(57)【要約】【課題】Ｓｔａｔ３経路阻害剤を効率的に腫瘍細胞に作用させるための、癌の治療システムを実現する。また、Ｓｔａｔ３経路阻害剤による抗腫瘍効果を確保しつつ、活性酸素量の増加を抑制することが可能な、癌の治療システムを提供する。【解決手段】本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含む。【選択図】図６
2017171640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含むことを特徴とする、癌の治療システム。
【請求項２】
上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｓｔａｔ３の活性を阻害するＳｔａｔ３阻害剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の癌の治療システム。
【請求項３】
上記Ｓｔａｔ３阻害剤が、以下の群（１）から選択される１以上の化合物又はその製薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項２に記載の癌の治療システム。
【化１】
2017171640.tif 000008
【請求項４】
上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｊａｋ１および／またはＪａｋ２の活性を阻害するＪａｋ阻害剤を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の癌の治療システム。
【請求項５】
上記癌の治療システムが、還元剤を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の癌の治療システム。
【請求項６】
上記還元剤が、ビタミンＣ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、リボフラビン、コハク酸、フマル酸、コエンザイムＱ１０及びナイアシンからなる群より選ばれる１以上の還元剤であることを特徴とする請求項５に記載の癌の治療システム。
【請求項７】
上記癌が、中皮腫、大腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌、骨芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、脂肪肉腫及び白血病からなる群より選択される１以上の癌である、請求項１から６のいずれか１項に記載の癌の治療システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、腫瘍細胞の増殖抑制及び／又は細胞死を目的として、数多くの抗腫瘍剤が使用されており、これら抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の活発な細胞分裂を阻害することを主たる作用としている。そのため、癌の再発の原因と考えられている癌幹細胞のように、分裂の頻度の少ない細胞には殆ど効果を示さない。癌幹細胞は、従来の抗腫瘍剤に対してのみならず、放射線の照射に対しても抵抗性を示すため、癌幹細胞の根絶に向けての大きな障壁となっている。
【０００３】
そこで近年、上記癌幹細胞に対する細胞増殖抑制剤及び／又は細胞死促進剤として、Ｓｔａｔ３経路を阻害する阻害剤が開発された（特許文献１、４、５）。上記Ｓｔａｔ３は、転写因子であり、正常細胞では通常不活性であるが、多くの種類の腫瘍において、癌幹細胞を含む腫瘍細胞では活性化されており、細胞増殖、抗酸化活性、浸潤、転移等、様々な腫瘍の特徴に関わる因子の転写を誘導している。
【０００４】
上記Ｓｔａｔ３は、様々な経路によって活性化され、Ｓｔａｔ３経路阻害剤は、当該Ｓｔａｔ３の活性化に必要なリン酸化及び二量体化、もしくは、活性化された後のＳｔａｔ３の核内移行等を阻害すること、又はＳｔａｔ３経路においてＳｔａｔ３の上流に存在するＪａｋを阻害することによって、癌幹細胞に細胞増殖抑制及び／又は細胞死の効果を引奏する。（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１２３３２号公報（２０１２年１月１９日公開）
【特許文献２】特開２０１５−３８１５１号公報（２０１５年２月２６日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来より、効率的に癌を根絶するための様々な方法が鋭意検討されており、そのための新たな治療システムの開発が常に求められている。
【０００７】
したがって、上述のように癌幹細胞に有効な、新規の抗腫瘍剤を開発することと同様に、当該抗腫瘍剤をさらに効率的に腫瘍組織に作用させるための、癌の治療システムの開発が喫緊の課題となっている。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を効率的に腫瘍細胞に作用させるための、癌の治療システムを実現することにある。
【０００９】
また、本発明者は、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤の投与により、細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）の量が増加することを見出した。
【００１０】
活性酸素はＤＮＡ及び細胞膜に損傷を与えるため、癌細胞を死滅させる上では有効であるが、正常な臓器に対しても損傷等の悪影響を与え得る。それゆえ、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線とを併用する場合、活性酸素量の増加に伴い、正常臓器損傷等の副作用が発生することが懸念される。
【００１１】
以上のことから、Ｓｔａｔ３経路阻害剤による抗腫瘍効果を確保しつつ、活性酸素量の過剰な増加を回避する必要性がある。
【００１２】
そこで、本発明はさらに、Ｓｔａｔ３経路阻害剤による抗腫瘍効果を確保しつつ、活性酸素量の増加を抑制することが可能な、癌の治療システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意検討した。その結果、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と、放射線とを併用することにより、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を単独で使用した場合に比べて、より高い抗腫瘍効果が得られることを見出した。さらに、上記構成に加えて還元剤を併用することによって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と、放射線との併用による相乗的な抗腫瘍効果を確保しつつ、活性酸素量の過剰な増加を回避できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含むことを特徴としている。
【００１５】
上記構成によれば、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を備えるため、Ｓｔａｔ３の活性化に必要なリン酸化、リン酸化されたＳｔａｔ３の二量体化、二量体化されたＳｔａｔ３の核内移行等の阻害、又は、Ｓｔａｔ３経路においてＳｔａｔ３の上流に存在するＪａｋの活性を阻害すること等ができるため、癌幹細胞の増殖を抑制することができる。
【００１６】
また、上記装置の上記放射性照射部は癌細胞に放射線を照射することができるため、癌細胞のＤＮＡに損傷を与えて細胞死を惹起することによって、癌細胞の増殖を抑制することができる。
【００１７】
したがって、相乗的な、優れた抗腫瘍効果を得ることができる。
【００１８】
本発明に係る癌の治療システムは、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｓｔａｔ３の活性を阻害するＳｔａｔ３阻害剤を含むことを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係る癌の治療システムは、上記Ｓｔａｔ３阻害剤が、以下の群（１）から選択される１以上の化合物又はその製薬学的に許容される塩であることを特徴としている。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
上記構成によれば、癌幹細胞において活性化されているＳｔａｔ３の活性を直接的に阻害し、癌遺伝子の転写を抑制することができる。それゆえ、癌幹細胞の増殖をより効果的に阻害することができる。
【００２２】
本発明に係る癌の治療システムは、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｊａｋ１および／またはＪａｋ２の活性を阻害するＪａｋ阻害剤を含むことを特徴としている。
【００２３】
上記構成によれば、Ｊａｋファミリーのうち、Ｓｔａｔ３経路において、Ｓｔａｔ３のリン酸化に関与するＪａｋ１またはＪａｋ２の活性を選択的に阻害することができるため、Ｓｔａｔ３の活性を間接的に阻害することが可能である。したがって、癌幹細胞の増殖を効果的に阻害することができる。
【００２４】
本発明に係る癌の治療システムは、還元剤を含むことを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る癌の治療システムは、上記還元剤が、ビタミンＣ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、リボフラビン、コハク酸、フマル酸、コエンザイムＱ１０及びナイアシンからなる群より選ばれる１以上の還元剤であることを特徴としている。
【００２６】
上記還元剤は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤の投与及び放射線の照射により細胞内に発生する活性酸素を減少させ得る。したがって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤及び放射線による、正常細胞に対する望ましくない効果を抑制することが可能である。
【００２７】
本発明に係る癌の治療システムは、上記癌が、中皮腫、大腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌、骨芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、脂肪肉腫及び白血病からなる群より選択される１以上の癌であることが好ましい。
【００２８】
上記癌には、癌幹細胞の存在が知られており、従来の化学療法又は放射線療法によって当該癌が検出限界未満まで縮小した後に、上記化学療法又は放射線療法に抵抗性の癌幹細胞のために、再発する可能性がある。上記構成によれば、Ｓｔａｔ３を阻害することができるため、癌幹細胞の生存を効率的に抑制することが可能である。それゆえ、治療後の癌の再発を防止することが可能である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含むため、癌幹細胞の生存だけでなく、当該癌幹細胞の周囲の癌細胞の生存も、効率的に抑制することができる。そのため、再発の可能性が少ない癌の治療システムを提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｓｔａｔ３阻害剤としてＳｔａｔｔｉｃを用いた場合の、胸膜中皮腫細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図２】Ｓｔａｔ３阻害剤としてＢＢＩ−６０８を用いた場合の、胸膜中皮腫細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図３】Ｓｔａｔ３阻害剤としてＢＢＩ−６０８を用いた場合の、胸膜中皮腫の癌幹細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【図４】胸膜中皮腫に対するＳｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）のＳｔａｔ３リン酸化抑制効果を示す図である。
【図５】マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍に対する、Ｓｔａｔｔｉｃと放射線治療との併用効果を示す図である。
【図６】マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍に対する、ＢＢＩ−６０８と放射線治療との併用効果を示す図である。
【図７】ＢＢＩ−６０８によるＳｔａｔ３のリン酸化阻害効果を、倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【図８】ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭであり、放射線を照射しなかったＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【図９】ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭ又は５μＭであり、２Ｇｙの放射線を照射したＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【図１０】ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭ又は５μＭであり、５Ｇｙの放射線を照射したＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【図１１】ＢＢＩ−６０８による胸膜中皮腫細胞へのアポトーシス誘導効果を示す図である。
【図１２】ＢＢＩ−６０８又はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄを投与した細胞内における活性酸素の産生をフローサイトメトリーによって測定した結果を示す図である。
【図１３】ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び２Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内における活性酸素の産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【図１４】ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び５Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内における活性酸素の産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【図１５】ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び２Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞内における活性酸素の産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【図１６】還元剤として、ビタミンＣの代わりにカタラーゼを用い、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）と併用して、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内における活性酸素の産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【図１７】胸膜中皮腫患者の肺に対して施したＩＭＲＴの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００３２】
〔実施の形態１：本発明に係る癌の治療システム〕
本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含む。さらに、本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線の照射とによる細胞内でのＲＯＳの発生を抑制するために、還元剤を含むことが可能である。そこでまず、Ｓｔａｔ３経路阻害剤について説明する。
【００３３】
（１）Ｓｔａｔ３経路阻害剤
Ｓｔａｔ３（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）は、種々のサイトカイン又は成長因子受容体からのシグナルを受けて作用する転写因子である。Ｓｔａｔ３は、正常細胞では殆ど活性化されていない一方で、癌幹細胞を含む癌細胞では活性化されており、癌細胞の生存及び増殖のみならず、転移及び浸潤にも関わっていることが知られている。
【００３４】
Ｓｔａｔ３は、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、Ｓｒｃ又はＪａｋ（Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ）等のチロシンキナーゼによって活性化され得る。
【００３５】
つまり、Ｓｔａｔ３は、上記チロシンキナーゼによって、ＳＨ２ドメインのチロシン残基がリン酸化されて活性化される。リン酸化されたＳｔａｔ３は、上記ＳＨ２ドメインを介して他のＳｔａｔ３と二量体を形成し、核内へ移行して特異的ＤＮＡ部位に結合し、遺伝子の転写を制御する。
【００３６】
Ｊａｋは、サイトカインのシグナルを受容体から受け取り、下流の因子へと伝達する細胞質のチロシンキナーゼである。Ｊａｋには、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３及びＴｙｋ２という４つのファミリータンパク質が存在する。当該４つのファミリータンパク質は、それぞれ異なった受容体からシグナルを受け取り、同じくそれぞれ異なったＳｔａｔファミリータンパク質（Ｓｔａｔ１〜４、Ｓｔａｔ５α、Ｓｔａｔ５β及びＳｔａｔ６）に、シグナルを伝達する。具体的には、シグナルを受け取ったＪａｋは、リン酸化され、二量体を形成することで活性化される。活性化されたＪａｋはＪａｋのキナーゼ活性を通して、基質であるＳｔａｔをリン酸化し、Ｓｔａｔを活性化する。そしてＪａｋファミリーのうち、Ｊａｋ１及びＪａｋ２がＳｔａｔ３に関わっていることが知られている。
【００３７】
以上のことから、Ｓｔａｔ３経路とは、活性化されていないＳｔａｔ３のリン酸化から、リン酸化されたＳｔａｔ３の二量体形成、二量体を形成したＳｔａｔ３の核内移行、核内移行したＳｔａｔ３の特異的ＤＮＡ部位への結合に至るまでの経路であると言える。また、Ｓｔａｔ３経路阻害剤とは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得る薬剤をいう。すなわち、Ｓｔａｔ３経路阻害剤には、上記チロシンキナーゼによるＳｔａｔ３のリン酸化、上記二量体形成、上記核内移行、Ｓｔａｔ３のタンパク質合成、及び上記特異的ＤＮＡ部位への結合等の反応のいずれかを阻害し得る薬剤が包含される。
【００３８】
よって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤としては、ＭＡＰＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、Ｊａｋ阻害剤、Ｓｔａｔ３阻害剤等を挙げることができる。これらの中でもＪａｋ１を選択的に阻害するＪａｋ１阻害剤、Ｊａｋ１およびＪａｋ２を阻害するＪａｋ１，２阻害剤、またはＪａｋ２を選択的に阻害するＪａｋ２阻害剤、もしくは、Ｓｔａｔ３の活性を阻害するＳｔａｔ３阻害剤であることが好ましく、癌幹細胞において活性化されているＳｔａｔ３の活性を直接的に阻害し、癌遺伝子の転写を抑制することができるため、Ｓｔａｔ３阻害剤であることがより好ましい。
【００３９】
つまり、本発明に係る癌の治療システムでは、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｓｔａｔ３の活性を阻害するＳｔａｔ３阻害剤を含むことが好ましい。なお、Ｓｔａｔ３経路阻害剤としては、１種類を用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
上記Ｓｔａｔ３阻害剤は、Ｓｔａｔ３のＳＨ２ドメインに結合し、Ｓｔａｔ３のリン酸化、二量体化及び／又はＳｔａｔ３の核内移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３のタンパク質合成を阻害すること、又はＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することによって、最終的にＳｔａｔ３による転写活性を抑制するものである。
【００４１】
上記Ｓｔａｔ３阻害剤としては、従来公知の阻害剤を用いることができる。例えば、上記Ｓｔａｔ３阻害剤がＳｔａｔ３のＳＨ２ドメインへの結合を介してＳｔａｔ３の転写活性を阻害する場合、当該Ｓｔａｔ３阻害剤としては、（Ａ）ｐｅｐｔｉｄｅ又はｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓであるＸｐＹＬ、Ａｃ−ｐＹＬＰＱＴＶ−ＮＨ２、ＩＳＳ６１０、Ｓ３１−Ｍ２００１もしくはＣＪ−１３８３；（Ｂ）下記の群（１）に示す低分子化合物であるＳｔａｔｔｉｃ、ＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−１２、Ｓ３１−２０１、ＳＦ−１０６６、ＢＢＩ−６０８もしくはＳＴＸ−０１１９；（Ｃ）クルクミンの誘導体であるＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ３２及びＦＬＬＬ６２からなる群より選択される１以上の化合物；等を挙げることができ、上記（Ａ）〜（Ｃ）に示す化合物の製薬学的に許容される塩であってもよい。
【００４２】
【化２】
2017171640.tif 000004
【００４３】
上記「製薬学的に許容されるその塩」は、上記（Ａ）〜（Ｃ）に示す化合物と無毒の塩を形成するものであればいかなる塩でもよい。例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸；シュウ酸、マロン酸、クエン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アンモニウム等の無機塩基；メチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、グアニジン、コリン、シンコニン等の有機塩基；又はリジン、アルギニン、アラニン等のアミノ酸と反応させることにより得ることができる。なお、本発明には、Ｓｔａｔ３経路阻害剤である各化合物の含水物、水和物及び溶媒和物も包含される。
【００４４】
上記群（１）に示す化合物（ａ）〜（ｇ）は、それぞれＳｔａｔｔｉｃ、ＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−１２、Ｓ３１−２０１、ＳＦ−１０６６、ＢＢＩ−６０８、ＳＴＸ−０１１９である。
【００４５】
上記（Ａ）〜（Ｃ）に示す化合物のうち、ＢＢＩ−６０８以外の化合物は、例えばFurgan et al. Journal of Hematology & Oncology 2013, 6: 90に記載されている。また、ＢＢＩ−６０８は、群（１）の（ｆ）に示すように、２−アセチルベンゾ［ｆ］［１］ベンゾフラン−４，９−ジオンである。
【００４６】
本実施の形態において、Ｓｔａｔ３阻害剤としては、群（１）に示す低分子化合物が好ましく、より好ましくはＳｔｔａｔｉｃ又はＢＢＩ−６０８であり、癌幹細胞に対する優れた増殖抑制効果を有するため、最も好ましくはＢＢＩ−６０８である。
【００４７】
上記Ｓｔａｔ３阻害剤がＳｔａｔ３のタンパク質合成を阻害する場合、当該Ｓｔａｔ３阻害剤は、ＡＺＤ９１５０のようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉを利用したｓｉＲＮＡｓもしくはショートヘアピンＲＮＡｓであってもよい。
【００４８】
上記Ｓｔａｔ３阻害剤がＳｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を阻害する場合、当該Ｓｔａｔ３阻害剤は、デコイオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、白金化合物であるＩＳ３  ２９５及びＧリッチオリゴヌクレオチドであるＧクォーターからなる群より選択される１つ以上のものであってもよい。
【００４９】
Ｓｔａｔ３阻害剤は１種類を用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】
上記Ｊａｋ阻害剤は、Ｊａｋの活性を阻害する薬剤であり、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２またはＪａｋ３を標的とするものである。上記Ｊａｋ阻害剤の作用は、Ｊａｋのタンパク質合成を阻害すること、および／またはＪａｋのキナーゼ活性を阻害することである。
【００５１】
上記Ｊａｋ阻害剤としては、Ｊａｋ１およびＪａｋ２がＳｔａｔ３の活性化に関与することから、Ｊａｋ１を選択的に阻害するＪａｋ１阻害剤、Ｊａｋ１およびＪａｋ２を選択的に阻害するＪａｋ１，２阻害剤、またはＪａｋ２を選択的に阻害するＪａｋ２阻害剤であることが好ましく、Ｊａｋ２選択的阻害剤であるＡＺＤ１４８０であることがより好ましい。
【００５２】
以上のことから、本発明に係る癌の治療システムでは、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤が、Ｊａｋ１および／またはＪａｋ２の活性を阻害するＪａｋ阻害剤を含むことも好ましいと言える。
【００５３】
なお、ＡＺＤ−１４８０は、（Ｓ）−５−クロロ−Ｎ２−（１−（５−フルオロピリミジン−２−イル）エチル）−Ｎ４−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリミジン−２，４−ジアミンと同義であり、以下の構造式によって表される化合物であり、その製薬学的に許容される塩であってもよい。「製薬学的に許容されるその塩」は、ＡＺＤ−１４８０と無毒の塩を形成するものであればいかなる塩でもよい。
【００５４】
【化３】
2017171640.tif 000005
【００５５】
Ｊａｋ阻害剤は、１種類を用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、Ｊａｋ阻害剤を、上記Ｓｔａｔ３阻害剤と組み合わせて用いることも可能である。
【００５６】
（２）癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置
上記装置としては、従来公知の放射線治療機器を用いることができる。例えば、リニアック、コバルト照射装置、医療用加速器、ガンマナイフ等の各種装置を用いることができる。放射線照射部とは、Ｘ線又はγ線等を照射する部材をいう。照射する放射線の種類は特に限定されるものではなく、治療目的に応じて適宜決定すればよい。治療法が外照射である場合、癌の場所、大きさ、種類等に応じて、体外から、体内の腫瘍部位に対して放射線が照射される。
【００５７】
上記装置は、体内の腫瘍部位を特定するための、Ｘ線照射部位（例えば、ＣＴ）および赤外線認識センサー等を含んでもよい。
【００５８】
また上記装置は、特定の１点に照射する、定位放射線治療機器であってもよく、または呼吸等の生命活動によって移動する部位に照射するため放射線照射部が可動である、動体追尾機能を備えた放射線治療機器であってもよい。
【００５９】
また上記装置は、部位によって照射する放射線の線量を変更するための装置を備えた、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）装置であってもよく、後述する図１７に使用例を記載している。
【００６０】
（３）還元剤
本発明に係る癌の治療システムは、上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤と癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とに加えて、還元剤を含むことができる。
【００６１】
本発明者は、後述する参考例６に示すように、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を細胞に作用させた場合、細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）量が増加することを見出した。また、本発明者は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線とを併用すると、相乗的な抗腫瘍効果が得られる一方で、後述する実施例３に示すように、Ｓｔａｔ３経路阻害剤のみを用いた場合よりも細胞内の活性酸素量が増加することを見出した。
【００６２】
活性酸素は反応性に富む物質であり、ラジカル連鎖反応によって他の分子を効率的にかつ非常に速く攻撃し、反応開始部位から遠く離れた部位に損傷を与えうるため、細胞の生存にとって望ましくない状態を引き起こし、結果として細胞死を導く可能性がある。
【００６３】
癌の治療において、化学療法、放射線療法などの目的は癌細胞の抑制であるが、一方で、正常細胞の抑制又は死滅という副作用が生じ得る。
【００６４】
上述した活性酸素の発生は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤の投与、又は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線との併用によって副作用が生じる可能性を示唆するものである。すなわち、活性酸素の発生は、癌細胞を死滅させる上では有効であるが、正常な臓器に対しても損傷等の悪影響を与え得る。したがって、過剰な活性酸素の除去が必要となってくる。
【００６５】
本発明者は、細胞内での活性酸素の除去について検討し、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線照射との併用とに加えて、さらに還元剤を併用することによって、細胞内における活性酸素の発生を抑制できることを明らかにした。
【００６６】
上記還元剤としては特に限定されるものではないが、ビタミンＣ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、リボフラビン、コハク酸、フマル酸、コエンザイムＱ１０及びナイアシンからなる群より選ばれる１以上の還元剤であることが好ましく、水溶性である点、点滴による静脈からの大量投与が可能であるため還元剤の血中濃度を急速に高めることが可能である点、等の観点から、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）であることが特に好ましい。また、血中の過剰なビタミンＣは尿中に排泄されるため本発明に係る癌の治療システムを用いた療法に好適である。上記還元剤は、１種類用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
後述する実施例３に示すように、胸膜中皮腫細胞について、肉腫型及び上皮型の何れにおいても、Ｓｔａｔ３経路阻害剤の投与、又は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線の照射との併用によって細胞内の活性酸素の量が増加し、特に５Ｇｙの放射線を照射した場合は増加が顕著であった。一方、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と、還元剤と、放射線の照射とを併用することによって、活性酸素の量を大幅に低減することができることが明らかとなった。また、５Ｇｙの放射線を照射した場合であっても、活性酸素の量を、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を単独投与した場合と同程度に抑制することができることも明らかとなった。つまり、還元剤の使用によって、過剰に生成された活性酸素を除去することができることが示された。
【００６８】
以上述べた事項から、本発明に係る癌治療システムは、Ｓｔａｔ３経路阻害剤がＳｔａｔ経路におけるシグナル伝達を阻害することによって、癌幹細胞にて活性化しているＳｔａｔ３を不活性化することができ、放射線照射によって癌細胞に直接障害を与えることができる。さらに、Ｓｔａｔ３経路と放射線の照射との併用によって細胞内に過剰に生成された活性酸素を、還元剤の投与によって除去することができると言える。
【００６９】
つまり、本発明に係る癌治療システムは、Ｓｔａｔ３経路阻害剤及び放射線照射による優れた抗腫瘍効果を得ることができるだけでなく、正常臓器の損傷等の副作用を減弱させることができる、非常に有用な癌治療システムであると言える。
【００７０】
なお、本明細書において、用語「癌細胞」は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍に由来する細胞の全集団を指し、用語「腫瘍細胞」と同義である。
【００７１】
（４）本発明に係る癌の治療システムを適用可能な癌について
本発明に係る癌の治療システムを適用可能な癌は、特に限定されるものではないが、中皮腫（胸膜中皮腫、心膜中皮腫、腹膜中皮腫の何れであってもよい）、大腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌、骨芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、脂肪肉腫及び白血病からなる群より選択される１以上の癌であることが好ましい。
【００７２】
上記癌には、癌幹細胞の存在が知られており、癌幹細胞においてはＳｔａｔ３が活性化されている。本発明に係る癌の治療システムは、上述のようにＳｔａｔ３の活性を阻害することができるため、癌幹細胞を死滅させることが可能であり、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線照射との併用による相乗的な抗腫瘍効果を得ることができ、かつ、副作用を減弱することができる。
【００７３】
よって、本発明に係る癌の治療システムは、癌幹細胞を含む癌組織を有する哺乳動物を適用対象とすることが好ましく、ヒトを適用対象とすることが最も好ましい。
【００７４】
（５）癌の治療システムの構築
本発明に係る癌の治療システムは、Ｓｔａｔ３経路におけるシグナル伝達を阻害し得るＳｔａｔ３経路阻害剤と、癌細胞に対して放射線を照射可能な放射線照射部を備えた装置とを含むことを必須とし、さらには還元剤を含むことが可能であるため、これらを適宜準備し、使用可能な状態にすることによって構築することができる。
【００７５】
本発明に係る癌の治療システムには、上記構成以外に、必要に応じてその他の成分、例えば製薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤等から選ばれる１以上の成分をさらに含ませて構築することもできる。
【００７６】
上記担体は、水及びピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物、又は合成由来の油を含む油など、無菌の液体でありうる。
【００７７】
上記Ｓｔａｔ３経路阻害剤及び還元剤が静脈内投与される場合は、水を担体として用いることができる。例えば、注射溶液用の液体担体としては、生理食塩液ならびにデキストロース及びグリセロールの水溶液もまた用いることができる。
【００７８】
適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。
【００７９】
また本発明に係る癌の治療システムは、任意で放射線増感剤（例えば、メトロニダゾール、ミソミダゾール、動脈内Ｂｕｄｒ、静脈内ヨードデオキシウリジン（ＩｕｄＲ）、ニトロイミダゾール、５−置換−４−ニトロイミダゾール、２Ｈ−イソインドレジオン、［［（２−ブロモエチル）−アミノ］メチル］−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−エタノール、ニトロアニリン誘導体、ハロゲン化ＤＮＡリガンド、１，２，４ベンゾトリアジンオキシド、２−ニトロイミダゾール誘導体、フッ素含有ニトロアゾール誘導体、ベンズアミド、ニコチンアミド、アクリジン−インターカレーター、５−チオトレトラゾール、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、４，５−ジニトロイミダゾール誘導体、ヒドロキシル化テキサフィリン、シスプラチン、マイトマイシン、チリパザミン、ニトロソウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、カルボプラチン、エピルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、エトポシド、パクリタキセル、熱（温熱療法）など）、および／または放射線防御剤（例えば、システアミン、アミノアルキル二水素ホスホロチオエート、アミフォスチン（ＷＲ  ２７２１）、ＩＬ−１、ＩＬ−６など）を含んでもよい。放射線増感剤は、腫瘍細胞の殺傷を増強する。放射線防御剤は、照射の有害な効果から健常組織を保護する。
【００８０】
〔実施の形態２：本発明に係る癌の治療システムの使用〕
本発明に係る癌の治療システムは、例えば上記（４）で述べた癌の治療に好適に用いることができる。この場合、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を患者に投与する工程と、癌細胞に対して放射線を照射する工程とを含む方法を用いること、または、Ｓｔａｔ３経路阻害剤及び還元剤を患者に投与する工程と、癌細胞に対して放射線を照射する工程とを含む方法を用いることが考えられる。Ｓｔａｔ３経路阻害剤と還元剤とは、同時に投与してもよいし、必要に応じて、一方の投与後、所定の間隔を空けて他方を投与してもよい。
【００８１】
Ｓｔａｔ３経路阻害剤及び／又は還元剤は、前記賦形剤等と混合して、常法により錠剤、丸剤、散剤、顆粒、坐剤、注射剤、点眼剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エアゾール剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の形態となすことにより、全身的或いは局所的に、いずれかの適切な体内経路により患者に投与することができる。上記体内経路としては、例えば、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、及び経口経路等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
Ｓｔａｔ３経路阻害剤の使用量は、効果的な腫瘍抑制の観点から、患者の体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。
【００８３】
１日当たりのＳｔａｔ３経路阻害剤の使用量としては、効果的な腫瘍抑制の観点から、２０ｍｇ／ｄａｙ〜１４００ｍｇ／ｄａｙであることが好ましく、５００ｍｇ／ｄａｙ〜１２００ｍｇ／ｋｇであることがより好ましく、１０００ｍｇ／ｄａｙであることが、特に好ましい。
【００８４】
還元剤の使用量は、体内での代謝を考慮の上、投与した還元剤の血中濃度を１０〜２０ｍＭで５〜６時間維持することを目的とし、患者あたり、５０〜５００ｇ／ｂｏｄｙを許容範囲として、患者の体表面積１ｍ２あたり７０〜１１０ｇ／ｍ２であることが好ましく、７０〜８０ｇ／ｍ２であることがより好ましい。
【００８５】
患者への放射線の照射量（線量）としては、１日当たり２Ｇｙ〜５Ｇｙ、総照射量６０Ｇｙ未満であることが好ましく、当該線量は、日常臨床で用いられる線量である。
【００８６】
Ｓｔａｔ３経路阻害剤の投与、水溶性の還元剤の投与、及び放射線の照射の順序は、限定されるものではないが、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を効率的に腫瘍組織に作用させるため、順に、Ｓｔａｔ３阻害剤投与、還元剤投与、及び放射線の照射、であることが好ましく、Ｓｔａｔ３阻害剤を投与した時から１〜２時間後に還元剤を投与し、還元剤を投与した時から１時間以内に放射線を患者に対して照射することがより好ましい。
【００８７】
放射線の照射方法としては、特に限定されるものではない。例えば、リニアック等の装置を用いて、皮膚を通して主要部位に所望の線量の放射線を照射することができる。また、放射線の照射方法として、ＩＭＲＴ（Intensity modulated radiation Therapy）を用いることもできる。例えば、胸膜中皮腫は、壁側胸膜から発生し、臓側胸膜に及ぶ。病変に対して重点的に放射線量を高めた方法がＩＭＲＴである。
【００８８】
図１７は、胸膜中皮腫患者の肺に対して施したＩＭＲＴの一例を示す図である。図１７において、３は低線量の放射線を照射した部位、４は高線量の放射線を照射した部位である。このように、病変部である部位４に高線量の放射線を照射し、その周辺部位である部位３には低線量の放射線を照射することにより、放射線による治療効果を高めることができ、かつ、正常肺全体で見れば低線量の照射とすることができる。なお、ＩＭＲＴについては、Journal of Thoracici Oncology   JTCS2015 Marc de Perrot (in press)に記載されている。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９０】
〔参考例１：Ｓｔａｔ３阻害剤（Ｓｔａｔｔｉｃ、ＢＢＩ−６０８）による胸膜中皮腫細胞の増殖抑制効果〕
胸膜中皮腫細胞としては、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２４５２、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８（American Type Culture Collectionより取得）を用いた。細胞は１０％ウシ胎児血清（Cell Culture Bioscience製）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Sigma-Aldrich製）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養したものを用いた。なお、ＮＣＩ−Ｈ２８及びＮＣＩ−Ｈ２０５２は肉腫型、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＮＣＩ−Ｈ２４５２は上皮型、ＭＳＴＯ−２１１Ｈは二相型の胸膜中皮腫細胞である。
【００９１】
上記各細胞の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製し、当該細胞浮遊液を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μｌ（すなわち、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を開始した。
【００９２】
２４時間培養後、Ｓｔａｔ３阻害剤を、１０μｌ、最終濃度が図１に示す濃度となるように上記各ｗｅｌｌに添加した。
【００９３】
なお、上記Ｓｔａｔｔｉｃは以下の構造式に示す構造を有する。
【００９４】
【化４】
2017171640.tif 000006
【００９５】
また、ＢＢＩ−６０８（大日本住友製薬製）は以下の構造式に示す構造を有する。
【００９６】
【化５】
2017171640.tif 000007
【００９７】
培養開始から７２時間後、１０μｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を上記各ｗｅｌｌに投与し、培養器中で２時間反応させた後に、マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９８】
結果を図１及び図２に示した。図１は、Ｓｔａｔ３阻害剤としてＳｔａｔｔｉｃを用いた場合の、胸膜中皮腫細胞の増殖抑制効果を示す図である。また、図２は、Ｓｔａｔ３阻害剤としてＢＢＩ−６０８を用いた場合の、胸膜中皮腫細胞の増殖抑制効果を示す図である。
【００９９】
図１及び図２では、対照群（すなわち、Ｓｔａｔｔｉｃの濃度が０μＭ）の吸光度を１．０として、Ｓｔａｔｔｉｃ投与群の吸光度との相対比を縦軸に示し、横軸にＳｔａｔｔｉｃの濃度を示した。図１及び図２において、（ａ）−（ｅ）は、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、又はＮＣＩ−Ｈ２４５２に対するＳｔａｔｔｉｃの増殖抑制効果をそれぞれ示している。
【０１００】
図１に示すように、Ｓｔａｔｔｉｃは、各細胞種に対して、概ね濃度依存的な増殖抑制効果を示し、ＮＣＩ−Ｈ２８及びＮＣＩ−Ｈ２２６に対しては、最終濃度が１０μＭの場合でも顕著な増殖抑制効果を示した。最終濃度が１０００μＭの場合は、何れの細胞種に対しても非常に顕著な増殖抑制効果を示した。
【０１０１】
また、図２に示すように、ＢＢＩ−６０８は、最終濃度が１０μＭ以上の場合、本実施例で用いた全ての細胞種に対して非常に顕著な増殖抑制効果を示した。
【０１０２】
〔参考例２：胸膜中皮腫に対するＳｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）の癌幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、以下「ＣＳＣ」と称する）抑制効果〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製し、６ｃｍ  ｄｉｓｈに５．０ｍｌずつ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を開始した。
【０１０３】
４８時間培養後、薬剤として、ＢＢＩ−６０８又はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄを、最終濃度が１μＭ又は１０μＭとなるように上記ｄｉｓｈに投与した。培養器中で上記薬剤を作用させた後に、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整し、抗体（抗ＣＤ４４抗体及び抗ＣＤ２４抗体）を反応させ、フローサイトメトリーを使用して、各抗体に結合した蛍光シグナルを測定することで、細胞集団における癌幹細胞の占める割合を評価した。なお、具体的な測定方法は、測定装置に添付されているプロトコールに従えばよい。
【０１０４】
結果を図３に示した。図３は、Ｓｔａｔ３阻害剤としてＢＢＩ−６０８を用いた場合の、胸膜中皮腫の癌幹細胞の増殖抑制効果を示す図である。図３の縦軸に抗ＣＤ４４抗体に結合されたＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を、横軸に抗ＣＤ２４抗体に結合されたＰＥ−Ｃｙ７−Ａの蛍光強度を、それぞれ対数で示した。なお、ＦＩＴＣ−Ａで示されるＣＤ４４陽性、且つＰＥ−Ｃｙ７−Ａで示されるＣＤ２４陰性の画分（図３中のＰ２のエリア）をＣＳＣと定義付けし、全細胞中に占めるＣＳＣの割合を数値で示した。図３の（ａ）は薬剤を投与していない対照群を、（ｂ）はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄを１０μＭ投与した群を、（ｃ）はＢＢＩ−６０８を１μＭ投与した群を、（ｄ）はＢＢＩ−６０８を１０μＭ投与した群を、それぞれ示している。
【０１０５】
図３の（ｂ）に示す、中皮腫の標準治療薬である抗腫瘍剤Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ投与群では、対照群と比べて全細胞中に占めるＣＳＣの割合が増加していることが認められる。これは、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄが治療抵抗性であるＣＳＣを死滅させることができなかったため、相対的に上記割合が増加したことによると考えられる。
【０１０６】
図３の（ｃ）及び（ｄ）に示す、ＢＢＩ−６０８投与群では、対照群と比べて全細胞中に占めるＣＳＣの割合が減少していることが認められ、さらに最終濃度が１０μＭの場合、ＣＳＣ抑制効果が非常に大きく、ＣＳＣがほぼ死滅したことが認められた。
【０１０７】
〔参考例３：胸膜中皮腫に対するＳｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）のＳｔａｔ３リン酸化抑制効果〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう調製し、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μｌずつ加え（すなわち、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を開始した。
【０１０８】
２４時間培養後、１０μｌのＢＢＩ−６０８を、最終濃度が図４に示す濃度となるように上記各ｗｅｌｌに添加し、培養器で培養した。培養開始から７２時間後、ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ  ＥＬＩＳ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって、リン酸化Ｓｔａｔ３の量を評価した。なお、具体的な測定方法は、試薬又は測定装置に添付されているそれぞれのプロトコールに従えばよい。
【０１０９】
結果を図４にグラフとして示した。図４は、胸膜中皮腫に対するＳｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）のＳｔａｔ３リン酸化抑制効果を示す図である。図４において、縦軸に４５０ｎｍにおける吸光度実測値を、横軸にＢＢＩ−６０８の濃度を、それぞれ示した。
【０１１０】
図４より、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が１０μＭ以上の場合、Ｓｔａｔ３のリン酸化が抑制されていることが認められた。Ｓｔａｔ３のリン酸化が抑制されることによって、それ以降のＳｔａｔ３の二量化及び核への移行を抑制することができる。よって、この結果から、ＢＢＩ−６０８は中皮腫の治療に有効であると言え、癌幹細胞の存在が認められる各種の癌の治療に有効であると言える。
【０１１１】
〔実施例１：マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍に対するＳｔａｔ３阻害剤（Ｓｔａｔｔｉｃ、ＢＢＩ−６０８）と放射線治療との併用効果〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製し、１群５匹を４群、合計２０匹のヌードマウス（日本クレア株式会社より購入、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ、メス４週齢）の皮下に、１匹あたり１００μｌ（すなわち、５×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）接種した。皮下腫瘍の体積が１００ｍｍ３を超えた時点から、各Ｓｔａｔ３阻害剤を、Ｓｔａｔｔｉｃについては２０ｍｇ／ｋｇとなるように、又はＢＢＩ−６０８については１０ｍｇ／ｋｇとなるように、それぞれ、連日経口投与した。
【０１１２】
また、放射線治療は、日立メディコ社製、Ｘ線照射装置ＭＢＲ１５２０Ｒを使用して、ヌードマウスに細胞浮遊液を接種した初日から５日間、１日あたり線量３ＧｙのＸ線を皮下腫瘍に照射し、皮下腫瘍の大きさを計測した。
【０１１３】
結果を図５及び図６にグラフとして示した。図５は、マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍に対する、Ｓｔａｔｔｉｃと放射線治療との併用効果を示す図である。図６は、マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍に対する、ＢＢＩ−６０８と放射線治療との併用効果を示す図である。結果は、１群５匹のマウスで得られた結果の平均値として示した。
【０１１４】
図５及び図６において、グラフの縦軸に皮下腫瘍の体積（ｍｍ３）を、横軸に各Ｓｔａｔ３阻害剤投与開始からの日数を、それぞれ示した。
【０１１５】
図５及び図６に示すように、Ｓｔａｔｔｉｃ及びＢＢＩ−６０８のどちらのＳｔａｔ３阻害剤とも、放射線照射を併用した場合、皮下腫瘍増殖抑制効果が最も大きくなることが認められ、単なる相加的効果ではなく相乗的な皮下腫瘍増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。また、図５に示すＳｔａｔｔｉｃ投与群よりも、図６に示すＢＢＩ−６０８投与群の方が、放射線照射を併用した場合、皮下腫瘍増殖抑制効果の方が大きいことが認められた。
【０１１６】
〔参考例４：ＢＢＩ−６０８によるＳｔａｔ３のリン酸化阻害効果〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製し、４ｗｅｌｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（Ｎｕｎｃ社製）に１ｗｅｌｌあたり１ｍｌ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。４８時間培養後、希釈したＢＢＩ−６０８を１００μｌ、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が５μＭとなるよう上記Ｓｌｉｄｅに添加した。
【０１１７】
培養器中で２時間反応させた後に、培養液を除去した上記Ｓｌｉｄｅに、緩衝液（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳＴ）で希釈した４％ホルムアルデヒドを細胞が２〜３ｍｍ浸る程度加えて、室温で１５分間反応させ、細胞を固定した。
【０１１８】
固定後、４％ホルムアルデヒド溶液を吸引除去し、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間、３回洗浄した後、上記Ｓｌｉｄｅを氷冷した１００％メタノールで覆い、−２０℃、１０分間反応させた。その後、メタノールを除去し、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間洗浄した後、ブロッキングバッファーを用いて、室温で６０分間反応させ、ブロッキングを行った。
【０１１９】
続いて、上記Ｓｌｉｄｅからブロッキングバッファーを吸引除去し、ＴＢＳＴで希釈した一次抗体（抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰＲラビットモノクローナル抗体；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃９１４５、５０倍希釈液）を、上記Ｓｌｉｄｅに添加し、４℃で、一晩反応させた。次に、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間、３回洗浄した後、ＴＢＳＴで希釈した、蛍光標識二次抗体（抗ラビットＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃４４１２、５００倍希釈液）を、室温、且つ暗室内で１〜２時間反応させた。
【０１２０】
ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間、３回洗浄した後、上記Ｓｌｉｄｅ上の細胞に、核染色剤を含んだ蛍光退色防止剤（ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃８９６１）を添加し、カバースリップで覆った。
【０１２１】
蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡（ツアイス社製、ＬＳＭ７８０）を使用して観察した。なお、具体的な観察方法は、蛍光顕微鏡に添付されているプロトコールに従えばよい。
【０１２２】
図７は、ＢＢＩ−６０８によるＳｔａｔ３のリン酸化阻害効果を、倍率４０倍で観察した結果を示す図である。図７の（ａ）は対照群の結果を、図７の（ｂ）はＢＢＩ−６０８投与群の結果を、それぞれ示している。図７において、１は核を、２は細胞質を示している。
【０１２３】
図７の（ａ）に示す対照群では、細胞質２にリン酸化Ｓｔａｔ３が認められた。リン酸化Ｓｔａｔ３は、ＤＡＰＩによって黄色に染色される。さらに、核１においてもリン酸化Ｓｔａｔ３が認められた。核はＤＡＰＩによって青色に染色されるが、核内のリン酸化Ｓｔａｔ３は緑色に染色される。
【０１２４】
以上のように、対照群では、細胞質に生じたリン酸化Ｓｔａｔ３が二量体を形成して核内に移行したことが分かる。核内に移行したリン酸化Ｓｔａｔ３は、遺伝子の転写を促進して細胞増殖を起こす。
【０１２５】
一方、図７の（ｂ）に示すＢＢＩ−６０８投与群では、細胞質２にリン酸化Ｓｔａｔ３は認められず、核１は青色として観察されており、核内に移行したＳｔａｔ３は認められなかった。つまり、ＢＢＩ−６０８投与群では、ＢＢＩ−６０８によってＳｔａｔ３のリン酸化が阻害されたため、リン酸化Ｓｔａｔ３の核内への移行が生じなかったと言える。それゆえ、ＢＢＩ−６０８投与群ではＮＣＩ−Ｈ２２６の増殖は阻害されると言える。
【０１２６】
〔実施例２：ＢＢＩ−６０８及び放射線照射によるＳｔａｔ３のリン酸化阻害効果と核の変化〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製し、４ｗｅｌｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（Ｎｕｎｃ社製）に１ｗｅｌｌあたり１ｍｌ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。４８時間培養後、希釈したＢＢＩ−６０８を１００μｌ、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が５μＭとなるよう上記Ｓｌｉｄｅに添加した。
【０１２７】
培養器中で２時間反応させた後に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製、ＭＢＲ１５２０Ｒ）を用いて、２Ｇｙ又は５Ｇｙの放射線（Ｘ線）を細胞に照射した。放射線の照射後、培養液を吸引除去した上記Ｓｌｉｄｅに、緩衝液（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳＴ）で希釈した４％ホルムアルデヒドを加えて、室温で１５分間反応させ、細胞を固定した。
【０１２８】
固定後、４％ホルムアルデヒド溶液を吸引除去し、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間、３回洗浄した後、上記Ｓｌｉｄｅを氷冷した１００％メタノールで覆い、−２０℃、１０分間反応させた。その後、上記Ｓｌｉｄｅからメタノールを除去し、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間洗浄した後、ブロッキングバッファーを上記Ｓｌｉｄｅに添加し、室温で６０分間反応させ、ブロッキングを行った。
【０１２９】
続いて、上記Ｓｌｉｄｅからブロッキングバッファーを吸引除去し、ＴＢＳＴで希釈した一次抗体（抗β−Ａｃｔｉｎ（８Ｈ１０Ｄ１０）マウスモノクローナル抗体；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃３７００、６０００倍希釈液、及び抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰＲラビットモノクローナル抗体；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃９１４５、５０倍希釈液）を、上記Ｓｌｉｄｅに添加し４℃で、一晩反応させた。次に、ＴＢＳＴで各Ｗｅｌｌを５分間、３回洗浄した後、抗体希釈バッファーで希釈した、蛍光標識二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃４４０９、５００倍希釈液、及び抗ラビットＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃４４１２、５００倍希釈液）を上記Ｓｌｉｄｅに添加し、室温、且つ暗室内で１〜２時間反応させた。
【０１３０】
上記Ｓｌｉｄｅ上の細胞に、核染色剤を含んだ蛍光退色防止剤（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ＣＳＴ＃８９６１、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ）を添加し、カバースリップで覆った。
【０１３１】
蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡（ツアイス社製、ＬＳＭ７８０）を使用して観察した。なお、具体的な観察方法は、蛍光顕微鏡に添付されているプロトコールに従えばよい。
【０１３２】
図８は、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭであり、放射線を照射しなかったＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【０１３３】
図９は、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭ又は５μＭであり、２Ｇｙの放射線を照射したＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【０１３４】
図１０は、ＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭ又は５μＭであり、５Ｇｙの放射線を照射したＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を蛍光顕微鏡によって倍率４０倍で観察した結果を示す図である。
【０１３５】
図８、図９の（ａ）及び図１０の（ａ）はＢＢＩ−６０８の最終濃度が０μＭの場合の結果を示し、図９の（ｂ）及び図１０の（ｂ）はＢＢＩ−６０８の最終濃度が５μＭの場合の結果を示す。また、１は核を、２は細胞質を示している。
【０１３６】
図８に示す対照群では、図７の（ａ）と同様に、細胞質２及び核１内に、共にリン酸化Ｓｔａｔ３が認められた。つまり、リン酸化Ｓｔａｔ３が核内に移行していた。
【０１３７】
図９の（ａ）に示すように、薬剤を非投与で且つ線量２Ｇｙの放射線を照射した細胞群では、核１内に移行した、緑色に染色されたリン酸化Ｓｔａｔ３が認められた。しかし、図９の（ｂ）に示す、ＢＢＩ−６０８を投与し、且つ線量２Ｇｙの放射線を照射した細胞群では、核１内にリン酸化Ｓｔａｔ３は認められず、青色に染色された核のみが観察され、細胞質にもリン酸化Ｓｔａｔ３は認められなかった。
【０１３８】
図１０の（ａ）に示すように、薬剤を非投与で且つ線量５Ｇｙの放射線を照射した細胞群では、図９の（ａ）と同様に核内にリン酸化Ｓｔａｔ３が認められた。しかし、図１０の（ｂ）に示す、ＢＢＩ−６０８を投与し、且つ線量５Ｇｙの放射線を照射した細胞群では、図９の（ｂ）と同様に、細胞質及び核内に、共にリン酸化Ｓｔａｔ３が認められなかった。なお、図１０の（ａ）及び（ｂ）に示す、線量５Ｇｙの放射線を照射した細胞群では、いくつかの核が凝集していることが観察された。
【０１３９】
〔参考例５：ＢＢＩ−６０８によるアポトーシス誘導効果〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう調製し、６ｃｍ  ｄｉｓｈに５．０ｍｌずつ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。４８時間培養後、ＢＢＩ−６０８を最終濃度が５μＭとなるように上記ｄｉｓｈに添加し、培養器中で、０，１，２，４，６，１２又は２４時間作用させた後、それぞれの細胞群から、タンパク質を抽出した。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ又はＢａｋの各発現量を、ウェスタンブロット法を用いて評価した。
【０１４０】
結果を図１１に示した。図１１は、ＢＢＩ−６０８による胸膜中皮腫細胞へのアポトーシス誘導効果を示す図である。図１１より、ＢＢＩ−６０８の投与から１２時間後に、アンチアポトーシスとして知られるＢｃｌ−２は消失した。また、ＢＢＩ−６０８の投与から１２時間後に、アンチアポトーシスとして知られているＢｃｌ−ｘＬが失活したことが確認された。
【０１４１】
一方、ＢＢＩ−６０８の投与から１２時間後又は２４時間後に、アポトーシスを誘導するタンパク質として知られているＢａｘ及びＢａｋが活性化した。
【０１４２】
〔参考例６：ＢＢＩ−６０８又はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ（ＰＥＭ）による細胞内活性酸素（ＲＯＳ）の産生〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう調製し、６ｃｍ  ｄｉｓｈに５．０ｍｌずつ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。３日間培養後、Ｓｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）又は抗腫瘍剤（ＰＥＭ）を最終濃度が１０μＭとなるように上記ｄｉｓｈに投与し、培養機中で２時間作用させた。
【０１４３】
２時間後、ＲＯＳ試薬（ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製、＃Ｃ１０４４４）を上記ｄｉｓｈに添加し、培養器中、３７℃で３０分間反応させた。当該ＲＯＳ試薬によって、細胞内のＲＯＳの量に比例して、ＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度が増加するため、フローサイトメトリーでＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を測定することにより、細胞内のＲＯＳの量を判定することができる。３０分間反応後、１×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう細胞浮遊液を調製し、フローサイトメトリーでＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を測定した。なお、具体的な測定方法は、試薬又は測定装置に添付されているそれぞれのプロトコールに従えばよい。
【０１４４】
結果を図１２に示した。図１２は、ＢＢＩ−６０８又はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄを投与した細胞内におけるＲＯＳの産生をフローサイトメトリーによって測定した結果を示す図である。図１２において、縦軸に細胞数を、横軸に、ＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を対数で、それぞれ示した。図１２の（ａ）はＳｔａｔ３阻害剤（ＢＢＩ−６０８）を用いた結果を、図１２の（ｂ）は抗腫瘍剤（ＰＥＭ）を用いた結果を、それぞれ示している。
【０１４５】
図１２の（ｂ）に示すように、中皮腫の標準治療薬であるＰＥＭを投与した細胞群では、対照群と比較して、細胞内のＲＯＳの量は増加した。一方、図１２の（ａ）に示すように、Ｓｔａｔ３阻害剤であるＢＢＩ−６０８を投与した細胞群では、ＰＥＭを投与した細胞群以上に、細胞内のＲＯＳが増加した。
【０１４６】
〔実施例３：ＢＢＩ−６０８、放射線照射及び還元剤（ビタミンＣ）を用いた場合の細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）産生について〕
ＮＣＩ−Ｈ２２６、又はＮＣＩ−Ｈ２０５２の細胞浮遊液を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう調製し、６ｃｍ  ｄｉｓｈに５．０ｍｌずつ加え、培養器中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【０１４７】
３日間培養後、薬剤として、上記ｄｉｓｈに、ビタミンＣ若しくはカタラーゼ、及び／又はＢＢＩ−６０８を投与し、培養器中で２時間作用させた。ビタミンＣの最終濃度は１ｍＭ、ＢＢＩ−６０８の最終濃度は５ｍＭ、カタラーゼの最終濃度は１５００Ｕ／ｍｌとした。なお、ビタミンＣとしてはシグマアルドリッチ社製の＃Ａ０２７８を用い、カタラーゼとしてはシグマアルドリッチ社製の＃Ｃ１３４５を用いた。
【０１４８】
２時間後、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製、ＭＢＲ１５２０Ｒ）を用いて、２Ｇｙ又は５Ｇｙの放射線（Ｘ線）を細胞に照射した。その後、参考例６で用いたのと同じＲＯＳ試薬を上記ｄｉｓｈに添加し、培養器中、３７℃で３０分間反応させた。３０分間反応後、１×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌとなるよう細胞浮遊液を調製し、フローサイトメトリーでＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を測定した。
【０１４９】
結果を図１３〜１６に示し、各図の縦軸に細胞数を、横軸に、ＦＩＴＣ−Ａの蛍光強度を対数で、それぞれ示した。各図中、「対照群」はＢＢＩ−６０８及び還元剤の投与を行わず、放射線照射も行わない群；「ビタミンＣ  １ｍＭ」は、最終濃度が１ｍＭとなるようにビタミンＣの投与のみを行った群；「照射２Ｇｙ」は、２Ｇｙの放射線照射のみを行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８の投与のみを行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ  照射２Ｇｙ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８を投与し、かつ、２Ｇｙの放射線照射を行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ  照射２Ｇｙ  ビタミンＣ  １ｍＭ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８を投与し、最終濃度が１ｍＭとなるようにビタミンＣを投与し、かつ、２Ｇｙの放射線照射を行った群；「照射５Ｇｙ」は、５Ｇｙの放射線照射のみを行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ  照射５Ｇｙ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８を投与し、かつ、５Ｇｙの放射線照射を行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ  照射５Ｇｙ  ビタミンＣ  １ｍＭ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８を投与し、最終濃度が１ｍＭとなるようにビタミンＣを投与し、かつ、５Ｇｙの放射線照射を行った群；「カタラーゼ  １５００Ｕ／ｍｌ」は、最終濃度が１５００Ｕ／ｍｌとなるようにカタラーゼの投与のみを行った群；「ＢＢＩ−６０８  ５μＭ  カタラーゼ  １５００Ｕ／ｍｌ」は、最終濃度が５μＭとなるようにＢＢＩ−６０８を投与し、かつ、最終濃度が１５００Ｕ／ｍｌとなるようにカタラーゼの投与を行った群；をそれぞれ意味する。
【０１５０】
図１３は、ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び２Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内におけるＲＯＳの産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。上述のように、ＮＣＩ−Ｈ２２６は上皮型の胸膜中皮腫細胞である。
【０１５１】
図１３の（ａ）に示すように、ビタミンＣ（１ｍＭ）の投与によって細胞内のＲＯＳ量は減少した。図１３の（ｂ）に示すように、放射線（２Ｇｙ）を照射した場合は、細胞内のＲＯＳ量は対照群とほぼ同等であった。また、図１３の（ｃ）に示すように、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）の投与によって細胞内のＲＯＳ量は増加し、放射線（２Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）との併用によって、細胞内のＲＯＳ量はさらに増加した。
【０１５２】
一方、図１３の（ｄ）に示すように、放射線（２Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）との併用下に、ビタミンＣ（１ｍＭ）を加えると、細胞内のＲＯＳ量は低下し、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）を単独投与した場合よりも少なくなった。
【０１５３】
図１４は、ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び５Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内におけるＲＯＳの産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【０１５４】
図１４の（ａ）に示すように、ビタミンＣ（１ｍＭ）を投与した場合、細胞内のＲＯＳ量は対照群とほぼ同等であった。図１４の（ｂ）に示すように、放射線（５Ｇｙ）を照射した場合、細胞内のＲＯＳ量は対照群と比較してわずかに増加した。また、図１４の（ｃ）に示すように、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）の投与によって細胞内のＲＯＳ量は増加した。放射線（５Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）とを併用した場合、細胞内のＲＯＳ量はさらに増加したが、放射線（２Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）とを併用した場合と同程度であった。
【０１５５】
一方、図１４の（ｄ）に示すように、放射線（５Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）との併用下に、ビタミンＣ（１ｍＭ）を加えると、細胞内のＲＯＳ量はＢＢＩ−６０８（５μＭ）を単独投与した場合と同程度まで低下した。
【０１５６】
このように、５Ｇｙという高線量の放射線を用いた場合であっても、還元剤を用いることによって、細胞内のＲＯＳ量を大幅に低減することができた。
【０１５７】
図１７に示すＩＭＲＴのように、病巣部に限定して高線量の放射線が照射される場合であっても、正常組織への被爆はさけられない。細胞内のＲＯＳ産生を原因とする正常組織における臓器障害、すなわち副作用を軽減するために、還元剤の投与は有効であると考えられる。一方で、ＲＯＳは腫瘍組織におけるアポトーシス促進因子としての側面も有しており、還元剤によって腫瘍組織における細胞内ＲＯＳ量が抑制されることは好ましくない。
【０１５８】
このように、正常組織において期待される一方で、腫瘍組織では望まれない、還元剤によるＲＯＳの抑制効果は、正常組織と腫瘍組織の血流分布差を利用することでもたらされ得る。
【０１５９】
具体的に、胸壁に限局した病巣に対するＩＭＲＴの照射を想定して説明する。
【０１６０】
図１７に示すように、胸壁に限局した病巣に対してＩＭＲＴの照射を行った際、正常肺への被爆が起こる。ＩＭＲＴに先立って、あらかじめ還元剤を点滴によって静脈から投与した場合、正常肺は血流が豊富で血液の流速が早いため、血中ビタミンＣは速やかに正常肺に送達され、正常肺における血中ビタミンＣの濃度は急速に高まり、その後血中ビタミンＣは尿としてすみやかに排泄される。
【０１６１】
一方、腫瘍組織は正常肺と比べて血流が悪いため、血中ビタミンＣの腫瘍組織への到達は正常肺と比べて遅い。この時間差を利用し、正常肺内でのビタミンＣ濃度が高く、かつ病巣である胸壁でのビタミンＣ濃度が上昇しない時間にＩＭＲＴを行う事で、正常肺への臓器障害を防げることが可能である。
【０１６２】
図１５は、ＢＢＩ−６０８、ビタミンＣ及び２Ｇｙの放射線を用いた場合の、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞内におけるＲＯＳの産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。上述のように、ＮＣＩ−Ｈ２０５２は肉腫型の胸膜中皮腫細胞である。
【０１６３】
図１５の（ａ）に示すように、ビタミンＣ（１ｍＭ）を投与した場合、細胞内のＲＯＳ量は対照群とほぼ同等であった。図１５の（ｂ）に示すように、放射線（２Ｇｙ）を照射した場合、細胞内のＲＯＳ量は対照群と比較して増加した。また、図１５の（ｃ）に示すように、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）の投与によって細胞内のＲＯＳ量は、対照群の１０倍程度に増加した。放射線（２Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）とを併用した場合、細胞内のＲＯＳ量はさらに増加し、対照群の２０倍程度となった。
【０１６４】
一方、図１５の（ｄ）に示すように、放射線（２Ｇｙ）とＢＢＩ−６０８（５μＭ）との併用下に、ビタミンＣ（１ｍＭ）を加えると、細胞内のＲＯＳ量は、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）を単独投与した場合よりも少なくなった。
【０１６５】
図１６は、還元剤として、ビタミンＣの代わりにカタラーゼを用い、ＢＢＩ−６０８（５μＭ）と併用して、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞内におけるＲＯＳの産生を測定し、対照と比較した結果を示す図である。
【０１６６】
図１６の（ａ）、（ｂ）に示すように、カタラーゼの投与又はＢＢＩ−６０８（５μＭ）の投与によって細胞内のＲＯＳ量は若干増加した。図１３〜１５に示したように、ビタミンＣは、細胞内のＲＯＳ量を低下させることができていたが、図１６の（ｃ）に示すように、カタラーゼをＢＢＩ−６０８と併用した場合、細胞内のＲＯＳ量を低下させることはできなかった。これは、水溶性のビタミンＣとは異なり、カタラーゼは細胞内に移行できないためである。
【０１６７】
上述したように、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線とを併用することによって、Ｓｔａｔ３経路阻害剤を単独投与した場合、及び、放射線照射のみを行った場合よりも、マウスの胸膜中皮腫の皮下腫瘍の体積を大幅に減少させることができる（図５，６）。つまり、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線との併用によって相乗的な抗腫瘍効果が得られると言える。
【０１６８】
一方、図１３〜１５に示すように、上記併用によって細胞内のＲＯＳ量は増加する。活性酸素はＤＮＡ及び細胞膜に損傷を与えるため、癌細胞を死滅させる上では有効であるが、正常な臓器に対しても損傷等の悪影響を与え得る。それゆえ、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線とを併用する場合、ＲＯＳの増加に伴う正常臓器損傷等の副作用の発生が懸念されるため、ＲＯＳの過剰な増加を回避する必要がある。
【０１６９】
今回、図１３〜１５の（ｄ）に示すように、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線とを併用する場合に、さらにビタミンＣを併用することによって、細胞内のＲＯＳを大幅に低下させることができた。したがって、本発明は、Ｓｔａｔ３経路阻害剤と放射線との併用によって相乗的な抗腫瘍効果を奏すると共に、ＲＯＳの増加に伴う正常臓器損傷等の副作用の発生リスクを大幅に低下させることができると言える。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明は、中皮腫を初めとする各種の癌の治療に有効に用いることができる。それゆえ、本発明は、医療に関連する分野において広く利用することができる。
【符号の説明】
【０１７１】
１  ・・・核
２  ・・・細胞質
３  ・・・胸膜中皮腫患者の肺において低線量の放射線を照射した部位
４  ・・・胸膜中皮腫患者の肺において高線量の放射線を照射した部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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