(57)【要約】【課題】  局在型表面プラズモン共鳴センサにおいて、回折光干渉の影響のない高品質のセンシングを再現性良く安定して行うことのできる方法及びシステムを提供する。【解決手段】  表面に形成された多数の突起部７２２より成る金属製微細構造物７２を有するセンサチップ７に試料流体Ｓを導入し、光源１からの光を照射し、その透過光を受光側光学素子５を介して受光器３で受光して分光強度を測定することで局在型表面プラズモン共鳴の発生波長を特定する。発生波長のシフトの有無により試料中の目的物質の有無を調べる。光学素子５１，３２，５２により、多数の突起部の平均配置ピッチｄ、測定波長域の中心値λ０、センサチップ７の光源１の発光部の視角α、受光器３における透過光の取り込み角βについて、ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄの関係を成立させる。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属製微細構造物を有するセンサチップに光照射し、光照射されたセンサチップからの透過光又は反射光を受光器で受光してその分光強度を測定することで局在型表面プラズモン共鳴の発生波長を特定する局在型表面プラズモン共鳴センシング方法であって、
金属製微細構造物は、基板上に形成された多数の突起部より成るものであり、多数の突起部の平均配置ピッチをｄ、分光強度の測定波長域の中心値又は最短値をλ０とし、センサチップからの光源の発光部の視角をαとしたとき、光照射されたセンサチップ上の一点からの光の発散角βについて、
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
となる関係が成立させながら前記透過光又は反射光を受光器に入射させることを特徴とする局在型表面プラズモン共鳴センシング方法。
【請求項２】
前記センサチップと前記受光器との間に、前記センサチップからの光を集光して前記受光器に入射させるレンズを配置し、このレンズの物体側ＮＡを、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させる発散角βについてｓｉｎβ以下とすることを特徴とする請求項１記載の局在型表面プラズモン共鳴センシング方法。
【請求項３】
前記光源と前記センサチップとの間にアパーチャを配置し、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させるよう当該アパーチャがない場合に比べて視角αを小さくすることを特徴とする請求項１又は２記載の局在型表面プラズモン共鳴センシング方法。
【請求項４】
金属製微細構造物を有するセンサチップに光照射し、光照射されたセンサチップからの透過光又は反射光を受光器で受光してその分光強度を測定することで局在型表面プラズモン共鳴の発生波長を特定する局在型表面プラズモン共鳴センシングシステムであって、
前記金属製微細構造物は、基板上に形成された多数の突起部より成るものであり、
前記金属製微細構造物における多数の突起部の平均配置ピッチをｄ、分光強度の測定波長域の中心値又は最短値をλ０とし、センサチップからの光源の発光部の視角をαとしたとき、光照射されたセンサチップ上の一点からの光の発散角βについて、
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
となる関係が成立していることを特徴とする局在型表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項５】
前記センサチップと前記受光器との間には、前記センサチップからの光を集光して前記受光器に入射させるレンズが配置されており、このレンズの物体側ＮＡは、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させる発散角βについてｓｉｎβ以下となっていることを特徴とする請求項４記載の局在型表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項６】
前記光源と前記センサチップとの間にアパーチャが配置されており、アパーチャは、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させるよう当該アパーチャがない場合に比べて視角αを小さくするものであることを特徴とする請求項４又は５記載の局在型表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【請求項７】
前記レンズの物体側ＮＡは０．８未満であることを特徴とする請求項５記載の局在型表面プラズモン共鳴センシングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、バイオセンサの一種である表面プラズモン共鳴センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシングは、生体起源の分子認識機構を利用する検出技術であり、酵素やイオンチャネル等により基質特異的な物質の変化移動に伴う化学ポテンシャル的、熱的又は光学的な変化等を捉えて電気信号へ変換することで検出を行う技術である。このようなバイオセンシングの一種に、表面プラズモン共鳴を利用した検出技術がある。
【０００３】
プラズモンとは、プラズマ振動を量子化して得られる擬似的な粒子を意味し、典型的には金属中の自由電子が集団として擬似的に粒子として振る舞う現象を指す。プラズモンは、一般的には電磁波で直接励起することはできないものの、金や銀といった表面波モードが存在する金属の表面では、全反射の際のエバネッセント場（近接場）を利用することで表面プラズモンを励起することができる。表面プラズモンの励起は、ある入射角の光が金属表面に入射した際に金属表面に沿って伝搬するエバネッセント波の位相速度と表面プラズモンの位相速度が一致する、すなわち共鳴することで達成されるので、表面プラズモン共鳴と呼ばれる。
【０００４】
表面プラズモン共鳴が生じると、プラズモンとの共鳴に光エネルギーが吸収されるため、検出される全反射光の強度が低下する。表面プラズモン共鳴が生じるかどうかは、光の入射角のみならず、金属周囲の媒質の比誘電率によっても大きく影響を受けることから、表面プラズモン共鳴を利用したセンサ、特にバイオセンサが開発されている。
【０００５】
図９は、表面プラズモン共鳴を用いた従来の一般的なバイオセンサの概略図である。表面プラズモン共鳴を利用してバイオセンシングをする場合、図９に示すように、一般的にはクレッチマン配置が採用され、全反射面に金属膜１０１を設けたプリズム１００において金属膜１０１の裏側に試料流体Ｓの流路１０２を形成した構造とされる。プリズム１００に入射した光は金属膜１０１で全反射するが、ある条件では表面波モードの光の伝搬とプラズモンの振動とが共鳴し、金属膜１０１の表面において表面プラズモン共鳴が生じる。表面プラズモン共鳴が生じると、検出器１０３で検出される全反射光の強度が低下するから、入射光の角度を変化（スキャン）させながら検出器１０３の出力を調べることで表面プラズモン共鳴の発生を検知することができる。
【０００６】
表面プラズモン共鳴が発生する際の光の入射角は、金属膜１０１の背後にある試料流体Ｓの比誘電率により変化（シフト）する。バイオセンサとして構成する場合、目的物質（アナライト）と特異的に結合する物質（リガンド）を金属膜１０１の背面に固定する。試料流体Ｓに目的物質が含まれている場合、リガンドに捕捉される。リガンドの捕捉により金属膜１０１の背後の比誘電率が変化し、これにより表面プラズモン共鳴の発生入射角が変化する。この変化の有無で、試料流体Ｓ中に目的物質が含まれているかを検出（同定）することができる。特異的結合には免疫反応が利用されることが多く、リガンドとして抗体が固定され、この抗体が特異的に結合する抗原を目的物質として検出が行われることが多い。
【０００７】
上述したように、従来の一般的な表面プラズモン共鳴センサでは、クレッチマン配置の裏側に試料流体Ｓを流し、表側のプリズム１００に対して入射角を変えながら反射光強度を検出器で測定することで表面プラズモン共鳴の発生を検知している。この種のセンサは既に実用化されてはいるものの、入射光の角度をスキャンする構造（ないしは受光角度をスキャンしながら全反射光強度を測定する構造）が必要で、光学系や検出系の構成が大がかりで複雑であるという欠点がある。また、金属膜１０１の背後に試料流路１０２を設ける必要があり、この点でも構造的に複雑で大がかりになり易い。このため、実用化されている表面プラズモン共鳴センサは、大型で高価なシステムとなっている。
【０００８】
この種のバイオセンサは、ウイルス感染の有無等、各種疾病の診断への利用に期待が寄せられている。疾病の早期発見、治療のためには、できるだけシンプルで安価なシステムとし、中小の病院や診療所等でも設置、利用できるようにすることが望ましい。
ここで、上記従来の一般的な表面プラズモン共鳴センサは、金属膜表面での電磁波の伝搬を利用しているので伝搬型表面プラズモン共鳴センサと呼ばれる。一方、上記のようなプラズモンと電磁波との共鳴は、全反射におけるエバネッセント場を利用するもの以外に、ナノレベルの金属の微細構造においても発現し得る。この種のプラズモン共鳴は、局在型表面プラズモン共鳴と呼ばれる（局在プラズモン共鳴又は局在表面プラズモン共鳴と呼ばれることもあるが、この明細書では局在型表面プラズモン共鳴で統一する）。
【０００９】
例えば光の波長程度の大きさの金属微粒子では、光の電界による自由電子の移動が微粒子の界面（表面）で制限されることから、微粒子の表面に分極が生じる。分極が生じた微粒子内には反電界が発生するが、ある条件の下では反電界による微粒子の分極の振動と光の電界の振動とが共鳴し、より大きな分極が生じる。これが局在型表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。
【００１０】
このような局在型表面プラズモン共鳴は、微粒子以外の金属微細構造物でも一般的に生じ得る。表面プラズモン共鳴が生じると、金属微細構造物におけるプラズモンの振動に入射光のエネルギーが吸収され、また金属表面の電荷によりその周囲の電界が増強される。したがって、金属微細構造物に光を照射しながらその吸光度を調べることで表面プラズモン共鳴が生じたか否かを検知することができる。そして、この種の表面プラズモン共鳴は、金属微細構造物における表面電荷によるものであり、金属微細構造物の周囲の材料の比誘電率（誘電分散式ε（ω））に対して敏感である。したがって、目的物質を含み得る試料を金属微細構造物周囲に導入し、表面プラズモン共鳴が生じたと判断される波長を特定し、その波長がシフトしたか否かで目的物質の有無を判断することができる。
【００１１】
上記のように、局在型表面プラズモン共鳴を利用するバイオセンサ（以下、局在型表面プラズモン共鳴センサ）では、表面プラズモン共鳴が生じた波長（すなわち、吸収がピークとなった波長、以下、共鳴波長と呼ぶ）のシフトによりセンシングを行う。このため、検出系としては、試料が導入された金属微細構造物について分光吸収スペクトルが測定できれば足り、伝搬型のような入射角をスキャンする機構は不要である。また、局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属微細構造を表面に作り込んだチップ（センサチップ）の表面に試料流体を滴下して光照射することで容易に検出が行える。小型の安価な分光器も多く市販されており、従来一般的な伝搬型表面プラズモン共鳴センサに比べ、安価で使い易いシステムが構成できる。このようなことから、各種疾病の早期発見等の各種用途において広く使用できるものとして、実用化が期待されている。
【００１２】
このような局在型表面プラズモン共鳴センサに使用されるセンサチップを開示したものとして、特許文献１及び特許文献２が知られている。このうち、特許文献１は、高感度化されたセンサチップ及びその製造方法が開示されている。この文献では、凹部の内側面で局在型表面プラズモン共鳴を発生させるとされており、ナノインプリンティングの技術を使用してチップを製造するとされている。
【００１３】
一方、特許文献２は、高感度化すべく凹部の密度を高めていくと、凹部間の距離が短くなるため、凹部間の領域が凸部として光に認識される問題を指摘し、逆に凹部の周囲に積極的に凸部として形成した構造とすることを提案している。特許文献２は、この凹凸構造（特許文献２はフジツボ体と称している）を製造する技術として、固体が分散されている懸濁液を塗布して懸濁液が乾燥するまでの間に光照射する技術を開示している。そして、この技術により製造された構造体を型として用い、透明基板の表面に多数のフジツボ状の凹凸を設け、その表面にスパッタリングによって金属膜を作成することでセンサチップを製造している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００８−２１６０５５号公報
【特許文献２】特許第５４３８１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述した従来技術のうち、特許文献２では、凸部の表面でもプラズモンによる分極が生じ、表面プラズモン共鳴が生じ得る。したがって、特許文献１と比べると、より高感度のセンシングが可能となる。しかしながら、これら特許文献１，２に開示された技術は、回折光の影響が無視できず、このため高精度のセンシングが行えないという問題を抱えている。以下、この点について説明する。
【００１６】
上記特許文献１のセンサチップでは、微細な凹部が周期的に配置されており、凹部に対して光照射し、その反射光を分光し、分光強度から試料の分光吸収率を測定している。そして、分光吸収率がピークとなった波長において表面プラズモン共鳴が生じたと判断しており、その波長がシフトするかでセンシングを行っている。この際、凹部が周期的に並んでいることから、光の波長によっては各凹部は回折格子と同様に作用し、検出器には、回折光の干渉により強め合ったり弱め合ったりした光が入射する。この結果、分光器において波長掃引した際、現れたピークが回折光の干渉によるものなのか、表面プラズモン共鳴の発生によるものなのかが判らなくなってしまい、センシングの精度低下、さらにはセンシング不能となり得る。
【００１７】
この点について、特許文献１は、凹部の間隔（ピッチ）を４００ｎｍ以下とすることで回折光の影響がなくなるとしている（段落００４１及び０１０６）。しかしながら、その一方、特許文献１は、ピッチは凹部の幅の２倍より大きいことが望ましいとしている（段落００５４）。したがって、特許文献１のセンサチップの構造では、回折光干渉の影響を排除しようとすると、凹部の幅が小さくせざるを得ないことになり、例えば４００ｎｍ以下のピッチでは、凹部の幅は２００ｎｍ以下ということになる。これに関連して、特許文献１のセンサチップは、表面プラズモン共鳴による凹部内での電界増強を利用してセンシングを行っている。したがって、センシングのためには目的物質の分子が凹部内に進入する必要があるが、このように凹部が狭いものであると、進入できる分子が限られることになる。つまり、特許文献１のセンサチップでは、非常に微小な分子サイズの目的物質のセンシングに用途が限られてしまうという問題がある。
【００１８】
一方、特許文献２においては、図３（ａ）を見る限り、凸部が不均等に配置されていると思われるので、特許文献１のセンサチップに比べると回折光の影響は少ないものと想像される。しかしながら、特許文献２では、表面凹凸の構造体は、粒状固体４７を分散させた懸濁液を使用することで形成され、凸部の位置は、粒状固体４７の残留位置に相当している（特許文献２の図４参照）。粒状固体４７は、不均一に分散して不均等な位置に残留する場合もあると思われるが、ある程度均一に分散してある程度均等な位置に残留する場合もあると思われる。均等な位置に残留すると、各凸部が周期性を持って存在することになるので、少なからず回折光の干渉が発生し、これに起因した検出光の強弱が測定データに多く含まれてしまうものと想像される。すなわち、特許文献２のセンサチップ及びその製造方法は、回折光干渉の影響のない高品質のセンシングを再現性良く安定して行うという点では、問題を抱えている。
【００１９】
この出願の発明は、上述したような従来技術の各課題を解決すべく為されたものであり、局在型表面プラズモン共鳴センサにおいて、目的物質の分子サイズによらず回折光干渉の影響のない高品質のセンシングを再現性良く安定して行うことのできる方法及びシステムを提供し、この技術の普及に大きく貢献することを解決課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するため、この出願の請求項１記載の発明は、金属製微細構造物を有するセンサチップに光照射し、光照射されたセンサチップからの透過光又は反射光を受光器で受光してその分光強度を測定することで局在型表面プラズモン共鳴の発生波長を特定する局在型表面プラズモン共鳴センシング方法であって、
金属製微細構造物は、基板上に形成された多数の突起部より成るものであり、多数の突起部の平均配置ピッチをｄ、分光強度の測定波長域の中心値又は最短値をλ０とし、センサチップからの光源の発光部の視角をαとしたとき、光照射されたセンサチップ上の一点からの光の発散角βについて、
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
となる関係が成立させながら前記透過光又は反射光を受光器に入射させるという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項２記載の発明は、前記請求項１の構成において、前記センサチップと前記受光器との間に、前記センサチップからの光を集光して前記受光器に入射させるレンズを配置し、このレンズの物体側ＮＡを、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させる発散角βについてｓｉｎβ以下とするという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項３記載の発明は、前記請求項１又は２の構成において、前記光源と前記センサチップとの間にアパーチャを配置し、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させるよう当該アパーチャがない場合に比べて視角αを小さくするという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項４記載の発明は、金属製微細構造物を有するセンサチップに光照射し、光照射されたセンサチップからの透過光又は反射光を受光器で受光してその分光強度を測定することで局在型表面プラズモン共鳴の発生波長を特定する局在型表面プラズモン共鳴センシングシステムであって、
前記金属製微細構造物は、基板上に形成された多数の突起部より成るものであり、
前記金属製微細構造物における多数の突起部の平均配置ピッチをｄ、分光強度の測定波長域の中心値又は最短値をλ０とし、センサチップからの光源の発光部の視角をαとしたとき、光照射されたセンサチップ上の一点からの光の発散角βについて、
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
となる関係が成立しているという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項５記載の発明は、前記請求項４の構成において、前記センサチップと前記受光器との間には、前記センサチップからの光を集光して前記受光器に入射させるレンズが配置されており、このレンズの物体側ＮＡは、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させる発散角βについてｓｉｎβ以下となっているという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項６記載の発明は、前記請求項４又は５の構成において、前記光源と前記センサチップとの間にアパーチャが配置されており、アパーチャは、前記
ｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄ
を成立させるよう当該アパーチャがない場合に比べて視角αを小さくするものであるという構成を有する。
また、上記課題を解決するため、請求項７記載の発明は、前記請求項５の構成において、前記レンズの物体側ＮＡは０．８未満であるという構成を有する。
【発明の効果】
【００２１】
以下に説明する通り、この出願の請求項１又は４記載の発明によれば、受光器における光の取り込み角βがｓｉｎ−１（λ０／ｄ−ｓｉｎα）より小さくなっているので、回折光干渉による強い光が取り込まれることがなく、回折光干渉が測定データに影響することはない。このため、局在型表面プラズモン共鳴の発生を精度良く検知することができ、信頼性の高いバイオセンシングが行える。この効果は、各突起部のサイズによらずに得られるので、目的物質の分子サイズが限定される問題もない。また、局在型表面プラズモン共鳴発生の面内均一性を高めるべく各突起部を均等配置したセンサチップにおいても同様に得られるので、センシングの高再現性の効果と両立させることができる。
また、請求項２又は５記載の発明によれば、上記効果に加え、センサチップからの光が集光されて受光器に入射するので、光の利用効率が高くなる。そして、レンズの物体側ＮＡを小さくすることでｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄの関係を成立させているので、センサチップから受光器までの光路長を長くする必要がなく、システム全体をコンパクトにする効果が得られる。
また、請求項３又は６記載の発明によれば、アパーチャにより不必要な光が遮断されるので、ノイズの低減したセンシングが行える。そして、アパーチャによりｓｉｎα＋ｓｉｎβ＜λ０／ｄの関係を成立させているので、光源からセンサチップまでの光路長を長くする必要がなく、システム全体をコンパクトにする効果が得られる。
また、請求項７記載の発明によれば、上記効果に加え、一般的な高感度のセンサチップにおいて回折光干渉の影響を排除したセンシングが行える構成となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施形態に係る局在型表面プラズモン共鳴センシングシステムの正面概略図である。
【図２】図１のセンシングシステムに使用される局在型表面プラズモン共鳴センサチップの正面断面概略図である。
【図３】図２に示すセンサチップにおける表面プラズモン共鳴の発現について模式的に示した図である。
【図４】実施形態のセンシングシステムにおけるセンシングの原理を示した概略図である。
【図５】実施形態のセンシングシステムに使用され得るセンサチップの微細構造のタイプについて示した平面概略図であり、二つの異なるタイプを示す平面概略図である。
【図６】各突起部を均等配置した場合と不均等配置した場合とでどのように検出結果が異なるかを調べたシミュレーション実験の結果を示した図である。
【図７】回折格子の原理について示した概略図である。
【図８】実施形態のセンシングシステムにおける光学系の構成を概略的に示した図である。
【図９】表面プラズモン共鳴を用いた従来の一般的なバイオセンサの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、この出願の発明を実施するための形態（以下、実施形態という）について説明する。図１は、実施形態に係る局在型表面プラズモン共鳴センシングシステムの正面概略図である。
実施形態のセンシングシステムは、局在型表面プラズモン共鳴センサチップ（以下、センサチップと略称する）に対して光照射し、その透過光の分光強度を測定することでセンシングを行うシステムとなっている。この際、回折光の干渉の影響が測定データに混入しないよう工夫した光学系を採用しており、これにより精度の高いセンシングを可能にしている。
【００２４】
具体的に説明すると、図１に示すセンシングシステムは、光源１と、光源１からの光が照射される位置にセンサチップ７を保持するチップホルダー２と、センサチップ７を透過した光を受光する位置に配置された受光器３と、受光器３における測定データを処理するデータ処理部４等を備えている。そして、センサチップ７と受光器３との間には、レンズ５１が配置されている。
センシングに使用する波長は可視域から近赤外域が想定されており、このような波長域の光を出力するものが光源１として使用される。具体的には、センサチップ５は局在型表面プラズモン共鳴の発生波長のシフトでセンシングを行うものであるため、光源１としては連続した波長の光を放射するものであることが好ましく、具体的にはハロゲンランプその他の白色光源が使用される。
【００２５】
前述したように、局在型表面プラズモン共鳴の検知には、波長掃引が必要である。このため、受光器３は分光素子を内蔵しており、入射光の分光強度を出力することが可能となっている。分光光学系の構成は、各種のものを使用し得るが、この実施形態では、シリコン系のリニアフォトダイオードアレイを使用したマルチチャンネル型の受光素子に対して回折格子（グレーティング）で分散させた光を入射させる構成を採用し得る。
【００２６】
受光器３からの出力データは、波長毎の光強度（分光強度）であり、このデータがデータ処理部４に入力されるようになっている。データ処理部４７は、プロセッサ、メモリ、ディスプレイ等を含んでいる。メモリには、受光器３からの出力データを処理して吸光度がピークとなった波長（共鳴波長）の特定等を行う検出プログラムが実装されている。検出プログラムは、共鳴波長がシフトしたか否かを判断するモジュールを含んでおり、シフトの有無に従ってセンシングの結果（目的物質の有無）をディスプレイに表示するようプログラミングされている。尚、受光器３にはセンサチップ７を経ない光を参照光として入射させることが可能となっており、センサチップ７を経た光と経ない光との比較によりセンサチップ７における吸光度が測定されるようになっている。
【００２７】
このようなセンシングシステムに使用されるセンサチップ７について、図２を使用して説明する。図２は、図１のセンシングシステムに使用される局在型表面プラズモン共鳴センサチップ７の正面断面概略図である。図２に示すセンサチップ７は、基板７１と、基板７１上に形成された金属製微細構造物（以下、単に微細構造物という）７２とを備えて構成されたものとなっている。
【００２８】
具体的に説明すると、このセンサチップ７は、上記のように透過光測定によりセンシングを行うシステムに使用されるため、基板７１はガラス又は樹脂等で形成された透明なものとなっている。基板７１の形成材料としては、微細構造物７２を形成する製造プロセスにおいてある程度の高温に晒されるため、必要な耐熱性を備えた材料が選定される。例えば石英ガラス、硼珪酸ガラスのような耐熱ガラス、その他耐熱性の透明樹脂等が基板７１の材料として選定される。
【００２９】
微細構造物７２は、この実施形態では金（Ａｕ）で形成されている。微細構造物７２は、図２に示すように、基板７１の表面に沿って延びるライナー部７２１と、基板７１から突出した状態の多数の突起部７２２とから成る構造となっている。ライナー部７２１と突起部７２２とは連続している。
各突起部７２２は、ほぼ円筒状の部位となっている。図２に示すように、突起部７２２の内径は、基板７１から遠ざかるに従って徐々に小さくなっており、突起部７２２の上側開口径は底部開口径より小さく絞られた構造となっている。
【００３０】
このような微細構造物７２は、補強のため及び製造上の理由から、誘電体製のベース７３によって支えられている。ベース７３も、同様にライナー部（以下、ベースライナー）７３１と突起部（以下、ベース突起）７３２とより成る構造であり、ベースライナー７３１の上に微細構造物７２のライナー部７２１が形成され、ベース突起７３２の上に微細構造物７２の突起部７２２が形成されている。尚、この実施形態では、ベース７３は酸化シリコンで形成されている。
【００３１】
このようなセンサチップ７及び実施形態のセンシングシステムを使用して行うバイオセンシングの原理について、図３及び図４を使用して説明する。図３は、図２に示すセンサチップ７における表面プラズモン共鳴の発現について模式的に示した図、図４は実施形態のセンシングシステムにおけるセンシングの原理を示した概略図である。
【００３２】
図２に示す実施形態のセンサチップ７では、微細構造物７２のうち突起部７２２、特に突起部７２２の先端部において表面プラズモン共鳴が発生し易い。先端部では、金属がより微細な構造となっている。このため、図３に示すように、先端部内で自由電子の移動が遮蔽されて分極が発生し易く、この部位において光の振動と共鳴し易い。
【００３３】
局在型表面プラズモン共鳴が生じると、周囲の電界が増強される。実施形態では、図３に示すように、断面構造において向かい合う左右の突起部７２２の先端部間の電界が増強される。突起部７２２は、実際には円筒状であるので、円筒の開口を横断する状態の電界が増強される。
表面プラズモン共鳴が生じると、前述したように共鳴に光エネルギーが吸収されるので、吸光度がピークとなる。プラズモン共鳴は、誘電分散式ε（ω）に依存し、したがって特定の波長でのみ生じ、また周囲の材料の比誘電率に敏感である。このため、分光吸収スペクトルの解析から吸光度のピーク波長を特定し、ピーク波長が変化（シフト）したか否かで、目的物質のセンシングが行われる。尚、吸光度は散乱や反射の分も含むので、厳密には光吸収率とは異なるが、ここでは散乱や反射は表面プラズモン共鳴発生の有無にかかわらず一定であるとして良く、吸光度のピークは光吸収率のピークであるとして良い。
【００３４】
図４に示すように、センサチップ７において、微細構造物７２の表面には、バインダ８１によりリガンド８２が固定されている。免疫反応を利用したバイオセンサの場合、リガンド８２は抗体であり、目的物質は抗原８３である。試料は、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）のようなバッファ液に溶解又は混合されて試料流体Ｓとなってセンサチップ７の上に滴下される。
【００３５】
試料流体Ｓ中に抗原８３が存在しない場合、バッファ液の比誘電率に応じた波長（λ１）で表面プラズモン共鳴が生じる（図４（１））。試料流体Ｓ中に目的物質としての抗原８３が存在すると、抗体であるリガンド８２と特異的に反応し、リガンド８２に捕捉される。この結果、微細構造物７２の周囲の比誘電率が変化し、この比誘電率の変化により、共鳴波長がシフトしてλ２となる（図４（２））。したがって、最初に試料を投入しないバッファ液のみの状態で共鳴波長を特定した後、試料をバッファ液に投入し状態で共鳴波長を再度特定する。両者の間にある程度以上の相違が見られれば、試料中に目的物質（抗原）８３が存在しているとして同定される。
【００３６】
さて、このような原理によりセンシングを行う実施形態のセンシングシステムは、回折光の影響を極力排除することでより高感度のセンシングを行えるようにしている。以下、この点について説明する。
前述したように、特許文献１や特許文献２のセンサチップ７では、回折光の干渉により生じる光の強弱が検出結果に影響し得る。この点に関して、センサチップ７における微細構造物の構造として、二つのタイプが考えられる。まず、この点について説明する。図５は、実施形態のセンシングシステムに使用され得るセンサチップ７の微細構造のタイプについて示した平面概略図であり、二つの異なるタイプを示す平面概略図である。
【００３７】
図５（Ａ）には、複数の突起部７２２が均等配置されたタイプのセンサチップ７の一例が示されている。このタイプは、局在型表面プラズモン共鳴が生じ得る箇所が基板上に均等に分布しているという点で、特許文献１のものと同様であるといえる。尚、「均等」とは、隣り合う突起部７２２間の離間間隔が、各突起部７２２において同じということである。
【００３８】
図５（Ａ）のタイプでは、一例として各突起部７２２が三方配置されたものとなっている。三方配置とは、図５（Ａ）に示すように、ある突起部７２２を基準にして三つの方向の両側に均等間隔で突起部７２２が設けられた配置である。
一方、図５（Ｂ）は、多数の突起部７２２が不均等に配置されたタイプのセンサチップ７の一例が示されている。不均等の程度も種々考えられるが、ここでは、平面内のいずれの方向で見た場合にも、隣接する三つの突起部７２２において離間距離が同一ではない配置となっている。また、各突起部７２２の径も相違するものとなっている。
【００３９】
前述したように、図５（Ａ）のように各突起部７２２が均等配置されているセンサでは、図５（Ｂ）のような不均等配置のセンサチップ７に比べ、回折光干渉の影響が出やすい。以下、この点を確認したシミュレーション実験の結果について説明する。
図６は、各突起部７２２を均等配置した場合と不均等配置した場合とでどのように検出結果が異なるかを調べたシミュレーション実験の結果を示した図である。この実験では、均等配置の例として、図５（Ａ）に示す三方配置の構造を採り上げた。また、不均等配置については、計算を容易にするため、実施形態の構造（不均等配置）については突起部７２２が１個のみであると想定し、三方配置（均等配置）については上記配置が無限に続くと想定してシミュレーションを行った。
【００４０】
同様に微細構造物の材料は金とし、照射する光としては、中心波長６５０ｎｍで分光分布がガウス分布となっている光を想定した。このような光を照射した際、分光吸収スペクトルがどのように観察されるかをシミュレーションした。シミュレーションには、ＦＤＴＤ（Finite-Difference Time-Domain）法が用いられ、ソフトウェアとしてはＳｙｎｏｐｓｙｓ社のＦＵＬＬＷＡＶＥ（同社の登録商標）が使用された。尚、バイオセンシングのシミュレーションとして、微細構造物の周囲が空気である場合と水である場合との双方について分光吸収スペクトルを調べた。図６（１）（２）中、■マーカーが空気の場合の分光吸収スペクトル、◆マーカーが水の場合の分光吸収スペクトルである。
【００４１】
図６（１）に示すように、均等配置の場合、回折光干渉の影響と見られる多数のピークが観察される。いずれかのピークが表面プラズモン共鳴起因のピークと思われるが、回折光干渉起因の多数のピークの中に埋没してしまい、どのピークが表面プラズモン共鳴起因のピークなのか判断することができない。空気と水とでは誘電率が異なるので、表面プラズモン共鳴起因のピークもシフトしていると思われるが、表面プラズモン共鳴起因のピークがどれであるかが判断できないので、ピークのシフトも判断することができない。
一方、図６（２）に示すように、不均等配置の場合、表面プラズモン共鳴起因のピーク（光吸収率極大値）のシフトが明確に観察できる。図６（２）中の矢印で示すのが、ピークのシフトである。
【００４２】
上述したシミュレーション実験の結果からは、センサチップ７の構造として、図５（Ｂ）に示すような不均等配置の構造の方が望ましいことがわかる。しかしながら、特許文献２に開示されたような粒状固体を用いる製造プロセスでは、各突起部７２２の形成位置（粒状固体の付着位置）は制御できないので、確実に不均等配置の構造が得られるとは限らない。すなわち、ある製品では不均等配置となって回折光干渉の影響が排除されるものの別の製品では回折光干渉の影響が出てしまうという結果になり易い。これを考慮すると、各突起部７２２の不均等配置の程度にかかわらず、常に回折光干渉の影響が排除できるようにしておくことが望ましい。
【００４３】
また、別の観点として、センサチップ７における面内均一性という点では、不均等配置よりも均等配置の方が望ましいという場合もあり得る。前述したように、各突起部７２２は、局在型表面プラズモン共鳴が生じる場所である。試料流体Ｓにおいて、目的物質（前記の例では抗原８３）の分子が均一に分布しているとは限らないことを考慮すると、各突起部７２２は均等に配置されている方が望ましい。各突起部７２２が不均等であると、目的物質の分子の分布の不均一性が影響して検出の再現性が低くなってしまうことがあり得るからである。
【００４４】
すなわち、各突起部７２２の不均等配置において、突起部７２２が密な領域を密領域とし、疎な領域を疎領域とすると、試料流体Ｓ中の目的物質の分子が豊富な部分が密領域に達し、目的物質の分子が乏しい部分が疎領域に達した場合には、局在型表面プラズモン共鳴発生による光の吸収量は多くなる。これに対し、目的物質の分子が豊富な部分が疎領域に達し、目的物質の分子が乏しい部分が密領域に達した場合には、光の吸収量は少なくなる。つまり、試料流体Ｓ中の目的物質の量は同じであっても、微細構造が不均一であると、測定結果に違いがで易い。この点を考慮すると、各突起部７２２が均等配置された構造の方が望ましい。
【００４５】
実施形態のセンシングシステムは、これらの点を考慮し、各突起部７２２が不均等配置であるか否かにかかわらず回折光干渉の影響が排除される構成を採用している。以下、この点について説明する。
図７は、回折格子の原理について示した概略図である。周知のように、回折格子における回折の条件は、入射光が回折面に垂直な面（主断面）に沿ったものであるとすると、以下の式１で表される。
【数１】
2017015666.tif 000003
式１において、ｍは回折光の次数、λは光の波長、ｗは格子幅、αｉは入射角、β０は回折光の出射角である。この条件が成立する場合、β０の方向において回折光の干渉により強められた光又は弱められた光（強弱光）が観測されることになる。
【００４６】
上記の点をセンシングシステムの構成において考えてみると、回折光干渉による強弱光が測定データに含まれないようにするには、上記β０の方向の光を受光器３が取り込まないようにすれば良い。すなわち、実施形態のセンシングシステムは、光学系の構成を工夫し、上記β０の方向の光を受光器３が取り込まないようにしている。以下、この点について図８を参照して説明する。図８は、実施形態のセンシングシステムにおける光学系の構成を概略的に示した図である。
【００４７】
前述したように、センサチップ７は、基板７１上に微細構造物７２が作り込まれた構造を有するする。この場合、コスト上の問題等から、微細構造物７２は基板７１上の小さな領域（以下、チップ領域という）に作り込まれる。チップ領域は、一般的には数ｍｍ角程度である。したがって、図８に示すように、チップ領域は光源１の発光部の大きさに比べてかなり小さい。
前述したように光源１からの光でセンサチップ７が照明され、微細構造物７２を透過した光が受光器３に入射する。この際、受光器３は分光器であるので、光取り込み部は、図８（ａ）に示すように入射スリット３１であるのが一般的である。
【００４８】
小さなチップ領域からの光を入射スリット３１に入射させるのみでは光の取り込み量が少なく効率が悪いので、図８（ａ）に示すようにセンサチップ７と入射スリット３１との間に受光側光学素子としてレンズ５１が配置される。レンズ５１は集光の目的であるが、このレンズ５１の物体側ＮＡを適宜選定することで上記β０の方向の光を受光器３が取り込まないようにすることができる。すなわち、レンズ５１について物体側ＮＡの小さなものを用い、上記β０の方向の光を取り込まないようにすれば良い。図８（ａ）に示すように、レンズ５１の物体側ＮＡを小さくするということは、発散角βが小さい光だけを受光器３に取り込ませることに他ならない。
【００４９】
尚、発散角βとは、光照射されたセンサチップ７上の一点から出射する光が光軸３０に対して成す角である。この場合、光軸３０は、図８（ａ）に示すように光取り込み部が入射スリット３１の場合、入射スリット３１の中心を通り入射スリット３１を形成する板に垂直な軸ということになる。光ファイバ３２により光を取り込むタイプの受光器が用いられることもあり、この例が図８（ｂ）に示されている。この場合は、光ファイバ３２の入射面の中心を通り入射面に垂直な軸が光軸３０ということになる。
【００５０】
いずれにしても、センサチップ７と入射スリット３１（又は光ファイバ３２）との間に配置されたレンズ５１について物体側ＮＡを小さなものを用いることで、回折光の影響を排除することができる。どの程度物体側ＮＡを小さくすれば良いかについては、上記式１に従って以下の式２で与えられる。すなわち、式２を満たすように物体側ＮＡを小さくすれば良い。
【数２】
2017015666.tif 000004
【００５１】
式２において、ｄはセンサチップ７における各突起部７２２の配置ピッチ、λ０は分光強度の測定波長域の中心値又は最短値（以下、基準波長という）、αはセンサチップ７からの光源１の発光部の視角である。配置ピッチｄは、不均等配置の場合、全突起部７２２における平均値である。配置ピッチｄは、３００ｎｍ以上１００μｍ以下の範囲で適宜選定される。
【００５２】
分光強度の測定波長域とは、局在型表面プラズモン共鳴の発生を検知するために分光吸収スペクトルを調べる波長範囲である。例えば４００〜１２００ｎｍの範囲で分光吸収スペクトルが調べられ、この場合、基準波長を中心値とするとλ０は８００ｎｍとなる。
視角αは、センサチップ７上の中央（光軸上の点）から光源１の発光部全体を見込む角度の半分の角度である。視角αは、センサチップ７に入射する光のうち最も大きな角度で入射する光の当該入射角に相当している。光軸３０に対してどの程度の位置であるかによって最大入射角は若干変わるが、視角αを最大入射角として実用上問題はない。
【００５３】
説明を簡単にするため、光源１からの光は平行光であるとし、センサチップ７に垂直に入射するとする。この場合、視角α＝０となる。また、より強く影響が出やすい１次回折光のみを考慮するものとし、ｍ＝１とする。この場合、回折格子の一般式（式１）は、格子幅ｗを配置ピッチｄに置き換え、波長を基準波長λ０とすると、以下の式３のように書き換えられる。
【数３】
2017015666.tif 000005
【００５４】
配置ピッチｄが基準波長λ０より短い場合はまれで、通常はλ０＜ｄである。したがって、発散角βの値によっては、取り込まれる光の中にβ０の発散角のものが存在して式３が成立してしまう。すなわち、回折光干渉の影響が出ることになる。例えば、λ０が６００ｎｍ、配置ピッチが１．１μｍの場合、ｓｉｎβ０＝０．５５程度となり、β０＝３３．４°程度となる。したがって、この例では、発散角βが３３．４°より大きい場合、回折光干渉の影響が出ることになる。逆にいえば、発散角βを３３．４°より小さくしておくことで回折光干渉の影響は排除されることになる。つまり、ｓｉｎ（３３．４）＝０．５５であるのでレンズ７１のＮＡを０．５５より小さくしておけば良いということである。
【００５５】
上記のように発散角βの調整により回折光干渉の影響を排除する場合、式３をより一般化した形で書き直すと、光学系は、発散角βについて以下の式４を成立させるものであれば良いことになる。
【数４】
2017015666.tif 000006
【００５６】
また、図８（ｂ）に示すように、光を光ファイバ３２に入射させて光ファイバ３２で分光用の光学系まで導く構成の場合、最終的に取り込まれる光の発散角βは、光ファイバ３２のＮＡによっても制限される。したがって、レンズ５１について特に物体側ＮＡを小さなものを用いなくても、光ファイバ３２のＮＡによって式４を成立させることもできる。言い換えれば、回折光干渉の影響が出ないように光ファイバ３２のＮＡを選定することがあり得る。
【００５７】
上記二つの例は、センサチップ７の出射側の光学素子（受光側光学素子）により回折光干渉の影響を排除する例であったが、センサチップ７の入射側に設けた光学素子により回折光干渉の影響を排除することもできる。この例が図８（ｃ）に示されている。この例では、視角αを調整することで式２ないし式４を成立させる例であり、アパーチャ５２を用いた例となっている。
【００５８】
前述したように光源１の大きさに比べて、チップ領域は小さい。したがって、光源１からの光をアパーチャ５２で絞ることは問題がなく、かえってノイズ（迷光）を小さくする観点から望ましい。すなわち、チップ領域以外に不必要に光照射がされると、何らかの要因で分光吸収スペクトル測定におけるノイズ（迷光）となる場合があり、精度の高い測定を行う観点からは、チップ領域の周囲には光照射しないようにすべきである。このため、アパーチャ５２の使用は効果的である。この際、図８（ｃ）に示すように、アパーチャ５２の開口の大きさを多少小さくしておき、光源１からの光を少し遮蔽する状態とする。このようにすると、視角αの大きな光がセンサチップ７に入射しなくなるので、結果的に視角αを小さくすることができる。αが小さくなると、式４の右辺が大きくなるので、βを小さくしなくても式４が成立するようになる。つまり、レンズ７１や光ファイバ７２においてＮＡを小さくする代わりにアパーチャ５２の開口を小さくすることで回折光干渉の影響を排除することができる。尚、レンズ７１や光ファイバ７２でＮＡを小さくすることに加えてアパーチャ５２の開口を小さくしても良いことは、勿論である。アパーチャ５２については、開口の大きさが可変のものを用いると、光量の確保と回折光干渉の影響排除とを両立させるための調整が容易に行えるので、好適である。
【００５９】
上記のように、実施形態のセンシングシステムによれば、発散角βをｓｉｎ−１（λ０／ｄ−ｓｉｎα）より小さくする光学系が与えられているので、干渉した回折光が取り込まれることがなく、回折光干渉が測定データに影響することはない。このため、局在型表面プラズモン共鳴の発生を精度良く検知することができ、信頼性の高いバイオセンシングが行える。
【００６０】
尚、前述したように一般的な測定波長域は４００〜１２００ｎｍであり、中心値でみた場合の基準波長λ０は８００ｎｍである。また、配置ピッチｄを大きくすると突起部７２２が数が少なくなり（疎な状態）となり、検出感度が低下するので、一般的には３００ｎｍ〜３μｍ程度の範囲で選定される。この範囲で、視角α＝０（平行光を照射する）としてｓｉｎβが最も小さくなる条件は、１μｍの配置ピッチの場合で、その値は０．８である。したがって、受光側光学素子５としてＮＡが０．８未満のレンズ５１を採用しておけば、一般的な高感度のセンサチップ７において回折光干渉の影響を排除したセンシングが行える構成となる。尚、基準波長は最短値とした方が回折光排除の観点からはより好ましいが、中心値としても実用上大きな問題はない。
【００６１】
前述したように特許文献１は、凹部の間隔を４００ｎｍ以下とすることで回折光の影響がなくなるとしている。この考え方は、式２において配置ピッチｄを小さくするものであり、配置ピッチｄを小さくすれば、βを小さくしなくても回折光干渉の影響を排除できる可能性がある。しかしながら、前述したように、特許文献１の考え方では、凹部自体のサイズも小さくなってくるため、センシングできる目的物質の分子サイズが小さいものに制限されてしまう問題がある。さらに、凹部や凹部のピッチが小さくなってくると、微細加工の困難性が増すという問題がある。これに比べると、実施形態のシステムには、目的物質の分子サイズの制限を受けることがなく、またセンサチップの製造が難しくならないという優位性がある。
【００６２】
尚、式２ないし式４を成立させる光学系の構成として、センサチップ７から受光器３までの距離（光路長）を長くすることで発散角βを小さくすることができる。この点は照射側も同様で、光源１からセンサチップ７までの距離を長くすることで視角αを小さくしても良い。但し、システム全体をコンパクトにする観点からはレンズ５１やアパーチャ５２等の光学素子を使用する構成の方が望ましい。照射側では、コリメータレンズ等で平行光をセンサチップ７に照射する構成が採用され得る。
【００６３】
尚、実施形態のセンシングシステムで使用されるセンサチップ７については、前述したように均等配置の微細構造のものと不均等配置の微細構造のものとがあるが、いずれの場合にも、フォトリソグラフィを用いた製造方法により好適に製造し得る。具体的には、基板上にフォトリソグラフィによって誘電体製のベース７３のパターン（ベースライナー７３１及び多数のベース突起７３２より成るパターン）を形成し、この上にスパッタリング等の手法により金属膜を作成する。作成される金属膜は、図２に示すようにベース突起７３２の先端において途切れた構造となり、多数の突起部７２２が形成された微細構造物７２が得られる。
【００６４】
また、センシングシステムの基本構成としては、センサチップ７からの透過光の分光強度を測定する構成の他、反射光の分光強度を測定する構成もあり得る。この場合、光路上にビームスプリッタ等を適宜配置し、反射した光を照射用の光路から取り出して受光器３に入射させる構成が採用され得る。
尚、センシング方法又はセンシングシステムにおいて、センサチップ７に導入される流体としては試料を含まない場合もあり得る。例えば、試料を含まないバッファ液について特性のチェック等のためプラズモンの発生波長を特定する場合もあり得る。
【符号の説明】
【００６５】
１  光源
２  チップホルダー
３  受光器
３１  入射スリット
３２  光ファイバ
４  データ処理部
５１  レンズ
５２  アパーチャ
７  局在型表面プラズモン共鳴センサチップ
７１  基板
７２  金属製微細構造物
７２２  突起部
７３  ベース
７３２  ベース突起
８２  リガンドとしての抗体
８３  目的物質としての抗原
Ｓ  試料流体
【図１】
2017015666.tif 000007
【図２】
2017015666.tif 000008
【図３】
2017015666.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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