(57)【要約】【課題】  プロテインＡカラムを用いて、ウシＩｇＧとウサギ抗体を分離する方法を提供する。【解決手段】  ウシ血清成分を含有する培地でウサギ抗体生産細胞を培養して得られた培養上清から、ウサギ抗体を精製する方法であって、（ｉ）培養上清をプロテインＡカラムに通液し、中性条ｐＨ件下でウシＩｇＧとウサギ抗体をプロテインＡに吸着させ、（ｉｉ）中性ｐＨ条件下で、非吸着成分を洗浄した後、（ｉｉｉ）溶離液のｐＨを洗浄時よりも酸性側にすることにより、ウシＩｇＧとウサギ抗体とを分離・溶出する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ血清成分を含有する培地でウサギ抗体生産細胞を培養して得られた培養上清から、ウサギ抗体を精製する方法であって、
（ｉ）培養上清をプロテインＡカラムに通液し、中性ｐＨ条件下でウシＩｇＧとウサギ抗体をプロテインＡに吸着させ、
（ｉｉ）中性ｐＨ条件下で、非吸着成分を洗浄した後、
（ｉｉｉ）溶離液のｐＨを洗浄時よりも酸性側にすることにより、ウシＩｇＧとウサギ抗体とを分離・溶出する、
ことを特徴とする精製方法。
【請求項２】
溶離液のｐＨをステップワイズ溶出とリニアーグラジエント溶出を組み合わせて変化させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウサギ抗体の精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その特異性と親和性の高さから、実験用試薬としてだけでなく、免疫診断などの分野でも幅広く利用されている。抗体には様々な動物種があるが、ウサギ抗体はマウスやラットの抗体と比較して、高親和性と高特異性を有しているため、高感度かつ高特異性が要求される診断項目に多く用いられている。
【０００３】
抗体の精製には、プロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが多用されている。プロテインＡは様々な動物由来のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に会合する性質をもっており、血清、培養上清、腹水等からのＩｇＧ精製に使用されている。
【０００４】
抗体生産細胞の培養には、細胞増殖因子を供給するため、牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地が頻繁に使用される。しかし、ＦＣＳにはウシＩｇＧが多量に含まれているため、培養上清中に産生された抗体を精製することを目的として、通常行われているプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの吸着、洗浄、溶離の操作では、精製サンプル中に血清中のウシＩｇＧが多量に混入してしまうという問題があった。
【０００５】
プロテインＡを用いて、培養上清中の目的抗体とウシＩｇＧを分離した例として、特許文献１に記載の方法があげられる。しかし、特許文献１はマウスＩｇＧ１の精製方法に関しては記載があるものの、ウサギ抗体精製に関する開示・示唆はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−９２２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、プロテインＡカラムを用いて培養上清中のウシＩｇＧとウサギ抗体とを分離することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）ウシ血清成分を含有する培地でウサギ抗体生産細胞を培養して得られた培養上清から、ウサギ抗体を精製する方法であって、
（ｉ）培養上清をプロテインＡカラムに通液し、中性ｐＨ条件下でウシＩｇＧとウサギ抗体をプロテインＡに吸着させ、
（ｉｉ）中性ｐＨ条件下で、非吸着成分を洗浄した後、
（ｉｉｉ）溶離液のｐＨを洗浄時よりも酸性側することにより、ウシＩｇＧとウサギ抗体とを分離・溶出する、
ことを特徴とする精製方法。
（２）溶離液のｐＨをステップワイズ溶出とリニアーグラジエント溶出を組み合わせて変化させることを特徴とする（１）に記載の方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
（１）ウサギ抗体
本発明のウサギ抗体は、抗体のＦｃ部分を有する抗体であればよく特に限定されない。ハイブリドーマの培養によって得られるウサギ抗体でもよいし、遺伝子組み換えの手法を用いて作製されたＩｎｔａｃｔ型のウサギ抗体、抗体のＨ鎖とＬ鎖をリンカーで連結した一本鎖抗体やｓｃＦｖ−Ｆｃでもよく特に限定されない。本発明では、遺伝子組み換えの手法を用いて作製されたＩｎｔａｃｔ型のウサギ抗体を用いることが好ましい。
【００１１】
（２）プロテインＡカラム
本発明のプロテインＡカラムは、プロテインＡを固定化した不溶性の担体を充填したものを用いればよく特に限定されない。
【００１２】
（３）中性ｐＨ条件での吸着・洗浄操作
本発明において、プロテインＡカラムへのウシＩｇＧとウサギ抗体の吸着操作及び非吸着成分の洗浄操作は中性ｐＨ条件で行い、その溶離液は特に限定されない。吸着・洗浄操作に用いる溶離液のｐＨは、６〜９が好ましく、さらには７〜８であることが好ましい。吸着・洗浄溶離液の緩衝液にはＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７〜９）、などを用いればよい。本発明では特に、ＰＢＳを用いることが好ましい。
【００１３】
（４）ウシＩｇＧとウサギ抗体の分離・溶出
ウシＩｇＧとウサギ抗体の分離・溶出の際の溶離液のｐＨは、吸着・洗浄の際のｐＨより酸性側にすることが必要である。その方法には特に限定はないが、例えばｐＨの異なる２つ以上の溶離液の混合によりｐＨの勾配を作製する方法があげられる。ｐＨの勾配は溶離液の混合割合を階段状に変更するステップワイズ溶出で行ってもよいし、溶離液の混合割合を徐々に変化させるリニアーグラジエント溶出で行ってもよく特に限定されない。分離・溶出に用いる溶離液としてはｐＨ３〜６付近で緩衝能を有する溶離液を用いることが好ましく、具体的にはクエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液などがあげられる。特に、本発明ではクエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
通常行われているプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの吸着、洗浄、溶離の操作では培養液中に含まれるウシＩｇＧとウサギ抗体の分離が困難であった。本発明の方法はｐＨグラジエントを用いることで、ウシＩｇＧとウサギ抗体を効率的に分離・溶出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】溶離液のｐＨ変化による溶出により、ウシＩｇＧとウサギ抗体を分離したクロマトグラムである。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を、抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）ウサギモノクローナル抗体を用いた実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
【００１７】
実施例１  抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体生産細胞の作製
抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体生産ＣＨＯ−Ｋ１細胞はＴ３結合牛血清アルブミン（Ｔ３−ＢＳＡ）を免疫したウサギ脾臓細胞を用いて、特許第５６６３８３４号公報に記載の方法により作製した。
【００１８】
実施例２  抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体生産細胞の培養
抗体生産細胞の培養は、１０％ＦＣＳを添加したＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬）を用いて行った。培養基材にはセルファクトリーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、炭酸水素ナトリウム（ナカライ）を用いた培地のｐＨ調整を行いながら培養することで、抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体を含む培養上清を得た。
【００１９】
実施例３  プロテインＡカラムの作製
プロテインＡカラムの作製は、Ｔｒｉｃｏｎｅ空カラム（Ｔｒｉｃｏｎｅ１０／２００  Ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ）にＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−６５０Ｆゲル（東ソー）を充填することで作製した。作製したプロテインＡカラムはＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１０カラムボリューム（ＣＶ）通液することで平衡化した。
【００２０】
実施例４  ウサギ抗体の精製
実施例２で得たウサギ抗体を含む培養上清４Ｌを、実施例３で作製したプロテインＡカラムに流速１５ｍＬ／ｍｉｎで通液することで、培養上清中の抗体成分をプロテインＡへ吸着させた。続いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１０ＣＶ通液し、非吸着成分の洗浄を行った。
【００２１】
プロテインＡカラムをＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥ）に接続し、下記条件で抗体を溶出させた。
溶離液Ａ；１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、溶離液Ｂ；１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）、カラム温度；４℃、検出波長；２８０ｎｍ、流速；１０ｍＬ／ｍｉｎ。
【００２２】
溶出条件
（１）１００％溶離液Ａ＋０％溶離液Ｂ、３ＣＶ
（２）３５％溶離液Ａ＋６５％溶離液Ｂ、１０ＣＶ
（３）３５〜０％溶離液Ａ＋６５〜１００％溶離液Ｂ、１０ＣＶ
（４）０％溶離液Ａ＋１００％溶離液Ｂ、３ＣＶ
結果を図１に示す。結果から、溶離液のｐＨ変化による溶出によってウシＩｇＧとウサギ抗体を分離可能であることが示された。
【図１】
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