(57)【要約】      （修正有）【課題】充填剤の充填に伴う作業難の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができるクロマトカラムの充填剤充填方法を提供する。【解決手段】バルブ１５，２５を閉、バルブ１７、平板栓２６を開とし、充填剤スラリーを配管１６を介してカラム２内に導入しつつ可動栓２０を上方移動させる。次いで、バルブ１７，２５を閉、バルブ１５、平板栓２６を開とし、可動栓２０を押し下げ、スラリー中の保存液をフィルタ１２及びスペース１３を経てバルブ１５から排出して充填剤層を形成する。その後、バルブ１５，２５を開、バルブ１７、平板栓２６を閉とし、純水又は平衡化バッファーを充填剤層に通液して充填剤層内の液を置換する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、
該カラムの一端側に設けられた固定栓と、
該カラム内に設けられた可動栓とを有するクロマトカラムの該カラム内に充填剤スラリーを導入して充填剤層を形成するクロマトカラムの充填剤充填方法において、
該固定栓と可動栓との一方の栓に充填剤スラリーをカラム内に導入可能な充填剤スラリー導入部を設けておき、
該可動栓を固定栓から離反させつつ該導入部を介してカラム内に充填剤スラリーを導入し、
その後、該導入部を閉じ、可動栓を固定栓に接近移動させ、可動栓及び固定栓の少なくとも一方を介して充填剤スラリー中の液を流出させて充填剤層を形成することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
【請求項２】
請求項１において、カラム内に導入する充填剤スラリーの圧力によって可動栓を固定栓から離反移動させることを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記固定栓は前記カラムの下端に設置されており、
該固定栓は、カラム内に臨む面がフィルタにて構成されており、
前記充填剤スラリーの導入部は、該フィルタを貫通する配管と、該配管のカラム側の先端に設けられた平板栓と、該配管に設けられたバルブとを有することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記充填剤層を形成した後、カラム内に純水又は平衡化バッファーを通水して充填剤層内の液を置換することを特徴とするクロマトカラムの充填剤充填方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程で用いられるクロマトカラムのカラムに充填剤を充填する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野での近年の進歩に伴って、タンパク質のような生体物質及び生化学物質を回収、精製及び分離するための迅速で一段と精密な技術が必要とされている。医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程ではクロマトグラフィーが広く用いられている。
【０００３】
クロマトグラフィーには、分離精製の原理や対象により、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等がある。クロマトグラフィーによる分離精製原理の例として、ゲル濾過クロマトグラフィー（以下ゲル濾過と略）について説明する。ゲル濾過は、タンパク質や多糖類、核酸などの生体分子を精製する際に用いられる代表的な方法の一つである。ゲル濾過では、カラムに充填されたゲル粒子状の充填剤にサンプル通すことにより、様々な大きさの分子を分子量（ここでは溶液中での分子の大きさの意味）に従って分離することができる。担体には小さな孔が開いてあり、小さい分子はその孔に入り込むため、長い間カラム内にとどまることになる。そのため、高分子ほど早く溶出され、低分子ほど溶出されるまで時間がかかる。
【０００４】
特許文献１に記載されているように、一般に、一連のクロマト構成操作、分離精製操作と、メンテナンス作業は、例えば以下のように行われる。なお、湿潤状態で新品購入または使用途中で一次保存されている充填剤は、雑菌繁殖を抑えるための化学薬品、例えばエタノールを含む保存液（例えばエタノール濃度２０％）に浸漬された状態（以下、混合液という。）にあり、目的成分の分離精製に用いる直前に、雑菌繁殖を抑制する化学薬品により洗浄して使用される。湿潤状態で新品購入または使用途中で一次保存されている充填剤として、例えば、セファロースやデキストランなどを重合した天然高分子および、これら天然高分子にイオン交換基やアフィニティ基などの官能基を導入した平均粒子径数十μｍから百数十μｍ程度の充填剤がタンパクや核酸等の分離精製用に汎用されている。これらの天然高分子は、柔軟性に富み、水分含有率が高く、一方、乾燥に弱く、また、微生物に毒性がない為、保管の際、湿潤状態に保つと同時に、微生物汚染や微生物繁殖を防ぐ必要があり、更に、医薬品精製に用いる為、人体に安全な状態で保管することが不可欠な為、例えばエタノール２０％水溶液が保存液として汎用されている。
（１）  カラム準備
予め洗浄して乾燥させた清浄な各部品を、カラムに組み立て、純水あるいは平衡化バッファーを満たし、気泡を除去する。
（２）  充填剤準備
粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーでデカンテーション操作を繰り返して洗浄し、化学薬品、例えばエタノールを含む保存液から置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
（３）  充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、スラリー注入口をシールする。
（４）  クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的成分の分離精製を繰り返す。
（５）  充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、または充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出してＮａＯＨなどの洗浄薬剤を含む洗浄液で洗浄する。
（６）  前記工程（１）〜（５）を繰り返す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−３４６８３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、充填剤の充填に伴う作業負担の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができるクロマトカラムの充填剤充填方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のクロマトカラムの充填剤充填方法は、カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、該カラムの一端側に設けられた固定栓と、該カラム内に設けられた可動栓とを有するクロマトカラムの該カラム内に充填剤スラリーを導入して充填剤層を形成するクロマトカラムの充填剤充填方法において、該固定栓と可動栓との一方の栓に充填剤スラリーをカラム内に導入可能な充填剤スラリー導入部を設けておき、該可動栓を固定栓から離反させつつ該導入部を介してカラム内に充填剤スラリーを導入し、その後、該導入部を閉じ、可動栓を固定栓に接近移動させ、可動栓及び固定栓の少なくとも一方を介して充填剤スラリー中の液を流出させて充填剤層を形成する。
【０００８】
本発明の一態様では、カラム内に導入する充填剤スラリーの圧力によって可動栓を固定栓から離反移動させる。
【０００９】
本発明の一態様では、前記固定栓は前記カラムの下端に設置されており、該固定栓は、カラム内に臨む面がフィルタにて構成されており、前記充填剤スラリーの導入部は、該フィルタを貫通する配管と、該配管のカラム側の先端に設けられた平板栓と、該配管に設けられたバルブとを有する。
【００１０】
本発明の一態様では、前記充填剤層を形成した後、カラム内に純水又は平衡化バッファーを通水して充填剤層内の液を置換する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明方法によると、バルブの操作と可動栓の昇降によりカラム内に充填剤層が形成される。従って、本発明方法によると、充填剤の充填に伴う作業負担の軽減を図り、雑菌混入を防いで清浄で効率よく充填剤を充填することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】クロマトカラムの概略的な縦断面図である。
【図２】クロマトカラムの充填剤充填方法を示す断面図である。
【図３】クロマトカラムの充填剤充填方法を示す断面図である。
【図４】クロマトカラムの充填剤充填方法を示す断面図である。
【図５】クロマトカラムの充填剤充填方法を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照して実施の形態について説明する。図１は、本発明方法で充填剤が充填されるクロマトカラム１の概略的な縦断面図である。
【００１４】
図１の通り、クロマトカラム１は、筒軸心方向を鉛直方向とした円筒状のカラム２と、該カラム２の下端に取り付けられた固定栓１０と、該カラム２内に上下方向移動可能に設置された可動栓２０と、可動栓２０を所定高さに固定するための固定ロッド（図示略）等を備えている。なお、該可動栓２０を上下移動させるジャッキを備えてもよい。
【００１５】
固定栓１０は、カラム２の下端のフランジ部２ａにクランプやボルト等の取付手段（図示略）によって取り付けられた円盤状の固定栓本体１１と、該固定栓本体１１の上面の凹所１１ａに被さる、多孔質材よりなる円盤状のフィルタ１２等を備えている。また凹所１１ａの底面には、中心から外周方向へ放射状に延在する複数の突起（図示しない）が設けられている。フィルタ１２は、凹所１１ａの周囲の段部１１ｄ及び前記突起に係止されており、フィルタ１２と凹所１１ａ底面との間に液の流通用のスペース１３が設けられている。なお、段部１１ｄと前記突起は略同じ高さに設計されている。
【００１６】
固定栓本体１１には、該スペース１３に配管１４が接続され、該配管１４にバルブ１５が接続されている。
【００１７】
フィルタ１２の中央には充填剤スラリーの導入用の配管１６が設けられ、この配管１６の先端に平板栓２６が設けられている。平板栓２６の上面はフィルタ１２の上面と面一となっている。平板栓２６は、弁体を弁座に対し下方から接離させることにより閉・開が行われるよう構成されている。この配管１６は短い管状であり、フィルタ１２、スペース１３及び固定栓本体１１を貫通している。配管１６の末端にはバルブ１７が接続されている。
【００１８】
可動栓２０は、外周面がカラム２の内周面にＯリング（図示略）等を介して水密的にかつ摺動可能に接している円盤状の可動栓本体２１と、該可動栓本体２１の下面の凹所２１ａに被さる、多孔質材よりなる円盤状のフィルタ２２等を備えている。凹所２１ａの天井面には、中心から外周方向へ放射状に延在する複数の突起（図示しない）が設けられている。フィルタ２２は、凹所２１ａの周囲の段部２１ｄ及び前記突起に係止されており、フィルタ２２と凹所２１ａ天井面との間に液の流通用のスペース２３が設けられている。なお、段部２１ｄと前記突起は略同じ高さに設計されている。
【００１９】
可動栓本体２１には、該スペース２３に連通する液流通用のポート２４が設けられており、該ポート２４にバルブ２５が接続されている。
【００２０】
このクロマトカラム１のカラム２内に充填剤層Ｂを形成する手順について次に説明する。
【００２１】
予め洗浄して乾燥させた清浄な各部品を用いて図１の通り、カラムを組み立てておく。図１の通り、可動栓２０を下降させて固定栓１０に密着させ、バルブ１５，２５を開、バルブ１７を閉とし、固定栓１０側から可動栓２０側へ純水あるいは平衡化バッファーを流して、気泡を抜く。次いで図２の通り、バルブ１５，２５を閉とし、バルブ１７及び平板栓２６を開とし、可動栓２０を上方向に移動させて充填剤スラリーをカラム内に吸い込むか、または、充填剤スラリーをポンプ（図示略）で送液し、可動栓２０を送液圧で上昇させ、カラム２内に充填剤スラリーＳを所定量導入する。
【００２２】
カラム内に所定量の充填剤スラリーが導入された後、可動栓２０の上昇を止めるか又は送液ポンプを止める。カラム２内に導入する充填剤スラリー量は、可動栓２０から固定栓１０までの間隔とカラム２の断面積から算出する。充填剤スラリーの流動性が悪い場合、純水あるいは平衡化バッファーで希釈すればよく、希釈した場合は、希釈倍率によって充填剤スラリー注入量を算出して、この算出した量の希釈スラリーを導入する。
【００２３】
次いで、図３の通り、バルブ１７，２５及び平板栓２６を閉とし、バルブ１５を開とし、可動栓２０を下降させ、カラム２内の充填剤スラリー中の液をフィルタ１２を透過させて搾出し、バルブ１５を介して流出させる。充填剤粒子同士が密着して所定高さの充填剤層Ｂが形成されるまで可動栓２０を低圧で下降させ、その後、バルブ１５，１７，２５及び平板栓２６を閉とする。この操作により、充填剤スラリー中の液（例えば保存液）のほとんどが排出される。なお、図３では、バルブ１５を開とし、バルブ１５から排液しているが、逆に図４の通り、バルブ１５を閉、バルブ２５を開とし、充填剤スラリー中の液をフィルタ２２を透過させてバルブ２５を介して排液してもよい。バルブ１５，２５の双方を開とし、双方のバルブを介して排液してもよい。
【００２４】
その後、図５の通り、バルブ１５，２５を開とし、バルブ１７及び平板栓２６は閉のままとし、バルブ１５からフィルタ１２を通して充填剤層Ｂへ純水あるいは平衡化バッファーよりなる洗浄液を通液して充填剤層Ｂ内に残留する保存液を洗い流す。洗浄排液はバルブ２５から排出される。バルブ２５を通って排出されてきた排液中の化学薬品濃度が所定量以下になるまで充填剤層Ｂを洗浄する。この洗浄後、バルブ１５，１７，２５及び平板栓２６を閉とする。なお、図５では、洗浄液を固定栓１０側から可動栓２０側へ上向流で通液しているが、逆に可動栓２０側から固定栓１０側へ下降流で通液してもよい。
【００２５】
上記のようにして洗浄された充填剤層Ｂを有するクロマトカラム１を用いてクロマト分離精製を行うことができる。即ち、このクロマトカラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的成分の分離精製を行う。
【００２６】
所定回数の分離精製操作を行った後、または充填剤が汚れた場合には、クロマトカラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出して洗浄化学薬剤、例えばＮａＯＨなどを含む洗浄液で洗浄し、再度、上記と同様にしてカラム２に充填し、クロマト分離精製に使用する。上記説明では、クロマトカラムをクロマト送液システムから外し充填剤を洗浄する場合を例示したが、クロマトカラムをクロマト送液システムに接続したまま上記操作を行っても構わない。
【００２７】
なお、内径１０００ｍｍのカラム内に４００リットルの充填剤スラリーを導入し、高さ３００ｍｍの充填剤層Ｂを形成する場合、従来法では合計約２０日を要していた。また、充填剤層Ｂの洗浄に要する純水あるいは平衡化バッファー量は１０００〜１６００リットルであった。
【００２８】
これに対し、図示の本発明方法によると、約１．５〜２．５時間で充填剤層を形成することができ、充填剤層Ｂの洗浄に要する純水あるいは平衡化バッファー量も４００〜８００リットル程度であった。
【００２９】
従来法に比べて、本発明の方法は、充填時間を大幅に短縮でき、作業効率の飛躍的向上、洗浄に用いる純水あるいは平衡化バッファー使用料の大幅な低減、および雑菌への曝露のリスク低減を図ることができる。
【００３０】
上記説明は本発明の一例であり、本発明は上記以外の態様とされてもよい。例えば、上記実施の形態では、固定栓１０をカラム２の下端側としているが、上下逆とし、固定栓１０をカラム２の上端側としてもよい。
【００３１】
上記平板栓２６の弁体及び弁座は、テーパ形となっているが、円柱形の弁体を円筒形の弁座に挿抜して閉・開する構成としてもよい。
【００３２】
本発明は、カラム直径が５０〜２０００ｍｍ（好ましくは１００〜１６００ｍｍ）のいずれのカラムについても本発明を使用することができる。ただし、５０〜１００ｍｍ程度であれば手動での操作も可能であるが、カラムが大型の場合は（例えば３００ｍｍ以上）、人手作業が困難になる上に作業時間が長時間化するほど雑菌混入のリスクが高くなってしまうため駆動手段による機械的操作による自動化が求められる。よって本発明はカラム直径３００ｍｍ以上（例えば３００〜２０００ｍｍ）のカラムの操作において好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００３３】
１  クロマトカラム
２  カラム
１０  固定栓
２０  可動栓
１５，１７，２５  バルブ
２６  平板栓
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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