(57)【要約】      （修正有）【課題】肺高血圧症の治療のための薬剤を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を肺高血圧症の治療のための薬剤の有効成分として使用する。2017048116.tif 000008（式中、Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基等を表し、Ｒ２は、シアノ基等を表し、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、水酸基等を表し、Ｘは、酸素原子等を表しそしてＹは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）【選択図】図２
2017048116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する肺高血圧症の治療のための薬剤。
【化１】
2017048116.tif 000007
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基又は１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、シアノ基又はニトロ基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、炭素数１〜８のアルコキシ基又は１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルコキシ基を表し、
Ｘは、酸素原子、ＮＨ又は硫黄原子を表し
そしてＹは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項２】
右心室拡張の進行、心不全または呼吸不全の予防のための請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
肺高血圧症が肺動脈性肺高血圧症である請求項１又は２記載の薬剤。
【請求項４】
Ｒ１が、炭素数１〜８のアルキル基である請求項１〜３記載の薬剤。
【請求項５】
Ｒ１が、メチル基である請求項４記載の薬剤。
【請求項６】
Ｒ２が、シアノ基である請求項１〜５記載の薬剤。
【請求項７】
Ｒ３が、水酸基である請求項１〜６記載の薬剤。
【請求項８】
Ｒ４が、水素原子である請求項１〜７記載の薬剤。
【請求項９】
Ｘが、酸素原子である請求項１〜８記載の薬剤。
【請求項１０】
Ｙが、酸素原子である請求項１〜９記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈の血圧が高くなる疾患である。肺高血圧症は、十分な量の血液を肺に送るためには高い圧力が必要になり、肺に血液を送り出す右心室への負荷が過大となる疾患である。肺高血圧症は、種々の原因により肺の血管内腔が狭くなったことに起因して発症するほか、左室性心疾患によっても発症し得る。
右心室は、高い圧力に耐えられるようにはできていないため、過大な負荷のかかった状態が続くと、心筋の収縮力は低下し、右心室は拡張ないし肥大したまま戻らなくなり、さらに心拍出力が低下するという悪循環に陥り、右心室不全による突然死の原因となる。
【０００３】
「肺高血圧症治療ガイドライン」（２０１２年改訂）によれば、肺高血圧症の臨床分類は、大きく分けて、肺動脈性肺高血圧症（第１群）、左心室心疾患に伴う肺高血圧症（第２群）、肺疾患および／または低酸素血症に伴う肺高血圧症（第３群）、慢性血栓塞栓性肺高血圧症（第４群）および詳細不明な多因子のメカニズムに伴う肺高血圧症（第５群）に分類される。
【０００４】
肺高血圧症のうち、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）は末梢肺動脈収縮と血管壁の肥厚に起因し、安静臥位での平均肺動脈圧が２５ｍｍＨｇ以上を呈する病態と定義される。その病態は特発性、遺伝性、薬物・毒物誘発性、各種疾患（結合組織病、ＨＩＶ感染、門脈圧亢進症、先天性心疾患等）に伴うもの等に分類される。「肺高血圧症治療ガイドライン」（２０１２年改訂）によると、２００９年１０月より特定疾患治療研究事業の対象疾患として、特発性／遺伝性ＰＡＨに加え、結合組織病に伴うＰＡＨや先天性心疾患ＰＡＨも難病として登録可能となった。２０１１年の統計ではＰＡＨの登録症例数は１，９６９例と報告されている。また、２０１０年度の報告では、我が国のＰＡＨ患者総数は約６０００人、全世界では、約２６万人と試算されている。
【０００５】
肺高血圧症の治療薬としては、従来は抗凝固薬（ワルファリン等）、抗血小板薬（アスピリン等）、利尿薬（フロセミド、トリクロルメチアジド、スピロノラクトン等）、強心薬（ドパミン、ドブタミン、ジゴキシン等）が使用されていた。最近、血管拡張作用を有するプロスタサイクリン製剤（エポプロステロール、ベラプロスト）、エンドセリン受容体拮抗剤（アンブリセンタン、ボセンタン）、ホスホジエステラーゼ−５阻害剤（シルデナフィル、タダラフィル）が開発され、肺高血圧症患者予後は改善傾向にある。
それでも、ＰＡＨの５年生存率は５０−６０％、平均生存期間は２．８年で、特に小児の場合には１０ヶ月と極めて予後が悪い。
一方、本件特許出願人は、後記一般式（Ｉ）で表される化合物がキサンチンオキシダーゼ阻害作用を有し、高尿酸血症治療剤として有用である旨の特許出願を行っている。（特許文献１）
しかしながら、この特許文献１には、後記一般式（Ｉ）で表される化合物が肺高血圧症治療薬として有用である旨の記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ０３／４２１８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の治療薬では、十分な効果が得られないこともあり、新規な肺高血圧症の治療または進行予防のための薬剤の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、次の一般式（Ｉ）で表される化合物が、肺高血圧症モデルにおいて優れた肺高血圧症の治療効果および進行予防効果を有することを見いだし本発明を完成した。
即ち、本発明は、次の一般式（Ｉ）、
【０００９】
【化１】
2017048116.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜８のアルキル基又は１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、シアノ基又はニトロ基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、炭素数１〜８のアルコキシ基又は１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルコキシ基を表し、
Ｘは、酸素原子、ＮＨ又は硫黄原子を表し
そしてＹは、酸素原子又は硫黄原子を表す。）
で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する肺高血圧症の治療または進行予防のための薬剤を提供する。
ここで、本発明の肺高血圧症の治療または進行予防のための薬剤は、右心室拡張の進行予防のための薬剤、心不全予防のための薬剤および呼吸不全予防のための薬剤を包含する。
また、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する肺動脈性肺高血圧症の治療または進行予防のための薬剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＳＤラットにモノクロタリン（ＭＣＴ）を皮下投与し、同時に腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプにより薬物Ａ投与を開始し、２８日間持続投与して、心筋リモデリング因子の一つである脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の遺伝子発現を測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＢＮＰ／ＡＣＴＢ（βアクチン）を示す。
【図２】ＳＤラットにＭＣＴを皮下投与し、同時に腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプにより薬物Ａ投与を開始し、２８日間持続投与して、肺のリモデリング因子であるｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）の遺伝子発現を測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＴＧＦ−β／ＡＣＴＢを示す。
【図３】ＳＤラットにＭＣＴを皮下投与し、同時に腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプにより薬物Ａ投与を開始し、２８日間持続投与して、肺組織の血管壁の中膜厚を測定した結果を示す図である。図中、縦軸は中膜厚／血管径（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を更に詳細に説明する。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物としては、次の化合物又はその塩が好ましい。
（１）
Ｒ１が、炭素数１〜８のアルキル基である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（２）
Ｒ１が、メチル基である上記（１）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【００１３】
（３）
Ｒ２が、シアノ基である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は上記（１）又は（２）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（４）
Ｒ３が、水酸基である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は上記（１）〜（３）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（５）
Ｒ４が、水素原子である上記（４）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（６）
Ｘが、酸素原子である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は上記（１）〜（５）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（７）
Ｙが、酸素原子である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は上記（１）〜（６）記載の化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【００１４】
本願において、炭素数１〜８のアルキル基としては、メチル基、エチル基等が挙げられる。
１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルキル基としては、１〜３個のフッ素原子で置換されたメチル基、エチル基等が挙げられる。
炭素数１〜８のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
１〜３のハロゲン原子で置換された炭素数１〜８のアルコキシ基としては、１〜３個のフッ素原子で置換されたメトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物、該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩において、薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、又はリチウム等のアルカリ金属塩が挙げられる。
【００１５】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物、該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物において、立体異性体としてはラセミ体や光学活性体等が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物、該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物において、溶媒和物としては、本発明の化合物又はその塩の医薬上許容される溶媒和物で、水和物も含む。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物、該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物において、互変異性体として、例えば実施例２記載の５−（７−ヒドロキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）−２−メトキシベンゾニトリルに関する以下の互変異性により生じる互変異性体等が含まれる。
【００１６】
【化２】
2017048116.tif 000004
【００１７】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物は、例えば以下で示す製造方法で得ることができる。
【００１８】
【化３】
2017048116.tif 000005
【００１９】
（表中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＸは前記と同じ。）
一般式（ｄ）で表される化合物は、一般式（ａ）で表される化合物と一般式（ｂ）で表される化合物とをトルエン等の反応に関与しない溶媒中、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等の塩基の存在下でのアミド化反応により一般式（ｃ）で表される化合物を得た後、アセトニトリル等の反応に関与しない溶媒中、炭酸セシウム等の塩基の存在下、閉環反応に付すことで得ることができる。なお、Ｒ３が水酸基である一般式（ｄ）で表される化合物は、Ｒ３がメトキシ基である一般式（ｄ）で表される化合物に鉱酸を作用することで得ることができる。
また、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物は、下記の実施例、ＷＯ０３／４２１８５、ＷＯ２００５／１２１１５３記載の方法と同様な方法により得ることができる。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、ヒトに対して経口投与又は非経口投与のような適当な投与方法により投与することにより、肺高血圧症の治療または進行予防をすることができ、さらに、右心室拡張の進行、心不全および／または呼吸不全を予防することができる。本発明の肺高血圧症の治療または進行予防のための薬剤は、また、他の肺高血圧症治療薬と併用することも可能である。
【００２１】
製剤化するためには、製剤の技術分野における通常の方法で錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、注射剤、坐薬等の剤型に製造することができる。
これらの調製には、例えば錠剤の場合、通常の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、色素などが用いられる。ここで、賦形剤としては、乳糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、ブドウ糖などが、崩壊剤としては、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム（ＣＭＣ−Ｃａ）などが、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどが、結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などが挙げられる。注射剤の調製には溶剤、安定化剤、溶解補助剤、懸濁剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤などが用いられる。
【００２２】
投与量は、通常成人においては、有効成分である上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、注射剤においては、０．１μｇ〜１ｇ／日、好ましくは０．００１〜２００ｍｇ／日、経口投与においては、１μｇ〜１０ｇ／日、好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／日投与されるが、年齢、症状等により増減することができる。  
【００２３】
次に薬理実験結果について述べる。
実施例３に記載のとおり、ＭＣＴ誘発肺高血圧症モデルにおいて、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に包含される実施例２記載の化合物（薬物Ａ）は、その持続投与において、ＭＣＴにより誘発された肺血管抵抗性及び右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の上昇並びに右室肥大（ＲＶＨ）を抑制した（表１）。また、薬物ＡはＭＣＴにより変動する心不全のマーカーである心筋中のＢＮＰ ｍＲＮＡの発現を正常化するとともに（図１）、線維化に伴って発現誘導される肺のＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現増加を抑制した（図２）。さらに、薬物ＡはＭＣＴにより誘発される肺小血管の壁厚増加を抑制した（図３）。一方、薬物Ａは実験期間において体重や血圧に明らかな影響を与えなかった（表１）。
従って、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物の互変異性体、立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物は、体重や全身血圧に明らかな影響を与えることなく、優れた肺高血圧症治療効果を示したことから、肺高血圧症治療薬、好ましくは肺動脈性肺高血圧症治療薬として有用である。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【実施例１】
【００２４】
２−メトキシ−５−（７−メトキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）ベンゾニトリル
（１）Ｎ−（４−クロロ−６−メトキシピリミジン−５−イル）−３−シアノ−４−メトキシベンズアミド
窒素雰囲気下、３−シアノ−４−メトキシ安息香酸クロリド（１．１０ｇ，５．６４ｍｍｏｌ）及び５−アミノ−４−クロロ−６−メトキシピリミジン（９０１ｍｇ，５．６４ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ｍＬ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（１．１ｍＬ，６．７７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で一晩加熱した。室温まで放冷し、水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：３→１：２）により精製し、表題化合物（１．４４ｇ，収率８０％）を白色結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝
４．０４（３Ｈ，ｓ），
４．０６（３Ｈ，ｓ），
７．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），
７．２９（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），
８．１−８．２（２Ｈ，ｍ），
８．５２（１Ｈ，ｓ）．
【００２５】
（２）２−メトキシ−５−（７−メトキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）ベンゾニトリル
上記で得たＮ−（４−クロロ−６−メトキシピリミジン−５−イル）−３−シアノ−４−メトキシベンズアミド（１．４４ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４８ｍＬ）に溶解し、炭酸セシウム（５．９３ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）を加え、２４時間加熱還流した。室温まで放冷後、水（１００ｍＬ）、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、１０分間攪拌し、析出している結晶をろ取した。得られた結晶を酢酸エチル（２０ｍＬ）で洗浄後、風乾して表題化合物（６４７ｍｇ，収率５０％）を白色結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝
４．０５（３Ｈ，ｓ），
４．２５（３Ｈ，ｓ），
７．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），
８．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，９Ｈｚ），
８．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），
８．６１（１Ｈ，ｓ）．
【実施例２】
【００２６】
５−（７−ヒドロキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）−２−メトキシベンゾニトリル
実施例１で得た２−メトキシ−５−（７−メトキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）ベンゾニトリル（７４３ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を酢酸（１０ｍＬ）に溶解し、塩酸（１０ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応混合物に水（４０ｍＬ）を加え、析出している結晶をろ取、水、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた結晶をクロロホルム（６ｍＬ）に懸濁し、１５分間加熱還流後、室温まで放冷し、析出している結晶をろ取し、クロロホルムで洗浄した。得られた結晶を酢酸エチル（９ｍＬ）に懸濁し、１時間加熱還流後、室温まで放冷した。析出している結晶をろ取し、酢酸エチルで洗浄後、風乾して表題化合物（６４５ｍｇ，収率９１％）を白色結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝
３．３１（３Ｈ，ｓ），
７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），
８．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），
８．２−８．４（２Ｈ，ｍ），
１３．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）．
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３０７３，２２３３，１７４５，１６１４，１５４７，１４９８，１４０６，１３４０，１３０２，１２８６，１２０９，１１８８，１１３０，１０８０，１０６５，１０１１，９２７，９０４，８２９，７８５，７４２，６４２，６０７，５５３，４９６，４６５．
【実施例３】
【００２７】
モノクロタリン（ＭＣＴ）誘発肺高血圧症モデルでの薬理実験
１）使用動物
動物は、７週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄性ラット（ 日本チャールスリバー（株））を用いた。
２）被験薬物の調製・投与
５−（７−ヒドロキシオキサゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）−２−メトキシベンゾニトリル（以下、薬物Ａという。）は５０％  ＤＭＳＯ−１５％  ＥｔＯＨ含有生理食塩水に２５ｍＭの濃度に溶解して浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｍｉｎｉｐｕｍｐｓ、ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に入れた。３７℃の生理食塩水中で４８時間回転振盪したものを腹腔内に埋め込み２８日間持続投与した。腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプから薬物Ａが体内に放出された（０．２５μＬ／時間；０．１５μｍｏｌｅ  薬物Ａ／日）。また、コントロールとして、５０％  ＤＭＳＯ−１５％  ＥｔＯＨ含有生理食塩水を浸透圧ポンプに入れて同様に投与した。
【００２８】
３）試験方法
（１）肺高血圧症モデルの作製
７週齢の雄性ＳＤラットに、モノクロタリン（ＭＣＴ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｍｇ／ｋｇを皮下投与し、同時に腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプを用いて薬物Ａの持続投与を開始し、２８日間持続投与を行った。
（２）心エコーによる解析
全ての動物について、投与前及び投与２週目から毎週、イソフルラン麻酔下で小動物用超音波画像診断装置（Ｖｅｖｏ  ２１００  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ，ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を用いて経胸的２次元、Ｍモード及びドプラ法を実施した。左室のＭモード測定は傍胸骨長軸像で実施した。肺動脈血流のパルスドプラ法は肺動脈弁のレベルで傍胸骨長軸像で実施した。肺動脈血流を特徴づけるために、肺動脈収縮期血流加速時間（ＡｃＴ）及び右室駆出時間（ＥＴ）を測定した。ＡｃＴは収縮期血流の立ち上がりから最高肺動脈血流速度に至るまでの時間として測定し、ＥＴは収縮期の肺動脈血流の立ち上がりから完了までの時間として測定した。
【００２９】
（３）右室カテーテルによる侵襲的測定
麻酔下に開胸術を施し、１４ゲージカテーテルを気管内に挿入した。１．６−Ｆｒ圧容積カテーテルを圧制御ユニット（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｃ．）に接続し、Ｌａｂｓｃｒｉｂｅ２データ取得ソフト（ｉＷｏｒｘ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）により観察した。カテーテルは圧測定のために右心室に誘導した。１５−２０圧サイクルの平均を最終的な圧として採用した。
（４）免疫組織学的解析
血行動態を測定したのち、右室肥大を評価するために心臓を摘出し、右室重量／（左室重量＋中隔重量）を算出した。
肺組織は２０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。肺切片（５μｍ）は抗α平滑筋アクチン抗体染色及びヘマトキシリン・エオジン染色を行った。壁肥厚（ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）は次式により算出した。
Ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（％）＝[（中膜厚×２）／血管径]×１００
直径３０−９０μｍの細肺動脈を評価に用いた。
【００３０】
（５）肺高血圧症と関連した因子のｍＲＮＡの発現
肺におけるＴＧＦ−β及び右室中のＢＮＰのｍＲＮＡレベルをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定した。全ＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、またｃＤＮＡ合成はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲはＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて行った。ｍＲＮＡの発現レベルは同じサンプルからのβ−ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡの発現レベルで標準化し、２−ΔΔＣＴ法により遺伝子発現変化を算出した。
【００３１】
４）試験結果
ＭＣＴ誘発肺高血圧症モデルにおいて、薬物Ａの持続投与はＭＣＴにより誘発された肺血管抵抗性及び右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の上昇並びに右室肥大（ＲＶＨ）を抑制した（表１）。また、薬物ＡはＭＣＴにより変動する心不全のマーカーである心筋中のＢＮＰ ｍＲＮＡの発現を正常化するとともに（図１）、線維化に伴って発現誘導される肺のＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現増加を抑制した（図２）。さらに、薬物ＡはＭＣＴにより誘発される細肺動脈の壁厚増加を抑制した（図３）。一方、薬物Ａは実験期間において体重や血圧に明らかな影響を与えなかった（表１）。
ＭＣＴで誘導された肺高血圧症に対する薬物Ａの阻害効果
【００３２】
【表１】
2017048116.tif 000006
【００３３】
ＡｃＴ／ＥＴ比：肺動脈収縮期血流加速時間（ＡｃＴ）／右室駆出時間（ＥＴ）
ＲＶＳＰ：右室収縮期圧
ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）：右室重量／（左室重量＋中隔重量）
ＭＣＴ：モノクロタリン
＊１）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−テスト  Ｐ値；ＭＣＴ＋溶媒  ｖｓ  ＭＣＴ＋薬物Ａ
＊２） ＲＶＳＰのデータは薬物Ａを０．３μｍｏｌｅｓ／ｄａｙ 投与した場合の値を示す。なお、薬物Ａを０．１５μｍｏｌｅｓ／ｄａｙ 投与した場合はＭＣＴ＋溶媒群と比較して有意な変化を示さなかった。
【図１】
2017048116.tif 000009
【図２】
2017048116.tif 000010
【図３】
2017048116.tif 000011