(57)【要約】【課題】魚類のノカルジア症の治療又は予防のために有効なワクチンの提供。【解決手段】魚類由来のIL-12タンパク質を含む、魚類の感染症に対するワクチンに添加するためのアジュバント、及び該アジュバントをワクチンと共に含む、ワクチン組成物を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のIL-12タンパク質を含む、魚類の感染症に対するワクチンに添加するためのアジュバント。
【請求項２】
感染症が細菌感染症である、請求項１記載のアジュバント。
【請求項３】
細菌感染症がノカルジア症である、請求項２記載のアジュバント。
【請求項４】
魚類由来のIL-12タンパク質が、ブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含む組換えタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載のアジュバント。
【請求項５】
感染症がスズキ目、カレイ目、フグ目、ダツ目、サケ目、及びコイ目のいずれかに属する魚類の細菌感染症である、請求項１〜４のいずれか１項記載のアジュバント。
【請求項６】
感染症がブリ、カンパチ、ヒラマサ、マグロ、ティラピア、フグ、ヒラメ、マダイ、カワハギ、サケ、マス、アユ、コイから選択される魚類の細菌感染症である、請求項５記載のアジュバント。
【請求項７】
ワクチン接種前、ワクチン接種時、又はワクチン接種後に投与される、請求項１〜６のいずれか１項記載のアジュバント。
【請求項８】
ブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含む組換えタンパク質。
【請求項９】
請求項８記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９記載のポリヌクレオチド又は請求項１０記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現したタンパク質を回収することを含む、請求項８記載の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項記載のアジュバントを魚類の感染症に対するワクチンと共に含む、ワクチン組成物。
【請求項１４】
感染症が細菌感染症である、請求項１３記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
細菌感染症がノカルジア症である、請求項１４記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
ワクチンが不活化ワクチンである、請求項１３〜１５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
魚類由来のIL-12をワクチンと組み合わせて魚類に投与することを特徴とする、魚類の感染症の治療及び／又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブリ等の養殖魚における感染症の治療及び予防のためのワクチン組成物に関し、より具体的には、不活化ワクチン等のワクチンと共に使用可能なワクチンアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
養殖ブリ等の魚類に発症するノカルジア症は、我が国の水産養殖において最も被害額が大きい疾病であり、水産養殖における総被害額の約25％を占めている。特に養殖総生産額の大半を占めるブリ類（ブリ・カンパチ等）で大きな被害が生じている。
【０００３】
ノカルジア症の原因菌であることが知られているノカルジア・セリオラエ（Nocardia seriolae）は細胞内寄生細菌であり、感染後に宿主の細胞内に寄生して、肝臓・腎臓・脾臓等に粟粒結節を形成することで慢性感染を呈する。近年までノカルジア症に対する魚類の感染防御機構が不明であったが、本発明者らは、(i)抗体を主体とする液性免疫が感染防御に有効ではないこと、(ii)マクロファージや細胞障害性T細胞の活性化を中心とした細胞性免疫が感染防御には有効であることを証明した。
【０００４】
一般的に、魚類の感染症の予防のために、抗生物質等の薬剤や、ホルマリン不活化ワクチン等のワクチンの投与、また寄生虫対策として網替えや薬浴が実施されている。しかしながら、薬剤の魚類体内への残留は好ましくなく、またノカルジア症に対しては有効な不活化ワクチンが得られていない。特許文献１−５ではノカルジア症等に対するワクチンとして種々の提案がなされているが、実際に有効なワクチンは未だ開発されていないのが現状である。
【０００５】
また、上記特許文献１−５にはアジュバントの使用が示唆されているが、開示されたアジュバントは、アルミニウム化合物、鉱物油エマルジョン、非イオン性界面活性剤、スクワレン、サポニン、細菌の菌体成分等である。現在、海外のアジュバントメーカーにより数種の水産用オイルアジュバントや多糖アジュバントが市販されているが、いずれもノカルジア症に対して有効なアジュバントではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-73990号公報
【特許文献２】特表2011-502972号公報
【特許文献３】特表2011-506577号公報
【特許文献４】特開2013-184916号公報
【特許文献５】特開2013-183673号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、医学・獣医学領域においては、細胞性免疫の誘導が重要な細胞内寄生病原体に対しては生ワクチンが選択されている。しかしながら、我が国の水産用ワクチンは、病原体を不活化した製剤である不活化ワクチンのみが承認される状況であり、生ワクチンは承認されていない。
【０００８】
上記の通り、魚類のノカルジア症に対して、不活化菌体単独投与ではワクチン効果を得ることができない。不活化ワクチンは一般に液性免疫を誘導する一方で細胞性免疫の誘導が弱いといった特性を有することから、抗原に何らかのアジュバントを添加することで細胞性免疫誘導能を増強する必要があると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題に鑑み、本発明者等は、魚類由来のインターロイキン12（IL-12）の細胞性免疫誘導能に着目し、これをアジュバントとしてワクチンに添加できる可能性を検討した。そして、ノカルジア・セリオラエの不活化菌体にIL-12を添加してカンパチ等に接種した結果、細胞性免疫を誘導し、ワクチン効果を増大させることができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．魚類由来のIL-12タンパク質を含む、魚類の感染症に対するワクチンに添加するためのアジュバント。
２．感染症が細菌感染症である、上記１記載のアジュバント。
３．細菌感染症がノカルジア症である、上記２記載のアジュバント。
４．魚類由来のIL-12タンパク質が、ブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含む組換えタンパク質である、上記１〜３のいずれか記載のアジュバント。
５．感染症がスズキ目、カレイ目、フグ目、ダツ目、サケ目、及びコイ目のいずれかに属する魚類の細菌感染症である、上記１〜４のいずれか記載のアジュバント。
６．感染症がブリ、カンパチ、ヒラマサ、マグロ、ティラピア、フグ、ヒラメ、マダイ、カワハギ、サケ、マス、アユ、コイから選択される魚類の細菌感染症である、上記５記載のアジュバント。
７．ワクチン接種前、ワクチン接種時、又はワクチン接種後に投与される、上記１〜６のいずれか記載のアジュバント。
８．ブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含む組換えタンパク質。
９．上記８記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１０．上記９記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１１．上記１０記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
１２．上記９記載のポリヌクレオチド又は上記１０記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現したタンパク質を回収することを含む、上記８記載の組換えタンパク質の製造方法。
１３．上記１〜６のいずれか記載のアジュバントを魚類の感染症に対するワクチンと共に含む、ワクチン組成物。
１４．感染症が細菌感染症である、上記１３記載のワクチン組成物。
１５．感染症がノカルジア症である、上記１４記載のワクチン組成物。
１６．ワクチンが不活化ワクチンである、上記１３〜１５のいずれか記載のワクチン組成物。
１７．魚類由来のIL-12をワクチンと組み合わせて魚類に投与することを特徴とする、魚類の感染症の治療及び／又は予防方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来有効なワクチンがなかったノカルジア症に対して効果的なワクチンを提供することができると共に、他の細菌感染症、ウイルス感染症及び寄生病原体感染症に対するワクチンにも利用可能な新規アジュバントが提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】カンパチ及びブリのIL-12、並びに他種の既知のIL-12ファミリーのアミノ酸配列から作製した系統樹を示す。図中の数字はブートストラップ値を示す。
【図２】本発明で用いた組換えIL-12アイソフォームの構造を模式的に示す。図中、SphI、KpnI、SacIIは遺伝子断片をpMIB/V5-His Bベクターに挿入する際に使用した制限酵素を示す。
【図３】単離・精製された組換えIL-12をSDS-PAGEで泳動した後にウエスタンブロッティングを行った結果を示す。いずれも単一のバンドであり、単離・精製されたことを示している。
【図４】IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン、およびN. seriolae不活化ワクチンを腹腔内接種によりワクチネーションしたのち、30日後にN. seriolae生菌 (1×105CFU/fish)を用いた攻撃試験を行った後（感染後）の生残率を示す。各試験区20尾ずつ使用した。
【図５】ワクチネーションしたカンパチにおける凝集抗体価の推移を示す。各試験区のカンパチより分離した血清およびN. seriolaeの不活化菌体による抗原抗体反応により凝集抗体価を判定した。また判定は目視で行った。データは3個体の平均値±標準偏差として示した。
【図６】ワクチネーション後のカンパチ頭腎白血球における免疫応答を示す。ワクチネーションの1、2、7日後に頭腎（魚類の主要造血器官）を取り出して白血球を分離したのち、リアルタイムPCRによりIFNγ遺伝子の発現を解析した。発現量は3個体の平均値±標準偏差として示す。
【図７】ワクチネーション後のカンパチ頭腎白血球における免疫応答を示す。ワクチネーションの1、2、7日後に頭腎を取り出して白血球を分離したのち、リアルタイムPCRによりIL-10遺伝子の発現を解析した。発現量は3個体の平均値±標準偏差として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ワクチンアジュバント
本発明は、第一の実施形態として、魚類由来のインターロイキン-12（IL-12）タンパク質を含む、魚類の感染症に対するワクチンに添加するためのアジュバントを提供する。本発明のアジュバントを使用して治療及び／又は予防することが意図される感染症としては、細菌感染症、ウイルス感染症、及び寄生病原体感染症が挙げられる。細菌感染症としては、限定するものではないが、例えばノカルジア・セリオラエ（Nocardia seriolae）を原因菌とするノカルジア症、ミコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）を原因菌とするミコバクテリア症（抗酸菌症とも呼ばれる）、フォトバクテリウム・ダムセラエ・サブエスピー・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. piscicida）を原因菌とする類結節症、エドワジエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）を原因菌とするエドワジエラ症等が挙げられ、これらはいずれも魚類の養殖において重大な疾病である。
【００１４】
本発明のワクチンアジュバントは、魚類の感染症の治療及び／又は予防のために使用される。本明細書において「治療」とは、細菌等によって既に感染している魚類における症状の軽減若しくは消失、発症の抑制のための投与をいい、「予防」とは、細菌等による感染の可能性がある健康な魚類に対して予め投与することをいう。
【００１５】
本発明のアジュバントは、限定するものではないが、細菌感染症、特に従来有効なワクチンが得られていないノカルジア症に対して使用することが意図される。
【００１６】
IL-12は、インターロイキングループに属するサイトカインの1種であり、2つのサブユニット、IL-12p35及びIL-12p40から構成されるホモ又はヘテロ二量体として存在することが知られている。哺乳類においては、マクロファージ等の抗原提示細胞からの抗原提示を受けたナイーブヘルパーT細胞が細胞性免疫誘導を担うＩ型ヘルパーT細胞に分化する際、IL-12の刺激を必要とする。すなわち抗原刺激時にIL-12を添加することで、Ｉ型ヘルパーT細胞の誘導が可能になる。
【００１７】
魚類においては未だヘルパーT細胞のサブセットは同定されていないが、哺乳類と同様に細胞性免疫と液性免疫の誘導が互いに拮抗関係にあることが本発明者等の研究により示唆されている。そこで本発明者等は、魚類由来のIL-12タンパク質を取得するために、ブリ類よりIL-12遺伝子を単離して組換え体を作製した。
【００１８】
本明細書において、「IL-12タンパク質」とは、魚類においてインターフェロンγ（IFNγ）や腫瘍壊死因子α（TNFα）遺伝子の発現を誘導し得るタンパク質をいうものとする（Wang等、(2014) European Journal of Immunology, 44(5):1541-51；Tsai等、(2014) Fish and Shellfish Immunology, 36(1):27-37）。上記の機能はサブユニットIL-12p35及びIL-12p40のヘテロ二量体（IL-12p70ともいう）によって得られるものであるとされている。一方、IL-12p40はモノマー又はホモ二量体の状態でIL-12p70の機能を阻害することが報告されている。
【００１９】
本発明のアジュバントとして利用可能な魚類由来のIL-12タンパク質は、特に限定するものではないが、例えばブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含む組換えタンパク質である。
【００２０】
本発明のアジュバントを適用して治療及び／又は予防することができる感染症は、例えばスズキ目、カレイ目、フグ目、ダツ目、サケ目、及びコイ目のいずれかに属する魚類の細菌感染症である。限定するものではないが、より具体的には、感染症はブリ（Yellowtail）、カンパチ（Amberjack）、ヒラマサ、マグロ、ティラピア、フグ、ヒラメ、マダイ、カワハギ、サケ、マス、アユ、コイから選択される魚類の細菌感染症である。
【００２１】
本発明のアジュバントは、治療及び／又は予防の標的となる感染症に応じて選択されるワクチン抗原と共に魚類に投与される。アジュバントの投与は、そのワクチン接種前、ワクチン接種時、又はワクチン接種後のいずれであっても良いが、水産用ワクチンにおいてはワクチン抗原との同時投与が望ましい。また、投与は、1回であっても複数回であっても良いが、作業の負担やコストを考慮すれば1回とすることが好ましい。
【００２２】
本発明のアジュバントの投与方法は、特に限定するものではないが、注射法、浸漬法、経口法が挙げられ、好ましくは注射法である。注射は、腹腔内接種、筋肉内接種が挙げられるが、好適には腹腔内投与である。
また本発明のアジュバントの投与量は、限定するものではないが、IL-12タンパク質量として1尾当たり0.1〜1μgの範囲とすることが好ましい。
【００２３】
組換えタンパク質及びその製造方法
本発明は、第二の実施形態として、上記の本発明のアジュバントとして使用できる組換えタンパク質を提供する。
本発明の組換えタンパク質は、ブリ又はカンパチ由来のIL-12p35及びIL-12p40を含み、IL-12の上記機能、すなわち魚類において細胞性免疫誘導能を有する。
【００２４】
本明細書において、「細胞性免疫誘導能」とは、限定するものではないが、魚類におけるインターフェロンγ（IFNγ）の発現誘導、凝集抗体の抑制、IL-10の発現抑制等の活性を有し、結果として魚類における感染症に対する不活化ワクチンの効果を増大させる能力をいう。
【００２５】
一態様において、上記のIL-12p35は、
(i)配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(ii)配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(iii)配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(iv)配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列に対して1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
を含む。
【００２６】
一態様において、上記のIL-12p40は、
(i)配列番号９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(ii)配列番号９、１１、１３、１５、１７又は１９に示される塩基配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(iii)配列番号１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(iv)配列番号１０、１２、１４、１６、１８又は２０に示されるアミノ酸配列に対して1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
を含む。
【００２７】
本発明の組換えタンパク質は、上記のIL-12p35及びIL-12p40が直接、又はリンカーを介して連結されたものであっても良い。リンカーは、当分野で使用されているものを適宜使用することができ、例えば5〜25個、好ましくは8〜20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えばGSリンカーを利用することができる。
【００２８】
また、一態様において、上記の本発明の組換えタンパク質は、
(i)配列番号２２、２４、２６、２８、３０又は３２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(ii)配列番号２２、２４、２６、２８、３０又は３２に示される塩基配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(iii)配列番号２３、２５、２７、２９、３１又は３３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(iv)配列番号２３、２５、２７、２９、３１又は３３に示されるアミノ酸配列に対して1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
であり得る。
【００２９】
本発明の組換えタンパク質は、当分野で通常行われているように、精製・検出等を目的として標識することができ、またタグを付すことができる。これらの標識及びタグは、組換えタンパク質のN末端又はC末端に直接、又はリンカーを介して結合させることができる。
【００３０】
上記に記載した塩基配列間の配列同一性（％）の決定は、当業者であれば容易に行うことができる。また上記の少なくとも90％の配列同一性は、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％であり得る。
【００３１】
1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、例えば、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。具体的には、上記配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、例えばDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて変異を導入することにより、変異DNAを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、例えばMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-8,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。アミノ酸の置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。
【００３２】
本発明はまた、上記の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。「ポリヌクレオチド」とは、当分野において通常用いられる場合と同じ意味を有し、DNA、RNAを含み、また天然であっても合成されたものであってもよい。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、上記の配列番号に示される配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて目的の遺伝子が存在することが予測されるcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００３４】
具体的には、魚類、特にはブリ、カンパチ等の魚類より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブやプライマーを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記cDNAの起源としては、魚類由来の各種の細胞又は組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全RNAの分離、mRNAの分離や精製、cDNAの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００３５】
また、上記のポリヌクレオチドとしては、上記配列番号に示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチド、例えばDNA断片を利用し、他の魚類等より、該DNAのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる他、前述の変異DNAの作製方法により調製することもできる。
【００３６】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターには、当分野で通常使用されるプロモーター、エンハンサー等の発現制御配列、選択マーカー遺伝子等を適宜含めることができる。発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドの細胞への導入及び発現のために好適な市販のものを利用することもできる。発現ベクターの細胞への導入は、特に限定するものではないが、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール、DEAE-デキストラン、両親媒性ペプチド、塩基性リン脂質、ポリリシン等を用いる法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等を適宜使用することができる。
【００３７】
本発明はまた、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本発明の組換えタンパク質の製造のために好適に使用可能なものであればいずれでも良く、特に限定するものではない。宿主細胞としては、特に限定するものではないが、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の動物細胞等が挙げられ、特に昆虫細胞及び哺乳動物細胞が好ましい。
【００３８】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチド又は上記の発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現したタンパク質を回収することを含む、上記の組換えタンパク質の製造方法を提供する。組換えタンパク質は、当分野で通常使用されている方法、例えば遠心分離、各種クロマトグラフィー、ウエスタンブロッティング等によって単離・精製することができる。
【００３９】
ワクチン組成物
本発明は、第三の実施形態として、上記の本発明のアジュバントを魚類の感染症に対するワクチンと共に含む、ワクチン組成物を提供する。感染症は、特に限定するものではないが、例えばノカルジア症、ミコバクテリア症、類結節症、及びエドワジエラ症である。
本発明のワクチン組成物において、ワクチンは不活化ワクチンとするのが好適である。
【００４０】
ノカルジア症に対して使用できる不活化ワクチンは、限定するものではないが、例えばノカルジア症を発症した魚類、例えばカンパチより分離したN. seriolaeをBrain Heart Infusion（BHI）寒天培地上で約10日間培養した後、集菌して滅菌PBSに懸濁し、最終濃度が0.5％となるようにホルマリンを添加して、4℃にて24時間以上静置することで取得することができる。その後、遠心分離によってホルマリンを除去し、所望の濃度、例えば109 CFU/mlとなるように滅菌PBSに再懸濁した後、本発明のアジュバントと混合して、最終濃度が10μg/mlとなるようにして魚類に投与することができる。
【００４１】
ミコバクテリア症に対して使用できる不活化ワクチンは、限定するものではないが、例えばブリ又はカンパチより分離したMycobacterium sp.を、小川培地あるいはMiddlebrook 7H11(あるいは7H9)培地にて培養後、2週間程度で生育した菌体を用い、上記と同様にして不活化処理を行ってワクチンを調製することができる。
【００４２】
エドワジエラ症に対して使用できる不活化ワクチンは、限定するものではないが、例えばヒラメ・マダイより分離したEdwardsiella tardaを、トリプトソーヤ（Trptosoya）寒天培地上にて2〜3日培養して得られた菌体を用い、上記と同様にして不活化処理を行ってワクチンを調製することができる。
【００４３】
ワクチン組成物におけるワクチンとアジュバントの比率は、特に限定するものではないが、例えば109CFUの不活化菌体に対して0.1〜1μgのIL-12を混合して使用することが好適であり得る。また、例えば、ワクチンとアジュバントとは、等タンパク量となるように混合することができる。
【００４４】
ワクチン組成物は、限定するものではないが、注射法、浸漬法、経口法、好ましくは注射法によって投与することができ、例えば腹腔内接種、筋肉内接種、特に腹腔内接種によって投与することが好適である。
【００４５】
魚類の感染症の治療及び／又は予防方法
本発明は、第四の実施形態として、魚類由来のIL-12をワクチンと組み合わせて魚類に投与することを特徴とする、魚類の感染症の治療及び／又は予防方法を提供する。
感染症は、特に限定するものではないが、ノカルジア症等の細菌感染症である。IL-12とワクチンとは、同時に、又は別個に投与することができ、同じか又は異なる投与経路で投与することができる。
感染症の治療及び／又は予防のために、10〜300gの大きさの魚類、例えばブリ又はカンパチにIL-12及びワクチンを投与する。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
実施例１  遺伝子の単離
ワクチン未接種のカンパチおよびブリ人工種苗より頭腎および脾臓を摘出して、リポポリサッカライドを含む培地中で6時間刺激した。その後、これらの組織からTotal RNAを抽出して、GeneRacer Kit (Life Technologies)を用いてcDNAを合成した。
既知の他魚種のIL-12p35およびIL-12p40の塩基配列をもとに縮重プライマーを設計して、カンパチのcDNAを鋳型としたPCRにより部分配列を得た。
その後、得られたIL-12p35、IL-12p40の部分配列をもとに特異的プライマーを設計してカンパチについてはRACE法により2種類のIL-12p35遺伝子（配列番号１及び５）と3種類のIL-12p40遺伝子（配列番号９、１３及び１７）と想定される完全長cDNAを単離した。なお、ブリIL-12遺伝子については、カンパチの配列を元に設計したプライマーを用いて、翻訳領域cDNA配列（IL-12p35遺伝子：配列番号３及び７；IL-12p40遺伝子：１１、１５及び１９）を明らかにした。
カンパチおよびブリより単離したIL-12p35およびIL-12p40遺伝子より演繹されるアミノ酸配列、他種の既知のIL-12ファミリーのそれらを用いて系統樹を作成した。その際、ヒトおよびマウスのCD8をアウトグループとした。
その結果、図１に示すように、ブリ類のIL-12p35はp35ファミリーに属するインターロイキン-6（Interleukin-6、IL-6）や顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor、G-CSF）ではなくIL-12p35のクラスターに含まれた。またブリ類のIL-12p40はp40ファミリーに属するインターロイキン-6受容体（Interleukin-6 receptor、IL-6R）や毛様体神経栄養因子受容体（Ciliary neurotrophic factor receptor、CNTFR）ではなくIL-12p40のクラスターに含まれた。これらのことから、単離された遺伝子はすべてIL-12p35あるいはIL-12p40をコードするものであることが示された。
【００４８】
実施例２  発現ベクターの構築及び組換えIL-12の作製
IL-12はIL-12p35とIL-12p40のヘテロダイマーとして産生されるが、ブリ類では2種類のIL-12p35遺伝子(IL-12p35a及びIL-12p35b)と3種類のIL-12p40 (IL-12p40a、IL-12p40b及びIL-12p40c)遺伝子が存在することから、6種類のIL-12が産生されている可能性が示された。そのため、考えられる6種類のIL-12について、昆虫細胞を用いて組換え体を作製・精製した。
カンパチのIL-12p35 (p35a（配列番号１及び２(塩基配列及びアミノ酸配列、以下同様)）、p35b（配列番号５及び６）)およびIL-12p40 (p40a（配列番号９及び１０）、p40b（配列番号１３及び１４）、p40c（配列番号１７及び１８）)の翻訳領域からシグナルペプチド配列および終止コドンを除いた領域の塩基配列をPCRにより増幅して、p40のC末端およびp35のN末端にGSリンカー (塩基配列：GGTGGCGGTGGGTCTGGTGGAGGTGAATCT（配列番号２１）)を付加し、両者を連結して、IL12p40-GSリンカー-IL12p35という遺伝子断片を作製した（図２）。作製した６種の遺伝子断片を昆虫細胞発現ベクターpMIB/V5-His B (Life Technologies)に制限酵素を利用して挿入した。
得られたプラスミドを昆虫細胞High FiveTM  (Life Technologies)に遺伝子導入して、抗生物質ブラストサイジンＳによる薬剤セレクションを行い、遺伝子導入細胞のみを増殖させた。その後、培養上清に分泌された組換えIL-12をHiTrap Q HPカラム(GE Healthcare) を用いた陰イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびHisTrap HP (GE Healthcare)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単一精製した（図３）。その結果、約65〜70kDaの6種の組換えIL-12の精製が確認された。得られた6種類の組換えIL-12の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２２〜３３に示す。
【００４９】
実施例３  アジュバント添加による生残率の向上
ノカルジア・セリオラエ（N. seriolae）不活化菌体109 CFU/mlに6種類の組換え体を等タンパク量混合したカクテルを10μg/mlとなるように添加したものをIL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチンとした。一方、IL-12カクテルを含まないN. seriolae不活化菌体109 CFU/ml懸濁液を対照N. seriolae不活化ワクチンとした。なお、これらのワクチンは溶媒として滅菌PBSを用いた。
これらワクチンおよび滅菌PBSを、ワクチン未接種のカンパチ人工種苗（魚体重約100g）の腹腔内に0.1 mlずつ接種した。なお、各試験区につき20尾を供試した。30日後、105 CFU/fishとなるようにN. seriolae生菌（024013株）を腹腔内接種する攻撃試験（感染）を行った後に飼育を継続したところ、17日後にはPBS接種区、33日後にはN. seriolae不活化ワクチン接種区が全滅したが、IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン接種区の生残率は攻撃試験から35日後の時点で88％であった（図４）。
【００５０】
実施例４  アジュバント添加による抗体産生の抑制
実施例３と同様にしてワクチン接種を行った後のカンパチの免疫応答を凝集抗体価によって解析した。その結果、ワクチン接種後に、N. seriolae不活化ワクチン接種区における凝集抗体価は大きく上昇したのに対し、IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン接種区における凝集抗体価の上昇はゆるやかであった（図５）。このことから、N. seriolae不活化ワクチン接種区では液性免疫が誘導されたのに対し、IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン接種区では液性免疫誘導が抑制されていることが示唆された。
【００５１】
実施例５  アジュバント添加によるIFN-γ発現の向上
実施例３と同様にしてワクチン接種を行い、1、2、7日後に頭腎（魚類の主要造血器官）を取り出して白血球を分離したのち、リアルタイムPCRにより細胞性免疫誘導の指標となるインターフェロンγ (IFNγ)の遺伝子発現を解析した。
その結果、図６に示すように、IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン接種区でのみIFNγ遺伝子の有意な発現が認められ、本発明のアジュバントによって細胞性免疫が誘導されたことが示された。
【００５２】
実施例６  アジュバント添加によるIL-10発現の変化
実施例５と同様にしてワクチン接種の1、2、7日後に頭腎から白血球を分離したのち、リアルタイムPCRにより液性免疫の指標となるIL-10遺伝子の発現を解析した。
その結果、図７に示すように、IL-12アジュバント添加N. seriolae不活化ワクチン接種区において、N. seriolae不活化ワクチン接種区と比較したIL-10の発現の上昇は見られず、液性免疫の誘導は抑制されていることが示唆された。
【００５３】
上記の結果から、N. seriolae不活化ワクチンにIL-12をアジュバントとして添加することで、液性免疫誘導を抑制するとともに細胞性免疫を強く誘導できることが示された。また、細胞性免疫誘導アジュバントであるIL-12をN. seriolae不活化ワクチンに添加することで、実用に耐えうるレベルの感染防御効果を示すワクチンとなることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、これまで効果的なワクチンが得られていなかったノカルジア症を含め、魚類における種々の感染症に対するワクチンアジュバントの提供が可能となった。
【００５５】
特に、本発明により、我が国の海面養殖総生産額の50％以上を占めるブリ類の養殖において最も被害が大きく、早急なワクチン開発のニーズが極めて高い疾病であるノカルジア症に対し、極めて有用なワクチンが提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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