(57)【要約】【課題】新規なメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤を提供することを課題とする。【解決手段】亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進剤。
【請求項２】
亜鉛の塩が硫酸亜鉛である請求項１に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
【請求項３】
経口剤である請求項１又は請求項２に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
【請求項４】
亜鉛１質量部に対しグルタチオンを１〜１０質量部含有する請求項３に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
【請求項５】
さらにセレン及び西洋タンポポ抽出物を含む請求項４に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
【請求項６】
亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進のための健康食品又はサプリメント。
【請求項７】
亜鉛１質量部に対しグルタチオンを１〜１０質量部、セレン及び西洋タンポポ抽出物を含む重金属排泄促進剤。
【請求項８】
重金属が水銀である請求項７に記載の重金属排泄促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康に有害な体内の重金属の解毒に係るメタロチオネインの産生を促進する剤及び重金属の排泄を促進する剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
重金属とは、比重が４〜５以上を示す金属元素をいう。一般的には鉄以上の比重を持つ金属の総称である。
過去には、鉱山や工場などからの廃液により、人体に重金属が蓄積されて重度の障害を引き起こす公害病が多発した。産業廃棄物などから排出される重金属もまた、しばしば水源や土壌などの環境中で、生物連鎖により濃縮されて、公害の原因となっている。代表的なものに、足尾銅山の鉱毒による被害、メチル水銀が引き起こした水俣病、カドミウムによるイタイイタイ病がある。重金属は生体に必須の金属もあるが、生体内の蓄積量がある一定量を超えると、生物に対し毒性をもつという考え方から、生体にとって必須量を超えて蓄積されることは好ましくない。従って重金属は、速やかに排泄することが健康管理上必要とされている。また、砒素やベリリウムを代表例とする半金属類、あるいは卑金属類も、人体に蓄積されると、健康に著しい悪影響を及ぼす。このためこれらの人体や動物に有害な作用を引き起こす重金属をはじめとする金属類は、有害金属とも呼ばれている。
【０００３】
生体内の過剰な重金属は、メタロチオネインと結合することでその毒性が軽減される。重金属は、肝臓においてメタロチオネインと結合して貯蔵され（解毒され）、その後血中に徐々に放出され、腎糸球体で濾過された後に近位尿細管にて一部再吸収される。この重金属の解毒作用を示すメタロチオネイン（Metallothionein）は、分子量が約６５００と低分子量の金属結合タンパク質である。メタロチオネインの構成アミノ酸は、生物種により異なるが約６１個のアミノ酸残基から構成され、その1/３をシステインが占めるという珍しいタンパク質であり、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含まない。
メタロチオネインは、カドミウム又は亜鉛の場合、１分子あたりあわせて７個の原子がＳＨ基と結合している。銅や銀は１２個結合する。通常生体に存在するメタロチオネインは亜鉛を結合した形（Ｚｎ−ＭＴ）で存在しており、過剰な重金属は、この亜鉛と置換して結合する。そしてこの亜鉛と置換しうる金属種は、銅（Ｃｕ＋）、カドミウム（Ｃｄ２＋）、鉛（Ｐｂ２＋）、銀（Ａｇ＋）、水銀（Ｈｇ２＋）、およびビスマス（Ｂｉ２＋）である。これらの金属に対するメタロチオネインの親和性は金属により異なる。また、生体内での半減期も金属種により異なる。例えばＣｄ−ＭＴで約８０時間、Ｃｕ−ＭＴで約２０時間、Ｚｎ−ＭＴで約１７時間であるといわれている。すなわちこれらの重金属は、メタロチオネインと結合することで速やかに体外に排泄される。カドミウム以外の重金属は、２４時間以内に排泄される。
生体内のメタロチオネインは、亜鉛やカドミウム等の金属の他に、グルココルチコイド、過酸化水素、インターロイキン-６等、種々の刺激で誘導される。したがって生体内でのメタロチオネインを誘導することで重金属による毒性を軽減し、排泄を促進することが可能となる。すなわちメタロチオネインの誘導剤は体内の有害金属、特に水銀などの重金属の排泄促進剤となりうる。しかしメタロチオネイン産生促進物質を有効成分とする有効な重金属の排泄促進剤は提供されていない。
なお、生体内のメタロチオネインの産生促進剤としては、ヒノキチオール（特許文献１）、真珠層を有する貝殻の可溶化物（特許文献２）、真珠又は真珠層由来蛋白加水分解物（特許文献３）などが知られている。
【０００４】
また体内の重金属や有害金属を尿中に排泄促進する効果のある物質や組成物が知られている。このような作用を有するものとしては、茶葉から抽出したエピガロカテキンガレート（特許文献４）、フィチン酸及びその塩、αリポ酸、キシロオリゴ糖からから選択される二種以上を含有する組成物（特許文献５）、αリポ酸とシトルリンを含む組成物（特許文献６）などが公知である。
さらに、重金属と結合する、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（以下、「ＤＭＰＳ」ともいう）、ジメルカプトコハク酸（以下、「ＤＭＳＡ」ともいう）、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」ともいう）等のキレート剤が知られている。しかしキレート剤は、生体に必須の金属も排泄してしまう場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０７−０９７３０９号公報
【特許文献２】特開２０１４−０５１４４０号公報
【特許文献３】特開２０１４−０７４０１６号公報
【特許文献４】特開２００６−２７３７３５号公報
【特許文献５】特開２００８−０７４８３５号公報
【特許文献６】特開２０１３−１８１０１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、メタロチオネインの産生を促進する物質を探索する過程で、亜鉛とグルタチオンを併用すると、亜鉛あるいはグルタチオンをそれぞれ単独で用いるよりも著しく高いメタロチオネイン産生が観察される事を発見した。本発明はこの発見に基づく。
すなわち、本発明は新規なメタロチオネイン産生促進剤を提供することを課題とする。また、このメタロチオネイン産生促進剤は、重金属特に水銀の体外排泄を促進することを見いだした。すなわち本発明は、新規なメタロチオネイン産生促進剤を有効成分とする重金属排泄促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の構成は、以下のとおりである。
（１）亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進剤。
（２）亜鉛の塩が硫酸亜鉛である（１）記載のメタロチオネイン産生促進剤。
（３）経口剤である（１）又は（２）に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
（４）亜鉛１質量部に対しグルタチオンを１〜１０質量部含有する（３）に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
（５）さらにセレン及び西洋タンポポ抽出物を含む（４）に記載のメタロチオネイン産生促進剤。
（６）亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進のための健康食品又はサプリメント。
（７）亜鉛１質量部に対しグルタチオンを１〜１０質量部、セレン及び西洋タンポポ抽出物を含む重金属排泄促進剤。
（８）重金属が水銀である（７）に記載の重金属排泄促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、新規なメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤が提供される。本発明のメタロチオネイン産生促進剤は、亜鉛とグルタチオンの相乗作用により、亜鉛あるいはグルタチオンをそれぞれ単独で用いるよりも高いメタロチオネイン産生促進効果が得られる。また生体内のメタロチオネイン産生が促進されることによって重金属の解毒効果が期待される。さらにメタロチオネインのもう一つの作用である抗酸化作用が強化されて、生体の抗酸化能が向上し、活性酸素やフリーラジカルが消去されて抗老化作用が期待される。また本発明の重金属排泄促進剤は、排泄が困難な水銀の排泄を促進する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】亜鉛とグルタチオン併用によるメタロチオネイン産生促進効果試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明のメタロチオネイン産生促進剤とプラセボを摂取したヒト試験に基づく摂取前後血中メタロチオネインの変化率を示すグラフである。
【図３】本発明の重金属排泄促進剤を摂取したヒト試験に基づく摂取前後の尿中に排泄された水銀の変化率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、亜鉛の塩又は亜鉛酵母及びグルタチオンを有効成分として含有するメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤に係るものである。
本発明に用いる亜鉛の塩は、従来から、食品に慣用的に配合されるものでよい。例えば、グルコン酸亜鉛、硫酸亜鉛を例示できる。また亜鉛酵母は、水溶性の亜鉛を数ｐｐｍ〜数百ｐｐｍ添加した培養液中で酵母を培養して増殖させた後酵母を回収し、洗浄後乾燥（スプレードライ）したものである。食品原料として普及しており、食品に亜鉛を強化する場合に用いられる。この場合に酵母培養に使用される水溶性の亜鉛としては、硫酸亜鉛を用いることができる。また、水溶性の亜鉛としては、硫酸亜鉛の他、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛等を用いてもよい。亜鉛の配合量としては、本発明の剤として１０ｇあたり、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜５０ｍｇが適当である。そして本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤に、亜鉛として１日当たり２〜２０ｍｇ摂取できる量を配合する。
【００１１】
グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グリシンが、この順番でペプチド結合したトリペプチドである（Ｌ−γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ）。ただし、グルタミン酸とシステインの結合は通常のペプチド結合とは異なり、グルタミン酸側鎖のγ-カルボキシ基とシステイン主鎖のα-アミノ基からなる（γ-グルタミル結合）。このためグルタチオンは、ペプチドでありながら、ほとんどのプロテアーゼに対して耐性であり、分解されない。グルタチオンは日本薬局方に収載されており、これを本発明の内の食品分野に用いる場合は、「Ｌ-システインペプチド」として用いることができる。本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤とする場合には、亜鉛の配合１質量部当たりグルタチオンを１〜１０質量部配合する。特に好ましくは、亜鉛の配合１質量部当たりグルタチオンを４〜６質量部配合する。
【００１２】
本発明のメタロチオネイン産生促進剤および重金属排泄促進剤には、さらにセレン及び西洋タンポポ抽出物を配合することができる。
セレンはセレノシステインとしてタンパク質に組み込まれ、主にセレノプロテインとして働く。セレンはビタミンＥやビタミンＣと協調して、活性酸素やラジカルから生体を防御する。セレンはセレン酵母を配合することが好ましい。セレン酵母は亜鉛酵母と同様に、亜セレン酸塩などの水溶性のセレンを数ｐｐｍ〜数百ｐｐｍ添加した培養液中で酵母を培養して増殖させた後酵母を回収し、洗浄後乾燥（スプレードライ）したものである。サプリメント原料として普及しており、セレンを強化する場合に用いられる。
セレンの配合量としては、本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤１０ｇあたり、０．１μｇ〜１０００μｇが適当である。
【００１３】
西洋タンポポ（Taraxacum officinale）は菊科の多年草である。西洋タンポポ抽出物は、植物体の根を含む全草を熱水で抽出し、乾燥させたものである。主成分は苦味質、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、有機物および微量元素が含有されていて、その效能として、利尿作用および消化液分泌作用が挙げられる。食欲不振や腹部膨満感、ガスのような消化障害に用いられ、また、胆汁分泌に問題のある場合や、小便量を増やそうとするときにおいても優れた効果がある。西洋タンポポ抽出物は、健康食品として販売されており、これを配合することもできる。
西洋タンポポ抽出物の配合量は、本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤１０ｇあたり、１０〜１０００ｍｇが適当である。
【００１４】
本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤は、経口剤として摂取される。剤形として散剤、液剤、ゼリー剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の形で体内に適用されるが、好ましくは錠剤、カプセル剤である。
【００１５】
本発明のメタロチオネイン産生促進剤及び重金属排泄促進剤は、上記必須成分のほかに、必要に応じ適宜賦形剤、呈味剤、着色剤、保存剤、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、酸化防止剤等を適量配合することができる。
このうち、賦形剤としては、所望の剤型としたときに通常用いられるものであれば何でもよく、例えば、微粒子二酸化ケイ素のような粉末類、ショ糖脂肪酸エステル、結晶セルロース・カルボキシメチルセルロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリンなどのでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、粉末水飴、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、マルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖などの糖類、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。これらの賦形剤は、単独又は二種以上組み合わせて使用することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に、試験例・実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜試験例１＞  亜鉛とグルタチオン併用によるメタロチオネイン産生促進効果試験
硫酸亜鉛及びグルタチオンの併用が相乗的にメタロチオネイン遺伝子の発現を促進することを確認した。
（１）試験方法
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）の懸濁液を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度になるように、１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２に調整したインキュベーター中で、１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用いて２４時間培養する。
次いでＰＢＳに溶解した５０ｍＭのグルタチオン又は硫酸亜鉛、グルタチオン＋硫酸亜鉛の溶液をそれぞれ５０μｌ添加し、さらに５時間同じ条件で培養する。
なお対照としてＰＢＳのみを５０μｌ添加したウェルを同様に培養する。
培養終了後トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥離し、Ｔｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は、ＴＲｌｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔに添付の説明書に従って行った。
抽出したＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡ合成し、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ）を用いてメタロチオネインのリアルタイムＰＣＲを行い、メタロチオネイン遺伝子の発現に及ぼす効果を評価した。
【００１７】
（２）結果
無添加ウェルの遺伝子発現量と各群の遺伝子発現量の差を図１に示す。
図１に示すように、硫酸亜鉛（Ｚｎ）はＰＢＳによるメタロチオネイン遺伝子の発現量を１とするとほぼ同等の遺伝子発現促進作用を示した。グルタチオン（Ｇｌｕ）は同様にＰＢＳの２．１倍のメタロチオネイン遺伝子の発現促進作用を示した。これに対して硫酸亜鉛とグルタチオンを併用（Ｇｌｕ＋Ｚｎ）するとメタロチオネイン遺伝子の発現は４．２１倍に増加した。すなわち硫酸亜鉛とグルタチオンを併用すると、メタロチオネインは相乗的に増加することが明らかとなった。
以上の試験から、水溶性亜鉛の塩とグルタチオンは、メタロチオネインの顕著な産生促進効果を有することが判明した。
【００１８】
次に本発明のメタロチオネイン産生促進剤製造例およびこのメタロチオネイン産生促進剤を用いたヒト試験例を示し、本発明の示す効果をさらに具体的に説明する。
【００１９】
＜製造例＞
下記の実施例１（高用量組成）、実施例２（低用量組成）のメタロチオネイン産生促進剤を製造した。組成は１カプセル当たりの含量を示す。
＜実施例１：高用量製剤（カプセル剤）＞
（成分）
西洋タンポポ抽出物                      ４５０．０７ｍｇ
Ｌ−システインペプチド含有酵母エキス    ３３３．４８ｍｇ
セレン酵母                                ７５．６０ｍｇ
亜鉛酵母                                  ９０．０５ｍｇ
食用ホタテ貝殻粉                        １７６．４０ｍｇ
ショ糖エステル                            ５０．４０ｍｇ
セルロース                              ５０４．００ｍｇ
ＨＰＭＣカプセル                        ３６０．００ｍｇ
（合計                                  ２０４０．００ｍｇ）
【００２０】
（製造法）
上記の西洋タンポポ抽出物からセルロースまでの各成分の７５００倍量を秤量・混合・造粒し、ＨＰＭＣカプセル２号に２８０ｍｇずつ充填し、実施例のカプセル剤を得る。
【００２１】
＜実施例２：低用量製剤（カプセル剤）＞
（成分）
西洋タンポポ抽出物                      ２２５．０４ｍｇ
Ｌ−システインペプチド含有酵母エキス    １６６．７４ｍｇ
セレン酵母                                ３７．８０ｍｇ
亜鉛酵母                                  ４５．０３ｍｇ
食用ホタテ貝殻粉                          ８８．２０ｍｇ
ショ糖エステル                            ２５．２０ｍｇ
セルロース                            １０９２．００ｍｇ
ＨＰＭＣカプセル                        ３６０．００ｍｇ
（合計                                  ２０４０．０１ｍｇ）
【００２２】
（製造法）
上記の西洋タンポポ抽出物からセルロースまでの各成分の７５００倍量を秤量・混合・造粒し、ＨＰＭＣカプセル２号に２８０ｍｇずつ充填し、実施例のカプセル剤を得る。
【００２３】
各原料成分を混合し造粒物を得た。この造粒物をカプスゲルジャパン株式会社製のハードカプセルＶｃａｐｓ  Ｐｌｕｓ（サイズ２号ＶＰ  ＮＡＴＵＲＡＬ  Ｂ／Ｃ）に充填して、カプセル製剤を得た。
【００２４】
＜試験例２＞高用量、低用量、プラセボ品を用いたヒト試験
製造例で得た２種類の含量のカプセル剤およびプラセボ剤の３種を用いたヒト試験を行った。
（１）被験者：健康な成人男子  高用量摂取群１５名、低用量摂取群１５名、プラセボ摂取群１５名の３群を設定し、３群間無作為化並行群間二重盲検試験とした。また予め本試験に直接関わらない割付責任者が被験者を無作為に３群に分け、年齢、体重、尿中水銀量、全身骨格筋量（ＤＸＡ、Ｉｎ  Ｂｏｄｙ）、体脂肪率（ＤＸＡ、Ｉｎ  Ｂｏｄｙ）が偏っていないか確認した。
（２）被験者の条件
・２０歳以上５０歳未満の健常な日本人男性
・ＢＭＩ１８．５以上２５未満の者
・体重６０ｋｇ以上８０ｋｇ未満の者
・習慣的に魚を好んで食べる者
・直近の検査でＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、γ−ＧＴ（γ−ＧＴＰ）、ＢＵＮ、クレアチニンが基準値内の者
【００２５】
（３）摂取量及び摂取期間
毎日カプセル剤３粒を１日２回（朝食後、夕食後）水とともに摂取させた。摂取期間は１２週間とした。
【００２６】
（４）検査項目
摂取前０日目と摂取後１２週間後に採血を行い、一般生化学項目及び血中メタロチオネイン量を測定した。血中メタロチオネイン量の測定は、メタロチオネインのＮ端側のアミノ酸を認識する特異性の高いメタロチオネインウサギポリクロナール抗体を用いた間接競合反応を使用した測定キット（株式会社フロンティア研究所）を用いて測定した。
また代表的な重金属として水銀の排泄量を指標として、体内の蓄積重金属量の変化量を確認した。測定は、尿中誘発検査法に基づいて評価した。
すなわち、キレート剤を単回経口投与後、数時間分蓄尿した尿中に含まれる有害金属量を分析する。本試験では経口キレート剤であるＤＭＳＡを２０ｍｇ／ｋｇを単回摂取し、６時間蓄尿し、尿中の水銀量を原子吸光分析法で定量した。このとき得られる水銀量が、その測定時点での被験者の体内水銀蓄積量の指標となる。
【００２７】
（５）結果
図２にメタロチオネインの測定結果を示す。なおメタロチオネインの測定結果は、摂取前の値が10〜50nｇ/ｍLであった被験者１８名（高用量群５名、低用量群５名、プラセボ群８名）のものを示し、摂取開始前の数値を０％とし、１２週経過後の増減率（％）で表示している。
プラセボ摂取群は、摂取前に比較してメタロチオネイン量に変化は認められなかった。一方本発明のメタロチオネイン産生促進剤を摂取すると摂取１２週経過後には、血中メタロチオネイン量は、高用量群では摂取前に比べて５２．５％増加した。また、低用量群では摂取前に比べて４４．６％増加した。血中メタロチオネインの増加は、組織のメタロチオネインの増加を反映していることから、生体内のメタロチオネインが増加したものと考えられた。
この結果から明らかなように、本発明のメタロチオネイン産生促進剤を摂取することで、顕著な血中メタロチオネイン量の増加が確認された。したがって本発明の剤はメタロチオネイン産生促進剤として有用であることが明らかとなった。
【００２８】
図３に、尿中誘発検査法に基づく体内水銀量の測定結果を示す。なお体内水銀量の測定結果は、摂取開始前の数値を０％とし、１２週経過後の増減率（％）で表示している。
プラセボ摂取群は、体内水銀量が、摂取前に比べて１９％増加した。一方本発明の剤を摂取すると１２週経過後には、体内水銀量は、高用量群では摂取前に比べて６２％低下した。また、低用量群でも摂取前に比べて６％低下した。すなわち本剤を摂取することで体内水銀量が排泄されていることがわかる。生体内の重金属の排泄が促進されたものと考えられた。
また本試験の摂取期間に体調不良や異常を訴えた被験者はいなかった。また血液生化学データの異常も認められないことから、本発明品は極めて安全であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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