(57)【要約】【課題】マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導する細胞培養基材を提供する。【解決手段】本発明のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする。本発明のマクロファージの形質制御方法は、前記マクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材上で、マクロファージを培養することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とするマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材。
【請求項２】
前記凹凸のパターンが格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状、ラビリンス状、ライン状又はドット状である、請求項１に記載のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材上で、マクロファージを培養することを特徴とするマクロファージの形質制御方法。
【請求項４】
前記マクロファージの培養時間が１時間以上１００時間以下である、請求項３に記載のマクロファージの形質制御方法。
【請求項５】
前記マクロファージを泡沫細胞（ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ）に形質誘導する、請求項３又は４に記載のマクロファージの形質制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材及びマクロファージの形質制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ（記号で、ＭΦと表される。）は血液中の白血球の５％を占める単球（単核白血球）から分化することが知られている。組織内の単球は、各組織において様々な環境因子および誘導因子の影響を受けてマクロファージに分化する。マクロファージの分化型には、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ等のＴｈ１サイトカインや腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リポ多糖（ＬＰＳ）等の刺激により形質誘導されるＭ１（炎症型）マクロファージと、インターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインによって形質誘導されるＭ２（抗炎症型）マクロファージとの少なくとも２種類があることが知られている。マクロファージには活性型（Ｍ１，Ｍ２）以外にも、休止型（ｒｅｓｔｉｎｇ）マクロファージがあることが知られている。
【０００３】
Ｍ１マクロファージはＴＮＦ−α、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインの発現レベルが高く、それらの分泌を介して酸化ストレスの誘発や好中球浸潤を誘導し、壊死組織を分解し、異物や細菌を除去するとともに、自らの貪食作用によりそれらの一翼を担っていると考えられている。一方、Ｍ２マクロファージはＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β等を高発現しており、ＩＬ−１０の分泌を介してＭ１マクロファージからの炎症性サイトカイン分泌を低下させることなどにより炎症を抑制させる方向に働くと共に、ＴＧＦ−βや血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の分泌を介して組織修復にも関与していると考えられている。
【０００４】
このようにＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとは生体内で異なる役割を果たしており、外的刺激による炎症の誘発及び損傷修復までの機構が正常に機能するためには、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとのバランスが重要となる。したがって、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとのバランスの不均衡は種々の疾患又は障害の原因となると考えられている。
【０００５】
特許文献１には、乳酸菌を含むＭ２マクロファージへの形質誘導剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−１８１１９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
乳酸菌を形質誘導剤として使用する方法は、マクロファージがＭ２マクロファージへと分化した後に、使用した乳酸菌を除去しなければならない。また、Ｍ２マクロファージへの形質誘導はできるが、Ｍ１マクロファージへの形質誘導はできない。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導する細胞培養基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、マクロファージの形質誘導が細胞表面上でのナノスケールの分子による刺激に起因するものであることに着目し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の第１の態様は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とするマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材である。
【００１１】
本発明の第２の態様は、前記マクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材上で、マクロファージを培養することを特徴とするマクロファージの形質制御方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の形質誘導制御用細胞培養基材によれば、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。また、生体適合性を向上させた医療材料に応用することができる。本発明のマクロファージの形質制御方法によれば、マクロファージを炎症型又は抗炎症型マクロファージに誘導し、疾患モデル等を簡便に構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材（パターン：ライン状）の拡大平面図及び拡大正面図である。（Ｂ）本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材（パターン：ドット状）の拡大平面図及び拡大正面図である。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）実施例１におけるＲＡＷ２６４細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生量の定量結果を示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）実施例１におけるＲＡＷ２６４細胞のアルギナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】（Ａ）（Ｂ）実施例２におけるＲＡＷ２６４細胞の泡沫細胞（ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ）への形質誘導試験の結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜マクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材＞＞
一実施形態において、本発明は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満である、マクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を提供する。
【００１５】
本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材によれば、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。また、生体適合性を向上させた医療材料に応用することができる。また、本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を用いることで、マクロファージを炎症型（Ｍ１）マクロファージ、抗炎症型（Ｍ２）マクロファージ又は泡沫細胞等に形質誘導することができる。よって、本明細書において、「形質誘導」は、「分化誘導」を含む。
【００１６】
＜単球＞
本明細書において、「単球」とは、血液中を循環している未熟な食細胞であり、抗原提示免疫細胞として働き、病原体や異物を食作用によって取り込み、分解する機能を持つ細胞を意味する。
単球としては、例えば、マウス、サル、ヒト等の哺乳動物に由来する単球を用いればよい。これらの中でも、ヒト由来の単球が好ましく、ヒト末梢血由来の単球（ヒト末梢血単球）がより好ましい。
【００１７】
単球は、ヒト末梢血由来ＣＤ１４＋単球（プロモセル社製）等の市販品を用いてもよいし、ドナーから採血した末梢血全血からアフェレシスにより採取した単球でもよい。アフェレシスの方法は、全血から単球を分離しうるものであれば特に限定されないが、例えば、血液成分分離装置等を用いればよい。血液成分分離装置としては、例えば、ＣＯＢＥ（Ｒ）  Ｓｐｅｃｔｒａ（テルモＢＣＴ社製）、ＣＯＭ．ＴＥＣ（フレゼニウスカービ社製）等が挙げられる。また、血液成分分離装置を用いなくても、密度勾配遠心法により全血から単球を分離及び回収してもよい。なお、ドナーは哺乳動物（好ましくは、ヒト）であり、ドナーから採血する場合には、採血の数日前からドナーに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与していてもよい。
【００１８】
＜マクロファージ＞
本明細書において、「マクロファージ」とは、マクロファージのマーカーであるＣＤ１４が陽性である細胞を意味する。さらに、マクロファージはその分化型により、Ｍ１（炎症型）マクロファージ及びＭ２（抗炎症型）マクロファージを包含する活性型マクロファージ、並びに休止型マクロファージに分類することができる。
本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を用いた培養に使用するマクロファージは、休止型マクロファージが好ましく、また、上述の単球から分化誘導された休止型マクロファージでもよい。また、本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を用いることで、形質誘導されたマクロファージを得ることができる。得られるマクロファージは、活性型マクロファージが好ましく、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージがより好ましい。
【００１９】
以下に、活性型マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ及び休止型マクロファージについて説明する。
【００２０】
［活性型マクロファージ］
活性型マクロファージとは、ＣＤ１４が陽性であり、かつ、Ｍ１マクロファージのマーカーであるＣＤ８０又はＭ２マクロファージのマーカーであるＣＤ２０６が陽性である細胞を意味する。すなわち、活性型マクロファージはＭ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む。
【００２１】
［Ｍ１（炎症型）マクロファージ］
Ｍ１マクロファージとは、マクロファージのマーカーであるＣＤ１４が陽性で、かつＭ１マクロファージのマーカーであるＣＤ８０も陽性である細胞を意味する。Ｍ１マクロファージは、古典的活性化マクロファージ、炎症性マクロファージとしても知られ、免疫を亢進し、炎症を惹起及び促進すると考えられている。
【００２２】
［Ｍ２（抗炎症型）マクロファージ］
Ｍ２マクロファージとは、マクロファージのマーカーであるＣＤ１４が陽性で、かつＭ２マクロファージのマーカーであるＣＤ２０６も陽性である細胞を意味する。Ｍ２マクロファージは、創傷治癒マクロファージ、抗炎症性マクロファージとしても知られ、免疫を抑制し、炎症を終結に向かわせると考えられている。
【００２３】
［休止型（ｒｅｓｔｉｎｇ）マクロファージ］
休止型マクロファージとは、マクロファージのマーカーであるＣＤ１４が陽性で、かつ、ＣＤ８０及びＣＤ２０６がともに陰性である細胞を意味する。休止型マクロファージは、血中から組織へ浸潤した単球がマクロファージに分化しているものの、非活性化状態（休止状態）にあると考えられている。
【００２４】
＜基材＞
本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材において、使用する基材は、基板上に凹凸のパターンを有する。また、基材は、細胞を培養する際や、滅菌処理のような前処理によって変形しないものであれば特に限定されない。基材は全体が同一の材料から構成されていてもよく、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されていてもよい。
【００２５】
基材の形態としては、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、たとえば、６、１２、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。
【００２６】
［基板］
基材が、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されている場合、基板の材質としては、細胞培養用途に用いられるものであれば、特別な限定はない。基板の材質としてより具体的には、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン等が挙げられる。これらの材質を用いることにより、自家蛍光物質が低く、培養された細胞を蛍光顕微鏡に観察することができる。
【００２７】
［凹凸パターン］
凹凸のパターンとしては、例えば、格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状（例えば、ハニカム構造状等）、ラビリンス状、ライン状又はドット状等が挙げられる。図１は、本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材の拡大平面図及び拡大正面図である。図１（Ａ）は、凹凸のパターンがライン状である場合を示しており、図１（Ｂ）は凹凸のパターンがドット状である場合を示している。図１（Ａ）の拡大正面図において、凸部の形状が直方体型のライン状を示しているが、これに限定されず、凸部の形状が角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型、半円柱型（半円柱には、半楕円柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等であってもよい。
【００２８】
また、図１（Ｂ）において、凸部の横断面が円形型であり、縦断面が直角形型である（すなわち、凸部の形状が円柱状である）ドット状を示しているが、これに限定されず、凸部の横断面又は縦断面が三角形及び四角形等の多角形型、円形型（円形には、略円形、楕円形、略楕円形、半円形、扇形を含む）、台形型、波型等であってもよい。すなわち、凸部の形状としては、例えば、角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型（角錐台には、双角錐台を含む）、円柱型（円柱には、楕円柱、半円柱、半楕円柱、扇形柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２９】
凹部及び凸部の幅は、５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることがより好ましく、１５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。幅が上記範囲であることにより、マクロファージの細胞表面を刺激し、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。なお、凸部の形状が円柱型、円錐台型である場合は、幅は凸部上面の直径を示す。
【００３０】
凹凸パターンの凸部の表面までの距離は、１０ｎｍ〜１００μｍが好ましい。凸部の表面までの距離が上記範囲内である場合、基材の自家蛍光を抑制しやすい。このため、上記範囲内の距離の基材を用いると、培養された細胞の蛍光顕微鏡による観察が容易である。
【００３１】
［凹凸パターンの形成方法］
凹凸パターンを形成する方法は、特に限定されない。凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、凹凸パターンを支持するための基材の表面に形成された感光性組成物層を選択的に露光した後、露光された感光性組成物層から凹部に相当する箇所を現像液により除去するフォトリソグラフィー法、基板表面に形成されたインプリント材料の層に凹凸のパターンを備える押し型を押し付けた後にインプリント材料を硬化させるインプリント法、基板表面に凸部に相当する箇所を被覆するマスクを設けた後に、エッチングのような化学的処理により基板表面に凹部を形成する方法、サンドブラストや種々の工作機械によって基板表面を研削加工する方法、所定の形状のパターンの凸部を構成する材料を基板の表面に貼り付ける方法等が挙げられる。フォトリソグラフィー法やインプリント法には、従来から種々の目的で使用されている感光性樹脂組成物や、感光性ＳＯＧ（スピンオングラス）材料を特に制限なく用いることができる。
【００３２】
（感光性樹脂組成物）
凹凸パターンの形成に使用される感光性樹脂組成物としては、例えば、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤を含有する感光性樹脂組成物等が挙げられる。感光性樹脂組成物は、ポジ型、ネガ型のいずれであってもよい。
【００３３】
樹脂成分としては、例えば、細胞培養に用いることができるものであれば、特別な限定はない。中でも、エチレン性不飽和結合を有する化合物の重合体が好ましい。エチレン性不飽和結合を有する化合物に含まれる重合性の官能基としては、例えば、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、及びアリル基等が挙げられる。エチレン性不飽和結合を有する化合物としては、例えば、単官能、２官能、又は３官能以上の多官能の、（メタ）アクリレート化合物、（メタ）アクリルアミド化合物、ビニル化合物、及びアリル化合物等を用いることができる。これらのエチレン性不飽和結合を有する化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３４】
エチレン性不飽和結合を有する多官能の化合物としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、エチレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、プロピレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート等の３官能以上のアクリレート；ポリイソシアネート化合物とヒドロキシ基含有（メタ）アクリレートモノマーと、を反応させて得られる多官能ウレタン（メタ）アクリレート；多価アルコールとＮ−メチロール（メタ）アクリルアミドとの縮合物等が挙げられる。これらの多官能の化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３５】
エチレン性不飽和結合を有する２官能の化合物としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリトリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、２−（メタ）アクロイルオキシエチル−２−ヒドロキシエチルフタレート、グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物、ウレタンモノマー、γ−クロロ−β−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、β−ヒドロキシエチル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、及びβ−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート等が挙げられる。
【００３６】
上記グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物としては、例えば、トリグリセロールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。上記ウレタンモノマーとしては、例えば、β位に水酸基を有する（メタ）アクリルモノマーとイソホロンジイソシアネート、２，６−トルエンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート等との付加反応物、ＥＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート、及びＥＯ，ＰＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００３７】
エチレン性不飽和結合を有する単官能の化合物としては、（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド類、アリル化合物、ビニルエーテル類、ビニルエステル類、スチレン類等が挙げられる。これらの化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３８】
（メタ）アクリル酸エステル類としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ｔ−オクチル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アクリレート、２，２−ジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フルフリル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＰＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ／ＰＯ共付加物の（メタ）アクリレート、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノエチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ＥＯ／ＰＯ共重合体のモノ（メタ）アクリレート、及びＥＯ／ＰＯ共重合体のモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００３９】
（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４０】
ビニルエーテル類としては、ヘキシルビニルエーテル、オクチルビニルエーテル、デシルビニルエーテル、エチルヘキシルビニルエーテル、メトキシエチルビニルエーテル、エトキシエチルビニルエーテル、クロルエチルビニルエーテル、１−メチル−２，２−ジメチルプロピルビニルエーテル、２−エチルブチルビニルエーテル、ヒドロキシエチルビニルエーテル、ジエチレングリコールビニルエーテル、ジメチルアミノエチルビニルエーテル、ジエチルアミノエチルビニルエーテル、ブチルアミノエチルビニルエーテル、ベンジルビニルエーテル、テトラヒドロフルフリルビニルエーテル等のアルキルビニルエーテル；ビニルフェニルエーテル、ビニルトリルエーテル、ビニルクロルフェニルエーテル、ビニル−２，４−ジクロルフェニルエーテル、ビニルナフチルエーテル、ビニルアントラニルエーテル等のビニルアリルエーテル等が挙げられる。
【００４１】
ビニルエステル類としては、ビニルブチレート、ビニルイソブチレート、ビニルトリメチルアセテート、ビニルジエチルアセテート、ビニルバレート、ビニルカプロエート、ビニルクロルアセテート、ビニルジクロルアセテート、ビニルメトキシアセテート、ビニルブトキシアセテート、ビニルフエニルアセテート、ビニルアセトアセテート、ビニルラクテート、ビニル−β−フェニルブチレート、安息香酸ビニル、サリチル酸ビニル、クロル安息香酸ビニル、テトラクロル安息香酸ビニル、ナフトエ酸ビニル等が挙げられる。
【００４２】
スチレン類としては、スチレン；メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルスチレン、イソプロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキシルスチレン、シクロヘキシルスチレン、デシルスチレン、ベンジルスチレン、クロルメチルスチレン、トリフルオロメチルスチレン、エトキシメチルスチレン、アセトキシメチルスチレン等のアルキルスチレン；メトキシスチレン、４−メトキシ−３−メチルスチレン、ジメトキシスチレン等のアルコキシスチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、トリクロロスチレン、テトラクロロスチレン、ペンタクロロスチレン、ブロモスチレン、ジブロモスチレン、ヨードスチレン、フルオロスチレン、トリフルオロスチレン、２−ブロモ−４−トリフルオロメチルスチレン、４−フルオロ−３−トリフルオロメチルスチレン等のハロスチレン等が挙げられる。
【００４３】
カチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー、Ｘ線、及び電子線等の放射線の照射を受けてカチオンを生じるものであり、そのカチオンが重合開始剤となりうる化合物である。
【００４４】
カチオン重合開始剤としては、例えば、ヨードニウム塩やスルホニウム塩のようなオニウム塩型のカチオン重合開始剤を用いることができる。オニウム塩型のカチオン重合開始剤を構成する、オニウムイオンの対イオンとなるアニオンは、フッ素化アルキルフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、又はヘキサフルオロアンチモン酸アニオン（ＳｂＦ６−）が好ましい。
【００４５】
感光性樹脂組成物に含まれる溶剤は、均一な感光性樹脂組成物を調製可能であり、露光による効果を阻害しないものであれば特に限定されない。溶剤の沸点は、５０℃〜２００℃が好ましい。
【００４６】
溶剤の具体例としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、及び１−ブタノールのようなアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−ヘプタノン、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、ジブチルエーテル、メチル−３−メトキシプロピオネート、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ブチルセロソルブ、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ヘキシレングリコール、シクロヘキサノン、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ピルビン酸エチル、及びエチルセロソルブアセテート等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４７】
感光性樹脂組成物は、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤の他に、従来から感光性樹脂組成物に使用されている種々の添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤としては、付加的樹脂、増感剤、可塑剤、安定剤、着色剤、カップリング剤、レベリング剤等が挙げられる。
【００４８】
感光性樹脂組成物は、上記各成分を３本ロールミル、ボールミル、サンドミル等の撹拌機で混合（分散・混練）し、必要に応じて５μｍメンブランフィルタ等のフィルタで濾過して調製することができる。
【００４９】
［基材の製造方法］
基材の製造方法は、上述の感光性樹脂組成物を露光して硬化させ、所望するパターンを有する基材を形成できる方法であれば特に限定されない。細胞培養基材の製造方法としては、例えば、基板上に、感光性樹脂組成物を塗布して塗布膜を形成する塗布工程と、基板上の塗布膜を露光して硬化させる露光工程と、を含む方法が挙げられる。上記の基材の製造方法は、必要に応じて、基板上の塗布膜を露光して硬化させた後に、露光された塗布膜を基板から剥離させる、剥離工程を含んでいてもよい。
【００５０】
塗布工程において、感光性樹脂組成物が塗布される基板は、基材を製造する過程で変形や劣化が生じないものであれば特に限定されない。基板の材質としては、上述の（基板）と同様のものが挙げられる。
【００５１】
凹凸のパターンの形成方法としては、上述の（凹凸パターンの形成方法）と同様のものが挙げられる。
【００５２】
基板上に塗布膜を形成する方法は特に限定されず、所定量の感光性樹脂組成物を基板上に滴下する方法や、ロールコータ、リバースコータ、バーコータ等の接触転写型塗布装置を用いる方法や、スピンナー（回転式塗布装置）、カーテンフローコータ等の非接触型塗布装置を用いる方法が挙げられる。
【００５３】
塗布膜を形成した後は、塗布膜を備える基板を減圧条件下におき、塗布膜を脱気してもよい。
【００５４】
露光工程において、塗布膜を露光する方法は、塗布膜を良好に硬化できればよく、特に限定されない。露光には、例えば、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、キセノンランプ、カーボンアーク灯等の紫外線を発する光源を用いればよい。塗布膜を露光する際の露光量は、感光性樹脂組成物の組成や、塗布膜の膜厚等を考慮して適宜定められる。典型的には、塗布膜を露光する際の露光量は、１０〜１０００００ｍＪ／ｃｍ２が好ましく、１００〜５００００ｍＪ／ｃｍ２がより好ましい。
【００５５】
塗布膜を露光する方法は特に限定されないが、最初に大気中で塗布膜を露光して部分的に塗布膜の硬化を進行させてもよい。これにより、露光工程において、感光性樹脂組成物が基板上からはみ出すことを防ぎ、後に、塗布膜を水中で露光することが可能となる。大気中での露光を行わずに、塗布膜を水中で露光すると、塗布膜が水に溶解する場合がある。大気中で塗布膜を露光した後に、水中で塗布膜を露光すると、酸素によるラジカル重合阻害を低減することが出来、良好な硬化膜を得ることができる。
【００５６】
また、露光工程は、真空中での塗布膜の露光を含んでいてもよい。真空中での塗布膜の露光を行うと、感光性樹脂組成物の塗布膜を基板に密着させた状態で硬化させることができ、所望するパターンの基材を形成しやすい。また、真空中での塗布膜の露光を行う場合、基板上面より塗布膜に対して圧力を印加しながら露光を行ってもよい。この場合、感光性樹脂組成物の塗布膜をより基板に密着させた状態で硬化させることができる。露光工程が、真空中での露光や、圧力を印加しながらの真空中での露光を含むと、特に、基材が備える凹凸のパターンに対応する鋳型を用いて基材を形成する場合に、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。このような条件下で塗布膜の露光を行うことにより、感光性樹脂組成物が硬化する際の収縮が抑制されるため、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。
【００５７】
塗布膜を真空中で露光する方法としては、例えば、塗布膜の表面を、例えばＰＥＴフィルムのようなフィルムで被覆した後に、少なくともフィルムと塗布膜との間を真空にした状態で塗布膜を露光する方法が挙げられる。塗布膜に圧力を印加しながら露光を行う場合に、塗布膜に圧力を印加する方法としては、例えば、負圧露光等の方法が挙げられる。
【００５８】
上記のような方法で露光されて硬化した塗布膜は、必要に応じて鋳型から剥離させた後基材として使用される。
【００５９】
また、露光されて硬化した塗布膜は、プラズマ処理してもよい。硬化した塗布膜に対して、プラズマ処理することにより、細胞が接着しやすい基材を形成することができる。プラズマ処理に用いるプラズマは特に限定されないが、例えばＯ２プラズマ、Ｎ２プラズマ、ＣＦ４プラズマ等が挙げられる。プラズマ処理を行うタイミングは特に限定されず、硬化した塗布膜を基板から剥離させる前後のいずれのタイミングでプラズマ処理を行ってもよい。
【００６０】
さらに、鋳型から剥離された基材は、リンス液によるリンスを行ってもよい。基材がリンス液によりリンスされることで、未反応の光重合性モノマーや光重合開始剤のような細胞毒性の原因となりうる化合物を基材の表面から除去することができる。リンス液としては、例えばプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン等の有機溶剤、水等が挙げられる。
【００６１】
＜用途＞
また、本実施形態のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を医療材料の表面に加工することにより、生体適合性が向上された医療材料を得ることができる。さらに、該医療材料を用いることで、マクロファージの分化を制御することができ、組織を効果的に再生することができる。
医療材料としては、例えば、心臓、血管、軟骨、皮膚、腎臓、肝臓、心筋、筋肉、腱等の組織再生又は移植用組織形成に使用する足場用の医療成型体；動脈瘤コイル、塞栓物質、人工粘膜、人工食道、人工気管、人工血管、人工弁、人工胸壁、人工心膜、人工心筋、人工横隔膜、人工腹膜、人工靱帯、人工腱、人工皮膚、人工関節、人工軟骨等の生体内埋め込み用の医療成型体；外科用縫合糸、外科用補填材、外科用補強材、創傷保護材、骨折接合材、カテーテル、シリンジ、輸液又は血液バッグ、血液フィルタ、体外循環用材料等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６２】
＜＜マクロファージの形質制御方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材上で、マクロファージを培養する、マクロファージの形質制御方法を提供する。
【００６３】
本実施形態のマクロファージの形質制御方法によれば、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。また、マクロファージを炎症型又は抗炎症型マクロファージに誘導し、疾患モデル等を簡便に構築することができる。
【００６４】
＜培養工程＞
本実施形態の形質制御方法は、上述のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を用いて、マクロファージを培養する。
【００６５】
用いるマクロファージとしては、上述の＜マクロファージ＞と同様のものが挙げられる。また、マクロファージは上述の単球から分化誘導されたものであってもよい。
【００６６】
使用する培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ギブコ（Ｒ）ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＨＬ−１既知組成、無血清培地（ロンザ社製）等が挙げられる。培養工程において、培地は細胞の増殖速度に応じて、適宜新しいものに交換すればよい。
【００６７】
また、使用する培地に、マクロファージの分化又は形質を誘導する化合物を添加してもよい。該化合物を添加することにより、分化又は形質変化の速度をさらに早めることができ、また一定の方向に分化又は形質を制御することができる。マクロファージをＭ１マクロファージに形質誘導する化合物としては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ等のＴｈ１サイトカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リポ多糖（ＬＰＳ）等が挙げられ、これら２種類以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。また、マクロファージをＭ２マクロファージに形質誘導する化合物としては、インターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカイン等が挙げられ、これら２種類以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。また、Ｍ１マクロファージに形質誘導する化合物及びＭ２マクロファージに形質誘導する化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００６８】
マクロファージの分化を誘導する化合物の濃度は、特に限定されず、１ｎＭ以上１μＭ以下であってよく、５ｎＭ以上１００ｎＭ以下であってよい。上記範囲内であることにより、より効率的にマクロファージからＭ１又はＭ２マクロファージへ形質誘導することができる。
【００６９】
培養条件は、マクロファージの培養に適した方法であれば、特に限定されず、例えば、マクロファージを培地に播種する密度は、１×１００〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０２〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。培養温度は、２５℃以上４０℃以下が好ましく、３０℃以上３９℃以下がより好ましく、３５℃以上３９℃以下がさらに好ましい。培養時間はマクロファージの生育状態によって適宜設定することができ、１時間以上１００時間以下であることが好ましい。上述のマクロファージの形質誘導制御用細胞培養基材を用いることにより、マクロファージの形質誘導が促進され、従来法より短時間でマクロファージを分化することができる。培養環境は、約５％の二酸化炭素を通したＣＯ２条件下で、培養することが好ましい。
【００７０】
＜泡沫細胞＞
本実施形態の形質制御方法において、マクロファージをさらに泡沫細胞に形質誘導することができる。
【００７１】
本明細書において、「泡沫細胞（ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ）」とは、酸化ＬＤＬコレステロールを認識し処理する受容体であるＣＤ３６が陽性であり、酸化ＬＤＬコレステロールを飲み込んだ後にできる細胞を意味する。蓄積された酸化ＬＤＬコレステロールが細胞内で泡粒のように見えるため、泡沫細胞と呼ばれている。泡沫細胞は、血小板増殖因子等のサイトカインを放出し、血管中膜に存在する平衡筋細胞を遊走及び増殖させることが知られている。通常、泡沫細胞は酸化ストレスにより死滅するが、アデイポネクチンが不足する等により、泡沫細胞が速やかに除去されない場合、細胞の内容物が漏れ出し、炎症を引き起こすことがある。この炎症反応は、新たなマクロファージを呼び寄せ、さらなる泡沫細胞の死を増加させるという悪循環をもたらし、やがて泡沫細胞の死骸が集積することにより、壊死中心ができる。壊死中心には、血管に生じた炎症を修復するために線維芽細胞も集まってくる。ケガをした際に、傷が盛り上がって瘡蓋ができるのは、この線維芽細胞の働きによるものである。線維芽細胞の働きにより、壊死中心はコラーゲンで固められ、アテロームプラークと呼ばれる、壊死中心及びそれを包み込みコラーゲンからなる瘤が形成される。このため、動脈硬化では（粥状アテローム）では、泡沫細胞がよく観察される。
【００７２】
よって、本実施形態の形質制御方法において、泡沫細胞に形質誘導することにより、動脈硬化等の疾患モデルを簡便に構築することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
［製造例１］ＤＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ）による基材の作製
（１）１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレンとポリメチルメタクリレートとのブロック共重合体（数平均分子量１８０００−ｂ−１８０００）２ｗｔ％のプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液を０．２ｍＬずつ滴下して、基板上に塗布膜を形成した。続いて、塗布膜を形成したガラス基板を２４０℃、６０秒間アニール処理した。続いて、塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、ポリメチルメタクリレート部を選択的にドライエッチングし、基材（ＬＳ１）を得た。また、１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレンとポリメチルメタクリレートとのブロック共重合体（数平均分子量４９０００−ｂ−２１０００）を用いて、同様の処理を行い、基材(Ｐ１)を得た。
【００７５】
（２）１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのガラス基板（平岡特殊ガラス株式会社製）及び１枚の０．８ｃｍ×０．８ｃｍのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）基板（三菱化学株式会社製）の平滑な表面に、ポリスチレン（数平均分子量１８０００）の２ｗｔ％プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液を０．２ｍＬずつ滴下して、基板上に塗布膜を形成した。続いて、塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、基材（Ｓｍｏｏｔｈ１及びＳｍｏｏｔｈ２）を得た。
【００７６】
【表１】
2017212963.tif 000002
【００７７】
なお、表１中、Ｓｍｏｏｔｈとは凹凸パターンを形成していない、コントロールとして使用する平面の基板を示す。また、幅とは、凸部の幅を示す。
【００７８】
［製造例２］ＡｒＦ（フッ化アルゴン）パターンからの転写による基材の作製
アクリル樹脂を主成分とする感光性樹脂組成物を含むラジカル重合型ネガ型のレジストをフォトレジスト組成物として用いた。ＡｒＦ露光機Ｎｉｋｏｎ Ｓ３０８を用いて形成した表１に示す凹凸のパターン（Ｓｍｏｏｔｈ３、Ｐ２〜５及びＬＳ２〜８）を有する０．８ｃｍ×０．８ｃｍのシリコンウエハーに対し、ラジカル重合ネガレジストを１ｍｌ滴下し、１００Ｐａの減圧条件下に３０分置いて塗布膜を脱気するとともに、凹凸パターンにラジカル重合ネガレジストを埋め込んだ。続いて、塗布膜を備えるシリコン基板１２枚を、大気中で紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量で露光を行った。続いて、ＰＥＴ基板（三菱化学株式会社製）に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを塗布した基板を、前記した露光によって硬化した膜上に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストが接するように覆い、真空中で、紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量での露光を５回繰り返して塗布膜及び膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを硬化させた。硬化した塗布膜から鋳型を剥離した後、硬化した塗布膜をプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に１０分間浸漬してリンスした後、窒素ガスを硬化した塗布膜に吹き付けて乾燥させた。続いて、乾燥された硬化した塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、基材（Ｓｍｏｏｔｈ３、Ｐ２〜５及びＬＳ２〜８）を得た。
【００７９】
［実施例１］マクロファージの形質制御
（１）マクロファージの培養
製造例１、２で得られた基材を用いて、培養温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で、細胞培養試験を行った。培養対象の細胞としては、マウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４細胞（理研バンク細胞を使用。理研バンクＲＣＢ０５３５）を用いた。培地は１０％ウシ血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。製造例１、２で得られた基材をウェル付のディッシュのウェル内に載置した後、１つの基材につき２×１０４個の細胞を、基材表面に播種した。その後、ウェル内に、ディスポーザブルピペットで培地を注入し、１日培養した。
【００８０】
１日培養後の細胞の形態を観察した結果、ＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いた場合において、ＲＡＷ２６４細胞が細長い形態に変化していることが確かめられた。通常、休止型マクロファージでは、丸い形態であり、炎症型に分化すると細長い形態に変化することが知られている。よって、ＬＳ６の基板を用いて培養することで、形質誘導化合物を使用せずに、マクロファージを分化させることができることが示唆された。
【００８１】
（２）マクロファージの分化
続いて、一部の培養したＲＡＷ２６４細胞に形質誘導化合物を添加した。炎症型であるＭ１マクロファージに形質誘導する化合物として、大腸菌由来のリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を用いた。また、抗炎症型であるＭ２マクロファージに形質誘導する化合物として、インターロイキン４（ＩＬ−４）を用いた。各化合物の培地中の濃度が１０ｎｇ／ｍＬのとなるように添加し、１日培養した。
【００８２】
（３）一酸化窒素（ＮＯ）産生量の定量
（２）において培養したＲＡＷ２６４細胞の培養液に、１０％グリース試薬を等量添加し、室温で１０分間反応させた。炎症型マクロファージでは、アルギニンから一酸化窒素（ＮＯ）を合成し、合成されたＮＯは酸化されてＮＯ２となる。さらに、水と反応して亜硝酸又は硝酸となる。グリース試薬を用いた方法では、生じた亜硝酸を定量することで、ＮＯ産生量を間接的に評価することができる。続いて、マイクロプレートリーダーを用いて、５４０ｎｍの吸光度を測定した。予め、亜硝酸標準液により検量線を作成し、培養上清中の亜硝酸濃度を計算した。結果を図２に示す。
【００８３】
図２から、一部の基板において、ＬＰＳ及びＩＦＮγを添加した場合においては、ＮＯ産生量が減少していた。Ｐ４（ピラーパターン、幅３００ｎｍ）及びＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いた場合において、ＬＰＳ及びＩＦＮγ非存在下で、ＮＯ産生量が増加していることが確かめられた。
以上のことから、Ｐ４（ピラーパターン、幅３００ｎｍ）及びＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いることで、炎症型であるＭ１マクロファージに形質誘導されたことが確かめられた。
【００８４】
（４）アルギナーゼ活性の評価
（４−１）酵素基質反応工程
（２）において培養した一部のＲＡＷ２６４細胞を破砕して、アルギナーゼを含む試料として細胞破砕液を調製した。続いて、マイクロプレートに細胞破砕液を２０μＬずつ分注した。続いて、Ｍｎ溶液（５ｍＭ  ＭｎＣｌ２・２５ｎＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５））２０μＬを分注して酵素を活性化した。続いて、アルギニンバッファー（０．５Ｍアルギニン（ｐＨ９．７））４０μＬを分注して、酵素基質反応を開始した。また、ブランクとして、２倍濃縮の基質バッファーを分注せず細胞破砕液のみを含むウェルも準備した。３７℃で２時間インキュベートし、酵素基質反応を行った。
【００８５】
（４−２）酵素失活及び尿素検出反応工程
続いて、マイクロプレートに、尿素検出試薬（ｉｓｏｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ  ９ｗｔ％／リン酸：濃硫酸：水＝１：３：７（体積比））を１８０μＬずつ添加して、酵素反応を停止し、尿素検出反応を開始した。続いて、９５℃で１時間４５分間インキュベートした。続いて、予め、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬの尿素溶液で検量線を引いたマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、アルギナーゼを含む試料の５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【００８６】
図３から、Ｐ４（ピラーパターン、幅３００ｎｍ）、ＬＳ３（ラインアンドスペースパターン、幅１５０ｎｍ）及びＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いた場合において、ＩＬ−４非存在下で、アルギナーゼ活性が増加していることが確かめられた。
以上のことから、Ｐ４（ピラーパターン、幅３００ｎｍ）、ＬＳ３（ラインアンドスペースパターン、幅１５０ｎｍ）及びＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いることで、抗炎症型であるＭ２マクロファージに形質誘導されたことが確かめられた。
【００８７】
［実施例２］マクロファージの泡沫細胞への形質誘導
（１）マクロファージの培養
製造例１、２で得られた基材を用いて、培養温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で、細胞培養試験を行った。培養対象の細胞としては、マウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４細胞（理研バンク細胞を使用。理研バンクＲＣＢ０５３５）を用いた。培地は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製、２２４００−０８９）を用いた。製造例１、２で得られた基材をウェル付のディッシュのウェル内に載置した後、１つの基材につき２×１０４個の細胞を、基材表面に播種した。その後、ウェル内に、ディスポーザブルピペットで培地を注入し、２４時間又は４８時間培養した。
【００８８】
（２）マクロファージの固定
４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ；ＰＦＡ）溶液（溶媒はＰＢＳ）を用いて、室温で１０分間静置して、細胞を固定した。続いて、４％ＰＦＡ溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した。
【００８９】
（３）細胞の染色
続いて、６０％イソプロパノール（４０％は精製水）を用いて、室温で１分間静置し、溶液を置換した。続いて、６０％イソプロパノールを除去し、６０％Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｏ−０６２５、溶媒はイソプロパノール：精製水＝６：４）を用いて、室温で１５分間静置して染色した。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏは、油滴を赤く染色する。続いて、６０％Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを除去し、精製水で洗浄後、光学顕微鏡（ドイツ  カールツァイスマイクロスコーピー社製、ルーチン倒立顕微鏡）を用いて、細胞を観察した。結果を図４に示す。図４（Ａ）は「Ｓｍｏｏｔｈ  ３」の基材を用いて、培養した結果であり、図４（Ｂ）は、ＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基材を用いて、培養した結果である。図４（Ａ）及び（Ｂ）ともに、２００倍に拡大した画像である。
【００９０】
図４（Ａ）及び（Ｂ）から、Ｓｍｏｏｔｈ  ３の基材を用いた場合においては、赤く染色された細胞は見られなかったが、ＬＳ６の基材を用いた場合においては、赤く染色された細胞が見られた。
よって、ＬＳ６（ラインアンドスペースパターン、幅３００ｎｍ）の基板を用いることで、泡沫細胞に形質誘導されたことが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の形質誘導制御用細胞培養基材によれば、マクロファージを一定の形質に簡便且つ効率良く誘導することができる。また、医療材料の表面加工によって、生体適合性の向上に応用することができる。本発明のマクロファージの形質制御方法によれば、マクロファージを炎症型又は抗炎症型マクロファージに誘導し、疾患モデル等を簡便に構築することができる。
【符号の説明】
【００９２】
１…ライン状凸部、２…ドット状凸部、１０，２０…基材。
【図１】
2017212963.tif 000003
【図２】
2017212963.tif 000004
【図３】
2017212963.tif 000005
【図４】
2017212963.tif 000006