(57)【要約】【課題】DNAメチル化パターンに基づいた免疫状態の解析法、前記免疫状態からサンプル提供者の疾患リスクを判定する方法、及び該方法に用いるキットを提供すること。【解決手段】被検者に由来する試料において、特定の遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定し、その測定値を基準値と対比して、免疫状態を評価することを特徴とする免疫状態解析法、該免疫状態からサンプル提供者の疾患リスクを判定する方法、及び該方法に用いるキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者に由来する試料において、表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定し、その測定値を基準値と対比して、免疫状態を評価することを特徴とする、免疫状態解析法。
【請求項２】
試料が血液試料、生検試料、及び手術試料から選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被検者に由来する試料において、表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定し、その測定値を基準値と対比して、免疫状態が亢進又は抑制した疾患の存在の指標とする、免疫疾患のリスクの判定方法。
【請求項４】
表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定するための道具を含有してなる、免疫状態を解析するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫状態解析法に関する。さらに詳しくは、エピジェネティックスに基づいた免疫状態解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における免疫状態のモニターには、現在、マーカータンパク質の定量、特定細胞集団の細胞数カウント、血中サイトカイン量の測定などの手法が用いられている。これらの手法は、一時的な免疫反応を評価する場合には有用であるが、長期にわたる免疫恒常性の評価や免疫バランスの状態把握には不十分である。
【０００３】
免疫恒常性の評価や免疫バランスの状態把握には、通常のT細胞(Tconv細胞)と免疫抑制機能をもつ制御性T細胞(Treg細胞)との構成比率評価、及びそれぞれの細胞群について活性化状態と非活性化状態のバランス評価が有用である。しかしながら、現在のところT細胞とTreg細胞それぞれについて活性化−非活性化のバランスを評価する方法はない。これは、免疫抑制能を持つ制御性T細胞と免疫活性化を担う活性化T細胞が、細胞表面マーカーが極めて類似しており、両者を明確に分離、定量化することが困難であるためである。一方、近年、Treg細胞にはTreg細胞特異的なDNA脱メチル化パターンが存在しており、このDNA脱メチル化パターンを用いれば、Tconv細胞とTreg細胞とを明確に区別することができることがわかった。さらに活性化による特異的なDNA脱メチル化パターンが、T細胞とTreg細胞とでそれぞれ独立に存在することも明らかになった。
【０００４】
特許文献１では、免疫細胞であるTreg細胞のメチル化パターンに基づいて、免疫状態のキャラクタリゼーションを行っている。例えば、サンプル中の、エフェクター細胞活性を同定したり、特定領域の遺伝子座についてメチル化プロファイルを調べたり、メチル化プロファイルの程度を参照値と対比したりすることで、サンプル提供者の免疫状態を解析する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／００６８１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１におけるメチル化の検出方法は、arrayを用いて特定領域を濃縮して調べているが、このarrayはIllumina社のInfinium HumanMethylation450 (450K) arrayであり、対象領域の殆どがCpG islandやプロモーター領域であることから、ゲノム全体のごく限られた領域を見ているに過ぎない。また、遺伝子発現の差はpromoterの差と相関しているので、CpG islandの違いではcell lineageを示す指標になるとは言い難い。cell lineageで違いが出る領域はintronであるが、この部分のプローブ数は少なく、大部分の違いは見落とされていると思われる。よって、特許文献１の方法では未だ十分ではなく、更なる優れた技術の開発が望まれている。
【０００７】
本発明の課題は、DNAメチル化パターンに基づいた免疫状態の解析法、前記免疫状態からサンプル提供者の疾患リスクを判定する方法、及び該方法に用いるキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
通常のヒトT細胞は、不活性な状態の細胞(naive T細胞)と抗原刺激を受け活性化した状態の細胞(activated T細胞)が存在する。ここで、免疫反応を負に制御し、免疫恒常性維持に必須な細胞群としてTreg細胞が存在するが、Treg細胞にも不活性状態のnaive Treg細胞と活性化したactivated Treg細胞が存在する。そこで、本発明者らは、これらの細胞群のバランスが免疫恒常性の維持に重要な働きをしていると考え、これらの細胞分画に特異的なDNAメチル化パターンを特定し、そのパターンの構成比率から各細胞分画の構成を算出して免疫状態を評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、〔１〕〜〔３〕に関する。
〔１〕  被検者に由来する試料において、表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定し、その測定値を基準値と対比して、免疫状態を評価することを特徴とする、免疫状態解析法。
〔２〕  被検者に由来する試料において、表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定し、その測定値を基準値と対比して、免疫状態が亢進又は抑制した疾患の存在の指標とする、免疫疾患のリスクの判定方法。
〔３〕  表２〜２０に記載される遺伝子領域からなる群から選択される少なくとも１種におけるDNAメチル化率を測定するための道具を含有してなる、免疫状態を解析するためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫状態解析法は、特定細胞のメチル化状態を調べることで、免疫状態を推定することができるという優れた効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ヒト末梢血におけるT細胞の分布パターンを示す図である。
【図２】図２は、光線療法前後の乾癬患者由来のCD4+T細胞分画のFoxp3遺伝子座のCpG脱メチル化状態を示す図である。
【図３】図３は、光線療法前後の乾癬患者由来のCD4+T細胞分画のAKAP11遺伝子座のCpG脱メチル化状態を示す図である。
【図４】図４は、光線療法前後の乾癬患者由来のCD4+T細胞分画のLGALS8遺伝子座のCpG脱メチル化状態を示す図である。
【図５】図５は、光線療法前後の乾癬患者由来のCD4+T細胞分画のASAH2遺伝子座のCpG脱メチル化状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、被検者における免疫状態を解析するための方法であって、特定のT細胞におけるDNAメチル化状態を定量して、該メチル化状態と脱メチル化状態の構成比率を算出し、その値を基準値と対比して、免疫状態を評価することを大きな特徴とする。より詳しくは、例えば、T細胞に特異的に認められる、メチル化領域、脱メチル化領域に関して、そのメチル化程度を測定して算出することにより、免疫状態が亢進又は抑制している、あるいは、慢性炎症状態、活性化状態、寛容状態等の状態を呈していると判断することが可能となる。従って、本発明は、免疫状態に関する情報を提供する方法でもある。
【００１３】
免疫状態に基づく情報が得られることにより、免疫状態の亢進の有無やどのような状態を呈しているかが分かって免疫疾患のリスクの判断が可能となり、免疫状態が亢進しているものは、発症前であっても将来的に免疫疾患のリスクがあることを知り、又は、初期の診断の補助に用いることが可能となる。加えて、自己免疫疾患や悪性腫瘍罹患時の免疫状態に関する情報は、治療法の選択、薬剤の選択、予後の予測等に利用できる。
【００１４】
以下に、免疫状態に関連するメチル化領域及び脱メチル化領域の同定方法を説明する。
【００１５】
本発明においては、T細胞として、通常のT細胞(Tconv細胞)と免疫抑制機能をもつ制御性T細胞(Treg細胞)について、それぞれ、不活性な状態と抗原刺激により活性化した状態の細胞に着目する。即ち、通常のT細胞の不活性な状態のnaive T細胞、通常のT細胞の活性化した状態のactivated T細胞、Treg細胞の不活性な状態のnaive Treg細胞、Treg細胞の活性化した状態のactivated Treg細胞の計４種類を用いる。これらの細胞抽出は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、血液試料、好ましくは末梢血を採取後に、PBMCを分離し、auto MACS、セルソーター等の手法により分取することができる。
【００１６】
先ず、前記分取した細胞からDNAを抽出し、それぞれについてメチル化解析を行う。メチル化解析は、公知の方法に従って行うことができるが、本発明では全ゲノムをターゲットとする観点から、例えば、Illumina社のHiseqシリーズのシークエンサーを用いることが好ましい。そして、検出されたメチル化情報を用いて、各細胞における特異的なメチル化領域又は脱メチル化領域を抽出する。メチル化領域又は脱メチル化領域の抽出においては、統計学的な解析手法、例えばFisherの正確確率検定を用いて、特定の特徴を有する領域の抽出を行う。この場合、免疫状態に特異的に関連するメチル化領域及び脱メチル化領域を見出すために、対照として用いられる他の細胞のメチル化領域や脱メチル化領域との比較を複数行い、共通して有意な差があると判定されるような領域を選択することが好ましい。具体的には、例えば、Treg細胞に特異的なCpG脱メチル化を、活性化依存的なCpG脱メチル化と分離するため、まずactivated Treg細胞とactivated T細胞間で60％以上の差でメチル化率が異なり、かつFisher’s正確性テストでp<0.01なる領域を特定し、activated Treg細胞特異的脱メチル化領域とした。また、naive Treg細胞とnaive T細胞間で、同様に60％以上の差でメチル化率が異なり、かつFisher’s正確性テストにおいてp<0.01となる領域を、naive Treg細胞特異的脱メチル化領域とした。両者に共通の領域、すなわちactivated状態下及びnaive状態下においても常にTreg細胞に特異的に脱メチル化している領域を、Treg特異的脱メチル化領域として同定することができる。なお、以降、かくして同定された免疫状態に関連するメチル化領域及び脱メチル化領域のことを、本発明のDNA領域と記載することもある。
【００１７】
次いで、得られた領域におけるメチル化状態を定量的に評価する。具体的には、抽出された領域に特異的なprimerを用いてbisulfite-PCR解析を行い、メチル化率を算出する。Bisulfite-PCR解析は、公知の方法に従って行うことができるが、本発明では定量性の観点から、例えば、Illumina社のMiseqを用いてamplicon sequence PCRを行い、最低1000クローンのシーケンスを行うことが好ましい。また、脱メチル化率は、出力されたDNA配列から当業者であれば容易に算出できる。よって、本発明において、メチル化率を測定するとは、脱メチル化率を測定することを包含するものである。
【００１８】
本発明においては、本発明のDNA領域に関してメチル化率又は脱メチル化率を調べることで、その値に基づいて免疫状態を評価（又は推定、分類、判定）することができる。なお、この評価は、用いるDNA領域を変更、または追加することにより、様々な免疫状態の評価を可能とするものであり、詳細は実施例にて説明するが、例えば、あるDNA領域においては、被検者における前記領域のメチル化率が基準値と比較して統計学的に有意に多い場合、炎症性反応が亢進している、もしくは炎症性疾患に罹患していると推定することができる。他のDNA領域においては、被検者における前記領域のメチル化率が基準値と比較して統計学的に有意に多い場合、免疫寛容が亢進している、もしくは免疫反応が抑制された状態にあると推定することができる。また、いくつかの領域のメチル化パターンを総合的に解析し、慢性炎症や自己免疫疾患の状態であると推定することもできる。本明細書中「評価」とは、前記のようにして得られた測定結果に基づいて、免疫状態が亢進又は抑制している疾患、あるいは免疫状態が慢性炎症状態、活性化状態、又は寛容状態をとる疾患等の疾患への罹患又は発症リスクの有無を評価することを指し、評価には、医師による判定を含まないことを意図している。なお、前記疾患とは、例えば、リウマチ、乾癬、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、感染症、悪性腫瘍を挙げることができる。
【００１９】
本明細書で用いられる「試料」としては、例えば、血液試料、尿、唾液、生検試料、手術試料などが例示されるが、好ましくは、血液試料、生検試料、又は手術試料である。本明細書中「血液試料」としては、全血、血清、及び血漿を用いることができる。また、「生検試料」としては、悪性腫瘍が疑われる場合の生検試料や、慢性糸球体腎炎が疑われる場合の腎生検試料等を、「手術試料」としては、摘出癌組織、摘出炎症組織、胎盤等を用いることができる。なお、試料の採取方法や調製方法は特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
【００２０】
「基準値」とは、例えば、健常者における前記領域のメチル化率又は脱メチル化率とすることができる。好ましくは、複数の前記疾患患者由来であることが確認された試料（陽性試料）におけるメチル化率又は脱メチル化率と、複数の健常者由来であることが確認された試料（陰性試料）におけるメチル化率又は脱メチル化率とをそれぞれ対比し、その結果に基づき最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値とする。
【００２１】
「健常者」とは、少なくとも前記疾患に罹患していない個体、好ましくは免疫状態の亢進又は抑制が認められない健康な個体をいう。さらに、健常者は、被検者と同一の生物種であることを要する。健常者の身体的条件は、被検者のそれと同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、身長、体重等が該当する。
【００２２】
健常者由来の試料としては、被検者由来の試料と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者由来の試料が血液試料である場合、健常者由来の試料も血液試料が好ましい。
【００２３】
健常者の試料におけるメチル化率又は脱メチル化率は、前記で説明をした本発明のDNA領域の同定において測定したメチル化率又は脱メチル化率の測定方法と同様の方法で測定することが好ましい。健常者の試料におけるメチル化率又は脱メチル化率は、被検者の試料におけるメチル化率又は脱メチル化率を測定する都度、新たに測定することもできるが、予め測定しておいたメチル化率又は脱メチル化率を利用することもできる。健常者の様々な身体的条件におけるメチル化率又は脱メチル化率を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被検者の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被検者との比較に最適な身体的条件を有する健常者のメチル化率又は脱メチル化率を即座に利用できるので便利である。
【００２４】
「統計学的に有意」とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合が挙げられる。それ故、測定値について「統計学的に有意に大きい」とは、被検者と健常者のそれぞれから得られたメチル化率又は脱メチル化率の量的差異を統計学的に処理したときに両者間に有意差があり、かつ被検者の前記メチル化率又は脱メチル化率が健常者のそれと比較して相対的に多い又は少ないことをいう。例えば、メチル化率に関して、被検者が健常者の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上多い又は少ない場合が該当する。量的差異が一定以上で統計的に有意であれば、免疫状態において何らかの差異が生じていると考えられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【００２５】
被検者のメチル化率又は脱メチル化率が基準値よりも統計学的に有意に多い又は少ない場合、そのメチル化パターンに基づき被検者は免疫状態が特定の状態にあると評価する。
【００２６】
このように、本発明のDNA領域におけるメチル化率又は脱メチル化率を調べることにより、被検者の免疫状態を推定でき、様々な疾患において治療法の選択、薬剤の選択、予後の予測等に利用できる。
【００２７】
また、前記解析において、例えば、被検者が前記疾患を発症していると判断された場合においては、健常者のメチル化率又は脱メチル化率を被検者の治療前のメチル化率又は脱メチル化率に設定し、治療後のメチル化率又は脱メチル化率を被検者のメチル化率又は脱メチル化率として対比することで、治療後のメチル化率又は脱メチル化率が減少していることが示された場合は、当該治療が前記疾患の治療に有効である可能性が高いと判断することができる。
【００２８】
従って、本発明はまた、治療を受ける前と受けた後において、本発明のDNA領域におけるメチル化率又は脱メチル化率を測定し、治療後の値が治療前のそれより小さい場合に、当該治療が効果を有すると判断することを特徴とする評価方法を提供することができる。
【００２９】
本発明の別の態様では、免疫状態を解析するためのキットを提供することができる。本キットには、本発明のDNA領域におけるメチル化率又は脱メチル化率を測定するための道具、例えば、アンプリコン又はプライマーセットが含まれているのであれば、特に限定はない。本発明のキットは、免疫状態の亢進又は抑制した疾患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度、あるいは前記疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。
【００３０】
本発明のキットを用いて、例えば、健常者と被検者の血液サンプル中に存在する本発明のDNA領域におけるメチル化率又は脱メチル化率を測定して、両者の発現量に有意差が生じた場合には、被検者における免疫状態の総合的な評価を行うことができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
【００３２】
実施例１  ヒトT細胞分画の取得
正常ヒト末梢血200mLからフィコールを用いて、peripheral blood mononuclear cells (PBMC)を分離した。PBMCは、auto MACSを用いてCD4+ T細胞を分離し、セルソーターに供した。CD4+ T細胞は、CD25およびCD45RA抗体で染色し、図１に示す分画により、naive Treg 細胞画分 (Fr1: CD25high, CD45RA+), activated Treg細胞 画分(Fr2: CD25superhigh, CD45RA-), activated T 細胞画分 (Fr3: CD25intermediate, CD45RA-), naive T 細胞画分(Fr6: CD25-, CD45RA+) を分取した。
【００３３】
実施例２  Genome DNAの調整とメチル化情報の取得
実施例１で分取したヒト末梢血由来CD4+ T 細胞画分（Fr1, Fr2, Fr3, Fr6）それぞれをprotease K処理し、フェノール・クロロフォルム抽出、RNase I処理を行って、それぞれの細胞画分からgenomic DNAを回収した。更に、回収したgenomic DNAは、ゲノムDNA抽出キット(Qiagen)を用いて、精製を行った。
回収したそれぞれの細胞画分由来のgenomic DNAについて、Post Bisulfite-Conversion adapter Tagging sequence (PBAT)法を用いた全ゲノムのDNAメチル化解析を行った。100ngのgenome DNAをBisulfite処理を行い、処理後のDNＡにadaptorを付加し、ライブラリーを作製し、Illumina Hiseq 2000 を用いてシーケンスを行った。各サンプルにつき30カバレッジでsequenceをおこない、各サンプルについて約10億リードを回収した。
【００３４】
実施例３  DNAメチル化パターンの解析
Hiseq2000より得られたfastqファイルは、クオリティーチェック後、fastx toolkitを用いてtrimmingを行い、bismark、bismark_methylation_extractorを用いて、DNAメチル化データへと変換した。各fractionに特異的なDNAメチル化領域の抽出は、以下の手順によりおこなった。1)各サンプルについて、全genomeを100 bpのwindow sizeに分割し、window内のメチル化CpGと脱メチル化CpGの数を積算した。2)積算したCpGメチル化数、脱メチル化数の差異を、全windowおよび、各サンプルのすべての組み合わせについてFisher’s exact testを用いて有意差検定をおこなった。3) 各フラクションの組み合わせを統合し、特定の特徴をもつ領域の抽出をおこなった。
【００３５】
実施例４  DNAメチル化状態の定量化
特定genome領域におけるDNAメチル化状態を定量的に評価するため、Bisulfite処理後のDNAをもとにamplicon sequenceを行った。CD4+ T細胞からgenome DNAを抽出し、Bisulfite処理をおこない、メチル化検出のための特異的なprimerを用いてPCRを行い、Illumina Miseqを用いて、amplicon sequenceを行った。シーケンス後のfastqファイルは、trimming後bismark, bismark_methylation_extractorにより、メチル化情報へと変換し、メチル化率を算出した。
【００３６】
実施例５  全ゲノムDNAメチル化情報の分析
実施例１〜４で得られた全ゲノムDNAのメチル化情報を分析した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2017143784.tif 000002
【００３８】
表１より、CpGメチル化率は、naive Treg細胞、activated Treg細胞、activated T細胞、naive T 細胞で、それぞれ 80.75％、74.14％、77.05％、84.65％であり、大部分のCpGは、メチル化状態にあった。最もCpG脱メチル化率の高い細胞は、activated Treg細胞であり、逆に最もCpGメチル化率の高い細胞はnaive T 細胞であった。
【００３９】
また、CpGメチル化について各chromosomeごとのメチル化率を算出、比較した場合、naive Treg細胞とnaive T 細胞、およびactivated Treg細胞とactivated T細胞の差異は、ごく限定されており、Treg-T細胞間よりむしろactivate-naive間の差が大きい傾向にあった。各サンプル間のCpGメチル化状態に基づくcorrelation distanceを計算し、クラスタリングをおこなったところ、naive Treg細胞とnaive T 細胞間, およびactivated Treg細胞とactivated T細胞間で、相関が高いことがわかった。
【００４０】
実施例６  Treg細胞に特異的なCpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
Treg細胞に特異的なCpG脱メチル化を活性化依存的CpG脱メチル化と分離するため、まずactivated Treg細胞とactivated T細胞間で、activated Treg細胞特異的脱メチル化領域を特定した。つづいて、naive Treg細胞とnaive T 細胞間で、naive Treg細胞特異的脱メチル化領域を特定した。両者に共通の領域が、activated およびnaive状態下においても常にTreg細胞に特異的に脱メチル化している領域として同定できる。
具体的な同定方法は、メチル化率が、
activated Treg細胞 - naive T細胞 < -0.6、
activated Treg 細胞 - activated T細胞 < -0.6、
naive Treg細胞 - naive T細胞 < -0.6、
naive Treg細胞 - activated T細胞 < -0.6、
Fisher’s exact test p < 0.01
である領域を、Treg細胞に特異的なCpG脱メチル化領域として同定した。これらの領域は、FOXP3, IKZF2の遺伝子領域など36 領域であった（表２）。なお、以降の表中において、Fr1meなどはメチル化率を、Fr1sumなどはn数（測定数）に該当し、Fr1-Fr2_diffなどはp値に相当する。
【００４１】
【表２】
2017143784.tif 000003
【００４２】
同様の方法で、Treg細胞特異的なCpGメチル化領域として、SCML4遺伝子領域の2箇所が同定された（表３）。
【００４３】
【表３】
2017143784.tif 000004
【００４４】
実施例７  activation特異的CpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
T 細胞のactivationによって変化するCpG脱メチル化領域を、Treg細胞とT細胞、それぞれについて特定し、活性化によって変化する領域が両細胞に共通して認められる領域を、activation特異的CpG脱メチル化領域として、実施例６と同様の方法で同定した。activation特異的CpG脱メチル化領域として、AVPR1A、MSRB3等の遺伝子領域42箇所が同定された（表４）。
【００４５】
【表４】
2017143784.tif 000005
【００４６】
同様にして、activation特異的CpGメチル化領域として、SATB1、NOG等の遺伝子領域16箇所が同定された（表５）。
【００４７】
【表５】
2017143784.tif 000006
【００４８】
実施例８  naive Treg特異的CpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
naive Treg細胞に特異的に認められ、activated Treg細胞、activated T細胞 及びnaive T細胞では認められない脱メチル化変化を示す領域を、実施例６と同様の方法で同定したところ、naive Treg特異的CpG脱メチル化領域として、WDR41、RORB等の遺伝子領域125箇所が同定された（表６）。
【００４９】
【表６−１】
2017143784.tif 000007
【００５０】
【表６−２】
2017143784.tif 000008
【００５１】
【表６−３】
2017143784.tif 000009
【００５２】
【表６−４】
2017143784.tif 000010
【００５３】
同様の手法により、naive Treg特異的CpGメチル化領域として、DEC1、RNF128等の遺伝子領域461箇所が同定された（表７）。
【００５４】
【表７−１】
2017143784.tif 000011
【００５５】
【表７−２】
2017143784.tif 000012
【００５６】
【表７−３】
2017143784.tif 000013
【００５７】
【表７−４】
2017143784.tif 000014
【００５８】
【表７−５】
2017143784.tif 000015
【００５９】
【表７−６】
2017143784.tif 000016
【００６０】
【表７−７】
2017143784.tif 000017
【００６１】
【表７−８】
2017143784.tif 000018
【００６２】
【表７−９】
2017143784.tif 000019
【００６３】
【表７−１０】
2017143784.tif 000020
【００６４】
【表７−１１】
2017143784.tif 000021
【００６５】
【表７−１２】
2017143784.tif 000022
【００６６】
【表７−１３】
2017143784.tif 000023
【００６７】
実施例９  activated Treg細胞特異的CpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
activated Treg細胞に特異的に認められ、naive Treg細胞、activated T細胞 及びnaive T細胞では、認められない脱メチル化変化を示す領域を、実施例６と同様の方法で同定したところ、activated Treg細胞特異的CpG脱メチル化領域として、ANK3, RAD51等の遺伝子領域23箇所が同定された（表８）。
【００６８】
【表８】
2017143784.tif 000024
【００６９】
同様の手法により、activated Treg細胞特異的CpGメチル化領域として、TCF7、FKBP5等の遺伝子領域11箇所が同定された（表９）。
【００７０】
【表９】
2017143784.tif 000025
【００７１】
実施例１０  activated T細胞特異的CpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
activated T細胞に特異的に認められ、naive Treg細胞、activated Treg細胞 及びnaive T細胞では、認められない脱メチル化変化を示す領域を、実施例６と同様の方法で同定したところ、activated T細胞特異的CpG脱メチル化領域として、LAYN、FYB等の遺伝子領域8箇所が同定された（表１０）。
【００７２】
【表１０】
2017143784.tif 000026
【００７３】
同様の手法により、activated T細胞特異的CpGメチル化領域を見出そうとしたが、activated T細胞特異的CpGメチル化領域は見いだせなかった。
【００７４】
実施例１１  naive T細胞特異的CpG脱メチル化領域及びメチル化領域の同定
naive T細胞に特異的に認められ、naive Treg細胞、activated Treg細胞 及びactivated T細胞では、認められない脱メチル化変化を示す領域を、実施例６と同様の方法で同定したところ、naive T細胞特異的CpG脱メチル化領域として、LRRN3、B4GALT4等の遺伝子領域9箇所が同定された（表１１）。
【００７５】
【表１１】
2017143784.tif 000027
【００７６】
同様の手法により、naive T細胞特異的CpGメチル化領域として、CPSF3、EML4等の遺伝子領域8箇所が同定された（表１２）。
【００７７】
【表１２】
2017143784.tif 000028
【００７８】
実施例１２  Treg細胞でactivationによりCpG脱メチル化するが、naive T細胞ではactivationによりCpGメチル化する領域の同定
naive Treg細胞に比しactivated Treg細胞でCpG脱メチル化しているが、naive T細胞に比しactivated T細胞ではCpGメチル化している領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、Treg細胞でactivationによりCpG脱メチル化するが、naive T細胞ではactivationによりCpGメチル化する領域として、TOX、ENOX2等の遺伝子領域11箇所が同定された（表１３）。
【００７９】
【表１３】
2017143784.tif 000029
【００８０】
実施例１３  Treg細胞でactivationによりCpGメチル化し、naive T細胞ではactivationによりCpG脱メチル化する領域の同定
naive T細胞に比しactivated T細胞ではCpG脱メチル化しているが、naive Treg細胞に比しactivated Treg細胞ではCpGメチル化している領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、Treg細胞でactivationによりCpGメチル化するが、naive T細胞ではactivationによりCpG脱メチル化する領域として、LINGO2、BCL2A1遺伝子領域等8箇所が同定された（表１４）。
【００８１】
【表１４】
2017143784.tif 000030
【００８２】
実施例１４  naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpG脱メチル化し、activated Treg細胞でさらにCpG脱メチル化が進行する領域の同定
naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpG脱メチル化が認められ、さらにactivated Treg細胞でCpG脱メチル化が進行する領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpG脱メチル化が認められ、さらにactivated Treg細胞でCpG脱メチル化が進行する領域として、SP100、NME7等の遺伝子領域15箇所が同定された（表１５）。
【００８３】
【表１５】
2017143784.tif 000031
【００８４】
実施例１５  naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpGメチル化し、activated Treg細胞でさらにCpGメチル化が進行する領域の同定
naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpGメチル化が認められ、さらにactivated Treg細胞でCpGメチル化が進行する領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、naive T細胞に比しnaive Treg細胞でCpGメチル化が認められ、さらにactivated Treg細胞でCpGメチル化が進行する領域として、C12orf79、MIR6874の遺伝子領域2箇所が同定された（表１６）。
【００８５】
【表１６】
2017143784.tif 000032
【００８６】
実施例１６  活性化によりTreg細胞のみでCpG脱メチル化する領域の同定
naive Treg細胞、naive T細胞及びactivated T細胞においてCpGメチル化状態に変化なく、activated Treg 細胞でのみCpG脱メチル化する領域を、実施例６と同様の方法により、同定したところ、活性化によりTreg細胞のみでCpG脱メチル化する領域として、NEK7、ASAH2等の遺伝子領域8箇所が同定された（表１７）。
【００８７】
【表１７】
2017143784.tif 000033
【００８８】
実施例１７  活性化によりTreg細胞のみでCpGメチル化する領域の同定
naive Treg細胞、naive T細胞及びactivated T細胞においてCpGメチル化状態に変化なく、activated Treg 細胞でのみCpGメチル化する領域を、実施例６と同様の方法により、同定したところ、活性化によりTreg細胞のみでCpGメチル化する領域として、FKBP5, THEMIS等の遺伝子領域4箇所が同定された（表１８）。
【００８９】
【表１８】
2017143784.tif 000034
【００９０】
実施例１８  活性化によりT細胞でのみでCpG脱メチル化する領域の同定
naive Treg細胞、activated Treg細胞及びnaive T細胞においてCpGメチル化状態に変化なく、activated T細胞でのみCpG脱メチル化する領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、活性化によりT細胞でのみでCpG脱メチル化する領域として、INPP4B、PHEX等の遺伝子領域8箇所が同定された（表１９）。
【００９１】
【表１９】
2017143784.tif 000035
【００９２】
実施例１９  活性化によりT細胞でのみでCpGメチル化する領域の同定
naive Treg細胞、activated Treg細胞及びnaive T細胞においてCpGメチル化状態に変化なく、activated T細胞でのみCpGメチル化する領域を、実施例６と同様の方法で、同定したところ、活性化によりT細胞でのみでCpGメチル化する領域として、SPPL3、LGMN等の遺伝子領域6箇所が同定された（表２０）。
【００９３】
【表２０】
2017143784.tif 000036
【００９４】
実施例２０  乾癬患者の治療効果の評価について
実施例６〜実施例１９において、各細胞群および細胞変化に特徴的なDNAメチル化領域を特定した。ヒト末梢血由来CD4+T細胞ゲノムDNAを抽出し、複数の特徴的ゲノム領域をアンプリコンとしたbisulfite-PCRをおこない、次世代シーケンサーでDNA配列を解析することにより、各アンプリコンにおけるDNAメチル化状態を決定することで、母集団の細胞構成、細胞状態を推定できるので、乾癬患者の治療の前後での免疫状態を比較し、治療効果の評価ができないのか検証した。
【００９５】
具体的には、光線療法前後の乾癬患者末梢血より、CD4+T細胞分画を回収し、genome DNAを抽出した(patient 1〜5)。Genome DNAに対し、Bisulfite処理をおこない、先に見いだした各細胞分画に特徴的なCpGメチル化パターンを示す領域についてアンプリコンPCRをおこなった。アンプリコンは、Treg細胞特異的脱メチル化領域であるFoxp3 (chrX, 49118000-49118500)、naive T細胞特異的メチル化領域であるAKAP11 (chr13, 42980000-42980500)、activation特異的なCpG脱メチル化領域であるLGALS8 (chr1, 236672000-236672500)、活性化によりTreg細胞のみでCpG脱メチル化する領域(Treg細胞のactivation特異的な脱メチル化領域)であるASAH2 (chr10, 52175000-52175500)を選択した。得られたPCR産物は精製後サンプルごとにID tagを付加し、Miseqによりシーケンスを行った。出力されたfastqファイルは、trimming後、bismark, bismark-methylation-extractorを用いて、メチル化情報に変換し、構成比率を産出し、結果を図２〜図５に示した。なお、図中の矢印は正常コントロールに比し顕著な差が認められた例を示す。
【００９６】
Treg細胞特異的脱メチル化領域Foxp3の結果では、patient2, 3に脱メチル化率の亢進が認められた。本結果は、patient2, 3でTreg細胞の増殖が生じていることを示唆する。naive T細胞特異的メチル化領域AKAP11の解析では、patient 3に大幅なメチル化率の減少を、patient1に軽微な現象を認めた。この結果と一致して、活性化依存的脱メチル化領域であるLGALS8領域の解析では、patient3に大幅な亢進を、patent2の治療後にわずかな亢進を認めた。これらの結果は、patient3ではほとんどのT細胞で活性化が起こっていることを示す。さらに、Treg特異的活性化依存的脱メチル化領域であるASAH2領域では、patient1に亢進を認めた。この結果は、patient1においてTregが選択的に活性化している可能性を示唆する。このように、本手法を用いることにより自己免疫疾患患者の免疫状態の評価が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明の方法により、サンプル中の免疫状態に関連するメチル化領域及び脱メチル化領域におけるメチル化率又は脱メチル化率を分析することにより、サンプル提供者の免疫状態が亢進又は抑制しているかに関する情報を得ることができ、ひいては、免疫疾患の治療を早期に開始することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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