(57)【要約】【課題】測定対象物の生成、拡散条件を均一化できるようにし、正確な測定を可能にする。【解決手段】測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、電解液中に測定対象物消却用電極を設け、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を含む電解液中に、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加して前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、
前記電解液中に測定対象物消却用電極を設け、
前記測定対象物消却用電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して前記測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、
前記消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、
前記新しい測定対象物を拡散させた後に前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加して前記電流を測定する電気化学測定ステップとを実行することを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却ステップでは前記作用極にも前記消却用電圧を印加することを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は前記作用極と同一平面上に設けられていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項４】
請求項３記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極はリング状をなし、前記作用極のまわりに配置されていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項５】
請求項３記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は格子状をなし、前記作用極のまわりに配置されていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項６】
請求項３記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は前記作用極のまわりに全面配置されていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は前記電解液中に３次元の広がりをもつ構造を有して設けられていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項８】
請求項７記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は３次元格子状をなし、前記電解液中において前記作用極が設けられている面の上方に前記作用極から離間して配置されていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項９】
請求項１又は２記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用電極は、前記作用極と同一平面上に設けられた電極と、前記平面の上方に前記作用極から離間して配置され、３次元の広がりをもつ構造を有する電極とを合わせて持つ形状とされていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項１０】
電解液と前記電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、前記電解液槽に設けられ、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記電解液槽に設けられた対極と、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、前記測定用電圧を印加している時に前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置において、
前記電解液槽に、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用電極が設けられ、
前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加していない時に、前記測定対象物消却用電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有していることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は前記作用極と同一平面上に設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極はリング状をなし、前記作用極のまわりに配置されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１３】
請求項１１記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は格子状をなし、前記作用極のまわりに配置されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１４】
請求項１１記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は前記作用極のまわりに全面配置されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１５】
請求項１０記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は前記電解液中に３次元の広がりをもつ構造を有して設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１６】
請求項１５記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は３次元格子状をなし、前記電解液中において前記作用極が設けられている面の上方に前記作用極から離間して配置されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１７】
請求項１０記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用電極は、前記作用極と同一平面上に設けられた電極と、前記平面の上方に前記作用極から離間して配置され、３次元の広がりをもつ構造を有する電極とを合わせて持つ形状とされていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１８】
電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列されて、前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように前記ＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが位置していることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項１９】
請求項１８記載のトランスデューサにおいて、
前記センサ領域上には、３次元格子状をなす第３の電極が設けられていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項２０】
請求項１８又は１９記載のトランスデューサにおいて、
前記第２の電極はリング状電極群によって構成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項２１】
請求項１８又は１９記載のトランスデューサにおいて、
前記第２の電極は格子状とされていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項２２】
請求項１８又は１９記載のトランスデューサにおいて、
前記第２の電極は前記第１の電極と導通することなく、前記センサ領域に全面形成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は細胞や細胞塊、組織片その他の生体試料及び生体関連物質を含む非生体試料（以下、本願では一括して単に「生体試料」という。）に由来する化学物質（化学反応生成物）を測定する電気化学測定方法、電気化学測定装置及び電気化学測定に用いるトランスデューサに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や細胞塊、組織片等の生体試料で起こる化学反応によって生成される物質を定量することは、医療、創薬等の現場において生体試料の生死判定、機能性評価等に必要な技術である。生体試料から放出される化学反応生成物の定量方法の１つに電気化学測定があり、例えば非特許文献１では肝細胞の分化の進行状態の観察を電気化学測定によって行っている。
【０００３】
電気化学測定は、外部電源とつながった２つ以上の電極が挿入されている電解液内の測定対象物に対し、電極を介して測定対象物から電子を奪うか、もしくは測定対象物へ電子を供与することで、酸化もしくは還元反応をおこさせると同時に、電極間を流れる電流を測定して酸化還元反応の有無、即ち測定対象物の有無を検出する方法である。
【０００４】
一般的な電気化学測定装置は、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極、作用極と外部電源を介してつながり、作用極で生じる電子移動を補償する対極、測定系内のイオンを介した電子の移動を可能とし、測定系全体を閉回路とするための電解液、電圧の基準を取るための参照極等で構成される。
【０００５】
非特許文献１では、マウスの胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）より作製したＥＳ細胞塊である胚様体（embryoid body：ＥＢ）に対し、ＥＳ細胞の細胞膜に存在する未分化マーカーであるアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase : ＡＬＰ）を電気化学測定にて間接的に測定している。
【０００６】
機能が限定されていない幹細胞が、機能が限定された体細胞に変化する反応は、一般に分化とよばれており、分化が起こっていないことを示す物質は未分化マーカーと呼ばれている。
【０００７】
ＡＬＰは細胞の未分化マーカーであると同時に、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する性質をもつ。ＡＬＰは例えば、リン酸エステル化合物ｐ−アミノフェニルホスフェート（p-aminophenyl phosphate：ＰＡＰＰ）をｐ−アミノフェノール（p-aminophenol：ＰＡＰ）へ変化させる反応の酵素として働く。酵素反応によって生成されたＰＡＰは電気化学的活性のある物質であり、参照極を基準として作用極へ電圧印加することによって、ｐ−キノンイミン(p-quinone imine : ＰＱＩ)へ酸化される。即ち、酵素反応、酸化還元反応の２回の反応によって、ＡＬＰの存在は電気化学測定における電流値として検出される。
【０００８】
非特許文献１では、φ４０μｍの作用極を２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に備えた多点電極電流測定装置を用いて測定している。この装置は４００個の電極から得られる電極電流値により数μｍ〜数百μｍの生体試料の反応の様子を２次元的かつ経時的にイメージングしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ”  ２０１３年，４８巻，ｐ．１２−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した非特許文献１における測定は、
・ＰＡＰＰを４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ含有した電解液にマウスＥＢを投入
・投入直後から酵素反応が開始し、細胞膜内ＡＬＰによってＰＡＰＰはＰＡＰへ変化
・ＰＡＰはＥＢ表面から電極付近まで拡散し、電極表面に到達
・拡散が安定するのを待ち、電極に電圧を印加
・ＰＡＰはＰＱＩへ変化
・電極間電流値を取得
といった過程で行われており、図１はこの過程を横軸を時間として示したものである。
【００１１】
図１において、ＥＢを電解液に投入し、酵素反応が始まった瞬間から電圧印加までの時間Ａは、ＥＢ表面からＰＡＰが拡散を開始し、電解液内のＰＡＰ濃度分布が安定する時間を想定して設けられており、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂは、電極でおこる酸化還元反応によって電極付近のＰＡＰ濃度分布の変化が安定する時間を想定して設けられている。
【００１２】
ところで、このような過程を経るＥＢのＡＬＰ活性測定では、測定の不確かさが生じうるものとなっている。
【００１３】
例えば、複数のＥＢを同時測定する場合において、ピペット等でアレイ状の電極上へＥＢを配置する際、複数回に分けて配置を行った場合にはＥＢがＰＡＰＰに触れるタイミングに違いが生じるため、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａは、各々のＥＢで違い、ＥＢまわりのＰＡＰ濃度分布及び電流値は仮に全てのＥＢが同様の活性（単位時間あたりのＰＡＰ放出速度）を持っていたとしても違う値を示す。即ち、測定電流値には、ＥＢの持つＡＬＰ活性の大きさの違いと、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの長さによる違いの双方が混在することになる。
【００１４】
また、仮に、複数のＥＢを同時にＰＡＰＰ溶液に入れたとしても、ある時に行ったＥＢ群の測定結果と、違う時に行ったＥＢ群の測定結果は、例えばＥＢ投入時の作業者の入れ方に基因する液揺れの違いなどにより、それらＥＢ群間の測定結果の比較が難しいことが考えられる。
【００１５】
この発明の目的はこのような問題に鑑み、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定条件の均一化を図れるようにし、よって正確な測定を可能とし、複数回測定の各回間及び１回の測定の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行えるようにした電気化学測定方法、電気化学測定装置及びその電気化学測定に用いるトランスデューサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１の発明によれば、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、電解液中に測定対象物消却用電極を設け、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行する。
【００１７】
請求項２の発明では請求項１の発明において、測定対象物消却ステップでは前記作用極にも消却用電圧を印加する。
【００１８】
請求項３の発明では請求項１又は２の発明において、測定対象物消却用電極は作用極と同一平面上に設けられる。
【００１９】
請求項４の発明では請求項３の発明において、測定対象物消却用電極はリング状をなし、作用極のまわりに配置される。
【００２０】
請求項５の発明では請求項３の発明において、測定対象物消却用電極は格子状をなし、作用極のまわりに配置される。
【００２１】
請求項６の発明では請求項３の発明において、測定対象物消却用電極は作用極のまわりに全面配置される。
【００２２】
請求項７の発明では請求項１又は２の発明において、測定対象物消却用電極は電解液中に３次元の広がりをもつ構造を有して設けられる。
【００２３】
請求項８の発明では請求項７の発明において、測定対象物消却用電極は３次元格子状をなし、電解液中において作用極が設けられている面の上方に作用極から離間して配置される。
【００２４】
請求項９の発明では請求項１又は２の発明において、測定対象物消却用電極は、作用極と同一平面上に設けられた電極と、前記平面の上方に作用極から離間して配置され、３次元の広がりをもつ構造を有する電極とを合わせて持つ形状とされる。
【００２５】
請求項１０の発明によれば、電解液と電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、電解液槽に設けられ、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、電解液槽に設けられた対極と、作用極と対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置において、電解液槽に測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用電極を設け、作用極と対極との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有するものとされる。
【００２６】
請求項１１の発明では請求項１０の発明において、測定対象物消却用電極は作用極と同一平面上に設けられる。
【００２７】
請求項１２の発明では請求項１１の発明において、測定対象物消却用電極はリング状をなし、作用極のまわりに配置される。
【００２８】
請求項１３の発明では請求項１１の発明において、測定対象物消却用電極は格子状をなし、作用極のまわりに配置される。
【００２９】
請求項１４の発明では請求項１１の発明において、測定対象物消却用電極は作用極のまわりに全面配置される。
【００３０】
請求項１５の発明では請求項１０の発明において、測定対象物消却用電極は電解液中に３次元の広がりをもつ構造を有して設けられる。
【００３１】
請求項１６の発明では請求項１５の発明において、測定対象物消却用電極は３次元格子状をなし、電解液中において作用極が設けられている面の上方に作用極から離間して配置される。
【００３２】
請求項１７の発明では請求項１０の発明において、測定対象物消却用電極は、作用極と同一平面上に設けられた電極と、前記平面の上方に作用極から離間して配置され、３次元の広がりをもつ構造を有する電極とを合わせて持つ形状とされる。
【００３３】
請求項１８の発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するようにＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが配置されているものとされる。
【００３４】
請求項１９の発明では請求項１８の発明において、センサ領域上には３次元格子状をなす第３の電極が設けられているものとされる。
【００３５】
請求項２０の発明では請求項１８又は１９の発明において、第２の電極はリング状電極群によって、構成されているものとされる。
【００３６】
請求項２１の発明では請求項１８又は１９の発明において、第２の電極は格子状とされる。
【００３７】
請求項２２の発明では請求項１８又は１９の発明において、第２の電極は第１の電極と導通することなく、センサ領域に全面形成されているものとされる。
【発明の効果】
【００３８】
この発明による電気化学測定方法は、電解液中に生成、拡散した測定対象物を一旦、消却した後に、再度、測定対象物を生成、拡散させて測定を行うものとなっており、またこの発明による電気化学測定装置はこのような測定を行えるものとなっている。よって、この発明による電気化学測定方法、電気化学測定装置によれば、測定対象物の生成、拡散条件の均一化を図ることができ、即ち測定条件の均一化を図ることができ、正確な測定が可能となる。
【００３９】
これにより、例えば複数回繰り返される測定の各回間や１回で複数のサンプル（生体試料）を測定する場合の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行うことが可能となる。
【００４０】
また、この発明によるトランスデューサはこのような電気化学測定に用いて好適なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】電気化学測定の従来の測定過程の一具体例を示すチャート。
【図２】図１に示した電気化学測定における酵素反応の時間Ａの違いによって生じる電流値の計算結果の違いを示すグラフ。
【図３】この発明における測定対象物消却用電極の第１の例を示す斜視図。
【図４】この発明における測定対象物消却用電極の第２の例を示す斜視図。
【図５】図４に示した測定対象物消却用電極の平面図。
【図６】Ａは一部省略した図５の部分拡大図、Ｂは省略せずに示したＡに対応する正面図。
【図７】この発明による電気化学測定の測定過程を従来の測定過程と共に示したチャート。
【図８】第１の例の測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフ。
【図９】第２の例の測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフ。
【図１０】第３の例の測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフ。
【図１１】対流がある場合の測定対象物消却ステップの実行有無による電流値の計算結果の違いを示すグラフ。
【図１２】この発明における測定対象物消却用電極の第４の例を示す斜視図。
【図１３】この発明による測定対象物消却用電極の第５の例を示す斜視図。
【図１４】この発明による電気化学測定装置の一実施例の構成を説明するための図。
【図１５】Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図、Ｂはその断面図。
【図１６】図１５Ａに示したトランスデューサの斜視図。
【図１７】Ａは図４に示した測定対象物消却用電極を構成するための具体的部品形状を示す斜視図、ＢはＡの部品を用いて構成された測定対象物消却用電極の斜視図。
【図１８】図１７Ｂに示した測定対象物消却用電極が設置されたトランスデューサの斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
最初に、マウスＥＢのＡＬＰ活性測定を例として、有限要素法による数値解析を行った結果について説明する。数値解析ソフトとして、ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  Ｖｅｒ４．４を用いた。以下に、解析モデル形状、境界条件を示す。
【００４３】
＜解析モデル形状＞
２．３ｍｍ×２．３ｍｍ×１．３ｍｍの解析空間を用意し、φ４０μｍの電極（作用極）を解析空間底面にアレイ状に設置した。電極の厚みは、十分無視できる程度の値として設定上、１ｎｍを指定した。
【００４４】
２．３ｍｍ×２．３ｍｍの解析空間底面の中心に原点を置き、電極アレイ全体の中心と解析空間底面の中心を合わせて電極を２５０μｍピッチで８×８＝６４個設置し、そのうち中心付近の４行目５列目の電極上へ中心を合わせてφ３００μｍのＥＢを模した球体を配置した。球体と直下の電極の間隔は解析メッシュの切りやすさを考慮し、３μｍの距離をとった。
【００４５】
＜境界条件＞
解析空間内は濃度４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌの基質ｐＡＰＰを設定して空間内濃度初期値とし、解析空間４辺の壁と天井は、解析空間外が濃度４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌの解放境界として設定した。ＥＢ表面（球体表面）は下記に示すミカエリス・メンテンの式（１）に従って、表面付近のＰＡＰＰの濃度に依存してＰＡＰが放出される境界とし、酵素反応のモデルとした。
【００４６】
【数１】
2017096721.tif 000002
【００４７】
ｖ：ＰＡＰ放出速度［ｍｏｌ／ｓ］
［Ｓ］：基質ＰＡＰＰ濃度（４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ）
Ｖｍａｘ：ＰＡＰＰ濃度最大時反応速度（３．３３×１０−１２ｍｏｌ／ｓ）
Ｋｍ：ミカエリス・メンテン定数（１．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ）
【００４８】
ＰＡＰの酸化還元反応を表現する為、電極上では電圧印加時にＰＡＰ濃度をゼロとして設定し、ＰＡＰ濃度勾配より電流値を計算した。電流値は電極に垂直な方向の濃度勾配に比例し、式（２）に従う。
【００４９】
【数２】
2017096721.tif 000003
【００５０】
ｉ：電極上の任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）における電流密度［Ａ／ｍ２］
Ｃ：任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）におけるＰＡＰ濃度［ｍｏｌ］
ｚ：電極に垂直な成分
ｘ，ｙ：電極に水平な成分
Ｆ：ファラデー定数（９６４８５Ｃ／ｍｏｌ）
Ｄ：酸化還元種ＰＡＰ拡散係数（６．４７×１０−１０ｍ２／ｓ）
ｎ：反応電子数（ｎ＝２）
【００５１】
なお、ＰＡＰ濃度分布の影響を視覚的に分かりやすく評価するため、６４個の電極の内、ＥＢが載っている電極と同じ列の７個（Ｙ軸に沿う７個）の電極の電流値を評価に使用した。
【００５２】
最初に、図１に示した過程に従うものとし、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａが３秒、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂが０．１秒の場合の電流値と、時間Ａが２０秒、時間Ｂが０．１秒の場合の電流値を計算した。結果を図２に示す。図２に示すように酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの違いが電流値に違いとなって現れた。なお、図２はＥＢ直下の電極位置をｙ＝０μｍとし、ＥＢ直下の電極と両側３個ずつの電極からの電流値をプロットしている（後述する図８〜１１のグラフも同様）。
【００５３】
この発明は、電解液中に測定対象物消却用電極を設け、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行するものであり、以下、数値解析に用いた測定対象物消却用電極の３つの形状（形状１〜３）について説明する。
【００５４】
・形状１：作用極と同極性の測定対象物消却用電極を作用極と同一平面上に設ける。測定対象物消却用電極は作用極と導通しない程度の隙間をあけて作用極のまわりに全面配置。図３はこの測定対象物消却用電極を示したものであり、φ４０μｍの作用極１０のまわりには同心の環状に２０μｍの隙間をあけて測定対象物消却用電極２１が全面配置されている。図３中、３１はφ３００μｍのＥＢを示す。ＥＢ３１は作用極１０の直上に位置している。
【００５５】
・形状２：作用極と同極性の測定対象物消却用電極を３次元格子状として作用極の近傍に配置。図４〜６はこの測定対象物消却用電極２２の配置、構成を示したものである。３次元格子はＸＹ方向に沿った２次元格子をＺ方向に３枚積層して構成されている。格子の太さは□３０μｍ、ピッチは５００μｍとしている。２５０μｍピッチの作用極１０に対して図４〜６に示すような位置に配置した。なお、３枚の２次元格子のＺ方向の間隔は１００μｍとした。
【００５６】
・形状３：形状１と２を併用した構造。
【００５７】
測定対象物消却用電極は、作用極と同じく、電圧印加時にＰＡＰ濃度がゼロとなるように解析境界条件を設定することで測定対象物消却用電極への電圧印加を再現した。
【００５８】
図７（Ａ）は上述の図２に示した計算結果の過程を示したものであり、図７（Ｂ）は測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを含む過程、即ちこの発明による電気化学測定方法の過程を示したものである。
【００５９】
酵素反応開始から３秒後と２０秒後の状態に対し、作用極と測定対象物消却用電極に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して１０秒の測定対象物消却ステップ（ＰＡＰ濃度分布消却ステップ）を実行した後に、消却用電圧の印加を停止し、再度、酵素反応を３秒起こさせて新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップを経た後に、作用極に測定用電圧を印加し、電気化学測定ステップを実行するものとし、０．１秒後の電流値を計算した。
【００６０】
図８〜１０は測定対象物消却用電極が形状１，形状２及び形状３の場合の電流値の計算結果をそれぞれ示したものである。
【００６１】
測定対象物消却ステップ後の反応（測定対象物の生成、拡散・・・測定対象物拡散ステップ）は、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒であるか、２０秒であるかに関わらず、一定であるので、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒、２０秒の双方の結果が一致することが望ましい。形状１，２，３各々の結果は、図２に示した結果よりも十分に３秒と２０秒の結果が近いものとなっている。
【００６２】
次に、例えば電解液に対流が存在する場合、電解液の流れはＥＢの形成するＰＡＰ濃度分布を乱してしまい、測定に影響を与えることが考えられる。この点に関し、電解液に対流がある場合のこの発明による電気化学測定方法の効果について計算した結果について説明する。
【００６３】
計算は下記３つのケース（ケース１〜３）について行った。
【００６４】
・ケース１：酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
【００６５】
・ケース２：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合において、酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
【００６６】
・ケース３：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合で、１０秒の対流の後、作用極及び作用極と同極性の測定対象物消却用電極を用いて１０秒の測定対象物消却ステップを実行し、その後、消却用電圧の印加を停止して、再度、酵素反応をおこさせ、１０秒の測定対象物拡散ステップを経た後に作用極に電圧を印加、電圧印加後０．１秒の電流値
【００６７】
図１１はこれらケース１〜３の電流値の計算結果を示したものであり、測定対象物消却ステップがなければ、対流によってケース２のように結果が歪み、本来の位置（ＥＢが存在する位置）からずれた位置に電流値のピークが生じるのに対し、測定対象物消却ステップを実行したケース３ではケース１の本来得られるはずの電流値に近い電流値が得られることがわかり、対流や液揺れの影響を除去することが可能であることがわかる。
【００６８】
以上数値解析を行った結果について説明したが、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とを設け、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定において、上述したように測定対象物消却ステップを実行すれば、電解液中の少なくとも測定に影響を与える範囲内に存在していた測定対象物はすべて酸化又は還元されることで消却され、その生成及び拡散の過程は初期化されて電解液中の状態がリセットされることになる。よって、後続する測定対象物拡散ステップの時間を一定に制御することで、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定対象物の生成、拡散の条件を均一化することができ、つまり測定条件の均一化を図ることが可能となる。
【００６９】
また、このように測定対象物消却ステップを実行することにより、電解液の液揺れや対流等の影響を排除することができ、さらには測定対象物を発生させるサンプル（生体試料）を電解液に投入した後、測定者の望むタイミングで測定を行うことが可能である。
【００７０】
なお、上記においては測定対象物消却用電極及び作用極の双方に消却用電圧を印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしているが、例えば消却用電圧を測定対象物消却用電極だけに印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしてもよい。
【００７１】
測定対象物消却用電極の形状は上述した例に限らず、例えば図１２や図１３に示したような形状としてもよい。図１２では測定対象物消却用電極２３はリング状とされて作用極１０と同一平面上に設けられており、φ４０μｍの作用極１０のまわりに配置されている。リング状をなす測定対象物消却用電極２３の外径は例えばφ１２０μｍとされ、内径は例えばφ８０μｍとされる。
【００７２】
図１３は測定対象物消却用電極を２次元格子状としたものであり、測定対象物消却用電極２４は作用極１０と同一平面上に設けられ、作用極１０のまわりに作用極１０を囲むように配置されている。この例では格子の幅は５０μｍとされ、ピッチは２５０μｍとされている。
【００７３】
測定対象物消却用電極はこれら図１２及び図１３に示した形状に加え、前述の図４〜６に示した形状２（３次元格子）を合わせて持つものとしてもよい。なお、測定対象物を発生させる生体試料が小さい場合などには、測定対象物消却用電極は作用極と同一平面上に設けただけでも効果を発揮すると考えられる。
【００７４】
その他、前述の形状２（３次元格子）とは異なる形状の３次元的な広がりを持つ測定対象物消却用電極を構築してもよい。例えば、金の細線をスチールウール状に凝縮したものに生体試料を内部に配置するための孔または凹部を設けて、作用極と接触しないように作用極の上方に支持または懸架してもよい。或いは、適度の空隙率をもつ多孔質状の素材の表面に金メッキを施した物などを用いることも可能である。
【００７５】
次に、この発明による電気化学測定装置の構成について説明する。
【００７６】
図１４は電気化学測定装置の構成を模式的に示したものである。電気化学測定装置は電解液４１と電解液４１中で測定対象物を発生させる生体試料３０とを収容する電解液槽４０を備え、電解液槽４０には作用極１０と測定対象物消却用電極２０と対極５０と参照極６０とが設けられた構成となっている。作用極１０及び測定対象物消却用電極２０は図１４では簡略化して示しているが、前述したように作用極１０は所定のピッチでアレイ状に多数配列された構成とされ、測定対象物消却用電極２０は図３に示した測定対象物消却用電極２１、図４〜６に示した測定対象物消却用電極２２、図１２に示した測定対象物消却用電極２３、図１３に示した測定対象物消却用電極２４のいずれかの構成、もしくは測定対象物消却用電極２１，２３，２４のいずれかと測定対象物消却用電極２２とを併用した構成を有するものとされる。図１４中、９０は塩橋を示す。
【００７７】
作用極１０、測定対象物消却用電極２０、対極５０及び参照極６０はこの例では図１４に示したようにポテンショスタット７０に接続されている。ポテンショスタット７０は可変電源７１と電圧計７２と電流計７３とを含んで構成されており、このポテンショスタット７０により作用極１０と対極５０との間への測定用電圧の印加及び測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極１０と対極５０との間に流れる電極間電流の測定が行われる。
【００７８】
また、作用極１０と対極５０との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用電極２０と対極５０との間への測定用電圧と同極性の消却用電圧の印加もポテンショスタット７０により行われる。作用極１０への測定用電圧の印加はスイッチ８１をＯＮ，スイッチ８２，８３をＯＦＦにすることに行われ、測定対象物消却用電極２０への消却用電圧の印加はスイッチ８２，８３をＯＮ，スイッチ８１をＯＦＦにすることにより行われる。なお、スイッチ８１をＯＮとして作用極１０にも消却用電圧を印加するようにしてもよい。
【００７９】
図１４では測定対象物消却用電極２０はポテンショスタット７０から消却用電圧が印加されるものとなっているが、これに限らず、消却用電圧の印加はポテンショスタット７０とは別の電源を用いて行うようにしてもよい。
【００８０】
次に、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるこの発明によるトランスデューサの構成について図１５及び図１６を参照して説明する。
【００８１】
このトランスデューサはバイオＬＳＩチップと称されるもので、電解液４１と電解液４１中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽４０がＬＳＩチップ１００上に搭載された構成となっている。電解液槽４０の中央には穴４２が形成されており、ＬＳＩチップ１００はこの穴４２の下端に穴４２を塞ぐように配置されている。
【００８２】
ＬＳＩチップ１００及び電解液槽４０は基板１１０上に搭載固定されており、基板１１０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン１１１が形成されている。図１５Ｂ中、１２０はＬＳＩチップ１００と配線パターン１１１とを接続するボンディングワイヤを示す。
【００８３】
ＬＳＩチップ１００の上面にはセンサ領域１０１が構成されている。図１５Ａではセンサ領域１０１をハッチングを付して示しており、電解液槽４０の底面の穴４２の位置にセンサ領域１０１は画定されている。詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域１０１にφ４０μｍの作用極（第１の電極）が２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に配列されて形成されている。また、作用極と同一平面上、各作用極のまわりに位置するように測定対象物消却用電極（第２の電極）が形成されている。測定対象物消却用電極は前述の図３，図１２，図１３にそれぞれ示した測定対象物消却用電極２１，２３，２４のいずれかの構成を有するものとされる。
【００８４】
ＬＳＩチップ１００は各作用極及び測定対象物消却用電極への電圧印加機能、各作用極での反応を電流値として検出し、増幅する機能さらにはスイッチング機能等を備えている。作用極及び測定対象物消却用電極は例えばリフトオフ法によって形成される。
【００８５】
図１５，１６に示したトランスデューサは作用極と同一平面に測定対象物消却用電極を備えた構成となっているが、さらに前述の図４〜６に示したような３次元格子構造の測定対象物消却用電極を具備するものとしてもよい。
【００８６】
図１７はトランスデューサに配置する３次元格子構造の測定対象物消却用電極（第３の電極）の具体的な構成を示したものであり、図１８は図１５，１６に示したトランスデューサに対し、３次元格子構造の測定対象物消却用電極が追加されたトランスデューサを示したものである。
【００８７】
３次元格子構造の測定対象物消却用電極１３０はこの例では３枚の金属板１３１と計１２個のスペーサ１３２とによって構成されている。金属板１３１は銅もしくはニッケルよりなり、厚さは３０μｍ程度とされる。フォトリソグラフィとエッチングなどで金属板１３１に図１７Ａに示したようにメッシュ１３１ａを形成する。メッシュ１３１ａのＬ／Ｓ（ライン／スペース）は３０μｍ／４７０μｍとする。メッシュ１３１ａを形成した金属板１３１の四隅にスペーサ１３２を配置し、スペーサ１３２を介して３枚の金属板１３１を積層することで図１７Ｂに示したような３次元格子構造の測定対象物消却用電極１３０となる。スペーサ１３２の厚さは７０μｍとし、これによりメッシュ１３１ａが形成された金属板１３１が１００μｍ間隔で積層される。スペーサ１３２と金属板１３１はスポット溶接等で固定され、積層後、金めっきを施すことにより３次元格子構造の測定対象物消却用電極１３０が完成する。
【００８８】
３次元格子構造の測定対象物消却用電極１３０は図１８に示したように穴４２内に収容されてセンサ領域１０１上に配置される。図１８中、１４０は測定対象物消却用電極１３０に消却用電圧を印加するための外部電源とつながる配線を示す。なお、ＬＳＩチップ１００のセンサ領域１０１から測定対象物消却用電極１３０へ消却用電圧を印加する構成とすることもできる。
【００８９】
対極及び参照極はトランスデューサとは別部品とされ、測定時（使用時）に電解液４１中に投入される。
【符号の説明】
【００９０】
１０    作用極
２０，２１，２２，２３，２４    測定対象物消却用電極
３０    生体試料                            ３１    ＥＢ
４０    電解液槽                            ４１    電解液
４２    穴                                  ５０    対極
６０    参照極                              ７０    ポテンショスタット
７１    可変電源                            ７２    電圧計
７３    電流計                              ８１，８２，８３    スイッチ
９０    塩橋                                １００    ＬＳＩチップ
１０１    センサ領域                        １１０    基板
１１１    配線パターン                      １２０    ボンディングワイヤ
１３０    測定対象物消却用電極              １３１    金属板
１３１ａ    メッシュ                        １３２    スペーサ
１４０    配線
【図１】
2017096721.tif 000004
【図２】
2017096721.tif 000005
【図３】
2017096721.tif 000006
【図４】
2017096721.tif 000007
【図５】
2017096721.tif 000008
【図６】
2017096721.tif 000009
【図７】
2017096721.tif 000010
【図８】
2017096721.tif 000011
【図９】
2017096721.tif 000012
【図１０】
2017096721.tif 000013
【図１１】
2017096721.tif 000014
【図１２】
2017096721.tif 000015
【図１３】
2017096721.tif 000016
【図１４】
2017096721.tif 000017
【図１５】
2017096721.tif 000018
【図１６】
2017096721.tif 000019
【図１７】
2017096721.tif 000020
【図１８】
2017096721.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月9日(2017.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
請求項１８の発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するようにＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが配置され、センサ領域上には３次元格子状をなす第３の電極が設けられているものとされる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
請求項１９の発明では請求項１８の発明において、第２の電極はリング状電極群によって構成されているものとされる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
請求項２０の発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するようにＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが配置され、第２の電極は格子状とされる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
請求項２１の発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するようにＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが配置され、第２の電極は第１の電極と導通することなく、センサ領域に全面形成されているものとされる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
請求項２２の発明では請求項２０又は２１の発明において、センサ領域上には３次元格子状をなす第３の電極が設けられているものとされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列されて、前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように前記ＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが位置しており、
前記センサ領域上には、３次元格子状をなす第３の電極が設けられていることを特徴とするトランスデューサ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
請求項１８記載のトランスデューサにおいて、
前記第２の電極はリング状電極群によって構成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列されて、前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように前記ＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが位置しており、
前記第２の電極は格子状とされていることを特徴とするトランスデューサ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】
電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列されて、前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように前記ＬＳＩチップに設けられている第２の電極とが位置しており、
前記第２の電極は前記第１の電極と導通することなく、前記センサ領域に全面形成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
請求項２０又は２１記載のトランスデューサにおいて、
前記センサ領域上には、３次元格子状をなす第３の電極が設けられていることを特徴とするトランスデューサ。