(57)【要約】【課題】植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供すること。【解決手段】本発明は試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：（ａ）セルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、ここで、前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を８時間を超えて１２時間以下の間、静置する工程、（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  セルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を８時間を超えて１２時間以下の間、静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）  工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程。
【請求項２】
前記植物病原性卵菌は、植物病原性フハイカビである。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記植物病原性卵菌は、Pythium helicoides、Pythium myriotylum、Phytophythra nicotianae、Pythium aphanidermatumからなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記セルロースフィルムの裏面を卵菌染色液に接触させる工程をさらに具備する。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記セルロースフィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、前記セルロースフィルムの表側の面および裏側の面の少なくともいずれか一方に設けられた基板によって支持されており、かつ
前記基板は、５マイクロメートルを超える直径を有する貫通孔を具備している。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記貫通孔が、８マイクロメートル以上の直径を有している。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
前記植物病原性卵菌は、植物病原性疫病菌である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。図１２は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。特許文献１に開示された糸状菌計量方法は、被験材料中の糸状菌数を計量するのに短時間の培養で糸状菌を計量し、また、正確な糸状菌を計量することができる糸状菌計量方法を提供することを目的としている。この糸状菌計量方法は、液体培養で培養した糸状菌１３、または微多孔膜支持体４の微多孔膜１上で培養した糸状菌１３の複数に伸びた偽菌糸を撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段１０で認識し解析させることにより、糸状菌１３を短時間の培養で計量できるという作用を有する。微多孔膜１は、押さえリング２およびベース３の間に挟まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２８７３３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  セルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を８時間を超えて１２時間以下の間、静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）  工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、第１容器１００の断面図を示す。
【図２】図２は、基板１７０の裏面に支持されたセルロースフィルム１０４の断面図を示す。
【図３】図３は、試験試料が供給された第１容器１００の断面図を示す。
【図４】図４は、植物病原性卵菌が表面に配置されたセルロースフィルム１０４の断面図を示す。
【図５】図５は、植物病原性卵菌がセルロースフィルム１０４を貫通した様子を示す断面図である。
【図６】図６は、卵菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図７】図７は、図６に続き、卵菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図８】図８は、セルロースフィルム１０４の裏面から卵菌を観察する様子を示す断面図である。
【図９】図９は、セルロースフィルム１０４の裏面から卵菌を観察する様子を示す断面図である。
【図１０】図１０は、実施例１Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面の顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、比較例２Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
まず、卵菌が説明される。卵菌は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌に大別される。植物病原性卵菌の例は、Pythium helicoides、Pythium myriotylum、Phytophythra nicotianae、またはPythium aphanidermatumである。これらの植物病原性卵菌は、赤焼病および根腐れ病を引き起こす。これらの植物病原性卵菌は、まず、植物の根に感染する。次いで、これらの植物病原性卵菌は根を腐らせる。最終的には、これらの植物病原性卵菌は、植物を枯らす。植物非病原性卵菌の例は、Pythium catenulatum、Pythium torulosum、またはPythium inflatumである。
【０００９】
用語「植物病原性」とは、植物に対して病原性を有していることを意味する。用語「植物非病原性」とは、植物に対して病原性を有していないことを意味する。卵菌が病原性を有しているとしても、植物に対して病原性を有していないのであれば、その卵菌は「植物非病原性」である。言い換えれば、卵菌が植物に対して悪影響を与えないのであれば、その卵菌は「植物非病原性」である。用語「植物非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「植物」を修飾しない。接頭語「非」は「病原性」を修飾する。
【００１０】
以下、本発明の実施形態が図面を参照しながら詳細に説明される。
【００１１】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有するセルロースフィルムの表側の面に試験試料が配置される。セルロースフィルムの厚みの重要性は、後述される。
【００１２】
具体的には、図１に示されるように、容器１００が用意される。容器１００は、上端にフランジ１０２を具備していることが望ましい。容器１００の底面は、セルロースフィルム１０４から形成されている。セルロースフィルム１０４は、基板（図１では図示せず）に支持されていることが望ましい。このことについては、後述される。
【００１３】
図３に示されるように、この容器１００の内部に、試験試料２００が供給される。このようにして、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に試験試料２００が配置される。試験試料２００が植物病原性卵菌２０２を含有している場合、図４に示されるように、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に植物病原性卵菌２０２が配置される。
【００１４】
試験試料２００は、固体、液体、または気体である。試験試料２００は、固体または液体であることが望ましい。固体の試験試料２００の例は、土壌または破砕された植物である。他の例は、バーミキュライト、ロックウール、またはウレタンのような農業資材である。液体の試験試料２００の例は、農業用水、水耕栽培のために用いられた溶液、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、または作業者の衣類あるいは靴を洗浄するために使用した後の液体である。
【００１５】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）の後、試験試料２００が所定の培養時間、静置される。培養時間は、８時間を超えてかつ１２時間以下である。以下、セルロースフィルム１０４の厚みおよび培養時間の重要性が以下、説明される。
【００１６】
工程（ｂ）においては、試験試料２００に含有される様々な卵菌が成長する。後述される実験例においても実証されているように、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）の条件の両者が充足される場合、植物病原性卵菌２０２は、図５に示されるように、セルロースフィルム１０４を貫通するように成長する。その結果、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れる。
条件（Ｉ）  セルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有すること。
条件（ＩＩ）  培養時間が８時間を超えてかつ１２時間以下であること
【００１７】
上記（Ｉ）および（ＩＩ）の条件の両者が充足される場合、植物非病原性卵菌は、セルロースフィルム１０４をほとんど貫通しない。そのため、植物非病原性卵菌は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂにほとんど現れない。このようにして、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【００１８】
セルロースフィルム１０４が、３．７マイクロメートルを超える厚みを有する場合、植物非病原性卵菌だけでなく植物病原性卵菌も、セルロースフィルム１０４を８〜１２時間の培養時間内に貫通しない。従って、セルロースフィルム１０４が３．７マイクロメートルを超える厚みを有する場合、選択性が失われる。セルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートル未満の厚みを有する場合、８〜１２時間の培養時間内に、植物非病原性卵菌だけでなく植物病原性卵菌も、セルロースフィルム１０４を貫通する。従って、セルロースフィルム１０４が０．５マイクロメートル未満の厚みを有する場合、選択性が失われる。
【００１９】
培養時間が４時間未満である場合、十分な数の植物病原性卵菌２０２がセルロースフィルム１０４を貫通しない。培養時間が１２時間を超えると、植物病原性卵菌だけでなく植物非病原性卵菌も、セルロースフィルム１０４を貫通する。本発明においては、培養時間は８時間を超えてかつ１２時間以下である。
【００２０】
図２に示されるように、セルロースフィルム１０４は、表側の面１０４ａおよび裏側の面１０４ｂの少なくともいずれか一方に、貫通孔１７２を具備する基板１７０を具備し得る。図２では、セルロースフィルム１０４は、表側の面に基板１７０を具備する。言い換えれば、図２では、基板１７０は、裏側の面１７０ｂにセルロースフィルム１０４を具備している。貫通孔１７２の直径は５マイクロメートルを超えることが望ましい。より望ましくは、貫通孔１７２の直径は８マイクロメートル以上であることが望ましい。貫通孔１７２の直径が５マイクロメートル以下の場合には、貫通孔１７２の内部に植物非病原性卵菌がほとんど到達せず、その結果、植物非病原性卵菌がセルロースフィルム１０４の表面に接することができない。このことについての詳細は、２０１５年０６月０２日に出願された特願２０１５−１１１８８５号および特願２０１５−１１１８８６号を参照せよ。
【００２１】
言うまでもないが、セルロースフィルム１０４がピンと張られる限り、基板１７０は不要である。言い換えれば、セルロースフィルム１０４をピンと張ることが困難である場合に、セルロースフィルム１０４をサポートするための基板１７０が用いられる。
【００２２】
参照符号１７０ａは、基板１７０の表側の面を表している。図２に示されるように、基板１７０は複数の貫通孔１７２を有することが望ましい。基板１７０の厚みは限定されないが、一例として１マイクロメートル以上５００マイクロメートル以下である。セルロースフィルム１０４は非常に薄い。しかし、このような基板１７０上にセルロースフィルム１０４が配置されると、セルロースフィルム１０４の取り扱いが容易となる。
【００２３】
卵菌の培養を加速させるために、試験試料２００に培地が供給され得る。具体的には、試験試料２００を含有する容器１００の内部に培地が供給され得る。培地は液体であることが望ましい。培地は、工程（ｂ）において供給され得る。これに代えて、培地は工程（ｂ）よりも前に供給され得る。言い換えれば、培地は工程（ａ）において供給され得る。培地は工程（ａ）の前に容器１００の内部に供給されても良い。
【００２４】
図６は、卵菌の培養を加速させる他の方法を示す。図６に示されるように、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂを液体の培地３０２に接触させることが望ましい。まず、液体の培地３０２を内部に有する第２容器３００が用意される。以下、第２容器３００から区別するため、容器１００は「第１容器１００」と呼ばれる。フランジ１０２の下面が第２容器３００の上端に接触するように、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる。言い換えれば、第１容器１００が第２容器３００の上端によって支持される。このようにして、液体の培地３０２がセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に挟まれる。
【００２５】
あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に液体の培地３０２が供給されても良い。
【００２６】
液体の培地３０２に代えて、粘性を有する固体の培地も用いられ得る。図６に示されるように、固体の培地３０４および液体の培地３０２の両者が用いられ得る。この場合、液体の培地３０２が固体の培地３０４およびセルロースフィルム１０４の間に挟まれる。図５に示されるように、裏面１０４ｂに現れた植物病原性卵菌の培養が、液体培地３０２および固体培地３０４の少なくとも一方により加速される。
【００２７】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の後、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂが観察される。光学顕微鏡を用いて裏面１０４ｂが観察されることが望ましい。
【００２８】
工程（ｂ）において説明されたように、植物病原性卵菌２０２は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。一方、植物非病原性卵菌は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このように、本発明では、植物病原性卵菌２０２は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに選択的に現れる。
【００２９】
言い換えれば、植物病原性卵菌２０２は、セルロースフィルム１０４を貫通する。一方、植物非病原性卵菌は、セルロースフィルム１０４を貫通しない。そのため、植物非病原性卵菌は、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このようにして、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【００３０】
工程（ｃ）では、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れているかどうかが観察される。
【００３１】
具体的には、以下のようにして、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れているかどうかが観察される。
【００３２】
図８に示されるように、セルロースフィルム１０４の表面１０４ａ上に配置された光源５００からの光をセルロースフィルム１０４に照射しながら、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、植物病原性卵菌２０２が光学的に観察される。
【００３３】
第２容器３００から液体の培地３０２および固体の培地３０４が除去される。次いで、第２容器３００の内部に、卵菌蛍光液４０２が添加される。次いで、図７に示されるように、第１容器１００は、卵菌蛍光液４０２を内部に有する第２容器３００に重ね合わされる。あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に卵菌蛍光液４０２が供給されても良い。
【００３４】
セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性卵菌２０２の一部分は、卵菌染色液４０２により染色される。第二容器３００と第一容器１００はセルロースフィルム１０４によって隔てられているので、卵菌蛍光液４０２は第１容器１００の内部には広がらない。従って、第１容器１００に含有されている植物非病原性卵菌は、卵菌蛍光液４０２により染色されない。
【００３５】
図９に示されるように、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された落射蛍光顕微鏡６００を用いて、卵菌蛍光剤により染色されている植物病原性卵菌２０２が観察される。言うまでもないが、植物病原性卵菌２０２は卵菌蛍光剤を用いずに観察され得る。
【００３６】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、工程（ｃ）においてセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに卵菌が見いだされた場合には、試験試料は植物病原性卵菌を含有すると判定される。言うまでもないが、工程（ｃ）においてセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに卵菌が見いだされなかった場合には、試験試料は植物病原性卵菌を含有しないと判定される。
【００３７】
（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。
【００３８】
（実験例１）
（Pythium aphanidermatumの培養）
植物病原菌の一種であるPythium aphanidermatumが、乾燥芝草とともにコーンミール寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で２４時間静置された。Pythium aphanidermatumは岐阜大学流域圏科学研究センターに所属する景山教授より与えられた。乾燥芝草は、高温高圧滅菌法で滅菌された高麗芝を摂氏６０度でおよそ２４時間かけて乾燥することにより得られた。
【００３９】
次いで、偽菌糸が付着した乾燥芝草を培地からつまみ出した。つまみ出された乾燥芝草は、ペトリ皿に含まれる純水の上面上に浮かべた。純水の容積は２０ミリリットルであった。
【００４０】
１８時間後、ペトリ皿に含まれる水が光学顕微鏡で観察された。その結果、ペトリ皿に含まれる水にPythium aphanidermatumの遊走子が放出されていることが確認された。このようにして、Pythium aphanidermatumを含有する水溶液が得られた。以下、この水溶液は、「植物病原菌水溶液」と呼ばれる。
【００４１】
（培地の用意）
第２容器３００に、６５０マイクロリットルのポテトデキストロース培地が液体の培地３０２として添加された。このようにして、液体の培地３０２を含む第２容器３００が用意された。
【００４２】
（実験例１）
実験例１は、実施例１Ａ〜実施例１Ｃ、参考例１Ｄ、比較例１Ｅ、参考例１Ｆ〜参考例１Ｈ、実施例１Ｉ、比較例１Ｊ〜比較例１Ｋからなる。
【００４３】
（実施例１Ａ）
図１に示される第１容器１００が以下のように用意された。
【００４４】
まず、セルロース（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手、商品名：Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１）がイオン液体に溶解され、２％の濃度を有するセルロース溶液が調製された。イオン液体は、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手）であった。
【００４５】
セルロース溶液は、摂氏６０度に加温された。次に、セルロース溶液が、底面にポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器（ミリポア社より入手、商品名：Millicell PIEP 12R 48）の裏面にスピンコート法により３０秒間、２０００ｒｐｍの回転速度で塗布された。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、基板１７０として機能した。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、８マイクロメートルの直径を有する複数の貫通孔１７２をランダムに有していた。このようにして、ポリエチレンテレフタラートフィルムの裏側の面に、２．０マイクロメートルの厚みを有するセルロースフィルム１０４が形成された。
【００４６】
容器は、エタノール中で１２時間、室温で静置された。このようにして、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅは、エタノールに置換された。言い換えれば、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅがセルロースフィルム１０４から除去された。
【００４７】
最後に、容器は真空デシケーター内で乾燥された。このようにして、図１に示される第１容器１００が得られた。図１においては、基板１７０として機能するポリエチレンテレフタラートフィルムが図示されていないことに留意せよ。
【００４８】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂは、液体の培地３０２に接していた。続いて、第１容器１００の内部に、２００マイクロリットルの体積を有する水が添加された。さらに、２００個のPythium aphanidermatumの遊走子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【００４９】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で１０時間静置された。言い換えれば、実施例１Ａでは、培養時間は１０時間であった。
【００５０】
６００マイクロリットルの体積を有する菌体結合性蛍光剤（商品名：Calcofluor White (BD261195)会社名：ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）が、第２容器３００の内部に添加された。菌体結合性蛍光剤の終濃度は０．００５％であった。
【００５１】
セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂは、菌体結合性蛍光剤に接していた。第１容器１００は、摂氏２５度で１０分間静置された。第１容器１００と第２容器３００はセルロースフィルム１０４によって隔離されているので、菌体結合性蛍光剤は第１容器１００の内部には広がらなかった。
【００５２】
その後、第１容器１００が第２容器３００から分離された。第２容器３００の内部に含まれる菌体結合性蛍光剤が除去された。次いで、第２容器３００の内部に、緩衝液が添加された。以下の表１は、この緩衝液に含有される成分および濃度を示す。
【００５３】
【表１】
2017029132.tif 000003
【００５４】
図９に示されるように、蛍光顕微鏡６００（モレキュラーデバイスジャパン株式会社より入手、商品名：ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＭＩＣＲＯ）を用いて、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂが観察された。表２は、蛍光顕微鏡６００に用いられたフィルタおよびレンズを示す。
【００５５】
【表２】
2017029132.tif 000004
【００５６】
図１０は、実施例１Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１０に見られるように、Pythium aphanidermatumの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れている。これは、Pythium aphanidermatumの偽菌糸がセルロースフィルム１０４を貫通したことを意味する。
【００５７】
裏面１０４ｂに現れたPythium aphanidermatumの偽菌糸の数が目視により数えられた。実施例１Ａは２回〜３回繰り返された。その結果、裏面１０４ｂに現れたPythium aphanidermatumの偽菌糸の数の平均値は１１３．０個であった。
【００５８】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ｂでは、セルロース溶液が３％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、３．７マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００５９】
（実施例１Ｃ）
実施例１Ｃでは、セルロース溶液が１％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６０】
（参考例１Ｄ）
参考例１Ｄでは、セルロース溶液が０．５％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、０．２マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６１】
（比較例１Ｅ）
比較例１Ｅでは、セルロース溶液が５％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、１２．４マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６２】
（参考例１Ｆ）
参考例１Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６３】
（参考例１Ｇ）
参考例１Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６４】
（参考例１Ｈ）
参考例１Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６５】
（実施例１Ｉ）
実施例１Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６６】
（比較例１Ｊ）
比較例１Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６７】
（比較例１Ｋ）
比較例１Ｉでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００６８】
（実験例２）
実験例２では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium catenulatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumとは異なり、Pythium catenulatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium catenulatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例２は、比較例２Ａ〜比較例２Ｋからなる。
【００６９】
（比較例２Ａ）
比較例２Ａでは、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium catenulatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００７０】
図１１は、比較例２Ａにおけるセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１１に見られるように、Pythium catenulatumの偽菌糸はほとんど裏面１０４ｂに現れなかった。これは、Pythium catenulatumの偽菌糸がセルロースフィルム１０４を貫通しなかったことを意味する。
【００７１】
（比較例２Ｂ）
比較例２Ｂでは、セルロース溶液が３％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、３．７マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７２】
（比較例２Ｃ）
比較例２Ｃでは、セルロース溶液が１％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７３】
（比較例２Ｄ）
比較例２Ｄでは、セルロース溶液が０．５％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、０．２マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７４】
（比較例２Ｅ）
比較例２Ｅでは、セルロース溶液が５％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が、１２．４マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７５】
（比較例２Ｆ）
比較例２Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７６】
（比較例２Ｇ）
比較例２Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７７】
（比較例２Ｈ）
比較例２Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７８】
（比較例２Ｉ）
比較例２Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００７９】
（比較例２Ｊ）
比較例２Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００８０】
（比較例２Ｋ）
比較例２Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、比較例２Ａと同様の実験が行われた。
【００８１】
（実験例３）
実験例３では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium helicoidesの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumと同様、Pythium helicoidesもまた、植物病原菌の１種である。Pythium helicoidesの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例３は、実施例３Ａ、参考例３Ｆ〜参考例３Ｈ、実施例３Ｉ、比較例３Ｊ、および比較例３Ｋからなる。
【００８２】
（実施例３Ａ）
実施例３Ａでは、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium helicoidesの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００８３】
（参考例３Ｆ）
参考例３Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８４】
（参考例３Ｇ）
参考例３Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８５】
（参考例３Ｈ）
参考例３Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８６】
（実施例３Ｉ）
実施例３Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８７】
（比較例３Ｊ）
比較例３Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８８】
（比較例３Ｋ）
比較例３Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、実施例３Ａと同様の実験が行われた。
【００８９】
（実験例４）
実験例４では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium myriotylumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumと同様、Pythium myriotylumもまた、植物病原菌の１種である。Pythium myriotylumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例４は、実施例４Ａ、参考例４Ｆ〜参考例４Ｈ、実施例４Ｉ、比較例４Ｊ、および比較例４Ｋからなる。
【００９０】
（実施例４Ａ）
実施例４Ａでは、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium myriotylumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００９１】
（参考例４Ｆ）
参考例４Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９２】
（参考例４Ｇ）
参考例４Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９３】
（参考例４Ｈ）
参考例４Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９４】
（実施例４Ｉ）
実施例４Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９５】
（比較例４Ｊ）
比較例４Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９６】
（比較例４Ｋ）
比較例４Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、実施例４Ａと同様の実験が行われた。
【００９７】
（実験例５）
実験例５では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Phytophythra nicotianaeの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumと同様、Phytophythra nicotianaeもまた、植物病原菌の１種である。Phytophythra nicotianaeの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例５は、実施例５Ａ、参考例５Ｆ〜参考例５Ｈ、実施例５Ｉ、比較例５Ｊ、および比較例５Ｋからなる。
【００９８】
（実施例５Ａ）
実施例５Ａでは、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium nicotianaeの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【００９９】
（参考例５Ｆ）
参考例５Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１００】
（参考例５Ｇ）
参考例５Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１０１】
（参考例５Ｈ）
参考例５Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１０２】
（実施例５Ｉ）
実施例５Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１０３】
（比較例５Ｊ）
比較例５Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１０４】
（比較例５Ｋ）
比較例５Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、実施例５Ａと同様の実験が行われた。
【０１０５】
（実験例６）
実験例６では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumとは異なり、Pythium torulosumは、植物非病原菌の１種である。Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例６は、比較例６Ａ、および比較例６Ｆ〜比較例６Ｋからなる。
【０１０６】
（比較例６Ａ）
比較例６Ａでは、水溶液が、Pythium aphanidermatumではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【０１０７】
（比較例６Ｆ）
比較例６Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１０８】
（比較例６Ｇ）
比較例６Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１０９】
（比較例６Ｈ）
比較例６Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１１０】
（比較例６Ｉ）
比較例６Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１１１】
（比較例６Ｊ）
比較例６Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１１２】
（比較例６Ｋ）
比較例６Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、比較例６Ａと同様の実験が行われた。
【０１１３】
（実験例７）
実験例７では、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium inflatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium aphanidermatumとは異なり、Pythium inflatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium inflatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。実験例７は、比較例７Ａ、および比較例７Ｆ〜比較例７Ｋからなる。
【０１１４】
（比較例７Ａ）
比較例７Ａでは、水溶液が、Pythium aphanidermatumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。
【０１１５】
（比較例７Ｆ）
比較例８Ｆでは、培養時間が４時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１１６】
（比較例７Ｇ）
比較例７Ｇでは、培養時間が６時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１１７】
（比較例７Ｈ）
比較例７Ｈでは、培養時間が８時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１１８】
（比較例７Ｉ）
比較例７Ｉでは、培養時間が１２時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１１９】
（比較例７Ｊ）
比較例７Ｊでは、培養時間が２時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１２０】
（比較例７Ｋ）
比較例７Ｋでは、培養時間が２４時間であったこと以外は、比較例７Ａと同様の実験が行われた。
【０１２１】
以下の表３〜表５は、上記の実験例において、セルロースフィルム１０４を貫通した偽菌糸の数を示す。
【０１２２】
【表３】
2017029132.tif 000005
【０１２３】
【表４】
2017029132.tif 000006
【０１２４】
【表５】
2017029132.tif 000007
【０１２５】
用語「計数不能」とは、偽菌糸が枝分かれしてセルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂ上で広がったため、セルロースフィルム１０４への偽菌糸の貫通点を観察することができなかったことを意味する。
【０１２６】
表３〜表５から明らかなように、セルロースフィルム１０４が０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有する場合、セルロースフィルム１０４の裏面に植物病原性卵菌が現れる。一方、この厚みの範囲内では、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物非病原性卵菌はほとんど現れない。従って、セルロースフィルム１０４が０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有する場合、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【０１２７】
培養時間が８時間以上１２時間以下である場合、セルロースフィルム１０４の裏面に植物病原性卵菌が現れる。一方、この培養時間の範囲内では、セルロースフィルム１０４の裏面１０４ｂに植物非病原性卵菌はほとんど現れない。従って、培養時間が８時間を超えて１２時間以下である場合、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【０１２８】
従って、植物病原性卵菌が選択的に裏面１０４ｂに現れる現象のためには、以下の条件（Ｉ）および（ＩＩ）の両者が充足されることが必要とされる。
条件（Ｉ）  セルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有すること。
条件（ＩＩ）  培養時間が８時間を超えて１２時間以下であること
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、農業用水または土壌のような試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを簡単に判定するために用いられ得る。
【符号の説明】
【０１３０】
１００  第１容器
１０２  フランジ
１０４  セルロースフィルム
１０４ａ  表側の面
１０４ｂ  裏側の面
１７０  基板
１７０ａ  表側の面
１７０ｂ  裏側の面
２００  試験試料
２０２  植物病原性卵菌
２０２ａ  植物病原性卵菌の一部分
３００  第２容器
３０２  液体の培地
３０４  固体の培地
４０２  卵菌染色液
５００  光源
６００  顕微鏡
【図１】
2017029132.tif 000008
【図２】
2017029132.tif 000009
【図３】
2017029132.tif 000010
【図４】
2017029132.tif 000011
【図５】
2017029132.tif 000012
【図６】
2017029132.tif 000013
【図７】
2017029132.tif 000014
【図８】
2017029132.tif 000015
【図９】
2017029132.tif 000016
【図１０】
2017029132.tif 000017
【図１１】
2017029132.tif 000018
【図１２】
2017029132.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月27日(2016.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  セルロースフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を８時間を超えて１２時間以下の間、静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）  工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程、
ここで、前記植物病原性卵菌は、Pythium helicoides、Pythium myriotylum、Phytophythra nicotianae、Pythium aphanidermatumからなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項２】
前記植物病原性卵菌は、植物病原性フハイカビである。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記セルロースフィルムの裏面を卵菌染色液に接触させる工程をさらに具備する。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記セルロースフィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記セルロースフィルムは、前記セルロースフィルムの表側の面および裏側の面の少なくともいずれか一方に設けられた基板によって支持されており、かつ
前記基板は、５マイクロメートルを超える直径を有する貫通孔を具備している。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記貫通孔が、８マイクロメートル以上の直径を有している。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記植物病原性卵菌は、植物病原性疫病菌である。