(57)【要約】【課題】プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含む溶液にて、プライマーの分解を抑制し、調製したＰＣＲ反応溶液を室温にて一定時間以上静置後にも、標的核酸を特異性よく検出する方法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする２種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。（ａ） 核酸中の標的領域を増幅するための２種類以上のプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むＰＣＲ反応溶液を調製する工程、（ｂ） 該ＰＣＲ反応溶液に試料を混合する工程、（ｃ） 該ＰＣＲ反応により増幅する工程、及び、（ｄ） 融解曲線解析によって標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする２種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。
（ａ） 核酸中の標的領域を増幅するための２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むＰＣＲ反応溶液を調製する工程、
（ｂ） 該ＰＣＲ反応溶液に試料を混合する工程、
（ｃ） 該ＰＣＲ反応により増幅する工程、及び、
（ｄ） 標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程
【請求項２】
前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液が２ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液中に、さらにインターカレーターを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液の調製工程を２０℃から３０℃の温度条件下にて行うことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
調製後の前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液を２０℃から３０℃の温度条件下にて４時間静置後に、前記（ｂ）〜（ｄ）の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルが、前記（ａ）の調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液を使用し、前記（ｂ）〜（ｄ）の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルと比較して３０％以上残存していることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料に含まれる標的核酸を増幅し、検出するための核酸増幅用キットであって、該核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを同一溶液中に含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、ＰＣＲ反応溶液中のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）の分解を抑制することで、標的核酸の検出感度を維持しながら保存時間をのばす方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。 
【０００３】
中でも、ＤＮＡの特異的配列の増幅に用いられるＰＣＲ法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、ＰＣＲ法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。  
【０００４】
ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、少なくとも一対のプライマーセット及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２０〜５０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーセットで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。  
【０００５】
ＰＣＲ法には、一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を増幅することで、目的とする遺伝子配列を増幅できる特徴がある反面、プライマーが目的としない誤った配列にハイブリダイズしてしまった場合（プライマーのミスマッチアニーリング）においても、目的としない配列の増幅が起こり、非特異的増幅が生じるという欠点がある。また、ＰＣＲ中にプライマー同士が会合することで、プライマーダイマーが生じ、これが鋳型ＤＮＡとして働いて、非特異的増幅産物が作られてしまうという欠点がある。そのため、ＰＣＲにおける課題は、非特異的増幅がなく目的産物のみを増幅させることにある。
【０００６】
非特異的増幅を低減させる代表的な方法として、抗体を利用したホットスタート法が挙げられる。ホットスタート法では中和抗体によりＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を阻害することで、サイクル前のミスマッチアニーリングやプライマーダイマ―に起因する非特異的増幅を低減する手法である。しかし、係る方法は、非特異的増幅の抑制に効果が十分でないことや、特異的な増幅までも抑制してしまったりすることが多い。
【０００７】
さらに、プライマーとＤＮＡポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを同一溶液中に含むと、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプライマーの分解が発生する。そのような場合、プライマーの特異性が下がり、プライマーダイマ―に起因する非特異的増幅が発生し、結果として標的核酸の検出感度を下げる原因となる。そのため、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を抑制するため、ＰＣＲ反応溶液の調製は常に氷上にて行う必要があり、ＰＣＲ反応溶液調製後はすみやかにＰＣＲ反応を行わなければならないという課題が存在していた。臨床検査の現場などからは、こうした課題を解消し、ＰＣＲ反応溶液を室温で一定時間静置させたいという強いニーズが存在している。
【０００８】
このように、室温（本発明においては、２０℃から３０℃までの温度をいう。）で、プライマーとＤＮＡポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを含むＰＣＲ反応溶液の調製が可能であり、また、調製したＰＣＲ反応溶液を室温にて一定時間以上静置後にも、標的核酸を感度よく検出する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５８３０２８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような事情を背景として、プライマーとＤＮＡポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを含む溶液にて、プライマーの分解を抑制することで室温でＰＣＲ反応溶液を調製することができ、さらに、調製したＰＣＲ反応溶液を室温にて一定時間以上静置後にも、標的核酸を特異性高く検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを使用することで、非特異増的幅産物の発生を抑制できること、そして、さらに、該ＤＮＡポリメラーゼを用いることでマグネシウムイオンとプライマー共存下でも、プライマーダイマ―の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする２種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。
（ａ） 核酸中の標的領域を増幅するための２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むＰＣＲ反応溶液を調製する工程、
（ｂ） 該ＰＣＲ反応溶液に試料を混合する工程、
（ｃ） 該ＰＣＲ反応により増幅する工程、及び、
（ｄ） 標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程
項２．前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液が２ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含むことを特徴とする項１に記載の方法。
項３．前記（ａ）のＰＣＲ反応溶中液に、さらにインターカレーターを含むことを特徴とする項１又は２に記載の方法。
項４．前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液の調製工程を２０℃から３０℃の温度条件下にて行うことを特徴とする項１から３のいずれかに記載の方法。
項５．調製後の前記（ａ）のＰＣＲ反応溶液を２０℃から３０℃の温度条件下にて４時間静置後に、前記（ｂ）〜（ｄ）の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルが、前記（ａ）の調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液を使用し、前記（ｂ）〜（ｄ）の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルと比較して３０％以上残存していることを特徴とする項１から４のいずれかに記載の方法。
項６．試料に含まれる標的核酸を増幅し、検出するための核酸増幅用キットであって、該核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを同一溶液中に含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、ＰＣＲ反応溶液を２０℃から３０℃で調製することが可能となる、さらに、調製後のＰＣＲ反応溶液を２０℃から３０℃で一定時間以上保存後も、非特異的増幅産物が発生せず、標的核酸を高い特異性をもって検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応溶液の調製後１０分以内のもの、および２５℃にて４時間静置したものをそれぞれ用いて標的核酸の検出を行った結果である。
【図２】エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応溶液の調製後１０分以内のもの、および２５℃にて４時間静置したものをそれぞれ用いて標的核酸の検出を行った結果である。
【図３】マグネシウムイオンを反応開始直前に添加した際の、標的核酸の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態において、ＰＣＲ反応液はオリゴヌクレオチドプライマーセット（プライマーセット）、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンを含む。その他の構成は特に限定されないが、鋳型となる核酸、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩などを含有することが好ましい。
【００１６】
ここで緩衝剤としては、例えばトリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビスートリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００１７】
反応緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度としては１０ｍＭから２００ｍＭ程度が好ましく、２０ｍＭから１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては７．０から９．５程度の範囲が好ましく、７．５から９．０程度の範囲がより好ましい。
【００１８】
本発明の反応組成には、１ｍＭから１０ｍＭのマグネシウムイオンを含むことが好ましい。より好ましくは２ｍＭから７ｍＭ、さらに好ましくは３ｍＭから５ｍＭのマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンの添加する形態は特に限定されないが、硫酸マグネシウムや塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明において使用されるプライマーは、目的の領域を増幅するように設計されていれば特に限定されない。本発明では複数のＤＮＡ領域を同時かつ迅速に検出するために、２種類以上、または３種類以上、あるいは４種類以上のプライマーセットを含み、各プライマーが標的とするＤＮＡを増幅する。また、フォワード側又はリバース側のいずれかのプライマーを共通とすることもできる。ＰＣＲ反応溶液には、ＰＣＲ反応が進行しているかを確認する目的で、内部標準遺伝子とその増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
【００２０】
本発明に使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されない。エキソヌクレアーゼ活性には３‘→５’エキソヌクレアーゼ活性と５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性が知られているが、本発明の実施形態では３‘→５’エキソヌクレアーゼ活性と５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性を共に示さないＤＮＡポリメラーゼを使用する。エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されず、エキソヌクレアーゼ活性を示さない野生型のＤＮＡポリメラーゼや、変異によってエキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＤＮＡポリメラーゼなどが使用できる。
【００２１】
本発明において使用される、変異によってエキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されないが、例えば、特許文献１に開示されている変異型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。前記Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性を低下もしくは欠失させるために、Ｎ末端側のアミノ酸を欠失させた改変Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
なお、本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼであれば、その起源、製造方法、変異箇所は特に限定されない。
【００２２】
本発明における標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程における検出手段としては、特に限定されるものではないが、融解曲線解析又は電気泳動等が挙げられる。特に、融解曲線解析が好ましい
【００２３】
本発明において、融解曲線解析により、蛍光物質を用いて増幅産物を検出する方法としてはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどのインターカレーターを用いた、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を添加するインターカレーター法が挙げられる。インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素をいうものである。
【００２４】
本発明においては、多種類のインターカレーターを用いることが可能である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標） ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標） ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９， ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。  
【００２５】
本発明における標的核酸由来のシグナルとは、融解曲線解析におけるインターカレーターに由来する蛍光の一次微分値の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）を指す。また、該微分値のピーク（Ｔｍ値）が前後１℃以内の温度範囲にあるとき、同一検体由来のシグナルであると判断するものとする。
【００２６】
本発明においては、同一検体由来のシグナルを比較した際に、調製後１０分以内にＰＣＲ反応溶液を用いて検出したシグナルと比較して、２５℃にて４時間静置したＰＣＲ反応溶液をもちいて検出した蛍光の、同一Ｔｍ値における一次微分値の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％残存していることを特徴とする。
【００２７】
本発明により、２５℃で４時間静置した場合にあっても、シグナルの低下を抑えることができることで、一旦調製した試薬をそのまま使用することが可能であり、その結果として、臨床検査などの現場における作業性を格段に高めることができるようになる。なお、室温ではなく、冷蔵条件下に静置することにより、４時間よりもさらに長時間使用することが可能であることは言うまでもない。
【００２８】
本発明の核酸増幅法において用いられる反応液には、上記のほかに、キャリーオーバー汚染を防止するための組成として、ウラシルグリコシダーゼ、ｄＵＴＰが含まれていてもよい。ウラシルグリコシダーゼはＤＮＡ配列中に存在するウラシルを特異的に切り出し、ＤＮＡの分解を起こす酵素である。反応液にｄＵＴＰが含まれる組成でＰＣＲを行い得られるＤＮＡ断片はウラシルを含んでおり、ウラシルグリコシダーゼで分解される。一方、天然のＤＮＡはウラシルを含まないため、分解されない。これを利用したキャリーオーバー汚染を防止する方法が知られている。
【００２９】
本発明のキットは、本発明の検出する方法に用いるためのキットである。すなわち、本発明のキットは、核酸中の標的領域を増幅するための２種類以上、または３種類以上、あるいは４種類以上のプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含む、試料に含まれる核酸を増幅し、融解曲線解析にて検出するためのキットであることを特徴とする。
【００３０】
本発明に用いられるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びマグネシウムイオンは、上記に説明した通りである。また、本発明のキットは、核酸増幅および融解曲線解析を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。具体的には、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩並びに上述のｄＵＴＰを含んでいてもよい。
本キットはプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオンが混合物として収容されていることを特徴とするが、そのほかの試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合されていてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１.ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がＰＣＲ反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のゲノムＤＮＡ各１０コピーを試料として用い、マルチプレックスＰＣＲ反応および融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが７１℃に、サルモネラ菌のピークが７６℃に、腸管出血性大腸菌のピークが８０℃に、赤痢菌のピークが８５℃に、それぞれＴｍ値を与える。
【００３３】
本実施例では、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットとして、腸内細菌遺伝子検出キットー高速蛍光検出―（ＴＯＹＯＢＯ）に含まれる１０×プライマーミックスを使用した。本実施例のＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。その他の反応溶液組成は表１に示す。
【００３４】
【表１】
2017175968.tif 000002
２５℃にて調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液、及び２５℃にて調製後、同一温度にて４時間静置したＰＣＲ反応溶液を使用した。これらＰＣＲ反応溶液に精製ゲノムＤＮＡ各１０コピーを添加し、ＰＣＲ反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表２に示すサイクル条件にてＰＣＲを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムＰＣＲ装置Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【００３５】
【表２】
2017175968.tif 000003
【００３６】
解析の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ反応溶液では、調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液と比較して、調整後４時間静置したＰＣＲ反応溶液では部標準遺伝子、サルモネラ菌、赤痢菌の標的遺伝子を示すシグナルが消失していた。腸管出血性大腸菌の標的遺伝子を示すシグナルは残存していたが、残存率は３０％程度であった。
【００３７】
実施例２.ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がＰＣＲ反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のゲノムＤＮＡ各１０コピーを試料として用い、マルチプレックスＰＣＲ反応及び融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが７１℃に、サルモネラ菌のピークが７６℃に、腸管出血性大腸菌のピークが８０℃に、赤痢菌のピークが８５℃に、それぞれＴｍ値を与える。
【００３８】
本実施例ではエキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとしてＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥ）を使用した。その他の反応溶液組成は表１に示す。
【００３９】
２５℃にて調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液、および２５℃にて調製後、同一温度にて４時間静置したＰＣＲ反応溶液を使用した。これらＰＣＲ反応溶液に精製ゲノムＤＮＡ各１０コピーを添加し、ＰＣＲ反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表２に示すサイクル条件にてＰＣＲを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムＰＣＲ装置Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【００４０】
解析の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ反応溶液では、内部標準のシグナルは内部標準を含む４つの標的遺伝子由来のシグナルが全て観察された。調製後１０分以内のＰＣＲ反応溶液と比較して、調整後４時間静置したＰＣＲ反応溶液では、内部標準遺伝子、サルモネラ菌、赤痢菌を示すシグナルは１００％残存しており、腸管出血大腸菌の標的遺伝子を示すシグナルは６５％程度残存していた。
【００４１】
実施例３．マグネシウムイオンがＰＣＲ反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のゲノムＤＮＡ各１０コピーを試料として用い、マルチプレックスＰＣＲ反応および融解曲線解析を実施した。２５℃にて表３に示す反応溶液を調製し、２５℃にて４時間静置した。本反応溶液にはエキソヌクレアーゼ活性を有するｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。静置後の反応溶液に終濃度３ｍＭとなるよう硫酸マグネシウムを添加した。本ＰＣＲ反応溶液に精製ゲノムＤＮＡ各１０コピーを添加し、ＰＣＲ反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表２に示すサイクル条件にてＰＣＲを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムＰＣＲ装置Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【００４２】
【表３】
2017175968.tif 000004
【００４３】
解析の結果、内部標準のシグナルは、内部標準を含む４つの標的遺伝子由来のシグナルが観察された。残存率は各４つのシグナルともに９０％以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを使用することで、マグネシウムイオン、オリゴヌクレオチドプライマーを同一溶液中に含むＰＣＲ反応溶液組成でも、室温での安定性を高めることが可能となる。また、従来は安定性を高めるためにマグネシウムイオン、又はオリゴヌクレオチドプライマーを別容器に含むキットが用いられてきたが、本発明の方法を使用することで、ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン及びオリゴヌクレオチドプライマーを同一溶液中に含むキットを作成することが可能となる。したがって、試薬の調製がより簡便となるため、特に核酸増幅技術に専門的な知識を有しない者により行われることの多い臨床診断などの場でも容易に核酸増幅検出を利用した遺伝子検査が可能となり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
2017175968.tif 000005
【図２】
2017175968.tif 000006
【図３】
2017175968.tif 000007