(57)【要約】      （修正有）【課題】高い乳酸分率を有する含乳酸ポリエステルを増大した分子量で得る方法の提供。【解決手段】含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物をポリ乳酸の良溶媒（アセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、及びＤＭＳＯ）を添加した炭素源を含む培地で培養する含乳酸ポリエステルの製造方法。含乳酸ポリエステルの製造用培地、及び４０mol%以上の乳酸分率を有し、且つ７０，０００以上の重量平均分子量（Mw）を有する含乳酸ポリエステル。【効果】含乳酸ポリエステルの生産時にポリ乳酸のの良溶媒を添加して培養した場合、ポリマーの分子量が増加し、ポリマーの乳酸分率も増加した。得られた含乳酸ポリエステルは機械的強度が増した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
含乳酸ポリエステルの製造方法であって、
１）該含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程；及び
２）工程１）で得られた培養物から該含乳酸ポリエステルを回収する工程を含んでなり、
工程１）において、ポリ乳酸の良溶媒を培地に添加し、培養することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記良溶媒が有機溶媒である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記良溶媒がアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記良溶媒を培養開始前に培地に添加する、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記良溶媒を培養開始から所定の時間経過した後に培地に添加する、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記良溶媒を一度に培地に添加する、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記良溶媒を所定の時間に渡って連続的に培地に添加する、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
炭素源、およびポリ乳酸の良溶媒を含有する、含乳酸ポリエステル製造用培地。
【請求項９】
前記良溶媒が有機溶媒である、請求項８記載の培地。
【請求項１０】
前記良溶媒がアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、請求項８記載の培地。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって得られる、含乳酸ポリエステル。
【請求項１２】
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも７０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、請求項１１記載の含乳酸ポリエステル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた共重合ポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖を炭素源としてポリエステルを生産する能力を有する微生物は、これまでに多数報告されており、微生物が生産するポリエステルは、自然界で容易に分解される生分解性プラスチックとして、また糖や植物油などのバイオマスを原料としたバイオプラスチックとして、注目されている。
【０００３】
天然の微生物が生産することができる代表的なバイオプラスチックとして、３−ヒドロキシ酪酸（3HB）をモノマー単位とするポリ−３−ヒドロキシ酪酸（P(3HB)）や、3HBと他の３−ヒドロキシアルカン酸（例えば、３−ヒドロキシ吉草酸（3HV）、３−ヒドロキシヘキサン酸（3HH）等）からなる共重合ポリエステルが知られている。
【０００４】
また、微生物を用いて３−ヒドロキシ酪酸（3HB）と３−ヒドロキシアルカン酸以外のモノマー単位とからなる共重合ポリエステルを製造する方法も開発されている。3HBと乳酸（LA）とからなる共重合ポリエステル（以下、「P(LA-co-3HB)」ともいう）は、3HBホモポリマー（P(3HB)）には見られなかった特性を有しており、また、その特性はポリマー内の乳酸分率（以下「LA分率」ともいう）によっても変化するため、乳酸分率を調整することで所望の物性を示すポリマーが得られることが期待されている。
【０００５】
特許文献１には、3HB−乳酸共重合体の合成に関与する遺伝子を導入した組換え微生物を、乳酸を添加した培地で培養することによりP(LA-co-3HB)を製造する方法が記載されている。特許文献２には、3HB−乳酸共重合体の合成系を改変した組換え微生物を用いることで、培地に乳酸を添加することなく、糖を原料とした微生物発酵によりP(LA-co-3HB)を生産することが記載されている。特許文献３には、含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群を導入した遺伝子組換えコリネ型細菌を作製し、これを用いることで、高い乳酸分率を有する含乳酸ポリエステルを生産することが記載されている。
【０００６】
しかしながら、微生物を用いた従来の含乳酸ポリエステルの製造法では、ポリマー内の乳酸分率が高いと、得られるポリマーの分子量が低下し、マテリアルとして利用可能な機械的強度が得られないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５４１７１９号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１３１１８６号
【特許文献３】特開２０１２−１５２１７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題を解決すべく、微生物を用いた含乳酸ポリエステルの製造において、得られる含乳酸ポリエステルの乳酸分率を高めるとともに分子量を増大させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、微生物を用いた含乳酸ポリエステルの生産において、乳酸分率が高くなると、得られるポリマーの分子量が低下するのは、重合酵素の性質だけでなく、重合途中のポリマー鎖の分子運動性が関係していると考えた。そこで、乳酸ポリマーが本来、天然のポリエステルと比較して分子運動性が低い（固い）分子であることに着目し、ポリマー鎖の分子運動性の向上を図るべく、ポリ乳酸の良溶媒を培地に添加し培養を行ったところ、意外にも、得られるポリマーの乳酸分率が増大すること、また、ポリマーの分子量が増大することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下の態様を包含する。
［１］
含乳酸ポリエステルの製造方法であって、
１）該含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程；及び
２）工程１）で得られた培養物から該含乳酸ポリエステルを回収する工程を含んでなり、
工程１）において、ポリ乳酸の良溶媒を培地に添加し、培養することを特徴とする方法。
［２］
前記良溶媒が有機溶媒である、［１］記載の製造方法。
［３］
前記良溶媒が両親媒性の有機溶媒である、［１］記載の製造方法。
［４］
前記良溶媒が細胞毒性の少ない溶媒である、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
前記良溶媒がアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、［１］記載の製造方法。
［６］
前記良溶媒を培養開始前または培養開始後に培地に添加する、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
前記良溶媒を培養開始から所定の時間経過した後に培地に添加する、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
前記良溶媒を培養開始から少なくとも６時間経過した後に培地に添加する、［７］記載の製造方法。
［９］
前記良溶媒を一度に培地に添加する、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
前記良溶媒を所定の時間に渡って連続的に培地に添加する、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］
前記良溶媒を培地中の終濃度が１〜１２００ｍＭになるように添加する、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
前記含乳酸ポリエステルが、ポリ乳酸である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
前記含乳酸ポリエステルが、３−ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルである、［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］
炭素源、およびポリ乳酸の良溶媒を含有する、含乳酸ポリエステル製造用培地。
［１５］
前記良溶媒が有機溶媒である、［１４］記載の培地。
［１６］
前記良溶媒が両親媒性の有機溶媒である、［１４］記載の培地。
［１７］
前記良溶媒が細胞毒性の少ない溶媒である、［１４］記載の培地。
［１８］
前記良溶媒がアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、［１４］記載の培地。
［１９］
前記良溶媒を１〜１２００ｍＭの濃度で含有する、［１４］〜［１８］のいずれかに記載の培地。
［２０］
前記含乳酸ポリエステルが、ポリ乳酸である、［１４］〜［１９］のいずれかに記載の培地。
［２１］
前記含乳酸ポリエステルが、３−ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルである、［１４］〜［１９］のいずれかに記載の培地。
［２２］
［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法によって得られる、含乳酸ポリエステル。
［２３］
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２４］
少なくとも５０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２５］
少なくとも６０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２６］
少なくとも７０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２７］
少なくとも８０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２８］
少なくとも９０mol%の乳酸分率を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［２９］
少なくとも７０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３０］
少なくとも８０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３１］
少なくとも９０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３２］
少なくとも１００，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３３］
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも７０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３４］
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも８０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３５］
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも９０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３６］
少なくとも４０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも１００，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３７］
少なくとも５０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも７０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３８］
少なくとも５０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも８０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［３９］
少なくとも５０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも９０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４０］
少なくとも５０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも１００，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４１］
少なくとも６０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも７０，０００の重量平均分子量（Mw）をする、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４２］
少なくとも６０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも８０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４３］
少なくとも６０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも９０，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４４］
少なくとも６０mol%の乳酸分率を有し、且つ少なくとも１００，０００の重量平均分子量（Mw）を有する、［２２］記載の含乳酸ポリエステル。
［４５］
ポリ乳酸である、［２２］〜［４４］のいずれかに記載の含乳酸ポリエステル。
［４６］
３−ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルである、［２２］〜［４４］のいずれかに記載の含乳酸ポリエステル。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、微生物を用いた従来の含乳酸ポリエステルの製造方法と比べて、高い乳酸分率を有する含乳酸ポリエステルを増大した分子量で得ることができ、本発明の方法で得られる含乳酸ポリエステルは、マテリアルとして利用可能な十分な分子量を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１で得たP(LA-co-3HB)から作製したフィルムの写真である。
【図２】実施例６の重合反応後の重合酵素のMALDI TOF MSスペクトルのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の含乳酸ポリエステルの製造は、含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物を、ポリ乳酸の良溶媒を添加した培地で培養し、培養物中に含乳酸ポリエステルを生成蓄積させ、該培養物から含乳酸ポリエステルを回収することにより行われる。
【００１４】
本発明の含乳酸ポリエステルの製造方法について以下に例示的に記載するが、微生物を用いた含乳酸ポリエステルの製造は、ポリ乳酸の良溶媒を培地に添加することを除いて、既に知られている方法（例えば、上記の特許文献１〜３に記載の方法）に準じて実施することができる。
【００１５】
本明細書における「含乳酸ポリエステル」なる語は、
以下の一般式
【化１】
2017029082.tif 000003
で示される、乳酸（LA）ユニットをモノマー単位とする単独重合体（ホモポリマー）、および
以下の一般式
【化２】
2017029082.tif 000004
で示される、3HBユニットとLAユニットとからなるランダム共重合体を包含する。
なお、本明細書では、上記の乳酸（LA）ユニットをモノマー単位とする単独重合体（ホモポリマー）のことを「ポリ乳酸」、また、上記の3HBユニットとLAユニットとからなるランダム共重合体のことを、「３−ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステル」、「本発明の共重合ポリエステル」または「P(LA-co-3HB)」という。
【００１６】
本発明の「ポリ乳酸の良溶媒」は、微生物による含乳酸ポリエステルの産生を阻害せず、ポリ乳酸と溶媒和するものであれば特に限定されない。本明細書では、「本発明の良溶媒」、または単に「本発明の溶媒」ということもある。
【００１７】
本発明の一実施形態では、ポリ乳酸の良溶媒は有機溶媒である。
本発明の一実施形態では、ポリ乳酸の良溶媒は両親媒性の有機溶媒ある。
本発明の一実施形態では、ポリ乳酸の良溶媒は細胞毒性の少ない有機溶媒である。
【００１８】
本発明におけるポリ乳酸の良溶媒の例としては、例えば、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明の良溶媒は、２種以上の溶媒を単独でまたは混合物として用いてもよく、各溶媒の比率は、用いる溶媒の種類、微生物の種類、培養条件等に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００１９】
培地に添加する本発明の良溶媒の量は、用いる溶媒の種類、微生物の種類、培養条件等に応じて当業者が適宜選択することができる。但し、培地中の良溶媒の濃度が高くなり過ぎると、例えば、微生物に生育阻害や代謝経路の異常などが生じ、所望の乳酸分率および／または分子量のポリマーが得られないこともある。そのような場合は、溶媒の濃度を適宜調整することができる。本発明の良溶媒の濃度の例としては、培地中の終濃度として、例えば１〜１２００ｍＭ、１〜１０００ｍＭ、１〜８００ｍＭ、１〜６００ｍＭ、１〜４００ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜１００ｍＭの範囲内の任意の濃度（例えば、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭが挙げられる）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の良溶媒を培地に添加するタイミングは、当該良溶媒の種類、微生物の種類、実際の培養条件等に応じて当業者が適宜選択することができる。また、本発明の良溶媒は、培養を開始する前に添加してもよく、あるいは培養開始後の任意の時点で添加してもよい。本発明の一実施形態では、培養開始から所定の時間（例えば、少なくとも６時間）経過し、微生物がある程度増殖してから良溶媒を添加することができる。
【００２１】
本発明の良溶媒は培地に一度に添加することができる。別の実施形態では、本発明の良溶媒を所定の時間に渡って連続的に培地に添加してもよい。例えば、本発明の良溶媒をシリンジ等の容器に入れ、ポンプなどを用いて、この容器と培地を含む容器とを連結したチューブを介して培地に添加することができる。
【００２２】
本発明において「含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物」とは、含乳酸ポリエステルを細胞内で産生し蓄積することができる微生物のことをいい、含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物であればいかなる微生物も本発明の方法に使用できる。例えば、下記１）〜４）の酵素タンパク質を発現している微生物は、含乳酸ポリエステルを産生することが可能であり、そのような微生物は含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物である。
１）乳酸（ＬＡ）にＣｏＡが転移される反応を触媒する酵素（プロピオニルＣｏＡ転移酵素またはＰＣＴ）、
２）２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する酵素（β-ケトチオラーゼまたはPhaA）、
３）アセトアセチルＣｏＡの還元反応を触媒する酵素（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼまたはPhaB）、および
４）ラクチルCoA（LA-CoA）または3HB-CoAの重合反応を触媒する酵素（ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素またはPhaC1）。
【００２３】
上記１）の酵素は、ＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒することにより、LAモノマーであるLA-CoAを供給する。
上記２）の酵素は、２分子のアセチルＣｏＡの縮合反応を触媒し、この縮合反応によって生じたアセトアセチルＣｏＡは、上記３）の酵素により還元され、これにより、3HBモノマーである3HB-CoAが供給される。
上記４）の重合酵素は、ＬＡモノマー成分（LA-CoA）どうしの重合反応、またはＬＡモノマー成分（LA-CoA）と3HBモノマー成分（3HB-CoA）との重合反応を触媒し、これにより本発明の含乳酸ポリエステル（ポリ乳酸またはP(LA-co-3HB)）が生成する。
【００２４】
これらの酵素系の更なる詳細は既に知られており、例えば、上記の特許文献１〜３、S. Taguchi, M. Yamada, K. Matsumoto, K. Tajima, Y. Sato, M. Munekata, K. Ohono, K. Kohda, T. Shimamura, H. Kambe, S. Obata: A microbial factory for lactate-based polyesters using a lactate-polymerizing enzyme, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 17323-17327 (2008)；Y. Song, K. Matsumoto, M. Yamada, A. Gohda, C. J. Brigham, A. J. Sinsky, S. Taguchi: Engineered Corynebacterium glutamicum as an endotoxin-free platform strain for lactate-based polyester production, Appl. Microbiol. Biotechnol., 93(5), 1917-1925 (2012)；K. Matsumoto, K. Tobitani, S. Aoki, Y. Song, T. Ooi, S. Taguchi: Improved production of poly(lactic acid)-like polyester based on metabolite analysis to address the rate-limiting step, AMB Express, 4,83 (2014)等にも記載されている。
【００２５】
本発明の含乳酸ポリエステル生産能を有する微生物は、例えば、上記１）〜４）の酵素を発現している自然界から単離された微生物、または、既に知られている遺伝子組換え技術を用いて上記１）〜４）の酵素を機能的に発現し得る核酸の導入により形質転換された組換え微生物であってもよい。このような含乳酸ポリエステル生産能を有する組換え微生物の作製方法は既に知られており、例えば、上記特許文献１〜３等にも詳述されている。
【００２６】
本発明に用いられる微生物種の例としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、Ｒ．ユートロファなどのラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、サッカロマイセス・セレビシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ(Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２７】
具体的な組換え微生物の種のリストは、例えば、上記特許文献１〜３に見出すことができる。列挙された及び他の発現系は当該分野でよく知られており、及び／又は商業的に入手可能である。
【００２８】
本発明の方法においては、ポリ乳酸の良溶媒を培地に添加することを除いては、特殊な組成を有する培地は特に必要とされない。用いる微生物の種類に応じて、それぞれの微生物について当分野に知られている一般的な培地を用いることができる。
【００２９】
本発明の培地に含まれる炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、キシロース等の炭水化物が挙げられる。また、炭素数４以上の油脂関連物質を炭素源とすることもできる。炭素数４以上の油脂関連物質としては、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸若しくはミリスチン酸等の脂肪酸又はこれらの脂肪酸のエステル、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール若しくはパルミチルアルコール等又はこれらアルコールのエステル等が挙げられる。また、安価な廃糖蜜なども使用することができる。
【００３０】
本発明の培地に含まれる窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
また、前記１）〜４）の酵素による酵素系で利用される基質またはその前駆体（例えば、ＣｏＡ（補酵素Ａ）の前駆体であるパントテン酸またはその塩、など）を培地に添加してもよい。
【００３２】
微生物の培養は、用いる微生物の種類に応じて、それぞれの微生物について当分野に知られている培養条件で行うことができ、当業者は適宜修飾を加えることができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、培養は、通常、振盪培養などの好気的条件下、適当な温度（例えば２５〜３７℃の範囲が挙げられるがこれに限定されない）で、前記１）〜４）の酵素タンパク質が転写発現されてから、さらに２４時間以上行うことが好ましい。嫌気条件下に培養を行うときは、前記時間は４８時間以上であることが好ましい。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。前記１）〜４）の酵素タンパク質をコードするＤＮＡのいずれか或いは全てを、組換え法により、誘導性プロモーターの制御下に導入した場合には、当該プロモーターの転写に誘導する因子を培地に添加すればよい。
【００３４】
本明細書において「培養物」とは、微生物を培養することにより得られる結果物を意味し、微生物、培地、微生物から分泌された成分等を含む。
【００３５】
当業者は公知の任意の方法によって本発明の含乳酸ポリエステルを、培養物から回収することができる。例えば、培養によって得られた培養物から遠心分離によって集菌し、菌体を洗浄後、乾燥させる。クロロホルムに乾燥菌体を懸濁し、加熱することによって、目的とする含乳酸ポリエステルをクロロホルム画分に抽出する。その後、このクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリエステルを沈殿させ、濾過や遠心分離などにより上澄み液を除去した後、乾燥することで、精製された含乳酸ポリエステルを得ることができる。あるいは、公知の方法により、培養物を化学的に処理（例えば、水系の界面活性剤を用いて微生物の細胞膜等を可溶化する等）した後、公知の方法により含乳酸ポリエステルを単離・精製することもできる。
【００３６】
回収された含乳酸ポリエステルが、ポリ乳酸、あるいは３ＨＢとＬＡとからなる共重合ポリエステルであることの確認は、当業者に公知の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。
【００３７】
本発明の一実施形態では、得られる含乳酸ポリエステルは、マテリアルとして利用可能な分子量を有する。マテリアルとして利用可能な含乳酸ポリエステルの分子量は、実際に使用される目的において要求される機械的強度を達成するのに十分な分子量であればよく、例えば、重量平均分子量（Mw）として、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも１００，０００が挙げられるが、用途や使用状況によって、これより小さい分子量でもマテリアルとして十分利用可能である。
【００３８】
本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルはまた、高い乳酸分率を有する。
【００３９】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜７０mol%の乳酸分率を有する。
【００４０】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜７５mol%の乳酸分率を有する。
【００４１】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜８０mol%の乳酸分率を有する。
【００４２】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜８５mol%の乳酸分率を有する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜９０mol%の乳酸分率を有する。
【００４４】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜９５mol%の乳酸分率を有する。
【００４５】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜９９mol%の乳酸分率を有する。
【００４６】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４０〜１００mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、４５〜１００mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５０〜１００mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、５５〜１００mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６０〜１００mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、６５〜１００mol%の乳酸分率を有する。
【００４７】
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも４０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも４５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも５０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも５５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも６０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも６５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも７０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも７５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも８０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも８５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも９０mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも９５mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、少なくとも９９mol%の乳酸分率を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって得られる含乳酸ポリエステルは、ポリ乳酸である。
【００４８】
以下、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例における各実験操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８９年， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）をはじめとする各種の実験操作を紹介したマニュアル、又は各種試薬及びキットに添付された指示書の各記載に従い、行った。
【実施例】
【００４９】
実施例１：組換え大腸菌株による共重合ポリエステルの製造
１）コンピテントセルの作製
E. coli 野生株（BW25113）のグリセロールストックから白金耳で菌を掻き取り、LBプレートに薄く塗布して37℃で約12時間培養した。プレート培地上の菌体を白金耳で掻き取り、試験管に入った2 mLのLB培地に植菌した。この試験管を37℃、180 rpmで6時間培養した。培養液500μLを、50 mLのLB培地が入った300 mLの三角フラスコに植菌し、37℃、180 rpmで1.5時間培養した。培養液を50 mLヌンクチューブに移し、5,000 rpm、4℃で10分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、冷TSSバッファーを5 mL加えて懸濁し、滅菌済みの冷エッペンドルフチューブに100μLずつ分注した。これを液体窒素で急冷して-80℃で保存し、E. coliのコンピテントセルとした。
２）形質転換
発現ベクターとして、プラスミドpTV118NpctphaC1Ps(ST/QK)ABを用いた。pTV118NpctphaC1Ps(ST/QK)ABは、P(LA-co-3HB)の生合成に必要な酵素タンパク質（pct、phaC1、phaAおよびphaB）をコードする遺伝子を機能的に発現可能なように含んでいる（プラスミドの調製方法の詳細はProc. Natl. Acad. Sci. USA, (2008) Vol.105, pp.17323-17327を参照のこと）。
上記で得られたコンピテントセル（保存期間が２週間以内のもの）を氷上で２分間融解させ、これにプラスミドの溶液（1μL）を加えた。30分氷上で静置した後、42℃で30秒間ヒートショックを行い、再度氷上で2分静置した。静置後、LB/Amp培地（900μL）を加え、37℃、180 rpmで1時間培養した。その後、培養液100μLをLB/Ampプレートに植菌し、30℃で14時間培養し、P(LA-co-3HB)生産能を有するE. coli 組換え株を得た。
３）E. coli組換え株によるP(LA-co-3HB)生産
ａ）上記で得られたE. coli 組換え株の単一コロニーから菌体を掻き取り、2 mLのLB/Amp培地に植菌し、30℃、180 rpmで12時間培養した(前培養)。その後、培養液1 mLを100 mLのLB/Amp培地が入った坂口フラスコに植菌し、炭素源であるキシロース及びCoA（補酵素Ａ）の前駆体であるパントテン酸カルシウム溶液を添加して48時間培養した(本培養)。本培養を開始する際に、キシロースを20 g/L、パントテン酸カルシウムを4.76 g/L(10 mM)の終濃度となるよう、フィルター滅菌済みの50 wt%キシロース溶液、0.5Mパントテン酸カルシウム溶液を添加し、さらにDMSOを培地に添加した（培地中の終濃度800mM）。
本培養後、培養液を200 mL遠心瓶15本に入れ、4℃、5,000 rpm、10分の遠心分離で集菌した。ペレットになった菌体を50 mLのMilliQ水で懸濁・洗浄し、4℃、5,000 rpm、10分の遠心分離を行った。更に50 mLのMilliQ水で懸濁・洗浄し、4℃、5,000 rpm、10分の遠心分離を行った。上清を完全に取り除き、-80℃で30分間凍結させた後、真空凍結乾燥機で約２日間乾燥させ、乾燥菌体とした。
ｂ）別途、DMSOの添加条件を下記のとおり変えて上記と同様に培養を行った。
ｉ）DMSOを本培養開始時（0時間後）、6時間後、12時間後、24時間後に一度に添加した（培地中のDMSOの終濃度800mM）。
ｉｉ）DMSOを本培養開始から6〜24時間後の18時間に渡って連続的に添加した。クリーンベンチ内で10 mLのプラスチック製ディスポシリンジにDMSOを入れ、200μLのマイクロピペット用チップを取り付けたシリコンチューブとシリンジを連結して、坂口フラスコのシリコ栓にチップを通した。このシリンジを、恒温振盪培養器の外側に置いたシリンジポンプに固定して、培養開始時から６時間後にシリンジポンプを作動させ、24時間後に終濃度800 mMとなるように設定した。
本培養後、培養液を200mL遠心瓶15本に入れ、4℃、5,000 rpm、10分の遠心分離で集菌した。ペレットになった菌体を50 mLのMilliQ水で懸濁・洗浄し、4℃、5,000rpm、10分の遠心分離を行った。更に50 mLのMilliQ水で懸濁・洗浄し、4℃、5,000 rpm、10分の遠心分離を行った。上清を完全に取り除き、−80℃で30分間凍結させた後、真空凍結乾燥機で約２日間乾燥させ、乾燥菌体とした。
【００５０】
実施例２：ポリマーの分析
ａ）核磁気共鳴(NMR)分析
上記実施例で得られたポリマーを核磁気共鳴(NMR)分析を用いて分析した。NMRの測定には400 MHz核磁気共鳴装置(日本電子(株)・JNM-ECS)を用いた。
（１）サンプル調製
サンプル調製には、溶媒に重クロロホルムを用いた。1HNMRでは5 mg/mLとなるようにポリマーを重クロロホルムに溶解させた。その後、NMRサンプルチューブに移し、分析サンプルとした。
（２）分析
サンプルチューブをNMR装置に挿入し、反応が最大となるようにSHIMの値を調整して測定した。1HNMRでは6回のスキャンを行った。
NMR分析の結果は、上記実施例で得られたポリマーがいずれもP(LA-co-3HB)であることを示した。
ｂ）乳酸分率の測定
上記実施例で得られたポリマーをガスクロマトグラフィーにより分析し、モノマー組成を測定した。
（１）サンプル調製
乾燥菌体重量を測定後、ネジ蓋付試験管に乾燥菌体を入れ、15 vol%-硫酸/メタノール溶液1 mLとクロロホルム1 mLを加え、蓋をしっかりと閉めた。100℃のヒートブロックで30分毎にボルテックスで激しく撹拌しながら140分間加熱した。この操作でポリマーをメタノリシス処理し、メチルエステル化したモノマーに変換した。放冷したサンプルにMilliQ水を1 mL加えてボルテックスし、激しく撹拌した。二層に分かれたうちの下層のみをパスツールピペットを用いて採取した。パスツールピペットに予め加熱して脱水したモレキュラーシーブスを１粒入れ、その上から硫酸ナトリウムを少量詰めて簡易フィルターとし、採取した下層をフィルターに通した。このサンプル75 μLに内部標準である0.1 vol%-カプリル酸メチル/クロロホルム溶液を75 μL加えて混合し、GC分析のサンプルとした。
（２）分析
GC装置はShimadzu GC-2010、カラムにはInertCap1(内径0.25 mm×30 m、膜厚0.25 μm：GL Sciences社製)、水素発生装置にはOPGU-2200(STEC社製)を用いた。キャリアガスとしてヘリウムを用い、成分検出は水素炎イオン化検出器(FID)を用いた。サンプル流入には、オートインジェクターAOC-20sを使用し、1回の注入量を0.2 μLとした。キャリアガス及び水素炎イオン検出に用いたガスの測定時の流量と測定時の設定温度を以下の表に示す。
【表１】
2017029082.tif 000005
【表２】
2017029082.tif 000006
解析には、内部標準物質としてカプリル酸メチルを用いて、ピーク面積比から検量線を作成し、これにサンプルの測定データを照合することでポリマー量を求めた。
実施例１の３）ａ）で得られたポリマーのモノマー組成を下表に示す。表に示されるように、培地にDMSOを添加することにより、乳酸分率は大幅に上昇した。
【表３】
2017029082.tif 000007
ｃ）分子量の測定
得られたポリマーの重量平均分子量（Mw）を、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて測定した。
（１）装置
GPCの装置にはGPC LC2901(日本分光)を、ガードカラムにはShodex GPC KG-800、分離カラムには2本のShodex GPC K-806L(共に昭和電工、設置順)を用いた。送液流量は0.8 mL/min、カラム温度は40℃、サンプル注入量は100μLとして分析した。ポリマーの分子量は、標準物質のポリスチレンを用いて作成した検量線から算出した。
（２）サンプル調製
抽出・精製したポリマーを、2 mg/mLの濃度になるように特級クロロホルムに溶解し、孔径0.20 μmのDISMIC（登録商標）-13HP(Millipore)フィルターで濾過した溶液を分析サンプルとした。
実施例１の３）ｂ）で得られたポリマーのモノマー組成および重量平均分子量（Mw）を下表に示す。
【表４】
2017029082.tif 000008
DMSOを添加することによりポリマー内の乳酸分率が上昇し、ポリマー分子量の増大も認められた。
【００５１】
実施例３：物性解析
ポリマーの物性解析のため、上記実施例で得られたポリマーを、下記のとおり、Solvent cast法によりフィルム化し、P(LA-co-3HB)のフィルムを作製した。
実施例１の３）ｂ）に従って得られたポリマー（約0.3 g）を5 mLのクロロホルムに溶解した。これをパスツールピペットにキムワイプを適量詰めた簡易濾過装置に通し、直径6 cmのガラスシャーレに展開した。展開後、アルミホイルでシャーレに蓋をして、クロロホルムの揮発量を制限するために蓋を輪ゴムで固定した。次に上面に爪楊枝で8個の穴を開け、クロロホルムを穏やかに揮発させた。これを水平台の上に置き、室温で48時間クロロホルムが揮発するまで静置した。その後、完全にクロロホルムを除くために、真空乾燥機で6日間乾燥を行った。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、フィルムを得た。
得られたP(LA-co-3HB)フィルムの透明度（図１）は、ＤＭＳＯの添加が培養開始後0時間、6時間、6〜24時間、12時間、24時間、無添加の順に高く、乳酸分率が高い順（表４）と一致していた。特に、乳酸分率が70 mol%のフィルム（ＤＭＳＯの添加が培養開始後0時間）はほぼ透明であった。
【００５２】
実施例４：各種良溶媒を用いたポリマー生産（１）
本発明の良溶媒として以下の表に示す溶媒を、下記濃度（培地中の終濃度）にて培地に添加し、実施例１の３）ａ）に記載した手順と同様にして培養を行った。得られたポリマーのモノマー組成を以下の表に示す。
【表５】
2017029082.tif 000009
表に示すとおり、本発明の良溶媒を培地に添加することにより、ポリマーの乳酸分率が上昇した。
【００５３】
実施例５：各種良溶媒を用いたポリマー生産（２）
本発明の良溶媒として以下の表に示す溶媒を、下記濃度（培地中の終濃度）にて培地に添加し、実施例１の３）ｂ）ｉｉ）に記載した手順と同様にして培養を行った。得られたポリマーの乳酸分率および重量平均分子量（Mw）を以下の表に示す。
【表６】
2017029082.tif 000010
本発明の良溶媒を培地に添加することにより、ポリマーの分子量が増大した。また、DMSOを添加した場合は乳酸分率の上昇もみとめられた。
【００５４】
実施例６：良溶媒による重合反応の促進効果
精製した重合酵素（PhaC1）のタンパク質に、ポリ乳酸のモノマー基質であるラクチルCoAを、本発明の良溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下または非存在下で作用させ、反応後の重合酵素の質量をMALDI TOF MSにより測定した。重合酵素はヒスチジンタグとの融合タンパク質として組換え大腸菌で発現させ、ニッケルとの親和性を利用する一般的な方法で精製した。緩衝液中、ＤＭＳＯの存在下または非存在下で重合酵素とラクチルCoAを３０℃にて３０分間反応させた後、マトリックス（trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]-malononitrile）のテトラヒドロフランの飽和溶液と混合しMALDI TOF MSのサンプルとした。
得られたMALDI-TOF MSスペクトルを図２に示す。重合した乳酸ポリマー鎖は重合酵素と結合しているため、重合した分だけ重合酵素の質量が増加する。
図に示されるように、重合酵素とラクチルCoAを同一濃度で一定時間反応させた場合（３０℃３０分）、有機溶媒が存在しない条件では平均約３０量体分のモノマーが重合したのに対し、有機溶媒（DMSO 8mM）の存在下では平均約４９量体分のモノマーの重合が認められた。この結果は、重合反応の促進が本発明の良溶媒の添加によるものであり、良溶媒に細胞が生理的に応答したことによる二次的効果によるものではないことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、微生物を用いた含乳酸ポリエステルの製造において有用である。
【図１】
2017029082.tif 000011
【図２】
2017029082.tif 000012