(57)【要約】【課題】新規な構成の顕微鏡法または組織学染色の同時局在化のための方法を提供する。【解決手段】サンプルを分析する方法であって：上記サンプルの複数の画像を生成する工程；上記サンプルを複数の切片にスライスする工程；上記複数の切片を染色する工程；複数の染色された切片を撮像することにより、上記サンプルの複数の二次画像を生成する工程；および上記サンプルの複数の二次画像を互いと同時位置合わせする工程を含む。上記サンプルは、組織サンプルを含み得る。上記サンプルの個々の一次画像が、上記サンプルの個々の切片がスライスされる前に生成され、上記サンプルの個々の切片が上記個々の一次画像と関連し得る。【選択図】図２Ａ
2017021028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを分析する方法であって：
該サンプルの複数の画像を生成する工程；
該サンプルを複数の切片にスライスする工程；
該複数の切片を染色する工程；
複数の染色された切片を撮像することにより、該サンプルの複数の二次画像を生成する工程；および
該サンプルの複数の二次画像を互いと同時位置合わせする工程、を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが、組織サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルの個々の一次画像が、該サンプルの個々の切片がスライスされる前に生成され、該サンプルの個々の切片が該個々の一次画像と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の一次画像に基づき、前記サンプルの仮想モデルを生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルの同時位置合わせされた複数の二次画像を、前記仮想モデルに同時位置合わせする工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルの仮想モデルおよび前記同時位置合わせされた複数の二次画像の同時位置合わせに応答して、診断を生成する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
個々の一次画像を、対応する個々の二次画像と同時位置合わせする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記個々の一次画像に基づき、対応する個々の二次画像を歪める工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、ナイフエッジ走査顕微鏡（ＫＥＳＭ）でスライスされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルを複数の切片にスライスする工程が、該サンプルのブロック面をスライスすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の切片を、複数のスライドにマウントする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の切片が、抗原またはタンパク質染色で染色される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
伸張、剪断、並進、回転、スプライン、非線形補間、または光学矯正変換の１つ以上を用いて、前記二次画像を歪める工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
個々の一次画像および個々の二次画像の合成画像を生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２０１５年７月１０に出願された米国仮出願番号第６２／１９０，９３１号の利益を主張し、この出願は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本開示は、一般に、診断目的または研究目的のために組織をスライスし、撮像し、そして染色する方法に関する。特に、本開示は、連続切片顕微鏡法、ミクロトームを用いる生物学的組織およびその他の材料サンプルの切片化法、そしてより詳細には、免疫組織化学的抗原で染色された組織サンプルを撮像する方法に関する。
【０００３】
免疫組織化学は、抗原のセットが生物学的組織の切片に付与されるプロセスである。免疫組織化学的染色は、一般に、組織のサンプル中の特定の抗原について試験するために抗体を採用して、異常細胞を識別するために用いられる。この抗体は、通常、顕微鏡下で組織中の抗原が可視的になるようにする放射活性物質または色素に連結され、そしてこのプロセスは、一般に、種々の癌細胞株を検出するために異なる染色のパネルまたはシリーズにおいて行われる。
【０００４】
本開示は、ＫＥＳＭ技術を用いて可能にされる新規な方法およびプロセスを用いることにより、免疫組織化学で伝統的に用いられているいくつかの異なるワークフローを集束および最適化する。当該技術分野の現在の状態を代表する伝統的ワークフローの以下の３つの研究を呈示することにより、本明細書に記載のような新規かつ有用な方法が、より良好に理解され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本開示は、一般に、医療診断または研究のために特定の生物学的マーカーを検出するために、目的物を、ミクロトームを用いて撮像し、そして免疫組織化学染色を適用するためのシステムおよび方法に関する。特に、本開示は、ナイフエッジ走査顕微鏡を用いて生物学的組織およびその他の材料サンプルを切片にすること、および個々の切片に染色を付与すること、ならびにサンプルを横切る種々の染色および反応を比較するためにナイフエッジ走査技術によって可能にされる空間多重化方法を用いることによって、これらの診断学のための連続切片顕微鏡法を用いることに関する。
【０００６】
以下は、複数の対比試薬を用いて組織サンプルの迅速病理学的および／または組織学的検査のための技術に関する。ナイフエッジ走査顕微鏡によって可能にされる組織取扱いの前にさらなる造影ステップを実施することによって、撮像された目的物の基礎的形状が、物理的または化学的変形がなされる前に捕捉され得る。それ故、変形されたスライスは、サンプルのもとの座標系に戻って位置合わせされ得る。これはまた、単一サンプルの多くの連続的切片を横切る生物学的マーカーをより良好に同一場所に置く特有の能力を呈示し得、そして、化学的または機械的処置後、互いに対して個々の切片を再マップするための中間撮像ステップを用いることにより、全体として、組織のより正確な表示を生成し得る。これは、複数の対比試薬が、より少ない歪みで伝統的なワークフローより迅速にサンプルを横切って迅速に比較されることを可能にすることによって、特有の利点を提供し得る。
【０００７】
本開示のその他の目的および利点は、以下の説明および添付の図面と組み合わせて考慮されるとき、さらに認識および理解される。以下の説明は、本開示の特定の実施形態を記載する特定の詳細を含み得るが、それらは、本開示の範囲に対する制限と解釈されるべきではなく、むしろ好ましい実施形態の例示としてである。本開示の各局面について、本明細書で示唆されるように、当業者に公知である多くの改変が可能である。種々の変更および改変が本開示の範囲内で、その思想から逸脱することなくなされ得る。
【０００８】
より特定すれば、本願明細書は、以下の項目に関する構成を記載する。
（項目１）
サンプルを分析する方法であって：
上記サンプルの複数の画像を生成する工程；
上記サンプルを複数の切片にスライスする工程；
上記複数の切片を染色する工程；
複数の染色された切片を撮像することにより、上記サンプルの複数の二次画像を生成する工程；および
上記サンプルの複数の二次画像を互いと同時位置合わせする工程、を含む方法。
（項目２）
上記サンプルが、組織サンプルを含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
上記サンプルの個々の一次画像が、上記サンプルの個々の切片がスライスされる前に生成され、上記サンプルの個々の切片が上記個々の一次画像と関連する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
上記複数の一次画像に基づき、上記サンプルの仮想モデルを生成する工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記サンプルの同時位置合わせされた複数の二次画像を、上記仮想モデルに同時位置合わせする工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記サンプルの仮想モデルおよび上記同時位置合わせされた複数の二次画像の同時位置合わせに応答して、診断を生成する工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
個々の一次画像を、対応する個々の二次画像と同時位置合わせする工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記個々の一次画像に基づき、対応する個々の二次画像を歪める工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
上記サンプルが、ナイフエッジ走査顕微鏡（ＫＥＳＭ）でスライスされる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記サンプルを複数の切片にスライスする工程が、上記サンプルのブロック面をスライスすることを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記複数の切片を、複数のスライドにマウントする工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記複数の切片が、抗原またはタンパク質染色で染色される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
伸張、剪断、並進、回転、スプライン、非線形補間、または光学矯正変換の１つ以上を用いて、上記二次画像を歪める工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
【０００９】
（項目１４）
個々の一次画像および個々の二次画像の合成画像を生成する工程をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
【００１０】
（摘要）
以下は、１つ以上の撮像操作から仮想画像のアセンブリによって顕微鏡法または組織学染色の同時局在化のための方法に関する。特に、この方法は、生物学的サンプルの複数の標識された抗原またはタンパク質組織学画像を得るために必要な時間を低減する。この方法は、組織が、ナイフエッジ走査顕微鏡とともにミクロトームによってスライスされるとき、この組織を撮像すること、および生成された画像によってこのサンプルを空間的に整列することを含む。この方法によって可能にされるサンプルの空間的整列は、異なる抗原またはタンパク質の二次または機能的染色のパネルが、異なるサンプルスライスを横切って比較されることを可能にし、それによって、組織および細胞の同時二次染色を可能にする。
【００１１】
（参照による援用）
本明細書で陳述されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が詳細かつ個々に示されているように参考として援用されるのと同じ程度まで本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項とともに呈示される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示の実施形態を呈示する以下の詳細な説明を参照することによって得られ得、そして添付の図面は以下の通りである。
【図１Ａ】図１Ａは、当該技術分野の現在の状態を用いる代表的な解剖学者のワークフローの概略表示である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、当該技術分野の現在の状態を用いる代表的な組織学者または病理学者のワークフローの概略表示である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、当該技術分野の現在の状態を用いる代表的な生物学者のワークフローの概略表示である。
【図１Ｄ１】図１Ｄ１は、当該技術分野の現在の状態を用いる代表的なワークフローでどのように画像歪みが生じるかの概略表示である。
【図１Ｄ２】図１Ｄ２は、本明細書に記載される技術を用いる空間的に多重化することが、歪んでいない画像に整列することによって画像スタックを整列するプロセスをどのように改善するのかの概略表示である。
【図２Ａ】図２Ａは、本明細書に記載される空間的多重化法を用いるサンプルを撮像するためのステップの概略表示である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、横に並んだ表示による一次および二次画像の同時位置合わせの概略表示である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、同時染色反応の合成画像を生成するための数学的組み合わせによって適用された異なる染色を用いたいくつかのＺ画像の同時位置合わせの概略表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
改良されたシステムおよび方法が、上記のように、組織サンプルをスライスし、染色し、そして撮像する３つの伝統的なプロセスと比較することによって、本明細書中に開示される。本開示は、ＫＥＳＭ技術によって可能にされる、切片化のときか、またはその前でさらなる撮像ステップ（単数または複数）を導入することによって、３つの前述のワークフローに対する改良を含む。
【００１４】
（定義）
「免疫組織化学」は、蛍光色素または染色のようなマーカーによって可視化され得る、抗原−抗体相互作用を引き起こす特定試薬として標識された抗体の使用による、組織切片における抗原またはタンパク質の適用をいい得る。
【００１５】
「連続切片顕微鏡法」は、ミクロトームで連続的な切片をとり、そしてそれらを、伝統的にスライスをガラスにマウントし、そして染色することによって撮像する実践をいい得る。
【００１６】
「ナイフエッジ走査顕微鏡」または「ＫＥＳＭ」は、自動化様式で連続切片顕微鏡法を実施する顕微鏡をいい得る。米国特許第６，７４４，５７２号を参照のこと。
【００１７】
「切片」または「スライス」は、サンプルとナイフとの間の相対的移動によってブロック面から除去された連続的材料の単一の細片をいい得る。
【００１８】
「ミクロトーム」は、材料の非常に薄い層が、ブロックの表面から除去、または切片化されるように、材料のブロックが正確に切断されるデバイスをいい得る。同様に、用語「ミクロトミー」は、ミクロトームの作動に適用され得る。
【００１９】
「形象（ｉｍａｇｅｒｙ）」は、「画像（ｉｍａｇｅ）」を測定するために設計された任意の技法、光学的または電気的応答の空間的マップを含み得る。これは、光学的または電子顕微鏡法技法を含み得る。
【００２０】
「撮像（ｉｍａｇｉｎｇ）」は、一般に、所定の領域の可視化を生成するためのデータ収集をいい得る。
【００２１】
「位置合わせ（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「同時位置合わせ」は、画像が互いに一致するように、整列され、引き延ばされ、および変形される計算ステップをいい得る。連続切片化顕微鏡法を参照して、このステップは、スライスすること、マウントすること、および化学的処理からの組織の変形を矯正し得る。
【００２２】
「多重」または「多重化」は、マトリックスの両側に、２つの選択的取扱いシステムを有すること、それ故、ＮＡ２位置を取り扱うために２Ｎセクターのみを必要とすることにより、マトリックス内の１つの位置を選択する方法をいい得る。
【００２３】
「染色」は、色素を取り付けること、遺伝子的に発現された発蛍光団、または撮像されるべく標的構造を改変するように設計された化学を含むがこれらに限定されない方法によって、媒体のすべてまたは一部の光量子応答を変更することを狙う化学的処理をいい得る。これは、伝統的な光顕微鏡法染色、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）標識技法において用いられる対比試薬を含むがこれらに制限されない。
【００２４】
「分子診断」は、組織のサンプルを取り、そして診断を行うために生物学的マーカーを識別する、化学的試験またはアッセイの形態をいい得る。
【００２５】
「変換」は、非染色画像から別の染色画像への画像における単一の点の再マッピングをいい得る。
【００２６】
「補間法」は、別の数値フィールドに由来する数値の選択的空間的サンプリングのための方法を包含する。一般的に用いられる方法は、「最近傍」補間法、線形、多項式、またはｂ−スプラインを基礎にした技法を含み得る。これらは、一般に、変換された画像の別個の「補間」値を計算するため、または所定の空間座標における関数の値を近似するために用いられる。
【００２７】
（定義）
ミクロトームからスライドガラスに切片を捕捉およびマウントするプロセスは、組織を物理的に歪め得る。この歪みは、薄く、かつ繊細な組織のたわみ、切片の折り畳み、または引き裂きでさえであり得る。このたわみは、連続的な切片の単純な整列を阻害し得る。なぜなら、顕微鏡的特徴が、切片から切片に適正に一列に並ばないかも知れないからである。代表的には、これらの歪みは、手動の編集およびソフトウェアの組み合わせを用いて矯正されなければならず、ここで、位置合わせマークが隣接する画像上で選択され、そしてソフトウェアが、位置合わせマークを整列する。このプロセスは、しばしば、遅くかつ困難であり、そして連続的切片化のより広く拡散する採用を妨げ得る。
【００２８】
（染色およびスライス厚み）
スライス厚みを制御することはいくつかの理由のために重要であり得る。
【００２９】
１．引き続き取り扱うこと、染色すること、マウントすること、および処理することのために切片の構造的／アーキテクチャ的一体性を維持すること。
【００３０】
２．切片が解像される構造に適切な厚みであることを確実にすること。スライスは、特有の特徴が、スライス内で適合するように十分に厚くあるべきである。細胞の特徴付けにおいて、スライスは、代表的には、平面に１〜２層の細胞を可能にするような厚さである。厚すぎる場合、細胞の多くの層が、能力を曖昧にし得、細胞レベルの詳細を曖昧にする。同様に、スライスが薄すぎる場合、単一の細胞層内の関係する特徴が切り捨てられ得る。
【００３１】
３．スライスが付随する特徴を適切に標識する染色の化学的動力学に十分に薄いことを確実にすること。多くの対比試薬は大きな分子を採用し、これは、それらが拡散し得、そしてそれに応じて標識する組織の量が制限され得る。
【００３２】
同様に、基礎材料の化学的動力学に依存し得る対比試薬は、厚い切片または薄い切片に対して異なって挙動し得る。
【００３３】
組織学または病理学ラボにおいては、異なる染色／対比技法のために異なる厚みのスライスを切断することが一般的な実践である。これは、迅速な結果が必要であるか（代表的には、薄いスライスはより迅速に染色され得る）、またはＩＨＣ法またはＩＳＨ法のように、複雑な化学が、染色において採用されるとき特に真実である。
【００３４】
（解剖学者ワークフロー）
生物学者が、空間の三次元容量を横切る組織性質を測定することを欲し得る多くの理由がある。当該技術分野の現在の状態を用いてこれをなすために、いくつかのスライスが切断され、染色され、そして互いに対して同時位置合わせされ得る。図１Ａは、当該技術分野の現在の状態を採用する代表的な解剖学者のワークフロー１００Ａを示す図である。ステップ１１１において、サンプル１０１が、第１の厚い切片１２１Ａ、第２の厚い切片１２１Ｂ、および第３の厚い切片１２１Ｃのような１つ以上の厚い切片にスライスされ得る。厚い切片１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃはステップ１３１で染色され得、そして厚い切片１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃは、次いで、ステップ１４１で撮像され、そして互いと同時位置合わせされ得る。
【００３５】
（組織学者／病理学者ワークフロー）
同様に、組織学者または病理学者が疾患組織の診断をなすことを試みているとき、いくつかの厚い切片１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃが切断され得る。次いで、１つは、ステップ１５１で染色、撮像および検査され得る。医療専門家からの形象入力に基づき、このプロセスは、ステップ１６１で最終的に診断が成される前に、数回繰り返され得、そしてこれら厚い切片の１つの診断が、さらなる厚い切片の染色、撮像、および検査に情報を与えるために用いられ得る。ステップ１７１で、染色された厚い切片の診断は、患者のための適切な処置を示し得る。図１Ｂは、当該技術分野の現在の状態を採用する代表的な組織学者または病理学者のワークフロー１００Ｂを示す図である。
【００３６】
（生物学者ワークフロー）
生物学研究者は、代表的には、免疫組織化学的染色技法を採用し、そこでは、特定の組織片が染色され、撮像され、次いで、組織の切片から染色がはぎ取られてきれいにされる。この染色およびはぎ取りプロセスは、組織のサンプル片に対して染色の全パネルの免疫または抗原反応を撮像するために繰り返され得る。図１Ｃは、当該技術分野の現在の状態を採用する代表的な生物学者のワークフロー１００Ｃを示す図である。サンプル１０１が、ステップ１８１で、スライスされ得、スライドに配置され得る。ステップ１９１では、スライス／スライドは染色され得る。ステップ１０１１で、染色されたスライド／スライスは撮像され得る。ステップ１０３１で画像は記憶され得る。ステップ１０２１で、染色が除去され得、そしてスライド／スライスは、ステップ１９１でもう一回染色され得る。
【００３７】
染色を止める、撮像する、染色をはぎ取る、再染色する、染色を再撮像する、次いで再び再撮像するこのプロセスは、連続多重化として知られている。免疫組織化学で生物学者によって一般に用いられるこのアプローチは、時間を浪費し、しばしば抗原染色の完全パネルを終了するために１週間以上を要する。
【００３８】
別のアプローチは、病理学者からの検査に基づく、次の切片の鑑別染色である。これは、かなり長い往復時間、ならびに医師からの増加した相互作用の必要性に至り得る。
【００３９】
これらのアプローチのすべては、本開示の範囲が対処することを求める基礎的な欠点を有する。−  各々が、同時位置合わせの最終プロセスを、困難、誤りがち、そして時間を浪費するものにし得る、特有の変形、歪みおよびスライド中のアーチファクトを導入するスライドマウンティング、染色、および撮像。
−しばしば多数の連続ステップがあり、その各々は、高品質の信頼性のある結果が生じされるべきである場合、細部まで顕著なヒトの労働および注意を含み得る。
−  サンプルの３Ｄ性質を考えると、複数の特徴は、隣接するスライスでさえ、横切って変化し得、そして自動化された特徴抽出、およびたわみ矯正は、より大きなサンプルでは困難である。
【００４０】
本開示は、サンプルに対する複数の染色を処理するために必要なヒトの努力を低減し、そして本明細書中で適用されるようなＫＥＳＭ技術によって可能になるさらなる撮像ステップを導入することによって再構築された産物の正確さを増大するシステムおよび方法を記載する。
【００４１】
（処理後の歪み）
代表的な連続切片顕微鏡法では、スライスはヒトの注釈またはアルゴリズムを用いて整列され、そこでは、マウンティングの間のたわみが再構築の前に矯正される。このプロセスは、代表的には、隣接する切片を横切って存在する点である位置合わせマークの選択を含む。この位置合わせ点は、画像中の画素を整列にもたらすために両方の画像に適用される変換関数を計算するために用いられ得る。一連の画像を横切る位置合わせマークを選択することは困難であり得る。なぜなら、スタック中の画像の各々は次とは異なるからである。複数の特徴はまた、切断面に正確に垂直に交差することは希であり、位置合わせマークのために同じ特徴が選択される場合、これらの特徴は、切片を横切って空間的にドリフトし得、そしてそれ故、例えば、傾斜にある目的物は、垂直であると誤解釈され得る。
【００４２】
本明細書で開示されるように、画像の後処理は改善され得る。なぜなら、歪みの後処理は、まさに同じ切片、歪みのない１つ、そして歪みない１つ以上の２つの画像に対して実施され得るからである。複数の画像が同じスライスのものであるので、同じ正確な位置合わせマークがすべての画像上にあり、選択プロセスをより容易、およびより首尾一貫したものにする。同じ現象がまた、そうでなければ切断面に対して傾斜して移動する円筒形特徴について生じるであろう空間的ドリフトを低減し得る。図１Ｄ１および図１Ｄ２は、当該技術分野の現在の状態を採用してどのように歪みが起こるのかを（図１Ｄ１）、本明細書で開示されるようにこれらの歪みについてどのように画像後処理が改善され得る（図１Ｄ２）のかを比較して示す。
【００４３】
図１Ｄ１に示されるように、目的物１０３は、２つのスライス１０５Ａおよび１０５Ｂにスライスされ得るサンプル１０１中に存在し得る。画像１０７Ａ、１０７Ｂが、各スライス１０５Ａ、１０５Ｂについてそれぞれ生成され得て、異なる深さにある目的物１０３を示す。
【００４４】
図１Ｄ２に示されるように、目的物１０３は、２つのスライス１０５Ａおよび１０５Ｂにスライスされ得るサンプル１０１中に存在し得る。一次画像および二次画像が、これらスライス１０５Ａおよび１０５Ｂの各々について生成され得（一次スライス１０５Ａについて一次画像１０９Ａ１および二次画像１０９Ａ２、および二次スライス１０５Ｂについて一次画像１０９Ｂ１および二次画像１０９Ｂ２など）。
【００４５】
（一次撮像）
本明細書に記載されるように、この方法の第１のステップは、一次撮像（ＰＩ）ステップを含み、これは、処理前の切片または処理後の切片の視野を捕捉し得る。これは、スライシング前のサンプルを撮像することにより、またはスライシングの間に撮像することにより達成され得る。一次撮像はＫＥＳＭを用いて実施され得、これはスライシング操作の間にブロック面上のたわんでいない画像を捕捉し得る。これらの画像は、Ｘ＿Ｎとして言及され得る。このＰＩステップを取り込むことにより、二次撮像（ＳＩ）ステップは、実際の当初の形状およびスライスの位置への直接的アンカを有し得、これは、サンプルの染色反応のより良好な位置合わせおよび分析を可能にし得る。図２Ａは、空間的多重化法２００のための撮像ステップを示す図である。サンプル１０１は、薄い切片２２１Ａがサンプル１０１からスライスされる前に一次撮像ステップ２１１Ａ中に撮像され得る。さらなる一次撮像ステップ２１１Ｂ〜２１１Ｎは、さらなる薄い切片２２１Ｂ〜２２１Ｎへのサンプルのさらなるスライシングの前に実施され得る。一次画像が集められ、そして互いと位置合わせされ得、仮想の厚いスライス２２３を生成する。
【００４６】
本明細書に記載されるように、ＰＩステップ（２２１Ａ，２２１Ｂ，  …  ２２１Ｎ）の後、スライス（単数または複数）はスライドガラス上にマウントされ得、そして抗原染色またはタンパク質染色が、次いでさらなる分析のためにステップ２３１でサンプルスライスに適用され得る。
【００４７】
（二次撮像）
本開示の別の局面は、二次撮像（ＳＩ）ステップ（単数または複数）２４１Ａ，２４１Ｂ，…２４１Ｎを含む。このＳＩステップでは、ＫＥＳＭが、染色または染色２３１の完全なパネルが適用された後、サンプル１０１の染色されたスライスを撮像するために用いられ得る。このステップ（単数または複数）は、所望されるような多くの回数繰り返され得、各回に新たな染色がサンプルに適用されてスライスを再撮像する。これらの画像は、Ｙ＿ｎと言及される。
【００４８】
（再構築）
本開示の別の局面は、再構築ステップを記載する。再構築ステップでは、種々の計算が、異なる染色された画像を横切る再構築された画像を生成するために採用され得る。図２Ａに示されるように、二次画像が集められ得、そして互いと位置合わせされ、同時位置合わせ染色２４３のスタックを生成する。一次仮想の厚いスライス２２３、および染色されたスライス２４２の同時位置合わせスタックが、データ集積または診断ステップ２５１で分析され得る。
【００４９】
本明細書で記載されるように、Ｙ＿ｎ画像の計算変換は、種々のサンプルスライスを互いに再構築および空間的に整列するために実施され得る。染色されたＹ＿ｎ画像のパネルは、計算変換を採用することにより、Ｘ＿ｎ画像によって確立されたバイオマーカー座標に戻ってマップされ得る。これらの再マップされた画像は、Ｚ＿ｎと称され得る。これらの計算変換は、制限されずに以下を含む。
【００５０】
ａ．画像を横切って可視変数またはバイオマーカーをマップするための伸張、剪断、並進、回転、およびより一般的なアフィン（ａｆｆｉｎ）変換を含み得る「プロクルステス（Ｐｒｏｃｒｕｓｔｅａｎ）」変換。
【００５１】
ｂ．アフィン変換および非アフィン変換の両方を取り込む、目的物の曲率を一致させることによりバイオマーカーをマップするための、基礎スプライン、またはその他の非線形補間スキームを採用する「弾性シート」タイプの変換。
【００５２】
ｃ．一次および二次撮像の光学の間の差異を説明するための光学的ベースの矯正。これは、斜視、バレル、ピンクッション、および着色矯正を含み得る。
【００５３】
（同時位置合わせ）
本開示の別の局面は、同時位置合わせステップを記載し、ここで、ＫＥＳＭによって捕捉されたＰＩおよびＳＩステップからの画像が比較され、そして再構築ステップで確立された、マップされたバイオマーカーを基に互いに整列される。
【００５４】
本明細書に記載のように、Ｚ＿ｎ画像のスタックが、異なる染色を同時位置合わせするためにスーパーインポウズされ得る。このステップは、染色の完全パネルを終了し、そして同時位置合わせされた画像に基づく結果を比較するために繰り返され得る。同時位置合わせステップを終了するための方法は、以下を含み得る。
【００５５】
ａ．Ｚ＿ｎ画像の横に並べた呈示、レンダリング、または画像オーバーレイ。図２Ｂは、横に並んだ呈示法を用いて一次画像２６１および二次画像２６２がどのように同時位置合わせされ、そして合成画像２６３として示され得るのかを示す。
【００５６】
ｂ．どこに異なる染色が存在するのか、そして／または同時に起こるのかを示し得る合成画像または仮想「スライス」を生成するためのいくつかのＺ画像の数学的組み合わせ。図２Ｃは、どのように、いくつかの画像２７１，２７２，２７３が、数学的組み合わせによって、合成画像２７４を生成するために組み合わせられ得るのかを示す。
【００５７】
（さらなる実施形態）
ワークフローのさらなる実施形態は、マウントするステップと染色するステップとの間のさらなる撮像ステップとともに、上記のワークフロー２００に類似し得る。
【００５８】
上記の説明（単数または複数）は、図２Ａ中の単一のスライスの処理を記載する。一次撮像情報を用いて、複数のスライスが、サンプル内で上下にスライスに対するＺ平面を横切って整列され得る。この係留を用いて、上記のワークフロー１００Ａ、１００Ｂ，１００Ｃが以下の様式で置換され得る。
【００５９】
−  解剖学者ワークフロー１００Ａ：「染色パネル」中の染色のすべてが、同じになされ得る。各染色されたスライスは、その一次撮像に戻って、そして一次画像は互いにリンクされ得る。これは、再構築の質を改善し得、そしてヒト関与の割合を最小にし得ることの両方を行う。
【００６０】
−  組織学者／病理学者ワークフロー１００Ｂ：多数の要求された染色が、パネル内で独立して実行され得る。これらの染色された画像の各々は、一次撮像に戻って再びリンクされ得、そして多くの層／対比試薬が全体サンプルに戻ってリンクされ得る。これは、医療専門家が関与されるであろう繰り返しの数を最少にし得、そしてより迅速な診断、およびラボ分析に関するより早い往復時間に至る。
【００６１】
−  生物学者ワークフロー１００Ｃ：いくつかの異なる染色は、間にさしはさまれた層に対して繰り返され得る。このようにして、染色は、サンプル容量上で多重化され得、そして例は、ａ、ｂ、ｃと標識された３つの染色を含み：
【００６２】
【化１】
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【００６３】
のように見えるであろう。
【００６４】
この多重化アプローチは、容量を横切る標識のより大きな３Ｄ分布を与え、その一方、各スライスを全体のブロックに戻ってつなぐ。さらに、染色された情報は、隣接する切片を横切って補間され得る。
【００６５】
これらの実施形態はまた、少なくとも以下の様式のいずれか１つにおいて増強され得る。
【００６６】
１．いくつかのチャネルの画像は、１つに組み合わせられ得、仮想のマルチチャネルパネル画像を生成する。
【００６７】
２．最適切片化厚み、および染色の数が、一次撮像で観察された特徴によって決定され得る。すなわち、いくつかの特徴は、大きくあり得、そして厚い切片が適切であり得、ここでその他の特徴は、より小さく、そして薄い切片を必要にし得る。
【００６８】
３．全体のパネルは、一度に決定される必要はない。撮像の第１のラウンドの出力は、第２のラウンドを決定するために用いられ得る。
【００６９】
４．切片の厚みは、染色化学に対して調節され得る。すなわち、より薄い、またはより厚い切片が、各特定の対比試薬の性質に対して最適化された多重化染色に対して切断され得る。
【００７０】
５．ｎ番目のスライス毎に、一次撮像に基づき異なって処理され得る。これは以下を含み得る：
６．問題の染色について最適の厚みでスライスされる。
【００７１】
７．分子診断またはその他の化学的アッセイに転送される。
【００７２】
８．撮像またはスライス中のサンプルのスライシング欠陥または欠如に基づき棄てられる。
【００７３】
９．規制に準拠するように達成される。
【００７４】
１０．上記のように、しかし、それに代わって、一次撮像ステップに基づき、スライス処理処置決定を行う。
【００７５】
本開示の好ましい実施形態が本明細中に示され、そして記載されているが、このような実施形態は、例示のみによって提供されることが当業者に明らかである。多くの改変、変更、および置換が、本開示の範囲から逸脱することなく当業者にここで起こり得る。本明細書中に記載される現在の開示の実施形態に対する種々の代替物が、本開示の発明を実施することで採用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を規定し、しかも、これら請求項およびそれらの等価物の範囲内の方法および構造が、請求項によってカバーされることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ１】
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【図１Ｄ２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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