(57)【要約】【課題】タンパク質凝縮体から、簡便な方法によってタンパク質凝縮体膜を得るタンパク質凝縮体膜の製造方法およびタンパク質凝縮体膜を提供する。【解決手段】本発明に係るタンパク質凝縮体膜５は、タンパク質１０、界面活性剤１２および水１１を含む複合体１の集合体からなり、水相から分離されたタンパク質凝縮体２を溶媒に分散させることによりタンパク質凝縮体分散液体３とし、これを基体に塗工して、乾燥することにより得られ、溶媒４が、水１１および水１１と相溶性を示す１種又は２種以上の有機溶媒からなり、界面活性剤１２は、疎水部２１、タンパク質１０と相互作用する親タンパク質部２３、および水１１と相互作用する親水部２３を含む。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体の集合体からなり、水相から分離されたタンパク質凝縮体を、溶媒に分散させてタンパク質凝縮体分散液体とし、これを基体に塗工して乾燥することにより得られた膜であり、
前記溶媒が、前記タンパク質と前記界面活性剤の結合を妨げないものであって、水および前記水と相溶性を示す１種又は２種以上の有機溶媒からなり、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体膜。
【請求項２】
前記複合体の前記タンパク質は、前記界面活性剤と静電相互作用または共有結合により結合されてなる請求項１に記載のタンパク質凝縮体膜。
【請求項３】
前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤の少なくとも一方を用いる請求項１又は２に記載のタンパク質凝縮体膜。
【請求項４】
前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
【請求項５】
前記界面活性剤の親水部に、ポリエーテルユニットおよびポリオールユニットの少なくともいずれかを含む請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
【請求項６】
前記溶媒は、水とアセトニトリルの混合溶媒である請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
【請求項７】
タンパク質と界面活性剤を水に混合する工程と、
前記タンパク質、前記界面活性剤および前記水を含む複合体を含み、水相から分離されるタンパク質凝縮体を形成する工程と、
前記タンパク質凝縮体に溶媒を加えてタンパク質凝縮体分散液体を得る工程と、
前記タンパク質凝縮体分散液体を基材に塗工する工程と、を含み、
前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含み、
前記溶媒は、前記タンパク質と前記界面活性剤の結合を妨げないものであって、水および前記水と相溶性を示す１種又は２種以上の有機溶媒からなるタンパク質凝縮体膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝縮体から得られるタンパク質凝縮体膜およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
立体構造を保持したままタンパク質を凝縮化した物質には、その立体構造に依存した特有の機能や物性発現が期待されるため、これまで種々の検討がなされてきた。
【０００３】
特許文献１においては、疎水性イオン−タンパク質複合体の沈殿物が記載され、固体状の前記複合体内でタンパク質は安定であり、貯蔵性、取扱い性等に優れることが記載されている。非特許文献１においては、フェリチンタンパク質を化学修飾してカチオン化し、これをポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩と混合して透析を行い、その後に凍結乾燥を経て加温することにより、界面活性剤とタンパク質からなる無溶媒でありながら液体状の複合体を得ている。また、非特許文献２には、酸素結合タンパク質であるヘム鉄含有のミオグロビンと２種類の界面活性剤を用いて、界面活性剤とタンパク質からなる無溶媒でありながら液体状の複合体を得ている。
【０００４】
本発明者らは、先般、水溶性のタンパク質、界面活性剤および水を含む複合体の集合体が水相から分離されるタンパク質凝縮体（タンパク質凝縮物）を提案した（特許文献２）。
【０００５】
ところで、タンパク質には、酸化還元反応に関与するタンパク質がある。いわゆる酸化還元タンパク質は、生体内において電子の伝達や電子移動を介した様々な反応の触媒として機能している。従って、タンパク質を膜化して電極に積層することにより、各種計測やセンサーに用いることが期待できる。膜化したタンパク質として、例えば、特許文献３の濾過膜が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／０８５９９号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１８２０４８号
【特許文献３】国際公開第２００９／００８５５６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stephen Mann et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6242‐6246
【非特許文献２】Stephen Mann et al. Nature Chemistry，2010, VOL 2, August, 622
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献２で得られるタンパク質凝縮体が、例えば粘性の高い液体の場合、所望の膜厚の膜を得ることは難しく、必ずしも取扱い性がよいとはいえなかった。得られるタンパク質凝縮体の粘性や状態（固体、液体等）によらず、膜を簡便に提供できれば、医療、薬学、生化学、分析化学をはじめとする様々な分野での利用の幅を広げることができる。また、電池、センサー、電気化学的手法等を用いた計測用途に有用である。
【０００９】
本発明は、上記背景に鑑みて成されたものであり、タンパク質凝縮体から、簡便な方法によって得られるタンパク質凝縮体膜およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討を重ねたところ、以下の態様において、本発明の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］：  タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体の集合体からなり、水相から分離されたタンパク質凝縮体を、溶媒に分散させてタンパク質凝縮体分散液体とし、これを基体に塗工して乾燥することにより得られた膜であり、前記溶媒が、前記タンパク質と前記界面活性剤の結合を妨げないものであって、水および前記水と相溶性を示す１種又は２種以上の有機溶媒からなり、前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含むタンパク質凝縮体膜。
［２］：  前記複合体の前記タンパク質は、前記界面活性剤と静電相互作用または共有結合により結合されてなる［１］に記載のタンパク質凝縮体膜。
［３］：  前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤の少なくとも一方を用いる［１］又は［２］に記載のタンパク質凝縮体膜。
［４］：  前記界面活性剤として、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を用いる［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
［５］：  前記界面活性剤の親水部に、ポリエーテルユニットおよびポリオールユニットの少なくともいずれかを含む［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
［６］：  前記溶媒は、水とアセトニトリルの混合溶媒である［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質凝縮体膜。
［７］：  タンパク質と界面活性剤を水に混合する工程と、前記タンパク質、前記界面活性剤および前記水を含む複合体を含み、水相から分離されるタンパク質凝縮体を形成する工程と、前記タンパク質凝縮体を分散させる溶媒を加えたタンパク質凝縮体分散液体を得る工程と、前記タンパク質凝縮体分散液体を基材に塗工する工程と、を含み、前記界面活性剤は、疎水部、前記タンパク質と相互作用する親タンパク質部、および前記水と相互作用する親水部を含み、前記溶媒は、前記タンパク質と前記界面活性剤の結合を妨げないものであって、水および前記水と相溶性を示す１種又は２種以上の有機溶媒からなるタンパク質凝縮体膜の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、タンパク質凝縮体から、簡便な方法によって得られるタンパク質凝縮体膜およびその製造方法を提供できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る複合体の一例を示す模式的説明図。
【図２】本発明に係るタンパク質凝縮体の一例を示す模式的説明図。
【図３】本発明に係るタンパク質凝縮体に用いる界面活性剤の一例を示す模式的説明図。
【図４】本発明に係るタンパク質凝縮体分散液体の一例を示す模式図。
【図５】本発明に係るタンパク質凝縮体膜の模式的説明図。
【図６】本発明に係るタンパク質凝縮体のＸ線小角散乱の測定結果を示すグラフ。
【図７】実施例に係るタンパク質凝縮体に溶媒を加え、静置させた後の写真（左からアセトニトリル、アセトニトリル：水＝９０：１０、同じく８０：２０、同じく７０：３０）。
【図８】実施例１に係るタンパク質凝縮体分散液体（アセトニトリル：水＝９０：１０）の動的散乱特性を示すグラフ。
【図９】実施例１に係るタンパク質凝縮体膜の斜入射Ｘ線小角散乱のグラフ。
【図１０】実施例２に係るタンパク質凝縮体膜の斜入射Ｘ線小角散乱のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るタンパク質凝縮体分散液体は、タンパク質、界面活性剤および水を含む複合体の集合体からなり、水相から分離されたタンパク質凝縮体に、水および水と相溶性を示す１種または２種以上の有機溶媒の混合液体に分散して得られた分散液体である。本発明に係るタンパク質凝縮体膜は、前記タンパク質凝縮体分散液体から形成された膜である。界面活性剤は、疎水部、親タンパク質部、および親水部を含む。
【００１４】
本明細書において「親タンパク質部」とは、タンパク質と親和性を示す界面活性剤の部分をいう。また、本発明において「タンパク質」は、純粋なタンパク質であることは必須ではなく、タンパク質特有の立体構造に起因した作用効果を少なくとも一部に有するものであればよく、タンパク質の一部の構造を置換、欠失または付加したもの、更に、タンパク質の表面を化学修飾したもの或いは一部を改変したものも含むものとする。また、「親水部」とは、複合体内で当該ユニット近傍に水を保持する機能を有するユニットをいう。以下本発明を適用した実施形態の一例について説明する。なお、以降の図における各部材のサイズや比率は、説明の便宜上のものであり、これに限定されるものではない。
【００１５】
＜タンパク質凝縮体＞
図１に実施形態に係る複合体の一例の模式図を、図２に実施形態に係るタンパク質凝縮体の一例の模式図を、図３に界面活性剤の模式的説明図を示す。図１に示すように、複合体１は、主として表層に界面活性剤１２が配され、水１１およびタンパク質１０を内包する。複合体１において界面活性剤１２の疎水部２１が外側に、親タンパク質部２３が主として内側に配向するので、複合体１の表層は疎水性を示す。
【００１６】
界面活性剤１２の親水部２２は主として水１１と相互作用し、親タンパク質部２３は主としてタンパク質と相互作用している。すなわち、水１１は、複合体１内においてタンパク質の界面活性剤の親水部近傍に保持されている。
【００１７】
複合体１が集合してタンパク質凝縮体２が形成される。複合体１同士は、疎水結合をベースに結合されている。複合体１に内包される水は、界面活性剤１２の疎水部２１の隙間部を介して複合体１の間に存在する水や他の複合体１との間で拡散可能になっている。複合体１の間に水分子が存在していなくてもよいが、図２に示すように複合体１の間に水分子が存在していてもよい。
【００１８】
複合体１内の水の含有量を調節するためには、界面活性剤１２の親水部２２が重要な役割を担う。界面活性剤において、親タンパク質部２３よりも親水部２２のユニットの方が大きいことが好ましい。親水部２２の好ましい例として、ポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニットまたはポリオールユニットが例示できる。
【００１９】
なお、親水部２２と親タンパク質部２３は必ずしも明確に区別する必要はなく、同一部分が親水部および親タンパク質部として機能してもよい。但し、実施形態の親水部は、タンパク質を取り囲むような水を保持できるための充分な長さを備えている必要がある。また、複合体１の構造は、実質的に上述した構造であればよく、タンパク質凝縮体２を得られる限度において、上述した構造に適合しない部分が含まれていてもよい。
【００２０】
タンパク質１０は、水に溶解可能な水溶性タンパク質であればよく、その種類は特に限定されない。タンパク質１０に合わせて界面活性剤１２の親タンパク質部２３を適宜選定する。疎水性タンパク質、水溶液中で立体構造を安定に保持し難いタンパク質、或いはそれ自身が集合して不均一な構造を形成するタンパク質等は、表面改質等を行って親水性を導入して水溶性タンパク質に誘導することにより、好適に適用できる。従って、本発明でいう「水溶性タンパク質」とは、本来的に水溶性を示すタンパク質の他、表面改質等により水溶性を示すタンパク質を含む。タンパク質凝縮体は、単一種類の複合体１が集合したものでも、異なる種類の複合体１がブレンドされたものでもよい。
【００２１】
好適なタンパク質として、大腸菌オルニチントランスカルバミラーゼ、表面改善ウマ肝臓フェリチン軽鎖、Pyrococcus furiosus（ピュロコックス・フリオスス）のフェリチン、Aspergillus niger(コウジカビ)グルコースオキシダーゼ、表面改善緑色蛍光タンパク質、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、金属貯蔵タンパク質（ＬｉＤｐｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ），ＧＦＰ−ＹＦＰ融合タンパク質、リゾチーム, Thermus thermophiles(サーマス・サーモフィルス)イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、赤色蛍光タンパク質(DsRed T1)等が例示できる。複合体１内には、単数または複数のタンパク質分子が内包されている。複合体１内に異なる種類のタンパク質分子が含有されていてもよい。
【００２２】
界面活性剤１２は、図３に示すように端部に親タンパク質部２３、他端部に疎水部２１、これらの間に親水部２２を有する構造が好ましい例として例示できるが、複合体１を形成できるものであればよく、図３の構成に限定されるものではない。例えば、両端部に疎水部、その隣接位に親水部が配置され、親水部に挟持された略中央部に親タンパク質部を有する折り畳み構造の界面活性剤を用いてもよい。また、親タンパク質部が複数ユニットあるものを用いてもよい。また、高分子界面活性剤を用いてもよい。生体適合性が求められる用途においては、生体適合性を有する界面活性剤を用いることが好ましい。
【００２３】
水１１は純水でもよいし、添加剤が含まれていてもよい。添加剤としては、金属をはじめとする無機化合物や、薬剤、化粧成分等の有機化合物や、有機無機ハイブリッド化合物等の添加剤が含まれていてもよい。図２においては、複合体１のコア部中心にタンパク質が配置されている例を示しているが、水１１がコア部中心に存在する態様、複数のタンパク質分子の間に存在している態様でもよい。タンパク質内には、別のタンパク質、有機物、金属等の無機物等が含まれていてもよい。
【００２４】
タンパク質１０と界面活性剤１２とが相互作用して複合体を形成するために、タンパク質１０の種類に応じて、用いる界面活性剤１２を適切に組み合わせる必要がある。用いるタンパク質１０への界面活性剤１２の結合量が少ないという理由でタンパク質凝縮体が得られない場合には、表面電荷を変更すればよい。例えば、アミノ酸残基の改変を行うことにより適切に表面電荷を変更することができる。表面電荷を変更する方法は特に限定されないが、好適な例として遺伝子工学的な手法を用いる方法がある。
【００２５】
タンパク質１０と界面活性剤１２の相互作用は、複合体１を形成できればよく特に限定されないが、静電相互作用により複合体を形成する方法、共有結合により複合体を形成する方法が好適である。
【００２６】
静電相互作用によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質１０の表面電荷の量に応じて界面活性剤の親タンパク質部２３にアニオン性ユニットを有するアニオン性界面活性剤または／および親タンパク質部２３にカチオン性ユニットを有するカチオン性界面活性剤を用いる方法が好適である。また、両性界面活性剤も好適である。タンパク質１０の表面電荷や電荷部分の立体配置などを考慮して、アニオン性界面活性剤または／およびカチオン性界面活性剤の添加量を決定すればよい。
【００２７】
タンパク質１０内にプラスの電荷を有する部分とマイナスの電荷を有する部分が存在する場合には、アニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤を、タンパク質１０内の電荷の分布や立体配置を考慮しつつ添加量比を調整すればよい。アニオン性ユニットとしてはカルボキシル基やスルホン酸基が挙げられ、カチオン性ユニットとしてはアミノ基が例示できる。また、親水部の好適な例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等が好ましい。これらの親水性を示す部分のユニットは、主鎖を構成する原子数で１０以上の長鎖ユニットからなることが好ましい。親水部は、構成する原子のうち１／４以上が親水性を示す原子（例えば、Ｏ原子）により構成されていることが好ましい。疎水部としてはアルキル基等が好ましい。カルボキシル基やスルホン酸基等のアニオン性ユニット、アミノ基等のカチオン性ユニットとは別に、ポリエーテルユニット、ポリビニルアルコール等の長鎖ユニットからなる親水部を有し、アルキル基等の疎水部をさらに有する界面活性剤を用いることにより、実施形態のタンパク質凝縮体を容易に得ることができる。
【００２８】
タンパク質凝縮体２のタンパク質含有量は、用途により適宜設計することができる。例えば、タンパク質凝縮体２に対して、例えば、タンパク質の含有量を１〜４０質量％とすることができる。タンパク質の質量％を増やすためには親水部２２の長さを短くすることが有効であり、タンパク質の質量％を減らすためには親水部２２の長さを長くすることが有効である。
【００２９】
アニオン型界面活性剤として、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型のものが例示できる。また、カチオン型界面活性剤として、第４級アンモニウム塩型、アルキルアミン塩型、ピリジン環型構造を有する化合物が例示できる。両性界面活性剤としては、アルキルべタイン型、脂肪酸アミドプロピルベタイン型、アルキルイミダゾール型、アミノ酸型、アミンオキシド型構造を有する化合物が挙げられる。
【００３０】
実施形態に好適な界面活性剤としては、例えば、以下のような化合物（１）〜（３）等が例示できる。
【化１】
2017171618.tif 000003
但し、ｘは６〜１８、ｙは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化２】
2017171618.tif 000004
但し、ｐは６〜１８、ｑは３〜２０、好ましくはｙ＝５〜２０、より好ましくはｙ＝８〜２０である。
【化３】
2017171618.tif 000005
但し、ｎは３〜２０、好ましくは５〜２０、より好ましくは６〜２０である。
より好ましくは、ｘが１１〜１３、ｙが１１、ｐが１１〜１３、ｑが１１、ｎが２０である。
【００３１】
共有結合によりタンパク質１０と界面活性剤１２を相互作用させる場合には、タンパク質と親タンパク質部とを共有結合させる方法が好適である。例えば、タンパク質のリジン残基のアミノ基と共有結合させる界面活性剤として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化界面活性剤が有効である。また、タンパク質のシステイン残基のメルカプト基と共有結合させる界面活性剤として、マレイミド化界面活性剤が有効である。
【００３２】
共有結合は、予め、タンパク質と界面活性剤を共有結合させてもよいし、タンパク質と界面活性剤を水中で混合する際に共有結合させてもよい。共有結合によりタンパク質と界面活性剤を結合することにより、より安定な複合体を形成できる。なお、共有結合とイオン結合の両者を含む複合体でもよい。すなわち、一の複合体において、タンパク質と界面活性剤が、共有結合により結合された部位とイオン結合により結合された部位を有していてもよい。また、タンパク質凝縮体内においてイオン結合により結合された複合粒子と共有結合により結合された複合粒子が混在していてもよい
【００３３】
＜タンパク質凝縮体分散液体＞
本発明に係るタンパク質凝縮体分散液体３は、図４に示すように、タンパク質凝縮体の構成単位である複合体１が、溶媒４に分散された液体をいう。ここで「分散」とは、実質的にタンパク質凝縮体の複合体１を単位粒子として分散した液体である。なお、この単位粒子は、少なくともタンパク質と界面活性剤を含む複合体であればよく、図１に示す複合体の形態をとっていなくてもよい。すなわち、水の含有量や界面活性剤の凝集形状等が相違していてもよい。また、水を含んでいない複合体であってもよい。複合体が水を含んでいる場合、その水は溶媒中の水と置換可能になっていると考えられる。タンパク質凝縮体分散液体３には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、他の成分が添加されていてもよい。
【００３４】
タンパク質凝縮体は、前述したように水を加えた場合、水と相分離する。また、例えば、アセトニトリル、エタノール、アセトン等の有機溶媒を単独で加えた場合も、タンパク質凝縮体と相分離し、分散させることはできないが、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、水と、水と相溶する１種または２種以上の有機溶媒であって、且つタンパク質と前記界面活性剤の結合を妨げない有機溶媒との混合溶媒を用いると、タンパク質凝縮体２の集合体を解離させ、複合体１の形態で分散させられることがわかった。
【００３５】
水と相溶する１種または２種以上の有機溶媒は、タンパク質に応じて適宜選定すればよい。タンパク質の種類により変動し得るが、前記有機溶媒の好適な例としてアセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，ＴＨＦ等が例示できる。
【００３６】
＜タンパク質凝縮体膜＞
本発明に係るタンパク質凝縮体膜５は、基体上にタンパク質凝縮体分散液体３を塗工し、乾燥することにより得られた膜である。基体は特に限定されない。ガラス基板、プラスチック基板、シリコン基板、ＩＴＯや金属等の導電膜、半導体膜、絶縁膜が塗布された基板等に塗工することもできる。
【００３７】
塗工後、乾燥することにより、溶媒を実施的に留去したタンパク質凝縮体膜５が得られる。タンパク質凝縮体膜５を構成する複合体１の凝縮形態により乾燥条件は変わるが、充分に乾燥することにより、複合体１に存在していた水を実質的に留去させることが可能である。例えば、真空乾燥により溶媒を留去する方法が好適である。このようなタンパク質凝縮体膜５は、複合体１同士が疎水相互作用により集合することで形成されている。
【００３８】
タンパク質凝縮体膜によれば、近接するタンパク質間の距離が、タンパク質の分子サイズに比して、１０倍以下、好ましくは５倍以下、更に好ましくは２倍以下である密度にタンパク質が配列した膜を得ることができる。溶媒を留去した膜を保管しておき、使用する際に水と接触させ、タンパク質凝縮体膜５に水を取り込むことができる。このとき、水に、化合物を溶解させ、当該化合物をタンパク質凝縮体膜５に取り込むこともできる。
【００３９】
また、タンパク質凝縮体分散液体３を塗工して乾燥する際に、乾燥条件を制御することにより、タンパク質凝縮体膜に水を内包させた膜を得ることができる。水の保持量を保つために、必要に応じて、水蒸気透過性の低いフィルムや水蒸気透過防止フィルムを積層してもよい。また、ガラス基板等で挟持し、側面をシール材などでシーリングしてもよい。このようなタンパク質凝縮体膜は、膜内において水が、界面活性剤１２の親水部２２近傍に主として保持されている。
【００４０】
また、タンパク質凝縮体分散液体３に予め化合物を溶解させ、タンパク質凝縮体膜５を形成する際に、前記化合物を取り込むようにしてもよい。
【００４１】
タンパク質凝縮体膜５のタンパク質含有量は、用途により適宜設計することができる。例えば、タンパク質凝縮体膜５に対して、タンパク質の含有量を１〜８０質量％とすることができる。タンパク質の質量％を増やすためには親水部２２の長さを短くすることが有効であり、タンパク質の質量％を減らすためには親水部２２の長さを長くすることが有効である。
【００４２】
タンパク質凝縮体膜５の膜厚は限定されず、用途に応じて適宜設定できる。タンパク質凝縮体膜５は、単層でもよいし、複数積層した積層体でもよい。積層体は、タンパク質凝縮体膜５を複数積層する態様の他、異なる種類の層を積層してもよい。
【００４３】
＜タンパク質凝縮体膜の製造方法＞
次に、本発明のタンパク質凝縮体膜の製造方法の一例について説明する。但し、本発明のタンパク質凝縮体膜の製造方法は、以下の製造方法に何ら限定されるものではない。
【００４４】
まず、タンパク質、界面活性剤および水を含む混合液を調製する工程ａと、水相と分離され、タンパク質および水を内包する複合体を含むタンパク質凝縮体を形成する工程ｂと、タンパク質凝縮体を水および水に相溶する１種または２種以上の有機溶媒の混合液に分散させる工程ｃと、得られたタンパク質凝縮体分散液液体を塗工して乾燥することによりタンパク質凝縮体膜を得る工程ｄとを有する。
【００４５】
まず、タンパク質と界面活性剤を低濃度の電解質濃度の水に溶解させた混合液を得る（工程ａ）。なお、ここでいう水には、タンパク質安定化のための成分（塩、酵素などの反応基質、グリセロール、ｐＨ緩衝成分）が溶解されているものや電解質水溶液も含まれる。電解質水溶液は、例えば、ＮａＣｌ等の塩を含む所定濃度のＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ等を好適に用いることができる。
【００４６】
界面活性剤を直接加えてもよいが、均一分散性やタンパク質の変性を回避する観点からは、タンパク質含有水溶液と界面活性剤の水溶液を混合する方法が簡便である。タンパク質含有水溶液、界面活性剤水溶液は、必要に応じてタンパク質が変性しないようにｐＨ調整を行うことができる。混合液の電解質濃度は、タンパク質凝縮体が得られればよく特に限定されないが、界面活性剤との相互作用を阻害しない観点からは５０ｍＭ以下とすることが好ましく、１０ｍＭ以下とすることがより好ましく、１ｍＭ以下とすることがさらに好ましい。タンパク質水溶液の濃度は、混合液にしたときに上述の電解質濃度になるように調整する方法が好ましい。
【００４７】
その後、タンパク質と界面活性剤の混合液（溶液または懸濁液）からタンパク質凝縮体を得る（工程ｂ）。短時間で複合体を得る観点からは、遠心分離が好ましいが、揺動させる方法や静置させる方法でもよい。遠心分離は、懸濁液が得られた後、直ちに行ってもよいし、所望のタイミングで遠心分離してもよい。遠心分離の温度は、タンパク質の種類、タンパク質凝縮体の状態に応じて常温で行うほか、加温したり、冷却したりすることができる。遠心分離を行うことにより、タンパク質凝縮体と不要の界面活性剤および塩とを分離することができる。上記工程を経て得られるタンパク質凝縮体は、例えば、液体、固体として取り出すことができる。タンパク質凝縮体が液体の場合には、マイクロピペットなどにより取り扱うことができる。固体の場合には、沈殿または濾過により回収すればよい。なお、ここでいう液体には粘性のある液体も含むものとする。
【００４８】
タンパク質凝縮体を当該方法により得ることにより、用いた物質の質量および体積が把握できるので、用いた物質の質量、体積が求まり、タンパク質と界面活性剤の濃度を定量することができる。更に、界面活性剤を滴定することにより、本発明のタンパク質凝縮体を得るための最適な条件（界面活性剤の種類、添加量等）を容易に決定できるというメリットがある。このため、電解質等の添加剤の影響についての知見も容易に得ることができる。更に、回収時のロスが少ない。更には、最適な界面活性剤量を加えて混合した後、遠心分離することにより直ぐにタンパク質凝縮体が得られるので、製造工程の点からも優れている。このため、大量調製にも好適である。なお、タンパク質凝縮体は、上記特許文献２に開示した透析法により得てもよい。以上の工程等を経てタンパク質凝縮体膜が得られる。
【００４９】
その後、タンパク質凝縮体を水、および水と相溶する１種又は２種以上の有機溶媒に分散させたタンパク質凝縮体分散液体を調整する（工程ｃ）。その後、タンパク質凝縮体分散液体を基板に塗工し、乾燥する（工程ｄ）。塗工方法は、スピンコート法、キャスト法、ディップコート法、ダイコーター法、ロールコーター法、バーコーター法、ロールツーロール（roll-to-roll）などの塗布法、インクジェット法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソグラフィー印刷法、オフセット印刷法、マイクロコンタクト印刷法などの各種印刷法、などの通常の方法を用いることができる。特に好ましくは、キャスト法、スピンコート法である。
【００５０】
本発明によれば、冷却・加熱処理工程を必須とせずにタンパク質凝縮体を自発的に水相から分離させてタンパク質凝縮体を得、それを液体にした後に、塗工によりタンパク質が高密度に配列したタンパク質凝縮体膜を得ることが可能である。このため、特に、取り扱いが難しい高粘度のタンパク質凝縮体や、固体のタンパク質凝縮体に対しても簡便にタンパク質凝縮体膜を得ることができる。また、膜厚等の制御が容易であるというメリットもある。
【００５１】
得られるタンパク質凝縮体膜は、温度や膜厚により集合状態が変わり得るが、透明または半透明の膜を容易に得ることができる。タンパク質凝縮体は、少なとも１つの散乱ピークを有するＸ線散乱パターンを有するタンパク質が一定間隔で配列した均一性を有する形態が好ましい。
【００５２】
タンパク質凝縮体膜において、乾燥条件を制御し、水蒸気透過性防止フィルム等で保護することにより、水を保持させたまま保管することが可能である。このため、水溶性タンパク質を自然界に近い状況で安定的に保管できる効果が期待できる。逆に、タンパク質凝縮体膜の溶媒を留去し、使用時に、必要に応じて反応基質等を含む水と接触させることも可能である。本発明のタンパク質凝縮体膜によれば、用途に応じて、種々の利用態様がある。
【００５３】
また、本発明によれば、タンパク質凝縮体分散液体において物質の取り込み特性を効率的に利用して、膜に所望の化合物を導入できる。従って、水の存在により様々な応用が期待できる。例えば、抗原抗体反応を利用したセンサー、複合体内の水を反応場として利用した反応リアクター等への応用が期待できる
【００５４】
また、タンパク質凝縮体膜は、電池、センサー、電気化学的手法等を用いた計測用途に有用である。また、医療、薬学、生化学、分析化学をはじめとする様々な分野に有用である。具体的には、ドラックデリバリーシステム、湿布等の貼付け用外用薬、塗り薬、化粧品、タンパク質含有食品などが例示できる。
【００５５】
タンパク質凝縮体膜は、徐放シートとして用いることもできる。タンパク質凝縮体膜を徐放させるには、塩強度を増加させた環境下におけばよい。徐放させるタイミングに、ＮａＣｌ等の塩が含まれた水溶液を含む膜を積層したり、タンパク質凝縮体膜を患部等に塗布し、その上に、経時的に徐放を促すシートを貼り付けたりする方法が例示できる。後者の方法により、患部に製剤としてのタンパク質を投与することができる。液状のタンパク質凝縮体そのものを塗布する方法に代えて、タンパク質凝縮体膜を患部に貼る方法によれば、取扱い性および、徐放制御を容易に行うことができるというメリットを有する。
【００５６】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。また、上記実施形態は、互いに好適に組み合わせられる。
【００５７】
≪実施例≫        
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。但し、本発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。なお、実施例および比較例における物性値の測定等は以下の方法により実施した。
Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）と斜入射Ｘ線小角散乱（ＧＩＳＡＸＳ）：Ｘ線小角散乱装置（リガク社製、「ナノスケールＸ線構造評価装置 NANO-Viewer」）を用いて測定した。タンパク質凝縮体の測定は、室温で行った。また、タンパク質凝縮体と比較するために、タンパク質水溶液の測定も行った。水中に分散する条件は、タンパク質が凝集しない条件（ｐＨ緩衝成分を含む）とした。
遠心機は、微量高速冷却遠心機（トミー精工社製、ＭＸ３０７）を用いて、１５，０００ｇ×１ｍｉｎの条件で行った。熱質量変化測定は、セイコーインスツルメンツ社製、EXSTRA6000 TG/DTA6300を用いた。
【００５８】
（実施例１）
遺伝子操作によって中性溶液中における総電荷を−２９とした緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」）を用意した。５ｍｍｏｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で前記ＧＦＰを溶かし、タンパク質水溶液を得た（工程ａ）。次いで、タンパク質１ｍｇあたり式（ａ）に示す陰イオン界面活性剤（以下、「Ｓ２」という。）の水溶液（ＫＯＨ中和水溶液）の１００ｍＭのＳ２の水溶液１４μＬ（＝１．４μｍｏｌ）および式（ｂ）に示す陽イオン界面活性剤（以下、「ｃＳ２」という。）の水溶液（ＨＣｌ中和水溶液）の１００ｍＭのｃＳ２の水溶液２６μＬ（＝２．６μｍｏｌ）を、前記タンパク質水溶液に加えて撹拌することにより懸濁液を得た（工程ｂ）。
【化４】
2017171618.tif 000006
【化５】
2017171618.tif 000007
なお、GFP(-29)のアミノ酸配列は、ASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATNGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESVLSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYKである。
【００５９】
その後、速やかに遠心分離した。すると、直ちに透明性のある緑色を示すタンパク質凝縮体が得られた。５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ水溶液６ｍＬ（３０ｍｇＧＦＰ）を用いて、３００μＬの液体のタンパク質凝縮体を得た。なお、実施例の表面電荷の変更は、非特許文献３を参照にして行った。
【００６０】
図６に、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）により構造解析を行った結果を示す。同図より、タンパク質凝縮体は、散乱ピーク（Ｑ＝０．８９，ｄ１＝７．１ｎｍ（２π／Ｑ）［以下同様］）を示し、タンパク質凝縮体内部に周期的な秩序構造が存在することを確認した。
【００６１】
図７に、タンパク質凝縮体に、アセトニトリルを加え静置した後の写真
図中の最も左の写真）、およびアセトニトリルと水の混合溶媒（図中の左２番目から順にアセトニトリル：水＝９０：１０、８０：２０、７０：３０）したタンパク質凝縮体分散液体を加え静置した後の写真を示す。同図に示すように、タンパク質凝縮体と水は相分離していることがわかる。
【００６２】
上記タンパク質凝縮体を１０倍体積のアセトニトリル：水＝９０：１０に分散させたタンパク質凝縮体分散液体の動的光散乱測定したところ、図８に示すように、粒径分布が単一ピークを示し、均一に分散していることを確認した。
【００６３】
シリコンウェハ上に１０００、２０００、４０００、７０００ｒｐｍで塗膜を形成した。回転数に応じて様々な厚さの膜を形成できることがわかった。また、タンパク質由来の蛍光を保持していることを確認した。膜厚は、１０００ｒｐｍのときは１９４ｎｍ、４０００ｒｐｍのときは１１９ｎｍであった。また、ＩＴＯ透明導電膜付きガラス基板上にも同様に塗膜を形成できた。
【００６４】
図９に、ＧＦＰを用いたタンパク質凝縮体膜の斜入射Ｘ線小角散乱（ＧＩＳＡＸＳ）による面内散乱強度プロファイルを示す。タンパク質凝縮体膜は面内散乱にピーク（Ｑ＝０．９５、ｄ＝６．６ｎｍ）を示し、タンパク質凝縮体膜においてタンパク質凝縮体が秩序を持って配向しており、複合体１の形態で、タンパク質凝縮体が高密度、且つ均一に配列していることを確認した。タンパク質凝縮体と数値がほぼ一致し、同等の構造を示すことを確認した。
【００６５】
（実施例２）
純水に１ｍｇ／ｍＬの濃度でグルコースオキシダーゼ（Glucose  Oxidase）を溶かし、タンパク質水溶液を得た（工程ａ）。次いで、タンパク質１ｍｇあたりＳ２の水溶液（ＫＯＨ中和水溶液）を０．４５６μｍｏｌおよびｃＳ２の水溶液（ＨＣｌ中和水溶液）を０．７４４μｍｏｌ（式（ａ）と式（ｂ）の化合物の合計で１．２μｍｏｌ）をタンパク質水溶液に加えて撹拌し、懸濁液を得た（工程ｂ）。その後、速やかに遠心分離した。すると、直ちに補酵素ＦＡＤ由来の透明性のある黄色を示すタンパク質凝縮体が得られた。
【００６６】
得られたグルコースオキシダーゼ凝縮体と水は、はっきり相分離することを確認した。得られたタンパク質凝縮体におけるタンパク質含有量は、２８０ｎｍの吸収から算出したおよその量は１８４ｍｇ／ｍＬであった。
【００６７】
なお、得られたグルコースオキシダーゼ凝縮体にＮａＣｌ水溶液を加えると溶解し、全体が均一な黄色の溶液となった。これは、タンパク質凝縮体を構成する複合体が解離されたことを示す。すなわち、タンパク質凝縮体は、塩を加えることにより徐放性を示すことを確認した。塩を添加後、約１０ｓ後に黄色の溶液が得られた。
【００６８】
次いで、上記タンパク質凝縮体を、１０倍体積のアセトニトリル：水＝７０：３０に分散させた。その結果、透明の黄色に呈する液体を得た。この液体を、動的光散乱測定したところ、粒径分布が単一ピークを示したことから、均一に溶解していることが判明した。
【００６９】
次に、シリコンウェハ上に２０００、７０００ｒｐｍで塗膜を形成した。膜厚は、２０００ｒｐｍのときは９９ｎｍ、７０００ｒｐｍのときは５２ｎｍであった。
【００７０】
図１０に、グルコースオキシダーゼ凝縮体膜のＧＩＳＡＸＳによる面内散乱強度プロファイルを示す。タンパク質凝縮体膜は面内散乱にピーク（Ｑ＝０．７３、ｄ＝８．６ｎｍ）を示し、タンパク質凝縮体膜においてタンパク質凝縮体が秩序を持って配向しており、複合体１の形態で、タンパク質凝縮体が高密度、且つ均一に配列していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のタンパク質凝縮体膜によれば、前述した様に、ドラッグデリバリーシステム、人体の治療などの医用用途、食品工業、化粧品製造の分野に好適である。また、フィルムやシートに成形して電子機器等をはじめとする各種部材に適用できる。特に、周期構造がみられるタンパク質凝縮体においては、光学フィルム等の光学材料、センサーの分野において利用することが期待できる。また、複合体の内部に金属イオンを導入して、金属構造体を作製したり、ゾルゲル法による無機化合物の合成に応用したりすることが期待できる。更に、燃料電池の触媒として、廃棄物処理用としても利用できる可能性がある。また、水中油型エマルションの状態での利用も期待できる。また、タンパク質凝縮体と外部の水が入れ替わることを利用して、反応リアクターとして利用することが期待できる。
【符号の説明】
【００７２】
１      複合体
２      タンパク質凝縮体
３      タンパク質凝縮体分散液体
４      溶媒
５      タンパク質凝縮体膜
１０    タンパク質
１１    水
１２    界面活性剤
２１    疎水部
２２    親水部
２３    親タンパク質部
【図１】
2017171618.tif 000008
【図２】
2017171618.tif 000009
【図３】
2017171618.tif 000010
【図４】
2017171618.tif 000011
【図５】
2017171618.tif 000012
【図６】
2017171618.tif 000013
【図７】
2017171618.tif 000014
【図８】
2017171618.tif 000015
【図９】
2017171618.tif 000016
【図１０】
2017171618.tif 000017