(57)【要約】【課題】膜分離活性汚泥法（ＭＢＲ）を、嫌気条件で稼働し嫌気性細菌を用いる嫌気性膜分離活性汚泥装置を提供しようとする。【解決手段】嫌気性微生物を含む活性汚泥によって生物処理を行う反応槽と、反応槽内部の活性汚泥を不活性ガスで攪拌する散気管と、生物処理後の処理水を膜分離して膜処理水を得る膜分離槽とを有する硝酸性窒素を含有する廃水の処理を行う嫌気性膜分離活性汚泥装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物を含む活性汚泥によって生物処理を行う反応槽と、反応槽内部の活性汚泥を不活性ガスで攪拌する散気管と、生物処理後の処理水を膜分離して膜処理水を得る膜分離槽とを有する、硝酸性窒素を含有する廃水の処理を行う嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【請求項２】
さらに、前記膜分離槽中の膜表面を不活性ガスで洗浄する膜洗浄手段を有する請求項１に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【請求項３】
さらに、原水流入口と反応槽と膜分離槽と膜処理水流出口とを有し、不活性ガス供給手段から不活性ガスを散気管を経由して反応槽および膜分離槽に供給し、装置内を嫌気性に維持して、供給された不活性ガスを排出する不活性ガス排出管を有する請求項１または２に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【請求項４】
前記不活性ガスを窒素とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【請求項５】
前記活性汚泥中に存在する嫌気性微生物が、Xanthomonadaceae（キサントモダセアエ）科のDokdonella（ドクドネラ）属に属する硝酸還元細菌、Rhodocyclaceae（ロドサイクラセアエ）科のMethyloversatilis（メチロバーサチリス）属に属する硝酸還元細菌、Methylophilaceae（メチロフィラセアエ）科Methylophilus（メチロフィルス）属に属する硝酸還元細菌、Burkholderiales（バークホルデリアレス）目のAzohydromonas（アゾヒドロモナス）属およびCaldimonas（カルディモナス）属に属する硝酸還元細菌、並びにFlavobacteriia（フラボバクテリイア）綱のFluviicola（フルヴィコラ）属に属する硝酸還元細菌からなる群から選択される少なくとも一つの硝酸還元細菌である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【請求項６】
前記活性汚泥中の嫌気性微生物の種類および量を微生物群菌叢解析で求めた場合に、硝酸還元能が報告されているDokdonella immobilis（ドクドネラ イモビリス）、Methyloversatilis universalis（メチロバーサチリス  ユニバーサリス）、Methylophilus sp. （メチロフィラス属細菌）、Azohydromonas lata（アゾヒドロモナス ラタ）、Fluviicola taffensis（フルヴィコラ タフェンシス）、Dyella sp. （ディエラ属細菌）、および、Caldimonas hydrothermale（カルディモナス  ヒドロサーマレ）からなる群から選択される少なくとも一つの細菌微生物が処理装置稼働期間中に有意に増加する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性条件でＭＢＲ（Membrane Bioreactor、膜分離活性汚泥法）を用いる嫌気性膜分離活性汚泥装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機物を含む排水の処理方法では、ＭＢＲ（膜分離活性汚泥法）が知られている。具体的には食品工業、し尿処理等の排水処理方法において、活性汚泥中にろ過膜を浸漬し、処理水を引き抜く方法であり、ろ過膜は空気のバブリングによって攪拌、洗浄される。
【０００３】
製鉄所のステンレス製造工程において、ステンレス鋼板表面を酸洗浄する工程がある。洗浄排水にはアンモニア態窒素および硝酸性窒素を含むため、所内の専用排水処理設備にて窒素を除去し、協定値以下の水質まで浄化したことを確認した後に公共海域へ処理水を放流している。窒素除去に関しては微生物の働きを利用した生物処理を用いる方式が一般的である。
【０００４】
従来のステンレス洗浄廃水の処理方法は、図６に生物処理フロー図で示すように、原水槽、反応槽、調整槽、沈殿槽および原水槽を用いて前処理する。前処理ではｐＨ調整剤、凝集剤等を用いて原水中の被沈殿物を沈殿させ、できるだけ除去し、得られた上澄みの原水を原水槽に得る。
前処理された原水は、原水槽から硝化槽、脱窒槽、再曝気槽をへて沈殿槽から上澄みを得て処理水として外部に排出される。前処理された原水は、硝化槽で硝化して硝酸窒素（ＮＯ３−Ｎ）または亜硝酸窒素（ＮＯ２−Ｎ）にして、脱窒槽でメタノール等の水素、有機物を添加して脱窒菌による生物処理を行ない、図２に化学式で示す脱窒工程を行ってＮ2ガスにする。脱窒工程の後には多すぎるメタノールを除去する再曝気槽、沈殿槽をへて処理水を得る。
このような従来の生物処理では以下の問題点があった。
１）清澄な水質が得られないリスクがある。
生物処理における活性汚泥を反応槽内に保持するため沈殿池（沈殿槽）で活性汚泥を沈降分離し、反応槽へ返送する。そのため汚泥の沈殿が不十分であった場合にはキャリーオーバー（汚泥の流出）が発生し、処理水質の懸濁物質量が増加する懸念がある。
２）広大な設置面積が必要となる。
上記した通り、生物処理では活性汚泥との沈降分離のため沈殿池（沈殿槽）を設置することが一般的である。そのため適切な沈降時間を稼ぐためには一定以上の設置面積が必要となる。
３）維持管理が困難。
設備数が多くなることから管理項目が多い。また単純な凝集沈降処理とは異なり、生物量および汚泥量の管理が必要となる。
【０００５】
特許文献１には、「リン酸カルシウムを含有する被処理水を活性汚泥により生物学的に処理する生物処理工程が実施され、活性汚泥を含有する水を膜分離する生物処理方法であって、水のｐＨを特定範囲に調整する方法（請求項１）」が記載されている。被処理物は無機物粒子や、有機化合物などが含有される水で、「所定のｐＨ範囲に調整されることでリン酸カルシウム粒子などの無機物粒子を溶解させた状態で膜分離を実施できる（特許文献１［００３８］参照）。」ことが記載されている。また、膜分離装置５１の下方の散気装置５２から酸素を含む気体（例えば空気）を供給することも記載されている（特許文献１［００２２］参照）。
【０００６】
特許文献２には、好気性処理と嫌気性処理とを交互にまたは間欠的に行う処理装置において、好気性気体において酸素を貧化して嫌気性気体として供給し循環利用する方法が記載され、嫌気性気体で分離膜を洗浄する方法が記載されている。この方法は好気性処理を行わずに嫌気性処理をする方法には適用できない。
【０００７】
一方、窒素除去を目的としたＭＢＲの適用は困難であると考えられてきた。膜分離装置では一定時間または連続的に膜表面を洗浄し、膜の目詰まりを防止する処置が必須である。一般的には空気を膜表面に吹きかけるまたは下部から吹き込む等の手段が用いられる。しかし、嫌気性条件を維持するためには低酸素濃度状態である必要があるため、空気を吹き込む行為と相反するため、嫌気性を維持しつつ膜による固液分離を実施することは困難であった。嫌気条件で活性汚泥により生物処理する装置および・または嫌気条件で活性汚泥と処理水とを膜分離する装置は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４６１２０７８号公報
【特許文献２】特開２０００−１１７２７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、これまで、し尿や食品工場などの有機物含有排水を処理するのに一部嫌気条件を含む好気条件で使われてきたＭＢＲを、嫌気条件で稼働し嫌気性細菌を用いる嫌気性膜分離活性汚泥装置を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の課題は、以下の装置および方法で解決できる。
（１）嫌気性微生物を含む活性汚泥によって生物処理を行う反応槽と、反応槽内部の活性汚泥を不活性ガスで攪拌する散気管と、生物処理後の処理水を膜分離して膜処理水を得る膜分離槽とを有する硝酸性窒素を含有する廃水の処理を行う嫌気性膜分離活性汚泥装置。
（２）さらに、前記膜表面を不活性ガスで洗浄する膜洗浄手段を有する（１）に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
（３）さらに、原水流入口と反応槽と膜分離槽と膜処理水流出口とを有し、不活性ガス供給手段から不活性ガスを散気管を経由して反応槽および膜分離槽とに供給し、装置内を嫌気性に維持して、供給された不活性ガスを排出する不活性ガス排出管を有する（１）または（２）に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
（４）前記不活性ガスを窒素とする（１）ないし（３）のいずれか１に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
（５）前記活性汚泥中に存在する嫌気性微生物が、Xanthomonadaceae（キサントモダセアエ）科のDokdonella（ドクドネラ）属に属する硝酸還元細菌、 Rhodocyclaceae（ロドサイクラセアエ）科のMethyloversatilis（メチロバーサチリス）属に属する硝酸還元細菌、 Methylophilaceae（メチロフィラセアエ）科のMethylophilus（メチロフィルス）属に属する硝酸還元細菌、 Burkholderiales（バークホルデリアレス）目のAzohydromonas（アゾヒドロモナス）属およびCaldimonas（カルディモナス）属に属する硝酸還元細菌、並びにFlavobacteriia（フラボバクテリイア）綱のFluviicola（フルヴィコラ）属に属する硝酸還元細菌からなる群から選択される少なくとも一つの硝酸還元細菌である、（１）ないし（４）のいずれか１に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
（６）前記活性汚泥中の嫌気性微生物の種類および量を微生物群菌叢解析で求めた場合、硝酸還元能が報告されているDokdonella immobilis（ドクドネラ イモビリス）、Methyloversatilis universalis（メチロバーサチリス  ユニバーサリス）、Methylophilus sp. （メチロフィラス属細菌）、Azohydromonas lata（アゾヒドロモナス ラタ）、Fluviicola taffensis（フルヴィコラ タフェンシス）、Dyella sp. （ディエラ属細菌）、および、Caldimonas hydrothermale（カルディモナス  ヒドロサーマレ）からなる群から選択される少なくとも一つの硝酸還元細菌が処理装置稼働期間中に有意に増加する（１）ないし（５）のいずれか１に記載の嫌気性膜分離活性汚泥装置。
【００１１】
（７）硝酸性窒素を含有する被処理水を、嫌気性微生物を含む活性汚泥を不活性ガスで攪拌しながら、生物処理を行う工程と、生物処理後の処理水を膜分離して膜処理水を得る工程とを有する、嫌気性膜分離活性汚泥方法。
（８）前記不活性ガスが、さらに、膜表面を洗浄する（７）に記載の嫌気性膜分離活性汚泥方法。
（９）前記硝酸性窒素を含有する被処理水が、ステンレスの酸洗処理排水である（７）または（８）に記載の嫌気性膜分離活性汚泥方法。
（１０）前記不活性ガスが鉄鋼製造工程で得られる酸素プラントの副産物である窒素ガスである（７）ないし（９）のいずれか１に記載の嫌気性膜分離活性汚泥方法。
（１１）本発明の上記方法または装置は、好ましくは、略密閉装置であり、後に説明する高純度な窒素ガス{ガス中の酸素濃度は好ましくは10,000ppm（１vol%）未満、より好ましくは1,000ppm（0.1 vol%）未満}を、装置の外から導入して膜洗浄後は外部に放出するのが好ましい。生物処理水を膜分離して膜表面を洗浄する不活性ガスは、好ましくは上記の高純度窒素ガスを外部から導入するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の嫌気性膜分離活性汚泥装置は、窒素除去に膜分離活性汚泥法を用いることができるので、以下の少なくとも一つの効果を得ることができる。
１）処理水を完全な固液分離した状態で得られる。
膜分離を用いるので活性汚泥を処理水から完全に除去することが可能である。そのため汚濁物質の除去性能が従来の沈降処理方式よりも向上し、懸濁物が含まれない極めて清澄な処理水が得られる。または懸濁物質中に含まれる窒素およびリン、有機物などの汚濁物質の高度な除去が期待できる。
２）施設の設置面積を縮小できる。
従来の活性汚泥法に必要であった最終沈殿池などの処理工程を省略することができるため、設置スペースを大幅に削減できる。また建設コストの削減に寄与できる。
３）運転管理が容易
最終沈殿池がないためバルキング（汚泥が沈降しにくくなり、清澄な水が取得しにくくなる現象）や汚泥界面に注意を払う必要がなく汚泥管理の負担がなくなる。また、主要な運転管理項目は自動計測による透過水量や膜差圧であることから自動制御運転を取り入れやすく運転管理が容易である。
４）発生汚泥量の削減、高濃度処理、処理時間の短縮
最終沈殿池がないため、汚泥のキャリーオーバーが発生しない。そのため生物量を高く維持できることにより汚泥滞留時間が長いことから，汚泥の自己分解により発生する発生汚泥量の削減が期待できる。また生物量が高いことから高濃度廃液に対応することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例に用いた本発明の嫌気性膜分離活性汚泥装置の実験装置を説明する模式図である。
【図２】脱窒工程の概要を示す模式図である。
【図３】実施例の実験期間中のＴＮ（硝酸性全窒素）量と、全有機炭素量との推移を示すグラフである。
【図４】実施例の実験期間中の細菌優占種のうち増加した９種の内２種の推移（相対増加量）およびＴＮ（硝酸性全窒素）量の推移の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例で増加した９種の細菌のうち、denovo25716以下の７種について、相対存在量のスケールを拡大して図４に示すＴＮ（硝酸性全窒素）量の推移と共に示すグラフである。ＴＮ（硝酸性全窒素）量のスケールは図４と同じである。
【図６】従来の生物処理を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に図１を用いて本発明の装置を説明するが、図面は１例であり、本発明の装置は図面に記載された構造に限定されない。
【００１５】
本発明の装置は、嫌気性微生物を含む活性汚泥２によって生物処理を行う反応槽３と、反応槽３内部の活性汚泥２を不活性ガスでバブリング管５から攪拌する散気管６と、生物処理後の処理水を膜モジュール９で膜分離して膜処理水２５を得る膜分離槽８とを有する、硝酸性窒素を含有する廃水の処理を行う嫌気性膜分離活性汚泥装置１０である。活性汚泥２を攪拌する不活性ガスは装置内を嫌気状態に維持する。不活性ガスは、酸素を含まないガスで細菌に害を及ぼさないガスであれば特に限定されないが、窒素、アルゴン、ヘリウム等が例示でき、これらの混合物でもよい。不活性ガスの中でも高純度な窒素ガスが好ましく、その際の酸素濃度は10,000ppm（１vol%）未満、望ましくは1,000ppm(0.1 vol%)未満の高純度な窒素ガスを用いることが好ましい。このような高純度な窒素ガスは、空気から深冷分離法、ＰＳＡ分離法、膜分離法等で得ることができる。特に、深冷分離法は100ppm(0.01 vol%）以下の高純度窒素を大量に発生させることができ好適である。また深冷分離法によるガス製造装置は、製鉄所のような精錬に酸素ガスを大量に必要とする工場では好適に使用されており、その際に副産物として大量の高純度窒素が発生するので好適である。
さらに、本発明の装置は、膜表面を不活性ガスで洗浄する膜洗浄手段７を有するのが好ましい。膜洗浄手段７は、膜表面を洗浄して膜表面を清澄に保ち、膜モジュール９および膜分離槽８内をより嫌気性に維持する。
本発明の装置はまた、さらに原水の流入口２１と反応槽３と膜分離槽８と膜処理水２５の流出口２２とを有し、不活性ガス供給手段４から不活性ガスを散気管６を経由して反応槽３および膜分離槽８とに供給し、装置内を嫌気性に維持して、好ましくは供給された不活性ガスを排出する不活性ガス排出管１４を有する嫌気性膜分離活性汚泥装置１０である。
本発明の装置は全体が覆われていれば空気の混入が避けられ容易に嫌気条件で排水処理できるので好ましい。反応槽３は、さらに第２反応槽１３を具えてもよく、さらに反応槽および膜分離槽を２以上具えてもよい。
流入口２１は、メタノール（基質）の流入口を兼ねてもよく、別にメタノール流入口１２を具えてもよい。
膜モジュール９で膜処理水２５を引き抜かれた活性汚泥は返送汚泥として返送管１５を経由して流入口２１から反応槽３に戻される。返送管１５中の返送汚泥の一部は好ましくは（図示しない）汚泥貯槽に送られて微生物が死滅している部分が廃棄されてもよいし、追加の活性汚泥が追加されてもよい。
複数の反応槽の間、反応槽と膜分離槽との間は、それぞれ必要な構造を持つ連通管１７、１７で連通されている。
【００１６】
本発明の嫌気性膜分離活性汚泥方法を、以下に説明する。本発明の方法は、上記の本発明の排水処理装置を用いてもよいがこれに限定されない。
本発明の方法は、硝酸性窒素を含有する被処理水を、活性汚泥を不活性ガスで攪拌しながら、嫌気性微生物を含む前記活性汚泥によって生物処理を行う工程と、生物処理後の処理水を膜分離して膜処理水を得る工程とを有する、嫌気性膜分離活性汚泥方法である。
本発明の被処理水は、窒素を除去する観点からは有機物を含んでいることが好ましい。
本発明の装置を用いればメタノール等の有機物を少量添加して、ＴＯＣ（全有機炭素濃度）の含有量が少ない工業排水でも硝酸性窒素を含有する被処理水から窒素を窒素ガスにして除去することができる。
不活性ガスを用いる本発明の装置は、後に実施例で説明するように、ＴＯＣ（全有機炭素濃度）の含有量が少ない工業排水でも脱窒菌を増やすことができる。例えば、ＴＯＣ（全有機炭素濃度）の含有量が５００ｍｍｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１００ｍｍｇ／Ｌ以下、の被処理水を有効に処理できる。
本発明の方法に用いる不活性ガスが、さらに、膜表面を洗浄することが好ましい。
硝酸性窒素を含有する被処理水は、ステンレスの酸洗処理排水を用いてもよい。処理される原水が硝酸性窒素ではなくその他の窒素を有する場合は、公知の硝酸性窒素を有する処理水を得る前処理を本発明の嫌気性膜分離活性汚泥方法の前に行ってもよいし、硝化槽を用いて硝化を行ってもよい。
用いる不活性ガスは、窒素、アルゴン、ヘリウム等が例示でき、これらの混合物でもよい。鉄鋼製造工程で得られる酸素プラントの副産物である窒素ガスを用いれば、高純度窒素ガスを用いる必要がなく安価で嫌気条件に維持して排水処理することができる。不活性ガスの吹き込み量は、反応槽の容量１０Ｌに対して例えば５〜１０Ｌ／ｍｉｎ．の比率で吹き込むことができる。
【００１７】
本発明の方法では、不活性ガスを散気管を通じて反応槽および膜分離槽に供給する本発明の活性汚泥装置を用いてもよい。不活性ガスには窒素を使用するのが好ましい。図１に例示する処理装置は反応槽３、第２反応槽１３、固液分離をする膜分離槽の三槽から構成される。反応槽３には処理される廃水および水素供与体となるメタノールを供給し、反応槽３、第２反応槽１３において活性汚泥による脱窒素処理を実施する。膜分離槽内に固液分離装置である膜モジュール９を浸漬させ、膜分離槽内で膜分離後の処理水と活性汚泥に分離する。
【００１８】
反応槽内の活性汚泥の攪拌および好ましくは膜モジュールの膜洗浄を実施するために窒素ガスを散気管で供給する。反応槽３においては活性汚泥１０Ｌに対して５〜１０Ｌ/ｍｉｎの範囲で反応槽下部から曝気（バブリング）する散気管が好ましく用いられる。膜洗浄する不活性ガスは膜表面と平行に噴射されることが好ましく、有効膜面積０．０１２ｍ２に対して窒素ガスを１０Ｌ/ｍｉｎ以上で供給されることが好ましい。膜洗浄処理は間欠運転とし、例えば９ｍｉｎ．処理水の引き抜きを実施し、その後１ｍｉｎ．は処理水の引き抜きを停止し洗浄時間とする間欠処理が例示できる。
【００１９】
本発明の活性汚泥装置または本発明の活性汚泥方法を実施する適切なタイミングで、活性汚泥中の微生物を解析することで嫌気性微生物、特に硝酸還元細菌が十分作用し処理水の窒素除去のＭＢＲが有効であることを確認することができる。微生物の解析には特に制限はないが、「次世代シークエンサ」と呼ばれる、高機能シークエンサを用いることが好ましい。次世代シークエンサでは、配列表の配列番号１〜９に記載の塩基配列を登録することで、微生物の同定およびその相同性検索を一度に大量に行うことができ、さらに、短時間に行うことができる。このような次世代シークエンサとしては特に制限はないが、例えば、Illumina社製のMiSeq等を用いることができ、その検出としては、付属説明書に従って実施することができる。ただし、より正確かつ詳細な系統学的情報の取得には、ＰＣおよび解析ソフトウェアを用いることが好ましい。なお、前記解析ソフトウェアとしては、例えば、実施例にて後述する各種ソフトウェアを用いることができる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
図１に示す本発明の嫌気性膜分離活性汚泥装置１０を用いて、硝酸性窒素を含有する被処理水の窒素除去を目的に実験を実施した。被処理水は製鉄所のステンレス製造工程において、ステンレス鋼板表面を酸洗浄した洗浄排水を用いた。不活性ガスは窒素ガスを用いた。
活性汚泥量：２８Ｌ
返送汚泥量：２８Ｌ/日
被処理水供給量：１．２５Ｌ/日
水理学的滞留時間：６日
曝気量は反応槽３で、５ Ｌ/ｍｉｎ、反応槽１３で、５Ｌ/ｍｉｎ．、膜分離槽１０Ｌ/ｍｉｎ．で実施した。
運転パターンは、処理水引き抜き時間９ｍｉｎ、処理水停止時間１ｍｉｎ．の間欠運転とした。メタノール添加量は、：１７μＬ/ｍｉｎ．、３４μＬ/ｍｉｎ．とした。
【００２２】
実験は図４に示すように５月２７日を０日目とし、２８日に実験を開始し、６月２３日（２７日目まで）での細菌種の推移を評価した。メタノール添加は図３に示すように６日目から最初の量を連続して添加し、２２日目に増量してそれぞれ連続して添加した。実験期間中の処理装置内のＤＯ（溶存酸素量）は、反応槽３、第２反応槽１３、および膜分離槽８全てにおいて０．５ｍｇ/Ｌ以下となり、窒素曝気による処理装置内の嫌気状態を維持できていた。活性汚泥の指標であるＭＬＳＳ（活性汚泥浮遊物(Mixed Liquor Suspended Solids)量）は３０００〜４５００ｍｇ/Ｌ内で維持されていた。
反応槽内の曝気は活性汚泥を循環させる用途にも用いられ、本発明の窒素曝気においても活性汚泥は処理装置下部に沈降することなく、空気曝気と同様の撹拌性能を確認できた。また膜分離槽の膜表面においても空気曝気と同様の膜洗浄性能が確認できた。
【００２３】
図３に膜分離槽で固液分離された処理液中の硝酸性窒素（ＴＮ）と全有機炭素（ＴＯＣ）濃度の推移を示す。実験開始６日目より廃水中の窒素除去を行うためメタノールの供給を開始した。メタノール投入直後は硝酸性窒素の変化は確認できず、メタノールが処理装置内に残留したためＴＯＣが増加した。図４にメタノール添加後の硝酸性窒素（ＴＮ）の量を●で示す。メタノール添加後、６月１５日にはＴＮ値はピーク近くになった。その後ＴＯＣの減少に伴い硝酸性窒素は急激に低下した。その後、更なる硝酸性窒素除去を目指し、メタノール投入量を３４μｌ/ｍｉｎ．に増加した。メタノール投入量変更から４日後には、硝酸性窒素を完全に除去することができ、嫌気性ＭＢＲによる窒素除去は可能であることがわかった。図３に示すように全有機炭素はメタノール添加の１、２日後までほぼ０であり、メタノール添加により急上昇して１５日目でほぼピークに達し、２０日目から急激に減少したので２２日目にメタノール添加量を増加した。硝酸性窒素の低下に伴いＴＯＣが減少していることから、生物による消費が安定的に行われていることが考えられる。メタノールの添加は１７μＬ/ｍｉｎ．で前半連続して添加し、後半で３４μＬ/ｍｉｎに増加されて実験期間中続けた。
【００２４】
原水の水質は、ｐＨ７、全硝酸性窒素量（ＴＮ ）6300mg/L 、全有機炭素（ＴＯＣ）23 mg/Lであった。
【００２５】
この結果から実験中の生物処理状態を考察するため、実験期間中の微生物群菌叢解析を行った。
〔微生物群解析〕
ここで前記次世代シークエンサでの前記微生物叢解析は、以下の手順で行った。
先ず、遠心分離により得た活性汚泥の汚泥サンプル（遠心沈殿物）に対して、平均粒子径が０．１ｍｍのジルコニアとシリカの混合ビーズ（Zirconia/Silica Beads）を加えた状態で、ビーズビータ（バイオメディカルサイエンス社製、Shake Master）に供し、前記汚泥サンプルに含まれる前記微生物の細胞を破砕する。
次いで、得られた細胞破砕液から、フェノール・クロロホルム抽出法により染色体ＤＮＡを抽出・精製する。
次いで、前記染色体ＤＮＡの16S rRNAをターゲットにしたユニバーサルプライマーを基に、Illumina社製のMiSeq用バーコード配列を付加した下記参考文献１に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ（Polymerase  Chain Reaction）法による前記16S rRNA遺伝子の増幅を行った。
参考文献1：J Gregory Caporaso et al.、The ISME Journal(2012)6,(1621-1624)
【００２６】
得られたＰＣＲ増副産物をAMPure磁気ビーズ（Beackmann coulter社製、A63881）および精製用マグネットスタンド（Beackmann coulter社製、A32782）を用いて未反応のプライマーおよびプライマーダイマーを除去し、次いで、得られた精製産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、スピンカラム（Promega社製、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System）を用いて目的の断片長を有するＰＣＲ増副産物のみを精製した。
次いで、前記ＤＮＡサンプルにおけるＤＮＡ濃度をＤＮＡ染色用蛍光試薬キットQuant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo scientific製、P11496）および微量用傾向スペクトロメータ（Thermo scientific製、NanoDrop 3300）を用いて定量し、必要量をMiSeq Reagent Kits v2（Illumina社製、MS-102-2001）に供し、前記次世代シークエンサによるＤＮＡ配列解析を行った。
その結果、前記ＤＮＡサンプルのそれぞれから50,000〜100,000 reads程度の配列データが取得された。
取得された前記配列データについて、ソフトウエアea-utils-1.1.2-301（インターネット上で入手可能なフリーソフト）を用いて遺伝子配列情報の連結を行い、さらに、ソフトウエアMothur version1.31.2を用いてキメラ配列を除去した後、ソフトウエアQIIME version1.6.0により遺伝子配列の系統学的解析を行い、各微生物種の相対存在率の増減と前記物理化学的パラメータとの関係性を考察した。なお、ソフトウエアMothur version1.31.2の詳細については、下記参考文献2を参照でき、ソフトウエアQIIME version1.6.0の詳細については、下記参考文献3を参照することができる。
参考文献2：Schloss P.D et al.,Appl.Environ.Microbiol（2009）75,7537-7541
参考文献3：Caporaso H.G et al.,Nat.methods（2012）7,335-336.
【００２７】
結果を全窒素量と共に図４および図５に示す。活性汚泥中に常在の嫌気微生物として硝酸還元細菌が存在することが分かった。さらに、実験終了時（６月２３日）に最も優占化した微生物２０種のうち、硝酸が減少する実験開始から１９日目から２７日目の時期に、それらの近縁種で硝酸還元能が報告されているDokdonella immobilis（ドクドネラ イモビリス）に近縁な２種、Methyloversatilis universalis（メチロバーサチリス  ユニバーサリス）１種およびそれに近縁な１種、Methylophilus sp.（メチロフィラス属細菌）に近縁な１種、Azohydromonas lata（アゾヒドロモナス ラタ）に近縁な１種、Fluviicola taffensis（フルヴィコラ タフェンシス）に近縁な１種、Dyella sp. （ディエラ属細菌）に近縁な１種、および、Caldimonas hydrothermale（カルディモナス ヒドロサーマレ）に近縁な１種の微生物量が有意に増加していることが分かった（増加率：１．７倍〜４８．３倍）。これらの９種の特定に使用した塩基配列を配列表の配列番号１〜９に示す。各配列はデータベースによる。すなわち、これらの硝酸還元細菌が蓄積していたメタノールの酸化分解とそれに共役する硝酸の還元分解に関与しており、活性汚泥中からの硝酸性窒素の除去に寄与していることを示唆していた。
６月２３日での優占細菌種の相対存在量（relative abundance(%)）とその増加量（hold change）を以下の表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
表１は優占種２０の種の内、全硝酸性窒素（ＴＮ)の減少に伴い（６月１５日の量に比較して６月２３日に）相対存在量が有意（P<0.05)に増加した細菌種９種の測定結果を示している。図４に実施例の実験期間中の細菌優占種のうち増加した９種の内２種の推移を示す。図５にはそのうち７種の相対存在量のスケールを拡大したグラフを示す。表１は９種について６月１５日の存在量に対する６月２３日の存在量を増加率の欄に示し、増加率が１．７倍〜４８．３倍であったことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
従来、窒素除去を目的としたＭＢＲの適用は困難であるとされてきた。その理由は、嫌気性条件を維持するためには低酸素濃度状態である必要があるため、活性汚泥の攪拌や膜洗浄のために空気を吹き込む行為と相反するため、嫌気性を維持しつつ膜による固液分離を実施することは困難であった。
本発明では初めてこの問題を解決し、嫌気性条件を維持しつつ排水処理においてＭＢＲへの適用を可能とした嫌気性膜分離活性汚泥装置が提供でき、今後の産業上の発展が期待でき有用性が高い。本発明の嫌気性膜分離活性汚泥方法は、嫌気条件で膜分離法を用いて排水処理ができるので広大な沈殿槽の設備が不要となり、工場排水の脱窒処理がＭＢＲで有効にできるので産業上の有用性が高い。
【符号の説明】
【００３１】
２・・活性汚泥、３・・反応槽、４・・不活性ガス供給手段、５・・バブリング管
６・・散気管、  ７・・膜洗浄手段、  ８・・膜分離槽、９・・膜モジュール、
１０・・嫌気性膜分離活性汚泥装置    １１・・原水、  １２・・メタノール
１３・・第２反応槽、１４・・不活性ガス排出管、  １５・・返送管、
１７・・連通管、      ２１・・流入口、２２・・流出口、２５・・処理水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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