(57)【要約】【課題】長期にわたって心筋細胞の特性を維持できる心筋細胞の製造方法を提供すること。【解決手段】取得した多能性幹細胞に対して中胚葉細胞への分化誘導処理を行う工程（ａ）；工程（ａ）で分化誘導処理した多能性幹細胞の中から、心血管前駆細胞を分離する工程（ｂ）；工程（ｂ）で分離した心血管前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する工程（ｃ）；及び工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する工程（ｄ）；の工程（ａ）〜（ｄ）を備え、好ましくは、さらに、工程（ｄ）で調製した心筋細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養する工程（ｅ）；及び工程（ｅ）で培養した心筋細胞を、培養液中で培養する工程（ｆ）；の工程（ｅ）及び（ｆ）を備えた方法を用いて心筋細胞を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えたことを特徴とする心筋細胞の製造方法。
（ａ）取得した多能性幹細胞に対して中胚葉細胞への分化誘導処理を行う工程；
（ｂ）工程（ａ）で分化誘導処理した多能性幹細胞の中から、心血管前駆細胞を分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で分離した心血管前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する工程；
【請求項２】
多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
心血管前駆細胞がＰＤＧＦＲα陽性細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に心血管前駆細胞を分離することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間培養することを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
工程（ｄ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後８〜２２日目まで培養することを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
さらに、以下の工程（ｅ）及び（ｆ）を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
（ｅ）工程（ｄ）で調製した心筋細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で培養した心筋細胞を、培養液中で培養する工程；
【請求項８】
工程（ｅ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも２２日目の間培養することを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
工程（ｆ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後２３〜９１日目まで培養することを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９及び／又はＩＷＰ−４である請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法を用いて調製した心筋細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の心筋細胞を内皮細胞及び壁細胞と混合して培養することを特徴とする心筋シートの製造方法。
【請求項１４】
少なくとも７０日間の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる心筋細胞の集団。
【請求項１５】
Ｗｎｔシグナル阻害剤を備えたことを特徴とする、少なくとも７０日間の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる心筋細胞の集団を誘導するためのキット。
【請求項１６】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９及び／又はＩＷＰ−４であることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を効率よく製造（調製）する方法や、かかる製造方法により得られた心筋細胞や、かかる心筋細胞を培養する心筋シートの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋細胞は心臓のポンプ機能の原動力であり、生物個体が生命を維持するうえできわめて重要である。人為的に心筋細胞を製造し、種々の心臓疾患の再生医療に利用しようという試みが盛んに行われており、例えばシート状の心筋細胞を心臓に移植する方法が開発されている。このような再生医療では、移植された心筋細胞が生体内でその機能を維持し続けることが必須である。
【０００３】
また、医薬の開発の過程では、候補薬物の安全性を確認する目的で、当該薬物が心臓の機能に悪影響を与えないこと、すなわち心毒性を有しないことを調べることが求められている。心筋細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心毒性評価は、簡便であり多数の候補薬物の評価が可能である点で、動物を使用する方法に比較して有利である。しかし候補薬物の心毒性を正しく評価するためには高品質な心筋細胞の安定した入手が必要である。
【０００４】
心筋細胞の入手方法として、多能性の幹細胞（胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞等）から心筋細胞を分化させる方法が知られている（例えば特許文献１、非特許文献１〜３）。これらは幹細胞を出発材料とし、心筋細胞誘導能を有するタンパク質やＷｎｔ経路を阻害する薬剤の存在下での培養を経て心筋細胞への分化を誘導する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０９０５５８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Uosaki et al.:PLoS One 2011;6(8),e23657
【非特許文献２】Lian et al．:PNAS 2012;109，E1848-1857
【非特許文献３】Burridge et al．:Nature Methods 2014;11,855-860
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上に述べた従来の心筋細胞の製造方法では、長期にわたって心筋細胞の特性を維持できる心筋細胞を製造する方法は提供されていない。例えば非特許文献３記載の方法で製造された心筋細胞では、分化誘導開始後１５日目に９５％以上であった心筋細胞の特異的マーカーである心筋トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ：ｃＴｎＴ又はＴＮＮＴ２）の陽性率が分化誘導開始後６０日目には約６０％まで低下する。
【０００８】
再生医療及び薬物評価に使用するための細胞の安定供給、品質管理の観点からは、より形質の安定した心筋細胞を製造する方法が求められている。
【０００９】
本発明は、このような従来の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、長期にわたって心筋細胞の特性を維持できる心筋細胞の製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導工程の途中段階において心血管前駆細胞を単離する工程を実施することにより、高純度の心筋細胞を取得し得ることを初めて見出した。さらに本発明者らは、当該方法の過程でＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を特定の時期に共存させた場合に、心筋細胞の収量が向上し、かつ得られた心筋細胞が長期にわたってその特性を維持することを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えたことを特徴とする心筋細胞の製造方法。
（ａ）取得した多能性幹細胞に対して中胚葉細胞への分化誘導処理を行う工程；
（ｂ）工程（ａ）で分化誘導処理した多能性幹細胞の中から、心血管前駆細胞を分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で分離した心血管前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する工程；
〔２〕多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞であることを特徴とする上記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕心血管前駆細胞がＰＤＧＦＲα陽性細胞であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕工程（ｂ）において、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に心血管前駆細胞を分離することを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕工程（ｃ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間培養することを特徴とする上記〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕工程（ｄ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後８〜２２日目まで培養することを特徴とする上記〔５〕に記載の製造方法。
〔７〕さらに、以下の工程（ｅ）及び（ｆ）を備えることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
（ｅ）工程（ｄ）で調製した心筋細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で培養した心筋細胞を、培養液中で培養する工程；
〔８〕工程（ｅ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも２２日目の間培養することを特徴とする上記〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕工程（ｆ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後２３〜９１日目まで培養することを特徴とする上記〔８〕に記載の製造方法。
〔１０〕ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１１〕Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９及び／又はＩＷＰ−４である上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の製造方法を用いて調製した心筋細胞。
〔１３〕上記〔１２〕に記載の心筋細胞を内皮細胞及び壁細胞と混合して培養することを特徴とする心筋シートの製造方法。
〔１４〕少なくとも７０日間の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる心筋細胞の集団。
〔１５〕Ｗｎｔシグナル阻害剤を備えたことを特徴とする、少なくとも７０日間の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる心筋細胞の集団を誘導するためのキット。
〔１６〕Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９及び／又はＩＷＰ−４であることを特徴とする上記〔１５〕に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、多能性幹細胞から長期にわたって特性を維持できる心筋細胞を効率的かつ高収量で製造することが可能となる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、心筋細胞の移植を必要とする疾患の治療、心筋細胞の異常等に起因する疾患の細胞モデル、薬物の安全性評価のための材料として使用することができる。また、本発明の方法により得られた心筋細胞を内皮細胞及び壁細胞と混合して培養することにより心筋シートを製造することができる。また、心筋細胞を長期間（少なくとも７０日間）にわたって培養・維持できるため、再生医療における良質な心筋細胞を、心筋細胞の製造地域やその周辺地域のみならず、遠隔地へ提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】分化誘導開始後２１、３１、４１、５１、６１及び９１日目の細胞のｃＴｎＴ陽性率を示す。
【図２】分化誘導開始後２１、３１、４１、５１、６１及び９１日目の生細胞数を示す。
【図３】分化誘導開始後５日目〜９日目の間、Ｙ−２７６３２を含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養したときの、９日目の細胞の顕微鏡画像を示す。
【図４】分化誘導開始後５日目〜９日目の間、Ｗｎｔ阻害剤（ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ−４）を含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養したとき、ＸＡＶ９３９を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養したとき、ＩＷＰ−４を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養したとき、及び、ＸＡＶ９３９とＩＷＰ−４の両方を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養したときの、２１日目の細胞のｃＴｎＴ陽性率を示す。
【図５】分化誘導開始後１１、１６、２１、２６、及び３１日目の細胞のｃＴｎＴ陽性率を示す。
【図６】分化誘導開始後２３日目〜９１日目の間、Ｂ２７サプリメントに代えて１０％血清を含む培地中で細胞を培養したときの、６１日目（図６Ａ）及び９１日目（図６Ｂ）の細胞のｃＴｎＴ陽性率を示す。なお、各データの縦軸は側方散乱（ＳＳＣ）レベルを示し、横軸は抗ｃＴｎＴ−ＦＩＴＣ抗体で検出された蛍光レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の心筋細胞の製造方法としては、取得した多能性幹細胞に対して中胚葉細胞への分化誘導処理を行う工程（ａ）；工程（ａ）で分化誘導処理した多能性幹細胞の中から、心血管前駆細胞を分離する工程（ｂ）；工程（ｂ）で分離した心血管前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する工程（ｃ）；及び工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する工程（ｄ）；の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備えた方法（以下、「本発明の製造方法１」ということがある）であれば特に制限されず、調製した心筋細胞を長期間（少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間、さらに好ましくは少なくとも４０日間、さらにより好ましくは少なくとも５０日間、特に好ましくは少なくとも６０日間、最も好ましくは少なくとも７０日間）培養・維持する場合、さらに、工程（ｄ）で調製した心筋細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養する工程（ｅ）；及び工程（ｅ）で培養した心筋細胞を、培養液中で培養する工程（ｆ）；の工程（ｅ）及び（ｆ）を順次備えた方法が好ましい。
【００１５】
本発明において、「心血管前駆細胞」とは、中胚葉細胞に属し、拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞及び血管平滑筋を生じる能力を有する細胞への分化能を有する細胞を意味し、通常はＰＤＧＦＲα陽性の細胞であり、ＣＤ８２陽性の細胞もＣＤ８２陰性の細胞も含む。また、本発明において、「心筋細胞」とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味し、通常はｃＴｎＴ陽性の細胞である。
【００１６】
本発明の製造方法１を用いると、少なくとも７０日間（好ましくは７５日間、より好ましくは８０日間）の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる高純度な心筋細胞集団を製造することができる。すなわち、本発明において「心筋細胞（の集団）」とは、細胞集団中に含まれる心筋細胞（ｃＴｎＴ陽性細胞）数の割合が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８８％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の高純度な心筋細胞集団を意味する。
【００１７】
上記心血管前駆細胞は、Ｎｋｘ２．５（NK-2 transcription factor related, locus 5）、ｉｓｌｅｔ１、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ（Myocyte Enhancer Factor 2C）、ＭＥＳＰ１（Mesoderm Posterior 1）等の転写因子や、血小板由来増殖因子受容体α（Platelet-Derived Growth Factor Receptor α：ＰＤＧＦＲα）、ＫＤＲ、Ｆｌｋ１、ＣＤ（cluster of differentiation）４４等の細胞表面抗原などの心血管前駆マーカーが通常発現している。すなわち、上記心血管前駆細胞としては、具体的には、Ｎｋｘ２．５陽性、ｉｓｌｅｔ１陽性、Ｔｂｘ５陽性、Ｔｂｘ２０陽性、ＧＡＴＡ４陽性、ＭＥＦ２Ｃ陽性、ＭＥＳＰ１陽性、ＰＤＧＦＲα陽性、ＫＤＲ陽性、Ｆｌｋ１陽性、及び／又はＣＤ４４陽性細胞を挙げることができ、ＰＤＧＦＲα陽性細胞が好ましい。
【００１８】
上記心血管前駆細胞は、心血管前駆細胞が、ＰＤＧＦＲα陰性細胞等の他の細胞集団中に含まれた状態のものであってもよく、ここで他の細胞集団中に含まれる心血管前駆細胞の割合としては、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％等を挙げることができる。
【００１９】
上記多能性幹細胞の生物種としては、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができ、これらの中でもマウス、ブタ、又はヒトが好ましく、心筋細胞を心疾患治療に用いる場合、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２０】
上記多能性幹細胞としては、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞であればよく、具体的には、初期胚より単離された胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離された胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離された生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-349参照）や、皮膚、骨髄等の間葉系組織から選択して得られた多能性を有する細胞（Ｍｕｓｅ細胞［Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell］）や、核移植により得られたクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞（例えば、Science. 2001， 292：740-743；Biol．Reprod．2005, 72：932-936；Nature. 2007， 450：497-502参照）や、体細胞と卵子又はＥＳ細胞とを融合させることにより得られた多能性を有する細胞（融合幹細胞）や、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ；induced pluripotent stemcell）を挙げることができ、これらの中でもｉＰＳ細胞が好ましく、本発明の製造方法１により得られた心筋細胞を心疾患治療に用いる場合、移植による拒絶反応のリスクを考慮すると、心疾患に罹患した患者由来の体細胞から得られたｉＰＳ細胞や、心疾患に罹患した患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ；Human leukocyte antigen）遺伝子型が同一又は実質的に同一である対象（ヒト）由来の体細胞から得られたｉＰＳ細胞を好適に例示することができる。ここで「ＨＬＡ遺伝子型が実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることを意味する。したがって、上記ＨＬＡ遺伝子型が実質的に同一である対象（ヒト）由来の体細胞としては、具体的には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲのＨＬＡ遺伝子型３種、或いはかかるＨＬＡ遺伝子型３種にＨＬＡ−Ｃを加えたＨＬＡ遺伝子型４種が一致するＨＬＡ遺伝子型が同一である対象（ヒト）由来の体細胞を挙げることができる。
【００２１】
ＥＳ細胞は、内部細胞塊を、マイトマイシンＣ処理済のマウス胎仔由来の初代線維芽細胞［ＭＥＦ］、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等のフィーダー細胞上で後述する血清含有又は無血清培養液中に培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。
【００２２】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む後述する血清含有又は無血清培養液中で培養することにより製造することができる（例えば、Ce11. 1992, 70:841-847参照）。
【００２３】
ＧＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で精巣細胞の継代を繰り返すことにより製造することができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
【００２４】
Ｍｕｓｅ細胞は、皮膚、骨髄等の間葉系組織を、トリプシンや低酸素処理などのストレスを与えることによりストレス耐性の細胞を選択したり、あるいは多能性幹細胞の表面抗原であるＳＳＥＡ−３の発現を指標として細胞を選択し、さらに単一細胞の状態で浮遊培養を重ねることにより、細胞を単離することにより製造することができる（特許第５１８５４４３号公報、Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107: 8639-8643）。
【００２５】
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術とＥＳ細胞作製技術とを組み合わせて製造することができる（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
【００２６】
融合幹細胞は、体細胞と卵子又はＥＳ細胞とを融合させることにより製造することができる（例えば、Curr．Biol． 2001, 11:1553-1558；Science. 2005, 26:1369-1373参照）。
【００２７】
ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じて更にｃ−Ｍｙｃ又はｎ−Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（例えば、Ce11. 2006, 126:663-676、Nature. 2007, 448:313-317、Nat Biotechno1. 2008, 26;101-106、Cel1. 2007, 131:861‐872、Science. 2007, 318:1917-1920、Ce11 Stem Cells. 2007, 1:55-70、Nat Biotechnol. 2007, 25:1177-1181、Nature. 2007, 448:318-324、Cell Stem Cells. 2008, 2:10-12、Nature. 2008, 451:141-146、Science. 2007, 318:1917-1920参照）。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（例えば、Nature. 1997, 385:810-813、Science. 1998, 280:1256-1258、Nature Biotechnology. 1999, 17:456-461、Nature. 1998, 394:369-374、Nature Genetics. 1999, 22:127-128、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96:14984-14989参照）、Rideout IIIら（NatureGenetics. 2000, 24:109-110）。多能性幹細胞としては、具体的に、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）、ヒトＥＳ細胞Ｈ１（ＷＡ０１）株（National Stem Cell bank、WISC Bank）、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３（いずれも京大再生研付属幹細胞医学研究センター）、ＨＥＳ３、ＨＥＳ４、及びＨＥＳ６（いずれもNational Stem Cell bank、モナッシュ大学）等のヒトＥＳ細胞や、２０１Ｂ７、２０１Ｂ７−Ｆｆ、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２及び８３６Ｂ３（いずれもｉＰＳアカデミアジャパン社、又は京都大学ｉＰＳ研究所）、Ｔｉｃ(ＪＣＲＢ１３３１株)、Ｄｏｔｃｏｍ（ＪＣＲＢ１３２７株)、Ｓｑｕｅａｋｙ(ＪＣＲＢ１３２９株)、及びＴｏｅ（ＪＣＲＢ１３３８株)、 Ｌｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株)（以上成育医療センター、医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部・ＪＣＲＢ細胞バンク）、ＵＴＡ−１株及びＵＴＡ−１−ＳＦ−２−２株（いずれも東京大学）等のｉＰＳ細胞を例示することができる。
【００２８】
＜工程（ａ）＞
上記工程（ａ）における分化誘導処理する方法としては、少なくとも心血管前駆細胞へ分化誘導できれば特に制限されず、心血管前駆細胞へ分化誘導処理する方法の他、心血管前駆細胞へ分化誘導した後、さらにＶＥＧＦを含有する培養液で培養することにより、心筋前駆細胞、内皮細胞及び壁細胞から構成される混合細胞を調製する方法（国際公開第２０１３／１３７４９１号パンフレット）も含まれる。
【００２９】
具体的には、例えば、文献（Yamashita, J. et al., Nature 408: 92-96 (2000)、Yamashita, J.K. et al., FASEB J. 19: 1534-1536 (2005)、Narazaki, G., Circulation 118: 498-506 (2008）)に記載の方法に従って、幹細胞をコラーゲンＩＶコーティングディッシュ（ＬＩＦ不含、フィーダー細胞無し）上で培養することにより、中胚葉前駆細胞であるＦｌｋ１（血管内皮増殖因子受容体−２［ＶＥＧＦＲ２］とも呼ばれる）陽性細胞へ分化誘導し、さらに、Ｆｌｋ１陽性細胞を、シクロスポリン−Ａ（ＣＳＡ）を含有する培養液中で培養することにより、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（特表２０１１−５１５０６４号公報）や、幹細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有する培養液中で浮遊培養させることにより、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（国際公開第２００６／０９３２７６号パンフレット）や、幹細胞をノギン、コーディン等のＢＭＰアンタゴニストを含有する培養液中で接着培養又は浮遊培養させることにより、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（国際公開第２００５／０３３２９８号パンフレット）や、幹細胞を、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ若しくはＷｎｔ−５ａ、ＧＳＫ３β阻害剤、又はアミノピリミジン誘導体であるＷｎｔアゴニストを含有する培養液中で培養することにより、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させ、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（国際公開第２００７／１２６０７７号パンフレット）や、幹細胞を、アクチビンＡを含有する培養液中で培養後、ＢＭＰ４を含有する培養液中で培養させることにより、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（特開２０１３−２１５２０６号公報、Laflamme, M.A. et al., Nat Biotechnol, 25: 1015-1024 (2007)）や、幹細胞をコーティング剤で処理された培養容器上で接着培養させ、さらにかかるコーティング剤を添加することで、幹細胞全体を上記コーティング剤でコーティング（サンドイッチ処理）し、アクチビンＡを含有する培養液中で培養後、ＢＭＰ４及びｂＦＧＦを含有する培養液中で培養させることにより、心血管前駆細胞へ分化誘導する方法（以下、「本件好適な分化誘導処理方法」ということがある）を挙げることができ、これらの中でも本件好適な分化誘導処理方法、すなわち、アクチビンＡを含有する培養液中で細胞培養する工程（ｉ）と、ＢＭＰ４を含有する培養液中で細胞培養する工程（ii）の２段階の工程により分化誘導処理する方法が好ましい。本件好適な分化誘導処理方法における工程（ｉ）及び（ii）の詳細について、以下に説明する。
【００３０】
（ｉ）アクチビンＡを含有する培養液を用いて細胞培養する工程
工程（ｉ）において、任意の方法で取得した多能性幹細胞を、アクチビンＡを含有する培養液中で浮遊培養又は接着培養（好ましくは、接着培養）する。培養容器は、多能性幹細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければ素材、形状はどのようなものであってもよく、かかる培養容器の素材としては、例えばガラス、不織布を含む合成樹脂や、天然樹脂又は金属等を挙げることができる。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等を挙げることができる。培養器は、市販の培養フラスコ、培養皿（培養ディッシュ）、培養バッグなどを用いることもできる。
【００３１】
上記「浮遊培養」とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することを意味し、浮遊培養は、通常、細胞接着性物質（例えば細胞外マトリックス）によりコーティングされていない培養容器や、人工的に接着を抑制する処理（例えばポリヒドロキシエチルメタクリル酸［ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ］によるコーティング）がなされた培養容器を用いて行われる。
【００３２】
また、接着培養は、通常、コーティング剤で処理された培養容器を用いて行われる。かかるコーティング剤としては、例えばマトリゲル、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ポリリジン、ゼラチン、ラミニン、へパラン硫酸プロテオグリカン又はエンタクチン、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）、及びこれらの組み合わせを挙げることができ、マトリゲルが好ましい。
【００３３】
接着培養した多能性幹細胞を培養容器から分離（剥離）する方法としては、物理的方法、キレート剤を用いる方法、プロテアーゼ活性及び／又はコラゲナーゼ活性を有する細胞分離液（例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロナーゼ、ペプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ等）を用いて処理する方法やそれらの組合せを挙げることができ、細胞分離液を用いた処理方法を好適に例示することができる。多能性幹細胞は、通常、培養容器に対して約８０％コンフルエントを目安にして継代・維持する。
【００３４】
工程（ｉ）における培養液としては、血清含有培養液であっても、無血清培養液であってもよい。かかる血清含有培養液としては、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＡＩＭ−Ｖ等）を挙げることができ、また、上記無血清培養液としては、市販のＢ２７サプリメント（−インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１〜３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。
【００３５】
工程（ｉ）における培養液には、例えば、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール［dithiothreitol；ＤＴＴ］等）、鉄源（例えば、トランスフェリン等）、ミネラル（例えば、亜セレン酸ナトリウム）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン、アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン等の非必須アミノ酸）、ビタミン類（例えば、塩化コリン、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサル、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール等）、糖類（例えば、グルコース等）、有機アミン類（例えば、プトレシン等）、ステロイド（例えば、プロゲステロン、β-エストラジオール等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６等）、接着因子（例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン等）、有機酸（例えば、ピルビン酸、コハク酸、乳酸等）若しくはその塩、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）及びこれらの組合せから選択される添加剤を必要に応じて適宜補充してもよい。
【００３６】
工程（ｉ）の培養液に含まれるアクチビンＡの濃度としては、通常５〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲内であり、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５〜５００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍＬである。
【００３７】
工程（ｉ）における培養液としては、ＢＭＰ４を含有するものであっても、ＢＭＰ４を含有しないものであってもよいが、ＢＭＰ４を含有する場合、中胚葉細胞への分化誘導処理に影響を及ぼさない濃度でＢＭＰ４を含有するものが好ましい。かかる中胚葉細胞への分化誘導処理に影響を及ぼさないＢＭＰ４の濃度としては、２ｎｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００３８】
工程（ｉ）における細胞の培養温度は、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、工程（ｉ）における培養時間は、通常６時間〜５日間の範囲内であり、好ましくは１２〜４８時間である。
【００３９】
（ii）ＢＭＰ４を含有する培養液を用いて細胞培養する工程
工程（ii）は、工程（ｉ）で培養後の細胞を、ＢＭＰ４を含有する培養液中で浮遊培養又は接着培養（好ましくは、接着培養）する。簡便性の面から、通常アクチビンＡを含有する培養液を、ＢＭＰ４を含有する培養液へ交換することにより行う。
【００４０】
工程（ii）における培養液としては、上記血清含有培養液であっても、上記無血清培養液であってもよく、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；basic fibroblast growth factor）をさらに含むものが好ましい。培養液に含まれるｂＦＧＦの濃度としては、通常０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜５０ｎｇ／ｍＬである。また、培養液には、上記添加剤を必要に応じて適宜補充してもよい。
【００４１】
工程（ii）の培養液に含まれるＢＭＰ４の濃度としては、通常０．５〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲内であり、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜５０ｎｇ／ｍＬである。
【００４２】
工程（ii）における培養液としては、アクチビンＡを含有するものであっても、アクチビンＡを含有しないものであってもよいが、アクチビンＡを含有する場合、中胚葉細胞への分化誘導処理に影響を及ぼさない濃度でアクチビンＡを含有するものが好ましい。かかる中胚葉細胞への分化誘導処理に影響を及ぼさないアクチビンＡの濃度としては、５０ｎｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらにより好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００４３】
工程（ii）における細胞の培養温度は、前述したように、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、前述したように、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、前述したように、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、工程（ii）における培養時間は、通常１〜１０日間の範囲内であり、好ましくは２〜６日間、より好ましくは３〜５日間である。
【００４４】
＜工程（ｂ）＞
上記工程（ｂ）において、分化誘導処理した多能性幹細胞の中から、心血管前駆細胞を分離する。ここで「分離」とは、心血管前駆細胞を培養容器から物理的に取り出すことを意味する。心血管前駆細胞が接着培養している場合、２０〜３７℃の範囲内の温度条件下で上記細胞分散液による処理を行うことにより心血管前駆細胞を培養容器から剥離させ、培養容器から心血管前駆細胞を含む培養液を、デカンテーションで別の容器へ分離したり、ピペットやピペットマンを用いて別の容器へ分離することができ、また、心血管前駆細胞が培養液中に浮遊培養している場合、培養容器から心血管前駆細胞を含む培養液を、デカンテーションで別の容器へ分離したり、ピペットマンを用いて別の容器へ分離することができる。
【００４５】
分離した細胞集団に心血管前駆細胞が含まれることは、上記心血管前駆マーカーから選択される少なくとも１つ（好ましくは、ＰＤＧＦＲα）が陽性であることにより確認できる。上記心血管前駆マーカーの発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、サザンブロティング法等のｍＲＮＡの発現を解析する方法や、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等のタンパク質の発現を解析する方法を用いて検出することにより、確認することができる。
【００４６】
かかる分離した心血管前駆細胞を用いて高純度な心筋細胞を調製する場合、高純度な心血管前駆細胞として単離処理を施した心血管前駆細胞を用いることが好ましい。心血管前駆細胞の単離は、蛍光物質で標識した、上記心血管前駆マーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳや、蛍光物質やビオチン、アビジン等の標識物質で標識した、上記心血管前駆マーカーに対する抗体と、かかる標識物質に対する抗体とＭＡＣＳビーズ（磁性ビーズ）とのコンジュゲート抗体とを用いた自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ）により行うことができる。上記蛍光物質としては、ＡＰＣ、ＰＥ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７等を挙げることができる。
【００４７】
多能性幹細胞が心血管前駆細胞へ分化誘導される時期は、分化誘導後の各時間の細胞サンプルを、上記心血管前駆マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現を解析する方法や、上記心血管前駆マーカータンパク質の発現を解析する方法を用いて、上記心血管前駆マーカー陽性細胞を検出することにより確認することができる。
【００４８】
分化誘導処理した多能性幹細胞の中から心血管前駆細胞を分離する時期としては、分化誘導処理方法や培養条件により異なるため、一概に特定することはできないが、通常分化誘導処理後１〜１４日目であり、好ましくは３〜１１日目であり、より好ましくは４〜８日目であり、さらに好ましくは４〜６日目である。
【００４９】
＜工程（ｃ）＞
上記工程（ｃ）において、心血管前駆細胞を、Rho結合リン酸化酵素（Rho-associated protein kinase：ＲＯＣＫ）阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む培養液中で培養する。かかる培養液としては、上記血清含有培養液であっても、上記無血清培養液であってもよい。また、かかる培養液には、上記添加剤の他、細胞増殖因子（例えば、インスリン、上皮成長因子［ＥＧＦ；Epidermal growth factor］、インスリン様成長因子［ＩＧＦ；Insulin-like growth factor］、ｂＦＧＦ、血小板由来成長因子［ＰＤＧＦ；Platelet-derived growth factor］、血管内皮細胞増殖因子［ＶＥＧＦ；Vesicular endothelial growthfactor］、肝細胞増殖因子［ＨＧＦ；Hepatocyte growth factor］、ＦＧＦ９、骨形成タンパク質４［ＢＭＰ４；bone morphogenetic protein 4］、ＢＭＰ５、アクチビンＡ、幹細胞因子［ＳＣＦ］、Ｄｋｋ１［Dickkopf-1］、白血病抑制因子［ＬＩＦ；Leukemia Inhibitory Factor］、ＴＧＦ−β等）を必要に応じて補充しても、補充しなくてもよい。
【００５０】
上記工程（ｃ）におけるＲＯＣＫ阻害剤としては、ＲＯＣＫ、すなわち、低分子量のＧＴＰ結合タンパク質であるＲｈｏで制御されるプロテインキナーゼの機能を阻害（抑制）できるものであれば特に限定されず、具体的には、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７ともいう）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１等の低分子化合物及びそれらの誘導体や、ＲＯＣＫ遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、ＲＯＣＫに対する競合ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターを挙げることができ、低分子化合物であるＲＯＣＫ阻害剤が好ましく、Ｙ−２７６３２を好適に例示することができる。また、本発明において、２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を併用してもよい。
【００５１】
培養液に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができ、例えばＹ−２７６３２を用いる場合、通常１〜１００μＭの範囲内であり、好ましくは２〜５０μＭ、より好ましくは１０〜４０μＭである。
【００５２】
上記工程（ｃ）におけるＷｎｔシグナル阻害剤としては、遺伝子発現や細胞骨格の制御に関与するＷｎｔシグナル経路を抑制できるものであれば特に限定されず、具体的には、ＸＡＶ９３９（ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤）、ＩＷＰ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＲ−１、５３ＡＨ（以上ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤）、ＫＹ０２１１１などの低分子化合物及びそれらの誘導体や、ＩＧＦＢＰ４、ＤＫＫ１、Ｗｎｔ−Ｃ５９などのタンパク質や、Ｗｎｔ及びＷｎｔシグナル経路を構成する蛋白質の発現又は機能を抑制するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、競合ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターを挙げることができ、低分子化合物であるＷｎｔシグナル阻害剤が好ましく、ＸＡＶ９３９やＩＷＰ−４を好適に例示することができる。また、本発明において、２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよく、特にＸＡＶ９３９とＩＷＰ−４を併用することが好ましい。
【００５３】
培養液に含まれるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度としては、Ｗｎｔシグナル阻害剤の種類に応じて適宜選択することができ、例えばＸＡＶ９３９を用いる場合、通常０．０２５〜１００μＭの範囲内であり、好ましくは０．０７５〜５０μＭ、より好ましくは０．２５〜１０μＭであり、ＩＷＰ−４を用いる場合、通常０．０１２５〜５０μＭの範囲内であり、好ましくは０．０７２５〜１５μＭ、より好ましくは０．１２５〜５μＭである。
【００５４】
上記工程（ｃ）において、細胞を培養する時期としては、分化誘導処理方法や培養条件により異なるため、一概に特定することはできないが、通常、細胞がＰＤＧＦＲａを発現している時期であり、具体的には、工程（ｂ）において、心血管前駆細胞の分離を、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に行った場合、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間が好ましく、少なくとも５〜８日目の間がより好ましい。
【００５５】
上記工程（ｃ）における細胞の培養温度は、前述したように、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、前述したように、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、前述したように、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、上記工程（ｃ）における培養時間は、通常２〜６日間の範囲内であり、好ましくは２〜４日間であり、より好ましくは３〜４日間である。
【００５６】
＜工程（ｄ）＞
上記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で培養した細胞を培養液中で培養し、心筋細胞を調製する。かかる培養液としては、上記血清含有培養液であっても、上記無血清培養液であってもよい。また、かかる培養液には、上記添加剤や細胞増殖因子を必要に応じて補充しても、補充しなくてもよい。また、かかる培養液としては、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含むものであっても、含まないものであってもよいが、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む場合、心筋細胞の成熟化に影響を及ぼさない濃度でＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含有するものが好ましい。ここで「成熟した心筋細胞」とは、成人の完全に成熟した心筋細胞と同等の性質を示す細胞を意味する。成熟した心筋細胞は、通常ＭＬＣ２ｖ陽性である。ＭＬＣ２ｖは、ミオシン軽鎖２（Myosin Light Chain 2）のアイソフォームの一つであり、成人の心臓においては、心室の心筋細胞で強く発現する。
【００５７】
上記工程（ｄ）において、細胞を培養する時期としては、分化誘導処理方法や培養条件により異なるため、一概に特定することはできないが、工程（ｂ）において、心血管前駆細胞の分離を、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に行い、かつ、工程（ｃ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間培養した場合、工程（ａ）で分化誘導処理後８〜２２日目までが好ましく、９〜２１日目までがより好ましい。
【００５８】
上記工程（ｄ）における細胞の培養温度は、前述したように、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、前述したように、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、前述したように、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、上記工程（ｄ）における培養時間は、通常５〜１３日間の範囲内であり、好ましくは７〜１３日間であり、より好ましくは９〜１３日間である。
【００５９】
＜工程（ｅ）＞
上記工程（ｅ）において、工程（ｄ）で調製した心筋細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液中で培養する。かかる培養液としては、上記血清含有培養液であっても、上記無血清培養液であってもよい。また、かかる培養液には、上記添加剤や細胞増殖因子を必要に応じて補充しても、補充しなくてもよい。
【００６０】
培養液に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、前述したように、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができ、例えばＹ−２７６３２を用いる場合、通常１〜１００μＭの範囲内であり、好ましくは２〜５０μＭ、より好ましくは１０〜４０μＭである。
【００６１】
上記工程（ｅ）において、細胞を培養する時期としては、分化誘導処理方法や培養条件により異なるため、一概に特定することはできないが、工程（ｂ）において、心血管前駆細胞の分離を、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に行い、工程（ｃ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間培養し、かつ、工程（ｄ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後８〜２２日目まで培養し、心筋細胞を調製した場合、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも２２日目の間が好ましく、少なくとも２１〜２２日目の間がより好ましい。
【００６２】
上記工程（ｅ）における細胞の培養温度は、前述したように、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、前述したように、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、前述したように、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、上記工程（ｅ）における培養時間は、通常１〜４日間の範囲内であり、好ましくは１〜３日間である。
【００６３】
＜工程（ｆ）＞
上記工程（ｆ）において、工程（ｅ）で培養した心筋細胞を、培養液中で培養する。かかる培養液としては、上記血清含有培養液であっても、上記無血清培養液であってもよい。また、かかる培養液には、上記添加剤や細胞増殖因子を必要に応じて補充しても、補充しなくてもよい。また、かかる培養液としては、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含むものであっても、含まないものであってもよいが、ＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む場合、心筋細胞の成熟化の維持に影響を及ぼさない濃度でＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含有するものが好ましい。
【００６４】
上記工程（ｆ）において、細胞を培養する時期としては、分化誘導処理方法や培養条件により異なるため、一概に特定することはできないが、工程（ｂ）において、心血管前駆細胞の分離を、工程（ａ）で分化誘導処理後４〜６日目に行い、工程（ｃ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも６〜７日目の間培養し、工程（ｄ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後８〜２２日目まで培養し、心筋細胞を調製し、かつ、工程（ｅ）において、細胞を、工程（ａ）で分化誘導処理後少なくとも２２日目の間培養した場合、心筋細胞の培養期間が長すぎると細胞の生存や性質に悪影響を及ぼす可能性を考慮すると、通常は１５０日目まで、好ましくは１３０日目まで、より好ましくは１２０日目まで、さらに好ましくは１１０日目まで、さらにより好ましくは１００日目まで、特に好ましくは９１日目までである。したがって、上記保存期間としては、通常、２３〜１５０日目の範囲内までであり、好ましくは２３〜１３０日目の範囲内までであり、より好ましくは２３〜１２０日目の範囲内までであり、さらに好ましくは２３〜１１０日目までの範囲内であり、さらにより好ましくは２３〜１００日目までの範囲内であり、特に好ましくは２３〜９１日目までの範囲内である。
【００６５】
上記工程（ｆ）における細胞の培養温度は、前述したように、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。また、培養時のＣＯ２濃度は、前述したように、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、前述したように、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、上記工程（ｆ）における培養時間は、通常６９〜１２８日間の範囲内であり、好ましくは６９〜８０日間である。
【００６６】
本発明の心筋シートの製造方法としては、本発明の製造方法１を用いて調製した心筋細胞を、内皮細胞及び壁細胞と混合して培養する方法（以下、「本発明の製造方法２」ということがある）であれば特に制限されない。
【００６７】
＜内皮細胞及び壁細胞を製造する工程＞
本発明の製造方法２において、使用する内皮細胞及び壁細胞は、ＦＬＫ陽性細胞を用いて製造することができる。まず、ＦＬＫ陽性細胞は、多能性幹細胞を任意の方法、例えばYamashita et al. (2000), Nature, 408:92-96記載の方法で培養することにより得る。次に、同文献の記載に基づいてＦＬＫ陽性細胞を培養することにより、内皮細胞及び壁細胞の混合細胞を得る。ここで、内皮細胞とは、血管内皮細胞（血管の内側にある一層の細胞）と同等の性質を示す細胞又はその前駆細胞を意味する。また、壁細胞とは、血管壁細胞（血管内皮細胞を外側から取り巻く細胞）と同等の性質を示す細胞又はその前駆細胞を意味する。
【００６８】
＜心筋シートを製造する工程＞
本発明の製造方法２において、心筋細胞と、内皮細胞及び壁細胞とを混合して培養することにより、心筋シートを製造する。例えば、温度感受性培養容器（例えばセルシード社製のＵｐＣｅｌｌ等）上でＦＬＫ陽性細胞を１〜７日間（例えば３日間）培養した後、内皮細胞及び壁細胞の混合細胞と、心筋細胞の適量とを培養容器に添加する。この細胞混合物を、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含有する培地中で１〜１０日間（例えば４日間）培養することにより、シート状の細胞構造物が生成する。こうして形成された心筋シートは、培養容器を室温に置くことで培養容器から剥離させ、回収することができる。さらに、所望により、製造された心筋シートは積層化される。
【００６９】
このようにして製造された心筋シートは、心疾患、例えば心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、心筋炎、各種心筋症の治療や、その他の用途に使用できる。例えば、心筋梗塞のような心疾患に関しては、心臓の所望の部位を覆うようにして心筋シートを配置し、治療が実施される。心筋シートは心臓組織に生着し、心臓の機能回復を促進する。
【００７０】
本発明のキットとしては、Ｗｎｔシグナル阻害剤を備え、「少なくとも７０日間の培養によりｃＴｎＴ陽性率を８０％以上維持できる心筋細胞の集団を誘導するため」という用途が限定されたキットであれば特に制限されず、ＲＯＣＫ阻害剤、培養液、心筋細胞集団を誘導する方法が記載された添付文書、ピペット、遠心管等をさらに含むものであってもよい。「ＲＯＣＫ阻害剤」、「Ｗｎｔシグナル阻害剤」、「培養液」の各用語の定義は、上記＜工程（ｃ）＞の項目に記載したとおりである。
【００７１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
１．心筋細胞への分化誘導法
ヒトｉＰＳ細胞（１２０１Ｃ１株及び２５３Ｇ１株）は、京都大学の山中教授より受領し、以前に報告された方法（Uosaki H.et al. PLoS One 2011;6:e23657）と同様の方法を用いてヒトｉＰＳ細胞の維持培養を行った。詳細は、次のとおりである。ヒトｉＰＳ細胞をマトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ、１：６０希釈、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）でコーティングされた培養容器に播種し、マウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（以下ＭＥＦ−ＣＭと記載する）に、４ｎｇ／ｍＬとなるようにヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ、ＷＡＫＯ社製）を添加した培地を用いて培養を行った。ＭＥＦ−ＣＭは、２０％ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯ社製）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ社製）、１％  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（ＧＩＢＣＯ社製）、４ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦを含むＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）を基礎培地として使用し、マイトマイシンＣ（ＷＡＫＯ社製）により２．５時間処理されたＭＥＦを用いて調製した。ＭＥＦ−ＣＭを用いたヒトｉＰＳ細胞の培養においては、４〜６日毎に、ＣＴＫ溶液（０．１％コラゲナーゼＩＶ、０．２５％トリプシン、２０％ＫＳＲ及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水）を用いてヒトｉＰＳ細胞のコロニーを剥離し、セルスクレーパーで小型の細胞塊の状態にしてから継代培養した。
【００７３】
続いて、効率的に中胚葉細胞へ分化誘導するため、下記に示す工程（マトリゲルサンドイッチ法）を行った。上記の方法で継代培養したヒトｉＰＳ細胞の培養容器にＶｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、３７℃で３〜５分間インキュベートした。Ｖｅｒｓｅｎｅを除き、ＭＥＦ−ＣＭを加え、細胞を培養容器から完全に剥離した。さらにピペッティングを行って細胞塊が分散した懸濁液を調製した後、細胞数をカウントした。次いで、マトリゲルでコーティングされた培養容器上に７０，０００〜１０５，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種し、４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを含むＭＥＦ−ＣＭ培地中で１〜２日間培養した。その後、１：６０希釈のマトリゲル及び４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを含むＭＥＦ−ＣＭ培地に培地交換し、さらに１６〜２４時間培養することにより、マトリゲルで細胞上層を覆った。
【００７４】
得られたマトリゲル被覆細胞を用いて下記の手順により中胚葉細胞へ分化誘導させた。まず、１００ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及びＢ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インスリン不含、ＧＩＢＣＯ社製）に培地交換し（この時点を分化誘導開始＝Ｄａｙ０とする）、２４時間培養した（Ｄａｙ１）。次に、１０ｎｇ／ｍＬ  ヒト骨形成タンパク質４（ｈＢＭＰ４、Ｒ＆Ｄ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及びＢ２７サプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インスリン不含）に培地交換し、４日間培養した（Ｄａｙ５）。
【００７５】
分化誘導開始後５日目（Ｄａｙ５）の培養物より、ＰＤＧＦＲα陽性細胞を磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により分離することで、心血管前駆細胞を得た。ＰＤＧＦＲα陽性細胞を分離するにあたってはＡＰＣ蛍光ラベルを結合した抗ＰＤＧＦＲα抗体を一次抗体として細胞の標識に使用し、抗ＡＰＣ抗体を包埋した磁気ビーズにより一次抗体で標識された細胞の回収を実施した。ＭＡＣＳにて分離された細胞中に存在するＰＤＧＦＲα陽性細胞の割合（ＰＤＧＦＲα陽性率）をフローサイトメトリーにて測定したところ、８９〜９９％であった。得られたＰＤＧＦＲα陽性細胞を３００，０００〜４２０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で再播種し、１０％ＦＢＳ、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０μＭ  Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）、１０μＭ  ＸＡＶ９３９（Ｗｎｔ阻害剤）、５μＭ  ＩＷＰ−４（Ｗｎｔ阻害剤）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した。
【００７６】
分化誘導開始後７日目（Ｄａｙ７）に、培地を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｂ２７サプリメント、２０μＭ  Ｙ−２７６３２、０．２５μＭ  ＸＡＶ９３９、０．１２５μＭ  ＩＷＰ−４を含むＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２日間培養した。
【００７７】
分化誘導開始後９日目〜２１日目（Ｄａｙ９〜２１）の間（１２日間）は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及びＢ２７サプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用し、２日毎に培地交換を行いながら培養を継続した。分化誘導開始後２１日目（Ｄａｙ２１）の細胞について抗ｃＴｎＴ抗体を使用したフローサイトメトリーを行って心筋細胞の純度（ｃＴｎＴ陽性率）を測定したところ、９６〜９９％であった。
【００７８】
１２０１Ｃ株を使用して実施した９回の心筋細胞製造、２５３Ｇ１株を使用して実施した２回の心筋細胞製造について、Ｄａｙ５、Ｄａｙ２１における細胞の分析結果をそれぞれ表１、表２に示す。両表中、実験番号における１２０１Ｃ１、２５３Ｇ１は各実験で使用されたヒトｉＰＳ細胞株を示す。特に表２から明らかなとおり、すべての製造例において高純度な心筋細胞が得られた。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
【表２】
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【実施例２】
【００８１】
２．心筋細胞の長期培養
京都大学の山中教授より受領したヒトｉＰＳ細胞（８３６Ｂ３株）より実施例１記載の方法で、分化誘導開始後２１日目まで培養した心筋細胞を調製した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ，フェノールレッド（ＧＩＢＣＯ社製）を使用して培養容器から回収した心筋細胞を、約２００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、ポリリジン（５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ社製）でコーティングした後にさらにゼラチン（０．５％）でコーティングした培養容器上に播種した。この心筋細胞を１０％血清、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、及び２０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むαＭＥＭを使用し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した後、培地を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及びＢ２７サプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０培地に交換した（分化誘導開始後２３日目）。その後、２日毎に培地の交換を行いながら培養を継続した。
【００８２】
分化誘導開始後２１、３１、４１、５１、６１及び９１日目にそれぞれ心筋細胞をサンプリングし、抗ｃＴｎＴ抗体を使用したフローサイトメトリーを行って心筋細胞の純度を測定した。図１に示すとおり、実施例１記載の方法で調製された心筋細胞は分化誘導開始後９１日目に至るまで９５％を超えるｃＴｎＴ陽性率を維持していた。また、培養容器上の生細胞数を測定した結果を図２に示す。分化誘導開始後２１日以降に細胞数の減少は認められなかった。
一方、分化誘導開始後５日目〜９日目の間、Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した場合、生細胞（接着した細胞）はほとんど認められず（図３参照）、また、分化誘導開始後５日目〜９日目の間、ＸＡＶ９３９又はＩＷＰ−４を単独で含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた場合、ｃＴｎＴ陽性細胞（心筋細胞）の割合は７４．９％及び７２．２％とやや低下していた（図４の左から２番目及び３番目のグラフ参照）。また、Ｗｎｔ阻害剤（ＸＡＶ９３９及びＩＷＰ−４）を含まないＲＰＭＩ１６４０培地を用いた場合、ｃＴｎＴ陽性細胞（心筋細胞）の割合は７．１％と大幅に低下していた（図４の左から１番目のグラフ参照）。
また、分化誘導開始後少なくとも１１日目において、ｃＴｎＴ陽性細胞（心筋細胞）の割合は、９０％を超えていた（図５参照）。
さらに、分化誘導開始後２３日目以降は、Ｂ２７サプリメントに代えて血清を用いた場合、同様に高いｃＴｎＴ陽性率を維持していた（図６参照）。
【００８３】
以上の結果は、心血管前駆細胞（ＰＤＧＦＲα陽性細胞）を、特定の時期（中胚葉細胞への分化誘導処理後５〜９日目）にＲＯＣＫ阻害剤及びＷｎｔ阻害剤存在下で培養すると、高効率で心筋細胞へ分化誘導が可能であることを示すとともに、長期間（少なくとも、分化誘導開始後１１〜９１日目の８０日間）にわたって心筋細胞が培養・維持されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の方法により、多能性幹細胞から長期にわたって特性を維持できる心筋細胞を効率的かつ高収量で製造することが可能となる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、心筋細胞の移植を必要とする疾患の治療、心筋細胞の異常等に起因する疾患の細胞モデル、薬物の安全性評価のための材料として使用することができる。また、本発明の方法により得られた心筋細胞を内皮細胞及び壁細胞と混合して培養することにより心筋シートを製造することができる。これらの心筋細胞及び心筋シートは、特に再生医療の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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