(57)【要約】【課題】Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供する。【解決手段】ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変されたＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地からＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取すること、を含むＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法であって、
前記細菌が、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性が低下するように改変されている、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼが、nudH遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１または２に記載の方法：
（ａ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下した、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子を欠損させることにより、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下した、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、さらに、Ｌ−システイン生合成系酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ−システイン生合成系酵素が、セリンアセチルトランスフェラーゼおよび／または３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が増大することにより、および／または、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を前記細菌に保持させることにより、セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増大した、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が増大することにより、および／または、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を前記細菌に保持させることにより、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が増大した、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌が、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および／またはＬ−セリンによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保持するように改変されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、さらに、Ｌ−システイン排出因子の活性が増大するように改変されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−システイン排出因子が、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌が、パントエア属細菌またはエシェリヒア属細菌である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が、パントエア・アナナティスまたはエシェリヒア・コリである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記関連物質が、Ｌ−シスチン、Ｓ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルセリン、タウリン、ヒポタウリン、およびエルゴチオネインからなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記関連物質が、Ｌ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌科の細菌を用いたＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする細菌酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。
【０００３】
Ｌ−システインの生産に好適に用いられる微生物としては、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することによりＬ−システイン生産能が向上した微生物が知られている。例えば、Ｌ−システイン生産能を有する微生物として、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。また、セリンによるフィードバック阻害が低減された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献５、６）。
【０００４】
また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン分解系を抑制することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた細菌としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献７）、又はＯ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（
特許文献８）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
【０００５】
また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出能を強化することによっても向上させることができる。例えば、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子（非特許文献１、特許文献９）、及びYfiKタンパク質をコードするyfiK遺伝子（非特許文献２、特許文献１０）は、Ｌ−システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるmar−遺伝子座、acr−遺伝子座、cmr−遺伝子座、mex−遺伝子座、bmr−遺伝子座、qacA
−遺伝子座（特許文献９）、又はemrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcrもしくはcusA遺伝子
（特許文献１１）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。またYeaSタンパク質をコードするyeaS遺伝子およびその変異型遺伝子の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献１２）。
【０００６】
nudH遺伝子（rppH遺伝子やygdP遺伝子等ともいう）は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ（RNA pyrophosphohydrolase）をコードする遺伝子である。ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼは、ＲＮＡの三リン酸化された５’末端を加水分解し二リン酸（ピロリン酸）を遊離させる反応を触媒する酵素である。ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼは、Escherichia coli等
において、ｍＲＮＡの分解に関与することが知られている（非特許文献３）。しかしながら、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼとＬ−システイン生産との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2002-233384号公報
【特許文献２】特開平11-155571号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第20050112731号
【特許文献４】米国特許第6218168号
【特許文献５】米国特許第5856148号
【特許文献６】米国特許出願公開第20050009162号
【特許文献７】特開2003-169668号公報
【特許文献８】特開2005-245311号公報
【特許文献９】米国特許第5972663号
【特許文献１０】特開2004-049237号公報
【特許文献１１】特開2005-287333号公報
【特許文献１２】特開2010-187552号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dassler et al., Mol.Microbiol. 36. 1101-1112 (2000)
【非特許文献２】Franke I. et al., J Bacteriol. 2003 Feb;185(4):1161-6
【非特許文献３】Deana A. et al., The bacterial enzyme RppH triggers messenger RNA degradation by 5' pyrophosphate removal. Nature. 2008 Jan 17;451(7176):355-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように細菌を改変することによって、細菌のＬ−システイン生産能を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取すること、を含むＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法であって、
前記細菌が、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性が低下するように改変されている、方法。
［２］
前記ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼが、nudH遺伝子にコードされるタンパク質である、前記方法。
［３］
前記ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号８または１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
［４］
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下した、前記方法。
［５］
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子を欠損させることにより、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下した、前記方法。
［６］
前記細菌が、さらに、Ｌ−システイン生合成系酵素の活性が増大するように改変されている、前記方法。
［７］
前記Ｌ−システイン生合成系酵素が、セリンアセチルトランスフェラーゼおよび／または３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである、前記方法。
［８］
セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が増大することにより、および／または、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を前記細菌に保持させることにより、セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増大した、前記方法。
［９］
３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が増大することにより、および／または、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を前記細菌に保持させることにより、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が増大した、前記方法。
［１０］
前記細菌が、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および／またはＬ−セリンによるフィードバック阻害が低減または解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保持するように改変されている、前記方法。
［１１］
前記細菌が、さらに、Ｌ−システイン排出因子の活性が増大するように改変されている、前記方法。
［１２］
前記Ｌ−システイン排出因子が、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質である、前記方法。
［１３］
前記細菌が、パントエア属細菌またはエシェリヒア属細菌である、前記方法。
［１４］
前記細菌が、パントエア・アナナティスまたはエシェリヒア・コリである、前記方法。［１５］
前記関連物質が、Ｌ−シスチン、Ｓ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルセリン、タウリン、ヒポタウリン、およびエルゴチオネインからなる群より選択される、前記方法。
［１６］
前記関連物質が、Ｌ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、腸内細菌科に属する細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができ、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の方法は、Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取すること、を含むＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法であって、前記細菌が、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変されている方法である。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。
【００１５】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変された、Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌である。
【００１６】
＜１−１＞Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌
本発明において、「Ｌ−システイン生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。したがって、本発明において、「Ｌ−システイン生産能」とは、Ｌ−システインを生産する能力に限られず、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産する能力を意味してよい。Ｌ−システイン生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を培地に蓄積することができる細菌であってよい。「非改変株」とは、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変されていない対照株をいう。すなわち、非改変株としては、野生株や親株、例えばEscherichia coli K-12 MG1655株（ATCC 47076）やPantoea ananatis SC17株（FERM BP-11091）、が挙げられる。また、Ｌ−システイン生産能を有する細菌は、好ましくは、０．２ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００１７】
本発明において、「システイン」という用語は、特記しない限り、Ｌ−システインを意味する。また、本発明において、「Ｌ−システイン」という用語は、特記しない限り、フリー体のＬ−システイン、その塩、またはそれらの混合物を意味する。塩については後述する。これらのシステインに関する説明は、Ｌ−システインの関連物質についても準用できる。すなわち、例えば、「Ｏ−アセチルセリン」という用語は、特記しない限り、フリー体のＯ−アセチル−Ｌ−セリン、その塩、またはそれらの混合物を意味する。
【００１８】
細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換されることがある。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。また、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在する
ケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010参照）。これらのチアゾリジン
誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。また、Ｌ−シス
テインは、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、Ｌ−システインを生産する能力に加えて、これらＬ−システインを経由して生合成される化合物を生産する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。また、本発明の細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−システインの前駆体が生成することがある。Ｌ−システインの前駆体としては、Ｏ−アセチルセリンや、その異性体であるＮ−アセチルセリンが挙げられる。本発明において、「Ｌ−システインの関連物質」とは、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体（例えば、Ｓ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール）、前記のようなＬ−システインを経由して生合成される化合物（例えばγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン）、前記のようなＬ−システインの前駆体（例えば、Ｏ−アセチルセリンやＮ−アセチルセリン）、タウリン、ヒポタウリン、およびエルゴチオネインの総称である。
【００１９】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００２０】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリ
ヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００２１】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００２２】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルテ
ィ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091
）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２３】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２４】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００２５】
本発明の細菌は、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよく、Ｌ−システイン生産能を有するように改変されたものであってもよい。Ｌ−システイン生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にＬ−システイン生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のＬ−システイン生産能を増強することにより、取得できる。
【００２６】
Ｌ−システイン生産能の付与または増強は、従来、腸内細菌科に属する細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参
照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００２７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００２８】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する
。
【００２９】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
【００３０】
以下、Ｌ−システイン生産菌、およびＬ−システイン生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなＬ−システイン生産菌が有する性質およびＬ−システイン生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システインの生合成系が強化されるように細菌を改変する方法が挙げられる。「Ｌ−システインの生合成系を強化する」とは、Ｌ−システインの生合成に関与する酵素（Ｌ−システイン生合成系酵素ともいう）から選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強することをいう。Ｌ−システイン生合成系酵素としては、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、および同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素が挙げられる。Ｌ−システイン生合成系酵素として、具体的には、セリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）や３−ホスホグリセ
レートデヒドロゲナーゼ（PGD）が挙げられる。SATおよびPGDをコードする遺伝子を、そ
れぞれSAT遺伝子およびPGD遺伝子ともいう。Ｌ−システイン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子や、その他各種生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。例えば、SAT遺伝子として
、cysE遺伝子がエシェリヒア・コリの野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになっている（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。また、例えば、PGD遺伝子として、エシェリヒア・コリ
等の各種生物のserA遺伝子が知られている。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のcysE遺
伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするCysEタンパク質（SAT）のアミノ酸配列を、
それぞれ配列番号１１および１２に示す。また、エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のserA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするSerAタンパク質（PGD）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３および１４に示す。
【００３２】
また、SATはＬ−システインによるフィードバック阻害を受けるため、このフィードバ
ック阻害が低減又は解除されたSATを利用してもよい。「フィードバック阻害が低減又は
解除されている」ことを「フィードバック阻害に耐性」ともいう。本発明において、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解除されたSATを「変異型SAT」ともいう。また、変異型SATをコードする遺伝子を「変異型SAT遺伝子」ともいう。すなわち、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、変異型SAT遺伝子を
保持するように細菌を改変する方法も挙げられる。すなわち、本発明の細菌は、変異型SAT遺伝子を保持するように改変されていてもよい。変異型SAT遺伝子を細菌に保持させることによって、SAT活性を増強することができ得る。変異型SATとしては、野生型SATの256位のメチオニン残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異を有するSATや、野生型SATの256位のメチオニン残基からＣ末端側の領域を欠失する変異を有
するSATが挙げられる（特開平11-155571）。前記「リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基」としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基、及びロイシン残基を除く17種類のアミノ酸残基が挙げられる。前記「リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基」として、具体的には、イソロイシン残基およびグルタミン酸残基が挙げられる。また、変異型SATとしては、野生型SATの89〜96位のアミノ酸残基に１又は複数の変異を有するSAT（米国特許公開第20050112731(A1)）、野生型SATの95位のバリン残基及び96位のアスパラギン酸残基を、各々アルギニン残基及びプロ
リン残基に置換する変異を有するSAT（変異型遺伝子名cysE5、米国特許公開第20050112731(A1)）、及び野生型SATの167位のスレオニン残基をアラニン残基に置換する変異を有す
るSAT（変異型遺伝子名cysEX、米国特許第6218168号、米国特許公開第20050112731(A1)）も挙げられる。「野生型SAT」とは、上述の変異（Ｌ−システインによるフィードバック
阻害に耐性となる変異）を有していないSATをいう。ここでいう「野生型」とは、「変異
型」と区別するための便宜上の記載であり、上述の変異を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型SATとしては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のSATが挙げられる。また、野生型SATとしては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のSATの保存的バリアント（元の機能が維持されたバリアント）であって、上述の変異を有しないものも挙げられる。SATについての「元の機能」とは、SAT活性をいう。256位のメチオニ
ン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型SATをコードする変異型cysEを含むプラスミ
ドpCEM256Eを保持するエシェリヒア・コリJM39-8株（E. coli JM39-8(pCEM256E)、プライベートナンバー：AJ13391）は、1997年11月20日に通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、FERM P-16527の受
託番号のもとで寄託され、2002年７月８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-8112が付与されている。
【００３３】
また、変異型SATは、上記のようにＬ−システインによるフィードバック阻害に耐性と
なるように改変されたものであってもよいが、元来フィードバック阻害を受けないものであってもよい。例えば、シロイヌナズナのSATは、Ｌ−システインによるフィードバック
阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に用いることができる。シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子を含むプラスミドとして、pEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）が知られている。
【００３４】
また、PGDはＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、このフィードバック
阻害が低減又は解除されたPGDを利用してもよい。本発明において、Ｌ−セリンによるフ
ィードバック阻害が低減又は解除されたPGDを「変異型PGD」ともいう。また、変異型PGD
をコードする遺伝子を「変異型PGD遺伝子」ともいう。すなわち、Ｌ−システイン生産能
を付与又は増強するための方法としては、例えば、変異型PGD遺伝子を保持するように細
菌を改変する方法も挙げられる。すなわち、本発明の細菌は、変異型PGD遺伝子を保持す
るように改変されていてもよい。変異型PGD遺伝子を細菌に保持させることによって、PGD活性を増強することができ得る。変異型PGDとしては、野生型PGDの410位（Ｎ末端）のチ
ロシン残基を欠失する変異を有するPGD（変異型遺伝子名serA5、米国特許第6,180,373号
）が挙げられる。「野生型PGD」とは、上述の変異（Ｌ−セリンによるフィードバック阻
害に耐性となる変異）を有していないPGDをいう。ここでいう「野生型」とは、「変異型
」と区別するための便宜上の記載であり、上述の変異を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型PGDとしては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のPGDが挙げられる。また、野生型PGDとしては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のPGDの保存的バリアント（元の機能が維持されたバリアント）であって、上述の変異を有しないものも挙げられる。PGDについての「元の機能」とは、PGD活性をいう。
【００３５】
Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システイ
ンの排出系が強化されるように細菌を改変する方法も挙げられる。「Ｌ−システインの排出系を強化する」とは、Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質（Ｌ−システイン排出因子ともいう）から選択される１またはそれ以上のタンパク質の活性を増強することをいう。Ｌ−システイン排出因子としては、ydeD遺伝子（eamA遺伝子）にコードされるタンパク質（特開2002-233384）、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質（特開2004-049237）、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusA遺伝子にコードされる各タンパク質（
特開2005-287333）、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質（特開2010-187552）が知られている。一例として、エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のydeD遺伝子の塩基配列、及び
同遺伝子がコードするydeDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および１６に示す。また、野生型YeaSタンパク質の28位のスレオニン残基、137位のフェニルアラ
ニン残基、および／または188位のロイシン残基に変異を有するYeaSタンパク質を利用し
てもよい。上述の変異を有するYeaSタンパク質を「変異型YeaSタンパク質」ともいう。また、変異型YeaSタンパク質をコードする遺伝子を「変異型yeaS遺伝子」ともいう。すなわち、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、変異型yeaS遺伝子を保持するように細菌を改変する方法も挙げられる。すなわち、本発明の細菌は、変異型yeaS遺伝子を保持するように改変されていてもよい。変異型yeaS遺伝子を細菌に保持させることによって、Ｌ−システイン排出系を強化することができ得る（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。変異型YeaSタンパク質は、具体的には、YeaSタンパク質の28
位のスレオニン残基をアスパラギンに置換する変異、137位のフェニルアラニン残基をセ
リン、グルタミン、アラニン、ヒスチジン、システイン、及びグリシンのいずれかに置換する変異、および／または188位のロイシン残基をグルタミンに置換する変異を有してい
てよい（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。「野生型YeaSタンパク質」とは、上述
の変異を有していないYeaSタンパク質をいう。ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、上述の変異を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型YeaSタンパク質としては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のYeaSタンパク質が挙げられる。また、野生型YeaSタンパク質としては、エシェリヒア・コリ等の各種生物由来のYeaSタンパク質の保存的バリアント（元の機能が維持されたバリアント）であって、上述の変異を有しないものも挙げられる。YeaSタンパク質についての「元の機能」とは、腸内細菌科に属する細菌において発現を上昇させた際に腸内細菌科に属する細菌のＬ−システイン生産能を向上させる性質をいう。
【００３６】
本発明において、「野生型SATのＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番
号１２におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。また、本発明において、「野生型PGDのＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番号１４にお
けるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。また、本発明において、「野生型YeaSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、エシェリヒア・コリK-12 MG1655株の野生型YeaSタンパク質におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ
酸残基を意味する。アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端から数
えてＸ番目の位置を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。なお、
アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、「野生型SATの167位のスレオニン残基」とは、配列番号１２における167位のスレオニン残基に相当するアミノ酸残
基を意味し、167位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から166番目のアミノ酸残基が「野生型SATの167位のスレオニン残基」であるものとする。また、167位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から168番目のアミノ酸残基が「野生型SATの167位のスレオニン残基」であるものとする。
【００３７】
任意のSATのアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号１２におけるＸ位
のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該SATのアミノ酸配列と配列番
号１２のアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。同様に、PGDまた
はYeaSタンパク質についても、PGDまたはYeaSタンパク質と、配列番号１４のアミノ酸配
列またはエシェリヒア・コリK-12 MG1655株の野生型YeaSタンパク質のアミノ酸配列との
アライメントを行えばよい。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal
of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【００３８】
変異型遺伝子（すなわち、変異型SAT遺伝子、変異型PGD遺伝子、または変異型yeaS遺伝子）は、野生型遺伝子（すなわち、野生型SAT遺伝子、野生型PGD遺伝子、または野生型yeaS遺伝子）を変異型タンパク質（すなわち、変異型SAT、変異型PGD、または変異型YeaSタンパク質）をコードするよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology,
Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型遺伝子は、化学合成によっても取得できる。変異後のコドンは、目的のアミノ酸をコードするものであれば特に制限されないが、本発明の細菌で使用頻度の高いコドンを使用することが好ましい。
【００３９】
変異型遺伝子を保持するように細菌を改変することは、変異型遺伝子を細菌に導入することにより達成できる。また、変異型遺伝子を保持するように細菌を改変することは、自然変異や変異原処理により細菌が有する遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
【００４０】
また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群をコードするcysPTWAMクラスター遺伝子の発現を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強することができる（特開2005-137369号公報、EP1528108号明細書）。
【００４１】
また、硫化物は、cysK遺伝子およびcysM遺伝子それぞれによりコードされるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−ＡおよびＢにより触媒される反応を介してＯ−アセチル−Ｌ−セリンに取り込まれ、Ｌ−システインが産生する。したがって、これらの酵素はＬ−システイン生合成経路の酵素に含まれ、これらの酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強することができる。
【００４２】
また、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システインの分解系が抑制されるように細菌を改変する方法も挙げられる。「Ｌ−システイン分解系を抑制する」とは、Ｌ−システインの分解に関与するタンパク質（Ｌ−システイン分解酵素ともいう）から選択される１またはそれ以上のタンパク質の活性を増強することをいう。Ｌ−システイン分解酵素としては、特に制限されないが、metC遺伝子にコードされるシスタチオニン−β−リアーゼ（特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、tnaA遺伝子にコードされるトリプトファナーゼ（特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、cysM遺伝子にコードされるＯ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特開2005-245311）、malY遺伝子にコードされるMalY（特開2005-245311）パントエア・アナナティスのd0191遺伝子にコードされるシステインデスルフヒドラーゼ（特開2009-232844）が挙げられる。
【００４３】
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、具体的には、例えば、変異型SATをコードする種々のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15 (米国特許第6
,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子の
発現が増強されたE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラ
ーゼ活性が低下したE. coli (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされる
システインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)、ydeD遺伝子、変異型cysE遺伝子（cysEX遺伝子）、および変異型serA遺伝子（serA5遺伝子）を含むプラスミドpACYC-DES（特開2005-137369 (US20050124049(A1)、EP1528108(A1))）を保持するE. coli等のE. coli株が挙げられる。なお、pACYC-DESは、上記３遺伝子をpACYC184に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はompAプロモーター（PompA）により制御される。
【００４４】
Ｏ−アセチルセリンはＬ−システインの前駆体であるため、Ｏ−アセチルセリンの生合成経路はＬ−システインの生合成経路と共通する。また、Ｏ−アセチルセリンは、中性〜アルカリ性のpH領域において自然反応によって容易にＮ−アセチルセリンに変換される。また、上述したようなＬ−システイン排出因子には、Ｏ−アセチルセリンも排出することができるものが知られている。よって、これらＬ−システイン前駆体の生産能は、Ｌ−システインの生合成系の強化やＬ−システインの排出系の強化等の、Ｌ−システインの生産能を付与又は増強する方法を一部利用することにより、付与又は増強することができる。
【００４５】
Ｌ−システインを出発物質として生合成されるγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、及びＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素（目的化合物を分解する酵素も含む）の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。
【００４６】
例えば、γ−グルタミルシステイン生産能は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び／又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及び／又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に耐性の変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ−グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を付与又は増強することができる。グルタチオンの生産についてはＬｉらの総説（Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242）に詳しく記載されている。
【００４７】
Ｌ−メチオニン生産能は、Ｌ−スレオニン要求性またはノルロイシン耐性を付与することによって、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成
能を失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、Ｌ−メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子
にコードされている。また、Ｌ−メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ−シンテース、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIなどのＬ−メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ−シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に耐性の変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもＬ−メチオニンの生産能を付与又は増強することができる（特開2000-139471号、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成
されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471号、US20080311632）。よって、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するためには、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強する方法も有効である。
【００４８】
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、具体的には、例えば、E. coli AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。
【００４９】
また、Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、具体的には、例えば、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471号）も挙げられる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニン
シンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたＬ−スレオニン要求株である。AJ13425は、平成１０年５月１４日より、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄
託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。
【００５０】
シスタチオニン、ホモシステインはＬ−メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を付与又は増強するためには、上記のＬ−メチオニンの生産能を付与又は増強する方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を付与又は増強する方法として、具体的には、メチオニン要求性変異株を用いる方法（特願2003-010654
）や、発酵培地にシステイン（またはその生合成原料）及び／又はホモセリン（またはその生合成原料）を添加する方法（特開2005-168422）が挙げられる。ホモシステインはシ
スタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を付与又は増強するためには、シスタチオニン生産能を付与又は増強する方法も有効である。
【００５１】
また、Ｌ−メチオニンを出発物質として生合成されるＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素（目的化合物を分解する酵素も含む）の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を強化することや（EP0647712、EP1457569）、mdfA遺伝子にコードされる排出因子MdfAを強化すること（US7410789）で付与又は増強
することができる。
【００５２】
Ｌ−システイン生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、Ｌ−システイン生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。具体的には、例えば、Ｌ−システイン生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述するＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子およびＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【００５３】
＜１−２＞ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性の低下
本発明の細菌は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変されている。本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように腸内細菌科に属する細菌を改変した後に、Ｌ−システイン生産能を付与または増強することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように改変されたことにより、Ｌ−システイン生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００５４】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性が低下するように腸内細菌科に属する細菌を改変することによって、腸内細菌科に属する細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。
【００５５】
以下に、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼおよびそれをコードする遺伝子について説明する。
【００５６】
「ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ」とは、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をいう。「ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性」とは、ＲＮＡの三リン酸化された５’末端を加水分解し二リン酸（ピロリン酸）を遊離させる反応を触媒する活性をいう。また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子を「ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子」ともいう。
【００５７】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼとしては、nudH遺伝子にコードされるNudHタンパク質が挙げられる。nudH遺伝子は、rppH遺伝子やygdP遺伝子等とも呼ばれる。同様に、NudHタンパク質は、RppHタンパク質やYgdPタンパク質等とも呼ばれる。腸内細菌科に属する細菌が有するnudH遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるNudHタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ等の公開データベースから取得できる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のnudH遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3  GI:556503834)として登録されているゲノム配列中、2968447〜2968977位の配列の相補配列に相当する。また、エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のNudHタンパ
ク質は、GenBank accession NP_417307 (version NP_417307.1  GI:16130734)として登録されている。MG1655株のnudH遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするNudHタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および８に示す。パントエア・アナナティスAJ13355株のnudH遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1  GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、2891727〜2892254位の配列の相補配列に相当する。また、パントエア・アナナティスAJ13355株のNudHタン
パク質は、GenBank accession WP_013026988 (version WP_013026988.1  GI:502792012)
として登録されている。AJ13355株のnudH遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするNudHタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９および１０に示す。すなわち、Ｒ
ＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、例えば、上記例示したnudH遺伝子の塩基配列（例えば配列番号７または９に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼは、例えば、上記例示したNudHタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号８または１０に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００５８】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子、例えば上記例示したnudH遺伝子、のバリアントであってもよい。同様に、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼは、元の機能が維持されている
限り、上記例示したＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ、例えば上記例示したNudHタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「nudH遺伝子」という用語は、上記例示したnudH遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「NudHタンパク質」という用語は、上記例示したNudHタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子やＲＮＡピロホスホヒドロラーゼのホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００５９】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性を有することをいう。
【００６０】
タンパク質のＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ活性は、同タンパク質を基質（例えば三リン酸化されたモノまたはオリゴリボヌクレオチド）とインキュベートし、同タンパク質および基質依存的な二リン酸（ピロリン酸）の生成を測定することにより、測定できる（Vasilyev N, Serganov A. Structures of RNA complexes with the Escherichia coli RNA pyrophosphohydrolase RppH unveil the basis for specific 5'-end-dependent mRNA decay. J Biol Chem. 2015 Apr 10;290(15):9487-99.）。
【００６１】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００６２】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子のホモログまたはＲＮＡピロホスホヒドロラーゼのホモログは、例えば、上記例示したＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列または上記例示したＲＮＡピロホスホヒドロラーゼのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知のＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる
。
【００６３】
ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば配列番号８または１０に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００６４】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００６５】
また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を
有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００６６】
また、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば配列番号７または９に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的
なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以
上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同
性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1
×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を
挙げることができる。
【００６７】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる
ことができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリ
ダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００６８】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００６９】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:44
3 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００７０】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、HigGlns et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、HigGlns et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００７１】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア
＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸
配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、
スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパ
ク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的
としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用
できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を
行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００７２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００７３】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ−システイン生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００７４】
＜１−３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、SATやPGD等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【００７５】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株に対して増大していることを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味
してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【００７６】
タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【００７７】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００７８】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００７９】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、ト
ランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する
こともできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【００８０】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００８１】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによ
っても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）
、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロ
ンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。
【００８２】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００８３】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。
【００８４】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００８５】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上のタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８６】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得
した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【００８７】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【００８８】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことがで
きる。
【００８９】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldstein
らの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００９０】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あ
るいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００９１】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【００９２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００９３】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００９４】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エ
チルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処
理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００９５】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。腸内細菌科に属する細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）
、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）により行うことができる。
【００９６】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００９７】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【００９８】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方
法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して
、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００９９】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１００】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばＬ−システイン生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１０１】
＜１−４＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼ等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０１０２】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０３】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０４】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、
遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、
遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１０５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【０１０６】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０１０７】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１０８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１０９】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子としては、遺伝子の全領域あるいは一部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を導入した遺伝子が挙げられる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (200
0)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E.
H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組
み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１１０】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１１１】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０１１２】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１１３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１１４】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株
と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１５】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１６】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１１７】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、ＲＮＡピロホスホヒドロラーゼの活性低下に加えて、任意のタンパク質、例えばＬ−システインの生合成経路から分岐してＬ−システイン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０１１８】
＜２＞本発明のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養すること、および該培地よりＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取すること、を含むＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法である。同方法において、「Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物」を「目的物質」ともいう。
【０１１９】
使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、腸内細菌科に属する細菌等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する腸内細菌科に属する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１２０】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、植物由来原料を好適に用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、生成物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の５炭糖、グルコース等の６炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して５炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して６炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、本発明の微生物にグルコース等の６炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、６炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２１】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２２】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２３】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２４】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分とし
ては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１２５】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。
【０１２６】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、腸内細菌科に属する細菌等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する腸内細菌科に属する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１２７】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1〜50％（v/v）植菌することにより行ってよい。
【０１２８】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１２９】
培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH5〜8であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整すること
ができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、２０〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１０時間〜１２０時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中に目的物質が蓄積する。
【０１３０】
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【０１３１】
発酵液からの目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法（Nagai, H. et al.
, Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法（WO2008/078448、WO2008/078646）が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによって目的物質を回収することができる。回収される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【０１３２】
尚、回収される目的物質は、目的物質以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。目的物質は、所望の程度に精製されていてもよい。回収される目的物質の純度は、例えば50％（w/w）以上、好ましくは85％（w/w）以上、特に好ましくは95%（w/w）以上であってよい(JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878))。
【０１３３】
また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、例えば、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合は、例えば、ジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。また、Ｏ−アセチルセリンが培地に蓄積した場合は、Ｏ−アセチルセリンは中性〜アルカリ性のpH領域において自然反応によって容易にＮ−アセチルセリンに変換されるが、培養液のpHを酸性に保つことによりＮ−アセチルセリンへの変換を防ぐこともできる（US20020146783A1）。
【０１３４】
Ｌ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。Ｌ−システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステインが挙げられる。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１３６】
実施例：nudH遺伝子の欠損によるＬ−システイン生産増加効果
本実施例では、nudH遺伝子の欠損がＬ−システイン生産に及ぼす効果を調べるために、Pantoea ananatisのnudH遺伝子欠損株を構築し、Ｌ−システイン生産培養を行った。nudH遺伝子はＲＮＡピロホスホヒドロラーゼをコードする遺伝子である。なお、本実施例において生産される「Ｌ−システイン」とは、Ｌ−システイン関連物質も含む。
【０１３７】
（１）Pantoea ananatis SC17株由来nudH遺伝子欠損株の構築
Pantoea ananatis SC17（FERM BP-11091）を親株として、染色体上のnudH遺伝子を欠損した株を以下の手順で構築した。SC17株は、2009年2月4日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室
）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。
【０１３８】
nudH遺伝子の欠損には、Red-driven integration（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）を利用した。Red-driven integrationのホスト菌株としては、P. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株（WO2008/075483）
を用いた。P. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株は、Red-driven integrationを効率よく
行うためのホスト菌株であり、λファージのRed遺伝子産物に耐性なP. ananatis SC17(0)株（VKPM B-9246）に、λファージのgam、bet、及びexoの各遺伝子（以下、「λRed遺伝
子」）を発現するヘルパープラスミドRSF-Red-TERが導入された菌株である（WO2008/075483）。SC17(0)株は、2005年9 月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), FGUP GosNII Genetika, 住所：1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【０１３９】
（１−１）pMW118-λattL-spcr-λattRの構築
配列番号１のプライマー（CGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCGAATTCGTTATAATAACTATAACTAATAACG）は、pMW118-λattL-Kmr-λattR（WO2008/090770）のカナマイシン耐性遺伝子の直上流の相同配列に続いてEnterococcus faecalis由来スペクチノマイシ
ン耐性遺伝子上流の相同配列を含む構成を有する。配列番号２のプライマー（ACTATGAATCAACTACTTAGATGGTATTAGTGACCTGTAACAGACTGCAGCTGATTACCAATTAGAATGAATATTT）は、Enterococcus faecalis由来スペクチノマイシン耐性遺伝子下流の相補配列に続いてpMW118-λattL-Kmr-λattRのカナマイシン耐性遺伝子の直下流の相補配列を含む構成を有する。これら
のプライマーを用い、Enterococcus faecalis由来スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むpDG1726（WO2013069634A1）を鋳型としてPCRを行うことにより、pMW118-λattL-Kmr-λattRのattLの３’端の配列とattRの５’端の配列に挟まれたスペクチノマイシン耐性遺伝子
を含む約1.2kbのDNA断片を増幅した。
【０１４０】
P. ananatis SC17(0)/RSFRedTER株にpMW118-λattL-Kmr-λattR（WO2008/090770）をエレクトロポレーション法により導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールと40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地（0.5% 酵母エキス、1.0% トリプトン、0.5% NaCl、1.5% 寒天）で選択することにより、SC17(0)/RSFRedTER pMW118-λattL-Kmr-λattR株を得た。この株を、λRed遺伝子発現誘導のためIPTGを添加した条件で培養し、エレクトロポレーション
用の菌体を調製した。この菌体に、上述の約1.2kbのDNA断片をエレクトロポレーションにより導入し、100mg/Lのスペクチノマイシンを含むLB寒天培地で選択することにより、pMW118-λattL-Kmr-λattRのカナマイシン耐性遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置
換されたプラスミドpMW118-λattL-spcr-λattRを有するSC17(0)/RSFRedTER pMW118-λattL-spcr-λattR株を得た。この株より常法によりpMW118-λattL-spcr-λattRを抽出した
。
【０１４１】
（１−２）nudH遺伝子欠損株の構築
pMW118-λattL-spcr-λattRをテンプレートに、プライマーDPan nudH-Fw（AGGAGTGTGAAACAATCAGACCATTCAATTTTAGCTTTTGAGGTAGTCCGTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA：配列番号
３）およびプライマーDPan nudH-Rv（GCCACCTTTTCAACAATTTCTCGCAACTGAGTGAGCATAAAGGGCGTGGCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA：配列番号４）を用いたPCRを行い、増幅されたDNA断片を常法により精製した。得られた精製DNA断片をnudH::attL-Spc-attRと名付けた。
【０１４２】
P. ananatis SC17(0)/RSFRedTER株を、λRed遺伝子発現誘導のためIPTGを添加した条件で培養し、エレクトロポレーション用の菌体を調製した。この菌体に、上述のnudH::attL-Spc-attRをエレクトロポレーションにより導入し、LB培地（0.5% 酵母エキス、1.0% ト
リプトン、0.5% NaCl）中で３４℃にて２時間振とう培養した後に、スペクチノマイシン
を100mg/L含むLB寒天培地に塗布し、1晩３４℃にて培養し、スペクチノマイシン耐性株を得た。得られたスペクチノマイシン耐性株について、染色体DNAをテンプレートに、プラ
イマーPan nudH-CF（CCGACATTACGCCCCTAAGCGCCCGCAAAT：配列番号５）およびプライマーPan nudH-CR（AGATCTCATTAACCAGAATGTCGAGTGCTT：配列番号６）を用いたPCRにより、nudH
遺伝子がattL-Spc-attRと置換されていることを確認し、この株をSC17(0)ΔnudH株と命名した。
【０１４３】
次に、SC17(0)ΔnudH株の染色体DNAを精製し、この染色体DNA 10μgをエレクトロポレ
ーション法によりP. ananatis SC17株（FERM BP-11091）に導入し、スペクチノマイシン
を100mg/L含むLB寒天培地に塗布し、1晩３４℃にて培養し、スペクチノマイシン耐性株を得た。得られたスペクチノマイシン耐性株について、染色体DNAをテンプレートに、プラ
イマーPan nudH-CF（配列番号５）およびプライマーPan nudH-CR（配列番号６）を用いたPCRにより、nudH遺伝子がattL-Spc-attRと置換されていることを確認し、この株をSC17ΔnudH株と命名した。
【０１４４】
（２）Ｌ−システイン生産菌の構築
P. ananatis SC17株及びSC17ΔnudH株に、プラスミドpACYC-DES（特開2005-137369、US20050124049(A1)、EP1528108(A1)）をエレクトロポーレーションにより導入し、25 mg/L
のテトラサイクリン塩酸塩を含むLB寒天培地に塗布し、1晩３４℃にて培養し、pACYC-DES導入株を得た。得られたpACYC-DES導入株をそれぞれSC17/pACYC-DES株及びSC17ΔnudH/pACYC-DES株と名付け、Ｌ−システイン生産菌として以降の実験に用いた。pACYC-DESは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子（US20050112731(A1)）、Ｌ−システイン排出因子をコー
ドするydeD遺伝子（US5972663）、及びＬ−セリンによるフィードバック阻害が低減され
た３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子（US6180373
）の発現プラスミドである。これら３つの遺伝子は、いずれもエシェリヒア・コリK-12 MG1655株由来である。前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、167位のスレオニン残基がアラニン残基に置換されている。また、前記３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、410位のチロシン残基を欠失している。
【０１４５】
（３）Ｌ−システイン生産培養
nudH遺伝子の欠損がＬ−システイン生産に及ぼす効果を調べるため、先述のP. ananatisＬ−システイン生産菌SC17/pACYC-DES及びSC17ΔnudH/pACYC-DESを用いてＬ−システイ
ン生産培養を行い、Ｌ−システインの生産量を比較した。培養は、Ｌ−システイン生産のための硫黄源として、硫酸塩（硫酸アンモニウム）とチオ硫酸塩（チオ硫酸ナトリウム）を併用した条件（「Sulfate + Thiosulfate」）と、硫酸塩（硫酸アンモニウム）のみを
用いた条件（「Sulfate」）で実施した。前者の条件（Sulfate + Thiosulfate）では、下記組成のＬ−システイン生産培地を用いた。後者の条件（Sulfate）では、成分６（チオ
硫酸ナトリウム）を添加しないこと以外は、下記組成のＬ−システイン生産培地と同一の組成の培地を用いた。
【０１４６】
〔Ｌ−システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
(NH4)2SO4                       15g/L
KH2PO4                          1.5g/L
MgSO4・7H2O                     1g/L
チアミン塩酸塩                  0.1mg/L
成分２：
FeSO4・7H2O                     1.7mg/L
Na2MoO4・2H2O                   0.15mg/L
CoCl2・6H2O                     0.7mg/L
MnCl・4H2O                      1.6mg/L
ZnSO4・7H2O                     0.3mg/L
CuSO4・5H2O                     0.25mg/L
成分３：
トリプトン                      0.6g/L
イーストエクストラクト          0.3g/L
NaCl                            0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム                  20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物    135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム              4g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩              2mg/L
成分８：
グルコース                      40g/L 
各成分について、10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100／6倍（成分３）、100倍（
成分５）、350/4倍（成分６）、1000倍 （成分７）、10倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。殺菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行った。
【０１４７】
Ｌ−システイン生産培養は以下の手順で行った。各Ｌ−システイン生産菌を25 mg/Lの
テトラサイクリン塩酸塩を含むLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の
菌体を3回掻き取り（3ループ）、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだ上記
Ｌ−システイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量が両菌株でほぼ同じになるよう調整した。32℃にて振盪培養を行い、４８時間後に培養を終了した。培地中に生産されたＬ−システイン（Ｌ−システイン関連物質を含む）の定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33）に記載の方法で行った。各株とも８連で実験を行った
。培地中に生産されたＬ−システインの量を表１に示す。表１中、野生株とはSC17/pACYC-DESを、nudH欠損株とはSC17ΔnudH/pACYC-DESを示す。本結果より、いずれの硫黄源を用いた場合においてもnudH遺伝子欠損によりＬ−システインの蓄積が増加することがわかった。
【０１４８】
【表１】
2017143756.tif 000002
【０１４９】
〔配列表の説明〕
配列番号１〜６：プライマー
配列番号７：Escherichia coli K-12 MG1655のnudH遺伝子の塩基配列
配列番号８：Escherichia coli K-12 MG1655のNudHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：Pantoea ananatis AJ13355のnudH遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Pantoea ananatis AJ13355のNudHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：Escherichia coli K-12 MG1655の野生型cysE遺伝子（野生型SAT遺伝子）
の塩基配列
配列番号１２：Escherichia coli K-12 MG1655の野生型CysEタンパク質（野生型SAT）の
アミノ酸配列
配列番号１３：Escherichia coli K-12 MG1655の野生型serA遺伝子（野生型PGD遺伝子）
の塩基配列
配列番号１４：Escherichia coli K-12 MG1655の野生型SerAタンパク質（野生型PGD）の
アミノ酸配列
配列番号１５：Escherichia coli K-12 MG1655のydeD遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Escherichia coli K-12 MG1655のYdeDタンパク質のアミノ酸配列
【配列表】
2017143756000001.app