(57)【要約】【課題】  並列反応用の懸濁液、この懸濁液を用いた並列反応、並列反応を利用したスクリーンニング法及び検査方法を提供する。【解決手段】  ゲルビーズ３内にはラテックスなどを材料とする微粒子４が多数分散している。各微粒子４の表面はアフィリティリガンド（ＰＣＲ用プライマー及びＮＴＡ）で修飾されている。具体的には、核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡで表面が修飾された微粒子４と、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）で表面が修飾された微粒子４がゲルビーズ３内に分散している。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルビーズが液体中に分散した並列反応用懸濁液であって、前記ゲルビーズ内にはアフィニティリガンドが表面に固定された微粒子が分散していることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項２】
請求項１に記載の並列反応用懸濁液において、前記アフィニティリガンドが、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）であることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項３】
請求項１に記載の並列反応用懸濁液において、前記アフィニティリガンドが、特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質であることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項４】
請求項１に記載の並列反応用懸濁液において、この並列反応用懸濁液中にはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）が表面に固定された微粒子が分散するゲルビーズと、特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質が表面に固定された微粒子が分散するゲルビーズとが分散していることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項５】
請求項２または４に記載の並列反応用懸濁液において、前記ＤＮＡは核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡであることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項６】
請求項３または４に記載の並列反応用懸濁液において、前記タグ配列を持つタンパク質を認識する物質は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ)、抗体、グルタチオン、マルトースの何れかであることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の並列反応用懸濁液において、前記微粒子の大きさ（平均径）は０．１〜１０μｍであることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項８】
請求項１乃至請求項７の何れか１項に記載の並列反応用懸濁液において、前記ゲルビーズがアガロースであることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８の何れか１項に記載の並列反応用懸濁液において、前記ゲルビーズの大きさ（平均径）は１〜５００μｍであることを特徴とする並列反応用懸濁液。
【請求項１０】
アフィニティリガンドが表面に固定された微粒子を含んだゲルビーズが液体中に分散した並列反応用懸濁液を用いた並列反応方法であって、複数種のＤＮＡが含まれる溶液を限界希釈または所定の濃度とし、この複数種のＤＮＡが含まれる溶液を液体中に分散することで前記ゲルビーズとし、１つのゲルビーズ中に１分子のＤＮＡを固定し、次いでゲルビーズ中に核酸増幅反応を行うのに必要な物質を導入し、個々のゲルビーズ中で個別の核酸増幅反応を同時に並行して行うことを特徴とする並列反応方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の並列反応方法において、前記アフィニティリガンドが、核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡであることを特徴とする並列反応方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の並列反応方法において、前記アフィニティリガンドが、特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質であることを特徴とする並列反応方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の並列反応方法において、前記複数種のＤＮＡが所定の濃度で含まれる溶液は核酸増幅反応を行うのに必要な物質を含有することを特徴とする並列反応方法。
【請求項１４】
請求項１０乃至１３の何れか１項に記載の並列反応方法において、ゲルビーズ中にタンパク質を合成するのに必要な物質を導入することで、前記個々のゲルビーズ中で核酸増幅反応を行った後に、タンパク質合成反応を個々のゲルビーズ中で同時に並行して行うことを特徴とする並列反応方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至請求項１４の何れか１項に記載の並列反応方法において、前記核酸増幅反応およびタンパク質合成反応を水と混じり合わない液体にゲルビーズを懸濁させて行うことを特徴とする並列反応方法。
【請求項１６】
請求項１０乃至請求項１４の何れか１項に記載の並列反応方法において、前記タンパク質合成反応に必要な物質はアミノ酸と酵素であることを特徴とする並列反応方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１６に記載された並列反応に続いて、個々のゲルビーズ内に固定されているタンパク質の特性を検査し、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを選別することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のスクリーニング方法において、前記ＤＮＡの選別は蛍光を発するゲルビーズを分取することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１０乃至１６に記載された並列反応に続いて、個々のゲルビーズに固定されているＤＮＡの量を評価することで、元のテンプレートＤＮＡ中の特定の配列を検査する検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数のゲルビーズ内で複数の化学反応、生化学反応を同時並行的に行うための懸濁液、この懸濁液を用いた並列反応方法、この並列反応を用いたスクリーニング方法およびこの並列反応を利用した検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランダムに変異が入った多くの候補タンパク質の中から、目的の活性を有する酵素を探索したり、多くの候補物質の中から目的の活性を持つ触媒を探索する手法は、創薬や新規化学物質の探索においてしばしば用いられている。
【０００３】
例えば非特許文献１には目的のタンパク質を発現する細胞をクローニングする際に、限界希釈法により１つの容器に１つの細胞が入る濃度から細胞を培養し、目的のタンパク質を発現するクローンを取得する方法が提案されている。
【０００４】
また非特許文献２及び非特許文献３には、ある酵素の一部のアミノ酸をランダムに置換してライブラリーを作製し、このライブラリーから産業上有用な活性を有する酵素を探索することが開示されている。
【０００５】
非特許文献２及び非特許文献３に示す手法では、一般的に９６穴ウェルプレートなどの数百μｌから数ｍｌ程度の容積の反応器を使用している。
【０００６】
例えば、目的の細胞を含む細胞懸濁液を９６穴ウェルプレートに分注し、抗体などを含む分析用試薬類を順次添加して細胞表面に発現した物質若しくは細胞から分泌される物質の量を定量する。また、多様なアミノ酸置換を含む酵素を発現するライブラリーの中について、９６穴ウェルプレート等の反応器の中で酵素を発現させ、酵素の反応基質等を添加することにより酵素の活性を測定して活性の高い酵素を発現するクローンを選択する。
つまり９６穴ウェルプレート等を用いる場合には、多数の反応器（穴）に順次複数の試薬を分注する必要があり、分析対象となる酵素や細胞の数の増加に伴い必要となる反応器数が増大し、それに伴う溶液・試薬の分注操作が煩雑となる。
【０００７】
非特許文献４には、半導体加工技術を利用して微小な反応容器を作製することが提案されているが、分注操作の問題は解消されていない。そこで、反応容器を更に小さくし且つ分注操作等も不要とする提案が特許文献１〜４及び、非特許文献５〜１０に提案されている。
【０００８】
本発明者らが２０１１年に提案した特許文献１には、懸濁液中の多数のゲル粒子（ゲルビーズ）の３次元網目構造の部分に、核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡを多数固定し、また前記ゲル粒子には限界希釈することによって１分子のテンプレートＤＮＡを含ませ、核酸増幅反応によって前記テンプレートＤＮＡを増幅して多数の同一ＤＮＡを１つのゲル粒子内で生産し、更にゲル粒子内にタンパク質合成に必要な物質を供給することで各ゲル粒子内の多数の同一ＤＮＡによって特定のタンパク質を合成することが開示されている。
【０００９】
また前記特許文献１では、核酸増幅反応プライマーとは別に、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）などの特定のタンパク質を認識する物質をゲル粒子（ゲルビーズ）の３次元網目構造の部分に固定することも開示されている。
【００１０】
特許文献２には、Ｗ／Ｏ型エマルションを構成する水滴中に、親水性分子と酵素などの機能性分子を別々に封じ込め、これら水滴を融合させることで、特異的な反応を誘導する内容が開示されている。また、この特許文献２にはＤＮＡを封じ込めることも開示されている。
【００１１】
特許文献３には、一方の荷電を有するベシクルに反応性物質を内包させ、他方の荷電を有するベシクルに前記反応性物質と反応する物質を内包させ、これら２つのベシクルを融合させ、融合した１つのベシクル内で反応を起こさせるようにしたことが開示されている。
【００１２】
特許文献４には、エマルションの水相（水滴）内にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用のプライマーが結合した固相担体を含ませ、水滴内でＰＣＲを行い固相担体に核酸複合体を連結させ、この後エマルションを破壊して固相担体−核酸複合体の結合体を回収し、この固相担体−核酸複合体を用いて無細胞タンパク質合成を行うことが開示されている。
【００１３】
非特許文献５にはエマルションの水相中（水滴）内にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用のプライマーを含ませ、この水滴を酵素分解したゲノムＤＮＡを含む水滴とマイクロ流体デバイス内で合一させ、この後水滴内でＰＣＲを行い、ゲノムＤＮＡ中の特定の部分を増幅する方法が開示されている。また非特許文献６には、エマルションの水相（水滴）内にタンパク合成用の酵素及び基質を含ませ、水滴内でタンパク合成反応を行う方法が開示されている。
【００１４】
非特許文献７には、リン脂質二重膜により構成される閉鎖小胞であるベシクルに目的とする分子を封じ込め、これらベシクルをレーザにより移動させて融合させる技術が開示されている。
また非特許文献８には、ゲル粒子内でタンパク質合成反応を行わせるために、ゲル粒子表面の高分子皮膜を通してゲル粒子内に基質を供給する内容が開示されている。非特許文献９にはゲル粒子を反応容器として用いてＰＣＲを行う方法が開示されている。
更に非特許文献１０には、高効率の遺伝子増幅プロセスとして、微小ビーズ内にプライマーＤＮＡを固定し、このビーズ内にＰＣＲに必要な物質を含ませ、ビーズ内でＰＣＲを行わせることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０２４８２１
【特許文献２】特開２０００−２７１４７５号公報
【特許文献３】特開２００８−２９９５２号公報
【特許文献４】特開２００９−１７８０６７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】バイオ実験イラストレイテッド，6，128-130
【非特許文献２】AISTToday 5(4), 18-19 (2005)
【非特許文献３】生化学,vol.72(12), 1430-1433,2000
【非特許文献４】Analytical Chemistry, 77(24), 8050-8056 (2005)
【非特許文献５】Nature Biotechnol., 27, 1025-1031 (2009)
【非特許文献６】Nature Biotechnol., 16, 652-656 (1998)
【非特許文献７】Langmuir, 19(20), 8206-8210 (2003)
【非特許文献８】Journal of Biotechnology, 143, 183-189 (2000)
【非特許文献９】Lab Chip, 10, 2841-2843 (2010)
【非特許文献１０】Analytical chemistry.2008,Vol.80, No.10, p3522-3529
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特許文献２〜４或いは非特許文献５〜９に開示されるような、ベシクル、エマルション或いはゲル粒子を反応容器とすることで、反応容器を小さくでき、多数の並列反応が可能になる。しかしながら、ゲル粒子などの微小容器内でタンパク質合成反応を起こさせ目的のタンパク質を得たとしても、タンパク質が容易にゲル粒子などの微小反応容器から溶出してしまう問題がある。
【００１８】
また、ベシクル、エマルション或いはゲル粒子を反応容器として用いる場合には、反応試薬を反応容器に導入する際には、非特許文献５，９に開示されるようなマイクロ流体デバイスがしばしば用いられるが、これらの加工は非常に複雑で高価である。
更に非特許文献９にはアガロースを分散相とし油相を連続相としたエマルションの当該アガロース滴中にプライマーＤＮＡを含ませ、アガロース滴中でＰＣＲを行うことが開示されているが、タンパク質の合成と合成したタンパク質を固定することについての開示がない。また、多段階の生化学反応に応用する方法は開示されていない。また、マイクロ流体デバイスを用いてＤＮＡを含ませる方法が用いられているが、マイクロ流体デバイスの加工は非常に複雑で高価である。
【００１９】
また、ゲル粒子等を用いた懸濁型の並列反応において、核酸増幅反応（ＰＣＲ）とタンパク質合成を連続して行おうとすると、ＰＣＲの二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに熱変性（denaturation）させる工程において、熱（９４℃）で、タンパク質合成酵素が失活してしまう問題がある。
【００２０】
上記した幾つかの問題は特許文献１或いは非特許文献１によって解消される。しかしながら特許文献１にあっては、ゲル（微小ビーズ）の材料としてＰＣＲを阻害しないアガロースやデキストリンを用い、ゲル（微小ビーズ）内にプライマーＤＮＡなどを固定している。
【００２１】
ゲルの網目構造にプライマーなどを固定するには、一般にゲルを構成する高分子の官能基を利用して固定するが、アガロースやデキストリンは反応活性の高い官能基を有していない。このため、ヒドロキシラジカル基を用いてゲルの網目構造に修飾することになるが、ヒドロキシラジカル基の反応活性はそれほど高くないため、十分な量のプライマーＤＮＡなどをゲルビーズ内に導入できない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するため本発明に係る並列反応用懸濁液は、ゲルビーズが液体中に分散し、前記ゲルビーズ内にはアフィニティリガンドが表面に固定された微粒子が分散した構成である。
【００２３】
前記アフィニティリガンドとしては、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いは特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質が挙げられ、ＤＮＡとしては、核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡを具体例として挙げることができ、ＤＮＡがコードするタンパク質としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ等の酵素や蛍光タンパク質が考えられる。
特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質としては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ)、抗体、グルタチオン、マルトースを具体例として挙げることができる。
【００２４】
また、微粒子の分散形態としては、１つのゲルビーズ内にＤＮＡを固定した微粒子または特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質を固定した微粒子のうちの一種類が複数分散したもの、或いは１つのゲルビーズ内にＤＮＡを固定した微粒子または特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質を固定した微粒子の両方が分散した形態が考えられる。
【００２５】
ゲルビーズの大きさ（平均径）としては、１〜５００μｍが好ましい。またゲルビーズ中に分散させる微粒子の大きさ（平均径）としては０．１〜１０μｍが好ましい。また微粒子の具体例としてはカルボキシル化ラテックス粒子が挙げられる。
【００２６】
また本発明に係る並列反応方法は、アフィニティリガンドが表面に固定された微粒子を含んだゲルビーズが液体中に分散した並列反応用懸濁液を用いて行う。即ち、複数種のＤＮＡが含まれる溶液を限界希釈または所定の濃度とし、この複数種のＤＮＡが含まれる溶液を液体中に分散することで前記ゲルビーズとし、１つのゲルビーズ中に１分子のＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）を固定し、次いでゲルビーズ中に核酸増幅反応を行うのに必要な物質を導入し、個々のゲルビーズ中で個別の核酸増幅反応を同時に並行して行う。
アフィニティリガンドの具体例としては前記と同様に、核酸増幅反応プライマーや特定のタグ配列を持つタンパク質を認識する物質が挙げられる。
【００２７】
限界希釈しても１つのゲル粒子中に複数のＤＮＡ分子が包含されたり、１つのゲル粒子中に包含されるＤＮＡ分子がない場合も想定される。本発明における限界希釈の意味は、平均的に１つのゲル粒子に１つのＤＮＡが包含される濃度である。
【００２８】
前記複数種のＤＮＡが含まれる溶液には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うのに必要な物質を予め含有させておいてもよい。また前記溶液から形成されるゲルビーズ中にタンパク質を合成するのに必要な物質（例えばアミノ酸と酵素）を導入することで、個々のゲルビーズ中でＰＣＲによる核酸増幅反応を行った後に、個々のゲルビーズ中でタンパク質合成反応を同時に並行して行うことができる。
【００２９】
反応物質がゲルビーズ間を相互移動したり、生成されたタンパク質がゲルから漏出するのを防ぐために、核酸増幅反応およびタンパク質合成反応は、水と混じり合わない液体にゲルビーズを懸濁させて行うことが好ましい。
【００３０】
ゲルビーズとなる水溶液中に核酸増幅反応およびタンパク質合成に必要な物質を導入し、次いで、水と混じり合わない液体にゲルビーズを懸濁させることで、複雑で高価なマイクロ流体デバイスを用いずとも、個々のゲル粒子中でコンパートメント化された核酸増幅反応およびタンパク合成反応を実施することが可能となる。
【００３１】
また、ＰＣＲでは熱変性して二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにする際に高温（９４℃）となり、タンパク質合成酵素が失活するため、核酸増幅反応（ＰＣＲ）が終了した後にタンパク質を合成するのに必要なアミノ酸と酵素などを導入する。
【００３２】
また、並列反応方法においては、反応中に反応物質がゲル粒子間を相互移動するのを抑制するために、核酸増幅反応およびタンパク質合成ともに水と混じり合わない液体にゲル粒子を懸濁させることが必要である。
【００３３】
また本発明に係るスクリーニング方法は、前記した並列反応に続いて、個々のゲルビーズ内に固定されているタンパク質の特性を検査し、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを選別する。選別方法としては、蛍光を発するゲルビーズを分取する。
【００３４】
また本発明に係る検査方法は、前記並列反応に続いて、個々のゲルビーズに固定されているＤＮＡの量を評価することで、元のテンプレートＤＮＡ中の特定の配列を特定する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る並列反応用懸濁液を用いることで、例えば、１０12個の反応を同時並列して行うことができる。
また、ゲル粒子からのＤＮＡやタンパク質の溶出を防止し、ゲル粒子内での反応が効率よく行われ、且つ反応生成物であるタンパク質の回収も効率よく行える。
【００３６】
特に本発明にあっては、ゲルビーズの官能基（網目構造）にプライマーＤＮＡなどのアフィリティリガンドを修飾（固定）するのではなく、微粒子表面の活性基にアフィリティリガンドを修飾するようにしたので、アフィリティリガンドの導入率を高めることができる。
その結果、ＤＮＡやタンパク質などの反応生成物の量が増加し、検出感度が向上し、生成物の評価・解析が容易になる。
【００３７】
更に、捕捉或いは生成する目的物質に応じた微粒子の大きさやゲルビーズ中の微粒子の濃度の調製・最適化を容易に行うことができ、反応器の設計にも自由度が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に係る懸濁液を説明した図
【図２】微粒子へのプライマー修飾過程を説明した図
【図３】本発明に係る懸濁液を利用した、ＰＣＲを説明した図
【図４】水相内のみでタンパク質合成及びタンパク質捕捉を行う例を説明した図
【図５】（ａ）ＮＴＡによるHis-GFPの捕捉を説明した図、（ｂ）はHis-FITCの捕捉を説明した図
【図６】プライマーＤＮＡ微粒子濃度を0.2ｇ／リットルとし、（ａ）はテンプレートＤＮＡがない（０copy/bead）場合、（ｂ）は増幅されたＤＮＡがある（1copy/bead）場合の明視野画像と蛍光画像
【図７】本発明に係る懸濁液を利用した、タンパク質合成を説明した図
【図８】ＮＴＡによるタンパク質の捕捉を説明した図
【図９】ＮＴＡによるタンパク質の捕捉を説明した図
【図１０】本発明に係る懸濁液を利用した、ＰＣＲからタンパク質合成までを説明した図
【図１１】図１０と同様の図
【図１２】（ａ）はテンプレートＤＮＡがない（０copy/bead）場合、（ｂ）は増幅されたＤＮＡがある（1000copy/bead）場合の明視野画像と蛍光画像
【図１３】本発明に係る並列反応用懸濁液を用いたスクリーニング方法を説明した図
【発明を実施するための形態】
【００３９】
図１に示すように、バイアル瓶内に収納される本発明に係る懸濁液は水相中にアガロース等からなるゲルビーズが分散している。ゲルビーズの数は１０5〜１０6であるが、実験における懸濁液中のゲルビーズ濃度は６５ビーズ／μＬとした。またゲルビーズの平均サイズは３８μｍ、ＣＶ値は１１．８％とした。
【００４０】
前記ゲルビーズ内にはラテックスなどを材料とする微粒子４が多数分散している。実験においては８０００個／ビーズとした。各微粒子の表面はアフィリティリガンド（ＰＣＲ用プライマー及びＮＴＡ）で修飾されている。図１に示す例では核酸増幅反応プライマーとして機能する長さが１５〜５０塩基の範囲に含まれる１本鎖ＤＮＡで表面が修飾された微粒子と、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）で表面が修飾された微粒子がゲルビーズ内に分散している。
【００４１】
微粒子へのプライマー修飾過程は、図２に示すように、カルボキシル化微粒子（フナコシ、東京、日本）表面に、アミノ基修飾を行ったプライマーをアミド結合により化学結合する技術を利用した(Kojima et al., 2005 Wittebolle et al., 2006)。
カルボキシル化微粒子を０．０１ＮのＮａＯＨで２回洗浄した。この時、遠心処理（10,000×ｇで１０分）によりカルボキシル化微粒子と水相に分離し、上澄みの液交換により洗浄操作を行った。その後、３回脱イオン水で洗浄し、slufo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt:東京化成工業、東京、日本）とMES buffer(pH 5.3)を仕込み、３０分間静かに撹拌し、EDC（1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩：東京化成工業、東京、日本）を加えて１５分間、活性エステル形成を行った。そこに（表１）に示すプライマー(eurfins、Luxembourg）を仕込み５時間反応させ、反応終了後は10mM TE buffer(pH 7.4)で４回洗浄し、TE buffer(pH 8.0)中に保存した。
また、それぞれのサンプル条件と試薬の導入量（反応スケールは３００μＬ）を（表２）に示す。
【００４２】
（表１）
2017143783.tif 000003
【００４３】
（表２）
2017143783.tif 000004
【００４４】
次に図３に基づき、ＰＣＲ用プライマーＤＮＡで修飾された微粒子を含んだゲルビーズが分散した懸濁液を用いたＰＣＲを説明する。
先ず（ａ）に示すようにバイアル瓶内に上記の懸濁液を入れる。次いで（ｂ）に示すように、懸濁液中にテンプレートＤＮＡとＰＣＲに必要な酵素（ポリメラーゼ）及び基質を添加し、これらをゲルビーズ内に導入する。
この後（ｃ）に示すように、ゲルビーズを油相中に懸濁させ、（ｄ）に示すようにゲルビーズ内でＰＣＲを行う。
【００４５】
図４は水相内のみで、タンパク質合成を行う例を示したものであり、表面がカルボキシル化された微粒子がゲルビーズ内に分散しており、微粒子表面にはＤＮＡが結合されている。このような状態の懸濁液中に基質を供給することで、微粒子表面に結合されたＤＮＡが特定のタンパク質を合成し、合成されたタンパク質は別の微粒子表面に結合しているＮＴＡに捕捉される。
【００４６】
ＰＣＲについて具体的に説明する。上記で作成した２種類のプライマー修飾微粒子（表２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはExpand High Fidelity PCR System (Roche, Penzberg, Germany)を使用した。キット記載の組成液にはプライマー修飾を0.2ｇ/Ｌ分散させた。ＤＮＡの検出を行うための蛍光試薬はSYBR Green Nucleic Acid Gel stain (Lonza, Basel, Schweizersche：以下サイバーグリーンと記す)を用い、２０００倍希釈になるように導入した。サンプル調製後、Denaturation９４℃  ２分、Denaturation９４℃  １５秒、Annealing６０℃  １分、Elongation７２℃  １分を２５サイクル、最後にElongation７２℃  ７分のＰＣＲの条件でThermal Cycler Dice(TP800,Takara)を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光増幅によるＤＮＡの増幅挙動を観察した。リアルタイムＰＣＲ後、プライマー修飾微粒子を10mM Tris-HCl (pH7.4)buffer で２回洗浄して波長490ｎｍの励起光を照射し、波長520ｎｍで蛍光観察を行った。
【００４７】
ゲルビーズ内でのＰＣＲおよびタンパク質合成は以下の通りである。
ＰＣＲキット組成液に（表３）のようにテンプレートＤＮＡおよびプライマー修飾微粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズを懸濁した。４℃で一晩ローテーターを用いて溶液を混合しながら、ＤＮＡおよびＰＣＲ用基質を供給した。その後、プライマー修飾微粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズを懸濁した水溶液50μＬを油相200μＬにピペッティングにより懸濁し、ＰＣＲを行った。ＤＮＡの増幅後、ヘキサンおよびクロロホルムを用いて油相の抽出による洗浄を行った。サイバーグリーンを仕込んだものと仕込まないものを用意し、サイバーグリーンを仕込んだサンプルについてはＰＣＲ後、油相を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察を行った。
【００４８】
（表３）
2017143783.tif 000005
【００４９】
ＰＣＲ後、サイバーグリーンを仕込んでいないプライマー修飾粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズを用いてタンパク質合成を行った。増幅ＤＮＡを捕捉していると考えられるプライマー修飾微粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズをタンパク質合成用の基質が溶解している水相に懸濁した。その後、４℃で一晩ローテーターを用いて溶液を混合しながら、タンパク質合成用の基質を供給した。タンパク質合成後、プライマー修飾微粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズを元液が１０6倍に希釈されるように４ｍＭＮｉイオンを含む１０ｍＭ Tris-HClで洗浄し、プライマー修飾微粒子およびカルボキシル化微粒子内包ゲルビーズの蛍光を観察した。
【００５０】
図５はタンパク質がＮＴＡに捕捉される過程を説明した図であり、（ａ）がHis-GFPの捕捉を、（ｂ）がHis-FITCの捕捉を説明している。
【００５１】
油中に懸濁したゲルビーズ内でのタンパク質合成は以下のように行った。
０又は１copy/beadになるように、各サンプルを調製し、前記したようにＰＣＲ基質の供給を行った。その後、プライマー修飾微粒子内包ゲルビーズが懸濁した水溶液１５μＬを油相２００μＬにピペッティング（２００回）により油中に懸濁し、ゲルビーズ内ＰＣＲを行った。その後、油相の洗浄を行い、水相にゲルビーズを懸濁しタンパク質合成用の基質の供給を行った。その後ＰＣＲ時と同様にゲルビーズを油中に懸濁してタンパク質合成を行った。タンパク合成後、蛍光顕微鏡により観察を行った。
【００５２】
図６（ａ）はテンプレートＤＮＡがない（０copy/bead）場合、（ｂ）は増幅されたＤＮＡがある（1copy/bead）場合の明視野画像と蛍光画像であり、（ｂ）の画像からＤＮＡが入っているゲルビーズはタンパク質を生産していることが分かる。
【００５３】
図７は本発明に係る懸濁液を利用した、タンパク質合成を説明した図である。この実施例ではＰＣＲは行っていない。
先ず（ａ）に示すようにバイアル瓶内に、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）で表面が修飾された微粒子がゲルビーズ内に分散した懸濁液を入れる。
次いで（ｂ）に示すように、懸濁液中に所定のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡとタンパク質合成に必要な酵素及びアミノ酸を添加し、これらをゲルビーズ内に導入する。
この後（ｃ）に示すように、ゲルビーズ３を油相中に懸濁させ、（ｄ）に示すようにゲルビーズ内でタンパク質合成反応を行わせ、合成されたタンパク質をＮＴＡで捕捉する。
【００５４】
図８及び図９はＮＴＡによる捕捉を説明したものであり、ゲルビーズ内で所定のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡは周知の過程を経てタンパク質（Ｈｉｓ）を合成する。合成されたタンパク質はゲルビーズ内に存在するＮｉイオンを介してＮＴＡに捕捉される。
【００５５】
図１０及び図１１は上記したＰＣＲとＮＴＡを利用したタンパク質の捕捉を組み合わせた実施例である。
この実施例にあっては、用意する懸濁液は、図１１（ａ）に示すように、核酸増幅反応プライマーとして機能する１本鎖ＤＮＡで表面が修飾された微粒子と、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）で表面が修飾された微粒子の両方が分散した懸濁液とする。
【００５６】
上記の懸濁液を図１０（ａ）及び図１１に示すように、バイアル瓶内に入れ、更に懸濁液にテンプレートＤＮＡ、酵素及び基質を添加し、これらテンプレートＤＮＡ、酵素及び基質をゲルビーズ内に導入する。
【００５７】
次いで、図１０（ｂ）及び図１１に示すようにゲルビーズ内で核酸増幅反応（ＰＣＲ）を行い、更に図１０（ｃ）及び図１１に示すように懸濁液にタンパク質合成用のアミノ酸と酵素を添加し、ビーズ内において３７℃でインキュベーションすることでタンパク質合成反応を行う。この後、図１０（ｄ）に示すように、合成されたタンパク質をＮＴＡにて捕捉する。
【００５８】
図１２（ａ）はテンプレートＤＮＡがない（０copy/bead）場合、（ｂ）は増幅されたＤＮＡがある（1000copy/bead）場合の明視野画像と蛍光画像であり、（ｂ）の画像からＤＮＡが入っているゲルビーズはタンパク質を生産していることが分かる。
【００５９】
次にＤＮＡライブラリー懸濁液を用いた並列反応からスクリーニングまでについて図１３に基づき以下に述べる。
先ずＤＮＡライブラリーを限界希釈し、ゲルビーズを作製する。このゲルビーズ内には前記したように、プライマーＤＮＡやＮＴＡで表面修飾された微粒子が含まれている。
希釈濃度およびゲルビーズの大きさは、ゲルビーズ１つにＤＮＡが１分子のみ入るようにする。現実にはゲルビーズの数は極めて多いため、すべてのゲルにＤＮＡが正確に１分子含まれる分けではなく、中にはＤＮＡが入っていないものや複数入っているゲル粒子も存在するが、並列反応を行うには問題とならない。
【００６０】
次いで、前記したＰＣＲにより、各ゲル粒子内で核酸増幅反応を行い、更にタンパク質合成に必要な物質をゲル粒子内に供給してゲル粒子内でタンパク質合成を行う。
【００６１】
目的とするタンパク質が合成されているゲルビーズを他のゲルビーズと分けるため、ＦＡＣＳ（登録商標）などのフローサイトメトリー（flow cytometry）を用いて分取する。具体的にはタンパク質が内部で合成されているゲル粒子を１個ずつシース流に送り出し、流路の途中でレーザ光を照射する。目的のタンパク質が内部で合成されているゲル粒子は蛍光抗体で染色され、他のゲルと区別されるので、そのゲル粒子を正に荷電し、下流側に負に荷電した偏向板によって他のゲルから分離して回収される。
【００６２】
このようにして並行反応とスクリーニングを行うことで、目的のタンパク質を合成するＤＮＡを特定することができる。
【００６３】
また、並列反応に続いて、個々のゲルビーズに固定されているＤＮＡの量を評価することで、元のテンプレートＤＮＡ中の特定の配列の転写量を検査することが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係る懸濁液は、多数の細胞の中から目的物質の分泌量の多い細胞を探索したり、ランダムに変異が入った多くの候補タンパク質の中から目的とする活性を有する酵素を探索する際の並列反応に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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