(57)【要約】【課題】神経前駆細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導する細胞培養基材を提供する。【解決手段】本発明の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材は、細胞が接着する面に凹凸のパターンが形成されており、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることを特徴とする。本発明の神経細胞の形質制御方法は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする。本発明の神経突起の伸長方法は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする。本発明のドパミン分泌制御方法は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする。本発明のアセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が接着する面に凹凸のパターンが形成されており、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることを特徴とする神経細胞の形質誘導用細胞培養基材。
【請求項２】
前記凹凸のパターンが格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状、ラビリンス状、ライン状又はドット状である、請求項１に記載の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする神経細胞の形質制御方法。
【請求項４】
前記神経細胞の培養時間が１時間以上１００時間以下である、請求項３に記載の神経細胞の形質制御方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする神経突起の伸長方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とするドパミン分泌制御方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とするアセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の形質誘導用細胞培養基材、神経細胞の形質制御方法、神経突起の伸長方法、ドパミン分泌制御方法及びアセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経伝達物質であるドパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ：ＤＡ）とアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：ＡＣｈ）とは互いに拮抗しあう関係にあり、ドパミンの量が増えると全体のアセチルコリンが減少し、その逆にアセチルコリンが増加するとドパミン量が減ることが知られている。
【０００３】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）では、黒質緻密部から投射するＤＡ作動性ニューロン終末が進行性に減少するために、背側線条体（尾状核・被殻）内で相対的にＡＣｈが優位になり、ＤＡとＡＣｈ のバランスが崩れていると考えられている。このＤＡ作動性ニューロン終末が減少する原因は明確ではなく、１０歳年を取るごとに１０％程度ずつ減少し、老齢期にＰＤが発症することが知られている。ＰＤ患者では、ＤＡが減少し、ＡＣｈが増加することで、運動障害が見られる。
【０００４】
一方、認知症のうち５０％を占めるアルツハイマー型認知症では、ＡＣｈが減少していることが明らかとなっている。ＡＣｈは、脳内では学習や記憶、覚醒、睡眠に対する神経伝達物質として働くことが知られている。アルツハイマー型認知症の初期において、短期記憶が障害されるのは、ＡＣｈの減少によるものであると考えられている。また、ＡＣｈを分解する酵素である、アセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ；ＡＣｈＥ）の働きを阻害する治療薬により、アセチルコリンを増加させるのが一般的である。
【０００５】
近年、パーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の治療として、神経幹細胞又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用して神経細胞を再生することが期待されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５７５４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の方法において、胚性幹細胞等は入手（採取）が困難である点が問題である。また、これら幹細胞は患部にそのまま移植されても神経細胞にほとんど分化せず生着も困難である。仮に生着した場合でもグリア細胞に分化してしまうものがほとんどであり、分化を制御することができない。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、神経前駆細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導する細胞培養基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、神経細胞の形質誘導が細胞表面上でのナノスケールの分子による刺激に起因するものであることに着目し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の第１の態様は、細胞が接着する面に凹凸のパターンが形成されており、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることを特徴とする神経細胞の形質誘導用細胞培養基材である。
【００１１】
本発明の第２の態様は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする神経細胞の形質制御方法である。
本発明の第３の態様は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とする神経突起の伸長方法である。
本発明の第４の態様は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とするドパミン分泌制御方法である。
本発明の第５の態様は、前記神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養することを特徴とするアセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材によれば、神経前駆細胞を一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。また、神経突起の伸長を促進し、神経の再生治療又はパーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の治療に応用することができる。さらに、パーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の創薬スクリーニング用の細胞を簡便に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材（パターン：ライン状）の拡大平面図及び拡大正面図である。（Ｂ）本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材（パターン：ドット状）の拡大平面図及び拡大正面図である。
【図２】（Ａ）（Ｂ）実施例１におけるＰＣ１２細胞のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】（Ａ）（Ｂ）実施例１におけるＰＣ１２細胞のドパミン産生量の定量結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜神経細胞の形質誘導用細胞培養基材＞＞
一実施形態において、本発明は、細胞が接着する面に凹凸のパターンが形成されており、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下である、神経細胞の形質誘導用細胞培養基材を提供する。
【００１５】
本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材によれば、神経前駆細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導することができる。また、本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材を用いることで、神経前駆細胞から神経細胞へ分化誘導することができ、さらに、分化誘導された神経細胞において、神経突起の伸長、ドパミンの分泌又はアセチルコリンエステラーゼ活性を制御し、形質誘導することができる。よって、本明細書において、「形質誘導」は、「分化誘導」を含む。
【００１６】
＜神経細胞＞
本明細書において、「神経幹細胞」とは、自己複製能を持つだけでなく、中枢神経系を構成する主要な細胞種であるニューロン、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）のいずれにも分化する多分化能を有する幹細胞を意味する。この神経幹細胞から自己複製能を持つ少し分化した前駆細胞が分裂する。神経前駆細胞からは神経細胞、グリア前駆細胞からはグリア細胞が生み出される。
本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材は、神経前駆細胞から神経細胞（ニューロン）への分化、又は、神経細胞の分化成熟を簡便且つ効率良く誘導することができる。
本明細書において、「神経細胞（ニューロン）」は神経前駆細胞を包含する。
【００１７】
本実施形態の神経細胞の形質誘導制御用細胞培養基材を用いることで、神経細胞は、分化成熟した神経細胞となり得る。分化成熟した神経細胞の特徴としては、神経突起の伸長が促進され、さらに、ドパミン分泌量又はアセチルコリンエステラーゼ活性量が増加している。
【００１８】
＜基材＞
本実施形態の神経細胞の形質誘導制御用細胞培養基材において、使用する基材は、基板上に凹凸のパターンを有する。また、基材は、細胞を培養する際や、滅菌処理のような前処理によって変形しないものであれば特に限定されない。基材は全体が同一の材料から構成されていてもよく、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されていてもよい。
【００１９】
基材の形態としては、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、たとえば、６、１２、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。
【００２０】
［基板］
基材が、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されている場合、基板の材質としては、細胞培養用途に用いられるものであれば、特別な限定はない。基板の材質としてより具体的には、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン等が挙げられる。これらの材質を用いることにより、自家蛍光物質が低く、培養された細胞を蛍光顕微鏡に観察することができる。
【００２１】
［凹凸パターン］
凹凸のパターンとしては、例えば、格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状（例えば、ハニカム構造状等）、ラビリンス状、ライン状又はドット状等が挙げられる。図１は、本実施形態の神経細胞の形質誘導制御用細胞培養基材の拡大平面図及び拡大正面図である。図１（Ａ）は、凹凸のパターンがライン状である場合を示しており、図１（Ｂ）は凹凸のパターンがドット状である場合を示している。図１（Ａ）の拡大正面図において、凸部の形状が直方体型のライン状を示しているが、これに限定されず、凸部の形状が角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型、半円柱型（半円柱には、半楕円柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等であってもよい。
【００２２】
また、図１（Ｂ）において、凸部の横断面が円形型であり、縦断面が直角形型である（すなわち、凸部の形状が円柱状である）ドット状を示しているが、これに限定されず、凸部の横断面又は縦断面が三角形及び四角形等の多角形型、円形型（円形には、略円形、楕円形、略楕円形、半円形、扇形を含む）、台形型、波型等であってもよい。すなわち、凸部の形状としては、例えば、角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型（角錐台には、双角錐台を含む）、円柱型（円柱には、楕円柱、半円柱、半楕円柱、扇形柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２３】
凹部及び凸部の幅は、５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることが好ましく、７５ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることがより好ましく、１００ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。幅が上記範囲であることにより、神経細胞の細胞表面を刺激し、神経細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導することができる。なお、凸部の形状が円柱型、円錐台型である場合は、幅は凸部上面の直径を示す。
【００２４】
凹凸パターンの凸部の表面までの距離は、１０ｎｍ〜１００μｍが好ましい。凸部の表面までの距離が上記範囲内である場合、基材の自家蛍光を抑制しやすい。このため、上記範囲内の距離の基材を用いると、培養された細胞の蛍光顕微鏡による観察が容易である。
【００２５】
［凹凸パターンの形成方法］
凹凸パターンを形成する方法は、特に限定されない。凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、凹凸パターンを支持するための基材の表面に形成された感光性組成物層を選択的に露光した後、露光された感光性組成物層から凹部に相当する箇所を現像液により除去するフォトリソグラフィー法、基板表面に形成されたインプリント材料の層に凹凸のパターンを備える押し型を押し付けた後にインプリント材料を硬化させるインプリント法、基板表面に凸部に相当する箇所を被覆するマスクを設けた後に、エッチングのような化学的処理により基板表面に凹部を形成する方法、サンドブラストや種々の工作機械によって基板表面を研削加工する方法、所定の形状のパターンの凸部を構成する材料を基板の表面に貼り付ける方法等が挙げられる。フォトリソグラフィー法やインプリント法には、従来から種々の目的で使用されている感光性樹脂組成物や、感光性ＳＯＧ（スピンオングラス）材料を特に制限なく用いることができる。
【００２６】
（感光性樹脂組成物）
凹凸パターンの形成に使用される感光性樹脂組成物としては、例えば、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤を含有する感光性樹脂組成物等が挙げられる。感光性樹脂組成物は、ポジ型、ネガ型のいずれであってもよい。
【００２７】
樹脂成分としては、例えば、細胞培養に用いることができるものであれば、特別な限定はない。中でも、エチレン性不飽和結合を有する化合物の重合体が好ましい。エチレン性不飽和結合を有する化合物に含まれる重合性の官能基としては、例えば、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、及びアリル基等が挙げられる。エチレン性不飽和結合を有する化合物としては、例えば、単官能、２官能、又は３官能以上の多官能の、（メタ）アクリレート化合物、（メタ）アクリルアミド化合物、ビニル化合物、及びアリル化合物等を用いることができる。これらのエチレン性不飽和結合を有する化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２８】
エチレン性不飽和結合を有する多官能の化合物としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、エチレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、プロピレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート等の３官能以上のアクリレート；ポリイソシアネート化合物とヒドロキシ基含有（メタ）アクリレートモノマーと、を反応させて得られる多官能ウレタン（メタ）アクリレート；多価アルコールとＮ−メチロール（メタ）アクリルアミドとの縮合物等が挙げられる。これらの多官能の化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２９】
エチレン性不飽和結合を有する２官能の化合物としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリトリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、２−（メタ）アクロイルオキシエチル−２−ヒドロキシエチルフタレート、グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物、ウレタンモノマー、γ−クロロ−β−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、β−ヒドロキシエチル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、及びβ−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート等が挙げられる。
【００３０】
上記グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物としては、例えば、トリグリセロールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。上記ウレタンモノマーとしては、例えば、β位に水酸基を有する（メタ）アクリルモノマーとイソホロンジイソシアネート、２，６−トルエンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート等との付加反応物、ＥＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート、及びＥＯ，ＰＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００３１】
エチレン性不飽和結合を有する単官能の化合物としては、（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド類、アリル化合物、ビニルエーテル類、ビニルエステル類、スチレン類等が挙げられる。これらの化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３２】
（メタ）アクリル酸エステル類としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ｔ−オクチル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アクリレート、２，２−ジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フルフリル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＰＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ／ＰＯ共付加物の（メタ）アクリレート、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノエチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ＥＯ／ＰＯ共重合体のモノ（メタ）アクリレート、及びＥＯ／ＰＯ共重合体のモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００３３】
（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００３４】
ビニルエーテル類としては、ヘキシルビニルエーテル、オクチルビニルエーテル、デシルビニルエーテル、エチルヘキシルビニルエーテル、メトキシエチルビニルエーテル、エトキシエチルビニルエーテル、クロルエチルビニルエーテル、１−メチル−２，２−ジメチルプロピルビニルエーテル、２−エチルブチルビニルエーテル、ヒドロキシエチルビニルエーテル、ジエチレングリコールビニルエーテル、ジメチルアミノエチルビニルエーテル、ジエチルアミノエチルビニルエーテル、ブチルアミノエチルビニルエーテル、ベンジルビニルエーテル、テトラヒドロフルフリルビニルエーテル等のアルキルビニルエーテル；ビニルフェニルエーテル、ビニルトリルエーテル、ビニルクロルフェニルエーテル、ビニル−２，４−ジクロルフェニルエーテル、ビニルナフチルエーテル、ビニルアントラニルエーテル等のビニルアリルエーテル等が挙げられる。
【００３５】
ビニルエステル類としては、ビニルブチレート、ビニルイソブチレート、ビニルトリメチルアセテート、ビニルジエチルアセテート、ビニルバレート、ビニルカプロエート、ビニルクロルアセテート、ビニルジクロルアセテート、ビニルメトキシアセテート、ビニルブトキシアセテート、ビニルフエニルアセテート、ビニルアセトアセテート、ビニルラクテート、ビニル−β−フェニルブチレート、安息香酸ビニル、サリチル酸ビニル、クロル安息香酸ビニル、テトラクロル安息香酸ビニル、ナフトエ酸ビニル等が挙げられる。
【００３６】
スチレン類としては、スチレン；メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルスチレン、イソプロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキシルスチレン、シクロヘキシルスチレン、デシルスチレン、ベンジルスチレン、クロルメチルスチレン、トリフルオロメチルスチレン、エトキシメチルスチレン、アセトキシメチルスチレン等のアルキルスチレン；メトキシスチレン、４−メトキシ−３−メチルスチレン、ジメトキシスチレン等のアルコキシスチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、トリクロロスチレン、テトラクロロスチレン、ペンタクロロスチレン、ブロモスチレン、ジブロモスチレン、ヨードスチレン、フルオロスチレン、トリフルオロスチレン、２−ブロモ−４−トリフルオロメチルスチレン、４−フルオロ−３−トリフルオロメチルスチレン等のハロスチレン等が挙げられる。
【００３７】
カチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー、Ｘ線、及び電子線等の放射線の照射を受けてカチオンを生じるものであり、そのカチオンが重合開始剤となりうる化合物である。
【００３８】
カチオン重合開始剤としては、例えば、ヨードニウム塩やスルホニウム塩のようなオニウム塩型のカチオン重合開始剤を用いることができる。オニウム塩型のカチオン重合開始剤を構成する、オニウムイオンの対イオンとなるアニオンは、フッ素化アルキルフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、又はヘキサフルオロアンチモン酸アニオン（ＳｂＦ６−）が好ましい。
【００３９】
感光性樹脂組成物に含まれる溶剤は、均一な感光性樹脂組成物を調製可能であり、露光による効果を阻害しないものであれば特に限定されない。溶剤の沸点は、５０℃〜２００℃が好ましい。
【００４０】
溶剤の具体例としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、及び１−ブタノールのようなアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−ヘプタノン、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、ジブチルエーテル、メチル−３−メトキシプロピオネート、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ブチルセロソルブ、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ヘキシレングリコール、シクロヘキサノン、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ピルビン酸エチル、及びエチルセロソルブアセテート等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４１】
感光性樹脂組成物は、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤の他に、従来から感光性樹脂組成物に使用されている種々の添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤としては、付加的樹脂、増感剤、可塑剤、安定剤、着色剤、カップリング剤、レベリング剤等が挙げられる。
【００４２】
感光性樹脂組成物は、上記各成分を３本ロールミル、ボールミル、サンドミル等の撹拌機で混合（分散・混練）し、必要に応じて５μｍメンブランフィルタ等のフィルタで濾過して調製することができる。
【００４３】
［基材の製造方法］
基材の製造方法は、上述の感光性樹脂組成物を露光して硬化させ、所望するパターンを有する基材を形成できる方法であれば特に限定されない。細胞培養基材の製造方法としては、例えば、基板上に、感光性樹脂組成物を塗布して塗布膜を形成する塗布工程と、基板上の塗布膜を露光して硬化させる露光工程と、を含む方法が挙げられる。上記の基材の製造方法は、必要に応じて、基板上の塗布膜を露光して硬化させた後に、露光された塗布膜を基板から剥離させる、剥離工程を含んでいてもよい。
【００４４】
塗布工程において、感光性樹脂組成物が塗布される基板は、基材を製造する過程で変形や劣化が生じないものであれば特に限定されない。基板の材質としては、上述の（基板）と同様のものが挙げられる。
【００４５】
凹凸のパターンの形成方法としては、上述の（凹凸パターンの形成方法）と同様のものが挙げられる。
【００４６】
基板上に塗布膜を形成する方法は特に限定されず、所定量の感光性樹脂組成物を基板上に滴下する方法や、ロールコータ、リバースコータ、バーコータ等の接触転写型塗布装置を用いる方法や、スピンナー（回転式塗布装置）、カーテンフローコータ等の非接触型塗布装置を用いる方法が挙げられる。
【００４７】
塗布膜を形成した後は、塗布膜を備える基板を減圧条件下におき、塗布膜を脱気してもよい。
【００４８】
露光工程において、塗布膜を露光する方法は、塗布膜を良好に硬化できればよく、特に限定されない。露光には、例えば、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、キセノンランプ、カーボンアーク灯等の紫外線を発する光源を用いればよい。塗布膜を露光する際の露光量は、感光性樹脂組成物の組成や、塗布膜の膜厚等を考慮して適宜定められる。典型的には、塗布膜を露光する際の露光量は、１０〜１０００００ｍＪ／ｃｍ２が好ましく、１００〜５００００ｍＪ／ｃｍ２がより好ましい。
【００４９】
塗布膜を露光する方法は特に限定されないが、最初に大気中で塗布膜を露光して部分的に塗布膜の硬化を進行させてもよい。これにより、露光工程において、感光性樹脂組成物が基板上からはみ出すことを防ぎ、後に、塗布膜を水中で露光することが可能となる。大気中での露光を行わずに、塗布膜を水中で露光すると、塗布膜が水に溶解する場合がある。大気中で塗布膜を露光した後に、水中で塗布膜を露光すると、酸素によるラジカル重合阻害を低減することが出来、良好な硬化膜を得ることができる。
【００５０】
また、露光工程は、真空中での塗布膜の露光を含んでいてもよい。真空中での塗布膜の露光を行うと、感光性樹脂組成物の塗布膜を基板に密着させた状態で硬化させることができ、所望するパターンの基材を形成しやすい。また、真空中での塗布膜の露光を行う場合、基板上面より塗布膜に対して圧力を印加しながら露光を行ってもよい。この場合、感光性樹脂組成物の塗布膜をより基板に密着させた状態で硬化させることができる。露光工程が、真空中での露光や、圧力を印加しながらの真空中での露光を含むと、特に、基材が備える凹凸のパターンに対応する鋳型を用いて基材を形成する場合に、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。このような条件下で塗布膜の露光を行うことにより、感光性樹脂組成物が硬化する際の収縮が抑制されるため、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。
【００５１】
塗布膜を真空中で露光する方法としては、例えば、塗布膜の表面を、例えばＰＥＴフィルムのようなフィルムで被覆した後に、少なくともフィルムと塗布膜との間を真空にした状態で塗布膜を露光する方法が挙げられる。塗布膜に圧力を印加しながら露光を行う場合に、塗布膜に圧力を印加する方法としては、例えば、負圧露光等の方法が挙げられる。
【００５２】
上記のような方法で露光されて硬化した塗布膜は、必要に応じて鋳型から剥離させた後基材として使用される。
【００５３】
また、露光されて硬化した塗布膜は、プラズマ処理してもよい。硬化した塗布膜に対して、プラズマ処理することにより、細胞が接着しやすい基材を形成することができる。プラズマ処理に用いるプラズマは特に限定されないが、例えばＯ２プラズマ、Ｎ２プラズマ、ＣＦ４プラズマ等が挙げられる。プラズマ処理を行うタイミングは特に限定されず、硬化した塗布膜を基板から剥離させる前後のいずれのタイミングでプラズマ処理を行ってもよい。
【００５４】
さらに、鋳型から剥離された基材は、リンス液によるリンスを行ってもよい。基材がリンス液によりリンスされることで、未反応の光重合性モノマーや光重合開始剤のような細胞毒性の原因となりうる化合物を基材の表面から除去することができる。リンス液としては、例えばプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン等の有機溶剤、水等が挙げられる。
【００５５】
＜用途＞
また、本実施形態の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材を医療材料の表面に加工することにより、生体適合性が向上された医療材料を得ることができる。さらに、該医療材料を用いることで、神経前駆細胞の分化を制御することができ、組織を効果的に再生することができる。
医療材料としては、例えば、神経、脳等の組織再生又は移植用組織形成に使用する足場用の医療成型体；人工神経等の生体内埋め込み用の医療成型体；外科用縫合糸、外科用補填材、外科用補強材、創傷保護材、骨折接合材、カテーテル、シリンジ、体外循環用材料等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５６】
＜＜神経細胞の形質制御方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養する、神経細胞の形質制御方法を提供する。
【００５７】
本実施形態の神経細胞の形質制御方法によれば、神経前駆細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導することができる。また、神経突起の伸長を促進し、神経ネットワーク形成の研究又はパーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の治療に応用することができる。さらに、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の創薬スクリーニング用の細胞を簡便に作製することができる。
【００５８】
また、本実施形態の神経細胞の形質制御方法を用いて、神経前駆細胞から分化誘導された神経細胞は、神経突起の伸長が見られる。この神経突起の伸長は、分化指標となり得る。
また、神経前駆細胞から分化誘導された、一部の神経細胞においては、ドパミン分泌能、又はアセチルコリンエステラーゼ活性の上昇が見られる。
よって、後述に示す通り、本実施形態の神経細胞の形質制御方法は、＜神経突起の伸長方法＞、＜ドパミン分泌制御方法＞、又は＜アセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法＞等の用途で使用することができ、分化誘導された神経細胞、さらに、有用な機能を有する神経細胞を得ることができる。
【００５９】
＜培養工程＞
本実施形態の神経細胞の形質制御方法は、上述の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材を用いて、神経前駆細胞を培養する。
【００６０】
用いる神経前駆細胞としては、特別な限定はなく、上述の神経幹細胞から分化誘導されたものであってもよい。
【００６１】
使用する培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ギブコ（Ｒ）ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社製）等が挙げられる。培養工程において、培地は細胞の増殖速度に応じて、適宜新しいものに交換すればよい。
【００６２】
また、使用する培地に、神経細胞の分化を誘導する化合物を添加してもよい。該化合物を添加することにより、分化の速度をさらに早めることができ、また一定の方向に分化を制御することができる。神経細胞の分化を誘導する化合物としては、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、ｄＢｕ−ｃＡＭＰ、スタウロスポリン等が挙げられ、これら２種類以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００６３】
神経細胞の分化を誘導する化合物の濃度は、特に限定されず、１ｎＭ以上１μＭ以下であってよく、５ｎＭ以上５００ｎＭ以下であってよい。上記範囲内であることにより、より効率的に神経前駆細胞から神経細胞へ分化誘導することができる。
【００６４】
培養条件は、神経細胞の培養に適した方法であれば、特に限定されず、例えば、神経細胞を培地に播種する密度は、１×１００〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０２〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。培養温度は、２５℃以上４０℃以下が好ましく、３０℃以上３９℃以下がより好ましく、３５℃以上３９℃以下がさらに好ましい。培養時間は神経細胞の生育状態によって適宜設定することができ、１時間以上１００時間以下であることが好ましい。上述の神経細胞の形質誘導制御用細胞培養基材を用いることにより、神経突起の伸長及び形質誘導が促進され、従来法より短時間で神経細胞を分化又は形質変化させることができる。培養環境は、約５％の二酸化炭素を通したＣＯ２条件下で、培養することが好ましい。
【００６５】
＜＜用途＞＞
＜神経突起の伸長方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養する、神経突起の伸長方法を提供する。
【００６６】
本実施形態の神経突起の伸長方法によれば、神経突起を簡便に短時間で伸長することができ、神経の再生治療に応用することができる。
【００６７】
＜ドパミン分泌制御方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養する、ドパミン分泌制御方法を提供する。
【００６８】
本実施形態のドパミン分泌制御方法によれば、神経細胞におけるドパミンの分泌量を制御することができ、ドパミンの分泌量と関わりのあるパーキンソン病等の中枢神経系疾患の治療に応用することができる。
【００６９】
＜アセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材上で、神経前駆細胞を培養する、アセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法を提供する。
【００７０】
本実施形態のアセチルコリンエステラーゼ活性の制御方法によれば、神経細胞におけるアセチルコリンの産生量を制御することができ、アセチルコリンの産生量と関わりのあるアルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の治療に応用することができる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７２】
［製造例１］ＤＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ）による基材の作製
（１）１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレンとポリメチルメタクリレートとのブロック共重合体（数平均分子量１８０００−ｂ−１８０００）２ｗｔ％のプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液を０．２ｍＬずつ滴下して、基板上に塗布膜を形成した。続いて、塗布膜を形成したガラス基板を２４０℃、６０秒間アニール処理した。続いて、塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、ポリメチルメタクリレート部を選択的にドライエッチングし、基材（ＬＳ１）を得た。また、１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレンとポリメチルメタクリレートとのブロック共重合体（数平均分子量４９０００−ｂ−２１０００）を用いて、同様の処理を行い、基材(Ｐ１)を得た。
【００７３】
（２）１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）及び１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）基板（三菱化学株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレン（数平均分子量１８０００）の２ｗｔ％プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液を０．２ｍＬずつ滴下して、基板上に塗布膜を形成した。続いて、塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、基材（Ｓｍｏｏｔｈ１及びＳｍｏｏｔｈ２）を得た。
【００７４】
【表１】
2017212964.tif 000002
【００７５】
なお、表１中、Ｓｍｏｏｔｈとは凹凸パターンを形成していない、コントロールとして使用する平面の基板を示す。また、幅とは、凸部の幅を示す。
【００７６】
［製造例２］ＡｒＦ（フッ化アルゴン）パターンからの転写による基材の作製
アクリル樹脂を主成分とする感光性樹脂組成物を含むラジカル重合型ネガ型のレジストをフォトレジスト組成物として用いた。ＡｒＦ露光機Ｎｉｋｏｎ Ｓ３０８を用いて形成した表１に示す凹凸のパターン（Ｓｍｏｏｔｈ３、Ｐ２〜５及びＬＳ２〜８）を有する０．８ｃｍ×０．８ｃｍのシリコンウエハーに対し、ラジカル重合ネガレジストを１ｍｌ滴下し、１００Ｐａの減圧条件下に３０分置いて塗布膜を脱気するとともに、凹凸パターンにラジカル重合ネガレジストを埋め込んだ。続いて、塗布膜を備えるシリコン基板１２枚を、大気中で紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量で露光を行った。続いて、ＰＥＴ基板（三菱化学株式会社製）に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを塗布した基板を、前記した露光によって硬化した膜上に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストが接するように覆い、真空中で、紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量での露光を５回繰り返して塗布膜及び膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを硬化させた。硬化した塗布膜から鋳型を剥離した後、硬化した塗布膜をプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に１０分間浸漬してリンスした後、窒素ガスを硬化した塗布膜に吹き付けて乾燥させた。続いて、乾燥された硬化した塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、基材（Ｓｍｏｏｔｈ３、Ｐ２〜５及びＬＳ２〜８）を得た。
【００７７】
［実施例１］神経細胞の形質制御
（１）神経前駆細胞の培養
製造例１、２で得られた基材を用いて、培養温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で、細胞培養試験を行った。培養対象の細胞としては、ラット褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞（理研バンク細胞を使用。理研バンクＲＣＢ００９）を用いた。培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地を用いた。製造例１、２で得られた基材をウェル付のディッシュのウェル内に載置した後、１つの基材につき１×１０４個の細胞を、基材表面に播種した。その後、ウェル内に、ディスポーザブルピペットで培地を注入し、１日培養を培養した。
【００７８】
１日培養後の細胞の形態を観察した結果、ＬＳ３〜８（ラインアンドスペースパターン、幅１５０ｎｍ〜１０００ｎｍ）及びＰ２〜５（ピラーパターン、幅１００ｎｍ〜５００ｎｍ）の基板を用いた場合において、ＰＣ１２細胞から神経突起が出現していることが確かめられた。
【００７９】
（２）神経前駆細胞の分化
続いて、一部の培養したＰＣ１２細胞に分化誘導化合物を添加した。分化誘導物質として、神経成長因子（ＮＧＦ）を用いた。培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地を用いた。神経成長因子（ＮＧＦ）の培地中の濃度が５０ｎｇ／ｍＬのとなるように添加し、２日培養した。
【００８０】
（３）アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の評価
（３−１）細胞破砕液の調製
（２）において培養した一部のＰＣ１２細胞を２００×ｇで１０分間４℃にて遠心分離し、上清を捨てる。続いて、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）  ０．５ｍＬで洗浄し、再度２００×ｇで１０分間４℃にて遠心分離する。続いて、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．５ｍＬ中でホモジナイズする。続いて、８，０００×ｇで１０分間４℃にて遠心分離する。得られた上清をアセチルコリンエステラーゼ活性の測定試料として使用する。
【００８１】
（３−２）アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の測定
（３−１）で得られた測定試料及びアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）標準液（０．０２５、０．０１２５、０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）各１００μＬをマイクロプレートに添加する。続いて、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＮＢ（５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））溶液５０μＬ及び２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＡＴＰ＋（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）溶液５０μＬを各ウェルに添加し、ピペッティングした。コントロールとして、測定試料１００μＬに対し、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＮＢ溶液５０μＬ及びＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬを展開したウェルを準備した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、マイクロプレートリーダーを用いて、４１５ｎｍの吸光度を測定した。続いて、測定試料中のＡＣｈＥ活性をＡＣｈＥ標準液の検量線から求めた。結果を図２に示す。
【００８２】
図２から、Ｐ２〜５及びＬＳ５〜８を用いて培養したＰＣ１２細胞において、ＮＧＦを添加しない場合においても、ＡＣｈＥ活性が上昇することが確かめられた。
【００８３】
（４）ドパミン量の評価
（４−１）細胞培養上清の調製
（２）において、それぞれの基材を用いて培養した細胞の培養上清を回収した。
【００８４】
（４−２）ドパミン量の測定
（４−１）で得られた細胞培養上清を５０μＬずつＲａｔ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ（ＤＡ）  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＭＢＳ０２６０３２）のマウス抗ＤＡ抗体が固定化されたマイクロタイタープレートのウェルに分注した。また、スタンダード溶液又は細胞培養上清の希釈液をそれぞれ５０μＬずつウェルに分注した。続いて、１００μＬのＨＲＰコンジュゲート試薬をそれぞれのウェルに分注し、カバーをして３７℃で６０分間インキュベートした。続いて、マイクロタイタープレートを１×Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（３５０μＬ／ウェル／１回の洗浄）を用いて、４回洗浄した。続いて、洗浄液を除去し、５０μＬの色素原溶液Ａ及び５０μＬの色素原溶液Ｂをそれぞれウェルに分注した。続いて、静かに混合し、遮光して３７℃で１５分間インキュベートした。続いて、５０μＬの反応停止溶液をそれぞれのウェルに分注し、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【００８５】
図３から、Ｐ２、３、５及びＬＳ２、７を用いて培養したＰＣ１２細胞において、ＮＧＦを添加しない場合においても、ドパミン量が上昇することが確かめられた。また、Ｐ１、４及びＬＳ１、６を用いて培養したＰＣ１２細胞において、ＮＧＦを添加しない場合に、ドパミン量が低下することが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の神経細胞の形質誘導用細胞培養基材によれば、神経前駆細胞を一定の方向に簡便且つ効率良く形質誘導することができる。また、神経突起の伸長を促進し、神経の再生治療又はパーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の治療に応用することができる。さらに、パーキンソン病、アルツハイマー型認知症等の中枢神経系疾患の創薬スクリーニング用の細胞を簡便に作製することができる。
【符号の説明】
【００８７】
１…ライン状凸部、２…ドット状凸部、１０，２０…基材。
【図１】
2017212964.tif 000003
【図２】
2017212964.tif 000004
【図３】
2017212964.tif 000005