(57)【要約】      （修正有）【課題】生体に移植可能な培養組織を容易に作製するための方法として、血管様構造の外部に生着している細胞へ十分に酸素や栄養を供給可能な血管様立体構造物およびその製造方法，血管様立体構造物製造装置，並びに血管様立体構造物製造用ニードルの提供。【解決手段】第一開口４及び第一開口４より小径の第二開口５を有する筒状であり血管内皮細胞による単層の管腔構造をなす血管様構造２と、血管様構造２の外面に接して血管様構造２を支持する支持構造７と、を有する血管様立体構造物１。血管様構造２が第一開口４から第二開口５へ向って内径が漸次小さくなるテーパー状の管部を有する血管様立体構造物１。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一開口及び前記第一開口より小径の第二開口を有する筒状であり血管内皮細胞による単層の管腔構造をなす血管様構造と、
前記血管様構造の外面に接して前記血管様構造を支持する支持構造と、
を有することを特徴とする血管様立体構造物。
【請求項２】
前記血管様構造が、前記第一開口から前記第二開口へ向かって内径が漸次小さくなるテーパー状の管部を有することを特徴とする請求項１に記載の血管様立体構造物。
【請求項３】
中心線が湾曲した一続きの筒状であり血管内皮細胞による単層の管腔構造をなす血管様構造と、
前記血管様構造の外面に接して前記血管様構造を支持する支持構造と、
を有することを特徴とする血管様立体構造物。
【請求項４】
チオール基及び細胞接着活性配列を含むオリゴペプチド及び前記チオール基が結合する金表面を有し両端の外径が互いに異なるニードルに血管内皮細胞を付着させて培養する培養工程と、
所定の硬化手順によりゲル化する流動体を前記ニードル及び前記血管内皮細胞に接するように充填する充填工程と、
前記流動体のゲル化物と前記金表面との間に所定の電圧を印加して前記金表面から前記オリゴペプチドを脱離させる脱離工程と、
前記血管内皮細胞が前記ゲル化物に付着した状態で前記ゲル化物から前記ニードルを抜き取る抜き取り工程と、
を有することを特徴とする血管様立体構造物の製造方法。
【請求項５】
互いに外径が異なる先端と基端とを有し金表面を有するニードルと、
前記ニードルを内部に収容可能な筒状培養チャンバーと、
前記ニードルを前記筒状培養チャンバー内に保持するニードルホルダと、
前記筒状培養チャンバー内に配置された電極を含む電極部と、
を備え、
前記ニードルが、チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドを有することを特徴とする血管様立体構造物製造装置。
【請求項６】
前記ニードルが、前記基端から前記先端に向かって漸次外径が小さくなるテーパー状をなしていることを特徴とする請求項５に記載の血管様立体構造物製造装置。
【請求項７】
互いに外径が異なる先端と基端とを有し金表面を有する棒状部材と、
チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドと、
を有する血管様立体構造物製造用ニードル。
【請求項８】
金表面を有する螺旋状の棒状部材と、
チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドと、
を有する血管様立体構造物製造用ニードル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管様立体構造物およびその製造方法，血管様立体構造物製造装置，並びに血管様立体構造物製造用ニードルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、三次元的な構造を有する生体組織類似構造物を生体外で構築する技術が知られている。
たとえば非特許文献１には、犠牲テンプレートとして糖ガラスを利用して培養組織中で血管網を形成する汎用的な高速鋳型法が開示されている。
また、非特許文献２には、コラーゲンゲルに貫通孔を形成してこの貫通孔内に血管内皮細胞の懸濁液を播種して培養することにより血管様の管腔構造を構築することが開示されている。
【０００３】
生体に移植可能な培養組織を容易に作製するための方法として、特許文献１には、一方の末端にチオール基を含んでいると共に他方の末端にＲＧＤモチーフを含んだ所定のアミノ酸配列を有する合成オリゴペプチドを金表面に結合させ、この合成オリゴペプチドに細胞を接着させた状態で細胞培養をすることにより細胞シートを作製することが開示されている。特許文献１に開示された技術では、金表面に結合した合成オリゴペプチドを還元離脱により金表面から離間させることで、容易に細胞シートを得ることができる。
また、非特許文献３には、特許文献１と同様の技術を利用して、金を表面に有する円柱状のニードルを用いて血管内皮細胞を培養し、血管様の管腔構造を有する立体構造物を作製することが開示されている。
【０００４】
上記の各文献に開示された技術により、血管網を模した構造（以下、「血管様構造」という。）を含んだ立体的な構造物を作製することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０３３１８１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jordan S. Miller, Kelly R. Stevens, Michael T. Yang, Brendon M. Baker, Duc-Huy T. Nguyen, Daniel M. Cohen, Esteban Toro, Alice A. Chen, Peter A. Galie, Xiang Yu, Ritika Chaturvedi, Sangeeta N. Bhatia, and Christopher S. Chen. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered 3D tissues. Nat Mater. 2012 September ; 11(9): 768-774. doi:10.1038/nmat3357.
【非特許文献２】Takayuki Takei, Shinji Sakai, Tsutomu Ono, Hiroyuki Ijima, Koei Kawakami. Fabrication of Endothelialized Tube in Collagen Gel as Starting Point for Self-Developing Capillary-Like Network to Construct Three-Dimensional Organs In Vitro. Biotechnol Bioeng. 2006 Sep 5;95(1):1-7.
【非特許文献３】Tatsuya Osaki, Takahiro Kakegawa, Tatsuto Kageyama, Junko Enomoto, Tadashi Nittami, Junji Fukuda. Acceleration of Vascular Sprouting from Fabricated Perfusable Vascular-Like Structures. PLoS One. 2015 Apr 10;10(4):e0123735. doi: 10.1371/journal.pone.0123735.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
再生医療に利用可能な立体的な組織を作製する場合、血管様構造の外部に様々な細胞を生着させる必要があり、これらの細胞に酸素や栄養を十分に供給すると共に老廃物を排出することが求められている。しかしながら、上記の各文献に開示された技術では、血管様構造の内部に培養液をスムーズに流すことができる点が示唆されているものの、血管様構造の外部に生着している細胞への培養液の供給が十分でなく、血管様構造外での細胞培養効率が低いという問題がある。
【０００８】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、血管様構造の外部に十分に酸素や栄養を供給可能な血管様立体構造物およびその製造方法，血管様立体構造物製造装置，並びに血管様立体構造物製造用ニードルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様は、第一開口及び前記第一開口より小径の第二開口を有する筒状であり血管内皮細胞による単層の管腔構造をなす血管様構造と、前記血管様構造の外面に接して前記血管様構造を支持する支持構造と、を有することを特徴とする血管様立体構造物である。
また、前記血管様構造が、前記第一開口から前記第二開口へ向かって内径が漸次小さくなるテーパー状の管部を有していてもよい。
【００１０】
本発明の第二の態様は、中心線が湾曲した一続きの筒状であり血管内皮細胞による単層の管腔構造をなす血管様構造と、前記血管様構造の外面に接して前記血管様構造を支持する支持構造と、を有することを特徴とする血管様立体構造物である。
【００１１】
本発明の第三の態様は、チオール基及び細胞接着活性配列を含むオリゴペプチド及び前記チオール基が結合する金表面を有し両端の外径が互いに異なるニードルに血管内皮細胞を付着させて培養する培養工程と、所定の硬化手順によりゲル化する流動体を前記ニードル及び前記血管内皮細胞に接するように充填する充填工程と、前記流動体のゲル化物と前記金表面との間に所定の電圧を印加して前記金表面から前記オリゴペプチドを脱離させる脱離工程と、前記血管内皮細胞が前記ゲル化物に付着した状態で前記ゲル化物から前記ニードルを抜き取る抜き取り工程と、を有することを特徴とする血管様立体構造物の製造方法である。
【００１２】
本発明の第四の態様は、互いに外径が異なる先端と基端とを有し金表面を有するニードルと、前記ニードルを内部に収容可能な筒状培養チャンバーと、前記ニードルを前記筒状培養チャンバー内に保持するニードルホルダと、前記筒状培養チャンバー内に配置された電極を含む電極部と、を備え、前記ニードルが、チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドを有することを特徴とする血管様立体構造物製造装置である。
また、前記ニードルが、前記基端から前記先端に向かって漸次外径が小さくなるテーパー状をなしていてもよい。
【００１３】
本発明の第五の態様は、互いに外径が異なる先端と基端とを有し金表面を有する棒状部材と、チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドと、を有する血管様立体構造物製造用ニードルである。
【００１４】
本発明の第六の態様は、金表面を有する螺旋状の棒状部材と、チオール基及び細胞接着活性配列を含み前記金表面に結合したオリゴペプチドと、を有する血管様立体構造物製造用ニードルである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、血管様構造の外部に十分に酸素や栄養を供給可能な血管様立体構造物およびその製造方法，血管様立体構造物製造装置，並びに血管様立体構造物製造用ニードルを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施形態の血管様立体構造物の模式的な断面図である。
【図２】同構造物の作用を説明するための説明図である。
【図３】血管様構造が直管状である場合の培養液の流れを模式的に示す説明図である。
【図４】同実施形態の構造物を製造するための製造装置の模式図である。
【図５】同製造装置におけるニードルの模式図である。
【図６】同構造物の製造方法を示すフローチャートである。
【図７】本発明の第２実施形態の血管様立体構造物の模式的な断面図である。
【図８】同構造物の模式的な正面図である。
【図９】同実施形態の構造物を製造するための製造装置の模式図である。
【図１０】（ａ）（ｂ）（ｃ）は本発明の第１実施形態の血管様立体構造物に液体を送液した実験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態について説明する。
まず、本実施形態の血管様立体構造物１の構成について説明する。図１は、本実施形態の血管様立体構造物の模式的な断面図である。
図１に示すように、本実施形態の血管様立体構造物１は、血管様構造２と、支持構造７とを有している。
【００１８】
血管様構造２は、血管内皮細胞による単層の管腔構造をなしている。血管様構造２は、両端が開口する筒状である。本実施形態の血管様構造２は、供給用管部３と、排出用管部６とを有している。
【００１９】
供給用管部３は、円錐面状の内面を有する管部である。供給用管部３の両端は開口されている。供給用管部３における両端の開口径は、互いに異なっている。供給用管部３の両端の開口のうち開口径が大きな第一開口４は、培養液の入口として使用される。供給用管部３の両端の開口のうち開口径が小さな第二開口５は、培養液の出口として使用される。また、供給用管部３の第二開口５は、培養液中の凝集物や培養液として血液を用いた場合の血球等を排出するためにも利用される。このため、血管内皮細胞からなる層を通過して供給用管部３の外に流出可能な液性成分のみからなる培養液を用いる場合には第二開口５は必須でないが、固形成分を含み得る液体を培養液として用いる場合には培養液中の固形成分の出口となる第二開口５を供給用管部３が有していることが好ましい。
【００２０】
また、供給用管部３の内径は、第一開口４から第二開口５へ向かって一定の割合で漸次小さくなっている。このため、本実施形態の供給用管部３は、所定のテーパー角を有するテーパー状の管部である。
【００２１】
供給用管部３の寸法として好適な数値範囲は、例えば以下の範囲である。
第一開口４から第二開口５までの距離（供給用管部３の管路長）：5mm以上、10cm以下
第一開口４から第二開口５までの供給用管部３の内面のテーパー角：供給用管部３の中心線Ｃ１に対する母線のなす角をθとした場合に0.002≦tanθ≦0.2
供給用管部３の最大径:0mmより大きく、5mm以下
供給用管部３の最小径:0mmより大きく、1mm以下
【００２２】
また、供給用管部３の寸法としてさらに好適な数値範囲は、例えば以下の範囲である。
第一開口４から第二開口５までの距離（供給用管部３の管路長）：5mm以上、5cm以下
第一開口４から第二開口５までの供給用管部３の内面のテーパー角：供給用管部３の中心線Ｃ１に対する母線のなす角をθとした場合に0.01≦tanθ≦1
供給用管部３の最大径:0mmより大きく、2mm以下
供給用管部３の最小径:0mmより大きく、300mm以下
【００２３】
なお、本実施形態の血管様立体構造物１の他の構成例として、供給用管部３が、両端部分が直管状で中間部がテーパー状である形状であってもよい。この場合、供給用管部３の寸法として好適な数値の選択において、直管部分とテーパー状部分との境界が上記の第一開口４及び第二開口５に相当するものとして上記の数値範囲から選択されてよい。
【００２４】
排出用管部６は、供給用管部３と平行に延びる管部である。排出用管部６の両端は開口されている。排出用管部６は、円錐面状の内面が供給用管部３とは逆のテーパー角を有するテーパー状の管部である。
なお、排出用管部６の形状は特に限定されない。また、排出用管部６は、供給用管部３の出口が設けられている側のみに開口している有底筒状であってもよい。また排出用管部６は一定の内径を有する直管状でも構わない。さらに、排出用管部６は、供給用管部３が延びる方向とは無関係な方向に長い管状であってもよい。
なお、本実施形態の血管様立体構造物１の他の構成例として、例えば、血管様構造２が、排出用管部６を有していなくてもよい。この場合、支持構造７を構成するゲルを通じて培養液が構造物外部に染み出すことで上記の血管様立体構造物１と同様に老廃物等の排出が可能である。
【００２５】
供給用管部３と排出用管部６とが毛細血管様管腔構造により接続されていてもよい。この毛細血管様管腔構造は、血管様立体構造物１の製造後に血管内皮細胞の培養を継続する過程で生じる。毛細血管様管腔構造が支持構造７に形成されている場合には、供給用管部３に送液された培養液の一部が、上記の毛細血管様管腔構造を通じて排出用管部６へ流れる。
【００２６】
支持構造７は、細胞の足場となる網目構造等を有するとともに、培養液が浸透可能な構造物である。支持構造７は、例えばハイドロゲルからなる。支持構造７の材料として、例えば、コラーゲン，ゼラチン，フィブリン，ヒアルロン酸，カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。
支持構造７は、血管様構造２を構成する血管内皮細胞の足場として機能する。すなわち、支持構造７は、血管様構造２の外面に接して血管様構造２を支持する。なお、支持構造７の内部には、血管様構造２を構成する血管内皮細胞とは異なる細胞が生着していてもよい。
【００２７】
本実施形態の血管様立体構造物１の作用について説明する。図２は、本実施形態の血管様立体構造物１の作用を説明するための説明図である。図２における矢印は、培養液の流れを示している。
本実施形態の血管様立体構造物１は、血管様構造２における両開口のうち、大径の第一開口４の方が培養液の流入側（入口）であり、小径の第二開口５の方が培養液の流出側（出口）である。
【００２８】
血管様立体構造物１は、血管様構造２の外部にある支持構造７に播種された細胞を血管内皮細胞とともに培養することにより、再生医療に使用可能な立体的な培養組織とすることができる。支持構造７内への細胞の播種方法は特に限定されない。たとえば、細胞を内部に含んだ支持構造７は、支持構造７を作製する過程で細胞懸濁液を混和することにより作製されてもよいし、支持構造７の形成後に細胞懸濁液や凝集塊を支持構造７内に注入することにより作製されてもよい。
【００２９】
血管様構造２の外部にある支持構造７内に播種された細胞を培養するためには、血管様構造２の入口から公知のポンプ等を利用して培養液を送液する。ポンプの構成は、培養液を滅菌状態で供給可能なポンプであれば、特に限定されない。ポンプを用いた培養液の送液圧力は、血管様立体構造物１が崩壊しない程度の圧力であればよい。また、血管様立体構造物１を生体に移植して使用する態様では、血管様構造２の第一開口４及び第二開口５を生体の血管に接続してもよい。この場合、心臓がポンプに相当し、血液が培養液に相当することとなる。この態様では、培養液としての血液のうち、生体における組織液に相当する成分が血管様構造２から支持構造７へと流出し、血球成分等は供給用管部３の第二開口５（出口）から流出する。
【００３０】
ポンプが送液する培養液は、血管様構造２の入口から血管様構造２内へと流入し、血管様構造２の内部を出口に向かって流れる。血管様構造２の内部の培養液は、一部が出口から流出し、その他は血管様構造２を構成する血管内皮細胞の隙間等からゲルへと流出する。血管様構造２の外のゲルへの培養液の流出は、自然な拡散に加えて、ポンプの送液圧力の一部を用いた加圧によって生じる。なお、供給用管部３における第一開口４が上、第二開口５が下となるように血管様立体構造物１を配置して培養液を送液する場合には、ポンプによらず重力により送液されることとなり加圧と同様の効果が得られる。
【００３１】
本実施形態の血管様立体構造物１の効果について、従来技術と比較して説明する。図３は、血管様構造が直管状である場合の培養液の流れを模式的に示す説明図である。
図３に示すように、たとえば血管様立体構造物１Ａの血管様構造２Ａが円筒状（直管状）である場合、血管様構造２Ａの入口４Ａと出口５Ａとで圧力差がほとんどなく、血管様構造２Ａからその外部（支持構造７Ａ）への培養液の移行は自然な拡散に依存する。すなわち、血管様構造２Ａが円筒状である場合、入口４Ａから流入した培養液の大部分は、支持構造７Ａへ流出することなく出口５Ａから流出することとなる。その結果、血管様構造２Ａが円筒状である場合、血管様構造２Ａからその外部の細胞への培養液の積極的な供給が不十分となるので、血管様構造２Ａの外部にある細胞に対する酸素や栄養の供給量が制限されている。
【００３２】
これに対して、図２に示すように、本実施形態の血管様立体構造物１では、培養液の入口側が大径であり培養液の出口側が小径であることにより、血管様構造２における入口への培養液の流入に対して出口からの培養液の流出が制限されている。このため、血管様構造２から支持構造７へと培養液を積極的に押し出す圧力が血管様構造２の内面にかかった状態となっており、培養液は血管様構造２を構成する血管内皮細胞の隙間等から支持構造７へと流出する。血管様構造２からの培養液の流出は、血管様構造２内に培養液を送液している間は常に起こっているので、供給用管部３から排出用管部６へ向かう培養液の流れが培養中常に起こっている。このため、血管様構造２の外部で支持構造７中に生着している細胞に対して、酸素や栄養の供給及び老廃物の排出が、生体における循環系を模した状態で再現される。
【００３３】
本実施形態の血管様立体構造物１によれば、血管様構造２の入口から出口に向かって漸次縮径する円錐面状の内面を血管様構造２が有しているので、血管様構造２の入口からの培養液の送液により血管様構造２の内面に圧力がかかり、血管様構造２の外部へ積極的に培養液の供給を行うことができる。その結果、本実施形態の血管様立体構造物１は、血管様構造２の外部の細胞に対する酸素や栄養の供給及び老廃物の排出の効率が高く、血管様構造２の外部の支持構造７に生着させる細胞の生着率や増殖率を高めることができる。
【００３４】
次に、本実施形態の血管様立体構造物１を作製するために用いられる製造装置１０の構成について説明する。図４は、本実施形態の血管様立体構造物１を製造するための製造装置の模式図である。図５は、同製造装置におけるニードルの模式図である。
図４に示すように、本実施形態の製造装置１０は、筒状培養チャンバー１１と、マルチニードルユニット１２と、ニードルホルダ１９と、電極部２０とを備えている。
筒状培養チャンバー１１は、血管様立体構造物１の外形を規定する中空部材である。本実施形態では、筒状培養チャンバー１１は円筒形である。筒状培養チャンバー１１の両端は開口されている。なお、筒状培養チャンバー１１が角筒形であってもよい。
筒状培養チャンバー１１の内部には、マルチニードルユニット１２の各ニードル１３を収容することができる。
【００３５】
図４に示すように、製造装置１０は、供給用管部３を形成するための第一のマルチニードルユニット１２ａと、排出用管部６を形成するための第二のマルチニードルユニット１２ｂとを有している。２つのマルチニードルユニット１２は、本実施形態では同形同大である。
【００３６】
図４に示すように、マルチニードルユニット１２は、ニードル１３と、ニードル１３を支持する台座部１８とを有している。本実施形態では、マルチニードルユニット１２の台座部１８に複数のニードル１３が支持されている。なお、複数のニードル１３は本実施形態では同形同大である。なお、複数のニードル１３の形状が互いに異なっていてもよい。
【００３７】
図５に示すように、ニードル１３は、金（Ａｕ）からなる表面（金表面１６）を有する棒状部材１４と、棒状部材１４に結合したオリゴペプチド１７とを有する。
棒状部材１４は、金製の棒若しくは金被覆された金属棒である。なお、棒状部材１４の外面が金被覆されている場合にはその芯材の材質は特に限定されない。また、棒状部材１４の材質として、金属チオール結合を作るすべての金属とそれらの合金を採用可能である。たとえば、棒状部材１４は、白金、銀、パラジウム等からなっていてもよい。棒状部材１４における金被覆は、例えばスパッタリングによって行われてもよい。棒状部材１４の先端１４ａ（台座部１８側とは反対側の端）の外径は、棒状部材１４の基端１４ｂ（台座部１８側の端）の外径よりも小さい。棒状部材１４は、基端から先端に向かって漸次外径が小さくなるテーパー状をなしている。一例として、棒状部材１４は、台座部１８側が大径で台座部１８から離れるに従って漸次縮径する円錐部１５を有している。
棒状部材１４の外面は、表面粗さがＲａ０．２μｍ以上０．４５μｍ以下となるように加工されている。棒状部材１４の外面に対する加工は、切削や研削・研磨・エッチング・レーザー加工等によって行うことができる。
【００３８】
棒状部材１４の形状は、製造される血管様立体構造物１における血管様構造２の内面形状を規定する。
棒状部材１４の寸法として好適な数値範囲は、例えば以下の範囲である。
棒状部材１４の全長：5mm以上、10cm以下
棒状部材１４のテーパー部のテーパー角：棒状部材１４の中心線に対する母線のなす角をθとした場合に0.002≦tanθ≦0.2
棒状部材１４の最大径:0mmより大きく、5mm以下
【００３９】
また、棒状部材１４の寸法としてさらに好適な数値範囲は、例えば以下の範囲である。
棒状部材１４の全長：5mm以上、5cm以下
棒状部材１４のテーパー部のテーパー角：供給用管部３の中心線に対する母線のなす角をθとした場合に0.01≦tanθ≦1
棒状部材１４の最大径:0mmより大きく、2mm以下
【００４０】
図５に示すように、ニードル１３のオリゴペプチド１７は、金に対して結合性を有する末端及び細胞接着性を有する末端を有する細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａを含む。
本実施形態の細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａは、一方の末端にチオール基を含んでいると共に他方の末端にＲＧＤモチーフを含んだ所定のアミノ酸配列を有する合成オリゴペプチドである。
【００４１】
本実施形態の製造装置１０に適用可能な上記の細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａの例として、例えば上記の特許文献１（国際公開第２０１２／０３３１８１号）に開示された構造（CGGGKEKEKEKGRGDSP）が挙げられる。
【００４２】
この細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａにおけるシステイン（Ｃ）のチオール基は、棒状部材１４の外面の金と結合する。このオリゴペプチド１７のチオール基は、電気化学的還元脱離に伴って、棒状部材１４の外面を構成する金表面１６から脱離する。
【００４３】
また、この細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａにおけるリジン（Ｋ）とグルタミン（Ｅ）との繰り返し部分は、静電的な引力により、金に結合した状態で隣り合うオリゴペプチド１７同士を整列させて棒状部材１４の外面に密な分子層を形成させる。
【００４４】
また、このオリゴペプチド１７におけるＲＧＤモチーフは、細胞接着性蛋白質に共通の細胞接着活性配列であり、ニードル１３の外面に接触した付着性細胞をこのオリゴペプチド１７上に保持する。なお、本実施形態における細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａは、末端に設けられたＧＲＧＤＳの５アミノ酸により、高い細胞接着性を有する。
【００４５】
なお、細胞接着性の制御のため、細胞接着性を有していない両性イオンオリゴペプチド１７ｂ（CGGGKEKEKEKG）が上記の細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａと共に棒状部材１４の外面に結合していてもよい。
なお、上記の各オリゴペプチド１７は、電気化学的還元脱離に伴って棒状部材１４から脱離するので、血管様立体構造物１の製造後には、棒状部材１４の外面に上記の各オリゴペプチド１７はほぼ存在しない。
【００４６】
マルチニードルユニット１２の台座部１８は、不図示の電源装置に電気的に接続されることで各ニードル１３に電力を印加可能な導電性部材である。
【００４７】
ニードルホルダ１９は、筒状培養チャンバー１１の両端の開口を封止する板状部材である。ニードルホルダ１９は、ニードル１３が挿通される貫通孔を有している。ニードルホルダ１９に形成された貫通孔は、ニードルホルダ１９とニードル１３とが実質的に水密状態となるように、ニードル１３の寸法に対応した形状とされている。
【００４８】
電極部２０は、筒状培養チャンバー１１内に配された電極（対極及び参照極）を有している。また、本実施形態のマルチニードルユニット１２は、不図示の電源装置に接続されることにより、電極部２０の一部となり、作用極として使用可能である。
【００４９】
本実施形態の製造装置１０の作用について、本実施形態の血管様立体構造物１の製造方法とともに説明する。図６は、本実施形態の血管様立体構造物１の製造方法を示すフローチャートである。
【００５０】
まず、マルチニードルユニット１２の各ニードル１３の外面に血管内皮細胞を接着させて培養を行う（ステップＳ１，培養工程，図６参照）。たとえば、滅菌済みのニードル１３の外面に細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａを無菌的に結合させたマルチニードルユニット１２を、血管内皮細胞の懸濁液及び培養液とともに細胞培養フラスコ内に封入し、所定の培養条件下で培養する。細胞懸濁液中に浮遊していた血管内皮細胞はニードル１３の外面にある細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａのＲＧＤモチーフに付着する。この状態で培養を継続すると、血管内皮細胞は、各ニードル１３の外面に沿った単層の筒状に配列され、管腔組織様の構造となる。
これでステップＳ１は終了し、ステップＳ２へ進む。
【００５１】
ステップＳ２（図６参照）では、血管内皮細胞を付着させたマルチニードルユニット１２、筒状培養チャンバー１１、及びニードルホルダ１９を組み合わせて、各ニードル１３が筒状培養チャンバー１１内に保持された密閉容器組立体（以下、単に「組立体」という。）とする。筒状培養チャンバー１１の内面及びニードルホルダ１９は予め滅菌されている。
これでステップＳ２は終了し、ステップＳ３へ進む。
【００５２】
ステップＳ３（充填工程，図６参照）では、組立体の内部に、支持構造７の材料となる流動体を充填する。この流動体は、所定の硬化手順（ゲル化剤の添加や冷却など、材料に対応して適宜選択される手順）によりゲル化する流動体である。組立体の内部で流動体がゲル化してなるゲル化物が上記の支持構造７である。ステップＳ３により、組立体の内部に支持構造７を作製することができる。ニードル１３の外面の細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａのＲＧＤモチーフに付着していた血管内皮細胞は、支持構造７を足場として利用可能となる。
これでステップＳ３は終了し、ステップＳ４へ進む。
【００５３】
ステップＳ４（脱離工程，図６参照）では、電極部２０に所定の電圧を印加することにより、ニードル１３の金表面１６と細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａのチオール基とを電気化学的還元脱離により分離する。これにより、血管内皮細胞は、細胞付着性両性イオンオリゴペプチド１７ａを足場として有したまま、ニードル１３から外れる。また、このとき、血管内皮細胞は支持構造７を足場としているとともに隣接する他の血管内皮細胞にも接着した状態なので、ニードル１３から血管内皮細胞が外れても、血管内皮細胞による管腔組織様の構造は維持される。
これでステップＳ４は終了し、ステップＳ５へ進む。
【００５４】
ステップＳ５（抜き取り工程，図６参照）では、組立体からマルチニードルユニット１２を取り外す。
本実施形態では、マルチニードルユニット１２を組立体からたとえば手作業で、あるいは適切な治具を用いてまっすぐ引き抜くことにより、血管内皮細胞が支持構造７に付着した状態のまま、各ニードル１３を支持構造７から抜き取る。これにより、支持構造７により血管内皮細胞が管腔状に保持された血管様構造２が形成される。必要に応じて、血管様構造２の第一開口４及び第二開口５に滅菌済みのチューブ等を接続して培養液を送液可能とする。また、必要に応じて、支持構造７内に細胞を播種してもよい。
【００５５】
本実施形態の製造装置１０によれば、円錐状のテーパー部を有するニードル１３を鋳型として、支持構造７にテーパー状の管部を形成することができるので、培養液を血管様構造２の外部の支持構造７に積極的に供給可能な形状の血管様立体構造物１を簡単に作製することができる。
【００５６】
さらに、本実施形態の製造装置１０は、ニードル１３の外面において血管内皮細胞が単層の管腔となるようにこの細胞を培養した後に、この管腔構造を支持組織に付着させることができる。このため、細胞密度のムラが少なく、単層であり且つ孔の少ない血管様構造２を形成することができる。
【００５７】
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態について説明する。なお、本実施形態では、上記の第１実施形態に開示された構成要素と同様の構成要素には、第１実施形態と同一の符号が付され、重複する説明は省略される。
【００５８】
まず、本実施形態の血管様立体構造物３０の構成について説明する。図７は、本実施形態の血管様立体構造物の模式的な断面図である。図８は、本実施形態の血管様立体構造物の模式的な正面図である。
【００５９】
図７及び図８に示すように、本実施形態の血管様立体構造物３０は、第１実施形態に開示された供給用管部３とは形状が異なる供給用管部３１を有している。
本実施形態における供給用管部３１は、中心線が湾曲した一続きの筒状である。一例として、本実施形態における供給用管部３１は、一定のコイル径を有するコイル状（螺旋状）の管部である。本実施形態では、供給用管部３１は一定の内径を有している。
【００６０】
本実施形態の血管様立体構造物３０の使用時には、供給用管部３１の両端のいずれか一方から培養液を送液する。供給用管部３１は、培養液が流れるコイル状の流路を構成しているので、培養液が供給用管部３１内を流れる際の抵抗は、供給用管部３１が直管状である場合よりも大きい。このため、供給用管部３１内にポンプを用いて培養液を送液すると、その送液圧力の一部により、第１実施形態と同様に、供給用管部３１から支持構造７へと培養液が流出する。これにより、本実施形態でも第１実施形態と同様に支持構造７内の細胞に酸素や栄養を十分に供給することができる。
【００６１】
次に、本実施形態の血管様立体構造物３０を作製するために用いられる製造装置４０の構成について説明する。図９は、本実施形態の血管様立体構造物３０を製造するための製造装置の一部を示す模式図である。
図９に示すように、本実施形態の製造装置４０は、上記の第１実施形態に開示された製造装置１０と比較して、コイル状（螺旋状）のニードル４１をマルチニードルユニット１２が有している点が異なっている。
【００６２】
コイル状のニードル４１は、第１実施形態と同様に、金表面１６及びオリゴペプチド１７（図５参照）を有している。
コイル状のニードル４１は、細胞の剥離後の引き抜きの過程で、コイル中心線回りに回転させながら引き抜くことにより、支持構造７を破壊することなく引き抜き可能である。
また、複数のニードル４１を有する場合、各ニードル４１を同期させて回転させながら引き抜くための不図示の駆動機構を製造装置４０が有していることが好ましい。
【００６３】
本実施形態のコイル状のニードル４１は、コイル状（螺旋状）の血管様構造２を形成するので、血管様構造２を繋ぐ微小な血管構造を一本のニードル４１で作製可能である。
【実施例】
【００６４】
本発明について、実施例を示して詳述する。本実施例は、血管内皮細胞による血管様構造２ではなく、支持構造７のみによってテーパー状の管部２Ｘを有するモデルにより行われた結果を示している。
【００６５】
図１０は、本実施例における液体の送液実験の結果を示す写真である。図１０（ａ）は、本実施例において作製した血管様立体構造物１Ｘの写真である。図１０（ｂ）は、同実施例の血管様立体構造物１Ｘにおける自然拡散による液体の流れを示す蛍光写真である。図１０（ｃ）は、同実施例の血管様立体構造物１Ｘにおいて液体の送液を継続した場合の液体の流れを示す蛍光写真である。
【００６６】
図１０（ａ）に示すように、本実施例では、上記の第１実施形態に開示された形状と同様の血管様立体構造物１Ｘを作製した。本実施例では、上記第１実施形態に開示された供給用管部３，排出用管部６，及び支持構造７に相当する形状を、ハイドロゲル（ゼラチンベースの半天然ハイドロゲル材料「ゼラチンメタクリレート（GelMA）」）を用いて形成した。図１０（ａ）において、符号３Ｘで示す管部が供給用管部に相当し、符号６Ｘで示す管部が排出用管部に相当する。
本実施例では、培養液の流れを可視化するために、トレーサーとして蛍光標識デキストランを含んだ液体を管部３Ｘの第一開口４Ｘ（開口径の大きい方の開口）から管部３Ｘ内に注入した。
【００６７】
図１０（ｂ）は、管部３Ｘに液体を注入して３０分静置した後に撮影したものである。図１０（ｂ）に示すように、蛍光標識デキストランが発する蛍光は、支持構造７には認められたものの、管部６Ｘには認められなかった。
【００６８】
図１０（ｃ）は、管部３Ｘに対して液体をシリンジポンプにより１０分間送液した後に撮影したものである。図１０（ｃ）に示すように、蛍光標識デキストランが発する蛍光が管部３Ｘ，支持構造７，及び管部６Ｘに認められた。
図１０（ｂ）と図１０（ｃ）との比較により、管部３Ｘに対して継続的に送液をすることにより、送液をしない場合よりも管部３Ｘから支持構造７への液体の流入量が増加することが示唆された。
【００６９】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
たとえば、供給用管部は、培養液が供給用管部内を流れる過程で供給用管部の内面に衝突するように屈曲した部位を有していてもよい。
【符号の説明】
【００７０】
１，３０  血管様立体構造物
２  血管様構造
３，３１  供給用管部
４  第一開口
５  第二開口
６  排出用管部
７  支持構造
１０，４０  製造装置
１１  筒状培養チャンバー
１２  マルチニードルユニット
１３，４１  ニードル
１４  棒状部材
１４ａ  先端
１４ｂ  基端
１５  円錐部
１６  金表面
１７  オリゴペプチド
１７ａ  細胞付着性両性イオンオリゴペプチド
１７ｂ  両性イオンオリゴペプチド
１８  台座部
１９  ニードルホルダ
２０  電極部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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