(57)【要約】【課題】ビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーがあり、味の持続性が認められる、新しい香味を有する低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料とその製造方法の提供。【解決手段】本発明によれば、麦芽等を原料の少なくとも一部とする低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料であって、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が２．５％より大きい、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料と、分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドを配合する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とする低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料であって、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）のペプチド量の比率が２．５％より大きい、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料。
【請求項２】
麦芽使用比率が５０％以上である、請求項１に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料。
【請求項３】
分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを配合する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来する、請求項３に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項５】
分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド（ＨＰＬＣゲル濾過法）が飲料中の全タンパク量に対して２．５％以上の比率となるよう配合される、請求項３または４に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項６】
前記ペプチドを含む原料から該ペプチドを調製する工程をさらに含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項７】
限外濾過法および硫安沈殿法により前記ペプチドを調製する、請求項６に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項８】
前記ペプチドを含む原料が、麦芽および／または未発芽の麦類あるいはその加工品である、請求項６または７に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項９】
前記ペプチドを含む原料が、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項１０】
分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを有効成分として含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善剤。
【請求項１１】
分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを添加する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とする低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビールテイスト発酵アルコール飲料にコクや味の厚みを付与する技術としては、カルボキシメチルリジンを含むペプチドをコク付与物質として用いる技術（特許文献１）が知られている。しかし、ビールテイスト発酵アルコール飲料、特に低糖質ビールの香味、特に柔らかくスムーズなテクスチャーの付与や味の持続性や余韻の付与などについては依然として改善の余地があった。また同様に、柔らかくスムーズなテクスチャーの付与や味の持続性などの観点から、低糖質のビールの香味の改良を試みた例は発明者らが知る限り報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１５８５０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ビールは、発泡酒や新ジャンルと比べて柔らかでスムーズなテクスチャーを有し、ボディ感が強いなどの好ましい味の特徴がある。本発明者らは、この違いに基づき、低糖質ビールにおいてビールの特徴をさらに強化する技術開発が実現すれば、これまでにない香味特徴のある低糖質ビールの製造を実現できると考えた。
【０００５】
本発明は、ビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーがあり、味の持続性が認められる、新しい香味を有する低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料とその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善剤と風味改善方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料において、特定分子量のペプチドがビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーの付与や味の持続性に寄与することを見出した。本発明者らはまた、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料において、特定分子量のペプチドの比率を特定範囲内にすることで、よりビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーや味の持続性が実現できることを見出した。本発明者らはさらに、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善に寄与するペプチドを具体的に特定した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とする低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料であって、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）のペプチド量の比率（以下、単に「ペプチド比率」ということがある）が２．５％より大きい、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料。
［２］麦芽使用比率が５０％以上である、上記［１］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料。
［３］分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを配合する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［４］前記ペプチドが、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来する、上記［３］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［５］分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド（ＨＰＬＣゲル濾過法）が飲料中の全タンパク量に対して２．５％以上の比率となるよう配合される、上記［３］または［４］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［６］前記ペプチドを含む原料から該ペプチドを調製する工程をさらに含んでなる、上記［３］〜［５］のいずれかに記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［７］限外濾過法および硫安沈殿法により前記ペプチドを調製する、上記［６］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［８］前記ペプチドを含む原料が、麦芽および／または未発芽の麦類あるいはその加工品である、上記［６］または［７］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［９］前記ペプチドを含む原料が、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料である、上記［６］〜［８］のいずれかに記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法。
［１０］分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを有効成分として含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善剤。
［１１］前記ペプチドが、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来するものである、上記［１０］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善剤。
［１２］分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを添加する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善方法。
［１３］前記ペプチドが、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来するものである、上記［１２］に記載のビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善方法。
【０００８】
本発明によれば、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドを配合するか、該ペプチドの比率を所定値の範囲内にすることによって、ビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーがあり、味の持続性が認められる低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料を提供することができる。特に、麦芽使用比率５０％以上のビールでは、ビールらしい柔らかくスムーズなテクスチャーと味の持続性が増強され、新しい香味特徴の低糖質ビールを提供できることになり、消費者の多様な嗜好ニーズに応えることが出来る点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】参考例１でビール系麦芽アルコール飲料に添加したペプチド量を示した図である。
【図２】参考例１の官能評価結果を示した図である。添加した画分ごとに官能評価スコアを示した。無添加のコントロールの官能評価スコアを２．５とした。
【図３】重合度５〜１０のα−グルカン濃度と栄養表示基準に基づく糖質濃度との相関関係を示した図である。
【図４】実施例１において実施したＨＰＬＣゲル濾過法の保持時間と既知物質の分子量から作成した検量線を示した図である。
【図５】実施例１の官能評価結果（味のスムーズさ）を示したバブルグラフである。縦軸を重合度５〜１０のα−グルカン濃度（ｍｇ／ｍＬ）とし、横軸を１０〜２０ｋＤａペプチド比率（％）として各サンプルをプロットした。菱形模様はサンプル番号１〜４（試醸品）、縦縞模様はサンプル番号５および６（添加品）である。バブルサイズは「味のスムーズさ」のスコアを表す。
【図６】実施例１の官能評価結果（味の持続性）を示したバブルグラフである。縦軸を重合度５〜１０のα−グルカン濃度（ｍｇ／ｍＬ）とし、横軸を１０〜２０ｋＤａペプチド比率（％）として各サンプルをプロットした。菱形模様はサンプル番号１〜４（試醸品）、縦縞模様はサンプル番号５および６（添加品）である。バブルサイズは「味の持続性」のスコアを表す。
【図７】参考例１で製造された飲料の試験区２についての２Ｄ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示した図である。図左側は分子量マーカー（ｋＤａ）である。矢印で示されたバンドは表１０のタンパク質同定結果と対応している。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明において「ビールテイスト」とは通常にビールを製造した場合、すなわち、酵母等による発酵に基づいてビールを製造した場合に得られるビール特有の味わい、香りを意味する。
【００１１】
本発明において「ビールテイスト発酵アルコール飲料」は、炭素源、窒素源および水などを原料として酵母により発酵させた飲料を意味し、ビール、発泡酒および原料として麦芽を使用するビールや発泡酒にアルコールを添加してなる飲料（例えば、酒税法上、「リキュール（発泡性）（１）」に分類されるリキュール系新ジャンル飲料）が挙げられる。
【００１２】
本発明のビールテイスト発酵アルコール飲料は麦由来の原料として少なくとも麦芽を使用するものとすることができ、その場合、麦芽使用比率は、例えば、５０％以上とすることができ、好ましくは６０％以上である。ここで、「麦芽使用比率」とは、醸造用水を除く全原料の質量に対する麦芽質量の割合をいう。
【００１３】
本発明において「低糖質」のビールテイスト発酵アルコール飲料とは、糖質の量（糖質濃度）が通常の製法で作られた同等の比較対象の飲料に対して４０％以上削減されたもの（すなわち、糖質オフ表示がなされた飲料）、あるいは糖質の量が０．５ｇ／１００ｍＬ未満（すなわち、糖質ゼロ表示がなされた飲料）であるものを意味する。このうち前者（糖質オフ表示がなされた飲料）の糖質濃度は、２．１ｇ／１００ｍＬ以下とすることができ、好ましくは０．５〜２．１ｇ／１００ｍＬの範囲である。ここで、糖質の量の測定は公知の方法に従って行うことができ、当該試料の質量から、水分、タンパク質、脂質、灰分および食物繊維量を除いて算出する方法（栄養表示基準（平成２１年１２月１６日  消費者庁告示第９号  一部改正）参照）に従って測定することができる。
【００１４】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料では、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率（ペプチド比率）（好ましくは、ビールテイスト発酵アルコール飲料の原料に由来する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率）が特定値以上であることを特徴とする。ここで、ペプチド比率の算出に当たっては、飲料中のタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ）を全タンパク量とし、飲料中の分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド濃度（ｍｇ／ｍＬ）を分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量とすることができる。また、本明細書において「ペプチド比率」の算出の元になるペプチド量は１０〜２０ｋＤａの分子量を有する１種または２種以上のペプチドの含有量を合計して算出されるものである。また本明細書においてペプチドの「分子量」はＨＰＬＣゲル濾過法により測定されるものであり、測定の具体例は後記実施例１に示される通りである。ペプチドおよびタンパクの定量はローリー法（Lowry法）により実施することができる。
【００１５】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料は、低糖質であるにも関わらず、新しい香味を有すること、すなわち、味のスムーズさと味の持続性が増強されたことを特徴とする。低糖質のビールテイスト発酵アルコール飲料（特に、低糖質のビールおよび発泡酒）は後味が弱く、飲み応えがないという特徴があり、それゆえにオフフレーバーが目立つという課題があった。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料では味のスムーズさと味の持続性が付与されることにより、低糖質のビールテイスト発酵アルコール飲料の香味上の課題を解決することができる。ここで、「味のスムーズさ」とは、舌で味を感じる時の口当たりの柔らかさの度合いを意味する。また、「味の持続性」とは、溜飲後に持続する味の余韻の度合いを意味する。
【００１６】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料では、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を２．５％より大きい比率にすることができ、好ましくは３．７％以上である。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料ではまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を２．５％より大きくし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を４．０ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料ではまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を２．５％より大きくし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を１．８〜４．０ｍｇ／ｍＬにすることができ、あるいは、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を２．５％より大きくし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を１．８ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料では好ましくは、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を３．７％以上にし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を４．０ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料ではまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を３．７％以上にし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を１．８〜４．０ｍｇ／ｍＬにすることができ、あるいは、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率を３．７％以上にし、かつ、重合度５〜１０のα−グルカン濃度を１．８ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率は味の調和の観点から上限を設けることができ、例えば、８．０％を上限とすることができる。
【００１７】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料ではまた、α−グルカンの濃度を所定値にすることができ、例えば、重合度５〜１０のα−グルカンの濃度を４．０ｍｇ／ｍＬ以下に設定することができる。本明細書において、「α−グルカン濃度」は重合度５〜１０の１種または２種以上のα−グルカンの含有量を合計して算出されるものである。また本明細書において「α−グルカン」とは複数のグルコース分子がα−１，４−グルコシド結合により結合して構成された直鎖状または分岐状のグルカン（例えば、α−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合で構成された分岐状のグルカン）を意味する。さらに、本明細書においてα−グルカンの「重合度」はグルカンを構成するグルコース残基の個数を意味し、直鎖状グルカンを構成するグルコース残基の個数のみならず、分岐構造を構成するグルコース残基の個数を含む。α−グルカンの重合度と含有量の測定は、例えば、コロナＣＡＤ検出器を用いたＨＰＬＣ分析により実施することができ、測定の具体例は後記実施例１に示される通りである。なお、本明細書および図面において重合度は単に「Ｇ」と表記されることがある。
【００１８】
なお、重合度５〜１０のα−グルカン濃度と栄養表示基準に基づく糖質濃度には相関関係が見られる。実施例１．Ｄに示されるとおり、例えば、重合度５〜１０のα−グルカン濃度４．０ｍｇ／ｍＬ以下の場合、栄養表示基準１．４ｇ／１００ｍＬ以下に相当すると考えられる。
【００１９】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料は分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率と、場合によっては重合度５〜１０のα−グルカン濃度が所定値の範囲内に調整される限り、通常の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造手順に従って製造することができる。例えば、麦芽、ホップ、副原料、醸造用水等の醸造原料から調製された麦汁に発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、発酵液を醸成させて、発酵麦芽飲料を製造することができる。得られた低糖質ビールテイストの発酵アルコール飲料は、低温にて貯蔵した後、濾過工程により酵母を除去することができる。なお、ビールテイスト発酵アルコール飲料のうちオールモルトビールは、麦芽、ホップ、水から製造できることはいうまでもない。
【００２０】
上記製造手順において麦汁の作製は常法に従って行うことができる。例えば、醸造原料と醸造用水の混合物を糖化し、濾過して、麦汁を得、その麦汁にホップを添加した後、煮沸し、煮沸した麦汁を冷却することにより麦汁を調製することができる。また、麦汁は、糖化工程中に市販の酵素製剤を添加して作製することもできる。例えば、タンパク分解のためにプロテアーゼ製剤を、糖質分解のためにα−アミラーゼ製剤、β−アミラーゼ製剤、グルコアミラーゼ製剤、プルラナーゼ製剤等を、繊維素分解のためにβ−グルカナーゼ製剤、繊維素分解酵素製剤（例えば、ヘミセルラーゼ製剤）等をそれぞれ用いることができ、あるいはこれらの混合製剤を用いることもできる。
【００２１】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造では、麦芽以外に、未発芽の麦類（例えば、未発芽大麦（エキス化したものを含む）、未発芽小麦（エキス化したものを含む））；米、とうもろこし、こうりゃん、馬鈴薯、でんぷん、糖類（例えば、液糖）等の酒税法で定める副原料；タンパク質分解物や酵母エキス等の窒素源；香料、色素、起泡・泡持ち向上剤、水質調整剤、発酵助成剤等のその他の添加物を醸造原料として使用することができる。本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料は、醸造用水以外の使用原料を少なくとも麦芽およびホップとすることができ、場合によっては更に糖類、米、とうもろこし、でんぷん等を使用原料とすることができる。
【００２２】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製法において製造飲料中の分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率を所定値の範囲内に調整するためには、例えば、原料である麦芽および／または未発芽の麦類の仕込み・糖化工程におけるタンパク分解を抑制することや、原料である麦芽の製麦工程におけるタンパク分解度を抑制することなどにより、調整することができる。なお、タンパク分解としては、麦芽や未発芽の麦類に内在するプロテアーゼ、あるいは外から添加するプロテアーゼ製剤によるものが挙げられる。分解の抑制は、プロテアーゼ製剤の添加量を減じる、タンパク分解の作用温度における処理時間を減じる、作用ｐＨを至適条件から変更するなどにより行うことができる。
【００２３】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製法において製造飲料中の栄養表示基準による糖質濃度やα−グルカンの濃度を所定値の範囲内に調整するためには、例えば、原料である麦芽および／または未発芽の麦類等の仕込みや糖化工程における糖質分解を促進すること、原料である麦芽の製麦工程における糖質分解を促進すること、それにより麦芽および／または未発芽の麦類等に由来する糖質が酵母に資化できる糖（資化性糖）まで充分に分解すること、あるいは糖質が酵母に資化できる糖まで充分分解された液糖を用いることなどにより、調整することができ、さらには発酵・貯蔵工程において、これらの資化性糖が酵母に十分に資化され、本発明の所定の糖質濃度以下に低下するまで酵母発酵を行うことなどにより、調整することもできる。なお、糖質分解としては、麦芽や未発芽の麦類に内在するαアミラーゼやβアミラーゼ等、あるいは外から添加するαアミラーゼ製剤、βアミラーゼ製剤、グルコアミラーゼ製剤、プルラナーゼ製剤等によるものが挙げられる。分解の促進は、αアミラーゼ製剤、βアミラーゼ製剤、グルコアミラーゼ製剤、プルラナーゼ製剤等の添加量を増加させること、糖質分解の作用温度における処理時間を延長すること、作用ｐＨを至適条件に合わせることなどにより行うことができる。
【００２４】
本発明においてはまた、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドを含む原料から、該ペプチドを含む画分を調製し、該画分をビールテイスト発酵アルコール飲料に添加することによって、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率が所定値の範囲内に調整されたビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。典型的には、実施例１の記載に従って、ビールテイスト発酵アルコール飲料から分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが含まれる画分を調製し、該画分を低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料に添加することによって、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率が所定値の範囲内に調整された低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。
【００２５】
すなわち、本発明によれば、分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチド（好ましくは、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来する分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチド）を配合してなる低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料が提供され、該飲料は本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の一部である。該ペプチドが配合されてなる飲料は、低糖質であるにも関わらずビールテイスト発酵アルコール飲料としての風味が改善あるいは向上されており、具体的には、味のスムーズさと味の持続性が増強された飲料である。
【００２６】
本発明の飲料への該ペプチドの配合量は、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が２．５％より大きくなるよう配合することができ、好ましくは３．７％以上である。本発明の飲料への該ペプチドの配合量はまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が２．５％より大きくなるように配合することができ、この場合、重合度５〜１０のα−グルカン濃度は４．０ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。本発明の飲料への該ペプチドの配合量はまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が２．５％より大きくなるように配合することができ、この場合、重合度５〜１０のα−グルカン濃度は１．８〜４．０ｍｇ／ｍＬ、あるいは、１．８ｍｇ／ｍｌ以下にすることができる。本発明の飲料への該ペプチドの配合量は好ましくは、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が３．７％以上になるように配合することができ、この場合、重合度５〜１０のα−グルカン濃度は４．０ｍｇ／ｍＬ以下にすることができる。本発明の飲料への該ペプチドの配合量はまた、全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率が３．７％以上になるように配合することができ、この場合、重合度５〜１０のα−グルカン濃度は１．８〜４．０ｍｇ／ｍＬ、あるいは、１．８ｍｇ／ｍｌ以下にすることができる。全タンパク量に対する分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド量の比率は味の調和の観点から上限を設けることができ、例えば、８．０％を上限とすることができる。
【００２７】
分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチド（特に、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来する分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチド）の例としては、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビター、トリプシンインヒビター、α−アミラーゼ・インヒビター（ＢＤＡＩ−１）、非特異的脂質転移タンパク１（non-specific lipid-transfer protein 1）あるいはアベニン・ライクａ１が挙げられ、好ましくは、これらのタンパク質およびペプチドは大麦由来、一部は小麦由来のものである。α−アミラーゼ／トリプシンインヒビター、トリプシンインヒビター、α−アミラーゼ・インヒビター（ＢＤＡＩ−１）、非特異的脂質転移タンパク１あるいはアベニン・ライクａ１をビールテイスト発酵アルコール飲料に配合するときは、これらのペプチドあるいはタンパク質は麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料から調製したもの以外のペプチドあるいはタンパク質であってもよい。
【００２８】
ビールテイスト発酵アルコール飲料に配合される分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドは、該ペプチドを含む原料から調製することができる。分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドを含む原料としては、麦芽および／または未発芽の麦類並びにその加工品、穀物タンパク分解物（例えば、大豆タンパク分解物、コーンタンパク分解物）が挙げられる。麦芽および／または未発芽の麦類の加工品としては、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とする麦汁、未発芽麦類のエキス、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料が挙げられ、好ましくは、麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料、より好ましくは麦芽を麦由来の原料の一部または全部とするビールテイスト発酵アルコール飲料である。原料からの分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドの調製手段としては、限外濾過法および硫安沈殿法の組み合わせや、ゲル濾過分画および固相抽出カラムの組み合わせが挙げられ、工業的生産の観点からは限外濾過法および硫安沈殿法の組み合わせが好ましい。なお、限外濾過法および硫安沈殿法の組み合わせにより分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドを調製するときには、限外濾過法を実施し、次いで、硫安沈殿法を実施することができる。
【００２９】
低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料に配合される分子量１０〜２０ｋＤａの１種または２種以上のペプチドは、好ましくは麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料（より好ましくは麦由来の原料として少なくとも麦芽を使用するビールテイスト発酵アルコール飲料、特に好ましくはオールモルトビール）から調製することができる。例えば、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造し、ゲル濾過分画や固相抽出カラムを用いて該飲料から分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが含まれる画分を調製することができる。分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドは必ずしも単離・精製されている必要はなく、ビールテイスト発酵アルコール飲料から分画処理されて得られたペプチド画分を低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料へ配合することができる。
【００３０】
低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料への分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドは、発酵前の発酵前液、発酵中の発酵液、あるいは発酵後の発酵液への添加により行うことができる。例えば、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造し、該飲料から分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが含まれる画分を調製し、該画分を発酵後の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料に添加することによって、分子量１０〜２０ｋＤａのペプチドが配合された低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。
【００３１】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料は分子量１０〜２０ｋＤａのペプチド比率または濃度が所定値の範囲内で配合されること以外は、通常の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造手順に従って製造することができる。例えば、麦芽、ホップ、副原料、醸造用水等の醸造原料から調製された麦汁に発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、発酵麦芽飲料を醸成させることができる。得られた低糖質ビールテイストの発酵アルコール飲料は、低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することができる。
【００３２】
上記製造手順において麦汁の作製は常法に従って行うことができる。例えば、醸造原料と醸造用水の混合物を糖化し、濾過して、麦汁を得、その麦汁にホップを添加した後、煮沸し、煮沸した麦汁を冷却することにより麦汁を調製することができる。
【００３３】
本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造では麦芽以外の原料を使用でき、具体的には、本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料に関する記載に従って麦芽以外の原料を使用できる。
【００３４】
本発明の別の面によれば、分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを有効成分として含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善剤が提供される。本発明のさらに別の面によれば、分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドを添加する工程を含んでなる、低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善方法が提供される。本明細書において「低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の風味改善」とは、味のスムーズさと味の持続性が増強されることを意味するものとする。また、分子量１０〜２０ｋＤａ（ＨＰＬＣゲル濾過法）の１種または２種以上のペプチドは、好ましくは麦芽および／または未発芽の麦類を原料の少なくとも一部とするビールテイスト発酵アルコール飲料に由来するものである。本発明の風味改善剤と風味改善方法は本発明の低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料および該飲料の製造方法についての記載に従って実施することができる。
【実施例】
【００３５】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、以下の例において割合（％）は特に断りがない限り質量％を表す。
【００３６】
参考例１：ビールテイスト発酵アルコール飲料に好ましい香味を付与するペプチド画分の特定
（１）ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造
大麦麦芽、ホップ、酵素製剤を用いて、インフュージョン法にてビールテイスト発酵アルコール飲料を製造した。
【００３７】
試験区１は、５０℃の湯３００ｍＬに大麦麦芽１００ｇを入れ、酵素製剤を添加して６０分保持後、６５℃に昇温して６０分保持し、さらに７８℃に昇温して５分保持後、濾過して麦汁を得た。試験区２は、５０℃工程を行わず、酵素製剤を添加しない以外は同様に麦汁を得た。続いて、ホップを０．８ｇ／Ｌ投入して１００℃で９０分煮沸したのち、濾過して発酵前液を得た。
【００３８】
その後、常法に従ってビール酵母により発酵を行い、発酵液の香味確認を行った。８名のパネルにより、「味の柔らかさ」、すなわち雑味が抑制され、ビールらしく柔らかくスムーズなテクスチャーがあり、調和のとれた味わいがあることを指標に、最低は１点、最高は５点として五段階で官能評価を行い、平均点を算出した。結果は表１に示される通りであった。
【００３９】
【表１】
2017216999.tif 000002
【００４０】
表１の通り、試験区１よりも試験区２の方が官能評価のスコア（味の柔らかさ）が良好であり、香味の印象も好ましかった
【００４１】
（２）ゲル濾過分画
上記（１）で得られた発酵液を０．４５μｍフィルターで濾過し、濾過済み発酵液を計量して凍結乾燥した。乾燥物を１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で溶解して５倍濃縮液を調製し、分画用サンプルとした。サンプルは、以下の条件にてゲル濾過分画を行った。
【００４２】
カラム：Ｈｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇ  ２６／６００（ＧＥヘルスケア社製）
サンプル注入量：５ｍＬ
溶離液組成：１００ｍＭ  ＮａＣｌ
流速：２．５ｍＬ／分（流速一定）
検出波長：２１５ｎｍ
分取：０．２９ｃｖ（カラム・ボリューム）から１９．１ｍＬ（フラクション０）、その後０．３５ｃｖから５ｍＬずつ分画（フラクション１〜５１）
【００４３】
分画物の官能評価により、香味の特徴の違いによって、表２のようにフラクションをプレ画分、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇの９つのグループに分けた。
【００４４】
【表２】
2017216999.tif 000003
【００４５】
（３）ペプチド画分の精製
上記（２）で得られた各画分は、固相抽出カラム（画分Ａ１、Ａ２、Ｂは、Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８  ＥＷＰ、画分Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧはＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８を使用、Agilent technologies社製）にて吸着処理を行い、脱塩水で洗浄した後、５０％エタノール水溶液にて溶出して、濃縮乾固を行い、これを脱塩水にて復水し、濃縮液とした。これをペプチド画分とした。
【００４６】
（４）ローリー法によるタンパク定量
上記（３）のゲル濾過分画によって得られたペプチド画分のタンパク定量は市販のキット（ＤＣプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたＬｏｗｒｙ法で行った。まず、上記分画液を５０μＬ採って遠心乾固し、超純水１０μＬを加えて再溶解して分析サンプルとした。そこにＡ液を５０μＬ加えて撹拌し、続いてＢ液を４００μＬ加えて攪拌した。室温で１５分発色反応を行った後、９６ウェルプレートに３５０μＬ移して７５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度と予め作成した検量線に基づき、ペプチド量を算出した。なお、検量線はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて作成した。
【００４７】
（５）官能評価
これらの分画・精製サンプルを、大麦と大麦麦芽を使用した市販の麦芽使用比率４９％未満のビール系アルコール飲料に、その飲料に含まれる各画分量の５０％上乗せとなるよう添加し（図１参照）、５名のパネルにより官能評価を行った。
【００４８】
官能評価の指標は、「旨み、甘味、厚み、ボディ、およびオフフレーバーとしての渋み・味の不調和」の総合評価として、１〜５点の五段階スコアで評価した。無添加のコントロールをスコア２．５とした。官能評価スコアの平均値は図２に、官能評価コメントは表３に示される通りであった。
【００４９】
【表３】
2017216999.tif 000004
【００５０】
ペプチド分画物は、プレ画分からＤにかけて、試験区２の官能評価スコア（図２）が高く、分画前の発酵液の官能評価結果と一致した。また、試験区２の画分Ａ１およびＡ２において、スコアが高く、柔らかさ、雑味低下との官能評価コメントだった（表３）。試験区２のプレ画分では、スコアは同等に高いが、柔らかいが味自体は少ないとの官能評価コメントだった。画分Ｂ〜Ｄは、スコアは同等に高いが、官能評価コメントでは厚み、ボディ、旨味の寄与がより強いと評価された。すなわち、プレ画分、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄで、試験区２の評価は高いが、それぞれ味質が異なっており、画分Ａ１、Ａ２は、ビールらしい柔らかさ、雑味低下等の効果があることがわかった。
【００５１】
ペプチド分画物は、実施例１に記載の、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５  １０／３００カラムにて分析を行い、分子量を推定したところ、画分Ａ１のペプチドが分子量約１０〜２０ｋＤａに分布し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動上でも、画分Ａ１〜Ａ２において、同様の分子量約１０〜２０ｋＤａのペプチドが分布していることが確認された（データ示さず）。また、香味上優れていた試験区２では、そのペプチド量が多くなっていることが確認された（図１）。
【００５２】
以上の結果より、分画・精製した分子量約１０〜２０ｋＤａのペプチド画分Ａ１およびＡ２は、雑味が抑制され調和のとれたビールらしい味わいをビール系飲料に付与できることが明らかとなった。
【００５３】
実施例１：低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造および該飲料へのペプチド添加と官能評価
Ａ：低糖質ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造
ビールテイスト発酵アルコール飲料においては、主原料として、大麦麦芽を使用し、副原料として、とうもろこしおよび液糖のいずれかまたは両方を使用した。糖化に際しては酵素製剤を用い、糖化の温度、時間を調整し、濾過することで、異なる組成の麦汁を得た。すなわち、糖化の温度帯は６０℃、６２℃、６４℃、６５℃など、６０℃〜６５℃の中で選択した。糖化の時間は、それぞれの温度工程において、５分〜１２０分の間で調整した。また、原料の熱処理温度は７０℃〜１２０℃の間で選択した。具体的には以下のようにして麦汁を得た。
【００５４】
（ア）サンプル番号１および２の糖化条件
６４℃の湯１００質量部に対して、大麦麦芽３３．６質量部、酵素製剤を投入して１００分保持後、７８℃に昇温して５分保持した後、濾過して麦汁を得た。
【００５５】
（イ）サンプル番号３の糖化条件
６０℃の湯１００質量部に対して、大麦麦芽３３．３質量部、グルコアミラーゼを主体とする酵素製剤を投入して２０分保持後、６５℃に昇温して１００分保持したものを醪Ａとした。同時に、５０℃の湯１００に対してとうもろこし１１．３質量部および資化性糖を主体とする液糖８．３質量部を投入して、５０℃で２０分、６５℃で１５分の順に保持し、その後煮沸したものを醪Ｂとした。糖化の終了した醪Ａと煮沸の終了した醪Ｂを直ちに混合させたのち、７８℃に昇温して５分保持した後、濾過して麦汁を得た。
【００５６】
（ウ）サンプル番号４の糖化条件
６５℃の湯１００質量部に対して、大麦麦芽１６．７質量部、グルコアミラーゼを主体とする酵素製剤を投入して１２０分保持後、７８℃に昇温して５分保持した後、濾過して麦汁を得た。
【００５７】
上記の麦汁調製工程（ア）〜（ウ）に続いて、得られたそれぞれの麦汁にホップおよび一部の麦汁（サンプル番号４）では資化性糖を主体とした液糖を投入して１００℃で９０分間煮沸した後、麦汁静置を行ない、トリューブを分離した後、冷却して発酵前液を得た。一部の発酵前液（サンプル番号１および２）ではグルコアミラーゼを主体とする酵素製剤を添加した。その後、発酵前液に下面発酵酵母を添加し、常法に従って主発酵および後発酵を行なった。続いて、後発酵後の発酵液を、より低温で保持することにより貯蔵を行ない、濾過して、清澄なビールテイスト発酵アルコール飲料（試醸品）（サンプル番号１〜４）を得た。
【００５８】
Ｂ：ビールテイスト発酵アルコール飲料のα−グルカン量の定量
（ア）ＨＰＬＣ分析用のサンプル調製
サンプル番号１〜４は、固相抽出カラムを用いて分離し、分画用サンプルを得た。具体的には、製品液を固相抽出カラム（Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８、Agilent technologies社製）にて吸着処理を行って素通り画分を回収し、回収液をさらにＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８  ＥＷＰ（Agilent technologies社製）に吸着させ、素通り画分を回収した。回収した素通り画分は、さらにイオン交換樹脂Ｓｅｐ  Ｐａｋ  ＱＭＡおよびＳｅｐ  ＰａｋＣＭ（いずれもWaters社）で順に処理した。得られた液を遠心濃縮させ、乾燥物を復水して分画用サンプルとした。
【００５９】
（イ）ＨＰＬＣによる糖分析
ＭＣＩ−ｇｅｌ  ＣＫ０２ＡＳカラム（２０×２５０ｍｍ）およびコロナＣＡＤ検出器により、サンプルに含まれるα−グルカンの鎖長分布状況を評価した。具体的には、以下の条件のようにして重合度（鎖長）を分析した。Ｇ５〜Ｇ１０マルトオリゴ糖を標準品とした検量線で組成を分析した。Ｇ５はマルトペンタオース（Maltopentaose）、Ｇ６はマルトヘキサオース（Maltohexaose）、Ｇ７はマルトヘプタオース（Maltoheptaose）、Ｇ８はマルトオクタオース（Maltooctaose）、Ｇ９はマルトノナオース（Maltononaose）、Ｇ１０はマルトデカオース（Maltodecaose）である。マルトペンタオース（Maltopentaose）、マルトヘキサオース（Maltohexaose）およびマルトヘプタオース（Maltoheptaose）については東京化成社より標準品を購入し、マルトオクタオース（Maltooctaose）、マルトノナオース（Maltononaose）およびマルトデカオース（Maltodecaose）についてはElicityl SA社より標準品を購入し、質量分析器条件を設定した。
【００６０】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＭＣＩ−ｇｅｌ  ＣＫ０２ＡＳカラム（２０×２５０ｍｍ、三菱化学社製）
移動相：ＭＱ水
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：８５℃
検出器：コロナＣＡＤ検出器
【００６１】
上記（イ）で設定した分析条件のもとでサンプル番号１〜４の分析を行った結果は表４に示される通りである。
【００６２】
Ｃ：栄養表示基準に基づく糖質濃度の分析
栄養表示基準に基づく糖質濃度の測定は公知の五訂日本食品標準成分表分析マニュアルに記載の方法に従って行った。すなわち、当該試料の質量から、水分（減圧加熱・乾燥助剤添加法）、タンパク質（自動分析装置による方法）、脂質（ソックスレー抽出法（３））、灰分（マッフル炉による燃焼法）および食物繊維量（プロスキー酵素重量法）を除いて算出する方法にて測定した。サンプル番号１〜４について測定した結果は表４に示される通りであった。
【００６３】
【表４】
2017216999.tif 000005
【００６４】
表４において、重合度５〜１０のα−グルカン濃度と、栄養表示基準に基づく糖質濃度との相関関係を図３に示した。近似直線における相関係数は、Ｒ２＝０．６２８２である。従って、例えば、重合度５〜１０のα−グルカン濃度が４．０ｍｇ／ｍＬ以下の場合、栄養表示基準に基づく糖質濃度は１．４ｇ／１００ｍＬ以下に相当すると考えられる。
【００６５】
Ｄ：タンパク定量
（ア）ゲル濾過分画用のサンプル調製
サンプル番号１〜４（試醸品）を計量した後、凍結乾燥した。乾燥物を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含む）で溶解して２．５倍濃縮液を調製し、分画用サンプルとした。
【００６６】
（イ）ＨＰＬＣゲル濾過法
ＨＰＬＣゲル濾過法の条件は以下の通りであった。
＜ＨＰＬＣゲル濾過法分析条件＞
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５  １０／３００（ＧＥヘルスケア社製）
サンプル注入量：１００μＬ
溶離液組成：５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
流速：０．５ｍＬ／分（流速一定）
検出波長：２１５ｎｍ
分画プログラム：
【００６７】
【表５】
2017216999.tif 000006
【００６８】
（ウ）分画範囲の設定
上記（イ）のＨＰＬＣゲル濾過法条件記載のカラム、溶離液、流速、検出波長において、分子量既知のペプチドを０．１〜５ｍｇ／ｍＬで適宜超純水に溶解したものを５０μＬ注入してＨＰＬＣ分析を行い、保持時間を確認した（表６）。その保持時間、分子量から検量線（図４）を作成し、分子量範囲と分画範囲を決定した。
【００６９】
【表６】
2017216999.tif 000007
【００７０】
（エ）分画液のＬｏｗｒｙ法によるタンパク定量
タンパク定量は、参考例１に記載のＬｏｗｒｙ法により行った。なお、得られた吸光度とＢＳＡ濃度から検量線を作成し、分画液のペプチド量（ＢＳＡ換算）を計算し、分画液量、濃縮倍率から、当該画分の製品相当ペプチド濃度（ｍｇ／ｍＬ）を算出した。
【００７１】
（オ）１０〜２０ｋＤａペプチドの定量
１０〜２０ｋＤａペプチド濃度は、上記ＨＰＬＣゲル濾過法における、検量線から決定した分子量１０〜２０ｋＤａの範囲である画分３に含まれるタンパク濃度を、製品相当ペプチド濃度（ｍｇ／ｍＬ）に換算して求めた。また、１０〜２０ｋＤａペプチド量が全タンパク量の中に占める比率、すなわち１０〜２０ｋＤａのペプチド比率は、以下の算出式にて求めた。
【数１】
2017216999.tif 000008
【００７２】
Ｅ：官能評価
サンプル番号１〜４（試醸品）に関して、７名の訓練されたパネラーによって官能評価を実施した。評価項目の指標は、「味のスムーズさ」および「味の持続性」の２項目とし、それぞれ、１（弱い）〜９（強い）点の９段階スコアで評価した。各サンプルの官能評価結果は表７に示される通りであった。また、この結果を図５および図６に示した。
【００７３】
【表７】
2017216999.tif 000009
【００７４】
表７並びに図５および図６に示される通り、１０〜２０ｋＤａのペプチド比率を２．５％より高くした試験醸造品において、「味のスムーズさ」と「味の持続性」が向上することが確認された。
【００７５】
なお、上記結果は、実施例１に記載した方法で分析した時の結果、すなわち、コロナＣＡＤ検出器（コロナ荷電化粒子検出器）を用いて得られた分析値である。本検出器は、物質の化学構造に依存せず、同一の分析条件下で、一貫した物質重量依存の応答性が得られる特徴がある（Thermofisher scientific社による）。
【００７６】
実施例２：ペプチドのビールテイスト発酵アルコール飲料への添加と官能評価
Ａ：ペプチド画分の調製
（ア）ゲル濾過分画
市販品（オールモルトビール）をガス抜きしたうえで凍結乾燥した。凍結乾燥物を１００ｍＭＮａＣｌ溶液に溶解して５倍濃縮液を調製し、分画用サンプルとしたサンプルは、以下の条件にてゲル濾過分画を行った。
【００７７】
＜ゲル濾過分画条件＞
カラム：Ｈｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０ｐｇ  ２６／６００（ＧＥヘルスケア社）
サンプル注入量：５ｍＬ
溶離液組成：１００ｍＭ  ＮａＣｌ
流速：２．５ｍＬ／分（流速一定）
検出波長：２１５ｎｍ
分取：０．２９ＣＶ（カラム・ボリューム）から１９．１ｍＬ（フラクション０）、その後０．３５ＣＶから５ｍＬずつ画分（フラクション１〜５１）
【００７８】
分画物の官能評価により、香味の特徴の違いによって、前記表２のようにフラクションをプレ画分、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇの９つのグループに分けた。
【００７９】
なお、ゲル濾過分画に付した市販品のペプチド比率および濃度並びにα−グルカン濃度（実施例１に従って測定）は表８に示される通りであった。
【表８】
2017216999.tif 000010
【００８０】
（イ）ペプチド画分の精製
上記（ア）で得られた画分のうち、Ａ１画分（フラクション番号：Ｆ１〜１２）について固相抽出カラム（Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃ１８  ＥＷＰ）にて吸着処理を行い、脱塩水で洗浄した後、５０％エタノール水溶液にて抽出して、濃縮乾固させて脱塩水で復水し、濃縮液とした。これをペプチド画分とした。
【００８１】
（ウ）Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク定量
上記（イ）のゲル濾過分画によって得られたペプチド画分のタンパク定量は市販キット（ＤＣプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いたＬｏｗｒｙ法で行った。まず、上記ペプチド画分溶液を対製品で１０倍希釈および４０倍希釈となるように濃度調整し、サンプル５μＬに対し、Ａ液２５μＬを加えて撹拌し、続けてＢ液２００μＬを加えて撹拌した。室温で１５分間発色反応を行った後、７５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度と予め作成した検量線に基づき、ペプチド量を算出した。なお、検量線はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて作成した。
【００８２】
Ｂ：試飲サンプルの調製
サンプル番号２（試醸品）に上記Ａで得られたペプチド画分を添加し、サンプル番号５および６（添加品）を調製した。具体的には、１０〜２０ｋＤａのペプチド量が０．２４ｍｇ／ｍＬおよび０．２９ｍｇ／ｍＬ、ペプチド比率が５．２％および５．７％となるようにペプチド画分を添加した。試飲サンプルと、ペプチド比率および濃度並びにα−グルカン濃度の対応関係は表９に示される通りであった。
【００８３】
Ｃ：官能評価
無添加のサンプル番号２（試醸品）と、前記Ｂで得られたサンプル番号５および６（添加品）について、７名の訓練されたパネラーによって官能評価を実施した。評価項目の指標は、「味のスムーズさ」、「味の持続性」の２項目とし、評価は実施例１．Ｅに記載の方法に準じて実施した。各サンプルの官能評価結果は表９に示される通りであった。また、各サンプルの官能評価結果は、先述の実施例１．Ｅの結果と合わせて、図５および図６に図示した。
【００８４】
【表９】
2017216999.tif 000011
【００８５】
表９並びに図５および図６に示される通り、１０〜２０ｋＤａのペプチド比率を高めると、「味のスムーズさ」と「味の持続性」が向上することが確認された。
【００８６】
実施例３：タンパク画分の分子種同定
本実施例では２Ｄ−ＰＡＧＥおよび四重極-飛行時間型質量分析装置により、ビールらしく柔らかいスムーズなテクスチャーがあり、調和のとれた味わいに寄与するタンパク質の同定を試みた。
【００８７】
参考例１で得られたゲル濾過分画と固相抽出精製によるペプチド画分Ａ１、Ａ２の等量混合液２００μＬをＴＣＡアセトン沈殿によってタンパク質を精製し、２Ｄ−ＰＡＧＥによる電気泳動後、銀染色を行った。香味に違いの見られた試験区１と試験区２のサンプルの間では、分子量４０ｋＤａ付近の太いバンドの量には違いがあまりなく、１０〜２０ｋＤａに分布するバンドにおいて量的な差があることがわかった（データ示さず）。
【００８８】
次に、試験区２の２Ｄ−ＰＡＧＥゲルから、図７で示す矢印のバンドを切り出し、トリプシン（ProteaseMAX(商標) Surfactant, Trypsin Enhancer、プロメガ社製）を用いてタンパク質を消化した。得られたトリプシン消化ペプチド溶液を四重極-飛行時間型質量分析装置（SCIEX社製）を用いてＭＳ/ＭＳスペクトルを取得し、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに登録されているデータベースを用いてタンパク質の同定を行った。
【００８９】
四重極-飛行時間型質量分析装置によるタンパク質同定の結果は表１０に示される通りであった。
【表１０】
2017216999.tif 000012
【００９０】
ゲル濾過画分（画分Ａ１〜Ａ２）中のタンパク質としては、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMa、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMb、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMd、トリプシンインヒビターCMe、α−アミラーゼ・インヒビター（BDAI-1）、非特異的脂質転移タンパク１（non-specific lipid-transfer protein 1）およびアベニン・ライクａ１が同定された。なお、同定されたタンパク質はオオムギ（Hordeum vulgare）由来、および一部、小麦（Triticum aestivum）由来のタンパク質として同定された。α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMa、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMb、α−アミラーゼ／トリプシンインヒビターCMd、トリプシンインヒビターCMeは、プロテアーゼ阻害タンパク質として知られており、α−アミラーゼ・インヒビター（BDAI-1）はαアミラーゼ阻害蛋白質として知られる。また、non-specific lipid-transfer protein 1は、脂質転移タンパク質として知られている。
【００９１】
実施例４：限外濾過および硫安沈殿により調製されたペプチドのビールテイスト発酵アルコール飲料への添加と官能評価
本実施例では大規模生産に適したペプチドの調製方法と官能評価に及ぼす影響について検討した。
【００９２】
Ａ：ペプチド画分の調製
（Ａ−１）限外濾過による分画
市販品（オールモルトビール）をガス抜きしたうえで、限外濾過膜（分画分子量；６０００、ＡＩＰ−１０１３Ｄ、旭化成社製）によりペプチドの濃縮および分画を行った。具体的には、オールモルトビールを約４倍濃縮して濃縮液を回収し、凍結乾燥した。次いで、乾燥物を市販品の６倍濃度となるように超純水で復水した後、分画分子量６０００〜８０００の透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、以下同様）により透析した。
【００９３】
（Ａ−２）硫安沈殿によるペプチドの分離
上記（Ａ−１）で得られた溶液について４０％飽和硫安沈殿を行うことにより、０〜４０％飽和硫安沈殿物を得た。沈殿物を超純水に溶解し、透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１により透析し塩を十分に除去した。次いで、凍結乾燥を行い超純水に溶解してペプチドの濃縮液を得た。濃縮液について、１０〜２０ｋＤａのペプチドが主成分となっていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の染色画像により確認した（データ示さず）。
【００９４】
Ｂ：試飲サンプルの調製
サンプル番号２（試醸品）に実施例２．Ａに記載された方法を用いて市販のオールモルトビールから精製した１０〜２０ｋＤａペプチド画分を添加し、サンプル番号７（添加品３）を調製した。また、サンプル番号２（試醸品）に上記Ａで得られた１０〜２０ｋＤａペプチド画分を添加し、サンプル番号８（添加品４）を調製した。具体的には、添加品３および４の１０〜２０ｋＤａペプチド比率が５．５％となるように各ペプチド画分を添加した。試飲サンプルと、ペプチドの量および比率並びにα−グルカンの量の対応関係は表１１に記載した。
【００９５】
Ｃ：官能評価
サンプル番号２および上記Ｂで得られたサンプル番号７および８（添加品）について、４名の訓練されたパネラーによって実施例１．Ｅの記載に従って官能評価を実施した。各サンプルの官能評価結果は表１１に示される通りであった。
【００９６】
【表１１】
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【００９７】
表１１に示される通り、１０〜２０ｋＤａペプチドを添加していない飲料（サンプル番号２）と比べ、限外濾過と硫安沈殿を組み合わせて得られた１０〜２０ｋＤａペプチドを添加した飲料（サンプル番号８）では、ゲル濾過分画と固相抽出により得られた１０〜２０ｋＤａペプチドを添加した飲料（サンプル番号７）と同様に、「味のスムーズさ」および「味の持続性」が向上することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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