(57)【要約】【課題】再溶解性が向上し、数秒程度で容易に再溶解可能な凍結乾燥体の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る凍結乾燥体の製造方法は、添加物を含む試薬を、凍結乾燥温度で凍結乾燥して凍結乾燥体を製造する凍結乾燥体の製造方法であって、添加物を含む試薬を、凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程と、凍結した試薬を、前記低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程と、昇温して所定時間維持した試薬を、凍結乾燥温度で減圧して乾燥する凍結乾燥工程と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
添加物を含む試薬を、凍結乾燥温度で凍結乾燥して凍結乾燥体を製造する凍結乾燥体の製造方法であって、
添加物を含む試薬を、前記凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程と、
前記凍結した試薬を、前記低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程と、
前記昇温して所定時間維持した試薬を、前記凍結乾燥温度で減圧して乾燥する凍結乾燥工程と、
を含む、凍結乾燥体の製造方法。
【請求項２】
前記液体は、液体窒素である、請求項１に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項３】
前記添加物は、トレハロースを含む、請求項１または請求項２に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項４】
前記試薬は、逆転写酵素を含む、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項５】
前記試薬は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーおよびプローブの少なくとも一種を含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項６】
前記添加物は、前記凍結乾燥体に含まれる固形分の全質量に対して４７質量％以上９５質量％以下である、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項７】
前記添加物は、前記凍結乾燥体に含まれる固形分の全質量に対して７８質量％以上８５質量％以下である、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項８】
前記凍結乾燥工程の後に、疎水性の液体を添加する添加工程を含む、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【請求項９】
前記疎水性の液体は、シリコーンオイルである、請求項８に記載の凍結乾燥体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野において、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）の技術が確立されている。最近、ＰＣＲ法における増幅の精度や検出感度は向上してきており、極微量の検体（ＤＮＡ等）を増幅し、検出・解析することができるようになってきた。ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。ＰＣＲの熱サイクルとしては、２段階又は３段階の温度で熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００３】
ＰＣＲに用いる核酸増幅反応試薬は、試薬に使用される酵素の保存性能が低く、その長期保存は一般的に非常に困難である。特に、逆転写酵素は、水溶液の状態では４℃で保存したとしても１日ももたず、活性が低下する。そこで、試薬に添加物を加えて凍結乾燥することで、試薬の保存安定性を向上させることが知られている（例えば、特許文献１参照）。ここでは、反応混合物に対して８〜１２％（重量／容量）の濃度のトレハロースを含むことにより、凍結乾燥した反応混合物の保存安定性を向上させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０００−５１４２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記技術で得られる凍結乾燥体は再溶解しにくく、ボルテックスミキサーによるミキシングが必要であり、時間も数分以上かかるのが一般的である。また、遺伝子検査装置にボルテックスミキサーを設けようとするとメカ機構が複雑になり、自動検査装置を構築する際の課題となる。
【０００６】
本発明に係る幾つかの態様は、上述の課題の少なくとも一部を解決することで、再溶解性が向上し、数秒程度で容易に再溶解可能な凍結乾燥体の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の態様または適用例として実現することができる。
【０００８】
［適用例１］
添加物を含む試薬を、凍結乾燥温度で凍結乾燥して凍結乾燥体を製造する凍結乾燥体の製造方法であって、
添加物を含む試薬を、前記凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程と、
前記凍結した試薬を、前記低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程と、
前記昇温して所定時間維持した試薬を、前記凍結乾燥温度で減圧して乾燥する凍結乾燥工程と、を含むことを特徴とする。
【０００９】
上記適用例に係る凍結乾燥体の製造方法によれば、凍結乾燥工程の前に、添加物を含む試薬を、前記凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程と、凍結した試薬を、前記低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程と、を含むことにより、製造された凍結乾燥体の再溶解性が向上し、数秒程度で容易に再溶解可能な凍結乾燥体を提供することができる。
【００１０】
［適用例２］
上記適用例において、
前記液体は、液体窒素であることができる。
【００１１】
［適用例３］
上記適用例において、
前記添加物は、トレハロースを含むことができる。
【００１２】
［適用例４］
上記適用例において、
前記試薬は、逆転写酵素を含むことができる。
【００１３】
［適用例５］
上記適用例において、
前記試薬は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーおよびプローブの少なくとも一種を含むことができる。
【００１４】
［適用例６］
上記適用例において、
前記添加物は、前記凍結乾燥体に含まれる固形分の全質量に対して４７質量％以上９５質量％以下であることができる。
【００１５】
［適用例７］
上記適用例において、
前記添加物は、前記凍結乾燥体に含まれる固形分の全質量に対して７８質量％以上８４質量％以下であることができる。
【００１６】
［適用例８］
上記適用例において、
前記凍結乾燥工程の後に、疎水性の液体を添加する添加工程を含むことができる。
【００１７】
［適用例９］
上記適用例において、
前記疎水性の液体は、シリコーンオイルであることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の凍結乾燥体のＳＥＭ写真。
【図２】比較例１の凍結乾燥体のＳＥＭ写真。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明の好適な実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の一例を説明するものである。また、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含む。
【００２０】
１．凍結乾燥体の製造方法
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法は、凍結乾燥温度で凍結乾燥して凍結乾燥体を製造する凍結乾燥体の製造方法であって、添加物を含む試薬を、前記凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程と、前記凍結した試薬を、前記低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程と、前記昇温して所定時間維持した試薬を、前記凍結乾燥温度で減圧して乾燥する凍結乾燥工程と、を含むことを特徴とする。以下、本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法の各工程について説明する。
【００２１】
１．１．凍結工程（凍結乾燥工程の前の予備的な凍結工程）
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法は、添加物を含む試薬を、凍結乾燥温度よりも低温の液体で冷却する凍結工程を含む。この凍結工程は、後述する凍結乾燥工程の前に、凍結乾燥する試薬を凍結乾燥温度よりも低い温度の液体を用いて予備的に凍結するものであり（以下、予備凍結ともいう。）、この工程を有することにより、製造された凍結乾燥体の微細孔の平均空隙径を小さくするものである。この予備的な凍結工程は、例えば、核酸増幅反応用容器に用いる容器に、核酸増幅反応用バッファーと１反応分の試薬を入れて行う。
【００２２】
１．１．１．試薬
ここで、予備凍結する添加物を含む試薬は、例えば、滅菌水、蒸留水、イオン交換水等の精製された水、又はそのような水に対して、核酸増幅反応に用いられる試薬と添加物とを溶解させた水溶液をさす。
【００２３】
核酸増幅反応に用いられる試薬としては、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰが挙げられるが、核酸増幅反応用プライマーおよび／または核酸増幅反応用プローブやバッファーを含んでいることが好ましい。また、試薬は、逆転写酵素を含んでいてもよい。その場合、逆転写用プライマーは、核酸増幅反応用プライマーと別に含んでいてもよく、核酸増幅反応用プライマーと共用してもよい。
【００２４】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００２５】
ｄＮＴＰは４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。つまり、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及びｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。
【００２６】
逆転写酵素も特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。耐熱性の酵素にも多数の市販品があるので、それらを利用することが可能である。
【００２７】
ここで、試薬中のポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プローブ、プライマー、バッファーおよび塩の濃度は、用いる反応に応じて適宜設定するものとするが、例えば、ｄＮＴＰを１０〜１０００ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜２０ｍＭが用いられる。
【００２８】
１．１．２．添加物
本実施形態において、試薬に添加する添加物は、製造された凍結乾燥体に含まれる固形分の全質量に対して４７質量％以上９５質量％以下である。試薬に使用される酵素等は保存性が乏しいため、その活性を長期にわたって維持するために添加物を所定量添加する。
【００２９】
添加物としては、核酸増幅反応に用いられる試薬を凍結乾燥した際に、凍結乾燥した酵素などが失活せず、核酸増幅反応を保持する機能、つまり、保存安定性に優れる物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、糖が挙げられる。糖としては、凍結保護剤として機能する糖であれば特に限定されるものではないが、水に溶けやすく、酵素等の他の物質と反応しないものが好ましい。例えば、二糖および三糖のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。これらの中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。
【００３０】
本実施形態において、添加物の含有量は、凍結乾燥試薬に含まれる固形分の全質量（１００質量％）に対して４７質量％以上９５質量％以下であり、好ましくは７８質量％以上８５質量％以下である。添加物の含有量が４７質量％以上９５質量％以下の場合には、製造された凍結乾燥体の保存安定性がよく、凍結乾燥体を再溶解して核酸増幅反応を行った際に反応阻害が生じにくい。
【００３１】
１．１．３．予備凍結
本実施形態において、添加物を含む試薬を、低温の液体で冷却する予備凍結では、後述する凍結乾燥工程よりも低い温度の液体で試薬を凍結可能な液体であれば特に限定されないが、例えば、液体窒素を用いることができる。液体窒素は、１ａｔｍにおける沸点が−１９６℃であり、凍結乾燥する添加物を含む試薬の温度を急激に低下させて凍結することができる。このため、予備凍結を経て得られた凍結乾燥体は、微細孔の平均空隙径が小さくなり、これにより、凍結乾燥体の再溶解性が向上し、数秒程度で容易に再溶解可能となる。
【００３２】
上記したように、予備的な凍結工程の温度は、凍結乾燥工程よりも低い温度で、凍結させる試薬のコラプス温度より低い温度であれば特に限定されないが、−７０℃から−２００℃であることが好ましい。また、予備凍結の時間は、試薬を充分に凍結する時間であれば限定されないが、液体窒素を用いた場合には、溶液量が２μｌ程度で、溶液が直接液体窒素に触れることができる場合であれば、５分程度でも充分に予備凍結が可能である。なお、凍結させる試薬は、急激に冷却させるために、液体窒素などの低温の液体に直接接触させることが好ましい。
【００３３】
液体窒素の他に用いることができる液体としては、例えば、エタノールまたはアセトンをドライアイスで冷却した液体が挙げられる。この場合、冷エタノールまたはアセトンの温度は、−７８〜−８０℃となる。
【００３４】
１．２．維持工程
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法は、上記予備的な凍結工程で用いた低温の液体の沸点より高い温度に昇温して所定時間維持する維持工程を含む。維持工程は、予備的な凍結工程で用いた低温の液体を昇温して、低温の液体が試薬中に残存しないように充分に気化させることを目的とする工程である。
【００３５】
維持工程の温度は、凍結工程で用いた低温の液体の沸点より高い温度で、凍結させる試薬のコラプス温度より低い温度であれば特に限定されないが、−７０℃から−８０℃であることが好ましい。また、維持工程の時間は、試薬中に含まれる低温の液体が充分に気化する時間であれば特に限定されない。
【００３６】
本実施形態では、凍結乾燥工程の前に維持工程を有することにより、後の凍結乾燥工程において、予備的な凍結工程で用いた低温の液体が凍結乾燥の妨げとなることを防ぎ、適切に凍結乾燥体を製造することができる。
【００３７】
１．３．凍結乾燥工程
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法は、減圧して試薬を凍結乾燥する凍結乾燥工程を含む。凍結乾燥工程は、維持工程を経た試薬を凍結乾燥する工程であり、維持工程で低温の液体を気化させた後に、試薬をさらに減圧して所定時間放置することにより、添加物を含む試薬中の水分を気化させて試薬を凍結乾燥する。
【００３８】
急速凍結の際の温度は特に限定されず、凍結乾燥させる試薬のコラプス温度よりも低く設定することが好ましく、−８０℃以上であることが好ましい。また、減圧時の圧力は特に限定されず、１００ｍｍＨｇ以下であることが好ましいが、２０ｍｍＨｇ以下であることが最も好ましい。凍結乾燥工程の時間も特に限定されず、２−２４時間であることが好ましいが、８時間程度であることが最も好ましい。
【００３９】
このように、本実施形態では、核酸増幅反応用容器に用いる容器中で試薬を凍結乾燥することにより、添加物を含む試薬を容器の底に固着させる。
【００４０】
１．４．添加工程
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法は、さらに、凍結乾燥工程の後に、疎水性の液体を添加する添加工程を含むことが好ましい。容器の底に固着した凍結乾燥体は、水分に弱く、水分がある状態では、長期間安定して保存できない。そこで、予め脱水した疎水性溶液で凍結乾燥体を覆うと、凍結乾燥体が水分子に暴露されにくくなり、凍結乾燥体の保存安定性能を更に向上させることができる。
【００４１】
疎水性の液体としては、例えば、オイルやワックスが挙げられる。これらは単独で用いることができるが、例えば、凍結乾燥体にオイルを加える前に、溶解したワックスを加え、ワックスが固形化した後でオイルを加えることによって、凍結乾燥体がオイル中で拡散するのを防ぐことができる。
【００４２】
ここで、ワックスとは、室温で液体または固体であって、室温で固体の場合には加熱すると液体となる有機物のことであるが、本発明に使用できるワックスは、３１℃以上、好ましくは３６℃以上、より好ましくは４１℃以上、さらに好ましくは４６℃以上であって、かつ１００℃以下、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは７０℃以下の融点を有し、中性脂肪、高級脂肪酸、炭化水素などからなることが好ましい。ワックスとしては、特に限定されず、例えば、パラフィン、マイクロクリスタリンなどの石油由来のワックス、蜜蝋、ウールワックス、鯨蝋などの動物由来のワックス、カルナバ、ロジン、キャンデリラワックス、木蝋などの植物由来のワックスのほか、エルクリスタ（登録商標、出光興産）、ニッサンエレクトール（登録商標、日油株式会社）、ポエム（登録商標、理研ビタミン）、リケマール（登録商標、理研ビタミン）、ネオワックス（登録商標、ヤスハラケミカ（株））、ハイワックス（登録商標、三井化学）、シリコンワックス（登録商標、東レ・ダウコーニング）などを用いることができる。
【００４３】
また、オイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などを用いることができる。
【００４４】
中でも、疎水性の液体としては、シリコーンオイル、ミネラルオイルおよびパラフィンかの少なくとも一種を含むことができ、中でもシリコーンオイルを用いることが好ましい。
【００４５】
凍結乾燥工程の後に疎水性の液体を添加する際には、凍結乾燥体が固着した容器を満たすように添加するのが好ましい。疎水性の液体としてワックスを使用する場合には、溶融した状態で添加する。オイルを使用する場合には、予めシリカゲルおよび／またはモレキュラーシーブなどで脱水しておくことが好ましく、オイルの添加は、水分が充分に少なく調節されたグローブボックス内などで行うことが好ましい。また、オイルを加えた後、容器を軽く遠心して、気泡を除去しておくのが好ましい。
【００４６】
１．５．凍結乾燥体の再溶解および使用方法
用いた容器がＰＣＲ装置などの核酸増幅装置に使用できる場合、凍結乾燥体が固着した容器は、そのまま核酸増幅反応に用いることができる。具体的には、増幅させるＤＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーが凍結乾燥体を浸すように添加し、核酸増幅反応を始めればよい。純水またはバッファーの量は、塩類などの最終濃度が核酸増幅反応に適するように、容易に決定することができる。なお、反応前に加熱処理や振とう処理をして、核酸増幅反応用の試薬を十分に溶解してもよい。
【００４７】
凍結乾燥体が逆転写酵素を含んでいる場合は、ＲＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーが凍結乾燥体を浸すように添加してもよく、その場合、逆転写反応を行うことができ、その後で核酸増幅反応を行うことができる。
【００４８】
疎水性の液体を含む場合にも上記溶解および使用方法は同じであるが、疎水性の液体としてワックスを用い、固形のワックスが凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を覆っている場合には、ワックスが溶解する温度まで加熱し、ワックスを溶解させてから、上述のように核酸を含んだ適量の純水またはバッファーを添加すればよい。この場合には、凍結乾燥体が疎水性の液体で覆われている場合であっても、疎水性の液体からの阻害を受けることなく反応が起こる。
【００４９】
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法で製造された凍結乾燥体は、所定量の添加物を含むことにより、凍結乾燥体のままで長期の室温の保存にも耐え得るものであるため、保存後に増幅させるＤＮＡを含んだ適量の純水またはバッファーを添加して核酸増幅反応を行った場合には、凍結乾燥前と同程度の活性を保持している。例えば、本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法で製造された凍結乾燥体は、２０℃の温度で２年近くの保存性能を実現する。
【００５０】
１．６．物性
本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法で製造された凍結乾燥体は、予備的な凍結工程と維持工程を含むことにより、スポンジ状もしくはケーキ状で、中に気泡がたまっている微細孔（気孔）が沢山ある多孔質であり、これによって再溶解性が向上する。微細孔の平均空隙径は、急速に凍結させた方が小さくなり、微細孔の平均空隙径が小さい方が再溶解性および保存性が良くなる。本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法で製造された凍結乾燥体は、孔の平均空隙径（例えば、断面の孔の径を顕微鏡下で一定回数計測し、その平均値をとったもの）が１０μｍ以下となる。特に、低温の液体として液体窒素を用いる場合には、孔の平均空隙径が５μｍ以下となり、再溶解性に優れ、数秒程度で容易に再溶解可能となる。
【００５１】
なお、試薬の凍結乾燥体が固着した容器に保存安定性のために疎水性の液体を添加した系においては、凍結乾燥体の孔の平均空隙径によっては、再溶解の際に水と疎水性の液体とのエマルジョンが形成され、完全に溶解しにくい状況となる。これに対し、本実施形態に係る凍結乾燥体の製造方法で製造された凍結乾燥体は、上記したように孔の平均空隙径が１０μｍ以下となるため、再溶解の際に水と疎水性の液体とのエマルジョンが形成されることなく、容易に再溶解が可能となる。
【００５２】
２．実施例
以下、本発明を実施例および比較例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５３】
２．１．実施例１
２．１．１．凍結乾燥する試薬の調製
下記の組成の核酸増幅反応用の試薬にトレハロースを添加した混合試薬溶液を調製し、調製した試薬１．６μｌを、２ｍｍテストチューブの底をカットし、そのお椀型の容器内または２００μｌのエッペンドルフ社製のＰＣＲチューブ内に導入した。
＜混合試薬溶液の組成＞
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（逆転写酵素）      ０．２μｌ
５ｘバッファー      ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ      ０．２５μｌ
２０ｍＭ  フォワードプライマー      ０．８μｌ
２０ｍＭ  リバースプライマー      ０．８μｌ
１０ｍＭ  プローブ      ０．５μｌ
５００ｍｇ／ｍｌ（質量／容量）  トレハロース水溶液      ２μｌ
ｉｎｆＡ      ０．５μｌ
Ｄ．Ｗ．  ｕｐ  ｔｏ  １０μｌ
プライマー：
Primer F：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C
Primer R：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA
プローブ：
TaqMan probe: FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA
【００５４】
２．１．２．予備凍結工程
次に、試薬を導入したＰＣＲチューブを液体窒素に浸し、５分間保持した。
【００５５】
２．１．３．維持工程
次に、予備凍結工程のＰＣＲチューブを−８０℃の温度のディープフリーザー内に設置し、１時間保持して液体窒素を気化させた。
【００５６】
２．１．４．凍結乾燥工程
次に、十分に凍結したサンプルを、すばやく、凍結乾燥装置内に設置し、室温において、１０Ｐａの減圧環境下、オーバーナイトで凍結乾燥を行い、実施例１の試料を得た。
【００５７】
２．２．比較例１
比較例１では、上記実施例１の２．１．２．予備凍結工程および２．１．３．維持工程の代わりに、予備凍結として試薬を導入したＰＣＲチューブを−８０℃の温度のディープフリーザー内に設置し、１時間保持した以外は実施例１と同様に行った。
【００５８】
２．３．評価
２．３．１．ＳＥＭ観察
実施例１および比較例１において、容器として２ｍｍテストチューブの底をカットした容器を用い、得られた凍結乾燥体をＳＥＭ観察した。装置は、日本電子株式会社製の低真空走査型電子顕微鏡  ＪＳＭ−６５１０ＬＶを用いた。観察は、実施例１については５ｋＶで、比較例１では１．００ｋＶで行った。
【００５９】
実施例１では微細孔１０の平均空隙径が２〜３μｍであったが、比較例１では微細孔２０の平均空隙径が１０μｍを超える結果となった。このように、予備凍結の条件が異なることにより微細孔の平均空隙径が異なる結果となった。なお、ＳＥＭ観察の作業中に凍結乾燥体が水を吸収したため、実際の微細孔の平均空隙径は観察された平均空隙径よりも小さいものと考えられる。
【００６０】
２．３．２．再溶解試験
次に、容器としてＰＣＲチューブを用い、さらに、凍結乾燥した試薬が底に固着したＰＣＲチューブ内に、粘度が２ＣＳのシリコーンオイル（信越化学製）５０μｌを滴下した試料について、再溶解試験を行った。
【００６１】
再溶解試験は、凍結乾燥体入りのＰＣＲチューブをヒーターにセットして温度を５０℃に保持し、そこに、蒸留水を１．６μｌ滴下した際における凍結乾燥体の溶解状況をカメラで撮影することにより行った。なお、試料は、凍結乾燥後すぐのものを使用し、ｎ＝１２で行った。
【００６２】
実施例１の試料は、液滴が凍結乾燥体に到達した瞬間に溶解した。このため、滴下後５００ｍｓの時点で、目視で完全な溶解が確認された。これに対し、比較例１では、滴下後１ｓのときに、凍結乾燥体が容器の下部に残っており、さらに、液滴内部にオイルを巻き込んで、液滴の中にさらに丸い液滴ができていた。また、細かい泡状のものもあり、滴下後１ｓの時点では、完全な溶解は確認されなかった。凍結乾燥体が完全に溶解するには２０ｓ以上かかり、滴下後３０ｓの時点で、上部にオイルと思われる粒々があった。
【００６３】
２．４．評価結果
以上により、液体窒素を用いた予備凍結工程と維持工程を有する実施例１では、凍結乾燥体の微細孔の平均空隙径が小さく、再溶解試験において短時間で簡単に溶解していたのに対し、予備凍結として−８０℃のディープフリーザーでの凍結のみを行った比較例１では、微細孔の平均空隙径が１０μｍより大きくなり、再溶解に時間がかかった。このように、本実施形態に係る凍結工程と維持工程を有することにより、再溶解性が向上し、数秒程度で容易に再溶解可能な凍結乾燥体を提供できることがわかった。
【００６４】
本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００６５】
１０、２０…凍結乾燥体の微細孔
【図１】
2017029008.tif 000002
【図２】
2017029008.tif 000003