(57)【要約】【課題】微生物によるクロロエテン類の分解のさらなる効率化手段と、様々な汚染条件にも対応可能な生物学的な浄化手段の提供。【解決手段】  下記の特徴（１）〜（３）を有する微生物群を、クロロエテン類のみならず、残留農薬成分であるγ−ヘキサクロロシクロヘキサンも併せた生物学的浄化、に対して用いることが可能であることを見出し、上記課題の解決を行った。（１）  テトラクロロエテン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡを保有するデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌が含まれている。（２）  クロロエテン類の嫌気的な脱塩素反応が行われる。（３）  γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの、ベンゼンとクロロベンゼンまでの嫌気的脱塩素化が行われる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特徴（１）〜（３）を有する微生物群：
（１）  テトラクロロエテン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡを保有するデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌が含まれている。
（２）  クロロエテン類の嫌気的な脱塩素反応が行われる。
（３）  γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの、ベンゼンとクロロベンゼンまでの嫌気的脱塩素化が行われる。
【請求項２】
前記微生物群における特徴（１）のデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌の
リード情報に基づき導出されたゲノムの塩基配列は、配列番号１８に記載の塩基配列である、請求項１に記載の微生物群。
【請求項３】
さらに、Spirochetales属細菌、Macellibacteroides属細菌、Proteocatella属細菌、Trichococcus属細菌、Sedimentibacter属細菌、Aminanaerobia属細菌、Clostridium属細菌
、及び、Desulfovibri属細菌からなる群から選ばれる１種以上の細菌を含有する、請求項１又は２に記載の微生物群。
【請求項４】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにおいて、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２０４、として２０１６年２月１８日に受領された微生物群。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の微生物群を、クロロエテン類又はγ−ヘキサクロロシクロヘキサンを含有する汚染物に接触させて、当該クロロエテン類又はγ−ヘキサクロロシクロヘキサンの脱塩素化を行うことを特徴とする、浄化方法。
【請求項６】
汚染物は、地下の土壌又は地下水であることを特徴とする、請求項５に記載の浄化方法。
【請求項７】
汚染物に対して微生物群を接触させると共に、電子供与体を直接的又は間接的に当該微生物群に対して供給することを特徴とする、請求項５又は６に記載の浄化方法。
【請求項８】
クロロエテン類に、テトラクロロエタン又はトリクロロエタンが含まれることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の浄化方法。
【請求項９】
Dehalococcoides mccartyi strain BTF08のゲノムとの相同性が高く、テトラクロロエ
テン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡを保有するデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌。
【請求項１０】
リード情報に基づき導出されたゲノムの塩基配列は、配列番号１８に記載の塩基配列である、請求項９に記載のデハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオレメディエーションに利用可能な微生物、及び、当該微生物を用いる浄化方法に関し、詳しくは、クロロエテン類とγ−ヘキサクロロシクロヘキサンの脱塩素が可能な微生物、及び、当該微生物を用いるクロロエテン類又はγ−ヘキサクロロシクロヘキサンを含有する浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土地の土壌や地下水は、天然あるいは人工のさまざまな化学物質により汚染されている場合がある。このような土地の汚染は、その土地を食糧生産のための農地として使用する場合はもちろん、居住や商業利用を企図する場合にも大きな問題となる。
【０００３】
しかし、直接口にする飲食物や、肌に接触する衣類・化粧品・装身具などと異なり、土地の汚染、とくに土壌汚染はあまり関心が払われることなく、過去には化学物質が穴を掘って埋め立て処理されたりする例もあった。このような土地の汚染の浄化は最近になって大きな問題となっており、それに対して様々な浄化処理方法が提案され実行されてきた。
【０００４】
この土地の浄化方法を大きく分類すると、高温加熱による化学物質の分解、活性炭への化学物質の吸着などの物理的処理、化学反応により化学物質を無害化する化学的処理、化学物質を分解する能力を有する微生物を利用する微生物浄化法、そして、化学物質を吸収あるいは吸着する能力を有する植物を利用する植物浄化法の４種に分類することができる。
【０００５】
なかでも、微生物や植物を用いる方法は環境への配慮やコストを抑えることが可能である点で最近注目を集めるところであり、微生物を利用する浄化方法は「バイオレメディエーション」、植物を利用する浄化方法は「ファイトレメデーション」とも言われ、さまざまな研究開発が行われており、処理可能な土壌体積が大きいことから、バイオレメディエーションの研究開発が活発化している。
【０００６】
バイオレメディエーションには２つの技術がある。ひとつは、対象汚染物質の分解に効果を発揮することが予め確認されている微生物を汚染場所に適用する技術であり、バイオオーグメンテーションといわれる。もうひとつは、汚染場所の土着微生物に酸素や栄養源を与えることで、微生物の働きを活性化させ、浄化作用を促す技術であり、バイオスティミュレーションといわれる。
【０００７】
また、バイオレメディエーションには２つの工法がある。ひとつは、汚染された土壌や地下水を除去し、別の場所で処理する工法であり、「施設型処理」と言われる。もうひとつは 、その場所において汚染された土壌や地下水を浄化する工法であり、「原位置浄化」と呼ばれる。
【０００８】
近年大きな問題となっている汚染物質としてテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、ダイオキシン類、ポリ塩素化ビフェニル類、有機塩素系農薬などの有機塩素化合物に代表される有機ハロゲン化合物がある。
【０００９】
テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンなどのクロロエテン類（揮発性有機ハロゲン化合物）は、呼吸を通して人体への影響が懸念されることから早急な対応が必要とされる場面が多く見られるようになってきている。この揮発性有機ハロゲ
ン化合物は、土壌に浸透しやすく、地下水脈にまで到達してしまい、広範囲に汚染が拡大しやすい。このような揮発性有機ハロゲン化合物を分解する土壌微生物も存在するが、一般に土壌は表面に近いほど有機物が多く土壌微生物も多く存在しているが、表層から深部に向かうにつれ有機物も土壌微生物も減少し、１ｍ以上深くなると微生物の活性は表層の１／１００以下にまで減少してしまう。これらの事情により、一度揮発性有機ハロゲン化合物に汚染された土地は長期間にわたり比較的低濃度で広範囲に汚染されたままになってしまうという問題がある。
【００１０】
このような比較的低濃度で広範囲に汚染された土地の浄化はバイオレメディエーションが有効な手段であることから、揮発性有機ハロゲン化合物による汚染の浄化を目的とした提案が各種行われている。
【００１１】
クロロエテン類に汚染された土地の浄化に使用する微生物としては嫌気性細菌、とくにデハロコッコイデス属細菌が知られている。この微生物が存在しない状態であると、クロロエテン類は最終的なエテンまでの分解がなされず中間物質であるジクロロエテンで分解が止まってしまい、有害なシス−１，２−ジクロロエテンや塩化ビニルが蓄積してしまう。しかし、たとえデハロコッコイデス属細菌であっても通常はその種類により分解可能な化合物が決まっており、テトラクロロエテンからエテンまでの分解には数種のデハロコッコイデス属細菌が関与し、必要となることも知られている（非特許文献１及び２）。そのため、デハロコッコイデス属細菌の各種クロロエテン類分解速度は必ずしも速いものではなく、また、デハロコッコイデス属細菌が存在していてもクロロエテン類の分解に関与しているとは限らない。
【００１２】
ジクロロエテンを分解可能なデハロコッコイデス属細菌として現在まで見出された例は少なく、Dehalococcoides ethenogenes 195（非特許文献３）、Dehalococcoides sp. BAV1（非特許文献４）、Dehalococcoides sp.VS(非特許文献５及び６)などが知られているのみである。しかもDehalococcoides ethenogenes 195は、塩化ビニル（ＶＣ）の分解酵素をもたず、ＶＣは共代謝で分解されるだけなので分解効率が悪く、最終的にエテンにまで分解されずにＶＣが蓄積してしまう問題がある。
【００１３】
近年、ＶＣ分解遺伝子に関し、相次いで２例の報告がなされている。一方はDehalococcoides sp. BAV1株のＢｖｃＡ（非特許文献７）であり、他方はDehalococcoides sp. VS株のＶｃｒＡ（非特許文献８）である。これら２つの報告には、特定のDehalococcoides属微生物株のＶＣ分解遺伝子の存在およびその配列について記載されている。さらに近年、ＢｖｃＡ遺伝子およびＶｃｒＡ遺伝子の定量検出方法についても提案がなされている（非特許文献９）。しかし、これらのＶＣ分解酵素遺伝子の塩基配列に多様性はあるのか、またＶＣ分解酵素としてはこれら２種類以外には存在しないのか、菌株の遺伝子の相同性とＶＣ分解酵素の種類に相関があるのかといった点についてはまだ、明らかとなっていない。
【００１４】
一方、γ−ヘキサクロロシクロヘキサン（別名γ−ベンゼンヘキサクロリド（Benzene Hexachloride）） は分子式、分子式γＣ６Ｈ６Ｃｌ６と表される有機塩素化合物であり
、シクロヘキサン環が持つ６個の炭素のそれぞれに塩素原子と水素原子がひとつずつ結合した化合物の異性体の１つである。リンダン (またはリンデン：lindene) と呼ばれる農
薬の主要成分であり、農業用や住居用の殺虫剤、殺ダニ剤として広く用いられていた。Hexachlorocyclohexane類（ＨＣＨ）は、環境中で分解されにくく、現在は多くの国で殺虫剤としての使用が禁止され、ＰＯＰｓ条約で規制対象として付属書Ａ(廃絶＝製造・使用禁止等)に記載されている。また、わが国では、化審法により第一種特定化学物質に指定されている。特に、農薬として使用した場合、動物が食物から摂取して、脂肪、肝臓、腎臓などに蓄積する危険がある。また、母乳に含まれる例も知られている。亜急性・慢性中毒は頭痛、眩暈、神経過敏、協調運動失調、嘔気、体重減少、全身倦怠感等の症状の他、再生不良性貧血等の造血障害、実験的には肝腫瘍形成や性機能障害等が認められる。
【００１５】
上記γ−ヘキサクロロシクロヘキサンは難分解性であり、その分解を行う微生物の研究は余り進んでいない。γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの好気的分解には、主にSphingomonas属細菌による脱塩素化が報告されている。Sphingomonas paucimobilis UT26株の分解経路については詳細が判明している。すなわち、当該好気的分解経路の上流では、２種類のデハロゲナーゼによる脱塩素化反応と脱水素反応で、２，５−ジクロロヒドロキシキノンが生成される。これが下流経路で還元的脱塩素化反応とオキシゲナーゼによる環開裂反応が生じ、マレイル酢酸へと変換され、β−ケトアジピン酸が生じる。β−ケトアジピン酸は土着微生物により代謝が進むため、この物質に至るまでが好気的分解経路となる。
【００１６】
一方、γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの嫌気的分解には、Desulfovibrio gigas ATCC
19364、Desulfovibrio africanus ATCC 19997、Desulfococcus multivorans ATCC 33890に由来する懸濁細胞によりモノクロロベンゼン、ベンゼンへの脱塩素化が確認されている（非特許文献１０）。また、Clostridium rectum S-17株では、テトラクロロシクロヘキ
サンを経由してモノクロロベンゼンへ脱塩素化反応を行うことが報告されている（非特許文献１１）。更に、デハロコッコイデス属細菌属細菌が占有している培養系においてγ−ヘキサクロロシクロヘキサンをモノクロロベンゼンへと脱塩素化する代謝経路が報告されている（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】崎原盛他「クロロエテン類を対象とした原位置レメディエーションにおけるDehalococcoides属細菌の挙動解析」地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会講演集（２００８年）
【非特許文献２】矢木修身「土地修復技術の現状と今後の展望」「食と環境の安全を求めて−農林水産生態系における有害化学物質−要旨集  １０頁」（２００７年）
【非特許文献３】Maymo-Gatell X, Anguish T, Zinder SH., Appl Environ Microbiol. 1999  Jul;65(7):3108-13.
【非特許文献４】He J, Ritalahti KM, Yang KL, Koenigsberg SS, Loffler FE., Nature. 2003 Jul 3;424(6944):62-5.
【非特許文献５】Cupples AM, Spormann AM, McCarty   PL., Appl Environ Microbiol. 2003 Feb;69(2): 953-9.
【非特許文献６】He J, Sung Y, Krajmalnik-Brown R, Ritalahti KM, Loffler FE. EnvironMicrobiol. 2005 Sep;7(9):1442-50.
【非特許文献７】Krajmalnik-Brown R, Holscher T, Thomson IN, Saunders FM, Ritalahti KM, Loffer FE., Appl Environ Microbiol. 2004 Oct;70(10): 6347-51.
【非特許文献８】Muller JA, Rosner BM, Von Abendroth G Meshulam-Simon G, McCarty PL, Spormann AM., Appl Environ Microbiol. 2004 Aug;70(8): 4880-8.
【非特許文献９】Ritalahti KM, Amos BK, Sung Y, Wu Q, KoenigsbergSS, Loffler FE., Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4): 2765-74.
【非特許文献１０】Alfred W. Boyle, Max M. Haeggblom, Lily Y. Young.  Dehalogenation of lindane (Q  hexachlorocyclohexane) by anaerobic bacteria from marine sediments and by sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiology Ecology 29 (1999) 379-387.
【非特許文献１１】N. Ohisa t M.  Yamaguchil, and N. Kurihara. Lindane Degradation by Cell-Free Extracts of Clostridium rectum. Arch. Microbiol. 125, 221-225 (1980)
【非特許文献１２】Theresa Kaufhold, Marie Schmidt, Danuta Cichocka, Marcell Nikolausz & Ivonne Nijenhuis. Dehalogenation of diverse halogenated substrates by a highly enriched Dehalococcoides-containing culture derived from the contaminated mega-site in Bitterfeld. FEMS Microbiol Ecol 83 (2013) 176-188.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
今後のバイオレメディエーションの需要の高まりを鑑みると、上記のクロロエテン類の分解のさらなる効率化と、様々な汚染条件にも対応可能な生物学的な浄化手段の提供が期待されている。
【００１９】
本発明では、デハロコッコイデス属細菌を中心として、新たな細菌種とこれを含む微生物群で、上記の課題を解決する手段の提供を課題として検討を行った。
【００２０】
以下、本明細書においては、原則としてデハロコッコイデス(Dehalococcoides)属細菌
一般を指す場合には、これを「デハロコッコイデス属」又は「デハロコッコイデス属細菌」と記し、特定の種の属名については「Dehalococcoides」を用いることとする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
その結果、クロロエテン類とγ−ＨＣＨを嫌気的に脱塩素可能な、新規のデハロコッコイデス属細菌を主要な構成細菌として含有する微生物群を確保し、これらを用いて、クロロエテン類を極めて効率的に脱塩素化すると共に、γ−ＨＣＨを他の細菌により分解が可能なベンゼンとクロロベンゼンまで脱塩素化することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００２２】
すなわち本発明は第１に、下記の特徴（１）〜（３）を有する微生物群（以下、本発明の微生物群ともいう）を提供する。
（１）  テトラクロロエテン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡを保有するデハロコッコイデス属細菌が含まれている。
（２）  クロロエテン類の嫌気的な脱塩素反応が行われる。
（３）  γ−ヘキサクロロシクロヘキサンの、ベンゼンとクロロベンゼンまでの嫌気的脱塩素化が行われる。
【００２３】
本発明の微生物群には、上記（１）の特徴を有し、かつ、Dehalococcoides mccartyi strain BTF08のゲノムとの相同性が高いデハロデハロコッコイデス属細菌（以下、本発明
のデハロコッコイデス属細菌ともいう）が含まれている。
【００２４】
本発明の微生物群は、本発明のデハロコッコイデス属細菌の他に、さらに、Spirochetales属細菌、Macellibacteroides属細菌、Proteocatella属細菌、Trichococcus属細菌、Sedimentibacter属細菌、Aminanaerobia属細菌、Clostridium属細菌、及び、Desulfovibri
属細菌からなる群から選ばれる１種以上の細菌を含有することが好適である。
【００２５】
さらに本発明の微生物群の実施例に対しては、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに対する寄託を行い、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２０４、として２０１６年２月１８日に受領された。
【００２６】
本発明は第２に、本発明の微生物群を、クロロエテン類又はγ−ヘキサクロロシクロヘキサンを含有する汚染物に接触させて、当該クロロエテン類又はγ−ヘキサクロロシクロヘキサンの脱塩素化を行うことを特徴とする、浄化方法（以下、本発明の浄化方法ともいう）を提供する発明である。
【００２７】
本発明の微生物群を接触させる汚染物は、地下の土壌又は地下水であることで、本発明の微生物群の嫌気的脱塩素作用を産業上最も効果的に活用することができる。この態様が、本発明の微生物群を用いるバイオレメディエーションである。本発明の浄化方法の対象となる汚染物には、クロロエテン類として、結合塩素の数が多いテトラクロロエタン又はトリクロロエタンが含まれていることが、本発明の浄化方法を効果的に行う上で好ましい。
【００２８】
本発明の浄化方法を行う際には、上記汚染物に対して本発明の微生物群を接触させると共に、電子供与体を直接的又は間接的に当該微生物群に対して供給することが好適である。「間接的」とは、水素及び酢酸をそのまま用いるのではなく、これらを本発明の微生物に対して供給可能な化合物を用いて供給することを意味している。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、クロロエテン類とγ−ＨＣＨを、嫌気的に脱塩素を行うことが可能な微生物群が提供され、土壌や地下水におけるこれらの汚染物質を生物学的に効果的に浄化する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本実施例の微生物群のＴＣＥの脱塩素化を時系列的に示したグラフである。
【図２】本実施例の微生物群の、全長に渡って高いCoverageを示した次世代シークエンサにおける６つのゲノムのマッピングデータである。
【図３】本実施例の微生物群に対するCoverageの低かった５種類のデハロコッロイデス属細菌、及び、Desulfitobacterium hafniense Y51の、次世代シークエンサにおけるマッピングデータである。
【図４】本実施例におけるデハロコッロイデス属細菌以外の微生物の存在確認のために行ったＰＣＲの結果を示す電気泳動図である。
【図５】次世代シークエンサＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩによる解析により構築された本実施例の微生物群に存在するデハロコッロイデス属細菌の全長のゲノム配列と、次世代シークエンサ５５００  ＳＯＬｉＤのリードデータをマッチングした結果を示す図面である。
【図６】本実施例の微生物群に存在するデハロコッロイデス属細菌と、D. mccartyi BTF08とのゲノム配列の比較を行った結果を示す図面である。
【図７】本実施例の微生物群のＰＣＥの脱塩素化を時系列的に示したグラフである。
【図８】本実施例の微生物群のγ−ＨＣＨの脱塩素化を時系列的に示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［本発明の微生物群］
本発明の微生物群は、クロロエテン類、又は、クロロエテン類とＨＣＨ類に汚染された土壌又は地下水からサンプリングを行い、栄養源としてクロロエテン類を用いて、その嫌気的脱塩素による分解活性を指標として微生物群の選抜を行い、クロロエテン類の嫌気的脱塩素活性が認められたサンプルに対して、さらにγ−ＨＣＨの嫌気的脱塩素の活性を指標とした選抜を行うことにより得ることができる。
【００３２】
上述のように本発明の微生物群には、本発明のデハロコッコイデス属細菌が含まれる。本発明のデハロコッコイデス属細菌単独では、クロロエテン類をエテンまで分解することは非効率であり、さらに電子供与体や炭素源が限定されてしまい、実用的に生育条件を整えることも困難である。これに対して、本発明のデハロコッコイデス属細菌と協調してクロロエテン類やγ−ＨＣＨを脱塩素化する微生物を含有させることにより、このような本
発明のデハロコッコイデス属細菌単独の問題点も解決される。
【００３３】
本発明の微生物群の菌叢解析は、当該微生物群の安全性の確認や、当該微生物群の再構築のために必要である。当該解析手段として、ＤＧＧＥ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、高性能シーケンサー（一般的には「次世代シーケンサー」と呼ばれている）等が挙げられる。ＤＧＧＥは、ＤＮＡ変性剤を添加したゲルで電気泳動を行うことで、ＤＮＡのＧＣ含量によってバンドを分ける手法である。多くの場合、生物間で共通する遺伝子配列の縮退プライマーを利用して、メタゲノムをテンプレートにしたＰＣＲを行い、それによって得られたバンドを分離するときに用いられる。リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、テンプレートのメタゲノムに含まれる遺伝子をＰＣＲ増幅する際に、プライマーやプローブに蛍光標識しておくことにより、蛍光の増幅からテンプレート内のターゲットの濃度を定量する方法である。マイクロアレイでは、蛍光標識した遺伝子断片を固定したガラス板上にメタゲノムを流し、ゲノムが結合したことを蛍光観察によって確認する。
【００３４】
次世代シーケンサーを用いる菌叢解析は、全ゲノムまたは全ＲＮＡのシーケンスデータを用いて、データベースに登録されている１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をリファレンス配列として解析される。
【００３５】
当該微生物群に含まれるデハロコッコイデス属細菌が、本発明のデハロコッコイデス属細菌であることの確認は、例えば、Dehalococcoides mccartyi strain BTF08のゲノムと
の高い相同性を確認し、テトラクロロエテン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡの確認は、これらの酵素遺伝子の存在のシーケンシングによって行うことができる。より具体的な内容については、実施例の欄において後述する。
【００３６】
［本発明の浄化方法］
本発明の浄化方法は、本発明の微生物群を、クロロエテン類又はγ−ＨＣＥを含有する汚染物に接触させて、当該クロロエテン類又はγ−ＨＣＥの脱塩素化を行う、浄化方法である。
【００３７】
ここで「クロロエテン類を含む汚染物」とは、テトラクロロエテン（ＰＣＥ）、トリクロロエテン（ＴＣＥ）、ジクロロエテン（ＤＣＥ）異性体、及び、塩化ビニル（ＶＣ）から選ばれる１種以上のクロロエテン類を含有する汚染物である。「γ−ＨＣＥを含む汚染物」とは、ＨＣＥの中でも特に農薬として用いられていたγ異性体を含有する汚染物である。汚染物は、通常は汚染された土壌、地下水等が該当するが、必要に応じて他の対象物、例えば、廃棄物や排水処理後の汚泥等も汚染物として例示される。また、土壌や地下水は環境から分離されている状態であっても、非分離の状態、すなわち汚染された土地（地下部分を含む）そのものであってもよい。
【００３８】
分離の状態とは、いわゆる「汚染土壌の掘削による汚染物質の除去」を行う場合であり、事前調査により把握した範囲の汚染土壌を掘削し、掘削した汚染土壌以外の清浄な土壌の他、浄化処理を行った当該掘削土壌にて埋め戻す作業であり、「施設型浄化」とも言われる。浄化された掘削土壌は、別の場所に載置する場合もある。いずれにしても、本発明の浄化方法を掘削土壌に適用する場合には、ランドファーミング、バイオパイル、スラリーバイオ等の手法を用いることが可能である。ランドファーミングは、掘削した汚染土壌を敷き広げ、栄養源や水を添加することにより汚染土壌中の微生物の活性を高めて有害物質を分解する方法である。バイオパイルは、掘削した汚染土壌を畝型に成型して、栄養源と水を供給しつつ微生物の活性を高め有害物質を分解する方法である。スラリーバイオは、掘削した汚染土壌に水を加えてスラリー状に調整して、これをスラリーリアクターという反応槽に移し、そこに栄養源を供給して混合することにより微生物を活性化する方法である。
【００３９】
ここで栄養源の中には、本発明の微生物等の電子供与体となる物質を含めることが好適である。具体的には、ポリ乳酸を主成分とするＨＲＣ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ社）、アデカジオメイト（ＡＤＥＫＡ社）、ＥＤＣ（エコサイクル社）等の水素徐放剤を挙げることができる。また、酢酸や水素ガスを用いることもできる。
【００４０】
非分離の状態とは、汚染土壌を掘削せずに、原位置において浄化する「原位置浄化（原位置バイオレメディエーション）」を意味するものである。本発明の微生物群は嫌気性細菌の群であるために、本発明の浄化方法ではこの手法を用いることが好適である。原位置浄化法にて、本発明の浄化方法を行う場合には、本発明の微生物群とＨＲＣ等の電子供与体は、浄化領域の上流（地下水の上流を意味する）に設けた１個又は２個以上の井戸から供給することが好適である。このようにすることにより、地下水により本発明の微生物等と電子供与体が、クロロエテン類を脱塩素化しつつ徐々に下流に移行し、結果として汚染全領域におけるクロロエテン類のエテンへの浄化を行うことができる。
【００４１】
本発明の微生物群の培養液は、そのまま井戸から汚染サイトに投入することも可能であるが、より効果的にするためには、培養した微生物を濃縮し、嫌気的に土壌や地下水中に投入し、安定に保持することが必要である。様々な手法が考えられるが、固定化担体に固定化することが１つの方法として考えられる。固定化することにより、徐放性を付与することができ、また、微生物の空気との接触容積を減ずることができる点で、嫌気性菌群である本発明の微生物群を扱う上では好適である。
【００４２】
本発明の浄化方法における本発明の微生物又は微生物群の投与量は、十分な浄化効果が得られる程度であれば良く、予め事前調査により汚染領域の範囲、汚染の程度、汚染物質の種類、存在する微生物の種類等を確認し、クロロエテン濃度のモニタリングを行いながら逐次追加設定すればよい。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００４４】
［実施例１］  本発明の微生物群の確立
クロロエテン類による汚染が疑われる沖縄県内の場所から土壌を採取し、本発明の微生物群の確立工程を行った。
【００４５】
以下の手順で、採取したサンプルおよび継代した培養系の作製を行った。なお、培養系の継代の際には、クロロエテン類の脱塩素化が確認された後に行った。
【００４６】
まず、炭素源を酢酸のみとした培地を作製するため、メディウム瓶に精製水１０００ｍＬを入れ、スターラーバーを入れて脱気を行い、表１に示した終濃度になるように試薬を添加し、精製水でメスアップを行った。
【００４７】
【表１】
2017055757.tif 000003
【００４８】
表１の100 x salts stock solutionとTrace element solutionＡとＢは、表２〜４の終濃度となるように試薬を添加し、精製水でメスアップを行った。
【００４９】
【表２】
2017055757.tif 000004
【００５０】
【表３】
2017055757.tif 000005
【００５１】
【表４】
2017055757.tif 000006
【００５２】
次に、１００ｍＬバイアル瓶に蓮田から採取した土を４．５ｇ入れ、上記の液体基礎培地を添加した。初期培養の際には液体基礎培地を４０ｍＬ、すでに培養している系から継代培養を行う際には、液体基礎培地を８６．４ｍＬ添加した。バイアル瓶にブチルゴム栓を施し、アルミシールを行った後、アルゴン置換を２分間行った。その後、バイアル瓶の栓の方を下に向け、オートクレーブ滅菌（１２１℃・１５分）を行った。オートクレー
ブ後は、バイアル瓶を室温で一晩静置した。
【００５３】
バイアル瓶のアルミシールを取り、採取した各々のサンプルを添加した。サンプルの添加量は、初期培養の場合は５０ｍＬ、継代培養の場合は３．６ｍＬ添加し、液体基礎培地量が９０ｍＬになるようにした。その後、再度アルミシールをし、アルゴン置換を２分間行った。
【００５４】
次に、プッシュ缶標準ガス水素からバイアル瓶に水素を１．５ｍＬ注入した。更に、電子受容体（対象汚染物質）として添加するＴＣＥをバイアル瓶１本当たり１０μｍｏｌ程度になるように添加した。培養条件は、２１℃静置で行った。なお、上記の成分のうち
電子供与体は、水素及び酢酸カリウムである。
【００５５】
図１は、第１３世代目におけるＴＣＥ分解のデータである。１６日以内でＴＣＥが１，２  ｃｉｓ−ＤＣＥ、ＶＣ を経て完全に脱塩素化されている。また、第６世代までのデ
ハロコッコイデス属細菌の１６S  ｒＲＮＡ遺伝子、ＴＣＥ脱塩素化酵素遺伝子(ＴｃｅＡ)、ＶＣ脱塩素化酵素化遺伝子(ＶｃｒＡ)を定量ＰＣＲで定量したところ、継代に従ってデハロコッコイデス属細菌が増加し、ＴｃｅＡ及びＶｃｒＡが１６S  ｒＲＮＡ遺伝子とほぼ同じ量であったことから、１種類のデハロコッコイデス属細菌がＴｃｅＡ及びＶｃｒＡを有し、ＴＣＥの完全な脱塩素化を担っていることが示された。そこで、得られたＴＣＥ分解活性を有する微生物群からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の次世代ＤＮＡシークエンサ５５００  ＳＯＬｉＤとＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ社のＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩで解析した。以下、この微生物群を「本実施例の微生物群」とも記載する。
【００５６】
本実施例の微生物群に対しては、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに対する寄託を行い、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２０４、として２０１６年２月１８日に受領された。
【００５７】
［実施例２］  次世代シークエンサ等を用いた本実施例の微生物群のキャラクタライズ
本実施例の微生物群に対して、次世代シークエンサ５５００  ＳＯＬｉＤ（ライフテクノロジーズ社）を用いた解析を行った。その結果、７５塩基長さのリードが全部で６５３，９２２，１３９リード（約４９Ｇ塩基）のデータが得られた。１０９，９５２，６１０リードデータを、１１種のデハロコッロイデス属細菌  （D. mccartyi BAV1、D. mccartyi CBDB1、D. mccartyi BTF08、D. mccartyi DCMB5、D. mccartyi GT、D. mccartyi CG5、D. mccartyi CG1、D. mccartyi CG4、D. mccartyi strain D. mccartyi 195、D. mccartyi VS、D. mccartyi GY50）のゲノム配列とＢｏｗｔｉｅを用いてマッチングを行った。また、比較のために脱ハロゲン呼吸細菌 Desulfitobacterium hafniense Y51のゲノムに対してもマッチングを行った。マッピング条件は、７５塩基の中に、ミスマッチは２つまで許容した。また、リードがベストヒットする箇所が複数ある場合は、ランダムに一箇所を選んでリードをマップした。ゲノム配列上の各塩基に対してマッピングされたリードの数（Coverage）をプロットした。
【００５８】
図２は、全長に渡って高いCoverageを示した６つのゲノムのマッピングデータである。各チャート共に、縦軸はCoverageを、横軸は塩基配列を示している。各チャート共に全長に渡って、一部の欠失した領域を除き、３０程度の高いCoverageを示している。
【００５９】
一方、Coverageの低かった５種類のデハロコッロイデス属細菌  及びDesulfitobacterium hafniense Y51のマッチング結果を図３に示す。各チャートの縦軸と横軸は、図２と同様である。
【００６０】
以上の結果から、本実施例の微生物群には、D. mccartyi BAV1、D. mccartyi CBDB1、D. mccartyi BTF08、D. mccartyi DCMB5、D. mccartyi GT、D. mccartyi CG5とゲノムレベルで高い相同性を有するデハロコッロイデス属細菌が存在することが分かった。
【００６１】
さらに５５００  ＳＯＬｉＤを用いて、ＳＩＬＶＡ  ＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子データベース（release 115：http://www.arb-silva.de）の配列データを参照配列として、６５３，９２２，１３９個のリードをマッピングし、本実施例の微生物群において、表５に示す微生物種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在が確認された。それらの配列にマッチするリード数とリードのCoverageの平均から、それぞれの微生物の存在率を推定し、その結果も併せて表５に示す。表５に記されているように、本実施例の微生物群におけるデハロコッロイデス属細菌の存在割合は約３０％であった。
【００６２】
【表５】
2017055757.tif 000007
【００６３】
本実施例の微生物群において、表５に示すデハロコッコイデス属細菌以外の微生物が存在することを確認するため、表６に示すプライマーを、増幅用プライマーとして用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲの遺伝子増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、図４に示す結果が得られ、いずれの微生物においても遺伝子増幅産物が認められた。すなわち、上記のデハロコッコイデス属細菌以外の微生物の、本実施例の微生物群における存在が確認された。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
さらに本実施例の微生物群における次世代シークエンサＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ（トミーデジタルバイオロジー社）による解析では、平均１．９ｋｂのリードデータを約８６０万リード得ることができた。そのうち、平均７．９ｋｂのリードデータ１４万７千のリードデータを選択し、他のデータをマッチングすることでエラーを修正した。その結果得られた平均３．３ｋｂの配列データ１８万５千を用いてアセンブルを行った。最終的に、最長５８５，５１１、Ｎ５０  ３２，３９６のコンティグを１５１個得ることができた。これらのコンティグからデハロコッコイデス属細菌のゲノムと相同性を有するコンティグを選び、相互の相同性などからほぼ全長のゲノムを構築した（配列番号１７）。そのゲノム配列に対して５５００  ＳＯＬｉＤのリードデータをマッチングした結果、全長に渡ってほぼ均一なCoverageであった（図５）。なお、図５のチャートの縦軸はCoverageを、横軸は塩基配列を示している。
【００６６】
図６は、本実施例の微生物群に存在するデハロコッコイデス属細菌とD. mccartyi BTF08とのゲノム配列の比較であるが、全長に渡って高い相同性が認められた。図６のグラフにおいて、縦軸はD. mccartyi BTF08のゲノム配列（配列番号１７）を示し、横軸は本実施例の微生物群中のデハロコッコイデス属細菌のゲノム配列（配列番号１８）を示している。グラフ横の数字付きの縦のバーは、上に行くほど相同性が高いことを示している。カラー原図のバーでは、下の青から上の赤へと、色の波長が長くなるように示されている。グラフは、相同性の高い配列を点で示しており、ほぼ全長に渡って９５％以上の相同性を示す上記バーの最も上に位置する、原図の赤い点がプロットされている。上記の配列番号１８の塩基配列が、リード情報に基づき導出された本実施例の微生物群中のデハロコッコイデス属細菌のゲノムの塩基配列である。リード情報とは、いわゆる次世代シークエンサにおける被験細菌のゲノム塩基配列の断片の配列の電子化情報である。当該塩基配列情報は、当該断片の片側からの解読データである「シングルエンドリード」と、両側からの解読データである「ペアエンドリード」である場合があり、どちらであっても本発明に適用することが可能である。上記のようにこのリード情報に基づいて、被験微生物のゲノムの塩基配列を高い確度で導き出すことが可能である。
【００６７】
図５と図６に示された、上記の本実施例の微生物群に存在するデハロコッコイデス属細菌のゲノム解析の結果、ＴＣＥ脱塩素化酵素遺伝子(ＴｃｅＡ)、ＶＣ脱塩素化酵素化遺伝子(ＶｃｒＡ)の他に、D. mccartyi BTF08のＰＣＥ脱塩素化酵素遺伝子(ＰｃｅＡ)が、当
該デハロコッコイデス属細菌において存在することが分かった。
【００６８】
［実施例３］  ＰＣＥとγ−ＨＣＨの脱塩素化能の検討
そこで、本実施例の微生物群を、ＰＣＥを栄養源として加えた培地を用いて培養を行い、その産生物を、ガスクロマトグラフィーを用いてＰＣＥの脱塩素化能について検討した。具体的には、１３代目までＴＣＥで培養した菌を、ＴＣＥに代えてＰＣＥを栄養源（電子受容体）として含培地に添加した。
【００６９】
その結果、ＰＣＥがＴＣＥ，ｃｉｓ−ＤＣＥ、ＶＣを経てエテンまで脱塩素化されたことが分かった。よって、本実施例の微生物群に存在するデハロコッロイデス属細菌はＰＣＥをエテンまで完全に脱塩素化能を有するものであることが、高い確度で示された（図７）。
【００７０】
また、本実施例の微生物群のデハロコッコイデス属細菌に様々な還元脱塩素化酵素遺伝子が存在することから、本発明の微生物群においてγ−ＨＣＨの脱塩素化が可能か否かを、上記のＰＣＥに代えてγ−ＨＣＨを栄養源（電子受容体）として加えた培地を用いて、本実施例の微生物群の培養を同条件で行い、その産生物をガスクロマトグラフィーにより解析することで検討した。その結果、速やかにγ−ＨＣＨの脱塩素化産物であるクロロベンゼンとベンゼンが生成したことが分かった（図８）。この結果は、本実施例の微生物群がγ−ＨＣＨを脱塩素化する能力があることを示している。しかも、当該微生物群中のデハロコッロイデス属細菌が脱塩素化を行っている可能性が高い。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本実施例の微生物群の結果から明らかなように、本発明の微生物群は、ＰＣＥ、ＴＣＥ、ＤＣＥ等のクロロエテン類の嫌気的な脱塩素化を行い、かつ、γ−ＨＣＨの嫌気的な脱塩素化を行うことが明らかになった。この優れた嫌気的脱塩素化特性により、本発明の微生物群は、クロロエテン類又はγ−ＨＣＨで汚染された土壌や地下水等に対するバイオレメディエーションおける浄化微生物として用いることが可能であり、当該バイオレメディエーションを核心的な内容とする本発明の浄化方法は、産業上極めて有用である。
【００７２】
また、本発明の微生物群に含有されるデハロコッコイデス属細菌は、テトラクロロエテン脱塩素化酵素遺伝子であるＰｃｅＡ、トリクロロエテン脱塩素化遺伝子であるＴｃｅＡ、及び、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるＶｃｒＡを保有する新規の微生物であり、本発明の微生物群と共に、又は、単独で、上記のバイオレメディエーションにおいて用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【配列表】
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