(57)【要約】【課題】多光子励起による蛍光観察をマルチビームによって同時に行うことを可能とし、低侵襲で多点を同時に高ＳＮ比で観察する。【解決手段】光源部３から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームに異なる変調を加える変調部５，６と、該変調部５，６により異なる変調が加えられた複数の極短パルスレーザ光ビームを試料Ｏの異なる位置に同時に集光させる照明光学系７と、極短パルスレーザ光ビームの各集光位置において発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出素子８と、該蛍光検出素子８からの出力を変調部５，６による変調情報に基づいて復調する復調部９を備えるレーザ顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源部から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームに異なる変調を加える変調部と、
該変調部により異なる変調が加えられた複数の前記極短パルスレーザ光ビームを試料の異なる位置に同時に集光させる照明光学系と、
前記極短パルスレーザ光ビームの各集光位置において発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出素子と、
該蛍光検出素子からの出力を前記変調部による変調情報に基づいて復調する復調部を備えるレーザ顕微鏡。
【請求項２】
複数の前記極短パルスレーザ光ビームの少なくとも１つの波面を変調する空間光変調素子を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記変調部が、複数の前記極短パルスレーザ光ビームに、異なる周波数の強度変調を加える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記変調部が、複数の前記極短パルスレーザ光ビームに、異なる位相の強度変調を加える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
光源部から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームに異なる変調を加える変調ステップと、
該変調ステップにより異なる変調が加えられた複数の前記極短パルスレーザ光ビームを試料の異なる位置に同時に集光させる照明ステップと、
該照明ステップによる前記極短パルスレーザ光ビームの各集光位置において発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出ステップと、
該蛍光検出ステップにより検出された蛍光信号を前記変調ステップによる変調情報に基づいて復調する復調ステップとを含む顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脳神経分野において神経細胞の活動を計測する手法として、パッチクランプ法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この手法は、細胞の細胞膜に微小電極を吸着させる必要があるため、オペレータに高度な技能が要求される。また、脳神経の特定領域に設定できる電極の数には限界がある上に、電極の刺入を伴うため組織への侵襲が高いという問題がある。
組織の深部を低侵襲で観察する方法として多光子励起による蛍光観察方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２２７１４５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８０８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献２の多光子励起による蛍光観察方法は、極短パルスレーザ光の集光位置から発せられ、散乱により種々の経路を経由して対物レンズにより集光された蛍光を検出するので、多数の極短パルスレーザ光のビームを同時に照射（マルチビーム観察）することができないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、多光子励起による蛍光観察をマルチビームによって同時に行うことを可能とし、低侵襲で多点を同時に高ＳＮ比で観察することができるレーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源部から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームに異なる変調を加える変調部と、該変調部により異なる変調が加えられた複数の前記極短パルスレーザ光ビームを試料の異なる位置に同時に集光させる照明光学系と、前記極短パルスレーザ光ビームの各集光位置において発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出素子と、該蛍光検出素子からの出力を前記変調部による変調情報に基づいて復調する復調部を備えるレーザ顕微鏡を提供する。
【０００６】
本態様によれば、光源部から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームが、変調部においてそれぞれ異なる変調を加えられた後に、照明光学系によって、試料の異なる位置に同時に集光させられる。極短パルスレーザ光ビームの各集光位置においては、光子密度が局所的に高められることにより蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は全方向に発せられて散乱され、その一部が種々の経路を辿った後に蛍光検出素子によって検出されて光電変換される。そして、蛍光検出素子から出力される電気信号は、変調部による変調情報に基づいて復調部において復調される。
【０００７】
すなわち、蛍光検出素子によって検出される蛍光は、複数の集光位置において同時に発生した蛍光を含んでいるが、該蛍光にも複数の極短パルスレーザ光ビームに加えた変調が引き継がれているため、蛍光検出素子によって検出された混合信号を復調部によって各変調情報に基づいて復調することにより、各極短パルスレーザ光ビームに対応して発生した蛍光を分離して取り出すことができる。これにより、多光子励起による蛍光観察をマルチビームによって同時に行うことを可能とし、低侵襲で多点を同時に高ＳＮ比で観察することができる。
【０００８】
上記態様においては、複数の前記極短パルスレーザ光ビームの少なくとも１つの波面を変調する空間光変調素子を備えていてもよい。
このようにすることで、少なくとも１つの極短パルスレーザ光ビームの波面を空間光変調素子によって変調することにより、照明光学系の焦点面とは異なる深さ位置に極短パルスレーザ光ビームを集光させることができ、複数の極短パルスレーザ光ビームを試料の異なる深さ位置に集光させることができる。
【０００９】
また、上記態様においては、前記変調部が、複数の前記極短パルスレーザ光ビームに、異なる周波数の強度変調を加えてもよい。
また、上記態様においては、前記変調部が、複数の前記極短パルスレーザ光ビームに、異なる位相の強度変調を加えてもよい。
このようにすることで、極短パルスレーザ光ビームの変調および復調を簡易に行うことができる。
【００１０】
また、本発明の他の態様は、光源部から発せられた同一種類の複数の極短パルスレーザ光ビームに異なる変調を加える変調ステップと、該変調ステップにより異なる変調が加えられた複数の前記極短パルスレーザ光ビームを試料の異なる位置に同時に集光させる照明ステップと、該照明ステップによる前記極短パルスレーザ光ビームの各集光位置において発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出ステップと、該蛍光検出ステップにより検出された蛍光信号を前記変調ステップによる変調情報に基づいて復調する復調ステップとを含む顕微鏡観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多光子励起による蛍光観察をマルチビームによって同時に行うことを可能とし、低侵襲で多点を同時に高ＳＮ比で観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡を示す模式図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡の復調部を示す模式図である。
【図３】図１のレーザ顕微鏡により試料に集光される極短パルスレーザ光ビームを示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。
【図５】（ａ）図１のレーザ顕微鏡のレーザ光源から出力される極短パルスレーザ光ビームのパルス列（ｂ）（ａ）の極短パルスレーザ光ビームに重畳される変調信号（ｃ）（ｂ）の変調信号によって変調された極短パルスレーザ光ビームのパルス列（ｄ）（ｃ）の極短パルスレーザ光ビームを試料に照射した際に集光位置において発生する蛍光信号をそれぞれ示す図である。
【図６】（ａ）図４の顕微鏡観察方法を用いて極短パルスレーザ光ビームを２次元的に走査して取得された蛍光画像（ｂ）（ａ）における蛍光強度のスケールをそれぞれ示す図である。
【図７】（ａ）図６（ａ）の画像の４列目（矢印で示す列）（ｂ）（ａ）を左から右に向かって走査したときの蛍光強度信号、（ｃ）復調された蛍光強度信号をそれぞれ示す図である。
【図８】図４の顕微鏡観察方法を用いて試料に設定された所定範囲の学習前の２つの注目領域の蛍光強度の変化を同時に取得した波形を示す図である。
【図９】図４の顕微鏡観察方法を用いて試料に設定された所定範囲の学習後の２つの注目領域の蛍光強度の変化を同時に取得した波形を示す図である。
【図１０】図８および図９の注目領域の相関強度を示す図である。
【図１１】図４の顕微鏡観察方法を用いて試料に設定された所定範囲における８つの注目領域を示す図である。
【図１２】（ａ）図１１の各注目領域を相関マトリクス上に当てはめた蛍光画像（ｂ）（ａ）における相関強度をそれぞれ示す図である。
【図１３】図１のレーザ顕微鏡の変形例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡１および顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、試料Ｏを搭載するステージ２と、２つのレーザ光源（光源部）３，４から射出される２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔにそれぞれ異なる周波数の周期的な強度変調を重畳する２つの音響光学素子（ＡＯＭ、変調部）５，６と、音響光学素子５，６から射出された２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを試料Ｏの異なる位置に集光させる照明光学系７と、異なる集光位置Ａ，Ｂにおいて発生した蛍光を検出する光電子増倍管（ＰＭＴ、蛍光検出素子）８と、該光電子増倍管８からの出力を復調する復調部９とを備えている。図中、符号１０は、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔの光路から蛍光を分岐するダイクロイックミラー、符号１１は集光レンズである。
【００１４】
２つのレーザ光源３，４は、同一種類の極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを別々に射出するものである。図１においては、２つの別個のレーザ光源３，４を例示したが、これに限定されるものではなく、単一のレーザ光源から射出された極短パルスレーザ光ビームをビームスプリッタによって２つに分岐することにより２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを形成することにしてもよい。
【００１５】
照明光学系７は、２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを別々に走査する２つのスキャナ１４，１５と、リレーする複数のリレーレンズ１６と、２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを合波するビームスプリッタ１７と、合波された極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを試料Ｏに集光する対物レンズ１８とを備えている。
【００１６】
２つのスキャナ１４，１５は対物レンズ１８の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されており、偏向角度を異ならせてリレーレンズ１６を通過した極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔがビームスプリッタ１７で合波される。合波された極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔは、双方の光軸が平行ながらもその位置が光軸と垂直方向にシフトして分離しており、対物レンズ１８によって、該対物レンズ１８の焦点面上の異なる集光位置Ａ，Ｂに集光させられるようになっている。図中、符号１２は、ビームスプリッタ１７を透過した光を略平行光にするリレーレンズである。また、符号１３は、ダイクロイックミラー１０を透過した試料Ｏからの蛍光を集光レンズ１１に向けて反射するミラーである。
【００１７】
光電子増倍管８は、検出した蛍光を光電変換して、蛍光の強度に応じた電流信号を出力するようになっている。
復調部９は、図２に示されるように、光電子増倍管８から出力される電流信号を電圧信号に変換して増幅する増幅器１９と、該増幅器１９により増幅された電圧信号を２つに分岐して、それぞれの電圧信号に２つの音響光学素子５，６により加えた変調周波数の正弦波信号をそれぞれ乗算する２つの乗算器２２，２３と、該乗算器２２，２３の出力を通過させる２つのローパスフィルタ（ＬＰＦ）２４，２５とを備えている。図中、符号２０，２１は、音響光学素子５，６により加えた変調周波数を発振する周波数ジェネレータである。
【００１８】
ここで、復調の原理について説明する。
一方の音響光学素子５による変調周波数をα、他方の音響光学素子６による変調周波数をβとし、ノイズ周波数をγとすると、光電子増倍管８から出力される電気信号Ｓ（ｔ）は、
Ｓ（ｔ）＝ｓｉｎαｔ＋ｓｉｎβｔ＋ｓｉｎγｔ
である。なお、上式では、周波数にのみ着目するため各項の重み付け係数は簡略化し、係数を全て１にしている。
【００１９】
この電気信号Ｓ（ｔ）を変調周波数αで復調するには、まず、電気信号Ｓ（ｔ）に周波数αの正弦波信号を乗算する。すなわち、
Ｓ（ｔ）×ｓｉｎαｔ
＝（ｓｉｎαｔ＋ｓｉｎβｔ＋ｓｉｎγｔ）×ｓｉｎαｔ
＝（ｃｏｓ（０）−ｃｏｓ２αｔ）／２
＋（ｃｏｓ（β−α）ｔ−ｃｏｓ（α＋β）ｔ）／２
＋（ｃｏｓ（γ−α）ｔ−ｃｏｓ（γ＋α）ｔ）／２
【００２０】
ここで、ｃｏｓ（０）は直流成分であり、他の項はそれぞれ０ではない周波数を持つ。そこで、この信号を適切なローパスフィルタ２４，２５によって直流成分だけ抽出すると、変調周波数αに由来するｃｏｓ（０）の項のみが出力として残る。これにより、復調させたい変調周波数αの成分のみを分離することができる。変調周波数βについても同様である。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いた顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、図４に示されるように、２つのレーザ光源３，４から射出された同一種類の２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔのそれぞれを別々の音響光学素子５，６において別々の変調周波数α，βで変調を加える変調ステップＳ１と、変調された２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを試料Ｏの異なる位置に同時に集光させる照明ステップＳ２と、異なる２つの集光位置Ａ，Ｂにおいて発生した蛍光を検出して光電変換する蛍光検出ステップＳ３と、検出された蛍光を、２つの音響光学素子５，６における２つの変調周波数α，βでそれぞれ復調する復調ステップＳ４とを含んでいる。
【００２２】
図５（ａ）にレーザ光源３，４から出力される極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔのパルス列の一例を示す。
図５（ｂ）は、変調ステップＳ１において極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔに重畳される変調信号の一例を示す。
そして、変調ステップＳ１において図５（ｂ）の変調信号によって変調された極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔのパルス列を図５（ｃ）に示す。
【００２３】
照明ステップＳ２において、図３に示されるように、試料Ｏの２カ所の異なる位置に２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔが集光させられると、各集光位置Ａ，Ｂにおいて、光子密度が局所的に高められることによる多光子励起効果により蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は集光位置Ａ，Ｂから全方向に放射され、試料Ｏ内の各部において散乱され、一部が対物レンズ１８によって集められる。
このようにして変調された極短パルスレーザ光が試料Ｏに照射された結果、集光位置Ａ，Ｂにおいて発生する蛍光信号の一例を図５（ｄ）に示す。
【００２４】
２つの集光位置Ａ，Ｂにおいては、蛍光が同時に発生しているので、対物レンズ１８によって集められ、光電子増倍管８によって検出される蛍光には、２つの集光位置Ａ，Ｂにおいて発生した異なる極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔに由来する蛍光が混合されている。
この場合に、各極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔに由来する蛍光は、各極短パルスレーザ光に加えられた変調周波数α，βを引き継いでいるので、復調ステップＳ４において２つの変調周波数α，βでそれぞれ復調することにより、精度よく分離することができる。
【００２５】
すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１および顕微鏡観察方法によれば、多光子励起効果を利用することによって、パッチクランプ法のように電極を刺入しないので、試料Ｏに対して低侵襲で観察を行うことができるとともに、変調および復調によって、異なる集光位置Ａ，Ｂにおいて同時に発生した蛍光を精度よく分離して観察することができるという利点がある。
【００２６】
特に、観察しようとする試料Ｏが神経細胞である場合には、神経細胞の応答が生体個体に対する刺激あるいは細胞への電気刺激などを行い、その直後からの応答を計測する方法が一般的である。本実施形態によれば、これらの刺激に対する応答を複数箇所において同時に観察できる。
【００２７】
ここで、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１および顕微鏡観察方法を用いて試料Ｏに設定された所定範囲の複数のＲＯＩ（注目領域）の画像を取得する場合について説明する。
この場合には、照明光学系７の２つのスキャナ１４，１５を別々の振り角度で揺動させることにより、２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを各ＲＯＩの範囲にわたって２次元的に走査させる。
【００２８】
図６（ａ）に単一の変調周波数αで変調された極短パルスレーザ光ビームＳをＸＹ方向に２次元的に走査して取得された８×８画素の蛍光画像の一例を示す。図６（ｂ）は図６（ａ）における蛍光強度の強弱を示すスケールである。図６（ａ）の画像の４列目（図６（ａ）に矢印で示す列、図７（ａ））の左から右に向かって極短パルスレーザ光を走査したとき、光電子増倍管８によって、図７（ｂ）に示されるように、蛍光強度信号が取得される。
【００２９】
この例では、極短パルスレーザ光ビームＳが１画素の区画を走査する間に、変調周波数αの周期が２周期含まれている。このようにして得られた蛍光強度信号を復調部９に入力して変調周波数αの正弦波信号の乗算およびローパスフィルタ２４，２５による直流成分の抽出を行うと、図７（ｃ）に示される波形の蛍光強度信号が得られる。なお、この蛍光強度信号は、試料Ｏから得られた生の蛍光強度信号ではなく、その生の蛍光強度信号の変調周波数αの成分振幅を示す復調蛍光強度である。
【００３０】
ここでは、１画素に相当する時間単位で時間窓を区切り、それぞれの時間窓で復調したものを表しているが、時間窓で区切ることなく連続的に復調を行って得られた直流成分変化の波形を１画素の時間で区切ることにしてもよい。
ここで注目すべきは、試料Ｏから得られた蛍光強度信号の絶対値、すなわち、図７（ｂ）の波形の絶対値は図７（ｃ）の波形である復調して得られた変調周波数αの成分の振幅とは関係がないことである。
【００３１】
具体的には、例えば、７（ａ）の一番左の画素においては、光電子増倍管８から得られる蛍光強度は変調周波数αの同調成分の他に、比較的大きい直流のベースラインが重畳している。しかし、図７（ａ）の中央部の画素においては、変調周波数αの同調成分が支配的であり直流のベースラインがほとんど存在していない。ここで一番左の画素のベースラインが大きくなる理由としては、例えば、変調周波数βで変調しているもう片方の励起光スポットからの蛍光混入が考えられる。そして、これらを変調周波数αで復調すると、一番左の画素の不要なベースラインが排除され純粋な変調周波数αの成分振幅のみが抽出されるため、もともとの信号強度の絶対値は比較的大きかったにもかかわらず、復調後の信号強度は小さくなる。一方で、中央部の画素は、もともとの信号強度の最大値で比較すると一番左の画素と同等レベルであったにもかかわらず、その大部分が変調周波数αの同調成分であるため復調後の信号強度は一番左の画素よりも大きく検出されることになる。
このようにして、試料Ｏからの蛍光強度信号の中の変調周波数αに同調する周波数成分の大きさを分離強調して検出し、グレイスケールで表して８×８画素で画像化したものが図６（ａ）である。
【００３２】
１画素に相当する時間に変調周波数αの周期が２周期含まれる例を示したが、復調の精度を向上するにはより多くの周期が含まれることが好ましい。そのためには変調周波数αを高くすることが挙げられるが、音響光学素子５，６の応答帯域による制限や、光電子増倍管８を含む検出回路の帯域による制限等により、技術上の上限がある。一方で、１画素に相当する時間を大きくすることも挙げられるが、画像の分解能の低下やフレームレートの低下を生ずるので、いずれを重視するのかによってこれらのパラメータのチューニングを行えばよい。
【００３３】
ここまでは変調周波数αで変調した極短パルスレーザ光ビームＳによるＲＯＩ走査と蛍光画像取得を説明した。同様にして、変調周波数βで変調した極短パルスレーザ光ビームＴによるＲＯＩ走査と蛍光画像取得を、顕微鏡視野内の別領域において同時に行い、それぞれのＲＯＩにおける蛍光強度復調を変調周波数α，βで別々に行えば双方のＲＯＩ位置からの蛍光を独立に分離して同時に取得することができる。
【００３４】
このとき、変調周波数α，βが異なっていても、精度よく復調できない場合がある。すなわち、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔの強度Ｐと、多光子励起効果によって発生する蛍光の強度Ｉとは、２光子励起の場合には、
Ｉ∝Ｐ２
であり、３光子励起の場合には、
Ｉ∝Ｐ３
である。
【００３５】
変調周波数αで変調した極短パルスレーザ光ビームＴの強度は、２光子励起の場合、
Ｐ∝（１＋ｓｉｎαｔ）
であるため、
Ｉ∝（１＋ｓｉｎαｔ）２
∝（１＋２ｓｉｎαｔ−（ｃｏｓ２αｔ−ｃｏｓ（０））／２）
となり、取得される蛍光には変調周波数αの他に、その２倍の２αの成分も含まれている。
【００３６】
このため、変調周波数βとして
β＝２α
となる周波数を設定してしまうと復調の際に精度よく分離できないことになる。３光子励起の場合には、
β＝３α
となる周波数が問題となる。
したがって、変調周波数α，βとして、上記関係を満たさないように設定することにより、精度よく復調を行うことができる。
【００３７】
また、ここまでは極短パルスレーザ光ビームＳ，ＴによりＲＯＩを走査してその時のそれぞれの蛍光を画像化する方法について説明したが、生体細胞の観察においては必ずしも画像化が必要ではなく、レーザ照射位置で発生する蛍光強度の時間的変化のみ知りたい場合がある。その場合には、例えば、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔは各々別々の位置において照射位置を固定しておき、そのとき発生する蛍光強度をそれぞれ変調周波数α，βで復調してその時間変化を連続取得すれば、高い時間分解能で双方の位置での応答を同時に測定できる。ただし、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを特定の集光位置のみに集光させ続けると試料Ｏの蛍光が急速に褪色していくため、蛍光強度の変化を正しく観察できない場合がある。また、試料Ｏが生体試料である場合には、試料Ｏへのダメージが大きいという問題もある。さらに、顕微鏡利用者が測定したい対象は、例えば、細胞一個というように極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔの集光点（スポット）と比較するともう少し大きい領域である、そのような領域の総体的な蛍光強度を高い時間分解能で観察したいという場合も多い。
【００３８】
そのため、集光位置を特定位置に固定するのではなく、微小範囲において、ラスタスキャンあるいは渦巻き状等に走査させることにより極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔの照射範囲を分散させ、蛍光の褪色や試料Ｏのダメージを低減したり，細胞一個の領域に万遍なく極短パルスレーザ光ビームを分散照射させるといったことができる。
【００３９】
次に、異なる変調を加えた２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを試料Ｏの異なる領域に照射したときに得られた蛍光強度変化を用いたデータ解析方法について説明する。
例えば、試料Ｏとして生きたマウスの脳組織を採用し、マウスに特定の学習を行わせる前後において神経細胞活動の変化を蛍光強度変化で観察する場合であって、顕微鏡視野内に２つのＲＯＩ１，ＲＯＩ２を設定し、各ＲＯＩ１，ＲＯＩ２の蛍光強度変化を分離して取得する場合を想定する。
【００４０】
図８に学習前のＲＯＩ１，ＲＯＩ２の蛍光強度の変化を同時に取得した波形を示す。また、図９に学習後のＲＯＩ１，ＲＯＩ２の蛍光強度の変化を同時に取得した波形を示す。図１０によれば、それぞれの波形の時間相関が学習前よりも学習後の方が強くなっていることがわかる。このような解析を行うには、ＲＯＩ１，ＲＯＩ２の蛍光強度変化を同時に、かつ、高い時間分解能で取得しなければならず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１および顕微鏡観察方法が有効である。
【００４１】
また、本実施形態においては、２つの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを異なる２つの位置に集光する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、３以上の極短パルスレーザ光ビームを異なる位置に集光させてもよい。
なお、異なるＲＯＩにおける蛍光強度変化の時間相関を観察する用途に限れば、３以上のＲＯＩがあっても、同時に検出することが必要となるのは２カ所で十分であり、同時に２カ所の組み合わせを総当たり的に全てのＲＯＩについて繰り返せばよい。３以上同時に検出することも可能であるが、徒にレーザ顕微鏡の構成が複雑になる。
【００４２】
例えば、図１１に示されるように、８カ所のＲＯＩを設定し、その中から２カ所を選択して時間相関の強弱を求め、図１２（ａ）、（ｂ）に示されるように、総当たり的に相関マトリクス上に当てはめて解析する手法は脳神経研究分野で広く知られており、このような用途にも本実施形態に係るレーザ顕微鏡１および顕微鏡観察方法は有効である。
【００４３】
また、本実施形態においては、対物レンズ１８の焦点面上の異なる位置に極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔを同時に集光させる場合について説明したが、試料Ｏの深さ方向に異なる位置に配置された複数箇所に極短パルスレーザ光ビームを同時に集光させることにしてもよい。
この場合には、図１３に示されるように、例えば、いずれかの極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔの光路上にデフォーマブルミラー（空間光変調素子）２６を配置すればよい。図中、符号２７は光路を迂回させるミラーである。
【００４４】
すなわち、デフォーマブルミラー２６は、反射面を変形させることにより、反射する極短パルスレーザ光ビームＳの波面を変更して、対物レンズ１８の焦点距離に配置されている焦点面とは深さ方向に異なる位置に極短パルスレーザ光ビームＳを集光させることができる。
反射式のデフォーマブルミラー２６からなる空間光変調素子に代えて、透過式あるいは他の反射式の液晶からなる空間光変調素子を採用してもよい。
【００４５】
また、本実施形態においては、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔにそれぞれ変調周波数の異なる強度変調を加えることとしたが、これに代えて、あるいは、これに加えて、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔにそれぞれ位相の異なる強度変調を行うことにしてもよい。
この場合、極短パルスレーザ光ビームＳ，Ｔから励起された各々の蛍光が混合したＰＭＴ出力から双方を分離する手段として、例えばＰＬＬ回路（Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｌｏｏｐ）により方々に加えた変調位相に同期する成分を分離する方法を採用できる。
【符号の説明】
【００４６】
１  レーザ顕微鏡
３，４  レーザ光源（光源部）
５，６  音響光学素子（変調部）
７  照明光学系
８  光電子増倍管（蛍光検出素子）
９  復調部
２６  デフォーマブルミラー（空間光変調素子）
Ｓ１  変調ステップ
Ｓ２  照明ステップ
Ｓ３  蛍光検出ステップ
Ｓ４  復調ステップ
Ａ，Ｂ  集光位置
Ｏ  試料
Ｓ，Ｔ  極短パルスレーザ光ビーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図６】
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【図７】
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