(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｕ５４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチドを用いたＨＨＶ−６Ｂを治療又は予防するワクチン、Ｕ５４に対する受動免疫療法剤、およびＵ５４に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法の提供。【解決手段】ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＨＨＶ−６Ｂ）のＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する性質を有する、ペプチド。ペプチドをコードする核酸。核酸を含む発現ベクター。ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４に提示した抗原提示細胞。核酸、発現ベクター、又は抗原提示細胞を有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂを治療、又は予防するためのワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：９に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペプチドにおいて、少なくとも１個のアミノ酸が欠失している、および／または、少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸又はアミノ酸アナログに置換されている、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＨＨＶ−６Ｂ）のＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する性質を有する、ペプチド。
【請求項４】
少なくとも１種の変異が、アミノ酸配列の置換である、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列の置換が、以下の一方または両方である、請求項４記載のペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニン群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｎ末端から９番目又は１０番目のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルアラニンの群より選択される。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４に提示した抗原提示細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド、請求項６記載の核酸、請求項７記載の発現ベクター、又は請求項８記載の抗原提示細胞を有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂを治療、又は予防するためのワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項８記載の抗原提示細胞を用いて末梢血リンパ球を刺激して得られる、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ。
【請求項１１】
請求項１０記載のＣＴＬを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと、末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＴＬを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤。
【請求項１３】
（１）請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的なＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬを誘導する工程、及び、
（２）誘導したＣＴＬが産生するサイトカイン及び／又はケモカイン及び／又は細胞表面分子を測定する工程
を含む、該末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの定量方法。
【請求項１４】
サイトカイン及び／又はケモカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、又はインターロイキンであり、細胞表面分子が、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、又はＣＤ６９である、請求項１３記載の定量方法。
【請求項１５】
（１）請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラマーを調製する工程、及び、
（２）主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させる工程、
を含む、該末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの定量方法。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドによりＣＴＬを誘導する工程を含む、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導する方法。
【請求項１７】
ＣＴＬを誘導する工程が、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドと、末梢血単核球を、血漿又は血清を含む培地中で接触させる工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの誘導のためのキット。
【請求項１９】
以下の工程を含む、ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤の製造方法：
（１）請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド、もしくは請求項８記載の抗原提示細胞により、末梢血リンパ球を刺激する工程、
（２）ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを取得する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤の製造方法：
（１）請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドを用いて、主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーを調製する工程、
（２）（１）で調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させる工程、
（３）該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させる工程、
（４）該結合体から単離して得られるＣＴＬを取得する工程。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体に特異的な抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ６Ｂ : ＨＨＶ−６Ｂ）に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以後、ＣＴＬと称する）エピトープペプチド、該ペプチドを用いたＨＨＶ−６Ｂ再活性化を治療又は予防するワクチン、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤、およびＨＨＶ−６Ｂに特異的なＣＴＬの定量方法に関する。さらに、本発明は、ＨＨＶ−６Ｂを標的とするＣＴＬを誘導することができるペプチドに関する。また本発明は、前記ペプチドを含むワクチン及び抗ウイルス剤に関する。更に本発明は、ウイルス感染細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペプチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトヘルペスウイルス６（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ６ ： ＨＨＶ−６）の初感染は、２歳児までに９０％以上で生じ、そのほとんどがＨＨＶ−６Ｂを原因ウイルスとする熱性発疹症である突発性発疹を伴う（非特許文献 １、２、３）。
【０００３】
ＨＨＶ-６は、β-ヘルペスウイルス亜科ロゼオロウイルス属に属するウイルスである。ＨＨＶ-６は１９８６年にＳａｌａｈｕｄｄｉｎらによってエイズ患者、リンパ腫患者の末梢血から分離された（非特許文献４）。その後、Ｔリンパ球親和性であることが明らかとされ、さらに小児の突発性発疹の原因ウイルスであることが証明されている（非特許文献１、４）。ＨＨＶ-６には、塩基配列や抗原性、宿主域などが異なるＨＨＶ−６ＡとＨＨＶ−６Ｂが存在し、２０１２年に国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：ＩＣＴＶ）により両者は異なるウイルス種として正式に分類された（非特許文献５）。突発性発疹を惹き起こす原因ウイルスはＨＨＶ-６Ｂであり、ＨＨＶ-６Ｂの病原性や疾患との関連が明らかとなっている。一方、ＨＨＶ-６Ａに関しては具体的な疾患との関連は知られていない。
【０００４】
ＨＨＶ−６初感染後は、末梢血単核球（単球・マクロファージ系細胞）、唾液腺上皮、中枢神経系（主にグリア細胞）、骨髄前駆細胞などで潜伏・持続感染し(非特許文献６、７)  成人のＨＨＶ−６陽性率は９５％にも達する(非特許文献３,８)。健常児、健常成人では明確な臨床症状がない患者が多いが、移植後などの高度免疫不全状態において再活性化が生じ、種々の病態を引き起こす。ＨＨＶ−６の再活性化はほとんどがＨＨＶ-６Ｂであり、同種造血幹細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＨＳＣＴ）では４０％以上（非特許文献９）、実質臓器移植（ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＳＯＴ）では２０〜８０％のレシピエントにおいて、移植後数週間の間に再活性化を生じる（非特許文献１０）。また、ＨＳＣＴ患者では、脳炎などの中枢神経障害の他、生着遅延、発熱、皮疹、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）、血小板減少、骨髄抑制、肝炎、間質性肺炎などが報告されている（非特許文献９、１１）。
【０００５】
特に、ＨＨＶ−６Ｂ再活性化による脳炎（ＨＨＶ−６脳炎）は移植後約２〜６週間後に発症する合併症であり、致死的経過をとることもあるほか、短期記憶障害が後遺症として残存することも多く、予後は不良である。その発生率は骨髄移植や末梢血幹細胞移植では０〜１１．６％、臍帯血移植では４．９〜２１．４％と報告されている（非特許文献１２）。またＳＯＴ患者では、発熱、皮疹、肝炎、肺炎、脳炎、腸炎などが報告されている（非特許文献９）。また、ＨＨＶ−６の再活性化と口腔癌（非特許文献１３）、慢性疲労症候群（非特許文献１４）、薬性過敏症（非特許文献１５）などの疾患との関連性も認識されつつある。
【０００６】
このように免疫不全患者におけるＨＨＶ−６の再活性化は、致死的な合併症を引き起こす可能性があるため、早期の治療開始が必要である。しかし、ＨＨＶ−６の予防ワクチン、治療薬、特異的治療方法は確立されておらず、他のヒトヘルペスウイルスであるヒトサイトメガロウイルス治療薬であるホスカルネット、ガンシクロビル、シドフォビルをＨＨＶ−６の感染予防・治療に使用しているのが現状である。また、化学療法の場合、毒性に起因する強い副作用や長期投与による耐性や再発が問題となる。このような化学療法に代わる治療法として、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を用いた免疫細胞療法は注目されている。本治療法は副作用が少ないウイルスに特異的な治療法であり、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡｄＶ）で臨床試験が実施され、その有効性が実証されている（非特許文献１６）。これまで報告されている免疫細胞療法の多くは、世界的にはＨＬＡ−Ａ２を対象とした臨床試験が最も多く、日本国内ではＨＬＡ−Ａ２４を対象者としている場合が多い。また、本治療法では、末梢血等からウイルス特異的ＣＴＬを誘導し増幅するためのＣＴＬエピトープペプチドが必要である。そのため、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＡｄＶでは、ＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ａ２４の拘束性ＣＴＬエピトープが同定されている。近年、ＨＨＶ−６についてもＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ４０拘束性のＣＴＬエピトープが報告されているが（非特許文献１７，１８、１９）、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬエピトープは未だに同定されていない。
【０００７】
Ｕ５４は、分子量約 ５２ ｋＤａ、全長４５９個のアミノ酸で構成され、ウイルスの構造維持に重要なウイルス外被タンパク質（テグメントタンパク質）として知られる。Ｕ５４のＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープは、近年報告がなされた（非特許文献１７）。
【０００８】
免疫療法は患者に備わっている免疫力を賦活化させ、ウイルス抗原を提示する細胞を特異的に攻撃・排除することを利用した治療方法であり、従来の治療方法にない特徴がある。これらの標的となる細胞を特異的に攻撃する中心的な役割を果たしているのが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）である。ＣＴＬが、標的細胞を認識するには、ＣＴＬ細胞膜表面上に発現しているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が重要な役割を担っている。ＴＣＲはウイルス粒子などの抗原分子そのものを直接認識するわけではなく、標的細胞の膜表面上に発現しているＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）と、ウイルス由来の８〜１０個のアミノ酸からなるペプチド（エピトープペプチド）との複合体に結合する。ＣＴＬは、このようにＴＣＲを介して標的細胞を認識し、殺傷効果を発揮する。ＨＬＡはクラス Ｉとクラス IIに大別され、ＨＬＡ クラス Ｉとペプチドの複合体はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＴＣＲに認識され、ＨＬＡ クラス IIとペプチドの複合体はＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現するＴＣＲに認識されて免疫応答が惹起される。ＨＬＡ クラスＩは更にＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃと呼ばれる古典的分類と、ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ばれる非古典的分類に区別される。移植医療におけるＤｏｎｏｒとレシピエントのＨＬＡ適合性は、ＨＬＡ−Ａ、ＢとＨＬＡ クラス IIに分類されるＨＬＡ−ＤＲＢの６座適合性が重要であり、特に非血縁者間での移植では、拒絶におけるリスクファクターとして考えられている。現在ＩＭＧＴのＨＬＡデータベース（http://www.imgt.org/）によると、ＨＬＡ−Ａは２,０４１種類、ＨＬＡ−Ｂは２,６８８種類、ＨＬＡ−Ｃは１,６７７種類のタンパク質が登録されている。しかしながら人種間で偏りがあることが知られており、例えば日本人の約６０％の人がＨＬＡ−Ａ２４を保持しており、ＨＬＡ−Ａ２は白人の５０％以上で、日本人も約２０％が保持している（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/ihwg.cgi）。
【０００９】
これまで報告されている免疫療法の多くは、世界的にはＨＬＡ−Ａ２を対象とした臨床試験が最も多く、日本国内ではＨＬＡ−Ａ２４を対象者としている場合が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Yamanishi K, Okuno T, Shiraki K, Takahashi M, Kondo T, Asano Y, Kurata T. Identification of human herpesvirus-6 as a causal agent for exanthem subitum. Lancet. 1988;1:1065-7.
【非特許文献２】Asano Y, Yoshikawa T, Suga S, Kobayashi I, Nakashima T, Yazaki T, Kajita Y, Ozaki T. Clinical features of infants with primary human herpesvirus 6 infection (exanthem subitum, roseola infantum). Pediatrics. 1994; 93:104-8.
【非特許文献３】Okuno T, Takahashi K, Balachandra K, Shiraki K, Yamanishi K, Takahashi M, Baba K. Seroepidemiology of human herpesvirus 6 infection in normal children and adults. J Clin Microbiol. 1989;27:651-653.
【非特許文献４】Salahuddin SZ, Ablashi DV, Markham PD, Josephs SF, Sturzenegger S, Kaplan M, Halligan G, Biberfeld P, Wong-Staal F, Kramarsky B, et al. Isolation of a new virus, HBLV, in patients with lymphoproliferative disorders. Science. 1986;234:596-601.
【非特許文献５】Ablashi D, Agut H, Alvarez-Lafuente R, Clark DA, Dewhurst S, DiLuca D, Flamand L, Frenkel N, Gallo R, Gompels UA, Hollsberg P, Jacobson S, Luppi M, Lusso P, Malnati M, Medveczky P, Mori Y, Pellett PE, Pritchett JC, Yamanishi K, Yoshikawa T. Classification of HHV-6A and HHV-6B as distinct viruses. Arch Virol. 2014;159:863-870.
【非特許文献６】Yoshikawa T. The mechanism, diagnosis and treatment of HHV-6B encephalitis. Clin Neurol 2012;52:1372-1374.
【非特許文献７】Luppi M, Barozzi P, Morris C et al. Human herpesvirus 6 latently infects early bone marrow progenitors in vivo. J Virol 1999; 73: 754-9.
【非特許文献８】Saxinger C, Polesky H, Eby N, Grufferman S, Murphy R, Tegtmeir G, Parekh V, Memon S, Hung C.J Virol Methods. Antibody reactivity with HBLV (HHV-6) in U.S. populations. 1988;21:199-208.
【非特許文献９】Becerra A, Gibson L, Stern LJ, Calvo-Calle JM. Immune response to HHV-6 and implications for immunotherapy. Curr Opin Virol. 2014;9:154-161.
【非特許文献１０】Le J, Gantt S; AST Infectious Diseases Community of Practice. Human herpesvirus 6, 7 and 8 in solid organ transplantation. Am J Transplant. 2013;13:128-137.
【非特許文献１１】Ljungman P, de la Camara R, Cordonnier C, Einsele H, Engelhard D, Reusser P, Styczynski J, Ward K; European Conference on Infections in Leukemia. Management of CMV, HHV-6, HHV-7 and Kaposi-sarcoma herpesvirus (HHV-8) infections in patients with hematological malignancies and after SCT. Bone Marrow Transplant. 2008;42(4):227-40
【非特許文献１２】Ogata M, Fukuda T, Teshima T. Human herpesvirus-6 encephalitis after allogeneic hematopoietic cell transplantation: What we do and do not know. Bone Marrow Transplant. 2015 Apr 27. doi: 10.1038/bmt.2015.76.
【非特許文献１３】Yadav M, Arivananthan M, Chandrashekran A et al. Human herpesvirus-6 (HHV-6) DNA and virus-encoded antigen in oral lesions. J Oral Pathol Med 1997; 26: 393-401.
【非特許文献１４】Chapenko S, Krumina A, Kozireva S et al. Activation of human herpesviruses 6 and 7 in patients with chronic fatigue syndrome. J Clin Virol 2006; 37 Suppl 1: S47-51.
【非特許文献１５】Gentile I, Talamo M, Borgia G. Is the drug-induced hypersensitivity syndrome (DIHS) due to human herpesvirus 6 infection or to allergy-mediated viral reactivation? Report of a case and literature review. BMC Infect Dis 2010; 10: 49.
【非特許文献１６】Heslop HE, Leen AM. T-cell therapy for viral infections. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013;2013:342-7.
【非特許文献１７】Martin LK, Schub A, Dillinger S, Moosmann A. Specific CD8+ T cells recognize human herpesvirus 6B. Eur J Immunol. 2012;42(11):2901-12.
【非特許文献１８】Gerdemann U, Keukens L, Keirnan JM, Katari UL, Nguyen CT, de Pagter AP, Ramos CA, Kennedy-Nasser A, Gottschalk SM, Heslop HE, Brenner MK, Rooney CM, Leen AM. Immunotherapeutic strategies to prevent and treat human herpesvirus 6 reactivation after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 2013;121(1):207-18.
【非特許文献１９】M Iampietro M, Morissette G, Gravel A, Dubuc I, Rousseau M, Hasan A, O'Reilly RJ, Flamand L. Human herpesvirus 6B immediate-early I protein contains functional HLA-A*02, HLA-A*03, and HLA-B*07 class I restricted CD8(+) T-cell epitopes. Eur J Immunol. 2014;44(12):3573-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、標的をＨＨＶ−６Ｂ特異抗原Ｕ５４とし、その目的は、Ｕ５４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチドを同定し、該ペプチドを用いたＨＨＶ−６Ｂを治療又は予防するワクチン、Ｕ５４に対する受動免疫療法剤、およびＵ５４に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、種々のＵ５４由来のペプチドについて抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ねた。その結果、配列番号：９に示すペプチドがＨＬＡ−Ａ*２４:０２拘束性のＵ５４特異的ＣＴＬを誘導し、該特異的ＣＴＬが細胞傷害活性を示すことを見いだした。本発明はこのような知見に基づいてなされたものであり、具体的な態様において、例えば以下の発明に関する。
【００１３】
［１］  配列番号：９に示すアミノ酸配列を含むペプチド。
［２］  配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
［３］  ［１］又は［２］記載のペプチドにおいて、少なくとも１個のアミノ酸が欠失している、および／または、少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸又はアミノ酸アナログに置換されている、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＨＨＶ−６Ｂ）のＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する性質を有する、ペプチド。
［４］  少なくとも１種の変異が、アミノ酸配列の置換である、［３］記載のペプチド。
［５］  アミノ酸配列の置換が、以下の一方または両方である、［４］記載のペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンの群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｎ末端から９番目又は１０番目のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルアラニンの群より選択される。
［６］  ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ*２４:０２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）である、［３］〜［５］のいずれかに記載のペプチド。
［７］  ［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
［８］  ［７］の核酸を含む発現ベクター。
［９］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４に提示した抗原提示細胞。
［１０］  ＨＬＡ−Ａ２４がＨＬＡ−Ａ*２４:０２である、［９］記載の抗原提示細胞。
［１１］  ［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチド、［７］記載の核酸、［８］記載の発現ベクター、又は［９］もしくは［１０］記載の抗原提示細胞を有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂを治療、又は予防するためのワクチン組成物。
［１２］  ［９］記載の抗原提示細胞を用いて末梢血リンパ球を刺激して得られる、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ。
［１３］  ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ*２４:０２拘束性ＣＴＬである、［１２］記載のＣＴＬ。
［１４］  ［１２］または［１３］記載のＣＴＬを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤。
［１５］  ［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと、末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＴＬを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤。
［１６］  （１）［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的なＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬを誘導する工程、及び、
（２）誘導したＣＴＬが産生するサイトカイン及び／又はケモカイン及び／又は細胞表面分子を測定する工程
を含む、該末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの定量方法。
［１７］  サイトカイン及び／又はケモカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、又はインターロイキンであり、細胞表面分子が、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、又はＣＤ６９である、［１６］記載の定量方法。
［１８］  （１）［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラマーを調製する工程、及び、
（２）主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させる工程、
を含む、該末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの定量方法。
［１９］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドによりＣＴＬを誘導する工程を含む、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導する方法。
［２０］  ＣＴＬを誘導する工程が、［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドと、末梢血単核球を、血漿又は血清を含む培地中で接触させる工程を含む、［１９］記載の方法。
［２１］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドを含む、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの誘導のためのキット。
［２２］  ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬが、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ*２４:０２拘束性ＣＴＬである、［２１］記載のキット。
［２３］  以下の工程を含む、ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤の製造方法：
（１）［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチド、もしくは［９］記載の抗原提示細胞により、末梢血リンパ球を刺激する工程、
（２）ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを取得する工程。
［２４］  ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬが、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ*２４:０２拘束性ＣＴＬである、［１６］〜［２０］および［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］  以下の工程を含む、ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤の製造方法：
（１）［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドを用いて、主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーを調製する工程、
（２）（１）で調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させる工程、
（３）該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させる工程、
（４）該結合体から単離して得られるＣＴＬを取得する工程。
［２６］  ［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体に特異的な抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＭＨＣ-モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例である。
【図２】図２は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテストの結果を表すグラフである。グラフはＭＨＣ−モノマーを表すピーク面積を表している。
【図３】図３は、検体番号：＊２４−３８から採取した培養０日のサンプルを、Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対応するＭＨＣ−テトラマー試薬と反応させ、フローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図４】図４は、検体番号：＊２４−３８から採取したサンプルを、Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号：1〜１２）で刺激培養し、培養１３日目に、Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号：1〜１２）に対応するＭＨＣ−テトラマー試薬と反応させ、フローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図５】図５（a）は、検体番号：＊２４−３８から採取したサンプルを、ＰＦＨ（９mer）ペプチドと共培養した際の、ＭＨＣ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析し、ＰＦＨ（９mer）ペプチドで誘導したＣＴＬが、ＰＦＨ（９mer）-Tet試薬特異的に反応することを示す図である。図５（b）は、検体番号：＊２４−５から採取したサンプルを、ＣＴＬ誘導用の陽性コントロールであるＱＹＤペプチド（配列番号：１３）と共培養した際の、ＭＨＣ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析し、ＰＦＨ（９mer）-Tet試薬の特異性をフローサイトメトリーで解析検討した結果を表す図である。
【図６】図６は、ＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的なＣＴＬの機能をＰＦＨ（９mer）ペプチドを用いて機能解析した結果を表す図である。ＰＦＨ（９mer）ペプチドで刺激した場合にＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的にＩＦＮγが検出されていることがわかる。
【図７】図７は、ＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的なＣＴＬの機能をＰＦＨ（９mer）ペプチドを用いて機能解析した結果を表す図である。ＰＦＨ（９mer）ペプチドで刺激した場合にＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的にＣＤ１０７ａが検出されていることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１６】
［エピトープペプチド］
本発明は、配列番号：９に示すアミノ酸配列を含むペプチド、及び配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。本発明でいうペプチドは、生理活性を有し、隣接するアミノ酸残基のα-アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなく、種々の長さであり得る。また、無電荷又は塩の形態であってもよく、場合によっては、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化等により修飾されていてもよい。
【００１７】
さらには、本発明は、上述のエピトープペプチドのうち、少なくとも１個のアミノ酸が欠失している、および／または、少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸又はアミノ酸アナログに置換されている、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＨＨＶ−６Ｂ）のＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する性質を有する、ペプチドを提供する。本発明のエピトープペプチドは、生理活性及び免疫活性を実質的に改変せず、投与した場合に有害な活性を有するものでない限り、１個又は数個（例えば、１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１個又は２個）のアミノ酸またはアミノ酸アナログの挿入、付加、置換、欠失等が生じたペプチドも本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変更目的は、例えば、
１．ＨＬＡとの親和性を高める為の変更（Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess PJ, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, White DE. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nat Med. 1998;4:321-327、Berzofsky JA, Ahlers JD, Belyakov IM. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. Nat Rev Immunol. 2001;1:209-219）、
２．ＴＣＲの認識性を向上させるための変更（Fong L, Hou Y, Rivas A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Davis MM, Engleman EG. Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:8809-8814、Rivoltini L, Squarcina P, Loftus DJ, Castelli C, Tarsini P, Mazzocchi A, Rini F, Viggiano V, Belli F, Parmiani G. A superagonist variant of peptide MART1/Melan A27-35 elicits anti-melanoma CD8+ T cells with enhanced functional characteristics: implication for more effective immunotherapy. Cancer Res. 1999;59:301-306）、 
３．血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更（Berzofsky JA, Ahlers JD, Belyakov IM. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. Nat Rev Immunol. 2001;1:209-219、 Parmiani G, Castelli C, Dalerba P, Mortarini R, Rivoltini L, Marincola FM, Anichini A. Cancer immunotherapy with peptide-based vaccines: what have we achieved? Where are we going? J Natl Cancer Inst. 2002;94:805-818、Brinckerhoff LH, Kalashnikov VV, Thompson LW, Yamshchikov GV, Pierce RA, Galavotti HS, Engelhard VH, Slingluff CL Jr. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. Int J Cancer. 1999;83:326-334）等が挙げられる。
【００１８】
本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形態として用いることができる。前記アミノ酸アナログとしては、種々のアミノ酸のＮ-アシル化物、Ｏ-アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。
【００１９】
また、ＨＬＡ分子とβ２-ミクログロブリン、エピトープペプチドとの３者複合体を細胞表面に提示する細胞を、ＣＴＬが特異的に認識できる範囲内であれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ-ブトキシカルボニル（ｔ-Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ-ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
なお、アスタリスクが付された「ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２」は一般的にアリルを意味するが、本願発明における「ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２」はアリル又は当該アリルから発現した分子を意味する。
【００２０】
また、本発明のエピトープペプチドは、生体内への導入を容易にしうる各種修飾を施されたものであってもよい。生体内への導入を容易にしうる各種修飾の例としては、ＰＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメインが有名である。ＨＩＶのＰＴドメインは、Ｔａｔタンパク質の４９〜５７番目のアミノ酸（Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ）で構成されたペプチドである。このＰＴドメインを目的とするタンパク質あるいはペプチドのＮ末端とＣ末端の両方、またはいずれかに付加することで、容易に細胞内に導入できることが報告されている（Ryu J, Han K, Park J, Choi SY. Enhanced uptake of a heterologous protein with an HIV-1 Tat protein transduction domains (PTD) at both termini. Mol Cells. 2003;16:385-391、Kim DT, Mitchell DJ, Brockstedt DG, Fong L, Nolan GP, Fathman CG, Engleman EG, Rothbard JB. Introduction of soluble proteins into the MHC class I pathway by conjugation to an HIV tat peptide. J Immunol. 1997;159:1666-1668）。
【００２１】
ＨＬＡクラスＩ分子を介して提示されるほとんどの抗原は、細胞質内のプロテアソームにより分解された後、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）へと移送され、粗面小胞体内においてＴＡＰに会合しているＨＬＡクラス Ｉ分子とβ２-ミクログロブリン（β２ｍ）の複合体と結合し、ゴルジ装置を経てエクソサイトーシスにより細胞表面へと運搬される。これら一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンであるＨＳＰ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）７０やＨＳＰ９０、またはｇｐ９６と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効率的に抗原提示させることが可能である（Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, Srivastava PK. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity. 2001;14:303-313）。
【００２２】
［エピトープペプチドをコードする核酸］
また、本発明は、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸及び、本発明の核酸をコードする発現ベクターを提供する。エピトープペプチドをコードする核酸は、遺伝子組換え技術を用いて、エピトープペプチドを宿主内で産生させる為に重要である。この場合、宿主間でアミノ酸コドンの使用頻度（codon usage）が異なる為、産生させる宿主のcodon usageに適合するようアミノ酸コドンを変更することが望ましい。エピトープペプチドをコードする核酸は、ワクチンとしても重要で、むき出しの核酸として移送することも、適切なウイルスもしくは細菌ベクターを用いて移送することもできる（Berzofsky JA, Ahlers JD, Janik J, Morris J, Oh S, Terabe M, Belyakov IM Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections. J Clin Invest. 2004;114:450-462、Berzofsky JA, Terabe M, Oh S, Belyakov IM, Ahlers JD, Janik JE, Morris JC. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer. J Clin Invest. 2004;113:1515-1525）。適切な細菌ベクターは、例えば、サルモネラ属亜種の細菌である。適切なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、ＥＢＶベクター、ワクシニアベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクターである。適切なワクシニアベクターの１例は、改変ワクシニア・アンカラベクターである。
【００２３】
［ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの選択］
１．コンピュータ予測アルゴリズムを用いた分析
本発明のＵ５４に特異的なＣＴＬエピトープ候補ペプチドは、全長４５９個アミノ酸配列について、目的とするＨＬＡクラス Ｉ分子に対して結合モチーフを有する８〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されている複数のエピトープ予測ソフトウェア（Pingping Guan, Irini A. Doytchinova, Christianna Zygouri, and Darren R. Flower MHCPred: a server for quantitative prediction of peptide? MHC binding Nucleic Acids Res. 2003;31:3621-3624、Karosiene E, Lundegaard C, Lund O, Nielsen M. NetMHCcons: a consensus method for the major histocompatibility complex class I predictions. Immunogenetics. 2012;64:177-186、Jorgensen KW, Rasmussen M, Buus S, Nielsen M.NetMHCstab - predicting stability of peptide-MHC-I complexes; impacts for cytotoxic T lymphocyte epitope discovery. Immunology. 2014;141:18-26）に照合して選択することができる。
【００２４】
２．アンカーモチーフを用いた検討
ＨＬＡクラスＩ分子は、主としてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃがあり、これらに結合して提示されるエピトープペプチドは、８〜１０個のアミノ酸からなる。エピトープペプチドのＮ末端側から２番目と、９あるいは１０番目のアミノ酸はＨＬＡクラスＩ分子との結合に対して最も重要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各々のＨＬＡクラスＩ分子の種類によって異なることが報告されている。例えば、世界的に最も研究が進められているＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にＬｅｕが配置され、９あるいは１０番目の位置にＬｅｕ又はＶａｌが配置されたペプチドであって、９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドが最も良く知られている（T Sudo, N Kamikawaji, A Kimura, Y Date, CJ Savoie, H Nakashima, E Furuichi, S Kuhara, and T Sasazuki Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes J. Immunol. 1995;155:4749-4756）。また、日本人や東南アジアの人種に多いＨＬＡ-Ａ２４（Chang CX, Tan AT, Or MY, Toh KY, Lim PY, Chia AS, Froesig TM, Nadua KD, Oh HL, Leong HN, Hadrup SR, Gehring AJ, Tan YJ, Bertoletti A, Grotenbreg GM. Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T-cell responses in acute and chronic viral diseases. Eur J Immunol. 2013;43:1109-1120）に結合するペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にTrp、Tyrまたは Pheのいずれかが配置され、９あるいは１０番目の位置にTrp、Ile、Met、LeuまたはPheのいずれかが配置されたペプチドであって、９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている（Rapin N, Hoof I, Lund O, Nielsen M. The MHC motif viewer: a visualization tool for MHC binding motifs. Curr Protoc Immunol. 2010;Chapter 18:Unit 18.17.）。タンパク質のアミノ酸配列中からこのアンカーモチーフを有する８〜１０個のアミノ酸配列を検索し、ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを選択することができる。
【００２５】
３．ペプチドライブラリーの作製
全長４５９個のアミノ酸であるＵ５４を網羅する２０個程度のアミノ酸配列よりなるペプチドライブラリーを合成する。２０個程度のアミノ酸のうち、１０個程度のアミノ酸配列は、前後のペプチドと重複するようにライブラリーを作製する。これによりタンパク質全体を網羅的に検索することが可能になり、一度ライブラリーを作製すればＨＬＡ拘束性も網羅的に検討することが可能になる。
【００２６】
〔ペプチドの合成〕
本発明の配列番号：１〜１２に示されるペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製可能である。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードする核酸を調製し、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することも可能である。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置）による合成も可能である。
【００２７】
［ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの検討］
上記の通り、予測ソフトを用いることで、タンパク質を構成するアミノ酸配列を短時間で分析し、ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとＨＬＡとの結合力や解離の半減期を予測することが可能である。しかしながら、この様な予測ソフトを用いて得られた候補ペプチドは、必ずしもＣＴＬエピトープとして生体内で機能しているわけではない。
【００２８】
理由として、これらの分析ソフトが、タンパク質の分解によるペプチド断片産生効率をほとんど加味していないことが挙げられる。ＣＴＬエピトープは８〜１０アミノ酸残基長のペプチド断片で構成されるが、これらは細胞内で様々なタンパク質分解を経て産生される。具体的には、最初に細胞質内でプロテアソームによるタンパク質分解を受けて、ペプチドのＣ末端側が形成される。その後、ＴＡＰ(ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ)分子により小胞体内腔に輸送され、そこでさらにＥＲＡＰ１というプロテアーゼによるタンパク質分解によりＮ末端側が形成されてはじめて、８〜１０アミノ酸残基長のペプチド断片になる。ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの予測には、これらの細胞内におけるペプチド断片の産生過程・効率が考慮されなければならないが、現在これを正確に予測することはできない。このため、予測ソフトを用いて得られた候補ペプチドの中には、実際には細胞内で８〜１０アミノ酸残基長のペプチド断片を構成できないものが多く含まれると考えられる。
【００２９】
このような理由から、単に予測ソフトでＣＴＬエピトープ候補ペプチドを得ることと、免疫応答を担うＣＴＬエピトープペプチドを同定することは大きく異なるといえる。発明者らは、ＭＨＣ−テトラマー試薬を用いて、候補ペプチドに特異的な生体内のＣＴＬを直接的に検出する手法によりＣＴＬエピトープペプチドの同定を実施した。すなわち、末梢血などの試料から、ＭＨＣ−テトラマー試薬によって特異的ＣＴＬが検出されるということは、候補ペプチド特異的な免疫応答が生体内で惹起されていることを意味し、候補ペプチドが抗原性を持つＣＴＬエピトープペプチドであることを示す。
【００３０】
以上から、前述の方法にて選択されたＣＴＬエピトープ候補ペプチドは、以下に示す（１）〜（３）の検討を経て初めてＵ５４特異的ＣＴＬエピトープペプチドと決定し得る。
【００３１】
（１）培養細胞株を用いた検討
プロテアソームによるタンパク質分解で生じたペプチド断片はＴＡＰ分子により小胞体内腔へと導かれ、ＨＬＡクラスＩ分子とβ２−ミクログロブリンとの複合体に結合し、細胞膜表面へ輸送される。このＴＡＰ分子を欠損した、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、内在性タンパク質の分解産物であるペプチド断片を細胞膜表面に発現できない。また、代表的なＴＡＰ遺伝子欠損細胞株であるヒトリンパ芽球様細胞株Ｔ２、あるいはＴ２にＨＬＡ−Ａ２４分子を遺伝子導入した細胞株（Ｔ２-Ａ２４）のＨＬＡ分子は、細胞膜表面上での発現が非常に不安定である。しかし、外部から供給したペプチドと結合した場合、ＨＬＡ分子は細胞膜表面上で安定化する。この性質を利用して、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、ＨＬＡ分子と外部から供給したペプチドの結合性を検証する実験に使用することが可能である。具体的には、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株とＣＴＬエピトープ候補ペプチドを混合培養後、抗ＨＬＡ抗体で染色し、フローサイトメトリーでＨＬＡ分子の発現強度の変化を算出することで、目的とするＨＬＡ分子とＣＴＬエピトープ候補ペプチドの結合性を検討できる。ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株が発現するＨＬＡ分子に対して、添加したＣＴＬエピトープ候補ペプチドが結合した場合、ＨＬＡ分子とペプチドの複合体は細胞膜表面上で安定化し、抗ＨＬＡ抗体で染色した場合、ＨＬＡ分子の発現増強が観察される。一方、添加したＣＴＬエピトープ候補ペプチドがＨＬＡ分子と結合性を示さない場合は、細胞膜表面上のＨＬＡ分子は不安定であり、抗ＨＬＡ抗体で染色しても、ＨＬＡ分子の発現増強は確認されない。この様な方法を用いて、ＨＬＡ分子とＣＴＬエピトープ候補ペプチドの結合性を検証することが可能である。
【００３２】
（２）フォールディングテスト
ＭＨＣ−テトラマー試薬は、ＭＨＣ（ヒトの場合はＨＬＡ）とβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）及びペプチド断片の３者複合体（ＭＨＣ−モノマー）を試験管内で製造し、ＭＨＣ−モノマーを４量体化した試薬である。ＭＨＣ−テトラマー試薬は、ＭＨＣ拘束性を示す抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を選択的に検出できる唯一の試薬である。またＭＨＣ−テトラマー試薬は、抗ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗体や抗サイトカイン抗体等と共染色後、フローサイトメトリーで分析することでＣＴＬの数を定量できるだけでなく、その活性化状態や分化段階を一つ一つの細胞毎に評価することが可能である。ＭＨＣ−テトラマー試薬製造の最初のステップは、原料であるＭＨＣとβ２ｍとペプチドを試験管内の適切な溶液中で混合するフォールディングから始まる。フォールディング溶液中では、この３種類の原料の会合反応により３者複合体（ＭＨＣ−モノマー）が形成される。この際、ＭＨＣとペプチドの結合力が高ければ、この会合反応はスムーズに進行し、ゲル濾過カラムで分析することで、３種類の原料の複合体（ＭＨＣ−モノマー）の検出が可能になる。一方、ＭＨＣとペプチドの結合力が無い場合は、ＭＨＣ−モノマーは殆ど検出されない。従って、フォールディング溶液を経時的に分析することで、或いは熱処理等を行うことで、ＭＨＣとペプチドの結合性と安定性を検証することが可能である。
【００３３】
（３）エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出
健常人から分離した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を適切な培地に１〜３×１０6個／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、これに合成したＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号：１〜１２）のいずれか、または数種類を １〜１００ μg/ｍＬの濃度となるように加え、９６ウェル培養プレートに１００μL/ウェルとなるように分注する。３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で培養し、２日後にＩＬ−２を添加する。以後、ペプチドとＩＬ−２による刺激を７〜１４日に１度行うことによりＣＴＬを誘導する。このようにして誘導したＣＴＬがＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、ＭＨＣ−テトラマー法で判定する。ＭＨＣ−テトラマー試薬で染色可能なＣＴＬが検出された場合、使用したＣＴＬエピトープ候補ペプチドはＣＴＬ誘導能を有する抗原性ペプチド（エピトープペプチド）と同定することが可能である。一般的に胸腺から移出したＴ細胞（ナイーブＴ細胞）は樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞による抗原刺激を受けて初めて活性化してエフェクターＴ細胞に分化する。単純にＰＢＭＣとペプチドを混合培養するこの方法では、特に人為的に調製した抗原提示細胞を用いていないため、末梢血のナイーブＴ細胞が分化している可能性は低く、ＰＢＭＣに存在していたエフェクター／メモリーＴ細胞がペプチド刺激により増殖していると考えられる。従って、ＭＨＣ−テトラマー試薬で染色可能なＣＴＬが検出された場合は、もともと供血者末梢血ＰＢＭＣにエフェクター／メモリータイプのＣＴＬが存在している事を意味しており、恒常的に抗原性ペプチドを介する免疫応答が生体内で惹起されていることを示唆している。
【００３４】
［Ｕ５４特異的ＭＨＣ−モノマー及びＭＨＣ−テトラマー試薬の製造］
Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを使用したＭＨＣ−モノマー及びＭＨＣ−テトラマー試薬は、公知の方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５，６３５，３６３、Ｆｒｅｎｃｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＦＲ９９１１１３３）により調製することができる。タンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製したＨＬＡクラス Ｉ分子、β２−ミクログロブリン及び本発明のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの３者の複合体であるＭＨＣ−モノマーをフォールディング溶液内で形成させる。組換えＨＬＡクラスI分子のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ−モノマー形成後この部位にビオチンを付加する。市販の色素標識されたストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣ−モノマーをモル比１：４で混合することによってＭＨＣ−テトラマー試薬を製造することができる。ＭＨＣ−テトラマー試薬と細胞表面タンパク質に対する抗体（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７やＣＤ４５ＲＡ等）と組み合わせて用いることで、ＣＴＬの分化段階を調べることができる（Seder RA, Ahmed R. Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation. Nat Immunol. 2003;4:835-on. Nat Immunol. 2003;4:835-8422）。あるいは細胞内サイトカイン染色法と組み合わせることで、ＣＴＬの機能性評価に用いることも可能である。例えば、骨髄移植後のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬについては、そのＣＴＬ存在の有無を調べるだけでなく、サイトカイン産生能の強弱を調べることが、抗ウイルス薬投与等のタイミングを計るために有効であると考えられ始めている（Ozdemir E, St John LS, Gillespie G, Rowland-Jones S, Champlin RE, Molldrem JJ, Komanduri KV. Cytomegalovirus reactivation following allogeneic stem cell transplantation is associated with the presence of dysfunctional antigen-specific CD8+ T cells. Blood 2002;100:3690-3697）。このように特異的なＣＴＬエピトープペプチドを同定し、ＭＨＣ−テトラマー試薬を製造すれば、特異的なＣＴＬの定量と定性が可能になり、診断情報を得る上で多大な貢献が可能になる。
【００３５】
［能動免疫ワクチン］
ペプチドワクチン
本発明のＣＴＬエピトープペプチドは、能動免疫療法においてペプチドワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを含んでなるワクチンを患者に投与し、Ｕ５４特異的ＣＴＬを体内で増殖させ、ＨＨＶ−６Ｂに対する予防、及び治療に役立てることができる。使用するエピトープペプチドは１種のみの使用であっても、あるいはワクチンの使用目的に応じて２種以上のペプチドを混合、または連結して使用することもできる。
【００３６】
抗原提示細胞を利用したワクチン
本発明は、本発明のエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞を提供する。本発明のＣＴＬエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫療法においてワクチンとして用いることができる。ＣＴＬエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞とは、
１．適当な培養液中で、抗原提示細胞とＣＴＬエピトープペプチドを３０分〜１時間混合して調製したＣＴＬエピトープペプチドパルス抗原提示細胞
２．ＣＴＬエピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にＣＴＬエピトープペプチドを提示させた細胞
３．人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞
を意味する。抗原提示細胞とは、例えば、(1)樹状細胞、(2)Ｂ細胞、(3)マクロファージ、又は、(4) PHA (phytohaemagglutinin)やPMA (phorbol myristate acetate)、CD3抗体、CD28抗体などを添加して培養し非特異的に活性化させたT細胞等を意味するが、該ペプチドが結合し得るＨＬＡ分子をその細胞表面上に発現する細胞であって、ＣＴＬ刺激能を有するものを意味する。人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞とは、例えば脂質二重膜やプラスティックあるいはラテックス等のビーズにＨＬＡ分子とＣＴＬエピトープペプチドとβ２-ミクログロブリンとの三者複合体を固定し、ＣＴＬを刺激し得るＣＤ８０、ＣＤ８３やＣＤ８６等の共刺激分子を固定するか、もしくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を固定することで調製可能である（Oelke M, Maus MV, Didiano D, June CH, Mackensen A, Schneck JP. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat Med. 2003;9:619-624、Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003;171: 4974-4978、Oosten LE, Blokland E, van Halteren AG, Curtsinger J, Mescher MF, Falkenburg JH, Mutis T, Goulmy E. Artificial antigen-presenting constructs efficiently stimulate minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Blood 2004;104:224-226）。
【００３７】
遺伝子ワクチン
本発明は、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸、又はその核酸含む発現ベクターを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂを治療又は予防するためのワクチン組成物を提供する。本発明のＣＴＬエピトープペプチドの核酸は、能動免疫療法においてＤＮＡワクチンや組換えウイルスベクターワクチン等に用いることができる。この場合、ＣＴＬエピトープペプチドの核酸配列は、組換えワクチンや、組換えウイルスワクチンを産生させる宿主に適合したcodon usageに変更することが望ましい（Casimiro, D.R. et al. Comparative Immunogenicity in Rhesus Monkeys of DNA Plasmid, Recombinant Vaccinia Virus, and Replication-Defective Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type 1 gag Gene J. Virol., 2003;77:6305-6313、Berzofsky JA, Ahlers JD, Janik J, Morris J, Oh S, Terabe M, Belyakov IM. Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections. J Clin Invest. 2004;114: 450-462）。
【００３８】
また、本発明のエピトープペプチド、又はエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞を有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂを治療又は予防するためのワクチン組成物を提供する。本発明のＣＴＬエピトープペプチド、又はＣＴＬエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞を含んでなるワクチンは、当分野において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、かかるワクチンとしては、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを有効成分として含有する注射剤又は固形剤等がある。ＣＴＬエピトープペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸などの無機塩、又は、酢酸、酒石酸などの有機酸が挙げられる。また、本発明のＣＴＬエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、製薬上許容され、該ペプチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）、及びその他のアジュバント等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。
【００３９】
本発明のワクチンは、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、一般的には非経口投与が好ましい。非経口投与としては経鼻投与や皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の注射剤、座薬等がある。また、経口投与としては、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
【００４０】
本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投与量は、患者一人当たり、ＣＴＬエピトープペプチドは１〜１００ ｍｇ、ＣＴＬエピトープペプチドパルス細胞では１０6〜１０9個の含有量とすることができる。また、投与間隔は、対象、目的により設定することができる。
【００４１】
［受動免疫ワクチン］
本発明は、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ、及び当該ＣＴＬを有効成分として含む、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤を提供する。本発明のＣＴＬエピトープペプチドは、受動免疫治療剤の調製に用いることができる。下記のようにして得られたＵ５４に特異的なＣＴＬはヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させて、ＨＨＶ−６Ｂに対する受動免疫療法剤とすることができる。受動免疫療法剤に含まれるＵ５４に特異的なＣＴＬは、以下のような調製方法によって得ることができ、ＣＴＬの純度を高める為に精製して用いることも可能である。
【００４２】
ＣＴＬ調製方法１
ＰＢＭＣと、適当な濃度のＵ５４特異的ＭＨＣ−テトラマー試薬を反応させる。この反応は、in vitroですることができるが、in vivoでしてもよい。ＭＨＣ−テトラマー試薬と結合したＵ５４特異的ＣＴＬは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡などを用いて染色されたＣＴＬのみを単離する。このようにして単離されたＵ５４特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００４３】
ＣＴＬ調製方法２
Ｕ５４特異的ＭＨＣ−モノマー及び／又はＭＨＣ−テトラマー試薬を無菌プレートなどに固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。プレートに固相化されたＭＨＣ−モノマー及び／又はＭＨＣ−テトラマー試薬に結合したＵ５４特異的ＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残った特異的ＣＴＬだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたＵ５４特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００４４】
ＣＴＬ調製方法３
Ｕ５４特異的ＭＨＣ−モノマー及び／又はＭＨＣ−テトラマー試薬と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の共刺激分子か、もしくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレートなどに固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。２日後にＩＬ−２を培地に添加し３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で７〜１４日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【００４５】
ＣＴＬ調製方法４
ＰＢＭＣあるいはＴ細胞を本発明のＣＴＬエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、または人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導されたＣＴＬを３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で７〜１４日培養する。ＣＴＬエピトープペプチドとＩＬ−２、又は抗原提示細胞とＩＬ−２による刺激を週に１度繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【００４６】
ＣＴＬの精製法
ＣＴＬ調製方法において、特異的ＣＴＬの割合が低い場合は、随時以下の方法を用いることで特異的ＣＴＬを高純度で回収することが可能である。
【００４７】
ＭＨＣ−テトラマー試薬による精製
Ｕ５４特異的ＭＨＣ−テトラマー試薬と、ＣＴＬ調製方法にて誘導されたＣＴＬを反応させ、ＭＨＣ−テトラマー試薬を標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した２次抗体を用いて分離することが可能である。このような磁気標識した２次抗体と、磁気標識細胞分離装置は、例えばＤｙｎａｌ社やＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社から入手可能である。このようにして単離されたＵ５４特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００４８】
分泌されるサイトカインによる精製
Ｕ５４特異的ＣＴＬが、放出するサイトカイン等を利用して、Ｕ５４特異的ＣＴＬを精製することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社から入手可能なキットを用いることで、ＣＴＬから放出されるサイトカインを細胞表面で特異抗体により捕捉し、抗サイトカイン標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特異的な抗体で反応させた後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製することも可能である。このようにして単離されたＵ５４特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００４９】
細胞表面タンパク質特異的抗体を用いた精製
特異的ＣＴＬの細胞表面では、特異的刺激により発現が増強する細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９など）が報告されている（Betts MR, Brenchley JM, Price DA, De Rosa SC, Douek DC, Roederer M, Koup RA. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 2003;281:65-78、Trimble LA, Shankar P, Patterson M, Daily JP, Lieberman J. Human immunodeficiency virus-specific circulating CD8 T lymphocytes have down-modulated CD3zeta and CD28, key signaling molecules for T-cell activation. J Virol. 2000;74:7320-7330）。このような細胞表面タンパク質に対する特異抗体を磁気標識することで、磁気分離装置等を用いてＣＴＬを精製することが可能である。また、このような特異抗体に対する抗ＩｇＧ抗体等を磁気標識することでも同様にＣＴＬの精製が可能である。あるいは、これら特異抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激を加えたＰＢＭＣを培養し、プレートに結合しなかった細胞集団を洗い流すことで特異的ＣＴＬを精製することも可能である。このようにして単離されたＵ５４特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ―２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００５０】
［Ｕ５４特異的ＣＴＬの定量］
本発明は、末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの定量方法を提供する。Ｕ５４特異的ＣＴＬが、患者の末梢血に存在するか否か、あるいはその量の変動を知ることは、ワクチン投与量、接種の回数、接種の間隔等を決定する上で非常に重要である。Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープペプチドを用いて調製されたワクチンあるいは受動免疫療法剤を投与された患者においてＵ５４特異的ＣＴＬを定量的に測定することは、ワクチンや受動免疫療法剤の効果成分を測定することと同じ意味である。更に、本発明で提供されるＵ５４特異的受動免疫療法剤の調製工程および最終的な製剤の有効成分量を測定する品質検定においても重要である。Ｕ５４特異的ＣＴＬの定量は、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを用いた以下の３つの方法によって行うことができる。
【００５１】
定量方法１（ＭＨＣ−テトラマー法）
本発明のＣＴＬエピトープペプチドを使用して製造したＭＨＣ−テトラマー試薬を用いて、末梢血中のＵ５４に特異的なＣＴＬを定量することができる。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。末梢血あるいはＰＢＭＣを、適当な濃度のＭＨＣ−テトラマー試薬と反応させる。該ＭＨＣ−テトラマー試薬と結合したＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。ＭＨＣ−テトラマー試薬と反応させる時に、ＭＨＣ−テトラマー試薬と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を反応させることで、Ｕ５４特異的ＣＴＬのＴ細胞サブセットも同時に判定できる。
【００５２】
定量方法２
ＰＢＭＣを本発明のＣＴＬエピトープペプチドで刺激することによってＣＴＬが産生するＩＦＮγ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ）、ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）、インターロイキン等のサイトカイン及び／又はケモカインを定量する方法である。以下にＩＦＮγを例にとり具体的に方法を示す。
【００５３】
２−１  サイトカイン定量による方法１（細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法）
ＰＢＭＣを適当な培地におよそ２×１０6個／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを加える。さらに細胞内タンパク質輸送阻止剤（例えば、Brefeldin AやMonensin等）を加え、３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で５〜１６時間培養する。培養後、Ｔ細胞マーカー抗体（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体）あるいは、ＭＨＣ−テトラマー試薬と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮγ抗体を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、Ｔ細胞中あるいはＭＨＣ−テトラマー試薬陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量する。
【００５４】
２−２  サイトカイン定量による方法２（エリスポットアッセイ）
抗ＩＦＮγ抗体を固相化した９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレート (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社)にＰＢＭＣを播種する。その後、ＣＴＬエピトープペプチドを各ウェルに入れ３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽にて２０時間培養する。その後、プレートを洗浄し、抗ＩＦＮγ抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体の順で反応させる。さらにペルオキシダーゼの基質を加え、発色によりＩＦＮγスポットを可視化し、実体顕微鏡かＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社）を用いてカウントすることで定量する。
【００５５】
２−３  サイトカイン定量による方法３（培養上清中に分泌されたＩＦＮγを定量する方法）
ＰＢＭＣを適当な培地におよそ２×１０6個／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを加える。３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で２４〜４８時間培養する。培養後、上清を回収し、その中に含まれるＩＦＮγ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（例えばＲ＆Ｄシステムズ社のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を使用して定量する。
【００５６】
定量方法３
細胞表面タンパク質特異抗体を用いて定量を行う。ＣＴＬエピトープペプチドに特異的なＣＴＬは、特異的刺激により細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９など）の発現が増強することが報告されている。従って、ＣＴＬエピトープペプチド等で刺激したＰＢＭＣと細胞表面タンパク質を特異的に認識する標識抗体を混合することで、ＣＴＬは標識抗体と結合し、標識色素により染色される。染色されたＣＴＬは、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントし、定量することができる。さらに、標識抗体と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を加えることで、特異的ＣＴＬのＴ細胞サブセットも同時に判定できる。
【００５７】
［ＣＴＬ誘導方法］
本発明は、ＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導する方法を提供する。当該ＣＴＬを誘導する方法は、本発明のエピトープペプチドを用いてＣＴＬを誘導する工程を含む。本発明のエピトープペプチドを用いてＣＴＬを誘導する工程は、末梢血単核球あるいはＴ細胞を本発明のＣＴＬエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、または人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激することで実施できる。好ましくは、末梢血単核球を血漿又は血清を含むＣＴＬ誘導培地におよそ２×１０6個/ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＴＬエピトープペプチドを加える。３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で培養し、２日後にIL-2を添加後、適宜IL-2 添加ＣＴＬ誘導培地の交換を行い、培養２週間を目途にＣＴＬの誘導が確認できるが、これに制限されない。
【００５８】
［受動免疫療法剤の製造方法］
本発明は、ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤の製造方法を提供する。ＨＨＶ−６Ｂの治療又は予防のための受動免疫療法剤は、（１）本発明のエピトープペプチド若しくは本発明の抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激する工程と、（２）Ｕ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを取得する工程を含む方法により、製造することができる。ここで、Ｕ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを取得する工程は、上述した末梢血中のＨＨＶ−６ＢのＵ５４特異的ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの誘導方法を用いることにより実施可能である。
【００５９】
また、本発明の受動免疫療法剤は、（１）本発明のペプチドを用いて、主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーを調製する工程、（２）（１）で調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させる工程、（３）該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させる工程、（４）該結合体から単離して得られるＣＴＬを取得する工程によっても、製造することができる。
【００６０】
ここで、（２）（１）で調製した主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させる工程は、適量の細胞数と１０ μLのＭＨＣ−テトラマー試薬とを穏やかに混合し２〜８℃で６０分間または、室温にて３０分間静置することで行うことができるが、これに限定されない。また、（３）該主要組織適合性抗原複合体及び／又は主要組織適合性抗原複合体−テトラマーにＣＴＬが結合した結合体を形成させる工程は、（２）と同様の条件下で行うことができるが、これに限定されない。さらに、（４）該結合体から単離して得られるＣＴＬを取得する工程は、具体的には、該結合体を、ＭＨＣ−テトラマー試薬を標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した２次抗体を用いて分離することによって実施することができる。
【００６１】
［ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的な抗体］
本発明は、本発明のエピトープペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体に特異的な抗体を提供する。同定したエピトープペプチドとＭＨＣの複合体に特異的なモノクローナル抗体（以下ｐＭＨＣ抗体）は、エピトープペプチドを細胞膜表面に提示する細胞を特異的に検出することができる。このため、ｐＭＨＣ抗体は免疫療法の診断薬として使用できるほか、抗体依存性細胞傷害活性（以下ＡＤＣＣ活性）により、特異性の高い治療用抗体としても有用性がある。ｐＭＨＣ抗体の取得は一般的に、ファージディスプレイ法によって行われる。ファージディスプレイ法とは、ファージの感染力を失わせないように外来遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムのことである。これを利用し、ファージに抗体可変領域を発現させスクリーニングすることで、特異的なモノクローナル抗体を分離できることが知られている（Tsukahara T, Emori M, Murata K, Hirano T, Muroi N, Kyono M, Toji S, Watanabe K, Torigoe T, Kochin V, Asanuma H, Matsumiya H, Yamashita K, Himi T, Ichimiya S, Wada T, Yamashita T, Hasegawa T, Sato N. Specific targeting of a naturally presented osteosarcoma antigen, papillomavirus binding factor peptide, using an artificial monoclonal antibody. J Biol Chem. 2014;289:22035-22047）。ｐＭＨＣ抗体の取得は、抗体ライブラリーの作製、パニング、抗体の単離、評価といった流れで行われる。パニングには、エピトープペプチドとＭＨＣの複合体（ＭＨＣ−モノマー）をＥＬＩＳＡプレートなどに固相化、あるいはビオチン−アビジン結合で固定したものを使用し、これにファージライブラリーを反応させ、洗浄・溶出を繰り返すことで、エピトープペプチドとＭＨＣの複合体に特異的な、結合力の高い抗体を単離できる。得られた抗体は、前述のＴＡＰ遺伝子欠損株Ｔ２にエピトープペプチドを添加し、抗体を反応させ、ＦＣＭで平均蛍光強度を測定することなどにより評価可能である。
【００６２】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に断りがない限り、実験法は成書（免疫実験操作法、右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、南江堂  １９９５）を参考に行った。
【００６４】
〔実施例１〕
[Ｕ５４ 特異的CTLエピトープ候補ペプチドの選択]
ＨＨＶ−６Ｂ  Ｚ２９株におけるＵ５４は４５９個のアミノ酸で構成されるタンパク質であり、アイソフォームの報告はない。本発明のＵ５４特異的CTLエピトープ候補ペプチドの選択は、Ｕ５４（ＧｅｎＢａｎｋ Accession：AAD４９６５７）のアミノ酸配列をもとに実施した。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２４分子に対して結合モチーフを有する８〜１０個のアミノ酸よりなるCTLエピトープ候補ペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されている複数のソフトウェアに照合して実施した。その結果、Ｕ５４のアミノ酸配列よりＨＬＡ−Ａ２４分子の結合モチーフを有する ９個または１０個のアミノ酸よりなるＣＴＬエピトープ候補ペプチドを合計１２種類選択し、これらのペプチドを合成し、以下にＣＴＬエピトープ候補ペプチドとして示した。また、各種検討に用いる比較対象用のペプチドとしてはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｐｐ６５タンパク質由来のＨＬＡ−Ａ＊２４:０２拘束性エピトープペプチド（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、配列番号：１３）とＨＩＶ ｅｎｖ のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ 拘束性エピトープペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ：配列番号：１５）、インフルエンザPB1のＨ−２Ｋｂ拘束性エピトープペプチド（ＳＳＹＲＲＰＶＧＩ：配列番号：１４）を用いた。
【００６５】
【表１】
2017132745.tif 000002
【００６６】
【表２】
2017132745.tif 000003
【００６７】
表１は、合成したＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの一覧を示す。ペプチド名は合成したペプチドのＮ末端側から3つのアミノ酸配列で示す。左から、ペプチド名、アミノ酸配列、由来タンパク質のアミノ酸配列上の位置、アミノ酸数、解析に用いたＢＩＭＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ.ｃｉｔ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ/）で算出されたスコアを示した。このスコアは、ＨＬＡ−Ａ２４とペプチドとの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、ＨＬＡとペプチドが安定した複合体を形成する可能性があることを意味する。このスコアは、分析に用いた５種類の分析ソフト（ＢＩＭＡＳ,ＳＹＦＰＥＩＴＨＹ,ＩＥＤＢ Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ＮｅｔＭＨＣ，ＮｅｔＭＨＣｐａｎで得られた代表例として示した。
【００６８】
表２は、合成したコントロールペプチドの一覧を示す。ペプチド名は合成したペプチドのＮ末端側から３つのアミノ酸配列で示す。左から、由来、ペプチド名、アミノ酸配列、アミノ酸数、スコアを示した。
【００６９】
〔実施例２〕
［Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテスト］
発明者らは、表１と表２に記載した配列番号：１から配列番号：１４の１４種類のペプチドを用いてフォールディングテストを実施した。具体的には、大腸菌発現系を利用して発現精製したＨＬＡ−Ａ＊２４:０２とβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）、および合成ペプチドをフォールディング溶液に添加して混合後、フォールディング溶液を経時的に分取してゲル濾過カラムにて分析を行った。ゲル濾過カラム分析では、ＨＬＡ−Ａ＊２４:０２とβ２ｍ、およびＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの３者複合体（ＭＨＣ−モノマー）の形成が認められる場合、ＭＨＣ−モノマーは原料よりも分子量が大きいため、ゲル濾過カラム分析での溶出時間が早くなる。また、ＭＨＣ−モノマー形成量は、２８０ ｎｍの吸収波長によって得られるピーク面積から算出可能である。一方、ＨＬＡ分子との結合性の無い候補ペプチドではＭＨＣ−モノマー形成が確認されない。ＭＨＣ−モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例を図１に示した。
【００７０】
ゲル濾過カラム分析の結果では、ＨＬＡ分子とβ２ｍは、大腸菌発現系を利用して発現精製する際に、封入体として不溶性分画を精製後８Ｍ尿素に可溶化させているが、難溶性であるＨＬＡ分子は、ＭＨＣ−モノマー形成に至らないものが凝集体として７〜８分に検出される。但し、凝集体の多くはゲル濾過カラム分析の前処理工程であるフィルター濾過により大部分が除去されている。β２ｍは、可溶性タンパク質であり、フォールディング溶液中で可溶化され、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をゲル濾過カラムに用いた場合、１４分付近に検出される。１５分以降にはフォールディング溶液の組成物やペプチドが検出される。フォールディングテスト開始直後（ｄａｙ ０）では１０分付近にＭＨＣ−モノマーのピークは確認されないが、１日後（ｄａｙ １）、３日後（ｄａｙ ３）とピークが大きくなり、ＭＨＣ−モノマー形成が順調に進行している事を示している。
【００７１】
図２に配列番号：１から配列番号：１４の１４種類のペプチドに対して実施したフォールディングテスト５日後の分析結果を示した。陽性コントロールペプチドとして、ＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質由来ＨＬＡ−Ａ＊２４:０２拘束性エピトープペプチド（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、配列番号：１３）、陰性コントロールとして、インフルエンザＰＢ１由来Ｈ−２Ｋｂ拘束性エピトープペプチド（ＳＳＹＲＲＰＶＧＩ、配列番号：１４）を比較対象に用いた。ＭＨＣ−モノマー形成を示すピークの面積を棒グラフで示した。その結果、Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号：１から配列番号：１２）は、陰性コントロールと比較して、全てのＣＴＬエピトープ候補ペプチドでＭＨＣ−モノマー形成が認められた。
【００７２】
〔実施例３〕
［Ｕ５４特異的ＭＨＣ−テトラマー試薬の製造］
フォールディングテストの結果に基づき、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを用いてＰＥ標識ＭＨＣ−テトラマー試薬を製造した。本発明で製造したＭＨＣ−テトラマー試薬は例えば、ＲＹＦ−Ｔｅｔと略号で示すが、これは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とＲＹＦペプチド（ＲＹＦＫＣＧＬＧＩ、配列番号：１）とβ２ｍの３者複合体を用いて製造されたＭＨＣ−テトラマー試薬を示す。ＭＨＣ−テトラマー試薬の製造は、まずタンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製したＨＬＡクラスＩ分子、β２ｍ及び本発明のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの複合体であるＭＨＣ−モノマーを適切なフォールディング溶液中で形成させる。組換えＨＬＡクラスI分子のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ−モノマー形成後この部位にビオチンを付加する。その後、市販の色素標識されたストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣ−モノマーをモル比１：４で混合することで、ＭＨＣ−テトラマー試薬が製造できる。
【００７３】
〔実施例４〕
［Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープペプチドの同定］
(検体のＨＬＡ型の選定)
Ｕ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドには、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対して結合モチーフを有する１２種類の候補ペプチドを選択した。更にフォールディングテストにより、試験管内でＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とβ２ｍと１２種類のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドが結合しＭＨＣ−モノマーを形成することが判明した。この１２種類のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドが細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に結合し、これを認識するＣＴＬが生体内に存在するかどうかを確認するためには、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保持する供血者の末梢血を用いて、末梢血中に存在するＵ５４特異的ＣＴＬを増幅することが可能であるかどうかを検討する必要がある。最初に、供血者がＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保持するかどうかは、ジェノサーチＨＬＡ−Ａ Ｖｅｒ.II（ＭＢＬ社）を用いてＨＬＡ−Ａの遺伝子型判定にて確認した。以降の検討は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保有する５名の健康成人由来のＰＢＭＣを用いて行った。
【００７４】
〔実施例５〕
［抗原提示細胞の調製］
（１）ＥＢＶ感染Ｂ細胞株の調製
定法（Kuzushima K, Yamamoto M, Kimura H, Ando Y, Kudo T, Tsuge I, Morishima T. Establishment of anti-Epstein-Barr virus (EBV) cellular immunity by adoptive transfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA-matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection. Clin Exp Immunol. 1996;103:192-198）に従い、ＥＢＶ産生細胞株であるＢ９５．８細胞株（ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより入手）の培養上清（生ＥＢＶウイルスを含む）とＰＢＭＣを混合培養し、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株(Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、以下、ＥＢＶ感染ＬＣＬと称する）を樹立した。約２週間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＣＤ２０の発現を確認した。
【００７５】
（２）ＣＤ４０−Ｂ細胞の調製
ヒトＣＤ４０Ｌを遺伝子導入し、安定的に発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ−ＣＤ４０Ｌ）とＰＢＭＣを、ＩＬ−４存在下で共培養した。ＮＩＨ−ＣＤ４０Ｌは９６ ＧｙのＸ線照射により増殖阻害し、３〜４日毎に共培養を繰り返した（Kondo E, Topp MS, Kiem HP, Obata Y, Morishima Y, Kuzushima K, Tanimoto M, Harada M, Takahashi T, Akatsuka Y. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 2002;169:2164-2171）。約２週間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３とＣＤ８６の発現を確認した。
【００７６】
（３）樹状細胞の調製
ＰＢＭＣをプラスティック製の培養皿で３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽内にて２時間培養し、培養皿に接着しなかった細胞を軽く洗い流した。これにＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を加え２４時間培養後、続けてＴＮＦαとＩＬ―１βおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）を加え、２４〜４８時間培養した。適当な培地等で軽く洗い流して回収できた細胞を樹状細胞とした（Kondo E, Topp MS, Kiem HP, Obata Y, Morishima Y, Kuzushima K, Tanimoto M, Harada M, Takahashi T, Akatsuka Y. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 2002;169:2164-2171）。４８時間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３とＣＤ８６の発現を確認した。
【００７７】
〔実施例６〕
［抗原特異的ＣＴＬの誘導］
（１）抗原提示細胞を利用した誘導
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保有するＰＢＭＣより、前述の抗原提示細胞（ＥＢＶ感染ＬＣＬ、ＣＤ４０−Ｂ細胞、樹状細胞）を予め調製した。抗原提示細胞をパルス用培地（０．１％ ヒト血清アルブミン／５５ μＭ ２-メルカプトエタノール／ＲＰＭＩ １６４０）あるいは、ＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に浮遊させ、１０ μg/ｍＬの濃度でＣＴＬエピトープ候補ペプチドを加え、およそ１５分間隔で穏やかに混合しながら室温にて３０〜６０分間放置後、過剰量の洗浄液（２％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）／ＰＢＳ）にて３回洗浄し、ＨＬＡ分子に未結合のペプチドを洗い流した。この操作を行うことで、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子にＣＴＬエピトープ候補ペプチドが結合すると考えられる。この操作を行った抗原提示細胞をペプチドパルス抗原提示細胞と呼ぶ。ペプチドパルス抗原提示細胞は、増殖能を失わせる為に、致死量のＸ線照射、またはマイトマイシンＣ処理を行った。これを同一人物から分離したＰＢＭＣ、あるいはＣＤ８陽性またはＣＤ４陽性のＴ細胞と混和し３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽にて培養を行った。用いる培地は、１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、あるいは１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、または、１〜１０％のヒト血漿含有ＲＰＭＩ１６４０培地等の検討を行ったが、本方法においては、１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で良好な結果が得られた。Ｔ細胞の生存の維持と、増殖を補助する目的でＩＬ−２（シオノギ製薬社）を添加したが、そのタイミングは通常混合培養開始後７〜１４日目とする報告が多く、本発明でＩＬ−２は培養開始時、培養開始２日後、６日後等の検討を行ったが培養開始２日後に投与した場合に良好な結果が得られた為、培養開始２日後に５０ Ｕ／ｍＬの濃度で加えた。培養開始１０〜１４日後に再度ペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加えた。１０〜１４日毎にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加え、ＣＴＬ誘導の評価は、およそ２週間後と４週間後に実施した。抗原特異的ＣＴＬの誘導が確認できた場合は、更にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加えＣＴＬラインを樹立した。
【００７８】
（２）抗原提示細胞を利用しない誘導法（ＭＬＰＣ法）
ＭＬＰＣ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）法は、ＰＢＭＣ培養液中にペプチドを添加してＣＴＬを誘導する方法である（Karanikas V, Lurquin C, Colau D, van Baren N, De Smet C, Lethe B, Connerotte T, Corbiere V, Demoitie MA, Lienard D, Dreno B, Velu T, Boon T, Coulie PG. Monoclonal anti-MAGE-3 CTL responses in melanoma patients displaying tumor regression after vaccination with a recombinant canarypox virus. J Immunol. 2003;171:4898-4904、Tsukahara T, Kawaguchi S, Torigoe T, Takahashi A, Murase M, Kano M, Wada T, Kaya M, Nagoya S, Yamashita T, Sato N. HLA-A＊0201-restricted CTL epitope of a novel osteosarcoma antigen, papillomavirus binding factor. J Transl Med. 2009;7:44）。ＰＢＭＣ中に存在する抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ある種のＴ細胞にペプチドが提示され、ＰＢＭＣに含まれるメモリータイプのペプチド特異的ＣＴＬが刺激を受け増殖すると考えられる。前述の抗原提示細胞を利用した誘導法と異なり、前もって抗原提示細胞を調製する必要が無い点で区別され、簡便に実施できることが利点である。あえて抗原提示細胞を利用しない事で末梢血中を循環しているメモリー/エフェクター型のＣＴＬを刺激増殖させるシステムである。ＨＬＡ−Ａ＊２４:０２を保有する健康成人より採血した末梢血を３，０００ ｒｐｍで５〜１０分間遠心処理し、上清の血漿部分を回収した。血漿部分以外は従来法である密度勾配遠心法にてＰＢＭＣを分離した。本発明では５％の血漿を加えた培地を用いて良好な結果が得られた。培地は一般に細胞培養に用いる培地に適切な添加物と抗生物質を加える。本発明に用いたＣＴＬ誘導培地は、ＲＰＭＩ１６４０ Ｈｅｐｅｓ ｍｏｄｉｆｙ（Ｓｉｇａｍ社）に２−メルカプトエタノール、Ｌ―グルタミン、抗生物質としてストレプトマイシンとペニシリンを加えた培地を使用した。これ以外にインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ピルビン酸、ヒト血清アルブミン、非必須アミノ酸溶液等を加えることもできる。約２×１０６個のＰＢＭＣを１ｍＬの培地に浮遊させた。これに１２種類のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのうち1種類を１０μg/ｍＬの濃度で加えた。ペプチドの濃度は、ペプチドの溶解度に応じて変更できる。本発明では１０μg/ｍＬにて実施した。ＰＢＭＣとペプチドの混合培養は、１４ｍＬポリプロピレン  ラウンドチューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）を用いた。細胞は３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽にて培養した。２日後に２０〜１００Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２を添加した。その後適宜ＩＬ−２添加ＣＴＬ誘導培地の交換を行った。Ｕ５４特異的ＣＴＬの確認は、培養２週間を目処に実施した。Ｕ５４特異的ＣＴＬの誘導が確認できた場合は、ペプチドパルス抗原提示細胞を用いた刺激または直接ペプチドで刺激し、ＣＴＬラインの樹立を試みた。
【００７９】
〔実施例７〕
［Ｕ５４特異的ＣＴＬの確認］
前述の方法で培養した細胞集団にＵ５４特異的なＣＴＬが存在するか否かの検討は、ＭＨＣ−テトラマー法により実施した。培養後、適量の細胞数に対して１０ μLのＰＥ標識ＭＨＣ−テトラマー試薬と、２０ μLのＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識Ｔ細胞表面抗体（例えばＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３）等を加えた。さらに、混入した赤血球による非特異的な蛍光を除外するために、ＰＣ５（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ５）等で標識されたＣＤ４５抗体を加えても良い。その後、穏やかに混合し２〜８℃で６０分間または、室温にて３０分間静置した。１．５ ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを吸引廃棄後、細胞を４００ μLのＰＢＳに再懸濁した。この際、死細胞による非特異的な蛍光を除外するために、７―ＡＡＤ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（死細胞検出試薬、ＭＢＬ社）を加えてもよい。２４時間以内にフローサイトメーターにて解析した。
【００８０】
Ｕ５４特異的ＣＴＬの確認は培養０日目と１３日目に行った。培養０日目は、培養開始前のＰＢＭＣをサンプルとして、３種類のＭＨＣ−テトラマー混合試薬を用いて陽性細胞集団の検出を行った。培養１３日目は、誘導に用いたＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対応した各ＭＨＣ−テトラマー試薬を用いて陽性細胞集団を検出し、いずれのペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されているかを確認した。
【００８１】
図３は、ＭＬＰＣ法の培養開始前のＰＢＭＣをサンプルとして、Ｕ５４特異的ＣＴＬ細胞集団の存在をＭＨＣ−テトラマー試薬で確認した結果を示した。５名の健康成人（検体番号：＊２４−３７、＊２４−３、＊２４−３８、＊２４−５、＊２４−５８）のＰＢＭＣを表１に記載したＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対応するＭＨＣ−テトラマー混合試薬であるＲＹＦ−Ｔｅｔ、ＰＹＡ−ＴｅｔおよびＬＹＧ−Ｔｅｔ（ＭＨＣ−テトラマー混合試薬１）または、ＲＬＰ−Ｔｅｔ、ＲＹＬ（９mer)−ＴｅｔおよびＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔ（ＭＨＣ−テトラマー混合試薬２）または、ＲＹＬ（１０mer）−Ｔｅｔ、ＩＦＮ−ＴｅｔおよびＤＹＬ−Ｔｅｔ（ＭＨＣ−テトラマー混合試薬３）または、ＰＦＨ (１０mer)−Ｔｅｔ、ＮＹＳ−ＴｅｔおよびＩＦＬ−Ｔｅｔ（ＭＨＣ−テトラマー混合試薬４）をもちいて染色し、代表的な例を結果として示した。ＭＨＣ−テトラマー混合試薬１、２、３、４いずれかと、ＣＤ８−ＦＩＴＣで染色し、ドットプロット展開図で結果を示した。ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）、ＬＲ（右下）と表記した場合、（ＵＲ ＋ ＬＲ）分のＵＲの百分率を示す。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＭＨＣ−テトラマー試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示した。その結果、培養開始前の検体番号：＊２４−３８のＰＢＭＣサンプルは、いずれのＭＨＣ−テトラマー試薬をもちいても、明らかなＣＤ８陽性且つＭＨＣ−テトラマー試薬陽性の細胞集団は検出されなかった。このことは、ＭＨＣ−テトラマー試薬がＰＢＭＣに非特異な反応を示すことがないことと、ＭＬＰＣを用いてＵ５４特異的なＣＴＬを誘導する前は、Ｕ５４特異的なＣＴＬエピトープ候補ペプチドに特異的に反応するＣＴＬがごくわずかにしか存在しない、または存在しないことを示している。
【００８２】
図４は、ＭＬＰＣ法にてＵ５４特異的ＣＴＬを誘導後の培養１３日目のＣＴＬ細胞集団の確認を行った結果を示した。表１に示す配列番号：１〜１２を用いてＭＬＰＣを行った後、各ＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対応するＭＨＣ−テトラマー試薬とＣＤ８−ＦＩＴＣで染色した。ドットプロット展開図は、図３におけるドットプロット展開図と同様の様式で表す。その結果、検体番号：＊２４−３８は、ＰＦＨ（９mer）-Ｔｅｔで染色した場合、明らかなＣＤ８陽性且つＭＨＣ−テトラマー試薬陽性の細胞集団が検出された。このことは、ＣＴＬ誘導に使用したＰＦＨ（９mer）ペプチドに対して特異的に反応して増殖するメモリータイプのＵ５４特異的ＣＴＬが、検体番号：＊２４−３８の末梢血に存在したことを示している。
【００８３】
表３は、検体番号：＊２４−３７、＊２４−３、＊２４−３８、＊２４−５、＊２４−５８とＵ５４特異的ＣＴＬエピトープ候補配列を用いたＭＬＰＣ結果を示す。Ｕ５４特異的ＣＴＬの誘導の確認ができたのは、検体番号：＊２４−３８とＰＦＨ（９mer）ペプチドを用いてＭＬＰＣを行った場合のみであった。検討に使用した検体は、全て健常人由来であり、ＨＨＶ−６感染に起因すると思われる自覚症状がある訳ではない。更に血中のウイルスDNAの存在も確かめていないため、5名中1名でのCTL誘導効率であった。ＨＨＶ−６は健常人では潜伏感染しており、通常は免疫機能により抑制されているため発症することは稀である。この事は成人での感染率が高いＥＢＶ(Epstein-Barr Virus)やＣＭＶ（Cytomegalovirus）でも同じことがいえる。例えばＨＴＬＶ−１(ヒトT細胞白血病ウイルス)は日本人の約1%の罹患率であり、ヒトT細胞白血病の発症には血中のＨＴＬＶ−１特異的CTL量が関与しているとの報告がある。同一抗原であっても認識するCTLエピトープペプチドの種類が異なる事や、採血のタイミング等でCTLの量が変動する事も良く知られた事である。（参考文献： Reduced Frequency, Diversity, and Function of Human T Cell Leukemia Virus Type 1-Specific CD8+ T Cell in Adult T Cell Leukemia Patients Kozako T, et. al J. Immunol., Oct 2006; 177: 5718 - 5726.)
【００８４】
【表３】
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【００８５】
図５（a）は、ＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的なＣＴＬの誘導の確認を行った結果を示す。
まず、検体番号：＊２４−３８のＰＢＭＣとＰＦＨ（９mer）ペプチドをもちいてＭＬＰＣを行った。培養１４日目にＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的な細胞集団をＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔを用いて実施例７と同様のＭＨＣ−テトラマー法で検討した。その結果、検体番号：＊２４−３８で、ＣＤ８陽性且つＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔ陽性の細胞集団が検出された。誘導されたＣＴＬは、ＲＹＬ−Ｔｅｔでは染色されず、ＰＦＨ（９mer）-Ｔｅｔ特異的なＣＴＬであることが示された。図５（b）は、ＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔ試薬の特異性の確認を行った結果を示す。まず、検体番号：＊２４−５のＰＢＭＣと陽性コントロールであるＱＹＤペプチド（配列番号：１３）をもちいてＭＬＰＣを行った。培養１４日目にＱＹＤ特異的な細胞集団をＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔ試薬を用いて実施例７と同様のＭＨＣ−テトラマー法で検討した。その結果、ＣＤ８陽性且つＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔ陽性の細胞集団は検出されなかった。この結果により、ＰＦＨ（９mer）−Ｔｅｔの試薬の特異性が示された。つまり、図４、図 ５（a）で検出したＣＤ８陽性且つＰＦＨ（９mer）-Ｔｅｔ陽性の細胞集団は、ＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的なＣＴＬであることが示された。
【００８６】
〔実施例８〕
［ＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的ＣＴＬの機能解析］
（１）細胞内ＩＦＮγ産生細胞の定量による機能解析
発明者らは、ＭＨＣ−テトラマー試薬により同定されたＵ５４特異的ＣＴＬエピトープペプチドで誘導されたＣＴＬの機能性を評価するために、細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量を実施した。
【００８７】
検体番号：＊２４−３８から誘導したＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的ＣＴＬを含むＰＢＭＣを９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートに、等量になるように２つのウェルに移した。ＰＦＨ（９mer）ペプチドを一方のウェル分に加え、もう一方のウェルは陰性コントロールとして、ＲＹＬペプチド（配列番号：１５）を最終濃度０．０１〜０．１０  μg/ｍＬとなるように加えた。さらに細胞内タンパク質輸送阻止剤としてＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを最終濃度１μg/ｍＬとなるように各ウェルに加え、３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽で５〜１６時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、ＰＣ７（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ７）標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、室温にて１５〜３０分間静置した。洗浄後、４％ ホルムアルデヒドにて、４℃で１５分間固定後、過剰量の洗浄液にて洗った。０．１％サポニンにて膜透過処理後、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、室温にて１５〜３０分間反応させた。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、Ｔ細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量した。
【００８８】
前述の方法でＩＦＮγ産生能を検証した結果を図６に示した。ドットプロット展開は、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＩＦＮγに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示した。ＵＲにＣＤ８陽性細胞数中のＩＦＮγ陽性細胞数の割合を示し、その下の括弧内にＰＢＭＣに占めるＩＦＮγ陽性細胞数の割合を示した。ＲＹＬペプチドではＣＤ８陽性且つＩＦＮγ陽性（産生）細胞が０．３１％であったのに対し、ＰＦＨ（９mer）ペプチドを用いた再刺激では、ＣＤ８陽性且つＩＦＮγ陽性細胞の存在率は１．０２％であり、陰性コントロールで刺激した場合と明らかな差が示された。この結果より、ＰＦＨ（９mer）ペプチドを用いて誘導したＣＴＬは、ＩＦＮγを産生するエフェクタータイプのＣＴＬであることが明らになった。
【００８９】
（２）ＣＤ１０７ａ表出細胞の定量による機能解析
発明者らは、ＣＤ１０７ａ表出細胞の定量をおこなった。ＣＴＬは、パーフォリン、グランザイムなどの細胞傷害性因子を放出する際に、細胞内顆粒内膜に存在するＣＤ１０７ａを細胞膜上に表出することが知られており、ＣＤ１０７ａ分子を検出することで、細胞傷害性因子の放出を間接的に調べることができる。
【００９０】
検体番号：＊２４−３８から誘導したＰＦＨ（９mer）ペプチド特異的ＣＴＬを含むＰＢＭＣを９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートに、等量になるように２つのウェルに移した。ＰＦＨ（９mer）ペプチドを一方のウェル分に加え、もう一方のウェルは陰性コントロールとして、ＲＹＬペプチド（配列番号：１５）を最終濃度０．０１〜０．１０μg/ｍＬとなるように加えた。さらに、抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣ標識抗体とさらに細胞内タンパク質輸送阻止剤としてモネンシンを最終濃度１μg/ｍＬとなるように各ウェルに加え、３７℃、５％ ＣＯ２恒温槽内にて４時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、ＰＣ７（フィコエリスリン−Ｃｙ７）標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、室温にて１５〜３０分放置した。過剰量の洗浄液にて洗い、フローサイトメーターを用いて、ＣＴＬの脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａを検出し陽性細胞率を算出した。
【００９１】
結果を図７に示す。ドットプロット展開は、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＣＤ１０７ａに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示した。ＵＲにＣＤ８陽性細胞数中のＣＤ１０７ａ陽性細胞数の割合を示し、その下の括弧内にＰＢＭＣに占めるＣＤ１０７ａ陽性細胞数の割合を示した。図７は、ＰＦＨ（９mer）ペプチド（配列番号：９）で刺激された場合にのみ、ＵＲにＣＤ８陽性且つＣＤ１０７ａ陽性細胞が出現し、陰性コントロールＲＹＬペプチド（配列番号：１５）を加えた場合は殆ど出現しなかった。この結果より、ＰＦＨ（９mer）ペプチドで誘導したＣＴＬは、再刺激によりグランザイムやパーフォリンを産生する細胞傷害性活性を有することがわかった。
【００９２】
以上より、本発明で同定されたＵ５４由来のＰＦＨ（９mer）ペプチド（配列番号：９）は末梢血中のＵ５４特異的ＣＴＬを増殖させる機能をもち、これらの細胞集団が細胞傷害性活性を有しかつＰＦＨ（９mer）-Ｔｅｔで検出可能であったことから、ＨＬＡ−Ａ＊２４:０２拘束性のＵ５４特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のエピトープペプチド、ワクチン、受動免疫療法剤等を用いることによって、ＨＨＶ−６Ｂの感染及び同ウイルス陽性の疾患の治療又は予防することができる。また、ＨＨＶ−６Ｂに特異的なＣＴＬの定量が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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