(57)【要約】【課題】圧電振動子の周波数変化に基づいて試料液中の感知対象物を感知するにあたって、測定精度を高める技術を提供すること。【解決手段】ビオチン化抗体１０１を含む液と、試料液と、増感粒子結合抗体１０２を含む液と、予め混合して測定液としている。吸着層４７の表面に固定された抗体１１１により抗原１００を捕捉させようとすると、抗体１１１は吸着層４７の表面付近を通過する抗原１００しか捕捉できないため結合率が低い。これに対して、ビオチン化抗体１０１を含む液と、試料液と、増感粒子結合抗体１０２を含む液と、を混合することにより、抗原１００とビオチン化抗体１０１の抗体１１１の部位とが接触しやすくなるため、抗原１００をより確実にビオチン化抗体１０１と結合させることができる。【選択図】図１０
2017156159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にアンカー物質が設けられた吸着層を圧電振動子の電極表面に形成してなる感知センサと、前記圧電振動子を発振させる発振回路と、前記発振回路の発振周波数を測定する測定部と、を用い、
感知対象物の対応する部位に吸着する性質を有する物質に前記アンカー物質と特異的に結合するターゲットを結合させたターゲット結合物質を含む液と、感知対象となる試料液と、を混合して感知対象物とターゲット結合物質とを結合させた測定液を得る工程と、
前記ターゲット結合物質を含む液からなる参照液を前記感知センサに供給してターゲット結合物質を吸着層に結合させて発振周波数の測定を行い、吸着層に吸着したターゲット結合物質の量に相当するブランク周波数を求める工程と、
前記感知センサに測定液を供給して、ターゲット結合物質と感知対象物とを吸着層に吸着させて発振周波数の測定を行い、吸着層に吸着したターゲット結合物質と感知対象物との量に相当する検出周波数を求める工程と、
前記検出周波数と前記ブランク周波数との差分値に基づいて、吸着層に吸着した感知対象物を検出する工程と、を含むことを特徴とする感知方法。
【請求項２】
前記アンカー物質は、アビジンであり、前記ターゲットは、ビオチンであることを特徴とする請求項１記載の感知方法。
【請求項３】
前記参照液を供給する感知センサと、前記測定液を供給する感知センサと、が異なることを特徴とする請求項１または２に記載の感知方法。
【請求項４】
前記測定液及び前記参照液は、各々前記感知対象物よりも粒子径が大きくかつ前記感知対象物に対応する部位に吸着する性質を有する粒子を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の感知方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧電振動子を用いて感知対象物を感知する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床分野において、例えば血糖値の自己モニタリングやインフルエンザウイルス検査等に代表されるＰＯＣＴ（Point of care testing）と呼ばれる簡便な検査方法が普及しており、この検査において、特許文献１に記載されているようなＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）を利用した手法が知られている。ＱＣＭについて簡単に説明すると、感知装置に設けられた水晶振動子の表面に試料液中の感知対象物が吸着され、感知対象物の吸着量に応じた質量付加効果により水晶振動子の発振周波数が変化する。当該発振周波数の変化に基づいて、試料液中の感知対象物の検出又は定量が行われる。
【０００３】
感知対象物を水晶振動子に吸着するにあたって、電極表面に例えば抗体で構成される吸着層を設け、感知対象物を含む試料液を電極表面に流すことにより、抗原抗体反応により感知対象物となる抗原を吸着層に吸着させている。しかしながら電極表面に固定された抗体と、電極表面を流れる液体に含まれる抗原とは、接触頻度が低いため、吸着効率が低い問題があった。
また従来は、抗原に対応した抗体を設ける必要があり、感知対象物に対応した感知センサを用意する必要があった。
【０００４】
特許文献２には、圧電材料の表面に設けられたアビジンにビオチン化抗体を結合させ、前記ビオチン化抗体に分析物を捕捉させるバイオセンサーが記載されている。しかしながらビオチン化抗体をアビジンに固定した後、分析物を含む試料液を通流させることで分析物を捕捉させており、本発明の課題を解決するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１４７５５６号公報
【特許文献２】特表２０１４−５２５５６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような事情の下になされたものであり、その目的は、圧電振動子の周波数変化に基づいて試料液中の感知対象物を感知するにあたって、測定精度を高める技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の感知方法は、表面にアンカー物質が設けられた吸着層を圧電振動子の電極表面に形成してなる感知センサと、前記圧電振動子を発振させる発振回路と、前記発振回路の発振周波数を測定する測定部と、を用い、
感知対象物の対応する部位に吸着する性質を有する物質に前記アンカー物質と特異的に結合するターゲットを結合させたターゲット結合物質を含む液と、感知対象となる試料液と、を混合して感知対象物とターゲット結合物質とを結合させた測定液を得る工程と、
前記ターゲット結合物質を含む液からなる参照液を前記感知センサに供給してターゲット結合物質を吸着層に結合させて発振周波数の測定を行い、吸着層に吸着したターゲット結合物質の量に相当するブランク周波数を求める工程と、
前記感知センサに測定液を供給して、ターゲット結合物質と感知対象物とを吸着層に吸着させて発振周波数の測定を行い、吸着層に吸着したターゲット結合物質と感知対象物との量に相当する検出周波数を求める工程と、
前記検出周波数と前記ブランク周波数との差分値に基づいて、吸着層に吸着した感知対象物を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、ターゲット結合物質を含む液と、感知対象物を含む試料液と、を混合して感知対象物とターゲット結合物質とを結合させた測定液としている。そして表面にアンカー物質が設けられた吸着層を圧電振動子の電極表面に形成した感知センサに測定液を供給し、ターゲットとアンカー物質と結合させて、ターゲット結合物質と、感知対象物と、を吸着層に吸着させて検出周波数を測定している。また感知対象物と結合していないターゲット結合物質を吸着層に吸着させてブランク周波数を測定している。そして検出周波数とブランク周波数との差分より感知対象物を検出している。予め感知対象物とターゲット結合物質とを液と液との混合により結合させるため結合効率が高いため、感知対象物が吸着層に吸着する効率が高くなり、測定精度が高くなる。
また感知対象物に対応した、ターゲット結合物質を用いることで、感知対象物とターゲット結合物質とを結合させて、感知対象物を吸着層に吸着させることができるため、一種の感知センサで複数種の感知対象物を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施の形態に係る感知装置の斜視図である。
【図２】感知センサの分解斜視図である。
【図３】感知センサの各部の上面側を示した分解斜視図である。
【図４】水晶振動子の表面側及び裏面側の平面図である。
【図５】吸着層の表面構造を示す断面図である。
【図６】感知センサの一部の下面側を示した分解斜視図である。
【図７】感知センサの断面図である。
【図８】感知装置の本体部の概略構成図である。
【図９】感知装置における水晶発振回路の構成を示すブロック図である。
【図１０】測定液を模式的に示した説明図である。
【図１１】参照液を模式的に示した説明図である。
【図１２】測定液及び参照液を供給したときの周波数の時間変化を示す特性図である。
【図１３】参照液を供給したときの吸着膜の表面を示す説明図である。
【図１４】測定液を供給したときの吸着膜の表面を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の形態に係る感知方法に用いる感知装置について説明する。この感知装置は、マイクロ流体チップを利用し、例えば人間の鼻腔の拭い液から得られた試料液中のウイルスなどの抗原の有無を検出し、人間のウイルスの感染の有無を判定することができるように構成されている。図１の外観斜視図に示すように、感知装置は本体部１２と、感知センサ２と、を備えている。本体部１２は、例えば、感知センサ２を接続するための複数の差込口１７を備えており、感知センサ２は、差込口１７に着脱自在に接続される。本体部１２の上面には、例えば液晶表示画面により構成される表示部１６が設けられており、表示部１６は例えば本体部１２内に設けられた後述する発振回路の出力周波数あるいは、周波数の変化分等の測定結果もしくは、ウイルスの検出の有無等を表示する。
【００１１】
続いて感知センサ２について説明する。感知センサ２は、図２、図３に示すように上側カバー体２１と下側ケース２２とで構成される容器２０を備えている。図３に示すように下側ケース２２の上方には、長さ方向に延伸された形状の配線基板３が設けられ、配線基板３における長さ方向の一端側には前述の本体部１２の差込口１７に差し込まれる差込部３１が形成されている。なお以降明細書中においては、感知センサ２の差込部３１側を前方とする。
【００１２】
また配線基板３の後方寄りの位置には貫通孔３２が形成されており、配線基板３は下側ケース２２の上方に、貫通孔３２が下側ケース２２の底面によって塞がれると共に、差込部３１が下側ケース２２の外側に突出するように配置される。貫通孔３２は、その下方が下側ケース２２の底面によって塞がれて凹部となる。更に配線基板３の後方側の端部には、厚さ方向に貫通する孔部３３が配線基板３の幅方向に２か所並べて形成されている。
配線基板３の表面側には、長さ方向に伸びる３本の配線２５〜２７が設けられており、各配線２５〜２７の一端側は、差込部３１において、夫々端子部２５２、２６２、２７２が形成されており、他端側は貫通孔３２の外縁にて、夫々端子部２５１、２６１及び２７１が形成されている。
【００１３】
図４（ａ）、（ｂ）に示すように水晶振動子４は、例えばＡＴカットの円板状の水晶片４１を備えており、図４（ａ）に示すように水晶片４１の表面側には、例えばＡｕ（金）により形成される励振電極４２Ａ、４２Ｂが互いに平行に伸びるように設けられている。励振電極４２Ａ、４２Ｂは、長さ方向一端側が接続され、接続された部分から水晶片４１の周縁部に向かって引き出し電極４４が伸ばされている。この引き出し電極４４は、水晶片４１の側面を引き回され、裏面の周縁部にて端子部４４ａが形成されている。図４（ｂ）に示すように水晶振動子４の裏面側には、例えばＡｕにより、励振電極４２Ａ、４２Ｂに対向するように夫々励振電極４３Ａ、４３Ｂが平行に伸びるように設けられている。励振電極４３Ａ、４３Ｂからは、夫々水晶片４１の周縁に向かって引き出し電極４５、４６が引き出されており、水晶片４１の周縁部にて夫々端子部４５ａ、４６ａが形成されている。
この水晶振動子４の共通電極４２における励振電極４２Ａと、励振電極４３Ａと、で挟まれた領域は、振動領域６１となる。また励振電極４２Ｂと、励振電極４３Ｂと、で挟まれた領域は、第２の振動領域６２となる。これらの第１及び第２の振動領域６１、６２は、互いに離間して設けられ、各々独立して振動する。
【００１４】
水晶振動子４の表側における励振電極４２Ａの表面には、図５に示すように、アンカー物質であるアビジン、例えばストレプトアビジン４０が設けられた吸着層４７が設けられている。また励振電極４２Ａに用いた金は、吸着性が強く、表面を流した試料液に含まれる感知対象物や試料液に溶解している分子などを吸着してしまうため、ストレプトアビジン４０の粒子の隙間は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）４９により埋められている。このため試料液が水晶振動子４の表面を流れたときに、試料液と、励振電極４２Ａが触れないようになっている。
さらに水晶振動子４の表面側に形成された励振電極４２Ｂ及び引き出し電極４４は、電極への感知対象物などの粒子の吸着を防ぐために、ＢＳＡ４９が塗布されたブロッキング層４８となっている。
図３に戻って、水晶振動子４は、裏面側の励振電極４３Ａ、４３Ｂが配線基板３の貫通孔３２に臨み、端子部４４ａ、４５ａ、４６ａが配線基板３上に設けられた夫々対応する端子部２６１、２５１、２７１に重なるように配置され、導電性接着剤により接着される。これにより水晶振動子４は、配線基板３に略水平な状態で固定される。
【００１５】
配線基板３の表面側における、後方側には、水晶振動子４の上方を覆うように流路形成部材５が積層される。流路形成部材５は、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で構成された板状の部材で構成される。流路形成部材５の後方寄りの位置には、流路形成部材５の位置合わせをするための孔部５８が、配線基板３に形成された孔部３３と対応する位置に、流路形成部材５を厚さ方向に貫通するように設けられている。
【００１６】
図６に示すように流路形成部材５の下面側には、水晶振動子４が収まるように概略円形の窪み５４が形成されている。また流路形成部材５の下面側には、配線基板３に形成された各配線２５〜２７が収まり、窪み５４に夫々連通した溝２５３、２６３、２７３が形成されている。窪み５４には、流路形成部材５が配線基板３側に押圧されたときに水晶振動子４の表面との間に試料液の供給流路５７を区画形成する囲み部５１が設けられている。この囲み部５１は、感知センサ２の前後方向にその長さ方向が向くように、その外縁が小判型に形成された環状の突出部により構成されている。囲み部５１は、窪み５４から３００μｍの厚さに突出するように構成され、囲み部５１の内側の領域は、窪み５４と同じ高さの平面になっている。流路形成部材５には、供給流路５７の前端と後端とに夫々開口し、流路形成部材５を厚さ方向に貫通する貫通孔５２、５３が穿設されている。
【００１７】
流路形成部材５は、孔部５８が配線基板３に設けられた孔部３３と揃うように配置される。この時囲み部５１が水晶振動子４の上面に配置され、供給流路５７の下面側が水晶振動子４により塞がれる。この時励振電極が４２Ａ、４２Ｂが供給流路５７の中心に並んで収まる。従って図４（ａ）に示すように第１及び第２の振動領域６１、６２が貫通孔５２から貫通孔５３に向かう方向に対して、左右に並ぶように配置される。またこの囲み部５１と水晶振動子４とに囲まれた領域は、底面が水晶振動子４により構成され、天上面と底面が平行に伸びる深さ３００μｍの供給流路５７を形成する。
【００１８】
また図３に示すように前記貫通孔５２、５３には、夫々多孔質の部材で構成された入口側毛細管部材５５と出口側毛細管部材５６が着脱自在に設けられている。
入口側毛細管部材５５は、例えば円柱状の部材であり、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの化学繊維束により構成されている。入口側毛細管部材５５は、貫通孔５２を塞ぐように配置され、その上端が後述する上側カバー体２１に形成された注入口２３に露出し、下端が供給流路５７内に進入するように設けられている。出口側毛細管部材５６も同様にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの化学繊維束により構成され、上方に伸びた後、屈曲して水平に伸びるＬ字型に形成される。出口側毛細管部材５６は、貫通孔５３を塞ぎ、その下端が供給流路５７内に進入するように配置されている。更に出口側毛細管部材５６の下端は、前方側から後方側に向かって傾斜している。
【００１９】
出口側毛細管部材５６の他端側は、ガラス管で構成される廃液流路５９の一端側に挿入されている。廃液流路５９の他端側には、例えば廃液流路５９から流出する液体を吸引する毛細管シート７１と、毛細管シート７１で吸引された液体を吸収する吸収部材７２と、から構成される廃液吸収部７が接続されている。下側ケース２２には、廃液吸収部７を収納すると共に、吸収部材７２からの液漏れを防ぐためのケース体７３が設けられている。なお図３中の７５は廃液流路５９を支持する支持部材である。
【００２０】
図６に示すように上側カバー体２１の裏面側には、流路形成部材５を配線基板３に押圧するための押圧部９０が設けられている。押圧部９０は、例えば略箱形に構成され、上側カバー体２１を下側ケース２２に嵌合して互いに係止した時に、その下面にて流路形成部材５の上面全体を垂直下方に押圧して、囲み部５１を水晶振動子４に密着させる。また押圧部９０には、貫通孔５２に対応する位置に注入口２３に貫通する貫通孔９１が設けられている。
【００２１】
また押圧部９０には、貫通孔５３に対応する位置から後方側に向かって、廃液流路５９及び出口側毛細管部材５６の設置領域を確保するための切欠き９２が形成されている。さらに押圧部９０には、流路形成部材５及び配線基板３に夫々設けられた孔部５８、３３に挿入され、流路形成部材５及び配線基板３のずれを規制するための固定柱９３が設けられている。
図２、図３に示すように下側ケース体２２には、差込部３１を除いた配線基板３、水晶振動子４、入口側毛細管部材５５及び出口側毛細管部材５６が接続された流路形成部材５、廃液流路５９及び廃液吸収部７が収納され、上部カバー体２１は、下部ケース体２２の周囲を上方側から覆うように設けられる。
この感知センサ２では、図７に示すように注入口２３に供給された処理液は、注入口２３→入口側毛細管部材５５→供給流路５７→出口側毛細管部材５６→廃液流路５９→廃液吸収部７と続く一連の流路を毛細管現象により流れる。
【００２２】
続いて感知装置の全体構成について説明する。図８に示すように本体部１２は、発振回路部６と、データ処理部６６とを備えている。上記の感知センサ２の差込部３１が、本体部１２に形成された差込口１７に差し込まれると、差込部３１に形成された端子部２５２、２６２、２７２が本体部１２に、これらの端子部２５２、２６２、２７２と対応するように形成された図示しない接続端子部に電気的に接続される。そして差込口１７の後段には、スイッチ６０が設けられ、発振回路部６と電気的に接続される感知センサ２が切り替えられるように構成されている。
【００２３】
ここでは、一の感知センサ２Ａを発振回路部６に接続した例で説明する。図９に概略図で示すように、発振回路部６は、例えばコルピッツ回路で構成された第１の発振回路６３及び第２の発振回路６４を備えており、第１の発振回路６３は水晶振動子４における励振電極４２Ａと励振電極４３Ａとに挟まれた領域である第１の振動領域６１を、第２の発振回路６４は励振電極４２Ｂと励振電極４３Ｂとに挟まれた領域である第２の振動領域６２を夫々発振させるように構成されている。また励振電極４２Ａ及び励振電極４３Ａは発振時にアース電位となるように接続される。
【００２４】
第１及び第２の発振回路６３、６４の出力側は、スイッチ部６５と接続され、スイッチ部６５の後段にはデータ処理部６６が設けられる。データ処理部６６は、入力信号である周波数信号のディジタル処理を行い、第１の発振回路６３により出力される発振周波数「ｆ１」の時系列データと、第２の発振回路６４により出力される発振周波数「ｆ２」の時系列データと、を取得する。
【００２５】
本発明の感知装置では、スイッチ部６５により、データ処理部６６と第１の発振回路６３とを接続するチャンネル１と、データ処理部６６と第２の発振回路６４とを接続するチャンネル２とを交互に切り替えた間欠発振を行うことにより、感知センサ２の２つの振動領域６１、６２間の干渉を避け、安定した周波数信号を取得できるようにしている。そしてこれらの周波数信号は、例えば時分割されて、データ処理部６６に取り込まれる。データ処理部６６では、周波数信号を例えばディジタル値として算出し、算出されたディジタル値の時分割データに基づいて、演算処理を行い、例えば、抗原の有無などの演算結果を表示部１６に表示する。
【００２６】
続いて本発明の実施の形態の作用について説明する。まず予め図１０に示すように抗体１１１にアビジンのターゲットであるビオチン１１２を結合させたビオチン化抗体１０１を含む液と、感知対象物となる抗原１００を含む試料液と、増感粒子１１３と抗体１１１とを結合させた増感粒子結合抗体１０２を含む液と、を混合した測定液を準備する。なおこの時ビオチン化抗体１０１のモル数及び増感粒子結合抗体１０２のモル数が抗原１００のモル数よりも過剰となるように混合する。
【００２７】
これにより試料液に含まれる感知対象物、例えば抗原１００と、ビオチン化抗体１０１の抗体１１１の部位が抗原抗体反応により１：１の割合で結合する。また当該抗原１００には、増感粒子結合抗体１０２における抗体１１１の部位が抗原抗体反応により１：１の割合で結合する。従って、抗原１００と、ビオチン化抗体１０１と、増感粒子結合抗体１０２との複合体１１０となる。この時ビオチン化抗体１０１のモル数及び増感粒子結合抗体１０２のモル数を抗原１００のモル数よりも多くしているため、抗原１００がほぼ全て複合体１１０を構成したとすると、測定液中においては、複合体１１０と共に、過剰分のビオチン化抗体１０１と、増感粒子結合抗体１０２と、が個別に存在することになる。
【００２８】
また測定液から感知対象物となる抗原１００を含む試料液を除き、試料液と同量のリファレンス測定用の感知対象物を含まない液、例えば生理食塩水と、を混合して参照液を準備する。図１１に示すように参照液においては、抗原１００が含まれていないため、ビオチン化抗体１０１と増感粒子結合抗体１０２とが各々個別の分子として含まれることになる。
【００２９】
続いて感知装置により参照液及び測定液の測定を行うが、まず感知センサ２Ａ、及び２Ｂを差込口１７に接続する。以下明細書中では、第１の感知センサ２Ａ、第２の感知センサ２Ｂと記載する。また第１の感知センサ２Ａ及び第２の感知センサ２Ｂは同様に構成され、吸着層４７における吸着効率の差はないものとする。
【００３０】
次いでユーザーがスポイトにより第１の感知センサ２Ａ及び第２の感知センサ２Ｂの注入口２３に例えば生理食塩水などの緩衝液など供給する。これにより緩衝液が供給流路５７を満たし、水晶振動子４における供給流路５７側の面が液相に変わる。
続いて参照液及び測定液を夫々感知センサ２Ａ、２Ｂに供給して発振周波数の測定を行う。図１２は、測定液及び参照液を測定したときの第１の発振回路６３から出力される発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４から出力される発振周波数ｆ２との差分値（ｆ１−ｆ２）の時間変化を示す特性図である。時刻０においては、供給流路５７内は、緩衝液により満たされた状態となっている。
【００３１】
まずスイッチ６０を発振回路部６と第１の感知センサ２Ａとを接続するように切り替える。そして第１の発振回路６３及び第２の発振回路６４の発振を開始し、例えばデータ処理部６６にて第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２との差分値（ｆ１−ｆ２）を算出する。時刻０においては、供給流路５７が緩衝液により満たされており、励振電極４２Ａ、４２Ｂ等しく緩衝液による圧力がかかる。そのため第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２との差はないため、差分値（ｆ１−ｆ２）は０となる。
【００３２】
次いで図１２中の時刻０にて、第１の感知センサ２Ａの注入口２３に参照液を注入する。これにより第１の感知センサ２Ａにおける供給流路５７内に参照液が流れ込み、供給流路５７内が緩衝液から参照液に徐々に置換される。従って水晶振動子４の表面の励振電極４２Ａ、及び４２Ｂが参照液に接することになる。励振電極４２Ａの表面は、図５に示したようにＢＳＡ４９中にストレプトアビジン４０が露出した構成になっている。また励振電極４２Ｂの表面及び引き出し電極４４の表面は、ＢＳＡ４９のブロッキング層４８となっている。
【００３３】
参照液には、既述のようにビオチン化抗体１０１及び増感粒子結合抗体１０２が個別の分子として含まれている。ビオチン１１２は、ストレプトアビジン４０に対して（ビオチン：ストレプトアビジン＝１：４）で結合する性質がある。またＢＳＡ４９で覆われている部分は、ビオチン化抗体１０１や増感粒子結合抗体１０２などの分子が吸着しにくい性質がある。そのため図１３に示すように参照液に含まれるビオチン化抗体１０１におけるビオチン１１２の部位が、吸着層４７に露出しているストレプトアビジン４０に１：４で結合する。また増感粒子結合抗体１０２は、ストレプトアビジン４０に吸着する部位がないため、参照液中に残ることになる。さらに励振電極４２Ｂの表面は、ブロッキング層４８で覆われているためビオチン化抗体１０１及び増感粒子結合抗体１０２のいずれも吸着しない。なお記載の煩雑化を避けるため図１３、図１４では、ストレプトアビジン４０とビオチン１１２とが１：１で結合するように記載しているが、実際は、ストレプトアビジン４０には、ビオチン１１２の結合部位が４か所あり、１つのストレプトアビジン４０に対して、４つのビオチン１１２が結合する。
【００３４】
そのため緩衝液が参照液に置換されるに従い、励振電極４２Ａにおいて、ビオチン化抗体１０１が付着して重量が増加する。これにより第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１が低下する。これに対して励振電極４２Ｂには、ビオチン化抗体１０１及び増感粒子結合抗体１０２のいずれも吸着しないため第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２は変化しない。従って第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２の差分値（ｆ１−ｆ２）は、ビオチン化抗体１０１が付着した重量に相当する分、低下することになる。即ち絶対値が増大することになる。この参照液を第１の感知センサ２Ａを用いて測定したときの差分値（ｆ１−ｆ２）の絶対値がブランク周波数Ｆｒとなる。そして例えばデータ処理部６６にて算出されたブランク周波数Ｆｒが表示部１６に表示される。
【００３５】
続いてスイッチ６０を発振回路部６と第２の感知センサ２Ｂとを接続するように切り替える。そして第２の感知センサ２Ｂにおける注入口２３に測定液を注入する。
第２の感知センサ２Ｂも時刻０においては、供給流路５７が緩衝液により満たされており、励振電極４２Ａ、４２Ｂ等しく緩衝液による圧力がかかっているため、第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２との差はなく、差分値（ｆ１−ｆ２）は０となっている。
【００３６】
そして第２の感知センサ２Ｂにおける注入口２３に測定液を注入すると、供給流路５７内が緩衝液から測定液に徐々に置換され、やがて供給流路５７内を測定液が満たし、励振電極４２Ａ、４２Ｂが測定液に接することになる。既述のようにストレプトアビジン４０に対してビオチン１１２は、（ビオチン：ストレプトアビジン＝１：４）で結合する性質がある。測定液中には、ビオチン化抗体１０１と抗原１００と増感粒子結合抗体１０２とが、結合した複合体と、過剰分のビオチン化抗体１０１とが存在している。従って図１４に示すように励振電極４２Ａにおいて吸着層４７に露出しているストレプトアビジン４０には、ビオチン化抗体１０１と抗原１００と増感粒子結合抗体１０２との複合体１１０と、過剰分のビオチン化抗体１０１と、が結合することになる。
【００３７】
複合体１１０は、抗原１００のモル数に対応しているため、過剰分のビオチン化抗体１０１のモル数は、測定液に混合したビオチン化抗体１０１のモル数と抗原１００のモル数との差分値となっている。従って吸着層４７に吸着したビオチン化抗体１０１と複合体との合計数に対する複合体１１０の割合は（抗原１００のモル数）／（測定液に混合したビオチン化抗体１０１のモル数）となる。また励振電極４２Ｂの表面は、ブロッキング層４８で覆われているため、複合体１１０、ビオチン化抗体１０１及び増感粒子結合抗体１０２のいずれも吸着しない。
【００３８】
この結果第２の感知センサ２Ｂの供給流路５７が緩衝液から測定液に置換されるに従い、励振電極４２Ａにおいて、ビオチン化抗体１０１及び複合体１１０が付着して重量が増加する。これにより第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１が低下する。これに対して励振電極４２Ｂには、ビオチン化抗体１０１及び増感粒子結合抗体１０２のいずれも吸着しないため第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２は変化しない。
従って第１の発振回路６３の発振周波数ｆ１と第２の発振回路６４の発振周波数ｆ２の差分値（ｆ１−ｆ２）は、ビオチン化抗体１０１及び複合体１１０が付着した重量に相当する分、低下することになる。この測定液を第２の感知センサ２Ｂを用いて測定したときの差分値（ｆ１−ｆ２）の絶対値が検出周波数Ｆａとなる。そして例えばデータ処理部６６にて算出された検出周波数Ｆａが表示部１６に表示される。
【００３９】
続いてデータ処理部６６においては、測定液を第２の感知センサ２Ｂを用いて測定したときの差分値（ｆ１−ｆ２）の絶対値である検出周波数Ｆａと、参照液を第１の感知センサ２Ａを用いて測定したときの差分値（ｆ１−ｆ２）の絶対値であるブランク周波数Ｆｒと、の差分値である周波数変化量Ｆが算出される。
周波数変化量Ｆについて説明する。既述のようにブランク周波数Ｆｒは、第１の感知センサ２Ａにおいて吸着層４７に吸着したビオチン化抗体１０１の重量に相当する。また検出周波数Ｆａは、第２の感知センサ２Ｂにおいて吸着層４７に吸着したビオチン化抗体１０１及び複合体１１０の重量に相当する
【００４０】
第２の感知センサ２Ｂの励振電極４２Ａには、ビオチン化抗体１０１及び複合体１１０と、が吸着するが、測定液に含まれるビオチン化抗体１０１の濃度と、参照液に含まれるビオチン化抗体１０１の濃度とは同じである。そのため第１の感知センサ２Ａの吸着層４７に吸着した吸着物において、ビオチン化抗体１０１分の重さは、第２の感知センサ２Ｂの吸着層４７に吸着した吸着物に占めるビオチン化抗体１０１分の重さと等しくなる。
【００４１】
従って検出周波数Ｆａとブランク周波数Ｆｒとの差分値（Ｆａ−Ｆｒ）は、第２の感知センサ２Ｂの吸着層４７において、吸着物の複合体１１０を構成している抗原１００と増感粒子結合抗体１０２との重量分に相当することになる。複合体１１０を構成している抗原１００と増感粒子結合抗体１０２とは、図１０にて示したように１：１で結合する。従って差分値（Ｆａ−Ｆｒ）は、吸着物の複合体１１０を構成している抗原１００の数に比例することになる。また吸着層４７に吸着したビオチン化抗体１０１と複合体との合計数に対する複合体１１０の割合は、（抗原１００のモル数）／（測定液に混合したビオチン化抗体１０１のモル数）であるため、吸着物に含まれる抗原１００の数は、測定液中の抗原１００の濃度によって決定されることになる。従って周波数変化量である差分値（Ｆａ−Ｆｒ）は、試料液に含まれる抗原１００、即ち感知対象物の量に対応した値を示すことになる。
【００４２】
上述の実施の形態においては、ビオチン化抗体１０１を含む液と、試料液と、増感粒子結合抗体１０２を含む液と、予め混合して測定液としている。吸着層４７の表面に固定された抗体１１１により抗原１００を捕捉させようとすると、抗体１１１は吸着層４７の表面付近を通過する抗原１００しか捕捉できないため結合率が低く、捕捉率が低くなってしまう。そのため抗原１００の濃度が低い試料では、十分に吸着膜に吸着させることができないおそれがある。これに対して、ビオチン化抗体１０１を含む液と、試料液と、増感粒子結合抗体１０２を含む液と、を混合することにより、抗原１００とビオチン化抗体１０１の抗体１１１の部位とが接触しやすくなるため、抗原１００をより確実にビオチン化抗体１０１と結合させることができる。
【００４３】
その後ビオチン化抗体１０１、抗原１００及び増感粒子結合抗体１０２の複合体１１０におけるビオチン１１２の部位と、励振電極４２Ａに固定されたストレプトアビジン４０とを結合することになるが、ストレプトアビジン４０とビオチン１１２とは、親和性が高いため、抗原抗体反応と比べて結合しやすい。そのため固定されたストレプトアビジン４０の表面にビオチン１１２を含む液を通流させたときにも、効率よく結合させることができる。従って抗原１００を効率よく吸着層４７に吸着させることができる。そのため抗原１００の濃度が低い試料液であっても、抗原１００を確実に吸着膜４７に吸着させることができ測定精度がよくなる。
なお増感粒子結合抗体１０２は、抗原１００に特異的に結合させて、その重量を大きくし、抗原１００が吸着層４７に吸着したときの水晶振動子４の周波数の変化を大きくして検知しやすくするためのものである。そのため測定液には、増感粒子１１３を含む液を混合しなくてもよい。
【００４４】
また本発明は感知対象となる感知対象物に応じて、感知対象物と特異的に結合する物質を選択し、当該物質にターゲットとなる物質、例えばビオチン１１２を結合させてビオチン化物質を構成し、ビオチン化物質を含む液と、感知対象物を含む試料液と混合すればよい。従って、感知センサの吸着層４７の種類を変えることなく、複数の種類の感知対象物を測定対象することができる。また感知対象物と特異的に結合する物質は、ビオチン化することができればよいため、例えば核酸や糖などをビオチン化して用いてもよい。
【００４５】
さらに上述の実施の形態では、２つの感知センサ２Ａ，２Ｂを用い、夫々の感知センサ２Ａ、２Ｂにて参照液と、測定液とを測定しているが、１つの感知センサ２で参照液と測定液とを測定するようにしてもよい。例えば一の感知センサ２に参照液を通流させてブランク周波数の測定を行った後、リン酸緩衝液を注入口２３から注入して、吸着層４７の表面を洗い流す。その後測定液を注入口２３から注入して、検出周波数の測定を行う例が挙げられる。さらに感知センサ２の供給流路５７に試料液を通流させる送液手段を備えたフロータイプの感知装置であってもよい。
【実施例】
【００４６】
本発明の実施の形態に係る感知方法の効果を確認するために以下の試験を行った。  
実施例として実施の形態に示した感知装置を用い、実施の形態に示した手順に従って、測定液及び参照液を第１及び第２の感知センサ２Ａ、２Ｂに注入して、ブランク周波数Ｆｒ、検出周波数Ｆａ及び周波数変化量（Ｆａ−Ｆｒ）を算出した。なお試料液としては、２０ｎｇ／ｍｌの抗原を含む試料液を用いた。
比較例として、励振電極４２Ａの表面に設けたストレプトアビジン４０にビオチン化抗体１０１を結合させて、吸着層とし、参照液及び測定液からビオチン化抗体１０１を含む液を除いたこととを除いて実施例を同様にブランク周波数Ｆｒ、検出周波数Ｆａ及び周波数変化量（Ｆａ−Ｆｒ）の算出を行った。
【００４７】
表１はこの結果を示し、実施例及び比較例の各々の参照液における第１の振動領域６１と第２の振動領域６２との周波数差（ブランク周波数）、測定液における第１の振動領域６１と第２の振動領域６２との周波数差（検出周波数）、試料液を測定したときの検出周波数及び参照液を測定したときのブランク周波数、定液を測定したときの周波数との差分値（周波数変化量）とを示す。
【００４８】
【表１】
2017156159.tif 000003
【００４９】
比較例では、ブランク周波数Ｆｒは、−０．８Ｈｚ、検出周波数Ｆａは、３２．８Ｈｚであり、差分値（Ｆａ−Ｆｒ）は、３３．６Ｈｚであった。実施例においては、ブランク周波数Ｆｒは２２２．０Ｈｚ、検出周波数Ｆａは、３００．８Ｈｚであり、差分値（Ｆａ−Ｆｒ）は、７８．８Ｈｚであった。従って抗原１００を含む試料液とビオチン化抗体１０１を含む液とを混合して、感知センサ２に供給することで、周波数変化量が２．３倍程度大きくなり検出感度がよくなるといえる。従って本発明の実施の形態に係る感知方法を用いることにより大きな効果を得ることができるといえる。
【符号の説明】
【００５０】
２                感知センサ
４                水晶振動子
１２              本体部
４０              ストレプトアビジン
４２Ａ、４２Ｂ、４３Ａ、４３Ｂ
励振電極
４７              吸着層
４８              ブロッキング層
５７              供給流路
６４              第１の発振回路
６５              第２の発振回路
１００            抗原
１０１            ビオチン化抗体
１０２            増感粒子結合抗体
１１０            複合体
１１２            ビオチン
【図１】
2017156159.tif 000004
【図２】
2017156159.tif 000005
【図３】
2017156159.tif 000006
【図４】
2017156159.tif 000007
【図５】
2017156159.tif 000008
【図６】
2017156159.tif 000009
【図７】
2017156159.tif 000010
【図８】
2017156159.tif 000011
【図９】
2017156159.tif 000012
【図１０】
2017156159.tif 000013
【図１１】
2017156159.tif 000014
【図１２】
2017156159.tif 000015
【図１３】
2017156159.tif 000016
【図１４】
2017156159.tif 000017