(57)【要約】【課題】  目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心などの比重分離を利用して当該目的細胞を分離する方法において、前記溶液中に含まれる目的細胞の数が非常に少ない場合であっても、前記目的細胞を高効率に分離回収する方法を提供すること。【解決手段】  目的細胞を含む溶液に当該目的細胞を安定化させるための安定化剤を含ませ、かつ当該溶液の浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とすることで、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的細胞を含む溶液から比重分離を利用して当該目的細胞を含む画分を分離回収する方法であって、目的細胞を含む溶液には当該目的細胞を安定化させるための安定化剤がさらに含まれており、かつ目的細胞を含む溶液の浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、前記方法。
【請求項２】
安定化剤としてホルムアルデヒドドナー化合物を少なくとも含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホルムアルデヒドドナー化合物が、０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）のイミダゾリジニル尿素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
安定化剤としてポリエチレングリコールを少なくとも含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
目的細胞を含む溶液が血液試料であり、安定化剤として抗凝固剤を少なくとも含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の（１）から（３）の工程を含む、溶液中に含まれる目的細胞の分離回収方法。
（１）目的細胞を安定化させるための安定化剤を含み、かつ浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心による比重分離を利用して、当該目的細胞を含む画分を分離回収する工程
（２）（１）で得られた画分を親水性高分子を結合したタンパク質および／または糖を含む溶液に添加する工程
（３）（２）で得られた溶液を遠心分離することで、目的細胞を含むペレットを回収する工程
【請求項７】
目的細胞を含む溶液から比重分離を利用して当該目的細胞を含む画分を分離回収し、当該画分を保存容器内で保存する方法であって、
目的細胞を含む溶液には当該目的細胞を安定化させるための安定化剤がさらに含まれており、かつ目的細胞を含む溶液の浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、前記方法。
【請求項８】
比重分離を利用した目的細胞を含む溶液からの当該目的細胞を含む画分の分離回収を、当該比重分離により目的細胞を多く含む画分を収容した部分と目的細胞をほとんど含まない画分を収容した部分とに分離可能な保存容器を用いて行ない、
目的細胞を含む画分の保存を、前記保存容器から目的細胞を多く含む画分を収容した部分を分離して保存する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
保存容器のうち、目的細胞を含む画分と接触する部分がタンパク質でコートされている、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）のイミダゾリジニル尿素を少なくとも含み、かつ浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、細胞保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心などの比重分離を利用して当該目的細胞を分離する方法に関する。特に本発明は、溶液中に含まれる目的細胞の数が非常に少ない場合であっても、効率的に当該目的細胞を分離回収可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織懸濁液や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
試料中に含まれる細胞を分離回収する方法として、密度勾配遠心などの比重分離を利用した方法が知られている（特許文献１）。特許文献１に記載の方法は、密度勾配を形成した溶液（以下、密度勾配溶液と記載する）の上に細胞懸濁液等の目的細胞を含む溶液を重層して遠心分離後、当該目的細胞を含む層を回収することで、当該溶液中に含まれる不要な細胞や他の成分が除去された細胞画分を得る方法である。
【０００４】
しかしながら、前述した比重分離を利用した目的細胞の分離回収を実施するまでに長い時間を要することがある。そのため溶液中に含まれる細胞が劣化し、当該細胞の形状崩壊ならびにそれに伴う当該細胞内の核酸およびタンパク質の放出や、比重変化が生じるおそれがあり、そのような現象が生じると、目的細胞の回収率の低下や、目的細胞中の核酸やタンパク質の解析能力の低下につながるおそれがあった。
【０００５】
前述した問題を解決するための方法として、特許文献２には、希少細胞を含む血液にホルムアルデヒド等の固定化剤を添加して血液中に含まれる希少細胞を固定化し、当該細胞の劣化を抑制した後、密度勾配遠心を利用して前記希少細胞を分離回収する方法を開示しており、本方法により、長期間保管した血液中に含まれる希少細胞の分離回収を実現している。しかしながら特許文献２に記載の方法を用いても、希少細胞を高効率に分離回収することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第１９９７／０２１４８８号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１６８７６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心などの比重分離を利用して当該目的細胞を分離する方法において、前記溶液中に含まれる目的細胞の数が非常に少ない場合であっても、前記目的細胞を高効率に分離回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、目的細胞を含む溶液から比重分離を利用して当該目的細胞を含む画分を分離回収する方法であって、目的細胞を含む溶液には当該目的細胞を安定化させるための安定化剤がさらに含まれており、かつ目的細胞を含む溶液の浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、前記方法である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、安定化剤としてホルムアルデヒドドナー化合物を少なくとも含む、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、ホルムアルデヒドドナー化合物が、０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）のイミダゾリジニル尿素である、前記第二の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第四の態様は、安定化剤としてポリエチレングリコールを少なくとも含む、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１３】
また本発明の第五の態様は、目的細胞を含む溶液が血液試料であり、安定化剤として抗凝固剤を少なくとも含む、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１４】
さらに本発明の第六の態様は、以下の（１）から（３）の工程を含む、溶液中に含まれる目的細胞の分離回収方法である。
（１）目的細胞を安定化させるための安定化剤を含み、かつ浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心による比重分離を利用して、当該目的細胞を含む画分を分離回収する工程
（２）（１）で得られた画分を親水性高分子を結合したタンパク質および／または糖を含む溶液に添加する工程
（３）（２）で得られた溶液を遠心分離することで、目的細胞を含むペレットを回収する工程
また本発明の第七の態様は、目的細胞を含む溶液から比重分離を利用して当該目的細胞を含む画分を分離回収し、当該画分を保存容器内で保存する方法であって、目的細胞を含む溶液には当該目的細胞を安定化させるための安定化剤がさらに含まれており、かつ目的細胞を含む溶液の浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、前記方法である。
【００１５】
また本発明の第八の態様は、
比重分離を利用した目的細胞を含む溶液からの当該目的細胞を含む画分の分離回収を、当該比重分離により目的細胞を多く含む画分を収容した部分と目的細胞をほとんど含まない画分を収容した部分とに分離可能な保存容器を用いて行ない、
目的細胞を含む画分の保存を、前記保存容器から目的細胞を多く含む画分を収容した部分を分離して保存する、
前記第七の態様に記載の方法である。
【００１６】
また本発明の第九の態様は、保存容器のうち、目的細胞を含む画分と接触する部分がタンパク質でコートされている、前記第七または第八の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１７】
また本発明の第十の態様は、０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）のイミダゾリジニル尿素を少なくとも含み、かつ浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である、細胞保存液である。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明において目的細胞を含む溶液とは、分離対象である目的細胞を少なくとも含んだ溶液のことをいい、具体的には、血液、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料または前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、などがあげられる。このうち生体試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００２０】
背景技術でも記載したように、目的細胞を含む溶液から、密度勾配遠心といった比重分離を利用して、当該目的細胞を含む画分を分離回収する場合、前述した比重分離を利用した目的細胞の分離回収方法を実施するまでに長い時間を要することがある。そのため溶液中に含まれる細胞が劣化し、当該細胞の形状崩壊ならびにそれに伴う当該細胞内の核酸およびタンパク質の放出や、比重変化が生じるおそれがあり、そのような現象が生じると、目的細胞の回収率の低下や、目的細胞中の核酸やタンパク質の解析能力の低下につながるおそれがある。そこで本発明では目的細胞を安定化させるための安定化剤を目的細胞を含む溶液にさらに含ませることで、当該目的細胞由来のタンパク質が不溶化および／または不活性化し、当該目的細胞が安定化することで、目的細胞の劣化を長時間抑制することができる。本発明で用いる安定化剤としては、アルデヒド類、酸類、脱水剤・有機溶媒類、金属塩類といった、当業者が細胞固定化剤として通常用いる物質の中から適宜選択すればよい。
【００２１】
このうちアルデヒド類を含む安定化剤は、タンパク質の高次構造を変化させたり、ポリペプチド鎖を保持することによってさらなる変性を防いだり、タンパク質構造を安定化するとともに、細胞原形質をゲル化させて酵素活性を抑えることで、細胞を安定化させる。アルデヒド類を含む安定化剤の一例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサールがあげられる。また酸類を含む安定化剤は、酸が有する強いタンパク質凝固作用により、細胞を安定化させる。酸類を含む安定化剤の一例として、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸、酢酸、氷酢酸、三塩化酢酸（トリクロロ酢酸）、クロム酸またはそれらの塩があげられる。また脱水剤・有機溶媒類を含む安定化剤は、強力な脱水と脂質溶解により細胞タンパク質を不溶化・変性させることで、細胞を安定化させる。脱水剤・有機溶媒類を含む安定化剤の一例として、エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルムがあげられる。また金属塩類を含む安定化剤は、金属塩が有する強い酸化作用により細胞を安定化させる。金属塩類を含む安定化剤の一例として、水銀、クロム、マンガン、亜鉛などの塩があげられる。
【００２２】
前述した安定化剤の中で、本発明で用いる安定化剤として好ましいのはアルデヒド類であり、特に好ましいのはホルムアルデヒドドナー化合物である。ホルムアルデヒドドナー化合物は、それ自体は直接細胞に作用しないが、加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出し、細胞を安定化させることが可能な化合物のことをいう。ホルムアルデヒドドナー化合物の具体例として、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、メテンアミン、パラホルムアルデヒドがあげられる。中でもイミダゾリジニル尿素は、ホルムアルデヒドを緩慢に放出できる点で最も好ましい安定化剤の一つといえる。
【００２３】
目的細胞を含む溶液への安定化剤の添加量は、当該安定化剤が有する目的細胞の固定化強度や固定化速度を考慮して適宜決定すればよいが、安定化剤としてホルムアルデヒドドナー化合物の一つであるイミダゾリジニル尿素を用いる場合は、目的細胞を含む溶液中の濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間とすればよく、０．２５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．３％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。
【００２４】
なお前述した安定化剤の他に、ポリエチレングリコールを安定化剤としてさらに含ませてもよい。ポリエチレングリコールの濃度は、目的細胞を含む溶液中の濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間とすればよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。
【００２５】
また目的細胞を含む溶液が血液試料の場合、なお前述した安定化剤の他に、抗凝固剤を安定化剤としてさらに含ませてもよい。なお本発明において血液試料とは、全血、希釈血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液由来成分に限らず、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腫瘍、リンパ節といった血液由来成分を含む組織の一片を適切な緩衝液で懸濁させた懸濁液や、尿、羊水、腹水といった血液由来成分を含み得る生体試料も含まれる。またこれらの試料や懸濁液を遠心分離などにより分離回収して得られた、血液由来成分を含む細胞の画分も、本発明における血液試料に含まれる。抗凝固剤の一例としては、血液凝固の要因となるカルシウムイオンを配位することで前記血液凝固を抑制するキレート剤や、血液凝固の要因となるトロンビン活性を抑制する抗トロンビン剤があげられる。具体的には、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＣＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス−２−アミノエチルエーテル四酢酸）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、低分子ヘパリン、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などがあげられる。
【００２６】
本発明では、安定化剤を含んだ目的細胞を含む溶液の浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とすることを特徴としている。ここで生理的浸透圧とは、浸透圧調整前の目的細胞を含む溶液（例えば血液試料など）が有する浸透圧のことをいい、一般的には２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲に入る。すなわち、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とは、一般的には浸透圧の値が２１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（２７５［ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ］−６０［ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ］）から３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（３１５［ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ］−０［ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ］）までの範囲といえる。
【００２７】
一般に、前述した安定化剤を含んだ目的細胞を含む溶液の浸透圧は、安定化剤を目的細胞内へ効率的に作用させるために、生理的浸透圧より高く（高張）している。しかしながら、目的細胞を含む溶液の浸透圧を生理的浸透圧に対し高く（高張）すると、密度勾配遠心時に目的細胞内の水分が細胞外へ流出し、目的細胞の比重が大きくなるため、目的細胞の回収効率が低下するおそれがある。一方本発明では、目的細胞を含む溶液の浸透圧を、安定化剤を含んだ態様で生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内としており、当該範囲であれば、密度勾配遠心による目的細胞の比重の変化は生じないまたはほぼ生じないため、目的細胞を効率的に回収することができる。なお目的細胞を含む溶液の浸透圧を、生理的浸透圧に対し−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏより低い浸透圧（低張）とすると、密度勾配遠心により目的細胞内に溶液が流入し、目的細胞の比重が小さくなるため、目的細胞の回収効率が低下する。
【００２８】
本発明の分離回収方法において、比重分離を利用した目的細胞を含む溶液からの当該目的細胞を含む画分の分離回収を、当該比重分離により目的細胞を多く含む画分を収容した部分と目的細胞をほとんど含まない画分を収容した部分とに分離可能な保存容器を用いて行なうと、当該目的細胞を含む画分の分離回収を、目的細胞を多く含む画分を収容した部分を保存容器から分離することで容易に行なえるため、好ましい。前記好ましい態様の容器の一例として、図１に示す構造体があげられる（ＷＯ２０１４／１９２９１９号参照）。図１に示す構造体１００は、
一端が閉塞して底部を形成し、他端が開口している筒状部材１０と、
両端が開口し、かつ一端の径が絞られた筒状部材２０と、
から構成されており、筒状部材１０と筒状部材２０の絞られた側の一端２１とが、連通開口端３０で連結／分離可能な構造となっている。
【００２９】
図１に示す構造体１００を用いて、本発明の目的細胞を含む画分の分離回収を行なうには、筒状部材１０と筒状部材２０とを連通開口端３０を介して連結した後、筒状部材１０内空間を密度勾配溶液４０で満たし、目的細胞を含む溶液５０（当該溶液の浸透圧は生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である）を筒状部材２０内空間に添加することで密度勾配溶液４０の上に目的細胞を含む溶液５０を重層（図２）させた後、密度勾配遠心により比重分離を行なう。比重分離後、目的細胞を含む画分６０が筒状部材２０内空間に存在する場合は、筒状部材２０の絞られていない側の一端の開口部２２を蓋７１を用いて閉塞し、筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、蓋７１による閉塞を解除し、絞られた側の一端２１から目的細胞を含む画分６０を別の容器２００に移し替えることで目的細胞を含む画分を分離回収することができる（図３）。分離回収した画分に含まれる目的細胞の測定（後述）を速やかに実施しない場合は、筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、絞られた側の一端２１を蓋７２で閉塞すればよい（図４）。蓋７２の形状としては、凸部を設けない蓋（図５（ａ））や、円柱状の凸部を設けた蓋（図５（ｂ））や、テーパーを有した円柱状の凸部を設けた蓋（図５（ｃ））が例示できる（図５）。中でも、図５（ｂ）および図５（ｃ）の態様は、筒状部材２０の絞られた側の一端２１内に設計されている貫通孔を塞ぐための凸部が設けられているため、前記貫通孔を塞ぐことが可能となる。図５（ｂ）および図５（ｃ）で設けられた凸部の形状としては、筒状部材２０の絞られた側の一端２１内に設計されている貫通孔部の体積に対して、前記凸部で３０％以上塞ぐと好ましく、６０％以上塞ぐとさらに好ましく、８０％以上塞ぐとさらにより好ましい。従って、図５（ａ）と比較して目的細胞の沈着が抑えられ、当該細胞の損失も抑えられる点で好ましい。筒状部材２０内空間に存在する目的細胞を含む画分６０が当該目的細胞を安定化させるための安定化剤を含んでおり、かつ当該画分の浸透圧が生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内であれば、目的細胞を安定化した状態で一定期間保存することができる。
【００３０】
なお図４に示す態様で保存すると、目的細胞を含む画分を高濃度タンパク雰囲気下で保存でき、目的細胞を長期間安定的に保存できるため好ましい。また別の容器２００（図３）や筒状部材２０（図４）のうち、内面など目的細胞を含む画分と接触する部分をタンパク質などでコートしても、目的細胞を長期間安定的に保存できるため好ましい。
【００３１】
本発明の方法で目的細胞を含む画分の分離回収を行なった後は、当該画分を遠心分離することで目的細胞を含むペレットを回収することができる。なお遠心分離操作の前に目的細胞を含む画分に、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含ませると試料中に含まれる細胞を効率的に回収できる点で好ましい。親水性高分子は電荷を持たない親水性高分子であればよく、一例としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマー、多糖類、ポリペプチドがあげられる。タンパク質は水溶性を有していればよく、一例として血清由来タンパク質や血漿由来タンパク質などの血液由来タンパク質やカゼインなどの乳由来タンパク質があげられ、さらに具体的な例として当業者が通常用いる血清由来タンパク質である、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）があげられる。親水性高分子を結合したタンパク質は、前述した親水性高分子とタンパク質とが一定の割合で結合したタンパク質であり、例えば、タンパク質と結合可能な官能基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を付与した親水性高分子とタンパク質とを一定のモル比で反応させることで得られる。なお親水性高分子とタンパク質との反応比は、タンパク質に対し親水性高分子を０．０１以上のモル比で反応させればよく、０．５以上のモル比で反応させればより好ましく、２以上のモル比で反応させると最も好ましい（一例として、血液由来タンパク質または乳タンパク質に対し親水性高分子を２以上のモル比で反応させると、血液由来タンパク質に対しては親水性高分子が実測モル比１以上で結合し、乳由来タンパク質に対しては親水性高分子が実測モル比０．２以上で結合する）（特開２０１６−１０６６２２号公報参照）。また遠心分離操作の前に目的細胞を含む画分に、糖をさらに含ませると試料中に含まれる細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。糖の一例として、マンニトール、グルコース、スクロースがあげられる。前記溶液に含ませる糖の濃度は等張液となる濃度とすると好ましく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間が好ましい範囲といえる。
【００３２】
本発明の方法で分離回収した目的細胞は、例えば、スライドに塗布したり、顕微鏡や光学検出器などで観察したり、フローサイトメトリーを用いて測定すればよい。なお顕微鏡や光学検出器などで観察して細胞の測定を行なう場合、前記細胞を含む懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察するとよい。保持部の例として、前記細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。また細胞を保持部に保持させる際、誘電泳動力を用いると、保持部に細胞を効率的に保持させることができる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００３３】
以下、本発明の分離回収方法の一例として、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離回収する方法を説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
（１）がんの疑いのある患者から血液を採取する。なお血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
（２）（１）で採取した血液（または希釈した血液）に、ＣＴＣを安定化させるための安定化剤を添加する。安定化剤としてイミダゾリジニル尿素を用いる場合は、後述の密度勾配遠心に供する溶液（希釈血液試料）中の濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）となるよう含ませればよく、０．２５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）となるよう含ませると好ましく、０．３％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）となるよう含ませるとさらに好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）となるよう含ませるとさらにより好ましい。血液（または希釈した血液）への安定化剤の添加量は、血液（または希釈した血液）１ｍＬあたり０．０１ｍＬから１０ｍＬの間であればよく、０．０４ｍＬから２ｍＬの間であればより好ましい。なお本操作で、溶液の浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内となるよう調整する。
（３）安定化剤を含ませ、浸透圧を調製した溶液（希釈血液試料）から、密度勾配遠心を用いて、ＣＴＣを含む画分を分離する。密度勾配遠心法は細胞をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体（密度勾配溶液）上に希釈血液試料を重層した後、遠心分離を行ない、目的とするＣＴＣを含む層（上層）を回収することで、不要な細胞を除去したＣＴＣを含む画分を得る。なお密度勾配遠心を行なう前に、血液または希釈血液に、不要な細胞である赤血球、白血球と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加するとよい。前記結合剤は、赤血球、白血球、および／またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心によるＣＴＣの分離を容易にする。なお得られた画分からのＣＴＣの測定を速やかに行なわない場合は、例えば図４に示す態様で保管すればよい。図４に示す態様の場合、室温で約３０日間ＣＴＣの保管が可能である。
（４）（３）で得られたＣＴＣを含む画分を遠心分離することで血液成分を除去し、当該ＣＴＣをペレット状にした後、適切な溶液を用いてＣＴＣを懸濁させる。なおＣＴＣを懸濁させる溶液に、親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ）を含ませてもよい。親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液でのタンパク質の終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）の間であれば好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましい。
（５）（３）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお必要に応じ、前記回収したペレットを親水性高分子を結合したタンパク質を含む溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の細胞の分離回収方法は、目的細胞を含む溶液から比重分離を利用して当該目的細胞を含む確認を分離回収する際、目的細胞を含む溶液に当該目的細胞を安定化させるための安定化剤をさらに含ませ、かつ目的細胞を含む溶液の浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とすることを特徴としている。本発明により、溶液中に含まれる目的細胞を高効率に分離回収することができる。特に前記溶液中に含まれる目的細胞量が非常に少ない場合に有用な方法である。
【００３５】
一例として本発明を、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離回収に適用することで、採血量を少なくすることができ、患者への負担を低減させることができる。またがんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、精度高くがんを診断することができる。
【００３６】
なお比重分離を利用した目的細胞を含む画分の分離回収に用いる、当該目的細胞を安定化させるための安定化剤（例えば、目的細胞を含む溶液中の濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）のイミダゾリジニル尿素）を含み、かつ浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とした細胞保存液は、目的細胞の保存に適した溶液であり、前記溶液は目的細胞の室温下での長期間保存を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の分離回収方法で用いる、好ましい構造体の一例を示す図。
【図２】図１に示す構造体を用いた、本発明の分離回収方法を示す図。
【図３】図１に示す構造体を用いた、本発明の分離回収方法を示す図。
【図４】図１に示す構造体を用いた、本発明の分離回収方法で得られた目的細胞を含む画分の保存方法を示す図。
【図５】図１に示す構造体における蓋７２の一例を示す図（断面図）。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
（２）イミダゾリジニル尿素２ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２ｇ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１００ｍｇ、および塩化ナトリウムを、超純水１００ｍＬに溶解し、得られた溶液を安定化剤として用いた。なお調製する際、塩化ナトリウムの添加量を変えることで、浸透圧の異なる安定化剤を調製した。
（３）ヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識した。蛍光標識されたＳＫＢＲ３細胞を目的とする細胞とした。
（４）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に（２）で調製した安定化剤３ｍＬ、および（３）で蛍光標識したＳＫＢＲ３細胞約１００個を添加し、得られた溶液を保存処理した希釈血液試料とした。なお浸透圧の異なる安定化剤を添加することで、保存処理した希釈血液試料の浸透圧を、生理的浸透圧（ここでは採取した血液の浸透圧のことをいう、以下同じ）と同じ（等張）または生理的浸透圧より−３０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏもしくは−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏとなるよう調製した。
（５）保存処理した希釈血液試料を室温で１０分放置し、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した後、図１に示す構造体の筒状部材２０の位置に添加し、室温で２０００×ｇで１０分間遠心した。なお図１に示す構造体の筒状部材１０内空間はあらかじめ密度１．０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液で満たしており、保存処理した希釈血液試料は当該密度勾配溶液上に重層された形（図２）となっている。
（６）遠心後、筒状部材２０の絞られていない側の一端２２の開口部を蓋７１を用いて閉塞し、筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、蓋７１による閉塞を解除し、目的細胞を含む画分を含む溶液をタンパク質をコーティングしていない５０ｍＬ容量の容器２００に回収した（図３）。
（７）回収後数分以内に０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップ後、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収したＳＫＢＲ３細胞の観察が良好になる。
（８）遠心後の上清を除去した後、ＳＫＢＲ３細胞を含むペレットを、（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
（９）再懸濁液を３００×ｇで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、再度、ＳＫＢＲ３細胞を含むペレットを、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血液成分を除去し、目的とするＳＫＢＲ３細胞を濃縮するための操作である。
（１０）（９）で上清を除去したＳＫＢＲ３細胞を含む懸濁液を細胞診断チップに導入し、交流電圧を３分間印加することで前記チップが有する保持部にＳＫＢＲ３細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞診断チップは、直径３０μｍで深さ３０μｍの微細孔からなる微細孔を複数有した絶縁体と前記絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜とからなる保持部を、厚さ１ｍｍのスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造であり、前記スペーサーを上部電極基板と下部電極基板とで挟んだ構造である。
（１１）細胞診断チップに保持されたＳＫＢＲ３細胞数を計測し、（４）で添加したＳＫＢＲ３細胞数で除することで回収率を算出した。
【００４０】
比較例１
実施例１（４）において、採取した血液３ｍＬが入った採血管に生理食塩水３ｍＬ、および（３）で蛍光標識したＳＫＢＲ３細胞約１００個を添加して、希釈血液試料を調製した他は、実施例１と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。なお希釈血液試料の浸透圧は生理的浸透圧と等張である。
【００４１】
比較例２
実施例１（４）で添加する安定化剤を、保存処理した希釈血液試料の浸透圧が生理的浸透圧に対し＋２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ、＋１１０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ、−９０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまたは−１２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏとなるような安定化剤とした他は、実施例１と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００４２】
実施例１ならびに比較例１および２での回収率の結果をまとめて表１に示す。なお表１において浸透圧は、実施例１（４）で採取した血液の浸透圧を生理的浸透圧とし、その値を基準としたときの差で表している。また表１において「安定化剤添加無し」は安定化剤の代わりに生理食塩水を添加して調製した希釈血液試料（比較例１）のことを指す。目的細胞の分離回収工程において、実施例１の条件で保存処理した希釈血液試料を用いたときの細胞の回収率は９９％前後と、安定化剤による保存処理を行なったにもかかわらず、保存処理をしない希釈血液試料（比較例１）を用いたとき（９９．３％）と同等の回収率となった。一方、比較例２の条件で保存処理した希釈血液試料を用いたときは、回収率が低下し、特に生理的浸透圧に対し−９０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏおよび−１２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏである保存処理した希釈血液試料では、密度勾配遠心時に不要細胞である赤血球が除去できず、回収率測定ができなかった。このことから安定化剤による保存処理を行なっても、実施例１の条件、すなわち浸透圧を生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内とすることで、保存処理をしない希釈血液試料（比較例１）を用いたときと同等の高い回収率で目的細胞を分離回収できることがわかる。
【００４３】
【表１】
2017055759.tif 000002
実施例２
（１）イミダゾリジニル尿素２ｇと、ＥＤＴＡ１００ｍｇと、塩化ナトリウム６００ｍｇとを、超純水１００ｍＬに溶解し、さらに分子量６０００のＰＥＧを保存処理した希釈血液試料中の濃度として０％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）となるよう添加することで、本実施例で用いる安定化剤を調製した。
（２）実施例１（４）で添加する安定化剤として、（１）に記載の安定化剤を用いた他は、実施例１と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。なお、本操作で得られた保存処理した希釈血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内であることを浸透圧計で確認している。
【００４４】
実施例２での回収率の結果を表２に示す。目的細胞の分離回収工程において、保存処理した希釈血液試料中の濃度としてＰＥＧを０．１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）添加すると、未添加時（９１．８％）と比較し回収率が向上（９２．２％から９８．４％）していることがわかる。特にＰＥＧを０．５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）添加したときは約９５％以上と極めて高い回収率となっている。
【００４５】
【表２】
2017055759.tif 000003
実施例３
（１）ＥＤＴＡ１００ｍｇと、分子量６０００のＰＥＧ２ｇと、塩化ナトリウムとを、超純水１００ｍＬに溶解し、さらにイミダゾリジニル尿素を保存処理した希釈血液試料中の濃度として０．２５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）となるよう添加することで、本実施例で用いる安定化剤を調製した。
（２）実施例１（４）で添加する安定化剤として（１）に記載の安定化剤を用い、実施例１（５）における保存処理した希釈血液試料の室温での放置時間を８時間とした他は、実施例１と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。なお、本操作で得られた保存処理した希釈血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内であることを浸透圧計で確認している。
【００４６】
比較例３
実施例３（１）でイミダゾリジニル尿素を添加しない（０％（ｗ／ｖ））他は、実施例３と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００４７】
実施例３および比較例３での回収率の結果を表３に示す。目的細胞の分離回収工程において、イミダゾリジニル尿素を添加しないとき（比較例３）は、８時間の室温放置により回収率が６２．７％に低下した。一方、イミダゾリジニル尿素を安定化剤として添加する（実施例３）ことで、回収率が７４．６％から８９．７％と、未添加時（比較例３）（６２．７％）と比較し、向上していることがわかる。特に保存処理した希釈血液試料中の濃度としてイミダゾリジニル尿素を０．２５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）添加したときは８５％以上と極めて高い回収率となっている。
【００４８】
【表３】
2017055759.tif 000004
実施例４
（１）イミダゾリジニル尿素２ｇと、分子量６０００のＰＥＧ２ｇと、ＥＤＴＡ１００ｍｇと、塩化ナトリウム６００ｍｇとを、超純水１００ｍＬに溶解することで、本実施例で用いる安定化剤を調製した。
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した安定化剤３ｍＬ、および実施例１（３）で蛍光標識したＳＫＢＲ３細胞約１００個を添加することで、保存処理した希釈血液試料を調製した。なお、本操作で得られた保存処理した希釈血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である。
（３）保存処理した希釈血液試料を室温で１０分放置し、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した後、図１に示す構造体の筒状部材２０の位置に添加し、室温で２０００×ｇで１０分間遠心した。なお図１に示す構造体の筒状部材１０内空間はあらかじめ密度１．０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液で満たされており、保存処理した希釈血液試料は当該密度勾配溶液上に重層された形（図２）となっている。
（４）遠心後、筒状部材２０の絞られていない側の一端２２の開口部を蓋７１を用いて閉塞し、筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、蓋７１による閉塞を解除し、目的細胞を含む画分を含む溶液をタンパク質でコートしていない５０ｍＬ容量の容器２００に回収し（図３）、遮光した状態で５日間室温で放置した。
（５）５日間放置後、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。
（６）実施例１（８）から（１１）と同様な操作を行ない、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００４９】
実施例５
（１）５０ｍＬ容量の容器に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む超純水を添加し、容器内全面を前記添加溶液で濡らした後、容器内を超純水で洗浄し、乾燥させることで、ＢＳＡでコーティングした容器を作成した。
（２）目的細胞を含む画分を回収する容器として、（１）に記載の容器を用いた他は、実施例４と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５０】
比較例４
実施例４（２）に示す工程で、実施例４（１）で調製した安定化剤の代わりに、比較例３で用いたイミダゾリジニル尿素を添加しない（０％（ｗ／ｖ））安定化剤３ｍＬを添加した他は、実施例４と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５１】
実施例６
（１）実施例４（１）から（３）と同様な方法で、保存処理した希釈血液試料を密度勾配遠心した。
（２）遠心後、筒状部材２０の絞られていない側の一端２２の開口部を蓋７１を用いて閉塞し、筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、絞られた側の一端２１を図５（ｂ）に示す蓋７２を用いて閉塞し（図４）、遮光した状態で５日間室温で放置した。
（３）５日間放置後、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。
（４）実施例１（８）から（１１）と同様な操作を行ない、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５２】
実施例７
（１）図１に示す構造体１００に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む超純水を添加し、構造体を構成する筒状部材１０・２０内面の全てを前記添加溶液で濡らした後、容器内を超純水で洗浄し、乾燥させることで、ＢＳＡでコーティングした構造体１００を作成した。
（２）目的細胞を含む画分を分離回収する容器として、（１）に記載の容器を用いた他は、実施例６と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５３】
実施例４から７および比較例４での回収率の結果をまとめて表４に示す。なお表４において「イミダゾリジニル尿素添加無し」はイミダゾリジニル尿素を含まない安定化剤を添加して調製した希釈血液試料（比較例４）のことを指す。目的細胞の分離回収工程において、イミダゾリジニル尿素を添加しないとき（比較例４）は、５日間の室温放置により回収率が５６．３％に低下した。一方、安定化剤を添加する（実施例４から７）ことで、回収率が８３．１％から９６．０％と、未添加時（比較例４）（５６．３％）と比較し、向上していることがわかる。また目的細胞を含む画分の保存容器として、タンパク質であるＢＳＡをコートすることで回収率が向上していることがわかる（実施例４と５との間、および実施例６と７との間での比較）。さらに目的細胞を含む画分の保存容器として、図４に示す容器を用いることで、別の容器を準備する場合と比較して回収率が向上していることがわかる（実施例４と６との間、および実施例５と７との間での比較）。
【００５４】
【表４】
2017055759.tif 000005
実施例８
実施例６（２）で筒状部材２０を筒状部材１０から分離した後、絞られた側の一端２１内に設計されている直径２ｍｍであり高さ８ｍｍの円柱状の貫通孔を閉塞する蓋７２として、図５（ａ）に示す蓋、図５（ｂ）に示す直径１．８５ｍｍであり高さ８ｍｍの円柱状の凸部が設けられた蓋および図５（ｃ）に示す蓋底部に接続されている一端が直径２ｍｍであり他端が直径１．８５ｍｍであるテーパーを有した高さ８ｍｍの円柱状の凸部が設けられた蓋のいずれかを用いた他は、実施例６と同様な方法でＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５５】
実施例８での回収率および筒状部材２０の絞られた側の一端２１への血球沈着の結果を表５に示す。なお表５において血球沈着の有無の評価は、筒状部材２０の端部２１を目視で観察し、血球の存在が確認できたか否かで行なっている。図５（ａ）から（ｃ）に示すいずれの蓋７２を用いても、回収率は高い値（回収率８１．４％から８２．２％）を示した。一方、血球沈着の有無を評価すると、筒状部材２０の絞られた側の一端２１内に設計されている貫通孔部の体積に対して８６％塞ぐことのできる凸部を設けた図５（ｂ）および前記貫通孔部の体積に対して９３％塞ぐことのできる凸部を設けた図５（ｃ）に示す蓋７２では血球沈着は確認できなかったが、前記貫通孔部を塞ぐことのできない凸部を設けない図５（ａ）に示す蓋７２では血球沈着を確認した。このことから蓋７２には、図５（ｂ）および図５（ｃ）に示すような凸部を設けると好ましいことがわかる。その理由として、筒状部材２０の絞られた側の一端２１内に設計されている貫通孔を塞ぐための凸部が図５（ｂ）および図５（ｃ）には設けられているため、前記貫通孔を塞ぐことが可能であることが考えられる。従って、図５（ａ）と比較して図５（ｂ）および図５（ｃ）に示すような凸部を設けることで目的細胞の沈着が抑えられることにより、当該細胞の損失も抑えられる点でも好ましいことがわかる。
【００５６】
【表５】
2017055759.tif 000006
実施例９
（１）ＥＤＴＡ１００ｍｇと、分子量６０００のＰＥＧ２ｇと、塩化ナトリウムとを、超純水１００ｍＬに溶解し、さらにイミダゾリジニル尿素を保存処理した希釈血液試料中の濃度として０．２５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）となるよう添加することで、本実施例で用いる安定化剤を調製した。
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した安定化剤３ｍＬ、および実施例１（３）で蛍光標識したＳＫＢＲ３細胞約１００個を添加することで、保存処理した希釈血液試料を調製した。なお、本操作で得られた保存処理した希釈血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である。
（３）保存処理した希釈血液試料を室温で１０分放置し、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した後、図１に示す構造体の筒状部材２０の位置に添加し、室温で２０００×ｇで１０分間遠心した。なお図１に示す構造体の筒状部材１０内空間はあらかじめ密度１．０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液で満たされており、保存処理した希釈血液試料は当該密度勾配溶液上に重層された形（図２）となっている。
（４）遠心後、筒状部材２０の絞られていない側の一端２２の開口部を蓋７１を用いて閉塞し、筒状部材２０を筒状部材１０から分離させた後、絞られた側の一端２１を図５（ｂ）に示す蓋７２を用いて閉塞し（図４）、遮光した状態で７日間室温で放置した。
（５）７日間放置後、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。
（６）実施例１（８）から（１１）と同様な操作を行ない、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５７】
比較例５
実施例９（１）でイミダゾリジニル尿素を添加しない（０％（ｗ／ｖ））他は、実施例９と同様な方法で、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５８】
実施例９および比較例５での回収率の結果を表６に示す。目的細胞の分離回収工程において、イミダゾリジニル尿素を添加しないとき（比較例５）は、７日間の室温放置により回収率が６６．７％に低下した。一方、イミダゾリジニル尿素を安定化剤として添加（実施例９）することで、回収率が８４．２％から９３．４％と、未添加時（比較例５）（６６．７％）と比較し、向上していることがわかる。特に保存処理した希釈血液試料中の濃度としてイミダゾリジニル尿素を０．５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）添加したときは９０％以上と高い回収率となっている。
【００５９】
【表６】
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実施例１０
（１）イミダゾリジニル尿素２ｇと、分子量６０００のＰＥＧ２ｇと、ＥＤＴＡ１００ｍｇと、塩化ナトリウム６００ｍｇとを、超純水１００ｍＬに溶解することで、本実施例で用いる安定化剤を調製した。
（２）実施例９（２）で添加する安定化剤として（１）に記載の安定化剤を用い、実施例８（４）の放置期間を３分、１５日または３０日とした他は、実施例９（２）から（６）と同様な操作を行ない、ＳＫＢＲ３細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。なお本実施例において、イミダゾリジニル尿素の濃度は、保存処理した希釈血液試料中の濃度として１％（ｗ／ｖ）となる。また保存処理した希釈血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ（等張）から−６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲内である。
【００６０】
実施例１０での回収率の結果を表７に示す。目的細胞を含む画分を得た後、速やかに分離操作を行なったとき（９７．５％）と比較し、７日間（実施例９）、１５日間または３０日間保存した画分を分離操作したときの回収率はやや低下しているものの、９０％以上の回収率は維持（７日間：９３．４％（表６の１％（ｗ／ｖ）の結果参照）、１５日間：９１．１％、３０日間：９０．８％）しており、実用上十分といえる。
【００６１】
【表７】
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【符号の説明】
【００６２】
１００：構造体
１０・２０：筒状部材
２１・２２：筒状部材２０の端部
３０：連通開口端
４０：密度勾配溶液
５０：目的細胞を含む溶液
６０：目的細胞を含む画分
７１・７２：蓋
２００：回収容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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