(57)【要約】      （修正有）【課題】緊密に関連するインスリン様増殖因子２が非常に過剰な濃度で存在する場合であっても、インスリン様増殖因子１の高感度で特異的な検出を可能にする、新規抗体の提供。体液試料中でも検出可能なインスリン増殖因子１の検出方法の提供。【解決手段】ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体における、アミノ酸７６〜アミノ酸８４の範囲のアミノ酸ストレッチ中に含まれるエピトープに特異的に結合する単離抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）内に含まれるエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが配列番号１５のＣＤＲ３領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項２の抗体。
【請求項４】
重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３領域、配列番号１６のＣＤＲ２領域および配列番号１７のＣＤＲ１領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項１または２の抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号１８のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項２の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７７〜８４（配列番号４）内に含まれるエピトープに結合する、請求項１の抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６の抗体。
【請求項８】
重鎖可変ドメインが配列番号２３のＣＤＲ３領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項７の抗体。
【請求項９】
重鎖可変ドメインが、配列番号２３のＣＤＲ３領域、配列番号２４のＣＤＲ２領域および配列番号２５のＣＤＲ１領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項７の抗体。
【請求項１０】
重鎖可変ドメインが、配列番号２３のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号２５のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号２６のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２７のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２８のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことにおいて、前記抗体が特徴付けられる、請求項７の抗体。
【請求項１１】
サンドイッチ・イムノアッセイを通じて、体液試料においてＩＧＦ−１を検出するための方法であって：
ａ）請求項１〜１０のいずれか記載の抗体と試料をインキュベーションし、それによって、前記試料中に含まれるインスリン様増殖因子１に対する前記抗体の結合が起こり、
ｂ）ＩＧＦ−１前駆体のアミノ酸７６〜８４を含まないエピトープに結合する、ＩＧＦ−１に対する第二の抗体と、試料をインキュベーションし、それによって、第二の抗体の結合が起こり、そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）において形成された免疫学的サンドイッチ複合体を測定し、それによって試料中のＩＧＦ−１を検出する
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
ヒト・インスリン様増殖因子１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０５０１９、ＩＧＦ１＿ヒト（配列番号））は、ソマトメジンＣおよびソマトメジンＡとしてもまた知られ、成熟型では７０ａａポリペプチド（配列番号２）であり、該ポリペプチドはＩＧＦ−２およびインスリンと長いストレッチの配列同一性および高い構造的相同性を共有する（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，  Ｅ．およびＨｕｍｂｅｌ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７３（１９７６）  ２３６５−２３６９；  Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，  Ｅ．およびＨｕｍｂｅｌ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５３（１９７８）  ２７６９−２７７６）。ヒトＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１より５００倍モル濃度過剰にヒト血清中に存在する（Ｊｏｎｅｓ，
Ｊ．Ｉ．およびＣｌｅｍｍｏｎｓ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １６（１９９５）  ３−３４）。ＩＧＦ−２の血清濃度がより高く、そしてＩＧＦ−２がＩＧＦ−１と配列相同性を持つことが、ＩＧＦ−１の特異的な免疫学的検出の大きな障害となっている。その結果、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の間を明らかに区別するＩＧＦ−１特異的抗体、すなわちＩＧＦ−２と交差反応性を持たない抗体の生成は困難であり、そしてこうした抗体の生成は、体液試料におけるＩＧＦ−１の特異的検出の礎石となるであろう。
【０００２】
インスリン同様、ＩＧＦ−１ポリペプチド鎖をドメインに分けることも可能である。ＩＧＦ−１は、それぞれ、４つのドメイン、Ｂ（アミノ酸残基１〜２９）、Ｃ（３０〜４１）、Ａ（４２〜６２）およびＤ（６３〜７０）を含む。ドメインＡおよびＢは、それぞれ、インスリンＢ鎖およびＡ鎖の構造的相同体であり、ドメインＣはプロインスリンの連結ペプチドに類似であり、一方、Ｄドメインはインスリン中に対応物を持たない。
【０００３】
Ｍａｎｅｓ  Ｓ．ら，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５４（１９９７）  ２９３−３０２に要約されるように、ＩＧＦ−１は、成長ホルモン（ＧＨ）の増殖促進活性を仲介すると考えられる（Ｓａｒａ，  Ｖ．Ｒ．およびＨａｌｌ，  Ｋ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ
Ｒｅｖ．  ７０（１９９０）  ５９１−６１４）。ＩＧＦ−１はまた、パラ分泌経路または自己分泌経路を通じて、多様な細胞タイプにおいて、細胞増殖、分化および生存を局所調節する際にも重要であると見なされる（Ｊｏｎｅｓ  Ｊ．Ｉ．およびＣｌｅｍｍｏｎｓ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｒｅｖ．  １６（１９９５）  ３−３４）。ＩＧＦ−１の推定上の受容体である、１型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）（Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ５（１９８６）  ２５０３−２５１２）は、腫瘍形成において重要な役割を果たすと提唱されてきている（Ｓｅｌｌ，  Ｃ．ら，  Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（１９９３）  １１２１７−１１２２１）。多くの腫瘍がＩＧＦ−１Ｒを発現し、そしてＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を産生し、そして細胞外環境に分泌し（Ｂａｓｅｒｇａ，  Ｒ．，  Ｃｅｌｌ  ７９（１９９４）  ９２７−９３０；  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｈ．ら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２７（１９９５）  ９８７−９９４）、それによって自己分泌方式で連続細胞増殖を促進することを示す、多くの証拠がある。
【０００４】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、どちらも、多くの組織および細胞タイプにおいて発現され、そして自己分泌、パラ分泌および内分泌機能を有しうる。成熟ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、ヒト、ウシおよびブタ・タンパク質の間で非常に保存されており（１００％同一性）、そしてまた、交差種活性を示す。ＩＧＦＬ（インスリン様増殖因子様）ファミリーには、ヒトにおける４つの小さい（〜１１ｋＤａ）、おそらく分泌されるファミリーメンバー、およびマウスにおける１つのメンバーが含まれる。
【０００５】
ＩＧＦ−１の重要な役割を考慮すると、ＩＧＦ−１特異的抗体、すなわちＩＧＦ−２に対する交差活性を持たない抗体の生成は、困難であるとともに、ＩＧＦ−１の特異的検出のために、非常に重要である。インスリン様増殖因子が３０年以上知られているにもかかわらず、これまでに、そして現在でもなお、体液試料中でＩＧＦ−１を特異的に検出すること、または組織試料中でタンパク質インスリン様増殖因子１を位置決定することは困難なままである。これは、例えば、当該技術分野に知られる抗体による、不十分な結合アフィニティおよび／または関連する分子に対する異なるレベルの交差反応性のためでありうる。
【０００６】
ＩＧＦ−１の血清検出において、大部分の装置は、ストリンジェントな洗浄工程を用いて、用いる特異的結合剤、例えば抗体の非特異的結合を減少させ、そして克服する。一般的に、天然ＩＧＦ−１での免疫によって発生する抗体は、より低いアフィニティおよび抗原複合体安定性で交差反応するＩＧＦ−２を認識するよりも、より高いアフィニティおよび抗原複合体安定性で、その本来の免疫原を認識する。例えば、天然組換えヒトＩＧＦ−１でのマウスの免疫キャンペーンから得られたネズミ・モノクローナル抗体＜ＩＧＦ−１＞−Ｍ２．２８．４４は、ＫＤ＝０．０３ｘ１０−９ｍｏｌ／Ｌアフィニティおよびｔ１／２解離＝９２分で、ＩＧＦ−１に対する結合動力学シグネチャーを示す（図８を参照されたい）一方、ＩＧＦ−２には、ＫＤ＝５ｘ１０−９ｍｏｌ／Ｌアフィニティおよびｔ１／２解離＝５分で結合する。基本的な相違は、抗原複合体安定性にある。ＩＧＦ−１特異的アッセイのためのこうした抗体の使用の成功は、その装置の洗浄セットアップに強く依存し、これは、＜ＩＧＦ−１＞−Ｍ  ２．２８．４４交差反応抗体からＩＧＦ−２を枯渇させる必要があるためである。簡潔には、ＩＧＦ−２への交差反応性を示すＩＧＦ−１結合抗体の技術的限界は、洗練された洗浄工程によってのみ乗り越えることが可能である。
【０００７】
ＩＧＦ−１特異性必要条件は、平衡条件下で適用される抗体に関して、特に、抗体−抗原免疫複合体の洗浄または精製法をいずれも行わない診断系において、はるかにより高いことが自明である。他の態様の中で、やはりｉｎ  ｖｉｖｏ状況もまた、主に熱力学平衡によって特徴付けられる。したがって、平衡条件下で、特に、いかなるＩＧＦ−２相互作用も欠如していることが証明されることが非常に重要である。
【０００８】
当該技術分野に知られるこれらの問題を克服する抗体を開発することが、本発明の目的であった。平衡条件下での適用に適したＩＧＦ−１特異的抗体に対する重要な要求は、ＩＧＦ−１が高アフィニティで認識されそして結合されるだけでなく、ＩＧＦ−２血清濃度が高い場合であっても、検出可能なＩＧＦ−２会合ｋａ（１／Ｍｓ）がないことである。
【０００９】
原則として、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の間の免疫学的区別は、それぞれの抗体がＩＧＦ−２対応物とはアミノ酸配列またはコンホメーションが明らかに異なるＩＧＦ−１エピトープをターゲットとする場合にのみ実現可能であるはずである。実際、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の間には顕著な配列逸脱は１つしかなく、特に、シグナルおよびプロペプチドで番号付けを開始する、ＩＧＦ−１アミノ酸７４〜９０位のＩＧＦ−１のターン−ループモチーフにおけるものである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０５０１９、ＩＧＦ１＿ヒト）。これまでは、実験動物において、免疫原として天然ＩＧＦ−１を用いた慣用的免疫戦略によって、このＩＧＦ−１モチーフをエピトープとしてターゲティングする抗体を得ることは不可能であった。
【００１０】
本発明は、ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜アミノ酸８４の範囲のアミノ酸ストレッチ内のこの本来のＩＧＦ−１エピトープに特異的に結合する単離抗体に関する。
【００１１】
新規抗体は、緊密に関連するＩＧＦ−２が非常に過剰に存在する場合であっても、イン
スリン様増殖因子１の高感度でそして非常に特異的な検出を可能にするため、非常に有用である。
【００１２】
驚くべきことに、ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜アミノ酸９０のアミノ酸ストレッチ（配列番号５）を利用し、そして代理免疫原内に操作し、それによって天然ＩＧＦ−１のＣドメインに特異的に結合する抗体を生成する地ならしをすることが可能であることが見出されてきている。本発明者らはまた、ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜アミノ酸８４内に含まれるエピトープに結合する単離抗体を用いると、ＩＧＦ−１の免疫学的検出に非常に好適でありうることも見出した。
【００１３】
驚くべきことに、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のかなり短い部分配列、すなわち配列番号１に示すＩＧＦ−１前駆体のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）が、非常に好適な特性を有し、そして当該技術分野に知られる問題の少なくともいくつかを克服することも可能であることが見出されてきている。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）内に含まれるエピトープに結合する、単離抗体に関する。
本発明の１つの態様において、配列番号３に含まれるエピトープ、またはアミノ酸のこのストレッチ内の部分配列（配列番号４）、例えばＩＧＦ−１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７７〜８４の範囲の部分配列に結合するモノクローナル抗体を開示する。
【００１５】
本発明はまた、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体の部分配列、およびイムノアッセイ法であって、液体試料を本発明記載の抗体とインキュベーションし、それによって前記試料中のインスリン様増殖因子１に対する前記抗体の結合が起こり、そして前記試料において抗インスリン様増殖因子１抗体に結合したＩＧＦ−１を検出する工程を含む、前記方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドのＳＤＳ  ＰＡＧＥ（クーマシー染色）および抗ｈｉｓタグウェスタンブロット（１０秒曝露）。Ｍ−Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ標準；１−２．５μｇのサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド；２−５．０μｇのサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド；３−１０μｇのサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド；Ｍ＊−Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋ。
【図２】サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドの分析用ＨＰＬＣクロマトグラム（上部の線：分子量標準。下部の線：融合ポリペプチド）。
【図３】それぞれ、捕捉抗原として、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）およびヒトＩＧＦ−１（＝ＩＧＦ−１）を用いたＥＬＩＳＡによって測定した、免疫１２週後のマウスにおける血清力価（ｍＥ＝ミリ吸光度）。
【図４】ＩＧＦ−１、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤポリペプチドに対する結合シグナルを示す、一次培養のＥＬＩＳＡスクリーン（ｍＥ＝ミリ吸光度、ＩＧＦ−１＝ヒトＩＧＦ−１）。
【図５】ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤポリペプチドに対する一次培養＜ＩＧＦ−１＞Ｍ−１１．０．１５の例示的なＢＩＡｃｏｒｅ動力学スクリーニング。（一次培養は１１．０．１５と称され、一方、最終クローニング後の名称は１１．１０．１５である）。
【図６】ＩＧＦ−１、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤポリペプチドに対するクローン培養上清のＥＬＩＳＡスクリーン。結合アフィニティの改善を示す吸収シグナルの増加が、ＩＧＦ−１およびサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドで検出された。
【図７】ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド、サーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤポリペプチド、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）野生型ＳｌｙＤポリペプチド、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ融合ポリペプチド、およびサーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）融合ポリペプチドに対する、＜ＩＧＦ−１＞Ｍ−１１．１１．１７−ＩｇＧのＢＩＡｃｏｒｅ測定。
【図８】新規に発生させた抗ＩＧＦ−１抗体の結合動力学を示す表。ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＲＵ：センサー上に捕捉されたモノクローナル抗体の相対反応単位；抗原：溶液中の抗原；ｋＤａ：溶液中の分析物として注入される抗原の分子量；ｋａ：会合速度定数；ｋｄ：解離速度定数；ｔ１／２解離：式、ｔ１／２解離＝ｌｎ（２）／６０＊ｋｄにしたがって計算される抗体−抗原複合体半減期；ＫＤ：解離定数；ＲＭＡＸ：９０ｎＭ分析物注入の会合期の終わりの結合シグナル；ＭＲ：モル濃度比；Ｃｈｉ２：測定のカイ二乗検定；ｎ．ｄ．：検出不能。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
成熟ヒト・インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、約８ｋＤａの分子量を有し、そして７０アミノ酸からなる。ＩＧＦ−１は、４つのよく定義された領域である、それぞれ、配列番号２のＢ（アミノ酸残基１〜２９）、Ｃ（３０〜４１）、Ａ（４２〜６２）およびＤ（６３〜７０）を含む。
【００１８】
本発明は、インスリン様増殖因子１のループ領域（配列番号５）内に含まれるエピトープに結合する単離抗体に関する。
１つの態様において、本発明は、インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸残基７６〜８４（配列番号３）内の単離抗体結合に関する。言い換えると、本発明記載の単離抗体は、配列番号３に含まれるエピトープに結合する。
【００１９】
別に説明しない限り、本明細書で用いるすべての技術的用語および科学的用語は、本明細書に開示する本発明が属する技術分野において、一般の当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌ  ｏｂｊｅｃｔ）の１または１より多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つの抗体または１より多い抗体を意味する。
【００２１】
「エピトープ」は、抗原結合分子（例えば抗体、抗体断片、抗体結合領域を含有する足場タンパク質、またはアプタマー）が結合するターゲット分子（例えば抗原、例えばタンパク質または核酸分子）上の部位である。エピトープは、ターゲット分子の連続残基または隣接する非連続残基（例えばアミノ酸残基）の両方から形成可能である。連続残基（例えばアミノ酸残基）から形成されるエピトープは、典型的にはまた、直鎖エピトープとも称される。エピトープには、典型的には、少なくとも５残基、そして最大約１２残基、大部分、６〜１０残基の間（例えばアミノ酸残基）が含まれる。「単離」抗体は、天然環境の構成要素から同定され、そして分離され、そして／または回収されているものである。
天然環境の混入構成要素は、抗体に関して、研究、診断または療法使用と干渉するであろう物質であり、そしてこれには酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれうる。いくつかの態様において、抗体を、例えばローリー法によって測定した際に、抗体重量の７０％より高く精製し、そしていくつかの態様において、重量８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高く精製する。１つの好ましい態様において、タンパク質検出のためのクーマシーブルー染色を用いて、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した際に、９０％純度より高く、本発明記載の単離抗体を精製する。
【００２２】
１つの態様において、本発明記載の抗体は、ポリクローナル抗体である。配列番号３に含まれる配列に結合するポリクローナル抗体は、例えば、免疫吸着物質としてこの配列を含有するアフィニティカラムを用いた免疫吸着によって、得ることも可能である。１つの態様において、本発明記載の抗体はモノクローナル抗体である。
【００２３】
先行技術の方法によって、ＩＧＦ−１のＣドメインに対する抗体を生成することはまったく不可能であったようである。実際、天然組換えＩＧＦ−１での免疫、ならびにＩＧＦ−１由来ペプチドでの免疫（Ｍａｎｅｓ  Ｓ．ら，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５４（１９９７）  ２９３−３０２）は、前記エピトープ領域に対するモノクローナル抗体を産生することができなかった。最も顕著には、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸７６〜８４を含む直鎖ポリペプチド配列での実験動物の免疫は、天然コンホメーションＩＧＦ−１に対する、またはその直鎖ペプチドモチーフに対する結合活性を示す抗体をいずれも生成することができなかった。
【００２４】
実験動物を免疫する目的のため、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸配列７６〜８４を含む拘束されたＩＧＦ−１ペプチドの十分な量を合成しようとする先の試みは、成功しなかった。
【００２５】
本明細書に開示する新規方法に基づいて、こうしたほとんどアクセス不能な抗体が、現在、再現可能な方式で生成可能となっている。簡潔には、本明細書に示す方法は、操作されたサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤの使用を含む。ＳｌｙＤ  ＩＦ（フラップ中の挿入物（Ｉｎｓｅｒｔ−Ｉｎ−Ｆｌａｐ））基質結合ドメインを、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸配列７６〜８４によって置き換え、こうして移植したペプチド免疫原を含む、熱安定性足場モジュールを構成する。
【００２６】
アミノ酸移植片は、ＩＧＦ−１挿入モチーフの天然様二次構造を保持する、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ  ＦＫＢＰドメインによって、拘束されたエンタルピー的に好ましい方式で提示される。このキメラ・ポリペプチドは、実験動物の免疫のための免疫原として用いられる。完全ポリペプチドに対する体液性免疫反応もまた、挿入モチーフに対してターゲティングされる。例えば野生型シャペロンに対する、または天然成熟ＩＧＦ−１に対する、比較スクリーニングによって、ＩＧＦ−１挿入モチーフを特異的に認識する抗体を選択可能である。こうしてキメラポリペプチドは、天然ＩＧＦ−１の代理ポリペプチドとして働き、そして驚くべきことに、初めて、高アフィニティ抗体を生成するために、あらかじめ選択されたエピトープに対する免疫反応を指向することが可能になった。
【００２７】
提供する方法および該方法を用いて生成される抗体は、それぞれ、例えば療法適用および診断適用のため、研究およびルーチンにおいて重要な価値がある。
本明細書において、用語「ヒトＩＧＦ−１に対する結合」、または「抗ＩＧＦ−１抗体」は、交換可能である。本発明記載のヒトＩＧＦ−１抗原に対する抗体結合は、好ましくは、２５℃で、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満のＫＤ値を有し、１つの態様において、２５℃で、１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満のＫＤ値を有する。標
準結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン・ウプサラ）で結合アフィニティを測定する。結合アフィニティのＫＤ値を測定するための方法を、実施例セクションに記載する。したがって、本明細書において、「ヒトＩＧＦ−１に結合する抗体」は、２５℃で、少なくともＫＤ  １．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満のＫＤで、好ましくはＫＤ  １．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ〜ＫＤ  １．０ｘ１０−１２ｍｏｌ／ｌで、ヒトＩＧＦ−１抗原に結合する抗体を指す。
【００２８】
本明細書記載の抗体は、ＩＧＦ−２に対して、２５℃で、いかなる測定可能な会合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）も示さない。抗体は、ＩＧＦ−１に対して、少なくともｋａ  ９ｘ１０５（１／Ｍｓ）またはそれより速い、拡散限界に近い会合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）を示す。したがって、１つの態様において、本発明記載の抗体は、ＩＧＦ−２に対して、２５℃で測定可能な会合速度定数を示さない。
【００２９】
１つの態様において、本発明記載の抗体は、２５℃で、少なくともｋｄ  ２ｘ１０−３（１／ｓ）〜ｋｄ  ３ｘ１０−５（１／ｓ）またはそれより遅い抗原複合体安定性を示す。
【００３０】
当業者が認識するであろうように、用語「特異的」は、試料中に存在する他の生体分子が、例えばインスリン様増殖因子１に特異的に結合する抗体に、有意に結合しないことを示すよう用いられる。好ましくは、インスリン様増殖因子１以外の生体分子への結合レベルは、無視できる結合アフィニティを生じ、すなわちＥＬＩＳＡまたは例えばＢｉａｃｏｒｅ  ４０００装置を用いたアフィニティ測定によって、測定可能な結合アフィニティを生じない。
【００３１】
「インスリン様増殖因子１に特異的に結合する」抗体は、インスリン様増殖因子２に結合しないであろう。より正確には、非常に高感度のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いた動力学測定は、分析物が高濃度であったとしても、ＩＧＦ−２に対するこうした抗体のいかなる測定可能な会合速度定数ｋａ（１Ｍｓ）も示さない（例えば図７を参照されたい）。さらに、「インスリン様増殖因子１に特異的に結合する」抗体は、２５℃で、ＩＧＦ−１の完全に機能的な化学量論結合によって特徴付けられ、ＭＲ＝１．７〜ＭＲ＝２．０のモル濃度比（ＭＲ）値によって示されるように、２つのＩＧＦ−１ポリペプチドに、１つの抗体が同時に結合可能である方式で、結合する（図８を参照されたい）。
【００３２】
結合アフィニティＫＤは、Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて測定される。
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＩＧＦ−１ペプチドへの結合特異性に関して、ハイブリドーマ培養上清を動力学的に評価する。製造者の指示にしたがって、ＣＭ５シリーズＳセンサーを系内に搭載し、そしてＨＢＳＮ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で標準化した。系の緩衝液をＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ２０）に交換する。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ  ＃８６５２４）を補った系の緩衝液である。系を２５℃で操作する。
【００３３】
１００００  ＲＵ  ＲＡＭＩｇＧＦＣ（それぞれのマウス免疫グロブリンＧサブクラスのウサギ抗マウスＦ（ｃ）ガンマ断片の相対単位／Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、フローセルＦＣ１（サブクラス１の抗マウスＦ（ｃ）ガンマ）、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を用いて、製造者の指示にしたがって固定する。１Ｍエタノールアミンを用いて、センサーを脱活性化する。
【００３４】
例えば配列番号３（ＩＧＦ−１  ７６〜８４）のペプチドに対する抗体の結合活性を動力学的に試験する。試料緩衝液中、１：３に希釈した未精製ハイブリドーマ上清を１０μｌ／分で１分間注入することによって、抗体を捕捉する。
【００３５】
流速を１００μｌ／分に設定する。例えば配列番号（ＩＧＦ−１前駆体タンパク質７６〜８４）のペプチドを、それぞれ０ｎＭ、１．１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭおよび９０ｎＭの異なる濃度段階で、３分間注入する。Ｋｉｎｊｅｃｔコマンドを用いて、解離を６００秒間監視する。３０μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を３回連続注入して、センサー表面の酸性再生を達成する。
【００３６】
１つの態様において、本発明記載の抗体は、配列番号３のアミノ酸配列内に含まれるエピトープに、すなわちインスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜８４内に含まれるエピトープに、２５℃で、１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌまたはそれ未満のＫＤ値で特異的に結合する。上述のように、本発明記載の、すなわち配列番号３に含まれるエピトープに結合するポリクローナル抗体は、例えば、免疫吸収のため、配列番号３のペプチドを用いた免疫吸着によって、免疫動物の血清から単離可能である。
【００３７】
モノクローナル抗体は、一定の品質で、そしてほぼ無制限の量で産生可能である。好ましい態様において、配列番号３に含まれるエピトープに結合する抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３８】
１つの態様において、配列番号３に結合する抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０．０７．０９（Ｍａｂ＜ｈ−ＩＧＦ−１＞Ｍ−１０．０７．０９を産生する）によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００３９】
新規に生成される２つの＜ＩＧＦ−１＞モノクローナル抗体（それぞれ、Ｍａｂ＜ｈ−ＩＧＦ−１＞Ｍ−１１．１１．１７を産生する１１．１１．１７、およびＭａｂ＜ｈ−ＩＧＦ−１＞Ｍ−１１．０９．１５を産生する１１．０９．１５）は、配列番号３に含まれる、さらにより小さいエピトープに結合し、すなわち、これらは配列番号４によって示されるエピトープに結合する。
【００４０】
１つの態様において、本発明の抗体は、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸７６〜８４を含むエピトープに、すなわち成熟ＩＧＦ−１のアミノ酸２８〜３６（配列番号４）に結合する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号４３〜配列番号４９の合成１５量体ペプチドに、すなわちインスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）からなるエピトープを含むペプチドに結合する。
【００４１】
１つの態様において、本発明の抗体は、インスリン様増殖因子１前駆体のアミノ酸７７〜８４（配列番号４）を含むエピトープに結合する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号４３〜配列番号５０の合成１５量体ペプチドに、すなわちインスリン様増殖因子１のアミノ酸７７〜８４（配列番号４）からなるエピトープを含むペプチドに結合する。
【００４２】
抗体が配列番号３または配列番号４のそれぞれに提供するアミノ酸配列のエピトープのいずれに結合するとしても、好ましくは、実施例セクションに記載するような、ＰｅｐＳｃａｎ分析によって評価する。例えば、配列番号３の配列を含む多様なＰｅｐＳｃａｎペプチドが、こうした分析において検査中の抗体で陽性の結果を示したならば、配列番号３のエピトープへの結合が承認される。
【００４３】
本発明はまた、重鎖可変ドメインＣＤＲ３領域として、配列番号１５のＣＤＲ３領域を含むことで特徴付けられる、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体にも関する。
好ましくは、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３領域および配列番号１６のＣＤＲ２領域を含むことで特徴付けられる。
【００４４】
好ましくは、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３領域、配列番号１６のＣＤＲ２領域、および配列番号１７のＣＤＲ１領域を含むことで特徴付けられる。
【００４５】
本発明はまた、重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号１８のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１に結合する抗体にも関する。
【００４６】
本発明はさらに、それぞれ、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２１であり；そして軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号２２であることで特徴付けられる抗体、またはそのヒト化型に関する。
【００４７】
本発明はまた、重鎖可変ドメインＣＤ３領域として、配列番号２３のＣＤＲ３領域を含むことで特徴付けられる、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体にも関する。
好ましくは、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号２３のＣＤＲ３領域および配列番号２４のＣＤＲ２領域を含むことで特徴付けられる。
【００４８】
好ましくは、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号２３のＣＤＲ３領域、配列番号２４のＣＤＲ２領域および配列番号２５のＣＤＲ１領域を含むことで特徴付けられる。
【００４９】
本発明はまた、重鎖可変ドメインが、配列番号２３のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号２５のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号２６のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２７のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２８のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことで特徴付けられる、ヒトＩＧＦ−１に結合する抗体にも関する。
【００５０】
本発明はさらに、それぞれ、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２９であり；そして軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号３０であることで特徴付けられる抗体、またはそのヒト化型に関する。
【００５１】
本発明はさらに、それぞれ、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号３１であり；そして軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号３２であることで特徴付けられる抗体、またはそのヒト化型に関する。
【００５２】
１つの態様において、本発明記載の抗体はモノクローナルである。１つの態様において、本発明記載の抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。１つの態様において、本発明記載の抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスである。１つの態様において、本発明記載の抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのモノクローナルヒト化抗体である。
【００５３】
本発明はまた、それぞれ、配列番号１５または配列番号２３のＨＣＤＲ３を含むキメラまたはヒト化抗体にも関する。
用語「抗体」は、限定されるわけではないが、全抗体および抗体断片を含む、多様な型
の抗体構造を含む。本発明記載の抗体は、好ましくは、本発明記載の特徴的な特性が保持される限り、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子操作された抗体である。
【００５４】
「抗体断片」は、全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ディアボディ、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０３（１９９１）  ４６−８８に記載される。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインとともに組立て可能であるＶＨドメインの特性、またはＩＧＦ−１に結合するＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインとともに機能的な抗原結合部位に組立て可能であるＶＬドメインの特性を有し、そしてそれによって本発明記載の抗体の特性を提供する、一本鎖ポリペプチドを含む。
【００５５】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製物を指す。
用語「キメラ抗体」は、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域、および異なる供給源または種由来の定常領域の少なくとも一部を含み、通常、組換えＤＮＡ技術によって調製されるモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。こうしたマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって含まれる「キメラ抗体」の他の型は、クラスまたはサブクラスが元来の抗体のものから修飾されているかまたは変化しているものである。こうした「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体を産生するための方法は、現在当該技術分野において周知である慣用的な組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を伴う。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１（１９８４）  ６８５１−６８５５；  ＵＳ  ５，２０２，２３８およびＵＳ  ５，２０４，２４４を参照されたい。
【００５６】
用語「ヒト化抗体」または「抗体のヒト化型」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較した際に、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾されている抗体を指す。好ましい態様において、「ヒト化抗体」を調製するため、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲが、ヒト抗体のフレームワーク内に移植される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）  ３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．Ｓ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）  ２６８−２７０を参照されたい。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来してもよい。ヒト抗体配列は、天然存在ヒト抗体の配列であってもよい。ヒト重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）  −Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｐ  Ａ．１Ｐ．１−Ａ．１Ｐ．３７に記載され、そしてＩＭＧＴを通じて、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）またはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを通じてアクセス可能である。場合によって、さらなる突然変異によって、フレームワーク領域を修飾してもよい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上述の抗原を認識する配列に相当するものに対応する。好ましくは、こうしたヒト化型は、ヒト定常領域とキメラ化される。用語「ヒト化抗体」は、本明細書において、また、本発明記載の特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関する特性を生成するように、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）
によって、定常領域において修飾されている。
【００５７】
用語「ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むと意図される。ヒト抗体は、当該技術分野に周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，  Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５（２００１）  ３６８−３７４）。ヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、免疫に際してヒト抗体の全レパートリーまたはセレクションを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）においても産生可能である。こうした生殖系列突然変異体マウスにおける、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原曝露に際して、ヒト抗体の産生を生じるであろう（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（１９９３）  ２５５１−２５５５；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）  ２５５−２５８；  Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．Ｄ．ら，  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７（１９９３）  ３３−４０を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７（１９９２）  ３８１−３８８；  Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２（１９９１）
５８１−５９７）。Ｃｏｌｅ，  Ａ．らおよびＢｏｅｒｎｅｒ，  Ｐ．らの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ，  Ａ．ら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｌｉｓｓ，  Ａ．Ｒ．（１９８５）  ｐ．  ７７；およびＢｏｅｒｎｅｒ，  Ｐ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７  （１９９１）  ８６−９５）。本発明記載のヒト化抗体に関してすでに言及したように、用語「ヒト抗体」は、本明細書においてまた、本発明記載の特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関する特性を生成するように、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において修飾されている抗体も含む。
【００５８】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において、ＮＳ０またはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、あるいは宿主細胞内にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現されるヒト免疫グロブリン遺伝子または抗体に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体など、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離されるすべてのヒト抗体を含むよう意図される。こうした組換えヒト抗体は、再編成された型の可変領域および定常領域を有する。本発明記載の組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞高頻度変異に供されている。したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、そしてこうした配列に関連しているが、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然には存在しない可能性もある。
【００５９】
本発明記載の抗体は、イムノアッセイの補助によって、液体試料からのインスリン様増殖因子１の検出に非常に有用であることが立証されてきている。
イムノアッセイは、当業者に周知である。こうしたアッセイを実施するための方法、ならびに実際上の適用および方法は、関連する教科書に要約される。関連する教科書の例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ−ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ中，  ｐｐ．  ２２１−２７８，  Ｂｕｒｄｏｎ，  Ｒ．Ｈ．およびｖ．  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．Ｈ．（監修），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  アムステルダム（１９９０）、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌ
ｏｗｉｃｋ，  Ｓ．Ｐ．およびＣａｐｌａｎ，  Ｎ．Ｏ．（監修），  Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）の、免疫学的検出法を扱う多くの巻、特に第７０巻、第７３巻、第７４巻、第８４巻、第９２巻および第１２１巻である。
【００６０】
本発明記載の方法における１つの態様において、ＩＧＦ−１タンパク質を、イムノアッセイ法で測定する。
特定の態様において、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、または電気化学発光に基づくイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）において、ＩＧＦ−１を検出する。
【００６１】
１つの態様において、サンドイッチアッセイ（サンドイッチ型アッセイ形式）において、ＩＧＦ−１を検出する。１つの態様において、サンドイッチ・イムノアッセイにおいては、少なくとも２つの非重複エピトープと反応性である少なくとも２つの抗体を使用して、ＩＧＦ−１の測定を行う。
【００６２】
１つの態様において、本発明は、サンドイッチ・イムノアッセイを通じて、体液試料においてＩＧＦ−１を検出するための方法であって、本発明記載の抗体と試料をインキュベーションし、それによって、前記試料中に含まれるインスリン様増殖因子１に対する前記抗体の結合が起こり、ＩＧＦ−１のアミノ酸７６〜８４を含まないエピトープに結合する、ＩＧＦ−１に対する第二の抗体と、試料をインキュベーションし、それによって、第二の抗体の結合が起こり、そして工程（ａ）および（ｂ）において形成された免疫学的サンドイッチ複合体を測定し、それによって試料中のＩＧＦ−１を検出する工程を含む、前記方法に関する。
【００６３】
サンドイッチアッセイは、最も有用で、そして最も一般的に用いられるアッセイの１つである。サンドイッチアッセイ技術の多くのバリエーションが存在し、そしてすべて、本発明によって含まれると意図される。簡潔には、典型的な順方向アッセイにおいて、非標識抗体を固体支持体（または固相）上に固定し、そして試験しようとする試料を、結合した分子と接触させる。この捕捉抗体の固定は、固相への直接吸着によってであってもよいし、または例えば特異的結合対を通じて、例えばストレプトアビジン−ビオチン結合対を通じて、間接的であってもよい。適切なインキュベーション期間後、抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間の後、次いで、検出可能シグナルを産生可能なレポーター分子で標識された、抗原に結合する第二の抗体を添加し、そしてインキュベーションし、抗体−抗原標識抗体のサンドイッチ複合体の形成に十分な時間置く。いかなる非反応物質も洗浄し、そしてレポーター分子によって産生されるシグナルの観察によって、ＩＧＦ−１の存在を決定する。結果は、視覚的シグナルの単純な観察によって、定性的であってもよいし、または既知の量のバイオマーカーを含有する対照試料と比較することによって、定量的であってもよい。
【００６４】
典型的なサンドイッチアッセイにおいて、第一の抗体は、固体表面に共有的にまたは非共有的に結合している。固体表面は、典型的には、ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、またはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを実行するのに適した任意の他の表面の形であってもよい。結合プロセスは当該技術分野に周知であり、そして一般的に、架橋、共有結合、または物理的吸着からなる。通常、抗体でコーティングした固体表面（「固相複合体」）を処理して、非特異的結合をブロッキングし、そして試験試料調製において洗浄する。次いで、試験しようとする試料のアリコットを固相複合体に添加し、そして十分な時間（例えば、２〜４０分間、またはより好適であるならば一晩）、そして適切な条件下（例えば室温から４０℃、例えば両端を含めて２５℃〜３２℃）でインキュベーションして、第一の抗体または捕捉抗体および対応する抗原の間の結合を可能にする。イン
キュベーション期間後、第一の抗体または捕捉抗体および該抗体に結合した抗原を含む固相を洗浄し、そして抗原上の別のエピトープに結合する第二の抗体または標識抗体とインキュベーションする。第二の抗体は、第一の抗体および関心対象の抗原の複合体への第二の抗体の結合を示すために用いるレポーター分子に連結されている。
【００６５】
アッセイのバリエーションには、試料および標識抗体の両方を、固相に結合した抗体または結合可能な抗体に、同時に添加する、同時アッセイが含まれる。これらの技術は、容易に明らかであろうように、重要でない任意のバリエーションを含めて、当業者に周知である。
【００６６】
別の競合法は、固相上にＩＧＦ−１を固定し、そして次いで、固定されたターゲットを試料とともに、ＩＧＦ−１に対する特異的抗体に曝露することを含み、この抗体は、レポーター分子で標識されていてもまたはされていなくてもよい。ターゲットの量およびレポーター分子シグナルの強度に応じて、ターゲット分子による競合は、こうした標識抗体を通じて、直接検出可能でありうる。あるいは、ＩＧＦ−１に特異的に結合する抗体は固定されていてもよく、そしてＩＧＦ−１は、標識ＩＧＦ−１と、試料中のＩＧＦ−１の競合を通じて測定可能である。
【００６７】
好ましい態様において、試料物質として体液を用いて、本発明記載の方法（単数または複数）を実施する。さらなる態様において、体液試料を、全血、血清または血漿から選択する。さらなる態様において、試料物質は血清または血漿である。１つの態様において、ＩＧＦ−１の測定のためのイムノアッセイは、試料物質として血清を用いる。１つの態様において、ＩＧＦ−１の測定のためのイムノアッセイは、試料物質として尿を用いる。
【００６８】
ＩＧＦ−１の検出において使用するため、キットまたは製品もまた、本発明によって提供される。これらのキットは、１またはそれより多い容器手段、例えばバイアル、チューブ等を緊密に封じ込めて受け入れる区画化されたキャリアー手段を含んでもよく、容器手段は各々、方法に用いようとする別個の要素の１つを含む。例えば、容器手段の１つは、本発明記載の抗体を含んでもよい。キットはまた、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識などのレポーター分子に結合した、ＩＧＦ−１に結合する第二の抗体などの、レポーター手段を含む容器も有してもよい。こうしたキットは、典型的には、上述の容器、ならびに商業的観点および使用者の観点から望ましい物質を含む、１またはそれより多い他の容器を含み、こうした物質には、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が含まれる。組成物が特定の適用に用いられることを示すラベルが、容器上に存在してもよいし、そしてまた使用説明書も示してもよい。
【００６９】
１つのさらなる特異的態様において、抗体に基づくキットのため、キットは例えば：（１）ＩＧＦ−１に特異的に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に付着するか、または固体支持体に結合可能である）および（２）ＩＧＦ−１に結合する第二の異なる抗体を含んでもよい。好ましくは、後者の抗体をレポーター分子で標識する。もちろん、こうしたアッセイを設計する際に、第一の抗体を第二の抗体と交換し、そして逆を行うことも可能である。
【００７０】
以下の実施例、配列表および図は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法において、修飾を作製してもよいことが理解される。
【００７１】
配列表の説明
配列番号１  ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体の配列
配列番号２  成熟ヒト・インスリン様増殖因子１の配列
配列番号３  ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体の部分配列（７６〜８４位）
配列番号４  ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体の部分配列（７７〜８４位）
配列番号５  ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体の部分配列（７４〜９０位）
配列番号６  人工配列：（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）
配列番号７  人工配列：（Ｈｉｓタグ）
配列番号８  人工配列：ＦｋＢＰ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合タンパク質
配列番号９  人工配列：ＳｌｙＤ−ＦｋＢＰ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合タンパク質
配列番号１０  人工配列：サーマス・サーモフィラス−ＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合タンパク質
配列番号１１  人工配列：サーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤタンパク質
配列番号１２  人工配列：ＩＦドメインを欠くサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ
配列番号１３  人工配列：サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合タンパク質
配列番号１４  人工配列：サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）融合タンパク質
配列番号１５  ＭＡｂ  １０．０７．０９の重鎖ＣＤＲ３Ｈ
配列番号１６  ＭＡｂ  １０．０７．０９の重鎖ＣＤＲ２Ｈ
配列番号１７  ＭＡｂ  １０．０７．０９の重鎖ＣＤＲ１Ｈ
配列番号１８  ＭＡｂ  １０．０７．０９の軽鎖ＣＤＲ３Ｈ
配列番号１９  ＭＡｂ  １０．０７．０９の軽鎖ＣＤＲ２Ｈ
配列番号２０  ＭＡｂ  １０．０７．０９の軽鎖ＣＤＲ１Ｈ
配列番号２１  ＭＡｂ  １０．０７．０９の重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号２２  ＭＡｂ  １０．０７．０９の軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号２３  ＭＡｂ  １１．１１．１７の重鎖ＣＤＲ３Ｈ
配列番号２４  ＭＡｂ  １１．１１．１７の重鎖ＣＤＲ２Ｈ
配列番号２５  ＭＡｂ  １１．１１．１７の重鎖ＣＤＲ１Ｈ
配列番号２６  ＭＡｂ  １１．１１．１７の軽鎖ＣＤＲ３Ｈ
配列番号２７  ＭＡｂ  １１．１１．１７の軽鎖ＣＤＲ２Ｈ
配列番号２８  ＭＡｂ  １１．１１．１７の軽鎖ＣＤＲ１Ｈ
配列番号２９  ＭＡｂ  １１．１１．１７の重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号３０  ＭＡｂ  １１．１１．１７の軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号３１  ＭＡｂ  １１．０９．１５の重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号３２  ＭＡｂ  １１．０９．１５の軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号３３〜６２  エピトープ分析で用いるような、ヒト・インスリン様増殖因子１前駆体の部分配列
【実施例】
【００７２】
実施例１
モノクローナル抗体の生成のための一般的方法
あらかじめ配合した融合ポリペプチド免疫原を、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはハムスターに、異なる投薬量で腹腔内投与する。Ｂ細胞収集前に、ブースト免疫を行う。ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ，
Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）  ４９５−４９７）にしたがって、Ｂ細胞ハイブリドーマを得ることも可能である。得たハイブリドーマを、マルチウェルプレートのウェル中に単一のクローンまたは細胞として入れる。分泌される抗体によって、抗体の結合に関して陽性の試験結果を生じた初代ハイブリドーマ培養を、動力学的スクリーニング法でさらにスクリーニングする。
【００７３】
実施例２
ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドを用いた、インスリン様増殖因子１に対する抗体の生成
ＩＧＦ−１に対するモノクローナル抗体の生成において、アミノ酸配列ＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ（配列番号５）を含む融合ポリペプチドを、実験動物の免疫に用いてもよい。
【００７４】
免疫原性ポリペプチドの提示を改善するため、配列番号５のＩＧＦ−１ターン−ループモチーフに、アミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端でＧＧＧＳリンカー（配列番号６）を隣接させるか、またはＩＧＦ−１アミノ酸配列のＮ末端でＨＧジペプチドを、そしてＩＧＦ−１アミノ酸配列のＣ末端でＧＡジペプチドを隣接させるか、いずれかを行ってもよい。
【００７５】
ＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ（配列番号５）からなるＩＧＦ−１アミノ酸配列に特異的に結合する抗ＩＧＦ−１抗体の発生のため、ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドを免疫原として、そしてまたスクリーニング試薬として、用いた。
【００７６】
配列番号７のアミノ酸配列タグもまた含むＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【００７７】
【化１】
2017048209.tif 000002
【００７８】
配列番号７のアミノ酸配列タグを含むＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【００７９】
【化２】
2017048209.tif 000003
【００８０】
ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドで免疫したＮＭＲＩマウスから得た細胞を、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。１ｍｌあたり０．４１μｇポリペプチドを含む溶液を適用することによって、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＦマルチウェルプレートをＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）またはＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−対照（配列番号５のペプチドを欠く）でコーティングした。その後、ＰＢＳ中に１％ＲＰＬＡを含む溶液を、室温で１時間適用することによって、未結合の結合部位をブロッキングした。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。９０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＧＦ−１または５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＧＦ−１−ペプチドループをそれぞれ含む溶液を適用することによって、化学的にビオチン化したＩＧＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ヒトＩＧＦ−１、カタログ番号１００−１１）および配列番号５のアミノ酸３〜１５を含むビ
オチン化ＩＧＦ−１ペプチドループを、それぞれ、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  ＳＡマルチウェルプレートのウェル中に固定した。ループペプチドは、配列番号５の２位に対応するシステインで始まり、そしてそれに加えて、配列番号５の１６位に対応するシステインを含有する。これらの２つのシステインを用いて、ペプチドを環状化し、それによって、ペプチドループが形成されている。Ｎ末端システインは、さらに、ビオチン化に用いられてきている。
【００８１】
試料として、ＰＢＳで１：５０に希釈したマウス血清を用いた。場合によって、１：８１９，２００の最終希釈まで、さらなる希釈を１：４段階で行った。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、ターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体を用いた（ＰＡＫ＜Ｍ−Ｆｃγ＞Ｓ−Ｆ（ａｂ’）２−ＰＯＤ）。１％（ｗ／ｖ）ＲＳＡを含むＰＢＳ中、８０ｎｇ／ｍｌの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。その後、ウェルをＡＢＴＳ溶液で、室温で１５分間インキュベーションした。発色強度を測光法で測定した。例示的な結果を以下の表に提示する。
【００８２】
表
【００８３】
【表１】
2017048209.tif 000004
【００８４】
−：ＥＬＩＳＡにおいて結合がまったく検出不能
免疫１０週後、ＥＬＩＳＡによって抗体力価を測定した。ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）（配列番号９）融合ポリペプチドで免疫したマウスは、ＩＧＦ−１に対して、配列番号５のペプチドに対して、ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドに対して、そしてＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２対照ポリペプチド（配列番号５の配列を含まない配列番号９）に対して、低い力価を示した。１匹のマウスのみ（上記表のＫ１５７６Ｍ１）が十分に高い抗ＩＧＦ−１力価を提供し、そしてこれをハイブリドーマの生成に用いた。これらの実験において、天然ＩＧＦ−１を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマはまったく同定不能であった。ＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）は、ＩＧＦ−１特異的抗体の発生のための免疫試薬としては不適切であるようである。その後、ポリペプチドＳｌｙＤ／ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）が熱力学的に安定でないことが実験的に確認された（データ未提示）。Ｓ
ｌｙＤドメインのみが正しくフォールディングし、ＦＫＢＰ１２−ＩＧＦ−１（７４〜９０）ドメインは正しくフォールディングしない。したがって、ＦＫＢＰ１２足場の熱力学的安定性が境界線上であるため、融合ポリペプチドは、ＩＧＦ−１（７４〜９０）移植配列を効率的に提示しない。
【００８５】
実施例３
サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドを用いた、インスリン様増殖因子１に対する抗体の生成
キメラであるサーマス・サーモフィラス−ＳｌｙＤ−抗原融合ポリペプチドを用いてマウスを免疫することによって、抗原特異的抗体を最終的に生成した。この足場表面上で、すなわちＦＫＢＰドメインおよびＩＦドメイン間の連結領域において、複数のエピトープをターゲティング可能である。陰性対照としての野生型サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤに対する、または陽性対照としての天然組換え抗原（ＩＧＦ−１）に対する、示差スクリーニングによって、移植されたターゲット抗原に結合する抗体を同定可能である。この例は、以前記載するように、準安定性ヒトＦＫＢＰ１２に比較して、熱安定性ＳｌｙＤ足場の好適な特性を立証する。サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤは、エンタルピー的に強固でそして安定な構造の提示が可能であり、そしてしたがって、そうでなければ例えば実験動物の免疫系にアクセス可能でないであろう、代理天然タンパク質構造に対するモノクローナル抗体の発生のための、抗原提示足場として使用するのに適している。
【００８６】
３．１  サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ融合ポリペプチドの産生
ＮＩＧＵ（ドイツ・ヴァルトクライブルク）からグアニジニウム塩酸（ＧｄｍＣｌ）（Ａ等級）を購入した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤錠剤、イミダゾールおよびＥＤＴＡを、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ・マンハイム）より購入し、すべての他の化学薬品は、Ｍｅｒｃｋ（ドイツ・ダルムシュタット）の分析等級であった。限外ろ過膜（ＹＭ１０、ＹＭ３０）をＡｍｉｃｏｎ（米国マサチューセッツ州ダンバース）より購入し、微小透析膜（ＶＳ／０．０２５μｍ）および限外ろ過装置（Ｂｉｏｍａｘウルトラフリーフィルターデバイス）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）より購入した。未精製溶解物のろ過のための硝酸セルロースおよび酢酸セルロース膜（１．２μｍ、０．４５μｍおよび０．２μｍ孔サイズ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ドイツ・ゲッティンゲン）より購入した。
【００８７】
発現カセットのクローニング
サーマス・サーモフィラス由来のＳｌｙＤポリペプチドの配列をＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（寄託番号Ｑ７２Ｈ５８）より回収した。サーモコッカス・ガンマトレランス由来のＳｌｙＤポリペプチドの配列をＰｒｏｓｉｔｅデータベース（寄託番号Ｃ５Ａ７３８）より回収した。サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤをコードする合成遺伝子、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）、およびサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦを、Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ（ドイツ）より購入し、そしてｐＱＥ８０Ｌ発現ベクター内にクローニングした。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）宿主細胞における発現のため、コドン使用を最適化した。したがって、サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ、サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）抗原およびサーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙ−Ｄ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）抗原をコードする類似の合成遺伝子をＧｅｎｅａｒｔ（ドイツ）より購入し、そしてｐＥＴ２４発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国ウィスコンシン州マディソン）内にクローニングした。
【００８８】
さらに、ＧＳリンカー（ＧＧＧＳ、配列番号６）を含め、そしてＨｉｓタグ（配列番号７）をカルボキシ末端に融合させて、固定金属イオン・アフィニティクロマトグラフィ（
ＩＭＡＣ）による融合ポリペプチドのアフィニティ精製を可能にした。
【００８９】
ＩＧＦ−１断片７４〜９０（アミノ酸配列ＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ、配列番号５を参照されたい）に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するため、親サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤタンパク質のアミノ酸７１〜１２２（すなわちＩＦドメイン）の分子置換によって、このアミノ酸配列を、サーマス・サーモフィラス由来の分子シャペロンＳｌｙＤ上に移植した。ＩＧＦ−１挿入配列の角度を最適化するため、組換えポリペプチドの７０位のアスパラギン酸残基および８８位のロイシン残基を、各々、グリシンによって置換した（Ｄ７０ＧおよびＬ８８Ｇ）。したがって、生じる融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を有する：
【００９０】
【化３】
2017048209.tif 000005
【００９１】
このサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド（ＳＤＳ  Ｐａｇｅおよびウェスタンブロットに関しては、図１を参照されたい）を、ＩＧＦ−１アミノ酸配列ＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ（配列番号５）をターゲティングする抗ＩＧＦ−１抗体の発生のための免疫原として、そしてまたスクリーニング試薬として用いた。
【００９２】
１つの陰性対照として、サーマス・サーモフィラス由来の組換え「野生型」ＳｌｙＤ（配列番号１１）をスクリーニング目的のために用いた。
【００９３】
【化４】
2017048209.tif 000006
【００９４】
さらに、スクリーニングおよび特異性試験のため、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ融合ポリペプチド（配列番号１２）を産生した。このサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ融合ポリペプチドは、ＩＦドメインを欠き、アミノ酸配列モチーフＡＧＳＧＳＳで置換され、そして配列番号７のＣ末端アミノ酸配列タグを含む。
【００９５】
【化５】
2017048209.tif 000007
【００９６】
さらなる対照として、配列番号７のＣ末端アミノ酸配列タグを含むサーモコッカス・ガンマトレランス由来の天然ＳｌｙＤを用いた：
【００９７】
【化６】
2017048209.tif 000008
【００９８】
ＩＧＦ−２に対する交差反応性に関して評価するため、ヒトＩＧＦ−２（アミノ酸５３〜６５）由来の構造的に相同な配列を、サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ内に挿入し、これをＣ末端でＧＳスペーサーおよびヘキサヒスチジンタグ（精製および再フォールディングのため）と融合させた：
【００９９】
【化７】
2017048209.tif 000009
【０１００】
融合ポリペプチドの発現、精製および再フォールディング
ほぼ同一のプロトコルを用いることによって、すべてのＳｌｙＤポリペプチドを精製し、そして再フォールディングさせることも可能である。特定の発現プラスミドを宿する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、選択的増殖のためそれぞれの抗生物質（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ、またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ））を含有するＬＢ培地中、３７℃で、１．５のＯＤ６００まで増殖させ、そして１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、細胞質ゾル過剰発現を誘導した。誘導３時間後、遠心分離（５，０００ｇで２０分間）によって細胞を採取し、凍結し、そして−２０℃で保存した。細胞溶解のため、７Ｍ  ＧｄｍＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを補った冷却５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に、凍結ペレットを再懸濁した。その後、懸濁物を氷上で２〜１０時間攪拌して、細胞溶解を完了させた。遠心分離（２５，０００ｇ、１時間）およびろ過（硝酸セルロース膜、８．０μｍ、１．２μｍ、０．２μｍ）後、溶解物を、溶解緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム上に適用した。続く洗浄工程において、イミダゾール濃度を１０ｍＭに上昇させ（７Ｍ  ＧｄｍＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中）、そして５ｍＭ  ＴＣＥＰを添加して、チオール部分を還元型に維持し、そして未成熟なジスルフィド架橋を防止した。少なくとも１５〜２０体積の還元性洗浄緩衝液を適用した。その後、ＧｄｍＣｌ溶液を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および５ｍＭ  ＴＣＥＰを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に置換して、マトリックス結合したＳｌｙＤ融合ポリペプチドのコンホメーション的な再フォールディングを誘導した。同時精製するプロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）を再フォールディング緩衝液に添加した。全部で１５〜２０カラム体積の再フォールディング緩衝液を一晩処置で適用した。その後、１００ｍＭ
ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１０カラム体積で洗浄することによって、ＴＣＥＰおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含阻害剤カクテルを除去した。最後の洗浄工程において、イミダゾール濃度を３０ｍＭ（１０カラム体積）に上昇させて、頑強な混入物質を除去した。次いで、同じ緩衝液中の２５０ｍＭイミダゾールを適用することによって、再フォールディングポリペプチドを溶出させた。Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、純度に関してタンパク質含有分画を評価し（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，  Ｈ．およびｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ，  Ｇ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６６（１９８７）  ３６８−３７９）、そし
てプールした。続いて、緩衝系としてリン酸カリウム（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供した。最後に、タンパク質含有分画をプールし、そしてＡｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）中で、〜５ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮した。
【０１０１】
サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド（配列番号１０）を、単量体型の可溶性で、そして安定したポリペプチドとして、成功裡に精製可能であった（図２を参照されたい）。
【０１０２】
ＵＶ分光測定
ＵＶＩＫＯＮ  ＸＬ二光線分光光度計で、タンパク質濃度測定を行った。ＳｌｙＤ変異体に関するモル吸光係数（ε２８０）を、Ｐａｃｅ（Ｐａｃｅ，  Ｃ．Ｎ．ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４（１９９５）  ２４１１−２４２３）にしたがって、計算した。
【０１０３】
ＣＤ分光測定
本発明記載のキメラ融合タンパク質が、フォールディングされたコンホメーションを採用するかどうかを調べるため、近ＵＶ領域におけるＣＤスペクトルを測定した。製造者の推奨にしたがって、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０装置およびＪＡＳＣＯソフトウェアを用いて、ＣＤスペクトルを記録し、そして評価した。０．２ｃｍ経路長を持つ水晶キュベットを用いた。装置パラメータを１℃解像度、１ｎｍバンド幅および５ｍｄｅｇの感度に設定した。試料緩衝液は５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡであった。各分析のためのタンパク質濃度は、３６μＭ（サーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤの場合）、２３μＭ（サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦの場合）、１６μＭ（サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ抗原の場合）、１９μＭ（サーモコッカス・ガンマデュランス野生型ＳｌｙＤの場合）、および１６μＭ（サーモコッカス・ガンマデュランスＳｌｙＤ抗原の場合）であった。ＣＤシグナルを２０℃で２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間、０．５ｎｍ解像度、そして１分あたり２０ｎｍのスキャン速度で記録した。シグナル対ノイズ比を改善するため、スペクトルを集積させた（９回）。続く実験態様において、ＣＤシグナルを固定波長で温度の関数として記録した。融解および再フォールディング曲線（２０℃〜１００℃／／１００℃〜２０℃）をサーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ誘導体に関して、ならびにサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ誘導体に関して（２０℃〜８５℃／／８５℃〜２０℃）、２７７ｎｍで記録した。加熱および冷却速度は１分あたり１℃であった。
【０１０４】
融合ポリペプチド、サーマス・サーモフィラス野生型ＳｌｙＤ、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ、および移植された抗原挿入物を含むサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤのＣＤスペクトルを記録してきている。近ＵＶ  ＣＤシグネチャーは、明らかに、ＩＦドメインが欠けているかまたは異種アミノ酸（抗原）移植物によって置換されている場合であっても、２０℃ですべての融合ポリペプチドが、緻密な、おそらく天然様のコンホメーションにフォールディングすることを示した。
【０１０５】
加熱／冷却周期後、すなわちタンパク質試料の熱誘導されたアンフォールティングおよびそれに続く冷却後、移植された抗原を含むサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤの近ＵＶ
ＣＤスペクトルは本質的に回復する。すなわち、融解および再フォールディング後のサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤの近ＵＶ  ＣＤスペクトルは、天然分子のスペクトルと実質的に同一である。これは、抗原挿入物を含むサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤの熱誘導されたアンフォールディングが完全に可逆性であることを強く示す。アンフォールディングの可逆性と組み合わせて、高い内因性熱力学的安定性は、免疫原の非常に望ましい特徴である。
【０１０６】
サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−抗原ポリペプチドに関しては、熱誘導されたアンフォールディングは、１００℃でも不完全であった。言い換えると、本発明者らの実験セットアップにおいては、アクセス可能な温度限界を構成する水の沸点であっても、足場／移植分子のかなりの部分はその天然様フォールディングを保持する。したがって、好熱性生物由来のＦＫＢＰドメインが非常に安定であるため、それぞれのＩＦドメインの置換によってポリペプチドの移植が可能になる一方、同時に、新規に生成されたキメラ足場タンパク質の全体のフォールディングは大部分保持される。簡潔には、熱安定性ＦＫＢＰドメインは、分子クランプとして働き、その中に免疫原ペプチドがよく定義されたコンホメーションで固定されることが可能である。
【０１０７】
３．２  サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）でのマウスの免疫およびＩＧＦ−１に対するモノクローナル抗体の発生
８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃおよびＮＭＲＩマウスをそれぞれ、１００μｇのサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）での反復腹腔内免疫に供した。マウスを３回免疫し、すなわち最初の免疫の６週後および１０週後の時点でもまた免疫した。完全フロイント・アジュバントを用いて第一の免疫を実行し、不完全フロイント・アジュバントを用いて第二および第三の免疫を行ってもよい。天然組換えＩＧＦ−１およびサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）に対するマウス血清力価を、以下に記載するように、ＥＬＩＳＡ法によって１２週後に試験した。Ｆｉｒｍｗａｒｅ：Ｖ３．１５  １９／０３／０１；ＸＲＥＡＤ  ＰＬＵＳバージョン：Ｖ４．２０の元で実行するＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ上で、ＥＬＩＳＡを行った。１ｍｌあたり０．５μｇポリペプチドを含む溶液を適用することによって、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｆマルチウェルプレートをサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）でコーティングした。９０ｎｇ／ｍｌビオチン化ＩＧＦ−１を含む溶液を適用することによって、単離およびビオチン化ＩＧＦ−１をＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ
ＳＡマルチウェルプレートのウェル中に固定した。その後、ＰＢＳ中に１％ＲＰＬＡを含む溶液を、室温で１時間適用することによって、未結合の結合部位をブロッキングした。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。マウス血清をＰＢＳで１：５０に希釈し、そして試料として用いた。場合によって、１：８１９，２００の最終希釈まで、さらなる希釈を１：４段階で行った。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、ターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体を用いた（ＰＡＫ＜Ｍ−Ｆｃγ＞Ｓ−Ｆ（ａｂ’）２−ＰＯＤ）。１％（ｗ／ｖ）ＲＳＡを含むＰＢＳ中、８０ｎｇ／ｍｌの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。その後、ウェルをＡＢＴＳ溶液と、室温で１５分間インキュベーションした。発色強度を測光法で測定した。図３は、得られたマウス血清力価を示す。
【０１０８】
脾臓細胞調製および骨髄腫細胞株との融合の３日前、１００μｇのサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドのｉ．ｖ．注射によって最終ブースター免疫を行った。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
免疫原、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）、ビオチン化天然ＩＧＦ−１および野生型サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤおよびブランクプレートそれぞれに対する反応性に関するＥＬＩＳＡによって、一次培養上清を試験した。Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ、Ｆｉｒｍｗａｒｅ：Ｖ３．１５  １９／０３／０１；ＸＲＥＡＤ
ＰＬＵＳバージョン：Ｖ４．２０で、ＥＬＩＳＡを駆動した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｆマルチウェルプレートを５μｇ／ｍｌ  ＳｌｙＤ融合ポリペプチドでコーティングした。１２５ｎｇ／ｍｌ組換えビオチン化ＩＧＦ−１抗体でＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  ＳＡマルチウェルプレートをコーティングした。その後、ＰＢＳ中の１％ＲＰＬＡによって、室温で１時間、未結合の結合部位をブロッキングした。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。ＲＰＭＩ  １６４０培地中の未希釈ハイブリドーマ上清を試料として用いた。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、ターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体を用いた（ＰＡＫ＜Ｍ−Ｆｃγ＞Ｓ−Ｆ（ａｂ’）２−ＰＯＤ）。１％（ｗ／ｖ）ＲＳＡを含むＰＢＳ中、８０ｎｇ／ｍｌの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は、室温で１時間であった。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含む溶液でウェルを３回洗浄した。その後、ウェルをＡＢＴＳ溶液で、室温で１５分間インキュベーションした。４０５ｎｍで、発色強度を測光法で測定した。参照波長は４９２ｎｍであった（図４を参照されたい）。組換えＩＧＦ−１、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）への結合に際して、ＥＬＩＳＡにおいて迅速でそして強い色形成を示し、そしてサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤに対してより少ない結合を示す、一次ハイブリドーマ上清を、以下に記載するような動力学スクリーニングプロセスに移した。
【０１１０】
ＳＰＲに基づく動力学スクリーニング
サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）、天然組換えＩＧＦ−１、天然組換えＩＧＦ−２、野生型サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ、およびサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）を、ＳＰＲに基づく動力学スクリーニング分析に用いた。ＳＰＲ分析のため、一般的に、溶液中で単量体および一価分析物を用いて、ラングミュア・モデルにしたがって抗体結合動力学を測定することが認められる。さらに、ＳＰＲ測定のため、より高い分子量を持つ分析物を用いて、測定感度を増加させることがむしろ好適であり、これはＳＰＲが質量感受性分析であるためである。
【０１１１】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００装置上、ソフトウェアバージョンＶ１．１の制御下で、動力学スクリーニングを行った。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップを装置内に搭載して、そして製造者の指示にしたがって、流体力学的にアドレス指定し、そしてプレコンディショニングした。泳動緩衝液として、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いた（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ２０）。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ捕捉抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、３０μｇ／ｍｌで、１０，０００ＲＵで、フローセル１、２、３および４中、スポット１、２、４および５に固定する（図５）。抗体をＮＨＳ／ＥＤＣ化学反応を通じて共有固定した。その後、１Ｍエタノールアミン溶液でセンサーを脱活性化した。スポット１および５を測定に用い、そしてスポット２および４を参照スポットとして用いた。センサーチップへの適用前に、ハイブリドーマ上清をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で１：２に希釈した。希釈溶液を３０μｌ／分の流速で１分間注入した。その直後に、分析物、例えばサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドを、３０μｌ／分の流速で２分間注入した。その後、シグナルを５分間の解離時間に関して記録した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）を流速３０μｌ／分で２分間注入することによって、センサーを再生した。結合後期（ＢＬ）と示される、分析物注入の終了の少し前に記録されるシグナル、および安定性後期（ＳＬ）と示される、解離時間終了の少し前に記録されるシグナルの２つのレポートポイントを用いて、動力学スクリーニング性能を特徴付けた。
【０１１２】
さらに、ラングミュア・モデルにしたがって解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）を計算し、そして式、ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）にしたがって、抗体／抗原複合体半減期を分の単位にして計算した。
【０１１３】
理解可能であるように、抗原、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）での免疫、ならびにサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ「野生型」、天然ＩＧＦ−１および天然ＩＧＦ−２でのスクリーニングによって、モノクローナル抗体を得た。足場に基づくスクリーニング・アプローチによって、ＩＧＦ−１、配列番号５に含まれるエピトープへの抗体結合を特異的に発生させることが可能になる。
【０１１４】
当該技術分野に知られる方法によって、クローン培養上清に限界希釈することにより、一次培養上清をさらに発生させた。アフィニティおよび特異性に関して、クローン培養上清を機能アッセイにおいて試験した。
【０１１５】
サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）およびサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤのそれぞれへの結合に比較して、ＩＧＦ−１への特異的結合に関して、ＥＬＩＳＡによって、クローン培養を分析した。
【０１１６】
３．３  抗体産生クローン培養上清のＢＩＡｃｏｒｅ性質決定
ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーを系内にマウントしたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４を１００μｌ／分で１分間注入することによって、センサーをプレコンディショニングした。
【０１１７】
系の緩衝液は、ＰＢＳ−ＤＴ（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、５％  ＤＭＳＯ）であった。試料緩衝液は系の緩衝液であった。
【０１１８】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００システムを制御ソフトウェアＶ１．１．１の元で駆動した。ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、それぞれ、フローセル１、２、３および４上、６５００ＲＵ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、３０μｇ／ｍｌで、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を通じて、製造者の指示にしたがって固定した。最後に、１Ｍエタノールアミン溶液を用いて、センサー表面をブロッキングした。全実験を２５℃で行った。
【０１１９】
およそ４０ｎＭでそれぞれの抗体を含有するクローン培養上清を＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ表面上、５μｌ／分の流速で、２分間捕捉した。溶液中の分析物として、組換え天然ＩＧＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．  カタログ番号１００−１１）、組換え天然ＩＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．  カタログ番号１００−１２）、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）、組換え野生型サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ、組換えサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ、組換え野生型サーモコッカス・ガンマデュランスＳｌｙＤ、組換えサーモコッカス・ガンマデュランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）融合ポリペプチドを用いた。サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦは、ＩＦドメインを欠くサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤのＦＫＢＰドメインのみである。サーモコッカス・ガンマデュランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）を用いて対比スクリーニングし（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）、そしてＩＧＦ−２ヘアピン挿入に比較して、ＩＧＦ−１ヘアピンに対する特異性を調べた。それぞれの分析物を９０ｎＭから、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭおよび０ｎＭの異なる濃
度段階で注入した。会合期を、１００μｌ／分の流速で３分間監視した。１００μｌ／分の流速で１０分間、解離を監視した。１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１．７）を用いて系を再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて動力学を評価した。
【０１２０】
以下の用語を本明細書に用いる：ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＲＵ：センサー上に捕捉されたモノクローナル抗体の相対反応単位；抗原：溶液中の抗原；ｋＤａ：溶液中の分析物として注入されるキロダルトンの抗原分子量；ｋａ：会合速度定数；ｋｄ：解離速度定数；ｔ１／２解離：式、ｔ１／２解離＝ｌｎ（２）／６０＊ｋｄにしたがって計算される抗体−抗原複合体半減期；ＫＤ：解離定数；ＲＭＡＸ：９０ｎＭ分析物注入の会合期終了時の結合シグナル；ＭＲ：モル濃度比；カイ２；測定失敗；ｎ．ｄ．：検出不能。
【０１２１】
図７において、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチド免疫キャンペーンから得た、抗ＩＧＦ−１モノクローナル抗体ｍＡｂ＜ＩＧＦ１＞Ｍ−１１．１１．１７での例示的なＢＩＡｃｏｒｅ測定を示す。抗体は、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）融合ポリペプチドおよびＩＧＦ−１に特異的に結合するが、試験したすべての他のポリペプチドには結合しない。
【０１２２】
モノクローナル抗体ｍＡｂ＜ＩＧＦ１＞Ｍ−１１．０９．１５を産生する別のハイブリドーマ細胞株を類似の方式で得た。
図８は、足場由来モノクローナル抗体Ｍ−１１．１１．１７が、ＩＧＦ−１に対してピコモル濃度アフィニティを有することを示す。足場由来モノクローナル抗体Ｍ−１０．７．９は、ＩＧＦ−１に対してナノモル濃度アフィニティを有する。ＩＧＦ−２に対する交差反応性も、または野生型サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤに対する交差反応性も、または野生型サーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤに対する交差反応性も、またはサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ΔＩＦ融合ポリペプチドに対する交差反応性も、またはサーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）融合ポリペプチドに対する交差反応性も、検出不能であった。
【０１２３】
Ｍ−２．２８．４４は、組換えヒトＩＧＦ−１でマウスを慣用的に免疫することによって得られるモノクローナル抗体である。抗体がＩＧＦ−１に対して３０ｐＭアフィニティを示すという事実に関わらず、ＩＧＦ−２に対して５００ｐＭ交差反応性が見られた（図８も参照されたい）。サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−１（７４〜９０）およびサーモコッカス・ガンマトレランスＳｌｙＤ−ＩＧＦ−２（５３〜６５）のどちらもこのモノクローナル抗体によって結合されないため、交差反応性ＩＧＦ−２エピトープはＩＧＦヘアピン領域ではないことが結論づけ可能である。
【０１２４】
３．３  ＜ＩＧＦ−１＞モノクローナル抗体に対するエピトープ分析
ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ合成およびエピトープマッピング
ヒトＩＧＦ１の配列に対応する重複固定ペプチド断片（長さ：１５アミノ酸）のライブラリーによって、エピトープマッピングを行った。合成する各ペプチドを、１アミノ酸ずつシフトし、すなわち各ペプチドは、前のペプチドおよび後のペプチドと、それぞれ１４アミノ酸の重複を有する。ペプチドアレイの調製のため、Ｉｎｔａｖｉｓ  ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ技術を使用した。このアプローチでは、修飾セルロースディスク上、自動化合成装置（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ）でペプチドを合成し、合成後にディスクを溶解させる。次いで、巨大分子セルロースに共有結合した個々のペプチドの溶液をコーティングした顕微鏡スライド上にスポットする。３８４ウェル合成プレート中、アミノ修飾セルロースディスク上で、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を利用して、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ合成を段階的に行った。各カップリング周期で、対応するアミノ酸をＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔの溶液で活性化した。カップリング工程間で、未反応アミノ基を、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミンおよび１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャッピングした。合成完了時、セルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、そして側鎖脱保護のため、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）および水の混合物で処理した。切断溶液を除去した後、セルロース結合ペプチドを、ＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ、ＴＩＳおよび水の混合物で溶解し、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、そしてＤＭＳＯ中に再懸濁した。続いて、Ｉｎｔａｖｉｓスライドスポッティングロボットを用いて、ペプチド溶液をＩｎｔａｖｉｓ  ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭスライド上にスポットした。
【０１２５】
エピトープ分析のため、上述のように調製したスライドを、エタノールで洗浄し、そして次いで、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄した後、５ｍＬのＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１０ｘウェスタンブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２．５ｇスクロースで、４℃で１６時間ブロッキングした。スライドをＴＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そしてその後、ＴＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の対応するＩＧＦ１抗体１μｇ／ｍＬと、周囲温度で２時間、インキュベーションし、そして続いて、ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。検出のため、スライドを抗ウサギ／抗マウス二次ＨＲＰ抗体（ＴＢＳ−Ｔ中、１：２００００）とインキュベーションした後、化学発光基質ルミノールとインキュベーションし、そしてＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で視覚化した。ＥＬＩＳＡ陽性スポットを定量化し、そして対応するペプチド配列の割り当てを通じて、抗体結合エピトープを同定した。
【０１２６】
エピトープマッピングに用いた配列（便宜上、最初の３２のみ示すが、全ＩＧＦ−１分子をスキャンしている）：
【０１２７】
【表２】
2017048209.tif 000010
【０１２８】
モノクローナル抗体ＭＡｂ＜ＩＧＦ−１＞Ｍ−１０．７．９は、配列番号４３〜４９のペプチドに結合することが見出された。これは、配列番号３に示すエピトープに対応する。
【０１２９】
類似の方式で、ＭＡｂ＜ＩＧＦ−１＞１１．１１．１７およびＭＡｂ＜ＩＧＦ−１＞１１．０９．１５それぞれに対するエピトープを決定している。これらのモノクローナル抗体はどちらも、配列番号４３〜５０のペプチドに結合することが見出された。これは、配列番号４に示すエピトープに対応する。
【図３】
2017048209.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図７】
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【配列表】
2017048209000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月9日(2016.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）内に含まれるエピトープに結合する単離された抗体であって、
重鎖可変ドメインが、配列番号１５のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号１８のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことにおいて特徴付けられる、前記抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変ドメインが配列番号２１であり、そして前記軽鎖可変ドメインが配列番号２２であることにより特徴付けられる、請求項１の抗体。
【請求項３】
インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７６〜８４（配列番号３）内に含まれるエピトープに結合する単離された抗体であって、
該抗体は、インスリン様増殖因子１前駆体（配列番号１）のアミノ酸７７〜８４（配列番号４）内に含まれるエピトープに結合し、そして重鎖可変ドメインが、配列番号２３のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２４のＣＤＲ２Ｈ領域、および配列番号２５のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号２６のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２７のＣＤＲ２Ｌ領域、および配列番号２８のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことにおいて特徴付けられる、前記抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインが配列番号２９であり、そして前記軽鎖可変ドメインが配列番号３０である、請求項３の抗体。
【請求項５】
前記重鎖可変ドメインが配列番号３１であり、そして前記軽鎖可変ドメインが配列番号３２である、請求項３の抗体。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項の抗体。
【請求項７】
サンドイッチ・イムノアッセイを通じて、体液試料においてＩＧＦ−１を検出するための方法であって：
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体と試料をインキュベーションし、それによって、該試料中に含まれるインスリン様増殖因子１に対する前記抗体の結合が起こり、
ｂ）ＩＧＦ−１前駆体のアミノ酸７６〜８４を含まないエピトープに結合する、ＩＧＦ−１に対する第二の抗体と、試料をインキュベーションし、それによって、第二の抗体の結合が起こり、そして
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）において形成された免疫学的サンドイッチ複合体を測定し、それによって試料中のＩＧＦ−１を検出する
工程を含む、前記方法。
【外国語明細書】
2017048209000001.pdf