(57)【要約】【課題】表皮におけるＣＭＬ形成を抑制するＣＭＬ形成抑制剤、表皮老化の予防又は改善剤、表皮黄変化予防又は改善剤の提供。【解決手段】チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤。
【請求項２】
チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮老化予防又は改善剤。
【請求項３】
チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮黄変化予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮においてカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ：Ｎε−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ）の形成を抑制するＣＭＬ形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツ（ＡＧＥｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）はタンパク質と還元糖の非酵素的な反応（メイラード反応）により形成される不可逆的な終末糖化産物である。
【０００３】
皮膚においては、加齢と共に真皮コラーゲンのＡＧＥｓ化が促進し（例えば非特許文献１）、皮膚の弾力性が低下する（例えば非特許文献２）ことが知られている。また、血糖値が高い糖尿病患者では真皮コラーゲンに対するＡＧＥｓ化が加速し、加齢に伴う皮膚弾力性の低下が健常人と比べてより顕著となる（例えば非特許文献３）。したがって、従来、皮膚のＡＧＥｓの研究は、ターンオーバーが遅いコラーゲンなど、真皮マトリクス成分を対象に進められ、例えばクロメン誘導体等に真皮のＡＧＥｓ形成を抑制する作用があることが報告されている（例えば特許文献１）。
【０００４】
ＡＧＥｓには、ＣＭＬ、ペントシジン、ピラリン、アルグピリミジン等の分子が知られているが、このうちＣＭＬは、近年、メイラード反応ではなく、生体内における脂質の過酸化を介して主に形成されることが報告され（例えば非特許文献４）、またグルコースの自動酸化等から生じるグリコールアルデヒドやグリオキサールを介した経路からもＣＭＬが形成されることが報告されている（例えば非特許文献５）。
【０００５】
斯かる状況の下、最近、本発明者らは、ＣＭＬが、ターンオーバーの速い角層及び表皮を構築する表皮細胞内においても存在すること、さらにはその主な標的タンパクは表皮細胞の骨格を形成するケラチン１０であることを明らかにした（例えば非特許文献６）。そしてさらに、表皮中のＣＭＬは加齢により増加傾向を示し、ＣＭＬ量の多い角層では角層厚が増大し、角層水分量が低下することを明らかにしている（例えば非特許文献７）。
【０００６】
ＣＭＬは、一度形成されると元のタンパク質と糖に戻ることはなく、表皮細胞中でＣＭＬが形成されると、角層を含む表皮全体に悪影響を及ぼすと考えられる。すなわち、表皮ＣＭＬ形成抑制は、新たな皮膚健全化のターゲットになり得ると考えられるが、表皮ＣＭＬの形成を抑制する物質はこれまでに見出されていない。
【０００７】
一方、チョウジは、別名チョウジノキ、クローブ等として知られており、抗菌作用（例えば特許文献２）、抗酸化作用（例えば特許文献３）、セラミド合成促進作用（例えば特許文献４）を有すること、また、メイラード反応阻害し、ペントシジンの生成を抑制すること（例えば特許文献５）、タンパク質架橋切断活性を有すること（例えば特許文献６）が知られている。
しかしながら、チョウジに表皮におけるＣＭＬ形成を抑制する作用があることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−０９６７７３号公報
【特許文献２】特開２００２−３７０９２１号公報
【特許文献３】特開２００４−２６２８５２号公報
【特許文献４】特開２００６−２０６５１３号公報
【特許文献５】特開２００５−３５９１１号公報
【特許文献６】特開２００２−２４１２９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dyer DG., Dunn JA., Thorpe SR., Bailie KE., Lyons TJ., McCance DR., BaunesJW. (1993) J. Clin Invest., 91, 2463-2469
【非特許文献２】菅原智子, 酒井進吾, 井上紳太郎, 高橋秀孝, 山門實. (2005) 人間ドッグ, 20 (3)
【非特許文献３】Yoon HS., Baik SH., Oh CH. (2002) Skin Res. Technol., 8, 250-254
【非特許文献４】Takeuchi M., Makita Z. (2001) Cuur. Mol. Med., 3, 305-315
【非特許文献５】Glomb MA.,Monnier VM. (1995) J. Biol. Chem., 270, 10017-10026
【非特許文献６】Kawabata K., Yoshikawa H., Saruwatari K., Akazawa Y., Inoue T., Kuze T., Sayo T., Uchida N., Sugiyama Y. (2011) Biochem. Biophys. Acta., 1814, 1246-1252
【非特許文献７】川端慶吾. (2014) アミノ酸研究, 8 (2), 109-116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、表皮におけるＣＭＬ形成を抑制するＣＭＬ形成抑制剤、表皮老化の予防又は改善剤、表皮黄変化予防又は改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、フトモモ科フトモモ属に属する植物であるチョウジの抽出物に、表皮におけるＣＭＬ形成を抑制する作用があることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤。
２）チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮老化予防又は改善剤。
３）チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮黄変化予防又は改善剤。 
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、表皮のＣＭＬ化を抑制し、表皮老化の予防又は改善、表皮細胞のＣＭＬ化に伴う表皮の黄色変化を予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】表皮ＣＭＬ化に起因する表皮の黄変化を示す図。
【図２】チョウジ抽出物の表皮におけるＣＭＬ形成抑制効果を示す図。
【図３】ニーム抽出物の表皮におけるＣＭＬ形成抑制効果を示す図。
【図４】チョウジ抽出物の肌の黄色化改善作用を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「チョウジ」とは、フトモモ科フトモモ属（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ Ｓｙｚｙｇｉｕｍ）のチョウジ（学名：Ｓｙｚｙｇｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）を指し、クローブとしても知られている。
【００１５】
チョウジは、その任意の部位、例えば、花、花蕾、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根、種子、全草又はそれらの組み合わせが使用され得るが、花蕾を用いるのが好ましい。
【００１６】
本発明において、チョウジは、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
【００１７】
チョウジ抽出物としては、公知の抽出方法により抽出して得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、固液抽出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。例えば、浸漬は、０℃〜溶媒沸点（好ましくは１５〜４０℃）で１時間〜４週間、浸漬・浸出することが挙げられ、固液抽出は、０℃〜溶媒沸点（好ましくは１５〜４０℃）下、３０〜１０００ｒｐｍで３０分〜２週間の攪拌もしくは振盪することが挙げられる。また、抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。また、還流抽出の場合には、ソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行うことができる。
【００１８】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、薬理活性および汎用性の点で、水、アルコール類およびそれらの混液が挙げられる。
【００１９】
上記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられる。このうち、薬理活性および操作性の点で、１価アルコール類および２価アルコール類が好ましい。また好ましくは、上記アルコール類は、炭素数１〜１０のアルコール、より好ましくは炭素数１〜４のアルコールであり得る。
【００２０】
上記アルコール類の好ましい例としては、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられる。
【００２１】
上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上であり、より好ましくは４０質量％以上であり、且つ好ましくは８０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは６０質量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％、さらに好ましくは４０〜６０質量％である。
【００２２】
上記アルコール類のうち、汎用性の観点から、エタノールがより好ましい。したがって、上記植物の抽出物を調製するためのより好適な溶媒としては、水、エタノール、エタノール水溶液が挙げられる。
【００２３】
抽出における溶媒の使用量としては、チョウジ（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１０００ｍＬが好ましい。抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されない。例えば、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３日以上、より好ましくは１週間以上であり、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは２週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。抽出条件の例としては、１５〜４０℃で３日〜５週間、好ましくは１〜２週間、６０〜９０℃で１〜５時間等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００２４】
本発明において、チョウジ抽出物はそのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・１，３−ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２５】
本発明のチョウジ抽出物は、例えば化粧品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができ、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２６】
後記実施例に示すように、チョウジ抽出物は、培養ヒト表皮細胞において、グリオキサール（ＧＯ）より誘導されるＣＭＬの形成を抑制する作用を有する。したがって、チョウジ又はその抽出物は、表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤となり得る。
表皮中のＣＭＬは、加齢により増加傾向を示し、さらにＣＭＬ量の多い角層では角層厚が増大し、角層水分量が低下する（前記非特許文献７）。したがって、表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤は、表皮老化の予防又は改善剤となり得る。また、ケラチン１０はケラチン１と結合し表皮の骨格となるケラチン線維を構築するが、表皮におけるＣＭＬ化のターゲットタンパクであるケラチン１０（前記非特許文献６）がＣＭＬ化されれば、ケラチンの重合様式が変化し、角層厚や表面状態を変化することで、表皮内部で光散乱が生じ、肌の色調変化を齎すと考えられる。実際に、グリオキサール処理したヒト培養表皮細胞では、ＣＭＬが形成され黄変化が認められる（参考例１）。よって、表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤は、表皮黄変化予防又は改善剤となり得る。
【００２７】
したがって、本発明のチョウジ又はその抽出物は、表皮老化の予防又は改善や表皮黄変化の予防又は改善が所望される動物、好ましくはヒトに投与することにより、表皮におけるＣＭＬ形成を抑制し、角層の肥厚を抑制し、また表皮の黄変を抑制し、表皮老化を予防又は改善することができ、表皮黄変化を予防又は改善することができる。また、本発明のチョウジ又はその抽出物は、表皮におけるＣＭＬ形成抑制、表皮老化の予防又は改善、表皮黄変化の予防又は改善のために使用することができる。
【００２８】
ここで、本発明のチョウジ又はその抽出物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよいが、非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。本発明において、非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での表皮老化予防又は改善のためのチョウジ又はその抽出物の使用、例えばエステティシャン、美容師、理容師、トリマー等による使用等が挙げられる。
【００２９】
本発明において、「表皮老化」とは、加齢に伴い角層が肥厚した状態を意味し、「表皮黄変化」とは、加齢に伴い表皮の黄色味が増加することを意味する。
【００３０】
本発明の表皮におけるＣＭＬ形成抑制剤、表皮老化予防又は改善剤、表皮黄変化の予防又は改善剤は、表皮におけるＣＭＬ形成抑制、表皮老化予防又は改善、表皮黄変化の予防又は改善を目的とした、化粧品、医薬品、医薬部外品であり得、又は表皮におけるＣＭＬ形成抑制、表皮老化予防又は改善、表皮黄変化の予防又は改善を目的とした、化粧品、医薬品、医薬部外品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００３１】
本発明のチョウジ又はその抽出物を含む、化粧品、医薬品、医薬部外品等の各種製剤組成物の形態は、経口又は非経口投与の形態のいずれでも良いが、非経口投与の形態であるのが好ましく、皮膚外用剤であるのがより好ましい。具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の種々の形態で用いることができるが、とりわけ保湿や美白用スキンケア製品、制汗剤、デオドラント剤、ボディソープ等の形態とするのが好ましい。
【００３２】
上記製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明のチョウジ又はその抽出物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明のチョウジ又はその抽出物の他、それぞれ化粧品、医薬部外品、医薬品等の製剤の種類に応じて、適宜、他の植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。また、表皮におけるＣＭＬ形成抑制効果を更に高めるべく、他の薬効成分を適宜配合することもできる。
【００３３】
当該製剤組成物中の本発明のチョウジ又はその抽出物の含有量は、当該チョウジ又はその抽出物の乾燥重量に換算して、一般的に好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、且つ好ましくは９９質量％以下、より好ましく２０質量％以下であり、また好ましくは０．００１〜９９質量％、より好ましくは０．０１〜２０質量％である。
本発明のチョウジ又はその抽出物の皮膚外用剤における含有率は、皮膚外用剤の総量を基準として、固形分換算で好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上、更に好ましくは０．００１質量％以上、且つ好ましくは５質量％以下、より好ましくは３質量％以下、更に好ましくは１質量％以下である。
【００３４】
上記医薬品、医薬部外品、化粧料の投与量は、対象のＣＭＬ形成抑制を達成できる量であり得る。例えば、有効量は、投与群のＣＭＬ形成を、未投与群の９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下に低下させることができる量であり得る。
【００３５】
当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、チョウジ又はその抽出物（乾燥物換算）として、例えば好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇである。また、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜５ｍｇである。
【００３６】
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
【００３７】
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、表皮の老化、特に表皮黄変化の予防又は改善を目的とするヒトが好ましい。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮ＣＭＬ形成抑制剤。
＜２＞チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮老化予防又は改善剤。
＜３＞チョウジ又はその抽出物を有効成分とする表皮黄変化予防又は改善剤。
【００３９】
＜４＞表皮ＣＭＬ形成抑制剤を製造するための、チョウジ又はその抽出物の使用。
＜５＞表皮老化予防又は改善剤を製造するための、チョウジ又はその抽出物の使用。
＜６＞表皮黄変化予防又は改善剤を製造するための、チョウジ又はその抽出物の使用。
【００４０】
＜７＞表皮ＣＭＬ形成抑制に使用するための、チョウジ又はその抽出物。
＜８＞表皮老化予防又は改善に使用するための、チョウジ又はその抽出物。
＜９＞表皮黄変化予防又は改善に使用するための、チョウジ又はその抽出物。
【００４１】
＜１０＞チョウジ又はその抽出物を適用することを含む表皮ＣＭＬ形成抑制方法。
＜１１＞チョウジ又はその抽出物を適用することを含む表皮老化予防又は改善方法。
＜１２＞チョウジ又はその抽出物を適用することを含む表皮黄変化予防又は改善方法。
【００４２】
＜１３＞上記＜７＞〜＜９＞において、上記使用は非治療的な使用である。
＜１４＞上記＜１０＞〜＜１２＞において、上記方法は非治療的な方法である。
＜１５＞上記＜１０＞〜＜１２＞において、適用は、表皮の老化又は表皮黄変化の予防又は改善を目的とするヒトへの投与であり、好ましくは皮膚への塗布である。
＜１６＞上記＜１＞〜＜１２＞において、抽出物は、好ましくはエタノール水溶液抽出物である。
＜１７＞上記＜１６＞において、エタノール水溶液中のエタノール濃度は、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上であり、より好ましくは４０質量％以上であり、且つ好ましくは８０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは６０質量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％、さらに好ましくは４０〜６０質量％である。
【実施例】
【００４３】
参考例１:表皮黄変化評価
以下の試験材料を用い、表皮のＣＭＬ化に伴う黄変化を評価した。
表皮モデル：ＥＰＩ−６０６キット：クラボウ社製 
培地：ＥＰＩ−１００ＮＭＭ培地（フェノールレッドフリー）：クラボウ社製
アミノグアニジン（ＡＧ）：ＣＭＬ形成抑制剤（Ferreira A. E. N., Ponces Freire A. M. J., Voit E. O. (2003) Biochem. J., 376, 109-121）
グリオキサール（ＧＯ）：４０質量％グリオキサール水溶液をＥＰＩ−１００ＮＭＭ培地（フェノールレッドフリー）に溶解して使用
【００４４】
１）方法
空気暴露１４日目の表皮モデルをグリオキサール（終濃度：１３．８ｍＭ）／ＥＰＩ−１００ＮＭＭ培地（フェノールレッドフリー）にて培地交換し、７日間培養した。比較対象として、上記培地にＣＭＬ形成抑制剤であるアミノグアニジン（終濃度：２ｍＭ）を添加したサンプルでも評価を行った。
【００４５】
２）結果
結果を図１に示す。グリオキサール処理した表皮モデルでは黄変化が認められた。一方、グリオキサールと同時にＣＭＬ形成抑制剤であるアミノグアニジンを添加すると黄変化が抑制されたことから、表皮の黄変化はＣＭＬに起因すると考えられる。
【００４６】
製造例１  チョウジ抽出物
チョウジの乾燥体１００ｇを１Ｌの５０％エタノール水溶液に浸漬し、常温、常圧下で１週間抽出した。得られた抽出液をろ過して残渣を除去した。
【００４７】
製造例２  ニーム抽出物
ニームの乾燥体１００ｇを１Ｌの５０％エタノール水溶液に浸漬し、常温、常圧下で１週間抽出した。得られた抽出液をろ過して残渣を除去した後、ろ液を減圧乾燥して抽出物を得た。
【００４８】
実施例１:表皮ＣＭＬ形成抑制効果
以下の試験材料を用い、ＣＭＬ形成抑制作用評価を実施した。
細胞：新生児ヒト包皮由来角化細胞
培地：ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地（０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）、ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地（１．２５ｍＭ Ｃａ２＋）
チョウジ抽出物：チョウジの５０％エタノール抽出物（一丸ファルコス社製）
アミノグアニジン（ＡＧ）：ポジティブコントロール（終濃度：２ｍＭ）
グリオキサール（ＧＯ）：４０質量％グリオキサール水溶液をＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地に溶解して使用
抗ＣＭＬ抗体：ＫＨ−０２４−０２（ＮＦ−１Ｇ−ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｔｒａｎｓ Ｇｅｎｉｃ社製）
【００４９】
１）方法
ＴｙｐｅＩコラーゲンでコーティングした１２穴プレートにＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地（０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）に溶解させた４×１０４個／ｗｅｌｌのヒト包皮由来角化細胞を２ ｍＬ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃で１日インキュベートした。翌日、グリオキサール（終濃度：２０ｍＭ）／ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地（１．２５ｍＭ Ｃａ２＋）にて培地交換し、チョウジ抽出物（終濃度：０．１、０．３％）を添加後、分化（角化）誘導のため３７℃で１日インキュベートした。細胞からタンパク質を抽出した後、ドットブロットによりＣＭＬ強度を測定した。タンパク量が５μｇ／ｓｐｏｔになるようアプライし、メンブレンを０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した。室温下、２％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、抗ＣＭＬ抗体（×１０，０００ ｄｉｌ．）を供し、４℃下で１２時間反応させた。メンブレンを０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ洗浄の後、化学発光法にてＣＭＬ化ケラチン１０を検出した。その後、得られたシグナル強度をＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ Ｖ ２．１にて数値化し、Ｄｕｎｎｅｔｔ法にて有意差検定を行った。
【００５０】
２）結果
チョウジ抽出物を添加した細胞では、コントロールと比べＰ＜０．００１％と有意なＣＭＬシグナル強度の減少が認められ、チョウジ抽出物は表皮ＣＭＬ形成抑制作用を有することが確認された（図２）。
【００５１】
＜比較例１＞
ニーム（学名：Ｍｅｌｉａ Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ）はセンダン科アザディラクタ属に属し、インドセンダンの別名でも知られる植物だが、その抽出物はＢＳＡを用いた蛍光ＡＧＥｓ検出評価系から、ＡＧＥｓ形成抑制効果を有することが知られている（例えば特許文献７）。そこで、これら一般的なＡＧＥｓ形成抑制効果の評価系において効果が認められたニームに関して、ニーム抽出物（粉末状エタノール抽出物（一丸ファルコス（株）製）を用い、終濃度０．１％及び０．３％の水溶液を調製）を用い、実施例１と同様の手法にて表皮細胞におけるＣＭＬ形成抑制効果を評価した。
その結果、ニーム抽出物を添加した細胞では、コントロールと比べＣＭＬシグナル強度の減少は認められなかった。よって、ニーム抽出物は表皮ＣＭＬ形成抑制作用を有さないと判断された（図３）。
【００５２】
実施例２: チョウジ抽出物の肌の黄変化に対する評価
１）チョウジ配合乳液の調製
以下に示す各成分を混合し、乳液を調製した。
【００５３】
【表１】
2017100991.tif 000002
【００５４】
２）被験者
２０１４年１１月１８〜２０日に健常成人１８名からチョウジ塗布側のベースラインｂ＊値が平均（１６．８０）より高い１２名（男性：６名、女性：６名、平均年齢３０．８歳）を被験者として選抜し、上腕内側部を対象とした連用塗布試験を実施した。
【００５５】
３）試験方法
左右上腕内側部に１）で調製したチョウジ配合乳液を朝晩１日２回、４週間連用塗布した。期間としては１１月〜１２月とした。
【００５６】
４）肌の黄色味測定方法
肌の黄色味（ｂ＊値）は測色計（ＣＭ２６００−Ｄ：ＫＯＮＩＣＡ ＭＩＮＯＬＴＡ社製）を用い、同一部位をそれぞれ３回測定し、その相加平均を代表値とした。その後、代表値を元にＴ−Ｔｅｓｔにて有意差検定を行った。
【００５７】
５）結果
チョウジ配合乳液を４週間連用塗布したことで肌の黄色味（ｂ＊値）は有意に減少した（図４：ｐ＜０．０１）。チョウジ抽出物を連用塗布したことで、表皮内のＣＭＬ形成が抑制され、上記のように表皮の黄変化が改善されたと考えられる。
【図１】
2017100991.tif 000003
【図２】
2017100991.tif 000004
【図３】
2017100991.tif 000005
【図４】
2017100991.tif 000006