(57)【要約】【課題】タンパク質と他の材料からなる複合体が集合してなるタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係るタンパク質凝縮体ゲル１００は、タンパク質１０、界面活性剤１２および水１１を含む複合体３と、前記複合体３を保持する高分子の三次元網目構造２とを備える。複合体３の集合体は水相から分離され、且つタンパク質１０および水１１が内包されており、界面活性剤１２は、疎水部２１、タンパク質１０と相互作用する親タンパク質部２３、および水１１と相互作用する親水部２３を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体と、前記複合体を保持する三次元網目構造とを含み、
前記複合体の集合体は水相から分離され、且つ前記タンパク質および前記水が内包されており、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項２】
前記タンパク質は、前記界面活性剤と静電相互作用または共有結合により結合されている請求項１に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項３】
前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤の少なくとも一方を用いる請求項１又は２に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項４】
前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項５】
前記界面活性剤の親水部に、ポリエーテルユニットおよびポリオールユニットの少なくともいずれかを含む請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項６】
Ｘ線小角散乱による構造解析により、少なくとも１つの散乱ピークを有するＸ線散乱パターンが確認される請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
【請求項７】
タンパク質、ゲル化剤、界面活性剤および水を含む混合液を調製する工程と、
前記タンパク質、前記界面活性剤および前記水を含む複合体および前記ゲル化剤を含み、水相から分離されるタンパク質凝縮体を形成する工程と、
前記ゲル化剤によりゲル化させる工程とを含み、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
立体構造を保持したままタンパク質を凝縮化した物質には、その立体構造に依存した特有の機能や物性発現が期待されるため、これまで種々の検討がなされてきた。
【０００３】
特許文献１においては、疎水性イオン−タンパク質複合体の沈殿物が記載され、固体状の前記複合体内でタンパク質は安定であり、貯蔵性、取扱い性等に優れることが記載されている。非特許文献１においては、フェリチンタンパク質を化学修飾してカチオン化し、これをポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩と混合して透析を行い、その後に凍結乾燥を経て加温することにより、界面活性剤とタンパク質からなる無溶媒でありながら液体状の複合体を得ている。また、非特許文献２には、酸素結合タンパク質であるヘム鉄含有のミオグロビンと２種類の界面活性剤を用いて、界面活性剤とタンパク質からなる無溶媒でありながら液体状の複合体を得ている。
【０００４】
本発明者らは、先般、水溶性のタンパク質、界面活性剤および水を含む複合体の集合体が水相から分離されるタンパク質凝縮体を提案した（特許文献２）。
【０００５】
ところで、架橋して三次元網目構造体を形成するゲル素材は、固体と液体の中間的な性質を併せ持つ物質である。ゲル素材は、内部に水等を高い割合で閉じ込めることができるという利点があり、寒天やゼラチン等の食品関連、コンタクトレンズ等の医療関連をはじめソフトマテリアル、高吸水性材料、薬剤放出制御剤等として種々の用途に応用展開されている。非特許文献３においては、タンパク質が共有結合を介してゲルに固定化する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／０８５９９号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１８２０４８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stephen Mann et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6242‐6246
【非特許文献２】Stephen Mann et al. Nature Chemistry，2010, VOL 2, August, 622
【非特許文献３】J. H. Priest et al. Applied Biochemistry and Biotechnology,1987, Vol.15, 11-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質を凝縮した複合体をゲルの形態で提供できれば、医療、薬学、生化学、分析化学をはじめとする様々な分野での利用の幅を広げることができる。また、ゲルから所定の条件でタンパク質を徐放できれば、薬剤等として有用である。
【０００９】
本発明は、上記背景に鑑みて成されたものであり、タンパク質を内包するタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討を重ねたところ、以下の態様において、本発明の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］：  タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体と、前記複合体を保持する三次元網目構造とを含み、
前記複合体の集合体は水相から分離され、且つ前記タンパク質および前記水が内包されており、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体ゲル。
［２］：前記タンパク質は、前記界面活性剤と静電相互作用または共有結合により結合されている［１］に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［３］：前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤の少なくとも一方を用いる［１］又は［２］に記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［４］：前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を用いる［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［５］：前記界面活性剤の親水部に、ポリエーテルユニットおよびポリオールユニットの少なくともいずれかを含む［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［６］：Ｘ線小角散乱による構造解析により、少なくとも１つの散乱ピークを有するＸ線散乱パターンが確認される［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体ゲル。
［７］：  タンパク質、ゲル化剤、界面活性剤および水を含む混合液を調製する工程と、
前記タンパク質、前記界面活性剤および前記水を含む複合体および前記ゲル化剤を含み、水相から分離されるタンパク質凝縮体を形成する工程と、
前記ゲル化剤によりゲル化させる工程とを含み、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体ゲルの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、タンパク質を内包するタンパク質凝縮体ゲルおよびその製造方法を提供することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態に係るゲルの一例を示す模式的斜視図。
【図２】図１のＩＩ−ＩＩ切断部の部分拡大端面図。
【図３】第１実施形態に係る界面活性剤の一例を示す模式的説明図。
【図４】第１実施形態に係るタンパク質凝縮体の一例を示す模式図。
【図５】第２実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルの一例を示す模式図。
【図６】水相から分離した実施例に係るタンパク質凝縮体の写真。
【図７】実施例に係るタンパク質凝縮体ゲルの写真。
【図８】実施例に係るタンパク質凝縮体およびタンパク質凝縮体ゲルのＸ線小角散乱の測定結果を示すグラフ。
【図９】タンパク質凝縮体ゲルを酵素として用いた時の生成物の反応速度をプロットしたグラフ。
【図１０】実施例に係るタンパク質凝縮体ゲルをＮａＣｌ水溶液に浸漬した後の写真。
【図１１】実施例に係るタンパク質凝縮体ゲルのＮａＣｌ水溶液浸漬前後のＸ線小角散乱の測定結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るタンパク質凝縮体ゲルは、タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体と、当該複合体を保持する三次元網目構造とを含む。複合体の集合体は、水相から分離される。界面活性剤は、親水部、疎水部および親タンパク質部を含む。タンパク質凝縮体ゲルの三次元網目構造とは、高分子鎖が高度に分岐し、三次元方向に網目状のネットワークを形成したものを指す。
【００１４】
本明細書において「親タンパク質部」とは、タンパク質と親和性を示す界面活性剤の部分をいう。また、本発明において「タンパク質」は、純粋なタンパク質であることは必須ではなく、タンパク質特有の立体構造に起因した作用効果を少なくとも一部に有するものであればよく、タンパク質の一部の構造を置換、欠失または付加したもの、さらに、タンパク質の表面を化学修飾したもの或いは一部を改変したものも含む。また、「親水部」とは、複合体内で当該ユニット近傍に水を保持する機能を有するユニットをいう。以下本発明を適用した実施形態の一例について説明する。なお、以降の図における各部材のサイズや比率は、説明の便宜上のものであり、これに限定されるものではない。
【００１５】
[第1実施形態]
図１に、第1実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルの一例を示す模式的斜視図を、図２に、図１のＩＩ−ＩＩ切断部の部分拡大端面図の一例を示す。また、図３に、用いた界面活性剤の模式的説明図を示す。
【００１６】
第1実施形態のタンパク質凝縮体ゲル１００は、シート状の形態を成す。シート状の厚みは特に限定されないが、丈夫さの観点からは１ｍｍ以上であることが好ましい。タンパク質凝縮体ゲル１００は、図２に示すように、高分子鎖が複雑に絡み合った三次元網目構造２を有し、複合体３が容易に動けない状態となっている。
【００１７】
第1実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルを得るためのゲル化方法は特に限定されないが、重合性単量体に、必要に応じて架橋剤、開始剤等を加えて光重合または熱重合等により重合せしめる方法が例示できる。
【００１８】
高分子の三次元網目構造は、単一ポリマーからなる網目構造、２種以上のポリマーが互いに侵入して絡みあった網目構造を例示できる。複数のポリマーが相互侵入した網目構造を用いる場合には、それぞれの高分子鎖が網目構造であることは必須では無く、全体として網目構造が構築できていればよい。また、高分子鎖間で互いに架橋構造を有していてもよい。
【００１９】
タンパク質凝縮体ゲルの形状は特に限定されず、任意の形態とすることができる。例えば、シート状、板状、球状、直方体、ビーズ状等が挙げられる。また、任意の形状を組み合わせて用いたり、複数のゲルを重ねて用いたりしてもよい。
【００２０】
タンパク質凝縮体ゲル１００は、ゲルを形成できればよくゲル化剤の分量は特に限定されないが、全質量に対して、例えば５〜２０質量％程度を添加する。ゲルに多量のタンパク質凝縮体を存在させることが可能なので、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）や塗布薬剤等の医薬品等に有用である。
【００２１】
複合体３は、図２に示すように、主として表層に界面活性剤１２が配され、水１１およびタンパク質１０を内包する。複合体３において界面活性剤１２の疎水部２１が外側に、親タンパク質部２３が内側に配向するので、複合体３の表層は疎水性を示す。
【００２２】
界面活性剤１２の親水部２２は主として水１１と相互作用し、親タンパク質部２３は主としてタンパク質と相互作用している。すなわち、水１１は、複合体３内においてタンパク質の界面活性剤の親水部近傍に保持されている。
【００２３】
複合体３同士は、疎水結合をベースに結合されている。複合体３に内包される水は、界面活性剤１２の疎水部２１の隙間部を介して複合体３の間に存在する水や他の複合体３との間で拡散可能になっている。複合体３の間に水分子が存在していなくてもよいが、図２に示すように複合体３の間に水分子が存在していてもよい。第１実施形態においては、水１１に溶解されたゲル化剤を架橋せしめることにより形成された三次元網目構造２によりゲルが形成される。
【００２４】
界面活性剤１２は、図３に示すように、親水部２２、疎水部２１および親タンパク質部２３を有する。複合体３内の水の含有量を調節するためには、親水部２２が重要な役割を担う。界面活性剤において、親タンパク質部２３よりも親水部２２のユニットの方が大きいことが好ましい。親水部２２の好ましい例として、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニットまたはポリオールユニットが例示できる。
【００２５】
なお、親水部２２と親タンパク質部２３は必ずしも明確に区別する必要はなく、同一部分が親水部および親タンパク質部として機能してもよい。但し、第1実施形態の親水部は、タンパク質を取り囲むような水を保持できるための充分な長さを備えている必要がある。また、複合体３の構造は、実質的に上述した構造であればよく、タンパク質凝縮体１を得られる限度において、上述した構造に適合しない部分が含まれていてもよい。
【００２６】
タンパク質１０は、水に溶解可能な水溶性タンパク質であればよく、その種類は特に限定されない。タンパク質１０に合わせて界面活性剤１２の親タンパク質部２３を適宜選定する。疎水性タンパク質、水溶液中で立体構造を安定に保持し難いタンパク質、或いはそれ自身が集合して不均一な構造を形成するタンパク質等は、表面改質等を行って親水性を導入して水溶性タンパク質に誘導することにより、好適に適用できる。従って、本発明でいう「水溶性タンパク質」とは、本来的に水溶性を示すタンパク質の他、表面改質等により水溶性を示すタンパク質を含む。タンパク質凝縮体は、単一種類の複合体３が集合したものでも、異なる種類の複合体３がブレンドされたものでもよい。
【００２７】
好適なタンパク質として、大腸菌オルニチントランスカルバミラーゼ、表面改善ウマ肝臓フェリチン軽鎖、Pyrococcus furiosus（ピュロコックス・フリオスス）のフェリチン、Aspergillus niger(コウジカビ)グルコースオキシダーゼ、表面改善緑色蛍光タンパク質、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、金属貯蔵タンパク質（ＬｉＤｐｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ），ＧＦＰ−ＹＦＰ融合タンパク質、リゾチーム, Thermus thermophiles(サーマス・サーモフィルス)イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、赤色蛍光タンパク質(DsRed T1)等が例示できる。複合体３内には、単数または複数のタンパク質分子が内包されている。複合体３内に異なる種類のタンパク質分子が含有されていてもよい。
【００２８】
界面活性剤１２は、図３に示すように端部に親タンパク質部２３、他端部に疎水部２１、これらの間に親水部２２を有する構造が好ましい例として例示できるが、複合体３を形成できるものであればよく、図３の構成に限定されるものではない。例えば、両端部に疎水部、その隣接位に親水部が配置され、親水部に挟持された略中央部に親タンパク質部を有する折り畳み構造の界面活性剤を用いてもよい。また、親タンパク質部が複数ユニットあるものを用いてもよい。また、高分子界面活性剤を用いてもよい。生体適合性が求められる用途においては、生体適合性を有する界面活性剤を用いることが好ましい。
【００２９】
水１１は純水でもよいし、添加剤が含まれていてもよい。添加剤としては、金属をはじめとする無機化合物や、薬剤、化粧成分等の有機化合物や、有機無機ハイブリッド化合物等の添加剤が含まれていてもよい。図２においては、複合体３のコア部中心にタンパク質が配置されている例を示しているが、水１１がコア部中心に存在したり、複数のタンパク質分子の間に存在していてもよい。タンパク質内には、別のタンパク質、有機物、金属等の無機物等が含まれていてもよい。第1実施形態において用いるゲル化剤も添加剤の一種である。
【００３０】
タンパク質１０と界面活性剤１２とが相互作用して複合体を形成するために、タンパク質１０の種類に応じて、用いる界面活性剤１２を適切に組み合わせる必要がある。用いるタンパク質１０への界面活性剤１２の結合量が少ないという理由でタンパク質凝縮体が得られない場合には、表面電荷を変更すればよい。例えば、アミノ酸残基の改変を行うことにより適切に表面電荷を変更することができる。表面電荷を変更する方法は特に限定されないが、好適な例として遺伝子工学的な手法を用いる方法がある。
【００３１】
タンパク質１０と界面活性剤１２の相互作用は、複合体３を形成できればよく特に限定されないが、第1実施形態においては、静電相互作用により複合体を形成する方法、共有結合により複合体を形成する方法が好適である。
【００３２】
静電相互作用によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質１０の表面電荷の量に応じて界面活性剤の親タンパク質部２３にアニオン性ユニットを有するアニオン性界面活性剤または／および親タンパク質部２３にカチオン性ユニットを有するカチオン性界面活性剤を用いる方法が好適である。また、両性界面活性剤も好適である。タンパク質１０の表面電荷や電荷部分の立体配置などを考慮して、アニオン性界面活性剤または／およびカチオン性界面活性剤の添加量を決定すればよい。
【００３３】
タンパク質１０内にプラスの電荷を有する部分とマイナスの電荷を有する部分が存在する場合には、アニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤を、タンパク質１０内の電荷の分布や立体配置を考慮しつつ添加量比を調整すればよい。アニオン性ユニットとしてはカルボキシル基やスルホン酸基が挙げられ、カチオン性ユニットとしてはアミノ基が例示できる。また、親水部の好適な例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等が好ましい。これらの親水性を示す部分のユニットは、主鎖を構成する原子数で１０以上の長鎖ユニットからなることが好ましい。親水部は、構成する原子のうち１／４以上が親水性を示す原子（例えば、Ｏ原子）により構成されていることが好ましい。疎水部としてはアルキル基等が好ましい。カルボキシル基やスルホン酸基等のアニオン性ユニット、アミノ基等のカチオン性ユニットとは別に、ポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等の長鎖ユニットからなる親水部を有し、アルキル基等の疎水部をさらに有する界面活性剤を用いることにより、第１実施形態のタンパク質凝縮体を容易に得ることができる。
【００３４】
タンパク質凝縮体１のタンパク質含有量は、用途により適宜設計することができる。例えば、タンパク質凝縮体１に対して、例えば、タンパク質の含有量を１〜４０質量％とすることができる。タンパク質の質量％を増やすためには親水部２２の長さを短くすることが有効であり、タンパク質の質量％を減らすためには親水部２２の長さを長くすることが有効である。
【００３５】
アニオン型界面活性剤として、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型のものが例示できる。また、カチオン型界面活性剤として、第４級アンモニウム塩型、アルキルアミン塩型、ピリジン環型構造を有する化合物が例示できる。両性界面活性剤としては、アルキルべタイン型、脂肪酸アミドプロピルベタイン型、アルキルイミダゾール型、アミノ酸型、アミンオキシド型構造を有する化合物が挙げられる。
【００３６】
第1実施形態に好適な界面活性剤としては、例えば、以下のような化合物（１）〜（３）等が例示できる。
【化１】
2017171617.tif 000003
但し、ｘは６〜１８、ｙは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化２】
2017171617.tif 000004
但し、ｐは６〜１８、ｑは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化３】
2017171617.tif 000005
但し、ｎは３〜２０、好ましくは５〜２０、より好ましくは６〜２０である。
より好ましくは、ｘが１１〜１３、ｙが１１、ｐが１１〜１３、ｑが１１、ｎが２０である。
【００３７】
共有結合によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質と親タンパク質部とを共有結合させる方法が好適である。例えば、タンパク質のリジン残基のアミノ基と共有結合させる界面活性剤として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化界面活性剤が有効である。また、タンパク質のシステイン残基のメルカプト基と共有結合させる界面活性剤として、マレイミド化界面活性剤が有効である。
【００３８】
共有結合は、予め、タンパク質と界面活性剤を共有結合させてもよいし、タンパク質と界面活性剤を水中で混合する際に共有結合させてもよい。共有結合によりタンパク質と界面活性剤を結合することにより、より安定な複合体を形成できる。なお、共有結合とイオン結合の両者を含む複合体でもよい。すなわち、一の複合体において、タンパク質と界面活性剤が、共有結合により結合された部位とイオン結合により結合された部位を有していてもよい。また、タンパク質凝縮体ゲル内においてイオン結合により結合された複合粒子と共有結合により結合された複合粒子が混在していてもよい。
【００３９】
次に、第1実施形態のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法の一例について説明する。但し、第1実施形態のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法は、以下の製造方法に何ら限定されるものではない。
【００４０】
第1実施形態のタンパク質凝縮体ゲルの製造方法は、タンパク質、ゲル化剤、界面活性剤および水を含む混合液を調製する工程ａと、水相と分離され、タンパク質および水を内包する複合体と、ゲル化剤とを含むタンパク質凝縮体を形成する工程ｂと、ゲル化剤によりゲル化させる工程ｃとを含む。
【００４１】
まず、タンパク質とゲル化剤を常温下で水に加え、タンパク質含有溶液を得る（工程ａ１）。なお、ここでいう水には、タンパク質安定化のための成分（塩、酵素などの反応基質、グリセロール、ｐＨ緩衝成分）が溶解されているものや電解質水溶液も含まれる。電解質水溶液は、例えば、ＮａＣｌ等の塩を含む所定濃度のＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ等を好適に用いることができる。
【００４２】
ゲル化剤は、タンパク質凝集体内に分散可能な重合性単量体を少なくとも含む。必要に応じて、架橋剤、重合開始剤を含む。これらは、水溶性であることが好ましい。また、非イオン性であることが好ましい。
【００４３】
重合性単量体は、例えば、炭素−炭素二重結合を有する不飽和モノマーがある。例えば、アクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸又はそれらの塩、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビニルピリジン、スチレン、メチルメタクリレート、フッ素含有不飽和モノマー（例えば、トリフルオロエチルアクリレート）、ヒドロキシエチルアクリレート、酢酸ビニル、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、およびアリルデキストリンを挙げることができる。
【００４４】
重合性単量体の重合を開始するために、必要に応じて重合開始剤が用いられる。重合性単量体の重合を開始できればよく特に限定されないが、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（2,2'-Azobis[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide]）、過硫酸カリウムなどの水溶性熱触媒、過硫酸カリウム−チオ硫酸ナトリウムなどのレドックス開始剤を用いることができ、光重合する場合には、光増感剤として２−オキソグルタル酸を用いることができる。また、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）なども好適である。必要に応じて、ベンゾフェノン等の光増感剤を用いてもよい。水中に均一に分散させる観点から水溶性の開始剤が好ましく、界面活性剤とタンパク質の静電相互作用を阻害しない観点からは非イオン性の開始剤が好ましい。
【００４５】
また、架橋構造を構築するために、必要に応じて架橋剤が用いられる。例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が用いられる。
【００４６】
次に、前記混合液に界面活性剤を加えて混合する（工程ａ２）。界面活性剤を直接加えてもよいが、均一分散性やタンパク質の変性を回避する観点からは、タンパク質含有水溶液と界面活性剤の水溶液を混合する方法が簡便である。タンパク質含有水溶液、界面活性剤水溶液は、必要に応じてタンパク質が変性しないようにｐＨ調整を行うことができる。混合液の電解質濃度は、タンパク質凝縮体ゲルが得られればよく特に限定されないが、界面活性剤との相互作用を阻害しない観点からは５０ｍＭ以下とすることが好ましく、１０ｍＭ以下とすることがより好ましく、１ｍＭ以下とすることがさらに好ましい。タンパク質水溶液の濃度は、混合液にしたときに上述の電解質濃度になるように調整する方法が好ましい。
【００４７】
その後、タンパク質と界面活性剤の混合液（溶液または懸濁液）からタンパク質凝縮体を得る（工程ｂ）。短時間で複合体を得る観点からは、遠心分離が好ましいが、揺動させる方法や静置させる方法でもよい。遠心分離は、懸濁液が得られた後、直ちに行ってもよいし、所望のタイミングで遠心分離してもよい。遠心分離の温度は、タンパク質の種類、タンパク質凝縮体の状態に応じて常温で行うほか、加温したり、冷却したりすることができる。遠心分離を行うことにより、タンパク質凝縮体と不要の界面活性剤および塩とを分離することができる。上記工程を経て得られるタンパク質凝縮体は、例えば、液体、固体として取り出すことができる。タンパク質凝縮体が液体の場合には、マイクロピペットなどにより取り扱うことができる。固体の場合には、沈殿または濾過により回収すればよい。なお、ここでいう液体には粘性のある液体も含むものとする。また、上記工程ａ１、工程ａ２は、必須ではなく、例えば、タンパク質、界面活性剤を加えた後に、ゲル化剤を加えてもよいし、これらを同時に加えてもよい。
【００４８】
その後、タンパク質凝縮体をゲル化する（工程ｃ）。重合反応は、加温または／および紫外線等の活性光線を照射する方法等により行うことができる。タンパク質凝縮体と重合性単量体等を混合した際にゲル化が進行しないように、光重合が好ましい。
【００４９】
重合反応の進行により、三次元網目構造を有するタンパク質凝縮体ゲルが得られる。タンパク質凝縮体が固体の場合や流動性が低い場合には、加温して重合性単量体との相溶性を高めるようにすることが好ましい。三次元網目構造の種類は一種類でも二種類以上でもよい。架橋度は、架橋剤の量を調整することにより容易に調整できる。タンパク質凝縮体の含有量を多くするには、架橋度を下げる事が好ましい。
【００５０】
上記方法によれば、用いた物質の質量および体積を把握できるので、用いた物質の質量、体積が求まり、タンパク質と界面活性剤の濃度を定量することができる。さらに、界面活性剤を滴定することにより、第1実施形態のタンパク質凝縮体を得るための最適な条件（界面活性剤の種類、添加量等）を容易に決定できるというメリットがある。このため、電解質等の添加剤の影響についての知見も容易に得ることができる。さらに、回収時のロスが少ないというメリットもある。また、最適な界面活性剤量を加えて混合した後、遠心分離することにより直ぐにタンパク質凝縮体が得られるので、製造工程の点からも優れている。このため、大量調製にも好適である。
【００５１】
また、第1実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルは、徐放剤として用いることができる。タンパク質凝縮体ゲルを徐放させるには、塩強度を増加させた環境下におけばよい。徐放させるタイミングに、ＮａＣｌ等の塩が含まれた水溶液を加えたり、タンパク質凝縮体ゲルを患部等に塗布し、その上に、経時的に徐放を促すシートを貼り付ける方法が例示できる。後者の方法により、患部に製剤としてのタンパク質を投与することができる。液状のタンパク質凝縮体そのものを塗布する方法に代えて、タンパク質凝縮体ゲルを患部に貼る方法によれば、取扱い性および徐放制御を容易に行うことができるというメリットを有する。
【００５２】
また、タンパク質を内包する水は、生体に無害であるので製剤、化粧品、食品の分野の他、他の素材とハイブリッドして医療用途、センサー用途などへの応用が期待できる。
【００５３】
第1実施形態の製造方法によれば、冷却・加熱処理工程を必須とせずにタンパク質凝縮体を自発的に水相から分離させ、得られたタンパク質凝縮体を架橋せしめることによりゲル化できるので製造工程が簡便である。タンパク質凝縮体は、界面活性剤の親水部とそれにより保持される水に囲まれているため、タンパク質を適切に保護することができる。すなわち、水溶性タンパク質は、もともと水に溶けているのでより自然界に近い状況としたり、水に安定性を示すものであるので、水で内包させることにより安定に保存することができる。また、水を含むことにより、ゲル内に酵素反応を行う際に必要な基質(反応物)を含浸させたり、金属などの添加剤を加えることも容易であるというメリットを有する。
【００５４】
第1実施形態におけるタンパク質凝縮体ゲルは、タンパク質凝縮体内の水の拡散により、外部の水との間で物質の出入りが可能である。ここでいう外部の水とは、タンパク質凝縮体と相分離し、界面に接した水のことである。この特性により任意の物質を溶解させた水溶液とタンパク質凝縮体を接触させることで、タンパク質凝縮体内部の水に物質を取り込むことが可能となる。第１実施形態によれば、拡散可能な水の存在により様々な応用が期待できる。例えば、抗原抗体反応を利用したセンサー、複合体内の水を反応場として利用した反応リアクター等への応用が期待できる
【００５５】
得られるタンパク質凝縮体ゲルは、温度により集合状態が変わり得るが、透明または半透明の液体を容易に得ることができる。これは、タンパク質が凝集していないことを示すものである。タンパク質凝縮体は、少なとも１つの散乱ピークを有するＸ線散乱パターンを有する秩序構造を有する形態が好ましい。秩序構造を有するタンパク質凝縮体を用いることにより、タンパク質凝縮体内で実質的に均一間隔に配置させることができる。これらの特性から、例えば、ドラックデリバリーシステム、湿布等の貼付け用外用薬、塗り薬、化粧品、タンパク質含有食品などへの応用が期待できる。また、タンパク質が秩序構造や周期性を示すことから、光学特性を利用した用途への応用展開も期待できる。
【００５６】
[第２実施形態]
次に、上記第1実施形態とは異なるタンパク質凝縮体ゲルについて説明する。第２実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルは、以下の点を除く基本的な構成は第１実施形態と同様である。すなわち、第２実施形態においては、タンパク質凝縮体ゲルの三次元網目構造にタンパク質凝縮体を構成する複合体が固定化されている点において、第1実施形態と相違する。
【００５７】
複合体を三次元網目構造に固定化する方法としては、種々の方法を適用できる。好適な方法として、タンパク質とゲル化剤を、共有結合を介して固定化させる方法がある。図５に、第２実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルの模式的説明図を示す。タンパク質凝縮体ゲル１００ａは、複合体３に内包するタンパク質１０ａと三次元網目構造２ａが共有結合により結合されている。これにより、タンパク質凝縮体ゲル１００ａ内にタンパク質を固定化することができる。例えば、非特許文献３のようにタンパク質にビニルモノマー等を共有結合させる方法が例示できる。
【００５８】
タンパク質を固定化させる別の方法としては、重合性官能基を有する界面活性剤と、ゲル化剤を併用する方法がある。また、界面活性剤自身に架橋性・二重結合などの重合性官能基を導入してゲル化させてもよい。これらの場合、界面活性剤は、界面活性剤としての機能を担うとともにゲル化剤としての機能も担う。重合性官能基を有する界面活性剤としては、以下に示すようなオレイル基含有の界面活性剤が例示できる。
【化４】
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【００５９】
界面活性剤と三次元網目構造を共有結合により結合させる方法の場合、タンパク質の固定化をより確実にする観点からは、複合体内の界面活性剤とタンパク質を共有結合により結合させる態様がより好ましい。
【００６０】
タンパク質を三次元網目構造に固定化させる方法によれば、タンパク質の固定化により、第１実施形態のような徐放性はなくなるが、酵素リアクターなどの用途に有用である。第２実施形態に係るタンパク質凝縮体ゲルによれば、徐放性以外について第１実施形態と同様の効果が得られる。
【００６１】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。また、上記実施形態は、互いに好適に組み合わせられる。
【００６２】
≪実施例≫        
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。なお、実施例および比較例における物性値の測定等は以下の方法により実施した。
【００６３】
Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）：Ｘ線小角散乱装置（リガク社製、「ナノスケールＸ線構造評価装置 NANO-Viewer」）を用いて測定した。タンパク質凝縮体の測定は、室温で行った。また、タンパク質凝縮体と比較するために、タンパク質水溶液の測定も行った。水中に溶解する条件は、タンパク質が凝集しない条件（ｐＨ緩衝成分を含む）とした。遠心機は、微量高速冷却遠心機（トミー精工社製、ＭＸ３０７）を用いて、１５，０００ｇ×１ｍｉｎの条件で行った。熱質量変化測定は、セイコーインスツルメンツ社製、EXSTRA6000 TG/DTA6300を用いた。
【００６４】
（実施例）
純水に１ｍｇ／ｍＬの濃度でグルコースオキシダーゼ（Glucose Oxidase））およびゲル化剤を加えた混合液（タンパク質溶液）を調製した（工程ａ）。ゲル化剤として、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを１９：１のモル比で加えた。界面活性剤の量は、界面活性剤を加えた後の総量に対して、ゲル化剤が１０質量％となるように加えた。次いで、タンパク質１ｍｇあたり式（ａ）に示す陰イオン界面活性剤（以下、「Ｓ２」という。）の水溶液（ＫＯＨ中和水溶液）を０．３８４μｍｏｌおよび式（ｂ）に示す陽イオン界面活性剤（以下、「ｃＳ２」という。）の水溶液（ＨＣｌ中和水溶液）を０．８１６μｍｏｌ（式（ａ）と式（ｂ）の化合物の合計で１．２μｍｏｌ）をタンパク質水溶液に加えて撹拌し、懸濁液を得た（工程ｂ）。
【化５】
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【化６】
2017171617.tif 000008
その後、速やかに遠心分離した。すると、直ちに補酵素ＦＡＤ由来の透明性のある黄色を示すタンパク質凝縮体が得られた。
【００６５】
得られたグルコースオキシダーゼ凝縮体と水は、はっきり相分離することを確認した。得られたタンパク質凝縮体におけるタンパク質含有量は、２８０ｎｍの吸収から算出したおよその量は１８４ｍｇ／ｍＬであった。
【００６６】
なお、得られたグルコースオキシダーゼ凝縮体にＮａＣｌ水溶液を加えると溶解し、全体が均一な黄色の溶液となった。これは、タンパク質凝縮体を構成する複合体が解離されたことを示す。すなわち、タンパク質凝縮体は、塩を加えることにより徐放性を示すことを確認した。塩を添加後、約１０ｓ後に黄色の溶液が得られた。
【００６７】
次いで、上記タンパク質凝縮体に、室温でＵＶ光（サンエナジー社製、ハンディタイプUV硬化電源、DGM2501A-04、最大強度波長３６５ｎｍ）を５ｍＷ／ｃｍ２で５分間照射した。その結果、図７に示すような透明性を有する黄色のタンパク質凝縮体ゲルを得た（工程ｃ）。なお、グルコースオキシダーゼは、これに含まれる補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチドが光開始剤として機能するので開始剤を加えていない。
【００６８】
図８に、グルコースオキシダーゼ水溶液、工程（ｂ）により得たタンパク質凝縮体および工程（ｃ）により得たタンパク質凝縮体ゲルのＳＡＸＳによる散乱ピークを示す。グルコキシオキシダーゼ水溶液においては散乱ピークが観測されなかったが、ゲル化前のタンパク質凝縮体は散乱ピーク（Ｑ＝０．６８３ｎｍ−１、ｄ＝９．２０ｎｍ）を示し、タンパク質が秩序を持って配向していることを確認した。また、ゲル化後のタンパク質凝集体ゲルは、散乱ピーク（Ｑ＝０．６６９ｎｍ−１、ｄ＝９．４０ｎｍ）を示し、タンパク質凝縮体と同一の散乱ピークを示すことを確認した。すなわち、タンパク質凝縮体ゲル内において、タンパク質は秩序構造を有していることを確認した。
【００６９】
次に、４ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）の緩衝液に、１０ｍＭのＤ−グルコースを加え、これに、１００μＭの式（ｃ）に示すＡＢＴＳを加え、さらに、酵素として０．５Ｕ／ｍＬのＨＲＰ（Horseradish peroxidase）を加えることにより、無色透明の混合液を得た。次いで、０．５ｍｇのグルコースオキシダーゼを用いて上述の方法により作製したタンパク質凝縮体ゲルを、２５℃の条件で４１４ｎｍの吸収の経時変化を観察した。その結果、透明性のある青色を示す均一に混ざった溶液が得られた。このことから、式（ｃ）に示すような酵素反応が進行したことがわかる。
【化７】
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【００７０】
図９に、タンパク質凝縮体ゲルを酵素として用いたときの生成物の反応速度をプロットした図を示す。同図には、グルコースオキシダーゼの水溶液を加えたときの同生成物の反応速度のグラフも示す。タンパク質凝縮体ゲルの酵素活性が、繰り返し利用できることを確認した。また、タンパク質含有ゲルにおける水の拡散性を確認できた。
【００７１】
タンパク質凝縮体ゲルを水に浸漬しても、タンパク質凝縮体ゲルの色味は変わらないのに対し、タンパク質凝縮体ゲルに５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液に浸漬すると、白色のゲルになった（図１０参照）。そして、浸漬した水が黄色に呈色した。また、白色ゲルはＳＡＸＳ測定において散乱ピークを示さなかった（図１１参照）。これは、ＮａＣｌ水溶液に浸漬することにより、タンパク質凝縮体ゲルからタンパク質が溶出したことを示すものである。塩濃度を調整することにより徐放時間や徐放濃度を制御することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のタンパク質凝縮体ゲルによれば、前述した様に、ドラッグデリバリーシステム、人体の治療などの医用用途、食品工業、化粧品製造の分野に好適である。また、フィルムやシートに成形して医療用途をはじめとする各種部材に適用できる。特に、周期構造がみられるタンパク質凝縮体においては、光学フィルム等の光学部材、センサーあるいは酵素反応や交代を用いた特定物質のセンサーなどに有用である。また、複合体の内部に金属イオンを導入して、金属構造体を作製したり、ゾルゲル法で無機化合物の合成にも応用が期待できる。さらに、燃料電池の触媒として、廃棄物処理用としても利用できる可能性がある。また、水中油型エマルションの状態での利用も期待できる。また、タンパク質凝縮体と、それと接する外部溶液との間で物質（溶質）の出入りが可能であることを利用して反応リアクターとして利用することが期待できる。
【符号の説明】
【００７３】
１      タンパク質凝縮体
２      三次元網目構造
３      複合体
１０    タンパク質
１１    水
１２    界面活性剤
２１    疎水部
２２    親水部
２３    親タンパク質部
１００  タンパク質凝縮体ゲル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2017171617.tif 000014
【図６】
2017171617.tif 000015
【図７】
2017171617.tif 000016
【図８】
2017171617.tif 000017
【図９】
2017171617.tif 000018
【図１０】
2017171617.tif 000019
【図１１】
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