(57)【要約】      （修正有）【課題】新規のアルドラーゼおよびその用途の提供。【解決手段】本アルドラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質。（Ｃ）（Ａ）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】図１
2017163852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とするアルドラーゼ。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記アルドラーゼの活性が、２−デオキシリボース  ５−リン酸アルドラーゼ活性を含む、請求項１記載のアルドラーゼ。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなることを特徴とするアルドラーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号２の塩基配列
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
【請求項４】
請求項３記載のアルドラーゼ遺伝子を含むことを特徴とするアルドラーゼ発現ベクター。
【請求項５】
請求項３記載のアルドラーゼ遺伝子または請求項４記載のアルドラーゼ発現ベクターが導入されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項３記載のアルドラーゼ遺伝子を発現させることにより、前記遺伝子がコードするアルドラーゼを合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とするアルドラーゼの製造方法。
【請求項７】
前記合成工程において、請求項５記載の形質転換体の培養により、前記アルドラーゼ遺伝子を発現させ、前記アルドラーゼを合成する、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記合成したアルドラーゼが、細胞内タンパク質である、請求項６または７記載の製造方法。
【請求項９】
さらに、前記培養した形質転換体から、アルドラーゼを含む無細胞抽出物を回収する回収工程を含む、請求項７または８記載の製造方法。
【請求項１０】
さらに、前記アルドラーゼを精製する精製工程を含む、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記精製工程の全部または一部において、塩化ナトリウムを共存させる、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記精製工程において、塩化ナトリウムの非存在下、前記無細胞抽出物から前記アルドラーゼを部分精製し、前記部分精製により得られた前記アルドラーゼを含む回収画分に塩化ナトリウムを共存させる、請求項１０または１１記載の製造方法。
【請求項１３】
前記部分精製が、アフィニティクロマトグラフィーによる部分精製である、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
前記精製工程において、前記部分精製の後、透析処理を施し、さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーを行う、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１または２記載のアルドラーゼを使用し、前記本発明のアルドラーゼ活性により２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドを合成するＴＥＨＰ合成工程を含むことを特徴とする２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアルドラーゼおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルドール縮合反応を触媒するアルドラーゼは、抗ウイルス剤のビルディングブロックとして有用な糖類関連化合物の構築や、高コレステロール血症治療薬の構築等に有用と考えられている。
【０００３】
しかし、既知のアルドラーゼ、例えば、大腸菌由来のアルドラーゼは、基質であるアルデヒドの反応性が高いため、高濃度アルデヒド存在下で失活し、非常に不安定である（非特許文献１）。このため、高濃度アルデヒド存在下において反応を行う場合、大量のアルドラーゼを使用する等の方法がとられていた（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S.  Jennewein  et  al.,  Biotechnol.  J.,  2006,  1,  537-548.
【非特許文献２】L.  Chen  et  al,.  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1992,  114,  741-748.
【非特許文献３】H.J.M.  Gijsen  &  C.  H.  Wong,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1994,  116,  8422-8423.
【非特許文献４】C.H.  Wong  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1995,  117,  3333-3339.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、高濃度アルデヒドの存在下でも安定性に優れる、新たなアルドラーゼの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のアルドラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【０００７】
本発明のアルドラーゼ遺伝子は、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号２の塩基配列
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列
【０００８】
本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、前記本発明のアルドラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の形質転換体は、前記本発明のアルドラーゼ遺伝子または前記本発明のアルドラーゼ発現ベクターが導入されたことを特徴とする。
【００１０】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、前記本発明のアルドラーゼ遺伝子を発現させることにより、前記遺伝子がコードするアルドラーゼを合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドの製造方法は、前記本発明のアルドラーゼを使用し、前記本発明のアルドラーゼ活性により２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドを合成するＴＥＨＰ合成工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアルドラーゼは、高濃度アルデヒドの存在下でも安定性に優れる。したがって、本発明のアルドラーゼは、例えば、抗ウイルス剤のビルディングブロックとして有用な糖類関連化合物の構築や、高コレステロール血症治療薬の構築等において、安定して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１における、精製工程の各段階におけるフラクションについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】図２は、実施例２における、本発明のアルドラーゼの活性に対する透析時のＮａＣｌ濃度の影響を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２における、本発明のアルドラーゼの活性型および不活性型の生成量を示す、ピーク取得結果およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】図４は、実施例３における、本発明のアルドラーゼの活性に対する反応液中のＮａＣｌ濃度の影響を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例３における、本発明のアルドラーゼの活性に対する反応液のｐＨの影響を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例３における、本発明のアルドラーゼの活性に対する熱処理温度の影響を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３における、本発明のアルドラーゼの活性に対する反応温度の影響を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例３における、本発明のアルドラーゼのＤＲＰに対するカイネティクスを示すグラフである。
【図９】図９は、実施例３における、本発明のアルドラーゼの分子量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例４における、本発明のアルドラーゼの活性に対する有機溶媒の影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例４における、本発明のアルドラーゼの活性に対するアセトアルデヒドの影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例５における、本発明のアルドラーゼによるＴＥＨＰの合成を示すＴＬＣの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のアルドラーゼは、例えば、前記アルドラーゼの活性が、２−デオキシリボース  ５−リン酸アルドラーゼ活性を含む。
【００１５】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記合成工程において、前記本発明の形質転換体の培養により、前記アルドラーゼ遺伝子を発現させ、前記アルドラーゼを合成する。
【００１６】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記合成したアルドラーゼが、細胞内タンパク質である。
【００１７】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、さらに、前記培養した形質転換体から、アルドラーゼを含む無細胞抽出物を回収する回収工程を含む。
【００１８】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、さらに、前記アルドラーゼを精製する精製工程を含む。
【００１９】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記精製工程の全部または一部において、塩化ナトリウムを共存させる。
【００２０】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記精製工程において、塩化ナトリウムの非存在下、前記無細胞抽出物から前記アルドラーゼを部分精製し、前記部分精製により得られた前記アルドラーゼを含む回収画分に塩化ナトリウムを共存させる。
【００２１】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記部分精製が、アフィニティクロマトグラフィーによる部分精製である。
【００２２】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記精製工程において、前記部分精製の後、透析処理を施し、さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーを行う。
【００２３】
＜アルドラーゼ＞
本発明のアルドラーゼは、前述のように、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質からなることを特徴とする。
【００２４】
本発明において、アルドラーゼとは、アルドール縮合反応およびその逆反応の少なくとも一方を触媒するタンパク質であることを意味する。アルドール縮合反応は、例えば、α位に水素を持つカルボニル化合物と、アルデヒド化合物またはケトン化合物とが反応して、β−ヒドロキシカルボニル化合物が生成する反応である。アルドラーゼは、例えば、アルデヒドリアーゼということもでき、国際生化学分子生物学連合の酵素分類によると、ＥＣ番号［４．１．２．−］に分類できる。本発明のアルドラーゼの触媒活性を、以下、アルドラーゼ活性という。
【００２５】
本発明のアルドラーゼは、例えば、２−デオキシリボース  ５−リン酸アルドラーゼ（以下、「ＤＥＲＡ」ともいう）活性を示す。ＤＥＲＡは、例えば、アセトアルデヒドとグリセルアルデヒド  ３−リン酸とを基質とするアルドール縮合反応により、２−デオキシリボース  ５−リン酸（ＤＲＰ）を合成する反応、または、その逆反応を触媒する。ＤＲＰは、例えば、ＤＮＡの構成成分であるデオキシヌクレオシド類の生化学的合成における出発原料として有用である。また、例えば、前記化合物を脱リン酸化することによって、２−デオキシリボースを得ることができる。２−デオキシリボースは、例えば、ヌクレオシド類の化学合成の出発原料として有用である。
【００２６】
なお、本発明のアルドラーゼは、例えば、前記ＤＥＲＡ活性に限定されず、その他の触媒活性を有してもよい。前記その他の触媒活性としては、例えば、アセトアルデヒドのみを基質としたアルドール縮合反応、または、その逆反応を触媒する活性等があげられる。アセトアルデヒド３分子がアルドール縮合して得られた化合物は、非酵素反応により環状化し、２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＴＥＨＰ）が合成される。ＴＥＨＰは、例えば、高コレステロール血症治療薬であるスタチン（ｓｔａｔｉｎ）の合成におけるビルディングブロックとして有用である。
【００２７】
本発明のアルドラーゼの基質としては、特に制限されず、例えば、アルデヒド、アセトアルデヒド、グリセルアルデヒド  ３−リン酸、グリセルアルデヒド、アセトン、フルオロアセトン等があげられる。基質と生成物の組合せとしては、例えば、下記表１があげられる。
【００２８】
【表１】
2017163852.tif 000003
2017163852.tif 000004
【００２９】
本発明において、前記（Ａ）のタンパク質は、下記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（配列番号１）
MDDIPDRIEHTVLGPTTTPDDVRTCLDEALQYGMRACIPPWALPLATEYANVQLTAVIDFPHGQGQTDSVCQAAKLAWDAGADELDMVCNIGLLKAGEDDAVRNHITEVVASVPVPVKVIVEAPLLSDDELERVGQLVADADAAYLKTATGFSEGGATVHDVEILSKYLPVKASGGVGSWADAQAMFEAGAERIGASSGDTIVREWQAATEGETVTEPERDRDDPDTTDGY
【００３０】
前記（Ａ）のタンパク質の調製方法は、特に制限されない。前記タンパク質は、例えば、生体から単離してもよいし、合成してもよい。前者の場合、前記（Ａ）のタンパク質は、例えば、高度好塩性古細菌であるハロアーキュラ（Haloarcula）属菌から得ることができ、前記Haloarcula属菌は、具体例として、例えば、Haloarcula japonica等があげられる。Haloarcula japonicaは、例えば、国立研究開発法人 理化学研究所バイオリソース推進室  ＢＲＣ−微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手できる。後者の場合、前記（Ａ）のタンパク質は、例えば、後述する本発明のアルドラーゼ遺伝子から発現させてもよいし、有機化学的手法により合成してもよい。前記遺伝子からの発現の場合は、例えば、宿主・ベクター系を用いた細胞タンパク質合成系でもよいし、無細胞タンパク質合成系でもよい。
【００３１】
前記（Ｂ）のタンパク質は、前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質である。前記（Ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１個または２個である。
【００３２】
前記（Ｃ）のタンパク質は、前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アルドラーゼ活性を有するタンパク質である。前記同一性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（Ｃ）において、同一性は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic  local  alignment  search  tool)、ＢＬＡＳＴ−２、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｓａｌｉｎ等の相同性検索ソフトウエアが使用できる。同一性の算出は、例えば、前述のような公知の相同性検索プログラムを用いて算出でき、具体例は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出できる。
【００３３】
本発明のアルドラーゼは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列に、さらに、タグの配列が付加されてもよい。前記タグの位置は、特に制限されず、例えば、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質のＮ末端でもよいし、Ｃ末端でもよい。前記タグは、特に制限されず、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等があげられる。前記Ｈｉｓタグは、２個以上の連続するヒスチジン残基を有するペプチドであり、連続するヒスチジン残基の個数は、特に制限されず、例えば、２〜１０個である。前記Ｈｉｓタグとしては、例えば、配列番号３のアミノ酸配列があげられる。
（配列番号３）
MNHKVHHHHHHIEGRH
【００３４】
＜アルドラーゼ遺伝子＞
本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述のように、前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなることを特徴とする。
【００３５】
本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前記本発明のアルドラーゼをコードする遺伝子である。このため、本発明のアルドラーゼ遺伝子を発現させることによって、前述した本発明のアルドラーゼを得ることができる。本発明のアルドラーゼ遺伝子は、例えば、前記塩基配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖でもよい。
【００３６】
前記（ａ）の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。前記（ａ）の塩基配列の調製方法は、特に制限されない。前記塩基配列は、例えば、生体から単離してもよいし、合成してもよい。前者の場合、前記（ａ）の塩基配列は、例えば、高度好塩性古細菌であるハロアーキュラ（Haloarcula）属菌から得ることができ、前記Haloarcula属菌は、具体例として、例えば、前述したHaloarcula japonica等があげられる。後者の場合、前記（ａ）の塩基配列は、例えば、有機化学的手法により合成してもよい。
【００３７】
前記（ｂ）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列である。
（配列番号２）
ATGGACGATATACCAGACCGCATTGAGCATACGGTCCTCGGACCGACGACGACACCGGACGATGTACGAACCTGTCTCGACGAGGCGCTCCAGTACGGCATGCGAGCGTGCATCCCGCCGTGGGCGCTCCCGCTTGCGACCGAATACGCGAACGTCCAACTGACGGCCGTCATCGACTTTCCGCACGGACAGGGTCAGACCGACAGCGTCTGCCAAGCGGCCAAGCTGGCCTGGGACGCCGGAGCCGACGAACTGGATATGGTGTGCAACATAGGCTTGCTCAAAGCCGGCGAGGACGATGCCGTCCGGAACCACATCACGGAAGTCGTCGCCAGCGTCCCGGTTCCCGTGAAGGTCATCGTCGAAGCGCCGCTGCTCTCCGACGACGAACTCGAACGGGTCGGCCAGCTCGTCGCAGACGCCGACGCCGCATATCTCAAGACCGCGACGGGCTTCAGCGAGGGCGGTGCGACGGTCCACGACGTGGAGATTCTCAGCAAGTACCTCCCAGTGAAAGCTAGCGGCGGCGTCGGATCGTGGGCCGACGCCCAAGCGATGTTCGAGGCCGGGGCCGAGCGGATCGGCGCGTCGAGTGGCGATACTATTGTTCGGGAATGGCAGGCCGCAACGGAAGGGGAGACCGTGACCGAACCGGAGCGGGACCGGGACGACCCAGACACGACCGACGGCTACTGA
【００３８】
前記（ｃ）の塩基配列は、前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列である。前記（ｃ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【００３９】
前記（ｄ）の塩基配列は、前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列である。前記（ｄ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。相同性は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、前述したアミノ酸配列と同様である。
【００４０】
前記（ｅ）の塩基配列は、前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、アルドラーゼをコードする塩基配列である。前記（ｅ）において、ストリンジェントな条件は、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられる。具体例としては、温度条件は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例は、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。これらの条件以外にも、ハイブリダイゼーションについては、例えば、Molecular  Cloning（A  Laboratory  Manual  Second  Edition（Cold  Spring  Harber  Laboratory  Press,  New  York（1989）.））等に準じて行うこともできる。また、市販のツールを使用する場合は、例えば、添付の使用説明書にしたがって行うことができる。
【００４１】
本発明のアルドラーゼ遺伝子は、例えば、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列に、さらに、タグのコード配列が付加されてもよい。前記タグのコード遺伝子の位置は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの塩基配列の５’末端でもよいし、３’末端でもよい。前記タグは、特に制限されず、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等があげられ、前記Ｈｉｓタグは、前述の通りである。前記Ｈｉｓタグのコード配列としては、例えば、配列番号４の塩基配列があげられる。
（配列番号４）
ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATCGAAGGTAGGCAT
【００４２】
＜ベクター＞
本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、本発明のアルドラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする。本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、前記本発明のアルドラーゼ遺伝子を発現可能なように有していればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、例えば、後述するように、宿主に導入し、前記宿主内で前記アルドラーゼ遺伝子を発現させることによって、本発明のアルドラーゼを製造できる。
【００４３】
本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、基本ベクターに前記本発明のアルドラーゼ遺伝子が挿入されていることが好ましい。この際、前記アルドラーゼ遺伝子は、前記基本ベクターにおける発現制御配列に、機能的に結合または配置されていることが好ましい。機能的に結合または配置するとは、例えば、前記アルドラーゼ遺伝子が発現しうる状態で結合または配置されていることを意味する。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、本発明のアルドラーゼ発現ベクターを導入する宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記基本ベクターは、例えば、非ウイルス性ベクターおよびウイルス性ベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等があげられる。前記プラスミドＤＮＡは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ１１、ｐＥＴ１５、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄＩＶ等の大腸菌由来プラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミド；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミド等があげられる。前記ファージＤＮＡは、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージ等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等があげられる。
【００４４】
本発明のアルドラーゼ発現ベクターは、例えば、さらに、他の塩基配列を有してもよい。前記塩基配列は、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リボソーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、タグをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子の塩基配列等があげられる。前記選択マーカー遺伝子は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等があげられる。
【００４５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、本発明のアルドラーゼ遺伝子を含む。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のアルドラーゼを発現し得るように、本発明のアルドラーゼ遺伝子を宿主に導入することにより得られる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のアルドラーゼ発現ベクターを有することが好ましい。この場合、宿主に、本発明のアルドラーゼ発現ベクターを導入することによって、前記形質転換体を得ることができる。
【００４６】
前記宿主は、特に制限されず、本発明のアルドラーゼ遺伝子から本発明のアルドラーゼを発現できるものがあげられる。前記宿主は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌；ハロアーキュラ・ジャポニカ(Haloarcula japonica)等のハロアーキュラ属に属する古細菌；サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等があげられる。
【００４７】
形質転換の方法は、制限されず、例えば、宿主および前記ベクターの種類に応じて、適宜、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、リン酸カルシウム法、スフェロプラスト法、ＤＥＡＥデキストラン法、接合伝達法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００４８】
＜アルドラーゼの製造方法＞
本発明の製造方法は、アルドラーゼの製造方法であって、前述のように、本発明のアルドラーゼ遺伝子を発現させることにより、前記遺伝子がコードするアルドラーゼを合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記タンパク質合成工程を含むことが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００４９】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、前記合成工程において、本発明の形質転換体の培養により、前記アルドラーゼ遺伝子を発現させ、前記アルドラーゼを合成することができる。この場合、本発明の製造方法は、本発明の形質転換体の培養により、前記アルドラーゼ遺伝子を発現させ、前記アルドラーゼを合成することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。前記形質転換体は、例えば、これらの変異株を含む。
【００５０】
前記合成工程において、本発明のアルドラーゼは、例えば、前記形質転換体の培養により、細胞内タンパク質（菌体内タンパク質ともいう）として発現させてもよいし、細胞外タンパク質（菌体外タンパク質ともいう）として発現させてもよい。本発明のアルドラーゼは、例えば、細胞内タンパク質として発現させる。
【００５１】
本発明の製造方法は、例えば、前記培養した形質転換体から、前記アルドラーゼを含む無細胞抽出物を回収する回収工程を含むことが好ましい。前記本発明のアルドラーゼが、細胞内タンパク質の場合、前記無細胞抽出物は、例えば、前記培養物中の形質転換体を破砕し、細胞画分を除去することにより回収できる。前記本発明のアルドラーゼが、細胞外タンパク質の場合、前記無細胞抽出物は、例えば、培養物から培養菌体を除去することにより回収できる。前記回収工程は、例えば、塩化ナトリウム非存在下で行うことが好ましい。ここで、塩化ナトリウム非存在下とは、例えば、前記形質転換体が有する塩化ナトリウムを意味するものではなく、外部からの添加物として塩化ナトリウムが非存在下であることを意味する。
【００５２】
本発明のアルドラーゼの製造方法は、例えば、さらに、前記アルドラーゼを精製する工程を含んでもよい。本発明の製造方法において、前記精製工程は、例えば、前記回収工程において得られた前記無細胞抽出物に対して施されることが好ましい。
【００５３】
前記精製工程は、特に限定されず、従来公知の手法が採用できる。前記精製工程における手法は、特に制限されず、例えば、塩析法、透析法、限外濾過法、等電点沈澱法、電気泳動法、熱変性処理、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等のアフィニティクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が採用できる。
【００５４】
前記精製工程は、例えば、一種類の精製処理のみを施してもよいし、二種類以上の精製処理を順次施しても良い。本発明は、例えば、前記無細胞抽出物に対して、部分精製を行った後、さらに、精製処理を施すことが好ましく、具体的には、第１の精製処理を行った後、さらに、第２の精製処理、第３の精製処理を施すことが好ましい。前記精製処理の組合せは、特に制限されないが、第１の精製処理が、例えば、アフィニティクロマトグラフィーであり、第２の精製処理が、例えば、透析法であり、第３の精製処理がゲル濾過クロマトグラフィーである。本発明のアルドラーゼは、例えば、熱安定性に優れるため、第１の精製処理として、前記熱変性を行ってもよい。具体的には、例えば、前記無細胞抽出物に対して熱処理を行った後、遠心分離により熱処理により熱変性した変性タンパク質を除去する方法があげられる。前記熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、６０〜８０℃（好ましくは７０℃）で、５〜２０分（好ましくは、１０分）の処理があげられる。
【００５５】
前記アフィニティクロマトグラフィーは、例えば、金属に対する親和性を利用するものがあげられ、具体例として、商品名Protino  Ni-IDA  column（Macherey-Nagel社製）等が使用できる。また、ゲル濾過クロマトグラフィーは、例えば、商品名Superdex  200  26/60  column（GE  Healthcare社製）等が使用できる。
【００５６】
前記精製工程は、例えば、その全部において、塩化ナトリウムを共存させてもよいし、その一部において、塩化ナトリウムを共存させてもよく、好ましくは後者である。具体的には、前記精製工程において、例えば、塩化ナトリウムの非存在下、前記無細胞抽出物から前記アルドラーゼを部分精製し、前記部分精製により回収した前記アルドラーゼを含む回収画分に塩化ナトリウムを共存させることが好ましい。塩化ナトリウムを共存させる場合、前記アルドラーゼを含む系における塩化ナトリウムの濃度は、例えば、０〜１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１〜１０ｍｏｌ/Ｌ、０．１〜５ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌである。
【００５７】
前記回収工程および前記精製工程は、例えば、緩衝液の存在下で行うことが好ましい。前記緩衝液は、例えば、クエン酸・クエン酸Ｎａ、クエン酸・Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４・ＫＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅ・ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４・Ｋ３ＰＯ４、ＫＣｌ・ＮａＯＨ、Ｈｅｐｅｓ・ＮａＯＨ等が好ましく、そのｐＨは、例えば、５〜１２．５であり、その濃度は、例えば、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５８】
＜ＴＥＨＰの製造方法＞
本発明の２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＴＥＨＰ）の製造方法は、前記本発明のアルドラーゼを使用し、前記本発明のアルドラーゼ活性によりＴＥＨＰを合成するＴＥＨＰ合成工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記ＴＥＨＰ合成工程を含むことが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００５９】
前記ＴＥＨＰ合成工程は、例えば、アセトアルデヒド３分子がアルドール縮合して得られた化合物を、非酵素反応により環状化させることによりＴＥＨＰを合成する工程である。
【００６０】
本発明の製造方法において、前記アルドラーゼは、例えば、予め製造したアルドラーゼを使用してもよいし、前記本発明のアルドラーゼの製造方法により合成してもよい。
【００６１】
前記ＴＥＨＰ合成工程は、例えば、緩衝液の存在下で行うことが好ましい。前記緩衝液は、例えば、クエン酸・クエン酸Ｎａ、クエン酸・Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４・ＫＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅ・ＮａＯＨ、Ｋ２ＨＰＯ４・Ｋ３ＰＯ４、ＫＣｌ・ＮａＯＨ、酢酸・酢酸Ｎａ、iｍｉｄａｚｏｌｅ・ＨＣｌ等が好ましく、そのｐＨは、例えば、５〜９であり、その濃度は、例えば、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【実施例】
【００６２】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【００６３】
実施例で使用したＤＥＲＡ活性の測定方法を以下に示す。
【００６４】
前述のように、アルドラーゼであるＤＥＲＡは、アセトアルデヒドとグリセルアルデヒド  ３−リン酸とから２−デオキシリボース  ５−リン酸（ＤＲＰ）を生成する反応と、その逆反応として、ＤＲＰを、アセトアルデヒドとグリセルアルデヒド  ３−リン酸とに分解する反応を触媒する。そこで、実施例においては、基質としてＤＲＰを用い、アルドラーゼが触媒する前記逆反応（分解反応）によって得られるグリセルアルデヒド  ３−リン酸を検出することで、アルドラーゼ活性を確認した。具体的に、下記反応１により生成したグリセルアルデヒド  ３−リン酸の検出は、下記反応２に示すように、まず、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）により、グリセルアルデヒド  ３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸を生成させ、さらに、下記反応３に示すように、ＮＡＤＨ存在下、グリセロール  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）により、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール  ３−リン酸に還元し、この反応において減少するＮＡＤＨ量を分光学的に測定した。ＮＡＤＨの減少量は、ジヒドロキシアセトンリン酸の量に対応し、間接的に、グリセルアルデヒド  ３−リン酸の量に対応することになるため、これによりアルドラーゼ活性を測定することができる。
【００６５】
（化１）
（反応１：アルドラーゼ）
DRP  →  グリセルアルデヒド  ３−リン酸  ＋  アセトアルデヒド
（反応２：ＴＰＩ）
グリセルアルデヒド  ３−リン酸  →  ジヒドロキシアセトンリン酸
（反応３：Ｇ３ＰＤＨ）
ジヒドロキシアセトンリン酸  ＋  NADH  →  グリセロール  ３−リン酸  ＋  NAD+
【００６６】
前述したアルドラーゼの活性測定は、以下に示す組成の反応液１ｍＬを使用した。
（反応液組成）
クエン酸・クエン酸Ｎａ緩衝液（pH  6.4）    100 mmol/L
NaCl                  1 mol/L
DRP                  2 mmol/L
NADH              0.15 mmol/L
TPI                  8 U
G3PDH              2.5 U
サンプル（活性測定に適した酵素量）
水                  残分
Total                1 mL
【００６７】
サンプル未添加の前記反応液を、３７℃で、３分間プレインキュベートし、各サンプルを添加後、波長３４０ｎｍでＮＡＤＨ量を測定した。サンプル添加時を反応開始（０秒）とし、４２０秒までのＮＡＤＨの減少量を、アルドラーゼ活性として求めた。そして、各実験におけるアルドラーゼ活性の最大値を１００％とし、アルドラーゼ活性の相対活性（％）を算出した。
【００６８】
［実施例１］
本発明のアルドラーゼを製造し、その活性を確認した。
【００６９】
（１）形質転換体の調製
高度好塩菌Haloarcula japonica（ＪＣＭ７７８５）から、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のアルドラーゼ遺伝子を単離した。そして、配列番号２のアルドラーゼ遺伝子の５’末端に、配列番号３のＨｉｓタグをコードする配列番号４の塩基配列を付加し、Ｈｉｓタグ付加アルドラーゼをコードするＨｉｓタグ付加アルドラーゼ遺伝子を調製した。そして、前記Ｈｉｓタグ付加アルドラーゼ遺伝子を、pColdI発現用ベクターの制限酵素部位（NdeI、BamHI）に挿入し、発現プラスミドを構築した。そして、前記発現プラスミドを、常法により、大腸菌のコンピテントセル（BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL株）に導入し、形質転換体を得た。
【００７０】
（２）培養
前記形質転換体は、まず、ＳＢ培地（1.2%  tryptone  peptone,  2.4%  yeast  extract,  1.25%  K2HPO4,  0.38%  KH2PO4および0.5%  glycerol）（アンピシリン終濃度１００μｇ／ｍＬ）において、３７℃で６時間培養後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、さらに、１５℃で２４時間培養した。得られた培養液を、７０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離し、集菌した。１ＬのＳＢ培地あたり湿重量１２．４ｇの菌体が回収できた。前記回収した菌体を０．８５％ＮａＣｌに懸濁し、７０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して洗菌した。そして、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に菌体を懸濁した。
【００７１】
（３）粗酵素液の調製
前記懸濁液中の菌体を超音波破砕した。超音波破砕の条件は、氷冷条件下、破砕処理１分と静置３分とを１セットとして、６セット繰り返した。前記破砕液を、１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離し、得られた上清を粗酵素液（無細胞抽出液）として回収した。
【００７２】
（４）アフィニティクロマトグラフィー
前記粗酵素液に対し、アフィニティカラムクロマトグラフィーを行った。カラムは、Protino（商標）  Ni-IDA（Macherey-Nagel社製）を使用した。まず、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で前記カラムを平衡化した後、前記粗酵素液をロードした。そして、前記バッファーで前記カラムを洗浄し、０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールを含む前記バッファーでグラジエント溶出を行った。得られたフラクションについて、下記ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび前記ＤＥＲＡ活性の測定を行い、ＤＥＲＡ活性を示すフラクションを回収し、部分精製のサンプル１とした。
【００７３】
（５）透析
前記サンプル１を、２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、透析処理後のサンプルを回収し、部分精製のサンプル２とした。
【００７４】
（６）ゲル濾過クロマトグラフィー
前記サンプル２に対し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。カラムは、HiLoad（商標）  26/60  Superdex  20（GE  Healthcare社製）を使用した。まず、２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で前記カラムを平衡化した後、前記サンプル２をロードした。そして、同じバッファーで溶出を行った。得られたフラクションについて、前記ＤＥＲＡ活性の測定を行い、ＤＥＲＡ活性を示すフラクションを回収し、これを精製サンプルとした。
【００７５】
（７）活性等の確認
前記粗酵素液、部分精製のサンプル１およびサンプル２、ならびに精製サンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに、タンパク質定量およびＤＥＲＡ活性の測定を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、分離ゲル濃度１２．５％、濃縮ゲル濃度４．５％とし、タンパク質定量は、Bio-Rad  Protein  Assay  Dye  Reagent  Concentrateを用いたブラッドフォード法により行った（以下、同様）。
【００７６】
これらの結果を、図１および表２に示す。図１は、各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す結果であり、左の数字は、分子量マーカーのサイズ（ｋ；×１０３）を示す。図１に示すように、最終的なゲル濾過クロマトグラフィーにより、単一のバンドが確認されたことから、目的のタンパク質を単一精製できたことがわかった。また、このバンドの分子量約２６ｋは、配列番号１のアルドラーゼのアミノ酸配列と、配列番号３のＨｉｓタグのアミノ酸配列とからから算出される理論値（Ｈｉｓタグ付加アルドラーゼ２６，６００、Ｈｉｓタグを除いたアルドラーゼ２４，６００）と略同一であり、また、ＤＥＲＡ活性が確認できたことから、本発明のアルドラーゼであることは明らかである。以下、実施例１で得た精製サンプルを、HjaDERAともいう。
【００７７】
【表２】
2017163852.tif 000005
【００７８】
［実施例２］
本発明のアルドラーゼの精製条件を確認した。
【００７９】
（１）透析時における塩濃度の検討
透析時における塩濃度の検討を行った。まず、前記実施例１と同様にして前記アフィニティカラムクロマトグラフィーを行い、部分精製のサンプル１を調製した。そして、このサンプル１について、所定濃度（０、０．５、１、１．５、２、２．５、３ｍｏｌ／Ｌ）となるようにＮａＣｌを添加した１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、透析処理を行った。そして、透析後の各サンプルについて、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。
【００８０】
この結果を図２に示す。図２は、本発明のアルドラーゼの活性に対する透析時のＮａＣｌ濃度の影響を示すグラフである。図２において、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、透析時のＮａＣｌ濃度（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ）を示す。図２に示すとおり、透析時にＮａＣｌを共存させることで、アルドラーゼの相対活性が高くなり、特に、ＮａＣｌ濃度を２ｍｏｌ／Ｌに設定した際、アルドラーゼの相対活性が最大となった。このため、透析の際、ＮａＣｌを共存させることが好ましく、また、その濃度は、例えば、１．５〜３ｍｏｌ／Ｌが好ましく、２ｍｏｌ／Ｌが最適であることがわかった。
【００８１】
（２）塩の添加時期の検討
本発明のアルドラーゼに対する塩の添加時期の検討を行った。まず、超音波破砕において、２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を使用し、常に２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む条件で、超音波破砕、アフィニティクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを行った（実施例２Ａ）。他方、実施例１と同様にして、超音波破砕、アフィニティクロマトグラフィー、透析およびゲル濾過クロマトグラフィーを行った（実施例２Ｂ）。そして、実施例２Ａおよび実施例２Ｂのそれぞれについて、ゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションについて、波長２８０ｎｍの吸光度測定、ＤＥＲＡ活性の測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量マーカーは、前記実施例１と同じとした。
【００８２】
これらの結果を図３に示す。図３において、左側（Ａ）のグラフと写真は、実施例２Ａの結果であり、右側（Ｂ）のグラフと写真は、実施例２Ｂの結果である。図３において、各グラフは、ゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションの波長２８０ｎｍの吸光度を示し、縦軸が、吸光度であり、横軸が溶出時間である。各写真は、ゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図３（Ａ）に示すように、超音波破砕時から２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを共存させた実施例２Ａは、グラフにおいて、２つのピークが確認された。これらのピークに該当する各フラクションについて、ＤＥＲＡ活性の測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、いずれのフラクションも、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより同程度の分子量であったが、左側のピークの各フラクションは、ＤＥＲＡ活性を示さず、右側のピークの各フラクションのみが、ＤＥＲＡ活性を示した。つまり、単量体としては同じ分子量のタンパク質であるが、左側のピークは、不活性型アルドラーゼであり、右側のピークは、活性型アルドラーゼであった。これに対して、図３（Ｂ）に示すように、アフィニティクロマトグラフィー後の透析から２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを共存させた実施例２Ｂは、実施例２Ａの活性型アルドラーゼと同じ箇所に一つの大きなピークが見られるのみであり、不活性型アルドラーゼと同じ箇所にはピークは見られなかった。そして、このピークについて、ＤＥＲＡ活性の測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、いずれのフラクションも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同程度の分子量を示し、且つ、ＤＥＲＡ活性を示した。つまり、前記透析時からＮａＣｌを共存させることによって、不活性型アルドラーゼの発生を抑制し、活性型アルドラーゼを効率的に回収できることがわかった。なお、不活性型アルドラーゼは、単量体としては同じ分子量であるが、凝集のため、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、活性型アルドラーゼよりも大きい分子量側で溶出されていると解されるが、本発明はこの推測には制限されない。
【００８３】
［実施例３］
本発明のアルドラーゼの化学的特性等を確認した。
【００８４】
（１）反応液中の塩濃度
本発明のアルドラーゼについて、反応液中のＮａＣｌ濃度の検討を行った。前記反応液組成において、ＮａＣｌ濃度を所定濃度（０、０．５、１、１．５、２、２．５、３ｍｏｌ／Ｌ）とした以外は、前記実施例１の精製サンプルを使用して、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。これらの結果を図４に示す。図４は、本発明のアルドラーゼの活性に対する反応液中のＮａＣｌ濃度の影響を示すグラフであり、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、反応液中のＮａＣｌ濃度（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ）を示す。図４に示すように、本発明のアルドラーゼは、前記反応液に添加するＮａＣｌ濃度が０〜３ｍｏｌ／Ｌの領域において、約６０％以上の相対活性を有しており、中でも、ＮａＣｌ濃度が０．５〜１ｍｏｌ／Ｌの場合、特に１ｍｏｌ／Ｌの場合に、高い相対活性を示した。
【００８５】
（２）ｐＨ安定性
本発明のアルドラーゼのｐＨ安定性を確認した。２ｍｏｌ／Ｌ（インキュベーションする溶液での終濃度）のＮａＣｌを含む２００ｍｍｏｌ／Ｌ（インキュベーションする溶液での終濃度）の緩衝液中で前記実施例１の精製サンプル（インキュベーションする溶液での終濃度０．４２ｍｇ／ｍｌ）を５０℃、３０分間インキュベート後、氷冷し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分）で沈殿を除去した。前記処理したサンプルを使用した以外は、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。緩衝液として、以下のものを使用した。なお、緩衝液のｐＨの調整は、２５℃で行った。
クエン酸・クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．３、５．８、６．３、６．８）
Ｋ２ＨＰＯ４・ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．３、６．７、７．１、７．５、７．９）
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７、８．７、８．９）
Ｇｌｙｃｉｎｅ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９、９．６、１０．２、１０．６、１１．１）
Ｋ２ＨＰＯ４・Ｋ３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ１１．４、１１．８、１２．２）
ＫＣｌ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１２．３、１２．６）
【００８６】
これらの結果を図５に示す。図５は、本発明のアルドラーゼの安定性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、インキュベーションした処理液のｐＨを示す。図５に示すように、本発明のアルドラーゼは、ｐＨが６．３〜１２．３の領域において、５０℃、３０分間インキュベーションした後でも安定して、高い相対活性を有した。
【００８７】
（３）熱安定性の検討
本発明のアルドラーゼについて、熱に対する安定性の検討を行った。前記実施例１の精製サンプル（０．８３ｍｇ／ｍｌ）を、１０分間、所定温度で処理した後、氷冷し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分）で沈殿を除去した。前記熱処理した精製サンプルを使用した以外は、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。この結果を図６に示す。図６は、本発明のアルドラーゼの安定性に対する熱処理温度の影響を示すグラフであり、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、熱処理温度（℃）を示す。図６に示すように、本発明のアルドラーゼは、熱処理温度７０℃まで、熱処理による相対活性の低下がみられず、高い熱安定性を示した。
【００８８】
（４）反応温度の検討
本発明のアルドラーゼについて、活性測定時の反応液の温度の検討を行った。反応温度を所定温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０℃）に設定した以外は、前記実施例１の精製サンプルを使用して、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。この結果を図７に示す。図７は、本発明のアルドラーゼの活性に対する反応温度の影響を示すグラフであり、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、反応液の温度（℃）を示す。図７に示すように、本発明のアルドラーゼは、反応温度が６０℃の場合において、最も高い相対活性を示した。
【００８９】
（５）ＤＲＰに対するカイネティクスの検討
本発明のアルドラーゼについて、基質である２−デオキシリボース  ５−リン酸（ＤＲＰ）に対するカイネティクスを検討した。反応温度を３７℃または２５℃とした以外は、前記実施例１の精製サンプルを使用して、ＤＥＲＡ活性の測定を行い、反応速度およびＫｍ値を算出した。この結果を図８に示す。図８は、本発明のアルドラーゼのＤＲＰに対するカイネティクスを示すグラフであり、（Ａ）は、反応温度３７℃の結果であり、（Ｂ）は、反応温度２５℃の結果である。図８において、縦軸は、反応速度の逆数（ｍｉｎ・ｍｇ／μｍｏｌ）を示し、横軸は、基質濃度の逆数（１／ｍＭ）を示す（Ｍは、ｍｏｌ／Ｌ）。図８に示すように、３７℃および２５℃において、ＤＲＰに対するＫｍ値は、それぞれ、１．１２±０．１８ｍｍｏｌ／Ｌ、１．０２±０．２２ｍｍｏｌ／Ｌであった。このため、本発明のアルドラーゼは、反応液の温度が３７℃および２５℃のどちらの場合においても、同様に高い活性を示すことがわかった。
【００９０】
（６）分子量測定
本発明のアルドラーゼについて、分子量とサブユニット数の算出を行った。前記実施例１の精製サンプルを、ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、分子量マーカーとの比較から分子量を算出した。この結果を図９に示す。図９は、本発明のアルドラーゼの分子量を示すグラフであり、縦軸は、分子量を示し、横軸は、溶出時間（分）を示す。図９において、四角のプロットは、本発明のアルドラーゼHjaDERAを示し、ひし形のプロットは、分子量マーカーである、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３，７００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）、ウサギ筋肉由来アルドラーゼ（分子量１５８，０００）、サイログロブリン（分子量６６９，０００）を示す。その結果、本発明のアルドラーゼHjaDERAの分子量は、約５１ｋであった。また、前記実施例１に示したように、本発明のアルドラーゼHjaDERAをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、約２６ｋの単一バンドが確認された。本発明のアルドラーゼHjaDERAは、配列番号１のアルドラーゼのアミノ酸配列と、配列番号３のＨｉｓタグのアミノ酸配列とから算出される理論値が、Ｈｉｓタグ付加アルドラーゼが２６，６００であり、Ｈｉｓタグを除いたアルドラーゼが２４，６００であることから、ホモ２量体で存在すると推測される。
【００９１】
（７）他生物由来のアルドラーゼとの比較
比較例として、大腸菌（Escherichia coli）由来のアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）であるEcoDERA、またはPyrobaculum aerophilum由来のアルドラーゼであるPaeDERAを使用した以外は、同様にして化学的特性等を確認し、前記実施例１の精製サンプルHjaDERAと比較した。この結果を表３に示す。表３に示すように、本発明のアルドラーゼは、EcoDERAよりも熱安定性が高く、PaeDERAよりも、25℃において非常に高い活性を示した。
【００９２】
【表３】
2017163852.tif 000006
【００９３】
［実施例４］
本発明のアルドラーゼについて、有機溶媒耐性およびアセトアルデヒド耐性を確認した。
【００９４】
（１）有機溶媒耐性
本発明のアルドラーゼの基質として、非常に強い疎水性の基質を使用する場合、前記基質を有機溶媒に溶解した上で、反応系に添加することが考えられる。そこで、本発明のアルドラーゼについて、様々な有機溶媒に対する安定性の検討を行った。２ｍｏｌ／Ｌ（インキュベーションする溶液での終濃度）のＮａＣｌ存在下、所定濃度（０、１０、２０、３０、４０、５０％；インキュベーションする溶液での終濃度）となるように有機溶媒を添加した溶液中で前記実施例１の精製サンプル（インキュベーションする溶液での終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を２５℃、１０分間インキュベートした。有機溶媒は、２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）による酵素の希釈と限外濾過フィルター（Amicon  Ultra  30K）による酵素の濃縮を繰り返して除去した。前記処理したサンプルを使用した以外は、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。有機溶媒として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトニトリル、エタノールを使用した。。この結果を図１０（Ａ）に示す。図１０（Ａ）は、本発明のアルドラーゼの安定性に対する有機溶媒濃度の影響を示すグラフである。図１０（Ａ）において、縦軸は、相対活性（％）を示し、横軸は、インキュベーションした処理液の有機溶媒濃度（％）を示す。図１０（Ａ）に示すように、本発明のアルドラーゼは、検討した４種すべての有機溶媒に対して、有機溶媒濃度２０％において、８０％以上の活性がみられた。さらに、ＤＭＳＯおよびアセトニトリルに対しては、有機溶媒濃度５０％を用いた１０分間の処理後においても、８０％以上の活性がみられた。
【００９５】
つぎに、有機溶媒による処理時間を変えて、アルドラーゼ活性の変化を測定した。まず、２ｍｏｌ／Ｌ（インキュベーションする溶液での終濃度）のＮａＣｌ存在下、有機溶媒を添加した溶液中で前記実施例１の精製サンプル（インキュベーションする溶液での終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を所定時間、２５℃でインキュベートした。有機溶媒としてＤＭＳＯ、アセトニトリル、メタノール、エタノールを使用した。前記混合液における前記有機溶媒の濃度は、ＤＭＳＯ  ５０％、アセトニトリル  ５０％、メタノール  ２０％、エタノール  ２０％とした。その後、前記有機溶媒濃度の検討と同様にして、混合液から有機溶媒を除去した。そして、前記処理後の混合液を使用した以外は、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。この結果を図１０（Ｂ）に示す。図１０（Ｂ）は、本発明のアルドラーゼの安定性に対する有機溶媒処理時間の影響を示すグラフである。図１０（Ｂ）において、縦軸は、相対活性（％）を示し、横軸は、有機溶媒による処理時間（分）を示す。図１０（Ｂ）に示すように、本発明のアルドラーゼは、検討した４種すべての有機溶媒に対して、５０分以上の処理後においても、高い活性を維持していた。
【００９６】
（２）アセトアルデヒド耐性
大腸菌（Escherichia coli）由来のアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）であるEcoDERAは、アルデヒドを基質とする反応を触媒するが、アルデヒドは、それ自体の反応性が高いことから、高濃度のアルデヒド存在下では、修飾を受け非常に不安定であり、失活する。そこで、本発明のアルドラーゼについて、アセトアルデヒド耐性を確認した。
【００９７】
まず、２ｍｏｌ／Ｌ（インキュベーションする溶液での終濃度）のＮａＣｌ存在下、所定濃度（０、３００ｍｍｏｌ／Ｌ）となるようアセトアルデヒドを添加した溶液中で前記実施例１の精製サンプル（インキュベーションする溶液での終濃度０．５ｍｇ／ｍL）を所定時間、２５℃でインキュベートした。その後、実施例４と同様にして混合液からアセトアルデヒドを除去した。そして、前記処理後の混合液を使用した以外は、実施例１と同様にして、ＤＥＲＡ活性の測定を行った。また、比較例として、前記実施例３の（７）の大腸菌由来のEcoDERAについても、同様に測定を行った。この結果を図１１に示す。図１１は、本発明のアルドラーゼの安定性に対するアセトアルデヒドの影響を示すグラフであり、縦軸は、アルドラーゼの相対活性（％）を示し、横軸は、アセトアルデヒドによる処理時間（時間）を示す。図１１に示すように、本発明のアルドラーゼHjaDERAは、５時間のアセトアルデヒド処理後において、約３５％の活性がみられた。一方、大腸菌由来のアルドラーゼEcoDERAは、５時間のアセトアルデヒド処理により、ほぼ活性が消失していた。これらの結果から、本発明のアルドラーゼは、アルデヒドに対して優れた安定性を有することが確認できた。
【００９８】
［実施例５］
本発明のアルドラーゼについて、アセトアルデヒドを基質とした縮合反応の触媒を確認した。
【００９９】
前述のように、本発明のアルドラーゼは、例えば、アセトアルデヒド３分子がアルドール縮合する反応を触媒し、この反応により得られた化合物は、環状化し、２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＴＥＨＰ）が合成される。そこで、本発明のアルドラーゼについて、アセトアルデヒドを基質とした縮合反応の触媒活性を確認した。
【０１００】
サンプルとして、前記実施例１の精製サンプルHjaDERA、前記実施例３の（７）の大腸菌由来のEcoDERAを用いて、ＴＥＨＰの合成の有無を確認した。ＴＥＨＰの合成には、以下に示す組成の反応液５０μＬを使用した。下記組成において、サンプルが前記精製サンプルHjaDERAの場合、ｐＨ調整試薬としてK2HPO4・KH2PO4緩衝液（ｐＨ７．５）を使用し、サンプルがEcoDERAの場合、ｐＨ調整試薬としてAcetate・Acetate  Na緩衝液（ｐＨ６）を使用した。
（反応液組成）
ｐＨ調整試薬        100 mmol/L
アセトアルデヒド    300 mmol/L
サンプル            20 μg（タンパク質量）
水                  残分
Total              50 μL
【０１０１】
前記反応液を、２５℃で、２時間または２０時間、反応させた後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で展開し、アニスアルデヒド試薬により発色を行った。展開溶媒は、混合溶媒（体積比  BtOH：AcOH：H2O＝4：1：1）を使用した。
【０１０２】
この結果を図１２に示す。図１２は、ＴＥＨＰの合成を示すＴＬＣの結果を示す写真であり、（Ａ）は、反応時間２時間の結果を示し、（Ｂ）は、反応時間２０時間の結果を示す。図１２において、矢印は、アルドール縮合反応の産物である、２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＴＥＨＰ）のバンドを示す。図１２に示すように、本発明のアルドラーゼは、２時間および２０時間のいずれの反応時間においても、EcoDERAと比較して、非常に高いＴＥＨＰの合成活性を示すことがわかった。
【０１０３】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明のアルドラーゼは、常温で高い活性を示し、高濃度アルデヒドの存在下でも安定性に優れる。したがって、本発明のアルドラーゼは、例えば、抗ウイルス剤のビルディングブロックとして有用な糖類関連化合物の構築や、高コレステロール血症治療薬の構築等において、安定して用いることができる。このため、本発明は、医薬および化学の分野等において、極めて有用といえる。
【図１】
2017163852.tif 000007
【図２】
2017163852.tif 000008
【図３】
2017163852.tif 000009
【図４】
2017163852.tif 000010
【図５】
2017163852.tif 000011
【図６】
2017163852.tif 000012
【図７】
2017163852.tif 000013
【図８】
2017163852.tif 000014
【図９】
2017163852.tif 000015
【図１０】
2017163852.tif 000016
【図１１】
2017163852.tif 000017
【図１２】
2017163852.tif 000018
【配列表】
2017163852000001.app