(57)【要約】【課題】抗体と抗原によるアレルギー反応を、標識免疫複合体の特異的な体内分布を指標として、イメージング装置などを用いた目視で迅速、簡便、高精度に測定する方法、及びそれを実施可能とするキットを提供することを課題とした。【解決手段】抗体あるいは抗原を化学的に標識する工程（１）、それを抗原あるいは抗体と混和し、標識された免疫複合体を形成させる工程（２）、作製した免疫複合体を生体に投与することにより、従来のアレルギー誘導法では引き起こされない本法独自の標識免疫複合体の特徴的な体内分布、特に図１に示すような皮膚における斑点状の分布（ＡＳＤＩＳ）を誘導し、それを指標として迅速、簡便、精度よく、イメージング装置などを用いた目視でアレルギー反応を検出・測定する工程（３）を含むことを特徴とするアレルギー反応測定法、およびその反応を誘導することが可能な物質を構成試薬として含むアレルギー反応検出キットを提供する。【選択図】図１
2017019755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）、（２）、及び（３）を備えたことを特徴とするアレルギー反応の判定方法。
（１）抗体または抗原を化学的に標識する工程；
（２）標識した抗体又は抗原を、抗体又は抗原と混和することにより、標識免疫複合体を作製する工程；
（３）作製した免疫複合体を生体に投与することにより、従来のアレルギー誘導法では引き起こされない本法独自の標識免疫複合体の特徴的な体内分布、特に皮膚における斑点状の分布（以後これをＡｎａｐｈｙｌａｘｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  Ｓｋｉｎ  の頭文字から発明者により作られたＡＳＤＩＳという略称で記載）を誘導し、それを指標として迅速、簡便、高精度に、イメージング装置などを用いた目視でアレルギー反応を検出・測定する工程；
ここで抗体は、抗体と相同性を有し、抗体と同様にアレルギーに影響を及ぼす能力を有するＦａｂなどの抗体断片やｓｃＦｖなどのペプチド、タンパク質などを含むものとする。また、標識した抗体や凝集させた標識した抗体のみの投与によってもＡＳＤＩＳが誘導され得るため、これらの方法も対象に含むものとする。標識した抗原は、標識した抗原と相同性を有し、抗原と同様にアレルギーを誘導する能力を有する抗原断片などを含むものとする。また、標識した抗原や凝集させた標識した抗原のみの投与によってもＡＳＤＩＳが誘導され得るため、これらの方法も対象に含むものとする。
【請求項２】
抗体の生体への投与後、２３時間以内に標識した抗原を生体内へ投与することにより、請求項１の工程（２）を生体内で行ない、ＡＳＤＩＳを誘導し、検出する方法。
【請求項３】
抗原の生体への投与後、２３時間以内に標識した抗体を生体内へ投与することにより、請求項１の工程（２）を生体内で行ない、ＡＳＤＩＳを誘導し、検出する方法。
【請求項４】
請求項１、２、あるいは３に記載の方法でＡＳＤＩＳを誘導した生体。
【請求項５】
請求項１、２、あるいは３に記載の方法で誘導したＡＳＤＩＳに対する被験物質の効果について解析することにより、被験物質の生理活性、その他の物性を明らかにする方法。
【請求項６】
請求項１、２、あるいは３に記載の方法で誘導したＡＳＤＩＳに対して、種々の基剤で塗布、貼付した物質のＡＳＤＩＳに対する効果について解析することにより、物質の生理活性、性質を明らかにする方法。また、基剤の性質や、その塗布薬、貼付薬への応用性を判定する方法。
【請求項７】
請求項１、２、あるいは３に記載の方法で誘導したＡＳＤＩＳに対して、種々の添加物を加えて物質を投与し、その効果について比較解析することにより、添加物の生理活性、性質を明らかにする方法。
【請求項８】
請求項１あるいは３に記載した抗体の標識物を他の標識物に変更してＡＳＤＩＳを誘導することにより、それら標識物の有用性を解析する方法。
【請求項９】
請求項１あるいは２に記載した抗原の標識物を他の標識物に変更してＡＳＤＩＳを誘導することにより、それら標識物の有用性を解析する方法。
【請求項１０】
神戸薬科大学  薬理学研究室において保管されているＡＳＤＩＳ誘導能を有するマウス抗卵白アルブミン（ＯＶＡ）モノクローナルＩｇＥを産生するハイブリドーマ「ＯＥ−１  ハイブリドーマ」および 「ＯＥ−３  ハイブリドーマ」、および、ＡＳＤＩＳ誘導能を有さず陰性コントロールとして用いることができるマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＥを産生するハイブリドーマ「ＯＥ−２  ハイブリドーマ」
【請求項１１】
請求項１０記載のハイブリドーマにより産生されるマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＥ「ＯＥ−１」、「ＯＥ−２」、および「ＯＥ−３」。
【請求項１２】
神戸薬科大学  薬理学研究室において保管されているＡＳＤＩＳを誘導しない陰性コントロールとして用いることができるマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＡを産生するハイブリドーマ「ＯＡ−１  ハイブリドーマ」、「ＯＡ−２  ハイブリドーマ」、「ＯＡ−３  ハイブリドーマ」、および「ＯＡ−４  ハイブリドーマ」。
【請求項１３】
請求項１２記載のハイブリドーマにより産生されるマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＡ「ＯＡ−１」、「ＯＡ−２」、「ＯＡ−３」、および「ＯＡ−４」。
【請求項１４】
神戸薬科大学  薬理学研究室において保管されているＡＳＤＩＳ誘導能を有するマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＧを産生するハイブリドーマ「Ｏ１−８  ハイブリドーマ」、「Ｏ１−１８  ハイブリドーマ」。
【請求項１５】
請求項１４記載のハイブリドーマにより産生されるマウス抗ＯＶＡモノクローナルＩｇＧ「Ｏ１−８」、および「Ｏ１−１８」。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原とそれを認識する抗体のいずれか、又は双方の標識物を作製し混和する、あるいは非標識物と混和することにより標識免疫複合体を形成させ、それを生体（特にマウス）に投与する、あるいは別々に短時間内に連続して投与することにより、従来のアレルギー誘導法では引き起こされない本法独自の標識物の特徴的な体内分布、特に皮膚における斑点状の分布（以後これを  Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  Ｓｋｉｎ  の頭文字から発明者により作られたＡＳＤＩＳという略称で記載）を誘導し、このＡＳＤＩＳをアレルギー反応の指標としてイメージング装置などを用いた目視で判定することを可能とする方法に関する。また、ＡＳＤＩＳを誘導することが可能な試薬をセットにしたキット、及びその方法を用いた被験物質の性質のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、生体への異物の侵入に対する防御を行う免疫系が活性化することによって起こる疾患である。代表的なアレルギー疾患として、食物アレルギーや花粉症、死に至るアナフィラキシーショックが挙げられる。
【０００３】
アレルギーは、様々な抗原分子の曝露による感作の成立から始まる。初期の抗原曝露では、臨床的なアレルギー症状は誘発されないが、免疫系の抗原特異的な活性化が誘導され、曝露された抗原に特異的に結合する抗体の産生が誘導される。種々のアイソタイプの抗体がアレルギーに関与しているが、中でもＩｇＥアイソタイプの重要性が高い。ＩｇＥは肥満細胞や好塩基球のＩｇＥ受容体に結合し、抗原の再侵入に際し、細胞が速やかに活性化できるような状態、すなわち感作状態にする。
【０００４】
感作状態となった生体に抗原が再侵入すると、アレルギーの次の段階であるアレルギー反応の誘導と、それに伴うアレルギー症状の発現が起こる。すなわち、抗原が肥満細胞の表面に存在するＩｇＥに結合し、ＩｇＥ受容体を凝集させることにより肥満細胞を活性化し、ヒスタミンなどのメディエーターを放出させる。その結果、かゆみ、下痢、血圧下降といったアレルギーの臨床症状が誘発される。
【０００５】
そのため、アレルギーの臨床症状を抑制するためには、ＩｇＥを始めとする種々のアイソタイプの抗体と抗原により引き起こされるアレルギー反応を抑制することが有効であり、そのような作用を有する薬物の開発が現在まで続けられている。
【０００６】
アレルギー反応を抑制するような薬物の探索には生体モデルの利用が有効である。通常ＩｇＥを用いたアレルギーモデルは、ＩｇＥを投与し約２４時間後以降に抗原を投与して、アレルギー反応を誘導する（非特許文献１を参照）。
【０００７】
しかし、アレルギー反応を抑制する薬物の探索においては、実質２日間を要する上述のようなモデルは理想的とはいえず、より迅速に判定できるモデルが求められる。
【０００８】
また、既存のモデルのアレルギー反応の判定においては、素早い判定のために引っ掻き行動のように行動変化を観察する場合が多い。しかし、この方法では、測定者個人の主観が入りやすいという欠点がある。また、放出されるメディエーター量の測定という方法も用いられるが、採取試料を用いて更なる分析・解析手段を用いて時間をかけて行うことになるため、より時間を要してしまう欠点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０３２，１３３−１３８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、迅速、簡便、精度よく、目視でアレルギー反応測定を可能とするアレルギー反応誘導および測定方法や、それを誘導する試薬で構成されるキット、およびその方法を用いた被験物質の性質のスクリーニング法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のアレルギー反応誘導および測定法の特徴は、抗体あるいは抗原を化学的に標識する工程（１）、並びにそれを抗原あるいは抗体と混和し、標識された免疫複合体を形成させる工程（２）、並びに作製した標識免疫複合体を生体に投与することにより、従来のアレルギーモデルでは認められなかった本法独自のアレルギー反応依存的な標識免疫複合体の特徴的な体内分布、特に皮膚における斑点状の分布（ＡＳＤＩＳ）を誘導し、それをアレルギー反応の指標として迅速、簡便、精度よく、イメージング装置などを用いた目視で検出・測定する工程（３）を含む点を要旨とする。また、本発明のアレルギー反応誘導キットの特徴は、標識および非標識の抗体と抗原を含み、ＡＳＤＩＳを誘導し、アレルギー反応の目視を可能とするような試薬キットであること、それを用いて被験物質の性質のスクリーニングを可能とすることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、アレルギー反応を誘導し、それを検出するまでの時間を大幅に短縮することができる。すなわち、誘導されるアレルギー依存的な反応であるＡＳＤＩＳは、一般的なアレルギーモデルにおいて要求される感作成立までの待ち時間を必要とせず、標識された抗原と抗体の混和物の投与、あるいはそれぞれの短時間内における連続の投与、あるいはいずれかの単独投与により誘導され、イメージング装置などを用いた標識物の目視という簡便な方法でのアレルギー反応の評価を可能とする。具体的には、本発明の方法により誘導されるＡＳＤＩＳは、抗体を投与してから１日後に抗原を投与しアレルギー反応を誘導する従来のアレルギーモデルと比較して、単回投与後１５分以内に反応を誘導することが可能であること、およびアレルギー反応を目視できることから非常に迅速なアレルギー反応の検出が可能である。
【００１３】
また、本発明では、標識物の皮膚における斑点状の分布というこれまでにない現象を惹起し、それをアレルギー反応の評価基準とすることにより、量的だけでなく、質的な変化をも検出するため、従来のアレルギーモデルにおける量的変化のみでの判定で起こりうる判定や解釈の誤りを回避することを可能とする。例えば、これまでの全身的なアレルギー反応の指標としては、血管から組織への色素の漏えいがあるが、この場合の漏えいは、組織全体へびまん的に起こる。そのため、その病状の深刻度の判断は、代表的な組織へ漏えいした色素の全体量の増加、すなわち量的変化を測定することにより行なわれる。ただし、この方法の問題点としては、大量の色素の誤投与によっても、同様のびまん的な色素の組織への漏えいが起こるという点が挙げられる。それに対し、本発明の方法で誘導されるＡＳＤＩＳでは、アレルギー反応に依存した皮膚における標識物量の増加という量的な変化のみならず、指標となる物質の斑点状の分布という質的な変化も誘導されるため、認められた反応がアレルギー依存的なものであるか否かを信頼性高く判別することを可能とする。
【００１４】
本発明の方法で誘導されるＡＳＤＩＳに対する種々の物質、薬物などの効果を測定することにより、アレルギー反応に影響を及ぼし得る物質、薬物の同定が可能となる。ＡＳＤＩＳの迅速性、アレルギー特異性は物質、薬物の効果のスクリーニングに特に適する。また、用いる抗体、抗原、標識物、添加物、基剤などを変更して、ＡＳＤＩＳを誘導することにより、これらの物質の性質について明らかにすることも可能となる。
【００１５】
さらに、本発明の方法によるＡＳＤＩＳでは、皮膚におけるアレルギー反応依存的な変化を、皮膚局所になんら手を加えることなく誘導可能であり、この点も大きな特徴である。この皮膚局所への直接的侵害がないという特徴は、塗布剤、貼付剤などの効果を測定する際に、プリックテストなど、方法上やむをえずアレルギー反応測定部位である皮膚に障害を与えてアレルギー反応を判定せざるをえない方法と比較して、信頼性の高い測定を可能とする。
【００１６】
また、全身の皮膚にＡＳＤＩＳを誘導した動物においては、局所局所で独立的にアレルギー反応の変化を検出できる。そのため、単一の生体で、ＡＳＤＩＳを抑制することができない陰性コントロール薬物、ＡＳＤＩＳを抑制することができる陽性コントロール薬物、スクリーニング対象である被検物質の効果を同時に測定することを可能とする。このことに加え、生体を生存したまま解析できるＡＳＤＩＳは、解析に使用する生体の数を減少させ得るという意味（動物愛護の観点）においても有用な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の方法（ＡＳＤＩＳ誘導法）により誘導されるＡＳＤＩＳ、すなわち標識免疫複合体（ＦＩＴＣ−卵白アルブミン（ＯＶＡ）-抗ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＯＥ−１）の分布の時間依存的な変化を示した説明図である。
【図２】図２は、ＩｇＥ投与の２４時間後に抗原を投与する従来のアレルギー誘導法では、ＡＳＤＩＳが誘導されないことを示した説明図である。
【図３】図３は、ＡＳＤＩＳ誘導法で処置したマウスと従来のアレルギー誘導法で処置したマウスのいずれにおいても、アレルギー症状の一つである体温低下が誘導されていることを示した説明図である。
【図４】図４は、ＡＳＤＩＳ誘導法で処置したマウスと従来のアレルギー誘導法で処置したマウスのいずれにおいても、アレルギー反応の指標である血中ヒスタミン濃度の上昇が誘導されていることを示した説明図である。
【図５】図５は、本発明の方法により誘導されるＡＳＤＩＳが、ヒスタミンＨ１受容体遮断薬の全身投与により阻害されることを示す説明図である。
【図６】図６は、本発明の方法により誘導されるＡＳＤＩＳが、肥満細胞依存的な反応を低下させる抗ＦｃεＲＩ抗体の投与により阻害されることを示す説明図である。
【図７】図７は、本発明の方法により誘導されるＡＳＤＩＳが、ヒスタミンＨ１受容体遮断薬を含む溶液の塗布により、局所的に阻害されることを示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、標識免疫複合体の構成成分である抗体は、抗原と結合し、かつ、アレルギー誘導能を有するものであれば、特に限定されない。すなわちモノクローナルであるか、ポリクローナルであるか、抗体の動物種やアイソタイプ、結合する抗原の種類に制限されない。ここで抗体は、抗体と相同性を有し、抗体と同様にアレルギーに影響を及ぼす能力を有するＦａｂなどの抗体断片やｓｃＦｖなどのペプチド、タンパク質などを含むものとする。また、以下に記載の方法により、上述の性質を有する抗体を実際に取得可能である。
【００１９】
ＯＶＡを抗原とする場合は、ＯＶＡを必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収し、精製することによって、ＯＶＡと結合する抗体（ポリクローナル抗体）を得ることができる。また、ＯＶＡを接種された動物の細胞からＯＶＡを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマの培養上清などから、ＯＶＡと結合する抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。
【００２０】
本発明において、標識免疫複合体の構成成分である抗原は、抗体と結合し、かつ、アレルギー誘導能を有するものであれば、特に限定されない。ここで抗原は、抗原と相同性を有し、抗原と同様にアレルギーを誘導する能力を有する抗原断片などを含むものとする。
【００２１】
本発明において、抗体、抗原、および免疫複合体を標識する物質としては、化学的標識反応や生物学的合成の困難さ、および測定装置による制約を回避することができれば特に限定されないが、たとえば以下のような物質が挙げられる。ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ＧＦＰなどの発光物質、１２５Ｉなどの放射性物質、ルシフェラーゼなどの酵素など。
【００２２】
工程（１）の抗体あるいは抗原を標識するための方法としては、従来公知の方法（化学結合法など）を用いて行なうことができる。例えばＯＶＡに蛍光を有する可溶性ＦＩＴＣ−Ｉなどを反応させて、ＦＩＴＣが結合したＯＶＡ（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）を得ることができる。
【００２３】
抗体あるいは抗原に物質を標識する時に混和する抗原（または抗体）：標識物質のモル比は、使用目的、抗体の力価、免疫複合体を作る際の相手分子（抗体であれば抗原、抗原であれば抗体）の種類、標識物質の性質、測定感度などにより、適宜設定できるが、抗原（または抗体）：ＦＩＴＣ−Ｉの場合、１：１００〜１００：１が好ましく、さらに好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは１：１０〜１０：１である。抗原として、ＯＶＡを用いた場合、最終的にＯＶＡ１分子に対してＦＩＴＣが３分子結合している標識状態であれば、良好な結果が得られる。
【００２４】
工程（２）の免疫複合体の形成では、混和する抗体と抗原のモル比（抗体：抗原）は、使用目的、標識物質の性質、測定感度などにより、適宜設定できるが、抗体：抗原が１：１００〜１００：１が好ましく、さらに好ましくは１：５０〜５０：１、特に好ましくは１：２０〜２０：１、最も好ましくは１：１０〜１０：１である。抗体としてマウス抗ＯＶＡ  ＩｇＥモノクローナル抗体ＯＥ−１を、抗原としてＦＩＴＣ−ＯＶＡを用いた場合、最終的には抗体：抗原が１：１であれば、免疫複合体が形成され、良好な結果が得られる。
【００２５】
工程（３）の動物への標識免疫複合体の投与と、標識免疫複合体の皮膚における斑点状の分布（ＡＳＤＩＳ）の検出・測定では、工程（２）で作製した標識免疫複合体を動物に投与する。投与後、麻酔下で標識免疫複合体を検出できる装置（蛍光標識であれば、蛍光インビボイメージング装置など）を用いてＡＳＤＩＳを検出する。検出する時間は投与後０〜１８０分が好ましく、さらに好ましくは３〜６０分、特に好ましくは５〜３０分、最も好ましくは１０〜２０分である。
【００２６】
なお工程（２）と（３）を入れ替え、抗体と標識抗原を別々に短時間内に動物へ投与し、その後、生体内で標識免疫複合体を形成させることによっても、ＡＳＤＩＳを誘導し、それを検出・測定することができる。この場合、抗体の投与から標識抗原の投与までの時間は０〜２３時間が好ましく、さらに好ましくは０〜６時間、特に好ましくは０〜６０分、最も好ましくは０〜５分である。
【００２７】
ＡＳＤＩＳを誘導することを目的とする本発明のキットは、標識免疫複合体そのものか、あるいは標識免疫複合体を形成できる抗体と抗原のセットである。さらに、構成試薬として、ＡＳＤＩＳを誘導し得ない陰性コントロール抗体やそれを含む標識免疫複合体、非標識免疫複合体、測定時に必要となる麻酔薬、希釈用試薬などを含んでもよい。また、取り扱い説明書、測定に必要な治具（例えば注射器など）などを含んでもよい。
【００２８】
本発明のキットは、例えば以下のようにしてアレルギー反応に影響を及ぼす物質（被験物質）のスクリーニングに適用できる。
１）抗体と抗原の混和；反応容器に抗体試薬と抗原試薬を分注し、標識免疫複合体を形成させる（０〜６０分程度）。
２）動物への被験物質の投与；被験物質を動物の静脈内、動脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、皮内、あるいは皮下などへ投与する。経口投与、吸入、皮膚への塗布、粘膜への適用なども可能である。この過程は、次の３）と同時、あるいは３）の後でも可能である。
３）動物への標識免疫複合体の投与；標識免疫複合体を静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、あるいは皮下などへ投与する。
４）ＡＳＤＩＳの検出；麻酔を施し、動物内での標識物の分布を測定できるイメージング装置などを用いてＡＳＤＩＳを検出する。
【００２９】
以上のように、本発明のアレルギー反応測定キットを用いれば、ＡＳＤＩＳを容易に誘導することができるため、それを指標としてイメージング装置などを用いて目視で迅速、簡便、精度よくアレルギー反応を検出・測定することができる。また、ＡＳＤＩＳ誘導前、誘導中、あるいは誘導後に被験物質を投与することにより被験物質の性質についてスクリーニングすることができる。
【００３０】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこの実施例に技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
（1）卵白アルブミン（ＯＶＡ）を認識するマウスＩｇＥ産生ハイブリドーマの作製 
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、以下に示す一般的方法に従って調製した。
【００３２】
すなわち初回免疫は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入したＯＶＡ  １００μｇをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、等量のＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．） と混合したものをマウス腹腔内に注入することにより行った。約２週間ごとに４回追加免疫を行った。追加および最終免疫は、ＰＢＳにＯＶＡ  ５０μｇを溶解したものを腹腔内投与することにより行った。
【００３３】
最終免疫より３から４日後に、免疫されたマウスから脾臓を外科的に回収した。脾臓細胞をマウスミエローマＮＳ１と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて細胞融合させることによりハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．）と１％のヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）中で培養することにより行った。さらに、ヒポキサンチン・チミジン含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて以下のように限外希釈法によりクローニングを行ない、シングルクローンとした。
【００３４】
抗ＯＶＡ  ＩｇＥモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのクローニング
ＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）  １００μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）の各ウェルに加え、４℃で１６時間以上インキュベートし、ＯＶＡをＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング液（１％カゼイン−ＰＢＳ）を加え、室温で１時間インキュベートしブロッキングした。各ウェルに、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）  ５０μｌ、および各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、１時間反応させた後、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をＰＢＳ−Ｔで１０００倍に希釈した溶液（１００μｌ）を、各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、発色基質液（ｐＮＰＰ  １００μｌ、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、室温下でインキュベートし、適宜波長４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリ−ダ−で測定した。陽性ウェル中の細胞をさらに限外希釈法を用いてクローニングし、モノクローンを得た。また、アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ，  Ｉｎｃ．）及び酵素標識抗マウスＩｇＥを用いたウエスタンブロット法で、そのモノクローンから産生される抗体のアイソタイプを確認した。このようにして、抗ＯＶＡ  ＩｇＥモノクローナル抗体産生細胞であるＯＥ−１ハイブリドーマ、ＯＥ−２ハイブリドーマ、及びＯＥ−３ハイブリドーマを得た。
【００３５】
抗ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＯＥ−１の精製
作製したハイブリドーマから産生される抗ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＯＥ−１の精製は、以下の方法で行った。培養フラスコ等にて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が５０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、０．２μｍのフィルター（ＩＷＡＫＩ  Ｃｏ．）を通し、ハイブリドーマ等の夾雑物を除去した。濾過後の培養上清をＯＶＡ結合ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｃｏｒｐ．）を用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に回収した。調製された抗体溶液は、ＶｉｖａＳｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）およびＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｃｏｒｐ．） を用いて濃縮、およびＰＢＳにバッファー交換し、孔径０．２μｍのフィルター（ＩＷＡＫＩ  Ｃｏ．）でろ過滅菌した。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度より算出した。
【００３６】
（２）ＦＩＴＣ−ＯＶＡの作製
本実施例に用いることができるＦＩＴＣ−ＯＶＡの作製は、以下に示す方法に従って調製した。７ｍｇのＯＶＡを２ｍｌのＰＢＳに溶解したものに、０．２ｍｇのＦＩＴＣ−Ｉ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をジメチルスルホキシド２００μｌに溶解したものを加え、遮光下、室温で２時間反応させた。反応後、ＰＤ１０カラムを用いて、未反応のＦＩＴＣ−Ｉを除くとともにＰＢＳにバッファー交換することによりＦＩＴＣ−ＯＶＡを作製した。なお、以降の実験は発明者らが作製したＦＩＴＣ−ＯＶＡと同様にＡＳＤＩＳを誘導し得た市販ＦＩＴＣ−ＯＶＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．）を用いて行った。
【００３７】
（３）ＦＩＴＣ標識免疫複合体の作製
精製した抗ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＯＥ−１  ２００μｇとＦＩＴＣ−ＯＶＡ  ５０μｇを混和し、３０分インキュベートすることによりＦＩＴＣ標識免疫複合体を形成させた。
【００３８】
（４）ＡＳＤＩＳの誘導
作製したＦＩＴＣ標識免疫複合体をＨＲ−１マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）へ尾静脈内投与し、継時的に麻酔下のマウスから発せられるＦＩＴＣ由来の蛍光をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲＭＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で観察した。ＡＳＤＩＳの時間依存的な変化を「図１」に示す。これにより、ＩｇＥと標識抗原を混和し尾静脈内に投与することにより、投与１５分後より明確なＡＳＤＩＳ、すなわち皮膚における斑点状の標識物質の分布が誘導されることが明らかとなった。
【００３９】
一方、従来のマウスアレルギーの誘導法に則り、抗ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＯＥ−１を尾静脈内に投与し、２４時間後にＦＩＴＣ−ＯＶＡを尾静脈内に投与し、継時的に麻酔下のマウスから発せられるＦＩＴＣによる蛍光をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲＭＳで観察した。その結果を「図２」に示す。従来の１日の感作時間を要するアレルギー誘導法ではＡＳＤＩＳが誘導されないことが明らかとなった。
【００４０】
上述のＡＳＤＩＳを起こす本発明の方法で処置したマウス、および従来のアレルギー誘導法でアレルギーを誘導したマウスにおけるアレルギー症状を、抗原投与１５分後の体温低下を指標として測定した。また、アレルギー反応を、抗原投与６０分後の血中ヒスタミン濃度を指標として測定した。その結果を、それぞれ「図３」、「図４」に示す。いずれのマウスにおいても、体温低下と血中ヒスタミン濃度の上昇が誘導された。このことから、従来法だけでなく、従来とは異なる本発明の方法で処置したマウスにおいても、アレルギーが起こっていること、一方、ＡＳＤＩＳは本発明の方法を実施した場合にのみ認められることが明らかとなった。
【００４１】
本発明の方法により誘導されるＡＳＤＩＳにヒスタミンおよびヒスタミンＨ１受容体が関与しているかを明らかにするために、ＦＩＴＣ標識免疫複合体投与の３０分前のヒスタミンＨ１受容体遮断薬クロルフェニラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（０．５、１．５ｍｇ）腹腔内投与がＡＳＤＩＳに与える効果について解析した。その結果を「図５」に示す。クロルフェニラミンはＡＳＤＩＳを抑制した。このことは、ＡＳＤＩＳがヒスタミンおよびヒスタミンＨ１受容体に依存して誘導されること、すなわちアレルギー反応に応じて誘導されることを示唆している。このことは、ＡＳＤＩＳがアレルギーを判定する指標となることも示している。
【００４２】
ＡＳＤＩＳに肥満細胞が関与しているかを明らかにするために、肥満細胞の活性を低下させる抗ＦｃεＲＩ抗体ＭＡＲ−１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．）（０．１５ｍｇ）の尾静脈内投与（ＦＩＴＣ標識免疫複合体投与の２日前）がＡＳＤＩＳに与える効果について解析した。その結果を「図６」に示す。抗ＦｃεＲＩ抗体ＭＡＲ−１はＡＳＤＩＳを抑制した。このことは、ＡＳＤＩＳが肥満細胞およびＦｃεＲＩに依存して誘導されることを示しており、ヒスタミンＨ１受容体遮断薬を用いて得られた結果と合わせて、ＡＳＤＩＳがアレルギーを判定する指標となることを強く示唆している。
【００４３】
ＡＳＤＩＳの抗アレルギー薬のスクリーニングへの応用の一例として、ＦＩＴＣ標識免疫複合体投与の３０分前のヒスタミンＨ１受容体遮断薬クロルフェニラミンあるいはジフェンヒドラミン１％含有メチルセルロースーＰＢＳ溶液の皮膚局所への塗布が、ＡＳＤＩＳに与える効果について解析した。その結果を「図７」に示す。薬物を塗布されたマウス左腹部の皮膚のみ、ＡＳＤＩＳの誘導が抑制されている。このことは、ＡＳＤＩＳが経皮的に適応される薬物のスクリーニングにも有用であること、アレルギー反応を局所的に解析できるため、同一個体の中で陰性コントロール、陽性コントロール、被験物質についてその性質を同時に解析可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のＡＳＤＩＳ、またそれを誘導するキットは、アレルギー反応感知の迅速性、簡便性、精度、目視可能であることなどから、従来のアレルギー反応解析法と比較して、格段に優れたものであり、アレルギー反応解明のための斬新なツールとなる。また、本発明のＡＳＤＩＳを誘導するキットは、抗アレルギー薬のスクリーニングに特に適しており、抗アレルギー薬の開発に貢献できる。なお、抗アレルギー薬は催眠誘導剤などとして他の疾患に用いられる薬物ともなるため、本発明のキットは種々の薬物のスクリーニングにも応用することが可能である。さらに、ＡＳＤＩＳをアレルギー反応の指標として用いることにより、薬物そのもののみならず、その際に使用した抗体、抗原、標識化合物、添加物、基剤の性質を明らかにすることも可能であるため、本発明のＡＳＤＩＳを誘導するキットは、それらの有用性をスクリーニングするためにも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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