(57)【要約】【課題】唾液由来のプロテアーゼの影響を低減して高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる方法の提供。【解決手段】唾液を濾過してプロテアーゼを除去する、唾液中プロテアーゼの除去方法。唾液中プロテアーゼの除去方法は、さらに、唾液の濾過を孔径０．２μｍ〜０．４５μｍのフィルターを用いて行うものであることが好ましい。また、前記フィルターがシリンジフィルターであることが好ましい。また、前記唾液中プロテアーゼの除去方法によって唾液中のプロテアーゼを除去する除去工程と、唾液中の測定対象物質を測定する測定工程を含む、唾液中対象物質測定方法。【選択図】図１
2017181131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液を濾過してプロテアーゼを除去する、唾液中プロテアーゼの除去方法。
【請求項２】
唾液の濾過を孔径０．２μｍ〜０．４５μｍのフィルターを用いて行うものである、請求項１に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法。
【請求項３】
前記フィルターがシリンジフィルターである、請求項２に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法によって唾液中のプロテアーゼを除去する除去工程と、唾液中の測定対象物質を測定する測定工程を含む、唾液中対象物質測定方法。
【請求項５】
前記測定対象物質がエンドトキシンである、請求項４に記載の唾液中対象物質測定方法。
【請求項６】
前記測定工程は、測定対象物質の濃度を測定するものである、請求項４又は５に記載の唾液中対象物質測定方法。
【請求項７】
前記測定工程がリムルステストである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の唾液中対象物質測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、唾液中プロテアーゼの除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
唾液中における特定の物質の濃度を明らかにすることは、医療の観点から有用である。例えば、エンドトキシンが唾液中に一定量以上存在すれば、歯肉炎などの歯周病を引き起こしやすいことが分かるため、エンドトキシンを測定することにより医学的処置を行うか否かを判断することができる。
これらの物質の濃度の測定には、プロテアーゼ反応を用いることがある。例えば、エンドトキシン測定法として、一般にリムルステストによる方法が知られている。リムルステストでは、エンドトキシンとリムルス試薬とを反応させてプロテアーゼ活性を有する複数の種類の物質を得て、反応液のプロテアーゼ活性を検出する。検出方法は一般的にゲル化測定や比色法が用いられるが、例えば特許文献１においては、蛍光反応等を用いて検出することにより、エンドトキシンの濃度を測定する。
しかしながら、唾液中の物質の濃度を測定する場合、試料中に残存する唾液由来のプロテアーゼにより検出反応が進行し、測定対象の物質を正確に検出できないという問題があった。
そこで、唾液中にプロテアーゼ阻害剤を加えて唾液由来のプロテアーゼ反応を阻害することや、ｐＨ変化や加熱といった変性処理を行って唾液由来のプロテアーゼを変性させることが試みられていた（特許文献２）。
しかしながら、プロテアーゼ阻害剤の添加や変性処理は、測定対象の物質に由来する反応液のプロテアーゼ活性も低下させるものである。したがって、唾液由来のプロテアーゼの影響を低減して高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−１４１０８８号公報
【特許文献２】特表平３−５００３６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、唾液由来のプロテアーゼの影響を低減して高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］唾液を濾過してプロテアーゼを除去する、唾液中プロテアーゼの除去方法。
［２］唾液の濾過を孔径０．２μｍ〜０．４５μｍのフィルターを用いて行うものである、［１］に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法。
［３］前記フィルターがシリンジフィルターである、［２］に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法。
［４］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の唾液中プロテアーゼの除去方法によって唾液中のプロテアーゼを除去する除去工程と、唾液中の測定対象物質を測定する測定工程を含む、唾液中対象物質測定方法。
［５］前記測定対象物質がエンドトキシンである、［４］に記載の唾液中対象物質測定方法。
［６］前記測定工程は、測定対象物質の濃度を測定するものである、［４］又は［５］に記載の唾液中対象物質測定方法。
［７］前記測定工程がリムルステストである、［４］〜［６］のいずれか一つに記載の唾液中対象物質測定方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の唾液中プロテアーゼの除去方法によれば、唾液由来のプロテアーゼの影響を低減して、高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本願の唾液中プロテアーゼの除去方法の一態様を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の唾液中プロテアーゼの除去方法は、唾液を濾過してプロテアーゼを除去する方法である。
唾液中にはプロテアーゼが存在する。唾液中に存在する化合物について測定しようとした場合、唾液中のプロテアーゼの存在は、測定の結果に影響を及ぼし測定対象物の高感度な測定を妨げる場合がある。
本発明者等は鋭意研究の結果、測定対象である唾液を濾過することによって、測定物質がプロテアーゼと同程度又はそれ以上の分子量を有する化合物である場合にも、測定対象物質を残存させつつ、唾液中のプロテアーゼを除去する技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
［測定対象及び測定対象物質］
本発明は、測定対象として唾液を用いる。試料としては、対象者の口腔内から採取した唾液又はその唾液を１０〜１０００００倍に希釈したものを用いることができる。濾過のし易さから、試料としては唾液を５００〜１０００倍に希釈したものを用いることが好ましい。唾液の希釈は、測定対象及びプロテアーゼに影響を及ぼさない希釈溶液を用いて行う。希釈用液としては、精製水又は注射用水が好ましい。
測定対象物質は、唾液中に存在する又は存在する可能性がある物質である。例えばエンドトキシン、βグルカン等が挙げられる。本発明は、唾液中のプロテアーゼが測定対象物質の測定を妨げる場合、特に好適である。すなわち、測定対象物質としては、プロテアーゼの存在によりその測定が妨げられる物質であることが好ましい。プロテアーゼの存在により測定が妨げられる物質とは、例えば測定対象物の測定にプロテアーゼ反応を利用する物質が挙げられ、例えばエンドトキシンが挙げられる。
【００１０】
「エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：内毒素）」は、グラム陰性菌の外膜を構成する成分の一つであり、その活性の本体はＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：リポ多糖）である。エンドトキシンは、生体内の菌体と結合した状態又は溶菌により遊離した状態で存在する。
【００１１】
エンドトキシンは歯周病に関わる重要な因子であることが知られている。エンドトキシンンが唾液中に一定量以上存在すれば、歯肉炎などの歯周病を引き起こしやすいことが分かるため、エンドトキシンの濃度を明らかにすることにより医学的処置を行うか否かを判断することができる。
【００１２】
［プロテアーゼ］
プロテアーゼとは、タンパク質分解反応の酵素として働くタンパク質である。プロテアーゼとしては、例えばエンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる。本発明の除去方法において除去されるプロテアーゼとは、唾液中に含まれるプロテアーゼであり、そのようなプロテアーゼとしては口腔内の細菌であるポロフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）菌が産生するトリプシン様タンパク質が考えられる。本発明の唾液中対象物質測定方法において除去されるプロテアーゼは、唾液中の測定対象物質の測定を妨げるプロテアーゼを含む。
【００１３】
［唾液の濾過］
唾液を濾過する濾過の方法としては特に限定されず、通常用いられる方法で行うことができる。濾過の方法としては、例えばフィルターを用いて真空濾過、加圧濾過又は遠心濾過が挙げられる。操作が容易であることから、シリンジフィルターを用いて加圧濾過を行うことが好ましい。
シリンジフィルターとは、シリンジに取り付けて用いられる濾過用器材である。
シリンジフィルターを用いた加圧濾過の方法の一態様を図１に示す。シリンジフィルター１は、シリンジ取り付けが可能なハウジング１ａとフィルター１ｂとが一体化している。シリンジ２は、筒部先端２ａと筒部２ｂとプランジャー２ｃとからなる。シリンジフィルター１を用いた加圧濾過は、以下のように行う。
シリンジ２の筒部２ｂに唾液試料Ｓを詰め、シリンジフィルター１をシリンジ２の筒部先端２ａに取り付ける。シリンジ２のプランジャー２ｃを押し込むことによりシリンジ２の筒部２ｂ中の内圧を高め、唾液試料Ｓをシリンジフィルター１に通過させ、濾過された唾液試料Ｓを容器３に受け取る。
濾過に用いるフィルターとしては、孔径０．２μｍ以上０．４５μｍ以下のものが好ましく、０．２μｍ以上０．３０μｍ以下のものがより好ましい。孔径が好ましい上限値以下であれば、唾液中プロテアーゼを十分に除去することができる。また、濾過に用いるフィルターの孔径の下限値は測定対象物質の大きさによって決めることができ、例えば測定対象物質がエンドトキシンの場合には孔径は０．２μｍ以上であることが好ましい。
濾過に用いるフィルターの材質は、ＰＴＦＥを用いることが好ましく、親水性ＰＴＦＥを用いることがより好ましい。
なお、ＰＴＦＥはテトラフルオロエチレンを表す。
上記の方法により、唾液中のプロテアーゼが除去されるため、唾液中の測定対象物質について高感度な測定を行うことができる。
【００１４】
［測定対象物質の測定］
本発明の唾液中対象物質測定方法は、上記に記載の唾液中プロテアーゼの除去方法によって唾液中のプロテアーゼを除去する除去工程と、唾液中の測定対象物質を測定する測定工程を含む。
測定としては、例えば唾液中の測定対象物質の濃度、構造、活性を調べる測定が挙げられる。
測定が通常プロテアーゼの存在により妨げられる測定方法により行われるものであれば、除去工程を行うことにより測定感度が向上する効果が顕著に表れる。
例えば測定対象物質がエンドトキシンである場合には、リムルステストによって濃度測定を行うことができる。リムルステストとは、エンドトキシンとリムルス試薬とを反応させてプロテアーゼ活性を有する複数の種類の物質を得て、反応液のプロテアーゼ活性を検出することにより、エンドトキシンの濃度を測定する測定方法である。検出は例えば、ゲル化試験、比色法、蛍光反応や生物化学発光反応等を利用した光学測定を用いて行われる。エンドトキシンとリムルス試薬との反応は、具体的に以下の（１）〜（３）の３段階の反応を含む。
（１）エンドトキシンが、Ｃ因子と強固に結合して、Ｃ因子を活性型に変換する段階。
（２）次いで、活性型Ｃ因子が、Ｂ因子を活性型に変換する段階。
（３）次いで、活性型Ｂ因子が、前凝固酵素から凝固酵素を生成する段階。
各段階で生成する活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子及び凝固酵素は、それぞれ配列特異的なプロテアーゼ活性を有するため、プロテアーゼ活性を検出することによりエンドトキシンの濃度を調べることができる。
【００１５】
プロテアーゼ活性の検出は、例えば以下のようにして行うことができる。
プロテアーゼ活性を検出する測定試料に、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質を添加し、反応させる。反応後、発光酵素及び発光反応に必要な他の化合物を含有する試薬を添加し、発光量を測定する。
リムルス試薬を用いてエンドトキシン濃度を測定する場合、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質は、前記Ｃ因子が活性化されることにより生成される活性型Ｃ因子、並びに活性型Ｃ因子の作用により生成される活性型Ｂ因子および凝固酵素のいずれか１種の作用により、前記発光基質と前記ペプチドとの結合が切断される構造を有するものである。したがって、発光合成基質を測定試料に添加すると、合成基質が切断され、発光基質が遊離する。
発光基質としては、アミノルシフェリンが好適に使用でき、発光基質と結合するペプチドとしては、該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素のいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。
発光酵素は、前記発光合成基質から遊離される発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させる酵素である。発光基質がアミノルシフェリンである場合の発光酵素はルシフェラーゼであり、発光反応に必要な他の化合物は、ＡＴＰおよび２価金属イオンである。
発光酵素及び発光反応に必要な他の化合物を含有する試薬を添加すると、遊離した発光基質と発光酵素との反応により、測定試料が発光する。
測定試料の発光量から、測定対象物質の濃度を算出することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
（濾過）
試料の濾過は、以下のように行った。
濾過対象の試料をシリンジに詰め、シリンジにシリンジフィルターを取り付けて加圧濾過を行った。
（リムルス反応）
試料２００μＬに対し、リムルス試薬（和光純薬工業株式会社製、カブトガニ血球抽出物ＥＳ−ＩＩ凍結乾燥品）３０μＬを添加し、３７℃にて５分間反応させた。
（発光量測定）
発光量の測定は以下のように行った。
試料２００μＬに対し、ペプチドにアミノルシフェリンが結合している合成基質（東亜ディーケーケー株式会社製）を５μｇ、ルシフェラーゼ（東亜ディーケーケー株式会社製）１０μｇ、ＡＴＰ（和光純薬工業株式会社製）８．８μｇ、及び二価金属イオン（酢酸マグネシウム：関東化学株式会社製）７．５μｇを含む凍結乾燥試薬を添加し、添加後４４秒後から０．１秒おきに１０回発光量を測定した。得られた１０回の測定値の合計を発光量とした。同試料について複数回発光量を測定し、その平均値を試料の平均発光量とした。
（ブランク測定）
プロテアーゼ非存在下において、ペプチドにアミノルシフェリンが結合している合成基質が発光量に与える影響を以下のようにして調べた。
純水を試料として、上記の発光量測定の方法により２回発光量を測定し、平均発光量を算出した。その結果、平均発光量は１７４であった。
なお、以降本明細書において平均発光量としてはブランクを除かない値を用いている。
【００１７】
［唾液中プロテアーゼ除去］
唾液中プロテアーゼが濾過により除去されていることを確認するため、下記のように試料１を調製して濾過前後の発光量を測定した。
（試料１）
注射用水（株式会社大塚製薬工場製、大塚蒸留水）でうがいした後の被験者に実験用ガムを噛ませ、出てきた唾液を約２ｍＬ採取した。採取した唾液を、注射用水を用いて１０００倍に希釈して試料１とした。
希釈液の半量を試料１（濾過無）とし、希釈液の残りの半量を上記の方法により濾過を行い試料１（濾過有）とした。濾過において、シリンジフィルターとしては、アドヴァンテックフィルター、１３ＨＰ０２０ＡＮ、親水性ＰＴＦＥ膜、孔径０．２μｍを用いた。
試料１（濾過無）と試料１（濾過有）について、リムルス反応を行わずに２回発光量を測定し、それぞれ平均発光量を算出した。結果を表１に示す。
試料１（濾過無）の平均発光量が８０３であったのに対し、試料１（濾過有）の平均発光量は１５２でありブランクと同程度であった。このことは、フィルターを用いた濾過を行うことにより、唾液中のプロテアーゼをブランクと同程度まで低減することができたことを示している。すなわち、フィルターを用いた濾過を行うことにより、唾液中のプロテアーゼをほぼ１００％除去できた。
【００１８】
【表１】
2017181131.tif 000003
【００１９】
［エンドトキシン残存確認］
唾液である試料を濾過後も、エンドトキシンが試料中に残存することを確認するため、下記のように試料２を調製して濾過前後の発光量を測定した。
（試料２）
ポロフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）菌由来の標準試料（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＵＳＡ）製、ＬＰＳ−ＰＧ）を注射用水（株式会社大塚製薬工場製、大塚蒸留水）に溶解して１ｍｇ／ｍＬ  ＬＰＳ溶液を調製して標準液とした。標準液を１０万倍に希釈して試料２とした。
希釈液の半量を試料２（濾過無）とし、希釈液の残りの半量を上記の方法により濾過を行い試料２（濾過有）とした。濾過において、シリンジフィルターとしては、アドヴァンテックフィルター、１３ＨＰ０２０ＡＮ、親水性ＰＴＦＥ膜、孔径０．２μｍを用いた。
試料２（濾過無）と試料２（濾過有）について、リムルス反応を行ってから、４回発光量を測定し、それぞれ平均発光量を算出した。結果を表１に示す。
【００２０】
試料２（濾過有）の平均発光量は、試料２（濾過無）の平均発光量の８３％であった。この結果は、濾過後も試料中にエンドトキシンが充分残存することを示している。
【００２１】
［プロテアーゼ除去における唾液中成分の寄与の確認］
プロテアーゼの濾過による除去には、プロテアーゼが唾液中にあることが寄与していることを示すため、下記のように試料３を調製して発光量を測定し、平均発光量を算出した。
（試料３、４）
プロテアーゼとしてトリプシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ）を最終濃度０．２５μｇ／ｍＬとなるように、純水に溶解し、試料３とした。
また、プロテアーゼとしてトリプシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ）を最終濃度０．２５μｇ／ｍＬとなるように、０．１％リン酸カルシウム懸濁液に溶解し、試料４とした。
試料３、試料４を上記の方法により濾過を行い試料３（濾過有）、試料４（濾過有）とした。濾過において、シリンジフィルターとしては、アドヴァンテックフィルター、１３ＨＰ０２０ＡＮ、親水性ＰＴＦＥ膜、孔径０．２μｍを用いた。
試料３（濾過有）と試料４（濾過有）について、リムルス反応を行わずに４回発光量を測定し、それぞれ平均発光量を算出した。結果を表１に示す。
【００２２】
試料４（濾過有）の平均発光量は、試料３（濾過有）の平均発光量の０．３４％であった。このことから、単にプロテアーゼ水溶液をフィルターでろ過するのみではプロテアーゼを除去できず、リン酸カルシウム存在下において濾過を行った場合にプロテアーゼが除去されることが示された。これは、リン酸カルシウムがプロテアーゼと結びつくことによりプロテアーゼの見かけの分子量が大きくなったためであると考えられる。試料１の唾液存在下において濾過により発光量が減少したのは、唾液中のリン酸カルシウムがプロテアーゼと結びついたためであることが示唆された。
【００２３】
［唾液中のエンドトキシン濃度］
唾液を濾過してプロテアーゼを除去することにより、唾液中におけるエンドトキシンの濃度を以下のように算出した。
（試料５）
注射用水（株式会社大塚製薬工場製、大塚蒸留水）でうがいした後の被験者に実験用ガムを噛ませ、出てきた唾液を約２ｍＬ採取した。採取した唾液を、注射用水を用いて１０００倍に希釈して試料５とした。
希釈液の半量を試料５（濾過無）とし、希釈液の残りの半量を上記の方法により濾過を行い試料５（濾過有）とした。濾過において、シリンジフィルターとしては、アドヴァンテックフィルター、１３ＨＰ０２０ＡＮ、親水性ＰＴＦＥ膜、孔径０．２μｍを用いた。
試料５（濾過無）と試料５（濾過有）について、リムルス反応を行ってから４回発光量を測定し、それぞれ平均発光量を算出した。結果を表１に示す。
なお、試料５（濾過無）は発光量が大きいため、１０倍に希釈して発光量を測定し、得られた値を１０倍して平均発光量の算出に用いた。
試料５（濾過無）に対する、試料５（濾過有）の平均発光量の割合（％）は１２％であった。このことから、試料中のプロテアーゼが十分除去されたことが示唆される。
（検量線の作成）
ポロフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）菌由来の標準試料（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＵＳＡ）製、ＬＰＳ−ＰＧ）を注射用水（株式会社大塚製薬工場製、大塚蒸留水）に溶解して、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｎｄｔｏｘｉｎ（ＳＴＤ）の濃度が０、１、３、５、１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＳＴＤ溶液を調製し、濾過した。濾過において、シリンジフィルターとしては、アドヴァンテックフィルター、１３ＨＰ０２０ＡＮ、親水性ＰＴＦＥ膜、孔径０．２μｍを用いた。
リムルス反応を行ってから４回発光量を測定し、それぞれ平均発光量を算出した。結果を表２に示す。平均発光量とＳＴＤ濃度について検量線を作成した。下記式（１）で表される検量線が得られた。
発光量＝ＳＴＤ濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１３６３１＋５４１６．３・・・（１）
【００２４】
【表２】
2017181131.tif 000004
【００２５】
（唾液中エンドトキシン濃度の算出）
上記式（１）及び試料５（濾過有）の発光量から、唾液（１０００倍希釈）中のエンドトキシン濃度を４．２ｎｇ／ｍＬと算出した。すなわち、唾液中エンドトキシンの濃度は４．２μｇ／ｍＬであった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の唾液中プロテアーゼの除去方法によれば、唾液由来のプロテアーゼの影響を低減して、高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる。したがって、本発明は産業上極めて重要である。
【符号の説明】
【００２７】
１    シリンジフィルター
１ａ  ハウジング
１ｂ  フィルター
２    シリンジ
２ａ  筒部先端
２ｂ  筒部
２ｃ  プランジャー
３    容器
Ｓ    唾液試料
【図１】
2017181131.tif 000005