(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトやその他の動物に対する有効性を評価するために、新たなグループＣ亜種を含め４つの亜種を区別して検出可能なビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法、及び定量法の提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対、及び前記オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマー、前記核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為の、請求項４に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス以外のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種との交差反応を示さない、請求項５に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム・ブレーベとの交差反応を示さない、請求項５又は６に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キット。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為の、請求項８に記載の核酸増幅用キット。
【請求項１０】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無によりビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の当該試料中における有無を判断することを含む、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、当該試料中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の量を、当該処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、オリゴヌクレオチドに関する。より詳しくは、本技術は、特定の配列を有するオリゴヌクレオチド及び当該オリゴヌクレオチドからなる核酸増幅用プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌は離乳前の乳児腸管内に多く生息しており、乳児の腸内環境を良好に維持することに貢献していると考えられている。ビフィドバクテリウム属細菌が有する生理的機能として、宿主に対する腸管感染防御作用、免疫機能の増強作用、栄養、腸内腐敗抑制作用などが挙げられる。上記のようなビフィドバクテリウム属細菌の有用性に着目し、育児用粉乳にビフィドバクテリウム属細菌を添加すること、並びに、製剤化したビフィドバクテリウム属細菌をヒトに投与することで感染症を防ぐこと若しくはアレルギー疾患の治療を促進することが考案されている。ヒトに投与されるビフィドバクテリウム属細菌としては、生理的観点からヒト腸管に生息するものであることが望ましい。ヒト腸管に生息するビフィドバクテリウム属細菌として、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）などが挙げられる。
【０００３】
ビフィドバクテリウム・ロンガムに関して、従前３つの亜種が存在することが知られていた。当該３つの亜種は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・スイス（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｉｓ）である（以下それぞれ「ロンガム亜種」、「インファンティス亜種」、及び「スイス亜種」ともいう）。しかし、近年急速に蓄積されてきたゲノム情報を踏まえ、新たな亜種としてグループＣ亜種が提唱された（下記非特許文献１第６〜７頁）。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガムは４つの亜種、すなわちロンガム亜種、インファンティス亜種、スイス亜種、及びグループＣ亜種に分類されうる。グループＣ亜種には、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＸＹ０１及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムＣＭＣＣＰ０００１が含まれる（下記非特許文献１図３）。
【０００４】
ビフィドバクテリウム属細菌のヒトやその他の動物に対する有効性を評価するためには、利用されるビフィドバクテリウム属細菌が、他のビフィドバクテリウム属細菌と区別して検出される必要がある。特定のビフィドバクテリウム属細菌を検出するには、例えば被検細菌を培養して形態的及び生化学的な性質により菌を特定する方法やＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験があるが、前者については手間や時間がかかる上に複雑であるという問題があり、後者については手間がかかるうえに精度についての問題もある。そこで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子等を検出するＰＣＲプライマーを用いてビフィドバクテリウム属細菌を解析する方法が行われてきている（下記非特許文献２〜８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pangenome  analysis  of  Bifidobacterium  longum  and  site-directed  mutagenesis  through  by-pass  of  restriction-modification  systems.    BMC  Genomics.  2015,  Vol.16,  No.1,  p.832-850.
【非特許文献２】Differentiation  of  bifidobacteria  by  use  of  pulsed-field  gel  electrophoresis  and  polymerase  chain  reaction.  Int  J  Food  Microbiol.  1996,  Vol.29,  No.1,  p.11-29.
【非特許文献３】Distribution  of  bifidobacterial  species  in  human  intestinal  microflora  examined  with  16S  rRNA-gene-targeted  species-specific  primers.  Appl  Environ  Microbiol.  1999,  Vol.65,  No.10,  p.4506-4512.
【非特許文献４】Molecular  differentiation  of  Bifidobacterium  species  with  amplified  ribosomal  DNA  restriction  analysis  and  alignment  of  short  regions  of  the  ldh  gene.  FEMS  Microbiol  Lett.  2000,  Vol.191,  No.1,  p.17-24.
【非特許文献５】Evaluation  of  the  PCR  method  for  identification  of  Bifidobacterium  species.  Lett  Appl  Microbiol.  2008,  Vol.46,  No.1,  p.7-13.
【非特許文献６】Use  of  tuf  gene-based  primers  for  the  PCR  detection  of  probiotic  Bifidobacterium  species  and  enumeration  of  bifidobacteria  in  fermented  milk  by  cultural  and  quantitative  real-time  PCR  methods.  J  Food  Sci.  2010,  Vol.75,  No.8,  p.M521-527.
【非特許文献７】Establishment  of  a  sensitive  system  for  analysis  of  human  vaginal  microbiota  on  the  basis  of  rRNA-targeted  reverse  transcription-quantitative  PCR.  J  Microbiol  Methods.  2015,  Vol.111,  p.93-104.
【非特許文献８】Species  specific  identification  of  nine  human  Bifidobacterium  spp.  in  feces.  Syst  Appl  Microbiol.  2002,  Vol.25,  No.4,  p.536-43.
【非特許文献９】Comparative  Genomic  Analysis  of  45  Type  Strains  of  the  Genus  Bifidobacterium:  A  Snapshot  of  Its  Genetic  Diversity  and  Evolution. PloS  ONE. 2015, Vol.10, No.2,  e0117912.  doi:10.1371/journal.pone.0117912
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムには、新たなグループＣ亜種を含め４つの亜種が含まれる。これらの亜種を区別して検出することは、細菌の有効性を評価するために必要である。
【０００７】
また、乳児腸管には、ビフィドバクテリウム・ロンガムと近縁であるビフィドバクテリウム・ブレーベが存在する。
例えば、育児用粉乳にビフィドバクテリウム・ロンガムを添加した場合の有効性を評価するためには、ビフィドバクテリウム・ブレーベとビフィドバクテリウム・ロンガムとを区別して検出する必要がある。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの乳児腸管における有効性を評価するためには、ビフィドバクテリウム・ブレーベとビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとを区別して検出する必要がある。
【０００８】
上記非特許文献２〜８には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子等の特定の領域を標的としたＰＣＲプライマーを用いてビフィドバクテリウム属細菌を解析する方法が開示されている。しかし、これら非特許文献に記載のＰＣＲプライマーは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを他の３つの亜種から区別して検出できない又はビフィドバクテリウム・ブレーベも検出してしまうという問題がある。そこで、特定のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種を他の亜種から区別して検出でき且つビフィドバクテリウム・ブレーベからも区別して検出できる技術が必要である。
【０００９】
本技術は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出に関する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス検出用プライマーのほとんどが１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子上の配列を標的としたものであった。  本発明者らは、細菌検出においてこれまで着目されていなかったｃｌｐＣ（タンパク質分解酵素）遺伝子の配列を調査したところ、上記課題を解決できる特定の配列を見つけ出し、本技術を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
また、本技術は、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。
【００１２】
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーも提供する。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為のものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス以外のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種との交差反応を示さないものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベとの交差反応を示さないものでありうる。
【００１３】
本技術は、前記核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キットも提供する。
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為のものでありうる。
【００１４】
本技術は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法も提供する。当該検出方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無によりビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の当該試料中における有無を判断することを含む。
また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの定量方法も提供する。当該定量方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、当該試料中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の量を、当該処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む。
【発明の効果】
【００１５】
本技術により、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを特異的に検出することができる。本技術により、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを他の亜種から区別して検出でき且つビフィドバクテリウム・ブレーベからも区別して検出できる。なお、本技術により奏される効果は、ここに記載された効果に必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プライマー１及び２の設計領域を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１８】
＜１．オリゴヌクレオチド＞
本技術は、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。また、本技術は、以下の配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
2017216979.tif 000002
これらオリゴヌクレオチドによって、他方のオリゴヌクレオチドと組み合わせて核酸増幅に用いた場合にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出ができるという効果が奏される。なお、本明細書内に記載の塩基配列は、他に言及されない限り、左端が５’端であり、右端が３’端である。
【００１９】
本技術のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのｃｌｐＣ（タンパク質分解酵素）遺伝子領域中の特定の配列に対応する。その結果、本技術のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことによって、当該ｃｌｐＣ遺伝子領域中の特定の領域が増幅される。
【００２０】
ビフィドバクテリウム・ロンガムは４つの亜種に分類されるが、上記オリゴヌクレオチドを用いた核酸増幅においてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸、特には染色体ＤＮＡが特異的に増幅される。すなわち、当該核酸増幅において他の３つの亜種の核酸は増幅されないか、又は増幅されたとしても検出限界以下となり、検出されない。よって、この亜種の細菌を、他の３つの亜種（すなわちロンガム亜種、スイス亜種、及びグループＣ亜種）と区別して検出することが可能になるという効果が奏される。
【００２１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムはビフィドバクテリウム・ブレーベと極めて近縁であるが（非特許文献９の図３参照）、上記オリゴヌクレオチドを用いた核酸増幅において、ビフィドバクテリウム・ブレーベの核酸は増幅されないか、又は増幅されたとしても検出限界以下となり、検出されない。よって、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを、ビフィドバクテリウム・ブレーベと区別して検出することが可能になるという効果が奏される。
【００２２】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。当該オリゴヌクレオチド対を核酸増幅に用いることで、上記で述べた効果が奏される。
【００２３】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに、これらオリゴヌクレオチドの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。これらオリゴヌクレオチドについても、上記で述べた効果が奏されうる。
【００２４】
本技術のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の合成方法や装置により製造されうる。合成方法としては例えば固相法が挙げられ、装置としては自動オリゴヌクレオチド合成装置が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
＜２．核酸増幅用プライマー＞
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーを提供する。本技術の核酸増幅用プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸、特にはＤＮＡ、より特には染色体ＤＮＡ中の特定の領域が特異的に増幅されるので、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出が可能となる。よって、本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為のものでありうる。
【００２６】
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス以外のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種との交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ロンガムに含まれる４つの亜種のうち、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸が特異的に増幅され、他の３つの亜種（すなわちロンガム亜種、スイス亜種、及びグループＣ亜種）の核酸は増幅されないか、又は増幅されたとしても検出限界以下となり、検出されない。このように、本技術の核酸増幅用プライマーにより、これら４つの亜種のうちのビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸が特異的に増幅される。より特には、本技術の核酸増幅用プライマーにより、これら４つの亜種のうち、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸のみが増幅されうる。
【００２７】
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベとの交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ロンガムと近縁であるビフィドバクテリウム・ブレーベの核酸は増幅されないか、又は増幅されたとしても検出限界以下となり、検出されない。このように、本技術の核酸増幅用プライマーにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベの核酸が増幅されることなく、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの核酸が特異的に増幅される。
【００２８】
本技術において、核酸増幅とは、試料中の核酸のうち増幅したい核酸（標的核酸）を、当該標的核酸の塩基配列の相補性を利用して増幅することをいう。核酸増幅方法の具体例として、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、及び３ＳＲなどが挙げられるがこれらに限定されない。本技術において、核酸増幅は好ましくはＰＣＲである。
【００２９】
本技術において、ＰＣＲは、一般的に行われているＰＣＲと同様の方法により行われてよい。典型的には、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、並びにその他の必要成分を含む反応液を用意し、変性工程、アニーリング工程、及び伸長反応工程に各々適した温度で当該反応液を所定時間保温するという一連の工程を２０〜４０サイクル繰り返すことにより行われうる。各工程における温度や保温時間並びにサイクル数は当業者により適宜定められうる。
【００３０】
ＰＣＲの反応条件は、使用する酵素や装置等に応じて当業者により適宜設定されうる。具体的には、例えば９５℃３分間加温後、変性工程：９０〜９８℃で１０〜４０秒、アニーリング工程：５０〜６５℃で２０〜４０秒、及び伸長反応工程：７０〜７５℃で２０〜４０秒の一連の工程を２０〜４０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する反応条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０２〜１０８コピーの染色体ＤＮＡに対しプライマー０．２〜２μｍｏｌであることが好ましい。
【００３１】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いることができるものであれば特に制限されない。ＤＮＡポリメラーゼとしては例えば、市販入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ、及びＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）などのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）などのＤＮＡポリメラーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。上記ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼは、これらの酵素と緩衝液とからなる組成物であってもよい。
【００３２】
本技術の核酸増幅用プライマーによる細菌の検出は、細菌の核酸が増幅されることにより行われるので、細菌の培養が行われなくてもよい。その結果、本技術により、細菌の検出を迅速、簡便、低コスト且つ高精度に行うことが可能になる。
【００３３】
また、検出に先立ち細菌の培養が行われてもよい。細菌の培養を行う場合は、例えば糞便、食品、又は土壌から得た細菌が、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養されうる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から細菌を抽出してもよい。
【００３４】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いて増幅される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。増幅される核酸は、細菌から抽出されたものでありうる。細菌からの核酸の抽出は、当業者に既知の方法により行われてよい。例えば、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔやＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３  ｐ２０８−２１８（１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１  ｐ５２７９−５２８０（１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等にも記載されている。
【００３５】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのＤＮＡがＰＣＲにより増幅される場合、例えば３５０〜４５０ｂｐ、特には３６０〜４２０ｂｐ、より特には３７０〜４００ｂｐの増幅産物が得られうるが、通常は３８４ｂｐの増幅産物が得られる。そのため、得られた増幅産物がビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来のものであるかをより確かに確認するために、増幅産物の長さが決定されてもよい。増幅産物の長さの決定は、当業者により適宜行われてよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行われうる。
【００３６】
＜３．核酸増幅用キット＞
本技術は、核酸増幅用キットも提供する。当該核酸増幅用キットは、本技術の核酸増幅用プライマーを含む。当該核酸増幅用キットは、核酸増幅に必要な他の要素も含みうる。当該他の要素として、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び／又は緩衝剤が挙げられるがこれらに限定されない。本技術の核酸増幅用キットは、陽性対照として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの染色体ＤＮＡ又は本技術の核酸増幅用プライマーによって増幅され得る染色体ＤＮＡ断片、及び／又は、陰性対照として、本技術の核酸増幅用プライマーの塩基配列のうち１、２、３、４又は５塩基についてミスマッチを有する塩基配列を含むＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
【００３７】
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為のものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用キットは、試料中にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスが存在するか又はこの細菌由来の核酸が存在するかを調査する為に用いられうる。当該調査の為に、本技術の核酸増幅用キットによる試料の核酸増幅反応が行われうる。当該核酸増幅反応によって増幅産物が得られた場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はこの細菌由来の核酸が存在することが確認され、増幅産物が得られない場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はこの細菌由来の核酸が存在しないことが確認されうる。本技術において、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来の核酸とは、例えばこの細菌に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡ、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。
【００３８】
＜４．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法及び定量方法＞
本技術は、以下に述べるとおり、本技術のオリゴヌクレオチド対を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法及び定量方法も提供する。
【００３９】
すなわち、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無によりビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の当該試料中における有無を判断することを含む、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの検出方法も提供する。本技術の検出方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の検出方法において、試料は細菌を１種類だけ含んでもよく、又は複数種類の細菌を含んでもよい。前者の場合、増幅産物が得られることによって、試料の細菌がビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスであると同定される。後者の場合は、増幅産物が得られることによって、試料がこの細菌を含むと判定されうる。
【００４０】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、当該試料中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来核酸の量を、当該処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの定量方法も提供する。本技術の定量方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の定量方法によって、試料中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの存在量を定量することが可能となる。
【００４１】
前記検出方法又は定量方法が適用されうる試料としては、糞便、食品、及び土壌、並びにこれらから得られた試料、例えばこれらをＤＮＡ抽出キットにより処理して得られたＤＮＡ含有試料などを挙げることができるがこれらに限定されない。試料は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのみを含むもの若しくは含まないものであってよく、又はこの細菌と他の細菌とを含むものであってもよい。他の細菌は、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス以外のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種、又はビフィドバクテリウム・ロンガム以外のビフィドバクテリウム属細菌でありうる。試料に含まれる細菌は、分離された単一の種類の細菌からなってよく、又は、複数種類の細菌を含むものであってもよい。
【００４２】
前記検出方法において、増幅産物の有無の決定は、当業者に既知の手法により行われうる。例えば、ＱＩＡｘｃｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて増幅反応後の溶液を電気泳動することにより増幅産物を検出することができる。或いは、アガロース電気泳動又はキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイド又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うことにより、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく増幅産物を検出することもできる。これらの手法により増幅産物の有無を調査し、その結果によりビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はこの細菌由来の核酸の当該試料中における有無が判断されうる。必要に応じて、増幅産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによって、増幅産物の有無又は量を確認することもできる。
【００４３】
前記定量方法において、Ｃｔ値に基づきビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又はこの細菌由来の核酸の量を定量することは、当業者により適宜行われうる。Ｃｔ値（Threshold Cycle）は、増幅産物が或る量に達したときのサイクル数である。当該定量は例えば、段階希釈した核酸含有量が既知の複数の参照試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、その結果からＣｔ値と核酸含有量との関係を示す検量線を作成し、一方で、被検試料についてもリアルタイムＰＣＲを行ってＣｔ値を得、前記検量線に被検試料のＣｔ値を当てはめることにより行われうる。リアルタイムＰＣＲにより、経時的に増幅反応を検出することができる。
【００４４】
前記定量方法において、増幅産物の検出は蛍光により検出されうる。検出方法としては、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光物質としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４５】
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【実施例１】
【００４６】
［プライマーの設計及び合成］
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、米国国立バイオテクノロジー情報センター）にゲノム配列が公開されているビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム５種類、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス１０種類、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・スイス３種類、ビフィドバクテリウム・ロンガム・グループＣ亜種３種類、及びビフィドバクテリウム・ブレーベ２種類の合計２３種類のハウスキーピング遺伝子（ｄｎａＢ、ｄｎａＧ、ｄｎａＪ、ｐｋｎＢ、ｐｕｒＦ、ｒｐｏＣ、ｘｆｐ、ｃｌｐＣ）のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列やアミノ酸配列の比較ソフトであるＭＥＧＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ／ｈｏｍｅ）を用いて比較した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス１０種類とそれ以外１３種類とを区別可能な領域をｃｌｐＣ遺伝子内に見出した。図１に当該領域の配列が示されており、当該領域は図１中のプライマー１設計領域及びプライマー２設計領域である。これら２つの領域に挟まれる領域を増幅するために用いられるプライマーとして、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した（以下それぞれ「プライマー１」及び「プライマー２」という）。これら２つのオリゴヌクレオチドとして、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社において合成されたものを用いた。プライマー１がフォワードプライマーであり、プライマー２がリバースプライマーである。
2017216979.tif 000003
【００４７】
［被検細菌の染色体ＤＮＡの調製］
下記表１に列記したビフィドバクテリウム属細菌をそれぞれＭＲＳ液体培地（０．５％のＬ−システイン塩酸塩一水和物を添加した）中において３７℃で嫌気的に培養した。培養後の菌液１ｍＬを７，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。こうして得られた菌体沈殿物から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて付属のプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。
【００４８】
【表１】
2017216979.tif 000004
【００４９】
［ＰＣＲによる被検細菌の検出］
下記表２に記載の組成のＰＣＲ反応液を調製し、Ｖｅｒｉｔｉ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）においてプライマー１及びプライマー２を用いてＰＣＲを行った。当該ＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間加温後、変性９５℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で３５サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱であった。
【００５０】
【表２】
2017216979.tif 000005
【００５１】
上記ＰＣＲ後、ＱＩＡｘｃｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ後の反応液の電気泳動を行った。増幅産物の検出はデータ解析ソフトであるＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒを用いてＤＮＡマーカー（ＱＸ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｒ  １５ｂｐ／５ｋｂ（ＱＩＡＧＥＮ））を指標として検出した。その結果を、下記表３に示す。表３中、「＋」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されたことを、「−」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されなかったことを示す。なお、「ＲＦＵ」は、ＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒにより補正された蛍光強度の単位を表す。
【００５２】
【表３】
2017216979.tif 000006
【００５３】
表３に示されるとおり、５種類のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスにおいてのみ増幅産物が得られた。増幅産物の長さは、３８４ｂｐであった。従って、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスが特異的に検出されることが分った。
【００５４】
なお、本出願人が保有する他の５種類のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスについても、同じ方法でＰＣＲを行った。その結果、これら５種類の細菌を用いたいずれの場合においても、増幅産物が検出された。この結果からも、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスが特異的に検出されることが確認された。
【実施例２】
【００５５】
［非特許文献に記載のプライマーの検証］
上記非特許文献２〜８に、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを検出する為のフォワードプライマー及びリバースプライマーが記載されている。これらフォワードプライマー及びリバースプライマーの両者が一致する配列がビフィドバクテリウム・ロンガムの上記４つの亜種のゲノム配列中に存在しているかどうかを検証した。
【００５６】
上記検証において用いられたプライマーは、Ｉｎｆ  Ｕ５及びＩｎｆ  Ｌ６（非特許文献２第１５頁表２）、ＢｉＩＮＦ−１及びＢｉＩＮＦ−２（非特許文献３第４５０７頁表２）、Ｂｉｌ  Ｆ３及びＩｎｆ  Ｒ５（非特許文献４第１９頁表２）、ＩＦＴＩＮＦ−１及びＩＦＴＩＮＦ−２（非特許文献５第９頁表２）、Ｂｉｎｆ−ｔＦ及びＢｉｎｆ−ｔＲ（非特許文献６第Ｍ５２３頁表２）、ＢＩＮＦ−２３Ｓ−Ｆ及びＢＩＮＦ−２３Ｓ−Ｒ（非特許文献７第９９頁表２）、並びにＢ７９１ｆ及びｌｍ３ｒである（非特許文献８第５３８頁表２）。
【００５７】
上記検証において、上記配列比較ソフトＭＥＧＡを用いた。上記検証のために用いられたゲノム配列は、実施例１のプライマー設計において用いた２３種類のビフィドバクテリウム属細菌のうち、ビフィドバクテリウム・ブレーベ２種類を除くビフィドバクテリウム・ロンガム２１種類のものであった。
【００５８】
検証の結果を下記表４に示す。表４において、「＋」はフォワードプライマー及びリバースプライマーの両者が一致する配列が該当亜種のゲノム配列中に存在していることを、「−」は存在していないことを示す。
【００５９】
【表４】
2017216979.tif 000007
【００６０】
表４に示されるとおり、非特許文献２、４、５、７及び８に記載のプライマーはいずれも、インファンティス亜種以外の亜種のゲノム配列に一致する配列であることが分った。よって、非特許文献２、４、５、７及び８に記載のプライマーは、上記４亜種の分類においてインファンティスのみを検出できないと考えられる。そこで、非特許文献３及び６に記載のプライマーについて、さらに以下の検証を行った。
【００６１】
［定量的ＰＣＲ反応による検証］
非特許文献３及び６に記載のプライマー、並びに、実施例１で用いたプライマー１及び２が、ビフィドバクテリウム・ブレーベを検出しないかどうかを定量的ＰＣＲ反応により検証した。
【００６２】
非特許文献３に記載のプライマーは、以下に記載した配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである（以下それぞれ「プライマー３」及び「プライマー４」という）。
2017216979.tif 000008
【００６３】
非特許文献６に記載のプライマーは、以下に記載した配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである（以下それぞれ「プライマー５」及び「プライマー６」という）。
2017216979.tif 000009
【００６４】
上記プライマー３〜６として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社において合成されたものを用いた。プライマー１及び２として、実施例１で用いたものを用いた。
【００６５】
下記表５に記載の組成の定量ＰＣＲ反応液を調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）において、プライマー１及びプライマー２を用いて、９５℃２０秒間加温後、変性９５℃３秒、アニーリング／伸長６０℃３０秒の条件で４０サイクルという条件でリアルタイムＰＣＲを行った。プライマー３及びプライマー４を用いたリアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃２０秒間加温後、変性９５℃３秒、アニーリング５５℃２０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で４０サイクルであった。プライマー５及びプライマー６を用いたリアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃２０秒間加温後、変性９５℃３秒、アニーリング／伸長６３℃３０秒の条件で４０サイクルであった。検量線用鋳型ＤＮＡとしては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ. ｉｎｆａｎｔｉｓ ＪＣＭ１２２２のＤＮＡ（５．８×１０１、５．８×１０２、５．８×１０３、５．８×１０４、及び５．８×１０５コピー／μＬの５段階）を用いた。これら５段階の希釈系列の試料夫々についてリアルタイムＰＣＲを行い、特定の閾値におけるＣｔ値を取得し、そのＣｔ値に基づき検量線を作成した。当該検量線に、プライマー１及び２、プライマー３及び４、並びにプライマー５及び６の夫々を用いてリアルタイムＰＣＲを行って得られたＣｔ値を当てはめ、被験細菌から調製した染色体ＤＮＡ溶液中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来とされる核酸量を求めた。
【００６６】
【表５】
2017216979.tif 000010
【００６７】
定量的ＰＣＲ反応の結果を以下の表６に示す。表６において、「＋」は検出限界以上の標的領域ＤＮＡコピー数が検出されたことを、「−」は検出限界以上の標的領域ＤＮＡコピー数が検出されなかったことを示す。検出限界は、５．８×１０１コピー／ＤＮＡ溶液１μｌである。
【００６８】
【表６】
2017216979.tif 000011
【００６９】
表６に示されるとおり、プライマー１及び２を用いた定量ＰＣＲでは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２のみが検出され、いずれの種類のビフィドバクテリウム・ブレーベとも交差反応を示さなかった。よって、プライマー１及び２によって、ビフィドバクテリウム・ブレーベとの交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスが特異的に検出される。一方、プライマー３及び４並びにプライマー５及び６を用いた定量的ＰＣＲでは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ  インファンティスＪＣＭ１２２２を検出したものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベと交差反応を示し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを特異的に検出できなかった。
【００７０】
なお、本出願人が保有するビフィドバクテリウム・ブレーベの他の２２種類の細菌についても、同じ方法で定量的ＰＣＲを行った。その結果、プライマー１及び２を用いた場合は、いずれのビフィドバクテリウム・ブレーベも検出されなかったが、プライマー３及び４を用いた場合は２２種類のうち７種類を検出し、プライマー５及び６を用いた場合は２２種中１８種を検出した。この結果からも、プライマー１及び２を用いることで、フィドバクテリウム・ブレーベとの交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスが特異的に検出されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本技術により、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの特異的な検出が可能になる。よって、本技術は、この細菌のより確実な有効性評価に利用でき、例えば腸への到達状況や腸内での生存状況の評価に利用できる。また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス又は当該菌を含む飲食品を工業的に製造する場合に菌数の測定や発酵状態の管理にも利用できる。
【図１】
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【配列表】
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