(57)【要約】【課題】本発明の目的は、簡便に、少なくとも１個の塊状細胞構造体を、他の細胞構造体で包み込んだカプセル化細胞構造体を製造する方法を提供することにある。【解決手段】本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器Ｉを準備する第一の準備工程と、前記被覆細胞培養器Ｉに、細胞Ｉを播種、培養し、少なくとも１個の塊状細胞構造体を得る第一の培養工程と、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器ＩＩを準備する第二の準備工程と、前記被覆細胞培養器ＩＩに、細胞ＩＩを播種、培養し、シート状細胞構造体を得る第二の培養工程と、前記細胞ＩＩ上に少なくとも１個の前記塊状細胞構造体をのせ、前記塊状細胞構造体を前記シート状細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を得る形成工程と、を含むことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器Ｉを準備する第一の準備工程と、
前記被覆細胞培養器Ｉに、細胞Ｉを播種、培養し、少なくとも１個の塊状細胞構造体を得る第一の培養工程と、
温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器ＩＩを準備する第二の準備工程と、
前記被覆細胞培養器ＩＩに、細胞ＩＩを播種、培養し、シート状細胞構造体を得る第二の培養工程と、
前記細胞ＩＩ上に少なくとも１個の前記塊状細胞構造体をのせ、前記塊状細胞構造体を前記シート状細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を得る形成工程と、
を含むことを特徴とする、カプセル化細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記第二の準備工程において、前記温度応答性ポリマーＩＩ又は前記温度応答性ポリマー組成物ＩＩ、及び細胞接着分子で細胞培養器の培養面を被覆する、請求項１に記載のカプセル化細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記細胞Ｉが心筋細胞であり、前記細胞ＩＩが間葉系幹細胞であり、前記細胞接着分子がフィブロネクチンである、請求項２に記載のカプセル化細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
細胞Ｉからなる塊状細胞構造体の少なくとも一部を細胞ＩＩからなるシート状細胞構造体で包んでなることを特徴とする、カプセル化細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプセル化細胞構造体の製造方法、及びカプセル化細胞構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
【０００３】
再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。
【０００４】
そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術が所望されている。組織の構造を模倣した立体的構造を有する細胞構造体を形成する方法としては、例えば、細胞培養器の培養面を、特定の細胞培養用組成物で被覆した、被覆細胞培養器を用いて塊状（ペレット状）や管腔状（チューブ状）の細胞構造体を得る方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−０２７９１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法は、簡便に肉眼で視認できるほどのサイズの、塊状（ペレット状）や管腔状（チューブ状）の細胞構造体を製造することができる優れた方法である。しかしながら、従来は、単一の細胞の層からなる細胞構造体しか知られていなかった。
【０００７】
少なくとも１個の塊状細胞構造体を他の細胞で包んだカプセル化細胞構造体は、例えば、患部へ投与、移植した後、外側の細胞が生着、浸潤して第一の作用をもたらし、その後内側の塊状細胞構造体が生着して第二の作用をもたらす、複数段階での作用が期待できる。そのため、少なくとも１個の塊状細胞構造体を他の細胞で包んだカプセル化細胞構造体が求められているのが現状である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、簡便に、少なくとも１個の塊状細胞構造体を、他の細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器Ｉを準備する第一の準備工程と、上記被覆細胞培養器Ｉに、細胞Ｉを播種、培養し、少なくとも１個の塊状細胞構造体を得る第一の培養工程と、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器ＩＩを準備する第二の準備工程と、上記被覆細胞培養器ＩＩに、細胞ＩＩを播種、培養し、シート状細胞構造体を得る第二の培養工程と、上記細胞ＩＩ上に少なくとも１個の上記塊状細胞構造体をのせ、上記塊状細胞構造体を上記シート状細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を得る形成工程と、を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、上記第２の準備工程において、上記温度応答性ポリマーＩＩ又は上記温度応答性ポリマー組成物ＩＩ、及び細胞接着分子で細胞培養器の培養面を被覆することが好ましい。
【００１１】
本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、上記細胞Ｉが心筋細胞であり、上記細胞ＩＩが間葉系幹細胞であり、上記細胞接着分子がフィブロネクチンであることが好ましい。
【００１２】
また、本発明のカプセル化細胞構造体は、本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法により製造されることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のカプセル化細胞構造体は、細胞Ｉからなる塊状細胞構造体の少なくとも一部を細胞ＩＩからなるシート状細胞構造体で包んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、上記構成を有するため、簡便に、少なくとも１個の塊状細胞構造体を、他の細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態のカプセル化細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態のカプセル化細胞構造体の製造方法を説明するための写真である。（Ａ）は、細胞ＩＩ上にのせた塊状細胞構造体が包まれていく様子を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。（Ｂ）は、カプセル化細胞構造体を実体顕微鏡で撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法、及び本発明のカプセル化細胞構造体の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１７】
［カプセル化細胞構造体の製造方法］
本発明のカプセル化細胞構造体の製造方法は、少なくとも、第一の準備工程、第一の培養工程、第二の準備工程、第二の培養工程、及び形成工程を、少なくとも含む。
なお、本明細書において、「塊状細胞構造体をシート状細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体」とは、シート状細胞構造体で塊状細胞構造体が完全に包まれている以外にも、シート状細胞構造体で塊状細胞構造体の一部（例えば、塊状細胞構造体の表面積の８０％以上）が包まれている場合も含むものとする。
【００１８】
（第一の準備工程）
本発明の実施形態の製造方法において、第一の準備工程は、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器Ｉを準備する工程である。
【００１９】
上記温度応答性ポリマーＩ及び上記温度応答性ポリマー組成物Ｉとしては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。中でも、塊状細胞構造体を他の細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体が得られやすいという観点から、（Ａ）が好ましい。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
上記（Ａ）（Ｂ）の温度応答性ポリマー及び（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の詳細は、後述する。
【００２０】
温度応答性ポリマーＩとしては、上記以外に、例えば、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等も挙げられる。
【００２１】
温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉは、加熱乾燥、凍結乾燥、減圧蒸留等により水分を除去して、水、緩衝液、生理食塩水、メタノール、エタノール等アルコール、ケトン、エステル等の有機溶媒に溶解してもよい。また、有機溶媒に溶解する場合には、更に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等の非イオン性でかつ親水性である親水性分子を加えてもよい。
【００２２】
温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉとして、温度応答性ポリマーＩを含む水溶液を用いる場合、被覆細胞培養器Ｉは、例えば、温度応答性ポリマーＩを含む水溶液を、温度応答性ポリマーＩの曇点以下の温度まで冷却する冷却工程と、冷却した水溶液を細胞培養器の培養面に流延させる流延工程と、水溶液が培養面に流延された細胞培養器を、曇点超の温度まで加熱する加熱工程と、を含む方法等で製造することができる。
なお、本明細書において、「被覆細胞培養器」とは、培養面の少なくとも一部が温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された細胞培養器をいう。被覆細胞培養器は、培養面の全面が被覆されていてもよいし、培養面の一部が被覆されていてもよい。
【００２３】
上記冷却工程では、例えば、温度応答性ポリマーＩを含む水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れることによって、温度応答性ポリマーＩの曇点以下の温度まで冷却することができる。
【００２４】
上記流延工程では、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーＩを含む水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって、又はスパチュラを用いて延ばすことによって、流延させることができる。なお、細胞培養器の培養面に、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマーＩを含む水溶液を滴下し、流延せずにそのまま加熱してもよい。
【００２５】
上記細胞培養器としては、市販の細胞培養用のプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ガラス等が挙げられる。
【００２６】
上記加熱工程では、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって、温度応答性ポリマーＩの曇点超の温度まで加熱することができる。
【００２７】
被覆細胞培養器Ｉの製造方法によれば、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉを細胞培養器の表面に被覆するための特別な処理、例えば、放射線グラフト重合などを施すことを要しない。すなわち、該培養器を用いる研究者自身により、簡便な方法で（特殊な装置を要することなく）、低コストで行うことができる。
【００２８】
被覆細胞培養器Ｉによれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。
これは、温度応答性ポリマーＩが側鎖に有する疎水性基及びカチオン性基が、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えていると推定される。また、例えば、カチオン性基とアニオン性基とを有する温度応答性ポリマーＩでは、カチオン性官能基による細胞毒性が、アニオン性ポリマーのアニオン性官能基による電気的に中和により、緩和される。こうして、温度応答性ポリマーＩは、正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、温度応答性ポリマーＩの親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にしているものと推定される。被覆細胞培養器Ｉによれば、細胞の活性を高く維持した状態で、培養操作を行うことが可能となる。
被覆細胞培養器Ｉによれば、トリプシン処理等の細胞剥離操作を行うことなしに、一般的な３７℃のインキュベーター中で細胞を培養するだけで、細胞が自ら収縮して凝集し、細胞構造体を形成し、更に収縮して細胞培養面との接着力が低下して培養面から剥がれるため、細胞構造体を容易に回収することができる。
【００２９】
被覆細胞培養器Ｉは、培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーＩの量が、５〜５０ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましく、１５〜４０ｎｇ／ｍｍ2であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、塊状の細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。
【００３０】
（第一の培養工程）
本発明の実施形態の製造方法において、第一の培養工程は、被覆細胞培養器Ｉに、細胞Ｉを播種、培養し、少なくとも１個の塊状細胞構造体を得る工程である。
【００３１】
細胞Ｉとしては、例えば、血管細胞、血管間質細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、心筋細胞、腎細胞、膵β細胞、神経細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、口腔粘膜上皮細胞、毛根細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞等が挙げられる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。中でも、毛乳頭細胞、心筋細胞、膵β細胞、軟骨細胞が好ましい。
上記細胞Ｉは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
上記第一の培養工程では、例えば、複数の被覆細胞培養器Ｉに、細胞Ｉを播種、培養して、複数の塊状細胞構造体を得てもよい。複数の塊状細胞構造体は、同一種の細胞Ｉからなる塊状細胞構造体であってもよいし、異なる種類の細胞Ｉからなる塊状細胞構造体であってもよい。
【００３３】
上記第一の培養工程では、塊状の細胞構造体が得られやすいという観点から、播種される細胞Ｉの細胞密度が１０．０×１０3個／ｍｍ2未満であることが好ましい。中でも、細胞Ｉが脂肪由来血管間質細胞である場合は、０．８×１０3〜８．０×１０3個／ｍｍ2が好ましい。
中でも、塊状の細胞構造体が一層得られやすいという観点から、播種される細胞Ｉの密度が７．０×１０3個／ｍｍ2未満であり、且つ温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉに含まれる温度応答性ポリマーのカチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）が１〜２０であることが好ましい。特に、細胞Ｉが脂肪由来血管間質細胞である場合は、細胞密度が０．８×１０3〜３×１０3個／ｍｍ2であり、且つＣ／Ａ比が３〜１２であることが好ましい。また、細胞Ｉが、口腔粘膜上皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞、肝細胞の場合は、細胞密度が１２．０×１０3個／ｍｍ2未満であり、且つＣ／Ａ比が５〜１３であることが好ましい。
なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
【００３４】
細胞Ｉの播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器Ｉを、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
【００３５】
次に、播種した細胞Ｉを培養する。細胞Ｉの培養は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。細胞Ｉの培養は、塊状細胞構造体が形成されるまで続けることが好ましく、具体的には、１０〜７２時間培養することが好ましい。
【００３６】
温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマーＩを被覆した培養面に接着、培養された細胞Ｉは、自己凝集をして、塊状細胞構造体を形成する。得られた塊状細胞構造体は、そのペレット状の構造内に生存している細胞を有する。
【００３７】
上記塊状細胞構造体の大きさは、細胞ＩＩからなるシート状細胞構造体に包まれたカプセル化細胞構造体が得られるという観点から、例えば、外径が１００μｍ〜２．５ｍｍであることが好ましい。また、上記塊状細胞構造体に含まれる細胞Ｉの数は、例えば、１万個〜２５０万個であることが好ましい。
【００３８】
（第二の準備工程）
本発明の実施形態の製造方法において、第二の準備工程は、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩで、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器ＩＩを準備する工程である。細胞ＩＩと被覆細胞培養器ＩＩとの接着力が適度な範囲となることで、被覆細胞培養器ＩＩ上で培養した細胞ＩＩが自己凝集してシート状の構造体を形成し、シート状の構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして、包むように収縮し始め、均質なカプセル状構造を一層形成しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩ、及び細胞接着分子で細胞培養器の培養面を被覆することが好ましい。
【００３９】
温度応答性ポリマーＩＩ及び温度応答性ポリマー組成物ＩＩとしては、例えば、上述の温度応答性ポリマーＩ及び温度応答性ポリマー組成物Ｉと同様のものが挙げられる。中でも、操作の容易性の観点から、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉと同じ組成であることが好ましい。
【００４０】
上記細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、パールカン、ＡＤＡＭＴＳ、ニドゲン等の細胞外マトリックス構成タンパク質、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、へパリン等のプロテオグリカン、ヒアルロン酸、インテグリン、カドヘリン等が挙げられる。中でも、コスト、操作性の観点から、フィブロネクチン、ラミニンが好ましい。また、フィブロネクチンは、遺伝子組み換えによる人工合成品が普及しておらず、天然抽出品を利用するのが通常である。そのため、天然抽出物中に含まれる未知物質による予期せぬ作用や、ロットごとに結果が変わる可能性があることや、動物を犠牲にしたりするため、遺伝子組み換え品のラミニンを用いることが好ましい。
上記細胞接着分子は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
細胞ＩＩとして、間葉系幹細胞を用いる場合、上記細胞接着分子はフィブロネクチンであることが好ましい。また、細胞ＩＩとして平滑筋細胞を用いる場合、上記細胞接着分子はラミニンであることが好ましい。これらは、使用する細胞の生体内環境、基底膜を構成するマトリックスに合わせて当業者によって適宜選択されれば良い。
【００４２】
細胞培養器の培養面に被覆する、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩ、及び上記細胞接着分子を含む混合物中の、上記細胞接着分子の含有量は、被覆細胞培養器ＩＩ上で培養した細胞ＩＩが自己凝集してシート状の構造体を形成し、シート状の構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして、包むように収縮し始め、カプセル状構造を一層形成しやすくなるという観点から、例えば、０．５〜５００ｎｇ／μＬであることが好ましく、１０〜１００ｎｇ／μＬであることがより好ましい。また、８０ｎｇ／μＬ超の場合は、コストが高くなること、及び塗江ムラが生じた場合に細胞構造体が剥離せず培地中に浮遊しない可能性があること、から、４０ｎｇ／μＬ以下であることが好ましい。
【００４３】
温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩには、例えば、添加剤、細胞接着分子、水、緩衝液、生理食塩水、メタノール、エタノール等アルコール、ケトン、エステル等の有機溶媒等を加えてもよい。
【００４４】
上記被覆細胞培養器ＩＩは、例えば、温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉを、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩに変更した以外は、被覆細胞培養器Ｉと同様にして製造することができる。
上記被覆細胞培養器ＩＩは、培養面の全面が被覆されていてもよいし、培養面の一部が被覆されていてもよい。
【００４５】
被覆細胞培養器ＩＩによれば、細胞を適切な培養条件で培養することにより、シート状の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。
【００４６】
上記被覆細胞培養器ＩＩでは、培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーＩＩの量が、１〜１００ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましく、５〜２０ｎｇ／ｍｍ2であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞ＩＩが自己凝集してシート状の構造体を形成し、シート状の構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして収縮するという効果が得られやすい。
【００４７】
上記被覆細胞培養器ＩＩでは、培養面が単位面積当たりに有する細胞接着分子の量が、５〜５０００ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍｍ2であることがより好ましく、４０ｎｇ／ｍｍ2以下であることがさらに好ましい。上記範囲とすれば、細胞ＩＩが自己凝集してシート状の構造体を形成し、シート状の構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして収縮するという効果が得られやすい。
【００４８】
（第二の培養工程）
本発明の実施形態の製造方法において、上記第二の培養工程は、上記被覆細胞培養器ＩＩに、細胞ＩＩを播種、培養し、シート状細胞構造体を得る工程である。
【００４９】
上記細胞ＩＩとしては、上記細胞Ｉと同様の細胞が挙げられる。中でも、自己凝集してシート状の構造体を形成し、シート状の構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして収縮しやすいという観点から、脂肪組織由来間葉系幹細胞等の間葉系幹細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、毛母細胞が好ましく、間葉系幹細胞、毛母細胞がより好ましい。
【００５０】
上記第二の培養工程では、細胞ＩＩが端部から離れて反り返るようにして自己凝集しやすくなるという観点から、播種される細胞ＩＩの細胞密度が１．０×１０3〜１０．０×１０3個／ｍｍ2であることが好ましい。
【００５１】
細胞ＩＩの播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器ＩＩを、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
【００５２】
次に、播種した細胞ＩＩを培養する。細胞ＩＩの培養は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。播種された細胞ＩＩは、温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩによる被覆部上に接着し、シート状細胞構造体を形成する（図１（ｖｉｉ）参照）。その後、シート状細胞構造体の端部が被覆部から離れて反り返り始めて端部反り返り細胞構造体となる（図１（ｖｉｉｉ）参照）。
具体的には、細胞ＩＩは、１〜９時間培養することでシート状細胞構造体を形成し、その後１〜１５時間培養することで端部反り返り細胞構造体となる。
【００５３】
（形成工程）
本発明の実施形態の製造方法において、上記形成工程は、上記細胞ＩＩ上に少なくとも１個の上記塊状細胞構造体をのせ、上記塊状細胞構造体を上記シート状細胞構造体で包んだカプセル化細胞構造体を得る工程である。中でも、少なくとも１個の上記塊状細胞構造体は、上記シート状細胞構造体上にのせることが好ましい。
なお、本明細書において、培養面に接着した細胞が単層のシート状の構造をとった細胞構造体を「シート状細胞構造体」、シート状細胞構造体の端部が培養面から離れて反り返っている細胞構造体を「端部反り返り細胞構造体」と称する場合がある。
【００５４】
上記細胞ＩＩ上に少なくとも１個の上記塊状細胞構造体をのせるタイミング（時点）の始点としては、播種した細胞ＩＩが被覆細胞培養器ＩＩに接着した後が好ましく、例えば、細胞ＩＩの播種後３時間以降が挙げられる。また、塊状細胞構造体とシート状細胞構造体との接着性に優れるカプセル化細胞構造体が得られる観点から、播種、接着した細胞ＩＩが収縮し始める前に上記塊状細胞構造体をのせることが好ましい。
【００５５】
細胞ＩＩ上に少なくとも１個の上記塊状細胞構造体をのせた後、細胞ＩＩは反り返ることで、塊状細胞構造体を包んだカプセル化細胞構造体を形成する（図１（ｉｘ）参照）。
具体的には、細胞ＩＩは、播種後６〜２４時間培養することでカプセル化細胞構造体が形成されることが好ましい
【００５６】
本発明の実施形態の製造方法において、細胞ＩＩがシート状細胞構造体となった時点で、上記塊状細胞構造体は形成されていることが好ましい。
【００５７】
上記細胞ＩＩ上の、上記塊状細胞構造体をのせる位置としては、塊状細胞構造体が均一の厚さの細胞ＩＩで包まれやすくなるという観点から、例えば、シート状細胞構造体又は端部反り返り細胞構造体の集団の中心部分が好ましい。
【００５８】
上記細胞ＩＩ上にのせる上記塊状細胞構造体は、１個であってもよいし、２個以上であってもよい。また、上記細胞ＩＩ上にのせる上記塊状細胞構造体は、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
複数個の塊状細胞構造体を細胞ＩＩ上にのせる場合、全ての塊状細胞構造体を同時に細胞ＩＩ上にのせてもよいし、何回かに分けて細胞ＩＩ上にのせてもよい。
【００５９】
図２に、本発明の実施形態におけるカプセル化細胞構造体の製造方法における、塊状細胞構造体が包まれていく様子の一例を示す。
上記細胞ＩＩは、自己凝集して被覆細胞培養器ＩＩの培養面上にシート状細胞構造体を形成する。細胞ＩＩを更に培養すると、細胞ＩＩはさらに自己凝集をして収縮することで、シート状細胞構造体の端部が培養面から離れて反り返るようにして端部反り返り細胞構造体６が形成される。そして端部反り返り細胞構造体６上に塊状細胞構造体３をのせる（図２（Ａ）左）。さらに培養を続けると、端部反り返り細胞構造体６は上記塊状細胞構造体３を包むようにして更に反り返り（図２（Ａ）真ん中）、その後、上記塊状細胞構造体を包んだカプセル化細胞構造体７が形成される（図２（Ａ）右）。
【００６０】
本発明の実施形態のカプセル化細胞構造体の製造方法で得られるカプセル化細胞構造体は、上記塊状細胞構造体の少なくとも一部が、上記シート状細胞構造体で包まれていればよい。中でも、上記塊状細胞構造体が、上記シート状細胞構造体で完全に覆われていることが好ましい。
【００６１】
本発明の実施形態のカプセル化細胞構造体の製造方法で得られるカプセル化細胞構造体としては、例えば、以下が挙げられる。
（一）細胞Ｉとしての毛乳頭細胞からなる塊状細胞構造体が、細胞ＩＩとしての毛母細胞からなるシート状細胞構造体に包まれたカプセル化細胞構造体。この例において、塊状細胞構造体は、シート状細胞構造体に完全に被覆されておらず、塊状細胞構造体の一部が露出していることが好ましい。この例において、細胞接着分子としては、コラーゲンが好ましい。
（二）細胞Ｉとしての心筋細胞からなる塊状細胞構造体が、細胞ＩＩとしての間葉系幹細胞からなるシート状細胞構造体に包まれたカプセル化細胞構造体。この例において、細胞接着分子としては、ラミニン及び／又はフィブロネクチンが好ましい。
（三）細胞Ｉとしての膵β細胞からなる塊状細胞構造体が、細胞ＩＩとしての間葉系幹細胞からなるシート状細胞構造体に包まれたカプセル化細胞構造体。この例において、細胞接着分子としては、フィブロネクチンが好ましい。
（四）細胞Ｉとしての軟骨細胞からなる塊状細胞構造体が、細胞ＩＩとしての間葉系幹細胞からなるシート状細胞構造体に包まれたカプセル化細胞構造体。この例において、細胞接着分子としては、フィブロネクチン、コンドロイチン、コラーゲン、テネイシンおよびＡＤＡＭＴＳが好ましい。
上記（二）〜（四）の例では、細胞ＩＩとして、宿主の免疫攻撃を受けない、免疫寛容能を有する間葉系幹細胞を用いることで、カプセル化細胞構造体を移植しても免疫攻撃を受けることなく生着、浸潤することができ、さらに内側の塊状細胞構造体によって（二）心筋を修復するサイトカインの分泌、（三）インスリンの分泌、（四）宿主の血液に触れると骨に分化する、等の作用が期待できる。この例において、細胞接着分子としては、ラミニンが好ましい。
【００６２】
図１に、本発明の実施形態におけるカプセル化細胞構造体の製造方法の一例を概略図で示す。
（ｉ）温度応答性ポリマーＩ（例えば、ＰＤＭＡＥＭＡ）で、細胞培養器の培養面を被覆し、温度応答性ポリマーＩによる被覆部（１）を有する被覆細胞培養器Ｉを準備する（第一の準備工程）。
（ｉｉ）被覆細胞培養器Ｉの温度応答性ポリマーＩによる被覆部（１）上に細胞Ｉ（２）（例えば、心筋細胞）を播種し、培養する（第一の培養工程）。
（ｉｉｉ）細胞Ｉ（２）が温度応答性ポリマーＩによる被覆部（１）上に、シート状に接着する（第一の培養工程）。
（ｉｖ）更に培養を続けると、細胞Ｉ（２）が自己凝集して、塊状細胞構造体（３）を形成する（第一の培養工程）。
（ｖ）一方で、温度応答性ポリマーＩＩ（例えば、ＰＤＭＡＥＭＡ）、細胞接着分子（例えば、フィブロネクチン）で、細胞培養器の培養面を被覆し、温度応答性ポリマーＩＩによる被覆部（４）を有する被覆細胞培養器ＩＩを準備する（第二の準備工程）。
（ｖｉ）被覆細胞培養器ＩＩの温度応答性ポリマーＩＩによる被覆部（４）上に細胞ＩＩ（５）（例えば、間葉系幹細胞）を播種し、培養する（第二の培養工程）。
（ｖｉｉ）細胞ＩＩ（５）が温度応答性ポリマーＩＩによる被覆部（４）上に接着し、シート状細胞構造体（６）を形成する（第二の培養工程）。
（ｖｉｉｉ）シート状に接着した細胞ＩＩがさらに自己凝集し、端部が培養面から離れて反り返った端部反り返り細胞構造体（７）となる。端部反り返り細胞構造体（７）の中心部分に、細胞Ｉからなる塊状細胞構造体（３）をのせる。
なお、この例の場合、（ｖｉｉｉ）の端部反り返り細胞構造体（７）が形成された時点で、塊状細胞構造体（３）が得られていることが好ましい。また、細胞ＩＩが温度応答性ポリマーＩＩによる被覆部（４）上に接着した後、細胞ＩＩが凝集して端部が反り返る前に、塊状細胞構造体（３）をシート状細胞構造体（６）上にのせると、塊状細胞構造体（３）とシート状細胞構造体の接着力が強いカプセル化細胞構造体（８）を得ることができる。
（ｉｘ）細胞ＩＩ（５）が更に自己凝集をして、塊状細胞構造体（３）を包み、カプセル化細胞構造体（８）を得る（形成工程）。
【００６３】
以下、本発明の実施形態の製造方法において用いられる温度応答性ポリマー、及び温度応答性ポリマー組成物について詳述する。
温度応答性ポリマーＩ又は温度応答性ポリマー組成物Ｉ、と温度応答性ポリマーＩＩ又は温度応答性ポリマー組成物ＩＩとは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００６４】
以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００６５】
−（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法−
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００６６】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水等が挙げられる。
【００６７】
上記混合物に対する重合禁止剤の重量割合は、０．０１〜１．５％であることが好ましく、０．１〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
上記混合物に対する水の重量割合は、１．０〜５０％であることが好ましく、９．０〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。
【００６８】
次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００６９】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００７０】
反応条件に関して、温度条件としては、１５〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７〜２４時間であることが好ましく、１７〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００７１】
なお、混合物調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００７２】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００７３】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2017055744.tif 000003
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2017055744.tif 000004
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００７４】
なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。
【００７５】
−（Ａ−１）の温度応答性ポリマー−
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。
【００７６】
上記温度応答性ポリマー（Ａ−１）は、曇点を細胞培養に適当な温度付近に維持しつつ、イオンバランスを確保する観点から、上記繰り返し単位（Ａ）のホモポリマー領域と、上記繰り返し単位（Ａ）と上記繰り返し単位（Ｂ）とのコポリマー領域とを有するポリマーであることが好ましい。
上記繰り返し単位（Ａ）のホモポリマー領域と、上記繰り返し単位（Ａ）と上記繰り返し単位（Ｂ）とのコポリマー領域とを有するポリマーの製造方法は、例えば、ＤＭＡＥＭＡを光照射してポリマー化し、ポリマーの数平均分子量が一定値を超えた時点（例えば、ポリマーの数平均分子量が５，０００Ｄａ（より好ましくは２０，０００Ｄａ）を超えた時点）で、アニオン性モノマーである上記繰り返し単位（Ｂ）を混合して更に光照射する方法が挙げられる。
【００７７】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）としては、１０〜５００ｋＤａが好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００７８】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００７９】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００８０】
また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる被覆細胞培養器を調製することができる。
【００８１】
更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状、シート状、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００８２】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００８３】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００８４】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００８５】
以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００８６】
−（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法−
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００８７】
ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る上記他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。上記他のモノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル数）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。
【００８８】
第一混合物に含まれ得る上記溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。上記溶媒は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８９】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００９０】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ2であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ2であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００９１】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００９２】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【００９３】
次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【００９４】
アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。上記アニオン性モノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９５】
第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。上記他のモノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。
【００９６】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。
【００９７】
数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００Ｄａであり、更に好適には２０，０００Ｄａであり、特に好適には１００，０００Ｄａである。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。
【００９８】
この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【００９９】
そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【０１００】
この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【０１０１】
第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。
【０１０２】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【０１０３】
上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【０１０４】
なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。
【０１０５】
−（Ａ−２）の温度応答性ポリマー−
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。
【０１０６】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。
【０１０７】
（Ａ−２）のの温度応答性ポリマーでは、ＤＭＡＥＭＡ単位、アニオン性モノマー単位の温度応答性ポリマー全体に対する割合（モル）が、それぞれ、９９．９９〜９０、０．０１〜１０であることが好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡ単位、アニオン性モノマー単位、他のモノマー単位の温度応答性ポリマー全体に対する割合（モル）が、それぞれ、９９．９９〜９０、０．０１〜１０、０．０１〜１０であることが好ましい。
【０１０８】
ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【０１０９】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【０１１０】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【０１１１】
上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【０１１２】
特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【０１１３】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる被覆細胞培養器を調製することができる。
【０１１４】
更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状（ペレット状）、シート状、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【０１１５】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【０１１６】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【０１１７】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【０１１８】
以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【０１１９】
−（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法−
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。
【０１２０】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。
【０１２１】
カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
カチオン性モノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２２】
アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
アニオン性モノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２３】
他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
他のモノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。
【０１２４】
ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量のモノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜９０とすることが好ましく、０．１〜１０とすることが更に好ましく、０．９とすることが特に好ましい。
カチオン性モノマーの使用量のモノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜９０とすることが好ましく、０．１〜１０とすることが更に好ましい。
アニオン性モノマーの使用量のモノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜１０とすることが更に好ましい。
他のモノマーの使用量のモノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜１０とすることが更に好ましい。
【０１２５】
ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。
【０１２６】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【０１２７】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【０１２８】
溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。溶媒は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２９】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【０１３０】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜１００ｍＷ／ｃｍ2であることが好ましく、０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ2であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、分解などの副反応を抑制しながら効率良く重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【０１３１】
温度条件としては、１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、省エネルギーであること、温度制御が容易であること、反応が効率良く進行すること、熱反応ルートでの重合反応を抑制できることができる。
反応時間としては、１分間〜７２０時間であることが好ましく、１〜４８時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、目的の分子量まで副反応を抑制しながら効率良く重合反応を進行させることができる。
【０１３２】
この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【０１３３】
次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【０１３４】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。
【０１３５】
この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【０１３６】
そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【０１３７】
この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【０１３８】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜１００ｍＷ／ｃｍ2であることが好ましく、０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ2であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【０１３９】
温度条件としては、１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、１分間〜７２０時間であることが好ましく、１〜４８時間であることが更に好ましい。
【０１４０】
この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【０１４１】
上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【０１４２】
なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。
【０１４３】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。
【０１４４】
−（Ｂ）の温度応答性ポリマー−
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。
【０１４５】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。
【０１４６】
例えば、従来の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡはポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記従来の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。
【０１４７】
一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
【０１４８】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する、ＮＩＰＡＭ単位の割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する、他のモノマー単位の割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。
【０１４９】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【０１５０】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。
【０１５１】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【０１５２】
上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【０１５３】
特に、前述の（Ｂ）の好適な温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【０１５４】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる被覆細胞培養器を調製することができる。
【０１５５】
更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状（ペレット状）、シート状、管腔状（チューブ状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【０１５６】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【０１５７】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【０１５８】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【０１５９】
−−（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法−−
以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【０１６０】
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（組成物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する（（２）トリスは任意選択的に含む。）。
【０１６１】
（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【０１６２】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【０１６３】
ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【０１６４】
また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体等が挙げられる。
【０１６５】
上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加などにより、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【０１６６】
上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸などが挙げられる。
【０１６７】
また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【０１６８】
（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【０１６９】
なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【０１７０】
ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。
【０１７１】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、塊状の細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【０１７２】
また、上記割合（（２）／（１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【０１７３】
上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【０１７４】
ここで、温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。
【０１７５】
Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、塊状の細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
【０１７６】
上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。
【０１７７】
［カプセル化細胞構造体］
本発明のカプセル化細胞構造体は、上記カプセル化細胞構造体の製造方法により製造させることが好ましい。また、本発明のカプセル化細胞構造体は、細胞Ｉからなる塊状細胞構造体の少なくとも一部を細胞ＩＩからなるシート状細胞構造体で包んでなることが好ましい。
本発明の実施態様のカプセル化細胞構造体は、内部に少なくとも１個の塊状細胞構造体を含み、該塊状細胞構造体が細胞ＩＩによって隙間なく包み込まれた構造を有していることが好ましい。
【０１７８】
本発明の実施態様のカプセル化細胞構造体の大きさは、例えば、外径が０．０５〜２．５ｍｍであることが好ましい。
【０１７９】
本発明の実施態様のカプセル化細胞構造体は、１〜１５０万個の塊状細胞構造体を包み込んだ構造を有することが好ましい。
【０１８０】
本発明の実施態様のカプセル化細胞構造体は、例えば、壊死した患部の組織再生等を目的とした再生医療等の用途に用いることができる。
【実施例】
【０１８１】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１８２】
（実施例１）
（試験Ａ）温度応答性ポリマーＩ液の調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２１時間紫外線照射することにより、上記反応物を、溶媒を用いることなく（すなわち、ニート条件下で）、重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び、１５時間後に固化して、重合体が、反応生成物として得られた。この反応生成物を、クロロホルムに溶解させ、その後、ｎ−ヘキサンを用いて再沈殿させた。クロロホルム／ｎ−ヘキサンを用いた上記再沈殿を、計６回繰り返すことにより、反応生成物を精製した。
精製した重合体をエバポレーションすることにより、その中に残留する溶媒を除去した。その後、重合体を１５０ｍＬのベンゼンに溶解させ、ＰＴＦＥ製の０．４５μｍフィルター（ポール社製、型番：Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｋ  ２５ＣＲ）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、カチオン性の温度応答性ポリマーが得られた（収量４．３ｇ、転化率：６１．４％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０5ｇ／ｍｏｌ（ＤＭＡＥＭＡに相当する構成単位（モル）／メタクリレートに相当する構成単位（モル）＝９）と決定した。
また、このポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ2Ｏ）中で測定した。結果は下記の通りである。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 2H, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 2H, -O-CH2-)
そして、ポリマーをダルベッコＰＢＳ緩衝溶液（ギブコ社、製品コード：１４１９０１３６）に溶解して、温度応答性ポリマーＩ液（終濃度１５ｎｇ／μＬ）を調製した。
【０１８３】
（試験Ｂ）被覆細胞培養器Ｉの調製
温度応答性ポリマーＩ液を４℃まで冷却して液体状態とし、２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ2）の１ウェルの略中心部に、温度応答性ポリマーＩ液を１μＬ、室温下で滴下して、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で６時間インキュベートして被覆細胞培養器Ｉを得た。
【０１８４】
（試験Ｃ）塊状細胞構造体の調製
細胞Ｉとしての、細胞蛍光標識剤（シグマ社、ＣｅｌｌＶｕｅ  ＣＦＲＦセルリンカーキット、品番４１Ｍ０８４９）で標識した、ルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ））を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５、ＦＣＳ：インビトロゲン社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させ、細胞密度が６×１０3個／ｍｍ2にとなるように、上記被覆細胞培養器Ｉの温度応答性ポリマーＩ液が塗布されたスポットへ１μＬ滴下した。
その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で、２４時間インキュベートしたところ、塊状細胞構造体が形成された。
【０１８５】
（試験Ｄ）温度応答性ポリマーＩＩ液の調製
一方、試験Ａで調製した温度応答性ポリマーＩと、細胞接着分子としてのフィブロネクチン（シグマ社製品）をＰＢＳで希釈して、温度応答性ポリマーＩＩ液（終濃度は、温度応答性ポリマー濃度１５ｎｇ／μＬ、フィブロネクチン濃度１００ｎｇ／μＬ）を調製した。
【０１８６】
（試験Ｅ）被覆細胞培養器ＩＩの調製
温度応答性ポリマーＩＩ液を４℃まで冷却して液体状態とし、２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ2）の１ウェルの略中心部に、温度応答性ポリマーＩＩ液を６μＬ、室温下で滴下して、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で６時間インキュベートして被覆細胞培養器ＩＩを得た。
【０１８７】
（試験Ｆ）シート状細胞構造体の調製
細胞ＩＩとしてのＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ））を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５、ＦＣＳ：インビトロゲン社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させ、細胞密度が６×１０3個／ｍｍ2にとなるように、上記被覆細胞培養器ＩＩの温度応答性ポリマーＩＩ液が塗布されたスポットへ６μＬ滴下した。
その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で、３時間インキュベートしたところ、細胞ＩＩがシート状細胞構造体を形成した。
【０１８８】
（試験Ｇ）カプセル化細胞構造体の調製
上記細胞ＩＩからなるシート状細胞構造体の中心部に、上記塊状細胞構造体を１個のせ、さらに２１時間インキュベートしたところ、塊状細胞構造体が細胞ＩＩで完全に覆われた、外径が５００μｍのカプセル化細胞構造体が得られた。
【０１８９】
（実施例２）
シート状細胞構造体の中心部に、上記塊状細胞構造体を２個のせた以外は、実施例１と同様にしてカプセル化細胞構造体を得た。カプセル化細胞構造体の外径は５００μｍであった。
【０１９０】
（実施例３）
細胞Ｉとして、ビーグル犬由来の心筋細胞、細胞ＩＩとして、ビーグル犬皮下脂肪由来の間葉系幹細胞を用いた以外は、実施例１と同様にしてカプセル化細胞構造体を得た。カプセル化細胞構造体の外径は５００μｍであった。
【０１９１】
（実施例４）
温度応答性ポリマーＩＩ液のフィブロネクチン濃度を５００ｎｇ／μＬとした以外は、実施例１と同様にしてカプセル化細胞構造体を得た。
温度応答性ポリマーＩＩ液を塗布したスポット上で細胞ＩＩはシート状細胞構造体の形状を維持したまま９時間以上維持され、端部からの剥離現象は不均質に起こり、最終的には均質な真球状のカプセル化細胞構造体とならなかったものの、塊状細胞構造体がわずかに露出したカプセル化細胞構造体が得られた（外径５００μｍ）。
【０１９２】
（実施例５）
温度応答性ポリマーＩＩ液のフィブロネクチン濃度を５０ｎｇ／μＬとした以外は、実施例１と同様にしてカプセル化細胞構造体を得た。
温度応答性ポリマーＩＩ液を塗布したスポット上で細胞ＩＩはシート状細胞構造体の形状を維持したまま９時間以上維持され、端部からの剥離現象は不均質に起こり、最終的には均質な真球状のカプセル化細胞構造体とならなかったものの、塊状細胞構造体がわずかに露出したカプセル化細胞構造体が得られた（外径５００μｍ）。
【０１９３】
（実施例６）
温度応答性ポリマーＩＩ液にフィブロネクチンを加えなかった以外は、実施例１と同様の操作を行った。（試験Ｆ）において、細胞ＩＩがあまり反り返らず、得られたカプセル化細胞構造体は、塊状細胞構造体が部分的に露出した不均質なカプセル化細胞構造体となった（外径５００μｍ）。
【０１９４】
（比較例１）
実施例１と同様にして試験Ａ〜Ｃを行い、試験Ｄ、Ｅにおいて、温度応答性ポリマー液ＩＩを用いずに、２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ2）をそのまま使用した。試験Ｆで、実施例１と同様にしてルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を播種、培養したところ、細胞ＩＩは、シート状細胞構造体を形成したが、そのまま単層のシート状構造を維持し、端部が培養面から離れず、カプセル化細胞構造体が得られなかった。
【０１９５】
［評価］
（外観）
実施例及び比較例で得られたカプセル化細胞構造体を蛍光顕微鏡（オリンパス社、ＩＸ−７１）で観察し、以下の基準で外観の評価を行った。
◎（優れる）：全ての塊状細胞構造体が、細胞ＩＩのシート状細胞構造体で完全に覆われていた。また、カプセル化細胞構造体全体に亘って細胞ＩＩがほぼ均一の厚さに分布していた。
○（良好）：塊状細胞構造体が、細胞ＩＩのシート状細胞構造体で覆われていたが、わずかに塊状細胞構造体が露出しており、細胞ＩＩの厚さが不均質なカプセル化細胞構造体が見られた。なお、塊状細胞構造体の露出面積は、塊状細胞構造体の全表面積に対して、５％未満であった。
△（普通）：塊状細胞構造体が、細胞ＩＩのシート状細胞構造体で覆われていたが、部分的に塊状細胞構造体が露出しており、細胞ＩＩの厚さが不均質なカプセル化細胞構造体が見られた。なお、塊状細胞構造体の露出面積は、塊状細胞構造体の全表面積に対して、５％以上２０％以下であった。
×（不良）：細胞ＩＩが塊状細胞構造体を包むように自己凝集せず、カプセル化細胞構造体を形成できなかった。
【０１９６】
（カプセル化細胞構造体の外径）
実施例及び比較例で得られたカプセル化細胞構造体を蛍光顕微鏡（オリンパス社、ＩＸ−７１）で観察し、最大の外径（μｍ）を測定し、カプセル化細胞構造体の外径（μｍ）とした。
【０１９７】
【表１】
2017055744.tif 000005
【０１９８】
実施例１〜６のカプセル化細胞構造体を、他の細胞培養器に播種したところ、細胞Ｉ及び細胞ＩＩは培養面上に拡散、増殖し、カプセル化細胞構造体内の細胞は生きていることを確認した。
【符号の説明】
【０１９９】
１  温度応答性ポリマーＩによる被覆部
２  細胞Ｉ
３  塊状細胞構造体
４  温度応答性ポリマーＩＩによる被覆部
５  細胞ＩＩ
６  シート状細胞構造体
７  端部反り返り細胞構造体
８  カプセル化細胞構造体
【図１】
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【図２】
2017055744.tif 000007