６２（第３バッファータンク６０）は、第１電極３２（第１バッファータンク３０）と第２電極５２（第２バッファータンク５０）との間に配置する形態に限定されず、必要に応じて、その配置形態を種々改変することが可能である。
【００７３】
例えば、第３電極６２（第３バッファータンク６０）は、図１５に示されるように、第１電極３２（第１バッファータンク３０）に関して、第２電極５２（第２バッファータンク５０）の逆側に配置することも可能である。この場合においても、第２電気泳動工程において、図１６に示されるように、第２および第３電極５２，６２に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、導入ゲル２３に電気泳動を阻害する血球９２が堆積していないため、導入ゲル２３に移動済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。
【００７４】
また、第３電極６２（第３バッファータンク６０）は、図１７に示されるように、第１電極３２（第１バッファータンク３０）に対して並置することも可能である。この場合においても、第２電気泳動工程において、図１８に示されるように、第２および第３電極５２，６２に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、導入ゲル２３に電気泳動を阻害する血球９２が堆積していないため、導入ゲル２３に移動済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。
【００７５】
図１９は、本発明の実施の形態に係る変形例３を説明するための概略図、図２０は、変形例３に係る第２電気泳動工程を説明するための概略図である。
【００７６】
電気泳動に適用される電極は３つに限定されず、例えば、第３バッファータンク６０に、第２のアノードである第４電極６８を配置することも可能である。この場合、電源部７０は、第４電極６８に対する電圧印加を制御するように構成される。
【００７７】
具体的には、図１９に示されるように、電源部７０は、電源７２，７３、電気回路７４，７５およびスイッチング機構７６，７７を有する。電源７２、電気回路７４およびスイッチング機構７６は、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加を制御するために使用される。電源７３、電気回路７５およびスイッチング機構７７は、第１および第４電極３２，６８に対する電圧印加を制御するために使用される。
【００７８】
次に、変形例３に係るゲル電気泳動方法を説明する。
【００７９】
検体配置工程においては、全血９０がウェル２０に配置される。これにより、全血９０は、後方ゲル２６を介して第１緩衝液３４と連通され、導入ゲル２３を介して第３緩衝液６４と連通される。
【００８０】
電極接続工程においては、スイッチング機構７７が制御され、電源７３と第１および第４電極３２，６８とが接続され、第１および第４電極３２，６８に対する電圧印加が可能に設定される。この際、電源７２と第２および第３電極５２，６２とは、接続されていない。
【００８１】
第１電気泳動工程においては、第１および第４電極３２，６８に対する電圧印加が開始され、全血９０に含まれる標的物質および血球９２は、導入ゲル２３に向かって泳動する（図１９参照）。この際、標的物質は、泳動ゲル２２（導入ゲル２３）に移動する一方、血球９２は、ウェル２０の他端（ウェル２０と導入ゲル２３との境界）に堆積し、電気の流れを妨害し、その結果、電気泳動を阻害する。
【００８２】
電極変更工程においては、電気泳動の阻害に対処するため、スイッチング機構７７を制御することにより、電源７３と第１および第４電極３２，６８との接続を解除し、第１および第４電極３２，６８に対する電圧印加を停止し、また、スイッチング機構７６を制御することにより、電源７２と第２および第３電極５２，６２とを接続することで、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加が可能に設定される。
【００８３】
第２電気泳動工程においては、第２および第３電極５２，６２に対する電圧印加が開始される。第３電極６２が配置され第３バッファータンク６０に貯留される第３緩衝液６４は、導入ゲル２３に連通しているため、図２０に示されるように、泳動ゲル２２（導入ゲル２３および分離ゲル２４）における電気泳動が正常に再開される。つまり、導入ゲル２３には、電気泳動を阻害する血球９２が堆積していないため、第２および第３電極５２，６２に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、泳動ゲル２２に移動済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。
【００８４】
以上のように、本実施の形態においては、全血に含まれる標的物質を電気泳動によって分離する際、泳動ゲル内に侵入できない血球の堆積により電気泳動が阻害されると、電圧印加される電極対が、第１および第２電極から第２および第３電極に切り替えられて、電気泳動が再開される。第２電極が配置される第２バッファータンクに貯留される第２緩衝液は、ウェルの逆側に位置する泳動ゲルの他端に連通するように設けられており、また、第３電極が配置される第３バッファータンクに貯留される第３緩衝液が連通している泳動ゲルの中間部位は、電気泳動を阻害する血球が堆積していない。したがって、第２および第３電極の電圧印加機能は、堆積した血球によって干渉されない。そのため、第２および第３電極に対して電圧印加を実行し、電気泳動を再開させる場合、泳動ゲルに移動（侵入）済みの標的物質に対する電気泳動が阻害されず、標的物質を良好に分離することができる。つまり、全血に含まれる標的物質を良好に分離し得るゲル電気泳動装置およびゲル電気泳動方法を提供することが可能である。
【００８５】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲で種々改変することができる。例えば、全血に含まれる標的物質は、標的物質に特異的に結合する物質（レセプター）を利用せずに、分離および定量することも可能である。また、後方ゲルを必要に応じて適宜省略したり、分離ゲルに導入ゲルの機能を持たせることで導入ゲルを適宜省略したりすることも可能である。
【符号の説明】
【００８６】
１０  ゲル電気泳動装置、
１２  装置本体部、
２０  ウェル、
２２  泳動ゲル、
２３  導入ゲル、
２４  分離ゲル、
２６  後方ゲル、
３０  第１バッファータンク、
３２  第１電極、
３４  第１緩衝液、
４０  支持部、
５０  第２バッファータンク、
５２  第２電極、
５４  第２緩衝液、
６０  第３バッファータンク、
６２  第３電極、
６４  第３緩衝液、
６６  貫通孔、
６８  第４電極、
７０  電源部、
７２，７３  電源、
７４，７５  電気回路、
７６，７７  スイッチング機構、
９０  全血、
９２  血球。
【図１】
2017078571.tif 000003
【図２】
2017078571.tif 000004
【図３】
2017078571.tif 000005
【図４】
2017078571.tif 000006
【図５】
2017078571.tif 000007
【図６】
2017078571.tif 000008
【図７】
2017078571.tif 000009
【図８】
2017078571.tif 000010
【図９】
2017078571.tif 000011
【図１０】
2017078571.tif 000012
【図１１】
2017078571.tif 000013
【図１２】
2017078571.tif 000014
【図１３】
2017078571.tif 000015
【図１４】
2017078571.tif 000016
【図１５】
2017078571.tif 000017
【図１６】
2017078571.tif 000018
【図１７】
2017078571.tif 000019
【図１８】
2017078571.tif 000020
【図１９】
2017078571.tif 000021
【図２０】
2017078571.tif 000022