(57)【要約】【課題】  ピーリング発生が抑制され、かつ遊離反応時間の短時間化が達成できるＯ−結合型糖鎖の遊離方法の提供。【解決手段】  一又は複数の実施形態において、下記工程Ａ）及びＢ）を含む、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法。  Ａ）糖鎖結合物質を含む水溶液と、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下のアンモニウム塩含有物とを混合して混合物を得ること。  Ｂ）前記Ａ）で得られた混合物を４５℃以上５８℃以下の温度で反応させること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法であって、
Ａ）糖鎖結合物質を含む水溶液と、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下のアンモニウム塩含有物とを混合して混合物を得ること、及び、
Ｂ）前記Ａ）で得られた混合物を４５℃以上５８℃以下の温度で反応させること、
を含む方法。
【請求項２】
前記Ｂ）における反応時間が、２時間以上７時間以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アンモニウム塩含有物におけるアンモニウム塩が、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及びカルバミン酸アンモニウム、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるアンモニウム塩である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法で遊離させたＯ−結合型糖鎖を分析又は検出することを含む、糖鎖結合物質のＯ−結合型糖鎖の分析又は検出方法。
【請求項５】
下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収方法。
（１）請求項１ないし３のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させて回収する工程。
【請求項６】
下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の標識方法。
（１）請求項１ないし３のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４’）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させるとともに該Ｏ−結合型糖鎖を標識化する工程。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程の説明書、アンモニウム塩含有物、及び、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収及び／又は標識キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｏ−結合型糖鎖の遊離、検出、分析、回収、標識化及びこれらのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合物質から該Ｏ−結合型糖鎖を生産する方法であって、Ａ）該糖鎖結合物質に、濃アンモニア水の不存在下、アンモニウム塩又はアンモニウムイオンを接触させる工程；Ｂ）Ａ）で得られた反応液を中和するか又は酸性にする工程；及びＣ）遊離した糖鎖を回収する工程、を包含する方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０１８８３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来から知られている、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法について、ピーリング反応（非還元末端側の糖鎖部分が欠落する反応）の発生を抑制でき、さらに、分析時間のさらなる短時間化ができれば、高精度のＯ−結合型糖鎖の分析の容易化かつ高精度化が達成できる可能性がある。
そこで、本開示は、一又は複数の実施形態において、ピーリング発生が抑制され、かつ遊離反応時間が短時間化されうる、Ｏ−結合型糖鎖の遊離方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記工程Ａ）及びＢ）を含む、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法に関する。
Ａ）糖鎖結合物質を含む水溶液と、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下のアンモニウム塩含有物とを混合して混合物を得ること。
Ｂ）前記Ａ）で得られた混合物を４５℃以上５８℃以下の温度で反応させること。
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収方法に関する。
（１）本開示にかかる方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させて回収する工程。
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の標識方法に関する。
（１）本開示にかかる方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４’）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させて該Ｏ−結合型糖鎖を標識化する工程。
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程の説明書、アンモニウム塩含有物、及び、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収及び／又は標識キットに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、ピーリング発生が抑制され、かつ遊離反応時間が短時間化された、Ｏ−結合型糖鎖の遊離、回収、標識化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１−４及び比較例１のプロトコルにしたがって処理し、Ｏ−結合型糖鎖の遊離、ビーズによる捕捉、ビーズからの遊離、２−ＡＢによる標識化、及び、ＬＣクロマトグラフィーで検出した結果の一例を示すクロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例１のプロトコルのＯ−結合型糖鎖遊離工程における反応温度を、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃としたときのピーリング率を比較した結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１のプロトコルのＯ−結合型糖鎖遊離工程におけるカルバミン酸アンモニウム量（２０μＬのサンプル溶液に対する量）を、１０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、７０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇとしたときのピーリング率及び糖鎖回収量（ピーク総面積）を比較した結果の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、アンモニウム塩含有物を用いたＯ−結合型糖鎖遊離工程において、アンモニウム塩含有物量を所定量とし、かつ、Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる（切り出す）反応温度を所定温度とすることで、ピーリング発生が抑制され、かつ遊離反応時間が短時間化されたＯ−結合型糖鎖の遊離が達成できるという知見に基づく。
【００１２】
本開示の方法において、ピーリング反応（非還元末端側の糖鎖部分が欠落する反応）の発生が抑制され、かつ遊離反応時間が短時間化されたＯ−結合型糖鎖の遊離が達成できるメカニズムの詳細は明らかではないが、所定量のアンモニウム塩含有物が、短時間でも十分なＯ−結合型糖鎖の切り出し反応を促進し、また、従来よりも低い所定温度と短時間の反応が、ピーリング反応の抑制に寄与していると考えられる。但し、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１３】
以下、本発明を説明する。本開示の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本開示において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１４】
（用語）
本開示において「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又は単糖の誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される複合糖質（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、ウロン酸ならびにそれらの複合体及び誘導体から構成される）の他、分解された多糖のほか、糖タンパク質、糖ペプチド、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及び糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本開示では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」、「オリゴ糖」と互換可能に使用され得る。
【００１５】
本開示において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式ＣnＨ2nＯnで表される化合物をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９及び１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノース及びデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒド又はケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。
【００１６】
本開示において「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。
【００１７】
本開示において「糖鎖結合物質」とは、糖鎖が糖鎖以外の物質（たとえば、タンパク質、脂質など）に結合した物質をいう。このような糖鎖結合物質は、生体内に多く見出され、例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子、及びそれらから分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。また、糖鎖結合物質は、どのような試料に含まれるものであってもよく、たとえば、糖鎖結合物質は、血清などの体液、培養細胞抽出物又は組織試料（たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル）に含まれるものを用いることができる。糖鎖結合物質は、結合している糖鎖の種類及び量によって、発揮する機能が大いに異なることが近年明らかになっており、その分析の重要性が増している。
【００１８】
本開示において「糖タンパク質」としては、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１９】
本開示において「Ｏ−結合型糖鎖」、「Ｏ−型糖鎖」及び「Ｏ型糖鎖」は、交換可能に用いられ、酸素（Ｏ）原子を介して結合された糖鎖又はなんらかの修飾を受けた（例えば、アセチル化、脱アセチル化）糖鎖をいう。代表的には、セリン又はスレオニンのＯＨ（水酸基）を介して結合することから、セリンスレオニン結合型糖鎖とも呼ばれる。このような糖鎖としては、たとえば、セリン又はスレオニン残基へのＮ−アセチルガラクトサミンの付加反応によって生じるＯ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｏ−Ｎ−アセチルグルコサミン）などが挙げられる。Ｏ−結合型糖鎖としては、このほかに、Ｏ−フコース（Ｎｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ様リピートのコンセンサス配列が−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｃ−（Ｘは任意のタンパク質、フコースはＳ／Ｔに結合。）に付加するものが知られる。）、Ｏ−グルコース（Ｎｏｔｃｈタンパク質のＥＧＦ様リピートのコンセンサス配列が−Ｃ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｐ−Ｃ−（Ｘは任意のタンパク質、グルコースはＳ／Ｔに結合。）に付加するものが知られる）。Ｏ−マンノース配糖体も存在する。また、コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸といったプロテオグリカンは、Ｏ−キシロース配糖体とみなせる。
【００２０】
本開示において「Ｏ−結合型糖鎖」とは、一又は複数の実施形態において、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合物質から、本開示にかかる方法によって分離又は生産される糖鎖をいい、糖鎖結合物質に結合していたＯ−結合型糖鎖自体のほか、何らかの構造変化（例えば、アセチル基の脱離など）が生じたものを含むことが理解される。したがって、狭義には、「Ｏ−結合型糖鎖」は、Ｏ−結合型糖鎖及びＯ−結合型糖鎖以外の糖鎖を包含することが理解される。なお、これに対し、タンパク質のアスパラギン残基に結合している糖鎖を「Ｎ−結合型糖鎖」、「Ｎ−型糖鎖」、「Ｎ型糖鎖」又は「アスパラギン結合糖鎖」という。
【００２１】
本開示において「Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合物質」は、糖鎖結合物質であって、Ｏ−結合型糖鎖を有するものであれば、いかなる物質でもよく、他に結合している物質がない糖鎖結合物質でも、他に別の結合物が存在する糖鎖結合物質でもよく、当然、Ｏ−結合型糖鎖を有しさえすればＮ−結合型糖鎖を含む糖鎖結合物質であってもよいことが理解される。また「Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合物質」に含まれるＯ−結合型糖鎖及びそれらに由来する（それらから誘導される）Ｏ−結合型糖鎖を含む。一つの態様として、「Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合物質」に含まれるＯ−結合型糖鎖が挙げられる。
【００２２】
本開示において「試料」とは、その中の少なくとも１つの成分（好ましくは糖鎖又は糖鎖含有物質）の分離、濃縮、精製又は分析を目的とするものであれば、どのような起源のものをも使用することができる。したがって、試料は、生物の全部又は一部から取り出されたものであり得るが、それに限定されない。たとえば、血清などの体液に由来する試料、培養細胞抽出物などの液体状の試料、組織試料等の固体試料（たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル）、また後述する生体分子（例えば、上記試料から単離されたもの）を用いることができる。別の実施形態において、試料は、合成技術によって合成されたものであり得る。
【００２３】
本開示において「被験体」とは、本発明の分析の対象となる試料中の目的物質を含む実体をいう。「被験物質」とは、本発明の分析の対象となる試料中の目的物質をいう。
【００２４】
本開示において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。そのような生体分子を含む試料を、本開示において特に生体試料ということがある。本開示において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。本開示において被験物質は、主に、この生体分子又は生体試料であることが多いがこれに限定されない。従って、生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本開示では、生体分子は、好ましくは、糖鎖結合物質（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）を含むと予想されるものであり得る。
【００２５】
そのような生体分子の供給源としては、生物由来の糖鎖が結合又は付属する材料であれば特にその由来に限定はなく、動物、植物、細菌、ウイルスを問わない。より好ましくは動物由来生体試料が挙げられる。好ましくは、例えば、全血、血漿、血清、汗、唾液、尿、膵液、羊水、髄液等が挙げられ、より好ましくは血漿、血清、尿が挙げられる。生体試料には個体から予め分離されていない生体試料も含まれる。例えば外部から試液が接触可能な粘膜組織、あるいは腺組織、好ましくは乳腺、前立腺、膵臓に付属する管組織の上皮が含まれる。
【００２６】
［Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法］
本開示は、一態様において、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法であって、下記Ａ）及びＢ）の工程を含む方法（「本開示にかかる方法」ともいう）に関する。
Ａ）糖鎖結合物質を含む水溶液と、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下のアンモニウム塩含有物とを混合して混合物を得ること。
Ｂ）前記Ａ）で得られた混合物を４５℃以上５８℃以下の温度で反応させること。
【００２７】
［糖鎖結合物質を含む水溶液］
工程Ａにおける「糖鎖結合物質を含む水溶液」は、上述した試料をそのまま使用してもよく、別途上述した試料を処理して調製してもよい。
【００２８】
「糖鎖結合物質を含む水溶液」のｐＨは、一又は複数の実施形態において、ピーリング率の抑制とＯ−結合型糖鎖の回収量（遊離量）の維持を両立しつつ、工程時間を短時間にする観点から、好ましくは７．０以上１１．０以下、より好ましくは７．５以上１０．０以下である。
【００２９】
［アンモニウム塩含有物］
本開示において「アンモニウム塩含有物」とは、少なくともアンモニウム塩を含む混合物をいう。「アンモニウム塩含有物」中のアンモニウム塩としては、一又は複数の実施形態において、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム等の無機塩及び有機塩、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。これらの中でも、アンモニウム塩としては、Ｏ−結合型糖鎖の遊離におけるピーリングの発生抑制及び遊離反応時間の短縮化の点から、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、及びカルバミン酸アンモニウム、並びにこれらの組み合わせが好ましく、Ｏ−結合型糖鎖の回収量（遊離量）の多さの点からは、カルバンミン酸アンモニウムが好ましい。「アンモニウム塩含有物」は、一又は複数の実施形態において、アンモニウム塩以外の物質を含み、その他の一又は複数の実施形態において、アンモニウム塩のみの形態である。
【００３０】
「アンモニウム塩含有物」中に含まれるアンモニウム塩以外の物質としては、反応性向上、ｐＨ安定化等の観点から、一又は複数の実施形態において、界面活性剤、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等の無機塩、例えばカルバミン酸メチル、カルバミン酸エチルなどのカルバミン酸誘導体、例えば酢酸ナトリウムやギ酸ナトリウム等の有機塩が挙げられる。
【００３１】
工程Ａで糖鎖結合物質を含む水溶液と混合するアンモニウム塩含有物は、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下であって、一又は複数の実施形態において、Ｏ−結合型糖鎖の遊離におけるピーリングの発生抑制及び遊離反応時間の短縮化の点から、好ましくは該水溶液１μＬあたり１．５ｍｇ以上１０ｍｇ以下、より好ましくは２ｍｇ以上７．５ｍｇ以下、さらに好ましくは２．５ｍｇ以上６．０ｍｇ以下である。アンモニウム塩含有物は、一又は複数の実施形態において、粉末の形態で糖鎖結合物質を含む水溶液と混合される。混合は、一又は複数の実施形態において、撹拌混合及び／又はボルテックスミキサによる混合で行える。
【００３２】
［反応温度］
工程Ｂにおける反応温度は、４５℃以上５８℃以下であって、一又は複数の実施形態において、Ｏ−結合型糖鎖の遊離におけるピーリングの発生抑制及び遊離反応時間の短縮化の点から、好ましくは５０℃以上５８℃以下、より好ましくは５３℃以上５７℃以下、さ
らに好ましくは５４℃以上５６℃以下である。
本開示において、反応温度とは、一又は複数の実施形態において、反応容器が配置される反応装置で設定される温度をいう。反応容器は、一又は複数の実施形態において、遠沈管、及びマイクロチューブが挙げられる。反応装置としては、一又は複数の実施形態において、ヒートブロック、サーマルサイキュラー、オーブン、ホットバスが挙げられる。
【００３３】
［反応時間］
工程Ｂにおける反応時間は、一又は複数の実施形態において、Ｏ−結合型糖鎖の遊離におけるピーリングの発生抑制及び遊離反応時間の短縮化の点から、好ましくは２時間以上７時間以下、より好ましくは３時間以上６時間以下、さらに好ましくは４時間以上５．５時間以下である。
本開示において、反応時間とは、一又は複数の実施形態において、所定の温度に達した反応装置に反応容器を配置した時、又は、反応容器を配置した反応容器が所定の温度に達した時からの時間をいう。
【００３４】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、Ｏ−結合型糖鎖を、還元末端を維持して遊離できる。また、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、ピーリング発生が抑制され、かつ遊離反応時間が短時間化されたＯ−結合型糖鎖の遊離が達成されうる。
【００３５】
本開示にかかる方法で遊離されたＯ−結合型糖鎖は、回収することができる。本開示にかかる方法で遊離されたＯ−結合型糖鎖は、分析又は検出することができる。本開示にかかる方法で遊離されたＯ−結合型糖鎖は、分析又は検出のために標識化することができる。本開示にかかる方法で遊離されたＯ−結合型糖鎖の回収及び標識化は、一又は複数の実施形態において、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（商標、住友ベークライト製）ビーズ及び標識キットを使用し、その取扱説明書に従って行う。
【００３６】
［Ｏ−結合型糖鎖の回収］
本開示にかかる方法で遊離されたＯ−結合型糖鎖の回収方法は、一又は複数の実施形態において、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種のクロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、糖鎖固定化用ビーズを用いた糖鎖精製を挙げることができ、好ましくはＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（商標、住友ベークライト製）ビーズ、アミノオキシ基を有するビーズ、又はヒドラジドビーズを用いる方法が挙げられる。
【００３７】
本開示においてＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（商標、住友ベークライト製）ビーズを用いた回収は、以下のようにして実施することができる。すなわち、還元末端を有する遊離糖鎖を、ヒドラジド基を有するＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（商標、住友ベークライト製）ビーズ上に結合させ、洗浄・シアル酸修飾等の処置後にビーズより酸あるいはヒドラジド化合物を用いて回収する。
【００３８】
よって、本開示は、その他の態様において、下記工程（１）から（４）を含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収方法に関する。
（１）本開示にかかる方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させて回収する工程。
【００３９】
［Ｏ−結合型糖鎖の検出又は分析］
本開示において糖鎖の「検出又は分析」は、その糖鎖の種類、構造、糖鎖内部の結合型、量、タンパク質等糖鎖結合物質における結合型などを定性的及び／又は定量的に調べることをいう。
本開示にかかる回収方法により回収されたＯ−結合型糖鎖は、一又は複数の実施形態において、質量分析（ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、紫外吸光光度計（ＵＶ）、エバポレイテイブ光散乱検出器（ＥＬＳ）、電気化学検出器、液体クロマトグラフ質量分析方法などを用いることができる。また、糖加水分解酵素と併用して構造決定することができる。本発明では、Ｎ−ＧａｌＮＡｃ型及びＮ−ＧｌｃＮａｃ型及びＯ−マンノース型、Ｏ−フコース型糖鎖の遊離物を解析することができる。
【００４０】
［Ｏ−結合型糖鎖の標識］
本開示にかかる回収方法により回収されたＯ−結合型糖鎖は、一又は複数の実施形態において、標識化してもよい。標識化することで、一又は複数の実施形態において、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳによる検出や分析を容易に行なうことが可能となる。
本開示は、その他の態様において、下記工程（１）から（４’）を含む、Ｏ−結合型糖鎖の標識方法に関する。
（１）本開示にかかる方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４’）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させるとともに該Ｏ−結合型糖鎖を標識化する工程。
【００４１】
標識化の方法は、一又は複数の実施形態において、ヒドラゾン結合からオキシム結合への交換反応により標識させることが挙げられ、或いは、遊離したＯ−結合型糖鎖に２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）を接触させて標識化することが挙げられる。
【００４２】
［キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程の説明書、アンモニウム塩含有物、及び、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収及び／又は標識キットに関する。本開示にかかるキットは、さらに、標識化合物を含んでいてもよい。
【００４３】
本開示は、さらに、下記の実施形態に関する。
＜１＞  Ｏ−結合型糖鎖を有する糖鎖結合型物質から該Ｏ−結合型糖鎖を遊離させる方法であって、
Ａ）糖鎖結合物質を含む水溶液と、該水溶液１μＬあたり０．５ｍｇ以上１５ｍｇ以下のアンモニウム塩含有物とを混合して混合物を得ること、及び、
Ｂ）前記Ａ）で得られた混合物を４５℃以上５８℃以下の温度で反応させること、
を含む方法。
＜２＞  前記Ｂ）における反応時間が、２時間以上７時間以下である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記アンモニウム塩含有物におけるアンモニウム塩が、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及びカルバミン酸アンモニウム、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるアンモニウム塩である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  ＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法で遊離させたＯ−結合型糖鎖を分析又は検出することを含む、糖鎖結合物質のＯ−結合型糖鎖の分析又は検出方法。
＜５＞  下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収方法。
（１）＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させて回収する工程。
＜６＞  下記工程を含む、Ｏ−結合型糖鎖の標識方法。
（１）＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程。
（２）アンモニウム塩を除去する工程。
（３）ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを用いて遊離したＯ−結合型糖鎖を捕捉し、該ビーズを回収する工程。
（４’）前記工程（３）で回収したビーズからＯ−結合型糖鎖を遊離させるとともに該Ｏ−結合型糖鎖を標識化する工程。
＜７＞  ＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法により糖鎖結合物質からＯ−結合型糖鎖を遊離させる工程の説明書、アンモニウム塩含有物、及び、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有するビーズを含む、Ｏ−結合型糖鎖の回収及び／又は標識キット。
【００４４】
次に、本開示の具体的な実施例について説明する。なお、本開示はこれらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
下記の試料を、下記のプロトコル（実施例１−４及び比較例１）に従って処理し、Ｏ−結合型糖鎖の遊離、ビーズによる捕捉、ビーズからの遊離、及び２−ＡＢによる標識化を行い、下記条件で分析した。その結果を図１に示す。
【００４６】
［試料の調製］
ウシ胎仔血清由来の糖タンパク質フェチュインを用いた（SIGMA社製「Fetuin from fetal calf serum」）。
【００４７】
［実施例１のプロトコル］必要時間：２日間
・Ｏ−結合型糖鎖遊離工程
１ｍｇ以上の前記糖タンパク質を準備
↓超純水で１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に調整
↓２０μＬのサンプル溶液をカルバミン酸アンモニウム１００ｍｇと撹拌混合する
（ｐＨ＝９．３）
↓５５℃、５時間で反応させる
・過剰試薬除去工程
６０℃、オーバーナイト、遠心減圧乾燥
↓２０μＬの超純水に溶解して糖鎖溶液を得る
・糖鎖捕捉工程
５０ｍｇのＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（商標、住友ベークライト製）ビーズを５００μＬの超純水に分散し、うち５０μＬを使用
↓２０μＬの糖鎖溶液（前工程で得たもの）と混合する
↓１８０μＬの２％酢酸−アセトニトリル溶液を添加する
↓８０℃、６０分間で糖鎖を捕捉させる
・洗浄工程
↓２００μＬの２Ｍ塩酸グアニジン溶液で２回洗浄
↓２００μＬの超純水で２回洗浄
↓２００μＬの１％トリエチルアミン−メタノール溶液で２回洗浄
・官能基キャッピング工程
↓１００μＬの１０％無水酢酸−メタノール溶液を前工程後のビーズに添加
↓室温、３０分間で反応させる
・糖鎖遊離工程
↓２００μＬの超純水で２回洗浄
↓２０μＬの超純水＋１８０μＬの２％酢酸−アセトニトリル溶液を添加する
↓７０℃、９０分間で糖鎖を遊離させる
・標識工程
↓３５０ｍＭの２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム、３０％酢酸／ＤＭＳＯ溶液を５０μＬ添加
↓６０℃、１２０分間で２−ＡＢラベルする
【００４８】
［実施例２のプロトコル］必要時間：２日間
Ｏ−結合型糖鎖遊離工程を下記のとおりに行い、その他は実施例１のプロトコルと同じ。
・Ｏ−結合型糖鎖遊離工程
１ｍｇ以上の前記糖タンパク質を準備
↓超純水で１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に調整
↓２０μＬのサンプル溶液をカルバミン酸アンモニウム１００ｍｇ、ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」（日水製薬製）０．２μｇと撹拌混合する
（ｐＨ＝９．１）
↓５５℃、５時間で反応させる
【００４９】
［実施例３のプロトコル］必要時間：２日間
Ｏ−結合型糖鎖遊離工程を下記のとおりに行い、その他は実施例１のプロトコルと同じ。
・Ｏ−結合型糖鎖遊離工程
１ｍｇ以上の前記糖タンパク質を準備
↓超純水で１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に調整
↓２０μＬのサンプル溶液を炭酸アンモニウム１００ｍｇと撹拌混合する
（ｐＨ＝８．７）
↓５５℃、５時間で反応させる
【００５０】
［実施例４のプロトコル］必要時間：２日間
Ｏ−結合型糖鎖遊離工程を下記のとおりに行い、その他は実施例１のプロトコルと同じ。
・Ｏ−結合型糖鎖遊離工程
１ｍｇ以上の前記糖タンパク質を準備
↓超純水で１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に調整
↓２０μＬのサンプル溶液を炭酸水素アンモニウム１００ｍｇと撹拌混合する
（ｐＨ＝７．７）
↓５５℃、５時間で反応させる
【００５１】
［比較例１のプロトコル］必要時間：４日間
Ｏ−結合型糖鎖遊離工程から糖鎖溶液を得るまで（下記官能基キャッピング工程まで）を下記のとおりに行い、糖鎖捕捉工程以降は実施例１のプロトコルと同じ。
・Ｏ−結合型糖鎖遊離工程
１ｍｇ以上の前記糖タンパク質を準備
↓超純水で１ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に調整
↓２０μＬのサンプル溶液をカルバミン酸アンモニウム３０ｍｇと撹拌混合する
（ｐＨ＝９．３）
↓６０℃、２０時間で反応させる
・過剰試薬除去工程
６０℃、オーバーナイト、遠心減圧乾燥
↓２０μＬの超純水に溶解する
・官能基キャッピング工程
↓４００μＬの１％酢酸水溶液を添加
↓室温で１６時間以上反応させて糖鎖溶液を得る
・糖鎖捕捉工程（以降、実施例１のプロトコルと同じ）
【００５２】
実施例１−４のプロトコルでは、１．５ｍＬキャップ付き遠沈管を使用し、ヒートブロックにて所定の温度で反応させた。比較例１のプロトコルでは、０．２ｍＬＰＣＲチューブを使用し、ＰＣＲ装置にて所定の温度で反応させた。
【００５３】
［糖鎖の検出条件］
２−ＡＢでラベル化された糖鎖を以下の条件で検出した。その結果を図１に示す。
（糖鎖検出条件）
ＬＣ装置：Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）
ＬＣ分析条件
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）  ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎ，  １．７  μｍ（２．１  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．  × １５０  ｍｍ  Ｌ．）
カラム温度：４０  ℃
移動相Ａ：０．１％ギ酸含有４０％アセトニトリル水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸含有９０％アセトニトリル水溶液
流速：０．２  ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１  μＬ
蛍光検出器：ＲＦ−２０Ａ  ｘｓ（励起波長  ３３０ｎｍ，  蛍光波長  ４２０ｎｍ）
濃度勾配条件：
【表１】
2017019994.tif 000003
【００５４】
図１に示すように、実施例１−４のプロトコルに従えば、比較例１のプロトコルと同種のＯ−結合型糖鎖を遊離、回収、分析できた。また、実施例１−４では、比較例１では検出できないピークも検出された。さらに、実施例１−４のプロトコルでは、比較例１のプロトコルに比べ、Ｎ型糖鎖の切断が抑制又は排除できた（データ示さず）。さらに、実施例１−４のプロトコルでは糖鎖のラベルまで二日間でできたが、比較例１のプロトコルでは四日間かかった。
さらに、ピーリング率は、実施例１−４が、それぞれ、２０％、１９％、３０％、２５％であったのに対し、比較例１ではピーリング率が４０％であった。すなわち、実施例１−４では、比較例１よりもピーリングの発生が抑制されていた。なお、データは示していないが、実施例２は緩衝剤を添加することで反応中のｐＨ変化を抑制できることが予想され、ｐＨ変化が大きくなる反応系では有用であると考えられる。
【００５５】
なお、ピーリング率は以下のように算出した。
（ピーリング率の算出方法）
ピーリング率＝ピーリング産物面積／４つの糖鎖のピーク面積の和ｘ１００（％）
（４つの糖鎖：図１の実施例１、比較例１に示された糖鎖）
【００５６】
［再現性］
実施例１のプロトコルによる分析を、一日５サンプル、異なる日に４回繰り返し、ピークパターンと糖鎖回収量のバラツキを検討した。その結果、同日、日差パターンのバラツキ、及び、同日、日差回収量のバラツキは、ともに２０％以下であった。これらの結果からは、実施例１のプロトコルによる定量分析が可能であることが分かった。
（バラツキの計算方法）
同日のバラツキ：Ｎ＝５で測定した総面積値のＣｖ値
日差のバラツキ：一日あたりＮ＝５測定、５日間測定した際の総面積値のＣｖ値
【００５７】
［Ｏ−結合型糖鎖遊離工程の温度］
実施例１のプロトコルのＯ−結合型糖鎖遊離工程における反応温度を、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃にしたときのピーリング率を比較した。その結果を図２に示す。
図２に示すとおり、ピーリング率は、６０℃未満において著しく抑制できることが確認された。
【００５８】
［Ｏ−結合型糖鎖遊離工程のカルバミン酸アンモニウム量］
実施例１のプロトコルのＯ−結合型糖鎖遊離工程におけるカルバミン酸アンモニウム量（２０μＬのサンプル溶液に対する量）を、１０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、７０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇとしたときのピーリング率及び糖鎖回収量（ピーク総面積）を比較した。その結果を図３に示す。
図３に示すとおり、カルバミン酸アンモニウム量が多いほど、ピーリングが抑制され、糖鎖回収量も増加した。
【００５９】
［酢酸アンモニウム及びギ酸アンモニウム］
実施例１のプロトコルのカルバミン酸アンモニウムを、酢酸アンモニウム又はギ酸アンモニウムに替えたほかは、実施例１と同様にしてＯ−結合型糖鎖を遊離、回収、分析した。その結果、遊離・回収されたＯ−結合型糖鎖が確認された。
【図２】
2017019994.tif 000004
【図３】
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【図１】
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