(57)【要約】【課題】従来のラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされた培養容器を用いて細胞を培養する方法と比較して、少ないラミニンフラグメント使用量で同等の培養効率を実現可能な細胞培養方法を提供する。【解決手段】インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器に細胞を播種して培養することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項１または２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．０３μｇ〜２μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項５】
培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．０６μｇ〜０．５μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
インテグリンがインテグリンα６β１、α６β４、α３β１、α７β１である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項７】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
細胞が哺乳動物細胞の幹細胞または該幹細胞から分化した細胞である請求項７に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
細胞が多能性幹細胞である請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有することを特徴とする細胞培養用培地。
【請求項１１】
ラミニンフラグメント濃度が、０．１５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである請求項１０に記載の細胞培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラミニンフラグメントを含有する培地を用いて細胞を培養する方法、およびラミニンフラグメントを含有する細胞培養用培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞などのヒト多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。ヒト多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、これら幹細胞を安全かつ安定的に培養、増幅する培養技術の開発が必要である。
【０００３】
本発明者らは、ヒトＥＳ細胞が発現するインテグリンのタイプを解析した結果、α６β１インテグリンがヒトＥＳ細胞の主要な接着受容体であること、およびヒトラミニン（特に、α３β３γ２からなるラミニン３３２およびα５β１γ１からなるラミニン５１１）の組換えタンパク質が、ヒトＥＳ細胞のフィーダーフリー培養基質として有用であることを報告した（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、ラミニン５１１のＥ８フラグメント（ラミニン５１１Ｅ８）をフィーダーフリー培養基質として用いることにより、従来困難であったヒト多能性幹細胞の単一分散による継代培養が可能であることを報告した（特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００４】
現在、組換えヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントが市販され（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ−５１１、株式会社ニッピ）、ヒトラミニン５１１Ｅ８はヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞などのヒト多能性幹細胞の培養基質として急速に普及し始めている。しかし、ヒトラミニン５１１Ｅ８を基質として細胞を培養するには、培養容器の表面にヒトラミニン５１１Ｅ８を大量にプレコーティングしておく必要がある。そのため、従来の方法では培養コストが高くなるという問題がある。また、通常、培養基質のコーティングには、リン酸緩衝液などを用いて調製した培養基質溶液を培養容器に添加し、約４℃〜約３７℃で数時間から一晩インキュベートすることが不可欠である。それゆえ、培養コストの低減とコーティング工程の省略が実現できれば、多能性幹細胞の培養基質としてヒトラミニン５１１Ｅ８がより広く利用されることが期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第２０１１／０４３４０５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
【非特許文献２】Miyazaki T, Futaki S, Suemori H, Taniguchi Y, Yamada M, Kawasaki M, Hayashi M, Kumagai H, Nakatsuji N, Sekiguchi K, Kawase E. Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun. 3,1236. Doi:10.1038/ncomms2231, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされた培養容器を用いて細胞を培養する従来の方法（プレコーティング法）と比較して、少ないラミニンフラグメント使用量で同等の培養効率を実現可能な細胞培養方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。
［２］ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器に細胞を播種して培養することを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養方法。
［３］インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである前記［１］または［２］に記載の細胞培養方法。
［４］培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．０３μｇ〜２μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養方法。
［５］培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．０６μｇ〜０．５μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする前記［４］に記載の細胞培養方法。
［６］インテグリンがインテグリンα６β１、α６β４、α３β１、α７β１である前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞培養方法。
［７］細胞が哺乳動物細胞である前記［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞培養方法。
［８］細胞が哺乳動物細胞の幹細胞または該幹細胞から分化した細胞である前記［７］に記載の細胞培養方法。
［９］細胞が多能性幹細胞である前記［８］に記載の細胞培養方法。
［１０］インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有することを特徴とする細胞培養用培地。
［１１］ラミニンフラグメント濃度が、０．１５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである前記［１０］に記載の細胞培養用培地。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来のプレコーティング法と比較して、少ないラミニンフラグメント使用量で同等の培養効率を実現可能な細胞培養方法を提供することができる。また、そのような方法に用いるための細胞培養用培地を提供することができる。本発明の細胞培養方法は、ラミニンフラグメントを予め培養容器にコーティングする必要がないので、細胞培養操作に必要な時間を短縮することができる。また、ラミニンフラグメントの使用量を低減できるので、培養コストを抑えることができる。さらに、コーティングの際の個人誤差を排除することができ、培養操作の習熟度に依存しない簡便な培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の細胞培養方法におけるヒト多能性幹細胞の培養基質濃度依存的接着効率を、プレコーティング法と比較した結果を示す図であり、（Ａ）はＨ９ヒトＥＳ細胞の結果、（Ｂ）は２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞の結果である。
【図２】本発明の細胞培養方法およびプレコーティング法におけるヒト多能性幹細胞の接着の様子を示す図である。
【図３】本発明の細胞培養方法おけるヒト多能性幹細胞の増殖速度を、プレコーティング法と比較した結果を示す図である。
【図４】本発明の細胞培養方法におけるヒト多能性幹細胞の増殖の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔細胞培養方法〕
本発明の細胞培養方法は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント（以下、単に「ラミニンフラグメント」と記す場合がある）を含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まない細胞培養方法である。すなわち、本発明の培養方法は、従来のプレコーティング法では必須である培養容器にコーティングする工程が不要である。
【００１２】
本発明の培養方法に用いる培養容器は特に限定されず、どのような培養容器でも好適に用いることができる。具体的には、培養面に何もコーティングされていない培養容器、培養面に培養基質（細胞外マトリックス）がコーティングされている培養容器、培養面に電荷処理等の細胞接着加工処理が施されている培養容器などが挙げられる。本発明の培養方法では、ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器を用いることが好ましい。ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器とは、培養容器の培養面にラミニン（全長ラミニン）およびラミニンフラグメント（全長ラミニンの一部）のどちらもプレコーティングされていない培養容器を意味し、培養面に何もコーティングされていない培養容器、ラミニンおよびラミニンフラグメント以外の培養基質がコーティングされている培養容器、培養面に電荷処理等の細胞接着加工処理が施されている培養容器などが含まれる。本発明の培養方法に用いる培養容器の材質、形状等は特に限定されず、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、などを好適に用いることができる。また、ポリマー膜製のカルチャーバッグも好適用いることができる。
【００１３】
本発明の培養方法は、具体的には、
（ａ）ラミニンフラグメント含有培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液を培養容器に播種する方法、
（ｂ）ラミニンフラグメントを含有しない培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加した後、当該細胞懸濁液を培養容器に播種する方法、または
（ｃ）ラミニンフラグメントを含有しない培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液を培養容器に播種した後、培地にラミニンフラグメントを添加する方法、
のいずれの方法であってもよい。
【００１４】
ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子である。α鎖はα１〜α５の５種類、β鎖はβ１〜β３の３種類、γ鎖はγ１〜γ３の３種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも１２種類以上のアイソフォームが存在する（本明細書において、例えば「ラミニンα５β１γ１」を「ラミニン５１１」と記す。他のアイソフォームも同様に記す。）。本発明の培養方法に用いるラミニンフラグメントは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであればよい。このようなラミニンフラグメントとしては、ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントであることが好ましい。具体的には、α鎖、β鎖およびγ鎖の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全部の鎖が全長より短いラミニンフラグメントである。ラミニンフラグメントがヘテロ３量体を形成していることは、ラミニンフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。ラミニンフラグメントがインテグリン結合活性を有していることは、固相結合アッセイ等により確認することができる。
【００１５】
ラミニンの由来は特に限定されず、各種生物由来のラミニンを用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のラミニンである。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のラミニンを用いることが特に好ましい。ヒトの再生医療材料を得るためにヒト幹細胞を培養する場合には、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー条件を満たす培養環境が求められることから、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の培養方法に用いるラミニンフラグメントとしては、インテグリン結合活性の強さ、組換えタンパク質としての発現効率の観点から、ラミニンＥ８フラグメント（以下、「ラミニンＥ８」と記す。）が好ましい。ラミニンのＥ８は、マウスラミニン１１１をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K. Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１Ｅ８に相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してＥ８フラグメントを分離・同定した報告はない。ラミニンＥ８は、α鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４および５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」と記す）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」と記す）およびγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」と記す）が３量体を形成したフラグメントであり、３量体の分子量は約１５０〜約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０〜約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０〜約２５０個のアミノ酸からなる。本発明に用いるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１のＥ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
【００１７】
ラミニンフラグメントは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持したまま、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンフラグメントの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニン高発現細胞から精製した全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００１８】
組換えラミニンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えラミニンフラグメントの製造方法としては、例えば、α鎖、β鎖およびγ鎖の部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。組換えラミニンフラグメント（ラミニンＥ８）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Ido, H et al., J. Biol. Chem. 282, 11144-11154, 2007.）の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。主要な哺乳動物のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。なお、組換えラミニン５１１Ｅ８は、商品名ｉＭａｔｒｉｘ−５１１として株式会社ニッピから市販されており、これを好適に用いることができる。
【００１９】
本発明の培養方法は、ラミニン結合性のインテグリンが発現している細胞の培養に好適に用いることができる。ラミニン結合性のインテグリンとしては、インテグリンα６β１、α６β４、α３β１およびα７β１が挙げられる。培養対象細胞として、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物の幹細胞、および幹細胞から体細胞への分化過程にある細胞である。幹細胞には体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞、ＭＵＳＥ細胞などが挙げられる。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。
【００２０】
例えば、ヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞が発現する主要なインテグリンはインテグリンα６β１であるので、本発明においてインテグリンα６β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームのフラグメントを用いれば、多能性幹細胞の分化多能性（未分化性）を維持した状態で培養するための有用な培養方法を提供することができる。インテグリンα６β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン３３２、ラミニン１１１が挙げられる（Matrix Biology 25(2006),189-197）。
【００２１】
例えば、ヒト神経前駆細胞が発現する主要なインテグリンはインテグリンα３β１またはα７β１であるので、本発明においてインテグリンα３β１またはα７β１と結合活性が高いラミニンアイソフォームのフラグメントを用いれば、多能性幹細胞から神経前駆細胞への分化過程にある細胞、あるいは樹立された神経前駆細胞の接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供することができる。インテグリンα３β１またはα７β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１が挙げられる（J Neurosci Res. 2006 April; 83(5):845-856、Matrix Biology 25(2006), 189-197）。
【００２２】
例えば、筋芽細胞が発現する主要なインテグリンはインテグリンα７β１であるので、本発明においてインテグリンα７β１と結合活性が高いラミニンアイソフォームのフラグメントを用いれば、多能性幹細胞から筋芽細胞への分化過程にある細胞、あるいは樹立された筋芽細胞の接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供することができる。インテグリンα７β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン１１１が挙げられる（J Cell Science 109, 3139-3150 (1996)）。
【００２３】
例えば、心筋細胞の分化過程において、分化初期段階において発現する主要なインテグリンはインテグリンα３β１とα６β１であり、分化が進むにつれ主要なインテグリン発現がα７β１に変わるので、本発明においてインテグリンα３β１、α６β１、α７β１と結合活性が高いラミニンアイソフォームのフラグメントを分化段階毎に分けて用いれば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化過程にある細胞、あるいは樹立された心筋細胞の接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供することができる。インテグリンα３β１、α６β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン３３２が挙げられ、インテグリンα７（Ｘ２）β１と結合活性の高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン２１１、ラミニン１１１が挙げられる（Cardiovascular Research 47 (2000) 715-725）。
【００２４】
例えば、ケラチノサイトが発現する主要なインテグリンはインテグリンα６β４であるので、本発明においてインテグリンα６β４と結合活性が高いラミニンアイソフォームのフラグメントを用いれば、多能性幹細胞からケラチノサイトへの分化過程にある細胞、あるいは樹立されたケラチノサイトの接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供することができる。インテグリンα６β４と結合活性が高いラミニンアイソフォームとしては、ラミニン３３２、ラミニン５１１が挙げられる（The Journal of biological chemistry 287(22), 17975-17984, 2012）。
【００２５】
なお、詳細なインテグリン発現は解析が行なわれていない細胞についても、試験管内あるいは生体内で発現するラミニンアイソフォームが判明している場合は、それらのラミニンアイソフォームのフラグメントを用いて、細胞の接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供することができる。例えば、血管内皮細胞はラミニン４１１およびラミニン５１１、脂肪細胞はラミニン４１１の発現が認められている。したがって、これらのラミニンアイソフォームのフラグメントを用いれば、血管内皮細胞や脂肪細胞の接着と機能性を維持するための有用な培養方法を提供できると考えられる。
【００２６】
本発明の培養方法に用いる培地は特に限定されず、培養対象細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。市販の培地を用いてもよく、自製した培地を用いてもよい。培地のラミニンフラグメント濃度は、培養対象の細胞を所望の接着効率で培養できる濃度であれば特に限定されない。通常、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．０３μｇ〜２μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度範囲から選択することができる。好ましくは、培養面１ｃｍ２あたり０．０６μｇ〜０．５μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度、より好ましくは、培養面１ｃｍ２あたり０．１μｇ〜０．２５μｇのラミニンフラグメントを含有する濃度である。ここで、培養容器に細胞を播種する際の液量を、例えば２００μｌ／ｃｍ２（培養面積）とすれば、０．０３μｇ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２は０．１５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌに相当し、０．０６μｇ／ｃｍ２〜０．５μｇ／ｃｍ２は０．３μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌに相当し、０．１μｇ／ｃｍ２〜０．２５μｇ／ｃｍ２は０．５μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌに相当する。
【００２７】
本発明者らは、本発明の培養方法を用いれば、プレコーティング法より培養面の単位面積当たりのラミニンフラグメント使用量を減らしても、プレコーティング法と同等の細胞接着効率および細胞増殖速度が得られることを確認している（実施例参照）。したがって、本発明の培養方法は、培養時間の短縮、培養操作の簡便性のみならず、コストの点でも従来法と比較して有利な方法である。また、ラミニンフラグメントをプレコーティングした培養容器に細胞を播種すると、細胞が最初に接触したラミニンフラグメントに接着するため、培養面における細胞の分布が不均一になることが指摘されている。本発明の培養補法を用いれば、プレコーティング法におけるこのような問題が解消され、細胞を培養面に均一に分布させることができる。
【００２８】
本発明の第一の実施形態は、ラミニンフラグメント含有培地を用いて細胞懸濁液を調製する工程と、調製した細胞懸濁液を培養容器に播種する工程と、培養対象細胞の培養に適して条件で培養を行う工程を含む。
本発明の第二の実施形態は、ラミニンフラグメントを含有しない培地を用いて細胞懸濁液を調製する工程と、調製した細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加する工程と、ラミニンフラグメントを添加した細胞懸濁液を培養容器に播種する工程と、培養対象細胞の培養に適して条件で培養を行う工程を含む。
本発明の第三の実施形態は、ラミニンフラグメントを含有しない培地を用いて細胞懸濁液を調製する工程と、調製した細胞懸濁液を培養容器に播種する工程と、播種後の細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加する工程と、培養対象細胞の培養に適して条件で培養を行う工程を含む。
本発明の細胞培養方法において行われる細胞培養の各操作手法はいずれも公知であり、当業者は容易に実施することができる。
【００２９】
本発明の培養方法の一実施形態として、ヒト多能性幹細胞を培養する場合を以下に示す。ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞を培養する場合の培地としては、ＴｅＳＲ−Ｅ８（商品名、STEMCELL Technologies）、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ（商品名、味の素株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（商品名、味の素株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（商品名、STEMCELL Technologies）、ＴｅＳＲ２（商品名、StemCell Technologies）、ＳＴＥＭＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（商品名、ThermoFisher Scientific）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商品名、Stemgent）、ＰＳＧｒｏ−ｆｒｅｅ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ／ＥＳＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、StemRD）、ＳｔｅｍＥＺ（商品名、Cellagen Technology）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商品名、ThermoFisher Scientific）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、Millipore）、ＰｅｐｒｏＧｒｏｗ ｈＥＳＣ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａ（商品名、PeproTech）、Ｌ７ ｈＰＳＣ Ｍｅｄｉａ（商品名、Lonza）、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商品名、Milteny Biotech）、ＨｙＣｅｌｌ−Ｓｔｅｍ Ｍｅｄｉａ（商品名、Hyclone）、ＤＥＦ−ＣＳ ５００（商品名、Cellartis）、Ｓ−Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、DS Pharma Biomedical）、Ｒｅｐｒｏ ＸＦ（商品名、Reprocell）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ ｈＰＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ Δ（商品名、Wako）等が挙げられる。
【００３０】
（１）フィーダー細胞との共培養系からヒト多能性幹細胞を回収
フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒト多能性幹細胞の培養ディッシュ（３〜５日目）に細胞剥離液（例えば、霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２、１ｍｇ／ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２など）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理し、ヒト多能性幹細胞とＭＥＦを剥離する。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移し、培地を約１０ｍｌ入れて細胞を懸濁した後、５分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を２回以上繰り返して、ヒト多能性幹細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
【００３１】
（２）ヒト多能性幹細胞の単一細胞状態への移行
回収したヒト多能性幹細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えば、ＥＤＴＡ溶液でヒト多能性幹細胞コロニーを恒温処理した後、ピペットマンで数回フラッシングすることにより、単一細胞状態に分散させる方法等が挙げられる。
【００３２】
（３）ヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養（プレコーティング法）
フィーダー細胞との共培養から作製した単一細胞状態のヒト多能性幹細胞、あるいはフィーダーフリー培養から分散剥離した単一細胞状態のヒト多能性幹細胞を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を含む培地に懸濁し、例えばラミニン５１１Ｅ８を０．５μｇ／ｃｍ２の濃度でプレコーティングした培養容器に、約１×１０４〜２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２（細胞数は培地に依存して異なる）の播種密度になるように播種する。培養は、用いた培地に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培地の交換は毎日または培地使用説明書の指示通りに行う。
【００３３】
細胞が増殖して培養面の不足あるいはコロニー内の死細胞の出現が目立つようになるのを目安に継代操作を行う。継代方法は限定されないが、培養容器に細胞分散剥離液（例えば５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）で約５〜約８分間室温で恒温処理して、ヒト多能性幹細胞を分散剥離する。処理時間は用いた培地に応じで適宜選択される。数回フラッシングして細胞を完全に剥離させた後、培地を加えて中和希釈し、遠心チューブに回収して遠心分離（1000×g, 3分）する。新鮮な培地で細胞を懸濁した後、例えばラミニン５１１Ｅ８をプレコーティングした培養容器に播種する。なお、プレコーティング法における培養基質はラミニン５１１Ｅ８に限定されない。
【００３４】
（４）本発明の培養方法への移行
フィーダー細胞との共培養またはプレコーティング法で維持培養しているヒト多能性幹細胞を分散剥離した後、ラミニン５１１Ｅ８を約１．２５μｇ／ｍｌの濃度で含有する培地に懸濁し、培養ディッシュに、約２００μｌ／ｃｍ２（培養面積）の液量で、約１×１０４〜約２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度になるように播種する。播種細胞数は、用いた培地に応じて適宜選択され、上記範囲に限定されない。培地には、細胞播種時に１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤の添加が必要であるが、培地交換以後は添加を必要としない。培養は、用いた培地に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培地の交換は毎日または培地使用説明書の指示通りに行う。なお、ラミニンフラグメントを含有しない培地で細胞懸濁液を調製し、播種後にラミニン５１１Ｅ８溶液を最終濃度が約１．２５μｇ／ｍｌになるように添加してもよい。なお、ヒト多能性幹細胞は単一細胞状態で播種することが好ましいが、これに限定されず、細胞塊が混在した状態で播種してもよい。
【００３５】
〔培地〕
本発明は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有する細胞培養用培地を提供する。本発明の培地に使用できるインテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよび培地の種類は、上述のとおりである。培地に含まれるラミニンフラグメント濃度は、通常０．１５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲から選択され、０．３μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌであることが好ましく、０．５μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌであることがより好ましい。本発明の培地を用いることにより、上記本発明の細胞培養方法において、培地にラミニフラグメントを添加してラミニンフラグメント含有培地を自製する工程を省略することができる。また、上記本発明の細胞培養方法において、均質なラミニンフラグメント含有培地を使用できる点で、培養細胞の品質管理を容易に行うことが可能となる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
〔実験材料〕
（１）細胞外基質
ｉＭａｔｒｉｘ−５１１は株式会社ニッピより購入した（Nippi #892011）。ラミニン５２１はＢｉｏＬａｍｉｎａ社より購入した（BioLamina #BLA-LN521-02）。ビトロネクチンは和光純薬より購入した（Wako #220-02041）。
【００３８】
（２）使用細胞
ヒトＥＳ細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより購入した株（Ｈ９）を使用した。ヒトｉＰＳ細胞は京都大学ｉＰＳ細胞研究所が作製した２５３Ｇ１株を使用した。各細胞は、各機関が推奨するフィーダー細胞との共培養法に従って維持培養した後、更にフィーダーフリー培養法で維持培養した細胞を、通常の維持培養方法と本発明の培養方法（添加法）に分けて培養した。
【００３９】
〔実施例１：本発明の細胞培養方法とプレコーティング法におけるヒト多能性幹細胞の培養基質濃度依存的接着効率の比較〕
プレコーティング法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１、ラミニン５２１およびビトロネクチンの各培養基質を、最終コーティング濃度が０〜４μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（DPBS）（Wako #045-29795）で希釈し、溶液５０μｌを９６ウェルマイクロプレート（BD #351172）に加え、３７℃ ＣＯ２インキュベーター内で３時間静置することでプレコーティング処理を行った。一方の本発明の細胞培養方法（以下、「本発明の方法」と記す。）では、細胞継代時に細胞懸濁液に各培養基質溶液をそれぞれ直接添加し、プレコーティング処理は行わなかった。
細胞継代処理では、プレコーティング法条件でＴｅＳＲ−Ｅ８培地を使用して維持培養しているＨ９ヒトＥＳ細胞または２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞に、５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＤＰＢＳ溶液を加え、５〜８分間室温で恒温処理して細胞をシングル状態に分散剥離し、細胞数をカウントした。細胞は５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度になるように各培地（１００μｌ）に懸濁し、プレコーティング法のウェルには１０μＭ Ｙ−２７６３２を添加、本発明の方法のウェルには１０μＭ Ｙ−２７６３２と、最終ｉＭａｔｒｉｘ−５１１濃度が０〜２μｇ／ｃｍ２／１００μｌになるようにｉＭａｔｒｉｘ−５１１のストック液を加えた。２４時間後、培養上清を除いて、温めたＤＭＥＭ−Ｆ１２培地でウェルを洗浄した後、１０％中性ホルマリン緩衝液を加えて１０分間細胞を固定した。１００％エタノールで１０分間処理した後、プレートを完全に乾燥させ、１０％Ｇｉｅｍｓａ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／９０％ ＭｉｌｌｉＱ水で細胞を１時間染色した。プレートをＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、完全に風乾させた後、１％ＳＤＳ水溶液を加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長５６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４０】
結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）はＨ９ヒトＥＳ細胞の結果、（Ｂ）は２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞の結果である。図１（Ａ）から明らかなように、Ｈ９ヒトＥＳ細胞を用いた場合、プレコーティング法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（図中ｉＭ５１１）はビトロネクチン（図中ＶＮ）と同等以上、ラミニン５２１（図中ＬＭ５２１）より高い最大細胞接着を示した。一方、本発明の方法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１はプレコーティング法と同等の最大細胞接着を示し、尚且つプレコーティング法より低濃度で最大細胞接着を示した。また、図１（Ｂ）から明らかなように、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞を用いた場合、プレコーティング法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１はビトロネクチンと同等、ラミニン５２１より高い最大細胞接着を示した。一方、本発明の方法では、一方、本発明の方法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１はプレコーティング法と同等の最大細胞接着を示し、尚且つプレコーティング法より低濃度で最大細胞接着を示した。
これらの結果から、プレコーティング法よりも本発明の方法の方が、より低濃度のラミニンフラグメントで効率的に、細胞接着効果を促すことが明らかとなった。
【００４１】
〔実施例２：基礎添加法とプレコーティング法それぞれにおけるヒト多能性幹細胞の接着の様子〕
実施例１のＨ９ヒトＥＳ細胞について、播種後２４時間目の細胞接着の様子を顕微鏡で観察した。プレコーティング法は各培養基質１μｇ／ｃｍ２のウェルを、本発明の方法は各培養基質０．２５μｇ／ｃｍ２のウェルを、培地で洗浄する前に観察した。
【００４２】
結果を図２に示した。上段がプレコーティング法の結果、下段が基礎添加法の結果である。スケールバーは１００μｍを示す。図２から明らかなように、本発明の方法におけるｉＭａｔｒｉｘ−５１１では、Ｈ９ヒトＥＳ細胞はフラットな細胞接着の形態を示し、０．２５μｇ／ｃｍ２の低濃度においてもプレコーティング法におけるｉＭａｔｒｉｘ−５１１の１μｇ／ｃｍ２と同等の細胞接着の形態を示した。一方、ラミニン５２１の場合、本発明の方法においては、細胞接着効果が得られず、生存している一部が凝集して浮いている状態であった。
【００４３】
〔実施例３：本発明の方法とプレコーティング法におけるヒト多能性幹細胞の増殖速度の比較〕
プレコーティング法では、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１の最終コーティング濃度を１μｇ／ｃｍ２に固定した。本発明の方法では、培養容器の培養面１ｃｍ２あたり０．２５μｇのｉＭａｔｒｉｘ−５１１を含有する濃度になるように、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１のストック液を加えた。
ＴｅＳＲ−Ｅ８培地で維持培養しているＨ９ヒトＥＳ細胞に５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＤＰＢＳ溶液を加え、５分間室温で恒温して細胞を単一状態に分散剥離し、細胞数をカウントした。細胞は２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度になるように細胞懸濁液を調製し、プレコーティング法では１０μＭ Ｙ−２７６３２を加えた後にプレコーティングした培養容器に、本発明の方法ではｉＭａｔｒｉｘ−５１１のストック溶液と１０μＭ Ｙ−２７６３２を加えた後にコーティング無し培養容器に、それぞれ細胞懸濁液を加えた。
【００４４】
増殖速度のグラフを図３に示した。図３から明らかなように、プレコーティング法の１μｇ／ｃｍ２と本発明の方法の０．２５μｇ／ｃｍ２は同等の細胞接着を示した後、同じ速度で細胞が増殖した。
本発明の方法で培養したＨ９ヒトＥＳ細胞の増殖の様子を、Ｄａｙ１（培養開始日）〜Ｄａｙ４まで、１日１回細胞を顕微鏡で観察した結果を図４に示した。スケールバーは２００μｍを示す。図４から明らかなように、本発明の方法で培養したＨ９ヒトＥＳ細胞は、培養途中で細胞の剥離が起きず、安定した接着と増殖が観察された。この結果から、本発明の方法においてｉＭａｔｒｉｘ−５１１を用いれば、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１の使用量がプレコーティング法より少なくて済むにもかかわらず、プレコーティング法と同等の高い増殖速度で細胞を増殖できることがわかった。
【００４５】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2017085963.tif 000002
【図２】
2017085963.tif 000003
【図３】
2017085963.tif 000004
【図４】
2017085963.tif 000005