(57)【要約】      （修正有）【課題】ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８株に由来する新規な遺伝子、及びその利用法の提供。【解決手段】ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８菌株に特異的な８種の遺伝子が存在し、そのうち４種の遺伝子がゲノム上に連続して存在すること、又、これら４種の遺伝子を含む１２種の遺伝子がクラスターを形成し、細胞外多糖の生合成に関与している、ＬＰ２８菌株。さらに、ＬＰ２８株は、細胞外に中性多糖と、ピルビン酸が付加した酸性多糖を産生する、ＬＬＰ２８菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｈ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号４３に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号４６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
【請求項２】
次の（ａ）〜（ｄ）いずれかのポリヌクレオチドからなる４種の遺伝子を含む遺伝子クラスター。
（ａ）配列番号４３に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号４６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
【請求項３】
さらに次の（ｉ）〜（ｐ）いずれかのポリヌクレオチドからなる８種の遺伝子を含む、請求項２記載の遺伝子クラスター。
（ｉ）配列番号４７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号５５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号５６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号５７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号５８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｏ）配列番号５９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号６０に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項４】
下記の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれかで示されるピルビン酸化された多糖。
【化１】
2017108739.tif 000015
（式中、Ｇｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｍａｎはマンノース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、該Ｇａｌの少なくとも一部にはピルビン酸が結合し；式中の数値は結合部位を示し；ｎは繰り返し単位を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８に由来する新規な遺伝子、それらを含む遺伝子クラスター及びその利用、並びに新規なピルビン酸化された多糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＬＰ２８（以下、「ＬＰ２８株」と略す）は、本発明者が見出した乳酸菌である。当該乳酸菌の菌体は、過栄養状態における体重増加を抑制し、肝臓中の脂肪滴、白色脂肪組織重量及び肝中性脂肪（トリグリセリド）量を減少させる効果を有することが見出され、体脂肪の蓄積、脂質代謝異常により引き起こされる病態、すなわち肥満や脂質代謝異常（例えば、脂肪肝、高脂血症）等の予防、治療又は改善への利用が期待されている（特許文献１、非特許文献１）。
しかしながら、ＬＰ２８株の全ゲノム解析はなされておらず、特にＬＰ２８株の上記生理的機能を理解し利用するためにも、ゲノム配列情報からＬＰ２８株に特異的に存在する遺伝子を探索し、その機能を解明することが望まれる。
【０００３】
一方、乳酸菌は、菌体外に多糖類やペプチド、アミノ酸、抗菌性物質等を産生することが知られている。なかでも細胞外多糖（ＥＰＳ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａ  ＰｏｌｙＳａｃｃｈａｒｉｄｅ）は代表的な代謝産物で、乳酸菌のプロバイオティクス機能に関わる重要なファクターであることが知られている（例えば、特許文献２）。ＥＰＳは構成単糖や分枝構造が多様でその構造と機能との関連は不明な点が多いものの、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＲＷ−９５９５Ｍが産生するＥＰＳにおいてはピルビン酸化されたＥＰＳが精製され、当該ピルビン酸化ＥＰＳについて種々の機能性報告がある（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２００６１１号公報
【特許文献２】特開２０１１−２０１７８１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＰＬｏｓ ＯＮＥ, ２０１２，Ｖｏｌ．７,Ｉｓｓｕｅ２,ｅ３０６９６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００２，３６３，ｐ．７−１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＬＰ２８株に由来する新規な遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＬＰ２８株のゲノム情報を検討し、機能を推定した結果、当該菌株に特異的な８種の遺伝子が存在し、そのうち４種の遺伝子がゲノム上に連続して存在すること、また、これら４種の遺伝子を含む１２種の遺伝子がクラスターを形成し、細胞外多糖の生合成に関与していることを見出した。さらに、ＬＰ２８株は、細胞外に中性多糖と、ピルビン酸が付加した酸性多糖を産生することを見出した。当該ピルビン酸が付加した酸性多糖はその構造解析の結果、新規な多糖であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕に係るものである。
〔１〕次の（ａ）〜（ｈ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号４３に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号４６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
〔２〕次の（ａ）〜（ｄ）いずれかのポリヌクレオチドからなる４種の遺伝子を含む遺伝子クラスター。
（ａ）配列番号４３に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号４６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
〔３〕さらに次の（ｉ）〜（ｐ）いずれかのポリヌクレオチドからなる８種の遺伝子を含む、〔２〕記載の遺伝子クラスター。
（ｉ）配列番号４７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号５５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号５６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号５７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号５８に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｏ）配列番号５９に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号６０に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
〔４〕下記の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれかで示されるピルビン酸化された多糖。
【０００９】
【化１】
2017108739.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｇｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｍａｎはマンノース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、該Ｇａｌの少なくとも一部にはピルビン酸が結合し；式中の数値は結合部位を示し；ｎは繰り返し単位を示す。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＬＰ２８株に特異的な遺伝子及び新規なピルビン酸化された多糖が提供される。該遺伝子を用いることで、ＬＰ２８株の持つ生理的機能を遺伝子レベルで解明することができる。さらに該特異的遺伝子は細胞外多糖生合成への関与が推定されるため、ＬＰ２８株の産生する細胞外多糖、とりわけピルビン酸化された多糖はその生理的機能に関わる重要なファクターと考えられ、本発明の遺伝子は斯かる有用な細胞外多糖の生物学的生産への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＬＰ２８株のプラスミド遺伝子のアガロース電気泳動解析を示す図。
【図２】ＬＰ２８株から抽出した細胞外多糖の分画精製を示す図。
【図３】ＬＰ２８株から抽出した細胞外多糖の構成単糖分析を示す図。
【図４】ＬＰ２８株から抽出した細胞外多糖からのピルビン酸検出を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の遺伝子は、次の（ａ）〜（ｈ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子であり、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＬＰ２８から見出され、配列決定された新規な遺伝子である。ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＬＰ２８は、受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−７００として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託（２００９年１月２７日）されている。
（ａ）配列番号４３に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号４５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号４６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４２に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
後記実施例に示すように、ＬＰ２８株のゲノムは１，７７４，８６５ｂｐの環状ゲノムと５，３６６ｂｐの環状プラスミドから構成され、それぞれ１，６８３個、６個のＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）が見出された。これらにつき、既存のデータベース上に登録されているペディオコッカス・ペントサセウス４菌株（ＡＴＣＣ２５７４５、Ｌ１０５、ＳＬ４及びＩＥ−３）の遺伝子とのホモロジー検索を行なった結果、ＬＰ２８株が有する遺伝子のうちタンパク質の機能が予測され、また同一性が５０％以下である遺伝子５３種を選択した。タンパク質の機能解析は、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって実施した。
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢタンパク質データベースによるＢＬＡＳＴ検索によれば、この５３種の遺伝子の殆どは菌体の生育に必要な一次代謝関連のタンパク質をコードしていると予測されたが、ペディオコッカス・ペントサセウス以外の他の乳酸菌に対しても同一性が５０％以下である遺伝子が８種（上記（ａ）〜（ｈ））見出され、これをＬＰ２８株に特異的な遺伝子として選択した。８種のうちの４種、すなわち上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子はゲノム上に連続して存在していることが見出された。
これら４種の遺伝子は、細胞外多糖の生合成に関連する遺伝子と推定された（［表１］）。なかでも、上記（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子はピルビン酸化多糖の合成に関連する遺伝子と推定された。
【００１４】
さらに、これら４種の遺伝子の前後を解析したところ、これら４種を含む計１２種、すなわち（ａ）〜（ｄ）に、次の（ｉ）〜（ｐ）いずれかのポリヌクレオチドからなる８種の遺伝子を含む計１２種の遺伝子がクラスターを形成し、これが細胞外多糖の生合成に関与していることが示唆された（［表２］）。当該細胞外多糖はピルビン酸による修飾を受けている可能性が示唆された。
１２種の残りの８種の遺伝子のうち４種の遺伝子（配列番号５８、５９、６０、４７）は他のペディオコッカス・ペントサセウスを含む乳酸菌の遺伝子と同一性が最大で６８％であるものの相対的に低かった。
（ｉ）配列番号４７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５４に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号５５に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号５６に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号５７に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号５８に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｏ）配列番号５９に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号６０に示すヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチド
【００１５】
【表１−１】
2017108739.tif 000003
【００１６】
【表１−２】
2017108739.tif 000004
【００１７】
【表２】
2017108739.tif 000005
【００１８】
これらから、上記４種の遺伝子、さらには１２種の遺伝子を含む遺伝子クラスターはＬＰ２８株に特異的であり、ＬＰ２８株は固有の細胞外多糖生合成遺伝子クラスターを有し、特異的構造を有する多糖を細胞外に産生すると考えられた。
一方、ＬＰ２８株は、中性多糖とピルビン酸が付加した酸性多糖の２種類の細胞外多糖を産生する（実施例２）。細胞外多糖の構造解析の結果、ピルビン酸が付加した酸性多糖は新規な多糖であり、ＬＰ２８株の産生する細胞外多糖、特にピルビン酸が付加した酸性多糖は、ＬＰ２８株特有の生理的機能に関わる重要なファクターと考えられる。
【００１９】
ＬＰ２８株により産生されるピルビン酸化された多糖は、構成成分としてグルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びピルビン酸を含有し、下記の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれかで示される。
【００２０】
【化２】
2017108739.tif 000006
【００２１】
（式中、Ｇｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｍａｎはマンノース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、該Ｇａｌの少なくとも一部にはピルビン酸が結合し；式中の数値は結合部位を示し；ｎは繰り返し単位を示す。）
【００２２】
本発明の多糖において、ピルビン酸はＧａｌに結合しているが、多糖を構成するＧａｌのうち、ピルビン酸化されたＧａｌの割合は５０質量％以下である。Ｇａｌは主鎖又は側鎖のいずれかであり得る。
【００２３】
よって、この一連の遺伝子群の知見は、例えば、ＬＰ２８株の特異的検出や当該菌株が有する固有の性質と同一の性質を保持する微生物のスクリーニング等に有用である。また、本発明の遺伝子及びこれを含む遺伝子クラスターを微生物に導入する、或いは微生物が有する当該遺伝子を改変することにより、当該微生物の細胞外多糖の産生を調節することが期待される。さらに、遺伝子導入又は改変された微生物は、細胞外多糖の産生に応じ、種々の生理効果、例えば、上記ＬＰ２８株による肥満や脂質代謝異常等の効果を効果的に発揮する飲食品や医薬品として利用することが期待される。
また、産生される新規なピルビン酸化された多糖は、それ自体、肥満や脂質代謝異常等の効果を効果的に発揮する飲食品や医薬品として利用することが期待される。さらに、当該ピルビン酸化された多糖をモデルとした機能性多糖の創出が期待される。
尚、ピルビン酸化された多糖の産生、回収、精製は、当業者に周知の方法により行うことができる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドには、タンパク質の機能を損なわない範囲でヌクレオチド配列の変異した次のポリヌクレオチドが包含され得る。
（ａ'）配列番号４３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ａ''）配列番号４３に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号４４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号４４に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号４５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号４５に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号４６に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
【００２５】
（ｅ'）配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号２７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号２７に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ'）配列番号３７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｇ''）配列番号３７に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ'）配列番号４２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｈ''）配列番号４２に示すヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【００２６】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。
アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）等のヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【００２７】
また、ストリンジエントな条件とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、求める同一性の高低によって、適宜条件を変えることができる。より高ストリンジェントな条件であるほど、より同一性の高い配列のみがハイブリダイズすることになる。例えば、ストリンジエントな条件として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，１９８９）に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００２８】
前記において、アミノ酸配列の同一性（相同性）は、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて適切にアライメントしたとき、好ましくは９５％以上、更に９６％以上、更に９７％以上、更に９８％以上、更に９９％以上の同一性を有することが好ましい。
また、同一性を有するヌクレオチド配列は、それぞれのヌクレオチド配列において相当する配列を適切にアライメントしたとき、当該ヌクレオチド配列と９０％以上、更に９５％以上、更に９６％以上、更に９７％以上、更に９８％以上、更に９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列が好ましい。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の相同性（同一性）は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−５８７７）を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，ｐ．４０３−４１０）。また、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いてもよい。
ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００２９】
本発明において、例えば、配列番号２２、２７、３７、４２、４３〜４６に示すそれぞれのヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の例としては、配列番号２２、２７、３７、４２、４３〜４６に示すそれぞれのヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列にアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、当業者によく知られている。
【００３０】
ポリヌクレオチドは、周知の方法によって作製することができる。例えば、配列番号２２、２７、３７、４２、４３〜４６を参考にプライマーを作製し、ＰＣＲ法等で得ることができる。
例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法は、本発明のポリヌクレオチドの５'側及び３'側の配列（またはその相補配列）のなかからそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等の増幅反応を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、当該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
また、ポリヌクレオチドは、例えば、紫外線照射や部位特異的変異導入のような、計画的な又はランダムな突然変異導入法により、配列番号４３等に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを改変することにより作製することもできる。
計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、ポリヌクレオチド配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。また、ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
（１）ＬＰ２８株のゲノム遺伝子配列の決定
ＬＰ２８株を表３に示すＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地で培養し、得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。
抽出したゲノムＤＮＡを断片化してＰａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ  Ｌｉｂｒａｒｙを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を用いてシーケンシングを実施した（リード長２×７５ｂｐ）。次に、同ゲノムＤＮＡを断片化してＭａｔｅ  Ｐａｉｒ  Ｌｉｂｒａｒｙを作製し、Ｒｏｃｈｅ４５４  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍを用いてシーケンシングを実施した（１／２ラン）。得られた両リード配列に対して、Ｎｅｗｂｌｅｒ  ｖ２．８（Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＦＬＸ  シーケンサーに付属の解析ソフトウェア）を用いてｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリー解析を行った。ＯｐＧｅｎ社のプロトコールに従ってＭａｐＣａｒｄ上にゲノムＤＮＡ溶液を添加し、制限酵素処理及び蛍光染色を行った後、各ＤＮＡ断片の長さを測定することで全ゲノム制限酵素地図を作成した。アセンブリー解析の結果得られたコンティグ配列を、全ゲノム制限酵素地図上にアラインすることで、コンティグ配列の整列化を実施した。
【００３３】
【表３】
2017108739.tif 000007
【００３４】
ＬＰ２８株のゲノムは総塩基数１，７７４，８６５ｂｐ（ＧＣ含有率３７．１％）の環状ゲノム及び５，３６６ｂｐ（ＧＣ含有率３６．５％）の環状プラスミドで構成されていた。得られた配列について遺伝子予測を行った結果、それぞれ１６８３個及び６個のＯＲＦを見出した。環状ゲノムは５１個のｔＲＮＡ遺伝子と６個のｒＲＮＡ遺伝子を含んでいた。結果を表４に示す。
【００３５】
【表４】
2017108739.tif 000008
【００３６】
得られたすべてのＯＲＦのアミノ酸配列に関してＮＣＢＩゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ検索を実施し、各タンパク質の機能解析を実施した。ＬＰ２８株は、胆汁塩に対する耐性に関与するコリルグリシンヒドラーゼ、６つの標準ストレスタンパク質（ＵｓｐＡ）、ヒ酸レダクターゼ等の代表的な環境ストレス耐性遺伝子を他のペディオコッカス・ペントサセウスと同様に高い相同性（同一性）を保持して有していた。一方でゲノム上に存在する１６８３個のＯＲＦに関して、他のペディオコッカス・ペントサセウス（ＡＴＣＣ２５７４５、ＬＩ０５、ＳＬ４、ＩＥ−３）に対する遺伝子配列の同一性を比較した結果、タンパク質機能が予測されており、他の４株すべてに対して同一性が５０％以下である特異的な遺伝子を５３個発見した（前記表１）。
これらの低類似性の配列に関してＵｎｉＰｒｏｔ  ＫＢタンパク質データベースによるＢＬＡＳＴ検索を実施し、ペディオコッカス・ペントサセウス以外の他の微生物との同一性を評価した。その結果、５３個の遺伝子のほとんどは生育に必要な一次代謝関連のタンパク質をコードしていると予測され、他の乳酸菌が有する遺伝子と高い同一性を保持していることが明らかになった（前記表１）。
一方で、５３個の遺伝子のうち、他の乳酸菌に対しても同一性が５０％以下である遺伝子が８個見出され（配列番号２２、２７、３７、４２、４３、４４、４５、４６）、このうち４個（配列番号４３、４４、４５、４６）はゲノム上に集中して存在していた。
これら連続する４個の遺伝子は細胞外多糖の生合成遺伝子と予測された。
さらに、それら４個の前後の遺伝子を解析したところ、１２個の遺伝子による細胞外多糖の生合成遺伝子クラスターを構成していた（前記表２）。
残りの８個の遺伝子のうち、４個（配列番号５４、５５、５６、５７）は他のペディオコッカス・ペントサセウスと高い同一性を有していたが、４個（配列番号５８、５９、６０、４７）については同一性が５０％以上ではあるが、相対的に低いものであった。
このことからＬＰ２８株が固有の細胞外多糖合成遺伝子クラスターを有し、特異的な構造を有する細胞外多糖を産生していることが示唆された。これらの同一性の低い遺伝子が多糖生合成クラスターとしてゲノム構造の中に集積していることは驚くべき事実であった。
また、これらの同一性が低い遺伝子のなかのひとつ（上記（ｄ）、ＩＤ：４９９３１８）はストレプトコッカス・コンステラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）の多糖ピルビン酸化酵素と僅かな同一性を有していたことから（前記表２）、ＬＰ２８株の細胞外多糖がピルビン酸による修飾を受けている可能性が示唆された。
【００３７】
（２）プラスミド上の遺伝子解析
ＬＰ２８株をＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ  （ＭＲＳ）培地で培養し、得られた培養液を遠心して菌体を回収し、Ｇｅｎｏｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出時にｌｙｓｏｚｙｍｅ（和光純薬社）およびａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（和光純薬社）をそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ添加し、室温で２〜３時間インキュベートした。抽出されたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動を実施した結果、ゲノム解析から得られた５，３６６ｂｐと同等の遺伝子サイズであることが確認された。図１に、アガロース電気泳動解析を示す。
プラスミドに存在する６個のＯＲＦのアミノ酸配列に関してＮＣＢＩゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ検索を実施し、各タンパク質の機能解析を実施した。その結果、表５に示すように、２個のＯＲＦがそれぞれＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎおよびＤＮＡ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ＡＴＰａｓｅ  ＦｔｓＫ／ＳｐｏＩＩＩＥ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎと低い同一性を有していたが、その他４個のＯＲＦの機能は未同定であった。従ってプラスミド上の遺伝子機能とＬＰ２８株の特異性についての関係性は見出せなかった。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
実施例２
（１）細胞外多糖（ＥＰＳ）の精製
ＬＰ２８株を２５０ｍＬフラスコ中のＭａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地３０ｍＬに植菌し、２８℃で１８ｈｒ静置培養した。培養液１０ｍＬを遠心集菌し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、全量を表６に示すＳＤＭ培地２．３Ｌに植菌した。培養は３Ｌ容量のジャーファーメンターを用いて温度３０℃、窒素通気２００ｍＬ／ｍｉｎ、撹拌２００ｒｐｍで４８時間実施した。この間２５％ＮａＯＨによりｐＨ下限を６．０に自動制御した。培養液中の多糖はフェノール・硫酸法により測定した。
この結果、ＬＰ２８株はＳＤＭ培地において２３４ｍｇ／ｍＬのＥＰＳを生産した。
【００４０】
【表６】
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【００４１】
培養後、培養液にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を４％加え、４℃で３０ｍｉｎ撹拌した後、遠心分離（１２，５００×ｇ，４°Ｃ，１０ｍｉｎ）により上清を取得した。上清に等量のアセトンを加え、４℃で一晩静置後、遠心分離（１２，５００×ｇ，４℃，１０ｍｉｎ）により沈殿を集めた。沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した後、遠心分離（２７，０００×ｇ，４℃，３０ｍｉｎ）で得られた上清にＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅをそれぞれ１０μｇ／ｍＬになるように加え、３７°Ｃで６ｈインキュベートした。さらにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを２０μｇ／ｍＬになるように加え、３７°Ｃで１６ｈインキュベートした。氷上で冷却しながら反応液に１００％ＴＣＡを１０％加え、１ｈ静置した後、遠心分離（２７，０００×ｇ，４℃，３０ｍｉｎ）により上清取得した。上清に３倍量の１００％エタノールを加え、遠心分離（１７，３００×ｇ，４℃，５ｍｉｎ）により沈殿を回収し７０％エタノールで洗浄した後風乾した。沈殿を精製水に溶解し、ＭＷＣＯ８，０００透析膜を用いて２００倍量の精製水に対して２日間透析した（途中水を４回交換）。透析後、凍結乾燥により粗精製ＥＰＳを得た。
粗精製ＥＰＳを５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍカラム（２．５ｃｍ×２２ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）による溶出分画（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）の後、同緩衝液を用いた０→０．５Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出フラクションを分画した。各フラクションのＥＰＳ濃度はフェノール・硫酸法による呈色反応により測定した。この結果、ＬＰ２８が産生する細胞外多糖は中性ＥＰＳおよび酸性ＥＰＳに分けられることが判明した。図２に、ＥＰＳの分画精製の結果を示す。
【００４２】
（２）ＥＰＳの分子量測定
ＥＰＳの分子量はＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によるゲル濾過クロマトにより測定した（移動相０．１Ｍ  ＮａＮＯ3、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）。各フラクションのＥＰＳはＲＩ検出器（ＲＩ−２０３１  Ｐｌｕｓ，Ｊａｓｃｏ社）で検出し、デキストラン分子量標準品（Ｓｉｇｍａ社）を用いて分子量を算出した。
その結果、中性ＥＰＳの分子量は約４０ｋＤａ、酸性ＥＰＳの分子量は約５０ｋＤａであった。
【００４３】
（３）ＥＰＳの単糖組成分析
中性ＥＰＳおよび酸性ＥＰＳの５ｍｇをそれぞれ２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍＬに溶解し、１２０℃で２ｈ加水分解を行った。加水分解溶液を減圧下で遠心乾燥させ、残渣を１００μＬの精製水に溶解し０．２μｍのフィルターで清澄化した後ＨＰＬＣ分析を行った。
＜ＨＰＬＣの条件＞
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＩＣＳ−５０００システム
検出器：Ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ
分離カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  ２×２５０ｍｍ
ガードカラム：ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  ２×５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
移動相：１６ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液
流量：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
【００４４】
その結果、中性ＥＰＳからはグルコース、マンノース、グルコサミンが検出され、酸性ＥＰＳからはグルコース、マンノース、ガラクトース、グルコサミンが検出された。
図３に、細胞外多糖の構成単糖分析を示す。また、それぞれの分子モル数比は表７に示す通りであった。
【００４５】
【表７】
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【００４６】
（４）ＥＰＳに含まれるピルビン酸の分析
ＥＰＳ  ２ｍｇを２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍＬに溶解し、１２０℃で２ｈ加水分解を行った。加水分解溶液を減圧下で乾燥し、３．８ＭのＨ2ＳＯ4に溶解した後、ＨＰＬＣ分析を行った。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
溶離液：３．８ｍＭ  Ｈ2ＳＯ4
検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
【００４７】
その結果、図４に示すとおり酸性ＥＰＳからピルビン酸が検出された。中性ＥＰＳにも僅かにピルビン酸が含まれていた。
【００４８】
（５）ＥＰＳ加水分解物に含まれる酢酸の分析
ＥＰＳの加水分解物からグルコサミンが検出されたが、細胞外多糖成分としてはＮ−アセチルグルコサミンとして存在しており、加水分解によりアセチル基が脱離していることが予想された。そこで、加水分解物中に酢酸が遊離しているかを分析した。
ＥＰＳ  ２ｍｇを２  Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍＬに溶解し、１２０℃で２ｈ加水分解を行った。加水分解溶液をＨＰＬＣで分析した。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＳ  ｐａｋ，ＫＣ−８１１，
溶離液：１．０ｍＭ  ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ
検出器：Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
【００４９】
その結果、酸性ＥＰＳおよび中性ＥＰＳの加水分解物から酢酸が検出されたため、グルコサミンは細胞外多糖成分としてはＮ−アセチルグルコサミンとして存在していることが確認された。
【００５０】
以上の結果から、ＬＰ２８株が産生する細胞外多糖（ＥＰＳ）は中性ＥＰＳおよび酸性ＥＰＳであり、中性ＥＰＳはグルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンから構成されており、酸性ＥＰＳはグルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンから構成されていることを見出した。また、酸性ＥＰＳにはピルビン酸が結合していることを確認した。
【００５１】
（６）酸性ＥＰＳの構造解析
多糖の結合様式を明らかにするため、メチル化して分析を行った。酸性ＥＰＳを常法によりメチル化した後にトリフルオロ酢酸を加えて加水分解し、この加水分解物を還元後アセチル化して得られた生成物をＧＣ／ＭＳ測定（ガスクロマトグラフ７８９０Ａ（アジレント・テクノロジー株式会社）及び質量分析計  ＪＭＳ−７００Ｖ（日本電子株式会社）を使用）にかけ、分析した。また、ＮＭＲ分析（ＡＶＡＮＣＥIII５００型（ブルカー・バイオスピン株式会社）を使用）により、結合状態の詳細を検討した。
これらのデータから、酸性ＥＰＳは以下の構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれかで示される反復構造を有すると決定した。尚、式中、Ｇｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｍａｎはマンノース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、式中の数値は結合部位を示す。
【００５２】
【化３】
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【００５３】
表８に構造式（Ｉ）に対応するメチル化分析の結果を示し、表９に構造式（ＩＩ）に対応するメチル化分析の結果を示す。
【００５４】
【表８】
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【００５５】
【表９】
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【００５６】
酸性ＥＰＳはその分子構造中にピルビン酸を含む酸性多糖であり、上記構造における少なくとも一部のＧａｌにピルビン酸が結合していた。分析の結果、ピルビン酸化されたＧａｌの割合は、全Ｇａｌの半分以下と推定された。
乳酸菌が産生するピルビン酸化された多糖としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＲＷ−９５９５Ｍが産生する細胞外多糖が知られているが（非特許文献２）、上記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のいずれかの反復構造を有するピルビン酸化された多糖は先行技術文献等に記載されていなく、新規な多糖であると判断した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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