(57)【要約】【課題】サンプルプレートに設けられた複数のウェル上のそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容されたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料を提供する。【解決手段】２以上のウェル（３８）のそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液がスポットされる。異なるウェルにスポットされた２以上の試料溶液は、ウェル上へのスポットの前後の少なくとも一方において、ウェルごとに異なる処理が行われる。異なる処理としては、同一の特定成分に対して異なるｍ／ｚを与える処理、同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える処理等が挙げられる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルプレートに設けられた複数のウェル上のそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容されたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料を調製する方法であって、
２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液がスポットされ、
異なるウェルにスポットされた同一の成分を含む２以上の試料溶液は、ウェル上へのスポット前およびスポット後の少なくとも一方において、スポット対象のウェルごとに異なる処理が行われる、分析用試料の調製方法。
【請求項２】
前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるｍ／ｚを与える２種以上の処理を含む、請求項１に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項３】
前記特定成分がジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドである、請求項２に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項４】
前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析においてジスルフィド結合が還元された成分を与える処理およびジスルフィド結合が維持される成分を与える処理を含む、請求項３に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項５】
前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える２種以上の処理を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項６】
サンプルプレートのウェル上にスポットされる試料溶液は、液体クロマトグラフィーにより分画された試料であり、
同一の成分を含む２以上の試料溶液は、液体クロマトグラフィーの溶出時間が同一または近接する試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記異なる処理は、スポット対象のウェルごとに種類および濃度の少なくとも一方が異なるマトリックスと、試料溶液とを混合する処理を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項８】
種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが、異なるウェルに収容されたサンプルプレートを準備し、
種類および濃度の少なくとも一方が異なるマトリックスが収容された２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液をスポットすることにより、前記異なる処理が行われる、請求項７に記載の分析用試料の調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の試料の調製方法に用いられるＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用サンプルプレートであって、
種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが、異なるウェルに収容されている、サンプルプレート。
【請求項１０】
１枚のサンプルプレート上の異なるウェルに、種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが収容されている、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用サンプルプレート。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により調製された分析用試料を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析することを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、ピークのｍ／ｚの相違、およびピーク強度の相違の少なくともいずれか一方に基づいてＭＳｎ分析対象試料を選別し、
選別された分析対象試料のＭＳｎ分析を実施する、請求項１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、同一の成分のｍ／ｚが相違する試料をＭＳｎ分析対象試料として選別する、請求項１２に記載の分析方法。
【請求項１４】
異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、同一の成分のピーク強度が最も高い試料をＭＳｎ分析対象試料として選別する、請求項１２または１３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法により質量分析を行うための試料の調製方法、および調製された試料の分析方法に関する。さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料の調製に用いられるサンプルプレートに関する。本発明は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ質量分析装置（ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の研究や医療、医薬品開発等の分野において、質量分析によりタンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析が盛んに行われるようになっている。質量分析では、イオン化された試料を質量および電荷に基づいて分離する。第一段階で分離されたイオンを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）等によりフラグメント化し、さらに質量分析を行う多段の質量分析（ＭＳｎ分析）は、タンパク質やペプチドの質量だけでなく、様々な構造情報を得ることができる。
【０００３】
質量分析における試料のイオン化法として、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法やマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法等が実用化されている。ＭＡＬＤＩ法は、マトリックスの選択により様々な生体分子の分析が可能であることや、ＥＳＩ法よりも少量の試料や低純度の試料でも分析が可能であるとの利点を有する。
【０００４】
多くの成分を含む生体試料を網羅的に解析するために、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析（ＭＳ）とを組み合わせた分析手法が用いられている。ＬＣとＥＳＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳでは、試料溶液中のタンパク質やペプチド等の試料成分を直接的にイオン化することが可能であるため、前段のＬＣからＭＳへの試料導入が自動化されている。一方、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、試料をイオン化するために、液体試料をマトリックスと混合する必要がある。そのため、ＬＣとＭＡＬＤＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、ＬＣで分離された試料をその溶出の時間順序に従って分画し、スポッティング装置によりサンプルプレート上の異なるウェルにスポットする。この際サンプルプレートのウェル上にあらかじめマトリックスを収容しておくか、試料のスポット時にマトリックスを添加することにより、ウェル上で試料とマトリックスとが混合される。その後、サンプルプレートをＭＡＬＤＩ質量分析装置にセットし、各サンプルに対する質量分析を順次行うことにより、マススペクトルが得られる。
【０００５】
多くの成分を含む生体試料の解析には、ＭＳの前段として高分離能のＬＣを利用することが有用である。ＬＣの分解能を高めることにより、１つの分画に含まれる成分の数を減少させ、ノイズ要因の少ない良好なマススペクトルが得られる。タンパク質やペプチド等の微量のサンプルの質量分析の感度を向上するために、微小流量でも安定した分離を実現可能なナノＬＣ技術も実用化されている。
【０００６】
一方、ＬＣの分解能を高めると、試料の分画数（サンプルプレートのウェル上にスポットされる試料の数）が多くなるため、質量分析に要する時間が長くなり、データの解析も複雑となる。このような問題を解決するために、ＬＣでの保持時間やＭＳでの質量等の先験情報に基づいて、ウェルにスポットする分画試料を選別する方法や、ＭＳの解析対象を選別する方法が提案されている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１７８１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先験情報に基づく分析対象の選別は、分析対象のタンパクやペプチドのＬＣ溶出時間等が未知の場合には、適用できない。また、ナノＬＣは、溶出時間に非線形の歪が生じやすく、正確な溶出時間の予測が困難であるため、分析対象の分画数を十分に絞り込むことは容易ではない。特に、ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ＬＣによる分離と質量分析とがオフラインであるため、マスクロマトグラムを確認しながらＬＣ条件の調整や分取分画の選択を行うことができず、分析条件の調整に試行錯誤が求められる場合が多い。また、ＭＡＬＤＩ法では、マトリックスの種類や濃度が異なると試料のイオン化効率が変化するため、マトリックスを最適化するための知見や予備実験を要する場合が多い。
【０００９】
上記のように、ＭＡＬＤＩ法は、高分子量のタンパク質をそのまま分析可能であるため、ＥＳＩ法に比べて試料の前処理が簡便であり、分析対象に関する多くの情報を得られるとの利点を有する。その反面、マトリックスの種類および濃度の最適化や、分析対象とするＬＣ分画の選別に試行錯誤を要することが多く、分析条件の設定が煩雑となりやすい。
【００１０】
上記に鑑み、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおけるマトリックスの選択や、分析対象の選択を容易に行い得る分析用試料の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、サンプルプレートに設けられた複数のウェル上のそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容されたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料の調製方法に関する。分析用試料は、サンプルプレート上の２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液がスポットされている。異なるウェルにスポットされた同一の成分を含む２以上の試料溶液は、ウェル上へのスポット前およびスポット後の少なくとも一方において、スポット対象のウェルごとに異なる処理が行われる。
【００１２】
ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行う場合、液体クロマトグラフィーにより分画された試料をサンプルプレートのウェル上にスポットすればよい。液体クロマトグラフィーの溶出時間が同一または近接する試料は、同一の成分を含む。そのため、２以上の異なるウェルにスポットするための試料溶液を容易に調製できる。
【００１３】
スポット対象のウェルごとに行われる異なる処理としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるｍ／ｚを与える２種以上の処理や、同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える２種以上の処理が挙げられる。
【００１４】
例えば、特定成分がジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドである場合、ジスルフィド結合が還元された成分を与える処理およびジスルフィド結合が維持される成分を与える処理を行えば、同一のタンパク質またはペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析においてｍ／ｚの異なるピークが得られる。
【００１５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える処理としては、スポット対象のウェルごとに種類および／または濃度が異なるマトリックスを用い、試料溶液と混合する処理が挙げられる。種類および／または濃度が異なるマトリックスを用いて、ｍ／ｚの異なるピークが得られるように処理を行ってもよい。
【００１６】
種類および／または濃度が異なる２以上のマトリックスを用いる場合、異なるマトリックスが、異なるウェルに収容されたサンプルプレートを利用できる。マトリックスが収容されたウェル上に試料溶液をスポットすることにより、マトリックスと試料溶液との混合を行い得る。なお、異なる２以上のマトリックスは、１枚のプレートのウェルに収容されていてもよく、２枚以上のプレートのウェルに収容されていてもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、上記で調製された分析用試料の分析を実施する分析方法に関する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（一段のＭＳ）分析により得られたマススペクトルの解析において、異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比する。同一の特定成分に対して、２種以上の異なる処理が行われている場合、これらの試料のマススペクトルは、特定成分のピークのｍ／ｚおよび／またはピーク強度が相違する。この対比結果に基づいて、ＭＳｎ分析の対象とする試料（ウェル）を選別できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、同一の特定成分に対して異なる処理を実施した２以上の試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を実施し、マススペクトルの対比を行うことにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおけるマトリックスの選択や、分析対象の選択を容易に行い得る。また、特定成分のＬＣ溶出時間や質量等の先験情報がない場合でも、マススペクトルの対比結果に基づいてＭＳｎ分析対象試料を容易に選定できる。分析対象試料を選定してＭＳｎ分析を実施することにより、分析に要する時間を短縮できるとともに、データの解析が容易となる。マススペクトルの対比結果に基づいて、ピーク強度の大きい試料をＭＳｎ分析対象として選別すれば、Ｓ／Ｎの高い良質の分析結果が得られるため、分析精度を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置の構成概略図である。
【図２】ウェル上に複数種のマトリックスが収容されたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの一形態を表す概念図である。
【図３】複数のサンプルプレート上に溶出液をスポットするためのスポッティング装置の構成概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明に用いられるＬＣ／ＭＳ装置の一形態の概略構成図である。ＬＣ／ＭＳ装置は、液体試料中の各種成分を保持時間に応じて分離するＬＣ部１０と、ＬＣ部で分離された成分を含む試料を分取・分画してサンプルプレート上のそれぞれ異なるウェル上へスポットするスポッティング装置２０と、サンプルプレート上にスポットされた分画試料をイオン化して質量分析を実行する質量分析部４０とを備える。
【００２１】
ＬＣ部１０は、移動相が貯留された移動相容器１１と、移動相中に試料を注入するインジェクタ１３と、カラム１５とを備える。移動相容器１１中の移動相は、不図示の送液ポンプにより一定流速でカラム１５に送液される。カラム１５は、移動相に乗って導入される試料中の各種成分を時間方向に分離して溶出する。
【００２２】
スポッティング装置２０は、カラム１５からの溶出液を所定の時間間隔で分画し、分注ヘッド２５から、スポッティング装置内に配置されたサンプルプレート３１上にスポットする。分注ヘッド２５は移動可能に構成されており、サンプルプレート３１上の異なるウェル３８に溶出液を順次スポットする。各ウェル３８にスポットされた溶出液は、カラム１５での保持時間が所定範囲内である溶出液を含む。すなわち、ウェル３８の位置は、ＬＣ保持時間と関連付けられている。
【００２３】
溶出液中の各成分の溶出時間には幅があるため、分画時間間隔が特定成分の溶出時間の幅よりも小さい場合には、１つの成分が位置の異なる複数のウェル３８上にスポットされる。１つのウェルへのスポット量は、例えば、０．１〜２μＬ程度である。ＬＣ部からの溶出液の量が多い場合は、カラム１５と分注ヘッド２５との間に設けられたバルブ２１を調整することにより、必要量のみを分注ヘッド２５に送液し、他の溶出液を貯液部２３へ送液してもよい。貯液部２３は、カラム１５から送液された溶出液を分画分取できるように構成されていてもよい。また、カラム１５からの溶出液を不図示の溶出液トラップに送液して貯留し、トラップに貯留された溶出液を、分析必要量のみ分注ヘッド２５へ送液して、ウェル３８上にスポットしてもよい。
【００２４】
サンプルプレートのウェル３８上では、溶出液とＭＡＬＤＩマトリックスとの混合物が得られる。ウェル上で溶出液とマトリックスとの混合物を得る方法としては、ウェル上にスポットされた溶出液上にマトリックスをスポットする方法、溶出液にマトリックスを混合してスポットする方法、ウェル上に予めマトリックスがスポットされたサンプルプレートを準備しておき、その上に溶出液をスポットする方法等がある。
【００２５】
ウェル上に試料成分を含む溶出液がスポットされたサンプルプレート３１は、質量分析部４０のステージ４１上に搬送される。スポッティング装置２０から質量分析部４０へのサンプルプレート３１の搬送操作は、搬送装置等により自動化されていてもよい。サンプルプレート３１の搬送が手動で行われる場合、スポッティング装置２０と質量分析部４０とは離れた場所に設置されていてもよい。
【００２６】
質量分析部４０は、ステージ４１上のサンプルプレート３１にレーザー光を照射するレーザー光源４２、イオンを内部に保持するイオントラップ４３、イオントラップから放出された各種イオンをｍ／ｚに応じて分離する質量分離器４５、分離されたイオンを順次検出する検出器４７等を含む。
【００２７】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析装置の多くは、飛行時間（ＴＯＦ）型の質量分析器を備えている。ＭＳ部は、イオントラップ４３に、イオンを分離する機能および衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりイオンを解離させる機能を持たせることにより、イオン選択とイオン解離とを１または複数回繰り返すＭＳｎ分析が可能である。ＭＳｎ分析を実施することにより、タンパク質やペプチド等の試料成分の質量だけでなく、アミノ酸配列や糖鎖の同定等、様々な構造解析が可能となる。
【００２８】
ＬＣ部１０、スポッティング装置２０および質量分析部４０は、各部の動作を制御する制御部や、得られたデータを処理するためのデータ処理部と接続されている。データ処理部では、ＬＣ部での溶出時間と、サンプルプレート上のウェルの位置情報との対応付けや、質量分析部の検出器４７で得られたマススペクトルデータの記憶等を行う。
【００２９】
本発明の分析方法では、サンプルプレート３１上の複数のウェルに、同一の成分を含む試料溶液（溶出液）がスポットされる。同一の成分を含む試料溶液は、スポット対象のウェルごとに２種以上の異なる処理が行われる。これにより、サンプルプレートの複数のウェル上に、同一の試料成分が異なる条件で調製された試料がスポットされた分析用試料が形成される。この試料を質量分析部４０で分析することにより、分析対象試料の確定やマトリックスの最適化等を行い得る。
【００３０】
上記処理は、ウェル上への試料溶液のスポット前およびスポット後のいずれに実施してもよい。異なる処理としては、同一の試料成分を含む試料成分を、種類および／または濃度の異なるマトリックスと混合することや、２種以上の異なる反応を行うことが挙げられる。なお、処理を行わない場合と特定の処理を行う場合も、「２種以上の異なる処理」に含まれる。
【００３１】
［第一形態］
本発明の第一形態では、特定成分のＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与える複数種のマトリックスが用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて、レーザー照射により生成するイオンの大半は１価イオン（ｚ＝１）であるため、特定成分の分子量を変化させることにより、ＭＳ分析において異なるｍ／ｚのピークが得られる。すなわち、異なるｍ／ｚを与える複数種のマトリックスとは、同一の試料成分に対して分子量の異なる成分を生成させる複数種のマトリックスの組み合わせである。このような組み合わせの典型例は、タンパク質やペプチドと反応して分子量を増加または減少させるマトリックスと、タンパク質やペプチドの分子量を変化させないマトリックスとの組み合わせである。
【００３２】
以下、特定成分がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を有するタンパク質またはペプチドである場合を例として説明する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ジスルフィド結合が残存したタンパク質やペプチド断片を試料として、マトリックスの種類を適切に選択することにより、ジスルフィド結合の有無や数を、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差としてとして検出できるため、ジスルフィド結合含有タンパク質の構造解析に適している。
【００３３】
図２は、２種類の異なるマトリックスが異なるウェルに交互に収容されたサンプルプレート３１０を示している。このサンプルプレートは、横方向に１〜１０の１０列、縦方向にＡ〜Ｆの８行、計８０個のウェルを備える。奇数列のウェル３８ａには、マトリックスとして１，５−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が収容されており、偶数列のウェル３８ｂにはマトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）が収容されている。
【００３４】
ＤＨＢは、最も一般的なＭＡＬＤＩマトリックスの１つであり、ジスルフィド結合には特段の影響を与えない。一方、ＤＡＮは試料をイオン化するための窒素レーザー照射時に還元剤として作用し、ジスルフィド結合部分を還元する。還元により、ジスルフィド結合が切断され、２つのシステイン残基の硫黄原子が水素化されるため、分子量が２Ｄａ増加する。したがって、Ｎ個のジスルフィド結合を有するタンパク質試料をＤＡＮマトリックスと混合してＭＳ分析を行うと、ＤＨＢマトリックスを用いた場合に比べてｍ／ｚが２Ｎ大きくなる（ｚ＝１の場合）。
【００３５】
横方向に並ぶウェルにＤＡＮとＤＨＢが交互に収容されたサンプルプレート３１０を、スポッティング装置２０にセットし、ＬＣ部１０からの溶出時間に沿って、試料溶液をＡ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順にウェルにスポットする。これにより、溶出試料は、ＤＡＮマトリックス上およびＤＨＢマトリックス上に交互にスポットされる。このように、マトリックスが収容されたウェル上に試料溶液をスポットすることにより、複数のウェルのそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容された分析用試料が得られる。
【００３６】
隣接するウェルには、ＬＣ溶出時間の近い試料がスポットされている。そのため、特定成分の溶出時間の幅よりも分画の時間間隔（隣接するウェル間の溶出時間の差）を小さくすれば、同一の試料成分（タンパク質またはペプチド）を含む試料溶液が、ＤＡＮマトリックスが収容されたウェルとＤＨＢマトリックスが収容されたウェルの両方にスポットされる。カラム１５からの溶出液をモニタするためのＵＶ検出器等が設けられている場合は、検出器で検出されるピーク幅を特定成分の溶出時間の幅として、同一の試料成分を含む試料溶液を複数のウェルにスポットするための分画時間間隔を設定してもよい。
【００３７】
あるいは、事前に分取した１つの分画に含まれる試料溶液を、奇数列のウェルと偶数列のウェルのそれぞれにスポットしてもよい。この場合、ＤＡＮマトリックスが収容された奇数列（２ｍ−１列）のウェルとＤＨＢマトリックスが収容された偶数列（２ｍ列）のウェルには、同一の（平均）溶出時間を有する試料溶液がスポットされる（ｍは自然数）。
【００３８】
試料溶液をスポット後のサンプルプレートを質量分析部４０にセットし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるＭＳ分析を実施する。隣接する２つのウェル（奇数列のウェルと偶数列のウェル）に、同一のタンパク質またはペプチドが含まれている場合、当該タンパク質またはペプチドがジスルフィド結合を有していなければ、２つのウェル上の試料のマススペクトルに、同一のｍ／ｚを有するピークが観測される。一方、Ｎ個のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドが２つのウェルの両方に含まれている場合、ＤＡＮマトリックスを有するウェルのマススペクトルには、ＤＨＢマトリックスを有するウェルよりも、ｍ／ｚが２Ｎ大きいピークが観測される。
【００３９】
このように、１つのプレート上に２種類のマトリックスを配置し、ＬＣ溶出時間が同一または近接する液体試料を２種類のマトリックスのそれぞれと混合し、ＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較することにより、ジスルフィド結合を含むタンパク質またはペプチドがスポットされたウェル（およびそれに対応するＬＣ溶出時間）を容易に確認できる。このようにして、ジスルフィド結合を含むタンパク質のＬＣ溶出時間が既知となるため、次回以降の分析において、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの分析対象とすべき分画の選定が容易となる。
【００４０】
上記で得られた結果に基づく知見は、次回以降の分析に利用できるのみならず、さらなる分析に供する試料の選定にも利用できる。ＭＡＬＤＩ法では、サンプルプレートのウェルに収容された試料を繰り返し分析可能である。そのため、ＤＡＮマトリックスを用いたマススペクトルとＤＨＢマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差からジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドの存在が確認されたウェルの試料を、分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。
【００４１】
例えば、ジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドの存在が確認されたウェルの試料をＭＳｎ分析対象試料として選別すれば、ジスルフィド結合を有する成分が含まれる試料に対して選択的にＭＳｎ分析（ｎは２以上）を実施できる。また、特定の数のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドをＭＳｎ分析対象試料として選別することもできる。例えば、３個のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドを特定成分として選別する場合、ＤＡＮマトリックスを用いたマススペクトルとＤＨＢマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差が６であるウェルの組み合わせを分析対象として選択すればよい。
【００４２】
ＭＳｎ分析は、分析の目的に応じて、ＤＡＮマトリックスを有するウェル上の試料に対して行ってもよく、ＤＨＢマトリックスを有するウェル上の試料に対して行ってもよい。ＤＡＮとＤＨＢの両方のマトリックス上の試料をＭＳｎ分析対象としてもよい。
【００４３】
このように、ＭＳ分析（一段の質量分析）の結果から、マトリックスの相違に起因してｍ／ｚが相違する試料群（ウェル）を抽出することにより、特定成分が含まれる分画試料のみを選択的にＭＳｎ分析に供することができる。特定成分が含まれるウェルを抽出するためのＭＳ分析により、分析対象のプリカーサイオンのｍ／ｚが既知となっているため、抽出されたウェル上の試料のＭＳｎ分析においては、分析対象のプリカーサイオンを選択的にＣＩＤ等によるイオン解離の対象とすればよい。そのため、ＭＳｎの分析対象の数を大幅に低減して、合計分析時間を短縮可能であるとともに、得られたデータの解析も容易となる。
【００４４】
ジスルフィド結合を有する試料に対して異なるｍ／ｚを与えるマトリックスの組み合わせとして、ジスルフィドの還元により分子量を増加させるＤＡＮと、分子量を増加させないＤＨＢの組み合わせを例示したが、マトリックスの種類はこれらに限定されない。分子量を増加させないマトリックスと分子量を減少させるマトリックスの組み合わせや、分子量の増加量あるいは減少量が異なるマトリックスの組み合わせ等でもよい。
【００４５】
ｍ／ｚの差を検出する特定成分は、ジスルフィド結合を有するタンパク質やペプチドに限定されず、マトリックスの種類を変更することにより、ＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるものであればよい。
【００４６】
例えば、マトリックスとして３−アミノキノリン／ｐ−クマル酸（３−ＡＱ／ＣＡ）を用いると、一般的な固体マトリックスよりもソフトなイオン化が可能であり、リン酸や糖鎖等の翻訳後修飾基の脱離が抑制される傾向がある。そのため、糖ペプチドやリン酸化ペプチドを分析対象（ｍ／ｚの差を検出すべき特定成分）とする場合、異種のマトリックスとして３−ＡＱ／ＣＡと、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）等の一般的な固体マトリックスを用いると、ＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルは、前者のマトリックスでは翻訳後修飾基が残存したタンパク質またはペプチドのピークが主となるのに対して、後者のマトリックスでは翻訳後修飾基が脱離したタンパク質またはペプチドのピークが主となる。例えば、１個のリン酸基が脱離すると分子量が９８Ｄａ減少し、1個のシアル酸が脱離すると分子量が２９１Ｄａ減少するため、これらの分子量の差が、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差として現れる。３−ＡＱ／ＣＡマトリックスを用いたマススペクトルとＣＨＣＡマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差に基づいて、糖ペプチドやリン酸化ペプチド等の存在が確認されたウェルの試料を分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。
【００４７】
分析対象をラベル化可能なマトリックスを用いて、分析対象を特定することもできる。例えば、マトリックスとして３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いると、糖鎖の還元末端に３−ＡＱが脱水付加し、分子量が１２６Ｄａ増加する。そのため、異種のマトリックスとして３−ＡＱ／ＣＨＣＡと、ＤＨＢ等のラベル化を行わないマトリックスとの組み合わせを用い、前者と後者のＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを対比すると、前者では糖ペプチド由来の糖鎖や遊離糖鎖等の糖鎖由来ピークが高質量側にシフトしている。このようなｍ／ｚの差が確認されたウェル、すなわち糖鎖の存在が確認されたウェルの試料を、分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。
【００４８】
図２では、サンプルプレート３１０のウェルに２種類のマトリックスが横方向に交互に収容された形態を示したが、マトリックスの配置は交互である必要はなく、ウェル上に収容されたマトリックスの配置にあわせて、分注ヘッド２５の移動順序を制御すればよい。また、それぞれのマトリックスが収容されたウェルの数は、同一である必要はなく、分析対象や目的等に応じて、特定のマトリックスが収容されたウェルの数を多くしたり少なくしてもよい。
【００４９】
マトリックスの種類は２種類に限定されず、３種類以上のマトリックスが用いられてもよい。例えば、ＤＡＮ、ＤＨＢおよび３−ＡＱ／ＣＨＣＡの３種のマトリックスを用い、これらのＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較すれば、ジスルフィド結合を有する糖ペプチドが含まれているウェルを特定することができる等、分析対象をより詳細に特定することが可能となる。
【００５０】
２種以上のマトリックスは、必ずしも１枚のサンプルプレート上に収容されていなくてもよい。図３は、ＬＣ部１０に、２枚のサンプルプレートを装填可能なスポッティング装置２００が接続された形態を示している。２枚のサンプルプレート３１１，３１２のそれぞれの上には、分注ヘッド２５１，２５２が配置されている。分注ヘッド２５１，２５２は各サンプルプレート３１１，３１２上を移動可能に構成されている。
【００５１】
第一サンプルプレート３１１のウェル３８１上には第一種マトリックスが収容されており、第二サンプルプレート３１２のウェル３８２上には第二種マトリックスが収容されている。第一種マトリックスと第二種マトリックスは、異種のマトリックスであり、特定成分のＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与える。例えば、第一サンプルプレート３１１のウェル３８１上には第一種マトリックスとしてＤＡＮが収容されており、第二サンプルプレート３１２のウェル３８２上には第二種マトリックスとしてＤＨＢが収容されている。
【００５２】
カラム１５からの溶出液はバルブ２１０で二分され、第一分注ヘッド２５１および第二分注ヘッド２５２のそれぞれに送液される。第一分注ヘッド２５１は第一サンプルプレート３１１のＡ１位置のウェル３８１に試料溶液をスポットし、第二分注ヘッド２５２は第二サンプルプレート３１２のＡ１位置のウェル３８２に試料溶液をスポットする。これにより、同一保持時間の溶出液が、ウェル３８１の第一マトリックス上およびウェル３８２の第二マトリックス上にスポットされる。その後、第一分注ヘッド２５１および第二分注ヘッド２５２は、それぞれのサンプルプレート３１１，３１２のＡ２位置のウェル上に移動し、各ウェルに試料溶液をスポットする。このように、分注ヘッドは、Ａ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順に移動しながら、ウェル上に試料溶液を順次スポットする。
【００５３】
複数のサンプルプレート上のそれぞれに分注ヘッドを有するスポッティング装置を用いることにより、同一保持時間を有する溶出試料を、異なるサンプルプレート上の異なるマトリックス上にスポットできる。また、１つの分注ヘッドを、複数のサンプルプレート上に順次移動させることにより、同一または近接する保持時間を有する溶出試料を異なるサンプルプレート上にスポットすることもできる。
【００５４】
複数のサンプルプレートを使用する形態は、試料とマトリックスを混合後にターゲット上での処理が行われる場合に特に有用である。例えば、前述の３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いて糖鎖の還元末端のＡＱラベル化を行う場合、ターゲット上で一定時間の加温（例えば６０℃、６０分）が必要である。一方、ＤＨＢ等の一般的なマトリックスは、ターゲット上での処理を必要としない。一例として、ウェル上にラベル化を行うためのマトリックス（例えば３−ＡＱ／ＣＨＣＡ）を収容したサンプルプレートと、ウェル上にラベル化を行わないマトリックス（例えばＤＨＢ等）を収容したサンプルプレートとを用いる場合について説明する。この例では、同一または近接する保持時間を有する溶出試料を、それぞれのサンプルプレートにスポットする。その後、ＤＨＢを収容したサンプルプレートはそのままＭＳ分析に供すればよい、３−ＡＱ／ＣＨＣＡを収容したサンプルプレートは一定時間加温して糖鎖のラベル化を行った後にＭＳ分析に供すればよい。このように、プレート上に試料をスポット後、ＭＳ分析までの処理が異なる複数種のマトリックスを用いる場合に複数のサンプルプレートを使用すれば、分析をより効率的に実施できる。
【００５５】
複数のサンプルプレート上の試料の質量分析を行う場合、複数のサンプルプレートを質量分析部４０内のプレート収容部（不図示）に装填し、試料搬送部により、プレート収容部とステージ４１上との間で、サンプルプレートを搬送してもよい。このような搬送機構を設けることにより、ステージ上のサンプルプレートの入れ替えを自動化できる。そのため、各プレート上の試料のマススペクトルの取得や、マススペクトルの対比に基づいてＭＳｎ分析対象を選定後の分析操作も自動化可能となる。
【００５６】
以上、ウェル上に予めマトリックスがスポットされたサンプルプレートを用い、その上に試料溶液をスポットする場合について説明したが、ウェル上に試料溶液をスポットした後、その上にマトリックスを添加してもよい。試料溶液がスポットされたウェル上へのマトリックスの添加は、所定量のマトリックスをスポット可能なスポット装置を用いてもよく、手動で行ってもよい。スポット装置を用いる場合、マトリックスのコンタミネーションを低減するために異種のマトリックスのスポットには、別々の分注ヘッドを用いることが好ましい。
【００５７】
また、溶出液にマトリックスを混合して、ウェル上にスポットしてもよい。例えば、分注ヘッドを二重管構造として、内管に溶出液を通過させ、外管からマトリックスを添加することにより、溶出液にマトリックスを混合できる。この場合も、異種のマトリックスには、別々の分注ヘッドを用いることが好ましい。
【００５８】
［第二形態］
上記の第一形態では、特定成分（例えば、ＭＳｎ分析対象）がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように、異なるマトリックスを用いたが、試料の種類によっては異なるｍ／ｚを与えるマトリックスの組み合わせの選択が困難な場合もある。第二形態では、分画された試料に対して、異なる処理を実施することにより、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように試料の調製を行う。前述のように、処理を行わない場合と特定の処理を行う場合も、「異なる処理」に含まれるものとする。
【００５９】
まず、第一形態と同様に、サンプルプレート上の複数のウェルに、同一の試料成分を含む溶出液がスポットされる。本形態では、サンプルプレート上にスポットされた試料溶液の反応を容易とするために、ウェル上にマトリックスがロードされていないサンプルプレートをスポッティング装置２０に装填することが好ましい。
【００６０】
サンプルプレート上に試料溶液をスポット後に、特定成分の分子量を変化させる処理が行われる。例えば、特定成分がシステイン残基を有するタンパク質またはペプチドである場合、ヨードアセトアミドを添加してアルキル化を行うと、ジスルフィド結合を形成していないシステイン残基がカルバミドメチル化され、システイン１残基あたり分子量が５８Ｄａ増加する。また、還元によりジスルフィド結合を切断した後、カルバミドメチル化を行うと、１個のジスルフィド結合（２個のシステイン残基）あたり分子量が１１６Ｄａ増加する（還元による２Ｄａの増加、および２個のシステイン残基のカルバミドメチル化による１１４Ｄａの増加）。
【００６１】
例えば、１個のジスルフィド結合（ジスルフィド結合を形成した２つのシステイン残基）とジスルフィド結合していない１個のシステイン残基（合計３個のシステイン残基）を有するタンパク質を含む試料溶液を３つのウェルにスポットし、第一のウェル上の試料は未処理とし、第二のウェル上の試料はカルバミドメチル化を行い、第三のウェル上の試料は還元カルバミドメチル化を行う。その後、各ウェルにマトリックスをロードし、風乾等による試料調製を行い、質量分析を実施する。
【００６２】
第二のウェル上の試料のマススペクトルでは第一のウェル上の試料よりもｍ／ｚが５８大きいピークが観測され、第三のウェル上の試料のマススペクトルでは、第一のウェル上の試料よりもｍ／ｚが１７４大きいピークが観測される。このように、異なる３種類の処理を実施した試料のＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較することにより、ジスルフィド結合の数だけでなく、ジスルフィド結合を形成していないシステイン残基の数も特定可能である。そのため、ＭＳｎ分析の対象とするウェルをさらに絞り込むことが可能となる。
【００６３】
マトリックスに依存せず特定成分の分子量を変化させる処理は、分子量を変化させる処理のバリエーションが多いため、適用可能な試料の制限が少ない。例えば、糖タンパクや糖ペプチドを対象とする場合は、酵素処理による脱グルコシル化の有無により、分子量を変化させることができる。また、糖鎖非還元末端のシアル酸等に対する修飾処理を行うことにより、特定の糖鎖を有する糖タンパク質や糖ペプチドを、分子量の変化の有無により選別できる。また、異なる化学反応を行う代わりに、同位体ラベルの有無により、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように試料の調製を行ってもよい。
【００６４】
試料溶液を分画後の処理は、サンプルプレートへのスポッティング前にオフラインで実施してもよい。例えば、ＬＣカラムからの溶出液を、溶出液トラップやフラクションコレクタ等により貯留し、貯留された溶出液を必要量取り出して処理を行った後、サンプルプレートのウェル上にスポットしてもよい。
【００６５】
［第三形態］
上記第一形態および第二形態では、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように、異なる処理（異なるマトリックスとの混合や異なる反応等）を行ったが、特定成分に対する異なる処理は、マススペクトルにおけるピーク強度を変化させるものでもよい。その具体例としては、分画後の試料溶液に、種類や濃度の異なるマトリックスを混合する方法が挙げられる。
【００６６】
特定成分の濃度が同一の試料であっても、マトリックスの種類や濃度が異なると、イオン化効率が異なる。ノイズ要因の少ない良好な分析を行うためには、分析対象成分のイオン化効率が高くなるマトリックスの選択が重要となる。同一の試料成分を含む溶出液に、種類や濃度の異なるマトリックスを混合することにより、サンプルプレートの複数のウェル上に、同一の試料成分が種類および／または濃度の異なるマトリックスと混合された試料がスポットされた分析用試料が形成される。
【００６７】
例えば、図２に示すサンプルプレート３１０の奇数列のウェル３８ａには、マトリックスとしてＣＨＣＡをロードし、偶数列のウェル３８ｂにはマトリックスとしてＤＨＢをロードしておく。ＣＨＣＡはペプチドや低分子量タンパク質に対して高いイオン化効率を与える傾向がある。一方、ＤＨＢは、糖タンパク質に対して高いイオン化効率を与える傾向がある。
【００６８】
横方向に並ぶウェルにＣＨＣＡとＤＨＢが交互に収容されたサンプルプレート３１０を、スポッティング装置２０にセットし、ＬＣ部１０からの溶出時間に沿って、試料溶液をＡ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順にウェルにスポットする。これにより、溶出試料は、ＣＨＣＡマトリックス上およびＤＨＢマトリックス上に交互にスポットされる。第一形態と同様、隣接するウェルには、ＬＣ溶出時間が近接するか同一である試料溶液がスポットされる。
【００６９】
試料溶液をスポット後のサンプルプレートを質量分析部４０にセットし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるＭＳ分析を実施する。ＣＨＣＡマトリックスを適用したウェル上試料のマススペクトルとＤＨＢマトリックスを適用したウェル上の試料のマススペクトルとを対比して、より高いピーク強度を与える試料を選択し、ＭＳｎ分析を実施することにより、Ｓ／Ｎ比の高い分析結果が得られる。なお、低分子量成分が含まれる分画では、ＣＨＣＡマトリックスを適用したウェルの試料がマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す傾向があり、糖タンパク質が含まれる分画では、ＤＨＢマトリックスを適用したウェルの試料がマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す傾向がある。
【００７０】
このように、試料がスポットされたウェルの全てに対してＭＳ分析を実施して、マトリックスの相違に起因してピーク強度の高いウェルを抽出することにより、それぞれの試料成分に対してイオン化効率の高いマトリックスを用いたＭＳｎ分析が可能となる。そのため、各分画に含まれるそれぞれの成分に対して、マトリックスを最適化し、分析を効率化できるとともに、Ｓ／Ｎ比の高い良好な分析結果が得られる。
【００７１】
異なるマトリックスの組み合わせとして、ＣＨＣＡとＤＨＢの組み合わせを例示したが、マトリックスの種類はこれらに限定されない。例えば、アルキル化トリヒドロキシアセトフェノン（ＡＴＨＡＰ）は、疎水性の高いペプチド分析に有効なマトリックスとして知られている。ＡＴＨＡＰと他のマトリックスの組み合わせを用い、ＡＴＨＡＰマトリックスを用いたマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す成分を抽出することにより、疎水性の高い試料を選択的にＭＳｎ分析に供して、Ｓ／Ｎ比の高い良好な分析結果を得ることができる。
【００７２】
また、３種以上のマトリックスを組み合わせてもよい。試料溶液中には様々なタンパク質やペプチドが含まれているため、質量分析の対象とすべき試料の種類等に応じて、マトリックスの組み合わせを選択すればよい。
【００７３】
ＭＡＬＤＩによるイオン化効率は、マトリックスの種類だけでなく、マトリックスの濃度（タンパク質やペプチドの量とマトリックスの量の比）によっても変化する。種類の異なるマトリックスを用いる代わりに、濃度の異なるマトリックスを用いることもできる。例えば、奇数列のウェル３８ａには低濃度のマトリックスをロードし、偶数列のウェル３８ｂには高濃度のマトリックスをロードしたサンプルプレートを用い、マトリックス濃度の相違に起因してピーク強度の高いウェルを抽出してもよい。マトリックス濃度は２水準に限定されず、３水準以上としてもよい。
【００７４】
また、マトリックスの種類および濃度の両方を変化させてもよい。例えば、低濃度ＣＨＣＡ、高濃度ＣＨＣＡ、低濃度ＤＨＢ、および高濃度ＤＨＢの４つの水準のマトリックスを、ウェル上に順に繰り返し配置したサンプルプレートを用いてもよい。この場合、４つのウェル上の試料のマススペクトルを対比して、最もピーク強度の高いウェルを抽出して、ＭＳｎ分析を行えばよい。
【００７５】
本形態は、生体試料中の多種多様なタンパク質やペプチドを網羅的に解析する場合に、特に有用である。複数のタンパク質やペプチドをＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析する場合、従来は、分析対象に応じたマトリックスの種類や濃度の選択に専門的な知見や試行錯誤が求められていた。これに対して、本形態では、マトリックスの種類や濃度を分析対象成分ごとに最適化可能である。最もピーク強度の高いウェルの抽出は、質量分析部に接続されたデータ処理部により自動化が可能であるため、専門的な知見がなくとも、各成分のマトリックスを最適化して、良好なマススペクトルを取得できる。
【００７６】
本形態においても、図３に示すように、種類および／または濃度の異なる複数のマトリックスを、複数のサンプルプレート上にロードしてもよい。また、サンプルプレートのウェル上に試料溶液をスポットした後、その上にマトリックスをロードしてもよく、溶出液にマトリックスを混合して、サンプルプレートのウェル上にスポットしてもよい。
【００７７】
［各形態の組み合わせ］
上記第一形態、第二形態および第三形態を組み合わせて応用してもよい。例えば、第一形態と第三形態の組み合わせでは、特定成分の分子量を増加または減少させるマトリックスを１種以上、分子量を変化させないマトリックスを１種以上用いる。
【００７８】
一例として、ＤＡＮ、ＤＨＢおよびＣＨＣＡの３種類のマトリックスの組み合わせについて説明する。ジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドが含まれている分画では、ＤＡＮが収容されたウェル上の試料は、ＤＨＢが収容されたウェル上の試料およびＣＨＣＡをロードしたウェル上の試料よりも、ｍ／ｚが２Ｎ大きいピークが観測される（Ｎはジスルフィド結合の数）。このように、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差から、特定成分（分析対象）としてジスルフィド結合含有成分が含まれているか否かを判断できる。さらに、３つのマススペクトルの中で、ジスルフィド結合含有成分のピークが最も高いものを選択してＭＳｎ分析を実施すれば、Ｓ／Ｎ比が高いＭＳｎマススペクトルが得られる。また、ＤＡＮが収容されたウェル上の試料のＭＳｎ分析を実施すれば、還元によりジスルフィド結合が切断されているため、構造情報が得られやすくなる。
【００７９】
また、３−ＡＱ／ＣＡ、ＤＨＢおよびＣＨＣＡの３種類のマトリックスの組み合わせを用いた場合、リン酸や糖鎖等の翻訳後修飾基を有するタンパク質またはペプチドが含まれている分画では、３−ＡＱ／ＣＡが収容されたウェル上の試料は、ＤＨＢが収容されたウェル上の試料およびＣＨＣＡをロードしたウェル上の試料よりも、ｍ／ｚが大きいピークが観測される。このｍ／ｚの差に基づいて、特定の翻訳後修飾基を有するタンパク質またはペプチドを特定することが可能である。例えば、３−ＡＱ／ＣＡマトリックスを用いたＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルにおいて、ｍ／ｚが９８大きいピークが観測される成分は、１個のリン酸基を有するリン酸化ペプチドであると特定できる。ＤＨＢおよびＣＨＣＡの２つのマススペクトルのうち、当該成分のピークが高い方を選択してＭＳｎ分析を実施すれば、よりＳ／Ｎ比が高いマススペクトルに基づいて、リン酸化ペプチドのペプチド部分の構造解析を実施できる。
【００８０】
上記と同様にして、第二形態と第三形態とを組み合わせることもできる。例えば、第二形態により分画された試料に対して、異なる処理を実施した後、同一の処理が施された試料溶液を複数のウェルにスポットする。同一の処理が施された試料がスポットされたウェルのそれぞれに、種類および／または濃度の異なるマトリックスをロードして質量分析を実施することにより、特定成分（分析対象）が含まれているか否かの判断およびマトリックスの最適化を行い得る。
【符号の説明】
【００８１】
１０      ＬＣ部
１５      カラム
２０，２００    スポッティング装置
２５，２５１，２５２    分注ヘッド
３１，３１０，３１１，３１２    サンプルプレート
３８，３８１，３８２      ウェル
４０      質量分析部
【図１】
2017181404.tif 000003
【図２】
2017181404.tif 000004
【図３】
2017181404.tif 000005