(57)【要約】      （修正有）【課題】測定対象物に付着した微生物による、カタラーゼ活性偽陽生を防止し、測定対象物のカタラーゼ活性を正確に測定する方法の提供。【解決手段】測定対象物を、エタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウム及びそれらの水溶液から選択される少なくとも１種に浸漬させ、付着している周辺環境の微生物の活性を除去して、次いで過酸化水素水と接触させて酸素の泡の発生を確認することを含む、測定対象物のカタラーゼ活性の測定方法。好ましくは前記対象物が加熱済み食品から採取した異物、特に好ましくは毛であるカタラーゼ活性性の測定法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を、エタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種に浸漬させ、次いで過酸化水素水と接触させることを含む、測定対象物のカタラーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記測定対象物が加熱済み食品から採取した異物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記測定対象物が毛である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記浸漬が１５秒〜１０分間の浸漬である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カタラーゼ活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品製造分野において、食品への異物の混入は重大な問題である。食品製造工場の衛生管理の観点から、食品への異物の混入時期を調べ、異物が工場の製造ラインで混入したのか、またはその後の流通や保存の過程で混入したのかを判定することは重要である。
【０００３】
異物のカタラーゼ活性を調べるカタラーゼ試験は、食品への異物の混入時期の判定に用いられている。カタラーゼは、過酸化水素を酸素と水に分解する反応を触媒する酵素であり、多くの生物に含まれる。カタラーゼ試験においては、生物由来の異物の細胞、例えば昆虫やその破片、毛髪の毛根部分などに過酸化水素を添加し、それにより発生する泡の有無によって該異物のカタラーゼ活性を調べる。生物やその細胞に過酸化水素を添加すると、カタラーゼの作用により酸素の泡が発生するが、加熱された生物や死んでから時間が経った生物やその細胞では、カタラーゼが失活しているため過酸化水素を添加しても泡は発生しない。カタラーゼ活性の有無により、該異物が食品の加熱前（製造ライン中）に混入したものであるか、またはその後に混入したものであるかを推定することができる。さらに特許文献１には、昆虫またはその抽出物を過酸化水素と接触させ、該過酸化水素の減少量を電気化学的に計測して該昆虫のカタラーゼの残存活性を測定し、当該残存活性に基づいて該昆虫の死亡時期を判定する方法が開示されている。
【０００４】
しかしながら、実際にカタラーゼ試験の対象となる異物には、特にそれが流通や販売後の食品から見つかった場合、周辺環境の微生物が付着していることがある。付着した微生物がカタラーゼ活性を有する場合、カタラーゼ活性試験での偽陽性の原因となり、食品への異物混入時期の正確な判定を妨げる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１６９６９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、測定対象物に付着した微生物によるカタラーゼ活性偽陽性を防止し、測定対象物のカタラーゼ活性をより正確に測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、測定対象物を、過酸化水素水と接触させる前に、エタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種に浸漬させることにより、該測定対象物のカタラーゼ活性を失活させることなく、測定対象物に付着した微生物由来のカタラーゼ活性を除去することができることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、測定対象物を、エタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種に浸漬させ、次いで過酸化水素水と接触させることを含む、測定対象物のカタラーゼ活性の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、測定対象物のカタラーゼ活性を維持したまま、該測定対象物に付着した微生物のカタラーゼ活性を除去することができる。したがって、本発明によれば、測定対象物のカタラーゼ活性をより正確に測定することができる。さらに本発明によるカタラーゼ活性の測定方法によれば、測定対象物の微生物汚染によるカタラーゼ活性偽陽性を防止することができるので、加熱済み食品への異物混入の時期をより正確に判定することが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、測定対象物のカタラーゼ活性の測定方法を提供する。本発明の方法においては、測定対象物を、エタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種に浸漬させ、次いで過酸化水素水と接触させる。過酸化水素水と接触した測定対象物からの泡の発生を観察することで、該測定対象物のカタラーゼ活性を評価する。
【００１１】
本発明のカタラーゼ活性の測定方法における測定対象物としては、カタラーゼ活性を調べたい物質であれば特に限定されないが、好適な例としては、従来一般的にカタラーゼ試験の対象とされている生物由来の細胞を含む試料、例えば、昆虫などの虫の体、その破片、ヒトやヒト以外の動物の毛（毛根や毛包を含むもの）、皮膚片などが挙げられ、好ましくは毛である。
【００１２】
本発明の方法においては、上記測定対象物を、過酸化水素水と接触させる前に、予めエタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の浸漬液に浸漬させる。この工程によって、該測定対象物に付着していた周辺環境由来の微生物のカタラーゼ活性が除去されるので、その後の過酸化水素水との接触の際に、該微生物のカタラーゼ活性による偽陽性を防止することができる。
【００１３】
上記測定対象物の上記浸漬液への浸漬の手段としては、容器に入った浸漬液に測定対象物を沈めること、測定対象物の上から測定対象物を覆う量の浸漬液を滴下すること、などが挙げられるが、これらに限定されず、測定対象物の表面を浸漬液で覆うことのできる手段であればよい。
【００１４】
上記浸漬工程の操作性及びその効果の観点からは、浸漬液にはエタノール、イソプロパノール、エタノールもしくはイソプロパノール水溶液、次亜塩素酸ナトリウム水溶液、またはそれらの混合液を使用することが好ましい。該エタノールもしくはイソプロパノール水溶液におけるエタノールもしくはイソプロパノールの濃度は、好ましくは４０容量％以上、より好ましくは５０容量％以上、さらに好ましくは５０〜９０容量％、なお好ましくは６０〜８０容量％である。次亜塩素酸ナトリウム水溶液における次亜塩素酸ナトリウムの濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０１〜１質量％、さらに好ましくは０．０２〜１質量％である。
【００１５】
上記浸漬の時間は、好ましくは１５秒〜１０分間であり、より好ましくは３０秒〜３分間である。浸漬時間が短すぎると、微生物カタラーゼ活性の除去効果が低下し、浸漬時間が長過ぎると、作業効率が低下する。
【００１６】
続いて、本発明の方法においては、上記浸漬液に浸漬した測定対象物を、過酸化水素水と接触させる。使用する過酸化水素水としては、通常のカタラーゼ試験に使用される濃度のもの、例えば２．５〜３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水が挙げられる。好ましくは、２．５〜３．５％（ｗ／ｖ）の過酸化水素水（例えば、オキシドール）、３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水などを使用することができる。
【００１７】
上記測定対象物と過酸化水素水とを接触させる手段としては、容器に入った過酸化水素水に測定対象物を沈めること、測定対象物の上から測定対象物を覆う量の過酸化水素水を滴下すること、などが挙げられるが、これらに限定されず、測定対象物にカタラーゼ活性を検出するための所定量の過酸化水素水を接触させることのできる手段であればよい。
【００１８】
好ましくは、上記浸漬液に浸漬した測定対象物を過酸化水素水と接触させる前に、該測定対象物から浸漬液を除去しておく。浸漬液を除去する手段としては、ペーパータオルなどによる液のふき取りや吸収、乾燥、洗浄などが挙げられる。測定対象物上に液体が残っていると過酸化水素水との反応に影響するため、洗浄した場合は、さらに洗浄液のふき取りや吸収または乾燥を行うことが好ましい。測定対象物に新たな微生物が付着することを防止するため、浸漬液を除去する工程は無菌または減菌環境下で行うことが望ましい。
【００１９】
過酸化水素水を接触させた測定対象物は、カタラーゼ活性を有していれば、カタラーゼと過酸化水素水との反応により酸素の泡を発生する。一方、該測定対象物がカタラーゼ活性を有していない場合、過酸化水素水と接触しても泡は発生しない。過酸化水素水との接触後に発生した泡を観察することによって、測定対象物のカタラーゼ活性を測定することができる。
【００２０】
例えば、測定対象物からの泡の発生の有無によって、そのカタラーゼ活性が陽性（＋）または陰性（−）と判定することができる。あるいは、測定対象物からの泡の発生量に基づいて、そのカタラーゼ活性の強度を評価することができる。より詳細には、過酸化水素水と接触させた測定対象物を所定の時間観察する。その間に泡が発生しない場合、該測定対象物をカタラーゼ活性陰性と判断し、泡が発生した場合、該測定対象物をカタラーゼ活性陽性と判断することができる。あるいは、該所定の時間中に発生した泡の量を測定することで、該測定対象物のカタラーゼ活性の強度を評価することができる。泡の観察時間は、好ましくは測定対象物と過酸化水素水との接触から１０分間程度、より好ましくは５分間程度であればよいが、測定対象物の状態や過酸化水素水の濃度などに応じて適宜変更してもよい。
【００２１】
過酸化水素水との接触後に泡を発生しない（すなわちカタラーゼ活性陰性の）測定対象物は、加熱等のカタラーゼ失活処理を受けたことによりカタラーゼ活性を失ったもの、または死んでから時間が経った生物であると推定することができる。本発明のカタラーゼ活性の測定方法においては、上述した浸漬工程により測定対象物に付着した微生物のカタラーゼ活性による偽陽性が防止されるため、測定対象物のカタラーゼ活性を正確に測定することが可能となる。
【００２２】
本発明のカタラーゼ活性の測定方法の好ましい実施形態において、測定対象物は、加熱済み食品から採取した異物、例えば昆虫などの虫の体、その破片、ヒトやヒト以外の動物の毛（毛根や毛包を含むもの）、皮膚片などの生物由来の細胞を含む異物である。この場合、本発明の方法は、異物の加熱済み食品への混入時期の判定に役立つ。
【００２３】
したがって、本発明はまた、加熱済み食品の異物の検査方法を提供する。当該方法は、加熱済み食品から採取した異物をエタノール、イソプロパノール、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の浸漬液に浸漬させ、次いで過酸化水素水と接触させること；及び、該異物のカタラーゼ活性の有無を判定すること、を含む。カタラーゼ活性の有無によって、異物の加熱済み食品への混入時期を判定することができる。例えば、該異物がカタラーゼ活性陽性であれば、該異物は該加熱済み食品の加熱後に（例えば流通もしくは販売過程、または消費者の手元で）混入したと推定することができ、一方、該異物がカタラーゼ活性陰性であれば、該異物は該加熱済み食品の加熱前に混入したと推定することができる。本方法における浸漬液への浸漬、必要であれば浸漬液の除去、過酸化水素水との接触、およびカタラーゼ活性の判定の詳細な手順は、上述したカタラーゼ活性の測定方法と同様である。本発明の異物の検査方法によれば、食品から採取した異物の微生物汚染によるカタラーゼ活性偽陽性を防止することができるので、加熱済み食品への異物混入の時期をより正確に判定することが可能になる。
【実施例】
【００２４】
次に本発明をさらに具体的に説明するために実施例を掲げるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  微生物カタラーゼ活性の測定
（１）毛髪サンプルの調製
毛根部を含むヒト毛髪は、沸騰水中で３０分間加熱してカタラーゼ活性を失活させた後、約２ｃｍの長さにカットした。
【００２６】
（２）供試菌の調製
供試菌（表皮ブドウ球菌；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を標準寒天培地（コージンバイオ社製）に塗抹し、３５℃で４８時間培養して単一コロニーを得た。この単一コロニーを標準寒天培地に塗抹し、３５で℃２４時間培養し、菌体自体にカタラーゼ活性があることを確認した上で、下記菌数測定に供した。
【００２７】
（３）試験液の調製
試験液には、表１に示した４種類（Ｎｏ．１〜４）を使用した。コントロールには水を使用した。各試験液は、ＡＧＣテクノグラス社製の無処理ディッシュ３５ｍｍ（ＩＷＡＫＩ  １０００−０３５）に２ｍＬずつ分注した。
【００２８】
【表１】
2017143778.tif 000002
【００２９】
（４）試験液処理
（１）で調製した毛髪サンプルは、（２）で調製した菌を付着させた後、（３）で調製したディッシュ中の各試験液に浸漬した。３０秒後、毛髪サンプルを試験液から取り出し、滅菌処理した濾紙の上に載せて余分な液を除去した。
【００３０】
（５）菌数測定
（４）で処理した毛髪サンプルを９ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ；３Ｍ社）に入れ、よく撹拌して試料原液を調製した。試料原液をＰＢＳにて適宜希釈し、標準寒天培地に塗抹し、３５℃で２４時間培養した。培地に出現したコロニー数を計測して、毛髪サンプル一本当たりの菌数を算出した。
【００３１】
（６）カタラーゼ活性の測定
（４）で処理した毛髪サンプルの上から３％（ｗ／ｖ）過酸化水素水（購入元：関東化学（株））を６０μＬ滴下し、泡（酸素）発生の有無を観察した。過酸化水素水の滴下の５分後までに泡が観察された場合はカタラーゼ活性あり（＋）、泡が観察されない場合はカタラーゼ活性なし（−）と評価した。
【００３２】
実施例２  毛髪カタラーゼ活性の測定
２ｃｍの長さにカットした毛根部を含むヒト毛髪は、表１記載の各試験液に浸漬させた。コントロールには水を使用した。３０秒後に毛髪を試験液から取り出し、滅菌濾紙で表面に付着した余分な液を拭き取った後、スライドガラスに載せ、カバーガラスをかぶせて固定した。カバーガラス縁部分に３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水（購入元：関東化学（株））を滴下し、毛根部に達するように拡散させた。過酸化水素水が毛根部に達した直後、１分後、３分後および５分後に泡の発生の有無を観察した。過酸化水素水の滴下の５分後までに泡が観察された場合はカタラーゼ活性あり（＋）、泡が観察されない場合はカタラーゼ活性なし（−）と評価した。
【００３３】
実施例１および２の結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
エタノール、次亜塩素酸ナトリウム水溶液、イソプロパノール（試験液Ｎｏ．１〜３）は、菌のカタラーゼ活性を消失させる一方で、毛髪自身のカタラーゼ活性を維持した。これらの試験液では、コントロールと比べて、３〜５オーダーの減菌効果が確認された。一方、メタノール（試験液Ｎｏ．４）を使用した場合、菌の減少とカタラーゼ活性の消失が認められたが、毛髪のカタラーゼ活性も消失した。コントロール（水）では、毛髪のカタラーゼ活性は維持されるものの、菌のカタラーゼ活性も残存した。