(57)【要約】【課題】小胞体内Ｃａ2+レベルを用いて正確にＣＩＣＲ活性抑制剤をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型リアノジン受容体とを発現する培養細胞、及び蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型リアノジン受容体とを発現する培養細胞とをそれぞれ培養し、被験物質の存在下で小胞体内Ｃａ2+濃度を測定し、前記両培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度を対比することを特徴とする、Ｃａ2+誘発性Ｃａ2+遊離活性抑制剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型リアノジン受容体とを発現する培養細胞、及び蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型リアノジン受容体とを発現する培養細胞とをそれぞれ培養し、被験物質の存在下で小胞体内Ｃａ2+濃度を測定し、前記両培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度を対比することを特徴とする、Ｃａ2+誘発性Ｃａ2+遊離活性抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記疾患変異型リアノジン受容体を発現する培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度が、前記野生型リアノジン受容体を発現する培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度に比べて上昇している被験物質をＣａ2+誘発性Ｃａ2+遊離活性抑制剤であると判定する請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
リアノジン受容体が、リアノジン受容体１又はリアノジン受容体２である請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアノジン受容体関連疾患治療薬として有用なＣａ2+誘発性Ｃａ2+遊離活性抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアノジン受容体（ＲｙＲ）は、筋収縮にとって不可欠なステップである、筋小胞体（ＳＲ）からのカルシウムイオン（Ｃａ2+）の遊離を担うＣａ2+遊離チャネルである。ＲｙＲは、細胞質基質側のＣａ2+に刺激されて、Ｃａ2+を細胞質基質中に遊離する（Ｃａ2+誘発性Ｃａ2+遊離、ＣＩＣＲ）。そのためポジティブフィードバック機構として働き、チャネル付近の細胞質基質中にある少量のＣａ2+が、ＳＲからより多くのＣａ2+遊離を引き起こす。
ＲｙＲには、サブタイプがあり、そのうち骨格筋に発現するＲｙＲ１と心筋に発現するＲｙＲ２が重要である。ＲｙＲ遺伝子変異は、ＣＩＣＲ活性の異常亢進を引き起こし、種々の疾患の原因とされている。例えば、ＲｙＲ１関連疾患としては、悪性高熱（ＭＨ）（手術時の吸入麻酔薬により体温上昇、骨格筋拘縮）、セントラルコア病（ＣＣＤ）（四肢の筋力低下、難病に指定されている）が挙げられる。また、ＲｙＲ２関連疾患としては、カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）（運動性不整脈）、不整脈性原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）（右室形成異常、不整脈誘発）、特発性心室細動（ＩＶＦ）（安静時に心室細動誘発）が挙げられる。
【０００３】
これらのＲｙＲ関連疾患の原因は、ＲｙＲ遺伝子変異によるＣＩＣＲ活性の異常亢進にあるものと考えられているが、有効な治療薬は存在しない。治療薬の開発のためにはＣＩＣＲ活性を精度よく測定でき、かつ多検体処理可能な方法が必要となる。ＣＩＣＲ活性は細胞膜を除去した筋線維（スキンドファイバー）を用いた直接測定や、単一チャネル電流記録法または[3H]リアノジン結合法によって測定されているが、いずれの方法も操作が煩雑で多検体処理することが困難である。本発明者らは、野生型及びさまざまな疾患変異ＲｙＲを培養細胞に発現させ、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターで小胞体内のＣａ2+濃度を測定したところ、疾患変異ＲｙＲとを発現する培養細胞においては、ＣＩＣＲ活性の程度に応じて小胞体Ｃａ2+レベルが低下していることを見出した（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nat. Commun., 2014, 5: 4153
【非特許文献２】PLOS ONE, 2015,10: e0130606
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の本発明者の知見によれば、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターで小胞体内Ｃａ2+濃度を測定することにより、簡便にＣＩＣＲ活性抑制剤のスクリーニングが可能と考えられた。しかしながら、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異ＲｙＲとを発現する培養細胞を用いて小胞体内Ｃａ2+レベルを測定しても、被験物質がＣａ2+インジケーターの蛍光そのものに影響を与える場合は蛍光強度の増大が必ずしも小胞体内Ｃａ2+濃度上昇によるとは限らず（偽陽性）、正確な判定が困難であった。
従って、本発明の課題は、小胞体内Ｃａ2+レベルを用いて正確にＣＩＣＲ活性抑制剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、ＣＩＣＲ活性抑制剤を正確、かつ再現性良くスクリーニングするための方法を開発すべく検討したところ、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞においては、活性ＣＩＣＲ抑制剤を添加しても小胞体内Ｃａ2+レベルが増大しないことを見出した。従って、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異ＲｙＲとを発現する細胞に加えて、この蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞も用いて被験物質の小胞体内Ｃａ2+濃度を測定し、それらの小胞体内Ｃａ2+濃度を対比すれば、正確にＣＩＣＲ活性抑制剤がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型ＲｙＲとを発現する培養細胞、及び蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞とをそれぞれ培養し、被験物質の存在下で小胞体内Ｃａ2+濃度を測定し、前記両培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度を対比することを特徴とする、ＣＩＣＲ活性抑制剤のスクリーニング方法。
〔２〕前記疾患変異型ＲｙＲを発現する培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度が、前記野生型ＲｙＲを発現する培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度に比べて上昇している被験物質をＣＩＣＲ活性抑制剤であると判定する〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔３〕ＲｙＲが、ＲｙＲ１又はＲｙＲ２である〔１〕又は〔２〕記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法によれば、培養系の実験だけで疾患変異ＲｙＲ異常に依存したＣＩＣＲ活性抑制剤が正確、かつ大量にスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】既知のＣＩＣＲ活性抑制薬による小胞体内Ｃａ2+濃度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法においては、（１）蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型ＲｙＲとを発現する培養細胞、及び（２）蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞を、それぞれ被験物質の存在下で蛍光強度を測定する。
【００１２】
蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターは、非特許文献１に記載のＣＥＰＩＡ（calcium-measuring organelle entrapped protein indicator）であり、Ｃａ2+が結合すると蛍光強度が増大するように設計されたインジケーターである。このインジケーターの蛍光強度を測定することにより、小胞体内のＣａ2+濃度が正確に測定できる。具体的には、非特許文献１記載のＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒが使用できる。
【００１３】
ＲｙＲとしては、ＲｙＲ１及びＲｙＲ２のいずれでもよい。
【００１４】
疾患変異型ＲｙＲとしては、既知の疾患変異型ＲｙＲが用いられ、例えばＲｙＲ１の疾患変異型としては、Ｃ３５Ｒ、Ｒ１６３Ｃ、Ｇ２４８Ｒ、Ｇ３４１Ｒ、Ｒ４０１Ｃ、Ｙ５２２Ｓ、Ｒ６１４Ｃ、Ｒ２１６３Ｃ、Ｖ２１６８Ｍ、Ｒ２４３５Ｈ、Ｒ２４５８Ｃ、Ｒ２５０８Ｃが挙げられる。ＲｙＲ２の変異型としては、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ４２０Ｗ、Ｖ２３２１Ｍ、Ｙ２３９２Ｃ、Ｒ２４７４Ｓ、Ｒ４４９７Ｃ、Ａ４８６０Ｇが挙げられる。これらの変異型と疾患との関係は既知である（表１及び表２）。
【００１５】
【表１】
2017216924.tif 000002
【００１６】
【表２】
2017216924.tif 000003
【００１７】
蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型ＲｙＲとを発現する培養細胞は、例えば非特許文献２に記載の方法により作製できる。具体的には、ＰＣＲ法を用いて変異型ＲｙＲを導入した発現ベクターを構築し、当該プラスミドを、蛍光小胞体インジケーター（Ｒ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ）を発現している培養細胞に導入することにより作製できる。培養細胞としては、ヒトまたは哺乳類由来の培養細胞であるのが好ましく、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００１８】
蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞は、例えば非特許文献２に記載の方法により作製できる。具体的には、蛍光小胞体インジケーター（Ｒ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ）を、野生型ＲｙＲ発現細胞に導入することにより作製できる。野生型ＲｙＲ発現細胞としては、ヒトまたは哺乳類由来の培養細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００１９】
前記２種の培養細胞の培養条件は、それらの細胞が生育する条件であればよく、ヒト由来の培養細胞であれば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中、３７±２℃で、２４〜４８時間培養するのが好ましい。
【００２０】
前記２種の培養細胞を培養した後、被験物質を添加して、小胞体内Ｃａ2+濃度を測定する。これらの培養細胞には、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターが導入されているので、小胞体内Ｃａ2+濃度が上昇すれば蛍光強度が上昇する。従って、蛍光強度を測定すれば、小胞体内Ｃａ2+濃度が測定できる。被験物質は、濃度を変化させて添加するのが好ましい。
【００２１】
本発明においては、前記２種の培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度を対比することが重要である。被験物質の作用により、疾患変異型ＲｙＲが導入された培養細胞のＲｙＲ活性が抑制されれば、ＣＩＣＲ活性が抑制される結果、小胞体内Ｃａ2+濃度は上昇して蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターの蛍光強度が増大する。しかし、被験物質の中には蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターの蛍光そのものに影響を与えるものもあり、蛍光強度の増大が必ずしも小胞体内Ｃａ2+濃度上昇によるとは限らない。これらは偽陽性となり、スクリーニングの精度を低下させる原因となる。本発明者は、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞では、ＣＩＣＲ抑制薬を添加しても小胞体内Ｃａ2+濃度は変化しないことを見出した。従って、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと野生型ＲｙＲとを発現する培養細胞における小胞体内Ｃａ2+濃度変化と、蛍光小胞体Ｃａ2+インジケーターと疾患変異型ＲｙＲとを発現する培養細胞における小胞体内Ｃａ2+濃度変化とを対比すれば、ＣＩＣＲ活性抑制剤が正確に測定できる。
【００２２】
野生型ＲｙＲ発現細胞を用いた場合に比べて有意差をもって小胞体内Ｃａ2+濃度が上昇している被験物質はＣＩＣＲ活性抑制剤として有用であると判定できる。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法によって選択されたＣＩＣＲ活性抑制剤は、ＲｙＲ関連疾患、特にＲｙＲ１又はＲｙＲ２の関連疾患の治療薬として期待できる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
実施例
（１）発現プラスミドの構築
ＲｙＲ１およびＲｙＲ２のｃＤＮＡはウサギ骨格筋およびマウス心筋からＰＣＲ法でクローニングして、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ用のハイグロマイシン耐性を有する発現ベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ）に組み込んだ。このベクターはテトラサイクリン誘導発現型（Ｔｅｔ-Ｏｎ）でドキシサイクリン存在下でＲｙＲを誘導発現する。Ｒ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒはネオマイシン耐性を有する発現ベクターであるｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲに組み込んだ。このベクターはＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒを恒常発現する。
【００２６】
（２）ＨＥＫ２９３細胞
ＨＥＫ２９３細胞はＴｅｔ−Ｏｎ誘導型のシステムに対応したＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ  ２９３細胞を用いた。細胞は３７℃でＣＯ2インキュベータ中で培養した。
【００２７】
（３）ＨＥＫ２９３細胞へのＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ（非特許文献１記載）及び疾患変異型ＲｙＲ遺伝子の導入疾患変異型ＲｙＲ遺伝子はリポフェクション法によりＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ  ２９３細胞に導入して、ハイグロマイシンを添加した培地で１０-１４日間培養することで安定発現株を樹立した。この疾患変異型ＲｙＲ安定発現株にＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ発現ベクターをリポフェクション法により導入して、Ｇ４１８を添加した培地で培養することで疾患変異型ＲｙＲ遺伝子とＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒを二重発現する安定発現株を樹立した。
【００２８】
（４）ＨＥＫ２９３細胞へのＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ及び野生型ＲｙＲ遺伝子の導入
野生型ＲｙＲ遺伝子はリポフェクション法によりＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ  ２９３細胞に導入して、ハイグロマイシンを添加した培地で１０-１４日間培養することで安定発現株を樹立した。この疾患変異型ＲｙＲ安定発現株にＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒ発現ベクターをリポフェクション法により導入して、Ｇ４１８を添加した培地で培養することで野生型ＲｙＲ遺伝子とＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒを二重発現する安定発現株を樹立した。
【００２９】
（５）蛍光小胞体内Ｃａ2+濃度の測定
疾患変異型ＲｙＲとＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒを発現する培養細胞及び野生型ＲｙＲとＲ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒを発現する培養細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに播種して、３７℃で２４時間培養した。ドキシサイクリンを添加した培地に交換してさらに２４時間培養してＲｙＲの発現を誘導した。測定前に培地をＫｒｅｂｓ溶液に交換した。蛍光測定はＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎで行った。Ｒ−ＣＥＰＩＡ１ｅｒは５６０ｎｍで励起して、６１０ｎｍの蛍光を取得した。蛍光は１０秒おきに３００秒間取得し、ＣＩＣＲ活性抑制剤は開始６０秒後に添加した。
【００３０】
図１に示すように、ＣＩＣＲ活性を抑制することが知られているテトラカイン及びダントロレンは疾患変異型ＲｙＲ１であるＲ２１６３Ｃを導入した培養細胞の小胞体内Ｃａ2+濃度を、野生型ＲｙＲ１を導入した培養細胞に比べて顕著に上昇させた。従って、本発明スクリーニング方法を用いれば、精度よくＣＩＣＲ活性抑制剤がスクリーニングできる。
【図１】
2017216924.tif 000004