(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトや動物などの哺乳動物の口腔などの粘膜部位から、綿棒などによる擦過や洗浄などによって微生物を採取する際、検体中に回収される菌の数を増やして検出感度を上げること、さらに検体中に含まれる菌の数を精度高く測定する方法の提供。【解決手段】ブロメラインを含有する、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物、該組成物を含有する口腔ぬぐい用器具、口腔微生物採取用キット又は口腔微生物検出用キット、並びに、該組成物を利用した口腔内微生物の採取方法、検出方法、及び感染症の診断のための情報を提供する方法。微生物がカンジダ菌、好気性細菌及び／又は嫌気性細菌であり、更に液状あることが好ましい、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物。
【請求項２】
哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で高感度に検出する方法において用いられるための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微生物が、カンジダ菌、好気性細菌及び／又は嫌気性細菌である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
液体状であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
うがい液又は口腔ぬぐい液である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ブロメラインの含有量が、０.０１％〜０.５％であることを特徴とする、請求項４又は請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
固体、顆粒状、パウダー状、又はゲル状であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
液体中に溶解又は懸濁させることにより、請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物を生成させるための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔ぬぐい用器具。
【請求項１０】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔微生物採取用キット又は口腔微生物検出用キット。
【請求項１１】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、及び、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取することを含む、口腔内生存微生物の採取方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取すること、当該サンプル中の所望の微生物が増殖する条件で培養すること、増殖した微生物の生菌数を計数することを含む、口腔内生存微生物の測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の口腔内生存微生物の測定方法を用いることを特徴とする、感染症の診断のための情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は動物の口腔から微生物を高感度に検出するための組成物及び方法に関する。具体的には、ヒト又は動物の口腔に生息する正常菌叢又は病原微生物の正確な数を測定するための組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
粘膜およびそれに近接した組織あるいは管腔の微生物感染の疾患例としては次のようなものがある。例えば、（１）高齢者に多い口腔カンジダ症や女性の膣カンジダ症の原因菌は、カンジダ属の真菌である。（２）小児に多いう蝕や高齢者に多い歯周病は、口腔の常在細菌の感染によって引き起こされる。
【０００３】
カンジダは健常人にも見い出せる常在性真菌であり、ときによって病原性を示し、口腔、腟、及び皮膚のカンジダ症の原因となる。例えば、口腔カンジダ症は、舌の疼痛や味覚異常などの症状を呈してＱＯＬの低下をもたらす感染症で、特に高齢者に多く発症し、老人ホームにおいてはその治療や予防が重要な課題となっている。口腔カンジダ症の原因菌は、その大半がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）などの菌種も比較的高い頻度で検出される。
【０００４】
小児に多いう蝕、及び高齢者に多い歯周病の主たる原因菌は、それぞれＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓであり、いずれも口腔常在細菌の一種である。
【０００５】
これらの感染症の診断に際し、口腔、鼻腔又は膣の粘膜又は分泌物からの原因微生物の検出は、もっとも確実な証拠であるといえる。よって、これら感染症の診断に際し、患部である口腔から原因微生物を検出することが試みられている。もし原因微生物が同定されれば、それに応じた処置を行うことができるため、原因微生物の検出及び同定はこれらの感染症の治療や予防において非常に重要である。
【０００６】
従来、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位からの微生物の採取は、それらの粘膜表面を綿棒などで擦過し、又は口腔をうがいすることで行われてきた。その後、採取された微生物を培養することにより原因微生物を検出していた。原因菌が多量に存在する場合は、従来の方法によって検出可能であるが、微生物は生体内で必ずしも均一に分散して存在しておらず、組織に付着していたり、複数個（同種間又は異種間）が凝集していたりする。よって、粘膜表面の一部を擦過した場合には、必ずしも微生物が存在する位置の検体を採取するとは限らず、感度良くかつ正確に微生物菌数を検出・測定することはできないという問題があった。また、例えば、たとえば口腔カンジダ症の場合、カンジダ菌は菌糸状となって舌組織に深く侵入するため浮遊状態の菌は少なく、浮遊状態として容易に採取できない。また、カンジダ菌は組織との親和性が高いため、回収された菌も組織片に凝集し、見かけ上少ない菌数として測定されることがある。このため、口腔カンジダ症などではその原因菌の検出率が悪く、検体をそのまま培養して形成されたコロニーを数えても、観察される菌数が実際の菌数よりも少なくなるという問題があった。
【０００７】
また、口腔内の病原菌以外の微生物であっても、消化管内微生物叢に大きな影響を与えることから、このような微生物についても高感度かつ正確な定量が必要とされている。しかし、健常人においても同様に微生物菌叢の定性的および定量的な把握が困難であった。すなわち、病原菌の検出・測定以外の非病原性共生菌などの検出・測定においても、従来は十分有効な方法が存在していなかった。
【０００８】
マウス口腔カンジダ症では菌糸が生体組織に深く侵入しているために、その生体組織を分散するのにタンパク分解酵素のトリプシンが有効であると考えられている。例えば、マウスの口腔カンジダ症モデルの場合は、舌苔など、菌が密集して侵襲している部位の組織を切り取り、その組織をホモジネートした後、トリプシンによって処理することにより、培養後に観察される見かけの生菌数が上昇することが報告されている（非特許文献１）。しかし、この方法は、少なくとも一部の組織を切除する過程を含み、そのままヒトに適用可能な方法ではない。ヒトにおいて、特に病態を形成していない健常人の舌表面及び唾液などの粘膜の外側にある分泌液、あるいは管腔液中のカンジダなどの微生物の菌数を検出・測定する際に、有効な処理法については、知られていない。
【０００９】
ブロメラインは、パイナップルの果実などに含まれるプロテアーゼであり、食品として摂取することで、舌苔除去効果及び口臭除去効果を有することが報告されている（特許文献１）。また、ブロメラインを含有する口腔ケア用の治療及び予防組成物が、歯の洗浄効果、歯垢蓄積の減少効果、再石灰化促進効果を有することが開示されている（特許文献２）。しかし、これらはいずれも口腔内微生物の除去又は沈着阻害が目的であり、生存微生物の効率的な回収に関しては全く言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００３／０９０７０４号
【特許文献２】特表２００９−５１７３８２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】羽山ら，Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．，５０，８５８−８６２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、従来、容易かつ安全で、高感度・高精度で口腔内の菌数を検出・測定する方法は知られていなかった。よって、安全かつ簡便に効率よく口腔内の微生物検体を採取する方法、及び口腔内の微生物の種類及び菌数を精度高く測定する方法が求められていた。従って、本発明は、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位から微生物を採取し、その菌の同定及び／又は菌数の測定方法に関して、従来の方法を改良し、対象微生物の検出感度や菌数の測定精度を改善することを課題にしている。
【００１３】
よって、本発明は、ヒトや動物などの哺乳動物の口腔などの粘膜部位から、綿棒などによる擦過や洗浄などによって微生物を採取する際、検体中に回収される菌の数を増やして検出感度を上げること、さらに検体中に含まれる菌の数を精度高く測定することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは微生物をより効率的に採取する処理方法について鋭意検討した結果、ブロメラインを含む液で、粘膜部位を処理（具体的な例としては、同酵素を含有するうがい液によるうがい、又は予め同酵素を含む溶液に浸した綿棒やガーゼ等で口腔内の粘膜部位等をぬぐう等）することにより、粘膜部位から微生物を高い回収率で採取できることを見出した。更に、本発明の方法によれば生きた状態で菌を多く回収することができるため、当該生菌を培養することで正確な菌数を測定することができることを見出した。さらに、凝集する微生物集団も効率よく分散させながら回収することができ、より正確な菌数測定が可能であることを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ヒト及び動物に安全に適用できるタンパク分解酵素であるブロメラインを含有する組成物を利用することにより、粘膜組織と微生物の結合力を低下させながら生きた状態で菌を回収し、さらには凝集する微生物集団を分散させることで、簡便かつ安全に口腔内の微生物の回収量を増加させ、また、正確な測定を可能とすることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
よって、本発明は、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位から微生物を採取し、微生物の菌数を測定する際に、採取方法や前処理法を改良し、対象微生物の検出感度や菌数の測定精度を大幅に改善したものであり、具体的には以下の発明に関する：
（１）  ブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物。
（２）  哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で高感度に検出する方法において用いられるための、（１）に記載の組成物。
（３）  前記微生物が、カンジダ菌、好気性細菌及び／又は嫌気性細菌である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）  液体状であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（５）  うがい液又は口腔ぬぐい液である、（４）に記載の組成物。
（６）  ブロメラインの含有量が、０.０１％〜０.５％であることを特徴とする、（４）又は（５）に記載の組成物。
（７）  固体、顆粒状、パウダー状、又はゲル状であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（８）  液体中に溶解又は懸濁させることにより、（４）〜（６）のいずれか１項に記載の組成物を生成させるための、（７）に記載の組成物。
（９）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔ぬぐい用器具。
（１０）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔微生物採取用キット又は口腔微生物検出用キット。
（１１）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、及び、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取することを含む、口腔内生存微生物の採取方法。
（１２）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取すること、当該サンプル中の所望の微生物が増殖する条件で培養すること、増殖した微生物の生菌数を計数することを含む、口腔内生存微生物の測定方法。
（１３）  （１２）に記載の口腔内生存微生物の測定方法を用いることを特徴とする、感染症の診断のための情報を提供する方法。
【００１６】
よって、本発明は、タンパク分解酵素であるブロメラインを含有する、哺乳動物の口腔内の微生物を生きた状態で採取するための組成物に関する。ブロメラインは、パイナップルなどに含まれるシステインプロテーアーゼであり、根茎由来のステムブロメライン（ＥＣ  ３．４．２２．３２）や果実由来のフルートブロメライン（ＥＣ  ３．４．２２．３３）を含むが、本発明の目的を達成する限り他のブロメラインであってもよい。
【００１７】
本明細書において、「微生物」とは、真菌及び細菌を含み、ヒト又は動物の口腔粘膜部位に付着する微生物であれば特に限定されるものではなく、例えば、好気性細菌、嫌気性細菌、酵母、カンジダを含む。また、微生物は、病原微生物に限られるものではなく、非病原性共生菌も含む。例えば、微生物として、一般にタンパク分解酵素耐性を示す微生物も含む。
【００１８】
本明細書において、「哺乳動物」とは、ヒト及び動物を含む哺乳動物全般を意味する。本明細書において「動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を意味し、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、リス、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、及びヤギ等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の組成物は哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するために用いられるものである。本明細書において、微生物が生存した状態であるとは、生体の構造又は機能を維持している状態であれば良く、例えば完全な細胞膜を有していることや、ＡＴＰ等の代謝活性があること、及び／又は、増殖活性があることを意味していても良い。
【００２０】
好ましくは、本発明の組成物は哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で高感度に検出する方法において用いられるための組成物である。また、本明細書において、「高感度」とは、ブロメラインを含有しない場合の微生物回収率よりも優れた回収率であることを意味し、たとえば、１．５倍又はそれ以上、１．８倍又はそれ以上、１．９倍又はそれ以上、２倍又はそれ以上であってもよい。
【００２１】
本発明の組成物は、使用態様に合わせて形態を選択することができ、例えば、液体状、スプレー状、クレーム状、ペースト状、固体状、顆粒状、パウダー状、又はゲル状であってもよい。また、本発明の組成物は、その使用態様に応じて、うがい液、又は口腔ぬぐい液とすることができ、あるいは、液体中に溶解又は懸濁させるための形態であってもよい。例えば、本発明の組成物が液体状である場合、ブロメラインの含有量としては、例えば、０.０１％〜０.５％、０．０１〜０．２５％、０．０５〜０．５％、０．０５〜０．２５％とすることができる。
【００２２】
本明細書において、「口腔ぬぐい用器具」とは、口腔粘膜をぬぐうことにより、該口腔粘膜上の微生物を採取する器具を意味する。一態様において、本発明の口腔ぬぐい用器具は、口腔粘膜と接触する部位の少なくとも一部において本発明の組成物を含む。好ましくは、口腔ぬぐい用器具は、本発明の組成物を液体として含浸した物であり、例えば、綿棒、コットンパフ、又はガーゼを挙げることができる。あるいは、本発明の口腔ぬぐい用器具は、固体状、顆粒状、又はパウダー状の本発明の組成物を含有していてもよい。この場合、必要に応じて該口腔ぬぐい用器具は、水や生理食塩水等の液体に浸してから用いても良い。
【００２３】
本明細書において、「口腔微生物採取用キット」は、本発明の組成物を備え、必要に応じて、口腔ぬぐい用器具、希釈用の液体、微生物回収用の液体、又は説明書等を備えていても良い。また、「口腔微生物検出用キット」は、本発明の組成物を備え、必要に応じて、口腔ぬぐい用器具、希釈用の液体、微生物回収用の液体、説明書、又は微生物検出用培地や試薬を備えていても良い。ここで、「希釈用の液体」とは、キットに含まれる本発明の組成物が希釈して用いるためのものである場合に、希釈液として使用する液体を意味し、例えば、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）などが含まれる。この場合、本発明のキットは、濃縮されたブロメライン組成物を含有する。また、「微生物回収用の液体」とは、キットに含まれる口腔ぬぐい用器具を用いて採取した微生物を液体中に浮遊させて回収する際に使用される液体を意味し、例えば、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、本発明の液体状の組成物などが含まれる。キットに含まれる本発明の組成物及び液体は、それぞれ、チューブ、バイアル、ＰＴＰ包装、アンプル、トレイ、カップ又はチューブ等の容器に収納されていても良い。また、本発明の組成物は、キットに含まれる口腔ぬぐい用器具に含まれていても良い。ただし、キットに備え付けられた口腔ぬぐい用器具は、必ずしも本発明の組成物を含む必要はなく、本発明のキットが口腔ぬぐい用器具と本発明の組成物を別々に有して、使用時に本発明の組成物を口腔ぬぐい用器具に付着又は含浸させて用いるようになっていても良い。
【００２４】
なお、本発明の組成物は、口腔のみならず、鼻腔や膣などの他の粘膜部位において使用することもできる。よって、別の態様において、本発明は、ブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の粘膜（例えば、鼻腔粘膜、膣粘膜）から微生物を生存した状態で採取又は検出するための組成物、当該組成物を含有する、粘膜ぬぐい用器具、当該組成物を含有する、粘膜ぬぐい用キットを含む。また、本発明は、前記組成物を被験者の粘膜と接触させること、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取すること、当該サンプル中の所望の微生物が増殖する条件で培養すること、増殖した微生物の生菌数を計数することを含む、粘膜内生存微生物の測定方法をも含む。更に、本発明は、前記粘膜内生存微生物の測定方法を用いることを特徴とする、感染症の診断のための情報を提供する方法を含む。この場合における各種定義・条件や好ましい態様は、口腔の場合についての本明細書の記載がそのまま適用される。この場合の感染症としては、例えば、鼻腔粘膜の場合、急性鼻炎や急性副鼻腔炎といった鼻腔の感染症、又は膣カンジダ症や細菌性膣炎といった膣の感染症を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の組成物が含有するブロメラインは、食品中に含まれるため、哺乳動物は食経験があることから、生体への毒性が低いと考えられる。ブロメラインを含有する液状組成物を用いて直接、口腔内を処理して微生物含有サンプルを回収することによって、回収されたサンプル中の微生物の生菌数を上昇させることができる。その結果、口腔内微生物の検出において、検出率を向上させ、正確な定量を可能とする。特に、感染症の直接の原因となる微生物を特定することを容易とすることで、診断の確度を高めることができる。病態をもたない健常人においても、同様に本発明の組成物を利用することにより検出率が向上し、健常人に常在する微生物の生菌数を正確に把握することができる。また、対象微生物の菌数の測定精度が上がるため、感染症の重症度の診断に際し、より的確な考察を加えることが可能になる。このような効果によって、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位の感染症に対し、より効果的な治療を施すことが可能になる。
また、近年、ヒトの口腔や鼻腔又は膣の粘膜部位に常在する微生物の研究が進み、いくつかの微生物は、感染症の惹起のみならず、その感染によって引き起される免疫系の亢進を介して、糖尿病などの代謝性疾患を悪化させることが分かってきた。したがって、ヒトの口腔や鼻腔又は膣に存在する微生物の検出感度や菌数の測定精度を大幅に改善することにより、ヒトの常在微生物研究をより効率的に行うことができる。なお、副次的な効果として、口腔中の微生物生菌数が減少することになり、歯周病、口腔カンジダ症などに関わる微生物の生菌数を減少することができ、ヒト又は動物の口腔衛生改善効果や健康維持効果、さらには疾病の予防効果に繋がることが期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のブロメラインを含有する組成物は、市販のブロメライン粉末を適宜、賦形剤、安定化剤、乳化剤、保存剤、防腐剤、結合剤等の添加物と混合して、液体状、クリーム状、ゲル状などの所望の形態とすることにより得ることができる。例えば、本発明のブロメラインを含有する組成物が液体の場合、市販のブロメライン粉末を水、生理食塩水、又は緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に溶解又は懸濁させることにより得ることができる。または、例えば、固体、顆粒状、パウダー状、又はゲル状のブロメライン原薬を液体中に溶解又は懸濁させることにより、液体状の本発明の組成物を生成させることもできる。
【００２７】
本発明のブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物が液体の場合、直接、ヒトの口腔の中に入れて３０秒「もぐもぐ」した（本明細書では『うがい』と称する）後、容器に吐き出すことにより微生物を採取することができる。「もぐもぐ」については例えば３〜１０秒、４〜７秒、又は５秒行うことができる。また、うがいを２回以上（例えば、２回、３回）行い、全うがい液から微生物を採取することができる。以下、うがいした後の本発明の組成物を「口腔うがい液」という。
【００２８】
または、本発明の組成物を含有する口腔ぬぐい用器具で口腔の粘膜部位をぬぐって、ぬぐった部位を微生物回収用の液体中で攪拌し、口腔ぬぐい用器具から付着物を十分に脱離させて微生物を採取することができる。あるいは、本発明の組成物をスプレーやクリーム等により口腔粘膜に予め塗布し、塗布部を別途口腔ぬぐい用器具でぬぐい、口腔ぬぐい用器具のぬぐった部位を微生物回収用の液体中で攪拌し、口腔ぬぐい用器具から付着物を十分に脱離させて微生物を採取してもよい。以下、口腔をぬぐった後の口腔ぬぐい用器具で攪拌し、微生物を回収した液体を「口腔ぬぐい液」という。
【００２９】
得られた口腔うがい液又は口腔ぬぐい液を遠心分離し、沈殿物に２０％牛胎児血清を加えて残っているブロメラインの酵素反応を停止させた後、再度遠心分離して、その沈殿を培地で再懸濁し、ピッペティングもしくはボルテックス震盪等により攪拌した後、得られた懸濁液を生菌数測定用のサンプルとする。サンプルは遠心分離用の容器に入れて遠心分離し、その中に含まれる微生物並びに組織片を沈殿として回収する。
【００３０】
生菌数は、例えば、回収された沈殿物の一定量を、目的の微生物に応じて適宜選択された培地に移し、目的の微生物の増殖に適した温度で一定時間培養し、形成されたコロニー数を計測することにより測定することができる。他にも生存微生物を測定する方法は既に広く知られており、例えば、膜透過性ＤＮＡ染色試薬と、それと異なる色の膜非透過性ＤＮＡ染色試薬を用いることにより、完全な膜を有する微生物を生存微生物として検出する方法（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ、サーモフィッサー・サイエンティフィック株式会社）や、微生物のＡＴＰ生成を検出することによりＡＴＰを生成する微生物を生存微生物として検出する方法（例えば、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  、プロメガ株式会社；ＲｕｂｙＧｌｏｗ、コスモバイオ株式会社）を採用することもできる。
【００３１】
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００３２】
以下の実施例においては、食品中に含まれるためヒトを含む哺乳動物に食経験があり、そのため安全性が高いと考えられるタンパク分解酵素を含有するうがい液を用いてうがいした後、当該うがい液中の微生物についてより感度よく菌数を検出する方法を示す。
【００３３】
実施例１．  健常人における口腔ブロメライン入りうがい液を用いた口腔内カンジダ菌数測定
ブロメライン含有うがい液を調製し、直接、ヒトの口腔の中に入れて３０秒うがいして吐き出したうがい液中の微生物の生菌数を測定した。対照として、ブロメライン非含有のうがい液を使用した。具体的には以下の方法で行った。
【００３４】
ブロメライン含有うがい液は、滅菌したリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中に、終濃度が０．０５％となるようにブロメラインを加えて溶解し、さらに濾過滅菌して調製した。対照うがい液として、滅菌したＰＢＳをブロメライン非含有うがい液として用いた。
【００３５】
被験者１名がブロメライン非含有うがい液（１０ｍｌ）で口内を３０秒「もぐもぐ」うがいした後、該うがい液を滅菌した５０ｍｌ容プラスチック遠心管に吐き出し、３７℃で５分間、恒温槽にて静置した。５分後、０．０５％ブロメライン含有うがい液（１０ｍｌ）で口内を３０秒「もぐもぐ」うがいした後、該うがい液を滅菌した５０ｍｌ容プラスチック遠心管に吐き出し、３７℃で５分間、恒温槽にて静置した。それぞれのうがい液を遠心分離（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）し、上清を除いた後、それぞれの沈殿に１ｍｌの２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えて、ブロメラインの酵素反応を止めた。ピペッティングで十分に懸濁し、懸濁液を広口先端１ｍｌ容チップで１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。５，０００ｒｐｍ，４℃で１０分間遠心分離し、上清を除いた沈殿に２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（ペニシリン、カナマイシン、及びＨＥＰＥＳ添加；ｐＨ７．２に調整）を加えた。ピペッティングとボルテックス震盪により懸濁した後、懸濁液１００μｌをクロモアガーカンジダ培地に塗抹して３７℃で７２時間培養した。形成された緑色コロニーをカンジダ・アルビカンスとして計測した。得られたコロニー数を沈殿あたりのカンジダ生菌数として算出した。
【００３６】
その結果、ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より２．２倍多かった。ブロメライン含有うがい液は、カンジダ菌の検出率を高くする効果があることが示された。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
実施例２．  健常人における０．０１％及び０．２５％ブロメライン含有うがい液を用いたカンジダ菌数測定
ブロメライン含有うがい液を、滅菌したリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中に、終濃度が０．０１％又は０．２５％なるようにブロメラインを加えて溶解し、さらに濾過滅菌することにより、０．０１％及び０．２５％ブロメライン入りうがい液を調製した。実施例１と同様にして、うがい及び微生物の回収・検出を行うことにより、うがい液中のカンジダ菌を測定した。
【００３９】
その結果、被験者２人において、０．０１％ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より、１．０４倍及び３．２倍多かった。また、０．２５％ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より５.９倍多かった。ブロメライン含有うがい液は、実施例１の０．０５％より５倍薄い濃度においても５倍濃い濃度においてもカンジダ菌の検出率を高くする効果があることが示された。
【００４０】
実施例３．  健常人における０．５％ブロメライン入りぬぐい液のカンジダ生菌数測定に及ぼす効果
綿棒あるいは口腔ケア用スポンジ棒を０．５％ブロメライン入りぬぐい液に浸し、これを以て口腔内を擦過して試料を採取した。
【００４１】
（綿棒を用いた試験）
具体的には、被験者１人において、綿棒を０．５％ブロメライン入りぬぐい液及び対照ぬぐい液（例えば、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓａｌｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ７．２））に浸し、浸した綿棒を用いて被験者の舌の右側半分をブロメラインぬぐい液で、左側半分を対照ぬぐい液で擦過（スワブ）して、クロモアガーカンジダ平板培地に塗抹し、３７℃で７２時間培養した。生育したカンジダ菌のコロニーを数えた。
【００４２】
その結果、ブロメラインぬぐい液では１４個、対照ぬぐい液では９個のコロニーを得た。ブロメラインぬぐい液の方が約１．６倍多く検出することができた。
【００４３】
（口腔ケア用スポンジ棒を用いた試験）
また、被験者１人において、口腔ケア用スポンジ棒を、それぞれ５０ｍＬ容プラスチック遠心管に入れた１０ｍＬの０．５％ブロメライン入りぬぐい液及び対照ぬぐい液（例えばｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓａｌｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ，  ７．２））に浸し、口腔内（歯、歯肉、頬など）をぬぐい、残量のある元の遠心管にもどしてスポンジ棒を管壁に当ててよく絞り出すようにした。その後、遠心分離し、実施例１と同様な方法で処理し、カンジダ生菌数測定を行った。
【００４４】
その結果、０．５％ブロメライン入りぬぐい液のカンジダ菌生菌数は１９，４８０、及び対照ぬぐい液の生菌数は１４，４８０であり、ブロメライン入りぬぐい液の方が、対照よりも１．３５倍多く回収することができた。
【００４５】
実施例４．  健常人における０．０５％パパイン入りうがい液のカンジダ生菌数測定に及ぼす効果
実施例１の０.０５％ブロメラインの代わりに０.０５％パパインを用いて、実施例１と同様な方法でうがい及び微生物の回収・検出を行うことにより、うがい液中のカンジダ菌を測定した。その結果、被験者１人において、０.０５％パパイン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は１５,４８０であったのに対して、パパイン非含有うがい液（対照うがい液）のカンジダ生菌数は１６,２８０であり、ほとんど変わらなかった。すなわち、パパイン含有うがい液のカンジダ菌の検出率を高くする効果はない、あるいは、あっても弱いことを示している。
【００４６】
実施例５．  健常人における０．０５％ブロメライン含有うがい液を用いた微生物生菌数測定
ブロメライン含有うがい液、及び対照うがい液は実施例１に記載の方法を用いて調整した。健常人３名について実施した。うがいは以下の３通りの方法で行った：（１）１回目は対照うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後に対照うがい液でうがいをする方法、（２）１回目は対照うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後にブロメライン含有うがい液でうがいをする方法、および（３）１回目はブロメライン含有うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後に対照うがい液でうがいをする方法。各うがいの時間は３０秒とした。３通りのうがいはそれぞれ異なる日に、昼食前に行った。それぞれのうがい液１０ｍｌを３７℃にて５分間保温した後４℃で保冷した。検体を二つに分け、検体量の９割をカンジダ生菌数測定に、検体量の１割を細菌生菌数測定に用いた。
【００４７】
カンジダ生菌数測定方法：
検体を遠心分離して得られた沈殿に２０％牛胎児血清１ｍｌを加えて懸濁した。得られた懸濁液を、再び遠心分離して、沈殿をＲＰＭＩ１６４０培地（ペニシリン、カナマイシン、及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸含有、ｐＨ７．２）で再懸濁し、その懸濁液をカンジダ生菌数測定用のサンプルとした。懸濁液は、必要に応じて希釈して、１００μｌをクロモアガーカンジダ培地に塗抹した。３７℃で７２時間培養後、形成したコロニーをカンジダ・アルビカンスとして計測した。得られたコロニー数を沈殿あたりの生菌数として算出した。
【００４８】
細菌生菌数測定方法：
検体を１０倍希釈法で希釈し、適切な希釈液を一般細菌（好気性細菌）および嫌気性細菌生菌数測定用のサンプルとした。５０μｌを普通寒天培地およびＧＡＭ寒天培地に塗抹して３７℃で７２時間培養した。一般細菌および嫌気性細菌のコロニー数を計測した。得られたコロニー数を検体１ｍｌあたりの生菌数として算出した。
【００４９】
３通りのうがいを行って回収したうがい液中のカンジダ生菌数、一般細菌（好気性細菌）生菌数および嫌気性細菌生菌数について、それぞれ２回目の生菌数を１回目の生菌数で割ってその比を百分率で表した結果を回収率として表２に示した。対照うがい液（ＰＢＳ）で２回うがいした場合は、表２で示したように各菌の回収率は７１〜９３％となり、若干の低下傾向を示すことがわかった。したがって、異なるうがい液の回収率の値が７１〜９３％であれば、対照うがい液と比較して優れた効果は特に認められないことを示す。１００％より大きい回収率は生菌数が増加していることを意味するため、回収された生菌数が増加する効果を有することを示し、反対に７１％より小さい回収率は生菌数が減少していることを意味するため、回収された生菌数が減少する効果を有することを示す。このように、対照うがい液（ＰＢＳ）で２回うがいした場合を対照として、ブロメライン含有うがい液の効果を評価した。１回目のうがいを対照うがい液（ＰＢＳ）で行い、２回目のうがいをブロメライン含有うがい液行い、各うがい液を回収及び測定した結果、その比は１６０〜２３０％（平均値は約２００％（２倍））となりブロメラインを含有することによって回収率が上昇した。１回目のうがいをブロメライン含有うがい液で行い、２回目のうがいを対照うがい液（ＰＢＳ）で行い、各うがい液を回収及び測定した結果、その比は１７〜３３％（平均値は約２５％）となり、極端に２回目のうがいにおける生菌数が低下した。いずれの結果も３種の微生物においてブロメライン含有うがい液の生菌回収効率が高いことを示した。
【００５０】
【表２】
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