(57)【要約】【課題】体内における抗酸化システムの活性を高め、抗酸化酵素の発現を上昇させる機能に優れた青ジソ抽出物及び前記青ジソ抽出物を得るための製造方法を提供すること。【解決手段】青ジソを原料とし、抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で行う亜臨界処理で得られ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する抗酸化機能を有する青ジソ抽出物、及び前記亜臨界処理を行う亜臨界処理工程を含むＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する抗酸化機能を有する青ジソ抽出物の製造方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
青ジソを原料とし、抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で行う亜臨界処理で得られ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する抗酸化機能を有する青ジソ抽出物。
【請求項２】
前記抗酸化機能が脳に作用する請求項１に記載の青ジソ抽出物。
【請求項３】
前記抗酸化機能が脳及び脳以外の臓器に作用する請求項１に記載の青ジソ抽出物。
【請求項４】
青ジソを原料とし、抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理する亜臨界処理工程、及び
亜臨界処理物を固液分離して抽出液を得る固液分離工程
を含むＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化し、抗酸化機能を有する青ジソ抽出物の製造方法。
【請求項５】
前記抗酸化機能が脳に作用する請求項４に記載の青ジソ抽出物の製造方法。
【請求項６】
前記抗酸化機能が脳及び脳以外の臓器に作用する請求項４に記載の青ジソ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化システムを活性化する機能を有する青ジソ抽出物及び亜臨界処理工程を含む抗酸化システムを活性化する機能を有する青ジソ抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸により生体内に取り込まれた酸素は、生体の生命を維持するためにほとんどが利用されるが、一部は不安定で様々な物質と反応しやすい活性酸素に変化する。活性酸素は細菌やウイルスに対する防御、細胞内情報伝達において重要な役割を果たしており、生体にとって必要なものである。しかし、活性酸素は生体内分子を攻撃し、脂質劣化、タンパク質変性、ＤＮＡ損傷などを引き起こし、各種疾患（動脈硬化、脳梗塞、心疾患、ガン、肝硬変、糖尿病、神経疾患、腎臓病、未熟児網膜症、老人性白内障、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、膠原病、進行性全身性硬化症など）や、老化の一因であると考えられている。
【０００３】
このような活性酸素に対し、生体内では、活性酸素を消去、軽減するための抗酸化システムが作用することでバランスを保っている。しかしながら、活性酸素の大量発生や、抗酸化システムの低下によりバランスが崩壊すると、活性酸素による攻撃が甚大になり、前記の各疾患などに繋がる恐れがある。そこで、近年、前記の各疾患を予防することを目的として、抗酸化システムを補強し、強固な抗酸化システムを維持するための医薬品、食品、化粧品などが注目されている。抗酸化システムを補強するための方法として、活性酸素と直接反応し、除去できるビタミンＣ、ビタミンＥやポリフェノールなどの抗酸化物質を大量に摂取する方法、及び、生体内の抗酸化酵素の発現を上昇させる方法が挙げられる。
【０００４】
しかし、抗酸化物質を大量に摂取するのは困難である。そこで、生体内の抗酸化酵素の発現を高レベルに保つことができる抗酸化成分を医薬品、食品、化粧品などとして摂取したり、使用したりすることで、活性酸素に対する抵抗を高め、各疾患の予防や老化を防止する方法が注目されている。
【０００５】
前記抗酸化酵素を発現誘導するシステムとしてＮｒｆ２−ＡＲＥ経路などが知られている。Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路は、通常は細胞質に存在する転写因子Ｎｒｆ２が、生体が活性酸素に晒されると核内に移行して遺伝子の上流に存在するＡＲＥ配列に結合し、抗酸化酵素、第二相薬物代謝酵素、γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ−ＧＣＳ）などの抗酸化システムに関連する酵素の発現を誘導するシステムである。
【０００６】
近年、植物に由来する抗酸化剤が種々報告されている。例えば、特許文献１にはシソ科植物に由来する抗酸化成分を含有する抗酸化剤の製造方法が、特許文献２にはシソ科、クスノキ科、フトモモ科、キク科植物のうち少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する生体内抗酸化剤が記載されている。
【０００７】
また、非特許文献１では、青ジソ抽出物がＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化すること、及び、この活性化成分が青ジソ抽出物中の２’，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４’，６’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ（ＤＤＣ）であることを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１０５３３７号公報
【特許文献２】特開２０１１−２３６１４９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Free Radical Biology and Medicine, 53 (2012) 669-679
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来技術であるエタノール抽出もしくは１００℃以下の熱水抽出により得られた青ジソ抽出物は、体内の特定の部位でしか、抗酸化酵素発現を上昇させることができなかった。そのため、抗酸化システムを活性化させる作用を向上し、体内における抗酸化酵素の発現を上昇させることができる青ジソ抽出物を得ることが求められている。特に脳における抗酸化システムを活性化させることができる青ジソ抽出物が求められている。
【００１１】
本発明は、体内における抗酸化システムの活性を高め、抗酸化酵素の発現を上昇させる機能に優れた青ジソ抽出物及び前記青ジソ抽出物を得るための製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らが鋭意検討した結果、青ジソを所定条件で亜臨界処理する工程を含む製造方法により得られた青ジソ抽出物は、生体内の抗酸化システムであるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する機能を有することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明は、青ジソを原料とし、抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で行う亜臨界処理で得られ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する抗酸化機能を有する青ジソ抽出物に関する。
【００１４】
また、本発明は、青ジソを原料とし、抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理する亜臨界処理工程、及び亜臨界処理物を固液分離して抽出液を得る固液分離工程を含むＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化し、抗酸化機能を有する青ジソ抽出物の製造方法に関する。
【００１５】
前記抗酸化機能が脳に作用することが好ましい。
【００１６】
前記抗酸化機能が脳及び脳以外の臓器に作用することが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の青ジソ抽出物は、生体内の抗酸化システムであるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化させることに優れる機能を有する。本発明の亜臨界処理により得られた青ジソ抽出物（以降、青ジソ  亜臨界抽出物と称す。）は、従来技術であるエタノール抽出により得られた青ジソ抽出物（以降、青ジソ  エタノール抽出物と称す。）あるいは、１００℃以下の熱水により得られた青ジソ抽出物（以降、青ジソ  熱水抽出物と称す。）に比べ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性化を高める度合いが高いことが確認されている。また、本発明で得られた青ジソ  亜臨界抽出物は、脳における抗酸化酵素γ−ＧＣＳの発現を上昇することが確認されている。さらに、脳以外の臓器でもγ−ＧＣＳの発現を上昇することが確認されている。
【００１８】
本発明の青ジソ抽出物製造方法によれば、従来技術に比べ、青ジソの生葉１ｇあたりの青ジソ抽出物（ｍｇ）である抽出エキス量を高めることができ、青ジソ抽出物の抽出効率を向上させることができる。青ジソ抽出物の抽出効率を向上させることができる。また、本発明青ジソ抽出物製造方法により生体内の抗酸化システムであるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化することができる。さらに、脳における抗酸化酵素γ−ＧＣＳの発現を上昇させることができる。らに、脳以外の臓器でもγ−ＧＣＳの発現を上昇することが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】動物試験での胃における抗酸化機能の測定結果を示すグラフである。
【図２】動物試験での小腸における抗酸化機能の測定結果を示すグラフである。
【図３】動物試験での大腸における抗酸化機能の測定結果を示すグラフである。
【図４】動物試験での脳における抗酸化機能の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法は、亜臨界処理工程及び抽出液を得る固液分離工程を含む青ジソ抽出物の製造方法である。また、本発明の青ジソ抽出物は抗酸化システム活性化による抗酸化酵素の発現を上昇させる作用を有するものである。
【００２１】
青ジソ抽出物の原料となる青ジソは、シソ科シソ属のＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｓｃｅｎｓ  ｆ．  ｖｉｒｉｄｉｓ  Ｍａｋｉｎｏであり、その葉は大葉とも称される。原料として使用する部位は、より多くの抗酸化成分を含有しているという理由から葉が好ましい。
【００２２】
前記青ジソの葉は、水分を含んだ生の状態、乾燥した状態（絶乾状態）、多少水分を飛ばした半乾燥状態などが考えられるが、いずれの状態の葉を用いてもよい。これらの中で、絶乾状態にした青ジソの葉を用いることが好ましく、その理由としては絶乾状態にすることで細かく粉砕することができ、亜臨界処理を行った際、抽出効率を向上させることができるためである。
【００２３】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理工程は、所定温度の条件下で亜臨界状態にした抽出溶媒としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明では青ジソ）とを耐圧容器内で接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出する工程である。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度及び圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００２４】
前記耐圧容器としては亜臨界処理条件に耐え得る容器であれば特に限定されず、ステンレスなどの金属製、セラミック製、樹脂製、ガラス製などの各種容器を用いることができる。溶媒の蒸発を防ぐことができるという理由から市販の圧力鍋やオートクレーブなどの金属製の密封容器、セラミック製の密封容器を用いることが好ましい。
【００２５】
亜臨界処理に用いる抽出溶媒は、安全性の観点から水を用いる。抽出溶媒である水は、高温の水であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水または水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にした、いわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器に青ジソと抽出溶媒である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態（後述の亜臨界処理時の温度以上、飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで亜臨界処理物が得られる。
【００２６】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理時の温度は、目的成分を効率的に抽出することができるという理由から１４０℃以上であり、１９０℃以上が好ましく、２１０℃以上がさらに好ましい。また、亜臨界処理時の温度は、２３０℃以下が好ましく、２２５℃以下がより好ましい。亜臨界処理時の温度は、１４０〜２３０℃の範囲で行うことが好ましい。前述の温度範囲にすることで青ジソ抽出物の抽出効率が向上し、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性が、従来技術である青ジソ  エタノール抽出物と比べ、２倍以上にすることができ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性の度合いが高められる。亜臨界処理時の温度が１４０℃未満では、青ジソ抽出物の抽出効率が低く、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性が高められない。また、２３０℃を越えると、得られた青ジソ抽出物が分解されることで抽出効率が低下し、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性も低下してしまう。
【００２７】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理時の温度は、１９０〜２３０℃の範囲で行うことがより好ましい。当該温度範囲にすることで青ジソ抽出物の抽出効率が、従来技術である青ジソ  エタノール抽出物と比べ、２倍以上にすることができ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性の度合いが高められる。
【００２８】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理時の温度は、２１０〜２３０℃の範囲で行うことがもっとも好ましい。当該温度範囲にすることで青ジソ抽出物の抽出効率が、従来技術である青ジソ  エタノール抽出物と比べ、２倍以上にすることができ、かつ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性が、従来技術で青ジソ  エタノール抽出物と比べ、５倍以上にすることができ、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性の度合いがより高められる。
【００２９】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上で行うことが好ましい。各温度での飽和蒸気圧は、日本機械学会蒸気表（１９６８年）を参照するなどして決定することができる。１４０〜２３０℃間の１０℃間隔における飽和蒸気圧を例示すると、１４０℃：０．３６ＭＰａ（３．６９ａｔ）、１５０℃：０．４８ＭＰａ（４．８５ａｔ）、１６０℃：０．６１ＭＰａ（６．３０ａｔ）、１７０℃：０．７９ＭＰａ（８．０７ａｔ）、１８０℃：１．００ＭＰａ（１０．２２ａｔ）、１９０℃：１．２５ＭＰａ（１２．７９ａｔ）、２００℃：１．５５ＭＰａ（１５．８６ａｔ）、２１０℃：１．９０ＭＰａ（１９．４５ａｔ）、２２０℃：２．３２ＭＰａ（２３．６６ａｔ）、２３０℃：２．７９ＭＰａ（２８．５３ａｔ）である。この飽和蒸気圧以上の圧力にすることにより、抗酸化成分を効率的に抽出することができる傾向がある。なお、亜臨界処理の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが好ましい。
【００３０】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における亜臨界処理時間は、５〜６０分の間で行うことが好ましく、１０〜３０分の間で行うことがより好ましい。この処理時間の範囲にすることにより、青ジソ抽出物の抽出が効率的に抽出することができるし、抽出物のＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性が高められる。
【００３１】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における固液分離工程は、亜臨界処理工程で得られた亜臨界処理物を抽出液と原料残渣（固体物）とに分離する工程である。具体的な固液分離工程としては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水などが挙げられる。なかでも、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過が好ましい。
【００３２】
前記固液分離工程のろ過に用いるろ材としては、特に限定はなく不織布、織布、セルロースろ紙、ガラスろ紙などの公知のろ紙やフィルターを用いることができる。なかでも食品に対して使用することができるという理由からセルロースろ紙を用いることが好ましい。
【００３３】
本発明の青ジソ抽出物の製造方法における固液分離工程により得られた抽出液は、そのまま使用することもできるが、より取り扱い性、保存性を高めるために乾燥させることが望ましい。乾燥方法としては一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。これらの中では凍結乾燥が好ましい。その理由は、原料となる青ジソの葉が絶乾状態と同等の状態になり、抽出物を長期間保持しやすいからである。また、一般的で簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。このようにして得られた青ジソ抽出物は、そのまま目的の使用に供することもできるし、他の成分を処方、配合して粉末、カプセル、錠剤の形態に加工してもよく、可溶性溶媒に溶解させて液体の形態で使用してもよい。
【００３４】
また、成分の精製または凝縮を目的として、さらに有機溶剤（アルコール類、ケトン類、アセトン類等）による抽出などの精製工程を行ってもよい。
【００３５】
青ジソ抽出物の評価としては、抽出効率に関する抽出エキス量、抗酸化機能に関するＮｒｆ２−ＡＲＥ活性試験、動物試験による抗酸化機能の上昇確認試験などが挙げられる。
【００３６】
抽出エキス量は、青ジソ生葉１ｇに対する抽出物（ｍｇ）で示され、その単位は（抽出物ｍｇ／生葉１ｇ）である。この数値が高いほど、抽出物の抽出効率が高いこととなる。
【００３７】
Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性試験は、青ジソ抽出物のＮｒｆ２−ＡＲＥ活性を数値化することによる評価方法である。
【００３８】
Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性試験は、例えば、ラットのＮＡＤＰＨ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）遺伝子のＡＲＥ配列を含むプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだ遺伝子カセットが導入されたラット副腎由来褐色細胞腫ＰＣ１２細胞（以下、単にＰＣ１２細胞）を用いて行うことができる。より具体的には、ＰＣ１２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で約２４時間培養させる。その後、青ジソ抽出物を、ウェル中の反応液１ｍｌに対する含有量が、青ジソ生葉０．１−５ｍｇに含まれる青ジソ抽出物となるように添加する。添加から約９時間後、ＡＲＥ活性化により生成されたルシフェラーゼの酵素活性を、ＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）や、化学発光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ社製のＡＲＶＯ  ＳＸＦＬ  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒなど）により測定する。結果は、青ジソ抽出物に替えて水を添加したコントロールを１とし、青ジソ抽出物１ｍｇあたりの活性を指数で表す。この指数が２００を越えると、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性の度合いが高いこととなる。
【００３９】
動物試験による抗酸化機能の確認試験は、青ジソ抽出物におけるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性での機能を確認するために行い、γ−ＧＣＳの発現量試験もしくはＮＱＯ１活性試験により行うことができる。
【００４０】
γ−ＧＣＳとは、グルタミン酸−システインリガーゼ（ＥＣ  ６．３．２．２）とも呼ばれ、γ−グルタミルシステイン合成酵素であり、グルタミン酸とシステインがペプチド結合したグルタチオンの前駆体を合成する酵素である。γ−グルタミルシステインは、グルタミン酸とシステインから合成され、さらにグルタチオン合成酵素（ＥＣ  ６．３．２．３）によってグリシンと反応しグルタチオンに変換される。本発明の青ジソ抽出物がＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化することによりγ−ＧＣＳの発現量を上昇させることでグルタチオン量が増加し、その結果、抗酸化機能が上昇するため、γ−ＧＣＳの発現量を測定することにより、青ジソによる抗酸化機能の上昇を評価することができる。
【００４１】
γ−ＧＣＳ発現量試験用の経口投与剤は、使用する青ジソ抽出物を溶媒に溶解させて作成することができる。このとき、γ−ＧＣＳ発現量試験のコントロール用経口投与剤には、青ジソ抽出物を含まない溶媒を用意する。本発明の青ジソ  亜臨界抽出物は水溶性であることから溶媒として水などを用いることができる。非水溶性の抽出物の経口投与剤を作成する場合は、オリーブオイルなどを溶媒として用いることができる。
【００４２】
予め２つのグループに分けたマウスを用意する。１つのグループには、青ジソ抽出物の経口投与剤を投与し、もう１つのグループには、コントロール用経口投与剤を投与する。それぞれのグループのマウスに経口投与剤を１日あたり一定量（目安２００μｌ）で４日間摂取させた後、マウスより脳、大腸、小腸、胃を摘出し、ＰＶＤＦ膜にＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に反応させて発色させ、ＩｍａｇｅＪなどによりγ−ＧＣＳの発現量を定量することができる。
【００４３】
そして、コントロール用経口投与剤を投与したグループにおける抗酸化機能を示すγ−ＧＣＳ量を１とし、青ジソ抽出物の経口投与剤を投与したγ−ＧＣＳ量を、グルタチオン合成酵素の発現量として指数化するなどにより評価することができる。
【００４４】
ＮＱＯ１活性試験用の経口投与剤も、使用する青ジソ抽出物を溶媒に溶解させて作成することができる。また、ＮＱＯ１活性試験のコントロール用経口投与剤には、青ジソ抽出物を含まない溶媒を用意する。本発明の青ジソ  亜臨界抽出物は水溶性であることから溶媒として水などを用いることができる。非水溶性の抽出物の経口投与剤を作成する場合は、オリーブオイルなどを溶媒として用いることができる。
【００４５】
予め２つのグループに分けたマウスを用意する。１つのグループには、青ジソ抽出物の経口投与剤を投与し、もう１つのグループには、コントロール用経口投与剤を投与する。それぞれのグループのマウスに経口投与剤を１日あたり一定量（目安２００μｌ）で４日間摂取させた後、マウスより脳、大腸、小腸、胃を摘出し、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，  ｙｅｌｌｏｗ  ｔｅｔｒａｚｏｌｅ）を用いて発色させ、５９５ｎｍで吸光度を測定することで抗酸化機能を定量化することができる。
【００４６】
そして、コントロール用経口投与剤を投与した抗酸化機能を示すＮＱＯ１活性の測定結果を１とし、青ジソ抽出物の経口投与剤を投与したＮＱＯ１活性の測定結果を指数化するなどにより評価することができる。
【００４７】
本発明の青ジソ  亜臨界抽出物は、前記製造方法により製造された青ジソ抽出物であり、従来技術であるエタノール抽出や１００℃以下の熱水による抽出方法で得られる青ジソ抽出物に比べて、抗酸化システムを活性化させる成分を高含有し、生体の抗酸化システムをより活性化させることを特徴とする。特に、本発明の青ジソ抽出物は、脳以外の臓器のみでなく、脳内においても抗酸化酵素発現作用を発揮し得ることを特徴とする。
【００４８】
従来技術である青ジソ  エタノール抽出物は、２’，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４’，６’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ（以降、ＤＤＣと称する。）を含有していることが確認されている。このＤＤＣにより、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性をさせると推定されている。また、エタノール抽出物は、不溶性成分であることから、ＤＤＣも不溶性成分であると推定される。
【００４９】
一方、本発明の青ジソ  亜臨界抽出物は、水溶性成分であることから、２’，３’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４’，６’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ（ＤＤＣ）以外に活性成分を含有していて、このＤＤＣ以外の活性成分が、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の活性を高めていると推定されている。さらに、ＤＤＣ以外の活性成分が、脳内での抗酸化システムを活性化し、γ―ＧＣＳの発現を上昇させていると推定されている。
【００５０】
前記青ジソ  亜臨界抽出物は、生体内の抗酸化酵素の発現を上昇させる機能を有する抽出物として使用することが好ましく、具体的には食品、化粧品、医薬品などとして使用することが好ましい。特に本発明の青ジソ抽出物は脳内の抗酸化酵素の発現を上昇させることから脳内で作用する機能を有する抽出剤として使用することがより好ましい。
【００５１】
前記青ジソ  亜臨界抽出物を、食品、化粧品、医薬品などとして使用する場合、他の成分を含有させてもよい。他の任意成分としては、着色料、甘味料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、苦味料、酸味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、可塑剤及び香料などが挙げられ、目的の剤型や摂取方法などに応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５２】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００５３】
＜試験用青ジソ抽出物の調製＞
実施例及び比較例における試験用青ジソ抽出物の調製工程を説明する。また、実施例及び比較例の主な処理条件を表１に示す。
【００５４】
実施例１
青ジソの生葉（２．２５９ｇ）を６０℃の恒温で１２時間乾燥した青ジソ  乾燥葉０．３３ｇ及び抽出溶媒として水６．６０ｇをステンレス製の耐圧容器に入れ、亜臨界処理時の温度１９５℃、亜臨界処理時の圧力１．４７ＭＰａ、処理時間１０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行い、亜臨界処理物を得た。亜臨界処理物をセルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液（亜臨界抽出液）を回収した。そして、亜臨界抽出液を凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製のＦＤＵ−２００）により−８０℃で１５時間乾燥させて粉末状態の青ジソ  亜臨界抽出物（１３４．０ｍｇ）を作製した。
【００５５】
実施例２
実施例２は、亜臨界処理時の温度１９５℃、亜臨界処理時の圧力１．４７ＭＰａ、処理時間３０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１０３．０ｍｇ）を作製した。
【００５６】
実施例３
実施例３は、亜臨界処理時の温度２１０℃、亜臨界処理時の圧力２．０２ＭＰａ、処理時間１０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１１９．０ｍｇ）を作製した。
【００５７】
実施例４
実施例４は、亜臨界処理時の温度２１０℃、亜臨界処理時の圧力２．０２ＭＰａ、処理時間２０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１２４．０ｍｇ）を作製した。
【００５８】
実施例５
実施例５は、亜臨界処理時の温度２１７．５℃、亜臨界処理時の圧力２．３５ＭＰａ、処理時間１０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１１８．５ｍｇ）を作製した。
【００５９】
実施例６
実施例６は、亜臨界処理時の温度２１７．５℃、亜臨界処理時の圧力２．３５ＭＰａ、処理時間２０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１２８．０ｍｇ）を作製した。
【００６０】
実施例７
実施例７は、亜臨界処理時の温度２１７．５℃、亜臨界処理時の圧力２．３５ＭＰａ、処理時間３０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１２０．０ｍｇ）を作製した。
【００６１】
実施例８
実施例８は、亜臨界処理時の温度２２５℃、亜臨界処理時の圧力２．７３ＭＰａ、処理時間１０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１３３．０ｍｇ）を作製した。
【００６２】
実施例９
実施例９は、亜臨界処理時の温度２２５℃、亜臨界処理時の圧力２．７３ＭＰａ、処理時間２０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（１２４．０ｍｇ）を作製した。
【００６３】
実施例１０
実施例１０は、亜臨界処理時の温度１４５℃、亜臨界処理時の圧力０．４２ＭＰａ、処理時間１０分（昇温時間は含まない）で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で、青ジソ  亜臨界抽出物（７７．３ｍｇ）を作製した。
【００６４】
比較例１（エタノール抽出）
青ジソの生葉１００ｇを７５℃の恒温で１２時間乾燥し、ミキサーで粉砕し青ジソの乾燥葉の粉末１５ｇを得た。乾燥粉末を１００％エタノール５００ｍｌに２日間浸した。３日目にエタノールを全量交換し、エタノールの交換日である３日目を含めて、さらに３日間浸し、合計５日間浸したエタノール処理物を得た。エタノール処理物をエバポレーター（東京理化器械株式会社製のＮ−Ｎ型）により濃縮させた後、エタノールに溶解させて回収し、窒素置換し、凍結乾燥機により−８０℃、１５時間乾燥させて、青ジソ  エタノール抽出物の粉末として２．４０７ｍｇを作製した。さらに、エタノール抽出物の粉末全量に水を加えて、再濃縮させることで濃縮液（３ｍｌ）が得られた。この濃縮液にオリーブオイル３ｍｌを加え、溶解し、青ジソ  エタノール抽出物（６ｍｌ）を作製した。
【００６５】
比較例２（熱水抽出）
青ジソの生葉１０ｇに水１００ｍｌを加え、９０℃で３０分静置することで抽出した。抽出後、セルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液（熱水抽出液）を回収した。そして、熱水抽出液を凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製のＦＤＵ−２００）により−８０℃で１５時間乾燥させて粉末状態の青ジソ  熱水抽出物を調製した。
【００６６】
＜評価＞
各実施例及び比較例で調製した青ジソ抽出物について、下記の評価を行った。
【００６７】
抽出率
各試験用青ジソ抽出物の質量を測定し、青ジソ生葉１ｇから抽出された抽出物量を算出した。結果は表１に示す。
【００６８】
Ｎｒｆ２−ＡＲＥ活性試験（細胞試験）
各試験用青ジソ抽出物のＮｒｆ２−ＡＲＥ活性を、ラットのＮＡＤＰＨ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）遺伝子のＡＲＥ配列を含むプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだ遺伝子カセットが導入されたラット副腎由来褐色細胞腫ＰＣ１２細胞（以下、単にＰＣ１２細胞）を用いたレポートアッセイにより調べた。ＰＣ１２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で約２４時間培養後、各試験用青ジソ抽出物を、ウェル中の反応液１ｍｌに対する含有量が、青ジソ生葉０．１〜５ｍｇに含まれる青ジソ抽出物となるように添加した。添加から約９時間後、ＡＲＥ活性化により生成されたルシフェラーゼの酵素活性を、ＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）及び化学発光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ社製のＡＲＶＯ  ＳＸＦＬ  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）により測定した。結果は、青ジソ抽出物に替えて水を添加したコントロールを１とする指数により、青ジソ抽出物１ｍｇあたりの活性を表１に示す。
【００６９】
γ−ＧＣＳ発現量試験（動物試験）
本発明の青ジソ抽出物による抗酸化作用を、当該青ジソ抽出物を摂取させたマウスにおけるγ−ＧＣＳの発現量により調べた。青ジソ抽出物として実施例６の青ジソ  亜臨界抽出物を用いた。９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウス（清水実験材料株式会社より購入）を各８匹ずつの３グループに分け、１日１回、計４日間胃ゾンデを用いて青ジソ  亜臨界抽出物を経口投与した。各グループにおける青ジソ  亜臨界抽出物の１回の投与量は、グループ１：２０ｇ／ｋｇ、グループ２：２００ｇ／ｋｇとした。青ジソ  亜臨界抽出物は１回の投与量が２００μｌとなるように水に溶解させた青ジソ  亜臨界抽出物水溶液を用いた。４日間の試験の後、各マウスの臓器（胃、小腸、大腸、脳）を摘出した。なお、コントロール１として青ジソ  亜臨界抽出物を含有しない水２００μｌを１日１回、計４日間胃ゾンデを用いて経口投与したマウスの臓器も摘出した。
【００７０】
摘出した各臓器を液体窒素で凍結後、一部を切り取って質量を測定し、１０％（ｗ／ｖ）になるようにｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えてホモジネート後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間冷却遠心し、ピペットマンを使用して上清を回収した。タンパク定量を行い、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにより希釈してタンパク濃度を揃え、調製した検体と同量のｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２４  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％  Ｂ．ｂｌｕｅ、４％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を加えた。１００℃で５分間熱変性させたものをサンプルとし、これをＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供して分離させ、次いでＰＶＤＦ膜に転写した。５質量％スキムミルク入りＴＢＳＴバッファーにより室温で１時間ブロッキング反応を行い洗浄した後、一次抗体（γ−ＧＣＳ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＮｏ．ＳＣ−２２７５５））を１：１０００希釈により一晩反応させた。その後二次抗体（抗ウサギＩｇ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＮＡ９３４Ｖ））を１：１０００希釈となるように添加して１時間反応させ、ＰＶＤＦ膜にＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）をかけて１分間反応させて発色させ、ＩｍａｇｅＪによりγ−ＧＣＳの発現量を定量した。発現量の定量結果は、前記コントロール１の発現量を１とする指数で表２に示した。
【００７１】
ＮＱＯ１活性試験（動物試験）
青ジソ  亜臨界抽出物との対比を行うため比較例１の青ジソ  エタノール抽出物を用いた。青ジソ  亜臨界抽出物で行った動物実験と同様に、８匹のマウスに、１日１回、計４日間、青ジソ  エタノール抽出物３００μｌを胃ゾンデを用いて経口投与した。経口投与したエタノール抽出物３００μｌは、青ジソ生葉重量５ｇに該当し、１日投与量２００ｇ／ｋｇとした。なお、前記の動物実験をグループ３とし、４日間の試験の後、各マウスの臓器（胃、小腸、大腸、脳）を摘出した。また、コントロール２として青ジソ  エタノール抽出物を含有しないオリーブオイル２００μｌを１日１回、計４日間胃ゾンデを用いて経口投与したマウスの臓器も摘出した。
【００７２】
摘出した各臓器を１０％（ｗ／ｖ）になるようにＰｏｔａｓｓｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １ｍＭ  ＥＧＴＡ）を加えて、ホモジネートにしたものをサンプルとした。ＭＴＴを用いて発色させ、５９５ｎｍで吸光度を測定した。ＮＱＯ１活性の測定結果は、前記コントロール２の発現量を１とする指数で表２に示した。
【００７３】
また、図１には胃における抗酸化機能の測定結果を、図２には小腸における抗酸化機能の測定結果を、図３には大腸における抗酸化機能の測定結果を、図４には脳における抗酸化機能の測定結果を示した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
【表２】
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【００７６】
図１には、胃における抗酸化機能の測定結果を示し、図２には、小腸における抗酸化機能の測定結果を示し、図３には、大腸における抗酸化機能の測定結果を示し、図４には、脳における抗酸化機能の測定結果を示した。
【００７７】
表１の抽出エキス量の結果より、本発明の青ジソ  亜臨界抽出物での抽出エキス量は、従来技術である青ジソ  エタノール抽出物よりも抽出量が高いことが確認され、さらに、亜臨界処理時の温度が１９５℃以上の条件では、さらに抽出量を高められることが確認された。
【００７８】
表１のＡＲＥ活性指数の結果より、本発明の青ジソ  亜臨界抽出物が、抗酸化酵素を発現誘導するシステムであるＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化する作用に優れ、生体内の抗酸化酵素の発現を上昇させる効果に優れることがわかる。また、亜臨界処理時の温度２１０℃以上では、ＡＲＥ活性指数がさらに高められることが確認された。本発明の青ジソ抽出物の製造方法がより効率的に青ジソ抽出物を製造する製造方法であることがわかる。
【００７９】
表２及び図１〜４の結果より、本発明の青ジソ  亜臨界抽出物が、マウスの胃、小腸、大腸に加え脳においてもγ−ＧＣＳの発現を上昇させ、抗酸化機能を増大することが確認された。すわなち、本発明における青ジソ抽出物は、脳内においても抗酸化作用を発揮し得ることがわかる。それに対して、従来技術である青ジソ  エタノール抽出物は、マウスの胃、小腸、大腸においても抗酸化機能が増大することが確認されが、脳においては抗酸化機能に変化がみられなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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