(57)【要約】【課題】２２Ｋヒト成長ホルモンと比較して，プロラクチン様活性が抑制され，且つ血中での半減期が長い持続型のヒト成長ホルモン製剤を有効成分として含有してなる薬剤を提供すること。【解決手段】ヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部を有する融合タンパク質であって，成長促進活性を有する融合タンパク質。特に，ヒト成長ホルモン部のＣ末端側にリンカー配列を介して２０Ｋヒト成長ホルモン部が結合したものである，融合タンパク質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部とを有する融合タンパク質であって，成長促進活性を有する融合タンパク質。
【請求項２】
該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に８個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に４個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
【請求項３】
該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１〜８個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１〜８個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
【請求項４】
該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
該ヒト血清アルブミン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
【請求項６】
該ヒト血清アルブミン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
【請求項７】
該ヒト血清アルブミン部が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
該ヒト血清アルブミン部が，配列番号２で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端から３１９番目のアミノ酸残基のチロシンがプロリン以外のアミノ酸残基に置換され，且つＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたアミノ酸配列を含むものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
該ヒト血清アルブミン部が，配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
該ヒト血清アルブミン部と該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，リンカー部を介して結合しているものである，請求項１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
該リンカー部が，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーからなるものである，請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
該リンカー部が非ペプチドリンカーからなるものであり，該非ペプチドリンカーが，ポリエチレングリコール又はその誘導体からなるものである，請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
一本鎖ポリペプチドである，請求項１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
該ヒト血清アルブミン部が，該成長ホルモン部のＮ末端側に位置するものである，請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
該成長ホルモン部が，該ヒト血清アルブミン部のＮ末端側に位置するものである，請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
一本鎖ポリペプチドであって，該ヒト血清アルブミン部と該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，リンカー部を介して結合してなるものである，請求項１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
該ヒト血清アルブミン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合してなるものである，請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該ヒト血清アルブミン部のＮ末端がペプチド結合により結合してなるものである，請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
該リンカー部が，１〜５０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーからなるものである，請求項１６乃至１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が２〜１０回反復したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が２〜６回反復したアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が３〜５回反復したアミノ酸配列。
【請求項２１】
該リンカー部が，以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
【請求項２２】
該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列に１又は２個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
【請求項２３】
該リンカー部が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
【請求項２５】
該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜５個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
【請求項２６】
該リンカー部が，配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる，請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
【請求項２８】
該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる，請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
【請求項２９】
該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，配列番号３６で示されるアミノ酸配列からなる，請求項１に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，血清アルブミンと２０Ｋ成長ホルモンとを結合させた融合タンパク質に関し，例えば，直接又はリンカー配列を介してヒト血清アルブミンのＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモンのＮ末端とを結合させた融合タンパク質及び当該融合タンパク質を有効成分として含む低身長症等の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は，その成熟型が５８５個のアミノ酸からなるタンパク質である。ＨＳＡは，血漿タンパク質の中では最も多い成分で，血漿中での半減期が１４〜２０日と長い。ＨＳＡは，血中に含まれる脂肪酸等の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して，これらを運搬する機能を有する。薬剤等の低分子物質は，各種臓器に取り込まれて代謝・排泄される。しかし，ＨＳＡと結合した物質は，一般的に臓器に取り込まれ難くなり，血中をより長時間循環できるようになる。
【０００３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）には，天然のバリアントが複数あることが知られている。ヒト血清アルブミンＲｅｄｈｉｌｌはその一つである（非特許文献１，２）。ヒト血清アルブミンＲｅｄｈｉｌｌは，５８５個のアミノ酸からなる上記の通常のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列と比べて，そのＮ末端側から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり，且つそのＮ末端にアルギニン残基が一つ付加している点で異なり，５８６個のアミノ酸からなる。上記のアラニンのトレオニンへの変化により，アルブミンＲｅｄｈｉｌｌではそのアミノ酸配列中にＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒで表される配列が生じ，この配列中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ−結合型グリコシド化される。このためアルブミンＲｅｄｈｉｌｌは，上記の通常のヒト血清アルブミンと比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。
【０００４】
酵素等のタンパク質をＨＳＡと融合させることにより，タンパク質の血漿中での安定性を増加させる方法が報告されている（非特許文献１，特許文献１，２）。ＨＳＡと酵素等との融合タンパク質は，ＨＳＡをコードする遺伝子と，酵素等をコードする遺伝子とをインフレームに結合させたＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した形質転換細胞を培養することにより，培地中又は細胞内に組換えタンパク質として作製される。
【０００５】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合させて血漿中での安定性を増加させたタンパク質の例としては，ＨＳＡとＧ−ＣＳＦとの融合タンパク質（特許文献３），ＨＳＡとインターフェロンとの融合タンパク質（特許文献４），ＨＳＡとＧＬＰ−１との融合タンパク質（特許文献５），ＨＳＡとインスリンとの融合タンパク質（特許文献６）等がある。
【０００６】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は，視床下部の制御下で前脳下垂体から分泌される分子量が約２２ｋＤのタンパク質であり，内部で二つのジスルフィド結合により架橋された１９１個のアミノ酸からなる単鎖のポリペプチドである。ｈＧＨは，軟骨形成促進，タンパク質同化促進等の成長促進活性を示すほか，体組成及び脂質代謝改善作用を示す。ｈＧＨの分泌が少ない小児は，健常児と比較して低身長を呈する成長ホルモン分泌不全性低身長症を発症する。
【０００７】
ｈＧＨ遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換えタンパク質として製造された分子量が約２２ｋＤのｈＧＨを有効成分として含有する製剤（ｈＧＨ製剤）が，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，骨端線閉鎖を伴わないＳＧＡ（Small-for-Gestational Age）性低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床応用されている。ｈＧＨ製剤は，皮下又は筋肉内に投与され，血中を循環し，その成長促進活性により患者の成長を促進する効果を発揮する。また，ｈＧＨ製剤は，成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床応用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では，脂質代謝異常等の異常が認められるが，ｈＧＨ製剤の投与により，患者の脂質代謝等が正常化する等して，患者のＱＯＬが改善される。成長ホルモン分泌不全性低身長症，成人成長ホルモン分泌不全症等のｈＧＨ製剤としては，例えば，グロウジェクト（登録商標）がある。
【０００８】
視床下部の制御下で前脳下垂体から分泌されるｈＧＨには，分子量が約２２ｋＤのｈＧＨ（２２ＫｈＧＨ）の他に，２２ＫｈＧＨを構成する１９１個のアミノ酸のうち，アミノ酸配列のＮ末端から数えて３２番目〜４６番目の１５個のアミノ酸が欠失した，分子量が約２０ｋＤのバリアント（２０ＫｈＧＨ）がある。血中での２０ＫｈＧＨの全ｈＧＨ中における存在比率は概ね５〜１５％である。また，２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨと同等の成長促進活性を示すことが知られている。
【０００９】
ｈＧＨに関しても，ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合させることにより，血漿中での安定性が増加する（特許文献４，５及び７〜１０）。但し，これらの報告は，いずれもＨＳＡと２２ＫｈＧＨとの融合タンパク質に関するものである。
【００１０】
ｈＧＨの血漿中での安定性を増加させる試みは，臨床上の要請によるものである。ｈＧＨの血漿中における半減期は２０分未満とされており，患者に投与されたｈＧＨは，速やかに血中から消失する。このため，ｈＧＨの薬効を患者で実質的に発揮させるには，ｈＧＨを週に３回筋肉内に又は毎日皮下に投与する必要がある。このような頻繁な投与は患者の負担となっている。従って，ｈＧＨの血漿中における安定性を増加させて半減期を延長させることにより患者へのｈＧＨの投与回数を減らすことができれば，患者の負担を大幅に軽減させることができ，好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表平７−５０３３６８号公報
【特許文献２】特開平３−１７８９９８号公報
【特許文献３】特表平７−５０３８４４号公報
【特許文献４】特表２００３−５３０８３８号公報
【特許文献５】特表２００５−５１４０６０号公報
【特許文献６】特表２０１０−５０００３１号公報
【特許文献７】特表２０００−５０２９０１号公報
【特許文献８】特表２００８−５１８６１５号公報
【特許文献９】特表２０１３−５０１０３６号公報
【特許文献１０】特表２０１３−５１８０３８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Poznansky MJ. et al., FEBS Letter. 239, 18-22 (1988)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記背景の下で，本発明の一目的は，ヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン（２０ＫｈＧＨ）部とを有する融合タンパク質を有効成分として含む，プロラクチン様活性の低い，成長促進活性を有する薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，ヒト血清アルブミンのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを結合させた融合タンパク質のプロラクチン様活性が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して低いこと等を，見出し本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）ヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部とを有する融合タンパク質であって，成長促進活性を有する融合タンパク質。
（２）該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，上記１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に８個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に４個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
（３）該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，上記１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１〜８個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１〜８個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（４）該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記１に記載の融合タンパク質。
（５）該ヒト血清アルブミン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，上記１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
（６）該ヒト血清アルブミン部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，上記１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（７）該ヒト血清アルブミン部が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
（８）該ヒト血清アルブミン部が，配列番号２で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端から３１９番目のアミノ酸残基のチロシンがプロリン以外のアミノ酸残基に置換され，且つＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたアミノ酸配列を含むものである，上記１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
（９）該ヒト血清アルブミン部が，配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記１乃至４のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１０）該ヒト血清アルブミン部と該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，リンカー部を介して結合しているものである，上記１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１１）該リンカー部が，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーからなるものである，上記１０に記載の融合タンパク質。
（１２）該リンカー部が非ペプチドリンカーからなるものであり，該非ペプチドリンカーが，ポリエチレングリコール又はその誘導体からなるものである，上記１１に記載の融合タンパク質。
（１３）一本鎖ポリペプチドである，上記１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１４）該ヒト血清アルブミン部が，該成長ホルモン部のＮ末端側に位置するものである，上記１３に記載の融合タンパク質。
（１５）該成長ホルモン部が，該ヒト血清アルブミン部のＮ末端側に位置するものである，上記１３に記載の融合タンパク質。
（１６）一本鎖ポリペプチドであって，該ヒト血清アルブミン部と該２０Ｋヒト成長ホルモン部が，リンカー部を介して結合してなるものである，上記１乃至９のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１７）該ヒト血清アルブミン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合してなるものである，上記１６に記載の融合タンパク質。
（１８）該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該ヒト血清アルブミン部のＮ末端がペプチド結合により結合してなるものである，上記１６に記載の融合タンパク質。
（１９）該リンカー部が，１〜５０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーからなるものである，上記１６乃至１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２０）該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである，上記１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が２〜１０回反復したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が２〜６回反復したアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列が３〜５回反復したアミノ酸配列。
（２１）該リンカー部が，以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
（２２）該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）該配列番号４で示されるアミノ酸配列に１又は２個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（２３）該リンカー部が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質。
（２４）該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
（２５）該リンカー部が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜５個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（２６）該リンカー部が，配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーからなるものである，上記１９に記載の融合タンパク質。
（２７）該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる，上記１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が決失し，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換され，且つ該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸が付加した，アミノ酸配列。
（２８）該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる，上記１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が決失したアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；及び，
（ｃ）配列番号３６で示されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列。
（２９）該ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合するものであり，該リンカー部がペプチドリンカーからなるものである，配列番号３６で示されるアミノ酸配列からなる，上記１に記載の融合タンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば，２０Ｋヒト成長ホルモンをヒト血清アルブミンと融合させることにより，２２Ｋヒト成長ホルモンと比較してプロラクチン様活性が低減された，成長ホルモン分泌不全性低身長症等の治療剤として使用することのできる持続型成長ホルモン製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｎ末端側から順に，ＨＳＡ部，リンカー部及び２０ＫｈＧＨ部を有する一本鎖ポリペプチドの融合タンパク質を模式的に示す図。図中，Ａはヒト血清アルブミン部，Ｂはリンカー部，Ｃは２０ＫｈＧＨ部，Ｎ-はＮ末端，-ＣはＣ末端をそれぞれ示す。
【図２】ｐＥ−ｎｅｏベクターの構築方法を示す流れ図。
【図３】ｐＥ−ｈｙｇｒベクターの構築方法を示す流れ図。
【図４−１】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−２】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−３】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−４】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−５】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−６】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−７】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−８】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図４−９】ｐＥ−ＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図５】ｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏの構築方法を示す流れ図。
【図６】ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクター（ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ））の構築方法を示す流れ図。
【図７】ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ発現用ベクター（ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ））の構築方法を示す流れ図。
【図８】ＨＳＡ−[ｌｉｎｋｅｒ]−２０ＫｈＧＨ発現用ベクター（ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ−[ｌｉｎｋｅｒ]−２０ＫｈＧＨ））の構築方法を示す流れ図。
【図９】ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定結果を示す図。縦軸は４９０ｎｍの吸光度，横軸は各検体の濃度（ｎＭ）を示す。
【図１０】ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いたプロラクチン（ＰＲＬ）様活性の測定結果を示す図。縦軸は４９０ｎｍの吸光度，横軸は各検体の濃度（ｎＭ）を示す。
【図１１】細胞増殖活性に対するｈＧＨＢＰの阻害活性を測定した結果を示す図。縦軸はｈＧＨＢＰが非添加のときの測定値を１００％としたときの４９０ｎｍの吸光度，横軸はｈＧＨＢＰの濃度（ｎＭ）を示す。
【図１２】カニクイザルを用いたＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の薬物動態解析の結果を示す図。縦軸はカニクイザル血漿中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ），横軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質を投与後の経過時間（日）を示す。図内の縦棒は標準偏差を示す。
【図１３】カニクイザルを用いたＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の薬効解析の結果を示す図。縦軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質を投与前の濃度を１００％としたときの，カニクイザル血漿中のＩＧＦ−１の濃度（％），横軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質を投与後の経過時間（日）を示す。図内の縦棒は標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は，ヒト血清アルブミン又はその変異体を含むポリペプチドと，２０Ｋヒト成長ホルモン又はその変異体を含むポリペプチドとを結合させた，融合タンパク質に関する。ここで，「ポリペプチドを融合させる」というときは，直接又はリンカー部を介して間接的に，共有結合により異なるポリペプチドを結合させることをいう。
【００１８】
２つの異なるポリペプチドを結合させる方法としては，例えば，一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換えタンパク質として発現させる方法が一般的である。得られた組換えタンパク質は，２つのポリペプチドが，直接又は別のアミノ酸配列を介してペプチド結合した，一本鎖ポリペプチドである。
【００１９】
その他，２つの異なるポリペプチドを結合させる方法としては，２つのポリペプチドを，例えば組換えタンパク質として別々に作製し，次いで，これら２つのポリペプチドを，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，例えば，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせた化合物を用いることができる。
【００２０】
本発明において，「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」というときは，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンに加え，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等のヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が決失，他のアミノ酸へ置換等されたＨＳＡの変異体も含まれる。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。例えば，配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸が決失した，５８４個のアミノ酸からなるものも，ヒト血清アルブミンに含まれる。また，これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望のＨＳＡの変異体とすることもできる。更には，野生型のＨＳＡ又はその変異体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものも，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等のヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，本発明におけるＨＳＡに含まれる。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望のＨＳＡの変異体とすることもできる。
【００２１】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせたＨＳＡの変異体としては，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００２２】
なお，本明細書中において，アミノ酸の他のアミノ酸への置換は，保存的又は非保存的アミノ酸置換のいずれであってもよい。保存的アミノ酸置換は，アミノ酸の極性，電荷，溶解度，疎水性，親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行われる。例えば，保存的アミノ酸置換としては，芳香族アミノ酸（Phe, Trp, Tyr），脂肪族アミノ酸（Ala, Leu, Ile, Val），極性アミノ酸（Gln, Asn），塩基性アミノ酸（Lys, Arg, His），酸性アミノ酸（Glu, Asp），水酸基を有するアミノ酸（Ser, Thr）などの同じグループに分類されるアミノ酸への置換が挙げられる。更に，保存的アミノ酸置換としては，疎水性アミノ酸（Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, Met），極性中性アミノ酸（Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Gln, Asn），ペプチド鎖の配向に影響を及ぼし得るアミノ酸（Pro, Gly）などの同じグループに分類されるアミノ酸への置換が挙げられる。
【００２３】
ヒト血清アルブミンの変異体の好ましい一形態として，配列番号２で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたものが挙げられる。また，配列番号２で示される野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３１９番目のアミノ酸残基のチロシンがプロリン以外のアミノ酸残基に置換され，且つＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたものも，ＨＳＡの変異体の好ましい一形態である。これら変異体では，アミノ酸の置換によりＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）で表わされるトリペプチド配列が生じる。このトリペプチド配列中のアスパラギン残基は，これら変異体をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み哺乳動物細胞等の真核細胞で発現させたとき，Ｎ−結合型糖鎖によりグリコシル化され得る。
【００２４】
本発明において，「ヒト血清アルブミンＲｅｄｈｉｌｌ」（ＨＳＡ−Ｒｅｄｈｉｌｌ）の語は，ヒト血清アルブミンのバリアントであって，配列番号４６で示される５８６個のアミノ酸残基からなるものを意味する。ヒト血清アルブミンＲｅｄｈｉｌｌは，配列番号２で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり且つＮ末端にアルギニン残基が一つ付加したものに相当する。アルブミンＲｅｄｈｉｌｌでは，このようにアラニンがトレオニンとなることにより，そのアミノ酸配列中にＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒで表される配列が生じ，この配列中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ−結合型グリコシド化される。このためアルブミンＲｅｄｈｉｌｌは，通常の野生型アルブミン（配列番号２）と比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。本発明において「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」というときは，このＨＳＡ−Ｒｅｄｈｉｌｌも含まれる。
【００２５】
ヒト脳下垂体から分泌されるヒト成長ホルモンには，主に２２Ｋヒト成長ホルモンと２０Ｋヒト成長ホルモンの分子量の異なる２種類がある。２２Ｋ成長ホルモンは，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する，１９１個のアミノ酸から構成されるタンパク質である。通常，「ヒト成長ホルモン」又は「ｈＧＨ」というときは，この２２Ｋ成長ホルモンのことを意味するが，以下の本明細書中において，単に「ヒト成長ホルモン」又は「ｈＧＨ」というときは，２２Ｋヒト成長ホルモンと２０Ｋヒト成長ホルモンのいずれもが含まれる。
【００２６】
野生型の２０Ｋヒト成長ホルモンは，配列番号３で示される２２Ｋ成長ホルモンを構成する１９１個のアミノ酸のうち，アミノ酸配列のＮ末端から数えて３２番目〜４６番目の１５個のアミノ酸が欠失した，配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する１７６個のアミノ酸から構成される，成長促進活性を有するタンパク質である。但し，本発明において，「２０Ｋヒト成長ホルモン」又は「２０ＫｈＧＨ」というときは，配列番号１で示される野生型の２０ＫｈＧＨに加え，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，他のアミノ酸へ置換等された２０ＫｈＧＨの変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１又は２個である。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望の２０ＫｈＧＨの変異体とすることもできる。
【００２７】
更には，野生型の２０Ｋヒト成長ホルモン又はその変異体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものであって成長促進活性を有するものも，本発明における２０Ｋヒト成長ホルモン（２０ＫｈＧＨ）に含まれる。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望の２０ＫｈＧＨの変異体とすることもできる。
【００２８】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせた２０Ｋヒト成長ホルモンの変異体としては，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に８個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に４個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００２９】
本発明の融合タンパク質は，ヒト血清アルブミンと２０ＫｈＧＨとを融合させた融合タンパク質であり，ヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部の各部を有する。
【００３０】
ここで，「ヒト血清アルブミン部」又は「ＨＳＡ部」というときは，当該融合タンパク質において，ＨＳＡに由来するアミノ酸配列を含む部分であって，血中に含まれる内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等のヒト血清アルブミンとしての機能を発揮する部分のことをいう。ここで，「ＨＳＡに由来するアミノ酸配列」とは，配列番号２で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に加え，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，他のアミノ酸へ置換等されたＨＳＡの変異体のアミノ酸配列も含まれる。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。例えば，配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸が決失した，５８４個のアミノ酸からなるものも，ＨＳＡに由来するアミノ酸配列に含まれる。また，これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望のＨＳＡの変異体のアミノ酸配列とすることもできる。
【００３１】
更には，野生型のＨＳＡ又はその変異体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものも，ＨＳＡに由来するアミノ酸配列に含まれる。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望のＨＳＡの変異体とすることもできる。但し，下記に詳述するリンカー部を有する一本鎖ポリペプチドとして融合タンパク質を作製した場合，リンカー部に属すべきとされ得るアミノ酸配列は，優先的にリンカー部に属するものとし，ＨＳＡ部には属さないものとする。
【００３２】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせたＨＳＡの変異体としては，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号２で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００３３】
ヒト血清アルブミン部として用いることのできるヒト血清アルブミンの変異体の好ましい一形態として，配列番号２で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたものが挙げられる。また，配列番号２で示される野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３１９番目のアミノ酸残基のチロシンがプロリン以外のアミノ酸残基に置換され，且つＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基のアラニンがトレオニン又はセリンに置換されたものも，ＨＳＡの変異体の好ましい一形態としてヒト血清アルブミン部として用いることができる。これら変異体では，アミノ酸の置換によりＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）で表わされるトリペプチド配列が生じる。このトリペプチド配列中のアスパラギン残基は，融合タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み哺乳動物細胞等の真核細胞で発現させたとき，Ｎ−結合型糖鎖によりグリコシル化され得る。配列番号４６で示される５８６個のアミノ酸からなるヒト血清アルブミンＲｅｄｈｉｌｌ（ＨＳＡ−Ｒｅｄｈｉｌｌ）もヒト血清アルブミン部として用いることができる。
【００３４】
また該融合タンパク質において，「２０Ｋヒト成長ホルモン部」又は「２０ＫｈＧＨ部」というときは，２０ＫｈＧＨに由来するアミノ酸配列を含む部分であって，成長促進活性を有する部分のことをいう。ここで，「２０ＫｈＧＨに由来するアミノ酸配列」とは，配列番号１で示される１７６個のアミノ酸からなる野生型の２０Ｋヒト成長ホルモンのアミノ酸配列に加え，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，他のアミノ酸へ置換等された２０ＫｈＧＨの変異体のアミノ酸配列も含まれる。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１又は２個である。アミノ酸を置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望の２０ＫｈＧＨに由来するアミノ酸配列とすることもできる。
【００３５】
更には，野生型の２０Ｋヒト成長ホルモン又はその変異体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものも，２０ＫｈＧＨに由来するアミノ酸配列に含まれる。このとき付加させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望の２０Ｋヒト成長ホルモンの変異体のアミノ酸配列とすることもできる。但し，下記に詳述するリンカー部を有する一本鎖ポリペプチドとして融合タンパク質を作製した場合，リンカー部に属すべきとされ得るアミノ酸配列は，優先的にリンカー部に属するものとし，２０ＫｈＧＨ部には属さないものとする。
【００３６】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせた２０Ｋヒト成長ホルモンの変異体としては，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の８個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に８個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の４個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に４個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号１で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質において，ヒト血清アルブミン部と２０ＫｈＧＨ部は，直接又はリンカー部を介して結合される。ここで，「リンカー部」というときは，ペプチド鎖又はペプチド以外の長鎖状の分子，若しくはこれらの誘導体からなる，ヒト血清アルブミン部と２０ＫｈＧＨ部のいずれにも属さない部分のことをいう。リンカー部がペプチド鎖又はその誘導体であるとき，リンカー部はペプチドリンカーからなるといい，リンカー部がペプチド鎖又はその誘導体以外の長鎖状の分子又はその誘導体であるとき，リンカー部は非ペプチドリンカーからなるという。リンカー部は，種々の機能を有する。その機能には，ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部との間にあって両部を結合する機能の他，両部の融合タンパク質分子内での距離を離すことにより，両部の相互の干渉を低減させる機能，ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部との間にあって，両部を連結するヒンジとなって，融合タンパク質の立体構造に柔軟性を与える機能等が含まれる。融合タンパク質の分子内において，リンカー部は，これら機能の少なくとも一つを発揮する。
【００３８】
ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質は，ＨＳＡをコードする遺伝子の下流又は上流に，インフレームでｈＧＨをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを導入して形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換えタンパク質として作製することができる。このようにして組換えタンパク質として作製される融合タンパク質は，一本鎖ポリペプチドからなる。また，本発明において，組換えタンパク質として作製された融合タンパク質のことを，組換え融合タンパク質という。
【００３９】
組換え融合タンパク質として融合タンパク質を作製する場合，ＨＳＡをコードする遺伝子の下流にインフレームで２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子を結合させることにより，ＨＳＡ部のＣ末端側に２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質が得ることができる。逆に，ＨＳＡをコードする遺伝子の上流にインフレームで２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子を結合させることにより，ＨＳＡ部のＮ末端側に２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質が得られる。いずれの場合においても，組換え融合タンパク質として作製される融合タンパク質は，一本鎖ポリペプチドである。
【００４０】
なお，本発明において，「一本鎖ポリペプチド」というときは，一つのＮ末端と一つのＣ末端を有するポリペプチドであって，枝分かれするペプチド鎖のないポリペプチドのことをいう。この条件を満たす限り，分子内ジスルフィド結合を有するもの，糖鎖，脂質，リン脂質等で修飾されたものも一本鎖ポリペプチドである。また，一本鎖ポリペプチドが非共有結合によりダイマー等の複合体を形成した場合にあっては，当該複合体を形成する個々のペプチド鎖は一本鎖ポリペプチドと理解され，当該複合体自体は，一本鎖ポリペプチドの集合体であると理解される。
【００４１】
本発明において，融合タンパク質の一本鎖ポリペプチド内において，ＨＳＡ部は２０ＫｈＧＨ部のＮ末端側又はＣ末端側のいずれかに位置することになるが，ＨＳＡ部は２０ＫｈＧＨ部のＮ末端側に位置することが好ましい。
【００４２】
融合タンパク質の一本鎖ポリペプチド内で，ＨＳＡ部が２０ＫｈＧＨ部のＮ末端側に位置する場合，ＨＳＡ部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端が，ペプチド結合により直接，又はリンカー部を介して結合される。ここで「リンカー部」とは，当該一本鎖ポリペプチド内において，ＨＳＡ部のＣ末端と２０ＫｈＧＨ部のＮ末端との間に存在する，ＨＳＡ部及び２０ＫｈＧＨ部のいずれにも属さないアミノ酸配列を有する部分のことをいう。図１にＮ末端側からＨＳＡ部，リンカー部及び２０ＫｈＧＨ部を順に有する一本鎖ポリペプチドの融合タンパク質を模式的に示す。この場合のリンカー部は，ペプチドリンカーからなるものであり，融合タンパク質はヒト血清アルブミン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合したものである。
【００４３】
また，当該一本鎖ポリペプチド内で，２０ＫｈＧＨ部がＨＳＡ部のＮ末端側に位置する場合，２０ＫｈＧＨ部のＣ末端とＨＳＡ部のＮ末端が，ペプチド結合により直接，又はリンカー部を介して結合される。ここで「リンカー部」とは，当該一本鎖ポリペプチド内において，２０ＫｈＧＨのＣ末端及びＨＳＡ部のＮ末端との間に存在する，ＨＳＡ部及び２０ＫｈＧＨ部のいずれにも属さないアミノ酸配列を有する部分のことをいう。この場合のリンカー部も，ペプチドリンカーからなるものであリ，融合タンパク質は２０Ｋヒト成長ホルモン部のＣ末端と該リンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，該リンカー部のＣ末端と該ヒト血清アルブミン部のＮ末端がペプチド結合により結合したものである。
【００４４】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は，融合タンパク質分子の中にあって，リンカー部としての機能が発揮されるものである限り特に限定はない。また，ペプチドリンカーの長さにも，融合タンパク質分子の中にあって，リンカー部としての機能が発揮されるものである限り特に限定はない。ペプチドリンカーは一個又は複数個のアミノ酸から構成されるものである。ペプチドリンカーが複数個のアミノ酸から構成される場合，そのアミノ酸の個数は，好ましくは２〜５０個であり，より好ましくは５〜３０個であり，更に好ましくは１０〜２５個である。ペプチドリンカーの好適な例として，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，又は配列番号４で示されるアミノ酸配列（これらをあわせて基本配列という）からなるもの，及びこれらを含むものが挙げられる。例えば，ペプチドリンカーは，基本配列が２〜１０回反復したアミノ酸配列を含むものであり，基本配列が２〜６回反復したアミノ酸配列を含むものであり，基本配列が３〜５回反復したアミノ酸配列を含むものである。ペプチドリンカーのアミノ酸配列の好ましい一例として，配列番号４が４回反復した配列番号５で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４５】
リンカー部のアミノ酸配列は，配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，他のアミノ酸へ置換等されたものであってもよい。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１又は２個である。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望のリンカー部のアミノ酸配列とすることもできる。
【００４６】
また，リンカー部のアミノ酸配列は，配列番号４で示されるアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものであってもよい。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望のリンカー部のアミノ酸配列とすることもできる。
【００４７】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせたリンカー部のアミノ酸配列としては，配列番号４で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の１個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に１個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましい。
【００４８】
リンカー部のアミノ酸配列は，配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，他のアミノ酸へ置換等されたものであってもよい。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１又は２個である。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望のリンカー部のアミノ酸配列とすることもできる。
【００４９】
また，リンカー部のアミノ酸配列は，配列番号５で示されるアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸が付加されたものであってもよい。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１又は２個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望のリンカー部のアミノ酸配列とすることもできる。
【００５０】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせたリンカー部のアミノ酸配列としては，配列番号５で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号５で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号５で示されるアミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の２個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に２個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましい。
【００５１】
ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，リンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合する，本発明の融合タンパク質の一実施形態として，配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有する，７８１個のアミノ酸からなる融合タンパク質であるＨＳＡ−［ｌｉｎｋｅｒ］−２０ＫｈＧＨがある。配列番号３６で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１〜５８５番目までの５８５個のアミノ酸からなる部分がヒト血清アルブミン部であり，Ｎ末端側から５８６〜６０５番目までの２０個のアミノ酸からなる部分がリンカー部であり，Ｎ末端側から６０６〜７８１番目までのアミノ酸からなる部分が２０Ｋヒト成長ホルモン部である。
【００５２】
ＨＳＡ−［ｌｉｎｋｅｒ］−２０ＫｈＧＨにおいて，融合タンパク質の各部，すなわちヒト血清アルブミン部，２０Ｋヒト成長ホルモン部及びリンカー部が，それぞれの機能を発揮するものである限り，適宜，配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸を，決失，他のアミノ酸へ置換等させてもよい。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望の融合タンパク質とすることもできる。
【００５３】
更には，融合タンパク質の各部，すなわちヒト血清アルブミン部，２０Ｋヒト成長ホルモン部及びリンカー部が，それぞれの機能を発揮するものである限り，適宜，配列番号３６で示されるアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸を付加させてもよい。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望の融合タンパク質とすることもできる。
【００５４】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせた所望の融合タンパク質としては，配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号３６で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００５５】
また，該ヒト血清アルブミン部のＣ末端と該２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端が，リンカー部を介さずにペプチド結合により結合する，本発明の融合タンパク質の一実施形態として，配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する，７６１個のアミノ酸からなる融合タンパク質であるＨＳＡ−２０ＫｈＧＨがある。配列番号２９で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１〜５８５番目までの５８５個のアミノ酸からなる部分がヒト血清アルブミン部であり，Ｎ末端側から５８６〜７６１番目までのアミノ酸からなる部分が２０Ｋヒト成長ホルモン部である。
【００５６】
ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨにおいて，融合タンパク質の各部，すなわちヒト血清アルブミン部及び２０Ｋヒト成長ホルモン部が，それぞれの機能を発揮するものである限り，適宜，配列番号２９で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸を，置換，決失等させてもよい。アミノ酸を置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸を決失させる場合，決失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の置換と決失を組み合わせて，所望の融合タンパク質とすることもできる。
【００５７】
更には，融合タンパク質の各部，すなわちヒト血清アルブミン部及び２０Ｋヒト成長ホルモン部が，それぞれの機能を発揮するものである限り，適宜，配列番号２９で示されるアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸を付加させてもよい。このとき付加されるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせて，所望の融合タンパク質とすることもできる。
【００５８】
これらアミノ酸の付加，置換及び決失を組み合わせた所望の融合タンパク質としては，配列番号２９で示されるアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に１０個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが好ましく，配列番号２９で示されるアミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の５個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に５個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものがより好ましく，配列番号２９で示されるアミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を決失させるとともに，該アミノ酸配列中の３個以下のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させ，更に該アミノ酸配列に３個以下のアミノ酸を付加させたアミノ酸配列を有するものが更に好ましい。
【００５９】
本発明のＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質は，ＨＳＡをコードする遺伝子の下流又は上流に，インフレームで２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子を結合させた融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換えタンパク質として製造することができる。
【００６０】
本発明のＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部とをリンカー部を介して結合させた融合タンパク質を製造する場合は，ＨＳＡをコードする遺伝子と２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子とを，リンカー部を構成するペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を介してインフレームで結合させた融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を作製する。このＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換えタンパク質として融合タンパク質を製造することができる。
【００６１】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターは，宿主細胞内に導入される。このとき用いることのできる宿主細胞は，発現ベクターを導入することにより融合タンパク質を発現させることができるものである限り特に制限はなく，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞，大腸菌，枯草菌等の原核細胞のいずれであってもよいが，哺乳動物細胞が好適である。また，使用する宿主細胞に応じて，適宜，好適な発現ベクターが選択される。
【００６２】
哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合，該哺乳動物細胞の種類について特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞，マウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞，ヒトの繊維芽細胞，及びアフリカミドリザルの腎線維芽細胞に由来するＣＯＳ細胞が好ましい。またこのとき，融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ-１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
【００６３】
このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれているタンパク質を発現するようになるが，その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って，融合タンパク質を効率よく生産するためには，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から，目的のタンパク質の発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために，発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。
【００６４】
選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン，ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素（薬剤耐性マーカー）である。哺乳動物細胞は一定濃度以上の上記薬剤の存在下で死滅する。しかし，薬剤耐性マーカー遺伝子の組み込まれた発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた薬剤耐性マーカー遺伝子の発現により上記薬剤を分解し，これを無毒化又は弱毒化することができるので，上記薬剤存在下でも生存可能となる。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーが組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し，その薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含有する選択培地中で，その薬剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度の薬剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，薬剤耐性マーカーとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として目的のタンパク質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００６５】
また，選択マーカーとして，グルタミン合成酵素（ＧＳ）を用いることもできる。グルタミン合成酵素は，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞を，グルタミン合成酵素の阻害剤，例えばメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有し，且つグルタミンを含有しない選択培地中で培養すると，細胞は死滅する。しかし，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能となる。このとき，ＭＳＸの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，グルタミン合成酵素とともに，一般に，発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として目的のタンパク質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００６６】
また，選択マーカーとして，ジヒドロ葉酸レデクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いることもできる。ＤＨＦＲを選択マーカーとして用いる場合，発現ベクターを導入した哺乳動物細胞は，メトトレキセート，アミノプテリン等のＤＨＦＲ阻害剤を含有する選択培地中で培養される。ＤＨＦＲ阻害剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＤＨＦＲ阻害剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，ＤＨＦＲとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として目的のタンパク質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００６７】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を介して，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）を配置させた発現ベクターが知られている（国際特許公報ＷＯ２０１２／０６３７９９，ＷＯ２０１３／１６１９５８）。これら文献に記載された発現ベクターは，本発明の融合タンパク質の製造に特に好適に使用することができる。
【００６８】
例えば，タンパク質を発現させるための発現ベクターであって，遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該タンパク質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，該遺伝子発現制御部位の又は「該遺伝子発現制御部位」とは別の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，発現ベクターは，本発明の融合タンパク質の製造に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて，遺伝子発現制御部位又は別の遺伝子発現制御部位としては，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１アルファプロモーター（ｈＥＦ-１αプロモーター），ヒトユビキチンＣプロモーターが好適に用いられるが，ｈＥＦ-１αプロモーターが特に好適である。
【００６９】
また，内部リボソーム結合部位としては，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが，マウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合，野生型のもの以外に，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また，この発現ベクターにおいて，好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は，好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり，より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。
【００７０】
また，例えば，タンパク質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子−１アルファプロモーター，その下流に該タンパク質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明の融合タンパク質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１３／１６１９５８に記載された発現ベクターが挙げられる。
【００７１】
また，例えば，タンパク質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子−１アルファプロモーター，その下流に該タンパク質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明の融合タンパク質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１２／０６３７９９に記載されたｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏ及びＷＯ２０１３／１６１９５８に記載されたｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｍＮｅｏが挙げられる。
【００７２】
野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の３’末端には，３つの開始コドン（ＡＴＧ）が存在しており，その３つの開始コドンを含む配列は配列番号６（5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3'：開示コドンのATGを大文字で示す）で示される。配列番号６に含まれる開始コドンのうちの一部が破壊されたものとしては，例えば，配列番号７（5'-atgataagcttgccacaaccatg-3'）で示されるものがある。上記のｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏ及びｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｍＮｅｏは，開始コドンのうちの一部が破壊された配列番号７で示される配列を含むＩＲＥＳを有する発現ベクターである。
【００７３】
本発明の一実施形態において，融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，組換え融合タンパク質の発現レベルの高い細胞を選択するために，選択培地中で選択培養される。
【００７４】
選択培養において，ＤＨＦＲを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＤＨＦＲ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは０．２５〜５μＭであり，より好ましくは０．５〜１．５μＭであり，更に好ましくは約１．０μＭである。
【００７５】
ＧＳを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＧＳ阻害剤がＭＳＸの場合，好ましくは１００〜１０００μＭであり，より好ましくは２００〜５００μＭであり，更に好ましくは約３００μＭである。またこのとき，一般的にグルタミンを含有しない培地が選択培地として用いられる。
【００７６】
ピューロマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるピューロマイシンの最大濃度は，好ましくは３〜３０μｇ／ｍＬであり，より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１０μｇ／ｍＬである。
【００７７】
ネオマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧ４１８の最大濃度は，好ましくは０．１ｍｇ〜２ｍｇ／ｍＬであり，より好ましくは０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１ｍｇ／ｍＬである。
【００７８】
また，哺乳動物細胞の培養のための培地としては，選択培養で用いる培地，後述する組換え融合タンパク質を産生させるために用いる培地（組換え融合タンパク質産生用培地）ともに，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。
【００７９】
選択培養により選択された組換え融合タンパク質の発現レベルの高い細胞は，組換え融合タンパク質産生細胞として，組換え融合タンパク質の生産に用いられる。組換え融合タンパク質の生産は，組換え融合タンパク質産生細胞を組換え融合タンパク質産生用培地中で培養することにより行われる。この培養を生産培養という。
【００８０】
本発明において，組換え融合タンパク質産生用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を３〜７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３〜１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１〜２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
【００８１】
組換え融合タンパク質産生用培地として用いられる無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社），ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０２培地又はＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３２５−ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。
【００８２】
ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質は，ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部とを組換えタンパク質として別々に作製し，これらをペプチドリンカー又は非ペプチドリンカーのいずれかを介して結合させることにより製造することもできる。ここで，「ペプチドリンカー」とは，ペプチド結合した１〜５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれＨＳＡ又は２０ＫｈＧＨのいずれかと共有結合を形成することにより，ＨＳＡと２０ＫｈＧＨとを結合させてＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質を形成させるものである。ペプチドリンカーとしては，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，又は配列番号４で示されるアミノ酸配列（これらをあわせて基本配列という）からなるもの，及びこれらを含むものを使用することができ，例えば，基本配列が２〜１０回反復したアミノ酸配列を含むもの，基本配列が２〜６回反復したアミノ酸配列を含むもの，基本配列が３〜５回反復したアミノ酸配列を含むもの等が使用できる。ペプチドリンカーのアミノ酸配列の好ましい一例として，配列番号５で示されるアミノ酸配列が挙げられる。また，ペプチドリンカーのアミノ酸配列は，配列番号４又は配列番号５で示されるアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸が，決失，付加，他のアミノ酸に置換等されたものであってもよい。
【００８３】
「非ペプチドリンカー」とは，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものから選択されるものであり，その分子内の官能基を介してＨＳＡ及び２０ＫｈＧＨの両方と共有結合することにより，ＨＳＡ部と２０ＫｈＧＨ部を有する融合タンパク質を形成させるものである。
【００８４】
非ペプチドリンカーとしてＰＥＧ用いてＨＳＡと２０ＫｈＧＨとを結合させた融合タンパク質は，特に，ＨＳＡ-ＰＥＧ-２０ＫｈＧＨという。ＨＳＡ-ＰＥＧ-２０ＫｈＧＨは，ＨＳＡとＰＥＧを結合させてＨＳＡ-ＰＥＧを作製し，次いでＨＳＡ-ＰＥＧと２０ＫｈＧＨとを結合させることにより製造することができる。又は，ＨＳＡ-ＰＥＧ-２０ＫｈＧＨは，２０ＫｈＧＨとＰＥＧとを結合させて２０ＫｈＧＨ-ＰＥＧを作製し，次いで２０ＫｈＧＨ-ＰＥＧとＨＳＡを結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧをＨＳＡ及び２０ＫｈＧＨと結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主にＨＳＡ及び２０ＫｈＧＨ分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧとＨＳＡ及び２０ＫｈＧＨが共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００〜６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００〜２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
【００８５】
例えば，ＨＳＡ-ＰＥＧは，ＨＳＡとアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ＡＬＤ-ＰＥＧ-ＡＬＤ）とを，ＨＳＡ：ALD-PEG-ALDのモル比が１：１，１：２．５，１：５，１：１０，１：２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，ＨＳＡ-ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，２０ＫｈＧＨと反応させることにより，ＨＳＡ-ＰＥＧ-２０ＫｈＧＨが得られる。逆に，先に２０ＫｈＧＨとＡＬＤ-ＰＥＧ-ＡＬＤとを結合させて２０ＫｈＧＨ-ＰＥＧを作製し，次いで２０ＫｈＧＨ-ＰＥＧとＨＳＡを結合させることによっても，ＨＳＡ-ＰＥＧ-２０ＫｈＧＨを得ることができる。
【００８６】
本発明のヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部を有する融合タンパク質は，成長促進活性を有する。成長促進活性は，実施例９に記載のＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた測定法により，細胞増殖活性として測定できる。当該融合タンパク質は，実施例９に記載のＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して同等若しくは低い細胞増殖活性を示すものである。より具体的には，当該融合タンパク質は，実施例９に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは１．０〜６．０倍であるものであり，より好ましくは１．５〜２．５倍であるものであり，更に好ましくは約１．６〜２．３倍であるものであり，更により好ましくは１．６〜２．０倍であるものである。実施例９に記載の測定法によれば，このＥＤ５０の値が大きい程，細胞増殖活性は低い。
【００８７】
本発明の一実施形態である，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質も，細胞増殖活性を有する。当該融合タンパク質は，実施例９に記載のＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して同等若しくは低い細胞増殖活性を示すものである。より具体的には，当該融合タンパク質は，実施例９に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは１．０〜２．５倍であるものであり，より好ましくは１．５〜２．５倍であるものであり，更に好ましくは約１．６〜２．３倍であるものであり，更により好ましくは１．６〜２．０倍であるものである。
【００８８】
配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例９に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値は，約４．３×１０−３ｎＭである。この値は２２ＫｈＧＨのＥＤ５０の値の５．０〜６．０倍である。
【００８９】
配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例９に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値は，約１．５×１０−３ｎＭである。この値は２２ＫｈＧＨのＥＤ５０の値の１．６〜２．０倍である。
【００９０】
本発明の融合タンパク質は，プロラクチン様活性を有する。当該融合タンパク質は，実施例１１に記載のＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いた測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して低いプロラクチン（ＰＲＬ）様活性を示すものである。より具体的には，本発明の融合タンパク質は，実施例１１に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは５〜２２倍であるものであり，より好ましくは１０〜１８倍であるものであり，更に好ましくは１２〜１５倍であるものである。実施例１１に記載の測定法によれば，ＥＤ５０の値が大きい程，プロラクチン様活性は低い。
【００９１】
本発明の一実施形態である，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質も，プロラクチン様活性を有する。当該融合タンパク質は，実施例１１に記載のＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いた測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して低いプロラクチン（ＰＲＬ）様活性を示すものである。より具体的には，当該融合タンパク質は，実施例１１に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは５〜２２倍であるものであり，より好ましくは５〜２０倍であるものであり，更に好ましくは約１０〜１８倍であるものであり，更により好ましくは１２〜１５倍であるものである。
【００９２】
配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例１１に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値は，約１．５ｎＭである。この値は２２ＫｈＧＨのＥＤ５０の値の２０〜２２倍である。
【００９３】
配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例１１に記載の測定法により得られるＥＤ５０の値は，約９．６×１０−１ｎＭである。この値は２２ＫｈＧＨのＥＤ５０の値の１２〜１５倍である。
【００９４】
本発明のヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部を有する融合タンパク質は，ヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｈＧＨＢＰ）への親和性を有する。当該融合タンパク質は，実施例１２に記載の測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して低いｈＧＨＢＰへの親和性を示すものである。より具体的には，当該融合タンパク質は，実施例１２に記載の測定法により得られるＩＣ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは２．５〜１０倍であるものであり，より好ましくは３．０〜７．０倍であるものであり，更に好ましくは３．０〜６．０倍であるものである。実施例１２に記載の測定法によれば，ＩＣ５０の値が大きい程，ｈＧＨＢＰへの親和性は低い。なお，実施例１２に使用されたｈＧＨＢＰは，大腸菌を用いて作製された組換えｈＧＨＢＰであり，糖鎖を有しないものである。
【００９５】
本発明の一実施形態である，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質も，ヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｈＧＨＢＰ）への親和性を有する。当該融合タンパク質は，実施例１２に記載の測定法により測定したときに，２２ＫｈＧＨと比較して低いｈＧＨＢＰへの親和性を示すものである。より具体的には，当該融合タンパク質は，実施例１２に記載の測定法により得られるＩＣ５０の値が，２２ＫｈＧＨのそれと比較して，好ましくは２．５〜１０倍であるものであり，より好ましくは３．０〜７．０倍であるものであり，更に好ましくは３．０〜６．０倍であるものである。
【００９６】
配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例１２に記載の測定法により得られるＩＣ５０の値は，２２ＫｈＧＨのＩＣ５０の値の３．０〜６．０倍である。
【００９７】
配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は，ヒト血清アルブミン部のＣ末端とリンカー部のＮ末端がペプチド結合により結合し，このリンカー部のＣ末端と２０Ｋヒト成長ホルモン部のＮ末端がペプチド結合により結合した一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質の一実施形態である。当該融合タンパク質の場合，実施例１２に記載の測定法により得られるＩＣ５０の値は，２２ＫｈＧＨのＥＤ５０の値の３．０〜６．０倍である。
【００９８】
すなわち，本発明の融合タンパク質は，２２ＫｈＧＨと比較して，ｈＧＨＢＰへの親和性が低いため，ヒトに投与したときに血中でｈＧＨＢＰと結合せずに存在するものの割合が増加することが期待される。ヒト成長ホルモンは，ｈＧＨＢＰと結合することにより，標的細胞の表面に存在するヒト成長ホルモン受容体への結合が阻害される。従って，ｈＧＨＢＰへの親和性が低い本発明の融合タンパク質は，ヒトに投与したときに，ｈＧＨＢＰによる影響が少なく，比較的高い成長促進活性を示すことができると予想される。また，本発明の融合タンパク質は，ヒト血清アルブミン部の存在により，血中における安定性が増加することから，ヒトに投与したときに体内において，高い成長促進活性を持続的に示すことができる。
【００９９】
ｈＰＲＬＲを介した細胞内への強いシグナル伝達は乳がん細胞を増殖させることが知られている。ヒト成長ホルモンは，ｈＰＲＬＲを介したプロラクチン様活性を有する。２２ＫｈＧＨを有効成分として含有する既存のヒト成長ホルモン製剤は，ヒトに投与したときに速やかに代謝されるので，その活性が体内で持続的に高く維持されることはなく，乳がんを誘発する危険性はない。しかし，ヒトに投与したときに体内で高い成長促進活性を持続的に示すことのできる持続型のヒト成長ホルモン製剤の場合，そのプロラクチン様活性も体内で高く維持されることになるので，乳がんを誘発する可能性が生じる。ところが，本発明の融合タンパク質は，ヒトに投与したときに体内で高い成長促進活性を持続的に示すことができる一方，プロラクチン様活性が低いので，乳がんを誘発させる危険性をほとんど除去できるか，又は低減することができる。
【０１００】
本発明のヒト血清アルブミン部と２０Ｋヒト成長ホルモン部とを有する融合タンパク質は，種々の低身長症の治療剤として使用することができる。該低身長症には，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長症，ＳＧＡ性低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症，ＳＨＯＸ欠損症による低身長症，又はヌーナン症候群における低身長であって，何れも骨端線閉鎖を伴わないものが含まれる。また，本発明の融合タンパク質は，種々の成長ホルモン分泌不全症の治療剤として使用することができる。該成長ホルモン分泌不全症には，成人成長ホルモン分泌不全症等が含まれる。その他，ＡＩＤＳによる消耗，及び拒食症による消耗を対象疾患とする医薬として使用することができるが，これに限らず，成長ホルモンの有する軟骨形成促進，タンパク質同化促進等の成長促進活性，体組成及び脂質代謝改善作用等の生理活性を，長期に渡って作用させることにより症状が改善され得る疾患の治療剤として使用することができる。
【０１０１】
本発明の融合タンパク質を有効成分として含有する治療剤は，凍結乾燥品として，又は水性液剤として医療機関に供給することができる。水性液剤の場合，当該融合タンパク質を，安定化剤，緩衝剤，等張化剤を含有する溶液に予め溶解したものを，バイアル又は注射器に封入した製剤として供給できる。注射器に封入された製剤は，一般にプレフィルドシリンジ製剤と呼称される。また，本発明の融合タンパク質を有効成分として含有する治療剤は，例えば，皮下又は筋肉内に注射することにより，ヒトに投与することができる。
【実施例】
【０１０２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【０１０３】
〔実施例１〕ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏの構築
ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクター（インビトロジェン社）を，制限酵素（ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ）で消化し，ＥＦ-１αプロモーター及びその第一イントロンを含むＤＮＡ断片を切り出し，このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に，ｐＣＩ-ｎｅｏ（インビトロジェン社）を，制限酵素（ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ-１αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域（平滑末端化処理後のもの）を挿入して，ｐＥ-ｎｅｏベクターを構築した（図２）。
【０１０４】
ｐＥ-ｎｅｏベクターを，制限酵素（ＳｆｉＩ及びＢｓｔＸＩ）で消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１ｋｂｐの領域を切除した（図３）。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ-Ｓｆｉ５’（配列番号８）及びプライマーＨｙｇ-ＢｓｔＸ３’（配列番号９）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した（図３）。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，制限酵素（ＳｆｉＩ及びＢｓｔＸＩ）で消化し，上記のｐＥ-ｎｅｏベクターに挿入して，ｐＥ-ｈｙｇｒベクターを構築した（図３）。
【０１０５】
発現ベクターｐＰＧＫＩＨ（Ｍｉｙａｈａｒａ Ｍ． ｅｔ．ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５，６１３−６１８（２０００））を制限酵素（ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ）で消化し，マウス脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ），ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ遺伝子）及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）のポリアデニル化領域（ｍＰＧＫｐＡ）を含む塩基配列ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒ-ｍＰＧＫｐＡ（配列番号１０：５’末端から，塩基１〜６からなる領域が「ＸｈｏＩサイト」，塩基１２０〜７１５及びこれに続く塩基７１６〜７１８（ａｔｇ）からなる領域が「マウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列」，該塩基７１６〜７１８（ａｔｇ）を含む塩基７１６〜１７４１からなる領域が「ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列」，塩基１７４７〜２２１０からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）のポリアデニル化領域を含む塩基配列」，及び３’末端の６個の塩基（塩基２２１１〜２２１６）からなる領域が「ＢａｍＨＩサイト」である。）よりなるＤＮＡ断片を切り出した（なお，Ｈｙｇｒ遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号１１で示されたものである。）。このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Stratagene社）のＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩサイト間に挿入し，これをｐＢＳＫ（ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒ-ｍＰＧＫｐＡ）とした（図４−１）。
【０１０６】
ｐＢＳＫ（ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒ-ｍＰＧＫｐＡ）を鋳型とし，プライマーＩＲＥＳ５’（配列番号１２）及びプライマーＩＲＥＳ３’（配列番号１３）を用いて，ＰＣＲによりＥＭＣＶのＩＲＥＳの一部を含むＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し，ｐＢＳＫ（ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒ−ｍＰＧＫｐＡ）のＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入し，これをｐＢＳＫ（ＮｏｔＩ-ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒ-ｍＰＧＫｐＡ）とした（図４−２）。ｐＢＳＫ（ＮｏｔＩ-ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒｏ-ｍＰＧＫｐＡ）を制限酵素（ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ）で消化し，ｐＥ-ｈｙｇｒベクターのＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩサイト間に挿入し，これをプラスミドｐＥ-ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒとした（図４−３）。
【０１０７】
発現ベクターｐＰＧＫＩＨを鋳型とし，プライマーｍＰＧＫＰ５’（配列番号１４）及びプライマーｍＰＧＫＰ３’（配列番号１５）を用いて，ＰＣＲによりｍＰＧＫのプロモーター領域（ｍＰＧＫｐ）含む塩基配列（配列番号１６：５’末端から，塩基４〜９が「ＢｇｌＩＩサイト」，これに続く塩基１０〜５１６からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む塩基配列」，これに続く塩基５２４〜５２９からなる領域が「ＥｃｏＲＩサイト」である。）よりなるＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で消化し，ｐＣＩ-ｎｅｏ（プロメガ社）のＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩサイト間に挿入し，これをｐＰＧＫ-ｎｅｏとした（図４−４）。ｐＥ-ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒを制限酵素（ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ）で消化してＤＮＡ断片（ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒ）を切り出し，ｐＰＧＫ-ｎｅｏのＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩサイト間に挿入し，これをｐＰＧＫ-ＩＲＥＳ-Ｈｙｇｒとした（図４−５）。
【０１０８】
ＣＨＯ-Ｋ１細胞からｃＤＮＡを調製し，このｃＤＮＡを鋳型とし，プライマーＧＳ５’（配列番号１７）及びプライマーＧＳ３’（配列番号１８）を用いて，ＰＣＲによりＧＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＢａｌＩ及びＢａｍＨＩ）で消化し，ｐＰＧＫ-ＩＲＥＳ-ＨｙｇｒのＢａｌＩ及びＢａｍＨＩサイト間に挿入し，これをｐＰＧＫ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ΔｐｏｌｙＡとした（図４−６）。
【０１０９】
ｐＣＡＧＩＰｕｒｏ（Ｍｉｙａｈａｒａ Ｍ． ｅｔ．ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５，６１３−６１８（２０００））を鋳型とし，プライマーｐｕｒｏ５’（配列番号１９）及びプライマーｐｕｒｏ３’（配列番号２０）を用いて，ＰＣＲによりピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ遺伝子）を含む塩基配列（配列番号２１：５’末端から，塩基２〜７からなる領域が「ＡｆｌＩＩサイト」，これに続く塩基８〜６０７からなる領域が「ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ遺伝子）をコードする塩基配列」，及び，その次の塩基６０８〜６１９からなる領域が「ＢｓｔＸＩサイト」である。）よりなるＤＮＡ断片を増幅させた（なお，ｐｕｒｏ遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号２２で示されたものである。）。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＡｆｌＩＩ及びＢｓｔＸＩ）で消化し，発現ベクターｐＥ-ｎｅｏのＡｆｌＩＩ及びＢｓｔＸＩサイト間に挿入し，これをｐＥ-ｐｕｒｏとした（図４−７）。
【０１１０】
ｐＥ-ｐｕｒｏを鋳型とし，プライマーＳＶ４０ｐｏｌｙＡ５’（配列番号２３）及びプライマーＳＶ４０ｐｏｌｙＡ３’（配列番号２４）を用いて，ＰＣＲによりＳＶ４０後期ポリアデニル化領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＮｏｔＩ及びＨｐａＩ）で消化し，発現ベクターｐＥ-ｐｕｒｏのＮｏｔＩ及びＨｐａＩサイト間に挿入し，これをｐＥ-ｐｕｒｏ（ＸｈｏＩ）とした（図４−８）。ｐＰＧＫ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ΔｐｏｌｙＡを制限酵素（ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ）で消化し，ＩＲＥＳ-ＧＳ領域を含むＤＮＡ断片を切り出し，このＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥ-ｐｕｒｏ（ＸｈｏＩ）のＮｏｔＩ及びＸｈｏＩサイト間に挿入し，これをｐＥ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏとした（図４−９）。
【０１１１】
発現ベクターｐＥ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏを鋳型とし，プライマーｍＩＲＥＳ-ＧＳ５’（配列番号２５）及びプライマーｍＩＲＥＳ-ＧＳ３’（配列番号２６）を用いて，ＰＣＲにより，ＥＭＣＶのＩＲＥＳからＧＳにかけての領域を増幅させ，ＥＭＣＶのＩＲＥＳの５’側から２番目に位置する開始コドン（ＡＴＧ）に変異を加えて破壊したＤＮＡ断片を増幅させた。発現ベクターｐＥ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏを鋳型として，このＤＮＡ断片と上記のプライマーＩＲＥＳ５’を用いて，ＰＣＲによりＩＲＥＳからＧＳにかけての上記領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩ）で消化し，切り出されたＤＮＡ断片を，発現ベクターｐＥ-ＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏのＮｏｔＩ及びＰｓｔＩサイト間に挿入し，これを哺乳動物細胞用の発現ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏとした（図５）。
【０１１２】
〔実施例２〕ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現用ベクターの構築
ＨＳＡのＣ末端と２２ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させた，配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨとした。配列番号２７に示されるアミノ酸配列において，１〜５８５番目のアミノ酸がＨＳＡのアミノ酸配列に相当し，５８６〜７７６番目のアミノ酸が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当する。ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨをコードする遺伝子（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ遺伝子）を含む配列番号２８で示される塩基配列を有するＤＮＡを化学的に合成し，このＤＮＡを制限酵素（ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）で消化し，実施例１で作製したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込むことにより，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ）を構築した。図６に，ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ）の構造を模式的に示す。
【０１１３】
〔実施例３〕ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ発現用ベクターの構築
ＨＳＡのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させた，配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨとした。配列番号２９に示されるアミノ酸配列において，１〜５８５番目がＨＳＡのアミノ酸配列に相当し，５８６〜７６１番目が２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当する。実施例２で構築したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ）を鋳型として，プライマーＹＡ０５５（配列番号３０）及びプライマーＹＡ０５６（配列番号３１）を用いてＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供し，増幅された目的のＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ ＩＩ（QIAGEN社）にて精製し，このＤＮＡ断片をメガプライマーとした。続いて，ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ）を鋳型として，プライマーＹＡ０３６（配列番号３２）とメガプライマーを用いてＰＣＲを行い，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨをコードする遺伝子（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ遺伝子）を含む配列番号３３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）で消化し，実施例１で作製したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏのＭｕｌＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ）を構築した。図７に，ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ）の構造を模式的に示した。
【０１１４】
〔実施例４〕ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現ベクターの構築
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して，ＨＳＡのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させた，配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨとした。配列番号３６に示されるアミノ酸配列において，１〜５８５番目がＨＳＡのアミノ酸配列に相当し，５８６〜６０５番目がペプチドリンカーのアミノ酸配列に相当し，６０６〜７８１番目が２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当する。ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ）を鋳型として，プライマーＹＡ０３６（配列番号３２）及びプライマーＹＡ０６５（配列番号３４）を用いてＰＣＲを行い，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ）で消化後，アガロース電気泳動に供し，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ ＩＩ（QIAGEN社）にて精製した。また，ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ）を鋳型として，プライマーＹＡ０６６（配列番号３５）及びプライマーＹＡ０５６（配列番号３１）を用いてＰＣＲを行い，２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ）で消化後，アガロース電気泳動に供し，２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ ＩＩにて精製した。
【０１１５】
このようにして調製したＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを，予め制限酵素（ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）で消化したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏと混合してライゲーション反応させることにより，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の下流に２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片が結合した，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ遺伝子を含む配列番号３６に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を，実施例１で作製したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏのＭｕｌＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ）を構築した。図８に，ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ）の構造を模式的に示した。
【０１１６】
実施例２〜４で作製したｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ），ｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ）及びｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ）を総称して，ＨＳＡ-ｈＧＨ発現用ベクターとした。
【０１１７】
〔実施例５〕ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質発現用細胞の作製
チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に，Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ エレクトロポレーションシステム（Bio Rad社）を用いて，実施例２〜４で作製した，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ），ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ），及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現用ベクターであるｐＥ-ｍＩＲＥＳ-ＧＳ-ｐｕｒｏ（ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ）をそれぞれ導入した。発現ベクターを導入した細胞を，メチオニンスルホキシミン（SIGMA社）及びピューロマイシン（SIGMA社）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を用いて選択培養を行い，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現細胞，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現細胞及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現細胞をそれぞれ確立した。選択培養の際には，メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて，最終的にメチオニンスルホキシミンの濃度を３００μＭ，ピューロマイシンの濃度を１０μｇ／ｍＬとして，より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。
【０１１８】
得られたＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現用細胞，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現用細胞及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現用細胞を総称して，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質発現用細胞とした。また，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質発現用細胞を培養することにより得られるＨＳＡとｈＧＨとの融合タンパク質を総称して，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質とした。
【０１１９】
〔実施例６〕ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質発現用細胞の培養
ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）に，メチオニンスルホキシミとピューロマイシンとを，それぞれ３００μＭ及び１０μｇ／ｍＬの濃度となるように添加して，細胞培養用培地を調製した。実施例５で作製したＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現細胞，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現細胞及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現細胞を，それぞれ２×１０５個／ｍＬの細胞密度となるように５ｍＬの細胞培養用培地に添加し，５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。５日毎に，２×１０５個／ｍＬの細胞密度となるように，細胞を新しい培養用培地に添加して，継代培養を行った。
【０１２０】
〔実施例７〕ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の精製
ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ発現細胞，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ発現細胞及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ発現細胞を，それぞれ細胞培養用培地に全量が２４０ｍＬとなるように２×１０５個／ｍＬの密度で懸濁した。この細胞懸濁液を３０ｍＬずつ，径１５ｃｍのシャーレ８枚に加えて，５日間，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養した。培養終了後に培地を回収し，膜フィルター（孔径０．２２μｍ，Millipore社）でろ過して，培養上清とした。次いで，各培養上清に，１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）又は酢酸を加えて，ｐＨを７．０〜７．２に調整した。
【０１２１】
ポリプロプレン製のカラム（ポリプレップＴＭカラム，バイオラッド社）に，５ｍＬの抗ヒト成長ホルモン抗体を結合させた樹脂（Ｃａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ａｎｔｉ ｈＧＨ ｒｅｓｉｎ，Thermo Fisher Scientific社）を充てんし，カラム体積の５倍容の５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を平衡化させた。次いで，ｐＨを調整した上記の培養上清を，カラムに約２．５ｍＬ／分の流速で負荷し，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質をそれぞれ樹脂に吸着させた。引き続き，同流速で，カラム体積の５倍容の５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の５倍容の０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）でＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質をそれぞれ樹脂から溶出させた。ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質を含む溶出画分を回収し，直ちに２Ｍ ＮａＣｌを含有する１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して，ｐＨを約６．５に調整した。溶出画分に含まれるＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の濃度を，ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて，ＢＳＡを標準物質として測定した。
【０１２２】
〔実施例８〕ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞の作製
ヒトＧＨ受容体（ｈＧＨＲ）遺伝子をマウスＢａＦ３細胞に導入することによりＧＨ依存性増殖能を獲得させたＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を，以下の通りにして作製した。配列番号３８に示される塩基配列を有するｈＧＨＲ ＥＣＤ人工合成遺伝子（ｈＧＨＲの細胞外領域をコードするｈＧＨＲ遺伝子の５’側断片）を鋳型として，プライマーＹＡ０３４（配列番号３９）及びプライマーＹＡ０３５（配列番号４０）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供し，ＱＩＡＥＸ ＩＩ（QIAGEN社）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をメガプライマーとした。ヒト肺由来ｃＤＮＡを鋳型として，プライマーＫ７０８（配列番号４１）及びプライマーＫ７０９（配列番号４２）を用いてＰＣＲを行い，ｈＧＨＲ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供し，ＱＩＡＥＸ ＩＩ（QIAGEN社）を用いて精製した。次いで，精製したｈＧＨＲ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を鋳型として，上記メガプライマー及びプライマーＫ７０９（配列番号４２）を用いてＰＣＲを行い，５’側にｈＧＨＲ ＥＣＤ人工合成遺伝子配列を有するｈＧＨＲの全長をコードする遺伝子を含む，配列番号４３に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩ）で消化し，レトロウイルスベクターであるｐＭＸ-ＩＩ（Ｏｎｏ Ｙ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． １９． ３０５０−８（２０００））のＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，これをｈＧＨＲ発現用レトロウイルスベクター（ｈＧＨＲ／ｐＭＸ-ＩＩ）とした。
【０１２３】
１０ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに６×１０６個の２９３細胞（大日本住友製薬社）を懸濁させ，これを細胞培養用１０ｃｍディッシュに添加し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した。なお，ここで用いた２９３細胞は，アデノウイルスのＥ１遺伝子により形質転換されたヒト胎児腎細胞である。
【０１２４】
５００μＬのＯｐｔｉ-ＭＥＭＩＴＭ（Thermo Fisher Scientific社）に，１５μＬのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Roche社）を加えて混合し，これに更に５μｇのレトロウイルスパッケージングベクターであるｐＣＬ−Ｅｃｏ（IMGENEX社）と，５μｇのｈＧＨＲ／ｐＭＸ−ＩＩを加えて混合した。この混合液を，室温にて１５分間静置した後，上記の２９３細胞を２４時間培養させた１０ｃｍディッシュに添加した。次いで，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した後，培地を３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収した。回収した上清をｈＧＨＲ発現レトロウイルス液とした。
【０１２５】
ＷＥＨＩ−３細胞（理化学研究所）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した後，培地を３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収した。２ｍＬのｈＧＨＲ発現レトロウイルス液に，５００μＬのＷＥＨＩ−３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とを加えて混合した。この混合液を，２×１０６個のＩＬ−３依存性細胞株であるＢａＦ３細胞（理化学研究所）に添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を７５ｃｍ２培養フラスコに移し，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で８時間培養し，更に，５００μＬのＷＥＨＩ−３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１６時間培養した。培養終了後，細胞を遠心して回収し，ＰＢＳで３回洗浄した。回収した細胞に１００ｎｇ／ｍＬの２２ＫｈＧＨを含む１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍＬ添加して細胞を懸濁させ，次いで，この細胞懸濁液を培養フラスコに移し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養し，ｈＧＨＲ遺伝子が発現することによりｈＧＨ依存的増殖能を獲得したＢａＦ３細胞を得た。この細胞をＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞とした。
【０１２６】
〔実施例９〕ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定
ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の細胞増殖活性は，マウスＢａＦ３細胞にヒトＧＨ受容体（ｈＧＨＲ）遺伝子を導入してＧＨ依存性増殖能を獲得させた実施例８に記載の方法で作製したＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いて評価した。
【０１２７】
対数増殖期にあるＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後，１％ウマ血清を含む１５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６個／ｍＬになるように希釈し，５％ＣＯ２存在下３７℃で１６時間培養した。培養後，細胞を３×１０５個／ｍＬになるよう同培地で希釈し，９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて，２２ＫｈＧＨ（グロウジェクトＴＭ，JCRファーマ社），２０ＫｈＧＨ（ATGen社），及び実施例７で精製した３種のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ，及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨ）をそれぞれ希釈し，表１に示す濃度範囲で８段階の検体希釈液をそれぞれ調製した。
【０１２８】
【表１】
2017165713.tif 000003
【０１２９】
こうして調製した検体希釈液を，ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を添加した９６ウェル培養プレートの各ウェルに２０μＬずつ添加し，プレートシェーカーを用いて混合した後，細胞を５％ＣＯ２存在下３７℃で２２時間培養した。従って，培地中における最終的な各検体の濃度範囲は，表１に示したものの約０．１６７倍となった。培養後，生細胞数を測定する比色定量分析用試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ＴＭ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ試液（プロメガ社）を２４μＬずつ各ウェルに加えて混和し，さらに３時間培養した。次いで，プレートリーダーを用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり，測定値をプロットした。４９０ｎｍにおける吸光度は，生細胞数の相対値を示すことから，測定値をプロットして得られた検量線は，検体の濃度と細胞の増殖量との相関を示すものであり，この検量で求められる細胞の増殖量の最大値に対して，細胞の増殖量が５０％であるときの検体の濃度をＥＤ５０として求めた。なお，全ての測定は二重検定で行った。
【０１３０】
〔実施例１０〕ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞の作製
ヒトプロラクチン受容体（ｈＧＨＲ）遺伝子をマウスＢａＦ３細胞に導入することによりプロラクチン依存性増殖能を獲得させたＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を，以下の通りにして作製した。ヒト脾臓由来ｃＤＮＡを鋳型として，プライマーＹＡ００１（配列番号４４）及びプライマーＹＡ００２（配列番号４５）を用いてＰＣＲを行い，ｈＰＲＬＲ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ）で消化し，レトロウイルスベクターｐＭＸ-ＩＩのＳａｌＩとＮｏｔＩの間に組み込み，これをｈＰＲＬＲ発現用レトロウイルスベクター（ｈＰＲＬＲ／ｐＭＸ-ＩＩ）とした。
【０１３１】
１０ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに６×１０６個の２９３細胞を懸濁させ，これを細胞培養用１０ｃｍディッシュに添加し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した。
【０１３２】
５００μＬのＯｐｔｉ-ＭＥＭＩＴＭに，１５μＬのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Roche社）を加えて混合し，これに更に５μｇのｐＣＬ-Ｅｃｏ（IMGENEX社）と５μｇのｈＰＲＬＲ／ｐＭＸ-ＩＩとを加えて混合した。この混合液を，室温にて１５分間静置した後，上記の２９３細胞を２４時間培養した１０ｃｍディッシュに添加した。次いで，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した後，培地を３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収した。回収した上清をｈＰＲＬＲ発現レトロウイルス液とした。
【０１３３】
２ｍＬのｈＰＲＬＲ発現レトロウイルス液に，５００μＬのＷＥＨＩ-３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とを加えて混合した。この混合液を，２×１０６個のＩＬ-３依存性細胞株であるＢａＦ３細胞に添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を７５ｃｍ２培養フラスコに移し，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で８時間培養し，更に，５００μＬのＷＥＨＩ-３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１６時間培養した。培養終了後，細胞を遠心して回収し，ＰＢＳで３回洗浄した。回収した細胞に１００ｎｇ／ｍＬのｈＰＲＬを含む１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍＬ添加して細胞を懸濁させ，次いで，この細胞懸濁液を培養フラスコに移し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養し，ｈＰＲＬＲが発現することによりｈＰＲＬＲ依存性増殖能を獲得したＢａＦ３細胞を得た。この細胞をＢａＦ３／ｈＰＲＬ細胞とした。
【０１３４】
〔実施例１１〕ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いたプロラクチン（ＰＲＬ）様活性の測定
各ＨＳＡ融合ｈＧＨのプロラクチン（ＰＲＬ）様活性は，マウスＢａＦ３細胞にヒトプロラクチン受容体（ｈＰＲＬＲ）遺伝子を導入してＰＲＬ依存性増殖能を獲得させた，実施例１０に記載の方法で作製したＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いた方法により評価した。
【０１３５】
対数増殖期にあるＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後，５％ＦＢＳを含む１５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６個／ｍＬになるように希釈し，５％ＣＯ２存在下３７℃で１６時間培養した。培養後，細胞を３×１０５個／ｍＬになるよう同培地で希釈し，９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて，２２ＫｈＧＨ（グロウジェクトＴＭ，JCRファーマ社），２０ＫｈＧＨ（ATGen社），及び実施例７で精製した３種のＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質（ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ，及びＨＳＡ−［ｌｉｎｋｅｒ］−２０ＫｈＧＨ）をそれぞれ希釈し，表２に示す濃度範囲で７段階の検体希釈液をそれぞれ調製した。また，陽性コントロールとして，ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ，R＆D System社）を希釈したものを調製した。
【０１３６】
【表２】
2017165713.tif 000004
【０１３７】
こうして調製した検体希釈液を，ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を添加した９６ウェル培養プレートの各ウェルに２０μＬずつ添加し，プレートシェーカーを用いて混合した後，細胞を５％ＣＯ２存在下３７℃で２２時間培養した。従って，培地中における最終的な各検体の濃度範囲は，表２に示したものの約０．１６７倍となった。培養後，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ＴＭ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ試液（プロメガ社）を２４μＬずつ各ウェルに加えて混和し，さらに３時間培養した。次いで，プレートリーダーを用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり，測定値をプロットした。４９０ｎｍにおける吸光度は，生細胞数の相対値を示すことから，測定値をプロットして得られた検量線は，検体の濃度と細胞の増殖量との相関を示すものであり，この検量線で求められる細胞の増殖量の最大値に対して，細胞の増殖量が５０％であるときの各検体の濃度をＥＤ５０として求めた。なお，全ての測定は二重検定で行った。
【０１３８】
〔実施例１２〕細胞増殖活性に対するｈＧＨＢＰの阻害活性の測定
対数増殖期にあるＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後，１％ウマ血清を含む１５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６個／ｍＬになるように希釈し，５％ＣＯ２存在下３７℃で１６時間培養した。
【０１３９】
培養後，細胞を３×１０５個／ｍＬになるよう同培地で希釈し，９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて，２２ＫｈＧＨ（グロウジェクトＴＭ，JCRファーマ社），及び実施例７で精製したＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨをそれぞれ希釈し，０．１ｎＭの濃度の検体希釈液を調製した。
【０１４０】
こうして調製した検体希釈液を，ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を添加した９６ウェル培養プレートの各ウェルに２０μＬずつ添加した。更に，組換えヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｒｈＧＨＢＰ，BioVision社）を，０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解して，１，１０，及び１００ｎＭの濃度に調整し，これを各ウェルに２０μＬずつ添加した。従って，培地中のｈＧＨＢＰの濃度は，０．１４３，１．４３，１４．３ｎＭ濃度となった。プレートシェーカーを用いて９６ウェル培養プレート内の溶液を混合した後，細胞を５％ＣＯ２存在下３７℃で２２時間培養した。培養後，プレートリーダーを用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸にｈＧＨＢＰのモル濃度（ｎＭ）をとり，測定値をプロットした。４９０ｎｍにおける吸光度は，生細胞数の相対値を示すことから，測定値をプロットして得られた検量線は，ｈＧＨＢＰの濃度と細胞の増殖量との相関を示すものであり，この検量線で求められる細胞の増殖量の最大値に対して，細胞の増殖量が５０％であるときのｒｈＧＨＢＰの濃度をＩＣ５０として求めた。なお，全ての測定は二重検定で行った。なお，本測定法により測定されるＩＣ５０の値が大きいものほど，ｈＧＨＢＰに対する親和性が低い。
【０１４１】
〔実施例１３〕カニクイザルを用いた薬物動態及び薬効解析
実施例７で精製したＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ及びＨＳＡ−２０ＫｈＧＨを，それぞれ，４．０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与した。ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ及びＨＳＡ−２０ＫｈＧＨの投与はそれぞれ３匹のカニクイサルを用いて行った。
【０１４２】
薬物動態解析用に，投与１５分後，１，４，８，１２，２４，４８，７２，１２０，１６８，及び２１６時間後に動物の末梢血を採取した。血液をＥＤＴＡ２カリウム入り採血管に採り，氷冷した後，遠心分離（１７００×ｇ，５分間，４℃）して血漿を分離した。調製した血漿中に含まれるＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の濃度を実施例１４で詳述する方法により測定し，縦軸にＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の濃度を，横軸に投与後の時間をプロットすることによりＣmax，ＡＵＣ0-216h，ＡＵＣ0-inf及びｔ1/2βを求めて薬物動態解析を行った。
【０１４３】
また，ＩＧＦ−１分泌促進を指標とし，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の薬効を次のようにして解析した。ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質投与前，投与６，１２時間後，１，２，３，４，５，６，７，８，及び９日後に末梢血を採血し，上記の手法により末梢血より血漿を調製した。血漿中に含まれるＩＧＦ−１の濃度を実施例１５で詳述する方法により測定し，縦軸にＩＧＦ−１の濃度を，横軸に投与後の時間をプロットすることにより薬効解析を行った。また，コントロールとして更に１匹のカニクイザルを準備して，これに０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２２ＫｈＧＨ（グロウジェクト（登録商標））を７日間連続して皮下投与し，血漿中のＩＧＦ−１の濃度を同様にして測定した。
【０１４４】
〔実施例１４〕血漿中のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の定量
マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体及びマウス抗ｈＧＨ抗体を，当業者に周知の手法により，ＨＳＡ又はｈＧＨで免疫したマウスの脾細胞をそれぞれミエローマ細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞を培養して得た。マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９）で透析した後，溶液中の抗体濃度をNanoDrop（Thermo Scientific社）を用いて測定した。次いで，５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解したEZ-LinkＴＭ NHS-LC-Biotin（Thermo Fisher Scientific社）を，１ｍｇの抗体当たり６０μｇのNHS-LC-Biotinの比率で抗体溶液に添加し，室温で２時間反応させた後，反応溶液をＰＢＳで透析し，ビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を得た。下記の定量法において，マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体を一次抗体，ビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を二次抗体として使用した。
【０１４５】
血漿中のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の濃度は，Sector Imager 6000（Meso Scale Diagnostics社）を用いて，電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ法により測定した。ＥＣＬイムノアッセイ法は，ルテニウム錯体であるSULFO-TAGでラベルした二次抗体にプレート上で電気化学的刺激を与え，SULFO-TAGの電解酸化・還元による波長６２０ｎｍの発光をＣＣＤカメラで検出することにより，検体を定量する方法である。
【０１４６】
測定は，Sector Imager 6000の使用説明書に従って，概ね下記のとおり実施した。マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体をHigh Bind Plate（Meso Scale Diagnostics社）に添加し，１時間静置して抗ＨＳＡ抗体（一次抗体）をプレートに固定した。次いで，Superblock Blocking buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）をプレートに添加して１時間振盪し，プレートをブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ（0.05% Tween20を含有するＰＢＳ）で洗浄した後，検体を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，ビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体（二次抗体）を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，SULFO-Tag-Streptavidin（Meso Scale Diagnostics社）を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，Read buffer T（Meso Scale Diagnostics社）を添加し，Sector Imager 6000（Meso Scale Diagnostics社）で波長６２０ｎｍの発光を測定した。同様にして同一プレート上で既知濃度のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質を定量して標準曲線を求め，これに検体の測定値を内挿し，血漿中のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質及び２２ＫｈＧＨの濃度を求めた。
【０１４７】
〔実施例１５〕血漿中のＩＧＦ−１の定量
血漿中に含まれるＩＧＦ−１の定量は，Human IGF-I Quantikine ELISA kit（R＆D systems社）を用いて，ELISA法により行った。
【０１４８】
〔実施例１６〕結果と考察（ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定）
図９は，縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり測定値をプロットした，ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定結果を示す図である。この図から，各検体のＥＤ５０を求めた（表３）。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
表３に示されるとおり，２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は，それぞれ８．０×１０−４ｎＭと８．４×１０−４ｎＭであり，２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨの細胞増殖活性はほぼ同等である。また，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨとＨＳＡ-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は，それぞれ４．９×１０−３ｎＭと４．３×１０−３ｎＭであり，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨの細胞増殖活性は，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨと比較して，若干高い。しかし，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨのＥＤ５０（４．９×１０−３ｎＭ）は，野生型である２２ＫｈＧＨのＥＤ５０（８．０×１０−４ｎＭ）の約６倍であり，またＨＳＡ-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０（４．３×１０−３ｎＭ）は，野生型である２０ＫｈＧＨのＥＤ５０（８．４×１０−４ｎＭ）の約５倍である。すなわち，２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨのいずれも，リンカーを介さずに融合タンパク質とした場合，野生型のものと比較して細胞増殖活性が低下する。
【０１５１】
一方，２０個のアミノ酸からなる配列番号５で示されるリンカー部を介してＨＳＡのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させたＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は１．５×１０−３ｎＭであり，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，リンカーを介さずにＨＳＡのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させたＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ（ＥＤ５０：４．３×１０−３ｎＭ）と比較して，高い細胞増殖活性を示す。また，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は１．５×１０−３ｎＭと，２２ＫｈＧＨのＥＤ５０（８．０×１０−４ｎＭ）の約１．９倍である。すなわち，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，２２ＫｈＧＨと比較して細胞増殖活性が若干低いものの，成長ホルモン分泌不全性低身長症等の治療剤として好適に使用し得る程度の細胞増殖活性を保持している。
【０１５２】
〔実施例１７〕結果と考察（ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いたプロラクチン（ＰＲＬ）様活性の測定）
図１０は，縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり測定値をプロットした，ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いたプロラクチン（ＰＲＬ）様活性の測定結果を示す図である。この図から，各検体のＥＤ５０を求めた（表４）。まず，陽性コントロールとしておいたヒトプロラクチンのＥＤ５０は，２．１×１０−３ｎＭであり，ＢａＦ／ｈＰＲＬＲ細胞を用いた本測定法により，プロラクチン（ＰＲＬ）様活性が定量的に測定できることが示された。
【０１５３】
【表４】
2017165713.tif 000006
【０１５４】
表４に示されるように，２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨのＥＤ５０を比較すると，２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は，それぞれ，７．２×１０−２ｎＭと２．７×１０−1ｎＭであり，２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨと比較してプロラクチン様活性が低い。
【０１５５】
また，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨとＨＳＡ-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０は，それぞれ５．２×１０−1ｎＭと１．５ｎＭであり，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨは，ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨと比較して，野生型の２２ＫｈＧＨと２０ＫｈＧＨとを比較したときと同様に，プロラクチン様活性が低い。
【０１５６】
また，２０個のアミノ酸からなるリンカー部を介してＨＳＡのＣ末端と２０ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させたＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨでは，ＥＤ５０が９．６×１０−1ｎＭである。すなわち，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，リンカー部を介さずにＨＳＡと２０ＫｈＧＨを結合させたＨＳＡ-２０ＫｈＧＨ（ＥＤ５０：１．５ｎＭ）と比較してプロラクチン様活性が高い。但し，ヒト成長ホルモン製剤である２２ＫｈＧＨとプロラクチン様活性を比較した場合，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨのＥＤ５０（９．６×１０−１ｎＭ）は，２２ＫｈＧＨのＥＤ５０（７．２×１０−２ｎＭ）の約１３倍である。これらの結果は，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨと同様に，野生型の２２ＫｈＧＨと比較して極めて低いプロラクチン様活性を有することを示すものである。
【０１５７】
〔実施例１８〕結果と考察（細胞増殖活性に対するｈＧＨＢＰの阻害活性）
図１１は，縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸にｈＧＨＢＰのモル濃度（ｎＭ）をとり測定値をプロットした，ＢａＦ３／ｈＰＲＬＲ細胞を用いたプロラクチン（ＰＲＬ）様活性の測定結果を示す図である。なお，縦軸の４９０ｎｍは，ｈＧＨＢＰの濃度がゼロのときの測定値を１００％としたときの相対値（％）を示す。ｈＧＨＢＰの２２ＫｈＧＨに対するＩＣ５０は６０〜８０ｎＭの範囲であり，一方，ｈＧＨＢＰのＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ及びＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨに対するＩＣ５０は，外挿によりともに２５０ｎＭ〜３５０ｎＭと求められる。これらの結果は，ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨとＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，いずれも２２ＫｈＧＨと比較して極めて低いｈＧＨＢＰとの親和性を有することを示すものである。
【０１５８】
〔実施例１９〕結果と考察（カニクイザルを用いた薬物動態解析）
図１２は，縦軸にカニクイザル血清中のＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質（ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ及びＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ）の濃度，横軸にＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質を投与後の経過時間をプロットした，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の薬物動態解析の結果を示す図である。この図から，各検体のＣmax，ＡＵＣ0-216h，ＡＵＣ0-inf及びt1/2βを求めた結果を表５に示す。
【０１５９】
【表５】
2017165713.tif 000007
【０１６０】
表５に示されるとおり，ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨとＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＡＵＣ0-infは，それぞれ８７２±１１５μｇ・時／ｍＬ，７５２±５５μｇ・時／ｍＬである。また，図１２に示されるとおり，投与後９日目においても，ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨとＨＳＡ−２２ＫｈＧＨは血中において検出されている。通常の２２ｋＧＨが投与後速やかに分解されて投与１日後には血中で検出されなくなることと併せて考えると，これらのデータは，ＨＳＡのＣ末端側にｈＧＨを結合させることにより，ｈＧＨを血中で安定化できることを示している。
【０１６１】
〔実施例２０〕結果と考察（カニクイザルを用いた薬効解析）
図１３は，縦軸に血漿中のＩＧＦ−１の濃度を，横軸に２２ＫｈＧＨ及びＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質（ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ及びＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ）の投与後の経過時間をプロットした，ＨＳＡ-ｈＧＨ融合タンパク質の薬効解析の結果を示す図である。ＩＧＦ−１は成長ホルモンによって分泌が誘導される骨成長促進作用等の活性を有するポリペプチドであり，ｈＧＨの生理活性の一部はＩＧＦ−１を介して発揮されることが知られている。
【０１６２】
図１３に示されるように，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２０ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２０ＫｈＧＨを投与した動物，及びＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを投与した動物のいずれにおいても，血漿中ＩＧＦ−１濃度は，投与後３日目に最大値を示している。しかし，その値はＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ投与動物のほうがＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ投与動物と比較して１０％以上高い。また，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ投与動物では投与後６日目に血漿中ＩＧＦ−１濃度がほぼ投与前の濃度までに戻るのに対し，ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ投与動物では，投与後９日目においても血漿中ＩＧＦ−１濃度が投与前の濃度と比較して高く維持されている。なお，図１３で２２ＫｈＧＨ投与動物の血漿中ＩＧＦ−１の濃度は，２日目から上昇し，その後測定最終日である９日目までの間，投与前の値よりも高い値を示しているが，これは，２２ＫｈＧＨのみ７日間連続投与を行ったことにより，２２ＫｈＧＨの効果が蓄積して表れたためと考えられる。
【０１６３】
〔実施例２１〕結果と考察（まとめ）
以上の結果から，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，成人成長ホルモン分泌不全症等の治療剤として使用されている２２ＫｈＧＨと比較した場合，成長促進活性が低いものの，ｈＧＨＢＰへの親和性が低いので，ヒトに投与したときに血中でｈＧＨＢＰと結合することにより活性がマスクされる割合が低下すると考えられる。従って，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，ヒトに投与したときに，成人成長ホルモン分泌不全症等の治療剤として使用できるレベルの成長促進活性を発揮できると考えられる。また，ＨＳＡ部の存在により，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨは，血中において野生型の２２ＫｈＧＨと比較して安定であることから，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨでは，２２ＫｈＧＨと比較して，ヒトに投与したときに成長促進活性を長期に持続させることができる。ヒトに投与したときに高い成長促進活性を持続的に示すことのできる持続型のヒト成長ホルモンの場合，これをヒトに投与したとき，そのプロラクチン様活性も体内で高く維持されることにより，乳がんが誘発される可能性が生じる。ところが，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨの場合，これをヒトに投与したとき，長期に渡り体内で高い成長促進活性を持続的に示すことができる一方で，プロラクチン様活性が低いので，乳がんが誘発される危険性をほとんど回避できる。
【０１６４】
また，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨも，ＨＳＡ-［ｌｉｎｋｅｒ］-２０ＫｈＧＨと同様に，成人成長ホルモン分泌不全症等の治療剤として使用されている２２ＫｈＧＨと比較した場合，成長促進活性が低いものの，ｈＧＨＢＰへの親和性が低いので，ヒトに投与したときに血中でｈＧＨＢＰと結合することにより活性がマスクされる割合が低下すると考えられる。従って，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨは，ヒトに投与したときに体内において，成人成長ホルモン分泌不全症等の治療剤として使用できるレベルの成長促進活性を発揮できると考えられる。また，ＨＳＡ部の存在により，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨは，ヒトの血中において２２ＫｈＧＨと比較して安定であることから，ヒトに投与したときの体内における成長促進活性は，２２ＫｈＧＨでは急速に消失するが，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨでは，その活性を長期に持続させることができる。また，ヒトに投与したときに体内で高い成長促進活性を持続的に示すことのできる持続型のヒト成長ホルモンの場合，これをヒトに投与したとき，そのプロラクチン様活性も体内で高く維持されることにより，乳がんが誘発される可能性が生じる。一方，ＨＳＡ-２０ＫｈＧＨの場合，これをヒトに投与したとき，長期に渡り体内で高い成長促進活性を持続的に示すことができる一方で，プロラクチン様活性が低いので，乳がんが誘発される危険性をほとんど回避できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明によれば，野生型の２２ＫｈＧＨと比較してプロラクチン様活性が低く且つ血中での安定性の高い，持続型の成長ホルモン分泌不全性低身長症等の治療剤として用いることのできる，新規な薬剤を提供することができる。
【符号の説明】
【０１６６】
１    ヒト血清アルブミン部
２    リンカー部
３    ２０ＫｈＧＨ部
４    LacZプロモーター
５    ｍPGKプロモーター
６    配列番号６に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の部分配列
６ａ  配列番号７に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の部分配列
７    ｍＰＧＫのポリアデニル化領域（ｍＰＧＫｐＡ）
８    ＥＦ−１ｐ及び第一イントロンを含む塩基配列
９    ＳＶ４０後期ポリアデニル化領域
１０  ＳＶ４０初期プロモーターを含む領域
１１  合成ポリアデニル化領域
１２  サイトメガロウイルスプロモーターを含む領域
１３  グルタミン合成酵素遺伝子
１４  ヒト血清アルブミンをコードする領域
１５  ２２ＫｈＧＨをコードする領域
１５ａ  ２０ＫｈＧＨをコードする領域
１６  リンカーをコードする領域
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号４：リンカー部の基本アミノ酸配列
配列番号５：リンカー部のアミノ酸配列の一例
配列番号７：変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分配列，合成配列
配列番号８：プライマー  Ｈｙｇ−Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号９：プライマー  Ｈｙｇ−ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号１０：ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒ−ｍＰＧＫｐＡ，合成配列
配列番号１１：ハイグロマイシン耐性遺伝子に対応するアミノ酸配列
配列番号１２：プライマー  ＩＲＥＳ５’，合成配列
配列番号１３：プライマー  ＩＲＥＳ３’，合成配列
配列番号１４：プライマー  ｍＰＧＫＰ５’，合成配列
配列番号１５：プライマー  ｍＰＧＫＰ３’，合成配列
配列番号１６：ｍＰＧＫｐ，合成配列
配列番号１７：プライマー  ＧＳ５’，合成配列
配列番号１８：プライマー  ＧＳ３’，合成配列
配列番号１９：プライマー  ｐｕｒｏ５’，合成配列
配列番号２０：プライマー  ｐｕｒｏ３’，合成配列
配列番号２１：ピューロマイシン耐性遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号２２：ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するアミノ酸配列
配列番号２３：プライマー  ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ５’，合成配列
配列番号２４：プライマー  ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ３’，合成配列
配列番号２５：プライマー  ｍＩＲＥＳ−ＧＳ５’，合成配列
配列番号２６：プライマー  ｍＩＲＥＳ−ＧＳ３’，合成配列
配列番号２７：ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列
配列番号２８：ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号２９：ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列
配列番号３０：プライマーＹＡ０５５，合成配列
配列番号３１：プライマーＹＡ０５６，合成配列
配列番号３２：プライマーＹＡ０３６，合成配列
配列番号３３：ＨＳＡ−２０ＫｈＧＨ遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号３４：プライマーＹＡ０６５，合成配列
配列番号３５：プライマーＹＡ０６６，合成配列
配列番号３６：ＨＳＡ−［ｌｉｎｋｅｒ］−２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列
配列番号３７：ＨＳＡ−［ｌｉｎｋｅｒ］−２０ＫｈＧＨ遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号３８：ｈＧＨＲ  ＥＣＤをコードする人工合成遺伝子の塩基配列，合成配列
配列番号３９：プライマーＹＡ０３４，合成配列
配列番号４０：プライマーＹＡ０３５，合成配列
配列番号４１：プライマーＫ７０８，合成配列
配列番号４２：プライマーＫ７０９，合成配列
配列番号４３：ｈＧＨＲをコードする人工合成遺伝子の塩基配列，合成配列
配列番号４４：プライマーＹＡ００１，合成配列
配列番号４５：プライマーＹＡ００２，合成配列
【図１】
2017165713.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
2017165713.tif 000013
【図４−４】
2017165713.tif 000014
【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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