(57)【要約】【課題】新規なカンゾウ属植物の栽培方法を提供する。【解決手段】本発明のカンゾウ属植物の栽培方法は、グルタチオンまたはその誘導体の存在下でカンゾウ属植物を栽培する工程を包含することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンまたはその誘導体の存在下でカンゾウ属植物を栽培する工程を包含する、カンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項２】
上記工程として、植物体を切断して得た切片から植物体を再生させる挿し木育成工程を包含していることを特徴とする、請求項１に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項３】
上記工程として、苗から植物体を生育させる植物栽培工程を包含している、請求項１または２に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項４】
上記挿し木育成工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行われ、
上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記挿し木育成工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜２，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、請求項２または３に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項５】
上記植物栽培工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行われ、
上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記植物栽培工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜４，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、請求項３または４に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項６】
上記植物栽培工程は閉鎖系施設内にて土壌栽培で行われ、
上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記挿し木育成工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜２，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、請求項３または４に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項７】
上記植物栽培工程は野外圃場にて土壌栽培で行われ、
上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記植物栽培工程において、施用される総量として、植物１個体当たり、０．２５ｍｇ〜１０，０００ｍｇの重量で上記植物体に施用されることを特徴とする、請求項３または４に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項８】
上記グルタチオンまたはその誘導体は、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、ホモグルタチオン、カルボキシプロピルグルタチオン、ジカルボキシエチルグルタチオン、およびこれらのエステル体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項９】
上記閉鎖系施設内の光強度は２０〜２，０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１であることを特徴とする、請求項４〜８の何れか一項に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項１０】
上記閉鎖系施設内の光源はメタルハライドランプ、ＬＥＤ灯、蛍光灯または太陽光であることを特徴とする、請求項４〜９の何れか一項に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【請求項１１】
上記カンゾウ属植物は、ウラルカンゾウ、スペインカンゾウおよびチョウカカンゾウからなる群から選択される植物であることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか一項に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なカンゾウ属植物の栽培方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬用植物であるカンゾウ属植物は、そのストロンを含む根部を乾燥させたものなどが生薬「甘草」として用いられる。甘草は、薬用成分として、グリチルリチン酸およびフラボノイド類を含んでおり、最も使用量および使用頻度の高い生薬である。
【０００３】
カンゾウ属植物を含む地下部を使用部位（生薬）とする薬用植物の多くは、圃場栽培の場合、十分な収量（乾燥重量）、薬用成分および含量を得るためには、数年以上の長期間の栽培を要する。例えば、カンゾウ属植物の一種であるウラルカンゾウでは、圃場栽培の場合、通常、３年以上の栽培期間を必要とする（非特許文献１および２）。これまでに、組織培養によるカンゾウ属植物の増殖方法、および養液栽培などの閉鎖系施設栽培によるカンゾウ属植物の栽培方法などの種々の栽培方法が検討されている（特許文献１および２）。また、近年、グリチルリチン酸生合成経路におけるグリチルリチン酸生合成に関連するグリチルリチン酸生合成酵素遺伝子群の解析が進められている（非特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１３７２９１（２００５年６月２日公開）
【特許文献２】特開２０１３−１９８４９１（２０１３年１０月３日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamamoto T et. al., J. Trad. Med.，22 (1), 86-97， 2005
【非特許文献２】Kojoma M et. al.，Biol. Pharm. Bull.，34 (8), 1334-1337， 2011
【非特許文献３】Hayashi H et. al., Biol PharmBull. 24(8):912-916, 2001.
【非特許文献４】Seki H et. al., Proc. Natl Acad.Sci. USA 105: 14204-14209, 2008.
【非特許文献５】Seki H et. al., Plant Cell 23:4112-4123, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、短期間で効率的に増殖させ、かつ、十分な薬用成分含量を有する植物を得る技術はいまだ確立していない。また、グリチルリチン酸生合成経路におけるグリチルリチン酸生合成のメカニズムおよびグリチルリチン酸生合成酵素の発現および活性調節機構は未だ十分に明らかになっていない。従って、より短期間で十分な収量と薬用成分組成および薬用成分含量とを得ることが可能な栽培方法のさらなる開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞  グルタチオンまたはその誘導体の存在下でカンゾウ属植物を栽培する工程を包含する、カンゾウ属植物の栽培方法。
＜２＞  上記工程として、植物体を切断して得た切片から植物体を再生させる挿し木育成工程を包含していることを特徴とする、＜１＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜３＞  上記工程として、苗から植物体を生育させる植物栽培工程を包含している、＜１＞または＜２＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜４＞  上記挿し木育成工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行われ、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記挿し木育成工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜２，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、＜２＞または＜３＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【０００８】
＜５＞  上記植物栽培工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行われ、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記植物栽培工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜４，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、＜３＞または＜４＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜６＞  上記植物栽培工程は閉鎖系施設内にて土壌栽培で行われ、
上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記挿し木育成工程において、培地の容量１Ｌ当たり、０．１ｍｇ〜２，０００ｍｇの濃度で上記培地に施用されることを特徴とする、＜３＞または＜４＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜７＞  上記植物栽培工程は野外圃場にて土壌栽培で行われ、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記植物栽培工程において、施用される総量として、植物１個体当たり、０．２５ｍｇ〜１０，０００ｍｇの重量で上記植物体に施用されることを特徴とする、＜３＞または＜４＞に記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜８＞  上記グルタチオンまたはその誘導体は、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、ホモグルタチオン、カルボキシプロピルグルタチオン、ジカルボキシエチルグルタチオン、およびこれらのエステル体からなる群より選択されることを特徴とする、＜１＞〜＜７＞の何れかに記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜９＞  上記閉鎖系施設内の光強度は２０〜２，０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１であることを特徴とする、＜４＞〜＜８＞の何れかに記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜１０＞  上記閉鎖系施設内の光源はメタルハライドランプ、ＬＥＤ灯、蛍光灯または太陽光であることを特徴とする、＜４＞〜＜９＞の何れかに記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
＜１１＞  上記カンゾウ属植物は、ウラルカンゾウ、スペインカンゾウおよびチョウカカンゾウからなる群から選択される植物であることを特徴とする、＜１＞〜＜１０＞の何れかに記載のカンゾウ属植物の栽培方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のカンゾウ属植物の栽培方法によれば、地上部および根部の生育が促進され、薬用部位である根の収量が増加する。また、従来よりも短期間で日本薬局方規格値（グリチルリチン酸２．０％以上）を満たす薬用成分含量を有する根を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１に係る、挿し木後各日数栽培後のウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２とＧｕ＃１１との合計（以下ＧｕＩＶ２+Ｇｕ♯１１として示す）の地上部の生育率を示す。図１の（ａ）は、ＧｕＩＶ２、図１の（ｂ）は、Ｇｕ＃１１、図１の（ｃ）は、ＧｕＩＶ２とＧｕ＃１１との合計の結果を示す。なお、１％の酸化型グルタチオンを含む粒剤状に加工した担体（以下、１％ＧＳＳＧ粒剤）をそれぞれ、バーミキュライト１Ｌあたり、０、０．５、１、５、１０および３０ｇずつ混合し、挿し床とした。図中の（ｇ／Ｌ）は、１％ＧＳＳＧ粒剤の施用量（０、０．５、１、５、１０および３０ｇ／Ｌ）として示している（以降の図も同様）。
【図２】本発明の実施例１に係る、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２+Ｇｕ♯１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根率を示す。
【図３】本発明の実施例１に係る、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２＋Ｇｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の根長（ｃｍ）を示す。２つの処理区間でｔ検定を行った。
【図４】本発明の実施例１に係る、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、およびＧｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。図４の（ａ）はウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。左から０、０．５、１、５および１０ｇ／Ｌの施用試験区の根を示す。図４の（ｂ）はウラルカンゾウ優良株Ｇｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。左から０．５、１、５および１０ｇ／Ｌの施用試験区の根を示す。
【図５】本発明の実施例２に係る、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるＧｕＩＶ1ストロン苗の地上部の生育率を示す。
【図６】本発明の実施例２に係る、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるＧｕＩＶ１ストロン苗のパミス水耕栽培の様子を示す。上のパネルの左から順番に、１３、２０および２７日後、下のパネルの左から順に３４、１２１および１７５日後の様子をぞれぞれ示している。
【図７】本発明の実施例２に係る、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤０．５、１、および５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体および長径１ｍｍ以上の根の様子を示す。図７の（ａ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。図７の（ｂ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。図７の（ｃ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。
【図８】本発明の実施例２に係る、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫したＧｕＩＶ１植物体の地下部の各部位における新鮮重量を示す。図８の（ａ）は、長径１ｍｍ以上の根、図８の（ｂ）は、長径１ｍｍ未満の細根、図８の（ｃ）は、ストロン、および、図８の（ｄ）は、古ストロン（苗の育成材料として用いたストロン）の新鮮重量をそれぞれ示している。
【図９】本発明の実施例２に係る、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫したＧｕＩＶ１植物体の地下部の各部位における乾燥重量を示す。図９の（ａ）は、長径１ｍｍ以上の根、図９の（ｂ）は、長径１ｍｍ未満の細根、図９の（ｃ）は、ストロン、および、図９の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量をそれぞれ示している。
【図１０】本発明の実施例２に係る、栽培２１３日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は１％ＧＳＳＧ粒剤施用量（ｇ／Ｌ）を示しており、各施用量のうちの２つの処理区間でｔ検定を行った。図１０の（ａ）は、グリチルリチン酸、図１０の（ｂ）は、リクイリチン、図１０の（ｃ）は、イソリクイリチン、および図１０の（ｄ）は、グリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。
【図１１】本発明の実施例３に係る、植物インキュベーター内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ２のストロン挿しによるストロン苗育成における地上部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１１の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における挿し木２３日後の植物体地上部の様子、図１１の（ｂ）は各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における新芽形成率、図１１の（ｃ）は挿し木２７日後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における新芽形成率、図１１の（ｄ）は挿し木２７日後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるシュート形成数、および、図１１の（ｅ）は、挿し木２７日後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における最大シュート長（ｃｍ）をそれぞれ示している。
【図１２】本発明の実施例３に係る、植物インキュベーター内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ２のストロン挿しによるストロン苗育成における挿し木２７日後の地下部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１２の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における植物体地下部の様子、図１２の（ｂ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根率、図１２の（ｃ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の発根数、図１２の（ｄ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の最大根長（ｃｍ）をそれぞれ示している。
【図１３】本発明の実施例４に係る、ウラルカンゾウストロン苗のパミス水耕栽培に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示している。図１３の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における水耕栽培５０日後の植物体地上部の様子、図１３の（ｂ）は各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における生育率、図１３の（ｃ）は、各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における草丈（ｃｍ）を示す。
【図１４】本発明の実施例４に係る、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区の栽培１０６日後における植物体の草丈、収穫したＧｕＩＶ２の長径１ｍｍ以上の根の最大根長（ｃｍ）および地下部の乾燥重量（ｇ）を示す。図１４の（ａ）は、草丈（ｃｍ）、図１４の（ｂ）は、長径１ｍｍ以上の根の最大根長（ｃｍ）、図１４の（ｃ）は、長径１ｍｍ以上の根の乾燥重量（ｇ）、および、図１４の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量（ｇ）をそれぞれ示している。
【図１５】本発明の実施例４に係る、水耕栽培１０６日後に収穫したＧｕＩＶ２地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は１％ＧＳＳＧ粒剤施用量（ｇ／Ｌ）を示している。図１５の（ａ）は、根のグリチルリチン酸、図１５の（ｂ）は、根のリクイリチン、図１５の（ｃ）は、根のイソリクイリチン、および図１５の（ｄ）は、根のグリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。図１５の（ｅ）は、古ストロンのグリチルリチン酸、図１５の（ｆ）は、古ストロンのリクイリチン、図１５の（ｇ）は、古ストロンのイソリクイリチン、および図１５の（ｈ）は、古ストロンのグリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。
【図１６】本発明の実施例５に係る、温室内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ１のストロン挿しによるストロン苗育成における地上部および地下部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１６の（ａ）は挿し木２３日後の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における植物体地上部の様子、図１６の（ｂ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における各日数栽培後の新芽形成率、図１６の（ｃ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根率、図１６の（ｄ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後のシュート形成数、図１６の（ｅ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の最大シュート長（ｃｍ）、図１６の（ｆ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根苗の発根数、図１６の（ｇ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根苗の最大根長（ｃｍ）をそれぞれ示している。
【図１７】本発明の実施例６に係る、温室におけるウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１ストロン苗の移植後の生育に対する移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１７の（ａ）は、移植６９日後の地上部の様子、図１７の（ｂ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０ｇ／Ｌ（施用なし）のストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｃ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０．１ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｄ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０．５ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｅ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用１ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｆ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用５ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｇ）は、各移植日数後の生育率、図１７の（ｈ）は、移植７１日後のストロン苗の活着率（移植後に活着したストロン苗数／挿し穂ストロン数×１００）、および、図１７の（ｉ）は、移植７１日後のストロン苗の草丈（ｃｍ）をそれぞれ示している。
【図１８】本発明の実施例６に係る、圃場へ定植後の生育状態を示す。図１８の（ａ）は、各試験区で用いた挿し穂数と各試験項目で得られた株数をまとめた表、図１８の（ｂ）は、圃場定植後の各栽培日数後の草丈（ｃｍ）、図１８の（ｃ）は、圃場定植８７日後の圃場での栽培風景（写真左上）、および各試験区における圃場定植８７日後の地上部の様子をそれぞれ示している。
【図１９】本発明の実施例８における５０ｍｇ／ＬのＧＳＳＧ処理１日後のウラルカンゾウ水耕栽培苗におけるグリチルリチン酸（ＧＬ）生合成酵素遺伝子の発現レベルを示している。
【図２０】本発明の参考例に係る、１％ＧＳＳＧ粒剤無施用の場合の栽培３２３日後および３６４日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部の乾燥重量を示す。図２０の（ａ）は、長径２ｍｍ以上の根、図２０の（ｂ）は、長径２ｍｍ未満の細根、図２０の（ｃ）は、ストロン、および、図２０の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量をそれぞれ示している。
【図２１】本発明の参考例に係る、栽培３２３日後および３６４日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は栽培日数を示している。図２１の（ａ）は、グリチルリチン酸、図２１の（ｂ）は、リクイリチン、図２１の（ｃ）は、イソリクイリチン、および図２１の（ｄ）は、グリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［用語について］
本明細書において、「再生」とは、培養組織、培養細胞、植物の切片などの状態の、植物の部分から、植物体を作出することを指す。
【００１２】
また、「植物体」とは、栄養体として、独立して植物としての生活を営む者を意味しており、水や肥料分、二酸化炭素を吸収して光合成をして、独立して生活を営む植物を意図する。
【００１３】
本明細書において「茎部（茎葉部または地上部）」は茎、頂芽、シュート、節および葉などを広く包含する。「根部（地下部）」は、根およびストロンなどを包含する。
【００１４】
本発明において、「閉鎖系施設」とは、環境条件を人為的に制御した閉鎖系空間を有する施設を指し、「閉鎖系施設栽培」とは、環境条件を人為的に制御した栽培空間における栽培形態を指す。また、外界と完全に遮断した空間における栽培形態だけではなく、温室などのように、外界と一定の境界が形成された施設または設備における栽培形態を広く包含する。また、太陽光などの自然環境を利用しながら、環境条件を制御した栽培空間における栽培形態も含まれる。
【００１５】
本発明において、「養液栽培」または「水耕栽培」とは、植物の生長に必要な養水分を液肥として与える栽培方法全般を指す。すなわち、根を支持するための培地（以下、支持体ともいう）を用いる場合と用いない場合の両者を広く包含する。
【００１６】
本発明において、「明期」とは、１日のうち、光の当たっている時間を指す。
【００１７】
本明細書中において使用される場合、「生育率」は、植物栽培工程における、グルタチオンまたはその誘導体施用後において、植物栽培工程に供した全個体数に対する、生存している個体（枯死した個体を除いた個体）数の割合が意図される。さらに、挿し木栽培を行った場合の生育率は、挿し木後の各日数経過後の全挿し穂数に対する生存している挿し穂数の割合を意味している。また、苗移植栽培を行った場合の生育率とは、苗の移植後の各日数経過後の全移植苗数に対する生存している苗数の割合を意味している。ここで、枯死した植物には、少なくとも地上部の枯死がみられる植物を含む。グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培すれば、グルタチオンまたはその誘導体を用いずに栽培する場合に比べて、当該植物の生育率を向上させることができる。「生育率が向上した植物」とは、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、生育率が向上している植物を指す。
【００１８】
また、「発根率」とは、挿し木栽培を行った場合の、全挿し穂数に対する発根がみられた挿し穂数の割合を意味している。「発根率が向上した植物」とは、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、発根率が向上している植物を指す。
【００１９】
また、「新芽形成率」とは、挿し木栽培を行った場合の、全挿し穂数に対する萌芽が見られた挿し穂数の割合を意味している。
【００２０】
また、「活着率」とは、苗を土壌に移植した場合の、苗の全株数に対する、移植後枯死することなく土壌への根の定着が見られた苗の株数の割合を意味している。
【００２１】
本明細書において「栽培」とは、植物体を育てることを広く指す。「育成」とは「栽培」に含まれる概念であり、特に、挿し穂または苗などを、一定以上の大きさ、例えば、生薬の生産のために植えつけられるために十分な大きさを有する植物体となるまで育てることを指す。
【００２２】
〔カンゾウ属植物の栽培方法〕
本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、グルタチオンまたはその誘導体の存在下でカンゾウ属植物を栽培する工程を包含する。
【００２３】
ここで、「グルタチオンまたはその誘導体の存在下」とは、植物にグルタチオンまたはその誘導体を直接供給（施用）することのみならず、植物の近傍に供給することも包含している。
【００２４】
まず、材料および条件等について詳細に説明する。
【００２５】
［カンゾウ属植物］
カンゾウ属（甘草属、学名「Glycyrrhiza」、以下同じ）の植物は、マメ科の多年草で、中国北部、ロシア南部、中央アジア、地中海地方などの乾燥地帯に主に自生する。
【００２６】
本発明に用いられるカンゾウ属（学名「Glycyrrhiza」、以下同じ）の植物は、根部に少なくともグリチルリチン酸を含有するものであればよい。例えば、ウラルカンゾウ（学名「G. uralensis」）、スペインカンゾウ（学名「G.glabra」）、チョウカカンゾウ（学名「G.inflata」）、学名「G.acanthocarpa」、学名「G.aspera」、学名「G. astragalina」、学名「G.bucharica」、学名「G.echinata」、学名「G.eglandulosa」、学名「G.foetida」、学名「G.foetidissima」、学名「G.gontscharovii」、学名「G.iconica」、学名「G.korshinskyi」、学名「G.lepidota」、学名「G.pallidiflora」、学名「G.squamulosa」、学名「G.triphylla」、学名「G.yunnanensis」、これらカンゾウ属植物の変種などが適用可能であり、ウラルカンゾウおよびスペインカンゾウが好適であり、ウラルカンゾウがより好適である。
【００２７】
本発明に係るカンゾウ属植物株の一例としては、例えば、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株、Ｇｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１（以下、「ＧｕＩＶ１」と記載する）株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２（以下、「ＧｕＩＶ２」と記載する）株、または、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１（以下、「Ｇｕ＃１１」と記載する）株のいずれかが挙げられる。本出願人は、これらの株を、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室（所在地：日本国茨城県つくば市八幡台１−２）内において自己寄託し、維持および保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲することを保証する。
【００２８】
（カンゾウ属植物の繁殖の手法について）
カンゾウ属植物の繁殖には、種子を圃場へ直播して繁殖させる種子繁殖および、植物体の茎などを切り出して得た切片（以下、挿し穂ともいう）を挿し床に挿し木することによって繁殖させる栄養繁殖が挙げられる。カンゾウ属植物はストロン（走出茎）を出す。そのため、挿し穂としては、植物体の茎葉部または地上部の茎部、または根部の一部、例えばストロンを挿し穂として用いることもできる。
【００２９】
以下、本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法についてより詳細に説明する。
【００３０】
本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法の例としては、挿し木による栽培方法、または苗の移植による栽培方法が挙げられる。
【００３１】
一実施形態において、本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、上記工程として、植物体を切断して得た切片（挿し穂）から植物体を再生させる挿し木育成工程を包含していることを特徴とする。
【００３２】
別の実施形態において、本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、上記工程として、苗から植物体を生育させる植物栽培工程を包含している。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明に係る挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法は、予め挿し木用の親株となる植物体を育成する親株育成工程と、当該親株育成工程において得られた植物体を切断して、切片を作成する挿し穂作成工程と、当該挿し穂から植物体を再生させる挿し木育成工程とを包含しており、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記挿し木育成工程の間に施用される。
【００３４】
さらなる別の実施形態において、本発明に係る苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法は、予め苗を育成する工程（苗育成工程）と、当該苗育成工程において得られた苗から植物体を生育させる工程（植物栽培工程）とを包含しており、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記植物栽培工程の間に施用される。あるいは、上記グルタチオンまたはその誘導体は、上記苗育成工程の間に施用されても良く、上記苗育成工程と植物栽培工程の両方の間に施用されても良い。
【００３５】
別のさらなる実施形態において、本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、上述の本発明に係る挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法と、上述の本発明に係る苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法とを組み合わせた栽培方法であり得る。
【００３６】
挿し木による栽培方法および苗の移植による栽培方法を包含する本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、栽培の全工程を通じて栽培の手法は特に限定されない。栽培の手法としては、圃場栽培、ハウス栽培および温室栽培または閉鎖系施設栽培のいずれであってもよく、各工程において栽培手法は異なっていても、同じであってもよいが、なかでも閉鎖系施設栽培が好ましい。閉鎖系施設栽培であれば、外部の天候などに左右されずに均一の品質の植物を生産できる点、季節変動に左右されずに植物を生産できる点、および栽培環境条件を制御できる点、などの利点を有する。
【００３７】
［グルタチオンまたはその誘導体］
生体内での解毒作用や抗酸化作用を有するグルタチオンは、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙからなるトリペプチドであり、植物において硫黄を貯蔵するため、または輸送するための一形態である。本発明の栽培方法において、植物に施用されるグルタチオンまたはその誘導体としては、酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」ともいう）であっても還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」ともいう）またはその誘導体であってもよい。本願明細書において「酸化型グルタチオン」とは、例えば、２分子の還元型グルタチオンがジスルフィド結合によってつながった分子を指す。グルタチオンの誘導体としては、ホモグルタチオン、カルボキシプロピルグルタチオンおよびジカルボキシエチルグルタチオン等が挙げられる。また、グルタチオンまたは上記誘導体のエステル体もまた、グルタチオンの誘導体に包含される。すなわち、本発明に使用されるグルタチオンまたはその誘導体は、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、ホモグルタチオン、カルボキシプロピルグルタチオン、ジカルボキシエチルグルタチオン、およびこれらのエステル体からなる群より選択される物質であり得る。
【００３８】
本発明に使用されるグルタチオンまたはその誘導体は、その製造条件は特に限定されず、人工的に合成されたものであっても、天然物由来のものであってもよい。また、その精製度は高いものであっても低いものであってもよく、市販品が利用されてもよい。
【００３９】
グルタチオンまたはその誘導体は、還元型であっても酸化型であってもよいが、酸化型であることが好ましい。
【００４０】
ＧＳＨは、酸化されやすい性質を有している。そのため、グルタチオンとして、ＧＳＨとＧＳＳＧとが混合した状態で含まれていてもよい。
【００４１】
本発明に係るグルタチオンまたはその誘導体組成物は、グルタチオンまたはその誘導体としてＧＳＨを含有させ、その保存時もしくは使用時に、該ＧＳＨをＧＳＳＧに酸化させる形態とすることができる。また、植物体に施用後に、ＧＳＨがＧＳＳＧに酸化される形態としてもよい。
【００４２】
なお、ＧＳＨをＧＳＳＧに酸化させる方法は特に限定されるものではない。例えば、空気酸化により、ＧＳＨをＧＳＳＧに容易に変換することができる。また、従来公知のあらゆる人為的な方法で、ＧＳＨをＧＳＳＧに変換してもよい。
【００４３】
本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、生育率が向上した植物を得ることができる。
【００４４】
また、本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、植物の発根率を向上させることができる。
【００４５】
本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、植物の根部の生育促進をさせることができる。根部の生育促進とは、具体的には、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、根部の乾燥重量が増大するおよび／または根部の長さが長くなるおよび／または発根数が増大することを意味する。
【００４６】
また、本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、植物の新芽形成率を向上させることができる。
【００４７】
また、本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、植物の地上部の生育促進もさせることができる。地上部の生育促進とは、具体的には、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、シュートの長さが長くなるおよび／または草丈が長くなるおよび／またはシュート形成数が増大することを意味する。
【００４８】
さらに本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培することによって、苗の土壌移植後または圃場定植後の活着率を高めることができる。
【００４９】
カンゾウ属植物は、薬用成分として、グリチルリチン酸の他に、リクイリチン、イソリクイリチン、グリシクマリン、リクイリチゲニンおよびイソリクイリチゲニンなどの二次代謝物を含んでいる。
【００５０】
本発明に係る栽培方法であれば、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、植物の根部における二次代謝物の収量を向上させることができる。
【００５１】
特にウラルカンゾウの場合の例としては、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下にて栽培した同一種の植物と比較して、根部における、グリチルリチン酸、リクイリチン、イソリクイリチンおよびグリシクマリンの含有量が上昇する。
【００５２】
（施用されるグルタチオンもしくはその誘導体、またはグルタチオンもしくはその誘導体の形態）
本発明に係るグルタチオンまたはその誘導体の施用においては、化合物としてのグルタチオンまたはその誘導体が直接用いられても、グルタチオンまたはその誘導体を含有している組成物が用いられてもよい。施用するグルタチオンまたはその誘導体の形態としては、固体の形態および液体の形態が挙げられる。また、少なくともグルタチオンまたはその誘導体を成分として含有する、固体の形態および液体の形態における組成物であってもよい。本発明の組成物の形態としては、液体剤、錠剤、散剤または顆粒剤の形態であり得る。
【００５３】
本発明に係るグルタチオンまたはその誘導体含有組成物には、グルタチオンまたはその誘導体の作用効果が損なわれない範囲であれば、他の成分を含有させてもよい。例えば、本発明の組成物は、水または従来公知の液体担体等に溶解されて、液剤、乳剤またはゲル状剤等の形態で提供されてもよい。そのような液体担体として、キシレン等の芳香族炭化水素類；エタノール、エチレングリコール等のアルコール類；アセトン等のケトン類；ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物は、グルタチオンまたはその誘導体を固形の担体成分に担持させた、固形剤、粉剤等であってもよい。そのような固形の担体成分としては、タルク、クレー、バーミキュライト、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機物；小麦粉、澱粉等の有機物等を例示できるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物は、他の補助剤が適宜配合されていてもよい。そのような補助剤として、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤；高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールアシルエステル、ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル、セルロース誘導体等の非イオン界面活性剤；ゼラチン、カゼイン、アラビアゴム等の増粘剤；増量剤、結合剤等が挙げられる。
【００５４】
必要に応じて、少なくとも１種類の他の植物生長調節剤、例えば安息香酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよびピペコリン酸等を、本発明の所期の効果を損なわない限度において、組成物中に配合することもできる。また、従来公知の肥料を、組成物中に配合してもよい。
【００５５】
（グルタチオンまたはその誘導体の施用時期について）
本発明のグルタチオンまたはその誘導体を施用する時期は特に限定されず、植物が、グルタチオンまたはその誘導体を常に吸収し得る条件下で施用してもよいし、栽培期間を通して、間欠的にグルタチオンまたはその誘導体を吸収し得る条件下で、本発明のグルタチオンまたはその誘導体を施用してもよく、特定の生育時期にのみ、グルタチオンまたはその誘導体を施用してもよい。間欠的条件としては、例えば、週１回または週２回といった間隔、あるいは、移植（植え替え）毎のような間隔で施用する条件が挙げられる。
【００５６】
一例においてグルタチオンまたはその誘導体は、挿し木による栽培方法における、挿し木育成工程の間に施用される。別の一例においてグルタチオンまたはその誘導体は、苗移植による方法における植物栽培工程の間に施用される。さらに別の例では、グルタチオンまたはその誘導体の施用は、植物栽培工程に加えて、挿し木栽培による方法における親株育成工程または苗移植による方法における苗育成工程の間においても行われる。
【００５７】
また、グルタチオンまたはその誘導体の施用方法の具体的な例としては、挿し木育成工程における切片（挿し穂）の植え付けのとき、または苗移植による方法における苗の植え付けのときに培地に添加されることによって施用される。
【００５８】
（グルタチオンまたはその誘導体の施用期間について）
グルタチオンまたはその誘導体を施用して植物を栽培する期間は、特に限定されないが、収穫の７か月（２１０日）前から収穫時点までであることが好ましい。なお、グルタチオンまたはその誘導体組成物の吸着体等を土壌に埋設し使用する場合には、植物体との接触時間が長くなり、液肥として土壌や植物に使用する場合よりも少量の施用で効果を発揮することができる。例えば、挿し穂または苗の植え付けから収穫まで持続的または断続的に施用されてもよく、収穫前の３か月（９０日）前から施用開始されてもよく、当該植物体の親株、挿し木育成または苗の育成の間から持続的または断続的に施用されてもよい。
【００５９】
また、一実施形態において、グルタチオンまたはその誘導体の施用は挿し木育成工程において行われる。挿し木育成工程においてグルタチオンまたはその誘導体の施用をして得られた挿し木苗は、グルタチオンまたはその誘導体の施用なしの挿し木苗に比べて、地上部および根部の生育促進、地下部の収量増加および二次代謝物含量の増加がみられる。さらに、別の実施形態において、グルタチオンまたはその誘導体の施用は挿し木育成工程と、苗から植物体を生育させ、栽培する植物栽培工程と、の両方の工程において行われる。
【００６０】
また、挿し木による栽培方法において、挿し木育成工程の間にもグルタチオンまたはその誘導体を施用する場合は、収穫前の２４か月（７２０日）前から施用開始されてもよく、収穫の１２か月（３６０日）前から収穫時点までであることが好ましい。
【００６１】
（グルタチオンまたはその誘導体の施用量について）
植物に施用するグルタチオンまたはその誘導体の量は、その濃度や施用方法に応じて調節することができるが、その量については、実際に植物に施用されるグルタチオンまたはその誘導体の総量によって定義付けることができる。グルタチオンまたはその誘導体を植物に施用することにより、当該植物の生育および／または根の生育を促進させることができる。また、結果として根に蓄積される二次代謝物量を、グルタチオンまたはその誘導体を施用しない場合と比較して増加させることができる。
【００６２】
栽培期間において施用するグルタチオンまたはその誘導体の濃度は、特定の範囲内であり得る。グルタチオンまたはその誘導体を植物に施用することにより、当該植物の生育および／または根の生育をより効果的に促進させることができる。また、結果として根に蓄積される二次代謝物量を、グルタチオンまたはその誘導体を施用しない場合と比較してより効果的に増加させることができる。また、栽培期間を通して植物に与えるグルタチオンまたはその誘導体の総量は、例えば用いるグルタチオンまたはその誘導体と、等しいモル濃度のＧＳＳＧの重量に換算することができる。例えば、７か月の栽培期間に使用するグルタチオンまたはその誘導体の総量は、植物１個体当たり０．２５ｍｇ〜１０，０００ｍｇの範囲内であることが好ましく、１ｍｇ〜２，０００ｍｇの範囲内であることがより好ましく、２．５ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲内であることがさらに好ましい。また、例えば、７か月の栽培期間に使用するグルタチオンまたはその誘導体の総量は、土壌１Ｌ当たり０．１ｍｇ〜４，０００ｍｇの範囲内であることが好ましく、０．４ｍｇ〜８００ｍｇの範囲内であることがより好ましく、１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内であることがさらに好ましい。
【００６３】
［固体の形態のグルタチオンまたはその誘導体の施用方法について］
固体の形態のグルタチオンまたはその誘導体の施用方法としては、例えば、植物を栽培する支持体に固体の形態のグルタチオンまたはその誘導体を混合する方法があげられる。
【００６４】
グルタチオンまたはその誘導体を固体の形態として植物に施用する場合、グルタチオンまたはその誘導体の使用濃度としては、培地の容量１Ｌ当たり０．１ｍｇ〜４，０００ｍｇであることが好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．４ｍｇ〜８００ｍｇであることがより好ましく、培地の容量１Ｌ当たり１ｍｇ〜１００ｍｇであることがさらに好ましい。一例として、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を１％粒剤の固体の形態で培地に施用することによって植物に施用する場合、培地の容量１Ｌ当たり０．０１ｇ〜４００ｇであることが好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．０４ｇ〜８０ｇであることがより好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．１ｇ〜１０ｇであることがさらに好ましい。このような濃度であれば、植物の生育率をより向上させることができる。なお、生育が阻害されることを防ぐ観点からは、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を１％粒剤の固体の形態で植物に施用する場合、培地の容量１Ｌ当たり３０ｇ未満であることが好ましい。
【００６５】
また、グルタチオンまたはその誘導体は、錠剤、散剤または顆粒剤にて施用される場合、植物を生育させるときに用いる培地に含有させてもよいし、水耕栽培する植物に適用する場合に水中に入れて徐々に溶解させてもよい。水に溶解させるための固形剤等として提供して、使用するときに水に溶解させるようにしてもよい。
【００６６】
（液体の形態のグルタチオンまたはその誘導体の施用方法について）
液体の形態のグルタチオンまたはその誘導体の施用方法としては、植物を植え付ける支持体をグルタチオンまたはその誘導体を含む溶液で湿潤させる方法などが挙げられる。
【００６７】
液体の形態にて提供される場合、本発明に係るグルタチオンまたはその誘導体含有組成物を、植物を生育させるときに用いる培地等に含有させてもよいし、生長点、芽、葉、茎等の植物の一部または全体に散布、滴下または塗布してもよい。
【００６８】
グルタチオンまたはその誘導体を液体の形態の組成物として植物に施用する場合、０．０００２ｍＭ〜７ｍＭが好ましく、０．０００７ｍＭ〜１ｍＭがより好ましく、０．００２ｍＭ〜０．２ｍＭがさらに好ましい。この範囲であれば、製造される植物の生育をより向上させることができる。液体の形態の組成物は、グルタチオンまたはその誘導体を、適当な溶媒（例えば、水など）に溶解させて調製され得る。水は、脱イオン水、蒸留水、逆浸透水、または水道水などのいずれも利用可能である。溶媒には、グルタチオンまたはその誘導体以外の成分、例えば市販の各種肥料や界面活性剤等を含ませることも可能である。なお、グルタチオンまたはその誘導体の濃度は、適用する植物の種類や、適用時期等に応じて適宜変更することができる。
【００６９】
例えば、植物を栽培するための支持体をグルタチオンまたはその誘導体を含む溶液で湿潤させる方法として、さらに具体的には、グルタチオンまたはその誘導体を含む溶液を支持体上部から散水する方法、グルタチオンまたはその誘導体を含む溶液を満たした容器内に支持体を置床し底面から潅水させる方法などが例示される。支持体上部から散水する場合には、上部からの散水量はグルタチオンまたはその誘導体の使用条件およびポット容積等の栽培条件に応じて適宜調整することができ、例えば５ｍＭのＧＳＳＧを用いることを想定した場合には、１個体あたり０．０８ｍＬ／回〜３０００ｍＬ／回が好ましく、０．３ｍＬ／回〜７００ｍＬ／回がより好ましく、０．８ｍＬ／回〜８０ｍＬ／回が更に好ましい。底面から潅水させる場合は、グルタチオンまたはその誘導体を含む溶液が支持体に、実質的に均一に湿潤されればよいが、このような場合に使用する液量および濃度としては、土壌あたりに施用するグルタチオンまたはその誘導体の量として定義付けることもできる。
【００７０】
液体の形態の組成物を植物に直接散布する場合は、溶液を、スプレーなどを用いて、植物の一部または全体に、霧状に散布してもよい。溶液の散布量は、溶液中のグルタチオンまたはその誘導体濃度によって適宜設定される。散布回数は、１回でも２回以上であってもよいが、栽培開始時に散布することが好ましい。さらにグルタチオンまたはその誘導体の使用条件に応じて、栽培期間中に適宜（例えば数日（７日〜１４日）おき）追加で散布を行ってもよい。
【００７１】
なお、固体の形態または液体の形態のグルタチオンまたはその誘導体の施用において、グルタチオンまたはその誘導体を含む培地または溶液は、グルタチオンまたはその誘導体が上記濃度範囲内に調製された後に植物に供給されることが好ましいが、植物に取り込まれる段階でグルタチオンまたはその誘導体が培地または溶液と混合されていればよい。よって、グルタチオンまたはその誘導体を含有しない培地または溶液と補助剤とが、同時にまたは連続的に、植物の外表面に直接的に供給されても、植物の近傍（支持体または用土）に供給されてもよい。このような手順を用いることによって、植物は、補助剤が混合された培地または溶液を取り込むことができる。また、グルタチオンもしくはその誘導体またはそれを含む組成物を、従来公知の肥料または植物ホルモン等の薬剤と混合して植物に与えてもよい。
【００７２】
本発明に係る栽培方法の全工程において、植物の栽培に使用される水耕栽培装置等は、公知のものが用いられる。また、栽培に用いる支持体および養液なども公知のものを用いることができる。
【００７３】
支持体としては、例えば、ロックウール、礫またはハイドロボールなどを用いてもよい。また、例えば、ココピート（ヤシの実の殻を形成するファイバー繊維を堆積および醗酵させた土壌改良剤）、パミス（火山性軽石）、ピートモス、バーミキュライト、パーライトなどの土壌を用いてもよい。また、異なる種類の土壌を任意の割合で混合したものであってもよい。養液栽培の場合、これらの土壌改良剤または土壌を、ポットなどの小型の容器や袋状物などに充填し、そこに植物体を移植し、容器または袋状物ごと養液に浸すことによって植物を栽培してもよい。
【００７４】
養液としては、公知のものを用いることができ、特に限定されない。たとえば、水であるか、または、窒素分、リン分、カリウム分および金属成分などの植物の生長に必要な成分を一種類以上含有する水溶液であり得る。例えば、アンモニア性窒素分、硝酸性窒素分、リン酸分（Ｐ２Ｏ５）、カリウム分（Ｋ２Ｏ）、マグネシウム分（ＭｇＯ）、マンガン分（ＭｎＯ）、ホウ素分（Ｂ２Ｏ２）、鉄分（Ｆｅ）、銅分（Ｃｕ）、亜鉛分（Ｚｎ）およびモリブデン分（Ｍｏ）などの成分のうちの一種類以上を含む水溶液を用いることができる。
【００７５】
［挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法］
一実施形態において、本発明に係る植物体を切断して得た切片（挿し穂）から植物体を再生させる挿し木育成工程を包含している。以下、植物体を切断して得られた切片（挿し穂）から植物体を再生させる挿し木育成工程を包含しているカンゾウ属植物の栽培方法（すなわち挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法）について、説明する。本方法は、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源および発根促進剤が含まれた液体培地などを必要としないため、安価で、かつ簡単な操作で、植物体を増殖させることができる。
【００７６】
一実施形態において、本発明に係る挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法は、予め挿し木用の親株となる植物体を育成する工程（親株育成工程）と、当該親株育成工程において得られた植物体を切断して、切片を作成する工程（挿し穂作成工程）と、当該切片（挿し穂）から植物体を再生させる工程（挿し木育成工程）とを包含している。
【００７７】
＜親株育成工程＞
まず、親株となる植物体を育成する。育成方法は特に限定されない。例えば、種子から苗を育成し、その苗を養液栽培に供してもよいし、養液栽培、圃場栽培または組織培養などにより得られたカンゾウ属植物株を養液栽培に供してもよいし、それらの株から所定長の根部または茎部の切片（挿し穂）を調製し、その切片（挿し穂）を養液栽培して植物を再生させて苗を育成してもよい。つまり、親株の育成工程には、以下に示す挿し木による栽培方法および苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法をそのまま適用することができる。また、培地としては、根を支持することができるものであればよく、特に限定されない。
【００７８】
親株育成期間は、例えば、挿し木栽培の場合、苗の植え付けから１３７日間〜３６４日間である。
【００７９】
＜挿し穂作成工程＞
次に、挿し穂作成工程について説明する。本発明の挿し穂作成工程は、植物体の根部または茎部を切断して切片を作成したもの挿し穂とし、挿し床に挿して増殖させることにより、植物体の個体数を増やす工程である。
【００８０】
挿し穂は、根部または茎部のいずれでもよいが、増殖効率の高さという観点からは茎部であることが好ましい。たとえば、養液（水耕）栽培植物の地上茎の場合、植物体の有する全ての地上茎を刈り取っても短期間で元の状態まで再生可能である。また、挿し穂作成前にあらかじめ挿し穂数を数えることが可能であり、植物体を掘り上げる必要がない。よって、地上茎を用いることによって高い増殖効率を得ることができる。
【００８１】
茎部の切片は、１つ以上の節を含むように、好ましくは２〜２０ｃｍ程度、より好ましくは３〜１０ｃｍ程度、さらに好ましくは３〜５ｃｍ程度の長さに調製する。切片の調製は、例えば、鋏、カッターおよびメスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。茎に含まれる節の数は、１つ以上であればよいが、植物体を再生させる確実性を高める観点からは２つ以上が望ましい。
【００８２】
具体的な手順の例としては、まず、植物体の茎葉部（地上部）を親株の植物体の根元より切除し、茎葉部の根元を直ちに純水、例えばイオン交換水に浸ける。次に、茎葉部からすべての葉を切除して１つ以上の節を含む約３〜５ｃｍ長の茎切片を調製し、茎切片を直ちに純水に浸ける。次に、茎切片を、閉鎖温室内（室温（２３〜２５℃、１６時間明期、相対湿度５０〜６０％）で２時間以上静置する。なお、茎切片を純水中に静置せず、純水を流して１時間以上流水処理しても良い。
【００８３】
なお、例えば特開２０１２−１１５２６１（２０１２年６月２１日公開）に記載の方法に基づき、切片調製後、養液栽培へ供する前に、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に速やかに浸漬してもよい。この操作により、切片の生長が促され、植物体が再生しやすくなる。
【００８４】
＜挿し木育成工程＞
さらに、切片（挿し穂）から植物体を再生させる。例えば、切片（挿し穂）を培地へ植えつけて植物体を再生させる。栽培の手法の一例は、養液栽培である。養液栽培の場合の具体的な手順としては、まず、閉鎖温室内に容器を設置し、その中に養液を入れる。切片（挿し穂）を支持体で固定し、支持体ごと容器内に置床し、支持体を養液に浸漬させて養液栽培する。養液の一例としては水であり、切片（挿し穂）植え付け直後２週間は水であることが好ましい。養液栽培の培地については、切片（挿し穂）を支持することができるものであればよく、特に限定されない。
【００８５】
養液栽培により植物体を再生、育成および栽培する期間においては、培養液の温度を２０〜３５℃、より好適には２０〜３０℃、さらに好適には２２〜２８℃に調節して再生、育成および栽培を行うことが好ましい。これにより、発根を促し、植物体の再生を促進できる。なお、培養液の温度が３０℃以上になると、光合成産物の蓄積に対する呼吸消耗の割合が大きくなるため、培養液の温度が２２〜２８℃の場合と比較して、植物体の生長の度合いは低くなる。
【００８６】
また、養液栽培により植物体を再生、育成および栽培する期間においては、冬季の短日条件を創出せず、長日条件を持続させる方が好ましい。長日条件を持続することにより、カンゾウ属植物の根部におけるグリチルリチン酸含有量を維持しつつ、リクイリチン、イソリクイリチンおよびグリシクマリンなどの薬用成分濃度を向上させることができる。
【００８７】
本発明において、長日条件は、明期が１日当たり１６時間以上の環境条件である。少なくとも、収穫前の３ヶ月間、より好適には収穫前の６ヶ月間、さらに好適には収穫前の９ヶ月間が長日条件になるように、光環境を制御することが好ましい。また、明期の長さは１２時間〜２２時間であることが好ましく、１４時間〜２０時間であることがより好ましく、１６時間〜１８時間であることがさらに好ましい。
【００８８】
切片（挿し穂）を植え付けてから約１か月〜３か月で植物体を再生できる。再生した植物は、再生後すぐに栽培するか、または、さらにある期間育成した後、栽培して収穫する。
【００８９】
養液栽培により植物体を再生および育成する期間については、特に限定されないが、切片（挿し穂）を植え付けてから約０．５カ月〜２年の間が好ましく、１か月〜１年の間がより好ましく、１か月〜６か月がさらに好ましい。
【００９０】
ここで再生した植物体を、苗として別の培地へ植えつけて、植物体を栽培してもよい。当該工程は、以下の（苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法）を適用することが可能である。
【００９１】
収穫時期は、例えば、再生植物体を植え付けてから約４カ月〜４年の間が好ましく、６か月〜２年の間がより好ましく、７か月〜１４か月の間がさらに好ましい。グリチルリチン酸は、主に、根部の長径が１ｍｍ以上の部分やストロンなどに多く含有するため、その部分を採集する。
【００９２】
また、７か月以上栽培後であれば、グリチルリチン酸含有率が第十七改正日本薬局方に定める基準値である２．０％以上を満たす根部を収穫することができる。
【００９３】
また、６か月以上栽培後であれば、根部の短径が第十七改正日本薬局方に定める基準値である５ｍｍ以上の部分を収穫することができる。
【００９４】
また、閉鎖系施設内の光照射装置は、公知のものを用いることができ、白色ＬＥＤ管などのＬＥＤ灯、白色蛍光管などの蛍光灯およびメタルハライドランプなどが挙げられるが、メタルハライドランプを用いることが好ましい。また、メタルハライドランプの例としては、セラミックメタルハライドランプを用いることがより好ましい。また、温室等を含む閉鎖系施設内の光照射は、太陽光を利用して行ってもよい。
【００９５】
また、閉鎖系施設内の光条件は、光強度が２０〜２，０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１であることが好ましく、１００〜１，０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１であることがより好ましく、２００〜６００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１であることがさらに好ましい。
【００９６】
具体的な手順の例としては、まず、上記挿し穂作成工程で作成した挿し穂を２５℃イオン交換水に２時間以上浸け、予めはかり取ったバーミキュライトに、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）１％粒剤を、バーミキュライト１．０Ｌ当たり、それぞれ所望の割合で良く混合する。水耕栽培装置（栽培容器の下方に高さが低い水受けトレイがあるもの）をグロースチャンバー（ＧＣ）室内に設置し、栽培容器内に上述した１％ＧＳＳＧ粒剤を各施用量で含有しているバーミキュライトを充填し、バーミキュライトを良く湿潤させる。バーミキュライトにピンセットで穴をあけて挿し穂を植え、１日１回１０分間、栽培容器下方よりイオン交換水を灌水しながら、グロースチャンバー室内で栽培する。グロースチャンバー室の環境条件の一例としては、２５℃、明期１６時間、照度２５，０００〜３５，０００ｌｕｘ、光合成有効放射：４００〜５５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）および相対湿度６０％である。グルタチオンまたはその誘導体の使用濃度としては、一例として、１％ＧＳＳＧ粒剤の固体の形態で植物に施用する場合、培地の容量１Ｌ当たり０．０１ｇ〜２００ｇであることが好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．０４ｇ〜８０ｇであることがより好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．１ｇ〜１０ｇであることがさらに好ましい。このような濃度であれば、植物の生育率を向上させることができる。なお、生育が阻害されることを防ぐ観点からは、培地の容量１Ｌ当たり３０ｇ未満であることが好ましい。
【００９７】
以上の手順で植物体切片（挿し穂）を再生させて育成することにより、同一クローン由来の株を多数増殖できるため、植物体の大量増殖に有用である。また、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、特定の液体培地などを必要としないため、安価で、かつ、簡単な操作で、植物体を増殖させることができる。さらに、これらの手順は、全て閉鎖系施設内で行うことができるため、気候の影響などを受けずに栽培でき、また、一年を通じての苗の生産が可能になるという利点がある。
【００９８】
（苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法）
一実施形態において、本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、苗の移植によって行われる。本発明に係るカンゾウ属植物の栽培方法は、苗から植物体を生育させ、栽培する植物栽培工程を包含している。
【００９９】
以下、苗から植物を生育させる苗育成工程を包含している方法（すなわち苗の移植によるカンゾウ属植物の栽培方法）について説明する。
【０１００】
ある実施形態において、苗の移植による栽培方法では、予め苗を育成する苗育成工程と、当該苗育成工程において得られた苗から植物を生育させる植物栽培工程とを包含している。
【０１０１】
＜苗育成工程＞
本発明の栽培方法において、苗育成工程は、種子から苗を育成してもよく、養液栽培、圃場栽培、または組織培養などにより得られたカンゾウ属植物株を養液栽培に供してもよいし、養液栽培または圃場栽培または組織培養などの所望の栽培手法による栽培で得られた所定の大きさの植物株から所定の長さの根部または茎部の切片（挿し穂）を調製し、その切片（挿し穂）を培地に挿し木することによって苗を育成してもよい。このうち、挿し木による栄養繁殖で苗を育成することがより好ましい。挿し木による繁殖方法では、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、および発根促進剤が含まれた液体培地などを必要としないため、安価であり、かつ簡単な操作で、植物体を増殖させることができる。また、挿し木によって育成した苗は、親植物のクローンであり品質面からも安定している。また、ストロンからの不定根のグリチルリチン酸含量は、実生の主根の含量と比較して、高い値を示すことが知られている。したがって、ストロンを切片（挿し穂）として用いて挿し木を行うことによってストロン苗を製造してもよい。また、上述した［挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法］の項目に記載されている、本発明に係る挿し木による栽培方法によって、苗を育成することができる。
【０１０２】
なお、本明細書では挿し穂がストロンである場合の挿し穂作成および挿し木育成工程ならびにストロン苗育成工程を経たストロン苗育成方法を「ストロン挿し」とも称する。
【０１０３】
苗の育成期間は、例えば、挿し木栽培の場合、挿し穂の植え付けから１４日間〜１０９日間である。
【０１０４】
＜植物栽培工程＞
さらに、植物栽培工程では、上述の工程で得られた苗から植物を生育させる。例えば、苗を培地へ植えつけて植物を生育させる。上述の苗育成工程によって得られた植物体を、支持体から取り出し、培地へ植えつける。具体的な手順の一例としては、まず、苗育成工程によって得られた植物体の根を傷付けないように注意しながら植物を取り出して水に浸す。パミスを入れた容器に所望の量のグルタチオンまたはその誘導体製剤を所望の濃度となるように入れ、根が長く下に伸びるように植える。植えつけ以降の生育温度、明期の長さおよび光条件などの条件は、挿し木栽培における挿し木育成工程と同様である。水耕栽培装置内に容器を設置し容器下面より養液を供給しながら水耕栽培する。
【０１０５】
グルタチオンまたはその誘導体の使用濃度としては、一例として、１％ＧＳＳＧ粒剤の固体の形態で植物に施用する場合、培地の容量１Ｌ当たり０．０１ｇ〜４００ｇであることが好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．０４ｇ〜８０ｇであることがより好ましく、培地の容量１Ｌ当たり０．１ｇ〜１０ｇであることがさらに好ましい。このような濃度であれば、植物の生育率を向上させることができる。
【０１０６】
一例では、植物栽培工程において、植物を、根部の収穫まで生育させる。また、収穫までに、新たな培地へ任意の回数の植え替えを行ってもよい。苗を植え付けてから植物体を育成する期間および栽培条件等は、上述の［挿し木によるカンゾウ属植物の栽培方法］の項目の＜挿し木育成工程＞に記載の再生した植物体を育成する場合と同様である。
【０１０７】
また、上述の親株育成工程と挿し木育成工程と、または苗育成工程と植物栽培工程と、またはこれらの工程の組み合わせのうちの２つ以上の工程は、同じまたは異なる空間および環境の条件下で実施されてもよく、栽培手法も、同じであっても異なっていてもよい。例えば、親株育成工程を圃場栽培または閉鎖系施設内の養液栽培で行った後、挿し木育成工程を圃場栽培または閉鎖系施設で養液栽培してもよい。また、親株育成工程または苗育成工程を圃場栽培または閉鎖系施設内の養液栽培で行った後、植物栽培工程を圃場栽培または閉鎖系施設内の養液栽培で行っても良い。このうち、栽培期間を短縮し、品質の安定した生薬を生産するという観点からは、親株育成工程、挿し木育成工程または苗育成工程を閉鎖系施設内の養液栽培で行った後、植物栽培工程を閉鎖系施設内で養液栽培を行うことが好ましい。
【０１０８】
一実施形態では、植物栽培工程は野外圃場にて土壌栽培で行われ、上記グルタチオンまたはその誘導体は、該植物栽培工程において、植物栽培工程中に施用される総量として、植物１個体当たり、０．２５ｍｇ〜１０，０００ｍｇの重量で上記植物体に施用されることが好ましく、１ｍｇ〜２，０００ｍｇ施用されることがより好ましく、２．５ｍｇ〜４００ｍｇ施用されることがさらに好ましい。施用の方法は、例えば上記植物体の一部、例えば植物体の根元に直接施用するか根元近くの土壌中に施用される。
【０１０９】
また、植物栽培工程は、養液栽培および圃場栽培などの方法で行うことができるが、養液栽培であることがより好ましい。例えば、閉鎖系施設内で養液栽培を行うことにより、栽培温度、相対湿度および明期の長さなどを調整できるという利点がある。これにより、外界の気候の影響などを受けずに栽培できるため、一年を通じての収穫が可能になる。つまり、親株育成工程および挿し木育成工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行うことが好ましく、また、苗育成工程および植物栽培工程は閉鎖系施設内にて養液栽培で行うことが好ましい。また、栽培方法における全工程を養液栽培で行うことがより好ましい。
【０１１０】
（グルタチオンまたはその誘導体の別の形態）
また、本願発明者らは、グルタチオンまたはその誘導体がグリチルリチン酸生合成酵素の発現を変化させることを見出した。従って、本発明の一態様としてのグルタチオンまたはその誘導体は、グリチルリチン酸生合成酵素活性化物質である。
【０１１１】
グルタチオンまたはその誘導体によって活性化されるグリチルリチン酸生合成酵素は、グリチルリチン酸生合成酵素合成経路に存在する酵素が挙げられる。例えば、ｂＡＳ、ＣＹＰ８８Ｄ６およびＣＹＰ７２Ａ１５４から選択されるグリチルリチン酸生合成酵素遺伝子であり得る。つまり、本発明の栽培方法で得られるカンゾウ属植物は、該カンゾウ属植物中のグリチルリチン酸生合成酵素の発現が変化している。
【０１１２】
ここで、グリチルリチン酸生合成酵素の「発現が変化した」とは、カンゾウ属植物における、該グリチルリチン酸生合成酵素の遺伝子またはタンパク質の存在量が、対照のカンゾウ属植物（例えばグルタチオンまたはその誘導体無施用以外は同一条件で栽培した同種のカンゾウ属植物）と比べて有意に低下または上昇した状態を指す。一実施形態では、グルタチオンまたはその誘導体は、ｂＡＳの発現を抑制する一方で、ＣＹＰ８８Ｄ６およびＣＹＰ７２Ａ１５４の発現を上昇させる。よって本発明の栽培方法で得られるカンゾウ属植物の一例は、該カンゾウ属植物中のｂＡＳの発現レベルが低下している一方で、ＣＹＰ８８Ｄ６およびＣＹＰ７２Ａ１５４の発現レベルが上昇している。
【０１１３】
また、これらのグリチルリチン酸生合成酵素の発現の変化は本発明のカンゾウ属植物の栽培方法において、植物中のグリチルリチン酸などの薬用成分含量が向上した植物を選抜するための指標として用いることができる。
【０１１４】
すなわち、本発明のカンゾウ属植物を栽培する工程は、該カンゾウ属植物中のグリチルリチン酸生合成酵素の発現を調べる工程と、該カンゾウ属植物中のグリチルリチン酸生合成酵素の発現が変化している植物を選抜する工程とを包含していてもよい。
【０１１５】
カンゾウ属植物中のグリチルリチン酸生合成酵素の発現の変化は、グリチルリチン酸生合成酵素遺伝子の発現の上昇または低下を確認することによって行うことも可能である。該遺伝子発現の上昇または低下の確認はノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析等による特異的なプローブまたはプライマーを用いた転写産物解析により該遺伝子発現を検査することによって実施できる。かかる検査は例えば、β−ｔｕｂｕｌｉｎなどの好適な遺伝子を内部標準として行えばよい。また、カンゾウ属植物中のグリチルリチン酸生合成酵素の発現の変化は、カンゾウ属植物におけるグリチルリチン酸生合成酵素タンパク質の存在量を検査することによっても確認することができる。該タンパクの存在量の検査は、抗体を用いたウェスタン分析またはＥＬＩＳＡ分析等によって実施することができる。
【０１１６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１７】
〔実施例１：グロースチャンバー（ＧＣ）室（完全閉鎖系施設、人工光源）内でのウラルカンゾウ地上茎の挿し木増殖に対する１％グルタチオン粒剤（ＧＳＳＧ）施用の効果〕
（挿し穂作成のための親株の育成）
まず、挿し穂作成のための親株となる植物体の育成を行った。
【０１１８】
植物材料：ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１
生育環境：グロースチャンバー（ＧＣ）室、２５℃、明期１６時間（セラミックメタルハライドランプ（岩崎電気セラルクス）４００Ｗ、光合成有効放射：５５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）、相対湿度６０％
支持体：ビーナスライト（２号および５号、芙蓉パーライト株式会社）
上記条件で植物体を１３７〜１６０日間水耕栽培したものを以下の挿し穂作成に用いた。
【０１１９】
（挿し穂の作成）
上記条件で育成した植物体の地上部を切り取り、葉を切り落として、長さ５ｃｍの挿し穂を調製した。各株の挿し穂の種類を以下の表１に示す。表１において、Ｓは、頂芽切片の個数を示し、Ｎは茎切片の個数を示す。なお、表１において、Ｎ（茎切片）の一部は長さ３．４〜４ｃｍである。また、Ｎ（茎切片）における節の数は任意であるが必ず１節以上の節を含んでいる。
【０１２０】
【表１】
2017104102.tif 000002
【０１２１】
（挿し穂の植え付け）
挿し穂を２５℃（ＧＣ室）でイオン交換水に２時間以上浸けた。予め１．０Ｌ（２００ｇ）ずつビニール袋に量り取ったバーミキュライト（株式会社タカムラ）に、１％ＧＳＳＧ粒剤を、バーミキュライト１．０Ｌ当たり、それぞれ０、０．５、１、５、１０、または３０ｇ加えて良く混合した。アラシステム（株式会社バイオメディカルサイエンス）をＧＣ室内に設置し、アラバスケット（０．１Ｌ）に、上述した１％ＧＳＳＧ粒剤を各割合（０、０．５、１、５、１０または３０ｇ／Ｌ）で含有しているバーミキュライトを充填し、水受けトレイにイオン交換水を入れ、バーミキュライトを良く湿潤させた。バーミキュライトにピンセットで穴をあけて挿し穂を植え、灌水チューブを水受けトレイにセットし、アラシステム全体を透明な９０Ｌポリ袋で覆った。１日１回１０分間アラバスケット下方よりイオン交換水を灌水しながら、ＧＣ室内、２５℃、明期１６時間（セラミックメタルハライドランプ（岩崎電気セラルクス）４００Ｗ、光合成有効放射：５５０μｍｏｌ
ｍ−２ｓ−１）および相対湿度６０％で栽培した。１％ＧＳＳＧ粒剤の割合０、０．５、１、５、１０および３０ｇ／Ｌは、それぞれ、ＧＳＳＧ濃度０、５、１０、５０、１００および３００ｍｇ／Ｌに相当する。
【０１２２】
挿し木日：２０１２年１月１７日または１月１８日（ただし大多数を２０１２年１月１７日に挿し木）
栽培後の生育状態を図１〜４に示す。
【０１２３】
図１は、挿し木後各日数栽培後のウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２とＧｕ＃１１との合計（以下ＧｕＩＶ２+Ｇｕ♯１１として示す）の地上部の生育率を示す。図１の（ａ）は、ＧｕＩＶ２、図１の（ｂ）は、Ｇｕ＃１１、図１の（ｃ）は、ＧｕＩＶ２とＧｕ＃１１との合計の結果を示す。ＧＳＳＧ施用量は、１％ＧＳＳＧ粒剤の割合（０、０．５、１、５、１０および３０ｇ／Ｌ）として示している（以降の図も同様）。
【０１２４】
図２は、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２+Ｇｕ♯１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根率を示す。
【０１２５】
図３は、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、Ｇｕ＃１１およびＧｕＩＶ２＋Ｇｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の根長（ｃｍ）を示す。
【０１２６】
図４は、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２、およびＧｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。図４の（ａ）は、ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。左から０、０．５、１、５および１０ｇ／Ｌの施用試験区の根を示す。図４の（ｂ）は、ウラルカンゾウ優良株Ｇｕ＃１１の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根の様子を示す。左から０．５、１、５および１０ｇ／Ｌの施用試験区の根を示す。
【０１２７】
なお、図２〜図４はいずれも、ＧｕＩＶ２については挿し木してから５５日後の結果を、Ｇｕ＃１１については挿し木してから５０日後の結果を示している。
【０１２８】
（結果のまとめ）
図１に示されているように、ＧｕＩＶ２では１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌ施用によって、Ｇｕ＃１１では１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌ施用によって、それぞれ地上部の生育促進効果が認められた。しかし、３０ｇ／Ｌ施用では両優良株とも栽培期間が長くなるにつれて生育阻害が認められた。また、１％ＧＳＳＧ粒剤施用区では、無施用（０ｇ／Ｌ）区に比べて発根率の上昇が認められ、特に０．５ｇ／Ｌ施用が良好であった。図２を参照すると、０．５ｇ／Ｌ施用における発根率は、ＧｕＩＶ２で３０．８％、Ｇｕ＃１１では１００．０％であった。
【０１２９】
図３および図４から明らかなように、根の伸長は、２つの優良株間で差が認められ、Ｇｕ＃１１の方がＧｕＩＶ２に比べて有意に根長が長かった（全ての１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区の全体においてＰ＝０．０１９）。また、図３および４から明らかなように、ＧｕＩＶ２においては、ＧＳＳＧ０．５ｇ／Ｌ施用の試験区の方が無施用区に比べて有意に根長が長かった（Ｐ＝０．０４７）。
【０１３０】
（結論）
バーミキュライトへの挿し木、およびグロースチャンバー室（２５℃、明期１６時間、光合成有効放射：５５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１、相対湿度６０％）における栽培では、１％ＧＳＳＧ粒剤０．５、１、５、および１０ｇ／Ｌ施用により、地上部の生育促進、発根促進および根の伸長促進効果が認められた。
【０１３１】
〔実施例２：グロースチャンバー（ＧＣ）室（完全閉鎖系施設、人工光源）内でのウラルカンゾウのパミス水耕栽培に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果〕
（苗の育成）
まず、植物体の苗の育成を行った。
【０１３２】
植物材料：ＧｕＩＶ１
生育環境：グロースチャンバー（ＧＣ）室、２５℃、明期１６時間（セラミックメタルハライドランプ（岩崎電気セラルクス）４００Ｗ、光合成有効放射：５５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）、相対湿度６０％
支持体：ハイドロボール（都市園芸）
上記条件で３６４日間水耕栽培した植物体より得たストロンより挿し穂を調製し、ストロン挿し（挿し床としてジフィーセブンタネまき土ポット径３０ｍｍ（サカタのタネ）を使用）により育成した苗（挿し木後１０９日のストロン苗）を以下の植物の栽培に用いた。
【０１３３】
（植物の栽培） 
＜苗の植え付け＞
ポリポット（上径１５．０ｃｍ、下径１０．５ｃｍ、高さ３０．５ｃｍ，角穴４個および径２ｃｍの底穴）の底にキムタオルを敷いてからパミス（Ｐｕｍｉｃｅ（登録商標）大江化学工業）５００ｇを入れ、別途パミス１０００ｇを量り取った。上述のストロン苗をジフィーセブンタネまき土ポット（サカタのタネ）から、根を傷付けないように注意しながら取り出し水に浸した。ポリポットのパミス５００ｇの上に、１％ＧＳＳＧ粒剤を１．２５ｇ、２．５ｇまたは１２．５ｇ入れ、根が長く下に伸びるようにポリポット上部に植物を固定し、パミス１０００ｇを入れながら植えた。
【０１３４】
水耕栽培装置内にポットを設置し、パミスの量が足りないものはさらに上方から追加した。１鉢あたりのパミスの容量は２．５Ｌとした。したがって、１％ＧＳＳＧ粒剤１．２５、２．５、１２．５ｇ添加による１％ＧＳＳＧ粒剤施用量は、パミス１Ｌあたり、それぞれ０．５ｇ、１ｇおよび５ｇとなる。
【０１３５】
各試験区に対して植えた植物体の株数を表２に示す。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
養液として標準濃度の２５％の大塚Ａ処方（大塚ハウス１号６ｇ＋大塚ハウス２号４ｇ／８Ｌ）を用い、ポット下面より養液を供給しながら水耕栽培した。養液はイオン交換水を用いて調製した。
水耕栽培開始日：２０１２年３月６日
水耕栽培装置内の条件は、２５℃、明期１６時間（セラミックメタルハライドランプ（岩崎電気セラルクス）４００Ｗ、光合成有効放射：５５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）および相対湿度６０％で栽培した。
【０１３８】
栽培後の生育状態を図５〜８に示す。
【０１３９】
図５は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるＧｕＩＶ1ストロン苗の地上部の生育率を示す。
【０１４０】
図６は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるＧｕＩＶ１ストロン苗のパミス水耕栽培の様子を示す。上のパネルの左から順番に、１３、２０および２７日後、下のパネルの左から順に３４、１２１および１７５日後の様子をそれぞれ示している。
【０１４１】
＜収穫物の重量測定＞
栽培２１３日後にＧｕＩＶ１植物体を収穫し、洗浄した。植物の様子を図７に示す。続いて、根（長径１ｍｍ以上）、細根（長径１ｍｍ未満）、ストロン、古ストロン（挿し穂に用いたストロン）に分割して新鮮重量を測定した。測定結果を図８に示す。その後、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。測定結果を図９に示す。
【０１４２】
図７は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤０．５、１および５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体および長径１ｍｍ以上の根の様子を示す。図７の（ａ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。図７の（ｂ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。図７の（ｃ）は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した１％ＧＳＳＧ粒剤５ｇ／Ｌ施用試験区の植物体の植物体（左）および長径１ｍｍ以上の根（右）を示す。
【０１４３】
図８は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した植物体の地下部の各部位における新鮮重量を示す。図８の（ａ）は、長径１ｍｍ以上の根、図８の（ｂ）は、長径１ｍｍ未満の細根、図８の（ｃ）は、ストロン、および、図８の（ｄ）は、古ストロンの新鮮重量をそれぞれ示している。
図９は、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後に収穫した植物体の地下部の各部位における乾燥重量を示す。図９の（ａ）は、長径１ｍｍ以上の根、図９の（ｂ）は、長径１ｍｍ未満の細根、図９の（ｃ）は、ストロン、および、図９の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量をそれぞれ示している。
【０１４４】
＜薬用成分の含量の測定＞
乾燥した収穫物を粉砕し、含有される成分について、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を図１０に示す。
【０１４５】
図１０は、栽培２１３日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は１％ＧＳＳＧ粒剤施用量（ｇ／Ｌ）を示しており、各濃度のうちの２つの処理区間でｔ検定を行った。図１０の（ａ）は、グリチルリチン酸、図１０の（ｂ）は、リクイリチン、図１０の（ｃ）は、イソリクイリチン、および図１０の（d）は、グリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。
【０１４６】
（結果のまとめ）
図５に示されているように、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２０日後、１％ＧＳＳＧ粒剤０．５および１ｇ／Ｌ施用区で１株ずつ枯死が認められた（生育率７５％）。しかし、図６からもわかるとおり、以後、生育株は旺盛に生育した。
【０１４７】
また、図７、８および９に示されているように、ＧｕＩＶ１ストロン苗の栽培２１３日後において、根および細根の新鮮重量および乾燥重量は０．５〜５ｇ／Ｌ施用の範囲では、濃度依存的に増大する傾向が認められた（根、細根とも０．５および５ｇ／Ｌ施用区間の乾燥重量はＰ＝０．０５２）。
【０１４８】
さらに、図１０に示されているように、植物体各部位のグリチルリチン酸含量は、１％ＧＳＳＧ粒剤施用量増加とともに上昇する傾向が認められ、１または５ｇ／Ｌ施用の根では、わずか約７ヶ月間の栽培で３％以上の値を示した。リクイリチン、イソリクイリチンも同様に、１％ＧＳＳＧ粒剤施用量増加とともに上昇する傾向が認められた。グリシクマリンでは０．５または１ｇ／Ｌ施用の根の含量は、無施用の根（図２１、栽培３２３日および３６４日）の含量よりも高い傾向を示した。
【０１４９】
（結論）
ウラルカンゾウ優良株のパミス水耕において、支持体であるパミスへの１％ＧＳＳＧ粒剤施用は、０．５〜５ｇ／Ｌの範囲では、濃度依存的に根の収量（乾燥重量）を増加させる効果が認められた。さらに、二次代謝物含量増加には非常に効果的であり、１または５ｇ／Ｌ施用で栽培した根は、わずか７か月間でグリチルリチン酸３．０％以上が得られた。
【０１５０】
〔実施例３：植物インキュベーター（完全閉鎖系施設、人工光源）におけるウラルカンゾウストロン挿しによるストロン苗育成に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果〕
（挿し穂の作成）
まず、挿し穂の作製を行った。
挿し穂材料：ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２地上茎の挿し木増殖で得た挿し木苗（実施例１におけるＧＳＳＧ施用無しの場合と同様の手法で作製した挿し木苗、ただし、挿し穂調製直後に水洗処理）を、２０１４年４月２２日に国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所種子島研究部圃場に定植し、２０１６年１月７日（栽培期間６２５日）に収穫して得たストロン。挿し木日まで、ミリＱ水で湿らせた新聞紙に包んでチャック付きポリ袋に入れ、保冷庫（４℃）で保管（２８日間）。
生育環境：植物インキュベーターＴＯＭＹ  ＣＦＨ−３０５（光源をエムテクノ社製白色ＬＥＤ：Ｍ−ＬＬ４０ＮＤ  １００Ｖに変更）：２５℃、１６時間明期（１７０．４０  μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１、９，６２４Ｌｕｘ）、湿度：調節せず（以下、当該条件の生育環境を培養庫２として記載）
挿し木日：２０１６年２月１０日
（挿し穂の植え付け）
１）  側面に１％ＧＳＳＧ粒剤０ｇ／Ｌ、１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌまたは１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌのラベルをそれぞれ貼った栽培槽１段のツリーポット（山利製作所製）を準備した。
２）  福島バーミ３号（粒径が細かいバーミキュライト）１Ｌをポリカップで測り取り、上記と同じラベルを貼ったチャック付きポリ袋に入れたものに、１％ＧＳＳＧ粒剤をそれぞれ０．５ｇおよび１ｇ測りとり、それぞれのラベルのバーミキュライトが入ったポリ袋に入れ、よく振って混合した。
３）  上記バーミキュライトをそれぞれのラベルがついたツリーポットに入れ、純水（イオン交換水）で湿らせた。
４）  ２Ｌポリビーカーでキッチンハイター（花王株式会社）１００倍液（殺菌液）を２個作成（ハイター２０ｍＬ／純水で２Ｌにメスアップ）した。
５）  ストロンの傷んだところを除き、なるべく大きいまま、殺菌液に漬け１０分間処理（ときどきかき混ぜた）。殺菌処理（１回目）後、濯ぎ用の純水入りのポリビーカー中で３回程度濯ぎ、再び殺菌液で１０分間処理した（２回目）。純水で５回程度よく濯ぎ、純水に浸しておいた。別のビーカーに純水を入れ、５ｃｍ程度の切片を調製（必ず節が２個以上となるようにした）して純水に浸した。上述の３個のツリーポットそれぞれに均等に切片を挿した（挿す方向は、切片の両端のうち、地上部の先端に向かう方向を上、根の方向が下となるように上下方向をそろえた）。
６）  ５００ｍＬ容量ペットボトルに純水を入れてツリーポットにセットし、ポット全体を透明なポリ袋で覆った。培養庫２（２５℃、１６ｈｒＬＥＤ）で栽培した。
７）  挿し木６日後にポリ袋を外し、栽培を継続した。
【０１５１】
なお、上記条件で育成した各試験区の挿し穂の数はそれぞれ１％ＧＳＳＧ粒剤施用量が０ｇ／Ｌの試験区は８個、０．５ｇ／Ｌの試験区は７個、１ｇ／Ｌの試験区は７個であった。
栽培後の生育状態を図１１および図１２に示す。
【０１５２】
図１１は、培養庫２内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ２のストロン挿しによるストロン苗育成における地上部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１１の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における挿し木２３日後の植物体地上部の様子、図１１の（ｂ）は各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における新芽形成率、図１１の（ｃ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における新芽形成率、図１１の（ｄ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区におけるシュート形成数、および、図１１の（ｅ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における最大シュート長（ｃｍ）をそれぞれ示している。ここで最大シュート長とは、各苗のシュート部分の中で最長のシュートの長さを指している。なお、図１１の（ｃ）〜（ｅ）はいずれも、挿し木してから２７日後の結果を示している。
【０１５３】
図１２は、培養庫２内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ２のストロン挿しによるストロン苗育成における地下部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１２の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における植物体地下部の様子、図１２の（ｂ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根率、図１２の（ｃ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の発根数、図１２の（ｄ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における発根苗の最大根長（ｃｍ）をそれぞれ示している。ここで最大根長とは、各苗の根部の中で最長の根の長さを示している。なお、図１２の（ａ）〜（ｄ）はいずれも、挿し木してから２７日後の結果を示している。
（結果のまとめ）
１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌ施用により、新芽形成率の上昇およびシュート形成数の増加傾向が認められた（図１１）。また、１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌ施用により、発根率の上昇、発根数の増加および最大根長の増加傾向が認められた（図１２）。このように、図１１および１２に示されているとおり、１％ＧＳＳＧ粒剤の施用によるウラルカンゾウストロン苗の生育促進効果が認められた。
【０１５４】
〔実施例４：培養庫２におけるウラルカンゾウストロン苗のパミス水耕栽培に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果〕
ストロン苗材料：実施例３で得たウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ２ストロン苗
栽培条件：培養庫２（実施例３と同一条件）
養液：標準濃度の２５％のセラミス室内観葉植物用液体肥料（株式会社パワーズジャパン、５ｍＬ／２ＬミリＱ水）を底面から供給
支持体：パミス（細粒、大江化学工業）
試験区：１％ＧＳＳＧ粒剤０ｇ／Ｌ（苗育成時も無施用）、１％ＧＳＳＧ粒剤０ｇ／Ｌ（苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／Ｌまたは１ｇ／Ｌ施用）、１％ＧＳＳＧ１ｇ／Ｌ（苗育成時に無施用または１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌ施用）。
（ストロン苗の定植方法）
１）  純水を入れたポリビーカーを準備し、各１％ＧＳＳＧ施用量のラベルを容器に入れておいた。
２）  根を傷つけないように注意しながら、シュパーテルでバーミキュライトよりストロン苗植物体を掘り上げて上記純水に浸けた。
３）  それぞれ側面に１％ＧＳＳＧ粒剤０ｇ／Ｌ（苗育成時もＧＳＳＧ無施用）、０ｇ／Ｌ（ＧＳＳＧ処理）、１ｇ／Ｌのラベルを貼った、ツリーポット３段（山利製作所製）を準備した。
４）  １％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌのラベルを貼った、チャック付きポリ袋を準備し１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌが含有されたパミス（大江化学工業、細粒）３Ｌを調製した。
５）ツリーポットと同じラベルのパミスを一旦ポリビーカーに入れ、苗の根が長く下に伸びるようにしながら周りからパミスを入れてストロン苗植物体を植えた。
６）  ５００ｍＬ容量のペットボトルに標準濃度の２５％のセラミス室内観葉植物用液体肥料（５ｍＬ／２Ｌ純水）を入れてツリーポットにセットした。
７）  洗浄瓶に養液を入れて上部から回しかけてパミスを湿潤させたのち、ポット全体をポリ袋で覆い、培養庫２で栽培した。
８）栽培６日後にポリ袋を取り外し、栽培を継続した。
栽培後の生育状態を図１３〜１５に示す。
【０１５５】
図１３は、ウラルカンゾウストロン苗のパミス水耕栽培に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示している。図１３の（ａ）は各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における水耕栽培５０日後の植物体地上部の様子、図１３の（ｂ）は各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における生育率、図１３の（ｃ）は、各日数栽培後の、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における草丈（ｃｍ）を示す。
【０１５６】
図１４は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区の栽培１０６日後における植物体の草丈、収穫したＧｕＩＶ２の長径１ｍｍ以上の根の最大根長（ｃｍ）および地下部の乾燥重量（g）を示す。図１４の（ａ）は、草丈（ｃｍ）、図１４の（ｂ）は、長径１ｍｍ以上の根の最大根長（ｃｍ）、図１４の（ｃ）は、長径１ｍｍ以上の根の乾燥重量（ｇ）、および、図１４の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量（ｇ）をそれぞれ示している。
【０１５７】
図１５は、水耕栽培１０６日後に収穫したＧｕＩＶ２地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は１％ＧＳＳＧ粒剤施用量（ｇ／Ｌ）を示している。図１５の（ａ）は、根のグリチルリチン酸、図１５の（ｂ）は、根のリクイリチン、図１５の（ｃ）は、根のイソリクイリチン、および図１５の（ｄ）は、根のグリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。図１５の（ｅ）は、古ストロンのグリチルリチン酸、図１５の（ｆ）は、古ストロンのリクイリチン、図１５の（ｇ）は、古ストロンのイソリクイリチン、および図１５の（ｈ）は、古ストロンのグリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。なお、上述の通り、古ストロンとは、ストロン挿しにおいて挿し穂として用いたストロンである。
【０１５８】
また、各試験区の株数（移植株数）、水耕栽培３１日後の生育株数、生育率および生育株を表３に示す。
【０１５９】
【表３】
2017104102.tif 000004
【０１６０】
（結果）
１）  表３に示すように、水耕栽培開始（移植）３１日後の生育率を表３に示している。生育率はその後１０６日後まで変化しなかった。
２）  図１３に示すように、栽培１０６日後、苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌを施用し、パミス水耕栽培時は無施用または１ｇ／Ｌを施用した株（表３の試験区(3)、(5)）の草丈は、全工程を通して無施用の株よりも草丈が高かった。
３）  図１４に示すように、栽培１０６日後に植物体を収穫し、草丈、最大根長、地下部（径１ｍｍ以上の根、古ストロン）の収量を調査した結果、草丈と根の収量（根の乾燥重量）は、苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌを施用し、パミス水耕栽培時は無施用または１ｇ／Ｌを施用した株（表３の試験区(3)、(5)）が大きかった。
４）  図１４に示すように、最大根長および古ストロンの収量（乾燥重量）は、苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌを施用し、パミス水耕栽培時に無施用の株が最も大きかった。
５）  図１５に示すように、地下部（根および古ストロン）を乾燥後にＨＰＬＣ分析に供した結果、根では、苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌを施用、パミス水耕栽培時は無施用、または１ｇ／Ｌ施用した株（表３の試験区(3)、(5)）の二次代謝物含量（グリチルリチン酸、リクイリチン、イソリクイリチンおよびグリシクマリン）が高かった。
６）  図１５に示すように、古ストロンでは、苗育成時に１％ＧＳＳＧ粒剤１ｇ／Ｌを施用し、パミス水耕栽培時は無施用の株（表３の試験区(3)）の二次代謝物（グリチルリチン酸、リクイリチンおよびイソリクイリチン、グリシクマリン以外）含量が高かった。
【０１６１】
以上より、ＧＳＳＧ施用によるウラルカンゾウストロン苗のパミス水耕栽培における生育促進、地下部の収量増加および二次代謝物含量増加効果が認められ、この効果は苗の移植後のＧＳＳＧ施用と比較して、苗の育成時でのＧＳＳＧ施用で強く現れた。
【０１６２】
〔実施例５：温室内でのウラルカンゾウストロン挿しによるストロン苗育成に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果〕
挿し穂材料：ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１地上茎の挿し木増殖で得た挿し木苗（実施例１におけるＧＳＳＧ施用無しの場合と同様の手法で作製した挿し木苗、ただし、挿し穂調製直後に水洗処理）を、２０１４年７月３１日に国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所筑波研究部ビニールハウスに定植し、２０１５年１２月１７日（栽培期間５０４日）に収穫して得たストロン（ハウスマルチ栽培）。挿し木日まで、ミリＱ水で湿らせた新聞紙に包んでチャック付きポリ袋に入れ、保冷庫（４℃）で保管（５４日間）。
挿し木日：２０１６年２月１０日
栽培場所：設定２０℃、明期：栽培場所の環境（太陽光）に依存、相対湿度５０％、光条件  測定日：２０１６年２月２６日１１：２５日当たり良好：２５，９１０Ｌｕｘ、５１９．２μｍｏｌｍ−２ｓ−１、柱影：９，０１０Ｌｕｘ、１８０．１２μｍｏｌｍ−２ｓ−１（以下、当該栽培場所を温室１とする）
試験区：１％ＧＳＳＧ粒剤：０ｇ／Ｌ（無施用）、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ
挿し床：培養土（福島バーミ３号（バーミキュライト））
（挿し木方法）
１）  アラトレーにジフィーストリップそのまま植えられる鉢（サカタのタネ）５ｃｍ角形５個を準備した。
２）  チャック付きポリ袋を準備し、それぞれに試験区のラベルを貼り、試験区の培養土を調製（０．５Ｌ／ストリップ）した。
３）培養土をジフィーストリップに入れラベルを挿し純水で湿らせた。
４）実施例３の挿し穂の植え付け方法の４）および５）と同様の方法で、殺菌液を作成し、ストロンを殺菌し、切片を作成した。
５）  鉢に切片を挿した（１本／鉢）。各試験区：１２本
６）  温室１の棚に設置し、灌水チューブ２本／トレーを挿し、灌水を確認した。
７）  １日１回１０分間底面より潅水しながら栽培した。
【０１６３】
栽培後の生育状態を図１６に示す。図１６は、温室内でのウラルカンゾウＧｕＩＶ１のストロン挿しによるストロン苗育成における地上部および地下部に対する１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果を示す。図１６の（ａ）は挿し木２３日後の各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における植物体地上部の様子、図１６の（ｂ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における各日数栽培後の新芽形成率、図１６の（ｃ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根率、図１６の（ｄ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後のシュート形成数、図１６の（ｅ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の最大シュート長（ｃｍ）、図１６の（ｆ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根苗の発根数、図１６の（ｇ）は、各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区における栽培２７日後の発根苗の最大根長（ｃｍ）をそれぞれ示している。
（結果）
図１６に示されているように、１％ＧＳＳＧ粒剤０．１〜５ｇ／Ｌ施用により、発根率の上昇およびシュート形成数の増加傾向が認められた。
１％ＧＳＳＧ粒剤０．１〜１ｇ／Ｌ施用により、最大根長の増加傾向が認められた。
【０１６４】
以上より、ＧＳＳＧ施用によるウラルカンゾウストロン苗の生育促進効果が認められた。
【０１６５】
〔実施例６：温室におけるウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１ストロン苗の移植後の生育に対する移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用の効果〕
本実施例では、実施例５で得られた各１％ＧＳＳＧ粒剤施用試験区（以下、苗育成時の施用量は、「前１％ＧＳＳＧ施用量」とする）のストロン苗を１％ＧＳＳＧ粒剤無施用の培養土に移植し、その後の生育を観察した。
ストロン苗材料：実施例５で得られたウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１ストロン苗。
移植日：２０１６年３月８日（挿し木２７日後）
栽培場所：温室１：設定２０℃、明期：栽培場所の環境（太陽光）に依存、相対湿度５０％
光条件測定日：２０１６年２月２６日１１時２５分、日当たり良好：２５，９１０Ｌｕｘ、５１９．２μｍｏｌｍ−２ｓ−１柱影：９，０１０Ｌｕｘ、１８０．１２μｍｏｌｍ−２ｓ−１
土壌：以下の通り混合した培養土；
上質赤玉土小粒（花と緑のパートナー、KUMEYA）：堆肥（サラブレットお馬のふかふか堆肥、兵庫アグリメイト））：タキイの育苗培土（草花・野菜育苗用）：川砂＝６：２：１：１
（移植方法）
１）  純水を入れたポリビーカーを準備し、各１％ＧＳＳＧ施用量のラベルを容器に入れた。根を傷つけないように注意しながら、シュパーテル等で植物体を掘り上げて上記純水に浸けた。
２）  温室１の棚にマルチ底面給水トレー（東海化成）、ＴＯシステムトレーＴＯ−４０Ｔ（東海化成）、径７．５ｃｍポリポット（東海化成）２セット（４０鉢タイプ）を設置し、ポットの穴に鉢底ネットを設置した。
３）  培養土を入れながら植物体を植え（上部を手で支え、なるべく根が長く下に伸びるようにした）、各発根株の情報（ＧｕＩＶ１、前１％ＧＳＳＧ施用量、移植日）を記載したラベルを挿した。
４）  給水トレーに潅水チューブ２本を挿して直ぐに潅水を行い、給水を確認した。
５）  １日１回１０分間底面より潅水しながら栽培した。
６）  移植３１日後にマグアンプＫ中粒（ＮＰＫ＋Ｍｇ：６−２０−６−１５、ハイポネックスジャパン）を給水トレーに施用（１ｇ／Ｌ）した。
７）  上記ストロン苗は、２０１６年６月１７日（移植から１０１日後、挿し木から１２８日後）に国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所筑波研究部圃場に定植して栽培した（シルバーマルチ栽培）。２０１６年８月１７日（定植から６１日後）に活着率と草丈を調査した。
【０１６６】
培養土に移植後の生育状態を図１７に示す。図１７の（ａ）は、移植６９日後の地上部の様子、図１７の（ｂ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０  ｇ／Ｌ（施用なし）のストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｃ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０．１ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｄ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用０．５ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｅ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用１ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｆ）は、移植前の１％ＧＳＳＧ粒剤施用５ｇ／Ｌのストロン苗の移植７１日後の地上部の様子、図１７の（ｇ）は、各移植日数後の生育率、図１７の（ｈ）は、移植７１日後のストロン苗の活着率（移植後に活着したストロン苗数／挿し穂ストロン数×１００）、および、図１７の（ｉ）は、移植７１日後のストロン苗の草丈（ｃｍ）をそれぞれ示している。
【０１６７】
圃場へ定植後の生育状態を図１８に示す。図１８の（ａ）は、各試験区で用いた挿し穂数と各試験項目で得られた株数をまとめた表、図１８の（ｂ）は、圃場定植後の各栽培日数後の草丈（ｃｍ）、図１８の（ｃ）は、圃場定植８７日後の圃場での栽培風景（写真左上）、および各試験区における圃場定植８７日後の地上部の様子をそれぞれ示している。
（結果）
図１７に示したように、ストロン苗育成段階において１％ＧＳＳＧ粒剤無施用で育成したＧｕＩＶ１ストロン苗は、培養土に移植後の生育率低下が著しく、移植５０日後にわずか１０％となった。これに対し、１％ＧＳＳＧ粒剤０．１〜５ｇ／Ｌ施用で育成したＧｕＩＶ１ストロン苗は、無施用に比べて培養土に移植後の生育率が高く、特に０．５ｇ／Ｌ施用では、移植７１日後も５０％を維持した。
【０１６８】
図１８に示したように、上記ストロン苗は圃場定植後も活発に生育した。
【０１６９】
以上より、ストロン挿しによるストロン苗育成時の１％ＧＳＳＧ粒剤０．１／Ｌ〜５ｇ／Ｌ施用は、該ストロン苗の土壌移植後および圃場定植後の活着率を高める効果が認められた。
〔実施例７：圃場におけるウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１地上茎挿木苗の生育に対するＧＳＳＧ施用の効果〕
本実施例では、ＧｕＩＶ１地上茎挿木苗を圃場に定植し、ＧＳＳＧを施用しながら栽培を行い、その後の生育状態および二次代謝産物含量を観察した。
植物材料：ウラルカンゾウ優良株ＧｕＩＶ１地上茎挿木苗（２０１６年５月１０日岡山県着）。
移植日：２０１６年５月１７日（晴れ）
栽培場所：岡山県農林水産総合センター生物科学研究所圃場、栽培面積：  ０．５ａ  畝幅：８０ｃｍ、株間：３０ｃｍ
明期：栽培場所の環境（太陽光）に依存、相対湿度５０％
栽培株数：ＧｕＩＶ１水耕栽培地上茎挿木苗１２０株
基肥：堆肥（牛糞）＝１００Ｋｇ／１ａ、苦土石灰＝１０Ｋｇ／１ａ、ＩＢ化成（１０−１０−１０）＝５Ｋｇ／１ａ、ようりん＝２Ｋｇ／１ａ、化成（８−８−８）＝６．２５Ｋｇ／１ａ
試験区：１週間おきに１個体あたり、一回の処理当たり、表５に示した条件のＧＳＳＧ（表５のR1、R2、W1およびW2）を施用し、資材の溶液は１００ｍｌを根元に潅水した。
各処理の条件は以下の通りである。
Ｔ１処理
６月２日からＧＳＳＧ  １００ｐｐｍ水溶液、週一回水和剤処理１００ｍＬ／株、計４回
（資材Ｗ２）、株の根元に潅水、ＧＳＳＧとしては１０ｍｇ／株×４回）
７月１日、７月２１日に２％ＧＳＳＧ粒剤０．５ｇ／株（資材Ｒ２）を株元に施用し、土寄せ。１０ｍｇ／株×２回
９月９日、１４日にＧＳＳＧ１００ｐｐｍ水溶液、週一回水和剤処理１００ｍＬ／株、計２回
（資材Ｗ２）、株の根元に潅水、ＧＳＳＧとしては１０ｍｇ／株×２回）
ＧＳＳＧとしては、合計８０ｍｇ／株
Ｔ２処理
６月２日からＧＳＳＧ  ６００ｐｐｍ水溶液、週一回水和剤処理１００ｍＬ／株、計４回
（資材Ｗ１）、株の根元に潅水、ＧＳＳＧとしては６０ｍｇ／株×４回）
７月１日、７月２１日に１％ＧＳＳＧ粒剤１．２５ｇ／株（資材Ｒ１）を株元に施用し、土寄せ。１２．５ｍｇ／株×２回
９月９日、１４日にＧＳＳＧ  ６００ｐｐｍ水溶液、週一回水和剤処理１００ｍＬ／株、計２回（資材Ｗ１）、株の根元に潅水、ＧＳＳＧとしては６０ｍｇ／株×２回）
ＧＳＳＧとしては、合計３８５ｍｇ／株
収穫日：２０１６年１０月４日  各試験区３株ずつを収穫（栽培期間１４０日間）
【０１７０】
【表４】
2017104102.tif 000005
【０１７１】
【表５】
2017104102.tif 000006
【０１７２】
(測定方法)
収穫した各試験区の株について、以下の通り生育状態を調べた。
２０１６年１０月７日  ５０℃乾燥機で根を乾燥させた（地上部は室温乾燥させた）。
２０１６年１０月１１日  ４日間乾燥後、乾燥重量および根の最大径を計測した。
(結果)
測定結果を表６に示す。
【０１７３】
【表６】
2017104102.tif 000007
【０１７４】
ＧＳＳＧ処理区のうちＴ２区は、他の試験区と比較し、根および地上部の乾燥重、最大根径ともに大きい傾向が認められた（表６）。
（二次代謝産物含量の測定）
(測定方法)
抽出
各試験区試料について、乾燥根の全量を乳鉢・乳棒を用いて破砕し、そのうち約５０ｍｇを精密に１５ｍＬ容プラスチック遠沈管に秤量し、５０％エタノールを７ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで激しく混ぜた後、超音波洗浄機で３０分間抽出した。さらに、ボルテックスミキサーで撹拌しながら、１分間抽出を行った後、３，５００ｒｐｍで３分間遠心した。その上清の５００μＬをウルトラフリーＭＣ（ミリポア）に入れ、１５，０００ｒｐｍ、２０℃で１〜５分間遠心分離した溶出液を試料溶液とした。
分析条件
装置: alliance HT HPLC system、 (waters；2795 separation module、2996 photodiode array detector)、カラム：TSK-GelODS-100V、5 μm、Φ4.6 mm×25 cm (TOSOH)、
カラム温度：40℃、流速：1mL/min、移動相：(A) 1% 酢酸と(B) アセトニトリルの下記グラジエント0→21 min: 20→76% B、21→22 min: 76→100% B、22→24 min: 100% B、
24→25 min: 100→20% B, 25-30 min: 20% B 
(結果)
乾燥根の粉砕物の５０％エタノール抽出物１０〜２０μＬをＨＰＬＣ分析した結果、各試験区間でＨＰＬＣクロマトグラム（２５４ｎｍ）のパターンに顕著な差異は認められなかった。
【０１７５】
主な成分の含量に関しては、ＧＳＳＧ処理区のうち、Ｔ２区で、リクイリチンおよびイソリクイリチンの含量と収量とがやや高い傾向が認められた。一方、グリチルリチン酸の含量は、Ｔ２区でやや低い傾向が認められたが、収量で比較すると各試験区間に差は認められなかった。また、グリシクマリン含量及び収量は、他試験区と比較し、Ｔ２区でやや低い傾向が認められた（表７）。
【０１７６】
【表７】
2017104102.tif 000008
【０１７７】
(まとめ)
ＧＳＳＧを約１週間おきに８回処理しながら、１４０日間栽培した結果、処理区のうち、Ｗ２（１００ｐｐｍ／個体）、Ｒ２（０．５ｇ／個体）で処理したＴ１区は、生育、含量ともに、Ｃ区との間に顕著な差は認められなかったが、Ｗ１（６００ｐｐｍ／個体）、Ｒ１（１．２５ｇ／個体）で処理したＴ２区では、Ｃ区と比較し、生育がやや促進され、リクイリチン、イソリクイリチンの含量および収量が増加傾向であった。
【０１７８】
〔実施例８：グリチルリチン酸生合成酵素遺伝子群の発現解析〕
本実施例では、ウラルカンゾウＧｕ＃１１株挿し木苗の根にＧＳＳＧ（５０ｍｇ／Ｌ）処理を施用した場合の、グリチルリチン酸（ＧＬ）生合成経路の３酵素遺伝子（ｂＡＳ、ＣＹＰ８８Ｄ６およびＣＹＰ７２Ａ１５４）の発現量変動について解析した。
【０１７９】
グリチルリチン酸生合成酵素各遺伝子ｂＡＳ、ＣＹＰ８８Ｄ６、ＣＹＰ７２Ａ１５４は以下に示すようにグリチルリチン酸生合成経路にそれぞれ関与している。ｂＡＳはＧＬのトリテルペン骨格形成に関与しており、ＣＹＰ８８Ｄ６およびＣＹＰ７２Ａ１５４はその後の酸化修飾に関わっていることが知られている（Seki H et. al., Plant Cell 23: 4112-4123, 2011）。
【０１８０】
【化１】
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【０１８１】
材料：ウラルカンゾウ優良株Ｇｕ＃１１の水耕栽培植物地上茎から挿し木により増殖した挿し木苗。バーミキュライトを充填したアラシステムに挿し木後、約４か月水耕栽培した株、７個体（１個体は予備）をＧＳＳＧ処理およびコントロールに使用した。
栽培条件  灌水：アラシステム底面灌水。施肥：マグアンプＫ（ハイポネックスジャパン）５ｇ／トレイ、月１回。温度２５℃、相対湿度６０％、明期１６時間（太陽光＋補光照明：セラミックメタルハライドランプ（岩崎電気セラルクス）４００Ｗ）。
【０１８２】
（挿し木苗のＧＳＳＧ処理方法）
ウラルカンゾウ水耕栽培苗に対するＧＳＳＧ処理条件として５０ｍｇ／Ｌの濃度を設定し、酸化型グルタチオン（興人、Lot No. GS05F02101）を５０ｍｇ／Ｌとなるよう逆浸透膜処理水（ＲＯ水）に溶解し、使用した。
【０１８３】
挿し木苗を水耕栽培のアラシステムトレーよりＧＳＳＧ処理試験トレーに移動し、地表部よりＧＳＳＧ（５０ｍｇ／Ｌ）水溶液を供給し、支持体（バーミキュライト）中の水耕液を置換することにより、試験を開始した。対照区はＲＯ水を使用した。
（グリチルリチン酸生合成酵素遺伝子群の発現解析）
１）  ＧＳＳＧ処理試験開始１日後に試験区および対照区それぞれ３株をサンプリングした。
２）  ＧＳＳＧ処理した苗および対照区の根を基部から５ｃｍの部分をサンプリングし、４．８ｍｍ径ステンレスボール２個とともに２ｍＬ容量のサンプリングチューブに入れ、新鮮重測定後、液体窒素で凍結し、以降の処理まで−８０℃フリーザーにて保存した。
３）  Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製にはRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）をプロトコルに準拠し使用した。試料チューブを液体窒素で５分間凍結し、ＭＸ−１００（トミー精工）で２，５００ｒｐｍ×２回粉砕を行った。これに、buffer RLT ６５０μＬおよびβ−メルカプトエタノール６．５μＬを加え、さらにＭＸ−１００で３，０００ｒｐｍ×１回破砕した。
４）  以後キットのプロトコルに従い調製を行い、最終的に６５μＬのｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液を得た。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液の２μＬを使用し、分光光度計ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を用い、吸光スペクトルの測定を行い品質および濃度の確認を行った。また、同溶液の３μＬをアガロースゲル電気泳動に供した。
５）  得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡはTURBO DNA Free（Ａｍｂｉｏｎ）でＤＮａｓｅ処理し、ＲＴ−ＰＣＲおよび定量ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲに使用した。
ｂＡＳ、ＣＹＰ８８Ｄ６、ＣＹＰ７２Ａ１５４の発現量は、SuperScript（登録商標）VILO（商標）Master Mix（ThermoFisher Scientific）を使用し、各検体のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００ｎｇを鋳型として逆転写反応を行ったものを５倍希釈し、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）（Thermo Fisher Scientific）を用いｒｅａｌ ｔｉｍｅ−ＰＣＲ法（反復ｗｅｌｌ数：３）により定量した。Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲ機器はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）を使用し、増幅データの取得および解析には、QuantStudio(商標)Design & AnalysisSoftware v1.2 (Thermo Fisher Scientific）を用いた。各発現量の相対定量は、β−ｔｕｂｌｉｎ遺伝子を対照としたcomparative CT法（ΔΔＣＴ法）で行った。
（結果および考察）
ＧＳＳＧ処理に対するＧＬ生合成遺伝子群の発現レベル応答
発現解析の結果を図１９に示す。図１９は、５０ｍｇ／ＬのＧＳＳＧ処理１日後のウラルカンゾウ水耕栽培苗におけるＧＬ生合成酵素遺伝子の発現レベルを示している。なお、地上部の生育に関してはＧＳＳＧ処理区と対照区（ＲＯ水）において処理前後で顕著な変化は認められなかった。
【０１８４】
１日間のＧＳＳＧ処理により、対照区と比較し、β−ｔｕｂｌｉｎ遺伝子発現量に対するｂＡＳの発現レベル低下が認められた一方、ＣＹＰ８８Ｄ６、ＣＹＰ７２Ａ１５４両遺伝子ついては、β−ｔｕｂｌｉｎ遺伝子発現量に対する発現レベルの上昇が認められた。
（結論）
ＧＳＳＧ（１ｄ）処理により、ＧＬのトリテルペン骨格形成に関わるｂＡＳの発現レベルは低下したが、その後の酸化修飾に関わる２種のＰ４５０酵素遺伝子ＣＹＰ８８Ｄ６、ＣＹＰ７２Ａ１５４の発現レベルは上昇した。長期間の栽培におけるＧＳＳＧのＧＬ生合成酵素遺伝子の発現量制御に及ぼす影響については更なる検討を要するが、本実験の結果から、即時応答的にはＧＳＳＧはウラルカンゾウの根におけるＧＬ生合成酵素遺伝子の発現に正、負両面の影響を及ぼすことが示唆された。
【０１８５】
〔参考例〕
参考例として、上述の実施例２と同様の栽培方法における、１％ＧＳＳＧ粒剤無施用の場合のＧｕＩＶ１ストロン苗の水耕栽培３２３日および３６４日後の乾燥重量および二次代謝物含量を測定した結果を示す。
【０１８６】
図２０は、１％ＧＳＳＧ粒剤無施用の場合の栽培３２３日後および３６４日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部の乾燥重量を示す。図２０の（ａ）は、長径２ｍｍ以上の根、図２０の（ｂ）は、長径２ｍｍ未満の細根、図２０の（ｃ）は、ストロン、および、図２０の（ｄ）は、古ストロンの乾燥重量をそれぞれ示している。
【０１８７】
図２１は、栽培３２３日後および３６４日後に収穫したＧｕＩＶ１地下部に含有される二次代謝物含量（％乾燥重量）を示す。各グラフのＸ軸の数値は栽培日数を示している。図２１の（ａ）は、グリチルリチン酸、図２１の（ｂ）は、リクイリチン、図２１の（ｃ）は、イソリクイリチン、および図２１の（ｄ）は、グリシクマリンの含量（％乾燥重量）をそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明のカンゾウ属植物の栽培方法によれば、地上部の生育促進、発根促進および根の伸長促進した植物体を得ることができ、短期間で日本薬局方の定める基準値以上の薬用成分を含有する根部の収穫が可能である。本発明は、農業および食品産業等の産業に広く利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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