(57)【要約】【課題】測定時の線流速が６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上の高線流速であっても測定を行うことが可能であり、高分子試料を高速分析する場合に有用であるサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法及びサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムを提供すること。【解決手段】本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法は、カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件で、多孔質粒子を充填することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件で、多孔質粒子を充填することを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
【請求項２】
前記多孔質粒子は、体積平均粒子径が５．０μｍ以下であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であり、かつ、細孔径が６００Å以下である請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
【請求項３】
前記多孔質粒子がスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、（メタ）アクリレート系架橋重合体粒子、及びポリビニルアルコール系架橋重合体粒子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
【請求項４】
前記多孔質粒子の充填方法がスラリー充填法であり、かつ、前記スラリー充填法に用いる分散媒がアルコール類、アルキルベンゼン類、ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、及び水からなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの方法で製造された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析において、
測定時の線流速が６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上であるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項６】
測定時の線流速が６．５〜１８．０ｃｍ／ｍｉｎである請求項５に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項７】
移動相の溶媒としてテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、及びＮ−メチルピロリドンからなる群から選ばれた少なくとも１種を用いる請求項５又は６に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項８】
カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件において、多孔質粒子が充填されたことを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
【請求項９】
前記多孔質粒子は、体積平均粒子径が５．０μｍ以下であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であり、かつ、細孔径が６００Å以下である請求項８に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
【請求項１０】
前記多孔質粒子がスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、及びポリビニルアルコール系架橋重合体粒子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項８または９に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
【請求項１１】
前記多孔質粒子の充填方法がスラリー充填法であり、かつ、前記スラリー充填法に用いる分散媒がアルコール類、アルキルベンゼン類、ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、及び水からなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子試料を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法及びサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体体クロマトグラフィーの主要な分離モードであるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は古くより工業用ポリマー素材、高分子添加剤、生体高分子などの高分子試料の分析に用いられており、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、ポリビニルアルコール系架橋重合体粒子、シリカゲルなどの多孔質の架橋重合体粒子を充填剤とし、充填剤を内径４．６〜８．０ｍｍ、長さ１５０〜３００ｍｍのハウジングに充填した分析カラムを用いた分析方法が広く知られている（例えば非特許文献１）。
【０００３】
しかし、これらの分析カラムによるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では測定可能な線流速は通常は０．５〜３．０ｃｍ／ｍｉｎ、最大でも６．０ｃｍ／ｍｉｎ以下に制約されている。理由としては多くの充填剤の粒子径が５μｍよりも大きいことから線流速を上げることで分離性能の低下が著しくなること、カラムサイズが大きいため圧力負荷が大きいことなどが挙げられる。線流速が制限されるため分析時間の短縮も困難であることが課題となってきた。
また、一般的にサイズ排除クロマトグラフィー用カラムは高価である。そのためできるだけ長期に繰り返し測定することが可能であり、高耐久性を有するカラムが望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃ．Ｓ．Ｗｕ，Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、１９９９、ｐ３−２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、高線流速で測定可能であり長期間の繰り返し使用において性能変化のないサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法及びサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体積平均粒子径と粒度分布（均一係数）等が制御された多孔質粒子が圧力１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍ（カラム長さ１ｃｍあたり）で充填された分析カラムを用いることで、測定時の線流速が６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上の高線流速で測定を行っても非常に高い繰り返し耐久性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は次の事項に関する。
［１］  カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件で、多孔質粒子を充填することを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
［２］  前記多孔質粒子は、体積平均粒子径が５．０μｍ以下であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であり、かつ、細孔径が６００Å以下である［１］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
［３］  前記多孔質粒子がスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、（メタ）アクリレート系架橋重合体粒子、及びポリビニルアルコール系架橋重合体粒子からなる群から選択される少なくとも１種である［１］または［２］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
［４］  前記多孔質粒子の充填方法がスラリー充填法であり、かつ、前記スラリー充填法に用いる分散媒がアルコール類、アルキルベンゼン類、ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、及び水からなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法。
［５］  ［１］〜［４］のいずれかの方法で製造された分析カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析において、
測定時の線流速が６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上であるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
［６］  測定時の線流速が６．５〜１８．０ｃｍ／ｍｉｎである［５］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
［７］  移動相の溶媒としてテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、及びＮ−メチルピロリドンからなる群から選ばれた少なくとも１種を用いる［５］又は［６］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
［８］  カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件において、多孔質粒子が充填されたことを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
［９］  前記多孔質粒子は、体積平均粒子径が５．０μｍ以下であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であり、かつ、細孔径が６００Å以下である［８］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
［１０］  前記多孔質粒子がスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、及びポリビニルアルコール系架橋重合体粒子からなる群から選択される少なくとも１種である［８］または［９］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
［１１］  前記多孔質粒子の充填方法がスラリー充填法であり、かつ、前記スラリー充填法に用いる分散媒がアルコール類、アルキルベンゼン類、ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、及び水からなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする［８］〜［１０］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラム。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法において平均粒子径と粒度分布（均一係数）等が制御された多孔質粒子を、圧力１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍ（カラム長さ１ｃｍあたり）の条件で充填する製造方法で得られた分析カラムを用いることで、測定時の線流速が６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上の高線流速であっても繰り返し耐久性を有することから、特に工業用ポリマー素材、高分子添加剤、生体高分子などの高分子試料を高速分析する場合に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１のカラムにおける測定１回目と３００回目の標準ポリスチレン較正曲線（重ね書き）である。
【図２】実施例２のカラムにおける測定１回目と３００回目の標準ポリスチレン較正曲線（重ね書き）である。
【図３】実施例３のカラムにおける測定１回目と５００回目の標準ポリスチレン較正曲線（重ね書き）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。但し、必ずしも具体的記述した事例だけに限定されるものではない。
＜サイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法＞
本発明によるサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法は、カラム長さ１ｃｍあたりの充填圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍである条件で、多孔質粒子を充填することを特徴とする。
このように製造されたカラムは、低い溶出容量（ｍｌ）と高い理論段数（Ｎ）、良好な繰り返し耐久性を発現できる。溶出容量は試料の溶出時間（ｍｉｎ）×流量（ｍｌ／ｍｉｎ）で算出することができ、溶出容量が低いと、少量試料を使用して短時間で分析が可能となる。理論段数は５．５４×（ピークの溶出時間／ピーク高さの５０％におけるピーク幅）２の計算式にて算出することができ（半値幅法、日本薬局方）、理論段数が高いと分離精度が高くなる。また、繰り返し耐久性は、例えば高線流速で測定を繰り返した場合にカラム圧力や溶出容量、理論段数などの初期値からの変化率（％）として表すことができる。例えば、理論段数の変化率（％）は、（理論段数／理論段数の初期値）×１００で算出することができる。
【００１１】
＜多孔質粒子＞
本発明に用いる高速分析用液体クロマトグラフィー充填剤に用いる多孔質粒子は基本的に液体クロマトグラフィーに用いられる材料であれば、その種類については特に制約はない。ただし、各種溶媒に対して化学的および物理的に安定で、分解・変質を起こさないこと、圧力に対しての機械的強度の安定性も有することが好ましい。
【００１２】
本発明による多孔質粒子はスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、ポリビニルアルコール系架橋重合体粒子、シリカゲルなどを用いることができる。特にサイズ排除クロマトグラフィーでの高速分析においては化学的、物理的ならびに機械的強度が安定であるスチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、またはポリビニルアルコール系架橋重合体粒子を好ましく用いることができる。
スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、スチレンとジビニルベンゼンを含む原料モノマーから得られる架橋重合体粒子であり、（メタ）アクリレート系架橋重合体粒子はメタクリレートまたはアクリレートを含む原料モノマーから得られる架橋重合体粒子であり、ポリビニルアルコール系架橋重合体粒子はポリビニルアルコールまたはその誘導体を含む架橋重合体粒子である。
【００１３】
本発明による多孔質粒子の体積平均粒子径、均一係数（体積換算）は粒度分布測定装置を用いて測定することができる。
【００１４】
ここで、本明細書において多孔質粒子の体積平均粒子径とは、２０００個以上の多孔質粒子を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径の球体とみなす。
【００１５】
また、本明細書において均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）とは、上記と同様の方法で各粒子の体積を算出し、全多孔質粒子のうち、体積の小さい方から並べて、２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（２５％）に対する７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（７５％）の比をいう。すなわち、（その粒子径以下の存在比率が７５体積％となる粒子径）／（その粒子径以下の存在比率が２５体積％となる粒子径）である。
【００１６】
十分なカラム性能を得るために多孔質粒子の体積平均粒子径は５．０μｍ以下とすることが好ましく、１．０〜４．０μｍとすることが特に好ましい。１．０μｍ未満ではカラムの圧力上昇が大きいため測定可能線流速が制限される場合がある。また５．０μｍを越えると高線流速でポリマーを分析する際にカラム性能の低下が低下する傾向がある。
【００１７】
本発明による多孔質粒子の均一係数は１．１５以下であることが好ましく、１．１０以下であることが特に好ましい。１．１５を越えると高線流速でポリマーを分析する際にカラム性能が低下する傾向がある。
【００１８】
本明細書において細孔径とは、窒素吸着測定を行い、窒素吸着等温線からＢＪＨ法により求めたものをいう。
細孔径はサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子試料の分離に影響を与えるため、６００Å以下であることが好ましく、１０〜６００Åであることがさらに好ましく、５０〜５００Åであることが特に好ましい。１０Å未満であると高分子試料は分子量範囲に関わらず充填剤とのサイズ排除効果は作用しにくくなる傾向がある。６００Å以上となると充填剤の物理的強度が低下する可能性がある。
上記の多孔質粒子は測定する高分子試料の分子量範囲により少なくとも１種類、または２種以上を混合して使用することができる。
【００１９】
＜分析用カラム（液体クロマトグラフィー用ハウジング）＞
液体クロマトグラフィー用ハウジングの材質には制約はないが、十分なカラム性能を得るために高耐圧性および低デッドボリューム構造である超高速液体クロマトグラフィー用に設計されたステンレス管を用いることが好ましい。ステンレス管はその内面を有機ポリマーで被覆したものを使用することもできる。ハウジングの耐圧は４０ＭＰａ以上であることが好ましく、７５ＭＰａ以上であることがさらに好ましく、１００ＭＰａ以上であることが特に好ましい。
ハウジングのサイズには制約はないが、高速分析において十分な性能を得るためには内径は４．６ｍｍ以下であることが好ましく、１．０〜４．６ｍｍであることがさらに好ましく、２．０〜４．６ｍｍであることが特に好ましい。１．０ｍｍ未満では多孔質粒子の充填が極めて困難となることがある。また４．６ｍｍを越えると高速分析時にカラム性能が十分得られないことがあるほか、カラム容量が大きいためカラム圧力が高くなり測定可能線流速が制限される場合がある。長さは１５０ｍｍ以下であることが好ましく、５０〜１５０ｍｍであることが特に好ましい。５０ｍｍ未満では測定する試料が十分にカラム内に保持、分離できないことがある。また１５０ｍｍを越えると、試料の溶出時間が著しく遅くなりカラム圧力も大きくなることから、高線流速分析には不適となる。
【００２０】
＜多孔質粒子のハウジングへの充填＞
本発明によるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、高速分析時にカラム性能を十分に得るため、多孔質粒子を、圧力が１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍ（カラム長さ１ｃｍあたり）にて充填される。充填方法は、多孔質粒子含有スラリー溶液を調製して充填するスラリー充填法を用いることができる。スラリー充填法は多孔質粒子を有機溶媒や水などに均一に分散・懸濁させた後に、ハウジングへ供給し、ポンプを用いて圧送する。ポンプには市販の高圧充填ポンプ（例えばＵＦ２０００（ユニフローズ社製））を使用することにより容易に圧送することができる。
充填は圧力および圧送液の流速をコントロールすることで行われる。充填方法としては、定圧充填法（圧力を一定とする）、定流速充填法（流速を一定とする）、ステップ充填法（段階的に圧力や流速を上げていく）、リニア充填法（傾斜的に圧力や流速を上げていく）などにより行うことができる。例えば、定圧充填法の場合、圧送開始後に設定圧力に到達するまでは流速は設定した最大値となり、設定圧力に到達後は圧力を一定とするため流速が制御される。圧力および流速はカラムのハウジングサイズ（内径、長さ）および多孔質粒子の粒子径などにより設定される。
【００２１】
本発明によるサイズ排除クロマトグラフィー分析用カラムの製造方法における充填圧力（カラム長さ１ｃｍあたりの圧力）は、１．２〜６．７ＭＰａ／ｃｍ（例えば長さが１５０ｍｍのカラムの場合、圧力１８〜１００ＭＰａ）であり、多孔質粒子の粒子径にもよるが、１．２〜５．０ＭＰａ／ｃｍ（同１８〜７５ＭＰａ）が特に好ましい。１．２ＭＰａ／ｃｍ未満では充填圧力と測定時の圧力差がなくなる、または充填圧力を越えてしまうため、充填状態が変化してしまい、カラムの耐久性が著しく低下してしまう可能性があるため、好ましくない。また、６．７ＭＰａ／ｃｍを越えると多孔質粒子が圧縮されて変形してしまう可能性がある。
【００２２】
また、流速は圧力が上記範囲であるならば線流速が６０．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば内径４．６ｍｍカラムの場合、流量１０ｍｌ／ｍｉｎ）以下であれば特に制約はない。定圧充填法の場合には圧力到達後に線流速が変動しても構わないが、３６．０ｃｍ／ｍｉｎ（同６ｍｌ／ｍｉｎ）以下が好ましく、３０．０ｃｍ／ｍｉｎ（同５．０ｍｌ／ｍｉｎ）以下が特に好ましい。６０．０ｃｍ／ｍｉｎを越えると線流速が早すぎるために多孔質粒子が細密に充填できない可能性があるほか、充填圧力が５．０ＭＰａ／ｃｍを越えてしまう可能性がある。
【００２３】
スラリー充填に用いるスラリー溶媒としてはアルコール類、ベンゼン類、ケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、水からなる群から選ばれた少なくとも１種が用いられる。アルコール類としてはメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられる。ベンゼン類としてはベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼンなどが挙げられる。ケトン類としてはアセトン、メチルエチルケトンなどが挙げられる。中でもメタノール、エタノール、トルエン、クロロホルム、水が好ましく用いられる。水を用いる場合は０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ程度の無機塩を添加することもできる。
【００２４】
多孔質粒子のスラリー濃度は１．０〜３０．０ｗｔ％が好ましく、１．０〜２０．０ｗｔ％がさらに好ましく、１．０〜１０．０ｗｔ％が特に好ましい。１．０ｗｔ％以下では多量のスラリー溶液を用いなければならないため非効率であり、３０ｗｔ％を越えるとスラリー濃度が濃すぎるため均一なスラリー溶液とするのが難しくなる。
【００２５】
また、圧送に用いる液体としてはスラリー溶媒と同じ液体を用いることができるが、スラリー溶媒に用いた液体よりも比重が小さいことが好ましい。またスラリー溶液が塩の水溶液である場合、塩を添加しない純水を用いることにより理論段数の悪化を防ぐことができる。これはカラム中入口側充填層の上端界面において、液組成が異なるために、圧送液注入時の充填剤層の圧送液側への拡散が抑制される効果によると考えられる。
【００２６】
＜サイズ排除クロマトグラフィー分析方法＞
＜測定時の線流速＞
本発明によるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法ではカラム線流速には制限はないが、ポリマーを短時間にて測定するためには測定時の線流速は６．５ｃｍ／ｍｉｎ以上（例えば内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのハウジングの場合に流量１．１ｍｌ／ｍｉｎに相当）であることが好ましく、６．５〜１８．０／ｍｉｎ（前記ハウジングの場合に１．１〜３．０ｍｌ／ｍｉｎに相当）であることが特に好ましい。１８．０ｃｍ／ｍｉｎ以上では高分子試料が十分に分離できない可能性がある他、分子鎖切断を生じて正しい分子量を測定できない可能性がある。
また、高分子試料の測定可能な分子量範囲には制約はないが、標準ポリスチレン換算において２００以上２００万以下で好ましく測定することができる。２００万を越えると高線流速測定を行った際に分子鎖切断を生じて正しい分子量を測定できない可能性がある。
【００２７】
＜移動相＞
本発明におけるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、特に有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィー：ＧＰＣ）を好ましく用いることができる。なお、有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィーとは、移動相に各種有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィーのことである。
有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィーでは移動相の有機溶媒としてテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどが好ましく用いられる。本発明におけるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、前記溶媒群からなる少なくとも１種を用いることができ、２種以上の溶媒を混合して使用することも可能である。
【００２８】
＜液体クロマトグラフィー装置＞
本発明によるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では超高速液体クロマトグラフィー装置を含む一般的な液体クロマトグラフィー装置であれば制限なく使用することができるが、高線流速測定を行った際の圧力に耐えられる性能を有することが好ましい。耐圧性能は４０ＭＰａ以上であることが好ましく、７５ＭＰａ以上であることがさらに好ましく、１００ＭＰａ以上であることが特に好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
【００３０】
（多孔質粒子の評価）
＜体積平均粒子径、均一係数＞
多孔質体粒子の体積平均粒子径、均一係数（いずれも体積換算）は、上述した測定方法に基づいて、フロー式粒子像分析装置ＦＰＩＡ−３０００（シスメックス（株）製）を用いて測定を行った。体積平均粒子径、均一係数は、高速撮像された粒子の静止画像（測定粒子数５２００）により二次元的に粒子の直径を測定して算出された数値である。
【００３１】
＜細孔径＞
多孔質粒子の細孔径は、上述した測定方法（ＢＪＨ法）に基づいて、ＡＳＡＰ ２０２０（マイクロメリティックス社製）を用いてガス吸着法により測定を行い算出された数値である。
【００３２】
（サイズ排除クロマトグラフィー分析方法の評価）  
＜溶出容量＞
溶出容量は試料の溶出時間（ｍｉｎ）×流速（ｍｌ／ｍｉｎ）で算出することができる。
【００３３】
＜理論段数＞
理論段数は５．５４×（ピークの溶出時間／ピーク高さの５０％におけるピーク幅）２の計算式にて算出することができる（半値幅法、日本薬局方）。
【００３４】
＜理論段数の変化率＞
理論段数の変化率（％）は、（理論段数の初期値／理論段数）×１００で算出することができる。
【００３５】
（実施例１）
（多孔質粒子が充填された分析カラムの作製）
実施例１に用いた多孔質粒子は、スチレン-ジビニルベンゼン共重合体粒子であり、体積平均粒子径が３．４μｍであり、均一係数が１．０５であり、細孔径が５００Åである。サイズ排除クロマトグラフィー分析用ハウジングとして、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの超高速液体クロマトグラフィー用ハウジング（（株）杉山商事製）を用いた。トルエン／メタノール＝８０／２０（質量比）の混合溶媒を用いてスラリー濃度８．５ｗｔ％の多孔質粒子含有スラリー溶液を調製した。その後、定圧充填法を用いて、調整した多孔質粒子含有スラリー溶液を以下の条件でカラムに充填した。
最大線流速を１８．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：３ｍｌ／ｍｉｎ）として、カラム長さ１ｃｍあたりの圧力が２．０ＭＰａ／ｃｍ（圧力：３０ＭＰａ）となるまで昇圧を行った。２．７ＭＰａ／ｃｍに到達後は圧力が一定となるよう線流速を調節して３０分かけて充填を行い、最終の線流速１５．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：２．５ｍｌ／ｍｉｎ）とした。多孔質粒子が充填されたカラムを作製した。
【００３６】
（測定の実施）
高速液体クロマトグラフィー分析装置として高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａ−ｉ（（株）島津製作所製）を用い、検出器には紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用いた。実施例１の多孔質粒子が充填されたカラムを用いて、カラム温度４０℃、移動相としてテトラヒドロフランを線流速９．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量１．５ｍｌ／ｍｉｎ）で通液し、フタル酸ジシクロへキシル濃度１０００質量ｐｐｍのテトラヒドロフラン溶液５μｌを３００回測定した。５０回毎におけるカラム圧力、フタル酸ジシクロへキシルの溶出時間、理論段数、理論段数の変化率を表１に示す。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１の結果からわかるように、３００回の測定においてカラム圧力の上昇やフタル酸ジシクロへキシルの溶出容量の変化および理論段数の低下はみられず良好な測定再現性が得られた。
また、測定1回目と３００回目における標準ポリスチレン（分子量５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万）による較正曲線にも変化はみられなかった。測定１回目と３００回目の較正曲線（重ね書き）を図１に示す。
【００３９】
（実施例２）
（多孔質粒子が充填された分析カラムの作製）
実施例１と同じ多孔質粒子、ハウジングを用いて、多孔質粒子をトルエン／メタノール＝８０／２０にてスラリー濃度を８．５ｗｔ％のスラリー溶液を調製後、最大線流速を１８．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：３ｍｌ／ｍｉｎ）としてカラム長さ１ｃｍあたりの圧力が１．３ＭＰａ／ｃｍ（圧力：２０ＭＰａ）となるまで昇圧を行った。１．３ＭＰａ／ｃｍに到達後は圧力が一定となるよう線流速を調節して３０分かけて充填を行い、最終の線流速１２．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：２ｍｌ／ｍｉｎ）とした。多孔質粒子が充填されたカラムを作製した。
【００４０】
（測定の実施）
実施例２の多孔質粒子が充填されたカラムを用いて、実施例１と同様に、フタル酸ジシクロへキシルを測定した。結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２の結果からわかるように、３００回の測定においてカラム圧力の上昇やフタル酸ジシクロへキシルの溶出容量の変化および理論段数の低下はみられず良好な測定再現性が得られた。
また、測定1回目と３００回目における標準ポリスチレン（分子量５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万）の較正曲線にも変化はみられなかった。測定1回目と３００回目の較正曲線（重ね書き）を図２に示す。
【００４３】
（実施例３）
実施例１と同じ多孔質粒子、ハウジング、充填条件を用いて多孔質粒子が充填されたカラムを作製した。
実施例１と同じ分析装置を用いて、多孔質粒子が充填されたカラムを用いて、カラム温度４０℃、移動相としてテトラヒドロフランを線流速１２．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：２ｍｌ／ｍｉｎ）で通液し、フタル酸ジシクロへキシル濃度１０００質量ｐｐｍのテトラヒドロフラン溶液５μｌを５００回測定した。５０回毎におけるカラム圧力、フタル酸ジシクロへキシルの溶出時間、理論段数、理論段数の変化率を表３に示す。
【００４４】
【表３】
2017211308.tif 000004
【００４５】
表３の結果からわかるように、線流速を１２．０ｃｍ／ｍｉｎに上げても５００回の測定においてカラム圧力の上昇やフタル酸ジシクロへキシルの溶出容量の変化はなく理論段数も変化率で８５％以上が維持されており良好な測定再現性が得られた。
また、測定1回目と５００回目における標準ポリスチレン（分子量５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万）の較正曲線にも変化はみられなかった。測定1回目と５００回目の較正曲線（重ね書き）を図３に示す。
【００４６】
（比較例１）
（カラムの作製）
実施例１と同じ多孔質粒子、ハウジングを用いて、多孔質粒子をトルエン／メタノール＝８０／２０（質量比）にてスラリー濃度を８．５ｗｔ％のスラリー溶液を調製後、最大線流速を１８．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：３ｍｌ／ｍｉｎ）としてカラム長さ１ｃｍあたりの圧力が１．１ＭＰａ／ｃｍ（圧力：１６ＭＰａ）となるまで昇圧を行い、１．１ＭＰａ／ｃｍに到達後は圧力が一定となるよう線流速を調節して３０分かけて充填を行い、最終の線流速１２．０ｃｍ／ｍｉｎ（流量：２ｍｌ／ｍｉｎ）とした。多孔質粒子が充填されたカラムを作製した。
【００４７】
（測定の実施）
実施例１と同じ分析装置を用いて、比較例１の多孔質粒子が充填されたカラムを用いて、カラム温度４０℃、移動相としてテトラヒドロフランを９．０ｃｍ／ｍｉｎ（１．５ｍｌ／ｍｉｎ）で通液し、フタル酸ジシクロへキシル濃度１０００質量ｐｐｍのテトラヒドロフラン溶液５μｌを３００回測定した。５０回毎におけるカラム圧力、フタル酸ジシクロへキシルの溶出時間、理論段数、理論段数の変化率を表３に示す。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
表４の結果からわかるように、フタル酸ジシクロへキシルの理論段数は初期から実施例１および２と比較して低く、また３００回の測定中に低下していく傾向にあった。充填圧力と測定時の圧力差が小さいことにより測定中に充填状態の変化が起きてしまったものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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