(57)【要約】      （修正有）【課題】比較的大きな寸法の足場材料でも芯部から短時間で均一に細胞を自動的に播種でき、更に細胞を培地に懸濁した細胞液の使用量も必要最小限に抑制できる、足場材料への細胞播種方法及びその装置の提供。【解決手段】細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料３に、細胞が培養液に懸濁した状態の細胞液を充填したシリンジ２を駆動し、均一に細胞を播種するための細胞播種装置１であって、基台１１上に、多孔性足場材料３を保持する足場材料保持部３１と、側面部に複数の吐出口を設けたニードル２３を備えたシリンジ２の外筒部２１を保持して穿刺方向に進退移動可能な主可動部１２と、シリンジ２のプランジャ２２の端部を保持してシリンジ２の外筒部２１に対して進退移動可能な副可動部１３とを備える細胞播種装置１。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料に、細胞を播種するための細胞播種方法であって、細胞が培養液に懸濁した状態の細胞液を、側面部に複数の吐出口を設けたニードルを備えたシリンジに充填し、足場材料に全ての吐出口が埋没するように穿刺した前記ニードルから細胞液を該足場材料の内部に加圧注入して、細胞を足場材料に均一に播種することを含む、足場材料への細胞播種方法。
【請求項２】
前記足場材料に対して前記ニードルを静止状態で細胞液を加圧注入する、請求項１記載の足場材料への細胞播種方法。
【請求項３】
前記足場材料に対して前記ニードルを穿刺方向に対して、前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら細胞液を加圧注入する、請求項１記載の足場材料への細胞播種方法。
【請求項４】
前記足場材料は円柱形状であり、前記ニードルを該足場材料の中心軸に沿って穿刺する、請求項１〜３の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種方法。
【請求項５】
前記ニードルは、ニードルチップを除く先端部分の側面部に複数の吐出口を備え、全ての吐出口で細胞液の単位時間当たりの吐出量を略均一に設定した、請求項１〜４の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種方法。
【請求項６】
細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料に、細胞が培養液に懸濁した状態の細胞液を充填したシリンジを駆動し、均一に細胞を播種するための細胞播種装置であって、基台上に、多孔性足場材料を保持する足場材料保持部と、側面部に複数の吐出口を設けたニードルを備えたシリンジの外筒部を保持して穿刺方向に進退移動可能な主可動部と、前記シリンジのプランジャの端部を保持して前記シリンジの外筒部に対して進退移動可能な副可動部とを備え、更に前記主可動部を前進駆動して前記ニードルを全ての吐出口が埋没するように足場材料に穿刺する穿刺モードを備えるとともに、前記主可動部を静止状態で前記副可動部を前進駆動して前記ニードルから細胞液を足場材料の内部に加圧注入する静止注入モードと、前記主可動部を前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら、前記副可動部を前進駆動して前記ニードルから細胞液を足場材料の内部に加圧注入する移動注入モードの少なくとも一方を備えた、足場材料への細胞播種装置。
【請求項７】
前記副可動部は、前記主可動部を基準として進退移動可能に設け、前記主可動部に対する副可動部の変位によって、前記シリンジの外筒部に対するプランジャの押し込み量を制御して、前記ニードルによる加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節する、請求項６記載の足場材料への細胞播種装置。
【請求項８】
前記副可動部は、前記基台を基準として進退移動可能に設け、前記基台に対する前記主可動部の変位と副可動部の変位の差分によって、前記シリンジの外筒部に対するプランジャの押し込み量を制御して、前記ニードルによる加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節する、請求項６記載の足場材料への細胞播種装置。
【請求項９】
前記足場材料保持部は、内部に前記足場材料の外周を取り囲んで包持する収容空間を備えるとともに、一部に前記ニードルが進入する導入口を備えている、請求項６〜８の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
【請求項１０】
前記足場材料は円柱形状であり、前記ニードルを該足場材料の中心軸に沿って穿刺する、請求項６〜９の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
【請求項１１】
前記ニードルは、ニードルチップを除く先端部分の側面部に複数の吐出口を備え、全ての吐出口で細胞液の単位時間当たりの吐出量を略均一に設定した、請求項６〜１０の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、足場材料への細胞播種方法及びその装置に係わり、更に詳しくは再生医療等において３次元培養のために必要な足場材料への細胞播種方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療等に用いるためのヒト軟骨等の３次元生体組織を、細胞を培養して作製する場合、通常は生分解性で連続多孔性の足場材料に細胞を播種し、適宜な培養方法によって３次元培養する。
【０００３】
特許文献１には、生分解性高分子のコーティング層を形成したコラーゲン糸状物を成形して作製した連通多孔体からなる組織再生材料に、細胞を培地（培養液）に懸濁した懸濁液（細胞液）を直接塗布して播種する方法が開示されている。しかし、足場材料の外部から細胞液を塗布する方法では、足場材料の芯部まで細胞を十分に注入することはできない。
【０００４】
特許文献２、３には、細胞を多孔性足場材料に減圧下で吸着させることにより播種する点が開示されている。具体的には、細胞を含む懸濁液に足場材料を浸漬し、スターラー等で培地を撹拌しながら、密閉容器内で真空ポンプ及び圧力調整器を用いて80〜120mmHgの陰圧をかけて一定時間（例えば5〜20分間）保持することにより、細胞を足場材料内に導入するという方法である。尚、陰圧の代わりに加圧条件下に置くこともある。
【０００５】
しかし、足場材料に減圧下で細胞液を浸透させる方法（減圧法）は、塗布法よりも足場材料のより内部まで細胞液を導入することができるものの、足場材料が浸漬するほど大量の細胞液が必要であり、また前述のような真空機器が必要になって装置コストが嵩むばかりでなく、クリーンルームあるいはアイソレータ内で使用するには排気処理も問題になり、手軽に利用することができない。また、この減圧法は、一度のバッチ処理に比較的長時間を要するので、大量に処理するのに適しているが、少量の処理には適しない。
【０００６】
更に、これら細胞を足場材料の外側から播種する方法では、足場材料の芯部まで細胞を十分に導入することができないばかりでなく、播種した細胞の密度が不均一になる。特に、再生医療には比較的大きな生体組織を作製する必要があり、それに応じて足場材料も肉厚が大きくならざるを得ないが、その場合には足場材料の芯部への細胞播種の問題は顕著になる。足場材料の芯部まで細胞を均一に播種できないと、それを培養して作製した生体組織も均質にはならない。
【０００７】
また、人手によってシリンジを用いて、細胞液を足場材料に注入する方法もあるが、作業者スキルによるバラツキが大きく、また細胞培養のアイソレータ内で作業中に針を直接何度も触るのでグローブの破損やコンタミのリスクが大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２７８９０９号公報（段落[００２７]）
【特許文献２】特許第４９２１６９２号公報（請求項１）
【特許文献３】特開２０１２−０８０８７４号公報（段落[００６７]）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、比較的大きな寸法の足場材料でも芯部から短時間で均一に細胞を自動的に播種することができ、更に細胞を培地に懸濁した細胞液の使用量も必要最小限に抑制できる、足場材料への細胞播種方法及びその装置を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前述の課題解決のために、以下の足場材料への細胞播種方法及び足場材料への細胞装置を構成した。
【００１１】
（１）細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料に、細胞を播種するための細胞播種方法であって、細胞が培養液に懸濁した状態の細胞液を、側面部に複数の吐出口を設けたニードルを備えたシリンジに充填し、足場材料に全ての吐出口が埋没するように穿刺した前記ニードルから細胞液を該足場材料の内部に加圧注入して、細胞を足場材料に均一に播種することを含む、足場材料への細胞播種方法。
（２）前記足場材料に対して前記ニードルを静止状態で細胞液を加圧注入する、（１）記載の足場材料への細胞播種方法。
（３）前記足場材料に対して前記ニードルを穿刺方向に対して、前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら細胞液を加圧注入する、（１）記載の足場材料への細胞播種方法。
（４）前記足場材料は円柱形状であり、前記ニードルを該足場材料の中心軸に沿って穿刺する、（１）〜（３）の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種方法。
（５）前記ニードルは、ニードルチップを除く先端部分の側面部に複数の吐出口を備え、全ての吐出口で細胞液の単位時間当たりの吐出量を略均一に設定した、（１）〜（４）の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種方法。
【００１２】
（６）細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料に、細胞が培養液に懸濁した状態の細胞液を充填したシリンジを駆動し、均一に細胞を播種するための細胞播種装置であって、基台上に、多孔性足場材料を保持する足場材料保持部と、側面部に複数の吐出口を設けたニードルを備えたシリンジの外筒部を保持して穿刺方向に進退移動可能な主可動部と、前記シリンジのプランジャの端部を保持して前記シリンジの外筒部に対して進退移動可能な副可動部とを備え、更に前記主可動部を前進駆動して前記ニードルを全ての吐出口が埋没するように足場材料に穿刺する穿刺モードを備えるとともに、前記主可動部を静止状態で前記副可動部を前進駆動して前記ニードルから細胞液を足場材料の内部に加圧注入する静止注入モードと、前記主可動部を前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら、前記副可動部を前進駆動して前記ニードルから細胞液を足場材料の内部に加圧注入する移動注入モードの少なくとも一方を備えた、足場材料への細胞播種装置。
（７）前記副可動部は、前記主可動部を基準として進退移動可能に設け、前記主可動部に対する副可動部の変位によって、前記シリンジの外筒部に対するプランジャの押し込み量を制御して、前記ニードルによる加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節する、（６）記載の足場材料への細胞播種装置。
（８）前記副可動部は、前記基台を基準として進退移動可能に設け、前記基台に対する前記主可動部の変位と副可動部の変位の差分によって、前記シリンジの外筒部に対するプランジャの押し込み量を制御して、前記ニードルによる加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節する、（６）記載の足場材料への細胞播種装置。
（９）前記足場材料保持部は、内部に前記足場材料の外周を取り囲んで包持する収容空間を備えるとともに、一部に前記ニードルが進入する導入口を備えている、（６）〜（８）の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
（１０）前記足場材料は円柱形状であり、前記ニードルを該足場材料の中心軸に沿って穿刺する、（６）〜（９）の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
（１１）前記ニードルは、ニードルチップを除く先端部分の側面部に複数の吐出口を備え、全ての吐出口で細胞液の単位時間当たりの吐出量を略均一に設定した、（６）〜（１０）の何れか１項に記載の足場材料への細胞播種装置。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の足場材料への細胞播種方法及びその装置によれば、比較的大きな寸法の足場材料でも芯部から短時間で均一に細胞を自動的に播種することができる。また、細胞を培地に懸濁した細胞液は、必要最小限の使用量で済み、高価な細胞や培地を節約できる。作業者スキルによらず、足場材料に安定した播種が行なえる。また、本発明の細胞播種装置は、クリーンルームあるいはアイソレータ内で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る細胞播種装置の全体斜視図である。
【図２】同じくハウジングを省略した状態の細胞播種装置の斜視図である。
【図３】シリンジを細胞播種装置に保持する構造を示す斜視図である。
【図４】主可動部を駆動する機構を示す部分斜視図である。
【図５】主可動部を示す部分斜視図である。
【図６】同じく主可動部を示す部分斜視図である。
【図７】足場材料保持部の構造を示す分解斜視図である。
【図８】タイプＡのニードルの斜視図である。
【図９】タイプＢのニードルの斜視図である。
【図１０】タイプＡのニードルの部分断面図である。
【図１１】細胞播種装置にシリンジを装着し、ホームポジション状態の縦断面図である。
【図１２】ニードルを足場材料に穿刺した状態の縦断面図である。
【図１３】ニードルから細胞液を足場材料に注入した状態の縦断面図である。
【図１４】横型の細胞播種装置の全体斜視図である。
【図１５】足場材料への播種実験における染色状態を観察するための切断箇所を示す説明図である。
【図１６】各播種速度における染色状態の観察結果を示す足場材料の切断面の図面代用写真である。
【図１７】各播種速度における染色面積比のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、添付図面に示した実施形態に基づき、本発明を更に詳細に説明する。図１〜図１３は本発明の足場材料への細胞播種装置を示し、図中符号１は細胞播種装置、２はシリンジ、３は足場材料、１１は基台、１２は主可動部、１３は副可動部、２１は外筒部、２２はプランジャ、２３はニードル、２４は吐出口、３１は足場材料保持部をそれぞれ示している。尚、図１〜図１３に示した細胞播種装置１は縦型であり、図１４に示した細胞播種装置１Ａは横型であるが、基本構造は縦型と同じである。
【００１６】
本発明の細胞播種装置１は、細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する多孔性足場材料３に、細胞が培地（培養液）に懸濁した状態の細胞液を充填したシリンジ２を駆動して、均一に細胞を播種するためのものである。
【００１７】
本発明において「足場材料」とは、細胞が３次元的に増殖するための足場として機能する細胞足場材料（スキャホールド）を意味する。足場材料の足場部分は３次元構造を有しており、すなわち足場部分が立体的に配置されている。足場材料はその内部への細胞の侵入を可能にするため、多数の気孔（空隙）を有する。足場材料は、気孔を任意の形状及び／又は分布で有するものであってよいが、多孔性であることが好ましい。足場材料は、気孔間連通性を有していることがさらに好ましく、３次元ネットワーク構造を有していることも好ましい。足場材料について「多孔性」とは、孔径数μm〜数百μm程度の無数の気孔（空隙）が足場材料全体に比較的均一に存在することを指す。本発明においては、足場材料の空隙率（足場材料の全体積に比した空隙部分の体積の割合）は好ましくは30〜95％、より好ましくは60〜90％である。足場材料の孔径（気孔の直径）は、以下に限定されないが、好ましくは10〜500μm、より好ましくは50〜300μm、例えば50〜200μm（平均値）である。
【００１８】
足場材料の形状は、シリンジのニードルを穿刺して細胞液を注入できる形状であれば特に限定されず、円柱形、ディスク状、ブロック状、球形、楕円球形など任意の形状であってよい。本発明では、足場材料の大きさは、特に限定されないが、作製する生体組織の大きさに合わせた大きさであることが好ましい。本実施形態では、直径１０ｍｍ、長さ５０ｍｍの円柱形のものを用いた。
【００１９】
本発明で用いる足場材料は、生分解性材料で構成される。本発明の足場材料は、医療分野等で使用される、生体内で分解されて細胞及び／又は生体に無毒な代謝産物を生成する生分解性材料で構成されることが好ましい。本発明における生分解性の足場材料は、例えば、コラーゲン、生分解性ポリマー、多糖類、又はそれらの組み合わせを含むものであってよい。「コラーゲン」としては、I型、II型、III型、IV型、V型、VI型及びVII型コラーゲンのいずれか、若しくはそれらの処理物（テロペプチドを除去したアテロコラーゲンや、熱変性体であるゼラチン等）、又はそれらの混合物が挙げられる。コラーゲンは、２種以上のコラーゲンの混合物であってもよく、一例として、生体内での利用のために抗原性低減が望まれる場合には複数種のアテロコラーゲンの混合物、例えば、熱変性アテロコラーゲンと線維化アテロコラーゲンの混合物（線維化アテロコラーゲンに熱変性アテロコラーゲンを5〜20％、例えば7〜12％添加したものなど）であってもよい。他の生分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリアルギン酸などの生分解性ポリエステル類、キチン、キトサン、アルギン酸、ポリアスパラギン酸、ヒアルロン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。生分解性の足場材料は市販のものを用いてもよいし、動物組織から抽出・精製したコラーゲン等の生分解性材料から作製したものを用いてもよい。本発明で用いる生分解性足場材料の好ましい例として、テルプラグ(R)（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）などの多孔性コラーゲンスポンジが挙げられる。
【００２０】
本発明において「細胞」とは、培養細胞であり、初代培養細胞又は樹立細胞株であり得る。そのような細胞は正常細胞由来であってもがん細胞由来であってもよい。本発明における細胞は、任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシなど）由来であってよいが、ヒト由来が好ましい。本発明における細胞はまた、体性幹細胞、臍帯血幹細胞、ES細胞、iPS細胞等の幹細胞から分化誘導により特定生体組織細胞に分化させたものであってもよい。細胞は不死化されていても、有限増殖性であってもよい。本発明における細胞はまた、ヒト生体より採取した初代細胞（正常細胞）でもよい。本発明における細胞は、遺伝子導入等の遺伝子改変がされていない非遺伝子組換え細胞であってもよい。
【００２１】
細胞を懸濁する培地（培養液）は、それらの細胞の培養に適した培地であれば特に限定されない。培地には、FBS（ウシ胎仔血清）や、Antibiotic-Antimycotic等の抗生物質を添加してもよい。培地には、分化誘導因子を含むものでもよい。
【００２２】
具体的には、本発明の細胞播種装置１は、図２及び図１１に示すように、基台１１上に、多孔性足場材料３を保持する足場材料保持部３１と、側面部に複数の吐出口２４，…を設けたニードル２３を備えたシリンジ２の外筒部２１を保持して穿刺方向に進退移動可能な主可動部１２と、前記シリンジ２のプランジャ２２の端部を保持して前記シリンジ２の外筒部２１に対して進退移動可能な副可動部１３とを備えている。ここで、本発明において「穿刺方向」とは、ニードル２３を足場材料３に突き刺す方向を意味する。本発明において「前進」とは穿刺方向に進むことを意味し、「後退」とは穿刺方向と逆に進むことを意味している。
【００２３】
更に、本発明は、図１１及び図１２に示すように、前記主可動部１２を前進駆動して前記ニードル２３を全ての吐出口２４，…が埋没するように足場材料３に穿刺する穿刺モードを備えている。加えて、本発明は、前記主可動部１２を静止状態で前記副可動部１３を前進駆動して前記ニードル２３から細胞液を足場材料３の内部に加圧注入する静止注入モード（図１３参照）と、前記主可動部１２を前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら、前記副可動部１３を前進駆動して前記ニードル２３から細胞液を足場材料３の内部に加圧注入する移動注入モードの少なくとも一方を備えている。つまり、前記移動注入モードは、更に前進注入モード又は後退注入モード又は前進後退注入モードを選択できるようになっている。
【００２４】
ここで、前記副可動部１３は、前記主可動部１２を基準として進退移動可能に設け、前記主可動部１２に対する副可動部１３の変位によって、前記シリンジ２の外筒部２１に対するプランジャ２２の押し込み量を制御して、前記ニードル２３による加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節するようにしている。尚、図示しないが、前記副可動部１３は、前記基台１１を基準として進退移動可能に設け、前記基台１１に対する前記主可動部１２の変位と副可動部１３の変位の差分によって、前記シリンジ２の外筒部２１に対するプランジャ２２の押し込み量を制御して、前記ニードル２３による加圧注入時の圧力及び単位時間当たりの注入量を調節することも可能である。
【００２５】
また、本発明において、前記足場材料保持部３１は、図１〜図３及び図７に示すように、前記基台１１に取付けたサポート部材３２と、内部に前記足場材料３を収容した状態で前記サポート部材３２に着脱可能に保持する保護部材３３とからなり、前記保護部材３３の内部に前記足場材料３の外周を取り囲んで包持する収容空間３４を備えるとともに、一部に前記ニードル２３が進入する導入口３５を備えている。本実施形態では、前記足場材料３は円柱形状であり、前記ニードル２３を該足場材料３の中心軸に沿って穿刺するようになっている。
【００２６】
更に詳しくは、前記足場材料保持部３１のサポート部材３２は、上方に開放した円筒部３６と下端部周囲に張り出した受皿部３７とを有し、前記円筒部３６の上部の対向壁部に切欠部３８，３８を形成して指を受け入れるようになっている。前記保護部材３３は、外形が前記サポート部材３２の円筒部３６に内嵌する円筒状で、中心線を含む直径方向に二つ割りした構造になっており、接合面にはダボ３９と凹部（図示せず）による凹凸嵌合構造を設けている。そして、前記保護部材３３を分離状態で、一方の分割部材３３Ａの収容空間３４に前記足場材料３を収容し、他方の分割部材３３Ｂを接合し、その接合状態を保ったまま、前記サポート部材３２の円筒部３６に収容して保持する。前記収容空間３４の大きさ及び形状は、それに収容する足場材料３に応じて決定される。
【００２７】
本実施形態のシリンジ２は、図３に示すように、外筒部２１の筒先に前記ニードル２３の基部のアダプター２５を接続して使用し、前記外筒部２１にはバックフランジ２６を備えるとともに、前記プランジャ２２の端部にプランジャボタン２７を備えた通常の構造である。そして、本発明における前記ニードル２３は、図８〜図１０に示すように、先端部分の側面部に複数の吐出口２４，…を備えている。更に詳しくは、本発明のニードル２３は、ニードルチップ２８を除く側面部に中心の流路２９に連通する複数の吐出口２４，…を備えている。前記吐出口２４を備える領域は、注入モードに応じて異なる。尚、前記ニードルチップ２８にも吐出口２４を設けることは可能であるが、足場材料３に穿刺時に該材料で吐出口が塞がることも想定されるので、細胞液の均一播種に必要である場合を除き、ニードルチップ２８には吐出口は設けない。
【００２８】
先ず、図８に示したニードル２３（Ａタイプ）は、静止注入モードで使用するものであり、前記足場材料３に穿刺した状態で、該足場材料３の内部に均一に細胞液を注入できるように、挿入部分の全長にわたって前記吐出口２４，…を一定間隔で設けたものである。本実施形態では、先端から等間隔に１０箇所の位置に前記吐出口２４，…を設けている。次に、図９に示したニードル２３（Ｂタイプ）は、移動注入モードで使用するものであり、先端部のみの狭い範囲に前記吐出口２４，…を一定間隔で設けたものである。本実施形態では、先端から等間隔に４箇所の位置に前記吐出口２４，…を設けている。
【００２９】
ここで、前記ニードル２３を前記足場材料３に穿刺した状態で、全ての吐出口２４，…で細胞液の単位時間当たりの吐出量を略均一に設定することが望ましい。オリフィスにおける流量は、内外の圧力差とコンダクタンスの積で表される。各吐出口２４の外側の圧力、つまり足場材料３に接する部分の圧力は一定であると仮定し、全吐出口２４の流路長が同じであると仮定する。ニードル２３の流路２９内の圧力が至るところで一定であると見なせる場合には、全吐出口２４の断面を同形、例えば断面が円形の場合には同じ直径又は半径に設定すれば、全ての吐出口２４のコンダクタンスは同じになり、吐出量を略均一にすることができる。一方、ニードル２３の流路２９の先端に向けて内圧が漸減する場合には、全吐出口２４で同じ吐出量を確保するためには、先端側の吐出口２４ほどコンダクタンスを大きく、例えば直径又は半径を大きくすればよい。あるいは、ニードル２３の単位長さ当たりの吐出量を略均一にするという発想もある。その場合、各吐出口２４のコンダクタンスを同じに設定し、ニードル２３の流路２９内の圧力の変化に応じて、吐出口２４を設ける数密度を変えればよい。
【００３０】
更に具体的に、本発明の細胞播種装置１を説明する。前記基台１１は、図４に示すように、水平なベース板１１１の上面に垂直な支柱部１１２を固定した構造であり、前記ベース板１１１の上面には前記足場材料保持部３１を取付けている。前記支柱部１１２は、支持板１１３とその両側に設けた補強板１１４，１１４とで平面視略コ字形の剛性の高い構造となっている。そして、前記支持板１１３には、上下方向にリニアガイド１１５のガイドレール１１５Ａを固定するとともに、該ガイドレール１１５Ａに平行に、ステッピングモータやサーボモータ等の回転数を制御可能な駆動モータ１１６で回転駆動される送りねじ機構１１７のねじ軸１１７Ａが設けられている。尚、送りねじ機構１１７の代わりに更に精度の高いボールねじを用いてもよい。
【００３１】
そして、前記主可動部１２は、図２及び図３に示すように、前記基台１１の支柱部１１２に上下移動可能に設けられている。前記主可動部１２は、図５及び図６に示すように、基板１１８の表側下部に前記シリンジ２の外筒部２１を保持する外筒部保持部１１９を設けるとともに、裏側に前記リニアガイド１１５を構成する可動ブロック１１５Ｂ，１１５Ｂを上下に固定するとともに、前記送りねじ機構１１７を構成するナット１１７Ｂを固定している。勿論、前記可動ブロック１１５Ｂ，１１５Ｂは、前記ガイドレール１１５Ａにスライド可能に連係し、前記ナット１１７Ｂは、前記ねじ軸１１７Ａに螺進退可能に連係している。それにより、前記主可動部１２は、前記駆動モータ１１６で駆動された送りねじ機構１１７により、前記リニアガイド１１５で案内されて、前記基台１１の支柱部１１２に対して上下移動する。
【００３２】
そして、前記副可動部１３は、図５及び図６に示すように、前記主可動部１２を基準として上下移動可能に設けられている。前記副可動部１３は、前記基板１１８の表側に、リニアガイド１２０と駆動モータ１２１で回転駆動される送りねじ機構１２２とによって上下移動可能に設けられている。この場合も、前記リニアガイド１２０は、前記基板１１８に上下方向に固定されたガイドレール１２０Ａと、前記副可動部１３の裏面側に固定され、前記ガイドレール１２０Ａに対してスライド移動する可動ブロック１２０Ｂとからなっている。また、前記送りねじ機構１２２も前記同様であり、前記基板１１８の表側に、前記ガイドレール１２０Ａに平行にねじ軸１２２Ａを設け、ナット１２２Ｂは前記副可動部１３の裏面に固定している。前記駆動モータ１２１も前記同様に、ステッピングモータやサーボモータ等の回転数を制御可能なものである。それにより、前記副可動部１３は、前記駆動モータ１２１で駆動された送りねじ機構１２２により、前記リニアガイド１２０で案内されて、前記基板１１８に対して上下移動する。更に、前記副可動部１３の表側に前記シリンジ２のプランジャ２２の端部を保持するプランジャ保持部１２３を設けている。
【００３３】
また、安全のためとホームポジションを決定するために、各可動部の可動範囲を制限するリミット機構が設けられている。先ず、前記主可動部１２に対しては、前記基台１１の支柱部１１２の上下部に近接センサ１２４，１２４を取付け、前記基板１１８の一側端に取付けた規制片１２５を検出し、前記駆動モータ１１６を強制停止するようになっている。また、前記副可動部１３に対しては、前記基板１１８の他側部の上下部に、適宜な取付金具を介して近接センサ１２６，１２６を取付け、前記副可動部１３の一側端に取付けた規制片１２７を検出し、前記駆動モータ１１６を強制停止するようになっている。また、前記機構部を前記シリンジ２に対して覆うために、前記基板１１８の下端部に下方へ延びたカバー１２８を設けるとともに、前記基板１１８と平行にカバー１２９を設けている。更に、前記支柱部１１２の背後に、着脱可能に補助脚１３０を設け、前記ベース板１１１の下面及び前記補助脚１３０の先端部にゴム製の接地パッド１３１，…を設けている。
【００３４】
前記主可動部１２に設けた外筒部保持部１１９は、図２及び図５に示すように、前記シリンジ２の外筒部２１を受け入れる凹部１３２と、前記バックフランジ２６を嵌合するフランジ嵌合部１３３と、前記外筒部２１を外側から押さえて保持する保持部材１３４とからなる。前記保持部材１３４は、一端を水平回動可能に保持するとともに、他端を弾性的にフック１３５で係脱できるように構成している。また、前記副可動部１３に設けたプランジャ保持部１２３は、前記シリンジ２のプランジャボタン２７を嵌合するボタン嵌合部１３６で構成している。前記凹部１３２、フランジ嵌合部１３３及びボタン嵌合部１３６は、シリンジ２に細胞液を充填した状態で、前記主可動部１２の前面側からシリンジ２の各部を受け入れて保持できる構造であり、特にニードル２３の穿刺方向において、前記フランジ嵌合部１３３に嵌合したバックフランジ２６を前記主可動部１２に対して移動不能に嵌合し、前記ボタン嵌合部１３６に嵌合したプランジャボタン２７を前記副可動部１３に対して移動不能に嵌合する。それにより、前記主可動部１２に対して前記副可動部１３が穿刺方向に相対変位、この場合、前進移動すると、前記プランジャ２２が外筒部２１内に押し込まれ、前記ニードル２３の吐出口２４，…から細胞液が吐出するのである。
【００３５】
本発明の細胞播種装置１は、可動部に設けた駆動モータ１２１や近接センサ１２６に接続するケーブルを保護するために、前記支柱部１１２と前記主可動部１２との間にチェーン型の可撓性ケーブル保護管１３７を設けている。また、図１及び図１４に示すように、前記基台１１の支柱部１１２には、前述の主可動部１２や副可動部１３などの機構部を覆うハウジング１３８を設け、該ハウジング１３８には前記シリンジ２の脱着作業のために前面側に開閉扉１３９を設けている。
【００３６】
また、前記足場材料保持部３１のサポート部材３２は、図１１に示すように、前記基台１１のベース板１１１に着脱可能に取付けている。前記ベース板１１１の前部の所定位置に開口１４０を形成し、該開口１４０に前記サポート部材３２の下面中央に突設した係合部１４１を係合させて位置決めし、下方から前記係合部１４１に取付ネジ１４２を螺合して締結する。前記サポート部材３２の円筒部３６の底部には液溜１４３を設けてあり、前記足場材料３から溢れた細胞液を受けるようになっている。更に、前記サポート部材３２の受皿部３７にも播種作業中にこぼれた細胞液を受けることができるようになっている。
【００３７】
本発明の細胞播種装置１の動作を図１１〜図１３に基づいて説明する。先ず、図１１に示すように、前記主可動部１２及び前記副可動部１３が最上位に位置する状態をホームポジションとする。前記外筒部保持部１１９の保持部材１３４を開いた状態で、細胞液を充填した前記シリンジ２を、前記凹部１３２、フランジ嵌合部１３３及びボタン嵌合部１３６に、それぞれ外筒部２１、バックフランジ２６及びプランジャボタン２７を嵌合し、それから保持部材１３４を閉じてフック１３５で保持する。一方、足場材料３は、前述のように保護部材３３の収容空間３４内に包持した状態で、前記サポート部材３２の円筒部３６に挿入してセットする。それから、穿刺モードを実行し、図１２に示すように、前記駆動モータ１１６を駆動して前記主可動部１２を穿刺方向に対して前進（下降）させて、前記ニードル２３を保護部材３３の導入口３５から侵入させて足場材料３に所定深さまで挿入する。それから、静止注入モードでは、図１３に示すように、前記主可動部１２を静止状態で前記副可動部１３のみを前進駆動して前記ニードル２３から細胞液を足場材料３の内部に加圧注入する。細胞液の注入が終った後に、抜刺モードを実行し、つまり前記主可動部１２を穿刺方向に対して後退（上昇）させてニードル２３を足場材料３から抜き去り、ホームポジションに戻す。それから、シリンジ２を取り外した後、前記副可動部１３もホームポジションに戻す。
【００３８】
また、前記主可動部１２を前進又は後退若しくは前進と後退を組み合わせて移動させながら、前記副可動部１３を前進駆動して前記ニードル２３から細胞液を足場材料３の内部に加圧注入する移動注入モードを選択することも可能である。この移動注入モードは、更にニードル２３を穿刺方向に挿入しながら細胞液を注入する前進注入モード又はニードル２３を深く刺し込んだ状態から抜きながら細胞液を注入する後退注入モード又はニードル２３を穿刺方向に対して前進及び後退を組み合わせて移動させながら細胞液を注入する前進後退注入モードを選択できる。
【００３９】
このように本発明の細胞播種装置１を用いて、足場材料３に内部から細胞を培地に懸濁した細胞液を注入した後、必要に応じて細胞液の残液をディッシュ等に受けて、それに足場材料３を浸漬して外部からも細胞液を浸透させることにより、更に均一な細胞の播種が可能となる。尚、足場材料３の形状によっては、前記シリンジ２のニードル２３を足場材料３の異なる位置に複数回穿刺する必要があり、そのために前記ベース板１１１に対して前記足場材料保持部３１を穿刺方向と交差する方向に移動可能にすることもある。それには、１軸あるいは２軸の移動テーブルを介して前記足場材料保持部３１を前記ベース板１１１に支持すればよい。
【００４０】
図１４は、横型の細胞播種装置１Ａを示しているが、前述の縦型の細胞播種装置１から補助脚１３０を外し、前記支柱部１１２の補強板１１４，１１４の先端と中間部に、ゴム製の接地パッド１３１，…を取付けて横置きとしたものである。この場合、前記受皿部３７の代わりに、前記支柱部１１２の支持板１１３の上面に、複数のダボ１４４で周囲を保持した受皿１４５を設けて足場材料３から溢れた細胞液を受ける。その他の構造は、前記同様であるので、同一構成には同一符号を付してその説明を省略する。
【００４１】
最後に、本発明の細胞播種装置１を用いて、足場材料に細胞を均一に播種できることを確認するための実験を行なった。足場材料は、直径１０ｍｍ、長さ５０ｍｍの円柱形のテルプラグ(R)（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）である。そして、細胞液の代わりにトリパンブルー水溶液を用いた。本実験では、図８に示したタイプＡのニードル２３を用い、静止注入モードで行なった。全注入量は１ｍｌ（１ｃｃ）で、播種速度（注入速度）を１０から２００μｌ／ｓの７種類を比較した。足場材料の中心軸にニードルを穿刺し、各々の速度でトリパンブルー水溶液を注入した後、図１５に示すように、中心軸に直角に５箇所を切断し、各切断片（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ）の上側の切断面あたりの染色面積を求め、比較を行なった。図１６は、各播種速度毎の切断面の写真であり、これから染色面積比を出し、その結果を図１７に示す。図１７には、各播種速度につき３回（Ｎ＝３）行なった結果を重ねて記載している。
【００４２】
図１７の結果から、播種速度が１００μｌ／ｓの場合が最もばらつきがなく、染色面積も高い値を示し、至適播種速度であると示唆されました。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、再生医療等に用いるためのヒト軟骨等の３次元培養に利用できる。
【符号の説明】
【００４４】
１  細胞播種装置（縦型）、
１Ａ  細胞播種装置（横型）、
２  シリンジ、
３  足場材料、
１１  基台、
１２  主可動部、
１３  副可動部、
２１  外筒部、                ２２  プランジャ、
２３  ニードル、              ２４  吐出口、
２５  アダプター、            ２６  バックフランジ、
２７  プランジャボタン、      ２８  ニードルチップ、
２９  流路、
３１  足場材料保持部、        ３２  サポート部材、
３３  保護部材、              ３３Ａ  分割部材、
３３Ｂ  分割部材、            ３４  収容空間、
３５  導入口、                ３６  円筒部、
３７  受皿部、                ３８  切欠部、
３９  ダボ、
１１１  ベース板、            １１２  支柱部、
１１３  支持板、              １１４  補強板、
１１５  リニアガイド、        １１５Ａ  ガイドレール、
１１５Ｂ  可動ブロック、      １１６  駆動モータ、
１１７  送りねじ機構、        １１７Ａ  ねじ軸、
１１７Ｂ  ナット、            １１８  基板、
１１９  外筒部保持部、        １２０  リニアガイド、
１２０Ａ  ガイドレール、      １２０Ｂ  可動ブロック、
１２１  駆動モータ、          １２２  送りねじ機構、
１２２Ａ  ねじ軸、            １２２Ｂ  ナット、
１２３  プランジャ保持部、    １２４  近接センサ、
１２５  規制片、              １２６  近接センサ、
１２７  規制片、              １２８  カバー、
１２９  カバー、              １３０  補助脚、
１３１  接地パッド、          １３２  凹部、
１３３  フランジ嵌合部、      １３４  保持部材、
１３５  フック、              １３６  ボタン嵌合部、
１３７  可撓性ケーブル保護管、１３８  ハウジング、
１３９  開閉扉、              １４０  開口、
１４１  係合部、              １４２  取付ネジ、
１４３  液溜、                １４４  ダボ、
１４５  受皿。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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