(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な牛白血病ウイルス感染動物の特定方法等を提供する。【解決手段】被験動物から採取された生物学的試料中に、WPPPQGRRRFGARAMVTYDCのアミノ酸配列の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する工程と、当該抗体が存在する場合には被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する工程とを含む、牛白血病ウイルス感染動物の特定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における牛白血病ウイルスの有無を検出する方法であって、
前記動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程を含む、検出方法。
【請求項２】
被験動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、
前記抗体が存在する場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する判定工程とを含む、牛白血病ウイルス感染動物の特定方法。
【請求項３】
前記判定工程では、さらに、前記抗体が存在しない場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染していないと判定する、請求項２に記載の特定方法。
【請求項４】
前記配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を認識する抗体は、配列番号３に示すアミノ酸配列（GRRRFGARAMVTY）の少なくとも一部を認識する抗体である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
動物における牛白血病ウイルスの有無を検出するためのキットであって、
配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を含む、ペプチド、タンパク質、およびウイルス粒子のうちの少なくとも１つを抗原として備える、検出キット。
【請求項６】
牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する、変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸のうちの少なくとも１つを含む、医薬品組成物。
【請求項７】
前記共通のＢ細胞エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）に含まれる１つまたは複数のエピトープである、請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記変異を有するエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の７、９、１０、１６および１８番目のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項６または７に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
牛白血病ウイルスワクチン組成物である、請求項６〜８の何れか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
請求項６〜９の何れか一項に記載の医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物を識別する方法であって、
請求項６〜９の何れか一項に記載の医薬品組成物が接種された被験動物から採取された生物学的試料中に、前記共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、
前記抗体が存在する場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する判定工程とを含む、識別方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の識別方法に使用される検出用抗体であって、
牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体である、検出用抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、牛白血病ウイルス感染動物の特定方法、および牛白血病ウイルスワクチン組成物等の医薬品組成物等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、悪性Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（ＥＢＬ）を引き起こすレトロウイルスである。ＢＬＶ感染牛は、長い潜伏期間（５〜１０年）の後に、その約５％が白血病を発症して死に至る。有効な予防法および根治療法はなく、国内外で感染率および発症率が増加しており、畜産界への打撃が懸念されている。現在の対処法は、隔離または淘汰によって、拡大を防ぐことである。そのため、ワクチン組成物等の医薬品組成物による予防法および治療法の確立が急がれる。
【０００３】
非特許文献１には、Ｅｎｖタンパク質であるｇｐ５１のアミノ酸配列の６４〜７３番目のペプチドをウサギに免疫して得られた抗血清が、ＢＬＶにより誘導されるシンシチウムの形成を阻害すること等が記載されている。また、非特許文献２には、ｇｐ５１の６１〜７０番目のアミノ酸配列をＣＤ４エピトープとして同定したことが記載されている。
【０００４】
ところで、近年、家畜にワクチン接種を行なった場合、ワクチンによる抗体上昇が起こるため、自然感染動物と識別できないことが問題視されている。そのため、例えば鳥へのワクチン接種の実施は、政府管理の下、ＤＩＶＡ（Differntiating infected from vaccinated animals（ワクチン接種を受けた動物と感染動物の区別））システムを導入した上で行なうことが国際機関によって勧告されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０８４４０３号公報（２００８年２月２２日公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】I. Callebaut et al., Journal of Virology, Sept. 1993, p. 5321-5327.
【非特許文献２】M. H. Gatei et al., Journal of Virology, Apr. 1993, p. 1796-1802.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＢＬＶ感染動物の効率的な特定ならびにワクチン組成物等の医薬品組成物による予防法および治療法を確立するためには、さらなるエピトープの探索が必要となる。また、ＢＬＶ自然感染動物とＢＬＶ医薬品組成物接種動物とを識別することも必要となる。
【０００８】
本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規なＢＬＶ感染動物の特定方法、ＢＬＶワクチン組成物等の医薬品組成物、および当該医薬品組成物接種動物の中からＢＬＶ感染動物を識別する方法等を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の課題を解決するために、本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
（１）動物における牛白血病ウイルスの有無を検出する方法であって、前記動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程を含む、検出方法。
【００１１】
（２）被験動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、前記抗体が存在する場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染いると判定する判定工程とを含む、牛白血病ウイルス感染動物の特定方法。
【００１２】
（３）前記判定工程では、さらに、前記抗体が存在しない場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染していないと判定する、前記（２）に記載の特定方法。
【００１３】
（４）前記配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を認識する抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列（GRRRFGARAMVTY）の少なくとも一部を認識する抗体である、前記（１）〜（３）の何れかに記載の方法。
【００１４】
（５）動物における牛白血病ウイルスの有無を検出するためのキットであって、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を含む、ペプチド、タンパク質、およびウイルス粒子のうちの少なくとも１つを抗原として備える、検出キット。
【００１５】
（６）牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する、変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸のうちの少なくとも１つを含む、医薬品組成物。
【００１６】
（７）前記共通のＢ細胞エピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列に含まれる１つまたは複数のエピトープである、前記（６）に記載の医薬品組成物。
【００１７】
（８）前記変異を有するエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列の７、９、１０、１６および１８番目のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有するアミノ酸配列を含む、前記（６）または（７）に記載の医薬品組成物。
【００１８】
（９）牛白血病ウイルスワクチン組成物である、前記（６）〜（８）の何れかに記載の医薬品組成物。
【００１９】
（１０）前記（６）〜（９）の何れかに記載の医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物を識別する方法であって、前記（６）〜（９）の何れかに記載の医薬品組成物が接種された被験動物から採取された生物学的試料中に、前記共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、前記抗体が存在する場合には前記被験動物が牛白血病ウイルスに感染いると判定工程とを含む、識別方法。
【００２０】
（１１）前記（１０）に記載の識別方法に使用される検出用抗体であって、牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体である、検出用抗体。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、新規なＢＬＶ感染動物の特定方法、ＢＬＶワクチン組成物等の医薬品組成物、および当該医薬品組成物接種動物の中からＢＬＶ感染動物を識別する方法等を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例においてＢＬＶ−Ｅｎｖ（ｇｐ５１）に基づき作製したペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】実施例においてＢＬＶ−Ｇａｇ（ｐ１５、ｐ２４、およびｐ１２）に基づき作製したペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】実施例におけるｇｐ５１のペプチドマイクロアレイの結果を示す図である。
【図４】実施例におけるｐ１５のペプチドマイクロアレイの結果を示す図である。
【図５】実施例におけるｐ２４のペプチドマイクロアレイの結果を示す図である。
【図６】実施例におけるｐ１２のペプチドマイクロアレイの結果を示す図である。
【図７】実施例におけるｇｐ５１ｐ５７のシングルアラニン置換のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図８】実施例におけるｇｐ５１タンパク質の発現の評価、シンシチウムの形成の評価、および保存性の解析を示す図である。
【図９】実施例における２３ＣＬＮ細胞のｐＢＬＶ−ＩＦ−Ｒ９Ａ産生の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕
本発明に係る検出方法は、動物における牛白血病ウイルスの有無を検出する方法であって、当該動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程を含む。
【００２４】
配列番号１に示すアミノ酸配列は、牛白血病ウイルスを構成する外被タンパク質であるＥｎｖ領域由来のｇｐ５１のアミノ酸配列（配列番号４）に基づき設計されたアミノ酸配列である。詳細には、配列番号１は配列番号４の５８〜７８番目のアミノ酸である。本発明者らは、後述の実施例のとおり、配列番号１に示すアミノ酸配列がＢＬＶ感染動物に共通するＢ細胞エピトープを含んでいることを見出している。
【００２５】
被験動物としては、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物は、特に限定されないが、例えば、ウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、スイギュウ（Bubalus bubalis）、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、およびサル等の哺乳動物が挙げられる。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、および役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。被験動物は、好ましくはウシ、コブウシおよびスイギュウであり、より好ましくはウシおよびスイギュウであり、さらに好ましくはウシである。被験動物は、生きている動物であってもよいし、死亡した動物であってもよい。
【００２６】
生物学的試料としては、特に限定されないが、例えば、血液、尿、唾液、乳汁、および鼻汁等の体液に由来する試料が挙げられる。好ましくは、血液に由来する。血液に由来する試料としては、例えば、全血液、血清および血漿等が挙げられる。生物学的試料は、中でも、全血液、血清および血漿が好ましく、血清および血漿がより好ましい。本発明に係る牛白血病ウイルス感染動物の特定方法の一実施形態は、被験動物から生物学的試料を採取する工程を含み得る。また、本発明に係る牛白血病ウイルス感染動物の特定方法の一実施形態は、被験動物から採取された生物学的試料を前処理する工程を含み得る。生物学的試料の前処理としては、例えば、採取された全血液を精製して血清を得ること、および採取された全血液を精製して血漿を得ること等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において「配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を認識する抗体」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部と結合可能な抗体、好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部と特異的に結合可能な抗体を指し、一例では、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも一部と結合可能な抗体である。別の一例では、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に結合可能な抗体であって、当該ペプチドまたはタンパク質中の配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部と結合可能な抗体である。一実施形態において当該抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列の７、９、１０、１６および１８番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つと結合可能な抗体である。より好ましい実施形態において当該抗体は、配列番号２に示すアミノ酸配列（PPQGRRRFGARAMVT）の少なくとも一部を認識する抗体である。さらに好ましい実施形態において当該抗体は、配列番号３に示すアミノ酸配列（GRRRFGARAMVTY）の少なくとも一部を認識する抗体である。この抗体のさらなる一例は、配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも一部と結合可能な抗体である。さらなる別の一例では、配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質に結合可能な抗体であって、このタンパク質中の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列の少なくとも一部と結合可能な抗体である。
【００２８】
検出工程における検出原理は、特に限定されず、例えば、抗原抗体反応等に基づく検出法が挙げられる。検出工程は、抗原抗体反応に基づくことが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列（以下「標的配列」という）の少なくとも一部を含むペプチド、タンパク質、またはウイルス粒子等を抗原として用いる（以下「検出用抗原」という）抗原抗体反応に基づくことがより好ましい。
【００２９】
標的配列の少なくとも一部を含むペプチドは、特に長さは限定されないが、例えば、３以上のアミノ酸長であることが好ましく、６以上のアミノ酸長であることがより好ましく、１３以上のアミノ酸長であることがさらに好ましく、１５以上のアミノ酸長であることがさらに好ましい。長さの上限についても特に限定されないが、ペプチドの長さは、例えば、５０以下のアミノ酸長であることが好ましく、４０以下のアミノ酸長であることがより好ましく、３０以下のアミノ酸長であることがさらに好ましい。標的配列の少なくとも一部を含むペプチドにおいて、当該標的配列の少なくとも一部以外の部分のアミノ酸配列は特に限定されない。標的配列の少なくとも一部を含むペプチドは、例えば、配列番号４に示すｇｐ５１の任意のフラグメントと同一のアミノ酸配列であってもよいし、配列番号４と１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの任意のフラグメントと同一のアミノ酸配列であってもよい。また、検出用のプレートまたはカラム等に固定するためのアミノ酸配列がさらに付加されていてもよい。
【００３０】
標的配列の少なくとも一部を含むタンパク質は、特に、標的配列の少なくとも一部を含む三次構造または四次構造を形成しているポリペプチドが意図される。標的配列の少なくとも一部を含むタンパク質において、当該標的配列の少なくとも一部以外の部分のアミノ酸配列は特に限定されない。標的配列の少なくとも一部を含むタンパク質は、例えば、配列番号４に示すｇｐ５１の全長と同一のアミノ酸配列であってもよいし、配列番号４と１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるタンパク質であってもよい。また、検出用のプレートまたはカラム等に固定するためのアミノ酸配列がさらに付加されていてもよい。また、他のタンパク質と複合体を形成していてもよい。
【００３１】
標的配列の少なくとも一部を含むウイルス粒子は、標的配列の少なくとも一部を含むペプチドまたはタンパク質を保持するウイルス粒子が意図される。標的配列の少なくとも一部を含むウイルス粒子は、天然のウイルス粒子そのものであってもよいし、加熱もしくは薬剤等による不活化処理、または、細胞継代もしくは動物継代等の馴化操作または遺伝子操作等による弱毒化処理が施されたウイルス粒子であってもよい。また、ウイルス粒子は、ウイルスゲノムを含まないいわゆるウイルス様粒子（Virus-Like Particle；VLP）であってもよい。また、上述した標的配列の少なくとも一部を含むペプチドまたはタンパク質を発現するように改変されたウイルス粒子であってもよい。標的配列の少なくとも一部を含むウイルス粒子において、ウイルス粒子表面に標的配列が露出していることが望ましい。
【００３２】
抗原抗体反応に基づく場合、例えば、検出用抗原を、プレート、膜、カラム、ビーズ、または金コロイド等に固定するか、特定の領域（例えば、ウェル内）に配置し、被験動物から採取された生物学的試料を検出用抗原に接触させ、生物学的試料中の抗体と検出用抗原とを反応させて検出する。検出方法は、光学的方法、化学的方法、および物理的方法等の何れであってもよい。
【００３３】
好ましい抗原抗体反応としては、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫凝集法、ラジオイムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィー法、蛍光抗体法、磁気ビーズ法、ペプチドアレイ法、蛍光ビーズ法、および金コロイド法等が挙げられる。
【００３４】
検出用抗原に対する抗体（検出用抗原特異的抗体）を使用した競合ＥＬＩＳＡ法を用いてもよい。競合ＥＬＩＳＡ法では、プレート等に付着させた検出用抗原と生物学的試料とを接触させ、次いで検出用抗原特異的抗体を添加する方法であり、もし、生物学的試料中に標的配列の少なくとも一部を認識する抗体（以下「検出対象抗体」という）が存在していれば、検出用抗原は検出対象抗体によってカバーされ、後から添加した検出用抗原特異的抗体は検出用抗原に結合することができない。そのため、例えば、検出用抗原特異的抗体を標識しておけば、生物学的試料中に検出対象抗体が存在するか否かを検出することができる。
【００３５】
「検出用抗原に対する抗体（検出用抗原特異的抗体）」は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラス、ならびに抗体の機能的断片が包含される。当該抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の何れの天然型抗体も含む概念であり、その他に、遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体、ならびに当該抗体の機能的断片を含む。抗体の機能的断片とは、前述の抗体の一部分の領域を有し、かつ抗原結合能を有しているもの（結合性断片と同義）を指す。天然型抗体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ラマ、ウシおよびニワトリ等を含む、あらゆる生物種に由来し得る。遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体を遺伝子改変して得られるヒト化抗体および霊長類化抗体等のキメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、変異導入抗体およびグラフト結合抗体（例えば、他のタンパク質および放射性標識等がコンジュゲートまたは融合している抗体）が挙げられ、既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。また、抗体の機能的断片としては、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilized Fv）およびｄＡｂ（single domain antibody）等が挙げられる。
【００３６】
上述の抗体の検出は、検出可能なシグナルを誘引できるレポーター分子で標識した二次抗体と複合体を形成させることによって行い得る。あるいは、上述の抗体がレポーター分子で予め標識されていてもよい。レポーター分子は、例えば、酵素、発蛍光団含有分子、または放射性核種含有分子である。このようなレポーター分子は、様々なものが公知であり、適宜選択すればよい。
【００３７】
レポーター分子として酵素を用いる場合、酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ等を用いることができる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を用いることができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシン等を用いることができる。また、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性核種としては、１２５Ｉまたは３Ｈ等を用いることができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等を用いることができる。
【００３８】
また、検出用抗原特異的抗体の代わりにペプチドプローブを用いることもできる。
【００３９】
検出対象抗体を含むことが分かっている試料および検出対象抗体を含まないことが分かっている試料のうちの少なくとも一方を、コントロールとして利用してもよい。
【００４０】
〔２．牛白血病ウイルス感染動物の特定方法〕
本発明に係る牛白血病ウイルス感染動物の特定方法は、被験動物から採取された生物学的試料中に、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、当該抗体が存在する場合には当該被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する判定工程とを含む。
【００４１】
本発明に係る特定方法における検出工程の説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕における検出工程の説明と同様である。また、本発明に係る特定方法の一実施形態は、被験動物から生物学的試料を採取する工程を含み得る。また、本発明に係る特定方法の一実施形態は、被験動物から採取された生物学的試料を前処理する工程を含み得る。
【００４２】
判定工程では、検出工程の結果に基づき、検出対象抗体が存在する場合には被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する。判定工程では、さらに、検出対象抗体が存在しない場合には被験動物が牛白血病ウイルスに感染していないと判定してもよい。
【００４３】
判定後、被検動物が非ヒト動物である場合、牛白血病ウイルスに感染していると判定された動物に対し、隔離または淘汰等の措置をとることができる。
【００４４】
〔３．牛白血病ウイルスの有無を検出するための検出キット〕
本発明はまた、動物における牛白血病ウイルスの有無を検出するためのキットであって、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の少なくとも一部を含む、ペプチド、タンパク質、およびウイルス粒子のうちの少なくとも１つを抗原として備える、検出キットを提供する。これらの抗原は、より好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含み、さらに好ましくは配列番号３に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。
【００４５】
本発明に係る検出キットは、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕に記載の検出方法、および〔２．牛白血病ウイルス感染動物の特定方法〕に記載の検出工程に好適に使用することができる。
【００４６】
抗原として備えられるペプチド、タンパク質、およびウイルス粒子（検出用抗原）の説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕における説明と同様である。
【００４７】
検出用抗原は、基材に結合されていてもよい。基材としては、例えば、プレート、膜、カラム、ビーズ、および金コロイド等が挙げられる。基材には、蛍光タンパク質またはタグタンパク質等が固定化されていてもよい。基材は、マイクロウェルプレート（例えば、９６ウェル）であることが好ましい。多数の試料を並行して処理することができるからである。
【００４８】
本発明に係る検出キットは、さらに、必要に応じて、基材、検出用抗原特異的抗体、ペプチドプローブ、各種試薬（二次抗体、レポーター分子、およびバッファー等）、器具（ピペット等）、検出キットの使用説明書、コントロール用の試料、等のうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。これらの具体的な説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕に記載されている。なお、検出キットの使用説明書には、例えば、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕で説明した検出方法、または〔２．牛白血病ウイルス感染動物の特定方法〕で説明した検出工程に関する具体的手順等が記載されている。
【００４９】
〔４．医薬品組成物〕
本発明に係る医薬品組成物は、牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する、変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸のうちの少なくとも１つを含む。
【００５０】
「牛白血病ウイルス感染動物に共通」とは、牛白血病ウイルス感染動物の一定の分類集団の中で実質的に共通していることを指し、例えば、少なくとも同一の種（species）の同一の品種（breed）の感染動物間で実質的に共通している、あるいは少なくとも同一の種の感染動物間で実質的に共通している、あるいは少なくとも同一の属（genus）の感染動物間で実質的に共通している、あるいは少なくとも同一の科（family）の感染動物間で実質的に共通している、あるいは少なくとも同一の目（order）の感染動物間で実質的に共通している場合等が挙げられる。「実質的に共通している」とは、感染動物の一定の分類集団において、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の感染動物で抗原抗体反応が検出されることを指す。感染動物は、特に限定されず、例えば、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕で被験動物として例示したものが挙げられる。より具体的な一例では、種としてはウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）およびスイギュウ（Bubalus bubalis）等が挙げられ、属としてはBos属およびBubalus属等が挙げられ、科としてはウシ科（Bovidae）等が挙げられ、属としては偶蹄目（Artiodactyla）等が挙げられる。また、ウシの具体的な品種としては、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
「Ｂ細胞エピトープ」とは、野生型の牛白血病ウイルスタンパク質またはそのフラグメントにおいて、牛白血病ウイルス感染動物のＢ細胞により産生される抗体が結合する領域（結合部位を含む連続したアミノ酸領域）または部位（実際に結合する１つまたは複数の特定のアミノ酸）を指す。野生型のアミノ酸配列は、１つに限定されず、天然に見出される全てのアミノ酸配列が包含される。本発明において、野生型のアミノ酸配列は、天然に見出される全てのアミノ酸配列のうち最も多く見出されるアミノ酸配列であることが好ましい。
【００５２】
牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープは、特に限定されないが、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）に含まれる１つまたは複数のエピトープが挙げられ、また配列番号１に示すアミノ酸配列全体がエピトープであり得る。より好ましくは、共通のＢ細胞エピトープは、配列番号２に示すアミノ酸配列（PPQGRRRFGARAMVT）に含まれる１つまたは複数のエピトープであり、また配列番号２に示すアミノ酸配列全体がエピトープであり得る。さらに好ましくは、共通のＢ細胞エピトープは、配列番号３に示すアミノ酸配列（GRRRFGARAMVTY）に含まれる１つまたは複数のエピトープであり、また配列番号３に示すアミノ酸配列全体がエピトープであり得る。
【００５３】
アミノ酸の変異としては、アミノ酸の置換、挿入および欠失が挙げられる。アミノ酸の置換の場合、置換後のアミノ酸の種類は、野生型におけるアミノ酸と別の種類のアミノ酸であれば特に限定されないが、野生型におけるアミノ酸と性質（例えば、酸性／中性／塩基性、または親水性／疎水性等）または大きさが異なるアミノ酸であることが好ましい。野生型におけるアミノ酸と性質または大きさが異なるアミノ酸である場合、医薬品組成物が接種された動物では、野生型におけるアミノ酸を有する牛白血病ウイルスへの自然感染動物において産生される抗体とは認識性が異なる抗体が産生され得るため、医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物（自然感染動物）を容易に識別することが可能となる。また、牛白血病ウイルスにおいて、Ｂ細胞エピトープの野生型のアミノ酸にバリエーションがある場合、バリエーションが見出されていないアミノ酸に変異していることが好ましい。一実施形態において、置換後のアミノ酸はアラニンである。
【００５４】
変異しているアミノ酸の個数は特に限定されないが、例えば、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１個であることがさらに好ましい場合がある。
【００５５】
アミノ酸変異の位置は、特に限定されないが、野生型において抗体が結合する位置であることが好ましい。医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物をより容易に識別することが可能となるからである。配列番号１に示すアミノ酸配列では、例えば、１番目（Ｗ）、６番目（Ｇ）、７番目（Ｒ）、９番目（Ｒ）、１０番目（Ｆ）、１５番目（Ｍ）、１６番目（Ｖ）、１７番目（Ｔ）、および１８番目（Ｙ）のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有することが好ましく、７番目（Ｒ）、９番目（Ｒ）、１０番目（Ｆ）、１６番目（Ｖ）、および１８番目（Ｙ）のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有することがより好ましく、７番目（Ｒ）および９番目（Ｒ）のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有することがさらに好ましく、９番目（Ｒ）に変異を有することが特に好ましい。配列番号２および配列番号３においても、上記アミノ酸に対応する箇所に変異を有することが好ましい。
【００５６】
変異を有するエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC）の７、９、１０、１６および１８番目のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列の７および９番目のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有するアミノ酸配列を含むことがより好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列の９番目のアミノ酸に変異を有するアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。また、変異を有するエピトープとして好ましい一例として、配列番号１に示すアミノ酸配列の上述のアミノ酸の少なくとも１つに変異を有するアミノ酸配列からなるものが挙げられ、より好ましい一例として、配列番号５〜９に示すアミノ酸配列を含むものまたは配列番号５〜９に示すアミノ酸配列からなるものが挙げられる。変異を有するエピトープとして特に好ましい一例は、配列番号６に示すアミノ酸配列である。
【００５７】
上述のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加は、公知の方法で行うことができる。公知の方法としては、例えば、Kunkel法等の部位特異的な変異導入法を利用して所望の変異を遺伝子に導入した後、変異体ペプチドまたはタンパク質を生合成する方法が挙げられる。あるいは、上述のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加をした配列を、ペプチド合成法によって合成することが挙げられる。
【００５８】
「変異体ペプチド」とは、野生型の牛白血病ウイルスにおける対応するペプチド（例えば、タンパク質のフラグメント）のアミノ酸に変異を有するペプチドを指し、牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープに少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する。なお、変異体ペプチドは、Ｂ細胞エピトープ以外のアミノ酸にも変異を有していてもよい。変異体ペプチドは、特に長さは限定されない。Ｂ細胞エピトープが配列番号１に示すアミノ酸配列に含まれるエピトープである場合、ペプチドの長さは、例えば、３以上のアミノ酸長であることが好ましく、６以上のアミノ酸長であることがより好ましく、１３以上のアミノ酸長であることがさらに好ましく、１５以上のアミノ酸長であることがさらに好ましい。長さの上限についても特に限定されないが、変異体ペプチドの長さは、例えば、５０以下のアミノ酸長であることが好ましく、４０以下のアミノ酸長であることがより好ましく、３０以下のアミノ酸長であることがさらに好ましい。
【００５９】
「変異体タンパク質」とは、野生型の牛白血病ウイルスにおける対応するタンパク質のアミノ酸に変異を有するタンパク質を指し、牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープに少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する。「変異体タンパク質」は、特に、三次構造または四次構造を形成しているポリペプチドが意図される。変異体タンパク質は、例えば、配列番号４に示す野生型ｇｐ５１の全長において共通Ｂ細胞エピトープに変異を有するものであってもよいし、配列番号４と１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるタンパク質において共通Ｂ細胞エピトープに変異を有するものであってもよい。また、変異体タンパク質は、精製用のアミノ酸配列が付加されていてもよい。また、変異体タンパク質は、他のタンパク質と複合体を形成していてもよい。
【００６０】
「変異体ウイルス粒子」は、上述の変異体ペプチドまたは変異体タンパク質を保持する、または上述の変異体ペプチドまたは変異体タンパク質をコードする遺伝子を保持するウイルス粒子が意図される。変異体ウイルス粒子は、加熱もしくは薬剤等による不活化処理、または、細胞継代もしくは動物継代等の馴化操作または遺伝子操作等による弱毒化処理が施されたウイルス粒子であってもよい。また、変異体ウイルス粒子は、ウイルスゲノムを含まないいわゆるウイルス様粒子（Virus-Like Particle；VLP）であってもよい。変異体ウイルス粒子において、ウイルス粒子表面に共通Ｂ細胞エピトープが露出していることが望ましい場合がある。また、医薬品組成物が変異体ウイルス粒子を含む場合であって、野生型タンパク質をコードする遺伝子が、変異体タンパク質をコードする遺伝子に置き変えられている場合には、接種される動物における変異体タンパク質の発現を完全には喪失しない、または変異体タンパク質の機能を完全には喪失しない変異であることが好ましい。
【００６１】
「これらをコードする核酸」とは、変異体ペプチド、変異体タンパク質、または変異体ウイルス粒子をコードする核酸（以下「変異体核酸」という）である。変異体核酸はＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。牛白血病ウイルスの核酸配列は公知である（例えば、GenBankアクセッション番号：EF600696）ため、当業者はコドン表等を参照すれば容易に変異体核酸の配列を設計することができる。なお、ｇｐ５１全長のアミノ酸をコードする核酸配列の一例は、配列番号１０に示すとおりであるが、これに限定されない。変異体ウイルス粒子をコードする核酸は、例えば、野生型の牛白血病ウイルスの感染性分子クローンに、遺伝子操作（例えば、site-direct mutagenesis）等によって変異を導入した核酸が挙げられる。
【００６２】
医薬品組成物は、当該医薬品組成物に含まれる「変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸のうちの少なくとも１つ」に対応する野生型のペプチド、タンパク質、ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸を含まないことが望ましい。
【００６３】
医薬品組成物は、これらの他に、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、抗酸化剤、粘度調整剤、賦活剤、またはナノ粒子等を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、およびミネラルオイル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
医薬品組成物における変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸の含有量は特に限定されず、適宜、設定すればよい。
【００６５】
医薬品組成物の形態も特に限定されず、例えば、注射剤、液剤、懸濁剤、乳剤、散剤、顆粒剤、およびカプセル剤等が挙げられる。医薬品組成物の投与形態も特に限定されず、経口投与であってもよいし、非経口投与（皮下投与、経鼻投与、腹腔内投与、皮膜投与、筋肉内投与、または静脈内投与等）であってもよい。本発明に係る医薬品組成物の一例は、牛白血病ウイルスワクチン組成物である。本発明に係る医薬品組成物の別の一例は、変異抗原含有組成物である。本発明に係る医薬品組成物のさらに別の一例は、変異Ｂ細胞エピトープ含有組成物である。
【００６６】
本発明に係る医薬品組成物は、牛白血病の予防または治療に好適に使用され得る。そのため、本発明はまた、本発明に係る医薬品組成物を対象動物に接種または投与する工程を含む、牛白血病の予防または治療方法を提供する。本発明はまた、本発明に係る牛白血病ウイルスワクチン組成物を対象動物に接種する工程を含む、牛白血病の予防方法を提供する。
【００６７】
〔５．医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物を識別する方法〕
本発明に係る識別方法は、上述の本発明に係る医薬品組成物が接種された動物の中から牛白血病ウイルス感染動物を識別する方法であって、当該医薬品組成物が接種された被験動物から採取された生物学的試料中に、前記共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体が存在するか否かを検出する検出工程と、当該抗体が存在する場合には当該被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する判定工程とを含む。
【００６８】
被験動物および生物学的試料の説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕における説明と同様である。
【００６９】
本明細書において「共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体」とは、共通のＢ細胞エピトープと結合可能な抗体、好ましくは共通のＢ細胞エピトープと特異的に結合可能な抗体を指す。
【００７０】
検出工程の説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕における検出工程と同様である。ただし、本発明に係る識別方法において、「検出用抗原」は、共通のＢ細胞エピトープを含むペプチド、タンパク質、またはウイルス粒子等であることが好ましく、「配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド、タンパク質、またはウイルス粒子等」はより好ましい一例である。
【００７１】
本発明に係る識別方法の検出工程は、検出用抗原に対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を使用した競合ＥＬＩＳＡ法であることが好ましい。競合ＥＬＩＳＡ法の基本的な原理の一例および具体的な説明については、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕に記載のとおりである。本発明に係る医薬品組成物は、共通のＢ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸に変異を有する、変異体ペプチド、変異体タンパク質、変異体ウイルス粒子、およびこれらをコードする核酸のうちの少なくとも１つを含んでいるため、自然感染した場合に産生される抗体（野生型に対する抗体）とは認識するアミノ酸が異なっている抗体（変異体に対する抗体）を産生させる。医薬品組成物が接種された動物のうち牛白血病ウイルスに感染していない動物では、変異体に対する抗体のみを体内に有する。そのため、プレート等に付着させた検出用抗原と生物学的試料とを接触させ、次いで検出用抗原特異的抗体を添加した場合、共通のＢ細胞エピトープを含む検出用抗原と変異体に対する抗体とは結合せず、検出用抗原特異的抗体が検出用抗原と結合する。一方、医薬品組成物が接種された動物のうち牛白血病ウイルスに感染している動物では、変異体に対する抗体だけでなく、野生型に対する抗体も体内に有する。そのため、プレート等に付着させた検出用抗原と生物学的試料とを接触させ、次いで検出用抗原特異的抗体を添加した場合、共通のＢ細胞エピトープを含む検出用抗原と野生型に対する抗体が結合し、検出用抗原特異的抗体は検出用抗原と結合することができない。そのため、例えば、検出用抗原特異的抗体を標識しておけば、生物学的試料中に共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体が存在するか否かを検出するができる。このような反応性の違いを利用することにより、好適に競合ＥＬＩＳＡ法を採用することができる。
【００７２】
検出対象抗体を含むことが分かっている試料および検出対象抗体を含まないことが分かっている試料のうちの少なくとも一方を、コントロールとして利用してもよい。
【００７３】
判定工程では、検出工程の結果に基づき、検出対象抗体が存在する場合には被験動物が牛白血病ウイルスに感染していると判定する。判定工程では、さらに、検出対象抗体が存在しない場合には被験動物が牛白血病ウイルスに感染していないと判定してもよい。
【００７４】
判定後、被検動物が非ヒト動物である場合、牛白血病ウイルスに感染していると判定された動物に対し、隔離または淘汰等の措置をとることができる。
【００７５】
また、本発明に係る識別方法の一実施形態は、被験動物から生物学的試料を採取する工程を含み得る。また、本発明に係る識別方法の一実施形態は、被験動物から採取された生物学的試料を前処理する工程を含み得る。
【００７６】
〔６．検出用抗体〕
本発明に係る検出用抗体は、本発明に係る識別方法に使用される検出用抗体であって、牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体である。当該抗体はレポーター分子で標識されていることが好ましい。
【００７７】
「牛白血病ウイルス感染動物に共通のＢ細胞エピトープを認識する抗体」の説明は、〔１．牛白血病ウイルスの有無を検出する方法〕における「検出用抗原に対する抗体」の説明と同様である。当該抗体は、医薬品組成物に含まれる変異体ペプチド、変異体タンパク質、および／または変異体ウイルス粒子と結合しない抗体であることが好ましい。
【００７８】
なお、本発明に係る検出用抗体のうち、共通のＢ細胞エピトープが配列番号１に示すアミノ酸配列に含まれる１つまたは複数のエピトープである場合、本発明に係る特定方法および本発明に係る検出方法においても使用することができ、また、本発明に係る検出キットの構成要素となり得る。
【００７９】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８０】
〔ペプチドマイクロアレイを用いた共通ＢＬＶエピトープの探索〕
ＢＬＶのＥｎｖ領域のタンパク質（ｇｐ５１）およびＢＬＶのＧａｇ領域のタンパク質（ｐ１５、ｐ２４、およびｐ１２）上のエピトープを網羅的に探索するために、これらタンパク質のアミノ酸配列に由来する１５アミノ酸からなる候補ペプチドを合計１５６種類合成した（図１、図２）。これらは４アミノ酸ずつずらして作製されたペプチドである。これらをスライドガラスに固定化したペプチドマイクロアレイ（JPT Peptide Technologies社製）を作製した。候補ペプチド１種類につき３ヶ所に固定した。なお、ｇｐ５１、ｐ１５、ｐ２４、およびｐ１２の全長のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４、１１〜１３に示すとおりである。
【００８１】
実験には、ＢＬＶ感染感受性の異なる４頭の黒毛和種牛を用意した。ＢＬＶ感染感受性に関するウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）クラスＩＩ ＤＲＢ３遺伝子の遺伝子型を、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３ ＰＣＲ−ＳＢＴ法（文献：Takeshima SN et al., Tissue Antigens 2011.参照）を用いてタイピングした。感受性牛１および感受性牛２はＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１６０１／＊１６０１の感受性牛であり、非感受性牛１はＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１５０１／＊２７０３中立牛であり、非感受性牛２はＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１５０１／＊０５０３の中立牛である。
【００８２】
まず、これら４頭のウシ個体からＢＬＶ感染前に採血し、血清サンプル（ＢＬＶ陰性血清）を得た。続いて、これら４頭の牛個体にＢＬＶを感染させ、ＢＬＶ−ＥＬＩＳＡによる抗体価の上昇、およびＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによるプロウイルス量の上昇を確認した後採血し、血清サンプル（ＢＬＶ陽性血清）を得た。
【００８３】
ペプチドマイクロアレイに血清を添加後、ＢＬＶ由来ペプチドと結合したウシ抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と結合したヤギ抗ウシＩｇＧ抗体で標識した。これをマイクロアレイリーダー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ，Molecular Devices社製）で検出し、それぞれのスポットの強度を目視で５段階評価（０〜４）した（図３〜６）。同一個体について、ＢＬＶ接種前と接種後とを比較することによって、ＢＬＶ特異的に反応の得られた候補ペプチドを選択した。その結果、４頭のウシで共通してＢＬＶ感染後に反応が上昇した候補ペプチドはｇｐ５１Ｎｏ１６（PPQGRRRFGARAMVT；配列番号２）のみであった（図３）。一方、ｐ１５、ｐ２４、およびｐ１２由来の候補ペプチドではＢＬＶ感染牛特異的に反応するものは見出されなかった（図４〜６）。
【００８４】
〔エピトープを用いたペプチドＥＬＩＳＡ法の確立〕
ペプチドマイクロアレイは多検体のエピトープの探索には適さないため、４頭のＢＬＶ感染牛で特異的に反応したｇｐ５１Ｎｏ１６ペプチドを用いたペプチドＥＬＩＳＡの開発を試みた。ペプチドをＥＬＩＳＡプレートに固相化するため、キャリアタンパク質を利用するペプチドＥＬＩＳＡ法を選択した。キャリアタンパク質ｍｃＫＬＨ（Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）をＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣにマレイミド化し、９６ウェル平底マイクロプレート（住友ベークライト株式会社製）に固相化した。このマレイミド化ＫＬＨのマレイミド基がフリーのスルフヒドリルを含むシステイン（Ｃｙｓ）と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。この反応を利用し、ｇｐ５１Ｎｏ１６ペプチドのアミノ酸配列を含むＢＬＶ由来の２０アミノ酸からなるペプチドｇｐ５１ｐ５７（WPPPQGRRRFGARAMVTYDC；配列番号１）のＣ末端側のＣｙｓを利用して、ｍｃＫＬＨと結合したペプチドＥＬＩＳＡ法の構築を試みた。
【００８５】
プレートに固定するキャリアタンパク質ｍｃＫＬＨの濃度検討を行い、０．５μｇ／ｗｅｌｌに決定した。次に、血清の希釈倍数の検討を行い、陽性血清の吸光度の値が１を超える、５００倍希釈を選択した。続いて、二次抗体の希釈倍数の検討行ったところ、吸光度の値が１前後を示す、６２５倍希釈を選択した。
【００８６】
一方、抗原ペプチドの添加なしでも高い吸光度の値が出ていることから、非特異的反応を検出していることが判明したため、血清中に予めＫＬＨおよびｍｃＫＬＨで混ぜ、３７℃で３０分間培養し非特異的な抗体を除去する、吸収法による血清中の非特異的な抗体の除去の検討を行った。血清中に混ぜるＫＬＨおよびｍｃＫＬＨの濃度の検討を行った。血清に添加するＫＬＨの濃度の増加に伴って、陰性血清と陽性血清とのバックグラウンド吸光度の差がなくなっていくことが明らかであった。最終的に、陰性血清と陽性血清がほぼ同じ値を示した、２００μｇ／ｍＬを吸収に用いるＫＬＨの濃度とした。続いて、吸収に用いるｍｃＫＬＨの濃度を検討した。ｍｃＫＬＨなしと比較して明らかな吸収効果が得られたため、ｍｃＫＬＨは２μｇ／ｗｅｌｌで使用することとした。さらに、バックグランドを低減させるため、ウマ血清またはブタ血清を用いたブロッキングステップを検討し、５％ウマ血清でブロッキングし、さらにサンプルに１０％ウマ血清を添加することとした。
【００８７】
〔９１７検体のＢＬＶ感染牛を用いた共通Ｂ細胞エピトープの同定結果〕
共通Ｂ細胞エピトープの同定を試みるために、上記で同定したｇｐ５１Ｎｏ１６を含むｇｐ５１ｐ５７（配列番号１）を合成して、異なるＢｏＬＡ−ＤＲＢ３アリルを有する大量の検体サンプル（９１７検体）を用いて反応性を調べた。その結果、ｇｐ５１ｐ５７は２５種類のＢｏＬＡ−ＤＲＢ３アリルを有する６４７頭のＢＬＶ自然感染牛由来の血清サンプルの中の５９０サンプル（９１．２％）、および２３種類のＢｏＬＡ−ＤＲＢ３アリルを有する２７０頭のＢＬＶ陰性牛由来の血清サンプルの中の３３サンプル（１２．２％）に対して陽性反応を示した。以上の結果から、ｇｐ５１ｐ５７は共通Ｂ細胞エピトープを含んでいることが示唆された。
【００８８】
〔共通抗体結合部位の同定結果〕
共通のＢ細胞エピトープを含んでいるｇｐ５１ｐ５７における抗体結合部位の同定を行った。そのために、ｇｐ５１ｐ５７のアミノ酸配列の１つのアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを合成して（図７左）、上述した４頭のＢＬＶ実験感染牛由来の血清（図７中央）および７１頭のＢＬＶ自然感染牛由来の血清（図７右）を用いて、ＥＬＩＳＡ実験を行った。野生型配列のｇｐ５１ｐ５７をポジティブコントロールとし、ペプチド無添加をネガティブコントロールとした。刺激指数（ＳＩ）を以下の式を用いて算出した：ＳＩ＝（野生型ｇｐ５１ｐ５７または変異ｇｐ５１ｐ５７のＯＤ４５０）／（ペプチド無添加のＯＤ４５０）。ＳＩ値がペプチド無添加の場合と同じかそれより低い場合に、反応性が低下していると判定した。４頭のＢＬＶ実験感染牛および７１頭ＢＬＶ自然感染牛由来の血清サンプルを用いた実験において、ｇｐ５１ｐ５７は全ての血清サンプルに反応したが、一方、シングルアラニン置換ペプチドＲ７Ａ、Ｒ９Ａ、Ｆ１０Ａ、Ｖ１６Ａ、およびＹ１８Ａは、調べた血清サンプルに対して反応を示さなかった。以上の結果から、共通Ｂ細胞エピトープｇｐ５１ｐ５７の中に、５つの抗体結合に寄与するアミノ酸：Ｒ（７）、Ｒ（９）、Ｆ（１０）、Ｖ（１６）、Ｙ（１８）が同定された。
【００８９】
〔ｇｐ５１タンパク質の発現およびシンシチウムの形成の評価〕
同定された抗体結合部位をＤＩＶＡ配列の候補として利用するには、ｇｐ５１タンパク質の発現およびシンシチウムの形成に影響がないことを確認する必要がある。そのため、同定された抗体結合部位のアミノ酸をアラニンに置換した変異体ＢＬＶ感染性分子クローンｐＢＬＶ−ＩＦを構築した。具体的には、ＢＬＶ感染性分子クローンｐＢＬＶ−ＩＦのｅｎｖ遺伝子を含む領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＩＩ（−）ベクターにクローニングした。これを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用いたｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓによって、シングルアラニン置換を導入した。このシングルアラニン置換が導入されたｅｎｖ遺伝子断片を、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｍｇＢＩを利用して、ｐＢＬＶ−ＩＦに挿入した。
【００９０】
これらの変異体ｐＢＬＶ−ＩＦを２３ＣＬＮ細胞にトランスフェクションして、ウェスタンブロット法でｇｐ５１タンパク質の発現を調べた（図８のａ）。野生型ｐＢＬＶ−ＩＦを２３ＣＬＮ細胞にトランスフェクションした場合は、ポジティブコントロールとして使用したＦＬＫ−ＢＬＶ（ＢＬＶ感染ヒツジ胎児腎臓細胞）と同じ分子量のｇｐ５１タンパク質を検出した。一方、コントロールベクターｐＳＫ−ＩＩをトランスフェクションした場合は、ＢＬＶ Ｅｎｖは検出されなかった。続いて、５つの変異体ｐＢＬＶ−ＩＦそれぞれについて、トランスフェクションした細胞において、ＦＬＫ−ＢＬＶで確認されたｇｐ５１タンパク質のバンドと同じ位置にバンドが検出された。この結果から、同定されたそれぞれ５つ抗体結合部に寄与するアミノ酸はｇｐ５１タンパク質の発現に影響がないことが明らかとなった。
【００９１】
また、これら抗体結合部に相当するアミノ酸がＥｎｖの機能であるシンシチウム形成能に関与するか否かを調べるために、変異体ｐＢＬＶ−ＩＦを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、３６時間培養後にシンシチウムを観察した。図８のｂに示すように、変異体ｐＢＬＶ−ＩＦをトランスフェクションした細胞では、野生型ｐＢＬＶ−ＩＦをトランスフェクションした細胞と同じようにシンシチウムを形成した。以上の結果から、全ての同定された抗体結合部位はｇｐ５１タンパク質の発現およびシンシチウムの形成に影響がないことが明らかとなった。
【００９２】
〔共通Ｂ細胞エピトープの保存性の解析〕
ＤＩＶＡ配列として利用するには高い保存性が必要である。そのため、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースからダウンロードした５１７種類のＢＬＶ配列を解析した（図８のｃ）。同定された抗体結合部に相当するアミノ酸Ｒ（７）およびＦ（１０）には変異が見つからなかったことから、非常の高い保存性を有することが示された。
【００９３】
〔α−ＤＩＶＡモノクローナル抗体の作製〕
ＤＩＶＡのモノクローナル抗体の作製過程において、ウサギの抗血清の中に、シングルアラニン置換ペプチドＲ９Ａに対して反応性が低下したものが存在したことから、Ｒ９Ａが医薬品組成物（例えばワクチン組成物）に組み込むＤＩＶＡ変異配列の候補の一つと考えられた。
【００９４】
〔２３ＣＬＮ細胞におけるｐＢＬＶ−ＩＦ−Ｒ９Ａ産生〕
２３ＣＬＮ細胞（ブタ由来細胞；理研登録番号RCB0179）を、５％ＦＢＳおよび１ｘ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ThermoFisher Scientific社製）を添加したＤ−ＭＥＭ培地で培養した。トランスフェクション用に１×１０６個の２３ＣＬＮ細胞を１０ｃｍφのｄｉｓｈ２０枚に播種し、１日間培養した。
【００９５】
トランスフェクションは、上記ｄｉｓｈ１枚に対して、ｐＢＬＶ−ＩＦ Ｒ９Ａ １２μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ ６００μＬに懸濁し、ＦｕｇｅｎｅＨＤ ４８μＬを添加後に室温で１５分間静置し、上記細胞に加えることによって行った。
【００９６】
トランスフェクション３日後に培養上清を回収し、遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって細胞デブリを沈降除去した。さらにこの上清に対して、超遠心分離（ローター：ＳＷ２８ ｂｅｃｋｍａｎ、２８０００ｒｐｍ、２時間、４℃）を行って、ウイルス粒子を沈降させた。上清を除去後、ＰＢＳ（−）に懸濁し、ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質量を定量した。
【００９７】
得られたタンパク質２５μｇを１２．５％アクリルアミドゲルにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜にブロットした。５％スキムミルクを用いて３０分間室温でブロッキングを行った。次いで抗ＢＬＶ ｐ２４および抗ＢＬＶ ｇｐ５１モノクローナル抗体（一次抗体）と１時間室温で反応させた。さらにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）と３０分間室温で反応させた。その後、検出剤ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｐｉｃｏと５分間室温で反応させた後、化学発光を検出した。
【００９８】
また、同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行った。
【００９９】
ウェスタンブロットにおいてＢＬＶ抗原であるｐ２４およびｇｐ５１のバンドが検出されたことから、Ｒ９Ａ変異を含むｇｐ５１抗原がｐＢＬＶ−ＩＦウイルス粒子に取り込まれ、培養上清に放出されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、牛白血病ウイルスに感染した動物を特定すること、および牛白血病ウイルスを予防すること等が必要な畜産分野において特に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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