(57)【要約】      （修正有）【課題】インスリン活性を向上させ、糖産生を阻害する有機セレン化合物を含有する組成物の提供。【解決手段】化合物（Ｃ）で表される５’−メチルセレノアデノシンＣやγ−グルタミル−メチルセレノ−システイン等のセレン化合物及びこれらの組み合わせを含む組成物。2017078056.tif 000027【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体においてインスリンを補充する方法。
【請求項２】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体においてインスリン活性を向上させる方法。
【請求項３】
インスリン又はその類似体若しくは誘導体を投与することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体において糖産生を阻害する方法。
【請求項５】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体において糖代謝を調整する方法。
【請求項６】
前記組成物が、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、インスリン又はその類似体若しくは誘導体を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、インスリン又はその類似体若しくは誘導体を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、インスリン又はその類似体若しくは誘導体を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、インスリン又はその類似体若しくは誘導体を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、インスリン又はその類似体若しくは誘導体を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬又はインクレチン模倣薬を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬又はインクレチン模倣薬を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬又はインクレチン模倣薬を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬又はインクレチン模倣薬を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない、請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物と、担体と、を含む組成物。
【請求項３１】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体と、を含む組成物。
【請求項３２】
少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容され得る塩、水和物若しくはプロドラッグと、担体と、を含む、請求項３０記載の組成物：
【化１】
2017078056.tif 000024
式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルであるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルから選択されるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシル若しくはＣ−アミドであるか；又は、Ｒ３及びＲ４とこれらが接続する原子とが一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシル若しくはＣ−アミドであるか；又は、Ｒ３及びＲ４とこれらが接続する原子とが一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ７は、カルボキシル基及びアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン・ヒスチジン・リジン・アスパラギン酸・グルタミン酸・セリン・トレオニン・アスパラギン・グルタミン・システイン・セレノシステイン・グリシン・プロリン・アラニン・バリン・イソロイシン・ロイシン・メチオニン・フェニルアラニン・チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。
【請求項３３】
少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）の式（ＩＩ）の化合物又はその医薬的に許容され得る塩、水和物若しくはプロドラッグと、担体と、を含む、請求項３０記載の組成物：
【化２】
2017078056.tif 000025
式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルであるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルから選択されるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシル若しくはＣ−アミドであるか；又は、Ｒ３及びＲ４とこれらが接続する原子とが一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシル若しくはＣ−アミドであるか；又は、Ｒ３及びＲ４とこれらが接続する原子とが一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルであり；
Ｒ９は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルであるか；又は、Ｒ９及びＲ１０が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルから選択されるか；又は、Ｒ９及びＲ１０が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ１１は、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシ又はアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル又は医薬的に許容され得る塩若しくは分子内塩から選択される。
【請求項３４】
少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）の式（ＩＩＩ）の化合物又はその医薬的に許容され得る塩、水和物若しくはプロドラッグと、担体と、を含む、請求項３０記載の組成物：
【化３】
2017078056.tif 000026
式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルであるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル若しくはヘテロシクリルから選択されるか；又は、Ｒ１及びＲ２が一体化し、酸素若しくは窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシ又はアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、又は医薬的に許容され得る塩若しくは分子内塩から選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、又は医薬的に許容され得る塩若しくは分子内塩であり；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、又は存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール又はアラルキルから選択され；
Ｒ７は、カルボキシル基及びアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン・ヒスチジン・リジン・アスパラギン酸・グルタミン酸・セリン・トレオニン・アスパラギン・グルタミン・システイン・セレノシステイン・グリシン・プロリン・アラニン・バリン・イソロイシン・ロイシン・メチオニン・フェニルアラニン・チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１４年３月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９５４２号の一部継続出願であり、この出願は、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本出願は、有機セレンの組成物および化合物の組成物、および種々の生体経路において、インスリンを補充し、インスリン活性を向上させ、糖産生を阻害するか、または糖代謝を調整するためのこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
セレン（Ｓｅ）は、複製、甲状腺ホルモン代謝、ＤＮＡ合成および酸化損傷および感染からの保護のような多くの生体過程に重要な役割を果たす必須微量元素である。セレンは、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、チオレドキシンレダクターゼおよびあるメチオニンスルホキシドレダクターゼのような種々のセレン依存性酵素の触媒部位に組み込まれる。これらのセレノ酵素は、代謝活性、免疫機能、抗酸化防御、細胞内酸化還元制御およびミトコンドリア機能の制御に寄与する。
【０００４】
それに加え、この文献の結果は、異なる化学形態のセレンが、異なる生体活性を有することを示す。例えば、セレノゾリジンは、セレノメチオニンよりも、肺腫瘍の数を減らすのに効果的であった（Ｐｏｅｒｓｃｈｋｅら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２０１２  ２６：３４４）。Ｂａｒｇｅｒらは、マウスに異なるセレン源（例えば、セレノメチオニン、亜セレン酸ナトリウムおよびセレン化酵母）を与えると、遺伝子発現およびミトコンドリアの構造および機能の特定の機能的経路に異なる影響を及ぼすことを示した（Ｂａｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２０１２  ７：１５５）。セレン化酵母は、多くのセレンおよび硫黄化合物を含有するが、セレン化酵母中の全てのセレン化合物が生体過程に影響を与えるわけではない。これに加え、セレン化酵母中のセレンと硫黄化合物の混合物は、互いに阻害性であることが示されているか、または生体過程に悪影響を与えるか、または細胞に対して毒性であることが示されている。
【０００５】
非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病（ＤＭ）は、膵臓のβ細胞機能に起因するインスリン分泌の不足と合わせ、骨格筋、肝臓および脂肪におけるインスリン抵抗性を特徴とする疾患である。インスリン抵抗性は、ＩＩ型糖尿病の中心的な特徴である。肝臓において、Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｃｌａｓｓ  Ｏ（ＦＯＸＯ）遺伝子転写因子ファミリーのメンバーは、これらのリン酸化していない状態では活性化し、細胞核の中に留まる。核において、ＦＯＸＯ転写因子は、遺伝子のプロモーター領域、例えば、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）に結合する。ＰＧＣ−１αのような他の転写因子と共に、Ｇ６ＰＣの転写が増え、これによって、糖産生速度が大きくなる。グルコース−６−ホスファターゼは、糖新生およびグリコーゲン分解の最後の工程も触媒し、肝臓から糖を放出する。従って、Ｇ６ＰＣは、特に、糖尿病被検体において、糖ホメオスタシスの制御に重要である。
【０００６】
別個の化学形態のセレンの生体活性およびアベイラビリティが明らかに異なるため、生体プロセスに良い影響を与えるセレンを含有する化合物を特定する必要がある。特に、種々の生体経路において、インスリンの補充、インスリン活性の向上、糖産生の阻害、または糖代謝の調整におけるセレンの影響を特性決定する必要がある。さらに、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を患う個体について、インスリン補充療法としてのセレン化合物の効果およびその効能を決定する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、被検体においてインスリンを補充する方法を提供する。インスリンを補充する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。この方法の組成物は、担体も含んでいてもよい。
【０００８】
本開示は、被検体においてインスリン活性を向上させる方法も提供する。インスリン活性を向上させる方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。この方法の組成物は、担体も含んでいてもよい。インスリン活性を向上させる方法は、インスリンまたはその類似体または誘導体をさらに投与することを含んでいてもよい。
【０００９】
本開示は、さらに、被検体において糖産生を阻害する方法を提供する。糖産生を阻害する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。この方法の組成物は、担体も含んでいてもよい。
【００１０】
本開示は、さらに、被検体において糖代謝を調整する方法を提供する。糖代謝を調整する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。この方法の組成物は、担体も含んでいてもよい。
【００１１】
被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインおよびγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含んでいてもよい。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含んでいてもよい。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、乾燥した形態またはカプセル形態であってもよい。
【００１２】
被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、さらに、インスリンまたはその類似体または誘導体を含んでいてもよい。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、さらに、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬またはインクレチン模倣薬を含んでいてもよい。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含んでいなくてもよい。
【００１３】
被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、経口投与されてもよい。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、５’−メチルセレノアデノシンまたは式（Ｉ）の化合物は、セレノグリコシドである。被検体においてインスリンを補充する方法、インスリン活性を向上させる方法、糖産生を阻害する方法、または糖代謝を調整する方法のいずれか１つにおいて、組成物は、被検体の肝細胞に投与されてもよい。
【００１４】
本開示は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を提供する。組成物は、担体も含んでいてもよい。
【００１５】
本開示は、さらに、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システインからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を提供する。組成物は、担体も含んでいてもよい。
【００１６】
本開示は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）の化合物
【化１】
2017078056.tif 000002
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む組成物を提供する。
【００１７】
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００１８】
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００１９】
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００２０】
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００２１】
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００２２】
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００２３】
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【００２４】
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。式（Ｉ）の組成物は、担体も含んでいてもよい。それに加え、組成物の５’−メチルセレノアデノシンまたは式（Ｉ）の化合物は、セレノグリコシドであってもよい。式（Ｉ）の組成物は、被検体の肝細胞にも投与されてもよい。
【００２５】
本開示は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の式（ＩＩ）の化合物
【化２】
2017078056.tif 000003
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む組成物も提供する。
【００２６】
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００２７】
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００２８】
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００２９】
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００３０】
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００３１】
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００３２】
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。
【００３３】
Ｒ９は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００３４】
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００３５】
Ｒ１１は、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルまたは医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択される。
【００３６】
式（ＩＩ）の組成物は、担体を含んでいてもよい。式（ＩＩ）の組成物は、被検体の肝細胞にも投与されてもよい。
【００３７】
最後に、本開示は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の式（ＩＩＩ）の化合物
【化３】
2017078056.tif 000004
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む組成物を提供する。
【００３８】
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００３９】
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００４０】
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択される。
【００４１】
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩である。
【００４２】
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００４３】
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００４４】
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【００４５】
式（ＩＩＩ）の組成物は、担体を含んでいてもよい。式（ＩＩＩ）の組成物は、被検体の肝細胞にも投与されてもよい。
【００４６】
本明細書に記載される組成物は、組成物の２種類の化合物それぞれを少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）を含んでいてもよく、または組成物の３種類の化合物それぞれを少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
図面の簡単な説明は、以下のとおりである。セレン化合物の混合物が示されている場合、ｐｐｂ単位での量は、混合物中のそれぞれのセレン化合物中のセレンのｐｐｂ量を示す。硫黄化合物の混合物が示されている場合、ｐｐｂ単位での量は、混合物中のそれぞれの硫黄化合物中の硫黄のｐｐｂ量を示す。例えば、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥは、全セレン濃度が４５０ｐｐｂであることと組み合わせて、化合物Ｃ中に１５０ｐｐｂのセレン、化合物Ｄ中に１５０ｐｐｂのセレン、化合物Ｅ中に１５０ｐｐｂのセレンを含む。例えば、１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪは、全硫黄濃度が４５０ｐｐｂであることと組み合わせて、化合物Ｈ中に１５０ｐｐｂの硫黄、化合物Ｉ中に１５０ｐｐｂの硫黄、化合物Ｊ中に１５０ｐｐｂの硫黄を含む。
【００４８】
【図１】図１は、ＯＤ４９０によって示されるようなＡＭＬ−１２肝細胞における細胞生存性に対する、１５０ｐｐｂの化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊの個々の化合物および種々の組み合わせそれぞれの効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＡＭＬ−１２肝細胞におけるＧ６ｐｃ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに対する化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊの種々の組み合わせの効果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、コントロールおよび１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥおよび化合物ＨＩＪで４８時間処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、個々の化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊで４８時間処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図３】図３は、ＡＭＬ−１２細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現レベルに対するインスリン、化合物ＣＤＥ、インスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせの効果を示す棒グラフである。コントロール群（インスリンおよび化合物ＣＤＥを含まない処理群）と比較したとき、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】図４は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで一緒に処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現レベルに対するインスリン、化合物ＣＤＥ、インスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせの効果を示す棒グラフである。挿入された図は、水のみ（コントロール）、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘとインスリンの組み合わせ、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す高解像度の棒グラフである。
【図５】図５は、ＡＭＬ−１２肝細胞におけるＩｎｓｒ遺伝子およびＩｇｆ１ｒ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルに対する化合物ＣＤＥおよび化合物ＨＩＪの効果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥおよび１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪで２４時間処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＩｎｓｒ  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。コントロール（水ビヒクルで処理された）群と比較したとき、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥおよび１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪで２４時間処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＩｇｆ１ｒ  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。コントロール（水ビヒクルで処理された）群と比較したとき、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】図５Ｃは、コントロール、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたＡＭＬ−１２細胞、または８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥで一緒に処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＩｎｓｒ  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。コントロール（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ／インスリン／化合物ＣＤＥで処理されていない）群と比較したとき、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｄ】図５Ｄは、コントロール、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたＡＭＬ−１２細胞、または８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥで一緒に処理されたＡＭＬ−１２細胞における相対的なＩｇｆ１ｒ  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。コントロール（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ／インスリン／化合物ＣＤＥで処理されていない）群と比較したとき、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６】図６は、血清を含む培地で培養されたＡＭＬ−１２細胞において、トレオニン３２でのリン酸化されたＦｏｘｏ３（ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２）およびトレオニン２８でのリン酸化されたＦＯＸＯ４（ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）のタンパク質レベルに対する化合物ＣＤＥおよび化合物ＨＩＪの効果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、水コントロールまたは１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥおよび１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪでのＡＭＬ−１２細胞の６時間処理に応答し、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２およびｐＦｏｘｏ４Ｔ２８を含む種々のシグナル伝達分子のタンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６ＡのゲルにおけるｐＦｏｘｏ３Ｔ３２タンパク質レベルの定量分析を示す棒グラフである。図６Ｃは、図６ＡのゲルにおけるｐＦｏｘｏ４Ｔ２８タンパク質レベルの定量分析を示す棒グラフである。
【図７】図７は、血清を含まない培地で培養されたＡＭＬ−１２細胞におけるｐＦｏｘｏ３Ｔ３２およびｐＦｏｘｏ４Ｔ２８のタンパク質レベルに対する化合物ＣＤＥ、化合物ＣＥおよび化合物ＤＥの効果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、水コントロールまたは１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、１５０ｐｐｂの化合物ＣＥおよび１５０ｐｐｂの化合物ＤＥでの６時間のＡＭＬ−１２細胞の処理に応答したｐＦｏｘｏ３Ｔ３２およびｐＦｏｘｏ４Ｔ２８を含む種々のシグナル伝達分子のタンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７ＡのゲルにおけるｐＦｏｘｏ３Ｔ３２タンパク質レベルの定量分析を示す棒グラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７ＡのゲルにおけるｐＦｏｘｏ４Ｔ２８タンパク質レベルの定量分析を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ヒトＩＭＲ−３２神経細胞におけるｐＦｏｘｏ４Ｔ２８、ｐＦｏｘｏ４Ｓ１９３および他のシグナル伝達分子のタンパク質レベルに対するコントロールまたは１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥおよび１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪの効果を示すウエスタンブロットである。
【図９】図９は、マウス初代培養肝細胞における糖産生、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現および細胞外のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性に対する化合物ＣＤＥの効果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、コントロール、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、およびインスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なグルコースレベルを示す棒グラフである。＊ビヒクル処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【図９Ｂ】図９Ｂは、コントロール、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、およびインスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。＊ビヒクル処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【図９Ｃ】図９Ｃは、コントロール、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、およびインスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なＬＤＨレベルを示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで刺激されたマウス初代培養肝細胞における糖産生、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現および細胞外のＬＤＨ活性に対する化合物ＣＤＥの効果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、コントロール、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘとインスリンまたは化合物ＣＤＥとの組み合わせ、および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なグルコースレベルを示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、コントロール、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘとインスリンまたは化合物ＣＤＥとの組み合わせ、および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞における相対的なＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、コントロール、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘとインスリンまたは化合物ＣＤＥとの組み合わせ、および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ、インスリンおよび化合物ＣＤＥの組み合わせで処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なＬＤＨレベルを示す棒グラフである。＊ビヒクル処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【図１１Ａ】図１１は、血清を含まない培地で培養したマウス初代培養肝細胞における糖産生および細胞外のＬＤＨ活性に対する化合物ＣＤＥの効果を示す。図１１Ａは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下または非存在下、基本的なコントロール（水ビヒクル）、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン（Ｉｎｓ）、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、インスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせで６時間処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なグルコースレベルを示す棒グラフである。＃基本的なコントロール処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。＊８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下または非存在下、基本的なコントロール（水ビヒクル）、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン（Ｉｎｓ）、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ、インスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせで６時間処理されたマウス肝細胞の培地中の相対的なＬＤＨレベルを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、マウス初代培養肝細胞におけるリン酸化されたＰｄｋ１（ｐＰｄｋ１）、セリン４７３でのＡｋｔ（ｐＡｋｔＳ４７３）、トレオニン２４でのＦｏｘｏ１（ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４）、トレオニン３２でのＦｏｘｏ３（ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２）、トレオニン２８でのＦｏｘｏ４（ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）およびセリン９でのＧｓｋ３ｂ（ｐＧｓｋ３ｂＳ９）のタンパク質発現レベルに対する化合物ＣＤＥの効果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、マウス初代培養肝細胞におけるｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔＳ４７３、ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２、ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８およびｐＧｓｋ３ｂＳ９のタンパク質レベルに対するコントロール、インスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの効果を示すウエスタンブロットである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、コントロール、１００ｎＭのインスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたマウス肝細胞における相対的なｐＰｄｋ１タンパク質レベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、コントロール、１００ｎＭのインスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたマウス肝細胞における相対的なｐＡｋｔＳ４７３タンパク質レベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、コントロール、１００ｎＭのインスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたマウス肝細胞における相対的なｐＦｏｘｏ１Ｔ２４タンパク質レベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、コントロール、１００ｎＭのインスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたマウス肝細胞における相対的なｐＦｏｘｏ３Ｔ３２タンパク質レベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、コントロール、１００ｎＭのインスリン、または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理されたマウス肝細胞における相対的なｐＧｓｋ３ｂＳ９タンパク質レベルを示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、血清を含まない条件で培養したマウス初代培養肝細胞におけるリン酸化されたＰｄｋ１、Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３のタンパク質発現レベルに対する化合物ＣＤＥ処理の時間の効果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、マウス初代培養肝細胞におけるｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔＴ３０８、ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２、ＡｋｔおよびＡｃｔｂのタンパク質レベルに対する０分、５分、３０分、１時間、２時間および３時間の化合物ＣＤＥの処理の効果を示すウエスタンブロットである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、０分、５分、３０分、１時間、２時間および３時間の化合物ＣＤＥを用いたマウス肝細胞の処理後の相対的なｐＰｄｋ１タンパク質レベルを示す棒グラフである。＊化合物ＣＤＥ処理を行わなかったもの（０分群）と比較して、Ｐが少なくとも＜０．０５。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、０分、５分、３０分、１時間、２時間および３時間の化合物ＣＤＥを用いたマウス肝細胞の処理後の相対的なｐＡｋｔＴ３０８タンパク質レベルを示す棒グラフである。＃Ｐ＜０．１５、＊化合物ＣＤＥ処理を行わなかったもの（０分群）と比較して、Ｐが少なくとも＜０．０５。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、０分、５分、３０分、１時間、２時間および３時間の化合物ＣＤＥを用いたマウス肝細胞の処理後の相対的なｐＦｏｘｏ１Ｔ２４およびｐＦｏｘｏ３Ｔ３２を合わせたタンパク質レベルを示す棒グラフである。＃Ｐ＜０．１５、＊化合物ＣＤＥ処理を行わなかったもの（０分群）と比較して、Ｐが少なくとも＜０．０５。
【図１４】図１４は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルに対する化合物ＣＤＥの効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、２７日齢〜３．５ヶ月齢のマウスから１日おきに生理的食塩水または化合物ＣＤＥを腹腔内注射した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルを示す棒グラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、３８日齢〜６６日齢のマウスから毎日、生理的食塩水または化合物ＣＤＥを腹腔内注射した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、２７日齢〜３．５ヶ月齢のマウスから１日おきに生理的食塩水または化合物ＣＤＥを腹腔内注射した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける糖耐能に対する化合物ＣＤＥの効果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、グルコース注射からゼロ時間点（グルコースを注射して直後に決定）および種々の時間点（０．２５時間、０．５時間、１時間および２時間）に、生理的食塩水および化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルに対する化合物ＣＤＥの効果を示すグラフである。＊同じ時間点で、食塩水で処理された群と比較して、Ｐが少なくとも＜０．０５を指す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａのグラフの曲線の下の面積（ＡＵＣ）の定量分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（定義）
本明細書で使用される場合、「投与」および「投与する」という用語は、薬物、プロドラッグまたは他の薬剤または治療的な処置（例えば、本出願の組成物）を被検体にｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞、組織および臓器に与える作業を指す。本開示の化合物および組成物は、当該技術分野で知られている任意の投与経路によって被検体に与えられてもよい。ヒトの身体への例示的な投与経路は、目（眼）、口（口腔）、皮膚（局所または経皮）、鼻（鼻腔）、肺（吸入薬）、口粘膜（頬）、脳、耳、結腸、膣、または注射などによるものであってもよい。注射経路は、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内などに投与されてもよい。
【００５０】
「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子を含み、好ましくは、少なくとも３個の炭素原子を含む分枝鎖または非分枝鎖の飽和炭化水素基を指す。ある実施形態において、「アルキル」基は、１〜１６個の炭素原子を含み（すなわち、Ｃ１−１６アルキル）、具体的には、他の実施形態において、アルキルは、３〜１６個の原子を含む（すなわち、Ｃ３−１６アルキル）。アルキル基は、場合により、アシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキル基、アリール基、ハロ基、グアニジニル基、オキソ基、スルファニル基、スルフェニル基、スルホニル基、ヘテロシクリル基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。アルキル基のさらなる例としては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、３−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎｅｏ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルおよびヘキサデシルが挙げられる。
【００５１】
Ｃ３−Ｃ１６アルキルの一実施形態において、アルキルは、置換アルキルではない。他の実施形態において、置換アルキルは、カルボニル基とアミノ基を両方含むものではない。さらなる実施形態において、Ｃ３−Ｃ１６アルキルは、カルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではない。
【００５２】
「アルカリ金属」という用語は、金属塩を指し、限定されないが、適切なアルカリ金属（Ｉａ族）塩、アルカリ土類金属（ＩＩａ族）塩および他の生理学的に許容され得る金属が挙げられる。金属塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛、またはこれらの組み合わせから作成することができる。
【００５３】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分枝鎖の炭素鎖を指す。ある実施形態において、「アルケニル」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を含む炭化水素を指す（すなわち、Ｃ１−１０アルケニル）。アルケニル基の例としては、限定されないが、エテン、プロペン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネンおよびデセンが挙げられる。アルケニル基は、場合により、アミノ基、アルキル基、ハロ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。
【００５４】
「アミド」という用語は、Ｃ−アミド基（例えば、−ＣＯＮＲ’Ｒ”部分）またはＮアミド基（例えば、Ｎ−Ｒ’ＣＯＲ”部分）のいずれかを指し、Ｒ’およびＲ”は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルであってもよい。「スルホアミド」基は、−ＮＲ’−ＳＯ２−Ｒ”部分を含み、Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、アリールまたはアラルキルであってもよい。
【００５５】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝鎖の炭素鎖を指す。例示的な実施形態において、「アルキニル」は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を含む炭化水素を指す（すなわち、Ｃ２−１０アルキニル）。アルキニル基の例としては、限定されないが、エチン、プロピン、ブチン、ペンチン、ヘキシン、ヘプチン、オクチン、ノニンおよびデシンが挙げられる。アルキニル基は、場合により、アミノ基、アルキル基、ハロ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。
【００５６】
「アリール」という用語は、１個、２個または３個の環を含む炭素環芳香族系を指す。環は、鎖状の様式で互いに接続していてもよく、または融合していてもよい。「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、テトラリン、インダン、インデンおよびビフェニルのような芳香族基を包含する。アリール基は、場合により、アミノ基、アルキル基、ハロ基、ヒドロキシル基、炭素環基、ヘテロ環基または別のアリール基で置換されていてもよい。
【００５７】
「組み合わせ」は、本明細書で使用される場合、複数の要素を指す。組み合わせは、複数の原子、複数の化合物、複数の組成物、複数の要素、複数の構成要素、複数の元素、複数の部分、複数の分子または複数の混合物を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。組み合わせは、限定されないが、１つの混合物を含む。
【００５８】
「融合した」という用語は、第１の環と共通する（すなわち、共有する）２個の隣接原子を有することによって第２の環が存在する（すなわち、接続するか、または形成される）ことを意味する。「融合する」という用語は、「縮合する」、「接続する」および「結合する」という用語と同義であり、相互に置き換え可能に用いられてもよい。。
【００５９】
「シクロアルキル」という用語は、単環の飽和または部分的に飽和の炭素環を指し、環原子の数は、いくつかの数の環原子を含む。ある実施形態において、「シクロアルキル」は、３〜１２個の環原子を含む炭素環を指す（すなわち、Ｃ３−１２シクロアルキル）。本明細書で使用される場合、シクロアルキルは、単環の環構造、架橋した環構造、スピロ環構造、融合した環構造、二環の環構造および三環の環構造を包含する。シクロアルキル基の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、ノルボルニル、デカリン、アダマンチルおよびシクロオクチルが挙げられる。シクロアルキル基は、場合により、アミノ基、アルキル基、ハロ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。
【００６０】
「アラルキル」という用語は、アリール置換されたアルキル部分を指す。アラルキル基は、「低級アラルキル」基であってもよく、アリール基は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基に接続する。アラルキル基の例としては、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチルおよびジフェニルエチルが挙げられる。「ベンジル」および「フェニルメチル」という用語は、相互に置き換え可能である。ある実施形態において、アルキルは、Ｃ３−Ｃ１６アルキルである。他の実施形態において、アルキルは、カルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではない。
【００６１】
「アリールオキシ」という用語は、酸素原子に接続したアリール基を指す。アリールオキシ基は、場合により、ハロ基、ヒドロキシル基またはアルキル基で置換されていてもよい。このような基の例としては、限定されないが、フェノキシ、４−クロロ−３−エチルフェノキシ、４−クロロ−３−メチルフェノキシ、３−クロロ−４−エチルフェノキシ、３，４−ジクロロフェノキシ、４−メチルフェノキシ、３−トリフルオロメトキシフェノキシ、３−トリフルオロメチルフェノキシ、４−フルオロフェノキシ、３，４−ジメチルフェノキシ、５−ブロモ−２−フルオロフェノキシ、４−ブロモ−３−フルオロフェノキシ、４−フルオロ−３−メチルフェノキシ、５，６，７，８−テトラヒドロナフチルオキシ、３−イソプロピルフェノキシ、３−シクロプロピルフェノキシ、３−エチルフェノキシ、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ、３−ペンタフルオロエチルフェノキシおよび３−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェノキシが挙げられる。
【００６２】
「アルコキシ」という用語は、アルキル基またはシクロアルキル基で置換されたオキシ含有基を指す。アルコキシ基の例としては、限定されないが、メトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシおよびシクロヘキシルオキシが挙げられる。「低級アルコキシ」基は、１〜６個の炭素原子を含み、限定されないが、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、イソプロポキシ基およびｔｅｒｔ−ブトキシ基が挙げられる。
【００６３】
「アラルコキシ」という用語は、他の基に対して酸素原子を介して接続した、オキシを含有するアラルキル基を指す。「低級アラルコキシ」基は、低級アルコキシ基に接続したフェニル基である。低級アラルコキシ基の例としては、限定されないが、ベンジルオキシ、１−フェニルエトキシ、３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ、３−トリフルオロメチルベンジルオキシ、３，５−ジフルオロベニルオキシ（３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｙｌｏｘｙ）、３−ブロモベンジルオキシ、４−プロピルベンジルオキシ、２−フルオロ−３−トリフルオロメチルベンジルオキシおよび２−フェニルエトキシが挙げられる。
【００６４】
「アシル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ部分を指し、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルである。好ましくは、Ｒは、水素、アルキル、アリールまたはアラルキルである。
【００６５】
「カルボキシル」という用語は、−Ｒ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ”部分を指し、Ｒ’およびＲ”は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、ヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｏａｌｋｙｌ）、アリール、エーテルまたはアラルキルである。Ｒ’は、さらに、共有結合であってもよい。「カルボキシル」は、カルボン酸およびカルボン酸エステルの両方を含む。
【００６６】
「カルボン酸」という用語は、Ｒ”が水素であるカルボキシル基または塩を指す。カルボン酸としては、限定されないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、２−メチルプロピオン酸、オキシラン−カルボン酸およびシクロプロパンカルボン酸が挙げられる。
【００６７】
「カルボン酸エステル」または「エステル」という用語は、Ｒ”がアルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルであるカルボキシル基を指す。カルボン酸の例としては、限定されないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、シクロプロパンカルボン酸、シクロブタンカルボン酸、シクロペンタンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロオクタンカルボン酸またはシクロノナンカルボン酸が挙げられる。
【００６８】
「カルボニル」という用語は、Ｃ＝Ｏ部分を指し、「オキソ」基としても知られる。
【００６９】
「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式環」という用語は、３〜１２個の炭素原子を含む芳香族または非芳香族の環状炭化水素を指す。例示的な実施形態において、「ヘテロシクリル」は、３個、４個、５個または６個の環原子を含む環状炭化水素を指す（すなわち、Ｃ３−６ヘテロシクリル）。ヘテロ環は、場合により、置換されていてもよく、飽和または不飽和であってもよい。典型的には、環原子の少なくとも１個は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）またはセレン（Ｓｅ）である。例えば、ある実施形態において、ヘテロシクリルからの環Ｎ原子は、−Ｃ（Ｏ）部分に結合してアミド、カルバメートまたはウレアを形成する原子である。ヘテロ環基の例としては、限定されないが、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、イミダゾール、テトラヒドロフラン、ピラン、チオピラン、チオモルホリン、チオモルホリン  Ｓ−オキシド、オキサゾリン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、チアン、イミダゾリジン、オキソジオキソレニル、オキサゾリジン、チアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、ピペラジン、オキサジン、ジチアン、ジオキサン、ピリジニル、フラニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ピローリル、チエニル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、インドリル、イミダゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピリミジニル、オキサゾリル、トリアジニルおよびテトラスチラ（ｔｅｔｒａｓｔｙｌａ）が挙げられる。例示的なヘテロ環としては、ベンズイミダゾール、ジヒドロチオフェン、ジオキシン、ジオキサン、ジオキソラン、ジチアン、ジチアジン、ジチアゾール、ジチオラン、フラン、インドール、３−Ｈ  インダゾール、３−Ｈ−インドール、インドリジン、イソインドール、イソチアゾール、イソオキサゾール、モルホリン、オキサゾール、オキサジアゾール、オキサチアゾール、オキサチアゾリジン、オキサジン、オキサジアジン、ピペラジン、ピペリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリミジン、ピリダジン、ピロール、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラジン、チアジアジン、チアジアゾール、チアトリアゾール、チアジン、チアゾール、チオフェン、トリアジンおよびトリアゾールが挙げられる。ヘテロ環は、場合により、アミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロ基、ヒドロキシル基、炭素環基、チオ基、他のヘテロ環基またはアリール基で置換されていてもよい。
【００７０】
「ヘテロアリール」という用語は、環状炭化水素を指し、複数の環原子の少なくとも１つがＯ、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＳｅである。ヘテロアリールの環は、環原子が共有する非局在化したπ電子（芳香族性）によって特徴付けられる。本明細書に定義されるヘテロアリール部分は、炭素（Ｃ）、Ｎ、Ｓ、ＰまたはＳｅの結合手を有していてもよい。例えば、ある実施形態において、ヘテロアリールからの環Ｎ原子は、−Ｃ（Ｏ）部分に結合してアミド、カルバメートまたはウレアを形成する原子である。例示的な実施形態において、「ヘテロアリール」は、５個または６個の環原子を含む環状炭化水素を指す（すなわち、Ｃ５−６ヘテロアリール）。ヘテロアリール基の例としては、限定されないが、ピロール、フラン、チエン、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジンおよびトリアジンが挙げられる。
【００７１】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、置換基−ＯＨを指す。
【００７２】
「オキソ」という用語は、置換基＝Ｏを指す。
【００７３】
「ニトロ」という用語は、ＮＯ２を指す。
【００７４】
「アジド」という用語は、Ｎ３を指す。
【００７５】
「硫黄類似体」という用語は、１個以上のセレン原子が、それぞれ１個以上の硫黄原子と置き換わった、ある化合物の類似体を指す。
【００７６】
「スルファニル」という用語は、−ＳＲ’部分を指し、Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルである。
【００７７】
「スルフェニル」という用語は、−ＳＯＲ’部分を指し、Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルである。
【００７８】
「スルホニル」という用語は、−ＳＯＲ’部分を指し、Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルを指す。
【００７９】
「ケトン」という用語は、カルボニル炭素が２個の他の炭素原子に結合した少なくとも１個のカルボニル基を含む部分を指す。例示的な実施形態において、「ケトン」は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を含むカルボニル含有部分を指す（すなわち、Ｃ３−１０ケトン）。ケトン基の例としては、限定されないが、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、シクロブタノン、シクロペンタノン、シクロヘキサノン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロノナノンおよびシクロデカノンが挙げられる。
【００８０】
「アミノ」という用語は、式−ＮＲ’Ｒ”の一級、二級または三級の基を指し、Ｒ’およびＲ”は、独立して、水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリール、カルボキシル、シクロアルキル、ヘテロ環または他のアミノ基（ヒドラジンの場合）である。Ｒ’およびＲ”と、これらが接続する窒素原子とが、４〜８原子を含む環を形成する。従って、「アミノ」という用語は、非置換、一置換（例えば、モノアルキルアミノまたはモノアリールアミノ）および二置換（例えば、ジアルキルアミノまたはアラルキルアミノ）アミノ基を含む。アミノ基としては、−ＮＨ２部分、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチル−エチルアミノ、ピロリジン−１−イルまたはピペリジノ、モルホリノなどが挙げられる。環を形成する他の例示的な「アミノ」基としては、ピローリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イミダゾリル、イソインドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニルが挙げられる。環を含有するアミノ基は、場合により、別のアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。
【００８１】
「アミン」という用語は、式−ＮＲ’Ｒ”の一級、二級または三級のアミノ基を指し、この定義で使用されるＲ’およびＲ”は、独立して、水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリール、カルボキシル、シクロアルキル、ヘテロ環または他のアミノ（ヒドラジドの場合）であるか、またはＲ’およびＲ”と、これらが接続する窒素原子とが、４〜８原子を含む環を形成する。従って、「アミノ」という用語は、本明細書で使用される場合、非置換、一置換（例えば、モノアルキルアミノまたはモノアリールアミノ）および二置換（例えば、ジアルキルアミノまたはアラルキルアミノ）アミノ基を含む。アミノ基としては、−ＮＨ２、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチル−エチルアミノ、ピロリジン−１−イルまたはピペリジノ、モルホリノなどが挙げられる。環を形成する他の例示的な「アミノ」基としては、限定されないが、ピローリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イミダゾリル、イソインドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニルが挙げられる。環を含有するアミノ基は、場合により、別のアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロ基またはヒドロキシル基で置換されていてもよい。
【００８２】
「アルコール」という用語は、「ヒドロキシ」、「ヒドロキシル」、または−ＯＨ部分を含む任意の置換基を指す。
【００８３】
「アミノアルコール」という用語は、アルコール基およびアミン基の両方を含む官能基を指す。「アミノアルコール」は、カルボン酸基の代わりにアルコールに結合した炭素を含む、上に定義されるようなアミノ酸も指す。例示的な実施形態において、「アミノアルコール」は、アルコールが結合する炭素に隣接する炭素に結合したアミンを含む。例示的な実施形態において、「アミノアルコール」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子を含む、アミンおよびアルコールを含有する部分を指す（すなわち、Ｃ１−１２アミノアルコール）。アミノアルコールの例としては、限定されないが、エタノールアミン、ヘプタミノール、イソエタリン、ノルエピネフリン、プロパノールアミン、スフィンゴシン、メタノールアミン、２−アミノ−４−メルカプトブタン−１−オール、２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタン−１−オール、システイノール、フェニルグリシノール、プロリノール、２−アミノ−３−フェニル−１−プロパノール、２−アミノ−１−プロパノール、シクロヘキシルグリシノール、４−ヒドロキシ−プロリノール、ロイシノール、ｔｅｒｔ−ロイシノール、フェニルアラニノール、ａ−フェニルグリシノール、２−ピロリジンメタノール、チロシノール、バリノール、セリノール、２−ジメチルアミノエタノール、ヒスチジノール、イソロイシノール、ロイシノール、メチオニノール、１−メチル−２−ピロリジンメタノール、スレオニノール、トリプトファノール、アラニノール、アルギニノール、グリシノール、グルタミノール、４−アミノ−５−ヒドロキシペンタンアミド、４−アミノ−５−ヒドロキシペンタン酸、３−アミノ−４−ヒドロキシブタン酸、リシノール、３−アミノ−４−ヒドロキシブタンアミドおよび４−ヒドロキシ−プロリノールが挙げられる。
【００８４】
「アミノ酸」という用語は、カルボキシレート基に直接隣接する炭素原子に結合したカルボン酸およびアミンを含む基を指し、天然アミノ酸および合成アミノ酸の両方を含む。アミノ酸の例としては、限定されないが、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンが挙げられる。ある実施形態において、カルボキシルは、Ｈ、塩、エステル、アルキルまたはアラルキルで置換される。アミノ基も、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシル、シクロアルキル、アラルキルまたはヘテロシクリルで置換されていてもよい。
【００８５】
「エーテル」という用語は、−Ｒ−Ｏ−Ｒ”部分を指し、Ｒ’およびＲ”は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭素環、ヘテロ環、アリールまたはアラルキルである。Ｒ’は、さらに、炭素に接続した共有結合であってもよい。
【００８６】
「ハロゲン」という用語は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を指す。
【００８７】
「ハロゲン化物」という用語は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子に結合した原子を含む官能基を指す。本明細書に開示される例示的な実施形態は、「ハロゲン化アルキル」基、「ハロゲン化アルケニル」基、「ハロゲン化アルキニル」基、「ハロゲン化シクロアルキル」基、「ハロゲン化ヘテロシクリル」基または「ハロゲン化ヘテロアリール」基を含んでいてもよい。例示的な実施形態において、「ハロゲン化アルキル」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を含む炭素−ハロゲン結合を含む部分を指す（すなわち、ハロゲン化Ｃ１−１０アルキル）。ハロゲン化アルキル基の例としては、限定されないが、フルオロメチル基、フルオロエチル基、クロロメチル基、クロロエチル基、ブロモメチル基、ブロモエチル基、ヨードメチル基およびヨードエチル基が挙げられる。特に示されていない限り、本明細書で言及される任意の炭素含有基は、１つ以上の炭素−ハロゲン結合を含んでいてもよい。非限定例として、Ｃ１アルキル基は、限定されないが、メチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル、トリブロモメチル、ヨードメチル、ジヨードメチル、トリヨードメチル、クロロフルオロメチル、ジクロロフルオロメチルおよびジフルオロクロロメチルであってもよい。
【００８８】
本明細書に記載される化合物において、ヘテロ原子は、複数の異なる価数を有することができる。非限定例として、Ｓ、ＳｅおよびＮは、中性であってもよく、または陽性電荷を保持していてもよい。これに加え、Ｏは、中性であってもよく、または陽性または陰性の電荷を保持していてもよい。
【００８９】
本開示の化合物および組成物の例示的な実施形態は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を含み、示されている化合物のジアステレオマーおよびエナンチオマーを包含していてもよい。エナンチオマーは、互いに鏡像であり、重ね合わせることができない分子部分の対の１つであると定義される。ジアステレオマーまたはジアステレオ異性体は、エナンチオマー以外の立体異性体であると定義される。ジアステレオマーまたはジアステレオ異性体は、鏡像と関連しない立体異性体である。ジアステレオ異性体は、物理特性の違いによって特徴付けられる。
【００９０】
本開示の一実施形態は、式（Ｉ）の化合物
【化４】
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またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含んでいてもよい。Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００９１】
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００９２】
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００９３】
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【００９４】
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００９５】
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【００９６】
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。
【００９７】
「化合物Ｃ」という用語は、５’−メチルセレノアデノシンを指し、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（メチルセラニル）メチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール（ＣＡＳ登録番号５１３５−４０−０）としても知られ、その任意の医薬的に許容され得る塩を含む。
【化５】
2017078056.tif 000006
【００９８】
本開示の別の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物
【化６】
2017078056.tif 000007
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含んでいてもよく、式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルであり；
Ｒ９は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ１１は、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルまたは医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択される。
【００９９】
「化合物Ｄ」という用語は、５’−セレノアデノシルホモシステイン；（２Ｒ）−２−アミノ−４−（（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）セラニル）ブタン酸（ＣＡＳ登録番号４０５３−９１−２）を指し、その任意の医薬的に許容され得る塩を含む。
【化７】
2017078056.tif 000008
【０１００】
本開示のさらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）の化合物
【化８】
2017078056.tif 000009
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含んでいてもよく、式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩であり；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【０１０１】
「化合物Ｅ」という用語は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインを指し、Ｎ５−（１−カルボキシ−２−（メチルセラニル）エチル）−Ｌ−グルタミンまたはその任意の医薬的に許容され得る塩としても知られる。
【化９】
2017078056.tif 000010
【０１０２】
「化合物ＣＤＥ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＣＤＥ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ＣＤＥ）」、「化合物ＣＤＥの組み合わせ」または「組み合わせた化合物ＣＤＥ」という用語は、化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅまたはこれらの医薬的に許容され得る塩の組み合わせまたは混合物を指す。
【０１０３】
「化合物Ｈ」という用語は、５’−メチルチオアデノシン；５’−Ｓ−メチル−５’−チオアデノシン（ＣＡＳ登録番号２４５７−８０−９）またはその医薬的に許容され得る塩を指す。
【化１０】
2017078056.tif 000011
【０１０４】
「化合物Ｉ」という用語は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを指し、（Ｓ）−５’−（Ｓ）−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５’−チオアデノシン（ＣＡＳ登録番号９７９−９２−０）またはその任意の医薬的に許容され得る塩としても知られる。
【化１１】
2017078056.tif 000012
【０１０５】
「化合物Ｊ」という用語は、γ−Ｌ−グルタミル−メチル−Ｌ−システインを指し、γ−グルタミル−メチル−システインまたはその医薬的に許容され得る塩としても知られる。
【化１２】
2017078056.tif 000013
【０１０６】
「化合物ＨＩＪ」という用語は、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊまたはこれらの医薬的に許容され得る塩の混合物を指す。
【０１０７】
「類似体」および「誘導体」という用語は、相互に置き換え可能であり、所与の分子の少なくとも１つの位置の天然または非天然の改質を指す。例えば、所与の化合物または分子の誘導体は、官能基または原子の付加、官能基または原子の除去、または異なる官能基または原子への官能基または原子の変更のいずれかによって改質されてもよい（限定されないが、同位体を含む）。
【０１０８】
「〜を含む」という用語は、包括的である組成物、化合物、製剤または方法を指し、さらなる要素または方法工程を除外しない。「〜を含む」という用語は、包括的であり、さらなる要素または方法工程を除外しない、本開示の組成物、化合物、製剤または方法の実施形態も指す。「〜からなる」という用語は、任意のさらなる要素または方法工程の存在を除外する、本開示の化合物、組成物、製剤または方法も指す。
【０１０９】
「〜から本質的になる」という用語は、組成物、化合物、製剤または方法の特徴に実質的に影響を与えないさらなる要素または方法工程を含む組成物、化合物、製剤または方法を指す。「〜から本質的になる」という用語は、組成物、化合物、製剤または方法の特徴に実質的に影響を与えないさらなる要素または方法工程を含む、本開示の組成物、化合物、製剤または方法も指す。
【０１１０】
「化合物」という用語は、身体の機能の疾患、疾病、病気または障害を治療、診断または予防するために使用可能な任意の１つ以上の化学部分、部分、医薬、薬物などを指す。化合物は、本出願のスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることによって治療薬であると決定することができる。
【０１１１】
「組成物」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的な使用または処理的な使用に特に適した組成物にする別の薬剤、例えば、限定されないが、担体薬剤を含むか、または含まない、１つ以上の化合物の組み合わせを指す（例えば、担体、不活性物質または活性物質を含む１つ以上のセレン含有化合物）。
【０１１２】
「要素」という用語は、化合物または組成物の構成部分を指す。例えば、組成物の要素は、化合物、担体、組成物中に存在する任意の他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１１３】
「有効な量」という用語は、有益な結果または望ましい結果をもたらすのに十分な組成物または化合物の量を指す。有効な量は、１つ以上の用途または用量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定することを意図していない。
【０１１４】
「水和物」という用語は、分子形態の水（すなわち、Ｈ−ＯＨ結合が分かれていない）と会合する化合物を指し、例えば、式Ｒ×Ｈ２Ｏによって表されてもよく、Ｒは、本明細書に開示される化合物である。所与の化合物は、例えば、一水和物（Ｒ×Ｈ２Ｏ）、二水和物（Ｒ２×Ｈ２Ｏ）、三水和物（Ｒ３×Ｈ２Ｏ）などを含め、一より大きな水和物を形成していてもよい。
【０１１５】
「阻害性」または「拮抗性」という用語は、別の化合物の作用または機能を低減させるか、制限するか、阻害するか、またはブロックする化合物の特性を指す。
【０１１６】
「単離される」という用語は、混合物中の少なくとも１つの他の材料から、またはその材料と天然で関係がある材料からの材料の分離を指す。例えば、合成によって合成された化合物は、出発物質または中間体から分離される。
【０１１７】
「既知の治療化合物」は、（例えば、動物実験またはヒトへの投与を伴う前実験によって）治療に有効であることが示された治療化合物を指す。言い換えると、既知の治療化合物は、疾患（例えば、神経変性疾患）の治療に効果的であることが知られているか、または示されている化合物に限定されない。
【０１１８】
「ミトコンドリア電位」という用語は、膜を通過する陽電荷の正味の移動によって維持される、内部ミトコンドリア膜を通過する電圧差を指す。
【０１１９】
「糖代謝を調整する」という用語は、糖またはその要素を形成し、変換するか、または分解する生化学的経路の細胞または生きている有機体における既知の状態または所定の状態からの状態（例えば、活性または量）の変化を指す。
【０１２０】
「任意要素の」または「場合により」は、その後に記載される事象または状況が起こってもよく、または起こらなくてもよい状況を指し、この記載は、この事象または状況が起こる場合と、起こらない場合を含む。「場合により」は、記載される状態が存在する実施形態と、記載される状態が存在しない実施形態を含む。例えば、「場合により置換されたフェニル」は、フェニルが置換されていてもよく、または置換されていなくてもよく、この記載が、置換されていないフェニルと置換が存在するフェニルの両方を含むことを意味する。
【０１２１】
「有機セレン」または「有機セレン化合物」という用語は、セレンが硫黄と置き換わった任意の有機化合物を指す。従って、有機セレンは、酵母によって生合成される任意のこのような化合物を指していてもよく、または、化学合成された遊離有機セレン化合物（例えば、遊離セレノメチオニン）を指していてもよい。
【０１２２】
「患者」または「被検体」という用語は、相互に置き換え可能に用いられ、動物界の任意のメンバーを指す。被検体は、哺乳動物であってもよく、例えば、ヒト、家庭用哺乳動物（例えば、イヌまたはネコ）または家畜哺乳動物（例えば、ウシ（ｃｏｗ／ｃａｔｔｌｅ）またはブタ（ｐｉｇ／ｓｗｉｎｅ））である。
【０１２３】
「ｐｐｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、セレン含有化合物のセレンを基準とするか、または硫黄含有化合物の硫黄を基準としたパーツパービリオンを指す。セレン含有化合物の例は、化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅである。硫黄含有化合物の例は、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊである。セレンを基準としたｐｐｂを、セレンを含有する化合物のｐｐｂに変換するために、示されたｐｐｂと以下のファクターを掛け算する。化合物Ｃについて４．３５、化合物Ｄについて５．４６、化合物Ｅについて３．９４。硫黄を基準としたｐｐｂを、硫黄を含有する化合物のｐｐｎに変換するために、示されたｐｐｂと以下のファクターを掛け算する。化合物Ｈについて９．２８、化合物Ｉについて１２．００、化合物Ｊについて８．２５。
【０１２４】
「医薬的に許容され得る」という句は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を引き起こさず、合理的な便益／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、堅実な医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物および／または投薬形態を指す。
【０１２５】
「担体」という用語は、医薬的に許容され得る担体を指す。「医薬的に許容され得る担体」という句は、セレン含有化合物、類似体または誘導体を、身体のある臓器または部分から身体の別の臓器または部分へと運ぶか、または輸送するのに関与する、医薬的に許容され得る材料、組成物またはコントロール、例えば、液体または固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を指す。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者または被検体に害を与えないという観点で許容され得るものでなければならない。
【０１２６】
医薬的に許容され得る担体として働き得る材料のいくつかの例としては、以下のものが挙げられる。（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびショ糖；（２）デンプン類、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤用ワックス；（９）油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール類、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤類、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張性食塩水；（１８）Ｒｉｎｇｅｒ溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）医薬製剤で使用される他の非毒性の適合性の物質。
【０１２７】
「プロドラッグ」という用語は、薬理学的に活性な薬剤を指す。さらに典型的には、「プロドラッグ」は、代謝変換によって薬理学的に活性な薬剤に変換される不活性な化合物を指す。本明細書に記載される化合物または組成物のプロドラッグは、上のいずれかの式の化合物中に存在する官能基を、修飾がｉｎ  ｖｉｖｏで開裂して親化合物を放出し得るような様式で修飾することによって調製される。ｉｎ  ｖｉｖｏで、プロドラッグは、生理学的条件で容易に化学変化を受け（例えば、加水分解または酵素触媒作用）、薬理学的に活性な薬剤を遊離する。プロドラッグは、ヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基が、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂してそれぞれ遊離ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボキシ基を再生し得る任意の基に結合した、本明細書に記載されるいずれかの式の化合物を含む。プロドラッグの例としては、限定されないが、上のいずれかの式の化合物のエステル類（例えば、アセテート、ホルメートおよびベンゾエート誘導体）、または生理学的ｐＨになるか、または酵素作用によって活性な親薬物に変換される任意の他の誘導体を含む。適切なプロドラッグ誘導体を選択し、調製するための従来の手順は、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５を参照）。
【０１２８】
「精製され」または「実質的に精製され」という用語は、組成物から、組成物の１０％以下（例えば、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下）が、不活性な要素、化合物または医薬的に許容され得る担体を含む程度まで、不活性または阻害性の要素（例えば、汚染物質）を除去することを指す。
【０１２９】
「塩」という用語は、遊離塩基の医薬的に許容され得る酸付加塩または付加塩を含んでいてもよい。医薬的に許容され得る酸付加塩を生成するために使用可能な酸の例としては、限定されないが、非毒性の無機酸（例えば、硝酸、リン酸、硫酸または臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、リン）から誘導される塩、および非毒性の有機酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシルアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸、および酢酸、マレイン酸、コハク酸またはクエン酸）から誘導される塩が挙げられる。このような塩の非限定例としては、ナパジシル酸塩、ベシル酸塩、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などが挙げられる。また、アミノ酸塩（例えば、限定されないが、アルギン酸塩、グルコン酸塩、ガラクツロン酸塩）および他の塩（例えば、限定されないが、Ｂｅｒｇｅら（「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ  １９７７；６６：１９）に開示されるもの）も想定される。
【０１３０】
「医薬的に許容され得る塩」という句には、限定されないが、当業者によく知られている塩が含まれる。例えば、本発明のモノ塩（ｍｏｎｏ−ｓａｌｔｓ）（例えば、アルカリ金属およびアンモニウム塩）およびポリ塩（ｐｏｌｙ  ｓａｌｔ）（例えば、ジ塩またはトリ塩（ｄｉ−ｓａｌｔまたはｔｒｉ−ｓａｌｔ））が含まれる。本開示の化合物の医薬的に許容され得る塩は、例えば、交換可能な基、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ−または−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−部分の水素が、医薬的に許容され得るカチオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオンまたはアンモニウムイオン）と置き換わったときに調製され、例えば、適切な塩基との反応によって、本明細書に開示される対応する化合物から簡便に調製することができる。
【０１３１】
化合物が、安定な非毒性の酸塩または塩基性塩を生成するために十分に塩基性または酸性である場合には、塩としての化合物の投与が適切な場合がある。医薬的に許容され得る塩の例は、生理学的に許容され得るアニオンを生成する酸を用いて作られる有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩および炭酸塩を含む適切な無機塩も生成してもよい。医薬的に許容され得る塩は、例えば、十分に塩基性の化合物（例えば、アミン）と、生理学的に許容され得るアニオンを与える適切な酸とを反応させることによって、当該技術分野でよく知られた標準的な手順を用いて得られてもよい。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）の塩を作成することもできる。
【０１３２】
「セレンを豊富に含む酵母」および「セレン化酵母」という用語は、セレン源（例えば、無機セレン塩）を含有する培地中で培養された任意の酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を指す。最終生成物中の残留無機セレン塩の量は、一般的にきわめて低い（例えば、２％未満）。
【０１３３】
ある部分と組み合わせた「置換され」という用語は、その部分の任意の許容され得る位置の部分でその部分に接続するさらなる置換基を指す。特に示されていない限り、部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄または任意の他の許容され得る原子を介して結合していてもよい。置換基の例としては、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、エーテル、アルケン、アルキン、エポキシド、アジリジン、オキシラン、アゼチジン、ジヒドロフラン、ピロリジン、ピラン、ピペリジン、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、カルボキシレート、イミン、イミド、アジド、アゾ基、エンアミン、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル、ハロゲン化アリール、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィナイト、ホスホナイト、ホスファイト、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、スルホキシド、スルホニル基、スルホキシル基、スルホネート、ニトレート、ニトライト、ニトリル、ニトロ基、ニトロソ基、シアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、カーボネート、ハロゲン化アシル、ペルオキシド、ヒドロペルオキシド、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、ジスルフィド、スルホン酸、スルホン酸、チオン、チアール、ホスホジエステル、ボロン酸、ボロン酸エステルおよびボロン酸およびボロン酸エステルが挙げられる。
【０１３４】
「治療すること」、「治療する」または「治療」という用語は、その目的が、望ましくない生理学的状態の発症を遅らせること（例えば、減らすか、または延期させること）、障害または疾患の症状を減らすこと、または部分的または全体的な回復、またはパラメータ、値または機能の低下または異常に達した結果または異常になるであろう結果の阻害のような、有益な結果または望ましい結果を得ることである、治療的な処置を指す。有益な結果または望ましい結果としては、限定されないが、その状態、症状または疾患の実際の臨床的な症状の迅速な現象、または向上または改善につながるかどうかにかかわらず、症状の緩和；状態、障害または疾患の発症の程度または進行力または発症率の減少；その状態、症状または疾患の状況の安定化（すなわち、悪化しない）；その状態、症状または疾患の発生を遅らせるか、または進行を遅らせること；その状態、症状または疾患の状況の軽減；および回復（部分的または全体的）が挙げられる。
【０１３５】
「遺伝子発現を特異的に検出することができる試薬」という用語は、本明細書に記載される種々の遺伝子の発現を検出することができるか、または検出するのに十分な試薬を指す。適切な試薬の例としては、限定されないが、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを特異的にハイブリダイズすることができる核酸プライマーまたは核酸プローブ、および抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）が挙げられる。
【０１３６】
「毒性」という用語は、毒性物質を投与する前の細胞または組織と比較して、同じ被検体、細胞または組織に対する任意の悪い影響または有害な影響を指す。
【０１３７】
（化合物および組成物）
本開示は、有機セレン化合物、組成物、およびこの化合物および組成物を使用する方法に関する。本明細書に開示される化合物および組成物は、種々の生体経路において、インスリンを補充してもよく、インスリン活性を向上させてもよく、糖産生を阻害してもよく、または糖代謝を調整してもよい。本開示の組成物、化合物および方法は、肝細胞において糖代謝に悪影響を与えないようであり、そのため、これを使用し、非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病を治療または予防してもよい。
【０１３８】
本開示の一実施形態は、式（Ｉ）の化合物：
【化１３】
2017078056.tif 000014
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物に関する。
【０１３９】
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【０１４０】
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【０１４１】
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【０１４２】
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成する。
【０１４３】
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【０１４４】
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択される。
【０１４５】
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【０１４６】
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。
【０１４７】
本明細書に記載される組成物のさらなる実施形態は、５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）、およびその任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。化合物Ｃは、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（（メチルセラニル）メチル）テトラヒドロフラン−３，４−ジオール（ＣＡＳ登録番号５１３５−４０−０）であり、その任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含む。
【化１４】
2017078056.tif 000015
【０１４８】
本開示の組成物は、式（Ｉ）の化合物、化合物Ｃ、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例えば、本出願の一態様は、５’−メチルセレノアデノシン、式（Ｉ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、これらの化合物の１つ以上を合成してもよく、単離してもよく、および／または精製してもよい。
【０１４９】
ある実施形態において、組成物は、少なくとも５’−メチルセレノアデノシンと、１つの他の化合物とを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。他の実施形態において、他の化合物は、セレン含有化合物である。さらなる実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンと他の化合物（例えば、セレン含有化合物）を少なくとも１：１〜１００：１、１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、または１：１〜３：１の比率で含む。
【０１５０】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ８は、それぞれＨであり；Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’またはＣ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ５およびＲ６は、それぞれ存在せず；Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【０１５１】
具体的な実施形態において、少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）の化合物または５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供される。別の実施形態において、組成物は、５’−セレノアデノシルホモシステインおよび／またはγ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインを含まない。なおさらなる実施形態において、組成物は、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインおよびγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まない。ある実施形態において、組成物は、式（Ｉ）の化合物または５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含み、但し、５’−メチルチオアデノシン、γ−グルタミル−メチル−システイン、またはアデノシルホモシステイン、ホモシステイン、またはメチオニンの１つ以上を含まない。
【０１５２】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む組成物が提供され、ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ８はそれぞれＨであり；Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’またはＣ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ５およびＲ６は、それぞれ存在せず；Ｒ７は、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、３−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎｅｏ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルおよびヘキサデシルからなる群から選択されるアルキル、またはアミノ酸である。
【０１５３】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物、または５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ８は、それぞれＨであり；Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ５およびＲ６は、それぞれ存在せず；Ｒ７は、アルキルまたはアミノ酸であり；但し、５’−セレノアデノシルメチオニン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、エチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシド、アデノシル−ヒドロキシセレノキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレノキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシドは、それぞれ組成物から除外されていてもよい。
【０１５４】
本開示のある実施形態において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、ここで、Ｒ７は、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、３−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎｅｏ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルおよびヘキサデシルからなる群から選択されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’であり、Ｒ’は、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、３−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎｅｏ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルおよびヘキサデシルからなる群から選択されるアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルである。
【０１５５】
ある実施形態において、本開示の組成物は、式（Ｉ）の化合物、５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、但し、５’−セレノアデノシルメチオニン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、エチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシド、アデノシル−ヒドロキシセレノキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デソキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレノキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシドは、それぞれ、組成物から除外されていてもよい。
【０１５６】
他の実施形態において、式（Ｉ）の１つ以上の化合物または５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）の１つ以上の化合物を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、セレン毒性を最低限にし、不活性化合物または阻害性化合物を除去し、および／または組成物の治療指数を最大限にするために、以下のそれぞれの化合物が、組成物から除外され、除外される化合物は、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、エチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシド、アデノシル−ヒドロキシセレノキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレノキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシドである。
【０１５７】
本開示の組成物の別の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物
【化１５】
2017078056.tif 000016
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ４は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、シクロアルキル、カルボキシルまたはＣ−アミドであるか；またはＲ３、Ｒ４と、これらが接続する原子を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ８は、水素、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニルであり；
Ｒ９は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ９とＲ１０を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ１１は、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリルまたは医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択される。
【０１５８】
本明細書に記載される組成物のさらなる実施形態は、５’−セレノアデノシルホモシステイン（「化合物Ｄ」）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、その任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含む。化合物Ｄは、（２Ｒ）−２−アミノ−４−（（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）セラニル）ブタン酸（ＣＡＳ登録番号４０５３−９１−２）であり、その任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含む。
【化１６】
2017078056.tif 000017
【０１５９】
本開示の組成物は、式（ＩＩ）の化合物、化合物Ｄ、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例えば、本出願の一態様は、５’−セレノアデノシルホモシステイン、式（ＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、これらの化合物の１つ以上を合成してもよく、単離してもよく、および／または精製してもよい。
【０１６０】
式（ＩＩ）のある実施形態において、組成物は、５’−セレノアデノシルホモシステイン（化合物「Ｄ」）と、１つの他の化合物とを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンと他のセレン含有化合物を少なくとも１：１〜１００：１、１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、または１：１〜３：１の比率で含む。いくつかの実施形態において、他の化合物は、５’−メチルセレノアデノシンである。いくつかの実施形態において、他の化合物は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインである。
【０１６１】
ある実施形態において、式（ＩＩ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８およびＲ９は、それぞれＨであり；Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、カルボキシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’またはＣ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ５およびＲ６は、存在せず；Ｒ１０は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択され；Ｒ１１は、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択される。
【０１６２】
ある実施形態において、式（ＩＩ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０は、上に定義されるとおりであり、Ｒ１１はＯＲであり、Ｒは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルから選択される。
【０１６３】
具体的な態様において、式（ＩＩ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ、５’−セレノアデノシルホモシステイン（化合物「Ｄ」）、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供される。
【０１６４】
ある実施形態において、組成物は、式（ＩＩ）の化合物、セレノアデノシルホモシステイン、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、但し、アデノシルホモシステイン、５’−セレノアデノシルメチオニン、アリルセレノアデノシルホモシステインおよびセレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステインの１つ以上は、それぞれ、組成物から除外されてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、５’−メチルチオアデノシン、γ−グルタミル−メチル−システイン、またはアデノシルホモシステイン、ホモシステインまたはメチオニンの１つ以上の化合物を含まない。
【０１６５】
本開示の組成物のさらなる実施形態は、式（ＩＩＩ）の化合物
【化１７】
2017078056.tif 000018
またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、式中、
Ｒ１は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルであるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ２は、Ｈ、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、カルボキシル、シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリルから選択されるか；または、Ｒ１とＲ２を合わせ、酸素または窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、４〜８個の環原子を含むヘテロ環式環を形成し；
Ｒ３は、ＯＨ、ＯＲ、アルコキシ、アラルコキシまたはアミノであり、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩から選択され；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、または医薬的に許容され得る塩または分子内塩であり；
Ｒ５は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ６は、オキソ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＯＲ’であるか、または存在せず；Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルから選択され；
Ｒ７は、Ｃ３−Ｃ１６アルキルがカルボキシル基およびアミノ基の両方を有する置換アルキルではないＣ３−Ｃ１６アルキル、アルケニル、アルキニル、ケトン、アミノアルコール、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸、ＯＲ’、Ｓｅ−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’であり、ＯＲ’のＲ’は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓｅ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｓ−Ｒ’のＲ’は、Ｈ、Ｃ３−Ｃ１６アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびヘテロシクリルからなる群から選択される。
【０１６６】
本明細書に記載される組成物のさらなる実施形態は、ガンマ（γ）−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン（「化合物Ｅ」）を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよく、その任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含む。化合物Ｅは、Ｎ５−（１−カルボキシ−２−（メチルセラニル）エチル）−Ｌ−グルタミンであり、その任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩を含む。
【化１８】
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【０１６７】
本開示の組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物、化合物Ｅ、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例えば、本出願の一態様は、ガンマ（γ）−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、これらの化合物の１つ以上を合成してもよく、単離してもよく、および／または精製してもよい。
【０１６８】
本出願の一態様は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン、式（ＩＩＩ）の化合物およびこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、これらの化合物の１つ以上を単離してもよく、および／または精製してもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、上述の化合物の１つを少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくともγ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインと、１つの他の化合物とを含む。ある実施形態において、組成物は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインと他のセレン含有化合物を少なくとも１：１〜１００：１、１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、または１：１〜３：１の比率で含む。いくつかの実施形態において、他の化合物は、５’−メチルセレノアデノシンである。いくつかの実施形態において、他の化合物は、ガンマ（γ）−Ｌ−グルタミル−メチル−Ｌ−システインである。
【０１７０】
具体的な実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン（「化合物Ｅ」）、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを、１つの他のセレン含有化合物に対して組成物中に少なくとも１：１の比率で含む組成物が提供される。
【０１７１】
ある実施形態において、組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含み、但し、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン，γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステインおよびセレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステインの１つ以上は、それぞれ、組成物から除外されていてもよい。
【０１７２】
ある実施形態において、組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン、またはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含み、但し、５’−メチルチオアデノシン、γ−グルタミル−メチル−システインまたはアデノシルホモシステイン、ホモシステインまたはメチオニンの１つ以上が除外される。
【０１７３】
本出願の別の態様は、本明細書に記載される生物学的に活性なセレン化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ））の類似体または誘導体を提供する。セレン含有化合物の類似体および／または誘導体は、合成によって調製することができる。例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の一実施形態は、これらの任意の類似体、誘導体または医薬的に許容され得る塩を含む。本組成物の別の実施形態は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせを含む。
【０１７４】
本開示の組成物のさらなる実施形態は、本明細書に記載される化合物の混合物を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。例えば、本組成物の一実施形態は、「化合物ＣＤＥ」である。化合物ＣＤＥは、化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅ、およびこれらの任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩の混合物を含む。化合物ＣＥは、化合物Ｃおよび化合物Ｅ、およびこれらの任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩の混合物を含む。化合物ＤＥは、化合物Ｄおよび化合物Ｅ、およびこれらの任意の類似体、誘導体、および／または医薬的に許容され得る塩の混合物を含む。
【０１７５】
ある実施形態において、本出願の組成物は、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥ、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）のいずれかの化合物、またはこれらの混合物を少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。例えば、組成物は、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の化合物、化合物ＣＤＥ、またはこれらの混合物を少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）、または少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）含んでいてもよい。
【０１７６】
例えば、ある実施形態において、組成物は、少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．０３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０４０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０４５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０５０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０５５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０６０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０６５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０７０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０８０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０８５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０９０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．０９５％（ｗ／ｖ）、または少なくとも約０．０３３％〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥのいずれかの化合物、またはこれらの混合物を含み、この間に含まれる全てのパーセント範囲の値を含む。
【０１７７】
例えば、ある実施形態において、組成物は、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０６０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０６５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０７０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０８０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０８５％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０９０％（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．０９５％（ｗ／ｖ）、または少なくとも約０．０５％〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥのいずれかの化合物、またはこれらの混合物を含み、この間に含まれる全てのパーセント範囲の値を含む。
【０１７８】
他の実施形態において、組成物は、約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜約９９．９％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約９０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約８０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約７０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約６０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約５０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約４０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約３０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．０３３％〜約５％（ｗ／ｖ）、または約０．０３３％〜約１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥのいずれかの化合物、またはこれらの混合物を含み、この間に含まれる全てのパーセント範囲の値を含む。
【０１７９】
他の実施形態において、組成物は、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約９９．９％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約９０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約８０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約７０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約６０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約５０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約４０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約３０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約５％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％〜約１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥのいずれかの化合物、またはこれらの混合物を含み、この間に含まれる全てのパーセント範囲の値を含む。
【０１８０】
さらなる実施形態において、組成物は、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約９９．９％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約９０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約８０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約７０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約６０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約５０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約３０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）、または約０．１％〜約１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥのいずれかの化合物、またはこれらの混合物を含み、この間に含まれる全てのパーセント範囲の値を含む。
【０１８１】
他の実施形態において、組成物は、少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）、または少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）〜少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の化合物、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥ、またはこれらの混合物を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも５’−メチルセレノアデノシンと、１つの他の化合物とを含む。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンと１つの他のセレン含有化合物を少なくとも１：１〜１００：１、１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、または１：１〜３：１の比率で含む。いくつかの実施形態において、他の化合物は、５’−セレノアデノシルホモシステインである。他の実施形態において、他の化合物は、Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステインである。
【０１８３】
他の実施形態において、組成物は、５’−メチルチオアデノシン（「化合物Ｈ」）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（「化合物Ｉ」）、γ−グルタミル−メチル−システイン（「化合物Ｊ」）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン、Ｓｅ−アデノシルホモシステインまたはグルタミルセレノシステインの１つ以上を含まなくてもよい。これらの化合物の１つ以上が組成物に不必要な場合があるか、または組成物中の他の化合物に対して阻害性の場合があるからである。
【０１８４】
本出願の一態様は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の化合物を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、これらの化合物の１つ以上を合成してもよく、単離してもよく、および／または精製してもよい。
【０１８５】
本出願の一態様は、５’−メチルセレノアデノシン（「化合物Ｃ」）、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（「化合物Ｄ」）、Ｌ−グルタミル−Ｓｅ−メチル−Ｌ−セレノシステイン（「化合物Ｅ」）およびこれらの類似体に関する。ある実施形態は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）および／または式（ＩＩＩ）の化合物およびこれらの混合物と、担体とを含む組成物を含む。
【０１８６】
他の実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。なおさらなる実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、少なくとも１種類を少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。なお別の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０１８７】
さらなる実施形態において、式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物の１つ以上を合成してもよく、単離してもよく、および／または精製してもよい。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物を含む組成物は、さらに、界面活性剤および安定化するアミノ酸を含む、水、生理的食塩水、生理的緩衝液のような担体を含む。
【０１８８】
ある実施形態において、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物ＣＤＥ、またはこれらの混合物の１つ以上に係る１つ以上の化合物を含む組成物が提供され、セレン毒性を最低限にし、不活性化合物または阻害性化合物を除去し、および／または組成物の治療指数を最大限にするために、以下のそれぞれの化合物の１つ以上が、組成物から除外され、除外される化合物は、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、エチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシド、アデノシル−ヒドロキシセレノキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デソキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレノキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレノキシドである。
【０１８９】
ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物と、担体とを含む。他の実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システインからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物と、担体とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンおよびγ−グルタミル−メチルセレノ−システインを含む。いくつかの実施形態において、この２種類の化合物は、それぞれ、組成物中に少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）存在する。
【０１９０】
他の実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む。他の実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システインからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物と、担体とを含む。いくつかの実施形態において、この３種類の化合物は、それぞれ、組成物中に少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）存在する。
【０１９１】
ある実施形態において、本明細書に記載される本出願のいずれかの化合物は、半減期を延ばすために、プロドラッグで改質されていてもよい。プロドラッグは、化合物が酸化するのを防ぎ、その化合物がある組織を標的とし、その化合物が血液脳関門を通過することができるために有用であろう。
【０１９２】
ある実施形態において、プロドラッグは、セレノグリコシドを含む。グリコシドは、単糖、二糖およびオリゴ糖を含む。糖類は、リボース、グルコース、ガラクトースまたはマンノースを含んでいてもよい。例えば、セレン部分に接合したガラクトースは、この化合物に肝臓を標的とする能力を与える。
【０１９３】
他の実施形態において、プロドラッグは、セレナゾリジンを含む。これらの化合物は、化合物の徐放性を与える。
【０１９４】
さらに他の実施形態において、プロドラッグは、ビタミンＣまたはビタミンＥのようなビタミンに対する有機セレン化合物の接合を含む。これらのプロドラッグ接合体は、改良された保護効果を有する。
【０１９５】
さらに他の実施形態において、プロドラッグは、チトクロムＰ４５０活性化されたプロドラッグであってもよい（例えば、環状ホスフェートまたはホスホネート）。他の実施形態のチトクロムＰ４５０活性化されたプロドラッグは、バイオアベイラビリティを改良する。特に、ヌクレオシドは、これらの分子を用いて改質され、この化合物は肝臓を標的とする。例示的なプロドラッグとしては、ＨｅｐＤｉｒｅｃｔプロドラッグが挙げられる。他の実施形態のチトクロムＰ４５０活性化されたプロドラッグは、バイオアベイラビリティを改良し、Ｈｕｔｔｕｎｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８  １５：２３４６に記載される。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、または化合物ＣＤＥのいずれかの化合物は、セレンの酸化を低減するように改質することができる。いくつかの実施形態において、化合物は、セレン原子間の接続を介してダイマーを形成することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、または化合物ＣＤＥのいずれかの化合物は、組織を標的とする薬剤または化合物の半減期を長くするための他の薬剤への接続によって改質することができる。組織を標的とする薬剤は、限定されないが、組織特異的な抗原に結合する特異的な抗体、トランスフェリン受容体または本明細書に記載されるようなプロドラッグを含む当該技術分野で知られている任意の薬剤を含んでいてもよい。
【０１９８】
ある実施形態において、本発明の組成物は、血液脳関門を通過するように配合される。本発明の組成物を、脳への送達に適したインプラント材料（例えば、生分解性ポリマーインプラントまたは担体）と合わせてもよい。このようなポリマー担体としては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリオルトエステル、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール、およびエチレン−コ−酢酸ビニルが挙げられる。
【０１９９】
他の実施形態において、組成物を脳に運び、他の組織を標的とするために、化合物を、ナノ粒子担体に接続するか、またはこれらと合わせてもよい。他のナノ粒子としては、リン脂質、キトサン、乳酸およびデキストランが挙げられる。
【０２００】
微小球およびリポソームは、本開示で使用可能なさらなる担体である。例えば、微小球およびリポソームは、限定されないが、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）担体を含んでいてもよい。他の実施形態において、脳または他の組織への組成物の担体の送達は、抗体、トランスフェリン受容体またはプロドラッグを標的化剤として含むリポソームまたは微小球を用いることによって標的化することができる。組織の標的化は、インスリン受容体およびトランスフェリン受容体のような受容体が介在する伝達を含んでいてもよい。本明細書に記載されるような組成物も含むリポソームまたは微小球に、これらの受容体を組み込むことができる。
【０２０１】
脂質プロドラッグも、本発明の化合物と共に使用するのに適している。非限定例として、特定の脂質プロドラッグが、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら（１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．５３：１８１５−１８２２）およびＨｏｓｔｅｔｌｅｒら、１９９６  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５９−６７）に記載され、両者ともその全体が参考として本明細書に組み込まれる。適切なプロドラッグ技術のさらなる例は、ＷＯ  ９０／００５５５号；ＷＯ  ９６／３９８３１号；ＷＯ  ０３／０９５６６５  Ａ２号；米国特許第５，４１１，９４７号；第５，４６３，０９２号；第６，３１２，６６２号；第６，７１６，８２５号；および米国出願公開第２００３／０２２９２２５号および２００３／０２２５２７７号に記載され、それぞれ、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。このようなプロドラッグは、それぞれがその全体が参考として本明細書に組み込まれるＥｒｉｏｎら（２００４  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：５１５４−５１６３；Ｅｒｉｏｎら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｐｈａｒｍ．＆  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．ＤＯＩ：１０．１１２４／ｊｅｐｔ．１０４．７５９０３（２００４）；ＷＯ  ０１／１８０１３  Ａ１号；米国特許第６，７５２，９８１号）に記載されるように、薬物化合物が患者の特定の組織（例えば、肝臓）を標的とする能力も保有していてもよい。非限定例として、本発明の化合物と共に使用するのに適した他のプロドラッグは、ＷＯ  ０３／０９０６９０号；米国特許第６，９０３，０８１号；米国特許出願第２００５／０１７１０６０Ａ１号；米国特許出願第２００２／０００４５９４Ａ１号；およびＨａｒｒｉｓら（２００２  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｃｈｅｍｏ．１２：２９３−３００；Ｋｎａｇｇｓら、２０００  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：２０７５−２０７８）に記載され、それぞれ、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
このようなプロドラッグは、それぞれがその全体が参考として本明細書に組み込まれるＥｒｉｏｎら（２００４  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：５１５４−５１６３；Ｅｒｉｏｎら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｐｈａｒｍ．＆  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．ＤＯＩ：１０．１１２４／ｊｅｐｔ．１０４．７５９０３（２００４）；ＷＯ  ０１／１８０１３  Ａ１号；米国特許第６，７５２，９８１号）に記載されるように、薬物化合物が患者の特定の組織（例えば、肝臓）を標的とする能力も保有していてもよい。非限定例として、本発明の化合物と共に使用するのに適した他のプロドラッグは、ＷＯ  ０３／０９０６９０号；米国特許第６，９０３，０８１号；米国特許出願第２００５／０１７１０６０Ａ１号；米国特許出願第２００２／０００４５９４Ａ１号；およびＨａｒｒｉｓら（２００２  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｃｈｅｍｏ．１２：２９３−３００；Ｋｎａｇｇｓら、２０００  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：２０７５−２０７８）に記載され、それぞれ、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
ある実施形態において、それぞれが式（Ｉ）の１つ以上の化合物を含む組成物が提供される。ある態様において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ；および５’−セレノアデノシルホモシステインまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む。
【０２０４】
ある実施形態において、式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）それぞれの１つ以上の化合物を含む組成物が提供される。ある態様において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ；５’−セレノアデノシルホモシステインまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ；およびγ−グルタミル−メチルセレノ−システインまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む。
【０２０５】
ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシンまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグ；およびγ−グルタミル−メチルセレノ−システインまたはその医薬的に許容され得る塩、水和物またはプロドラッグを含む。
【０２０６】
ある実施形態において、式（Ｉ）および式（ＩＩ）それぞれの１つ以上の化合物を含む組成物が提供される。ある態様において、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）それぞれの１つ以上の化合物を含む組成物が提供される。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物のいずれかは、糖代謝を調整するか、または糖尿病を治療するために、異なる治療薬をさらに含んでいてもよい。
【０２０８】
ある実施形態において、異なる治療薬は、インスリンまたはその類似体である。インスリン類似体は、迅速に作用するインスリン類似体と、長く作用するインスリン類似体を含む。インスリン類似体は、１つ以上のアミノ酸が変更されていてもよい。迅速に作用するインスリン類似体としては、アスパルト、グルリジンおよびリスプロが挙げられる。長く作用するインスリンとしては、ＮＰＨインスリン、インスリンデテミル、デグルデクインスリンまたはインスリングラルジンが挙げられる。
【０２０９】
一実施形態において、組成物は、糖代謝を調整するか、または糖尿病を治療するために、異なる治療薬をさらに含む。ある実施形態において、異なる治療薬は、インスリンまたはその類似体である。ある実施形態において、異なる治療薬は、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬またはインクレチン模倣薬である。メトホルミン、スルホニルウレア、メグリチニド、Ｄ−フェニルアラニン誘導体、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、αグルコシダーゼ阻害剤、胆汁酸封鎖剤およびこれらの組み合わせを含め、本組成物に有効な他の例示的な治療薬を使用し、糖尿病を治療してもよい。
【０２１０】
本発明の別の態様によれば、医薬組成物は、治療に有効な量の本発明の１つ以上の化合物またはその医薬的に許容され得る塩、エステルまたはプロドラッグを、医薬的に許容され得る希釈剤または担体と共に含む。本発明の例示的な希釈剤および担体は、本出願の定義の章に詳細に記載される。例えば、ある実施形態において、担体は、界面活性剤または安定化するアミノ酸（例えば、ヒスチジンまたはグリシン）を含有する、水、生理的食塩水、緩衝化水溶液を含んでいてもよい。本出願の一実施形態において、医薬的に許容され得る担体は、医薬的に不活性である。
【０２１１】
本出願のある実施形態において、セレンを含む組成物および／または製剤のみが被検体に投与されてもよく、または他の形態のセレン、薬物、低分子と組み合わせて、または賦形剤または他の医薬的に許容され得る担体と混合した医薬組成物で投与されてもよい。他の実施形態において、本出願の組成物は、経口投与に適した用量で、当該技術分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体を用い、配合することができる。このような担体によって、医薬組成物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして配合することができ、または治療される患者によって口または鼻から摂取するために配合することができる。それに加え、限定されないが、５’−メチルセレノアデノシン、式（Ｉ）の化合物、およびこれらの組み合わせを含む１種類以上の化合物を含む組成物が、医薬的に許容され得る担体（例えば、生理的食塩水）に含まれる状態で被検体（例えば、患者）に静脈内投与されてもよい。
【０２１２】
組成物は、特に、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内または鼻腔内の投与を含め、任意の投与経路のために配合されてもよい。組成物は、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、溶液、懸濁物、分散物、シロップ、スプレー剤、ゲル、坐剤、パッチ剤およびエマルションのような任意の従来の形態で配合されてもよい。
【０２１３】
医学分野でよく知られているように、ある任意の被検体のための用量は、患者の大きさ、身体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全体的な健康、同時に投与される他の薬物との相互作用を含め、多くの因子に依存して変わってもよい。治療によって変えられることが求められる標的に依存して、医薬組成物は、全身的または局所的に配合され、投与されてもよい。
【０２１４】
治療化合物の配合および投与のための当該技術分野で知られている技術は、本発明の化合物および組成物を投与するのに十分なものであり、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．）の最新版の中に見出されるだろう。本開示の組成物は、任意の投与経路のために、特に、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内または鼻腔内の投与のために配合されてもよい。適切な投与経路は、例えば、経口投与または経粘膜投与；および筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、髄腔内投与、心室内投与、静脈内投与、腹腔内投与または鼻腔内投与を含む非経口送達を含んでいてもよい。
【０２１５】
注射のために、本出願の組成物（例えば、セレン含有組成物）は、水溶液に配合されてもよく、例えば、生理学的に適合性のバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液または生理緩衝化食塩水に配合されてもよい。組織、臓器または細胞に投与するために、浸透する特定の障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られている。
【０２１６】
本出願で使用するのに適した医薬組成物は、意図した目的を達成するのに有効な量で活性成分（例えば、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの混合物）が含まれる組成物を含む。例えば、好ましい実施形態において、有効な量の医薬組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの混合物からなる群から選択される所定量の化合物を含む。有効な量の決定は、特に、本明細書に与えられる開示内容の観点で、当業者の能力の範囲内に十分に入る。
【０２１７】
ある種のセレン含有化合物は、合成によって調製され、精製され、生体活性アッセイでスクリーニングされている。セレン化酵母から得られたとき、セレン化酵母またはその水抽出物中に見出される全ての要素および化合物が生体活性を有するわけではなく、実際に、細胞にとって毒性のものもある。
【０２１８】
本開示の組成物は、特に、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内または鼻腔内の投与を含め、任意の投与経路のために配合されてもよい。適切な投与経路は、例えば、経口投与または経粘膜投与；および筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、髄腔内投与、心室内投与、静脈内投与、腹腔内投与または鼻腔内投与を含む非経口送達を含んでいてもよい。
【０２１９】
注射のために、本出願の組成物（例えば、セレン含有組成物）は、水溶液に配合されてもよく、例えば、生理学的に適合性のバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液または生理緩衝化食塩水に配合されてもよい。組織または細胞に投与するために、浸透する特定の障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られている。
【０２２０】
ある実施形態において、化合物を含有する組成物または合成によって配合された化合物を含む組成物は、それぞれのセレン含有要素を等量含んでいてもよく、例えば、γ−グルタミル−メチルセレノ−システインと５’−メチルセレノアデノシンとＳｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを少なくとも１：１：１の比率で含んでいてもよい。他の実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の成分を１：１〜１００：１、１：１〜５０：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、または１：１〜３：１の比率で含んでいてもよい。
【０２２１】
５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物およびこれらの組み合わせを含む１種類以上の化合物を含む組成物が、医薬的に許容され得る担体（例えば、生理的食塩水）に含まれる状態で被検体（例えば、患者）に静脈内投与されてもよい。化合物を細胞内送達するための標準的な方法を使用してもよい（例えば、リポソームを介した送達）。このような方法は、当業者によく知られている。
【０２２２】
セレンを含む組成物は、静脈内投与および非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内）に有用である。注射のために、本出願のセレンを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、水溶液に配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合性のバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液または生理緩衝化食塩水に配合されてもよい。組織または細胞に投与するために、浸透する特定の障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られている。
【０２２３】
ある実施形態において、医薬製剤は、崩壊剤、アルファ化デンプンおよびコーティングを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、崩壊剤としては、架橋したポリビニルピロリドン、ガム、アルファ化デンプンを含むデンプン、セルロース製品が挙げられる。いくつかの実施形態において、コーティングは、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体およびメタクリル酸誘導体を含む。
【０２２４】
本出願のある実施形態において、セレンを含む組成物および／または製剤のみが被検体に投与されてもよく、または他の形態のセレン、薬物、低分子と組み合わせて、または賦形剤または他の医薬的に許容され得る担体と混合した医薬組成物で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、毒性を最低限にするために、組成物は、１種類以上のアミノ酸またはセレノアミノ酸、例えば、メチオニン、システインまたはセレノシステインを含んでいてもよい。本出願の一実施形態において、医薬的に許容され得る担体は、医薬的に不活性である。本出願の別の実施形態において、セレンを含む組成物が、単独で、糖代謝に関連する疾患または状態のリスクがあるか、またはこれらを患っている個々の被検体に投与されてもよい。
【０２２５】
組成物は、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、溶液、懸濁物、分散物、シロップ、スプレー剤、ゲル、坐剤、パッチ剤およびエマルションのような任意の従来の形態で配合されてもよい。本出願の組成物、特に、５’−メチルセレノアデノシン、式（Ｉ）の化合物、およびこれらの組み合わせを含む組成物を、日々の消費を補助するために栄養ドリンクまたは食物（例えば、ＥＮＳＵＲＥ、ＰＯＷＥＲＢＡＲなど）、マルチビタミン、栄養製品、食品などに加えてもよい。
【０２２６】
（本化合物および組成物を使用する方法）
本開示の化合物および組成物は、生体プロセスおよび転写活性化／不活性化に関する遺伝子の遺伝子発現に関し、組織特異性を示す。例えば、本出願は、被検体の種々の生体経路において、インスリンを補充し、インスリン活性を向上させ、糖感受性を高めるか、糖産生を阻害するか、または糖代謝を調整するために本明細書に記載される化合物および組成物を用いる方法に関する。従って、セレンを含有する組成物および化合物のみが被検体に投与されてもよく、または本明細書に記載される遺伝子異常に関連する疾患または状態を患うリスクがあるか、またはこれらを患っている個々の被検体に組み合わせて投与されてもよい。例えば、本出願の方法は、非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病（ＤＭ）に関連する状態を有する被検体を診断または治療（例えば、予防的または治療的に）する際の用途が見出されるだろう。
【０２２７】
本開示の一実施形態において、被検体においてインスリンを補充する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、インスリンを補充する。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２２８】
別の実施形態において、被検体においてインスリン活性を向上させる方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、インスリン活性を向上させる。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。被検体においてインスリン活性を向上させる方法のさらなる実施形態は、インスリンまたはその類似体または誘導体を投与することをさらに含む。
【０２２９】
なお別の実施形態において、被検体において糖産生を阻害する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、糖産生を阻害する。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３０】
別の実施形態において、被検体においてＦＯＸＯ３および／またはＦＯＸＯ４のリン酸化を増加させる方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、ＦＯＸＯ３およびＦＯＸＯ４のリン酸化を増加させる。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、被検体において糖代謝を調整する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物からなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む有効な量の組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、糖代謝を調整する。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、被検体において糖感受性を高める方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、糖感受性を高めた。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、被検体において糖尿病を治療する方法は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、糖尿病を治療する。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３４】
ある実施形態において、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体において、Ｇ６ＰＣの発現を阻害するための方法または使用が提供される。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、Ｇ６ＰＣ遺伝子発現を阻害する。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３５】
ある方法の実施形態において、Ｇ６ＰＣの減少は、上述の化合物で処理されていない同じ種類の細胞と比較して、約５０％の増加または減少から、５００％の増加または減少までの範囲である。このＧ６ＰＣ応答の大きさは、細胞の種類、特定の化合物および細胞と接触する時間に依存して変わる。
【０２３６】
他の実施形態において、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体において、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）の発現を増加させるための方法または使用が提供される。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、インスリン受容体の発現を増加させる。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも約０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２種類の異なる化合物を含む組成物を被検体に投与することを含む、被検体において、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の発現を増加させるための方法または使用が提供される。別の実施形態において、有効な量の組成物は、組成物で処理されなかった被検体の肝細胞と比較して、被検体の肝細胞において、インスリン様成長因子受容体の発現を増加させる。ある実施形態において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、２種類をそれぞれ少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）含む。他の実施形態において、組成物は、これらの化合物のうち、３種類をそれぞれ少なくとも０．０３３％（ｗ／ｖ）含む。
【０２３８】
本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システインまたはこれらの混合物を含んでいてもよい。本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）の５’−メチルセレノアデノシンを含んでいてもよい。
【０２３９】
本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、乾燥した形態またはカプセル形態であってもよい。本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、インスリンまたはその類似体または誘導体をさらに含んでいてもよい。本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進薬またはインクレチン模倣薬をさらに含んでいてもよい。
【０２４０】
本明細書に記載されるいずれかの方法において、５’−メチルチオアデノシン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはγ−グルタミル−メチル−システインの１つ以上を含まなくてもよい。本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、経口投与されてもよい。
【０２４１】
本明細書に記載されるいずれかの方法において、組成物は、被検体の１つ以上の肝細胞に投与されてもよい。ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの方法は、インスリンまたはその類似体を投与することをさらに含むか、または、糖代謝を調整するか、または糖尿病を治療するために異なる治療薬を投与することをさらに含む。
【０２４２】
本出願の方法のいくつかの実施形態において、被検体においてインスリンを補充するか、またはインスリン活性を向上させるための、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物からなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物のための使用が提供される。いくつかの実施形態において、この使用は、インスリンまたはその類似体をさらに含む。いくつかの実施形態において、この使用は、糖代謝を調整するか、または糖尿病を治療するための異なる治療薬をさらに含む。本出願の他の実施形態において、肝臓においてＧ６ＰＣを阻害するための、５’−メチルセレノアデノシン、Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物のための使用が提供される。
【０２４３】
セレン含有化合物は、神経細胞とは異なる状態で、肝細胞における遺伝子発現に影響を及ぼす。本明細書に記載されるような肝細胞に対する化合物および組成物の影響とは対照的に、同じ組成物または同様の組成物が、反対の様式で神経細胞に影響を及ぼすことがある。例えば、本明細書に記載される組成物は、本開示の方法で特定されるようにＦＯＸＯ３および／またはＦＯＸＯ４の発現を増加させるのとは異なり、神経細胞においてＦＯＸＯ３および／またはＦＯＸＯ４のリン酸化を減少させる。
【０２４４】
本開示の方法のさらなる実施形態において、本明細書に記載される化合物および組成物の有効な量は、肝細胞に対して毒性であることなく、肝細胞においてＧ６ＰＣの発現を阻害し、肝細胞において糖産生を減少させるか、または肝細胞においてＦＯＸＯリン酸化を増加させるのに有効な量である。選択される化合物の有効な量は、マウスの骨格筋細胞、ヒト神経細胞またはマウス肝細胞を含む例示的ないずれかの細胞について、毒性を示さない。それに加え、本明細書に記載される化合物を含む組成物は、肝細胞における糖代謝に悪影響を与えない。
【０２４５】
被検体の細胞において遺伝子発現を決定する方法は、当業者に知られており、プライマーおよび／またはプローブを用いたハイブリダイゼーションを含んでいてもよく、例えば、アレイまたはＰＣＲ法によるものであってもよい。遺伝子発現を決定するためのアレイおよび／またはプライマーは、市販されている。プライマーおよびアレイまたはマイクロアレイは、本明細書に記載される遺伝子（例えば、Ｇ６ＰＣ、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＩＮＳＲおよびＩＧＦ１Ｒ）のための公的に利用可能な配列を用い、容易に設計されるだろう。例えば、Ｇ６ＰＣのための例示的な配列は、ＮＭ＿０００１５１．３、ＧＩ：３９３５３７０３０、遺伝子番号：２５３８の中に見出され、ＦＯＸＯ３のための例示的な配列は、ＮＭ＿００１４５５．３、ＧＩ：１４６２６０２６６、遺伝子番号：２３０９の中に見出され、ＦＯＸＯ４のための例示的な配列は、ＮＭ＿００１１７０９３１．１、ＧＩ：２８３４３６０８２、遺伝子番号：４３０３の中に見出され、ＩＮＳＲのための例示的な配列は、ＮＭ＿０００２０８．２、ＧＩ：１１９３９５７３５、遺伝子番号：３６４３の中に見出され、ＩＧＦ１Ｒのための例示的な配列は、ＸＭ＿０１１５２１５１３．１、ＧＩ：７６７９８３９９６、遺伝子番号：３４８０の中に見出される。肝細胞における遺伝子発現の調整は、本明細書に記載される組成物によって処理された被検体から採取したサンプルについての多くのアッセイを用い、本明細書に記載されるように決定することができる。
【０２４６】
医学分野および研究分野でよく知られているように、任意の被検体のための用量は、限定されないが、患者の大きさ、身体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全体的な健康、同時に投与される他の薬物との相互作用を含め、多くの因子に依存して変わってもよい。いくつかの実施形態において、本組成物の用量は、その効能またはセレン中毒症の明らかな徴候が被検体で観察されるかどうかに依存して調節されてもよい。セレン中毒症は、限定されないが、ニンニク臭い息、抜け毛または剥がれやすい爪を含む症状によって示されるだろう。
【０２４７】
ある実施形態において、血液中で原子状セレンの定常状態を達成するために、少なくとも１日に１回、所定時間に、上述の用量の本組成物が投与される。さらに他の実施形態において、被検体が疾患または障害の症状を経験している間、上述の用量の本組成物が投与される。
【実施例】
【０２４８】
以下の実施例は、本開示の組成物、化合物および方法の具体例または実施形態を与える。本開示の化合物、組成物および方法の具体的な実施形態は、一例として本明細書で与えられる。本開示の概念および技術は、種々の改変および代替的な形態に変えることができ、その具体的な実施形態は、図中に一例として示されており、ここに詳細に記載される。しかし、本開示の概念を、開示される特定の形態に限定することを意図しているものではなく、これとは対照的に、本発明は、本開示および添付の特許請求の範囲と一致するすべての改変例、均等物および変形例を包含することを意図していることを理解すべきである。
【０２４９】
本明細書に記載される技術は、広い用途を有すると理解されるべきである。技術の原理およびいくつかの実際の用途を説明するために、上述の実施形態が選択され、記載される。特定の実施形態が、本明細書で記載され、および／または例示されてきたが、その考慮可能な変形例および改変例が可能であることを想定している。
【０２５０】
（実施例１：５’−メチルセレノアデノシン（「Ｃ」）の合成および特性決定）
化合物Ｃを製造するための合成スキームおよび方法論は、以下であった。
【化１９】
2017078056.tif 000020
マグネチックスターラーを取り付け、２０ｍＬの無水エチルアルコールが入った２００ｍＬ丸底フラスコに水素化ホウ素ナトリウム（２２７ｍｇ、６．０ｍＭ、Ａｒ°下）を入れ、氷冷却浴に置いた。冷却し、攪拌しつつ、Ａｒ流下、このフラスコにジメチルジセレニド（１９０ｕＬ、３７６ｍｇ、２．０ｍＭ）を加えた。黄色がかった溶液が生成した後、固体の５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン（１１４３ｇ、４．０ｍＭ）を加えた。１００ｍＬのエチルアルコールを加え、沈殿を溶解させた。その後に混合物の攪拌を室温で４日間続けた。約７５％の転化を監視するために質量分析法を使用し、この転化は、５日後に達成された。溶媒を蒸発させ、生成物３．２２ｇ（出発物質（ＳＭ）を約２０％含む）を集め、逆相（Ｃ−８）分取クロマトグラフィーによって精製した。１．１ｇの純粋な生成物を集め、その分子量を質量分析法によって確認した。
【０２５１】
（実施例２：Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（「化合物Ｄ」）の合成および特性決定）
化合物Ｄを製造するための合成スキームおよび方法論を、工程１〜６で以下に示す。
【化２０】
2017078056.tif 000021
【０２５２】
（５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン（６３９−６２））
オーブンで乾燥した２Ｌの４ッ口フラスコに滴下漏斗、スターラー、気体入口／出口および温度計を取り付け、これに８９グラム（０．３６６ｍｏｌｅ、１ｅｑ．）のアデノシン、５９．３ｍＬ（５８、１．８３３ｍｏｌｅ、２ｅｑ．）の無水ピリジンおよび１Ｌの無水アセトニトリルを入れた。反応物のセットを氷／塩浴に入れ、攪拌を開始した。溶液の温度を３℃未満まで下げたら、塩化チオニルをゆっくりと添加した。反応混合物の温度は、塩化チオニル添加中および４時間より長い間、５℃未満に維持した（このとき、溶液は黄色であり、底部に白色から黄色の沈殿がある）。次いで、反応物を周囲温度で一晩放置した。
【０２５３】
次の日の朝、多量の沈殿を、焼結ガラスフィルタを用いて濾別し、このフィルタを体積３００ＭＬの乾燥アセトニトリルで洗浄した。その間に沈殿の色は白色に変化した。次いで、濡れた沈殿を、８００ＭＬのメタノールと１６０ＭＬの水の混合物が入った上述の２Ｌの反応フラスコに戻した。機械攪拌し、水浴で冷却しつつ、この反応フラスコに８０ＭＬの濃水酸化アンモニウム溶液を滴下した。混合物を周囲温度で４５分間攪拌し、生成した白色沈殿を、減圧濾過によって溶液から分離した。
【０２５４】
減圧ロータリーエバポレーターを用い、濾液を乾燥するまで濃縮し、その間に沈殿を約５６０ＭＬの熱水から結晶化させた。沈殿を氷水浴中で冷却し、１回目の集めた結晶を濾別し、凍結乾燥させた。次いで、１回目の濾液のロータリーエバポレーションから得られた固体の結晶化において、この濾液を溶媒として使用し、２回目の生成物を得た。この２回目の生成物も２日間かけて凍結乾燥させた。減圧デシケーター中、五酸化リンの上で、両方の結晶を最終的に２日間乾燥させた。８４グラムの白色結晶（収率８０．５％）を得た。ＭＳ（２８６−Ｍ＋Ｈ）、ｍｐ．１８７℃。
【０２５５】
（セレノアデノシルホモシステイン（６５５−４０））
２Ｌの３ッ口フラスコに温度計、大きな冷却フィンガー（出口にバブルメーターを備える）、アンモニア気体入口（フラスコの底部に達する）および磁気攪拌棒を取り付け、これにＬ−セレノメチオニン（９．８０６グラム、５０ｍＭ、１ｅｑ．）を投入し、ＣＯ２−アセトン冷却浴を備える２．５Ｌデュワー容器に入れた。Ａｒ°をこのフラスコに流した後に、アセトン浴および冷却フィンガーに固体ＣＯ２を加えた。フラスコ内の温度が−３５℃未満まで下がったときに、無水アンモニア（気体）の流れを開始し、液体アンモニアの液面が体積８００ＭＬに達したときに、気体の流れを止めた。
【０２５６】
溶液の青色から紫色の着色が約３０秒間続くようになるまで、十分に攪拌した溶液に金属ナトリウムの小片を加えた。４５分以内に合計２．６４５グラム（１１５ｍＭ、２．３ｅｑ．）のナトリウムを加えた。攪拌および冷却を３０分より長く維持した。このときに、すべての要素は溶液の状態になっていた。無水５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン（１４．８５６グラム、５２ｍＭ、１．０４ｅｑ．）を一度に加え、攪拌し、非常にゆっくりとＡｒ°を流しつつ、反応混合物を一晩放置した。
【０２５７】
次の日の朝、フラスコ中に存在する白色固体に３５０ＭＬの無水メタノールを加えた。このフラスコを油浴に入れ、還流凝縮器を設置し、Ａｒ°気体の流れを維持し、その後、油浴を２４時間かけて５０℃まで加熱した。この溶液１ＭＬを、数滴の０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ３．５まで酸性化し、質量分析法を用い、基質の存在についてサンプルを分析した。
【０２５８】
基質が５％未満の場合には、１Ｎ  ＨＣｌを用い、混合物をｐＨ３．５まで酸性化し、塩から濾過し、減圧ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで濃縮してもよく、未精製生成物を水−エタノール混合物から結晶化によって精製することができる。１回目の集めたセレノアデノシルホモシステイン結晶から、１５．９８グラムの生成物が収率７４％で得られた。なお、生成物の約９５％はきれいであり、さらに精製することなく、生物学的試験に使用することができる。
【０２５９】
（実施例３：γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン（「化合物Ｅ」）の合成および特性決定）
化合物Ｅを製造するための合成スキームおよび方法論を、工程１〜４で以下に示す。
【化２１】
2017078056.tif 000022
【０２６０】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ（６５５−９０）の合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（３０３ｍｇ、１．０Ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２１ｍｇ、１．０５Ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２２７ｍｇ、１．１Ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水エチルエーテルに懸濁／溶解し、この反応混合物にシリンジから１０ｕＬのジメチルエチルベンジルアミンを加えた。周囲温度（２２℃）での攪拌を４８時間維持した。この混合物を濾過し、沈殿を１０ｍＬのエチルエーテルで１０回洗浄した。濾液を濃縮し、高減圧下で乾燥させ、白色結晶生成物を得た（５７０ｍｇ、収率約９０％）。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝４２３．１７。
【０２６１】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＭｅＳｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（６５５−９０）の合成）
６ｍＬの１，４−ジオキサンと２ｍＬの水の混合物に、Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｅ（５７０ｍｇ、０．９Ｍｍｏｌ）、メチルセレノシステイン（１７５ｍｇ、０．８Ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５２ｍｇ、２０９μＬ、１．５Ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物の磁気攪拌を１００時間維持した。その後、１．２１ＮのＨＣｌ（１．６５ｍＬ）を加え、反応後の混合物を２０ｍＬのエチルエーテルで３回抽出した。抽出物を、減圧ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで濃縮し、６４９ｍｇのワックス状生成物を得て、これを分取ＨＰＬＣにかけた。２８３ｍｇの生成物を集めた（収率７５．６％）。質量スペクトルから生成物の分子量を確認し、その中に１個のＳｅ原子が存在することを確認した。Ｃ１８Ｈ３２Ｎ２Ｏ７ＳｅのＭｓ計算値＝４６８．４２。これらの結果から、４６９．２４  ｍ／ｅ（Ｍ＋Ｈ＋）および４９１．２４  ｍ／ｅ（Ｍ＋Ｎａ＋）であることがわかった。
【０２６２】
（γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン（６５５−９２）の合成）
２８３ｍｇ（０．６Ｍｍｏｌ）のＮ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＭｅＳｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ、２ｍＬのチオアニソールおよび５ｍＬのトリフルオロ酢酸の混合物を、油浴中、磁気攪拌しつつ６３℃で６時間加熱した。混合物を周囲温度（２２℃）で一晩放置した。この後、激しく攪拌したエチルエーテル２０ＭＬに、この反応混合物を滴下した。生成した沈殿を２０ＭＬのエチルエーテルで２回洗浄した。この生成物から１３８．３ｍｇのクリーム状の沈殿を得て、次いで、これを分取ＨＰＬＣによって精製した。
【０２６３】
（実施例４）
個々の合成有機セレン化合物、個々の有機セレン化合物およびその硫黄類似体の組み合わせを、本明細書に記載される実施例において、細胞の生存または生存性および遺伝子発現に対する影響について、細胞培養物中で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）試験した。特に、試験した細胞は、マウスＡＭＬ−１２肝細胞であった。
【０２６４】
（材料および方法）
（細胞株および化合物）
マウス肝細胞株ＡＭＬ−１２およびヒト神経芽細胞ＩＭＲ−３２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア）から購入した。ＡＭＬ−１２細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｄｅｘ、Ｓｉｇｍａ）および１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレン化ナトリウムを含有する）溶液（Ｓｉｇｍａ）を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改質イーグル培地およびＨａｍのＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）の培地の中で増幅した。ＩＭＲ−３２細胞を、１０％ＦＢＳを追加したイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。
【０２６５】
化合物Ｃ（５’−メチルセレノアデノシン）、化合物Ｄ（Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）および化合物Ｅ（γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン）およびこれらの硫黄類似体、化合物Ｈ（５’−メチルチオアデノシン）、化合物Ｉ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）および化合物Ｊ（γ−グルタミル−メチル−システイン）は、合成されたか、または（入手可能な場合）商業的な供給源から得た。試験した全ての化合物の純度は、質量分析法によって決定される場合、９９％以上であると確認された。上述のように合成した３バッチの化合物を以下の実験に使用した。
【０２６６】
本明細書の実施例で示されるｐｐｂ値は、等量のセレンまたは硫黄が実験で試験されるのを確保するために、セレン含有化合物中のセレンのｐｐｂまたは硫黄含有化合物中の硫黄のｐｐｂを指す。
【０２６７】
セレンを基準としたｐｐｂを、化合物のｐｐｂに変換するために、セレンの原子量を化合物の原子量で割り、これに１００を掛け算することによって、化合物中のＳｅ％を計算する。硫黄を基準としたｐｐｂを、化合物のｐｐｂに変換するために、硫黄の原子量を化合物の原子量で割り、これに１００を掛け算することによって、化合物中のＳ％を計算する。
【０２６８】
例えば、セレンの原子量７８．９６を化合物Ｃの分子量３４４で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｃのセレン％が２３％との結果が得られる。同様に、化合物Ｄについて、セレンの原子量７８．９６を化合物Ｄの分子量４３２で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｄのセレン％が１８％との結果が得られる。化合物Ｅについて、セレンの原子量７８．９６を化合物Ｅの分子量３１１で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｅのセレン％が２５％との結果が得られる。
【０２６９】
これらのＳｅ％値を使用し、セレンのｐｐｂを化合物のｐｐｂに変換するためのファクターを誘導する。これらのファクターは、化合物Ｃについて４．３５、化合物Ｄについて５．４６、化合物Ｅについて３．９４である。セレンを基準としたｐｐｂを、化合物のｐｐｂに変換するために、示されたセレンのｐｐｂと、以下の表に示されるそれぞれの化合物についてのファクターを掛け算する。例えば、以下の実験において、１５０ｐｐｂの化合物Ｃは、１５０ｐｐｂのセレンを指し、６５３ｐｐｂの化合物Ｃと等価である。
【０２７０】
硫黄化合物について、硫黄の原子量３２を化合物Ｈの分子量２９７で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｈの硫黄％が１１％との結果が得られる。同様に、化合物Ｉについて、硫黄の原子量３２を化合物Ｉの分子量３８４で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｉの硫黄％が８％との結果が得られる。化合物Ｊについて、硫黄の原子量３２を化合物Ｊの分子量２６４で割り、この結果に１００を掛け算し、化合物Ｊの硫黄％が１２％との結果が得られる。
【０２７１】
これらのＳ％値を使用し、硫黄のｐｐｂを化合物のｐｐｂに変換するためのファクターを誘導する。これらのファクターは、化合物Ｈについて９．２８、化合物Ｉについて１２．００、化合物Ｊについて８．２５である。硫黄を基準としたｐｐｂを、化合物のｐｐｂに変換するために、示された硫黄のｐｐｂと、以下の表に示されるそれぞれの化合物についてのファクターを掛け算する。例えば、以下の実験で記載されるような１５０ｐｐｂの化合物Ｈは、１５０ｐｐｂの硫黄を指し、１３９２ｐｐｂの化合物Ｈと等価である。
【表１】
2017078056.tif 000023
【０２７２】
（細胞生存性アッセイ）
培養したＡＭＬ−１２細胞中の細胞生存性を、製造業者のプロトコルおよび指示に従って、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキットを用いて決定した。簡単に言うと、ＡＭＬ−１２（１×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルの透明プレート（ＶＷＲ）に接種し、１０％のＦＢＳ、１×ＩＴＳおよび４０ｎｇ／ｍｇのＤｅｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一晩培養した。次いで、１０％のＦＢＳおよび４０ｎｇ／ｍｇのＤｅｘを含み、ＩＴＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、細胞をコントロール（水）または化合物で４８時間処理した。
【０２７３】
培養した細胞をＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液（１００ｕｌ／ウェルあたり）と共に３７℃で１時間インキュベートし、それぞれのサンプルにおいて、ＯＤ４９０の吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーによって決定した。培養した細胞の細胞生存性を、培養した細胞のＯＤ４９０ｎｍから、プレーン培地（細胞を摂取していない）のＯＤ４９０ｎｍを引き算することによって決定した。上述の分析のために、各処理あたり８個のサンプルを試験した。データを、８個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０２７４】
（ＲＮＡおよびタンパク質分析のための細胞処理）
インスリン受容体（Ｉｎｓｒ）のＲＮＡ分析のために、インスリン様成長因子受容体（Ｉｇｆ１ｒ）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）、ＡＭＬ−１２細胞を、ＩＴＳ、ＤｅｘおよびＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増幅させ、ＤＥＸを含むか、またはＤＥＸを含まず、１０％  ＦＢＳ  ＩＴＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２４ウェル（６．７×１０４細胞／ウェル）プレート中で一晩培養した。これらの細胞をコントロール（水）または種々の化合物（ＤＥＸを含むか、またはＤＥＸを含まず、１０％  ＦＢＳ  ＩＴＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で希釈）で６時間、２４時間または４８時間処理した。
【０２７５】
ある実験において、２４時間の化合物処理の後、ＡＭＬ−１２細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、血清を含まず、２０ｍＭのラクトースおよび２ｍＭのピルベート、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（グルコース産生培地）を追加したグルコース／フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地中、インスリン（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）、０．１ｍＭの８−ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）、または０．５μＭのＤｅｘ存在下、または非存在下、セレン化合物（それぞれの化合物を１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂ）と共にさらに６時間インキュベートした。処理後、細胞培地を集め、Ａｂｃａｍグルコースアッセイキットを製造業者のプロトコルに従って用い、グルコースアッセイを行った。細胞を溶解させ、Ｇ６ｐｃ、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒのＲＮＡ単離およびＰＣＲ分析のために集めた。
【０２７６】
タンパク質発現の試験のために、ＡＭＬ−１２細胞を、ＩＴＳ、ＤｅｘおよびＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増幅させ、ＤＥＸを含むか、またはＤＥＸを含まず、１０％  ＦＢＳ  ＩＴＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、６ウェル（３．３３×１０５細胞／ウェル）プレート中で一晩培養した。血清を含有する培地（ＤＥＸを追加し、１０％  ＦＢＳ  ＩＴＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）または血清を含まない培地（ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中、これらの細胞をコントロール（水）または種々の化合物で６時間および２４時間処理した。それに加え、ヒト神経芽細胞ＩＭＲ−３２細胞を１０％  ＦＢＳ  ＥＭＥＭ培地中で培養し、次いで、同じ血清を含有する培地中、コントロール（水）、セレン化合物およびその硫黄類似体で６時間および２４時間処理した。
【０２７７】
（ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ分析）
これらの細胞からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、次いで、ＤＮａｓｅ  Ｉと共にインキュベートし、任意の潜在的な混入したゲノムＤＮＡを除去した。Ａｐｐｌｉｅｄ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキットおよびあらかじめ設計されたＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、すでに記載されたように（Ｌａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００３）、ＲＮＡサンプルにリアルタイムＰＣＲ分析を行った。それぞれの処理群において、３〜６個のサンプルを分析した。それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｉｎ  Ｂ（Ａｃｔｂ）のレベルによってデータを正規化し、３〜６個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０２７８】
（タンパク質の調製およびウエスタンブロット分析）
ＡＭＬ１２肝細胞またはＩＭＲ−３２神経細胞を６ウェルプレートに接種し、次いで、本明細書に記載されるように、ビヒクルおよび種々の化合物で６時間および２４時間処理した。処理の後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、完全なプロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を含む氷冷したＲＩＰＡバッファーに、氷の上で３０分間溶解した。セルスクレーパーおよび移動ピペットを用いて細胞溶解物を集め、次いで、１２０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離処理し、ＤＮＡペレットを除去し、タンパク質抽出物を得た。これらの細胞溶解物の上澄み中のタンパク質レベルを、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ）を用いて決定した。
【０２７９】
ウエスタンブロット分析のために、コントロールおよび化合物で処理した細胞からの全タンパク質５μｇにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離を行い、次いで、すでに記載されたように（Ｒｅｄｄｙ、Ｌｉｕら、２００８  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＶＤＦ膜に移した。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で膜をブロックし、特定の一次抗体と共にインキュベートした。その後、ＨＲＰに接合した抗−マウスまたは抗−ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．）と共にインキュベートした。
【０２８０】
Ａｃｔｂ（Ｌｉ−ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ）、Ｅｌｆ２ｂεおよびｐＥｌｆ２ｂε（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）以外の全ての一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．から購入した。膜ブロットの上の陽性シグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍの改良型の化学発光Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）を用いて検出した。膜ブロットの上のこれらの発光シグナルの画像を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃ  Ｉｍａｇｅシステム（リンカーン、ネブラスカ）を用いて捕捉した。同じ膜ブロットに筋を入れ、ＧＥ  ＷＢ  ＥＣＬ−プライム−検出プロトコル（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）に記載されるように、別の抗体で再びブロット処理した。ウエスタンブロットのタンパク質のバンド密度を、Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  ｓｔｕｄｉｏソフトウエアまたはＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて決定し、次いで、それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂレベルによって正規化した。それぞれの群あたり、データを３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０２８１】
（統計分析）
適用可能な場合、スチューデントのｔ検定を用い、０．０５未満のｐ値で、生理食塩水で処理した群と、化合物ＣＤＥで処理した群との統計差を決定した。
【０２８２】
（結果および考察）
（ＡＭＬ−１２細胞の生存性に対する化合物ＣＤＥの効果）
ＡＭＬ−１２細胞の生存に対し、セレン化合物の毒性の影響があるか否かを試験するために、肝細胞について細胞生存性アッセイを行った。ＡＭＬ−１２細胞を水コントロールまたは１５０ｐｐｂの個々の化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｊ；化合物ＩとＪの組み合わせ（「化合物ＩＪ」）；化合物Ｄと化合物Ｅの組み合わせ（「化合物ＤＥ」）；および化合物Ｃ、化合物Ｄと化合物Ｅの組み合わせ（「化合物ＣＤＥ」）で４８時間処理した。
【０２８３】
単一の化合物および化合物の組み合わせを含めた化合物処理は、コントロール群と比較したときに、ＡＭＬ−１２細胞における細胞生存性（ＯＤ４９０ｎｍによって示される）を有意に低下させなかった（図１）。これらの結果は、セレン化合物ＣＤＥが、ＡＭＬ−１２細胞の生存または生存性になんら悪い影響を与えないことを示した。
【０２８４】
（ＦＢＳおよびＤｅｘを含有し、ＩＴＳを含まない培地中で培養したＡＭＬ−１２細胞における、化合物ＣＤＥによるＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現の阻害）
肝臓は、血流の正常な糖濃度を維持するために糖を産生する主要な臓器である。グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ｐｃ）は、肝臓における糖新生にとって必須の酵素である。肝臓における化合物ＣＤＥの潜在的な機能を探求するために、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析によって、本明細書に記載される種々の条件下で培養したＡＭＬ−１２細胞において、Ｇ６ｐｃ発現を調べた。
【０２８５】
ＡＭＬ−１２細胞を、血清、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム補助剤（ＩＴＳ）およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含有する培地中で培養するか、または増幅させることを推奨する。ＩＴＳ中のインスリンおよび亜セレン酸ナトリウムが、ＡＭＬ−１２細胞において試験したセレン化合物の作用を妨害し得る可能性を除外するために、ＩＴＳを含まないが、ＦＢＳおよびＤｅｘを含有する培地中で培養したＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現を観察した。簡単に言うと、ＡＭＬ−１２細胞を完全増幅培地（１０％  ＦＢＳ、ＩＴＳおよびＤｅｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養／増幅し、培養プレートに接種し、ＩＴＳを含まず、ＦＢＳおよびＤｅｘを含有する培地中で一晩培養した。これらの細胞をコントロール（水）、それぞれ用量１５０ｐｐｂで、化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅといった個々のセレン化合物、化合物Ｈ、化合物Ｉ、化合物Ｊといった個々の硫黄化合物で処理した。化合物ＣＤＥの組み合わせ、化合物ＨＩＪの組み合わせも、この細胞について４８時間試験した。これらの処理の後、細胞を集め、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【０２８６】
図２Ａに示されるように、化合物ＨＩＪの硫黄類似体の組み合わせではなく、化合物ＣＤＥの組み合わせでＡＭＬ−１２肝細胞を処理すると、この実験条件下、肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現が非常に顕著に（約５０％）減少した。それに加え、個々の化合物すべてで処理した後のＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現をさらに調べた（図２Ｂを参照）。Ｇ６ｐｃ発現の顕著な変化（例えば、増加または減少）は観察されなかった。データを、４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０２８７】
化合物ＣＤＥの組み合わせに応答してＧ６ｐｃ発現が減少するという効果が、異なるバッチの細胞を用い、３回の繰り返し実験で観察された（データは示さない）。この効果は、細胞の生存に対するセレン化合物の潜在的な毒性の影響に起因するものではなかった。化合物ＣＤＥは、この同じ実験条件下でＡＭＬ−１２細胞の生存性に影響を与えなかったからである（図１を参照）。これらの結果は、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、個々の化合物またはその硫黄類似体とは異なり、培地中にＦＢＳおよびＤｅｘが存在する状態でＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現を阻害することができることを示す。
【０２８８】
（ＩＴＳおよびＤｅｘを含まず、ＦＢＳを含む培地中で２４時間、その後、血清を含まない培地中で６時間、化合物ＣＤＥの組み合わせが、ＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現を阻害する）
Ｄｅｘが肝臓におけるＧ６ｐｃ発現を制御する能力を有することが報告されている。ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培養条件で、ＡＭＬ−１２細胞における化合物ＣＤＥの効果を観察した。血清を含まない条件で２４時間および４８時間培養した肝臓ＡＭＬ−１２細胞は、一部異常な細胞形態を示した。しかし、血清を含まない培地で６時間培養した後のＡＭＬ−１２細胞の全体的な形態変化は観察されなかった（データは示さない）。従って、ＡＭＬ−１２細胞を、血清を含有するがＩＴＳおよびＤｅｘを含まない培地中、化合物ＣＤＥで２４時間前処理し、その後、血清／ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地中、これらの化合物で６時間再処理し、Ｇ６ｐｃ発現に対する化合物ＣＤＥの効果をさらに観察した。
【０２８９】
簡単に言うと、ＡＭＬ−１２細胞を１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせ（１０％  ＦＢＳを含むが、ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地で希釈）で２４時間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留ＦＢＳを除去し、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン（ＦＢＳ／ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地で希釈）存在下または非存在下、同じ用量のこれらのセレン化合物と共に６時間インキュベートした。化合物ＣＤＥの効果の効能と、化合物ＣＤＥとインスリンの潜在的な相加作用または相乗作用を比較するために、インスリンのみの処理も含まれていた。
【０２９０】
図３に示されるように、両用量のインスリン（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）の処理は、Ｇ６ｐｃ発現を顕著に阻害し、これは予想されることである。化合物ＣＤＥのみの処理は、１５０ｐｐｂの用量で、Ｇ６ｐｃ発現は減少傾向にあった（図３）。さらに大幅に、３００ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥで処理すると、これらのＡＭＬ−１２肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現は、安定して顕著に低下し、その効能は、少なくとも１００ｎＭのインスリンに匹敵するものであった（図３）。それに加え、インスリン処理と、１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの試験した組み合わせも、コントロールと比較して、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現を顕著に低下させた（図３）。この結果は、化合物ＣＤＥが、ＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンの模倣物となり得、有効な用量である３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥが、１００ｎＭのインスリンに匹敵することを明らかに示す。
【０２９１】
（模擬糖尿病条件（ｃＡＭＰおよびＤｅｘ両方によって模擬実験した）で培養したＡＭＬ−１２細胞において、化合物ＣＤＥによるＧ６ｐｃ発現の制御におけるＧ６ｐｃ発現の阻害およびインスリン作用の向上）
Ｇ６ｐｃ発現に対する化合物ＣＤＥの効果をさらに観察するために、細胞透過性の８−（４−クロロフェニルチオ）ｃＡＭＰ（８−ＣＰＴ）およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で一緒に処理したＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現を調べた。環状ＡＭＰ（８−ＣＰＴ）およびＤｅｘは、肝臓におけるＧ６ｐｃ発現および糖産生のよく知られた刺激物質であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの糖尿病状態を模倣している。簡単に言うと、１０％  ＦＢＳを含むが、ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地中、ＡＭＬ−１２肝細胞を、水（コントロール）または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせで２４時間かけて前処理した。この初期の処理の後、血清を含まない培地中、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、０．１ｍＭの８−ＣＰＴおよび０．５μＭのＤｅｘ存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。これらの処理の後、細胞を集め、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。それぞれの群あたり、データを４個のサンプルの平均±ＳＥＭとして図４にあらわす。図４の異なる文字（ａ対ｂ、ａ’対ｂ’対ｃ’、ａ”対ｂ”対ｃ”）は、これら２群間の有意差を意味する。
【０２９２】
図４に示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理されたＡＭＬ−１２肝細胞は、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現において大きな増加を示した。両用量のインスリンを用いた処理によって、ＡＭＬ−１２細胞において、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現が有意に減少した（図４の棒グラフの８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合）。さらに重要なことに、用量１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥも、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現を有意に弱めた。８−ＣＰＴ／Ｄｅｘと高用量（３００ｐｐｂ）の化合物ＣＤＥの組み合わせで処理した後、この処理群のＧ６ｐｃ発現が大きく変動したことに起因して、（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合に）Ｐ値は０．０５より大きかったが、Ｇ６ｐｃ発現の平均レベルは、ＡＭＬ−１２細胞においてさらに減少した。これにかかわらず、これらの試験は、インスリンと同様に、化合物ＣＤＥのみでも、用量試験用量で８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現を阻害することができることを示している（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合、約４０〜４８％の減少）。
【０２９３】
それに加え、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘと共に、１５０ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥと１０ｎＭインスリンとを組み合わせて処理すると、１０ｎＭインスリン群および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合に、ＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現をさらに阻害した（図４の棒グラフにおいて、ａ’対ｂ’で示される）。また、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルの平均レベルは、１０ｎＭのインスリン、８−ＣＰＴ／Ｄｅｃおよび高用量の化合物ＣＤＥで処理した後のＡＭＬ−１２細胞において、低かった（１０ｎＭのインスリン／８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ／３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥ群  対  １０ｎＭのインスリン／８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ／１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥ群）。しかし、これら２群に統計的な有意差はなかった。
【０２９４】
さらに劇的には、挿入された棒グラフに示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘと共に、３００ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥと１００ｎＭインスリンとを組み合わせて処理すると、１００ｎＭインスリン群および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合に、ＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現をさらに顕著に阻害した（図４の棒グラフにおいて、ａ”対ｂ”対ｃ”で示される）。さらに、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルは、１００ｎＭのインスリン、８−ＣＰＴ／Ｄｅｃおよび３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理した後のＡＭＬ−１２細胞において、１００ｎＭのインスリン／８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ／１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥ群よりも有意に低かった（図４の挿入されたグラフを参照）。
【０２９５】
これらを合わせると、これらの結果は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ処理に起因するＧ６ｐｃ発現上昇の阻害において、インスリンと化合物ＣＤＥの組み合わせが、インスリンのみまたは化合物ＣＤＥのみの場合よりもかなり効果的であることを示す。
【０２９６】
上述の処理の後のＡＭＬ−１２細胞の培地についても、グルコース分析を行った。残念なことに、ＡＭＬ−１２細胞によって作られるグルコースの濃度は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ刺激の後であっても、低すぎて高感度蛍光グルコースアッセイ（Ａｂｃａｍ）で検出することができなかった（データは示さない）。
【０２９７】
まとめると、上述の培養条件で培養したＡＭＬ−１２細胞に関するこれらの結果は、化合物ＣＤＥが、正常モデルと、病的な状態または糖尿病状態のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（例えば、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘでの細胞処理）の両方で、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣する能力を有することを示した。それに加え、化合物ＣＤＥは、模擬糖尿病状態で培養したＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンの作用を向上させることができる。これらの結果は、化合物ＣＤＥが、Ｉ型および／またはＩＩ型の糖尿病における過剰な糖産生を阻害する能力を有するという分子的な証拠を与える。
【０２９８】
（化合物ＣＤＥで処理した後のＡＭＬ−１２細胞におけるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現の上方制御）
インスリン受容体（Ｉｎｓｒ）およびインスリン様成長因子１受容体（Ｉｇｆ１ｒ）は、Ｇ６ｐｃ発現およびその後の肝臓での糖産生を制御するインスリンとＩＧＦ１の作用にとって必須である。化合物ＣＤＥの組み合わせが、受容体に依存する様式で肝細胞においてインスリンまたはＩＧＦ１の感受性を調整することができるか否かを調べるために、インスリンおよびＩＧＦ１受容体の発現をＱＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定した。
【０２９９】
まず、ＦＢＳ／Ｄｅｘを含有するが、ＩＴＳを含まない培地中、ＡＭＬ−１２細胞を水コントロール（コントロール、ｎ＝４）、セレン化合物ＣＤＥおよびこれらの硫黄類似体である化合物ＨＩＪ（ｎ＝４）で２４時間処理し、次いで、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。図５Ａに示されるように、Ｉｎｓｒ  ｍＲＮＡレベルは、化合物ＣＤＥで処理した後に、２．７８倍に安定に増加した。同様に、Ｉｇｆ１ｒ発現も、化合物ＣＤＥによって約２．２倍増加し、有意に刺激された（図５Ｂを参照）。しかし、硫黄類似体である化合物ＨＩＪは、ＡＭＬ−１２細胞において、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現に影響を与えなかった（図５Ａおよび５Ｂを参照）。
【０３００】
化合物ＣＤＥがＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現を向上させる能力を有することをさらに検証するために、ＦＢＳを含有するが、ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地中、ＡＭＬ−１２細胞を２種類の用量の化合物ＣＤＥで２４時間処理した。次いで、ＦＢＳ／ＩＴＳ／Ｄｅｘを含まない培地中、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下または非存在下、この細胞を同じ用量の化合物ＣＤＥで６時間かけて再処理した。それに加え、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現の制御において、インスリンと化合物ＣＤＥに差があるかどうかをみるために、これらの細胞をインスリンで６時間処理した。
【０３０１】
図５Ｃおよび５Ｄに示されるように、１５０ｐｐｂおよび３００ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥで処理すると、コントロール（すなわち、０ｐｐｂの化合物ＣＤＥ／インスリンなし、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘなしの群）と比較して、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理を行っていないＡＭＬ−１２細胞におけるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現が有意に向上した。しかし、インスリンのみでは、ＡＭＬ−１２細胞におけるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現は増加しなかった（図５Ｂおよび５Ｃを参照）。同様に、インスリンを用いずに、３００ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥで処理しても、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理されたＡＭＬ−１２細胞おけるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現が有意に向上した（図５Ｃおよび５Ｄの黒色の棒グラフを参照）。
【０３０２】
これらの結果は、化合物ＣＤＥが、試験した条件でＡＭＬ−１２細胞におけるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現を刺激する能力を有することを示す。それに加え、これらのデータは、ＡＭＬ−１２細胞における遺伝子発現の制御において、インスリンと化合物ＣＤＥの作用に差があることを示す。また、この結果は、化合物ＣＤＥが、インスリン感受性を改良することによってＩ型およびＩＩ型の糖尿病の治療に有用であり得ることを示唆している。
【０３０３】
合わせると、上述の遺伝子発現試験（図２〜４）は、化合物ＣＤＥが、個々の化合物またはこれらの硫黄類似体とは異なり、Ｇ６ｐｃ発現を顕著に弱めるインスリンを模倣する能力を有し、それによって肝臓の糖生成を減らす新規な様式を示している。これらのデータは、化合物ＣＤＥが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘのような糖産生刺激剤の存在下でさえ、マウス肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現の阻害において、インスリンと同様の様式で作用する能力を有するという分子的な証拠も与える（図３〜４）。
【０３０４】
それに加え、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで刺激されたＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現をさらに阻害するインスリンの作用も向上させる（図４）。組み合わせた状態の化合物ＣＤＥは、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現を刺激する能力を有し（図５）、これも、インスリン／Ｉｇｆ１の感受性の向上および糖の輸送の向上と共に、肝臓における糖産生のためのＧ６ｐｃ発現の減少にも寄与する。さらに、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥは、肝細胞の生存性に対し、毒性の影響を有していなかった（図１）。要するに、これらの結果は、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、マウス肝臓ＡＭＬ−１２細胞において、細胞の生存または生存性に対し、なんら毒性の影響を有することなく、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣し、Ｉｎｓｒおよび／またはＩｇｆ１ｒの発現の刺激によるものと同様に、このプロセスでのインスリンの作用も向上させることを示す。
【０３０５】
（実施例５：化合物ＣＤＥは、ＡＭＬ−１２細胞において、ＦＯＸＯ３およびＦＯＸＯ４のリン酸化を標的とする）
Ｆｏｒｋｈｅａｄ転写因子ファミリーサブクラスＯ（ＦＯＸＯ）は、肝臓における代謝、糖新生およびインスリン感受性にとって重要な役割を果たす。ＦＯＸＯ遺伝子の細胞内活性は、後翻訳修飾によって厳しく制御される。特に、ＦＯＸＯのリン酸化によって核から除外され、それによって、標的遺伝子への接近がブロックされる。インスリン抵抗性の個人または糖尿病の個人において、ＦＯＸＯが核から除外されるシグナルが存在しないため、核の中に留まり続け、Ｇ６ｐｃの転写を刺激する。Ｇ６ｐｃの発現が増加すると糖新生が誘発され、高血糖症が引き起こされる。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、肝臓での糖産生のためのＦＯＸＯが介在するＧ６ｐｃ発現を制御するインスリンの作用を調整することもできる。
【０３０６】
すでに記載されたように、ＡＭＬ−１２肝細胞は、組み合わせた状態での化合物ＣＤＥが、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するインスリンの作用を模倣する能力を有し、このプロセスでのインスリンの作用を向上させる能力を有することを示した。ＦＯＸＯは、肝臓における糖新生およびインスリン感受性の主要なシグナル伝達分子であるため、化合物ＣＤＥが、インスリンと同様に、ＡＭＬ−１２細胞においてＦＯＸＯおよび他の関連するシグナル伝達分子を標的とするかという問題を調べた。
【０３０７】
（化合物ＣＤＥは、血清を含む培地で培養されたＡＭＬ−１２細胞において、ＦＯＸＯ３およびＦＯＸＯ４のリン酸化を標的とする）
化合物ＣＤＥの組み合わせが、肝臓においてＦＯＸＯリン酸化を制御することができるかどうかを決定するために、血清およびＤｅｘを含有し、ＩＴＳを含有しない培地中、ＡＭＬ−１２細胞を、コントロール、１５０ｐｐｂのセレン化合物ＣＤＥおよびこれらの硫黄類似体である１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪで６時間処理した。処理された細胞にウエスタンブロット分析を行った。ウエスタンブロットにおけるタンパク質発現の定量データを、３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。棒グラフ中の異なる文字は、これら２群間の有意差を意味する（Ｐ＜０．０５）。
【０３０８】
図６Ａは、水、血清およびＤｅｘを含有する（が、ＩＴＳを含まない）培地で希釈した１５０ｐｐｂの化合物ＨＩＪおよび１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで６時間処理した後のＡＭＬ−１２細胞におけるリン酸化されたＦｏｘｏ３Ｔ３２（トレオニン３２；ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２）、リン酸化されたＦｏｘｏ  Ｔ２８（トレオニン２８；ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）、リン酸化されたＰＤＫ１（ｐＰＤＫ１）、リン酸化されたＡＫＴ  Ｔ３０８（トレオニン３０８；ｐＡＫＴＴ３０８）、リン酸化されたＡＫＴ  Ｓ４７３（セリン４７３；ｐＡＫＴＳ４７３）、ＡＫＴ、リン酸化されたＧｓｋ３ａ  Ｓ２１（セリン２１；ｐＧｓｋ３ｂＳ２１）、リン酸化されたＧｓｋ３ｂ  Ｓ９（セリン９；ｐＧｓｋ３ｂＳ９）、Ｇｓｋ３ａ、Ｇｓｋ３ｂ、リン酸化された４ＥＢＰ１  Ｔ３７／４６（トレオニン３７およびトレオニン４６；ｐ４ＥＢＰ１Ｔ３７Ｔ４６）、リン酸化されたＥｌｆ２ｂεＳ５３９（セリン５３０；ｐＥｌｆ２ｂεＳ５３０）およびＥｌｆ２ｂεを含む種々のシグナル伝達分子のタンパク質発現を示す。Ｆｏｘｏ３のリン酸化された形態（例えば、トレオニン３２でのｐＦｏｘｏ３であるｐＦｏｘｏ３Ｔ３２）およびＦｏｘｏ４のリン酸化された形態（例えば、トレオニン２８でのｐＦｏｘｏ４であるｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）のタンパク質は、化合物ＨＩＪではなく、化合物ＣＤＥで６時間処理した後のＡＭＬ−１２細胞において、目に見えて上昇していることがわかるということを発見した（図６Ａ）。定量分析は、化合物ＣＤＥで処理されたＡＭＬ−１２細胞において、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２が約２．５倍増加し、ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８が約３．２倍増加したことを示した（図６Ｂおよび６Ｃ）。本願発明者らは、いくつかのリン酸化されたＦｏｘｏ１（ｐＦｏｘｏ１）抗体も試験したが、ウエスタンブロット上にこれらの抗体による特異的なｐＦｏｘｏ１タンパク質バンドを検出することはできなかった（データは示さない）。この結果は、ＡＭＬ−１２細胞におけるｐＦｏｘｏ１の発現が、おそらく非常に低いことを示唆している。
【０３０９】
上述の同じ処理の後のＡＭＬ−１２細胞において、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のタンパク質レベルのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。Ｆｏｘｏ１、３または４のｍＲＮＡ発現に有意な変化はなんら観察されず（データは示さない）、リン酸化されたＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４の増加が観察されたこと（図６を参照）は、化合物ＣＤＥによるＡＭＬ−１２細胞におけるＦｏｘｏ３／４タンパク質発現の潜在的な増加に起因するものではない。実際に、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４タンパク質レベルの合計は、血清を含まない条件で培養されたＡＭＬ−１２細胞において、化合物ＣＤＥによって影響を受けなかった（図７Ａを参照）。
【０３１０】
それに加え、ＡＭＬ−１２細胞において、それぞれ１５０ｐｐｂの用量の化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅを試験し、同じ培養条件（血清を含む培地中）で、６時間および２４時間にわたって、Ｆｏｘｏ３／４リン酸化に対する影響を決定した。個々の化合物Ｃ、化合物Ｄまたは化合物Ｅの処理による処理後、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２およびｐＦｏｘｏ４Ｔ２８のタンパク質レベルの変化は観察されず（データは示さない）、このことは、ＡＭＬ−１２細胞においてＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のリン酸化を引き起こす、組み合わせた状態での化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅに相乗効果が存在することを示している。
【０３１１】
合わせると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、個々の化合物またはこれらの硫黄類似体とは異なり、血清を含む培地で培養したとき、ＡＭＬ−１２細胞においてＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のリン酸化を向上させる能力を有することを示す。ＦＯＸＯのリン酸化によって、これらの転写因子が核から除外されるため、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、ＡＭＬ−１２肝細胞においてＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４の不活性化剤として機能することを示唆している。
【０３１２】
ホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１（ＰＤＫ１）／タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）は、肝臓におけるインスリンが介在する糖産生の制御のためのＦＯＸＯの上流の主要なシグナル伝達経路であるため、これらの化合物で処理されたＡＭＬ−１２細胞において、リン酸化されたＰＤＫ１（ｐＰＤＫ１）およびＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のレベルに変化があるかどうかを評価した。驚くべきことに、試験した６時間の処理で、化合物ＣＤＥは、ＰＤＫ１およびＡＫＴのリン酸化または全ＡＫＴレベルに影響を与えなかった（図６Ａ）。このことは、初期の時間点（試験した６時間の試験時間が試験される前）で、ＡＭＬ−１２細胞中で起こるＰＤＫ１およびＡＫＴの活性化に対する化合物ＣＤＥの潜在的で一時的な影響に起因するものであろう。
【０３１３】
それに加え、２種類の他の下流のシグナル伝達分子である、リン酸化されたＧＳｋ３ａおよびＧＳＫ３ｂのレベルは、ＡＫＴによって直接的に制御されるが、これらのタンパク質レベルの変化は観察されなかった（図６Ａ）。インスリンによって誘発されるタンパク質合成または翻訳の鍵となるリン酸化された４ＥＢＰ１（ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達の下流の分子標的）およびｐｅｌｆ２ＢεＳ５３９（Ｇｓｋ３の下流の分子標的）も、影響を受けなかった（図６Ａを参照）。これらの結果は、化合物ＣＤＥが、すでに記載したようなＡＭＬ−１２細胞の増殖または生存に対し、毒性の影響を有していなかったというさらなる直接的な分子的証拠を与える（図１）。
【０３１４】
合わせると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、培地に血清が存在する状態で、ＡＭＬ−１２細胞において上に記載したＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４を除き、Ｇｓｋ３ａ、Ｇｓｋ３ｂ、ｐ４ＥＢＰ１およびｐＥｌｆ２ｂεＳ５３９のようなＡＫＴのいくつかの直接的または間接的な下流のシグナル伝達分子に影響を与えなかったことを示唆している。言い換えると、化合物ＣＤＥは、ＡＭＬ−１２肝細胞におけるＦＯＸＯのリン酸化を向上させることによって、ＦＯＸＯを選択的に不活性化することができる。
【０３１５】
（化合物ＣＤＥは、血清を含まない条件で培養したＡＭＬ−１２細胞におけるＦｏｘｏ３／４のリン酸化を標的とする）
すでに述べたように、ＡＭＬ−１２細胞を、明らかな形態上の欠陥を生じることなく、血清を含まない培地で短期間（すなわち、６時間）培養することができる（データは示さない）。従って、血清を含まない条件で培養したＡＭＬ−１２細胞中のリン酸化されたＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４タンパク質のタンパク質レベルを調べた。
【０３１６】
簡単に言うと、血清を含まず、ＩＴＳを含まず、Ｄｅｘを含まない培地中、ＡＭＬ−１２細胞を、コントロール（水）、化合物ＣＤＥ（それぞれの化合物のセレンが１５０ｐｐｂ）、化合物ＣＥ（それぞれの化合物のセレンが１５０ｐｐｂ）または化合物ＤＥ（それぞれの化合物のセレンが１５０ｐｐｂ）で６時間処理し、ウエスタンブロット分析および定量分析を行った。定量的なデータをＡｃｔｂタンパク質レベルによって正規化し、３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。図７Ｂおよび７Ｃの棒グラフ中の異なる文字は、これら２群間の有意差を意味する（Ｐ＜０．０５）。
【０３１７】
図７Ａに示されるように、Ｆｏｘｏ３（トレオニン３２でのｐＦｏｘｏ３）およびＦｏｘｏ４（トレオニン２８でのｐＦｏｘｏ４）のリン酸化されたタンパク質レベルは、血清を含まない培地中で６時間、化合物ＤＥではなく、化合物ＣＤＥおよび化合物ＣＥで処理した後のＡＭＬ−１２細胞において上昇していることがわかった。セレン化合物で処理した後のＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４タンパク質レベルの合計に明らかな変化はなかった（図７Ａ）。これらのタンパク質サンプルについて、いくつかの特異的なｐＦｏｘｏ１抗体を用い、ｐＦｏｘｏ１の特異的なバンドは検出されなかった（データは示さない）。
【０３１８】
定量分析は、化合物ＣＤＥで処理されたＡＭＬ−１２細胞および化合物ＣＥで処理されたＡＭＬ−１２細胞において、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２レベルが約１．８倍増加し（図７Ｂ）、ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８レベルが約６倍増加したことを示した（図７Ｃ）。ｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔ、ｐＧｓｋ３ａ、ｐＧｓｋ３ｂおよびｐ４ｅｂｐ１のような他のすべての試験した分子は、化合物ＣＤＥによって明らかな変化はなかった（図７Ａを参照）。化合物ＣＤＥによって血清を含まない条件で培養されたＡＭＬ−１２細胞から得られた上述の結果は、血清を含む培地で培養されたＡＭＬ−１２細胞からの知見（図６）と一致している。この実験では、インスリンまたはＦＢＳは、細胞の培地に添加されなかったため、ＡＭＬ−１２細胞における化合物ＣＤＥによるＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のリン酸化の向上は、ＦＢＳ、成長因子またはインスリンから完全に独立している。言い換えると、化合物ＣＤＥは、インスリンまたは成長因子を迂回して、肝細胞においてＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４を不活性化する能力を有する。
【０３１９】
要するに、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、血清を含む培地（図６）および血清を含まない培地（図７）において培養されたＡＭＬ−１２細胞において、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のリン酸化を特異的に標的とすることができることを示す。従って、これらの試験から、化合物ＣＤＥが、新規なＦＯＸＯ不活性化剤であり、化合物ＣＤＥによるこれらのＦＯＸＯ分子の不活性化が、マウス肝細胞において、インスリン、ＦＢＳおよび他の成長因子とは無関係であることを結論付けることができる。
【０３２０】
ＡＭＬ−１２肝細胞においてＦＯＸＯ４リン酸化の増加が観察されたことが、哺乳動物細胞における化合物ＣＤＥの組み合わせの一般的な効果であるかどうかを試験するため、本願発明者らは、肝臓ではないＩＭＲ−３２神経細胞株におけるｐＦＯＸＯ４レベルを調べ、ＡＭＬ−１２肝細胞と同時に、同じ実験条件で試験を行った。図８に示されるように、化合物ＣＤＥによって処理されたＩＭＲ−３２神経細胞において、ＦＯＸＯ４リン酸化の増加は観察されなかった。リン酸化されたＦＯＸＯ１およびＦＯＸＯ３のタンパク質レベルも調べ、特異的な抗体によって、リン酸化されたＦＯＸＯ３はほとんど検出されず、リン酸化されたＦＯＸＯ１は検出されなかったことがわかった（データは示さない）。これにかかわらず、化合物ＣＤＥによるＩＭＲ−３２細胞におけるＦＯＸＯ４のリン酸化の増加がみられない（図８）ことは、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、神経細胞に対してなんら毒性の影響を有していないことを示す。従って、本願発明者らは、化合物ＣＤＥによるＦＯＸＯリン酸化の向上が、肝細胞に特異的であると結論付けることができる。
【０３２１】
合わせると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、個々の化合物またはこれらの硫黄類似体とは異なり、肝細胞に特異的な新規なＦＯＸＯ不活性化剤として機能し、化合物ＣＤＥによるこれらのＦＯＸＯ分子の不活性化が、マウス肝細胞において、インスリンおよび任意の他の成長因子から独立していることを示唆している。
【０３２２】
本明細書にすでに記載したデータは、化合物ＣＤＥが、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するインスリンの作用を模倣する能力を有し、ＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現をさらに阻害するためにインスリンの作用を向上させる能力を有することを示した（図３〜４）。後者（図４）は、すでに考察したように、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現の向上にも寄与するだろう（図５）。これらすべての事象は、インスリン／成長因子／ＦＢＳから独立した化合物ＣＤＥによるＦｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４の不活性化に起因すると思われる（図６〜７）。Ｇ６ｐｃは、ヒトの肝臓においてよく知られたＦＯＸＯ標的遺伝子であり、一方、ＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒは、これらの遺伝子プロモーターの多くのＦｏｘｏ結合モチーフの存在に起因して、２つの潜在的なＦｏｘｏ３／４標的遺伝子だからである（データは示さない）。化合物ＣＤＥによるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒの発現の向上（図５）は、インスリンの作用をさらに向上させ、またはインスリン感受性を改良し、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するためのＦｏｘｏ３／４のリン酸化をさらに刺激するだろう。
【０３２３】
それにもかかわらず、これらの結果は、化合物ＣＤＥの組み合わせが、ＡＭＬ−１２肝細胞において強力なインスリンまたは他の成長因子から独立したＦＯＸＯ不活性化剤として特異的に作用し、Ｇ６ｐｃ発現を減少させ、肝臓の糖生成を減らすと思われる能力を有することを示唆している。それに加え、肝臓の糖生成を減らすようにＧ６ｐｃ発現を制御するという観点で、化合物ＣＤＥの投与は、肝細胞がインスリン抵抗性になるという生理学的結果を減らすと思われる。ＦＯＸＯが介在するＧ６ｐｃ発現の制御によって糖ホメオスタシスを制御することを可能にしつつ、化合物ＣＤＥによってインスリンを迂回してＦｏｘｏリン酸化を向上させると、一般的な糖尿病の治療のための多くの治療可能性が広がる。結果として、糖尿病治療は、外からの一方的なインスリン投与またはインスリン受容体の正しい機能発揮への依存度が低くなる。
【０３２４】
（実施例６）
（組み合わせた状態での化合物ＣＤＥは、マウス初代培養肝細胞において、細胞に対して毒性ではなく、Ｇ６ｐｃ発現および糖産生の阻害におけるインスリンの作用を改良し、インスリンを迂回して、Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１／３／４シグナル伝達を制御する）
３種類の有機セレン化合物の組み合わせ（化合物ＣＤＥ）を、糖産生、Ｇ６ｐｃ発現およびＦｏｘｏ１／３／４リン酸化に対する効果について、マウス初代培養肝細胞の細胞培養物において試験した。
【０３２５】
（材料および方法）
（マウス初代培養肝細胞の単離および化合物）
マウス初代培養肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，ＬＬＣ（リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ）から購入した。これらのマウス初代培養肝細胞を、健康な正常Ｃ５７ＢＬ６成マウスから単離し、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（ＴＲＬ）で、コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートまたは２４ウェルプレートで２４時間培養し、次いで、実験のために本願発明者の実験室に運んだ。
【０３２６】
化合物Ｃ（５’−メチルセレノアデノシン）、Ｄ（Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）およびＥ（γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン）を、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成した。試験したすべての化合物の純度は、質量分析法によって決定すると、９９％以上であると確認された。
【０３２７】
（細胞の培養および処理）
１２ウェルまたは２４ウェルのコラーゲンでコーティングされた培養プレートで成長したマウス初代培養肝細胞を、マウスから新しい肝細胞を単離してから３日目にＴｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ（ＴＲＬ）から受領し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、肝細胞維持培地（ＴＲＬ）で培養し、ＴＲＬが推奨する手順（リサーチトライアングルパーク、ＮＣ）に従って、肝細胞を８時間または一晩かけて順化させた。
【０３２８】
一晩かけて順化させた肝細胞をＰＢＳで２回洗浄し（ＴＲＬ肝細胞維持培地中の残留するＦＢＳおよび他の添加物を除去し）、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を追加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、コントロール（水）またはセレン化合物ＣＤＥ（それぞれのセレン化合物を１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂ）で２４時間かけて前処理した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血清を含まず、グルコースを含まず、２０ｍＭのラクトース（Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭのピルベート（Ｓｉｇｍａ）および１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）を追加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、インスリン（１０ｎＭまたは１００ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭの８−ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）または０．５μＭのＤｅｘ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下、同じ用量の化合物ＣＤＥ（１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂ）と共にさらに６時間インキュベートした。処理後、細胞培地を集め、グルコースアッセイおよびラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の毒性試験を行い、ＲＮＡおよびタンパク質の分析のために細胞を集めた。
【０３２９】
血清をまったく含まない培養条件で、マウス初代培養肝細胞での化合物ＣＤＥの試験のために、肝細胞維持培地（ＴＲＬ）で肝細胞を８時間かけて順化させ、ＰＢＳで２回洗浄し（培養皿の中の残留ＦＢＳおよび他の添加物を除去し）、次いで、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一晩かけて飢餓状態にした。これらの血清がなく飢餓状態になった肝細胞の一部を、血清を含まず、グルコース／フェノールレッドを含まず、２０ｍＭのラクトースおよび２ｍＭのピルベートおよび１５ｍＭのＨＥＰＥＳを追加したＤＭＥＭ培地中、インスリン（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）、０．１ｍＭの８−ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）または０．５μＭのＤｅｘ（Ｓｉｇｍａ）存在下または非存在下、コントロール（水）、セレン化合物（それぞれの化合物を１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂ）で６時間処理した。６時間の処理の後、グルコース分析およびＬＤＨ活性をモニタリングする毒性試験のために培地を集め、培養した細胞をタンパク質分析のために単離した。それに加え、無添加のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、血清がなく飢餓状態になった肝細胞の一部を化合物ＣＤＥ（それぞれの化合物を３００ｐｐｂ）で０分、５分、３０分、６０分、１２０分、１８０分処理し、種々のシグナル伝達分子の時間経過に伴うタンパク質分析のために細胞を集めた。
【０３３０】
（ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ分析）
これらの細胞からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、次いで、ＤＮａｓｅ  Ｉと共にインキュベートし、任意の潜在的な混入したゲノムＤＮＡを除去した。Ａｐｐｌｉｅｄ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキットおよびあらかじめ設計されたＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、すでに記載されたように（Ｌａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００３）、ＲＮＡサンプルにリアルタイムＰＣＲ分析を行った。それぞれの処理群において、３〜４個のサンプルを分析した。それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂ  ｍＲＮＡのレベルによってデータを正規化し、３〜４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０３３１】
（タンパク質の調製およびウエスタンブロット分析）
上述の処理の後、マウス初代培養肝細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、完全なプロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）を含む氷冷したＲＩＰＡバッファーに、氷の上で３０分間溶解した。セルスクレーパーおよび移動ピペットを用いて細胞溶解物を集め、次いで、１２０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離処理し、ＤＮＡペレットを除去し、タンパク質抽出物を得た。これらの細胞溶解物の上澄み中のタンパク質レベルを、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ）を用いて決定した。
【０３３２】
ウエスタンブロット分析のために、コントロールおよび化合物で処理した細胞からの全タンパク質５μｇにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離を行い、次いで、すでに記載されたように（Ｒｅｄｄｙ、Ｌｉｕら、２００８  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＶＤＦ膜に移した。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で膜をブロックし、特定の一次抗体と共にインキュベートし、その後、ＨＲＰに接合した抗−マウスまたは抗−ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．）と共にインキュベートした。Ａｃｔｂ（Ｌｉ−ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ）以外の全ての一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．から購入した。膜ブロットの上の陽性シグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍの改良型の化学発光Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）を用いて検出した。膜ブロットの上のこれらの発光シグナルの画像を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃ  Ｉｍａｇｅシステム（リンカーン、ネブラスカ）を用いて捕捉した。同じ膜ブロットに筋を入れ、ＧＥ  ＷＢ  ＥＣＬ−プライム−検出プロトコル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）に記載されるように、別の抗体で再びブロット処理した。ウエスタンブロットのタンパク質のバンド密度（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて決定し、次いで、それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂレベルによって正規化した。それぞれの群あたり、データを３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０３３３】
（糖産生の分析）
上述の処理から得た細胞培地を集め、３００×ｇで５分間遠心分離処理し、剥がれる可能性がある肝細胞を除去し、製造業者のプロトコルに従って、比色グルコースアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を用いたグルコース分析を行った。サンプルおよび種々の濃度のグルコース標準のＯＤ５７０ｎｍでの吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーによって決定し、グルコース標準曲線から、それぞれのサンプルの培地のグルコース濃度を得て、次いで、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ）を用い、製造業者のプロトコルに従って決定した、付着した細胞中のタンパク質レベルによって正規化した。それぞれの処理群のグルコースレベルを、コントロール群（化合物ＣＤＥ、インスリン、８−ＣＰＴおよびＤｅｘの処理を行わない）の平均値で割り、相対的なグルコースレベルを得た。データを３〜４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０３３４】
（培地中のＬＤＨレベルを調べることによる毒性試験）
上述のグルコースアッセイと同様に、上述の処理から得た細胞培地を集め、３００×ｇで５分間遠心分離処理し、剥がれる可能性がある肝細胞を除去し、製造業者のプロトコルに従って、比色グルコースアッセイキット（Ａｂｃａｍ）を用いたＬＤＨ分析を行った。簡単に言うと、ＬＤＨ標準およびＬＤＨ基質と共にインキュベートした後の培地サンプルのＯＤ４５０ｎｍでの吸光度を、２分ごとに４０分までＢｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーによって決定した。線形範囲の吸光度の中にあるＯＤ４５０の読みを引き算し、その後、ＬＤＨ標準曲線を用い、製造業者のプロトコルに従って、それぞれのサンプルの培地のＬＤＨ濃度を得た。次いで、それぞれのサンプルの培地で得られたＬＤＨレベルを、付着した細胞中のタンパク質レベルによって正規化した。それぞれの処理群のＬＤＨレベルを、コントロール群（化合物ＣＤＥ、インスリン、８−ＣＰＴおよびＤｅｘの処理を行わない）の平均値によってさらに正規化し、それぞれの群の相対的なＬＤＨレベルを得た。データを３〜４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０３３５】
（統計分析）
適用可能な場合、スチューデントのｔ検定を用い、２群間の統計差を決定した。０．０５未満のＰ値を有意であるとした。
【０３３６】
（結果および考察）
（マウス初代培養肝細胞において、組み合わせた状態での化合物ＣＤＥは、糖産生およびＧ６ｐｃ発現を阻害する）
ＡＭＬ−１２細胞において本明細書にすでに記載した試験は、化合物ＣＤＥが、Ｇ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣する能力を有する（図３〜４）が、ＡＭＬ−１２細胞の生存性に対し、なんら毒性の影響を有さないことを示す（図１）。しかし、ＡＭＬ−１２細胞によって作られる培地中のグルコースレベルは、低すぎて高感度蛍光グルコースアッセイ（Ａｂｃａｍ、データは示さない）で検出することができなかったため、化合物ＣＤＥが、ＡＭＬ−１２細胞において糖産生を制御する能力を有するかどうかを確立することはできなかった。従って、マウス初代培養肝細胞を使用し、化合物ＣＤＥが、糖産生を阻害するインスリンを模倣する能力を有するかどうかを調べ、さらに、Ｇ６ｐｃ発現に対する化合物ＣＤＥの阻害効果はあるが、ＡＭＬ−１２細胞で観察された細胞生存性に対し毒性の影響はないことを確認した。
【０３３７】
ＡＭＬ−１２細胞についての試験と同様に、血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、マウス初代培養肝細胞を、コントロール（水）または１５０ｐｐｂおよび３００ｐｐｂの用量のセレン化合物ＣＤＥで２４時間前処理した。この処理の後、インスリン（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）存在下または非存在下でのこれらのセレン化合物を用いた再処理、またはインスリンのみでの再処理を６時間行った。それに加え、コントロールで６時間かけて前処理された肝細胞の一部に細胞透過性のｃＡＭＰ、８−ＣＰＴおよびＤｅｘも加え、マウス初代培養肝細胞が、肝細胞における糖産生のよく知られている刺激に応答して機能を発揮するかどうかを検証した。上述の処理の後、グルコースアッセイおよび毒性分析（ＬＤＨレベルを測定することによる）のために細胞培地を集めた。付着した細胞についてタンパク質分析を行い、サンプル中の全細胞を反映する各ウェル中のタンパク質レベルを決定した。次いで、培地から得られたグルコースレベルを、各サンプル中のタンパク質レベルによって正規化した。データを４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。図９において、＊ビヒクル処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。図９Ｃにおいて、コントロール処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対し、すべての処理群で有意な増加はない。
【０３３８】
図９Ａに示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの処理によって、初代培養肝細胞において糖産生が有意に増加し、このことは、これらの初代培養肝細胞は、処理され、運ばれ、マウス肝臓からの最初の単離から５日間培養された後であっても生物学的に機能性であった。この知見をさらに裏付けるために、１０ｎＭおよび１００ｎＭの用量のインスリンのみを用いて処理すると、糖産生が有意に減少した（水で処理したコントロール群と比較して、約２５〜３０％の減少。図９Ａを参照）。
【０３３９】
さらに重要なことに、両用量（１５０ｐｐｂおよび３００ｐｐｂ）の化合物ＣＤＥを用いて処理すると、水で処理したコントロール群と比較して、糖産生が約２０〜８０％、有意に減少した（図９Ａを参照）。化合物ＣＤＥとインスリンを合わせて処理しても、コントロール群と比較して、試験した処理において、糖産生を約３２〜３８％、有意に阻害した（図９Ａを参照）。
【０３４０】
両試験用量の化合物ＣＤＥによる糖産生の減少の程度は、インスリン（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）に匹敵することを強調すべきであり、このことは、化合物ＣＤＥが、この試験用量で、糖産生を阻害する１００ｎＭの濃度のインスリンと同様に有効であることを示唆している。本願発明者らのデータは、インスリン、化合物ＣＤＥまたは両者によって得ることができる最大限の糖産生の減少は、これらの肝細胞で約２０〜３８％であることを示す。それにもかかわらず、本願発明者らのデータは、化合物ＣＤＥが、マウス初代培養肝細胞において糖産生を阻害するインスリンを模倣する能力を有することを示す。
【０３４１】
Ｇ６ｐｃは、肝臓における糖産生に必須である。従って、本願発明者らは、同じバッチの肝細胞において、同じ処理後にＧ６ｐｃ発現を調べた。簡単に言うと、２個１セットの初代培養肝細胞を、血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、コントロール（水）または用量が１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂのセレン化合物ＣＤＥで前処理し、その後、インスリン（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。これらの処理の後、肝細胞を集め、ＲＮＡ単離を行った後、Ｇ６ｐｃおよびＡｃｔｂのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【０３４２】
図９Ｂに示されるように、インスリンのみ、または両用量の化合物ＣＤＥ存在下で、Ｇ６ｐｃ発現を有意に阻害した。おそらくサンプル数が限定されているため、統計的に有意ではなかったが、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥも、Ｇ６ｐｃ発現を減少させた（約３１％の減少、図９Ｂ）。しかし、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみで処理した後の肝細胞において、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルの有意な減少（４２％の減少）が観察された（図９Ｂ）。これらの結果は、初代培養肝細胞においてＧ６ｐｃ発現を阻害する１００ｎＭの用量のインスリンよりわずかに有効性が低いが、化合物ＣＤＥもインスリンを模倣する能力を有することを示す。これらの知見は、ＡＭＬ−１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現の阻害（図３）および上述のマウス初代培養肝細胞における化合物ＣＤＥによって弱められた糖産生（図９Ａ）と一致している。
【０３４３】
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、肝細胞において化合物の毒性を試験するための薬物開発に広く用いられる。化合物処理による培地中のＬＤＨレベルの増加（培養した細胞中のタンパク質レベルによって正規化された後）は、この化合物が、細胞基質のＬＤＨを培地に放出する細胞の破壊または細胞膜の漏れに起因して、肝細胞にとって毒性であることを示唆している。化合物ＣＤＥがマウス初代培養肝細胞にとって毒性であるか否か、化合物ＣＤＥによる糖産生およびＧ６ｐｃ発現の観察された減少（図９Ａおよび９Ｂ）が、毒性に起因するかどうかを観察するために、上述のグルコースアッセイに記載されるような化合物ＣＤＥで処理した後のマウス初代培養肝細胞の培地中のＬＤＨレベルを調べた。
【０３４４】
簡単に言うと、マウス初代培養肝細胞を、血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、コントロール（水）または用量が１５０ｐｐｂおよび３００ｐｐｂのセレン化合物ＣＤＥで前処理し、その後、インスリン（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。次いで、細胞培地をＬＤＨの毒性分析のために集め、付着した細胞についてタンパク質分析を行い、それぞれのタンパク質レベルを決定した。培地から得られたＬＤＨレベルを、各サンプル中のタンパク質レベルによって正規化した。
【０３４５】
図９Ｃに示されるように、化合物ＣＤＥ、インスリンまたは両者で処理しても、培地中のＬＤＨレベルは有意に増加しなかった。その代わりに、ＬＤＨレベルは、インスリン存在下または非存在下のいずれかで、３００ｐｐｂの用量の化合物ＣＤＥで処理した後の肝細胞において、わずかに減少しているようであり、このことは、高用量の化合物ＣＤＥは、細胞の破壊に対する保護効果に影響を与える場合すらあることを示している。
【０３４６】
このように、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、マウス初代培養肝細胞にとって毒性ではないことを示しており、このことは、ＡＭＬ−１２細胞の生存性に対し、化合物ＣＤＥの毒性の効果がないことと一致している（図１）。それに加え、これらの結果は、上述の観察された糖産生およびＧ６ｐｃ発現の減少（図９Ａおよび９Ｂ）が、化合物ＣＤＥで処理した後のマウス初代培養肝細胞中の健康ではない肝細胞によって引き起こされる可能性も除外する。
【０３４７】
合わせて、上述の試験は、化合物ＣＤＥが、Ｇ６ｐｃ発現を阻害し、さらに重要なことに、マウス初代培養肝細胞において、細胞にとって毒性ではなく、糖産生を阻害するインスリンを模倣する能力を有することを示す。これらの結果は、Ｇ６ｐｃ発現の阻害がインスリン非依存性であること、安定なマウス肝臓ＡＭＬ−１２細胞で観察される細胞の生存に対して毒性がないこと（図１および図３）と一致している。
【０３４８】
（模擬糖尿病条件（８−ＣＰＴおよびＤｅｘ両方によって模擬実験した）でのマウス初代培養肝細胞において、化合物ＣＤＥによるこれらのプロセスにおける糖産生およびＧ６ｐｃ発現の阻害およびインスリン作用の向上）
本明細書に記載する試験は、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの刺激がある状態でＡＭＬ−１２細胞においてＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣する能力を有し、インスリンの作用を向上させることを示す（図４）。化合物ＣＤＥの効果をさらに観察するために、ｃＡＭＰおよびＤｅｘ（肝臓における糖産生およびＧ６ｐｃ発現のよく知られた２種類の刺激物質）で一緒に処理されたマウス初代培養肝細胞において、糖産生およびＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現を調べた。
【０３４９】
簡単に言うと、マウス初代培養肝細胞を、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、水（コントロール）または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせで２４時間かけて前処理し、その後、血清を含まない培地中、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、０．１ｍＭの８−ＣＰＴおよび０．５μＭのＤｅｘ存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。これらの処理の後、すでに記載したようにグルコースアッセイおよびＬＤＨアッセイのために培地を集めた。また、上に記載したのと同じ処理の後、２個１セットの初代培養肝細胞（同じバッチの肝細胞由来）に、Ｇ６ｐｃ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。データを３〜４個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。図１０Ａ〜１０Ｂにおいて、異なる文字（ａ対ｂ、ａ’対ｂ’対ｃ’、ａ”対ｂ”対ｃ”）は、これら２群間の有意差を意味する。図１０Ｃにおいて、＊ビヒクル処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【０３５０】
図１０Ａに示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理すると、コントロールのみの処理群と比較して、糖産生が有意に増加した。このデータは、培養したマウス初代培養肝細胞が正常に機能していることを示していた。８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較して、両用量のインスリンを用いた処理で８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された肝細胞における糖産生が有意に減少した（図１０Ａを参照）。重要なことに、肝細胞において、用量１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理すると、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害する傾向があった。さらに劇的に、肝細胞において、用量３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を有意に阻害し、減少した糖産生の程度は、１００ｎＭのインスリンの効果とほぼ同じであった。これらの結果は、糖尿病状態と同じ条件であっても、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥが、初代培養肝細胞において糖産生を阻害する１００ｎＭの濃度のインスリンと同様に有効であることを示唆している。これらの結果は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理しなかったマウス初代培養肝細胞で観察される知見（図９Ａ）と一致しており、このことは、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、インスリンとは独立した様式でインスリンを模倣し、糖産生を阻害することをさらに示唆している。
【０３５１】
それに加え、試験した両用量の化合物ＣＤＥと、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリンを組み合わせると、マウス初代培養肝細胞において、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較して、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生を有意に阻害するだけではなく、用量試験用量で化合物ＣＤＥのみ、またはインスリンのみよりも、このプロセスで高い有効性を示した（図１０Ａ）。例えば、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１０ｎＭのインスリンの組み合わせで処理した後の肝細胞における８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発される糖産生の減少の程度は、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１０ｎＭのインスリンのみの場合よりも顕著であった。さらに明らかなことに、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発される糖産生の阻害において、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１００ｎＭのインスリンのみも非常に有効であるが、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１００ｎＭのインスリンで処理した後の肝細胞において、糖産生がさらに減少した（コントロールで処理された細胞群のレベルより低いレベルまで減少）（図１０Ａ）。１０ｎＭのインスリンと１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせ、１００ｎＭのインスリンと１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発される糖産生をほぼ完全に阻害した（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ処理を行わないコントロール細胞のレベルに近いレベルまで減少）。これらの結果は、化合物ＣＤＥが、マウス初代培養肝細胞においてインスリンを補充するか、またはインスリンの作用を向上させ、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発される糖産生を阻害することができることを示す。
【０３５２】
すでに記載されたように、組み合わせた状態の化合物ＣＤＥが、ＡＭＬ−１２細胞において、このプロセスにおいて８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣し、インスリンの作用を向上させる能力を有することがわかった（図４を参照）。Ｇ６ｐｃ発現の阻害によって、マウス初代培養肝細胞において糖産生を阻害することができる。従って、マウス肝細胞を、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、水（コントロール）または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせで２４時間かけて前処理し、その後、血清を含まない培地中、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリン、０．１ｍＭの８−ＣＰＴおよび０．５μＭのＤｅｘ存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。これらの処理の後、細胞を集め、Ｇ６ｐｃ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【０３５３】
図１０Ｂに示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって、Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡの発現が大きく増加した（約１３０倍の増加）。これらのデータは、肝細胞が正しく機能していることをさらに確認している。両用量のインスリンを用いた処理によって、マウス初代培養肝細胞において、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較して、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生が有意に減少した（図１０Ｂの棒グラフの８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合）。上述のグルコース試験と同様に、肝細胞において、用量１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理すると、有意ではないが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けたＧ６ｐｃを阻害する傾向を示した（図１０Ｂを参照）。しかし、用量３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡ発現を有意に阻害したが、用量試験用量のインスリンほど強力ではなかった（図１０Ｂを参照）。これらの結果は、ＡＭＬ−１２細胞で得られた結果と同様に、化合物ＣＤＥが、インスリン非依存性に、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現を阻害する能力を有することを明らかに示している（図４）。
【０３５４】
３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥと、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリンを組み合わせて処理すると、肝細胞において、１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリンまたは３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの治療と比較して、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けたＧ６ｐｃ発現をさらに有意に阻害した。これらの結果を、棒グラフのａ’対ｂ’またはａ”対ｂ”によって図１０Ｂに示す。これらの結果は、インスリンと３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの組み合わせが、８−ＣＰＴ／ＤｅｘによるＧ６ｐｃの発現の上昇を阻害することにおいて、もっと効果的であったことを示す。
【０３５５】
上の試験は、化合物ＣＤＥが、特に３００ｐｐｂの用量で、インスリンより有効性は低いものの、マウス初代培養肝細胞において、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣する能力を有し、このプロセスでインスリンの作用を向上させる能力を有することを示す。これらの結果は、ＡＭＬ−１２細胞で観察された知見と部分的に一致している（図４）。Ｇ６ｐｃは糖産生に必要であるため、化合物ＣＤＥによる、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生について観察された上述の阻害（図１０Ａ）は、少なくとも部分的に、マウス初代培養肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現の下方制御に起因する（図１０Ｂ）。
【０３５６】
化合物ＣＤＥが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下で培養された初代培養肝細胞にとって毒性であるか否か、化合物ＣＤＥによる糖産生およびＧ６ｐｃ発現について観察された上述の減少（図１０Ａ〜１０Ｂ）が、肝細胞中の化合物ＣＤＥの潜在的な毒性（培地中のＬＤＨレベルの上昇によって示されるような）に起因するかどうかをさらに観察するために、上述のように処理された肝細胞の培地中のＬＤＨレベルを調べた。
【０３５７】
図１０Ｃに示されるように、インスリン非存在下または存在下での８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの処理は、ビヒクルコントロールと比較して、ＬＤＨレベルをわずかに高めた。しかし、インスリン非存在下または存在下、試験した両用量の化合物ＣＤＥと共に８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理した後の肝細胞において、ＬＤＨレベルの有意な増加はなかった（図１０Ｃを参照）。また、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘおよびインスリンで処理した後の肝細胞におけるＬＤＨレベルのわずかな増加は、試験した両用量の化合物ＣＤＥで一緒に処理することによって観察されなかった（図１０Ｃを参照）。
【０３５８】
これらの結果は、化合物ＣＤＥが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下で培養した初代培養肝細胞にとって毒性ではないことをさらに示す。また、これらの結果は、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生およびＧ６ｐｃ発現について観察された上述の減少（図１０Ａおよび１０Ｂを参照）が、化合物ＣＤＥの処理後の初代培養肝細胞中の健康ではない肝細胞によって引き起こされる可能性を除外する。
【０３５９】
まとめると、上述の試験は、糖尿病状態（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激された）と同様の条件であっても、化合物ＣＤＥが、初代培養肝細胞において毒性ではなく、糖産生およびＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンを模倣する能力を有し、これらのプロセスでのインスリンの作用を向上させる能力を有することを示す。
【０３６０】
化合物ＣＤＥによる糖産生の阻害（上述）は、血清を含む培地中、本開示の化合物で前処理されたマウス初代培養肝細胞において特性決定された。化合物ＣＤＥが、インスリン非依存性におよび他の成長因子から独立した様式で糖産生を阻害するインスリンを模倣する能力を有することをさらに確認するために、血清をまったく含まない培養条件を適用し、ＦＢＳ中の潜在的な痕跡量のインスリンまたは他の成長因子を除去した。血清を含まない条件で培養したマウス初代培養肝細胞において糖産生およびその潜在的な毒性の影響（すなわち、培地中のＬＤＨレベル）に対する化合物ＣＤＥの影響を調べた。
【０３６１】
簡単に言うと、マウス初代培養肝細胞を一晩かけ、血清がない飢餓状態にした。次いで、血清をまったく含まない培地中、インスリン、８−ＣＰＴおよびＤｅｘ存在下または非存在下、細胞をコントロール（水）または１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物で短時間（すなわち、６時間）処理した。次いで、培地を集め、グルコースとＬＤＨの分析を行い、糖産生およびＬＤＨレベルの正規化のために、培養した細胞のタンパク質分析を行った。データを３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。図１１Ａにおいて、＃基本的なコントロール群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。＊８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ処理群（グラフの１つめの棒グラフ）に対してＰ＜０．０５。
【０３６２】
８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの処理を行っていないマウス肝細胞における糖産生に対する化合物ＣＤＥの効果を観察した（図１１を参照）。図１１Ａに示されるように、両用量のインスリンのみの処理をすると、マウス初代培養肝細胞において糖産生を約４０〜４７％、有意に阻害した。これらの結果は、このバッチのマウス初代培養肝細胞が生物学的に機能することを示す。
【０３６３】
さらに重要なことに、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理すると、マウス初代培養肝細胞において、１００ｎＭのインスリンと同様に効果的に糖産生を有意に減少させ、一方、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥは、糖産生の阻害において、１００ｎＭのインスリンよりももっと有効であった（図１１Ａを参照）。これらの初代培養肝細胞において、インスリンと化合物ＣＤＥの間に相加作用または相乗作用はなかったが、化合物ＣＤＥとインスリンで一緒に処理しても、糖産生を有意に阻害した。これらの結果は、ＦＢＳを含有する培地中、化合物ＣＤＥで前処理された肝細胞から得られた結果と一致していた（図９を参照）。合わせると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、１００ｎＭの濃度のインスリンと同様に効果的であるか、またはもっと効果的なものとして、インスリン非依存性および他の因子とは独立した様式で、インスリンを模倣し、糖産生を阻害する能力を有することを明らかに示す。化合物ＣＤＥが、インスリンと同様に、比較的短期間（すなわち６時間）の処理の後のマウス初代培養肝細胞において糖産生を阻害するのに効果的であることも結論付けることができる。
【０３６４】
８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生が、血清を含まない培養条件でマウス肝細胞において阻害されるかどうかをみるためにも、化合物ＣＤＥを試験した。図１１Ａに示されるように、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理すると、基本的なコントロール群（ビヒクルで処理）と比較して、糖産生が有意に増加し、このことは、このバッチの初代培養肝細胞が生物学的に機能したことをさらに示している。１００ｎＭのインスリンで処理した後の肝細胞において、糖産生の減少傾向のみが存在したが、１０ｎＭのインスリンで処理すると、糖産生を有意に阻害した。後者の結果は、試験したサンプルの数が少なく（ｎ＝３）、あるサンプルの糖産生が、同じ群の他の２つのサンプルと比較してかなり大きかったことに起因するだろう（データは示さない）。
【０３６５】
さらに重要なことに、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理すると、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害する傾向を示し、一方、３００ｐｐｂの濃度の化合物ＣＤＥは、１０ｎＭのインスリンと同様に効果的であり、インスリン非依存性および他の成長因子から独立した様式で、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を有意に阻害した（図１１Ａ）。３００ｐｐｂの濃度の化合物ＣＤＥは、この処理のグルコースレベルは、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの刺激がない基本的なコントロール群に匹敵するものであったため、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘの刺激の影響をほぼ完全に打ち消すことを注記しておくべきである。
【０３６６】
同様に、化合物ＣＤＥとインスリンで一緒に処理しても、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を有意に阻害した（図１１Ａを参照）。それに加え、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１００ｎＭのインスリンのみよりも、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１００ｎＭのインスリンの組み合わせによって、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生をさらに顕著に減少させた。これらの結果は、このプロセスにおいて、化合物ＣＤＥとインスリンの間にさらなる作用が存在することを示した（図１１Ａ）。
【０３６７】
上述の血清を含まない培地のマウス初代培養肝細胞において、化合物ＣＤＥが、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害する効果は、血清を含む培地中、化合物ＣＤＥで前処理された肝細胞で観察された知見（図１０Ａ）と一致している。肝細胞は、血清がなく飢餓状態にあり、血清をまったく含まない培地中、化合物ＣＤＥで処理されたため、これらのデータは、化合物ＣＤＥが、少なくとも１０ｎＭのインスリンと同様に効果的に、インスリン非依存性および成長因子から独立した様式で、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害するインスリンを模倣する能力を有することを明らかに示す。インスリンの作用と同様に、これらの血清を含まないマウス初代培養肝細胞において、本明細書に記載される化合物が、迅速に作用し、比較的非常に短い期間の処理時間の後に、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害することも結論付けることができる。これらの血清を含まないマウス初代培養肝細胞において、化合物ＣＤＥとインスリンの間に、少なくとも１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１００ｎＭのインスリンとの間に、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生の阻害について、相加作用または相乗作用も存在する（図１１Ａを参照）。
【０３６８】
最後に、血清を含まない条件で培養したマウス初代培養肝細胞に対する毒性を決定するために、化合物ＣＤＥを試験した。上述の処理の後のマウス初代培養肝細胞の培地中のＬＤＨレベルを調べ、次いで、そのタンパク質レベルによって正規化した。図１１Ｂによって示されるように、水ビヒクルで処理された群を含む基本的なコントロール群（すなわち、図１１Ｂの１つめの棒グラフ）と比較したとき、上述のすべての処理の後の肝細胞中のＬＤＨレベルの有意な増加はなかった。これらの結果は、化合物ＣＤＥにさらされたときに、肝細胞において細胞の損傷または細胞膜の漏れがなかったことを示した。その代わりに、高用量の３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理した後の肝細胞において、ＬＤＨレベルの有意な減少が観察された（図１１Ｂを参照）。従って、この結果は、化合物ＣＤＥが、初代培養肝細胞に対して毒性ではなく、その代わりに、もっと高用量で、これらの細胞における細胞膜の漏れに対し、ある程度の保護効果を有し得ることを示唆している。また、これらの結果は、基本的な糖産生および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生について観察した上述の阻害（図１１Ａを参照）が、化合物ＣＤＥで処理した後のマウス初代培養肝細胞中の健康ではない肝細胞によって引き起こされる可能性も除外する。
【０３６９】
結論として、血清を含まない培養物のマウス初代培養肝細胞に関する上述の試験は、化合物ＣＤＥが、ＦＢＳとは独立して、さらに特定的には、インスリンおよび成長因子から独立した様式で、基本的な糖産生および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生の両方を阻害するインスリンを模倣する能力を有する。また、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、肝細胞に対して毒性をもたないことをさらに示唆している。
【０３７０】
（化合物ＣＤＥ：マウス初代培養肝細胞におけるＦｏｘｏ１／３／４リン酸化を向上させるためのＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達のインスリン非依存性の活性化）
ＡＭＬ−１２細胞に関する本願発明者らの以前の試験は、化合物ＣＤＥが、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４のリン酸化を向上させるインスリンを模倣する能力を有することを示唆しており、これにより糖産生のためのＧ６ｐｃ発現を阻害する（図６〜７）。インスリンが肝細胞で迅速に作用し、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達を活性化し、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４の転写因子を不活性化し、糖産生を非常に迅速に低下させることが十分に記載されている。
【０３７１】
化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣するが、インスリン非依存性に作用し、Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化し、その後に、糖産生の阻害のためのＦＯＸＯリン酸化を向上させるかどうかをさらに観察するために、糖新生の鍵となるこれらのシグナル伝達分子のリン酸化状態を、２つの異なる培養／処理条件で、マウス初代培養肝細胞において観察した。
【０３７２】
（化合物ＣＤＥは、血清を含む培地中、化合物ＣＤＥで２４時間、その後、血清を含まない培地中で６時間かけて前処理されたマウス初代培養肝細胞において、Ｆｏｘｏ１／３／４リン酸化を標的とする）
化合物ＣＤＥの組み合わせが、インスリンを模倣し、ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１／３／４シグナル伝達を制御するかどうかを決定するために、血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、マウス初代培養肝細胞をコントロール（水）または用量が１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂのセレン化合物ＣＤＥで２４時間かけて前処理した。この処理の後、血清を含まない培地中、これらのセレン化合物で６時間かけて再処理した。コントロールで前処理された肝細胞も、１００ｎＭのインスリンと共に６時間インキュベートした。これらの処理の後、図９に詳細に記載したように、グルコースおよびＬＤＨの分析のために培地を集めた。細胞を集め、タンパク質分析を行い、種々のＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１／３／４シグナル伝達分子のウエスタンブロット分析のために全タンパク質レベルを決定した。これらのシグナル伝達分子のタンパク質発現レベルを、Ａｃｔｂタンパク質レベルによって正規化し、図１２Ｂ〜Ｆに、３個のサンプルの平均±ＳＥＭとしてあらわす。図１２〜Ｆの棒グラフの異なる文字は、これら２群間の有意差を意味する（Ｐ＜０．０５）。
【０３７３】
図１２Ａに示されるように、インスリンで処理すると、セリン９でのＧｓｋ３ｂ（ｐＧｓｋ３ｂＳ９）を除き、リン酸化形態のＰｄｋ１、セリン４７３でのＡｋｔ、トレオニン２４でのＦｏｘｏ１（ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４）、トレオニン３２でのＦｏｘｏ３（ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２）、トレオニン２８でのＦｏｘｏ４（ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）が有意に増加し、一方、インスリン処理の後のこれらの細胞において、トレオニン２８でのリン酸化されたＦｏｘｏ４（ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８）のレベルは、ほとんど検出することができなかった。これらの結果は、インスリンが実際にＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を制御し、上述の実験条件でこれらの肝細胞においてＦｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３を不活性化することを示唆している。さらに重要なことに、ｐＧｓｋ３ｂＳ９を除き、ｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔＳ４７３、ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４およびｐＦｏｘｏ３Ｔ３２のタンパク質レベルは、両用量の化合物ＣＤＥの処理の後に、これらの肝細胞において目に見えて上昇した（図１２Ａ）。それに加え、ｐＦｏｘｏ４Ｔ２８レベルも、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの処理の後に、肝細胞において安定に増加した（図１２Ａ）。
【０３７４】
定量分析は、化合物ＣＤＥで処理されたマウス初代培養肝細胞において、ｐＰｄｋ１が約１．５倍の増加、ｐＡｋｔＳ４７３が２．２〜３倍の増加、ｐＦｏｘｏ１Ｔ２４が３〜４倍の増加、ｐＦｏｘｏ３Ｔ３２が約３倍の増加を示したが、ｐＧｓｋ３ｂＳ９は増加しなかった（図１２Ｂ〜Ｆ）。マウス初代培養肝細胞において、ｐＰｄｋ１およびｐＡｋｔの上昇は、化合物ＣＤＥの６時間の処理でＡＭＬ−１２細胞において観察されなかったが、化合物ＣＤＥによるｐＦｏｘｏ３Ｔ３２およびｐＦｏｘｏ４Ｔ２８の発現の向上は、ＡＭＬ−１２細胞における本願発明者らの先の観察と一致していた（図６〜７）。
【０３７５】
インスリンおよび両方の用量試験用量の化合物ＣＤＥによって引き起こされる、これらの肝細胞におけるｐＰｄｋ１およびｐＡｋｔＳ４７３のタンパク質レベルの上昇は、化合物ＣＤＥが、インスリンと同様に、Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化する能力を有することを示す。化合物ＣＤＥによるｐＡｋｔ／Ｆｏｘｏ１／３のリン酸化の上昇度は、１００ｎＭのインスリンほど強くないが、試験した両用量の化合物ＣＤＥは、１００ｎＭのインスリンと同様に効果的であり、同じ実験条件下、マウス初代培養肝細胞において糖産生を阻害した（図９Ａ）。従って、化合物ＣＤＥによるｐＦｏｘｏ１Ｔ２４およびｐＦｏｘｏ３Ｔ３２の約３〜４倍の上昇（図１２Ｄ〜Ｅ）は、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３を不活性化するのに十分であり、これらのマウス初代培養肝細胞においてＧ６ｐｃ発現および糖産生を阻害する。本願発明者らの結果は、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣し、ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化し、上述の培養条件および処理条件で、マウス初代培養肝細胞においてＦｏｘｏ１／３／４リン酸化を向上させることを明らかに示す。
【０３７６】
（血清を含まない条件で、初代培養肝細胞において、化合物ＣＤＥが迅速に作用し、順次、Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化し、Ｆｏｘｏ１／３リン酸化を向上させる）
化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣し、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を活性化し、Ｆｏｘｏ１／３リン酸化を向上させることができるかどうかをさらに観察するために、血清を含まない条件下、マウス初代培養肝細胞において、これらのシグナル伝達分子の時間経過に伴う発現試験を行った。簡単に言うと、マウス初代培養肝細胞を、一晩かけて血清のない飢餓状態にし、次いで、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、用量が３００ｐｐｂのセレン化合物ＣＤＥと共に０分、５分、３０分、１時間、２時間および３時間インキュベートした。処理後、肝細胞を集め、ウエスタンブロット分析を行った。
【０３７７】
図１３Ａ〜Ｂに示されるように、リン酸化されたＰｄｋ１のレベルは、化合物ＣＤＥを用いた処理の５分後に、これらの血清を含まない培養物の肝細胞において、増加する傾向があった。化合物ＣＤＥで３０分処理した後、これらの肝細胞において、ｐＰｄｋ１レベルが安定的に有意に増加した（図１３Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、化合物ＣＤＥが、これらの肝細胞において、ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１シグナル伝達を迅速に活性化することができることを示唆している。Ｐｄｋ１の活性化に続き、化合物ＣＤＥで３０分処理したときに肝細胞においてｐＡｋｔＴ３０８レベルが増加する傾向があり、さらに重要なことに、化合物ＣＤＥで１時間処理した後に、ｐＡｋｔＴ３０８が安定的に有意に増加した（図１３Ａ、Ｃ）。これらの結果は、化合物ＣＤＥがその後にＡｋｔを活性化させることができることを示唆している。
【０３７８】
活性化されたＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の下流の標的であるｐＦｏｘｏ１Ｔ２４およびｐＦｏｘｏ３Ｔ３２のレベルは、インキュベートの３０分前に化合物ＣＤＥによって、肝細胞において影響を受けなかった（図１３Ａ、Ｄ）。化合物ＣＤＥで１時間処理すると、肝細胞において、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３のリン酸化が増加する傾向があった（図１３Ｄ）。処理２時間および３時間の時点で、化合物ＣＤＥは、血清を含まない条件で培養したこれらのマウス初代培養肝細胞において、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３のリン酸化を有意に向上させた（図１３Ａ、Ｄ）。従って、これらの肝細胞において、化合物ＣＤＥによってＰｄｋ１およびＡｋｔが順次活性化し、その後、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３のリン酸化が向上し、これらの事象は、インスリンの作用と非常によく似た様式で、化合物ＣＤＥで処理してから２時間未満で起こる。無添加のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にインスリンまたは成長因子は存在せず、これらの実験では培地にＦＢＳを加えないことを考慮すると、これらの肝細胞における化合物ＣＤＥによるＰｄｋ１、Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３のリン酸化の向上は、ＦＢＳ、成長因子またはインスリンから独立している。言い換えると、化合物ＣＤＥは、マウス初代培養肝細胞において、インスリンまたは成長因子の作用を迂回し、ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を迅速に活性化し、その後、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３を不活性化する（Ｆｏｘｏ１／３リン酸化の向上）ことができる。
【０３７９】
（概要）
本願発明者らの試験は、化合物ＣＤＥが、マウス初代培養肝細胞において、インスリンを模倣し、肝細胞に対して毒性ではなく、インスリン非依存性に糖産生を阻害する能力を有することを示す。これらの知見は、異なる条件で培養されたマウス初代培養肝細胞での試験から明らかに確立された。第１に、糖産生は、血清を含有する培地中、化合物ＣＤＥで２４時間かけて前処理し、その後、血清を含まない培地中、これらの化合物で６時間かけて再処理することによって顕著に減少することがわかり、その有効性は、１００ｎＭの用量のインスリンに匹敵するものであった（図９Ａ）。次に、糖産生は、血清を含有する培地中、化合物ＣＤＥで２４時間かけて前処理し、その後、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ（糖尿病状態を模倣するためのグルコース産生の刺激物質）存在下、血清を含有しない培地中、これらの化合物で６時間かけて再処理することによって、マウス初代培養肝細胞において顕著に阻害されることもわかり、このプロセスにおける３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥの有効性は、１００ｎＭの濃度のインスリンに匹敵するものであった（図１０Ａ）。最後に、本願発明者らは、血清を含まない培養技術を応用し、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣し、ＦＢＳとは独立して、またはさらに特定的には、インスリンおよび成長因子から独立した様式で、短い処理期間（６時間の処理）の後、基本的な糖産生および８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害することができることを示した（図１１Ａ）。また、糖産生の阻害における化合物ＣＤＥの有効性は、少なくとも１０ｎＭの用量のインスリンに匹敵するものであった（図１１Ａ）。それに加え、化合物ＣＤＥ処理の後、培地中のＬＤＨの有意な増加はなかったため、化合物ＣＤＥを用いた処理は、上述の３つの異なる条件で培養したマウス初代培養肝細胞の健康に対する毒性の影響（例えば、細胞膜の漏れを誘引する）に対する毒性の影響を有していなかった（図９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｂ）。
【０３８０】
これらの試験で観察される糖産生の減少は、化合物ＣＤＥによるマウス初代培養肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現の阻害に少なくとも部分的に寄与する。３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥによって、肝細胞におけるＧ６ｐｃ  ｍＲＮＡレベルが有意に減少し（４２％の減少）、一方、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥで処理した後、Ｇ６ｐｃ発現が減少する傾向（統計的に有意ではないが、約３１％の減少）も、肝細胞で観察された（図９Ｂ）。８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けたマウス初代培養肝細胞でも同様の結果が得られた（図１０Ｂ）。従って、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣し、インスリン非依存性に、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘ存在下でさえ、マウス初代培養肝細胞においてＧ６ｐｃ発現を阻害することができることを明らかに示す。これらの結果は、ＡＭＬ−１２細胞で観察された知見と一致している（図３〜４）。
【０３８１】
試験した高用量の化合物ＣＤＥによるＧ６ｐｃ発現の減少の程度が、マウス初代培養肝細胞において、上述の２つの培養条件（すなわち、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘで処理するか、または処理せずに）で、インスリン（１０ｎＭ）より小さく、一方、化合物ＣＤＥは、少なくとも１０ｎＭの用量のインスリンと同様に効果的であり、基本的な糖産生および肝細胞において８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって刺激を受けた糖産生を阻害したことを注記しておくべきである（図９Ａ、１０Ａ、１１Ｂ）。従って、Ｇ６ｐｃ以外に、培養したマウス肝細胞においてグルコースレベルを下げるために、化合物ＣＤＥが他の分子を制御してもよいことも考え得る。それにもかかわらず、本願発明者らの結果は、化合物ＣＤＥによるマウス初代培養肝細胞における糖産生の阻害が、少なくとも部分的に、Ｇ６ｐｃ発現の阻害に起因するものであることを示唆している。
【０３８２】
それに加え、この結果は、化合物ＣＤＥが、模擬糖尿病状態（８−ＣＰＴ／Ｄｅｘを用いる）で、インスリンの作用を改良または補強し、マウス初代培養肝細胞における糖産生およびＧ６ｐｃ発現を阻害することができることも示す（図１０Ａ〜Ｂ、１１Ａ）。これらは、以下の観察結果によって裏付けられた。
（１）肝細胞における８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生は、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１０ｎＭのインスリンの組み合わせによって、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１０ｎＭのインスリンのみの場合よりも顕著に減少（図１０Ａ）。
（２）肝細胞における８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生は、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１００ｎＭのインスリンの組み合わせによって、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１００ｎＭのインスリンのみの場合よりもさらに減少（図１０Ａ）。
（３）血清を含まない培地中、肝細胞における８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生は、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥと１００ｎＭのインスリンの組み合わせによって、１５０ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１００ｎＭのインスリンのみの場合よりも顕著に減少（図１１Ａ）。
（４）８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現は、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥとインスリン（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）の組み合わせによって、３００ｐｐｂの化合物ＣＤＥのみ、または１０ｎＭまたは１００ｎＭのインスリンのみの場合よりも顕著に減少（図１０Ｂ）。
【０３８３】
ＡＭＬ−１２細胞においても、化合物ＣＤＥのみ、またはインスリンのみの場合よりも、化合物ＣＤＥとインスリンの組み合わせによって、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発されたＧ６ｐｃ発現の顕著な阻害が、観察された（図４）。合わせて、本願発明者らの結果は、化合物ＣＤＥが、マウス初代培養肝細胞において、８−ＣＰＴ／Ｄｅｘによって誘発された糖産生およびＧ６ｐｃ発現を阻害するインスリンの作用を改良することができることを示す。
【０３８４】
さらに、シグナル伝達分子の分析は、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣し、マウス初代培養肝細胞において、ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を迅速に活性化し、Ｆｏｘｏ１、３および４のリン酸化を向上させる能力を有することを示す。血清を含む培地中、化合物ＣＤＥで２４時間前処理し、その後、血清を含まない培地中、これらの化合物で６時間再処理された（図１２）、または血清をまったく含まない条件で５〜１８０分の短期間、これらの化合物で処理された（図１３）マウス肝細胞におけるこれらの分子のリン酸化されたタンパク質のウエスタンブロット分析は、この結論を裏付ける。
【０３８５】
ＡＭＬ−１２細胞において、本願発明者らは、Ｐｄｋ１およびＡｋｔのリン酸化の増加は、試験した期間（化合物ＣＤＥ処理から６時間後）にＡＭＬ−１２細胞で観察されなかったが、化合物ＣＤＥが、Ｆｏｘｏ３／４を標的化し、そのリン酸化を向上させる能力を有することもわかった（図６〜７）。前者の結果は、初期の時間点（６時間より前）で起こり得る化合物ＣＤＥによるＰｄｋ１／Ａｋｔの潜在的で一時的な影響に起因するものであろう。
【０３８６】
それにもかかわらず、マウス初代培養肝細胞における試験は、化合物ＣＤＥが、インスリンまたは任意の成長因子を迂回し、ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を迅速に活性化し、その後、Ｆｏｘｏ１／３／４リン酸化を向上させることを明らかに示す。ＦＯＸＯタンパク質（特に、Ｆｏｘｏ１）は、肝臓において、Ｇ６ｐｃ発現および糖産生の制御に重要であるため、化合物ＣＤＥによってマウス初代培養肝細胞において上で観察された糖産生およびＧ６ｐｃ発現の阻害は、おそらく、インスリンから独立したＰｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の活性化から生じるＦｏｘｏ１／３／４の不活性化、その後、Ｆｏｘｏ１／３／４のリン酸化の向上によって引き起こされるようである。また、上のプロセスにおけるインスリン作用の向上も、化合物ＣＤＥおよびインスリンによるＦｏｘｏ１／３／４リン酸化の向上のさらなる効果に起因するようである。
【０３８７】
簡単に言えば、本願発明者らは、マウス初代培養肝細胞において、糖産生のための糖尿病刺激物質存在下であっても、肝細胞に対して毒性がなく、インスリンの作用を迂回し、糖産生およびＧ６ｐｃ発現を阻害することができるセレン化合物の組み合わせを明らかにした。また、この化合物の組み合わせ（化合物ＣＤＥ）は、マウス初代培養肝細胞において、インスリンの作用を改良し、糖尿病刺激物質によって誘発される糖産生およびＧ６ｐｃ発現をさらに阻害することができる。さらに、この化合物の組み合わせは、インスリンを模倣するが、インスリンを迂回し、肝細胞において、ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を迅速に活性化し、その後、Ｆｏｘｏ１／３／４リン酸化を向上させることもできる。従って、この化合物の組み合わせを、強力なインスリン補充医薬としてだけではなく、Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病の治療のためのインスリンを強化する医薬として使用してもよい。組み合わせた状態での化合物ＣＤＥは、インスリンを迂回し、インスリンとは独立したＦｏｘｏ１／３／４の不活性化、Ｆｏｘｏが介在するＧ６ｐｃ発現の阻害および／または肝臓におけるこれらのプロセスにおけるインスリン作用の向上によって肝臓のグルコース生成を減らすことによって、肥満の治療に有用であり、または、肝細胞がインスリン抵抗性になるのを防ぐために投与されてもよい。
【０３８８】
（実施例７：インスリン抵抗性であり、糖尿病のレプチン受容体（Ｌｅｐｒ）の自然発生的なヌル変異マウスにおいて、化合物ＣＤＥを用いた混合処理に応答した、血流のグルコースレベルの減少および糖耐能の向上）
（材料および方法）
（化合物）
化合物Ｃ（５’−メチルセレノアデノシン）、化合物Ｄ（Ｓｅ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）および化合物Ｅ（γ−グルタミル−メチルセレノ−システイン）を、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成した。試験したすべての化合物の純度は、質量分析法によって決定すると、９９％以上であると確認された。
【０３８９】
（動物および処理）
ヘテロ接合の糖尿病の自然発生変異（レプチン受容体変異）を有するＬｅｐｒｄｂ／＋成マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン）から購入し、次いで、これを交雑受精させ、ホモ接合のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（マウス遺伝子型判定によって決定）を作成した。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのプロトコルに従って、離乳期（出産から２１日目）にマウスの尾の遺伝子型判定を行った。これらのＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、出産から２７日目に、生理的食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）または化合物ＣＤＥを腹腔内注射した。化合物ＣＤＥは、化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅを組み合わせた状態で含み（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物の５μｇのセレンは、注射あたり、それぞれのセレン化合物５ｐｐｂと等価である）、３．５月齢までは１日おきに投与し、次いで、グルコース分析および糖耐能アッセイを行った。上のように処理したマウスの体重を、毎週、秤を用いて記録し、目に見える異常な動物全体の形状および歩行挙動を毎日モニタリングした。
【０３９０】
さらに５週齢の雄Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、生理的食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）または化合物ＣＤＥを毎日腹腔内注射した。化合物ＣＤＥは、化合物Ｃ、化合物Ｄおよび化合物Ｅを組み合わせた状態で含み（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物の５μｇのセレンを滅菌生理的食塩水で希釈した）、出産から３８日目から開始し、２８日間行った。この実験は、急性糖尿病治療としてのこれらの化合物の潜在的な使用を試験するために設計された（３５日齢を超えるＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、高血糖症を患っているか、まもなく患う）。長期間にわたって注射してきた若いマウスの試験は、糖尿病前状態の被検体またはリスクがある被検体のための予防的な調製物としてより多くの化合物を評価することを意図していた。上のように処理されたマウスの体重も、毎週、秤によって記録し、目に見える異常な動物全体の形状および歩行挙動を毎日モニタリングした。
【０３９１】
（血中グルコースアッセイ）
生理的食塩水または化合物ＣＤＥの最後の注射の後、マウスを一晩絶食させた。次いで、マウスの尾の先端を切断することによってこれらのマウスからの血液の小さな液滴を集め、グルコース測定の最大能が６００ｍｇ／ｄＬのグルコメーターを用い、血中グルコースレベルを決定した。
【０３９２】
（糖耐能試験および曲線の下の面積（ＡＵＣ）の定量化）
糖耐能試験を、すでに記載されているように行った（Ｌｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２００８；４：２９−３６）。簡単に言うと、生理的食塩水または化合物ＣＤＥで処理した後、一晩絶食させたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、２グラム／体重の２０％Ｄ−グルコースを腹腔内注射した。グルコース測定の最大能が６００ｍｇ／ｄＬのグルコメーターを用い、０時点（グルコースを注射する直前）注射してから０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間の血中グルコースレベルを決定した。このため、６００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースレベルは、本願発明者らのデータ分析では６００ｍｇ／ｄＬと計測した。上のグルコース試験アッセイにおいて、それぞれのマウスの曲線より下の面積（ＡＵＣ）の定量化を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて計算した。
【０３９３】
（統計解析）
適用可能な場合、スチューデントのｔ検定を行い、０．５未満のＰ値を用い、生理的食塩水で処理された群と化合物ＣＤＥで処理された群の間の統計的有意差を決定した。図面に示された数のマウスの平均±ＳＥＭとしてデータをあらわす。
【０３９４】
（結果および考察）
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子（Ｌｅｐｒ）のすべての既知のアイソフォームが欠損している。このホモ型マウスモデルは、糖耐能不全、インスリン感受性の低下、高血糖症および高インスリン血症を伴う、急速に進行するＩＩ型糖尿病マウスモデルである。これらのマウスは、３〜４週齢で全体的に肥満状態を示し、１０〜１４日目に血漿インスリンの上昇が始まり、４〜８に高血糖症（すなわち、血中の糖濃度が高い）になる（Ｃｏｌｅｍａｎ  ＤＬ．１９７８  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １４：１４１−８）。
【０３９５】
本明細書に記載されるＡＭＬ−１２細胞およびマウス初代培養肝細胞についての試験は、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣するが、インスリンを迂回し、肝細胞においてＦｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４を不活性化する能力を有することを示す。それに加え、化合物ＣＤＥは、Ｆｏｘｏが介在するＧ６ｐｃ発現を阻害し、これらの肝細胞にとって毒性ではなく、糖産生を下げることができる（図１〜４、６〜７および９〜１３）。また、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、化合物ＣＤＥが、模擬糖尿病条件で、肝細胞においてインスリン作用を向上させ、糖産生およびＧ６ｐｃ発現を下げる能力を有することを示す（図４、１０〜１１）。従って、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスモデルは、血流のグルコースを潜在的に下げ、インスリン感受性および糖尿病に対する糖耐能の向上において、この新規化合物の組み合わせの使用を観察するのに理想的なモデルである。
【０３９６】
（高血糖症の発生前と発生後に化合物ＣＤＥを投与した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルの減少）
化合物ＣＤＥの２つの投与計画を適用し、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで表出しているような高血糖症の予防および治療における化合物ＣＤＥの潜在的な役割を観察した。本明細書に記載される化合物を観察し、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで４〜８週齢に発生する高血糖症の進行を予防する際に影響を与えるかどうかを決定した。高血糖症を発症する直前に化合物ＣＤＥを腹腔内注射することによって、マウスに治療薬を投与した。
【０３９７】
簡単に言うと、２７日齢の若年のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、マウスが３．５月齢に達するまで、化合物ＣＤＥ（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物のセレン５μｇ、それぞれのマウスへの注射あたり、それぞれの化合物５ｐｐｂと等価）または生理的食塩水を１日おきに腹腔内注射した。治療終了時に、マウスを一晩絶食させ、グルコース分析を行った。これらの試験したマウスの体重を、１日おきに秤を用いて記録し、治療期間中の体重増加に対し、これらの化合物がなんらかの影響を有するかどうかを試験した。データを、図１４の棒グラフの下に示される数のマウスの平均±ＳＥＭとしてあらわす。
【０３９８】
化合物ＣＤＥを用いた処理は、これらの変異マウスの体重増加に影響を与えないことがわかった（データは示さない）。このことは、化合物ＣＤＥが、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで表出する餌接種のための異常な食欲増加に対し、ほとんど、またはまったく、阻害効果を有さないようであることを示している。また、試験期間中、生理的食塩水で処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（コントロール）と、化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの間で、動物の全体形状および歩行挙動に目に見える差はなかった（データは示さない）。これらの結果は、化合物ＣＤＥが、用量試験用量で、動物の挙動または活動性に影響を与えなかったことを示す。
【０３９９】
しかし、化合物ＣＤＥで処理すると、コントロールと比較して、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血中のグルコースレベルが約４０％の減少であり、有意に減少した（図１４Ａを参照）が、化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルは、同じ年齢の正常な野生型マウスよりもまだ高かった（約１００ｍｇ／ｍＬ、データは示さない）。用量試験用量の化合物ＣＤＥが、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて高血糖症の発症を完全に防ぐことはなかったが、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、この重篤なＩＩ型糖尿病マウスモデルにおいて血中のグルコースレベルを有意に減少させる能力を有することを明らかに示し、このことは、化合物ＣＤＥが高血糖症を予防する可能性を示している。
【０４００】
これらの糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるグルコース生成を減らす際の化合物ＣＤＥの役割をさらに観察するために、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける高血糖症の発症後または発症中に化合物ＣＤＥを腹腔内注射する別の投与計画を適用し、これらのマウスにおける血中グルコースレベルを調べた。簡単に言うと、３８日齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理的食塩水または化合物ＣＤＥ（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物のセレン５μｇ）を毎日２８日間、腹腔内注射した。マウスの体重および異常な形態または歩行挙動を毎日記録するか、またはモニタリングした。
【０４０１】
上述の処理の後、動物を一晩絶食させ、次いで、血中グルコース分析を行った。上の動物試験と同様に、化合物ＣＤＥの処理は、処理期間中、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける体重増加、動物全体の形態および歩行挙動に影響を与えなかった（データは示さない）。しかし、化合物ＣＤＥで処理すると、生理的食塩水で処理されたマウスと比較して、これらのＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルが有意に減少した（約２５％の減少）（図１４Ｂを参照）。これらの試験は、化合物ＣＤＥが、これらの重篤なＩＩ型糖尿病マウスにおけるグルコース生成を減らす能力を有することをさらに示し、このことは、これらの化合物の高血糖症の治療への可能性を示している。
【０４０２】
まとめると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける高血糖症の発症前と発症後または発症中に、これらの化合物を腹腔内注射することによって、この変異動物におけるグルコース生成を減らす能力を有することを示す。
【０４０３】
それに加え、上述の注射計画で、これらの化合物の処理の後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける目に見える形態変化または歩行挙動の変化はなかった。実際に、正常な野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける動物の健康に対する化合物ＣＤＥの実際の効果を調べ、高用量（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物のセレン５００μｇ、データは示さない）の化合物ＣＤＥの腹腔内注射を行ってから１週間の間に異常な全体形態および歩行挙動の異常は観察されなかった。従って、化合物ＣＤＥは、これらのマウスにおいて、毒性の影響がほとんどないか、またはまったくないようである。
【０４０４】
合わせると、これらの結果は、化合物ＣＤＥが、急速に進行するＩＩ型糖尿病マウスモデルにおいて、血中グルコースレベルを有意に下げる能力を有することを示す。これらの結果は、糖尿病被検体における高血糖症の予防および治療への化合物ＣＤＥの可能性を示す。
【０４０５】
（高血糖症の発症前に化合物ＣＤＥを投与した後の糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの糖耐能の向上）
糖耐能試験は、血中の糖が高く、迅速に上昇した後（通常は食事の後）に身体がグルコースを取り扱う様式の異常さを特定する。インスリンは、肝臓における糖産生の阻害だけではなく、筋肉、肝臓および脂肪細胞でのグルコースの取り込み、保存および代謝に重要な役割を果たし、血中のグルコースレベルを下げる。
【０４０６】
糖尿病患者は、インスリンを産生することができないか、または糖ホメオスタシスを維持するのに効率的なインスリンの応答がないことに起因して、糖耐能が非常に低い。本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、化合物ＣＤＥが、インスリンを模倣するだけではなく、インスリンを迂回し、インスリン作用を向上させ、糖産生および／または肝細胞における糖産生にとって鍵となる遺伝子であるＧ６ｐｃの発現を阻害する能力を有することを示す（図２〜４、９〜１１）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、糖ホメオスタシスの維持における化合物ＣＤＥの役割を観察するために、糖耐能不全およびインスリン抵抗性がこれらの変異マウスで表出していることを考慮すると、理想的なマウスＩＩ型糖尿病モデルである。従って、２７日齢〜３．５月齢のマウスに化合物ＣＤＥを腹腔内注射した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの糖耐能の向上に対する化合物ＣＤＥの影響が観察された。
【０４０７】
上述の試験と同様に、２７日齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理的食塩水または組み合わせた状態の化合物ＣＤＥ（体重１ｋｇあたり、それぞれの化合物の５μｇのセレンは、それぞれのマウスにおいて、注射あたり、それぞれの化合物５ｐｐｂと等価である）を１日おきに、マウスが３．５月齢に達するまで腹腔内注射した。治療終了時に、マウスを一晩絶食させ、グルコース（２ｇ／体重ｋｇ）を注射し、グルコース注射から０．２５時間（１５分）、０．５時間（３０分）、１時間（６０分）、２時間（１２０分）後に血中グルコースレベルを測定した。グルコース注射直前（ゼロ時間点と呼ばれる）の血中グルコースレベルも記録した。平均±ＳＥＭ。図１５の＊は、生理的食塩水で処理された群と同じ時間点で比較して、Ｐが少なくとも＜０．０５を指すことを示す。
【０４０８】
図１５Ａに示されるように、生理的食塩水で処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、グルコース注射から０．２５時間後から開始し、以下の全ての試験時間点で、血中グルコースレベルの有意な増加が観察された。上述のように、これらの分析のために使用されるグルコメーターのグルコース測定限界は、６００ｍｇ／ｄＬであった。従って、この限界を超えるグルコースレベルは、６００ｍｇ／ｄＬと記録されなければならない。このことを述べる理由は、この測定を指摘するためであり、特に、生理的食塩水で処理された動物について、真の血中グルコース濃度が低く概算されることがよくあるだろう。
【０４０９】
化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、血中グルコースレベルは、グルコース注射前に、生理的食塩水で処理されたマウスより有意に低かった。生理的食塩水で処理されたマウスと同様に、６匹の試験された化合物ＣＤＥで処理されたマウスのうち５匹は、グルコース注射から０．５時間後および１時間後で血中グルコースレベルが６００ｍｇ／ｄＬに近いか、６００ｍｇ／ｄＬより高かった（図１５Ａを参照）。しかし、化合物ＣＤＥで処理した後の６匹の試験したすべてのＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコースレベルは、グルコース注射から２時間後に、生理的食塩水で処理されたものより有意に低かった（図１５Ａ）。
【０４１０】
図１５Ａに示される上述のグラフの曲線の下の面積（ＡＵＣ）の定量分析は、生理的食塩水で処理されたマウスと比較して、化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、グルコース注射後の試験した期間中、血中グルコースも有意に減少したことを示す（図１５Ｂを参照）。しかし、ここで再び、グルコメーターの測定限界に起因して、この減少は、図１５Ｂに示されるよりももっと劇的であったと思われる。それにもかかわらず、この減少は、有意な差であると強調しなければならない。
【０４１１】
グルコース注射から２時間後の化合物ＣＤＥで処理されたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースレベルは、グルコース注射前のグルコースレベルよりまだ高いことを注記しておく（図１５Ａを参照）。これらの結果は、化合物ＣＤＥによるＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血中の投与されたグルコースの完全な排泄は、この実験で使用される２時間のモニタリング時間より長くかかるようであることを示唆している。
【０４１２】
簡単に言うと、上述の試験は、用量試験用量の化合物ＣＤＥが、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて糖耐能を有意に向上させる能力を有することを示す。これらの化合物の作用は、肝臓および他の臓器（例えば、筋肉および脂肪組織）におけるグルコースの排泄におけるインスリン感受性の向上が介在していると思われる。
【０４１３】
（概要）
これらの結果は、最初に、化合物ＣＤＥが、急速に進行するＩＩ型糖尿病マウスモデルにおいて、空腹時のグルコースレベルを下げる（図１４）だけではなく、糖耐能も向上させる能力を有する（図１５）ことを示す。広範囲に及ぶ細胞培養研究に基づき、これらの動物における化合物ＣＤＥの作用機序は、おそらく、（１）マウス初代培養肝細胞およびＡＭＬ−１２肝細胞で示されているように、インスリンを迂回し、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３、Ｆｏｘｏ４を不活性化し、肝細胞においてＧ６ｐｃ発現および糖産生を減少させる（図２〜４、６〜７、９〜１３）；（２）これも培養した肝細胞での試験によって示されるように、肝臓において、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３、Ｆｏｘｏ４が介在するＧ６ｐｃ発現および糖産生の阻害によってインスリン感受性を向上させる（図４、１０〜１１）；および／または（３）図１５で示唆されるように、肝臓、筋肉および脂肪細胞において、インスリン作用を向上させ、またはインスリンを迂回し、グルコースの取り込みおよび／または代謝を向上させる。それに加え、インスリン感受性の向上は、マウス肝臓ＡＭＬ−１２細胞での試験によって示されるように、化合物ＣＤＥによるＩｎｓｒおよびＩｇｆ１ｒ発現の向上に起因するだろう（図５）。
【０４１４】
それにもかかわらず、本願発明者らの試験は、化合物ＣＤＥが、インスリン抵抗性の糖尿病マウスモデルにおいて、グルコース生成を阻害し、糖耐能を向上させる能力を有することを示す。これらの結果は、糖尿病患者において高血糖症およびインスリン不応症の治療のために化合物ＣＤＥを開発することができることを示唆する。その他に、リスクのある患者で高血糖症を発症する前に投与される場合、血中のグルコース生成を下げる能力によって、化合物ＣＤＥを前糖尿病状態の被検体における高血糖症の発症を予防するのに使用することもできる。それに加え、化合物ＣＤＥは、血中のグルコースレベルを下げる能力に起因して、肥満の治療にも有用であろう。
【０４１５】
本明細書で述べられる全ての刊行物および特許は、本明細書に参考として組み込まれる。本出願の記載されている方法および組成物の種々の改変および変形は、本出願の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本出願を具体的な好ましい実施形態と組み合わせて記載したが、請求されている本出願が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、関連分野の当業者に明らかである本出願を行うための上述の態様の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
2017078056.tif 000028
【図２Ａ−２Ｂ】
2017078056.tif 000029
【図３】
2017078056.tif 000030
【図４】
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【図５Ａ−５Ｂ】
2017078056.tif 000032
【図５Ｃ−５Ｄ】
2017078056.tif 000033
【図６Ａ−６Ｂ】
2017078056.tif 000034
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ−１２Ｄ】
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【図１２Ｅ−１２Ｆ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−１３Ｄ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
2017078056.tif 000051
【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【外国語明細書】
2017078056000001.pdf