(57)【要約】【課題】従来法に比して、簡便、簡単、迅速な遺伝子検査技術を提供すること。【解決手段】その表面が撥水性である凹凸構造を有する検体採取部を有する検体採取器具；ならびに、該検体採取器具を用いて体液由来の検体を採取する工程、該検体を核酸増幅用反応液中に放出させる工程、核酸を増幅させる工程、および増幅産物を検出する工程を含む、体液中の標的核酸を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液中の標的核酸を検出する方法であって、
検体採取部を有する検体採取器具を用いて哺乳動物の体液由来の検体を該検体採取部に採取する工程であって、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記工程、
該検体採取部を核酸増幅用反応液中に浸漬することにより該検体を該反応液中に放出させた後、該検体採取部を該反応液から除去する工程、
核酸増幅反応により該反応液中の標的核酸を増幅させる工程、および、
増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
核酸を抽出または精製する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的核酸の検出が、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該浸漬が、核酸増幅反応用のチューブ中で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該検体採取器具の長手方向の長さが３．５〜１５．０ｃｍであり、かつ該長手方向に垂直な面における該検体採取部の長さが０．３〜３．０ｃｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該体液が唾液または血液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に用いるための器具であって、該器具は、哺乳動物の体液由来の検体を採取するための検体採取部を有し、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記器具。
【請求項９】
請求項８に記載の器具、ならびに、
核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも１つ
を含む、哺乳動物の体液中の標的核酸の検出用キット。
【請求項１０】
核酸増幅反応を用いて哺乳動物の体液中の標的核酸を検出する方法における、請求項８に記載の器具の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液からの核酸検出方法およびそのための採取器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの遺伝子検査においては、採取した血液を抽出し精製することで、時間をかける精密な検査が行われている。しかしながら、近年、個別医療や個別診断によりヒト遺伝子を用いる検査が増加しており、簡便、簡単、迅速に遺伝子検査を行う技術が求められている。このため、ラテラルフロー型やディップスティック型等のストリップを用いる遺伝子検査のニーズが高まっている。
【０００３】
これらのストリップを用いた遺伝子検査では、検体から核酸を抽出し、抽出した核酸の特定の配列を増幅させ、その増幅した特定配列核酸をストリップ上で反応させる。しかしながら、これらの反応は数時間程度の時間を要することになる。そのため、簡便、簡単でありながらより迅速に行うことができる技術が求められている。
【０００４】
簡便、簡単に遺伝子検査を行うため、唾液を含む口腔内の検体がよく用いられている。そのため、唾液を効率よく採取する採取器具が発明、考案されており、綿棒を自在に動かせる技術や平板の孔に唾液を採取させる技術等が知られている（特許文献１−４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５２６７３９９号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８１１５２号公報
【特許文献３】特許第４８９３８２９号公報
【特許文献４】特開２０１２−１３２８９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らがこれらの従来技術を用いた遺伝子検査を行ったところ、採取した検体を容器に移す際に、検体が損失するという問題が起こることが分かった。具体的には、従来技術による遺伝子検査には下記の問題点が存在する。
１．採取器具を用いて採取した検体は、チューブ内の反応液や緩衝剤を含む水分に浸すことで回収することができる。その際に、採取器具は唾液を採取しやすいことから、採取器具をチューブから引き上げるときに、検体を回収した反応液や水分が採取器具に吸収されてしまい、チューブ内の検体量が減少してしまう。この場合、核酸を抽出、精製する場合は問題なく増幅反応を行うことができるが、それでは迅速な検査に適さない。
２．採取器具を用いて採取した検体は、チューブ内のＰＣＲ反応液中に回収する。核酸の抽出、精製をせず直接ＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物を用いて核酸の検出を行ってもよい。しかしながら、このような抽出、精製の工程を省略ないし簡略化するような簡易な遺伝子検査を行った場合、ストリップ上で反応を示さず、誤判定となることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、検体を採取するが、検体を回収した後のチューブから引き上げる際に検体を損失することのない採取器具を用いることを着想した。
本発明によれば、採取器具の先端の採取部を、水分を弾く撥水性とし、さらに体液をストックできる凹凸形状にした構造とすることで上記課題は解決される。
即ち、本発明は以下を提供する。
【０００８】
［１］哺乳動物の体液中の標的核酸を検出する方法であって、
検体採取部を有する検体採取器具を用いて哺乳動物の体液由来の検体を該検体採取部に採取する工程であって、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記工程、
該検体採取部を核酸増幅用反応液中に浸漬することにより該検体を該反応液中に放出させた後、該検体採取部を該反応液から除去する工程、
核酸増幅反応により該反応液中の標的核酸を増幅させる工程、および、
増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、前記方法。
［２］核酸を抽出または精製する工程を含まない、上記［１］に記載の方法。
［３］該標的核酸の検出が、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて行われる、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］該浸漬が、核酸増幅反応用のチューブ中で行われる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］該検体採取器具の長手方向の長さが３．５〜１５．０ｃｍであり、かつ該長手方向に垂直な面における該検体採取部の長さが０．３〜３．０ｃｍである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］該体液が唾液または血液である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法に用いるための器具であって、該器具は、哺乳動物の体液由来の検体を採取するための検体採取部を有し、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記器具。
［９］上記［８］に記載の器具、ならびに、
核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも１つ
を含む、哺乳動物の体液中の標的核酸の検出用キット。
［１０］核酸増幅反応を用いて哺乳動物の体液中の標的核酸を検出する方法における、上記［８］に記載の器具の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、体液検体を採取する際には、凹凸構造の中に粘性の体液が入り込むため採取器具の先端に体液検体を採取できる。
チューブ内の核酸増幅用反応液に浸して採取器具を撹拌して液中から引き上げる際には、採取器具の先端は水分を弾く撥水性であるため、反応液が付着せず、採取した体液を反応液中に回収し、検体を損失させることがない。
その反応液をそのまま用いて核酸増幅反応を行い、体液由来の標的核酸を増幅し、その増幅産物を検出することができる。
この採取器具を用いることで、核酸の抽出、精製を行わず、微量の検体であっても、簡便、簡単、迅速な遺伝子検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態による検体採取器具の概略の側面図を示す図である。
【図２】図１の検体採取器具における検体採取部の拡大図を示す図である。
【図３】本体部に凸部を設けることにより形成された凹凸構造を有する検体採取部の例を示す図である。
【図４】本体部に凹部を設けることにより形成された凹凸構造を有する検体採取部の例を示す図である。
【図５】実施例で用いた核酸検出用ストリップを説明する図である。
【図６】実施例１における核酸検出用ストリップを用いた標的核酸の検出の結果を示す図である。
【図７】実施例２における核酸検出用ストリップを用いた標的核酸の検出の結果を示す図である。
【図８】実施例３における核酸検出用ストリップを用いた標的核酸の検出の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（定義）
本発明において、哺乳動物の種類は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができ、好ましくはヒトである。
【００１２】
体液の種類は特に限定されず、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、胸水等が挙げられる。採取が容易であり、かつ十分な粘性を有することから、好ましい体液としては、唾液、血液である。体液は、例えば、口腔粘膜を含む唾液であってもよい。
【００１３】
標的核酸は、検出の対象とするものであって、その種類は特に限定されない。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。標的核酸としては、その発現が、特定の疾患または状態の発症やそのリスク、治療感受性、あるいは特定の体質などに関連することが知られているものが挙げられる。上記の疾患または状態としては、癌、生活習慣病（例えば、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満）、薬の副作用などが挙げられ、上記の体質としては、アルコール耐性などが挙げられる。例えば、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ）は、特定の疾患または状態の発症やそのリスク、治療感受性、あるいは特定の体質などに関連することが知られている。従って、好ましい遺伝子としては、そのようなＳＮＰを有する遺伝子が挙げられる。具体的な遺伝子としては、例えば、アルコール耐性に関与するアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ１Ｂ）やアセトアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ２）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
（核酸検出方法）
本発明は、哺乳動物の体液中の標的核酸を検出する方法（以下、本発明の方法ともいう。）を提供する。本発明の方法は、
（工程１）検体採取部を有する検体採取器具を用いて哺乳動物の体液由来の検体を該検体採取部に採取する工程であって、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記工程、
（工程２）該検体採取部を核酸増幅用反応液中に浸漬することにより該検体を該反応液中に放出させた後、該検体採取部を該反応液から除去する工程、
（工程３）核酸増幅反応により該反応液中の標的核酸を増幅させる工程、および、
（工程４）増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む。本発明の方法は、好ましくは、核酸を抽出または精製する工程を含まない。
【００１５】
（工程１）検体採取部を有する検体採取器具を用いて哺乳動物の体液由来の検体を該検体採取部に採取する工程であって、該検体採取部は、検体を採取するための凹凸構造を有し、該凹凸構造の表面が撥水性を有する、前記工程
工程１における検体の採取は、検体採取器具の検体採取部を体液に接触させることにより行うことができる。
【００１６】
本発明の一実施形態による検体採取器具１の概略の側面図を図１に示す。図１に示す実施形態による検体採取器具１は、本発明において使用される検体採取器具の特徴を説明するために便宜上与えた単なる例示であり、本発明を何ら限定するものではない。検体採取器具１は、検体を採取するための検体採取部２、および把持するための把持部３を有している。検体採取部２と把持部３との間に介在する中間部（ロッド部；図示せず）を設けてもよい。
【００１７】
検体採取器具１の概略の形状は、典型的には、略直線形状である。好ましくは、検体採取器具１の長手方向の長さは、核酸増幅用の反応チューブの底部に届くものであり、かつ検体採取の目的のために必要かつ十分なものである。この観点から、検体採取器具１の長手方向の長さは、例えば、３．５〜１５．０ｃｍ、好ましくは、４．５〜１０．０ｃｍである。唾液採取を目的とする場合、該長さは、安全性の観点から該検体採取器具１が喉の奥まで届かないように８ｃｍ程度とすることができる。
【００１８】
検体採取部２は、通常、検体採取器具１の長手方向の一端に配置されている。検体採取部２の長手方向の長さは、例えば、０．２〜２．０ｃｍである。また、検体採取部２の長手方向に垂直な面における最大の長さ（即ち、太さ）は、後述の工程２において検体採取部２を核酸増幅反応用のチューブに入れることができるよう、０．３〜３．０ｍｍであることが好ましい。
【００１９】
図１に示す検体採取器具１における検体採取部２の拡大図を図２に示す。図２では、検体採取部２における凹凸構造は、基材となる本体部５に１つ以上の凸部４を設けることにより形成されているが、該凹凸構造は、本体部５に１つ以上の凹部を設けることにより形成されていてもよいし、本体部５に１つ以上の凸部および１つ以上の凹部を設けることにより形成されていてもよい。凸部４は、金型を用いて本体部５と一体的に形成されていてもよいし、本体部５に別部品として付け加えたものであってもよい。
【００２０】
本体部５の形状は特に限定されず、例えば、棒状、略球体状などであってよい。長手方向における本体部５の断面形状も特に限定されず、例えば、多角形（例、四角形、六角形など）、円形などであり得る。該断面形状は、長手方向に沿って一様であってもよいし、あるいはテーパー状や逆テーパー状など、長手方向に沿って変動してもよい。
【００２１】
検体採取部２の凹凸構造において、凸部に対する凹部の深さ（即ち、高低差）は、例えば、０．１〜１．２ｃｍ、好ましくは、０．２〜０．８ｃｍであってよい。また、凹部の幅は、例えば、０．１〜２．０ｃｍ、好ましくは、０．２〜１．０ｃｍである。
【００２２】
次に、検体採取部２における凹凸構造の具体例を説明する。
【００２３】
凹凸構造が１つ以上の凸部を設けることにより形成されたものである場合、該凸部は、単発的な突起であってもよいし、あるいは稜線状に延びた突起であってもよい。好ましくは、該凸部は、本体部５の胴体を周方向に全周取り巻いて連なる稜線状突起、または本体部５の胴体をらせん状に取り巻く突起である。
【００２４】
単発的な突起による凸部を有する検体採取部２としては、図３（ａ）に概略の側面図を示すようなブラシ状の構造を有するものが挙げられる。図３（ａ）に示すブラシでは突起は整列して配置されているが、突起の配置は特に限定されるものではなく、任意の個数の突起が無秩序に設けられていてもよい。また、本体部５の胴体を周方向に全周取り巻いて連なる稜線状突起を有する検体採取部２としては、本体部５の周囲に円盤などの板状物を２つ以上並べたもの（概略の斜視図を図３（ｂ）に示す。）、本体部５の周囲に２つ以上のリングを並べたもの（概略の側面図を図３（ｃ）に示す。）などが挙げられる。図３（ｂ）に示す実施形態と図３（ｃ）に示す実施形態は、本体部５に対する凸部の直径の比率が異なるだけで、基本の構成は同様である。稜線状突起を設ける実施形態において、図３（ｄ）に概略の側面図を示すように、先端から遠ざかるにつれてより多くの体液を保有できるように、本体部５をテーパー状に構成してもよい。また、上記の本体部５の胴体をらせん状に取り巻く突起を有する検体採取部２の一実施形態の概略の斜視図を図３（ｅ）に示す。図３に具体的に示す凸部の構成はあくまでも例示であり、その個数、形状や大きさ、間隔などのパラメーターは適宜設定できる。
【００２５】
凹凸構造が１つ以上の凹部を設けることにより形成されたものである場合、該凹部は、単発的な穴であってもよいし、あるいは溝状に延びた穴であってもよい。好ましくは、該凹部は、本体部５の胴体を周方向に全周取り巻いて設けられた溝、または本体部５の胴体にらせん状に設けられた溝である。
【００２６】
本体部５の胴体を周方向に全周取り巻いて設けられた溝を有する検体採取部２の一例を図４（ａ）に示す。溝の形状は特に限定されず、例えば、矩形、Ｕ字形、Ｖ字形などであってよい。また、例えば、図４（ｂ）に示すように、各溝において、検体採取器具１の先端側の壁を直角に形成し、反対側の壁をなだらかな曲面として形成することにより、使用時に検体採取器具１を引くように動かした際に効率的に体液を掻き取ることが可能である。本体部５の胴体にらせん状に設けられた溝を有する検体採取部２の例を図４（ｃ）および４（ｄ）に示す。図４（ｃ）に示す実施形態では、単一の溝がらせん状に本体部５を取り巻いているのに対し、図４（ｄ）に示す実施形態では、複数（図では２つ）の互いに交差する溝がらせん状に本体部５を取り巻いている。更に、溝状に延びた穴を有する検体採取部２の別の実施形態として、本体部５に長手方向に形成された１つ以上のスリットを有するものが挙げられる（図５（ｅ））。図４に具体的に示す凹部の構成はあくまでも例示であり、その個数、形状や大きさ、間隔などのパラメーターは適宜設定できる。
【００２７】
検体採取部２の凹凸構造の表面は撥水性を有する。本明細書において、検体採取部２の凹凸構造の表面とは、図２を参照すると、凸部の表面Ｓ１のみならず、凹部の表面（側面Ｓ２および底面Ｓ３を含む）も含む意味である。
【００２８】
検体採取部２の凹凸構造表面の撥水性は、水への濡れ性が低いものであれば特に限定されない。当該技術分野において、「撥水性」という用語は明確に定義されておらず、接触角が９０°以下のものを親水性、９０°以上のものを撥水性と区分することもあるが、本発明における「撥水性」はこの定義によって限定されるものではない。本発明において撥水性とは、接触角が例えば６０°以上、好ましくは７０°以上、８０°以上、または９０°以上である。該撥水性は、例えば、表面に水滴を滴下した時、このような接触角を３０秒以上、好ましくは６０秒以上維持するものであり得る。接触角は、自体公知の方法を用いて測定することができ、例えば、該表面上の水滴を撮像した画像において接線法や幅高さ法（θ／２法）を用いて計算することができる。また、接触角の上限は特に限定されないが、典型的には、接触角は例えば１５０°以下である。
【００２９】
凹凸構造表面の撥水性は、撥水性材料を用いて該凹凸構造を構成することにより実現できる。具体的な撥水性材料としては、例えば、シリコーン、ポリオレフィン、セルロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、レーヨン、バイオプラスチックなどの合成または天然の樹脂、ステンレス、アルミニウムなどの金属を挙げることができ、これらを適宜組み合わせて用いることができる。好ましい撥水性材料としては、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン）、ポリエステルである。撥水性材料は、ガラス、プラスチック、エラストマー（例えば、熱可塑性エラストマー）などであってもよい。
【００３０】
また、撥水性は、撥水性コーティングなどによる表面処理により付与されたものであってもよい。このようなコーティングのために、フッ素系のもの、酸化チタン、アルマイトなどのコーティング剤を用いることができる。
【００３１】
検体採取部２は、その表面全体が撥水性を有することが好ましい。
【００３２】
検体採取器具１の把持部３は、把持するために好適なものである限り、その材料や形状は特定されない。材料として、例えば、検体採取部２に関して上述したような樹脂や金属を用いることができる。あるいは、把持部３は親水性の材料から構成されていてもよい。把持を容易にするために、把持部３を平板状にする、あるいは中間部よりも太くするなどしてもよい。また、滑りにくくするために、把持部３は、例えば検体採取部２に関して上述したような各種の凹凸構造を有してもよい。把持部３の長手方向の長さは、例えば０．５〜５．０ｃｍ程度、太さは、例えば０．１〜０．７ｃｍ程度とすることができる。
【００３３】
把持部３にバーコード等を付すことで、検体の取り間違いを防ぐことができる。
【００３４】
検体採取器具１が上記の中間部を有する場合、中間部の材料などは特に限定されないが、工程２において検体採取部２を核酸増幅用反応液中に浸漬したときに中間部も反応液と接触することがあるので、検体採取部２と同様に撥水性を有することが好ましい。また、中間部の形状も特に限定されないが、通常、検体採取部２および把持部３よりも細い。
【００３５】
上述したような検体採取器具１の検体採取部２を体液に接触させることにより、検体採取部２の凹凸構造に体液を採取することができる。例えば、検体が唾液の場合、検体採取器具１の先端（検体採取部２）で口腔粘膜を削ることにより、唾液を採取することができる。
【００３６】
（工程２）該検体採取部を核酸増幅用反応液中に浸漬することにより該検体を該反応液中に放出させた後、該検体採取部を該反応液から除去する工程
本工程では、工程１の操作により検体を保有した検体採取部２を核酸増幅用反応液（後述）中に浸漬する。浸漬は、核酸増幅用の反応チューブ中で行うことが好ましい。浸漬の操作は、例えば、回転・振動、チューブ底部に先端部を複数回押し当てるなどの操作により行うことができる。これにより、検体採取部２に保有された検体を反応液中に放出させることができる。その後、検体採取部２を例えば垂直に引き上げることにより、反応液から除去する。
【００３７】
（工程３）核酸増幅反応により該反応液中の標的核酸を増幅させる工程
核酸増幅反応の方法としては、標的核酸を増幅できるものである限り制限されない。本明細書において、標的核酸の増幅とは、必ずしも標的核酸（例えば標的遺伝子）の全体を増幅するものでなくてもよく、少なくとも該核酸の検出対象領域を増幅できればよい。核酸増幅反応のための方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法のみならず、それを基にした各種改良法を含む。）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＣＬＲ（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；特願2015-17396、特願2015-17398に記載の技術）法などを用いることができる。ＰＣＲ法は最も広く用いられている核酸増幅法であることから当該方法に最適化された様々な試薬や機器が容易に入手できるだけでなく、上記の通り様々なバリエーションの方法があり、汎用性が極めて高いため、本発明のために好適な手法として挙げられる。また、マルチプレックスの核酸増幅法（例、マルチプレックスＰＣＲ）の使用も好ましい。
【００３８】
核酸増幅用反応液とは、前記核酸増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。核酸増幅用反応液の組成は、使用する核酸増幅法によって多少異なるが、通常は基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、核酸増幅反応用プライマーセットと、をバッファー中に含むことを基本とする。ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００〜４００μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。ＤＮＡポリメラーゼは、用いる核酸増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＰＣＲ法であれば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、その他バイオサイエンス関連の各社により開発されたもの等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１〜６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００３９】
核酸増幅反応用プライマーセットに含まれる増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸や修飾核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が１０ｎＭから２μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。増幅プライマーの数は、標的核酸を増幅可能であれば特に問わない。増幅プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜６０塩基であり、より好ましくは２５〜４０塩基である。ただし、増幅プライマーの増幅に関係しないタグ領域の配列は塩基数として含まない。増幅プライマー間の距離、即ち検出領域は通常５０〜５０００塩基の範囲であり、好ましくは１００〜２０００塩基である。増幅プライマーの配列は、検出領域を前記核酸増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が通常５０℃から７５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６８℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu）等を用いてもよい。
【００４０】
上記のバッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する核酸増幅法によっては、更にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、核酸増幅用反応液は、各核酸増幅法の反応用として様々なタイプが市販されており、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。
【００４１】
ＰＣＲを含む核酸増幅反応の条件、操作等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。また、核酸増幅反応は、市販の機器や試薬を用い、その説明書に従って行うことができる。
【００４２】
（工程４）増幅された該標的核酸を検出する工程
増幅された標的核酸の検出の方法は、該増幅産物を検出できるものであれば特に限定されない。ＰＣＲ法などに用いた反応液をそのまま利用し、核酸増幅の有無を迅速かつ簡便に確認できるという点で、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いた検出方法が好ましい。
【００４３】
本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、クロマトグラフィーを用いて標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸を含むクロマトグラフィー溶液を、特定の領域に検出用プローブを固定した固相担体の内部または表面上に展開させて、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズ産物を形成させ、ハイブリダイズ産物を検出することを含む。ハイブリダイズ産物の検出は、展開に先立って（例えば、核酸増幅時に）または展開の際に、標的核酸に対して付与したシグナル要素を利用して行う。核酸クロマトグラフィーとして、例えば、特開2014-018150、特開2013-059319、特開2013-059320、特開2013-059321、特開2014-057565、特開2014-079260、特許第5503021号などに記載の技術を用いることができる。核酸クロマトグラフィーの実施形態は特に限定されず、ほぼ水平状態での展開を意図したいわゆるラテラルフロー型であってもよいし、ほぼ鉛直方向での展開を意図したいわゆるディップスティック型であってもよい。
【００４４】
本明細書において、検出用プローブを固定した上記の固相担体をストリップと呼称する。ストリップは従来公知のものを用いることができる。例えば、ストリップはプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、ストリップに固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。また、代表的なストリップとしては、ＴＢＡ社製の商品Ｃ-ＰＡＳがあげられる。このストリップは、幅２ｍｍ×長さ１０ｃｍ程度の検査試験紙であり、表面のニトロセルロース膜上に核酸をプローブとしてプリントしたものである。このプローブと相補的にハイブリダイゼーションするタグを持つプライマーをセットで用いることで核酸の検出が可能となる。
【００４５】
（器具およびキット）
本発明はまた、本発明の方法に用いるための器具（以下、本発明の器具ともいう。）、および該器具を構成要素として含む哺乳動物の体液中の標的核酸の検出用キット（以下、本発明のキットともいう。）も提供する。
【００４６】
本発明の器具は、上述の本発明の方法に用いるための検体採取器具であり、その構成、および好ましい態様は上述した通りである。
【００４７】
本発明のキットは、上記の検体採取器具に加えて、上述の核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも一つを含む。一実施形態において、本発明のキットは、該検体採取器具、該ストリップ、および該プライマーセットを含む。本発明のキットが該ストリップを含む場合、該キットは展開用緩衝液をさらに含むことが好ましい。また、本発明のキットが該プライマーセットを含む場合、該キットは、核酸増幅反応を行うために必要な、上述したようなその他の構成要素も含むことが好ましい。
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
本発明の方法による核酸検出を以下の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。なお、本実施例での検出は、核酸クロマトグラフィーのストリップを用いた目視による確認であるが、検出方法はあくまでも一例であり、その他の方法でも検出は可能である。
手順：
１．検体の採取
２．標的核酸の増幅反応
３．標的核酸の検出反応（核酸クロマトグラフィーを使用）
【実施例１】
【００５０】
１．検体の採取
口腔粘膜を含む唾液を採取器具を用いて採取した。口腔内の舌下に採取器具の先端を軽く当て、擦るようにして唾液検体を採取した。採取器具としては歯間ブラシ（小林製薬株式会社製：やわらか歯間ブラシ、柄の材質：ポリプロピレン、ブラシの材質：熱可塑性エラストマー、サイズ：ＳＳ〜Ｍ）を使用した。
【００５１】
２．標的核酸の増幅反応
２−１．検体の回収
１の工程で得た唾液検体を０．２ｍＬチューブに入れたＰＣＲ反応液中に回収した。採取器具の先端を反応液中に浸漬させ、チューブ先端に軽く押し当ててから引き抜いた。０．２ｍＬチューブを軽くボルテックスを用いて撹拌し、卓上遠心機を用いてスピンダウンを行った。
２−２．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液は下記表の組成とした。核酸増幅試薬としてＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００５２】
【表１】
2017176000.tif 000002
【００５３】
プライマー配列は、標的とする核酸を増幅できる限り、特に制限されない。ＰＣＲ反応にはＶｅｒｉｔｉ（登録商標）サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。サーマルサイクル反応（９５℃で９分後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒を３０サイクル、４℃に下げる）を行った。
【００５４】
３．標的核酸の検出反応
検出用のストリップを用いて、核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応によって検出を行った。ストリップはＴＢＡ社製のものを使用した（図５）。
３−１．反応液の調製
２の工程で得られた増幅核酸を、核酸クロマトグラフィーを用いて検出した。反応液は下記表の通りに調製した。ＴＥバッファー、展開液（藤倉化成社製）、ラテックスビーズ（藤倉化成社製）を用いた。１サンプルにおける反応液の組成は下記の通りである。
【００５５】
【表２】
2017176000.tif 000003
【００５６】
反応液を１．５ｍＬチューブに３０．０μＬ加え、５０℃で５分間以上加温した。その後、ＰＣＲ反応液１０．０μＬをこの反応液に加えて混合し、２分間静置した。
３−２．標的核酸の確認
反応液に核酸クロマトグラフィーストリップを挿入し、４０分間静置した。標的の核酸があればストリップ上に青いラインとして現れるので、標的核酸の増幅可否を目視で判定した。
結果を図６に示す。１のラインは採取した唾液検体、Ｎのラインはネガティブコントロールである。１では青いラインを確認でき、Ｎでは青いラインを確認できなかった。このことから、唾液由来の核酸の検出を行うことができた。
【実施例２】
【００５７】
１．検体の採取
口腔粘膜を含む唾液を採取器具を用いて採取した。口腔内の舌下に採取器具の先端を軽く当て、擦るようにして唾液検体を採取した。採取器具としては歯間ブラシ（小林製薬株式会社製：やわらか歯間ブラシ、柄の材質：ポリプロピレン、ブラシの材質：熱可塑性エラストマー、サイズ：ＳＳ〜Ｍ）を使用した。
【００５８】
２．標的核酸の増幅反応
２−１．検体の回収
１の工程で得た唾液検体を０．２ｍＬチューブに入れたＰＣＲ反応液中に回収した。採取器具の先端を反応液中に浸漬させ、チューブ先端に軽く押し当ててから引き抜いた。０．２ｍＬチューブを軽くボルテックスを用いて撹拌し、卓上遠心機を用いてスピンダウンを行った。
２−２．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液は下記表の組成とした。核酸増幅試薬としてＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００５９】
【表３】
2017176000.tif 000004
【００６０】
プライマー配列は、標的とする核酸を増幅できる限り、特に制限されない。ＰＣＲ反応にはＶｅｒｉｔｉ（登録商標）サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。サーマルサイクル反応（９５℃で９分後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル、その後７２℃で５分後、４℃に下げる）を行った。
【００６１】
２−３．ＣＬＲ法
ＣＬＲ法における反応液の組成は以下のとおりとした。なお、ライゲーション用プローブとして、コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製のものを用いた。ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【００６２】
【表４】
2017176000.tif 000005
【００６３】
反応液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１分、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【００６４】
３．標的核酸の検出反応
検出用のストリップを用いて、核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応によって検出を行った。ストリップはＴＢＡ社製のものを使用した（図５）。
３−１．反応液の調製
２の工程で得られた増幅核酸を、核酸クロマトグラフィーを用いて検出した。反応液は下記表の通りに調製した。ＴＥバッファー、展開液（藤倉化成社製）、ラテックスビーズ（藤倉化成社製）を用いた。１サンプルにおける反応液の組成は下記の通りである。
【００６５】
【表５】
2017176000.tif 000006
【００６６】
反応液を１．５ｍＬチューブに３０．０μＬ加え、５０℃で５分間以上加温した。その後、ＰＣＲ反応液１０．０μＬをこの反応液に加えて混合し、２分間静置した。
３−２．標的核酸の確認
反応液に核酸クロマトグラフィーストリップを挿入し、２５分間静置した。標的の核酸があればストリップ上に青いラインとして現れるので、標的核酸の増幅可否を目視で判定した。
結果を図７に示す。１のラインは採取した唾液検体、Ｎのラインはネガティブコントロールである。１では青いラインを確認でき、Ｎでは青いラインを確認できなかった。このことから、唾液由来の核酸の検出を行うことができた。
【実施例３】
【００６７】
１．検体の採取
試験管に分注された採血済みの血液を、採取器具を用いて採取した。試験管内の血液に採取器具の先端を浸して引き上げることで、血液検体を採取した。採取器具としては歯間ブラシ（小林製薬株式会社製：やわらか歯間ブラシ、柄の材質：ポリプロピレン、ブラシの材質：熱可塑性エラストマー、サイズ：ＳＳ〜Ｍ）を使用した。
【００６８】
２．標的核酸の増幅反応
２−１．検体の回収
１の工程で得た血液検体を０．２ｍＬチューブに入れたＰＣＲ反応液中に回収した。採取器具の先端を反応液中に浸漬させ、チューブ先端に軽く押し当ててから引き抜いた。０．２ｍＬチューブを軽くボルテックスを用いて撹拌し、卓上遠心機を用いてスピンダウンを行った。
２−２．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液は下記表の組成とした。核酸増幅試薬としてＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００６９】
【表６】
2017176000.tif 000007
【００７０】
プライマー配列は、標的とする核酸を増幅できる限り、特に制限されない。ＰＣＲ反応にはＶｅｒｉｔｉ（登録商標）サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。サーマルサイクル反応（９５℃で９分後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル、その後７２℃で５分後、４℃に下げる）を行った。
【００７１】
２−３．ＣＬＲ法
ＣＬＲ法における反応液の組成は以下のとおりとした。なお、ライゲーション用プローブとして、コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製のものを用いた。ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【００７２】
【表７】
2017176000.tif 000008
【００７３】
反応液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１分、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【００７４】
３．標的核酸の検出反応
検出用のストリップを用いて、核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応によって検出を行った。ストリップはＴＢＡ社製のものを使用した（図５）。
３−１．反応液の調製
２の工程で得られた増幅核酸を、核酸クロマトグラフィーを用いて検出した。反応液は下記表の通りに調製した。ＴＥバッファー、展開液（藤倉化成社製）、ラテックスビーズ（藤倉化成社製）を用いた。１サンプルにおける反応液の組成は下記の通りである。
【００７５】
【表８】
2017176000.tif 000009
【００７６】
反応液を１．５ｍＬチューブに３０．０μＬ加え、５０℃で５分間以上加温した。その後、ＰＣＲ反応液１０．０μＬをこの反応液に加えて混合し、２分間静置した。
３−２．標的核酸の確認
反応液に核酸クロマトグラフィーストリップを挿入し、２５分間静置した。標的の核酸があればストリップ上に青いラインとして現れるので、標的核酸の増幅可否を目視で判定した。
結果を図８に示す。１のラインは採取した血液検体、Ｎのラインはネガティブコントロールである。１では青いラインを確認でき、Ｎでは青いラインを確認できなかった。このことから、血液由来の核酸の検出を行うことができた。
【００７７】
結果：
採取器具を用いることで、核酸抽出を行わず核酸増幅反応を行った操作で、簡易の核酸クロマトグラフィーによる核酸検出が可能であることが確認できた。このことから、本発明の技術により、簡便、簡単、迅速な遺伝子検査を行うことができる。
【符号の説明】
【００７８】
１  検体採取器具
２  検体採取部
３  把持部
４  検体採取部の凸部
５  検体採取部の本体部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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