(57)【要約】【課題】藻類を用いて油脂を製造する方法において、栄養制限のための培養液の交換操作を行うことなく、高い生産性を達成することが可能な技術の提供。【解決手段】藻類をリジンデアセチラーゼ阻害剤（ＫＤＡＣ阻害剤）で処理し、細胞内タンパク質のアセチル化度を亢進させる工程を含む、藻類油脂の製造方法を提供する。この製造方法によれば、培養液中に栄養が十分に存在していてもＫＤＡＣ阻害剤を添加するだけで細胞の油脂蓄積を誘導できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類をリジンデアセチラーゼ阻害剤で処理し、細胞内タンパク質のアセチル化度を亢進させる工程を含む、藻類油脂の製造方法。
【請求項２】
リジンデアセチラーゼ阻害剤を含む、藻類油脂の産生促進剤。
【請求項３】
細胞内タンパク質のアセチル化度が高められた藻類。
【請求項４】
請求項３記載の藻類を培養する工程を含む、藻類油脂の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類油脂の製造方法及び藻類油脂の産生促進剤に関する。より詳しくは、リジンデアセチラーゼ阻害剤を用いた藻類油脂の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物油脂は、食用に加え、界面活性剤の原料や燃料の用途のために、需要が拡大している。藻類は、栄養欠乏、強光などのストレス条件下で油脂を蓄積する。藻類を用いて油脂を製造する方法として、窒素を含有している培養液を用いて藻類を培養し増殖させた後、培養液を窒素を含有しないものに交換して細胞を窒素飢餓状態とすることによって、藻類の油脂産生を誘導する方法がある。しかし、この従来方法では、栄養制限のための培養液の交換に多くのエネルギー消費とコストが発生する。
【０００３】
特許文献１には、栄養制限のための培養液の交換操作を行うことなく、バイオマスを産生させることが可能な藻類が開示されている。この藻類は、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる操作を加えることにより、デンプンの産生能を向上させたものである。
【０００４】
リジンデアセチラーゼ阻害剤（ＫＤＡＣ阻害剤）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）とも称され、抗がん剤としての応用が検討されてきている（特許文献２）。上市された抗がん剤に、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫の治療薬であるゾリンザ（一般名ボリノスタット）がある。
【０００５】
特許文献３では、ＫＤＡＣ阻害剤を糸状菌の分化抑制剤として用い、植物病害防除のために利用することが提案されている。藻類によるバイオマス産生のためにＫＤＡＣ阻害剤を利用することは、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０２９７２７号
【特許文献２】国際公開第９９／１１６５９号
【特許文献３】特開２００７−２６２０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、藻類を用いて油脂を製造する方法において、栄養制限のための培養液の交換操作を行うことなく、高い生産性を達成することが可能な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］藻類をリジンデアセチラーゼ阻害剤（ＫＤＡＣ阻害剤）で処理し、細胞内タンパク質のアセチル化度を亢進させる工程を含む、藻類油脂の製造方法。
［２］前記リジンデアセチラーゼ阻害剤が、Ｋｙ−６、Ｋｙ−９、Ｋｙ−７２、Ｋｙ−３１７、ＦＫ２２８、ＭＣ１５６８、Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ及びトリコスタチンからなる群より選択される一以上の化合物である［１］の製造方法。
［３］前記藻類が、紅藻類、緑藻類又は灰色藻類である［１］又は［２］の製造方法。
［４］前記藻類が、シアニジオシゾン（Cyanidioschyzon）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属又はユーグレナ（Euglena）属に属する［３］の製造方法。
［５］前記藻類が、シアニジオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardii）又はユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）である［４］の製造方法。
［６］前記藻類がシアニジオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）であり、前記リジンデアセチラーゼ阻害剤がＫｙ−６、Ｋｙ−７２、Ｋｙ−３１７、ＦＫ２２８及びＴＳＡからなる群より選択される一以上の化合物である［５］の製造方法。
［７］前記藻類がクラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardii）であり、前記リジンデアセチラーゼ阻害剤がＫｙ−６、Ｋｙ−９、Ｋｙ−３１７、ＭＣ１５６８及びＴＳＡからなる群より選択される一以上の化合物である［５］の製造方法。
［８］前記藻類がユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）であり、前記リジンデアセチラーゼ阻害剤がＫｙ−６，Ｋｙ−９，Ｋｙ−２９，Ｋｙ−７２，Ｋｙ−３１７，ＳＡＨＡ，ＭＳ−２７５，ＦＫ２２８及びＴｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａからなる群より選択される一以上の化合物である［５］の製造方法。
［９］栄養制限のための培養液の交換工程を含まない［１］〜［８］の製造方法。
【０００９】
［１０］リジンデアセチラーゼ阻害剤を含む、藻類油脂の産生促進剤。
［１１］前記リジンデアセチラーゼ阻害剤が、Ｋｙ−６、Ｋｙ−９、Ｋｙ−７２、Ｋｙ−３１７、ＦＫ２２８、ＭＣ１５６８、Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ及びトリコスタチンからなる群より選択される一以上の化合物である［１０］の産生促進剤。
【００１０】
［１２］細胞内タンパク質のアセチル化度が高められた藻類。
［１３］［１２］の藻類を培養する工程を含む、藻類油脂の製造方法。
［１４］栄養制限のための培養液の交換工程を含まない［１３］の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、栄養制限のための培養液の交換操作を行うことなく、高い生産性を達成することが可能な藻類油脂の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＳＡを処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅにおけるトリグリセリドの蓄積量を測定した結果を示す図である（実施例１）。Ａは細胞の乾燥重量に対するＴＡＧ重量の比率、Ｂは総脂質重量に対するＴＡＧ重量の比率を示す。
【図２】ＴＳＡを処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅにおけるトリグリセリドの蓄積量を測定した結果を示す図である（実施例１）。図は細胞の乾燥重量に対するＴＡＧ重量の比率を示す。
【図３】ＴＳＡを処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅの細胞の蛍光観察像を示す（実施例１）。
【図４】ＴＳＡを処理したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉにおけるトリグリセリドの蓄積量を測定した結果を示す図である（実施例２）。図は細胞の乾燥重量に対するＴＡＧ重量の比率を示す。
【図５】種々のＫＤＡＣ阻害剤により処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ（Ａ）及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉ（Ｂ）において、ヒストンＨ３及びＨ４のアセチル化度を評価した結果を示す図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１４】
［ＫＤＡＣ阻害剤処理工程］
本発明に係る藻類油脂の製造方法は、藻類をリジンデアセチラーゼ阻害剤（ＫＤＡＣ阻害剤）で処理する工程を含むことを特徴とする。該工程では、ＫＤＡＣ阻害剤の処理の結果、細胞内タンパク質のアセチル化度の亢進が生じる。すなわち、細胞内タンパク質のアセチル化度が高められた藻類が得られる。実施例に示されるように、ＫＤＡＣ阻害剤の処理によって、細胞内タンパク質のアセチル化度が亢進された状態となると、藻類が油脂を蓄積するようになる。
【００１５】
ＫＤＡＣ阻害剤の処理は、藻類の培養液中にＫＤＡＣ阻害剤を添加することによって行えばよい。培養液中へのＫＤＡＣ阻害剤の添加濃度は、特に限定されないが、０．５〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭとされる。また、ＫＤＡＣ阻害剤の処理時間は、特に限定されないが、２４時間以上、好ましくは４８時間以上とされる。
【００１６】
本発明に用いるＫＤＡＣ阻害剤は、藻類に対してリジンデアセチラーゼ阻害活性を示すものであればよく、特に限定されない。ＫＤＡＣ阻害剤としては、以下を例示できる。本発明において、ＫＤＡＣ阻害剤は藻類油脂の産生促進剤として作用するものであり、本発明は、ＫＤＡＣ阻害剤を含む藻類油脂の産生促進剤をも提供するものである。
【００１７】
Ｋｙ−１（特許文献２参照）
【化１】
2017153369.tif 000002
【００１８】
Ｋｙ−２
〈cyclo(-L-2-amino-8-hydroxamido-suberoyl-aminoisobutylyl-L-phenylalanyl-D-prolyl-)〉（特許文献３参照）
【化２】
2017153369.tif 000003
【００１９】
Ｋｙ−６
〈cyclo(-L-2-amino-7-(2-pyridyldisulfidryl)heptanoyl-aminoisobutylyl-L-phenylalanyl-D-prolyl-)〉（特許文献３参照）
【化３】
2017153369.tif 000004
【００２０】
Ｋｙ−９（特開２００８−１４３８８６参照）
【化４】
2017153369.tif 000005
Ｋｙ−９：上記式においてｌ＝３、Ｙ1＝ＯＣＨ3
【００２１】
Ｋｙ−２９（特開２００８−１４３８８６参照）
【化５】
2017153369.tif 000006
Ｋｙ−２９：上記式においてｎ＝３、Ｘ1＝Ｓ、Ｙ2＝ＣＯＣＦ3
Ｋｙ−７２：上記式においてｎ＝３、Ｘ1＝Ｓ、Ｙ2＝ＣＯＣＨ3
【００２２】
Ｋｙ−３１７（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010) 997-999参照）
【化６】
2017153369.tif 000007
【００２３】
ＳＡＨＡ（特許文献３参照）
【化７】
2017153369.tif 000008
【００２４】
ＳＡＨＡ  ａｎａｌｏｇ
【化８】
2017153369.tif 000009
【００２５】
ＭＳ−２７５
【化９】
2017153369.tif 000010
【００２６】
ＦＫ２２８
【化１０】
2017153369.tif 000011
【００２７】
Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ
【化１１】
2017153369.tif 000012
【００２８】
ＭＧＣＤ０１０３（Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ）
【化１２】
2017153369.tif 000013
【００２９】
ＭＣ１５６８
【化１３】
2017153369.tif 000014
【００３０】
ＪＮＪ−２６４８１５８５
【化１４】
2017153369.tif 000015
【００３１】
トリコスタチンＡ（特許文献３参照）
【化１５】
2017153369.tif 000016
【００３２】
トリコスタチンＣ（特許文献３参照）
【化１６】
2017153369.tif 000017
【００３３】
酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ：ＳＢ）
ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ：ＮＡ）
バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ Ａｃｉｄ：ＶＰＡ）
【００３４】
これらのＫＤＡＣ阻害剤のなかでは、Ｋｙ−６、Ｋｙ−９、Ｋｙ−７２、Ｋｙ−３１７、ＦＫ２２８、ＭＣ１５６８、Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ及びトリコスタチンが好ましい。
【００３５】
ＫＤＡＣ阻害剤の藻類に対するリジンデアセチラーゼ阻害活性の評価は、例えば、アセチル化タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットにより、細胞内のアセチル化タンパク質の量を測定し、ＫＤＡＣ阻害剤の処理前後で比較することによって行うことができる（実施例３参照）。
【００３６】
具体的には、ＫＤＡＣ阻害剤の処理前の藻類のアセチル化タンパク質（例えば、アセチル化ヒストン）の量と比較して、処理後の量が１．１倍以上である場合に、該ＫＤＡＣ阻害剤が該藻類に対してリジンデアセチラーゼ阻害活性を有すると判断することができる。さらに、ＫＤＡＣ阻害剤の処理前後でアセチル化タンパク質の量にｔ検定で５％レベルの有意な増加がある場合に、該ＫＤＡＣ阻害剤が該藻類に対してリジンデアセチラーゼ阻害活性を有すると判断することが好ましい。
【００３７】
実施例に示されるように、ＫＤＡＣ阻害剤の処理によって、細胞内タンパク質のアセチル化度が亢進された状態となると、細胞は油脂蓄積するようになることが確認されている。ここで、細胞内タンパク質のアセチル化度を亢進させるための手段は、ＫＤＡＣ阻害剤によるリジンデアセチラーゼの阻害に替えて、リジンデアセチラーゼの発現抑制や、リジンアセチラーゼ（ＫＡＴ）の活性化又は発現誘導であってもよい。これらの手段によっても、細胞内タンパク質のアセチル化度の亢進を伴う油脂蓄積を誘導できる可能性がある。
【００３８】
［藻類］
本発明に用いる藻類は、油脂の産生能を有するあるいはＫＤＡＣ阻害剤による処理によって油脂の産生能を発現するものであればよく、特に限定されない。油脂の産生能を有する藻類としては、例えば、紅藻類、緑藻類又は灰色藻類が知られている。
【００３９】
紅藻類としては、シアニジオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）等のシアニジオシゾン属、ポルフィリジウム・クルエンタム（Porphyridium cruentum）及びポルフィリジウム・エゾエンシス（Porphyra yezoensis）等のポルフィリジウム属などが挙げられる。
【００４０】
緑藻類としては、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）等のクラミドモナス属、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）等のクロレラ属、ボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）等のボトリオコッカス属などが挙げられる。
【００４１】
灰色藻類としては、シアノフォア・パラドキサ（Cyanophora paradoxa）等のシアノフォア属が挙げられる。
【００４２】
藻類としては、シアニジオシゾン（Cyanidioschyzon）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属又はユーグレナ（Euglena）属に属するものを好適に選択できる。より具体的には、シアニジオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardii）又はユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を好適に選択できる。
【００４３】
藻類としてシアニジオシゾン・メロラエ（Cyanidioschyzon merolae）を用いる場合には、ＫＤＡＣ阻害剤にはＫｙ−６、Ｋｙ−７２、Ｋｙ−３１７、ＦＫ２２８及びＴＳＡからなる群より選択される一以上の化合物を用いることが好適となる。
藻類としてクラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardii）を用いる場合には、ＫＤＡＣ阻害剤にはＫｙ−６、Ｋｙ−９、Ｋｙ−３１７、ＭＣ１５６８及びＴＳＡからなる群より選択される一以上の化合物を用いることが好適となる。
藻類としてユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を用いる場合には、ＫＤＡＣ阻害剤にはＫｙ−６，Ｋｙ−９，Ｋｙ−２９，Ｋｙ−７２，Ｋｙ−３１７，ＳＡＨＡ，ＭＳ−２７５，ＦＫ２２８及びＴｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａからなる群より選択される一以上の化合物を用いることが好適となる。
【００４４】
［油脂］
製造する油脂としては、脂肪族カルボン酸と、１価又は３価の脂肪族アルコールと、からなる脂肪族エステル化合物が挙げられる。脂肪族カルボン酸は、藻類が産生するものであれば特に限定されず、例えば、炭素数１４〜２２の脂肪族カルボン酸であって、具体的には、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸等を挙げることができる。また、油脂としては、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロイド化合物、カロテノイド等の光合成色素等も含み得る。
【００４５】
［培養工程］
ＫＤＡＣ処理前及び処理後の藻類の培養は、従来から採用されている培養条件で行えばよい。通常、空気中の二酸化炭素を炭素源として光合成で増殖させる光独立栄養的培養によって、常温で、好ましくは２５〜３７℃で培養する。光合成のための光源は、太陽光、又は人工的な光源を用いることができる。藻類の増殖を早めるため、藻類への光照射は、２〜１００キロルックスで３０〜５００時間行うことが好ましい。培地雰囲気中の二酸化炭素濃度は０．３〜１０体積％が好ましく、培地中への溶け込みを促進するために、必要に応じて培地を撹拌、又は空気によって曝気してもよい。
【００４６】
培地には、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地等、一般的な無機培地を用いることができる。無機培地には、通常、窒素源としてＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2ＯやＫＮＯ3が、その他の主要な栄養成分としてＫＨ2ＰＯ4やＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ等が含まれている。また、培地には、藻類の生育に影響を与えない抗生物質等を添加してもよい。培地のｐＨは、３〜１０が好ましい。培養期間は、初めに接種する藻体量にもよるが、０．５ｇ／Ｌの藻体濃度で培養を開始した場合、１〜２０日間とすることが好ましい。
【００４７】
［油脂抽出工程］
培養した藻類を培地から分離し、必要に応じて乾燥を行った後、油脂の抽出を行う。分離は、ろ過や遠心分離等の固液分離手段を用いて藻類を培地から分離することが好ましい。また、培地成分の残留量を一層低減する観点から、固液分離手段によって分離された藻類を水、好ましくは脱イオン水又は蒸留水、あるいは緩衝液等で洗浄することが好ましい。
【００４８】
乾燥は、一般的な条件で行うことが可能である。なお、効率的に水分が除去され、かつ、藻類細胞内の脂肪族化合物が酸化劣化を受けない条件で行うことが好ましい。例えば、大気中−３０〜１８０℃の温度で行うことが好ましい。具体的な乾燥方法としては、凍結乾燥や、加温による乾燥等が挙げられる。乾燥によって、藻類の固形粉末が得られる。
【００４９】
なお、培地から分離された藻類は、乾燥を行うことなく油脂抽出に供してもよい。また、分離を行うことなく、培養工程に引き続いて、藻類を含む培養液を直接油脂抽出に供してもよい。
【００５０】
油脂抽出は、得られた藻類の固形粉末中に含まれる脂肪族化合物、及び／又は該固形粉末に付着する脂肪族化合物を溶媒によって抽出する。ここで、溶媒には、ヘキサンやペンタン等の脂肪族炭化水素や、酢酸エチル、ジエチルエーテル、メチルエチルケトン等の極性溶媒が用いられる。
【００５１】
本発明に係る藻類油脂の製造方法によれば、培養液中に栄養が十分に存在していてもＫＤＡＣ阻害剤を添加するだけで細胞の油脂蓄積を誘導できる。従って、本発明に係る藻類油脂の製造方法では、栄養制限のための培養液の交換操作を行う必要がなく、高い生産性を達成することが可能である。
【００５２】
また、本発明に係る藻類油脂の製造方法においては、従来の栄養欠乏条件による方法とは異なり、細胞内の葉緑体を維持できる（実施例１、図３参照）。従って、本発明に係る藻類油脂の製造方法では、藻類の光合成による炭素固定を維持したまま、油脂の産生を誘導できる可能性がある。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１：ＴＳＡを処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅの油脂産生能の評価＞
ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅの油脂産生能を、窒素欠乏条件で培養したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅの油脂産生能との比較により評価した。
【００５４】
藻類の培養：MA2培地、40℃、2% CO2にて通気培養を行った。培養液を適宜希釈して以下の処理に使用した。
ＴＳＡの処理：シゾン培養液の細胞密度を1×107/ml程度に調整し、TSAを終濃度1μMとなるよう培養液に添加し、MA2培地、40℃, 2% CO2にて通気培養を行った。対照群には、エタノールのみを添加した。
窒素欠乏条件での培養：シゾン培養液の細胞密度を2〜5×107/ml程度となるように調整した。培地を、MA2培地から、硫酸アンモニウムを硫酸ナトリウムに置換したMA2-N培地に交換した後、40℃, 2% CO2にて通気培養を行った。
【００５５】
ＴＳＡの処理２４，４８，７２，９６時間後及び窒素欠乏条件での培養開始２４、４８，７２，９６時間後に細胞を回収した。回収した細胞を凍結乾燥機により十分乾燥させ、Bligh-Dyer法によりトリグリセリド（ＴＡＧ）を分離し、定量した。
【００５６】
また、分離されたＴＡＧ中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィー水素炎イオン検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）により解析した。
【００５７】
結果を図１〜図３に示す。図１Ａ及び図２は細胞の乾燥重量に対するＴＡＧ重量の比率、図１Ｂは総脂質重量に対するＴＡＧ重量の比率を示す。窒素欠乏条件で培養した細胞と同様に、ＴＳＡを処理した細胞では、対照群に比してＴＡＧの蓄積量が増加していた。
【００５８】
図３に、ＴＳＡの処理後２４、４８，９６時間及び窒素欠乏条件での培養開始後２４、４８，９６時間における細胞の蛍光観察像を示す。緑蛍光は油滴の染色像、赤蛍光は葉緑体の染色像である。ＴＳＡを処理した細胞及び窒素欠乏条件で培養した細胞では全ての観察時間において油滴の蓄積が確認できる。窒素欠乏条件で培養した細胞では、４８時間以後、葉緑体が破壊されているのに対し、ＴＳＡを処理した細胞では、同時間以降も、葉緑体が維持されているのが確認できる。この知見は、ＴＳＡ処理においては、窒素欠乏条件での培養と異なり、細胞内の葉緑体を維持して藻類の光合成による炭素固定を停止させることなく、油脂産生を誘導できる可能性を示している。
【００５９】
ＴＡＧ中の脂肪酸組成の解析結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2017153369.tif 000018
【００６１】
ＴＳＡを処理した細胞では、処理時間に依存してリノール酸（１８：２）の蓄積が進行する傾向が認められた。
【００６２】
＜実施例２：ＴＳＡを処理したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉの油脂産生能の評価＞
ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）処理したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉの油脂産生能を、窒素欠乏条件で培養したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉの油脂産生能との比較により評価した。
【００６３】
ＴＳＡの処理及び窒素欠乏条件での培養は実施例１と同様にして行った。ＴＳＡの処理２４時間後及び窒素欠乏条件での培養開始２４時間後に細胞を回収した。実施例１と同様にしてトリグリセリド（ＴＡＧ）の分離及び定量と、ＴＡＧ中の脂肪酸組成の解析を行った。
【００６４】
結果を図４に示す。図は細胞の乾燥重量に対するＴＡＧ重量の比率を示す。窒素欠乏条件で培養した細胞と同様に、ＴＳＡを処理した細胞では、対照群に比してＴＡＧの蓄積量が増加していた。
【００６５】
ＴＡＧ中の脂肪酸組成の解析結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2017153369.tif 000019
【００６７】
＜実施例３：種々のＫＤＡＣ阻害剤の油脂産生促進作用の評価＞
Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉを種々のＫＤＡＣ阻害剤により処理し、油脂産生量の変化を評価した。
【００６８】
ＫＤＡＣ阻害剤には、Ｋｙ−１，Ｋｙ−２，Ｋｙ−６，Ｋｙ−９，Ｋｙ−２９，Ｋｙ−７２，Ｋｙ−３１７，ＶＰＡ，ＳＡＨＡ，ＳＡＨＡ  ａｎａｌｏｇ，ＭＳ−２７５，ＦＫ２２８，Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ，ＭＧＣＤ０１０３，ＭＣ１５６８，ＪＮＪ−２６４８１５８５，ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ（ＳＢ），ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＮＡ），ＴＳＡを用いた。ＫＤＡＣ阻害剤の処理は実施例１と同様にして行った。ＴＳＡの処理２４時間後及び窒素欠乏条件での培養開始２４時間後に細胞を回収した。実施例１と同様にしてトリグリセリド（ＴＡＧ）の分離及び定量を行った。
【００６９】
また、回収した細胞内のヒストンＨ３及びＨ４のアセチル化度をウェスタンブロットにより評価した。回収した細胞を8M Ureaに懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行って得た抽出物をサンプルとした。ウェスタンブロットは抗アセチル化抗体（Cell Signaling Technology、#9441）を用いて行い、15kDa付近と12kDa付近に現れるバンドをそれぞれアセチル化ヒストンH3、H4として検出した。LAS-3000(Fujifilm) chemiluminescence modeにてバンドを撮像し、画像解析ソフト（image gauge）にてエリア値を算出した。
【００７０】
ヒストンのアセチル化度を図５に示す。図は、ヒストンのアセチル化度を、対照群(各阻害剤の溶媒（エタノール、DMSO、1mM DTT含DMSO）で処理したもの）を１とした相対値により示す。Ｋｙ−６，Ｋｙ−３１７，ＴＳＡを処置したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ（図Ａ参照）及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉ（図Ｂ参照）では、ヒストンのアセチル化度が亢進されているのが確認できる。また、Ｋｙ−７２，ＦＫ２２８を処理したＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅと、Ｋｙ−９，ＭＣ１５６８を処理したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉでは、ヒストンのアセチル化度が亢進された。
【００７１】
ＴＡＧの定量の結果、ヒストンのアセチル化度の亢進が確認された細胞と、ＴＡＧの蓄積量の増加が認められた細胞とは一致した。すなわち、Ｋｙ−６，Ｋｙ−３１７，ＴＳＡは、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉにおいて油脂産生促進作用を示した。また、Ｋｙ−７２，ＦＫ２２８はＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅにおいて、Ｋｙ−９，ＭＣ１５６８はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉにおいて油脂産生促進作用を示した。この結果から、培養液への添加によって藻類に対して活性を示し得るＫＤＡＣ阻害剤であれば、藻類による油脂の産生を促進できることが明らかとなった。
【００７２】
＜実施例４：ＫＤＡＣ阻害剤を処理したＥｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｋｌｅｂｓの油脂産生能の評価＞
ＫＤＡＣ阻害剤を処理したＥｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｋｌｅｂｓ  ＮＩＥＳ−４８（国立環境研究所から入手）の油脂産生能を評価した。ＫＤＡＣ阻害剤には、Ｋｙ−１，Ｋｙ−２，Ｋｙ−６，Ｋｙ−９，Ｋｙ−２９，Ｋｙ−７２，Ｋｙ−３１７，ＳＡＨＡ，ＳＡＨＡ  ａｎａｌｏｇ，ＭＳ−２７５，ＦＫ２２８，Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ，ＭＧＣＤ０１０３，ＭＣ１５６８，ＪＮＪ−２６４８１５８５，ＴＳＡを用いた。ＫＤＡＣ阻害剤の処理は実施例１と同様にして行った。ＴＳＡの処理２４時間後に、細胞内の油滴を蛍光染色し、蛍光観察を行った。
【００７３】
その結果、Ｋｙ−６，Ｋｙ−９，Ｋｙ−２９，Ｋｙ−７２，Ｋｙ−３１７，ＳＡＨＡ，ＭＳ−２７５，ＦＫ２２８，Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａを処理した細胞では、対照群に比して細胞内の油滴が増加した。特にＫｙ−６及びＴｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａは効果が顕著であった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係る藻類油脂の製造方法によれば、培養液中に栄養が十分に存在していてもＫＤＡＣ阻害剤を添加するだけで細胞の油脂蓄積を誘導でき、従来方法のような栄養制限のための培養液の交換操作を不要とできる。従って、本発明に係る藻類油脂の製造方法は、界面活性剤の原料や燃料に用いられる藻類油脂を生産性良く製造するために利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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