(57)【要約】【課題】溶液中のプロテアーゼの活性を維持すること、及び、プロテアーゼ溶液中に生じる沈殿を防止することを課題とする。【解決手段】Aspergillus属由来のプロテアーゼ、ポリオール及び糖類を含有することを特徴とする、プロテアーゼ溶液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aspergillus属由来のプロテアーゼ、ポリオール及び糖類を含有することを特徴とする、
プロテアーゼ溶液。
【請求項２】
該糖類は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、スクロース、デキストリン、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール及びマルチトールから選択される１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のプロテアーゼ溶液。
【請求項３】
該ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール及びポリエチレングリコールから選択される１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載のプロテアーゼ溶液。
【請求項４】
３０℃、３０日間保存後におけるプロテアーゼ残存活性が、保存前の活性の８０％以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ溶液。
【請求項５】
溶液中におけるAspergillus属由来のプロテアーゼの活性維持方法であって、
該プロテアーゼをポリオール及び糖類を含有する溶液中で保存することを特徴とする、
プロテアーゼの活性維持方法。
【請求項６】
Aspergillus属由来のプロテアーゼを含有するプロテアーゼ溶液の沈殿防止方法であって、
ポリオール及び糖類と該プロテアーゼとを混合することを特徴とする、
プロテアーゼ溶液の沈殿防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は溶液中におけるプロテアーゼの活性維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼはタンパク質のペプチド結合を加水分解する酵素であり、化粧品、洗剤、食品の製造に広く使用されており、産業上の利用価値は高い。しかしながら、プロテアーゼはタンパク質を分解するため、皮膚に付着すると皮膚を冒すこと、吸い込むとアレルギー症状を起こすこともあり、粉末状では取扱いが困難であった。粉末の吸引を防止するために顆粒状にした製剤も市販されているが、アレルギー対策としてはまだ十分ではなく、より飛散の少ない液体の製剤が求められている。
【０００３】
また、プロテアーゼは飲料の原料となる素材中のタンパク質を分解して風味を増強させる効果や、乳タンパク等が酸性で沈殿するのを抑制する効果があり、このような飲料用途では、液中でプロテアーゼを作用させるため、溶解に手間のかかる粉体よりも液体のものが好まれている。
【０００４】
しかしながら、プロテアーゼは水系溶媒に溶解すると自身をも分解して、失活していくこと、酵素は水系溶媒中で保存すると、酵素そのものや不純物が沈殿して異物となることから、プロテアーゼの液体製剤化は困難であった。これまでも液中で活性を維持させるための研究が為されており、例えばタンパク質阻害剤を添加し、液剤中では自身を分解する活性は発揮せず、使用時に希釈することで活性を発揮するように設計した製剤例がある（特許文献１）。
【０００５】
また、酵素の沈殿を防止するために、ポリビニルピロリドンを添加する例などがある（特許文献２）。
【０００６】
しかし、これらの製剤には食品用途として認められていないものが使用されており、食品用、飲料用途のプロテアーゼ液体製剤は未だ達成が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−８８５３４号公報
【特許文献２】特開平９−５２８４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、溶液中のプロテアーゼの活性を維持すること、及び、プロテアーゼ溶液中に生じる沈殿を防止することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、プロテアーゼをポリオール及び糖類を含む溶液中で保存することにより、溶液中におけるプロテアーゼの活性を長期間に渡り維持でき、かつ沈殿を防止できることがわかり本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞  Aspergillus属由来のプロテアーゼ、ポリオール及び糖類を含有することを特徴とする、
プロテアーゼ溶液。
＜２＞  該糖類は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、スクロース、デキストリン、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール及びマルチトールから選択される１種または２種以上であることを特徴とする、＜１＞に記載のプロテアーゼ溶液。＜３＞  該ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール及びポリエチレングリコールから選択される１種または２種以上であることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載のプロテアーゼ溶液。
＜４＞  ３０℃、３０日間保存後におけるプロテアーゼ残存活性が、保存前の活性の８０％以上であることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプロテアーゼ溶液。
【００１１】
＜５＞  溶液中におけるAspergillus属由来のプロテアーゼの活性維持方法であって、
該プロテアーゼをポリオール及び糖類を含有する溶液中で保存することを特徴とする、
プロテアーゼの活性維持方法。
【００１２】
＜６＞  Aspergillus属由来のプロテアーゼを含有するプロテアーゼ溶液の沈殿防止方法であって、
ポリオール及び糖類と該プロテアーゼとを混合することを特徴とする、
プロテアーゼ溶液の沈殿防止方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、長期間にわたりプロテアーゼ残存活性を高い状態で維持でき、かつ沈殿が防止されたプロテアーゼ溶液を提供することができる。本発明のプロテアーゼ溶液は生体にとって安全な成分で構成されているため、飲食品製造用の添加物として好適に使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、これらの内容に特定はされない。
【００１５】
本発明は、プロテアーゼ溶液であって、Aspergillus属由来のプロテアーゼ、ポリオール及び糖類を含有することを特徴とする。
また、本発明は、溶液中におけるAspergillus属由来のプロテアーゼの活性維持方法であって、該プロテアーゼをポリオール及び糖類を含む溶液中で保存することを特徴とする。
また、本発明は、Aspergillus属由来のプロテアーゼを含有するプロテアーゼ溶液の沈殿防止方法であって、ポリオール及び糖類と、プロテアーゼとを混合することを特徴とする。
【００１６】
（１）Aspergillus属由来のプロテアーゼ
本発明に用いるプロテアーゼとしては、食品等に含まれるタンパク質を分解するプロテアーゼを用いることができ、このようなプロテアーゼとしてAspergillus属由来のプロテアーゼを用いることができる。Aspergillus属としては、Aspergillus oryzae：例えば、SANK-11870、IFO-30102等, Aspergillus niger：例えば、ATCC-9642 、IFO-4407等, Aspergillus awamori：例えば、IAM-2112、IFO-4033等, Aspergillus usamii：例えば、IAM-2414、IFO-6082等， Aspergillus sojae：例えば、IAM-2666等, Aspergillus phoenicis：例えば、IAM-2215等, Aspergillus wentii：例えば、IAM-2133等が挙げられる。中でも、酵素生産能が高く、同微生物由来物の食経験が豊富であることから、Aspergillus oryzaeが好ましい。
【００１７】
プロテアーゼの作用法はエンド型・エキソ型を問わないが、エンド型とエキソ型の両方の活性を持つものが好ましい。また、酸性からアルカリ性まで幅広く活性を持つものが好ましい。複数のAspergillus属由来のプロテアーゼを混合して使用してもよい。
【００１８】
さらに、食品用に使用する際、加熱殺菌時には失活するように８０℃程度で活性を失うものが好ましい。
【００１９】
このような酵素としては、上記微生物から常法により生産・調製したものを用いることができる。また、市販のものを用いることができる。市販の酵素としては、特に限定されないが、コクラーゼＰ（三菱化学フーズ製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、プロテアックス（天野エンザイム製）、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ、スミチームＭＰ、スミチームＬＰＬ、スミチームＡＰ、スミチームＦＬＡＰ（新日本化学工業製）、オリエンターゼＡＹ（エイチビイアイ製）、ブリューワーズクラレックス、バリダーゼＡＦＰ、バリダーゼＦＰ６０、べイクザイムＢ５００（ディー・エス・エムジャパン製）、モルシンＦ（キッコーマンバイオケミファ製）、グリンドアミルＰＲ５０（ダニスコジャパン製）パンチダーゼＰ、パンチダーゼＮＰ−２、パンチダーゼＭＰ、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（ヤクルト薬品工業製）、フレーバザイム（ノボザイムジャパン製）等が挙げられる。
【００２０】
プロテアーゼ溶液における、Aspergillus属由来のプロテアーゼの含有量としては、酵素の種類、使用用途等に応じて設定することができ、特に限定されないが、通常１０重量％〜６０重量％であり、好ましくは２０重量％〜５０重量％である。プロテアーゼ活性としては、通常１，０００  Ｕ／ｍＬ〜１，０００，０００  Ｕ／ｍＬ、好ましくは３，０００  Ｕ／ｍＬ〜２００，０００Ｕ／ｍＬである。
【００２１】
（２）ポリオール
本発明に使用されるポリオールとしては、特に限定されないが、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができ、中でも食品として使用可能な、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリエチレングリコールとしては、数平均分子量として２００〜２０００のものが好ましく、２００〜１０００のものがより好ましい。
また、ポリオールは単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。使用されるポリオールのプロテアーゼ溶液に対する量は、ポリオールを合計して、通常１０重量％〜８０重量％であり、好ましくは２０重量％〜６０重量％である。少なすぎると酵素の保存安定性の効果が得られにくくなり、多すぎると危険物に該当するものもあり、取扱いにくくなる場合がある。
【００２２】
（３）糖類
本発明に使用される糖類は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、糖アルコール、アミノ糖など特に限定されないが、単糖、二糖、オリゴ糖、糖アルコールが好ましい。
【００２３】
単糖としては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等が挙げられる。二糖としては、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられる。オリゴ糖としては、デキストリン、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖等が挙げられ、糖アルコールとしては、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール等が挙げられる。
【００２４】
糖類は単独で使用してもよいし、これらの中から２種類以上を混合して使用してもよい。糖類の２種類以上の組み合わせとしては、二糖と糖アルコールとの組合せが好ましい。
【００２５】
糖類のプロテアーゼ溶液に対する使用量は、糖類を合計して、通常１０重量％〜７０重量％であり、好ましくは２０重量％〜５０重量％である。少な過ぎると、沈殿防止の効果が低く、多過ぎると粘度があがり、溶液の流動性が下がり、取扱いが難しくなる場合がある。
【００２６】
プロテアーゼ溶液におけるポリオールと糖類との含有比（質量比）としては、通常５：１〜１：５、好ましくは２：１〜１：２である。
【００２７】
（４）任意成分
上記必須成分の他に、プロテアーゼ溶液において、酵素、糖類を溶解できる量の水等の溶媒を含んでよい。その他の成分は特に限定されず、腐敗防止のための防腐剤や、溶液を取扱いしやすいように乳化剤等の添加剤を添加してもよい。
【００２８】
（５）保存方法
本発明の活性維持方法においては、プロテアーゼをポリオール及び糖類を含む溶液中で保存する。保存期間は、特に制限されない。
溶液は室温等でも保存可能であるが、プロテアーゼの失活をより効果的に防ぐために１５℃以下の冷暗所で保存することが望ましい。
【００２９】
（６）プロテアーゼ溶液の調製法
プロテアーゼ溶液の構成成分であるプロテアーゼは、Aspergillus属を培養した培養上清をそのまま用いること、カラム等で培養液からプロテアーゼを精製したものを用いること、限外濾過膜で濃縮したものを用いること、あるいは、これらの方法で得られた溶液状態のプロテアーゼを乾燥させて得られた固形のプロテアーゼを水等の溶媒に溶解させて用いることができる。これらプロテアーゼにその他の構成成分を添加し、混合し、溶解させる方法によりプロテアーゼ溶液を調製することができる。具体的な方法を以下に例示する。
培養液や培養液を精製した溶液状態のプロテアーゼを用いる場合は、あらかじめプロテアーゼが所望の濃度となるように水等で希釈もしくは限外濾過膜等で濃縮しておき、その他の構成成分を所定量秤量して加え、撹拌機能のある容器、もしくはマグネティックスターラーやスリーワンモーター等の撹拌機器を用いて４０℃以下で撹拌溶解させ、プロテアーゼ溶液を調製する。
固形のプロテアーゼを用いる場合は、あらかじめプロテアーゼを所望の濃度となるように水に溶解しておき、その他の構成成分を所定量秤量して加え、撹拌機能のある容器、もしくはマグネティックスターラーやスリーワンモーター等の撹拌機器を用いて、４０℃以下にて撹拌溶解させ、プロテアーゼ溶液を調製する。
【００３０】
本発明のプロテアーゼの活性維持方法における、プロテアーゼ、ポリオール及び糖類を含む溶液についても、上記と同様に調製することができる。また、本発明のプロテアーゼ溶液の沈殿防止方法における、プロテアーゼ溶液についても、上記と同様に調製することができる。
【００３１】
（７）プロテアーゼ活性測定方法
プロテアーゼの活性測定は、食品添加物公定書自主規格  プロテアーゼ測定  第一法にのっとって行うことができる。具体的には、実施例に記載した方法等により、測定することができる。
本発明のプロテアーゼ溶液は、３０℃、３０日間保存後におけるプロテアーゼ残存活性
が、保存前の活性の８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。
【００３２】
（８）プロテアーゼ溶液の用途
本発明のプロテアーゼ溶液は、タンパク質素材の改質に使用できる。すなわち、飲料の原料に使用して味質の改善をする、小麦粉焼成品の原料に使用して生地の物性改質を行う、魚や肉類に使用し肉質を柔らかくする、等の用途に使用することができる。すなわち、飲食品の原料に配合して飲食品を製造するための飲食品用添加物として使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。
【００３４】
＜活性測定＞
プロテアーゼの活性測定は、以下のようにして行った。
カゼインを乾燥物として１．２ｇ秤量し、０．０５Ｍリン酸一水素ナトリウム試液１６０ｍＬに溶解後、１Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ６．０に調整した後、２００ｍＬにメスアップし、基質溶液とした。
【００３５】
試験管に基質溶液５ｍＬをとり、３７℃で約１０分間予熱後、液体製剤を適宜ＲＯ水で希釈して調製した酵素溶液を１ｍＬ加えて混合し、３７℃で１０分間反応させた。反応後、０．４４ｍｏｌ／Ｌのトリクロロ酢酸５ｍＬを加えて酵素反応を停止させた。３７℃で３０分放置後、Ｎｏ．６濾紙にて濾過し、この液２ｍＬを別の試験管にとり、５ｍＬ炭酸ナトリウム溶液を加えた。これに１ｍＬフォリン試薬を加え３７℃で３０分放置後、水を対照に６６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３６】
別途、試験管に基質５ｍＬ、０．４４ｍｏｌ／Ｌのトリクロロ酢酸溶液５ｍＬを加えた後、試料溶液１ｍＬを加え、よく混合させた。３０分放置後、濾紙濾過以降同様に操作して吸光度を測定し、反応ブランクとした。
【００３７】
また、チロシン(ナカライテスク製)を０〜４０μｇ／Ｌに０．５Ｎ  ＨＣｌにて溶解・希釈した液を調製し、そのうち２ｍＬを取り５ｍＬ炭酸ナトリウム溶液を加えた後、１ｍＬのフォリン試薬を加え３７℃で３０分放置後、６６０ｎｍの吸光度を測定して、チロシン検量線とした。
【００３８】
反応１分あたり１μｇのチロシンを遊離せしめる酵素活性を１単位（Ｕ）とした。
【００３９】
＜実施例１＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）とグリセロール（Ｍｏｏｎ Ｋｏｓｈｅｒ Ｇｌｙｃｅｒｉｎ，Ｐ＆Ｇ製）１５ｇ（３０ｗｔ％）、ソルビトール（ネオゾルブＰ２０，ＲＯＱＵＥＴＴＥ製）７．５ｇ（１５ｗｔ％）、グラニュー糖（伊藤忠商事製）７．５ｇ（１５ｗｔ％）を混合し、よく撹拌混合して、糖類を溶解させ、液体製剤（プロテアーゼ溶液）とした。液体製剤処方を、表１に示した。
これをガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後［作製日から、保存８日目（７日間保存）、保存１６日目（１５日間保存）及び保存３１日目（３０日間保存）］にプロテアーゼ活性を測定した。作製日（保存前）の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後（保存３１日目に測定）の沈殿の有無を表３に示した。沈殿の有無は目視で確認した。
【００４０】
＜実施例２＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）と、グリセロール（Ｍｏｏｎ
Ｋｏｓｈｅｒ Ｇｌｙｃｅｒｉｎ，Ｐ＆Ｇ製）を１５ｇ（３０ｗｔ％）と、ソルビトール（ネオゾルブＰ２０，ＲＯＱＵＥＴＴＥ製）を１５ｇ（３０ｗｔ％）混合し、液体製剤とした。液体製剤処方を、表１に示した。
ガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後にプロテアーゼ活性を測定した。作製日の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後の沈殿の有無を表３に示した。
【００４１】
＜実施例３＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）と、グリセロール（Ｍｏｏｎ
Ｋｏｓｈｅｒ Ｇｌｙｃｅｒｉｎ，Ｐ＆Ｇ製）を１５ｇ（３０ｗｔ％）と、グラニュー糖（伊藤忠商事製）を１５ｇ（３０ｗｔ％）混合し、液体製剤とした。液体製剤処方を、表１に示した。
ガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後にプロテアーゼ活性を測定した。作製日の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後の沈殿の有無を表３に示した。
【００４２】
＜比較例１＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）、グリセロール（Ｍｏｏｎ Ｋｏｓｈｅｒ Ｇｌｙｃｅｒｉｎ，Ｐ＆Ｇ製）１５ｇ（３０ｗｔ％）と水１５ｇ（３０ｗｔ％）を混合し、液体製剤とした。液体製剤処方を、表１に示した。
ガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後にプロテアーゼ活性を測定した。作製日の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後の沈殿の有無を表３に示した。
【００４３】
＜比較例２＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）、グラニュー糖（伊藤忠商事製）１５ｇ（３０ｗｔ％）と水１５ｇ（３０ｗｔ％）を混合し、液体製剤とした。液体製剤処方を、表１に示した。
ガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後にプロテアーゼ活性を測定した。作製日の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後の沈殿の有無を表３に示した。
【００４４】
＜比較例３＞
Aspergillus属由来のプロテアーゼ（コクラーゼＰ，三菱化学フーズ製）を４０ｗ/ｗ％となるように水に溶解させた。これを２０ｇ（４０ｗｔ％）と、水を３０ｇ（６０ｗｔ％）混合し、液体製剤とした。液体製剤処方を、表１に示した。
ガラス瓶中で３０℃の恒温槽にて保存し、所定日数後にプロテアーゼ活性を測定した。作製日の活性を１００％としたときの活性残存率を表２に示した。また、３０日間保存後の沈殿の有無を表３に示した。
【００４５】
【表１】
2017029129.tif 000002
【００４６】
【表２】
2017029129.tif 000003
【００４７】
【表３】
2017029129.tif 000004
【００４８】
表２、表３に示したとおり、実施例１のプロテアーゼ溶液はグリセロール、糖類が配合されていない他の比較例のプロテアーゼ溶液に比べて３０℃における保存安定性が高く、且つ保存中に沈殿が生じないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、飲食品に応用できる。