(57)【要約】【課題】保存安定性に優れ、かつ、核酸増幅反応において反応阻害が生じにくい凍結乾燥試薬、この凍結乾燥試薬を調製するために用いる混合試薬溶液、および凍結乾燥試薬の保存方法を提供する。【解決手段】本発明に係る凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を凍結乾燥した核酸増幅反応用の凍結乾燥試薬であって、糖は、凍結乾燥試薬に含まれる固形分濃度に対して７２質量％以上８６質量％以下である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を凍結乾燥した核酸増幅反応用の凍結乾燥試薬であって、
前記糖の質量は、前記凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７２質量％以上８６質量％以下である、凍結乾燥試薬。
【請求項２】
前記糖は、二糖類または三糖類である、請求項１に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項３】
疎水性の液体中で保存される、請求項１または請求項２に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項４】
前記疎水性の液体は、シリコーンオイル、ミネラルオイルおよびパラフィンの少なくとも一種を含む、請求項３に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項５】
前記糖は、トレハロースを含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項６】
前記試薬は、逆転写酵素を含む、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項７】
前記試薬は、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項８】
前記試薬は、プライマーおよびプローブの少なくとも一種を含む、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項９】
前記添加物は、前記凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７７質量％以上８４質量％以下である、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬。
【請求項１０】
核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を含む核酸増幅反応用の混合試薬溶液であって、
前記混合試薬溶液中における前記糖の濃度は、１０％（質量／容量）以上２４％（質量／容量）以下である、混合試薬溶液。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の凍結乾燥試薬を疎水性の液体中で保存する、凍結乾燥試薬の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥試薬、この凍結乾燥試薬を調製するために用いる混合試薬溶液、および凍結乾燥試薬の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野において、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）の技術が確立されている。最近、ＰＣＲ法における増幅の精度や検出感度は向上してきており、極微量の検体（ＤＮＡ等）を増幅し、検出・解析することができるようになってきた。ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。ＰＣＲの熱サイクルとしては、２段階又は３段階の温度で熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００３】
ＰＣＲに用いる核酸増幅反応試薬は、試薬に使用される酵素の保存性能が低く、その長期保存は一般的に非常に困難である。特に、逆転写酵素は、水溶液の状態では４℃で保存したとしても１日ももたず、活性が低下する。そこで、試薬に添加物を加えて凍結乾燥することで、試薬の保存安定性を向上させることが知られている（例えば、特許文献１参照）。ここでは、反応混合物に対して８〜１２％（重量／容量）の濃度のトレハロースを含むことにより、凍結乾燥した反応混合物の保存安定性を向上させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０００−５１４２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、反応混合物に対してトレハロースを８〜１２％（重量／容量）含む場合、凍結真空乾燥した反応混合物は、０℃から１０℃の温度領域では６ヵ月活性を維持するが、１５℃以上と０℃以下の温度では１ヵ月以内に完全に失活し、さらなる長期の保存安定性のニーズに対応することができない。
【０００６】
一方、試薬の凍結乾燥状態を保持して長期の保存安定性を得るために、凍結乾燥試薬が入ったバイアル瓶を冷蔵庫で保存したり、凍結乾燥試薬の水分子との接触を避けるために、凍結乾燥試薬が入ったバイアル瓶中を窒素置換したり、凍結乾燥試薬と一緒に乾燥剤を同梱することが行われているが、それでも、凍結乾燥試薬中に水分子が吸い込まれることがある。そして、一旦、凍結乾燥試薬中に吸収された水分子は外れることがないため、凍結乾燥試薬であったとしても長期間の保存安定性は得られない。
【０００７】
本発明に係る幾つかの態様は、上述の課題の少なくとも一部を解決することで、保存安定性に優れ、かつ、核酸増幅反応において反応阻害が生じにくい凍結乾燥試薬、この凍結乾燥試薬を調製するために用いる混合試薬溶液、および凍結乾燥試薬の保存方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の態様または適用例として実現することができる。
【０００９】
［適用例１］
本発明に係る凍結乾燥試薬の一態様は、
核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を凍結乾燥した核酸増幅反応用の凍結乾燥試薬であって、
前記糖は、前記凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７２質量％以上８６質量％以下であることを特徴とする。
【００１０】
上記適用例によれば、凍結乾燥試薬に含まれる添加物の濃度を調整することにより、保存安定性に優れ、かつ、核酸増幅反応において反応阻害が生じにくい凍結乾燥試薬を提供することができる。
【００１１】
［適用例２］
上記適用例において、
前記糖は、二糖類または三糖類であることができる。
【００１２】
［適用例３］
上記適用例において、
疎水性の液体中で保存されることができる。
【００１３】
［適用例４］
上記適用例において、
前記疎水性の液体は、シリコーンオイル、ミネラルオイルおよびパラフィンの少なくとも一種を含むことができる。
【００１４】
［適用例５］
上記適用例において、
前記添加物は、トレハロースを含むことができる。
【００１５】
［適用例６］
上記適用例において、
前記試薬は、逆転写酵素を含むことができる。
【００１６】
［適用例７］
上記適用例において、
前記試薬は、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含むことができる。
【００１７】
［適用例８］
上記適用例において、
前記試薬は、プライマーおよびプローブの少なくとも一種を含むことができる。
【００１８】
［適用例９］
上記適用例において、
前記添加物は、前記凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７７質量％以上８４質量％以下であることができる。
【００１９】
［適用例１０］
本発明に係る混合溶液の一態様は、
核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を含む核酸増幅反応用の混合試薬溶液であって、
前記混合試薬溶液中における前記糖の濃度は、１０％（質量／容量）以上２４％（質量
／容量）以下である、混合試薬溶液。
【００２０】
上記適用例の混合試薬溶液に含まれる添加物の濃度を調整することにより、この混合試薬溶液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥試薬は、保存安定性に優れ、かつ、核酸増幅反応において反応阻害が生じにくい。
【００２１】
［適用例１１］
本発明に係る凍結乾燥試薬の保存方法の一態様は、
上記適用例の凍結乾燥試薬を疎水性の液体中で保存することを特徴とする。
【００２２】
上記適用例によれば、含まれる添加物の濃度が調整された凍結乾燥試薬を疎水性の液体中で保存することにより、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】トレハロースの濃度依存性について、標準条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示すグラフ。
【図２】トレハロース添加による１週間後の保存安定性について示すグラフ。
【図３】トレハロース添加による１ヶ月後の保存安定性について示すグラフ。
【図４】トレハロースとオイル添加による保存安定性について示すグラフ。
【図５】トレハロース添加による保存安定性について示すグラフ。
【図６】スクロース添加による保存安定性について示すグラフ。
【図７】ラフィノース添加による保存安定性について示すグラフ。
【図８】ポリプロピレン添加による保存安定性について示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に本発明の好適な実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の一例を説明するものである。また、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含む。
【００２５】
１．凍結乾燥試薬
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、糖と、を凍結乾燥した核酸増幅反応用の凍結乾燥試薬であって、前記糖は、前記凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７２質量％以上８６質量％以下であることを特徴とする。以下、本実施形態に係る凍結乾燥試薬に含まれる各成分等について説明する。
【００２６】
１．１．反応混合物
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物を含む。反応混合物は、例えば、滅菌水、蒸留水、イオン交換水等の精製された水、又はそのような水に対して、核酸増幅反応に用いられる試薬を溶解させた水溶液を凍結乾燥したものである。
【００２７】
核酸増幅反応に用いられる試薬としては、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰが挙げられるが、核酸増幅反応用プライマーおよび／または核酸増幅反応用プローブやバッファーを含んでいることが好ましい。また、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬は、逆転写酵素を含んでいてもよい。その場合、逆転写用プライマーは、核酸増幅反応用プライマーと別に含んでいてもよく、核酸増幅反応用プライマーと共用してもよい。
【００２８】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメ
ラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００２９】
ｄＮＴＰは４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。つまり、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及びｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。
【００３０】
逆転写酵素も特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ
Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。耐熱性の酵素にも多数の市販品があるので、それを利用することが可能である。
【００３１】
ここで、反応混合物に用いられる試薬を水に溶解させて反応液とした場合に、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プローブ、プライマー、バッファーおよび塩の濃度は、用いる反応に応じて適宜設定するものとするが、例えば、ｄＮＴＰを１０〜１０００ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜２０ｍＭが用いられる。
【００３２】
１．２．糖
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、糖を含み、糖は、凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量に対して７２質量％以上８６質量％以下である。試薬に使用される酵素等は保存性が乏しいため、その活性を長期にわたって維持するために糖を所定量添加し、更に、糖と反応混合物とを含む混合試薬溶液を凍結乾燥する。
【００３３】
凍結乾燥試薬中に含まれる糖としては、核酸増幅反応に用いられる試薬を凍結乾燥した際に、凍結乾燥した酵素等が失活せず、核酸増幅反応を保持する機能、つまり、保存安定性に優れ、凍結保護剤として機能する糖であれば特に限定されるものではないが、水との親和性が高く、酵素等の他の物質と反応しないものが好ましい。例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。
【００３４】
二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させる、と推測される。
【００３５】
本実施形態において、糖の含有量は、凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量（１００質量％）に対して７２質量％以上８６質量％以下であり、好ましくは７７質量％以上８４質量％以下である。糖の含有量が７２質量％以上８６質量％以下の場合には、凍結乾燥試薬の保存安定性がよく、凍結乾燥試薬を再溶解して核酸増幅反応を行った際に反応阻害が
生じにくい。
【００３６】
特に、本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量（１００質量％）に対して７２質量％以上８６質量％以下という、従来に比べて多量の、凍結乾燥体中の大部分を占める糖を含むことにより、室温においても、長期に渡って凍結乾燥前と同程度の活性を保持することが可能となる。
【００３７】
なお、凍結乾燥試薬に含まれる糖の濃度は、凍結乾燥前の反応混合物との混合試薬溶液の状態で、１０％（質量／容量）以上２４％（質量／容量）以下となる。好ましくは、１３％（質量／容量）以上２１％（質量／容量）以下である。凍結乾燥試薬に含まれる糖の濃度が、凍結乾燥前の混合試薬溶液の状態で１０％（質量／容量）以上２４％（質量／容量）以下の場合には、添加した糖による反応阻害が生じないと同時に、保存安定性に優れ、凍結乾燥後の試薬は活性を維持しつつ長期保存が可能である。
【００３８】
１．３．凍結乾燥試薬の調製方法
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応に用いられる試薬を含む反応混合物と、所定量の糖とを含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調製することができる。例えば、核酸増幅反応用容器に、核酸増幅反応用バッファーと１反応分の反応混合物と糖を含む混合試薬溶液を入れ、低温低圧で所定時間放置することにより凍結乾燥して、反応混合物と糖とを容器の底に固着させる。この際、核酸増幅反応用バッファーの量が少ないほど、試薬が容器の底に小さく硬く固着するようになる。
【００３９】
凍結乾燥の温度は特に限定されないが、凍結乾燥させる試薬のコラプス温度よりも低く設定することが好ましく、−８０℃以上であることが好ましい。なお、微細孔の平均空隙径は、急速に凍結させた方が小さくなり、微細孔の平均空隙径が小さい方が再溶解性および保存性が良くなる。このため、凍結乾燥の前に、予備凍結として、液体窒素中に保持する等の方法により、凍結乾燥よりも低い温度の液体中に保持し、更に、用いた液体を気化させる工程を経た後に凍結乾燥することが好ましい。
【００４０】
低圧時の圧力は特に限定されず、１００ｍｍＨｇ以下であることが好ましいが、２０ｍｍＨｇ以下であることが最も好ましい。低圧に保つ時間も特に限定されず、２−２４時間であることが好ましいが、８時間程度であることが最も好ましい。
【００４１】
このようにして核酸増幅反応用容器に用いる容器中で混合試薬溶液を凍結乾燥することにより、反応混合物と糖とを容器の底に固着させる。その後に、後述するように、疎水性の液体を添加する場合には、容器を満たすように添加するのが好ましい。疎水性の液体としてワックスを使用する場合には、溶融した状態で添加する。オイルを使用する場合には、予めシリカゲルおよび／またはモレキュラーシーブなどで脱水しておくことが好ましく、オイルの添加は、水分が充分に少なく調節されたグローブボックス内などで行うことが好ましい。また、オイルを加えた後、容器を軽く遠心して、気泡を除去しておくのが好ましい。
【００４２】
１．４．物性
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、スポンジ状もしくはケーキ状で、中に気泡がたまっている微細孔（気孔）が沢山ある多孔質であることが好ましく、それによって、凍結乾燥後に再溶解して使用する際の再溶解性が向上する。微細孔の平均空隙径は、急速に凍結させた方が小さくなり、微細孔の平均空隙径が小さい方が溶解性および保存性が良くなる。孔の平均空隙径（例えば、断面の孔の径を顕微鏡下で一定回数計測し、その平均値をとったもの）が２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００４３】
１．５．凍結乾燥試薬の保存方法
上記調製方法により調製された本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応用容器に用いる容器中で糖と共に容器の底に固着する。本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、糖を多く含むことにより保存安定性が向上しており、凍結乾燥体のままでも長期の室温の保存に耐え得るものの、更に水分子との接触を排除して長期保存安定性を得るために、反応混合物と糖が底に固着した容器に疎水性の液体を添加することにより、凍結乾燥試薬を疎水性の液体中で保存することが好ましい。これにより、更に凍結乾燥試薬が水分子に暴露されにくくなり、保存安定性能を更に向上させることができる。
【００４４】
疎水性の液体としては、例えば、オイルやワックスが挙げられる。これらは単独で用いることができるが、例えば、凍結乾燥した凍結乾燥試薬にオイルを加える前に、溶解したワックスを加え、ワックスが固形化した後でオイルを加えることによって、凍結乾燥試薬がオイル中で拡散するのを防ぐことができる。
【００４５】
ここで、ワックスとは、室温で液体または固体であって、室温で固体の場合には加熱すると液体となる有機物のことであるが、本発明に使用できるワックスは、３１℃以上、好ましくは３６℃以上、より好ましくは４１℃以上、さらに好ましくは４６℃以上であって、かつ１００℃以下、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは７０℃以下の融点を有し、中性脂肪、高級脂肪酸、炭化水素などからなることが好ましい。ワックスとしては、特に限定されず、例えば、パラフィン、マイクロクリスタリンなどの石油由来のワックス、蜜蝋、ウールワックス、鯨蝋などの動物由来のワックス、カルナバ、ロジン、キャンデリラワックス、木蝋などの植物由来のワックスのほか、エルクリスタ（登録商標、出光興産）、ニッサンエレクトール（登録商標、日油株式会社）、ポエム（登録商標、理研ビタミン）、リケマール（登録商標、理研ビタミン）、ネオワックス（登録商標、ヤスハラケミカ（株））、ハイワックス（登録商標、三井化学）、シリコンワックス（登録商標、東レ・ダウコーニング）などを用いることができる。
【００４６】
また、オイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などを用いることができる。
【００４７】
中でも、疎水性の液体としては、シリコーンオイル、ミネラルオイルおよびパラフィンの少なくとも一種を含むことができる。
【００４８】
疎水性の液体は、予め脱水されていることが好ましい。疎水性の液体を予め脱水しておくことにより、更に、凍結乾燥試薬が水分子に暴露されにくくなり、保存安定性能を向上させることができる。
【００４９】
１．６．凍結乾燥試薬の再溶解および使用方法
用いた容器がＰＣＲ装置などの核酸増幅装置に使用できる場合、この核酸増幅反応用の試薬を有する核酸増幅反応用容器は、そのまま核酸増幅反応に用いることができる。具体的には、増幅させるＤＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーが凍結乾燥した試薬を浸すように添加し、核酸増幅反応を始めればよい。純水またはバッファーの量は、塩類などの最終濃度が核酸増幅反応に適するように、容易に決定することができる。なお、反応前に加熱処理や振とう処理をして、核酸増幅反応用の試薬を十分に溶解してもよい。
【００５０】
凍結乾燥した核酸増幅反応試薬が逆転写酵素を含んでいる場合は、ＲＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーが凍結乾燥した試薬を浸すように添加してもよく、その場合、逆転写反応を行うことができ、その後に核酸増幅反応を行うことができる。
【００５１】
疎水性の液体を含む場合にも上記溶解および使用方法は同じであるが、疎水性の液体としてワックスを用い、固形のワックスが凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を覆っている場合には、ワックスが溶解する温度まで加熱し、ワックスを溶解させてから、上述のように核酸を含んだ適量の純水またはバッファーを添加すればよい。この場合には、凍結乾燥試薬が疎水性の液体で保存されている場合であっても、疎水性の液体からの阻害を受けることなく反応が起こる。
【００５２】
なお、凍結乾燥試薬を再溶解させた溶液に含まれる糖の濃度は、凍結乾燥前の混合試薬溶液と同じ容量になるように上記純水またはバッファーを添加した場合、凍結乾燥前の混合試薬溶液と同じように、１０％（質量／容量）以上２４％（質量／容量）以下となる。再溶解後の溶液に含まれる糖の濃度が１０％（質量／容量）以上２４％（質量／容量）以下の場合には、核酸増幅反応において添加した糖による反応阻害が生じることがない。
【００５３】
本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、所定量の糖を含むことにより、凍結乾燥体のままで長期の室温の保存にも耐え得るものであるため、保存後に増幅させるＤＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーを添加して核酸増幅反応を行った場合には、反応阻害が生じることなく、凍結乾燥前と同程度の活性を保持している。本実施形態に係る凍結乾燥試薬は、例えば、疎水性の液体との組み合わせにより、２０℃の温度で２年近くの保存性能を実現する。
【００５４】
２．実施例
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５５】
２．１．トレハロースの濃度による反応阻害についての検討
まず、核酸増幅反応試薬中に添加したトレハロースがＩｎｆＡの増幅反応に及ぼす影響について検討した。
【００５６】
下記の核酸増幅反応試薬にトレハロースを添加した混合試薬溶液１．６μｌを、２００μｌのエッペンドルフ社製のＰＣＲチューブ（核酸増幅反応用容器）内に導入した。混合試薬溶液は、核酸増幅反応試薬にそれぞれ０〜８００ｍＭに調整したトレハロース水溶液を２μｌ添加した後に蒸留水を加えて１０μｌとなるようにして調製した。すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度は０〜２７．１％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度は０〜８７質量％である。その後、凍結乾燥のため、−８０℃のディープフリーザー内で凍結し、十分に凍結したサンプルを、すばやく、凍結乾燥装置内に設置した。続いて、室温において、１０Ｐａの減圧環境下、オーバーナイトで凍結乾燥を行った。次に、混合試薬の凍結乾燥体が入ったＰＣＲチューブ内に、インフルエンザＡのテンプレートが入った水溶液１．６μｌを滴下して凍結乾燥体を再溶解し、その溶液を用いて、下記プロトコルでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５７】
＜混合試薬溶液の組成＞
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（逆転写酵素）      ０．２μｌ
バッファー      ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ      ０．２５μｌ
２０ｍＭ  フォワードプライマー      ０．８μｌ
２０ｍＭ  リバースプライマー      ０．８μｌ
１０ｍＭ  プローブ      ０．５μｌ
０〜８００ｍＭ  トレハロース水溶液      ２μｌ
ｉｎｆＡ      ０．５μｌ
Ｄ．Ｗ．  ｕｐ  ｔｏ  １０μｌ
プライマー：
Primer F：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C
Primer R：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA
プローブ：
TaqMan probe: FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
逆転写  ５０℃  ６０秒
増幅反応
変性  １０５℃  ５秒
アニーリング／伸張  ５７℃  ２０秒
変性とアニーリング／伸張：５０サイクル
液滴サイズ:  １．６μｌ
実験装置:  昇降式
【００５９】
図１に示すように、添加したトレハロース水溶液の濃度が７００ｍＭ（凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が２３．８％（質量／容量））までの場合には、Ｃｔ値にそれほど影響が見られないが、添加したトレハロース水溶液の濃度が８００ｍＭ（凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が２７．１％（質量／容量））の場合はＣｔ値の遅れが顕著に確認され、増幅反応が阻害されることがわかった。これらのことから、混合試薬中に含まれるトレハロース濃度は、凍結乾燥前の溶液の状態では２４％（質量／容量）（凍結乾燥体中の濃度では８６質量％）以下が好ましいことがわかった。
【００６０】
２．２．トレハロースによる保存安定性の検討
次に、凍結乾燥試薬中に含まれるトレハロースの保存安定性について検討した。
【００６１】
核酸増幅反応試薬にトレハロースを添加した混合試薬溶液１．６μｌを、２００μｌのエッペンドルフ社製のＰＣＲチューブ（核酸増幅反応用容器）内に導入した。その後、凍結乾燥のため、−８０℃のディープフリーザー内で凍結し、十分に凍結したサンプルを、すばやく、凍結乾燥装置内に設置した。続いて、室温において、１０Ｐａの減圧環境下、オーバーナイトで凍結乾燥を行った。凍結乾燥直後、凍結乾燥体を３０℃の高温槽に保存し、２日後、１週間後および１ヶ月後に、凍結乾燥体が入ったＰＣＲチューブ内にインフルエンザＡのテンプレートが入った水溶液１．６μｌを滴下して凍結乾燥体を再溶解し、その溶液を用いて、２．１．と同様の条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６２】
なお、混合試薬溶液の組成は、混合試薬溶液に２μｌ添加するトレハロース水溶液として１００〜６００ｍｇ／ｍｌの濃度のトレハロース水溶液を用いた以外は上記２．１．と同様である。すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度は１．９〜１３．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度は３２〜７８質量％である。
【００６３】
凍結乾燥直後と２日後では、いずれの濃度も同様に増幅反応が起こった。これに対し、図２に示すように、１週間保存後の場合は、添加したトレハロース水溶液の濃度が１００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が１．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が３２質量％では、増幅反応が見られず、保存安定効果が得られなかった。また、添加したトレハロース水溶液の濃度が２００、３００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が３．９〜６．１％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が５０〜６１質量％では、Ｃｔ値に遅れが確認され、保存安定効果が
低かった。これに対し、添加したトレハロース水溶液の濃度が４００〜６００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が８．５〜１３．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が６８〜７８質量％では、高い保存安定効果が得られ、反応阻害も確認されなかった。
【００６４】
次に、図３に示すように、１ヶ月保存後の場合は、添加したトレハロースの濃度が１００〜３００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が１．９〜６．１％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が３２〜６１質量％では、増幅反応が見られず、保存安定効果が得られなかった。これに対し、添加したトレハロース水溶液の濃度が４００〜６００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が８．５〜１３．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が６８〜７８質量％では、保存安定効果が得られた。特に、添加したトレハロース水溶液の濃度が５００〜６００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が８．５〜１３．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が６８〜７８質量％では、では、反応阻害も確認されず、高い保存安定効果が得られた。
【００６５】
以上により、添加したトレハロース水溶液の濃度が４００〜６００ｍｇ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が１１．１〜１３．９％（質量／容量）であり、凍結乾燥後の凍結乾燥試薬中のトレハロース濃度が７３．８〜７８質量％では、高い保存安定効果が得られた。
【００６６】
２．３．トレハロースおよびオイル添加による保存安定性の検討
次に、トレハロースを添加した凍結乾燥試薬をオイル中に保存した場合の保存安定性について検討した。
【００６７】
核酸増幅反応試薬にトレハロースを添加した混合試薬溶液１．６μｌを、２００μｌのエッペンドルフ社製のＰＣＲチューブ（核酸増幅反応用容器）内に導入した。次に、凍結乾燥のため、−８０℃のディープフリーザー内で凍結し、十分に凍結したサンプルを、すばやく、凍結乾燥装置内に設置した。続いて、室温において、１０Ｐａの減圧環境下、オーバーナイトで凍結乾燥を行った。その後、凍結乾燥体が入ったチューブ内に粘度が２ＣＳのシリコーンオイル（信越化学製）５０μｌを滴下した。得られた凍結乾燥体を室温に保存し、８ヵ月後、１年後および１年８ヵ月後に、凍結乾燥体が入ったＰＣＲチューブ内にインフルエンザＡのテンプレートが入った水溶液１．６μｌを滴下して凍結乾燥体を再溶解し、その溶液を用いて、２．１．と同様の条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。比較として、凍結乾燥していない溶液１．６μｌについても同様の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６８】
なお、混合試薬溶液の組成は、添加するトレハロース水溶液の濃度が１．６ｍｍｏｌ／ｍｌ、すなわち、凍結乾燥前の混合試薬溶液中のトレハロースの濃度が１８．８％（質量／容量）であり、凍結乾燥体中のトレハロース濃度が８３質量％となるように調製した以外は上記２．１．と同様である。
【００６９】
ｎ＝２で実施した実験結果を図４に示す。図４より、１年８ヵ月後であっても凍結乾燥していない溶液と同様に増幅反応がみられ、トレハロースの添加とオイルとを組み合わせることにより、２０℃の温度で約２年間の保存性能を有する可能性が示唆された。
【００７０】
２．４．トレハロース以外の糖による保存安定性の検討
最後に、トレハロース以外の糖による保存安定性について検討した。
【００７１】
核酸増幅反応試薬にトレハロースを添加した混合試薬溶液１．６μｌを、２００μｌのエッペンドルフ社製のＰＣＲチューブ（核酸増幅反応用容器）内に導入した。次に、凍結乾燥のため、−８０℃のディープフリーザー内で凍結し、十分に凍結したサンプルを、すばやく、凍結乾燥装置内に設置した。続いて、室温において、１０Ｐａの減圧環境下、オーバーナイトで凍結乾燥を行った。その後、凍結乾燥体が入ったチューブ内に粘度が２ＣＳのシリコーンオイル（信越化学製）５０μｌを滴下した。凍結乾燥直後、凍結乾燥体を３０℃の高温槽に保存し、１週間後および３週間後に、凍結乾燥体が入ったＰＣＲチューブ内にインフルエンザＡのテンプレートが入った水溶液１．６μｌを滴下して凍結乾燥体を再溶解し、その溶液を用いて、２．１．と同様の条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７２】
なお、混合試薬溶液の組成は、混合試薬溶液に添加する添加物として、トレハロース、スクロース、ラフィノースおよびポリプロピレンを用い、それぞれ混合試薬溶液中の濃度が１０％（質量／容量）となるように調製した以外は上記２．１．と同様である。
【００７３】
図５〜８に示すように、凍結乾燥直後では、いずれの例においても同様に増幅反応がみられた。これに対し、図６、７に示すように、トレハロースの代わりにスクロース、ラフィノースを添加した例では、１週間後にＣｔ値の遅れが見られたが、３週間後においても増幅反応が確認された。このように、トレハロースと同じ濃度で実験した場合に、トレハロース程ではないが、スクロースとラフィノースも保存安定効果が得られた。このように、非還元糖であれば、二糖類に限らず三糖類でも添加物として使用可能であることがわかった。
【００７４】
なお、図８に示すように、凍結乾燥物の賦形剤として用いられるポリプロピレンを添加した例では、保存１週間後においても試薬の保存性が損なわれていることが顕著に確認されており、他の例のような保存安定効果が見られなかった。
【００７５】
本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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