(57)【要約】【課題】血小板の凝集能、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ホスファチジルセリンの露出の促進、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）発現の増加、Ｓｒｃキナーゼの活性化（リン酸化）、ＰＬＣγIIの活性化（リン酸化）等の血小板機能を維持及び／又は増強することができる血小板機能改善組成物を提供することにある。【解決手段】重炭酸イオン又は重炭酸塩を含有する血小板機能の維持及び／又は増強剤有効成分とする血小板機能の維持及び／又は増強剤を調製する。上記血小板機能の維持及び／又は増強剤は、脳脊髄手術用洗浄灌流液として好適な液剤組成物に調製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重炭酸イオン又は重炭酸塩を含有する血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【請求項２】
重炭酸イオンの濃度が、１０〜５０ｍＥｑ／Ｌであることを特徴とする請求項１記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【請求項３】
重炭酸塩が、重炭酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【請求項４】
血小板機能が、血小板の凝集能、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ホスファチジルセリンの露出の促進、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）発現の増加、Ｓｒｃキナーゼの活性化（リン酸化）及びＰＬＣγIIの活性化（リン酸化）から選択される１種又は２種以上の機能であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【請求項５】
脳脊髄手術用洗浄灌流液として用いるための請求項１〜４のいずれか記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重炭酸イオン又は重炭酸塩を有効成分として含有する血小板機能の維持及び／又は増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術を行う際、術野における出血量を低減することは、失血を最小化するためだけでなく、患部の位置、構造や切開面を明確に視認するためにも重要であり、手術時間の短縮にもつながる点で重要である。手術時間の延長は、患者の体力を低下させるほか、切開部の損傷にもつながるため好ましくない。特に神経外科手術の場合は、手術時間の延長による切開部の損傷がより大きな問題となる。また、術野の明瞭な視界を確保することが特に求められる顕微鏡手術や内視鏡神経外科手術などの手術では、手術によるリスクを最小化するため、手術の間、双極性鑷子による止血と共に、生理的な手段による止血も常に維持することが求められている。
【０００３】
従来より、神経外科手術中の手術野用の灌流液として、生理食塩水（ＮＳ）、乳酸リンゲル液等の市販の灌流液や、病院内で調製された人工髄液（ＣＳＦ）が使用されている。灌流液の組成は、生理的止血（非特許文献１）、星状膠細胞の細胞毒性（非特許文献２、３）、脳浮腫、血管透過性（非特許文献４）、及び神経内視鏡手術後の患者の術後毒性反応（非特許文献５）などに影響を及ぼすことが知られている。上記非特許文献１には、市販の人工ＣＳＦ液及び乳酸リンゲル液による灌流が、術中出血を防ぐ可能性があることが示されており、かかる防止作用におけるカルシウムとカリウムの潜在的役割が示唆されている。非特許文献１の実験では、脳表面出血について新規に開発された齧歯類モデルにおいて、出血点の数が最小化された。しかし、生理食塩水との比較において、一次止血や二次止血に対して灌流液がもたらすプラス効果の機構や、止血に重要な灌流液の成分は究明されていなかった。
【０００４】
血小板は、巨核球細胞質から形成される無核細胞であり、濃染顆粒やα顆粒等の血小板特異的細胞内小器官を含み、止血及び血栓形成に中心的役割を担っている。受傷後、血小板は、露出した血管内皮下組織に付着する際、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）とコラーゲンが止血に重要な役割を果たす（非特許文献６）。血小板は、ｖＷＦ上を回転する間に、ｖＷＦと糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂ−IX−Ｖ複合体との相互作用により内皮下コラーゲンと結合する（非特許文献７〜９）。また、コラーゲンへの血小板の付着は、血小板表面にあるコラーゲン受容体ＧＰVI及びＧＰＩａ／IIａ（インテグリンα２β１）が重要である（非特許文献１０）。血小板がコラーゲンと相互作用する結果、フィブリノゲン受容体であるＧＰIIｂ／IIIａ（インテグリンαIIｂβ３）を介して血小板凝集が起こる（非特許文献６）。さらに、活性化血小板は、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）を発現し、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）を分泌し、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を血小板表面に露出させる。Ｐ−セレクチンを発現した血小板及びホスファチジルセリンを露出した血小板は、効率的な凝固及び正常な血栓形成に必要とされる。
【０００５】
血小板等を凝固させて止血する技術として、例えば紅景天属（Rhodiola、ベンケイソウ科）植物のアルコール抽出物が血小板凝集効果及び止血効果を有していることを利用し、該アルコール抽出物を有効成分とする止血剤が知られている（特許文献１）。また、血小板凝集促進活性を有するｇｐ４４タンパク質も知られている（特許文献２）。しかし、これらの技術はいずれも、実用性等の点で不十分であった。
【０００６】
他方、重炭酸ナトリウムは、炭酸水素ナトリウムとも呼ばれ、化学式ＮａＨＣＯ３で表される物質である。重炭酸ナトリウムは、加熱すると分解して二酸化炭素を生成するため、ふくらし粉として使用される他、ｐＨ調整剤や、胃酸過多に対する制酸剤など、様々な用途に広く用いられている。しかし、重炭酸ナトリウムが、血小板の凝集機能を増強することができることは、これまで知られていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、血小板の凝集能、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ホスファチジルセリンの露出の促進、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）発現の増加、Ｓｒｃキナーゼの活性化（リン酸化）、ＰＬＣγIIの活性化（リン酸化）等の血小板機能を維持及び／又は増強することができる血小板の維持及び／又は増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、以下の（ａ）〜（ｃ）の知見を得たことによって本発明を完成させるに至った。
（ａ）重炭酸ナトリウムが、トロンビンや、コラーゲンや、エピネフリンや、カルシウムイオノファＡ２３１８７によって誘導された血小板凝集機能を維持及び／又は増強すること。
（ｂ）重炭酸ナトリウムが、血小板機能を維持及び／又は増強する作用を有していること。より具体的には、重炭酸ナトリウムが、血小板におけるインテグリンαIIｂβ３を活性化し、血小板におけるホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出を促進し、血小板におけるＰ−セレクチン（ＣＤ６２）発現を増加し、血小板におけるＳｒｃキナーゼを活性化（リン酸化）し、及び、血小板におけるＰＬＣγIIを活性化（リン酸化）すること。
（ｃ）モデルマウスの切除した尾部を、重炭酸ナトリウムを含む水溶液に浸漬させると、出血時間が短縮すること。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）重炭酸イオン又は重炭酸塩を含有する血小板機能の維持及び／又は増強剤。
（２）重炭酸イオンの濃度が、１０〜５０ｍＥｑ／Ｌであることを特徴とする上記（１）記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
（３）重炭酸塩が、重炭酸ナトリウムであることを特徴とする上記（１）記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
（４）血小板機能が、血小板の凝集能、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ホスファチジルセリンの露出の促進、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）発現の増加、Ｓｒｃキナーゼの活性化（リン酸化）及びＰＬＣγIIの活性化（リン酸化）から選択される１種又は２種以上の機能であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
（５）脳脊髄手術用洗浄灌流液として用いるための上記（１）〜（４）のいずれか記載の血小板機能の維持及び／又は増強剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、血小板の凝集機能を効果的に維持・増強することができる血小板機能の維持及び／又は増強剤を提供することができる。また、本発明の血小板機能の維持及び／又は増強剤は、輸液、手術用の灌流液、各種細胞の洗浄・保存・懸濁液等に好適に用いることができる。
例えば、外科手術中に、組織の湿潤を保つ又は術野を洗浄する際には通常生理食塩水を用いるが、生理食塩水使用下では血小板機能が低下するので、これを重炭酸イオンを含有する製剤に代えて使用することで、血小板機能の維持が可能となる。
また、生理食塩水が多用される頭蓋内手術でも、電気メスやバイポーラ鑷子を用いた凝固止血やフィブリン製剤を用いた止血の際に、重炭酸イオン製剤により、血小板機能の維持による安定した止血が得られるといった使用方法が考えられる。更に、抗血小板剤を使用している場合には血小板機能は全身的に低下しており、このような状況下での自然止血、圧迫止血、凝固止血、フィブリン製剤による止血のすべてにおいて血小板機能維持による安定した止血が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】市販の人工ＣＳＦ液（ａＣＳＦ）を添加した血小板高含有血漿又は洗浄血小板における血小板凝集を示す図である。Ａ．血小板高含有血漿中の血小板（４×１０８ｍＬ−１）をａＣＳＦ又はＮＳに２×１０８ｍＬ−１となるように希釈し、（ｉ）コラーゲン（０．５、０．２５μｇ ｍＬ−１）、（ii）ＡＤＰ（１．０、０．５μＭ）、又は（iii）エピネフリン（２．０μｇ ｍＬ−１）で刺激した。攪拌条件下での透光度を経時的に測定し、血小板凝集を分析した。Ｂ〜Ｄ．血小板凝集を、ａＣＳＦ又はＮＳの存在下においてトロンビン（Ｂ）、コラーゲン（Ｃ）、又はＡ２３１８７（Ｄ）で刺激した後に分析した。Ａ〜Ｃ（ｉ）．アゴニストの濃度を最適化するため、洗浄血小板（２〜２．５×１０８ｍＬ−１）をトロンビン（Ｂ（ｉ））、コラーゲン（Ｃ（ｉ））、又はＡ２３１８７（Ｄ（ｉ））をそれぞれ表示された濃度で刺激した。Ｂ〜Ｄ（ii）．種々の濃度のａＣＳＦを調製するため、ａＣＳＦをＮＳで事前希釈した（ａＣＳＦ：ＮＳ＝１：０、１：１又は１：３）。血小板（４〜５×１０８ｍＬ−１）をＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で洗浄した後、種々の濃度のａＣＳＦ又はＮＳに２倍希釈し、それら血小板（２〜２．５×１０８ｍＬ−１）を、最適化したトロンビン（０．２５ＵｍＬ−１）（Ｂ（ii））、コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）（Ｃ（ii））、又はＡ２３１８７（０．０５μＭ）（Ｄ（ii））で刺激した。ａＣＳＦの最終濃度は以下のとおりに維持した。ａＣＳＦ：ＮＳ＝１：０＝ａＣＳＦ１／２；１：１＝ａＣＳＦ１／４；１：３＝ａＣＳＦ１／８。攪拌条件下での透光度を経時的に測定し、血小板凝集を分析した。ａＣＳＦ、人工髄液；Ｈｅｒｐｅｓ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；ＮＳ、生理食塩水。
【図２】血小板におけるインテグリンαIIｂβ３の活性化、ＰＳの露出、及びＣＤ６２Ｐの発現に及ぼすａＣＳＦの効果を示す図である。ＦＩＴＣ結合抗ヒトＰＡＣ−１（活性インテグリンαIIｂβ３）ｍＡｂ（Ａ）、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ（Ｂ）、又はＰＥ結合抗ヒトＣＤ６２ＰｍＡｂ（Ｃ）により血小板を染色し、種々の濃度のａＣＳＦ又はＮＳの存在下において、トロンビン（０．５ＵｍＬ−１）刺激の存在下若しくは非存在化で５分間暴露した（Ａ〜Ｃ（ｉ））。ＦＩＴＣ結合抗ヒトＰＡＣ−１ｍＡｂ（Ａ）、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ（Ｂ）、又はＰＥ結合抗ヒトＣＤ６２ＰｍＡｂ（Ｃ）により血小板を染色し、ａＣＳＦ又はＮＳの存在下において、トロンビン（０．５ＵｍＬ−１）刺激の存在下若しくは非存在化で２、５及び１０分間暴露した（Ａ〜Ｂ（ii）、Ｃ（iii））。陽性事象の平均蛍光強度は、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ６２ＰｍＡｂの結合により示す（Ｃ（ii））及び（Ｃ（iv））。平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示すデータは、３回実施した同様の実験の代表例である。ａＣＳＦ、人工髄液；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＮＳ、生理食塩水；ＰＥ、フィコエリトリン；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＳＤ、標準偏差。
【図３】ＰＴ及びＡＰＴＴに及ぼすａＣＳＦの効果を示す図であり、ａＣＳＦは、凝固には顕著な効果を示さないことが示唆される。Ａ．ＮＳで希釈した血漿を用いて最適化したＰＴ又はＡＰＴＴを示す。Ｂ．ａＣＳＦ又はＮＳで希釈した血漿中で測定したＰＴを示す。Ｃ．ａＣＳＦ又はＮＳで希釈した血漿中で測定したＡＰＴＴを示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を示す。ａＣＳＦ、人工髄液；ＡＰＴＴ、活性化部分トロンボプラスチン時間、ＮＳ、生理食塩水；ＰＴ、プロトロンビン時間；ＳＤ、標準偏差。
【図４】血小板活性化に及ぼす重炭酸ナトリウムの影響を示す図である。Ａ．上部チャンバー（ＵＣ）溶液、下部チャンバー（ＬＣ）溶液、又はａＣＳＦの混合溶液の存在下において、（ｉ）トロンビン（０．２５Ｕ ｍＬ−１）、又は（ii）コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）で血小板（２〜２．５×１０８ｍＬ−１）を刺激した。Ｂ．ＵＣ溶液、ＬＣ溶液、又はａＣＳＦ（ａｐ−ａＣＳＦ）の混合溶液の存在下において、（ｉ）トロンビン（０．２５Ｕ ｍＬ−１）、又は（ii）コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）で血小板を刺激した。Ｃ．塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、又はリン酸二水素カリウムを除去したＬＣ溶液の存在下において、コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）で血小板を刺激した（ｉ）。種々の濃度の重炭酸ナトリウムを含有するＬＣ溶液の存在下において、コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）で血小板を刺激した（ii）。Ｄ．血小板を、ａＣＳＦ（ｉ）又はＮＳ（ii）に再懸濁した後、ＨＣＯ３−／Ｃｌ−エクスチェンジャーの選択的阻害剤であるＤＩＤＳの種々の濃度存在下において、コラーゲン（１．０μｇ ｍＬ−１）で刺激した。ａＣＳＦ、人工髄液；ＤＩＤＳ、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩；ＮＳ、生理食塩水。
【図５】ａＣＳＦ存在下で活性化された血小板におけるＳｒｃとＰＬＣγIIのリン酸化を示す図である。Ａ．ａＣＳＦ又はＮＳの存在下において、血小板をトロンビン（０．５Ｕ ｍＬ−１）で刺激した。Ａｋｔ、Ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、及びｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化をイムノブロット分析により検出した。Ｂ．ａＣＳＦ又はＮＳの存在下において、血小板をトロンビン（０．５Ｕ ｍＬ−１）で刺激した。Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、及びＰＬＣγIIのリン酸化をイムノブロット分析により検出した。等量の試料の投入を確保するため、すべての実験においてβ−アクチンをイムノブロット分析により検出した。Ｃ．洗浄血小板（２〜２．５×１０８ｍＬ−１）をａＣＳＦ又はＮＳに再懸濁した後、種々の濃度のＳｒｃファミリー阻害剤ＰＰ２の存在下において、トロンビン（０．５Ｕ ｍＬ−１）で刺激した。血小板凝集は、攪拌条件下にて光吸収により分析した。ａＣＳＦ、人工髄液；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＭＡＰＫ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ；ＰＬＣγII、ホスホリパーゼＣγ−２；ＮＳ、生理食塩水。
【図６】尾部からの出血時間を示す図である。各マウスの尾端から５ｍｍの断片を切除した後、尾部を３７℃まで加温したａＣＳＦ又はＮＳに浸漬した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を示す。ａＣＳＦ処理マウスの出血時間は、ＮＳ処理マウスの出血時間と比較して著しく短かった。ａＣＳＦ、人工髄液；ＮＳ、生理食塩水；ＳＤ、標準偏差
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の血小板機能の維持及び／又は増強剤としては、重炭酸イオン又は重炭酸塩を含有するものであれば特に制限されず、かかる重炭酸塩は炭酸水素塩ともよばれ、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）とアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオンなどから得られる医薬的に許容される塩を例示することができ、重炭酸ナトリウム（炭酸水素ナトリウム）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ３）２）、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）等を具体的に例示することができ、中でも重炭酸ナトリウムを特に好適に例示することができる。また、これら重炭酸塩は無水物であっても、水和物であってもよく、また、固形状であってもよいし、溶媒に溶解した溶液状であってもよい。かかる固形状としては、粒状、顆粒状、粉末状等を挙げることができる。
【００１３】
上記血小板機能としては、血小板の凝集能、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ホスファチジルセリンの露出の促進、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）発現の増加、Ｓｒｃキナーゼの活性化（リン酸化）、ＰＬＣγIIの活性化（リン酸化）等を例示することができる。そして、血小板機能の維持とは、出血、疾病、投薬等によるストレスが掛かる前の状態において生体が保持している上記血小板に関する機能レベルを維持することを指し、出血の際、出血部の洗浄時に生理食塩水を使用する場合や、アスピリンなどの抗血小板薬を服用している場合や、血小板製剤製造の際に洗浄や調製を行う場合など、何らかの理由で血小板機能が低下し、止血作用が低下、止血時間が延長する場合、これらを抑制もしくは回復させる作用をいう。
【００１４】
本発明の重炭酸イオン又は重炭酸塩を含有する血小板機能の維持及び／又は増強剤は、輸液、手術用の灌流液、各種細胞の洗浄・保存・懸濁液等の形態で使用されるが、特に脳脊髄手術用洗浄灌流液として好適に用いることができる。重炭酸塩は水に溶解すると、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）すなわち重炭酸イオンを生じる。血小板機能の維持及び／又は増強剤における重炭酸イオンの濃度は、閉鎖系の炭酸ガス雰囲気下で１０〜５０ｍＥｑ／Ｌ、好ましくは１５〜４０ｍＥｑ／Ｌ、より好ましくは２０〜３０ｍＥｑ／Ｌである。例えば、重炭酸塩として重炭酸ナトリウムを用いる場合、好ましい使用濃度は０．１〜０．３質量％である。また、脳脊髄手術用洗浄灌流液等として用いる場合、重炭酸ナトリウム等の重炭酸塩の外に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、リン酸二水素カリウム、クエン酸ナトリウム等の他の電解質成分も併用することができるが、塩化ナトリウム、塩化カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むものはａＣＳＦとして公知であるので、本発明から除かれる。
【００１５】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により限定されるものではない。
【００１６】
＜方法＞
［試薬類］
本実施例の実験に用いた試薬類は以下のとおりである。
人工ＣＳＦ液（ａＣＳＦ）ＡＲＴＣＥＲＥＢ（登録商標）は、大塚製薬工場（株）（徳島県）から入手した。ウマＩ型コラーゲンは、二光バイオサイエンス（株）（東京都）から購入した。エピネフリン、ＡＤＰ、ロイペプチン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、及び４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩（ＤＩＤＳ）は、Sigma Chemical Company（ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ａ２３１８７及びトロンビンは、Merck社（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。ペファブロックは、Roche Molecular Biochemicals社（ドイツ、マンハイム）から購入した。プロトロンビン時間（ＰＴ）用のニコプラスチンは、Axis-Shield社（ノルウェー、オスロ）から購入した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）用のアクチンは、Siemens社（ドイツ、ミュンヘン）から購入した。ウエスタンブロット分析用の抗体は以下のとおり：ウサギ抗−ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ウサギ抗−Ａｋｔ、ウサギ抗−ホスホ−ｐ４４／４２マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ウサギ抗−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、ウサギ抗−ホスホ−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ウサギ抗−Ｌｙｎ及びウサギ抗−ホスホ−ＰＬＣγ２（Ｔｙｒ１２１７）ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Cell Signaling Technology社製、マサチューセッツ州ビバリー）；マウス抗−ｐ３８α／βモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Santa Cruz Biotechnology社製、カリフォルニア州サンタクルーズ）；ウサギ抗−Ｌｙｎホスホ（ｐＹ３９６）及びウサギ抗−ＰＬＣγII ｍＡｂ（Epitomics社製、カリフォルニア州バーリンゲーム）；ウサギPhosphoDetect（登録商標）抗Ｓｒｃファミリー（ｐＴｙｒ４１６）ｐＡｂ（Merck社製）；ウサギ抗−ＳｒｃｐＡｂ（Signalway Antibody社製、メリーランド州カレッジパーク）；及びマウス抗−β−アクチンｍＡｂ（Sigma Chemical Company製）。その他のすべての試薬は、特記しない限りSigma Chemical Companyから購入したものである。
【００１７】
［血小板の調製方法］
血液試料は、自らの試料を実験に提供することについて、書面によるインフォームドコンセントを提出した健常被験者から得た。別段の指示がない限り、血液試料は２２ゲージ針で抽出し、３．２％クエン酸ナトリウム又は１５％クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）が入ったプラスチック製シリンジに回収した。血小板高含有血漿（ＰＲＰ）は、遠心分離（室温下、１８０ｇにて１０分間）によって得た。血小板低含有血漿は、遠心分離（室温下、１６１０ｇにて１０分間）によって得た。ＰＲＰを室温下で５００ｇにて２０分間遠心分離にかけ、洗浄血小板を調製した。１０％ＡＣＤを含む４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタン−スルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ｍＭ グルコース、０．１％［ｗ／ｖ］ウシ血清アルブミン、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）に血小板を再懸濁した。１０％ＡＣＤを含むＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を用いて血小板を２回洗浄し、Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に再懸濁した。
【００１８】
［血小板凝集試験の方法］
血小板活性化の指標となる血小板凝集をトレースして記録した。攪拌ＰＲＰ又は洗浄血小板の光線透過率の上昇率を分光光度法で測定し、血小板の凝集量を評価した。
種々の濃度を調製するため、ａＣＳＦをＮＳに予備希釈した（ａＣＳＦ：ＮＳ＝１：０、１：１又は１：３）。ＰＲＰ（４×１０８ｍＬ−１）をａＣＳＦ又はＮＳで２倍希釈した（表１）（非特許文献１１）。洗浄血小板（４〜５×１０８ｍＬ−１）を種々の濃度のａＣＳＦ又はＮＳで希釈した。血小板凝集に用いたａＣＳＦの上記希釈による最終濃度は以下のとおり：ａＣＳＦ：ＮＳ＝１：０＝ａＣＳＦ１／２；１：１＝ａＣＳＦ１／４；１：３＝ａＣＳＦ１／８。希釈ＰＲＰ（２×１０８ｍＬ−１）又は洗浄血小板（２〜２．５×１０８ｍＬ−１）を様々なアゴニストで刺激し、Easy Tracer RT-800機器（東京光電（株）、東京都）を用いて血小板凝集を攪拌条件下で測定した。ａＣＳＦの血漿非依存性の効果を調べるため、洗浄血小板も調製した。
【００１９】
［血小板におけるインテグリンαIIｂβ３の活性の測定試験の方法］
活性インテグリンαIIｂβ３アッセイを行うため、刺激した後の試料をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＰＡＣ−１（活性インテグリンαIIｂβ３）モノクローナル抗体と、フィコエリトリン（ＰＥ）−シアニン−５−結合抗ヒトＣＤ４２ｂモノクローナル抗体（Becton and Dickinson社製、カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、暗条件下で染色した。血小板中の活性インテグリンαIIｂβ３をフローサイトメトリー（Becton and Dickinson社製）で分析した。
【００２０】
［血小板におけるＰＳ露出及びＣＤ６２Ｐ発現の測定試験の方法］
ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出アッセイを行うため、２ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄した血小板を３７℃で１５分間プレインキュベートし、その後、トロンビンで刺激した。刺激後、ＦＩＴＣ−結合アネキシンＶ（Sigma社製）及びＰＥ−シアニン−５−結合抗ヒトＣＤ４２ｂモノクローナル抗体（Becton and Dickinson社製）を用い、暗条件下にて試料を染色した。ＣＤ６２Ｐ発現アッセイを行うため、２ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄した血小板を３７℃で１５分間プレインキュベートし、その後、トロンビンで刺激した。刺激後、１％パラホルムアルデヒドで反応を停止させた。ＰＥ−結合抗ヒトＣＤ６２Ｐモノクローナル抗体（Becton and Dickinson社製）を用い、固定した血小板を暗条件下にて染色した。ＰＳ露出及びＣＤ６２Ｐ発現をフローサイトメトリー（Becton and Dickinson社製）で分析した。
【００２１】
［プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間の測定試験の方法］
得られた血漿をａＣＳＦ又はＮＳで希釈した。ＰＴ及びＡＰＴＴはＣＡ−５０凝固測定装置（シスメックス（株）製、神戸市）で測定した。なお、プロトロンビン時間とは、出血が始まってから肝臓でプロトロンビン（血液凝固因子）がつくられるまでの時間を意味し、活性化部分トロンボプラスチン時間とは、血液が凝固するまでの時間を意味する。
【００２２】
［イムノブロット分析の方法］
１０μｇ ｍＬ−１ロイペプチン、２μｇ ｍＬ−１アプロチニン、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、及び２ｍＭ ペファブロックを含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１％トリトン−Ｘ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に、洗浄血小板を溶解した。氷上での３０分間のインキュベーション後、遠心分離（４℃、１２０００ｇにて１０分間）により、不溶物質を除去した。可溶物質を３×試料緩衝液（０．０１％ブロモフェノールブルー、３０％グリセロール、９％ＳＤＳ、１０％［ｖ／ｖ］２−メルカプトエタノール、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）に再懸濁し、９５℃で５分間煮沸した。ウエスタンブロット分析を行うため、この試料緩衝液中で調製したタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Hybond ECL、Amersham Biosciences社製、スウェーデン、ウプサラ）により分離し、０．５％Tween-20を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Ｔ−ＴＢＳ、和光純薬工業（株）製）及び５％ウシ血清アルブミンを用い、室温で１時間ブロッキング処理を行った。特異的抗体の溶液を用いてメンブレン処理を行い、Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗イムノグロブリン抗体溶液（Amersham Bioscienses社製）でインキュベーションし、３回洗浄し、ＥＣＬ−イムノブロッティング検出キット（Amersham Biosciences社製）を用いて処理した。別の抗体溶液でメンブレンをリプローブするため、メンブレンをストリッピング緩衝液（２％ＳＤＳ、０．７２％２−メルカプトエタノール、及び６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７）中にて５０℃で３０分間洗浄し、再度ブロッキング処理を行った。
【００２３】
［出血時間の測定試験の方法］
出血時間は、尾部出血時間モデルを用いて評価した。日本チャールスリバー株式会社（横浜市）から雌のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（８週齢）を購入した。各マウスの尾端から５ｍｍの断片を切除し、尾部を３７℃まで加温したａＣＳＦ（ｎ＝８）又はＮＳ（ｎ＝８）に浸漬させ、出血時間を測定した。動物実験は、筑波大学動物実験委員会の承認を得て行った。
【００２４】
［統計分析］
統計分析はエクセルソフトウエア（Microsoft社製、ワシントン州シアトル）を使用して行った。すべてのインビトロ実験は各々少なくとも３回繰り返し、データは平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。２つの測定値の間の相違の確率値はｔ検定により得ることとし、０．０５未満の確率値を有意とした。
【００２５】
＜結果＞
［ａＣＳＦ添加に伴う血小板凝集試験］
本発明者らは、上記の［血小板凝集試験の方法］に記載の方法にしたがって、コラーゲン（最終：０．５、０．２５μｇ ｍＬ−１）、ＡＤＰ（最終：１．０、０．５μＭ）、又はエピネフリン（最終：２．０μｇ ｍＬ−１）によって誘導された血小板凝集を分析し、血小板機能に対するａＣＳＦの効果を評価した。しかしながら、ａＣＳＦ（７１．１％）とＮＳ（６９．３％）との間で、最大量のコラーゲン（０．５μｇｍＬ−１）に誘導された凝集レベルに顕著な違いは認められなかった（図１Ａ（ｉ））。ａＣＳＦ存在下での凝集は、ＮＳ存在下の場合よりもより迅速に最大応答（response）に達し（ａＣＳＦ：４．５分ｖｓＮＳ：６．０分）、ａＣＳＦ添加により誘導された血小板中コラーゲンに対する早期応答は、ＮＳ添加によって誘導されたものより優れていた。より低濃度のコラーゲン（０．２５μｇ ｍＬ−１）に誘導された凝集は、ａＣＳＦ存在下で増強された（ａＣＳＦ：４３．７％ｖｓＮＳ：３３．５％）（図１Ａ（ｉ））。ａＣＳＦ存在下において、ＡＤＰ及びエピネフリンにそれぞれ誘導された凝集増強も観察された（図１Ａ（ii）及び（iii））。
【００２６】
トロンビン濃度を最適化するため、洗浄血小板を種々の濃度のトロンビンで刺激したところ、０．５〜１．０Ｕ ｍＬ−１では凝集が観察されたが、０．２５Ｕ ｍＬ−１のトロンビンでは観察されなかった（図１Ｂ（ｉ））。単独では凝集が誘導されなかった、より低濃度のトロンビン（０．２５Ｕ ｍＬ−１）で凝集刺激を行ったときのａＣＳＦの直接的な効果を確認するため、種々の濃度のａＣＳＦ存在下においてトロンビンで血小板を刺激した。その結果、凝集はａＣＳＦの用量依存的に増強された（図１Ｂ（ii））。コラーゲン濃度（図１Ｃ（ｉ））又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（図１Ｄ（ｉ））の最適化後、種々の濃度のａＣＳＦの存在下において、血小板をコラーゲン又はＡ２３１８７で刺激した。ａＣＳＦによる凝集増強は、コラーゲン及びＡ２３１８７で刺激した場合にも観察された（図１Ｃ（ii）及び１Ｄ（ii））。特に、コラーゲンに誘導される凝集は、ａＣＳＦにより用量依存的に増強され（図１Ｃ（ii））、低濃度のａＣＳＦ（ａＣＳＦ１／４、１／８）の存在下でＡ２３１８７に誘導された凝集レベルは、より高濃度のＡ２３１８７に誘導された凝集レベルにほぼ同等であった（図１Ｄ（ii））。より高濃度のａＣＳＦ（ａＣＳＦ１／２）の存在下で観察された凝集レベルは、より高濃度のトロンビン、コラーゲン及びＡ２３１８７（トロンビン：１．０Ｕ ｍＬ−１；コラーゲン：８．０μｇ ｍＬ−１；Ａ２３１８７：０．１μＭ）によって誘導された凝集レベルとほぼ同等であった。
【００２７】
［血小板活性化に及ぼすａＣＳＦの影響］
血小板におけるフィブリノゲン受容体として知られるインテグリンαIIｂβ３は、止血及び血小板血栓形成に重要な役割を果たしている（非特許文献６）。低親和性状態のインテグリンαIIｂβ３は、フィブリノゲン結合能を有さないものの、ＡＤＰ及びＴＸＡ２による刺激により、或いはＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ複合体又はＧＰＶＩからのシグナル伝達により、低親和性状態から高親和性状態へと変化する（非特許文献６、１２）。したがって、インテグリンαIIｂβ３の活性化が血小板活性化マーカーの一つであることから、アゴニストの刺激によるインテグリンαIIｂβ３の血小板中での活性化が、ａＣＳＦ存在下で亢進する可能性があるとの仮説を本発明者らは立てた。このことを確かめるため、上記の［血小板におけるインテグリンαIIｂβ３の活性の測定試験の方法］に記載の方法にしたがって、刺激した血小板をａＣＳＦ又はＮＳの存在下でフローサイトメトリーによって分析した。その結果、トロンビン刺激後の活性インテグリンαIIｂβ３陽性血小板の数は、ＮＳを添加した場合より、ａＣＳＦを添加した場合のほうが顕著に増加していた（図２Ａ（ii））。ＮＳ存在下の活性インテグリンαIIｂβ３のレベルは、時間依存的に減少したが、ａＣＳＦ存在下では、ＮＳの場合と比較して刺激中にわたって維持されていた（図２Ａ（ii））。
【００２８】
また、血小板におけるＰＳ露出及びＣＤ６２Ｐ発現がａＣＳＦによってどのような影響を受けるかを確かめるため、上記の［血小板におけるＰＳ露出及びＣＤ６２Ｐ発現の測定試験の方法］に記載の方法にしたがって、血小板をａＣＳＦ又はＮＳの存在下にてトロンビンで刺激し、血小板におけるＰＳ露出及びＣＤ６２Ｐ発現をフローサイトメトリーによって分析した。その結果、ＰＳ露出血小板についても、血小板をａＣＳＦ又はＮＳの存在下にてトロンビンで刺激した場合、ａＣＳＦ添加により、その数が著しく増加した（図２Ｂ）。他方、これらの結果とは対照的に、ＣＤ６２Ｐ発現血小板の数は、ａＣＳＦを添加しても影響を受けなかった（図２Ｃ（ｉ）及び（iii））。しかし、抗ＣＤ６２Ｐの平均蛍光強度は、ａＣＳＦ添加により向上した（図２Ｃ（ii）及び（iv））。これらの結果から、ａＣＳＦが血小板の凝集及び活性化を増強する能力を有していることが示された。
【００２９】
［ａＣＳＦ存在下における凝固］
最適化のために本発明者らはまず、上記の［プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間の測定試験の方法］に記載の方法に従って、ＮＳで希釈した血漿を用いてプロトロンビン時間（ＰＴ）又は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定した。図３Ａに示すとおり、ＰＴの延長は７５％血漿では確認されなかったが、５０％血漿ではＰＴが延長した（平均±ＳＤ；１００％：１５．４±０．６秒；７５％：１７．６±１．３秒；５０％：２１．９±２．３秒）。５０％血漿でＡＰＴＴが延長したが、７５％血漿ではＡＰＴＴ延長は軽度であった（平均±ＳＤ；１００％：３１．８±１．８秒；７５％：３７．３±０．７秒；５０％：５３．０±１．５秒）（図３Ａ）。これらの結果に基づき、ａＣＳＦで希釈した血漿（５０％血漿＝ａＣＳＦ１／２、７５％血漿＝ａＣＳＦ１／４）におけるＰＴ及びＡＰＴＴを測定し、凝固に対するａＣＳＦの効果を調べた。しかし、ＰＴ及びＡＰＴＴはａＣＳＦの影響を受けなかった（図３Ｂ及び３Ｃ）。これらのデータは、ａＣＳＦが、インテグリンαIIｂβ３活性化、ＰＳ露出、ＣＤ６２Ｐ発現等の血小板活性化の増強には関与しているが、凝固には関与していないことを示唆している。
【００３０】
［重炭酸ナトリウムによる血小板凝集の増強］
ＡＲＴＣＥＲＥＢ ａＣＳＦは、上部チャンバー［ＵＣ］溶液（グルコース、塩化ナトリウム、塩化カルシウム水和物及び塩化マグネシウム）と下部チャンバー［ＬＣ］溶液（重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム及びリン酸二水素カリウム）の２種類の溶液で構成され、これら２種類の溶液は臨床使用前に混合しなければならない（表１）。なお、表１における生理食塩水には重炭酸ナトリウム（ＨＣＯ３−）は含まれない。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
しかし、ａＣＳＦ中のいずれの要素が血小板活性化を増強するのかは明確に特定されていない。本発明者らは次に、ａＣＳＦ中のいずれの要素が血小板活性化を増強するのかを調べるアッセイを、上記の［血小板凝集試験の方法］記載の方法にしたがって行った。図４Ａ（ｉ）及び（ii）に示すとおり、ＵＣ、ＬＣ又は混合溶液（トロンビン：ＵＣ１１．３％ｖｓＬＣ７６．７％ｖｓ混合７６．３％；コラーゲン：ＵＣ２４．０％ｖｓＬＣ７３．３％ｖｓ混合７０．２％）の存在下において、トロンビン又はコラーゲンにより血小板を刺激したところ、ＬＣ溶液（ｐＨ７．０〜７．８）及びａＣＳＦの混合溶液（ｐＨ７．３）の添加後に血小板凝集の増強が観察されたが、ＵＣ溶液（ｐＨ４．０〜４．８）の添加後には観察されなかった。
【００３３】
同様に、図４Ｂ（ｉ）及び（ii）に示すとおり、凝集増強は、本発明者らが自作調製したＬＣ溶液（ｐＨ７．７９〜７．９３）の存在下、及び溶液パッケージに添付の要素一覧表（トロンビン：ＵＣ１７．９％ｖｓＬＣ８１．１％ｖｓ混合７４．０％；コラーゲン：ＵＣ２３．０％ｖｓＬＣ７８．９％ｖｓ混合７３．９％）に従って本発明者らが自作調製したａＣＳＦの混合溶液（ｐＨ７．７７〜７．８０）の存在下において、観察された。本発明者らが自作調製したＵＣ溶液（ｐＨ５．６５〜５．９８）の場合には、凝集増強は観察されなかった。さらに、いずれの要素が血小板凝集に影響したかを究明するため、ａＣＳＦのＬＣ溶液から特定の要素を除去した溶液を調製した（表２）。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
血小板凝集は、重炭酸ナトリウムを除去することにより顕著に阻害された（図４Ｃ（ｉ）、３７．３％）。これとは極めて対照的に、凝集性は、塩化ナトリウム（８１．７％）、塩化カリウム（７６．３％）又はリン酸二水素カリウム（７６．１％）を除去しても影響は受けなかった（図４Ｃ（ｉ））。図４Ｃ（ii）に示すとおり、規定濃度（１／１）及び低濃度（１／２、１／４）の重炭酸ナトリウムにおいて血小板凝集レベルに顕著な違いは認められなかった（１／１：７９．２％ｖｓ１／２：７７．１％ｖｓ１／４：７３．４％）。血小板活性化における重炭酸ナトリウムの役割を明確にするため、ＨＣＯ３−／Ｃｌ−エクスチェンジャーの選択的阻害剤であるＤＩＤＳの種々の濃度存在下において血小板凝集のアッセイを行った。ＤＩＤＳの添加により、ａＣＳＦによって増強された血小板凝集が著しく阻害された（図４Ｄ）（ａＣＳＦ；ジメチルスルホキシド[ＤＩＤＳ ０μＭ]：６１．７％ｖｓＤＩＤＳ ５０μＭ：１９．４％）。以上の結果から、血小板凝集の増強が、重炭酸ナトリウムの添加によって誘導されていることが示された。
【００３６】
［Ｓｒｃの活性化を介したａＣＳＦによる血小板の活性化］
本発明者らは、血小板においてａＣＳＦが、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ、及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路を含む複数のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導している可能性があるとの仮説を立てた。かかる仮説を検討するため、複数のシグナル伝達カスケードの活性化を、上記の［イムノブロット分析の方法］に記載の方法にしたがってイムノブロット分析を行うことにより調べた。図５Ａに示すとおり、ａＣＳＦ又はＮＳの存在下で血小板をトロンビンにより刺激したところ、Ａｋｔ及びｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化は、刺激中にわたって維持されていた。ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化は、刺激後２分でピークに達し、刺激後５分で脱リン酸化が生じた。しかし、ａＣＳＦとＮＳとの間で、Ａｋｔ、ｐ３８ＭＡＰＫ及びｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化のレベル及びパターンに顕著な違いは認められなかった。従来の文献に、Ｓｒｃ及びＬｙｎを含むタンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの活性化が、インテグリンαIIｂβ３シグナル伝達を含む血小板凝集に関与することが示されている（非特許文献１３〜１５）。次に本発明者らは、Ｓｒｃファミリーキナーゼのリン酸化アッセイを行った。ＮＳ存在下では、血小板におけるＳｒｃのリン酸化に刺激の有無による違いは認められなかったが、ＮＳの場合と比較し、リン酸化はａＣＳＦ存在下で顕著に増加した（図５Ｂ）。しかし、Ｌｙｎのリン酸化レベルは、ａＣＳＦとＮＳとの間で顕著な違いはなかった（図５Ｂ）。ホスホリパーゼＣγ−２（ＰＬＣγII）は、血小板におけるアウトサイドインシグナル伝達において、Ｓｒｃキナーゼ活性化の下流での主要な基質であることから（非特許文献１６）、本発明者らは、ＰＬＣγIIがａＣＳＦ存在下で活性化される可能性があるとの仮説を立てた。この可能性を検討するため、ａＣＳＦ存在下でＰＬＣγII活性化のアッセイを行った。ＰＬＣγIIのリン酸化は、ＮＳ存在下での場合と比較し、ａＣＳＦ存在下で亢進していた（図５Ｂ）。ａＣＳＦ添加により、Ｓｒｃを介して血小板活性化が増強するという推測を考察するため、本発明者らは、種々の濃度のＳｒｃファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ２の存在下で、上記の［血小板凝集試験の方法］に記載の方法にしたがって、血小板凝集アッセイを行った。ＮＳ存在下では、ＰＰ２の添加により血小板凝集が顕著に阻害された（図５Ｃ）。しかし、ａＣＳＦによって増強された血小板凝集は、より高濃度（２５μＭ）のＰＰ２であっても影響を受けなかった（図５Ｃ）。これらの結果から、ａＣＳＦの添加により、Ｓｒｃ活性化を介して血小板活性化が増強されることが示される。
【００３７】
［ａＣＳＦ存在下における出血時間への効果］
最後に、ａＣＳＦの生体内（インビボ）での効果を評価するため、尾部を切除したモデルマウスを用いて出血時間のアッセイを行った。アッセイの方法は、上記の［ａＣＳＦ存在下における出血時間への効果］に記載の方法にしたがった。アッセイの結果、ａＣＳＦ処理マウスの出血時間は、ＮＳ処理マウスの出血時間と比較して著しく短かった（平均±ＳＤ；ａＣＳＦ：１１２．６±９８．８ｖｓＮＳ：３５８．５±１８９．８秒；それぞれｎ＝８）（図６）。この結果から、重炭酸ナトリウムにより出血時間を短縮できることが生体内（インビボ）において実証された。
【００３８】
＜まとめ＞
本発明者らは、用量依存的なａＣＳＦの添加により、血小板における主要なフィブリノゲン受容体であるインテグリンαIIｂβ３の活性化が亢進し、その結果、血小板凝集が直接増強されることを示した。血小板におけるタンパク質キナーゼ経路のうち、Ｓｒｃ及びＰＬＣγIIの活性が、ａＣＳＦによる血小板活性化に関連していた。増強された血小板活性は、顕微鏡神経外科手術や内視鏡神経外科手術中の止血促進に主要な役割を果たしていると考えられる。ＰＴ及びＡＰＴＴデータからも、ａＣＳＦの添加は、手術部位における凝固活性とは一次的な関連性がないと示唆される。血小板凝集の増強は、ａＣＳＦの数種類の要素のうちの重炭酸ナトリウムの添加により誘導される。
【００３９】
本発明では、コラーゲン、ＡＤＰ及びエピネフリンに誘導された血小板凝集はすべてａＣＳＦの添加により、ＮＳを添加した場合と比較して明らかに増強を示した。したがって、ａＣＳＦは、ＮＳよりも迅速に血小板凝集を増強するという利点があり、かかる利点は、内視鏡手術中の双極性凝固及び灌流など、顕微鏡手術での止血にも想定できる。注目すべきことに、洗浄血小板を用いた実験から得たデータから、血小板活性化がａＣＳＦにより増強されたこと、また、その効果は血漿依存的ではなかったことが示された。興味深いことに、ａＣＳＦ処理マウスの尾部における出血時間は、ＮＳ処理マウスのものよりも短かった。
【００４０】
活性インテグリンαIIｂβ３陽性血小板は、ａＣＳＦにより加速され、ＮＳと比べて良好に維持されていた。本発明者らはまた、これらの血小板におけるフィブリノゲン受容体であるインテグリンαIIｂβ３が、トロンビン刺激によって効果的に活性化されたことを示す予備データも有している（データは示さず）。これらのデータは、血小板活性化がａＣＳＦ添加により増強されたことを示している。従来の文献に、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｙｅｓ及びＦｒｇを含むタンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーが血小板で発現すること、また、Ｓｒｃファミリーキナーゼの活性化が、凝集を含む血小板活性化に関与していることが報告されている（非特許文献９、１３、１４）。本発明では、ヒトＳｒｃのＴｙｒ４１６リン酸化部位を取り囲む抗体認識アミノ酸を用いることにより、ａＣＳＦが、Ｓｒｃ活性化を加速させて血小板活性化を増強することを観察した。さらに、ＮＳと比べ、ａＣＳＦにより血小板中のＰＬＣγIIが活性化された。ＰＬＣγIIは、アウトサイドイン血小板シグナル伝達において活性化Ｓｒｃキナーゼの主要な基質であることが知られている（非特許文献１６）。したがって、ａＣＳＦの添加によるＳｒｃの加速及びＰＬＣγIIの活性化が、血小板凝集を含む血小板活性化の増強に重要な役割を果たしている可能性がある。
【００４１】
血小板の活性化及び凝固が止血に関与しているが、ａＣＳＦ又はＮＳで希釈した血漿におけるＰＴ及びＡＰＴＴに関する本発明者らのデータから、ａＣＳＦは凝固には関与していないことが示された。上記非特許文献１は、生体内（インビボ）における出血点の数を連続写真で計測した研究を報告した。この報告では、血小板依存的な一次止血及び血管収縮に基づく出血時間に測定結果が影響された可能性があると結論している。ａＣＳＦ添加の結果、血小板凝集、インテグリンαIIｂβ３の活性化、ＰＳ露出、ＣＤ６２Ｐ発現等の血小板活性化は増強されたが、凝固は増強されなかった。しかし、プロトロンビンをトロンビンに転換するプロトロンビナーゼ複合体のアセンブリにＰＳが関与していることから、ＰＳを露出した血小板が凝固に重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１７）。かかる結果からは、生体内（インビボ）環境においてａＣＳＦが凝固に及ぼす影響の可能性を排除できない。
【００４２】
最後に本発明者らは、ａＣＳＦのいずれの要素が止血機能不全の最小化に重要な役割を果たしているのかを実験設定において分析した。灌流液の組成に関し、人工ＣＳＦ溶液の使用又は不使用の場合における凝固カスケードに対するカルシウムイオンの役割は、既に報告されている（非特許文献１）。マグネシウムイオンを使用しない灌流は、くも膜下出血イヌモデルの大脳動脈血管収縮の原因となることが究明されている（非特許文献１８）。本実験では、血小板凝集は、塩化カルシウム水和物及び塩化マグネシウムを含有するＵＣ溶液の添加による影響を受けなかった。血小板凝集がＵＣ溶液の添加により影響を受けなかった理由は、刺激前のＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中のマグネシウムイオン及びカルシウムイオンの濃度が凝集に十分なものだったからであると、本発明者らは考える。他方、血小板凝集は、ＬＣ溶液及びａＣＳＦの混合溶液の添加によって著しく増強した。血小板凝集が増強した原因を明らかにするため、ＬＣ溶液から特定の成分を除去した溶液を調製した。重炭酸ナトリウムを除去した場合に血小板凝集が著しく阻害された。さらに、ＨＣＯ３−／Ｃｌ−エクスチェンジャーの選択的阻害剤であるＤＩＤＳを添加したところ、ａＣＳＦにより増強される血小板凝集が顕著に阻害された。従来の文献で、ＴＸＡ２アゴニストであるＵ−４６６１９に誘導されるラットでの血小板凝集が、ＤＩＤＳの添加により阻害されることから、血小板においてＨＣＯ３−／Ｃｌ−エクスチェンジャーが、ＴＸＡ２に仲介されるシグナル伝達経路に関与している可能性があることが報告されている（非特許文献１９）。したがって、これらの結果から、重炭酸ナトリウムが、血小板凝集の増強能を有していることが示唆される。本発明で使用したａＣＳＦ（ＡＲＴＣＥＲＥＢ）は、成分の観点からみて（Ｎａ＋、１４５．５ｍＥｑ／Ｌ；Ｋ＋、２．８ｍＥｑ／Ｌ；Ｍｇ２＋、２．２ｍＥｑ／Ｌ；Ｃａ２＋、２．３ｍＥｑ／Ｌ；Ｃｌ−、１１１．９ｍＥｑ／Ｌ；ＨＣＯ３―、２３．１ｍＥｑ／Ｌ；Ｐ、１．１ｍｍｏｌ／Ｌ；グルコース、０．６１７ｇ／Ｌ；対ＮＳ浸透圧比、１．０；ｐＨ７．３０７）、ヒトＣＳＦで見いだされたものとほぼ同じ特徴を有する（非特許文献１１、２０）。したがって、灌流液中だけではなくヒトＣＳＦにも存在する重炭酸ナトリウムが、神経内視鏡的手法及び顕微鏡手術手法における止血中に血小板凝集能を増強する上で、重要な役割を担っていることが示唆される（非特許文献１９）。
【００４３】
適切な灌流液を理解することは、外科医が神経外科手術中に有利な止血条件を維持する上で有用である。たとえ血管性腫瘍及び血管奇形における頻繁な双極性凝固や、凝固障害患者の手術など、困難な止血を伴う状況においてであっても、神経外科手術において疾患コントロール及び機能保全を達成することが理想である。手術危険度は、手術野の分刻みでの視覚の明瞭さに依存することが往々にしてある。よって、手術野で何が起きるかを説明する基本データの蓄積により、血小板の機能及び凝固を促進する灌流液以外の条件の最適化が導かれる。
【００４４】
以上のとおり、重炭酸ナトリウムが、血小板凝集機能を増強することにより、止血を促進することが明らかである。ＣＳＦの存在及びａＣＳＦを用いた灌流は、生理学的止血により良好な条件をもたらし、また、双極性凝固により、又は神経内視鏡的手法中の灌流により止血を改善する能力を有する。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、血小板機能を効果的に維持・増強することができる。また、本発明の血小板機能の維持・増強剤は、輸液、手術用の灌流液、各種細胞の洗浄・保存・懸濁液等に好適に用いることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４６】
【特許文献１】特開２０００−１２８７９６号公報
【特許文献２】特開２００４−３５０６７７号公報
【非特許文献】
【００４７】
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【非特許文献２】Neurochem Int. 2004;44(6):459-467.
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【非特許文献４】Surg Neurol. 2006;66(6):565-571.
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【図１】
2017165703.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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