(57)【要約】【課題】移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制することができるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供する。【解決手段】多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が４μｍ以下であり、円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いることを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、
前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が４μｍ以下であり、
円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、
高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いることを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項２】
前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）であることを特徴とする請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項３】
前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項４】
前記移動相は、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィーによる分析方法は、古くより食品、医薬、化学工業、環境等の分野において広く用いられている。高速液体クロマトグラフィーにおける分離モードは、分子量２０００以下の低分子試料の分離や、定量に用いられる逆相クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等と、分子量２０００を超える高分子試料の分離や分子量測定に用いられるサイズ排除クロマトグラフィーとに大別することができる。
【０００３】
低分子試料の分析方法である逆相クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等においては、ＯＤＳ（Ｏｃｔａ  Ｄｅｃｙｌ  Ｓｉｌｙｌ）カラムと呼ばれるものに代表されるシリカゲル系カラム、または、メタクリレート系架橋重合体粒子やポリビニルアルコール系架橋重合体粒子等が充填されたポリマー系カラムが用いられる。低分子試料の分析方法では、充填剤表面の官能基（例えば、オクタデシルシリル基やアミノ基等）と低分子試料との疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン的相互作用等に基づいて、試料が分離、溶出される。また、低分子試料の分析方法では、移動相に用いるアセトニトリルやメタノール等の有機溶媒の抑制を目的として体積平均粒子径が５μｍ以下の充填剤が充填され、ハウジングがダウンサイズ化された市販のカラム（例えば、Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＤＰ２  ＨＰ−２Ｄ（商品名、内径：２．０ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）、昭和電工株式会社製）を用いることもできる。
【０００４】
一方、高分子試料の分析方法であるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、古くより工業用ポリマー素材、高分子添加剤、生体高分子等の高分子試料の分析に用いられている。サイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、多孔性充填剤が充填されたカラムが用いられている。サイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、分子量の異なる高分子試料は、多孔性充填剤の細孔内への通過度合いが異なることに基づいて、試料が分離、溶出される。多孔性充填剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、ポリビニルアルコール系架橋重合体粒子、シリカゲル等が広く用いられている。
【０００５】
サイズ排除クロマトグラフィー分析方法の中でも、移動相として、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン等の有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）においては、内径４．６ｍｍ〜８．０ｍｍ、かつ長さ１５０ｍｍ〜３００ｍｍのハウジングと、ハウジングに充填された体積平均粒子径が５μｍ以上の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填剤と、を備えたカラムを用いる方法が広く知られている（例えば、非特許文献１参照）。多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィー用カラムとしては、市販のカラム（例えば、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＦ−４００シリーズ（商品名、内径：８．０ｍｍ、長さ：３００ｍｍ）、昭和電工株式会社製）を用いることもできる。
【０００６】
多孔性充填剤の細孔内への高分子試料の通過に基づくサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、充填剤の体積平均粒子径が大きく、粒度分布も広いことにより、カラム内において、高分子試料の多流路拡散が大きくなる。そのため、ハウジングをダウンサイズ化すると、高分子試料の分離や定量性の低下が著しくなる。従って、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、ハウジングのダウンサイズ化は難しい。そこで、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、高分子試料の分離測定能を高めるためや、広い分子量領域における測定を可能とするために、カラムを２本以上連結して用いることも多かった。
【０００７】
しかしながら、カラムを２本以上連結して用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、カラムの溶出容量が非常に大きくなるため（例えば、８．０ｍｍ（内径）×３００ｍｍ（長さ）カラムの１本あたりの溶出容量は１５．０ｍＬ）、カラムの平衡化や測定にも時間を要することから、移動相の消費量が多くなる。高分子試料の高感度分析において、移動相として用いられるテトラヒドロフラン等の有機溶媒は、液体クロマトグラフィー用に高純度化された高価な試薬を用いる必要がある。そのため、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、必ずしも経済的ではない。また、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法において、社会問題化している地球環境問題の観点からも、有機溶媒の省量化が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃ．Ｓ．Ｗｕ，Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ,１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制することができるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、体積平均粒子径が４μｍ以下の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填され、円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いることにより、移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
［１］多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が４μｍ以下であり、円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いることを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１２】
［２］前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）である［１］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１３】
［３］前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下である［１］または［２］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１４】
［４］前記移動相は、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種である［１］〜［３］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制することができるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例３におけるポリスチレン較正曲線を示す図である。
【図２】比較例４におけるポリスチレン較正曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１８】
［サイズ排除クロマトグラフィー分析方法］
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が４μｍ以下であり、円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いる。
【００１９】
ここで、本明細書において架橋重合体粒子の体積平均粒子径とは、２０００個以上の架橋重合体粒子を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径の球体とみなす。
前記粒度分布測定装置としては、例えば、フロー式粒子像分析装置（商品名：ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を使用することができる。
また、本明細書において均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）とは、上記と同様の方法で各粒子の体積を算出し、全架橋重合体粒子のうち、体積の小さい方から並べて、２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（２５％）に対する７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（７５％）の比をいう。すなわち、（その粒子径以下の存在比率が７５体積％となる粒子径）／（その粒子径以下の存在比率が２５体積％となる粒子径）である。
【００２０】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、例えば、移動相として有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）分析方法である。
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、例えば、円筒形状をなすカラムのハウジングと、そのハウジングの内部に充填された、体積平均粒子径の粒度分布が制御された多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填剤とを備える分析カラムが用いられる。
ハウジングの材質は、特に限定されない。ハウジングとしては、十分なカラム性能を得るために高耐圧性および低デッドボリューム構造（分離に関係ない空間が小さい構造）であり、超高速液体クロマトグラフィー用に設計されたステンレス管を用いることが好ましい。
【００２１】
ステンレス管としては、その内面が高分子化合物で被覆されたものを用いることもできる。
ハウジングが耐え得る圧力（内圧）は、４０ＭＰａ以上であることが好ましく、６０ＭＰａ以上であることがより好ましく、７５ＭＰａ以上であることがさらに好ましい。
ハウジングが耐え得る圧力が４０ＭＰａ以上であれば、カラム内に、後述する流速で、有機溶媒のみを流すか、または、有機溶媒と高分子試料を同時に流しても、ハウジングが破損する可能性が低い。
【００２２】
ハウジングの大きさは、特に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法において移動相の消費量の抑制効果を十分に得るためには、円筒型分析カラムのハウジングの内径は２．０ｍｍ以下であり、０．５ｍｍ〜２．０ｍｍであることが好ましく、１．０ｍｍ〜２．０ｍｍであることがより好ましい。
ハウジングの内径が０．５ｍｍ以上であれば、ハウジング内に、容易に多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を充填することができる。一方、ハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であれば、カラムの溶出容量が大きくなり過ぎることがないため、移動相の消費量の抑制効果が十分に得られる。
【００２３】
また、同様の理由により、ハウジングの長さは２５０ｍｍ以下であることが好ましく、５０ｍｍ〜２５０ｍｍであることがより好ましい。
ハウジングの長さが５０ｍｍ以上であれば、カラム内において、分析対象の高分子試料の溶出時間（保持時間）を十分に確保することができるため、高分子試料に含まれる複数の成分（分子量の異なる高分子化合物）を分離することができる。一方、ハウジングの長さが２５０ｍｍ以下であれば、高分子試料の溶出時間が長くなり過ぎることを防止でき、カラム圧力（カラムの内圧）が大きくなることも防止できる。
【００２４】
本発明におけるカラム性能としては、例えば、高分子試料に含まれる成分の溶出容量（ｍＬ）、理論段数（半値幅法、Ｎ）、耐流速性等が挙げられる。
溶出容量は、高分子試料の溶出時間（ｍｉｎ）×流量（ｍＬ／ｍｉｎ）から算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
理論段数は、５．５４×（ピークの溶出時間／ピーク高さの５０％におけるピーク幅）２の計算式から算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
耐流速性は、例えば、高流速で測定を続けた場合にカラム圧力や溶出容量、理論段数等の初期値からの変化率（％）として表すことができる。理論段数は、４０００以上であることが好ましく、５０００以上であることがより好ましい。
【００２５】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、一般的にサイズ排除クロマトグラフィー分析方法に用いられるものであれば、特に限定されない。本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、各種溶媒に対して化学的および物理的に安定で、分解・変質を起こさず、圧力に対して機械的強度の安定性も有することに加えて、円筒型分析カラムのハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、十分なカラム性能および高い耐流速性を有する必要がある。
【００２６】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径は、４．０μｍ以下であり、１．０μｍ〜４．０μｍであることが好ましい。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が１．０μｍ以上であれば、カラム圧力が大きく上昇することを防止できるため、測定可能なカラム流速が制限されることがない。一方、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が４．０μｍ以下であれば、ハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、十分なカラム性能（溶出容量、理論段数、耐流速性等）が得られる。
【００２７】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）であることが好ましく、１．１０以下であることがより好ましい。
均一係数が１．１５以下であれば、円筒型分析カラムのハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、十分なカラム性能（溶出容量、理論段数、耐流速性等）が得られる。
なお、均一係数は、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径の均一性を表わす指標であり、１に近いほど体積平均粒子径の均一性が高いことを表わす。ハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、十分なカラム性能（溶出容量、理論段数、耐流速性等）を得るためには、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が均一であることが好ましい。
【００２８】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、６０ｎｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ〜６０ｎｍであることがより好ましく、５ｎｍ〜５０ｎｍであることがさらに好ましい。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が１ｎｍ以上であれば、高分子試料に含まれる成分（高分子化合物）には、その分子量に応じて、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子とのサイズ排除効果が作用し、分離することができる。一方、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下であれば、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の物理的強度が低下することがないため、円筒型分析カラムのハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、十分なカラム性能（溶出容量、理論段数、耐流速性等）が得られる。
【００２９】
尚、本明細書において平均細孔径とは、窒素吸着測定を行い、窒素吸着等温線からＢＪＨ法により求めたものをいう。より具体的には、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子０．２ｇを窒素吸着させて測定を行い、体積平均で算出したものである。
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、例えば、高機能比表面積／細孔分布測定装置（型式名：ＡＳＡＰ ２０２０、マイクロメリティックス社製）を用いてガス吸着法により測定を行い算出された数値である。
【００３０】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、測定対象の高分子試料に含まれる高分子化合物の分子量範囲に応じて、上記の均一係数、体積平均粒子径および平均細孔径が同一の１種を単独で用いてもよく、上記の均一係数、体積平均粒子径および平均細孔径のうち少なくとも１つが互いに異なる２種以上を混合して用いてもよい。
【００３１】
本発明における分析カラムは、分析の対象である高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下であり、０．２ｍＬ〜０．５ｍＬであることが好ましい。
分析カラムの高分子試料を含む移動相の最大溶出容量がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下であれば、移動相の消費量を十分に抑制することができる。
【００３２】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積である最大溶出容量により、高分子試料の分子量を測定することができる。そのため、分析カラムの最大溶出容量が小さいほど、移動相の消費量を抑制することができる。なお、分析カラムの最大溶出容量は、ハウジングの内径やカラム容量によって制御することができる。
【００３３】
本発明において、サイズ排除クロマトグラフィー用カラムとして十分な性能を得るためには、理論段数が４０００段以上であることが好ましく、５０００段以上であることがより好ましい。
【００３４】
本発明において、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法にて移動相として用いることができる有機溶媒は、特に限定されないが、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、例えば、次のようにして、上記の有機溶媒が用いられる。
まず、上記の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、そのカラム内に、移動相として、上記の有機溶媒を通液して、分析カラムを平衡化する。
【００３６】
次に、平衡化に用いた有機溶媒を移動相として、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法により、分析の対象となる成分を含む高分子試料を分析する。すなわち、高分子試料に含まれる高分子化合物を分離する。
【００３７】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、分析時のカラム流速は、すなわち、高分子試料の分析時において、カラム内を流れる高分子試料を含む移動相の線流速は、特に限定されない。内径が２．０ｍｍ以下のハウジングにおいて十分なカラム性能を得るためには、カラム流速は、１．５ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍ、長さが１５０ｍｍの場合、流量０．０５ｍＬ／ｍｉｎに相当）以上であることが好ましく、１．５ｃｍ／ｍｉｎ〜１８．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍ、長さが１５０ｍｍの場合、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ〜０．６０ｍＬ／ｍｉｎに相当）であることがより好ましい。
カラム流速が１．５ｃｍ／ｍｉｎ以上であれば、ハウジングの内径を２．０ｍｍ以下とした場合においても、高分子試料に含まれる高分子化合物を、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子に吸着させて、高分子化合物を十分に分離することができる。一方、カラム流速が１８．０ｃｍ／ｍｉｎ以下であれば、高分子試料に含まれる高分子化合物を、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子に吸着させて、高分子試料を十分に分離することができ、また、高分子化合物の分子鎖を切断することなく、正確に分子量を測定することができる。
【００３８】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、分析の対象である高分子試料となる高分子化合物、すなわち、分析可能な高分子化合物の分子量（重量平均分子量）は、特に限定されない。本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、ポリスチレン換算において分子量が１００以上３００万以下、好ましくは３００以上２００万以下の高分子化合物を分析することができる。分析の対象となる高分子化合物の分子量が３００万以下であれば、高流速測定を行った際に、高分子化合物の分子鎖を切断することなく、正確に分子量を測定することができる。
【００３９】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法によれば、体積平均粒子径が４μｍ以下の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填され、円筒型分析カラムのハウジングの内径が２．０ｍｍ以下であり、高分子試料を含む移動相の最大溶出容量（高分子試料の保持時間の最大値と移動相の流量の積）がカラム１本あたり０．８ｍＬ以下である分析カラムを用いることにより、移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制できる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
以下の実施例および比較例において、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径および均一係数は、フロー式粒子像分析装置（型式名：ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を用いて静止画像として撮像された粒子（測定粒子数５０００個〜１００００個）により、二次元的に直径を測定して算出された数値である。また、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、高機能比表面積／細孔分布測定装置（型式名：ＡＳＡＰ ２０２０、マイクロメリティックス社製）を用いて、ガス吸着法により測定し、算出された数値である。
【００４２】
［実施例１］
（カラムの作製）
充填剤として、均一係数が１．０５、体積平均粒子径が３．４μｍ、平均細孔径が５０ｎｍの多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を、トルエンとメタノールを質量比で８０：２０の割合で混合した混合溶媒に加えた後、超音波バスにて分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。
得られた充填剤スラリーを用いて、円筒形状であり、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、カラム容積：０．４７ｍＬの超高速液体クロマトグラフィー用ハウジング（株式会社杉山商事製）に、上記の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を充填した。
すなわち、ハウジング内に、上記の充填剤スラリーを注入し、ハウジングの入口側から出口側に向かって、上記のトルエンとメタノールの混合溶媒を通液することにより、充填剤スラリーを３０ＭＰａ（定圧）にて３０分加圧し、ハウジング内に多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填層を形成し、実施例１の液体クロマトグラフィー用の分析カラムを得た。
【００４３】
（カラムの評価）
高速液体クロマトグラフ分析装置として高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用い、検出器として紫外検出器（波長：２５４ｎｍ）を用いて、実施例１の分析カラムを評価した。
分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを、１．９０ｃｍ／ｍｉｎ（０．０６ｍＬ／ｍｉｎ）で１６．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（０．９６ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、テトラヒドロフランの線流速を維持したまま、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル（テトラヒドロフランに溶解）１μＬを分離分析した（分析時間：７．００分）。
ここで、分析時間は、フタル酸ジシクロヘキシルを含有した分析試料をカラム内に注入してから、フタル酸ジシクロヘキシルのピークが現われてフタル酸ジシクロヘキシルの溶出が完了し、データ採取を終了するまでに費やした時間である。
重量平均分子量が極めて小さいために長い保持時間を示す高分子試料を想定して、フタル酸ジシクロヘキシル（重量平均分子量：３３０）を選択し、これを本実施例での分析対象とした。
フタル酸ジシクロへキシルの保持時間、溶出容量、理論段数および移動相の通液量を表１に示す。ここで、通液量とは、平衡化の間に通液した量と分離分析で通液した量とを加算した量である。
【００４４】
［実施例２］
（カラムの評価）
実施例１と同じ分析カラム、高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、分析カラムを評価した。
分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを、６．３６ｃｍ／ｍｉｎ（０．２０ｍＬ／ｍｉｎ）で５．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（１．００ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、テトラヒドロフランの線流速を維持したまま、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル（テトラヒドロフランに溶解）１μＬを分離分析した（分析時間：２．５０分）。
フタル酸ジシクロへキシルの保持時間、溶出容量、理論段数および移動相の通液量を表１に示す。
【００４５】
［比較例１］
（カラムの作製）
充填剤として、均一係数が１．３０、体積平均粒子径が６．１μｍ、平均細孔径が１５ｎｍの多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を用いた以外は実施例１と同様な方法で、比較例１の液体クロマトグラフィー用の分析カラムを得た。
【００４６】
（カラムの評価）
実施例１と同じ高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、比較例１の分析カラムを評価した。
分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを、１．９０ｃｍ／ｍｉｎ（０．０６ｍＬ／ｍｉｎ）で１６．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（０．９６ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、テトラヒドロフランの線流速を維持したまま、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル（テトラヒドロフランに溶解）１μＬを分離分析した（分析時間：７．００分）。
フタル酸ジシクロへキシルの保持時間、溶出容量、理論段数および移動相の通液量を表１に示す。
【００４７】
［比較例２］
（カラムの作製）
円筒形状であり、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ、カラム容積０．８３ｍＬの超高速液体クロマトグラフィー用ハウジング（株式会社杉山商事製）を用い、充填剤スラリーを１０ＭＰａ（定圧）にて３０分加圧した以外は実施例１と同様な方法で、比較例２の液体クロマトグラフィー用の分析カラムを得た。
【００４８】
（カラムの評価）
実施例１と同じ高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、比較例２の分析カラムを評価した。
分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを、１．８０ｃｍ／ｍｉｎ（０．３０ｍＬ／ｍｉｎ）で６．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（１．８ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、テトラヒドロフランの線流速を維持したまま、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル（テトラヒドロフランに溶解）１μＬを分離分析した（分析時間：２．５０分）。
フタル酸ジシクロへキシルの保持時間、溶出容量、理論段数および移動相の通液量を表１に示す。
【００４９】
［比較例３］
（カラムの作製）
円筒形状であり、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、カラム容積２．４９ｍＬの超高速液体クロマトグラフィー用ハウジング（株式会社杉山商事製）を用いた以外は実施例１と同様な方法で、比較例３の液体クロマトグラフィー用の分析カラムを得た。
【００５０】
（カラムの評価）
実施例１と同じ高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、比較例３の分析カラムを評価した。
分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを、１．８０ｃｍ／ｍｉｎ（０．３０ｍＬ／ｍｉｎ）で１７．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（５．０ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、テトラヒドロフランの線流速を維持したまま、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル（テトラヒドロフランに溶解）５μＬを分離分析した（分析時間：７．００分）。
フタル酸ジシクロへキシルの保持時間、溶出容量、理論段数および移動相の通液量を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2017211334.tif 000002
【００５２】
表１の結果から、ハウジングの内径が２．０ｍｍの分析カラムを用いた実施例１では、移動相の線流速が、ハウジングの内径が４．６ｍｍの分析カラムを用いた比較例２に近いが、移動相の通液量が、比較例２における移動相の通液量の５３．８％であり、移動相の通液量を大幅に抑制できることが分かった。また、分析カラムの理論段数も良好な結果が得られた。
実施例２では、フタル酸ジシクロへキシルの保持時間が比較例２と同等になるように流速を上げているが、移動相の通液量が、比較例２における移動相の通液量の５７．７％であり、大幅に抑制できた。また、分析カラムの理論段数も良好な結果が得られた。
【００５３】
一方、体積平均粒子径および均一係数が大きい多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を用いた比較例１では、移動相の通液量が実施例１と同じであるが、分析カラムの理論段数が低いため、  サイズ排除クロマトグラフィー用カラムとしては十分なカラム性能が得られなかった。
また、比較例２では、カラム長さを短くすることで分析時間の短縮を図ったため、移動相の通液量を、比較例３における移動相の通液量の３６．１％まで抑制することができた。しかし、比較例２では、実施例１および実施例２と比較して、分析カラムの理論段数が低いため、サイズ排除クロマトグラフィー用カラムとしては十分なカラム性能が得られなかった。
【００５４】
［実施例３］
（高分子試料の分離比較）
実施例１の分析カラムを用いて、ポリスチレン標準試料による較正曲線を作成した。
実施例１と同じ高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを１．８０ｃｍ／ｍｉｎ（０．０６ｍＬ／ｍｉｎ）で１７．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（１．８ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、重量平均分子量が５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万のポリスチレン標準試料を順番に分析し、較正曲線を作成した。
実施例３におけるポリスチレン較正曲線を図１に示す。
全てのポリスチレン標準試料の分析に要した時間は４４分（合計６０分）であり、平衡化時間と合わせた移動相の通液量は３．６ｍＬであった。
【００５５】
［比較例４］
（高分子試料の分離比較）
比較例２の分析カラムを用いて、ポリスチレン標準試料による較正曲線を作成した。
実施例１と同じ高速液体クロマトグラフ分析装置および検出器を用いて、分析カラムの温度を４０℃として、分析カラム内に、移動相としてテトラヒドロフランを１．８０ｃｍ／ｍｉｎ（０．３０ｍＬ／ｍｉｎ）で１６．０分間かけてカラム容積の２．０倍量相当（５．０ｍＬ）通液して、分析カラムを平衡化した。
その後、重量平均分子量が５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万のポリスチレン標準試料を順番に分析し、較正曲線を作成した。
比較例４におけるポリスチレン較正曲線を図２に示す。
全てのポリスチレン標準試料の分析に要した時間は４３分（合計６０分）であり、平衡化時間と合わせた移動相の通液量は１８．０ｍＬであり、実施例３に比べて５倍量使用しなければならなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填された分析カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析方法において、移動相として用いる有機溶媒の消費量を抑制できることから、特に有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）において工業用ポリマー素材、高分子添加剤等の高分子試料を少量の移動相にて分析する場合に有用である。
【図１】
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【図２】
2017211334.tif 000004