(57)【要約】【課題】電子顕微鏡での高倍率観察が可能な試料を作製でき、その作製の工程も簡略化され、極めて短時間で試料作製ができる方法を提供すること。【解決手段】ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を有効成分と含有する電子顕微鏡用導電性コーティング剤、及び試料にポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を有効成分として含有する電子顕微鏡用導電性コーティング剤を適用する工程を含む、電子顕微鏡用試料の作製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を有効成分として含有する、電子顕微鏡用導電性コーティング剤。
【請求項２】
試料に、ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を有効成分として含有する電子顕微鏡用導電性コーティング剤を適用する工程を含む、電子顕微鏡用試料の作製方法。
【請求項３】
前記コーティング剤を濾過する工程を更に含む、請求項２に記載の試料の作製方法。
【請求項４】
ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を有効成分として含有する電子顕微鏡用導電性コーティング剤で作製された、電子顕微鏡用試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡用導電性コーティング剤に関する。更に詳細には、走査型電子顕微鏡用又は透過型電子顕微鏡用の導電性コーティング剤、電子顕微鏡用試料の作製方法、及び電子顕微鏡用試料に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型電子顕微鏡は、鏡体内が高真空であるため、水分を含む生物試料等を三次元的に直接観察することができない。そこで、試料を固定し、脱水、乾燥、蒸着して試料作製することが必要となる。
【０００３】
電子顕微鏡の試料の作製において、近年、イオン液体が用いられ始めた。イオン液体は、真空下で蒸発しないというという特性がある。そこで、その特性を生かして、走査型電子顕微鏡の試料の作製に応用されている。
【０００４】
イオン液体を電子顕微鏡用試料に適用した例として、特許文献１が挙げられる。特許文献１によれば、イオン液体を用いると、チャージアップにより試料の像を正確に観察することができないという従来の走査型電子顕微鏡の問題点を防止できる、としている。
【０００５】
また、イオン液体が適用される以前は、水分が含まれる生体試料等の場合、水分を完全に蒸発させ、生体試料を乾燥させなければならないため、生体の本来有するありのままの形状等を観察することができない、という問題があった。この問題に対しても、特許文献１によれば、イオン液体に生体試料を浸漬し、真空下に置いて水分を除去すれば、生体試料が収縮せずに、生体試料のありのままの形状を観察することができる、としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開2007/83756パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、試料にイオン液体を適用すると、試料表面にイオン液体の残渣が付着することが多々ある。この残渣は、試料本来の観察面を覆い、試料観察の障害になり、また試料によっては高倍率の観察においてコンタミネーションをおこし、高倍率での観察に限界があった。例えば、血液細胞では、倍率を2000〜3000倍程度までしか上げることができなかった。
【０００８】
従来の走査型電子顕微鏡用試料の作製には、試料の切り出し、固定、脱水、乾燥、蒸着工程を経るため、合計８時間以上も時間を費やさなければならなかった。
細胞の微細構造保存のために必要である固定工程の後の、脱水工程、乾燥工程、金属蒸着工程を省くことができれば、試料作製の時間短縮のみならず、試料本来の形態に近いであろう像の観察が可能となる。
【０００９】
本発明の主目的は、電子顕微鏡用試料の作製工程が簡略化され、極めて短時間で試料を作製でき、かつ試料の高倍率観察を可能とするコーティング剤、及びそれを用いた試料作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の導電性ポリマーを電子顕微鏡用試料コーティング剤として用いると、電子顕微鏡を高倍率にしても安定してきれいな像を得ることができ、かつ、簡便に短時間で試料を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）を含有する、電子顕微鏡用導電性コーティング剤を提供する。
また、本発明は、試料に前記電子顕微鏡用導電性コーティング剤を適用する工程を含む、電子顕微鏡用試料の作製方法を提供する。
更に、本発明は、前記電子顕微鏡用導電性コーティング剤で作製された電子顕微鏡用試料を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、電子顕微鏡用試料を短時間で簡便に作製することができ、高倍率で試料本来の形態に近い状態で観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】従来の電子顕微鏡用試料の作製方法と本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法のフローを示す図である。
【図２】従来の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された赤血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図３】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された赤血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図４】従来の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された白血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図５】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された白血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図６】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された赤血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図７】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製された白血球の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図８】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図９】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１０】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１１】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１２】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１３】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１４】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１５】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット肝臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１６】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１７】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１８】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図１９】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２０】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２１】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２２】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２３】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２４】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２５】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２６】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２７】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたラット腎臓の電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２８】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたカラーコンタクトレンズの電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図２９】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたカラーコンタクトレンズの電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図３０】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたカラーコンタクトレンズの電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図３１】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたカラーコンタクトレンズの電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【図３２】本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法で作製されたカラーコンタクトレンズの電子顕微鏡像の図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜電子顕微鏡用導電性コーティング剤＞
１．主成分
本発明の電子顕微鏡用導電性コーティング剤の主成分は、ポリ（２，３−ジヒドロチエノ−１，４−ジオキシン）−ポリ（スチレンスルホナート）である。当該化合物は、３，４−エチレンジオキシチオフェンのポリマー（以下、PEDOTと記載することがある。）とスチレンスルホン酸のポリマー（以下、PSSと記載することがある）とを共存させた、ポリマーコンプレックスである(以下、当該ポリマーコンプレックスをPEDOT/PSSと記載することがある)。
【００１５】
PEDOT/PSSは、元来、インクジェット、グラビア印刷、スクリーン印刷等のコーティング、ポリマーの永久帯電防止や液晶偏光板のプロテクトテープ等のコーティング、タッチパネルや太陽電池等の高導電性コーティング、EL材料等の分野や、ITO代替材料として使用されていたものである。
【００１６】
本発明は、PEDOT/PSSを、電子顕微鏡の試料作製に初めて適用したものである。PEDOT/PSSを試料作製に適用すると、予想外にも、脱水工程、乾燥工程、蒸着工程を省略でき、試料作製時間を大幅に（約５時間）短縮できるという効果をもたらす。また、試料本来の形態に近い像を得ることができる。
【００１７】
PEDOT/PSSは水に分散可能であり、分散液の状態で市販されている。例えば、Heraeus社からClevios（登録商標）シリーズ、Sigma-Aldrich社からOrgacon（登録商標）シリーズ等が入手可能である。
【００１８】
例えば、CleviosシリーズのClevios FE-Tの物理的及び化学的性質は、以下のとおりである。
密度（約20℃）：1g/cm3(calc.)
有機溶剤含有量：<1%
水：85〜95％
固形物含有量：<5％
導電率：250S/cm
水と完全に混合可能。
また、Clevios FEの物理的及び化学的性質は、Clevios FE-Tとほぼ同じだが、導電率は150S/cmである。
【００１９】
２．その他の成分
本発明の電子顕微鏡用導電性コーティング剤には、その他の成分として、例えば、エタンジオール、ポリエステルレジン、ジエトキシ（３−グリシジルオキシプロピル）メチルシラン、タンニン、プロパン−１−オール及び２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物を更に含有してもよい。熱安定性や紫外線に対する安定性、透過性、低抵抗性等を高めることができる。
【００２０】
＜電子顕微鏡用試料の作製方法＞
１．材料
本発明の電子顕微鏡用試料となる材料は、特に限定されず、微生物、植物、動物、これらの組織又は細胞、高分子化合物等の工業製品など、様々なものが対象となる。
また、材料に水分を含んでもよい。水分を含んだ試料として、例えば、生体組織（肝臓、腎臓等）、生体細胞（赤血球、白血球等）、高含水物質（ソフトコンタクトレンズ等）が挙げられる。
【００２１】
２．試料作製方法
まず、試料となる材料を固定する。固定方法及び固定液は、一般的に知られており、材料によって適切なものを選択すればよい。
例えば、動物組織であれば、前固定及び後固定の2段階で行ってもよい。前固定液は、例えば2〜3%グルタールアルデヒド溶液（pH7.2〜7.4、例えば0.1Mリン酸緩衝液で希釈）、あるいは2〜3%グルタールアルデヒドと1.5〜2%パラホルムアルデヒドの混合液、後固定液は1%四酸化オスミウムが一般的に使用される。
【００２２】
動物組織を、76カミソリ（登録商標、フェザー安全剃刀株式会社製）にて厚さ0.5mm幅に切り出し、前固定液に一晩固定する。取り出したのち1時間ほど洗浄する。洗浄液は、例えば、リン酸緩衝液を用いればよい。洗浄後、動物組織を後固定液に入れ、例えば1時間〜1.5時間固定する。
なお、前固定は、灌流固定でもよい。
後固定終了後は、蒸留水で洗浄する。
【００２３】
次に、試料を前記導電性コーティング剤に浸漬する。浸漬後は、試料の脱水工程、乾燥工程等を行わなくてよい。
導電性コーティング剤の濃度は、試料によって変えることができる。例えば、導電性コーティング剤の異なる希釈倍率の溶液を準備し、適切な濃度と浸漬時間をあらかじめ検討しておく。導電性コーティング剤は、例えば、数%〜数十%の濃度にして使用する。希釈液は、エタノール等を用いればよい。
【００２４】
導電性コーティング剤は、原液を試料作製直前に希釈することが好ましい。濃度を調整した導電性コーティング剤は、濾過することが更に好ましい。フィルターは、導電性コーティング剤中の残渣等を除去できれば特に限定されないが、例えば、0.45μmのフィルターで濾過すればよい。濾過により、コンタミネーションが生じることを防ぐことができる。
【００２５】
試料は、適切な濃度の導電性コーティング剤に適切な時間に浸漬後、取り出し、例えば室温でブロアーや冷風ドライヤー等を用いて導電性コーティング剤を乾かす。試料は、直ちに電子顕微鏡で観察することができる。
【００２６】
図１に、従来の電子顕微鏡用試料の作製方法と本発明の電子顕微鏡用試料の作製方法のフローを示す。本発明の作製方法は、従来の作製方法と比較して、工程が省略され、作製時間も短縮される。
【００２７】
＜電子顕微鏡用試料＞
本発明の電子顕微鏡用導電性コーティング剤で作製されている電子顕微鏡用試料は、固定後、前記導電性コーティング剤で浸漬又は被覆された試料である。従って、材料にもよるが、作製した試料を一定期間保存することができる。
【実施例１】
【００２８】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２９】
１．血液（血球）の観察
１−１．血液（血球）の試料作製
ヒトの血液を採取し、遠心分離した。血漿を除去し、Buffy coatの各層（白血球層、赤血球層）をパスツールピペットで静かに試験管に採取した。
1%グルタールアルデヒド固定液（0.12molリン酸緩衝液、pH7.4）を10mlずつ試験管2本に用意し、室温にて、それぞれの固定液の中にパスツールピペットで血球を1滴滴下し、浮遊液にした。
【００３０】
浮遊液をPLLコート付きスライドガラスに置き、室温で３０分間静置した。蒸留水で洗浄した後、0.45μmのフィルターで濾過した10%導電性コーティング剤（希釈溶液：100%エタノール）に10分間浸漬した。
ピンセットでスライドガラスを挟み、ブロアーで導電性コーティング剤を乾かした後、カーボン両面テープを貼った電子顕微鏡の試料台に載台後、冷風ドライヤーで乾かした。
【００３１】
１−２．電子顕微鏡による観察・撮影
電界放出型走査電子顕微鏡（日立S-4800）を用いた。なお、あらかじめ、加速電圧、エミッション電流、SE検出器等の撮影条件を検討し、加速電圧：3kV、エミッション電流：5.5uA、SE検出器：Upperの条件とした。
比較例として、従来の試料作製方法で作製した電子顕微鏡用試料も撮影した。従来の試料作製方法は、以下のとおりである：
1%グルタールアルデヒド固定液にて固定した後、蒸留水で軽く洗浄し、エタノール上昇系列にて脱水を行い、最終的に100％エタノールに移行させ、細胞の水分を除き、完全エタノールに置き換える。
液化CO2を用いた臨界点乾燥を行う。
試料台にマウントし、オスミウム蒸着にて金属コーティングを行う。
【００３２】
１−３．結果
図２に従来の試料作製方法による赤血球の電顕像（倍率：×10.0k）、図３に本発明の導電性コーティング剤による赤血球の電顕像（×10.0k）、図４に従来の試料作製方法による白血球の電顕像（×7.00k）、図５に本発明の導電性コーティング剤による電顕像（×7.00k）を示す。
図２及び図４は、画像上に白く浮いたライン等が観察され、チャージアップ現象がみられた。一方、図３及び図５は、チャージアップ現象がみられなかった。
また、図６に本発明の導電性コーティング剤による赤血球の、倍率がより高い電顕像（×20.0k）を、図７に本発明の導電性コーティング剤による白血球の、倍率がより高い電顕像（×20.0k）を示す。
【実施例２】
【００３３】
２．ラット肝臓の観察
２−１．ラット肝臓の試料作製
ラットの肝臓を2%グルタールアルデヒドで灌流固定し、0.12molリン酸緩衝液で１時間洗浄した。次に、1%四酸化オスミウム（OsO4）で2時間固定後、蒸留水で洗浄した。
【００３４】
毛細胆管観察用試料は、実施例１と同様にして濾過した5%導電性コーティング剤（希釈溶液；30%エタノール）に2時間浸漬した。
類洞観察用試料は、実施例１と同様にして濾過した5%導電性コーティング剤（希釈溶液；70％エタノール）に1時間浸漬した。
浸漬後は、実施例１と同様にして導電性コーティング剤を乾かし、試料を作製した。
【００３５】
２−２．電子顕微鏡による観察・撮影
加速電圧：1.5〜3kV、エミッション電流：4.7〜10uA、SE検出器：Mixとし、実施例１と同様にして試料を撮影した。
【００３６】
２−３．結果
図８〜図１１に、本発明の導電性コーティング剤による毛細胆管観察用試料の電顕像を示す。図８は×2.00k、図９は×5.00k、図１０は×7.00k、図１１は×30.0kである。
また、図１２〜図１５に、本発明の導電性コーティング剤による類洞観察用試料の電顕像を示す。図１２は×4.00k、図１３は×8.00k、図１４は×10.0k、図１５は×12.0kである。
【００３７】
図８〜図１５に示されるように、チャージアップ等がなく、高倍率で細部まで観察可能な電顕像が得られた。また、試料作製時に脱水工程や乾燥工程等を省くことができるので、脱水剤による収縮や乾燥の影響を受けない、試料本来の形態であろう像の観察ができた。
以上のことから、導電性コーティング剤に使用する希釈溶液の濃度と浸漬時間を変えることで、毛細胆管や類洞の内皮細胞表面の有窓構造等、同一組織で目的とする部位の詳細観察も可能であることがわかった。
【実施例３】
【００３８】
３．ラット腎臓の観察
３−１．ラット腎臓の試料作製
ラットの腎臓を実施例２と同様にして、灌流固定、洗浄、四酸化オスミウム固定、洗浄を行った。
糸球体観察用試料、尿細管観察用試料ともに、5%導電性コーティング剤（希釈溶液：70%エタノール）に1時間浸漬した他は、実施例２と同様にして試料を作製した。
【００３９】
３−２．電子顕微鏡による観察・撮影
糸球体観察用試料、尿細管観察用試料ともに、加速電圧：1〜1.5kV、エミッション電流：4.7uA、SE検出器：Mixとし、実施例１と同様にして試料を撮影した。
【００４０】
３−３．結果
図１６〜図２３に、本発明の導電性コーティング剤による糸球体観察用試料の電顕像を示す。図１６は×100、図１７は×300、図１８は×1.00k、図１９は×10.0k、図２０は×25.0k、図２１は×20.0k、図２２は×15.0k、図２３は×15.0kである。
図１９〜図２３に示されるように、糸球体の上皮細胞や足突起、糸球体断面の血管内腔面の無数の小孔等、10,000倍以上の高倍率観察が可能であった。また、従来の作製における脱水剤や乾燥の影響を受けない、試料本来の形態に近いであろう像の観察ができた。
【００４１】
図２４〜図２７に、本発明の導電性コーティング剤による尿細管観察用試料の電顕像を示す。図２４は×1.00k、図２５は×7.00k、図２６は×10.0k、図２７は×20.0kである。
図２６、図２７に示されるように、近位尿細管の刷子縁の10,000倍以上の高倍率において観察が可能であった。また、試料本来の形態に近い像で観察することができた。
【実施例４】
【００４２】
４．カラーコンタクトレンズの観察
４−１．カラーコンタクトレンズの試料作製
高含水のソフトコンタクトレンズ表面に金属による着色が施されたカラーコンタクトレンズを材料とした。
カラーコンタクトレンズを、1%グルタールアルデヒドで固定し、蒸留水で洗浄後、実施例１と同様にして濾過した10%導電性コーティング剤（希釈溶液：蒸留水）に10分間浸漬した。キムワイプ（登録商標）でカラーコンタクトレンズに付いた余分な液を軽く吸い取ったのち、カーボン両面テープを貼った試料台にカラーコンタクトレンズを載台し、ブロアーで乾かし、観察に供した。
【００４３】
４−２．電子顕微鏡による観察・撮影
加速電圧：3kV、エミッション電流：10μA、SE検出器：Lowとし、実施例１と同様にして試料を撮影した。
【００４４】
４−３．結果
図２８〜図３２に本発明の導電性コーティング剤によるカラーコンタクトレンズの試料の電顕像を示す。図２８は、カラーコンタクトレンズのまぶた側と角膜側を一緒に撮影した電顕像（×25）である。図２９、図３０は、カラーコンタクトレンズのまぶた側の電顕像（それぞれ、×5.00k、×10.0k）である。レンズ表面の構造はレンズ自体の構造である。図３１、図３２は、カラーコンタクトレンズの角膜側（色素付着側）の電顕像（それぞれ、×30.0k、×50.0k）である。
【００４５】
図２９〜図３２に示されるように、高倍率観察においてもコンタクトレンズ表面に導電性コーティング剤の残渣もなく、電子線損傷が軽減された像が得られた。
【００４６】
５．まとめ
導電性コーティング剤の試料作製は、試料にあった希釈溶液を選択したうえで、適切な濃度と浸漬時間を検討することで、チャージアップ現象や電子線損傷のない高倍率観察が可能となった。加速電圧、エミッション電流、SE検出器を調整して、試料に適する条件を検討することで、安定した電顕像を得ることができた。
また、導電性コーティング剤は極めて短時間に、かつ簡略化した方法で試料作製ができ、高倍率観察も可能な新しい電顕試料作製方法が確立された。該電顕試料作製方法による遊離細胞、実質臓器、高分子化合物等の試料での観察可能性も実証された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
含水試料（生物試料等）を前処理なしで、短時間で簡略化した試料作製が可能となり、三次元の超微形態研究に対して大きな即戦力となることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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