(57)【要約】【課題】簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無を評価できる抗酸菌症のバイオマーカーを提供する。【解決手段】本発明の抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーは、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であることを特徴とする。本発明の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体は、表面上に、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプローブが少なくとも一つ固定されたことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であることを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカー。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列からなるｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
前記抗酸菌症が非結核性抗酸菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ；ＮＴＭ）症である、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
被検者における抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無を評価するための方法であって、
被検者の試料中の請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオマーカーの濃度を測定する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記被検者が、抗酸菌症を有する疑いがある、又は抗酸菌に感染している疑いがある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
表面に、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプローブが少なくとも一つ固定されたことを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体。
【請求項７】
配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’ 末端側の部分配列と相補的な塩基配列を含む逆転写プライマーと、
配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡ及び前記逆転写プライマーを用いた逆転写反応で得られる逆転写産物を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーと、
配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の少なくとも３塩基と同一の塩基配列を含む、標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キット。
【請求項８】
前記逆転写プライマーが、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の部分配列と相補的な塩基配列に加えて、ループ構造を形成し得る塩基配列を含む、請求項７に記載の抗酸菌症又は抗酸菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的に問題となる抗酸菌症としては、例えば、結核症、ハンセン病、非結核性抗酸菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＮＴＭ）症等が挙げられる。結核症、ハンセン病は、治癒可能な感染症となったが、ＮＴＭ症は、未だ病態が不明であり、有効な治療法も確立されていない。２０１４年度厚生労働省全国調査によると、ＮＴＭ症の推定罹患率は１４．７人／１０万人で、新登録結核年換算罹患率の１２．９人／１０万人を越え、今後、難治性感染症としてＮＴＭ症はさらに問題になっていくと考えられる。
【０００３】
ＮＴＭ症において、肺Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＡＣ）症は、日本におけるＮＴＭ症の約９０％を占めている。原因菌であるＭＡＣは、水や土壌等の生活環境中に偏在するが、ヒトからヒトへは感染せず、発症者に喫煙歴及び基礎疾患のない中高年女性が多いという非常に特徴的な傾向があること以外に、感染成立に至る機序についてはほとんど解明されていない。治療方法としては、例えば、多剤併用抗菌化学療法等が行なわれるが、治療開始時期、治療期間、治療終了時期を判断する基準がないため、再発又は再燃を繰り返す症例が多い。また、長期間無治療で経過観察が可能な症例もあれば、急激に病状が悪化し治療抵抗性で死に至る症例もある。しかし現時点では、肺ＭＡＣ症の疾患活動性を評価するバイオマーカーはなく、そのため、肺ＭＡＣ症の疾患活動性の評価、予後の予測は極めて困難である。
【０００４】
近年、様々な疾患のバイオマーカーとして注目されているのがｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは２１〜２５ｂｐのノンコーディングＲＮＡで、翻訳抑制、ｍＲＮＡ分解、脱アデニル化等様々な方法で遺伝子発現の下方制御を行なうことが知られている。２００２年に初めて疾患との関連が示唆されて以降、特に腫瘍領域で研究が進み、ｍｉＲＮＡが発ガンの指標として利用しうる可能性が示された。２００７年には、エキソソーム内にｍｉＲＮＡやｍＲＮＡが存在し、エキソソームがｍｉＲＮＡの細胞間輸送に利用されている可能性が報告された。さらに、２００８年には病変組織から血中に放出された腫瘍特異的 ｍｉＲＮＡを測定することによって具体的にバイオマーカー利用への可能性が示唆され、侵襲性の少ない検査法への応用としてさらにｍｉＲＮＡに注目が集まっている。
【０００５】
特許文献１には、患者における肺疾患を特徴づけるための血清バイオマーカーまたは血漿バイオマーカーとして使用することができるｍｉＲＮＡが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１３−５０２９３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載のｍｉＲＮＡは、肺腫瘍又は肺病変のマーカーとして使用できることについて開示されているが、抗酸菌症のバイオマーカーとして使用可能なｍｉＲＮＡは開示されていない。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無を評価できる抗酸菌症のバイオマーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、抗酸菌症患者の血清中において高発現しているｍｉＲＮＡの存在に着目し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の一態様は、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であることを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーである。
【００１１】
また、本発明の一態様は、表面に、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプローブが少なくとも一つ固定化されたことを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体である。
【００１２】
また、本発明の一態様は、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の部分配列と相補的な塩基配列を含む逆転写プライマーと、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡ及び前記逆転写プライマーを用いた逆転写反応で得られる逆転写産物を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーと、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の少なくとも３塩基と同一の塩基配列を含む、標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のバイオマーカーによれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）〜（Ｅ）実施例１におけるＭＡＣ症患者及び健常者の血清中の各ｍｉＲＮＡの濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図２】実施例２における結核患者及び健常者の血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４６濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図３】実施例３におけるＭＡＣ感染及び未感染のマクロファージの細胞上清中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４６濃度を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜＜抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカー＞＞
一実施形態として、本発明は、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーを提供する。
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、抗酸菌症患者の血清中において高発現しているｍｉＲＮＡの存在に着目し、中でもｍｉＲ−３４６が抗酸菌症に深く関与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーによれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価をすることができる。
【００１８】
通常、「抗酸菌症」とは、グラム陽性桿菌である結核菌を含むマイコバクテリウム属に属する細菌が原因で発症する感染症のことを意味する。抗酸菌症としては、例えば、結核症、ハンセン病、非結核性抗酸菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＮＴＭ）症等が挙げられる。さらに、ＮＴＭ症としては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ（マイコバクテリウム・アビウム）とＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（マイコバクテリウム・イントラセルラーエ）の２菌種を区別しないＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ（マイコバクテリウム・アビウム・コンプレックス、ＭＡＣ）症、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ（マイコバクテリウム・カンサシ）による感染症等が挙げられ、この３菌種でＮＴＭ症の９１％以上を占めている。
【００１９】
＜ｍｉＲＮＡ＞
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染のバイオマーカーは、ヒトから採取した試料（例えば、血液、唾液、涙液、汗、尿等の生体試料も含む。）中で、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡであり、該ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することによって、抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価に使用することができる。
【００２０】
通常、「ｍｉＲＮＡ」とは、成熟ｍｉＲＮＡと呼ばれているものを意味する。成熟ｍｉＲＮＡは、ゲノム上にコードされた内在性の２０〜２５塩基程度の非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ、以下、「Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ぶ。）として転写され、次にプロセッシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、さらにプロセッシングを受けて２０〜２５塩基程度の二本鎖成熟ｍｉＲＮＡとなる。二本鎖成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちの一本鎖がＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。
【００２１】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、配列番号１（５’−ＵＧＵＣＵＧＣＣＣＧＣＡＵＧＣＣＵＧＣＣＵＣＵ−３’）で表される塩基配列と８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡである。本実施形態におけるｍｉＲＮＡの一例は、配列番号１で表される塩基配列と１００％の同一性を有するｍｉＲＮＡである。すなわち、本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３４６である。
配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡには、配列番号１で表される塩基配列において、１又は２の塩基が付加、置換又は欠失した塩基配列からなるｍｉＲＮＡも含まれる。
【００２２】
＜＜被検者における抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無を評価するための方法＞＞
一実施形態として、本発明は、被検者における抗酸菌症の疾患活動性を評価するための方法であって、被検者の試料中の上述のバイオマーカーの濃度を測定する工程を備える、方法を提供する。
【００２３】
本実施形態の評価方法によれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無の評価することができる。さらに、評価結果に基づいて、抗酸菌症の治療方針を明確に決定することができる。
【００２４】
通常、「疾患活動性」とは、病気の進行度や症状、患者の機能障害の程度などを総合して表す際に用いられる用語である。本明細書においては、特に抗酸菌症の進行度、感染の有無や度合、症状の度合等を意味する。また、本明細書における疾患活動性の評価は、抗酸菌症の予後の予測も包含する。
【００２５】
＜測定工程＞
以下に、本実施形態の評価方法について、詳細に述べる。
まず、被検者から採取した試料中の上述のバイオマーカーの濃度を測定する。被検者から採取する試料としては、上述の＜ｍｉＲＮＡ＞と同様のものが挙げられる。例えば、血液試料を用いることができる。血液試料としては、例えば、血液、血清、血漿等が挙げられる。また、被検者としては、すでに抗酸菌症を発症している患者に限らず、抗酸菌症を有する疑いがある、抗酸菌症を発症する危険性がある者（例えば、以前、抗酸菌症を発症し、完治したと診断された者等）、又は抗酸菌に感染している疑いのある者も含む。
試料中に含まれるｍｉＲＮＡは、当業者に周知の方法を用いて、あるいは市販のｍｉＲＮＡのキットを用いて、抽出及び精製することができる。そして、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えばマイクロアレイや、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定することができる。
【００２６】
次に、測定したｍｉＲＮＡの発現レベルを健常者のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する。健常者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルは、あらかじめ測定することもできるが、被検者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同時に測定することもできる。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えば、マイクロアレイを用いる場合はトータルＲＮＡを揃えて標準化したり、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合は内在性コントロールに基づき標準化したりすることにより、比較することができる。内在性コントロールとしては、例えば、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ等を用いることができる。ここで、健常者とは、抗酸菌に感染していない者のことであって、被検者と同一の性別であってもよい。調べる健常者は、複数人とすることができる。被検者と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルは、範囲で表されてもよい。被検者と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルの範囲は、例えば、各健常者に対する複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。健常者の発現レベルが範囲で表されている時、その上限より高い場合を、健常者の発現レベルより高いと判断し、下限より低い場合を、健常者の発現レベルより低いと判断する。
【００２７】
測定工程において、被検者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、健常者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した結果、被検者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、健常者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い場合は、前記被検者が抗酸菌症である、又は抗酸菌に感染している可能性が高いと判断することができる。逆に、被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、健常者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同じか、より低い場合は、前記被検者が抗酸菌症でない、又は抗酸菌に感染していない可能性が高いと判断することができる。
【００２８】
また、測定工程において、被検者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、予め決めた特定の数値と比較して、被検者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、その数値より高い場合には、前記被検者が抗酸菌症である、又は抗酸菌に感染している可能性が高く、その数値より低い場合には、前記被検者が抗酸菌症でない、又は抗酸菌に感染していない可能性が高いと判断してもよい。この数値は、複数の抗酸菌症患者及び健常者から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定してその分布を調べることにより、当業者が適宜決定することができる。
【００２９】
本実施形態の評価方法において、既存の評価方法と組み合わせて抗酸菌症の疾患活動性を評価してもよい。
【００３０】
＜＜抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体＞＞
一実施形態として、本発明は、表面に、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプローブが少なくとも一つ固定化されている、抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体を提供する。
【００３１】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体は、マイクロアレイを用いた方法により上述のｍｉＲＮＡを測定する場合に用いることができる。本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体によれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価をすることができる。
【００３２】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体に用いられるプローブは、上述のｍｉＲＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。プローブが、上述のｍｉＲＮＡの一部と相補的な塩基配列である場合、該ｍｉＲＮＡを特異的に捕捉できる限り、該ｍｉＲＮＡの全長に対する「一部」の長さ（例えば、塩基数）は特に限定されず、例えば、該ｍｉＲＮＡの全長の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上とすることができる。プローブは、ｍｉＲＮＡを高精度に検出する観点から、ｍｉＲＮＡと相補的ではない配列をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
通常、「ポリヌクレオチド」とは、複数個のヌクレオシドがリン酸等の連結部を介して相互に結合した構成を有するものを意味し、通常は、複数個のヌクレオチドが相互に結合した構成を有するものを意味し、構成しているヌクレオシドの数は特に限定されない。したがって、例えば、１０個以下のヌクレオシド又はヌクレオチドが結合した構成を有するもののように、通常「オリゴヌクレオチド」と称されるものも、本明細書においては「ポリヌクレオチド」と称する。
【００３４】
本実施形態におけるプローブは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイゼーションするために、分子的な自由度が必要であることから、固相担体と結合する末端にスペーサーを有していてもよい。
【００３５】
スペーサーの長さ（例えば、塩基数を意味する。）としては、特に限定されないが、例えば３〜５０塩基であってよく、例えば５〜２５塩基であってよい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。かかる場合には、スペーサーに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
【００３６】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体を用いて行う検出に用いられるｍｉＲＮＡを含む試料としては、特に限定されないが、例えば、上述の＜＜被検者における抗酸菌症の疾患活動性又は抗酸菌感染の有無を評価するための方法＞＞に用いる場合には、上述の＜測定工程＞で挙げたものと同様のもの等が挙げられる。
【００３７】
また、試料中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、サンプルから抽出された全ＲＮＡから分画により濃縮したｍｉＲＮＡを試料として用いてもよく、分画操作をしていないものを試料として用いてもよい。
【００３８】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体の一態様として、抗酸菌症検出基板が挙げられる。抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用基板に用いられる、プローブを固定する基板としては、例えば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。プローブを基板上に固定する方法としては、例えば、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法等が挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板上でプローブを合成してもよい。
スポッティングによりプローブを固定する場合には、プローブに固相結合部位を設け、基板に固相結合部位認識部位を設けておくことができる。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、プローブを例えば、アミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板を例えば、アミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組み合わせや、金−チオール結合を利用した組合せ等が挙げられる。
また、スポッティングによりプローブを固定する他の方法としては、例えば、シラノール基を有するプローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法等も挙げられる。
【００３９】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体の他の態様として、例えば、金属製、ガラス製、又は樹脂製ビーズや、各種メンブレン等が挙げられ、これらの固相担体には、公知の方法でプローブを固定することができる。
【００４０】
本実施形態におけるプローブを構成するポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得るものであればよく、特別な限定はない。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであってもよく、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
【００４１】
本明細書において、「ハイブリダイズし得る」とは、ｍｉＲＮＡの少なくとも一部がプローブにハイブリダイズし、相補的に複合体を形成することを意味する。また、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件等が挙げられ、より具体的には、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃〜１０℃程高い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件等が挙げられる。
【００４２】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体を用いる場合、ｍｉＲＮＡを検出するために、固相担体に固定化されているプローブ（以下、「固定化プローブ」と呼ぶ場合もある。）の他に、検出プローブを用いてもよい。検出プローブを用いる場合は、固定化プローブは、ｍｉＲＮＡと相補的な配列に加えて、ｍｉＲＮＡと相補的ではない塩基配列であって、検出プローブとハイブリダイズし得る配列を有していてもよい。検出プローブは標識物質により標識することができる。検出プローブにおける標識物質の配置は、ｍｉＲＮＡと隣接する端には結合していなければよく、特に制限されない。
【００４３】
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
【００４４】
上述したように、全ＲＮＡに含まれる、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、ｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、標識した検出プローブを用いる場合は、高感度に、ごく微量のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【００４５】
さらに、固定化プローブが標識物質により標識されていてもよい。この場合、固定化プローブを標識する標識物質と検出プローブを標識する標識物質との組合せは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ   Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こり得ない組合せであっても、ＦＲＥＴが起こり得る組合せでもあってもよい。
ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、固定化プローブの固相担体に近い末端をＦＡＭで標識し、検出プローブの固相担体から最も遠い部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
一方、検出プローブが固定化プローブに連結された場合と固相担体に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、例えば、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組合せ等が挙げられる。
【００４６】
＜＜抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キット＞＞
一実施形態として、本発明は、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’ 末端側の部分配列と相補的な塩基配列を含む逆転写プライマーと、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡ及び前記逆転写プライマーを用いた逆転写反応で得られる逆転写産物を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーと、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の少なくとも３塩基と同一の塩基配列を含む、標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、を備えることを特徴とする抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キットを提供する。
【００４７】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キットは定量ＲＴ−ＰＣＲ法により上述のｍｉＲＮＡを測定する場合に用いることができる。本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キットによれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価をすることができる。
【００４８】
本実施形態における逆転写プライマーは、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’ 末端側の部分配列と相補的な塩基配列を含む。３’末端側の部分配列は、例えば、標的ｍｉＲＮＡの３’末端から１個、２個、３個、４個、又は５個の塩基の配列とすることができる。前記塩基配列が標的であるｍｉＲＮＡにアニーリングすることにより、逆転写酵素により伸長反応を進めて、ｃＤＮＡを合成することができる。
【００４９】
本実施形態における逆転写プライマーは、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’ 末端側の部分配列と相補的な塩基配列に加えて、さらに、ループ構造を形成し得る塩基配列を含んでいてもよい。本実施形態における逆転写プライマーがループ構造を有する場合、逆転写プライマーと、逆転写酵素により合成されたｃＤＮＡとが連結されたポリヌクレオチドを逆転写産物として得ることができ、後に続くリアルタイムＰＣＲ反応の際に、逆転写プライマーのループ構造部分の塩基配列に対して特異的なリバースプライマーを使用することにより、より特異性を高く、ｍｉＲＮＡを検出することができる。
【００５０】
本実施形態におけるフォワードプライマーは、前記逆転写プライマーにより得られた逆転写産物のうち、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなるｍｉＲＮＡに由来するｃＤＮＡの３’末端領域の塩基配列に対して特異的な配列とすることができる。また、本実施形態におけるリバースプライマーは逆転写プライマーの５’末端領域の塩基配列に対して特異的な配列とすることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーが上記配列を有することにより、リアルタイムＰＣＲ反応において、逆転写産物をより特異的に増幅することができる。
【００５１】
本実施形態における標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列の３’末端側の少なくとも３塩基と同一の塩基配列を含む。前記塩基配列を含むことにより、プローブは逆転写産物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。本実施形態における標識されたプローブとしては、例えば、５’末端にクエンチャーが、３’末端に標識物質が結合しているものを用いることができる。５’末端にクエンチャー、３’末端に標識物質を備えることにより、リアルタイムＰＣＲ反応のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の際に、ポリメラーゼの持つ５’−３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性により、逆転写産物にハイブリダイズしたプローブが分解され、クエンチャーによる抑制が解除されて標識物質を検出することができる。
【００５２】
プローブの３’末端に結合した標識物質としては、上述の＜＜抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体＞＞の検出プローブの標識物質と同様のものが挙げられ、例えば、蛍光色素とすることができる。プローブの３’末端に結合した標識物質が蛍光色素である場合、プローブの３’末端に結合した標識物質とプローブの５’末端に結合したクエンチャーとの組み合わせとしては、上述の＜＜抗酸菌症又は抗酸菌感染検出用固相担体＞＞の検出プローブ及び固定化プローブのＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せ等が挙げられる。
【００５３】
本実施形態の抗酸菌症又は抗酸菌感染検出キットは、使用する核酸増幅方法によって異なるが、この他に、基質としてのヌクレオチド三リン酸、核酸合成酵素、増幅反応用緩衝液の１つ以上を含んでいてもよい。ヌクレオチド三リン酸は、核酸合成酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ等）である。核酸合成酵素は、使用する核酸増幅方法に応じた酵素であり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等が挙げられる。増幅反応用緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、ｐＨは特に限定されない。
【００５４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
（１）検体の選定
診断が確定した無治療肺ＭＡＣ症の女性患者（患者群：ＭＡＣ）及び女性健常者（健常者群：ＣＯＮ）を各１６名選定し、両群間で統計学的な差がなく、年齢及びＢＭＩがマッチしていることを確認した。
【００５６】
（２）血清からのｍｉＲＮＡの抽出
（１）で選定したＭＡＣ群及びＣＯＮ群から採血し、血清を得た。得られた血清から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｐｌａｓｍａ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を用いて、ｍｉＲＮＡを抽出した。外部コントロールとして、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９（１００ｆｍｏｌ）を添加した。３００μＬの血清から３５μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで溶出したｍｉＲＮＡ抽出液を得た。
【００５７】
（３）ｃＤＮＡの合成
（２）で得られたｍｉＲＮＡ抽出液を用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。具体的な反応条件としては、総量１５μＬ中に３μＬのｍｉＲＮＡ抽出液、１×ステムループ逆転写プライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に含まれている）、３．３３Ｕ／μＬの逆転写酵素、０．２５Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１×反応バッファーを含む反応液を調製し、サーマルサイクラ―Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、１６℃で３０分、４２℃で３０分、８５℃で５分の反応を行った。
【００５８】
（４）リアルタイムＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４６の定量を行った。具体的には、１．３３μＬの（３）で得られた逆転写反応液に、１μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（２０×フォワードプライマー、２０×リバースプライマー及び２０×プローブ含有）、１０μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ（ＵＮＧ含有）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加えて、総量２０μＬの定量反応液を調製した。続いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、５０℃で２分、９５℃で１０分の加熱後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の反応を４５サイクル行い、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。各反応は２重測定で行った。各測定毎に、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）を用いた検量線作成用の測定を行い、また実験間のばらつきを補正するために、外部コントロールとして添加したｃｅｌ−ｍｉＲ−３９量と、血清中の発現量が一定であるとされている内在性ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ量の測定も同時に行った。結果を図１（Ａ）〜（Ｅ）に示す。図１（Ａ）〜（Ｅ）では、事前に行った網羅的解析により抗酸菌症のバイオマーカーの候補として挙がった５種類のｍｉＲＮＡの血清中濃度を示している。
【００５９】
図１（Ａ）〜（Ｅ）から、５種類のｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４６の血清中の濃度が健常者群に比べて、患者群で統計学的に有意に高い（ｐ＜０．０５）ことが明らかとなった。
【００６０】
［実施例２］
（１）検体の選定
診断が確定した無治療結核症患者（患者群：ＴＢ）及び健常者（健常者群：ＣＯＮ）を各１０名選定し、両群間で統計学的な差がなく、年齢及びＢＭＩがマッチしていることを確認した。
【００６１】
（２）血清からのｍｉＲＮＡの抽出
（１）で選定したＴＢ群及びＣＯＮ群から採血し、血清を得た。得られた血清から、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、ｍｉＲＮＡ抽出液を得た。
【００６２】
（３）ｃＤＮＡの合成
（２）で得られたｍｉＲＮＡ抽出液を用いて、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
【００６３】
（４）リアルタイムＰＣＲ
１．３３μＬの（３）で得られた逆転写反応液を用いて、実施例１の（４）と同様の方法で、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４６の定量を行った。結果を図２に示す。
【００６４】
図２から、血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４６濃度が健常者群に比べて、ＴＢ群で統計学的に有意に高い（ｐ＜０．００１５）ことが明らかとなった。
【００６５】
［実施例３］
（１）細胞の培養
ヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）由来のマクロファージを、６ウェルプレートにコンフルエントになるように培養した。培地としては、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉａ（ＩＭＤＭ）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いた。
【００６６】
（２）ＭＡＣの感染
（１）で培養したマクロファージに、ＭＡＣ１０４を多重感染度  ５０で感染させ、３７℃で４時間培養した。コントロールとして、感染させていない細胞も準備した。
【００６７】
（３）ｍｉＲＮＡの定量
続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩＭＤＭ培地（血清不含）６００μＬに置き換えて、３７℃で培養した。２４時間後の細胞上清３００μＬ中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４６の定量を行った。定量方法は、実施例１の（２）〜（４）と同様の方法を用いて、ｍｉＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成及びリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図３に示す。
【００６８】
図３から、血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４６濃度がＭＡＣ未感染のマクロファージに比べて、ＭＡＣ感染のマクロファージで統計学的に有意に高いことが明らかとなった。
【００６９】
以上の結果から、ｍｉＲ−３４６が抗酸菌症のバイオマーカーとして有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のバイオマーカーによれば、簡便且つ正確に抗酸菌症の疾患活動性の評価又は抗酸菌感染の有無の評価をすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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