(57)【要約】【課題】マクロファージの増殖・分化阻害又はマクロファージの老化促進による肺線維症を抑制するための組成物の提供。【解決手段】スフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（S1P2)アンタゴニストを有効成分として含有する、線維化領域におけるマクロファージの老化を促進する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（S1P2)アンタゴニストを有効成分として含有する、線維化領域におけるマクロファージの老化を促進する組成物。
【請求項２】
さらに、線維化領域における線維芽細胞におけるコラーゲン分解酵素の発現を促進する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
スフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（SIP2)アンタゴニストが以下の式で表される（１）又は（２）のピラゾロピリジン誘導体、又はその製薬上許容される塩である、請求項１又は２に記載の組成物：
（１）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化１】
2017019741.tif 000019
又は
（２）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化２】
2017019741.tif 000020
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含む、肺線維化抑制剤。
【請求項５】
マクロファージの増殖・分化を阻害するコロニー刺激因子1受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤を有効成分として含む、肺線維化抑制剤。
【請求項６】
コロニー刺激因子1受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤が下記（１）〜（６）のいずれかの化合物である、請求項５記載の肺線維化抑制剤：
（１）
BLZ945（4-(2-((1R,2R)-2-hydroxycyclohexylamino)benzo[d]thiazol-6-yloxy)-N-methylpicolinamide）
【化３】
2017019741.tif 000021
、
（２）
GW2580
（2,4-Pyrimidinediamine, 5-[[3-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxy]phenyl]methyl]）
【化４】
2017019741.tif 000022
、
（３）
Linigfanib（ABT-869)
（1-(4-(3-amino-1H-indazol-4-yl)phenyl)-3-(2-fluoro-5-methylphenyl)urea）
【化５】
2017019741.tif 000023
、
（４）
OSI-930
（3-[(4-quinolinylmethyl)amino]-N-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-2-thiophenecarboxamide）
【化６】
2017019741.tif 000024
、
（５）
CEP-32469
（Urea, N-[3-[(6,7-dimethoxy-4-quinazolinyl)oxy]phenyl]-N-[5-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimethylethyl)-3-isoxazolyl]）
【化７】
2017019741.tif 000025
、又は
（６）
Pexidartinib（PLX3397)
（N-[5-[(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)methyl]-2-pyridinyl]-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinemethanamine）
【化８】
2017019741.tif 000026
【請求項７】
S1P2を発現する細胞と候補化合物を接触させ、S1P2の活性又は発現を阻害する候補化合物を選択することを特徴とする線維化抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
放射標識S1Pの結合の阻害活性、タンパクリン酸化酵素ERK活性化、又は細胞内シグナル伝達活性化を指標にして、候補化合物を選択する、請求項７記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺線維症に関与するマクロファージの増殖・分化を阻害し、又はマクロファージの老化を促進する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺線維症（IPF：Idiopathic pulmonary fibrosis)は、特発性間質性肺炎の一つであり、特発性間質性肺炎の中で最も患者数が多く、予後が極めて悪い疾患である。肺線維症は肺の間質の炎症に起因し、肺の線維化が進み、肺におけるガス交換が低下し、呼吸不全を引き起こす。
【０００３】
特発性の肺線維症は原因が不明であり、二次性の肺線維症は、膠原病、放射線、抗癌剤などの薬剤、中毒等が原因となり発症することがわかっている。
【０００４】
日本における発症頻度は、特発性の場合、10万人当たり約20人である。
【０００５】
治療法としては、ステロイド、免疫抑制剤、ビルフェニドン投与が行われているが、対症療法であり効果は限定的である。肺線維症の予後は極めて悪く、診断後生存期間は2.5〜3.5年に過ぎない。
【０００６】
スフィンゴシン-１-リン酸（S1P)は、血漿中に数百nMの濃度で存在する脂質メディエーターであり、細胞膜上に存在するS1P受容体のリガンドとして細胞運動制御、アクチン骨格形成、細胞増殖、接着結合形成など様々な細胞応答を引き起こす。S1P受容体として、Gタンパク質共役型受容体の類縁分子であるS1P1(EDG-1）、S1P2(EDG-5)、S1P3(EDG-3)、S1P4(EDG-6)及びS1P5(EDG-8)がこれまでに同定されている。
【０００７】
S1P受容体のアンタゴニストが、線維化を含む種々の疾患の治療に利用できる可能性について報告されていた（特許文献１及び２を参照）。しかし、疾患に関連した受容体として同定されていたのは、S1P1(EDG-1）及びS1P4(EDG-6)のみであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第WO01/03739号
【特許文献２】特開2012-102124号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マクロファージの増殖・分化阻害又はマクロファージの老化促進による肺線維症を抑制するための組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、スフィンゴシン-１-リン酸（S1P)受容体であるS1P2が関与する生体内の様々な細胞応答について研究すべく、S1P2遺伝子をノックアウトしたマウスを作出し、種々の検討を行った。
【００１１】
その中で、肺線維化とS1P2の関連を調べるべく、野生型マウスにおいて肺線維症マウスモデル(ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデル）を作出する方法であるブレオマイシン投与を野生型マウスとS1P2遺伝子をノックアウトしたマウスに対して行い、両マウスの肺の線維化が誘導されるかについて検討を行った。
【００１２】
その結果、S1P2遺伝子をノックアウトしたマウスにおいて、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症が軽症であることを見出した。
【００１３】
本発明者らは、S1P2遺伝子ノックアウトマウスにおいてブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症が軽症となるメカニズムについてさらに検討を行い、肺線維化領域においてS1P2発現細胞が集積していること、並びにマクロファージが肺の線維化に関与しており、S1P2遺伝子ノックアウトマウスではマクロファージの老化が進み、さらに肺線維芽細胞の老化が進みコラーゲン分解酵素の発現上昇が認められることから、S1P2がマクロファージ及び肺線維芽細胞老化を抑制することにより肺線維化が促進していることを見出した。
【００１４】
また、マクロファージ増殖・分化阻害剤を用いて、マクロファージの増殖を阻害することにより、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維化を抑制することを見出した。
【００１５】
本発明者らは、これらの知見より、S1P2の作用を拮抗する物質がマクロファージや肺線維芽細胞の細胞老化を促進することにより肺線維化を抑制し、さらにマクロファージの増殖・分化を阻害させることにより肺線維化を抑制することを見出し、S1P2の作用を拮抗する物質又はマクロファージ増殖・分化阻害剤を肺線維化の抑制薬として利用し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  スフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（S1P2)アンタゴニストを有効成分として含有する、線維化領域におけるマクロファージの老化を促進する組成物。
[２]  さらに、線維化領域における線維芽細胞におけるコラーゲン分解酵素の発現を促進する、[１]の組成物。
[３]  スフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（S1P2)アンタゴニストが以下の式で表される（１）又は（２）のピラゾロピリジン誘導体、又はその製薬上許容される塩である、[１]又は[２]の組成物：
（１）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化１】
2017019741.tif 000002
又は
（２）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化２】
2017019741.tif 000003
[４]  [１]〜[３]のいずれかの組成物を含む、肺線維化抑制剤。
[５]  マクロファージの増殖・分化を阻害するコロニー刺激因子1受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤を有効成分として含む、肺線維化抑制剤。
[６]  コロニー刺激因子I受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤が下記（１）〜（６）のいずれかの化合物である、[５]の肺線維化抑制剤：
（１）
BLZ945（4-(2-((1R,2R)-2-hydroxycyclohexylamino)benzo[d]thiazol-6-yloxy)-N-methylpicolinamide）
【化３】
2017019741.tif 000004
、
（２）
GW2580
（2,4-Pyrimidinediamine, 5-[[3-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxy]phenyl]methyl]）
【化４】
2017019741.tif 000005
、
（３）
Linigfanib（ABT-869)
（1-(4-(3-amino-1H-indazol-4-yl)phenyl)-3-(2-fluoro-5-methylphenyl)urea）
【化５】
2017019741.tif 000006
、
（４）
OSI-930
（3-[(4-quinolinylmethyl)amino]-N-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-2-thiophenecarboxamide）
【化６】
2017019741.tif 000007
、
（５）
CEP-32469
（Urea, N-[3-[(6,7-dimethoxy-4-quinazolinyl)oxy]phenyl]-N-[5-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimethylethyl)-3-isoxazolyl]）
【化７】
2017019741.tif 000008
、又は
（６）
Pexidartinib（PLX3397)
（N-[5-[(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)methyl]-2-pyridinyl]-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinemethanamine）
【化８】
2017019741.tif 000009
[７]  S1P2を発現する細胞と候補化合物を接触させ、S1P2の活性又は発現を阻害する候補化合物を選択することを特徴とする線維化抑制剤のスクリーニング方法。
[８]  放射標識S1Pの結合の阻害活性、タンパクリン酸化酵素ERK活性化、又は細胞内シグナル伝達活性化を指標にして、候補化合物を選択する、[７]のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１７】
肺線維化には、マクロファージが関与し、マクロファージが増殖し、線維化領域に集積することにより線維化が進む。本発明のS1P2アンタゴニストは、マクロファージや線維芽細胞の老化を促進し、また本発明のコロニー刺激因子1受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤はマクロファージの増殖・分化を抑制することにより、マクロファージの集積を阻害し、肺線維化を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】S1P2欠失がブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制することを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2遺伝子欠損（S1P2-KO）マウス（図１−１B）及び野生型マウス（図１−１A）の肺のSirius Red染色像（上段）とPDGFRαの免疫染色像（下段）を示す。図は代表的な染色像を示す。
【図１−２】S1P2欠失がブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制することを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白丸）及び野生型マウス（黒丸）の肺の線維化領域（図１−２A）と肺線維化の病理評価（図１−２B）を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図１−３】S1P2欠失がブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制することを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白バー）及び野生型マウス（黒バー）の肺組織内のフィブロネクチン(図１−３A)，コラーゲンIα1（図１−３B)およびFSP1（図１−３C)のmRNA発現を示す。データは野生型マウスの生理食塩水投与群を1として相対量を平均±標準誤差で示す。β-アクチンを内部標準遺伝子として用いた。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図２】S1P2欠失がブレオマイシン投与による肺胞炎症を抑制することを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白丸）及び野生型マウス（黒丸）の気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図２A）、総タンパク量（図２B）、総細胞数（図２C）、マクロファージ数（図２D）を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図３−１】肺組織におけるS1P2の発現解析の結果を示す図である。ブレオマイシン（図３−１B）あるいは生理食塩水（図３−１A）の腹腔内投与後33日のS1P2LacZ/+マウスの肺のX-gal染色像を示す。図は代表的な染色像を示す。
【図３−２】肺組織におけるS1P2の発現解析の結果を示す図である。ブレオマイシン（図３−２B）あるいは生理食塩水（図３−２A）の腹腔内投与後33日のS1P2LacZ/+マウスの肺のX-gal染色とMac-3の免疫染色の二重染色像を示す。図は代表的な染色像を示す。
【図４】骨髄由来細胞に発現するS1P2がブレオマイシンで誘発される肺線維化に関与することを示す図である。図４Aは、ブレオマイシンの腹腔内投与後33日の各骨髄移植マウスの肺の線維化領域を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。図４B、C及びDは、ブレオマイシンの腹腔内投与後33日の各骨髄移植マウスの気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図４B）、総細胞数（図４C）、マクロファージ数（図４D）を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図５−１】マクロファージ増殖・分化阻害剤（BLZ945）がブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制することを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後25日のBLZ945投与群（図５−１C）、溶媒投与群（図５−１B）、非投与群（図５−１A）の各マウスの肺のSirius Red染色像を示す。図は代表的な染色像を示す。
【図５−２】マクロファージ増殖阻害剤（BLZ945）がブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制することを示す図である。ブレオマイシンの腹腔内投与後25日のBLZ945投与群，溶媒投与群，非投与群の各マウスの肺の線維化領域(図５−２A）。気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図５−２B）、総細胞数（図５−２C）、マクロファージ数（図５−２D）を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図６−１】S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス及び野生型マウスの肺のSA-β-gal染色像を示す。図は代表的な染色像で示す。
【図６−２】S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白丸）及び野生型マウス（黒丸）の肺の1視野あたりのSA-β-gal陽性細胞数を示す。データは平均±標準誤差で示す。
【図６−３】S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス及び野生型マウスの気管支肺胞洗浄液中の細胞のF4/80とp16INK4aの蛍光免疫染色像を示す。図は代表的な染色像で示す。
【図６−４】S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白丸）及び野生型マウス（黒丸）の気管支肺胞洗浄液中の細胞のF4/80陽性細胞数に対するp16INK4a陽性細胞数の割合を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図６−５】S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス(図６−５B)及び野生型マウス（図６−５A)の肺のp16INK4aの免疫染色像を示す。図は代表的な染色像を示す。
【図７−１】S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス及び野生型マウスの肺線維芽細胞のp16INK4aタンパク発現を示すウエスタンブロットの結果を示す。
【図７−２】S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白バー）及び野生型マウス（黒バー）の肺線維芽細胞のp16INK4aタンパク発現を示し、GAPDHタンパクを内部標準としてp16INK4aタンパクの発現量を補正及び算出した。データは野生型マウスの生理食塩水投与群から単離した肺線維芽細胞を1として相対量を平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図７−３】S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス及び野生型マウスの肺線維芽細胞のSA-β-gal染色像を示す。図は代表的な染色像で示す。
【図７−４】S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白バー）及び野生型マウス（黒バー）の総細胞数に対するSA-β-gal陽性細胞数の割合を示す。データは平均±標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図７−５】S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なることを示す図である。ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス（白バー）及び野生型マウス（黒バー）の肺線維芽細胞内のコラーゲン分解酵素MMP1（図７−５A)、MMP2（図７−５B)、MMP3（図７−５C)のmRNA発現を示す。データは野生型マウスの生理食塩水投与群から単離した肺線維芽細胞を1として相対量を平均＋標準誤差で示す。括弧の中の数値は各群の実験に使用したマウスの匹数を示す。
【図８】S1P1及びS1P3は線維化抑制効果に関与しないことを示す図である。図中、黒丸は野生型マウス(WT)を示し、白丸はS1P1+/-マウス（図８A)又はS1P3-KOマウス（図８B)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、S1P2のアンタゴニスト（拮抗剤）を有効成分として含む、マクロファージ又は線維芽細胞の老化を促進する組成物に関する。該組成物は、線維化領域におけるマクロファージ又は線維芽細胞の老化(senescence）を促進することにより、肺の線維化を抑制するとともに肺胞の炎症を抑制し、肺線維症の予防又は治療に用いることができる。
【００２１】
本発明の組成物により予防又は治療し得る肺線維症は、特発性間質性肺炎（IIP: Idiopathic interstitial pneumonia)の一つである特発性肺線維症である。
【００２２】
アンタゴニストは、生体内の受容体分子に働いて、シグナル伝達等を遮断する化合物をいい、S1P2アンタゴニストは、S1P2に結合しS1P2拮抗作用を有する。
【００２３】
S1P2のアンタゴニストとしては、以下の式で表される（１）又は（２）のピラゾロピリジン誘導体、又はその製薬上許容される塩が挙げられる。
（１）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化９】
2017019741.tif 000010
（２）  下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化１０】
2017019741.tif 000011
【００２４】
また、S1P2のアンタゴニストとして、S1P2に対するアンタゴニスト抗体も含む。該抗体は、S1P2に結合することにより、S1P2にリガンドが結合することを阻止し、シグナル伝達を阻害する。該抗体は、例えば、S1P2のリガンドと結合する部位に存在するエピトープを認識する抗体である。抗体は、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も含み、好ましくはモノクローナル抗体である。また、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体も含まれる。S1P2に対するアンタゴニスト抗体は、公知の手法によって作製することができ、S1P2にリガンドが結合することを阻止する活性により選択すればよい。
【００２５】
製薬上許容される塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の各種無機酸付加塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩又はアスコルビン酸塩等の各種有機酸付加塩；アスパラギン酸塩、又はグルタミン酸塩等の各種アミノ酸との塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、場合によっては、含水物、水和物あるいは溶媒和物であってもよい。
【００２６】
S1P2は、単球の血管外遊出、又は常在マクロファージの増殖を促進することにより、線維化病変におけるマクロファージ集積に関与していると予測される。この際、S1P2の作用により、マクロファージの老化が抑制される。従って、S1P2のアンタゴニストを用いてS1P2の作用を阻害することにより、マクロファージの老化が促進され、マクロファージの増殖が阻害される。その結果、線維化病変部位におけるマクロファージの集積が抑制され、線維化が抑制される。
【００２７】
また、マクロファージのS1P2は、メディエーター放出を促進し、この作用を介して線維化領域において、線維芽細胞の老化を促進し、細胞老化関連分泌現象（SASP; senescence-associated secretory phenotype)( J. Cell Biol., 2011, 192, 547-556）によりコラーゲンを分解する酵素であるMMP（マトリックスメタロプロテアーゼ）発現を変化させると予測される。従って、S1P2のアンタゴニストを用いてS1P2の作用を阻害することにより、線維芽細胞によるMMPの発現レベルが増加し、コラーゲンの分解が促進され、線維化が抑制される。
【００２８】
さらに、本発明はマクロファージ増殖阻害剤を含む肺線維症の予防又は治療薬を包含する。該医薬は、肺の線維化抑制剤でもある。
【００２９】
マクロファージ増殖阻害剤として、膜貫通受容体型のチロシンキナーゼであるコロニー刺激因子I受容体（CSF1R：Colony Stimulating Factor 1 Receptor)の阻害剤が挙げられる。CSF1R(FMS、CD115）は１回膜貫通型のチロシンキナーゼであり、マクロファージ等の細胞で多く発現しており、CAF1R阻害剤はマクロファージの増殖を阻害することにより、肺の線維化を抑制し得る。
【００３０】
CSF1R阻害剤の例として、以下の化合物を挙げることができる。
【００３１】
BLZ945（4-(2-((1R,2R)-2-hydroxycyclohexylamino)benzo[d]thiazol-6-yloxy)-N-methylpicolinamide）
【化１１】
2017019741.tif 000012
【００３２】
GW2580
（2,4-Pyrimidinediamine, 5-[[3-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxy]phenyl]methyl]）
【化１２】
2017019741.tif 000013
【００３３】
Linigfanib（ABT-869)
（1-(4-(3-amino-1H-indazol-4-yl)phenyl)-3-(2-fluoro-5-methylphenyl)urea）
【化１３】
2017019741.tif 000014
【００３４】
OSI-930
（3-[(4-quinolinylmethyl)amino]-N-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-2-thiophenecarboxamide）
【化１４】
2017019741.tif 000015
【００３５】
CEP-32469
（Urea, N-[3-[(6,7-dimethoxy-4-quinazolinyl)oxy]phenyl]-N-[5-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimethylethyl)-3-isoxazolyl]）
【化１５】
2017019741.tif 000016
【００３６】
Pexidartinib（PLX3397)
(N-[5-[(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)methyl]-2-pyridinyl]-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinemethanamine)
【化１６】
2017019741.tif 000017
【００３７】
本発明の組成物を含む医薬は、製剤化に際し通常用いられる担体、賦形剤、増粘剤、保剤、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、嬌味剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、無痛化剤、含硫還元剤等の成分や吸収改善、固体安定化等を目的として種々の他の機能性成分を適宜配合することができる。担体、賦形剤の例としては、水溶性又は難溶性のもので、例えば糖類、多糖類、デキストリン類、セルロース類、合成又は半合成高分子類、アミノ酸類、ポリアミノ酸類、タンパク質類、リン脂質類等が挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物を含む医薬の投与経路としては、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、経口が挙げられる。治療剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、たとえば、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、あるいは錠剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられる。通常は、経口投与が好ましいため、水溶液又は錠剤が好ましい。
【００３９】
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、一回に0.005〜５mg/kg体重が好ましく、0.005〜１mg/kg体重がより好ましい。１日１回あるいは数回に分けて連日投与することができる。
【００４０】
本発明は、さらにS1P2の活性又は発現を阻害し、線維化抑制作用を有する化合物をスクリーニングする方法を包含する。スクリーニングは、例えば、S1P2を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary  (CHO））細胞などの細胞を用いて、該細胞と候補化合物を接触させ、細胞における放射標識S1Pの結合の阻害活性、タンパクリン酸化酵素ERK活性化や細胞内遊離カルシウム濃度上昇などの細胞内シグナル伝達活性化を指標として行うことができる。候補化合物がS1P2アンタゴニスト活性を有する場合、細胞における放射標識S1Pの結合が阻害され、タンパクリン酸化酵素ERK活性が活性化され、細胞内遊離カルシウム濃度上昇などの細胞内シグナル伝達が活性化される。
【００４１】
線維化抑制と関係を有するのは、S1P受容体中でもS1P2のみであり、S1P1やS1P3が線維化抑制に関与しないことは後記の比較例でも示されている。
【実施例】
【００４２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
実施例  S1P2と線維化抑制の関係
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は，以下の通りである。
【００４４】
（マウス）
S1P2遺伝子欠損（S1P2-KO）マウス（129Ola;C57BL/6J mixed background）は，文献（Cancer Res. 2010, 16, 509-520）に記載した方法により作成した。S1P2-KOマウスは、C57BL/6Jマウスと1回戻し交配をし、実験には8〜10週齢雄のS1P2-KOマウス及び同腹の野生型マウスを用いた。S1P2遺伝子座にβ-galactosidase遺伝子を挿入した（S1P2LacZ/+）マウス（129Ola;C57BL/6J mixed background）は、文献（Cancer Res. 2010, 16, 509-520）に記載した方法により作成した。S1P2LacZ/+マウスは、C57BL/6Jマウスと3回戻し交配をし、実験には8〜10週齢雄のS1P2LacZ/+マウスを用いた。マウスは、自由に飼料と水が接種可能な24℃、湿度60％以下、12時間消灯―12時間点灯サイクルの条件下で飼育した。マウスの遺伝子型の確認はPCRによって行った。標準的な手法によってマウスの尾から回収したゲノムDNAをPCRのテンプレートとして用いた。S1P2遺伝子欠損アリル及び野生型アリルを検出するために以下の三種類のプライマーを使用した。
【００４５】
Forward1; 5’-tggctacccgtgatattgctgaagagcttg-3’（配列番号１）
Reverse1; 5’-tgagcagtgagttaagggtggcaaaggcaa-3’（配列番号２）
Forward2; 5’-cagtgacaaaagctgccgaatgctgatgct-3’（配列番号３）
PCRは，94℃30秒、59℃45秒、2℃60秒のサイクルを40回繰り返した。
【００４６】
（ブレオマイシン誘発性肺線維化モデル）
雄マウス（8〜10週齢）に0.035 mg/g体重のブレオマイシン（日本化薬、東京）を腹腔内投与してブレオマイシン誘発性のマウス肺線維化モデルを作成した。ブレオマイシン溶液（生理食塩水にて5 mg/mlの濃度に調製）を週2回、4週間、計8回、27ゲージ針を装着したテルモシリンジを用いて腹腔内投与した。対照群には、生理食塩水（150μl）を腹腔内投与した。最終投与より1週間後（投与後33日目）に、マウスを安楽死させ、以下の解析を行った。
【００４７】
（組織染色）
ブレオマイシン腹腔内投与後33日のマウスをペントバルビタール（共立製薬株式会社、東京）(50 mg/kg, i.p)深麻酔にて安楽死させた後に腹大動脈切断により放血させた。すばやく胸腔を開き、肺を露出させ、右肺門部を結紮した後、右肺を取り出し、液体窒素で凍結した。右肺はmRNA発現分析に用いた。左心房に切開を加えてから4％パラホルムアルデヒド液（0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）に溶解）を右心室に注入して肺を灌流固定後、マウス気管上部より18ゲージ針を挿入し、テルモシリンジにて0.5 mLの0.5％低融点アガロース含有4％パラホルムアルデヒド液（0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）に溶解）を気管内に注入した。18ゲージ針をはずす際に気管を縛って、膨張した肺の固定を維持した。肺を取り出した後に、4％パラホルムアルデヒド液中で24時間以上さらに固定した後、左肺を矢状断にて肺門部、中心部、及び末梢部に三分割し、パラフィン包埋、薄切し、5μmのパラフィン切片を作製した。
【００４８】
肺の線維化領域のコラーゲン線維の増加は、左肺の肺門部、中心部及び末梢部の各パラフィン切片をSirius redで染色後、画像解析ソフトImage-Jソフトウエアにて各切片の肺の全面積に対するSirius red陽性面積の割合（％値）を算出した。左肺の肺門部、中心部及び末梢部それぞれの線維化領域の平均により肺全体の線維化領域を評価した。肺の線維化領域の線維芽細胞の浸潤・遊走は、ヤギポリクローナル抗PDGFRα抗体（AF1062, R&D systems社）を用いたパラフィン切片の免疫染色で評価した。パラフィン切片の免疫染色はABC法（VECTASTAIN社）を用いて行った。ABC法に用いた二次抗体は、DAB（3,3'-Diaminobenzidine,tetrahydrochloride，和光，大阪）により発色した。反応終了後、核をヘマトキシリンによって染色し、エタノールで脱水後、キシレンで脱脂してEntellan New（Merck社）で封入した。
【００４９】
肺線維化の病理評価は、Ashcroftによる肺線維化スコアにより行った。顕微鏡下400倍の倍率にて各視野毎に肺の線維化の程度を軽度から重度に0-8の段階に分けスコア―化し、全視野（各マウスにつき10視野以上）をスコアリングしてスコアの平均により肺全体の線維化程度を評価した。
【００５０】
（気管支肺胞洗浄液の解析）
１．気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）の採取
ブレオマイシン腹腔内投与後33日のマウスの気道洗浄を行い、BALFを採取した。まず、ペントバルビタール（共立製薬株式会社、東京）(50 mg/kg, i.p)深麻酔にて安楽死させた後に腹大動脈切断により放血させた。すばやくマウス気管上部より18ゲージ針を挿入し、テルモシリンジにてリン酸緩衝生理食塩水（phosphate-beffered saline, PBS）1 mlを気管内に注入し採取した。この作業を2回繰り返し、注入総量（2 ml）の約80％以上のBALFを回収した。回収したBALFは遠心（450×g, 4℃, 10 min）により沈渣（細胞成分）と上清に分離した。
【００５１】
２．気管支肺胞洗浄液の細胞分画の分析
沈渣にPBS 1 mlを加えて細胞を懸濁し、血球計数板を用いて光学顕微鏡下で細胞数を計測した。残りの沈渣溶液は総細胞数が10万個になるように調整し、塗抹標本を作製した。塗抹標本はDiff Quick（シスメックス国際試薬株式会社、神戸）で染色した。1標本あたり150〜200個の細胞を数え、マクロファージの割合を算出した。
【００５２】
３．BALF中総タンパク量の測定
Lowry法によりBALF中の総タンパク量を測定した。ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin, BSA）（和光、大阪）を用いて検量線を作成した。
【００５３】
４．BALF中可溶性コラーゲン量の測定
BALF中の可溶性コラーゲン量はSircol assay kit (Biocolor社)により測定した。ウシコラーゲンを用いて検量線を作成した。
【００５４】
（mRNA発現分析）
１．総RNAの抽出
ブレオマイシン腹腔内投与後33日のマウスをペントバルビタール（共立製薬株式会社、東京）(50 mg/kg、 i.p)深麻酔にて安楽死させた後にすばやく腹大動脈切断により放血させ、肺を摘出した。TRIzol Reagent（Invitrogen社）を用いて、摘出肺あるいは培養肺線維芽細胞から総RNAを抽出した。
【００５５】
２．定量的PCR反応
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems社)を用いて逆転写反応を行い、2μgの総RNAからcDNAを合成した。その産物の1/5量を用いて、定量的PCR反応を行った。MESA Green qPCR MasterMix Plus (Eurogenetec社)試薬を用い、ABI PRISM 7300 sequence detection system (Applied Biosystems社)で定量的PCR 反応を行った。PCRは、94℃15秒、60℃60秒のサイクルを40回繰り返した。すべての実験においてDissociation curve分析で解離温度を確認し、PCR産物をアガロースゲル電気泳動し目的産物の増幅を確認した。遺伝子発現の定量化のため、β-アクチンを内部標準遺伝子とし、比較Ct法（ΔΔCT法）を用いた相対的定量で解析した。
使用したプライマーは表１に示す。
【００５６】
【表１】
2017019741.tif 000018
【００５７】
（X-gal染色）
ブレオマイシン腹腔内投与後33日のS1P2lacZ/+マウスをペントバルビタール（共立製薬株式会社、東京）(50 mg/kg、 i.p)深麻酔にて安楽死させた後、左心房に切開を加えてから4%パラホルムアルデヒド液（0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）に溶解）を右心室に注入して肺を灌流固定した。凍結組織包埋剤OCTコンパウンド(Sakura Fine Chemical、 東京)に包埋、薄切し、10μmの凍結切片を作成した。X-gal染色のために、0.2％グルタールアルデヒドで処理した後、PBSで洗浄し、X-gal染色液（1 mg/ml X-gal  （5-bromo-4-chloro-3-indolyi-β-D-galactopyranoside)、100 mM soudium phosphate、pH 7.4、5 mM potassium ferrocyanide、5mM potassium ferricyanide、2mM MgCl2）を用いて37℃で一晩反応させ、S1P2遺伝子座に挿入されたlacZの発現を解析した。核の対比染色にNuclear fast Red（VECTOR社）を用いた。また、X-gal染色とラットモノクローナル抗Mac-3抗体（553322, BD Biosciences社）を用いた免疫染色の二重染色は、X-gal染色後、免疫染色はABC法を用いて行った。反応終了後、エタノールで脱水後、キシレンで脱脂してEntellan Newで封入した。
【００５８】
（骨髄移植実験）
致死量の放射線照射（3時間間隔の4.8 Gyの2回照射）をおこなった8週齢のS1P2-KOマウスあるいは野生型マウスに、S1P2-KOマウスあるいは野生型マウスの大腿骨及び脛骨より調製した骨髄細胞（1 x 107個）を尾静脈から静脈内注射し、骨髄移植を施行した。マウスを六週間回復させた後、ブレオマイシンで誘発される肺線維化を解析した。
【００５９】
（BLZ945）
雄C57BL/6Jマウス（8週齢）に200 mg/kg体重/日のマクロファージ増殖・分化阻害剤BLZ945(Csf1受容体キナーゼ阻害剤)（Chemshuttle社）をブレオマイシン腹腔内投与開始の3日前から連日経口投与した。BLZ945溶液は20％ Captisol (Captisol 社)にて40 mg/mlの濃度に調製した。対照群には、20％ Captisol（100μl）を経口投与した。
【００６０】
（肺線維芽細胞の単離）
マウスより摘出した肺を細切し、Collagenase A（Roche社）含有DMEM培地中でインキュベートした。その後、細胞懸濁液を遠心した。上清を除去し、再懸濁して細胞培養用ディシュに播種した。細胞の接着を確認して非接着細胞（上清）を除去し、接着細胞を培養し、実験に用いた。
【００６１】
（ウエスタンブロット）
肺線維芽細胞をPBSで洗浄した後、2倍濃度のLaemmli SDSサンプル緩衝液を加えて回収し、5分間煮沸した。回収したサンプルを15％SDS-PAGEにて分離した。その後、イモビロン-Pメンブレン（Merck社）に転写後、ウサギポリクローナル抗p16INK4a抗体（M-156、Santa Cruz Biotechnology社）、ウサギモノクローナル抗GAPDH抗体（2118、Cell Signaling Technology社）を用いてそれぞれのバンドを検出し、バンドの濃さをデンシトメーターを用いて数値化した。GAPDHタンパクを内部標準としてp16INK4aタンパクの発現量を補正及び算出した。
【００６２】
（SA-β-gal染色）
ブレオマイシン腹腔内投与後33日のマウス肺の凍結切片あるいは培養肺線維芽細胞を0.2％グルタールアルデヒドで処理した後、PBSで洗浄し、X-gal染色液（1 mg/ml X-gal  （5-bromo-4-chloro-3-indolyi-β-D-galactopyranoside)、40 mM クエン酸-リン酸緩衝液、pH6.0、5 mM potassium ferrocyanide、5 mM potassium ferricyanide、150 mM NaCl、2 mM MgCl2）を用いて37℃一晩反応させ、老化マーカーとして広く知られている老化細胞でみられる酸性β-ガラクトシダーゼ活性を解析した。核の対比染色にNuclear fast Red（VECTOR社）を用いた。マウス肺においては一視野あたりにおけるSA-β-gal陽性細胞数を、肺線維芽細胞においては総細胞数に対するSA-β-gal陽性細胞数の割合（％）を求めた。
【００６３】
（免疫蛍光細胞染色）
気管支肺胞洗浄液の細胞を培養用チャンバースライドに播種した。2時間後に細胞の接着を確認して非接着細胞（上清）を除去し、接着細胞を実験に用いた。細胞をPBSで洗浄後、4％パラホルムアルデヒド液で固定し、その後、15分間、PBS中の1％ Triton X-100で透過処理した。細胞を5％正常ヤギ血清（和光、大阪）でブロッキング後、ラットポリクローナル抗F4/80抗体（Cl:A3-1 AbD Serotec社）とウサギポリクローナル抗p16INK4a抗体で一晩インキュベートし、続いて、ヤギAlexaFlour 488あるいは584結合2次抗体（Molecular Probe社）で1時間インキュベートした。細胞を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI, Molecular Probe社）で5分間対比染色した。スライドを蛍光法組織染色用水系封入剤フルオロマウント（FluoromountTM, Diagnostic Biosystems社）で封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss Axiovert 200M with LSM5 Pascal）で観察した。F4/80陽性細胞数に対するp16INK4a陽性細胞数の割合（％）を求めた。
【００６４】
（統計処理）
測定値はすべて平均値±標準偏差で表した。有意差検定は，二元配置分散分析、post hoc test検定にはBonferroni法を用い、危険率5％未満を統計学的に有意と判定した。加えて、図４はMann-Whitney法を用いて解析した。これらの統計処理にはPrism 6 software (GraphPad Software, San Diego, USA)を使用した。
【００６５】
結果
１．  S1P2遺伝子破壊（ノックアウト（KO））マウスではブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症が軽症である。
【００６６】
ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症モデルを使用して，S1P2が肺線維化にどのような影響を与えるかを確認した。
【００６７】
野生型マウスとS1P2-KOマウスに0.035 mg/g体重のブレオマイシン溶液を週2回4週間計8回腹腔内投与した。投与後33日目に各マウスから肺を摘出し、Sirius Red染色（collagen染色）とPDGFRα（肺線維芽細胞マーカー）の免疫組織染色を行い、肺組織の病理組織学的変化を検討した（図１−１及び１−２）。野生型マウスの肺組織において、生理食塩水投与群に比較してブレオマイシン投与群では、Sirius Red陽性領域は増加しており、肺線維化の促進が確認された（図１−１）。また、肺線維化領域ではPDGFRα陽性領域が強かった。一方、S1P2-KOマウスでは，ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維化が軽度であり、PDGFRα陽性領域も低下していた（図１−１）。投与後33日目の肺のSirius Red染色像を用いて線維化領域と線維化の程度を定量化したところ、S1P2-KOマウスでは線維化領域の低下及び線維化の程度を示すAshcroftスコアの数値の低下を認めた（図１−２）。定量的PCR法を用いて、ブレオマイシン投与マウスの肺組織内における細胞外マトリックスであるフィブロネクチンとコラーゲンタイプI α1及び線維芽細胞のマーカーであるFSP1のmRNA発現を解析した（図１−３）。ブレオマイシン投与によりフィブロネクチン、コラーゲンタイプI α1及びFSP1のmRNA発現が増加した。S1P2-KOマウスでは野生型マウスと比較して、肺組織中のフィブロネクチン、コラーゲンタイプI α1及びFSP1のmRNA発現が低下していた（図１−３）。
【００６８】
以上の結果から、S1P2-KOマウスではブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症が軽症であったことから、S1P2は線維化を促進する因子であると考えられた。
【００６９】
２．  S1P2-KOマウスではブレオマイシン投与による肺胞炎症が抑制されている。
S1P2がブレオマイシン投与による肺胞腔への炎症波及にどのような影響を与えるかを確認した。
【００７０】
ブレオマイシン投与後33日目の野生型マウスとS1P2-KOマウスの気管支肺胞洗浄液を採取し、気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量、総タンパク量、総細胞数及びマクロファージ数を測定した。野生型マウスとS1P2-KOマウスにおいて、生理食塩水投与群に比較してブレオマイシン投与により気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図２A）、総タンパク量（図２B）、総細胞数（図２C）及びマクロファージ数（図２D）は有意に増加あるいは増加傾向を示した。また、S1P2-KOマウスでは気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図２A）、総細胞数（図２C）及びマクロファージ数（図２D）は野生型マウスと比べて有意に低下した。また総タンパク量（図２B）は低下傾向を示した。
【００７１】
以上の結果から、S1P2はブレオマイシン腹腔内投与による肺胞腔への炎症波及に関与すると考えられた。
【００７２】
３．  肺組織におけるS1P2の発現解析の結果
S1P2LacZ/+マウスを用いて，肺組織におけるS1P2の発現細胞を確認した。
ブレオマイシンあるいは生理食塩水の腹腔内投与後33日のS1P2LacZ/+マウスの肺のX-gal染色を行った（図３−１及び３−２）。肺組織において、X-gal染色陽性細胞(青）はII型肺胞上皮細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞及び線維芽細胞に検出された。また、線維化領域にX-gal染色陽性細胞の集積が観察された（図３−１）。また、X-gal染色とマクロファージマーカーであるMac3の免疫染色（赤）との二重染色を行ったところ、Mac3陽性のマクロファージはX-gal染色陽性であった（図３−２）。
【００７３】
以上の結果から、肺組織においてS1P2はマクロファージを含む肺の主な構成細胞に発現していること、及び線維化領域にS1P2発現細胞が集積することが明らかになった。
【００７４】
４．  骨髄由来細胞に発現するS1P2が肺線維症に関与する。
肺組織においてS1P2はマクロファージを含む肺の主な構成細胞に発現していることから、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維化に骨髄由来細胞あるいは非骨髄由来細胞のどちらに発現するS1P2が関与するかを確認した。
【００７５】
致死量の放射線を照射した野生型マウスあるいはS1P2-KOマウスに、野生型骨髄あるいはS1P2-KO骨髄を移植して骨髄キメラマウスを作成し、ブレオマイシン溶液を週2回4週間計8回腹腔内投与した。投与後33日目の各骨髄キメラマウスの肺のSirius Red染色像を用いて、線維化領域を定量化した（図４A）。S1P2-KO骨髄を移植したマウスでは、野生型骨髄を移植したマウスと比較して線維化領域の低下を認めた（図４A）。さらに、ブレオマイシン投与後33日目の各骨髄キメラマウスの気管支肺胞洗浄液を採取し、気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量、総タンパク量、総細胞数及びマクロファージ数を測定した（図４B、４C及び４D）。S1P2-KO骨髄を移植したマウスでは、野生型骨髄を移植したマウスと比べて気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量（図４B）、総タンパク量（図４C）、総細胞数及びマクロファージ数（図４D）が有意に減少あるいは低下傾向を示した。
【００７６】
以上の結果から，骨髄由来細胞に発現するS1P2が肺線維化に関与することが考えられた。
【００７７】
５．  マクロファージ増殖・分化阻害剤（BLZ945）はブレオマイシンで誘発される肺線維化を抑制する。
【００７８】
骨髄由来細胞に発現するS1P2が肺線維化に関与することが考えられたので、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維化にマクロファージが関与するかを確認した。
【００７９】
ブレオマイシン腹腔内投与による肺線維化にマクロファージが重要であるかどうかを検討するために、毎日1回20 mg/kg体重のBLZ945(CSF1受容体キナーゼ阻害剤)を連日経口投与し、0.035mg/g体重のブレオマイシン溶液を週2回計7回腹腔内投与した。投与後25日目のBLZ945投与群、溶媒投与群、非投与群のマウス肺組織のSirius Red染色を行った（図５−１）。溶媒投与群に比較してBLZ945投与群ではSirius Red陽性領域は低下しており、肺線維化が軽減していた（図５−１）。線維化領域を定量化したところ、BLZ945投与群では、溶媒投与群に比較して線維化領域の低下を認めた（図５−２A）。さらに、ブレオマイシン投与後25日目の各群のマウスの気管支肺胞洗浄液を採取し、気管支肺胞洗浄液中の可溶性コラーゲン量、総タンパク量、総細胞数及びマクロファージ数を測定したところ、BLZ945投与群では溶媒投与群と比較して有意に減少した（図５−２B、５−２C及び５−２D）。
【００８０】
以上の結果から、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維化にマクロファージが重要な役割を果たしていることが考えられた。
【００８１】
６．  S1P2-KOマウスではマクロファージの老化が進んでいる。
S1P2-KOマウスの肺組織内のマクロファージはブレオマイシン投与により老化が進んでいることを確認した。
【００８２】
ブレオマイシン投与後33日目のS1P2-KOマウスの肺組織内のマクロファージのサイズが増大していることを観察したことから、ブレオマイシン投与によりマクロファージが細胞老化を起こしているかどうかを検討した。細胞老化を検討するために、ブレオマイシン投与後33日目の野生型マウスとS1P2-KOマウスの肺組織のSA-β-gal染色を行った（図６−１及び６−２）。ブレオマイシン投与により肺組織のSA-β-gal染色陽性細胞が認められた（図６−１及び６−２）。S1P2-KOマウスでは野生型マウスに比較して、肺組織内のSA-β-gal染色陽性細胞(青：モノクロ図では、濃い粒状の像として観察される）が多かった（図６−１及び６−２）。またSA-β-gal染色陽性細胞の多くが肺胞腔内に局在していた（図６−１及び６−２）。次に、ブレオマイシン投与後33日目の野生型マウスとS1P2-KOマウスの気管支肺胞洗浄液から細胞を単離し、マクロファージマーカーであるF4/80と細胞老化マーカーであるp16INK4aの蛍光免疫染色を行った（図６−３及び６−４）。ブレオマイシン投与によりF4/80陽性（赤）；p16INK4a陽性（緑）の細胞が認められ、細胞のサイズの大きいF4/80陽性マクロファージが特にp16INK4a陽性であった（図６−３及び６−４）。S1P2-KOマウスでは野生型マウスに比較して、F4/80陽性；p16INK4a陽性の細胞が多く観察された（図６−３及び６−４）。ブレオマイシン投与後33日目の野生型マウスとS1P2-KOマウスの肺組織のp16INK4a発現を免疫染色で検討した（図６−５）。ブレオマイシン投与によりp16INK4a陽性細胞が肺胞腔内に認められ、サイズの大きい細胞が特にp16INK4a陽性であった（図６−５）。S1P2-KOマウスでは野生型マウスに比較して，p16INK4a陽性細胞が多く観察された（図６−５）。
【００８３】
以上の結果から、S1P2はブレオマイシン投与による肺線維化に重要なマクロファージの細胞老化を抑制することにより線維化を促進していることが考えられた。
【００８４】
７．  S1P2-KO肺線維芽細胞の表現型は野生型肺線維芽細胞と異なる。
S1P2-KOマウスの肺線維芽細胞は野生型肺線維芽細胞と比較してブレオマイシン投与により細胞老化が進んでいること、及びコラーゲン分解酵素のmRNA発現の亢進を確認した。ブレオマイシン投与によりマクロファージ以外の細胞も細胞老化を起こしているかどうかを検討するために、ブレオマイシン投与後33日目のS1P2-KOマウスと野生型マウスの肺から線維芽細胞を単離した。細胞老化を検討するために、各マウスから単離した肺線維芽細胞のウエスタンブロットによるp16INK4aタンパクの発現とSA-β-gal染色により解析した（図７−１〜７−４）。ブレオマイシン投与から単離した肺線維芽細胞でp16INK4aタンパクの発現が認められた（図７−１及び７−２）。S1P2-KO肺線維芽細胞では野生型肺線維芽細胞に比較して、p16INK4aタンパクの発現が増加していた（図７−１及び７−２）。ブレオマイシン投与マウスから単離した肺線維芽細胞でSA-β-gal染色陽性細胞が多く認められた（図７−３及び７−４）。S1P2-KO肺線維芽細胞では野生型肺線維芽細胞に比較して、SA-β-gal染色陽性細胞数が増加していた（図７−３及び７−４）。定量的PCR法を用いて、ブレオマイシン腹腔内投与後33日のS1P2-KOマウス及び野生型マウスから単離した肺線維芽細胞内のコラーゲン分解酵素MMP1、MMP2及びMMP3のmRNA発現を解析した（図７−５）。ブレオマイシン投与から単離した肺線維芽細胞において、S1P2-KO肺線維芽細胞では野生型肺線維芽細胞に比較して、MMP1、MMP2及びMMP3のmRNA発現が増加していた（図７−５）。
【００８５】
以上の結果から、S1P2はブレオマイシン投与による肺線維芽細胞の細胞老化も抑制することにより線維化を促進していることが考えられた。
【００８６】
比較例  S1P1及びS1P3と線維化抑制の関係
S1P2の類縁受容体分子である、S1P1及びS1P3が線維化の抑制に関与するか否かについて確認した。
【００８７】
具体的には、ブレオマイシン投与によって誘発される肺線維症モデルを使用して，S1P1とS1P3が肺線維化にどのような影響を与えるかを確認した。
【００８８】
野生型マウスとS1P1+/-マウス（ホモマウスは胎生致死のため、ヘテロマウスを使用）とS1P3-KOマウスに0.035 mg/g体重のブレオマイシン溶液を週2回4週間計8回腹腔内投与した。投与後33日目に各マウスから肺を摘出し、Sirius Red染色（collagen染色）を行った（図８A及びB）。投与後33日目の肺のSirius Red染色像を用いて線維化領域を定量化したところ、野生型マウスとS1P1+/-マウス（図８A）あるいはS1P3-KO（図８B）との間に有意な差は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のスフィンゴシン-1-リン酸2型受容体（S1P2)アンタゴニストを有効成分として含有する組成物は、線維化領域におけるマクロファージの老化を促進し、線維化を抑制する医薬として用い得る。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１〜１７  プライマー
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図４】
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【図５−２】
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【図６−２】
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【図６−４】
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【図７−２】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８】
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【図１−１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図５−１】
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【図６−１】
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【図６−３】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−３】
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【配列表】
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