(57)【要約】【課題】  ヒトの体から採取した初代培養肝細胞は、プレートに播種して使用すると、時間経過とともに薬物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の活性が著しく低下するという問題が知られていた。【解決手段】  肝細胞培養用培地にＧＳＫ３シグナルインヒビターまたはＤＹＲＫ（dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase）インヒビターのいずれか、または両方を含めることにより、従来の培地よりも長期にわたりヒト初代培養肝細胞のＣＹＰ活性を維持しうる培地組成物を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞培養用培地組成物であって、
１）ＧＳＫ３シグナルインヒビター、および
２）ＤＹＲＫインヒビター
から成る群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地組成物。
【請求項２】
前記ＧＳＫ３シグナルインヒビターが、
（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；
（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；
（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン；
ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体；
４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；
２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール；
２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン；
アルファ−４−ジブロモアセトフェノン；
Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア；
３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；
Ｌ８０３ペプチドまたはそのミリストイル化物；
２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；
６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；
９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および
３−［１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン
から成る群より選択される少なくとも１つの阻害剤である、請求項１記載の培地組成物。
【請求項３】
前記ＤＹＲＫインヒビターが、
１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール；
Ｎ−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン；
（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；
（１Ｚ）−１−（５−アセチルオキシ３エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；
Ｎ−［２−クロロ−５−［［［（３−クロロフェニル）メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−７，８−ジヒドロ−２−メトキシ−７−オキソピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド；および
（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン
から成る群より選択される少なくとも１つの阻害剤である、請求項１または２記載の培地組成物。
【請求項４】
Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１、コレラ毒素、上皮成長因子、アデニン塩酸塩、インスリン、ヒドロコルチゾン、Ｙ−２７６３２、およびＡ８３−０１から成る群より選択される１以上の成分をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の培地組成物。
【請求項５】
６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルおよび／または１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オールを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の培地組成物。
【請求項６】
９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オンおよび／または（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムをさらに含む、請求項５記載の培地組成物。
【請求項７】
Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１およびＷｎｔ３ａをさらに含む、請求項５または６記載の培地組成物。
【請求項８】
培養される肝細胞が、初代培養肝細胞、肝前駆細胞、肝幹細胞、不死化した肝細胞、またはｉＰＳ細胞由来の肝細胞から選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の培地組成物。
【請求項９】
培養される肝細胞の薬物代謝機能を実質的に維持できることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の培地組成物。
【請求項１０】
肝細胞の薬物代謝機能の評価方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載の培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；および
ｂ）肝細胞の薬物代謝機能の指標を測定する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
薬物代謝機能の指標が、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る 群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
薬物代謝機能の指標が、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性である、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
薬物代謝機能の指標が、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性である、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
薬物が肝細胞機能に与える影響を評価する方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載の培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；
ｂ）肝細胞と薬物とを接触させる工程；および
ｃ）薬物が肝細胞機能に与える影響の指標を測定する工程
を含み、
薬物が肝細胞機能に与える影響の指標が、
ｉ）ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性；
ｉｉ）ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性；または
ｉｉｉ）ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性
を測定することにより得られる、方法。
【請求項１５】
薬物が肝細胞機能に与える影響が、肝細胞毒性である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
肝細胞培養用培地組成物の調製に使用するためのサプリメントであって、
ａ）Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１、ＥＧＦ、アデニン塩酸塩、インスリン、ヒドロコルチゾン、Ｙ−２７６３２、およびＡ８３−０１から成る群より選択される１つまたは複数の成分；
ｂ）（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン；Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；Ｌ８０３ペプチドまたはそのミリストイル化物；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン；３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および３−［１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンから成る群より選択される１つまたは複数のＧＳＫ３インヒビター；ならびに
ｃ）１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール；Ｎ−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン；（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；（１Ｚ）−１−（５−アセチルオキシ３エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；Ｎ−［２−クロロ−５−［［［（３−クロロフェニル）メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−７，８−ジヒドロ−２−メトキシ−７−オキソピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド；および（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノンから成る群より選択される１つまたは複数のＤＹＲＫインヒビター
を含む、サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞培養用の培地組成物とその使用に関する。より具体的には、培養される肝細胞の薬物代謝能が実質的に維持される培地組成物とその使用に関し、さらに具体的には、ヒト初代培養肝細胞におけるＣＹＰ活性が維持される培地組成物とその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は毒物の代謝に非常に重要な役目を担っており、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）や欧州医薬品庁（ＥＭＡ）では、新規薬物の評価における初代培養肝細胞を用いた薬物（毒物）代謝試験が定められている（非特許文献１）。しかしながら、ヒトの体から採取した初代培養肝細胞は、プレートに播種して使用すると、時間経過とともに薬物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０（単にＰ４５０あるいはＣＹＰとも言う）の活性が著しく低下することが問題とされている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Wilke et al., Nat Rev Drug Discov. 2007 Nov; 6(11): 904-916.
【非特許文献２】Ulvestad et al., Biochem Pharmacol. 2013;86:691-702.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、ヒトの体から採取した初代培養肝細胞は、プレートに播種して使用すると、時間経過とともに薬物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の活性が著しく低下するという問題が知られていた。そこで、本発明は、ヒト初代培養肝細胞において従来の培地よりも長期にわたりＣＹＰ活性が維持される培地組成物を提供することを目的の一つとする。さらに、そのような規培地組成物を用いて培養した細胞を用いた薬物代謝試験方法を提供することも目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、肝細胞培養用培地にＧＳＫ３シグナルインヒビターまたはＤＹＲＫ（dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase）インヒビターのいずれか、または両方を含めることにより、従来の培地よりも長期にわたりヒト初代培養肝細胞のＣＹＰ活性を維持しうることを見出した。本発明は、このような知見を基礎とするものであり、具体的には、以下の事項に関する。
【０００６】
［１］肝細胞培養用培地組成物であって、（１）ＧＳＫ３シグナルインヒビター、および（２）ＤＹＲＫインヒビターから成る群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地組成物。
［２］前記ＧＳＫ３シグナルインヒビターが、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン；Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；Ｌ８０３ペプチドまたはそのミリストイル化物；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン；３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および３−［１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンから成る群より選択される少なくとも１つの阻害剤である、［１］記載の培地組成物。
［３］前記ＤＹＲＫインヒビターが、１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール；Ｎ−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン；（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；（１Ｚ）−１−（５−アセチルオキシ３エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；Ｎ−［２−クロロ−５−［［［（３−クロロフェニル）メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−７，８−ジヒドロ−２−メトキシ−７−オキソピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド；および（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノンから成る群より選択される少なくとも１つの阻害剤である、［１］または［２］記載の培地組成物。
［４］Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１、コレラ毒素、上皮成長因子、アデニン塩酸塩、インスリン、ヒドロコルチゾン、Ｙ−２７６３２、およびＡ８３−０１から成る群より選択される１以上の成分をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか一項記載の培地組成物。
［５］６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルおよび／または１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オールを含む、［１］〜［４］のいずれか一項記載の培地組成物。
［６］９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オンおよび／または（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムをさらに含む、［５］記載の培地組成物。
［７］Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１およびＷｎｔ３ａをさらに含む、［５］または［６］記載の培地組成物。
［８］培養される肝細胞が、初代培養肝細胞、肝前駆細胞、肝幹細胞、不死化した肝細胞、またはｉＰＳ細胞由来の肝細胞から選択される、［１］〜［７］のいずれか一項記載の培地組成物。
［９］培養される肝細胞の薬物代謝機能を実質的に維持できることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか一項記載の培地組成物。
［１０］肝細胞の薬物代謝機能の評価方法であって、（ａ）［１］〜［９］のいずれか一項記載の培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；および（ｂ）肝細胞の薬物代謝機能の指標を測定する工程を含む、方法。
［１１］薬物代謝機能の指標が、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性である、［１０］記載の方法。
［１２］薬物代謝機能の指標が、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性である、［１０］または［１１］記載の方法。
［１３］薬物代謝機能の指標が、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性である、［１０］〜［１２］のいずれか一項記載の方法。
［１４］薬物が肝細胞機能に与える影響を評価する方法であって、（ａ）［１］〜［９］のいずれか一項記載の培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；（ｂ）肝細胞と薬物とを接触させる工程；および（ｃ）薬物が肝細胞機能に与える影響の指標を測定する工程を含み、薬物が肝細胞機能に与える影響の指標が、（ｉ）ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性；（ｉｉ）ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性；または（ｉｉｉ）ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性を測定することにより得られる、方法。
［１５］薬物が肝細胞機能に与える影響が、肝細胞毒性である、［１４］記載の方法。
［１６］肝細胞培養用培地組成物の調製に使用するためのサプリメントであって、（ａ）Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１、ＥＧＦ、アデニン塩酸塩、インスリン、ヒドロコルチゾン、Ｙ−２７６３２、およびＡ８３−０１から成る群より選択される１つまたは複数の成分；（ｂ）（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン；Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；Ｌ８０３ペプチドまたはそのミリストイル化物；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン；３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および３−［１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンから成る群より選択される１つまたは複数のＧＳＫ３インヒビター；ならびに（ｃ）１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール；Ｎ−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン；（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；（１Ｚ）−１−（５−アセチルオキシ３エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；Ｎ−［２−クロロ−５−［［［（３−クロロフェニル）メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−７，８−ジヒドロ−２−メトキシ−７−オキソピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド；および（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノンから成る群より選択される１つまたは複数のＤＹＲＫインヒビターを含む、サプリメント。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】さまざまな組成の培地組成物を用いて培養した初代培養肝細胞におけるＣＹＰ活性の測定結果を示す図面である。Ｍ３６培地の活性を１とした場合の相対値が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に組み込まれていると解釈すべきである。
【０００９】
培地組成物の調製
本発明の一つの態様に係る肝細胞培養用培地組成物は、通常は基本培地にサプリメントとウシ胎児血清（ＦＢＳ）とを加えることにより調製される。基本培地の例示的な組成（最終濃度）を表１に示す。また、サプリメントの例示的な組成（最終濃度）を表２に示す。ＦＢＳは通常は１〜２０％の最終濃度、好ましくは５〜１５％、例えば１０％の最終濃度となるように加える。なお、基本培地とサプリメントとの区別は便宜上のものであって、必然的なものではないことが当業者には理解される。すなわち、以下の表において基本培地成分に含まれている成分をサプリメントの成分としても良いし、逆に、以下の表においてサプリメント成分に含まれている成分を基本培地の成分としても良い。
【００１０】
【表１】
2017104057.tif 000003
【００１１】
【表２】
2017104057.tif 000004
【００１２】
基本培地
本発明に係る肝細胞培養培地組成物の調製に使用される基本培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ham's F12培地、Ham's F12培地などを使用することができるが、これらに限定はされない。基本培地として、ＤＭＥＭ／Ham's F12培地、Ham's F12培地などを混合して使用してもよい。ＤＭＥＭ／Ham's F12培地とHam's F12培地は、例えば１：１の体積比で混合して使用することができる。ＤＭＥＭ／Ham's F12培地、Ham's F12培地といった基本培地の組成は、当業者にとり公知であり、市販されている培地も利用可能である。本発明に係る肝細胞培養培地組成物の調製に使用される基本培地はさらに、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）などのタンパク質、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤、Ａ８３−０１などのＡＬＫ５阻害剤、アデニン−ＨＣｌ、インスリン、および／またはヒドロコルチゾンなどの成分を含んでいてもよい。なお、基本培地、サプリメントといった区別は便宜的なものであり、必ずしも培地中の各成分をこれらのいずれかに区分して調製しなければならないわけではない。
【００１３】
サプリメント
本発明に係る肝細胞培養培地組成物の調製に使用されるサプリメントには、基本培地に含まれていない培地成分の全部または一部が含まれている。サプリメントの成分としては、例えば、１または複数種のＧＳＫ３インヒビター、１または複数種のＤＹＲＫインヒビターなどが含まれる。このようなサプリメントを基本培地に加えることで、簡便に所望の培地の調製を行うことができる。なお、基本培地、サプリメントといった区別は便宜的なものであり、必ずしも培地中の各成分をこれらのいずれかに区分して調製しなければならないわけではない。
【００１４】
ＧＳＫ３インヒビター
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活化する酵素として見出された、プロリン指向性セリン／スレオニンリン酸化酵素のひとつである。ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、つまりＧＳＫ３インヒビターとしては、例えば、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン；Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン；３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；Ｌ８０３ペプチドまたはそのミリストイル化物；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン；６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン；３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および３−［１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンなどが知られており、本発明に係る培地組成物において使用可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る培地組成物において、ＧＳＫ３インヒビターは２種以上を組み合わせて使用してもよい。培地組成物中におけるＧＳＫ３インヒビターの濃度は、例えば、０．００１〜３０μＭ、好ましくは２５ｎＭ〜３μＭとすることができるが、使用する物質の性質に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。
【００１５】
ＤＹＲＫインヒビター
ＤＹＲＫ（Dual-specificity tYrosine-phosphorylation Regulated protein Kinase）は、互いに類似したキナーゼドメインを持つ複数のメンバーからなり、ヒトではＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、ＤＹＲＫ２、ＤＹＲＫ３、ＤＹＲＫ４の５つのキナーゼを含む。ＤＹＲＫの活性を阻害する物質、つまりＤＹＲＫインヒビターとしては、例えば、１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール；Ｎ−（２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン；（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；（１Ｚ）−１−（５−アセチルオキシ３エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノン；Ｎ−［２−クロロ−５−［［［（３−クロロフェニル）メチル］アミノ］カルボニル］フェニル］−７，８−ジヒドロ−２−メトキシ−７−オキソピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド；および（１Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−プロパノンなどが知られており、本発明に係る培地組成物において使用可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る培地組成物において、ＤＹＲＫインヒビターは２種以上を組み合わせて使用してもよい。培地組成物中におけるＤＹＲＫインヒビターの濃度は、例えば、０．００１〜８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬとすることができるが、使用する物質の性質に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。
【００１６】
サプリメント中に含まれうるその他の成分
本発明に係る肝細胞培養培地組成物を調製する際に利用されるサプリメント中には、上皮成長因子（ＥＧＦ）などのタンパク質、アデニン塩酸塩、インスリン、ヒドロコルチゾン、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤、および／またはＡ８３−０１などのＡＬＫ５阻害剤などが含まれていてもよい。サプリメント中に含まれうる他の成分としては、他にＷｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１、コレラ毒素などもあるが、これらに限定されない。特に、肝細胞の薬物代謝機能を維持する上では、Ｗｎｔ３ａタンパク質とＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質を培地組成物に含めることが好ましい。培地組成物中におけるこれらの成分の濃度は、使用する物質の性質に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。なお、上述のように、基本培地、サプリメントといった区別は便宜的なものであり、培地中の各成分をこれらのいずれかに区分して調製しなければならないわけではない。サプリメント中に含まれるタンパク質が由来する生物種は、特に限定されるものではないが、ヒト由来のタンパク質を用いるのが好ましい。
【００１７】
培地組成物中に含まれうるその他の成分
本発明に係る肝細胞培養培地組成物には、上記のように、通常はウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれている。ＦＢＳは通常は１〜２０％の最終濃度、好ましくは５〜１５％、例えば１０％の最終濃度となるように加える。ＦＢＳに代えて代替血清等の他の成分を用いてもよい。また、本発明に係る肝細胞培養培地組成物には、他の細胞の培養に使用された馴化培地が含まれていてもよい。
【００１８】
肝細胞培養用培地組成物
本発明に係る肝細胞培養培地組成物は、上述のように、ＧＳＫ３シグナルインヒビター、ＤＹＲＫインヒビター、Ｗｎｔ３ａタンパク質、およびＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質から成る群より選択される少なくとも１つの成分を含むことができるが、各成分を組み合わせて使用する場合、その具体的な態様としては、例えば、（１）Ｗｎｔ３ａタンパク質とＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質とを含む培地組成物、（２）ＧＳＫ３シグナルインヒビターとＤＹＲＫインヒビターとを含む培地組成物、（３）Ｗｎｔ３ａタンパク質とＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質、ＧＳＫ３シグナルインヒビターとを含む培地組成物、（４）Ｗｎｔ３ａタンパク質とＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質、ＤＹＲＫインヒビターとを含む培地組成物、（５）Ｗｎｔ３ａタンパク質とＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質、ＧＳＫ３シグナルインヒビター、ＤＹＲＫインヒビターを含む培地組成物など挙げることができる。ここで、ＧＳＫ３シグナルインヒビター、ＤＹＲＫインヒビターはそれぞれ、１種または複数の種類のインヒビターの組み合わせのいずれを用いてもよい。
【００１９】
細胞の培養
細胞の培養は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。肝細胞の培養は、例えば、本発明に係る肝細胞培養培地中に懸濁した細胞をコラーゲンコートプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養することにより行うことができる。
【００２０】
薬物代謝機能の評価
本発明の一つの態様は、肝細胞の薬物代謝機能の評価方法に関する。このような評価方法は、例えば、（ａ）本発明に係る肝細胞培養培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；および（ｂ）肝細胞の薬物代謝機能の指標を測定する工程を含むことができる。
【００２１】
ここで、薬物代謝機能の指標は、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性でありうる。ＣＹＰ活性の測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。ＣＹＰ活性の測定に利用可能なキット製品も市販されており、例えば、Promega社のP450-Glo(TM) CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAなどを購入して利用することができる。
【００２２】
あるいは、薬物代謝機能の指標は、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性でもよい。または、薬物代謝機能の指標は、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性でもよい。これらの活性の測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。
【００２３】
薬物が肝細胞機能に与える影響の評価方法
本発明の一つの態様は、薬物が肝細胞機能に与える影響を評価する方法に関する。このような方法は、例えば、（ａ）本発明に係る肝細胞培養培地組成物を用いて肝細胞を培養する工程；（ｂ）肝細胞と薬物とを接触させる工程；および（ｃ）薬物が肝細胞機能に与える影響の指標を測定する工程を含むことができ、ここで、薬物が肝細胞機能に与える影響の指標は、（ｉ）ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、およびＣＹＰ２Ｅ１から成る群より選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の活性；（ｉｉ）ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ、およびカテコールＯ−メチルトランスフェラーゼから成る群より選択される少なくとも１つの酵素の活性；または（ｉｉｉ）ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１（Ｐ−ｇｐ）、ＭＲＰ２、ＢＣＲＰ１、ＭＡＴＥ１、およびＢＳＥＰから成る群より選択される少なくとも１つの多剤耐性関連タンパク質の活性を測定することにより得ることができる。これらの活性の測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。薬物が肝細胞機能に与える影響は、例えば、肝細胞毒性である。
【００２４】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：培地組成物の調製
各種組成を有する培地組成物を以下のようにして調製した。Ｍ３６培地は、ＤＭＥＭ／Ham's F-12培地（ナカライテスクより購入）とHam's F-12培地（ナカライテスクより購入）をそれぞれ２５０ｍＬずつ混合し、その混合液にｈＥＧＦ（ライフテクノロジーズ、Ｒ＆Ｄシステムズより購入）を５μｇ、アデニン−ＨＣｌ（和光純薬より購入）を１２ｍｇ、インスリン（和光純薬）を２．５ｍｇ、ヒドロコルチゾン（シグマより購入）を２００μｇ加え、Ｙ−２７６３２（和光純薬、Ｓｔｅｍｇｅｎｔより購入）が１０μＭ，Ａ８３−０１（Stemgentより購入）が０．５ｍＭとなるように追加し、さらにＦＢＳ（シグマ、和光純薬）を２５ｍＬ加えた。
【００２６】
ＦＹＲＷＡ培地は、Ｍ３６培地５００ｍＬに対して、ＤＭＥＭと１０％ＦＢＳを用いて培養したＬ−Ｗｎｔ３Ａ細胞のコンディションドメディウムを２５ｍＬと、コレラ毒素（シグマより購入）４．２μｇを加えたものである。
【００２７】
Ｍ２培地は、Ｍ３６培地５００ｍＬに対して、ＤＭＥＭと１０％ＦＢＳを用いて培養したＬ−Ｗｎｔ３Ａ細胞のコンディションドメディウムを２５ｍＬを加えたものである。
【００２８】
Ｍ１０培地は、Ｍ３６培地５００ｍＬに対して、ヒトＷｎｔ−３ａ（Ｒ＆Ｄシステムズより購入）５０μｇとヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ＆Ｄシステムズより購入）５００μｇを加え、よく混合したものである。
【００２９】
Ｍ３培地は、Ｍ１０培地に６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル（Stemgentより購入）３μＭ、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン（和光純薬より購入）５００μＭ、１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール（株式会社ナードに合成依頼）３３５ｎＭ、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（Stemgentより購入）２μＭを追加したものである。
【００３０】
Ｍ１１培地は、Ｍ３培地からＷｎｔ−３ａとＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を除いた組成を有する培地である。
【００３１】
Ｍ９培地は、Ｍ３培地からＷｎｔ−３ａを除いた組成を有する培地である。
【００３２】
Ｍ８培地は、Ｍ３培地からＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を除いた組成を有する培地である。
【００３３】
Ｍ７培地は、Ｍ３培地から６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルを除いた組成を有する培地である。
【００３４】
Ｍ６培地は、Ｍ３培地から１−（４−メトキシフェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オールを除いた組成を有する培地である。
【００３５】
Ｍ５培地は、Ｍ３培地から（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムを除いた組成を有する培地である。
【００３６】
Ｍ４培地は、Ｍ３培地から９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オンを除いた組成を有する培地である。
【００３７】
実施例２：細胞の培養とＣＹＰ活性の評価
実施例１で調製した培養培地を用いて、解凍した初代培養肝細胞を０．５〜０．７×１０６細胞／ｍＬの懸濁液にし、１００μＬずつコラーゲンコートされた９６ウェルプレートに播種した。播種の４時間後に培養培地による培地交換を行った。以降、播種後２４、４８、７２時間の時点で培地交換を行った。
【００３８】
９６時間後、P450-Glo(TM) CYP450 Assay System（プロメガ社より購入）のP450-Glo CYP3A4/Luciferin-IPA luminogenic CYP substrateを５０μＬ加え、３７℃で６０分間、ＣＯ２インキュベーター中に静置した。細胞をインキュベーターから取り出し、上清２５μＬを測定用のプレートに移し、Luciferin Detection Reagentを２５μＬ加えて室温で２０分間インキュベートした。２０分後、発光をパーキンエルマー社製プレートリーダーで読み取った（０．２５〜１秒／ウェル）。
【００３９】
ＣＹＰ３Ａ４による蛍光を各サンプルについて比較した結果を図１に示す。図１では、最も含有成分の少ないＭ３６培地を基準とし、グラフ内に破線を示している。棒グラフ横の数値は、Ｍ３６培地の値を１とした時の相対値を示している。
【００４０】
Ｍ３６培地に対しＣＹＰ３Ａ４の活性が特に高い培地としてＭ７培地とＭ５培地があげられる。これらに共通する点として、Ｗｎｔ３ａとＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１を含有している点があげられる。
【００４１】
実施例３：三次元培養と薬物代謝機能の評価
Alvetex(R) Scaffold（Reinnervateより購入）のメンブレン部分をコラーゲンコートでコーティングし、半日程度コーティングを行ってから、コラーゲン溶液を抜き取り、各種培養培地をメンブレン上に培地が見えるまで入れる。コーティングしたAlvetex(R) Scaffoldに解凍した肝細胞を０．５〜０．７×１０６細胞／ｍＬの懸濁液にして５００μＬずつ播種する。播種後４時間で培地を交換する。播種後２４時間は、培養用培地で培地交換を行い、４８、７２時間では培養用培地にリファンピシン（シグマより購入）１０μＭを加えたもので培地交換を行う。
【００４２】
播種から９６時間後に、RNeasy Mini kit（キアゲンより購入）を用いて細胞からＲＮＡを単離する。まず、メンブレンに付着している細胞にRNeasy Mini kit付属のRLT Bufferを３５０μＬずつメンブレンに加え、５分待ったあと、メンブレン部分を新しいプレートに移し、遠心してライセートを回収する。溶解液をプレートから回収し、等量の７０％エタノール（和光純薬から購入したエタノールを超純水で調整したもの）を加え、ピペットでよく混和する。
【００４３】
前述のサンプルをRNeasyスピンカラムに全量アプライし、10000rpmで１５秒間遠心した後、ろ液を捨てる。７００μＬのBuffer RW1をコレクションカラムのついたスピンカラムに添加し10000rpmで１５秒間遠心した後、ろ液を捨てる。５００μＬのBuffer RPEをコレクションカラムのついたスピンカラムに添加し、10000rpm、１５秒間遠心した後、ろ液を捨てる。再度５００μＬのBuffer RPEをコレクションカラムのついたスピンカラムに添加し、10000rpmで２分間遠心した後、ろ液を捨て、スピンカラムに新しいコレクションカラムを取り付け、最高速度で１分間遠心を行う。スピンカラムにサンプル回収用のコレクションカラムを取り付け、RNA Free waterを３０μＬ加えたのち、10000rpmで１分間遠心する。
【００４４】
上記で得られたＲＮＡの濃度を吸光度計で測定し、５００ｎｇ量を計算する。QuantiTect Reverse Transcription Kit（キアゲンより購入）の試薬を氷上で融解した後、０．２ｍＬチューブに５００ｎｇ量のＲＮＡ、２μＬのgDNA Wipeout Buffer，RNA Free Waterを加え、液量が１４μＬになるように調整する。
【００４５】
サーマルサイクラーを用いて４２℃で２分間インキュベートし、すぐに氷上に置き、Quantiscript Reverse Transcriptaseを１μＬ，Quantiscript RT Bufferを４μＬ，RT primer Mixを１μＬサンプルに加えてよく混ぜる。サンプルをサーマルサイクラーで４２℃で３０分間インキュベートし、Quantiscript Reverse Transcriptaseを不活化するために９５℃で３分間インキュベートする。
【００４６】
Rotor-Gene Q（キアゲンより購入）専用の４連チューブ１ウェルに、TaqMan(R) Universal PCR Master Mixを１２．５μＬ，発現を調べたいプライマーのForward、Reverseをそれぞれ１μＬ，テンプレートｃＤＮＡを２５ｎｇ、RNA Free waterを混合し、全量２５μＬの反応液を作る。１サンプルにつき３ウェル分を作成し、Rotor-Gene Qにセットし、ＰＣＲ初期活性化を９５℃、変性を９５℃、アニーリングを６０℃に設定し、変性とアニーリングのセットを４５サイクル行うプログラムを設定し、測定を行う。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
ヒトの体から採取した初代培養肝細胞は、プレートに播種して使用すると、時間経過とともに薬物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の活性が著しく低下するという問題が知られていたが、本明細書において示した培地組成物は、ヒト初代培養肝細胞において、従来の培地よりも長期にわたりＣＹＰ活性を維持しうるものであり、培養肝細胞を用いた薬物代謝試験等において好適に使用されうる。 
【図１】
2017104057.tif 000005