(57)【要約】【課題】複数の融合遺伝子の検出を簡便な操作で、かつ同時に実施できる手段の提供。【解決手段】肺癌細胞からチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法であって、  （ａ）被検細胞中のＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ遺伝子のチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡの発現量を測定する工程、  （ｂ）チロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量を、予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線とを対比する工程、及び  （ｃ）チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が回帰直線よりも有意に高い細胞を、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞と判定する工程、を有することを特徴とするチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌細胞からチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法であって、
（ａ）被検細胞中のＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ遺伝子のチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡの発現量を測定する工程、
（ｂ）チロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量を、予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線とを対比する工程、及び
（ｃ）チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が回帰直線よりも有意に高い細胞を、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞と判定する工程、
を有することを特徴とするチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、キャプチャープローブ、レポータープローブ及びコントロールプローブを用いてハイブリダイゼーションした結果をデジタルアナライズする方法により行う請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
チロシンキナーゼ非活性ドメインが５’−側ドメインであり、チロシンキナーゼ活性化ドメインが３’−側である請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線が、肺癌１００症例以上チロシンキナーゼ非活性ドメインの発現量の対数値と、チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量の対数値から得られる回帰直線である請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が、回帰直線より有意に高い細胞が、回帰直線とのずれを標準偏差で割った標準化残差が２以上ある細胞と判定する請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌の診断に有用な肺癌融合遺伝子の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な癌種においてドライバー遺伝子異常が発見され、新たな治療法の開発は従来の殺細胞性抗癌剤治療から腫瘍の遺伝子異常に基づいた個別化治療へ大きくパラダイムシフトしている。特に肺癌においてその成果はめざましく、ＥＧＦＲ変異、ＡＬＫ融合遺伝子などを治療標的としたチロシンキナーゼ阻害薬は飛躍的な治療成績の改善をもたらした。現在までに発見されている肺癌遺伝子変異はＥＧＦＲ、ＫＲＡＳが大多数を占め、肺癌融合遺伝子においてはＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１などがある（非特許文献１，２）。
【０００３】
肺癌遺伝子変異はＥＧＦＲ、ＫＲＡＳの遺伝子変異の検査は既に一般化されている。肺癌融合遺伝子においては、ＡＬＫにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、ＩＨＣなどを用いた臨床検査が近年確立しているが、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１などの検査方法は臨床検査としては未だ確立していない。また、確立したＡＬＫの検査においても、ＦＩＳＨの診断感度の低さや融合遺伝子パートナーが多岐に渡るためＲＴ−ＰＣＲの検査においても煩雑な検査となり問題点を抱えている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Oxnard GR et al. J Clin Oncol 31:1097-1104.
【非特許文献２】Kohno T et al. Transl Lung Cancer Res 2015;4(2):156-164
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＡＬＫ以外の融合遺伝子の臨床方法は未だ確立しておらず、ＡＬＫ以外のＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＴＲＫ１の融合遺伝子の検査においても、ＦＩＳＨの診断感度の低さや、融合遺伝子パートナーが多岐に渡るためＲＴ−ＰＣＲにおいては操作が煩雑になることが予想される。
従って、本発明の課題は、複数の融合遺伝子の検出を簡便な操作で、かつ同時に実施できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、キャプチャープローブ、レポータープローブ及びコントロールプローブを用いてハイブリダイゼーションをデジタルアナライズできる装置を用いて約９０個のチロシンキナーゼ遺伝子の５’−側（チロシンキナーゼ非活性ドメイン）と３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）のＲＮＡ発現をそれぞれ定量化することに成功し、同時に４個のチロシンキナーゼ遺伝子（ＡＬＫ，ＲＯＳ，ＲＥＴ，ＮＴＲＫ１）については２３３例の肺腺癌手術検体を用いてその診断規準となる５’−側と３’−側の両発現差を回帰直線化することに成功した。この回帰直線を用いて、サンプルのチロシンキナーゼ遺伝子の５’−側と３’−側のＲＮＡ発現量を対比すれば、相対的に３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）のみが活性化している融合遺伝子陽性のサンプルを検出可能になり、上記４つの融合遺伝子が発現しているか否かが判定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕肺癌細胞からチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法であって、
（ａ）被検細胞中のＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ遺伝子のチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡの発現量を測定する工程、
（ｂ）チロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量を、予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線とを対比する工程、及び
（ｃ）チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が回帰直線よりも有意に高い細胞を、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞と判定する工程、
を有することを特徴とするチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法。
〔２〕工程（ａ）が、キャプチャープローブ、レポータープローブ及びコントロールプローブを用いてハイブリダイゼーションした結果をデジタルアナライズする方法により行う〔１〕記載の検出方法。
〔３〕チロシンキナーゼ非活性ドメインが５’−側ドメインであり、チロシンキナーゼ活性化ドメインが３’−側である〔１〕又は〔２〕記載の検出方法。
〔４〕予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線が、肺癌１００症例以上チロシンキナーゼ非活性ドメインの発現量の対数値と、チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量の対数値から得られる回帰直線である〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の検出方法。
〔５〕チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が、回帰直線より有意に高い細胞が、回帰直線とのずれを標準偏差で割った標準化残差が２以上ある細胞と判定する〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、肺癌ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１の融合遺伝子の診断を簡便及び正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ロバスト回帰直線の例を示す。
【図２】サンプルの採取方法を示す。
【図３】チロシンキナーゼＢ遺伝子（例としてＡＬＫなど）において、５’−側（チロシンキナーゼ非活性ドメイン）と３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）プローブの発現データに基づいたｍＲＮＡ発現定量化される仕組みと融合遺伝子陽性の場合の例を示す。
【図４】肺癌２３３例とそれに含まれるＡＬＫ融合遺伝子陽性１５例に基づいたＡＬＫ遺伝子の診断直線から、ＡＬＫ融合遺伝子陽性に分類された例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
肺癌細胞からチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞を検出する方法であって、次の工程（ａ）〜（ｃ）を有することを特徴とする。
（ａ）被検細胞中のＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ遺伝子のチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡの発現量を測定する工程。
（ｂ）チロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量を、予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線とを対比する工程。
（ｃ）チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が回帰直線よりも有意に高い細胞を、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞と判定する工程。
【００１２】
本発明において被検細胞は、肺癌組織由来の細胞であり、例えば肺癌患者の肺から採取した腫瘍細胞、培養腫瘍細胞、パラフィン包埋腫瘍細胞等が挙げられる。また、被検細胞中のチロシンキナーゼ遺伝子のＲＮＡ発現量を測定するので、当該被検細胞からＲＮＡを採取して使用する。ＲＮＡの採取は、例えば肺癌患者の肺から採取した腫瘍細胞、培養腫瘍細胞、パラフィン包埋腫瘍細胞等が挙げられる。
【００１３】
工程（ａ）は、被検細胞中のＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ遺伝子のチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡの発現量を測定する工程である。
【００１４】
チロシンキナーゼ非活性ドメインとしては、５’−側ドメインが好ましく、チロシンキナーゼ活性化ドメインとしては、３’−側ドメインが好ましい。前記のチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ非活性ドメインは５’−側にあり、チロシンキナーゼ活性化ドメインは３’−側ドメインにあることが知られているからである。
ＲＮＡの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、ＩＨＣなどにより行うこともできるが、同時に多量の検体を可視化できる点で、キャプチャープローブ、レポータープローブ及びコントロールプローブを用いてハイブリダイゼーションした結果をデジタルアナライズする方法によるのが好ましい。このデジタルアナライズ方法は、nCounter Prep Stationの過程にて、標的配列とハイブリダイズしたコードセットの精製とアナライザーカートリッジへの固定化をフルオートで行う。具体的には、nCounter Prep Stationを用いてｍＲＮＡとキャプチャープローブとレポータープローブをハイブリダイズする。そのハイブリダイズされたサンプルに対してnCounter Prep Stationを用いて精製（ピューリファイ）を行う。その後nCounter Prep Stationを用いてnCounter Cartridgeへのイモビライズの処理を行う。その後のnCounter Digital Analyzerの過程にて、リポータープローブのカラーバーコードの蛍光の読取りとカウントを行い、データを出力する。具体的には、nCounter Cartridge のDigital Analyzerによるスキャンを行い各チロシンキナーゼＲＮＡ転写産物の各設置プローブに一致したｍＲＮＡ発現プロファイリングを獲得する方法である。この方法は、n Counter Analysis System（登録商標）を使用することにより簡便に行うことができる。
このデジタルアナライズ法によれば、チロシンキナーゼ非活性ドメイン及びチロシンキナーゼ活性化ドメインそれぞれの発現量を簡便に測定することができる。この２つのドメインの発現比の差が大きければ融合遺伝子があると判定することができる。なぜなら、５’−側（チロシンキナーゼ非活性ドメイン）と３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）のｍＲＮＡ発現は通常の遺伝子発現では同様・同程度の発現形態をとるが、融合遺伝子の発生の場合は３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）は活性され高発現となるが、５’−側（チロシンキナーゼ非活性ドメイン）の発現に活性化は生じないため高発現にはならない。そのことよりそれぞれのプローブの発現に大きな発現差を生じ融合遺伝子陽性例の同定が可能となるからである。
【００１５】
従来の方法の問題点としては、同じ遺伝子に対するプローブでも、プローブの塩基配列によるハイブリダイズの親和性(ハイブリダイゼーション効率)が異なる場合には、直接的な発現強度の比較が難しいことが挙げられる。そのため、ハイブリダイゼーション効率の違いに影響されることなく、融合遺伝子を持つ症例候補を適切に検出する方法が必要である。そこで、各キナーゼ遺伝子に対して、キナーゼ活性ドメインと非活性ドメインの発現量を用いて回帰直線を推定することにより、これらのドメイン間の発現比が集団内でどの程度外れているかを見積もる方法を開発した。これにより、ハイブリダイゼーション効率の違いに左右されることなく、融合遺伝子を持つ患者を推定することが可能となったとともに、適切なカットオフ値を設定することにより、診療への応用が可能になった。
かかる観点から、工程（ｂ）では、チロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量を、予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線とを対比する。
【００１６】
ここで予め作成されたチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインのＲＮＡ発現量の回帰直線としては、肺癌１００症例以上チロシンキナーゼ非活性ドメインの発現量の対数値と、チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量の対数値から得られる回帰直線であるのが好ましい。回帰直線としては、ロバスト回帰直線がより好ましい。本発明者は、肺癌２００症例以上の例からロバスト回帰直線を作成した。
【００１７】
より具体的には、n Counterで測定された２３３検体の生データを、nanoString社のnSolver Analysis Software（登録商標）（バージョン２．０）を用いて、以下の条件を用いて正規化を行った。
【００１８】
・Background subtractionなし
・Positive Control Normalizationあり(６プローブ)
・インターナルコントロール:ＴＢＰおよびＰＧＫ
【００１９】
その結果得られたデータをnSolver上でＣＳＶ(comma-separated values)形式ファイルに出力した。
【００２０】
得られたデータをより詳細に検討するため、上記のＣＳＶファイルを統計処理ソフトウェアＲ（バージョン３．０．２、http://www.r-project.org/）にインポートして解析した。それぞれのチロシンキナーゼ遺伝子（ＡＬＫ）に対して、チロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量のｌｏｇ２値とチロシンキナーゼ非活性ドメインである５’側エクソンの発現量のｌｏｇ２値を計算し、それぞれを軸とした散布図を作成した（図１）。また、回帰直線の推定には、Ｒに標準で付属するロバスト回帰法の一つであるｒｌｍ関数を用いた。
【００２１】
上記の如くして予め作成された回帰直線と、被検細胞におけるチロシンキナーゼ非活性ドメインとチロシンキナーゼ活性化ドメインとのＲＮＡ発現量を対比する。対比は、被検細胞のチロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量の対数値とチロシンキナーゼ非活性ドメインの発現量の対数値と、回帰直線とを対比すればよい（図１参照）。
【００２２】
工程（ｃ）でチロシンキナーゼ活性化ドメインの発現量が回帰直線よりも有意に高い細胞を、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＲＥＴ及びＮＴＲＫ１から選ばれるチロシンキナーゼ融合遺伝子を有する細胞と判定する。有意に高いか否かの判定は、例えば、回帰直線とのずれを標準偏差で割った標準化残差が２以上ある細胞と判定することができる。より詳細には、各検体に対して予測値から実測値のずれ（残差）を標準偏差で割った標準化残差を求めた。一般には、標準化残差が３以上となる場合には外れ値とみなすことが多いため、標準化残差３以上の群と、標準化残差が２〜３となる群に着目して検討を行った（図１）。さらに、ＲＯＳ／ＲＥＴ／ＡＬＫの各遺伝子に対し、標準化残差がおおむね３より大きい症例に対して、ＲＴ−ＰＣＲによりキナーゼドメインの有意な亢進があるかどうかを確認した。その結果、以下の２条件を満たす症例でキナーゼドメインの亢進が陽性と判断されることが判明した（図４）。
【００２３】
（１）標準化残差＞３
（２）キナーゼドメインの最低発現量が閾値以上（カットオフ値は遺伝子により異なる）
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２５】
実施例１
図２のように肺癌より腫瘍を採取して診断のためにｍＲＮＡを抽出する。キャプチャープローブ、レポータープローブ及びコントロールプローブを用いてハイブリダイゼーションした結果をデジタルアナライズする。このデジタルアナライズ方法は、nCounter Prep Stationの過程にて、標的配列とハイブリダイズしたコードセットの精製とアナライザーカートリッジへの固定化をフルオートで行う。具体的には、nCounter Prep Stationを用いてｍＲＮＡとキャプチャープローブとレポータープローブをハイブリダイズする。そのハイブリダイズされたサンプルに対してnCounter Prep Stationを用いて精製（ピューリファイ）を行う。その後nCounter Prep Stationを用いてnCounter Cartridgeへのイモビライズの処理を行う。その後のnCounter Digital Analyzerの過程にて、リポータープローブのカラーバーコードの蛍光の読取りとカウントを行い、データを出力する。具体的には、nCounter Cartridge のDigital Analyzerによるスキャンを行い各チロシンキナーゼＲＮＡ転写産物の各設置プローブに一致したｍＲＮＡ発現プロファイリングを獲得する。実際のデータとしては、図３のような５’−側（チロシンキナーゼ非活性ドメイン）プローブと３’−側（チロシンキナーゼ活性化ドメイン）プローブの発現不均衡を取ることで融合遺伝子陽性となる。実際にある検体がＡＬＫ融合遺伝子陽性であった場合は、その獲得されたデータは２３３例で作成された基準直線上に図４のように位置づけられ、その結果としてＡＬＫ融合遺伝子陽性と診断される。
【００２６】
実施例２
n Counterで測定された２３３検体の生データを、nanoString社のnSolver Analysis Software (バージョン２．０)を用いて、以下の条件を用いて正規化を行った。
【００２７】
・Background subtractionなし
・Positive Control Normalizationあり（６プローブ）
・インターナルコントロール:ＴＢＰおよびＰＧＫ
【００２８】
その結果得られたデータをnSolver上でCSV(comma-separated values)形式ファイルに出力した。
【００２９】
得られたデータをより詳細に検討するため、上記のＣＳＶファイルを統計処理ソフトウェアＲ（バージョン３．０．２、http://www.r-project.org/）にインポートして解析した。それぞれのキナーゼ遺伝子に対して、キナーゼドメインの発現量のｌｏｇ２値と、非キナーゼドメインである５’側エクソンの発現量のｌｏｇ２値を計算し、それぞれを軸とした散布図を作成した（図１）。また、回帰直線の推定には、Ｒに標準で付属するロバスト回帰法の一つであるｒｌｍ関数を用いた。各検体に対して予測値から実測値のずれ（残差）を標準偏差で割った標準化残差を求めた。一般には、標準化残差が３以上となる場合には外れ値とみなすことが多いため、標準化残差３以上の群と、標準化残差が２〜３となる群に着目して検討を行った。
【００３０】
さらに、ＲＯＳ／ＲＥＴ／ＡＬＫの各遺伝子に対し、標準化残差がおおむね３より大きい症例に対して、ＲＴ−ＰＣＲによりキナーゼドメインの有意な亢進があるかどうかを確認した。その結果、以下の２条件を満たす症例でキナーゼドメインの亢進が陽性と判断されることを見出した（図４）。
【００３１】
（１）標準化残差＞３
（２）キナーゼドメインの最低発現量が閾値以上（カットオフ値は遺伝子により異なる）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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