(57)【要約】【課題】血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出する方法及び該検出に用いるキットの提供。【解決手段】血液試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出する方法であって、von Willebrand因子を固相化した支持体に試料及び標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、支持体上でvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することを含む、方法、並びに該方法に用いるキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出する方法であって、von Willebrand因子を固相化した支持体に試料及び標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、支持体上でvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することを含む、方法。
【請求項２】
支持体に固相化されたvon Willebrand因子がβメルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウムで変性処理されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液試料中のvon Willebrand因子と複合体を形成したvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出する方法であって、抗von Willebrand因子抗体を固相化した支持体に試料及び標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、支持体上で抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子とvon Willebrand因子に対する自己抗体の複合体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することを含む、方法。
【請求項４】
ウエスタンブロット法、ELISA法及びイムノクロマト法からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出のための補助的データを取得するための方法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
後天性von Willebrand症候群(AVWS)が自己免疫性von Willebrand病(AVWD)である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
von Willebrand因子を固相化した支持体及び標識した抗ヒトIgG抗体を含み、支持体上でvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することにより血液試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出するためのキット。
【請求項８】
支持体に固相化されたvon Willebrand因子がβメルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウムで変性処理されたものである、請求項７記載のキット。
【請求項９】
抗von Willebrand因子抗体を固相化した支持体及び標識した抗ヒトIgG抗体を含み、支持体上で抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子とvon Willebrand因子に対する自己抗体の複合体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することにより血液試料中のvon Willebrand因子と複合体を形成したvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出するためのキット。
【請求項１０】
ウエスタンブロット法用キット、ELISA法用キット及びイムノクロマト法用キットからなる群から選択される、請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出のための補助的データを取得するためのキットである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
後天性von Willebrand症候群(AVWS)が自己免疫性von Willebrand病(AVWD)である、請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗von Willebrand因子抗体検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝固von Willebrand因子の著明な低下が原因である後天性von Willebrand症候群(AVWS)は、早期診断、早期治療が必要な重篤な出血性疾患であり、多彩な原因によって発症することが知られている（非特許文献１及び２を参照）。そのうち、自己のvon Willebrand因子に対する抗体の出現に基づく自己免疫性von Willebrand病（AVWD)は、治療に免疫抑制療法が必要なため、迅速な抗体の検出が不可欠である。これまで、信頼できる抗von Willebrand因子自己抗体の検出法がなかったため、全ての後天性von Willebrand症候群(AVWS)の中でも本疾患の割合も不明であったので、再現性の高い検出法の確立が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Federici AB et al., Thromb Haemost 2000;84: 345-9.
【非特許文献２】Tiede A et al., Blood. 2011;117:6777-85.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出する方法及び該検出に用いるキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、自己のvon Willebrand因子に対する抗体の出現に基づく自己免疫性von Willebrand病（AVWD)を正確に検出すべく、von Willebrand因子に対する自己抗体の検出法について鋭意検討を行った。
【０００６】
本発明者らは、von Willebrand因子に対する自己抗体が遊離の抗体の状態、又はvon Willebrand因子と複合体を形成した状態で血液中に存在することに鑑み、von Willebrand因子を支持体に固相化して血中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を捕捉して測定するサンドイッチ法の原理に基づく免疫学的測定方法、及び抗von Willebrand因子抗体を支持体に固相化しvon Willebrand因子と複合体を形成した状態で血液中に存在するvon Willebrand因子に対する自己抗体を捕捉するサンドイッチ法の原理に基づく免疫学的測定法を開発し、血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を高感度でかつ特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  血液試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出する方法であって、von Willebrand因子を固相化した支持体に試料及び標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、支持体上でvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することを含む、方法。
[２]  支持体に固相化されたvon Willebrand因子がβメルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウムで変性処理されたものである、[１]の方法。
[３]  血液試料中のvon Willebrand因子と複合体を形成したvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出する方法であって、抗von Willebrand因子抗体を固相化した支持体に試料及び標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、支持体上で抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子とvon Willebrand因子に対する自己抗体の複合体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することを含む、方法。
[４]  ウエスタンブロット法、ELISA法及びイムノクロマト法からなる群から選択される、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５]  後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出のための補助的データを取得するための方法である、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６]  後天性von Willebrand症候群(AVWS)が自己免疫性von Willebrand病（AVWD)である、[５]の方法。
[７]  von Willebrand因子を固相化した支持体及び標識した抗ヒトIgG抗体を含み、支持体上でvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することにより血液試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出するためのキット。
[８]  支持体に固相化されたvon Willebrand因子がβメルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウムで変性処理されたものである、[７]のキット。
[９]  抗von Willebrand因子抗体を固相化した支持体及び標識した抗ヒトIgG抗体を含み、支持体上で抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子とvon Willebrand因子に対する自己抗体の複合体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体を形成させ、標識した抗ヒトIgG抗体からのシグナルを検出することにより血液試料中のvon Willebrand因子と複合体を形成したvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出するためのキット。
[１０]  ウエスタンブロット法用キット、ELISA法用キット及びイムノクロマト法用キットからなる群から選択される、[７]〜[９]のいずれかのキット。
[１１]  後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出のための補助的データを取得するためのキットである、[７]〜[１０]のいずれかのキット。
[１２]  後天性von Willebrand症候群(AVWS)が自己免疫性von Willebrand病（AVWD)である、[１１]のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のvon Willebrand因子を固相化した支持体又は抗von Willebrand因子抗体を固相化した支持体を用いた、サンドイッチ法の原理に基づく免疫学的測定法により、血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を高感度でかつ特異的に検出することができる。被験体の血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出することにより、自己免疫性von Willebrand病（AVWD)を含む後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出、遺伝性VWD症例における「抗von Willebrand因子同種抗体」の検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】von Willebrand因子検出に対する感度と特異度の高い抗体の選抜に用いた１次抗体のリストを示す図である。
【図１−２】von Willebrand因子検出に対する感度と特異度の高い抗体の選抜のためのウエスタンブロット法の結果を示す図である。
【図２】抗von Willebrand因子抗体の検出感度をウエスタンブロット法で検討した結果を示す図である。
【図３】ウエスタンブロット法による自己免疫性von Willebrand病（AVWD)の診断の結果を示す図である（症例１）。
【図４】ウエスタンブロット法による自己免疫性von Willebrand病（AVWD)の診断の結果を示す図である（症例２）。
【図５】抗von Willebrand因子自己抗体検出ELISA法の結果を示す図である。
【図６】抗von Willebrand因子自己抗体検出ELISA法（SDS，2-ME処理あり）の結果を示す図である。
【図７】抗von Willebrand因子自己抗体検出イムノクロマト法（抗原塗布法）の結果を示す図である。
【図８】抗von Willebrand因子自己抗体検出イムノクロマト法（抗体塗布法）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、血液中のvon Willebrand因子（von Willebrandタンパク質）に対する自己抗体を、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法により測定する方法である。ここで本発明のサンドイッチ法を測定原理とした免疫学的測定法とは、抗体である標的物質を該標的物質に結合する抗原又は抗体を用いて挟み込むように捕捉して、標的物質を測定する方法をいい、単にサンドイッチ法ともいう。サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法においては、標的物質に結合し標的物質を捕捉し得る抗体又は抗原を結合させた固相を用いる。サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法としては、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定吸着法（ELISA法）、ウエスタンブロット法等が挙げられる。
なお、本発明において、「測定」という場合、定量、半定量、検出のいずれも含む。
【００１２】
血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体は遊離の抗体として存在するか、あるいはvon Willebrand因子と複合体を形成した状態で存在する。血液中のvon Willebrand因子の量が多い場合、von Willebrand因子と自己抗体の複合体（von Willebrand因子-自己抗体の複合体）が形成されやすくなる。従って、本発明の方法においては、遊離のvon Willebrand因子に対する自己抗体又はvon Willebrand因子と自己抗体の複合体を検出する。
【００１３】
von Willebrand因子に対する遊離の自己抗体をサンドイッチ法により測定する場合、固相にvon Willebrand因子を結合させ、該固相にvon Willebrand因子に対する自己抗体を含む試料を添加する。von Willebrand因子に対する自己抗体は固相に結合したvon Willebrand因子に結合し捕捉される。次いで、自己抗体に対する抗体であって標識した抗体を添加し、自己抗体に結合させる。この結果、固相上にvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する自己抗体-自己抗体に対する抗体であって標識した抗体の複合体が形成され、標識した抗体から発するシグナルを測定することにより、試料中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を測定することができる。この方法を「抗原塗布法」という。
【００１４】
von Willebrand因子と複合体を形成した状態で存在する自己抗体をサンドイッチ法で測定する場合、固相に抗von Willebrand因子抗体を結合させ、該固相にvon Willebrand因子と自己抗体の複合体を含む試料を添加する。von Willebrand因子と自己抗体の複合体は固相に結合した抗von Willebrand因子抗体にvon Willebrand因子部分が結合し捕捉される。次いで、自己抗体に対する抗体であって標識した抗体を添加し、自己抗体に結合させる。この結果、固相上に抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子と自己抗体の複合体-自己抗体に対する抗体であって標識した抗体の複合体が形成され、標識した抗体から発するシグナルを測定することにより、試料中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を測定することができる。この方法を「抗体塗布法」という。
【００１５】
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法において、von Willebrand因子又は抗von Willebrand因子抗体を固相化する固相としては、抗体や抗原を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、マイクロタイタープレート、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。イムノクロマト法やウエスタンブロット法においてはメンブレンを、ELISA法においてはマイクロタイタープレートを用いればよい。
【００１６】
von Willebrand因子又は抗von Willebrand因子抗体の固相への結合は、吸着を利用してもよいし、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用して共有結合により結合させてもよい。
【００１７】
固相化する抗von Willebrand因子抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を用いる。抗体は公知の方法で製造することができる。また、市販の抗体を用いてもよい。
【００１８】
標識して用いるvon Willebrand因子に対する自己抗体に対する抗体としては、抗ヒトIgG抗体を用いればよい。抗von Willebrand因子抗体及びvon Willebrand因子に対する自己抗体に対する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を用いる。抗体は公知の方法で製造することができる。また、市販の抗体を用いてもよい。
【００１９】
固相化又は標識して用いる抗体は、FabやF(ab’)2のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、これらの断片も含む。これらの断片は公知の方法で調製することができる。
【００２０】
標識抗体を標識する物質としては、アルカリホスファターゼ（ALP)や西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)等の酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色ポリスチレン粒子等の有色粒子や金コロイド等のコロイド粒子などを用いることができる。抗体の標識は公知の方法で行うことができる。
【００２１】
用いる試料としては、被験体の全血、血清、血漿等が挙げられる。本発明において、血液中のvon Willebrand因子に対する自己抗体を検出するという場合、試料として全血、血清、血漿のいずれを用いる方法も含む。
【００２２】
例えば、ELISA法は以下の工程で行う。
von Willebrand因子を固相化したポリスチレン等でできたマイクロタイタープレートに試料を添加し、抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して試料中のvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を検出することができる。あるいは、抗von Willebrand因子抗体を固相化したポリスチレン等でできたマイクロタイタープレートに試料を添加し、抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗ヒトIgG抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して試料中のvon Willebrand因子と複合体を形成した自己抗体を検出することができる。また、酵素で標識した抗ヒトIgG抗体の代りに蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を用いて、抗原・抗体反応をさせた後に蛍光を測定してもよい。
【００２３】
ELISA法において、添加する試料の量は数十μL〜数百μLである。試料は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。
【００２４】
抗原抗体反応は4℃〜45℃、好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。
【００２５】
また、イムノクロマト法は以下の工程でおこなう。
von Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を測定する場合、該自己抗体を捕捉するvon Willebrand因子が固相化された検出領域を有する固相支持体（メンブレン）、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の標識物質で標識した展開移動可能な標識抗ヒトIgG抗体を有する標識物質領域、試料を添加するサンプルパッド、展開された試料液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートからなるイムノクロマト法用免疫測定デバイスを用いて行えばよい。該方法においては、von Willebrand因子を固相化した固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した抗ヒトIgG抗体とvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体の複合体をメンブレン上に展開移動させる。この結果、固相化したvon Willebrand因子-von Willebrand因子に対する遊離の自己抗体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識物質のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、遊離の自己抗体を検出することができる。該免疫測定方法は、５〜３５℃、好ましくは室温で行うことができ、試料を添加後数分で判定することができる。
【００２６】
Willebrand因子と複合体を形成した自己抗体を検出する場合、固相支持体上に抗von Willebrand因子を固相化すればよい。固相支持体上には、固相化した抗von Willebrand因子抗体-von Willebrand因子と自己抗体の複合体-標識した抗ヒトIgG抗体の複合体が形成される。
【００２７】
イムノクロマト法において、添加する試料の量は数十μL〜数百μLである。試料は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。
【００２８】
イムノクロマト法は、４℃〜45℃、好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、試料添加から判定までの時間は、数分から十数分程度である。
【００２９】
イムノクロマト法で用いる固相支持体の材料は毛管現象により試料が吸収され展開流動し得るものであれば限定されない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、又はこれらの混合物を用いることができる。固相支持体は好ましくは短冊状のストリップの形状を有する。
【００３０】
本発明のサンドイッチ法の測定原理を利用した免疫学的測定法によりvon Willebrand因子に対する遊離の自己抗体を測定するときに固相化に用いるvon Willebrand因子は、交叉反応が起こらない精製度の高いものを利用することが好ましく、特に組換えvon Willebrand因子を用いることが好ましい。また、von Willebrand因子の断片タンパク質を用いてもよい。さらに、von Willebrand因子は分子量の大きい球状の立体構造を有する巨大分子であるため、固相化するときは、βメルカプトエタノール（2-ME)あるいは2-ME及びSDS（Sodium dodecyl sulfate:ドデシル硫酸ナトリウム)で処理し、変性させタンパク質を伸展させ立体構造をとらない状態で固相化することが好ましい。
【００３１】
また、測定の際に測定系に増感剤を添加してもよい。増感剤としては、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリアミノ酸、アミノメタンスルホン酸誘導体等が挙げられる。
【００３２】
本発明の方法により、自己免疫性von Willebrand病（AVWD)疑い症例の血液において「抗von Willebrand因子自己抗体」を確実に検出することができる。本発明は、自己免疫性von Willebrand病（AVWD)を含む後天性von Willebrand症候群(AVWS)のポイント・オブ・ケア・テスト（臨床現場迅速試験）のために有用である。また、測定原理が共通であることから、遺伝性VWD症例における「抗von Willebrand因子同種抗体」の検出にも有用であると推測される。
【００３３】
すなわち、本発明は、自己免疫性von Willebrand病（AVWD)を含む後天性von Willebrand症候群(AVWS)の検出方法、あるいは自己免疫性von Willebrand病（AVWD)を含む後天性von Willebrand症候群(AVWS)の診断を行うための補助的データの取得方法を含む。さらに、本発明は、遺伝性VWD症例における「抗von Willebrand因子同種抗体」を検出する方法を含む。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
後天性von Willebrand症候群（AVWS）はvon Willebrand病（VWD）様の病態を呈する比較的稀な出血性後天性凝固異常症である。その内、抗von Willebrand因子（VWF）自己抗体が原因である自己免疫性von Willebrand病（AVWD)は、本出願人らの調査により我が国でも7例が確認されているが、抗von Willebrand因子自己抗体を検出する測定法が存在しないため、より多数の症例が見逃されていると推定される。そこで、（１）ウエスタンブロット法で抗von Willebrand因子自己抗体を検出するための抗体、抗原を選別し、（２）ELISA法により抗von Willebrand因子自己抗体測定系を構築し、（３）抗von Willebrand因子自己抗体検出イムノクロマト法を開発した。
【００３６】
１．  von Willebrand因子検出に対する感度と特異度の高い抗体の選抜
〔方法〕
von Willebrand因子抗原として血漿分画製剤コンファクトF（Astellas社）を用いて、抗体として抗von Willebrand因子モノクローナル抗体(Hoast: mouse, Species reactivity: human)10種類(図１−１の１〜１０）に対して、抗原濃度と抗体を段階的に希釈して、ウエスタンブロット法にて最適な抗原と抗体検出の組み合わせを決定した。
【００３７】
図１−２にウエスタンブロット法の結果を示す。
SANTA CRUZ社SC-73268が感度、特異度の両面で最適であり、SANTA CRUZ社SC-53466が次善であることが判明した。
【００３８】
２．  疑似抗von Willebrand因子抗体血清の作成
抗von Willebrand因子抗体を正常プール血漿に混ぜた疑似検体を作製し、抗原を血漿分画製剤コンファクトＦ（治療用ヒトvon Willebrand因子+FVIII/8複合製剤）として、抗原を系列的希釈して（１μg/mL（図２A)、200ng/mL（図２B）、100ng/mL（図２C））検出感度をウエスタンブロット法で検討した。
【００３９】
反応性をウエスタンブロット法で検討すると、SANTA CRUZ社SC-73268添加血清が最も反応性がよく、コンファクトＦ 0.002 unitに対して血清中にvon Willebrand因子抗体100 ng/mLの存在まで検出可能であった（図２）。
【００４０】
３．  ウエスタンブロット法による自己免疫性von Willebrand病（AVWD)の診断
機能的方法で抗von Willebrand因子自己抗体の存在が強く示唆された、自己免疫性von Willebarnd病（AVWD)疑い症例をウエスタンブロット法で解析した。
【００４１】
対象症例と凝固データは以下のとおりであった。
症例１
活性阻害抗体（+）
von Willebrand因子活性      ＜6％
von Willebrand因子抗原量    21％
1:1混合血漿活性阻害：有り（38.5％）
FVIII/8活性  22％
症例２
活性阻害抗体（−）（結合型抗体）
von Willebrand因子活性      25％
von Willebrand因子抗原量    45％
1:1混合血漿活性阻害：無し（3.5％）
FVIII/8活性39％
【００４２】
解析は以下の方法で行った。
抗原としては、von Willebrand因子(IHVWF-1656) 37.5〜75 ngを用いた。検体試料としては、患者血漿又は健常者（コントロール）血漿（ｘ50）を用い、４℃、overnightでウエスタンブロット膜上で抗原抗体反応を行わせた。２次抗体として抗ヒトIgG-HRP（x4000）を用い、ウエスタンブロット法にて抗体を検出した。
【００４３】
症例１の患者において、血漿50倍希釈に対してvon Willebrand因子(IHVWF-1656)抗原37.5〜75 ngの反応系で症例自己抗体（中和型＝活性阻害型）が判別できることが、ウエスタンブロット法で確認された（図３の枠内）。図３Ａは患者血漿を用いた結果を示し、図３Ｂはコントロール血漿を用いた結果を示す。
【００４４】
症例２の患者において、血漿５０倍希釈に対してvon Willebrand因子(IHvWF-1656) 抗原37.5〜75 ngの反応系で症例自己抗体(非中和型＝結合型)が判別できることが、ウエスタンブロット法で確認された(図４の枠内）。図４Ａは患者血漿を用いた結果を示し、図４Ｂはコントロール血漿を用いた結果を示す。
【００４５】
４．  抗von Willebrand因子自己抗体検出ELISA法
von Willebrand因子抗原を固相化してELISA法を構築した。von Willebrand因子抗原は処理を行わずにそのままマイクロプレートに固相化する方法とSDSやメルカプトエタノールを含む緩衝液で処理を行ったタンパクを固相化する方法の両方で評価を行った。
【００４６】
結果を図５に示す。von Willebrand因子抗原を未処理で固相化したプレートは陽性コントロールと陰性コントロールで差は見られたが、ブランクの値も高く、非特異反応が観測された(図５パターン１〜３）。
【００４７】
メルカプトエタノールで処理すると非特異反応は改善され、さらにSDSを加える事で特異性が増加した。いずれも、陽性コントロールと陰性コントロールで明確な差が得られた（図６パターン４及び５）。
【００４８】
５．  抗von Willebrand因子自己抗体検出イムノクロマト法
（１）  抗原塗布法
von Willebrand因子抗原をメンブレン側に固相化してイムノクロマト法用デバイスを試作した。前述したELISA測定系の結果から、自己抗体の検出にはvon Willebrand因子が球状の状態では無く、シェアストレスがかかり、タンパクが伸展している状態が検出に望ましいことが示唆されたので、抗原をそのまま塗布したもの（未処理）と、抗原を「ＳＤＳ＋2-メルカプトエタノール（βメルカプトエタノール）+煮沸」処理した（変性）後、固相化したイムノクロマト法を試作した。評価は抗FXIII/13-Aサブユニット自己抗体検出イムノクロマト法と同様の方法で検討を行った。10倍に希釈した検体を泳動し、その後洗浄液を泳動させ、最後に抗ヒトIgG抗体を感作した金コロイドを泳動させた。
【００４９】
結果を図７に示す。抗原変性ありの実験系でも抗原未処理の系でも、テストラインで金コロイドが凝集するような現象が見られ、明らかな差が認められなかった。一方、抗原未処理の系に増感剤を入れると陽性検体と陰性検体との差が大きくなり、抗体の検出が可能になった（直接法；検体未処理）。
【００５０】
（２）抗体塗布法
抗von Willebrand因子抗体（SANTA CRUZ社SC-73268）をメンブレン側に塗布してイムノクロマト法を試作した。抗原量を多く持つ症例の検体はそのまま（直接法）イムノクロマト法に使用し、抗原が少ない症例検体は予め健常対照の血漿と混合した後（混合法）に泳動した。評価は抗FXIII/13-Aサブユニット自己抗体検出イムノクロマト法と同様の方法で、10倍に希釈した検体を泳動し、その後洗浄液を泳動させ、最後に抗ヒトIgG抗体を感作した金コロイドを泳動させた。
【００５１】
結果を図８に示す。抗原が少ない症例検体を予め健常対照の血漿と混合した後、イムノクロマトストリップに泳動する測定系では、増感剤を入れると陽性検体と陰性検体との差が大きくなり、免疫複合体が検出可能となった（混合法；検体未処理）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の方法により、自己免疫性von Willebrand病（AVWD)疑い症例の血液において「抗von Willebrand因子自己抗体」を確実に検出することができる。
【図１−１】
2017122586.tif 000002
【図１−２】
2017122586.tif 000003
【図２】
2017122586.tif 000004
【図３】
2017122586.tif 000005
【図４】
2017122586.tif 000006
【図５】
2017122586.tif 000007
【図６】
2017122586.tif 000008
【図７】
2017122586.tif 000009
【図８】
2017122586.tif 000010