(57)【要約】【課題】  細胞が密集し近接・隣接しているような場合や、同一の細胞群でも画素強度のばらつきが大きい場合などにも、適切に細胞画像の二値化を行うことができ、細胞画像において細胞の特定を行うことができる細胞画像解析方法および細胞画像解析装置を提供する。【解決手段】  特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得工程と、細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定工程とを備え、細胞領域特定工程は、細胞画像の各二値化対象画素に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定し、周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、各周辺領域における対象画素の画素値のいずれかが閾値を超えたか否かに基づき、細胞画像を動的二値化処理し、動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定する。【選択図】図１
2017150923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析方法であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得工程と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定工程と、
を備え、
前記細胞領域特定工程は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
各周辺領域における対象画素の画素値のいずれかが前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定する細胞画像解析方法。
【請求項２】
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析方法であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得工程と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定工程と、
を備え、
前記細胞領域特定工程は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
前記周辺領域における対象画素の画素値が前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定することを、
前記細胞画像において、細胞領域と特定されなかった画素に対して、前記周辺領域の形状を変えながら、所定回数繰り返す細胞画像解析方法。
【請求項３】
前記周辺領域が、前記二値化対象画素を中心として、ｎ回対称（ｎは偶数）であり、かつ、前記二値化対象画素を含む直線を対称軸とする線対称の形状である請求項１または２に記載の細胞画像解析方法。
【請求項４】
前記周辺領域の長軸が、前記細胞の直径の１〜４倍である請求項１から３のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項５】
前記周辺領域の短軸が、前記細胞の直径の０．５〜１倍である請求項４に記載の細胞画像解析方法。
【請求項６】
前記閾値が、前記周辺領域の各画素の輝度の平均値、中央値、またはこれらに所定の定数を加算したものである請求項１から５のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項７】
前記閾値が、下記式（１）で表される請求項１から５のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【数１】
2017150923.tif 000004
ここで、（ｘ，ｙ）は、周辺領域における画素の座標、ｈ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における重み係数、Ｉ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における輝度、αは所定の定数であり、Σｈ（ｘ，ｙ）＝１である。
【請求項８】
前記細胞領域特定工程は、前記動的二値化処理した細胞画像と、所定の閾値によって単純二値化処理した細胞画像とに基づき、前記細胞領域を特定する請求項１から７のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項９】
前記動的二値化処理した細胞画像と、前記単純二値化処理した細胞画像の少なくとも一方で前記細胞領域と特定された領域を細胞領域と特定する請求項８に記載の細胞画像解析方法。
【請求項１０】
前記動的二値化処理した細胞画像と、前記単純二値化処理した細胞画像の両方で前記細胞領域と特定された領域を細胞領域と特定する請求項８に記載の細胞画像解析方法。
【請求項１１】
前記細胞領域特定工程が、前記細胞画像の各画素について、所定値以上の画素値を所定値に置換することをさらに含む請求項１から１０のいずれかに記載の細胞画像解析方法。
【請求項１２】
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析装置であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得手段と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定手段と、
を備え、
前記細胞領域特定手段は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
各周辺領域における対象画素の画素値のいずれかが前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定する細胞画像解析装置。
【請求項１３】
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析装置であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得手段と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定手段と、
を備え、
前記細胞領域特定手段は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
前記周辺領域における対象画素の画素値が前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定することを、
前記細胞画像において、細胞領域と特定されなかった画素に対して、前記周辺領域の形状を変えながら、所定回数繰り返す細胞画像解析装置。
【請求項１４】
前記周辺領域が、前記二値化対象画素を中心として、ｎ回対称（ｎは偶数）であり、かつ、前記二値化対象画素を含む直線を対称軸とする線対称の形状である請求項１２または１３に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１５】
前記周辺領域の長軸が、前記細胞の直径の１〜４倍である請求項１２から１４のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１６】
前記周辺領域の短軸が、前記細胞の直径の０．５〜１倍である請求項１５に記載の細胞画像解析装置。
【請求項１７】
前記閾値が、前記周辺領域の各画素の輝度の平均値、中央値、またはこれらに所定の定数を加算したものである請求項１２から１６のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項１８】
前記閾値が、下記式（１）で表される請求項１２から１６のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【数２】
2017150923.tif 000005
ここで、（ｘ，ｙ）は、周辺領域における画素の座標、ｈ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における重み係数、Ｉ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における輝度、αは所定の定数であり、Σｈ（ｘ，ｙ）＝１である。
【請求項１９】
前記細胞領域特定手段は、前記動的二値化処理した細胞画像と、所定の閾値によって単純二値化処理した細胞画像とに基づき、前記細胞領域を特定する請求項１２から１８のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項２０】
前記動的二値化処理した細胞画像と、前記単純二値化処理した細胞画像の少なくとも一方で前記細胞領域と特定された領域を細胞領域と特定する請求項１９に記載の細胞画像解析装置。
【請求項２１】
前記動的二値化処理した細胞画像と、前記単純二値化処理した細胞画像の両方で前記細胞領域と特定された領域を細胞領域と特定する請求項１９に記載の細胞画像解析装置。
【請求項２２】
前記細胞領域特定工程が、前記細胞画像の各画素について、所定値以上の画素値を所定値に置換することをさらに含む請求項１２から２１のいずれかに記載の細胞画像解析装置。
【請求項２３】
請求項１から１１のいずれかに記載の細胞画像解析方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【請求項２４】
請求項２３に記載のプログラムを記録したコンピュータ可読記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数細胞腫を含む試料を撮影した細胞画像を解析し、目的の細胞を抽出する細胞画像解析方法および細胞画像解析装置に関し、特に、密集・凝集した複数の細胞群の細胞画像から、特定の細胞群の領域を特定する細胞画像解析方法および細胞画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）は、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。
【０００３】
しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１〜１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。
従来、このような希少細胞を複数細胞腫が混在した試料から識別するため、目的の希少細胞に特異的な染色を施した状態で複数細胞腫を含む試料を撮像し、得られた明視野像や蛍光画像などの細胞画像において特定の細胞腫のコントラストを上げるなどの画像処理をして、特異的な染色が施された希少細胞を検出している。
【０００４】
具体的には、このような細胞画像から、細胞の領域を抽出する際には、例えば、細胞の蛍光画像では、画素強度に対して一定の閾値を設けて二値化画像を生成し、細胞の領域を特定している。
【０００５】
しかしながら、細胞画像の背景の濃淡にムラがある場合や、目的の細胞群の画素強度のばらつきが大きい場合などには、１つの画像に対して１つの閾値では適切に二値化できない。
【０００６】
このため、細胞画像の各画素に対してそれぞれ閾値を設定する動的二値化を用いて細胞画像を二値化することも行われている。
動的二値化では、例えば、目的の画素に隣接または近接する画素の平均強度をもとに閾値を設定することで、背景強度の影響を小さくすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、細胞が密集し近接・隣接しているような場合や、同一の細胞群でも画素強度のばらつきが大きい場合などには、下記のような理由により、上述するような平均強度に基づく動的二値化を行っても、適切に細胞画像を二値化することができない。
【０００８】
上述するような場合、低強度の細胞の周囲を高強度の細胞に囲まれている状況では、低強度の細胞の画素強度は、周囲の細胞の平均画素強度よりも小さく、二値化の際に低輝度、すなわち、低強度の細胞が存在しないものとして扱われ、低強度の細胞の特定ができない。
【０００９】
本発明では、このような現状に鑑み、細胞が密集し近接・隣接しているような場合や、同一の細胞群でも画素強度のばらつきが大きい場合などにも、適切に細胞画像の二値化を行うことができ、細胞画像において細胞の特定を行うことができる細胞画像解析方法および細胞画像解析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前述したような従来技術における課題を解決するために発明されたものであって、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した細胞画像解析方法は、
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析方法であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得工程と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定工程と、
を備え、
前記細胞領域特定工程は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
各周辺領域における対象画素の画素値のいずれかが前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定する。
【００１１】
また、本発明の一側面を反映した細胞画像解析方法は、
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析方法であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得工程と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定工程と、
を備え、
前記細胞領域特定工程は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
前記周辺領域における対象画素の画素値が前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定することを、
前記細胞画像において、細胞領域と特定されなかった画素に対して、前記周辺領域の形状を変えながら、所定回数繰り返す。
【００１２】
また、本発明の一側面を反映した細胞画像解析装置は、
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析装置であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得手段と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定手段と、
を備え、
前記細胞領域特定手段は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
各周辺領域における対象画素の画素値のいずれかが前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定する。
【００１３】
また、本発明の一側面を反映した細胞画像解析装置は、
細胞を含む試料についての細胞画像において、細胞が存在する細胞領域を特定するための細胞画像解析装置であって、
特定の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する細胞画像取得手段と、
前記細胞画像に基づいて細胞領域を特定する細胞領域特定手段と、
を備え、
前記細胞領域特定手段は、
前記細胞画像の各二値化対象画素に対して、周辺領域を設定し、
前記周辺領域の各画素の輝度に基づいて、該周辺領域における閾値を算出し、
前記周辺領域における対象画素の画素値が前記閾値を超えたか否かに基づき、前記細胞画像を動的二値化処理し、
前記動的二値化処理した細胞画像に基づいて、細胞領域を特定することを、
前記細胞画像において、細胞領域と特定されなかった画素に対して、前記周辺領域の形状を変えながら、所定回数繰り返す。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞画像の二値化対象画素に対して、複数の周辺領域を設定し、各周辺領域における閾値に基づいて動的に二値化処理しているため、細胞が密集し近接・隣接しているような場合や、同一の細胞群でも画素強度のばらつきが大きい場合などにも、適切に細胞画像の二値化を行うことができ、細胞画像において細胞の特定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一態様における細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図２は、周辺領域の形状の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、周辺領域の形状の他の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、一例として、被検試料として白血球のみが含まれる試料を撮影して得られた細胞画像（Ａ）と、この細胞画像を二値化処理した画像（Ｂ）〜（Ｆ）とを示す画像である。
【図５】図５は、図４とは異なる被検試料について撮影した得られた細胞画像（Ａ）について、同様の処理を施して得られた画像である。
【図６】図６では、本実施例の細胞画像解析方法による二値化処理において、周辺領域のサイズによる二値化結果の比較を示す。
【図７】図７は、目的細胞を検出する流れを示す工程図である。
【図８】図８は、目的細胞検出工程において、中間画像の染色領域と第１細胞画像の染色領域が近接しているか否かを判断する方法を説明するための模式図である。
【図９】図９は、目的細胞検出工程において、中間画像の染色領域と第１細胞画像の染色領域が近接しているか否かを判断する別の方法を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。
図１は、本発明の一態様における細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。
【００１７】
図１に示すように、本実施例の細胞画像解析装置１０は、複数種類の細胞を含む試料（以下、「被検試料」と呼ぶ。）についての細胞画像を取得する細胞画像取得手段１２と、細胞画像取得手段１２で取得した細胞画像から後述するように細胞領域を特定する細胞領域特定手段１４とを備えている。
【００１８】
なお、細胞画像解析装置１０は、コンピュータなどによって構成することができ、細胞画像取得手段１２、細胞領域特定手段１４は、コンピュータにより実行されるソフトウェアであってもよい。
【００１９】
また、細胞画像取得手段１２は、任意の細胞を特異的に染色した細胞画像を取得するように構成されており、具体的には、事前に撮影されデータ化された細胞画像を細胞画像解析装置１０に取り込むためのソフトウェアのみによって構成することもできるし、図１に示すように、さらに、細胞画像を撮影するためのデジタルカメラなどの画像撮影装置１３も含む構成とすることもできる。
【００２０】
なお、本実施例において被検試料に含まれる細胞としては、「目的細胞」、「非目的細胞」、「残余細胞」が含まれるものとして説明する。
本明細書において、「目的細胞」とは、被検試料中から検出すべき任意の細胞、例えば、血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）などの希少細胞とすることができる。
【００２１】
また、「非目的細胞」とは、被検試料中に含まれる細胞のうち「目的細胞」以外の細胞であって、比較的、被検試料中の含有量が多い、例えば、白血球などの非希少細胞とすることができる。なお、「非目的細胞」には、複数種類の細胞が含まれていてもよい。
【００２２】
また、「残余細胞」とは、被検試料中に含まれる「目的細胞」でも「非目的細胞」でもない細胞を意味する。すなわち、通常であれば、目的細胞を特異的に染色する抗体にも、非目的細胞を特異的に染色する抗体にも染色されない細胞である。なお、本実施例では残余細胞が存在するものとして説明するが、残余細胞が存在しない場合もある。
【００２３】
このような、目的細胞、非目的細胞、残余細胞が含まれる被検試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液など、ヒトまたはその他の動物から採取された検体などが挙げられる。
【００２４】
また、細胞画像は、以下のようにして撮影することができる。
１．染色工程
まず、被検試料について、特定の細胞に対して特異的に染色を施す。
なお、目的細胞を特異的に染色する方法としては、検出対象となる細胞が有する抗原に結合する標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。
検出対象となる細胞が有する抗原と特異的な反応を示す抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＫ抗体、抗β-アクチン抗体、抗α-チューブリン抗体、抗β-チューブリン抗体、抗ビメンチン抗体などを用いることができる。
【００２５】
また、非目的細胞を特異的に染色する方法としては、細胞膜全域を染色するような標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。
細胞膜全域を染色するような抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体などを用いることができる。
【００２６】
なお、非目的細胞を特異的に染色する場合には、複数の染色剤によって染色を施し、細胞画像において、非目的細胞の輪郭が識別可能な程度に、非目的細胞全体を染色することが好ましい。
【００２７】
また、このような標識抗体としては、公知の蛍光色素によって標識された抗体や、色素によって標識された抗体などによって標識された抗体などを用いることができる。なお、蛍光色素を用いる場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素と、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素とを分離して測定できるように、それぞれ異なる励起波長、蛍光波長を有する蛍光色素を用いればよい。
【００２８】
また、細胞全てに対して染色を施す方法としては、細胞核を染色することで行うことができ、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、Hoechst系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）、Acridine Orange、ＤＡＭＯ、Ethidium Bromide（臭化エチジウム）、Ethidium Homodimer、Propidium Iodideなどを用いることができる。
【００２９】
このように染色を施しているため、細胞全てに対して染色を施す場合には、細胞それぞれについて、局所的に染色が行われることになる。
なお、このように被検試料に対して染色を施す前に、適切な前処理を行うことが好ましい。以下、被検試料として代表的な検体である血液を用いた場合の前処理方法について説明する。
【００３０】
・抗凝固処理
採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。
【００３１】
全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンIIIと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。
【００３２】
・密度勾配遠心処理
密度勾配遠心処理は、細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができ、特に血液中に多量に含まれている赤血球を除去して、ＣＴＣ等の目的細胞を含む白血球のみを細胞観察の対象とするために用いることができる。
【００３３】
密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう溶接できるものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などのショ糖溶液を用いることができる。
【００３４】
この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。
【００３５】
例えば、分離液の比重を好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」への赤血球の混入率を２〜６％またはそれ以下に抑えることができる。「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」を用いて細胞
観察を行うと、ＣＴＣ等の目的細胞が赤血球に紛れて検出し損ねる危険性が低下し、診断の精度を高めることができるため好ましい。
【００３６】
また、被検試料に含まれる細胞に対して必要に応じて、固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理、その他の前処理を行うこともできる。これらの前処理は、所期の効果が発揮される限り、任意の時点で、任意の順序で行うことができる。
【００３７】
例えば、密度勾配遠心処理で細胞画分を得た後、観察用基板に固相化する前に、細胞の固定化処理をし、観察用基板に固相化した後、浸透化処理およびブロッキング処理を同時に行う（つまり浸透化剤およびブロッキング剤の両方を含む溶液で細胞を処理する）ようにしてもよい。
【００３８】
なお、観察用基板に固相化する前に細胞を固定化する場合、固定化によっても細胞は観察用基板に吸着する能力を失っていないので、固相化の際には細胞の吸着（細胞と基板との物理的（分子間）相互作用）を利用することができる。
【００３９】
また、観察用基板に固相化した後に細胞を固定化する場合、すでに細胞が観察用基板に吸着していれば、その後に固定化しても吸着による固相化を保持することができる。
また、場合によっては、細胞に対する前処理を、血液等の検体から細胞画分を分離する前に行う（例えば血液検体を採取した直後に血液の抗凝固処理とともに細胞の固定化処理等を行い、その後密度勾配遠心処理を行って細胞画分を得る）ようにすることも可能である。
【００４０】
・固定化処理
固定化処理は、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するために行われる処理であり、本発明では、ＣＴＣ等の目的細胞の検出性を高めるとともに、抗原抗体解離工程で用いる酸等の解離剤が細胞または抗原に与えるダメージを抑えることが可能となる。
【００４１】
特に結合と解離を複数回繰り返して実験を行うような場合、解離剤のダメージが細胞に与える影響は格段に大きくなるため、通常であれば細胞劣化が大きくなり実験が継続出来ないこともあり得る。
【００４２】
しかし本工程のように固定化処理を行うことで細胞が形態や抗原性の保持力が高まり、複数回繰り返して実験を行うような場合であっても免疫染色性が劣化しにくくなるという効果をもたらす。
【００４３】
固定化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール等のアルデヒド類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；エタノール、メタノール等のアルコール類が挙げられる。このうち、ホルムアルデヒド等のアルデヒド類およびアセトン等のケトン類は、アルデヒド基およびケトン基が特定のアミノ酸残基と反応して共有結合を形成し、架橋剤として作用する固定化剤であり、タンパク質構造を安定化すると共に細胞の原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができるため、本発明における好ましい固定化剤である。
【００４４】
また、それ自体が固定化剤として直接作用するものではないが、加水分解等を受けることによって固定化剤を遊離する供与体、たとえばホルムアルデヒド供与体も固定化剤の一形態として用いることができる。これらの固定化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解した（あるいはホルマリンのようにもとから水溶液で市販されているものを希釈した）水溶液を固定化処理液として用いることができる。
【００４５】
固定化処理は、適切な濃度の固定化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。固定化処理液中の固定化剤の濃度は適宜調節することができるが、たとえばアルデヒド類の場合は０．１〜１０ｗ／ｗ％程度、アルコール類の場合は７０〜１００ｖ／ｖ％程度である。固定化処理液と細胞との接触時間（固定化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。
【００４６】
固定化処理は、染色工程前または工程中に実施することができ、１回目の染色工程前または工程中の１回だけであってもよいし、第Ｎ回の解離工程後かつ第（Ｎ＋１）回の染色工程前または工程中に繰り返し実施してもよい。
【００４７】
・浸透化処理
浸透化処理は、細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質が浸透しやすくするための処理であり、本発明では、細胞内（原形質）にある抗原に対して蛍光標識抗体を結合させやすくして免疫染色性を向上させるという効果をもたらす。
【００４８】
浸透化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、サポニン、ジギトニン、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、ＮＰ−４０などの界面活性剤（商品）が挙げられる。これらの浸透化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解させた水溶液を浸透化処理液として用いることができる。
【００４９】
浸透化処理は、適切な濃度の浸透化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。浸透化処理液中の浸透化剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば上記のような界面活性剤であれば、０．０１〜１．０ｖ／ｖ％程度である。浸透化処理液と細胞との接触時間（浸透化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。
【００５０】
・ブロッキング処理
ブロッキング剤は、細胞の目的抗原以外の部位が非特異的に染色されるのを防ぐために用いられる。細胞のブロッキング処理は、染色工程前あるいは染色工程中に実施すればよく、いずれか一方で実施しても、両方で実施してもよい。
【００５１】
ブロッキング剤を入れた細胞を固相化する場合は、上述したように観察用基板にマイクロチャンバー等を形成しておく（後述する細胞の固相化方法に関する構造的手法を用いる）必要がある。
【００５２】
また、細胞表面の観察用基板との吸着（相互作用）を起こしやすい部位を被覆することにより、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着してしまうことを防止し、所定の部位に細胞を収容されるようにするためにも用いられる。
【００５３】
ブロッキング剤としては様々なものが公知であるが、例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール等の親水性高分子、リン脂質、エチレンジアミン、アセトニトリル等の低分子化合物が挙げられる。これらのブロッキング剤をＰＢＳ等の適切な溶媒で希釈した水溶液をブロッキング処理液として用いることができる。
【００５４】
ブロッキング処理は、適切な濃度のブロッキング処理液を適切な時間、細胞あるいは観察用の基板に接触させることで行うことができる。ブロッキング処理液中のブロッキング剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば、０．０１〜２０ｗ／ｖ％程度である。ブロッキング処理液と細胞との接触時間（ブロッキング処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、５〜１２０分間程度である。
【００５５】
２．撮影工程
上述する染色工程において、３種類の染色が施された被検試料について画像撮影装置１３を用いて細胞画像の撮影を行う。
【００５６】
なお、蛍光色素による標識を行っている場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、細胞全てを標識する蛍光色素のそれぞれを励起する励起光を順次照射し、それぞれの蛍光色素から発光する蛍光に基づく細胞画像を撮影すればよい。
【００５７】
このような細胞画像を撮影する画像撮影装置１３としては、特に限定されるものではないが、コンピュータで実行されるソフトウェアにより取り扱うことが可能な画像データとして細胞画像を撮影する装置であることが好ましく、例えば、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどを用いたデジタルカメラとすることができる。
【００５８】
画像撮影装置１３により撮影された細胞画像の画像データは、細胞画像取得手段１２により細胞画像解析装置１０に読み込まれ、細胞領域特定手段１４において細胞画像の画像解析が行われる。
【００５９】
細胞領域特定手段１４では、以下のようにして、細胞画像から任意の細胞の領域を特定する。
３．細胞領域特定工程
細胞領域の特定は、細胞画像の各画素に対して、以下のように、動的に二値化処理することにより行われる。なお、本実施例における二値化処理では、閾値よりも小さい輝度の画素の値を０、閾値よりも大きい輝度の画素の値を１としている。
【００６０】
まず、細胞画像の任意の対象画素（二値化対象画素）に対して、複数の異なる形状を有する周辺領域を設定する。
本明細書において、「周辺領域」とは、任意の対象画素についての閾値を決定する際に用いる該対象画素の周辺の領域のことを意味する。すなわち、従来の動的二値化であれば、閾値を決定するための対象画素に隣接または近接する画素群の領域を意味する。
【００６１】
周辺領域の形状としては、複数の周辺領域がそれぞれ異なる形状であれば、特に限定されるものではないが、以下のように、複数の周辺領域を設定することができる。
第１の周辺領域：任意の対象画素を中心として、４回対称であり、かつ、対象画素を含む直線を対称軸とする線対称の領域
第２の周辺領域：任意の対象画素を中心として、２回対称であり、かつ、４回対称ではなく、かつ、対象画素を含む直線を対称軸とする線対称の領域
なお、本明細書において、ｎ回対称とは、中心軸の周りを（３６０／ｎ）°回転させると自らと重なる形状のことをいう。
【００６２】
具体的には、第１の周辺領域１７としては、図２（ａ）に示すように、画素１５の配列に対して各辺が平行となる正方形、図２（ｂ）に示すように、画素１５の配列に対して各対角線が平行となる略正方形、図２（ｃ）に示す略円形などが挙げられる。なお、符号１６は、二値化処理を施す任意の対象画素である。
【００６３】
また、第２の周辺領域１８としては、図３（ａ）に示すように、画素１５の配列に対して各辺が平行となる長方形、図３（ｂ）に示すように、画素１５の配列に対して各対角線が平行となる略菱形、図３（ｃ）に示す長方形、図３（ｄ）に示す略楕円形などが挙げられる。
【００６４】
また、図示しないが、第３の周辺領域として、例えば、第２の周辺領域を±９０°回転させた形状の領域を設定することもでき、さらには、４つ以上の周辺領域を設定することも可能である。また、周辺領域としては、任意の対象画素を中心として、６回以上の対称性を有するものであってもよい。すなわち、周辺領域は、任意の対象画素を中心として、ｎ回対象（ｎは偶数）であり、かつ、対象画素を含む直線を対称軸とする線対称の形状とすることができる。
【００６５】
また、各周辺領域の大きさは、同程度であることが好ましく、例えば、第１の周辺領域１７がｍ×ｍピクセルの領域である場合、第２の周辺領域１８は、ｎ×ｍピクセル（ｎ＜ｍ）の領域、第３の周辺領域は、ｍ×ｎピクセル（ｎ＜ｍ）の領域のように設定することが好ましい。
【００６６】
このように設定した複数の周辺領域からそれぞれの閾値を決定するためには、各周辺領域の輝度の代表値を用いることができる。ここで、輝度の代表値としては、例えば、平均値や中央値、またはこれらに所定の定数を加算したものを用いることができ、より一般的には、下記式（１）で表される値を用いることができる。
【００６７】
【数１】
2017150923.tif 000003
【００６８】
ここで、（ｘ，ｙ）は、周辺領域における画素の座標、ｈ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における重み係数、Ｉ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）における輝度、αは所定の定数である。
【００６９】
ただし、Σｈ（ｘ，ｙ）＝１であり、周辺領域外においてはｈ＝０である。例えば、周辺領域が１１×１１ピクセルの正方形である場合、周辺領域における各画素の重み係数ｈ（ｘ，ｙ）＝１／１２１とすれば、閾値として周辺領域の輝度の平均値が求められる。
【００７０】
このようにして得られた各周辺領域それぞれの閾値を用いて、各周辺領域において対象画素の二値化を行い、すべての周辺領域における結果が０の場合には、対象画素の画素値を０とし、いずれかの周辺領域における結果が１の場合には、対象画素の画素値を１とする。
【００７１】
なお、本実施例では、上述するように、周辺領域から対象画素の閾値を決定しているが、これに限定されるものではなく、既知の様々な手法を適宜用いることもできる。
このような二値化処理を細胞画像のすべての画素に対して行った結果、画素値が１、すなわち、画像において白く表現された箇所が細胞領域となる。
【００７２】
本実施例のような細胞画像解析方法を用いることによって、単純二値化や従来の動的二値化を施した場合には、適切に細胞領域を特定することが困難な細胞が密集し近接・隣接していたり、同一の細胞群でも画素強度のばらつきが大きかったりする細胞画像であっても、適切に細胞領域を特定することができる。
【００７３】
なお、細胞領域特定工程においては、上述する二値化処理だけではなく、後述するように、複数の二値化処理や他の画像処理を組み合わせて施すことも可能である。
図４では、一例として、被検試料として白血球のみが含まれる試料を撮影して得られた細胞画像（Ａ）と、この細胞画像を二値化処理した画像（Ｂ）〜（Ｆ）とを示す。
【００７４】
なお、細胞画像（Ａ）は、基板上に並べた白血球を抗ＣＤ４５抗体で標識した蛍光色素で染色し、５倍の対物レンズを用いて撮影した画像の一部をトリミングしたものである。この細胞画像（Ａ）における最大輝度は０．４５であった。また、細胞画像（Ａ）について、目視にて細胞数を計数したところ、６６個を識別することができた。
【００７５】
画像（Ｂ）〜（Ｄ）は、細胞画像（Ａ）に対して従来の二値化処理を施した画像であって、画像（Ｂ）は、大津の二値化法を用いて閾値を設定して単純二値化処理した画像、画像（Ｃ）は、画像（Ｂ）における閾値よりも小さい閾値を設定して単純二値化処理した画像、画像（Ｄ）は、２１×２１ピクセルの周辺領域の平均輝度値＋０．００３を閾値として動的二値化処理した画像である。
【００７６】
画像（Ｂ）のように、大津の二値化法を用いて閾値を設定し単純二値化を施した場合には、低強度の細胞を検出できないことがある。なお、画像（Ｂ）について、目視にて細胞数を計数したところ、４４個を識別することができた。
【００７７】
一方で、このような低強度の細胞を検出しようと、閾値を小さく設定（本実施例では、閾値を０．０３５と設定）した場合には、画像（Ｃ）のように、細胞間の隙間、すなわち、細胞が存在しない箇所まで細胞領域と特定してしまうことになる。なお、画像（Ｃ）について、目視にて細胞数を計数することは困難である。
【００７８】
また、画像（Ｄ）のように、従来の動的二値化処理を施した場合には、画像（Ｂ）と比べて、低強度の細胞も検出することができるが、細胞画像（Ａ）のように、低強度の細胞と高強度の細胞が混在する場合には、低強度の細胞の周囲に高強度の細胞が存在することが少なくなく、動的二値化であっても、検出できない低強度の細胞が存在する。なお、画像（Ｄ）について、目視にて細胞数を計数したところ、４６個を識別することができた。
【００７９】
画像（Ｅ）は、細胞画像（Ａ）に対して、本実施例の細胞画像解析方法による動的二値化処理を施した画像であり、２１×２１ピクセル、２１×７ピクセル、７×２１ピクセルの３つの周辺領域を用いて上述するように二値化処理している。なお、各周辺領域において、周辺領域の平均輝度値＋０．００３を閾値として設定している。
【００８０】
このように、本実施例の細胞画像解析方法を用いることにより、従来の単純二値化、動的二値化では検出できなかった低強度の細胞も検出することができる。なお、画像（Ｅ）について、目視にて細胞数を計数したところ、５３個を識別することができた。
【００８１】
画像（Ｆ）は、細胞画像（Ａ）に対して、所定値以上の画素値を所定値に置換した後に本実施例の細胞画像解析方法による動的二値化処理を施した結果と、閾値を０．０２として単純二値化処理を施した結果とに基づいて生成した画像である。
【００８２】
具体的には、細胞画像（Ａ）において、画素値が０．０２５以上の画素を０．０２５で置換した後、画像（Ｅ）と同様に二値化処理した動的二値化画像を得る。次いで、閾値を高めに設定として単純二値化処理を施した単純二値化画像を得る。
【００８３】
そして、動的二値化画像と単純二値化画像とを画素ごとに比較し、両方とも画素値が０であれば、対象画素の画素値を０とし、いずれか一方でも値が１であれば、対象画素の画素値を１として生成した画像が画像（Ｆ）である。
【００８４】
このように、複数の二値化処理や他の画像処理を組み合わせて施すことによって、画像（Ｆ）のように、低強度の細胞の多くを検出することができる。なお、画像（Ｆ）について、目視にて細胞数を計数したところ、６３個を識別することができた。
【００８５】
なお、このような画像処理の組合せとしては、上述するように、本実施例の細胞画像解析方法による動的二値化処理と既知の画像処理とを適宜組み合わせることができるが、例えば、本実施例の細胞画像解析方法による動的二値化処理を施した結果と、閾値を低めに設定して単純二値化処理を施した結果とを画素ごとに比較し、両方とも画素値が１であれば、対象画素の画素値を１とし、いずれか一方でも値が０であれば、対象画素の画素値を０として細胞領域の特定を行うこともできる。
【００８６】
また、細胞画像の各画素に対して、第１の周辺領域により二値化処理を施し、この結果、細胞領域と特定されなかった、すなわち、画素値が０とされた各画素についてのみ、第２の周辺領域を用いて二値化処理を施すようにしてもよい。
【００８７】
このように、細胞画像において、細胞領域と特定されなかった画素に対して、周辺領域の形状を変えながら、逐次的に二値化処理を所定回数繰り返すことによって、コンピュータを用いて細胞領域を特定するのに要する時間を短縮することができる。なお、繰り返す回数は適宜設定することができる。
【００８８】
図５は、図４とは異なる被検試料について撮影した得られた細胞画像（Ａ）について、同様の処理を施して得られた画像である。
図４の場合と同様に、従来の二値化処理を施した画像と比べて、本実施例の細胞画像解析方法による二値化処理を施した画像では、より多くの細胞を検出することができた。
【００８９】
図６では、本実施例の細胞画像解析方法による二値化処理において、周辺領域のサイズによる二値化結果の比較を示す。
細胞画像（Ａ）は、基板上に並べた白血球を抗ＣＤ４５抗体で標識した蛍光色素で染色し、５倍の対物レンズで撮影した画像の一部をトリミングしたものである。撮影には、ＣＣＤイメージセンサを用いたデジタルカメラを用い、ＣＣＤの画素サイズは、６．４５μｍ×６．４５μｍである。また、細胞画像（Ａ）における画素ピッチは１．３μｍであり、白血球の直径は、約９ピクセルである。
【００９０】
この細胞画像（Ａ）に対して、それぞれ周辺領域のサイズを、（Ｂ）７×７ピクセル、（Ｃ）９×９ピクセル、（Ｄ）１９×１９ピクセル、（Ｅ）２９×２９ピクセル、（Ｆ）３６×３６ピクセル、（Ｇ）６１×６１ピクセルとして、動的二値化処理を行った。
【００９１】
（Ｂ）のように、周辺領域のサイズが、細胞（白血球）の直径よりも小さい場合には、細胞領域の中心部が黒く、すなわち、細胞領域ではないことになってしまい、正確に細胞領域の特定ができない。
【００９２】
これは、周辺領域のサイズが細胞直径よりも小さいために、同一細胞内での輝度ムラを反映してしまった結果である。
なお、（Ｃ）のように、周辺領域のサイズを細胞直径と同程度にすることで、細胞領域の特定を概ね正確に行うことができる。
【００９３】
一方で、（Ｇ）のように、周辺領域のサイズが、細胞の直径よりも大幅に大きい場合には、細胞が存在しない箇所が白く、すなわち、細胞領域であることになってしまい、正確に細胞領域の特定ができない。
【００９４】
これは、周辺領域のサイズが細胞直径に対して大きすぎることから、周辺領域の中で細胞がしめる割合が小さくなってしまった結果、周辺領域内での輝度平均値が小さくなり、低い閾値で二値化処理が行われるため、背景に比べて輝度が高くなっている細胞間の隙間の領域までも細胞領域と特定してしまうことになる。
【００９５】
なお、（Ｆ）のように、周辺領域のサイズが細胞直径の４倍程度であれば、細胞領域の特定を概ね正確に行うことができる。
以上のことより、周辺領域のサイズとしては、長軸が細胞直径の１〜４倍であることが好ましい。
【００９６】
なお、本明細書において、「長軸」とは、例えば、正方形の１辺、長方形の長辺、円形の直径、楕円形の長軸、菱形の対角線などを含んだ意味である。
また、周辺領域のサイズとして、短軸は細胞直径の０．５〜１倍であることが好ましい。
【００９７】
なお、本明細書において、「短軸」とは、例えば、長方形の短辺、楕円形の短軸などを含んだ意味である。
なお、本実施例では、細胞画像（Ａ）の画素ピッチを１．３μｍと、細胞直径の１／９程度にしているが、細胞が画像上でその形状を認識可能な程度の解像度が得られればよく、画素ピッチは細胞直径の１／５以下であることが好ましい。
【００９８】
以下、本実施例の細胞画像解析方法を用いて、血液細胞の細胞画像から、血中循環癌細胞（ＣＴＣ）を検出する流れを説明する。なお、血液細胞には、目的細胞としてＣＴＣ、非目的細胞として白血球が含まれている。
【００９９】
このように、目的細胞と非目的細胞が混在する被検試料から、目的細胞を検出するためには、一般的に、以下の３種類の染色を施した細胞画像を用いる。
（１）目的細胞（ＣＴＣ）に特異的に反応する抗体を用いた染色１
（２）非目的細胞（白血球）に特異的に反応する抗体を用いた染色２
（３）すべての細胞（目的細胞、非目的細胞、残余細胞）に施す染色３
染色１を施した細胞画像である第１細胞画像２２と、染色２を施した細胞画像である第２細胞画像２４と、染色３を施した細胞画像である第３細胞画像２６とに基づいて、被検試料中の目的細胞（ＣＴＣ）を検出する。
【０１００】
図７は、目的細胞を検出する流れを示す工程図である。
まず、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４の重畳部分を除去することで中間画像２８を生成する。
【０１０１】
具体的には、第２細胞画像２４を本実施例の細胞画像解析方法による二値化処理をし、第３細胞画像２６を本実施例の細胞画像解析方法による二値化若しくは従来の単純二値化や動的二値化によって二値化処理し、それぞれ二値化処理された第３細胞画像２６から第２細胞画像２４を減算処理すればよい。
【０１０２】
なお、本明細書において「減算処理」とは、画像処理における減算を意味し、一方の細胞画像の画素の値から、他方の細胞画像の同じ位置の画素の値を引くことを全ての位置の画素において行うことにより求めることができる。なお、画素の値は通常、最低値を０とし、減算処理の結果、画素の値が負となった場合には、０とすることが好ましい。
【０１０３】
次いで、中間画像２８と第１細胞画像２２とを比較することによって、目的細胞を検出する。
具体的には、本実施例の細胞画像解析方法により二値化若しくは従来の単純二値化や動的二値化によって第１細胞画像２２を二値化処理した後、以下のようにして、中間画像２８の染色領域２９（目的細胞と残余細胞の一部が染色された領域）と、第１細胞画像２２の染色領域２３（目的細胞、非目的細胞、細胞でない異物の一部が染色された領域）とを比較し、両方の染色領域が重畳または近接する領域を目的細胞として検出している。なお、検出画像において白く表現された領域を含む細胞が、目的細胞（ＣＴＣ）の領域と判断することができる。
【０１０４】
両方の染色領域が近接しているか否かの判定は、例えば、以下のように行うことができる。
中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図８に示すように、両方の染色領域の各画素同士の距離の最小値ｔを算出し、この最小値ｔを中間画像２８の染色領域２９と第１細胞画像２２の染色領域２３との最短距離とする。この最短距離が所定の近接判定値ｊ以下であれば近接していると判断することができる。
【０１０５】
なお、近接判定値ｊは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、例えば、目的細胞の平均的な大きさが白血球と同等と考えられる場合には、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を７μｍとすることが望ましい。また、白血球の半径が１５μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を１５μｍとすることが望ましい。これは白血球などの半径の範囲にお互いの細胞が位置していれば、細胞同士が上下方向に重複していない限り１つの細胞であると判断できるからである。
【０１０６】
また、中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図９に示すように、両方の染色領域を既知の画像処理アルゴリズム（例えば、最近傍法、バイリニア補間法、バイキュービック補間法、Lanczos補間法等）に基づいて所定の膨張値ｄだけ膨張させ、膨張後の染色領域２９ａ，２３ａが重畳する場合に近接していると判断することもできる。
【０１０７】
なお、膨張値ｄは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、近接判定値ｊの半分よりやや大きい値とすることができる。例えば、目的細胞の大きさが白血球と同等と想定される場合、染色対象同士が白血球の直径の範囲内に存在すれば同一の可能性があるため、白血球の直径が１５μｍ程度であると想定する場合には、膨張値を８μｍとすることができる。
【０１０８】
また、染色対象同士が白血球の半径の範囲内に存在すれば上記以上に同一の可能性が高いと判断することができ、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、膨張値ｄを４μｍとすることができる。
【０１０９】
また、上述する近接判定を組み合わせて行うことにより、より正確に、両方の染色領域が近接しているか否かを判定することができる。
また、一方の染色領域の中心（重心）位置と、他方の染色領域の中心（重心）位置との距離が、所定の近接判定値よりも小さい場合に、両染色領域が近接していると判定するようにしてもよい。
【０１１０】
以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、上記実施例では、目的細胞としてＣＴＣ等の希少細胞を検出するようにしているが、目的細胞としては希少細胞に限定されるわけではなく、任意の細胞を検出するために用いることができるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【０１１１】
また、上述する細胞画像解析方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム及び該プログラムを記録した、例えば、磁気テープ（デジタルデータストレージ（ＤＳＳ）など）、磁気ディスク（ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）など）、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、光磁気ディスク（ＭＯ）、フラッシュメモリ（ＳＳＤ（Solid State Drive）、メモリーカード、ＵＳＢメモリなど）などのコンピュータ可読記録媒体も本発明の一態様として含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、多数の非目的細胞の中から極少数の目的細胞を検出する場合に特に有効である。例えば、血液細胞から血中循環癌細胞（ＣＴＣ）を検出する場合には、目的細胞であるＣＴＣを非目的細胞である多数の白血球から分離する必要がある。
【０１１３】
ＣＴＣを検出する方法として、細胞展開用基板上に白血球とＣＴＣの懸濁液を流し、基板上に細胞を並べ、適切な蛍光染色をして蛍光画像を取得し、蛍光画像中のＣＴＣ数を計数する。
【０１１４】
この際に、ＣＴＣに特異的な染色１と、白血球に特異的な染色２の２通りの染色をして、染色１で染められて、かつ、染色２で染められていない細胞をＣＴＣと判断する。例えば、染色１には抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体を、染色２には抗ＣＤ４５抗体を使用する。染色１、染色２ともに非特異染色される細胞があるため、２種類の特異的な染色を組み合わせてＣＴＣを特定する。
【０１１５】
この際、白血球のＣＤ４５強度は同一検体においてもバラツキがあり、明るく光る白血球と暗く光る白血球が混在する。また、細胞展開用基板に多数の細胞を高密度に展開するため、各々の細胞は近接した状態にある。
【０１１６】
ここで、抗ＣＤ４５抗体で染色した血液細胞の蛍光画像から白血球を識別する際に、ＣＤ４５強度の高い白血球に挟まれたＣＤ４５強度の低い白血球を検出し逃すと、ＣＴＣの過検出につながる。
【０１１７】
逆に、ＣＤ４５強度の高い白血球に隣接するＣＴＣがある場合、白血球の蛍光がＣＴＣの領域にも広がりを持って検出されることがあり、これは、ＣＴＣの検出ロスにつながる。したがって、抗ＣＤ４５抗体で染色した血液細胞の蛍光画像から、白血球を過不足なく正確に特定することが重要である。
【符号の説明】
【０１１８】
１０      細胞画像解析装置
１２      細胞画像取得手段
１３      画像撮影装置
１４      細胞領域特定手段
１５      画素
１６      二値化対象画素
１７      第１の周辺領域
１８      第２の周辺領域
２２      第１細胞画像
２３      染色領域
２３ａ    膨張後の染色領域
２４      第２細胞画像
２６      第３細胞画像
２８      中間画像
２９      染色領域
２９ａ    膨張後の染色領域
【図１】
2017150923.tif 000006
【図２】
2017150923.tif 000007
【図３】
2017150923.tif 000008
【図４】
2017150923.tif 000009
【図５】
2017150923.tif 000010
【図６】
2017150923.tif 000011
【図７】
2017150923.tif 000012
【図８】
2017150923.tif 000013
【図９】
2017150923.tif 000014