(57)【要約】【課題】安全で活性が高く、抗腫瘍剤の有効成分としても好適なｍＲＮＡ成熟阻害剤の提供。【解決手段】下記一般式（１）〜（３）［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、ｍＲＮＡ成熟阻害剤。［化１］2017132762.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）〜（３）
【化１】
2017132762.tif 000006
［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］
のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする、ｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基である、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項３】
前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子である、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項４】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項５】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項６】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項７】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項８】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項９】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項１０】
腫瘍の治療又は再発予防に用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ成熟阻害剤を含有することを特徴とする、医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全で活性が高く、抗腫瘍剤の有効成分としても好適なｍＲＮＡ成熟阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、がんによる死亡が３人に１人となっている。特に高齢者は、染色体中にこれまでに蓄積された変異を多く含むために、細胞ががん化しやすい傾向がある。がんは、細胞の増殖異常によるものであるため、食品から細胞増殖を抑制する機能性化合物を積極的に摂取することによって、効果的にがんの発症を抑制できると期待できる。現代社会の多様化した生活環境から、このような機能性化合物は、食品だけでなくサプリメント等として摂取する視点も重要となっている。すなわち、抗腫瘍作用を有する生理活性化合物を、食品やサプリメント等から継続的に摂取する方法論を確立することは、超高齢化社会を迎えた日本において健康な長寿社会を築いていく上で極めて重要な社会課題となる。
【０００３】
従来、抗腫瘍剤としては、化学的合成品が主体であるが、これらは使用濃度の制限や副作用等の課題があり、天然に存在する安全性が高くかつ活性の強い抗腫瘍剤への要望が高まっている。今までに、食品や天然物から抗腫瘍成分の探索が数多くなされている。例えば特許文献１には、茶由来のエピガロカテキンガレートを有効成分とする抗腫瘍剤が開示されている。また、特許文献２には、シノブヒバ中のジテルペンに抗腫瘍活性があることが記載されている。特許文献３には、リンゴ由来のプロアントシアニジンの抗腫瘍活性が提案されている。特許文献４には、広く野菜や果物に存在しているフラボノイドの一種モリンを有効成分とする抗腫瘍剤であって、口腔ガンを抑制する抗腫瘍剤が開示されている。特許文献５には、桂皮酸誘導体を含有するヒアルロニダーゼ阻害剤が記載されている。特許文献６には、アンニンコウから無極性溶媒で抽出される成分を含有する抗腫瘍剤が提案されている。さらに、非特許文献１には、コーヒーのクロロゲン酸に肝細胞がん増殖抑制効果があることが記載されている。
【０００４】
一方で、ｍＲＮＡの成熟は、核内において、５’−キャッピング、スプライシング、３’ −エンドプロセッシング等の多段階の反応によりなされ、成熟ｍＲＮＡは、核外に運ばれる。成熟段階のいずれかが適切に行われず、ｍＲＮＡの成熟が阻害された場合には、核内に未成熟のｍＲＮＡが蓄積される。最近、ｍＲＮＡ成熟過程の阻害因子が、抗がん剤としての機能を期待されている。本発明者らは、抗腫瘍活性を持つ化合物の新たなスクリーニング系として、蛍光ラベルされたオリゴｄＴプローブを用いたＲＮＡ−ＦＩＳＨを利用し、ｍＲＮＡ成熟阻害活性を有する物質をスクリーニングするアッセイ系を開発した（非特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６０−１９０７１９号公報
【特許文献２】特開昭６１−５０９１６号公報
【特許文献３】特開２００４−５１５１３号公報
【特許文献４】特許第４５７０１８４号公報
【特許文献５】特許第４７１３３２４号公報
【特許文献６】特許第５６５８４８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yagasaki，et al., Cytotechnology, 2000, vol.33, p.229-235.
【非特許文献２】Fujita，et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2012, vol.76(6), p.1248-1251.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１〜６に記載の抗腫瘍剤は、天然物由来であり、比較的安全性が高いものの、抗腫瘍効果が不充分であったりする。このため、飲食品に本来含まれていて安全であることに加えて、より充分な抗腫瘍活性を有する化合物が求められている。そこで、本発明は、安全で活性が高く、より高い抗腫瘍活性を有する成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、新たに開発したｍＲＮＡ成熟阻害活性を有する物質をスクリーニングするアッセイ系を用いて各種食品素材のスクリーニングを実施したところ、焙煎コーヒー豆に含まれているクロロゲン酸ラクトンが、高いｍＲＮＡ成熟阻害作用を有していることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
［１］  本発明の第一の態様に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、下記一般式（１）〜（３）
【００１０】
【化１】
2017132762.tif 000002
【００１１】
［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］
のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする。
［２］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であることが好ましい。
［３］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であることが好ましい。
［４］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［５］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［６］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［７］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［８］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［９］  前記［１］のｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［１０］  前記［１］〜［９］のいずれかのｍＲＮＡ成熟阻害剤としては、腫瘍の治療又は再発予防に用いられることが好ましい。
［１１］  本発明の第二の態様に係る医薬品は、前記［１］〜［１０］のいずれかのｍＲＮＡ成熟阻害剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
クロロゲン酸ラクトンは、高いｍＲＮＡ成熟阻害活性を備えることに加えて、天然にはコーヒーに比較的多く含まれている成分であり、比較的安全に投与可能である。このため、クロロゲン酸ラクトンを有効成分とする本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、サプリメントや医薬品等の有効成分として好適であり、特に、腫瘍等のように細胞の過増殖が原因となる疾患に対する治療又は再発防止のための医薬品の有効成分として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における、クロロゲン酸処理後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比を調べた結果（ｎ＝２０）を示す。
【図２】実施例１における、カフェ酸処理後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比を調べた結果（ｎ＝２０）を示す。
【図３】実施例１における、キナ酸処理後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比を調べた結果（ｎ＝２０）を示す。
【図４】実施例１における、クロロゲン酸ラクトン（３−ＣＱＬ：組み合せ１）処理後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比を調べた結果（ｎ＝２０）を示す。
【図５】実施例１における、ジカフェオイルキナ酸ラクトン（３，４−ｄｉＣＱＬ：組み合せ１０）処理後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比を調べた結果（ｎ＝２０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、クロロゲン酸ラクトンを有効成分とする。クロロゲン酸ラクトンは、細胞内に取り込まれた後、ｍＲＮＡの成熟工程のいずれかの段階を阻害し、タンパク質合成を阻害する。このｍＲＮＡ成熟阻害の結果、細胞増殖が抑制される。このため、本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、細胞の過増殖により引き起こされる疾患の治療や予防のための医薬品、特に、腫瘍の治療や再発防止のための医薬品の有効成分として好適である。
【００１５】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、具体的には、下記一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする。下記一般式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。
【００１６】
【化２】
2017132762.tif 000003
【００１７】
カフェオイル基を下記式（ａ）に、フェルロイル基を下記式（ｂ）に、クマロイル基を下記式（ｃ）に、それぞれ示す。式（ａ）〜（ｃ）中、「＊」が付された結合手は、一般式（１）〜（３）中のシクロヘキサン環に結合した酸素原子との結合手を示す。
【００１８】
【化３】
2017132762.tif 000004
【００１９】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンとしては、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基である化合物であってもよく、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であってもよく、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であってもよい。
【００２０】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか１つが水素原子である場合、残る２つの基は、同種の基であってもよく、異種の基であってもよい。同様に、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基の場合、これら３つ基は全て同種の基であってもよく、２種以上の基が組み合わせられていてもよい。
【００２１】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンのＲ１、Ｒ２、及びＲ３の基の組み合わせを表１に示す。表１中、「Ｈ」は水素原子、「（ａ）」はカフェオイル基、「（ｂ）」はフェルロイル基、「（ｃ）」はクマロイル基を示す。
【００２２】
【表１】
2017132762.tif 000005
【００２３】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤の有効成分としては、一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンが好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、若しくはクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトン、又は一般式（１）で表され、かつＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、若しくはクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンがより好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１〜６、１０〜１２のいずれかの一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）がさらに好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１、４、又は１０のいずれかの一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）がよりさらに好ましく、一般式（１）で表され、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）が特に好ましい。
【００２４】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、焙煎コーヒー豆から精製することができる。具体的には、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物又は熱水抽出物残渣から、ＯＤＳカラム（Ｃ１８カラム）等の逆相系カラムを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により単離精製することができる。
【００２５】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、キナ酸ラクトン（一般式（１）〜（３）であって、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てが水素原子である化合物）の水酸基と、カフェ酸、フェルラ酸、又はｐ−クマル酸のカルボキシル基とを、脱水縮合させることによって合成することができる。脱水縮合反応は、常法により行うことができる。
【００２６】
また、一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、１−カフェオイルキナ酸（CAS ID：1241-87-8）、クロロゲン酸（３−カフェオイルキナ酸）（CAS ID：327-97-9）、シクロヘキサンカルボン酸（CAS ID：327161-03-5）、クリプトクロロゲン酸（CAS ID：905-99-7）、ネオクロロゲン酸（CAS ID：906-33-2）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：19870-46-3）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：14534-61-3）、４，５−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：57378-72-0）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：30964-13-7）、３，５−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：2450-53-5）、３−フェルロイルキナ酸（CAS ID：1899-29-2）、４−フェルロイルキナ酸（CAS ID：2613-86-7）、５−フェルロイルキナ酸、４，５−ジフェルロイルキナ酸、３，５−ジフェルロイルキナ酸、３，４−ジフェルロイルキナ酸、３，５−ジフェルロイルキナ酸、３−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：1899-30-5）、４−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：93451-44-6）、５−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：32451-86-8）、１−ｐ−クマロイルキナ酸、３−カフェオイル−４−フェルロイルキナ酸、３−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、４−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、１−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、３−フェルロイル−４−カフェオイルキナ酸、３−フェルロイル−５−カフェオイルキナ酸、４−フェルロイル−５−カフェオイルキナ酸等のクロロゲン酸を加熱処理し、シクロヘキサン環に結合したカルボキシル基と水酸基の脱水反応により合成することができる。クロロゲン酸の加熱処理によるラクトン化は、常法により行うことができる。
【００２７】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを、１種類のみ含有していてもよく、２種類以上を組み合わせて含有していてもよい。例えば、本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、有効成分として、表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンのみを含有するものであってもよく、表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンと表１の組み合わせ１の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンと表１の組み合わせ４の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンを含有するものであってもよい。
【００２８】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、有効成分である一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンのみからなるものであってもよく、他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分としては、一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンによるｍＲＮＡ成熟阻害作用を損なわないものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、流動性改良剤（固結防止剤）、安定剤、保存剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤、矯味剤、甘味料、酸味料、香料、着色料等として用いられている各種物質を、所望の製品品質に応じて適宜含有させてもよい。
【００２９】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤の剤型は、特に限定されるものではなく、各種の剤型を適用できる。当該剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、スプレー剤、注射剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。服用が容易であることから、本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口投与に適したものが好ましい。
【００３０】
本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤の有効成分であるクロロゲン酸ラクトンは、焙煎コーヒー豆に比較的多く含まれている物質であり、比較的安全に服用できる。そこで、これらは、飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の原料として好適であり、特に腫瘍の治療又は再発予防に用いられる医薬品やサプリメントの有効成分として有用である。例えば、本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤を配合させたサプリメントを継続的に摂取することにより、細胞増殖が抑制され、細胞の過増殖によって引き起こされる各種疾患（例えば、腫瘍など）の発症や再発リスクを低減できることが期待できる。
【００３１】
その他、本発明に係るｍＲＮＡ成熟阻害剤は、細胞のタンパク質発現のメカニズム解明のためのツールとしても好適である。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
クロロゲン酸、前記一般式（１）で表され、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、Ｒ１がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン（３−ＣＱＬ：表１の組み合せ１）、前記一般式（１）で表され、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるジカフェオイルキナ酸ラクトン（３，４−ｄｉＣＱＬ：表１の組み合せ１０）、カフェ酸、及びキナ酸について、ｍＲＮＡ成熟阻害活性を調べた。ポジティブコントロールとして、ｍＲＮＡスプライシングに対する阻害活性を有するＧＥＸ１Ａを用いた。
【００３４】
ｍＲＮＡ成熟阻害活性は、非特許文献２に記載されているＲＮＡ−ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を利用した方法に準じて行った。ＲＮＡ−ＦＩＳＨには、ヒト骨肉腫細胞から樹立された培養細胞株Ｕ２ＯＳ細胞を用いた。Ｕ２ＯＳ細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で、３７℃、５％二酸化炭素環境下で培養した。
【００３５】
具体的には、まず、５×１０４／ｍＬとなるように細胞を１２ウェルプレートのカバーグラス上に接種し、２４時間培養した。次いで、各ウェルに、ＧＥＸ１Ａ溶液（ＧＥＸ１Ａを３０ｎｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液）、クロロゲン酸溶液（クロロゲン酸を１５０μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液）、カフェ酸溶液（カフェ酸を１５０μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液）、３−ＣＱＬ溶液（３−ＣＱＬを１００μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液）、又は３，４−ｄｉＣＱＬ溶液（３，４−ｄｉＣＱＬを１００μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液）を添加し、さらに２４時間培養した。各ウェルに添加されるＤＭＳＯ量は等しくなるように調整し、ネガティブコントロールとして等量のＤＭＳＯを添加したウェルも、同様に２４時間培養した。
【００３６】
培養後、カバーグラス上の培養細胞を１０％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（リン酸生理食塩水）にて２０分間固定処理した後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて１０分間透過処理（透過性付与処理）を行った。続いて、当該細胞を、ＰＢＳにて１回当たり１０分間インキュベートする洗浄処理を３回行い、次いで２×ＳＣＣバッファー（２×クエン酸ナトリウム標準）にて５分間洗浄処理した。
【００３７】
洗浄後の細胞に対して、ＲＮＡ−ＦＩＳＨを行った。すなわち、加湿チャンバー内にて、細胞をoligo hybridization buffer (Ambion社製)により４２℃、１時間予備ハイブリダイズした後、２０ｐＭのＣｙ３ラベルされたオリゴｄＴ４５プローブを含むoligo hybridization buffer (Ambion社製)により４２℃、２４時間ハイブリダイズした。その後、２×ＳＣＣバッファーにて４２℃、２０分間洗浄した後、０．５×ＳＣＣバッファーにて１回、０．１×ＳＣＣバッファーにて１回、順次洗浄した。
【００３８】
さらに、洗浄後の細胞の核を、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色して可視化した後、核内と細胞全体のＣｙ３蛍光強度を画像解析ソフトウェアImageＪ（imagej.nih.gov/ij/）を用いて測定し、細胞当たりのポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比（［核内のＣｙ３蛍光量］／［細胞全体のＣｙ３蛍光量］）を求めた。結果を図１〜５に示す。
【００３９】
t検定を行ったところ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比は、ネガティブコントロールであるＤＭＳＯを添加した細胞に比べて、クロロゲン酸、カフェ酸、３−ＣＱＬ、及び３，４−ｄｉＣＱＬを添加した細胞では有意差が見られ、核内のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ量が有意に多くなっていた。なお、３，４−ｄｉＣＱＬを５０μＭ又は２００μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液を添加した細胞におけるｍＲＮＡの核内蓄積量は、３，４−ｄｉＣＱＬを１００μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた溶液を添加した細胞（図５）と同程度であった（図示せず。）。つまり、クロロゲン酸、カフェ酸、３−ＣＱＬ、及び３，４−ｄｉＣＱＬは、ｍＲＮＡ成熟阻害活性を有していた。一方で、キナ酸を添加した細胞では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの核内の局在比はＤＭＳＯを添加した細胞と同程度であり、キナ酸にはｍＲＮＡ成熟阻害活性がなかった。
【００４０】
クロロゲン酸はカフェ酸のカルボキシル基がキナ酸の３位のヒドロキシ基と脱水縮合した構造をもつ化合物であり、３−ＣＱＬはクロロゲン酸のキナ酸残基の一部に環状構造ができた形をした化合物であり、３，４−ｄｉＣＱＬは３−ＣＱＬにカフェオイル基が導入された化合物である。このため、これらの３種の化合物に共通しているカフェ酸の構造が、ｍＲＮＡ成熟阻害活性に関係しているものと考えられた。クロロゲン酸ラクトンに強いｍＲＮＡ成熟阻害活性があったのに対して、クロロゲン酸やカフェ酸では当該活性が低かったことから、より高いｍＲＮＡ成熟阻害活性を達成するためには、ラクトン構造が重要であることが分かった。クロロゲン酸ラクトンが、クロロゲン酸よりもｍＲＮＡ成熟阻害活性が高かったのは、ラクトン構造により、培地中から細胞の核内へより効率よく移行したためと推察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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