(57)【要約】【課題】スクリーニングされるペプチドの多様性に偏りが生じにくい、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  （ａ）ペプチドアレイに金属を接触させて、各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｂ）金属結合性が高かった１個又は複数のペプチドを選択し、アミノ酸の出現頻度を算出する工程、（ｃ）算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを有するペプチドアレイを準備する工程、（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返す工程、（ｅ）ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｆ）金属結合性が高かった１個又は複数個のペプチドを金属結合性ペプチドとして選択する工程、を備える、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属結合性ペプチドのスクリーニング方法であって、
（ａ）ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、
（ｂ）工程（ａ）において、金属結合性が高かった１個又は複数のペプチドを選択し、選択した前記ペプチドのアミノ酸の出現頻度を算出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを有するペプチドアレイを準備する工程、
（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返す工程、
（ｅ）前記ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、
（ｆ）工程（ｅ）において、金属結合性が高かった１個又は複数個のペプチドを金属結合性ペプチドとして選択する工程、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記金属が、貴金属、ベースメタル又はレアメタルである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる金属結合性ドメイン。
ＸｍＺｎＸｐ  （１）
［但し、ｍ及びｐは１〜５の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基又はメチオニン残基を表し、Ｚｎはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基又はスレオニン残基を少なくとも１残基含み、且つフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びメチオニン残基を含まないアミノ酸配列を表す。］
【請求項４】
前記金属が金である、請求項３に記載の金属結合性ドメイン。
【請求項５】
イソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基を含有しない、請求項３又は４に記載の金属結合性ドメイン。
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の金属結合性ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法及び金属結合性ドメインに関する。
【背景技術】
【０００２】
金属結晶や酸化物結晶等の無機物質に対する特異的な結合能を有するペプチドが知られている。例えば、特許文献１には、希土類金属に特異的に結合するペプチドが報告されている。
【０００３】
このような機能性ペプチドは、例えば、希土類金属の回収への応用、バイオセンサ等の無機材料及び有機材料を併用して利用する必要がある用途における、無機材料と有機材料との界面を形成する分子としての応用等が検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−５１４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的に、特定の物質に結合するペプチドのスクリーニングには、ファージディスプレイライブラリー、大腸菌や酵母を利用した細胞表層ディスプレイペプチドライブラリー等が利用される。しかしながら、これらの方法では、スクリーニングに生物を利用するため、例えば特定の配列を有するペプチドがうまく発現されない等の理由により、スクリーニングされるペプチドに偏りが生じる場合がある。その結果、スクリーニングによって得られるペプチドが制限される場合がある。
【０００６】
そこで、本発明は、スクリーニングされるペプチドの多様性に偏りが生じにくい、化学合成に基づく金属結合性ペプチドのスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明はまた、金属結合性ドメインを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
［１］金属結合性ペプチドのスクリーニング方法であって、（ａ）ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｂ）工程（ａ）において、金属結合性が高かった１個又は複数のペプチドを選択し、選択した前記ペプチドのアミノ酸の出現頻度を算出する工程、（ｃ）工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを有するペプチドアレイを準備する工程、（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返す工程、（ｅ）前記ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｆ）工程（ｅ）において、金属結合性が高かった１個又は複数個のペプチドを金属結合性ペプチドとして選択する工程、を備える、スクリーニング方法。
［２］前記金属が、貴金属、ベースメタル又はレアメタルである、［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる金属結合性ドメイン。
ＸｍＺｎＸｐ  （１）
［但し、ｍ及びｐは１〜５の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基又はメチオニン残基を表し、Ｚｎはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基又はスレオニン残基を少なくとも１残基含み、且つフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びメチオニン残基を含まないアミノ酸配列を表す。］
［４］前記金属が金である、［３］に記載の金属結合性ドメイン。
［５］イソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基を含有しない、［３］又は［４］に記載の金属結合性ドメイン。
［６］配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［３］〜［５］のいずれか一項に記載の金属結合性ドメイン。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、スクリーニングされるペプチドの多様性に偏りが生じにくい、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。また、金属結合性ドメインを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例３のペプチドアレイのスキャン画像である。
【図２】図１のスキャン画像を数値化した結果を示すグラフである。
【図３】実験例５のペプチドアレイのスキャン画像である。
【図４】図３のスキャン画像を数値化した結果を示すグラフである。
【図５】図４の結果に基づいて作成したヒストグラムである。
【図６】実験例５で着目したペプチドにおいて、アミノ酸の出現頻度（％）を算出した結果を示すグラフである。
【図７】実験例７のペプチドアレイのスキャン画像である。
【図８】実験例９のペプチドアレイのスキャン画像である。
【図９】実験例５、７及び９の結果に基づいて作成したヒストグラムである。
【図１０】実験例１０で着目したペプチドにおいて、アミノ酸の出現頻度（％）を算出した結果を示すグラフである。
【図１１】実験例１１の結果を示すグラフである。
【図１２】実験例１２の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜金属結合性ペプチドのスクリーニング方法＞
１実施形態において、本発明は、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法であって、（ａ）ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｂ）工程（ａ）において、金属結合性が高かった１個又は複数のペプチドを選択し、選択された前記ペプチドのアミノ酸の出現頻度を算出する工程、（ｃ）工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを有するペプチドアレイを準備する工程、（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返す工程、（ｅ）前記ペプチドアレイに金属を接触させて、前記ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する工程、（ｆ）工程（ｅ）において、金属結合性が高かった１個又は複数個のペプチドを金属結合性ペプチドとして選択する工程、を備える、スクリーニング方法を提供する。
【００１１】
ここで、金属結合性ペプチドが結合する金属としては特に制限されず、例えば、貴金属、ベースメタル、レアメタル、酸化金属、半導体結晶等が挙げられる。貴金属としては、例えば、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、オスミウム等が挙げられる。また、ベースメタルとしては、例えば、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム等が挙げられる。また、レアメタルとしては、例えば、リチウム、ベリリウム、ホウ素、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、ニッケル、ガリウム、ゲルマニウム、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、インジウム、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、タリウム、ビスマス等が挙げられる。また、酸化金属としては、例えば、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化アンチモン、酸化錫、酸化チタン、酸化マンガン、酸化ジルコニウム等が挙げられる。また、半導体結晶としては、例えば、シリコン、ゲルマニウム、酸化亜鉛、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、テルル化亜鉛、酸化カドミウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、酸化マグネシウム、硫化マグネシウム、セレンマグネシウム、テルルマグネシウム、酸化水銀、硫化水銀、セレン化水銀、テルル化水銀、窒化アルミニウム、リン化アルミニウム、砒素化アルミニウム、アンチモンアルミニウム、窒化ガリウム、リン化ガリウム、砒素化ガリウム、アンチモンガリウム、窒化インジウム、リン化インジウム、砒素化インジウム、アンチモンインジウム、窒化タリウム、リン化タリウム、砒素化タリウム、アンチモンタリウム、硫化鉛、セレン化鉛、テルル化鉛、銅インジウムセレン、硫化銅インジウム、銅インジウムガリウムセレン等が挙げられる。
【００１２】
以下、本実施形態のスクリーニング方法の各工程について説明する。
【００１３】
［工程（ａ）］
本工程において、ペプチドアレイに金属を接触させて、ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する。本工程におけるペプチドアレイは、例えば、ランダムな配列を有するペプチドを有するペプチドアレイであってもよい。あるいは、金属結合性を有することがすでに知られているペプチドを有するペプチドアレイ等であってもよい。ペプチドの長さは特に制限されず、例えば４〜１００アミノ酸であってもよく、例えば４〜５０アミノ酸であってもよく、例えば４〜４０アミノ酸であってもよく、例えば４〜３０アミノ酸であってもよく、例えば４〜２０アミノ酸であってもよく、例えば４〜１０アミノ酸であってもよい。
【００１４】
ペプチドアレイは、板状の固相上に形成されていてもよく、例えばセルロース膜等の膜状の固相上に形成されていてもよい。
【００１５】
ペプチドアレイに接触させる金属は微粒子であることが好ましい。微粒子の平均粒径は、例えば１０μｍ以下であってもよく、例えば１μｍ以下であってもよく、例えば１００ｎｍ以下であってもよい。
【００１６】
ペプチドアレイと金属との接触は、例えば、金属微粒子を適切な溶媒中に分散させた懸濁液中にペプチドアレイを浸漬させること等により行うことができる。上記の溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられる。溶媒には有機塩、無機塩、界面活性剤等を添加してもよい。
【００１７】
ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性は、例えば、当該ペプチドのスポットに結合した金属の量を測定することにより評価することができる。ペプチドのスポットに結合した金属の量は、例えば、ペプチドアレイを撮影した画像を画像処理ソフト等を用いて処理することにより数値化することができる。
【００１８】
［工程（ｂ）］
本工程では、工程（ａ）において、金属結合性が高かった１個又は複数のペプチドを選択し、選択したペプチドにおけるアミノ酸の出現頻度を算出する。アミノ酸の出現頻度は、次のようにして算出することができる。まず、工程（ａ）で選択した１個又は複数のペプチドを構成する各アミノ酸の数を数える。続いて、各アミノ酸の数が、工程（ａ）で選択したペプチドを構成するアミノ酸の総数に占める割合を算出し、アミノ酸の出現頻度とする。
【００１９】
［工程（ｃ）］
本工程では、工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを有するペプチドアレイを準備する。
【００２０】
金属結合性ペプチドのスクリーニングにおいては、スクリーニングされるペプチドはできるだけ多様であることが好ましい。これにより、より網羅的にスクリーニングを行うことができる。
【００２１】
そこで、場合により、工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に修正を加える。例えば、出現頻度が０％であったアミノ酸の出現頻度を０％を超える値に設定する。例えば０．１〜１０％に設定してもよいし、例えば０．３〜５％に設定してもよいし、例えば０．５〜１．５％に設定してもよい。
【００２２】
また、例えば、チオール基を有するシステイン等のアミノ酸は、スクリーニングの結果得られたペプチドの末端に結合させて、化学修飾の官能基等として利用することができる。そこで、例えば、システインの出現頻度を０％に設定することにより、金属結合性ペプチドを構成するアミノ酸から除外してもよい。
【００２３】
このようにして、工程（ｂ）で算出したアミノ酸の出現頻度に基づいたアミノ酸の出現頻度を設定する。続いて、設定したアミノ酸の出現頻度を有し、且つランダムなアミノ酸配列を有する複数のペプチドを設計する。
【００２４】
続いて、設計したペプチドがスポットされたペプチドアレイを準備する。ペプチドアレイは例えば外注により作製してもよいし、ペプチド合成機を用いて作製してもよい。また、ペプチドアレイには、陽性対照又は陰性対照となるペプチドを含めておくことが好ましい。
【００２５】
［工程（ｄ）］
本工程では、場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を１回又は複数回繰り返す。すなわち、工程（ｃ）で準備したペプチドアレイに金属を接触させて金属結合性を評価し、金属結合性が高かったペプチドを選択し、選択したペプチドのアミノ酸の出現頻度を算出し、算出したアミノ酸の出現頻度に基づいて新たなペプチドアレイを準備することを１回又は複数回繰り返してもよいし、本工程を実施せずに次の工程に進んでもよい。
【００２６】
後述する実施例において示すように、工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことにより、より金属結合性の高いペプチドを得ることができる場合がある。
【００２７】
［工程（ｅ）］
本工程において、工程（ｃ）で準備されたペプチドアレイ、又は、工程（ｄ）を実施した場合には工程（ｄ）で準備されたペプチドアレイに金属を接触させて、ペプチドアレイを構成する各ペプチドの金属結合性を評価する。金属結合性の評価は上述した工程（ａ）と同様にして行うとよい。
【００２８】
［工程（ｆ）］
本工程において、工程（ｅ）で金属結合性が高かった１個又は複数個のペプチドを金属結合性ペプチドとして選択する。以上の工程（ａ）〜（ｆ）を備えるスクリーニング方法により、金属結合性ペプチドをスクリーニングすることができる。
【００２９】
本発明によれば、スクリーニングの過程で生物を利用しないことから、スクリーニングされるペプチドの多様性に偏りが生じにくい。このため、ファージディスプレイライブラリー、大腸菌や酵母を利用した細胞表層ディスプレイペプチドライブラリー等の、従来の生物を利用するスクリーニング方法では得られなかった金属結合性ペプチドを得ることができる。
【００３０】
＜金属結合性ドメイン＞
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる金属結合性ドメインを提供する。式（１）中、ｍ及びｐは１〜５の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基又はメチオニン残基を表し、Ｚｎはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基又はスレオニン残基を少なくとも１残基含み、且つフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びメチオニン残基を含まないアミノ酸配列を表す。
ＸｍＺｎＸｐ  （１）
【００３１】
式（１）において、ｍ及びｐは、例えば１〜３であってもよく、例えば１〜２であってもよい。また、ｎは、例えば１〜１５であってもよく、例えば１〜１０であってもよく、例えば２〜１０であってもよく、例えば２〜９であってもよく、例えば２〜８であってもよく、例えば２〜７であってもよく、例えば２〜５であってもよい。
【００３２】
本実施形態の金属結合性ドメインは、金属結合性ペプチドの全体又は一部を構成する。金属結合性ペプチドは、金属結合性ドメインを１個有していてもよく、複数有していてもよい。また、金属結合性ドメインは「ＷＨＷ」を除くアミノ酸配列を有していてもよい。
【００３３】
本実施形態の金属結合性ドメインを構成するアミノ酸は、金属結合性ドメインが金属結合性を維持している限り、アミノ酸誘導体に置き換えられていてもよい。すなわち、式（１）において、Ｘはフェニルアラニン残基の誘導体、トリプトファン残基の誘導体、チロシン残基の誘導体又はメチオニン残基の誘導体を含んでいてもよく、Ｚｎはアスパラギン酸残基の誘導体、グルタミン酸残基の誘導体、ヒスチジン残基の誘導体、リジン残基の誘導体、アスパラギン残基の誘導体、グルタミン残基の誘導体、セリン残基の誘導体又はスレオニン残基の誘導体を含んでいてもよい。
【００３４】
アミノ酸誘導体としては、上記アミノ酸の各種誘導体が挙げられ、例えば、非天然アミノ酸；アミノアルコール；側鎖のカルボニル基、アミノ基、チオール基等が各種置換基により置換したもの等が挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基、ハロゲン原子（フッ素等）で修飾された芳香族基、各種保護基等が挙げられる。より具体的なアミノ酸誘導体としては、例えば、Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Ｓ−ニトロシステイン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−アリルシステイン、バリンアミド、２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール等が挙げられる。
【００３５】
本実施形態の金属結合性ドメインは、金に結合するものであってもよい。後述する実施例で示すように、上記式（１）で表されるドメインを有するペプチドは高い金結合性を示す。
【００３６】
本実施形態の金属結合性ドメインは、イソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基を含有しなくてもよい。後述する実施例で示すように、高い金結合性を示す金属結合性ドメインは、イソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基を含有しない傾向にある。
【００３７】
本実施形態の金属結合性ドメインは、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３８】
後述する実施例で示すように、配列番号１に記載のアミノ酸配列「ＷＳＥＨＱＮＧＷ」からなる金属結合性ドメインを有するペプチドは、高い金結合性を示した。ここで、数個とは、例えば１〜３個、例えば１〜２個を意味する。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
［実験例１］
（金ナノ粒子の合成）
Ｎ−ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、「ＣＴＡＣ」という。１００ｍＭ）と塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４、２５０μＭ）との混合溶液１０ｍＬを用意した。続いて、この溶液中に、氷冷されたホウ酸水素ナトリウム（ＮａＢＨ４、６００μＭ）を還元剤として加え１分間撹拌した。続いて、上記の溶液を２８℃の温浴槽中で２時間静置した。その結果、直径約７ｎｍの金ナノ粒子が合成された。この金ナノ粒子溶液は、吸光のピークが５１２ｎｍにあり、５１２ｎｍの吸光度が０．１３２であった。この結果から、調製した金ナノ粒子溶液の濃度は４．２０ｎＭであると計算された（Haiss W., et al., Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra., Anal. Chem., 79(11), 4215-4221, 2007. を参照。）。
【００４１】
［実験例２］
（ペプチドアレイの作製）
まず、活性化メンブレンを作製した。３７℃で１日乾燥させたセルロースメンブレンを、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）に１日浸漬した。続いて、メンブレンをメタノールで２回洗浄した後乾燥させた。続いて、ＤＭＦ  ３００ｍＬ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａｎｉｎｅ  ２４ｍＬ（１．０Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＰＣＩ」という。）５００μＬ、１−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）４００μＬを混合して調製した活性化試薬に、上記のメンブレンを２日間浸漬した。最後に、メンブレンを、ＤＭＦ及びメタノールでそれぞれ３回ずつ洗浄し、冷風をあてて乾燥させた。完成した活性化メンブレンは−２０℃の冷凍庫中に保存した。
【００４２】
続いて、ペプチドアレイを作製した。ペプチド合成機（型式「ＲｅｓＰｅｐ  ＳＬ、ＫＩＦＵ２０１４００４７−００００」、Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いて、上述した活性化メンブレン上の決められた位置にアミノ酸のスポッティングを繰り返すことにより、Ｆｍｏｃ固相合成反応によるペプチドの伸長反応を行った。スポットするアミノ酸溶液としては、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（以下、「ＮＭＰ」という。）に溶解した０．５Ｍ  Ｆｍｏｃアミノ酸溶液、及び、ＤＩＰＣＩとヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨｏＢｔ」という。）をモル比で２：８に混合して調製した活性化剤を、１７：１００の容量比で混合させたものを使用した。Ｆｍｏｃ基の脱保護には、２０％ピペリジン（渡辺化学社）を用いた。キャッピングには、無水酢酸とＤＭＦとを容量比で２：１００に混合した溶液を使用した。また、メンブレンの洗浄には、ＤＭＦ及びエタノールを使用した。
【００４３】
［実験例３］
（既知の金結合性ペプチドの金結合性の検討）
表１に既知の金結合性ペプチドのアミノ酸配列を示す。まず、実験例２と同様にして、表１に示す１０種類のペプチドがスポットされたペプチドアレイを作製した。続いて、このペプチドアレイを実験例１で作製した金ナノ粒子溶液に浸漬し一晩撹拌した。続いて、ペプチドアレイを取出し、スキャナー（型式「ＬｉＤＥ２２０」、キャノン社製）でスキャンした。続いて、得られた画像を画像解析ソフト（商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で解析し、ペプチドアレイに結合した金ナノ粒子の色の濃さ（シグナル強度）を数値化することにより、各ペプチドの金に対する結合能を評価した。
【００４４】
【表１】
2017015661.tif 000002
【００４５】
図１はペプチドアレイのスキャン画像である。図１に示すように、本ペプチドアレイでは、各ペプチドが３スポットずつスポットされていた。図２は、図１のスキャン画像を数値化した結果を示すグラフである。
【００４６】
その結果、配列番号５のペプチドが金に対する最も高い結合性を有することが示された。次いで、配列番号４、７及び１０のペプチドが同程度の結合能を示した。
【００４７】
以上の結果より、配列番号４、５、７及び１０の４種のペプチドをリード配列として採用し、後の実験に用いた。
【００４８】
［実験例４］
（ペプチドアレイの設計１）
実験例３で選択した配列番号４、５、７及び１０の４種のペプチドのアミノ酸配列に基づいてペプチドアレイを設計した。まず、上記の４種のペプチドのアミノ酸の出現回数を数えた。表２に結果を示す。
【００４９】
【表２】
2017015661.tif 000003
【００５０】
続いて、表２に基づいて、ペプチドアレイを構成するペプチドのアミノ酸出現頻度を決定した。具体的には、ペプチドの多様性を確保するために、表２において出現回数が０であったアミノ酸について０．５を加えた。但し、システインについては、金属結合性ペプチドの利用性を考慮して０のままとした。
【００５１】
続いて、各アミノ酸の出現回数を百分率で表し、ペプチドアレイを構成するペプチドのアミノ酸出現頻度とした。表３に、設計したアミノ酸出現頻度（％）を示す。
【００５２】
【表３】
2017015661.tif 000004
【００５３】
続いて、表３に示すアミノ酸出現頻度を有し、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを約６００種類設計した。各ペプチドの長さは１０アミノ酸とした。
【００５４】
［実験例５］
（金結合性ペプチドのスクリーニング１）
実験例２と同様にして、実験例４で設計した約６００種類のペプチド、陽性対照として配列番号５のペプチド及び陰性対照として配列番号１１のペプチドがスポットされたペプチドアレイを作製した。このペプチドアレイを用いて、実験例３と同様にして金結合性を評価した（以下、「１回目のスクリーニング」という場合がある）。
【００５５】
図３は、金ナノ粒子溶液を２０時間接触させた後のペプチドアレイのスキャン画像である。図中の四角で示すＴ２８の位置のスポットは、陽性対照である配列番号５のペプチドの結果を示す。また、Ｔ３０の位置のスポットは、陰性対照である配列番号１１のペプチドの結果を示す。
【００５６】
図３から明らかなように、ペプチドアレイ上の金ナノ粒子の色の濃さを測定することにより、全く金結合性を示さないペプチド、非常に高い金結合性を示すペプチドを含む、多様な結果を一括して取得可能であることが示された。
【００５７】
また、興味深いことに、ペプチドのスポットの中には、紫色に近いスポットやピンク色に近いスポット等が確認された。この結果が、ペプチドの金結合性に由来するのか、あるいは、ペプチドに結合した金ナノ粒子同士の距離に由来するのかは不明であるが、異なる呈色効果を示す金結合性ペプチドを探索できる可能性があることを示していると考えられた。
【００５８】
図４は、図３のスキャン画像を数値化した結果を示すグラフである。図４中の横線は、陽性対照である配列番号５のペプチドが示した金結合性の値である。図４の結果から、配列番号５のペプチドよりも高い金結合性を示すペプチドが存在していることが明らかとなった。
【００５９】
図５は、図４の結果に基づいて作成したヒストグラムである。図５の横軸は、陽性対照である配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値を示し、縦軸はペプチドの出現頻度（％）を示す。
【００６０】
その結果、配列番号５のペプチドと比較してより高い金結合性を示すペプチドが、ペプチドアレイに含まれていたペプチド全体の約２５％、１４７種同定された。同定された金結合性ペプチドのアミノ酸配列を表４−１〜４−３に示す。表中、「順位」は、金結合性の値が高いペプチドから順に並べた順位を示す。また、「金結合性（相対値）」は、配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値を示す。
【００６１】
【表４−１】
2017015661.tif 000005
【００６２】
【表４−２】
2017015661.tif 000006
【００６３】
【表４−３】
2017015661.tif 000007
【００６４】
また、金結合性を示さないペプチドが、ペプチドアレイに含まれていたペプチド全体の約１４％、８１種同定された。なお、ここでは、陰性対照である配列番号１１のペプチド以下の金結合性を示すペプチドを金結合性を示さないペプチドとした。同定された、金結合性を示さないペプチドのアミノ酸配列を表５−１〜５−２に示す。表中、「順位」は、金結合性の値が低いペプチドから順に並べた順位を示す。
【００６５】
【表５−１】
2017015661.tif 000008
【００６６】
【表５−２】
2017015661.tif 000009
【００６７】
また、図６に、表４−１〜４−３に示す金結合性ペプチドのうち金結合性の値が高いものから５０種（配列番号１２〜６１）、表５−１〜５−２に示す金結合性を示さないペプチドのうち金結合性の値が低いものから５０種（配列番号１５９〜２０８）、及び既知の金結合性ペプチド（配列番号２〜１０）について、アミノ酸の出現頻度（％）を算出した結果を示す。
【００６８】
その結果、金結合性ペプチドのうち金結合性の値が高いものから５０種においては、既知の金結合性ペプチドと比較して、グルタミン酸（Ｅ）、トリプトファン（Ｗ）の出現頻度が上昇していることが明らかとなった。具体的には、グルタミン酸の出現頻度は４．６％から１０．２％に上昇し、トリプトファンの出現頻度は６．１％から１０．４％に上昇していた。逆に、既知の金結合性ペプチドと比較して、アルギニン（Ｒ）の出現頻度は１０．４％から５．０％に低下していることが明らかとなった。
【００６９】
一方、金結合性を示さないペプチドのうち金結合性の値が低いものから５０種においては、既知の金結合性ペプチドと比較して、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）等の出現頻度が上昇していることが明らかとなった。
【００７０】
［実験例６］
（ペプチドアレイの設計２）
表４−１〜４−３に示す金結合性ペプチドのうち金結合性の値が高いものから５０種（配列番号１２〜６１）について算出したアミノ酸の出現頻度を有し、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを約６００種類設計した。各ペプチドの長さは１０アミノ酸とした。
【００７１】
［実験例７］
（金結合性ペプチドのスクリーニング２）
実験例２と同様にして、実験例６で設計した約６００種類のペプチド、陽性対照として配列番号５のペプチド及び陰性対照として配列番号１１のペプチドがスポットされたペプチドアレイを作製した。このペプチドアレイを用いて、実験例３と同様にして金結合性を評価した（以下、「２回目のスクリーニング」という場合がある）。
【００７２】
図７は、２回目のスクリーニング後のペプチドアレイのスキャン画像である。図中の四角で示すＴ２８の位置のスポットは、陽性対照である配列番号５のペプチドの結果を示す。また、Ｔ３０の位置のスポットは、陰性対照である配列番号１１のペプチドの結果を示す。
【００７３】
２回目のスクリーニングの結果、金結合性の値が高いものから５０種（配列番号２４０〜２８９）のペプチドを表６に示す。表６中、「順位」は、金結合性の値が高いペプチドから順に並べた順位を示す。また、「金結合性（相対値）」は、配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値を示す。
【００７４】
【表６】
2017015661.tif 000010
【００７５】
［実験例８］
（ペプチドアレイの設計３）
表６に示す５０種の金結合性ペプチド（配列番号２４０〜２８９）について算出したアミノ酸の出現頻度を有し、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを約３００種類設計した。各ペプチドの長さは１０アミノ酸とした。
【００７６】
［実験例９］
（金結合性ペプチドのスクリーニング３）
実験例２と同様にして、実験例８で設計した約３００種類のペプチド、陽性対照として配列番号５のペプチド及び陰性対照として配列番号１１のペプチドがスポットされたペプチドアレイを作製した。このペプチドアレイを用いて、実験例３と同様にして金結合性を評価した（以下、「３回目のスクリーニング」という場合がある）。
【００７７】
図８は、３回目のスクリーニング後のペプチドアレイのスキャン画像である。図中の四角で示すＴ１３の位置のスポットは、陽性対照である配列番号５のペプチドの結果を示す。また、Ｔ１５の位置のスポットは、陰性対照である配列番号１１のペプチドの結果を示す。
【００７８】
３回目のスクリーニングの結果、金結合性の値が高いものから２５種（配列番号２９０〜３１４）のペプチドを表７に示す。表７中、「順位」は、金結合性の値が高いペプチドから順に並べた順位を示す。また、「金結合性（相対値）」は、配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値を示す。
【００７９】
【表７】
2017015661.tif 000011
【００８０】
図９は、実験例５（１回目のスクリーニング）、実験例７（２回目のスクリーニング）、及び実験例９（３回目のスクリーニング）の結果に基づいて作成したヒストグラムである。図９の横軸は、陽性対照である配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値を示し、縦軸はペプチドの出現頻度（％）を示す。
【００８１】
図９に示すように、スクリーニングを繰り返す度に、より金結合性の高いペプチドを多く含むペプチドアレイが作製され、３回目のスクリーニングでは、陽性対照である配列番号５のペプチドよりも高い金結合性を示すペプチドの割合が約９０％まで増加したことが明らかとなった。
【００８２】
また、１回目のスクリーニングで最も高い金結合性を示したペプチドが、配列番号５のペプチドに対して１．８倍程度の金結合性を示したのに対し、２回目及び３回目のスクリーニングで最も高い金結合性を示したペプチドは、配列番号５のペプチドに対して２．４倍程度の金結合性を示した。
【００８３】
しかしながら、２回目のスクリーニングで最も高い金結合性を示したペプチドと、３回目のスクリーニングで最も高い金結合性を示したペプチドは、同程度の金結合性を示していたため、スクリーニングの回数をさらに増やしても、より高い結合能を示すペプチドを獲得することは困難であることが考えられた。
【００８４】
以上、実験例４〜９の結果から、金結合性の高いペプチドのアミノ酸の出現頻度に基づいてペプチドアレイを作製し、作製したペプチドアレイに金を接触させて金結合性を評価することを繰り返すスクリーニング方法が、高い金結合性を示すペプチドをスクリーニングする手段として有用であることが示された。
【００８５】
［実験例１０］
（アミノ酸出現頻度の検討）
図１０は、既知の金結合性ペプチド（配列番号２〜１０）、実験例５（１回目のスクリーニング）で金結合性の値が高いものから５０種（配列番号１２〜６１）、実験例７（２回目のスクリーニング）で金結合性の値が高いものから５０種（配列番号２４０〜２８９）、及び実験例９（３回目のスクリーニング）で金結合性の値が高いものから２５種（配列番号２９０〜３１４）のペプチドにおける、アミノ酸の出現頻度（％）を示すグラフである。なお、既知の金結合性ペプチド（配列番号２〜１０）のアミノ酸の出現頻度においては、アミノ酸の存在が認められなかった、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）の出現頻度を０．５とし、システイン（Ｃ）の出現頻度を０とした。
【００８６】
その結果、スクリーニングを繰り返す過程で、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）の出現頻度が顕著に増加していることが明らかとなった。
【００８７】
また、グルタミン酸（Ｅ）、メチオニン（Ｍ）は、出現頻度が単調に上昇していたことから、金ナノ粒子との吸着点を担っていると考えられた。また、トリプトファン（Ｗ）も吸着点を担っていると考えられるが、３回目のスクリーニングにおいて出現頻度が減少していたことから、単にトリプトファン（Ｗ）をペプチド内に多く含むだけでは金結合性の向上に限界があると考えられた。
【００８８】
また、３回目のスクリーニングにおいて、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）の出現頻度が大きく上昇したことが明らかとなった。これらのアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）からなる吸着点を補佐するような役割を担っていると考えられた。
【００８９】
トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）及びメチオニン（Ｍ）は、金ナノ粒子との結合において特に重要なアミノ酸であると考えられた。
【００９０】
［実験例１１］
（金結合性ペプチドへの金の結合量の経時変化の検討）
実験例２と同様にして、配列番号５のペプチド、１回目のスクリーニングで得られた配列番号１２のペプチド、２回目のスクリーニングで得られた配列番号２４０及び２４１のペプチド、３回目のスクリーニングで得られた配列番号２９０及び２９１のペプチドがスポットされたペプチドアレイを作製した。
【００９１】
続いて、このペプチドアレイを実験例１で作製した金ナノ粒子溶液に約２週間浸漬し、撹拌した。途中でペプチドアレイを取出し、実験例３と同様にして、ペプチドアレイに結合した金ナノ粒子の色の濃さを数値化し、金の結合量の経時変化を検討した。
【００９２】
図１１は、金の結合量の経時変化を示すグラフである。その結果、反応開始後約１日の時点では、配列番号５のペプチドのシグナル強度と配列番号２９０、２９１のペプチドのシグナル強度には約２倍の差が認められたが、反応開始後約２週間の時点では、シグナル強度の差がほとんどなくなることが明らかになった。これは、１つのペプチドは１つの金ナノ粒子としか吸着できないためであると考えられた。
【００９３】
［実験例１２］
（金結合性ペプチドの解離定数の測定）
配列番号５のペプチドと配列番号２９０のペプチドについて、濃度の異なる金ナノ粒子溶液を用いて金ナノ粒子との結合性を測定し、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔ法により、解離定数を求めた。図１２は、配列番号５のペプチドと配列番号２９０のペプチドのＳｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔを示すグラフである。図１２のグラフの傾きの逆数の絶対値が解離定数となる。
【００９４】
その結果、配列番号５のペプチドの解離定数ｋｄは３．６１×１０−１０［ｓ−１］と計算された。また、配列番号２９０のペプチドの解離定数ｋｄは１．６２×１０−１０［ｓ−１］と計算された。この結果から、スクリーニングによって、２．２倍高い金結合性を有するペプチドが同定されたことが確認された。
【００９５】
［実験例１３］
（金属結合性ドメインの抽出）
実験例５（１回目のスクリーニング）、実験例７（２回目のスクリーニング）及び実験例９（３回目のスクリーニング）の結果を合わせて、陽性対照である配列番号５のペプチドが示した金結合性を１００とした場合の金結合性の相対値が高いものから順に５０種のペプチドを抽出した。抽出したペプチドを表８に示す。
【００９６】
また、同様に、金結合性の相対値が低いものから順に５０種のペプチドをそれぞれ抽出した。抽出したペプチドを表９に示す。
【００９７】
続いて、金結合性が高いペプチドに存在し、金結合性が低いペプチドには存在しない金属結合性ドメインを抽出した。
【００９８】
その結果、下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるドメインが金属結合性ドメインであると考えられた。式（１）中、ｍ及びｐは１〜５の整数を表し、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基又はメチオニン残基を表し、Ｚｎはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基又はスレオニン残基を少なくとも１残基含み、且つフェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びメチオニン残基を含まないアミノ酸配列を表す。
ＸｍＺｎＸｐ  （１）
【００９９】
表８及び９に示すアミノ酸配列において、フェニルアラニン残基（Ｆ）、トリプトファン残基（Ｗ）、チロシン残基（Ｙ）又はメチオニン残基（Ｍ）を太字で示す。上記式（１）で表される金属結合性ドメインは、表８に示すペプチド５０種のうち４３種に存在していた。一方、上記の金属結合性ドメインは、表９に示すペプチド５０種のうち２種にしか存在していなかった。表８には、上記式（１）で表される金属結合性ドメイン及び配列番号も示す。例えば、配列番号２４１のペプチドは、第２〜４残基の領域がアミノ酸配列「ＦＳＳＷ」（配列番号３１５）からなる、上記式（１）で表される金属結合性ドメインを形成していた。また、例えば、配列番号２４２のペプチドでは、第１〜５残基の領域及び第５〜１０残基の領域が、それぞれアミノ酸配列「ＷＹＥＫＷ」（配列番号３１７）及びアミノ酸配列「ＷＱＫＡＮＷ」（配列番号３１８）からなる、上記式（１）で表される金属結合性ドメインを形成していた。
【０１００】
【表８】
2017015661.tif 000012
【０１０１】
【表９】
2017015661.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、スクリーニングされるペプチドの多様性に偏りが生じにくい、金属結合性ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。また、金属結合性ドメインを提供することができる。
【図２】
2017015661.tif 000014
【図４】
2017015661.tif 000015
【図５】
2017015661.tif 000016
【図６】
2017015661.tif 000017
【図９】
2017015661.tif 000018
【図１０】
2017015661.tif 000019
【図１１】
2017015661.tif 000020
【図１２】
2017015661.tif 000021
【図１】
2017015661.tif 000022
【図３】
2017015661.tif 000023
【図７】
2017015661.tif 000024
【図８】
2017015661.tif 000025
【配列表】
2017015661000001.app