(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ迅速にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出可能な、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセット、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法及びＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットの提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、標識物質であり、より好ましくは前記標識物質が蛍光標識物質であり、前記標識化されたオリゴヌクレオチドが、グアニン消光プロープであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プロープ【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項２】
前記配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は、前記配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが標識物質により標識化されたオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項３】
前記標識物質が蛍光標識物質である、請求項２に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項４】
前記標識化されたオリゴヌクレオチドがグアニン消光プローブである、請求項２又は請求項３に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項５】
前記標識物質が、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に結合されている、請求項２〜請求項４のいずれか一項に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項６】
前記標識物質が、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端の位置に結合されている、請求項５に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブとを含む、プローブセット。
【請求項８】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ又は請求項７に記載のプローブセットを含む、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
【請求項９】
配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、をさらに含む請求項８に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
【請求項１０】
配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーをさらに含む請求項９に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
【請求項１１】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ又は請求項７に記載のプローブセットを用いる、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
【請求項１２】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、請求項１１に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、又は、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブと、試料中の一本鎖核酸とをハイブリダイズして得られたハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること。
（ｉｉ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を決定すること。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において決定されたＴｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプを判定すること。
【請求項１３】
請求項７に記載のプローブセットを用い、前記（ｉｉｉ）において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを用いて決定したＴｍ値に基づいて判定し、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプを配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを用いて決定したＴｍ値に基づいて判定する、請求項１２に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
【請求項１４】
固定された生体試料を被験検体とする、請求項１０〜請求項１３のいずれか一項に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
【請求項１５】
前記固定がホルマリン固定である、請求項１４に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセット、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法及びＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＹＴ−ＳＳＸ（synovial sarcoma translocation-synovial sarcoma X break point）融合遺伝子は、滑膜肉腫においてほぼ全例で観察されることが報告されており、腫瘍発生に中心的な役割を果たしていると考えられている。染色体１８ｑ１１．２に位置するＳＹＴ遺伝子と、Ｘ染色体に位置するＳＳＸ遺伝子とが融合してＳＹＴ−ＳＳＸキメラタンパク質が発現することが明らかになっている（特許文献１）。したがって、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の有無は滑膜肉腫の診断において重要な意義を有している。
ＳＳＸ遺伝子には数種類のサブタイプが存在するが、滑膜肉腫においてＳＹＴ遺伝子との融合遺伝子として観察されるのは、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２及びＳＳＸ４の３種類のサブタイプである。ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプの判定結果は、滑膜肉腫の予後の判定及び治療方針の決定に用いられている。
【０００３】
ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出には、通常の方法として、滑膜肉腫組織からＲＮＡを抽出し、逆転写によってｃＤＮＡを得て、さらにそれをＰＣＲ法によって増幅してＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出を行う方法が取られる。ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプの判定は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析、シークエンシング等によって行われる。あるいは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプそれぞれを特異的に増幅する複数のプライマーセットを作成し、増幅産物の塩基長の相違によってサブタイプを判定する方法（特許文献２）等により行われる。
【０００４】
また、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出に用いる検体としては、滑膜肉腫組織の新鮮検体もしくは新鮮凍結検体が多く用いられているが、ホルマリン固定後にパラフィン包埋された滑膜肉腫組織を検体とした報告は比較的少数である。これは、ホルマリン固定及びパラフィン包埋後の保管によりＲＮＡが断片化され、核酸増幅が困難であるためであると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２５２８０２号公報
【特許文献２】特許第３５７２３１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来行われているＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出の方法は、いずれも簡便に行うことができるものではない。この現状を踏まえ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出するために効果的な技術開発が待ち望まれていた。
【０００７】
本発明は、簡便かつ迅速にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出可能な、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセット、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法及びＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題は以下の手段により解決することができる。
＜１＞  配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜２＞  前記配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は、前記配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが標識物質により標識化されたオリゴヌクレオチドである、＜１＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜３＞  前記標識物質が蛍光標識物質である、＜２＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜４＞  前記標識化されたオリゴがヌクレオチドグアニン消光プローブである、＜２＞又は＜３＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜５＞  前記標識物質が、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に結合されている、＜２＞〜＜４＞のいずれか一つに記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜６＞  前記標識物質が、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端の位置に結合されている、＜５＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ。
＜７＞  配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブとを含む、プローブセット。
＜８＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ又は＜７＞に記載のプローブセットを含む、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
＜９＞  配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、をさらに含む＜８＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
＜１０＞  配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーをさらに含む＜９＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット。
＜１１＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ又は＜７＞に記載のプローブセットを用いる、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
＜１２＞  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、＜１１＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、又は、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブと、試料中の一本鎖核酸とをハイブリダイズして得られたハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること。
（ｉｉ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を決定すること。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において決定されたＴｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプを判定すること。
＜１３＞  ＜７＞に記載のプローブセットを用い、前記（ｉｉｉ）において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを用いて決定したＴｍ値に基づいて判定し、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプを配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを用いて決定したＴｍ値に基づいて判定する、＜１２＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
＜１４＞  固定された生体試料を被験検体とする、＜１０＞〜＜１３＞のいずれか一つに記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
＜１５＞  前記固定がホルマリン固定である、＜１４＞に記載のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、簡便かつ迅速にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出可能な、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセット、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法及びＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２））の、野生型ＳＹＴ遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の各種サブタイプへの結合を示す。
【図２−１】（Ａ）及び（Ｂ）は、野生型ＳＹＴ遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子のｍＲＮＡそれぞれにおける、ＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子の融合点の近傍の塩基配列、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１及び／又はＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の結合領域を示す。
【図２−２】（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のｍＲＮＡそれぞれにおける、ＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子の融合点の近傍の塩基配列、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１及びＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の結合領域を示す。
【図３】ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子の、ＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点付近の配列のアラインメントを示す。
【図４】ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子及び野生型ＳＹＴ遺伝子における、プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）の結合領域、及び、プライマーの結合領域の一例を示す。
【図５】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ実施例１及び実施例２の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ実施例３〜実施例５の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）〜（Ｃ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図７】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例１及び比較例２の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図８】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例３及び比較例４の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図９】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例５及び比較例６の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図１０】（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ実施例６〜実施例１１の融解曲線及び微分融解曲線である。（Ａ）〜（Ｆ）のそれぞれにおいて、上段に融解曲線、下段に微分融解曲線を示す。
【図１１】実施例１２の波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（Ｗａｖｅ２）及び波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（Ｗａｖｅ３）における融解曲線及び微分融解曲線である。
【図１２】実施例１３の波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍｎｍ（Ｗａｖｅ２）及び波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍｎｍ（Ｗａｖｅ３）における融解曲線及び微分融解曲線である。
【図１３】実施例１４の波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（Ｗａｖｅ２）及び波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（Ｗａｖｅ３）における融解曲線及び微分融解曲線である。
【図１４】実施例１５の波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（Ｗａｖｅ２）及び波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（Ｗａｖｅ３）における融解曲線及び微分融解曲線である。
【図１５】実施例１６の結果を示す。従来法による測定結果、ｉ−ｄｅｎｓｙで測定を行った、波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（Ｗａｖｅ２）及び波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（Ｗａｖｅ３）における融解曲線及び微分融解曲線、及び試薬反応性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブである。
【００１２】
配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２）を用いれば、検体にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定することができる。
配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプローブ（ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）を用いれば、検体にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定することができる。加えて、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子であるか、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子であるか、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子であるか、を判定することもできる。
【００１３】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセットは、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とを含むプローブセットである。
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを少なくとも１種用いてＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出することを含む方法である。
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブを少なくとも１種含むＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を検出するためのキットである。
【００１４】
本明細書において、「ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子」は、ＳＹＴ遺伝子と各種サブタイプのＳＳＸ遺伝子のいずれかとが融合した遺伝子の総称を意味する。すなわち、「ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子」は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ３融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子、を含む。
また、本明細書において「ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出」は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプの判定を意味する。
【００１５】
本明細書における「ＳＹＴ遺伝子」及び「ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子」は、ヒトを初めとする生物種において既に公知であり、その塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ等の公開されたデータベースから入手することができる。例えば、ヒトの野生型のＳＹＴ遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００１８．１０の配列に相当する。配列番号７にＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００１８．１０の塩基配列を示す。
ヒトＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の転写産物と相補的な全長ｃＤＮＡの例は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００５６３５．３（配列番号８）として公開されている。ヒトＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子の転写産物と相補的な全長ｃＤＮＡの例は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１１６４４１７．２（配列番号９）として公開されている。ヒトＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子の転写産物と相補的な全長ｃＤＮＡの例は、ＮＣＢＩのＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＭ＿００１０３４８３２．３（配列番号１０）として公開されている。
【００１６】
本明細書において、試料中の試料核酸、プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
また、本明細書において「遺伝子」は、ゲノムに存在する遺伝子のみならず、その転写産物であるＲＮＡ、ＲＮＡを逆転写することによって得たｃＤＮＡ又は前記ｃＤＮＡの増幅産物を意味する場合がある。
【００１７】
本明細書において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
また、本明細書において「検体」は、ヒト又は動物等より採取した組織、細胞、体液等を意味する。検体はホルマリン固定やパラフィン包埋などの処理をされていてもよい。採取した細胞は、採取後に培養されたものであってもよい。
本明細書において、「試料」は本発明の実施形態にかかる検出に用いられる試料を包含する。具体的には、その文脈において対象とされる試料を指す。例えば、文脈によって、検体から抽出された核酸を含む試料、検体から抽出された核酸を増幅して得た増幅産物を含む試料、プローブと標的配列とをハイブリダイズさせたハイブリッドを含む試料、などを指す場合がある。
【００１８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１９】
＜ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ＞
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２）又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）である。
【００２０】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の塩基配列を以下に示す。
・ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２：ｃｃｔｔａｔｇｇａｔａｔｇａｃｃａｇａｔｃａｔｇ（配列番号１）
・ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１：ｃｃａｇｃａｇａｇｇａａｇｇａａａｔｇ（配列番号２）
【００２１】
図１に、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の、野生型ＳＹＴ遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子（ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子）に対する結合性を示す。
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の塩基配列は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子においてＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点を含む領域の塩基配列と相補的であり、ミスマッチを有さない。しかし、野生型ＳＹＴ遺伝子はＳＳＸ遺伝子領域を持たないため、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の塩基配列は、野生型ＳＹＴ遺伝子の配列に対しては、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の３’側の６塩基中５塩基のミスマッチを有する。標的配列とプローブとの間の塩基のミスマッチは、後述する通り、例えば、Ｔｍ値を解析することによって検出することができる。ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と標的配列との間にミスマッチが検出されないことは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在することを示す。
ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の塩基配列は、ＳＳＸ１遺伝子の塩基配列とは２塩基ミスマッチを有し、ＳＳＸ２遺伝子の塩基配列とはミスマッチを有さず、ＳＳＸ４遺伝子の塩基配列とは１塩基ミスマッチを有する。
検体に含まれる核酸のＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点周辺の領域を増幅した増幅産物とハイブリダイズさせる場合、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列との間に２塩基ミスマッチが検出されることは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在し、かつ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプがＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子であることを示す。ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列との間にミスマッチが検出されないことは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在し、かつ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプがＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子であることを示す。ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列との間に１塩基ミスマッチが検出されることは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在し、かつ、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の遺伝子型がＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子であることを示す。
【００２２】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子それぞれとの結合領域を図２−１（Ａ）及び（Ｂ）、図２−２（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。図２−１及び図２−２中、塩基配列は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列が示されている。ただし、ＲＮＡにおけるウラシルはチミンに置き換えて示されている。
【００２３】
ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子において、ＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点はＳＳＸ遺伝子のサブタイプによらず同じ位置である。ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子における融合点は、図３に示されている。
プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子において、ＳＹＴ遺伝子と各ＳＳＸ遺伝子との融合点を含む領域に結合する。ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の結合領域の配列は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子の間で相違がない。
【００２４】
プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子において、ＳＹＴ遺伝子と各ＳＳＸ遺伝子との融合点近傍のＳＳＸ遺伝子を含む領域に結合する。
ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の標的配列との間には、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の５’側から数えて１２番目と１４番目の塩基でミスマッチがある（２塩基ミスマッチ）。具体的には、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１では５’側から数えて１２番目の塩基はＡ（アデニン）であり、１４番目の塩基はＧ（グアニン）である。ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子のセンス鎖では、前記１２番目の塩基に対応する塩基はＧ（グアニン）であり、前記１４番目の塩基に対応する塩基はＴ（チミン）である。
【００２５】
ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子では、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の標的配列との間にミスマッチはない（パーフェクトマッチ）。
【００２６】
ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子では、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の標的配列との間には、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の結合領域の５’側から数えて１４番目の塩基でミスマッチがある（１塩基ミスマッチ）。具体的には、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１では結合領域の５’側から数えて１４番目の塩基はＧ（グアニン）である。これに対し、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のセンス鎖では、前記１４番目の塩基に対応する塩基はＴ（チミン）である。
【００２７】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１に含まれるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、標識物質により標識化されたオリゴヌクレオチド、リン酸基が付加されたオリゴヌクレオチドなどを含む。前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられるが、デオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００２８】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１において、その塩基配列から、１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプローブであっても、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と同様に、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子型の判定が可能なプローブも存在し得る。このような、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の塩基配列から１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプローブも、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子型の判定が可能であれば、本発明の一実施形態として本発明に包含される。
つまり、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の塩基配列から１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプローブであっても、野生型ＳＹＴ遺伝子の標的配列とのミスマッチと、ＳＹＴＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の標的配列とのミスマッチに差異があり、ミスマッチの差異を例えばＴｍ値の差異によって検出できるプローブであれば、本発明の一実施形態として本発明に包含される。ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の塩基配列から１〜３個の塩基が伸長、短縮、挿入、欠失、又は置換された塩基配列を有するプローブであっても、ＳＳＸ１遺伝子、ＳＳＸ２遺伝子及びＳＳＸ４遺伝子の、標的配列とのミスマッチに差異があり、ミスマッチの差異を例えばＴｍ値の差異によって検出できるプローブであれば、本発明の一実施形態として本発明に包含される。
【００２９】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば、アミダイト法、Ｈ−ホスホネート法又はチオホスファイト法などによって化学的に合成することができる。遺伝子組換え微生物を用いてＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１を作製する方法もまた当業者に周知である。
【００３０】
プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）と、標的配列とのミスマッチは、例えば、Ｔｍ値を解析することによって検出することができる。プローブと標的配列との間にミスマッチが少ないほどＴｍ値は高くなり、ミスマッチが多いほどＴｍ値は低くなる。例えば、ミスマッチがない場合のＴｍ値と、１塩基のミスマッチがある場合のＴｍ値、２塩基のミスマッチがある場合のＴｍ値には差異がある。プローブと標的配列とをハイブリダイズさせてハイブリッドのＴｍ値を測定することによってミスマッチの検出を行うことができる。
Ｔｍ値を解析することによってミスマッチを検出する場合、例えば、プローブと野生型ＳＹＴ遺伝子又は各サブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子中の標的配列とのハイブリッドのＴｍ値を測定又は計算によって予め得ておいてもよい。Ｔｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用いて算出することができる。例えば、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０等の任意の条件で算出することができる。検出対象試料のＴｍ値解析を行い、予め得ておいたプローブと野生型ＳＹＴ遺伝子又は各サブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子中の標的配列とのハイブリッドのＴｍ値と比較することによって、検出対象試料中の核酸とＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とのミスマッチを検出することができる。
【００３１】
本明細書において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【００３２】
各プローブと、検出対象遺伝子とのＴｍ値を解析するためには、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１のオリゴヌクレオチドが標識物質によって標識化されていることが好ましく、標識物質が蛍光物質であることが特に好ましい。蛍光標識物質としては、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するか又は増加する蛍光標識物質が好ましい。その中でも、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識物質がより好ましい。
【００３３】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブの一例は、グアニン消光プローブであり、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光標識物質で標識化することが特に好ましい。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離によるＴｍ値の変化を容易に検出することができる。
【００３４】
なお、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００３５】
前記蛍光標識物質としては、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３及びＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識プローブの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光標識物質を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３６】
蛍光標識物質によるプローブの標識は、蛍光標識物質をプローブに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させればよい。蛍光標識された塩基が、５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することが、蛍光標識の効率及び検出感度の観点から好ましい。蛍光標識物質はオリゴヌクレオチドに直接結合させてもよいし、リンカー等を介して間接的に結合させてもよい。
蛍光標識物質のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法に従って行うことができる。Ｍｅｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＯｌｉＧｒｏ（登録商標）等の市販のラベリングキットを用いて行うこともできる。
【００３７】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブとして、好適に用いられるのは、標識された配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブ又は標識された配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブである。特に好適には、前記標識は蛍光標識である。
【００３８】
また、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１は、３'末端にリン酸基が付加されていてもよい。蛍光標識プローブの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、検出する核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識プローブを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３９】
＜ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセット＞
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセットは、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と、を含むＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブセットである。
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とを組み合わせて用いることによって、それぞれを単独で用いる場合よりもより精度が高い判定をすることができる。
【００４０】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とは、標的配列における結合領域が異なるため、互いに補い合う情報をもたらすことができる。
例えば、確率としては低いが、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するにもかかわらず、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子中のＳＳＸ遺伝子の領域に未知の変異があるためにＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１プローブと結合しないことが想定される。このような場合に、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と組み合わせることによって、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の存在の有無をより正確に判定することができる。
【００４１】
前記プローブセットに含まれる、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１には、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１それぞれについての蛍光標識等についての前述の記載がそのまま適用される。
また、前記プローブセットにおいて、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とが混合された状態である場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば使用時に同じ反応系でプローブと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合には、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことが可能である。
【００４２】
＜ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法＞
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２もしくはＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１、又はＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１、を用いるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法である。
前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法によれば、プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１を含むことにより、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるかを、簡便かつ感度よく検出可能である。
【００４３】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１を使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
なお、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法に使用するプローブについては、プローブについて前述した事項をそのまま適用することができる。
【００４４】
ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列とのハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ここで特異的なハイブリッドとは、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１が標的配列に結合して形成されたハイブリッドをいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられる。本発明の一実施形態にかかる条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００４５】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を含んでいてもよい。なお、本発明のＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、前記プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）を使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
（Ｉ）検体からＲＮＡを抽出すること。
（ＩＩ）検体に含まれるＳＹＴ遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の転写物であるＲＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製すること。
（ＩＩＩ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）の標的配列を含む領域の核酸を増幅すること。
【００４６】
前記（Ｉ）において、ＲＮＡの抽出は当業者に公知の方法、例えば、Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction（AGPC 法）（Chomczynski & Sacchi (1987) Analytical Biochemistry, 162: 156-159）により行うことができる。
【００４７】
前記（ＩＩ）において、ＲＮＡと相補的なＤＮＡの調製は逆転写酵素を用いて行うことができる。逆転写酵素としては、Moloney Murine Leukemia Virus（M-MVL）、Avian Myeloblastosis Virus （AMV）などのレトロウイルスに由来する逆転写酵素などを例示することができるが、これらに限定されない。
ｃＤＮＡの調製は公知の方法、例えば、Cleveland, D.L. and Ihle, J.H. (1995) Cell 81, 479.又はTartaglia, L.A. and Goeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13,151.に記載の方法によって行うことができる。
【００４８】
本発明の一実施形態において、核酸は、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、前記（ＩＩＩ）の工程を行うことが好ましい。前記（ＩＩＩ）で得られる増幅産物の長さは特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。
前記（ＩＩＩ）において、核酸の増幅は、例えばポリメラーゼを用いる方法等によって行うことができる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明のプローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで判定できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００４９】
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μＬに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、検出感度が高まるなどの傾向がある。
【００５０】
ＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれる標的配列のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによる核酸の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる標的配列のコピー数や存在比を評価することができる。
【００５１】
前記（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）は、一反応として逆転写ＰＣＲ法により行ってもよい。逆転写ＰＣＲ法は公知の方法で行うことができる。例えば、プロメガ社製の市販キット（Evans, H., and Sillibourne, J. Promega Notes 57, p21.）、クロンテック社製の市販キット（J. Biol. Chem., 2008; 283: 17175-17183.）などを使用して逆転写ＰＣＲ法を行うことができる。
【００５２】
＜プライマー＞
前記（ＩＩＩ）において、核酸の増幅をＰＣＲ法によって行う場合には、適切なプライマーを用いて核酸の増幅を行う。使用しうるプライマーは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子又はＳＹＴ野生型遺伝子の、プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）に対応する塩基を含む領域の核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
【００５３】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号７〜１０で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にしてもよい。
【００５４】
標的配列をＰＣＲ法によって増幅するためには、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマーセットを用いればよい。
ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を増幅するためのプライマーセットと、野生型ＳＹＴ遺伝子を増幅するためのプライマーセットとを用いて、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅のための増幅反応と野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅のための増幅反応とを並行して一つの増幅反応系で行ってもよいし、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅と野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅を別の増幅反応系で行ってもよい。なお、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１のみを用いる場合には、野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅は必要とされない。
また、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子にはサブタイプが存在するが、サブタイプ間で共通する配列に対応するプライマーセットを用いてＰＣＲ法による増幅を行ってもよいし、特定のサブタイプの配列を特異的に増幅するプライマーセットを用いてサブタイプ毎にＰＣＲ法による増幅を行ってもよい。サブタイプ毎にＰＣＲ法による増幅を行う場合、サブタイプ毎の増幅のための増幅反応は一つの反応系で並行して行ってもよいし、サブタイプ毎に別の増幅反応系で行ってもよい。
一つの実施形態においては、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子を増幅するプライマーセット及び野生型ＳＹＴ遺伝子を増幅するプライマーセットにおいて、フォワードプライマー又はリバースプライマーを共用し、３つのプライマーによりＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅と野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅のための増幅反応とを一つの増幅反応系で並行して行うこともできる。
【００５５】
ＰＣＲ法に適用するプライマーとして特に好適なプライマーとして、以下に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーが例示される。
−フォワードプライマー−
・配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２）
−リバースプライマー−
・配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１）
・配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２）
・配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２）
【００５６】
好適なプライマーの一例である、ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２、ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１及びＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２の標的配列への結合位置を図４に示す。
ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子と野生型ＳＹＴ遺伝子のどちらにも存在する、ＳＹＴ遺伝子のエクソン１０中の領域に結合する。ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２は、野生型ＳＹＴ遺伝子に存在するがＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子には存在しない、融合点より下流側のＳＹＴ遺伝子の領域に結合する。ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１及びＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子には存在し、野生型ＳＹＴ遺伝子には存在しないＳＳＸ遺伝子の領域に結合する。また、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１及びＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプであるＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子及びＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子に共通して存在する配列を有する領域に結合し、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がいずれのサブタイプの場合であっても、増幅を行うことができる。
したがって、ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２と、ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２と、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２とを用いれば、３つのプライマーによって野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅反応と、３つのサブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅反応とを１つの増幅反応系で並行して行うことができる。
また、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２の配列は、配列番号５で示される配列中にＲで示されるアデニン又はグアニンである塩基を含む。ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２をリバースプライマーとして用いる場合には、Ｒで示される塩基がアデニンであるプライマーとグアニンであるプライマーとを好ましくは等量混合して用いることによって、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれをも効率良く増幅することができる。
【００５７】
ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子において、ＳＳＸ側に由来する配列はＳＳＸ遺伝子のサブタイプによって塩基配列が異なり、さらに、一塩基多型などの個体間の遺伝子配列の差異も多数存在する（図３）。したがって、野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅反応と、３つのサブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅反応とを並行して同一増幅反応系で行うことができるプライマーセットを得ることは当業者といえども困難である。しかし、フォワードプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２と、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２とを用いることによって、野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅反応と、３つのサブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅反応とを並行して同一増幅反応系で行うことが可能である。
【００５８】
さらには、フォワードプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２を用いることによって、通常は困難とされるホルマリン固定やパラフィン包埋された検体に含まれる核酸の目的領域の核酸増幅が可能である。
前記プライマーは、本発明の一実施形態にかかるプローブ以外のプローブを用いる場合であっても、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点を含む領域又は野生型ＳＹＴ遺伝子の対応する領域の核酸を増幅するために使用することができる。
【００５９】
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含んでいてもよい。
（ｉ）プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）と試料中の一本鎖核酸をハイブリダイズして得られたハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定すること。
（ｉｉ）前記シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を決定すること。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において決定されたＴｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるかを判定すること。
【００６０】
＜ハイブリダイズ＞
前記（ｉ）においては、プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）と、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６１】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【００６２】
また、解離した一本鎖核酸と前記プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６３】
ハイブリダイズの反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液における核酸の濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記プローブの濃度は、例えば、前記核酸に対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【００６４】
本発明の一実施形態において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識プローブとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記プローブとのハイブリダイズが可能となる。
【００６５】
試料中の核酸に対する、前記プローブ（ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１）の添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中の核酸に対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在する検出対象核酸と野生型ＳＹＴ遺伝子が存在する検出対象核酸との合計でもよいし、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在する検出対象配列を含む増幅産物と野生型ＳＹＴ遺伝子が存在する検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
前記核酸に対する前記プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６６】
前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブは、核酸を含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中で核酸を含む試料と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ等の増幅反応を行う場合、増幅反応の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅反応前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅反応前に前記検出用プローブを添加蛍光標識化したり、３’末端にリン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００６７】
＜ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動の測定＞
前記（ｉ）においては、得られた前記一本鎖核酸と前記プローブのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。
次に、（ｉ）において、ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。
【００６８】
例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖核酸とハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（又は消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６９】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【００７０】
また、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動（好ましくはシグナル強度の増加）を測定する方法に代えて、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００７１】
具体例として、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（又は消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７２】
＜Ｔｍ値の決定＞
前記（ｉｉ）においては、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られたシグナル強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりのシグナル強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７３】
本発明の一実施形態において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖核酸と前記ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。前記プローブは、標識して、相補配列にハイブリダイズしていないときのシグナル強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときのシグナル強度が減少（消光）する標識プローブ、又は相補配列にハイブリダイズしていないときのシグナル強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときのシグナル強度が増加する蛍光標識プローブとすることができる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが解離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化を標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
なお、各ハイブリッドのＴｍ値について、絶対的な数値を算出又は測定することは必要とされない。ハイブリッドにおける塩基のミスマッチを検出するためのＴｍ値の差異を把握できれば足りる。
【００７４】
＜ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出＞
前記（ｉｉｉ）において、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２を用いる場合には、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２によって試料にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定する。
プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と標的配列のハイブリッドにおいて、パーフェクトマッチであるときのＴｍ値を示す場合に、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在すると判定する。
プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２と標的配列のハイブリッドにおいて、６塩基ミスマッチであるときのＴｍ値を示す場合に、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在しないと判定する。
【００７５】
前記（ｉｉｉ）において、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１を用いる場合には、ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１によって、試料にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるかを判定する。
ＳＹＴ遺伝子とＳＳＸ遺伝子との融合点周辺の領域を含む核酸の増幅産物を試料とした場合には、以下の通り判定することができる。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、パーフェクトマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在すると判定し、サブタイプはＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子であると判定する。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、２塩基ミスマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在すると判定し、サブタイプはＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子であると判定する。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、１塩基ミスマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在すると判定し、サブタイプはＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子であると判定する。
【００７６】
プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及びＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１を用いた場合には、プローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２による判定結果が、試料中にＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在することを示した場合には、以下の通り判定することができる。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、パーフェクトマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子が存在すると判定する。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、２塩基ミスマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子が存在すると判定する。
・プローブＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と標的配列のハイブリッドにおいて、１塩基ミスマッチであるときのＴｍ値を示す場合には、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子が存在すると判定する。
【００７７】
＜検体＞
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法には、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるかについて判定したい検体を用いればよい。好適な被験検体は生体試料であり、ヒト滑膜肉腫の組織が挙げられる。その他、他の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生体試料を用いてもよい。
検体に含まれる核酸の種類は特に限定されないが、リボ核酸（Ribonucleic acid：RNA）であることが好ましい。本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出方法においては、検体から抽出した核酸、特にＲＮＡを被験対象とすることが好ましい。
なお、検体の採取方法、検体から核酸を含む試料を調製する方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該核酸の特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
【００７８】
検体としては、固定された組織を用いることができる。検体からＲＮＡを抽出する場合には、固定や保管によってＲＮＡが断片化するために、一般に新鮮検体又は新鮮凍結検体からＲＮＡを抽出することが好ましいとされる。しかし、本発明の一実施形態においては、フォワードプライマー−としてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２を、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２のいずれかを用いることによって、例えば、断片化が進行していると考えられる固定された生体試料を検体として使用することができる。
前記固定された生体試料は、固定後にパラフィン又は樹脂等に包埋された生体試料の切片でもよいし、染色された後の生体試料であってもよい。生体試料の固定方法は特に限定されないが、ホルマリン固定、パラホルムアルデヒド固定、グルタールアルデヒド固定、アルコール固定などが例示される。染色方法も特に限定されないが、ヘマトキシリンエオジン染色などが例示される。
【００７９】
＜ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キット＞
本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２又はＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１のいずれかのプローブを含むか、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とを含むプローブセットを含む、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットである。
前記プローブ又は前記プローブセットの少なくとも１種を含むことにより、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるか、をより簡便に精度良く判定することができる。
【００８０】
また、本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、前記プローブがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含んでいてもよい。これにより、本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるか、をより高感度で検出することができる。
【００８１】
また、本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、フォワードプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２を、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２のいずれかを含んでいてもよい。前記フォワードプライマーと、前記リバースプライマーとのいずれかを用いることによって、例えば、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるか、を精度よく検出することができる。さらには、固定された組織など、ＲＮＡが断片化された試料も使用することができる。リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２をさらに含んでいてもよい。ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２をさらに用いることによって、例えば、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを精度よく検出することができる。
なお、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットに含まれるプローブ及びプライマーについては、プローブ及びプライマーについて前述した事項をそのまま適用することができる。
【００８２】
また、本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
標的配列（プローブがハイブリダイズする領域）を含む領域を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度にＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子を検出することができる。
【００８３】
試薬類は、例えば、緩衝液中に溶解された状態で含まれていてもよいし、凍結乾燥品として含まれていてもよい。試薬類を収容する容器としては、例えば、ガラス製やプラスチック製のバイアル等を用いることができる。
【００８４】
さらに本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子検出用キットは、前記プローブを使用して、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子のいずれのサブタイプであるか、を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含んでいてもよい。
【００８５】
本発明の一実施形態において、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１の両方のプローブを含む場合、それらは混合された状態で含まれていても、それぞれ別個に含まれていてもよい。
またＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とが混合された状態で本発明の一実施形態にかかるＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子検出用キットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば使用時に同じ反応系でプローブと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合には、ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２とＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１とは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことが可能である。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００８７】
＜プローブの評価＞
［実施例１〜５及び比較例１〜６］
表１に示す反応液を調製し、下記表２に記載の各プローブの評価を行った。プローブの評価は、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）にて、下記表３に記載の相補鎖との結合を、Ｔｍ値を測定することによって行った。表１に記載の「Taq Universal Buffer」は株式会社ニッポンジーンの市販製品を使用した。
表２のプローブの名称中の「５Ｔ」は、プローブの５’末端の塩基が蛍光色素ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）で標識されていることを示し、「５ＦＬ」は、プローブの５’末端の塩基が蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）で標識されていることを示す。
【００８８】
なお、蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【００８９】
【表１】
2017175953.tif 000003
【００９０】
【表２】
2017175953.tif 000004
【００９１】
上記表１で使用した相補鎖の詳細を以下の表３に示す。表３に示す相補鎖は、野生型ＳＹＴ遺伝子又はＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子の一部に相当するオリゴヌクレオチドである。表３の相補鎖の名称中の「５Ｔ」は、相補鎖の５’末端の塩基が蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識されていることを示す。
【００９２】
【表３】
2017175953.tif 000005
【００９３】
Ｔｍ解析は、反応液を９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を、ＴＡＭＲＡで標識されたプローブの場合には波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍで、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識されたプローブの場合には波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで測定し、融解曲線及び微分融解曲線を得た。
【００９４】
−実施例１−
プローブとして５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）、相補鎖として、ＳＳＸ遺伝子の配列を含まない野生型ＳＹＴ遺伝子の一部に相当する５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ１（配列番号１４）を使用した。５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定するためのプローブである。
Ｔｍ解析の結果を図５（Ａ）に示す。微分融解曲線において５３℃をピークとする蛍光が検出された。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２が野生型ＳＹＴ遺伝子の一部に結合することを示す。
【００９５】
−実施例２−
プローブとして実施例１で使用した５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の融合点を含む領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｒ１（配列番号１５）を使用した。
Ｔｍ解析の結果を図５（Ｂ）に示す。微分融解曲線において６５℃をピークとする蛍光が検出された。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２がＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の融合点を含む領域に結合することを示す。
−実施例３−
プローブとして５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子に存在するＳＳＸ１遺伝子の領域に相当する５Ｔ-ＳＹＴＳＳＸ１-１＿２＿４-Ｒ１（配列番号１７）を使用した。５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の遺伝子型を判定するためのプローブである。
Ｔｍ解析の結果を図６（Ａ）に示す。微分融解曲線において４７℃をピークとする蛍光が検出された。蛍光が検出された。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１がＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子に存在するＳＳＸ１遺伝子の領域に結合することを示す。
【００９６】
−実施例４−
プローブとして実施例３で使用した５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子に存在するＳＳＸ２遺伝子の領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ２−１＿２＿４−Ｒ１（配列番号１８）を使用した。
Ｔｍ解析の結果を図６（Ｂ）に示す。微分融解曲線において、６２℃をピークとする蛍光が検出された。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１がＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子に存在するＳＳＸ２遺伝子の領域に結合することを示す。
【００９７】
−実施例５−
プローブとして実施例３で使用した５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子に存在するＳＳＸ４遺伝子の領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ４−１＿２＿４−Ｒ１（配列番号１９）を使用した。
Ｔｍ解析の結果を図６（Ｃ）に示す。微分融解曲線において、５５℃をピークとする蛍光が検出された。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１がＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子に存在するＳＳＸ４遺伝子の領域に結合することを示す。
【００９８】
−比較例１−
プローブとして５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１（配列番号３）、相補鎖として、ＳＳＸ遺伝子の配列を含まない野生型ＳＹＴ遺伝子の一部に相当する５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ１（配列番号１４）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定するためのプローブである。
Ｔｍ解析の結果を図７（Ａ）に示す。微分融解曲線において、野生型ＳＹＴが存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１が相補鎖に相当する、ＳＳＸ遺伝子の配列を含まない野生型ＳＹＴ遺伝子の一部に結合しないことを示す。
【００９９】
−比較例２−
プローブとして比較例１で使用した５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１（配列番号３）、相補鎖としてＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の融合点を含む領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｒ１（配列番号１５）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
Ｔｍ解析の結果を図７（Ｂ）に示す。微分融解曲線において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１が、相補鎖に相当するＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の融合点を含む領域に結合しないことを示す。
【０１００】
−比較例３−
プローブとして５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ１（配列番号４）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ３融合遺伝子に存在するＳＳＸ３遺伝子の領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ３−２＿３＿５−Ｒ１（配列番号１６）を使用した。５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ１は、ＳＳＸ遺伝子の遺伝子型を判定するためのプローブである。
Ｔｍ解析の結果を図８（Ａ）に示す。微分融解曲線において、ＳＹＴ−ＳＳＸ３融合遺伝子が存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ１が、相補鎖に相当するＳＹＴ−ＳＳＸ３融合遺伝子のＳＳＸ遺伝子領域に結合しないことを示す。
【０１０１】
−比較例４−
プローブとして比較例３で使用した５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ１（配列番号４）、相補鎖として、ＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子に存在するＳＳＸ５遺伝子の領域に相当する、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ５−２＿３＿５−Ｆ１（配列番号２０）を使用した。
Ｔｍ解析の結果を図８（Ｂ）に示す。微分融解曲線において、ＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子が存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ１が、相補鎖に相当するＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子のＳＳＸ遺伝子領域に結合しないことを示す。
【０１０２】
−比較例５−
プローブとして５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２（配列番号５）、相補鎖として５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ５−２＿３＿５−Ｆ１（配列番号２０）を使用した。に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２は、ＳＳＸ遺伝子の遺伝子型を判定するためのプローブである。
Ｔｍ解析の結果を図９（Ａ）に示す。微分融解曲線において、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２が、ＸＸに結合しないことを示す。
【０１０３】
−比較例６−
プローブとして比較例５で使用した５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２（配列番号５）、相補鎖としてＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子に存在する領域に相当する５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ５−２＿３＿５−Ｆ１（配列番号２０）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
Ｔｍ解析の結果を図９（Ｂ）に示す。微分融解曲線において、ＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子が存在していても蛍光のピークは検出されなかった。この結果は、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２が、相補鎖に相当するＳＹＴ−ＳＳＸ５融合遺伝子のＳＳＸ遺伝子領域に結合しないことを示す。
【０１０４】
＜プライマーの評価＞
［実施例６〜１１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名  ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ株式会社）にて、核酸増幅の鋳型となるテンプレートとしてヒトＳＹＴ−ＳＳＸ２のｍＲＮＡの配列に相当する合成ＲＮＡ（配列番号９）と、下記表４に記載の逆転写ＰＣＲ反応液とを用いて、逆転写ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。さらに、下記に示す式によって試薬反応性を算出した。
試薬反応性＝（融解曲線の微分値の最大値）／（融解曲線の最大値）×１００
【０１０５】
【表４】
2017175953.tif 000006
【０１０６】
なお、上記表４で使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの詳細を以下の表５及び表６にそれぞれ示す。なお、表６の塩基配列中において、「Ｒ」で示される塩基は、アデニン又はグアニンを示す。表４に示す処方においてＲで示される塩基を含むリバースプライマーを用いた場合には、Ｒで示される塩基がアデニンであるリバースプライマー溶液を５０体積％と、Ｒで示される塩基がグアニンであるリバースプライマー溶液を５０体積％含有するリバースプライマーを用いた。
なお、上記表４におけるプローブの濃度は１０μＭであり、フォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度は、いずれも１００μＭである。それぞれの溶媒はＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０、ナカライテスク株式会社）である。
＊プローブ、プライマー溶液の組成を追加しました。
【０１０７】
【表５】
2017175953.tif 000007
【０１０８】
【表６】
2017175953.tif 000008
【０１０９】
表７に実施例６〜１１で用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを示す。ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ１（配列番号２１）及びＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２（配列番号３）は、ＳＹＴ遺伝子領域においてプローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の標的配列の上流側にアニーリングするフォワードプライマーである。ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２（配列番号６）は、野生型のＳＹＴにおいて、融合点より下流側のＳＹＴ野生型遺伝子のみが有する配列にアニーリングするリバースプライマーである。ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１（配列番号４）、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２（配列番号５）、ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ３（配列番号２２）及びＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ４（配列番号２３）は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子において、プローブ５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２の標的配列の下流側にアニーリングするリバースプライマーである。
【０１１０】
【表７】
2017175953.tif 000009
【０１１１】
逆転写ＰＣＲは、５５℃で９００秒相補鎖の合成を行い、続いて９５℃で１２０秒処理して逆転写酵素を失活させた後、９５℃で１秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとして、６０サイクルを繰り返し行った。
またＴｍ解析は、逆転写ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍで測定した。
【０１１２】
実施例６〜１１のＴｍ解析の結果（融解曲線及び微分融解曲線）を図１０にそれぞれ（Ａ）〜（Ｆ）として示す。
図１０及び図１１中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量又は（ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【０１１３】
実施例６〜８では、標的配列と増幅産物のハイブリッドに特異的なピークが認められ、試薬反応性はそれぞれ２．３８、２．７６及び２．８９と十分であった。実施例９〜１１では、標的配列と増幅産物のハイブリッドに特異的なピークが認められたが、試薬反応性はそれぞれ１．７９、２．２７及び１．１５と実施例６〜８の方が良好であった。
以上の結果より、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の増幅には、フォワードプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２（配列番号３）を、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ１（配列番号４）又はＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２（配列番号５）を用いた場合に目的の領域が特異的に増幅され、かつ、試薬反応性が特に良好であることがわかった。野生型ＳＹＴ遺伝子の増幅には、フォワードプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２（配列番号３）を、リバースプライマーとしてＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２（配列番号６）を用いた場合に目的の領域が特異的に増幅され、かつ、試薬反応性が特に良好であることがわかった。
【０１１４】
＜マルチ検出系の評価＞
[実施例１２〜１５]
プローブ５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２及び５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１と、プライマーセットを単一の反応液中に調製し、逆転写、標的配列の増幅及び標的配列の検出を１つの反応系で１回の操作で行うことができるマルチ検出系を構築し、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ株式会社）にて評価を行った。
マルチ検出系の反応液の組成は以下に示す表８の通りである。また、表８中に示すＥ−ｍｉｘ、Ｕ−ｍｉｘ、Ｐ−ｍｉｘ及びＲＴ−ｍｉｘの組成を表９、１０、１１及び１２にそれぞれ示す。使用したプライマーセットは表１１に示されている。
【０１１５】
【表８】
2017175953.tif 000010
【０１１６】
【表９】
2017175953.tif 000011
【０１１７】
【表１０】
2017175953.tif 000012
【０１１８】
【表１１】
2017175953.tif 000013
【０１１９】
表１１において、ＳＹＴ−ＷＴ−Ｆ２は、ＳＹＴ遺伝子領域においてプローブＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２の標的配列の上流側にアニーリングするフォワードプライマーである。ＳＹＴ−ＷＴ−Ｒ２は、野生型のＳＹＴにおいて、融合点より下流側のＳＹＴ野生型遺伝子のみが有する配列にアニーリングするリバースプライマーである。ＳＹＴ−ＳＳＸ−Ｒ２は、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子において、プローブ５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−２＿３＿５−Ｆ２の標的配列の下流側にアニーリングするリバースプライマーである。
また、５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２は、５’末端の塩基が蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識された、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否かを判定するためのプローブである。５ＦＬ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１は、５’末端の塩基が蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識された、ＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子が存在するか否か、及び／又はＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の遺伝子型を判定するためのプローブである。
【０１２０】
【表１２】
2017175953.tif 000014
【０１２１】
表１２において、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは４０Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅはインビトロジェン  ４０Ｕ／μＬ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用した。
【０１２２】
マルチ検出系の評価において、核酸増幅の鋳型として用いたテンプレートを表１３に示す。合成ＲＮＡは定法に従って合成した。
【０１２３】
【表１３】
2017175953.tif 000015
【０１２４】
逆転写ＰＣＲは、５５℃で９００秒相補鎖の合成を行い、続いて９５℃で１２０秒処理して逆転写酵素を失活させた後、９５℃で１秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとして、６０サイクルを繰り返し行った。
またＴｍ解析は、逆転写ＰＣＲに続いて、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの蛍光強度の測定は波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍｎｍ（ｗａｖｅ２）で行い、蛍光色素ＴＡＭＲＡの蛍光強度の測定は５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ｗａｖｅ３）で行った。
【０１２５】
−実施例１２−
テンプレートとして、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ−ＳＳＸ１５００コピーと、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ  ＷＴ５００コピーとの混合物を用いて核酸増幅及び検出を行った。
Ｔｍ解析の結果を図１１に示す。波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ｗａｖｅ３）で５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）の蛍光強度の変化を測定した結果、５３℃及び６２℃にピークが認められた。これは、ＳＹＴ野生型遺伝子とＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の両方が検出されたことを意味する。
波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（ｗａｖｅ２）で５ＦＬ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）の蛍光強度の変化を測定した結果、５０℃にピークが認められた。この結果は、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子が検出されたことを意味する。
−実施例１３−
テンプレートとして、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ−ＳＳＸ２  ６００コピーと、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ  ＷＴ  ６００コピーとの混合物を用いて核酸増幅及び検出を行った。
Ｔｍ解析の結果を図１２に示す。波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ｗａｖｅ３）で５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）の蛍光強度の変化を測定した結果、５３℃及び６２℃にピークが認められた。これは、ＳＹＴ野生型遺伝子とＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の両方が検出されたことを意味する。
波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（ｗａｖｅ２）で５ＦＬ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）の蛍光強度の変化を測定した結果、６０℃にピークが認められた。この結果は、ＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子が検出されたことを意味する。
−実施例１４−
テンプレートとして、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ−ＳＳＸ４  ５００コピーと、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ  ＷＴ  ５００コピーとの混合物を用いて核酸増幅及び検出を行った。
Ｔｍ解析の結果を図１３に示す。波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ｗａｖｅ３）で５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）の蛍光強度の変化を測定した結果、５３℃及び６２℃にピークが認められた。これは、ＳＹＴ野生型遺伝子とＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子の両方が検出されたことを意味する。
波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（ｗａｖｅ２）で５ＦＬ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）の蛍光強度の変化を測定した結果、５５℃にピークが認められた。この結果は、ＳＹＴ−ＳＳＸ４融合遺伝子が検出されたことを意味する。
−実施例１５−
テンプレートとして、合成ＲＮＡ  ＳＹＴ  ＷＴ  １００００コピーを用いて核酸増幅及び検出を行った。
Ｔｍ解析の結果を図１４に示す。波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ（ｗａｖｅ３）で５Ｔ−ＳＹＴＳＳＸ−ＦＵＳＩＯＮ−Ｆ２（配列番号１）の蛍光強度の変化を測定した結果、５３℃にピークが認められた。これは、ＳＹＴ野生型遺伝子が検出されたことを意味する。
波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ（ｗａｖｅ２）で５ＦＬ−ＳＹＴＳＳＸ−１＿２＿４−Ｆ１（配列番号２）の蛍光強度の変化を測定した結果、ピークは認められなかった。この結果は、いずれのサブタイプのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子も検出されなかったことを意味する。
【０１２６】
実施例１２〜１５に示された通り、作成したテンプレートのＳＹＴ−ＳＳＸ融合遺伝子のサブタイプは、マルチ検出系によって全て正しく判定された。
【０１２７】
＜実検体の測定＞
[実施例１６]
３人の患者から採取されたヒト滑膜肉腫の組織をホルマリン固定後パラフィン包埋し、組織切片を作成して検体１〜検体３と番号を付した。検体１はＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ 抽出キット（株式会社キアゲン）を用いて組織切片からＲＮＡを抽出した。検体２及び検体３はＭａｘｗｅｌｌ  １６  ＲＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ（プロメガ株式会社）を用いて組織切片からＲＮＡを抽出した。
抽出したＲＮＡを使用し、実施例１２〜１５と同様のマルチ検出系によって逆転写ＰＣＲ及びＴｍ解析をｉ−ｄｅｎｓｙを用いて行った。また、従来法による結果と比較するために、検体から抽出したＲＮＡを、従来公知の方法を用いて核酸増幅を行い、増幅産物を電気泳動法により確認し、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子の遺伝子型の判定を行った。
【０１２８】
検体１〜検体３の判定結果を図１５に示す。従来法による測定結果では、検体１にはＳＹＴ−ＳＳＸ２融合遺伝子が存在すること、検体２にはＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子が存在すること、検体３にはＳＹＴ−ＳＳＸ１融合遺伝子が存在しないことが示された。実施例１２〜１５と同様のマルチ検出系による判定結果において、従来法による結果と同じ結果が得られた。従来法と実施例１２〜１５で用いられたマルチ検出系による判定結果は一致しており、本発明の一実施態様により正しい判定結果が得られたことが示された。
【図１】
2017175953.tif 000016
【図２−１】
2017175953.tif 000017
【図２−２】
2017175953.tif 000018
【図３】
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【図４】
2017175953.tif 000020
【図５】
2017175953.tif 000021
【図６】
2017175953.tif 000022
【図７】
2017175953.tif 000023
【図８】
2017175953.tif 000024
【図９】
2017175953.tif 000025
【図１０】
2017175953.tif 000026
【図１１】
2017175953.tif 000027
【図１２】
2017175953.tif 000028
【図１３】
2017175953.tif 000029
【図１４】
2017175953.tif 000030
【図１５】
2017175953.tif 000031
【配列表】
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