(57)【要約】【課題】従来の胃癌の治療方法とは異なり、frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入する方法を提供すること。【解決手段】frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を、超音波照射及びマイクロバブルを形成する造影剤を使用して胃癌細胞に導入すれば、該化合物は効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入できることを確認して、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を含む胃癌治療剤であって、
該化合物は超音波照射により胃癌細胞に導入されることを特徴とする胃癌治療剤。
【請求項２】
前記Frizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物は、Frizzled-2の発現を抑制するsiRNA又はshRNAを有効成分として含有することを特徴とする請求項１に記載の胃癌治療剤。
【請求項３】
前記Frizzled-2の発現を抑制する作用を有する化合物が、frizzled-2に対するshRNAであり、ここで該shRNAの二重鎖RNA部分が配列番号１に記載の塩基配列から転写されたオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる請求項２に記載の胃癌治療剤。
【請求項４】
前記Frizzled-2の発現を抑制する作用を有する化合物が、frizzled-2に対するsiRNAであり、ここで該siRNAの二重鎖RNA部分が配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる請求項２に記載の胃癌治療剤。
【請求項５】
前記マイクロバブルを形成する造影剤は、ペルフルブタンマイクロバブルである請求項１〜４のいずれか１に記載の胃癌治療剤。
【請求項６】
二重鎖RNA部分が配列番号１に記載の塩基配列から転写されたオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むfrizzled-2に対するshRNA並びにペルフルブタンマイクロバブルを含む胃癌治療剤であって、
該shRNAは超音波照射により胃癌細胞に導入されることを特徴とする胃癌治療剤。
【請求項７】
以下の工程を含む細胞に標的遺伝子を導入する方法：
（１）標的遺伝子、ペルフルブタンマイクロバブル及び細胞を共存させる環境を作成する工程、及び
（２）該環境に超音波を照射する工程。
【請求項８】
以下の工程を含む胃癌の治療方法：
（１）frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を胃癌患者の胃に投与する工程；及び
（２）該胃癌患者の胃の胃癌部に超音波を照射する工程。
【請求項９】
前記Frizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物は、Frizzled-2の発現を抑制するsiRNA又はshRNAを有効成分として含有することを特徴とする請求項８に記載の胃癌の治療方法。
【請求項１０】
前記マイクロバブルを形成する造影剤は、ペルフルブタンマイクロバブルである請求項８又は９に記載の胃癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌治療剤及び標的遺伝子導入法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（frizzled）
frizzledがコードするタンパク質であるFrizzledは細胞表面受容体であり、Wntリガンドの作用を媒介する。以下、frizzled（遺伝子）及びFrizzled（タンパク質）を、それぞれ、fz及びFzと略称することがある。例えば、frrizled-2をfz2、Frrizled-2をFz2と略称することがある。fzファミリー遺伝子は、構造および機能の相同性に基づいて10種類が同定されている。Fzは発癌および胚発生に関与することが知られている。
【０００３】
（Fzの発現抑制による癌の治療方法）
Fzの発現抑制により腫瘍増殖が抑制されたことが報告されている。
fz10に対するsiRNAを用いた滑膜肉腫の治療方法が開示されている（特許文献１）。
fz7に対するsiRNAを大腸癌に導入することにより大腸癌の増殖を抑制する方法が報告されている（非特許文献１）。
fz2に対するsiRNAを用いた肺癌、肺芽腫及び膵癌の治療剤が開示されている（特許文献２）。
fz9に対するsiRNAを用いた肝癌の治療剤が開示されている（特許文献３）。
しかしながら、上記報告では、胃癌の治療剤を開示又は示唆をしていない。
【０００４】
fz2に対するshRNA（short-hairpin RNA）を用いた胃癌の治療方法が開示されている（非特許文献２）。しかし、該shRNAとマイクロバブルを形成する造影剤を共存させて、該shRNAを超音波照射により胃癌細胞に導入することは開示又は示唆をされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５０９０７６号公報
【特許文献２】特開２０１３−５３１１４号公報
【特許文献３】特開２０１０−２３５５１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ウエノ（Ueno K.）ら、「Frizzled-7 as a potential therapeutic target in colorectal cancer」、ネオプラジア（Neoplasia）、2008年、第10巻、p.697-705。
【非特許文献２】Minoru Tomizawaら、「INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 」46：1018-1024, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
fz2に対するshRNAを生体の胃の胃癌部の胃癌細胞に導入するにはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等を使用した方法がある。しかし、これらの方法では、遺伝子導入効率は低く、さらに胃の健常部にも導入される可能性がある。
本発明では、従来の胃癌の治療方法とは異なり、frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を、超音波照射及びマイクロバブルを形成する造影剤を使用して胃癌細胞に導入すれば、該化合物は効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入できることを確認して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の〔１〕〜〔１０〕である。
〔１〕frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を含む胃癌治療剤であって、
該化合物は超音波照射により胃癌細胞に導入されることを特徴とする胃癌治療剤。
〔２〕前記Frizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物は、Frizzled-2の発現を抑制するsiRNA又はshRNAを有効成分として含有することを特徴とする前記の〔１〕に記載の胃癌治療剤。
〔３〕前記Frizzled-2の発現を抑制する作用を有する化合物が、frizzled-2に対するshRNAであり、ここで該shRNAの二重鎖RNA部分が配列番号１に記載の塩基配列から転写されたオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる前記の〔２〕に記載の胃癌治療剤。
〔４〕前記Frizzled-2の発現を抑制する作用を有する化合物が、frizzled-2に対するsiRNAであり、ここで該siRNAの二重鎖RNA部分が配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる前記の〔２〕に記載の胃癌治療剤。
〔５〕前記マイクロバブルを形成する造影剤は、ペルフルブタンマイクロバブルである前記の〔１〕〜〔４〕のいずれか１に記載の胃癌治療剤。
〔６〕二重鎖RNA部分が配列番号１に記載の塩基配列から転写されたオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むfrizzled-2に対するshRNA並びにペルフルブタンマイクロバブルを含む胃癌治療剤であって、
該shRNAは超音波照射により胃癌細胞に導入されることを特徴とする胃癌治療剤。
〔７〕以下の工程を含む細胞に標的遺伝子を導入する方法：
（１）標的遺伝子、ペルフルブタンマイクロバブル及び細胞を共存させる環境を作成する工程、及び
（２）該環境に超音波を照射する工程。
〔８〕以下の工程を含む胃癌の治療方法：
（１）frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を胃癌患者の胃に投与する工程；及び
（２）該胃癌患者の胃の胃癌部に超音波を照射する工程。
〔９〕前記Frizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物は、Frizzled-2の発現を抑制するsiRNA又はshRNAを有効成分として含有することを特徴とする前記の〔８〕に記載の胃癌の治療方法。
〔１０〕前記マイクロバブルを形成する造影剤は、ペルフルブタンマイクロバブルである前記の〔８〕又は〔９〕に記載の胃癌の治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の胃癌治療剤は、Frizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物であるshRNAを効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入でき、さらに、胃癌細胞の増殖を抑えることができるので、優れた治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】超音波内視鏡による照射。（Ａ）超音波内視鏡は先端に超音波診断装置が装着されている。（Ｂ）先端に風船を装着し、水で満たして超音波の伝達を容易にしている。（Ｃ）96孔培養皿の底に超音波内視鏡を接着させている。（Ｄ）超音波内視鏡より超音波を照射中、モニターにより照射野を確認している。「*」及び「矢頭」は、それぞれ、「Ｃにおけるプローブ」及び「培養皿の底」を示す。
【図２】ヨウ素デンプン反応。ヨウ素とデンプンを培地に溶解し96孔プレートに入れ、底から超音波内視鏡を用いて超音波を照射した。培地にはペルフルブタンマイクロバブルを添加した。1分間照射後490nmにおける吸光度を測定した。「*」は、ペルフルブタンマイクロバブル0%に比して有意に吸光度が高値を呈した(one-way analysis of variance, P<0.05)。
【図３】ルシフェラーゼアッセイ。96孔プレートに胃癌細胞株MKN45（Ａ）とMKN74（Ｂ）を培養した。培地にpMetLuc2-controlを添加し、プレートの底から超音波内視鏡を用いて超音波を照射した。48時間後ルシフェラーゼアッセイを行った。「*」は、ペルフルブタンマイクロバブル0%に比して有意にルシフェラーゼ活性が高値を呈した(one-way analysis of variance, P<0.05)。
【図４】Short-hairpin RNA frizzled 2（以下、shRNA-fz2と略称することがある）を添加し、超音波内視鏡にて超音波照射後の細胞増殖の抑制。96孔プレートに胃癌細胞株MKN45（Ａ）とMKN74（Ｂ）を培養した。培地にshort-hairpin RNA frizzled 2を添加し、超音波内視鏡を用いて超音波を照射した。72時間後細胞増殖を3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt (MTS)アッセイを行った。490nmにて吸光度測定を行った。「*」は、ペルフルブタンマイクロバブル0%に比して有意に吸光度が低値を呈した(one-way analysis of variance, P<0.05)。  各レーンは、以下の通りである。  レーン１：超音波内視鏡装置での超音波照射又は遺伝子導入（リポフェクタミンLTXを使用）なし  レーン２：遺伝子導入（リポフェクタミンLTXを使用）を使用してのshRNA-fz2の導入  レーン３：超音波内視鏡装置での超音波及び0％のペルフルブタンマイクロバブルを使用してのshRNA-fz2の導入  レーン４：超音波内視鏡装置での超音波及び1％のペルフルブタンマイクロバブルを使用してのshRNA-fz2の導入  レーン５：超音波内視鏡装置での超音波及び3％のペルフルブタンマイクロバブルを使用してのshRNA-fz2の導入  レーン６：超音波内視鏡装置での超音波及び10％のペルフルブタンマイクロバブルを使用してのshRNA-fz2の導入  レーン７：超音波内視鏡装置での超音波及び30％のペルフルブタンマイクロバブルを使用してのshRNA-fz2の導入  * P<0.05対LTX、N=3。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本発明の対象）
本発明は、「frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を含む胃癌治療剤であって、該化合物は超音波照射により胃癌細胞に導入されることを特徴とする胃癌治療剤」、「（１）標的遺伝子、マイクロバブルを形成する造影剤及び細胞を共存させる環境を作成する工程及び（２）該環境に超音波を照射する工程を含む標的遺伝子を細胞に導入する方法」並びに「（１）frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を胃癌患者の胃に投与する工程及び（２）該胃癌患者の胃の胃癌部に超音波を照射する工程を含む胃癌の治療方法」に関する。以下に詳細に説明する。
【００１３】
（Fz2）
本発明の「Fz2」とは、哺乳類、特にヒト由来の配列番号３に記載の塩基配列で表されるDNAによりコードされるタンパク質を例示できる。Fz2は、配列番号３に記載の塩基配列で表されるヒト由来のDNAによりコードされるタンパク質に制限されず、このDNAと配列相同性を有するDNAによりコードされるタンパク質であって、Fz2と同様の生物学的機能を有するタンパク質も含まれる。塩基配列の配列相同性は、塩基配列全体のうち少なくとも８０％である。好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００１４】
さらに、Fz2をコードするfz2のDNAは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と配列相同性を有するタンパク質をコードするDNAであることが好ましい。アミノ酸配列の配列相同性は通常、アミノ酸配列の全体で80％以上であることが適当である。好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上であることが適当である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるDNAと配列相同性を有するDNAには、該塩基配列において、1個以上、例えば1〜300個、好ましくは1〜90個、より好ましくは1〜60個、さらに好ましくは1〜30個、特に好ましくは1〜9個、最も好ましくは1〜3個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるDNAが含まれる。変異の程度およびそれらの位置は、該変異を有するDNAによりコードされるタンパク質が、配列番号３に記載の塩基配列で表されるDNAによりコードされるタンパク質と同様の配列相同性および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。配列番号３に記載の塩基配列で表されるDNAによりコードされるタンパク質と配列相同性を有するタンパク質には、そのアミノ酸配列において、1個以上、例えば1〜100個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、特に好ましくは1〜3個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表されるタンパク質が含まれる。
【００１５】
（Fz2の発現）
本発明の「Fz2の発現」とは、fz2のDNAの遺伝子情報がmRNAに転写されること、又は、mRNAに転写され、さらにfz2から発現されるタンパク質であるFz2のアミノ酸配列として翻訳されることを意味する。
【００１６】
（Fz2の発現を抑制する）
本発明の「Fz2の発現を抑制する」とは、fz2のDNAの遺伝子情報がmRNAに転写される過程、又は、mRNAに転写され、さらにfz2にコードされる遺伝子情報がアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる反応を妨げることにより、fz2の遺伝子の転写・翻訳によるFz2の生成を低減させることを意味する。
【００１７】
（Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物）
本発明の「Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物」とは、例えば、Fz2の発現を特異的に抑制する作用を有する低分子量化合物である。Fz2の発現を特異的に抑制するとは、Fz2の発現を強く抑制するが、他のタンパク質の発現は抑制しないか、弱く抑制することを意味する。低分子量化合物は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、有機化合物及び無機化合物である。この低分子量化合物の分子量は、例えば7000以下、好ましくは5000以下、より好ましくは500以下の化合物である。
【００１８】
（siRNA）
Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物として、例えばFz2の発現をRNA干渉の手法により低下又は消失させる作用を有するsiRNA（small interfering RNA）を例示できる。siRNAは標的遺伝子のmRNAを分解してその発現を抑制する短鎖二重鎖RNAである。
【００１９】
Fz2の発現を抑制する作用を有するsiRNAは、Fz2遺伝子の部分配列からなるRNA（センス鎖）と該RNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA（アンチセンス鎖）とを、該遺伝子のmRNAの配列に基づいて設計し、化学合成法により合成し、得られた両RNAをアニーリングさせることで製造することができる。siRNAを構成するセンスRNA及びアンチセンスRNAは、各々20個から35個のヌクレオチドからなることが好ましい。また、各々3'末端に、オーバーハング配列と呼ばれるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列はRNAをヌクレアーゼから保護する作用を有する。
【００２０】
Fz2の発現を抑制する作用を有するsiRNAとして、該siRNAの二重鎖RNA部分が配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなるsiRNAが挙げられる。Fz2の発現を抑制するsiRNAは、細胞外ドメインでいかなるligandとの結合も起きず、Fz2以下の細胞内刺激伝達系は不活性のままである。siRNAを用いるとFz2の発現が低下するので、これら細胞外ドメインとの相互作用も抑制される。即ちsiRNAを用いるとWntとの結合が阻害されることはもとより、その他のタンパク質との結合、相互作用が阻害される。このようにFz2の特定の作用点を阻害するのではなく、Fz2そのものの発現を消失させてしまうので、Fz2の発現抑制が効果的に行われる。
【００２１】
siRNAを高効率かつ長期に細胞中で発現させるには、siRNAを含む発現ベクターを用いて細胞内に導入する方法が好ましい。Fz2の発現を抑制する作用を有するsiRNAを処置対象内で発現可能な発現ベクターは、Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物として好ましく使用できる。一般的には、U6プロモータを使用したヘアピン型RNA発現ベクターがよく用いられている。
siRNAを胃の胃癌部で発現可能な発現ベクターは、具体的には、発現ベクターのプロモータの下流に、少なくとも、ライゲーション用制限酵素サイト、配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに転写されるDNA塩基配列、ループ配列、配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに転写されるDNA塩基配列、ターミネータ配列、及びライゲーション用制限酵素サイトをこの順序で含む合成DNAが挿入された発現ベクターである。
【００２２】
（shRNA）
Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物として、shRNAを例示できる。shRNAは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖RNAであり、siRNAと同様、RNA干渉により遺伝子の発現を抑制する。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センスRNA由来部分とアンチセンスRNA由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を有する。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAに加え、これら2つのRNAを連結し且つループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含むRNAを、fz2のmRNAの塩基配列に基づいて設計して製造できる。好ましくは、センスRNAの3'末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの5'末端とが結合し、更にループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの3'末端とアンチセンスRNAの5'末端とが結合したオリゴヌクレオチドである。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センスRNAとアンチセンスRNAの間に存在して両RNAを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。ヘアピン構造を有する二重鎖は、センスRNA由来部分とアンチセンスRNA由来部分とをアニーリングすることにより形成できる。
【００２３】
Fz2の発現を抑制する作用を有するshRNAとして、該shRNAの二重鎖RNA部分が配列番号１記載の塩基配列から転写されたオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるshRNAがあげられる。shRNAは細胞内で転写された後に代謝され、最終的にsiRNAになるので、上述したsiRNAと同様の理由によりFz2の発現を低下させる。
【００２４】
shRNAを高効率で長期に細胞中で発現させるには、shRNAを含む発現ベクターを用いて細胞内に導入する方法が好ましい。Fz2の発現を抑制する作用を有するshRNAを処置対象内で発現可能な発現ベクターは、Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物として好ましく使用できる。加えて、発現ベクターは、siRNAの発現ベクターと同様な構造を利用することができる。
【００２５】
（Fz2の機能）
本発明の「Fz2の機能」とは、Fz2が備えている生物学的機能を意味する。Fz2の生物学的機能として、Wntリガンドの受容体としての機能、即ち、Wntリガンドと結合する機能、Wntリガンドの結合による刺激を細胞内に伝達する機能、及び、その結果Wntリガンドの作用により生理機能を発現させる機能を例示できる。
【００２６】
（Fz2の機能を抑制する）
本発明の「Fz2の機能を抑制する」とは、fz2及びFz2が備えている生物学的機能を低減又は消失させることを意味する。具体的には、Fz2の機能を抑制するとは、例えばFz2とWntリガンドとの結合機能及び／又はFz2の細胞内刺激伝達機能を抑制することを意味する。
【００２７】
（Fz2の機能を抑制する作用を有する化合物）
本発明の「Fz2の機能を抑制する作用を有する化合物」は、例えば、Fz2の発現を特異的に抑制する作用を有する低分子量化合物である。Fz2の機能を特異的に抑制するとは、Fz2の機能を強く抑制するが、他のタンパク質の機能は抑制しないか、弱く抑制することを意味する。
【００２８】
Fz2の機能を抑制する作用を有する化合物として、例えば、Fz2とWntリガンドとの結合を阻害する作用を有する化合物がある。具体的には、Fz2とWntリガンドとが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、Fz2又はWntリガンドのアミノ酸配列から設計し、公知のペプチド合成法により合成したものから、Fz2とWntリガンドとの結合を阻害するものを選択することにより取得できる。
Fz2とWntリガンドとの結合を阻害する作用を有する化合物として、Fz2又はWntリガンドを認識する抗体であってFz2とWntリガンドとの結合を阻害する抗体及び該抗体のフラグメントを例示できる。または、Fz2とWntリガンドとの結合を阻害する作用を有する化合物として、Fz2又はWntリガンドを特異的に認識するアプタマーであって、Fz2とWntリガンドの結合を抑制するアプタマーを例示できる。
【００２９】
（マイクロバブルを形成する造影剤）
本発明の「マイクロバブルを形成する造影剤」は、マイクロバブルを形成することができる造影剤であれば特に限定されないが、ペルフルブタンマイクロバブル（商品名：ソナゾイド登録商標、製造販売元：第一三共株式会社）、ガラクトース・パルミチン酸混合物（999：1 ：レボビスト登録商標、製造販売元：バイエル薬品株式会社）等を例示することができる。
ペルフルブタンマイクロバブルは、アルブミンを主成分とする殻に空気を蓄えた微小な泡（マイクロバブル）である。Mechanical indexが4.0以上では、該泡が破砕して、sonoporation（細胞膜に一時的な孔の生成）が発生し、遺伝子の細胞導入効率が向上する。また、Mechanical indexが4.0以下では、崩壊せず、強いコントラストを形成するので超音波検査の造影剤として使用されている。
ペルフルブタンマイクロバブルの投与濃度は、胃に経口投与する場合は、成人1回、0.001mL/kg〜0.100mL/kg、より好ましくは0.005mL/kg〜0.050mL/kg、さらに好ましくは0.010mL/kg〜0.020mL/kgである。
【００３０】
（超音波照射）
本発明の「超音波照射」では、frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を、マイクロバブルを形成する造影剤の共存下において、胃癌細胞に導入できれば、どのような方法により超音波照射しても良い。
好ましくは、リアルタイムに照射野を確認することができる超音波診断装置を使用する。超音波診断装置、特に、超音波内視鏡（内視鏡の先端に超音波発生装置が付加されている）は、超音波を送信すると共に、反射した超音波を受信する役割を持つプローブと、受信した信号に様々な処理をする処理部と、リアルタイムに画像を表示するディスプレイ部と、を備えて構成される。このような、超音波内視鏡を使用することにより照射野をモニターしながら超音波を導入できるため、目的とする領域のみに本発明の胃癌治療剤を効率的に導入することができる。また、文献「World J Methodol 2013 December 26; 3(4): 39-44」を参照することができる。
【００３１】
具体的な超音波照射方法の例示として、周波数3.5MHz〜20MHz、好ましくは、5.0MHz〜20MHz、より好ましくは10〜20MHzの超音波を超音波発生装置のプローブから胃癌部（胃癌細胞）に照射する。
【００３２】
（胃癌治療剤）
本発明の「胃癌治療剤」は、いずれの段階（早期、進行、末期）のすべての胃癌（又は胃癌の可能性）の患者（哺乳動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、より好ましくはヒト）を対象とする。
【００３３】
（胃癌治療剤の組成）
本発明の胃癌治療剤は、医薬組成物として調製できる。この場合、有効成分に加えて１種又は２種以上の医薬用担体を含むことが好ましい。医薬組成物中に含まれる有効成分は、例えば0.00001〜80重量％、好ましくは0.0001〜8重量％である。医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて使用され、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤及び賦形剤を例示できる。
また、所望により安定化剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤等を適宜使用することもできる。
【００３４】
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のL−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。L−アミノ酸は、例えばグリシン、システイン等である。糖類は例えばグルコース、マンノース等の単糖類、マンニトール、イノシトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖類等である。セルロース誘導体は、例えばメチルセルロース、エチルセルロース等である。
【００３５】
緩衝剤は、例えばホウ酸、リン酸、酢酸等である。等張化剤は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等である。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム等である。界面活性剤は、イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系等が包含される。
【００３６】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与経路、投与形態、疾患の種類等に応じて選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重1kgあたり0.01μg〜100mg程度、好ましくは0.1μg〜1mg程度の範囲である。投与量は1日1回〜数回に分けて投与することができ、数日又は数週間に1回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００３７】
投与経路は、全身投与又は局所投与のいずれも可能である。経口経路投与の場合には、本発明の胃癌治療剤を含む溶液をそのまま飲めばよい。また、非経口経路投与の場合には、本発明の胃癌治療剤を含む溶液を胃に直接投与することもできる。
なお、本発明の胃癌治療剤では、投与の容易性及び侵襲性の観点から経口投与が好ましい。
加えて、投与形態は、各種の形態が可能である。例えば錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。
【００３８】
Fz2の発現を抑制する作用を有する化合物が核酸や発現ベクターである場合、これらのうち少なくとも１つを有効成分として含む遺伝子治療剤を調製することができる。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。所望の遺伝子を含有するウイルスベクターの投与量は、例えばレトロウイルスベクターであれば1日あたり体重1kgあたりレトロウイルスの力価として約1×103pfu〜1×1015pfuである。
【００３９】
（胃癌の治療方法）
本発明の「胃癌の治療方法」は、少なくとも以下の工程を有する。
（１）fz2及び／又はFz2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を胃癌患者の胃に投与する工程；及び
（２）該胃癌患者の胃の胃癌部に超音波を照射する工程。
より詳しくは、胃癌患者の胃に水を満たし、さらに、fz2及び／又はFz2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を投与する。又は、胃癌患者は、fz2及び／又はFz2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物並びにマイクロバブルを形成する造影剤を含む溶液を飲む。なお、超音波内視鏡により、胃の胃癌部は容易に観察することができる。
次に、超音波発生装置のプローブを胃の胃癌部に当てて、該プローブの先端から周波数5.0MHz〜20MHzの超音波を該胃癌部に照射する。なお、照射中は、リアルタイムに照射部位の状況を確認できるので、適宜、周波数や照射位置を変えることができる。
なお、周波数が大きいと解像力が優れるが、深部に超音波が到達せず表面しか照射できない。一方、周波数が小さいと解像力が劣るが、深部に超音波が到達できる。
以上により、本発明の「胃癌の治療方法」では、fz2及び／又はFz2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入することができるので、治療効果が高い。
【００４０】
（標的遺伝子を細胞に導入する方法）
本発明では、以下の工程を含む細胞に標的遺伝子を効率的に導入する方法も含む。
（１）標的遺伝子、ペルフルブタンマイクロバブル及び細胞を共存させる環境を作成する工程、及び
（２）該環境に超音波を照射する工程。
標的遺伝子は、特に限定されないが、細胞が癌細胞であれば、癌細胞の生育を抑制する化合物が好ましい。
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
（材料及び方法）
以下の材料及び方法により、下記の実施例２を行った。詳細は、以下の通りである。
【００４３】
（細胞培養）
GC細胞株（胃癌細胞株）であるMKN45及びMKN74は、理研細胞バンク（筑波、日本）から購入した。細胞は、10％仔牛血清添加RPMI-1640培地（Sigma, St. Louis、MO）で培養した。細胞株は、加湿チャンバー内で37℃、5％の二酸化炭素濃度で培養した。細胞は、下記実施例で使用される24時間前に、厚さ190±19μmの透明ポリスチレンフィルムで形成されている底を有する96ウェル蛍光イムノアッセイ（FIA）ブラックプレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）に分取した。細胞は、超音波内視鏡での超音波照射又は遺伝子導入のために、トリプシン処理し、回収し、さらに、96ウェルFIAブラックプレートに播種し（1,000細胞/孔）、そして、10％仔牛血清添加RPMI-1640培地で24時間培養した。該培養した細胞は、培養翌日、超音波内視鏡での超音波照射又は遺伝子導入が行われた。
【００４４】
（超音波内視鏡での超音波照射）
超音波内視鏡装置（GF-UCT260;オリンパス、東京、日本）のプローブを、バルーンで覆った（図１Ａ）。該バルーンは、超音波を媒介するために、水で充填し、膨らました（図１Ｂ）。該バルーンは、その後、96ウェルFIAブラックプレートの裏底に付けて、そして、超音波を、水を介して、該裏底から照射した（図１Ｃ）。
プラスミド（100ng）は、25μlのOpti-MEM Reduced Serum Media (Life Technologies)中の細胞に添加し、そして、プラスミド-細胞混合溶液は、超音波内視鏡装置により30秒又は2分間の超音波照射を受けた。
ペルフルブタンマイクロバブル（商品名：ソナゾイド登録商標、製造販売元：第一三共株式会社）は、Opti-MEM Reduced Serum Mediaに、0（コントロール）、1、3、10又は30体積％になるように添加した。超音波照射後において、照射後細胞に、25μl の10％仔牛血清添加RPMI-1640培地を添加した。
超音波照射箇所は、超音波内視鏡装置のディスプレイを使用して、リアルタイムでモニターした（図１Ｄ）。このモニター確認より、超音波内視鏡装置のプローブによる超音波照射は、標的部位（標的細胞）に特異的に超音波を照射できることを確認した。
【００４５】
（プラスミド）
下記の実施例２で使用したプラスミドは、shRNAの発現に使用されている市販のpCMV-V-RS（OriGene Technologies, Inc社）を使用した。挿入した塩基配列は、配列番号１の塩基配列、ループ構造を形成する塩基配列及び配列番号１の塩基配列の相補的塩基配列であった。
なお、コントロールで使用したプラスミドでは、配列番号４の塩基配列、ループ構造を形成する塩基配列及び配列番号４の塩基配列の相補的塩基配列を導入した。
【００４６】
（遺伝子導入）
培養細胞を、製造元の指示書に従って、リポフェクタミンLTX（Life Technologies）を用いて、100 ngのプラスミドで遺伝子導入をした。遺伝子導入のためのプラスミドを25μlのOpti-MEM中の細胞に添加し、そして、リポフェクタミンLTXとの混合物を作成した。該複合物は、25μlの10％仔牛血清添加RPMI-1640培地と混合した。
【００４７】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ルシフェラーゼアッセイは、pMetLuc2-control(Promega, Madison, WI）を用いて行った。ルシフェラーゼアッセイにおいて、メトリディアルシフェラーゼ（cytomegalovirus immediate early promoterの駆動により発現する）は、培地中に分泌された。胃癌細胞からの培地を、超音波照射又は遺伝子導入した48時間後に、回収した。そして、酵素活性は、Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter Assay (Clontech, Mountain View, CA) 及びGene Light (GL-200A) luminometer (Microtech CO., Ltd., 船橋、日本)を使用して測定した。遺伝子導入効率を測定するために、10ngのpSEAP2 control vector（Clontech）を96ウェルFIAブラックプレートの各孔で使用し、そして、転写活性を、製造元の指示に従い、secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) chemiluminescence kit (Clontech) 及びGene Light luminometerを用いて測定した。ルシフェラーゼアッセイは、メトリディアルシフェラーゼ活性をSEAP活性で割った値として算出した。
【００４８】
（細胞増殖分析）
shRNA-fz2（プラスミド）を超音波照射又は遺伝子導入（リポフェクタミンLTXを使用）により培養細胞に導入し、そして72時間培養した。
該培養後の細胞は、製造元の指示に従い、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルフォフェニル)-2H-テトラゾリウム インナー ソルト（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt ：MTS）アッセイ（Promega Corporation, Madison, WI）に使用した。吸光度は、iMark Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad)を使用して490nm波長で分析した。
【００４９】
（統計分析）
吸光度分析は、一元配置分散分析法（one factor ANOVA）により行った。P値＜0.05の差異を統計的に有意であると判断した。
【実施例２】
【００５０】
（マイクロバブルを形成する造影剤及び超音波照射による遺伝子導入）
本実施例では、超音波照射及びマイクロバブルを形成する造影剤が特定物質(特に、遺伝子)の細胞導入効率を向上させることができるかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５１】
図２の結果から明らかなように、マイクロバブルを形成する造影剤がsonoporationを向上させることを確認した。詳しくは、吸光度は、10％及び30％のペルフルブタンマイクロバブルで増加した。さらに、30％のペルフルブタンマイクロバブルで統計的有意性を確認した。これらの結果は、sonoporationがマイクロバブルを形成する造影剤であるペルフルブタンマイクロバブルで向上できることを確認した。
【００５２】
図３の結果から明らかなように、プラスミド（標的遺伝子）を細胞に導入できることを確認した。詳しくは、相対ルシフェラーゼ活性は、MKN45細胞（図３Ａ）とMKN 74細胞（図３Ｂ）において、超音波照射後に上昇した。これらの結果は、超音波照射を用いた細胞へのプラスミドの導入はペルフルブタンマイクロバブルの存在により向上できた。
【００５３】
図４の結果から明らかなように、治療用プラスミド（標的遺伝子）を細胞に導入できることを確認した。詳しくは、胃癌細胞増殖は、超音波照射及びマイクロバブルを形成する造影剤を用いて胃癌細胞にshRNA-fz2（治療用プラスミド）を導入することにより、抑えることができた。これらの結果は、超音波照射を用いた細胞への治療用プラスミドの導入はペルフルブタンマイクロバブルの存在により向上できた。
【００５４】
（総論）
実施例１及び２の結果より、frizzled-2及び／又はFrizzled-2の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物であるshRNAを、マイクロバブルを形成する造影剤であるペルフルブタンマイクロバブル及び超音波内視鏡のプローブを使用して胃癌細胞に導入すれば、該化合物は効率的かつ特異的に胃癌細胞に導入でき、さらに、胃癌細胞の増殖を抑えることができる。加えて、細胞に標的遺伝子を効率的に導入する方法でもある。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、新規な胃癌治療剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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