(57)【要約】      （修正有）【課題】実験動物による飼料の摂餌速度を速めることができる給餌方法を提供すること。【解決手段】実験動物への飼料の給餌方法であって、飼料組成物と水との混合物を凍結して得られる凍結飼料を、実験動物に自由摂取させることを含み、前記凍結飼料の全質量に対する水分含有割合が２０質量％以上である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験動物への飼料の給餌方法であって、
飼料組成物と水との混合物を凍結して得られる凍結飼料を、実験動物に自由摂取させることを含み、
前記凍結飼料の全質量に対する水分含有割合が２０質量％以上である、給餌方法。
【請求項２】
前記凍結飼料が微生物をさらに含む、請求項１に記載の給餌方法。
【請求項３】
前記実験動物がげっ歯類の動物である、請求項１又は２に記載の給餌方法。
【請求項４】
前記凍結飼料の硬度が２０ｋｇ／ｃｍ２以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の給餌方法。
【請求項５】
飼料組成物と水とが混合された状態にあり、且つ水分含有割合が凍結飼料の全質量に対して２０質量％以上である、実験動物に自由摂取させる為の実験動物用凍結飼料。
【請求項６】
微生物をさらに含む、請求項５に記載の実験動物用凍結飼料。
【請求項７】
げっ歯類に給餌する為に用いられるものである、請求項５又は６に記載の実験動物用凍結飼料。
【請求項８】
硬度が２０ｋｇ／ｃｍ２以下である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の実験動物用凍結飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、実験動物への飼料の給餌方法に関する。より詳しくは、本技術は、凍結飼料を用いた実験動物への飼料の給餌方法及び実験動物用凍結飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
実験動物は、その飼養及び保管において、特には実験動物を用いた実験の期間中において、適切に給餌される必要がある。実験動物への給餌方法として、例えば強制給餌による方法又は自由摂取させる方法がある。強制給餌による方法としては、例えばゾンデによる経口投与法が挙げられる。ゾンデによる経口投与法によって、例えば実験動物に所定量の飼料を摂取させたい場合に、当該所定量の飼料や被検物質を確実に胃に到達させることができる。しかし、強制給餌では実験動物に負荷がかかる。一方、実験動物に飼料を自由摂取させる方法では、実験動物へのそのような負荷がなく、ゾンデによる食道へのダメージも無い。
【０００３】
実験動物に被検物質を投与する場合、強制給餌の場合と同様にゾンデ等による強制的投与方法が用いられうるが、そのような投与方法はやはり実験動物に負荷がかかる。強制的でない投与方法としては、被検物質と餌との混餌投与が挙げられる。
【０００４】
実験動物に給餌される飼料に関して、例えば下記特許文献１は「実験動物等の小動物の飼料に適した各種原料混合物を、硬度１０ｋｇ／ｃｍ２以下となるよう成型したことを特徴とするペレット状固型飼料」（請求項１）を記載する。また、下記特許文献２は「鳥獣肉及び／又は魚介肉の乾燥固形物の表面に増粘多糖類及び／又はゼラチンからなる被覆材をコーティングしてある飼育動物用の飼料」（請求項１）を記載する。
【０００５】
混餌投与に関して、例えば下記特許文献３は「γ−アミノ酪酸含有飼料を用いて家畜を飼育すること」（請求項７）を記載する。下記非特許文献１は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅを高脂肪飼料に混ぜたものをマウスに投与する旨を記載する（第１６５７頁左欄「Ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ」の段落）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−１８６号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３１３号公報
【特許文献３】特開２０１１−１９３８５８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Antiobesity effects of Bifidobacterium breve strain B-3 supplementation in a mouse model with high-fat diet-induced obesity. (2010) Biosci Biotechnol Biochem. 74(8):1656-61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
実験動物に被検物質を投与する場合、実験動物への負荷を考慮すると、強制的投与方法よりも、混餌投与、すなわち被検物質と餌との混合物を自由摂取させることが望ましい。しかしながら、当該自由摂取では、所定量の被検物質を実験動物が全量摂取するまでに時間を要する場合がある。そのような場合において、被検物質が室温や酸素に晒されている時間が長くなることにより、被検物質の活性や機能が低下しうる。その結果、被検物質に関して得られたデータの信頼性が低くなる恐れがある。この問題は、被検物質がプロバイオティクス等の嫌気性微生物である場合に特に当てはまると考えられる。なぜなら、嫌気性微生物は室温や酸素に晒されている時間が長くなるとその活性が低下する傾向が考えられるからである。そこで、被検物質と餌との混合物を自由摂取させる給餌方法において、所定量の被検物質をより短時間で確実に摂取させる必要がある。
【０００９】
また、実験期間中だけでなく実験期間外の実験動物の飼養及び保管においても、実験動物は嗜好性により餌を食べきらないことがあり、餌の摂取量を十分に把握できない場合がある。そこで、所定量の餌を短時間で確実に摂取させる方法が必要である。
【００１０】
本技術は、上記課題を解決する給餌方法を提供することを目的とする。また、本技術は、上記課題の解決に資する飼料を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、特定の水分含有割合にある、飼料組成物と水との混合物の凍結飼料を自由摂取させた場合の摂餌速度が、当該飼料組成物そのものを自由摂取させた場合の摂餌速度よりも速いということを見出し、本技術を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本技術は、実験動物への飼料の給餌方法であって、
飼料組成物と水との混合物を凍結して得られる凍結飼料を、実験動物に自由摂取させることを含み、
前記凍結飼料の全質量に対する水分含有割合が２０質量％以上である給餌方法を提供する。
本技術の給餌方法において、前記凍結飼料は微生物をさらに含みうる。
本技術の給餌方法において、前記実験動物はげっ歯類の動物でありうる。
本技術の給餌方法において、前記凍結飼料の硬度は  前記凍結飼料の硬度が２０ｋｇ／ｃｍ２以下でありうる。
【００１３】
また、本技術は、上記方法に用いられる飼料も提供する。
すなわち、本技術は、飼料組成物と水とが混合された状態にあり、且つ水分含有割合が凍結飼料の全質量に対して２０質量％以上である、実験動物に自由摂取させる為の実験動物用凍結飼料を提供する。
本技術の凍結飼料は、微生物をさらに含みうる。
本技術の凍結飼料は、げっ歯類に給餌する為に用いられるものでありうる。
本技術の凍結飼料は、硬度が２０ｋｇ／ｃｍ２以下でありうる。
【発明の効果】
【００１４】
本技術により、自由摂取の場合における実験動物による飼料組成物の摂餌速度が速まるという効果を奏する。なお、本技術により奏される効果は、ここに記載された効果に必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で作成した凍結飼料１〜４及び対照飼料をマウスに自由摂取させた場合の摂餌速度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１７】
＜１．実験動物への飼料の給餌方法＞
本技術の給餌方法は、飼料組成物と水との混合物を凍結して得られる凍結飼料を、実験動物に自由摂取させることを含む。前記凍結飼料の全質量に対する水分含有割合は２０質量％以上である。本技術により、自由摂取の場合における実験動物による飼料組成物の摂餌速度が速まるという効果を奏する。当該効果により、所定量の飼料組成物をより短い時間内に全て食べさせることが可能になるとともに、実験動物による飼料組成物の摂取量の把握をより確実に行うことも可能となる。また、当該効果により、実験動物の適切な健康管理が可能になる。
【００１８】
前記凍結飼料を得る為に用いられる前記飼料組成物は、実験動物への給餌において用いられるものであって、水と混合して凍結により成形されうるものであればよい。前記飼料組成物は、例えばペレット、フレーク、顆粒、又は粉末の形状にある固形飼料であってよく、又は、液状又はゼリー状の飼料であってもよい。また、市販の飼料を粉砕等したものであってもよい。
【００１９】
前記凍結飼料は、飼料組成物を水と混合して得られる混合物を凍結することにより得ることができる。飼料組成物は、水との混合前に、必要に応じて粉砕等により水と混合しやすい状態にされうる。水と飼料組成物との混合は任意の手段により行われてよい。当該混合は、例えばヘラを用いて混合することにより又はミキサー等の機械的手段により行われてもよい。
【００２０】
当該混合物は、任意の形状に成形された後に凍結されてもよく、又は、任意の形状の型に入れた状態で凍結されてもよい。前記凍結飼料の形状及び大きさは、当該飼料が与えられる実験動物に応じて当業者により適宜定められうる。例えば実験動物がげっ歯類の動物である場合、前記凍結飼料の形状は例えばペレットでありうる。ペレット形状は、例えば球状、スティック状（例えば円柱状、角柱状）でありうる。当該混合物を凍結するための温度は、例えば−１０℃以下、−２０℃以下、又は−３０℃以下の温度でありうる。得られた凍結飼料の保管温度も、上記凍結するための温度と同じであってよく、又は異なっていてもよい。
【００２１】
前記凍結飼料は、その全質量に対する水分含有割合が２０質量％以上であり、好ましくは２２質量％以上であり、より好ましくは２５質量％以上でありうる。当該水分含有割合により、自由摂取における実験動物の飼料摂取を促し、摂餌速度が速まりうる。また、飼料組成物が固形飼料である場合に、この水分含有割合により水との混合がより容易になる。
【００２２】
前記水分含有割合は以下のように測定される。−３０℃で保存されている凍結飼料を室温下に出した直後にその質量（Ａ）を測定する。次に、当該凍結飼料を１０５℃の乾熱機で一晩乾燥させたものの質量（Ｂ）を測定する。（Ａ）−（Ｂ）の値（Ｃ）が凍結飼料中の水分の質量であり、（Ｃ）／（Ａ）×１００が水分含有割合（質量％）である。
【００２３】
前記水分含有割合の上限は、特に制限はないが、より少ない凍結飼料質量でより多くの栄養分を投与するためには、例えば７０質量％、特には６５質量％、より特には６０質量％でありうる。前記水分含有割合の範囲は、例えば２０〜７０質量％、特には２２〜６５質量％、より特には２５〜６０質量％である。
【００２４】
本技術の給餌方法は、被検物質が混餌投与により投与される為に用いられうる。すなわち、本技術に用いられる凍結飼料はさらに被検物質も含みうる。被検物質は、例えば飼料組成物と水との混合物にさらに添加されることにより、凍結飼料中に含まれうる。本技術の給餌方法では、所定量の凍結飼料を短時間で実験動物に摂取させることが可能であるので、凍結飼料に含まれる所定量の被検物質も短時間で実験動物に摂取させることが可能になる。その結果、所定量の被検物質をより正確に実験動物に摂取させることが可能になるとともに、被検物質の摂取量の把握をより正確に行うことも可能となる。従って、被検物質に関する試験において、より信頼性の高い実験データを得ることが可能となる。当該被検物質は、実験動物に対するその影響を評価する為に実験動物に投与されるものであればよく、例えば生物学的物質又は化学的物質でありうる。生物学的物質の例としては、微生物、タンパク質、脂質、糖質、核酸、酵素等を挙げることができるがこれらに限定されない。化学的物質としては例えば、食品、飼料、医薬、又は化粧品に用いられる化合物を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２５】
被検物質と飼料組成物との混餌投与に本技術を適用した場合、被検物質は凍結状態にあるので、被検物質の活性や機能が維持されるという効果も奏される。よって、本技術の給餌方法は、凍結状態においてその機能又は活性の維持が図られる被検物質に特に適している。そのような物質として、熱安定性が低い化合物、蛋白質、微生物（細菌類）等が例示され、特には微生物を挙げることができる。
微生物は室温において又は水の存在下において、時間と共にその活性が低下する傾向にある。しかしながら、本技術の給餌方法に用いられる凍結飼料は凍結状態にあるために、そのような活性の低下が抑制され、微生物の活性が維持されうる。よって、本技術の給餌方法は、被検物質として微生物を用いた場合の実験に特に適している。
また、微生物のうち、特にプロバイオティクス等の嫌気性微生物は酸素にさらされると、その活性が低下する傾向にある。本技術において用いられる凍結飼料に嫌気性微生物が含まれる場合、嫌気性微生物と酸素との接触が抑制されるので、本技術の給餌方法は、プロバイオティクス等の嫌気性微生物に特に適している。以上のとおり、本技術の給餌方法は、被検物質の活性や機能が維持されるという効果を奏し、特には被検物質として微生物を用いた実験、より特には被検物質としてプロバイオティクス等の嫌気性微生物を用いた実験に適している。
また本技術において用いられる凍結飼料は凍結状態にあることによって、凍結飼料に含まれる飼料組成物についても、例えば成分分解の抑制や酸化防止によってその品質がより長く維持されうる。
【００２６】
本技術の給餌方法で用いられる凍結飼料に含まれる微生物は、例えば実験動物に対するその影響を評価する為に用いられる微生物、又は、実験動物の健康状態を良好に維持又は改善する為に用いられる微生物でありうる。当該微生物として例えばプロバイオティクスを挙げることができる。プロバイオティクスとは、腸内フローラを改善して有益な作用をもたらす微生物をいう。また、当該凍結飼料には、プロバイオティクスに加えて、プロバイオティクスの餌となるプレバイオティクスが含まれうる。プレバイオティクスとしては、例えばオリゴ糖や食物繊維を挙げることができる。当該凍結飼料は、例えば、プロバイオティクスは含まれないが、プレバイオティクスが含まれるものであってもよい。
【００２７】
上記プロバイオティクスの例としては、ラクトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、及びストレプトコッカス属細菌、又は、ビフィドバクテリウム属細菌を挙げることができるが、これらに限定されない。ラクトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、及びストレプトコッカス属細菌は、代謝により乳酸を生成する細菌類の総称である乳酸菌とも呼ばれうる。ビフィドバクテリウム属細菌は、代謝により乳酸及び酢酸を生成する細菌類の総称であるビフィズス菌とも呼ばれうる。
【００２８】
上記プロバイオティクスのより具体的な例は以下のとおりである。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の例として、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ジアセチラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ． ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等の菌株；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の例として、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ． ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）等の菌株；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の例として、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィルス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の菌株等が挙げられ、これらの細菌を１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
また、ビフィドバクテリウム属細菌の例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）等の菌株が挙げられ、これらの細菌を１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
本技術において実験動物とは、実験に付されうる動物であって、咀嚼により飼料を摂取することができる動物であればよい。本技術の給餌方法は、特にげっ歯類の実験動物に適している。げっ歯類の実験動物として、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスターを挙げることができる。しかしながら、本技術の給餌方法は、げっ歯類以外の実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サルに適用することも可能である。これら実験動物に特有のモノをかじるという習性の点から、本技術に用いられる凍結飼料が適していると考えられる。本技術に用いられる凍結飼料のカリカリとした食感が、特にはげっ歯類の実験動物に適していると考えられる。
【００３１】
本技術において用いられる凍結飼料の硬度は、好ましくは２０ｋｇ／ｃｍ２以下、より好ましくは１７ｋｇ／ｃｍ２以下、さらにより好ましくは１５ｋｇ／ｃｍ２以下でありうる。当該硬度は、−３０℃に保存されている凍結飼料を冷凍庫から室温に出して２分以内にテクスチャーアナライザー（TA.XT.plus  Texture  Analyser、Stable  Micro  Systems  LTD.)を用いて測定されたものである。当該測定において用いられるプローブはHDB/VB;  VOLOPKEVICH  BITE  JAWS(底面積０．２ｃｍ２（０．２センチｘ１．０センチ）であり、テクスチャーアナライザーの先端の下降速度は０．１ｍｍ／秒である。本技術に用いられる凍結飼料は、上記硬度を有することによって、実験動物、特にはげっ歯類の実験動物の摂餌をさらに促すと考えられる。
【００３２】
本技術において用いられる飼料組成物の組成は、用いられる実験動物に適したもの又は用いられる実験系に適したものであれば任意のものであってよい。飼料組成物の粗タンパク質含有割合は、飼料組成物全質量に対して、例えば１０〜３０質量％、特には１２〜２５質量％でありうる。飼料組成物の粗脂肪含有割合は、飼料組成物全質量に対して、例えば２〜１５質量％、特には３〜１０質量％でありうる。飼料組成物の粗灰分含有割合は、飼料組成物全質量に対して、例えば１〜５質量％、特には２〜４質量％でありうる。飼料組成物の粗繊維含有割合は、飼料組成物全質量に対して、例えば１〜８質量％、特には２〜６質量％でありうる。飼料組成物の可溶性無窒素物の含有割合は、飼料組成物全質量に対して、例えば４５〜７５質量％、特には５０〜７０質量％でありうる。また、飼料組成物は、例えばカゼインを、例えば１０〜３０質量％、特には１２〜２５質量％含みうる。飼料組成物は、例えばデンプン、特にはコーンスターチを、例えば４０〜７０質量％、特には４５〜６５質量％含みうる。飼料組成物は、例えばショ糖を、例えば３〜１５質量％、特には５〜１２質量％含みうる。げっ歯類の実験動物用の飼料組成物としては、例えばＡＩＮ精製飼料（米国国立栄養研究所(AIN)から1977年(AIN-76)及び、1993年(AIN-93)に発表されたマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料）が例示され、ＡＩＮ−９３Ｇ、ＡＩＮ−９３Ｍ、及びＡＩＮ−７６等を挙げることができる。
【００３３】
本技術において自由摂取とは、飼料の摂取を実験動物に強制せず、実験動物の意に任せて飼料を摂取させることをいう。自由摂取は例えば、実験動物が飼育されているケージ内に、当該実験動物が自由に摂餌することができるように飼料を置いた状態で、実験動物に当該飼料を摂取させることでありうる。具体的な給餌様式は当業者により適宜定められてよいが、例えば実験動物を飼育しているケージ内に本技術の凍結飼料を落とし、その落ちた凍結飼料を実験動物に自由に摂取させたり、又は、ケージ内に本技術の凍結飼料を入れたケースを置いて、そのケース内の当該凍結飼料を実験動物に自由に摂取させたりしてもよい。
【００３４】
本技術の給餌方法において、本技術に係る凍結飼料と、凍結されていない他の飼料組成物、例えば一般的な実験動物用飼料組成物とが併用されうる。１日に投与される飼料全質量に対する本技術に係る凍結飼料の構成割合は、当業者により適宜設定されてよいが、例えば５割以下、４割以下、３割以下、又は２割以下でありうる。
【００３５】
＜２．実験動物用凍結飼料＞
本技術は、実験動物に自由摂取させる為の実験動物用凍結飼料を提供する。当該実験動物用凍結飼料は、上記本技術の給餌方法に関して述べた凍結飼料と同じでありうる。すなわち、当該凍結飼料は、飼料組成物と水とが混合された状態にあり、且つ水分含有割合が凍結飼料の全質量に対して２０質量％以上である。
【００３６】
本技術の実験動物用凍結飼料は、飼料組成物と水とを混合し、得られる混合物を凍結することを含む製造方法により、製造されうる。当該製造方法において用いられる飼料組成物、飼料組成物と水との混合手段、凍結飼料の形状、凍結温度、凍結飼料の水分含有割合、および凍結飼料の硬度は、本技術の給餌方法に関して述べた凍結飼料と同様でありうる。
【００３７】
本技術の実験動物用凍結飼料は、本技術の給餌方法において用いられうる。すなわち、実験動物に自由摂取させる為に用いられうる。自由摂取の様式は、本技術の給餌方法に関して述べたとおりである。
【００３８】
本技術の実験動物用凍結飼料は、本技術の給餌方法に関して述べた混餌投与に用いられうる。すなわち、本技術の実験動物用凍結飼料は被検物質をさらに含みうる。当該被検物質は、特には微生物、より特にはプロバイオティクス等の嫌気性微生物でありうる。被検物質を含む本技術の実験動物用凍結飼料は、例えば上記製造方法のうち飼料組成物と水との混合工程において、被検物質が混合物に添加されることにより製造されうる。なお、飼料組成物と被検物質とが先に混合され、次に水が添加されてもよく、飼料組成物、水、及び被検物質の添加順序は当業者により適宜定められてよい。
【００３９】
以下、実施例に基づいて本開示を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本開示の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。
【実施例１】
【００４０】
［凍結飼料の製造］
粉末状の飼料組成物（ＡＩＮ−９３Ｇ、オリエンタル酵母工業株式会社）と水とを、以下の表１に記載の割合で混合して練ることにより、飼料組成物と水との混合物４種（以下それぞれ、「混合物１」〜「混合物４」という）を得た。混合物１〜４の合計質量に対する添加水分の質量割合は２０質量％、３０質量％、４０質量％、及び５０質量％であり、当該飼料組成物自体に含まれる水分含有割合は９質量％であった。当該飼料組成物は、粗蛋白質含有割合が１７．９質量％、粗脂肪含有割合が７．０質量％、粗灰分含有割合が２．５質量％、粗繊維含有割合が３．０質量％、可溶性無窒素物含有割合が６０．６質量％であった。また、当該飼料組成物は、カゼインを２０．０質量％、コーンスターチを３９．７４８６質量％、α化コーンスターチを１３．２質量％、ショ糖を１０．０質量％含むものであった。
【００４１】
【表１】
2017175977.tif 000002
【００４２】
５ｍｌ容量のシリンジ（テルモシリンジ（商標）、テルモ株式会社、外筒部分の直径１．３ｃｍ）の筒先を切り落として、押し子を押したときに内容物が外筒の直径と同じ直径の円柱状物として押し出されるようにした。当該筒先を切り落としたシリンジに、混合物１を詰めた。その後、当該シリンジから混合物１を押し出すことにより、混合物を直径１．３ｃｍの円柱状に成形した。当該円柱状混合物を、０．５ｇ分ずつ輪切りにし、ラップに包み、−３０℃にて冷凍して凍結飼料（以下、「凍結飼料１」という）を得た。凍結飼料１は使用直前まで−３０℃にて保存された。
【００４３】
混合物２〜４についても、凍結飼料１と同じ方法で成形及び凍結して凍結飼料（以下それぞれ「凍結飼料２」〜「凍結飼料４」という）を作成した。
【００４４】
対照飼料として、ペレット飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ、オリエンタル酵母工業株式会社）を０．５ｇ分ずつ輪切りにしたものを用意した。当該対照飼料の形状は、凍結飼料の形状とほぼ同等であった。
【００４５】
［凍結飼料の水分含有割合測定］
−３０℃で冷凍庫内に保存されている凍結飼料１のうち、水分含有割合測定のために４つの０．５ｇ片サンプルを冷凍庫から取り出し、取り出した直後にそれら４サンプルの質量（Ａ）を夫々測定した。次に、それら４サンプルを１０５℃の乾熱機内で一晩乾燥させて、乾燥後の質量（Ｂ）を夫々測定した。（Ａ）−（Ｂ）により、凍結飼料中の水分質量（Ｃ）を求め、（Ｃ）／（Ａ）×１００により、水分含有割合（質量％）を４サンプル夫々について算出し、算出された値に基づきこれら４サンプルの平均水分含有割合を算出した。同じ方法により、凍結飼料２〜４及び対照飼料についても、平均水分含有割合を算出した。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2017175977.tif 000003
【００４７】
［凍結飼料の硬度測定］
−３０℃で冷凍庫内に保存されている凍結飼料１のうち、硬度測定のために４つの０．５ｇ片サンプルを冷凍庫から室温に出し、室温に出してから２分以内にテクスチャーアナライザー（TA.XT.plus Texture Analyser、Stable Micro Systems LTD.）を用いて夫々のサンプルについて硬度を測定した。当該測定においてプローブとして、HDB/VB;  VOLOPKEVICH BITE JAWS（底面積０．２ｃｍ２（０．２センチ×１．０センチ））用いた。テクスチャーアナライザーの先端の下降速度は０．１ｍｍ／秒であった。４サンプル夫々についての測定値に基づき、４サンプルの平均硬度を算出した。同じ方法により、凍結飼料２〜４及び対照飼料についても平均硬度を算出した。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2017175977.tif 000004
【００４９】
［マウスによる凍結飼料の摂餌速度の測定］
摂餌速度の測定において、ペレット飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ、オリエンタル酵母工業株式会社）で個飼いされているＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。凍結飼料の投与期間は７日間とし、凍結飼料の投与量は１日当たり０．５ｇとした。当該投与量は、マウスが１日に食べる飼料全質量の２割以下である。凍結飼料は、投与直前まで−３０℃に保存されていた。当該７日間のうち、最初の３日間は、もともと食べている飼料を取り上げた後に、凍結飼料０．５ｇをケージ内に落として凍結飼料の自由摂取を開始し、凍結飼料を落としたときから凍結飼料を食べ終わるまでの時間を測定した。それ以降は、凍結飼料を優先的に食べるので、もともと食べている飼料はそのままとした状態で、凍結飼料をケージ内に落として凍結飼料の自由摂取を開始し、凍結飼料を落としたときから凍結飼料を食べ終わるまでの時間を測定した。以上の測定を、各凍結飼料について４匹のマウスに対して行い、測定された時間の平均値を算出した。
対照飼料についても、同じように摂餌速度の測定を行った。測定結果を表４及び図１に示す。
なお、図１中の「＊」は、ダネット検定（Dunnett’s test）により各凍結飼料の結果を対照飼料の結果に対して比較したところ、ｐ＜０．０５であることを示す。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
表４及び図１に示されるとおり、凍結飼料１〜４のいずれについても、飼料を食べ終わるまでの時間は、対照飼料についてのものよりも短かった。特に３日目以降は、凍結飼料１〜４のいずれについても、飼料を食べ終わるまでの時間は、対照飼料についてのものよりも有意に短かった。これらの結果により、本技術の給餌方法により、摂餌速度が速められることが示された。
【実施例２】
【００５２】
［凍結飼料中における微生物の活性］
飼料０．５ｇあたりビフィズス菌（Bifidobacterium longum ATCC BAA-999）を０．００７２ｇ（１×１０９ CFU/ml）追加して混合したこと以外は、実施例１に記載の凍結飼料２（添加水分添加割合３０％）と同じ方法で、凍結飼料を作成した。当該凍結飼料のうち３つの０．５ｇ片サンプルについて夫々、−３０℃での保存下における当該ビフィズス菌の活性を測定した。保存期間は３０日とした。当該活性の尺度として、凍結飼料中の当該ビフィズス菌の生菌数を用いた。
生菌数の測定は、飼料０．５ｇを生理食塩水中に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈した菌液をＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社製）により混釈し、３７℃で４８時間嫌気条件下で培養し、コロニーをカウントすることにより行った。なお、嫌気培養には、アネロパック、アネロパック角型ジャー（三菱ガス化学株式会社製）を使用した。
上記３つのサンプル夫々について凍結前、凍結後３日目、７日目、及び３０日目での生菌数を測定し、測定された生菌数の平均値を算出した。測定結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
表５に示されるとおり、凍結飼料中の上記ビフィズス菌は、約１ヶ月間活性を維持した。よって、本技術に従う凍結飼料は、凍結状態下において、ビフィズス菌等の微生物の活性を長期間にわたり維持することができる。従って、微生物を被検物質として用いた動物実験を行う際に、実験開始時に凍結飼料を大量に調製して保存しておくことで、飼料調製の手間を省くことができる。
実験動物用の飼料の調製において凍結作業はコストや手間の面から一般には採用しないものであるが、あえて飼料を凍結させたことで、上記のとおり摂餌速度を速めるという効果を得ることができるとともに、被検物質の活性等の維持や飼料調製の手間を省くという効果が奏される。加えて、実験期間を通じて、同一ロットの凍結飼料による給餌が可能となり、より信頼性の高い実験データを得ることも可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本技術の給餌方法は、実験動物への適切な給餌に資するものであり、自由摂取において所定量の飼料組成物を確実に摂取させるために利用できる。また、本技術の給餌方法は、被検物質と飼料組成物との混餌投与にも適用できるので、自由摂取において所定量の被検物質を確実に実験動物に摂取させるためにも利用できる。
【図１】
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