(57)【要約】【課題】ＳＮＰを利用する遺伝子検査を個々の女性のＱＯＬをより高めるための手段として利用して、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システムや、かかるシステムの遺伝子検査における、簡便な遺伝子検査キットを提供することにある。【解決手段】アメリカ国立衛生研究所が公開している遺伝子情報に基づき、女性の罹患者が多い乳がんを中心とするバストケアに関連する可能性のあるＳＮＰに注目し、かかるＳＮＰを含む増幅領域や増幅するプライマーセットの設計、増幅条件の設定、ＳＮＰを含む増幅領域を検出するために最適なプローブ配列の性能評価及び選択を行うことにより、５つのＳＮＰの良性変異の有無を乳がんの予防にかかわる解析に利用するとともに、女性のバストケアの領域及び全般的な健康状態に関わるＳＮＰにおける変異の有無を利用することにより、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを備えたことを特徴とする女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システム。
１）対象女性の唾液からＤＮＡを抽出、増幅した後に、女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析し、健康遺伝子解析データを得るステップ（ａ）；
２）前記対象女性が入力した生活習慣などの環境要因入力データを得るステップ（ｂ）；
３）ステップ（ａ）で得られた健康遺伝子解析データとステップ（ｂ）で得られた環境要因入力データとを組み合わせて、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を前記対象女性に提供するステップ（ｃ）；
【請求項２】
ＤＮＡチップを用いて女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析することを特徴とする請求項１記載の提供システム。
【請求項３】
遺伝子のＳＮＰが、良性変異を有するｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれることを特徴とする請求項１又は２記載の提供システム。
【請求項４】
環境要因入力データが、身長、体重、体温、心拍数、呼吸数、歩数／日から選ばれるデータであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の提供システム。
【請求項５】
女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報が、食事、運動、睡眠における健康管理情報であるであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の提供システム。
【請求項６】
女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を特異的に増幅するプライマーセットであって、前記ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰを有することを特徴とするプライマーセット。
【請求項７】
女性の健康遺伝子のＳＮＰを特異的に検出するプローブが担体上に固定化されてなるＤＮＡチップであって、前記ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項８】
対象女性由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項６記載のプライマーセットにより女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を増幅する工程と、請求項７記載のＤＮＡチップにおける担体上に固定化されたプローブと前記増幅ＤＮＡとを接触させる工程と、各プローブにおける増幅ＤＮＡとのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした核酸の比に基づいて女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する工程とを含むことを特徴とする女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する方法。
【請求項９】
請求項６記載のプライマーセット、及び請求項７記載のＤＮＡチップを含むことを特徴とする女性の健康遺伝子のＳＮＰ解析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、女性の健康遺伝子のＳＮＰｓを解析した健康遺伝子解析データと、女性の生活習慣などの環境要因入力データとを組み合わせた、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ある集団で１％以上の遺伝子の変異が観察されるものを遺伝子多型という。多型を生じる原因は、塩基がほかの塩基に置き換わる“置換”、塩基が失われる“欠失”、塩基が追加される“挿入”や“重複”及び遺伝的組換え等を挙げることができるが、特にひとつの塩基が他の塩基に置き換わっている多型は一塩基多型（ＳＮＰ；single nucleotide polymorphism）と呼ばれており、個別化マーカーとして有用視されている。
【０００３】
すなわち、タンパク質のコーディング領域（ＯＲＦ；オープンリーディングフレーム）に存在するＳＮＰは、タンパク質におけるアミノ酸配列の変更を伴う確率が高く、アミノ酸配列の変更を伴う変異は、当該タンパク質の機能に影響を与える可能性が高くなるため、個人の疾患の発症や悪化等に関連している可能性が高いと考えられ、特に疾患と関連のあるＳＮＰは臨床分野での疾患の診断や薬剤の使い分けのマーカーとして有用であるとされている。そして、ＳＮＰと疾患の関係については多数の文献が存在し、例えば、以下のものを挙げることができる。
【０００４】
ＴＣＦ７Ｌ２のｒｓ７９０３１４６は、糖尿病と強く関連し、ＣＣホモ接合体野生遺伝子型と比較した場合、２型糖尿病を発症するリスクは、ＴＣＦ７Ｌ２のｒｓ７９０３１４６のリスクＴ−アレル（ＣＴヘテロ接合体）の保有者でほぼ４５％上昇し、ＴＴホモ接合体では少なくとも２倍になるという報告があり（非特許文献１）、ＴＣＦ７Ｌ２のｒｓ７９０３１４６においてＣＴ遺伝子型を持っている患者やＴＣＦ７Ｌ２のｒｓ７９０３１４６においてＴＴ遺伝子型を持っている患者は、抗糖尿病療法で治療するのが困難である旨予想されている（特許文献１）。
【０００５】
ＦＴＯ（fat mass and obesity-associated gene）遺伝子のＳＮＰであるｒｓ１４２１０８５については、被験者から取得したバイオマーカーのデータを、健常者や疾患患者からのバイオマーカーのデータと比較して、被験者における肥満や２型糖尿病のリスク評価、診断、予後を行う工程を含む肥満、２型糖尿病のリスク評価、診断、予後等のインビトロ方法（特許文献２）が提案されている。
【０００６】
ＦＴＯ遺伝子の別のＳＮＰであるｒｓ９９３９６０９については、ボディマス指数（ＢＭＩ）や肥満と関連することが報告されており、（非特許文献２）、ＦＴＯ遺伝子のｒｓ９９３９６０９の塩基がＴ／Ｔとなっていれば、肥満、糖尿病やメタボリックシンドロームになりにくいが、Ｔ／Ａ、Ａ／Ａとなっていれば肥満、糖尿病やメタボリックシンドロームとなりやすいことが示唆されている（特許文献３）。
【０００７】
ＭＣ４Ｒ遺伝子（４型メラノコルチン受容体遺伝子）は、視床下部や脳幹部で高発現し，エネルギー代謝調節をはじめとする多くの生理作用を有していることが知られているが、ＭＣ４Ｒ異常症の症例から，ヒトにおける食欲調節やエネルギー代謝調節にＭＣ４Ｒが重要な役割を有するであろうことが示唆されている（非特許文献３）。ＭＣ４ＲのＳＮＰの一つであるｒｓ２２２９６１６において、ｒｓ２２２９６１６；Ａ／＊を含む多型遺伝子座又はリスク対立遺伝子に関する被験体の遺伝子型を決定することによって、より低いレベルのＨＤＬとそれらの関連性を得るために被験体の遺伝子における多型を決定する方法や、より低いレベルのＨＤＬとそれらの関連性を得るために被験体の遺伝子における多型を決定する方法等が提案されている。また、ｒｓ２２２９６１６；Ｇ／＊を含む多型遺伝子座またはリスク対立遺伝子に関する被験体の遺伝子型を決定することによって、より高いレベルのトリグリセリドとそれらとの関連性を得るために被験体の遺伝子における多型を決定する方法等が提案されている（特許文献４）。
【０００８】
ＡＴＰ２Ｂ１遺伝子（ＡＴＰ２Ｂ１（ATPase,Ca2+transporting,plasma  membrane1）遺伝子）のＳＮＰであるｒｓ２６８１４７２は高血圧の遺伝子マーカーとして提案されており、ｒｓ２６８１４７２がＧＧ型又はＡＧ型の場合には低リスク群であり、ＡＡ型の場合に高リスク群であると判定する高血圧発症リスク判定方法が提案されている（特許文献５）。
【０００９】
また、２型糖尿病は、乳がんの発症を促進する旨の報告（非特許文献４）や、短時間睡眠が乳がんの発症を促進する旨の報告（非特許文献５）や、メタボリックシンドロームと乳がんの関連を示唆した報告（非特許文献６）もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５−１６４９６４号公報
【特許文献２】特表２０１０−５２３０９７号公報
【特許文献３】特開２０１２−２３１７２７号公報
【特許文献４】特開２０１２−５０６２５６号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００９／１０４７３０号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Grant et al, Nature Genetics, Vol.38, 2006, p320-323
【非特許文献２】Science 2007;316:889-94
【非特許文献３】医学のあゆみ Volume 233, Issue 9, 736 - 742 (2010)
【非特許文献４】Diabetes Care 2003 Jun; 26(6): 1752-1758.
【非特許文献５】HealthyWoman from Bottom Line、February 7, 2013
【非特許文献６】J BUON. 2012 Apr-Jun;17(2):223-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一般に、遺伝子の塩基配列の変異によって生じるタンパク質の変化は、ヒトの健康にとって、好ましくない方向に働くとされ、先天性心疾患の原因や、がん等の発症原因に結びつく要因としてとらえられることが多かった。現在広く行われている各種の遺伝子診断は、特定の疾患を発症する確率を算出するリスク判定に関するものであって、変異があることにより特定の疾患にかかるリスクが高いと判定された被検者は、食餌療法を行うことを余儀なくされたり、早期診断のために検査を頻繁に受けることを強いられたりする場合が多い。しかしながら、それらの措置によっても発症確率が減少するとは必ずしもいえず、極端な場合には病巣となりうる組織を事前に切除する等の侵襲性の高い処置を行うこともある等、精神的にダメージを与えるという点で、ＱＯＬ（クオリティオブライフ）の点からは問題となる場合も多かった。
【００１３】
本発明の課題は、ＳＮＰを利用する遺伝子検査を個々の女性のＱＯＬをより高めるための手段として利用して、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システムを提供することにある。また、本システムのＳＮＰにおける変異の有無を判定する遺伝子検査では、複数の項目を検査するために煩雑な作業が必要であり、簡便な遺伝子検査キットが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、病気のかかりやすさについての診断や、薬剤への応答性における変異として用いられているＳＮＰについて、個々人のＱＯＬを高めるための手段として用いることもできる場合もあるのではないかと考えた。また、ある特性を有する人にとっては好ましい変異であっても、別の特性を有する人にとっては好ましくない変異としてとらえることができるＳＮＰがあるのではないかと考えた。そこでアメリカ国立衛生研究所が公開している遺伝子情報に基づき、特に女性を対象として、女性の罹患者が多い乳がんを中心とするバストケアに関連する可能性のあるＳＮＰに注目したところ、ＳＮＰにおける変異を有することが、かえって、乳がんにかかりにくい体質であることに関連する、いわゆる「良性変異」として把握できるＳＮＰが５種類あることを確認した。そこで、これらの５つのＳＮＰの良性変異の有無を乳がんの予防にかかわる解析に利用するとともに、より広く女性のバストケアの領域、及び全般的な健康状態に関わるＳＮＰにおける変異の有無を利用することにより、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を提供できることを見いだした。さらに、複数の検査項目を高精度に解析するために、ＳＮＰを含む増幅領域や増幅するプライマーセットの設計、これらの増幅条件設定、ＳＮＰを含む増幅領域を検出するために最適なプローブ配列の性能評価及び選択の実施によりこれらの技術を確立し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下のステップを備えたことを特徴とする女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システム。
１）対象女性の唾液からＤＮＡを抽出、増幅した後に、女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析し、健康遺伝子解析データを得るステップ（ａ）；
２）前記対象女性が入力した生活習慣などの環境要因入力データを得るステップ（ｂ）；
３）ステップ（ａ）で得られた健康遺伝子解析データとステップ（ｂ）で得られた環境要因入力データとを組み合わせて、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を前記対象女性に提供するステップ（ｃ）；
［２］ＤＮＡチップを用いて女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析することを特徴とする上記［１］記載の提供システム。
［３］遺伝子のＳＮＰが、良性変異を有するｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の提供システム。
［４］環境要因入力データが、身長、体重、体温、心拍数、呼吸数、歩数／日から選ばれるデータであることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の提供システム。
［５］女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報が、食事、運動、睡眠における健康管理情報であるであることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の提供システム。
［６］女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を特異的に増幅するプライマーセットであって、前記ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰを有することを特徴とするプライマーセット。
［７］女性の健康遺伝子のＳＮＰを特異的に検出するプローブが担体上に固定化されてなるＤＮＡチップであって、前記ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
［８］対象女性由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記［６］記載のプライマーセットにより女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を増幅する工程と、上記［７］記載のＤＮＡチップにおける担体上に固定化されたプローブと前記増幅ＤＮＡとを接触させる工程と、各プローブにおける増幅ＤＮＡとのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした核酸の比に基づいて女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する工程とを含むことを特徴とする女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する方法。
［９］上記［６］記載のプライマーセット、及び上記［７］記載のＤＮＡチップを含むことを特徴とする女性の健康遺伝子のＳＮＰ解析キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、試料として唾液や、生活習慣などの環境要因入力データを提出することにより、健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供を容易に受け取ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】検体となる唾液試料から、ＤＮＡの抽出・増幅を行った後、ＤＮＡチップと反応させることにより得られる蛍光画像の例（左）と遺伝子の判別方法（右）を示す図である。この蛍光画像のパターン解析から、１２種類の遺伝子を同時に解析することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報の提供システムとしては、１）対象女性の唾液からＤＮＡを抽出、増幅した後に、ＤＮＡチップを用いて女性の健康遺伝子のＳＮＰｓを解析し、健康遺伝子解析データを得るステップ（ａ）；２）前記対象女性が入力した生活習慣などの環境要因入力データを得るステップ（ｂ）；３）ステップ（ａ）で得られた健康遺伝子解析データとステップ（ｂ）で得られた環境要因入力データとを組み合わせて、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を前記対象女性に提供するステップ（ｃ）；の各ステップを備えたシステムであれば特に制限されず、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）とは、特定の集団において１％以上の頻度で認められる塩基配列中の一塩基の相違である。なお、本発明において、ＳＮＰの遺伝子中の位置は、ｒｓ番号により定義されるが、かかるｒｓ番号は、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ ＩＤ番号を意味し、米国のＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information：国立生物工学情報センター）が、各ＳＮＰを定義する番号である。また、本発明においてＳＮＰの「変異」を有する変異型は、野生型に比べて５０％未満の頻度で認められる上記一塩基の相違をいう。
【００１９】
上記ステップ（ａ）において、ＤＮＡは、対象女性の唾液から抽出される。唾液は、無痛で採取可能であること、無侵襲であること、対象女性の年齢や肉体的、精神的なハンディキャップに左右されないこと、繰り返しの採取が容易であり、さらに、唾液は血液の状態をよく反映することから、全身状態のモニターに適している。そのため、唾液は不特定多数の女性を対象女性とする本発明の試料として最適である。対象女性により採取された唾液は郵送等により、ＳＮＰｓ検査機関に送られる。
【００２０】
上記ステップ（ａ）において、唾液からＤＮＡを抽出する方法としては、従来公知の方法であれば特に制限されず、唾液からＤＮＡを抽出できる市販のキットを用いて、生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することもできる。例えば、Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ社のＳａｌｉｖａ ＤＮＡ，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，＆ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを挙げることができる。
【００２１】
上記ステップ（ａ）において、ＤＮＡを増幅する方法としては、特に制限されないが、ＰＣＲ法を好適に挙げることができる。ＰＣＲ法では、女性の健康遺伝子の各ＳＮＰ領域を含むＤＮＡ断片を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、ＤＮＡ断片の増幅処理が行われる。ＰＣＲ法を行う装置としては、一般的なサーマルサイクラー等を用いることができ、かかる装置により、ＤＮＡ変性工程、アニーリング工程、ＤＮＡ合成工程、及びその繰り返しを含む、ＰＣＲ工程を行うことができる。
【００２２】
上記ＰＣＲ法に用いられる反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、ヌクレオチド合成基質（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを含む、ｄｋａｒｅＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ等）、プライマーセット、ヌクレオチド合成酵素（Ｆａｓｔｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）、Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等）、試料のＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えば、ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、１０×ｃｏｎｃ． ｗｉｔｈ ２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）等を用いることができる。
【００２３】
上記プライマーセットとしては、上記ＤＮＡ試料中の女性の健康遺伝子の各ＳＮＰ領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅ＤＮＡを得ることができるプライマーセットであれば特に制限されないが、上記ＳＮＰが、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５つの良性変異を有するＳＮＰを含むプライマーセットや、以下の［表１］に示すプライマーセットのうち、少なくともｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有する１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５つのＳＮＰを含むプライマーセットが好ましい。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上記増幅ＤＮＡは、蛍光標識されていることが好ましい。蛍光標識を行う方法としては、上記ヌクレオチド合成基質として蛍光標識ヌクレオチドアナログを使用することにより、上記ＰＣＲ工程においてＤＮＡを増幅すると同時に標識を行う方法を挙げることもでき、また、増幅反応に使用する５’末端側プライマーをあらかじめ標識することにより、５’末端側が蛍光色素で標識された蛍光標識増幅ＤＮＡを調製する方法を挙げることができる。
【００２６】
上記標識を行うための物質としては、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光色素、具体的にはＦｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３やＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）、ＩＣ５（株式会社同人化学研究製）等の市販品を挙げることができ、ＩＣ５が特に好ましい。
【００２７】
上記ステップ（ａ）において、解析される女性の健康遺伝子のＳＮＰとしては、健康遺伝子解析データを得ることができるＳＮＰであれば特に制限されないが、良性変異を有するＳＮＰが好ましい。
【００２８】
ＳＮＰにおける良性変異とは、野生型ではない変異型を有する対象女性が、健康度が高いことを示す変異を意味する。健康度が高いことを示す変異を有する対象女性とは、例えば、通常よりもＤＮＡ修復能力が高い体質である対象女性、乳がん耐性がある対象女性、肥満耐性体質である対象女性、高血圧症への耐性がある対象女性、腎臓機能が高い対象女性、活力が高い対象女性等解析したＳＮＰにおいて悪性変異ではない変異を有する対象女性であり、かつ、野生型を有する対象女性よりも特定の疾病になりにくい対象女性などを挙げることができる。
【００２９】
本発明において健康遺伝子のＳＮＰｓを解析する方法としては、各ＳＮＰの変異を評価する方法を挙げることができ、具体的には対象女性は２つの対立遺伝子を有することから、２つの対立遺伝子上のある健康遺伝子のＳＮＰの遺伝子型が２つとも野生型である場合をワイルド型（Ｗ）；１つの対立遺伝子上の当該健康遺伝子のＳＮＰの遺伝子型が野生型であって、別の対立遺伝子上のＳＮＰの遺伝子型が変異型である場合をヘテロ型（Ｈ）；２つの対立遺伝子上の当該健康遺伝子ＳＮＰの遺伝子型が２つとも変異型である場合をバリアントホモ型（Ｖ）；として判定をする方法を挙げることができる。
【００３０】
上記良性変異によってＤＮＡ修復能力が高い体質となるＳＮＰとしては、ヒトＸＲＣＣ２遺伝子に存在するｒｓ３２１８５３６を挙げることができる。ｒｓ３２１８５３６は、ＤＮＡ修復能力に差異をもたらすＳＮＰとして知られており、ｒｓ３２１８５３６における良性変異としては、ヘテロ型Ｇ／Ａ及びバリアントホモ型Ａ／Ａを挙げることができる。かかる良性変異は、ＤＮＡ修復能力が高めである点で、ＤＮＡ修復能力が通常である野生型を有する対象女性よりも有利であって、良性変異の配列を有する対象女性に対しては、ブレストケアにおいては乳がんになりにくい、また、女性の健康度の評価においては、上皮性卵巣がんになりにくい体質である旨の評価を結果に含めることができる。
【００３１】
上記ｒｓ３２１８５３６におけるワイルド型Ｇ／Ｇは、一般的な体質とされるため、ワイルド型の配列を有する対象女性に対しては、年一回以上の婦人科検診を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。
【００３２】
上記良性変異によって乳がん耐性が高い体質となるＳＮＰとしては、ヒトＣＡＳＰ８遺伝子に存在するｒｓ１０４５４８５を挙げることができる。ｒｓ１０４５４８５は、乳がん耐性に差異をもたらすＳＮＰとして知られており、ｒｓ１０４５４８５における良性変異としては、ヘテロ型Ｇ／Ｃ及びバリアントホモ型Ｃ／Ｃを挙げることができる。かかる良性変異は、乳がんへの耐性が高めという点で、乳がんへの耐性が通常程度であるとされるワイルド型よりも有利であって、良性変異を有する対象女性に対しては、ブレストケア・女性の健康度の評価のいずれにおいても、乳がんになりにくい体質である旨の評価を結果に含めることができる。
【００３３】
上記ｒｓ１０４５４８５におけるワイルド型Ｇ／Ｇは、一般的な体質とされるため、ワイルド型の配列を有する対象女性に対しては、年一回以上の乳がん検診が奨励される旨の評価を結果に含めることができる。
【００３４】
上記良性変異によって肥満耐性体質となるＳＮＰとしては、ヒトＭＣ４Ｒ遺伝子に存在するｒｓ２２２９６１６を挙げることができる。ｒｓ２２２９６１６は、食欲や肥満耐性に差異をもたらすＳＮＰとして知られており、ｒｓ２２２９６１６における良性変異としては、ヘテロ型Ａ／Ｇ及びバリアントホモ型Ａ／Ａを挙げることができる。かかる良性変異は、肥満に対する耐性がある点で、食欲のコントロールやメタボリックシンドロームや肥満の予防においてワイルド型よりも有利であって、良性変異の配列を有する対象女性に対しては、ブレストケアにおいては、乳がんになりにくい体質である旨、女性の健康度の評価においては、食事管理がしやすく肥満にはなりにくい体質である旨の評価を結果に含めることができるほか、過食を防ぐために体重に関する評価を特に行わないこともできる。
【００３５】
上記ｒｓ２２２９６１６におけるワイルド型Ｇ／Ｇは、食欲が通常程度であり、摂取カロリーの管理を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。
【００３６】
上記良性変異によって塩分への感受性が高い、及び／又は高血圧症への耐性が高い体質となるＳＮＰとしては、ヒトＡＴＰ２Ｂ１遺伝子に存在するｒｓ２６８１４７２を挙げることができる。ｒｓ２６８１４７２は、塩分摂取による血圧への影響度に差異をもたらすＳＮＰとして知られており、ｒｓ２６８１４７２における良性変異としては、ヘテロ型Ｃ／Ｔ、バリアントホモ型Ｃ／Ｃを挙げることができる。かかる良性変異は、血圧管理においてワイルド型よりも有利であって、良性変異の配列を有する対象女性に対しては、ブレストケアにおいては、乳がんになりにくい体質である旨、女性の健康度の評価においては高血圧症になりにくいが過度の塩分摂取に対して留意することを奨励する旨の評価を結果に含めることができる。
【００３７】
上記ｒｓ２６８１４７２におけるワイルド型Ｔ／Ｔは、高血圧への耐性が通常程度であり、減塩の食事の摂取を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。
【００３８】
上記良性変異によって腎臓機能が高い、及び／又は高血圧症への耐性が高い体質となるＳＮＰとしては、ヒトＵＭＯＤ遺伝子に存在するｒｓ１３３３３２２６を挙げることができる。ｒｓ１３３３３２２６は、ナトリウム濃度調整能力に差異をもたらすＳＮＰとして知られており、ｒｓ１３３３３２２６における良性変異としては、ヘテロ型Ａ／Ｇ、バリアントホモ型Ｇ／Ｇを挙げることができる。かかる良性変異は、血圧管理においてワイルド型よりも有利であって、良性変異の配列を有する対象女性に対しては、ブレストケアにおいては、乳がんになりにくい体質である旨、女性の健康度の評価においては高血圧症になりにくい旨の評価を結果に含めることができる。
【００３９】
上記ｒｓ１３３３３２２６におけるワイルド型Ａ／Ａは、体内のナトリウム濃度調整能力が通常程度であり、減塩の食事の摂取を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。
【００４０】
前記健康遺伝子解析データを得ることができるＳＮＰには、ＳＮＰにおける非良性変異の有無を判定するＳＮＰを含めてもよく、非良性変異とは、野生型ではない変異型を有する対象女性が、特定の分野・性状において健康度が低いと判定される変異を意味する。健康度が低いことを示す非良性変異を有する被検女性としては、例えば、耐糖能力が低い体質である対象女性、脂肪の蓄積能力が高い対象女性、体重が増加しやすい対象女性、カフェインの代謝能力が低い対象女性、肺がんや乳がんになりやすい対象女性等を挙げることができる。
【００４１】
上記非良性変異があることによって耐糖能力が低い体質となるＳＮＰとしては、いずれも耐糖能力に差異をもたらすＳＮＰとして知られているヒトＴＣＦ７Ｌ２遺伝子に存在するｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ７９０１６９５を挙げることができる。
【００４２】
ｒｓ１２２５５３７２における非良性変異としては、耐糖能力が低いヘテロ型Ｇ／Ｔ及びバリアントホモ型Ｔ／Ｔを挙げることができ、これらの変異を有する対象女性に対しては、緩やかに糖の摂取をすることを奨励する旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ｇ／Ｇは、耐糖能力が通常程度である旨の評価を結果に含めることができる。
【００４３】
上記ｒｓ７９０３１４６における非良性変異としては、耐糖能力が低いヘテロ型Ｔ／Ｃ及びバリアントホモ型Ｃ／Ｃを挙げることができ、これらの変異を有する対象女性に対しては、緩やかに糖の摂取をすることを奨励する旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ｔ／Ｔは、耐糖能力が通常程度である旨の評価を結果に含めることができる。
【００４４】
上記ｒｓ７９０１６９５における非良性変異としては、耐糖能力が低いヘテロ型Ｃ／Ｔ及びバリアントホモ型Ｔ／Ｔを挙げることができ、これらの変異を有する対象女性に対しては、緩やかに糖の摂取をすることを奨励する旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ｃ／Ｃは、耐糖能力が通常程度である旨の評価を結果に含めることができる。
【００４５】
上記脂肪を蓄積しやすい体質となるＳＮＰとしては、ヒトＦＴＯ遺伝子に存在するｒｓ１４２１０８５とｒｓ９９３９６０９を挙げることができる。ｒｓ１４２１０８５における非良性変異としては、ヘテロ型Ｔ／Ｃ及びバリアントホモ型Ｃ／Ｃを挙げることができ、これらの非良性変異を有する対象女性に対しては、脂肪蓄積能力が非常に高いため積極的な運動を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ｔ／Ｔは、脂肪の蓄積能力が通常程度である旨の評価を結果に含めることができる。また、ｒｓ９９３９６０９における非良性変異としては、ヘテロ型Ａ／Ｔ及びバリアントホモ型Ａ／Ａを挙げることができ、これらの非良性変異を有する対象女性に対しては、体重が増えやすいため、体重管理の習慣と積極的な運動を奨励する旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ｔ／Ｔは、体重管理が比較的容易である旨の評価を結果に含めることができる。
【００４６】
上記カフェイン代謝が通常より低くなる体質となるＳＮＰとしては、ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子に存在するｒｓ７６２５５１を挙げることができる。ｒｓ７６２５５１における変異としては、ヘテロ型Ｃ／Ａ及びバリアントホモ型Ｃ／Ｃを挙げることができる。かかる変異を有する者は、カフェインを摂取することにより、覚醒効果が持続するため、労働意欲や勉強時の集中力が持続する等の効果を得ることができるという側面もあるが、本発明においては、上記変異を有する対象女性に対しては、快眠を得るために、又乳がんを予防するために、夕方以降にカフェイン摂取を控えることや一日当たりのカフェイン過剰摂取を控えることを奨励し、快眠を得ることによりバストボリュームのアップにもつながる旨の評価を結果に含めることができる。ワイルド型Ａ／Ａは、カフェインの代謝能力が通常程度であり、快眠を得やすい旨の評価を結果に含めることができる。
【００４７】
上記肺がんや乳がんになりやすい体質となるＳＮＰとしては、ヒトＮＱＯ１遺伝子に存在するｒｓ１８００５６６を挙げることができる。ｒｓ１８００５６６における非良性変異としては、バリアントホモ型Ｔ／Ｔを挙げることができ、かかる変異は、コエンザイムＱ１０量が高目となりリラクゼーションが容易であるが、ブレストケアにおいては、乳がんになりやすい体質である旨、女性の健康度の評価においては肺がんになりやすい旨の評価を結果に含めることができる。
【００４８】
ｒｓ１８００５６６におけるワイルド型Ｃ／Ｃ及びヘテロ型Ｃ／Ｔは、ブレストケアにおいては、乳がんになりにくい体質である旨、女性の健康度の評価においては、肺がんになりにくい旨の評価を結果に含めることができる。
【００４９】
上記ステップ（ａ）における、ＳＮＰｓを解析する方法としては、従来公知の方法を含め特に制限されず、シークエンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法等を挙げることができるが、ＤＮＡチップを用いることにより同時に多数のＳＮＰにおける良性変異の有無を検出することが可能である点でＤＮＡマイクロアレイ法が好ましい。
上記ＤＮＡマイクロアレイ法においては、前記ＰＣＲ法により増幅されたヌクレオチドの配列における各ＳＮＰにおける野生型と変異型の配列を区別するために、ハイブリダイズできるヌクレオチドプローブ（以下、単に「プローブ」ともいう）を予め合成し、かかるプローブがそれぞれ担体上の定められた領域に固定されているＤＮＡチップを作製し、前記蛍光標識増幅ＤＮＡを、ＤＮＡチップに接触させて、前記蛍光標識増幅ＤＮＡと前記プローブとのハイブリダイゼーションの有無を判定することにより、上記女性の健康遺伝子のＳＮＰｓを解析することが好ましい。
【００５０】
上記ＤＮＡチップにおける基板の材料としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素等のシリコン；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト等の無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂等の樹脂材料を挙げることができるが、担体表面には、その後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点でカーボン層が形成されることが好ましく、カーボン層の形成において有利な点でシリコンが好ましい。
【００５１】
上記カーボン層としては、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物；天然ダイヤモンド；ダイヤモンドとカーボンとの混合体であるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の軟ダイヤモンド；アモルファスカーボン；グラファイト；フラーレン；カーボンナノチューブ；これらの混合物又はこれらの積層物からなるカーボン層を挙げることができる。
【００５２】
上記カーボン層が形成されたチップの表面には、プローブを強固に固定化するために、従来公知の方法により化学修飾基を導入することが好ましい。上記化学修飾基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基を挙げることができ、さらには、化学修飾基を導入されたチップ表面を、公知の方法にて活性エステル基等により活性化をすることもできる。
【００５３】
かかるチップに固定化されるプローブは、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいが、プローブの安定性に優れていることからＤＮＡプローブであることが好ましく、上記ＰＣＲ法により増幅されたヌクレオチドの配列の各ＳＮＰにおける野生型と変異型の配列を区別してハイブリダイズすることができるプローブであることが必要である。
【００５４】
上記各ＳＮＰにおける野生型と変異型の配列を区別して、ハイブリダイズできるプローブとしては、例えば、ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６である場合には、野生型Ｇと変異型Ａを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ１０４５４８５である場合には、野生型Ｇと変異型Ｃを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ１２２５５３７２である場合には、野生型Ｇと変異型Ｔを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ７９０３１４６である場合には、野生型Ｃと変異型Ｔを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ７９０１６９５である場合には、野生型Ｔと変異型Ｃを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ１４２１０８５である場合には、野生型Ｔと変異型Ｃを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ９９３９６０９である場合には、野生型Ｔと変異型Ａを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ２２２９６１６である場合には、野生型Ｇと変異型Ａを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ２６８１４７２である場合には、野生型Ｔと変異型Ｃを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ１３３３３２２６である場合には、野生型Ａと変異型Ｇを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ７６２５５１である場合には、野生型Ａと変異型Ｃを区別してハイブリダイズできるプローブ、ＳＮＰがｒｓ１８００５６６である場合には、野生型Ｃと変異型Ｔを区別してハイブリダイズできるプローブであれば特に制限されず、例えば、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる、１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５つのＳＮＰの良性変異を有するＳＮＰを野生型と変異型を区別して特異的に検出するプローブ（セット）や、以下の［表２］に示す配列の１又は２以上を含むプローブ（セット）のうちや、少なくともｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有する１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５つのＳＮＰを含むプローブ（セット）を挙げることができる。
【００５５】
上記各プローブにおいては、チップへの固定化の効率を高めるために、また、上記増幅ＤＮＡとハイブリダイズする効率を向上するために、オリゴＴ配列を５’末端に付加することも好ましい。
【００５６】
【表２】
2017211886.tif 000003
【００５７】
前記ワイルド型、ヘテロ型、又はバリアントホモ型を判定する方法としては、
上記各プローブとハイブリダイズした上記蛍光増幅ＤＮＡの蛍光標識を検出することにより定量化する方法を挙げることができ、具体的には、特定の蛍光標識を適切に検出できる波長光を照射することにより、各ハイブリダイズした蛍光増幅ＤＮＡにおける励起した蛍光を測定する方法を挙げることができる。例えば、蛍光標識がＩＣ５である場合には、６４０ｎｍの波長の光を各スポットに照射することにより蛍光を検出し、各スポットの蛍光強度値をもとに、例えば、以下の式１により求められた判定値を指標として、あらかじめ用意された分類表により、蛍光強度／バックグラウンド値の値が２以上であることを前提として、対象女性の各ＳＮＰがワイルド型、ヘテロ型、バリアントホモ型のいずれかであるかを判定する方法を挙げることができる。
【００５８】
【数１】
2017211886.tif 000004
【００５９】
上記判定値において、例えば、あるＳＮＰにおける判定値が０〜０．４８である場合は、対象女性の当該ＳＮＰの遺伝子型はワイルド型である旨、上記判定値が０．４９〜１．４５である場合はヘテロ型である旨、上記判定値が１．４８以上である場合はバリアントホモ型である旨判定することができるが、かかる判定値は、ＳＮＰのプローブの種類や長さ等の条件により変動しうることから、ＳＮＰ毎に修正を加えて後、上記分類表を作成することが好ましい。
【００６０】
上記健康遺伝子解析データの作成は、各対象女性の各ＳＮＰについて、ワイルド型、ヘテロ型、バリアントホモ型の判定がなされた後に、各ＳＮＰにおける遺伝子型の結果を照らし合わせることにより総合的に行われることが好ましい。例えば、上記良性変異を有するＳＮＰにおいて、被検女性が、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６の５つの良性変異を有する場合には、乳がん発症の可能性がきわめて低いと判定することができ、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；等の組合せの４つの良性変異を有する場合は、乳がん発症の可能性がかなり低いと判定することができる。
【００６１】
また、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、ｒｓ１３３３３２２６；等の組合せの３つの良性変異を有する場合は、乳がん発症の可能性が低いと判定することができる。
【００６２】
そしてまた、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２２２９６１６；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１３３３３２２；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ１３３３３２２６；ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２；ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ１３３３３２２６；等の組合せの２つの良性変異を有する場合は、乳がん発症の可能性がすこし低いと判定することができる。
【００６３】
さらに、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、又はｒｓ１３３３３２２６の１つの良性変異を有する場合は、乳がん発症の可能性がやや低いと判定することができる。
【００６４】
上記ＳＮＰにおける良性変異を用いる判定に加えて、上記ＳＮＰにおける非良性変異の有無を判定することを含めることができ、非良性変異に関するＳＮＰとしては、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ１４２１０８５、ｒｓ９９３９６０９、ｒｓ７６２５５１、ｒｓ１８００５６６等を挙げることができる。
【００６５】
上記ステップ（ｂ）における生活習慣などの環境要因入力データは、例えば判定機関のパソコン等から送付されたフォーマットにしたがって、対象女性が身長、体重、体温、心拍数、呼吸数、歩数／日等の生活習慣などを自ら入力し、スマホ等により判定機関に送信される。かかる環境要因入力データは、上記ＳＮＰｓ検査機関から判定機関に送付された健康遺伝子解析データと組み合わせることにより、女性の健康増進に有用なカスタマイズ情報を提供することができる。
【００６６】
上記ステップ（ｃ）において、対象女性に提供するカスタマイズ情報としては、ステップ（ａ）で得られた健康遺伝子解析データと、ステップ（ｂ）で得られた環境要因入力データとを組み合わせることにより、上記健康遺伝子解析データと組み合わせることにより、女性の健康増進に有用な情報を、例えば判定機関から対象女性にパソコン送信等により提供することができる。これらの健康増進に有用な情報は、個々の女性にカスタマイズされていることからカスタマイズ情報であり、例えば対象女性の生活習慣などの環境要因入力データの変更に伴い、適宜更新されていく。
【００６７】
本発明の女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する方法としては、対象女性由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を増幅する工程と、ＤＮＡチップにおける担体上に固定化されたプローブと前記増幅ＤＮＡとを接触させる工程と、各プローブにおける増幅ＤＮＡとのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした核酸（ＤＮＡ）の比に基づいて女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する工程とを含む方法を挙げることができ、上記ＳＮＰを含む領域を増幅する工程においては、例えば、女性の健康遺伝子のＳＮＰを含む領域を特異的に増幅するプライマーセットであって、ＳＮＰがｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰを有するプライマーセットを用いることによりＳＮＰを含む領域を増幅することができ、また、ｒｓ３２１８５３６、ｒｓ１０４５４８５、ｒｓ２２２９６１６、ｒｓ２６８１４７２、及びｒｓ１３３３３２２６から選ばれる良性変異を有するＳＮＰにおける野生型と変異型の配列を区別することができるプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いることにより、増幅ＤＮＡとのハイブリダイズを検出することができる。
【００６８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
［ＤＮＡ試料の調製］
女性の被検者４０人について唾液を０．５〜２ｍＬ採取し、Ｓａｌｉｖａ ＤＮＡ，Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，＆ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを用いて、ＤＮＡを抽出し、各被検者のＤＮＡ試料を調製した。
【００７０】
［プローブの作製］
１２種類のＳＮＰの遺伝子配列について、試料中の増幅ＤＮＡが野生型かバリアント型かを判別するために、野性型検出用ＤＮＡプローブには各ＳＮＰにおいて野生型の配列を有する由来の蛍光増幅ＤＮＡがハイブリダイズし、変異型検出用ＤＮＡプローブにはバリアント型配列を有する蛍光増幅ＤＮＡがハイブリダイズするようにプローブを作製した。プローブ塩基長の調整及びプローブ性能評価による選別を実施し、以下の［表３］に示す１２種類のプローブを作製した。
【００７１】
【表３】
2017211886.tif 000005
【００７２】
（ＤＮＡチップの作製）
２種類ずつのプローブ（合計２４種類）及び位置プローブを、それぞれジーンシリコン（東洋鋼鈑社製）上に、１つのプローブに付き２箇所ずつスポッターを使用して固定化したＤＮＡチップを作製した。また、固定化プローブの模式図を図１に示す。図１に示した女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析するキット（ＢＣＧチップキット）は、女性の健康遺伝子のＳＮＰを増幅するプライマーセット、増幅した女性の健康遺伝子のＳＮＰを検出するためのプローブ、当該プローブを備えるＤＮＡチップ、これらを使用して女性の健康遺伝子のＳＮＰを解析する方法を含む。なお、具体的なチップの単体基板材料、固定化に使用した試薬、固定化方法等についてはＷＯ２００９／１３０７９７の実施例に記載した方法に準じた。
【００７３】
［ＤＮＡ試料の増幅］
上記各被検者のＤＮＡ試料について、上記２４種類のプローブとハイブリダイズしうるＤＮＡ配列領域を含む核酸断片を増幅した。
【００７４】
（蛍光標識プライマーの作製）
５’末端をアミノ基で標識した以下の［表４］中の各ＳＮＰ領域増幅用フォワードプライマー又はリバースプライマー１２種類と、ＩＣ５−Ｏｓｕ（株式会社同仁化学研究所製）とを、リン酸ナトリウム緩衝液中で４℃にて一晩反応させた後精製することにより、１２種類の蛍光標識プライマーを作製した。
【００７５】
【表４】
2017211886.tif 000006
【００７６】
上記蛍光標識プライマー１２種類と上記表４に示される未標識プライマー１２種類を含む以下のＰＣＲ反応液を上記各被検者のＤＮＡ試料（５μＬ）に加え、マルチプレックスＰＣＲを行い、蛍光標識増幅ＤＮＡを得た
【００７７】
【表５】
2017211886.tif 000007
【００７８】
サーマルサイクラーにおける増幅のプログラムとしては、９５℃にて５分の後、９５℃にて３０秒、６０℃にて６０秒、７２℃にて９０秒を１サイクルとして、４０サイクル行った後、４℃に冷却した。
【００７９】
（プローブとのハイブリダイゼーション）
上記蛍光標識増幅ＤＮＡ４μＬと、ハイブリダイズ反応用緩衝液２μＬ（２．２５×ＳＳＣ／０．２３％ＳＤＳ／１．８ｎＭ ＩＣ５標識オリゴＤＮＡ）の混合液とを調製し、この溶液を３μＬとり、ハイブリダイズカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップの上に被せ、５３℃にて６０分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。
【００８０】
（ＤＮＡチップの洗浄）
ハイブリダイズ反応後、非特異的にＤＮＡプローブとハイブリダイズしている増幅ＤＮＡを０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸し、その後、チップの蛍光強度を検出するまで１×ＳＳＣ溶液（室温）に浸した。
【００８１】
（ＤＮＡチップの蛍光検出） 
上記ＤＮＡチップにカバーフィルムを被せ、遺伝子解析装置ＢＩＯＳＨＯＴ（Ａ＆Ｔ株式会社製）にセットした。波長６４０ｎｍのレーザー光を照射することにより各ハイブリダイズしたＤＮＡ蛍光増幅産物中の励起した蛍光を測定した。
【００８２】
（遺伝子解析）
上記蛍光測定の結果を基に、１２種類の遺伝子のＳＮＰの遺伝子型を解析した。ハイブリダイズの有無の検出には、遺伝子解析装置研究用ＢＩＯＳＨＯＴを用い、露光時間を７秒に設定した。各スポット径内の画素の数値から、同じプローブがスポットされている２つのスポットの蛍光強度の平均値を求めた。ＳＮＰの変異の評価については、各スポットの蛍光強度値から上記式１により求められた判定値を指標として、ワイルド型、ヘテロ型、バリアントホモ型の判定を行った。
【００８３】
ワイルド型、ヘテロ型、バリアントホモ型の判定を行うための分類表を以下の表６に示す。
【００８４】
【表６】
2017211886.tif 000008
【００８５】
検体となる唾液試料から、ＤＮＡの抽出・増幅を行った後、ＤＮＡチップと反応させることにより得られる蛍光画像の例（左）と遺伝子の判別方法（右）を示す図である。この蛍光画像のパターン解析及び上記分類表から、各被検者における１２種類の遺伝子を同時に解析した。
【図１】
2017211886.tif 000009
【配列表】
2017211886000001.app