(57)【要約】【課題】本願発明の目的は、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成する、細胞構造体の製造方法を提供することにある。【解決手段】本願発明の細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００〜３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを含むことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、
前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、
心筋細胞と、前記心筋細胞１００個に対して２００〜３００個の割合の線維芽細胞を前記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、
播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程と
を含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種する、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記播種工程以降であって、前記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を前記被覆細胞培養器にさらに添加する、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記免疫系細胞が、マクロファージ及び／又はＴ細胞である、請求項３に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記温度応答性ポリマー又は前記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の面積が２００ｍｍ２以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓の機能障害の研究において、動物の生体心臓を心不全等の状態とする心疾患モデルとしては、冠状動脈の閉塞、薬剤投与、心筋ミオシンの下肢への筋注で自己免疫性に心筋炎を惹起させる等の方法で作製したモデル動物が公知である。
【０００３】
心臓は、生命の維持にきわめて重要な臓器であるとともに、他の臓器の状態をも左右するため、心機能を低下させた心疾患モデルを再現よく作製することは困難であった。例えば、冠状動脈閉塞であれば、閉塞の程度が軽いと健常状態とほとんど差異がなく、少しでも重いとすぐに動物をロストすることとなり、その程度の差が近いために加減が非常に困難であった。また、ミオシン投与による自己免疫反応での心筋炎モデル作製では、免疫反応の程度によって心筋組織の病状が大きく変わり、さらに心機能自体が、離れた他の臓器の状態にも大きく影響するため、安定した実験、再現性のある実験系を組むことが極めて困難であった。
また、作製した心疾患モデル臓器を生体内から摘出しても、多くの酸素を要求する心筋細胞を維持することが困難であった。
また、実験動物の使用は、動物愛護や倫理上の問題もあった。
【０００４】
一般に心不全等を起こした組織は、管状動脈の部分的閉塞、ウイルス・細菌の感染、自己免疫反応等により心筋細胞が壊死し、壊死した心筋細胞に置き換わって線維芽細胞が過増殖している状態にあることが知られている。
そこで、心不全等を起こした心疾患の組織を試験管内で再現することが試みられている。これには、低酸素に弱い心筋細胞を保護しつつし、増殖が早い線維芽細胞と共培養して細胞構造体とする必要があり、細胞構造体の作製に１〜２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では困難であった。
【０００５】
短時間で、効率よく細胞塊を製造する方法として、特定の温度応答性ポリマーを塗布した細胞培養器を用いた方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７４６２４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の方法において、心不全等の心疾患の組織の再現は検討されておらず、心疾患を試験管内で再現する方法が求められているが現状である。
【０００８】
従って、本発明の目的は、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成する、細胞構造体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００〜３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを含むことを特徴とする、細胞構造体の製造方法を提供する。
【００１０】
上記播種工程において、血管内皮細胞をさらに播種することが好ましい。
【００１１】
上記播種工程以降であって、上記細胞構造体が得られる前に、免疫系細胞を上記被覆細胞培養器にさらに添加することが好ましい。
【００１２】
上記免疫系細胞が、マクロファージ及び／又はＴ細胞であることが好ましい。
【００１３】
上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の面積が２００ｍｍ２以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞構造体の製造方法は、上記構成を有するため、心疾患モデルとして有用な、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体を容易に形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態の細胞構造体の製造方法を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［細胞構造体の製造方法］
本発明の細胞構造体の製造方法は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する、培養器準備工程と、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００〜３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する、播種工程と、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る、培養工程とを、この順に含む。
なお、本明細書において、細胞培養器の培養面における、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分を「被覆培養面」と称する場合がある。また、被覆細胞培養器とは、被覆培養面を有する細胞培養器である。被覆細胞培養器は、培養面全面が被覆培養面であってもよいし、培養面の一部が被覆培養面であってもよい。また、培養面に１個の被覆培養面を有していてもよいし、複数の被覆培養面を有していてもよい。
【００１７】
心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体は、公知のＵ字低接着性培養皿やハンギングドロップ法で１〜２週間もの長い時間かけてスフェロドを形成させることも可能であるが、作製に時間がかかるため、低酸素状態に極めて弱い心筋細胞の維持が困難となる問題、増殖速度の異なる細胞同士の共培養が困難という問題等があった。
本発明者らは、驚くべきことに、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆した被覆細胞培養器に、心筋細胞と線維芽細胞とを播種することで、心不全を起こした心疾患の組織を模倣した細胞構造体を容易に形成できることを見出した。
本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、心筋細胞と線維芽細胞とが均質分散した状態を維持して凝集させることが可能であり、心筋細胞と線維芽細胞とを含む、生体内に存在する状態に近い、心不全を起こした組織を再現することができる。
【００１８】
本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、播種された混合細胞は被覆培養面に接着し、更に培養すると、混合細胞は自己凝集をして収縮して、シート状に広がった細胞の端部が被覆培養面から離れて反り返るようにして凝集し、塊状の細胞構造体を形成する。
特に、本実施形態の細胞構造体の製造方法では、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で培養面が被覆されており、被覆培養面と細胞との接着力が適度な範囲にあるため、凝集しにくい性質を有する心筋細胞を含む混合細胞であっても、塊状の細胞構造体を形成することができる。また、凝集しやすい線維芽細胞と組み合わせることにより、容易に塊状の細胞構造体を形成することができる。
【００１９】
心筋細胞と、線維芽細胞とは、増殖速度が異なるため、従来の長時間培養をして細胞構造体を形成する方法では、心筋細胞を多く含む細胞構造体を形成することができなかった。本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、心筋細胞と線維芽細胞とを増殖させることなく細胞構造体を形成することができるため、播種時の心筋細胞と線維芽細胞との細胞比と、ほぼ同様の比率の細胞で構成される細胞構造体を得ることができる。そのため、細胞構造体を構成する細胞の混合比率を容易に調整することができる。また、本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、被覆培養面と細胞との接着力が適度な範囲にある被覆細胞培養器を用いているため、細胞の増殖を必要とせず、例えば、播種後２４時間以内等の短時間で、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞が凝集して丸まるため、増殖速度が異なる２種以上の細胞からなり、心筋細胞を生きた状態で含み、且つ拍動している塊状の細胞構造体を容易に形成することができる。
【００２０】
（調製工程）
実施形態の細胞培養器に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。中でも、心筋細胞と線維芽細胞とを含む、塊状の細胞構造体が一層得られやすいという観点から、（Ａ）が好ましい。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロック（重合鎖ω末端）とを含む、温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本発明の実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００２２】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する混合物調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程とを含み、ここで、混合物調製工程において、混合物は重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は不活性雰囲気下において照射される、ことを特徴とする。
【００２３】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（混合物調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００２４】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００２５】
重合禁止剤の上記混合物に対する質量割合は、０．０１〜１．５％であることが好ましく、０．１〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の上記混合物に対する質量割合は、１．０〜５０％であることが好ましく、９．０〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。
【００２６】
次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００２７】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００２８】
反応条件に関して、温度条件としては、１５〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７〜２４時間であることが好ましく、１７〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００２９】
なお、混合物調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００３０】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００３１】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2017163911.tif 000003
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2017163911.tif 000004
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００３２】
なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。
【００３３】
（温度応答性ポリマー）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。
【００３４】
ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００３５】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００３６】
上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００３７】
また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーが被覆されている細胞培養器を調製することができる。
【００３８】
更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）、塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００３９】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００４０】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００４１】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００４２】
以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００４３】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一重合工程における重合物の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含むことを特徴とする。
【００４４】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００４５】
ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル割合）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。
【００４６】
溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００４８】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００４９】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００５０】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【００５１】
次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【００５２】
アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。
【００５４】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。
【００５５】
数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。
【００５６】
この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【００５７】
そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００５８】
この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００５９】
第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。
【００６０】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【００６１】
上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【００６２】
なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。
【００６３】
（温度応答性ポリマー）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。
【００６４】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。
【００６５】
ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【００６６】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００６７】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００６８】
上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００６９】
特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【００７０】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。
【００７１】
更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００７２】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００７３】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００７４】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００７５】
以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００７６】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。
【００７７】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。
【００７８】
カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８０】
他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。
【００８１】
ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。
【００８２】
ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。
【００８３】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含む。
【００８４】
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００８５】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００８６】
溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８７】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００８８】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００８９】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００９０】
この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【００９１】
次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【００９２】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。
【００９３】
この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【００９４】
そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００９５】
この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００９６】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００９７】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００９８】
この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【００９９】
上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【０１００】
なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。
【０１０１】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。
【０１０２】
更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。
【０１０３】
更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。
【０１０４】
（温度応答性ポリマー）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。
【０１０５】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。
【０１０６】
従来の温度応答性ポリマーのうちの１つ（特開２０１４−１６２８６５号公報参照）では、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡは、ポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
そして、上記温度応答性ポリマーを、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記従来の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。
【０１０７】
一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
【０１０８】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。
【０１０９】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【０１１０】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。
【０１１１】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【０１１２】
上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【０１１３】
特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【０１１４】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。
【０１１５】
更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【０１１６】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【０１１７】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【０１１８】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【０１１９】
以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【０１２０】
（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（Ｃ３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。なお、（Ｃ２）トリスは任意選択的な成分である。
【０１２１】
（温度応答性ポリマー組成物）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物は、上記の通り、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。
【０１２２】
（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（Ｃ２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（Ｃ３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【０１２３】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【０１２４】
ここで、上記（Ｃ１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【０１２５】
また、（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【０１２６】
上記（Ｃ２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【０１２７】
上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピン等の人工核酸等が挙げられる。
【０１２８】
また、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【０１２９】
（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸等のジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【０１３０】
なお、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【０１３１】
ここで、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、質量割合であるものとする。
【０１３２】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【０１３３】
また、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【０１３４】
上記と同様の理由により、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【０１３５】
ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（Ｃ１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（Ｃ３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。
【０１３６】
Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
【０１３７】
上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。
【０１３８】
（培養器準備工程）
本発明の実施形態の製造方法において、上記培養器準備工程は、上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物で、細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する工程である。
【０１３９】
上記培養器準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー溶液としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（培養器準備工程ＩＩ）としてもよい。
【０１４０】
上記培養器準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃等）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。
【０１４１】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０１４２】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）に対して、０．０５〜２．０質量％であることが好ましく、０．１〜１．５質量％であることがより好ましい。
【０１４３】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００質量％）に対して、０．００００１〜０．０００１５質量％であることが好ましく、０．００００３〜０．０００１質量％であることがより好ましい。
【０１４４】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００質量％）中の水の質量割合が０．５質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。
なお、水の質量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法等当業者に周知の方法により測定可能である。
【０１４５】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面上に、被覆培養面を１個設けてもよいし、複数の被覆培養面を設けてもよい。なお、培養面の一部に温度応答性ポリマー溶液を塗布する場合は、培養面が細胞非接着性である細胞培養器を用いることが好ましい。
なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。
【０１４６】
上記培養器準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０〜７０℃、時間１〜３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。
【０１４７】
上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。
【０１４８】
上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。
【０１４９】
上記培養器準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。
【０１５０】
上記培養器準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。
【０１５１】
上記細胞培養器としては、市販のマルチウェルプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。上記細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ガラス等が挙げられる。中でも、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であり、透明性があるため顕微鏡観察に向いているという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。
【０１５２】
上記細胞培養器は、培養面表面に細胞接着処理等の処理が施されたものであってもよいし、表面が無処理であってもよい。上記培養面表面は、細胞の接着性を調整するために、コーティング処理、加工処理等がされていてもよい。
【０１５３】
上記培養面の平面視形状は、特に限定されないが、例えば、略四角形等の略多角形、略円形等の形状が挙げられる。中でも、より均質な細胞構造体が得られやすいという観点から、略円形が好ましい。
【０１５４】
上記培養面の底形状（底面の断面形状）は、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸状底等が挙げられる。中でも、より均質で球状の細胞構造体が得られやすいという観点から、平底又は若干のＲがついた凹面底が好ましい。
【０１５５】
上記細胞培養器の培養面の面積は、心筋細胞への酸素供給の観点から、２００ｍｍ２以下であることが好ましく、７５ｍｍ２以下であることがより好ましく、３２ｍｍ２以下であることがさらに好ましい。なお、上記細胞培養器の培養面の面積の下限値は、市販サイズのものであれば使用可能であり、特に限定されない。
【０１５６】
上記被覆培養面の各面積（温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された部分の各面積）は、心筋細胞への酸素供給の観点から、２００ｍｍ２以下であることが好ましく、７５ｍｍ２以下であることがより好ましく、３２ｍｍ２以下であることがさらに好ましい。
【０１５７】
上記被覆細胞培養器は、被覆培養面が単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーの量が、０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｍ２であることが好ましく、０．５〜５．０ｎｇ／ｍｍ２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、塊状の細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。
【０１５８】
上記被覆細胞培養器における、被覆培養面のゼータ電位としては、０〜５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０〜３５ｍＶ、更に好ましくは１０〜２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の細胞構造体を一層作製しやすくなる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、被覆培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５〜＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。
【０１５９】
上記被覆培養面に対する水の接触角としては、本発明の効果を高める観点から、５０〜９０°が好ましく、より好ましくは６０〜８０°、更に好ましくは６２〜７８°である。なお、被覆培養面に対する水の接触角とは、被覆培養面内の任意の数点において、ＪＩＳ  Ｒ  ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。
【０１６０】
（播種工程）
上記播種工程は、心筋細胞と、上記心筋細胞１００個に対して２００〜３００個の割合の線維芽細胞を上記被覆細胞培養器に播種する工程である。細胞の播種は、全細胞を混合して一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。また、各細胞は、一度に播種してもよいし、複数回に分けて播種してもよい。
【０１６１】
上記被覆細胞培養器の上記被覆培養面に播種する細胞は、少なくとも心筋細胞、線維芽細胞を含む。
上記心筋細胞としては、心筋細胞と線維芽細胞とが一層均質に分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、心筋細胞、心筋幹細胞、および分化誘導段階のｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等が好ましい。
上記心筋細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１６２】
上記線維芽細胞としては、心筋線維芽細胞、皮下脂肪、筋膜、滑膜、骨膜由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、心筋細胞と線維芽細胞とが一層均質に分散した細胞構造体が得られやすいという観点から、心筋線維芽細胞、皮下脂肪由来の間葉系幹細胞が好ましい。
上記線維芽細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１６３】
上記播種工程において、さらに血管内皮細胞や血管間質細胞を播種してもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１６４】
上記播種工程において、さらに免疫系細胞を播種してもよい。上記免疫系細胞としては、例えばマクロファージ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＴ細胞、単球等が挙げられる。中でも、心不全等の心疾患を起こした組織に一層近い細胞構造体が得られるという観点から、マクロファージ及び／又はＴ細胞を含むことが好ましい。
上記免疫系細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１６５】
上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する線維芽細胞の割合は、２００〜３００個であり、２００〜２５０個であることが好ましく、２００〜２３０個であることがより好ましい。線維芽細胞の割合を、心筋細胞１００個に対して２００個以上とすることにより、混合細胞が丸まって塊状の細胞構造体を形成しやすくなる。また、３００個以下とすることにより、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体を得ることができる。
【０１６６】
上記播種工程において、播種する全細胞中の心筋細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、全細胞数（１００％）に対して、２５〜５０％であることが好ましく、２５〜３０％であることがより好ましい。
【０１６７】
上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する血管内皮細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、５〜５０個であることが好ましく、１０〜３０個であることがより好ましい。
【０１６８】
上記播種工程において、心筋細胞１００個に対する免疫系細胞の割合は、心不全等の心疾患を起こした組織により近い細胞構造体が得られる観点から、５〜５０個であることが好ましく、１０〜３０個であることがより好ましい。
【０１６９】
上記播種工程において、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度は、上記被覆培養面の表面積に対して、９０〜１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５〜１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９〜１００％コンフルエントである。播種する細胞密度が上記範囲であると、各細胞がそれぞれコロニーを形成せずに、均質分散した状態を維持して凝集して細胞構造体を形成することができる。また、細胞の密度が高いと、播種した細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に塊状の細胞構造体を形成することができるため、播種した細胞と細胞数の割合が同じ細胞構造体を形成することができる。また、細胞の増殖速度の違いによる影響を受けにくい。また、播種した細胞は、増殖する際の性質が変化する場合があるが、細胞が増殖しにくいと、播種時と同じ性質の細胞を含む細胞構造体を形成することができる。
細胞の種類にもよるが、播種後の全細胞の被覆培養面上の密度としては、２０〜１５，０００個／ｍｍ２が好ましい。例えば、被覆培養面の面積が２００ｍｍ２である２４ウェル細胞培養プレートに、１．０ｍＬの細胞液を加えて播種する場合、４×１０４〜３０×１０４個／ｍＬが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
【０１７０】
細胞の播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
なお、細胞は培地に希釈して播種することが好ましい。希釈する培地としては、細胞の培養が可能な培地であれば、特に限定されない。
【０１７１】
（培養工程）
上記培養工程は、播種した細胞を培養して塊状の細胞構造体を得る工程である。
【０１７２】
心筋炎を起こした組織では、心筋細胞が壊死し、壊死した心筋細胞に置き換わって線維芽細胞が過増殖していることに加え、炎症性の免疫細胞も多く浸潤していることが知られている。免疫系細胞が浸潤した心筋炎組織を試験管内で再現するには、心筋細胞、線維芽細胞に加え、浮遊細胞である免疫系細胞を浸潤させた細胞構造体を作製することが望ましい。しかしながら、細胞構造体の作製に１〜２週間を要する従来のハンギングドロップ法や低接着性培養皿では、これは困難であった。
本実施形態の製造方法では、上記培養工程において、さらに免疫系細胞を被覆細胞培養器に添加してもよい。免疫系細胞を添加するタイミングとしては、上記播種工程以降（細胞の播種と同時以降）であって、細胞構造体が得られる前であることが好ましく、播種した細胞が被覆培養面に付着してシート状の細胞構造体を形成（図２の（ｉｉｉ）参照）した以降、シート状の細胞構造体が被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体を形成する前までがより好ましい。即ち、免疫系細胞の添加は、播種工程時に播種してもよいし、播種工程後に添加してもよい。
具体的には、細胞の播種と同時以降、細胞（例えば、最後に播種する細胞）の播種後４８時間以内に免疫系細胞を添加することが好ましい。
免疫系細胞を上記のタイミングで添加することにより、浮遊細胞である免疫系細胞が重力の作用で沈降し、被覆培養面に接着した細胞が巾着袋状に凝集する際に免疫系細胞が内部に取り込まれ、これによって内部に免疫系細胞を含む細胞構造体を形成することができ、心筋炎、心不全等を起こした心疾患モデルの組織に一層近い細胞構造体を得ることができる（図２参照）。
【０１７３】
播種した細胞を培養する条件としては、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。細胞の培養は、塊状細胞構造体が形成されるまで続けることが好ましく、具体的には、１０〜９６時間培養することが好ましく、１５〜５０時間培養することがより好ましい。
なお、本実施形態の細胞構造体の製造方法では、驚くべきことに、接着細胞（例えば、心筋細胞等）と、浮遊細胞（例えば、免疫系細胞等）とを混合して、播種、培養する場合であっても、特殊な培地を用意することなく、使用する接着細胞に適した培地又は使用する浮遊細胞に適した培地(好ましくは接着細胞に適した培地)を用いて、接着細胞と浮遊細胞とを同時に、播種、培養すれば、細胞構造体を得ることができる。
【０１７４】
上記被覆培養面に接着、培養した、上記心筋細胞及び上記線維芽細胞を含む混合細胞は、自己凝集をして、塊状の細胞構造体を形成する。得られた細胞構造体は、その塊状の構造体内に生存している細胞を有する。
【０１７５】
上記細胞構造体の大きさは、内部に生きた心筋細胞を含み、拍動した細胞構造体が得られるという観点から、例えば、外径が３０〜２００μｍであることが好ましく、４０〜１５０μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることがさらに好ましい。
【０１７６】
本実施形態の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体は、心不全等の心疾患を起こした組織を再現した心疾患モデルであり、例えば、心筋梗塞、心不全、心筋炎等の心疾患の研究、心疾患の薬剤開発、心疾患の治療法開発の用途に用いることができる。
【０１７７】
以下に、本実施形態の細胞構造体の製造方法の一例について、図１、２を用いて説明する。
【０１７８】
図１は、心筋細胞と線維芽細胞とを含む細胞構造体の製造方法の一例である。
細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図１（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図１（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着する（図１（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図１（ｉｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図１（ｉｖ）参照）。その後、更に凝集を続け、塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図１（ｖ）参照）。
【０１７９】
図２は、心筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ等の免疫系細胞（浮遊細胞）を含む細胞構造体の製造方法の一例である。
細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマーを塗布して、被覆し、被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備する（図２（ｉ）（ｉｉ）参照）。その後、被覆培養面に、培地で希釈した、心筋細胞と線維芽細胞との混合細胞を加え、混合細胞を播種する（図２（ｉｉ）参照）。播種した混合細胞は、被覆培養面全面に接着し、シート状の細胞構造体（単層）を形成する（図２（ｉｉｉ）参照）。なお、この例では、混合細胞の密度は、１００％コンフルエントである（図２（ｉｉｉ）参照）。
心筋細胞と線維芽細胞とがシート状の細胞構造体を形成した後に、マクロファージ等の免疫系細胞を添加する（図２（ｉｖ））。その後、被覆培養面に接着した混合細胞は、被覆培養面中央部に向かって凝集し始め、端部が被覆培養面から離れて反り返り始めて、端部が反り返った細胞構造体となる（図２（ｖ）参照）。その際、シート状の細胞構造体に付着したり、培養皿中に浮遊したりしている免疫系細胞を包み込む。その後、更に凝集を続け、心筋細胞、線維芽細胞及び免疫系細胞を含む塊状の細胞構造体となり、被覆培養面から浮遊する（図２（ｖｉ）参照）。
【実施例】
【０１８０】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１８１】
（実施例１）
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５ｍＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５質量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１．０×１０５ｇ／ｍｏｌ（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。
【０１８２】
上述の温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、代表的なピークを示す。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, -O-CH2-).
ここで、主鎖のメチル基（δ 0.8-1.2）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの
場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖のジメチルアミノ基（δ 2.2-2.4）のメチ
ルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき６個で）Ｂと
から、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、重合反応と同時に進行する側鎖のエステル結
合の加水分解反応により生じた側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、上述の温度応答性ポリマーの場合は９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。
【０１８３】
上述の温度応答性ポリマーの曇点を以下の方法で測定した。
温度応答性ポリマーの３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０〜４０℃の間で測定した。
その結果、２０〜３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、温度応答性ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
なお、温度応答性ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。
【０１８４】
上述の温度応答性ポリマーを、純水に溶解して、温度応答性ポリマー溶液（終濃度６ｎｇ／μＬ）を調製した。３５ｍｍディッシュ（住友ベークライト社製、品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」（登録商標）、ＭＳ−９０３５Ｘ）の培養面上の１０箇所に、温度応答性ポリマー溶液０．５μＬを、円形状に塗布した。
１箇所あたりの円形の被覆培養面の直径は、約２，０００μｍであり、また、各被覆培養面間の距離は、約２，０００μｍであった。
そして、インキュベーター（４０℃）中で１時間放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させ、複数の被覆培養面を有する被覆細胞培養器を準備した。
【０１８５】
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）３００個の割合で混合した混合細胞を、培地（ＳｋＧＭ（ロンザ株式会社、型番：ＣＣ−３２４５）＋１０％ＦＢＳ（ギブコ社製、ロット番号：７１５９２９）中に混ぜて調製した、７．２×１０６個／ｍＬの混合細胞溶液５ｍＬを被覆細胞培養器に加え、細胞を播種した。
その後、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で、１時間培養し、新たな培地を用いて培地交換し、さらに細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で、４８時間培養して、塊状の細胞構造体を得た。
【０１８６】
（実施例２）
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を２３３個の割合で混合したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１８７】
（実施例３）
細胞には、心筋細胞としての新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞、間葉系幹細胞としてのＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）、免疫系細胞としてのマクロファージの３種を使用した。マクロファージとしては、ラット骨髄由来の単球から分化誘導して使用した（コスモバイオ社製、骨髄単球培養キット、品番：ＢＭＭ０１）。
第一段階として、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞２５０個の割合で混合した細胞を実施例１と同様にして播種し、５時間後に、細胞が接着して単層を形成した後に、培地交換を行った。この単層の上へ、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ラット由来マクロファージ５個の割合となるように、マクロファージを含むラット由来マクロファージ浮遊液を加え、静置培養を継続したこと以外、実施例１と同様の操作を行なった。
心筋細胞と間葉系幹細胞からなる単層培養層が巾着袋状に凝集する際に、該単層培養層の上に沈降していたマクロファージは凝集に巻き込まれ、１個の塊状の細胞構造体を得た。露出した培養面にマクロファージは確認されず、播種したマクロファージの全数が細胞凝集塊中に取り込まれたことが確認された。
【０１８８】
（比較例１）
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を７５個の割合で混合したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１８９】
（比較例２）
ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を混ぜずに、新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞のみから細胞溶液を調製したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１９０】
（比較例３）
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を３３個の割合で混合したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１９１】
（比較例４）
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を２５個の割合で混合したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１９２】
（比較例５）
新生Ｌｅｗｉｓ系ラット心筋細胞１００個に対して、ＧＦＰ組換えルイスラット脂肪組織由来間葉系幹細胞を１００個の割合で混合したこと以外、実施例１と同様にして塊状の細胞構造体を得た。
【０１９３】
［評価］
（細胞構造体の外観）
実施例、比較例で得られた塊状の細胞構造体を、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察し、以下の基準で細胞の外観を評価した。
○（良好）：１０箇所全ての被覆培養面において、球形の塊状の細胞構造体が得られた。
△（不良）：１０箇所のいずれかの被覆培養面において、被覆培養面に接着した細胞が凝集せず単層のまま、又は凝集する部分と被覆培養面から剥離しない接着部分とが混在する端部が反り返った細胞構造体、の例が見られた。
【０１９４】
（拍動の有無）
実施例、比較例で得られた塊状の細胞構造体を、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＥＳ−Ｔｉ」）で観察した。その後、４８時間にわたって、観察を行った。そして、以下の基準で拍動の有無を評価した。
○（良好）：４８時間の観察期間中、当初は拍動が確認されたが、その後拍動が見られなくなった。
×（不良）：４８時間の観察期間中、毎回の観察で拍動が確認された。
【０１９５】
【表１】
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【０１９６】
表１に示すように、実施例の細胞構造体は、細胞構造体形成直後は拍動していたものの、その後拍動が見られなり、心疾患モデルとして使用可能と判断した。一方比較例の細胞構造体は、４８時間の観察期間において、拍動が観察され、健常な心臓に近い形態と判断した。
【図１】
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【図２】
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