(57)【要約】【課題】  簡便にニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）の切断を検出できる、ＮＲＧ１の切断検出用プローブを提供する。【解決手段】  本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブは、ＮＲＧ１、第１の標識物質、および第２の標識物質を含み、前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の標識物質、および第２の標識物質を含み、
前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、
前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、
前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、
前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質であることを特徴とする、ＮＲＧ１の切断検出用プローブ。
【請求項２】
前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質であり、
前記異なるシグナルを発する標識物質が、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質である、請求項１記載の検出用プローブ。
【請求項３】
前記Ｎ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナル配列領域、アイソフォーム特異的領域、およびＥＧＦ様領域を、この順序で含み、
前記第１の標識物質が、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記シグナル配列領域のＮ末端に付加される、請求項１または２記載の検出用プローブ。
【請求項４】
前記Ｃ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、膜貫通領域および細胞質領域を、この順序で含み、
前記第２の標識物質が、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記細胞質領域のＣ末端に付加される、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
【請求項５】
前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｈｕ）のタンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
（Ｎ１Ｈｕ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項６】
前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｚｅ）のタンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
（Ｎ１Ｚｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項７】
前記検出用プローブが、下記（Ｐ１Ｚｅ）のタンパク質である、請求項１から４および６のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
（Ｐ１Ｚｅ）配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項８】
ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の蛍光タンパク質、および第２の蛍光タンパク質を含み、
前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、
前記第１の蛍光タンパク質と前記第２の蛍光タンパク質とが、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質であり、
前記第１の蛍光タンパク質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、
前記第２の蛍光タンパク質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、ＮＲＧ１の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記Ｎ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナル配列領域、アイソフォーム特異的領域、およびＥＧＦ様領域を、この順序で含み、
前記第１の標識物質が、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記シグナル配列領域のＮ末端に付加される、請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記Ｃ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、膜貫通領域および細胞質領域を、この順序で含み、
前記第２の標識物質が、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記細胞質領域のＣ末端に付加される、請求項８または９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｈｕ）のタンパク質である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（Ｎ１Ｈｕ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１２】
前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｚｅ）のタンパク質である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（Ｎ１Ｚｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、下記（Ｐ１Ｚｅ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項８から１０および１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（Ｐ１Ｚｅ）配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、下記（ｐ１Ｚｅ）のポリヌクレオチドである、請求項８から１０、１２および１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（ｐ１Ｚｅ）配列番号６、７、８、および１８のいずれか塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現ベクター。
【請求項１６】
請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＮＲＧ１の切断検出用形質転換体。
【請求項１７】
前記形質転換体が、動物または細胞である、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記動物が、ゼブラフィッシュである、請求項１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出することにより、前記ＮＲＧ１の切断を検出する検出工程を含むことを特徴とする、ＮＲＧ１の切断検出方法。
【請求項２０】
前記発現系における前記検出用プローブの第１の標識物質由来のシグナルおよび第２の標識物質由来のシグナルに基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項１９記載の検出方法。
【請求項２１】
前記第１の標識物質由来のシグナル量と、前記第２の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項２０記載の検出方法。
【請求項２２】
前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項２３】
被検物質から、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）切断酵素による、請求項１から７のいずれか一項に記載のＮＲＧ１の切断検出用プローブの切断を抑制する被検物質を、ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含むことを特徴とする、ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系に、前記被検物質を共存させて、前記ＮＲＧ１切断酵素により前記検出用プローブを切断する切断工程、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出する検出工程、および
前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも前記検出用プローブの切断量が少ない被検物質を、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含む、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
前記発現系における前記検出用プローブの第１の標識物質由来のシグナルおよび第２の標識物質由来のシグナルに基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項２４記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記第１の標識物質由来のシグナル量と、前記第２の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項２５記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＲＧ１の切断検出用プローブ、ＮＲＧ１の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド、ＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現ベクター、ＮＲＧ１の切断検出用形質転換体、ＮＲＧ１の切断検出方法、およびＮＲＧ１切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューレグリン１（Neuregulin 1、ＮＲＧ１）は心臓、脳等の形成や再生、乳腺の発達等に関与していることが知られており、また、ＢＡＣＥ１（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1）等のプロテアーゼにより切断されることで活性化する。ＮＲＧ１の切断制御機構は、アルツハイマー病の原因タンパク質であると考えられているアミロイド前駆タンパク質の切断制御機構と類似していることが知られているが、その切断制御機構は未だ解明されていない部分が多い。このため、ＮＲＧ１の切断制御機構の解明が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＮＲＧ１の切断の可視化方法としては、ＧＦＰタンパク質をＮ末端に付加したＧＦＰ付加プローブを用い、このＧＦＰ付加プローブの挙動を観察する方法が考えられた。しかしながら、前記ＧＦＰ付加プローブを用いた場合、未切断のＧＦＰ付加プローブと、切断されたＧＦＰ付加プローブとを、そのブラウン運動の違いに基づき検出する必要があり、特殊な方法により検出する必要がある。また、前記ＧＦＰ付加プローブは、生体内での検出に使用できないという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明は、簡便にＮＲＧ１の切断を検出できる、ＮＲＧ１の切断検出用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブ（以下、「プローブ」ともいう。）は、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の標識物質、および第２の標識物質を含み、
前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、
前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、
前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、
前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質であることを特徴とする。
【０００６】
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド（以下、「プローブ遺伝子」ともいう。）は、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の蛍光タンパク質、および第２の蛍光タンパク質を含み、
前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、
前記第１の蛍光タンパク質と前記第２の蛍光タンパク質とが、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質であり、
前記第１の蛍光タンパク質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、
前記第２の蛍光タンパク質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする。
【０００７】
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現ベクター（以下、「発現ベクター」ともいう。）は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明のＮＲＧ１の切断検出用形質転換体（以下、「形質転換体」ともいう。）は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のＮＲＧ１の切断検出方法（以下、「検出方法」ともいう。）は、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出することにより、前記ＮＲＧ１の切断を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明のＮＲＧ１切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法は、被検物質から、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）切断酵素による、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの切断を抑制する被検物質を、ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡便にＮＲＧ１の切断を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例１におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図３】図３は、実施例１におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例１における蛍光顕微鏡による観察の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例１における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２におけるＦ１のゼブラフィッシュの神経細胞を顕微鏡により観察した結果を示す写真である。
【図７】図７は、実施例２における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例３における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例４におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、実施例５におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１１】図１１は、実施例５における顕微鏡による観察の結果を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例５における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例５における顕微鏡による観察の結果を示す写真である。
【図１４】図１４は、実施例５における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検出用プローブは、例えば、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質であり、
前記異なるシグナルを発する標識物質が、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質である。
【００１４】
本発明の検出用プローブおよびプローブ遺伝子は、例えば、前記Ｎ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナル配列領域、アイソフォーム特異的領域、およびＥＧＦ様領域を、この順序で含み、
前記第１の標識物質が、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記シグナル配列領域のＮ末端に付加される。
【００１５】
本発明の検出用プローブおよびプローブ遺伝子は、例えば、前記Ｃ末端側領域が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、膜貫通領域および細胞質領域を、この順序で含み、
前記第２の標識物質が、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記細胞質領域のＣ末端に付加される。
【００１６】
本発明の検出用プローブおよびプローブ遺伝子は、例えば、前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｈｕ）のタンパク質である。
（Ｎ１Ｈｕ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
【００１７】
本発明の検出用プローブおよびプローブ遺伝子は、例えば、前記ＮＲＧ１が、下記（Ｎ１Ｚｅ）のタンパク質である。
（Ｎ１Ｚｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
【００１８】
本発明の検出用プローブは、例えば、前記検出用プローブが、下記（Ｐ１Ｚｅ）のタンパク質である。
（Ｐ１Ｚｅ）配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
【００１９】
本発明のプローブ遺伝子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、下記（Ｐ１Ｚｅ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
（Ｐ１Ｚｅ）配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
【００２０】
本発明のプローブ遺伝子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、下記（ｐ１Ｚｅ）のポリヌクレオチドである。
（ｐ１Ｚｅ）配列番号６、７、８、および１８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００２１】
本発明の形質転換体は、例えば、前記形質転換体が、動物または細胞である。前記動物が、例えば、ゼブラフィッシュである。
【００２２】
本発明の検出方法およびスクリーニング方法は、例えば、前記発現系における前記検出用プローブの第１の標識物質由来のシグナルおよび第２の標識物質由来のシグナルに基づき、前記検出用プローブの切断を検出する。
【００２３】
本発明の検出方法およびスクリーニング方法は、例えば、前記第１の標識物質由来のシグナル量と、前記第２の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、前記検出用プローブの切断を検出する。
【００２４】
本発明の検出方法およびスクリーニング方法は、例えば、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質である。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系に、前記被検物質を共存させて、前記ＮＲＧ１切断酵素により前記検出用プローブを切断する切断工程、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出する検出工程、および
前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも前記検出用プローブの切断量が少ない被検物質を、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含む。
【００２６】
＜ＮＲＧ１の切断検出用プローブ＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブは、前述のように、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の標識物質、および第２の標識物質を含み、前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質であることを特徴とする。
【００２７】
本発明のプローブは、前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記Ｎ末端側領域、前記切断領域、および前記Ｃ末端側領域を、この順序で含み、前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質であることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
【００２８】
本発明のプローブは、前記Ｎ末端側領域およびＣ末端側領域が、異なるシグナルを発する標識物質を含むことにより、前記プローブが未切断の場合、例えば、前記プローブを発現する細胞上で、両標識物質由来のシグナルの位置が極近傍となるため、例えば、蛍光顕微鏡等で観察した際に、前記両標識物質由来のシグナルが重なる。他方、前記プローブが切断された場合、例えば、前記プローブを発現する細胞上で、前記Ｃ末端側領域の前記第２の標識物質由来のシグナルが観察され、前記Ｎ末端側領域の前記第１の標識物質由来のシグナルが観察されなくなる。このため、本発明のプローブによれば、ＮＲＧ１が切断されたか否かを簡便に検出できる。また、本発明のプローブは、メカニズムは不明であるが、動物等の生体においても、例えば、前記ＮＲＧ１と同様の局在を示す。このため、本発明のプローブによれば、例えば、前記生体においても、前記ＮＲＧ１の切断を検出できる。
【００２９】
本発明において、前記ＮＲＧ１の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、メダカ等の魚類、トリ等の鳥類、カエル等の両生類があげられる。
【００３０】
前記ＮＲＧ１のアイソフォームは、特に制限されず、例えば、１型、２型、３型、４型、５型、６型のアイソフォームがあげられる。また、前記ＮＲＧ１は、例えば、前記ＥＧＦ様領域のアミノ酸配列により、α型と、β型とに分類できる。本発明において、前記ＮＲＧ１が前記ＥＧＦ様領域を含む場合、前記ＮＲＧ１は、例えば、α型でもよいし、β型でもよい。また、以下の説明において、前記アイソフォームが１型且つα型の場合、α１型、前記アイソフォームが１型且つβ型の場合、β１型等のように、アイソフォームの名称を略称で記載することもある。
【００３１】
前記ＮＲＧ１は、前述のように、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記Ｎ末端側領域、前記切断領域、および前記Ｃ末端側領域を、この順序で含む。
【００３２】
前記Ｎ末端側領域は、前記ＮＲＧ１のＮ末端から前記切断領域までの領域である。前記Ｎ末端領域は、例えば、前記シグナルペプチドであるシグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的なアミノ酸配列であるアイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ（epidermal growth factor）様ドメインであるＥＧＦ様領域等の機能的領域を含んでもよい。前記Ｎ末端側領域における各機能的領域は、例えば、当業者であれば、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列に基づき、適宜決定できる。前記Ｎ末端側領域における各機能的領域の順序は、特に制限されず、例えば、前記アイソフォームに応じて適宜決定できる。前記ＮＲＧ１がβ１型のアイソフォームの場合、前記Ｎ末端側領域は、例えば、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、および前記ＥＧＦ様領域をこの順序で含む。
【００３３】
前記切断領域は、前記ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される領域である。前記ＮＲＧ１切断酵素は、特に制限されず、例えば、ＢＡＣＥ（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme）、ＡＤＡＭ１０（A Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10）、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１９等のメタロプロテアーゼ等があげられる。前記ＮＲＧ１切断酵素がＢＡＣＥ、ＡＤＡＭ１０、およびＡＤＡＭ１７（以下、「ＢＡＣＥ等」ともいう。）の場合、前記切断領域のアミノ酸配列は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列があげられる。前記ＮＲＧ１切断酵素の由来は、特に制限されず、例えば、前記ＮＲＧ１の説明を援用できる。前記ＮＲＧ１切断酵素の由来と、前記ＮＲＧ１の由来とは、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。
【００３４】
切断領域のアミノ酸配列（配列番号９）
MASFYKHLGIEFME
【００３５】
前記Ｃ末端側領域は、前記ＮＲＧ１の前記切断領域からＣ末端からまでの領域である。前記Ｃ末端領域は、例えば、細胞膜を貫通するアミノ酸配列である膜貫通領域、およびプロテインカイネースＣによりリン酸化されるＰＫＣリン酸化領域等を含む細胞質領域等の機能的領域を含んでもよい。前記Ｃ末端側領域における各機能的領域は、例えば、当業者であれば、前記Ｃ末端側領域のアミノ酸配列に基づき、適宜決定できる。前記Ｃ末端側領域における各機能的領域の順序は、特に制限されず、例えば、前記アイソフォームに応じて適宜決定できる。前記ＮＲＧ１がβ１型のアイソフォームの場合、前記Ｃ末端側領域は、例えば、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記膜貫通領域および前記細胞質領域をこの順序で含む。
【００３６】
前記ＮＲＧ１は、例えば、前記ＮＲＧ１の変異タンパク質でもよい。前記変異タンパク質は、例えば、前記ＮＲＧ１のアミノ酸配列において、１もしくは数個、１〜１２０個、１〜９０個、１〜６０個、１〜３０個、１〜２４個、１〜１８個、１〜１２個、１〜６個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質であってもよいし、前記ＮＲＧ１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質であってもよい。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。また、前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。具体例として、前記変異タンパク質は、例えば、前記Ｎ末端側領域における前記シグナル配列領域等の一部の機能的領域またはその部分が欠失したＮＲＧ１、前記Ｃ末端側領域における一部の機能的領域またはその部分が欠失したＮＲＧ１等があげられる。
【００３７】
前記ＮＲＧ１がヒト由来ＮＲＧ１の場合、前記ＮＲＧ１は、例えば、下記（Ｎ１Ｈｕ）〜（Ｎ３Ｈｕ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｎ１Ｈｕ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｎ２Ｈｕ）  前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質
（Ｎ３Ｈｕ）  前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質
【００３８】
前記（Ｎ１Ｈｕ）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号１のアミノ酸配列において、下線で示したアミノ酸配列が、前記ＢＡＣＥ等が前記ＮＲＧ１切断酵素である場合の前記切断領域のアミノ酸配列であり、下線で示したアミノ酸配列より上流のアミノ酸配列が、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列であり、下線で示したアミノ酸配列より下流のアミノ酸配列が、前記Ｃ末端側領域のアミノ酸配列である。また、配列番号１のアミノ酸配列は、β型の１型のアイソフォームに対応する。
【００３９】
ヒトＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム（配列番号１）
MGKGRAGRVGTTALPPRLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNEIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSSTSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFMEAEELYQKRVLTITGICIALLVVGIMCVVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRSERNNMMNIANGPHHPNPPPENVQLVNQYVSKNVISSEHIVEREAETSFSTSHYTSTAHHSTTVTQTPSHSWSNGHTESILSESHSVIVMSSVENSRHSSPTGGPRGRLNGTGGPRECNSFLRHARETPDSYRDSPHSERYVSAMTTPARMSPVDFHTPSSPKSPPSEMSPPVSSMTVSMPSMAVSPFMEEERPLLLVTPPRLREKKFDHHPQQFSSFHHNPAHDSNSLPASPLRIVEDEEYETTQEYEPAQEPVKKLANSRRAKRTKPNGHIANRLEVDSNTSSQSSNSESETEDERVGEDTPFLGIQNPLAASLEATPAFRLADSRTNPAGRFSTQEEIQARLSSVIANQDPIAV
【００４０】
前記（Ｎ２Ｈｕ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｎ２Ｈｕ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断される範囲であればよい。前記（Ｎ２Ｈｕ）の「１もしくは数個」は、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列において、例えば、１〜１２４個、１〜９３個、１〜６２個、１〜３１個、１〜２４個、１〜１８個、１〜１２個、１〜６個、１〜３個、１個または２個である。前記（Ｎ２Ｈｕ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｎ２Ｈｕ）は、例えば、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列において、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００４１】
前記（Ｎ３Ｈｕ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｎ３Ｈｕ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断される範囲であればよい。前記（Ｎ３Ｈｕ）の「同一性」は、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（Ｎ３Ｈｕ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｎ３Ｈｕ）は、例えば、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列において、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、前記（Ｎ１Ｈｕ）のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００４２】
前記ＮＲＧ１がゼブラフィッシュ由来ＮＲＧ１の場合、前記ＮＲＧ１は、例えば、下記（Ｎ１Ｚｅ）〜（Ｎ３Ｚｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｎ１Ｚｅ）  配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｎ２Ｚｅ）  前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質
（Ｎ３Ｚｅ）  前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質
【００４３】
前記（Ｎ１Ｚｅ）における配列番号２のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号２のアミノ酸配列において、下線で示したアミノ酸配列が、前記ＢＡＣＥ等が前記ＮＲＧ１切断酵素である場合の前記切断領域のアミノ酸配列であり、下線で示したアミノ酸配列より上流のアミノ酸配列が、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列であり、下線で示したアミノ酸配列より下流のアミノ酸配列が、前記Ｃ末端側領域のアミノ酸配列である。また、配列番号２のアミノ酸配列は、β型の１型のアイソフォームに対応する。
【００４４】
ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム（配列番号２）
MAEVKAGKEGKSGDKKKDKESVRSNKPDNSPQAEPKLKNLRSVTVEDGKKTVLKCEILAGNPAPNVKWYKNGKELTGKNKPKSIKIKKKKQGKISELLIRKSTEGDAGLYTCEAVNSLGKTNTTANLFIINTATSTTPSAKTSSHVTPCNESEKEYCVNHGKCFTLEVTPGNIRRLCRCPNEFTGDRCQHYVMASFYKHLGIEFMEAEELYQKRVLTITGICIALLVVGIMCVVAYCKTKKQRKKLHDRLRQSLRERNAAAKGPQHPHPPPENLQLVNHYMPTNPVPAHMTDKEAETSLSTNEFTSPTHPSTAITHSSSQCWSNGKAESVVSDSHAVLMKPSAENCQHGTPSHRGRLNATGGVHQLNDYLKNSREAQGSNRDSPYSERYVSAMTTPTRLSPVGLLSPVTPSSPPSEMSAPLSSLATSVPSMLTSPSGEEERPLLFRTPPILRDKSASTQGRKSGHNLRNSAHYNHGLDIPSPPPSPLHIEEEIDCLEQYKSTSVPSSAPHSPSAARTQPSGQAAPEQAVSGSNSESSSSESETEDERVGEDTPFLGLQNPLAAGSLVLDGLEGSRTNPALHLSPQHELQNRLTAVMANQDPIAV
【００４５】
前記（Ｎ２Ｚｅ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｎ２Ｚｅ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断される範囲であればよい。前記（Ｎ２Ｚｅ）の「１もしくは数個」は、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、例えば、１〜１２０個、１〜９０個、１〜６０個、１〜３０個、１〜２４個、１〜１８個、１〜１２個、１〜６個、１〜３個、１個または２個である。前記（Ｎ２Ｚｅ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｎ２Ｚｅ）は、例えば、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００４６】
前記（Ｎ３Ｚｅ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｎ３Ｚｅ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断される範囲であればよい。前記（Ｎ３Ｚｅ）の「同一性」は、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（Ｎ３Ｚｅ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｎ３Ｚｅ）は、例えば、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、前記（Ｎ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断されるタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００４７】
前記第１の標識物質および前記第２の標識物質は、特に制限されず、例えば、それぞれ、蛍光標識物質、放射性標識物質、酵素、ペプチドタグ等があげられる。前記蛍光標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質、蛍光タンパク質等があげられ、例えば、後述する本発明のプローブ遺伝子を用いて簡便に製造できることから、好ましくは、蛍光タンパク質である。このため、本発明のプローブは、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質であることが好ましい。前記蛍光タンパク質は、特に制限されず、公知のタンパク質が使用でき、具体例として、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ等の緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ等の赤色蛍光タンパク質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ等の酵素があげられる。
【００４８】
前記第１の標識物質と前記第２の標識物質とは、異なるシグナルを発する標識物質である。前記異なるシグナルは、例えば、区別可能なシグナルであり、具体例として、異なる種類のシグナルでもよいし、同じ種類であり、且つ異なる特性のシグナルでもよい。前者は、例えば、電気シグナルと光学シグナルとの組合せ等があげられる。後者は、例えば、光学シグナルの場合、波長特性の異なるシグナルがあげられる。具体例として、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、前記第１の蛍光タンパク質および前記第２の蛍光タンパク質である場合、前記異なるシグナルを発する標識物質は、例えば、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質、すなわち区別可能な波長特性を有する蛍光タンパク質であることが好ましい。
【００４９】
本発明において、前記第１の標識物質は、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加されていればよい。前記挿入は、例えば、前記Ｎ末端側領域の２つのアミノ酸の間において、前記２つのアミノ酸が、前記第１の標識物質を介して間接的に連結していることを意味する。前記付加は、例えば、前記第１の標識物質が、前記Ｎ末端領域のアミノ酸の末端に連結していることを意味する。前記Ｎ末端側領域において、前記第１の標識物質が挿入また付加される位置は、特に制限されず、任意の位置とできる。前記Ｎ末端側領域がＮ末端からＣ末端にかけて、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、および前記ＥＧＦ様領域を、この順序で含む場合、前記第１の標識物質が、例えば、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または前記シグナル配列領域のＮ末端に付加される。この場合、前記第１の標識物質が、例えば、前記ＮＲＧ１と同様の局在を示すことから、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記ＥＧＦ様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間に挿入される、または前記シグナル配列領域のＮ末端に付加されることが好ましい。具体例として、前記第１の標識物質が前記第１の蛍光タンパク質の場合、前記第１の標識物質は、例えば、前記Ｎ末端領域のＮ末端に付加されてもよいし、前記シグナル配列領域と前記アイソフォーム特異的領域との間に挿入されてもよいし、前記アイソフォーム特異的領域と前記ＥＧＦ様領域との間に挿入されてもよい。
【００５０】
本発明において、前記第２の標識物質は、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されていればよい。前記挿入は、例えば、前記Ｃ末端側領域の２つのアミノ酸の間において、前記２つのアミノ酸が、前記第２の標識物質を介して間接的に連結していることを意味する。前記付加は、例えば、前記第２の標識物質が、前記Ｃ末端領域のアミノ酸の末端に連結していることを意味する。前記Ｃ末端側領域において、前記第２の標識物質が挿入また付加される位置は、特に制限されず、任意の位置とできる。前記Ｃ末端側領域がＮ末端からＣ末端にかけて、前記膜貫通領域および前記細胞質領域を、この順序で含む場合、前記第２の標識物質が、例えば、前記切断領域、前記膜貫通領域および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または前記細胞質領域のＣ末端に付加される。この場合、前記第２の標識物質が、例えば、前記ＮＲＧ１と同様の局在を示すことから、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間に挿入される、または前記細胞質領域のＣ末端に付加されることが好ましい。具体例として、前記第２の標識物質が前記第２の蛍光タンパク質の場合、前記第２の標識物質は、例えば、前記Ｃ末端側領域のＣ末端に付加される。
【００５１】
本発明のプローブは、例えば、その他のアミノ酸配列を含んでもよい。前記その他のアミノ酸配列は、例えば、リンカーペプチド等があげられる。
【００５２】
前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、前記第１の蛍光タンパク質および前記第２の蛍光タンパク質の場合、本発明のプローブは、例えば、下記（Ｐ１Ｚｅ）〜（Ｐ３Ｚｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｐ１Ｚｅ）  配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２Ｚｅ）  前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質
（Ｐ３Ｚｅ）  前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質
【００５３】
前記（Ｐ１Ｚｅ）における配列番号３〜５および１７のアミノ酸配列は、以下の通りである。以下、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質を、第１のプローブ−１ともいい、配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質を、第１のプローブ−２ともいい、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質を、第２のプローブともいい、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質を、第３のプローブともいう。前記（Ｐ１Ｚｅ）は、前記ゼブラフィッシュ由来ＮＲＧ１のβ１型のアイソフォームを含むプローブである。前記配列番号３〜５および１７のアミノ酸配列において、下線で示したアミノ酸配列が、前記ＢＡＣＥ等が前記ＮＲＧ１切断酵素である場合の前記切断領域のアミノ酸配列であり、下線で示したアミノ酸配列より上流のアミノ酸配列が、前記Ｎ末端側領域および前記第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列であり、前記Ｎ末端側領域および第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において、四角で囲ったアミノ酸配列が、前記第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列であり、四角で囲っていない領域が、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列である。また、この場合、下線で示したアミノ酸配列より下流のアミノ酸配列が、前記Ｃ末端側領域および前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列であり、前記Ｃ末端側領域および前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において、四角で囲ったアミノ酸配列が、前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列であり、四角で囲っていない領域が、前記Ｃ末端側領域のアミノ酸配列である。前記第２および第３のプローブにおいて、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸における括弧で囲んだ下線のアミノ酸配列は、リンカーペプチドのアミノ酸配列である。
【００５４】
第１のプローブ−１（配列番号３）
2017165688.tif 000003
【００５５】
第１のプローブ−２（配列番号１７）
2017165688.tif 000004
【００５６】
第２のプローブ（配列番号４）
2017165688.tif 000005
【００５７】
第３のプローブ（配列番号５）
2017165688.tif 000006
【００５８】
前記（Ｐ２Ｚｅ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐ２Ｚｅ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有する範囲であればよい。前記（Ｐ２Ｚｅ）の「１もしくは数個」は、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２１８個、１〜１６３個、１〜１０９個、１〜５４個、１〜４３個、１〜３２個、１〜２１個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。前記（Ｐ２Ｚｅ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｐ２Ｚｅ）は、例えば、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００５９】
前記（Ｐ３Ｚｅ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｐ３Ｚｅ）が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有する範囲であればよい。前記（Ｐ３Ｚｅ）の「同一性」は、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（Ｐ３Ｚｅ）において、例えば、前記切断領域のアミノ酸配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｐ３Ｚｅ）は、例えば、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列における切断領域のアミノ酸配列が保存され、前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００６０】
＜ＮＲＧ１の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチドは、前述のように、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）、第１の蛍光タンパク質、および第２の蛍光タンパク質を含み、前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｎ末端側領域、ＮＲＧ１切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびＣ末端側領域を、この順序で含み、前記第１の蛍光タンパク質と前記第２の蛍光タンパク質とが、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質であり、前記第１の蛍光タンパク質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、前記第２の蛍光タンパク質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする。
【００６１】
本発明のプローブ遺伝子は、前記ＮＲＧ１が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記Ｎ末端側領域、前記切断領域、および前記Ｃ末端側領域を、この順序で含み、前記第１の蛍光タンパク質と前記第２の蛍光タンパク質とが、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質であり、前記第１の蛍光タンパク質が、前記Ｎ末端側領域に挿入または付加され、前記第２の蛍光タンパク質が、前記Ｃ末端側領域に挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のプローブ遺伝子によれば、例えば、本発明のプローブを製造できる。本発明のプローブ遺伝子は、例えば、本発明のプローブの説明を援用できる。
【００６２】
本発明のプローブ遺伝子は、例えば、前記本発明のプローブのアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【００６３】
前記プローブが、下記（Ｐ１Ｚｅ）〜（Ｐ３Ｚｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質の場合、本発明のプローブ遺伝子は、例えば、下記（Ｐ１Ｚｅ）〜（Ｐ３Ｚｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
（Ｐ１Ｚｅ）  配列番号３、４、５、および１７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２Ｚｅ）  前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質
（Ｐ３Ｚｅ）  前記（Ｐ１Ｚｅ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質
【００６４】
本発明のプローブ遺伝子は、例えば、下記（ｐ１Ｚｅ）〜（ｐ４Ｚｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであってもよい。
（ｐ１Ｚｅ）配列番号６、７、８、および１８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｐ２Ｚｅ）前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ３Ｚｅ）前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ４Ｚｅ）前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００６５】
本発明のプローブ遺伝子は、例えば、前述のような本発明のプローブの遺伝子工学的手法による合成に有用である。
【００６６】
前記（ｐ１Ｚｅ）における配列番号６〜８および１８の塩基配列は、以下の通りである。以下、配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、第１のプローブ遺伝子−１ともいい、配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、第１のプローブ遺伝子−２ともいい、配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、第２のプローブ遺伝子ともいい、配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、第３のプローブ遺伝子ともいう。前記第１のプローブ遺伝子−１は、例えば、前記第１のプローブ−１をコードするポリヌクレオチドである。前記第１のプローブ遺伝子−２は、例えば、前記第１のプローブ−２をコードするポリヌクレオチドである。前記第２のプローブ遺伝子は、例えば、前記第２のプローブをコードするポリヌクレオチドである。前記第３のプローブ遺伝子は、例えば、前記第３のプローブをコードするポリヌクレオチドである。前記（Ｐ１Ｚｅ）は、前記ゼブラフィッシュ由来ＮＲＧ１のβ１型のアイソフォームをコードするプローブ遺伝子である。前記配列番号６〜８および１８の塩基配列において、下線で示した塩基配列が、前記切断領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、下線で示した塩基配列より上流（５’端側）の塩基配列が、前記Ｎ末端側領域および前記第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、前記Ｎ末端側領域および第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、四角で囲った塩基配列が、前記第１の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、四角で囲っていない領域が、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。また、この場合、下線で示した塩基配列より下流（３’端側）の塩基配列が、前記Ｃ末端側領域および前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、前記Ｃ末端側領域および前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、四角で囲った塩基配列が、前記第２の蛍光タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、四角で囲っていない領域が、前記Ｃ末端側領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。前記第２および第３のプローブ遺伝子において、前記Ｎ末端側領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列における括弧で囲んだ下線の塩基配列は、リンカーペプチドをコードする塩基配列である。
【００６７】
第１のプローブ遺伝子−１（配列番号１８）
2017165688.tif 000007
【００６８】
第１のプローブ遺伝子−２（配列番号６）
2017165688.tif 000008
【００６９】
第２のプローブ遺伝子（配列番号７）
2017165688.tif 000009
【００７０】
第３のプローブ遺伝子（配列番号８）
2017165688.tif 000010
【００７１】
前記（ｐ２Ｚｅ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｐ２Ｚｅ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有する範囲であればよい。前記（ｐ２Ｚｅ）の「１もしくは数個」は、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列において、例えば、１〜６５３個、１〜４９０個、１〜３２６個、１〜１６３個、１〜１３０個、１〜９８個、１〜６５個、１〜３２個、１〜１６個、１〜８個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。前記（ｐ２Ｚｅ）において、例えば、切断領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｐ２Ｚｅ）は、例えば、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列において、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列における切断領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列が保存され、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００７２】
前記（ｐ３Ｚｅ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｐ３Ｚｅ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有する範囲であればよい。前記（ｐ３Ｚｅ）の同一性は、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（ｐ３Ｚｅ）において、例えば、切断領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｐ３Ｚｅ）は、例えば、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列において、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列における切断領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列が保存され、前記（ｐ１Ｚｅ）の塩基配列に対して、７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＮＲＧ１切断酵素により切断され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが異なる波長特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００７３】
前記（ｐ４Ｚｅ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｐ１Ｚｅ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００７４】
前記（ｒ４Ｚｅ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００７５】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
【００７６】
＜ＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現ベクター＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現ベクターは、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチド、すなわち、前記本発明のプローブ遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の発現ベクターによれば、例えば、本発明の発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明のプローブを容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明プローブおよび前記本発明のプローブ遺伝子等の説明を援用できる。
【００７７】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明のプローブ遺伝子がコードするプローブを発現可能なように、前記プローブ遺伝子を含んでいればよく、その構成は特に制限されない。
【００７８】
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記プローブ遺伝子を挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター、ｐＱＥ−８０ＬベクターおよびｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、例えば、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。ゼブラフィッシュ等の非ヒト動物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＥＦ−ＢＯＳ等があげられる。
【００７９】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記プローブ遺伝子の発現および前記プローブ遺伝子がコードする前記プローブの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記非ヒト動物に形質転換を行なう場合、本発明の発現ベクターは、例えば、前記発現ベクター内のプローブ遺伝子を非ヒト動物のゲノム配列に組み込む転移因子を含むことが好ましい。前記転位因子は、例えば、Ｔｏｌ２トランスポゾン等のトランスポゾン等があげられる。本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記プローブ遺伝子の発現およびこれがコードする前記プローブの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００８０】
本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００８１】
＜ＮＲＧ１の切断検出用プローブの製造方法＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの製造方法（以下、「製造方法」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により、前記プローブを産生させることにより製造してもよいし、前記ＮＲＧ１に、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質を、挿入または付加することにより製造してもよい。前記遺伝子工学的手法の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明のプローブ遺伝子を発現させる工程を含む。後者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記ＮＲＧ１に前記第１の標識物質および前記第２の標識物質を、挿入または付加する工程を有する。これによって、前記本発明のプローブを製造できる。
【００８２】
前記プローブ遺伝子の発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。
【００８３】
前記プローブ遺伝子を発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【００８４】
前者の場合、例えば、前記プローブ遺伝子が導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記プローブ遺伝子を発現させることが好ましい。このように、例えば、前記プローブ遺伝子を宿主に導入することで、本発明のプローブ遺伝子を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、前記プローブを合成できる。
【００８５】
前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。前記宿主は、例えば、前述の非ヒト動物でもよい。この場合、前記形質転換体は、例えば、遺伝子組み換え非ヒト動物ということもできる。前記非ヒト動物は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００８６】
前記宿主の培養および飼育の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。また、飼育時の条件は、特に制限されず、前記非ヒト動物の種類に応じて適宜決定できる。
【００８７】
前記プローブ遺伝子を前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記プローブ遺伝子のポリヌクレオチドは、例えば、前記発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が非ヒト動物の場合、例えば、中でも、遺伝子組み換えによる方法、転位因子を利用する方法等が好ましい。前記プローブ遺伝子は、例えば、前記発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【００８８】
後者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記プローブ遺伝子を発現させることが好ましい。この場合、前記プローブ遺伝子の発現には、前記発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のプローブ遺伝子が導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
【００８９】
前記ＮＲＧ１に、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質を、挿入または付加する方法は、特に制限されず、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質の種類に応じ、従来公知のタンパク質の修飾方法に基づいて、適宜実施できる。
【００９０】
本発明の製造方法は、例えば、前記プローブの精製工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。本発明の製造方法により得られたプローブは、例えば、そのまま非精製プローブとして使用してもよいし、部分的に精製した部分精製プローブとして使用してもよいし、単一に精製した精製プローブとして使用してもよい。また、本発明の製造方法により得られたプローブは、例えば、粒子状キャリアに導入してもよい。前記粒子状キャリアに導入することにより、例えば、前記粒子状キャリアと、前記プローブの導入対象とを接触させることで、前記導入対象に前記プローブを簡便に導入できる。
【００９１】
＜ＮＲＧ１の切断検出用形質転換体＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出用形質転換体は、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチド、すなわち前記本発明のプローブ遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明のプローブ遺伝子を含むことが特徴であり、その他構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体によれば、例えば、生体において、前記ＮＲＧ１の切断を検出できる。また、本発明の形質転換体によれば、例えば、生体において前記ＮＲＧ１を切断するＮＲＧ１切断酵素の阻害剤をスクリーニングできる。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明のプローブ、前記本発明のプローブ遺伝子、前記本発明の発現ベクターおよび前記本発明の製造方法の説明を援用できる。
【００９２】
本発明において、前記形質転換体の宿主は、特に制限されず、例えば、前述の宿主の説明を援用できる。前記形質転換体は、例えば、ヒトおよび非ヒト動物を含む動物、培養細胞等の細胞等があげられる。
【００９３】
＜ＮＲＧ１の切断検出方法＞
本発明のＮＲＧ１の切断検出方法は、前述のように、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出することにより、前記ＮＲＧ１の切断を検出する検出工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明のプローブの発現系を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の検出方法によれば、例えば、前記ＮＲＧ１の切断を検出できる。本発明の検出方法は、例えば、前記本発明のプローブ、前記本発明のプローブ遺伝子、前記本発明の発現ベクターおよび前記本発明の製造方法の説明を援用できる。
【００９４】
前記発現系は、特に制限されず、例えば、前記プローブを発現させた形質転換体、前記プローブを含む粒子状キャリア等があげられる。前記発現系は、例えば、前記ＮＲＧ１切断酵素を発現する発現系でもよいし、前記ＮＲＧ１切断酵素を発現しない発現系でもよい。後者の場合、前記検出工程は、例えば、前記ＮＲＧ１切断酵素の共存下で実施してもよい。
【００９５】
前記検出工程において、前記プローブの切断の検出は、例えば、未切断のプローブの検出でもよいし、切断されたプローブの検出でもよいし、両者の検出でもよい。前記プローブの切断の検出は、例えば、前記発現系における前記プローブの前記第１の標識物質由来のシグナルおよび前記第２の標識物質由来のシグナルに基づき、検出できる。前記シグナルの検出方法は、特に制限されず、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質に応じて、適宜決定できる。具体的に、前記プローブの切断の検出は、例えば、前記第１の標識物質由来のシグナル量と、前記第２の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、検出できる。前記シグナル量は、特に制限されず、前記シグナルの種類に応じて、適宜設定できる。前記シグナルが光学シグナルの場合、前記シグナル量は、例えば、吸光度、反射度、蛍光強度等があげられる。
【００９６】
具体例として、前記第１の標識物質および前記第２の標識物質が、それぞれ、第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質であり、前記シグナル量の比に基づき、前記プローブの切断を検出する場合を例にあげて説明する。ただし、本発明は、以下の例に何ら制限されない。前記プローブは、例えば、前記Ｃ末端側領域に膜貫通領域を有する。このため、前記プローブが切断されると、前記第１の蛍光タンパク質は、例えば、前記発現系から遊離し、拡散する。つまり、例えば、前記プローブが切断されると、前記発現系における前記第１の蛍光タンパク質由来のシグナル量が、減少する。他方、前記第２の蛍光タンパク質は、前記Ｃ末端領域に挿入または付加されているため、前記プローブが切断されても、例えば、前記発現系に保持される。つまり、例えば、前記プローブが切断されても、前記発現系における前記第２の蛍光タンパク質由来のシグナル量が、有意に変動しない。このため、前記発現系において、前記プローブが切断されると、例えば、前記発現系における前記第１の蛍光タンパク質のシグナル量に対する前記第２の蛍光タンパク質のシグナル量の比が、増加する、または前記発現系における前記第２の蛍光タンパク質のシグナル量に対する前記第１の蛍光タンパク質のシグナル量の比が、減少する。したがって、例えば、前記第１の蛍光タンパク質のシグナル量と、前記第２の蛍光タンパク質シグナル量との比の増加もしくは減少の有無、または、増加もしくは減少の程度により、前記プローブの切断が検出できる。
【００９７】
本発明の検出方法は、前記シグナルから前記発現系における前記プローブの切断量を算出する算出工程を含んでもよい。前記算出工程において、前記プローブの切断量は、例えば、得られたシグナル、およびシグナルと前記発現系における未切断のプローブの量または切断されたプローブの量との相関関係に基づき、算出できる。前記相関関係は、例えば、検量線、回帰直線、検量表等で表わすことができる。前記相関関係は、例えば、前記切断されたプローブの量または前記未切断のプローブの量が既知である標準試料について、前記本発明の検出方法により得られたシグナルと、前記標準試料の前記切断されたプローブの量または前記未切断のプローブの量とをプロットすることにより求めることができる。前記標準試料は、前記切断されたプローブまたは前記未切断のプローブの希釈系列が好ましい。このように算出を行うことによって、信頼性の高い定量が可能となる。
【００９８】
＜ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法＞
本発明のＮＲＧ１切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法は、前述のように、被検物質から、ニューレグリン１タンパク質（ＮＲＧ１）切断酵素による、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの切断を抑制する被検物質を、ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、前記本発明のプローブの発現系を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤をスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のプローブ、前記本発明のプローブ遺伝子、前記本発明の発現ベクター、前記本発明の製造方法、および前記本発明検出方法の説明を援用できる。
【００９９】
本発明において、前記被検物質は、特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられる。
【０１００】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のＮＲＧ１の切断検出用プローブの発現系を用い、前記発現系に、前記被検物質を共存させて、前記ＮＲＧ１切断酵素により前記検出用プローブを切断する切断工程、前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出する検出工程、および前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも前記検出用プローブの切断量が少ない被検物質を、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含む。
【０１０１】
前記発現系は、特に制限されず、例えば、前記プローブを発現させた形質転換体、前記プローブを含む粒子状キャリア等があげられる。前記発現系は、例えば、前記ＮＲＧ１切断酵素を発現する発現系でもよいし、前記ＮＲＧ１切断酵素を発現しない発現系でもよい。後者の場合、前記切断工程は、例えば、前記ＮＲＧ１切断酵素の共存下で実施してもよい。
【０１０２】
前記切断工程は、前記発現系に、前記被検物質を共存させて、前記ＮＲＧ１切断酵素により前記検出用プローブを切断する工程である。前記切断工程における温度、時間等の反応条件は、特に制限されず、前記ＮＲＧ１切断酵素に応じて、適宜決定できる。
【０１０３】
前記検出工程は、例えば、前記本発明の検出方法における検出工程の説明を援用できる。
【０１０４】
前記選択工程は、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも前記検出用プローブの切断量が少ない被検物質を、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤として選択する。前記プローブの切断量は、例えば、前記本発明の検出方法における算出工程の説明を援用できる。
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【０１０６】
［実施例１］
本発明のプローブを使用し、ＮＲＧ１の切断を検出できることを確認した。
【０１０７】
（１）発現ベクターの構築
成体のゼブラフィッシュ（Danio rerio）の脳全体から作製したｃＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーセットを用い、ＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム（配列番号２）をコードするＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡ（配列番号１０）を、ＰＣＲにより増幅した。
【０１０８】
ＮＲＧ１のβ１型アイソフォームプライマーセット
フォワードプライマー（配列番号１１）
5’-CTGCATCATGGCTGAGGTGAAAGC-3’
リバースプライマー（配列番号１２）
5’-GCATTTTCACACAGCTATAGGATC-3’
【０１０９】
ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡ（配列番号１０）
5’-ATGGCTGAGGTGAAAGCAGGCAAAGAAGGGAAAAGTGGCGATAAGAAAAAGGATAAGGAGTCTGTGAGATCAAACAAGCCTGACAACTCTCCGCAAGCGGAACCGAAGTTAAAAAACCTTCGGAGCGTGACAGTGGAGGACGGGAAAAAAACGGTACTCAAATGTGAGATTTTGGCAGGAAACCCAGCGCCCAATGTCAAGTGGTACAAGAACGGAAAAGAGCTCACAGGCAAAAACAAACCCAAAAGCATAAAGATTAAAAAAAAGAAACAGGGGAAAATATCTGAACTGTTGATACGGAAATCCACGGAGGGAGATGCTGGATTATACACCTGCGAGGCCGTCAACAGCCTTGGAAAAACAAATACCACAGCAAACCTATTCATCATCAACACAGCCACCAGCACCACTCCCTCGGCCAAGACATCCAGTCACGTGACGCCCTGCAACGAGAGCGAGAAGGAATACTGTGTAAACCATGGCAAGTGCTTCACGCTGGAGGTCACACCCGGCAACATCAGGCGCCTTTGCAGGTGCCCCAATGAGTTTACTGGTGATCGCTGCCAACACTACGTAATGGCCAGCTTCTACAAACATCTTGGGATTGAATTTATGGAAGCTGAGGAGCTCTATCAGAAACGCGTTTTGACTATAACAGGCATCTGCATCGCTCTTCTAGTTGTTGGCATCATGTGTGTGGTGGCTTACTGCAAAACAAAGAAACAACGGAAAAAGCTACATGATCGTTTGCGGCAGAGTTTACGAGAGCGAAACGCTGCAGCCAAAGGCCCTCAACACCCTCACCCTCCACCGGAAAACCTGCAGCTGGTCAATCATTACATGCCGACGAATCCTGTCCCAGCTCATATGACAGACAAAGAAGCGGAAACATCACTCTCCACAAATGAGTTCACATCACCAACACATCCGTCCACAGCCATCACTCACTCATCTAGCCAATGCTGGAGTAATGGCAAAGCAGAGAGTGTGGTTTCTGATAGTCATGCAGTCCTGATGAAGCCATCAGCTGAGAACTGTCAGCACGGGACACCTAGTCACAGGGGCCGTCTGAACGCTACTGGAGGTGTCCATCAGCTCAATGATTACCTAAAGAACTCCAGAGAAGCCCAGGGCTCCAACAGAGACTCTCCTTACAGCGAGAGGTATGTTTCAGCCATGACTACCCCGACCCGTCTGTCCCCTGTGGGGCTTCTCTCGCCGGTGACGCCGTCCTCTCCTCCCTCAGAGATGTCAGCTCCTCTCTCCAGCCTGGCGACCTCCGTTCCATCCATGTTAACCAGTCCCTCTGGAGAAGAGGAGCGTCCTCTGCTGTTCCGGACACCACCAATCCTGCGTGACAAATCTGCTTCAACCCAAGGCCGTAAATCAGGCCATAATCTCCGTAACTCCGCCCACTACAATCACGGCCTGGACATCCCCAGCCCTCCACCCAGCCCGCTGCATATAGAGGAGGAGATTGATTGTTTAGAGCAGTACAAAAGCACATCTGTCCCGTCCTCCGCCCCGCACAGCCCCAGCGCCGCAAGAACTCAACCGAGTGGTCAAGCGGCGCCTGAGCAAGCGGTTAGTGGCAGTAACTCAGAGAGCAGCAGCTCAGAGAGCGAGACCGAGGATGAACGGGTGGGCGAGGACACGCCGTTTCTGGGCTTACAGAACCCTCTGGCCGCTGGTTCGCTTGTTCTGGACGGGCTAGAGGGCAGCAGAACTAACCCCGCGCTGCACCTCTCACCGCAACACGAGCTGCAGAACAGACTAACAGCCGTCATGGCCAACCAGGATCCTATAGCTGTGTGA-3’
【０１１０】
得られたＰＣＲ産物について、制限酵素で処理することにより、ＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の８９および９０番目の塩基間で切断した。つぎに、前記切断後のＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡと、別途増幅したｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡ（配列番号１３）とを、リガーゼ存在下で反応させることにより、ＮＲＧ１β１型  ｃＤＮＡのＯＲＦの８９および９０番目の塩基間に、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡの３〜７０８番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挿入されたポリヌクレオチドを作製した。さらに、前記挿入後のＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡと、別途増幅したＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）とをリガーゼ存在下で反応させることで、前記挿入後のＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡの３’末端にＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの４〜７１７番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを付加し、第１のプローブ遺伝子１−１（配列番号１８）または第１のプローブ遺伝子−２（配列番号６）（以下、「第１のプローブ遺伝子」ともいう。）を作製した。
【０１１１】
ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡ（配列番号１３）
5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3’
【０１１２】
ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）
5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3’
【０１１３】
そして、前記第１のプローブ遺伝子を、転位因子のＴｏｌ２因子を含むｐＴ２ＡＵＡＳＭＣＳベクター（自家調製）に、前記ベクター内の５×ＵＡＳ（upstream activator sequence）の下流に配置されるよう連結した。前記第１のプローブ遺伝子−１および前記第１のプローブ遺伝子−２を挿入したベクターを、それぞれ、第１のプローブ遺伝子−１の発現ベクターおよび第１のプローブ遺伝子−２の発現ベクター（以下、「第１のプローブ遺伝子の発現ベクター」ともいう。）とした。なお、以下、第１のプローブ遺伝子−１および第１のプローブ遺伝子−２から発現するタンパク質を、それぞれ、第１のプローブ（配列番号３）および第１のプローブ−２（配列番号１７）（以下、「第１のプローブ」ともいう。）ともいう。
【０１１４】
また、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６（Herpes simplex virus protein 16）由来の転写活性化ドメインとを融合したタンパク質（Ｇａｌ４−ＶＰ１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）をｐＥＦ−ＢＯＳに連結した。前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したベクターを、Ｇａｌ４−ＶＰ１６発現ベクターとした。
【０１１５】
Ｇａｌ４−ＶＰ１６をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）
5’-ATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGTCGAGGTCGACCCCGGGAATTCAGATCTCTCGAGCCGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGTCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGTAGCGGATCTACTA-3’
【０１１６】
（２）プローブの発現および切断の確認
３５ｍｍガラス製ディッシュで培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターおよび前記Ｇａｌ４−ＶＰ１６発現ベクターを、トランスフェクション試薬（ＰＥＩ−ＭＡＸ、Polysciences Inc.社製）を用い、添付のプロトコルにしたがって導入した。前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとした。前記導入後、３７℃の条件下で、終夜培養し、前記培養液を、１μｍｏｌ／ｍＬとなるようにＰＭＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）を添加した、飢餓用培養液に交換した（ＰＭＡ添加群）。前記飢餓用培養液は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、および１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Thermo Fisher Scientific, Inc.社製）を含む無血清のFluorobrite（商標）ＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific, Inc.社製）とした。
【０１１７】
前記培養液の交換後、３７℃の条件下で、培養した。前記培養後、上清および前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収した。前記上清は、限外濾過法により濃縮した。つぎに、溶解バッファーを用いて、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解し、細胞溶解液を調製した。前記溶解バッファーは、プロテアーゼインヒビターカクテル（CompleteTM protease inhibitor mixture、Roche Molecular Biochemicals社製）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、および１％デオキシコール酸ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）とした。そして、前記濃縮された上清および前記細胞溶解液について、タンパク質濃度測定試薬（Pierce（商標）Protein Assay Kit 、Life Technologies社製）を用いて、タンパク質濃度を測定した。そして、ＳＤＳゲルの各レーンに添加するタンパク質の重量が１５−２０μｇとなるように、前記濃縮後の上清および前記細胞溶解液を、それぞれ、１０％のＳＤＳゲルの各レーンに導入し、電気泳動を行なった。
【０１１８】
つぎに、前記ＳＤＳゲルからメンブレンに転写した。前記転写後、１または５％スキムミルクでブロッキングを行なった。つぎに、前記メンブレンについて、ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォームのＮ末端に結合するラビット抗体、ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォームのＣ末端に結合するラビット抗体、および抗β−アクチン抗体（clone AC-74、４０００倍希釈で使用、Sigma Aldrich社製）を用い、前記第１のプローブ、前記切断後の第１のプローブ、およびβ−アクチンを検出した。前記メンブレンと前記抗体との反応は、４℃、２４時間とした。また、ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして、阻害剤添加群は、前記ＰＭＡに加えて、５０μｍｏｌ／ＬとなるようにＮＲＧ１切断酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害剤（ＧＭ６００１、Calbiochem社製）を添加した以外は、同様にして、前記第１のプローブ、前記切断後の第１のプローブ、およびβ−アクチンを検出した。
【０１１９】
これらの結果を図１に示す。図１は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１において（Ａ）は、前記上清の結果を示す写真であり、（Ｂ）は、前記細胞溶解液の結果を示す写真であり、上段が、前記プローブの検出結果を示す写真であり、下段が、β−アクチンの検出結果を示す写真である。図１において、写真の左側は、分子量を示し、各レーンは、左から、前記ＤＭＳＯ添加群、前記ＰＭＡ添加群、および前記阻害剤添加群の結果を示す。図１（Ａ）に示すように、前記上清において、前記ＤＭＳＯ添加群では、前記切断後の第１のプローブが観察されないのに対し、前記ＰＭＡ添加群では、前記切断後の第１のプローブが観察された。また、前記阻害剤添加群は、前記切断後の第１のプローブが観察されず、前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤により、前記第１のプローブの切断が阻害されていた。また、図１（Ｂ）の１５０ＫＤａ付近の矢印で示すように、前記細胞溶解液において、前記ＤＭＳＯ添加群および前記ＰＭＡ添加群では、未切断の第１のプローブが観察され、前記阻害剤添加群では、未切断の第１のプローブの量が増加していた。また、１００ＫＤａ弱付近の矢印で示すように、前記ＤＭＳＯ添加群、前記ＰＭＡ添加群および前記阻害剤添加群では、前記切断後の第１のプローブの量は、同等であった。これらの結果から、前記第１のプローブが発現すること、前記ＮＲＧ１と同様に前記第１のプローブがＮＲＧ１切断酵素により切断されること、および前記第１のプローブの切断が、ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤により阻害できることがわかった。
【０１２０】
（３）プローブの経時的な切断の確認
前記（２）と同様にして、前記培養液を、前記ＰＭＡを含む飢餓用培養液に交換後、３７℃の条件下で、培養した（ＰＭＡ添加群）。前記培養開始後、所定時間（０、１５、３０、および６０分）において、上清を回収した以外は、前記（２）と同様にして、前記第１のプローブおよび前記切断後の第１のプローブを検出した。また、ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして、前記第１のプローブおよび前記切断後の第１のプローブを検出した。
【０１２１】
この結果を図２に示す。図２は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図２において、上段が、前記ＰＭＡ添加群の結果を示す写真であり、下段が、前記ＤＭＳＯ添加群の結果を示す写真である。図２において、写真の左側は、サンプルの種類を示し、各レーンは、左から、０、１５、３０、および６０分後に回収した上清の結果を示す。図２の下段に示すように、前記ＤＭＳＯ添加群では、前記切断後の第１のプローブの量は、有意な変化が観察されなかった。これに対し、図２の上段に示すように、前記ＰＭＡ添加群では、経時的に、前記切断後の第１のプローブの量が増加した。これらの結果から、前記ＮＲＧ１切断酵素により経時的に前記第１のプローブが切断されることがわかった。
【０１２２】
（４）切断後のプローブの活性の確認
前記ＰＭＡを含む飢餓用培養液に代えて、前記飢餓用培養液を添加し、３７℃の条件下で２４時間培養した以外は、前記実施例１（３）と同様にして、上清を回収した。
【０１２３】
切断後のプローブの活性は、Ｃ２Ｃ１２細胞（American Type Culture Collection（ATCC）より入手）の活性化を指標に検討した。具体的には、６０ｍｍディッシュに播種した、分化させたＣ２Ｃ１２細胞に、２ｍＬの前記上清を添加し、３７℃の条件下で、３０分培養した。そして、前記実施例１（２）と同様にして、細胞溶解液を調製した。前記Ｃ２Ｃ１２細胞の培養液は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとし、前記Ｃ２Ｃ１２細胞の分化用培養液は、２％Horse Serumを含むＤＭＥＭとした。
【０１２４】
前記上清および前記細胞溶解液に代えて、Ｃ２Ｃ１２細胞由来の細胞溶解液を使用した以外は、前記（２）と同様にして、メンブレンに転写後、ブロッキングした。そして、抗リン酸化ＥｒｂＢ３抗体（clone 21D3、Cell Signalling Technology社製）、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（clone C31E5E、Cell Signalling Technology社製）、および抗リン酸化Ｅｒｋ抗体（Cell Signalling Technology社製）を用い、前記リン酸化ＥｒｂＢ３、前記リン酸化Ａｋｔ、および前記リン酸化Ｅｒｋを検出した。また、前記（２）と同様にしてβ−アクチンを検出した。さらに、コントロール１（ＢＳＡ）は、前記上清に代えて、０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液を等量添加した以外は、同様にして、コントロール２（recombinant NRG1）は、前記上清に代えて、ヒトリコンビナントＮＲＧ１（R&D system社製）を１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した以外は、同様にして、コントロール３（Ｍｏｃｋ）は、前記第１のプローブ遺伝子ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔに代えて、前記ｐＴ２ＡＵＡＳＭＣＳベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた以外は、同様にして、前記リン酸化ＥｒｂＢ３、前記リン酸化Ａｋｔ、前記リン酸化Ｅｒｋ、および前記β−アクチンを検出した。
【０１２５】
これらの結果を図３に示す。図３は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図３において、１〜４段目の写真は、上段から、リン酸化ＥｒｂＢ３の結果、リン酸化Ａｋｔの結果、リン酸化Ｅｒｋの結果、およびβ−アクチンの結果を示す。また、図３において、各レーンは、左から、コントロール１、コントロール２、コントロール３および実施例の結果を示す。図３に示すように、ＢＳＡ溶液を添加したコントロール１およびコントロール３の上清を添加した場合、ＥｒｂＢ３とＡｋｔとは、リン酸化が観察されず、Ｅｒｋは、若干のリン酸化が観察された。これに対し、実施例では、ＥｒｂＢ３とＡｋｔとのリン酸化が、リコンビナントＮＲＧ１タンパク質を添加したコントロール２と同程度観察され、且つ、Ｅｒｋのリン酸化も、コントロール２と同程度観察された。これらの結果から、前記切断後の第１のプローブが、前記切断後のＮＲＧ１と同等の活性を示すことがわかった。
【０１２６】
（５）蛍光顕微鏡を用いたプローブの切断の確認
前記（２）と同様にして、前記培養液を、前記ＰＭＡを含む飢餓用培養液に交換した（ＰＭＡ添加群）。また、前記培養液の交換前１０分から、倒立顕微鏡（OLYMPUS IX81、オリンパス社製）を用い、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光シグナルおよびＥＧＦＰの蛍光シグナル経時的に撮像した。なお、対物レンズは、PlanApo 60x/1.40 oil objective lensを用いた。つぎに、ソフトウェア（MetaMorph software、Universal Imaging社製）を用い、得られた画像からバックグラウンドを除去後、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光シグナル強度（ＩＲ）とＥＧＦＰの蛍光シグナル強度（ＩＧ）とのシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）を算出した。また、前記培養液交換前１０分間のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値に基づき、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）を補正した。そして、各画像について前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に基づき、３２段階の色調で塗り分けを行なった。また、ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして、阻害剤添加群は、前記ＰＭＡに加えて、５０μｍｏｌ／ＬとなるようにＧＭ６００１を添加した以外は、同様にして、分析した。
【０１２７】
これら結果を図４に示す。図４は、顕微鏡による観察の結果を示す写真である。図４において、（Ａ）が、前記ＤＭＳＯ添加群の結果、（Ｂ）が、前記ＰＭＡ添加群の結果、（Ｃ）が、前記阻害剤添加群の結果を示す。図４において、写真は、左から、前記培養液交換後、０、５、１５、３０および６０分の結果を示し、図中の矢印は、前記第１のプローブの切断が観察された箇所を示す。図４（Ａ）に示すように、前記ＤＭＳＯ添加群では、いずれの時間においても前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。これに対し、図４（Ｂ）に示すように、前記ＰＭＡ添加群では、図中の矢印で示すように、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が減少、すなわち前記第１のプローブの切断が観察され、且つ前記第１のプローブの切断が観察される領域が拡大した。他方、前記阻害剤添加群では、いずれの時間においても前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。
【０１２８】
つぎに、経時的な補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を図５に示す。図５は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を示すグラフである。図５において、横軸は、培養液交換時を基準とした時間を示し、縦軸は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）を示す。図５に示すように、前記ＤＭＳＯ添加群では、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。これに対し、前記ＰＭＡ添加群では、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が減少した。他方、前記阻害剤添加群では、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。これらの結果から、前記第１のプローブの切断を簡便に検出できることがわかった。
【０１２９】
以上のことから、本発明のプローブによれば、前記ＮＲＧ１の切断を簡便に検出できることが分かった。
【０１３０】
［実施例２］
本発明のプローブを使用し、生体内でＮＲＧ１の切断を検出できることを確認した。
【０１３１】
（１）プローブ発現ゼブラフィッシュの作製
前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターと、Ｔｏｌ２トランスポゼースのｍＲＮＡ（配列番号１６）とを、ゼブラフィッシュの受精卵内にインジェクションした。前記受精卵から得られたゼブラフィッシュを、前記Ｇａｌ４−ＶＰ１６を発現するゼブラフィッシュ（大学共同利用機関法人  自然科学研究機構  生理学研究所  生命時空間設計研究領域(神経分化研究部門）から分与）と交配し、前記第１のプローブを神経系の細胞に発現するＦ１のゼブラフィッシュを得た。
【０１３２】
Ｔｏｌ２トランスポゼースのｍＲＮＡ（配列番号１６）
5’-ATGGAGGAAGTATGTGATTCATCAGCAGCTGCGAGCAGCACAGTCCAAAATCAGCCACAGGATCAAGAGCACCCGTGGCCGTATCTTCGCGAATTCTTTTCTTTAAGTGGTGTAAATAAAGATTCATTCAAGATGAAATGTGTCCTCTGTCTCCCGCTTAATAAAGAAATATCGGCCTTCAAAAGTTCGCCATCAAACCTAAGGAAGCATATTGAGAGAATGCACCCAAATTACCTCAAAAACTACTCTAAATTGACAGCACAGAAGAGAAAGATCGGGACCTCCACCCATGCTTCCAGCAGTAAGCAACTGAAAGTTGACTCAGTTTTCCCAGTCAAACATGTGTCTCCAGTCACTGTGAACAAAGCTATATTAAGGTACATCATTCAAGGACTTCATCCTTTCAGCACTGTTGATCTGCCATCATTTAAAGAGCTGATTAGTACACTGCAGCCTGGCATTTCTGTCATTACAAGGCCTACTTTACGCTCCAAGATAGCTGAAGCTGCTCTGATCATGAAACAGAAAGTGACTGCTGCCATGAGTGAAGTTGAATGGATTGCAACCACAACGGATTGTTGGACTGCACGTAGAAAGTCATTCATTGGTGTAACTGCTCACTGGATCAACCCTGGAAGTCTTGAAAGACATTCCGCTGCACTTGCCTGCAAAAGATTAATGGGCTCTCATACTTTTGAGGTACTGGCCAGTGCCATGAATGATATCCACTCAGAGTATGAAATACGTGACAAGGTTGTTTGCACAACCACAGACAGTGGTTCCAACTTTATGAAGGCTTTCAGAGTTTTTGGTGTGGAAAACAATGATATCGAGACTGAGGCAAGAAGGTGTGAAAGTGATGACACTGATTCTGAAGGCTGTGGTGAGGGAAGTGATGGTGTGGAATTCCAAGATGCCTCACGAGTCCTGGACCAAGACGATGGCTTCGAATTCCAGCTACCAAAACATCAAAAGTGTGCCTGTCACTTACTTAACCTAGTCTCAAGCGTTGATGCCCAAAAAGCTCTCTCAAATGAACACTACAAGAAACTCTACAGATCTGTCTTTGGCAAATGCCAAGCTTTATGGAATAAAAGCAGCCGATCGGCTCTAGCAGCTGAAGCTGTTGAATCAGAAAGCCGGCTTCAGCTTTTAAGGCCAAACCAAACGCGGTGGAATTCAACTTTTATGGCTGTTGACAGAATTCTTCAAATTTGCAAAGAAGCAGGAGAAGGCGCACTTCGGAATATATGCACCTCTCTTGAGGTTCCAATGTTTAATCCAGCAGAAATGCTGTTCTTGACAGAGTGGGCCAACACAATGCGTCCAGTTGCAAAAGTACTCGACATCTTGCAAGCGGAAACGAATACACAGCTGGGGTGGCTGCTGCCTAGTGTCCATCAGTTAAGCTTGAAACTTCAGCGACTCCACCATTCTCTCAGGTACTGTGACCCACTTGTGGATGCCCTACAACAAGGAATCCAAACACGATTCAAGCATATGTTTGAAGATCCTGAGATCATAGCAGCTGCCATCCTTCTCCCTAAATTTCGGACCTCTTGGACAAATGATGAAACCATCATAAAACGAGGCATGGACTACATCAGAGTGCATCTGGAGCCTTTGGACCACAAGAAGGAATTGGCCAACAGTTCATCTGATGATGAAGATTTTTTCGCTTCTTTGAAACCGACAACACATGAAGCCAGCAAAGAGTTGGATGGATATCTGGCCTGTGTTTCAGACACCAGGGAGTCTCTGCTCACGTTTCCTGCTATTTGCAGCCTCTCTATCAAGACTAATACACCTCTTCCCGCATCGGCTGCCTGTGAGAGGCTTTTCAGCACTGCAGGATTGCTTTTCAGCCCCAAAAGAGCTAGGCTTGACACTAACAATTTTGAGAATCAGCTTCTACTGAAGTTAAATCTGAGGTTTTACAACTTTGAGTAG-3’
【０１３３】
（２）生体内でのプローブの切断の確認
つぎに、前記Ｆ１のゼブラフィッシュについて、共焦点顕微鏡（Leica TCS SP8、Leica社製）を用いて、フォトンカウントモードで観察し、撮像した。なお、対物レンズは、HC PL APO CS2 20×/NA 0.75, 40×/NA 1.30または63×/NA 1.40を用いた。また、取得したＺスタック画像の最大値投影処理は、ソフトウェア（LAS AF software、Leica MicroSystems社製）を用いて処理し、処理画像について、前記実施例１（５）と同様にして、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の算出および補正を行なった。そして、各処理画像について前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に基づき、３２段階の色調で塗り分けを行なった。さらに、各処理画像について、前記ゼブラフィッシュの神経細胞の細胞体および神経突起について、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を算出した。
【０１３４】
これらの結果を図６に示す。図６は、前記Ｆ１のゼブラフィッシュの神経細胞を顕微鏡により観察した結果を示す写真である。図６において（Ａ）は、前記神経細胞全体を示す写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）において左上の点線で囲んだ領域の拡大図であり、前記神経細胞の細胞体を示す写真であり、（Ｃ）は、（Ａ）において、右下の点線で囲んだ領域の拡大図であり、前記神経細胞の神経突起の末端を示す写真である。図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記神経細胞の細胞体では、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が相対的に高かった。他方、図６（Ｃ）に示すように、前記神経細胞の神経突起の末端では、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が相対的に低かった。
【０１３５】
つぎに、前記神経細胞の細胞体および神経突起における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を図７に示す。図７は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を示すグラフである。図７において、グラフの下は、前記神経細胞における解析対象を示し、縦軸は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を示す。図７に示すように、前記神経細胞において、前記神経突起は、前記細胞体と比較して、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値が有意に低かった。これらの結果から、本発明のプローブを使用し、生体内でＮＲＧ１の切断を検出できることがわかった。
【０１３６】
［実施例３］
本発明のプローブを使用し、生体内でＮＲＧ１阻害剤のスクリーニングができることを確認した。
【０１３７】
前記実施例２（１）と同様にしてＦ１のゼブラフィッシュの受精卵を作製した。そして、前記受精卵を、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧＭ６００１、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＢＡＣＥ１阻害剤ＩＶ（Calbiochem社製）、および２％ＤＭＳＯを含む受精卵用培養液で、前記受精後２５−３６時間培養した（阻害剤添加群）。前記培養後、前記受精卵は、４％ＰＦＡを含むリン酸緩衝液で固定した。そして、前記固定後の受精卵について、前記実施例２（２）と同様にして、前記受精卵の神経細胞の細胞体および軸索の補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を算出した。また、ＤＭＳＯ添加群は、前記ＧＭ６００１およびＢＡＣＥ１阻害剤ＩＶに代えて、ＤＭＳＯを添加した以外は、同様にして、前記受精卵の神経細胞の細胞体および軸索の補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を算出した。
【０１３８】
これらの結果を、図８に示す。図８は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を示すグラフである。図８において、グラフの下は、前記神経細胞における解析対象を示し、縦軸は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を示す。図８に示すように、前記ＮＲＧ１の切断が生じていない前記神経細胞の細胞体では、前記阻害剤添加群（inhibitor）および前記ＤＭＳＯ添加群（DMSO）において、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値に有意差はなかった。これに対し、前記ＮＲＧ１の切断が生じている前記神経細胞の軸索では、前記阻害剤添加群が、前記ＤＭＳＯ添加群に対して、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値が有意に高かった。これらの結果から、本発明のプローブを使用し、生体内でＮＲＧ１阻害剤のスクリーニングができることがわかった。
【０１３９】
［実施例４］
本発明のプローブを使用し、ＮＲＧ１の切断を検出できることを確認した。
【０１４０】
（１）発現ベクターの構築
ＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡのシグナル配列領域に対応する塩基配列を除去し、ＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の６９および７０番目の塩基間で切断し、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡの４〜７０８番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挿入して、第２のプローブ遺伝子（配列番号７）を作製した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、発現ベクターを作製した。以下、前記発現ベクターを第２のプローブ遺伝子の発現ベクターともいい、第２のプローブ遺伝子から発現するタンパク質を、第２のプローブ（配列番号４）ともいう。
【０１４１】
また、ＮＲＧ１のβ１型アイソフォーム  ｃＤＮＡの５’末端にｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡを付加して、第３のプローブ遺伝子（配列番号８）を作製した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、発現ベクターを作製した。以下、前記発現ベクターを第３のプローブ遺伝子の発現ベクターともいい、第３のプローブ遺伝子から発現するタンパク質を、第３のプローブ（配列番号５）ともいう。
【０１４２】
（２）プローブの発現および切断の確認
前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターに代えて、前記第２のプローブ遺伝子の発現ベクターまたは前記第３のプローブ遺伝子の発現ベクターを用い、ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォームのＮ末端に結合するラビット抗体、ゼブラフィッシュＮＲＧ１のβ１型アイソフォームのＣ末端に結合するラビット抗体に代えて、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（clone 1C51、２０００倍希釈で使用、Abcam社製）および抗ＧＦＰ抗体（clone AB3080、２０００倍希釈で使用、Millipore社製）を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、前記第２のプローブまたは前記第３のプローブ、および切断後の第２のプローブまたは切断後の第２のプローブを検出した。コントロール（Ｍｏｃｋ）は、前記第２のプローブ遺伝子の発現ベクターまたは前記第３のプローブ遺伝子の発現ベクターに代えて、前記ｐＴ２ＡＵＡＳＭＣＳベクターを用いた以外は、同様にして検出した。
【０１４３】
これらの結果を図９に示す。図９は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図９において（Ａ）は、細胞溶解液の結果を示す写真であり、（Ｂ）は、上清の結果を示す写真である。図９において、写真の左側は、分子量を示し、各レーンは、左から、Ｍｏｃｋ、前記第２のプローブ遺伝子の発現ベクターを導入した細胞（第２のプローブ群、＃２）の結果、および前記第３のプローブ遺伝子の発現ベクターを導入した細胞（第３のプローブ群、＃３）の結果を示す。図９（Ａ）の１５０ＫＤａ付近の矢印で示すように、前記細胞溶解液において、前記第２のプローブ群および前記第３のプローブ群では、それぞれ、未切断の第２のプローブおよび未切断の第３のプローブが観察された。また、７５ＫＤａ付近の矢印で示すように、前記第２のプローブ群および前記第３のプローブ群では、前記切断後の第２のプローブおよび前記切断後の第３のプローブが観察された。これに対し、前記Ｍｏｃｋでは、いずれのプローブおよび切断後のプローブも観察されなかった。また、図９（Ｂ）に示すように、前記上清において、前記Ｍｏｃｋでは、いずれの切断後のプローブも観察されないのに対し、前記第２のプローブ群および前記第３のプローブ群では、５０−７５ＫＤａ付近に、複数の切断後の第２のプローブおよび前記切断後の第３のプローブが観察された。これらの結果から、前記第２のプローブおよび前記第３のプローブが発現すること、ならびに前記ＮＲＧ１と同様に、前記第２のプローブおよび前記第３のプローブが、前記ＮＲＧ１切断酵素により切断されることがわかった。また、シグナルペプチドを除去した前記第２のプローブと比較して、ＮＲＧ１の全てのドメイン（領域）を含む第１のプローブおよび第３のプローブでは、切断後のプローブのバンドが単一であり、前記ＮＲＧ１と同様の挙動を示した。これらの結果から、前記プローブは、前記ＮＲＧ１の全てのドメイン（領域）を含むことで、前記ＮＲＧ１とより近い性質を示すことがわかった。
【０１４４】
［実施例５］
本発明のプローブにおいて、切断領域がＮＲＧ１切断酵素を介した切断に重要であることを確認した。
【０１４５】
（１）発現ベクターの構築
前記切断領域のアミノ酸配列（配列番号９）をコードする塩基配列を除去して、変異プローブ遺伝子を作製した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、発現ベクターを作製した。以下、前記発現ベクターを変異プローブ遺伝子の発現ベクターともいい、変異プローブ遺伝子から発現するタンパク質を、変異プローブともいう。
【０１４６】
（２）プローブの発現および切断の確認
前記実施例１（２）と同様にして、前記第１のプローブ、および切断後の第１のプローブを検出した（ＷＴ  ＰＭＡ添加群）。また、ＷＴ  ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして、前記第１のプローブおよび切断後の第１のプローブを検出した。さらに、前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターに代えて、前記変異プローブ遺伝子の発現ベクターを用いた以外は、同様にして、前記変異プローブおよび前記切断後の変異プローブを検出した（ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群）。また、ＭＵＴ  ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして、前記変異プローブおよび前記切断後の変異プローブを検出した。
【０１４７】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１０において（Ａ）は、上清の結果を示す写真であり、（Ｂ）は、前記細胞溶解液の結果を示す写真であり、上段が、前記プローブの検出結果を示す写真であり、下段が、β−アクチンの検出結果を示す写真である。図１０において、写真の左側は、分子量を示し、各レーンは、左から、ＷＴ  ＤＭＳＯ添加群、ＷＴ  ＰＭＡ添加群、ＭＵＴ  ＤＭＳＯ添加群、およびＭＵＴ  ＰＭＡ添加群の結果を示す。図１０（Ａ）に示すように、前記上清において、前記ＷＴ  ＰＭＡ添加群は、前記ＷＴ  ＤＭＳＯ添加群と比較して、前記切断後の第１のプローブの量が増加した。これに対して、前記ＭＵＴ  ＤＭＳＯ添加群および前記ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群は、共に前記切断後の変異プローブは観察されなかった。また、図１０（Ｂ）の１５０ＫＤａ付近の矢印で示すように、前記変異プローブを導入した細胞の細胞溶解液は、前記第１のプローブを導入した細胞の細胞溶解液と比較して、未切断のプローブの量が増加していた。これらの結果から、前記切断領域が、前記ＮＲＧ１切断酵素による切断に重要であることがわかった。
【０１４８】
（３）蛍光顕微鏡を用いたプローブの切断の確認
前記実施例１（５）と同様にして、シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の算出および補正を行なった。そして、各画像について前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に基づき、３２段階の色調で塗り分けを行なった（ＷＴ  ＰＭＡ添加群）。また、ＷＴ  ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は同様にして分析した。さらに、前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターに代えて、前記変異プローブ遺伝子の発現ベクターを用いた以外は、同様にして、シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の算出および補正を行なった。そして、各画像について前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に基づき、３２段階の色調で塗り分けを行なった（ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群）。また、ＭＵＴ  ＤＭＳＯ添加群は、前記ＰＭＡに代えて、等量のＤＭＳＯを添加した以外は、ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群と同様にして分析した。
【０１４９】
これら結果を図１１に示す。図１１は、顕微鏡による観察の結果を示す写真である。図
において、（Ａ）が、前記ＷＴ  ＰＭＡ添加群の結果、（Ｂ）が、前記ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群の結果を示す。図１１において、写真は、左から、培養液交換後、０、１５、および３０分の結果を示し、図中の矢印は、前記プローブの切断が観察された箇所を示す。図１１（Ａ）に示すように、前記ＷＴ  ＰＭＡ添加群では、図中の矢印で示すように、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が減少、すなわち前記第１のプローブの切断が観察され、且つ前記第１のプローブの切断が観察される領域が拡大した。これに対し、図１１（Ｂ）に示すように、前記ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群では、いずれの時間においても前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。
【０１５０】
つぎに、経時的な補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を図１２に示す。図１２は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の結果を示すグラフである。図１２において、横軸は、培養液交換時を基準とした時間を示し、縦軸は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）を示す。図１２に示すように、前記ＷＴ  ＤＭＳＯ添加群、前記ＭＵＴ  ＰＭＡ添加群および前記ＭＵＴ ＤＭＳＯ添加群では、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の変化は観察されなかった。これに対し、前記ＷＴ  ＰＭＡ添加群では、前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が減少した。これらの結果から、前記切断領域が、前記ＮＲＧ１切断酵素による切断に重要であることが分かった。
【０１５１】
（４）生体内でのプローブの切断の確認
前記実施例２（１）と同様にして、前記第１のプローブを神経系の細胞に発現するＦ１のゼブラフィッシュを得た（ＷＴゼブラフィッシュ）。また、前記第１のプローブ遺伝子の発現ベクターに代えて、前記変異プローブ遺伝子の発現ベクターを用いた以外は、同様にして、前記変異プローブを神経系の細胞に発現するＦ１のゼブラフィッシュを得た（ＭＵＴゼブラフィッシュ）。
【０１５２】
つぎに、これらのＦ１のゼブラフィッシュについて、前記実施例２（２）と同様にして、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の算出および補正を行なった。そして、各処理画像について前記補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に基づき、３２段階の色調で塗り分けを行なった。さらに、各処理画像について、前記ゼブラフィッシュの神経細胞の細胞体および軸索について、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を算出した。
【０１５３】
これらの結果を図１３に示す。図１３は、前記Ｆ１のゼブラフィッシュの神経細胞を顕微鏡により観察した結果を示す写真である。図１３において（Ａ）は、前記ＷＴゼブラフィッシュの神経細胞を示す写真であり、（Ｂ）は、前記ＭＵＴゼブラフィッシュの神経細胞を示す写真である。図１３（Ａ）および（Ｂ）の矢印で示すように、前記ＭＵＴゼブラフィッシュの神経細胞の細胞体と、前記ＷＴゼブラフィッシュの神経細胞の細胞体とは、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が同程度であった。これに対して、図中の矢印で示すように、前記ＭＵＴゼブラフィッシュの神経細胞の軸索は、前記ＷＴゼブラフィッシュの神経細胞の軸索と比較して、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が相対的に高かった。
【０１５４】
つぎに、前記神経細胞の細胞体および軸索における補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を図１４に示す。図１４は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値の結果を示すグラフである。図１４において、グラフの下は、前記神経細胞における解析対象を示し、縦軸は、補正後のシグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）の平均値を示す。図１４に示すように、前記ＭＵＴゼブラフィッシュ（ＭＵＴ）の神経細胞の細胞体と、前記ＷＴゼブラフィッシュ（ＷＴ）の神経細胞の細胞体とは、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）に有意差はなかった。これに対して、前記ＭＵＴゼブラフィッシュの神経細胞の軸索は、前記ＷＴゼブラフィッシュの神経細胞の軸索と比較して、前記シグナル量比（ＩＲ／ＩＧ）が有意に高かった。これらの結果から、前記切断領域は、生体内における前記ＮＲＧ１切断酵素による切断に重要であることが分かった。
【０１５５】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
以上のように、本発明のプローブによれば、ＮＲＧ１が切断されたか否かを簡便に検出できる。また、本発明のプローブは、動物等の生体においても、例えば、前記ＮＲＧ１と同様の局在を示す。このため、本発明のプローブによれば、例えば、前記生体においても、前記ＮＲＧ１の切断を検出できる。また、本発明のプローブを用いることで、例えば、前記生体内で前記ＮＲＧ１切断酵素の阻害剤をスクリーニングできる。このため、本発明は、医薬分野、生命科学分野等において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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