(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅効率及び検出感度を向上させ、効果的な核酸増幅を行うことができる組成物の提供。【解決手段】テトラメチルアンモニウム塩、特に酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物およびテトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼを共存させた組成物であって、酵素に対する阻害作用がなく、操作性の低下も極めて少なく、長期保存が可能で、混合液状態での安定性が高い核酸増幅用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム塩、及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
【請求項２】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項３】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１０と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項４】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項５】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項６】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の変異体である請求項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項７】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである請求項６に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項８】
前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項９】
テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が１００〜２１０ｍＭである請求項１〜８のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１０】
少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンをさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１１】
少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１２】
核酸増幅反応がＰＣＲである請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１３】
核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１４】
テトラメチルアンモニウム塩及び、及び終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム耐性を有するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法。
【請求項１５】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、５０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである請求項１４に記載の核酸増幅法。
【請求項１６】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１０と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである請求項１４または１５に記載の核酸増幅法。
【請求項１７】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである請求項１４〜１６のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項１８】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである請求項１４〜１７のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項１９】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の変異体である請求項１４〜１８のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２０】
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである請求項１４〜１９のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２１】
前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項１４〜２０のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２２】
テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が１００〜２１０ｍＭである請求項１４〜２１のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２３】
少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１４〜２２のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２４】
少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１４〜２３のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２５】
核酸増幅反応がＰＣＲである請求項１４〜２４のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項２６】
核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである請求項１４〜２５のいずれかに記載の核酸増幅法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅効率及び検出感度を向上させ、効果的な核酸増幅を行うことができる組成物及び核酸増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００３】
検出対象核酸がＲＮＡである場合、たとえば病原性微生物の検出において対象がＲＮＡウイルスである場合、あるいは遺伝子の発現量をｍＲＮＡの定量によって測定する場合などは、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応（逆転写反応）をＰＣＲの前に行う。
【０００４】
この逆転写酵素による逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲは、各々の酵素の至適条件の違いから、先に逆転写反応を行いついで別の反応液に移してＰＣＲが行われることが多い。この煩雑さを解消するために２つの反応を同一反応液中で連続して行う方法、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ法が近年に開発された（特許文献１）。
【０００５】
また、近年では、ＰＣＲの中でも、リアルタイムＰＣＲ法が広く実施されるようになってきた。リアルタイムＰＣＲ法は増幅された核酸を経時的に解析することができ、高い定量性を確保し、高感度の検出を行うことができる。
【０００６】
しかしながら、このような核酸増幅において、検出対象核酸が微量である時は増幅にバラつきが生じ、うまく増幅しない場合が散見される。特に検出対象核酸がＲＮＡの場合は、逆転写反応をＰＣＲの前に行うことにより試料のロスを生じやすく、環境中のＲＮＡ分解酵素により分解される可能性もあることから、少量のＲＮＡを定量することは困難である。また、患者の血清検体といった生体試料からウィルスＲＮＡを検出する場合は、ウィルス感染初期の検体中のウィルスＲＮＡの量が少なく、しばしば検出できないことがある。
【０００７】
このような背景から、前記核酸増幅法の効率や感度を向上させるために、核酸増幅反応液中に様々な試薬を添加する方法が試みられている。
【０００８】
例えば、核酸増幅効率を向上させる方法として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、グリセロール、ベタインなどが報告されてきた（特許文献２、３、４）。これらの薬剤は核酸の融解温度を低下させることで、核酸の増幅効率を向上させることが知られている。しかしながら、これらの物質にはいずれも短所があることが知られている。例えば、ジメチルスルホキシドやホルムアミドは、ＰＣＲの特異性を高めるために多用されるホットスタート用抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害する性質がある（非特許文献１）。また、ホルムアミドは、それ自身の水溶液中での安定性が低く、ＰＣＲの反応液に混合した状態での長期保存が困難である。一方、グリセロールやベタインは、反応阻害や安定性の面では問題が少ないが、融解温度を低下させる作用が比較的低いため、ＰＣＲの反応液に混合する際は極めて高濃度を添加する必要がある。特にグリセロールはそれ自身の粘性が高く、高濃度の添加によって反応液調製時の操作性が著しく低下する、あるいは少液量での反応液調製時に、添加量の誤差が発生しやすいという問題もあった。
【０００９】
非特許文献２には、テトラメチルアンモニウム塩が増幅効率及び特異性を向上させるエンハンサーであることが明記され、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ反応におけるテトラメチルアンモニウム塩の効果及び至適濃度について検討されている。非特許文献２によると、増幅効率が最大となる濃度は塩化テトラメチルアンモニウムが５ｍＭ、酢酸テトラメチルアンモニウムが１０ｍＭ以下、特異性が最大となる濃度は塩化テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウムともに２０ｍＭである。さらに、テトラメチルアンモニウム塩は高濃度では酵素を阻害することが知られており、非特許文献２によると、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、塩化テトラメチルアンモニウムは３５ｍＭ、酢酸テトラメチルアンモニウムは４０ｍＭを超えると核酸増幅が９０％阻害される。このように、テトラメチルアンモニウム塩は、従来は一般的に１００ｍＭよりもはるかに低い濃度で核酸増幅に使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許２９６８５８５号公報
【特許文献２】特許４７６１２６５号公報
【特許文献３】特許４３００３２１号公報
【特許文献４】特開２０１４−２７９３４号公報
【非特許文献１】Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ取扱説明書（２００５年３月発行）
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１３（２０００年発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
核酸増幅法において、核酸増幅効率及び検出感度を向上させる核酸増幅方法の検討が進められてきた。しかしながら、従来の検討は、安定性を低下させるものや、ＤＮＡポリメラーゼを阻害するもの、操作が煩雑で時間を要するもの、いずれも使用に際し短所を有するものであった。
【００１２】
そこで、本発明は、核酸増幅試薬として、（１）操作が煩雑でないこと、（２）核酸増幅効率を向上させ、高感度な検出ができること、かつ、（３）操作が簡便でコンタミネーションのリスクが低いこと、を満たす組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、テトラメチルアンモニウム塩、特に酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物に、テトラメチルアンモニウム塩に耐性があり阻害を受けにくいＤＮＡポリメラーゼを共存させて核酸増幅を行うと、増幅効率を向上させ、高感度な検出が可能であることを見出した。そして、この知見をもとに、酵素に対する阻害作用がなく、操作性の低下も極めて少なく、長期保存が可能で、さらに混合液状態での安定性が高い核酸増幅用組成物が提供できることを見出した。また、この知見がＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ特にワンステップＲＴ−ＰＣＲにも適用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
即ち、本発明の概要は以下の通りである。
項１．終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム塩、及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項２．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである項１に記載の核酸増幅用組成物。
項３．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１０と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項４．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項５．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項６．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の変異体である項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項７．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである項６に記載の核酸増幅用組成物。
項８．前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項９．テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が１００〜２１０ｍＭである項１〜８のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１０．少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンをさらに含む項１〜９のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１１．少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１２．核酸増幅反応がＰＣＲである項１〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１３．核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである項１〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１４．テトラメチルアンモニウム塩及び、及び終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム耐性を有するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法。
項１５．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、５０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである項１４に記載の核酸増幅法。
項１６．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１０と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項１４または１５に記載の核酸増幅法。
項１７．
前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである請求項１４〜１６のいずれかに記載の核酸増幅法。
項１８．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである項１４〜１７のいずれかに記載の核酸増幅法。
項１９．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の変異体である項１４〜１８のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２０．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１１の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである項１４〜１９のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２１．前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１４〜２０のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２２．テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が１００〜２１０ｍＭである項１４〜２１のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２３．少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１４〜２２のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２４．少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１４〜２３のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２５．核酸増幅反応がＰＣＲである項１４〜２４のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２６．核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである項１４〜２５のいずれかに記載の核酸増幅法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、核酸増幅効率及び感度を向上させることができる。本発明の方法は、特に取り扱いに注意が必要な試薬を用いることなく、また試料やターゲットの種類に依存することもなく、簡便に核酸を増幅させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｃＤＮＡ合成試薬でｃＤＮＡを合成し、酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を０ｍＭから１６０ｍＭまで添加した時の感度を、リアルタイムＰＣＲにおいて検討した。ＡはＣｔ値をまとめたものであり、Ｂは増幅曲線である。
【図２】酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を０ｍＭから１７０ｍＭまで添加したときの感度を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて検討し、Ｃｔ値をまとめたものである。なお、表中の黒塗りはＣｔ値が測定不可（Ｎ．Ｄ．）を示す。
【図３】酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を１８０ｍＭから２００ｍＭまで添加したときの感度を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて検討し、Ｃｔ値をまとめたものである。なお、表中の黒塗りはＣｔ値が測定不可（Ｎ．Ｄ．）を示す。
【図４】酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を０ｍＭから２００ｍＭまで添加したときの感度を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて検討し、縦軸にＣｔ値、横軸に全量ＲＮＡの対数値をとってグラフ化した図である。
【図５】酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。
【図６】酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。Ａは酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファー、Ｂは酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーである。
【図７】酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び含まないバッファーを調製した。調製したバッファーで、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。
【図８】酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び含まないバッファーを調製した。調製したバッファーで、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。ＡはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した時、ＢはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した時の図である。
【図９】酢酸テトラメチルアンモニウム及び塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。
【図１０】酢酸テトラメチルアンモニウム及び塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーを調製した。調製したバッファー及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。Ａは酢酸テトラメチルアンモニウムを使用した時、Ｂは塩化テトラメチルアンモニウムを使用した時の図である。
【図１１】テトラメチルアンモニウム塩に耐性があるか否かを、ＰＣＲの反応系に酢酸テトラメチルアンモニウムを追添し確認した図である。
【図１２】酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び含まないバッファーを調製した。調製したバッファーを用い、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体で血液からリアルタイムＰＣＲを実施した時の増幅曲線、およびＣｔ値である。
【図１３】Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列同一性を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第一の態様は、核酸の検出において、核酸増幅効率及び検出感度を向上させることのできる核酸増幅法である。この核酸増幅法はテトラメチルアンモニウム塩及びテトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用試薬である。
【００１８】
一般的に、核酸増幅に先立ち、被験物から細胞、細菌、ウィルス等を分離し、核酸を抽出する必要がある。酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により細胞や細菌を分解し、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、その分解物から核酸を抽出する方法が、従来より使用されている。本発明における核酸抽出法は臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）を指し、これらに限定されるものではない。また、本発明における核酸精製法とは生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の核酸増幅用試薬が適用される核酸増幅反応とは、鋳型の核酸に対し、相補的な配列を持つ核酸を配列依存的に合成する反応を指し、その様式は特に限定されないが、より具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のように特定の標的配列を指数関数的に増幅する方法が例示される。ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであっても良い。その他の形態として、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）、競合的ＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｒｅｄ  ＰＣＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃａｌｍｐ法、ストレッチＰＣＲ、Ａｌｕ  ＰＣＲ、メガプライマーＰＣＲ、Ｉｍｍｕｎｏ  ＰＣＲ等、ＰＣＲ法を応用した方法も、前記核酸増幅方法に含まれる。
【００２０】
本発明の核酸増幅法は、ＲＴ−ＰＣＲに適用することもできる。ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写の工程とＰＣＲの工程とは、順次別々に行っても良いし、連続して行うワンステップ法を採用しても良い。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであっても良い。
【００２１】
本発明におけるテトラメチルアンモニウム塩は、いかなる第４級アンモニウム塩を用いても良いが、好ましくは、水酸化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウムが用いられる。より好ましくは、酢酸テトラメチルアンモニウムが用いられる。これらのテトラメチルアンモニウム塩は、構造により製法が異なるものの、いずれも工業的な製造方法が確立されており、安価で容易に入手が可能である。これらのテトラメチルアンモニウム塩は１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を任意に組み合わせて用いたとしても本発明の効果を奏する。
【００２２】
本発明におけるテトラメチルアンモニウム塩は、核酸増幅反応用試薬に予め混合することが好ましい。また本発明における、核酸増幅反応溶液中のテトラメチルアンモニウム塩の下限は終濃度として１００ｍＭが好ましい。一方、テトラメチルアンモニウム塩の上限は、終濃度として２１０ｍＭが好ましい。
【００２３】
本発明の核酸増幅用試薬において使用するＤＮＡポリメラーゼは、テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲの反応系にテトラメチルアンモニウム塩が含まれていても阻害されないＤＮＡポリメラーゼをいうものであり、好ましくは５０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましい。さらに望ましくは１００ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましく、さらに望ましくは２００ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましい。
【００２４】
テトラメチルアンモニウム塩に耐性があるか否かは、以下のようにして確認することができる。
ＤＮＡポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
ＢｌｅｎｄＴａｑ（東洋紡）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５０ｎｇヒトゲノム、β―アクチン１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１２及び１３に記載のプライマーを含む５０μｌの反応液中に、耐性の有無を判定したい酵素を２．５Ｕになるよう添加する。酢酸テトラメチルアンモニウムを終濃度０、５０、１００、１５０、２００ｍＭになるように添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、９０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認し、酢酸テトラメチルアンモニウムを添加したものと酢酸テトラメチルアンモニウムを添加していないものを比較し、増幅量が変わらなければ、その濃度までテトラメチルアンモニウム塩に耐性があるということができる。
【００２５】
テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼは、具体的にはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。前記ＤＮＡポリメラーゼは野生型のものでも良いし、ＤＮＡポリメラーゼ活性を維持する範囲で改変されたものであっても良い。また、さらにそれらを適当な発現系で組換え生産したものでもよい。また、テトラメチルアンモニウム塩に耐性を持たせるためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに変異を加えたものであってもよい。より好ましくは配列番号１１におけるＥ５０７位、Ｅ７４２位に変異を入れたものであってもよいが、それ以外にＤＮＡポリメラーゼ活性を維持する範囲で改変されたものであっても良く特に限定されない。また、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの場合には、配列番号１０と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【００２６】
本発明の核酸増幅用試薬において、核酸増幅反応用液中には、テトラメチルアンモニウム塩及びテトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼのほかに、さらに鋳型となる核酸、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーとなるオリゴヌクレオチド、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応バッファー、マグネシウムイオン等の金属イオンを、実施する核酸増幅方法により必要に応じて存在させる。
【００２７】
一例として、ＰＣＲ法を用いた核酸増幅においては、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、反応バッファーが一般的に必要である。
【００２８】
リアルタイムＰＣＲの場合は、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。
【００２９】
ＲＴ−ＰＣＲの場合は、さらに、逆転写に必要なものとして逆転写酵素を必要に応じて存在させる。
【００３０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの場合は、さらに、逆転写に必要なものとして逆転写酵素を必要に応じて存在させる。また、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。
【００３１】
本発明の核酸増幅用試薬において、核酸増幅反応溶液中には、ホットスタートＰＣＲ法を実施するために、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含んでいても良い。従前、核酸の融解温度を調整する目的でＤＭＳＯやホルムアルデヒドを添加した場合、これらの物質は抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害するものとなっていた。本発明では、終濃度として１００ｍＭから２１０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩を添加するが、これは抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害することがないため、ホットスタートＰＣＲ法は極めて有用である
【００３２】
ここでいう抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体は、その形態は特に限定されないが、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに結合し、５０℃以下の低温において活性を８０％以上阻害するもの、より好ましくは９０％以上阻害するものを用いることができる。またここでいう抗耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抗体は単一種のモノクローナル抗体を用いるか、または複数のモノクローナル抗体を用いるか、あるいはポリクローナル抗体を用いることができる。このような抗体はマウス、ラット、ハムスター等を用いたハイブリドーマ作製等による公知のモノクローナル抗体作製法により作ることができる。
【００３３】
本発明の核酸増幅用試薬において、核酸増幅のための温度・時間・反応サイクル等の条件は、増幅したい核酸の種類や塩基の配列、鎖長等によって変わるが、当業者であれば適宜設定できる。ただし、本発明の効果を享受するため、変性反応における設定温度や設定時間は、通常より温度を低く若しくは時間を短く設定することが好ましいが、この限りではない。
【００３４】
本発明の別の態様は、増幅効率と感度の高い核酸増幅用試薬であって、テトラメチルアンモニウム塩及びテトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼを含む、核酸増幅用試薬である。ここで言う試薬とは、キットなどのように市販品として流通するものに限定されず、自家調製によるもの等を含み、形態を問わない。別の切り口では、ＰＣＲ用試薬、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用試薬などの態様が挙げられる。本発明の核酸増幅用試薬に含まれる組成物の構成や各構成成分の詳細は、上述の核酸増幅法の説明に準ずる。
【００３５】
本発明の核酸増幅用試薬において、テトラメチルアンモニウム塩及びテトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼは、同一の容器に含まれていてもよいし、別々の容器に保持されていたものを使用するより前に混合しても良い。特にワンステップＲＴ−ＰＣＲの場合は、逆転写酵素を存在させる必要があるが、この逆転写酵素についても前記の試薬類と同一の容器に含まれていてもよいし、別々の容器に保持されていたものを使用するより前に混合しても良い。
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、エンテロウィルスＲＮＡ（Ｖｉｒｃｅｌｌ）を使用した。１５７０コピーのエンテロウィルスＲＮＡを鋳型として使用した。
（２）ｃＤＮＡ合成
エンテロウィルスＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡）の５×ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２μＬ、
ＲＮＡ  ５μＬ、
を含む反応液１０μＬを、以下の温度条件で反応した。
３７℃  １０分
５０℃  ５分
９８℃  ５分
（３）ＰＣＲ反応
酢酸テトラメチルアンモニウムを０から１６０ｍＭまで添加したバッファーを調製し、（２）で取得したｃＤＮＡを添加してリアルタイムＰＣＲを実施した。
ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスフォアードプライマー（配列番号１）  ０．６μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスプローブ（配列番号２）  ０．４μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスリバースプライマー（配列番号３）  ０．６μＬ、
ＲＮＡ  ５μＬ、
酢酸テトラメチルアンモニウム  各条件の濃度、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
【００３８】
（４）結果
その結果を図１に示す。図１Ａは、リアルタイムＰＣＲで求められた各コピー数におけるＣｔ値をまとめたものである。図１Ｂは、リアルタイムＰＣＲで得られた増幅曲線の図である。驚くべきことに酢酸テトラメチルアンモニウムを０から１６０ｍＭまで添加するにしたがって、増幅曲線の立ち上がりが早くなっている（Ｃｔ値が小さくなる）。このことから、酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を上げることにより、ＰＣＲ反応の増幅効率が向上することがわかる。
【００３９】
同様の実験を以下のように、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）でも実施し、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと同様に、０から１６０ｍＭまで酢酸テトラメチルアンモニウムの添加で増幅曲線の立ち上がりが早くなった（Ｃｔ値が小さくなった）。
Ｚ０５  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスフォアードプライマー（配列番号１）  ０．６μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスプローブ（配列番号２）  ０．４μＬ、
１０μＭ  エンテロウィルスリバースプライマー（配列番号３）  ０．６μＬ、
ＲＮＡ  ５μＬ、
酢酸テトラメチルアンモニウム  各条件の濃度、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
【００４０】
汎用的に使用されているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼはテトラメチルアンモニウム塩に耐性がなく、反応を促進するテトラメチルアンモニウムの効果を十分発揮することができなかった。Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼはテトラメチルアンモニウムに耐性があり、テトラメチルアンモニウム塩の効果を十分発揮できる濃度で反応を実施することができると考えられる。
【００４１】
実施例２
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、バクテリオファージＭＳ２由来のＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス（品番：１０１６５９４８００１））を使用した。ＭＳ２  ＲＮＡを１，０００，０００コピーから１コピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
酢酸テトラメチルアンモニウムを０から３００ｍＭまで添加したときの感度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて比較した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＰＣＲの反応効率と感度の指標として、ＭＳ２ ＲＮＡを標的としたＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  ＭＳ２フォアードプライマー（配列番号４）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ＭＳ２プローブ（配列番号５）  ０．４μＬ、
１０μＭ  ＭＳ２リバースプライマー（配列番号６）  ０．６μＬ、
ＲＮＡ  ５μＬ、
酢酸テトラメチルアンモニウム  各条件の濃度、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
４２℃  １０分
９５℃  ５分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
酢酸テトラメチルアンモニウム濃度は０から３００ｍＭ（終濃度）までの条件を比較した。
【００４２】
（３）結果
その結果を図２、図３、図４に示す。図２及び図３は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで求められた各コピー数におけるＣｔ値をまとめたものである。図４は、ＭＳ２ＲＮＡのコピー数の対数値をｘ軸に、Ｃｔ値をｙ軸にとり、グラフ化したものである。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウムを０から１００ｍＭまで添加するにしたがって、増幅曲線の立ち上がりが早くなり（Ｃｔ値が小さくなる）、検出感度が向上している。また、酢酸テトラメチルアンモニウムの１００から２１０ｍＭ程度で増幅曲線の立ち上がりが最も早く（Ｃｔ値が最小）、検出感度も最大となり、２２０ｍＭを越えて添加すると、反応が阻害されて検出できないことがわかる。
【００４３】
実施例３
１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、ムンプスウィルスＲＮＡ（Ｖｉｒｃｅｌｌ）を使用した。ムンプスウィルスＲＮＡを６２５０コピーから２４コピーまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＰＣＲの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスＲＮＡを標的としたＲＴ−ＰＣＲを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスフォアードプライマー（配列番号７）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスプローブ（配列番号８）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスリバースプライマー（配列番号９）  ０．４μＬ、
ＲＮＡ  ５μＬ、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  １０分
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
【００４４】
（３）結果
その結果を図５、図６に示す。図５は、１２０ｍＭ  酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファー、１２０ｍＭ  酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図６は、調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。図Ａは１２０ｍＭ  酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファー、図Ｂは１２０ｍＭ  酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーの図である。酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファーでは１００コピー程度までの増幅が可能だったが、酢酸テトラメチルアンモニウムを添加すると、驚くべきことに、３０コピー以下の検出が可能となった。
【００４５】
実施例４
１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーで、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、ムンプスウィルスＲＮＡ（Ｖｉｒｃｅｌｌ）を使用した。ムンプスウィルスＲＮＡを６２５０コピーから２４コピーまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＰＣＲの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスＲＮＡを標的としたＲＴ−ＰＣＲを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）またはｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔａｑ抗体または抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスフォアードプライマー（配列番号７）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスプローブ（配列番号８）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスリバースプライマー（配列番号９）  ０．４μＬ、
０．３Ｍ  カルニチン
４％  トリメチレングリコール
ＲＮＡ  ５μＬ、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  １０分
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
【００４６】
（３）結果
その結果を図７、図８に示す。図７は、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図８のＡはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、図８のＢはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせにより、検出感度が向上した。一方、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは阻害され、検出不可能であった。
【００４７】
実施例５
１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウム及び１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウムの代わりに塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーをそれぞれ調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、ムンプスウィルスＲＮＡ（Ｖｉｒｃｅｌｌ）を使用した。ムンプスウィルスＲＮＡを６２５０コピーから２４コピーまで、１／４ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＰＣＲの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスＲＮＡを標的としたＲＴ−ＰＣＲを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム又は塩化テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスフォアードプライマー（配列番号７）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスプローブ（配列番号８）  ０．６μＬ、
１０μＭ  ムンプスウィルスリバースプライマー（配列番号９）  ０．４μＬ、
０．３Ｍ  カルニチン
４％  トリメチレングリコール
ＲＮＡ  ５μＬ、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  １０分
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ４５秒  ４５サイクル
【００４８】
（３）結果
その結果を図９、図１０に示す。図９は縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図１０のＡは酢酸テトラメチルアンモニウム、Ｂは塩化テトラメチルアンモニウムでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、塩化テトラメチルアンモニウムを使用した場合も酢酸テトラメチルアンモニウムと同様に検出感度が向上した。
【００４９】
実施例６
Ｔａｑ変異体の作製
Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１４）を含有するプラスミド、ｐＴａｑ  Ｅ５０７Ｋ、ｐＴａｑ  Ｅ５０７Ｒ、ｐＴａｑ  Ｅ７４２Ｋ、ｐＴａｑ  Ｅ７４２Ｒを作製した。
【００５０】
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１４）（ｐＴａｑ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、ｐＴａｑ  Ｅ５０７Ｋについては配列番号１５および１６に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ  Ｅ５０７Ｒについては配列番号１７および１８に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ  Ｅ７４２Ｋについては配列番号１９および２０に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ  Ｅ７４２Ｒについては配列番号２１および２２に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
【００５１】
実施例７
Ｔｔｈ変異体の作製
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２６）を含有するプラスミド、ｐＴｔｈ  Ｑ５０９Ｋ、ｐＴｔｈ  Ｑ５０９Ｒ、ｐＴｔｈ  Ｅ７４４Ｋ、ｐＴｔｈ  Ｅ７４４Ｒを作製した。
【００５２】
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２６）（ｐＴｔｈ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、ｐＴｔｈ  Ｑ５０９Ｋについては配列番号２７および２８に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ  Ｑ５０９Ｒについては配列番号２９および３０に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ  Ｅ７４４Ｋについては配列番号３１および３２に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ  Ｅ７４４Ｒについては配列番号３３および３４に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
【００５３】
実施例８
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例６、７で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍｌの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。
【００５４】
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００５５】
（試薬）
Ａ液：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ  塩化マグネシウム、１５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ液：  １．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ  
Ｃ液：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）  
Ｄ液：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：  １ｍｇ／ｍｌ  仔牛胸腺ＤＮＡ
【００５６】
（方法）  
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を、液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０  ＴＲ）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００５７】
実施例９
ＤＮＡポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
上記のテトラメチルアンモニウム塩耐性評価方法で、実施例７で得られた改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を評価した。
【００５８】
結果を図１１に示す。野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは、５０ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウム添加で阻害が生じ増幅が見られなくなった。一方、改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼは２００ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウムを添加しても増幅の阻害は見られなかった。改変によって、テトラメチルアンモニウム塩に耐性ができることがわかる。また、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼはテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることがわかる。図１３にＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の同一性を示す。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼは９５％以上の同一性があり、この同一性の高さからも同様の性能が出たことが考えられる。
【００５９】
また、改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼでも同様のテトラアンモニウム塩耐性評価を行った。結果、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのＱ５０９Ｋ、Ｑ５０９Ｒ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ変異体でも野生型と同様、２００ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウムを添加しても増幅の阻害は見られなかった。
【００６０】
実施例１０
１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーで、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  Ｅ５０７Ｋ、Ｔａｑ  Ｅ５０７Ｒ）で血液を鋳型にリアルタイムＰＣＲを実施した。
（１）鋳型
鋳型として、血液１μlを使用した。
（２）ＰＣＲ反応
酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を、下記に示す。
Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）または改変型Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １ｕｎｉｔ、
抗Ｔａｑ抗体  ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）  ２μＬ、
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）  ０．４μＬ、
１０μＭ  プライマー（配列番号２３）  ０．６μＬ、
１０μＭ  プローブ（配列番号２４）  ０．６μＬ、
１０μＭ  プライマー（配列番号２５）  ０．４μＬ、
０．３Ｍ  カルニチン
４％  トリメチレングリコール
血液  １μＬ、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
９５℃  １分
９５℃  １５秒−６０℃  ６０秒  ４０サイクル
【００６１】
（３）結果
その結果を図１２に示す。図１２はそれぞれの酵素で行った増幅曲線を示す。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは増幅が見られないものの、改変型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ５０７Ｋ、Ｅ７４２Ｋ）では立ち上がりが見られ、血液から直接、精製を経ることなく増幅できることが示された。Ｅ５０７Ｒ、Ｅ７４２Ｒでも同様の結果が得られた。テトラメチルアンモニウム塩の効果でＰＣＲの効率が向上し、血液の阻害を受けることなくＰＣＲが成功したと考えられる。
【００６２】
同様の評価を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの代わりに野生型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び改変型Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｋ、Ｑ５０９Ｒ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ）を用いても実施した。結果、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼでは野生型、改変型共に立ち上がりが見られ、血液から直接、精製を経ることなく増幅できることが示された。テトラメチルアンモニウム塩に耐性があれば野生型だけでなく改変型ＤＮＡポリメラーゼでも、血液からの増幅が可能になる。
【００６３】
今まで汎用的に使用していたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼではテトラメチルアンモニウム塩の阻害効果の方が大きく、ＰＣＲを促進する効果を十分見ることができなかった。テトラメチルアンモニウム塩耐性のＤＮＡポリメラーゼを用いることで、テトラメチルアンモニウム塩のＰＣＲ促進効果を十分に発揮させ、通常はできないと考えられていた、血液からの直接ＰＣＲをも可能にできることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、分子生物学の分野において有用な組成物、殊に鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な組成物を提供する。本発明により、核酸増幅において反応阻害がなく、操作性の低下が顕著でなく、低コストで反応を実施でき、特に、核酸増幅反応用のプレミックス試薬への混合という用途において、より利便性の高い試薬形態を供給可能である。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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