(57)【要約】【課題】飲食品に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤、及び当該阻害剤を含有する組成物の製造方法の提供。【解決手段】焙煎コーヒー豆の熱水抽出物と脂溶性有機溶媒を混合した後、脂溶性有機溶媒層のみを、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物として回収する脂溶性有機溶媒層回収工程を有することを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法、及び、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から、脂溶性有機溶媒により抽出された脂溶性有機溶媒抽出物を有効成分とすることを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物と脂溶性有機溶媒を混合した後、脂溶性有機溶媒層のみを、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物として回収する脂溶性有機溶媒層回収工程を有することを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法。
【請求項２】
前記脂溶性有機溶媒が、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、又はこれらのいずれかを含む混合溶媒である、請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法。
【請求項３】
前記脂溶性有機溶媒層回収工程の後、回収された脂溶性有機溶媒層から、ピロガロールを含む画分を回収する分画工程を有する、請求項１又は２に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法。
【請求項４】
前記分画工程の後、前記ピロガロールを含む画分をｐＨ６．５〜８．０に調整するアルカリ処理工程を有する、請求項３に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法。
【請求項５】
前記アルカリ処理工程の後、ｐＨ６．５〜８．０に調整した前記画分を、ｐＨ４．５〜５．５に調整する酸処理工程を有する、請求項４に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法。
【請求項６】
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から、脂溶性有機溶媒により抽出された脂溶性有機溶媒抽出物を有効成分とすることを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項７】
フェルオイルキナ酸ラクトン類を有効成分とすることを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項８】
クマロイルキナ酸ラクトン類を有効成分とすることを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする、医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤、及び当該阻害剤を含有する組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病の一つとして知られている痛風は、プリン体の代謝異常による高尿酸血症を原因として、足の親指等の関節に激しい痛みを伴う疾患である。このような痛みは、液中で増加した尿酸が結晶化し、関節に沈着するために起こる。近年、食生活が急速に変化し、高カロリー、高タンパク、高脂肪の食事を摂る人が増加している。この食生活の変化に伴って痛風の患者も年々増加しており、痛風及び高尿酸血症の予防及び治療に関する関心が高まっている。
【０００３】
痛風は、血液中の尿酸の増加によっておこる病気であり、血液中の尿酸を正常値内にコントロールすることが、痛風や高尿酸血症等の病気に対する予防及び治療の基本である。キサンチンオキシダーゼは、生体内尿酸合成において重要な役割をはたしている酵素であり、このキサンチンオキシダーゼを阻害する薬剤は、痛風や高尿酸血症等の予防薬及び治療薬として有用である。
【０００４】
しかしながら、血中尿酸値調整用薬剤として従来から使用されている尿酸合成抑制剤「アロプリノール」等は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が一過性であること、副作用を伴うこと等の問題点がある。そこで、副作用のないあるいは少ない天然物由来であり、かつ日常摂取している飲食品由来の尿酸値低減剤が求められている。例えば、特許文献１には、ウイスキー又はその製造に用いられるブナ科コナラ植物から抽出された成分を有効成分とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤が開示されており、特許文献２には、大麦の発酵物由来の成分を有効成分とする血清尿酸値低減剤が記載されている。また、特許文献３には、アスコフィラム抽出物及びタマリンド抽出物が、血清中尿酸値低減に有効であることが記載されており、特許文献４には、バラ抽出物を有効成分とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤が開示されている。さらに、非特許文献１には、焙煎したコーヒー豆の熱水抽出物中に含まれているクロロゲン酸ラクトンにキサンチンオキシダーゼ阻害活性があることが報告されている。その他、非特許文献２には、ピロガロールに弱いキサンチンオキシダーゼ阻害活性があることが、非特許文献３には、プルプロガリンにキサンチンオキシダーゼ阻害活性があることが、それぞれ報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４９８８１６６号公報
【特許文献２】特許第５０４４６４３号公報
【特許文献３】特許第５４３７６７２号公報
【特許文献４】特許第５４９８０６７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Honda, et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2014, vol.78(12), p.2110-2116.
【非特許文献２】Gray and Felsher, Experimental Biology and Medicine, 1945, vol.59(2), p.287-289.
【非特許文献３】Sheu, et al.，Anticancer Research，1998，vol.18，p.263-268.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１〜４に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性成分は、原料となる天然物からの精製や単離が困難である。一方で、非特許文献１には、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物中に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性がある物質として、クロロゲン酸ラクトン以外については記載がない。また、クロロゲン酸ラクトンの焙煎コーヒー豆の熱水抽出物からの抽出・精製の効率も充分ではない。また、非特許文献２にはプルプロガリンについては記載されておらず、非特許文献３にはピロガロールについては記載されていない。
【０００８】
本発明は、世界で最も利用されている嗜好飲料であるコーヒーの焙煎豆に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤、コーヒーの焙煎豆からキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を含有する画分を、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物として回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、焙煎コーヒー豆に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する物質は、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から脂溶性有機溶媒で抽出することにより効率よく回収できること、回収された脂溶性有機溶媒抽出物中に含まれているフェルオイルキナ酸ラクトン類及びクマロイルキナ酸ラクトン類は、強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有すること、回収された脂溶性有機溶媒抽出物中にピロガロールが含まれていること、及び、ピロガロールとそのアルカリ処理物も強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
［１］  本発明の第一の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法は、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物と脂溶性有機溶媒を混合した後、脂溶性有機溶媒層のみを、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物として回収する脂溶性有機溶媒層回収工程を有することを特徴とする。
［２］  前記［１］のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法としては、前記脂溶性有機溶媒が、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、又はこれらのいずれかを含む混合溶媒であることが好ましい。
［３］  前記［１］又は［２］のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法としては、前記脂溶性有機溶媒層回収工程の後、回収された脂溶性有機溶媒層から、ピロガロールを含む画分を回収する分画工程を有することが好ましい。
［４］  前記［３］のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法としては、前記分画工程の後、前記ピロガロールを含む画分をｐＨ６．５〜８．０に調整するアルカリ処理工程を有することも好ましい。
［５］  前記［４］のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法としては、前記アルカリ処理工程の後、ｐＨ７〜８に調整した前記画分を、ｐＨ４．５〜５．５に調整する酸処理工程を有することも好ましい。
［６］  本発明の第二の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から、脂溶性有機溶媒により抽出された抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
［７］  本発明の第三の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、フェルオイルキナ酸ラクトン類を有効成分とすることを特徴とする。
［８］  本発明の第四の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、クマロイルキナ酸ラクトン類を有効成分とすることを特徴とする。
［９］  本発明の第五の態様に係る医薬品は、前記［６］〜［８］のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法により、焙煎コーヒー豆に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する物質を効率よく抽出し、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が非常に高い組成物を製造することができる。また、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が高いことに加えて、焙煎コーヒー豆由来であり、比較的安全に投与可能であり、痛風及び高尿酸血症の予防及び治療のための医薬品の有効成分として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例３における、浅煎り豆の熱水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物の分取ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図２】実施例３における、深煎り豆の熱水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物の分取ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３】実施例３における、深煎り豆の分取ＨＰＬＣ画分２のクロマトグラムである。
【図４】実施例３における、深煎り豆の分取ＨＰＬＣ画分３のクロマトグラムである。
【図５】実施例４における、酢酸エチル可溶性画分をＭＰＬＣで分画した各画分のキサンチンオキシダーゼ阻害率（％）の測定結果を示した図である。
【図６】実施例４における、前記酢酸エチル可溶性画分からＭＰＬＣで分画して得られたＦｒ．２の分取ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図７】実施例５における、ピロガロールを各ｐＨ条件でインキュベートした溶液中のピロガロールとプルプロガリンの含有量の経時的変化を示した図である。
【図８】実施例５における、プルプロガリンをｐＨ７．４でインキュベートした溶液中のプルプロガリンの含有量の経時的変化を示した図である。
【図９】実施例６における、ピロガロールをｐＨ７．４でインキュベートした溶液の、ピロガロールとプルプロガリンの含有量及びキサンチンオキシダーゼ阻害率（％）の経時的変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、焙煎コーヒー豆に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を有効成分とする。焙煎コーヒー豆に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物としては、非特許文献１に開示されているクロロゲン酸ラクトン類に加えて、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロール（１，２，３−Ｂｅｎｚｅｎｅｔｒｉｏｌ）が挙げられる。また、プルプロガリン（２，３，４，６−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｈ−ｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｈｅｐｔｅｎ−５−ｏｎｅ）のようなピロガロールをアルカリ処理して得られた化合物も、強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有しており、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分となり得る。
【００１４】
なお、本願明細書における「クロロゲン酸ラクトン類」とは、ネオクロロゲン酸ラクトン、クリプトクロロゲン酸ラクトンを指す。すなわち、「クロロゲン酸ラクトン類」は、３−カフェオイルキナ酸ラクトン、４−カフェオイルキナ酸ラクトンの総称である。
【００１５】
フェルオイルキナ酸ラクトン類は、フェルラ酸のカルボキシル基とキナ酸ラクトンの水酸基が脱水縮合している構造を有する分子式Ｃ１７Ｈ１８Ｏ８の化合物であり、例えば、下記式（１−１）〜（１−５）で表される化合物が挙げられる。クマロイルキナ酸ラクトン類は、ｐ−クマル酸のカルボキシル基とキナ酸ラクトンの水酸基が脱水縮合している構造を有する分子式Ｃ１７Ｈ１８Ｏ８の化合物であり、例えば、下記式（２−１）〜（２−５）で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
【化１】
2017048185.tif 000002
【００１７】
【化２】
2017048185.tif 000003
【００１８】
フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロールは、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から脂溶性有機溶媒抽出により、抽出して回収することができる。すなわち、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物の製造方法（以下、「本発明に係る組成物の製造方法」ということがある。）は、焙煎コーヒー豆から、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロールを含むキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を抽出して、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する組成物（以下、「キサンチンオキシダーゼ阻害組成物」ということがある。）を得る方法である。具体的には、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物と脂溶性有機溶媒を混合した後、脂溶性有機溶媒層のみを、キサンチンオキシダーゼ阻害組成物として回収する脂溶性有機溶媒層回収工程を有する。
【００１９】
原料として用いる焙煎コーヒー豆としては、焙煎されていればよく、コーヒー豆の種類や産地は特に限定されず、アラビカ種であってもよく、ロバスタ種であってもよく、リベリカ種であってもよく、これらをブレンドしたものであってもよい。また、焙煎方法も特に限定されるものではなく、直火焙煎法、熱風焙煎法、遠赤外線焙煎法、炭火式焙煎法、マイクロ波焙煎法等の一般的にコーヒー豆の焙煎に使用されるいずれの方法で行ったものであってもよい。
【００２０】
焙煎されているコーヒー豆には、焙煎度にかかわらず、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、クロロゲン酸ラクトン類、及びピロガロール等のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物が含まれている。このため、原料として用いる焙煎コーヒー豆の焙煎度は、特に限定されるものではなく、極浅煎りであってもよく、浅煎りであってもよく、中煎りであってもよく、深煎りであってもよい。ピロガロール、フェルオイルキナ酸ラクトン類及びクマロイルキナ酸ラクトン類の含有割合が多くなり、かつクロロゲン酸ラクトン類とは別の未知活性成分（クロロゲン酸ラクトン類よりも高極性画分に含まれる活性成分）の含有量も多くなることから、原料として用いる焙煎コーヒー豆の焙煎度は高い方が好ましく、中煎り又は深煎りの焙煎コーヒー豆がより好ましく、深煎りの焙煎コーヒー豆が特に好ましい。
【００２１】
なお、コーヒー豆の焙煎度は、明度（Ｌ*値）で表すことができる。焙煎度が低いほうが明度が大きく、焙煎度が高くなるほど明度は小さくなる。例えば、粉砕豆を色差計にて分析した際の明度は、深煎りの焙煎豆でＬ値１８程度であり、中煎りの焙煎豆でＬ値２１程度であり、浅煎りの焙煎豆でＬ値２４程度である。
【００２２】
抽出効率が高くなるため、焙煎コーヒー豆は、熱水抽出される前に粉砕されていることが好ましい。焙煎コーヒー豆の粉砕は、ロールミル等の一般的な粉砕機を用いて行うことができる。粉砕度は特に限定されるものではなく、粗挽き、中粗挽き、中挽き、中細挽き、細挽きなどの種々の形状の焙煎コーヒー豆を用いることができる。
【００２３】
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物は、焙煎コーヒー豆の粉砕物に加熱した水を接触させて水溶性固形分を抽出させることにより得られる。抽出方法は、一般的にコーヒーを淹れる際に用いられる方法や、インスタントコーヒーを製造する際に、焙煎コーヒー豆の粉砕物から可溶性固形分を抽出する際に用いられる方法により行うことができる。具体的には、ドリップ式、エスプレッソ式、サイフォン式、パーコレーター式、コーヒープレス（フレンチプレス）式等のいずれを用いて行ってもよい。
【００２４】
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物と脂溶性有機溶媒を混合することにより、熱水抽出物中のフェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロール等のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物が脂溶性有機溶媒に抽出される。つまり、脂溶性有機溶媒層（脂溶性有機溶媒抽出物）を、本発明におけるキサンチンオキシダーゼ阻害組成物とすることができ、これを水層や不溶物から分離して回収する。脂溶性有機溶媒による抽出及び脂溶性有機溶媒層の回収は、一般的な有機溶媒による抽出方法や分液方法と同様にして行うことができる。
【００２５】
脂溶性有機溶媒としては、水と相分離可能であり、かつフェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロールなどの比較的極性の低い成分が溶解可能な有機溶媒であれば特に限定されるものではないが、回収された脂溶性有機溶媒抽出物から除去が容易であることから、揮発性の高い有機溶媒が好ましい。当該脂溶性有機溶媒としては、具体的には、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン（塩化メチレン）、ジエチルエーテル、又はこれらのいずれかを少なくとも含む混合溶媒が挙げられる。本発明に係る組成物の製造方法においては、フェルオイルキナ酸ラクトン類などの各種ケイヒ酸結合キナ酸ラクトン類やピロガロール等の抽出効率が高いことから、酢酸エチルが特に好ましい。
【００２６】
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物は、そのまま脂溶性有機溶媒による抽出に供されてもよく、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロールは回収されるが、これより分子量の大きい化合物を除去する処理を行った後に脂溶性有機溶媒による抽出に供されてもよい。焙煎コーヒー豆の熱水抽出物中には、キサンチンオキシダーゼ促進活性を有する高分子化合物が含まれているため、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から高分子量画分を予め除くことにより、よりキサンチンオキシダーゼ阻害活性の高い脂溶性有機溶媒抽出物が得られる。高分子量画分を除去する方法としては、例えば、分画分子量が１０００〜３０００の限外濾過膜を用い、限外濾過膜を通過した画分をフェルオイルキナ酸ラクトン類等を含む画分として回収する方法が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る組成物の製造方法が脂溶性有機溶媒層回収工程のみからなる場合、前記脂溶性有機溶媒抽出物が、当該製造方法により製造されるキサンチンオキシダーゼ阻害組成物である。こうして得られた脂溶性有機溶媒抽出物は、脂溶性有機溶媒を除去して濃縮することができる。また、当該組成物から脂溶性有機溶媒を完全に除去することにより、フェルオイルキナ酸ラクトン類等を含む固形状のキサンチンオキシダーゼ阻害組成物が得られる。脂溶性有機溶媒の除去は、エバポレーター等の一般的に有機溶媒を除去する際に用いられる方法を適宜利用することができる。
【００２８】
得られた脂溶性有機溶媒抽出物には、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、クロロゲン酸ラクトン類、及びピロガロール等が含まれる。そこで、本発明に係る組成物の製造方法は、脂溶性有機溶媒層回収工程の後に、さらに、この脂溶性有機溶媒抽出物からキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する特定の化合物を精製する工程を有していてもよい。すなわち、本発明に係る組成物の製造方法は、前記脂溶性有機溶媒層回収工程の後、回収された脂溶性有機溶媒層（脂溶性有機溶媒抽出物）から、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する特定の化合物を回収する分画工程を有していてもよい。分画工程において回収される化合物としては、ピロガロール、フェルオイルキナ酸ラクトン類、又はクマロイルキナ酸ラクトン類が好ましい。なお、当該分画工程における「特定の化合物の回収」は、回収する目的の化合物の回収後の組成物全体に占める割合（質量）が、回収前の脂溶性有機溶媒抽出物全体に占める割合（質量）よりも高くなればよく、当該化合物を完全に単離精製する方法に限定されるものではない。
【００２９】
分画工程において、ピロガロール、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類等を回収する方法としては、特に限定されるものではなく、一般的に複数の化合物を含む組成物から目的の化合物を精製する場合に使用される方法の中から適宜選択して使用することができる。当該方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィー法が挙げられる。目的の化合物を含む画分は、当該化合物の化学合成品（標品）の保持時間を指標として回収することができる。例えば、脂溶性有機溶媒抽出物から、ＯＤＳカラム（Ｃ１８カラム）等の逆相系カラムを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法や中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）法により、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、及びピロガロールをそれぞれ単離精製することができる。
【００３０】
ピロガロールの安定性は、ｐＨの影響を受ける。ピロガロールは、ｐＨ４．０〜５．５程度の酸性条件下では安定である。しかし、より高いｐＨ、例えばｐＨ６．０〜８．０では不安定であり、ピロガロール同士が反応してプルプロガリンに変換されることによって、ピロガロールは消失する。プルプロガリンも、高いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有し、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分とし得る。
【００３１】
例えば、前記分画工程において、ピロガロールを含む画分を回収した後、当該画分を、ｐＨ６．０〜８．０に調整するアルカリ処理工程を行うことにより、ピロガロールのアルカリ処理物を得ることができる。ピロガロールの他の化合物への変換反応は、ｐＨが高いほど反応速度が速い。このため、アルカリ処理工程においては、ピロガロールを含む画分をｐＨ６．５〜８．０に調整することが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０に調整することがより好ましい。アルカリ処理の時間は、ピロガロールがプルプロガリン等に変換されるのに十分な時間であればよく、ｐＨを考慮して適宜調整することができる。例えば、１０〜３００分間が好ましく、１０〜２００分間がより好ましく、１０〜１２０分間がさらに好ましく、１０〜９０分間がよりさらに好ましい。
【００３２】
プルプロガリンは、アルカリ条件下では安定性はあまり高くはなく、分解されてしまう。そこで、本発明に係る組成物の製造方法においては、前記アルカリ処理工程の後、さらに、ｐＨ６．５〜８．０に調整した前記画分を、ｐＨ４．５〜５．５に調整する酸処理工程を有することも好ましい。
【００３３】
ピロガロールを含む画分のアルカリ処理及び酸処理は、一般的なｐＨ調節処理により行うことができる。例えば、目的のｐＨのバッファーを添加したり、アルカリ化合物や酸を混合することによって、当該画分のｐＨを調整することができる。当該バッファーとしては、リン酸バッファー、トリスバッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、ホウ酸バッファー等の当該分野で汎用されているものの中から適宜選択して用いることができる。また、アルカリ処理は、ピロガロールを含む画分を、陰イオン交換樹脂のようなアルカリ性樹脂に接触させる処理によっても行うことができる。酸処理は、ピロガロールを含む画分に、酸化ビタミンＣ（デヒドロアスコルビン酸）等の酸化剤を混合する処理によっても行うことができる。
【００３４】
本発明に係る組成物の製造方法により製造されたキサンチンオキシダーゼ阻害組成物や、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンは、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する。したがって、これらはキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分として用いることができる。また、これらはいずれも昔から飲料として広く服用されているコーヒー由来の物質であり、比較的安全に服用できる。そこで、これらは、飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の原料として好適であり、特に痛風及び高尿酸血症の予防及び治療のために用いられる医薬品やサプリメントの原料として有用である。
【００３５】
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、本発明に係る組成物の製造方法により製造されたキサンチンオキシダーゼ阻害組成物、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンからなる群より選択される一種以上を有効成分とする。有効成分とするフェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンは、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物に由来するものでなくてもよく、例えば化学合成品であってもよい。本発明に係る組成物の製造方法により製造されたキサンチンオキシダーゼ阻害組成物のうち、中でも、前記脂溶性有機溶媒抽出物は、ＨＰＬＣ法による操作を必要とせずより簡便に得ることができる上に、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、クロロゲン酸ラクトン類、及びピロガロールを含んでおり、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分として非常に有用である。一方で、より高いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していることから、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、前記脂溶性有機溶媒抽出物からキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を分画して得たものであることも好ましい。中でも、フェルオイルキナ酸ラクトン類とクマロイルキナ酸ラクトン類の少なくとも一方を有効成分とするものや、ピロガロール、及びプルプロガリンの少なくとも一種を有効成分とするものが好ましく、フェルオイルキナ酸ラクトン類とクマロイルキナ酸ラクトン類の両方を有効成分とするものや、ピロガロールとプルプロガリンの両方を有効成分とするものであってもよい。
【００３６】
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、有効成分として、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンのみを含有していてもよく、他の成分を含有するものであってもよい。有効成分となるその他の成分としては、例えば、クロロゲン酸ラクトン類等のその他の焙煎コーヒー豆に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物や、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物以外からキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を抽出した抽出物が挙げられる。
【００３７】
また、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する有効成分のみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分としては、キサンチンオキシダーゼ阻害組成物、フェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンによるキサンチンオキシダーゼ阻害作用を損なわないものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、流動性改良剤（固結防止剤）、安定剤、保存剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤、矯味剤、甘味料、酸味料、香料、着色料等として用いられている各種物質を、所望の製品品質に応じて適宜含有させてもよい。
【００３８】
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の剤型は、特に限定されるものではなく、各種の剤型を適用できる。本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、経口摂取することによってキサンチンオキシダーゼ阻害効果を奏するため、経口投与に適したものが好ましい。当該剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。
【００３９】
例えば、溶媒を除去したキサンチンオキシダーゼ阻害組成物や、精製されたフェルオイルキナ酸ラクトン類、クマロイルキナ酸ラクトン類、ピロガロール、及びプルプロガリンをそのまま、液体コーヒー、インスタントコーヒー等に添加して使用することもできる。ここで、液体コーヒーとしては、缶又はいわゆるペットボトル容器に入れられて市販されているコーヒー飲料（若しくはコーヒー入り飲料と呼ばれるもの）が挙げられる。また、インスタントコーヒーとしては、焙煎粉砕コーヒーを熱湯で抽出した抽出液を噴霧又は凍結乾燥方法により水分を除去した可溶性粉末コーヒーと呼ばれるものが挙げられる。コーヒーミックス飲料としては、可溶性粉末コーヒーに砂糖、クリーミングパウダーなどを添加して混合した飲料などが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
【００４１】
＜キサンチンオキシダーゼ阻害活性測定＞  
以下の実施例等において、特に記載のない限り、サンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、次のようにして測定した。
まず、１ｍｍｏｌ／Ｌのキサンチン水溶液１０μＬと、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させたサンプル１０μＬと、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）１６０μＬを混合した反応液を、３７℃で５分間、プレインキュベーションした。サンプルに代えてＤＭＳＯを用いたものをコントロールの反応液とした。次いで、当該反応液に、ＸＯバッファー（０．０２７ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにキサンチンオキシダーゼをバッファーに溶解したもの）２０μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベートして反応させた後、３％のＨＣＬＯ４水溶液２５μＬを添加して反応を停止させた。その後、２０μＬの反応液を、以下の条件でＨＰＬＣシステムにインジェクトし、尿酸濃度を決定した。
【００４２】
ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ-１８ ＧＰ Ａｑｕａ(２５０×４．６ｍｍ（内径））（関東化学社製）、
溶媒：ＣＨ３ＯＨ−０．１％リン酸水溶液（２．５：９７．５（ｖ／ｖ））、
流速：０．５ｍＬ／分、
温度：３５℃、
検出波長：２９０ｎｍ及び２７０ｎｍ。
【００４３】
キサンチンオキシダーゼ阻害率は、下記式により算出した。
［阻害率（％）］＝（［コントロールの尿酸のピーク面積］−［サンプルの尿酸のピーク面積］）×１００／［コントロールの尿酸のピーク面積］
【００４４】
［参考例１］
コーヒー豆の熱水抽出物から得られるキサンチンオキシダーゼ阻害組成物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に対するコーヒー豆の種類と焙煎度の影響を調べた。コーヒー豆は、ブラジル産アラビカ種「ブラジルサントス」とベトナム産ロバスタ種の生豆、浅煎り豆、中煎り豆、及び深煎り豆の合計８種を用いた。各コーヒー豆の色を色差計により測定した結果を表１に示す。表中、「ｈ＊」は色相角度、「Ｃ」は彩度、「Ｌ＊」及び「Ｌ＊２」は明度をそれぞれ示す。色相角度、彩度、及び明度「Ｌ＊」は、粉砕前の豆に対して測定し、明度「Ｌ＊２」は、粉砕された豆に対して測定した。
【００４５】
【表１】
2017048185.tif 000004
【００４６】
各コーヒー豆の粉末１０ｇを、それぞれ沸騰水５０ｍＬに浸漬させ、１時間加温して撹拌しながら熱水抽出を行った。フィルター濾過によりコーヒー粉末を除去した後、得られた熱水抽出物の一部を分取して固形分含有量（ｍｇ）を測定し、測定結果に基づいて、各熱水抽出物を固形分の終濃度が０．６ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルについて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めた。結果を表１に示す。この結果、いずれのコーヒー豆においても、生豆ではわずかにキサンチンオキシダーゼ活性を促進し、焙煎豆ではキサンチンオキシダーゼ活性を阻害した。焙煎豆の焙煎度による差はほとんどなく、いずれも２０％程度の阻害を示した。
【００４７】
また、各熱水抽出物中のクロロゲン酸類（ネオクロロゲン酸、クロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸）とクロロゲン酸ラクトン類の含有量を、非特許文献１に記載の方法で測定したところ、いずれもクロロゲン酸ラクトン類よりもクロロゲン酸類の含有量が多く、クロロゲン酸類が主成分といえた。また、クロロゲン酸類とクロロゲン酸ラクトン類のいずれも、焙煎度が高くなるほど減少する傾向が観察された。
【００４８】
［参考例２］
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物を分子量で分画し、各画分のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
まず、ブラジル産アラビカ種「ブラジルサントス」の中煎り豆（明度Ｌ＊＝３２．２３）の粉末を用いて、参考例１と同様にして熱水抽出物を調製した。調製した熱水抽出物３０．０ｍｇを水１ｍＬに溶解させた熱水抽出物溶液を３つ用意し、１つを分画分子量３０００の限外濾過膜（Ｎanosep  ３Ｋ  Ｏmega, Pall社）で濾過し、限外濾過膜を通過した濾過物を「ＭＷ＜３Ｋ画分」、限外濾過膜上に保持された画分を「ＭＷ＞３Ｋ画分」とした。同様に、３つの熱水抽出物溶液の１つについて、分画分子量２０００の限外濾過膜(Vivacon 500，Sartorius社）で濾過し、限外濾過膜を通過した濾過物を「ＭＷ＜２Ｋ画分」、限外濾過膜上に保持された画分を「ＭＷ＞２Ｋ画分」とした。残る１つの熱水抽出物溶液は、分子量がおよそ１０００であるビタミンＢ１２を指標に用いて、オープンカラムクロマト分画（充填材：ＴＯＹＯＰＥＡＬ  ＨＷ−４０Ｆ，東ソー社）を行い、ビタミンＢ１２よりも早く溶出した画分を「ＭＷ＞１Ｋ画分」、ビタミンＢ１２を含み、ビタミンＢ１２以降に溶出した画分を「ＭＷ＜１Ｋ画分」とした。
【００４９】
各画分の一部を分取して固形分含有量（ｍｇ）を測定し、測定結果に基づいて、各画分を固形分の終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルについて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めた。阻害率（％）の結果を、各画分の固形分含有量（ｍｇ）と共に表２に示す。この結果、分子量の小さい画分ではキサンチンオキシダーゼ阻害活性が見られたが、分子量の大きい画分ではキサンチンオキシダーゼ活性が促進されていた。
【００５０】
【表２】
2017048185.tif 000005
【００５１】
［参考例３］
焙煎コーヒー豆のエタノール抽出物、アセトン抽出物、及び酢酸エチル抽出物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
抽出溶媒としてエタノールを用いる場合には、まず、ブラジル産アラビカ種「ブラジルサントス」の中煎り豆の粉末１ｇを、エタノール５ｍＬに浸漬させ、６０℃で１時間加温して撹拌しながら抽出した後、フィルター濾過により濾液（エタノール１回抽出物）を回収した。フィルター上の残渣である焙煎コーヒー豆粉末を、新しいエタノール５ｍＬに浸漬させ、６０℃で１時間加温して撹拌しながら抽出した後、フィルター濾過により濾液（エタノール２回抽出物）を回収した。フィルター上の残渣である焙煎コーヒー豆粉末を、新しいエタノール５ｍＬに浸漬させ、６０℃で１時間加温して撹拌しながら抽出した後、フィルター濾過により濾液（エタノール３回抽出物）を回収した。回収されたエタノール抽出物は全て混合した。抽出溶媒としてアセトン及び酢酸エチルを用いた場合も、それぞれ同様にして行った。
【００５２】
各溶媒抽出物の一部を分取して固形分含有量（ｍｇ）を測定し、測定結果に基づいて、各溶媒抽出物を固形分の終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ又は０．１５ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルについて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めた。阻害率（％）の結果を、各溶媒抽出物の抽出された固形分量（ｍｇ）と含有されているクロロゲン酸ラクトンの含有量（ｎｍｏｌ／１．０ｍｇ）と共に表３に示す。なお、各溶媒抽出物のクロロゲン酸ラクトンの含有量は、非特許文献１に記載の方法で測定した。
【００５３】
【表３】
2017048185.tif 000006
【００５４】
この結果、各溶媒抽出物の阻害率は、クロロゲン酸ラクトンの含有量との相関がみられたものの、阻害活性は不充分であった。つまり、焙煎コーヒー豆中のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物は、焙煎コーヒー豆の粉末から直接有機溶媒抽出を行った場合には抽出効率が悪く、充分な阻害活性をもつ抽出物は得られないことが確認された。
【００５５】
［実施例１］
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物のジクロロメタン抽出物と酢酸エチル抽出物について、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
まず、ブラジル産アラビカ種「ブラジルサントス」の中煎り豆の粉末を用いて、参考例１と同様にして、熱水抽出物を得た。
【００５６】
＜抽出法１＞
５ｍＬの熱水抽出物（固形分含有量が１００．０ｍｇ）に、ジクロロメタン５ｍＬを添加して撹拌し、抽出を行った。発生したミセル状不溶物を綿栓濾過により除去したところ、濾過残渣は７．３ｍｇであった。次いで、濾液を分液し、ジクロロメタン層（ジクロロメタン抽出物）と水層に分けて回収した。回収した水層に、酢酸エチル５ｍＬを添加して撹拌し、抽出を行った。発生したミセル状不溶物を綿栓濾過により除去し、濾液を分液し、酢酸エチル層（酢酸エチル１回抽出物）と水層に分けて回収した。回収した水層に、酢酸エチル５ｍＬを添加して撹拌し、抽出を行った。発生したミセル状不溶物を綿栓濾過により除去し、濾液を分液し、酢酸エチル層（酢酸エチル２回抽出物）と水層に分けて回収した。酢酸エチル１回抽出物と酢酸エチル２回抽出物を混合したものを、酢酸エチル抽出物とした。なお、酢酸エチルを混合して発生したミセル状不溶物の合計量（２回の濾過残渣の合計量）は、３．３ｍｇであった。
【００５７】
＜抽出法２＞
５ｍＬの熱水抽出物（固形分含有量が１００．０ｍｇ）に、酢酸エチル５ｍＬを添加して撹拌し、抽出を行った。発生したミセル状不溶物を綿栓濾過により除去し、濾液を分液し、酢酸エチル層（酢酸エチル１回抽出物）と水層に分けて回収した。回収した水層に、酢酸エチル５ｍＬを添加して撹拌し、抽出を行った。発生したミセル状不溶物を綿栓濾過により除去し、濾液を分液し、酢酸エチル層（酢酸エチル２回抽出物）と水層に分けて回収した。酢酸エチル１回抽出物と酢酸エチル２回抽出物を混合したものを、酢酸エチル抽出物とした。なお、酢酸エチルを混合して発生したミセル状不溶物の合計量（２回の濾過残渣の合計量）は、５．６ｍｇであった。
【００５８】
抽出法１において得られたジクロロメタン抽出物、酢酸エチル抽出物、及び水層と、抽出法２において得られた酢酸エチル抽出物及び水層について、固形分含有量（ｍｇ）とキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。キサンチンオキシダーゼ阻害活性は、固形分の終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルを用いて測定した。測定結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
2017048185.tif 000007
【００６０】
表４に示すように、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物の有機溶媒抽出物、特に酢酸エチルによる抽出物において、３００質量ｐｐｍの低濃度で、６０％を超える強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性が確認された。これらの結果から、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から脂溶性有機溶媒による抽出という簡便な手法により、焙煎コーヒー豆由来の強力なキサンチンオキシダーゼ阻害物質を効率よく抽出できるということがわかった。
【００６１】
［実施例２］
種類及び焙煎度の異なる焙煎コーヒー豆の熱水抽出物から酢酸エチルで抽出した抽出物について、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。コーヒー豆は、ブラジル産アラビカ種「ブラジルサントス」、ベトナム産ロバスタ種、及びコロンビア産アラビカ種「エクセルソ」の浅煎り豆、中煎り豆、及び深煎り豆の合計９種を用いた。
各焙煎コーヒー豆の粉末２．００ｇを、それぞれ沸騰水１０ｍＬに浸漬させ、１時間加温して撹拌しながら熱水抽出を行った。次いで、フィルター濾過により固形分を除去した熱水抽出物に、実施例１の抽出法２と同様にして、酢酸エチル５ｍＬを２回に分けて添加して、酢酸エチル抽出物を得た。得られた酢酸エチル抽出物の一部を分取して固形分含有量（ｍｇ）を測定し、測定結果に基づいて、各酢酸エチル抽出物を固形分の終濃度が０．０３、０．１、又は０．３ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルについて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めた。各酢酸エチル抽出物について、終濃度０．０３、０．１、及び０．３ｍｇ／ｍＬの阻害率（％）から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。各酢酸エチル抽出物の固形分含有量（ｍｇ）、阻害率（％）、及びＩＣ５０（ｍｇ／ｍＬ）を表５に示す。
【００６２】
【表５】
2017048185.tif 000008
【００６３】
この結果、いずれの焙煎コーヒー豆からも、阻害率が６０％程度と非常に高い酢酸エチル抽出物が得られた。これにより、コーヒー豆の産地や種類にかかわらず、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物を酢酸エチル抽出することにより、キサンチンオキシダーゼ阻害活性の高い抽出物が得られることが確認された。また、いずれの焙煎コーヒー豆においても、深煎り豆が最もＩＣ５０が小さく、深煎り豆からのほうが、キサンチンオキシダーゼ阻害活性がより強力な酢酸エチル抽出物が得られることがわかった。
【００６４】
ブラジル産アラビカ種とベトナム産ロバスタ種の浅煎り豆、中煎り豆、及び深煎り豆の合計６種から調製された酢酸エチル抽出物について、クロロゲン酸ラクトン類の含有量を非特許文献１に記載の方法により測定した。測定結果を表６に示す。この結果、クロロゲン酸ラクトン類の含有量は、焙煎度が高くなるほど低くなる傾向が観察された。表５及び６の結果から、深煎り豆から調製された酢酸エチル抽出物には、クロロゲン酸ラクトン類以外のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物が存在しており、当該化合物により非常に強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性が達成されていることが示唆された。
【００６５】
【表６】
2017048185.tif 000009
【００６６】
［実施例３］
ブラジル産アラビカ種の浅煎り豆と深煎り豆の熱水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を単離して同定した。
まず、実施例２と同様にして、ブラジル産アラビカ種の浅煎り豆と深煎り豆の粉末からそれぞれ熱水抽出物を調製し、この熱水抽出物から酢酸エチル抽出物を調製した。この酢酸エチル抽出物を、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣにより分離し、クロロゲン酸ラクトン類よりも前に溶出される画分１（クロロゲン酸ラクトン類溶出前画分）と、クロロゲン酸ラクトン類が溶出される画分２（クロロゲン酸ラクトン類溶出画分）と、クロロゲン酸ラクトン類よりも後に溶出される画分３（クロロゲン酸ラクトン類溶出後画分）の３つに分画した。分取ＨＰＬＣ条件は下記の通りにして行った。
【００６７】
分取ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（２５０×２０ｍｍ（内径）、ナカライテスク社製）、
溶媒Ａ：１％酢酸含有水溶液、
溶媒Ｂ：アセトニトリル、
溶出条件：クロロゲン酸ラクトン類溶出前まで[Ａ:Ｂ＝８５：１５（ｖ／ｖ）]、クロロゲン酸ラクトン類溶出部時間[Ａ:Ｂ＝５０：５０（ｖ／ｖ）]、クロロゲン酸ラクトン類溶出後から[Ａ:Ｂ＝０：１００（ｖ／ｖ）]、
流速：９．６ｍＬ／分、
検出波長：３２０ｎｍ。
【００６８】
図１に、浅煎り豆の熱水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物の分取ＨＰＬＣのクロマトグラムを、図２に、深煎り豆の熱水抽出物から調製された酢酸エチル抽出物の分取ＨＰＬＣのクロマトグラムを、それぞれ示す。図中、「１」が画分１（クロロゲン酸ラクトン類溶出前画分）、「２」が画分２（クロロゲン酸ラクトン類溶出画分）、「３」が画分３（クロロゲン酸ラクトン類溶出後画分）を示す。
【００６９】
各画分について、実施例２と同様にして、終濃度０．０３、０．１、及び０．３ｍｇ／ｍＬの阻害率（％）と、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。各画分の終濃度０．３ｍｇ／ｍＬの阻害率（％）及びＩＣ５０（ｍｇ／ｍＬ）を表７に示す。この結果、深煎り豆と浅煎り豆のいずれにおいても、画分１、画分２、及び画分３の全てにおいて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が観察された。すなわち、すべての画分に、活性既知のクロロゲン酸ラクトン類以外の高いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する物質が含まれていることがわかった。
【００７０】
【表７】
2017048185.tif 000010
【００７１】
深煎り豆の画分１から画分３に含まれる化合物について、ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳによる総成分分析を行った。ＨＰＬＣ及びＴＯＦＭＳの条件は下記の通りにして行った。ピーク化合物の元素組成は、脱プロトン化分子のイオンからの高分解能ＭＳデータを用いて、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ．４．１，Ｗａｔｅｒｓ社製）を利用して計算した。
【００７２】
ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（２５０×４．６ｍｍ（内径）、ナカライテスク社製）、
溶媒Ａ：１％酢酸含有水溶液、
溶媒Ｂ：アセトニトリル、
リニアグラジエント条件：５％溶媒Ｂ（０分）から４５％溶媒Ｂ(８０分) へ、さらに１００％溶媒Ｂ(１００分)へ、
流速：０．５ｍＬ／分、
検出：２８０ｎｍ及び３２０ｎｍ。
【００７３】
ＴＯＦＭＳ条件；
ＥＳＩ：ｎｅｇａｔｉｖｅ、
キャピラリー電圧：１．２ｋＶ、
コーン電圧：２３Ｖ、
イオン源温度：１２０℃、
脱溶媒温度：４５０℃、
コーンガス流量：５０Ｌ／ｈ、
脱溶媒ガス流量：８００Ｌ／ｈ、
ＭＳＥ低コリジョンエネルギー：６Ｖ、
ＭＳＥ高コリジョンエネルギー：２０−３０Ｖ。
【００７４】
深煎り豆の画分１においては、ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析において主要な化合物ピーク及びその分子量データが得られなかったが、画分２のＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ分析では、４つの主ピークとそのＭＳデータが確認された（図３）。保持時間の短いピークから順に１〜４と番号をふり、これらのピークのＭＳデータを表８に示す。
【００７５】
【表８】
2017048185.tif 000011
【００７６】
深煎り豆の画分３のＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳのクロマトグラムでは、６つの主ピークが確認された（図４）。保持時間の短いピークから順に５〜１０と番号をふり、これらのピークのＭＳデータを表９に示す。
【００７７】
【表９】
2017048185.tif 000012
【００７８】
ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳにより得られた画分２及び３の各主要ピークの分子量関連イオン及びフラグメントイオンから、画分２のピーク１〜４はクロロゲン酸のラクトン（カフェ酸部分の位置異性体）であり、画分３のメインピーク７は、５とともにフェルオイルキナ酸ラクトン（フェルラ酸部分の位置異性体で位置は不明）であり、ピーク６はクマロイルキナ酸ラクトン（クマル酸部分の位置は不明）であることを確認した。これらの結果から、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物の脂溶性有機溶媒抽出物には、クロロゲン酸ラクトン類に加えて、フェルオイルキナ酸ラクトン類とクマロイルキナ酸ラクトン類が含有されていることがわかった。フェルオイルキナ酸ラクトン類とクマロイルキナ酸ラクトン類も、深煎り豆に由来する強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を担っていると考えられる。
【００７９】
［実施例４］
焙煎コーヒー豆の熱水抽出物の酢酸エチル抽出物について、フェルオイルキナ酸ラクトン類とクマロイルキナ酸ラクトン類以外のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する化合物を調べた。
まず、焙煎コーヒー豆の粉末２ｋｇ（明度Ｌ＊値：２１．７）を、沸騰水１０Ｌに浸漬させ、時々撹拌しながら２時間加温して熱水抽出を行った。次いで、フィルター濾過により固形分を除去した熱水抽出物に、実施例１の抽出法２と同様にして、１０Ｌの酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル抽出物を得た。得られた酢酸エチル抽出物を減圧濃縮し、酢酸エチル可溶性画分３２．３ｇを調製した。
【００８０】
この酢酸エチル可溶性画分のうち０．３５ｇを、ＯＤＳカラムを用いたＭＰＬＣにより、１０個の画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１０）に分離した。ＭＰＬＣの条件は以下の通りにして行った。
【００８１】
ＭＰＬＣ条件；
カラム：ＵＬＴＲＡ  ＰＡＣＫ  ＯＤＳ−Ｓ−５０（３００×５０ｍｍ（内径）、山善社製）、
溶媒：アセトニトリル／０．１％酢酸含有水溶液の混合溶媒（１２．５／８７．５（容量比））、
流速：９．６ｍＬ／分。
【００８２】
各画分の一部を分取して固形分含有量（ｍｇ）を測定したところ、Ｆｒ．１は３１．８ｍｇ、Ｆｒ．２は１５．５ｍｇ、Ｆｒ．３は１０．７ｍｇ、Ｆｒ．４は１０５．４ｍｇ、Ｆｒ．５は２９．９ｍｇ、Ｆｒ．６は９．８ｍｇ、Ｆｒ．７は９．４ｍｇ、Ｆｒ．８は５．７ｍｇ、Ｆｒ．９は８．３ｍｇ、Ｆｒ．１０は１２．１ｍｇであった。また、各画分を固形分の終濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬに調整したサンプルについて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めた。測定結果を図５に示す（ｎ＝３）。図５中、「＊」はｔ−ｔｅｓｔ検定でコントロールに対しｐ＜０．０５を示す。
【００８３】
次いで、最もキサンチンオキシダーゼ阻害活性が高かったＦｒ．２を、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣにより分離し、得られたクロマトグラムのピークから６つの画分を分取した。得られたクロマトグラム及び分取した画分（Ｆｒ．２−１〜Ｆｒ．２−６）を図６に示す。なお、ＨＰＬＣの条件は以下の通りにして行った。
【００８４】
ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（２５０×４．６ｍｍ（内径）、ナカライテスク社製）、
溶媒Ａ：１％酢酸含有水溶液、
溶媒Ｂ：アセトニトリル、
ステップワイズ溶出条件：５％溶媒Ｂ（０分から１６分の間）、その後１０％溶媒Ｂ (１６分から２８分の間)、さらに１００％溶媒Ｂ(２８分から４４分の間) 、
流速：９．６ｍＬ／分、
検出：２８０ｎｍ。
【００８５】
各画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．６）について、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、各サンプルの阻害率（％）を求めたところ、Ｆｒ．２−１が最もキサンチンオキシダーゼ阻害活性が高く、図６のクロマトグラム中、保持時間６．５分にピークが表れる化合物が非常に強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していることが示唆された。そこで、再度調製したＦｒ．２から前記と同じＨＰＬＣ条件で、保持時間６．５分にピークを示す化合物を含む画分を回収した。回収された画分の固形分含有量は１４．３ｍｇであった。この画分を、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（５６０×２．５ｍｍ（内径））を用いたゲルろ過クロマトグラフィー（溶媒：メタノール）により精製し、純粋な活性物質４ｍｇを単離した。得られた活性物質は、下記のＮＭＲとＭＳデータから、ピロガロールであると同定された。
【００８６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）：δ６．３１（２Ｈ，ＡＡ’Ｂ）及びδ６．５１（１Ｈ，ＡＡ’Ｂ）。
【００８７】
ＤＡＲＴ−ＴＯＦＭＳ：ｍ／ｚ  １２７．０３８３［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ６Ｈ５Ｏ３のモノアイソトピック質量は１２７．０３９５）、ｍ／ｚ  １２５．０２３１［Ｍ−Ｈ］−（Ｃ６Ｈ３Ｏ３のモノアイソトピック質量は１２５．０２３９）。
【００８８】
ピロガロールとその構造類似の化合物について、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。この結果、ピロガロールはＩＣ５０が０．７３μｍｏｌ／Ｌという、痛風薬アロプリノール（ＩＣ５０：０．５０μｍｏｌ／Ｌ）に匹敵する活性強度を示した。一方で、ピロガロールの２００μｍｏｌ／Ｌにおけるキサンチンオキシダーゼ阻害率を１００％とした場合の各化合物の相対阻害率（％）はそれぞれ、１，２，４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅが３１．７±１．５％、ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌが５．９２±０．２１％、ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅが−８．９４±１．０％、ｃａｔｅｃｈｏｌが−３．３９±２．４％、ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌが−０．４１±２．６％であり、ピロガロールのような高い活性は認められなかった。
【００８９】
［実施例５］
ｐＨ５．０、６．０、７２、及び７．８におけるピロガロールの安定性を調べた。なお、ｐＨ５．０は浅煎りコーヒー豆の熱水抽出物のｐＨに相当し、ｐＨ６．０は深煎りコーヒー豆の熱水抽出物のｐＨに相当し、ｐＨ７．４は生体内のｐＨに相当し、ｐＨ７．８はキサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定条件のｐＨである。
【００９０】
具体的には、４ｍＭのピロガロール（化学合成品）１０μＬと１２．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．０、６．０、７．４、又は７．８）１９０μＬとを混合し、得られたサンプル溶液を３７℃で２９０分間インキュベーションした。各サンプル溶液の一部を、インキュベーション開始から０、１０、８０、１５０、２２０、及び２９０分経過時点でサンプリングし、ＨＰＬＣにて成分分析を行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りにして行った。
【００９１】
ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（２５０×４．６ｍｍ（内径）、ナカライテスク社製）、
溶媒Ａ：０．１％リン酸含有水溶液、
溶媒Ｂ：アセトニトリル、
リニアグラジエント条件：５％溶媒Ｂ（０分）から４５％溶媒Ｂ(４０分) へ、次いで１００％溶媒Ｂ（５０分）へ、５５分まで１００％溶媒Ｂを維持した後、５％溶媒Ｂ（５５．１分）へ、さらに６５分まで５％溶媒Ｂを維持、
流速：１．０ｍＬ／分、
検出：２５４、２８０、３２０ｎｍ、
インジェクション量：２０μＬ。
【００９２】
測定結果を図７に示す。図７（ａ）はｐＨ７．８のサンプル溶液の結果を、図７（ｂ）はｐＨ７．４のサンプル溶液の結果を、図７（ｃ）はｐＨ６．０のサンプル溶液の結果を、図７（ｄ）はｐＨ５．０のサンプル溶液の結果を、それぞれ示す。図中、「Ｐｙｒ」がピロガロールの測定結果である。この結果、ピロガロールは、ｐＨ５．０ではほとんど減少せず、安定であったのに対して、ｐＨ６．０〜７．８ではインキュベーションの時間が長くなるにつれ消失することがわかった。ピロガロールは、ｐＨ６．０では５時間かけてゆっくり消失したが、ｐＨ７．４とｐＨ７．８では、インキュベーション開始から１０分経過時点ではピロガロールは半分程度に減少し、１時間程度でほぼ全量が消失した。
【００９３】
ｐＨ５．０のサンプルではＨＰＬＣにおいて他のピークは確認されなかったが、ｐＨ６．０〜７．８のサンプルでは、ピロガロールの消失と相関するように別の化合物のピークが確認された。当該ピークに含まれる化合物は、ＨＰＬＣの保持時間と特徴的なＵＶ−ＶＩＳスペクトル（λｍａｘ）を標品データと比較した結果から、プルプロガリンであると同定された。なお、標品として用いたプルプロガリンは、ピロガロールのＮａＩＯ３酸化（Evans and Dehn，Journal of the American Chemical Society，1930，vol.52，p.3647-3649）により調製した。プルプロガリンのＮＭＲとＭＳデータを下記に示す。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＤ）：δｐｐｍ ６．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２及び１２．４Ｈｚ），６．８６（１Ｈ，ｓ），７．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）。
【００９５】
ＨＲ−ＤＡＲＴ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ２２１．０４６９［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１１Ｈ９Ｏ５のモノアイソトピック質量は２２１．０４５０）。
【００９６】
各サンプル溶液に含まれるプルプロガリンの含有量の測定結果を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。図中、「Ｐｕｒ」がプルプロガリンの測定結果である。この結果、プルプロガリンは、ｐＨ５．０では検出されなかったが、ｐＨ６．０では緩やかに生成されており、ｐＨ７．４とｐＨ７．８では、インキュベーション開始から１０分経過時点までに急激に生成され、その後徐々に減少し、４時間程度でほとんど消失していた。
【００９７】
また、プルプロガリンのｐＨ７．４における安定性を調べた。
具体的には、０．４ｍＭ又は４ｍＭのプルプロガリン（化学合成品）５０μＬと１２．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）９５０μＬとを混合し、得られたサンプル溶液（プルプロガリン濃度：２０μＭ又は２００μＭ）を３７℃で３００分間インキュベーションした。各サンプル溶液の一部を、インキュベーション開始から０、３０、６０、１２０、１８０、２４０、及び３００分経過時点でサンプリングし、ＨＰＬＣにて成分分析を行った。ＨＰＬＣの条件は、検出波長のうち２５４ｎｍを２６８ｎｍに変更した以外はピロガロールの条件と同じ条件で行った。
【００９８】
測定結果を図８に示す。図８（ａ）はプルプロガリン濃度が２０μＭのサンプル溶液の結果を、図７（ｂ）はプルプロガリン濃度が２００μＭのサンプル溶液の結果を、それぞれ示す。この結果いずれのサンプル溶液でも、プルプロガリンは緩やかに減少し、インキュベート開始から５時間でほぼ全量消失した。
【００９９】
［実施例６］
ピロガロールをｐＨ７．４の条件下でインキュベートした場合の、ピロガロールとプルプロガリンの含有量とサンチンオキシダーゼ阻害活性の経時的変化を調べた。
具体的には、４００μＭのピロガロール（化学合成品）５０μＬと１２．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）９５０μＬとを混合し、得られたサンプル溶液を３７℃で３００分間インキュベーションした。各サンプル溶液の一部を、インキュベーション開始から０、３０、６０、１２０、２４０、及び３００分経過時点でサンプリングし、ＨＰＬＣによる成分分析とサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定を行った。
【０１００】
ＨＰＬＣによる成分分析は、８０μＬのサンプル溶液に、３％の過塩素酸８μＬを添加したものを用い、ＨＰＬＣの条件は、インジェクション量を２２μＬとし、検出波長のうち２５４ｎｍを２６８ｎｍに変更した以外は、実施例５と同じ条件で行った。
【０１０１】
キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定は、まず、１ｍｍｏｌ／Ｌのキサンチン水溶液１０μＬと１２．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）１６０μＬを混合した溶液を準備し、当該溶液に１０μＬのサンプル溶液を添加して撹拌した後、直ちにＸＯバッファー（０．０１１ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにキサンチンオキシダーゼをバッファーに溶解したもの）２０μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベートして反応させた後、３％のＨＣＬＯ４水溶液２５μＬを添加して反応を停止させた。その後、２０μＬの反応液をＨＰＬＣシステムにインジェクトし、尿酸濃度を決定し、キサンチンオキシダーゼ阻害率（％）を求めた。１０μＬのサンプル溶液にかえて１０μＬの１２．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いたものをコントロールの反応液とした。ＨＰＬＣの条件は、流速を１．０ｍＬ／分に変更した以外は前記＜キサンチンオキシダーゼ阻害活性測定＞に記載のＨＰＬＣ条件と同じ条件で行った。
【０１０２】
測定結果を図９に示す（ｎ＝２）。図中、「Ｐｙｒ」がピロガロールの含有量（左縦軸）の結果であり、「Ｐｕｒ」がプルプロガリンの含有量（μＭ、左縦軸）の結果であり、「ＸＯＩ」がキサンチンオキシダーゼ阻害率（％、右縦軸）の結果である。ピロガロールはｐＨ７．４のリン酸バッファーを添加後（インキュベート開始後）３０分経過時点で半分以下に減少し、２時間経過時点では全量が消失した。プルプロガリンは、インキュベート開始後３０分経過時点で生成量が最大となり、その後緩やかに減少し、２４０分経過時点にはほぼ全量が消失した。これに対して、キサンチンオキシダーゼ阻害率は、インキュベート開始時点（プルプロガリン生成前）の時点で３４．１％であり、インキュベート開始後３０分〜６０分経過時点には６０％程度にまで上昇し、その後緩やかに減少し、インキュベート開始から２４０分経過時点ではほとんどキサンチンオキシダーゼ阻害活性はみられなかった。図９に示すように、キサンチンオキシダーゼ阻害率の増減は、プルプロガリン含有量に連動していた。これらの結果から、ピロガロールとプルプロガリンの両方ともキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有しているが、プルプロガリンの阻害活性のほうがピロガロールの阻害活性よりも強いことが示唆された。
【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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