(57)【要約】      （修正有）【課題】病虫害や奇形等で等級外となるために廃棄される果実を、酵素加水分解反応によって液化ならびにアルコール発酵を同一反応系で行い、低環境負荷で低エネルギーかつ廃棄物の有効利用が可能なバイオアルコール生産技術の提供。【解決手段】収穫後選別により等級外とされて発生するあるいは樹上において食害等で放置されて発生する廃棄果実１の液化をアーミング酵母２により行う液化工程と、前記液化工程で得られた果汁に含まれる糖を発酵するアルコール発酵工程とを同一反応槽３で同えるバイオアルコールの生産技術。ペクチンを加水分解する酵素ペクチナーゼをアルコール発酵能を有するサッカロマイセス・セレビシエに属する酵素に細胞表層に提示する様に形質転換したアーミング細胞を用いることが好ましいバイオアルコールの生産技術。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
廃棄果実を菌体による液化を行う液化工程と、前記液化工程で得られた果汁に含まれる糖を発酵するアルコール発酵工程とを備え、前記廃棄果実は収穫後選別により等級外とされて発生するあるいは樹上において食害等で放置されて発生する廃棄果実であり、前記菌体はアーミング酵母であることを特徴とするアルコール製造方法。
【請求項２】
前記液化工程と前記アルコール発酵工程が、アルコール発酵性が良好なアーミング酵母を用いて同一反応槽において同時に実施されることを特徴とする請求項１記載のアルコール製造方法。
【請求項３】
前記アーミング酵母がペクチンを加水分解する酵素であるペクチナーゼを細胞表層に提示するように形質転換されたアーミング酵母であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれか１項記載のアルコール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は廃棄果実を原料とするアルコール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖やデンプン等を原料とするアルコール製造では、トウモロコシやサトウキビ等から製造することから、将来的に食糧問題と競合するため、食糧作物に依存しないバイオアルコールの製造法の開発が求められている。このために、バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースを酵素などで分解し、次いで生成した糖を発酵させることによりアルコール生成するバイオアルコール製造方法が知られている。
【０００３】
セルロースおよびヘミセルロースを原料とするバイオアルコールの製造方法は、バイオマスに含まれるリグニンを破壊処理し、当該バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの構造分解処理する前処理工程と、この前処理工程にて構造分解処理を施したセルロースおよびヘミセルロースを酵素分解させる酵素分解工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を発酵させる発酵工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を含む溶液と、上記発酵工程にて生成したアルコールを含む溶液との熱交換を行う熱交換工程と、上記発酵工程にて生成したアルコールを含む溶液から発酵菌を分離する発酵菌分離工程を有することを特徴としている（特許文献１）。
【０００４】
また、セルロースを代謝可能なアーミング酵母としてトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のエンドグルカナーゼ遺伝子（ＥＧＩＩ）およびセロビオヒドロラーゼ遺伝子（ＣＢＨＩＩ）およびアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のベータグルコシダーゼ遺伝子（ＢＧＬ１）を細胞表層提示型で発現する酵母の構築についても知られている（特許文献２）。
【０００５】
一方、セルロースおよびヘミセルロースを原料とするバイオアルコールの製造方法の実用化は進んでおらず、容易に実施できる前処理工程が非効率であることと、セルロースを糖化する酵素であるセルラーゼの性能が低いことなどによる。
【０００６】
このため、食糧との競合がなく、効率的な発酵が可能なバイオマスが求められており、廃棄される農作物を有効活用が可能である。この中で廃棄農作物の中でも果実は糖類を含有するために有望なバイオマスである。また、病虫害や変形などにより等級外になる果実は廃棄されるために、この有効活用が望まれている。
【０００７】
果実を原料としたアルコール発酵自体は、古来より世界中で行われており、ワインなどのアルコール飲料として醸造されている。果実を原料とする場合、果汁を調製した後アルコール発酵を行う必要がある。果実により、例えばブドウなどでは搾汁工程で果汁を得ることができるが、柿などは酵素処理を行って果実を液化することで初めて果汁を得ることができる（非特許文献１）。いずれの場合においても、果汁を調製する工程とアルコール発酵を行う工程によりアルコールを得ており、果実を直接発酵することにより、アルコールを獲得している事例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１００７１３号公報
【特許文献２】特開２０１１−０３０５６３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】川西祐成，山中信介，松澤一幸，奈良県工業試験場研究報告No.13, 24-27(1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、病虫害や奇形等で等級外となるために廃棄される果実を、酵素加水分解反応によって液化ならびにアルコール発酵を同時に行い、低環境負荷で低エネルギーかつ廃棄物の有効利用が可能なバイオアルコール生産技術の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、廃棄果実を菌体による液化を行う液化工程と、前記液化工程で得られた果汁に含まれる糖を発酵するアルコール発酵工程とを備え、前記廃棄果実は収穫後選別により等級外とされて発生するあるいは樹上において食害等で放置されて発生する廃棄果実であり、前記菌体はアーミング酵母であることを特徴とするものである。
【００１２】
また、液化工程とアルコール発酵工程が、アルコール発酵性が良好なアーミング酵母を用いて同一反応槽において同時に実施されることを特徴とするものである。
【００１３】
また、アーミング酵母がペクチンを加水分解する酵素であるペクチナーゼを細胞表層に提示するように形質転換されたアーミング酵母であることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明では廃棄果実からのアルコールの製造を、廃棄果実の液化工程と、この液化工程で得られた果汁に含まれる糖をアルコール発酵する工程とを同一反応槽において同時に実施する。上記の反応を行うために、アルコール発酵能をもつサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母にペクチナーゼを細胞表層に提示するように形質転換されたアーミング酵母を作成した。
【００１５】
果実に上記アーミング酵母を加えることで、果実に含まれるペクチン質が分解されて液化すると同時に、液化した果実に含まれる糖分はアーミング酵母によりアルコール発酵されてアルコールを生産する。これにより液化工程とアルコール発酵が同一反応槽において同時に実施することが可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のアルコール製造方法は、廃棄果実をそのまま使用して糖化分解、発酵させるので、搾汁などの労力や、酸処理や熱エネルギーを必要とすることなく、温和な条件かつ省力的に液化および発酵することにより、廃棄される等級外の果実をバイオマス資源として有効利用が図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アーミング酵母を使用した廃棄果実の発酵工程図
【図２】ペクチナーゼを細胞表層提示型発現させるアーミング酵母を作成するプラスミドマップ図
【図３】クロコウジカビ由来エンド型ペクチナーゼ遺伝子（ｐｇａＡ、ｐｇａＢ、ｐｇａＩ）を細胞表層提示型発現させるアーミング酵母でのペクチナーゼ活性比較図
【図４】ｐｇａＢを細胞表層提示型発現させる実験室酵母と実用酵母のペクチナーゼ活性比較図
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、アーミング酵母を用いた方法で廃棄果実からアルコールを得ることを具現化する方法を図１から図４に基づいて示すが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
具体的構成の前にペクチナーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母を作成する工程について説明する。
果実を物理的な力によらず液化するためには、酵素によって果実に多く含まれているペクチンを加水分解することで液化することが知られている。そこで、ペクチンを分解する酵素であるペクチナーゼを酵母の細胞表層に提示して発現させることで、液化とエタノール発酵を同時に行うアーミング酵母の構築を行った。
【００２０】
酵母の表層にペクチナーゼを提示させることで、果実の軟化を進めて液化し、生じる果汁を直接発酵できる酵母を構築できる。そこで、アルコール発酵能が高い酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にエンド型ペクチナーゼを表層提示させる酵母の構築を行った。まず糸状菌のエンド型ペクチナーゼをＰＣＲ法で分子遺伝学的に単離した。単離したペクチナーゼ遺伝子はＰＣＲでの増幅時にベクターに組み込むための制限酵素の認識部位を予め付加する。
【００２１】
使用したベクタープラスミドは、ＧＰＩアンカーとしてα-アグルチニンを含むｐＧＫ４０６−ＡＧ（神戸大学より譲渡）を用いて、酵母の細胞の表層に酵素提示した。
【００２２】
ｐＧＫ４０６−ＡＧに単離したエンド型ペクチナーゼ遺伝子を挿入し、このプラスミドをＵＲＡ３遺伝子の内部のＥｃｏＲＶ認識部位で切断し、一本鎖にして、染色体に組み込んで酵母を形質転換した。形質転換した酵母は細胞表層のペクチナーゼで果実を液化し、生じた果汁に含まれる糖を資化する酵母である。図２にプラスミドマップを示す。上記のアーミング酵母は、特開２００８−１９３９３５の明細書の実施例１に記載されている方法により構築することができる。
【００２３】
次に、より具体的に黒麹カビ  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のエンド型ペクチナーゼを細胞表層提示型で発現させたアーミング酵母の作成の方法を示す。
【００２４】
黒麹カビ  アスペルギルス・ニガーＲＩＢ２０３６株のエンド型ペクチナーゼ遺伝子ｐｇａＡ（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｙ１８８０４）、ｐｇａＢ（ＩＮＳＤアクセッション番号ＫＭ２４４０４５）、ならびにｐｇａＩ（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５８８９２）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって分子遺伝学的に単離し、５’側にＥｃｏＲＩ、３’側にＳｐｈＩの認識配列を付加した。なお、本実施例１のＰＣＲはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて実施した。
【００２５】
ｐｇａＡ遺伝子を含む１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡフラグメントは、アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡを鋳型として、２つに分断されたエクソンをそれぞれＥｃｏＲＩ−ＰＧＡＡ−ｆｗ（配列番号１）およびｐｇａＡｅｘｏｎ１ｒｖ（配列番号２）；ｐｇａＡｅｘｏｎ２ｆｗ（配列番号３）およびＳｐｈＩ−ＰＧＡＡ−ｒｖ（配列番号４）のプライマー対を用いてＰＣＲによって調製した。
【００２６】
ｐｇａＢ遺伝子を含む１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡフラグメントは、アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡを鋳型として、３つに分断されたエクソンをそれぞれＥｃｏＲＩ−ＰＧＡＢ−ｆｗ（配列番号５）およびｐｇａＢｅｘｏｎ１ｒｖ（配列番号６）；ｐｇａＢｅｘｏｎ２ｆｗ（配列番号７）およびｐｇａＢｅｘｏｎ２ｒｖ（配列番号８）；ならびにｐｇａＢｅｘｏｎ３ｆｗ（配列番号９）およびＳｐｈＩ−ＰＧＡＢ−ｒｖ（配列番号１０）のプライマー対を用いてＰＣＲによって調製した。
【００２７】
ｐｇａＩ遺伝子を含む１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡフラグメントは、アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡを鋳型として、３つに分断されたエクソンをそれぞれＥｃｏＲＩ−ＰＧＡＩ−ｆｗ（配列番号１１）およびｐｇａＩｅｘｏｎ１ｒｖ（配列番号１２）；ｐｇａＩｅｘｏｎ２ｆｗ（配列番号１３）およびｐｇａＩｅｘｏｎ２ｒｖ（配列番号１４）；ならびにｐｇａＩｅｘｏｎ３ｆｗ（配列番号１５）およびＳｐｈＩ−ＰＧＡＩ−ｒｖ（配列番号１６）のプライマー対を用いてＰＣＲによって調製した。
【００２８】
ｐｇａＡ遺伝子、ｐｇａＢ遺伝子，ならびにｐｇａＩ遺伝子のＤＮＡフラグメントはそれぞれ、ｐＧＫ４０６−ＡＧのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩセクションに導入し、ｐＧＫ４０６−ｐｇａＡ−ＡＧ、ｐＧＫ４０６−ｐｇａＢ−ＡＧ、およびｐＧＫ４０６−ｐｇａＩ−ＡＧと命名した。なお、ペクチナーゼ遺伝子のＤＮＡ断片をｐＧＫ４０６−ＡＧに導入する際にＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を使用して実施した。
【００２９】
上記プラスミドｐＧＫ４０６−ｐｇａＡ−ＡＧ、ｐＧＫ４０６−ｐｇａＢ−ＡＧはＥｃｏＲＶで切断し、およびｐＧＫ４０６−ｐｇａＩ−ＡＧはＳｔｕＩで切断した後、実験室酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＹＰＨ４９９株を用いて酢酸リチウム法で形質転換した。得られた形質転換体はそれぞれ、ｐｇａＡ、ｐｇａＢ，ならびにｐｇａＩを細胞表層に提示している。
【００３０】
さらに前記ｐＧＫ４０６−ｐｇａＢ−ＡＧを、清酒酵母サッカロマイセス・セレビシエＫ７０１株にセルフクローニングでＵＲＡ３遺伝子に変異を導入したＫ７ＵＴ−１Ｔ株（Katsuhiko Kitamoto, Kaoko Oda, Katsuya Gomi, Kojito Takahashi;Agric. Biol. Chem.,55(11)pp.2979-2987, 1990）に細胞表層提示型で発現させた。
【００３１】
まず、図１に基づいて本実施例１の製造工程を説明する。
図中の１は原料となる廃棄果実を示し、２はペクチナーゼを細胞表層に提示したアーミング酵母を示す。これらを発酵槽３に同時に投入することにより、４に示す果実の液化・発酵工程を経て、５に示すアルコール発酵液を得る。
【００３２】
発酵に使用する廃棄果実として、病虫害や傷などにより商品価値が低下したために商品として利用されていない果実を利用する。アルコール発酵に用いる果実として糖度が多く含まれる果実が望ましく、Ｂｒｉｘ５％〜５０％の果実が好ましい。
【００３３】
果実の種類は、果汁を使用することから水分を多く含む必要があるため、５０〜９０％の水分を含む果実が好ましい。
【００３４】
前記の条件を満たすため、成熟した果実が肉厚で汁気の多い果肉に種子が包まれている液果である必要がある。また、液果でない場合は子房以外の花托などが肥大化した偽果に糖分が多く含まれる果実があり、イチゴ状果、ナシ状果、イチジク状果、ウリ状果、バラ状果、桑状果、ミカン状果など糖分が５％〜５０％含み、水分が５０〜９０％の偽果も使用できる。
【００３５】
前記の糖分を満たす果実であれば、果物に分類されるもの以外に野菜に含まれる果菜類も利用できる。
【００３６】
ワインなど果実酒の製造に見られるように、従来は果汁を得る工程とエタノール発酵を別の容器を用いて別々の工程で実施していたものが、本工程により、一反応槽で一工程にすることが可能となり、省力化が可能である。
【００３７】
また、ペクチナーゼが酵母の細胞表層に提示されていることから、機械的な搾汁では果汁を獲得しにくい果実からも容易に果汁を得ることができ、同時にエタノール発酵を行うことができる。
【００３８】
次に図２に基づいて廃棄果実の液化とエタノール発酵を同時に行う酵母の構築に用いベクタープラスミドについて説明する。
使用したｐＧＫ４０６−ＡＧ（神戸大学より譲渡）は、プロモーターとしては酵母のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ＰＧＫ１のプロモーター、ターミネーターとして酵母のα-アグルチニン遺伝子ＳＡＧ１のターミネーターを含む。また細胞外への移行シグナルとして酵母のαファクターのシグナル配列を含み、その３’末端側に外来遺伝子挿入のためのマルチクローニングサイトがある。
【００３９】
マルチクローニングサイトの３’末端側にはＧＰＩアンカーとしてα-アグルチニンの３’末端側の半分を含み、マルチクローニングサイトに挿入された外来遺伝子由来のタンパク質と融合タンパク質を形成させることができる。
【００４０】
この融合タンパク質は細胞表層に付着し、酵素などの外来タンパク質を酵母の細胞の表層に提示することができるため、単離したエンド型ペクチナーゼ遺伝子をｐＧＫ４０６−ＡＧに挿入したプラスミドを用いると酵母の細胞表層にエンド型ペクチナーゼを提示することが可能である。
【００４１】
このプラスミドを形質転換酵母の選抜マーカーであるＵＲＡ３遺伝子の内部のＥｃｏＲＶ認識部位で切断し、一本鎖にして、染色体に組み込んで形質転換した酵母は細胞表層のペクチナーゼで果実を液化し、同時に生じた果汁に含まれる糖を資化してエタノール発酵を可能となる。
【００４２】
次に図３に基づいてｐｇａＡ、ｐｇａＢ，ならびにｐｇａＩを細胞表層に提示している実験室酵母ＹＰＨ４９９株を用いたペクチナーゼのアイソザイムの活性の強さの比較について説明する。
【００４３】
ペクチナーゼ活性は次のように確認した。一晩液体培地で培養した菌体を集め、蒸留水で懸濁し、この懸濁液１ｍＬと１％ペクチン（ナカライテスク製）９ｍＬを混合し、５０℃で２時間反応させ、オストワルド粘度計（内径０．５ｍｍ）で粘度の低下を測定して分解比を求めて評価した（真部  孝明；フローチャートで見る食品分析の実際 ｐｐ１１５−１１６, 幸書房,２００３）。
【００４４】
作成したアーミング酵母からそれぞれ２菌株を用いて、酵母におけるペクチナーゼ活性を測定し、酵素活性の強さを比較した。その結果、供試したペクチナーゼは全て活性が認められ、酵母の細胞表面で機能することが明らかとなった。
【００４５】
また、ｐｇａＩの活性が最も弱く、ｐｇａＡとｐｇａＢの活性はほぼ同等であったが、ｐｇａＢが最も強い活性を持つ傾向があったため、効率よく果実を液化するためにはｐｇａＢを用いることが適当であることが示唆されるものである。
【００４６】
次に図４に基づいて実用酵母であるＫ７ＵＴ−１Ｔ株におけるｐｇａＢの活性の強さについて検討した結果を示す。
【００４７】
作成したアーミング酵母のペクチナーゼ酵素活性を測定すると、ｐｇａＢ遺伝子をＹＰＨ４９９株で発現させたものと、Ｋ７ＵＴ−１Ｔ株で発現させたものは、同等の活性の強さを示し、実用酵母において果実の液化とアルコール発酵を同時に実施可能な菌株が作成できた。
【００４８】
ペクチナーゼ活性を示すアーミング酵母を用いた果実の発酵は、川西らの方法（川西祐成、山中信介、松澤一幸；奈良県工業試験場研究報告ｖoｌ．１１，ｐｐ．１０−１３，１９８５）に従って行った。容器に投入可能な大きさにおおざっぱにカットした果実に、前培養したアーミング酵母を加え、ｐＨ調整として酒石酸などの有機酸と、防腐剤としてメタ亜硫酸カリウムを少量添加し、３０℃で、３日間発酵させた。
【００４９】
ｐｇａＢ遺伝子を表層提示したＹＰＨ４９９株およびＫ７ＵＴ−１Ｔ株を用いて、２００ｇの富有柿を原料として、３日間、３０℃で発酵を行った。１００ｍｇの酵素剤を用いて柿を軟化させてＫ７０１株で発酵させたものと、酵素剤を加えずにＫ７０１株で発酵させたものを対照とした。発酵液には、４０ｍｇのメタ亜硫酸カリウムと、６００ｍｇの酒石酸を加えた。酵母は、一晩培養した培養液を１２ｍＬの蒸留水で懸濁して全量加えた。
【００５０】
３日間の発酵後、遠心分離により発酵液を収集した。液量は酵母のみを加えた場合は、８７ｍＬ、酵素剤と酵母を加えた場合は１５７．４ｍＬであった。アーミング酵母を加えた場合は、ＹＰＨ４９９株では１０９．４ｍＬ、Ｋ７ＵＴ−１Ｔ株では１１５．８ｍＬであり、液化が進行していた。
【００５１】
発酵液のアルコールは、アーミング酵母（Ｋ７ＵＴ−１Ｔ株）では８．３５％であり、酵素剤と酵母（Ｋ７０１株）を加えたものは８．７％であり、ほぼ同程度であった。一方、アーミング酵母（ＹＰＨ４９９株）は軟化・液化が進行したものの、元の菌株のアルコール発酵能が低く、７．９％に留まり、酵母（Ｋ７０１株）のみ加えた場合は、アルコールが８．２％あったものの、液量が最も少なかった。富有柿果実を材料としたアーミング酵母による発酵試験結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
以上の通り、所定の糖分を満たすものであれば、果物に分類されるもの以外に野菜に含まれる果菜類も利用できる。
【００５４】
また、本工程により、一反応槽で一工程にすることが可能となり、省力化が可能である。
【００５５】
また、ペクチナーゼが酵母の細胞表層に提示されていることから、機械的な搾汁では果汁を獲得しにくい果実からも容易に果汁を得ることができ、同時にエタノール発酵を行うことができる。
【００５６】
本実施例１においては、アーミング酵母の一例としてエタノール生成に対応した酵母で説明したが、メタノール等の他のアルコール生成酵母を利用しても同様の効果を奏するものである。
【００５７】
また、本願発明における廃棄果実という名称は学術上の名称ではなく、本願発明においては、一般的に糖分及び水分を多く含み、花托が肥大化した偽果を含むものであり、偽果を本願発明の廃棄果実として用いても同様の効果を奏するものである。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のアルコール製造方法は、付加価値が低く、従来であれば廃棄していた果実の有効利用が図れるために、環境負荷の少ないバイオアルコール製造方法として利用できる。
【符号の説明】
【００５９】
１  廃棄果実
２  アーミング酵母
３  発酵槽
４  液化・発酵工程
５  アルコール発酵液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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