(57)【要約】【課題】  本来微生物発現系では不溶性・不活性型でしか発現しないタンパク質を菌体内および／または培地中に直接、可溶性かつ活性型で発現させる方法を提供すること。【解決の手段】  目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を水素酸化細菌に導入して得られる水素酸化細菌、および前記水素酸化細菌を培養し前記目的タンパク質遺伝子および前記輸送タンパク質遺伝子とを共発現させることで、本来微生物では不溶性・不活性型でしか発現できないタンパク質を菌体内および／または培地中に可溶性かつ活性型で発現させる方法により、前記課題を解決する。【選択図】  図１
2017212959.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入した水素酸化細菌であって、前記タンパク質が可溶性かつ活性型で発現することを特徴とする水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【請求項２】
前記輸送タンパク質が、配列番号１１または１９に記載の配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【請求項３】
前記輸送タンパク質遺伝子が配列番号１０または１８に記載の配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【請求項４】
前記目的タンパク質がＴＧＦ−β３である、請求項１から３のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【請求項５】
目的タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【請求項６】
前記水素酸化細菌がＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌である、請求項１から５のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本来微生物では不溶性・不活性型としてしか発現できないような目的タンパク質の発現において、目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を導入することで前記タンパク質を直接可溶性かつ活性型で菌体内および／または培養液中に発現可能な水素酸化細菌、およびそれを用いた前記タンパク質の発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは多様な機能を持つ増殖因子であり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーと呼ばれる構造が類似した一群の増殖因子の一つである（非特許文献１）。これらの増殖因子は細胞の増殖、分化、細胞外マトリクスの形成などに関与する。ＴＧＦ−βにはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３等と呼ばれる複数の類縁体が知られている。これらのアミノ酸配列のホモロジーは６５％以上であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では類似した生理活性を示すことが報告されている（非特許文献２）。一方で、造血幹細胞への阻害、内皮細胞の増殖、脊椎動物胚における中胚葉の形成などに対する効果には相違があることが知られており（非特許文献１）、生体内ではそれぞれ別の役割をもっているものと考えられている。
【０００３】
ＴＧＦ−βはいずれもアミノ酸残基数３９０〜４１２の２本ポリペプチド鎖よりなる前駆体として生合成され、限定的タンパク質分解を受けてＣ末端側のアミノ酸残基数１１２のポリペプチド２本よりなる成熟体となる（特許文献１）。前駆体のＮ末端付近にはシグナルペプチドを有しており、生合成の際の細胞外への分泌に関与する。続くプロ領域は分子種毎に長さが異なっており、タンパク質のフォールディングや２量体の形成、因子の活性調整に関与する。プロ領域には細胞結合アミノ酸配列モチーフであるＲＧＤ配列が存在し、またＣ末端側には限定的タンパク質分解のサイトとなる共通アミノ酸配列モチーフＲＸＸＲが存在する。成熟体は７つのシステイン残基を有し、そのうち６つがポリペプチド内でのＳＳ結合を形成し、残りの１つはポリペプチド間でのＳＳ結合を形成して２量体の安定化に関与する。（非特許文献３）。上記の構造はＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質全てに共通した構造である。
【０００４】
ＴＧＦ−βは細胞や組織のタイプ、他の増殖因子の有無に依存して、細胞の有糸分裂や増殖・成長を促進・阻害し、脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成、免疫細胞機能の調節、走化性の刺激、分化の誘導や阻害の活性を示す。また、炎症の発生後に顆粒組織の形成に関与し、フィブロネクチンやコラーゲン、各種プロテアーゼインヒビター等の細胞外マトリクス遺伝子の発現を促進するなどの多様な生理活性を示す（特許文献１）。そのためＴＧＦ−βは医薬品や再生医療における細胞調製用試薬として注目されており、安価に提供するための大腸菌による製造法の検討が多数行われている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献４）。しかしこれらの方法ではいずれの場合も成熟体領域は菌体内に不溶性かつ不活性型のインクルージョンボディとして生成するのみであり、可溶性かつ活性型のＴＧＦ−βを得るためにはリフォールディング操作が必要であった。ＴＧＦ−βのリフォールディング操作は、時間が掛かる、回収率が低い、リフォールディング効率が悪く不完全であるといった問題点があり、菌体を培養するだけで直接可溶性かつ活性型のＴＧＦ−βが得られるような菌体内での可溶性での発現方法、より望ましくは培地中への分泌発現方法が求められていた。
【０００５】
インクルージョンボディになりやすいタンパク質の発現において、大腸菌以外に有効と考えられる宿主のひとつとしては、水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが知られている。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは従属栄養条件下の高密度培養ではＰＨＢを含む菌体収量が２８１ｇ／Ｌにまで達することが確認されており（非特許文献５）、古くから化成品などの発現における微生物宿主として注目されてきた。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは、このＰＨＢの発現・分解サイクルを繰り返すことで高密度培養時でも有機酸を蓄積することなく大腸菌以上に高密度培養が可能であり、こうした代謝系の特徴から菌体内の酸化還元バランスが活性型タンパク質の製造においても有望であると考えられてきた。実際、大腸菌発現ではインクルージョンボディになり易く、高密度培養による大量調製が難しいタンパク質のひとつである有機リン分解酵素を、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを宿主とし、無機塩とグルコースのみの原料から大量発現した例が報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
さらに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａはゲノム中の膜タンパク質・分泌タンパク質の種類・数が大腸菌よりも豊富であることから、タンパク質の培地中への分泌発現においても有効な宿主であると考えられている。分泌発現は細胞内発現に比べ、目的タンパク質の検出・精製が容易であり、細胞由来成分であるエンドトキシンの汚染がないため目的タンパク質の純度が高いことが知られている。また、細胞内タンパク質分解酵素による分解、非特異的ジスルフィド結合の形成、封入体の形成を防ぐことが出来るためタンパク質自体の活性が高いというメリットがある。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを宿主とし、タンパク質の培地中への分泌発現を行った事例としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのゲノムより目的タンパク質の分泌発現に有効な輸送タンパク質遺伝子をスクリーニングし、Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子と共発現することで、ヒトＦｃ受容体等のＦｃ結合性タンパク質を培養液中に分泌発現した例が知られている（特許文献２，３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４３５４９８０号
【特許文献２】特開２０１５−１７１３４０
【特許文献３】特願２０１５−０６６４２０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｎら、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．１１，１６９−１７８
【非特許文献２】Ｇｒａｙｃａｒら、１９８９年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．３，１９７７−１９８６
【非特許文献３】Ｂｏｔｔｎｅｒら、２０００年、Ｊ．Ｎｅｒｒｏｃｈｅｍ．７５，２２２７−２２３９
【非特許文献４】Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎ．Ｐｒｏｇ．２５，１３８７−１３９５
【非特許文献５】Ｒｙｕら、１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  ５５，２８−３２
【非特許文献６】Ｓｒｉｒａｍ  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８，５９２５−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａに代表されるＲａｌｓｔｏｎｉａ属の細菌はもともと温泉や土壌など様々な環境に生息している微生物であり、独立栄養条件で増殖できるなど、その環境適応性から物質の取り込みに関わる機能が発達していることが示唆されてきた。実際、芳香族化合物の取り込みや分解を行うＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４、重金属アンチポーターによる重金属排出能を持つＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４、多数の細胞外毒素を放出する機構を持つＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、細胞外ＰＨＢデポリメラーゼを持つＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉなどの様々な種が存在し、細胞膜上の物質輸送に関するタンパク質が多様性に富んでいることが明らかとなっている。また、ゲノム情報解析の結果では、ゲノム中のタンパク質遺伝子のうち１２％が物質の輸送に関わるものであり、大腸菌の９％と比べ多く、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ属の細菌における膜輸送タンパク質の多様性を裏付ける結果となっている。
【００１０】
このように大腸菌など既存の組換え微生物よりも膜輸送タンパク質が豊富であることから、膜輸送タンパク質をキャリアとして利用し、目的タンパク質の分泌発現を行う為の宿主として、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属の水素酸化細菌は有望であると考えられる。これまで、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属の水素酸化細菌のゲノムからスクリーニングされた、目的タンパク質の分泌発現に有効な輸送タンパク質遺伝子としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子やＨ１６＿Ａ０９８３遺伝子、Ｈ１６＿Ｂ０２７１のＮ末端領域遺伝子が挙げられる。これらの輸送タンパク質遺伝子を目的タンパク質の細胞外への発現に利用した事例としては、これら輸送タンパク質遺伝子とヒトＦｃ受容体等のＦｃ結合性タンパク質遺伝子の融合遺伝子を水素酸化細菌へと導入し共発現することで、Ｆｃ結合性タンパク質を培養液中に分泌発現した例が報告されている。しかしながら、Ｆｃ結合性タンパク質は元々大腸菌発現系においても可溶性発現が可能なタンパク質であり、精製工程の手間やコストといった問題を除けば、菌体ペレットからのタンパク質抽出、および精製工程を経ることで、Ｆｃ結合性を維持した活性体を得ることは既存の発現系でも比較的容易であった。
【００１１】
一方、ＴＧＦ−βスーパーファミリーと呼ばれる構造が類似した一群の増殖因子の一つであるＴＧＦ−β３は、動物細胞を用いた発現が殆どであったが、近年再生医療技術などの発展に伴い、安価な微生物発現系での大量発現が望まれていた。これまでに報告されている大腸菌による発現系ではＴＧＦ−β３は不溶性かつ不活性型（または活性が著しく低い）のインクルージョンボディとしてのみ発現が確認されており、活性体を得るためには、菌体からのインクルージョンボディ調製、リフォールディング、精製操作が必要であった。このうち特にリフォールディング操作については、時間が掛かる、回収率が低い、リフォールディング効率が悪く不完全であるといった問題があり、これらの煩雑な工程を経た最終的な可溶性・活性型タンパク質の収量は極めて低いものであった。然るにこれまでの所、微生物発現系による、ＴＧＦ−β３の可溶性かつ活性型での菌体内または培地中への直接発現例は全く報告されておらず、ＴＧＦ−β３の市場価格高騰の原因にもなっていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明の目的は、微生物宿主で菌体内に可溶性発現、もしくは培地中に直接分泌発現が困難であるような目的タンパク質遺伝子の発現において、前記目的タンパク質を可溶性かつ活性型で菌体外または菌体内に発現可能な水素酸化細菌、および前記水素酸化細菌を用いた可溶性かつ活性型目的タンパク質の発現方法を提供することにある。本発明では水素細菌ゲノムより選抜された目的タンパク質の分泌発現に有効な輸送タンパク質遺伝子と、目的タンパク質遺伝子とを水素細菌を宿主として共発現することで、インクルージョンボディ調製およびリフォールディング操作が不要な、可溶性かつ活性型の目的タンパク質の直接発現が可能となる。
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、目的タンパク質遺伝子を導入した水素酸化細菌において、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子またはＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子を輸送タンパク質遺伝子として導入し、前記水素酸化細菌を宿主とし、前記目的タンパク質遺伝子と前記輸送タンパク質遺伝子とを共発現させることで、ＴＧＦ−β３のように不溶性かつ不活性型としてしか微生物発現が確認されていないようなタンパク質であっても、可溶性かつ活性型タンパク質として菌体内および／または培地中へ直接発現することができ、リフォールディング操作が不要な可溶性・活性型タンパク質発現方法を構築できることを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は以下の態様を包含する。
［１］目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入した水素酸化細菌であって、前記タンパク質が可溶性かつ活性型で発現することを特徴とする水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
［２］前記輸送タンパク質が、配列番号１１または１９に記載の配列からなるポリペプチドであることを特徴とする［１］に記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
［３］前記輸送タンパク質遺伝子が配列番号１０または１８に記載の配列からなるポリヌクレオチドである、［１］に記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
［４］前記目的タンパク質がＴＧＦ−β３である、［１］から［３］のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
［５］目的タンパク質がＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質である、［１］から［３］のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
［６］前記水素酸化細菌がＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌である、［１］から「５］のいずれかに記載の水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において、宿主として用いる水素酸化細菌は特に限定はないものの、独立栄養条件下で増殖でき、かつ物質の取り込みに関わる機能が発達しているＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌が好ましく、その中でもＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは多様な環境適応性を持ち、かつ物質輸送に関わるタンパク質の機能や数が豊富である点で、特に好ましい水素酸化細菌といえる。
【００１７】
本発明は、水素酸化細菌を宿主として目的タンパク質を発現させる際に、目的タンパク質遺伝子に加えて輸送タンパク質遺伝子も水素酸化細菌に導入することを特徴としている。輸送タンパク質は、水素酸化細菌が有する分泌性タンパク質または膜タンパク質の中から、目的タンパク質との共発現により当該目的タンパク質を培養液中に放出する機能を持つタンパク質を適宜選択すればよいが、親水性の高いタンパク質や分子量４０ｋＤａ以下のタンパク質を選択すると好ましい。なお輸送タンパク質の全長が４０ｋＤａ以上の場合は、親水性の高い領域のみを利用し４０ｋＤａ以下の輸送タンパク質として発現させればよい。  
輸送タンパク質の一例としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株  染色体１由来のＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子、染色体１由来のＨ１６＿Ａ０９８３遺伝子のＮ末端領域、染色体２由来のＨ１６＿Ｂ０２７１のＮ末端領域があげられる。
【００１８】
水素酸化細菌に導入する輸送タンパク質遺伝子は、前記輸送タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製後適当な方法で連結して得てもよいし、前記輸送タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換後人工的に合成して得てもよい。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。輸送タンパク質遺伝子の一例としては、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる輸送タンパク質（Ｈ１６＿Ａ２８２０）をコードするポリヌクレオチドである配列番号１０に記載の配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなる輸送タンパク質（Ｈ１６＿Ｂ０２７１のＮ末端側領域）をコードするポリヌクレオチドである配列番号１８に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００１９】
本発明において目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を導入する際、ペリプラズム中または外膜中に存在する宿主由来のプロテアーゼにより自動的に切断される適当な切断リンカーを介して連結し、目的タンパク質と輸送タンパク質との融合タンパク質として共発現させると好ましい。このようにすることで、発現した目的タンパク質と輸送タンパク質の融合タンパク質がペリプラズムに輸送された後プロテアーゼにより切断されることで、他の特別な処理を行なうことなく自動的に培養液中に分泌されるからである。
【００２０】
ここで用いる切断リンカーは、宿主由来のプロテアーゼで切断されるものであれば特に限定はなく、例えば大腸菌のｐｅｌＢやＰａｕｃｉｍｏｎａｓ  ｌｅｍｏｉｇｎｅｉの細胞外ＰＨＢ分解酵素のシグナル配列であるｐｒｅＰｈａＺ１が例示できる。また本発明において目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を導入する際、（目的タンパク質遺伝子−（好ましくは切断リンカー）−輸送タンパク質遺伝子）の融合タンパク遺伝子の上流にファジンプロモーターを導入するとさらに好ましい。ファジンプロモーターはＰＨＢ（ポリヒドロキシ酪酸）顆粒の表面を覆うタンパク質であるファジン発現のプロモーターであり、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａの中で強力なプロモーターとして知られている。またファジンプロモーターは、培養液中の窒素源やリン源の枯渇により活性化するため、大腸菌発現系などで用いられるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）などの高価な誘導剤の添加なしにタンパク質の高発現が可能となる。
【００２１】
本発明の水素酸化細菌を作製する際、目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子の水素酸化細菌への導入方法としては、主に広域宿主ベクターを用いた発現方法と自殺ベクターを用いたゲノム組換え法がある。水素酸化細菌としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いた場合、広域宿主ベクターとしてはｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１が、自殺ベクターとしてはｐＪＱ２００ｍｐ１８、ｐＮＨＧ１、ｐＬＯ１が、それぞれ例示できる。なお広域宿主ベクターと自殺ベクターを併用して遺伝子導入を行なってもよい。
【００２２】
本発明の水素酸化細菌を用いて可溶性かつ活性型で発現可能な目的タンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモンなどのヒト由来タンパク質、およびそれらの受容体タンパク質があげられる。なお本発明の水素酸化細菌を用いて可溶性かつ活性型で発現させる目的タンパク質は、完全体であってもよいし、目的タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるポリペプチドであってもよいし、さらに目的タンパク質を構成するアミノ酸の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。以降、本発明の水素酸化細菌を用いて可溶性かつ活性型で発現可能な目的タンパク質のうち、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質であるスーパーファミリーのタンパク質であるＴＧＦ−β３について詳細に説明する。
【００２３】
ＴＧＦβはいずれもアミノ酸残基数３９０〜４１２の２本ポリペプチド鎖よりなる前駆体として生合成され、限定的タンパク質分解を受けてＣ末端側のアミノ酸残基数１１２のポリペプチド２本よりなる成熟体となる（特許文献１）。前駆体のＮ末端付近にはシグナルペプチドを有しており、生合成の際の細胞外への分泌に関与する。続くプロ領域は分子種毎に長さが異なっており、タンパク質のフォールディングや２量体の形成、因子の活性調整に関与する。プロ領域には細胞結合アミノ酸配列モチーフであるＲＧＤ配列が存在し、またＣ末端側には限定的タンパク質分解のサイトとなる共通アミノ酸配列モチーフＲＸＸＲが存在する。成熟体は７つのシステイン残基を有し、そのうち６つがポリペプチド内でのＳＳ結合を形成し、残りの１つはポリペプチド間でのＳＳ結合を形成して２量体の安定化に関与する。（非特許文献３）。上記の構造はＴＧＦβスーパーファミリーに属するタンパク質全てに共通した構造である。
【００２４】
ＴＧＦ−β３は生体内で通常は、プロ領域と成熟体領域間のペプチド結合切断されているものの、両者が非共有結合的に結合したラテント複合体（Ｌａｔｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）として存在する。この複合体はＮ末端付近のシステイン残基で別のタンパク質であるラテントＴＧＦ結合タンパク（Ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＴＢＰ）のシステイン残基にＳＳ結合で結合し、これを介して細胞外マトリクス内に局在する。このラテント複合体のＲＧＤモチーフに、細胞が表層のインテグリンを介して結合すると、ラテント複合体に力学的な刺激が加えられて変形し、成熟体が複合体から遊離して活性発現することが知られている。
【００２５】
本明細書においてＴＧＦ−β３タンパク質は、ヒトＴＧＦ−β３の成熟領域（具体的には天然型ヒトＴＧＦ−β３の場合、配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしも活性発現に必要なこの最小限の領域のみだけでなくともよく、前述のプロ領域におけるタンパク質分解のサイトとなる共通アミノ酸配列モチーフＲＸＸＲやＲＧＤ配列を含んでいても良く、細胞増殖・分化効果などの報告されているＴＧＦ−β３の機能を発揮するものであれば特に限定されない。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の水素酸化細菌を宿主としたタンパク質発現方法は、目的タンパク質遺伝子および輸送効率に優れた輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ａ２８２０またはＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子を導入し、前記目的タンパク質と前記輸送タンパク質とを共発現させることで、これまで困難であった、微生物発現では不溶化・不活性化し易いような目的タンパク質の、菌体内または培地中への可溶性・活性型での直接発現を可能とする。
（２）本発明の水素酸化細菌を宿主としたタンパク質発現方法は、従来のタンパク質発現方法よりもタンパク質製造のコストを抑えることができる。ＴＧＦ−β３のようにこれまで不溶性・不活性型としてしか微生物発現が確認されていないような種類のタンパク質の発現については、インクルージョンボディ調製やリフォールディングといった煩雑で時間の掛かる工程を経て可溶性・活性型タンパク質の回収を行う必要があり、精製プロセスを含めたコストの増大、タンパク質回収率の低下の要因となっていた。一方本発明では、目的タンパク質遺伝子および輸送効率に優れた輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ａ２８２０またはＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子を導入し、前記目的タンパク質と前記輸送タンパク質とを共発現させることで、目的タンパク質の菌体内または培地中への直接の可溶性・活性型での発現が可能となり、インクルージョンボディ調製やリフォールディングといった手間を省き、菌体からのタンパク質抽出・精製のみまたは培地中からのタンパク質精製のみで、可溶性・活性型での目的タンパク質の回収が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】タンパク質の分泌に有効な輸送タンパク質遺伝子とＴＧＦ−β３成熟領域遺伝子の融合タンパク質遺伝子を導入した水素酸化細菌による、試験管培養におけるＴＧＦ−β３の発現性を評価・比較した結果を示す図である。黒はＴＧＦ−β３の培養液中への発現量、白は菌体タンパク質抽出物中への発現量である。
【実施例】
【００２８】
以下、タンパク質としてＴＧＦ−β３を、水素酸化細菌としてＲａｌｓｔｏｎｉａ属の菌を、それぞれ用いたときの実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００２９】
実施例１
（ａ）タグ配列とコドン最適化ＴＧＦ−β３遺伝子の融合遺伝子のｐＴｒｃベクターへのクローニング
培養基材への固定化用のタグであるシステインタグまたはシスタグ、および発現タンパク質精製用タグであるヒスタグ、およびＴＧＦ−β３成熟領域をコードする遺伝子を連結した融合タンパク遺伝子のｐＴｒｃベクターへのクローニングを行った。
【００３０】
（ａ−１）シグマジェノシス２本鎖ＤＮＡ合成サービスにより、システインタグとヒスタグ配列を含む配列番号１の２本鎖ＤＮＡ，およびシスチンタグとヒスタグ配列を含む配列番号２の２本鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と配列番号２の塩基番号７―１２は制限酵素ＮｃｏＩ切断配列、塩基番号１５―２０は制限酵素ＣｌａＩ切断配列、塩基番号２１―４４はそれぞれシステインタグ（配列番号１）またはシスチンタグ（配列番号２）をコードする配列、塩基番号４５―５０は制限酵素ＳｐｅＩ切断配列、塩基番号５１―６８はヒスチジンタグをコードする配列、塩基番号６９―７４は制限酵素ＮｈｅＩ切断配列、塩基番号１０９―１１４は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列である。
【００３１】
（ａ−２）タカラバイオ社人工遺伝子合成サービスにて配列番号３に示す塩基配列をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９  （Ｓｉｍｐｌｅ）  に導入したものを作製した。塩基配列３はヒト型ＴＧＦ−β３遺伝子のシグナル配列、プロ領域、成熟領域のタンパク質（アミノ酸配列を配列番号４に示す。）をコードする遺伝子を水素細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６にコドン最適化した配列（配列番号５）の、４番目から６番目、６０１番目から６０３番目、９６４番目から９６６番目の塩基配列をＴＣＧからＡＧＣに、８０４番目の塩基をＧからＣに変更した配列を含むものである。
【００３２】
（ａ−３）配列番号１と２の２本鎖ＤＮＡ、および配列番号６に示すｐＴｒｃベクター由来のプラスミド（配列番号６中塩基番号２６６−３３１は改変型ＰｅｌＢシグナルをコードする塩基配列、塩基番号３３２−１１８３は改変型Ｆｃ結合タンパク質をコードする塩基配列）をそれぞれＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロース電気泳動により、それぞれ約０．１ｋｂｐ、約０．１ｋｂｐ、約４．２ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲル抽出キットにより精製した。
【００３３】
（ａ−４）配列番号１の２本鎖ＤＮＡのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片、および配列番号２の２本鎖ＤＮＡのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片をそれぞれ、配列番号６に示すプラスミドＤＮＡのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片と１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行ない、得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
【００３４】
（ａ−５）形質転換後の溶液を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ平板培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、バクトアガロース１５ｇ／Ｌ）に撒き、形質転換体コロニーを得た。
【００３５】
（ａ−６）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、配列番号１中のシステインタグ配列とヒスタグ配列が挿入されたプラスミドであるｐＴｒｃ−ｔａｇ１、および配列番号２中のシスチンタグ配列とヒスタグ配列が挿入されたプラスミドであるｐＴｒｃ−ｔａｇ２のプラスミドを選定した。ｐＴｒｃ−ｔａｇ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２はそれぞれ、配列番号６に示すプラスミドのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイト間（塩基配列中の配列番号３３６−１１８１）が配列番号１の塩基配列中の配列番号１３−１０８、配列番号２の塩基配列中の配列番号１３−１０８で置換されたものである。
【００３６】
（ａ−７）配列番号３に示す塩基配列をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９  （Ｓｉｍｐｌｅ）へと導入したプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲ反応によりＴＧＦ−遺伝子の成熟領域アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド領域含むＤＮＡ領域を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ（東洋紡績社製）を用い、プライマーは配列番号７（５’末端側より１番目から６番目までの配列はＮｈｅＩサイトの配列）に示すフォワードプライマーと配列番号８（５’末端側より１番目から６番目までの配列はＮｈｅＩサイトの配列）に示すフォワードプライマー、配列番号９（５’末端側より１番目から６番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列、７番目から１２番目までの配列はＥｃｏＲＩサイトの配列）に示すリバースプライマーを用い、温度条件は９４℃で２分、その後（９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１分）のサイクルを４０回、最後に６８℃で７分で増幅反応を行った。このようにして、配列番号７と配列番号９に示すプライマーの組み合わせ、および配列番号８と配列番号９に示すプライマーの組み合わせで増幅したＰＣＲ産物であるＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２をそれぞれ得た。ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２はそれぞれ、配列番号３中の配列番号７６１−１２７０、配列番号８６８−１２７０を含む増幅産物である。
【００３７】
（ａ−８）得られたＰＣＲ増幅産物ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでそれぞれ約０．５ｋｂｐ、約０．４ｋｂｐのポリヌクレオチド断片を精製した。
【００３８】
（ａ−９）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。形質転換操作後の溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布し、形質転換体コロニーを得た。
【００３９】
（ａ−１０）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−１、ｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−２を得た。ｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−１、ｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−２はそれぞれＰＣＲ増幅産物ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
【００４０】
（ａ−１１）ｐＴｒｃ−ｔａｇ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２、ｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−１、ｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−２をそれぞれＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロース電気泳動により、それぞれ約４．３ｋｂｐ、約４．３ｋｂｐ、約０．５ｋｂｐ、約０．４ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲル抽出キットにより精製した。
【００４１】
（ａ−１２）ｐＴｒｃ−ｔａｇ１のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物とｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−１のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物とｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−２のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物とｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−１のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物とｐＵＣ１１８−ＴＧＦ−２のＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物をそれぞれの組み合わせで１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。形質転換操作後の溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布し、形質転換体コロニーを得た。
【００４２】
（ａ−１３）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、プラスミドｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２を得た。ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１はｐＴｒｃ−ｔａｇ１プラスミドのＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイト間が配列番号３中の配列番号７６１−１２７０で置換されたもの、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２はｐＴｒｃ−ｔａｇ１プラスミドのＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイト間が配列番号３の配列番号８６８−１２７０で置換されたもの、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１はｐＴｒｃ−ｔａｇ２プラスミドのＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイト間が配列番号３中の配列番号７６１−１２７０で置換されたもの、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２はｐＴｒｃ−ｔａｇ２プラスミドのＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイト間が配列番号３の塩基配列中の配列番号８６８−１２７０で置換されたものである。このようにしてシステインタグまたはシスタグをコードする遺伝子とヒスチジンタグをコードする遺伝子、およびＴＧＦ−β３成熟領域を含むタンパク質領域をコードする遺伝子が連結された融合遺伝子を挿入したｐＴｒｃベクターを得た。
【００４３】
（ｂ）ファジンプロモーター遺伝子、および（輸送タンパク質遺伝子−切断リンカー遺伝子−ＴＧＦ−β３成熟領域遺伝子）の融合遺伝子、ターミネーター遺伝子を導入した水素細菌発現用広域宿主ベクターの作製。
【００４４】
特許文献２に記載の、Ｆｃ結合性タンパク質分泌発現用ベクターにおけるＦｃ結合性タンパク質をコードする遺伝子を、（ａ）で作製したタグ配列とＴＧＦ−β３成熟領域遺伝子の融合タンパクをコードする遺伝子で置換することで、ＴＧＦ−β３分泌ベクターを作製した。
【００４５】
（ｂ−１）Ｆｃ結合性タンパク質分泌発現用ベクターであるＡ２８２０−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロース電気泳動により、それぞれ約６．１ｋｂｐ、約６．４ｋｂｐ、約６．３ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲル抽出キットにより精製した。
下記（ｂ−１−１）から（ｂ−１−３）にそれぞれのプラスミドの詳細な説明を示す。
【００４６】
（ｂ−１−１）Ａ２８２０−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２
Ａ２８２０−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２の塩基配列を配列番号１０に示す。塩基番号１８２９−１８３４は制限酵素ＡｐａＩ切断配列、塩基番号１８３５−２２７２はファジンプロモーター遺伝子配列、塩基番号２２７３−２２７８は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列、塩基番号２２７９−２６０２は輸送タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号１１、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。）、塩基番号２６０３−２６０８は制限酵素ＳｐｅＩ切断配列、塩基番号２６０９−２７１６は切断リンカー遺伝子（遺伝子配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。）、塩基番号２７１７−２７２２は制限酵素ＣｌａＩ切断配列、塩基番号２７２３−３５５９はＦｃＲ結合性タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。）、塩基番号３５６０−３５６５は制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列、塩基番号３５６６−３６７６はターミネーター遺伝子、塩基番号３６７７−３６８２は制限酵素ＸｂａＩ切断配列である。          
（ｂ−１−２）
Ａ０９８３Ｎ−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２の塩基配列を配列番号１７に示す。塩基番号１８２９−１８３４は制限酵素ＡｐａＩ切断配列、塩基番号１８３５−２２７２はファジンプロモーター遺伝子配列、塩基番号２２７３−２２７８は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列、塩基番号２２７９−２８８７は輸送タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号１８、アミノ酸配列を配列番号１９に示す。）、塩基番号２８８８−２８９３は制限酵素ＳｐｅＩ切断配列、塩基番号２８９４−３００１は切断リンカー遺伝子（遺伝子配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。）、塩基番号３００２−３００７は制限酵素ＣｌａＩ切断配列、塩基番号３００８−３８４４はＦｃＲ結合性タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。）、塩基番号３８４５−３８５０は制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列、塩基番号３８５１−３９６１はターミネーター遺伝子、塩基番号３９６２−３９６７は制限酵素ＸｂａＩ切断配列である。
【００４７】
（ｂ−１−３）
Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２の塩基配列を配列番号２０に示す。塩基番号１８２９−１８３４は制限酵素ＡｐａＩ切断配列、塩基番号１８３５−２２７２はファジンプロモーター遺伝子配列、塩基番号２２７３−２２７８は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断配列、塩基番号２２７９−２７９１は輸送タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号２１、アミノ酸配列を配列番号２２に示す。）、塩基番号２７９２−２９９７は制限酵素ＳｐｅＩ切断配列、塩基番号２７９８−２９０５は切断リンカー遺伝子（遺伝子配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。）、塩基番号２９０６−２９１１は制限酵素ＣｌａＩ切断配列、塩基番号２９１２−３７４８はＦｃＲ結合性タンパク質遺伝子（遺伝子配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。）、塩基番号３７４９−３７５４は制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列、塩基番号３７５５−３８６５はターミネーター遺伝子、塩基番号３８６６−３８７１は制限酵素ＸｂａＩ切断配列である。
【００４８】
（ｂ−２）（ａ−１３）で得られたプラスミドである、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２をそれぞれＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロース電気泳動により、それぞれ約０．６ｂｐ、約０．５ｋｂｐ、約０．６ｋｂｐ、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲル抽出キットにより精製した。
【００４９】
（ｂ−３）（ｂ−１）で得られたＡ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物をそれぞれ、（ｂ−２）で得られたｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物と１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。形質転換操作後の溶液を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布し、形質転換体コロニーを得た。
【００５０】
（ｂ−４）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、プラスミドＡ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。
【００５１】
Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ２８２０−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ２８２０−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ２８２０−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ２８２０−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたものである。
【００５２】
（ｂ−５）（ｂ−１）で得られたＡ０９８３Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物をそれぞれ、（ｂ−２）で得られたｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物と１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。形質転換操作後の溶液を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布し、形質転換体コロニーを得た。
【００５３】
（ｂ−６）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、プラスミドＡ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。
【００５４】
Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ０９８３Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ０９８３Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ０９８３Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＡ０９８３Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたものである。
【００５５】
（ｂ−７）（ｂ−１）で得られたＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物をそれぞれ、（ｂ−２）で得られたｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１、ｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ消化物と１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。形質転換操作後の溶液を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布し、形質転換体コロニーを得た。
【００５６】
（ｂ−８）複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認し、プラスミドＢ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。
【００５７】
Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたもの、  Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２はＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイト間がｐＴｒｃ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２のプラスミドのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素消化断片配列で置換されたものである。
【００５８】
実施例２  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ形質転換体の作製
以下の方法により、実施例１（ｂ−４）で作製したＡ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、実施例１（ｂ−６）で作製したＡ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、実施例１（ｂ−８）で作製したＢ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、およびネガティブコントロールとして、市販のｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドで、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株とＰＨＢ＿４株を形質転換した。
【００５９】
（２−１）プラスミドＡ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２で、接合性大腸菌Ｓ１７−１を形質転換した。
【００６０】
（２−２）形質転換後の溶液を、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含むＬＢ平板培養液に撒き、大腸菌Ｓ１７−１株形質転換株を得た。
【００６１】
（２−３）それぞれの大腸菌Ｓ１７−１株形質転換体を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）培養液中、３０℃で一晩培養を行なった。
【００６２】
（２−４）市販のＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）またはａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）をそれぞれ抗生物質を含まないＬＢ（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）培養液中、３０℃で一晩培養を行なった。
【００６３】
（２−５）（３）で得た大腸菌培養物１ｍｌと（４）で得たＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ培養物１ｍｌとをそれぞれの組み合わせで混合し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上澄み液を廃棄し、混合菌体ペレットを１００μｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ製、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ８ｇ／Ｌ）に懸濁し、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈプレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ８ｇ／Ｌ、バクトアガロース１５ｇ／Ｌ）に撒き３０℃で一晩培養した。また、コントロールとして、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株またはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株について、それぞれ２ｍｌの菌体を遠心して得られる菌体ペレットを、１００μｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ製、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ８ｇ／Ｌ）に懸濁し、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈプレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ８ｇ／Ｌ、バクトアガロース１５ｇ／Ｌ）に撒き３０℃で一晩培養した。
【００６４】
（２−６）プレート表面の菌体を５ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培養液に懸濁させ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培養液で１／１０００に希釈した後、カナマイシン６００μｇ／ｍＬを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈプレートに１００μｌ塗布し、３０℃で２日から３日培養した。コントロールである、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株またはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株のみを培養したプレートからはコロニーは０から数個しか出現しなかった。一方、大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体とＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株またはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４の混合菌体を塗布したプレートからは、それぞれ数十〜数百個のコロニーが得られた。
【００６５】
（２‐７）得られた接合菌体の各クローンを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンの分析により、目的のプラスミドが伝達されたことを確認した。
【００６６】
以上の方法で、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株に接合伝達した株であるＡ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、および、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＡ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ２８２０−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、およびＡ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株に接合伝達した株であるＡ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、および、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＡ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、およびＢ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１���株に接合伝達した株であるＢ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、および、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をそれぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＢ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株を得た。
【００６７】
実施例３  試験管培養におけるＴＧＦ−β３の発現量評価
実施例（２‐７）に記載した水素細菌形質転換株を培養し、菌体のタンパク質抽出物及び培養上清中に発現したＴＧＦ−β３を下記の方法によりＥＬＩＳＡ法にて定量した。
【００６８】
（３−１）実施例２で作製した水素細菌形質転換株のうち、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株を、それぞれカナマイシン３００μｇ／ｍＬを含む３ｍｌの２×ＹＴ（バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）培養液を用いて試験管で前培養した（３０℃、１８０ｒｐｍ、一晩）。
【００６９】
（３−２）（１）の前培養液をそれぞれカナマイシン３００μｇ／ｍＬを含む試験管２本の３ｍｌの２×ＹＴへ１５０μＬ植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで６時間培養を行なった。その後、グルコン酸ナトリウムを終濃度４％（ｗ／ｖ）となるように添加し、２０℃、１８０ｒｐｍで１６時間培養を行なった。
【００７０】
（３−３）菌体を１ｍＬずつマイクロチューブに採取し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで培養上清と菌体ペレットを分離し、培養上清を別のマイクロチューブに保存した。上清を除いた菌体ペレットは、タンパク抽出試薬１ｍＬ（リゾチーム０．２ｍｇ／ｍＬ、エチレンジアミン四酢酸２ｍＭ、フッ化フェニルメチルスルホニル２ｍＭ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  １２５Ｕ／ｍＬを含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）タンパク質抽出試薬）を加えることで菌体内のタンパク質を抽出した。菌体タンパク質抽出液は１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで抽出残渣を沈降させ、タンパク質抽出物の可溶性画分である上澄み液を別のマイクロチューブに保存した。
【００７１】
（３−４）保存した培養上清とタンパク質抽出物中のＴＧＦ−β３発現量をＴＧＦ−β３，  Ｈｕｍａｎ，  ＤｕｏＳｅｔ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステム社製）によるＥＬＩＳＡ法で測定した。測定方法はキット添付の標準プロトコルに従い、以下の方法で行った。
【００７２】
（３−４−１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＴＧＦ捕捉抗体として２．０  ｇ／ｍＬ  のｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β３（ＴＢＳ緩衝液：１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））による希釈物）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で１８時間静置することにより固定した。
【００７３】
（３−４−２）０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ緩衝液でプレートを洗浄後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液を３００μＬずつ添加し、室温で１時間以上静置することでブロッキング操作を施した。
【００７４】
（３−４−３）０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ緩衝液でプレートを洗浄後、培養上清または菌体抽出物の原液を各ウェルに１００μＬ添加し、固定化したｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−３と室温で２時間反応させた。また同様に、キットに添付のＴＧＦ−β３標準資料の希釈系列（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液による希釈物）についても、各ウェルに１００μＬを添加し、固定化したｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−３と室温で２時間反応させた。
【００７５】
（３−４−４）反応終了後、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ緩衝液でプレートを洗浄し、１次抗体として１００  ｎｇ／ｍＬ  のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−３（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液による希釈物）を各ウェルに１００μＬ添加して室温で２時間反応させた。
【００７６】
（３−４−５）反応終了後、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ緩衝液でプレートを洗浄し、２次抗体としてｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液による希釈物）を各ウェルに１００μＬ添加して室温で２０分間反応させた。
（３−４−６）反応終了後、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ緩衝液でプレートを洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し室温で３０分間発色反応させた。
（３−４−７）発色後、１Ｍリン酸水溶液を各ウェルに１００μＬ添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７７】
（３−５）
ＴＧＦ−β３標準資料の希釈系列をアプライしたウェルの４５０ｎｍの吸光度より検量線を作製し、上清と菌体タンパク抽出物をアプライしたウェルの４５０ｎｍの吸光度より各サンプル中のＴＧＦ−β３濃度を算出した。
結果を図１に示す。ネガティブコントロール（ＴＧＦ−β３成熟領域遺伝子を導入しない株）である、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株は上清と菌体タンパク抽出物のいずれにもＴＧＦ−β３を発現しなかった。また、ＴＧＦ−β３成熟領域遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を水素酸化細菌に導入した菌株の内、Ａ０９８３Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ１−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株は培養上清とタンパク質抽出物中のＴＧＦ−β３発現量が合計で０．０２μｇ／Ｌ以下であった。一方、Ａ２８２０−ｔａｇ１−ＴＧＦ１‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ｔａｇ２−ＴＧＦ２‐ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株は培養上清とタンパク質抽出物中両者にそれぞれ０．１μｇ／Ｌの良好な発現を示した。
【００７８】
このことから、高性能な輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子またはＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子をＴＧＦ−β３遺伝子と共に水素酸化細菌に導入し両者を共発現することで、本来微生物発現系では不溶性・不活性型でしか発現しないＴＧＦ−β３を、タンパク質を菌体内および／または培地中に直接、可溶性かつ活性型で発現可能であることがわかる。
【図１】
2017212959.tif 000003
【配列表】
2017212959000001.app