(57)【要約】【課題】皮膚刺激性及び皮膚感作性が低く、皮膚外用組成物に適した新規のチロシナーゼ阻害剤、及び美白剤を提供する。【解決手段】下記（Ａ）、または（Ａ）及び（Ｂ）を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、美白剤、及び皮膚外用組成物：（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸またはその塩（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、またはこれらの塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
さらに（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含有する、請求項１に記載するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載するチロシナーゼ阻害剤を含む美白剤。
【請求項４】
請求項３に記載する美白剤を含有する皮膚外用組成物。
【請求項５】
（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することを特徴とする、上記（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性を相加以上に増大させる方法。
【請求項６】
（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することを特徴とする、上記（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性を相加以上に増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチロシナーゼ阻害剤、及びそれを含む美白剤に関する。また、本発明は、これらの作用に基づいて、日焼け後の黒化、及び色素沈着によるしみやソバカス等の予防または改善に有効に使用しえる皮膚外用組成物に関する。さらに本発明は、3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸またはその塩、並びにアスコルビン酸、その誘導体またはそれらの塩の各々について、それらのチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼはメラニンの生合成に関与する酵素である。具体的には、チロシナーゼは、生体細胞内において、チロシンからL-ドーパへの水酸化反応、及びＬ-ドーパからドーパキノンへの酸化反応を触媒し、メラニンの生成に直接関与することが知られている。例えば皮膚が紫外線照射を受けると、上記反応によりメラニンが生成され、皮膚が黒化したり、また色素沈着によってしみやソバカスが生じることも知られており、美容上並びに健康面から予防の必要性が指摘されている。
【０００３】
このため、従来から、チロシナーゼの活性を阻害することでメラニン生成を抑制したり、生成したメラニン色素を還元する作用を有する成分がスクリーニングされ、美白剤として皮膚外用組成物に配合されている。例えば、チロシナーゼ阻害作用を有する美白剤として、アスコルビン酸やその誘導体、システイン、ハイドロキノン、２-ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体、アルブチン、コウジ酸、レチノイド、リノール酸、エラグ酸、ルシノール、ビタミンＥ、グルタチオン、胎盤抽出物、ならびに植物や藻類の抽出物などが用いられている（例えば、非特許文献１等参照）。
【０００４】
一方、3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸に関しては、従来、ケラチン繊維を加熱条件下で直毛化する作用を有することが知られており、頭髪のストレート化剤としての用途が提案されているものの（特許文献１等参照）、チロシナーゼ阻害作用やメラニン生成抑制作用については、これまで全く報告されていない（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】船坂陽子、「しみの治療と美白化粧品」、資生堂グループ・ホームページ  インフォメーションレター・バックナンバー2000年No.001（https://www.shiseidogroup.jp/rd/doctor/informationletter/backnumber/）
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５３７６１９号公報
【特許文献２】特表２００７−１８６４４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は新規のチロシナーゼ阻害剤を提供することを目的とする。より詳細には、優れたチロシナーゼ阻害作用を有し、且つ皮膚に対する刺激性や皮膚感作性が低く安全性の高いチロシナーゼ阻害剤を提供することを目的とする。また本発明は当該チロシナーゼ阻害剤を含有する美白剤、つまりチロシナーゼ阻害作用を有する新規の美白剤を提供することを目的とする。さらに本発明はこれらのチロシナーゼ阻害剤または美白剤を有効成分として含む皮膚外用組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
また本発明は、3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸またはその塩について、そのチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、アルコルビン酸、その塩またはその誘導体について、そのチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討していたところ、3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸に、優れたチロシナーゼ阻害作用があることを見出し、また皮膚に対する刺激性や皮膚感作性が極めて低く、高い安全性を有することを確認した。さらに本発明者らは、当該3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸をアスコルビン酸類と併用すると、各々が有するチロシナーゼ阻害作用が相乗的に増強してメラニン生成抑制作用が格段に増大することを見出し、両成分を配合することで各々単独の美白効果よりも格段に優れた美白効果を発揮し得る美白剤として提供できることを見出した。
【００１０】
本発明はこれらの知見に基づいて、さらなる検討によって完成したものであり、下記の実施形態を包含する。
【００１１】
（Ｉ）チロシナーゼ阻害剤
（I-1）（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
（I-2）さらに（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含有する、（I-1）に記載するチロシナーゼ阻害剤。
【００１２】
（II）美白剤
（II）（I-1）または（I-2）に記載するチロシナーゼ阻害剤を含む美白剤。
【００１３】
当該美白剤には、下記の態様が包含される。
（II-1）（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする美白剤。
（II-2）さらに（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含有する、（II-1）に記載する美白剤。
【００１４】
（III）皮膚外用組成物
（III）（I）に記載するチロシナーゼ阻害剤、または（II）に記載する美白剤を含有する皮膚外用組成物。
【００１５】
当該皮膚外用組成物には、下記の態様が包含される。
（III-1）（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を美白成分として含有する皮膚外用組成物。
（III-2）さらに（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含有する、（III-1）に記載する皮膚外用組成物。
（III-3）皮膚化粧料、入浴料、洗浄料、外用医薬組成物、及び外用医薬部外品よりなる群から選択される少なくとも１種である（III-1）または（III-2）に記載する皮膚外用組成物。
（III-4）上記皮膚化粧料、入浴料、洗浄料、外用医薬組成物、及び外用医薬部外品が、色素沈着の予防若しくは改善、または美白を作用効果とするものである、（III-3）に記載する皮膚外用組成物。
【００１６】
（IV）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸類のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法
（IV-1）（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することを特徴とする、上記（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法。
（IV-2）上記チロシナーゼ阻害活性の増大の程度が、（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性と（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性の相加以上である、（IV-1）記載の方法。
（IV-3）上記チロシナーゼ阻害活性の増大の程度が、（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性と（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性の相加より大きいものである、（IV-1）記載の方法。
【００１７】
（V）アスコルビン酸類のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法
（V-1）（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することを特徴とする、上記（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法。
（V-2）上記チロシナーゼ阻害活性の増大の程度が、（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性と（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性の相加以上である、（V-1）記載の方法。
（V-3）上記チロシナーゼ阻害活性の増大の程度が、（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性と（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性の相加より大きいものである、（V-1）記載の方法。
【００１８】
（VI）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸の用途
（VI-1）皮膚外用組成物に、（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を配合することを特徴とする、皮膚外用組成物に美白作用を付与するか、または皮膚外用組成物の美白作用を増強する方法。
（VI-2）皮膚外用組成物の美白作用を増強する方法であって、当該皮膚外用組成物が（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種に加えて、（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を含有するものである、（VI-1）に記載する方法。
（VI-3）皮膚外用組成物に美白作用を付与する方法であって、当該皮膚外用組成物に、（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種に加えて、さらに（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を配合する、（VI-1）に記載する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、優れたチロシナーゼ阻害作用を有する新規のチロシナーゼ阻害剤、及び美白剤を提供することができる。特に（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸またはその塩（（Ａ）成分）に、（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種（（Ｂ）成分）を併用すると、それぞれのチロシナーゼ阻害作用が相乗的に向上する結果、両者を含有する本発明のチロシナーゼ阻害剤及び美白剤は、極めて高いチロシナーゼ阻害作用及び美白作用を発揮することができる。
【００２０】
また本発明のチロシナーゼ阻害剤及び美白剤は、皮膚刺激性及び皮膚感作性が極めて低いため、例えば化粧料、皮膚外用医薬品及び医薬部外品などの皮膚外用組成物の成分として好適に用いることができる。
【００２１】
このため本発明のチロシナーゼ阻害剤または美白剤を配合した皮膚外用組成物は安全性が高く、また本発明のチロシナーゼ阻害剤または美白剤の作用に基づいて、皮膚における過剰なメラニン生成を抑制し、紫外線などによって引き起こされる色素沈着、シミまたはソバカスを予防または改善する効果に優れており、特に美白化粧料として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸(化合物Ａ)、アスコルビン酸、並びに化合物Ａとアスコルビン酸の併用のそれぞれについて、チロシナーゼ阻害活性を測定した結果を示す（試験例２）。グラフの縦軸はチロシナーゼ阻害率（％）、横軸は各被験化合物の濃度（mg/ml）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１）本発明の有効成分
（Ａ）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸、またはその塩
本発明のチロシナーゼ阻害剤、美白剤、及び皮膚外用組成物は、いずれも3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸（以下、これを「化合物Ａ」と称する場合がある）、またはその塩を有効成分とすることを特徴とする。以下、これらの有効成分を「（Ａ）成分」と総称する場会がある。
【００２４】
3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸は公知の化合物であり（CAS番号：5631-68-5）、商業的に入手することもできるし、また後述する製造例に記載する方法に従って化学合成することもできる。
【００２５】
3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸の塩としては、例えば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム及びバリウム等のアルカリ土類金属塩；並びに亜鉛及びアルミニウム等の多価金属塩などの各種の金属塩；アンモニウムやトリシクロヘキシルアンモニウム等のアンモニウム塩；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等の各種のアルカノールアミン塩を挙げることができる。好ましくは金属塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、更に好ましくはアルカリ金属塩、特に好ましくはナトリウム塩である。
【００２６】
（Ｂ）アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩
本発明のチロシナーゼ阻害剤、美白剤、及び皮膚外用組成物は、上記（Ａ）成分に加えて、アスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩（以下、これらを総称して「（Ｂ）成分」と称する場合がある）よりなる群から選択される少なくとも１種を含有していてもよい。後述する試験例に示すように、（Ａ）成分に（Ｂ）成分を併用することで、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分がそれぞれ有するチロシナーゼ阻害作用が相加以上、好ましくは相加を越えて、より好ましくは相乗的に向上し、極めて高いチロシナーゼ阻害作用を発揮することができる。
【００２７】
（Ｂ）成分は、医薬上又は生理学的に許容できるものであればよく、特に制限されないが、好ましくは外用組成物（化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品）に配合可能なものである。
【００２８】
この観点から、アスコルビン酸誘導体として、アスコルビルリン酸、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸、アスコルビン酸グルコシド（例えば、アスコルビン酸２−グルコシド）、アスコルビン酸エチル（例えば、２−Ｏ−エチルアスコルビン酸、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸）、アスコルビン酸硫酸、３−Ｏ−セチルアスコルビン酸、テトライソパルミチン酸アスコルビル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸メチルシラノール、デヒドロアスコルビン酸、イソステアリルアスコルビルリン酸、パルミチン酸アスコルビルリン酸、及びリン酸アスコルビルアミノプロピル等を挙げることができる。
【００２９】
アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；並びに亜鉛、アルミニウム等の多価金属塩などの各種の金属塩；アンモニウムやトリシクロヘキシルアンモニウム等のアンモニウム塩；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等の各種のアルカノールアミン塩；キトサン塩等を挙げることができる。好ましくは金属塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、更に好ましくはアルカリ金属塩であり、特に好ましくはナトリウム塩である。
【００３０】
アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の塩の具体的な例として、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウム、アスコルビン酸亜鉛、及びキトサンアスコルビン酸等のアスコルビン酸の塩；並びにアスコルビルリン酸ナトリウム、アスコルビルリン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸２ナトリウム、パルミチン酸アスコルビルリン酸３ナトリウム、イソステアリルアスコルビルリン酸２ナトリウム、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
なお、本発明のチロシナーゼ阻害剤には、（Ｂ）成分のなかから１種を単独で使用しても、２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【００３２】
（２）チロシナーゼ阻害剤
本発明が対象とするチロシナーゼ阻害剤は、チロシナーゼの活性を阻害する作用を有し、もっぱらチロシナーゼ活性を阻害する目的で使用されるものである。
【００３３】
ここでチロシナーゼ活性には、チロシンをL-ドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）に変換する活性、及びL-ドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）をドーパキノンに変換する活性が含まれる。このため、本発明がいう「チロシナーゼ阻害」または「チロシナーゼ阻害作用」は、チロシンをL-ドーパに変換する活性を阻害する作用、及びL-ドーパをドーパキノンに変換する活性を阻害する作用の両方が含まれる。つまり、これらのいずれか少なくとも一方の阻害作用を有するものは、本願発明の「チロシナーゼ阻害剤」に該当する。
【００３４】
また本発明が対象とするチロシナーゼは、その由来を限定するものではないが、好ましくは哺乳類由来のチロシナーゼであり、より好ましくはヒト由来のチロシナーゼである。つまり、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、哺乳類、好ましくはヒトの皮膚に適用した場合に、当該哺乳類（ヒト）の皮膚細胞におけるチロシナーゼの活性を阻害する作用を発揮するものである。なお、ヒト由来チロシナーゼの活性に対する阻害作用は、マッシュルーム由来チロシナーゼの活性に対する阻害作用に基づいて評価することができ、当該方法は当業界で確立されている方法である（後述する試験例参照）。
【００３５】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、前述するように上記（Ａ）成分を有効成分とすることを特徴とする。
【００３６】
本発明のチロシナーゼ阻害剤における上記（Ａ）成分の配合割合は、当該チロシナーゼ阻害剤がチロシナーゼ阻害作用を発揮することを限度として、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、チロシナーゼ阻害剤１００重量％中、０．００１〜１０重量％の範囲から適宜設定することができる。なお、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、上記（Ａ）成分からなるものであってもよいし、またチロシナーゼ阻害作用を妨げないことを限度として、他の成分を含有していてもよい。かかる他成分については、後述する。
【００３７】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、上記（Ａ）成分に加えて、前述する（Ｂ）成分よりなる群から選択される少なくとも１種を含有していてもよい。後述する試験例に示すように、（Ａ）成分に（Ｂ）成分を併用することで、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分がそれぞれ有するチロシナーゼ阻害作用が相加以上、好ましくは相加を越えて、より好ましくは相乗的に向上し、極めて高いチロシナーゼ阻害作用を発揮することができる。
【００３８】
本発明のチロシナーゼ阻害剤が（Ａ）成分と（Ｂ）成分の両方を含有するものである場合、（Ｂ）成分の配合割合は、当該チロシナーゼ阻害剤がチロシナーゼ阻害作用を発揮することを限度として、特に制限されない。好ましくは、（Ａ）成分を含有するチロシナーゼ阻害剤のチロシナーゼ阻害作用が、（Ｂ）成分の配合により増強するような割合である。制限されないものの、かかる（Ｂ）成分の量の一例として、例えばチロシナーゼ阻害剤１００重量％中、１〜２０重量％を例示することができる。また、チロシナーゼ阻害剤に含まれる（Ａ）成分１重量部に対する（Ｂ）成分の配合割合として、制限されないものの、２０〜１０００重量部を挙げることができる。さらに、制限はされないものの、この範囲の中で例えば２０〜５０重量部、さらに１００〜１０００重量部の範囲を例示することができる。またこの場合、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分だけからなるものであってもよいし、またチロシナーゼ阻害作用を妨げないことを限度として、他の成分を含有していてもよい。
【００３９】
他成分としては、抗菌剤（防腐剤又は殺菌剤）、及び抗酸化剤等の他、チロシナーゼ阻害剤の形態に応じて、その形態に調製するうえで通常に使用される担体や添加剤などを挙げることができる。例えばチロシナーゼ阻害剤の形態としては、液状（液剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤、エキス剤、チンキ剤、エアゾール剤、リポソーム剤など）、固形状（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤など）、半固形状（軟膏、硬膏、クリームなど）などの形態を挙げることができる。
【００４０】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、それ自体、チロシナーゼ阻害剤として使用される他、後述する美白剤または皮膚外用組成物の有効成分として、これらの製造に際して一成分として添加配合する用途または態様で用いられる（添加剤的使用）。なお、それ自体をチロシナーゼ阻害剤として使用する場合、この使用は、in vitro及びin vivoでの使用の別、ヒト及び非ヒト動物に対する使用の別、治療的使用及び非治療的使用の別を問わず、あらゆる場合の使用が包含される。
【００４１】
（３）美白剤
本発明が対象とする美白剤は、チロシナーゼの活性を阻害する作用を有し、もっぱら皮膚を美白する目的で使用されるものである。
【００４２】
ここで美白には、チロシナーゼの作用によるメラニン生成に起因する皮膚の黒化、または色素沈着によるシミやそばかすの発生を予防することが含まれる。また好ましくは、上記メラニン生成によって生じた皮膚の黒化や皮膚の色素沈着（シミやそばかす）を軽減若しくは改善することも含まれる。
【００４３】
本発明の美白剤は、前述するように上記（Ａ）成分を有効成分とすることを特徴とする。
【００４４】
本発明の美白剤における上記（Ａ）成分の配合割合は、当該美白剤がチロシナーゼ阻害作用に基づいて美白作用を発揮することを限度として、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、美白剤１００重量％中、０．００１〜１０重量％の範囲から適宜設定することができる。制限されないものの、この範囲の中で例えば０．００１〜１重量％、また１〜１０重量％の範囲を例示することができる。なお、本発明の美白剤は、上記（Ａ）成分からなるものであってもよいし、またチロシナーゼ阻害作用（美白作用）を妨げないことを限度として、他の成分を含有していてもよい。かかる他成分については、後述する。
【００４５】
本発明の美白剤は、上記（Ａ）成分に加えて、前述する（Ｂ）成分よりなる群から選択される少なくとも１種を含有していてもよい。後述する試験例に示すように、（Ａ）成分に（Ｂ）成分を併用することで、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分がそれぞれ有するチロシナーゼ阻害作用が相加以上、好ましくは相加を越えて、より好ましくは相乗的に向上し、その結果、極めて高い美白作用を発揮することができる。
【００４６】
本発明の美白剤が（Ａ）成分と（Ｂ）成分の両方を含有するものである場合、（Ｂ）成分の配合割合は、当該美白剤がチロシナーゼ阻害作用（美白作用）を発揮することを限度として、特に制限されない。好ましくは、（Ａ）成分を含有する美白剤のチロシナーゼ阻害作用（美白作用）が、（Ｂ）成分の配合により増強するような割合である。制限されないものの、かかる（Ｂ）成分の量の一例として、例えば美白剤１００重量％中、１〜２０重量％を例示することができる。
また、美白剤に含まれる（Ａ）成分１重量部に対する（Ｂ）成分の配合割合としては、制限されないものの、２０〜１０００重量部を挙げることができる。さらに制限されないものの、この範囲の中で例えば２０〜５０重量部、さらに１００〜１０００重量部の範囲を例示することができる。またこの場合、本発明の美白剤は、上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分だけからなるものであってもよいし、またチロシナーゼ阻害作用（美白作用）を妨げないことを限度として、他の成分を含有していてもよい。
【００４７】
他成分としては、抗菌剤（防腐剤又は殺菌剤）、及び抗酸化剤等の他、美白剤の形態に応じて、その形態に調製するうえで通常に使用される担体や添加剤などを挙げることができる。例えば美白剤の形態としては、液状（液剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤、エキス剤、チンキ剤、エアゾール剤、リポソーム剤など）、固形状（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤など）、半固形状（軟膏、硬膏、クリームなど）などの形態を挙げることができる。
【００４８】
本発明の美白剤は、それ自体、美白剤として使用される他、後述する皮膚外用組成物の有効成分として、これらの製造に際して一成分として添加配合する用途または態様で用いられる（添加剤的使用）。なお、それ自体を美白剤として使用する場合、この使用は、in vitro及びin vivoでの使用の別、ヒト及び非ヒト動物に対する使用の別、治療的使用及び非治療的使用の別を問わず、あらゆる場合の使用が包含される。
【００４９】
（４）皮膚外用組成物
本発明の皮膚外用組成物は、前述するチロシナーゼ阻害剤、または美白剤を有効成分として含有することを特徴とする。言い換えれば、チロシナーゼ阻害作用または美白作用を発揮する有効成分として、前述する（Ａ）成分を含有することを特徴とする。また（Ａ）成分に加えて、（Ｂ）成分を含有していてもよい。より高い美白作用を発揮するという点からは、好ましくは美白成分として（Ａ）成分と（Ｂ）成分の両方を含有するものである。
【００５０】
本発明の皮膚外用組成物における上記（Ａ）成分の配合割合は、美白作用を発揮することを限度として、特に制限されないが、通常、０．００１〜２０重量％の範囲、好ましくは０.００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜０．５重量％を挙げることができる。  本発明の皮膚外用組成物が（Ａ）成分と（Ｂ）成分の両方を含有するものである場合、（Ｂ）成分の配合割合は、当該皮膚外用組成物が美白作用を発揮することを限度として、特に制限されない。制限されないものの、かかる（Ｂ）成分の量の一例として、皮膚外用組成物１００重量％中、１〜２０重量％を例示することができる。また、皮膚外用組成物に含まれる（Ａ）成分１重量部に対する（Ｂ）成分の配合割合としては、制限されないものの、２０〜１０００重量部を挙げることができる。さらに、制限されないものの、この範囲の中で例えば２０〜５０重量部、さらに１００〜１０００重量部の範囲を例示することができる。
【００５１】
本発明の皮膚外用組成物は、皮膚に適用される外用組成物であればよく、例えば化粧料（基礎化粧料、及びメークアップ化粧料を含む）、洗浄料、入浴料、外用医薬品、及び外用医薬部外品等を挙げることができる。好ましくは皮膚（肌）の美白、詳細には皮膚への色素沈着の予防、軽減若しくは改善を目的または効能効果とする化粧料（美白化粧料）、洗浄料、入浴料、外用医薬品、及び外用医薬部外品である。なかでも化粧料、洗浄料、及び入浴料、特に化粧料が好ましい。
【００５２】
本発明の皮膚外用組成物の形態は、特に限定されず、上記用途に応じて、適宜設定調製することができる。例えば液状（ローション状、ゲル状、乳液状、懸濁液状、エキス、チンキ、エアゾール状、リポソーム状など）、固形状（錠剤状、カプセル剤状、散剤状、顆粒剤状、石鹸のような固化形状など）、半固形状（軟膏状、硬膏状、クリーム状など）、及び貼付剤（パップ剤、パスタ剤、貼付剤など）などの慣用の形状が採用できる。なお、液剤は、基材に含浸させた形態で用いてもよい（例えば、パック、ウェットコットンやウェットティッシュなど）。
【００５３】
本発明の皮膚外用組成物には、本発明の効果を妨げないことを限度として、さらに美白作用を増強又は補足するため、化粧品、医薬品、または医薬部外品分野において外用組成物に配合し得る慣用の美白成分、生理活性物質、及び有用成分を併用してもよい。このような美白成分としては、例えば、システイン、ハイドロキノン、２-ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体、アルブチン、コウジ酸、レチノイド、リノール酸、エラグ酸、ルシノール、ビタミンＥ又はその誘導体、ビタミンＡ又はその誘導体、パントテン酸又はその誘導体、グルタチオン、胎盤抽出物、ならびに美白効果を有する植物、担子菌又は藻類の抽出物や精油などが挙げられる。これらの美白成分は、１種で又は２種以上組み合わせて使用できる。また生理活性物質及び有用成分としては、例えば、ビタミン類、アミノ酸類、抗菌剤（防腐剤又は殺菌剤）、消炎・抗炎症剤、血行促進・末梢血流改善剤、収斂剤、紫外線吸収剤、皮膚軟化剤、酵素成分、抗酸化剤、保湿剤、精油成分、植物由来原料、その他の天然由来原料などを挙げることができる。
【００５４】
さらに本発明の皮膚外用組成物には、その形状や使用形態に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、担体又は添加剤などを任意に選択、配合することができる。担体（又は基剤）又は添加剤としては、例えば、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール、糖、高分子化合物、界面活性剤、ｐＨ調整剤、粉末成分、キレート剤、着色剤（着色料）、水などが含まれる。これらの担体及び添加剤は、形状に合わせて適宜組み合わせて使用することができる。具体的には、水性液状組成物を調製する場合、通常、基剤として水を用いることができ、また非水性液状組成物の調製には、種々の油性基剤、例えば、植物油（例えば、オリーブ油、大豆油、ゴマ油、綿実油など）、アルコール類（セチルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、鉱物油（流動パラフィンなど）などが使用できる。クリーム状または乳液状組成物の調製には、水性基剤（水など）、油性基剤（流動パラフィン、スクワランなどの鉱物油；ラノリンなどのロウ；セチルアルコール、プロピレングリコールなどのアルコール類など）、界面活性剤などが使用できる。軟膏状組成物の調製には、油性基剤（炭化水素系基剤、例えば、ワセリン、流動パラフィンなどの鉱物油；ロウ；セチルアルコールなどのアルコール類；高級脂肪酸エステルなどの各種軟膏基剤など）などが用いられ、またゲル状組成物の調製には、ゲル基剤（例えば、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ガム質など）を用いられ、さらに散剤などの粉末状の組成物の調製には粉末成分を基剤として用いることができる。
【００５５】
本発明の皮膚外用組成物は、美白効果に優れるため、紫外線などの外的刺激によりメラニン産生が生じやすい外皮（皮膚）、例えば、顔、首、腕、手、胴、足などの種々の部位の外皮などに適用するのに適している。また本発明の皮膚外用組成物は、比較的安全性が高いため、目の回りや唇など、粘膜に接触する虞のある部位に対しても用いることが可能である。
【００５６】
本発明の皮膚外用組成物の用法及び用量は、製品の種類（化粧料、入浴料、洗浄料、医薬品、または医薬部外品）やその形態、使用者の症状、年齢などに応じて適宜設定選択することができる。例えば、化粧料、外用医薬品または外用医薬部外品の場合、１日あたり１〜５回程度、所定部位に適用することができる。また入浴料の場合、入浴時に湯船に添加して用いることができる。また、洗浄料の場合、１日あたり１〜３回程度、所定部位の洗浄に使用することができる。
（５）3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸類のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法
本発明は、（Ａ）成分、つまり3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ｂ）成分、つまりアスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することで、（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法である。
【００５７】
当該方法は、（Ａ）成分の少なくとも１種に（Ｂ）成分の少なくとも１種を併用することで実施することができる。
【００５８】
ここで（Ａ）成分、特に3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸の塩は先の（１）（Ａ）で説明した通りであり、当該記載はここに援用することができる。また（Ｂ）成分、特にアスコルビン酸誘導体、及びアスコルビン酸またはその誘導体の塩は先の（１）（Ｂ）で説明した通りであり、当該記載はここに援用することができる。さらに、（Ａ）成分に（Ｂ）成分を併用する割合についても、先の（２）で説明した通りであり、具体的には、制限されないものの、（Ａ）成分１重量部に対する（Ｂ）成分の割合として２０〜１０００重量部を挙げることができる。さらに制限はされないものの、この範囲の中で、例えば２０〜５０重量部、さらに１００〜１０００重量部の範囲を例示することができる。
【００５９】
（Ａ）成分に（Ｂ）成分を併用することによるチロシナーゼ阻害活性の増大の程度としては、（Ａ）成分のチロシナーゼ阻害活性が増大する程度であればよく、制限されないものの、好ましくは（Ａ）成分及び（Ｂ）成分がそれぞれ有するチロシナーゼ阻害活性の相加以上を挙げることができる。好ましくは相加を超える程度であり、より好ましくは相乗的に増大する程度を挙げることができる。
【００６０】
（６）アスコルビン酸類のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法
本発明は、（Ｂ）成分、つまりアスコルビン酸、その誘導体、及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも１種に、（Ａ）成分、つまり3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種を併用することで、（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性を増大させる方法である。
【００６１】
当該方法は、（Ｂ）成分の少なくとも１種に（Ａ）成分の少なくとも１種を併用することで実施することができる。
【００６２】
ここで（Ｂ）成分、特にアスコルビン酸誘導体、及びアスコルビン酸またはその誘導体の塩は先の（１）（Ｂ）で説明した通りであり、当該記載はここに援用することができる。また（Ａ）成分、特に塩は先の（１）（Ａ）で説明した通りであり、当該記載はここに援用することができる。さらに、（Ｂ）成分に（Ａ）成分を併用する割合については、制限されないものの、（Ｂ）成分１重量部に対する（Ａ）成分の割合として０．００１〜１重量部を挙げることができる。さらに制限はされないものの、この範囲の中で、例えば０．００１〜０．０１重量部、さらに０．０２〜０．０５重量部の範囲を例示することができる。
【００６３】
（Ｂ）成分に（Ａ）成分を併用することによるチロシナーゼ阻害活性の増大の程度としては、（Ｂ）成分のチロシナーゼ阻害活性が増大する程度であればよく、制限されないものの、好ましくは（Ｂ）成分及び（Ａ）成分がそれぞれ有するチロシナーゼ阻害活性の相加以上を挙げることができる。好ましくは相加を超える程度であり、より好ましくは相乗的に増大する程度を挙げることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、試験例及び実施例等により本発明をさらに詳しく説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００６５】
製造例  3-(2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸の製造
（１）3-（2,4-ジベンジルオキシフェニル）プロピオン酸メチルの製造
温度計、磁気回転子および還流冷却管を備えた５００ｍｌ三口フラスコに、ウンベリフェロン２０．０ｇ（１２３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン２００ｍｌ、メタノール２００ｍｌ、および１０％パラジウムカーボン１．０ｇを加え、攪拌下に系内を水素置換する。この混合液を３０℃に加熱した後、水素雰囲気下に６時間反応させる。反応液を冷却し、パラジウムカーボンを濾過して分離する。
【００６６】
続いて、得られた濾液を温度計、磁気回転子および還流冷却管を備えた５００ｍｌ三口フラスコに移し、ｐ−トルエンスルホン酸・一水和物０．１９ｇ（１ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、還流させながら２時間攪拌する。この反応混合液を室温まで冷却した後、ナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液を０．３ｍｌ添加する。この反応混合液を減圧下に濃縮すると残渣２５．５５ｇを得ることができる。
【００６７】
続いて、温度計、磁気回転子、滴下漏斗および還流冷却管を備えた５００ｍｌ三口フラスコに、上記操作で得られた残渣２５．５５ｇ、アセトン３００ｍｌおよび炭酸カリウム３４．００ｇ（２４６ｍｍｏｌ）を加え、窒素下、アセトンが還流するまで加熱攪拌する。これに臭化ベンジル４６．３９ｇ（２７０ｍｍｏｌ）を、１時間かけて滴下する。滴下終了後、還流下にさらに５時間攪拌する。この反応混合液を室温まで冷却した後、副生した塩を濾過により除去し、濾液からアセトンを減圧下に留去する。得られた残渣にトルエン２００ｍｌおよび水２００ｍｌを添加し、有機層と水層を分離する。有機層からトルエンを減圧下に留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１）を用いて精製し、３−（２，４−ジベンジルオキシフェニル）プロピオン酸メチル４５．２ｇ（９６ｍｍｏｌ、ウンベリフェロン基準の収率：７８％）を得る。
【００６８】
（２）3-（2,4-ジベンジルオキシフェニル）プロピオン酸メチルの製造
温度計、磁気回転子および還流冷却管を備えた１００ｍｌ三口フラスコに、水酸化ナトリウム２．７２ｇ（６９．３ｍｍｏｌ）、水２０ｇ、テトラヒドロフラン３０ｇ、および（１）で製造した３−（２，４−ジベンジルオキシフェニル）プロピオン酸メチル８ｇ（２３．１ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら４０℃で１時間反応させ、その後さらに３０分還流する。反応混合物を室温に冷却後、トルエン３０ｍｌおよび水３０ｍｌを加え３０分間攪拌する。これを分液して水層を取得し、８質量％硫酸水溶液３０ｍｌを添加して内液を酸性とした後にトルエン５０ｍｌで３回抽出する。抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、残渣にテトラヒドロフラン１００ｍｌおよび１０％パラジウムカーボン０．８ｇを加えて、室温・大気圧条件下で２４時間かけて水素添加する。パラジウムカーボンを濾過した後、濾液を減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することで３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸２．７２ｇを得ることができる（１４．９ｍｍｏｌ、収率：６５％）。
【００６９】
試験例１  3-（2,4-ジベンジルオキシフェニル）プロピオン酸のチロシナーゼ阻害活性
Hanamuraらの報告(Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(12), 3211-3218, 2008)に準じて、マッシュルームに由来するチロシナーゼに対する阻害活性を指標にして、３−(２，４−ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸（以下、「化合物Ａ」とも称する）のチロシナーゼ阻害活性を評価した。
【００７０】
１．試験方法
被験試料として下記のものを用いて、ジメチルスルホキシド(DMSO) に完全溶解し、それぞれ表１に記載する３通りの濃度になるように希釈調整し、被験試料溶液として試験に用いた。
［被験試料］
a．３−(２，４−ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸（化合物Ａ）
b．アスコルビン酸（比較品１）
c．コウジ酸（比較品２）。
【００７１】
９６穴マイクロプレートに、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．８) ７０μＬ、被験試料溶液２μＬを分注し、これに７１．５ｕｎｉｔｓ/ｍＬのチロシナーゼ溶液３０μＬを添加し、２５℃にて５分間、プレインキュベーションを行った。次いで、これに１０ｍＭ Ｌ-ジヒドロキシフェニルアラニン３０μＬ添加し、さらに上記と同条件で２分間インキュベーションを行い、その後、直ちにマイクロプレートリーダーにて４７５ｎｍの吸光度を測定した。
【００７２】
２．試験結果
測定結果を、表１に記載する。
【００７３】
【表１】
2017057148.tif 000002
【００７４】
測定結果から、化合物Ａのチロシナーゼ阻害活性はＩＣ５０＝０．０８ｍｇ／ｍＬ、アスコルビン酸のチロシナーゼ阻害活性はＩＣ５０＝１．２２ｍｇ／ｍＬ、コウジ酸のチロシナーゼ阻害活性はＩＣ５０＝０．０５ｍｇ／ｍＬであることが判明し、化合物Ａには、アスコルビン酸のチロシナーゼ阻害活性を大きく越え、コウジ酸とほぼ同等のチロシナーゼ阻害活性があることが確認された。
【００７５】
試験例２  アスコルビン酸との併用
上記試験例１の結果を受けて、試験例２では、化合物Ａにアスルビン酸を併用した場合のチロシナーゼ阻害活性を測定し、化合物Ａに対するアスルビン酸の影響（またはアスコルビン酸に対する化合物Ａの影響）を評価した。
【００７６】
１．試験方法
被験試料として化合物Ａ、アスコルビン酸、並びに化合物Ａとアスコルビン酸の併用を用いて、試験例１に記載する方法に従って、チロシナーゼ阻害活性を測定した。
【００７７】
２．試験結果
表２、３及び図１に、化合物Ａ、アスコルビン酸、並びに化合物Ａとアスコルビン酸の併用それぞれについて、チロシナーゼ阻害活性（チロシナーゼ阻害率（％））を測定した結果を示す。
【００７８】
【表２】
2017057148.tif 000003
【００７９】
【表３】
2017057148.tif 000004
【００８０】
表２、３及び図１に示すように、化合物Ａとアスコルビン酸とを併用することで、両者のチロシナーゼ阻害活性が相乗的に増強することが確認された。
【００８１】
この相乗効果により、化合物Ａはアスコルビン酸を併用することで、またアスコルビン酸は化合物Ａを併用することで、お互いにより少量の配合で美白効果を期待することができる。特に化合物Ａは、下記試験例３で示すように、本来安全性の高い化合物であるものの、上記のようにアスコルビン酸との併用で低配合量とすることで、副作用リスクをさらに低減することができる。また、美白の医薬部外品承認物質であるアスコルビン酸を併用することで、美白を標榜した安全な皮膚外用組成物（美白化粧料、美白医薬部外品）として提供することができる。
【００８２】
試験例３  安全性評価
化合物Ａを０．５重量％の含有量になるように配合し、クリーム形態の皮膚外用剤を製造した。
【００８３】
これを用いて、２０名の被験者を対象として、「化粧品の安全性評価に関する指針」（日本化粧品工業連合会）に準拠した２４時間閉塞パッチテストを行った。その結果、２０名の全被験者とも反応はなく、皮膚刺激指数は０．０であった。このことから、化合物Ａは、チロシナーゼ阻害剤として公知の２−ヒドロキシ酸とは異なり、皮膚刺激性及び皮膚感作性はなく、皮膚に対して安全性が高い化合物であることが確認された。
【００８４】
処方例  各種美白用皮膚外用剤
本発明による各種化粧料組成物の処方例を下記に示すが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００８５】
処方例１  美白化粧水
１．グリセリン                                                      ５．０
２．１，３−ブチレングリコール                                      ５．０
３．モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン                      １．０
４．エタノール                                                    １５．０
５．化合物Ａ                                                      ０．０１
６．グルコース                                                      １．０
７．フラクトース                                                    １．０
８．抗菌・防腐剤                                                      適量
９．精製水                                            全量を１００とする量。
【００８６】
処方例２  美白乳液
１．スクワラン                                                      ５．０
２．オリーブ油                                                      ５．０
３．ホホバ油                                                        ５．０
４．セチルアルコール                                                １．５
５．グリセリンモノステアレート                                      ２．０
６．ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル                        ３．０
７．ポリオキシエチレン（２０）ソオルビタンモノオレート              ２．０
８．１，３−ブチレングリコール                                      １．０
９．グリセリン                                                      ２．０
１０．化合物Ａ                                                      ０．０１
１１．防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）                              適量
１２．精製水                                            全量を１００とする量。
【００８７】
処方例３  美白クリーム
１．スクワラン                                                    ２０．０
２．ミツロウ                                                        ５．０
３．精製ホホバ油                                                    ５．０
４．グリセリンモノステアレート                                      ２．０
５．ソルビタンモノステアレート                                      ２．０
６．ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート            ２．０
７．グリセリン                                                      ５．０
８．化合物Ａ                                                      ０．０１
９．精製水                                            全量を１００とする量。
【００８８】
処方例４  美白化粧水
１．グリセリン                                                      ５．０
２．１，３−ブチレングリコール                                      ５．０
３．モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン                      １．０
４．エタノール                                                    １５．０
５．化合物Ａ                                                    ０．００１
６．グリセリルアスコルビン酸                                        １．０
６．グルコース                                                      １．０
７．フラクトース                                                    １．０
８．抗菌・防腐剤                                                      適量
９．精製水                                            全量を１００とする量。
【００８９】
処方例５  美白乳液
１．スクワラン                                                      ５．０
２．オリーブ油                                                      ５．０
３．ホホバ油                                                        ５．０
４．セチルアルコール                                                １．５
５．グリセリンモノステアレート                                      ２．０
６．ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル                        ３．０
７．ポリオキシエチレン（２０）ソオルビタンモノオレート              ２．０
８．１，３−ブチレングリコール                                      １．０
９．グリセリン                                                      ２．０
１０．化合物Ａ                                                    ０．００２
１１．グリセリルアスコルビン酸                                        ０．１
１２．防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）                              適量
１３．精製水                                            全量を１００とする量。
【００９０】
処方例６  美白クリーム
１．スクワラン                                                    ２０．０
２．ミツロウ                                                        ５．０
３．精製ホホバ油                                                    ５．０
４．グリセリンモノステアレート                                      ２．０
５．ソルビタンモノステアレート                                      ２．０
６．ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート            ２．０
７．グリセリン                                                      ５．０
８．化合物Ａ                                                    ０．００２
９．グリセリルアスコルビン酸                                        ０．１
１０．精製水                                            全量を１００とする量。
【図１】
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