(57)【要約】【課題】反応部位が高密度に配置されたマイクロアレイ上で酵素増感法を適用しても、酵素反応によって生成された標識体が隣接する反応部位へと浸入し、検出感度が低下しない方法を提供する。【解決手段】酵素で標識された標的物質を、マイクロアレイ上に搭載された反応部位のプローブに捕捉させ、酵素反応によって標識体を生成する基質を含んだ酵素反応液を添加することによって標的物質の検出を行う方法であって、酵素反応液にデキストランが含まれることを特徴とする標的物質の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ上の反応部位に捕捉されている、酵素で標識された標的物質に、基質を含む酵素反応液を添加して標識体を生成し、マイクロアレイで標的物質の検出を行う方法であって、酵素反応液にデキストランが含まれることを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記酵素反応液中の前記デキストランの濃度が３０ｗ／ｖ％以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的物質が、核酸又はタンパク質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素がペルオキシダーゼ、フォスファターゼ、グリコシダーゼ、又はルシフェラーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロアレイ上で酵素で標識された標的物質を検出するためのキットであって、当該酵素の酵素反応により標識体を生成する基質及びデキストランを含む溶液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素で標識された標的物質をマイクロアレイで検出する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
材料化学、合成化学、薬学又は生物科学などの分野では、多数の情報を一括して網羅的に検出して解析できる分析手法としてマイクロアレイを用いた分析方法が注目されている。マイクロアレイは、微小な基盤上に、解析したい物質（標的物質）と結合するプローブをアレイ状に複数配置させたものである。個々のプローブが配置された場所は反応部位と呼ばれ、反応部位の搭載数が多いほど、多くの情報を検出することができる。
【０００３】
マイクロアレイで試料中の標的物質を解析する方法は、蛍光色素などのシグナルを発生する標識体と標的物質を結合させ、そのシグナルを測定することで標的物質を間接的に検出し、情報を解析する方法が一般的である（特許文献１）。しかしながら、この方法では、シグナルの強度が標的物質の量に依存するため、検出感度を向上させるためには、標的物質の量を増加させる必要がある。
非特許文献１又は２には、酵素で標識した標的物質を、反応部位のプローブに捕捉させ、基質を含む酵素反応液を添加することで、酵素反応により基質から標識体を生成させ、マイクロアレイで検出する方法が開示されている。この方法を用いると、酵素反応によって標識体が生成されるため、標的物質が少量でも、高感度な検出が可能になる。非特許文献１は、酵素反応によってマイクロアレイ上で比色色素を生成させて数ｐｍｏｌのｍＲＮＡを検出する方法が開示されている。非特許文献２は、酵素反応によってマイクロアレイ上で発光色素を生成させ、数十ｆｍｏｌのタンパク質を検出する方法を開示している。
【０００４】
また、検出方法以外にマイクロアレイの構造についても検討されている。例えば、東レ株式会社の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）は、反応部位を高密度に配置することで、反応部位の搭載数を増加させ、基盤自体を小型化することで、より少ない試料から、より多くの標的物質を検出することを可能にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開１９９７／０１０３６５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ ＪＪら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９８年８月１日、第５１巻、第３号、ｐ．３１３−２４．
【非特許文献２】Ｏｋａｄａ Ｈら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１２年７月、第５巻、ｅ３７０３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、反応部位が高密度に配置されたマイクロアレイに、非特許文献１又は２に開示されている酵素による増感法（酵素増感法）を組み合わせれば、より少量の標的物質を検出することが可能になると考え、検出方法を検討した。しかしながら、反応部位が高密度に配置されたマイクロアレイでは、酵素反応によって生成された標識体が拡散し、隣接する反応部位へ浸入するため、検出ノイズが増加し検出性能が低下することがわかった。
【０００８】
本発明は、標識体の拡散を抑制することにより、より少量の標的物質から、高感度なマイクロアレイの解析を可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、非特許文献１又は２に開示されているマイクロアレイを用いた酵素による増感法（酵素増感法）において、デキストランを含む酵素反応液を用いると、酵素反応によって生成された標識体の拡散が抑制され、検出ノイズが低減されて、高感度な検出が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下の構成を含む。
（１）マイクロアレイ上の反応部位に捕捉されている、酵素で標識された標的物質に、基質を含む酵素反応液を添加して標識体を生成し、マイクロアレイで標的物質の検出を行う方法であって、酵素反応液にデキストランが含まれることを特徴とする標的物質の検出方法。
（２）前記デキストランの濃度が３０ｗ／ｖ％以上である（１）に記載の方法。
（３）前記標的物質が、核酸又はタンパク質である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記酵素がペルオキシダーゼ、フォスファターゼ、グリコシダーゼ、又はルシフェラーゼである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）マイクロアレイ上で酵素で標識された標的物質を検出するためのキットであって、当該酵素の酵素反応により標識体を生成する基質及びデキストランを含む溶液を含むキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、酵素反応によって生成した標識体の拡散が抑制され、検出ノイズを低減できるため、マイクロアレイを用いた酵素増感法による標的物質の検出、特に従来よりも少量の標的物質の検出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】酵素反応度、局在性を評価するための酵素が固定されたプレートのウェル拡大図。
【図２】局在性の評価基準。
【図３】（Ａ）デキストラン又はその他の糖を含まない酵素反応液を添加した場合の蛍光色素拡散の経時変化。(Ｂ)分子量４０，０００のデキストランを酵素反応液に対して濃度１００ｗ／ｖ％となるように溶解させた酵素反応液を添加した場合の蛍光色素拡散の経時変化。
【図４】マイクロアレイ上で標的物質が捕捉される反応部位の場所。
【図５】（Ａ）デキストラン又はその他の糖を含まない酵素反応液をマイクロアレイに添加した際の蛍光色素の拡散の経時変化。（Ｂ）分子量１，０００のデキストランを酵素反応液に対し濃度１００ｗ／ｖ％となるように溶解させた酵素反応液をマイクロアレイに添加した際の蛍光色素の拡散の経時変化。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で用いられるマイクロアレイは、基板や膜にプローブが固定された微小な反応部位が複数搭載されたものである。マイクロアレイの他に、マクロアレイ、チップ、アレイなどの呼び方があるが、明細書中では、これらの総称として、マイクロアレイと記載する。本発明で用いるマイクロアレイの反応部位の素材、形状、大きさなどに特に制限はなく、数ミリ各のチップ状であっても、直径がナノメーターから数ミリメーターのビーズ状や球状であってもよい。
【００１４】
本発明の方法は、マイクロアレイの反応部位が高密度に配置されているほど、その効果が顕著に表れる。反応部位が高密度に配置されているマイクロアレイとは、例えば隣り合う２つの反応部位の中心から中心までの距離が、１ｍｍ以下の構造を有するマイクロアレイである。より具体的には、例えば隣合う２つの反応部位の中心から中心までの距離が、５０μｍ〜２５０μｍ程度の構造を有するマイクロアレイで特に顕著に効果が表れ、特に好ましい範囲は、１００μｍ〜２５０μｍである。
【００１５】
本発明で用いるマイクロアレイの構造は特に限定されないが、生成された標識体が隣接する反応部位へ浸入することを妨げられない構造を有している場合、本発明は特に有効である。具体的には、窪み、穴、囲い又はウェルなどの構造によって個々の反応部位が区切られたり、囲われていたりしない構造のものが例示される。
【００１６】
また、マイクロアレイが、上記のような構造を有していても、複数の反応部位を取り囲むような構造や、個々の反応部位を区切る隔壁などに間隙や穴などが存在し、生成した標識体が隣接する反応部位へ浸入する場合には、本発明の効果が発揮される。
【００１７】
本発明で用いられる標的物質は、特に限定されないが、核酸、タンパク質、脂質、糖、ウィルス、細胞又は低分子化合物などが挙げられ、核酸やタンパク質が好ましい。
【００１８】
核酸は、特に限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）、人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて人工的に作製できる。
【００１９】
タンパク質は、特に限定されないが、一般的なタンパク質の他に、抗原、抗体及びペプチドなどが挙げられる。
【００２０】
本発明は、酵素で標識された標的物質に、基質を含んだ酵素反応液を添加し、酵素反応によって標識体を生成させる方法（酵素増感法）により、当該標的物質をマイクロアレイで検出する方法である。本発明の方法は、具体的には、標的物質を酵素で標識する工程、工程１）標的物質をマイクロアレイの反応部位に固定されたプローブに捕捉させる工程２）、工程２で捕捉された標的物質を検出するために、デキストランと基質を含む酵素反応液を添加して標識体を生成させる工程３）を含む。工程１と工程２はどちらを先に行ってもよい。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【００２１】
工程１に用いる標識方法は特に限定されないが、例えば、酵素が予め結合した一次抗体を標的タンパクと結合させ複合体を形成させる方法や、ビオチン、イミノビオチン又はデスチオビオチンを結合させた標識物質と、予め酵素結合したアビチン又はストレプトアビジンを用いて、ビオチン−アビジン複合体を形成させる方法が挙げられる。
【００２２】
本発明で用いる酵素は、基質を酵素の触媒反応によって変換し、標識体を生成させるものであれば特に限定されないが、具体的には、ペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼ、酸フォスファターゼ、アルカリフォスファターゼなどのフォスファターゼ、β―グリコシダーゼ、β―グルクロニダーゼ、β―グルコシダーゼなどのグリコシダーゼなどが挙げられる。
【００２３】
酵素と基質の間には好ましい組み合わせがあることが知られており、本発明でも、酵素に応じて、適切な基質を選択することが好ましい。
【００２４】
基質は、特に限定されないが、酵素が触媒する化学反応によって、比色色素、蛍光色素、吸光、ハプテン、燐光、化学発光、電気化学ルミネッセンス又はエネルギー移動色素などの標識体に変換される物質であれば特に限定されないが、比色定量基質、化学発光基質又は蛍光発生基質が好ましい。
【００２５】
酵素と基質の組み合わせについては、例えば、オキシドレダクターゼは、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）などの比色定量基質、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ-3-メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン、還元型ベンゾチアジン（「Ａｍｐｌｅｘ」（登録商標）Ｒｅｄ試薬及びその改変体（米国特許第４，３８４，０４２号）を含む）、還元型ジヒドロキサンチン（ジヒドロフルオレセイン（ 米国特許第６，１６２，９３１号）を含む）、ジヒドロローダミン（ ジヒドロローダミン１２３を含む）、チラミド（米国特許第５，１９６，３０６号などのチラミドを用いた増感法を含む）などの蛍光発生基質と組み合わせることができる。
【００２６】
フォスファターゼは、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファストレッド（Ｆａｓｔ−Ｒｅｄ）／ナフトール−ＡＳ−ＴＳホスフェートなどの比色定量基質、ＥＬＦ９７又はＥＦＬ３９などのホスフェート（米国特許第５，３１６，９０６号及び同第５，４４３，９８６号）、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号）、フルオレセインホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レゾルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）、２−（５’−クロロ−２’−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン（ＣＰＰＣＱ）などの蛍光発生基質と組み合わせて用いることができる。
【００２７】
グリコシダーゼは、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フッ化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号）、フルオレセインジグルクロニドなどの蛍光発生基質、又はこれらの構造的改変体（米国特許第５，２０８，１４８号；同第５，２４２，８０５号；同第５，３６２，６２８号；同第５，５７６，４２４号および同第５，７７３，２３６号）と組み合わせて用いることができる。
【００２８】
上記以外にも、オキシドレダクターゼに分類されるルシフェラーゼと、発光基質に分類されるルシフェリンとを組み合わせて用いることができる。
【００２９】
また、ペルオキシダーゼを用いる場合には、酵素と基質の他に、酸化剤として過酸化水素を添加することが好ましい。
【００３０】
工程２は、標的物質を、反応部位上のプローブに特異的に捕捉させる工程である。プローブは、標的物質を特異的に捕捉する物質であり、標的物質が核酸の場合、標的物質と相補的な配列を有する核酸がプローブに用いられ、ハイブリダイゼーションによって標的物質の核酸がプローブに特異的に捕捉される。また、標的物質がタンパク質の場合、標的物質のタンパク質と結合する抗体、アプタマー、ハプテンなどがプローブに用いられ、抗体結合などによって、標的物質のタンパク質がプローブに特異的に捕捉される。反応部位上に標的物質が捕捉されたら、反応部位をマイクロアレイの一般的な方法で洗浄し、ブロッキングすることが好ましい。例えば、反応部位をクエン酸ナトリウム溶液などで洗浄し、捕捉されていない余分な標的以外の物質などを除いた後、乳タンパク質でブロッキングする方法などが挙げられる。
【００３１】
工程３では、デキストランを含む酵素反応液を反応部位に添加して標的物質の検出を行う。酵素増感法は、酵素で標的物質を標識し酵素反応によって標識体を生成させる方法であるため、標的物質が微量であっても、高感度に検出できるという利点がある。しかしながら、酵素反応によって生成され続ける標識体は、時間の経過と共に、酵素反応液中をブラウン運動などによって拡散し、隣接する反応部位へと浸入して、検出ノイズを増加させる。本発明では、デキストランを酵素反応液に添加することによって、酵素反応を阻害することなく、標識体の拡散を抑制できることを見出した。
【００３２】
本発明で用いるデキストランは、α−グルコースを唯一の構成成分とする多糖類であり、α−１，６グリコシド結合で直鎖状につながった骨格を主体として、α−１，４グリコシド結合、α−１，３グリコシド結合及び／又はα−１，２グリコシド結合の枝分かれ構造を持つ。
【００３３】
酵素反応液に添加するデキストランの分子量は、例えば１，０００〜２１０，０００の分子量を用いることができる。また、異なる分子量のデキストランを混ぜ合わせて用いてもよい。
【００３４】
酵素反応液におけるデキストランの濃度は、好ましくは、３０ｗ／ｖ％以上、より好ましくは、最大溶解度で溶解させることが好ましい。最大溶解度とは、溶質が溶媒に溶解し得る最大の濃度を意味する。ここで、ｗ／ｖとは、重量／容量である。
【００３５】
本発明では、デキストランを溶解させた酵素反応液の粘度は、例えば、デキストランが添加された５ｃｐから５０００ｃｐ程度の粘度の酵素反応液を好ましく用いることができる。
【００３６】
本発明で用いる酵素反応液は、酵素反応によって標識体に変換される基質と、酵素反応に必要な酸化剤又は還元剤を含む。
【００３７】
酵素反応液を調製する場合の、基質、酸化剤又は還元剤を溶解するための溶液は、基質が酵素の非存在下で化学反応を起こしたり、酵素反応を阻害したりしない溶液であれば特に限定されないが、緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝液や、酢酸緩衝液などを用いることができる。
【００３８】
本発明の効果は、「酵素反応度」、「局在性」、「シグナル／ノイズ比」を指標として評価することができる。本発明は、これら３つの指標全てについて、以下で説明するそれぞれの基準を満たすことを目的とする。
【００３９】
酵素反応度は、デキストランの添加による酵素反応への影響を確認し、検出に十分な量の標識体が生成されているかを評価する指標である。評価方法は特に限定されないが、例えば標識体として蛍光色素基質を用いて以下のような方法で評価することができる。
【００４０】
酵素反応によって生成される蛍光基質を検出するために、一つのウェルの直径が６．４ｍｍである９６ウェルプレートを用意し、ウェル内にペルオキシダーゼを固定して、蛍光色素の基質として「Ａｍｐｌｅｘ」（登録商標）Ｒｅｄを含む酵素反応液を添加する。続いて、酵素反応によって生成された蛍光色素の蛍光強度を測定し、一定以上の蛍光強度が得られた場合には、マイクロアレイの検出に必要な量の蛍光基質が生成されるために十分な酵素反応度で酵素反応が進行したと評価できる。
【００４１】
蛍光強度の測定には、隣接する反応部位が明確に示されるよう１０ｍｍ未満の解像度を持つ画像測定機を用いることが望ましい。例えば、可動共焦点レーザー走査方式による画像解析装置タイフーン９４１０（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社）、アレイスキャナーＳｃａｎＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（パーキンエルマー社）、「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ（東レ株式会社）などで測定することができる。
【００４２】
デキストランを添加せずに酵素と基質をプレート上で反応させ、上記の測定器を用いて蛍光強度を測定した結果、蛍光強度（ＲＦＵ）が５０，０００以上となるように基質量を調製し、コントロールとして用いることが望ましい。「Ａｍｐｌｅｘ」(登録商標）Ｒｅｄであれば、1つのウェルに対し、６０μｇ／Ｌの濃度で１００μＬ程度添加することが好ましい。
【００４３】
上記のように実験系を構築した上で、酵素反応液にデキストランを添加して、蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度の値によって酵素反応度は以下のように評価できる。
【００４４】
ＲＦＵ値が１００未満の場合は酵素反応度０、１００以上１０，０００未満の場合は酵素反応度１、１０，０００以上３０，０００未満の場合は酵素反応度２、３０，０００以上５０，０００未満の場合は酵素反応度３、５０，０００以上の場合は酵素反応度４として評価する。本発明では、酵素反応度２以上を、マイクロアレイでの検出が可能な値として判断する。
【００４５】
局在性の評価について説明する。本発明の局在性とは、酵素反応によって生成された標識体が、時間の経過と共に拡散した範囲の程度である。標識体の拡散する範囲が狭い場合には、局在性ありと評価し、拡散する範囲が広い場合には局在性なしと評価する。局在性は、例えば、標識体に蛍光色素を用いて以下のように評価することができる。
【００４６】
プレート上の一点に酵素を固定し、酵素反応液を添加して、一定時間経過した後、生成された標識体が、酵素の固定位置から拡散した範囲を評価することができる。具体的には、一つのウェルの直径が６．４ｍｍである９６ウェルプレートを用いて、図１に示すようにウェル内の端一点にペルオキシダーゼを固定する。続いて、蛍光色素の基質である「Ａｍｐｌｅｘ」（登録商標）Ｒｅｄを用いて酵素反応液を調製し、ペルオキシダーゼが固定されたウェルに添加して、４０分間静置する。蛍光色素の拡散の範囲を目視で観察し、以下のように局在性を評価することができる。図２に示すように、局在性０：ウェル内面積の４分の３以上に拡散、局在性１：ウェル内面積の２分の１〜４分の３に拡散、局在性２：ウェル内面積の４分の１〜２分の１に拡散、局在性３：ウェル内面積の４分の１以下に拡散、とスコア化し、本発明では、局在性１以上を局在性有りと評価する。
【００４７】
検出性能は、本来検出すべきシグナルに対するバックグラウンドノイズとの比、「シグナル／ノイズ比」で評価される。具体的には、標的物質の存在が想定される反応部位のシグナル強度（シグナル）を、標的物質が存在していないと想定される反応部位のシグナル強度（ノイズ）で割った値であり、検出の感度が高ければ高いシグナル／ノイズ比が得られる。一般に標的物質が正しく検出されるためには、２．０以上のシグナル／ノイズ比が求められる。また、検出すべき標的物質の量が多ければ高いシグナル／ノイズ比の値が得られる傾向があり、検出すべき標的物質の量が少なければ低いシグナル／ノイズ比が得られる傾向がある。
【００４８】
本発明によれば、酵素反応によって生成された標識体の拡散が抑制され、マイクロアレイの検出性能を向上させることができるため、微量の標的物質をマイクロアレイで検出することが可能となる。具体的には、１〜１０ａｍｏｌ程度の標的物質の量を検出することができる。
【００４９】
本発明のキットは、マイクロアレイ上で酵素で標識された標的物質を検出するためのキットであって、当該酵素の酵素反応により標識体を生成する基質及びデキストランを含む溶液を含むキットである。また、キットには、当該酵素が含まれていてもよい。ここでいうところの酵素、基質、デキストランは、上記で示した通りである。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。
【００５１】
＜参考例＞ウェルプレート及び酵素反応液の調製と酵素反応度及び局在性の評価方法
酵素増感法によるマイクロアレイを検出する方法を検討するにあたり、検討の結果を評価する基準を設定した。
【００５２】
＜参考例１＞酵素反応度の評価基準の設定
黒色透明平底の９６ウェルプレート（株式会社グライナー・ジャパン、＃６５５０９６）にリン酸緩衝液で１，０００倍希釈した「ＥＣＬ」（登録商標）抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社、＃ＮＡ９３３Ｖ）の酵素液を図１のようにウェルの端一点滴下した。６時間静置し、酵素液が乾燥して酵素がウェルの一点に固定されたことを確認した後、ウェルプレートをＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ＨＲＰコーティングプレートを作成した。
【００５３】
次に、酵素反応液として、５ｍＭ酢酸緩衝液で１３６μｇ／ｍＬに調製した「Ａｍｐｌｅｘ」（登録商標）Ｒｅｄ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と０．２Ｍのリン酸緩衝液で２ｍＭに調製した過酸化水素をそれぞれ１：１に混合した溶液を調製した。ＨＰＲコーティングプレート1ウェルあたり系１００μＬの酵素反応液を添加し、速やかに生成した蛍光色素の蛍光強度を測定した。
【００５４】
蛍光色素強度の検出には、可動共焦点レーザー走査方式による画像解析装置タイフーン９４１０（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社）を用いて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定した。励起波長５８０ｎｍ，ＰＭＴ６００，解像度１００μｍに設定し、画像解析ソフトウェア「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ」（登録商標）（モレキュラーダイナミックス）を用いて画像を取得した。
【００５５】
画像を解析した結果、酵素反応液を添加した場合の蛍光強度（ＲＦＵ）は５０，０００であった。この蛍光強度を酵素反応が阻害されていないコントロールの値として、ＲＦＵ値が１００未満の場合は酵素反応度０、１００以上１０，０００未満の場合は酵素反応度１、１０，０００以上３０，０００未満の場合は酵素反応度２、３０，０００以上５０，０００未満の場合は酵素反応度３、５０，０００以上の場合は酵素反応度４として評価基準を設定した。以降の実験では、酵素反応度２以上をマイクロアレイの検出に必要な酵素反応度として評価した。
【００５６】
＜参考例２＞局在性の評価基準の設定
上記で作成したＨＲＰコーティングプレートに、参考例１で調製した酵素反応液を添加し、４０分後に生成した標識体がウェルプレート上の酵素固定位置からどの範囲まで拡散しているかを目視で観察し、色素の局在性について図２に示すように拡散の範囲に応じて局在性の基準を設定した。局在性０：ウェル内面積の４分の３以上に拡散、局在性１：ウェル内面積の２分の１〜４分の３に拡散、局在性２：ウェル内面積の４分の１〜２分の１に拡散、局在性３：ウェル内面積の４分の１以下に拡散、とスコア化し、以後の実験では、局在性１以上をマイクロアレイの検出に必要な値として評価した。
【００５７】
＜実施例１＞デキストランを添加した酵素反応液を用いた酵素反応度、局在性の検討
酵素反応によって生成された標識体の拡散は、酵素反応液の粘度を高めることによって抑制されると考えた。酵素反応液に化合物を溶解させて粘度を高め、酵素反応度、局在性が変化するか検討した。酵素反応液に溶解させる化合物としてデキストランを選択した。参考例1で作成したＨＲＰコーティングプレートに各分子量のデキストランを溶解させた酵素反応液を添加し、酵素反応度及び局在性を評価した。酵素反応液に対するデキストランやその他の糖の分子量や酵素反応液に対する濃度（ｗ／ｖ）は表1に示した通りである。
【００５８】
デキストランを添加した以外は、参考例１及び２と同様の操作、条件で実験を行い、酵素反応度と局在性を評価した。コントロールには、デキストランを添加せずに同量の０．２Ｍのリン酸緩衝液を添加した酵素反応液を用いた。表１に結果を示す。
【００５９】
また、局在性の試験結果の代表例として、コントロールの結果を図３（Ａ）に、分子量４０，０００のデキストランを濃度１００ｗ／ｖ％になるよう溶解させた酵素反応液を用いた結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）では、時間の経過とともに生成された蛍光色素がウェル全体に拡散し、４０分経過後には、局在性が０になる様子が確認できた。一方図３（Ｂ）の分子量４０，０００のデキストランを含む酵素反応液を添加したウェルプレートでは、酵素反応液添加から４０分が経過した後も蛍光色素の拡散が抑えられ、核酸範囲が、ウェルの４分の１〜２分の１の局在性２の結果となった。
【００６０】
これらの結果から、各分子量のデキストランを酵素反応液に溶解させた場合、酵素反応度２以上、局在性１以上の値が得られることがわかった。
【００６１】
また、表１には各酵素反応液の粘度を測定した結果を示した。粘度はＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ社製粘度計ＤＶ−ＩＩにて測定した。測定の結果、酵素反応液の粘度は５〜４，５９４ｃＰであった。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
＜比較例１＞デキストラン以外の糖を添加した酵素反応液を用いた酵素反応度、局在性の検討
続いて、酵素反応液の粘度を高める化合物として、デキストラン以外の各種糖を選択し、酵素反応度と局在性の検討を行った。酵素反応液に、ソルビトール、スクロース、α−シクロデキストリン、β―シクロデキストリン、アミロース、マルトデキストリン、シクロアミロース、γ−シクロデキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのいずれかを溶解させた以外は、実施例1と同様の条件、操作で実験を行った。酵素反応液に対する各種糖の分子量や酵素反応液に対する濃度（ｗ／ｖ％）は表２に示した通りである。結果及び各種等を添加した酵素反応液の粘度を表２に示す。
【００６４】
これらの結果から、β-シクロデキストリン、アミロース、γ―シクロデキストリン、メチルセルロースを酵素反応液に添加した場合、酵素反応度２以上、局在性１以上の値が得られることがわかった。また、各種糖を溶解させた酵素反応液の粘度も表２に示す。これらの結果と、実施例1の酵素反応液の粘度の結果について、局在性の結果との関係を検討すると、酵素反応液の粘度の値と、局在性の値との間には、相関関係がないことがわかった。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
＜参考例３＞マイクロアレイの調製
マイクロアレイで検出する標的物質として、３０塩基長のＤＮＡ（５’−ＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣ-３’）の５’末端にビオチンが１分子結合した核酸を合成し（オペロン社）、これを１ａｍｏｌ使用した。マイクロアレイは上記標的核酸及び他の配列を捕捉するためのプローブが３スポットずつ搭載されているカスタム設計の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）２５６チップ（東レ株式会社）を用いた。上記プローブのマイクロアレイ上の配置を図４に模式図として示す。マイクロアレイへの核酸結合及び洗浄は「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）ｍｉＲＮＡ＿ｖＥ１．１０プロトコールに則って実施した。標的核酸がハイブリダイズしたＤＮＡチップはブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル、＃ＵＫＢ８０）でブロッキングし、ＰＢＳＴ洗浄液で１回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰと室温で１０分間反応させ、更にＰＢＳＴ洗浄液で３回洗浄した。
【００６７】
＜実施例２＞マイクロアレイ上でのデキストラン含有酵素反応液を用いた標的核酸の検出
実施例１で、各分子量のデキストランを含む酵素反応液を使用することによって、酵素反応度２以上、局在性１以上の値を得られることがわかったため、マイクロアレイを用いた微量な標的核酸の検出における、酵素反応液への各種デキストランの添加効果を検討した。
【００６８】
実施例１と同様の酵素反応液に分子量１,０００、１,５００、３,５００、５,０００、１０,０００、１７,５００、２０,０００、４０,０００、６０,０００、２１０,０００のデキストランをそれぞれ表２の濃度（ｗ／ｖ％）になるように酵素反応液に溶解した。コントロールには、デキストランの代わりに同量の０．２Ｍのリン酸緩衝液を添加した酵素反応液を用いた。参考例３で調製した１ａｍｏｌの標的核酸が結合したマイクロアレイに、酵素反応液３０μＬを反応部位に滴下後、カバーシールで蓋をした。酵素反応液添加後は速やかにアレイスキャナーＳｃａｎＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（パーキンエルマー社）を用いて蛍光強度を測定した。５３２ｎｍ励起蛍光画像をレーザー強度１００％で取得した。ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）はスポット１〜２個シグナルが飽和している強さのレベルを最適値として選択した。得られた蛍光画像はＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ６．０（モレキュラーデバイス）によってそれぞれ数値化した。検討結果の評価基準には、シグナル／ノイズ比を用いた。この時、標的核酸配列が、この配列の逆鎖である捕捉プローブとマイクロアレイ上で結合し発生する蛍光色素から得られたシグナルを標的シグナルとし、他の配列に対する捕捉プローブと結合して発したシグナルをノイズとした。
【００６９】
図５は、酵素反応液をマイクロアレイに添加した、１、３、６分経過後の蛍光画像である。図５（Ａ）は、デキストラン又はその他の糖を含まない酵素反応液を用いたコントロールの結果である。蛍光色素が隣接する反応部位へと浸入し、マイクロアレイ全体に拡散する様子が確認できる。図５（Ｂ）は分子量１，０００のデキストランを酵素反応液に対し濃度５０ｗ／ｖ％となるように溶解させた酵素反応液を用いた結果である。蛍光色素が拡散せず、反応部位上に留まっている様子が確認できた。さらに図５（Ｂ）では、図４で示された反応部位と同様の場所で蛍光色素が生成されていることも確認できた。
【００７０】
表３に、各分子量のデキストランを酵素反応液に溶解させマイクロアレイ上で反応させた場合の反応１分後のシグナル／ノイズ比を示した。これらの結果、デキストランを含まないコントロールの酵素反応液を用いた場合のシグナル／ノイズ比は、１．２であったのに対し、各種分子量のデキストランを含む酵素反応液を用いた場合にはシグナル／ノイズ比が８以上の結果となった。つまり、各種のデキストランを含む酵素反応液を用いることによって、一般的に検出に有効であるとされるシグナル／ノイズ比２．０を顕著に上回る高い値を得られることがわかった。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
＜比較例２＞従来法との比較
従来法である標識体で標識した標的物質をマイクロアレイで検出する方法を検討した。ストレプトアビジンが結合したフィコエリスリン色素（インビトロジェン社、#Ｓ−８６６）と組成液（２ｘＭＥＳ、１．８５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トゥイーン２０、４ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）を同量混合して得られた溶液４０μＬを、参考例３で準備された、標的核酸がハイブリダイズしたマイクロアレイに滴下してカバーグラスを載せ、冷暗４℃で３０分間静置反応後、上記同様のマイクロアレイ洗浄を繰り返した。マイクロアレイの蛍光画像はアレイスキャナーＳｃａｎＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（パーキンエルマー社）を用いて５３２ｎｍで励起、５７０ｎｍで取得した。その結果、シグナル／ノイズ比は１．２となり１ａｍｏｌの標的核酸を検出することができなかった。
【００７３】
続いて、標的核酸を１０ａｍｏｌに増やし、同様の実験を行った。その結果シグナル／ノイズ比は、３．０となり、標的核酸検出を行うことができた。
【００７４】
＜比較例３＞
比較例１で酵素反応度２以上、局在性１以上の結果が得られた、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、アミロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースについて、これらを含む酵素反応液を用いた場合のマイクロアレイでの検出効果を検討した。
【００７５】
酵素反応液に、表４の濃度（ｗ／ｖ％）となるように各種糖を溶解させた以外は、実施例２と同様の条件、操作で実験を行った。結果を表４に示す。これらの結果から、シグナル／ノイズ比は、いずれも２．０を下回ることがわかった。
【００７６】
実施例１，２及び比較例１，２，３の結果から、酵素反応度２以上かつ局在性１以上の基準を満たしていても、デキストラン以外の各種糖は、マイクロアレイを用いた検出で、標的物質を検出できないことがわかった。つまり、酵素増感法を用いて、反応部位が高密度に配置されたマイクロアレイで標的物質の検出を行うためには、酵素反応度２以上、局在性１以上、シグナル／ノイズ比２．０以上の３つの基準を満たす化合物を選択し、酵素反応液に添加する必要があることがわかった。
【００７７】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、反応部位が高密度に配置されたマイクロアレイでも、酵素増感法を用いた検出が可能となり、従来法よりも少量の標的物質を高い検出感度で検出できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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