(57)【要約】【課題】  患者の中皮腫の進行や漿膜劣化の程度を把握することは、臨床上極めて重要であるにもかかわらず、簡便な検出法がない為、定期的に施行されないことが多い。中皮腫はII期以上に進行すると外科的手術の効果が期待できないため、初期病変で診断することが求められている。一方、腹膜透析療法を安全に施行し広く普及させるためには、漿膜劣化の程度を定期的にモニターして、腹膜透析の重篤な合併症であるＥＰＳの発症を未然に防ぐために適切な時期に腹膜透析から血液透析に移行するなどの処置が重要である。即ち中皮腫もしくは漿膜劣化を早期に簡便に検出する方法が求められている。【解決手段】血液等の体液もしくは体腔内貯留液を採取し、検体中のグルタミン酸およびグルタミンの濃度比を検出することを特徴とする、漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出により、中皮腫もしくは漿膜劣化を判定する。【選択図】    図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された体液を検体とし、検体中のグルタミンとグルタミン酸との濃度を比較することを特徴とする漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
【請求項２】
検体は血液である請求項１に記載の漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
【請求項３】
生体から採取された体腔内からの排液を検体とし、検体中のグルタミンとグルタミン酸との濃度を比較することを特徴とする漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
【請求項４】
検体は体腔洗浄排液、腹膜透析によって得られる透析排液、腹水または胸水である請求項３に記載の漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漿膜表層における紡錘形細胞の増殖を簡便にかつ低侵襲に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漿膜の表面は通常は一層の敷石状の中皮細胞で覆われているが、炎症や酸化ストレス、低酸素などによって引き起こされる漿膜傷害の初期には、中皮細胞が紡錘形の間葉細胞の形質を獲得する。この現象を中皮細胞の上皮間葉転換（Epithelial-to-Mesenchymal Transition /or Transformation, ＥＭＴ）という(非特許文献1)。ＥＭＴにより中皮細胞は、細胞極性や周囲の細胞との接着機能が喪失して紡錘形の細胞となり、重層しながら細胞増殖を繰り返す。中皮腫は漿膜のうち、主に胸膜と腹膜で頻発し、稀に心膜や精巣で生じることもある。例えば胸部の体腔である胸腔を形成している漿膜の一種である胸膜がアスベストや凝灰岩などに含まれるエリオン沸石に暴露されると、インターロイキン６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインの産生が誘導され、胸膜の中皮細胞はＥＭＴにより紡錘形の中皮腫に形質転換する。中皮腫が悪性の場合、病状が進行すると息切れ、胸痛、咳、発熱、胸水貯留による胸部圧迫感さらには呼吸困難を呈することがあるが、初発症状は乏しい。中皮腫が腹腔の漿膜である腹膜で発生した場合は、進行が進むと、腹部膨満、腹痛、食欲不振、悪心・嘔気・嘔吐、腹水貯留などが生じ、末期には腸管の癒着によりａｂｄｏｍｉｎａｌ cocoonと呼ばれる繭状の内臓器塊を形成する。中皮腫は有効な早期診断法が無い為、診断された時には既にび慢性に広範囲に進展していて根治手術が不可能であることが多い。胸腔の中皮腫の場合はI期などの早期であれば、外科的手術により患部を除去することが可能な場合が多いが、II期以降になると外科的切除が困難な為、放射線療法、抗がん剤による化学療法もしくは緩和療法となる。中皮腫と診断された時には病巣が広範囲に進展していることが多いので、生命予後はきわめて不良である。１年生存率が５０％、２年生存率が２０％と低いことから、病態初期の診断が求められている。現在、中皮腫の診断は、浸襲が高組織生検に依るところが大きく、簡便で低浸襲に検査可能な診断方法が求められている。
【０００３】
中皮細胞のEMTは、良性の病態にも関与している。人工透析は、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対し、本来腎臓が果たしている血液浄化作用を腎臓に代わって行う血液浄化療法であり、生体内から過剰な水を除去することによって体液の組成を一定に保つとともに体液中の尿素等の老廃物などを除去することを主な目的としている。現在の人工透析には、主に血液透析療法と腹膜透析療法がある。
腹膜透析療法は漿膜の一種である腹膜で囲まれることによって形成された腹部の体腔である腹腔内に浸透圧の高い透析溶液を貯留することによって生体内の過剰な水と老廃物を取り除くことを基本とする。即ち腹膜の微小血管を介して腹腔内に貯留させた透析溶液中に老廃物もしくは水が移動することによって透析される。この時の水の移動は透析溶液と体液の間に生じる浸透圧格差によって起きる。透析溶液中の浸透圧調節物質としてグルコースやグルコースポリマーなどが用いられるが、腹腔内に非生理的な浸透圧の高い透析溶液を貯留するため、腹膜は傷害を受けて劣化しやすい。
【０００４】
１９７５年にPopovichとMoncriefにより持続的携行型腹膜透析が開始されてから４０年ほど経つが、透析患者のほとんどが血液透析であり、わが国の腹膜透析患者は全透析患者の３％にも満たない。しかし血液透析は急激な血液組成の変化が生じるため循環系への負担が多く、食事制限も厳しく、週3回程度医療機関に通院する必要があるため拘束時間が長い。一方、腹膜透析は自宅で透析が行えるので、通院の頻度が少なくなるといったＱＯＬ（クオリティーオブライフ）に優れているだけでなく、血液透析と比べて循環系への影響や生体内部環境の変動が少ないといった特色を持っている。腹膜透析がこのような利点を持つのにもかかわらず広く普及しない理由としては、腹膜劣化により腹膜機能が低下し、除水や老廃物の除去が困難もしくは出来なくなるために腹膜透析を断念せざるをえなくなることがあげられる。さらには腹膜の劣化が進行すると被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）を発症することがある。EPSは除水能の低下や溶質除去不全に陥るだけでなく、腸管が癒着する。さらに病態が進行すると膠原性線維に富む肥厚した腹膜で腸管が包まれて、ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃｏｃｏｏｎを形成する。臨床的には腹部膨満、腹痛、食欲不振、悪心・嘔気・嘔吐、低栄養による痩せ、下痢、便秘、腸管蠕動音の低下など腸閉塞症状や腹水貯留が生じる。発症頻度は必ずしも高くはないが、２年後の生存率は約５０％しかなく、致死率が非常に高い。ＥＰＳによる直接の死因は、内臓の高度な癒着、すなわちａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃｏｃｏｏｎの形成により、腸管が圧迫・癒着した結果、循環障害・壊死をおこし、これが原因となって敗血症になるためと考えられる。すなわち、ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃｏｃｏｏｎの形成を予防、防止することが極めて重要である。腹膜劣化の成因としては、細菌や真菌感染による腹膜炎と腹膜透析液の生体非適合性があげられる（非特許文献２）。後者の要因には透析液のｐH、高乳酸濃度、高浸透圧、高ブドウ糖濃度、メチルグリオキサールなどのブドウ糖分解物などが考えられる。EPSの治療法としては発症初期ではステロイド剤や免疫抑制剤、抗がん剤の一種であるタモキシフェリンなどの投与が有効との報告があるが、ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃｏｃｏｏｎ形成後では被嚢した腹膜を剥離する外科的治療や保存的対応しかなく、外科的治療は熟練した一部の外科医にしか対応できない。現在、ＥＰＳの診断は、イレウス症状等の臨床所見のほか腹部の触診（塊状物の触知）がなされているが、客観的な基準ではない。さらにEPSが進行した場合でも上述のような典型的症状を起こさない場合も多く、診断が遅れることが多い。一部ではＸ線やＣＴ検査、超音波検査などの画像解析による診断もなされているが、病状がある程度進行しないと判定できないといった欠点があり、早期判定には向いていない。日本透析医学会の「腹膜透析ガイドライン」ではEPS の発症を回避するためには、発症の素因となる腹膜劣化の程度を個々の患者で経時的に把握・推測することが肝要とされている（非特許文献２）。
【０００５】
日本透析医学会の「腹膜透析ガイドライン」では漿膜劣化の評価として、腹膜平衡試験（Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ：ＰＥＴ）を定期的に行うことが推奨されている（エビデンスレベルVI：委員会オピニオン）。PETはTwardowski らにより提案され、全世界で利用されている腹膜機能の試験法であるが、煩雑で患者の拘束時間も長い（非特許文献２、３、４）。ＰＥＴは以下のように実施される。まず、８〜１２時間腹腔に貯留した透析液を２０分かけて排液し、グルコース（通常は２．５％のことが多い）を含む腹膜透析液（通常２Ｌ）を腹腔に２００ｍＬ/分の速度で注液する。注液直後、２時間後、４時間後に腹腔に貯留した透析液の一部を回収して、クレアチニン濃度とグルコース濃度を測定する。さらに、注液２時間後では血液を約５ｍＬ採取して血中のクレアチニン濃度の測定を行う。各時間の透析液中のクレアチニン濃度の値を血中クレアチニン濃度の値で除することにより、Ｄ/Ｐクレアチニン値を算出し、血液中から腹腔内に貯留した透析液中へのクレアチニンの移動のしやすさを調べる。一方、各時間の透析液中のグルコース濃度の値を注液直後の透析液中のグルコース濃度の値で除することにより、Ｄ／Ｄ０グルコース値を算出し、腹腔内に貯留した透析液中のグルコース濃度の変化の割合を調べる。以上のように算出したＤ／Ｐクレアチニン値とＤ／Ｄ０グルコース値から、腹膜における小分子物質の透過性を解析して腹膜機能を評価する。ＰＥＴの結果は、腹膜における小分子物質の透過が高い方から順に、Ｈｉｇｈ、Ｈｉｇｈ  ａｖｅｒａｇｅ、Ｌｏｗ  ａｖｅｒａｇｅ、Ｌｏｗの四つのカテゴリーに分けて判定される。Ｈｉｇｈの方が漿膜における小分子物質の透過性が高いので、血中の老廃物除去能も高いが、除水量は少ない。逆にＬｏｗでは、腹膜における小分子物質の透過性が低いので、血中の老廃物の除去能は低いが、除水量は多い。ＰＥＴは上述したように患者は病院に半日拘束され、かつ医療従事者の負担も多い。即ちＰＥＴは手間がかかるため、医療従事者もＰＥＴ検査の重要性は認識しながらも、定期的に施行していない医療機関も多い。
腹膜劣化の程度を把握することは、臨床上極めて重要であるにもかかわらず、簡便な検出方法がない。腹膜透析療法を安全に施行し、広く普及させるためには、腹膜劣化の進行をモニターして、適切な時期にＥＰＳの発症を未然に防ぐために腹膜透析から血液透析に移行することが重要である（非特許文献２、５）。
【０００６】
上記した腹膜は腹腔を覆う漿膜であり、その表面は通常は一層の敷石状の中皮細胞で覆われているが、腹膜傷害の初期には、EMTにより中皮細胞が間葉細胞に形質転換する。その結果、腹膜表層に紡錘形の細胞増殖に伴う新生被膜が形成され、腹膜肥厚を促進する（非特許文献６）。これら紡錘形の細胞では、ポドプラニンの発現が誘導される。ポドプラニンは凝固系を亢進するため、新生被膜で覆われた臓器は癒着し、さらに被膜では紡錘形の細胞の増殖が繰り返され、ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃｏｃｏｏｎと呼ばれる繭状の厚い被膜に内臓が覆われることになる（非特許文献７）。Ａｇｕｉｌｅｒａらは中皮細胞のEMTは腹膜透析において腹膜劣化のトリガーであることを報告している（非特許文献８）。また腹膜における小分子物質の透過性の亢進は中皮細胞のＥＭＴに関連しているとの報告もある（非特許文献９）。これらのことから中皮細胞のEMTで生じた腹膜表層の紡錘形細胞の増殖を検出することにより、腹膜劣化を早期に診断できると期待される。
上述したように中皮細胞のEMTもしくは漿膜表層の紡錘形細胞の増殖を検出することにより、中皮腫もしくは漿膜劣化を早期に診断でき、EPS等漿膜の重篤な疾患の発生の予測に利用することが可能になると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Thiery JP： Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer ２００２；２（６）：４４２−４５４．
【非特許文献２】２００９年版日本透析医学会「腹膜透析ガイドライン」．日本透析医学会雑誌 ２００９；４２（4）：２８５−３１５．
【非特許文献３】Twardowski ZJ, et al： Peritoneal equilibration test. Perit Dial Bull  １９８７；７：１３８−1４７．
【非特許文献４】山下明泰： 「よくわかる腹膜透析の基礎」. 東京医学社  １９９８年.
【非特許文献５】野本保夫、川口良人、酒井信治、他：硬化性被嚢性腹膜炎(ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ、ＳＥＰ)診断・治療指針（案）―１９９７年度における改訂―．透析会誌 １９９８；３１：３０３−３１１．
【非特許文献６】Hirahara I, Ishibashi Y, Kaname S, Kusano E, Fujita T：  Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.  Nephrol Dial Transplant.  ２００９；２４（２）：４３７−４４７．
【非特許文献７】Hirahara  I, Sato H, Imai T, Onishi A, Morishita Y, Muto S, Kusano E, Nagata D： Methylglyoxal induces basophilic spindle cells with podoplanin at the surface of peritoneum in rat peritoneal dialysis model. BioMed Research International ２０１５；２０１５：２８９７５．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１５／２８９７５１．
【非特許文献８】Aguilera A, Yanez-Mo M, Selgas R, et al： Epithelial to mesenchymal transition as a triggering factor of peritoneal membrane fibrosis and angiogenesis in peritoneal dialysis patients. Current Opinion Investigational Drugs ２００５；６（３）：２６２−２６８．
【非特許文献９】del Peso G, Jimenez-Heffernan JA, Bajo MA, et al：Epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells is an early event during peritoneal dialysis and is associated with high peritoneal transport. Kidney International ２００８；７３， supplement：Ｓ２６−３３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、漿膜表層における紡錘形細胞の増殖を検出する方法を提供し、中皮腫もしくは漿膜の劣化を早期に診断することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（４）の本発明により達成される。
（１）  生体から採取された体液を検体とし、検体中のグルタミンとグルタミン酸との濃度を比較する漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
（２）  検体は血液である請求項１に記載の漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
（３）  生体から採取された体腔内からの排液を検体とし、検体中のグルタミンとグルタミン酸との濃度を比較する漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
（４）  検体は体腔洗浄排液、腹膜透析によって得られる透析排液、腹水または胸水である上記（３）に記載の漿膜表層における紡錘形細胞増殖の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、血液等の体液もしくは体腔内からの排液に含まれるグルタミン酸およびグルタミンの濃度比を測定することで、漿膜表層の紡錘形細胞の増殖を検出することが可能であり、これにより中皮腫や漿膜劣化を早期に診断することが出来るため、適切な処置が可能となり、臨床での生命予後が著しく改善されると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コントロール群の漿膜の状態を示す図（図面代用写真）である。筋肉の表層に一層の中皮細胞からなる漿膜が見られる。
【図２】漿膜劣化群（紡錘形細胞増殖群）において劣化した漿膜表面に中皮細胞のEMTによって生じた紡錘形の間葉細胞が増殖していることを示した図（図面代用写真）である。
【図３】漿膜劣化群（紡錘形細胞増殖群）のコントロール群に対する漿膜肥厚の割合を示した図である。
【図４】血液中のグルタミン酸とグルタミンの濃度をコントロール群と漿膜劣化群（紡錘形細胞増殖群）で比較した図である。
【図５】腹腔内貯留液中のグルタミン酸とグルタミンの濃度をコントロール群と漿膜劣化群（紡錘形細胞増殖群）で比較した図である。
【図６】血液中のグルタミン酸とグルタミンの濃度比を解析した結果である。
【図７】腹腔内貯留液中のグルタミン酸とグルタミンの濃度比を解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の好適実施例について詳細に説明する。
本発明の検出方法は、血液等の体液もしくは体腔内からの排液から、漿膜表層の紡錘形細胞の増殖を反映して増減する複数の指標物質を検出し、濃度もしくは絶対量あるいは相対量を測定してそれらの濃度比を算出するものである。本方法によれば中皮腫や漿膜劣化を簡便に評価することができる。
本発明者は血液等の体液もしくは体腔内からの排液を検体として採取して研究を重ねた結果、漿膜表層の紡錘形細胞の増殖に相関して検体中の濃度もしくは絶対量あるいは相対量が変化する物質と変化しない物質が存在することを発見した。したがって血液もしくは体腔内の貯留液中からこのような物質、すなわち指標物質を検出し、濃度比を調べることにより、漿膜表層の紡錘形細胞の増殖を簡便に評価することができる。このような指標物質として、例えば濃度が著しく上昇する物質としてはグルタミン酸が、濃度が殆ど変わらないもしくは減少する物質としてはグルタミンなどの代謝産物があることを見出した。即ち、血液等の体液もしくは体腔内からの排液中のグルタミン酸やグルタミンなどの代謝産物等を指標物質として検体中の濃度もしくは絶対量あるいは相対量を測定し、それらの濃度比を算出することで、中皮腫や漿膜劣化を簡便に評価することが可能である。
【００１３】
特に腹膜透析を施行している患者の場合、腹膜透析のため腹部に留置されたカテーテルを介して腹腔貯留液である検体を採取することが好ましい。さらには腹膜透析の排液バッグに設けられたサンプリングチューブから採取する方法、もしくは排液バッグに連通するチューブの一部を融着により封止、切断して、かかるチューブ内あるいは排液バッグ内の排液を採取する方法などが挙げられる。排液バッグは、腹膜透析を行っている患者の腹部に接続されたカテーテルから分離され、流路が遮蔽されるので、検体を採取するときに、当該患者の体内に細菌等が進入することがなく、感染症等の誘発を防止することができる。このように検体を調製すれば患者に対して非侵襲的に評価することができる。
採取した検体から、指標物質を検出する際には、例えば電気泳動法、もしくはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イムノクロマトグラフィー等を用いたクロマトグラフィー法、マススペクトルを測定する方法などが挙げられる。特に指標物質がアミノ酸の場合には、イオン交換クロマトグラフィーにより各アミノ酸を分離し、ニンヒドリン反応により発色させて、アミノ酸標品と比較して、アミノ酸を定量してもよい。もちろんこれらの原理を応用した全自動アミノ酸分析機を使用しても良く、この場合、手間がかからずに解析することができる。もしくは高速液体クロマトグラフィーを用いて指標物質を定量してもよい。あるいはＣＥ-ＴＯＦＭＳ法で解析してもよい。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験1）動物モデルの作成
ＳＤラット（雄、５週齢、ｎ＝６）に対し、コントロール群には酸性透析液（ｐＨ５）を、漿膜劣化群（ＭＧＯ投与群）には２０ｍＭメチルグリオキサール添加酸性透析液（ｐＨ５）を、1回/日、３週間連続腹腔内投与した。検体の採取は、２２日目に、体腔洗浄液（2.5% glucose、100mM NaCl、35mM sodium lactate、2mM CaCl2、0.7mM MgCl2）を腹腔内に投与し、９０分後に排液して回収して行った。同時に、採血を行い血液検体とした。血液もしくは腹腔内貯留液の代謝産物はＣＥ-ＴＯＦＭＳ法で解析した。
一方、腹腔漿膜の劣化は形態変化で評価した。腹腔の壁側漿膜を採取してホルマリン固定した後、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン／エオジン染色を行い、漿膜の厚さを測定した。この結果、コントロール群は漿膜の表面に一層の中皮細胞が存在していたのに対し、ＭＧＯ投与群の漿膜表層では、紡錘形の幼若細胞が著しく増殖しており、新生漿膜の形成が観察された。紡錘形の幼若細胞は中皮細胞のEMTにより生じたと考えられた。また、漿膜は著しく肥厚しており、形態的に漿膜劣化が確認された。コントロール群の漿膜の断面写真と、MＧＯ投与群の漿膜の断面写真をそれぞれ図1と図２に示した。また、漿膜の肥厚の割合を図３に示した。
【００１５】
実験2）血液および腹腔内貯留液中の指標物質の測定（ＣＥ-ＴＯＦＭＳ法）
検体の前処理として、内部標準物質の終濃度が１０μＭとなるように調整したメタノール溶液９００μＬに血液もしくは腹腔内貯留液１００μＬを添加して、検体中の酵素を失活させて代謝反応をとめた。さらに精製水４００μLとクロロホルム１ｍＬを加え、１分間攪拌し、４℃にて２３００×ｇ、５分間の遠心分離を行い、２液に分離した上層の水層を限外濾過チューブ（５ｋＤａ、ミリポア社性ウルトラフリーＭＣ ＰＢＣＣ遠心フィルターユニット）に２５０μＬ×３本に分注し、４℃、９１００×ｇ、１２０分間の限外濾過を行い、タンパク質を除去した。得られた濾液を凍結乾燥させ、再度精製水２５μＬに溶解して測定に供した。
キャピラリー電気泳動は、Ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  （内径：５０μｍ、外径：３５０μｍ、全長：１００ｃｍ）で行った。検体は加圧法で５０ｍｂａｒで１５秒間注入し、緩衝液は1Ｍ蟻酸（ｐＨ１．８）を使用し、２０℃で加電圧＋３０ｋＶで解析した。
続いて飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）（アジレント ＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ  Ｄシステム、アジレント社）で質量を分析した。正イオンモードで、キャピラリー電圧４０００Ｖ、フラグメンター電圧７５Ｖ、スキマー電圧50Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧１２５Ｖで行った。乾燥ガスは窒素を用い、３００℃、圧力１０ｐｓｉｎｇで行い、スキャンレンジはｍ／ｚ ５０−１０００で解析した。質量校正はレゼルピン（ｍ／ｚ：８３．０７０３）で行った。
【００１６】
ＣＥ-ＴＯＦＭＳで検出されたピークは、自動積分ソフトウエアＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  Ｖｅｒ.１.０.６.８（慶應義塾大学製）で自動抽出し、質量荷電比(ｍ／ｚ)、泳動時間（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）とピーク面積を計測した。ピーク以外のノイズを除去した後、得られたｍ／ｚとＭＴ値をもとにピークの同定と定量を行った。
漿膜劣化群では漿膜表層に紡錘形細胞の増殖が観察され、コントロール群と比べて血中のグルタミン酸が増加したが、グルタミンは減少した（図４）。腹腔貯留液検体では、漿膜劣化群ではコントロール群と比べてグルタミン酸が顕著に高値を示したが、グルタミンは殆ど変化しなかった（図５）。
漿膜劣化群では、コントロール群と比べて、血液検体および腹腔貯留液検体の両方で、グルタミン酸/グルタミン値は顕著に増加した（図６、図７）。
【００１７】
グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼにより供与アミノ酸からアミノ基転移を受けて、クレブス回路のα-ケトグルタル酸から合成される。さらにグルタミン酸はミトコンドリアに存在するグルタミン合成酵素により、ＡＴＰ存在下でアンモニアと結合してグルタミンに変換される。この反応は脳でのアンモニア解毒や腎臓でのアンモニアの排出に重要に関わっている。即ち  グルタミン酸は神経毒性や血液をアルカリ性にするアンモニアを消費してグルタミンに変換され、末梢組織から腎臓へアンモニアを輸送している。健常な状態では、血液中のグルタミンは腎臓に取り込まれないが、アシドーシスの場合は、腎臓の近位尿細管のミトコンドリアに移行し、グルタミナーゼによりグルタミン酸とアンモニアに分解された後に、アンモニウムイオン（NH4+）として腎臓から排出される。腎臓で生成されるアンモニア（NH3）の50％はグルタミン由来である。またグルタミン酸はグルタミン合成酵素によりグルタミンに、逆にグルタミンはグルタミナーゼによりグルタミン酸に相互変換される。
中皮細胞がEMTにより紡錘形の間葉細胞に転換して細胞増殖が亢進すると、グルタミンの濃度は殆ど変わらないか若しくは減少するのに対し、グルタミン酸の濃度は著しく上昇した。グルタミン酸とグルタミンは直接相互転換されることから、一方の代謝物のみが高値になることは非常に特徴的である。増加したグルタミン酸はα-ケトグルタル酸への転換を経てTCA回路に入り、ATPの合成を促進して、細胞増殖や細胞遊走のエネルギー源として利用されると推察される。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明によれば、検体を採取した被験者の中皮腫もしくは漿膜劣化を容易に検出することができる。しかも本発明によれば、指標物質の測定を行うだけでよいので、かかる検査を簡単に行うことができ、その精度も高い。血液を検体として使用する場合は、通常の血液検査で採取する血液の一部で診断可能であり、患者への負担は殆どない。被験者が腹膜透析患者の場合、検体として腹膜透析における腹膜透析排液や腹腔洗浄排液を用いれば、検体を採取するために特別な操作を行う必要がなく、しかも、検体を採取する被験者に対して特別の処置を施す必要がないので、被験者への侵襲もない。特に腹膜透析の透析排液を検体とすれば、検体の採取が非常に容易となり、被験者等が自ら、自宅等で検体を採取することも可能である。また、検体として、腹膜透析の排液容器に回収された排液をサンプリングすれば、被験者に感染症等を引き起こす恐れもない。
以上のような利点を本発明は有しているので、本発明を用いることにより、中皮腫患者に対しては、早期に診断することで、著しい予後の改善が期待できる。
また腹膜透析患者に対しては、腹膜透析の安全性を高めることができ、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対して計り知れない利益をもたらすことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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