(57)【要約】【課題】励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な、生体分子検出用試験キットを提供する。【解決手段】生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、  前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、  生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。
【請求項２】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、請求項２又は３に記載のキット。
【請求項５】
前記色素の発色団が下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のキット。
2017181050.tif 000007
（一般式（１）及び（２）において、Ｒはアルキル基、芳香族環基、複素環基、又はハロゲン原子を示す。一般式（２）において、Ｘはアルキル基、芳香族環基、又は複素環基を示す。）
【請求項６】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項７】
前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項８】
生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、
生体分子の検出方法。
【請求項９】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項８に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１０】
前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項９に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１１】
前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、請求項９又は１０に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１２】
前記色素の発色団が下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
2017181050.tif 000008
（一般式（１）及び（２）において、Ｒはアルキル基、芳香族環基、複素環基、又はハロゲン原子を示す。一般式（２）において、Ｘはアルキル基、芳香族環基、又は複素環基を示す。）
【請求項１３】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１４】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１５】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１６】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定する、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１７】
前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１８】
燐光色素含有シリカナノ粒子からなる、生体分子検出用標識試薬。
【請求項１９】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、請求項１８に記載の生体分子検出用標識試薬。
【請求項２０】
前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、請求項１９に記載の生体分子検出用標識試薬。
【請求項２１】
前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、請求項１９又は２０に記載の生体分子検出用標識試薬。
【請求項２２】
前記色素の発色団が下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
2017181050.tif 000009
（一般式（１）及び（２）において、Ｒはアルキル基、芳香族環基、複素環基、又はハロゲン原子を示す。一般式（２）において、Ｘはアルキル基、芳香族環基、又は複素環基を示す。）
【請求項２３】
前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用標識試薬粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の抗原などの生体分子を検出する手法として、生体分子を捕捉する捕捉物質を担体に固定化させた多孔質の試験片と、生体分子を捕捉する標識試薬を用いた検出法がある。この方法では、検体液に含まれる生体分子を標識粒子に捕捉させ、多孔質支持体を毛細管現象により移動させる。そして、多孔質支持体に例えばライン状に固定された捕捉物質と生体分子とを接触させることによって、前記生体分子を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを標識試薬により発色させる。この発色によって生体分子の有無を判定することができる。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point  Of  Care  Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
【０００３】
一方で、近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子や、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。
上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる（例えば、特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１５３０５７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１４７７７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用可能な生体分子検出用試験キットを提供することを課題とする。
また、本発明は、前記生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法及び生体分子検出用標識試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特許文献１及び２に記載されている蛍光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子を用いることで、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。
特許文献１及び２に記載されている標識試薬粒子は、図６に示すように、標識試薬粒子に照射する励起光の波長領域と、標識試薬粒子から発せられる発光領域とが、一部重なり合う。よって、蛍光を検出するには、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを発光検出装置に設ける必要がある。しかしこのようなフィルタは高価であるため、低コストで生体分子の検出システムを提供するには発光検出装置のフィルタを不要とする生体分子の検出方法の開発が望まれる。また、発光検出装置のフィルタが不要な生体分子の検出方法は、検出キットのコンパクト化の観点からも望ましい。
しかし、特許文献１及び２に記載されているような従来の標識試薬粒子を用いる生体分子の検出方法において、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いて発光を検出しても、蛍光強度など、発光によるバックグランド値が上昇するため、ごく微量の生体分子を検出する十分な精度の確保が困難となる。
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。具体的には、図２に示すような励起波長領域と発光波長とが互いに重なり合わない色素を用いた生体分子の検出可能性を検討した。その結果、励起光のノイズをカットし燐光を検出することで前述したフィルタを発光検出装置に設けなくても、生体分子の検出が可能となることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００８】
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域を設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用試験キット。
（２）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（１）項に記載のキット。
（３）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（２）項に記載のキット。
（４）前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、前記（２）又は（３）項に記載のキット。
（５）前記色素の発色団が下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（２）〜（４）のいずれか１項に記載のキット。
【０００９】
【化１】
2017181050.tif 000002
【００１０】
（一般式（１）及び（２）において、Ｒはアルキル基、芳香族環基、複素環基、又はハロゲン原子を示す。一般式（２）において、Ｘはアルキル基、芳香族環基、又は複素環基を示す。）
（６）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試験キット。
（７）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の試験キット。
【００１１】
（８）生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有し、
前記試験片は、生体分子を捕捉する試験領域設けた、前記標識試薬粒子が移行するメンブレンを含んでなり、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が前記試験領域に固定化され、
生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が前記燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入されている、
生体分子の検出方法。
（９）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（８）項に記載の生体分子の検出方法。
（１０）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（９）項に記載の生体分子の検出方法。
（１１）前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、前記（９）又は（１０）項に記載の生体分子の検出方法。
（１２）前記色素の発色団が前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１３）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（８）〜（１２）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１４）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（８）〜（１３）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１５）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始する、前記（８）〜（１４）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１６）前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定する、前記（８）〜（１５）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１７）前記メンブレンに、標的物質とする生体分子を捕捉していない標識試薬粒子が固定化される参照領域をさらに設けた、前記（８）〜（１６）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【００１２】
（１８）燐光色素含有シリカナノ粒子からなる、生体分子検出用標識試薬。
（１９）前記燐光色素含有シリカナノ粒子が、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子である、前記（１８）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２０）前記紫外励起燐光色素の発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である、前記（１９）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２１）前記紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、前記紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にある、前記（１９）又は（２０）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２２）前記色素の発色団が前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（１９）〜（２１）のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（２３）前記燐光色素含有シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１８）〜（２２）のいずれか１項に記載の生体分子検出用標識試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の生体分子検出用試験キットは、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置にも適用することができる。
また、本発明の生体分子の検出方法は、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させるフィルタを設けない発光検出装置を用いても生体分子を検出することができる。
さらに、本発明の燐光色素シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬は、前記方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明で用いる生体分子検出用試薬に対する励起光照射後の経過時間と発光の強度の関係の一例である。
【図２】本発明で用いる生体分子検出用標識試薬に照射する励起光の波長領域と強度、及び試薬より発せられる発光の波長領域と強度を模式的に示すグラフである。
【図３】本発明で用いることができる生体分子検出用試験片の好ましい実施形態を模式的に示す図あり、図３（ａ）が平面図であり、図３（ｂ）が展開断面図である。
【図４】本発明で用いることができる生体分子検出用試験片の別の好ましい実施形態を模式的に示す図あり、図４（ａ）が平面図であり、図４（ｂ）が展開断面図である。
【図５】本発明で用いることができる生体分子検出用試験片のさらに別の好ましい実施形態を模式的に示す図あり、図５（ａ）が平面図であり、図５（ｂ）が展開断面図である。
【図６】従来法で用いられている生体分子検出用標識試薬に照射する励起光の波長領域と強度、及び試薬より発せられる発光の波長領域と強度を模式的に示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
【００１６】
本発明の生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子を有する。そして、本発明の生体分子の検出方法は、当該生体分子検出用試験キットを用いて、生体分子の検出を行う。
以下、本発明の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
【００１７】
［生体分子］
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は抗原の検出に好適に用いることができる。
【００１８】
本発明において、生体分子を含有する試料としては特に制限はないが、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
【００１９】
［生体分子検出用の試験片］
本発明において、生体分子検出用の試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）とを有する生体分子検出用試験キット以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、抗原抗体反応により抗原などの検出対象物質を検出することが好ましい。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
【００２０】
［本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験片］
本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図３及び４を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００２１】
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬粒子、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００２２】
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図３に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域１０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域１０へ固定化される。
この試験領域１０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
【００２３】
図４に示すように、メンブレン３には、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子を固定化するための試験領域２０を設け、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
【００２４】
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００２５】
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により生体分子を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
【００２６】
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
【００２７】
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００２８】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass  Fiber  Conjugate  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow  Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose  Fiber  Sample  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives  Research社製）等が挙げられる。
【００２９】
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
【００３０】
［本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験片］
本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、標識試薬粒子を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図５を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００３１】
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、生体分子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００３２】
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド５は、標識試薬粒子を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した生体分子を含む液と標識試薬粒子とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５に含浸させる標識試薬粒子の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。
【００３３】
（メンブレン）
図５に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域２０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域２０へ固定化される。
この試験領域２０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図５に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
【００３４】
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００３５】
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により抗原を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
【００３６】
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
【００３７】
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００３８】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２及びコンジュゲートパッド５としてはGlass  Fiber  Conjugate  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow  Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose  Fiber  Sample  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives  Research社製）等が挙げられる。
【００３９】
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド５、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
【００４０】
［標識試薬粒子］
本発明の標識試薬粒子は、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる。中でも、励起波長が紫外領域にあり、発光波長が可視光領域にある燐光色素含有シリカナノ粒子が好ましく、紫外線を吸収して可視光領域側の燐光を発する紫外励起燐光色素をシリカ粒子中に含有する紫外励起燐光粒子がより好ましい。紫外励起燐光色素の発光寿命は、10マイクロ秒以上100ミリ秒以下であることが好ましい。また、紫外励起燐光色素の励起波長が230nm〜350nmの範囲にあり、紫外励起燐光粒子の燐光発光ピークが450〜600nmの間にあることが好ましい。このような燐光色素含有シリカナノ粒子を用いることで、励起光をカットした後で光を検出できるため、励起光に起因するノイズがなくなり高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。また、シリカナノ粒子の表面には様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度であるので、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。
以下、燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
【００４１】
燐光色素含有シリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって燐光色素含有シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal  of  Colloid  and  Interface  Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号パンフレットに記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
【００４２】
燐光色素含有シリカナノ粒子の調製例について、具体的に説明する。しかし本発明はこれに制限されるものではない。
燐光色素を含有するシリカ粒子は、燐光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した燐光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００４３】
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００４４】
【化２】
2017181050.tif 000003
【００４５】
（紫外励起発光色素）
紫外励起発光色素は紫外光を吸収して可視光領域で発光するものであれば特に限定されないが、その発色団が含窒素複素芳香族化合物の残基であることが好ましい。
前記紫外励起発光色素の発色団は、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基からなることが好ましい。
【００４６】
【化３】
2017181050.tif 000004
【００４７】
一般式（１）及び（２）において、Ｒはアルキル基（好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６、より好ましくは炭素数１〜３、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、オクチル、ｔｅｒｔ−オクチル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル等が挙げられる）、芳香族環基（好ましくは炭素数６〜２４、より好ましくは炭素数６〜１４、より好ましくは炭素数６〜１０、例えばフェニル、ｐ−クロロフェニル、メシチル、トリル、キシリル、ナフチル、アントリル、アズレニル、アセナフテニル、フルオレニル、フェナントリル、インデニル、ピレニル、ビフェニリル等が挙げられる）、複素環基（好ましくは炭素数０〜２０のヘテロ環基で、環構成ヘテロ原子が酸素原子、窒素原子、硫黄原子が好ましく、５員環または６員環でベンゼン環やヘテロ環で縮環していてもよく、この環は飽和環、不飽和環、芳香環であってもよく、例えば、２−ピリジル、４−ピリジル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリル等が挙げられる）、又はハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）を示す。
【００４８】
一般式（２）において、Ｘはアルキル基（好ましくは炭素数１〜２０、より好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６、より好ましくは炭素数１〜３、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、オクチル、ｔｅｒｔ−オクチル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル等が挙げられる）、芳香族環基（好ましくは炭素数６〜２４、より好ましくは炭素数６〜１４、より好ましくは炭素数６〜１０、例えばフェニル、ｐ−クロロフェニル、メシチル、トリル、キシリル、ナフチル、アントリル、アズレニル、アセナフテニル、フルオレニル、フェナントリル、インデニル、ピレニル、ビフェニリル等が挙げられる）、又は複素環基（好ましくは炭素数０〜２０のヘテロ環基で、環構成ヘテロ原子が酸素原子、窒素原子、硫黄原子が好ましく、５員環または６員環でベンゼン環やヘテロ環で縮環していてもよく、この環は飽和環、不飽和環、芳香環であってもよく、例えば、２−ピリジル、４−ピリジル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリル等が挙げられる）を示す。
【００４９】
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００５０】
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００５１】
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
【００５２】
シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、２０ｎｍ以上が好ましく、３０ｎｍ以上がより好ましく、６０ｎｍ以上がさらに好ましく、１０００ｎｍ未満が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、３００ｎｍ以下が特に好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００５３】
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００５４】
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面には、抗原などの生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が導入されている。シリカナノ粒子の表面に導入する捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有するものであれば特に制限はない。
【００５５】
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。また、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に導入する捕捉物質を導入したときに燐光色素含有シリカナノ粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
【００５６】
以下、燐光色素含有シリカナノ粒子を調製する方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００５７】
まず、反応性官能基を有するシランカップリング剤を加水分解し、加水分解されたシランカップリング剤と燐光色素含有シリカナノ粒子の表面に存在するヒドロキシル基とを縮重合させ、反応性官能基を燐光色素シリカナノ粒子の表面に導入する。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
【００５８】
反応性官能基としてはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基及びイソシアネート基から選ばれる少なくとも１種の反応性官能基が好ましく、チオール基がより好ましい。
反応性官能基がチオール基である場合は、燐光色素含有シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives  of  Biochemistry  and  Biophysics,  82,  70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
【００５９】
シリカナノ粒子の表面に導入した反応性官能基と、これと化学結合を形成するリンカー分子とを反応させる。そして、リンカー分子とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを結合させ、燐光色素含有シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、燐光色素シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
【００６０】
そして、シリカナノ粒子に結合するＢＳＡと、捕捉物質とを常法に従って結合させる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって、ＢＳＡと捕捉物質とを結合させることができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合により、ＢＳＡと捕捉物質とを結合させることができる。なお、ＢＳＡと捕捉物質とが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的にＢＳＡと捕捉物質とが結合して複合体を形成していてもよい。
【００６１】
燐光色素含有シリカナノ粒子の表面における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、燐光色素含有シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりの捕捉物質の導入量は、０．０００１ｍｏｌ以上０．１ｍｏｌ以下が好ましく、０．００１ｍｏｌ以上０．０５ｍｏｌ以下が好ましい。
【００６２】
［生体分子の検出方法］
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と燐光色素含有シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子を有する生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００６３】
まず本発明の第１の実施態様では、生体分子を含有しうる液体試料と本発明の標識試薬粒子との混合物を、前記試験片１のサンプルパッド２に滴下する。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片１の構成に合わせて適宜調節することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
【００６４】
本発明の第２の実施態様では、本発明の標識試薬粒子を生体分子アッセイに用いる部材に乾燥された状態で含ませておく。そして、抗原抗体反応などの特異的な反応により生体分子を検出する前に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合させる。例えば、イムノクロマト法により生体分子を検出する場合、前記標識試薬粒子をサンプルパッド２やメンブレン３に含ませておき、生体分子を含有しうる液体試料がこれらの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。あるいは、前記標識試薬粒子を含ませたコンジュゲートパッド５をメンブレン３よりも上流に設け、生体分子を含有しうる液体試料がこの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。これらの場合、生体分子を含有しうる液体試料が前記部材を通過した後に抗原抗体反応などの特異的な反応が行われる。
そして、毛細管現象によりコンジュゲートパッド５からメンブレン３に移動してきた生体分子と燐光色素含有シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
【００６５】
標識試薬粒子の標識の検出方法に特に制限はなく、目視で検出してもよいし、汎用の燐光色素検出器を用いて検出してもよい。
また前述のように、本発明では、発光寿命が10マイクロ秒以上100ミリ秒以下である紫外励起燐光色素が好ましく用いられる。そのため、前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始することが好ましく、前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、10マイクロ秒以上経過後100ミリ秒経過前に燐光の測定を開始することがより好ましい。さらに、前記燐光色素含有シリカナノ粒子への励起光の照射停止後、前記燐光色素含有シリカナノ粒子の燐光発光持続時間内で燐光を測定することが好ましい。
【００６６】
汎用の発光検出器は、励起光源を含んでなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。また前記発光検出器には、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタを設けてもよいが、検出器のコンパクト化、低コスト化の観点から、フィルタを設けないことが好ましい。前記発光検出器は、発光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の発光も検出でき、さらにはその発光強度を測定できる。
【００６７】
照射する励起光の波長は特に限定されないが、２３０ｎｍ以上４００ｎｍ未満が好ましく、２５０ｎｍ以上３３０ｎｍ未満が特に好ましい。
発光の波長は４５０ｎｍ以上が好ましく、４８０ｎｍ以上特に好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６９】
（調製例１）燐光色素含有標識シリカナノ粒子の調製
（１）燐光色素含有シリカナノ粒子の調製
下記に示す構造式を有する、燐光色素のスクシンイミジルエステル体（励起波長293nm、発光波長500-600nm、株式会社アイエスティー社製）３１ｍｇを１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１２μＬのＡＰＳ（信越シリコーン社製）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い燐光色素−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
【００７０】
【化４】
2017181050.tif 000005
【００７１】
得られた燐光色素−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した燐光色素含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２５０ｎｍの燐光色素含有シリカナノ粒子２．３３ｇを得た。収率約９０％。
【００７２】
（２）チオール基の導入
上記で得た粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）を１．５ｍＬ加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を１０ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する燐光色素含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された燐光色素含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａと呼ぶ。）を得た。
得られたチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａ  ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
【００７３】
（３）チオール基を介した燐光色素含有シリカナノ粒子と抗体との結合
チオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−(４−アミノフェニル)マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入燐光色素含有シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、マウス由来、HyTest社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。そして、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はPierceBCA  Protein  Assay  Kit（商品名、Thermo  Fisher  Scientific社製）を用いた。その結果、燐光色素含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、７．９ｍｇであった。
【００７４】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。そして１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した燐光色素含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイドを得た。
【００７５】
（調製例２）蛍光色素含有標識シリカナノ粒子の調製
蛍光分子である5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp  Biotech  GmbH社製）３１ｍｇを１０ｍＬのＤＭＦに溶解した。ここに１２μＬのＡＰＳ（信越シリコーン社製）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
得られた5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した蛍光分子含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子含有シリカナノ粒子１．６５ｇを得た。収率約９４％。
以下、調製例１と同様の操作を行い、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイドを得た。
【００７６】
（調製例３）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow  Plus180  メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
【００７７】
続いて、幅約１ｍｍのコントロールライン２１として、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（AKP  Goat  anti-mouse  IgG  Antibody、BioLegend社製）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は３ｍｍとした。
【００７８】
前記抗体固定化メンブレン３、サンプルパッド（商品名：Glass  Fiber  Conjugate  Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（商品名：Cellulose  Fiber  Sample  Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives  Research社製）６上で組み立てた。なお、メンブレン３はテストライン２０がサンプルパッド２側、コントロールライン２１が吸収パッド４側になる向きで構成した。続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
【００７９】
（試験例）インフルエンザ核タンパク質の検出
表１に示す組成で、Ａ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。続いて同混合液１００μＬと、調製例１のコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬの混合液をテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。調製例２のコロイドについても同様に試験を実施した。１５分後、下記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。
その結果を表１に示す。
【００８０】
＜検出装置＞
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が293ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し発光を420ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
【００８１】
測定は、以下の手順で行った。まず、ＰＣからファンクションジェネレーター経由であらかじめＰＭＴをＯＮにしてから、０．００１μ秒後にＰＣからファンクションジェネレーターを経由で293nmの波長のレーザーをサンプルに照射し、サンプルからの発光を１０μ秒、ＰＭＴを介して受光した。この作業を繰り返し、オシロスコープにデータを蓄積し、全データをＰＣへ出力した。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
表１の結果から、調製例１で作製した粒子を用いた場合、調製例２で作製した粒子を用いた場合と比べ、発光強度の絶対値は小さくなった。しかし、検体の検出濃度範囲は変わっておらず、従来法と同様の感度が得られることが分かる。
さらに、420ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを除いて測定した場合も、調製例１のサンプルでは同様の結果が得られた。
【符号の説明】
【００８４】
１  テストストリップ
２  サンプルパッド
３  メンブレン
４  吸収パッド
６  バッキングシート
１０  試験領域
２０  試験領域
２１  参照領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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