(57)【要約】【課題】本発明は、効率的なリモネンの製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、Ｐｉｃｅａ属、Ａｂｉｅｓ属、Ｍｅｎｔｈａ属、又はＣｉｔｒｕｓ属に属する植物由来のリモネンシンターゼ等のリモネンシンターゼを発現する微生物を培養培地中で培養してリモネンを生成することを含む、リモネンの製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を培養培地中で培養してリモネンを生成することを含む、リモネンの製造方法。
【請求項２】
前記細菌は、前記リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる１又は２以上のポリヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
（ａ）（ｉ）配列番号２で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号２で表される塩基配列中の１９３〜１９０５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）（ｉｖ）配列番号５で表される塩基配列、（ｖ）配列番号５で表される塩基配列中の２０５〜１９１４番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｖｉ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ｖｉｉ）配列番号８で表される塩基配列、（ｖｉｉｉ）配列番号８で表される塩基配列中の１６９〜１８００番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｘ）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｘ）配列番号１１で表される塩基配列、（ｘｉ）配列番号１１で表される塩基配列中の１５４〜１８２７番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｉｉ）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）（ｘｉｉｉ）配列番号１４で表される塩基配列、（ｘｉｖ）配列番号１４で表される塩基配列中の１５４〜１８２１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｖ）配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｏ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記リモネンシンターゼは、以下の（Ａ）〜（Ｏ）からなる群より選ばれる１又は２以上のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）（ｉ’）配列番号１で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の６５〜６３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）（ｉｉｉ’）配列番号４で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｖ’）配列番号４で表されるアミノ酸配列中の６９〜６３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｆ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｇ）（ｖ’）配列番号７で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉ’）配列番号７で表されるアミノ酸配列中の５７〜５９９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｉ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｊ）（ｖｉｉ’）配列番号１０で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉｉｉ’）配列番号１０で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｋ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｌ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｍ）（ｉｘ’）配列番号１３で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｘ’）配列番号１３で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（Ｎ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｏ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記リモネンシンターゼは、Ｐｉｃｅａ属、Ａｂｉｅｓ属、Ｍｅｎｔｈａ属、又はＣｉｔｒｕｓ属に属する植物由来のリモネンシンターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リモネンシンターゼは、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、アラスカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｕ）、又はレモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）由来のリモネンシンターゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌は、さらにゲラニル二リン酸シンターゼを発現する細菌である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌は、２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されている微生物である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
２−ケトグルコン酸生成経路が、グルコース脱水素酵素活性の低減により遮断されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌において、グルコース脱水素酵素遺伝子であるポリヌクレオチドが破壊されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドは、以下の（ｘ）〜（ｚ）からなる群より選ばれる１又は２以上のポリヌクレオチドである、請求項１２記載の方法。
（ｘ）〔ｉ〕配列番号１８で表される塩基配列、もしくは〔ｉｉ〕配列番号１８で表される塩基配列中３０１〜２６９１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｚ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記グルコース脱水素酵素は、以下の（Ｘ）〜（Ｚ）からなる群より選ばれる１又は２以上のタンパク質である、請求項１２又は１３記載の方法。
（Ｘ）配列番号１９で表される全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｙ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質；及び
（Ｚ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
前記細菌は、パントエア・アナナティスである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リモネンの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香物質として知られるリモネンは、ハッカやレモンをはじめ、様々な植物の精油中に含まれる単環式モノテルペンの一種である。リモネンは、香水、化粧品、シャンプー、石鹸等の香粧品に利用され、食品又は飲料へのフレーバー付加のための添加物としても利用される。また、リモネンは、製薬および香料産業において、例えばカルベオール、カルボン、ペリリルアルコールなどの化合物の出発化合物として、あるいは、有機溶剤としても重要な化合物である。
【０００３】
リモネンにはエナンチオマーが存在し、（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅ（ｄ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ、４Ｒ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ）、及び（−）−ｌｉｍｏｎｅｎｅ（ｌ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ、４Ｓ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ）と称される。（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅと（−）−ｌｉｍｏｎｅｎｅは、異なる香りを呈することが知られており（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅは爽やかな柑橘類様香気を、（−）−ｌｉｍｏｎｅｎｅは強いテレピン油様の香気を呈するとされている。２つのエナンチオマーは匂いの閾値も異なり、（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅは（−）−ｌｉｍｏｎｅｎｅの２．５倍程度高い閾値を示すとされる。また、リモネンが有する生物活性の研究が進められており、鎮静作用、抗がん作用など、比較的多くの生物活性を有することが明らかとなってきている。近年、健康志向の高まりから機能性の植物由来素材が添加された食品や飲料のニーズが高まってきており、リモネンを添加することでリモネンが有する機能を訴求した商品の開発も実際に行われている。今後もこのような食品や飲料のニーズが高まると予想され、それに伴いリモネンの需要も高まることが考えられ、ナチュラルを訴求可能かつ、効率的にリモネンを生産できる製法の確立が望まれている。
また、カルボンはキャラウェイやスペアミントに含まれ、香料として利用される。リモネンからカルボンへの化学的、酵素的な変換が知られている（非特許文献６）。このことから、リモネンは素材そのものの有用性に加え、有用物質の中間体としての用途が挙げられる。
【０００４】
リモネンは、リモネンシンターゼによって、モノテルペンの共通前駆体であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）より合成される。ＧＰＰは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、及びその異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の縮合によって生成するが、これらの生合成経路として、メバロン酸経路及び非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の存在が知られている。メバロン酸経路は、植物、動物、酵母などの真核生物や一部の放線菌や古細菌に存在している。一方、ＭＥＰ経路は、バクテリアや植物のプラスチドに存在している。
従来、リモネンなどの植物の精油成分は、様々な抽出法によって植物から抽出することで製造されている。抽出法として例えば、特許文献１には水蒸気蒸留が、特許文献２には減圧蒸留法が、それぞれ記載されている。また、特許文献３には植物材料と溶媒の混合物を超高温処理することで植物成分を抽出する方法の記載がある。一方で、化学合成による製法も確立されており、例えば、特許文献４には高温高圧水環境下での化学合成によるα−ピネンを原料としたリモネンの製造法が記載されている。さらに近年では遺伝子組換え技術を用いて酵母及び原核生物でのリモネン生産が報告されている（特許文献５、６、７、８及び９、非特許文献１、２、３、４及び５）。しかしながら、遺伝子組換え酵母又は遺伝子組換え原核生物によるリモネン生産量は非常に微量なレベルに止まっており、必ずしも効率的な生産方法とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２９８５８０号公報
【特許文献２】特開２００６−２９１００７号公報
【特許文献３】特表２０１１−５０６７１３号公報
【特許文献４】特開２００９−１２６８２１号公報
【特許文献５】国際公開第２０１４／０２７１１８号
【特許文献６】国際公開第２０１５／０２７２０９号
【特許文献７】国際公開第２００７／１３９９２４号
【特許文献８】国際公開第２００７／１４０３３９号
【特許文献９】国際公開第２００２／０２０８１５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｈｒｅｎｄｏｒｆｆ  Ｊ，Ｖｉｃｋｅｒｓ  Ｃ  Ｅ，Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ  Ｐ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｌ  Ｋ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｒｉｅｓ，２０１３，１２：  ７６−８７．
【非特許文献２】Ａｌｏｎｓｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｊ，Ｃｈａｎ  Ｒ，Ｂａｔｔｈ  Ｔ  Ｓ，Ａｄａｍｓ  Ｐ  Ｄ，Ｋｅａｓｌｉｎｇ  Ｊ  Ｄ，Ｐｅｔｚｏｌｄ  Ｃ  Ｊ，Ｌｅｅ  Ｔ  Ｓ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２０１３，１９，３３−４１．
【非特許文献３】Ｈａｌｆｍａｎｎ  Ｃ，Ｇｕ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｒ，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，１６（６），３１７５−３１８５．
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｒｏｄｔ  Ｃ，Ｈｏｓｃｈｅｋ  Ａ，Ｂｕｈｌｅｒ  Ｂ，Ｓｃｈｍｉｄ  Ａ，Ｊｕｌｓｉｎｇ１  Ｍ  Ｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１５，１１２（９），１７３８−１７５０．
【非特許文献５】Ｗｉｌｌｒｏｄｔ  Ｃ，Ｄａｖｉｄ  Ｃ，Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｓ，Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｂ，Ｊｕｌｓｉｎｇ  Ｍ  Ｋ，Ｓｃｈｍｉｄ  Ａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４，９（８），１０００−１０１２．
【非特許文献６】ＭＡＲＩＵＳＺ  ＴＲＹＴＥＫ，ＪＡＮ  ＦＩＥＤＵＲＥＫ，Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｐｏｌａｎｉｃａ，２００２，５１（１），５７−６２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率的なリモネンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、トウヒ属、モミ属、ハッカ属又はミカン属に属する植物由来のリモネンシンターゼを発現する微生物を培養培地で培養することにより、リモネンを効率的に生産することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を培養培地中で培養してリモネンを生成することを含む、リモネンの製造方法。
［２］前記細菌は、前記リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、［１］記載の方法。
［３］前記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｏ）からなる群より選ばれる１又は２以上のポリヌクレオチドである、［２］記載の方法。
（ａ）（ｉ）配列番号２で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号２で表される塩基配列中の１９３〜１９０５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）（ｉｖ）配列番号５で表される塩基配列、（ｖ）配列番号５で表される塩基配列中の２０５〜１９１４番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｖｉ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ｖｉｉ）配列番号８で表される塩基配列、（ｖｉｉｉ）配列番号８で表される塩基配列中の１６９〜１８００番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｘ）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｘ）配列番号１１で表される塩基配列、（ｘｉ）配列番号１１で表される塩基配列中の１５４〜１８２７番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｉｉ）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）（ｘｉｉｉ）配列番号１４で表される塩基配列、（ｘｉｖ）配列番号１４で表される塩基配列中の１５４〜１８２１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｖ）配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｏ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［４］前記リモネンシンターゼは、以下の（Ａ）〜（Ｏ）からなる群より選ばれる１又は２以上のタンパク質である、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）（ｉ’）配列番号１で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の６５〜６３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）（ｉｉｉ’）配列番号４で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｖ’）配列番号４で表されるアミノ酸配列中の６９〜６３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｆ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｇ）（ｖ’）配列番号７で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉ’）配列番号７で表されるアミノ酸配列中の５７〜５９９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｉ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｊ）（ｖｉｉ’）配列番号１０で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉｉｉ’）配列番号１０で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｋ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｌ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｍ）（ｉｘ’）配列番号１３で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｘ’）配列番号１３で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（Ｎ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｏ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質。
［５］前記リモネンシンターゼは、Ｐｉｃｅａ属、Ａｂｉｅｓ属、Ｍｅｎｔｈａ属、又はＣｉｔｒｕｓ属に属する植物由来のリモネンシンターゼである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記リモネンシンターゼは、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、アラスカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｕ）、又はレモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）由来のリモネンシンターゼである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記細菌は、さらにゲラニル二リン酸シンターゼを発現する細菌である［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記細菌が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の合成能を有する、［１］〜［７］のいずれか１項記載の方法。
［９］前記細菌が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の合成能を有する、［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法。
［１０］前記細菌は、２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されている微生物である、［１］〜［９］のいずれか１項記載の方法。
［１１］２−ケトグルコン酸生成経路が、グルコース脱水素酵素活性の低減により遮断されている、［１０］記載の方法。
［１２］前記細菌において、グルコース脱水素酵素遺伝子であるポリヌクレオチドが破壊されている、［１１］記載の方法。
［１３］前記ポリヌクレオチドは、以下の（ｘ）〜（ｚ）からなる群より選ばれる１又は２以上のポリヌクレオチドである、［１２］記載の方法。
（ｘ）〔ｉ〕配列番号１８で表される塩基配列、もしくは〔ｉｉ〕配列番号１８で表される塩基配列中３０１〜２６９１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｚ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１４］前記グルコース脱水素酵素は、以下の（Ｘ）〜（Ｚ）からなる群より選ばれる１又は２以上のタンパク質である、［１２］又は［１３］記載の方法。
（Ｘ）配列番号１９で表される全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｙ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質；及び
（Ｚ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質。
［１５］前記細菌は、パントエア・アナナティスである、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、リモネンを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを示す図である。
【図２】図２は、ｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳのマップを示す図である。
【図３】図３は、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳ染色体固定用プラスミドを示す図である。
【図４】図４は、（Ａ）ＰｌｌｄＤ、（Ｂ）ＰｐｈｏＣ、または（Ｃ）ＰｐｓｔＳの転写制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを示す図である。
【図５】図５は、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲベクターの構築の概要を示す図である。
【図６】図６は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ染色体固定用発現ベクターを示す図である。
【図７】図７は、化学合成により得られたＫＤｙＩオペロン中のコドン最適化を示す図である。
【図８】図８は、コドン最適化したＫＤｙＩオペロンを保持する、（Ａ）ｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体固定プラスミドを示す図である。
【図９】図９は、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドを示す図である。
【図１０】図１０は、（Ａ）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、（Ｂ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、および（Ｃ）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを示す図である。
【図１１】図１１は、（Ａ）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）、および（Ｂ）Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）のゲノム改変物のマップを示す図である。
【図１２】図１２は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｃ）ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体改変物のマップを示す図である。
【図１３】図１３は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ、および（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳの染色体改変物のマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、リモネンの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法は、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を培養培地中で培養してリモネンを生成することを含む。
【００１４】
リモネンは、Ｃ10Ｈ16で表されるイソプレノイド化合物の１種である。ＣＡＳ番号１３８−８６−３で表され、Ｒ体は５９８９−２７−５、Ｓ体は５９８９−５４−８で表記される。
【００１５】
本発明の方法は、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を培養培地中で培養してリモネンを生成することを含む。
【００１６】
リモネンシンターゼとは、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からのリモネンの合成に関与する１以上の酵素をいう。リモネンシンターゼとしては、例えば、Ｐｉｃｅａ属植物（例えば、アラスカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、オウシュウトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ））、Ａｂｉｅｓ属植物（例えば、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ））、Ｍｅｎｔｈａ属植物（例えば、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ））、Ｃａｎｎａｂｉｓ属植物（例えば、大麻草（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））、Ｓｏｌａｎｕｍ属植物（例えば、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、Ｒｉｃｃｉｏｃａｒｐｏｓ属植物（例えば、イチョウウキゴケ（Ｒｉｃｃｉｏｃａｒｐｏｓ  ｎａｔａｎｓ））、Ｐｅｒｉｌｌａ属植物（例えば、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））、Ａｇａｓｔａｃｈｅ属植物（例えば、カワミドリ（Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ））、Ｃｉｔｒｕｓ属植物（例えば、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｕ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ））、Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ属植物（例えば、ケイガイ（Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ））、Ｒｉｃｉｎｕｓ属植物（例えば、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ））、Ｌａｖａｎｄｕｌａ属植物（例えば、ラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ））由来のリモネンシンターゼが挙げられる。これらのうち、Ｐｉｃｅａ属、Ａｂｉｅｓ属、Ｍｅｎｔｈａ属、又はＣｉｔｒｕｓ属に属する植物由来のリモネンシンターゼが好ましく、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、アラスカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｕ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）由来のリモネンシンターゼがより好ましい。
【００１７】
遺伝子、プロモーター等の核酸配列、またはタンパク質等のアミノ酸配列について本明細書中で用いられる語句「由来」は、微生物により天然またはネイティブに合成される、あるいは天然または野生型の微生物から単離され得るヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味し得る。
【００１８】
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）およびパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、パントエア・アナナティスＳＣ１７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１９０１）、パントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株（ＶＫＰＭ  Ｂ−９２４６）（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）が挙げられる。
【００１９】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、例えば、リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む発現ベクターでパントエア属細菌を形質転換することにより得ることができる。
【００２０】
リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｏ）よりなる群より選ばれる１以上のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）（ｉ）配列番号２で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号２で表される塩基配列中の１９３〜１９０５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｉｉ）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）（ｉｖ）配列番号５で表される塩基配列、（ｖ）配列番号５で表される塩基配列中の２０５〜１９１４番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｖｉ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）前記（ｉｖ）、（ｖ）もしくは（ｖｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）（ｖｉｉ）配列番号８で表される塩基配列、（ｖｉｉｉ）配列番号８で表される塩基配列中の１６９〜１８００番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｉｘ）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）前記（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）もしくは（ｉｘ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）（ｘ）配列番号１１で表される塩基配列、（ｘｉ）配列番号１１で表される塩基配列中の１５４〜１８２７番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｉｉ）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）前記（ｘ）、（ｘｉ）もしくは（ｘｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）（ｘｉｉｉ）配列番号１４で表される塩基配列、（ｘｉｖ）配列番号１４で表される塩基配列中の１５４〜１８２１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列、もしくは（ｘｖ）配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｏ）前記（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）もしくは（ｘｖ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
配列番号２で表される塩基配列は、アラスカトウヒ由来リモネンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号２で表される塩基配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜１９２番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、１９３〜１９０５（１９０２）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟リモネンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列における１９３〜１９０５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列にあるコドンが改変されており、さらに５’末端にメチオニンコドンが付加されているヌクレオチド配列からなる。
配列番号５で表される塩基配列は、アメリカオオモミ由来リモネンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号５で表される塩基配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜２０４番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、２０５〜１９１４（１９１１）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟リモネンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。配列番号６で表される塩基配列は、配列番号５で表される塩基配列における２０５〜１９１４番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列にあるコドンが改変されており、さらに５’末端にメチオニンコドンが付加されているヌクレオチド配列からなる。
配列番号８で表される塩基配列は、スペアミント由来リモネンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号８で表される塩基配列は、配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜１６８番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、１６９〜１８００（１７９７）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟リモネンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。配列番号９で表される塩基配列は、配列番号８で表される塩基配列における１６９〜１８００番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列にあるコドンが改変されており、さらに５’末端にメチオニンコドンが付加されているヌクレオチド配列からなる。
配列番号１１で表される塩基配列は、ウンシュウミカン由来リモネンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号１１で表される塩基配列は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜１５３番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、１５４〜１８２７（１８２４）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟リモネンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。配列番号１２で表される塩基配列は、配列番号１１で表される塩基配列における１５４〜１８２７番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列にあるコドンが改変されており、さらに５’末端にメチオニンコドンが付加されているヌクレオチド配列からなる。
配列番号１４で表される塩基配列は、レモン由来リモネンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号１４で表される塩基配列は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜１５３番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、１５４〜１８２１（１８１８）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟リモネンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。配列番号１５で表される塩基配列は、配列番号１４で表される塩基配列における１５４〜１８２１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列にあるコドンが改変されており、さらに５’末端にメチオニンコドンが付加されているヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
塩基配列との同一性％は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。リモネンシンターゼ活性とは、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からリモネンを生成する活性をいう（以下同様）。
【００２３】
塩基配列の同一性％および後述するようなアミノ酸配列の同一性％は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００２４】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性を有する実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２５】
上記（ａ）〜（ｏ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、チミン塩基をウラシル塩基に置換することにより対応するＤＮＡから得られるＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００２６】
リモネンシンターゼは、以下の（Ａ）〜（Ｏ）からなる群より選ばれる１以上のタンパク質であることが好ましい。
（Ａ）（ｉ’）配列番号１で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の６５〜６３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）（ｉｉｉ’）配列番号４で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｖ’）配列番号４で表されるアミノ酸配列中の６９〜６３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｆ）前記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｇ）（ｖ’）配列番号７で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉ’）配列番号７で表されるアミノ酸配列中の５７〜５９９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｉ）前記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｊ）（ｖｉｉ’）配列番号１０で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｖｉｉｉ’）配列番号１０で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｋ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｌ）前記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｍ）（ｉｘ’）配列番号１３で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｘ’）配列番号１３で表されるアミノ酸配列中の５２〜６０６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（Ｎ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｏ）前記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリモネンシンターゼ活性を有するタンパク質。
【００２７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１〜６４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルを含み得る。６５〜６３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟リモネンシンターゼを含み得る。配列番号４で表されるアミノ酸配列中の１〜６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルを含み、６９〜６３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟リモネンシンターゼを含み得る。配列番号７で表されるアミノ酸配列中の１〜５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルを含み、５７〜５９９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟リモネンシンターゼを含み得る。配列番号１０で表されるアミノ酸配列中の１〜５１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルを含み、５２〜６０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟リモネンシンターゼを含み得る。配列番号１３で表されるアミノ酸配列中の１〜５１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルを含み、５２〜６０６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟リモネンシンターゼを含み得る。微生物で成熟リモネンシンターゼの発現を実施する場合には、通常、Ｎ末端にメチオニン残基が付加された配列を用いる。
【００２８】
アミノ酸配列との同一性％は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００２９】
アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。上記（Ａ）〜（Ｏ）のタンパク質は、Ｎ末端に開始メチオニン残基を有していてもよい。上記（Ａ）〜（Ｏ）のタンパク質は、Ｃ末端にヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。
【００３０】
（Ｂ）及び（Ｃ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のリモネンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。（Ｅ）及び（Ｆ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ｉｉｉ’）もしくは（ｉｖ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のリモネンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。（Ｈ）及び（Ｉ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ｖ’）もしくは（ｖｉ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のリモネンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。（Ｋ）及び（Ｌ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ｖｉｉ’）もしくは（ｖｉｉｉ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のリモネンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。（Ｎ）及び（Ｏ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ｉｘ’）もしくは（ｘ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のリモネンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
【００３１】
上記タンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、タンパク質中の変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号１、４、７、１０又は１３により表されるアミノ酸配列、および他のリモネンシンターゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、リモネンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００３２】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖（例、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００３３】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、ゲラニル二リン酸シンターゼも発現することが好ましい。ゲラニル二リン酸は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ、ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（ユビキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７−１１４６）。ゲラニル二リン酸シンターゼとしては、例えば、エシェリヒア・コリ由来のゲラニル二リン酸シンターゼが挙げられる。もしくは、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）（例えば、国際公開第２００７／０２９５７７Ａ１号）由来、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、特開２０００−２４５４８２号公報）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、放線菌（国際公開第２００７／０２９５７７Ａ１号）等の微生物由来のゲラニル二リン酸シンターゼが挙げられる。また、アメリカオオモミ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ×  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、オウシュウトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）等の植物由来のゲラニル二リン酸シンターゼが挙げられる。
【００３４】
ゲラニル二リン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、以下の（ｐ）、（ｑ）及び（ｒ）からなる群より選ばれる１以上のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｐ）（ｘｖｉ）配列番号１６で表される塩基配列、もしくは（ｘｖｉｉ）配列番号１７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）前記（ｘｖｉ）、もしくは（ｘｖｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｒ）前記（ｘｖｉ）、もしくは（ｘｖｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３５】
配列番号１６で表される塩基配列は、エシェリヒア・コリ由来ファルネシル二リン酸／ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列である。配列番号１７で表される塩基配列は、配列番号１６で表される塩基配列にあるコドンが改変されており、セリンコドンがフェニルアラニンコドンに変異している。この変異ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子によりコードされるタンパク質は、ゲラニル二リン酸シンターゼとして知られている（Ｒｅｉｌｉｎｇ  ＫＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２）  ２００−２１２）。ゲラニル二リン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、上記のＳ８０Ｆ変異に限らず、同様の効果が得られる変異を有していてもよく、変異はＳ８０Ｆ変異に限定されるものではない。また、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子の由来はエシェリヒア・コリに限定されるものではなく、例えばバチルス・ステアロサーモフィルス由来のファルネシル二リン酸シンターゼにおいて、菌体内のゲラニル二リン酸の濃度を高める変異が明らかにされている（Ｎａｒｉｔａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２６（３）５６６−５７１．）。また、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子への変異導入によって得られるゲラニル二リン酸シンターゼに限らず、元々ゲラニル二リン酸シンターゼとして機能する遺伝子を用いても良い。例えば、ニチニチソウ由来ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子（Ｒａｉ  Ａ.,    ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．６（５）１５３１−４９）、シロイヌナズナ由来ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子（Ｃａｍａｒａ  Ｂ，．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２４  （２），  ２４１−２５２）、放線菌由来ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子（国際公開第２００７／０２９５７７Ａ１号）等を用いてもよい。ゲラニル二リン酸シンターゼ活性とは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからゲラニル二リン酸を生成する活性をいう。ファルネシル二リン酸シンターゼ活性とは、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からファルネシル二リン酸を生成する活性をいう。塩基配列の同一性、ストリンジェントな条件、ポリヌクレオチドの定義は、上記（ａ）〜（ｏ）のポリヌクレオチドにて説明したのと同様である。
【００３６】
ゲラニル二リン酸シンターゼは、以下の（Ｐ）〜（Ｒ）からなる群より選ばれる１以上のタンパク質であることが好ましい。
（Ｐ）配列番号７６又は７７で表される全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｑ）前記アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質；及び
（Ｒ）前記アミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【００３７】
配列番号７６で表されるアミノ酸配列は、成熟ファルネシル二リン酸／ゲラニル二リン酸シンターゼを含み得る。配列番号７７で表されるアミノ酸配列は、変異型成熟ファルネシル二リン酸／ゲラニル二リン酸シンターゼを含み得る。（Ｑ）及び（Ｒ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、配列番号７６又は７７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質のゲラニル二リン酸シンターゼ活性の、好ましくはゲラニル二リン酸シンターゼ活性及びファルネシル二リン酸シンターゼ活性の、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の活性を有することが好ましい。欠失、置換、付加もしくは挿入の定義、アミノ酸の同一性等については、上記（Ａ）〜（Ｏ）のタンパク質にて説明したのと同様である。
【００３８】
本発明で用いられる細菌が含み得る発現単位では、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびプロモーターの一方は、宿主細胞に固有のものではない。したがって、発現単位は、異種発現単位であり得る。好ましくは、リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド、必要に応じて含まれるゲラニル二リン酸シンターゼ、およびプロモーターのいずれもが、宿主細胞に固有のものではない。プロモーターは、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよい。発現単位はさらに、ターミネーター、リボソーム結合部位、および薬物耐性遺伝子等のさらなるエレメントを含んでいてもよい。発現単位はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。異種発現単位は、リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド以外のタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。斯かるタンパク質としては、例えば、リモネンシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、イソプレンシンターゼ、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素、およびメバロン酸経路に関与する１以上の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。  
【００３９】
本発明で用いられる細菌は、例えば、以下の発現ベクターで形質転換することにより得ることができる：リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む発現ベクター；リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド、ゲラニル二リン酸シンターゼ及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む発現ベクター；リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の発現単位と、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の発現単位とを含む発現ベクター；及び、リモネンシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む第１の発現ベクターと、ゲラニル二リン酸シンターゼ及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む第２の発現ベクターの組み合わせ。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、リモネンシンターゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーター、または誘導型プロモーターの制御下に配置され得る。構成型プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。誘導型プロモーターとしては、例えば、後述の増殖促進剤逆依存プロモーターが挙げられる。用語「作動可能に連結された」とは、調節領域のヌクレオチド配列が核酸分子又は遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）のヌクレオチド配列にポリヌクレオチドの発現（例、増強された、向上された、構成的な、基礎的な、抗転写終結の、弱毒化された、調節解除された、減少した、又は抑制された、発現）が可能な形式で連結しており、これによりヌクレオチド配列によりコードされるポリヌクレオチドの発現産物が生産されることを意味する。
【００４０】
ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ、ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（ユビキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７−１１４６）。リモネンシンターゼを発現するパントエア族細菌は、ジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸供給経路によるジメチル二リン酸の合成能を有することが好ましい。ジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸供給経路としては、例えば、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及びメバロン酸（ＭＶＡ）経路が挙げられる。
【００４１】
リモネンの材料であるＤＭＡＰＰは、通常、微生物が固有またはネイティブに有するメチルエリスリトールリン酸経路またはメバロン酸経路のいずれかにより生合成される。したがって、効率的なリモネンの製造のためのＤＭＡＰＰの供給の観点から、本発明で用いられる細菌は、後述するように、メチルエリスリトールリン酸経路および／またはメバロン酸経路が強化されていてもよい。
【００４２】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、ジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸供給経路を有し、かつ２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されていることが好ましい。
【００４３】
本発明で用いる細菌は、２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されている細菌であることが好ましい。２−ケトグルコン酸生成経路においては、グルコースがグルコース脱水素酵素により酸化されてグルコン酸が生成し、次いでグルコン酸がグルコン酸２−ケト脱水素酵素により酸化されてＮＡＤＰＨと２−ケトグルコン酸が生成される。よって、２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されている細菌は、グルコース脱水素酵素（ＧＣＤ）及びグルコン酸２−ケト脱水素酵素からなる群より選ばれる１以上の酵素の活性を低減させることにより得ることができる。好ましくは、２−ケトグルコン酸生成経路は、酵素活性の低減により遮断される。すなわち、本発明で用いる細菌は、グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコン酸２−ケト−デヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素の酵素活性が低減しており、これにより細菌内で２−ケトグルコン酸生成経路が遮断されている。
【００４４】
細菌における酵素活性の低減は、例えば、酵素活性の低下及び完全消失を含む。また、細菌における酵素活性の低減は、例えば、細菌における酵素の発現の低下及び完全消失を含む。細菌における酵素の発現の低下又は完全消失は、細菌が保有する活性の低下又は完全消失につながるためである。細菌における酵素活性の低減は、例えば、酵素をコードする遺伝子、酵素の発現又は活性を調節し得る因子をコードする遺伝子、又はこれらの遺伝子の上流に位置する転写調節領域、翻訳調節領域等の発現調節領域（例、プロモーター、シャインダルガルノ（ＳＤ）配列）、非翻訳領域を破壊することにより達成することができる。上記の遺伝子又は領域の破壊は、酵素の発現又は活性を低下又は完全消失させるように、上記の遺伝子又は領域に対応するゲノム領域を改変することにより行うことができる。このような改変としては、例えば、上記ゲノム領域の一部又は全ての欠失、上記ゲノム領域へのポリヌクレオチドの挿入、および上記ゲノム領域の別のポリヌクレオチドへの交換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を合成する能力のある、あるいは、培養環境中に含まれるＰＱＱを利用する能力のある細菌であることが好ましい。
【００４６】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、グルコース脱水素酵素の活性が低減していることが好ましく、ＰＱＱを補酵素として利用するグルコース脱水素酵素の活性が低減していることがより好ましい。
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌が、リモネンシンターゼの発現ベクターで、本来的に２−ケトグルコン酸経路を有しているパントエア属細菌等の宿主を形質転換して得られる場合には、該細菌は２−ケトグルコン酸経路を遮断するための改変がなされることが好ましい。
例えば、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科に属する微生物はグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持ち、ＧＣＤアポ酵素を産生するが、ＰＱＱ産生能を有していないため、ＰＱＱ非添加ではＧＣＤ活性を有しない。しかしながらある外来遺伝子を菌体内で発現させるとＰＱＱを代替する物質が生成し、ＧＣＤ活性を発現することが知られている（ＷＯ２００６／１３３８９８）。ＧＣＤ活性を後天的に獲得した上述の腸内細菌科に属する微生物等の微生物は、本発明における「本来的に２−ケトグルコン酸経路を有する微生物」に含まれる。
【００４７】
２−ケトグルコン酸生成経路を遮断するための改変は、グルコース脱水素酵素活性を低減するための改変であることが好ましく、ＰＱＱを補酵素として利用するグルコース脱水素酵素活性を低減するための改変であることが好ましい。改変は、細菌の細胞あたりのＧＣＤ活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなるように行い得る。例えば、改変株の細胞あたりのＧＣＤの分子数、又は分子あたりのＧＣＤ活性が、野生株のそれよりも低下すればよい。細胞あたりのＧＣＤ活性の比較は、例えば、同じ条件で培養した改変株と野生株の細胞抽出液に含まれるＧＣＤ活性を比較することによって、行うことができる。比較の対照となり得る野生型のパントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、パントエア・アナナティスＳＣ１７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１９０１）、パントエア・アナナティス  ＳＣ１７（０）株（ＶＫＰＭ  Ｂ−９２４６）（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）が挙げられる。
【００４８】
ＰＱＱを補酵素とするＧＣＤの活性は、下記反応を触媒する活性をいう（以下同様）。
【００４９】
β−Ｄ−グルコース＋酸化型ＰＱＱ→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋還元型ＰＱＱ
【００５０】
ＧＣＤ活性は、例えば、以下の反応を介した還元型ＤＣＰＩＰの生成を６００ｎｍの吸光度を測定による検出に基づき、測定することができる（特開２００７−１２９９６５；以下同様）。
【００５１】
Ｄ−グルコース＋酸化型ＰＭＳ→Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋還元型ＰＭＳ
還元型ＰＭＳ＋酸化型ＤＣＰＩＰ→酸化型ＰＭＳ＋還元型ＤＣＰＩＰ
ＰＭＳ：フェナジンメトサルフェート
ＤＣＰＩＰ：２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール
【００５２】
ＧＣＤの活性は、ＧＣＤをコードする遺伝子（ｇｃｄ遺伝子）、ＧＣＤの発現又は活性を調節し得る因子をコードする遺伝子、又はこれらの遺伝子の上流に位置する転写調節領域を破壊することにより低減させることができる。
【００５３】
ｇｃｄ遺伝子としては、以下の（ｘ）〜（ｚ）よりなる群より選ばれる１以上のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｘ）〔ｉ〕配列番号１８で表される塩基配列、もしくは〔ｉｉ〕配列番号１８で表される塩基配列中３０１〜２６９１番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｚ）前記〔ｉ〕もしくは〔ｉｉ〕の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５４】
配列番号１８に示す塩基配列は、パントエア・アナナティスのｇｃｄ遺伝子の完全長の塩基配列である。配列番号１８で表される塩基配列は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列をコードし、３０１〜２６９１（２６８８）番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、ＧＣＤのアミノ酸配列をコードし得る。塩基配列の同一性、ストリンジェントな条件、ポリヌクレオチドの定義は、上記（ａ）〜（ｏ）のポリヌクレオチドにて説明したのと同様である。
【００５５】
ＧＣＤは、以下の（Ｘ）〜（Ｚ）からなる群より選ばれる１以上のタンパク質であることが好ましい。
（Ｘ）配列番号１９で表される全長アミノ酸配列、もしくは〔ｉｉ’〕配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１〜７９６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｙ）前記〔ｉ’〕もしくは〔ｉｉ’〕のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質；及び
（Ｚ）前記〔ｉ’〕もしくは〔ｉｉ’〕のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＧＣＤ活性を有するタンパク質。
【００５６】
配列番号１９で表されるアミノ酸配列は、ＧＣＤを含み得る。（Ｙ）及び（Ｚ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質のＧＣＤ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。欠失、置換、付加もしくは挿入の定義、アミノ酸の同一性等については、（Ａ）〜（Ｏ）のタンパク質にて説明したのと同様である。
【００５７】
ｇｃｄ遺伝子は、これらの配列に基づき、オリゴヌクレオチドを合成し、パントエア・アナナティスの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングすることができる。ｇｃｄ遺伝子の破壊は、相同組換えにより行ってもよい。この場合、染色体上のｇｃｄ遺伝子と一定以上の相同性、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子を用いてもよい。また、染色体上のｇｃｄ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いてもよい。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００５８】
ｇｃｄ遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の標的遺伝子の上下流の配列を含めた標的遺伝子全体の欠失、ｇｃｄ遺伝子の不活化は、染色体上のｇｃｄ遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）の導入、終始コドンの導入（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異の導入によっても達成出来る（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２：８６１１−８６１７（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ  ９５  ５５１１−５５１５（１９９８），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６，２０８３３−２０８３９（１９９１））。
【００５９】
各遺伝子の破壊は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法としては例えば、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列（例、プロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域）の一部又は全部を欠失させること、又はこれらの領域にポリヌクレオチドを挿入することが挙げられる。
【００６０】
発現調節配列の破壊は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、更に好ましくは３塩基以上につき行われる。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低減するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を破壊することができる。欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００６１】
コード領域にポリヌクレオチドを挿入する場合、挿入位置は、標的遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を破壊することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。ポリヌクレオチドとしては、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を低減させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子を又はＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００６２】
染色体上の標的遺伝子を上記のように改変する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。まず、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生できない変異遺伝子を作製する。次に、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、変異遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を変異遺伝子に置換する。得られる欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、その活性が低減する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立している。例えば、「Ｒｅｄドリブンインテグレーション(Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ)」と呼ばれる方法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−６６４５（２０００））、又は、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Ｃｈｏ，Ｅ．Ｈ．，Ｇｕｍｐｏｒｔ，Ｒ．Ｉ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５２００−５２０３（２００２））とを組合わせた方法（ＷＯ２００５／０１０１７５号）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達能力を有するプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などが挙げられる（米国特許第６３０３３８３号明細書、または特開平０５−００７４９１号公報）。
【００６３】
標的遺伝子の転写が低下するか否かの確認は、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），２００１））。転写量は、野生株あるいは非改変株のいずれかと比較して低下していればよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも７５％以下、５０％以下、２５％以下、又は１０％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【００６４】
標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＵＳＡ），２００１））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも７５％以下、５０％以下、２５％以下、又は１０％以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【００６５】
ＧＣＤの活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、パントエア属に属する細菌等の腸内細菌科に属する微生物を紫外線照射または、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＧＣＤの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。
【００６６】
ＧＣＤの活性は、ＰＱＱの合成能の低減によっても低減させることができる。ＰＱＱの合成能は、例えば、ＰＱＱ生合成に必要なオペロンであるｐｑｑＡＢＣＤＥＦの一部又は全部を欠失させることによって、低下させることができる（Ｊ．Ｓ．Ｖｅｌｔｅｒｏｐ，Ｐ．Ｗ．Ｐｏｓｔｍａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７（１７）：５０８８−５０９８（１９９５））。
【００６７】
リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、好気性微生物、嫌気性微生物のいずれであってもよい。微生物を好気条件下で培養するときは、培地中の溶存酸素の濃度は微生物の増殖に十分な程度以上の濃度であればよい。好気性微生物の増殖に十分である培地中の溶存酸素の濃度は、好気性微生物の増殖を促進できる濃度である限り特に限定されず、例えば１ｐｐｍ以上、３ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、または７．２２ｐｐｍ以上であってもよい。好気性微生物の増殖のための溶存酸素の濃度はまた、例えば０．３ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。
【００６８】
リモネンシンターゼを発現する微生物は、効率的なリモネンの製造のためのＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの供給の観点からジメチルアリル二リン酸供給経路によるジメチル二リン酸の合成能を有することが好ましい。ジメチルアリル二リン酸供給経路としては、例えば、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及びメバロン酸（ＭＶＡ）経路が挙げられる。
【００６９】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する１以上の酵素（例、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００７０】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、これらの酵素をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００７１】
リモネンの材料であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、上記のとおり通常、微生物が固有に有するメチルエリスリトールリン酸経路又はメバロン酸経路のいずれかにより生合成される。そのため、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、さらにリモネンの基礎的材料（例、イソプレンシンターゼの基質）であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。
このような強化のため、本発明で用いられるパントエア属細菌は、リモネンシンターゼに加えて、メバロン酸キナーゼをさらに発現していてもよい。したがって、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、メバロン酸キナーゼ発現ベクターで形質転換されていてもよい。メバロン酸キナーゼ遺伝子としては、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）等のメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）等のメタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ）等のメタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、およびニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）等のニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物の遺伝子が挙げられる。
リモネンシンターゼを発現する微生物は、メバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素発現ベクターにより形質転換されていてもよい。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。具体的には、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。構成型プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。
このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を一緒または個別に発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種、例えば、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）、放線菌、植物に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
放線菌としては例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｐｈｙｔｏｃｏｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ属、Ａｌｌｏａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ属、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｃｒｏｓｓｉｅｌｌａ属、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ属、Ｈａｌｏｅｃｈｉｎｏｔｈｒｉｘ属、Ｋｉｂｄｅｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ属、Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ属、Ｌａｂｅｄａｅａ属、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ属、Ｌｅｎｔｚｅａ属、Ｌｏｎｇｉｍｙｃｅｌｉｕｍ属、Ｐｒａｕｓｅｒｅｌｌａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ属、Ｓｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ属、Ｔａｍａｒｉｃｉｈａｂｉｔａｎｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｕｎｉｃａ属、Ｕｍｅｚａｗａｅａ属、Ｙｕｈｕｓｈｉｅｌｌａ属等の微生物が挙げられる。植物の例としては、前述したリモネンシンターゼの由来する植物の具体例が挙げられる。
【００７２】
発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路及び／又はメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００７３】
また、メチルエリスリトールリン酸経路及び／又はメバロン酸経路強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼが、微生物に導入されてもよい。
【００７４】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００７５】
上述したような遺伝子を含む発現ベクターによる宿主の形質転換は、１以上の公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００７６】
本発明の方法は、以下の１）〜３）を含むことが好ましい。
１）十分な濃度の増殖促進剤の存在下でリモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌（以下、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を「微生物」と称することがある）を培養し増殖させること；
２）増殖促進剤の濃度を減少させて、前記微生物によるリモネンの生成を誘導すること；および
３）前記微生物を培養してリモネンを生成すること。
【００７７】
効率的なリモネンの製造の観点から、微生物の増殖期に対応する上記工程１）、およびリモネンの生成期に対応する上記工程３）が分離される。また、上記工程２）は、微生物の増殖期からリモネンの生成期に移行させるため、リモネン生成の誘導期に対応する。
【００７８】
増殖促進剤とは、微生物により消費され得る、微生物の増殖に必須の因子または微生物の増殖の促進作用を有する因子であって、微生物により消費され培地中の量が減少すると微生物の増殖が喪失または低減するものをいう。例えば、ある量の増殖促進剤を用いた場合、その量の増殖促進剤が消費されるまで微生物は増殖し続けるが、一旦増殖促進剤が全て消費されると、微生物は増殖し得ず、または増殖速度が低下し得る。したがって、増殖促進剤により、微生物の増殖の程度を調節することができる。このような増殖促進剤としては、例えば、酸素（ガス）等の物質；鉄、マグネシウム、カリウム、カルシウムのイオン等のミネラル；リン酸（例、モノリン酸、二リン酸、ポリリン酸）またはその塩等のリン化合物；アンモニア、硝酸、亜硝酸、尿素等の窒素化合物（ガス）；硫酸アンモニウム、チオ硫酸等の硫黄化合物；ビタミン（例、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、アスコルビン酸）、およびアミノ酸（例、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン）等の栄養素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法では、１種の増殖促進剤を用いてもよいし、２種以上の増殖促進剤を組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
本発明の方法が上記工程１）〜３）を含む場合、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、増殖促進剤に依存して増殖する能力、および増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してリモネンを生成する能力を有する、酵素反応によるリモネン合成能を付与された微生物であることが好ましい。斯かる微生物は、微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、増殖できる。ここで、「十分な濃度」とは、微生物の増殖に有効な濃度で増殖促進剤が用いられることをいい得る。表現「増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してリモネンを生成する能力」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、リモネンを少しも生成できず、またはリモネンの生成効率が低いが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、リモネンを生成できること、またはリモネンの生成効率が高いことを意味し得る。したがって、本発明で好ましく用いられる微生物は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、良好に増殖し得るが、リモネンを生成できず、またはリモネンの生成効率が低い。本発明で用いられる微生物はまた、不十分な濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、良好に増殖し得ないが、リモネンを生成でき、またはリモネンの生成効率が高いことが好ましい。
【００８０】
本発明の方法が上記工程１）〜３）を含む場合、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌のリモネンシンターゼ遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にあり得る。表現「増殖促進剤逆依存性プロモーター」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、転写活性を有しない、または低い転写活性を有するが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、転写活性を有する、または高い転写活性を有するプロモーターを意味し得る。したがって、増殖促進剤逆依存性プロモーターは、微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、リモネンシンターゼ遺伝子の発現を抑制でき、一方、微生物の増殖に不十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、リモネンシンターゼ遺伝子の発現を促進できる。具体的には、微生物は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にある。
【００８１】
例えば、増殖促進剤がリン化合物である場合、リン欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。表現「リン欠乏誘導型プロモーター」とは、低濃度のリン化合物で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低濃度のリン化合物とは、（遊離）リン濃度１００ｍｇ／Ｌ以下の条件をいい得る。表現「リン」は、表現「リン化合物」と同義であり、それらは交換可能な様式で使用され得る。総リン濃度は、溶液中の全種のリン化合物を、強酸あるいは酸化剤によってオルトリン酸態リンに分解して定量可能である。リン欠乏条件下の総リン濃度は、１００ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。リン欠乏誘導型プロモーターとしては、例えば、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＡ）のプロモーター、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＣ）のプロモーター、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＲ）のプロモーター、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＢ）のプロモーター、およびリン取り込み担体をコードする遺伝子（例、ｐｓｔＳ）のプロモーターが挙げられる。
【００８２】
上記工程１）では、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌が、十分な濃度の増殖促進剤の存在下で増殖される。より具体的には、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌の増殖は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、培地中でリモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を培養することにより行うことができる。
【００８３】
例えば、リン化合物が増殖促進剤として用いられる場合、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌は、十分な濃度のリン化合物の存在下で良好に増殖することができるので、リン化合物は、増殖促進剤として作用することができる。増殖促進剤がリン化合物である場合、１）において、増殖に十分なリン化合物の濃度は、特に限定されないが、例えば２００ｍｇ／Ｌ以上、３００ｍｇ／Ｌ以上、５００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、または２０００ｍｇ／Ｌ以上であってもよい。増殖のためのリン化合物の濃度はまた、例えば２０ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、または５ｇ／Ｌ以下であってもよい。
【００８４】
上記工程２）では、微生物によるリモネンの生成の誘導が、増殖促進剤の濃度を減少させることにより行われる。より具体的には、増殖促進剤の濃度の減少は、培地中への増殖促進剤の供給量を低下させることにより、行うことができる。増殖促進剤の濃度の減少はまた、培地中への増殖促進剤の供給量を１）２）を通じて一定にした場合であっても、微生物の増殖を利用して行うことができる。１）における微生物の増殖の初期では、微生物が十分に増殖しておらず、培地中の微生物数が少ないため、微生物による増殖促進剤の消費も相対的に少ない。したがって、増殖の初期では、培地中の増殖促進剤の濃度は、相対的に高い。一方、１）における微生物の増殖の後期では、微生物が十分に増殖しており、培地中の微生物数が多いため、微生物による増殖促進剤の消費も相対的に多い。したがって、増殖の後期では、培地中の増殖促進剤の濃度は、相対的に低くなる。このように、一定量の増殖促進剤を、１）２）を通じて培地中に供給し続けた場合、微生物の増殖と反比例して、培地中の増殖促進剤の濃度は減少する。この減少した濃度をトリガーとして、微生物によるリモネンの生成を誘導することができる。
【００８５】
例えば、リン化合物またはアミノ酸が増殖促進剤として用いられる場合、微生物によるリモネンの生成を誘導できる培地中のリン化合物またはアミノ酸の培地中の濃度は、例えば１００ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、または１０ｍｇ／Ｌ以下であり得る。
【００８６】
上記工程３）では、リモネンの生成が、微生物を培養することにより行われる。より具体的には、リモネンの生成は、増殖促進剤の濃度が減少した２）の条件下において培地中で微生物を培養することにより行うことができる。培地中の増殖促進剤の濃度は、微生物によるリモネンの生成を可能にするため、２）で上述したような濃度に維持され得る。
【００８７】
本発明の方法では、３）における微生物の培養期間を、１）のその期間よりも長く設定することも可能である。誘導剤を利用する従来の方法では、より多量のリモネンを得るためには、リモネンの生成期において誘導剤を用いて微生物を長期培養する必要があった。しかし、長期培養すると誘導剤が分解することから、微生物がリモネンの生産能を維持できなくなる。そのため、誘導剤を継続的に培養培地に添加する必要があるが、誘導剤は高価であり得、リモネン製造費が上昇し得る。したがって、リモネンの生成期において誘導剤を用いる微生物の長期培養は、その培養期間の長さに応じて、リモネンの製造費が上昇し得るという問題があった。一方、３）において誘導剤等の特定物質を用いない本発明の方法では、当該特定物質の分解を考慮する必要がなく、リモネンの生成期における長期培養がリモネン製造費の上昇を引き起こすという従来の問題も生じない。したがって、本発明の方法は、誘導剤を用いる従来の方法とは異なり、３）の期間を長く設定し易い。本発明の方法では、３）の期間を長く設定すればするほど、より多量のリモネンを製造することができる。
【００８８】
本発明の方法は、リモネンの生成量をさらに向上させる観点等から、他の方法と併用されてもよい。このような方法としては、例えば、光（Ｐｉａ  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｓｕｎｇｓｏｏｎ  Ｐａｒｋ，Ａｎａｓｔａｓｉｏｓ  Ｍｅｌｉｓ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２（２０１０）：７０−７９）または温度（Ｎｏｒｍａ  Ａ  Ｖａｌｄｅｚ−Ｃｒｕｚ，Ｌｕｉｓ  Ｃａｓｐｅｔａ，Ｎeｓｔｏｒ  Ｏ  Ｐeｒｅｚ，Ｏｃｔａｖｉｏ  Ｔ  Ｒａｍiｒｅｚ，Ｍａｕｒｉｃｉｏ  Ａ  Ｔｒｕｊｉｌｌｏ−Ｒｏｌｄaｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１０，９：１）等の環境因子を利用する方法、ｐＨの変化（ＥＰ  １２３３０６８  Ａ２）、界面活性剤の添加（ＪＰ  １１００９２９６  Ａ）、自己誘導法（ＷＯ２０１３／１５１１７４）が挙げられる。
【００８９】
本発明の方法で用いられる培地は、リモネン生成のための炭素源を含んでいてもよい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００９０】
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β−１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
【００９１】
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
【００９２】
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
【００９３】
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含み、室温で液体の脂質であり得、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００９４】
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は２以上の炭素原子を有する炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、上記の基「Ｒ」における２つの炭素原子間に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００９５】
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
【００９６】
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
【００９７】
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、炭素源は、前処理され得る。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
【００９８】
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
【００９９】
本発明の方法では、リモネンシンターゼを発現するパントエア属細菌を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【０１００】
培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはリモネンの産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
【０１０１】
微生物の培養条件としては、標準的な培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜４０℃であり得、ｐＨが、約４．５〜約９．５であり得る。
また、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。培養方法としては、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を適宜用いることができる。
【実施例】
【０１０２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０３】
実施例１：リモネンシンターゼ発現プラスミドの構築
１−１）Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ（アラスカトウヒ）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ由来リモネンシンターゼ（ＰｓＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＤＱ１９５２７５．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＡ８６２４８．１.）は、既に知られている。Ｐ．ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号１、及び配列番号２に示す。ＰｓＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳの塩基配列を配列番号３に示す。ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳと名付けた。
【０１０４】
１−２）Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ（アメリカオオモミ）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来リモネンシンターゼ（ＡｇＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ００６１９３．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＢ７０９０７．１.）は既に知られている。Ａ．ｇｒａｎｄｉｓ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号４、及び配列番号５に示す。ＡｇＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳの塩基配列を配列番号６に示す。ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳと名付けた。
【０１０５】
１−３）Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ（スペアミント）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ由来リモネンシンターゼ（ＭｓＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｌ１３４５９．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＣ３７３６６．１）は既に知られている。Ｍ．ｓｐｉｃａｔａ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号７、及び配列番号８に示す。ＭｓＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳの塩基配列を配列番号９に示す。ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳと名付けた。
【０１０６】
１−４）Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ（ウンシュウミカン）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来リモネンシンターゼ（ＣｕＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ１１０６３７．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＤ２７２５７．１）は既に知られている。Ｃ．ｕｎｓｈｉｕ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号１０、及び配列番号１１に示す。ＣｕＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳの塩基配列を配列番号１２に示す。ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳと名付けた。
【０１０７】
１−５）Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ（レモン）由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来リモネンシンターゼ（ＣｌＬＭＳ）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ５１４２８７．１）、及びアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＭ５３９４４．１．）は既に知られている。Ｃ．ｌｉｍｏｎ由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号１３、及び配列番号１４に示す。ＣｌＬＭＳ遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させＰ．ａｎａｎａｔｉｓのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳと名付けた。ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳの塩基配列を配列番号１５に示す。ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ遺伝子を化学合成した後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳと名付けた。
【０１０８】
１−６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来変異型ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子の取得
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのファルネシル二リン酸シンターゼは、ｉｓｐＡ遺伝子（配列番号１６）によりコードされている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）  １０８：９９５−１０００．）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のファルネシル二リン酸シンターゼにおいて、菌体内のゲラニル二リン酸の濃度を高める変異が明らかにされている（Ｎａｒｉｔａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２６（３）：５６６−５７１．）。本知見を基にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのファルネシル二リン酸シンターゼにおいても、同様の変異体が作出されている（Ｒｅｉｌｉｎｇ  ＫＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２）  ２００−２１２．）。ゲラニル二リン酸生成活性の高いｉｓｐＡ変異体（Ｓ８０Ｆ）遺伝子を効率的に発現させるため、二次構造を解消させるようにコドンを最適化した配列を設計し、これをｉｓｐＡ*と名付けた。ｉｓｐＡ*の塩基配列を配列番号１７に示す。ｉｓｐＡ＊遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*と名付けた。
【０１０９】
１−７）ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号２０に示したプライマーと配列番号２１に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２２に示したプライマーと配列番号２１に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号２３に示したプライマーと配列番号２４に示したプライマーを用いて得られたｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。
【０１１０】
１−８）ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号２５に示したプライマーと配列番号２６に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２２に示したプライマーと配列番号２６に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号２３に示したプライマーと配列番号２４に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。
【０１１１】
１−９）ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号２７に示したプライマーと配列番号２８に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２２に示したプライマーと配列番号２８に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号２３に示したプライマーと配列番号２４に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。
【０１１２】
１−１０）ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号２９に示したプライマーと配列番号３０に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２２に示したプライマーと配列番号３０に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号２３に示したプライマーと配列番号２４に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。
【０１１３】
１−１１）ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ、及びｉｓｐＡ*遺伝子の同時発現用プラスミドの構築
配列番号３１に示したプライマーと配列番号３２に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳを鋳型にＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ断片を鋳型として配列番号２２に示したプライマーと配列番号３２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ断片を得た。さらに、配列番号２３に示したプライマーと配列番号２４に示したプライマーを用いてｐＵＣ５７−ｉｓｐＡ*を鋳型にＰＣＲを行い、ｉｓｐＡ*断片を得た。精製したＰｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ断片、及びｉｓｐＡ*断片を制限酵素ＰｓｔＩとＳｃａＩで消化したｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を構築した。
【０１１４】
１−１２）ＳＷＩＴＣＨ−ＰｈｏＣΔｇｃｄの構築とリモネン生成株の構築
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｇｃｄ遺伝子（配列番号１８）は、グルコースデヒドロゲナーゼ（配列番号１９）をコードしており、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓは好気性増殖中にグルコン酸を蓄積することが知られている（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｍａｙ；３１８（１）：５５−６０）。
プライマーｇｃｄ−ａｔｔＬおよびｇｃｄ−ａｔｔＲ（表１）及び鋳型としてｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｋａｎ−ａｔｔＲプラスミドを用いるＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いて、ｇｃｄ遺伝子が破壊されたＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株を構築する。組込み体を確認するため、プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２（表１）を用いる。
【０１１５】
ＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株のゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ）を用いて単離し、既報の方法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがって、後述の参考実施例１で得られたＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ株のマーカーを含まない誘導体中に電気形質転換する。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−Δｇｃｄ（ＫｍＲ）株を得る。プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２（表１）を、得られた組込み体のＰＣＲ解析に用いる。カナマイシン耐性マーカー遺伝子を、標準的なλＩｎｇ／Ｘｉｓ媒介手法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがって得る。得られた株を、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株と命名する。
【０１１６】
【表１】
2017104099.tif 000002
【０１１７】
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄのコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*、ｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*あるいはｐＡＣＹＣ１７７−Ｐｔａｃ−ｏｐｔ＿ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*を導入した。得られた株をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株と命名した。
【０１１８】
実施例２：ＳＷＩＴＣＨ  ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ株由来リモネンシンターゼ発現株のリモネン生産能の評価
実施例１で得られたＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株のグリセロールストックを融解し、１０μＬを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６時間培養した。得られたプレート上の菌体を、ＮｕｎｃTMディスポーザブルループ１μＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の１ループ程度の量を掻き取った。掻き取った菌体をヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）中の、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む以下の表２に記載のリモネン発酵用培地１ｍＬに接種し、バイアルはヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）を用いて密栓した。往復振とう培養装置で３０℃、１２０ｒｐｍの条件にてＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株は４８時間培養した。ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ｐＡＣＹＣ１７７株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株は同様に発酵を行い、これらの株の培養時間を７２時間とした。
【０１１９】
【表２】
2017104099.tif 000003
【０１２０】
滅菌完了後に上記Ａ区、Ｂ区、Ｃ区を混合した。
【０１２１】
培養終了後に、ヘッドスペースサンプラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ＴｕｒｂｏＭａｔｒｉｘ  ４０）付きガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所社製  ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０）を用いてヘッドスペースバイアル中のリモネン濃度を測定した。分析条件の詳細を下記に記す。ＧＣのカラムとして、ＨＰ−５ｍｓ  Ｕｌｔｒａ  Ｉｎｅｒｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用し、リモネン標準液は試薬リモネン（東京化成工業製）を用いて調製した。
【０１２２】
ヘッドスペースサンプラー
注入時間                ０．０２ｍｉｎ
オーブン温度            ８０℃
ニードル温度            ８０℃
トランスファー温度      ８０℃
ＧＣサイクル時間        ５ｍｉｎ
加圧時間                ３ｍｉｎ
引き上げ時間            ０．２ｍｉｎ
保温時間                ５ｍｉｎ
キャリアガス圧力        １２４ｋＰａ
【０１２３】
ガスクロマトグラフィー部
キャリアガス            Ｈｅ
気化室温度              ２００．０℃
温度条件                １７５℃（定温）
【０１２４】
質量分析部
イオン源温度            ２５０℃
インターフェイス温度    ２５０℃
検出器電圧              ０．１ｋＶ
検出イオン分子量        ６８
補助イオン分子量        ９３
フィラメント点灯時間    ２．０−３．５ｍｉｎ
【０１２５】
リモネン濃度は培地量に換算した値として示した。バイアル２本の結果の平均値を表３及び４に示す。対照ベクターｐＡＣＹＣ１７７を導入した対照株ではリモネン生産は認められなかったが、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＰｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＡｇＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＭｓＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｕＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＣｌＬＭＳ−ｉｓｐＡ*株においてリモネン生産が確認された。
【０１２６】
【表３】
2017104099.tif 000004
【０１２７】
【表４】
2017104099.tif 000005
【０１２８】
参考実施例１：微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ）及びリン酸欠乏誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ，ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ）、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ）の構築
１−１）ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
１−１−１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３７、及び配列番号３８にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号３９に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。
【０１２９】
１−１−２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号４０、及び配列番号４１にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号４２に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。
【０１３０】
１−１−３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号４３と配列番号４４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号４５と配列番号４６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号４７と配列番号４８に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３０６９６３４Ａ１）を鋳型として配列番号４９と配列番号５０に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号４３と配列番号４６に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号４７と配列番号５０に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。
【０１３１】
１−２）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
１−２−１）異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を含むプラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
【０１３２】
ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図１）。
【０１３３】
オペロンのプロモーター欠損バリアントを得るために、ｐＭＷ２１９−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、同じ組込み型ベクター中にサブクローニングした。得られたプラスミドのマップを、図２に示す。
【０１３４】
異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを構築した。この目的のために、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含むポリリンカーを、ｍｖａＥＳ遺伝子の上流に位置する唯一のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位中に挿入した。この目的を達成するために、プライマー１および２（表５）とポリヌクレオチドキナーゼを用いてアニーリングを行った。得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ポリヌクレオチドキナーゼで５’リン酸化し、得られたリン酸化フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳプラスミドにライゲーション反応により挿入した。得られたｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳプラスミド（図３）は、ｍｖａＥＳ遺伝子の前で所望の配向性を保ちながらプロモーターをクローニングに都合が良いものである。ｌｌｄＤ、ｐｈｏＣおよびｐｓｔＳ遺伝子の調節領域を保持するＤＮＡフラグメントを、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ならびにプライマー３および４、プライマー５および６、ならびにプライマー７および８（表５）をそれぞれ用いて、ＰＣＲにより生成し、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳの適切な制限酵素認識部位中にクローニングした。得られたプラスミドを、図４に示す。クローニングされたプロモーターフラグメントの配列決定を行い、予想されるヌクレオチド配列に正確に対応することを確認した。
【０１３５】
１−２−２）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体固定用プラスミドの構築
ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを、プライマー９および１０（表５）、ならびにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ  ＬＡおよびＲｏｓｅ  ＲＥ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲが得られた（図５）。
【０１３６】
Ｐｔａｃプロモーターを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲベクター（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ認識部位に挿入した。その結果、染色体固定用発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃが構築された。クローニングしたプロモーターフラグメントの配列を決定し、設計通りの配列であることを確認した。ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃのマップを、図６に示す。
【０１３７】
ＡＴＧ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｇｅｎｅ（ロシア）により化学合成された、レアコドンを同義コドンに置換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（図７）を、染色体固定用ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ制限酵素認識部位中にサブクローニングした。化学合成されたＫＤｙＩオペロンを含むＤＮＡ配列を配列番号７５に示す。Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ発現カセットを保持する得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩを、図８（Ａ）に示す。その後、薬剤耐性マーカー遺伝子を置換する目的でｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲにて対応するフラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを得た（図８（Ｂ））。
【０１３８】
古典的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ［完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照］由来の推定ｍｖｋ遺伝子のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメントを、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。ｍｖｋ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドのマップを、図９に示す。
【０１３９】
１−３）レシピエント株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築
ａｔｔＬｐｈｉ８０およびａｔｔＲｐｈｉ８０に隣接したｋａｎ遺伝子、ならびに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージｐｈｉ８０  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存的な除去（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド［Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３］を鋳型として用いて、プライマー１１および１２、ならびにプライマー１３および１４（表５）をプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨおよびａｍｐＣ遺伝子領域への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。プライマー１５および１６、ならびにプライマー１７および１８（表５）を、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。
【０１４０】
並行して、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０  ３２０ｋｂメガプラスミド上に位置するｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）にしたがって行った。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、プライマー１９および２０（表５）を用いる反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と名付けた。プライマー２１および２２（表５）を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）。オリゴヌクレオチド２１および２２を、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図１０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示す。
【０１４１】
上記ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に組み込んだ。プラスミドの組込みを、プライマー２１および２３、ならびにプライマー２２および２４（表５）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図１１（Ａ）に示す。
その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）を介してＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の遺伝形質をＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０へ移行させた。得られた株はテトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＲＡをマーカーとして利用している。ｔｅｔＲＡマーカー遺伝子を含むｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分を、既報のｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミド［Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４］を用いて除去した。その結果、マーカー遺伝子欠損株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図１１（Ｂ）に示す。
【０１４２】
１−４）ＳＷＩＴＣＨ株のセットの構築
ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがい、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３−ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍＲクローンを、プライマー１１および１５、ならびにプライマー１１および１７（表５）を用いたＰＣＲ反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０またはΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体改変物のマップを、図１２（Ａ）および（Ｂ）に示す。
ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ（ここで、Ｐｘは、以下の調節領域のうちの一つである：ａｒａＣ−Ｐａｒａ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＰｌｌｄＤ、ＰｐｈｏＣ、ＰｐｓｔＳ）を、既報のプロトコル［Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０］にしたがってｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）およびＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−１およびＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ染色体改変物のマップを図１３に示す。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
１−５）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
常法に従いＳＷＩＴＣＨ菌のエレクトロコンピテントセルを作成し、エレクトロポレーションによりムクナ由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドであるｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（ＷＯ２０１３／１７９７２２）を導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭと命名した。
【０１４５】
その好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、本願の一部として参照により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の方法は、リモネンの製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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