(57)【要約】【課題】  合成コラーゲンを原料としたナノファイバーを提供すること。さらに、高次構造を維持した前記ナノファイバーを提供すること。【解決手段】  合成コラーゲンからなるポリペプチドナノファイバーであって、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」の繰り返し配列が、アミノ酸配列全体の、アミノ酸の個数を基準として９５％以上、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」配列の繰り返し数が１０〜１００００であるポリペプチドナノファイバー。  本発明に寄れば、安全性が高く、丈夫で、様々な機能を持つ、生体への親和性の高い材料を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成コラーゲンからなるポリペプチドナノファイバーであって、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」の繰り返し配列が、アミノ酸配列全体の、アミノ酸の個数を基準として９５％以上、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」配列の繰り返し数が１０〜１００００であるポリペプチドナノファイバー。
【請求項２】
合成コラーゲンが三重らせん構造を形成している請求項１のポリペプチドナノファイバー。
【請求項３】
ポリペプチドナノファイバーの直径が５０〜１０００ｎｍである請求項１又は２のポリペプチドナノファイバー。
【請求項４】
請求項１、２又は３のポリペプチドナノファイバーからなる細胞の足場材。
【請求項５】
電界紡糸する工程を含む請求項１、２又は３のポリペプチドナノファイバーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学合成されたコラーゲン様ポリペプチドを原料とするポリペプチドナノファイバーに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要な蛋白質である。コラーゲンは健康食品や化粧品の原料、そして医療分野で人工皮膚などの生体材料として使われている。コラーゲンとしては動物由来のものが広く使われているが、プリオンやウイルスなどの病原体混入の危険性や抗原性の問題から、化学合成されたコラーゲン様ポリぺプチド（以下、合成コラーゲン）（特許文献１）も用いられている。また、合成コラーゲンはゲル、フィルム、スポンジという形態で、医療分野の研究に使われている。
【０００３】
ところで、ナノファイバーは直径がナノメートルスケールの繊維で、単位質量当たりの表面積（以下、比表面積）が大きい、ナノサイズの太さが様々な機能的効果をもたらす、非常に強度が高いといった特徴を有している。コラーゲンを原料としたナノファイバーの製造についても研究が進められ、その生体への親和性から生体材料への応用が期待されている。特に、コラーゲンは、生体内において、細胞が分化増殖する際に足場となる細胞外基質（ＥＣＭ）の一種であることから、細胞の分化、増殖の際の足場としての応用が期待されている。
【０００４】
コラーゲンを原料としてナノファイバーを製造する技術としては、例えば、動物由来のコラーゲンをナノファイバー化したもの（非特許文献１）や、合成コラーゲンにポリマーを混合して、ナノファイバー化したものがある（特許文献２）。しかし、動物由来のコラーゲンは安全性に問題がある上、機能性材料という観点からは、熱安定性に乏しい、細胞の接着性をコントロールするのが難しいという問題がある。また、ポリマーのようなナノファイバー化を助ける材料（以下、紡糸助材）を混合する方法では、紡糸助材が生体内で分解しない、あるいは分解してもその分解物の細胞毒性が問題になり得るといった問題がある。例えば、紡糸助材としてポリグリコール酸やポリ乳酸を使用すると、分解の過程で、グリコール酸や乳酸が放出されｐＨが低下するため炎症が生じることがある。また、紡糸助材が目的とする機能、例えば足場材としての細胞接着性を阻害することがあるという問題もある。
一方で、合成コラーゲンは、動物由来のコラーゲンに比べ分子量分布が広く、鎖長の短い分子も存在するため、繊維化してもきれやすい。そのため、紡糸助材を使わずに合成コラーゲンからナノファイバーを製造することは難しく、紡糸助材を含まない合成コラーゲンを原料としたナノファイバーの製造は現在まで成功していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−３２１５００号公報
【特許文献２】特開２０１３−１９９７１３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，  ＤＯＩ  １０．１００２／ｊｃｐ．２５０３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、合成コラーゲンを原料としたナノファイバーを提供することである。本発明の他の目的は、高次構造を維持した上記ナノファイバーを提供することである。本発明のさらに他の目的は、それらナノファイバーを組織再生のために細胞の足場材として提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記本発明の目的を達成するために種々検討の結果、特定の溶媒、就中ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）に合成コラーゲンを溶解して電界紡糸することで、紡糸助材を用いずに合成コラーゲンを原料としたナノファイバーを製造することに成功した。また、このナノファイバーを構成する合成コラーゲンが三重らせん構造を形成することを見出した。さらに、このナノファイバーに、骨髄間質細胞が接着増殖し、骨芽細胞へ分化することを確認することで本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．合成コラーゲンからなるポリペプチドナノファイバーであって、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」の繰り返し配列が、アミノ酸配列全体の、アミノ酸の個数を基準として９５％以上、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」配列の繰り返し数が１０〜１００００であるポリペプチドナノファイバー。
２．合成コラーゲンが三重らせん構造を形成している前記１のポリペプチドナノファイバー。
３．ポリペプチドナノファイバーの直径が５０〜１０００ｎｍである前記１又は２のポリペプチドナノファイバー。
４．前記１、２又は３のポリペプチドナノファイバーからなる細胞の足場材。
５．電界紡糸する工程を含む前記１、２又は３のポリペプチドナノファイバーの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
合成コラーゲンを原料としたナノファイバーが製造可能となることで、安全性が高く、丈夫で、様々な機能を持った生体材料の提供が可能になり、特に組織再生のための細胞の足場材として、期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のポリペプチドナノファイバーに接着した骨髄間質細胞の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明のポリペプチドナノファイバー上でコロニーを形成した骨髄間質細胞の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明のポリペプチドナノファイバー上で骨分化した骨髄間質細胞の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明のポリペプチドナノファイバー上で骨分化した骨髄間質細胞のアリザリンレッドＳ染色像である。
【図５】本発明で用いた電界紡糸装置の模式図である。
【図６】本発明のポリペプチドナノファイバーの走査型電子顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する合成コラーゲンは、ペプチドを重縮合して合成したもので、コラーゲン様ポリペプチドである（特許文献１）。合成コラーゲンは、分子量数万から数十万のポリペプチドからなり、天然のコラーゲンと比較して分子量分布が広い。本発明のポリペプチドナノファイバーのアミノ酸配列は、「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」配列が繰り返されたものである。この配列は極めて安定であり、三重らせん構造を維持しやすい。その繰り返し数は１０〜１００００である。好ましくは１５〜５０００である。１０未満では三重らせん構造の安定性が低下し、１００００を超えると、凝集しやすくなり溶媒に難溶になる。「Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ」の繰り返し配列が、アミノ酸配列全体の、アミノ酸の個数を基準として９５％以上、好ましくは９７％以上である。９５％未満では三重らせん構造の安定性が低下する。また、５％以下で他のアミノ酸配列を含んでもよい。このような配列としては、例えば、機能性ペプチドなどを含んでいてもよい。そのようなペプチドは主鎖に導入してもよいし、側鎖として導入してもよい。例えば、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）やＹＩＧＤＲ配列（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）を導入することで、細胞接着性をコントロールできるし、ＢＦＰ（Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を導入することで、骨髄間質細胞の骨芽細胞への分化を促進することができる。さらに、ＴＮＦＲＰ（ＴＮＦ受容体由来ペプチド、Cell Transplant. 2005;14(9):665-72.）を導入すれば、神経幹細胞の神経分化を促進できる。
【００１２】
本発明のポリペプチドナノファイバーは、ナノファイバー化を助ける紡糸助材は含まない。紡糸助材とは、天然、合成の高分子であり、それ自体ナノファイバー化しやすいものである。例えばポリグリコール酸、ポリエチレンオキシド、ポリカプロタクトン、ポリ乳酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸／ポリカプロラクトン共重合体、ポリビニルアルコール、ポリジオキサノン、ポリウレタン、キトサン、ヒアルロン酸及び天然コラーゲンが挙げられる。本発明のポリペプチドナノファイバーは、紡糸助材でない材料は含んでいてもいいし、合成コラーゲン単独で構成されていてもいい。本発明は紡糸助材を含まないので、紡糸助材が生体内で分解しないというような不都合がなく、あるいはその分解物による細胞毒性が生じず、生体材料として優れている。また、紡糸助材による目的とする機能、例えば足場材としての細胞接着性の阻害といった問題も生じない。
また、ナノファイバー化することで、高分子鎖が整列し、非常に強度が強くなり、さらに比表面積が増大することで、細胞の接着性が向上する。
【００１３】
本発明のポリペプチドナノファイバーを構成する合成コラーゲンは三重らせん構造を形成していることが好ましい。従来、紡糸助材を用いずに合成コラーゲンからナノファイバーを製造することは成功していない。ただ、動物由来のコラーゲンからＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）やＴＦＥ（２，  ２，  ２−トリフルオロエタノール）などのフルオロアルコールを溶剤として電界紡糸でナノファイバーを製造することは試みられているが、コラーゲン特有の三重らせん構造が崩れるという問題があった。しかし、本発明のポリペプチドナノファイバーは、フルオロアルコール中で三重らせん構造が崩れるが、紡糸時及び／または水系の溶媒に浸漬することで、再び三重らせん構造を形成する。本発明のポリペプチドナノファイバーを構成する合成コラーゲンは、熱耐性も高く、８０℃の温度でも安定して三重らせん構造を形成する。
【００１４】
本発明のポリペプチドナノファイバーの直径は、好ましくは５０〜１０００ｎｍで、より好ましくは５０〜５００ｎｍである。５０ｎｍ未満では、強度が低下し、１０００ｎｍを超えると比表面積が低下する。
【００１５】
本発明のポリペプチドナノファイバーは、合成コラーゲン溶解液を、例えば図５のような装置で、電界紡糸することにより製造することができる。合成コラーゲンは、好ましくは、ＨＦＩＰやＴＦＥなどのフルオロアルコールに溶解する。濃度に特に制限はないが、１〜３０ｗｔ％に調整するのが好ましい。１ｗｔ％未満であれば、粒子を形成し繊維状となりにくく、３０ｗｔ％を超えると高粘度のため、ノズルから吐出されにくくなる。ノズルからの吐出速度は０．０１〜１００μＬ／ｍｉｎが好ましく、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎがさらに好ましい。０．０１μＬ／ｍｉｎ未満では紡糸効率が悪く、１００μＬ／ｍｉｎを超えると溶媒が蒸発する前にターゲットに付着してショートの危険性がある。印加電圧は５〜３０ｋＶが好ましく、１０〜２０ｋＶがさらに好ましい。５ｋＶ以下では溶液を糸状に引き出すことができず、３０ｋＶ以上では、万が一ショートした際に、機器へ大きなダメージを与えることになる。
電界紡糸すると、合成コラーゲンナノファイバーは、ターゲットの電極版に貼りついて表面を覆うように不織布シートを形成する。この際、電極板の代わりに円筒型の回転ターゲットを用いたり、ノズルをスキャンできるようにしたりして、シートの面積を調節できるようしてもよい。また、ノズルからの射出速度を調整することで、シートの厚さを調節してもよい。
【００１６】
本発明のポリペプチドナノファイバーは組織再生のための細胞の足場材として使用することができる。細胞は特に限定されないが、例えば、神経再生に関わる細胞、骨形成に関わる細胞、皮膚の再生に関わる細胞、血管再生に関わる細胞など組織再生に関わる細胞をあげることができる。より具体的には、骨髄幹細胞、神経幹細胞及び脂肪幹細胞などの成体幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞をあげることができる。組織に移植する際は、足場材のみで、移植することもできるし、足場材に細胞を接着させた状態で移植することもできる。本発明のポリペプチドナノファイバーの密度は、細胞を分化増殖させるのに適したものとすることができる。
【実施例】
【００１７】
以下に、本発明を実施例で説明する。
【００１８】
実施例１
［ナノファイバーの作成］
１ｗｔ％合成コラーゲン水溶液（（株）ＰＨＧ社製）を凍結乾燥し、ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）に溶解した。濃度は４ｗｔ％に調整した。
この溶液を用いて、電界紡糸を行った。電界紡糸装置の構成を図５に示す。ノズルには２７Ｇ注射針（先端９０°カット、外径０．４０ｍｍ、内径０．２２ｍｍ  ）を用い、ノズル−ターゲット間距離３ｃｍ、吐出速度０．１μｌ／ｍｉｎ、印加電圧１５ｋＶのとき、直径数十〜１００ｎｍ程度のファイバーが集積した不織布が得られた。これを水系溶媒に浸漬した。白金蒸着後、走査型電子顕微鏡（日立社製ＳＵ３５００型）で観察した。不織布表面の走査型電子顕微鏡観察画像を図６に示す。
【００１９】
実施例２
［骨髄間質細胞の培養］
実施例１で得られた不織布状のナノファイバーを０．５ｃｍ×０．５ｃｍの大きさに切断し、エタノールに浸漬して１５分間静置する事を３回繰返して殺菌した。無菌条件下で減圧乾燥したナノファイバー不織布を直径３．５ｃｍのディッシュ（ファルコン３００１、ベクトン・ディッキンソン社製）に入れた。ラットの大腿骨と脛骨から採取した骨髄間質細胞を２０％のウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（日水製薬製）に分散し、細胞１０５個をディッシュに加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。ダルベッコのリン酸塩緩衝生食液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄後、２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液に４℃、２時間浸漬して固定化した。水、エタノールの順に洗浄した後、減圧乾燥した。金蒸着後、走査型電子顕微鏡（日立社製Ｓ４６００型）で観察した。
走査型電子顕微鏡で観察した結果を図１と図２に示す。骨髄間質細胞が、ナノファイバー不織布上に接着し、増殖してコロニーを形成している事が分かった。
【００２０】
実施例３
［ＲＧＤ，  ＢＦＰ固定化ナノファイバーの作製］
実施例１で得られた不織布状のナノファイバー４．６ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で１回振盪洗浄した後、少量のＤＭＦ中で、イソプロパノールから再結晶した無水コハク酸４７．５ｍｇとジイソプロピルエチルアミン８２．５μＬを加え、氷上で３時間、次いで室温で終夜振盪撹拌した。コハク酸化された不織布状のナノファイバーをＤＭＦで３回、次いでメタノールで３回振盪洗浄した後、減圧乾燥した。赤外吸収スペクトルにおいて、１７３５ｃｍ−１に新たな吸収が出現し、コハク酸化が確認された。
得られたコハク酸化ナノファイバー不織布をＤＭＦで３回洗浄した後、少量のＤＭＦ中でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド５．５ｍｇと１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩９ｍｇを加え、室温で終夜振盪撹拌した。ＤＭＦで３回洗浄後、ＢＦＰ（ペプチド研究所製、ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬ−ＮＨ２）１  ｍｇとＲＧＤ（アナスペック社製、ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＫ））１ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン１μＬを加え、室温で終夜振盪撹拌した。その後、グリシンを１ｍｇ加え、室温で１．５時間振盪撹拌した。ＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄後減圧乾燥して、ＲＧＤとＢＦＰを固定化したナノファイバーを得た。
【００２１】
実施例４
［ＲＧＤ，  ＢＦＰ固定化ナノファイバーを用いた骨髄間質細胞の骨分化］
実施例３で得られたＲＧＤ，  ＢＦＰ固定化ナノファイバーを、実施例２と同様に０．５ｃｍ×０．５ｃｍの大きさに切断し、エタノールに浸漬して１５分間静置する事を３回繰返して殺菌した。減圧乾燥後、２４穴プレート（ヌンク、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）中で、ラットの大腿骨と脛骨から採取した骨髄間質細胞を少量の２０％のウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（日水製薬製）に分散し、細胞１０５個を加えた。１時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置して細胞をナノファイバーに接着させた後、２０％のウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地  ０．５ｍｌを加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で終夜培養した。その後、骨分化培地（１０  ｍＭβ−グリセロホスフェート、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸−２−ホスフェート、１００ｎＭデキサメタゾンを含む２０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ）中で２７日間培養した。その間３−４日ごとに培地の半分を新鮮な骨分化培地と交換した。
【００２２】
２７日間骨形成培地中で培養したナノファイバーをＰＢＳで３回洗浄後、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中、４℃、２時間静置して固定化した。ＰＢＳ、水、メタノールの順に洗浄した後、減圧乾燥した。金蒸着後、走査型電子顕微鏡（日立社製Ｓ４６００型）で観察した。
走査型電子顕微鏡で観察した結果を図３に示す。骨髄間質細胞が、ナノファイバー不織布上に接着し、球状の骨芽細胞に分化して、ナノファイバー上に骨基質を形成している様子が観測された。
また、別の２７日間骨形成培地中で培養したナノファイバーをＰＢＳで３回洗浄後、７０％の４℃に冷却したエタノールに１時間浸漬して固定化した。その後、アリザリンレッドＳ染色液（２％水溶液、ｐＨ４．２にアンモニウム水で調節）に３０分間浸漬し、ミリＱ水で４回洗浄し、風乾した。
染色結果を図４に示す。ナノファイバー状不織布のほとんどが赤く染色され、石灰化していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の合成コラーゲンナノファイバーは、細胞増殖の足場材として有用であり、再生医療の分野に資するものである。  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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