(57)【要約】      （修正有）【課題】酢酸生成菌の非存在下で、メトキシ化合物から直接メタンを生成することのできる新規微生物及び当該微生物を用いたメトキシ化合物からメタンを生成する方法の提供。【解決手段】日本の高温油田貯留層から単離されたMethermicoccaceae科に属する微生物、及び、当該微生物を用いたメトキシ化合物を基質とするメタン生成方法。前記微生物は受託番号ＤＳＭ−１８８５６（Ｔ）のＺＣ株ではなく、受託番号ＮｉＴＥ  Ｐ−０２０７６のＡｍａ株であることが好ましく、メトキシ基を有する芳香族化合物から直接メタンを生成する作用を有することが望ましい微生物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有し、かつ、Methermicoccaceae科に属する微生物(ただし、前記微生物は受託番号DSM 18856(T)のZC-1株ではない)。
【請求項２】
(ａ)配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸、又は、
(ｂ)配列番号１に記載の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
を含む16SrRNA遺伝子を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物(ただし、前記微生物は受託番号DSM 18856(T)のZC-1株ではない)。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物であって、前記微生物が受託番号NITE P-02076のAmaM株であるか、又は、前記AmaM株の菌学的特徴を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を含むメタン生成促進剤。
【請求項５】
(ａ)配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸、又は、
(ｂ)配列番号２に記載の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
を含む16SrRNA遺伝子を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物を含む、メタン生成促進剤。
【請求項６】
受託番号DSM 18856(T)のZC-1株であるか、又は、前記ZC-1株の菌学的特徴を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物を含む、メタン生成促進剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のメタン生成促進剤であって、担体をさらに含むメタン生成促進剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物、又は、請求項４〜７のいずれか一項に記載のメタン生成促進剤を用いて、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する工程を含む、メタンの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物および当該微生物を用いたメトキシ化合物(メトキシ基を有する芳香族化合物)からメタンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油及びガスの貯留層内に存在する微生物由来のメタンは、地下に埋めこまれた堆積物内の有機物質が、地質学的な時間の尺度で生分解を受けることにより生成される。このように微生物により生成されるメタンは、世界中の天然ガス資源としてのメタン資源のうち、２０％以上の割合を占めると推測されている(非特許文献１)。そのため、深部地下生物圏における有機物からメタンが生成するメカニズムの解明は、地球規模の炭素循環の理解に留まらず、天然ガス資源の形成およびその分配を理解することにつながり、その解明が望まれている。
深部地下生物圏に存在するメタン生成菌は、例えばH2/CO2、ギ酸、酢酸、又はメチル化合物(メタノール、メチルアミン、ジメチル硫化物など)のような非常に限られた基質からメタンを生成する。これらの基質は、深部地下生物圏におけるケロジェン、石炭、原油などの主要な有機物の生分解や熱分解による生成物であると考えられている。しかしながら、これらの有機物が、どのような反応経路によりメタン生成菌が資化可能な基質へと変換されるのか、また、どのような微生物が特定の反応の担い手であるのか等の、分解経路の詳細に関して現在得られている情報はわずかである。
深部地下生物圏において、メタン生成菌が資化可能な基質を供給する重要な経路の一つとして推測されるのが、メトキシ基を有する芳香族化合物(methoxylated aromatic compounds: MACs)から酢酸を生成する経路である。そして、わずかな電子受容体しか存在しない深部地下生物圏の条件下においては、MACs由来の酢酸を介してメタンが生成可能であると考えられている。すなわち、酢酸は、深部地下生物圏の環境におけるメタン生成のための最も重要な直接の前駆体であると指摘されている(非特許文献２〜４)。
ここで、メタン生成菌(methanogenic archaea もしくは methanogens)の代謝経路は大きく分けて、（１）水素酸化(二酸化炭素還元)型(hydrogenotrophic)、（２）酢酸資化型(acetoclastic)、及び、（３）メチル化合物資化型(methylotrophic)の３つのタイプに分類されることが知られている。これら３つの代謝経路の基質となる物質は、主に発酵性細菌による有機物の分解物である。そのため、メタン生成菌によるメタン生成は、基質の供給元である発酵性細菌との共生に依存している。
深部地下生物圏において酢酸を供給する微生物として、酢酸生成菌(acetogens)が知られている。酢酸生成菌として知られている微生物の多くは、メトキシ化合物の脱メチル化工程を含む酢酸の生成経路を有しており、シリンガ酸(syringic acid)やバニリン酸(vanillic acid)のようなMACsを基質として利用することが知られている。また、堆積物の続成作用の初期段階にある石炭やケロジェンにおいてはリグニン由来の化学構造がよく保存されているが(非特許文献５)、当該リグニンを構成する３つのモノマーのうち、コニフェリルアルコール及びシナピルアルコールの２つの化合物はMACsに属する。よって、深部地下生物圏に存在する微生物はリグニンを構成するようなMACsから酢酸を生成している可能性がある(非特許文献６)。なお、深部地下生物圏における酢酸生成菌の存在は、深部地下生物圏の堆積有機物中のMACsを基質として酢酸生成菌が酢酸を生成していることを支持するものである(非特許文献７〜９)。
このように、深部地下生物圏において、メタン生成菌は、基本的に酢酸生成菌由来の酢酸の供給に依存して、MACs由来の酢酸を利用してメタンを生成していると考えられていた。また、MACsを直接資化可能なメタン生成菌および当該菌によるメタン生成経路についてはこれまで全く報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Rice and Claypool, Am. Assoc. Pet. Geol. Bull., vol. 74 (1981)
【非特許文献２】Wellsbury et al., Nature 388:573-576 (1997)
【非特許文献３】Vieth et al., Organic Geochemistry:39, 985-991 (2008)
【非特許文献４】Mayumi, D. et al., Environ Microbiol, 13 (2011)
【非特許文献５】Vandenbroucke, M. and Largeau, C., Organic Geochemistry, 38 (2007)
【非特許文献６】Lever, C. et al., Hippocampus 20(2): 229-234 (2010)
【非特許文献７】Lever. C. et al., Cell, 149(1):18-20, (2012)
【非特許文献８】Liu, S. and Suflita, J. M., Trends Biotechnol, 11:344-352 (1993)
【非特許文献９】Krumoholz et al., Applied and Environmental Microbiology, 65:2300-2306 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、メトキシ化合物から直接メタンを生成することのできる新規微生物の提供と、当該微生物を用いたメトキシ化合物からメタンを生成する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者らは、深部地下生物圏においてメタン生成に寄与する有用な新規微生物の分離培養について鋭意検討した結果、日本国内において、高温の石油貯留層より回収した油層水から新規な微生物株(Methermicoccus shengliensis AmaM株)を単離することに成功した。
この微生物は、驚くべきことに、酢酸生成菌の非存在下で、メトキシ化合物から直接、メタンを生成する経路を有していた。これまでメトキシ化合物がメタン生成菌の直接の基質となることは全く知られておらず、上記のようにメトキシ化合物から直接メタンを生成可能なメタン合成経路も、今までに報告がなかった。このような微生物及びMACsを直接の基質とするメタン合成経路は本発明者らにより初めて見出されたものである。
また、これまでにMethermicoccus shengliensisに属する株としてZC-1株が報告されていたが（Cheng L., Int J Syst Evol Microbiol. 57: 2964-2969 (2007)）、ZC-1株が、メトキシ化合物からメタンを直接生成する経路を有するか否かについては明らかにされていなかった。本発明者らは、ZC-1株についてもAmaM株と同様にメトキシ化合物からメタンを直接生成する経路を有していることを初めて明らかにした。
本発明は、上記知見に基づき完成された発明である。
【０００６】
すなわち、本発明は、
〔１〕メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有し、かつ、Methermicoccaceae科に属する微生物(ただし、前記微生物は受託番号DSM 18856(T)のZC-1株ではない)に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔２〕(ａ)配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸、又は、
(ｂ)配列番号１に記載の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
を含む16SrRNA遺伝子を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物(ただし、前記微生物は受託番号DSM 18856(T)のZC-1株ではない)に関する。
【０００７】
ここで、本発明の微生物は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の微生物であって、前記微生物が受託番号NITE P-02076のAmaM株であるか、又は、前記AmaM株の菌学的特徴を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物であることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一つに記載の微生物を含むメタン生成促進剤に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔５〕(ａ)配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸、又は、
(ｂ)配列番号２に記載の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸
を含む16SrRNA遺伝子を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物を含む、メタン生成促進剤に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔６〕受託番号DSM 18856(T)のZC-1株であるか、又は、前記ZC-1株の菌学的特徴を有し、かつ、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物を含む、メタン生成促進剤に関する。
【０００９】
ここで、本発明のメタン生成促進剤は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔４〕〜〔６〕のいずれか一つに記載のメタン生成促進剤であって、担体をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔８〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一つに記載の微生物、又は、上記〔４〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のメタン生成促進剤を用いて、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する工程を含む、メタンの生成方法に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、
〔９〕メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物をスクリーニングする方法であって、
メトキシ基を有する芳香族化合物を含む培地で微生物を含む試料を培養する工程を含む、スクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単独で、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有するMethermicoccaceae科に属する微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１(ａ)は、Methermicoccus shengliensis AmaM株を透過型電子顕微鏡(TEM)により撮影した画像を示す。図１(ｂ)は、Methermicoccus shengliensis AmaM株を走査型電子顕微鏡(SEM)により撮影した画像を示す。
【図２】図２は、Methermicoccus shengliensis AmaM株を、2-メトキシベンゾエートを基質として培養した際のメタン、2-ヒドロキシベンゾエート、及び、2-メトキシベンゾエートの濃度を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、Methanosarcinales目に属する１０の属について、７種のMACsを基質として培養した際のメタン生成量を示すグラフである。
【図４】図４は、Methermicoccus shengliensis AmaM株及びZC-1株におけるMACsについての基質特異性を示す図である。
【図５】図５は、下記実施例「５．石炭からのメタン生成」で使用した石炭(褐炭(lignite)、亜瀝青炭(subbituminous)、瀝青炭(bituminous))を示す写真図である。
【図６】図６は、褐炭、亜瀝青炭、又は、瀝青炭を含む培養液中でAmaM株を培養した際に生成したメタンの量を示すグラフである。
【図７】図７は、褐炭、亜瀝青炭、又は、瀝青炭を含む溶液をオートクレーブ処理(121℃、20分間)した際に検出したMACsを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Methermicoccus shengliensis AmaM株(NITE P-02076)は、基質としてメタノールを使用する集積培養法により、日本の高温の油田貯留層から単離された。
AmaM株が分類される、Methermicoccus属は、Methanosarcinales目Methermicoccaceae科に唯一存在する属である。このMethermicoccus属に属する株としては、AmaM株の他、ZC-1株(ドイツ微生物細胞培養コレクションにおける受託番号DSM 18856(T))が知られている。
このMethermicoccaceae科の微生物(古細菌またはアーキア)は、メチル化合物を資化利用するメタン生成菌であり、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、及び、トリメチルアミンの存在下で生育する。一方、Methermicoccaceae科の微生物は、H2/CO2、ギ酸塩、酢酸塩、アルコール、や上記に列挙するメチル化合物(メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、及び、トリメチルアミン)以外のメチル化合物は生育に利用しない。さらに、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、及び、トリメチルアミンなどのメチル化合物に加えて、Methermicoccaceae科の微生物は、MACsを唯一の炭素源とする条件下で生育することができる。すなわち、Methermicoccaceae科の微生物は、他の共生細菌を必要とせずに、単独で、メトキシ基を有する芳香族化合物を基質としてメタンを生成することができる。
【００１３】
このように、本発明は、メトキシ基を有する芳香族化合物から直接メタンを生成する作用を有する微生物を提供するものである。
ここで、本発明の微生物というとき、「メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する」微生物をいい、好ましくはMethermicoccaceae科の微生物であり、より好ましくはMethermicoccus 属の微生物であり、さらに好ましくはMethermicoccus shengliensisに属する微生物である。また、本発明は、言い換えれば、メトキシ化合物資化性のメタン生成菌を提供するものである。
【００１４】
ここで、本明細書において、「メトキシ基を有する芳香族化合物」は、ベンゼン環を構成する少なくとも１つの炭素原子にメトキシ基が結合している芳香族の化合物をいう。よって、「メトキシ基を有する芳香族化合物」には、ベンゼン環を構成する少なくとも１つの炭素原子にメトキシ基が１つ以上結合している芳香族の化合物が広く含まれる。このような化合物は、以下に限定されないが、少なくとも１つのメトキシ基を有する芳香族化合物であって、（ｉ）当該化合物のベンゼン環を構成する炭素に対して、ヒドロキシル基、カルボキシ基、アルデヒド基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、アセチル基、アセトキシ基などの官能基が１つ又は複数結合しているもの、（ｉｉ）ベンゼン環に付加する水素原子がハロゲン原子(例えば、塩素)に置換したもの、若しくは、前記(ｉ)の化合物における官能基に存在する水素原子がハロゲン原子に置換したもの、又は、（ｉｉｉ）ベンゼン環を構成する炭素が窒素等により置換されたヘテロ芳香族化合物であるもの、などが含まれる。
Methermicoccaceae科の微生物は、このようなメトキシ基を有する芳香族化合物を広く基質としてメタン生成に利用することが可能である。
【００１５】
また、本発明のメトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物は、メトキシ基を有する芳香族化合物からＯ−脱メチル化反応により、メタンを生成する代謝経路を有することを特徴とする。
これにより、本発明により提供する微生物は、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する。
【００１６】
本発明の微生物の単離方法としては、例えば、土壌等の自然界由来の試料を、適当な有機物(メタノールやMACsであり、望ましくはMACsのみ)を含む基本培地(培養液)に添加する。その後、ガスクロマトグラフィー等を用いてメタンの生成が確認された際に、培地に含まれる菌を本発明に係る微生物として単離する方法が挙げられる。この際、継代培養を任意に行ってもよい。シングルコロニーは、増殖した株を適当な方法で希釈し、例えばロールチューブ法により単離することができる。本発明者らは上記方法より、日本国内において、高温の石油貯留層より回収した油層水よりAmaM株を単離することができた。また、上記のような方法を利用することにより、本発明の微生物をスクリーニングすることが可能である。また、下記に記載するような遺伝子工学的手法を用いてスクリーニングを行うこともできる。例えば、16SrRNA遺伝子の塩基配列の同一性解析や、上記代謝経路に関与する遺伝子又はそのホモログの有無を確認することにより行うことができる。
【００１７】
ここで、本発明者らにより単離されたMethermicoccus shengliensis AmaM株は、配列番号１に記載の塩基配列からなる16SrRNA遺伝子を有していた。また、Methermicoccus shengliensis ZC-1株は、配列番号２に記載の塩基配列からなる16SrRNA遺伝子を有している。すなわち、本発明の微生物には、メトキシ基を有する芳香族化合物を基質としてメタンを生成する性質を有するものであって、かつ、16SrRNA遺伝子が、配列番号１若しくは２に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１若しくは２に記載の塩基配列と85％以上(好ましくは90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、最も好ましくは100％)の同一性を有する微生物も含まれる。なお、配列番号１又は２に記載の塩基配列と85％以上の同一性を有する16SrRNA遺伝子を有する微生物としては、例えば、アクセッション番号JQ989653、FJ712387、JQ245658、AY835421、HQ916496、JQ817919、KC574884、JQ816358、HQ700677、DQ837291、JQ989403、JQ817507、DQ228531、DQ787474、GU179506、AY835420、AY835418、HQ692052で特定される16SrRNA遺伝子を有する微生物を挙げることができる。上記に列挙する16SrRNA遺伝子を有する微生物群は、16SrRNA遺伝子の配列の同一性からMethermicoccaceae科に属する微生物に分類される。また、これらのうち、DQ787474、GU179506、AY835420、AY835418、HQ692052で特定される16SrRNA遺伝子を有する微生物は、配列番号１又は２に記載の塩基配列と94%以上の同一性を示す16SrRNA遺伝子を有し、Methermicoccus属に属する可能性が高い。
なお、当業者であれば、16SrRNA遺伝子が上記の同一性を有していることを確認するために、適当にプライマーを設計して微生物の16SrRNA遺伝子の塩基配列をPCR法により増幅し、PCR産物を用いて塩基配列を決定することができる。さらに、決定された塩基配列は、BLAST(DNA Data Bank of Japan(DDBJ)のホームページ(http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)に掲載のプログラム)、ClustalXやGenetyxといったソフトウェアを使用して、他の系統の16SrRNAとの配列における同一性を比較することができる。
本明細書において塩基配列の同一性というとき、比較すべき２つの核酸配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率で表したものである。本明細書では、配列間の同一性のことを、類似性、相同性ということもあるものとする。当業者であれば、BLAST、ClustalXやGenetyxといったソフトウェアのパラメーターを適当に設定し、塩基配列の同一性を決定することができる。
【００１８】
本発明のメトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有する微生物としては、AmaM株又はZC-1株からなる群より選択されるものが挙げられる。なお、本発明の微生物には、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有し、かつ、上記AmaM株又はZC-1株の菌学的特徴を有するMethermicoccaceae科の微生物も含まれる(ここで、Methermicoccaceae科の微生物とは、好ましくはMethermicoccus属の微生物である)。また、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する作用を有するものであれば、自然の又は人工の手段によって変異させた上記株の変異体であってもよく、上記の作用を有するものは、本発明の微生物に包含される。
【００１９】
本発明の微生物は、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、及び、トリメチルアミンなどのメチル化合物、並びに、メトキシ基を有する芳香族化合物からメタンを生成する。
メタンの生成条件は、適当な炭素源を含む基本培地で本発明の微生物を培養することを含む。例えば、無酸素環境下(培養器のヘッドスペースガスとしてN2/CO2混合ガス等を用い、硫化ナトリウムやシステイン塩酸塩等の適切な還元剤を培地に添加した条件下)において、メトキシ基を有する芳香族化合物を含む培地で適当な温度下で適当な日数培養すればよい。
【００２０】
本発明の微生物を培養する際に用いる培地としては、本発明の微生物が生育できるものであれば特に制限はないが、液体培地が好ましい。また、MACsもしくはメタノール等のメチル化合物を添加した培地が好ましく、MACsやメチル化合物を唯一の炭素源とする培地がより好ましい。具体的には、純水やミネラル・塩類のみを含む各種最小培地に対しMACsを添加したものが好ましい。なお、培地のpHは、例えばpH6〜8程度とすることができ、好ましくは7程度とする。
【００２１】
本発明の微生物の培養条件は、嫌気条件下で行うことができ、静置培養、振盪培養、回転振盪培養等、公知の培養方法により培養を行うことができる。培養温度は、50〜65℃程度の範囲が好ましいがその範囲に限定されない。
上記のような培養条件下での培養において、培地にMACsを添加しておくことで本発明の微生物を利用してMACsからメタンを生成することができる。
また、発明の微生物の保管は、常法に従って行うことができ、例えば凍結法で保管することができる。保管条件は適宜設定し得るが、例えば、凍結法であれば、終濃度10〜20％のグリセロール存在下で、−80℃の条件で保管し得る。
【００２２】
AmaM株の菌学的特徴を以下に記載する。
なお、下記のようなAmaM株の菌学的特徴を有し、かつ、MACsからメタン生成する作用を有する微生物は本発明の微生物に含まれる。
〔形態的性質〕
（１）細胞の形及び大きさ：AmaM株は光学顕微鏡により細胞形態は球菌であり、菌の直径は約0.7〜1.0μm程度であった。
（２）運動性の有無：AmaM株は運動性を示さなかった。
なお、図１に、AmaM株を透過型電子顕微鏡(TEM)及び走査型電子顕微鏡(SEM)により撮影した画像を示す。
【００２３】
〔培養的性質〕
AmaM株の寒天培地上でのコロニー形態は、直径約0.5〜1.0mm、色調は黄褐色、形は円盤状であった。
【００２４】
〔生理学的性質〕
最適生育pHは6.5〜7.5である。生育可能pHは4.5〜7.0である。生育可能温度は40℃〜65℃である。最適生育温度は60℃である。
・酸素要求性：絶対嫌気性
・利用基質：メトキシ化合物、メチル化合物
【００２５】
〔化学分類学的性質〕
AmaM株のDNAを抽出し、PCR法により16SrRNA遺伝子のDNA配列を増幅し、得られたPCR産物の塩基配列についてシークエンサーを用いて配列決定した。得られた塩基配列を用いてBLAST検索を行い、類似する塩基配列を調べた。
その結果、16SrRNA遺伝子について、AmaM株は、ZC-1株と99.9％の高い配列同一性が示された。
また、AmaM株のゲノムのGC含量は、55mol％であった。Methermicoccus shengliensisに属するAmaM株とZC-1株とのDNAハイブリダイゼーションは、AmaM株をプローブとした場合に76％の同一性を有し、ZC-1株をプローブとした場合に78％の同一性を有していた。
【００２６】
なお、ZC-1株の菌学的特徴については公知であり、例えば、下記特徴を有する。下記のようなZC-1株の菌学的特徴を有し、かつ、MACsからメタン生成する作用を有する微生物は本発明の微生物に含まれる。
〔形態的性質〕
（１）細胞の形及び大きさ：ZC-1株は光学顕微鏡により細胞形態は球菌であり、菌の直径は約0.7〜1.0μm程度である。
（２）運動性の有無：ZC-1株は運動性を示す。
〔培養的性質〕
ZC-1株の寒天培地上でのコロニー形態は、直径約1〜5mm、黄色、全縁で半レンズ状の円形コロニーであった。
【００２７】
〔生理学的性質〕
最適生育pHは6.0〜6.5である。生育可能pHは5.5〜8.0である。生育可能温度は50℃〜70℃である。最適生育温度は65℃である。
・酸素要求性：絶対嫌気性
・利用基質：メトキシ化合物、メチル化合物
【００２８】
〔化学分類学的性質〕
ZC-1株のゲノムのGC含量は、56mol％であった。
【００２９】
また、本発明は、別の態様として、本発明の微生物を含むメタン生成促進剤を提供する。本発明のメタン生成促進剤は、メトキシ基を有する芳香族化合物から直接メタンを生成する作用を有するものである。すなわち、本発明のメタン生成促進剤は、メトキシ基を有する芳香族化合物から直接メタンを生成するために使用することができる。なお、本発明のメタン生成促進剤には、本発明の微生物を含有し、そのほかに適宜担体や緩衝剤、無機塩類、ビタミン類、金属類等を含有することができる。
メタン生成促進剤中の微生物の濃度は、メタン生成の作用が発揮される限りにおいて限定されず、適用対象や適用する態様により適宜調整することができる。なお、例えば、1×107〜1×1012cells/mlの範囲とすることができる。なお、微生物の含有形態としては、特に限定されず、生菌体、凍結菌体等とすることができる。
また、メタン生成促進剤に含まれる担体としては、液状、固形状のもので微生物が担持・保持されるものであれば特に限定されず、例えば多孔性セラミクス、活性炭、多孔性ポリマー、キトサン、おがくず、穀物殻、動植物繊維、砂、珪藻土、粉ミルク、及びそれらをスラリー化したもの等を用いることができる。メタン生成促進剤中の担体量は、使用する用途、担体の種類等によって適宜設定することができる。
本発明の微生物、又は、本発明の微生物を含むメタン生成促進剤を用いてメタンを生成する方法は、本発明の微生物が資化可能な基質(続成が進んでいない石炭など)を含む培地、土壌、若しくは、深部地下生物圏における堆積物、又は、ケロジェン、ガス田、炭田、石炭層等にメタン生成促進剤を投与することにより行うことができる。
【００３０】
これより本発明を実施例とともに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されない。また、以下の実施例に用いた全てのメトキシ基を有する芳香族化合物は、全て和光純薬工業(東京、日本)及びシグマアルドリッチ(Sigma-Aldrich；ミズーリ州、米国)より購入した。
【実施例】
【００３１】
（１．メトキシ基を有する芳香族化合物を基質とするメタン生成）
AmaM株が、メトキシ基を有する化合物である2-メトキシベンゾエートを炭素源としてメタン生成可能であるか否かを確認するため、以下の試験を行った。
2-メトキシベンゾエートを含む溶液(終濃度10mM)は純水を用いて調製した。また、調製した溶液は、MOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)バッファーを用いてpHを7.0〜8.0に調整した後、N2気相条件下で121℃で20分間オートクレーブ処理を行った。オートクレーブ処理後の2-メトキシベンゾエートを含む溶液を、ゴム栓つきの70ml容量バイアル容器中に20ml移した。次に、AmaM株を当該バイアル容器中に移して数週間培養した。培養は、AmaM株の最適温度(60℃)において嫌気条件下培養を行った。なお、メタンは熱伝導度検出器を備えるガスクロマトグラフ(GC-8A、島津、京都、日本)を用いて定期的に測定した。また、2-メトキシベンゾエート及び2-ヒドロキシベンゾエートについてはHPLCを用いて定期的に測定をした。
【００３２】
その結果を図２に示す。AmaM株を2-メトキシベンゾエートとともにインキュベートしている間、AmaM株はメタン及び2-ヒドロキシベンゾエートを生成した。一方で、培養液中の2-メトキシベンゾエートは減少を示した(図２)。なお、生成した2-ヒドロキシベンゾエートの量は、減少した2-メトキシベンゾエートの量とほぼ等しかった。これは、AmaM株が、メトキシ基のＯ−脱メチル化を通してメタンを生成したことを示す(4R-OCH3＋2H2O→4R-OH＋3CH4＋CO2)。メトキシ基を有する化合物を基質としてメタン生成する反応において、化学量論の観点からは、1molのメトキシ基から3/4molのメタンが生産できると考えられる。しかしながら、本試験におけるメタンの収率は約3/5molであり、予測値よりもかなり低い値であった。メタンとして回収できなかった炭素(15％)は、いくつかのメチル資化性のメタン生成菌で見られるように、AmaM株の生育に利用されたと考えられる(Penger et al., 2012, AEM)。
【００３３】
（２．Methanosarcinales目微生物によるMACsを基質としたメタン生成）
M.shengliensis属は、Methanosarcinales目Methermicoccaceae科に分類される唯一の属である。なお、これまでに報告されている全てのメチル資化メタン生成菌は、Methanosarcinales目に属する。その他のメタン生成菌がMACsについても利用できるかどうか確認するために、Methanosarcinales目に属する１０の属について、７種のMACsを基質とした培養による生育を試みた。
なお、試験に用いた１０の属は、Methermicoccaceae科Methermicoccus属、Methanosaetaceae科Methanosaeta属、Methanosarcinaceae科Methanomicrococcus属、Methanosarcinaceae科Methanolobus属、Methanosarcinaceae科Methanococcoides属、Methanosarcinaceae科Methanohalobium属、Methanosarcinaceae科Methanohalophilus属、Methanosarcinaceae科Methanosalsum属、Methanosarcinaceae科Methanomethylovorans属、及びMethanosarcinaceae科Methanosarcina属である。
これらの属に属する株として、M. shengliensis ZC-1(DSM 18856(T))、M. thermophile DSM6194(T)、M. blatticola DSM13328(T)、M. tindarius DSM2278(T)、M. methylutens DSM2657(T)、M. evestigatus DSM3721(T)、M. mahii DSM5219(T)、M. zhilinae DSM4017(T)、M. hollandica DSM15978(T)をドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH:DSMZ)より入手した。また、M. barkeri NBRC100474(T)を、独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE Biological Resource Center: NRBC)より入手した。
本試験に用いたMACsは、2-メトキシベンゾエート、3-メトキシベンゾエート、4-メトキシベンゾエート、3,4,5-トリメトキシベンゾエート、3,4,5-トリメトキシシンナメート、3,4,5-トリメトキシベンゼン、3,4,5-トリメトキシベンジルアルコールの７種を用いた。
上記に列挙したメタン生成菌によるメタン生成能を試験するために、上記実施例「１．メトキシ基を有する芳香族化合物を基質とするメタン生成」に記載の方法と同様にして、メタン生成菌の培養及び生成したメタンの測定を行った。なお、培地については、必要に応じて適宜それぞれのメタン生成菌に適した塩濃度及びpHとなるように無機培地(Sekiguchi, 2000,IJSEM)をわずかに修正して用いた。なお、各MACsは、メトキシ基の終濃度が30mMとなるように培地に添加した。培養は９ヶ月間行い、培養後に生成したメタンを実施例１と同様にして測定した。
【００３４】
その結果、Methermicoccus shenglienesisであるZC-1株においてのみ、有意なメタン生成を観察することができた(図３)。なお、ZC-1株は、AmaM株と16SrRNA遺伝子において99.9％の同一性を有しており、AmaM株と最近縁種である。この結果より、MACsを利用できる特性は、唯一の属・種であるMethermicoccus shenglienesisを有するMethermicoccaceae科に備わるものであると考えられる。なお、図３において、わずかにメタンを検出した試験区があったが、これらの区ではそれぞれの微生物株がMACsを利用してメタンを生成したのではなく、前培養からのメタンの持ち込み等の影響によりメタンが検出されたと考えられる。
【００３５】
（３．MACsの検討）
MACsには、ベンゼンやフェノール、ベンゾエートなどのコア分子の多様性と、ベンゼン環に結合するメトキシ基の数や位置により、非常に多くの化合物が含まれる。そこで、AmaM株及びZC-1株がどのような種類のMACsを利用可能であるかを確認するため、下記表１に列挙する３７種のMACsについてAmaM株及びZC-1株による資化利用を検討した。なお、試験の方法は、上記実施例「１．メトキシ基を有する香族化合物を基質とするメタン生成」に記載の方法と同様にして行った。その結果を表１及び図４に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
AmaM株、ZC-1株は、市販の３７種のMACsのうち、それぞれ３５種及び３４種のMACsを利用可能であった。また、例え、メトキシ基の数や結合部位が同じであったとしても(例えば、3,4,5-トリメトキシベンゾエートと3,4,5-トリメトキシフェノールとの比較においても)、生成されたメタンの収量は、各MACsのコア分子の違いにより差異が生じた。これは、MACsの利用率がメトキシ基の数や結合部位と関連する立体障害よりも、コア分子における官能基と関連する水溶性のような化学特性に依存することを示唆する。
【００３８】
（４．石炭からのメタン生成）
微生物生態学及び生物地球科学的炭素循環における、メトキシ化合物資化性のメタン生成の意義を理解するために、Methermicoccaceae科Methermicoccus属のメタン生成菌が生育する深部地下生物圏における、堆積している有機物からのメタン生成に注目した。MACsは高等植物を構成するリグニンの構造を構成する物質である(Stafford, 1987, Phytochemistry)。リグニンは、続成作用に対して相対的に安定しているため、石炭やケロジェンのような深部地下生物圏における不溶性有機物質中には、リグニン由来の化学構造がよく保存されている(Stout et al., 1988,; Vandenbroucke and Largeau, 2007)。しかしながら、芳香族のメトキシ基は、続成作用の初期段階において脱メチル化されるため、結果としてメトキシ基は減少する(Hatcher and Clifford, 1997)。そのため、より続成過程が進んでいない石炭やケロジェンにおいて、メトキシ基がより豊富に存在することを期待した。
【００３９】
MACsは典型的なリグニンの熱分解生成物であり(Saiz-Jimenez and de Leeuw, 1986)、MACsは熱熟成度が低い石炭やケロジェンの中にも含まれる。実際、アルキルメトキシフェノールは、白亜紀黒色頁岩中のケロジェンの熱分解生成物中に検出できる。なお、当該ケロジェンの熟成度は初期の段階にあると予想される。そのため、未熟成な石炭やケロジェンの熱分解は、MACsの生成を生じ、Methermicoccaceae科Methermicoccus属のメタン生成菌は、このようにして生じたMACsを深部地下生物圏においてメタン生成のための基質として利用することができる。
【００４０】
この可能性を検証するために、異なる熱熟成度を有する石炭、すなわち、褐炭(lignite)、亜瀝青炭(subbituminous)、瀝青炭(bituminous)についてメタン生成の基質としての利用を確認した。本試験に使用した石炭は、国立研究開発法人産業技術総合研究所より入手した(図５及び表２)。
【表２】
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粉砕した各石炭1gを含む培地をN2気相条件下で121℃で20分間オートクレーブ処理することにより石炭からMACsの抽出を行った。その後、培地をMOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)バッファーによりpH8に調整し、AmaM株とともにインキュベーションを行った。インキュベーションは、60℃で100日間行い、メタンの濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
その結果、100日間のインキュベーションの後、少量だが有意なメタンの生成を、最も熟成度が低い褐炭粉砕物を含む３つの培地において確認することができた。また、同様に、亜瀝青炭粉砕物を含む２つの培地のうちの１つにおいて、さらに、瀝青炭粉砕物を含む２つの培地のうちの１つにおいてメタンの生成を確認することができた(図６)。
【００４１】
AmaM株はメタノール、メチルアミン、MACsのみをメタン生成の基質として利用するため、それらのいずれかが石炭のオートクレーブ処理後に、又は、インキュベーション前に培地中に存在しているはずである。
そこで、粉砕した各石炭1gを含む培地をN2気相条件下で、121℃で20分間オートクレーブ処理することにより得られた、各石炭抽出物を含む培地中に含まれるメタノール、メチルアミン、MACsの検出を試みた。石炭より抽出されたメタノール及びメチルアミンは、GC/MS分析により測定した。
また、MACsの検出は下記のようにして行った。メトキシ基を有する芳香族化合物の標準試料、又は、オートクレーブ処理をした石炭を含む培地を0.45μm細孔径のPTFE(Polytetrafluoroethylene)メンブレンフィルタ(メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ)を用いてろ過を行った。次いで、ステンレスカップの中にろ過後の培地を100μl移し、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)を用いて60℃の条件下、メチル化を行った。メチル化処理後、乾燥するまで培地を蒸発させ、1μlのメタノールを各試料に添加した。その後、各試料を、PY-2020iD 熱分解炉(Frontier laboratories Ltd.、福島、日本)及び6890N/5973i GC/MS(Agilent technologies、カナダ、米国)から構成される熱分解GC/MSにより分析した。
【００４２】
その結果を図７に示す。なお、図７において、NDは、その成分の生成量がわずかであり、GC/MS分析において検出できなかったことを示す。メタノールは、褐炭粉砕物を含む２つの培地において検出された(図７)。メチルアミン類は、褐炭粉砕物を含む４つの培地において検出された(図７)しかしながら、褐炭粉砕物を含む培地で生産されるはずのメタンの量と比較すると、検出されたメタノールやメチルアミン類の濃度は非常にわずかであった。一方、２種又は３種のメトキシ基を有する芳香族化合物が、メタンの生成が観察された培地中で検出された(図７)。これらのメトキシ基を有する芳香族化合物の濃度は、低い値であったが、GC/MS分析の検出限界(0.1mg/L)を確実に超えるものであった(下記表３)。
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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