(57)【要約】【課題】コラーゲンの修復や排毒促進に有効なＨｓｐ９０、ｇｐ９６、Ｈｓｐ７０、ｇｐ４７の発現誘導性能を有するコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法を提供する。【解決手段】コラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法は、複数種の乳酸菌を共生培養して乳酸菌生産物質を生成する工程と、乳酸菌生産物質に対して所定の割合でエタノール、天然アルカリ温泉水、及び乳酸菌を含む菌の代謝産物を混合する工程と、混合して得られた水溶液を所定の期間熟成する工程と、熟成して得られた水溶液中の沈殿物を濾過する工程と、濾過により得られた水溶液に所定の量の蒸留水を混合して抽出用溶液を生成する工程と、絹を加熱処理して得られた変性絹を抽出用溶液を用いて熱水抽出する工程と、を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の乳酸菌を共生培養して乳酸菌生産物質を生成する工程と、
前記乳酸菌生産物質に対して所定の割合のエタノール、天然アルカリ温泉水、及び乳酸菌を含む菌の代謝産物を混合する工程と、
混合して得られた水溶液を所定の期間熟成する工程と、
熟成して得られた水溶液中の沈殿物を濾過する工程と、
前記濾過により得られた水溶液に所定の量の蒸留水を混合して抽出用溶液を生成する工程と、
絹を加熱処理して得られた変性絹を前記抽出用溶液を用いて熱水抽出する工程と、
を含むコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法。
【請求項２】
前記抽出用溶液は、中性又は弱アルカリ性である、
請求項１に記載のコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト表皮には、様々な種類の細胞が存在し、それぞれが有効成分を取り込む働きをしたり、外敵からのバリアになったり、外部環境刺激に対応して生体防御機構を発揮している。この生体防御機構の中でも特に注目されている機構として熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン（Ｈｓｐ：heat shock proteins）ともいう。）が知られている。このＨｓｐは、細胞が熱や紫外線等のストレスにさらされたときに発現し、細胞を保護する。Ｈｓｐには、様々な種類が存在し、定常状態では細胞内にごくわずかしか存在していないが、刺激に対応して大量に誘導されてくる。このＨｓｐの発現を誘導する能力を有する物質を見出すことは、今後、様々な分野で有効活用されることが期待されている。
【０００３】
従来、Ｈｓｐに関する発明として、ヒートショックプロテイン発現誘導剤（特許文献１）、ヒートショックプロテイン７０産生誘導剤（特許文献２）、皮膚外用剤（特許文献３）が提案されている。
【０００４】
特許文献１に記載されたヒートショックプロテイン発現誘導剤は、ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるものであり、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導が認められ、メラニン産生を抑制するとともに、脳梗塞やアルツハイマー病など脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用であるとしている。
【０００５】
特許文献２に記載されたヒートショックプロテイン７０産生誘導剤は、亜鉛化合物を１０ｍＭ以上含有する培地で培養した酵母の菌体抽出物を有効成分とするものであり、上皮細胞でのヒートショックプロテイン７０の産生誘導が可能となり、胃潰瘍、胃粘膜傷害を防止する医薬品に利用が可能であるとしている。
【０００６】
特許文献３に記載された皮膚外用剤は、ヒートショックプロテイン、二価カルボン酸１種又は２種以上と水酸基価から算出した平均重合度が２〜１５のポリグリセリンとのオリゴマーエステル、及びグリセリン、平均重合度２〜４のポリグリセリンからなる群から選択される１種又は２種以上を含有したものであり、Ｈｓｐ７０が皮膚に十分浸透して、肌状態を改善できるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−７１９０２号公報
【特許文献２】特開２０１４−１０８９４５号公報
【特許文献３】特開２０１５−１２４１８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来のＨｓｐに関する発明によると、Ｈｓｐ７０が発現するのみであるので、コラーゲンの修復や排毒促進に十分とはいえない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、コラーゲンの修復や排毒促進に有効なＨｓｐ９０、ｇｐ９６、Ｈｓｐ７０、ｇｐ４７の発現誘導性能を有するコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［１］複数種の乳酸菌を共生培養して乳酸菌生産物質を生成する工程と、
前記乳酸菌生産物質に対して所定の割合のエタノール、天然アルカリ温泉水、及び乳酸菌を含む菌の代謝産物を混合する工程と、
混合して得られた水溶液を所定の期間熟成する工程と、
熟成して得られた水溶液中の沈殿物を濾過する工程と、
前記濾過により得られた水溶液に所定の量の蒸留水を混合して抽出用溶液を生成する工程と、
絹を加熱処理して得られた変性絹を前記抽出用溶液を用いて熱水抽出する工程と、
を含むコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法。
［２］前記抽出用溶液は、中性又は弱アルカリ性である、
前記［１］に記載のコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、コラーゲンの修復や排毒促進に有効なＨｓｐ９０、ｇｐ９６、Ｈｓｐ７０、ｇｐ４７の発現誘導性能を有するコラーゲン修復・排毒促進剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、それぞれＨｓｐ１０４、ｇｐ９６、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれＨｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ３２のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ検体１（第１のＨｓｐ発現誘導剤）、検体２（補助剤）、検体３（第２のＨｓｐ発現誘導剤）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態に係るヒートショックプロテイン発現誘導剤の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ヒートショックプロテイン発現誘導剤をＨｓｐ発現誘導剤と略す場合がある。また、本実施の形態に係るＨｓｐ発現誘導剤は、コラーゲン修復・排毒促進剤でもある。「排毒」とは、食物などを介して摂取され、生体内で生成せれた毒性異物を体外に排出することをいう。「コラーゲン修復」とは、減少したり劣化したコラーゲンを元の状態に近づけることをいう。コラーゲン修復・排毒促進剤は、例えば、人体表面への塗布用又は飲料用としてクリーム状又は液状でもよい。
【００１４】
（１）第１のＨｓｐ発現誘導剤の製造工程
複数種の乳酸菌を共生培養して乳酸菌生産物質を生成する。乳酸菌生産物質は、ラクトバチルス菌属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム菌属に属する乳酸菌、及びストレプトコッカス菌属に属する乳酸菌を用いるとともに、それら３属の乳酸菌から選択した１種又は２種以上の乳酸菌を用いて複数のグループを形成し、それらグループ毎に継代培養して共棲状態を維持し、この継代培養されたグループ単位の乳酸菌同士をさらに共棲培養して得た乳酸菌培養液を濾過した水溶液である。乳酸菌生産物質としては、例えば光英科学研究所製のものを用いることができる。
【００１５】
次に、上記乳酸菌生産物質８〜１２質量％（一例として９．８質量％）に対してエタノールを８〜１２質量％（一例として９．８質量％）混合し、これに天然アルカリ温泉水７３〜８３質量％（一例として７８．４質量％）をさらに加え、最後に菌の代謝産物を１〜３質量％（一例として２質量％）投入して第１の水溶液を生成する。菌の代謝産物としては、例えば、ラクトバチルス菌属に属する乳酸菌（例えば、高粱（穀物）由来の乳酸菌）、及び酵母菌を用い、共棲培養して得た乳酸菌代謝産物を濾過した水溶液を用いることができる。
【００１６】
次に、第１の水溶液を、直射日光が当たらない屋内にて、常温（約２５℃）の下、２週間に一度のペースで攪拌し、７年以上熟成させて第２の水溶液を生成する。第２の水溶液は、例えばｐＨ３．２の酸性寄り弱酸性の溶液であるが、ｐＨ３．０以上６．０未満の弱酸性の溶液でもよい。この第２の水溶液中に発生した沈殿物を濾過して得られた水溶液が第１のＨｓｐ発現誘導剤であり、コラーゲン修復・排毒促進剤でもある。長期熟成であればあるほど、粘質が増して、強烈な酸味と味にも深みが増すので、極力熟成を長め（理想は７年以上）にすることが望ましい。熟成が早い（３年未満）と酸味のある単なる薄いエタノールのような味になる。第１のＨｓｐ発現誘導剤の１回の製造量は、５０リットル以上が熟成が進み易くなり、品質も安定するので望ましい。
【００１７】
（２）補助剤の製造工程
無農薬の飼料により育成した蚕が産生した繭玉を無消毒のまま乾燥させ、乾燥後熱水によって絹繊維を取り出し絹の真綿を作製する。使用する絹の量は水溶液１００ｍｌに対して１７個分の繭（約３７．４ｇ）である。
【００１８】
次に、真綿を細断し、温度範囲６０〜１４０℃で加熱処理して変成絹（補助剤）を生成する。変性絹の生成方法としては、例えば国際特許公報ＷＯ２００６／０３３４７３号により開示されている。変性絹は、塗布により、皮膚のしみ、しわ、くすみ、乾燥、たるみの改善や、塗布により、皮膚の吹き出物、にきび、アトピー性皮膚炎の改善や、塗布により、皮膚の切り傷、擦り傷、痛み、やけど、かゆみ、股ずれ、おむつかぶれ、あかぎれ、虫さされ、あせも、湿疹、床ずれ、花粉症の改善など多様な効果が認められており、美肌に優秀な素材として取り扱われている。
【００１９】
（３）第２のＨｓｐ発現誘導剤の製造工程
上記第１のＨｓｐ発現誘導剤の製造工程で得られた第１のＨｓｐ発現誘導剤を、その４倍の量の化粧品製造用蒸留水と混合し、抽出用溶液を生成する。生成された抽出用溶液は、例えば、ｐＨ７．８の弱アルカリ性寄りの中性の溶液であるが、ｐＨ６．０以上８．０以下（中性）でも、ｐＨ８．０を超えて１１．０以下（弱アルカリ性）でもよい。
【００２０】
次に、上記補助剤製造工程で得られた補助剤を上記抽出用溶液を用いて熱水抽出して抽出水溶液を生成する。この生成された抽出水溶液が第２のＨｓｐ発現誘導剤でもあり、コラーゲン修復・排毒促進剤でもある。
【００２１】
（評価）
次に、上記第１のＨｓｐ発現誘導剤、補助剤及び第２のＨｓｐ発現誘導剤のそれぞれの検体（以下それぞれの検体を「検体１」、「検体２」、「検体３」という。）について、Ｈｓｐの発現誘導能力を評価した。
【００２２】
ヒト皮膚繊維芽細胞に検体３種を各段階希釈にて添加し、所定の時間後に細胞を回収して、細胞内のＨｓｐに関するｍＲＮＡレベルを定量ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法を用いて測定した。
【００２３】
すなわち、ヒト皮膚繊維芽細胞を細胞培養プレート（６well-plate）に分散し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定したＣＯ２インキュベータ（恒温培養器）内で培養する。
【００２４】
次に、各検体を希釈溶液（例えば培養液）で段階希釈（希釈倍率５００倍、２５００倍、１２５００倍）して培養液中に添加し、培養を継続させる。なお、希釈倍率５００倍は一例であり、例えば４００〜６００倍、４５０〜６５０倍又は４９０〜５１０倍とする。
【００２５】
所定の時間（例えば４時間）刺激した後、培養液は除去し、細胞表面をＰＢＳ（リン酸バッファー）で洗浄する。次に、細胞からトータルＲＮＡ抽出用試薬を用いてトータルＲＮＡを抽出する。詳細はTRIzol（登録商標） reagentのプロトコールに準ずる。
【００２６】
次に、得られたトータルＲＮＡの量を定量した後、所定量のトータルＲＮＡに対してＲＴ反応試薬を用いて逆転写反応（ＲＴ反応）によりｃＤＮＡを合成する。詳細はTakara PrimeScript master mix Kitに準ずる。
【００２７】
次に、ｃＤＮＡを鋳型として、各種熱Ｈｓｐ−ｍＲＮＡ配列に則ったプリマーペア（別途合成済み）と、ＲＣＲ反応液（SYBR green 系）を用いて反応溶液を各検体に対して調整する。
【００２８】
次に、これらを９６ウェルＰＣＲプレートに分散し、定量ＰＣＲ装置にセットする。定量ＰＣＲ装置における専用のプログラムにより、各種Ｈｓｐ-ｍＲＮＡの元々存在した量をデルターデルターＣＴ法により相対的に定量する。
【００２９】
（評価結果）
得られたｍＲＮＡ発現量から各種検体のＨｓｐ発現誘導能力を評価する。各ｍＲＮＡ発現量は、細胞に何も処理を加えていないコントロール下でのｍＲＮＡ発現量を１とした際の倍数で表示した。
【００３０】
熱ショックタンパク質は、Ｈｓｐ１０４、ｇｐ９６、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ３２について、検討した。Ｈｓｐ１０４は、異常タンパク質を再生する作用がある。ｇｐ９６は、Ｈｓｐの仲間であり、小胞体内で抗原の運搬や、細胞表面にまで抗原を提示する作用がある。Ｈｓｐ９０は、他のタンパク質を活性調節する作用がある。Ｈｓｐ７０は、最も代表的なＨｓｐであり、強力な細胞保護作用を有する。Ｈｓｐ６０は、タンパク質のフォールディング維持や膜透過の作用がある。Ｈｓｐ４７は、高等動物にのみ存在するものであり、コラーゲンの生産を助ける作用がある。Ｈｓｐ３２は、活性酸素を減らす作用がある。
【００３１】
ｍＲＮＡ発現量の測定結果を表１に示す。図１〜図３は、表１に対応するものである。図１（ａ）〜（ｄ）は、それぞれＨｓｐ１０４、ｇｐ９６、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０についてのｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれＨｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ３２についてのｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ検体１（第１のＨｓｐ発現誘導剤）、検体２（補助剤）、検体３（第２のＨｓｐ発現誘導剤）の各種ＨｓｐのｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
総括的には、いずれの検体も５００倍希釈すれば、何らかの刺激となって発現を上昇させる傾向が認められた。今回、Ｈｓｐ１０４：ｇｐ９６：Ｈｓｐ９０：７０：６０：４７：３２の遺伝子発現力を同時に測定した。この試みは今回初めてのことである。また、Ｈｓｐ７０以外のＨｓｐの結果が出たのも今回初めてのことである。
【００３４】
Ｈｓｐの発現誘導能力が最も高かったのは、検体３の第２のＨｓｐ発現誘導剤であった。第２のＨｓｐ発現誘導剤は、Ｈｓｐ種として、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ７０などの発現誘導能力が強いことから、細胞内タンパク質の保護、維持、再生系に働くものと推測される。第１のＨｓｐ発現誘導剤は、Ｈｓｐ種として、Ｈｓｐ７０の発現誘導能力が高かった細胞の保護に有効に働くものと推測される。また、第１のＨｓｐ発現誘導剤は、ｇｐ９６の遺伝子発現力も高かったことから、異物認識能力の向上、すなわち排毒効果が高くなったことが示唆された。Ｈｓｐ４７に関しても遺伝子発現が認められた。このことにより、肌の張りに重要なコラーゲンのまき直しに関与するＨｓｐが活性化されたことが、示唆された。
【００３５】
Ｈｓｐ７０、９０、ｇｐ９６がリンクして細胞のレセプタクルに抗原提示することは知られている。例えば、抗原が浸入すると、マクロファージが異物として認識し、抗原を取り込む。これをＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０が共同的にタンパク質に断片化し、小胞体（ＥＲ）に送り込む。小胞体に退避しているｇｐ９６が粗面小胞体を通り、マクロファ―ジの細胞表面のレセプターに抗原として提示する。このことにより、キラーＴ細胞が認識し、異物を保有しているマクロファージを攻撃し叩く。キラーＴ細胞はここで認識したシグナルを他の同様のシグナルを提示している細胞にアタックして行く。以上のことはガン細胞より抗原＋Ｈｓｐを取り出してｇｐ９６、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０を上手く活用した抗ガン剤の治療に応用研究されている。本発明者らは、第１のＨｓｐ発現誘導剤及び第２のＨｓｐ発現誘導剤がｇｐ９６、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０の発現誘導性能が高いことを発見し、排毒促進剤に適用できると考えた。また、第１のＨｓｐ発現誘導剤及び第２のＨｓｐ発現誘導剤がｇｐ４７の発現誘導性能が高いことを発見し、コラーゲン修復剤に適用できると考えた。すなわち、第１のＨｓｐ発現誘導剤及び第２のＨｓｐ発現誘導剤は、コラーゲン修復・排毒促進剤に適用できるといえる。
【００３６】
第１のＨｓｐ発現誘導剤によれば、以下の効果を奏する。
（１）Ｈｓｐ７０により細胞ダメージの修復が優れている。
（２）Ｈｓｐ７０により粘膜組織の修復が優れている。
（３）潰瘍、腫瘍などの改善が期待できる。
すなわち、皮膚の紫外線ストレスに対する抵抗性をあげ、バリア機能の保持、炎症防止および修復などの効果が期待できる。
【００３７】
第２のＨｓｐ発現誘導剤によれば、以下の効果を奏する。
（１）ｇｐ９６により生体内の異物を分解、運搬し、細胞のレセプター上にのせ、抗原提示ができる。
（２）ｇｐ９６により食細胞が異物をいち早く発見し、貪食することができる。
（３）生体内の清浄化作用を持つ。
（４）上記作用による、各種疾患（癌：血流障害：糖尿病：高脂血症：尿酸血症：神経系疾患：皮膚疾患：美容などを含め各種生活習慣病）や健康障害の改善効果をもつ。
【００３８】
なお、本発明の実施の形態は、上記実施の形態に限定されず、種々な実施の形態が可能
である。例えば、本実施の形態では、得られたＨｓｐ発現誘導剤をコラーゲン修復・排毒促進剤に適用を説明したが、化粧品や肌状態を改善する皮膚外用剤でもよい。また、本発明の要旨を変更しない範囲内で、上記実施の形態の製造工程において、工程の追加、削除、変更、入替え等が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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