(57)【要約】【課題】本願は、電子線が照射された試料から放たれるカソードルミネッセンスによって得られる画像に写る標的物質の像を高精細化可能で、且つ、容易に様々な色で結像可能な蛍光試薬および観察方法を開示する。【解決手段】カソードルミネッセンス用の蛍光試薬であって、量子ドットと、量子ドットを標的物質へ特異的に結合させる特異的結合物質と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カソードルミネッセンス用の蛍光試薬であって、
量子ドットと、
前記量子ドットを標的物質へ特異的に結合させる特異的結合物質と、を含む
蛍光試薬。
【請求項２】
前記量子ドットは、表面がＺｎＳで被覆されたコアシェル構造である、
請求項１に記載の蛍光試薬。
【請求項３】
前記量子ドットは、粒径が１ｎｍから１０ｎｍの範囲内である、
請求項１または２に記載の蛍光試薬。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載の蛍光試薬で標的物質を染色する工程と、
前記蛍光試薬によって前記標的物質が染色された試料に電子線を照射し、前記電子線によって励起する前記標的物質の蛍光を捉える工程と、を有する
観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光試薬および観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子顕微鏡は、ナノメートルオーダの分解能を有しているため、生物学や医学、薬学といった様々な分野で利用されている。しかし、電子顕微鏡は、試料に衝突した電子の挙動を基に画像を得るものなので、得られる画像はモノクロである。一方、紫外線等の励起光を照射された試料が放つ光を基に画像を得る蛍光顕微鏡は、カラーの画像を得られるので、例えば、標的物質ごとに異なる色の光が放たれるように複数種の蛍光色素で試料を染色すれば、標的物質を見分けることも可能である。
【０００３】
しかし、蛍光顕微鏡は、励起光を利用しているため、光学系の回析限界により、電子顕微鏡のような分解能を得ることができない。そこで、近年では、粒径が数十ｎｍ程度の蛍光体（「ナノ粒子蛍光体」と呼ばれる場合もある）で標的物質を染色した試料に電子線を照射し、試料から放たれるカソードルミネッセンス（Cathode Luminescence：以下、「ＣＬ」という）を分光器に導いてその発光強度から画像を得る技術の研究開発が行われている（例えば、特許文献１を参照）。電子線の波長は蛍光顕微鏡で使われる励起光の波長より遥かに短いため、電子線を照射した際に試料から放たれるＣＬを使えば、蛍光顕微鏡で得られる画像よりも高分解能の画像を得ることも可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２４６１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＣＬ用の蛍光体としては、例えば、特許文献１に紹介されているようなドープト金属酸化物からなる蛍光体粒子を用いたものが提案されている。しかしながら、金属酸化物からなる蛍光体は、標的物質を精緻に染色できるように粒径を数ｎｍから数十ｎｍ程度に微小化すると、表面欠陥の影響で量子効率が低くなる。また、細胞内部にある標的物質を染色したい場合には、蛍光体が細胞壁を透過するように粒子径を少なくとも１０ｎｍ以下にすることが望ましいため、粒径の微小化による量子効率の低下の問題が不可避になる。また、金属酸化物からなる蛍光体は、色ごとに組成の異なる様々な化合物を用意する必要があり、所望の色で染色することが容易でない。
【０００６】
そこで、本願は、電子線が照射された試料から放たれるカソードルミネッセンスによって得られる画像に写る標的物質の像を高精細化可能で、且つ、容易に様々な色で結像可能な蛍光試薬および観察方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明では、カソードルミネッセンス用の蛍光試薬として量子ドットを用いることにした。
【０００８】
詳細には、本発明は、カソードルミネッセンス用の蛍光試薬であって、量子ドットと、量子ドットを標的物質へ特異的に結合させる特異的結合物質と、を含む。
【０００９】
量子ドットによって染色された標的物質の像は、例えば、同程度の粒径の金属酸化物か
らなる蛍光体によって得られる像に比べると、量子効率の違いにより像が鮮明になる。また、量子ドットよりも粒径の大きい粒子によって染色された標的物質の像より高精細になる。また、量子ドットは、粒径に応じた色を発光する。よって、所望する色に応じて適宜選択した粒径の量子ドットで標的物質を染色することにより、標的物質を容易に様々な色で結像することができる。
【００１０】
なお、量子ドットは、表面がＺｎＳで被覆されたコアシェル構造であってもよい。このようなコアシェル構造の量子ドットであれば、量子収率が上がるので発光強度が高く、また、抗体などによる表面修飾も容易である。
【００１１】
また、量子ドットは、粒径が１ｎｍから１０ｎｍの範囲内であってもよい。このような粒子径の量子ドットであれば、細胞内にある標的物質の染色が容易となる。
【００１２】
また、本発明は、観察方法の側面から捉えることもできる。例えば、本発明は、上記何れかの蛍光試薬で標的物質を染色する工程と、蛍光試薬によって標的物質が染色された試料に電子線を照射し、電子線によって励起する標的物質の蛍光を捉える工程と、を有する観察方法であってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
上記実施形態の蛍光試薬および観察方法であれば、電子線が照射された試料から放たれるカソードルミネッセンスによって得られる画像に写る標的物質の像を高精細化可能で、且つ、容易に様々な色で結像可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施形態に係る蛍光試薬に含まれる粒子の構造図である。
【図２】図２は、第１例に係る顕微鏡の構成図である。
【図３】図３は、第２例に係る顕微鏡の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下に示す実施形態は、本発明の一態様であり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１６】
＜蛍光試薬＞
図１は、実施形態に係る蛍光試薬に含まれる量子ドットの構造図である。本実施形態に係る蛍光試薬に含まれる量子ドット１は、いわゆるコアシェル構造の粒子であり、コア部分を形成するコア２と、コア２の表面を覆うシェル３とを有する。
【００１７】
量子ドット１は、ＱＤ（Quantum Dot）とも呼ばれる球体の半導体結晶である。量子ド
ット１は、粒径が最大でも約１０ｎｍ程度の半導体結晶であり、この粒径の範囲内であればあらゆる粒径のものを適宜選択可能である。粒径が約１０ｎｍ以下の半導体結晶は、電子を狭い領域に閉じ込めて電子の運動自由度を制限する。電子は、狭い領域の中で定常波を作る状態でしか存在できないため、半導体結晶の粒径が小さくなるに従って定常波の波長を短くする。このため、適宜の粒径の量子ドット１を蛍光試薬に用いることで、電子線が当たった際に量子ドット１から発光するＣＬを所望の色にすることができる。量子ドット１は、金属酸化物からなる蛍光体のように組成によって色を変えるのではなく、粒径によって色を変えることができるので、色ごとに組成の異なる様々な化合物を用意する必要が無い。
【００１８】
なお、量子ドット１の粒径は、約１０ｎｍ以下であれば例えば細胞内の標的物質の染色が可能であるが、好ましくは１ｎｍから１０ｎｍの範囲内、より好ましくは１ｎｍから７
ｎｍの範囲内、更に好ましくは１ｎｍから５ｎｍの範囲内である。量子ドット１の粒径が小さくなるに従い、細胞内の標的物質の染色がより容易になる。
【００１９】
なお、コア２の具体的な組成としては、例えば、２価の陽イオンになるＺｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ等と２価の陰イオンになるＯ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ等との組み合わせ（セレン化カドミウムＣｄＳｅ、硫化亜鉛ＺｎＳ等）、３価の陽イオンとなるＧａ、Ｉｎ等と３価の陰イオンとなるＰ、Ａｓ、Ｓｂ等との組み合わせ（リン化インジウムＩｎＰ、ヒ化ガリウムＧａＡｓ等）、また、カルコパイライト型化合物（ＣｕＩｎＳｅ２等）からなる量子ドットが挙げられる。
【００２０】
また、シェル３は、コア２の量子収率を上げてＣＬの強度を高める。シェル３の組成としては、例えば、ＺｎＳが挙げられる。ＺｎＳでシェル３が構成されたコアシェル構造の量子ドット１であれば、シェル３の無いコア２だけのものより量子収率が上がるのでＣＬの強度が高く、また、抗体などによる表面修飾も容易である。
【００２１】
本実施形態に係る蛍光試薬は、標的物質の種類に応じて適宜選択された抗体（本願でいう「特異的結合物質」の一例である）を上記量子ドット１の表面に修飾した蛍光体を含有した試薬であり、様々な標的物質を染色可能である。
【００２２】
なお、本願で開示する蛍光試薬は、量子ドットをシェルで覆ったコアシェル構造の粒子を含有するものに限定されない。本実施形態に係る蛍光試薬が含有する量子ドット１は、例えば、シェル３が省略されていてもよい。
【００２３】
＜試料の作製＞
上記実施形態に係る蛍光試薬を使った試料は、各種の試料作製法に従って作製することができる。上記実施形態に係る蛍光試薬を用いることが可能な試料作製法の一例として、超薄切片法を以下に紹介する。
【００２４】
超薄切片法では、例えば、観察したい組織や細胞をグルタールアルデヒド等で化学固定する処理が行われた後、エタノール等を用いた脱水処理が行われる。更に、エポキシ系の樹脂等で樹脂包埋が行われた後、ミクロトームで例えば１００ｎｍ程度の厚さになるように薄切され、その後、上記実施形態に係る蛍光試薬で染色が行われる。
【００２５】
このようにして作製された試料は、例えば、以下のような顕微鏡を使って観察することができる。
【００２６】
＜顕微鏡の第１例＞
図２は、第１例に係る顕微鏡の構成図である。第１例に係る顕微鏡１０Ａは、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ）と、電子顕微鏡の電子線によって試料から発せられるＣＬを捉える装置とを組み合わせた顕微鏡である。すなわち、顕微鏡１０Ａは、図２に示すように、真空チャンバ１１Ａ内において電子源１２Ａから放たれた電子によって試料４から発生する二次電子を二次電子検出器１３Ａで捉えて電子顕微鏡画像を生成するＳＥＭ１４Ａを備える。また、顕微鏡１０Ａは、真空チャンバ１１Ａ内において電子源１２Ａから放たれた電子によって発光する試料４のＣＬを、ミラー１５Ａや光ファイバ１６Ａ、分光器１７Ａ、カラーフィルタ１８Ａ、ＣＣＤカメラ１９Ａ、ＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）２０Ａで捉え、ＳＥＭ１４Ａの電子顕微鏡画像にＣＬの蛍光色を
重ねて合成画像を生成するコンピュータ２１Ａを備える。
【００２７】
上記実施形態の蛍光試薬によって標的物質が特異的に染色された試料４は、このような顕微鏡１０Ａを用いることにより、標的物質の部分が着色された顕微鏡画像として観察す
ることができる。そして、このような顕微鏡１０Ａによって得られる試料４の顕微鏡画像に写る標的物質の像は、標的物質を染色する約１０ｎｍ以下のコア２から発光される蛍光の像なので、金属酸化物等の蛍光体よりも高精細である。
【００２８】
＜顕微鏡の第２例＞
図３は、第２例に係る顕微鏡の構成図である。第２例に係る顕微鏡１０Ｂは、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope：ＴＥＭ）と、電子顕微鏡の電子線によって試料から発せられるＣＬを捉える装置とを組み合わせた顕微鏡である。すなわち、顕微鏡１０Ｂは、図３に示すように、真空チャンバ１１Ｂ内において電子源１２Ｂから放たれて試料４を透過した電子が当たる蛍光板２２Ｂで電子顕微鏡画像を生成するＴＥＭ１４Ｂを備える。また、顕微鏡１０Ｂは、真空チャンバ１１Ｂ内において電子源１２Ｂから放たれた電子によって発光する試料４のＣＬを、試料４の上下に各々配置された２つのミラー１５ＢＵ，１５ＢＬ、光ファイバ１６Ｂ、分光器１７Ｂ、カラーフィルタ１８Ｂ、ＣＣＤカメラ１９Ｂ、ＰＭＴ２０Ｂで捉え、ＴＥＭ１４Ｂの電子顕微鏡画像にＣＬの蛍光色を重ねて合成画像を生成するコンピュータ２１Ｂを備える。
【００２９】
上記実施形態の蛍光試薬によって標的物質が特異的に染色された試料４は、このような顕微鏡１０Ｂを用いることにより、標的物質の部分が着色された顕微鏡画像として観察することができる。そして、顕微鏡１０Ｂは、２つのミラー１５ＢＵ，１５ＢＬでＣＬを捉えるので、１つのミラー１５ＡでＣＬを捉える顕微鏡１０ＡよりもＣＬの集光効率が高い。このため、顕微鏡１０Ｂを使って得られる試料４の顕微鏡画像は、顕微鏡１０Ａを使って得られる試料４の顕微鏡画像に比べると、標的物質の部分がより明確に着色された画像となる。なお、顕微鏡１０Ｂに備わるＴＥＭ１４Ｂは、走査透過型電子顕微鏡（Scanning
Transmission Electron Microscope：ＳＴＥＭ）に代えてもよい。
【００３０】
上記実施形態に係る蛍光試薬で標的物質を染色した試料を作成し、上記の第２例に係る顕微鏡１０Ｂに相当する装置でこの試料を観察したので、その内容を以下に説明する。
【実施例１】
【００３１】
本実施例における試料は、上述の超薄切片法に従い作成した。以下にその手順について述べる。本実施例の観察対象となる細胞としては、ヒト由来Ｕ−２  ＯＳ細胞を用いた。細胞の固定法としては、酸化剤などの化学反応により固定する化学固定法と急速凍結により物理固定する手法があり、いずれの手法を用いることも可能であるが、本実施例では、化学固定法、特に二重固定法を用いた。ｐＨが７．４となるように調整した０．１Ｍリン酸緩衝液中に２．５％グルタールアルデヒド、２．０％パラフォルムアルデヒドとなるように希釈し、前固定液を作成した。同様にして、リン酸緩衝液中に１．０％オスミウムとなるように後固定液を作成した。これら２種の固定液を用いて、常法である浸漬固定法に従い、化学固定を施した。この試料を１００％エタノールを用いて脱水処理後、エポキシ樹脂を用いて樹脂包埋した。本試料をミクロトームを用いて、厚さ約５０ｎｍとなるようにトリミング、薄切した。
【００３２】
次の染色工程においては、先ず、発光波長が５３０ｎｍである量子ドットＩｎＰ／ＺｎＳの表面を抗ヒスタミン抗体（Ａｎｔｉ−ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ，  Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ）により修飾した蛍光試薬Ａと発光波長が６５０ｎｍである量子ドットＩｎＰ／ＺｎＳの表面を抗ヒスタミンレセプター抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈ１，  Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ）により修飾した蛍光試薬Ｂを含む５０％エタノール水溶液からなる蛍光染色液を調整した。本蛍光染色液を用いて蛍光染色を施した。５０％エタノールで洗浄後、蒸留水で洗浄し、５分間ウラン染色を施した。更に５０％エタノールで洗浄後、蒸留水で洗浄し、１分間鉛染色を施した。ウラン染色および鉛染色は、電子顕微鏡画像のコントラスト向上のためである。最後に試料を乾燥させ、超薄切片法による観察試
料を作成した。本試料を、上記第２例の顕微鏡１０Ｂに相当する装置を用いて観察したところ、電子線によって励起された蛍光試薬からの発光により、細胞内のヒスタミンが緑（波長：５３０ｎｍ）に、ヒスタミンレセプターが赤（波長：６５０ｎｍ）に染色され、ヒスタミンがレセプターに結合している様子が観測された。また、ＳＴＥＭによる電子線観察から、微細部分を電子顕微鏡観察できることも確認した。本実施例で使った量子ドットの詳細等を以下の表に示す。
【表１】
2017181237.tif 000003
【実施例２】
【００３３】
本実施例における試料は、上述の超薄切片法に従い作成した。以下にその手順について述べる。本実施例の観察対象となる細胞としては、ヒト由来肥満細胞を用いた。細胞の固定法としては、酸化剤などの化学反応により固定する化学固定法と急速凍結により物理固定する手法があり、いずれの手法を用いることも可能であるが、本実施例では、化学固定法、特に二重固定法を用いた。ｐＨが７．４となるように調整した０．１Ｍリン酸緩衝液中に２．５％グルタールアルデヒド、２．０％パラフォルムアルデヒドとなるように希釈し、前固定液を作成した。同様にして、リン酸緩衝液中に１．０％オスミウムとなるように後固定液を作成した。これら２種の固定液を用いて、常法である浸漬固定法に従い、化学固定を施した。この試料を１００％エタノールを用いて脱水処理後、エポキシ樹脂を用いて樹脂包埋した。本試料をミクロトームを用いて、厚さ約５０ｎｍとなるようにトリミング、薄切した。
【００３４】
次の染色工程においては、先ず、発光波長が５２０ｎｍである量子ドットＣｄＳｅ／ＺｎＳの表面を抗インスリン抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ［ＥＰＲ１７３５９］）により修飾した蛍光試薬Ａと発光波長が６３０ｎｍである量子ドットＣｄＳｅ／ＺｎＳの表面を抗インスリンレセプター抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ［ＥＰＲ５５１０（２）］）により修飾した蛍光試薬Ｂを含む５０％エタノール水溶液からなる蛍光染色液を調整した。本蛍光染色液を用いて蛍光染色を施した。５０％エタノールで洗浄後、蒸留水で洗浄し、５分間ウラン染色を施した。更に５０％エタノールで洗浄後、蒸留水で洗浄し、１分間鉛染色を施した。なお、ウラン染色および鉛染色を実施した方が、電子顕微鏡画像のコントラストが向上するため、より好適である。最後に試料を乾燥させ、超薄切片法による観察試料を作成した。本試料を、上記第２例の顕微鏡１０Ｂに相当する装置を用いて観察したところ、電子線によって励起された蛍光試薬からの発光により、細胞内のインスリンが緑（波長：５２０ｎｍ）
にインスリンレセプターが赤（波長：６３０ｎｍ）に染色され、インスリンがレセプターに結合している様子が観測された。また、ＳＴＥＭにより、微細部分を電子顕微鏡観察できることも確認した。本実施例で使った量子ドットの詳細等を以下の表に示す。
【表２】
2017181237.tif 000004
【符号の説明】
【００３５】
１・・量子ドット：２・・コア：３・・シェル：４・・試料：１０Ａ，１０Ｂ・・顕微鏡：１１Ａ，１１Ｂ・・真空チャンバ：１２Ａ，１２Ｂ・・電子源：１３Ａ・・二次電子検出器：１４Ａ・・ＳＥＭ：１４Ｂ・・ＴＥＭ：１５Ａ，１５ＢＵ，１５ＢＬ・・ミラー：１６Ａ，１６Ｂ・光ファイバ：１７Ａ，１７Ｂ・・分光器：１８Ａ，１８Ｂ・・カラーフィルタ：１９Ａ，１９Ｂ・・ＣＣＤカメラ：２０Ａ，２０Ｂ・・ＰＭＴ：２１Ａ，２１Ｂ・・コンピュータ：２２Ｂ・・蛍光板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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