(57)【要約】【課題】神経幹細胞の浮遊培養を必要としなくともニューロスフィアの形成が可能な技術を提供する。【解決手段】含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を含む細胞を培養し、前記基材に保持したニューロスフィアを形成することを含む、神経幹細胞の培養方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を含む細胞を培養し、前記基材に保持したニューロスフィアを形成することを含む、神経幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記含フッ素ポリマーが、芳香族フッ素化合物を構造単位として含む、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培養を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、およびＬＩＦからなる群から選択される成長因子の１つ以上の存在下で行う、請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記培養を、無血清培地で行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法によりニューロスフィアを形成すること、および
前記基材に前記ニューロスフィアを保持した状態で、前記神経幹細胞の分化を誘導すること、を含むニューロスフェロイドの形成方法。
【請求項６】
前記神経幹細胞の分化誘導を、血清、Ｂ２７−サプリメント、ＳＭ−Ｎｅｕｒｏｎａｌサプリメント、レチノイン酸およびその誘導体、ＮＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ならびにＳＨＨからなる群から選択される１種以上を含む培地での培養によって行う、請求項５に記載の形成方法。
【請求項７】
前記ニューロスフェロイドが神経細胞を含む、請求項５または６に記載の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞の培養方法、およびニューロスフェロイドの形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓、膵臓、皮膚、血管等の各器官を形成する細胞は、生体内において、細胞同士が三次元的にネットワークを形成し機能を発現している。そこでこれらの器官の機能を再生する再生医療の研究において、これらの器官の細胞を培養する場合には、細胞同士が三次元的にネットワークを形成できるような培養（すなわち、三次元培養）が求められる。一般的な樹脂製の細胞培養用基材の表面で細胞を培養する場合、細胞は平面状に広がって増殖（二次元培養）し、三次元的なネットワークを形成することは困難である。
【０００３】
神経幹細胞は、神経細胞やグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）への分化能を有し、且つ増殖能（自己複製能力）を保持した細胞である。神経幹細胞を浮遊培養することにより、単一で、または他の細胞と共に三次元的なネットワークを形成させ、ニューロスフィアと呼ばれる細胞凝集塊を形成することが可能である。神経幹細胞の場合、一般的な樹脂製の細胞培養用基材の表面で培養を行うと、基材との接着によって分化が誘導されて進行してしまう。このため、神経幹細胞を未分化の状態で増殖、維持させてニューロスフィアを形成するためには基材との接着を避ける必要があり、従来、ニューロスフィアの形成は、浮遊培養により行われてきた（従来の「ニューロスフィア法」）。形成されたニューロスフィアを用いて神経幹細胞の分化を誘導することにより、神経細胞やグリア細胞を含む細胞凝集塊であるニューロスフェロイドを形成することもできる。未分化且つ増殖能を保持した神経幹細胞を含むニューロスフィアや、生体に類似した三次元的ネットワークを有するニューロスフェロイドは、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症等の神経系疾患の研究やその治療法の開発において非常に有用なツールとなる。
【０００４】
上記理由により、ニューロスフィアの形成に用いられる細胞培養容器の開発においては、培養容器表面に対する神経幹細胞の接着性を低下させる工夫がなされてきた。例えば、培養容器表面に対する神経幹細胞の接着性を低下させる技術として、特許文献１には、神経幹細胞凝集塊形成用容器の製造方法であって、水溶性樹脂を前記容器内面に被覆させて水溶性樹脂被覆層を形成する水溶性樹脂被覆工程と、前記工程後に、前記水溶性樹脂被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性する非水溶性硬化皮膜変性工程と、を含むことを特徴とする神経幹細胞凝集塊形成用容器の製造方法に係る発明が開示されている。
【０００５】
一方、分化誘導後は神経幹細胞を未分化の状態で増殖させる必要が無く、敢えて浮遊系での培養を行う必要が無い。したがって、操作性の観点から、ニューロスフェロイドの培養は基材に定着させた状態で行うことが一般的である。このため、ニューロスフェロイドの形成を行う際は、上記のような細胞接着性の低い培養容器で神経幹細胞の培養を行った後、形成されたニューロスフィアを細胞接着性の高い培養容器に移してから分化誘導を行うという手法がとられてきた。しかしながら、ニューロスフィア形成時に使用する培養容器と異なる培養容器を使用して分化誘導を行うことは、作業工程が煩雑になるばかりか、形成されたニューロスフィアが培地交換の際に崩壊したり、培地とともに一部をロスしたりすることがあった。かような問題に対し、単一の培養容器内でニューロスフィアの形成とニューロスフェロイドの形成とが可能な技術として、例えば、特許文献２には、所定の化学構造を有する基が表面近傍に存在する培養容器を用いて、増殖因子を含む培地中で神経幹細胞を浮遊培養して細胞凝集塊を形成する工程と、該培地に分化誘導因子を添加して該細胞凝集塊を該培養容器に接着させて該神経幹細胞を分化させる工程を有する、神経幹細胞から神経細胞及び／又はグリア細胞を形成する培養方法に係る発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２２０２０５号公報
【特許文献２】特開２０１３−１３５６４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載の培養方法では、単一の培養容器を用いて、神経幹細胞から分化後の神経細胞および／またはグリア細胞取得までを行うことが可能ではあるものの、ニューロスフィアの形成を浮遊培養で行う必要がある。浮遊系での培養は、ニューロスフィアの崩壊やロスといった問題が依然として存在する。また、ニューロスフィアの培養を浮遊系で行うと、培地中を漂うニューロスフィア同士の会合により過剰に大きなニューロスフィアが形成され、ニューロスフィア中央部に存在する細胞が壊死する場合があった。さらに、神経幹細胞へ分化誘導を施す際は、形成されたニューロスフィアを一旦回収してから分化誘導処理を行う必要があるため、ハンドリングも煩雑となる。
【０００８】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、神経幹細胞の浮遊培養を必要としなくともニューロスフィアの形成が可能な技術を提供することを課題とする。
【０００９】
本発明はまた、単一の細胞培養容器内でニューロスフィアの形成とニューロスフェロイドの形成とが可能な技術を提供することを別の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を培養することにより上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、神経幹細胞の浮遊培養を必要としなくともニューロスフィアの形成が可能な技術を提供できる。
【００１２】
本発明によればまた、単一の細胞培養容器内でニューロスフィアの形成とニューロスフェロイドの形成とが可能な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１における含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を培養し、基材上に保持されたニューロスフィアが形成されることを確認した光学顕微鏡像である（図１（ａ）培養１日目、（ｂ）培養３日目、（ｃ）培養５日目、（ｄ）培養８日目）。図１中、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの上段は倍率４０倍、下段は２００倍であり、白棒は２００μｍである。
【図２】図２は、実施例１における含フッ素ポリマー基材上で培養した神経幹細胞に対して分化誘導処理し、ニューロスフェロイドが形成されることを確認した光学顕微鏡像である（図２（ａ）分化培地への培地交換当日を０日目として、分化培地での培養１日目、（ｂ）分化培地での培養３日目、（ｃ）分化培地での培養５日目、（ｄ）分化培地での培養９日目）。図２中、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの上段は倍率４０倍、下段は２００倍であり、白棒は２００μｍである。
【図３】図３は、比較例１における浮遊培養にて形成したニューロスフェロイドの光学顕微鏡像である（図３（ａ）培養１日目、（ｂ）培養３日目、（ｃ）培養５日目、（ｄ）培養８日目）。図３中、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの上段は倍率４０倍、下段は２００倍であり、白棒は２００μｍである。
【図４】図４は、比較例１における浮遊培養にて形成したニューロスフェロイドに対して分化誘導処理した場合の、光学顕微鏡像である（図４（ａ）分化培地への培地交換当日を０日目として、分化培地での培養１日目、（ｂ）分化培地での培養３日目、（ｃ）分化培地での培養５日目、（ｄ）分化培地での培養９日目）。図４中、（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの上段は倍率４０倍、下段は２００倍であり、白棒は２００μｍである。
【図５】図５は、実施例１と比較例１それぞれの分化誘導前後において細胞に発現している未分化マーカーおよび分化マーカーの発現量を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一側面は、含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を含む細胞を培養し、前記基材に保持したニューロスフィアを形成することを含む、神経幹細胞の培養方法に関する。本発明は、含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を培養することにより、神経幹細胞を未分化のまま基材に保持した状態で増殖させ、ニューロスフィアの形成が可能であるという驚くべき知見に基づくものである。本発明によれば、浮遊培養によるニューロスフィアの形成が不要となるため、形成されたニューロスフィアが培地交換の際に崩壊したり、培地とともに一部をロスしたりするリスクを大幅に低減することができる。また、本発明によれば、培地中を漂うニューロスフィア同士の会合により過剰に大きなニューロスフィアが形成されることを有効に防止し得る。従来、基材上に保持した状態での形成ができなかったニューロスフィアが、含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を培養することにより形成可能である詳細なメカニズムは不明であるが、以下のような理由が推測される。すなわち、神経幹細胞が基材に接着することにより分化誘導が進行する詳細な機構は不明な点が多いものの、細胞の基材への接触という物理的刺激が分化誘導シグナルのインプットとして関与していると考えられる。一方、含フッ素ポリマーには、疎水的で撥水性が高いという特徴がある。したがって、神経幹細胞の培養を含フッ素ポリマー基材上で行うことにより、含フッ素ポリマーの疎水的性質が基材と神経幹細胞との相互作用を適度なものとし、分化誘導シグナルが抑制されつつも基材上へのニューロスフィアの保持を可能にしているのではないかと推測される。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００１５】
本発明の別の側面は、含フッ素ポリマー基材上で神経幹細胞を培養し、前記基材に保持したニューロスフィアを形成すること、および前記基材に前記ニューロスフィアを保持した状態で、前記神経幹細胞の分化を誘導すること、を含むニューロスフェロイドの形成方法に関する。かような、基材上に保持した状態のニューロスフィアに対して分化誘導処理が可能な技術により、単一の細胞培養容器内でニューロスフィアの形成とニューロスフェロイドの形成とが可能となる。また、本発明者らは、詳細なメカニズムは不明であるものの、含フッ素ポリマー上に保持したニューロスフィアに対して誘導剤を用いた誘導処理を行うと、誘導剤に対して細胞が高感度に応答し、分化が強く誘導されるという利点があることも見出した。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１７】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行う。
【００１８】
＜神経幹細胞の培養方法＞
本発明では、神経幹細胞の培養を含フッ素ポリマー基材上で行うことを特徴とする。含フッ素ポリマーとしては、例えば、含フッ素ポリイミド、フッ素化ポリアリールエーテルケトン、フッ素化ポリエステルポリエーテル、フッ素化ポリエーテル等が例示できる。基材を形成する含フッ素ポリマーは、化学構造が異なる２種類以上のポリマーのブレンドであってもよい。含フッ素ポリマーとしては、得られるフィルムの強度や耐熱性の観点から芳香族フッ素化合物を構造単位として含むことが好ましい。一実施形態では、含フッ素ポリマーは、好ましくは含フッ素ポリイミドであり、より好ましくは以下の式（ＩＩ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミドである。
【００１９】
（含フッ素ポリイミド）
本発明で用いる含フッ素ポリイミドは、繰り返し単位中に１個以上のフッ素原子を有するポリイミドであり、典型的には、酸二無水物とジアミンとを各々１種以上重合させて得られるポリアミド酸をイミド化することにより得られる含フッ素ポリイミドである。本発明において細胞の足場となる表面を構成する含フッ素ポリイミドは、ポリアミド酸を化学構造の一部に含んでいてもよい。含フッ素ポリイミドの製造のためには、酸二無水物およびジアミンのうち少なくとも１種の化合物として、分子内にフッ素原子を有するものを用いる。
【００２０】
ポリイミドを製造する方法としては、二段合成法や、一段合成法が使用できる。
【００２１】
ポリイミドの二段合成法は前駆体としてポリアミド酸を合成し、ポリアミド酸をポリイミド酸に変換する方法である。前駆体としてのポリアミド酸はポリアミド酸誘導体であってもよい。ポリアミド酸誘導体としては、例えばポリアミド酸塩、ポリアミド酸アルキルエステル、ポリアミド酸アミド、ビスメチリデンピロメリチドからのポリアミド酸誘導体、ポリアミド酸シリルエステル、ポリアミド酸イソイミドなどが挙げられる。
【００２２】
ポリイミドの一段合成法としては、例えば高温溶融重合法、イソシアナート法、テトラカルボン酸ジチオ無水物法、イオン液体を用いる方法などの、溶媒を用いる一段合成法が使用できる。その他の一段合成法としては、ナイロン塩型モノマーを経由する重合法、高温固相重合法、高圧下での高温固相重合法、水中での固相重合法などが挙げられる。
【００２３】
また、本発明において、「酸二無水物残基」は上記構造を形成する４価の有機基であればよく、実際に酸二無水物が反応して形成された残基である必要はなく、同様に、「ジアミン化合物残基」は上記構造を形成する２価の有機基であればよく、実際にジアミン化合物が反応して形成された残基である必要はない。
【００２４】
含フッ素ポリイミドとしては、主鎖中に以下の式（Ｉ）
【００２５】
【化１】
2017163898.tif 000003
【００２６】
〔式（Ｉ）中、
Ｘ０は４価の有機基であり、Ｙ０は２価の有機基であり、
Ｘ０およびＹ０に含まれるフッ素原子の合計は１個以上であり、
Ｙ０は、ビフェニル基を含み、該ビフェニル基の２つのベンゼン環の各々が１つのアミノ基で置換されたジアミン化合物の構造であって、前記各アミノ基が窒素原子への単結合に置換された構造を有する。〕
で示される繰り返し単位を含む。
【００２７】
本発明では、以下の式（ＩＩ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミドが、ニューロスフィア形成性の観点から好ましい。
【００２８】
【化２】
2017163898.tif 000004
【００２９】
上記式（ＩＩ）中、Ｘは酸素原子、硫黄原子、または２価の有機基の何れかを示し；Ｙは２価の有機基を示し；Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれかを示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含み、ｐは０または１である。なお、含フッ素ポリイミドにおいて、式（ＩＩ）で示される化学構造は、ポリマーの構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。
【００３０】
上記式（ＩＩ）中、ｐ＝０である場合にはＸは存在していなくても（換言すれば、左右のベンゼン環が直接結合していても）よいが、ｐ＝１である場合には、左右のベンゼン環はＸを介して結合する。
【００３１】
Ｘで示される２価の有機基としては、具体的には、アルキレン基、アリーレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基等が挙げられ、これらの中でも、アルキレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基が好ましく、アルキレン基、アリーレンオキシ基がより好ましく、これらはフッ素原子で置換されていてもよく、２価の有機基における全水素原子がフッ素原子で置換されていることが好ましい。上記アルキレン基の炭素数は、例えば１〜１２であり、好ましくは１〜６である。
【００３２】
Ｘの例であるフッ素原子で置換されたアルキレン基としては、例えば、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−Ｃ（ＣＦ３）２−等を例示することができる。Ｘの例である上述したアルキレン基の中では、−Ｃ（ＣＦ３）２−が好適である。
【００３３】
Ｘの例であるアリーレン基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
【００３４】
【化３】
2017163898.tif 000005
【００３５】
Ｘの例であるアリーレンオキシ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
【００３６】
【化４】
2017163898.tif 000006
【００３７】
Ｘの例であるアリーレンチオ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
【００３８】
【化５】
2017163898.tif 000007
【００３９】
Ｘの例である上述したアリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基は、各々独立して、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基およびトリフルオロメチル基よりなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基に置換している好適な置換基は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であり、好適にはフッ素原子である。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基は、Ｙにフッ素原子が含まれない場合、少なくとも１つ以上のフッ素原子で置換されることが好ましい。
【００４０】
上記式（ＩＩ）中、Ｙで示される２価の有機基としては、特に制限されないが、例えば、芳香環を有する２価の有機基が挙げられる。詳しくは、１個のベンゼン環からなる基もしくは、２個以上のベンゼン環が単結合、炭素数１〜４のアルキレン基（例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基）、酸素原子、硫黄原子を介してまたは直接結合した構造を有する基が挙げられる。好ましくは、Ｙで示される２価の有機基としては、それぞれ独立に置換基を有してもよい２または３個のベンゼン環が、単結合、酸素原子、または硫黄原子を介して結合した構造を有する基である。より好ましくは、Ｙで示される２価の有機基としては、それぞれ独立に置換基を有してもよい２または３個のベンゼン環が、酸素原子、または硫黄原子を介して結合した構造を有する基である。ベンゼン環の置換基としては、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される基が例示できる。
【００４１】
Ｙで示される２価の有機基としては、具体的には、以下の基を例示することができる。
【００４２】
【化６】
2017163898.tif 000008
【００４３】
【化７】
2017163898.tif 000009
【００４４】
【化８】
2017163898.tif 000010
【００４５】
【化９】
2017163898.tif 000011
【００４６】
Ｙの例である上述した芳香環を有する２価の有機基は、置換可能であれば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。芳香環を有する２価の有機基に置換している好適な置換基は、特にＸにフッ素原子が含まれない場合は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であることが好ましい。
【００４７】
Ｙは、下記の式（ＩＩＩ）で表される構造であってもよい。
【００４８】
【化１０】
2017163898.tif 000012
【００４９】
式（ＩＩＩ）において、Ｂ１は、ＣＦ３またはＣＮを表す。Ｂ２は、同一若しくは異なって、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表す。Ｒ１は、炭素数１〜２０のハロゲン置換アルキル基を表す。ＸＡは、同一若しくは異なって、ＯまたはＳを表す。ＸＢは、ＯまたはＳを表す。ｎは、Ｂ２で表される基の置換数を表し、０〜２の整数である。ｍは、ＸＢＲ１で表される基の置換数を表し、１〜３の整数である。また、ｎ＋ｍ＝３である。
【００５０】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１はハロゲン置換アルキル基を表すが、ハロゲン置換アルキル基とは、アルキル基を構成する炭素原子に結合した水素原子の少なくとも一部がハロゲン原子で置換された基を意味し、構造は特に制限されず、直鎖、分岐、環状アルキル基のいずれの構造であってもよい。また、ハロゲン置換アルキル基中にエーテル結合を有するものであってもよい。上記ハロゲン原子としては、フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）が好ましく、これらの２種以上の原子で置換されていてもよい。Ｒ１は炭素数１〜２０のフッ素置換アルキル基であることが好ましい。Ｒ１の炭素数は、２〜１８であることがより好ましく、更に好ましくは３〜１５である。
【００５１】
Ｒ１として特に好適な基としては、例えば、下記化学式で表される群から選択される少なくとも１つの基が挙げられる。
ＣＦ３−（ＣＦ２）７−（ＣＨ２）２−
ＣＦ３−（ＣＦ２）９−（ＣＨ２）２−
ＣＦ３−（ＣＦ２）２−ＣＨ２−
ＣＦ３−（ＣＦ２）３−ＣＨ２−
ＣＨＦ２−（ＣＦ２）７−ＣＨ２−
（ＣＦ３）２−ＣＦ（ＣＦ２）２−（ＣＨ２）２−
ＣＦ３ＣＨ２−
ＨＣＦ２ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）２ＣＨ２−
ＣＨＦ２ＣＦ２ＣＨ２−
（ＣＦ３）２ＣＨ−
ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ２−
Ｈ（ＣＦ２）２ＣＨ２−
Ｃｌ（ＣＦ２）２ＣＨ２−
（ＣＦ３）Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−
Ｆ（ＣＦ２）３ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）２−
ＣＦ３ＣＨＦＣＦ２ＣＨ２−
ＣＦ３（ＣＨ２）３−
Ｆ（ＣＦ２）２Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−
ＣＦ３Ｃ（ＣＨ３）２−
ＣＨ３Ｃ（ＣＦ３）２−
（ＣＦ３）４Ｃ−
（ＣＦ３）２Ｃ（ＣＣｌ３）−
Ｆ（ＣＦ２）４ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）３（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）３−
ＣＦ３（ＣＨ２）４−
（ＣＦ３）２ＣＦＣＨ２ＣＨ２−
（ＣＦ３）２Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２−
Ｈ（ＣＦ２）４ＣＨ２−
Ｃｌ（ＣＦ２）４ＣＨ２−
Ｂｒ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）３−
ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−
ＣＦ３ＣＦ（ＯＣＦ３）ＣＨ２ＣＨ２−
（ＣＦ３）２ＣＨＯＣＨ２ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）３Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−
Ｆ（ＣＦ２）５ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）４（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）３（ＣＨ２）３−
Ｆ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）４−
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＨ２）３−
（ＣＦ３）３ＣＣＨ２ＣＨ２−
ＣＦ３ＣＦ（ＯＣＦ３）（ＣＨ２）３−
Ｆ（ＣＦ２）３ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＨ２−
Ｈ（ＣＦ２）５ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）２Ｃ（ＣＨ３）２−
ＣＦ３ＣＨＦＣＦ２Ｃ（ＣＨ３）２−
Ｆ（ＣＦ２）６ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）５（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）４（ＣＨ２）３−
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）２−
（ＣＦ３）２ＣＦＣＨＦＣＦ（ＣＦ３）ＣＨ２−
ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ（ＣＦ３）（ＣＨ２）３−
Ｈ（ＣＦ２）６ＣＨ２−
Ｃｌ（ＣＦ２）６ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）７ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）６（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）５（ＣＨ２）３−
Ｆ（ＣＦ２）４（ＣＨ２）４−
Ｆ（ＣＦ２）２（ＣＨ２）６−
Ｆ（ＣＦ２）３ＯＣＦ（ＣＦ３）（ＣＨ２）３−
（ＣＦ３）３Ｃ（ＣＨ２）４−
Ｈ（ＣＦ２）７ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）８ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）６（ＣＨ２）３−
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＨ２）６−
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）３ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＨ２−
Ｈ（ＣＦ２）８ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）４（ＣＨ２）６−
ＣＦ３（ＣＦ２）７（ＣＨ２）２−
Ｆ（ＣＦ２）８（ＣＨ２）３−
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６（ＣＨ２）２−
Ｈ（ＣＦ２）１０ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）６（ＣＨ２）６−
Ｆ（ＣＦ２）１０（ＣＨ２）２−
Ｈ（ＣＦ２）１２ＣＨ２−
Ｆ（ＣＦ２）８（ＣＨ２）６−
式（ＩＩＩ）中、ｍは１〜３の整数であり、好ましくは２〜３であり、より好ましくは１である。
【００５２】
式（ＩＩＩ）中、ＸＡは２つともＯであるか、２つともＳであることが好ましく、２つともＯであることが最も好ましい。
【００５３】
式（ＩＩＩ）において、Ｂ２は、同一若しくは異なって、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表すが、Ｂ２の少なくとも１つがハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）であることが好適である。中でも式（ＩＩＩ）における２個のＢ２が、いずれもハロゲン原子であることが好ましい。また、ハロゲン原子の中でも塩素原子（Ｃｌ）やフッ素原子（Ｆ）が好ましく、より好ましくはフッ素原子（Ｆ）である。特に好ましくは、式（ＩＩＩ）における２個のＢ２が、いずれもフッ素原子（Ｆ）であることであり、このように上記Ｂ２がＦ（フッ素原子）である形態もまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００５４】
ニューロスフィアの保持性の観点から、上記式（ＩＩ）中、Ｙはｄ−１〜ｄ−１０、ｅ−１、ｆ−１〜ｆ−７、ｇ−１〜ｇ４および式（ＩＩＩ）からなる群から選択される構造であることが好ましく、より好ましくはｄ−３およびｅ−１からなる群から選択される構造であり、更に好ましくはｅ−１で表される構造である。
【００５５】
上記式（ＩＩ）中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６は、各々同じであってもよく異なっていてもよく、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子から選ばれ、ＸおよびＹの少なくとも一方にフッ素原子が含まれない場合、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６の少なくとも１つはフッ素原子である。式（ＩＩ）に含まれるフッ素原子の数は１個以上であればよいが、好ましくは４個以上である。フッ素原子数の上限は特に制限されず、分子構造によっても異なるが、例えば、式（ＩＩ）で示される構造単位１つ当たり、例えば３０個以下である。
【００５６】
ニューロスフィアの保持性の観点から、好ましい一実施形態では、上記式（ＩＩ）で示される構造単位は、以下の式（ＩＩ−２）で示される構成単位である。
【００５７】
【化１１】
2017163898.tif 000013
【００５８】
上記の式（ＩＩ−２）において、Ｘはフッ素原子で置換されていてもよいアルキレン基、アリーレンオキシ基、およびアリーレンチオ基からなる群から選択される基であり；Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６は上記式（ＩＩ）と同様であり；Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１２は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチル基およびトリフルオロメチル基のいずれかを示し；Ｘ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１２の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含み；Ｙ１はそれぞれ独立に酸素原子および硫黄原子から選択され；ｑは１〜３の整数であり、好ましくは１または２である。式（ＩＩ−２）のＸの具体例については、式（ＩＩ）について上述のとおりである。
【００５９】
上記式（ＩＩ）で示される構造単位は、より具体的には、以下の式（ＩＩ−３）（６ＦＤＡ／ＴＰＥＱ）および（ＩＩ−４）（６ＦＤＡ／ＯＤＡ）で示される構造単位から選択されるものであることがより好ましい。
【００６０】
【化１２】
2017163898.tif 000014
【００６１】
【化１３】
2017163898.tif 000015
【００６２】
上記の式（ＩＩ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミドは、酸二無水物とジアミンとの重合により得られるポリアミド酸をイミド化する手法により得ることができる。以下に、一具体例として、６ＦＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体の合成過程を示す。
【００６３】
【化１４】
2017163898.tif 000016
【００６４】
ポリアミド酸合成反応は有機溶媒中で行われることが好適である。ポリアミド酸合成反応に用いられる有機溶媒としては、原料である酸二無水物とジアミンとの反応が効率よく進行でき、かつこれらの原料に対して不活性であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン、アセトン、メチルエチルケトン、イソブチルケトン、メタノール等の極性溶媒；トルエンやキシレン等の非極性溶媒等が挙げられる。中でも、極性溶媒を用いることが好ましい。これらの有機溶媒は、単独で使用されてもよいし、２種以上の混合物として使用されてもよい。アミド化反応後の反応混合物をそのまま熱イミド化に供してもよい。前記ポリアミド酸の溶液中の前記ポリアミド酸の濃度は特に限定されないが、得られる樹脂組成物の重合反応性と重合後の粘度、その後の製膜、焼成での取り扱いやすさから、好ましくは、５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは４０重量％以下である。
【００６５】
前記ポリアミド酸を、熱イミド化または化学イミド化のいずれかによりイミド化して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。
【００６６】
特定の実施形態では、前記ポリアミド酸を、加熱処理によりイミド化（熱イミド化）して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。熱イミド化で得られたポリイミドは、触媒の残存の可能性がなく、細胞培養用途ではより好ましい。なお、含フッ素ポリイミド樹脂のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、含フッ素ポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）や式（ＩＩ）で表される構造単位の環状イミド構造の一部が開環したアミド構造である構造単位を、一部に含むものであってもよい。
【００６７】
熱イミド化によりイミド化する場合、例えば、前記ポリアミド酸を、空気中で、またはより好ましくは窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、或いは真空中で、好ましくは温度５０〜４００℃、より好ましくは１００〜３８０℃、好ましくは時間０．１〜１０時間、より好ましくは０．２〜５時間の条件下で焼成してイミド化反応を行うことによりポリイミドを含む樹脂組成物を得ることができる。
【００６８】
熱イミド化反応に供する前記ポリアミド酸は、適当な溶媒中に溶解された形態であることが好ましい。溶媒としては、ポリアミド酸を溶解するものであれば良く、ポリアミド酸合成反応に関して上記した溶媒を用いることもできる。
【００６９】
化学イミド化によりイミド化する場合では、適当な溶媒中で後述の脱水環化試薬の使用によりポリアミド酸を直接イミド化することができる。
【００７０】
前記脱水環化試薬は、ポリアミド酸を化学的に脱水環化してポリイミドとする作用を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。このような脱水環化試薬としては、第三級アミン化合物を単独で用いるか、または、第三級アミン化合物とカルボン酸無水物とを組合せて用いることが、イミド化を効率よく促進させうる点で好ましい。
【００７１】
第三級アミン化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン等が挙げられる。これらの中でも特に、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタンが好ましく、ＤＡＢＣＯがより好ましい。３級アミンは１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
【００７２】
カルボン酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水コハク酸、無水マレイン酸等が挙げられる。これらの中でも特に、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸が好ましく、無水酢酸がより好ましい。カルボン酸無水物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
【００７３】
化学イミド化においてポリアミド酸を溶解する溶媒としては、溶解性に優れる極性溶媒が好適である。例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらの中でも特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群より選ばれる１種以上であることが均一反応をする観点から好ましい。アミド化反応の溶媒としてこれらの溶媒を用いた場合、アミド化反応後の反応混合物からポリアミド酸を分離せずそのまま化学イミド化に用いることができる
（フッ素化ポリアリールエーテルケトン）
フッ素化ポリアリールエーテルケトンとしては、以下の式（ＩＶ）で示される構成単位からなるフッ素化ポリアリールエーテルケトンが例示できる。
【００７４】
【化１５】
2017163898.tif 000017
【００７５】
〔式（ＩＶ）中、ｎは重合度を表し、ｍは０または１の整数であり、Ｒ４１は下記式（ＩＶ−２）
【００７６】
【化１６】
2017163898.tif 000018
【００７７】
（式（ＩＶ−２）中、ｐは０または１の整数であり、Ｒ４２は以下の構造：
【００７８】
【化１７】
2017163898.tif 000019
【００７９】
のいずれかである。）で表される基である。〕
で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンである。
【００８０】
式（ＩＶ）において、重合度ｎは、具体的には２〜５０００、好ましくは５〜５００である。さらに、本発明において、フッ素化ポリアリールエーテルケトンは、同一の繰り返し単位からなるものであってもまたは異なる繰り返し単位からなるものであってもよく、後者の場合には、その繰り返し単位はブロック状またはランダム状のいずれでもよい。
【００８１】
なお、本発明において、上記式（ＩＶ）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンの製造方法については詳述するが、この記載から、式（ＩＶ）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンの末端は、フッ素原子を含むベンゼン環側がフッ素であり、Ｒ４１側が水素原子であると、即ち、式（ＩＶ）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンは下記式（ＩＶ−３）：
【００８２】
【化１８】
2017163898.tif 000020
【００８３】
〔式中、ｎは重合度を表し、ｍは０または１の整数であり、Ｒ４１は上で定義した通りである。〕
で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンであると考えられる。
【００８４】
上記式（ＩＶ）において、ｍが０の場合には、下記式（ＩＶ−４）：
【００８５】
【化１９】
2017163898.tif 000021
【００８６】
〔式中、ｎは重合度を表す。〕
で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンとなる。
【００８７】
また、上記式（ＩＶ）において、ｍが１でありかつｐが０である場合には、下記式（ＩＶ−５）：
【００８８】
【化２０】
2017163898.tif 000022
【００８９】
〔式中、ｎは重合度を表す。〕
で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンとなる。
【００９０】
さらに、上記式（ＩＶ）において、ｍが１でありかつｐが１である場合には、下記式（ＩＶ−６）：
【００９１】
【化２１】
2017163898.tif 000023
【００９２】
〔式中、ｎは重合度を表し、Ｒ４２は前記のとおりである。〕
で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンとなる。なお、上記式（ＩＶ−６）では、ｎは、好ましくは２〜２０００、より好ましくは５〜２００である。
【００９３】
すなわち、好ましい実施形態において、式（ＩＶ）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンは、下記式（ＩＶ−７）：
【００９４】
【化２２】
2017163898.tif 000024
【００９５】
〔式中、Ｒ４２は前記のとおりである。〕
で表される繰り返し単位を含むポリマーである。
【００９６】
特に好ましい実施形態において、式（ＩＶ）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンは、下記式（ＩＶ−８）：
【００９７】
【化２３】
2017163898.tif 000025
【００９８】
で表される繰り返し単位を含むポリマーである。
【００９９】
これらのうち、式（ＩＶ−２）および（ＩＶ−４）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンは、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、下記式（ＩＶ−９）：
【０１００】
【化２４】
2017163898.tif 000026
【０１０１】
〔式中、ｑは０または１の整数である。〕
で示される２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル化合物を加熱することにより得られる。
【０１０２】
上記反応において、反応温度は、３０〜２５０℃、好ましくは５０〜２００℃である。
【０１０３】
また、上記（ＩＶ−６）で示されるフッ素化ポリアリールエーテルケトンは、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、下記式（ＩＶ−１０）：
【０１０４】
【化２５】
2017163898.tif 000027
【０１０５】
で示される４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテルおよび下記式（ＩＶ−１１）：
【０１０６】
【化２６】
2017163898.tif 000028
【０１０７】
〔式中、Ｒ４２は以下の構造：
【０１０８】
【化２７】
2017163898.tif 000029
【０１０９】
のいずれかである。〕
で示される２価のフェノール化合物を加熱することよって、得られる。
【０１１０】
上記反応において、反応温度は、２０〜１５０℃、好ましくは５０〜１２０℃である。この際、このように低温度で反応することで副反応を抑制し、重合体のゲル化を防止することができる。また、重合時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、好ましくは、１〜４８時間、より好ましくは２〜２４時間である。さらに、重合反応は、常圧下または減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。
【０１１１】
上記重合反応で使用される有機溶媒としては、例えば、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびメタノール等の極性溶媒やトルエンなどが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独でまたは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【０１１２】
また、有機溶媒におけるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物の濃度は、５〜５０重量％、好ましくは１０〜３０重量％である。
【０１１３】
トルエンや他の同様の溶媒を反応の初期段階に使用する際には、フェノキシド生成の際に副生する水を、重合溶媒に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【０１１４】
本発明において使用される塩基性化合物は、重縮合反応によって生成するフッ化水素を捕集することにより重縮合反応を促進するよう作用し、さらに２価のフェノール化合物による重縮合反応の場合には、フェノール化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用がある。
【０１１５】
このような塩基性化合物としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸リチウムおよび水酸化カリウムが挙げられる。
【０１１６】
また、本発明において、塩基性化合物の使用量は、式（ＩＶ−２）および（ＩＶ−４）の重合体の場合では、使用されるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物１モルに対して、０．５〜１０モル、好ましくは０．５〜５モルであり、または、式（ＩＶ−５）の重合体の場合では、使用されるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物１モルに対して、１〜２０モル、好ましくは１〜１０モルである。
【０１１７】
本発明において使用される２価のフェノール化合物としては、例えば、２，２−ビス（４−ビドロキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−へキサフルオロプロパン（以下、「６ＦＢＡ」という）、ビスフェノールＡ（以下、「ＢＡ」という）、９，９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＨＦ」という）、ビスフェノールＦ（以下、「ＢＦ」という）、ハイドロキノン（以下、「ＨＱ」という）およびレゾルシノール（以下、「ＲＳ」という）が挙げられる。２価のフェノール化合物の使用量は、４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテル１モルに対して、０．８〜１．２モル、好ましくは０．９〜１．１モルである。
【０１１８】
例えば、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテルと、２価のフェノール化合物として６ＦＢＡとを反応させることにより、上記式（ＩＶ−８）で表される繰り返し単位を含むフッ素化ポリアリールエーテルケトンを生成することができる。
【０１１９】
重合反応終了後は、反応溶液より蒸発等により溶媒の除去を行ない、必要により留出物を洗浄することによって、所望の重合体が得られる。または、反応溶液を重合体の溶解度が低い溶媒中に加えることにより、重合体を固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって、重合体を得てもよい。
【０１２０】
（フッ素化ポリエステルポリエーテル）
フッ素化ポリエステルポリエーテルとしては、以下の式（Ｖ）で示される構成単位からなるフッ素化ポリエステルポリエーテルが例示できる。
【０１２１】
【化２８】
2017163898.tif 000030
【０１２２】
〔式（Ｖ）中、ｍ’およびｎ’は、同一または異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５１およびＲ５２は、同一または異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位を必須とするフッ素化ポリエステルポリエーテルである。
【０１２３】
本発明において使用するフッ素化ポリエステルポリエーテルは、上記式（Ｖ）で表される繰り返し単位を必須とするものである限り、その他の繰り返し単位を含んでいてもよいが、上記式（Ｖ）で表される繰り返し単位がフッ素化ポリエステルポリエーテルを構成する繰り返し単位の主成分であることが好ましい。なお、フッ素化ポリエステルポリエーテルにおいては、上記式（Ｖ）で表される繰り返し単位の構造は、同一であっても異なっていてもよく、異なる繰り返し単位により構成される場合には、ブロック状、ランダム状等のいずれの形態であってもよい。
【０１２４】
上記式（Ｖ）で表される繰り返し単位において、（−Ｏ−Ｒ５２−Ｏ−）の部分は、ベンゼン環のエステル結合している炭素に対して、オルト位、メタ位、パラ位のいずれの炭素に結合していてもよいが、オルト位またはパラ位に結合しているものが好ましい。本発明において使用するフッ素化ポリエステルポリエーテルにおいては、フッ素原子を有するベンゼン環は、４つの水素原子の一部または全部がフッ素原子に置換された形態となっており、また、ベンゼン環の水素原子がフッ素原子以外のハロゲン原子や、アルキル鎖を有する置換基等のその他の置換基により置換された形態となっていてもよい。したがって、１つのベンゼン環において水素原子とフッ素原子、および、フッ素原子以外のハロゲン原子や、その他の置換基との合計は４である。
【０１２５】
Ｒ５１、Ｒ５２は、同一または異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表すが、２価の有機基としては、炭素数１〜５０の有機基であることが好ましい。より好ましくは、下記式（８−１）〜（８−１９）で表される基のいずれかである。
【０１２６】
【化２９】
2017163898.tif 000031
【０１２７】
上記式（８−１）〜（８−１９）中、Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２、Ｙ２’、Ｙ３およびＹ４は、同一若しくは異なって、置換基を表し、１つのベンゼン環は、０〜４個のＹ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４、０〜３個のＹ１’およびＹ２’を置換基として有する。Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２、Ｙ２’、Ｙ３およびＹ４で表される置換基としては、例えば、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアミノ基、アリールチオ基等が挙げられる。
【０１２８】
本発明において使用するフッ素化ポリエステルポリエーテルにおいては、上記式（８−１）〜（８−１９）で表される基のベンゼン環が置換基を１つ以上有し、その置換基が炭素数１〜３０であって、置換基を有していてもよいアルキル基、アルコキシ基等であること、または、ベンゼン環が置換基を有しないことが好ましい。より好ましくは、ベンゼン環は置換基を有しない。すなわち、下記式（９−１）〜（９−１９）で表される基であることが好ましい。
【０１２９】
【化３０】
2017163898.tif 000032
【０１３０】
本発明において使用するフッ素化ポリエステルポリエーテルにおいては、上記式（Ｖ）中、Ｒ５１の構造が上記（９−６）または（９−１８）のいずれかであって、かつベンゼン環が置換基を有さないものであることが好ましい。すなわち、フッ素化ポリエステルポリエーテルは、下記式（Ｖ−２）：
【０１３１】
【化３１】
2017163898.tif 000033
【０１３２】
〔式中、ｍ’およびｎ’は、同一または異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５２は、同一または異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位および／または下記式（Ｖ−３）：
【０１３３】
【化３２】
2017163898.tif 000034
【０１３４】
〔式中、ｍ’およびｎ’は、同一または異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５２は、同一または異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位を必須とするものであることが好ましい。
【０１３５】
上記式（Ｖ）で表されるフッ素化ポリエステルポリエーテルの製造方法は、特に制限されないが、含フッ素エステル化合物とジヒドロキシ化合物とを重合する工程を含む製造方法が好ましい。また、反応効率の点から、この工程は、塩基性触媒存在下で行われることが好ましい。
【０１３６】
すなわち、上記式（Ｖ）で表されるフッ素化ポリエステルポリエーテルは、下記式（Ｖ−４）：
【０１３７】
【化３３】
2017163898.tif 000035
【０１３８】
〔式中、ｍおよびｎは、同一または異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜５の整数である。Ｒ５１は、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。〕
で表される含フッ素エステル化合物と下記式（Ｖ−５）：
【０１３９】
【化３４】
2017163898.tif 000036
【０１４０】
式中、Ｒ５２は、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。〕
で表されるジヒドロキシ化合物とを塩基性触媒存在下で重合する工程を含む製造方法により製造されることが好ましい。
【０１４１】
上記式（Ｖ−４）で表される含フッ素エステル化合物は、反応性が高いことから、上記製造方法のように、この含フッ素エステル化合物を原料として重合体を製造する場合には、均一系での重合、界面重合等、重合方法を選ばず様々な重合方法を用いることができ、また、従来の含フッ素化合物を用いた重合反応に比べて低温である１５０℃以下の条件下でも重合することが可能である。
【０１４２】
上記製造方法においては、ジヒドロキシ化合物由来の構造（−Ｏ−Ｒ５２−Ｏ−）の部分がベンゼン環のエステル基が結合している炭素に対して、オルト位、メタ位、パラ位のいずれの炭素に結合していてもよいが、オルト位またはパラ位に結合したものが好ましい。また、１つのベンゼン環にジヒドロキシ化合物由来の部分が２つ以上結合すると、架橋構造を形成することになる場合があるが、架橋構造を有すると生成する重合体がゲル化することから、架橋構造が少ないものが好ましい。上記製造方法においては、反応温度と反応時間、用いる溶媒や塩基性触媒の種類と濃度、原料の仕込み順序や反応系中の水分量等によって架橋構造の生成しやすさが異なるため、それぞれを最適化することにより、架橋構造の生成を抑制することが可能となる。
【０１４３】
上記製造方法における重縮合反応においては、反応原料の有効利用および生成物の収率の向上の点から、原料として使用されるジヒドロキシ化合物と含フッ素エステル化合物との比率を適宜設定することが好ましく、含フッ素エステル化合物１モルに対して、ジヒドロキシ化合物を０．８〜１．２モル使用することが好ましい。より好ましくは、ジヒドロキシ化合物を０．９〜１．１モル使用することである。
【０１４４】
上記製造方法における重縮合反応の反応温度としては、０〜１００℃とすることが好ましく、より好ましくは１０〜８０℃である。また、反応時間は、１〜４０時間とすることが好ましく、より好ましくは１〜３０時間である。更に、上記反応は、減圧下、常圧下または加圧下のいずれで行われてもよいが、設備面等を考慮すると、常圧下で反応を行うことが好ましい。
【０１４５】
上記製造方法における重縮合反応においては、含フッ素エステル化合物が溶媒への溶解性に優れていることに起因して様々な溶媒を用いることができ、アセトニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類；ニトロベンゼン、ニトロメタン等のニトロ類；アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、シクロヘキサノン等のケトン類；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類；ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類；蟻酸メチル、蟻酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル類；Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等を用いることができる。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アセトン、アセトニトリル、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）が好ましい。溶媒の量としては、上記反応を効率良く進行できる量であればよいが、含フッ素エステル化合物が溶媒中に１〜５０質量％となるような量とすることが好ましく、より好ましくは１〜３０質量％存在するような量である。
【０１４６】
上記製造方法における重縮合反応において用いられる塩基性化合物としては、重縮合反応によって生成するフッ化水素を捕集することにより重縮合反応を促進するよう作用し、更に上述したようなジヒドロキシ化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用があるものが好適であり、例えば、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、フッ化カリウム、トリブチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、炭酸リチウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン等の１種または２種以上が好適である。このような塩基性化合物の使用量としては、使用される含フッ素エステル化合物１モルに対して、０．５〜２０モルが好ましい。より好ましくは０．８〜１０モルである。
【０１４７】
上記重縮合反応終了後は、蒸発等により反応溶液中の溶媒の除去を行い、必要により留出物を洗浄することによって、上記式（Ｖ）で表される繰り返し単位を有するフッ素化ポリエステルポリエーテルが得られることになる。また、反応溶液を重合体の溶解度が低い溶媒中に加えることにより、フッ素化ポリエステルポリエーテルを固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって得ることもできる。
（フッ素化ポリエーテル）
フッ素化ポリエーテルとしては、以下の式（ＶＩ）で示される構成単位からなるフッ素化ポリエーテルが例示できる。
【０１４８】
【化３５】
2017163898.tif 000037
【０１４９】
〔式（ＶＩ）中、Ｒ３１は、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキル基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルコキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルアミノ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルチオ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリール基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールオキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールアミノ基または置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールチオ基を表し；Ｒ６１は、２価の有機基を表し；並びにｎは重合度を表す。〕
で示されるフッ素化ポリエーテルである。
【０１５０】
前記式（ＶＩ）において、Ｒ３１は、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルおよび２−エチルヘキシル、好ましくはメチル、エチル、プロピルおよびブチル；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、フルフリルオキシおよびアリルオキシ、好ましくはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシおよびブトキシ；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルアミノ基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ｓｅｃ−ブチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノ、好ましくはメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノおよびジエチルアミノ；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルチオ基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオおよびｎ−ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオおよびｉｓｏ−プロピルチオ、好ましくは、メチルチオ、エチルチオおよびプロピルチオ；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリール基、例えば、フェニル、ベンジル、フェネチル、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トリル、２，３−若しくは２，４−キシリル、メシチル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、ビフェニリル、ベンズヒドリル、トリチルおよびピレニル、好ましくはフェニル並びにｏ−，ｍ−およびｐ−トリル；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールオキシ基、例えば、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヒドロキシ安息香酸およびそのエステル類（例えば、メチルエステル、エチルエステル、メトキシエチルエステル、エトキシエチルエステル、フルフリルエステルおよびフェニルエステルなど；以下、同様）由来の基、ナフトキシ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−メチルフェノキシ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−フェニルフェノキシ、フェニルエチニルフェノキシ、並びにクレソチン酸およびそのエステル類由来の基、好ましくはフェノキシおよびナフトキシ；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールアミノ基、例えば、アニリノ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トルイジノ、１，２−若しくは１，３−キシリジノ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−メトキシアニリノ並びにアントラニル酸およびそのエステル類由来の基、好ましくはアニリノおよびｏ−，ｍ−若しくはｐ−トルイジノ；または置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールチオ基、例えば、フェニルチオ、フェニルメタンチオ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トリルチオ並びにチオサリチル酸およびそのエステル類由来の基、好ましくはフェニルチオを表す。これらのうち、置換基を有してもよいアリールオキシ基、アリールチオ基およびアリールアミノ基が好ましく、さらに、フェノキシ、フェニルチオおよびアニリノがＲ３１として最も好ましい。
【０１５１】
また、上記式（ＶＩ）において、Ｒ３１が置換基を有するアルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアミノ基またはアリールチオ基を表す際に使用できる置換基としては、目的物の所望の特性に応じて適宜選択でき、特に制限されるものではないが、例えば、炭素原子数１〜１２のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシル；ハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素；シアノ基、ニトロ基並びにカルボキシエステル基などが挙げられる。これらのうち、好ましくはメチルおよびカルボキシエステル基である。
【０１５２】
さらに、上記式（ＶＩ）において、Ｒ６１は、２価の有機基を表し、例えば、下記式で示される基が挙げられる。
【０１５３】
【化３６】
2017163898.tif 000038
【０１５４】
これらのうち、下記式：
【０１５５】
【化３７】
2017163898.tif 000039
【０１５６】
で示される２価の有機基がＲ６１として好ましく、特に下記式：
【０１５７】
【化３８】
2017163898.tif 000040
【０１５８】
で示される２価の有機基がＲ６１として好ましい。
【０１５９】
さらに、上記式（ＶＩ）において、ｎは重合度を表し、具体的には、５〜１０００、好ましくは１０〜５００である。なお、本発明において使用するフッ素化ポリエーテルは、上記式（ＶＩ）の構成単位の同一の繰り返し単位からなるものであってもまたは異なる繰り返し単位からなるものであってもよく、後者の場合には、その繰り返し単位はブロック状またはランダム状のいずれでもよい。
【０１６０】
また、フッ素化ポリエーテルの製造方法については以下に詳述するが、この記載から、式（ＶＩ）で示されるフッ素化ポリエーテルの末端は、フッ素原子を含むベンゼン環側がフッ素であり、酸素原子（Ｒ６１）側が水素原子であると、即ち、式（ＶＩ）で示されるフッ素化ポリエーテルは下記式（ＶＩ−４）：
【０１６１】
【化３９】
2017163898.tif 000041
【０１６２】
で示されるポリマーであると考えられる。
【０１６３】
フッ素化ポリエーテルは、下記式（ＶＩ−２）：
【０１６４】
【化４０】
2017163898.tif 000042
【０１６５】
で示されるテトラフルオロベンゾニトリル誘導体を、下記式（ＶＩ−３）：
【０１６６】
【化４１】
2017163898.tif 000043
【０１６７】
で示されるジヒドロキシ化合物と塩基性触媒の存在下で重合することによって、製造される。この際、上記式（ＶＩ−２）におけるＲ３１および上記式（ＶＩ−３）におけるＲ６１の定義は、上記式（ＶＩ）におけるＲ３１およびＲ６１の定義と同様である。
【０１６８】
本発明において、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、公知の方法によって製造できるが、例えば、式：Ｒ３１Ｈ［式中、Ｒ３１は上記式（ＶＩ）における定義と同様である］で示される化合物を有機溶媒中で塩基性化合物の存在下で２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾニトリル（本明細書中、「ＰＦＢＮ」とも称する）と反応させることによって得られる。
【０１６９】
上記反応において、式：Ｒ３１Ｈで示される化合物およびＰＦＢＮは、それぞれ、単一の化合物として使用されてもあるいは２種以上の式：Ｒ３１Ｈで示される化合物および／またはＰＦＢＮの混合物の形態で使用されてもよいが、精製工程やポリマーの物性などを考慮すると、単一の化合物として使用されることが好ましい。なお、後者の場合には、使用される複数または単一のＰＦＢＮのモル数の合計が、複数または単一の式：Ｒ３１Ｈで示される化合物のモル数の合計に等しいまたはほぼ等しいことが好ましいが、具体的には、式：Ｒ３１Ｈで示される化合物の使用量が、ＰＦＢＮ  １モルに対して、好ましくは０．１〜５モル、より好ましくは０．５〜２モルである。
【０１７０】
上記反応において使用できる有機溶媒としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタンおよびメタノール等の極性溶媒；並びにこれらの極性溶媒とトルエンやキシレン等の非極性溶媒との混合溶媒などが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独でまたは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、有機溶媒におけるＰＦＢＮの濃度は、１〜４０質量％、好ましくは、５〜３０質量％である。この際、トルエンや他の同様の溶媒を反応の初期段階に使用する際には、反応中に副生する水を、重合溶媒に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【０１７１】
また、上記反応において使用される塩基性化合物は、反応を促進させるために生成するフッ化水素を捕集するよう作用するものであることが望ましい。このような塩基性化合物としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、フッ化カリウム、トリエチルアミン、トリブチルアミンおよびピリジンなどが挙げられる。この際、塩基性化合物の使用量は、使用されるＰＦＢＮ  １モルに対して、０．１〜５モル、好ましくは０．５〜２モルである。
【０１７２】
さらに、上記反応における反応条件は、Ｒ１Ｈで示される化合物とＰＦＢＮとの反応が効率よく進行するものであれば特に制限されるものではないが、例えば、反応は、好ましくは反応系を撹拌状態に保ちながら、通常、２０〜１８０℃、好ましくは４０〜１６０℃の温度で行なわれる。また、反応時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、通常、１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間である。さらに、反応は、常圧下または減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。このような反応によって得られる生成物は、反応混合物に蒸留水を注加し、ジクロロメタン、ジクロロエタンまたは四塩化炭素等の抽出剤で抽出した後、有機層を抽出物から分離し、抽出剤を留去することにより得られる。さらに、この生成物を、必要であれば、メタノールまたはエタノール等で再結晶化することによって、結晶として得てもよい。
【０１７３】
このようにして合成された式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、上述したように、さらに式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物と塩基性触媒の存在下で重合に供されることによって、目的の式（ＶＩ）のフッ素化ポリエーテルが製造される。この際、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、上記したような抽出、再結晶化、クロマトグラフィーおよび蒸留等の精製工程を経た後使用されてもまたは精製工程を行なわずにそのまま使用してもよいが、次工程の収率などを考慮すると精製された後使用することが好ましい。
【０１７４】
上記反応において使用される式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物は、目的産物である式（ＶＩ）のフッ素化ポリエーテルの構造に従って選択される。好ましく使用される式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物としては、以下に示されるように、２，２−ビス（４−ビドロキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−へキサフルオロプロパン（以下、「６ＦＢＡ」という）、４，４’−ジヒドロキシジフェニルエーテル（以下、「ＤＰＥ」という）、ハイドロキノン（以下、「ＨＱ」という）、ビスフェノールＡ（以下、「ＢＡ」という）、９，９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＨＦ」という）、フェノールフタレイン（以下、「ＰＰ」という）、９，９−ビス（３−メチル−４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＭＨＦ」という）、１，４−ビス（ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン（以下、「ＣＨＢ」という）、および４，４’−ジヒドロキシビフェニル（以下、「ＢＰ」という）が挙げられる。
【０１７５】
【化４２】
2017163898.tif 000044
【０１７６】
上記反応において、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体および式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物は、それぞれ、単一の化合物として使用されてもあるいは２種以上の式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体および／または式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物の混合物の形態で使用されてもよいが、精製工程やポリマーの物性などを考慮すると、単一の化合物として使用されることが好ましい。なお、後者の場合には、使用される複数または単一の式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体のモル数の合計が、複数または単一の式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物のモル数の合計に等しいまたはほぼ等しいことが好ましいが、具体的には、式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物の使用量は、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体１モルに対して、０．１〜５モル、好ましくは１〜２モルである。
【０１７７】
上記反応は、有機溶剤中で行なわれてまたは無溶剤下で行なわれてもよいが、有機溶剤中に行われることが好ましい。前者の場合、使用できる有機溶剤としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタンおよびメタノール等の極性溶媒；並びにこれらの極性溶媒とトルエンやキシレン等の非極性溶媒との混合溶媒などが挙げられる。これらの有機溶剤は、単独でまたは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、有機溶剤における式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体の濃度は、１〜５０質量％、好ましくは５〜２０質量％である。この際、トルエンや他の同様の溶剤を反応の初期段階に使用する際には、反応中に副生する水を、重合溶剤に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【０１７８】
また、本発明において、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体および式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物の反応は、塩基性触媒の存在下で行なうことを必須とする。塩基性触媒は、式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物による重縮合反応を促進するよう、式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用を有するものが好ましく、具体的には、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムまたはフッ化カリウムなどが挙げられる。また、塩基性触媒の使用量は、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体と式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物との反応が良好に進行できる量であれば特に制限されるものではないが、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体１モルに対して、通常、０．１〜５モル、好ましくは０．５〜２モルである。
【０１７９】
さらに、上記重合反応における反応条件は、式（ＶＩ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体と式（ＶＩ−３）のジヒドロキシ化合物との反応が効率よく進行するものであれば特に制限されるものではないが、例えば、重合温度は、好ましくは２００℃以下、より好ましくは２０〜１５０℃、最も好ましくは４０〜１００℃である。このように低温度で反応することで、特別の設備を必要とすることなく、副反応を抑制し、ポリマーのゲル化を防止することができる。また、重合時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、好ましくは、１〜４８時間、より好ましくは２〜２４時間である。さらに、重合反応は、常圧下または減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。
【０１８０】
上記重合反応終了後は、反応溶液より蒸発等により溶媒の除去を行ない、必要により留出物を洗浄することによって、所望のポリマーが得られる。または、反応溶液をポリマーの溶解度が低い溶媒中に加えることにより、ポリマーを固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって、ポリマーを得てもよい。
【０１８１】
（含フッ素ポリマーの性状）
本発明で用いられる含フッ素ポリマーのフッ素含有量は、例えば１〜６０質量％、好ましくは５〜６０質量％、より好ましくは１０〜６０質量％、さらに好ましくは１５〜３０質量％、特に好ましくは１７〜１９質量％以下である。なお、上記のフッ素含有量は、実施例に記載の方法により測定できる。
【０１８２】
基材の細胞培養面は、静的水接触角が７５°以上であることが好ましく、より好ましくは８０°超、更に好ましくは８３°超であり、静的水接触角の上限は、例えば１５０°未満、好ましくは１２０°未満である。なお、上記の静的水接触角は、実施例に記載の方法で測定される値である。
【０１８３】
本発明で用いられる含フッ素ポリマーとしては、引張弾性率が２ＧＰａを超えるものが好ましい。引張弾性率が１ＧＰａ以上の含フッ素ポリマーを用いることにより、ニューロスフィアの保持性が一層向上する。含フッ素ポリマーの引張弾性率は、より好ましくは２ＧＰａ超であり、さらに好ましくは２．３ＧＰａ以上である。引張弾性率の上限は特に制限されないが、現実的には、例えば６ＧＰａ以下であり、好ましくは４ＧＰａ以下であり、より好ましくは３．４ＧＰａ未満であり、更に好ましくは３ＧＰａ以下である。好ましい一実施形態では、引張弾性率が２ＧＰａ超３．４ＧＰａ未満の含フッ素ポリマーが用いられる。含フッ素ポリマーの引張弾性率は、任意の手段により制御することができる。例えば、ポリマー主鎖にエーテル結合が多く存在すると、柔軟な構造になり得る。したがって、材料の選択や重合度を低くするなどの手法により、ポリマー１分子当たりの、エーテル結合等の分子に柔軟性を与える基の数を少なくすることで、引張弾性率を高くすることができる。あるいは、例えば含フッ素ポリイミドであれば、イミド化反応の条件（例えば、焼成温度を高くすることにより、引張弾性率を高くすることができる。）を適宜設定することにより引張弾性率を制御することができる。なお、上記の引張弾性率は、実施例に記載の方法で測定される値である。
【０１８４】
含フッ素ポリマーの重量平均分子量は、例えば、５，０００〜２，０００，０００、好ましくは８，０００〜１，０００，０００であり、より好ましくは１０，０００〜５００，０００であり、更に好ましくは１００，０００以上３００，０００未満である。なお、本明細書において、ポリマーの重量平均分子量は、実施例に記載の方法により測定された値である。
【０１８５】
培養に用いる培養容器は、細胞接着面が含フッ素ポリマー基材により構成されるものであれば特に制限されない。細胞培養用容器は、含フッ素ポリマー基材と他の部材とが組み合わされて構成されていてもよいし、含フッ素ポリマー基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよいし、含フッ素ポリマー基材のみにより構成されていてもよい。含フッ素ポリマー基材がフィルム状等の柔軟な基材である場合は、剛性を有する適当な支持部材と組みあわせて形成してもよい。支持部材を構成する材料としては、例えば、ソーダガラス、無アルカリガラス、硼硅酸ガラスなどの無機ガラス；カーボン；シリコン等の金属；ポリエチレン、ポリプロピレン、環状オレフィン等のポリオレフィン樹脂；ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂；ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系樹脂；エポキシ樹脂；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン）樹脂、ポリカーボネート樹脂、ビニルエーテル、ポリアセタール、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリアリールエーテル、ポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリアリールエーテルケトン、フェノール樹脂、ポリエーテルニトリル（ＰＥＮ）、石英等が例示できる。細胞培養用容器は、細胞接着面が含フッ素ポリマー基材を備えていればよく、全体としてどのような形状であってもよい。例えば、シングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、またはバッグ等の各種容器の形状であることができる。細胞培養用容器はまた、大量培養装置や潅流培養装置などの培養装置における細胞培養用容器の形態であってもよい。
【０１８６】
（神経幹細胞）
本明細書において、神経幹細胞とは、神経細胞およびグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）への分化能を有し、増殖能（自己複製能力）を有する細胞である。神経幹細胞が由来する生物種は特に制限されず、ヒトおよび非ヒト動物由来の各種細胞を用いることができる。細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー、タマリンおよびマーモセット等の霊長類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウズラ、ミンク、ツパイ、アフリカツメガエル、ならびにゼブラフィッシュ等が例示できる。神経幹細胞はまた、生体から採取したものであってもよく、あるいは全能性細胞、または人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）もしくは胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）等の多能性細胞を国際公開第２０１１／１０８７６６号等に記載の手法により神経幹細胞に分化誘導したものであってもよい。全能性細胞や多能性細胞の神経幹細胞への分化誘導を、本発明に係る含フッ素ポリマー基材上で行ってもよい。
【０１８７】
神経幹細胞を生体組織から回収して用いる場合、その由来する組織も特に限定されず、中枢神経系組織および抹消神経系組織のいずれであってもよいが、例えば脳由来の神経幹細胞が好適に用いられうる。
【０１８８】
本明細書において、ニューロスフィアとは、神経幹細胞を含む細胞凝集塊である。形成されるニューロスフィアの大きさ（分化誘導前のニューロスフィアの大きさ）は、例えば直径が１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜５００μｍ、より好ましくは１００〜２００μｍである。なお、上記のニューロスフィアの大きさは、光学顕微鏡にて観察した１０個以上のニューロスフィアについての平均値である。
【０１８９】
従来の浮遊培養にてニューロスフィアを形成した場合、培地中を漂うニューロスフィア同士の会合により、過剰に大きなニューロスフィアが形成される場合があった。この場合、ニューロスフィア中央部に存在する細胞が壊死するおそれがある。このため、過剰に大きなニューロスフィアが形成されることを防止するためには、従来は直径４００μｍ程度の微小なウェル内で浮遊培養を行うなどの対応がとられてきた。一方、本発明によれば、ニューロスフィアが基材に保持されているため、浮遊によるニューロスフィア同士の会合が効果的に抑制され得る。これにより、微小なウェル内での培養のような操作性に劣る手段を必要とせずとも、ニューロスフィアが過剰に大きくなることを有効に防止し得る。
【０１９０】
なお、本発明においては、少なくとも神経幹細胞を含む細胞を含フッ素ポリマー基材上で培養すればよい。すなわち、本発明の目的効果が阻害されない程度において、ニューロスフィアにおける神経幹細胞以外の他の細胞（例えば、神経前駆細胞やグリア芽細胞等）の存在は許容される。本発明においては、神経幹細胞を、神経幹細胞以外の細胞（例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性細胞；間葉系幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞等の多分化能を有する細胞；各種前駆細胞および幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、網膜細胞、角膜由来細胞、生殖腺由来細胞、各種線細胞；各種癌細胞など）の存在下でニューロスフィアの形成を行ってもよい。神経幹細胞以外の他の細胞は、神経幹細胞と同一の組織に由来するものであってもよく、他の組織に由来するものであってもよい。
【０１９１】
神経幹細胞の培養に用いる基礎培地としては、神経幹細胞の培養に通常用いられる従来公知のものが採用でき、特に制限されるものではない。例えば、基礎培地としては、イーグル最小必須培地（Ｅ−ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（Ｇ−ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＭ’ｓＦ−１０培地（Ｆ−１０）、ＨＡＭ’ｓＦ−１２培地（Ｆ−１２）、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ−Ａ培地等が挙げられる。基礎培地として、例えばＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２のような、上記培地を任意の割合で混合した混合培地を用いてもよい。さらに、必要に応じて、成長因子、抗生物質、脂質、ホルモン（例えば、インスリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、β−エストラジオール、プロゲステロン等）、鉄源（例えば、トランスフェリン等）、有機酸（例えば、ピルビン酸等）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸、非必須アミノ酸等）、糖（例えば、グルコース、ヘパリン等）、ビタミン（例えば、アスコルビン酸、ビオチン等）、塩類（例えば、亜セレン酸ナトリウム等）、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール等）、エタノールアミン、血清蛋白質（例えば、アルブミン等）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）、細胞培養用各種サプリメント（例えば、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉサプリメント等）、ＢＭＰ阻害剤（例えば、Ｎｏｇｇｉｎ等）などの添加剤を添加した培地を使用してもよい。
【０１９２】
培地に添加する成長因子としては、神経幹細胞の増殖を促進し、分化を誘導しない濃度での使用が可能なものであれば特に限定されない。細胞増殖性の観点から、神経幹細胞の培養を、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、およびＬＩＦ（白血病阻止因子）からなる群から選択される成長因子の１つ以上の存在下で行うことが好ましい。これらの成長因子の添加量は細胞密度等により適宜調整すればよいが、例えば、培地中、各成長因子の濃度が１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは１０〜４０ｎｇ／ｍｌである。
【０１９３】
本発明では、分化誘導が効果的に抑制されるという観点から、神経幹細胞の培養を、無血清培地で行うことが好ましい。本明細書において無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない基礎培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、成長因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。特に、増殖性の観点から、神経幹細胞の培養に用いる培地は、Ｎ２−サプリメント（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ５８，９４（１９７９））を含む無血清培地であることが好ましい。
【０１９４】
以下、一具体例として、神経幹細胞の培養に用いる好適な培地の組成を示す：
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地
１０〜４０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ
１０〜４０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ
１〜５０μｇ／ｍｌ  ヘパリン
０．５〜４％（ｖ／ｖ）  Ｎ−２サプリメント。
【０１９５】
含フッ素ポリマー基材上での神経幹細胞の培養開始時の細胞密度（神経幹細胞およびその他の細胞を含む細胞全体の密度）は、例えば１×１０２〜１×１０６細胞／ｃｍ２であり、好ましくは１×１０３〜５×１０５細胞／ｃｍ２である。
【０１９６】
培養条件も特に制限されず、本技術分野において通常用いられる条件にて行う。例えば、培養条件は、１〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２雰囲気下、２５〜４０℃程度、好ましくは３２〜３８℃で、所望のサイズのニューロスフィアが形成されるまで（例えば、３〜１５日程度）行う。培地は、２〜５日一度のペースで交換することが好ましい。培地交換は全量交換でもよいし、部分的な交換（例えば、半量交換）でもよい。
【０１９７】
形成された細胞凝集塊中に未分化の神経幹細胞が存在することは、神経幹細胞の遺伝子やタンパク質の分子マーカーの発現によって確認することができる。かような神経幹細胞の分子マーカーとしては、従来公知のものを使用することができ、例えば、ネスチン等の中間径フィラメントなどの分子マーカーを、必要に応じて複数組み合わせて測定すればよい。分子マーカーの測定は、遺伝子であればＰＣＲ（例えば、定量ＰＣＲ）やノーザンブロッティング等、タンパク質であればＥＬＩＳＡ法や免疫染色法等、従来公知の手段で行えばよい。
【０１９８】
＜ニューロスフェロイドの形成方法＞
本発明の一側面では、上記の神経幹細胞の培養方法によりニューロスフィアを形成すること、および前記基材に前記ニューロスフィアを保持した状態で、前記神経幹細胞の分化を誘導すること、を含むニューロスフェロイドの形成方法が提供される。ニューロスフィアの形成を介してニューロスフェロイドを形成することにより、任意の大きさ、形状で三次元的なネットワークが形成されたニューロスフェロイドとすることができる。特に、含フッ素ポリマー上に保持したニューロスフィアに対して誘導剤を用いた誘導処理を行うと、誘導剤に対して細胞が高感度に応答し、分化が強く誘導されうる。
【０１９９】
なお、ニューロスフェロイドとは、神経細胞、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）および／またはこれらの前駆細胞を含む、複数の細胞によって形成される凝集塊である。ニューロスフェロイドは神経幹細胞のような未分化細胞や、神経系以外の組織の細胞（例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性細胞；間葉系幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞等の多分化能を有する細胞；各種前駆細胞および幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、網膜細胞、角膜由来細胞、生殖腺由来細胞、各種線細胞；各種癌細胞等の細胞等）を含んでいてもよい。ニューロスフェロイドは神経細胞およびグリア細胞のいずれを含んでいてもよく、両者を含んでいてもよい。一実施形態では神経細胞を含むニューロスフェロイドが提供され、別の実施形態ではグリア細胞を含むニューロスフェロイドが提供される。ニューロスフェロイドの形状や大きさは特に制限されず、用途や使用目的等に応じて適宜設定できるが、例えば直径（神経突起を含まない）が１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜５００μｍ、より好ましくは１００〜２００μｍである。なお、上記のニューロスフェロイドの大きさは、光学顕微鏡にて観察した１０個以上のニューロスフェロイドについての平均値である。
【０２００】
神経幹細胞の分化誘導は、通常、誘導剤（分化誘導剤）を含む培地での培養によって行う。誘導剤を適宜選択することにより、所望の細胞を高い選択性で得ることが可能である。神経幹細胞の分化誘導に用いる基礎培地は、特に制限されるものではないが、例えばイーグル細小必須培地（Ｅ−ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（Ｇ−ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＭ’ｓＦ−１０培地（Ｆ−１０）、ＨＡＭ’ｓＦ−１２培地（Ｆ−１２）、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ−Ａ培地等が挙げられる。基礎培地として、例えばＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２のような、上記培地を任意の割合で混合した混合培地を用いてもよい。さらに、必要に応じて、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ（例えば、ｂＦＧＦ）、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β等）、抗生物質、脂質、ホルモン（例えば、インスリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、β−エストラジオール、プロゲステロン等）、鉄源（例えば、トランスフェリン等）、有機酸（例えば、ピルビン酸等）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸、非必須アミノ酸等）、糖（例えば、グルコース、ヘパリン等）、ビタミン（例えば、アスコルビン酸、ビオチン等）、塩類（例えば、亜セレン酸ナトリウム等）、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール等）、エタノールアミン、血清蛋白質（例えば、アルブミン等）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）、細胞培養用各種サプリメント（例えば、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉサプリメント等）などの添加剤を添加した培地を使用してもよい。
【０２０１】
誘導剤（分化誘導剤）としては、従来公知のものを適宜選択して用いることができる。より具体的には、神経幹細胞の分化誘導を、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、イヌ血清のような動物血清）、Ｂ２７−サプリメント、ＳＭ−Ｎｅｕｒｏｎａｌサプリメント、レチノイン酸およびその誘導体（例えば、レチノイン酸、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール、ＡＭ５８０（４−［［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］アミノ］−安息香酸）、ＴＴＮＰＢ（４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペン−１−イル］−安息香酸）、パルミチン酸レチノール等）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＬＩＦ（白血病阻止因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質−２）、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質−４）、ならびにＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）からなる群から選択される１種以上を含む培地での培養によって行う。誘導剤（分化誘導剤）は１種を単独でまたは２種以上を混合して用いてもよく、分化の進行程度に応じて組成を適宜変更してもよい。神経細胞への分化誘導方法としては、神経幹細胞の分化誘導をＢ２７−サプリメント（Ｂｒｅｗｅｒ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  ３５，５６７（１９９３））を含む培地での培養によって行うことがより好ましく、Ｂ２７−サプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地培地での培養によって行うことが更に好ましい。詳細なメカニズムは不明であるものの、含フッ素ポリマーを基材として用いた場合、浮遊培養の場合と比べて誘導剤による分化シグナルの応答性が向上し、特にＢ２７−サプリメントを用いることで、分化シグナルの応答性が特に顕著に向上する。Ｂ２７−サプリメントの添加量は、培地中、例えば１〜４％（ｖ／ｖ）である。
【０２０２】
培養条件も特に制限されず、本技術分野において通常用いられる条件にて行う。例えば、培養条件は、１〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２雰囲気下、２５〜４０℃程度、好ましくは３２〜３８℃で、所望のサイズのニューロスフィアが形成されるまで（例えば、１〜２０日程度）行う。培地は、１〜５日一度のペースで交換することが好ましい。培地交換は全量交換でもよいし、部分的な交換（例えば、半量交換）でもよい。
【０２０３】
神経幹細胞の分化もまた、遺伝子、タンパク質、糖等の分子マーカーの発現によって確認することができる。かような分化マーカーとしては従来公知のものを適宜選択して使用することができ、例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ポリシアル酸神経接着分子）、βチューブリン−３、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）、ＰＬＰ（プロテオリピッドタンパク質）、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）等の分子マーカーを、必要に応じて適宜組み合わせて測定すればよい。分子マーカーの測定もまた、遺伝子であればＰＣＲ（例えば、定量ＰＣＲ）やノーザンブロッティング等、タンパク質であればＥＬＩＳＡ法や免疫染色法等、従来公知の手段が採用されうる。
【実施例】
【０２０４】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【０２０５】
＜実施例１＞
（フッ素含有量の測定方法）
元素分析装置（ジェイサイエンス製：マイクロコーダー  ＪＭ−１０）により、含フッ素ポリマーフィルム中のフッ素含有量の定量を行った。
【０２０６】
（重量平均分子量の測定）
装置：東ソー株式会社製ＨＣＬ−８２２０ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ２０、リン酸入りＮＭＰ）  ：０．０１モル／Ｌ
測定方法：０．５重量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出した。
【０２０７】
（静的水接触角の測定）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に２μｌの水を滴下した直後の液滴の付着角度を測定した（測定温度：２５℃）。
【０２０８】
（動的粘弾性測定方法）
装置：動的粘弾性（ティー・エイ・インスツルメント社製：ＲＳＡ  Ｇ２）
測定方法：厚さ４０μｍのフィルムを５ｍｍ×４０ｍｍの短冊状に切り出し、２５℃での伸びと応力を測定し、引張弾性率を算出した。
【０２０９】
（含フッ素ポリマー基材の製造）
１００ｍｌ容量の三口フラスコに１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）２．９７６ｇ（１０．２ミリモル）、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）４．５２４ｇ（１０．２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド４２．５ｇを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１８万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量は実質的に同一である。
【０２１０】
【化４３】
2017163898.tif 000045
【０２１１】
【化４４】
2017163898.tif 000046
【０２１２】
上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが４０μｍとなるように、ダイコーターを用いて硝子基体上に塗膜を形成した。次いで、３００℃で１時間、窒素雰囲気下で塗膜の焼成を行った。その後、焼成物を硝子基体から剥離し、含フッ素ポリイミドフィルム１を得た。
【０２１３】
得られた含フッ素ポリイミドフィルム１のフッ素含有量は１７質量％であり、静的水接触角は８７°であり、引張弾性率は２．８ＧＰａであった。
【０２１４】
（神経幹細胞の培養）
上記で得られた含フッ素ポリイミドフィルム１を基材として細胞培養面に配置した２４穴プレートを作製し、以下の手法により、神経幹細胞の培養に供した。なお、含フッ素ポリイミドフィルムは滅菌して細胞培養に用いた。
【０２１５】
Ｗｉｓｔａｒラットから胎齢１４日の胎仔を摘出し、摘出した胎仔から脳を回収した。回収した胎仔脳を、２ｍｌの細胞分離／分散溶液（Ａｃｃｕｍａｘ、イノベーティブセルテクノロジーズ社製）にて室温で１０〜１５分間処理し、細胞分散液を得た。次いで、得られた細胞分散液に４ｍｌのＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１（ｖ：ｖ））培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、ポアサイズ３０μｍのフィルターで細胞を濾過し、ろ液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、維持培地（１％（ｖ／ｖ）Ｎ２−サプリメント（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２０ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ、および１０μｇ／ｍｌヘパリンを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１（ｖ：ｖ））培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社））で、２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度となるように沈殿を再度懸濁させた。含フッ素ポリマー基材を細胞培養面に配置した２４穴プレートに、上記で調製した細胞懸濁液を播種（５×１０４細胞／ｃｍ２）した（培養０日目）。その後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベーター内で培養を行い、培養３日目に半量交換で培地交換し、８日目まで培養した。培養の経過に伴い、基材に保持されたニューロスフィアが出現することを光学顕微鏡で確認した。光学顕微鏡による観察像を、図１（図１（ａ）培養１日目、（ｂ）培養３日目、（ｃ）培養５日目、（ｄ）培養８日目）に示す。培養８日目のニューロスフィアの大きさは、直径１７１±６６μｍ（４１個のニューロスフィアの平均値±標準偏差μｍ）であった。
【０２１６】
（未分化であることの確認）
神経幹細胞の培養を行った培養プレートから、細胞分離／分散溶液（Ａｃｃｕｍａｘ、イノベーティブセルテクノロジーズ社製）を用いて細胞を回収した。Ｂ−２７サプリメント含有Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を用いて、回収した細胞を洗浄した。１ｍｌのＢ−２７サプリメント含有Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に、回収した細胞を懸濁し、細胞数を計測した。得られた細胞から、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いてＲＮＡを回収した。
【０２１７】
回収したＲＮＡを試料として、定量ＰＣＲ法にてネスチン（未分化マーカー）およびβチューブリン−３（分化マーカー）の遺伝子発現量を測定した。なお、定量ＰＣＲ用のキットとしてＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、測定機器名：７３００／７５００  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により分析した。ネスチンおよびβチューブリン−３の遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）の発現量に対するそれぞれの相対量として校正し、比較例１における各標的遺伝子の相対的発現量を１として算出した。結果を図５に示す。
【０２１８】
（ニューロスフェロイドの形成）
培養８日目、ニューロスフィアの形成を確認した後、培地を分化培地（２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７−サプリメント（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））に交換した。培地を毎日半量ずつ交換しつつ、培養を継続し、ニューロスフェロイドが形成されることを光学顕微鏡で確認した。
【０２１９】
ニューロスフェロイドの光学顕微鏡による観察像を図２（図２（ａ）分化培地への培地交換当日を０日目として、分化培地での培養１日目、（ｂ）分化培地での培養３日目、（ｃ）分化培地での培養５日目、（ｄ）分化培地での培養９日目）に示す。図２に示すように、含フッ素ポリマー基材を用いた場合、分化培地での培養５日目以降に、ニューロスフェロイド同士が連結した三次元的なネットワーク構造を確認した。
【０２２０】
分化培地に交換してから１１日目（神経幹細胞播種から１９日目）に細胞分離／分散溶液（Ａｃｃｕｍａｘ、イノベーティブセルテクノロジーズ社製）を用いて上記と同様の手法により細胞を回収し、ＲＮＡを回収した。
【０２２１】
回収したＲＮＡを試料として、上記と同様の手法により、定量ＰＣＲ法にてネスチンおよびβチューブリン−３の遺伝子発現量を測定した。マーカー分子発現量の測定結果を図５に示す。
【０２２２】
＜比較例１＞
細胞培養基材表面を表面処理することで基材への細胞の接着性を低下させた浮遊培養系プレートを用いた以外は実施例１と同様の手法により、神経幹細胞の培養を行った。浮遊培養系プレートを用いて培養した神経幹細胞の、光学顕微鏡による観察像を、図３（図３（ａ）培養１日目、（ｂ）培養３日目、（ｃ）培養５日目、（ｄ）培養８日目）に示す。浮遊培養系培養プレートでは、ニューロスフィアは基材に保持されず、培地中に浮遊していた。また、含フッ素ポリマー基材上で培養した場合と比較して、ニューロスフィアのサイズが巨大化していた。
【０２２３】
神経幹細胞の培養を行った浮遊培養系プレートから細胞分離／分散溶液（Ａｃｃｕｍａｘ、イノベーティブセルテクノロジーズ社製）を用いてニューロスフィアを回収し、実施例１と同様の手法によりＲＮＡを回収した。
【０２２４】
培養８日目、含フッ素ポリマー基材を用いたプレートに代えて、浮遊培養系プレートを用いた以外は実施例１と同様の手法により、分化培地での培養を開始した。
【０２２５】
浮遊培養系プレートを用いて分化培地中で培養した神経幹細胞の、光学顕微鏡による観察像を図４（図４（ａ）分化培地への培地交換当日を０日目として、分化培地での培養１日目、（ｂ）分化培地での培養３日目、（ｃ）分化培地での培養５日目、（ｄ）分化培地での培養９日目）に示す。図４に示すように、浮遊培養で培養した場合、ニューロスフェロイド同士が連結した三次元的なネットワーク構造を確認することはできなかった。
【０２２６】
分化培地に交換してから１１日目（神経幹細胞播種から１９日目）に細胞分離／分散溶液（Ａｃｃｕｍａｘ、イノベーティブセルテクノロジーズ社製）を用いて上記と同様の手法により細胞を回収し、ＲＮＡを回収した。
【０２２７】
回収したＲＮＡを試料として、上記と同様の手法により、定量ＰＣＲ法にてネスチンおよびβチューブリン−３の遺伝子発現量を測定した。マーカー分子発現量の測定結果を図５に示す。
【０２２８】
図５に示すように、比較例１では、分化培地へ培地交換した後であっても、分化マーカーの発現量の上昇程度は大きくなかった。
【０２２９】
図５に示すように、実施例１では、分化誘導前における未分化マーカーの高い発現量と、分化マーカーの低い発現量とを確認した。これは、基材に保持されたニューロスフィア内において神経幹細胞が多く存在しており、分化誘導が効果的に抑制されていることを示す。さらに、実施例１では、分化誘導後において分化マーカーの発現量が顕著に上昇していた。この結果から、含フッ素ポリマー基材上に保持したニューロスフィアに分化誘導処理を行うことで、分化誘導のシグナルに対して細胞が高感度に応答していることを示す。
【０２３０】
＜実施例２、３＞
（含フッ素ポリマー基材の製造）
１００ｍｌ容量の三口フラスコに４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）２．３３０ｇ（１１．６４ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド４２．５ｇを仕込み溶解させた。そこへ、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）５．１７０ｇ（１１．６４ミリモル）を加え、窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１２万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量は実質的に同一である。
【０２３１】
【化４５】
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【０２３２】
上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例１と同様の方法により含フッ素ポリイミドフィルム２を得た。
【０２３３】
得られた含フッ素ポリイミドフィルム２のフッ素含有量は１９質量％であり、静的水接触角は８６°であり、引張弾性率は２．９ＧＰａであった。
【０２３４】
１００ｍｌ容量の三口フラスコに２，２’−ビス（トリフルオロメチル）ベンジジン（ＴＦＭＢ）３．１４１ｇ（９．８１ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド４２．５ｇを仕込み溶解させた。そこへ、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）４．３５９ｇ（９．８１ミリモル）を加え、窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は３０万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量は実質的に同一である。
【０２３５】
【化４６】
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【０２３６】
上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例１と同様の方法により含フッ素ポリイミドフィルム３を得た。
【０２３７】
得られた含フッ素ポリイミドフィルム３のフッ素含有量は３１質量％であり、静的水接触角は８８°であり、引張弾性率は３．４ＧＰａであった。
【０２３８】
（神経幹細胞の培養）
上記で得られた含フッ素ポリイミドフィルム２および含フッ素ポリイミドフィルム３を基材として細胞培養面に配置した２４穴プレートをそれぞれ作製し、実施例１と同様の手法により神経幹細胞の培養を行った。培養過程におけるニューロスフィアを光学顕微鏡で観察し、以下の基準に従って評価した。評価結果を下記表１に示す。
○：細胞は、三次元に凝集塊を形成した
△：細胞は、三次元に凝集塊を形成した部分と基材上に伸展した状態が混在した
×：細胞の三次元な凝集塊は認められなかった
【０２３９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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