(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な構成でグルコース濃度を高感度で測定可能な酵素電極を提供する。【解決手段】集電体を含む電極と、該集電体表面に結合した単分子膜を形成する分子２と、該分子に結合したCytochromeCサブユニットを含むグルコース脱水素酵素３とを含み、グルコース脱水素酵素の酸化還元反応により、グルコース脱水素酵素と集電体間で電子授受が行われる酵素電極Ａ。【選択図】図１
2017211383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
集電体を含む電極と、
該集電体表面に結合した単分子膜を形成する分子と、
該分子に結合したCytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素とを含み、
前記グルコース脱水素酵素の酸化還元反応により、グルコース脱水素酵素と集電体間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極。
【請求項２】
前記集電体が金、パラジウム、銀および白金から選択される金属である、請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
前記単分子膜を形成する分子は、チオール基またはジチオール基を有する分子である、請求項２に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記単分子膜を形成する分子はDithiobis(succinimidyl hexanoate)、Dithiobis(succinimidyl octanoate)またはDithiobis(succinimidyl undecanoate)である、請求項３に記載
の酵素電極。
【請求項５】
前記集電体がグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンから選択される炭素である、請求項１に記載の酵素電極。
【請求項６】
前記単分子膜を形成する分子は、ピレンを有する分子である、請求項５に記載の酵素電極。
【請求項７】
前記グルコース脱水素酵素は、自身のアミノ基またはカルボキシル基と、前記単分子膜を形成する分子が有する官能基との反応により、前記単分子膜を形成する分子に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素電極。
【請求項８】
前記単分子膜を形成する分子はサクシンイミド基を有し、該サクシンイミド基と前記グルコース脱水素酵素のアミノ基との反応により、前記グルコース脱水素酵素と結合した、請求項７に記載の酵素電極。
【請求項９】
前記単分子膜を形成する分子はオキサゾリン基を有し、該オキサゾリン基と前記グルコース脱水素酵素のカルボキシル基との反応により、前記グルコース脱水素酵素と結合した、請求項７に記載の酵素電極。
【請求項１０】
直接電子移動型の酵素電極である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素電極。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素電極を備えたバイオセンサ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、基質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から基質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された基質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電極表面に酵素が固定化された酵素電極およびそれを用いたグルコースを計測するための電気化学バイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサに使用される酵素電極は酵素反応により生じた電子を電極から取り出す構造を有し、一般的には、電極と、電極の表面に酵素及び導電性粒子を架橋剤やバインダを用いて固定化した検知層とを含む。特許文献１では、電極と検知層とを含み、該検知層は、酵素、導電性粒子、並びに該酵素及び該導電性粒子の少なくとも一方とアミド結合またはエステル結合を形成する高分子とを有する、酵素電極が記載されている。
【０００３】
一方、酵素と集電体（電極）の間の電子移動を効率的に行うために、自己組織化単分子膜
(SAM：Self assembled monolayer)を形成する分子を用いる方法は非特許文献１において開示されており、具体的には、HRP(Horseraddish Peroxydase)などの酵素をSAMを形成す
る分子を介して集電体表面に固定化させたことが例示されている。しかし、酵素を吸着等によりSAM形成分子を介して固定する方法については、これまでグルコース測定用バイオ
センサで最も使用される酵素の一つであるグルコース脱水素酵素（Glucose dehydrogenase)においては成功事例は報告されていない。その理由として、一般的なグルコース脱水素酵素の触媒部位は酵素中心部に位置し、電極近傍に固定したとしても集電体に電子伝達が生じにくく、特に、ランダムな吸着等による酵素の固定化では、集電体と酵素の距離が制御できないことなどが考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−６１５４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Braz. Chem. Soc. Vol. 14, No. 2, 230-243, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法ではバインダとして、オキサゾリン基を含有する高分子ポリマーを用いているが、酵素と集電体（電極）の距離は制御されておらず、個々の酵素によってばらつきがあるため、固定酵素量から期待される応答値に比して実際得られる応答値が小さいという課題を有している。
そこで、本発明は、グルコース濃度を測定するための酵素電極であって、酵素と集電体の距離が制御され、グルコース濃度を高感度かつ定量的に測定することのできる酵素電極を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は、
集電体を含む電極と、
該集電体表面に結合した単分子膜を形成する分子と、
該分子に結合したCytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素とを含み、
前記グルコース脱水素酵素の酸化還元反応により、グルコース脱水素酵素と集電体間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極を提供する。
前記単分子膜は、分子が一層に配列して形成した膜であり、Cytochrome Cサブユニットを
含むグルコース脱水素酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子伝達サブユニットとしてシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素であり、前記触媒サブユニットは、基質の反応を触媒する機能を持つサブユニットであり、前記電子伝達サブユニットは、電子受容体に電子を伝達する機能をもつサブユニットである。前記酵素電極は、酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接、電極に伝達されることにより、酵素と電極間の電子授受が行われる“直接電子移動型の酵素電極”である。
【０００８】
本発明はまた、前記酵素電極を備えたバイオセンサを提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記バイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、基質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から基質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された基質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一態様によれば、酵素と集電体とを、長さの制御された単分子膜を形成する分子を介し、該分子の反応性基と酵素の特定のアミノ酸残基との共有結合により、固定化できる。よって、酵素の活性中心に近い部分で固定化される酵素の量が相対的に増加する。これにより、ランダムな吸着による酵素の固定化よりも、酵素と集電体との距離がより制御された酵素電極が提供される。したがって、酵素と集電体間での電子授受効率が改善し、酵素電極の応答電流値を向上させることができ、グルコース濃度を高感度かつ定量的に測定することができる。上記効果は、特に触媒部位が酵素中心部に位置するような、Cytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素で顕著である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、一実施形態に係る酵素電極の構造を模式的に示す図である。
【図２】図２は、本発明の測定装置の一態様を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の測定装置を用いた測定プログラムの一態様を示すフローチャート図である。
【図４】図４は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの、グルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）またはDSHなしで酵素を直接吸着させた酵素電極（電極材料：金）を用いたときの（印加電圧＋４００ｍＶ）、グルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。なお、Bare electrodeはピランハ処理を行わない電極に酵素を吸着させた電極の測定結果である。
【図６】図６は、単分子膜形成分子としてDSH、DSOまたはDSUを用いて酵素を固定化させた本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの、グルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの、アセトアミノフェン（Ａ）またはアスコルビン酸（Ｂ）含有試料における印加電圧と応答電流の関係を示すグラフである。
【図８】図８は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）またはDSHなしで酵素を直接吸着させた酵素電極（電極材料：金）を用いたときの（印加電圧＋１００ｍＶ）、グルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。
【図９】図９は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの（印加電圧＋０．１Ｖ）、アセトアミノフェン存在下または非存在下におけるグルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。なお、Bare electrodeはピランハ処理を行わない電極に酵素を吸着させた電極の測定結果である。
【図１０】図１０は、単分子膜形成分子としてDSHを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの（印加電圧＋０．１Ｖ）、アスコルビン酸存在下または非存在下におけるグルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。なお、Bare electrodeはピランハ処理を行わない電極に酵素を吸着させた電極の測定結果である。
【図１１】図１１は、単分子膜形成分子としてDSH、DSOまたはDSUを用いて酵素を固定化させた本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：金）を用いたときの、アセトアミノフェン（Ａ）またはアスコルビン酸（Ｂ）含有試料における印加電圧と応答電流の関係を示すグラフである。
【図１２】図１２は、単分子膜形成分子としてPySEを用いて酵素を固定化した本発明の一態様に係る酵素電極（電極材料：カーボン）を用いたときの、グルコース濃度と応答電流の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の一実施形態としての酵素電極について図面を参照して説明する。以下に挙げる実施形態はそれぞれ例示であり、本発明は以下の実施形態の構成に限定されない。
【００１３】
（酵素電極の構成）
図１は、本発明の実施形態に係る酵素電極を模式的に示した図である。図１において、酵素電極Ａは、絶縁性基板４と、電極（集電体）１と、電極１の表面（図１では上面）に単分子膜形成分子２を介して固定化された酵素（Cytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素）３を含む。ただし、絶縁性基板４は必須ではない。
【００１４】
（電極）
電極１は、集電体である、金（Au）、白金（Pt）、銀（Ag）及びパラジウム（Pd）のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成される。電極１は、例えば、図１に示すような絶縁性基板４上に形成される。絶縁性基板４は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極１及び絶縁性基板４の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
【００１５】
（測定電流）
本発明の酵素電極を用いて測定されるのは、物質の拡散に依存する電流（拡散律速電流）ではなく、測定対象物質（基質）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。これは、酵素と測定対象物質との反応によって、該酵素から電極へ電子が移動する際に生じる電流である。
【００１６】
測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を測定するためには、作用電極を“直接電子移動型の酵素電極”とすることが好ましい。ここで、“直接電子移動型の酵素電極”とは、試薬層で酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接、電極に伝達されることにより、酵素と電極間の電子授受が行われるタイプの酵素電極である。
【００１７】
図１に示すように、酵素３の分子は、単分子膜形成分子２を介して電極１に固定化されているので酵素反応により生じた電子は、直接的に電極１に移動することができる。すなわち、本発明の実施形態に係る酵素電極Ａでは、直接電子移動によって酵素３と電極１との間で電子授受が行われる。
【００１８】
（単分子膜形成分子）
単分子膜形成分子は前記集電体に結合し、かつ、酵素分子を結合させることのできる化合物であり、集電体表面に一定方向で複数結合することにより単分子膜を形成できる化合物である。好ましくは、集電体に親和性を有する第一の官能基と、スペーサー部位と、酵素分子の有する官能基と反応しうる第二の官能基を有する。より好ましくは、スペーサー部位の第一の端に集電体に親和性を有する第一の官能基が結合し、スペーサー部位の第二の端に酵素分子の有する官能基と反応しうる第二の官能基が結合した構造を有する。
【００１９】
集電体に親和性を有する第一の官能基は集電体の種類によって適宜選択される。
単分子膜形成分子の集電体表面への結合様式は共有結合、配位結合、イオン結合などの化学的結合やファンデルワールス力などによる物理的結合が挙げられるが、共有結合もしくは、配位結合が好ましい。前記集電体に結合できる第一の官能基としては、集電体が金属の場合、チオール基またはジチオール基が挙げられる。一方、集電体がカーボンの場合、ピレン、ポルフィリンが挙げられる。
【００２０】
酵素分子の有する官能基と反応しうる第二の官能基としては、酵素分子の有する官能基の種類によって適宜選択される。例えば、酵素分子が有するアミノ基（末端アミノ基及び側鎖アミノ基を含む）と反応させる場合はサクシンイミド基が挙げられ、この場合、単分子膜形成分子の第二の端はサクシンイミド基とアミノ基の反応残基となる。一方、酵素分子が有するカルボキシル基（末端カルボキシル基及び側鎖カルボキシル基を含む）と反応させる場合はオキサゾリン基が挙げられ、この場合、単分子膜形成分子の第二の端はオキサゾリン基とカルボキシル基の反応残基となる。よって、酵素と第二の官能基の反応により、酵素を単分子膜形成分子に共有結合によって固定化することが可能になる。
【００２１】
スペーサーの長さは酵素電極を“直接電子移動型の酵素電極”とするために、酵素分子の電極（集電体）表面からの距離を一定以内の距離に保つことのできる長さであることが好ましい。なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は１０−２０Åと云われており、電極と酵素から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、メディエータの移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。よって、酵素を電極から２０Å以内に保つことができる長さが好ましく、酵素を電極から１０Å以内に保つことができる長さがより好ましい。スペーサーの種類としては、例えば、炭素数１〜２０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５）のアルキレン、炭素数１〜２０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５）のアルケニレン、炭素数１〜２０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５）のアルキニレン、重合度２〜５０（好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５）のポリエチレングリコール、アミノ酸残基１〜２０（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５）のオリゴペプチドなどが挙げられる。なお、前記アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンにおいては、一部の-CH2-が-S-に置換されてもよいし、連続しない一部の-CH2-が-O-に置換されてもよい。
【００２２】
例えば、チオール基またはジチオール基を有する単分子膜形成分子としては、以下のような構造を有する化合物が例示される。これらは、SAMを形成する化合物である。
なお、Lはスペーサーであり、Xは酵素分子の有する官能基と反応しうる官能基である。
SH-L-X・・・（１）
X-L-S-S-L-X・・・（２）
【００２３】
このような化合物としては、以下のDSHなどが例示される。
【化１】
2017211383.tif 000003
また、表１に記載のDSO（Dithiobis(succinimidyl octanoate)）、DSU（Dithiobis(succinimidyl undecanoate)）も使用できる。
このようなジチオールを有する単分子膜形成分子の場合は、１分子につき、酵素分子を２分子結合させることができる。
【００２４】
例えば、ピレンまたはポルフィリンを有する単分子膜形成分子としては、以下のような構造を有する化合物が例示される。
なお、Pyはピレン、Poはポルフィリン、Lはスペーサーであり、Xは酵素分子の有する官能基と反応しうる官能基である。
Py-L-X・・・（３）
Po-L-X・・・（３’）
【００２５】
例えば、ピレンを有する単分子層形成分子としては、以下のような構造を有する化合物が例示される。
【化２】
2017211383.tif 000004
1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester :PySE
J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3838-3839，Noncovalent Sidewall Functionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes for Protein
J. Electroanal. Chem., 1994, 365, 157-164，Application of bifunctional reagents for immobilization of proteins on a carbon electrode surface: Oriented immobilization of photosynthetic reaction centers
【００２６】
また、ピレンを有しSAMを形成する分子としては以下の化合物が例示される。
例示されたPHTの末端はSHとなっているが、例えばN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)ス
クシンイミドなどでSH基の先にスクシンイミド基を付加して酵素のアミノ基と反応させたり、マレイミド基を導入した酵素を用いてマレイミド基を介してPHTに酵素を固定化する
ことが可能である。
【化３】
2017211383.tif 000005
17-(1-pyrenyl)- 13-oxo-heptadecanethiol：PHT
Chemical Physics Letters 367 (2003) 747-752
Self-assembly of gold nanoparticles to carbon nanotubes using a thiol-terminated
pyrene as interlinker
【００２７】
（酵素）
酵素３としては、Cytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素（GDH）を用い
る。Cytochrome Cサブユニットを含むGDHは、少なくとも触媒サブユニットおよび電子伝
達サブユニットとしてシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。前記、触媒サブユニットは、基質の反応を触媒する機能を持つサブユニットであり、前記電子伝達サブユニットは、電子受容体に電子を伝達する機能をもつサブユニットである。
GDHの触媒サブユニット及び触媒ドメインは、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含むGDHとして、PQQグルコース脱水素酵素（PQQGDH）が挙げられ、FADを含むGDHとして、FADを含んだαサブユニットを持つシトクロムグルコース脱水素酵素が挙げられる。PQQグルコース脱水素酵素（PQQGDH）は、例えば、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（G3DH from Agrobacterium tumefasience)やPQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質を使用することができる。PQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質は、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。
FADを含むGDHとして、Burkholderia cepacia由来FAD依存グルコース脱水素またはその変
異体が挙げられる。Burkholderia cepacia由来FAD依存グルコース脱水素の変異体として
は、４７２位及び４７５位のアミノ酸残基が置換された変異体（WO 2005/103248）、３２６位、３６５位および４７２位のアミノ酸残基が置換された変異体（特開2012-090563）
、３６５位と３２６、４７２、４７５、及び５２９位等が置換された変異体（WO 2006/137283）などが挙げられる。
【００２８】
なお、酵素を含む検知層の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等が挙げられる。
【００２９】
（酵素電極の作製方法）
上記酵素電極Ａは、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板４の片面に、電極１として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板４の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（
例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
次に、電極１上に単分子膜形成分子２を結合させる。そして、単分子膜形成分子の反応性官能基と、酵素３のアミノ基またはカルボキシル基を反応させて、単分子膜形成分子を介して酵素３を電極１上に固定化することができる。
【００３０】
本発明の酵素電極を用いることにより、試料中に含まれる測定対象物質（グルコース）の濃度を電荷移動律速電流に基づいて測定することができる。試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されないが、生体試料が好ましく、血液、尿などが挙げられる。
【００３１】
（バイオセンサ）
本発明の酵素電極はグルコースセンサとしてのバイオセンサに使用できる。バイオセンサは、本発明の酵素電極とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀／塩化銀電極を用いることができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や
、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極を参照極とした３電極系を用いてもよい。
【００３２】
（装置）
次に、図面を用いて、本発明の測定装置について説明する。ここでは、グルコース測定装置の一態様について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。
図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ１８，ポテンショスタット１９，電力供給装置１１が、筐体内に収容された基板２０上に設けられている。
制御コンピュータ１８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access Memory）,ＲＯＭ（Read Only Memory））
のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、出力部１０、制御部１２、演算部１３及び検出部１４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ１８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいても良い。
【００３３】
制御部１２は、電圧印加のタイミング，印加電圧値などを制御する。
電力供給装置１１は、バッテリ１６を有しており、制御部コンピュータ１８やポテンショスタット１９に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置１１は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット１９は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部１２によって制御され、端子ＣＲ，Ｗを用いて、グルコースセンサ１７の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部１４に送る。
【００３４】
演算部１３は検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、記憶する。出力部１０は、表示部ユニット１５との間でデータ通信を行い、演算部１３による測定対象物質の濃度の演算結果を表示部ユニット１５に送信する。表示部ユニット１５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたグルコース濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。
【００３５】
図３は、制御コンピュータ１８によるグルコース濃度測定処理の例を示すフローチャート
である。制御コンピュータ１８のＣＰＵ（制御部１２）は、グルコース濃度測定の開始指示を受け付けると、制御部１２は、ポテンショスタット１９を制御して、作用極への所定の電圧（例えば、銀／塩化銀電極に対し、＋１００〜５００ｍＶ、＋１００〜４００ｍＶ、または＋１００〜２００ｍＶ）を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。
【００３６】
次に、ポテンショスタット１９は、電圧印加によって得られる応答電流、すなわち、試料内の測定対象物質（グルコース）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流、例えば、電圧印加から１〜２０秒後の定常電流を測定し、検出部１４へ送る（ステップＳ０２）。
【００３７】
演算部１３は、電流値に基づいて演算処理を行い、グルコース濃度を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ３の演算部１３は、電極上に配置されたグルコースデヒドロゲナーゼに対応する、グルコース濃度の計算式またはグルコース濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてグルコース濃度を算出する。
【００３８】
出力部１０は、グルコース濃度の算出結果を、表示部ユニット１５との間に形成された通信リンクを通じて表示部ユニット１５へ送信する（ステップＳ０４）。その後、制御部１２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０５）、エラーがなければ測定を終了し、グルコース濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。また、算出結果を演算部１３に保存し、後から算出結果を呼び出して、表示部に表示し確認することも可能である。なお、ここでは、算出結果の表示部ユニット１５への送信（ステップS０４）後に、制御部１２による測定エラー検知（ステ
ップS０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。
【実施例】
【００３９】
以下、酵素電極の実施例について説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。
【００４０】
実施例１
（酵素電極の作製）
金表面に単分子膜形成分子を介してCytochrome Cサブユニットを含むGDHを固定化した酵
素電極を作製した。単分子膜形成分子としては、以下のDSHを用いた。
【化４】
2017211383.tif 000006
【００４１】
具体的には、金ワイヤ（先端3mm）をピランハ溶液（200μl）に室温で一晩浸漬し、その
後、アセトンで洗浄し、DSHのアセトン溶液（濃度1μM、10μMまたは90μM）に浸漬し、
２５℃で８時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた。続いて、ア
セトンで洗浄し、酵素（Burkholderia cepacia由来FADGDH(濃度0.028mg/ml)）を含むHEPES（100μl）に浸漬し、４℃で２時間インキュベートしてDSHの官能基を介して酵素を結合させ、酵素電極を得た。
【００４２】
（グルコース濃度の測定）
上記酵素電極（DSH濃度1μM、10μM、90μMのそれぞれで調整したもの各2ロット）を用いて、0mM（バックグラウンド）、1mM、3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電圧を＋０．４Ｖ
（vs.銀/塩化銀）とし、３７℃で行った。
【００４３】
（測定結果の評価）
結果を図４に示す。図４に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子（DSH）の濃度が１
μMのときはS/B比が低く、再現性も十分ではなかったが、濃度を10μMにしたときはグル
コース濃度測定に適した再現性及びS/B比が得られた。
【００４４】
実施例２
（酵素電極の作製）
単分子膜形成分子の有無による直接電子移動効率の違いを確認するため、単分子膜形成分子無しで作製した電極と単分子膜形成分子ありで作製した電極の応答を比較した。具体的には、単分子膜形成分子無しの電極は、金ワイヤ（先端3mm）をピランハ溶液（200μl）
に室温で一晩浸漬し、その後、アセトンで洗浄し、酵素（Burkholderia cepacia由来FADGDH(濃度0.028mg/ml)）を含むHEPES（100μl）に浸漬し、４℃で２時間インキュベートし
て酵素を吸着させ、酵素電極を得た。単分子膜形成分子ありの電極は上記工程のピランハ溶液処理後アセトンで洗浄した後、DSHのアセトン溶液（濃度10μM）に浸漬し、２５℃で２４時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた以外は、同じ工程で
電極を作製した。
【００４５】
（グルコース濃度の測定）
上記酵素電極（DSHあり、なしでそれぞれで調製したもの各２ロット）を用いて、0mM（バックグラウンド）、1mM、 3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電圧を＋０．４Ｖ（vs.銀/塩
化銀）とし、３７℃で行った。
【００４６】
（測定結果の評価）
結果を図５に示す。図５に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子（DSH）を介して酵
素を固定した場合において、DSHを用いない場合と比較し７．５倍高いグルコース濃度測
定電流値が得られた。
【００４７】
実施例３
（酵素電極の作製）
単分子膜の鎖長による直接電子移動効率の違いを確認するため、金表面に各単分子膜形成分子を介してCytochrome Cサブユニットを含むGDHを固定化した酵素電極を作製した。単
分子膜形成分子としては、以下のDSH、DSO（Dithiobis(succinimidyl octanoate)）、DSU（Dithiobis(succinimidyl undecanoate)）を用いた。
【表１】
2017211383.tif 000007
具体的には、金ワイヤ（先端3mm）をピランハ溶液（200μl）に室温で一晩浸漬し、その
後、アセトンで洗浄し、各単分子膜形成分子のアセトン溶液（濃度10μM）に浸漬し、２
５℃で２４時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた。続いて、ア
セトンで洗浄し、酵素（Burkholderia cepacia由来FADGDH (濃度0.028mg/ml)）を含むHEPES（100μl）に浸漬し、４℃で２時間インキュベートして酵素を吸着させ、酵素電極を得た。
【００４８】
（グルコース濃度の測定）
上記酵素電極（DSH、DSO、DSUでそれぞれで調製したもの各3ロット）を用いて、0mM（バ
ックグラウンド）、1mM、 3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対す
る応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電圧を＋０．４Ｖ（vs.銀/塩
化銀）とし、３７℃で行った。電流が定常になったときの電流値を測定値としてサンプリングした。
【００４９】
（測定結果の評価）
結果を図６に示す。図６に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子の鎖長が短くなるにつれて高いグルコース濃度測定電流値が得られた。
【００５０】
実施例４
（アスコルビン酸およびアスコルビン酸の影響の解析）
単分子膜形成分子を介して酵素を固定した電極がアスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響を受けるかを調べた。
具体的には、上記実施例２で作製した酵素電極（DSH、各3ロット）を用いて、1.1mM、0.55mMもしくは0mMアセトアミノフェン水溶液または100μM、50μMもしくは0μMアスコルビ
ン酸に対する応答電流値の測定をリニアスイープボルタンメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電圧を−
０．２〜＋０．８Ｖ（vs.銀/塩化銀）とした。結果を図７に示す。その結果、アセトアミノフェンでは400mVを越えたあたりから電流が流れ、アスコルビン酸では200mVを越えたあたりから電流が流れ、グルコースを測定する際にアスコルビン酸やアセトアミノフェンの混入が問題になると考えられた。
【００５１】
上記の結果からアスコルビン酸やアセトアミノフェンのような夾雑物の混入の可能性のある試料のグルコース濃度を測定する際は低電圧が好ましいと考えられた。
そこで、作用極への印加電圧を＋１００ｍＶ（vs.銀/塩化銀）として実施例2と同様の実
験（クロノアンペアメトリー）を行った（各3ロット）。その結果、図８に示すように、
印加電位を＋100 mVに下げた場合でも単分子膜形成分子を介して酵素を固定化した電極（with DSH）では電流値を検出することができ、その応答電流値は酵素を直接吸着させた電極（without SAM）より10倍以上高い値であった。
【００５２】
次に、実際に、＋100mVで測定したときに、アスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響
がないかを確かめた。具体的には、上記実施例２で作製した酵素電極（DSH、各3ロット）を用いて、図８と同様の実験（クロノアンペアメトリー）を、100μMアスコルビン酸もしくは1.1mMアセトアミノフェンを含有するグルコース溶液を用いて行った。
その結果、図９，１０に示すように、単分子膜形成分子を介して酵素を固定した電極を用い、＋100mVの電位を印加したときはアスコルビン酸やアセトアミノフェンが存在すると
きと存在しないときの電流値はほとんど変わらず、アスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響を受けにくいことが分かった。このことは、＋150mVの印加電位でも同様であった
。
【００５３】
さらに、表１に記載のDSH、DSO、DSUを用い、アスコルビン酸やアセトアミノフェンの影
響とリンカー長さの関係をリニアスイープボルタンメトリー（印加電圧−０．２〜＋０．８Ｖ（vs.銀/塩化銀））調べた（各3または2ロット）。その結果、図１１に示すように、同じ電圧を印加した時でもリンカー長さが長いほどアスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響が少ないことが分かった。このことから、単分子膜形成分子のリンカーの長さを長くすることで電極表面への夾雑物の影響をブロッキング可能であることが示唆された。 
【００５４】
実施例５
（酵素電極の作製）
カーボン表面に単分子形成分子を介してCytochrome Cサブユニットを含むGDHを固定化し
た酵素電極を作製した。単分子形成分子としては、以下のPySEを用いた。
【化５】
2017211383.tif 000008
1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester :PySE
【００５５】
具体的には、メソポーラスカーボン(56μg)にPySEのアセトン溶液（濃度10μM）を10μl
加え、1時間室温でインキュベート後、室温で1時間アセトンを揮発させPySE修飾メソポーラスカーボン粉末を得た。これにBurkholderia cepacia由来FADGDH(濃度27.7mg/ml)を3μlおよびHEPES (pH8.0, 濃度50mM)を6μl添加し、1時間室温でインキュベートし、スクロ
ース水溶液（濃度20%）を1μl加えて酵素修飾メソポーラスカーボン分散液を得た。これ
を金スパッタにより形成したフィルム状電極（電極面積0.1mm2）に0.05μlずつ4回滴下し、乾燥後、室温でグルタルアルデヒド飽和蒸気環境に1時間静置して架橋し、酵素/PySE修飾メソポーラスカーボンを金電極に固定した。その後、Tris-HCl水溶液（濃度10mM）に20分間電極を浸漬して未反応のGAをブロッキングし、酵素/PySE/メソポーラスカーボン電極を得た。また比較対照としてPySE無しで酵素電極を同時に調製した。具体的にはPySE修飾メソポーラスカーボンの代わりに、56μgの未修飾メソポーラスカーボンにBurkholderia cepacia由来FADGDH(濃度27.7mg/ml)を3μlおよびHEPES (pH8.0, 濃度50mM)を6μl添加し
、スクロース水溶液（濃度20%）を1μl加えて酵素を吸着させたメソポーラスカーボン分
散液を得た。これを金スパッタにより形成したフィルム状電極（電極面積0.1mm2）に0.05μlずつ4回滴下し、乾燥後、室温でグルタルアルデヒド飽和蒸気環境に1時間静置して架
橋し、酵素/PySE修飾メソポーラスカーボンを金電極に固定した。その後、Tris-HCl水溶
液（濃度10mM）に20分間電極を浸漬して未反応のGAをブロッキングし、酵素吸着メソポーラスカーボン電極を得た。
【００５６】
（グルコース濃度の測定）
上記酵素電極（DSH濃度1μM、10μM、90μMのそれぞれで調製したもの各2ロット）を用いて、0mM（バックグラウンド）、1mM、3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極（Ptワイヤ）、参照極（銀/塩化銀）を用い、作用極への印加電圧を＋０．４Ｖ
（vs.銀/塩化銀）とし、３７℃で行った。電流が定常になったときの電流値を測定値としてサンプリングした。
【００５７】
（測定結果の評価）
結果を図１２に示す。図１２に示す試験結果によれば、単分子形成分子（PySE）を用いて酵素を固定した場合において、吸着のみで電極を調製した場合と比較して2.5倍のグルコ
ース測定電流値が得られた。
【符号の説明】
【００５８】
Ａ・・・酵素電極
１・・・電極
２・・・単分子膜形成分子
３・・・酵素
４・・・絶縁性基板
Ｂ・・・測定装置
１０・・・出力部
１１・・・電力供給装置
１２・・・制御部
１３・・・演算部
１４・・・検出部
１５・・・表示部ユニット
１６・・・バッテリ
１７・・・グルコースセンサ
１８・・・制御コンピュータ
１９・・・ポテンショスタット
２０・・・基板
ＣＲ、Ｗ・・・端子
【図１】
2017211383.tif 000009
【図２】
2017211383.tif 000010
【図３】
2017211383.tif 000011
【図４】
2017211383.tif 000012
【図５】
2017211383.tif 000013
【図６】
2017211383.tif 000014
【図７】
2017211383.tif 000015
【図８】
2017211383.tif 000016
【図９】
2017211383.tif 000017
【図１０】
2017211383.tif 000018
【図１１】
2017211383.tif 000019
【図１２】
2017211383.tif 000020