(57)【要約】【課題】マウスイヤーからの簡便な核酸増幅法および核酸増幅用核酸試料の調製法を提供する。より詳細には、精製をすることなく、マウスイヤーに含まれている核酸を抽出し、核酸増幅用の核酸試料とする方法を提供する。【解決手段】マウスイヤーとアルカリ性溶媒との混合物を加熱処理することにより得られた核酸試料を鋳型とする核酸増幅方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したマウスイヤーとアルカリ性溶媒との混合物を加熱処理することにより得られた混合物を核酸試料とする核酸増幅方法。
【請求項２】
加熱処理として、９０〜１００℃の温度で１０分以上の処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出法。
【請求項３】
アルカリ性溶媒が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種類のアルカリ金属水酸化物を含有する水溶液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸抽出法。
【請求項４】
アルカリ金属水酸化物の濃度が２００ｍＭを超えることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
以下の（ａ)及び（ｂ）を含むことを特徴とする核酸増幅反応用試薬キット。
（ａ)２００ｍＭを超える濃度でアルカリ金属水酸化物を含有する核酸抽出溶液
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質及び金属塩を少なくとも含有する核酸増幅反応溶液
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法、核酸増幅用核酸試料の調製法に関する。本発明は、特にマウスイヤーを用いた遺伝子の研究、検査等に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
【０００３】
今までＰＣＲは、色素やタンパク質、糖類などの夾雑物の影響を受けやすく、夾雑物が反応を阻害すると言われていた。そのため、通常、生体試料中の遺伝子を増幅する場合は、ＤＮＡの精製が必要とされていた（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、最近では、ＰＣＲ酵素の組成等が検討され、簡単な抽出だけで核酸を増幅できるようになってきている。抽出法は様々であり、単純に熱をかける熱処理法やプロテアーゼＫで処理するＰｒｏＫ法、ＣＴＡＢなどを含む界面活性剤を用いる方法、ＮａＯＨなどのアルカリ性溶媒で溶解する方法など数多くの方法が検討されている（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、これらの抽出法は生体試料間や生体試料の部位によって最適な条件が異なり、一般的な抽出法をそのまま用いるだけでは、増幅不良が起きる場合があった。また、抽出操作に時間を要したり、抽出後の核酸増幅が効率よく進行しなかったりといった問題もあった。
【０００６】
近年、ゲノム編集の技術が確立され、容易にトランスジェニックマウスを作製できるようになっている。これらマウスにおいては、テールやイヤー、血液を用いて、遺伝子を増幅する場合があるが、なかでもイヤーについては、一般的な抽出法では増幅することが困難であった。
【０００７】
上記のような背景から、マウスイヤーの核酸を簡単に増幅できる核酸増幅法及び核酸試料の調製法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第２００８１０２３４３０４．９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,  第３９巻,  第２号，ｐ．４８５−４９３（２００１年）
【非特許文献２】ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ取扱説明書（２０１０年、東洋紡株式会社発行）
【非特許文献３】株式会社島津製作所ホームページ  Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）ＵＳＥＲ’Ｓボイス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎ．ｓｈｉｍａｄｚｕ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｉｏ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ａｍｐ／ｖｏｉｃｅ．ｈｔｍ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はマウスイヤーからの簡便な核酸増幅法及び核酸増幅用核酸試料の調製法を提供する。より詳細には、精製をすることなく、マウスイヤーに含まれている核酸を抽出し、核酸増幅用の核酸試料とする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するための本発明の核酸増幅法は、マウスイヤーとアルカリ性溶媒との混合物を加熱処理し、得られた核酸試料を鋳型とする核酸増幅方法である。すなわち、本発明者はマウスイヤーに含まれる核酸をアルカリ性溶媒に添加し加熱することで抽出し、精製することなく、核酸を増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、アルカリ性溶媒の濃度を２００ｍＭより高い濃度にして加熱処理をすることで、抽出効果を高め、また一緒に溶出してくる夾雑物を失活させ、ＰＣＲの成功率を上げることを見出し、本発明を成すに至った。
【００１２】
代表的な本願発明は以下の通りである。
［項１］
単離したマウスイヤーとアルカリ性溶媒との混合物を加熱処理することにより得られた混合物を核酸試料とする核酸増幅方法。
［項２］
加熱処理として、９０〜１００℃の温度で１０分以上の処理を行うことを特徴とする項１に記載の核酸抽出法。
［項３］
アルカリ性溶媒が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種類のアルカリ金属水酸化物を含有する水溶液であることを特徴とする項１又は２に記載の核酸抽出法。
［項４］
アルカリ金属水酸化物の濃度が２００ｍＭを超えることを特徴とする項３に記載の核酸増幅方法。
［項５］
以下の（ａ)及び（ｂ）を含むことを特徴とする核酸増幅反応用試薬キット。
（ａ)２００ｍＭを超える濃度でアルカリ金属水酸化物を含有する核酸抽出溶液
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質及び金属塩を少なくとも含有する核酸増幅反応溶液
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、マウスイヤーに含まれる核酸を簡便に増幅することができる。一般的に、個体識別のためにイヤーを切除することが多い。イヤーから増幅できる本発明を用いれば、新たにサンプルを取得することなく、遺伝子を解析できるため、非常に効率が良い方法である。
また、マウスイヤーを回収する治具がすでに販売されており、動物を大きく傷つけることなくサンプルを回収できるため、動物にも優しい解析法である。本発明は、簡便に遺伝子解析することを可能にし、特に研究分野において非常に役立つ技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、ＮａＯＨの濃度による影響を検討した結果である。
【図２】実施例２において、マウス系統の種類による影響を検討した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における核酸増幅方法は、マウスイヤーをアルカリ性溶媒中で加熱処理することにより得られた混合物を核酸試料とする核酸増幅方法である。
【００１６】
本発明の核酸除去法が適用されるＰＣＲ組成は、特に限定されない。例えば、以下の（ａ）から（ｅ）を含む組成が挙げられる。
（ａ）緩衝剤
（ｂ）金属塩
（ｃ）ｄＮＴＰｓ
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ
【００１７】
（ａ）から（ｅ）の具体的な態様については、いずれも特に限定されるものではないが、例えば、以下のようなものが例示される。
【００１８】
（ａ）緩衝剤としては、トリス（Ｔｒｉｓ）やビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。
（ｂ）金属塩としては、マグネシウム、マンガン、カリウムなどの塩が挙げられる。
（ｃ）ｄＮＴＰｓとしては、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰが適宜好ましいバランスで含まれていれば良いが、それ以外のものを含んでいても構わない。例えばｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含ませることもできる。
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼとしては、α型、ＰｏｌＩ型のいずれでもよく、α型であればＫＯＤ、Ｐｆｕなど、ＰｏｌＩ型であればＴａｑ、Ｔｔｈなどが挙げられる。前記の天然型のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を改変したものであってもよい。
【００１９】
本発明において、マウスイヤーの単離方法としては、市販されているイヤーパンチなどの治具を使用してもよいし、はさみやカッターなどで切除してもよい。イヤーの大きさについては特に限定されないが、イヤーパンチで単離された場合、Φ１．５ｍｍやΦ２．０ｍｍが好ましい。はさみやカッターで切除した場合、１ｍｍ〜３ｍｍ程度の大きさが好ましい。
【００２０】
本発明に用いられるマウスについては、ｄｄＹ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、Ａ／Ｊ、ＤＢＡ、ＣＢＡ、またはこれらの系統から遺伝子改変されたものが挙げられるが、特に限定されない。
【００２１】
本発明における加熱処理は、９０〜１００℃で１０分以上行うことが好ましい。ウォーターバスやサーマルサイクラ―などを用いて実施することができる。加温処理の方法については、特に限定されない。
【００２２】
本発明におけるアルカリ性溶媒とは、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムから選ばれる少なくとも１種類のアルカリ金属水酸化物を含有する水溶液である。好ましくは、水酸化ナトリウムを含有する水溶液である。
【００２３】
これらアルカリ金属水酸化物の濃度は、マウスイヤー由来の阻害物質を失活させ、核酸抽出効率を高めるために、２００ｍＭを超えることが好ましい。２００ｍＭを超えていれば、特に限定されないが、１０Ｍ以下であることが好ましく、１Ｍ以下であることがより好ましく、４００ｍＭ以下であることが特に好ましい。具体的には、２５０ｍＭから３００ｍＭ程度が特に好ましい。
【００２４】
また、マウスイヤーをアルカリ性溶媒中で加熱処理した後、核酸増幅反応に供する前に、混合物の中和を行ってもよい。中和には、トリス−塩酸緩衝液のような緩衝液、あるいは塩酸のような酸を用いることができる。
【００２５】
なお、本発明は、いわゆる試薬キットの形態も含まれる。本発明の試薬キットは、少なくとも、（ａ)２００ｍＭを超える濃度でアルカリ金属水酸化物を含有する核酸抽出溶液及び（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質及び金属塩を少なくとも含有する核酸増幅反応溶液を含むことを特徴とする。本発明の試薬キットは、マウスイヤーはもとより、各種生体試料に適用することが可能である。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
【００２７】
（実施例１）
ＮａＯＨの濃度検討
マウスイヤーからトランスフェリンレセプター遺伝子１１７６ｂｐが増幅できるＮａＯＨの濃度を検討した。
【００２８】
・  試料の調製
マイクロチューブにマウスイヤーを添加し、アルカリ性溶媒５０から３００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を２００μｌ加え、よく撹拌し、９５℃で１０分加熱処理を行った試料を核酸試料とした。
【００２９】
２．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応系にはＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。
（１）１×添付のＢｕｆｆｅｒ、１Ｕの酵素含む反応液にマウストランスフェリンを増幅するプライマー（配列番号１および２）を０．３μＭになるように加え、前記核酸試料を１μｌ添加し、ＰＣＲ反応液を調製した
（２）反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
【００３０】
前記で反応させたＰＣＲ反応液を用いて、ＧｅｌＭａｔｅ（ＴＯＹＯＢＯ）をもちいて、アガロースゲルで泳動を行い、１１７６ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した。
その結果、２５０ｍＭ  と３００ｍＭでＮａＯＨで加熱処理を行ったマウステールからトランスフェリンレセプターの増幅が見られた。（図１）。２００ｍＭを超えるＮａＯＨ濃度でマウスイヤーから核酸増幅できることが示唆された。
【００３１】
（実施例２）
２５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いた検討
２５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて８系統のマウスイヤーを加熱処理し、トランスフェリンレセプター遺伝子１１７６ｂｐが増幅できるか検討した。
【００３２】
・  試料の調整
マイクロチューブにマウスイヤーまたはマウステールを添加し、アルカリ性溶媒２５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を２００μｌ加え、よく撹拌し、９５℃で１０分加熱処理を行った試料を核酸試料とした。
【００３３】
２．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応系にはＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。
（１）１×添付のＢｕｆｆｅｒ、１Ｕの酵素含む反応液にマウストランスフェリンを増幅するプライマー（配列番号１および２）を０．３μＭになるように加え、前記核酸試料を１μｌ添加し、ＰＣＲ反応液を調製した
（２）反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
【００３４】
前記で反応させたＰＣＲ反応液を用いて、アガロースゲルで泳動を行い、１１７６ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した。
その結果、８種類のマウス系統においてマウステールからトランスフェリンレセプターの増幅が見られた。（図２）。２５０ｍＭ  ＮａＯＨでアルカリ加熱処理することでマウスイヤーから核酸増幅ができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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