(57)【要約】【課題】高度な多様性を備える生物集団を効率的に生産する方法及びその利用を提供する【解決手段】真核生物体の正倍数性を超える倍数体である親真核生物体の細胞内においてＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させて親真核生物体のゲノムセットを改変する改変工程を備え、改変されたゲノムセットを保持する真核生物体の集団を取得するようにする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物体のゲノムの改変方法であって、
生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を用いて前記生物体のゲノムを改変する改変工程を備える、改変方法。
【請求項２】
前記タンパク質は、好熱菌でない細菌由来の制限酵素である、請求項１に記載の改変方法。
【請求項３】
前記タンパク質の前記ＤＮＡ二本鎖切断活性の前記至適温度は、２５℃以上４０℃以下である、請求項１又は２に記載の改変方法。
【請求項４】
前記生物体は、真核生物体である、請求項１〜３のいずれかに記載の改変方法。
【請求項５】
前記改変工程は、２５℃以上４５℃以下で実施する、請求項１〜４のいずれかに記載の改変方法。
【請求項６】
前記改変工程は、１０分以上３時間以下実施する、請求項５に記載の改変方法。
【請求項７】
前記タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって得られる前記タンパク質を用いる、請求項１〜６のいずれかに記載の改変方法。
【請求項８】
前記改変工程は、前記タンパク質の産生を、前記生物体の生育能を維持しつつ前記ゲノムを改変可能な程度に制御する工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の改変方法。
【請求項９】
前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を誘導して前記生物体のゲノムを改変する工程である、請求項６に記載の改変方法。
【請求項１０】
前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を定常的に維持して前記生物体のゲノムを改変する工程である、請求項８又は９に記載の改変方法。
【請求項１１】
前記改変工程は、前記タンパク質を前記生物体の細胞に直接導入して作用させる工程である、請求項１〜６のいずれかに記載の改変方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＭｓｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＭｂｏＩ、及びＨｂａＩからなる群から選択される１種又は２種以上の制限酵素である、請求項１〜１０のいずれかに記載の改変方法。
【請求項１３】
前記生物体は、植物体又はその一部である、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変方法。
【請求項１４】
前記植物体又はその一部は、種子、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚並びにこれらの一部からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１３に記載の改変方法。
【請求項１５】
前記生物体は、微生物である、請求項１〜１２のいずれかに記載の改変方法。
【請求項１６】
ゲノムが改変された生物体集団の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程、
を備える、生産方法。
【請求項１７】
ゲノムが改変された生物体の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程と、
改変されたゲノムを保持する真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１８】
育種用材料であって、
常温域に至適温度を呈するDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするコード領域を有するDNAを備え、
前記コード領域は、前記育種材料のホスト内でプロセッシングされないイントロンを含む、育種用材料。
【請求項１９】
真核生物体用の発現ベクターである、請求項１８に記載の育種用材料。
【請求項２０】
前記ホストは、原核生物である、請求項１８又は１９に記載の育種用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、生物体のゲノムの改変方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物資源の質量（バイオマス）を増大させること、なかでも植物バイオマスの増大は、食糧の増産のみならず、地球環境保全、地球温暖化防止、温室効果ガス排出低減の効果があるといえる。したがって、植物バイオマスの増産技術や有用な植物の創出は、極めて重要である。
【０００３】
また、微生物は、様々な産業において有効に利用されている。例えば、セルロースなどの多糖を原料とするバイオエタノール製造においてはより低コストにエタノール発酵を行うために、高温耐性、高アルコール濃度耐性、高アルコール合成能などの特性を持った酵母等が期待されている。
【０００４】
有用な植物体や微生物など各種の真核生物が有する特性は、概して、単一遺伝子ではなく多数の遺伝子発現の影響を受ける量的形質であることが多い。量的形質の改変は、通常の変異処理では、一回の操作による形質変化が小さく膨大な世代にわたる処理が必要となってしまう。
【０００５】
そこで、量的形質を改変するためのゲノムの大規模な再編成を効率的に実施できる方法の開発が報告されている（特許文献１、２、３）。これらの方法によれば、細胞においていわゆる制限酵素を一過的に発現させることにより、ゲノム全体のＤＮＡ切断を誘発して、同時多発的に多数のゲノム再編成を実現して、多様なゲノム構成の変異体集団を効率的に得ることができることが報告されている。これらの方法は、例えば、TaqI遺伝子などの耐熱性多頻度制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断酵素をコードする遺伝子を植物細胞内に導入し、制限酵素が活性化する温度以上であって細胞の傷害が回避できる程度の温度、例えば、３７℃で一過的に制限酵素を活性化してゲノムに作用させるものである。
【０００６】
一方、例えば、植物においては、たとえば顕花植物の生殖成長期などは高温に対して非常に脆弱であることが知られている（非特許文献1）。また、高温は作物の生長や収量に大きな影響を及ぼす重大なストレスとなることも報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１６８７９８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４１３２２号公報
【特許文献３】特開２０１２−４４８８３号公報
【特許文献４】特開平１１−１５１０５０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Endo, S., Shinohara, H., Matsubayashi, Y., & Fukuda, H , Current Biology, 2013; 23(17): 1670-1676
【非特許文献２】Schlenker, W., & Roberts, M. J., PNAS. 2009 ;106(37):15594 -15598
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らによれば、好熱菌由来の制限酵素を用いるのは、生物体の生育温度でのこれらの酵素の作用を回避するためであった。しかしながら、こうした好熱菌由来の制限酵素を、その至適温度よりも相当程度低い３７℃程度の温度での一時的なＤＮＡ二本鎖切断酵素の活性化処理（熱処理）であっても、植物や微生物に対する負荷が予想以上に大きいことがわかった。このため、ゲノム改変の程度や多様性を向上させるために、処理温度を高くしたり処理時間を増大させたりすることは困難な場合があった。
【００１０】
また、特に、植物の種類、器官及び生育段階によっては、熱負荷の影響が一層大きくかつＤＮＡ切断効率も低く、遺伝的組換えを実現できないこともあった。
【００１１】
以上のように、こうした好熱菌由来の制限酵素を用いた熱処理によるＤＮＡ二本鎖切断酵素の活性化によるゲノム改変は、それによる微生物や植物体への熱負荷や改変程度が問題となる場合があることがわかった。
【００１２】
そこで、本明細書は、改変対象となる生物体に対する負荷を低減しつつ効果的にゲノム改変を実現する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、熱負荷の低減のために、ＤＮＡ二本鎖切断酵素の至適温度に着目した。これまで、生物体の生育温度近傍にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するようなタンパク質を作用させることは、生物体の生存や生育そのものに対する悪影響が大きすぎると考えていた。しかしながら、あえて、生物体の生育温度近傍に至適温度を備えるＤＮＡ二本鎖切断酵素を用い、必要に応じてその作用状態を制御することで生物体に対する熱負荷を回避又は抑制したほうがより効果的にゲノム改変を効果的に実現できるという知見を得た。本明細書はこの知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１４】
（１）生物体のゲノムの改変方法であって、
生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を用いて前記生物体のゲノムを改変する改変工程を備える、改変方法。
（２）前記タンパク質は、好熱菌でない細菌由来の制限酵素である、（１）に記載の改変方法。
（３）前記タンパク質の前記ＤＮＡ二本鎖切断活性の前記至適温度は、２５℃以上４０℃以下である、（１）又は（２）に記載の改変方法。
（４）前記生物体は、真核生物体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の改変方法。
（５）前記改変工程は、２０℃以上４５℃以下で実施する、（１）〜（４）のいずれかに記載の改変方法。
（６）前記改変工程は、１０分以上３時間以下実施する、（５）に記載の改変方法。
（７）前記タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって得られる前記タンパク質を用いる、（１）〜（６）のいずれかに記載の改変方法。
（８）前記改変工程は、前記タンパク質の産生を、前記生物体の生育能を維持しつつ前記ゲノムを改変可能な程度に制御する工程である、（１）〜（７）のいずれかに記載の改変方法。
（９）前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を誘導して前記生物体のゲノムを改変する工程である、（６）に記載の改変方法。
（１０）前記改変工程は、前記外来遺伝子の発現を定常的に維持して前記生物体のゲノムを改変する工程である、（８）又は（９）に記載の改変方法。
（１１）前記改変工程は、前記タンパク質を前記生物体の細胞に直接供給して作用させる工程である、（１）〜（６）のいずれかに記載の改変方法。
（１２）前記タンパク質は、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＭｓｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＭｂｏＩ、及びＨｂａＩからなる群から選択される１種又は２種以上の制限酵素である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の改変方法。
（１３）前記生物体は、植物体又はその一部である、（１）〜（１２）のいずれかに記載の改変方法。
（１４）前記植物体又はその一部は、種子、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚並びにこれらの一部からなる群から選択される１種又は２種以上である、（１３）に記載の改変方法。
（１５）前記生物体は、微生物である、（１）〜（１２）のいずれかに記載の改変方法。
（１６）ゲノムが改変された生物体集団の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程、
を備える、生産方法。
（１７）ゲノムが改変された生物体の生産方法であって、
親生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて前記親生物体のゲノムを改変する改変工程と、
改変されたゲノムを保持する真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程と、
を備える、生産方法。
（１８）育種用材料であって、
常温域に至適温度を呈するDNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードするコード領域を有するDNAを備え、
前記コード領域は、前記育種材料のホスト内でプロセッシングされないイントロンを含む、育種用材料。
（１９）真核生物体用の発現ベクターである、（１８）に記載の育種用材料。
（２０）前記ホストは、原核生物である、（１８）又は（１９）に記載の育種用材料。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】イントロン挿入した常温型制限酵素の遺伝子ならびにタンパク構造を示す図である。
【図２】通常生育条件における常温型制限酵素発現植物の生育の遅延を示す図である。
【図３】通常生育条件で常温型制限酵素発現植物において二本鎖切断ゲノム修復因子BRCA1遺伝子の発現上昇を示す図である。
【図４】通常生育条件で常温型制限酵素発現植物において小規模再編頻度の向上を示す図である。
【図５】常温型制限酵素発現の誘導による幼植物体生育の遅延を示す図である。
【図６】常温型制限酵素発現の誘導による二本鎖切断ゲノム修復因子BRCA1遺伝子発現の上昇を示す図である。
【図７】常温型制限酵素発現の誘導による小規模再編頻度の向上を示す図である。
【図８】常温型制限酵素発現の誘導による植物花茎生育の遅延を示す図である。
【図９】常温型制限酵素発現の誘導による花芽および茎生葉における二本鎖切断ゲノム修復因子BRCA1遺伝子発現の上昇を示す図である。
【図１０】常温型制限酵素発現の誘導による発芽後実生の生育の遅延を示す図である。
【図１１】常温型制限酵素発現による酵母生存数の低下を示す図である。
【図１２】酵母由来イントロンを含む常温型制限酵素発現による酵母生存数の低下を示す図である。
【図１３】常温型制限酵素のタンパク質レベルでの発現を示した図である。
【図１４】常温型制限酵素タンパク質の直接導入による酵母生存数の低下を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書の開示は、生物体のゲノムの改変方法及び当該改変方法の利用に関する。本改変方法は、生物体のゲノムを改変するのにあたって、生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質を作用させて生物体のゲノムを改変する改変工程を備えることができる。本改変方法によれば、生物体に対する負荷の低減とゲノム再編とを両立して、効果的にゲノムを改変することができる。この結果、生物体のゲノムの遺伝的組換えを促進し、ひいてはゲノムを再編成することができる。
【００１７】
本改変方法で用いるＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質は、常温域で至適温度を有する。このため、ＤＮＡ二本鎖切断活性を発揮させるための温度を抑制しまた時間を短縮化できる。これにより、生物体に対する熱的負荷が抑制される。
【００１８】
一方、本発明者らによると、生物体の好適な生育温度に近い常温域で至適温度を有する前記タンパク質を作用させるため、生物体の生育活性ひいては生存に対して悪影響の増大が想定しえた。しかしながら、発明者らの予想に反して、前記タンパク質の意図的な作用条件下では生物体の生育に対する影響等があっても、前記タンパク質の作用を意図しない又は作用を抑制する条件下においては、前記タンパク質の作用による悪影響は抑制又は回避されることがわかった。そして、結果として、生物体のゲノムに、転座、逆位、重複などのゲノム再編成、点突然変異、染色体異数性などの様々な変異を効果的に誘発してゲノムを改変できることがわかった。この結果、本改変方法によると、速やかにかつ多様に形質が変化した生物体集団を得ることができる。
【００１９】
また、本改変方法によれば、従来は困難であった、例えば、生物体の種々の生育段階、器官若しくは組織においても、熱的負荷を抑制しつつ前記タンパク質を十分に作用せしめることができる。この結果、得られる生物体の多様性や改変効率の観点から有効なゲノム改変が期待できる時期及び／又は部位において、生物体のゲノムを改変することが可能となっている。
【００２０】
本発明者らによれば、従来、耐熱性制限酵素を熱処理により一過的に活性化することによる遺伝的組換えによるゲノム再編の誘発は、必ずしも十分でなかった。特に、種子や茎頂、側芽、花芽などの種々の生育段階においてまた組織ないし器官においては低調であった。しかしながら、本改変方法によると、種子や茎頂、側芽、花芽などの種々の生育段階においてまた組織ないし器官において、ゲノム改変を誘発してゲノムと細胞の多様性を十分に創出することが可能になった。
【００２１】
例えば、種子では個体サイズが小さいので大量の植物体を用いたゲノム改変の誘発が可能となるライブラリーの作製の速度を加速することができる。また、例えば、茎頂におけるゲノム再編誘発は栄養繁殖性植物の育種に有効であるし、花芽では、次世代に伝わる運命の細胞が確実に存在する組織であり、効率的なゲノム再編誘発に有効である。
【００２２】
本改変方法を利用する本開示の生物体集団の生産方法によれば、親生物体に対して上記タンパク質を作用させる改変工程を備えるため、従来に比して多様性に富む生物体集団を効率的に生じさせることができる。さらに、本改変方法を利用する本開示の生物体の生産方法によれば、多様性に富む生物体集団から意図に応じた生物体を得ることができる。
【００２３】
本明細書において「ゲノム」とは、生物体において染色体ＤＮＡとして存在し、その細胞において自己複製可能であって娘細胞に伝達されるＤＮＡをいうものとする。また、真核細胞にあっては、核内に存在する染色体ＤＮＡのほか、ミトコンドリアＤＮＡを含むことができる。
【００２４】
また、本明細書において「遺伝的組換え」とは、広い意味において、細胞において生じるDNA切断・再結合現象を意味する。本発明における「遺伝的組換え」には、相同組換え、非相同組換え、遺伝子変換、逆位、不等交叉、交叉、転座、コピー数変動、染色体融合、変異が含まれる。
【００２５】
本明細書において、「常温域」とは、１５℃以上４２℃以下、より好ましくは１５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上３７℃以下、なお好ましくは３０℃以上３７℃以下を意味するものとする。
【００２６】
以下、本明細書の開示の各種実施形態について、詳細に説明する。
【００２７】
（生物体のゲノムの改変方法）
本開示の生物体のゲノムの改変方法（以下、本改変方法という。）は、生物体の細胞内においてＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質（以下、本タンパク質という。）を常温域で作用させて前記生物体のゲノムを改変する改変工程、を備えることができる。
【００２８】
（改変工程）
（生物体）
本改変方法は、任意の生物体に適用可能である。生物体としては、真核生物体及び原核生物体が含まれる。真核生物体としては、動物体、植物体、真核性微生物が挙げられる。動物体としては特に限定しないで、哺乳動物及び各種の魚類などの非哺乳動物又はその一部が挙げられる。また、動物又はその一部としては、動物に由来するものであればよく、細胞、組織、器官、未受精卵、受精卵などいずれの形態であってもよい。受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。
【００２９】
植物体としても特に限定するものではないが、例えば、双子葉植物のほか、例えば、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する単子葉植物（下記参照）の一部が挙げられる。
【００３０】
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Brassica Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis. hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
フトモモ科：ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis）など。
【００３１】
本改変方法に適用される植物体としては、植物に由来するものであればよく、植物としては、細胞、組織、器官、種子、カルスなどいずれの形態であってもよい。完全な植物に再生する能力を好適に保持しているものであれば、改変した植物を得るのに都合がよい。
【００３２】
また、微生物としても、特に限定するものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）属などに属する麹菌やサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス（Saccharomyces）属などに属する各種の酵母などの工業的に有用な真核微生物が挙げられる。また、微生物としては、大腸菌（Escherichia coli）などの各種グラム陽性細菌、ラクトバチルス属などの各種乳酸菌、枯草菌等のバチルス属菌などの各種グラム陽性細菌等が挙げられる。
【００３３】
（生物体の準備）
本改変方法においては、各種生物体又はその一部を用いるが、生物体のゲノムセットの倍数性は特に問わない。すなわち、その生物体の本来の倍数性を備える正倍数体であってもよいし、その生物体の本来の倍数性（正倍数性）を超える倍数体であってもよいし、さらに、その生物体の本来の倍数性を下回る倍数体であってもよい。また、同質倍数体であってもよいし、異質倍数体であってもよい。また、整数倍の倍数体のほか、一部の染色体の数が変異している異数性を備える異数体であってもよい。真核生物体の染色体の倍数性については、従来公知の方法によって決定できるほか、例えば、フローサイトメーターやタイリングアレイなどの方法によって決定することができる。
【００３４】
（本タンパク質：ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質）
本工程では、生物体の細胞内において、本タンパク質、すなわち、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質を作用させる。本タンパク質としては、特に限定しないが、典型的には、公知のＤＮＡ二本鎖切断酵素又はその変異体を用いることができる。
【００３５】
ＤＮＡ二本鎖切断酵素としては、ＤＮＡ上の４塩基〜６塩基程度を認識部位とするＤＮＡ二本鎖切断酵素（制限酵素）が好ましい。ゲノムにおける切断箇所の数が遺伝的組換え効率に寄与するため、かかる塩基数の認識部位とすることで、好ましい頻度で染色体ＤＮＡを切断できる。例えば、４塩基〜５塩基の認識部位とするＤＮＡ二本鎖切断酵素がより好ましく、４塩基の認識部位とすることがさらに好ましい。このようなＤＮＡ二本鎖切断酵素としては、特に限定されないが、各種公知の制限酵素が挙げられる。なお、こうした認識部位を有するＤＮＡ二本鎖切断酵素は、一般的には、多頻度制限酵素と称されることもある。
【００３６】
制限酵素としては、概ね最大のＤＮＡ二本鎖切断酵素活性を有する温度である至適温度（インキュベーション温度ともいう。）を高温域でなくより低温域に有する制限酵素（以下、常温型制限酵素という。）を用いることができる。ここで、高温域とは、５０℃以上の温度域とすることができる。より好ましくは４５℃以上の温度域である。したがって、本明細書における常温型制限酵素としては、５０℃未満にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有する酵素が挙げられ、好ましくは４５℃未満に同至適温度を有する制限酵素が挙げられる。
【００３７】
常温型制限酵素は、より好ましくは常温域にDNA二本鎖切断活性の至適温度を有することができる。ここで、「常温域」とは、１５℃以上４２℃以下、より好ましくは１５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上４０℃以下、さらに好ましくは２５℃以上３７℃以下、なお好ましくは３０℃以上３７℃以下を意味するものとする。
【００３８】
概して、常温型制限酵素は、２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）に至適温度を有している。また、常温型制限酵素は、概して、６０〜７０℃、１５分〜２０分のインキュベートにより不活性化されうる。１５分〜２０分のインキュベートによって酵素活性を失活する温度を失活温度というものとする。常温型制限酵素であっても、８０℃以上の失活温度を有する場合もある。
【００３９】
常温型制限酵素を用い、必要に応じて、当該制限酵素の量（発現量）、作用タイミング、作用温度、作用時間及びその他の作用条件を調節することにより、生物体への悪影響を回避しつつ効率的に細胞内においてＤＮＡを切断することができる。
【００４０】
また、制限酵素としては、好熱菌でない細菌に由来する制限酵素（非好熱菌由来制限酵素）を用いることもできる。好熱菌は、至適生育温度が４５℃以上又は生育限界温度が５５℃以上である細菌をいう。好熱菌は概して古細菌である。非好熱菌由来制限酵素は、概して常温型制限酵素でありうる。一方、好熱菌由来制限酵素は、概して、８０℃又はそれ以上の温度を失活温度としうる。また、好熱菌由来制限酵素は、至適温度が３７℃以上８０℃以下程度である。
【００４１】
常温型制限酵素又は非好熱菌由来制限酵素は、生物体に一般的に適用される温度（生育温度や培養温度）の温度域においてそのDNA二本鎖切断活性をある程度有するため、各種作用条件を調節することでその作用強度（レベル）を高い自由度で設定できる。
【００４２】
常温型制限酵素としては、至適温度が２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。好ましくは、こうした至適温度を備え、さらに、失活温度が６０℃以上７０℃以下として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。
【００４３】
また、非好熱菌由来制限酵素としては、公知の非好熱菌由来制限酵素を適宜選択して用いることができる。
【００４４】
こうした制限酵素としては、特に限定しないが、例えば、ＡｌｕＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＭｓｅＩ、ＭｂｏＩ、ＨａｅＩＩＩ等が挙げられる。これらの至適温度はいずれも３７℃とされている。また、例えば、ＢｆａＩ、ＢｆｕＣＩＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＢｓｕＲＩ、ＤＰｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦｓｐＢＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ等が挙げられる。以上列挙した制限酵素は、いずれも、至適温度が約３７℃である。また、ＡｐａＩ、ＢａｅＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＱＩ、ＳｍａＩ及びＳｗａＩが挙げられる。これらの制限酵素は、４塩基認識であり、至適温度はいずれも約２５℃とされている。
【００４５】
また、制限酵素としては、上記以外の酵素、すなわち、至適温度が５０℃以上の制限酵素や好熱菌由来の制限酵素を用いることもできる。こうした制限酵素を常温域近傍温度で作用させても、その作用条件を適宜設定して作用強度を調節することにより、生物体への悪影響を回避しつつ効率的に細胞内においてＤＮＡを切断することができる。こうした制限酵素としては、適宜公知の制限酵素を用いることができる。
【００４６】
なお、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の至適温度は、当該酵素の入手先のプロトコールに記載されるほか、当該酵素に好適とされているバッファ中、所定の基質の所定濃度存在下、各種温度で酵素反応評価した結果に基づくことができる。
【００４７】
例えば、制限酵素の至適温度の測定方法としては、文献（Greene, P.J., Poonian, M.S., Nussbaum, A.L., Tobias, L., Garfin, D.E., Boyer, H. W., & Goodman, H. M (1975), Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the Eco RI substrate.  Journal of molecular biology, 99(2), 237-261）の方法が挙げられる。具体的には、制限酵素による、ＳＶ４０ ＤＮＡ（32Ｐ標識）の切断に関して定量解析する。すなわち、全量５０μｌの反応液（０．１Ｍ Tris HCl（ｐＨ７．５）、５ｍＭ、MgCl2、０．０５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、１．６ｐＭ、 ＳＶ４０ ＤＮＡ）に５μｌ制限酵素溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮＰ４０, ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．７ｐＭ制限酵素）を加え、各温度（０℃〜８０℃程度において適度な温度間隔に設定された温度）において、制限酵素処理を数分間程度適切な時間行う。１％ＳＤＳを添加して反応を停止後、ａｇａロス電気泳動により、supercoil DNA（フォームＩ）、open circle DNA（フォームII）及び線状DNA（フォームIII）に分離する。各フォームの線量（ｃｐｍ）を測定し、制限酵素処理により切り出されたホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）を下記計算式で求める。各温度において切り出されたホスホジエステル結合数をグラフ化して、ピーク値近傍をその酵素の至適温度（ＤＮＡ二本鎖切断活性の）とすることができる。
ホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）＝
[２×フォームIIIの線量（ｃｐｍ）＋フォームIIの線量（ｃｐｍ））／（フォームＩ、II及びIIIの合計線量（ｃｐｍ））]×ＤＮＡ量（ｐｍｏｌ）
【００４８】
また、例えば、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の失活温度は、当該酵素を、各種温度で１５分〜２０分程度維持する熱処理の前後の活性を測定することにより得ることができる。活性が検出できなくなる温度が失活温度である。
【００４９】
本タンパク質を生物体の細胞内において作用させるには、少なくとも、本タンパク質をその細胞内に存在させる。本タンパク質は、本来的に細胞内に存在するが、好ましくは、外部から供給する。本タンパク質は、生物体の細胞に直接供給してもよいし、あるいは本タンパク質をコードする外来遺伝子の発現によって供給してもよい。
【００５０】
生物体の細胞において、本タンパク質を発現させるベクターは、当業者であれば、従来公知の手法により適宜細胞の種類や形質転換手法に応じて構築することができる。本タンパク質をコードする塩基配列は、各種データベースより入手可能である。また、細胞に応じたベクターを適宜入手可能であるほか、適切なプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなども適宜選択した、所望の発現カセットを構築することができる。なお、特に限定するものではないが、用いる真核生物体において有用な核移行シグナルを伴うことが好ましい。
【００５１】
例えば、植物の細胞内において、タンパク質を発現させるための発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００５２】
プロモーターは、植物体内で制限酵素遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。後述するように、例えば、シロイヌナズナのシグマ因子由来のＳＩＧ２（ＡｔＳＩＧ２）プロモーターなどの、発現強度が３５Ｓプロモーターよりも低いプロモーターであることも好ましい。
【００５３】
本タンパク質をコードする遺伝子を発現可能とする発現ベクターを生物体の細胞に供給する場合、本タンパク質を生物体の細胞内で発現誘導を経て作用させてもよい。こうすることで、意図したタイミングで、本タンパク質の作用を発現させることができる。こうした誘導的プロモーターとしては、例えば、化学物質又はその濃度、熱、浸透圧などの外部条件によって誘導される誘導性プロモーターのほか部位特異的プロモーター、時期特異的プロモーター等が挙げられる。こうした各種の誘導的プロモーターは、例えば、ＤＥＸプロモーター、ＨＳＰ１８．２プロモーター等、公知のプロモーターから適宜選択される。
【００５４】
発現ベクターは、適宜、プロモーター及び上記制限酵素遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選抜マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００５５】
転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることができる。
【００５６】
その他、選抜マーカー及び翻訳効率を高めるための塩基配列としては、公知の要素を適宜選択して用いることができる。発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに対して、必要とする要素を適宜導入すればよい。
【００５７】
こうした発現ベクターは、かかるタンパク質を一過的に発現させるかあるいは恒常的に発現させるように、植物細胞に導入される。タンパク質を一過的に発現させるには、例えば、PEG法、エレクトロポレーション法及びパーティクルガン法を用いて発現ベクターをプラスミド等として植物細胞内に物理的に導入する。また、恒常的に発現させるには、アグロバクテリウム法等を用いて植物ゲノムに組み込むようにする。
【００５８】
アグロバクテリウム法を用いる場合には、本タンパク質をコードする遺伝子の導入に起因する植物細胞の死滅割合を低くすることができるため、ゲノムセットの多様性を確保することができる点において、有利である。また、アグロバクテリウム法は、双子葉植物、特にシロイヌナズナに適用することが好ましい。
【００５９】
形質転換した植物細胞等から、植物体を再生する方法については、従来公知の方法を適用することができる。
【００６０】
また、酵母などの細胞内において、本タンパク質を発現させるには、同様に酵母に適した発現ベクターを構築し、酵母に導入すればよい。発現ベクターは、当業者であれば、公知の方法を用いて、プロモーター、ターミネーター他、適宜エンハンサーを用いて構築することができる。発現カセットを染色体導入形態に構成することもできるし、染色体外で保持される形態に構成することもできる。
【００６１】
発現ベクターを構築するのにあたっては、タンパク質を発現させるタイミングを意図的に決定できる誘導的プロモーターを用いることが好ましい。また、発現強度を所望のレベルに設定するために、プロモーターやターミネーターなどの他の制御領域についても適宜設定することが好ましい。
【００６２】
例えば、誘導的プロモーターは、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０などのガラクトース誘導性プロモーター、Ｔｅｔ−ｏｎシステム／Ｔｅｔ−ｏｆｆシステムなどのドキシサイクリンの添加による誘導／除去による誘導システムに用いるプロモーター、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０などの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）をコードする遺伝子のプロモーター等を用いることができるが、好ましくは、銅イオンの添加で活性化するCUP1プロモーターを用いる。CUP1プロモーターを用いることで、グルコース等の炭素源を含み銅イオンを含まない培地で細胞を培養し、その後銅イオン化合物を培地に添加して培養することでＤＮＡ二本鎖切断酵素を発現誘導することができる。なお、銅イオンの添加濃度は適宜設定できるが、例えば、５０μＭ以上３００μＭ以下程度とすることができる。また、培養時間は、１時間〜６時間程度とすることができる。さらに、発現誘導と同時にＤＮＡ二本鎖切断酵素を活性化しないためには、ＤＮＡ二本鎖切断酵素の活性化条件に該当しない温度等（例えば、２５℃程度）で細胞を培養することが好ましい。ＣＵＰ１プロモーターは、意図的なＤＮＡ二本鎖切断酵素の発現誘導及び活性化を簡易にかつ迅速に実行できるという利点がある。
【００６３】
こうした発現ベクターを酵母に導入して、染色体内又は染色体外に保持するように酵母を形質転換することは、当業者であれば、従来公知の方法に基づき実施できる。
【００６４】
本タンパク質を発現する発現ベクターは、そのほか、適用する生物体の種類や本タンパク質に関して意図する作用条件に応じ、当業者は、組換え操作（本発明の核酸、プロモーター、選択マーカー遺伝子等のベクターへの挿入等）には、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた方法等、標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる）を利用することができる。
【００６５】
本タンパク質を生物体の細胞に直接供給するには、特に限定しないが、好ましくは、生物体又はその一部と本タンパク質とを、本タンパク質が水や緩衝液などの水系媒体に溶解した状態で供給する。こうすることで、効率的に生物体の細胞内にタンパク質が供給される。
【００６６】
生物体の細胞内に本タンパク質を供給するには、生物体とこうした溶液とを、例えば、塗布、浸漬及び混合等により接触させるほか、生物体に注入することも可能である。こうした供給温度や条件は、特に限定しないが、本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度でないことが好ましい。例えば、ＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度が３７℃程度の場合、供給時の温度は３０℃以下とすることが好ましく、より好ましくは２５℃以下である。本タンパク質を直接供給する形態は、生物体が細胞、組織又は器官である場合において有用である。
【００６７】
（生物体の細胞内において本タンパク質を作用させる態様）
次いで、生物体の細胞内において本タンパク質を作用させる態様について説明する。以下の説明において、生物体の細胞内というときには、生物体の態様は特に限定するものではない。例えば、生物体が植物体の場合には、植物体の態様は問わないで、植物個体の一部としての細胞、組織、器官のほか、種子、幼苗、あるいはその後の成長した植物個体のほか、カルスにおける細胞内を意味している。また、生物体が、酵母など微生物の場合には、その細胞内で本タンパク質を作用させることを意味する。
【００６８】
生物体の細胞内において本タンパク質を作用させるには、本タンパク質を細胞内に存在させればよいが、生物体の生育能を維持しつつゲノムを改変可能な程度に制御することが好ましい。このためには、例えば、意図的に及び／又は一時的に本タンパク質を作用させる。より好ましくは、意図的かつ一時的に本タンパク質を作用させるようにする。本タンパク質が常時一定以上の強度で作用することで、過度のDNA二本鎖切断により細胞の生育が影響を受けるからである。
【００６９】
生物体の細胞内において本タンパク質を作用させるのに、誘導的プロモーター、部位特異的プロモーター及び時期特異的プロモーター等によって本タンパク質を発現の誘導を制御することが好ましい。本タンパク質の発現を誘導することで、意図的なタイミングや目的とする部位で本タンパク質を細胞内で発現させて作用させることができるし、誘導を停止したり、あるいは一定期間経過することでおおよそその作用を低下又は停止することができる。誘導的プロモーターを用いる場合、プロモーターの種類に応じ、温度や化学物質等が適宜細胞に供給されるようにする。
【００７０】
プロモーターやターミネーター等による本タンパク質の発現強度の制御も、本タンパク質の細胞内における作用強度に関連する。したがって、用いるプロモーターやターミネーターによって奏される発現強度も考慮してプロモーター等を選択することが好ましい。
【００７１】
本タンパク質の至適温度などの特性によっては、構成的プロモーターで本タンパク質を発現を定常的に維持することが有用である場合もある。本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性が、温度に大きく依存するなどの特性がある場合には、後述する温度条件の制御によって十分にそのＤＮＡ二本鎖切断活性を制御できるからである。また、低い発現強度で定常的（構成的）に発現させることが有用である場合もある。
【００７２】
生物体の細胞内において本タンパク質を作用させるには、細胞内に存在させた本タンパク質を、そのまま生物体の生育条件下で作用させることもできるが、好ましくは、細胞内の本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性を人為的に活性化する。さらに、好ましくはその後、不活性化する。こうすることで、よりスピーディにかつ効果的に本タンパク質を作用させることができる。このためには、例えば、本タンパク質に、その至適温度近傍の温度条件を付与することで意図的なタイミングで本タンパク質を活性化することができる。この方法は、本タンパク質を直接細胞に供給する形態においても有用である。
【００７３】
本タンパク質は、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するため、本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性の活性化に際し、こうした常温域近傍の温度条件を付与することで、生物体の生育活性に対する温度条件の影響を低減しつつ、かつ本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性を有効に発揮させることができる。より具体的には、本タンパク質の作用温度及び作用時間を短縮するなどの作用レベル（作用強度）を低減して、温度やＤＮＡ二本鎖切断活性による生物体への悪影響を回避又は抑制できる。
【００７４】
ここで、常温域近傍とは、既に説明した各種態様の常温域を含む温度範囲とすることができる。例えば、下限は、好ましくは１０℃以上であり、より好ましくは１５℃以上であり、さらに好ましくは２０℃以上であり、なお好ましくは２５℃以上であり、上限は、好ましくは４７℃以下であり、より好ましくは４５℃以下であり、さらに好ましくは４２℃以下である。また、その範囲としては、好ましくは１０℃以上４７℃以下であり、より好ましくは１０℃以上４５℃以下、さらに好ましくは１５℃以上４５℃以下、さらに好ましくは２０℃以上４２℃以下、なお好ましくは２５℃以上４２℃以下である。
【００７５】
また、作用時間は、その作用温度条件や本タンパク質の至適温度にもよるが、例えば、数分以上〜１時間以下程度とすることができる。好ましくは、１０分以上５０分以下、より好ましくは１５分以上４５分以下とすることができる。また、例えば、１時間以上１０時間以下とすることもでき、好ましくは１時間以上６時間以下、より好ましくは１時間以上４時間以下、さらに好ましくは１時間以上３時間以下とすることができる。
【００７６】
こうした温度条件は、本タンパク質の至適温度、生物体に対する影響、ＤＮＡの改変程度等を考慮して適宜決定することができる。
【００７７】
本タンパク質を生物体の細胞内で作用させる改変工程は、例えば、植物においては、本タンパク質が作用可能な状態で、好ましくは、本タンパク質を発現可能に形質転換した親植物である生物体から収穫した播種前の種子、播種後から発芽までの間、発芽後の幼苗、より成長した植物体に対して一定期間実施する。また、例えば、酵母等においては、本タンパク質を発現可能に形質転換した親酵母に対して、本タンパク質を発現させるか、あるいは発現させた本タンパク質を活性化させるようにする。
【００７８】
こうした改変工程は、生物体が植物の場合には、種子、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚並びにこれらの一部からなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。このような植物体又はその一部においてゲノムを改変することでより効果的な特性改変が期待できるからである。
【００７９】
改変工程は、例えば、生物体が植物であるとき、本タンパク質が作用可能な状態で、種子、幼苗、成長した植物などを、例えば、３７℃の温度条件下で数十分から数時間インキュベーションし、その後、より低い温度の生育条件（例えば、シロイヌナズナの場合、２０℃〜２５℃程度）に戻すような場合が挙げられる。
【００８０】
また、生物体が酵母であるときには、本タンパク質が作用可能な状態で、酵母の培養条件を、例えば、３７℃で、数十分〜数時間程度維持してその後、通常の培養温度（おおよそ２５℃〜３０℃程度）に戻すような態様が挙げられる。
【００８１】
さらに、生物体が動物であるとき、本タンパク質が作用可能な状態で、未受精卵や受精卵を含む動物細胞を、例えば、３７℃で数十分〜数時間程度維持するようにして、その後、本タンパク質の作用を排除する（プロモーターの作用解除等）ような態様が挙げられる。
【００８２】
なお、こうした改変工程における本タンパク質の選定や各種作用条件の設定にあたり、本タンパク質の作用状態を生物体の生育状態（生育の遅延・抑制、生存率の低下）を指標として評価する評価工程を予め実施することができる。本タンパク質のＤＮＡ二本鎖切断活性が発揮されてゲノムにおいて遺伝的組換えが生じている場合には、生物体の生育の遅延又は抑制や生存率の低下が観察されるからである。本発明者らによれば、かかる生育抑制等があっても、生物体においては有効なゲノム改変が生じていることがわかっている。
【００８３】
また、こうした評価工程に加え、あるいはこうした評価工程に換えて、本タンパク質の作用状態を、生物体における組換えを間接的に検出する評価工程を実施してもよい。こうした評価工程は、例えば、生物体におけるＢＲＣＡ１遺伝子などのＤＮＡの修復に関する遺伝子の発現量の増大やGUSレポーター遺伝子を用いた相同組換えのレベルを指標とすることができる。かかる評価工程を実施することで、本タンパク質の作用による生物体における遺伝的組換えの程度をより具体的に把握することができる。
【００８４】
こうした本タンパク質の作用状態の評価を実施することで、当業者であれば、本改変方法に用いるのに有効な生物体、制限酵素、その作用強度や作用条件を適宜設定することができる。
【００８５】
以上のことから、本開示によれば、生物体のゲノムの改変システムの評価方法であって、
生物体の細胞内において常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有する１又は２以上のタンパク質を１又は２以上の条件下で作用させる工程と、
前記１又は２以上のタンパク質の前記１又は２以上の条件下での作用状態を前記生物体の生育状態又は前記生物体における遺伝的組換えを指標として前記タンパク質の作用状態を評価する工程と、
を備える、評価方法も提供される。
【００８６】
以上のことから、本開示によれば、生物体のゲノムの改変システムに用いるタンパク質及び／又はその作用条件の決定方法であって、
生物体の細胞内において常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有する１又は２以上のタンパク質を１又は２以上の作用条件下で作用させる工程と、
前記１又は２以上のタンパク質の前記１又は２以上の作用条件下での作用状態を前記生物体の生育状態又は前記生物体における遺伝的組換えを指標として前記タンパク質の作用状態を評価する工程と、
を備え、
前記評価に基づいて前記システムに用いるタンパク質及び／又はその作用条件を決定する、方法も提供される。
【００８７】
こうした改変工程を実施することで、ゲノムにおいて遺伝的組換えが生じて、改変されたゲノムを備える生物体を得ることができる。本タンパク質によるゲノム改変程度は、本タンパク質を適用した細胞など生物体ごとに異なるため、結果として、種々の異なる改変態様を有する生物体の集団を得ることができる。
【００８８】
以上説明したように、本改変方法によれば、生物体の細胞内において、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有する本タンパク質を作用させることで、本タンパク質の作用時の生物体に対する熱的負荷を低減し、効果的なゲノム改変が可能となっている。この結果、量的形質などの複数の遺伝子が関連する形質を効率的に向上させることができる。
【００８９】
本改変方法は、それ自体、改変されたゲノムを有する生物体の生産方法であり、こうした改変工程を親生物体に対して適用することで、ゲノムが改変された生物体集団を得ることができる、ゲノムが改変された生物体集団の生産方法でもある。また、こうして得られる生物体集団から任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する工程を実施することにより、意図に応じた生物体を取得することができる、改変された特性を有する生物体の生産方法でもある。
【００９０】
（育種用材料）
本明細書の開示の育種材料は、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有するタンパク質をコードするコード領域を有するＤＮＡを備え、前記コード領域は、前記育種材料のホスト内でプロセッシングされないイントロンを含むことができる。かかる育種材料によれば、このイントロンの存在により、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有する成熟タンパク質として合成されない。この結果、成熟タンパク質が発揮するＤＮＡ二本鎖切断活性によってこのＤＮＡを保持するホストの生育活性が低下することが抑制又は回避される。
【００９１】
イントロンは、タンパク質を作用させることを意図する真核生物体においてはプロセッシングされるように構成される。
【００９２】
かかる育種用材料は、真核生物体用の各種公知の発現ベクターとすることができる。発現ベクターは、概して、適当なホストで保持されまた増幅される。本育種用材料によれば、大腸菌などの原核微生物である原核生物のホストにおいても、確実に保持され、増幅することができる。
【００９３】
本育種用材料に適用されるイントロンは、特に限定されないで、公知の真核生物体のタンパク質のコード領域の既知のイントロンを適宜用いることができる。
【実施例】
【００９４】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明する。なお、以下の実施例は、本開示を説明するものであってその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９５】
（１）HinP1I遺伝子およびMseI遺伝子の植物発現用ベクターの構築
【００９６】
HinP1I遺伝子およびMseI遺伝子の塩基配列に関しては、Genbankに登録されている配列を参照した（HinP1I遺伝子配列；AY849924 、MseI遺伝子配列；DQ356003）。これらの配列についてシロイヌナズナコドン最適化を行い、次にCastor beanのcatalase由来のイントロン配列（Ma et al., 2011, Plant Science 181,188-194）を挿入し、さらに5’末端側にFLAGタグ配列、3’末端側に核移行シグナル（NLS）配列を連結した人工合成遺伝子を設計した。この人工合成遺伝子については、以後FLAG-iHinp1I-NLSおよびFLAG-iMseI-NLSと称した（図１）。
【００９７】
上記人工合成遺伝子の植物発現用ベクターとして、HSP18.2プロモーターの下流に目的遺伝子を配置したpBI HSP18.2:FLAG-iHinP1I-NLSおよびpBI HSP18.2:FLAG-iMseI-NLS、DEX誘導性プロモーター（以後DEXと表記）の下流に目的遺伝子を配置したpBI DEX: FLAG-iHinP1I-NLSおよびpBI DEX: FLAG-iMseI-NLSを用いた。
【実施例２】
【００９８】
（２）目的遺伝子のシロイヌナズナへの導入
【００９９】
pBI HSP18.2:FLAG-iHinP1I-NLSまたはpBI HSP18.2:FLAG-iMseI-NLSまたはpBI DEX: FLAG-iHinP1I-NLSまたはpBI DEX: FLAG-iMseI-NLSを保持するアグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナ1406株（EMBO Journal (2006) 25, 5579-5590）に各遺伝子を導入した。
【０１００】
1406株はInverted repeat 構造をもつGUSレポーター遺伝子がCol-0株に導入されており、GUS遺伝子内で相同組み換えが生じるとGUS遺伝子が発現するように構築されている。この仕組みにより相同組換えの定量解析に利用されている。形質転換方法としてはインプランタ法を用いて行った。アグロバクテリウムの感染後取得した種子を、カナマイシンを含むMS寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar, 50 mg / l 硫酸カナマイシン）に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50 μmol/m2/secの人工気象室で2週間生育後、カナイマイシン耐性個体を選抜し形質転換体を得た。
【実施例３】
【０１０１】
（３）DEX: FLAG-iHinP1I-NLS遺伝子またはDEX: FLAG-iMseI-NLS遺伝子導入植物体（DEX: iHinP1I導入系統またはDEX: iMseI導入系統）の生育観察
【０１０２】
DEX: iHinP1I導入系統またはDEX: iMseI導入系統または耐熱性多頻度制限酵素であるTaqIを恒常的に発現する形質転換体系統（TaqI-ox、特開2011-160798）の各種子をカナマイシン含有MS寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar, 50 mg / l 硫酸カナマイシン）に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50 μmol/m2/secの人工気象室で2週間インキュベート後、生育の様子を観察した。DEX: iHinP1I導入系統またはDEX: iMseI導入系統では植物個体の生育が抑制されていた（図２）。
【実施例４】
【０１０３】
（４）1-4  DEX: iHinP1I導入系統またはDEX: iMseI導入系統の遺伝子発現解析
【０１０４】
（３）の解析で用いた植物体よりRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いて全RNAを抽出し、次にHigh-Capacity RNA-to-cDNA Kit（ライフテクノロジーズ社）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを調整した。次にリアルタイムPCR（ABI PRISM 7300）により、Power SYBR Green PCR Master Mix（ライフテクノロジーズ社）を用いて、18SrRNA及びBRCA1遺伝子の発現を解析した。18SrRNAは内在性コントロールとして使用し、各サンプル間の比較においては（BRCA1のシグナル値）／（18SrRNAのシグナル値）を相対的発現量として算出し解析した。結果を図３に示す。
【０１０５】
発現解析に使用したプライマーは下記の通りである。
18SrRNA-F：CGGCTACCACATCCAAGGAA（配列番号01）
18SrRNA-R：TGTCACTACCTCCCCGTGTCA（配列番号02）
BRCA1-F：CCATGTATTTTGCAATGCGTG（配列番号03）
BRAC1-R：TGTGGAGCACCTCGAATCTCT（配列番号04）
【０１０６】
図３に示すように、通常生育条件（22℃）において、TaqI発現系統ではBRCA1発現はコントロールと同程度であったが、常温型制限酵素発現系統においては、数十倍に上昇していた。BRCA1はゲノム二本鎖切断に対する修復の重要因子であることが知られており（West, C. E., et al. "Arabidopsis DNA double-strand break repair pathways." Biochemical Society Transactions 32.6 (2004): 964-966.）、常温型制限酵素発現系統においては、植物ゲノムに多頻度ゲノム切断され、ゲノム再編が誘発されていることが示唆された。
【実施例５】
【０１０７】
（５）DEX: iHinP1I導入系統またはDEX: iMseI導入系統のGU-US遺伝子再編の解析
【０１０８】
（３）の解析で用いた植物体をGUS染色に供した。GUS染色は基本的には Kimら(Kim et al., 2006)の方法に従った。まず90% アセトンをチューブに分注し4℃にあらかじめ冷やしておく。観察を行う植物体を90% アセトンに浸し、サンプリングが終了するまで氷上で静置した。すべてのサンプリングが終了後、室温で20分静置した。この間に２，３回チューブを反転させ、アセトン溶液とサンプルを穏やかに攪拌した。
【０１０９】
その後、50 mM Phosphate Buffer (pH7.0) で3回リンスを行い、その後、X-Gluc Solution (1.9 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide-cyclohexylammonium salt), 0.5 mM K3Fe(CN)6, 0.5 mM K4[Fe(CN)6]・3H2O, 0.3% Triton X-100, 50 mM Phosphate buffer (pH7.0)) に置換した。
【０１１０】
次に0.075MPaの圧力でサンプルを減圧し (5秒、2回)、X-Gluc Solution をサンプル内に浸潤させた後、37℃で2時間から一晩静置した。染色された組織は青色を呈する。染色が確認されたら、70% EtOHで置換し、染色反応を停止するとともに、クロロフィルなどの脱色を行った。GUS染色後の植物体をそれぞれ実体顕微鏡で観察し、GU-US遺伝子の再編により生じたGUS遺伝子の発現に由来する青色スポット数を植物体ごとに計測した。結果を図４に示す。
【０１１１】
図４に示すように、通常生育条件（22℃）において、TaqI発現系統ではGUSスポット数はコントロールと同程度であったが、常温型制限酵素発現系統においては、スポット数が4倍程度増加していた。
【０１１２】
ゲノムの二本鎖切断を修復する因子であるBRCA1遺伝子の発現上昇と考え合わせると、常温型制限酵素の植物細胞内での発現により常温域（植物が通常生育している温度域）において、ゲノム再編を誘発することが可能であることが示唆された。一方で、今回解析した遺伝子導入系統では、植物の生育に影響を及ぼす程度に常温型制限酵素が恒常的に発現しゲノム再編を誘発している可能性がある。発現漏れの少ない発現誘導系の構築により、植物の生育への影響を抑え随意的にゲノム再編を高効率で誘発することができると考えられた。
【実施例６】
【０１１３】
（６）HSP18.2: FLAG-iHinP1I-NLS遺伝子またはHSP18.2: FLAG-iMseI-NLS遺伝子導入植物体（HSP18.2: iHinP1I導入系統またはHSP18.2: iMseI導入系統）の生育観察
【０１１４】
HSP18.2: iHinP1I導入系統またはHSP18.2: iMseI導入系統またはTaqI-ox系統の各種子をMS寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar,）に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50 μmol/m2/secの人工気象室（通常生育条件）で2週間インキュベート後、生育の様子を観察した。結果を図５に示す。
【０１１５】
図５に示すように、HSP18.2: iHinP1I導入系統またはHSP18.2: iMseI導入系統、TaqI-ox系統では植物個体の生育はコントロール植物と顕著な差は認められなかった。植物の生育への影響が抑えられていることから、発現漏れの少ない発現誘導系が構築できたと考えられた。
【０１１６】
また、図５に示すように、各系統を播種後1週間、通常生育条件でインキュベートし、37℃、3時間、光強度約30〜50 μmol/m2/secで熱処理を行った後、更に通常生育条件で1週間インキュベートした場合には、HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統において生育の遅延が認められた。HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統では、常温型制限酵素の発現誘導により植物ゲノムの多頻度切断が誘発されていることが示唆された。
【実施例７】
【０１１７】
（７）HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の遺伝子発現解析
【０１１８】
（６）の解析で用いた植物体のうち、播種後1週間通常生育条件でインキュベートした系統および播種後1週間通常生育条件でインキュベートした後、HSP18.2: iHinP1I導入系統またはHSP18.2: iMseI導入系統については37℃、3時間、TaqI-ox系統については37℃、24時間の熱処理を行いサンプリングした。各サンプルよりRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いて全RNAを抽出し、次にHigh-Capacity RNA-to-cDNA Kit（ライフテクノロジーズ社）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを調整した。次にリアルタイムPCR（ABI PRISM 7300）により、Power SYBR Green PCR Master Mix（ライフテクノロジーズ社）を用いて、18SrRNA及びBRCA1遺伝子の発現を解析した。結果を図６に示す。
【０１１９】
図６に示すように、通常生育条件（22℃）において、TaqI-ox系統、HSP18.2: iHinP1I導入系統ならびにHSP18.2: iMseI導入系統ではBRCA1発現はコントロールと同程度であった。37℃、24時間の熱処理によりTaqI-ox系統においてBRCA1遺伝子の発現上昇が認められたが、HSP18.2: iHinP1I導入系統ならびにHSP18.2: iMseI導入系統では37℃、3時間の熱処理でTaqI-ox系統より高いBRCA1発現が誘導された。従来のTaqI発現系統より、1/8の熱処理時間で、より高いゲノム再編誘発効果が認められた。
【実施例８】
【０１２０】
（８）HSP18.2: iHinP1I発現系統およびHSP18.2: iMseI発現系統のGU-US遺伝子再編の解析
【０１２１】
（６）の解析で用いた植物体についてGU-US遺伝子再編の解析をするためGUS染色実験を行った。結果を図７に示す。
【０１２２】
図７に示すように、37℃、24時間の熱処理によりTaqI-ox系統においてGUSスポット数の増加が認められたが、HSP18.2: iHinP1I導入系統では37℃、3時間の熱処理でもTaqI-ox系統よりGUSスポット数が増加していた。したがって、常温型制限酵素発現系統においては従来よりも軽度（少なくとも1/8程度）の熱処理により、TaqI-ox系統より高頻度なゲノム再編を実現することが可能であると考えられた。
【実施例９】
【０１２３】
（９）HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の花茎における生育観察
【０１２４】
HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の各種子をMS寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar,）に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50 μmol/m2/secの人工気象室（通常生育条件）で2週間インキュベート後、ソイルミックスに植え替え4週間通常生育条件でインキュベートした。37℃、3時間熱処理後通常生育条件にて1週間インキュベートし植物の生育を観察した。結果を図８に示す。
【０１２５】
図８に示すように、熱処理したHSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統においては生育の遅延が確認された。コントロール植物の稔性に影響を及ぼさない程度の熱処理で、常温型制限酵素発現系統において植物ゲノムの切断が誘発されることが示唆された。
【実施例１０】
【０１２６】
（１０）HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の花茎における発現解析
【０１２７】
（９）の解析で用いた植物のうち、37℃、3時間の熱処理を行った直後の植物について、花芽および茎生葉をそれぞれサンプリングした。各サンプルよりRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いて全RNAを抽出し、次にHigh-Capacity RNA-to-cDNA Kit（ライフテクノロジーズ社）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを調整した。次にリアルタイムPCR（ABI PRISM 7300）により、Power SYBR Green PCR Master Mix（ライフテクノロジーズ社）を用いて、18SrRNA及びBRCA1遺伝子の発現を解析した。結果を図９に示す。
【０１２８】
図９に示すように、HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統では37℃、3時間の熱処理で花芽および茎生葉のいずれの器官においても、コントロール植物に比べ数十倍から数百倍にBRCA1発現が上昇していた。コントロール植物の稔性に影響を及ぼさない程度の熱処理で、常温型制限酵素発現を誘導することにより植物ゲノム再編が誘発されることが示唆された。
【実施例１１】
【０１２９】
（１１）HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の吸水種子における生育観察
【０１３０】
HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統の各種子を無菌処理し、温水中（29℃、32℃、35℃）で1時間インキュベートした（熱処理）のち、MS寒天培地（ムラシゲスクーグ無機塩, 1% ショ糖, 0.05% MES, 0.8% Agar,）に播種した。22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜50 μmol/m2/secの人工気象室（通常生育条件）で4日間インキュベート後、緑化した子葉が展開した個体を計数し発芽率とした。HSP18.2: iHinP1I導入系統およびHSP18.2: iMseI導入系統においては熱処理条件下で発芽率がコントロール植物と比較して遅延していた。種子においても、常温型制限酵素が発現誘導されゲノム再編を誘発することが示唆されたTaqI-ox系統では、熱処理による発芽の遅延は認められなかった（図10）。TaqIを初めとする耐熱性多頻度制限酵素発現系統においては、種子におけるゲノム再編の誘発は確認されていない。我々が今回開発した常温型制限酵素発現系統では、種子におけるゲノム再編を誘発することが可能であることを示した。
【実施例１２】
【０１３１】
（１２）酵母における常温型制限酵素発現の生存率
【０１３２】
出芽酵母を用い常温型制限酵素発現が生育に及ぼす影響を解析した。下記のオリゴDNAを用いてPCR反応を行ない、FLAG-iHinp1I-NLS遺伝子およびFLAG-iMseI-NLS遺伝子断片を取得した。
iHinP1I-F：CATAAAATATTCAGCGAATTGGATCCATGGATTACAAGGACGATGATG（配列番号05）
iHinP1I-R：GATGGTGATGCGATCCTCTCTGCAGTCAACCTCCAACCTTCCTCTTCTT（配列番号06）
iMseI-F：CATAAAATATTCAGCGAATTGGATCCATGGATTACAAGGACGATGATGA（配列番号07）
iMseI -R：GATGGTGATGCGATCCTCTCTGCAGTCAACCTCCAACCTTCCTCTTCTT（配列番号08）
各遺伝子断片を銅イオン添加により発現が誘導されるpORF-CLONEベクター(MoBiTec社)に導入した。作製したプラスミドベクターをpORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLSおよびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLSとした。pORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLSおよびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLSおよびコントロールとしてpORF-CLONEをYPH499(S288C)株に導入し、pORF-CLONE-FLAG-iHinp1I-NLS/YPH499およびpORF-CLONE-FLAG-iMseI-NLS/YPH499およびpORF-CLONE//YPH499を作製した。形質転換酵母を通常の培養に用いる最少培地（SD-LEU培地（2%グルコース、0.67% yeast nitrogen base、0.69 g/l CSM-LEU））を用いて30℃で24時間培養した。さらに、150・M硫酸銅を加え、30℃で4時間培養することで、FLAG-iHinp1I-NLS遺伝子およびFLAG-iMseI-NLS遺伝子の発現誘導を行った。さらに滅菌MilliQ水で細胞を洗った後、滅菌MilliQ水で5×105 cells/mlとし、30℃または42℃で30分間の加温インキュベートを行った。熱処理後は速やかに氷上に移し、YPDプレートにまき、30℃で2日間培養し生存率を測定した。結果を図11に示す。
【０１３３】
図１１に示すように、空ベクターを導入したコントロール酵母（pORF-CLONE/YPH499、vec）と比較して、銅イオン誘導後の加温インキュベートの有無に関わらず、常温型制限酵素発現酵母（L1およびL2）において生存率が低下していることがわかった。これまでの先行開発では、TaqI発現酵母において、高温依存的に生存率が低下していた。酵母内で植物型のイントロンが切り出され常温型制限酵素MseIが発現し、DNA切断により酵母生育に影響を及ぼしていることが示唆された。
【実施例１３】
【０１３４】
（１３）酵母イントロンを挿入した常温型制限酵素の効果
【０１３５】
pBI HSP18.2:FLAG-iMseI-NLSを鋳型として下記のオリゴDNAを用いPCR反応を行い酵母RUB1遺伝子由来イントロン配列を挿入した人工遺伝子iMseI(RUB1)を作製した。
NT123: AGATCTATGGATTACAAGGACGATGA（配列番号９）
NT124: GAGCTCTCAACCTCCAACCTTCCTCT（配列番号１０）
NT125: GTAAAATCGGTTAATTTCCCCTTTCTTTCTTTTCCTCACTCCGAAGTGTACATACCTTTTCACTCTGAGTCC（配列番号１１）
NT127: AGGTCTCAAAAACGTAAATAAACTTAAAAGATAATTAACCACTGAATGAACATACCTTTTCACTCTGAGTCCCTT（配列番号１３）
【０１３６】
またpBI HSP18.2:FLAG-iMseI-NLSに対して下記のオリゴDNAを用いてPCR反応を行い酵母CNB1遺伝子由来イントロン配列を挿入した人工遺伝子iMseI(CNB1)を作製した。
NT123: AGATCTATGGATTACAAGGACGATGA（配列番号９）
NT124: GAGCTCTCAACCTCCAACCTTCCTCT（配列番号１０）
NT126: GAAAAGAAAGAAAGGGGAAATTAACCGATTTTACTAACACTGACACTTTGAACAGGTCTGGATCTTCTGATGCTG（配列番号１２）
NT128: TAATTATCTTTTAAGTTTATTTACGTTTTTGAGACCTTACTAACGACCAGGATAGGTCTGGATCTTCTGATGCTG（配列番号１４）
【０１３７】
各遺伝子断片をドキシサイクリンにより発現が誘導されるprtTA-pCMV-pCYC1-kamMXベクターに導入した。作製したプラスミドベクターをprtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXおよびprtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(CNB1)-kanMXとした。prtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXおよびprtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(CNB1)-kannMXおよびコントロールとしてprtTA-pCMV-pCYC1-kanMXをYPH499株（S288C系統）に導入しYPH499/prtTA-pCMV-pCYC1-kanMXおよびYPH499/prtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXおよびYPH499/prtTA-pCMV-pCYC1-iMseI(CNB1)-kanMXを作製した。
【０１３８】
形質転換体をSD/MSG+G418培地（2% グルコース,0.17% yeast nitrogen base w/o amino acid, 0.1% monosodium glutamic acid, 10mg/L Adenine, 50mg/L L-Arginine, 50mg/L L-Asparatic acid, 20mg/L L-Hisitidine, 50mg/L L-Isoleucine, 100mg/L L-Leucine, 50mg/L L-Lysine, 20mg/L L-Methionine, 50mg/L L-Phenylalanine, 100mg/L L-Threonine, 50mg/L L-Tryptophan, 50mg/L Tyrosine, 20mg/L Uracil, 140mg/L Valine, 200mg/L G418）において25℃で24時間培養した。
【０１３９】
10uMのドキシサイクリンを添加して25℃、5時間培養することにより遺伝子の発現を誘導した。滅菌MilliQ水で細胞を洗ったあと細胞を滅菌MilliQ水に懸濁した。25℃もしくは37℃において60分間の加温インキュベートを行った。細胞を希釈してYPDプレートにまき25℃で3日間培養して生存率を測定した。結果を図１２に示す。
【０１４０】
図１２に示すように、遺伝子を含まないベクターを保持したコントロール酵母と比較して常温型制限酵素発現株では加温により生存率の低下が観察された。またこの生存率の低下は遺伝子誘導の有無にかかわらず観察された。常温型制限酵素MseIが発現することにより、DNA切断が発生して酵母生育に影響を与えることが示唆された。
【０１４１】
次に、MseIタンパク質発現のために遺伝子断片をドキシサイクリンにより発現が誘導されるprtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-kanMXベクターに導入した。作製したプラスミドベクターをprtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXとした。prtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXおよびコントロールとしてprtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-kanMXをYPH499（S288C）系統株に導入してYPH499/prtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXを3株およびYPH499/prtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-kanMXを1株取得した。すべての形質転換体をSD/MSG+G418培地において25℃で24時間培養した。
【０１４２】
10uMのドキシサイクリンを添加して25℃で6時間培養することにより遺伝子の発現を誘導した。細胞を遠心により集菌した後煮沸およびグラスビーズで破砕することにより細胞抽出液を調整した。細胞抽出液をウェスタンブロット法によりメンブレンに吸着させた。抗FLAG抗体およびHRP融合抗マウス抗体を用いてFLAGタンパク質を検出した。結果を図１３に示す。
【０１４３】
図１３に示すように、prtTA-pADH1(Sc)-pCYC1-iMseI(RUB1)-kanMXを保持した株では２０キロダルトンと25キロダルトンの分子量マーカの間にバンドが検出された。FLAG-iMseI-NLSの予想分子量は23キロダルトンであり、酵母イントロンが切り出され常温型制限酵素MseIが発現したと考えられる。以上より、酵母イントロンが切り出され常温型制限酵素MseIが発現することにより、DNA切断が生じて酵母生育に影響を与えることが示唆された。同時に、このことは、酵母においてＤＮＡ切断により遺伝的組換えが生じていることが示唆された。
【実施例１４】
【０１４４】
（１４）酵母における常温型制限酵素の直接導入
【０１４５】
YPH499(S288C系統)株をSD培地(2% グルコース,0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid, 0.1% monosodium glutamic acid, 10mg/L Adenine, 50mg/L L-Arginine, 50mg/L L-Asparatic acid, 20mg/L L-Hisitidine, 50mg/L L-Isoleucine, 100mg/L L-Leucine, 50mg/L L-Lysine, 20mg/L L-Methionine, 50mg/L L-Phenylalanine, 100mg/L L-Threonine, 50mg/L L-Tryptophan, 50mg/L Tyrosine, 20mg/L Uracil, 140mg/L Valine)において30℃で24時間培養した。細胞をPBS溶液で2回洗浄したのち800ul PBS溶液に懸濁した。
【０１４６】
XfectTM Protein Transfection Reagent(タカラバイオ社) 30ulを脱イオン水170ulと混合した。この溶液のうち１００ulをバッファー溶液85ulと15ulの常温型制限酵素HaeIII溶液（ニューイングランドバイオラボ社）と混合した。また、Reagentと脱イオン水混合液の内100ulをコントロールとして制限酵素溶液を含まないバッファー溶液100ulと混合した。これらの混合液を25℃で30分間静置した。
【０１４７】
細胞懸濁液を均等に分割して一方をHaeIIIを含まない溶液と混合した。残りの細胞懸濁液をHaeIIIの存在する溶液と混合した。両サンプルを30℃で2時間静置培養した。培養後両サンプルをPBSで2回洗浄してPBS 500ulに懸濁した。さらに、サンプルを4つに分割してそれぞれ、37℃ 120分、60分、30分および25℃ 120分加温した。細胞を希釈してYPDプレートにまき30℃で2日間培養して生存率を測定した。結果を図１４に示す。
【０１４８】
図１４に示すように、37℃ 30分、60分および120分の加熱においてHaeIIIを含む溶液と混合した細胞はコントロール溶液と混合した細胞に比べて生存率が低下していることが判明した。以上のことから、酵母において常温型制限酵素HaeIIIが細胞内に取り込まれ、DNA切断が発生して酵母生育に影響を与えることが示唆された。同時に、このことは、酵母においてＤＮＡ切断により遺伝的組換えが生じていることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１４９】
配列番号１〜１４：プライマー
【図１】
2017104082.tif 000003
【図２】
2017104082.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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