(57)【要約】      （修正有）【課題】植物のバイオマスを効果的に増大させる遺伝子の同定、及び当該遺伝子が導入された植物、当該遺伝子を用いて植物のバイオマスを増大させる方法、並びに当該遺伝子を用いてバイオマスが増大した植物を作製する方法の提供。【解決手段】植物のバイオマスを増大させる活性を有する特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸が導入された植物、及び該タンパク質をコードする核酸、並びに被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程を含むバイオマスが増大した植物のスクリーニング及び判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードする核酸が導入された植物であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記植物。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の植物。
【請求項４】
タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質をコードする核酸およびプロモーターを含むコンストラクトであって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記コンストラクト。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１０又は１１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のコンストラクトを含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターが導入された、植物。
【請求項１６】
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物を判定する方法。
【請求項２０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のバイオマスを増大させる新規遺伝子に関し、より詳細には、当該遺伝子が導入された植物、当該遺伝子を用いて植物のバイオマスを増大させる方法、及び当該遺伝子を用いてバイオマスが増大した植物を作製する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスとは、一般に、特定の時点においてある空間に存在する生物（bio）の量を物質の量（mass）として表現したものと理解されている。バイオマスは、日本語では「生物体量」または「生物量」の語が用いられる場合があり、生態学では「現存量（standing crop）」と呼ばれることもある。バイオマスの数値化は、通常、質量又はエネルギー量で行われるが、単位面積当たりの該当生物の乾重量で表されることもある。バイオマスにおいては、多くの場合、植物が利用されており、植物のバイオマスを増大させることは、バイオ燃料や再生可能エネルギーの提供のみならず、農作物の生産量を上昇させる点で食料供給の安定化にも有用であると考えられている。
【０００３】
植物バイオマスの増大に関して、産業上有益な植物の新品種を開発するために、植物同士を交配させて後代を選抜する交配育種法や、植物に突然変異を誘発させる突然変異育種法などが従来行われている。また近年では、有用遺伝子を植物に導入してその機能を発現させる遺伝子組換え植物も開発されている。このような新品種の開発のためには優れた性質を付与し得る遺伝子を集積する方法が有効であるが、作物のさらなる生産性の向上が望まれる状況にあって、利用できる遺伝子の種類は未だ少なく、特に多収形質等のバイオマスの増大に関与する遺伝子については、その特定が望まれている。
【０００４】
植物の生育促進には多くの場合、植物ホルモンが影響を及ぼしており、その一つとしてブラシノステロイドが知られている。ブラシノステロイドは、ステロイド骨格を有する化合物の一群であり、代表的なものとしてブラシノリドがある。植物の生育に関し、ブラシノステロイドは、（ｉ）茎、葉及び根の伸長成長促進、（ｉｉ）細胞分裂促進、（ｉｉｉ）葉肉細胞から導管又は仮導管への分化促進、（ｉｖ）エチレン合成促進、（ｖ）種子の発芽促進、並びに（ｖｉ）環境ストレスへの耐性付加などの作用を有している。このようなブラシノステロイドの生理活性を利用し、ブラシノステロイド生合成遺伝子をイネに導入することによってその収量を増加させる試みが行われている（非特許文献１）。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものとはいえなかった。また、ブラシノステロイドの合成や情報伝達に関する遺伝子はこれまでにいくつか同定されているが、植物のバイオマス増大を十分に実現する遺伝子の特定には未だ至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chuan-yin Wu et al. The Plant Cell, 2008, 20(8):2130-2145
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、植物のバイオマスを増大させる遺伝子、特に種子収量を向上させる遺伝子の探索は、未だ十分であるとはいえない。このため、植物のバイオマスを効果的に増大させる新規な遺伝子を見出し、当該遺伝子を利用した技術を開発すること、例えば、当該遺伝子を利用してバイオマスを増大させた植物体を開発すること等が強く求められている。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物のバイオマスを効果的に増大させる新規遺伝子を同定し、当該遺伝子をその利用技術と共に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ブラシノステロイド生合成の阻害剤であるブラシナゾール（Ｂｒｚ）の存在下且つ暗所での芽生えの胚軸形態を選択基準として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異体のスクリーニング及び関連遺伝子の単離を試みた。具体的には、FOX hunting system（Full-length cDNA Over-expression Gene Hunting System）による方法を用いて変異体のスクリーニングを行い、関連遺伝子を探索した。その結果、ブラシナゾール耐性が極めて強い変異体が見出され、さらに遺伝子解析を行ったところ、ｂｉｌ７（Brz-insensitive-long-hypocotyl 7）遺伝子がその変異に関与していることが明らかとなった。
【０００９】
本発明者らはさらに、ｂｉｌ７遺伝子を発現するコンストラクトを作製し、これを植物に導入して当該遺伝子を過剰発現する形質転換体を作製した。そして、当該形質転換体の形態を調べたところ、花茎長等の種々の点で野生体に比べて生育が促進されていることが明らかとなった。これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
タンパク質をコードする核酸が導入された植物であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記植物。
［態様２］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１の植物。
［態様３］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１又は２の植物。
［態様４］
タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
［態様５］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様４の方法。
［態様６］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様４又は５の方法。
［態様７］
タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
［態様８］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様７の方法。
［態様９］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様７又は８の方法。
［態様１０］
タンパク質をコードする核酸およびプロモーターを含むコンストラクトであって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記コンストラクト。
［態様１１］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１０のコンストラクト。
［態様１２］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１０又は１１のコンストラクト。
［態様１３］
態様１０〜１２のいずれか１のコンストラクトを含む、ベクター。
［態様１４］
態様１３のベクターを含む、宿主細胞。
［態様１５］
態様１４のベクターが導入された、植物。
［態様１６］
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法。
［態様１７］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１６の方法。
［態様１８］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１６又は１７の方法。
［態様１９］
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物を判定する方法。
［態様２０］
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１９の方法。
［態様２１］
タンパク質が、配列番号３〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１９又は２０の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、植物のバイオマスを効果的に増大させることができる。また、本発明を用いることにより、バイオマスが効果的に増大した植物及びその作製方法を提供することができ、さらに、バイオマスが増大した植物のスクリーニングに有用な手段、及び植物のバイオマスを増大させる物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、暗所条件下におけるbil7-1Dのブラシナゾール（Ｂｒｚ）耐性を示す図面である。図１より、bil7-1Dは暗所での発芽においてＢｒｚ耐性を示すことが明らかである。Ａは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸伸長の様子を示す。Ｂは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸の伸長長を示す。Ｃは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸の伸長率を示す。Scale bar = 3 mm、Error bar = S.D.、n = 30、***：P < 0.001、Student t test relative to Brz 0μM。
【図２】図２は、bil7-1Dの形態学的特徴を示す図面である。図２より、bil7-1Dは生育促進的な形態を示すことが明らかである。Ａは、60日目の植物の様子を示す（Scale bar = 10 cm）。Ｂは、40日目の植物体のロゼッタ葉の形態を示す（Scale bar = 1 cm）。Ｃは、70日目の植物体の花茎長を示す（n = 12）。Ｄは、70日目の植物体の花茎数を示す（n = 12）。Ｅは、70日目の植物体の二次花茎数を示す（n = 12）。Error bar = S.D.、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。
【図３】図３は、bil7-1Dの花弁、鞘及び種子における形態学的特徴を示す図面である。図３より、bil7-1Dは種子の数が減少し、重量は増加することが明らかである。Ａは、bil7-1Dの正常開花（左）と開花異常（右）とを示す（Scale bar = 1 mm）。Ｂは、bil7-1Dの正常な鞘（左）と開花異常の鞘（右）とを示す（Scale bar = 5 mm）。Ｃは、野生型の種子（左）とbil7-1Dの種子（右）とを示す（Scale bar = 0.5 mm）。Ｄは、70日目の植物体の花数を示す（n = 12）。Ｅは、70日目の植物体の正常鞘数を示す（n = 12）。Ｆは、１鞘当たりの種子数を示す（n = 12）。Ｇは、種子100粒の重量を示す（n = 5）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、**：P < 0.01、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。
【図４】図４は、bil7-1Dの花茎伸長期間及び開花期間を示す図面である。図４より、bil7-1Dは花茎伸長期間及び開花期間が長いことが明らかである。Ａは、開花期のロゼッタ葉の枚数を示す（n = 5）。Ｂは、開花までに要した日数を示す（n = 5）。Ｃは、花茎長の経時的変化及び開花期間を示す（n = 24）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。
【図５】図５は、暗所7日目でのbil7-1DにおけるBIL7候補遺伝子の発現量を示す図面である。図５より、bil7-1DにおいてBIL7候補遺伝子の高発現が認められることが明らかである。
【図６】図６は、暗所条件下におけるBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）及びBIL7発現抑制形質転換体（BIL7-RNAi）のＢｒｚ耐性及びBIL7発現量を示す図面である。図６より、BIL7発現量の高いラインほど暗所Brz条件下の発芽において胚軸伸長を示すことが明らかである。Ａは、暗所7日目でのBrz 3μM条件における胚軸を示す（Scale bar = 3 mm）。Ｂは、暗所7日目でのBrz 3μM条件における胚軸長を示す（Error bar = S.D.、n = 50、***：P < 0.001、Student t test relative to WT）。Ｃは、27日目の植物体の各ラインのBIL7発現量を示す（Error bar = S.D.）。WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。
【図７】図７は、BIL7-OX及びBIL7-RNAiの形態学的特徴を示す図面である。図７より、BIL7発現量の高いラインほど成熟時に花茎伸長形態を示すことが明らかである。Ａは、63日目の植物の様子を示す（Scale bar = 10 cm）。Ｂは、86日目の植物体の花茎長を示す（n = 10、Error bar = S.D.、*：P < 0.1、***：P < 0.001、Student t test relative to WT）。WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。
【図８】図８は、BIL7-OX及びBIL7-RNAiの形態学的特徴を示す図面である。図８より、BIL7-OXは二次花茎数及び種子重量の増加傾向を示すことが明らかである。Ａは、72日目の植物体のロゼッタ葉の形態を示す（Scale bar = 5 cm）。Ｂは、各ラインの種子を示す（Scale bar = 1 mm）。Ｃは、86日目の植物体の花茎数を示す（n = 10）。Ｄは、86日目の植物体の二次花茎長を示す（n = 10）。Ｅは、86日目の植物体の正常鞘数を示す（n = 10）。Ｆは、種子100粒の重量を示す（n = 5）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、**：P < 0.01、***：P < 0.001、Student t test relative to WT、WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。
【図９】図９は、OsBIL7高発現形質転換体（OsBIL7-OX）におけるバイオマス増大を示す図面である。Ａは、Ｔ１での結果を示す。Ａより、イネにおけるBIL7相同性遺伝子OsBIL7を高発現化したイネ-OsBIL7-OX株（T1）において、１株当たりの植物体の総重量、分けつ数、籾粒数、稔実種子数（150%）の増加が認められることが明らかである。Ｂは、Ｔ２での結果を示す。Ｂより、イネにおけるBIL7相同性遺伝子OsBIL7を高発現化したイネ-OsBIL7-OX株（T2）において、１株当たりの分けつ数、籾粒数、稔実種子数（140%）の増加が認められることが明らかである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）核酸及びタンパク質
本発明では、植物バイオマスの増大に寄与する核酸としてｂｉｌ７（Brz-insensitive-long-hypocotyl 7）遺伝子が用いられる。ｂｉｌ７遺伝子は、ブラシノステロイド生合成阻害剤であるブラシナゾール（Ｂｒｚ）の存在下でも胚軸の徒長が見られる変異体から見出された、ブラシノステロイドシグナル伝達に関与する遺伝子であり、種々の植物において見ることができる。ｂｉｌ７遺伝子のヌクレオチド配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質（即ち、ＢＩＬ７タンパク質）のアミノ酸配列は各種植物によって相違するが、本発明におけるタンパク質は、下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列の共通モチーフを有している。
【００１４】
配列番号１：
Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-X1-X2-X3-Ser-X4-X5-X6-Ser-X7-X8-X9-X10-Pro-X11-Gly-Pro-Tyr-Ala-X12-Glu-X13-X14-X15-Val-X16-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X17-X18-X19-Thr-X20-Pro-Ser-X21-Ala-Pro-X22-Thr-Pro-Pro-X23-Pro-Ser-Ser-Pro-X24-Val-Pro-X25-Ala-X26-Pro-X27-Ser-Pro-X28-Ser-Pro
（式中、X1はPhe又はTyr、X2はPhe、Leu、Thr又はAla、X3はGln、Pro、His又はAsn、X4はGlu、Gly、Asp、Ala又はMet、X5はPro、Gly、Leu又はAla、X6はPro、Ala、Thr又はSer、X7はAla、Ile、Val、Ser、又はThr、X8はThr、Val、Ser又はAla、X9はGln又はHis、X10はSer又はThr、X11は15〜30個のアミノ酸残基、X12はHis又はAsn、X13はThr又はPro、X14はGln又はAla、X15はLeu又はPro、X16はSer又はThr、X17はThr又はAla、X18はTyr又はPhe、X19はThr、Ile又はPro、X20はGlu又はAla、X21はSer又はThr、X22はIle、Val、Tyr又はPhe、X23は3〜15個のアミノ酸残基、X24はGlu又はAsp、X25はPhe又はTyr、X26は20〜50個のアミノ酸残基、X27はGly、Glu又はAsp、X28は5又は6個のアミノ酸残基を示す。）
【００１５】
上記アミノ酸配列において、Ｘ１１は好ましくは１７〜２９個のアミノ酸残基、より好ましくは２０〜２６個のアミノ酸残基、Ｘ２３は好ましくは３〜１２個のアミノ酸残基、より好ましくは８〜１２個のアミノ酸残基、Ｘ２６は好ましくは２３〜４９個のアミノ酸残基、より好ましくは２３〜３０個のアミノ酸残基、Ｘ２８は好ましくは５個のアミノ酸残基である。
【００１６】
上記の共通モチーフを含むＢＩＬ７タンパク質を有する植物としては、特に限定されないが、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ダイズ（Glycine max）、イネ（Oryza sativa）、トウモロコシ（Zea mays）、ダイコン（Raphanus sativus）、ポプラ（Populus trichocarpa）、ブドウ（Vitis vinifera）、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）などが挙げられる。各植物のＢＩＬ７タンパク質をコードするｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列及びＢＩＬ７タンパク質のアミノ酸配列は同定されており、下記の表の通りGenbankアクセッション番号が登録されている。
【００１７】
【表１】
2017212881.tif 000002
【００１８】
また、上記共通モチーフを有するＢＩＬ７タンパク質には、各植物のＢＩＬ７タンパク質のホモログも含まれる。例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７には３種類のホモログタンパク質が存在しており、そのｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、下記の表の通りGenbankアクセッション番号が登録されている。
【００１９】
【表２】
2017212881.tif 000003
【００２０】
本発明におけるタンパク質はまた、上記共通モチーフを含むことに加え、シロイヌナズナ又はイネのＢＩＬ７タンパク質を基準として、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。本発明では、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１で表されるアミノ酸配列）は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１で表されるアミノ酸配列）は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。
【００２１】
本明細書においてアミノ酸配列の同一性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）や配列整列プログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ））、あるいは遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］）などを用いて算出することができる。本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、具体的には、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）のウェブサイトで公開されている系統解析プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を用い、初期設定の条件（Version 2.1、Alignment type: slow、DNA Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1）で求めることができる。
【００２２】
本発明におけるタンパク質は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２３】
シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とそのホモログとの間の同一性は、それぞれ４１％（ホモログ１）、４３％（ホモログ２）及び２８％（ホモログ３）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と２５％以上、３０％以上又は４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とダイズ、イネ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の同一性は、それぞれ４４％（ダイズＢＩＬ７）、４１％（イネＢＩＬ７）及び４０％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。イネのＢＩＬ７タンパク質とダイズ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の同一性は、それぞれ４２％（ダイズＢＩＬ７）及び８５％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１１で表されるアミノ酸配列と４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本明細書においてアミノ酸配列の類似性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の類似性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基及び類似性を示すアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸残基の類似性は、物理化学的な性質が相互に類似するアミノ酸残基の関係により示され、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、疎水性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、ヒドロキシル基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などのグループにおいて、同一のグループに属するアミノ酸同士は、相互に類似するアミノ酸残基であると理解される。このような類似性を示すアミノ酸残基は、タンパク質の表現型に影響を及ぼさないことが予測される。アミノ酸配列の類似性は、同一性と同様に視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知の配列類似性検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ）や、遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］）などを用いて算出することができる。本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］ネットワーク版ver. 11.1.3（株式会社ゼネティックス）を用い、Protein vs Protein Global Homologyを初期設定の条件（Unit size to compareを２に設定する）で求めることができる。
【００２５】
本発明におけるタンパク質は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２６】
シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とダイズ、イネ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の類似性は、それぞれ７６％（ダイズＢＩＬ７）、７６％（イネＢＩＬ７）及び７５％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。イネのＢＩＬ７タンパク質とダイズ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の類似性は、それぞれ８３％（ダイズＢＩＬ７）及び９７％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明におけるタンパク質は、上記の共通モチーフを含み、且つ配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と所定の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むことに加え、さらに植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする。
【００２８】
本明細書において植物のバイオマスとは、植物個体の全体、一部、個別器官、あるいはその組み合わせに係る量を意図する。植物個体の全体、一部、あるいは個別器官としては、例えば、全体、地上部、根、茎、葉、果実、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉、又は穂等が挙げられる。また、量としては、例えば、数、大きさ、長さ、幅、重量、面積、又は体積等が挙げられる。従って、バイオマスの例としては、全体重、地上部重、収量、茎径、茎数、稈長、葉面積、葉数、籾数、種子数、分げつ数、穂数、一穂粒数、穂長、最大穂長、又は全穂重等を挙げることができる。また、「増大」とは、上記に例示されるような植物のバイオマスのいずれかが単独で、又は複数が組み合わさって増大していればよい。
【００２９】
植物のバイオマスを増大させる活性は、例えば、増大の指標としてコントロール（親植物、非形質転換体、野生型等）のバイオマスを用い、植物の成熟体において当該コントロールと比較することにより評価を行うことができる。コントロールとの比較により増大が見られた場合には植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができ、当該バイオマスが数値化可能であれば、数値を比較した上で、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、又は７０％以上の増大が見られた場合に植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができる。
【００３０】
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列とすることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシなどが挙げられる。また、これらの植物のＢＩＬ７タンパク質のホモログ（例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７のホモログタンパク質）も、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に含まれる。
【００３１】
配列番号２：
Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X29-X30-Ser-X31-X32-X33-Ser-X34-X35-X36-X37-Pro-X38-Ser-X39-X40-X41-X42-Gly-Pro-Tyr-Ala-X43-Glu-Thr-Gln-X44-Val-X45-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X46-X47-X48-Thr-Glu-Pro-Ser-X49-Ala-Pro-X50-Thr-Pro-Pro-X51-Pro-Ser-Ser-Pro-X52-Val-Pro-X53-Ala-X54-Pro-X55-Ser-Pro-X56-Leu-X57-Ser-Pro
（式中、X29はPhe、Leu又はThr、X30はGln、His、Pro又はAsn、X31はGlu、Gly、Asp又はAla、X32はPro、Gly又はLeu、X33はPro、Ala、Thr又はSer、X34はAla、Val、Ile又はThr、X35はThr、Ala、Val又はSer、X36はGln又はHis、X37はSer又はThr、X38は10〜25個のアミノ酸残基、X39はIle、Val、Ala又はMet、X40はPhe又はTyr、X41はAla又はThr、X42はIle、Val又はThr、X43はHis又はAsn、X44はLeu又はPro、X45はSer又はThr、X46はThr又はAla、X47はTyr又はPhe、X48はThr又はIle、X49はSer又はThr、X50はIle、Phe又はTyr、X51は3〜15個のアミノ酸残基、X52はGlu又はAsp、X53はPhe又はTyr、X54は20〜35個のアミノ酸残基、X55はGly、Glu又はAsp、X56は3〜5個のアミノ酸残基、X57はIle又はArgを示す。）
【００３２】
上記アミノ酸配列において、Ｘ３８は好ましくは１２〜２１個のアミノ酸残基、より好ましくは１５〜２１個のアミノ酸残基、Ｘ５１は好ましくは３〜１２個のアミノ酸残基、より好ましくは８〜１２個のアミノ酸残基、Ｘ５４は好ましくは２３〜３５個のアミノ酸残基、より好ましくは２３〜３０個のアミノ酸残基、Ｘ５６は好ましくは３又は４個のアミノ酸残基、より好ましくは３個のアミノ酸残基である。
【００３３】
本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号３で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、イネなどが挙げられる。
【００３４】
配列番号３：
Met-X58-Ser-Gly-X59-Asn-X60-X61-Asp-Thr-X62-Asn-Ala-Ala-Ala-X63-Ala-Ile-X64-X65-X66-X67-X68-Arg-X69-Arg-Lys-Trp-X70-X71-X72-X73-Ser-X74-X75-X76-Cys-Phe-Gly-Ser-X77-X78-X79-X80-X81-Arg-Ile-X82-X83-X84-Val-Leu-Val-Pro-Glu-Pro-X85-Pro-Phe-X86-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X87-Gln-Ser-X88-X89-X90-Ser-X91-X92-Gln-Ser-Pro-Val-Gly-X93-X94-Ser-Phe-Ser-Pro-Leu-X95-X96-Asn-X97-Pro-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X98-X99-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-X100-Ala-Pro-X101-Thr-Pro-Pro-X102-Ser-X103-X104-Leu-Thr-Thr-X105-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-X106-Ala-X107-Leu-X108-X109-Ser-X110-Glu-X111-Gln-X112-Tyr-Gln-X113-X114-Pro-X115-Ser-Pro-X116-Gly-X117-Leu-Ile-Ser-Pro-Ser-X118-Ser-Gly-X119-X120-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-X121-Ser-X122-Phe-Pro-X123-Phe-X124-Val-X125-X126-Pro-Pro-Lys-X127-Leu-X128-Gly-X129-His-X130-Val-Ser-Phe-X131-Leu-X132-X133-X134-X135-Val-X136-Arg-Cys-X137-X138-X139-Lys-X140-Pro-X141-X142-Ser-X143-Asp-X144-Ser-Leu-X145-X146-X147-Lys-Glu-Phe-X148-Phe-X149-Val-X150-X151-X152-X153-X154-Ala-X155-X156-Lys-X157-Trp-Ser-Phe-Phe-Pro-Val-X158-Gln-X159-Gly
（式中、X58はArg又はGln、X59は3〜10個のアミノ酸残基、X60はVal又はSer、X61はPhe又はVal、X62はIle又はVal、X63はSer又はVal、X64はAla又はVal、X65はSer又はThr、X66はSer又はAla、X67はAsp又はGlu、X68はAsp又はSer、X69は5〜10個のアミノ酸残基、X70はTrp又はAla、X71はAsn又はAsp、X72はArg又はTrp、X73はTrp又はLeu、X74はLeu又はVal、X75はLeu又はTyr、X76はLys又はPhe、X77はSer又はGln、X78はArg又はLys、X79はGln又はAsn、X80はArg又はGly、X81はLys又はArg、X82はGly又はSer、X83はAsn又はHis、X84はSer又はAla、X85は20〜25個のアミノ酸残基、X86はIle又はVal、X87はPhe又はLeu、X88はGlu又はGly、X89はPro又はGly、X90はPro又はAla、X91はAla又はIle、X92はThr又はVal、X93はIle又はAla、X94はLeu又はPro、X95はPro又はSer、X96はCys又はPro、X97は1〜10個のアミノ酸残基、X98はThr又はAla、X99はTyr又はPhe、X100はSer又はThr、X101はIle又はPhe、X102は1〜5個のアミノ酸残基、X103はIle又はVal、X104はTyr又はHis、X105は0〜5個のアミノ酸残基、X106はPhe又はTyr、X107はGln又はLys、X108はPhe又はLeu、X109はAsn又はThr、X110は10〜20個のアミノ酸残基、X111はPhe又はLeu、X112はPhe又はSer、X113はLeu又はIle、X114はPro又はTyr、X115はGly又はGlu、X116はLeu又はIle、X117はGln又はArg、X118は1〜5個のアミノ酸残基、X119はPro又はThr、X120はThr又はCys、X121は1〜10個のアミノ酸残基、X122はLeu又はThr、X123はHis又はSer、X124はGln又はPro、X125はSer又はArg、X126はAsp又はGlu、X127はLeu又はIle、X128は3〜20個のアミノ酸残基、X129は10〜30個のアミノ酸残基、X130は1〜5個のアミノ酸残基、X131はAsp又はGlu、X132はAsp又はThr、X133はAla又はVal、X134はAsp又はGlu、X135はHis又はAsp、X136はIle又はAla、X137はVal又はLeu、X138はAsp又はGlu、X139はGln又はLys、X140は3〜25個のアミノ酸残基、X141はGlu又はArg、X142はAla又はGlu、X143はSer又はAsn、X144は5〜25個のアミノ酸残基、X145はGly又はArg、X146はSer又はLys、X147はAsn又はAla、X148はAsn又はLys、X149は5〜15個のアミノ酸残基、X150はAsp又はGly、X151はGlu又はSer、X152はHis又はAsp、X153はArg又はTrp、X154はSer又はTrp、X155はSer又はAsn、X156はPro又はGlu、X157は5〜15個のアミノ酸残基、X158はMet又はAla、X159はSer又はProを示す。）
【００３５】
上記アミノ酸配列において、Ｘ５９は好ましくは４〜７個のアミノ酸残基、Ｘ６９は好ましくは８〜１０個のアミノ酸残基、Ｘ８５は好ましくは２１〜２２個のアミノ酸残基、Ｘ９７は好ましくは２〜７個のアミノ酸残基、Ｘ１０２は好ましくは２〜４個のアミノ酸残基、Ｘ１０５は好ましくは０〜２個のアミノ酸残基、Ｘ１１０は好ましくは１０〜１７個のアミノ酸残基、Ｘ１１８は好ましくは２〜３個のアミノ酸残基、Ｘ１２１は好ましくは３〜８個のアミノ酸残基、Ｘ１２８は好ましくは５〜１８個のアミノ酸残基、Ｘ１２９は好ましくは１３〜２８個のアミノ酸残基、Ｘ１３０は好ましくは１〜２個のアミノ酸残基、Ｘ１４０は好ましくは５〜２４個のアミノ酸残基、Ｘ１４４は好ましくは７〜２２個のアミノ酸残基、Ｘ１４９は好ましくは８〜１１個のアミノ酸残基、Ｘ１５７は好ましくは４〜１１個のアミノ酸残基である。
【００３６】
本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号４で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズなどが挙げられる。
【００３７】
配列番号４：
Met-Arg-X160-Gly-Ala-Asn-Gly-X161-Asn-Asn-X162-X163-X164-Thr-Ile-Asn-Ala-Ala-Ala-X165-X166-Ile-Ala-Ser-X167-X168-X169-Arg-Leu-X170-Gln-X171-X172-Pro-X173-X174-X175-Lys-X176-X177-Trp-X178-Asn-X179-X180-Ser-X181-X182-X183-Cys-Phe-Gly-X184-X185-X186-X187-Arg-X188-Arg-Ile-Gly-X189-X190-Val-Leu-Val-Pro-Glu-X191-X192-X193-X194-X195-X196-X197-Asn-X198-Thr-X199-Ile-X200-X201-X202-X203-Phe-X204-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X205-X206-Ser-Glu-Pro-Pro-Ser-X207-X208-Gln-Ser-Pro-X209-X210-Ile-Leu-Ser-X211-X212-Pro-X213-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-Thr-X214-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-X215-Ala-Pro-X216-Thr-Pro-Pro-X217-Thr-Thr-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-Phe-Ala-Gln-Leu-X218-X219-X220-Asn-X221-X222-X223-X224-X225-X226-X227-X228-X229-Phe-X230-Tyr-X231-Phe-X232-X233-Tyr-Gln-Leu-X234-Pro-Gly-Ser-Pro-X235-Gly-Gln-Leu-Ile-Ser-Pro-X236-Ser-X237-X238-X239-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-X240-Ser-Leu-X241-X242-X243-Phe-Gln-X244-X245-Asp-X246-Ser-X247-X248-X249-X250-Gly-X251-X252-Thr-Pro-X253-Gln-X254-X255-X256-X257-Pro-X258-X259-X260-Val-Ser-X261-X262-X263-X264-Ala-X265-X266-Val-X267-X268-Cys-Val-X269-Lys-Leu-X270-Thr-X271-X272-Pro-X273-Glu-X274-X275-Ser-Asp-X276-Glu-X277-X278-X279-His-X280-Lys-Glu-Phe-Asn-Phe-X281-X282-X283-Glu-X284-Leu-X285-X286-Asp-X287-Ala-Ser-X288-Ser-Asn-X289-Trp-Ser-Phe-Phe-Pro-X290-X291-X292-X293-Gly
（式中、X160は0〜3個のアミノ酸残基、X161は0〜5個のアミノ酸残基、X162はVal又はThr、X163はPhe又はLeu、X164はAsp又はGlu、X165はSer又はThr、X166はAla又はVal、X167はSer又はVal、X168はAsp又はGlu、X169はAsp又はAsn、X170はHis又はAsp、X171はSer又はPro、X172はSer又はHis、X173はIle又はHis、X174はHis又はVal、X175はLys又はGln、X176はArg又はLys、X177はLys又はSer、X178はTrp又はGly、X179はArg又はTrp、X180はTrp又はLeu、X181はLeu又はIle、X182はLeu又はTyr、X183はLys又はTrp、X184はSer又はHis、X185はSer又はArg、X186はArg又はLys、X187はGln又はAsn、X188はLys又はGln、X189はAsn又はHis、X190はSer又はAla、X191はPro又はArg、X192はVal又はIle、X193はSer又はPro、X194はMet又はSer、X195はSer又はGly、X196はSer又はThr、X197はSer又はAsp、X198はSer又はAla、X199は5〜15個のアミノ酸残基、X200はThr又はIle、X201はThr又はPro、X202はLeu又はPhe、X203はPro又はHis、X204はIle又はVal、X205はPhe又はLeu、X206はGln又はHis、X207はAla又はVal、X208はThr又はAla、X209はVal又はSer、X210はGly又はAla、X211はPhe又はLeu、X212はSer又はThr、X213は1〜10個のアミノ酸残基、X214はTyr又はPhe、X215はSer又はThr、X216はIle又はPhe、X217は3〜15個のアミノ酸残基、X218はPhe又はLeu、X219はAsn又はAsp、X220はSer又はPro、X221はHis又はAsn、X222はGln又はLys、X223はThr又はAsn、X224はGly又はSer、X225はSer又はGlu、X226はTyr又はThr、X227はGly又はTyr、X228はTyr又はGln、X229はLys又はArg、X230は3〜7個のアミノ酸残基、X231はGlu又はAsp、X232はGln又はHis、X233はPhe又はSer、X234はPro又はHis、X235はLeu又はVal、X236は1〜10個のアミノ酸残基、X237はGly又はSer、X238はPro又はThr、X239はThr又はSer、X240は1〜10個のアミノ酸残基、X241はPhe又はLeu、X242はPro又はLeu、X243はHis又はAsn、X244はVal又はThr、X245はSer又はAsp、X246は3〜10個のアミノ酸残基、X247はPro又はHis、X248はLys又はGln、X249はThr又はGly、X250はAla又はSer、X251はVal又はSer、X252はThr又はLeu、X253は1〜10個のアミノ酸残基、X254はLys又はAla、X255はIle又はSer、X256はVal又はPhe、X257はPro又はLeu、X258はHis又はSer、X259はLys又はHis、X260はPro又はTrp、X261はPhe又はIle、X262はAsp又はGlu、X263はLeu又はVal、X264はAsp又はSer、X265はAsp又はGln、X266はHis又はGlu、X267はIle又はPhe、X268はArg又はAsn、X269は1〜15個のアミノ酸残基、X270はArg又はLys、X271はThr又はAsp、X272はPhe又はAla、X273は0〜15個のアミノ酸残基、X274はAla又はThr、X275はSer又はPro、X276は1〜15個のアミノ酸残基、X277はSer又はArg、X278はMet又はVal、X279はAsn又はHis、X280は5〜10個のアミノ酸残基、X281はGly又はAsp、X282はThr又はAsn、X283はAsp又はAla、X284は1〜10個のアミノ酸残基、X285はThr又はVal、X286はVal又はAla、X287は1〜10個のアミノ酸残基、X288は1〜7個のアミノ酸残基、X289はAsp又はAsn、X290はVal又はMet、X291はMet又はIle、X292はGln又はArg、X293はSer又はProを示す。）
【００３８】
上記アミノ酸配列において、Ｘ１６０は好ましくは０〜１個のアミノ酸残基、Ｘ１６１は好ましくは０〜３個のアミノ酸残基、Ｘ１９９は好ましくは７〜９個のアミノ酸残基、Ｘ２１３は好ましくは４〜７個のアミノ酸残基、Ｘ２１７は好ましくは６〜１０個のアミノ酸残基、Ｘ２３０は好ましくは４〜５個のアミノ酸残基、Ｘ２３６は好ましくは３〜６個のアミノ酸残基、Ｘ２４０は好ましくは３〜９個のアミノ酸残基、Ｘ２４６は好ましくは５〜９個のアミノ酸残基、Ｘ２５３は好ましくは３〜７個のアミノ酸残基、Ｘ２６９は好ましくは２〜１２個のアミノ酸残基、Ｘ２７３は好ましくは０〜１１個のアミノ酸残基、Ｘ２７６は好ましくは１〜１１個のアミノ酸残基、Ｘ２８０は好ましくは６〜１０個のアミノ酸残基、Ｘ２８４は好ましくは２〜８個のアミノ酸残基、Ｘ２８７は好ましくは４〜７個のアミノ酸残基、Ｘ２８８は好ましくは３〜５個のアミノ酸残基である。
【００３９】
本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号５で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、イネ、トウモロコシなどが挙げられる。
【００４０】
配列番号５：
Met-Gln-Ser-Gly-X294-X295-Met-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ser-Val-Asp-Thr-Val-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ala-Ile-Val-Thr-Ala-Glu-Ser-Arg-Thr-Gln-Pro-X296-Ala-Glu-X297-Arg-Arg-Lys-Trp-Ala-Asp-X298-Leu-Ser-Val-Tyr-Phe-Cys-Phe-Gly-Ser-Gln-Lys-Asn-Gly-Arg-X299-Arg-X300-X301-His-Ala-X302-Leu-Val-Pro-Glu-Pro-X303-Pro-X304-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-X305-X306-Glu-Ile-Pro-X307-His-Pro-Pro-Pro-Pro-Val-Phe-Pro-Phe-Val-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-Leu-Gln-Ser-X308-X309-X310-Ser-Ile-Val-Gln-Ser-Pro-X311-Gly-Ala-Pro-X312-Phe-Ser-Pro-Leu-Ser-Pro-Asn-Ser-X313-Ser-Pro-Thr-Gly-Pro-Pro-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-Ala-Phe-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-Thr-Ala-Pro-Phe-Thr-Pro-Pro-Pro-Glu-Ser-Val-His-Leu-Thr-Thr-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-Tyr-Ala-Lys-Leu-Leu-Thr-Ser-Ile-Asn-Asn-Ser-Lys-Asn-X314-Glu-X315-Gly-X316-Leu-Gln-Ser-Tyr-X317-X318-Tyr-Pro-X319-Ser-Pro-Ile-Gly-Arg-Leu-Ile-Ser-Pro-Ser-Ser-X320-Cys-Ser-Gly-Thr-X321-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-Pro-Glu-X322-Gln-X323-Ser-Ser-Arg-Ser-X324-X325-X326-X327-Phe-Pro-Val-Arg-Glu-Pro-Pro-Lys-Ile-Leu-Asp-Gly-Glu-Gly-X328-Ala-Thr-Gln-Lys-Leu-Ile-Pro-Arg-His-Met-Arg-Asn-Gly-Gly-Ser-Leu-Leu-Asp-Gly-X329-Ile-Ser-Ala-Ala-Val-Pro-Val-Val-Asp-Phe-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-X330-Asn-X331-His-Ala-Met-Asp-His-Arg-Val-Ser-Phe-Glu-Leu-Thr-Val-Glu-Asp-Val-Ala-Arg-Cys-Leu-Glu-Lys-Lys-Thr-X332-Ile-X333-Gly-X334-Ser-X335-X336-Ala-Ser-Phe-X337-Leu-X338-Pro-Thr-Gly-X339-Gly-Asp-X340-His-X341-Arg-Glu-Ser-Asn-X342-X343-Arg-Ala-Gly-Leu-X344-Val-Asp-Glu-X345-Tyr-His-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Ala-Arg-Arg-Ser-Leu-Ser-Leu-Arg-X346-Ala-Lys-Glu-Phe-X347-Phe-Asn-Asn-Val-Asp-X348-X349-Ser-Val-Glu-Pro-Ser-Val-Gly-Ser-Asp-Trp-Trp-Ala-Asn-Glu-Lys-Val-Ala-Gly-X350-Thr-X351-Glu-Pro-X352-Lys-X353-Trp-Ser-Phe-X354-Pro-Val-X355-Gln-Pro-Gly-Val-Ser
（式中、X294はSer又はGly、X295はGlu又はAsp、X296はGln又はPro、X297はPro又はGln、X298はTrp又はArg、X299は0〜5個のアミノ酸残基、X300はIle又はVal、X301はSer又はAsn、X302はVal又はAla、X303はLeu又はAla、X304はPro又はGln、X305はMet又はAla、X306はPro又はAla、X307はIle又はAsn、X308はGly又はGlu、X309はGly又はPro、X310はAla又はThr、X311は0〜5個のアミノ酸残基、X312はSer又はAla、X313はPro又はGln、X314はAla又はGly、X315はThr又はAla、X316は0〜5個のアミノ酸残基、X317はGln又はPro、X318はIle又はAsn、X319はGlu又はAsp、X320はAla又はGly、X321はCys又はSer、X322はVal又はMet、X323はThr又はAla、X324はThr又はAla、X325はPhe又はLeu、X326はPro又はArg、X327はSer又はLeu、X328はIle又はVal、X329はHis又はGln、X330はAsn又はPro、X331はAsp又はGlu、X332はAsn又はAla、X333はAsn又はSer、X334はGlu又はAsp、X335はAla又はGly、X336はAla又はThr、X337はArg又はHis、X338はVal又はAla、X339はAsn又はSer、X340は0〜5個のアミノ酸残基、X341はPro又はHis、X342はAsp又はGlu、X343はThr又はAla、X344はCys又はTyr、X345はThr又はSer、X346はLys又はLeu、X347はLys又はAsn、X348はAla又はVal、X349はPro又はGly、X350はIle又はMet、X351はSer又はThr、X352はArg又はLys、X353はSer又はAsn、X354はPhe又はHis、X355はAla又はValを示す。）
【００４１】
上記アミノ酸配列において、Ｘ２９９は好ましくは０〜２個のアミノ酸残基、Ｘ３１１は好ましくは１〜２個のアミノ酸残基、Ｘ３１６は好ましくは１〜２個のアミノ酸残基、Ｘ３４０は好ましくは０〜２個のアミノ酸残基である。
【００４２】
本発明では、上述したタンパク質をコードする核酸が用いられる。本明細書において核酸とは、ヌクレオチドがリン酸エステル結合で連結した高分子を意味し、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの用語と互換可能に使用される。核酸の構造は、特に限定されず、１本鎖及び２本鎖のいずれであってもよい。核酸には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらの混成物（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッド２本鎖、ＤＮＡ及びＲＮＡが１本鎖に連結されたキメラ核酸）が含まれる。核酸の構成単位には、主としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基が含まれるが、対象のタンパク質への翻訳を行う限り、これらの修飾物も含まれる。本発明で用いられる核酸は、好ましくは対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡである。
【００４３】
本発明における核酸及びタンパク質は、植物のバイオマスを増大させる限り特に限定されないが、双子葉植物又は単子葉植物由来であることが好ましい。あるいは、ヒメツリガネゴケ由来であってよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマトなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ダイコンであり、より好ましくはシロイヌナズナ、ダイズであり、さらに好ましくはシロイヌナズナである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
【００４４】
本発明におけるタンパク質としては、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質を利用することができ、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、又はヒメツリガネゴケ由来のＢＩＬ７タンパク質（即ち、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質）とすることができる。また、本発明におけるタンパク質には各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質のホモログも利用可能であり、例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７のホモログタンパク質（即ち、配列番号２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質）を用いてもよい。
【００４５】
本発明ではまた、一つの態様として、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質及びそのホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、数個のアミノ酸としては、例えば、２〜４０個、２〜３０個、２〜２０個、２〜１０個、２〜７個、２〜５個、５個、４個、３個、２個のアミノ酸を意味する。アミノ酸の欠失、挿入、置換又は付加は、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、核酸を改変することにより）行うことができる。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４６】
核酸への変異の導入は、Kunkel法またはGapped duplex法等又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばTransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Clontech Laboratories, Inc.）、又はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent Technologies）が使用可能である。また、核酸への変異の導入には、ＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物のような化学的変異剤が使用可能であり、Ｘ線、アルファー線、ベータ線、ガンマ線、イオンビーム等の放射線又は紫外線も使用可能である。
【００４７】
本発明ではまた、一つの態様として、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質及びそのホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列）において、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性、又は、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の類似性を有し、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質も含まれる。アミノ酸配列の同一性及び類似性に関しては、上記に説明した通りである。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４８】
本発明におけるタンパク質として、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、又はヒメツリガネゴケ由来のＢＩＬ７タンパク質を用いた場合、当該タンパク質をコードする核酸としては、主として、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸が用いられる。また、シロイヌナズナＢＩＬ７の３種類のホモログタンパク質を用いた場合、当該タンパク質をコードする核酸としては、主として、配列番号２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸が用いられる。
【００４９】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸については、そのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明の一態様として含まれる。
【００５０】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、核酸の長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。
【００５１】
高ストリンジェントな条件もまた、例えば核酸の長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００５２】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００５３】
本発明ではまた、一つの態様として、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有し、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。
【００５４】
２つのヌクレオチド配列の同一性は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つのヌクレオチド配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：  ６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  １９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：  ５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される���をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５５】
（２）コンストラクト
本発明は、上記の核酸及びプロモーターを含むコンストラクトを提供する。本明細書においてコンストラクトとは、複数の核酸を連結させた結合物を意味し、本発明では、その構成単位として上記の核酸とプロモーターとが含まれる。本発明における核酸とプロモーターとは直接的に連結されている必要はなく、別種の核酸を介して間接的に連結されていてもよい。プロモーターは、本発明の核酸に作動可能に連結していることが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターがその機能を発揮するように、即ち、対象とする核酸の転写を行うように連結することを意味する。
【００５６】
プロモーターは、対象とする核酸の転写を植物細胞内で行うことができる限り、特に限定されない。そのようなプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種ユビキチンプロモーター、各種アクチンプロモーター、タバコＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００５７】
また、本発明では、植物において部位特異的に発現させる機能を有するプロモーターも用いることができる。そのようなプロモーターとしては、葉部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、イネｐｓｂ０遺伝子プロモーター（特開２０１０−１６６９２４））、茎部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＦＡ６プロモーター（Gupta et al. 2012 Plant Cell Rep. 31: 839-850.））、根部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、ＲＣｃ３プロモーター（Xu et al. 1995 Plant Mol Biol 27: 237-248））、主に根、茎、葉の栄養器官で発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＡＳプロモーター）等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明では、誘導性プロモーターも使用可能である。そのようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、オーキシンやブラシノステロイドといったホルモン等の特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：387）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol. Gen. Genet. 240:1）、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624）、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223 (2000)）等が挙げられる。
【００５９】
（３）ベクター
本発明は、上記のコンストラクトを含むベクターを提供する。即ち、本発明では、作動可能に連結されたプロモーターと本発明における核酸とを含むベクターが提供される。
【００６０】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクターに所望の核酸を常法により連結することによって、調製することができる。本発明における核酸を用いて植物のバイオマスを増大させる場合には、植物形質転換用ベクターが特に有用である。本発明で使用されるベクターは、植物細胞中で本発明の目的とする効果を達成するために使用できるものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＩ系のベクター、pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等を使用できる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などが挙げられる。ｐＢＩ系のベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の核酸を導入できるという点で好ましい。また、pBluescript系のベクターとしては、例えば、pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)などが挙げられる。ｐＵＣ系のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系ベクターは、植物に核酸を直接導入することができるという点で好ましい。さらにはpGreenシリーズ（www.pgreen.ac.uk）、pCAMBIAシリーズ（www.cambia.org）などのバイナリーベクターや、pSB11（Komari et al, 1996, Plant J, 10: 165-174）、pSB200（Komori et al, 2004, Plant J, 37: 315-325）などのスーパーバイナリーベクターも好ましく使用することができる。
【００６１】
また、上記ベクターは、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含む転写ターミネーター配列を含むことが好ましい。当業者は、転写ターミネーター配列を適切に選択することができる。
【００６２】
転写ターミネーター配列は、転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。転写ターミネーター配列は、使用するプロモーターに応じて選択可能であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）等を用いることができる。上記組換え発現ベクターにおいては、転写ターミネーター配列を適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成する現象等の発生を防止することができる。
【００６３】
また、上記組換え発現ベクターには、さらに他の核酸セグメントを含んでいてもよい。当該他の核酸セグメントは特に限定されるものではないが、形質転換体選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００６４】
形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる（抗生物質カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）。また、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等も利用可能である。これにより、上記抗生物質や除草剤を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００６５】
翻訳効率を高めるためのヌクレオチド配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。
【００６６】
また、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまな核酸セグメントを含ませることができる。
【００６７】
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、本発明における核酸、プロモーター、及びターミネーター配列、並びに必要に応じて他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。核酸を母体となるベクターに挿入するには、常法にしたがい、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる（例えば、Molecular Cloning, 5.61-5.63）。
【００６８】
当業者においては、所望の遺伝子を有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することにより容易に作製できる。
【００６９】
（４）宿主細胞
本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞（換言すれば、本発明における核酸が導入された宿主細胞）を提供する。
【００７０】
本発明の宿主細胞は、特に限定されないが、植物細胞であることが好ましい。当該植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、植物体中の細胞等が含まれる。
【００７１】
植物細胞は、特に限定されないが、双子葉植物由来又は単子葉植物由来の細胞を用いることができる。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
【００７２】
本発明における核酸も種々の植物種由来のものを用いることができ、本発明では、核酸が由来する植物種と宿主細胞（植物細胞）が由来する植物種とは一致していてもよく、或いは相違していてもよい。即ち、本発明は、宿主細胞（植物細胞）の植物種と同一の植物種由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された宿主細胞（植物細胞）、及び宿主細胞（植物細胞）の植物種とは異なる植物種由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された宿主細胞（植物細胞）のいずれをも提供することができる。また、本発明では、核酸が由来する植物が双子葉植物の場合には、双子葉植物の宿主細胞を選択してもよく、また、核酸が由来する植物が単子葉植物の場合には、単子葉植物の宿主細胞を選択してもよい。
【００７３】
宿主細胞内で対象の核酸を発現させる方法としては、当該核酸を適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により生体内に導入する方法が挙げられる。本発明においては、アグロバクテリウム法を好ましく使用することができる。植物細胞内に核酸を導入する場合、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて直接的に核酸を導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば、代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。
【００７４】
（５）形質転換植物
本発明は、上記のベクターが導入された植物（換言すれば、本発明における核酸が導入された植物）を提供する。本発明の宿主細胞が植物細胞である場合、当該植物細胞は本発明の植物（形質転換植物）に包含される。本発明の植物には、植物細胞のみならず、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、実生、多芽体、毛状根及び培養根等のいずれもが含まれる。
【００７５】
本発明の植物は、双子葉植物又は単子葉植物である。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
【００７６】
本発明の植物においては、上記の宿主細胞と同様に、その種は、導入される核酸が由来する植物種と一致していてもよく、或いは相違していてもよい。即ち、本発明は、同一種の植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された植物（核酸又はこれを含むベクターが導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と同一である、前記植物）、及び異なる種の植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された植物（核酸又はこれを含むベクターが導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と異なる、前記植物）のいずれをも提供することができる。また、本発明において、核酸が由来する植物が双子葉植物の場合には、導入先の植物は双子葉植物であってよく、また、核酸が由来する植物が単子葉植物の場合には、導入先の植物は単子葉植物であってよい。
【００７７】
本発明の植物には、本発明における核酸又はこれを含むベクターが導入された植物細胞を生育させた植物体、及び当該植物体の後代、子孫またはクローンである植物、並びにこれらの繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）が含まれる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。上記技術については既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられており、本発明において上記方法を好適に用いることができる。
【００７８】
形質転換された植物細胞を再分化させて植物体を再生させる方法は、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）の方法が挙げられる。上記手法により再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡ
の抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にしたがって実施することができる。
【００７９】
例えば、再生させた植物体中に存在する外来核酸を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸、あるいは改変された核酸のヌクレオチド配列に従って適当に選択されたヌクレオチド配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、対象の核酸のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明の遺伝子に対応することを確認することが可能である。
【００８０】
一旦、ゲノム内に対象の核酸が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明における核酸又はこれを含む組換え発現ベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。つまり、本発明には、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物が含まれる。
【００８１】
本発明の植物（形質転換植物）には、野生型植物（外部から本発明の核酸（例えば、ｂｉｌ７遺伝子）が導入されていない植物を含む）の有するｂｉｌ７遺伝子を制御するネイティブプロモーターについて、これを、上記の各種プロモーターに置換した、いわゆる「部位特異的形質転換体」も含まれる。このような植物は、置換されたプロモーターによって当該植物がもともと有しているｂｉｌ７遺伝子の発現が亢進することにより、バイオマスが増大するという特性を有する。本発明では、結果的に所定の核酸（例えば、ｂｉｌ７遺伝子）が植物内で強発現（過剰発現）する植物も一態様として含まれるため、このような部位特異的形質転換体も本発明の対象となり得る。このような植物を作製する方法として、ＣＲＩＳＰＲ法、ＺＦＮ法やＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法などの公知のゲノム編集技術を用いることができる。
【００８２】
このようにして作出された形質転換植物は、通常の植物に比べて、バイオマスが増大するという有利な特性を有することが期待される。本発明で形質転換をする対象として用いられる植物は特に限定されるものではなく、本発明の方法により、バイオマスが増大する種々の形質転換植物を作製することができる。
【００８３】
（６）植物のバイオマスを増大させる方法
本発明は、上記の核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、本発明における核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製する工程、当該ベクターを宿主細胞（植物細胞）に導入する工程、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法である。本発明における核酸がコードするタンパク質が有する植物のバイオマスを増大させる活性を利用することにより、本発明の方法が得られる。
【００８４】
本発明の方法では、上記の核酸のみならず、当該核酸を含むベクターを植物に導入してもよい。核酸又はこれを含むベクターを植物に導入する方法は上記に説明した通りであり、宿主細胞（植物細胞）への導入を通じて植物に当該核酸を導入することができる。また、本発明の方法で対象とされる植物の種類や導入される核酸が由来する植物種との関係等も上述した通りであり、その他当該方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。
【００８５】
（７）バイオマスが増大した植物の作製方法
本発明は、上記の核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、本発明における核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製する工程、当該ベクターを宿主細胞（植物細胞）に導入する工程、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法である。本発明における核酸がコードするタンパク質が有する植物のバイオマスを増大させる活性を利用することにより、本発明の方法が得られる。
【００８６】
本発明の方法では、上記の核酸のみならず、当該核酸を含むベクターを植物に導入してもよい。核酸又はこれを含むベクターを植物に導入する方法は上記に説明した通りであり、宿主細胞（植物細胞）への導入を通じて植物に当該核酸を導入することができる。また、本発明の方法で対象とされる植物の種類や導入される核酸が由来する植物種との関係等も上述した通りであり、その他当該方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。
【００８７】
（８）バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法
本発明は、上記に説明したタンパク質又は核酸を利用したバイオマスが増大した植物のスクリーニング方法を提供し、当該方法には下記の工程が含まれる。
（１）被験植物および野生型植物において、本発明におけるタンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、及び
（３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程。
【００８８】
本発明のスクリーニング方法において対象とされる植物の形態としては、上記と同様に、植物細胞のみならず、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、実生、多芽体、毛状根及び培養根等が含まれるが、スクリーニングを行うという観点から、これらは特に植物が成熟体となる前の状態、或いは幼若な状態であることが好ましい。そのため、種子（完熟種子、未熟種子）、完熟胚、未熟胚、カルス、苗条、実生等は、本発明のスクリーニング方法において特に好ましい植物の形態である。
【００８９】
本明細書において野生型植物とは、対象とされる植物の中で最も高い頻度で見いだされる表現型の系統又は個体であり、主として何らの遺伝子操作も行われていない植物種をいう。野生型植物の形態は、上記の形態のいずれもが利用可能であるが、被験植物の形態と一致させることが好ましい。
【００９０】
タンパク質又は核酸の発現量を測定する方法は、当該技術分野において周知の方法を利用することができる。例えば、タンパク質については、植物からタンパク質を抽出し、本発明におけるタンパク質（例えば、各種植物のＢＩＬ７タンパク質）に対する抗体を作製又は入手し、当該抗体を用いてウェスタンブロッテング、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ等）又はこれらに準ずる方法を行うことにより、その発現量を測定することができる。使用される抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、また、当該抗体は抗体分子それ自体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ(ａｂ’)２等のフラグメントであってもよい。また、抗体の標識には、自体公知の放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。核酸の発現量については、例えば、植物からＲＮＡを抽出して、本発明における核酸（例えば、各種植物のｂｉｌ７遺伝子）のヌクレオチド配列に基づいて当該核酸を特異的に増幅し得るプライマー、又は特異的に検出し得るプローブを作製又は入手し、当該プライマー又はプローブを用いてＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッテング又はこれらに準ずる方法を行うことにより、その発現量を測定することができる。
【００９１】
タンパク質又は核酸の発現量は定性的であっても定量的であってもよいが、数値（測定値）として定量化することが好ましい。被験植物および野生型植物より得られた発現量を相互に比較し、被験植物における発現量が野生型植物における発現量よりも多い場合に植物のバイオマスが増大すると判定することができ、そのような被験植物を選択することによって、植物のバイオマスが増大した植物のスクリーニングを行うことができる。
【００９２】
（９）バイオマスが増大した植物を判定する方法
本発明は、上記に説明したタンパク質又は核酸を利用したバイオマスが増大した植物を判定する方法を提供し、当該方法には下記の工程が含まれる。
（１）被験植物および野生型植物において、本発明におけるタンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、及び
（３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程。
【００９３】
本発明の判定方法は、本発明におけるタンパク質又は核酸をマーカー（タンパク質マーカー又は核酸マーカー）として使用することと同義である。即ち、本発明におけるタンパク質又は核酸が植物において検出され、且つその発現量が野生型での発現量よりも高い場合には、当該植物は植物のバイオマスが増大することが期待される。
【００９４】
本発明の判定方法において対象とされる植物の形態は、上記のスクリーニング方法と同様であり、上記に例示したあらゆる部位等がその形態として含まれるが、特に植物が成熟体となる前の状態、或いは幼若な状態にある形態が好ましい。そのため、種子（完熟種子、未熟種子）、完熟胚、未熟胚、カルス、苗条、実生等は、本発明の判定方法において特に好ましい植物の形態である。
【００９５】
本発明の判定方法におけるタンパク質又は核酸の発現量の測定方法は、当該技術分野において周知の方法を利用することができ、その具体例は上記のスクリーニング方法で説明した通りである。また、本発明においてタンパク質又は核酸の発現量は定性的であっても定量的であってもよいが、数値（測定値）として定量化することが好ましい。被験植物および野生型植物より得られた発現量を相互に比較し、被験植物における発現量が野生型植物における発現量よりも多いことを確認することによって、植物のバイオマスが増大すると判定することができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９７】
実施例１  bil7変異体の選抜
FOX hunting system（Full-length cDNA Over-expression Gene Hunting System）は、完全長cDNAを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化からDNAの機能を明らかにする方法である（WO03/018808）。ここでは、約8,800種のアラビドプシスFOXライン（Ichikawa et al. 2006）より、ブラシノステロイド（BR）生合成阻害剤であるブラシナゾール（Brz）存在下、暗所で、野生型アラビドプシスと比べて胚軸が伸長するbil（Brz-insensitive-long-hypocothl）形態を示すラインの選抜を行った。Brz存在下、暗所においてbil形態を示す植物体は、Brz耐性を有していると考えられる。選抜は二次選抜まで行い、選抜されたラインについては野生型とのback crossにより作出した交配F１世代植物体がBrz存在暗所下でbil形態を示すことを確認し、bil変異が優性形質である事を確認した。FOXラインは機能獲得型変異体であるため、優性変異はその変異原因がFOXに由来することを示すと考えられた。
【００９８】
まずFOXライン20〜40ラインの種子を混合し、暗所において、Brz 3μM発芽条件下で育成し、胚軸伸長ラインを一次選抜した。次に一次選抜の個体を育成し、得られた種子を、再び暗所、Brz 3μM発芽条件下で育成して胚軸伸長ラインを二次選抜した。なお、二次選抜時には、bil形態が強いものが1/4、中程度のものが2/4、野生型と同等のものが1/4に分離したことからもbil変異が優性形質である事が確認できた。この選抜の結果、野生型Columbia-0（Col-0）より明らかに胚軸伸長を示す数ラインの候補変異体を得た。その中で、最も長い胚軸伸長形態を示したNo.72ラインをbil7-1D（Brz-insensitive-long-hypocothl 7-1D）と名付け、解析を進めることとした。bil7-1DのBrz 3μM存在暗所下における胚軸伸長は、野生型の約2.5倍であり、BR情報伝達のマスター転写因子BIL1／BZR１の機能獲得型変異体bil1-１D/bzr1-1D（耐Brzを示すポジティブコントロール）と同等の強い耐Brz変異形質であると考えられた（図１）。
【００９９】
bil7-1Dの形態的特徴を解析する為、成熟時の形態観察を行った。bil7-1D変異体の生育がほぼ止まったと思われた60日目の成熟個体について形態解析を行った結果、bil7-1Dは野生型に比べ花茎長が約1.5倍に伸長することが明らかとなった（図２Ａ、Ｃ）。また、野生型と比べ、花茎数はほぼ変わらないが、二次花茎数は約2倍に増加していることが明らかとなった（図２Ｄ、Ｅ）。また、ロゼッタ葉は野生型に比べ丸みを帯びており、bil1-1D/bzr1-1Dのロゼッタ葉に似た形態を示した（図２Ｂ）。
【０１００】
さらに、生殖器官について解析を行った。bil7-1Dでは、花において花弁の展開が正常に起こらず（図３Ａ）、そのため花が存在していても正常な鞘が生成してこない現象が、全てでは無いものの約45％程度の花において観察された（図３Ｂ）。そのため、bil7-1Dでは、野生型に比べ花の数は増加するが、正常な鞘の数は減少していた（図３Ｄ、Ｅ）。また、1鞘当たりの種子数も減少していたことから、総種子数は減少していた（図３Ｆ）。種子は野生型に比べて大きくなり（図３Ｃ）、種子重量については野生型に比べ約2倍に増加していた（図３Ｇ）。
【０１０１】
bil7-1Dの生育過程について解析した結果、若干の開花遅延（図４Ａ）、生育遅延（図４Ｂ）の傾向はあるものの、開花遅延型であると報告されているbil1-1D/bzr1-1D（Zhang et al. 2013）の値を考慮すると、野生型と大きな差は無いと考えられた。また経時的観察では、bil7-1Dは花茎伸長の速度は野生型とほぼ変わらないものの、野生型が播種後約45日目で開花期が停止し、花茎伸長も停止するのに対し、bil7-1Dは約60日目まで開花期および花茎伸長が継続した（図４Ｃ）。これらの結果より、bil7-1Dは花茎伸長において顕著に生育促進的な形態を示すことが明らかとなった。
【０１０２】
実施例２  bil7-1D変異原因遺伝子の単離と同定
bil7-1D植物体の形態解析から、変異原因遺伝子BIL7は花茎伸長などの生育促進形態や、BR情報伝達の活性化を引き起こすと推測された。そこでbil7-1D変異原因遺伝子BIL7を単離し、相同性タンパク質の解析や機能ドメインの探索を行った。続いてBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）を作製し、BIL7候補遺伝子を高発現させることによりbil7-1D形態が再現されることを確認して、BIL7遺伝子の確定を行った。
【０１０３】
2-1  bil7-1D変異原因遺伝子の単離
bil7-1D変異体の導入cDNAについて、変異体ゲノムをテンプレートとし、35S CaMVプロモーターとNOSターミネーターに特異的なプライマーを用いたPCR法とシークエンスにより遺伝子断片を得た。
【０１０４】
bil7-1D変異体からロゼッタ葉を採取し、Nucleon DNA Extraction Kit（Amersham）を用いて、ゲノムDNAを抽出した。次に抽出したDNAに対してPCRを行った。PCR反応液、反応条件、プライマーは以下のとおりである。
【０１０５】
【表３】
2017212881.tif 000004
【０１０６】
【表４】
2017212881.tif 000005
【０１０７】
このようにして得られたPCR産物について塩基配列を決定した結果、機能が未知の新規タンパク質をコードする遺伝子がBIL7候補遺伝子として提示された。
【０１０８】
このBIL7候補遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCRにより解析した。RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いて植物体からTotal RNAを抽出した。次にTakara PrimeScript RT regant Kit （Perfect Realtime）を用いて反応液を作製し、cDNA反応（37℃ 15min、85℃ 5 sec、4℃ end）にてcDNAを合成した。このようにして合成されたcDNAをテンプレートとして、以下の条件でリアルタイムPCRを行った。
【０１０９】
【表５】
2017212881.tif 000006
【０１１０】
【表６】
2017212881.tif 000007
【０１１１】
その結果、bil7-1DにおけるBIL7候補遺伝子の発現量が、野生型に比べ約40倍以上増加していた（図５）。この結果とbil7-1Dが優性の変異体であることと併せて、BIL7候補遺伝子の過剰発現がbil7-1Dの原因であると示唆された。
【０１１２】
2-2  BIL7遺伝子のアミノ酸配列の解析
BIL7候補遺伝子が機能未知のタンパク質をコードしていることから、翻訳産物の機能を推測するため、BIL7のアミノ酸配列を基に、PROSITE（http://prosite.expasy.org/）およびPSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）データベースによるモチーフ検策とGENETYX-MACによる疎水性解析を行った。
【０１１３】
その結果、BIL7はその配列にN-ミリストイル化予測サイトとN-グリコシル化予測サイトが存在した。その他には機能を予測出来るようなドメインは存在しなかった。膜貫通領域は認められず、核移行シグナル（NLS）が存在する事から核局在が推測された。
【０１１４】
BIL7相同タンパク質はArabidopsis thalianaに3種存在した。また他種植物では、ダイコン（Raphanus sativus）、ダイズ（Glycine max）、ポプラ（Populus trichocarpa）、ブドウ（Vitis vinifera）、イネ（Oryza sativa）、ヒメツリガネコケ（Physcomitella patens）など広い植物種において相同性の高いタンパク質が存在することが明らかとなった。これらはいずれも報告例の無い新規かつ機能未知のタンパク質であった。また、これらの相同タンパク質群の中で、特に保存性が高い領域が認められた。この領域を基にさらに相同性を示すアミノ酸の検策を行ったが、機能が推測できるようなタンパク質は存在しなかった。また、ミリストイル化予測サイトの配列部分は、他の遺伝子でも比較的保存性が見られたことから、BIL7の機能はこれらタンパク質において共通する機能と関係している可能性が示唆された。
【０１１５】
2-3  BIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）の作製及び形態観察
BIL7遺伝子を35S CaMVプロモーターの下流に連結したコンストラクトを野生型アラビドプシスに形質転換してBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）を作製し、形態の観察を行った。
【０１１６】
野生型アラビドプシスのロゼッタ葉からRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いRNAを抽出した。次に「SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR」（Invitrogen）を用いて、kitのプロトコールに従いcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いたPCR法を行ってBIL7を増幅した。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
増幅したBIL7は、「pENTER/D TOPO cloning kit」（Invitrogen）を用いて、エントリーベクター（pENTR）へのクローニングを行った。作製したpENTRベクターをGateway techonology により「Gateway LR Clonase IIenzyme mix（Invitrogen）」を用いて、35Sプロモーターを含むpGWB2及びRNAiコンストラクトを含むpGWB80に導入し、BIL7が挿入された形質転換用ベクターpGWB2-BIL7及びpGWB80-BIL7-RNAiを得た。
【０１１９】
次に作製したベクターをアグロバクテリウムに導入し、flower dipping法により野生型アラビドプシスの形質転換をおこなった。
【０１２０】
アグロバクテリウムコンピテントセル50μlに対し、2μlの作製したベクターを加え、混和し氷上で30分静置した。液体窒素中に1分間静置した後、37℃で1分融解した。YEP液体培地を250μl加え、28℃で1時間培養した後、KmおよびHyg 50μg/ml、リファンピシン100μg/mlを含むYEP培地に撒き、コロニーPCRにてベクター導入の有無を確認した。
【０１２１】
ベクターが導入されたアグロバクテリウムのコロニーをYEP液体培地で1晩培養し、その後、培養液を500mlにスケールアップし1晩培養した。培養液を5000rpm、10分間遠心し上清を取り除いた後、5%(w/v)スクロースを含むMS培地に懸濁した。鞘を除去した野生型にflower dipping法により形質転換をおこなった。得られたT1種子をKm 25μg/mlを含むMS培地にて選抜をおこなって、BIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）及びBIL7発現抑制形質転換体（BIL7-RNAi）を得た（図６）。
【０１２２】
BIL7-OXラインについて、実施例１で述べたbil7-1Dに見られた形態的特徴を調査した（図７、８）。その結果、bil7-1Dに見られたロゼット葉形態は、BIL7発現量の低いBIL7-OX1では見られずBIL7発現量の高いBIL7-OX2にのみ認められた（図７Ａ）。花茎長および二次花茎数においては、BIL7発現量の多いラインほど促進される傾向を示した（図７Ａ、Ｂ、図８Ｄ）。また、bil7-1Dでは野生型とほぼ変わらなかった花茎数は、若干、BIL7発現増加により花茎数が減少する傾向が見られた（図８Ｃ）。種子においては、BIL7の発現が高い程正常な鞘数は減少したものの、bil7-1Dと同様に種子重量は増加した（図８Ｂ、Ｅ、Ｆ）。
【０１２３】
以上のように、bil7-1Dで観察された成熟形態は全てBIL7-OXラインにおいても観察された。胚軸のBrz耐性形態での観察結果とあわせ、BIL7候補遺伝子の高発現によりbil7-1Dの形態が再現されたと考えられた。これらの結果より、この遺伝子がbil7-1Dの原因遺伝子であることが確認できた。
【０１２４】
実施例３  イネのBIL7相同遺伝子OsBIL7のイネへの形質転換
イネにおけるBIL7相同遺伝子OsBIL7について、イネでの構成的発現プロモーターであるUbiquitinプロモーター下流に接続したベクターを構築し、イネへの形質転換を行った。
【０１２５】
最初にイネのBIL7相同遺伝子OsBIL7のクローニングを行った。イネ日本晴野生型total RNAをQiagenのRNA easy plantキットで抽出した。次にこれよりInvitrogenのSuperScript IIキットを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にして、以下のプライマーでPCRしてOsBIL7を増幅した。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
増幅したOsBIL7は、「pENTER/D TOPO cloning kit」（Invitrogen）を用いて、クローニングを行った。
【０１２８】
次に作製したベクターを用いてイネへの形質転換を行った。イネの品種は日本晴を用いた。前記で構築したベクターを、アグロバクテリウムEHA105株を用いて高速形質転換法（Toki et al. Plant J. 47:969-76, 2006）により形質転換を行った。得られた形質転換T1世代、T2ホモ世代について、収量形質の調査を行った。その結果、T1世代、T2ホモ世代のいずれにおいても、分けつ数の増加、種子収量の増加などが認められた（図９Ａ、Ｂ）。
【０１２９】
以上から、BIL7はイネにおいても収量を向上させることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明は、バイオマスが利用可能な産業分野、例えば、食品分野、エネルギー分野、環境分野等において有用である。本発明を用いることによって、植物のバイオマスを効果的に増大させることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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