(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫疾患の進行を防止、疾患の症状を軽減させるため、血漿中に含まれる自己抗体及び免疫複合体を吸着剤によって吸着・除去する方法にあって、ＩｇＧ型抗体と高い親和性で相互作用するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材の提供。【解決手段】水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが特定のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材９、及び液体を流入させる入口ポート５と、前記液体を流出させる出口ポート７と、を有する容器と、前記容器に充填されたＩｇＧ型抗体吸着材とを備えるＩｇＧ型抗体吸着器１、並びにＩｇＧ型抗体吸着器１に流入する液体が血液、血漿及び血清から選択される体液である、体液浄化デバイス１。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが下記配列番号１のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材：
ＦＮＭＱＣＱＡＥＦＹＥＩＬＨＥＸ16Ｘ17ＡＸ19Ｘ20ＧＧＧＧＧＸ26ＧＫＸ29Ｘ30ＡＸ32Ｘ33ＡＫＩＡＡＬＲＤＡＣ  （配列番号：１）
（配列番号１中、
Ｘ16は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｘ17は、Ｒ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｘ19は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、
Ｘ20は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ26は、Ｇ、Ｅ又は欠失しており、
Ｘ29は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、
Ｘ30は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ32は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、
Ｘ33は、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである）。
【請求項２】
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖ、Ｌ又はＭであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴである、
請求項１に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項３】
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖであり、
Ｘ20が、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ26が、Ｇであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ30が、Ａ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎである、
請求項１又は２に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項４】
前記ペプチドのＩｇＧに対する解離定数が３０００ｎＭ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項５】
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号２〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
【請求項６】
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号４７〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
【請求項７】
前記ペプチドがヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項８】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステインと、同アミノ酸配列中のＣ末端のシステインがジスルフィド結合した、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項９】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインがＱで置換された、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１１】
前記ペプチドがリンカーを介して前記水不溶性担体に担持された、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１２】
前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、１５万〜１０００万の排除限界分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１３】
液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
前記容器に充填された請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、
を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する親和性を有するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、及び臨床検査学の飛躍的な進歩によって、疾患の原因又は疾患の進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、血液中に存在するＩｇＧを本体とする自己抗体及び免疫複合体は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の原因及び病態の進行と密接な関係を持っていると考えられている。
【０００３】
そこで、血液及び血漿等の体液成分から、上記自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着除去することで、上述の疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめ、更には疾患の治癒を早めることが期待されている。体液中の自己抗体及び免疫複合体を除去する技術としては、全血を血球成分と血漿成分とに分離し、血漿中に含まれる上記自己抗体及び免疫複合体を吸着材によって吸着し、除去する方法がある。
【０００４】
従来、このような目的に使用する吸着材としては、水不溶性担体にリガンドとして疎水性アミノ酸であるトリプトファンを固定化した吸着材が知られている（例えば特許文献１）。さらにＩｇＧ型抗体と特異的に相互作用することが知られているプロテインＡ及び抗ヒト免疫グロブリン抗体等の生物由来のＩｇＧ型抗体結合性物質、所謂、生物学的リガンドを、水不溶性担体に固定化した吸着材が知られている（例えば非特許文献１）。例えば、生物学的リガンドの一例であるプロテインＡをシリカマトリックスに結合させた、ＩｇＧ及びＩｇＧ複合体除去のための免疫吸着材が知られている（例えば特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭６３−０５３９７１号公報
【特許文献２】特公平３−０６５１９０号公報
【特許文献３】特開２０１５−７４６２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】未来材料、第８巻、１１号（２００８）、ｐｐ２８−３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
トリプトファンをリガンドとして水不溶性担体に固定化させた吸着材は、治療効果が認められる一方で、ＩｇＧ型抗体を吸着する容量が十分に大きいとはいえない。さらに、上記吸着材は病因物質ではないフィブリノーゲン（Ｆｂｇ）も吸着除去し、選択吸着性が悪いという欠点がある。
【０００８】
一方で、生物学的リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、トリプトファンをリガンドとした吸着材が有する上述のような問題を解決可能であると考えられる。しかしながら、これらの生物学的リガンドは一般的に原料の確保が困難で製品コストがかかるという不利な点がある。さらに、上記吸着材を体液に接触させて使用する際、上記生物学的リガンドが体液中に溶出して重大な副作用を生じる危険がある。加えて、上記生物学的リガンドの製造工程で混入する可能性がある未知のウィルス又は病原菌に由来する感染のリスクがあるといった難点も含んでいる。
【０００９】
これまで、本発明者らはヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有し、標的のタンパク質と高い親和性で相互作用するペプチドを見出している。このようなペプチドとして、特許文献３には、ＩｇＧ型抗体と相互作用するペプチド及びこのペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材が開示されている。
【００１０】
しかしながら、ＩｇＧ型抗体とさらに親和性の高いＩｇＧ型抗体吸着材が求められている。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＩｇＧ型抗体と高い親和性で相互作用するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、ＩｇＧ型抗体と選択的に結合することを見出した。さらに、本発明者らは、上記ペプチドをＩｇＧ型抗体を結合させるためのリガンドとし、上記リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材が、体液を浄化させるための治療器（体液浄化用治療器、体液浄化デバイス）として、血液、血漿及び血清等の体液中から、自己抗体及び免疫複合体を構成するＩｇＧ型抗体を驚くほど高い吸着容量かつ、高選択的に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが下記配列番号１のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材：
ＦＮＭＱＣＱＡＥＦＹＥＩＬＨＥＸ16Ｘ17ＡＸ19Ｘ20ＧＧＧＧＸ26ＧＧＫＸ29Ｘ30ＡＸ32Ｘ33ＡＫＩＡＡＬＲＤＡＣ  （配列番号：１）
（配列番号１中、
Ｘ16は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｘ17は、Ｒ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｘ19は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、
Ｘ20は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ26は、Ｇ、Ｅ又は欠失しており、
Ｘ29は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、
Ｘ30は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ32は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、
Ｘ33は、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである）。
［２］
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖ、Ｌ又はＭであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴである、［１］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［３］
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖであり、
Ｘ20が、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ26が、Ｇであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ30が、Ａ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎである、［１］又は［２］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［４］
前記ペプチドのＩｇＧに対する解離定数が３０００ｎＭ以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［５］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号２〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
［６］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号４７〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
［７］
前記ペプチドがヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［８］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステインと、同アミノ酸配列中のＣ末端のシステインがジスルフィド結合した、［１］〜［７］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［９］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１０］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインがＱで置換された、［１］〜［７］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１１］
前記ペプチドがリンカーを介して前記水不溶性担体に担持された、［１］〜［１０］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１２］
前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、１５万〜１０００万の排除限界分子量を有する、［１］〜［１１］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１３］
液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
前記容器に充填された［１］〜［１２］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、
を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
［１４］
［１３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、ＩｇＧと高い親和性を有するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材であり、ＩｇＧ型抗体を高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能である。
【００１５】
さらに、上記ペプチドは体液中でも安定であるため、本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、血漿及び血清等の体液から高い吸着容量かつ、高い選択性でＩｇＧ型抗体を吸着させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。
【図２】図２はＩｇＧ結合性ペプチドライブラリーのスクリーニングを示す図であって、「Round 1」は第１ラウンド後の結果を、「Round 2」は第２ラウンド後の結果を、「Round 3」は第３ラウンド後の結果を、「FK60」は参考となるＩｇＧ結合性ペプチド（ＦＫ６０）の結果を示す。
【図３】図３は蛍光プレートリーダーによる９６クローンのＩｇＧ結合性ペプチドのＩｇＧ結合活性を示す図である。
【図４】図４は、５種のＩｇＧ結合性ペプチドのＣＤスペクトルである。
【図５】実施例２並びに比較例１及び２において製造した各担体における各種タンパク質の吸着率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
【００１８】
本実施形態における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材は、ＩｇＧ型抗体を吸着する。本実施形態における「ＩｇＧ型抗体」とは、ＩｇＧクラスと同様のＦｃ領域を有するタンパク質であれば、タンパク質分子内のＦｃ領域以外の領域が変性、及び／又は欠損したタンパク質であってもよい。
【００１９】
本明細書においては、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載し、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）方向へ左から右へ記載する。
【００２０】
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、配列番号１〜５１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドをリガンドとして、水不溶性担体に担持させたものである。一態様において、上記ペプチドは配列番号４７〜５１に記載のアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
【００２１】
上記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列：
ＦＮＭＱＣＱＡＥＦＹＥＩＬＨＥＸ16Ｘ17ＡＸ19Ｘ20ＧＧＧＧＧＸ26ＧＫＸ29Ｘ30ＡＸ32Ｘ33ＡＫＩＡＡＬＲＤＡＣ  （配列番号：１）
を有する場合、
Ｘ16は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、好ましくはＬ又はＭであり、
Ｘ17は、Ｒ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、好ましくはＲ又はＫであり、
Ｘ19は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、好ましくはＶ、Ｌ又はＭであり、より好ましくはＶであり、
Ｘ20は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＧ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ26は、Ｇ、Ｅ又は欠失しており、好ましくはＧであり、
Ｘ29は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ30は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＡ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｘ32は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、好ましくはＬ又はＦであり、
Ｘ33は、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧであり、好ましくはＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴであり、より好ましくはＮである。
【００２２】
本実施形態において、上記ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチドが所望のＩｇＧ親和性有する限り、天然アミノ酸であっても、天然アミノ酸の誘導体や非天然アミノ酸であってもよい。一態様において、好ましくは、上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然アミノ酸である。
【００２３】
天然アミノ酸の誘導体としては、例えば、ヒドロキシル基が導入されたアミノ酸であるヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン等、アミノ基が導入されたアミノ酸であるジアミノプロピオン酸等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては：主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸など；側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するホモアミノ酸（ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）など；が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
上記ペプチドは、所望のＩｇＧ親和性有する限り、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加又は欠損、置換されたペプチドでも有り得る。
【００２５】
一態様において、上記ペプチドは、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及びＣ末端のシステインのいずれか又は両方が任意のアミノ酸（例えば、荷電を有さないアミノ酸、好ましくはＱ）で置換されたペプチドであり得る。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと構造が類似し、Ｎ末端から５番目及びＣ末端にシステインを有するペプチドにおいて、５番目のシステインを同じく荷電を有さないグルタミンに置換しても、ＩｇＧに対する解離定数に大きな影響がなかったことを確認している。
一態様において、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目及びＣ末端の２つのシステインは、相互に結合して環状ペプチドを形成するアミノ酸で置換されていてもよい。
【００２６】
上記ペプチドは、各種動物のＩｇＧ、特にヒトのＩｇＧに対して強い結合性を示す。一態様において、ＩｇＧに対する結合性は、ＩｇＧに対する解離定数（ＫD）により評価することができる。解離定数の算出方法は当業者に公知であり、例えば後述の実施例に記載の方法により、水不溶性担体に担持させる前のペプチドを用いて算出することができる。好ましい態様において、上記ペプチドは、ＩｇＧ（好ましくは、ヒトＩｇＧ）に対する解離定数（ＫD）が３０００ｎＭ以下であり、好ましくは１０００ｎＭ以下であり、より好ましくは５００ｎＭ以下であり、さらに好ましくは１００ｎＭ以下であり、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下であり、特に好ましくは１５ｎＭ以下である。
【００２７】
上記ペプチドは、配列番号１〜５１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有しているかぎり特に限定されないが、一態様において、好ましくは、配列番号１〜５１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００２８】
上記ペプチドの全長は、アミノ酸残基で３８〜２００残基であることが好ましく、アミノ酸残基で３８〜１００残基であることがより好ましい。
【００２９】
上記ペプチドは、非環状であってもよく、環状であってもよい。一態様において、上記ペプチドは好ましくは環状ペプチドである。
【００３０】
非環状のペプチドは、当該技術において、それ自体公知のペプチド合成法に従って合成することができる。例えばＦｍｏｃ固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法等があげられる。操作が簡便である点から、ペプチド合成方法は固相合成法であることが好ましい。また、非環状ペプチドは、遺伝子工学的手法を用いて製造することも可能である。例えば、上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターによって適切な宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌）を形質転換する。そして、上記宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養することによって、培養物からペプチドを得ることができる。
【００３１】
環状ペプチドは、非環状ペプチドを得た後、これを公知の手法で環化して得ることができる。ペプチドの環化は、例えば、アミノ酸配列中の２つのシステイン間に、公知の手法によってジスルフィド結合を形成することにより行うことができる。また、公知の手法によって、分子内でチオエステルやチオエーテル結合を形成することによって行うこともできる。さらに、例えば高度希釈法など公知の手法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させることによっても行うこともできる。
【００３２】
好ましい態様において、上記ペプチドは、Ｎ末端側の１０前後のアミノ酸残基及びＣ末端側の１０前後のアミノ酸残基がそれぞれα−ヘリックスを形成し、この２つのα−へリックスが７つのグリシン残基を含むループで結合したヘリックス−ループ−ヘリックス構造（ＨＬＨ構造）を有する。理論に束縛されるものではないが、このＨＬＨ構造を有するペプチドにおいて、２本のα−ヘリックスは、内側に存在するロイシン側鎖の疎水相互作用等により安定なＨＬＨ構造を形成する。さらに、Ｎ末端およびＣ末端のシステインが分子内ジスルフィド架橋することでさらに立体構造の安定性が向上する。
【００３３】
上記ペプチドを水不溶性担体に担持することによって、本実施形態におけるＩｇＧ型抗体吸着材として利用し得る。
【００３４】
水不溶性担体とは、水に溶けない担体を意味する。上記ペプチドリガンドを担持させる際に使用する水不溶性担体としては、親水基の表面を有し、かつペプチドリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記水不溶性担体は吸着に使用できる有効表面積が広い多孔性であるもの（多孔質体）が好ましい。
【００３５】
上記水不溶性担体は、粒子状、繊維状、シート状、中空糸状等の任意の公知の形状のものを用いることができる。ペプチドリガンドの保持量又は吸着材としての取扱い性を考慮すると、水不溶性担体は粒子状のものが好ましい。
【００３６】
粒子状担体の平均粒径は、２５μ〜２５００μｍであることが好ましい。担体の比表面積と体液の流通性の面から、上記平均粒径は５０μ〜１５００μｍであることがより好ましい。
【００３７】
使用できる水不溶性担体としては、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、多孔質ガラス、ビニルポリマー等の有機又は無機の多孔体が挙げられ、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料は全て用いることができる。
【００３８】
これらの担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア（旭化成株式会社製）及びＣＭ−セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０6、生化学工業株式会社販売）等のセルロース系担体、特公平１−０４４７２５号公報に記載の全多孔質活性化ゲル、ＣＭ−トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０6、東ソー株式会社製）等のポリビニル系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０7、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のポリアクリルアミド系担体、及び、セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０7、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のアガロース系担体等の有機質担体、並びに、ＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０8、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトローニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕等の多孔性ガラス等の無機質担体が挙げられる。
【００３９】
上記水不溶性担体は、体液浄化用水不溶性担体であることが好ましい。体液浄化用水不溶性担体とは、吸着材が血液等の体液に接触した場合、体液中に溶け出さない担体であって、タンパク質の非特異吸着が少ない、ブラジキニン産生能が低い、補体活性化能が低い等、血液適合性等の体液適合性が高い担体を意味する。上記体液浄化用水不溶性担体は、ポリビニルアルコールが架橋したもの（架橋化ＰＶＡ）であることが好ましい。
【００４０】
水不溶性担体としては、粒子状の多孔質体が好ましく、例えば、多孔性重合体粒子を用いることができる。粒子状の多孔質体は、ペプチドリガンドを固定化できるものである。目的吸着物質であるＩｇＧ型抗体の分子量が約１５万であることから、粒子状の多孔質体の排除限界分子量（タンパク質）は、１５万〜１０００万であることが好ましい。最も好ましい排除限界分子量は１００万〜５００万である。
【００４１】
重合体の組成は、ポリアミド系重合体、ポリエステル系重合体、ポリウレタン系重合体及びビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとり得る公知の重合体を用いることができる。特に親水性モノマーによって親水化したビニル化合物系多孔性重合体が好ましい結果を与える。
【００４２】
ペプチドリガンドの水不溶性担体への担持方法としては、公知の担体活性化方法及び固定化法を用いることができる。例えば、担体がアミノ基又はカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、ペプチドリガンドと縮合反応させる方法、及び、担体とペプチドリガンドとをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて結合させる方法が挙げられる。また、担体が水酸基を有する場合には、例えば、臭化シアン等のハロゲン化シアンを担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基の部分で反応させる方法、及び、エピクロロヒドリン等のエポキシドを有する化合物を担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基やメルカプト基の部分で反応させる方法等が挙げられる。また、ペプチドリガンドがシステインを有する場合には、マレイミド化した担体と反応させることで固定化することが可能である。
【００４３】
必要に応じて、水不溶性担体とペプチドリガンドとの間に任意の長さの分子（リンカー）を導入したものを吸着材として使用することもできる。リンカー分子としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアラニン鎖、ポリグリシン鎖等が挙げられる。リンカーの導入は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。
【００４４】
本実施形態において、具体的には、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよし、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。また、ペプチドリガンドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。
【００４５】
水不溶性担体に対するペプチドの固定化量は、少なすぎると吸着能力が低くなる傾向にあり、多すぎても吸着容量の増大は飽和する。よって、水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌの範囲が好ましく、より好ましくは１〜５０μｍｏｌの範囲である。なお、ペプチドの固定化量は、後述の実施例に示すとおり、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度を紫外可視分光光度計で測定し、反応前後の吸光度の差分に基づいて算出される。
【００４６】
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器内に充填保持されることによって、ＩｇＧ型抗体吸着器として使用することができる。このようなＩｇＧ型抗体吸着器としては、例えば、ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールが挙げられる。
【００４７】
図１はＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。図１に示す体外循環モジュール１は、円筒２の一端開口部に、内側にフィルター３を張ったパッキン４を介して体液を流入させる入口ポート５（導入口）を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部に内側にフィルター３’を張ったパッキン４’を介して体液を流出させる出口ポート７（導出口）を有するキャップ８をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター３及び３’の間隙にＩｇＧ型抗体吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。体外循環モジュール１は、例えば、自己抗体及び免疫複合体を除去するための体液浄化デバイスとして使用することができる。
【００４８】
吸着材層９には、ＩｇＧ型抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合して充填してもよい。また、ＩｇＧ型抗体吸着材と他の吸着材とが積層するように充填してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これによって吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用いる場合、５０ｍＬ〜７００ｍＬ程度が適当である。
【００４９】
体液浄化デバイスを体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つの方法は、体内から取り出した血液を遠心分離機又は膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化した後、血球成分とあわせて体内に戻す方法である。他の一つの方法は、体内から取り出した血液を直接、上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化する方法である。
【００５０】
体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし、又は断続的に通液してもよい。
【００５１】
このような、本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材を備えたＩｇＧ型抗体吸着器を、体液浄化デバイスとすることもできる。
【００５２】
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、ＩｇＧ型自己抗体吸着材及びＩｇＧ型自己抗体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織（移植されたものも含む）に対して産生される抗体を意味する。
また、本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、免疫複合体吸着材及び免疫複合体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「免疫複合体」とは、ＩｇＧ型抗体と抗原が結合した複合体を意味する。
【００５３】
本実施の形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、上記のとおり、装置に充填してＩｇＧ型抗体吸着作用を利用した治療器として用いられるにとどまらず、免疫グロブリン、自己抗体、免疫グロブリン誘導体、免疫グロブリン複合体等の分離用吸着剤、精製用吸着材及び、これらの測定用基材としても極めて有効に利用できる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例によって本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
［実施例１：ＩｇＧ結合性ペプチド］
〔ペプチドライブラリーの作製〕
特許文献３に記載されたＨＬＨ構造を有する非環状ペプチドに種々の改変を加えて、環状構造を有する環状ペプチドライブラリー（配列番号１に示すアミノ酸配列を有する）を作製した。なお、ここでは配列番号１に示すアミノ酸配列中のＸ１６，Ｘ１９，Ｘ２９，Ｘ３２はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌの何れかのアミノ酸となり、Ｘ１７，Ｘ２０，Ｘ３０，Ｘ３３はタンパク質を構成するとされる２０種類のアミノ酸のいずれか１種となり、Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又は欠失するようにライブラリーを構成した。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドはα−ヘリックス部分のＮ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ｃ５とＱ６）と３つのアミノ酸からなるスペーサ（Ｎ２、Ｍ３、Ｑ４）を介して結合したフェニルアラニン（Ｆ１）と、α−ヘリックス部分のＣ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ａ４２とＣ４３（Ｘ２６が欠失している場合は４１番目のＡ及び４２番目のＣを指す））を有し、２つのシステインＣ５、Ｃ４３はジスルフィド結合している。
【００５６】
（１）L-Random酵母表層ペプチドライブラリーの構築
overlap extension PCR 及び2nd PCRにより上記で設計したアミノ酸配列を有するL-Random ペプチドライブラリーをコードした遺伝子断片を作製し、制限酵素NcoI及びXho
Iで処理した。同様に処理した酵母表層提示用ベクターpYD11-BxXNとライゲーションする
ことによりL-Randomペプチドライブラリーのプラスミドを構築した。大腸菌にエレクトロポレーション法により形質転換して増幅した後、酵母細胞に酢酸リチウム法により形質転換することで9.4×106のライブラリーサイズをもつL-Random酵母表層提示ペプチドライブラリーを得た。
【００５７】
（２）human IgG-Fcに対するスクリーニング
得られたライブラリーに対してセルソーターBD FACSAria（商標名）II(BDバイオサイエンス社）を用いてhuman IgG-Fcに対する結合性スクリーニングを行った。ペプチドファイブラリーをSG/RCAA培地（で培養することでペプチドの細胞表層への提示を誘導した。PBSで洗浄した後、bio-human IgG-Fc（最終濃度100nM：Bethyl laboratory社）及びmouse anti-FLAG抗体（Sigma社）と反応させた後、SA-PE（Streptavidin-R-phycoerythrin：Invitrogen社）及びanti-mouse-Alexa488（Alexa Flour（登録商標）488 goat anti-mouse IgG（H+L）：Invitrogen社）を結合させることで蛍光ラベルした。BD FACSAria（商標名）を用いて３回ソートした。
【００５８】
このとき、human IgG-Fcに対する解離定数（ＫＤ）が既知であるアミノ酸配列（FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC（配列番号：５２））を有するペプチド（FK60）が提示したクローンの蛍光強度よりも高い領域（P5領域)に設定して、スクリーニングを行った。
【００５９】
Round1では、1×108細胞をBulk sortモードによりソートし、全体の0.4％に設定したP5エリアに存在する細胞群1.4×105細胞を回収した。Round2ではRound1で回収した細胞を全てBurk sortモードでソートし、P5エリアを全体の9％に設定して9000細胞を回収した。さらに、Round3ではRound2で回収した細胞をsingle-cell sortモードでソートし、P5エリアを全体の13％に設定して96細胞を96 well SDプレート培地に回収した（図２）。RoundごとにP5のエリアを狭めて、蛍光強度の高い酵母細胞のみを選別した。これを30℃で2日間培養した。
【００６０】
（３）human IgG-Fc結合性クローンの活性解析
前記Round3で96well SDプレートに回収した酵母細胞96クローンをSDCAA培地で培養して増幅させた後、SG/RCAA培地で再び提示を誘導して、それぞれのbio-human IgG-Fcに対する結合活性を、蛍光プレートリーダー（Varioskan）を用いて測定した。結合活性を示すR-PE(PE-A)の相対蛍光強度（RFU）と、同時に測定したペプチドの提示量を示すAlexa-488の相対蛍光強度（RFU）との関係を図にプロットした（図３）。そのうち、R-PEの相対蛍光強度の高い約５０のクローン（図に薄い黒丸で示される）を選択して、コロニーPCRによってそれぞれのクローンが保持するペプチドをコードした遺伝子断片を増幅させた。得られた遺伝子断片を鋳型としてシーケンシング反応を行い、遺伝子断片のDNA配列を解析することで、提示するクローンが保持するペプチドのアミノ酸配列を決定した。決定した配列（配列番号：２〜５１）を以下に示す。
FNMQCQAEFYEILHEMRAMKGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：２）
FNMQCQAEFYEILHELKAFNGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：３）
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKISALHAKIAALRDAC（配列番号：４）
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：５）
FNMQCQAEFYEILHEMRAIGGGGGGGKLQAMNAKIAALRDAC（配列番号：６）
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKIHALNAKIAALRDAC（配列番号：７）
FNMQCQAEFYEILHELRAVEGGGGGGGKLAALNAKIAALRDAC（配列番号：８）
FNMQCQAEFYEILHEIRAVGGGGGGGGKMRALNAKIAALRDAC（配列番号：９）
FNMQCQAEFYEILHEIRAVRGGGGGGGKIIAMNAKIAALRDAC（配列番号：１０）
FNMQCQAEFYEILHEMKAMSGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC（配列番号：１１）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKITAFDAKIAALRDAC（配列番号：１２）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVAGGGGGGGKIIALDAKIAALRDAC（配列番号：１３）
FNMQCQAEFYEILHELRAVVGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：１４）
FNMQCQAEFYEILHEIRALGGGGGGGGKLQAFNAKIAALRDAC（配列番号：１５）
FNMQCQAEFYEILHEIKAVRGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC（配列番号：１６）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC（配列番号：１７）
FNMQCQAEFYEILHELKALQGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：１８）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVTALHAKIAALRDAC（配列番号：１９）
FNMQCQAEFYEILHEMRAIRGGGGGGGKLQALNAKIAALRDAC（配列番号：２０）
FNMQCQAEFYEILHEMRALEGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：２１）
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC（配列番号：２２）
FNMQCQAEFYEILHEIKAVHGGGGGGGKLTALNAKIAALRDAC（配列番号：２３）
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKVKALNAKIAALRDAC（配列番号：２４）
FNMQCQAEFYEILHEMKALKGGGGGGGKFSALNAKIAALRDAC（配列番号：２５）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVRGGGGGGGKLPALDAKIAALRDAC（配列番号：２６）
FNMQCQAEFYEILHEFKAVYGGGGGGGKLKALNAKIAALRDAC（配列番号：２７）
FNMQCQAEFYEILHELRAMGGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC（配列番号：２８）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGEGKLKALGAKIAALRDAC（配列番号：２９）
FNMQCQAEFYEILHEMRALSGGGGGGGKLNALNAKIAALRDAC（配列番号：３０）
FNMQCQAEFYEILHELKAMGGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：３１）
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：３２）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC（配列番号：３３）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVDGGGGGGGKMQALAAKIAALRDAC（配列番号：３４）
FNMQCQAEFYEILHELYAVQGGGGGGGKIVAINAKIAALRDAC（配列番号：３５）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC（配列番号：３６）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGGGKMPALDAKIAALRDAC（配列番号：３７）
FNMQCQAEFYEILHEMRALRGGGGGGGKMQALNAKIAALRDAC（配列番号：３８）
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKINALTAKIAALRDAC（配列番号：３９）
FNMQCQAEFYEILHELKAVSGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：４０）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKMSALAAKIAALRDAC（配列番号：４１）
FNMQCQAEFYEILHELQAVLGGGGGGGKVLALNAKIAALRDAC（配列番号：４２）
FNMQCQAEFYEILHELRAVAGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC（配列番号：４３）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVDAFNAKIAALRDAC（配列番号：４４）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVLALHAKIAALRDAC（配列番号：４５）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：４６）
FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：４７）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC（配列番号：４８）
FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC（配列番号：４９）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC（配列番号：５０）
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：５１）
【００６１】
（４）human IgG-Fc結合性ペプチドの結合性（解離定数の算出）
アミノ酸配列を決定したhuman IgG-Fc結合性ペプチドのうちランダムに５個（ＦＫ６０１４、ＦＫ６０３２、ＦＫ６０５３、ＦＫ６０６３、ＦＫ６０６５）を選択し、アミドレジンを用いて0.023μmolスケールでFmoc固相合成法によりそれぞれを化学合成し、SPR法を用いてhuman IgG-Fcに対する結合活性測定を行った。なお、ＦＫ６０１４、ＦＫ６０３２、ＦＫ６０５３、ＦＫ６０６３、ＦＫ６０６５はそれぞれ、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１で示される配列を有する。
【００６２】
100mgのFmoc-PAL-PEG-PS（商標名）アミドレジン（置換率：0.2 mmol/g）をリアクションベッセル量り取り、ペプチド自動合成機PSSM-8（SHIMAZU社）のプロトコルに従ってそれぞれのFmocアミノ酸（10equiv.）を、HCTU（10equiv）、DIEA（20equiv）、30%ピペリジン、5%無水酢酸を調製して、各ペプチドを化学合成した。終了後、レジンをジエチルエーテルで洗浄し乾燥させ、クリベージ溶液（TFA：EMS：Anisole：EDT＝93：3：3：1）を2mL添加して、室温で4時間反応させた。クリベージ溶液をろ過したのち、氷冷したジエチルエーテルを過剰量添加することでペプチドを析出させた。氷上で10分間静置し、6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を捨てた。回収した沈殿物に再び氷冷したジエチルエーテルを加えて激しく撹拌させた後、氷上で10分間静置して6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を除去することで沈殿物を洗浄した。この洗浄行為を2回繰り返した。沈殿物を減圧下で乾燥させたのち、2 mLの滅菌水に溶解し、0.22 mmのフィルターでろ過してペプチド溶液（非環状ペプチド）を得た。ペプチド溶液をRP-HPLCで精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。
【００６３】
その後、滅菌水で溶解したペプチド溶液を30mM Tris-HCl（pH8.5）に常温で一晩かけて滴下しながら撹拌することで酸化反応させ、分子内ジスルフィド架橋を施した。反応溶液をRP-HPLCを用いて上記と同様の条件で精製した。MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。
【００６４】
得られた５つの環状ペプチドについて、Biacore T200（GEヘルスケア社）とThiol coupling kit（GE ヘルスケア社）を用いて各濃度における結合活性を測定した。全ての工程において、ランニングバッファーはHBS-EP+を用いた。Serise S CM5 センサーチップに、human IgG-Fcの固定化用としてフローセル2を用いて、流速10μL/min、25℃の条件で行った。予備試験によりhuman IgG-Fcの固定化に最適なpHを決定した後、フローセル2に前記キット中のEDCとNHSを混合した液（容量比で1：1）を調製し、7分間センサーチップに流すことでカルボキシル基を活性化させた。5 mg/mL human IgG-Fcを10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で調製し、活性化させたフローセル2に7分間流すことでhumanIgG-Fcを固定化した。固定化量は2000RUであった。未反応の活性化されたカルボキシル基はエタノールアミンを7分間流すことによって、全て不活性化した。フローセル1をEDC及びNHSによる活性化とエタノールアミンによるブロッキングを施すことでリファレンスセルとして使用した。各ペプチドをHBS-EP+バッファーで0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μMに段階希釈し，流速30μL/min.でそれぞれの結合活性を測定した。測定結果は、BIA evaluation 4.1ソフトウェアで、平衡値解析により解離定数（KD）を算出した。その結果を表１に示した。
【００６５】
５つのペプチドはどれも非常に高い結合活性（FK6014：ＫD＝９nM、FK6032：ＫD＝８nM、FK6053：ＫD＝５nM、FK6063：ＫD＝１２nM、FK6065：ＫD＝８nM）を示した。比較対照としたペプチドFK60（ＫD＝２１μM＝２１０００nM）に比べて1000倍以上結合活性が向上した。
【００６６】
【表１】
2017165656.tif 000003
【００６７】
（５）ＣＤスペクトルの測定
各ペプチドのCDスペクトルを測定した。ペプチドを20mM Phosphate buffer（pH7.4）に最終濃度20mMとなるように調製し、円二色性分散計J-720（JASCO社）、温度コントローラー Peltier PTC-423L（TOMY SEIKO)を用いて、20℃の温度における190nmから260nmの波長でのCDスペクトルを0.2nm間隔で測定した。その結果を図４に示す。それぞれのペプチドは208nm及び222nmに明瞭な負の極大を有しており、安定なα−ヘリックス構造を保持していることがわかった。α−ヘリックスの内側の適切な位置に疎水性アミノ酸が配置されるようデザインしたことにより、α−ヘリックス構造の形成に必要な両親媒性を獲得し、安定な立体構造を形成しているものと推測される。
【００６８】
［実施例２：ＩｇＧ結合性ペプチドを固定化した吸着材］
（１）ペプチド固定化担体の作製
ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍＬ／ｍＬ以上）１８ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）１８０ｍＬに投入し、そこに、エピクロロヒドリン（和光純薬工業株式会社製）１３７ｍＬ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）の水溶液（２１ｇ／３１．５ｍＬ）及び水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）８８ｍｇを添加し、３０℃で５時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、エポキシ基を導入した球状多孔質体をメタノール（キシダ化学株式会社製）で洗浄し、その後、純水で洗浄してエポキシ活性化担体を得た。得られた担体は、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬと、活性化担体１ｍＬに１％フェノールフタレインエタノール溶液（和光純薬工業株式会社製）２滴を滴下し、８０℃で赤色の呈色が確認されなくなるまで０．１Ｍの塩酸（和光純薬工業株式会社製）を加え、「活性化量（単位樹脂量あたりのエポキシ基の量）＝塩酸濃度×塩酸滴定量／樹脂量」の式によって導入されたエポキシ基の量を求め、１１０μｍｏｌ／ｍＬ以上であることを確認した。
【００６９】
次に、エポキシ化担体を３０ｍＬ秤量し、アンモニア水（濃度：２８−３０％、関東化学株式会社）を４５ｍＬ加え、４０℃で９０分間反応させることで、エポキシ基をアミノ基に変換した。得られたアミノ化担体は元素分析によって、定量的にエポキシ基からアミノ基となっていることを確認した。
【００７０】
次に、アミノ化担体を５ｍＬ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬株式会社製）で膨潤させた後、１０ｍＭのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液１０ｍＬを加え、３０℃で３時間反応させた。反応後、ＤＭＳＯで洗浄し、その後純水で洗浄することで、マレイミド化担体を得た。
【００７１】
得られたマレイミド化担体を２ｍＬ秤量し、０．８ｍＭのペプチド（配列番号４９のアミノ酸配列からなるペプチドについて、実施例１（４）に記載の方法で５番目のシステイン残基と４３番目のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成しており、Ｎ末端にリンカーとしてグリシン５残基を介してシステインを付与したペプチド）ＰＢＳ溶液５ｍＬを加えた。その後、３７℃で１７時間反応させることで、ペプチド中のメルカプト基と担体中のマレイミド基を共有結合させた。反応後、純水で洗浄することで、ペプチド固定化担体を得た。ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。
【００７２】
（２）血漿タンパク質吸着試験
健常人から採取したＣＰＤ加血液（Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ加血液）を遠心分離にて血漿分離し、健常人ヒト血漿を得た。次に得られたペプチド固定化担体を０．５ｍＬ秤量し、その６倍容の健常人ヒト血漿を加え、３７℃で１７．５間分振とうさせた。振とう後、遠心分離にてペプチド固定化担体を除き、上澄み血漿中に含まれる血漿タンパク質（ＩｇＧ、フィブリノーゲン（Ｆｂｇ）、アルブミン（Ａｌｂ））を測定することで、ペプチド固定化担体への吸着率を算出した。ＩｇＧについては免疫比濁法、Ｆｂｇについては凝固時間測定法、Ａｌｂについてはネフェロメトリーをそれぞれ用いて、公知の手法により定量した。
【００７３】
［比較例１：トリプトファンを固定化した吸着材］
実施例２（１）で作製したエポキシ化担体を１０ｍＬ秤量し、４６ｍＭのトリプトファン（和光純薬工業株式会社製）炭酸緩衝溶液２０ｍＬを加え、５０℃で１６時間反応させることで、トリプトファンを担体に共有結合させた。反応後、純水で洗浄することでトリプトファン固定化担体を得た。トリプトファンの固定化量は、トリプトファン導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。このトリプトファン固定化担体を用いて、実施例２（２）と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
【００７４】
［比較例２：アミノ酸及びペプチドを固定化しないアミノ化吸着材］
実施例２（１）で作製したアミノ化担体を用いて、実施例２（２）と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
【００７５】
実施例２、並びに、比較例１及び２の結果を表２及び図５に示す。
【表２】
2017165656.tif 000004
【００７６】
表１に示すように、ペプチド固定化担体を用いた実施例２は、リガンド固定化量がトリプトファンの１０分の１以下であるにもかかわらず、高いＩｇＧ吸着率を示した。また、トリプトファン固定化担体と比較して、他の血漿タンパク質成分を吸着することなく、ＩｇＧを極めて選択的に吸着することも示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、例えば、医療産業及び製薬業等で利用可能である。特に、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能であることから、自己免疫疾患の治療に有用である。また、ＩｇＧ型抗体等の分離精製、測定等においても有用である。
【符号の説明】
【００７８】
１…体液浄化デバイス（体外循環モジュール）、２…円筒、３、３’…フィルター、４、４’…パッキン、５…入口ポート（体液導入口）、６…キャップ、７…出口ポート（体液導出口）、８…キャップ、９…ＩｇＧ型抗体吸着材。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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