(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光発光体を含有する試料の高速高分解能の局在化顕微鏡検査の方法を提供する【解決手段】照明光源３からの放射線により試料２にある蛍光発光体は励起され、蛍光放射線を放射する。蛍光を発している試料２は、ビームスプリッタ５を介して広視野カメラ４上に撮像される。顕微鏡１の動作は、制御装置６によって制御され、制御装置６は、対応する制御線を介して、広視野カメラ４、照明光源３および任意選択的に試料２が置かれるテーブルに接続され、これらの要素を作動させ、またはこれらの要素からのデータ、特に広視野カメラ４からの画像データを受信し、回折限界を超えた空間分解能を有する撮像が可能となる。【選択図】図１
2017151416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光発光体（１１）を含有する試料（２）の高速高分解能の顕微鏡検査方法であって、
−  第１の状態および第２の状態を有する蛍光発光体（１１）が使用され、前記第１の状態は、前記蛍光発光体（１１）が励起放射線（ａ）の照射によって蛍光放射線（ｆ）を放射する明状態（Ｈ）であり、前記第２の状態は、前記蛍光発光体（１１）が励起放射線（ａ）の照射によって蛍光放射線（ｆ）を放射しない暗状態（Ｄ）であり、前記蛍光発光体（１１）は、励起放射線（ａ）の照射によって前記明状態（Ｈ）から前記暗状態（Ｄ）にされることができ、前記暗状態（Ｄ）は、特定の寿命（ｔｄ）であって、その後に前記蛍光発光体（１１）が自発的に前記明状態（Ｈ）に戻る、特定の寿命（ｔｄ）を有し、
−  前記試料（２）と、したがって前記蛍光発光体（１１）とは、ある強度の励起放射線（ａ）によって広視野で照らされ、それによって、前記蛍光発光体（１１）は励起されて明滅し（Ｂ）、その結果、前記蛍光発光体（１１）は、ある明滅周波数（ｆＢ）で明状態（Ｈ）と暗状態（Ｄ）との間で交互に切り替わり、
−  前記明滅する試料（２）は、ある空間分解能において広視野で撮像されてカメラ（４）で検出され、
−  前記励起放射線（ａ）の強度は、少なくとも一部の蛍光発光体（１１）が前記空間分解能に関して個々の画像（１４）に分離されるように設定され、前記励起放射線（ａ）の強度と前記カメラ（４）のリフレッシュレートとは、前記個々の画像（１４）が生成される前記リフレッシュレートが前記明滅周波数（ｆＢ）より低くないように互いに適合され、
−  前記個々の画像（１４）は局在化解析を受け（Ｓ４）、前記個々の画像（１４）内の分離された蛍光発光体（１１）について、前記空間分解能を超える精度で所在場所が決定される、高速高分解能の顕微鏡検査方法。
【請求項２】
前記個々の画像の生成のための積分時間は、前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）よりも長くない、請求項１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項３】
テスト測定において、前記励起放射線（ａ）がパルス方式で照射され、前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）が測定され、
前記リフレッシュレートは、好ましくは積分時間が前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）の９０％であるという結果を伴って、それに応じて設定される、請求項１または２に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項４】
前記リフレッシュレートは、前記積分時間が前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）の５０％であるように設定される、請求項３に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項５】
前記リフレッシュレートは、前記積分時間が前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）の１０％であるように設定される、請求項３に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項６】
前記積分時間は、３００μｓより長くない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項７】
前記積分時間は、１００μｓより長くない、請求項６に記載の微鏡検査方法。
【請求項８】
前記積分時間は、５０μｓより長くない、請求項６に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項９】
前記積分時間は、１μｓ〜３０μｓである、請求項６に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１０】
前記蛍光発光体（１１）は、前記暗状態（Ｄ）の寿命（ｔｄ）に関して化学的に影響されない状態にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１１】
前記励起放射線（ａ）の強度は、１ＭＷ／ｃｍ２を超えない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１２】
前記励起放射線は、５０ｋＷ／ｃｍ２を超えない、請求項１１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１３】
前記励起放射線は、２ｋＷ／ｃｍ２を超えない、請求項１１に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１４】
前記励起放射線（ａ）の強度は、前記明滅周波数（ｆＢ）が１／（３００μｓ）より低くない値を有するように設定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１５】
前記明滅周波数は、１／（５０μｓ）より低くない値を有する、請求項１４に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１６】
前記明滅周波数は、１／（３０μｓ）〜１／（１μｓ）の値を有する、請求項１４に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１７】
前記個々の画像（１４）の生成において、前記励起放射線（ａ）はＣＷ放射線として照射される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡検査方法。
【請求項１８】
蛍光発光体（１１）を含有する試料（２）の高速顕微鏡検査のための高分解能顕微鏡であって、
−  蛍光放射線（ｆ）を放射するために、励起放射線（ａ）によって広視野で前記試料（２）を励起するように設計される励起装置（３）と、ある空間分解能において広視野で前記試料（２）を撮像するように設計される撮像装置（４）とであって、前記励起装置（３）は、少なくとも一部の蛍光発光体（１１）が前記空間分解能に関して前記撮像において分離されるように設計される、励起装置（３）および撮像装置（４）と、
−  前記分離された蛍光発光体（１１）について、前記空間分解能を超える精度で所在場所を決定するように設計される局在化解析装置（６）と、
−  請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って、前記励起装置（３）および前記撮像装置（４）を制御するように設計される制御装置（６）と
を備える、高分解能顕微鏡。
【請求項１９】
前記撮像装置（４）は、ビーム経路の上流に接続されたイメージインテンシファイア（４ｂ）を備えるＣＭＯＳ２次元検出器（４ａ）を含む、請求項１８に記載の顕微鏡。
【請求項２０】
前記リフレッシュレートは、１／（３００μｓ）より低くない値を有する、請求項１８に記載の顕微鏡。
【請求項２１】
前記値は、１／（１００μｓ）より低くない、請求項２０に記載の顕微鏡。
【請求項２２】
前記値は、１／（５０μｓ）より低くない、請求項２０に記載の顕微鏡。
【請求項２３】
前記値は、１／（３０μｓ）〜１／（１μｓ）である、請求項２０に記載の顕微鏡。
【請求項２４】
前記撮像装置（４）は、２次元検出器としてＳＰＡＤアレイ（２５）を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項２５】
画像フィールド（３７）を変位させることによって、前記ＳＰＡＤアレイ（２５）上に試料フィールド（Ｐ）を撮像し、幾つかの部分的な個々の画像から各々の個々の画像（１４）を組み立てるために、画像フィールド変位装置（３０）を備える、請求項２０に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光発光体を含有する試料の高速高分解能の局在化顕微鏡検査のための方法に関する。この方法では、試料中の蛍光発光体が蛍光放射線を放射するように励起され、試料はある空間分解能において広視野で撮像され、励起は少なくとも一部の蛍光発光体が空間分解能に関して分離されるようにもたらされ、局在化解析（localization analysis）において、分離された蛍光発光体について、空間分解能を超える精度で所在場所が決定される。
【０００２】
さらに、本発明は、蛍光放射線を放射するために試料中の蛍光発光体を励起するように設計される励起装置と、ある空間分解能で試料を撮像するように設計される撮像装置とを備える、蛍光発光体を含有する試料の高速局在化顕微鏡検査のための高分解能顕微鏡に関する。この顕微鏡では、励起装置は、少なくとも一部の蛍光発光体が空間分解能に関して画像内で分離されるように設計され、顕微鏡は、分離された蛍光発光体について、空間分解能を超える精度で所在場所を決定するように設計される局在化解析装置を備える。
【背景技術】
【０００３】
最新技術では、回折限界を破るために、顕微鏡検査において種々の方法が開発されている。特許文献１または特許文献２によれば、試料を撮像するために標識物質を使用するＰＡＬＭ（光活性化局在顕微鏡法）と略記される方法が知られており、標識は、例えば光学的放射線を用いて活性化することができる。活性化状態においてのみ標識物質は特定の蛍光放射線を放射することができる。非活性化標識分子は、励起放射線での照射後にさえ、蛍光放射線をまったく放射しないか、または少なくとも顕著には放射しない。したがって、活性化放射線は一般に切り替え信号と呼ばれ、分子は光スイッチと呼ばれる。ＰＡＬＭでは、切り替え信号は、少なくとも一部の活性化標識が隣接する活性化標識と間隔を置かれ、それにより、（顕微鏡検査の光学的分解能の見地において）画像処理方法によって切り離されるか、または実質的に切り離され得るように適用される。これは蛍光発光体のサブセットが分離されると言われる。個々の画像は、このようにして準備された試料についてキャプチャされる。その中で、分離される発光体における、分解能限界によってもたらされる放射線分布の中心が決定される。分子の位置は、光学分解能によって実際に許容されるよりも高い正確度で、この中心から計算することができる。この手順は局在化（localization）と呼ばれる。また、増加した分解能は、「超分解能」と呼ばれる。これは、試料において少なくとも所与の光学分解能の範囲内で分離される、活性化標識のサブセットを区別し得ることを必要とする。これにより、より高い精度で活性化標識の所在場所を決定することができる。すなわち、それらを局在化することができる。
【０００４】
ＰＡＬＭ法は、個々の標識分子を分離するために統計効果を利用する。切り替え信号の強度を設定することにより、顕微鏡の光学分解能の範囲内で区別され得る蛍光放射線を標識のみが放射し得る十分な部分領域があるように、試料の所与の領域に存在する標識が活性化される確率が非常に低いことを確実にすることができる。分離および局在化のシーケンスは数回繰り返され、毎回異なって構成されるサブセットが個々の画像に寄与する。これらの個々の画像からの局在化データは、高分解能の全体画像を形成するために最終的に集められる。
【０００５】
ＰＡＬＭ法は、検出される標識の活性化に関して、例えば特許文献３において改良された。このために、特定の電子状態を有する蛍光標識が使用される。それらは、分子の大多数が電子的な蛍光性でない暗状態にさせられるように、高輝度の照明放射線によって活性化される。したがって、そのとき蛍光を発している残りの分子は、光学分解能に関して分離することができる。撮像および個々の画像のキャプチャは、十分な割合の分子が暗状態にされるとすぐに、すなわち励起と同期してなされる。個々の画像に対する露光時間は、励起放射線の一定の照射によって標識を暗状態にさせるのにかかる平均時間に基づいている。特許文献３は、暗状態の寿命が化学物質の添加を通して延長されるという趣旨の試料中の分子の操作を必要とする。
【０００６】
その一方で、例えばＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭなど、他の略記を与えられたＰＡＬＭの修正形態が、技術的な文献において説明されていることにも留意されたい。したがって、本明細書では、蛍光分子を最初に分離して次に局在化することによって、使用される装置の光学分解能を超える空間分解能を達成するすべての顕微鏡検査方法を包含するために、用語「局在化顕微鏡検査（localization microscopy）」を使用する。
【０００７】
通例、局在化顕微鏡検査は、照明のために高い空間分解能を必要としない。多くの場合、単純な広視野照明で十分である。しかしながら、それは、各々の場合に分離される分子を含む、試料の多くの個々の画像がキャプチャされることを必要とする。完全に試料を撮像するために、個々の画像のすべての合計は、可能な限り分子のすべてが少なくとも１つの個々の画像で分離されることを確実にしなければならない。したがって、局在化顕微鏡検査のために、言及された複数の個々の画像は、定期的にキャプチャされなければならず、それは全体画像を生成するためにある一定の持続時間を必要とする。
【０００８】
また、キャプチャ時間は、それ自体として有利な広視野検出が、個々の分子の検出に十分高感度でなければならない２次元検出器も必然的に必要とするという点で、局在化顕微鏡検査のために問題である。通常は量子効率によって示される感度および読み出し雑音は、理想的には個々の分離された分子を検出することができるようなものでなければならない。この要件は、個々の画像のキャプチャにおける積分時間についての下限値と、したがって画像リフレッシュレートの上限値とを、局在化顕微鏡検査の最新技術で使用されるカメラに対して設定する。
【０００９】
生細胞の顕微鏡検査が実行されることになるとき、時間制限は特に懸念されるものである。これに対して局在化顕微鏡検査を適当な時間体制へと導くために、各々の回折限界点について幾つかの分子を評価に入れること、したがって、回折限界点である撮像の分解能限界の見地において、分子群を隣接する分子群から分離することで十分であるという趣旨で、用語「分離される」を拡張することが考慮され得る。したがって、活性化分子の密度をデータキャプチャ中にすでに増加させることができ、所与の数の分子をより速く検出することができる。しかしながら、現在の顕微鏡検査方法の場合、これは局在化精度を過度に犠牲にすることになる。
【００１０】
特許文献３は、暗状態の寿命が化学的操作によって増加されるという点で、積分持続時間の問題を回避しようと試みている。類似の手法は、非特許文献１によってもとられている。ここでは、積分時間は、個々の分子出現の分離のために適切に設定することができる。しかしながら、試料はその後に化学的に操作される必要がある。
【００１１】
ＳＯＦＩとも呼ばれる、いわゆるゆらぎ解析は、高分解能への別のルートを表している。ここでは、個々の蛍光体が明滅させられ、明滅する試料が広視野検出で撮像される。したがって、分解能の増加は、局在化を通してではなく、異なる明滅状態間の相互関係を通して行われる。ＳＯＦＩ顕微鏡検査法の手法は、航海における灯台の認識と同様に見ることができる。そこでは、特定の灯台は、その明滅動作において他の灯台と異なることになる。まったく同一の場所で、隣接する点の明滅と異なる明滅が生じるとき、この場所に発光体（航海における灯台、顕微鏡検査における蛍光分子）が存在しなければならないことは明らかである。ＳＯＦＩ顕微鏡検査法は、相互に関係付けられたゆらぎが、カメラがアクセス可能な時間尺度で必ず生じることを必要とする。これは、最終的に、きわめて特定の染料または標識、例えば十分にゆっくり明滅するいわゆる量子ドットを必要とする。これらの染料は、生きている試料にはあまり適当でなく、あるいはまったく適当でない。加えて、分解能の妥当な増加のために、ある一定の最小数の個々の画像が必要とされるため、ここでも長い測定長の問題がある。特許文献３におけるように、カメラの積分期間は、明滅する発光体の明状態の持続時間にも適合される。ＳＯＦＩ顕微鏡検査法は、相互関係を評価し、分離のステップおよび局在化のステップなしで動作するため、局在化顕微鏡検査とはみなされない。加えて、分解能の可能な増加が、局在化顕微鏡検査と比較して限定される。生細胞の顕微鏡検査の場合におけるさらなる態様は光損傷である。非特許文献２は、短波長を用いた照射がより長波長の光を用いた照射よりも何倍も有害であることを示している。ＰＡＬＭ／ｄＳＴＯＲＭなどのために使用される切り替え波長は４０５ｎｍであり、光スイッチなしで済ませるさらなる理由である。
【００１２】
したがって、蛍光発光体の選択に関して限定されず、特に蛍光発光体の化学的操作をまったく必要としない、高分解能の顕微鏡検査方法の必要性が存在する。特に高速の顕微鏡検査が望まれる。このような方法は、特に生細胞の顕微鏡検査のために要求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２７６９２号
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２００６０２１３１７Ａ１号
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２００８０２４５６８Ａ１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈｅｉｌｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ．”，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，４８．３７，（２００９）：６９０３−６９０８
【非特許文献２】Ｗａｅｌｄｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，５：１５３４８，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１５３４８，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、局在化顕微鏡検査方法を特定すると共に、従来の染料によって化学的操作なしで高速撮像を可能にする、この方法のために設計された顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、蛍光発光体を含有する試料の高速高分解能の顕微鏡検査方法を提供する。第１の状態および第２の状態を有する蛍光発光体が使用される。第１の状態は、蛍光発光体が励起放射線の照射によって蛍光放射線を放射する明状態である。第２の状態は、蛍光発光体が励起放射線の照射によって蛍光放射線を放射しない暗状態である。蛍光発光体は、励起放射線の照射によって明状態から暗状態にされることができる。暗状態は、特定の寿命であって、その後に蛍光発光体が自発的に明状態に戻る、特定の寿命を有する。試料と、したがって蛍光発光体とは、ある強度の励起放射線によって広視野で照らされる。それによって、蛍光発光体は励起されて明滅し、蛍光発光体は、ある明滅周波数で、自然の、すなわち化学的に修正されない明状態と暗状態との間で、交互に切り替わる。明滅する試料は、ある空間分解能において広視野で撮像されてカメラで検出される。励起放射線の強度は、少なくとも一部の蛍光発光体が、空間分解能に基づいて個々の画像で分離されるように設定される。励起放射線の強度およびカメラのリフレッシュレートは、個々の画像が生成されるリフレッシュレートが平均明滅周波数より低くならないように互いに適合される。個々の画像は局在化解析を受ける。この局在化解析では、個々の画像内の分離された蛍光発光体について、空間分解能を超える精度で所在場所が決定される。
【００１７】
さらに、本発明は、蛍光発光体を含有する試料の高速顕微鏡検査のための高分解能顕微鏡を提供する。顕微鏡は、蛍光放射線を放射するために励起放射線によって広視野で試料を照射するように設計される励起装置を備える。顕微鏡は、ある空間分解能において広視野で試料を撮像するように設計される撮像装置をさらに備える。励起装置は、少なくとも一部の蛍光発光体が空間分解能に基づいて撮像において分離されるように設計される。局在化解析装置は、分離された蛍光発光体について、空間分解能を超える精度で所在場所を決定するように設計される。制御装置は、言及した顕微鏡検査方法に従って、励起装置および撮像装置を制御するように設計される。局在化解析装置および制御装置は、１つの装置に組み合わせることもできる。
【００１８】
本発明は、蛍光放射線を放射するために励起放射線、すなわち特定波長の光を用いた照明によって励起され、励起時に蛍光放射線を放射することができる、局在化顕微鏡検査のための蛍光発光体を使用する。励起放射線を用いた照明下で、蛍光発光体は、絶えず非励起の基底状態と励起状態との間のサイクルを通過して、基底状態に再び戻る。基底状態から励起状態への遷移は、励起放射線によって促進される。分子レベルでは、これは励起放射線の光子の吸収によって説明される。蛍光発光体は、励起状態から基底状態に戻り、その戻る間に光学的な蛍光放射線を放射する。分子レベルでは、励起状態から基底状態へのこの変化は、蛍光光子の放射と関係している。蛍光発光体が励起状態に留まる期間は、ナノ秒のスケールである。すなわち、励起光子の吸収後、蛍光発光体は、励起状態にまったく留まらないも同然であり、むしろ事実上直ちに蛍光光子を放射する。この状況の結果は、励起放射線で照らされる蛍光発光体が連続的に蛍光放射線を放射するということである。蛍光発光体を励起放射線でいつでも励起することができ、蛍光発光体は照らされる限り蛍光放射線を放射する、蛍光発光体のこの状態を本明細書では「明状態」と呼ぶ。蛍光発光体が励起放射線の照射にもかかわらず蛍光放射線を放射しない、したがって励起放射線に対してほとんど無反応である暗状態がこれと対比される。暗状態は、例えば、分子のいわゆる三重項状態とすることができる。このような暗状態および特に三重項状態は、ある一定の寿命を有する。すなわち、基底状態から今度は励起放射線を用いた励起および蛍光放射線の放射がいつでも可能であるため、蛍光発光体が暗状態から基底状態に（光学的放射線の放射なしで）戻るために、したがって明状態になるために、ある一定の時間がかかる。暗状態の寿命は、励起状態の寿命より著しく長い。換言すれば、本発明の枠組内で、明状態は、蛍光放射線が放射される蛍光発光体の基底状態および励起状態を含む。これに対して、暗状態は、励起放射線の照明下でさえ、蛍光発光体を励起状態にすることが可能でなく、したがって蛍光放射線が放射されない状態である。
【００１９】
励起放射線の照射によって、蛍光発光体は第１の確率で明状態に留まる。第１の確率より小さい第２の確率で、蛍光発光体は暗状態へ移る。しかしながら、暗状態の寿命は励起状態の寿命よりはるかに長いため、蛍光発光体が特定の期間内に暗状態に移行することになる確率は、励起放射線の強度の増加とともに増加する。発光体は、暗状態の寿命の間は暗状態に留まり、そのとき励起放射線に無反応であるため、この寿命の間はほとんどスイッチを切られる。暗状態と異なり、明状態自体に明確な寿命があるとは考えられない。明状態の励起状態に寿命があると考えられるのみである。しかしながら、すでに述べたように、これは暗状態の寿命より何倍も短い。理論的な２状態系では、特定の強度の励起放射線によって励起された蛍光発光体は、ほとんど無制限の蛍光放射線を放射し得る。
【００２０】
本発明は、励起放射線の照射によって、蛍光発光体の特定の割合が暗状態、例えば三重項状態に移行するという、ほとんどすべての蛍光発光体の一般的な特性を使用する。暗状態に入る蛍光発光体の割合は、励起放射線の強度に依存する。それは、励起放射線の強度が増加するにつれて増加する。各々の蛍光発光体について、それが励起光子を通して基底状態から標準的な励起状態へ移り、そこから無放射で暗状態へ移ることになる、ある一定の確率が存在する。用語「無放射」は、蛍光放射線の波長に関連している。通例、暗状態にある確率は、励起放射線の強度が増加するにつれて増加する。蛍光発光体が暗状態にある場合、蛍光発光体は、暗状態の寿命の間は蛍光放射線を放射しない。蛍光発光体が暗状態から明状態に戻っていたときにのみ、発光体は励起されれば再び蛍光放射線を放射することができる。これらの状況によって、蛍光発光体は明滅し、明滅の暗時間は暗状態の寿命によって決定される。発光体は、明状態で励起されている間は発光しているため、明時間の長さは、蛍光発光体が明状態から暗状態へ移るのにどの程度長くかかるかに依存する（最終的には、平均明時間は励起放射線の強度に依存する）。期間、したがって明滅の明滅周波数は、明時間と暗状態の平均寿命との合計によって形成される。暗時間の持続時間は励起強度に依存するため、明滅周波数は励起強度の選択によって設定される。
【００２１】
幾つかの実施形態では、暗時間、すなわち暗状態の平均寿命は、すべての明滅周波数に対して分子特有に事前決定される。幾つかの実施形態では、それは化学的に操作されない。すなわち、暗時間は自然の暗状態の寿命である。換言すれば、励起放射線の強度の適当な選択を通して蛍光発光体が暗状態へと一時的に変化することによって、明状態における各々の蛍光発光体の連続的な発光が中断されるという点で明滅が生成される。
【００２２】
本発明は、励起強度の適当な選択によって望ましい周波数で染料を明滅させ、局在化顕微鏡検査を行い、カメラの積分時間または画像周波数を明滅周波数に適合させる。幾つかの理由で、これは最新技術から離れた体系的な変更を表す。
【００２３】
１．本発明は、蛍光発光体の明滅を計画的に引き起こし、この明滅を局在化顕微鏡検査のために使用する。画像キャプチャは、リフレッシュレートが明滅周波数より低くならないように設計される。局在化顕微鏡検査のために、蛍光発光体は、明滅しているために必ず数回検出される。これに対して、従来のＰＡＬＭ手法およびその修正形態は、分子を可能であれば一度のみ照らされた状態にするものであり、いずれにしても明滅を正確に回避することを目的とする。
【００２４】
２．従来の蛍光体のために、したがって蛍光顕微鏡検査の通常用途の大多数のために、暗状態への遷移の確率は、言及したように、励起放射線の強度に依存する。明時間、したがって明滅周波数は、互いに関して逆に変化する。励起放射線がより強くなるほど、蛍光体はより多く暗状態へ移り、明時間はより短くなる（明滅周波数はより高くなる）。したがって、明滅周波数は、単純な光学手段によって適切に設定して、カメラの必要性に適合させることができる。明滅周波数を増加させることによって、分子が明状態にある期間は減少する。しかしながら、暗状態は、好ましくは不変の分子特有の寿命を有する自然の暗状態であるため、長さが変化しないままである。したがって、明時間と暗時間との間の比率は、暗状態が明状態と比較して長くなるという点において制御される。相対的なスケールで、化学的操作を伴う最新技術でのみ可能であった結果、すなわち暗状態の延長が達成される。
【００２５】
３．明滅周波数を参照することにより、本発明は、カメラの積分時間／画像周波数と励起放射線の強度との相互作用の有利な利用を達成し、ＰＡＬＭでは利用可能でなかった、従来の蛍光体を化学的影響なしで局在化顕微鏡検査のために使用することができるという結果をもたらす。
【００２６】
４．明滅周波数より低くならないカメラのリフレッシュレートは、カメラの設定の、例えば画像キャプチャの積分時間の、励起放射線の強度に対する適当な相互適合を通して取得することができる。したがって、励起放射線強度によって規定される明滅周波数とカメラ積分時間／リフレッシュレートによって規定されるカメラの検出感度との間の逆の関係が利用される。幾つかの実施形態では、局在化解析においてマルチエミッタ解析を利用する。すなわち、蛍光発光体の群が蛍光発光体の他の群から分離されるという意味で、「分離される」という用語を理解し、または、少なくとも一部の蛍光発光体が個々の画像内で空間分解能を考慮して分離されるという定義を理解する。それにもかかわらずカメラは好ましい性能範囲で動作するため、分解能は最新技術で予想されるほど大きく減少しない。
【００２７】
５．個々の画像のリフレッシュレートは明滅周波数より低くならないため、明滅周波数に対する参照は、正確に明滅分子の１つの暗状態がそれぞれの個々の画像に含まれることを確実にする。この周波数は、１つの明状態および１つの暗状態から構成される。したがって、対応する分子の局在化は、従来の方法で依然として可能である。そのため、本発明による顕微鏡検査方法の局在化解析は、標準的なＰＡＬＭまたはその修正形態の局在化解析と基本的には異ならない。しかしながら、試料の蛍光発光体がそれらの明時間の間に幾つかの光子を放射するため、各々の分子はそのとき、幾つかの光子によって検出される。これは、最新技術と比べて比較的短く明滅周波数に適合される積分時間に有利な補償を提供する。比較的迅速な画像キャプチャは、驚くべきことに局在化解析において、信号／雑音比の劣化につながらない。
【００２８】
励起放射線の強度とリフレッシュレートとを互いに適合させるために、本発明の幾つかの実施形態では、テスト測定で暗状態の寿命を測定し、それに応じてリフレッシュレートを設定する。寿命を測定するために、励起放射線をパルス方式で放出してもよく、蛍光放射線は、励起放射線に同期して検出することができる。例えば蛍光相関分光法によって知られているように、連続波動作で励起して自己相関分析を行うことも可能である。
【００２９】
積分時間は、好ましくは暗状態の寿命の９０パーセント、特に好ましくは５０パーセント、きわめて特に好ましくは１０パーセントである。
【００３０】
本発明は、ほとんどの標準的な蛍光体の暗寿命の規模の時間体制で動作する。この範囲は１μｓ〜３００μｓである。励起強度は、蛍光を発しない暗状態の寿命によって明滅動作が支配されるように設定される。ほとんどの場合、これは三重項状態である。画像周波数が１／（３００μｓ）の値未満に下がらないように、励起放射線の強度を設定することが好ましい。
【００３１】
顕微鏡検査方法の実施形態において、励起放射線の強度は、１ＭＷ／ｃｍ２を超えることはなく、好ましくは５０ｋＷ／ｃｍ２を超えることはなく、特に好ましくは２ｋＷ／ｃｍ２を超えることはない。
【００３２】
リフレッシュレートは、好ましくは明滅周波数の１５０％を上回ることはなく、さらに好ましくは１３０％を上回ることはなく、特に好ましくは１１０％を上回ることはなく、きわめて特に好ましくは１０５％を上回ることはなく、かつ１００％を上回るように選択され、１００％には到達しない。
【００３３】
特に好ましい実施形態において、蛍光発光体は、それらの暗状態の寿命に関して化学的に影響されない状態にある。生細胞に対する化学的な影響は一般に非常に不利であるため、このことは生細胞の顕微鏡検査において特に有利である。本発明は、励起放射線の出力をリフレッシュレートに適合させる。試料の光子圧力は、より速いリフレッシュレートで減少するため、このことは生細胞の顕微鏡検査に対して特に有利である。
【００３４】
顕微鏡のセットアップは、典型的な広視野蛍光顕微鏡のセットアップに対応し、したがって、制御装置は、励起強度およびリフレッシュレートを互いに合わせるために励起装置および撮像装置を制御するように適合される。励起放射線は、連続放射線（ＣＷ放射線）の形態で試料を照らすことができる。蛍光測定のために、パルス励起およびそれに同期したカメラの動作が好ましい。この同期動作は、個々の分子の発光体に対して信号対背景放射線の比率を改善するために、すなわち、例えば相当に長いまたは相当に短い寿命で、暗状態のおよび／または明状態の相当に異なる寿命の背景自己蛍光が試料に存在しているときにも使用することができる。
【００３５】
本発明は、カメラのリフレッシュレートと試料の明滅周波数とを互いに調整する。明滅周波数、したがってリフレッシュレートを比較的高く設定することには、一定の利点がある。その際、カメラの積分時間は比較的短い。高いリフレッシュレートを使用する幾つかの実施形態では、カメラ内のＳＰＡＤ検出器アレイを利用する。したがって、カメラがＳＰＡＤアレイを備えることが好ましい。
【００３６】
多数のピクセルを有するＳＰＡＤアレイは、入手することが比較的難しく高価である。好ましい実施形態では、広視野での回折限界撮像を依然として可能としない数のピクセルを有するＳＰＡＤアレイが使用される。これらの実施形態では、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨの独国特許出願公開第１０２０１２２０５０３２Ａ１号によって知られる技術を使用することができる。この技術によれば、試料は画像フィールドで撮像され、画像フィールドの位置は試料全体にわたって数回ずらされる。部分的な個々の画像が画像フィールドの各々の位置について取得され、取得された部分的な個々の画像は、個々の画像を形成するために組み立てられる。
【００３７】
方法ステップが以下で解説される場合、それらのステップは、適切に設計された制御装置を有する顕微鏡の対応する動作によって実現することができる。したがって、方法の特徴が説明される場合、これらは、例えば適当な動作プログラムを通して、制御装置の設計に関連している。例えば対応するプログラミング手段を通して達成される制御装置の特徴が、同じように対応する動作方法の特徴に関連し、かつこれを開示するように意図され、当然のことながら逆も同様に当てはまる。
【００３８】
上で明示された特徴および下でさらに解説される特徴が、述べられた組合せでだけでなく、他の組合せでまたは単独で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることが理解される。
【００３９】
本発明は、本発明に不可欠な特徴も開示する添付の図面を参照して、例としてさらにより詳細に解説される。局在化顕微鏡検査は、ＰＡＬＭの変形形態の実施例について解説される。しかしながら、上述のように、これは本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＰＡＬＭ法に基づく本発明の一実施形態による顕微鏡の概略表現である。
【図２】ＰＡＬＭ法に基づいて図１の顕微鏡で高分解能画像を生成するためのフローチャートである。
【図３】蛍光発光体の明状態および暗状態を解説するための項図の概略表現である。
【図４】蛍光発光体の明滅状態を解説するためのタイミング図である。
【図５】生成される個々の画像上の平面図である。
【図６】高分解能の顕微鏡検査方法を行うための顕微鏡の概略表現である。
【図７】図１の顕微鏡の画像フィールドの異なる位置を有する試料の表面上の平面図である。
【図８】隣接する画像フィールド位置間の重複を例示するための図２に類似した表現である。
【図９】２つの蛍光顕微鏡検査画像であり、上の画像は標準的な広視野キャプチャに対応し、下の画像は同じ試料の高分解能の全体画像である。
【図１０】図９の画像の区間「１」および「２」を通した２つの断面表現である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１は、高分解能で試料２を撮像する顕微鏡１を概略的に示している。ここで、撮像の回折限界を超えて増加した空間分解能を有する撮像方法に対して、最新技術において普通である高分解能という用語が使用される。顕微鏡１は、蛍光発光体を含有する試料２を撮像するのに役に立つ。照明光源３からの放射線を用いて蛍光発光体は励起され、蛍光放射線を放射する。蛍光を発している試料２は、ビームスプリッタ５を介して広視野カメラ４上に撮像される。顕微鏡１の動作は、制御装置６によって制御される。制御装置６は、（さらに識別されない）対応する制御線を介して、広視野カメラ４、照明光源３および任意選択的に試料２が置かれるテーブルに接続され、これらの要素を作動させ、またはこれらの要素からのデータ、特に広視野カメラ４からの画像データを受信する。
【００４２】
一実施形態では、広視野カメラ４は、ＣＭＯＳカメラおよびイメージインテンシファイアの組み合わせを備える。例えば、Ｇｉｇｅ−Ｖｉｓｉｏｎによる「強化された高速ＣＭＯＳカメラ」、または上流のイメージインテンシファイア、例えばＬａｍｂｅｒｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるイメージインテンシファイア「ＨｉＣＡＴＴ、ハイスピードカメラアタッチメント」を有する、ＣＭＯＳカメラの形態で実現される。この実施形態および他の実施形態において、広視野カメラ４は、そのリフレッシュレート、すなわち露光時間または積分時間に関して調節することができる。制御装置６は、制御線を介して対応する設定を引き受ける。さらに、好ましい実施形態では、制御装置６は、リフレッシュレートへの同期を確立する。
【００４３】
照明光源３は、試料に励起放射線Ａを放出する。この放射線の強度は、ＣＷ放射線の形態またはパルス放射線の形態で、制御装置６によって設定される。さらに、制御装置６は任意選択的に、キャプチャされた個々の画像で局在化解析も行い、処理された個々の画像から高分解能の全体画像を生成する。
【００４４】
図３は、顕微鏡１で使用される蛍光発光体についての項図を概略的に示している。蛍光発光体は、基底状態Ｓ０を有する。励起放射線Ａの照射を通して、蛍光発光体は励起状態Ｓ１へ移り、そこから蛍光放射線の放射とともに基底状態へ戻る。基底状態Ｓ０および励起状態Ｓ１は、蛍光発光体の明状態Ｈを形成する。明状態Ｈにおいて、蛍光発光体は励起放射線Ａの照射に対していつでも蛍光放射線Ｆを放射する。励起状態Ｓ１の寿命は数ナノ秒であるため、明状態Ｈにおいては、励起放射線Ａで照らされる蛍光発光体は絶えず蛍光放射線Ｆを放射する。蛍光放射線Ｆの個々の光子の放射がナノ秒間隔で起こるという事実は本明細書では関係なく、また本明細書で説明される装置を用いた測定技術によっては検出できない。
【００４５】
励起放射線Ａは、蛍光発光体を、励起状態Ｓ１を経由して三重項状態Ｔ１にすることもできる。これは、数μｓの範囲、例えば１μｓ〜３００μｓの寿命を有する。蛍光発光体が三重項状態Ｔ１にある間、蛍光発光体は励起放射線Ａのさらなる照射に反応しない。三重項状態への遷移および三重項状態からの遷移は、（少なくとも蛍光放射線Ｆの波長に関して）無放射であり、したがって図３では破線で描かれる。蛍光発光体はそのとき、励起放射線Ａを用いた照明にもかかわらず蛍光放射線Ｆを放射しないため、三重項状態Ｔ１は、したがって暗状態Ｄである。蛍光発光体が基底状態Ｓ０に戻ったとき、したがって暗状態Ｄを出て再び明状態Ｈにあるときのみ、蛍光発光体は、励起放射線Ａを用いた照明に対して絶えず蛍光放射線Ｆを放射する。
【００４６】
励起状態Ｓ１から基底状態Ｓ０への遷移の確率は、励起状態Ｓ１から三重項状態Ｔ１への遷移の確率よりはるかに高い。したがって、励起放射線Ａの光子の照射に対して、蛍光発光体は、暗状態Ｄに変化するよりも明状態Ｈに留まる可能性がはるかに高い。しかしながら、確率はゼロではない。励起放射線Ａの強度が増加するにつれて、すなわち、いわば励起放射線の光子による衝撃の増加とともに、蛍光発光体がある一定の期間内に暗状態Ｄに移行する確率は増加する。
【００４７】
図３で示される項図は、単なる実施例と解釈されるべきであり、単に励起放射線Ａを照射することによって両方とも到達される明状態Ｈおよび暗状態Ｄがあるという意味で、本明細書で使用される物質を蛍光発光体として特徴付けるようにのみ意図される。暗状態Ｄで、単一状態が三重項状態Ｔ１の形態で存在することが絶対的に必要ではなく、多状態系も可能である。しかしながら、蛍光発光体が、ゼロを上回る遷移の確率で励起放射線Ａの入射を通して暗状態Ｄへ移ることは重要である。
【００４８】
これは、励起放射線Ａの波長と異なる波長の放射線を使用するＰＡＬＭ変形形態に対して大きな相違をもたらす。特定のスイッチング放射線で動作する、ｄＳＴＯＲＭとして知られるＰＡＬＭ変形形態は、一例にすぎない。このような別個のスイッチング放射線は、本発明の実施形態では使用されない。むしろ、蛍光発光体は、もっぱら励起放射線Ａの照射を通して（ある一定の確率で）暗状態へ移る。
【００４９】
この状況の効果は、図４に示されている。この図は、蛍光発光体の光放射のタイムシーケンスを表している。この中で、下位レベル８は暗い蛍光発光体を示し、上位レベル９は蛍光を発している蛍光発光体を示している。解説したように、蛍光発光体は、励起放射線Ａによってある一定の確率で暗状態Ｄにさせられるため、励起放射線Ａの照射を通して、蛍光発光体は遅かれ早かれ、光る明状態（上位レベル９）から暗状態（下位レベル８）へと移る。この暗状態Ｄの間、発光体は暗いままである。この暗状態の持続時間は、上記の場合において、蛍光発光体に対して光学的に影響され得ない。暗時間（図４の曲線の下位レベル８）は、暗状態Ｄの寿命ｔｄに相当する。その後、蛍光発光体は、再び暗状態Ｄを出て光る（図４の上位レベル９）。純粋に統計的に、蛍光発光体は、ある一定期間後に再び暗状態Ｄへと戻ることになる。蛍光発光体が光る期間は、明時間ｔｈを表す。明時間ｔｈは、暗状態Ｄへの遷移の確率に依存し、したがって励起放射線Ａの強度に依存する。結果として、蛍光発光体は、非発光（下位レベル８）と発光（上位レベル９）との連続から形成される明滅７を行う。この明滅の期間ＰＢは、その逆数が明滅周波数ｆＢであり、暗状態Ｄの寿命ｔｄと明時間ｔｈとの合計によって形成される。
【００５０】
励起放射線Ａの強度が増加されると、発光体が暗状態Ｄへ移る確率が増加し、それによって明時間ｔｈが減少する。この状況は、図４では破線で描かれている。励起放射線Ａの強度を増加させることによって、統計的平均ではより早く暗状態Ｄに到達するため、平均明時間ｔｈは短縮される。図４では、これは左から見た第２の暗状態の前方への変位１０によって、破線でプロットされている。明滅周波数ｆＢが増加する（明滅期間ＰＢが減少する）ことは直ちに見てとることができ、暗状態Ｄの寿命ｔｄは変化しないままである。それは好ましくは、暗状態Ｄの自然寿命、例えば三重項状態Ｔ１の自然寿命に対応する。
【００５１】
制御装置６は、顕微鏡１が、局在化に基づく顕微鏡検査方法、例えばＰＡＬＭ法を行うように全体として設計されている。
【００５２】
実行される方法手順は、フロー図として図２に表されている。ステップＳ１における方法の開始後、励起ステップＳ２において、試料２は照明光源３からの励起放射線Ａによって照らされる。これは個々の蛍光発光体が撮像の空間分解能に関して分離されるように行われる。後続の画像キャプチャステップＳ３で撮像が行われ、このステップでは、少なくとも個々の蛍光発光体の隣接する蛍光発光体からの間隔が広視野撮像の空間分解能よりも大きいという点で、広視野で試料の個々の画像を供給する。この状態は図５に概略的に示されており、これは試料２の個々の画像１４を示している。個々の画像で、個々の蛍光発光体１１は分離されている。ここでは、それらは星印としてプロットされている。現時点においては暗状態Ｄにある発光しない蛍光発光体は、図５ではリングによって記号で表されている。大多数の蛍光発光体、特に領域１３の蛍光発光体は、それらを互いから切り離すことができるように間隔を置かれている。しかしながら、例えば領域１２では、個々の蛍光発光体は、互いに非常に接近して隣り合っているため、それらは光学的におよび局在化解析において区別することができない。１００％分離を達成することができない（またこれがまったく必要でもない）という事実は、局在化解析に関する当業者には周知である。
【００５３】
後続の局在化ステップＳ４は、これらの分離された蛍光発光体について、回折限界が実際に許容するよりも大きい空間分解能で画像中の所在場所を決定する。領域１２内にあるような切り離すことができない蛍光発光体は、局在化ステップＳ４で廃棄される。これは、分離された蛍光発光体からキャプチャされる放射線が、１つの蛍光発光体から発するのか、または少数の蛍光発光体から発するのかを、局在化ステップＳ４で利用するという点において起こり得る。この知識から所在場所が決定され、蛍光発光体は、回折限界が許容するよりも高い精度で位置決めされる。局在化ステップＳ４で行われる局在化解析は、分離された蛍光発光体のエアリーディスクの中心が決定されるように単純化された方式で想定することができ、その中心はそのときの所在場所を表す。蛍光発光体の所在場所は、点像分布関数に当てはめることによって、単純に中心を決定するよりも正確に決定することができる。この関数は、例えば２Ｄガウス分布によって近似することができ、または光学系の実験的に決定された点像分布関数を使用することもできる。局在化解析を行うために、例えば、本明細書の導入部分で言及した刊行物から、多くの異なる手法が最新技術において知られている。
【００５４】
個々の画像１４における局在化ステップＳ４の１つの単一の実行は、対応する広視野画像内で発光した、すなわち暗状態Ｄでない蛍光発光体についてのみ所在場所を与える。さらに、分離された蛍光発光体のみが局在化される（したがって、例えば領域１２の発光体は局在化されない）。可能であれば、すべての蛍光発光体に関して試料を撮像するために、ステップＳ２〜Ｓ４は、最良の場合には、分離された蛍光発光体のサブセットが少なくとも一度すべての蛍光発光体１１を有するようにするために数回繰り返される。したがって、質問ステップＳ５が局在化ステップＳ４に続き、ここでは試料２が十分な程度に撮像されたかどうかチェックされる。例えばこのステップは、局在化ステップＳ４の前のサイクルのすべてから取得した多数の所在場所にアクセスすることができる。このような手段は、所在場所の許容誤差を決定せずに動作するＰＡＬＭ法または他の局在化ベースの高分解能方法でも使用されるため、このような質問は最新技術の当業者には周知である。試料が十分に包括的に検出された場合（Ｊ分岐）、ステップＳ６で全体画像が生成され、画像が表示される。そうでなければ（Ｎ分岐）、ステップＳ２〜Ｓ４が再び実行され、繰り返しサイクルの間に、可能な限り他の蛍光発光体が分離されるように注意が払われる。
【００５５】
（それが最も単純である故に）最も有利な選択肢は、最初に個々の画像１４をすべてキャプチャしてそれらを保存し、次に保存された各々の個々の画像１４に対して局在化解析を実行することである。あるいは、特に十分な処理能力の場合には、オンライン解析が行われる。画像表示ステップＳ６における全体画像の生成および表示の後、ステップＳ７が方法を終了させる。試料２は、光学的な回折限界が許容するよりも良好な空間分解能で撮像された。
【００５６】
励起放射線Ａは、試料中の蛍光発光体を明滅７するように励起し、蛍光発光体は、明状態Ｈと暗状態Ｄとの間を明滅周波数ｆＢで交互に切り替わる。励起ステップＳ２は、適当な強度の励起放射線Ａを介して、明滅する試料を提供する。明滅する試料２は、画像キャプチャステップＳ３において広視野撮像機器構成で撮像され、広視野カメラ４で検出される。カメラはリフレッシュレートを有しており、したがって、個々の画像１４のそれぞれに対して画像キャプチャ時間を規定する。画像キャプチャ時間は、個々の画像生成プロセスの積分時間によって決定される。制御装置６は、広視野カメラ４でこの積分時間を設定する。さらに、制御装置６は、照明光源３で励起放射線Ａの強度を設定する。
【００５７】
励起放射線Ａの強度と蛍光体１１が明滅する明滅周波数ｆＢとは、互いに関連している。励起強度Ａが大きく増加すると、明滅周波数ｆＢは増加する。同時に、リフレッシュレートの増加は、広視野カメラ４の検出感度を低下させる。対応する感度曲線または感度依存性を記述する他のデータは、制御装置６に保存される。同様に、励起強度Ａと明滅周波数ｆＢとの間の関係、または励起強度と平均明時間ｔｈとの間の関係は、制御装置６に保存される。この関係は、曲線としてまたはデータの形態で（例えばテーブルとして）保存することができる。それは、蛍光体に対して事前に知られているか、または顕微鏡の特別なテスト測定モードで決定される。テスト測定モードは、要求に応じてまたは自動的に、制御装置６によって実行される。このテスト測定モードで、制御装置６は、同期された照明光源３および広視野カメラ４のパルス動作を通して、（励起強度の関数として１つの選択肢で）暗状態Ｄの寿命ｔｄおよび／または明時間ｔｈおよび／または明滅周波数ｆＢを検出する。あるいは、寿命測定は、ＣＷ励起放射線（上記を参照のこと）を用いても行うことができる。
【００５８】
制御装置６は、制御装置６に保存された要求、または制御装置６に入力された要求に従って、照明光源３によって放射される励起放射線Ａの強度および広視野カメラ４のリフレッシュレートを設定する。
【００５９】
要求は、例えば、可能な限り速く画像キュプチャが必要とされると主張することができる。制御装置６は、広視野カメラ４のリフレッシュレートと光学的検出限界との間の保存された関係から、試料２を撮像するために必要とされる最小リフレッシュレートを決定し、明滅周波数ｆＢがリフレッシュレートを下回るように、照明光源３において励起放射線Ａの強度を設定する。励起放射線Ａの強度と個々の画像キャプチャのリフレッシュレートとの互いの相互作用は、全体画像の生成を最小化するように適合されるため、この動作モードは、高速動作モードと解釈することができる。個々の画像キャプチャの許容可能な最大リフレッシュレートを決定する際、蛍光発光体１１の一部の分離に対する要件は、マルチエミッタ解析として、すなわち各々の回折限界点に対して幾つかの分子が評価に入ることを許して、ステップＳ４において局在化解析を行うことによってさらに下げることができる。したがって、広視野カメラ４についての性能要求はさらに減少され、可能なリフレッシュレートは増加する（ただし、これは若干のしかし一定の用途において容認可能な分解能の犠牲を伴う）。
【００６０】
可能な限り速い画像キャプチャの反対の極致は、蛍光発光体１１の最大の分離を目的とする、励起放射線Ａの強度とリフレッシュレートとの相互適合である。その際、制御装置６は、照明光源３において励起放射線Ａの強度を増加させ、それによって明滅周波数が増加する。同時に、リフレッシュレートも最大に設定され、それによって、究極的には分離の程度も増加する。暗状態の寿命と比較した露光時間がより短いほど、分離はより大きくなり得る。このようにして、局在化精度、したがって高分解能が増加される（ただし、試料の光子負荷または圧力を犠牲にする）。
【００６１】
好ましい実施形態では、制御装置６は、リフレッシュレートと励起放射線強度との相互適合に関するパラメータが指定される入力インタフェースを有する。インタフェースは、例えば、ユーザに対する入力インタフェース、または対応するパラメータデータを供給するためのデータインタフェースとすることができる。１つの実施形態では、パラメータデータまたはユーザを介した入力は、好ましくは相対的なスケール、例えば０〜１００で画像キャプチャレートを指定する値を含むことができる。別の実施形態では、代わりにまたは加えて、ここでも好ましくは無次元スケールで、局在化精度および／または試料の光子圧力のパラメータを指定することができる。パラメータ値または幾つかのパラメータ値から、制御装置６は、保存された関係またはテーブルに従って、広視野カメラ４において設定されるリフレッシュレートまたは積分時間または露光時間、および（ＣＷまたはパルス放射線として）照明光源３において設定される励起放射線Ａの強度を決定する。
【００６２】
本明細書の概要部分で解説したように、幾つかの実施形態では、発光体の特性変数の測定をさらに行う制御装置６を含む。これは例えば、明滅周波数ｆＢまたは暗状態Ｄの寿命ｔｄの測定とすることができる。顕微鏡１は広視野カメラ４を使用し、当該広視野カメラ４のリフレッシュレートが明滅周波数ｆＢに設定または適合される。高いリフレッシュレートを実現することを可能にするために、幾つかの実施形態では、ＳＰＡＤアレイを備える広視野カメラ４を使用する。
【００６３】
この手法の改良では、望ましい試料フィールドで必要とされる分解能に対して理論的には十分でないはずのＳＰＡＤアレイが使用される。図６は、顕微鏡１のこの実施形態を概略的に示している。顕微鏡１は平らな試料２を撮像する。試料２の試料領域Ｐが撮像される。顕微鏡１は、試料フィールドＰを撮像するために対物レンズ２３およびさらなるレンズ２４を備える。試料フィールドＰの一部は、空間分解で、すなわちピクセル化検出器２５で撮像される。それによって、図１の設計と対照的に、試料２の画像フィールドは、検出される試料フィールドより小さい検出器２５上に撮像される。試料２は、照明光源３の１つの実施例である、レーザからの励起放射線Ａに暴露される。励起放射線Ａは、蛍光放射線Ｆを放射するために、試料２中の蛍光発光体１１を励起する。励起放射線Ａは、より詳細に説明されない光学系およびビームスプリッタ５を介して、対物レンズ２３へのビーム経路に結合される。放射線は、ビームスプリッタ５から偏向ミラー２９および適応ミラー３０までを走る。偏向ミラー２９は、ビーム経路をコンパクトに保つのに役立ち、その他の点ではさらなる重要性を有さない。適応ミラー３０は、個々に作動させることができるミラーセグメントを含む。適応ミラー３０は、撮像ビーム経路および照明ビーム経路の中間画像平面ＺＢに配置される。適応ミラー３０は、試料領域Ｐ全体にわたって画像フィールドをシフトするための画像フィールドシフト装置の実施例であり、この画像フィールドは検出器２５で撮像される。他の選択肢は、ミラースキャナまたは試料ホルダによる試料シフトである。中間画像平面ＺＢに同じく配置される絞り３２も画像フィールド選択に寄与する。試料２の画像は、レンズ３３および旋回ミラー３４を介して、同様に中間画像平面ＺＢにある検出器２５に到達する。旋回ミラー３４は、代替的には通常の広視野カメラ３５で試料を見ることを可能にする。旋回ミラー３４およびカメラ３５は、任意選択的である。カメラ３５の動作の間、絞り３２は好都合な方法で全開に設定されるか、またはビーム経路から除去され、試料２の試料フィールド全体が照らされるという結果になる。撮像ビーム経路にはレンズ３１も設けられ、これはレンズ３３のように中間の撮像をもたらす。レンズ３１は、絞り３２が配置される中間画像平面ＺＢを規定する。レンズ３３は、検出器２５が配置される中間画像平面ＺＢを規定する。
【００６４】
図６の実施例で適応ミラー３０によって実現される画像フィールド変位機構の機能は、検出される試料２の試料フィールドＰの平面図を示す図７から明らかである。試料フィールドＰよりかなり小さい画像フィールドは、３７でラベル付けされている。画像フィールド３７は、試料フィールドＰ全体にわたってシフトされる。対応するシフト位置およびシフト位置から生じる画像フィールド３７の位置は、図７において概略的に示される。
【００６５】
図８は、隣接する位置３８の間に重複領域３９が生じるように、画像変位装置が画像フィールド３７を種々の位置３８にすることを示している。これは任意選択的であるが、試料フィールドＰを再現する１つの画像を形成するために、個々の部分画像を後で組み立てることをより容易にする。
【００６６】
適応ミラー３０を用いた実施形態では、適応ミラー３０は、試料フィールドＰ全体にわたって画像フィールド３７をシフトする１つまたは複数のグループ化された要素を含む。検出器２５で撮像される画像フィールド３７のサイズは、一方では検出器２５自体の表面積によって、他方では絞り３２の大きさによって、事前に決定される。絞り３２は、撮像を改善するが必須ではない。絞り３２が省略される場合、対応する中間画像平面ＺＢおよびこれを生成するための光学手段はなしで済ますことができる。
【００６７】
検出器２５は、試料フィールドＰ全体が撮像される場合、究極的には対物レンズ２３によって規定される光学的分解能限界にはるかに及ばないであろう幾つかのピクセルを有する検出器アレイである。したがって、検出器２５は、局在化顕微鏡検査のためには、それ自体では不適当であることになる。したがって、画像フィールド３７のサイズおよび顕微鏡１の拡大率は、分解能限界に対応する試料２における構造長が、検出器上のピクセルのサイズに対応するか、またはさらに大きいように選択される。それにもかかわらず、試料フィールドＰは、画像フィールド３７を幾つかの位置へシフトすることによって走査することができる。したがって、高い測定速度を有する検出器を使用することができる。電子検出器の場合、個々の画像のリフレッシュレートは、検出器の積分時間および読み出し時間によって限定される。顕微鏡１の検出器２５は、例えば、比較的大きい従来のＣＭＯＳベースまたはＣＣＤベースの２次元検出器よりも大きさは小さいがはるかに速い、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管またはＧａＡｓＰハイブリッド検出器のアレイとすることができる。したがって、試料フィールドＰは、空間分解検出器２５によって撮像される。ここで、光学的撮像は、最大分解能が回折限界である、構造長が検出器上でその構造長の規模で検出器ピクセルに対応するように行われる。検出される画像フィールド３７は、試料フィールドＰよりはるかに小さい。試料フィールドＰ全体の検出のために、画像フィールドは種々の位置３８にもってこられる。各々の位置について、試料２の下位の個々の画像１４は、現在位置３８に対応してキャプチャされる。その後、下位の個々の画像は、試料フィールドＰの個々の画像１４を形成するために組み立てられる。このさらなるデベロップメントは、標準的な広視野での撮像のためには十分でないピクセル数で利用可能な高速検出器アレイを使用することができる。例えば、１２８×１２８ピクセルを有するＳＰＡＤアレイが使用される場合、Ｎｉｃｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＥＥＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ４３，ｐａｇｅ  ２９７７，２００８によって知られているように、５×５の異なる画像フィールド位置の合計は、サイズが５０μｍの典型的な試料フィールドをカバーすることができる。
【００６８】
図９は、説明された顕微鏡の実施形態を用いて生成された２つの画像を示している。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨによる、Ｅｌｙｒａ型顕微鏡が使用された。画像キャプチャのための検出器として、米国ＤｕｌｌｅｓのＶｉｄｅｏ  Ｓｃｏｐｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｔｄ．による、Ｕｌｔｒａｃａｍ７が使用された。蛍光体は、染料Ａｌｅｘａ４８８である。この染料はファロイジンにマークを付け、それによって細胞の細胞骨格（アクチン）の一部が着色される。励起放射線の強度は、４８８ｎｍの波長において０．１ｋＷ／ｃｍ２であった。
【００６９】
上の画像では、図９の標準的な広視野画像４１を示しているのに対して、下の画像は同じ試料の高分解能の全体画像４２を示している。３０，０００の個々の画像が生成され、それらの画像は、復帰時間を含む３１．２５μｓの露光時間に対応する３２ｋＨｚのフレームレートでキャプチャされた。合計測定時間として１秒を要した。局在化解析のために、２Ｄガウス関数が当てはめられた。ＥＭＣＣＤ検出器を用いた従来のＰＡＬＭ顕微鏡検査法では、同じ測定のために１０分〜１７分を必要とするであろう。広視野画像４１は、３０，０００の個々のフレームを、何ら処理を施すことなく単純に合計することによって取得された。したがって、広視野画像４１は、露光時間が１秒の画像に対応する。
【００７０】
図１０は、図９の広視野画像４１および全体画像４２における、マークが付いた２つの区間「１」および「２」を示している。図１０の上部の表現は、区間「１」に対する２つの曲線、すなわち、広視野画像４１に対する曲線４３、および高分解能全体画像４２に対する曲線４４を示している。
【００７１】
見てとれるように、高分解能全体画像４２における空間分解能は非常に良好である。図１０の下部の表現は、区間「２」を参照して、不正確な情報が一部の区間に対して広視野で確かに生じる場合があり、それによって例えば隣接する明領域を曲線内で過度に光らせることを証明している。これは、高分解能全体画像４２によって回避される。この相違は、図１０の下部の表現で明らかに認識することができる（例えば０．８μｍ〜０．９μｍの領域で参照のこと）。広視野画像４１に対する曲線４５は、高分解能の全体画像４２の曲線４６によれば、実際に試料構造がないか、または僅かにのみ存在する位置で最大を呈する。
【００７２】
暗状態の実施例として三重項状態が説明されたが、これは単に例として理解されるべきである。三重項状態でない暗状態を有する、蛍光顕微鏡検査の当業者に周知の蛍光染料が存在する。
【００７３】
顕微鏡検査方法、および対応する顕微鏡１の設計を行うことは、特に次の時間体制、すなわち暗寿命ｔｄが３μｓ〜３２０μｓの範囲で有利である。カメラの積分時間は、好ましくはこの寿命より短い。したがって、可能な極値は、ｔｈ＝０．１ｔｄ、ｔｄ＝３μｓ、ＰＢ＝３．３μｓおよびｆＢ＝約３００ｋＨｚである。別の極致では、ｔｈはｔｄ＝３００μｓにほぼ等しく、ＰＢ＝６００μｓおよびｆＢ＝１．６ｋＨｚである。
【図１】
2017151416.tif 000003
【図２】
2017151416.tif 000004
【図３】
2017151416.tif 000005
【図４】
2017151416.tif 000006
【図５】
2017151416.tif 000007
【図６】
2017151416.tif 000008
【図７】
2017151416.tif 000009
【図８】
2017151416.tif 000010
【図９】
2017151416.tif 000011
【図１０】
2017151416.tif 000012
【外国語明細書】
2017151416.tif 000013
2017151416.tif 000014
2017151416.tif 000015
2017151416.tif 000016
2017151416.tif 000017
2017151416.tif 000018
2017151416.tif 000019
2017151416.tif 000020
2017151416.tif 000021
2017151416.tif 000022
2017151416.tif 000023
2017151416.tif 000024
2017151416.tif 000025
2017151416.tif 000026
2017151416.tif 000027
2017151416.tif 000028
2017151416.tif 000029
2017151416.tif 000030
2017151416.tif 000031
2017151416.tif 000032
2017151416.tif 000033
2017151416.tif 000034
2017151416.tif 000035
2017151416.tif 000036
2017151416.tif 000037
2017151416.tif 000038
2017151416.tif 000039