(57)【要約】      （修正有）【課題】補酵素の添加なしに２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡとその製造方法の提供。【解決手段】Pseudomonas protegens Pf-５株のＨａｓＡ遺伝子（accession No.WP_０１１０６３６００)の合成工程と、合成ＨａｓＡ遺伝子を発現ベクターpET２８aに挿入する発現ベクター挿入工程と、作製した発現ベクター（pET２８a/ＨａｓＡ）を大腸菌株（BL２１）に形質転換する形質転換体作製工程と、培養条件（ＴＢ培地：誘導温度３０℃）にて発現、得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにてＨａｓＡ発現させる工程と、発現物をＮｉアフィニティーカラムによる精製・回収工程と、固定化用担体に固定化させる工程を含む、不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡとその製造方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡを製造する方法であって；
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列（ＨａｓＡに対応）を用いて合成した遺伝子（ＨａｓＡに対応）を、発現ベクターに挿入する発現ベクター挿入工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記発現ベクター挿入工程により作製した発現ベクターを、大腸菌株に形質転換して形質転換体を作製する形質転換工程と、
培養条件にて発現させえることにより得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにてＨａｓＡ発現させる発現工程と、
前記発現工程における発現物をＮｉアフィニティーカラムにより精製・回収する回収工程と、
前記発現工程により回収されたＨａｓＡを、固定化用担体に固定化させて固定化ＨａｓＡを得る固定化工程とを更に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記遺伝子配列を用いる遺伝子合成において、大腸菌用に配列を最適化して合成すること、または
目的遺伝子の両末端に、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加し、または
合成遺伝子をベクターに挿入した形で作成する、請求項１または２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４】
前記発現ベクター挿入工程における、Ｎｉアフィニティーカラム後のＨａｓＡの精製・回収において、平衡化／洗浄バッファー、溶出バッファーを使用した、次いで、固定化用担体を添加し、振とうする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記発現ベクター挿入工程における固定化用担体が多孔質カオリナイトであって；該多孔質カオリナイトのＨａｓＡ溶液濁度の色の変化から、該固定化の進行を評価する請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記発現ベクター挿入工程で得られた固定化ＨａｓＡを、水分除去し、乾燥し、紛体化処理する請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記多孔質カオリナイトが、オイパーギットＣ２５０Ｌ、トヨナイト-２００、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ａ、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ｍ、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ｐ、トヨナイト２００Ａのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００ＡＧＡ、またはメタクリレート重合体であるレバチット１６００から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
固定化用担体と、該固定化用担体に固定化されたＨａｓＡとを含むことを特徴とする固定化ＨａｓＡ。
【請求項９】
前記固定化ＨａｓＡが、補酵素の不存在下においても不斉酸化反応活性を有する成分を含む、請求項８に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項１０】
前記補酵素が、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）のいずれかである請求項８または９のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項１１】
前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物により発現されたＨａｓＡに由来する請求項８〜１０のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項１２】
前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ生成の期間を要する請求項１１に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項１３】
基質たるラセミ体アルコールに、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液存在下による溶媒を用いる請求項１３に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１５】
前記ＨａｓＡが、固定化用担体に固定化されている請求項１３または１４のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１６】
基質たるラセミ体アルコールに、請求項８〜請求項１２のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１７】
前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、請求項１６に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１８】
前記光学活性アルコールの製造に際して、反応系における溶媒としてｐＨ９.０付近のリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液を用いる請求項１７に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１９】
前記反応系における溶媒としてリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる請求項１８に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２０】
前記反応系における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用する、請求項１９に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２１】
前記反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる請求項１９に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２２】
キャップフリー、ナノ酸素バブル水使用の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う請求項１８に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２３】
反応系におけるＨａｓＡの活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である請求項１８に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２４】
前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２ｍｇを、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間４０時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項２５】
前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である請求項８〜１２および請求項２４のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項２６】
前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する請求項８〜１２および請求項２４のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項２７】
前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である請求項８〜１２および請求項２４のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項２８】
前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体である請求項８〜１２および請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項２９】
前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである請求項８〜１２および請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項３０】
前記ＨａｓＡの多孔質担体への固定化が、吸着によるものである請求項８〜１２および請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【請求項３１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である請求項８〜１２および請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【請求項３２】
前記固定化ＨａｓＡを第１回目の反応に供し、その後該複合体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である請求項８〜１２および請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ−２級アルコールの一方の鏡像体を立体選択的に酸化できる不斉酸化反応を触媒することができる（すなわち、不斉酸化反応活性を有する）固定化ＨａｓＡ（hemophore）、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここに、
医薬、食品分野を始めとする種々の分野において、光学異性体を分離し、有用な一方の光学異性体を分取する技術の必要性が高まっている。例えば、光学異性体の一方を選択的に酸化還元又はデラセミ化する機能を有する不斉水素化（還元）酵素を用いて、医薬品や香料を生成させる方法について研究されている（特許文献１参照）。
【０００３】
このような不斉酸化反応において、その一態様たる「ワンポット反応」は、中間体の単離・精製の手間を省き、それに伴う収率低下の回避・有機合成使用量の低減・反応時間の短縮を可能とする、特に好ましいタイプの環境調和型の合成手法である。ここに、「ワンポット反応」とは、複数の反応を同一反応容器内で進行させ、シンプルな原料から目的生成物を合成する反応をいう。
【０００４】
一般的に、酵素を触媒として用いる反応は、温和な条件で行われ、副反応や反応対象物の熱によるダメージ等を起こすことがない。しかしながら、他方、酵素が高コストであるために、該酵素を効率的に使用して回収効率を高める必要が存在する。このような目的に鑑み、酵素を固定化するための技術開発が進んでいる。例えば、マンガンペルオキシダーゼを、メソポーラスシリカ多孔質担体へ固定化する方法が知られている（特許文献２参照）。 
【０００５】
例えば、「生物化学実験法２８・バイオリアクター実験入門」（学会出版センター）によると、酵素の固定化方法は、「担体結合法」、「架橋法」、および「包括法」の３種類に分類されている。「担体結合法」は、更に共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法に分類される。「共有結合法」は、担体を臭化シアンやヒドラジン等の活性化試薬で処理して活性基を導入して酵素を共有結合させる方法であり、「架橋法」は、グルタールアルデヒド等の多官能性架橋剤架橋を用いる方法であり、包括法は、カラギーナンやアルギン酸等、食用天然高分子原料を用いる方法である。
【０００６】
しかしながら、上述した「共有結合法」では、担体を臭化シアンやヒドラジン等の活性化試薬で処理して活性基を導入して酵素を共有結合で結合させるのが一般的であり、「架橋法」や「共有結合法」の一部では、グルタールアルデヒド等の多官能性架橋剤架橋を用いことが一般的であった。したがって、食品や化粧品、医薬品等、人体に「直接使用」する場合には、これらの化学物質の使用は必ずしも好ましいとは言えなかった。また、包括法の場合も化学物質を酵素溶液と共に重合させるため、実質的に食品や化粧品、医薬品等の用途には好ましいとは言えなかった（特許文献１参照）。
【０００７】
従って、食品や化粧品、医薬品の製造に供しても安全であるような、安定な固定化酵素を調製する方法として、固定化時若しくは固定化後の洗浄時に塩水溶液が存在することにより、担体と酵素とが適度に結合し、酵素反応効率が高く、且つ漏洩がない優れた固定化酵素が開発されてきた（特許文献２参照）。
【０００８】
例えば、酵素の固定化担体にはエポキシ基を有する多孔質アクリル樹脂系担体であるオイパーギットＣ２５０Ｌ（「Eupergit Ｃ２５０Ｌ」）（商品名；デグサジャパン（株）製））、多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００（「Toyonite-２００」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００A（「Toyonite-２００Ａ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００M（「Toyonite-２００Ｍ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００P（「Toyonite-２００Ｐ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００Aのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００AGA、メタクリレート重合体であるレバチット１６００（商品名；バイエル（株）製）などが報告されている。
【０００９】
これらの固定化担体は、例えば、特に限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム等の塩化物、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩等の塩水溶液で、酵素に接触させて吸着させることを特徴とする固定化方法を提供している。
【００１０】
酵素としては、加水分解酵素が好ましく、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、ブロメライン、パンクレアチン、サブチリシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ等のホスホリパーゼ、リパーゼ等の脂質分解酵素が特に好ましく使用されている。
【００１１】
特に、固定化リパーゼは有機合成分野にも注目されており、例えば、キトサン担体であるキトパールＢＣＷ３５１０（富士紡績（株））の湿潤重量１００ｇに対し、１５重量％塩化カルシウム水溶液（イオン強度；０．６９）によって２．５ｍｇ／ｍｌに調製したホスホリパーゼＡ２（Lecitase  １０Ｌ、ノボザイムズ）溶液２００ｍｌを加え、４０℃で３時間混合撹拌した。ホスホリパーゼＡ２溶液をデカンテーションで捨て、１５重量％塩化カルシウム水溶液を２００ｍｌ加え、４０℃で２０分間撹拌した後、１５重量％塩化カルシウム水溶液を除去し、同様の洗浄操作を合計３回繰り返し、固定化ホスホリパーゼＡ２を得た例がある（特許文献１参照）。
【００１２】
このような酵素の作用・機構を有用物質生産や分析に利用するシステムがバイオリアクターであるが、リアクター中に留まる反応素子は金属イオンを活性中心にもつ酵素、即ち、金属酵素の有する電子伝達・移動に元づく機能として理解されてきた（非特許文献１を参照）。
【００１３】
ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群は、有機合成反応への利用が期待され、特に、シトクロムＰ４５０は、不活性な有機基質を水酸化できたり（非特許文献１を参照）、スチレン分子のエポキシ化できたり（非特許文献２を参照）、脱メチル化（非特許文献３を参照）できることが報告されている。
【００１４】
鉄は、酸素をはじめとした気体と親和性を有し、中性ｐＨの還元環境下において容易に電子を授受できる。したがって、鉄は鉄イオンや鉄補欠分子族（鉄−硫黄クラスタ−やヘム）の形でタンパク質と結合し、酸素運搬、エネルギー産生、核酸合成をはじめとする種々の酸化還元反応の活性中心として利用されている。
【００１５】
ヘムタンパク質の機能としては、ヘモグロビンによる酸素運搬（酸素分子の結合）やシトクロムｃによる電子伝達（酸化還元中心）が良く知られている。その働きの中で、コレラ菌由来タンパク質HutZに、１）ヘモグロビンから「ヘム」を菌体内に取込む機能、及び２）酸素を使ってヘム分解できる機能などが知られている（非特許文献４を参照）。
【００１６】
「ヘム」をヘモグロビンから奪って菌体内に取込むタンパク質としては他に、病原性細菌（緑膿菌や結核菌）由来ヘモフォア（ＨａｓＡ；Heme Acquisition System A）がある（非特許文献５を参照）。酸化触媒活性のないヘムタンパク質ＨａｓＡに、不斉酸化反応を付与する為にはＨａｓＡ−レドキシン複合体となる必要があり、鉄−硫黄クラスタ−であるレドキシンが活性中心となることでFenton反応が生じ得る。
【００１７】
鉄及び鉄補欠分子族の代謝調節に関しては、鉄代謝制御タンパク質（IRP: Iron Regulatory Protein）が、細胞内鉄イオン濃度が低い場合のみ、鉄応答性エレメント（IRE：Iron Responsive Element）と結合し、細胞内遊離鉄イオン濃度を高めるように作用することが知られている（非特許文献６を参照）。
【００１８】
一方、鉄−硫黄クラスタ（鉄と硫黄によって構成される構造体で４Fe-４S、２Fe-２S型がある）は、ミトコンドリアのＩＳＣ（Iron-Sulfur Cluster assembly）machineryによって形成され、細胞質のcytoplasmic iron-sulfur cluster assembly (CIA) machineryによって運ばれてＩＲＰに挿入される。この鉄−硫黄クラスタのIRPへの脱着こそ、細胞内の鉄濃度変化を感知して鉄代謝を制御するメカニズムとの報告がある（非特許文献７を参照）。
【００１９】
更に、ヘム生合成の抑制的な転写調節因子（IRR:  Iron Responsive Regulator）は、細胞内の鉄濃度のシグナル伝達分子としてヘムと結合し、そのヘムに分子状酸素が結合することによって活性酸素種が産生され、更に、タンパク質の酸化修飾の進行を促し、転写抑制を解消させる仕組みも報告されている（非特許文献８を参照）。
【００２０】
生物界に広範に存在するシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）は、薬物代謝や解毒、ホルモンの生合成などに関連した不活性な有機基質を水酸化する強力なヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群で、その有機合成反応への利用が期待されている。細菌由来Ｐ４５０は、動植物由来Ｐ４５０より比活性は高く、基質への基質特異性は高い。しかしながら、広範囲な基質酸化には対応できないデメリットがある。
【００２１】
例えば、枯草菌由来Ｐ４５０BSβは過酸化水素を用いて長鎖脂肪酸を水素化することが知られており、シュードモナスプチダ由来のカンファー水酸化酵素のＰ４５０ｃａｍや巨大菌由来Ｐ４５０ＢＭ−３は非常に高い活性を示すことから、広く研究対象とされている（非特許文献１を参照）。また、Ｐ４５０は、他の基質の酸化反応にはまったく適用できないというデメリットも有している。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
また、Ｐ４５０反応として、例えば、枯草菌由来Ｐ４５０ＢＳβによる、スチレンのエポキシ化反応がある（非特許文献２を参照）。
【００２４】
【化２】
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【００２５】
更に、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、内在性の生理活性物質であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を基質とする。ＥＥＴ  は膜リン脂質から切り出されたアラキドン酸がシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）によってエポキシ化された脂肪酸である。即ち、P４５０はEET の合成酵素である。例えば、次のような脱メチル化反応を触媒することが知られている（非特許文献３を参照）。
【００２６】
【化３】
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【００２７】
【化４】
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このように、ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群であるＰ４５０は、活性酸素種による鉄電子移動系の基質酸化として良く知られている。他方、Ｐ４５０は、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）依存性である。すなわち、Ｐ４５０に基づく反応を実現するためには、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）が該反応に関与することが必須である。従って、反応コスト低減の目的及び簡便なワンポット−デラセミ化反応を実現可能な酵素（例えば、２級アルコールの不斉脱水素酵素に関わるＰ４５０）の報告は、未だに確認されていない。
【００２８】
大腸菌発現系によるタンパク質発現は、ＨａｓＡに関しては、比較的に平易な技術である。生産プロセスとして１）蛍光菌ＨａｓＡ由来の遺伝子情報から人口遺伝子合成、２）プラスミド構築、３）小スケール大腸菌発現試験を実施後に発現条件の至適化（宿主、誘導・培養条件など）、４）スケールアップ発現、５）ヒスタグ精製によって生産可能である。例えば、和光純薬工業（株）における委託合成も、対応可能となっている。
【００２９】
遺伝子のタンパク質の発現は、培養細胞・大腸菌・酵母菌・こうじ菌・Bacillus属菌などを用いて行うことができる。大腸菌を用いた発現技術の研究は、歴史が古く（１９７０年初頭）、種々の関連技術の開発が進んでいるため、さまざまな種類のタンパク質の発現に応用されている。汎用的ではあるが分泌による発現ができないため、菌体内部で発現したタンパク質は菌体内に蓄積されてしまい、生産量には限界があるといったデメリットもある。
【００３０】
こうじ菌・Bacillus属菌などの分泌型の微生物は、菌体内で発現させた目的のタンパク質を次々と菌体外に分泌するため、発現量が多いという特長を有し、この特長を生かして洗剤用酵素などのタンパク質の発現技術として利用されている。
【００３１】
しかしながら、分泌型の微生物は、多種のタンパク質を分泌するため、目的とするタンパク質を取り出すための精製が煩雑である。また、これら分泌型の微生物は、菌体外に存在するタンパク質を積極的に分解して利用するという性質をもっている。そのため、この発現方法に適応できるタンパク質は、分解されにくいタンパク質に限定されていた。すなわち、幅広い種類のタンパク質が発現できる汎用性をもちながら、分泌発現量も多い技術はこれまで存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】特開２００４−０６５１５３号（固定化酵素の製造方法）
【特許文献２】特開２００７−０６８５１８号（固定化マンガンペロオキシダーゼ及びその製造方法）
【特許文献３】特許第２８６２５０９号（トヨナイトを用いたタンパク質固定化法に関して）
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】“J. Am. Chem. Soc. １２０,（１９９８）１１０４４-１１０４８”（R Hydroxylation of Carboxylic Acids with Molecular Oxygen Catalyzed by the R Oxidase of Peas (Pisum satiVum): A Novel Biocatalytic Synthesis of Enantiomerically Pure (R)-２-Hydroxy Acids）「Waldemar Adamら」
【非特許文献２】“Tetrahedron ６０,(２００４) ５２５-５２８”（Alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P４５０ BM-３１３９-３）「Edgardo T. Farinasら」
【非特許文献３】“Chem. Res. Toxicol. ９ (１９９６) ３６５-３７３”（Involvement of Cytochrome P４５０ ３A４ Enzyme in the N-Demethylation of Methadone in Human Liver Microsomes）「Christelle Iribarneら」
【００３４】
【非特許文献４】“Chem. Commun. ４８,（２０１２）６７４１-６７４３”（A heme degradation enzyme, HutZ, from Vibrio cholerae）「Takeshi Uchidaら」
【非特許文献５】“J. Inorg. Biochem. １３８, (２０１４)３１-３８”（Spectroscopic studies on ＨａｓＡ from Yersinia pseudotuberculosis）「S. Ozakiら」
【非特許文献６】“Chem.Lett., ４３, (２０１４) １６８０-１６８９” （Unique Heme Environmental Structures in Heme-regulated Proteins Using Heme as the Signaling Molecule）「K. Ishimoriら」
【００３５】
【非特許文献７】“Annual Review of Biochemistry  ７４（２００５）２４７-２８１”（STRUCTURE, FUNCTION, AND FORMATION OF BIOLOGICAL IRON-SULFUR CLUSTERS）「Deborah C. Johnsonら」
【非特許文献８】“Biochemistry, ５０ (２０１１), １０１６-１０２２”（Unusual Heme Binding in the Bacterial Iron Response Regulator Protein: Spectral Characterization of Heme Binding to the Heme Regulatory Motif）「Haruto Ishikawaら」
【非特許文献９】“Inorg. Chem. ５３ (２０１４), ６４７３-６４８１”（Electronic Structure and Formation of Simple Ferryloxo Complexes: Mechanism of the Fenton Reaction）「Alban S. Petitら」
【００３６】
【非特許文献１０】・M.Kamoriら““Kamori５０９号（トヨナイトを用いたタンパク質固定化法に関して）
【非特許文献１１】immobilized lipaseイ（２０００年）、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 発行、第９, ２６９〜２７４頁
【非特許文献１２】・酵素固定化担体Toyoniteパンフレット（英語バージョン、日本語パージョンの２種類）、東洋電化工業株式会社発行。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
本発明の目的は、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）非依存の条件下において、ラセミ−２級アルコールの一方の鏡像体を立体選択的に不斉酸化することができるＨａｓＡを固定化してなる、「固定化ＨａｓＡ」を提供することにある。
【００３８】
本発明の他の目的は、該固定化ＨａｓＡを用いて、所定の目的物を得るためのワンポット反応を実現することにある。
【００３９】
本発明の更に他の目的は、創薬プロセスの環境的側面および安全性およびコスト性に優れた固定化ＨａｓＡ、及びその好適な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
本発明者は、ＨａｓＡ（鉄ポルフィリン錯体）が、２級アルコール基質の不斉酸化反応を触媒できることを発見した。即ち、本発明は、システイン配位ヘム構造を有しないＨａｓＡが、酸素存在下、活性酸素種―鉄電子移動系を与えることができ、基質２級アルコールの一方の鏡像体を立体選択的に不斉酸化可能であることの発見に基づくものである。
【００４１】
【化５】
2017221171.tif 000007
【００４２】
本発明者は、更に鋭意研究の結果、ラセミ−２級アルコールのＲ−アルコール不斉酸化を触媒し、その後Ｓ−アルコールを回収することを可能とする固定化ＨａｓＡ、及びその製造方法を見出した。該固定化ＨａｓＡは、例えば、後述するように、蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子を微生物発現させることで得ることができる。
【００４３】
本発明者は、Ｐ４５０反応では導き得ない、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）非依存系のデラセミ化反応（すなわち、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）の存在を必須としないデラセミ化反応）を実現可能な２級アルコールの不斉酸化反応を触媒するＨａｓＡの存在を発見した。このような還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）非依存系反応を用いれば、更には著しく簡便な「ワンポット−デラセミ化反応」を実現可能である。
【００４４】
ＨａｓＡも鉄ポルフィリン錯体ではあるが、システイン配位ヘム構造を有していない為に、一般的には、Ｐ４５０様の酸化活性は持ちえないと考えられていた。しかしながら、本発明では、ＨａｓＡ中には、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）及び酸化剤（Ｈ２Ｏ２又はｍＣＰＢＡ）非依存系（更には、ワンポット−デラセミ化反応）を実現可能な活性酸素種による鉄電子移動系が認められている。従って、持続可能社会の構築に配慮した新しい酵素として、ＨａｓＡ不斉酸化触媒が、触媒生産のコスト削減と引き続く創薬プロセス削減が確実に期待できる。
【００４５】
本発明は、２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡを製造する方法であって；
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列（ＨａｓＡに対応）を用いて合成した遺伝子（ＨａｓＡに対応）を、発現ベクターに挿入する発現ベクター挿入工程を含むことを特徴とする方法である。
【００４６】
本発明は、例えば、以下の様態を含むことができる。
【００４７】
［１］  ２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡを製造する方法であって；
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列（ＨａｓＡに対応）を用いて合成した遺伝子（ＨａｓＡに対応）を、発現ベクターに挿入する発現ベクター挿入工程を含むことを特徴とする方法。
【００４８】
［２］  前記発現ベクター挿入工程により作製した発現ベクターを、大腸菌株に形質転換して形質転換体を作製する形質転換工程と、
培養条件にて発現させえることにより得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにてＨａｓＡ発現させる発現工程と、
前記発現工程における発現物をＮｉアフィニティーカラムにより精製・回収する回収工程と、
前記発現工程により回収されたＨａｓＡを、固定化用担体に固定化させて固定化ＨａｓＡを得る固定化工程とを更に含む、［１］に記載の製造方法。
【００４９】
［３］  前記遺伝子配列を用いる遺伝子合成において、大腸菌用に配列を最適化して合成すること、または
目的遺伝子の両末端に、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加し、または
合成遺伝子をベクターに挿入した形で作成する、［１］または［２］のいずれか１項に記載の製造方法。
【００５０】
［４］  前記発現ベクター挿入工程における、Ｎｉアフィニティーカラム後のＨａｓＡの精製・回収において、平衡化／洗浄バッファー、溶出バッファーを使用した、次いで、固定化用担体を添加し、振とうする［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
【００５１】
［５］  前記発現ベクター挿入工程における固定化用担体が多孔質カオリナイトであって；該多孔質カオリナイトのＨａｓＡ溶液濁度の色の変化から、該固定化の進行を評価する［１］〜［４］のいずれか１項に記載の製造方法。
【００５２】
［６］  前記発現ベクター挿入工程で得られた固定化ＨａｓＡを、水分除去し、乾燥し、紛体化処理する［１］〜［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
【００５３】
［７］  前記多孔質カオリナイトが、オイパーギットＣ２５０Ｌ、トヨナイト-２００、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ａ、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ｍ、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した固定化用担体であるトヨナイト２００Ｐ、トヨナイト２００Ａのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００ＡＧＡ、またはメタクリレート重合体であるレバチット１６００から選択される［１］〜［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
【００５４】
［８］  固定化用担体と、該固定化用担体に固定化されたＨａｓＡとを含むことを特徴とする固定化ＨａｓＡ。
【００５５】
［９］  前記固定化ＨａｓＡが、補酵素の不存在下においても不斉酸化反応活性を有する成分を含む、［８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００５６】
［１０］  前記補酵素が、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）のいずれかである［８］または［９］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００５７】
［１１］  前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物により発現されたＨａｓＡに由来する［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００５８】
［１２］  前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ生成の期間を要する［１１］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００５９】
［１３］  基質たるラセミ体アルコールに、［８］〜［１２］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【００６０】
［１４］  ［８］〜［１２］のいずれか１項に記載のＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液存在下による溶媒を用いる［１３］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６１】
［１５］  前記ＨａｓＡが、固定化用担体に固定化されている［１３］または［１４］のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６２】
［１６］  基質たるラセミ体アルコールに、［８］〜［１２］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【００６３】
［１７］  前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、［１６］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６４】
［１８］  前記光学活性アルコールの製造に際して、反応系における溶媒としてｐＨ９.０付近のリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液を用いる［１７］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６５】
［１９］  前記反応系における溶媒としてリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる［１８］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６６】
［２０］  前記反応系における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用する、［１９］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６７】
［２１］  前記反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる［１９］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６８】
［２２］  キャップフリー、ナノ酸素バブル水使用の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う［１８］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００６９】
［２３］  反応系におけるＨａｓＡの活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である［１８］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００７０】
［２４］  前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２ｍｇを、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間４０時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［８］〜［１２］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７１】
［２５］  前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［８］〜［１２］および［２４］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７２】
［２６］  前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［８］〜［１２］および［２４］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７３】
［２７］  前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［８］〜［１２］および［２４］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７４】
［２８］  前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体である［８］〜［１２］および［２４］〜［２７］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７５】
［２９］  前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである［８］〜［１２］および［２２］〜［２８］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７６】
［３０］  前記ＨａｓＡの多孔質担体への固定化が、吸着によるものである［８］〜［１２および［２２］〜［２９］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７７】
［３１］  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である［８］〜［１２］および［２２］〜［３０］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【００７８】
［３２］  前記固定化ＨａｓＡを第１回目の反応に供し、その後該複合体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である［８］〜［１２］および［２２］〜［３１］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００７９】
本発明は、更に、例えば以下の様態を含むことができる。
【００８０】
［Ａ１］  補酵素の添加なしに２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡとその製造方法。
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(ＨａｓＡ; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図７)を遺伝子合成する第１の工程と；合成した遺伝子（ＨａｓＡ）を発現ベクター（pET２８a(+)；図８）に挿入する第２の工程。
【００８１】
［Ａ２］  前記第２の工程における作製した発現ベクター（pET２８a/ＨａｓＡ）を、大腸菌株（BL２１）に形質転換して形質転換体を作製する第３の工程と、培養条件（ＴＢ培地：誘導温度３０℃）にて発現、得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにてＨａｓＡ発現させる第４の工程と、発現物をＮｉアフィニティーカラムにより精製・回収する第５の工程と、引き続き、多孔質セラミック球状担体に固定化させる第６の工程を含む不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡを得る請求項１に記載の製造方法。
【００８２】
［Ａ３］  前記第１の工程が、必要に応じて、大腸菌用に配列を最適化して合成したり、目的遺伝子の両末端には、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加したりできる、更には、合成遺伝子をｐＵＣ−５７ベクターに挿入した形で作成できる［Ａ１］に記載の製造方法。
【００８３】
［Ａ４］  前記第２の工程における、Ｎｉアフィニティーカラム後のＨａｓＡの精製・回収において、平衡化／洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）、溶出バッファー（１５０ｍＭ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）を使用後、引き続き、多孔質セラミック球状担体を挿入・振とうして作成できる不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡの製造方法。
【００８４】
［Ａ５］  前記第２の工程における多孔質セラミック球状担体がトヨナイトであって；そのＨａｓＡｐｆ吸着性については、ＨａｓＡｐｆ溶液濁度の色の変化から、Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順であることを特徴とする不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡの製造方法。
【００８５】
［Ａ６］  前記第２の工程で得られた固定化ＨａｓＡが、ろ紙などで水分除去後、低温風またはデシケータ中で乾燥し、紛体化処理できることを特徴とする［Ａ１］〜［Ａ５］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡの製造方法。
【００８６】
［Ａ７］  多孔質セラミック担体の種類が、オイパーギットＣ２５０Ｌ（「Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌ」）（商品名；デグサジャパン（株）製））、多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００（「Toyonite-２００」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００A（「Toyonite-２００Ａ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００M（「Toyonite-２００Ｍ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００P（「Toyonite-２００Ｐ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００Aのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００AGA、メタクリレート重合体であるレバチット１６００（商品名；バイエル（株）製）である固定化ＨａｓＡの製造方法。
【００８７】
［Ａ８］  前記固定化ＨａｓＡは、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、不斉酸化反応を有する成分を含む［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれか１項に記載の不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡ。
【００８８】
［Ａ９］  前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物発現されたＨａｓＡに由来する［Ａ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００８９】
［Ａ１０］  前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ生成の期間（１日）を要する［Ａ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００９０】
［Ａ１１］  基質たるラセミ体アルコールに、［Ａ８］〜［Ａ１０］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【００９１】
［Ａ１２］  前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液存在下による溶媒を要する［Ａ１１］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００９２】
［Ａ１３］  前記ＨａｓＡが、多孔質セラミック球状担体に固定化されている［Ａ８］〜［Ａ１２］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【００９３】
［Ａ１４］  基質たるラセミ体アルコールに、［Ａ７］〜［Ａ１３］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【００９４】
［Ａ１５］  前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、［Ａ１３］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００９５】
［Ａ１６］  ［Ａ１］〜［Ａ９］に記載の微生物発現されたＨａｓＡを、［Ａ１３］に記載の多孔質セラミック球状担体に固定化し、反応系における溶媒としてｐＨ９.０付近のリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液を用いる［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００９６】
［Ａ１７］  ［Ａ１３］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における溶媒として酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００９７】
［Ａ１８］  ［Ａ１３］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも触媒活性を損なわない、［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００９８】
［Ａ１９］  ［Ａ１３］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【００９９】
［Ａ２０］  キャップフリー、ナノ酸素バブル水使用の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１００】
［Ａ２１］  反応系におけるＨａｓＡの活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である［Ａ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１０１】
［Ａ２２］  前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２ｍｇを、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間４０時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［Ａ１］〜［Ａ６］に記載の微生物発現させた固定化ＨａｓＡ。
【０１０２】
［Ａ２３］  前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［Ａ６］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０３】
［Ａ２４］  前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［Ａ６］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０４】
［Ａ２５］  前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［Ａ６］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０５】
［Ａ２６］  固定化用の担体と、該多孔質担体に固定化されたＨａｓＡとを含む固定化ＨａｓＡ。
【０１０６】
［Ａ２７］  前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体［Ａ２６］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０７】
［Ａ２８］  前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである［Ａ２６または２７のいすれか１項］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０８】
［Ａ２９］  前記ＨａｓＡの多孔質担体への固定化が、吸着によるものである［Ａ２６］〜［Ａ２７］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１０９】
［Ａ３０］  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である［Ａ２７］〜［Ａ２９］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【０１１０】
［Ａ３１］  前記固定化ＨａｓＡを第１回目の反応に供し、その後該複合体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である［Ａ２６］〜［Ａ３０］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１１１】
本発明は、更に、例えば以下の様態を含むことができる。
【０１１２】
［Ｂ１］補酵素の添加なしに２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する固定化ＨａｓＡとその製造方法。
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(ＨａｓＡ; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図１５)を遺伝子合成する第１の工程と；合成した遺伝子（ＨａｓＡ）を発現ベクター（pET２８a(+)；図１５）に挿入する第２の工程。
【０１１３】
［Ｂ２］前記第２の工程における作製した発現ベクター（pET２８a/ＨａｓＡ）を、大腸菌株（BL２１）に形質転換して形質転換体を作製する第３の工程と、培養条件（ＴＢ培地：誘導温度３０℃）にて発現、得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにてＨａｓＡ発現させる第４の工程と、発現物をＮｉアフィニティーカラムにより精製・回収する第５の工程と、引き続き、多孔質セラミック球状担体に固定化させる第６の工程を含む不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡを得る請求項１に記載の製造方法。
【０１１４】
［Ｂ３］前記第１の工程が、必要に応じて、大腸菌用に配列を最適化して合成したり、目的遺伝子の両末端には、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加したりできる、更には、合成遺伝子をｐＵＣ−５７ベクターに挿入した形で作成できる請求項１に記載の製造方法。
【０１１５】
［Ｂ４］前記第２の工程における、Ｎｉアフィニティーカラム後のＨａｓＡの精製・回収において、平衡化／洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）、溶出バッファー（１５０ｍＭ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）を使用後、引き続き、多孔質セラミック球状担体を挿入・振とうして作成できる不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡの製造方法。
【０１１６】
［Ｂ５］前記第２の工程における多孔質セラミック球状担体がトヨナイトであって；そのＨａｓＡｐｆ吸着性については、ＨａｓＡｐｆ溶液濁度の色の変化から、Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順であることを特徴とする不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡの製造方法。
【０１１７】
［Ｂ６］前記第２の工程で得られた固定化ＨａｓＡが、ろ紙などで水分除去後、低温風またはデシケータ中で乾燥し、紛体化処理できることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡの製造方法。
【０１１８】
［Ｂ７］多孔質セラミック担体の種類が、オイパーギットＣ２５０Ｌ（「Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ２５０Ｌ」）（商品名；デグサジャパン（株）製））、多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００（「Toyonite-２００」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００A（「Toyonite-２００Ａ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００M（「Toyonite-２００Ｍ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００P（「Toyonite-２００Ｐ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００Aのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００AGA、メタクリレート重合体であるレバチット１６００（商品名；バイエル（株）製）である固定化ＨａｓＡの製造方法。
【０１１９】
［Ｂ８］この固定化ＨａｓＡは、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、不斉酸化反応を有する成分を含む［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれか１項に記載の不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡ。
【０１２０】
［Ｂ９］前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物発現されたＨａｓＡに由来する［Ｂ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１２１】
［Ｂ１０］前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ生成の期間（１日）を要する［Ｂ９］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１２２】
［Ｂ１１］基質たるラセミ体アルコールに、［Ｂ７］〜［Ｂ１０］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【０１２３】
［Ｂ１２］前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液存在下による溶媒を要する［Ｂ１１］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１２４】
［Ｂ１３］前記ＨａｓＡが、多孔質セラミック球状担体に固定化されている［Ｂ７］〜［Ｂ１２］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１２５】
［Ｂ１４］基質たるラセミ体アルコールに、［Ｂ７］〜［Ｂ１３］のいずれか１項に記載のＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【０１２６】
［Ｂ１５］前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、［Ｂ１４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１２７】
［Ｂ１６］に記載の微生物発現されたＨａｓＡを、［Ｂ１３］に記載の多孔質セラミック球状担体に固定化し、反応系における溶媒としてｐＨ９.０付近のリン酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液を用いる［Ｂ１５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１２８】
［Ｂ１７］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における溶媒として酸緩衝液又はグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる［Ｂ１６］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１２９】
［Ｂ１８］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも触媒活性を損なわない、［Ｂ１４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１３０】
［Ｂ１９］に記載の固定化処理されたＨａｓＡを用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる［Ｂ１６］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１３１】
［Ｂ２０］キャップフリー、ナノ酸素バブル水使用の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う［Ｂ１６］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１３２】
［Ｂ２１］反応系におけるＨａｓＡの活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である［Ｂ１６］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【０１３３】
［Ｂ２２］前記固定化ＨａｓＡ（粒径５０μｍ）の２ｍｇを、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間４０時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［Ｂ１］〜［Ｂ８］に記載の微生物発現させた固定化ＨａｓＡ。
【０１３４】
［Ｂ２３］前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［Ｂ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１３５】
［Ｂ２４］前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［Ｂ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１３６】
［Ｂ２５］前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［Ｂ８］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１３７】
［Ｂ２６］固定化用の担体と、該多孔質担体に固定化されたＨａｓＡとを含む固定化ＨａｓＡ。
【０１３８】
［Ｂ２７］前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体［Ｂ２７］に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１３９】
［Ｂ２８］前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである［Ｂ２６］または［Ｂ２７］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１４０】
［Ｂ２９］前記ＨａｓＡの多孔質担体への固定化が、吸着によるものである［Ｂ２６］〜［Ｂ２７］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【０１４１】
［Ｂ３０］以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である［Ｂ２７］〜［Ｂ２９］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の１０ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【０１４２】
［Ｂ３１］前記固定化ＨａｓＡを第１回目の反応に供し、その後該固定化体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である［Ｂ２６］〜［Ｂ３０］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ。
【発明の効果】
【０１４３】
本発明の特徴としては、例えば、以下の２点を挙げることができる。
（ａ）微生物発現ＨａｓＡを多孔質セラミック担体（例えば、東洋電化工業製トヨナイト）を用いて固定化体とした後、２級アルコールの不斉酸化反応へ有効利用すること。
（ｂ）該ＨａｓＡ又は固定化ＨａｓＡが、溶媒中溶存酸素の存在下、活性酸素種の再合成系を通じて、２級アルコールの不斉酸化反応を触媒すること。
【０１４４】
従って、本発明によれば、微生物発現から作製可能な、２級アルコールの不斉酸化反応活性を有する固定化ＨａｓＡが提供される。
【０１４５】
上述したように本発明によれば、実用的な不斉酸化反応を触媒する活性を付与した微生物発現由来の固定化ＨａｓＡが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】微生物発現ＨａｓＡ（以下、ＨａｓＡｐｆと称す）固定化体の製造方法の一態様を表す概念図である。
【図２】ＨａｓＡｐｆの構成元素分析の結果を示す透過電子顕微鏡測定後の（ＺＡＦ）法簡易定量分析による定量結果である。
【図３】固定化ＨａｓＡｐｆ（１８ｍｇ／ｇ）のＦＴＩＲ結果を示すグラフの一例である。
【図４】大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡ（０.６ｍｇ相当）による０．６ｍＭ基質ラセミ−１−（２−ナフチル）エタノール（以下、Ｒａｃ−２と称す）の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中（４．０ｍＬ）における不斉酸化反応を示すグラフの一例である。
【０１４７】
【図５】ＤＭＳＯ補助溶媒の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中（４．０ｍＬ）中、基質Ｒａｃ−２（０．８ｍＭ）に対する不斉酸化に及ぼす影響を示したグラフの一例である。
【図６】５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４．０ｍＬ）中、ゼオライト固定化ＨａｓＡpfのＮａＢＨ４（５０ｍｇ×３）によるワンポットデラセミ化反応の概略図の一例である。
【図７】ヘム捕獲タンパク質（ＨａｓＡ）とヘム受取タンパク質（ＨａｓＲ）の分子機能に関わる一態様を示す模式図、および大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）のゲノム配列（６２７ｂｐ）を示す図である。
【図８】ｐＥＴ２８ａベクターのゲノム配列（５３６９ｂｐ）を示す図である。
【０１４８】
【図９】５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４．０ｍＬ）中、ＨａｓＡ２級アルコール不斉酸化反応における、ヘムの活性酸素種−再合成系を表す模式図の一例である。
【図１０】ＨａｓＡ２級アルコール不斉酸化反応系にて生成される、基質ナプロキセン前駆体（Rac-１）の合成と；更なるナプロキセン合成を示す模式図の一例、及び、従来のナプロキセン合成フローを示す模式図の一例である。
【図１１】大腸菌発現ＨａｓＡ遺伝子の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の一例を示す写真である。
【図１２】固定化ＨａｓＡｐｆ（５ｍｇ）による基質ｒａｃ−２（０．６ｍｇ）／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）における不斉酸化反応の経時変化：光学純度の一例を示すグラフである。図中の記号の意味は、以下の通りである：  （−●−：％ｅｅ），Ｓ−２（−□−：０．２ｍｇ），Ｒ−２（−○−：０．２ｍｇ），そして生成ケトン（−△−）．
【図１３】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（０．６ｍｇ）／基質ｒａｃ−２（０．６ｍｇ）／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）系不斉酸化反応におけるＵＶ測定（０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後）経時変化の結果の一例を示すグラフである。
【０１４９】
【図１４】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）系不斉酸化反応における０時間後と５０時間後のＥＳＲ測定結果の一例を示すグラフである。
【図１５】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）系不斉酸化反応における１００時間後のＥＳＲ測定結果の一例を示すグラフである。
【図１６】ＨａｓＡ溶液（こげ茶色）／トヨナイトの２日振とう吸着後の透明度比較の一例を示す写真である。
【図１７】トヨナイト吸着させて、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）中で５０時間反応後の１）各種ＨａｓＡ溶液残渣による生成ケトン％（−□−：青）、２）各種ＨａｓＡ固定化担体による生成ケトン％（−□−：赤）、３）各種ＨａｓＡ固定化担体による光学純度の結果の一例を示すグラフである。
【０１５０】
【図１８】Toyoniteの細孔分布の一例を示すグラフである。
【図１９】トヨナイトToyoniteのＳＥＭ写真の一例を示すＳＥＭ写真。
【図２０】４種類のToyoniteの有機官能基の違いを示す模式図の一例である。
【図２１】ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体（２００と２００Ａ）の基質濃度と連続再利用の様子の一例を示すグラフである。
【０１５１】
【図２２】ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体（２００Ｐと２００Ｍ）の基質濃度と連続再利用の様子の一例を示すグラフである。
【図２３】蛍光菌ＨａｓＡpf反応における活性酸素種によるヘムＦｅ電子移動サイクルの一例を示す模式図である。
【図２４】固定化ＨａｓＡｐｆ量（０.５ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、６ｍｇ）／４ｍL-５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒系に及ぼす基質濃度（１.２ｍＭ、又は１.６ｍＭ）の不斉変換に及ぼす影響の一例を示すグラフである。
【図２５】図２４のデータに元づく、固定化ＨａｓＡｐｆ量（０.５ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、６ｍｇ）と初速度（ｍＭ／ｈｒ）との関係一例を示すグラフである。
【０１５２】
【図２６】サイリックなデラセミ化反応の模式図１およびグラフの一例である。
【図２７】サイリックなデラセミ化反応の模式図２の一例である。
【図２８】固定化ＨａｓＡが光学分割可能な基質ラセミ−２級アルコール類の一例である。
【０１５３】
【図２９】固定化ＨａｓＡが分割した香料R-１−オクテン−３−オールのＧＣクロマトの一例である。
【図３０】本発明の実施例に使用したＦＴＩＲ測定装置の概要を示す、模式部分断面図である。ダイヤモンド結晶部を示す模式部分断面図である。
【図３１】本発明の実施例に使用したＦＴＩＲ測定装置の概要を示す、模式部分断面図である。加圧治具、試料およびダイヤモンド結晶部の関係を示す模式部分断面図である。
【図３２】ＦＴＩＲ測定の測定領域（１７５０ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１）における、トヨナイト２００と、固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）の計５サンプルにおける濃度違いの波長である。
【図３３】ＦＴＩＲ測定の測定領域（１７５０ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１）において、トヨナイト２００を減算処理した後の固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違い波長である。
【図３４】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違いの検量線（キャリブレーションカーブ）を示す。
【図３５】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違いの検量線（キャリブレーションカーブ）を示す。
【図３６】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違い波長のキャリブレーション作成（キャリブレーション手順−１）およびデータ処理の画面（Ｐａｎｏｒａｍａソフトウェア）である。
【図３７】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違い波長のキャリブレーション作成（キャリブレーション手順−２）およびデータ処理の画面（Ｐａｎｏｒａｍａソフトウェア）である。
【図３８】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違い波長のキャリブレーション作成（キャリブレーション手順−３）およびデータ処理の画面（Ｐａｎｏｒａｍａソフトウェア）である。
【図３９】固定化ＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｇ、４．５ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、１８ｍｇ／ｇ）濃度違い波長のキャリブレーション作成（キャリブレーション手順−４）およびデータ処理の画面（Ｐａｎｏｒａｍａソフトウェア）である。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」及び「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【０１５５】
（固定化ＨａｓＡ）
本発明の「固定化ＨａｓＡ」は、固定化用担体と、該固定化用担体に固定化されたＨａｓＡとを含むものである。このようにＨａｓＡを担体に「固定化」することにより、得られた「固定化ＨａｓＡ」の安定的な利用が可能となる。更には、該「固定化ＨａｓＡ」の繰り返し利用が可能となる。
【０１５６】
（ＨａｓＡ）
本発明において「ＨａｓＡ」とは、「Heme Acquisition System A」を言う。この「ＨａｓＡ」の由来の一態様については、必要に応じて、上記した「非特許文献５」（J. Inorg. Biochem. １３８, (２０１４)３１-３８”（Spectroscopic studies on HasA from Yersinia pseudotuberculosis）を参照することができる。
【０１５７】
（好適な固定化用担体）
本発明において好適に使用可能な「固定化用担体」は、後述する「実施例７」に準じた「ＨａｓＡの固定化」条件において、（後述する実施例１７に示す）ＦＴＩＲ法により測定した固定化用担体（１グラム）当たりの「ＨａｓＡの固定化量」（例えば、図１７の「Ｔ２００」の棒グラフに示すもの）が、２ｍｇ／ｇ以上であることが好ましい。この「ＨａｓＡの固定化量」は、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｇ以上、更には３ｍｇ／ｇ以上、更には３．５ｍｇ／ｇ以上、更には４ｍｇ／ｇ以上、更には４．５ｍｇ／ｇ以上、更には５ｍｇ／ｇ以上、更には５．５ｍｇ／ｇ以上、更には６ｍｇ／ｇ以上、更には６．５ｍｇ／ｇ以上、更には７ｍｇ／ｇ以上、更には７．５ｍｇ／ｇ以上、更には８ｍｇ／ｇ以上、更には８．５ｍｇ／ｇ以上、更には９ｍｇ／ｇ以上、更には９．５ｍｇ／ｇ以上、更には１０ｍｇ／ｇ以上、更には１０．５ｍｇ／ｇ以上、更には１１ｍｇ／ｇ以上、更には１１．５ｍｇ／ｇ以上、更には１２ｍｇ／ｇ以上、更には１２．５ｍｇ／ｇ以上、更には１３ｍｇ／ｇ以上、更には１３．５ｍｇ／ｇ以上、更には１４ｍｇ／ｇ以上、更には１４．５ｍｇ／ｇ以上、更には１５ｍｇ／ｇ以上、更には１５．５ｍｇ／ｇ以上、更には１６ｍｇ／ｇ以上、更には１６．５ｍｇ／ｇ以上、更には１７ｍｇ／ｇ以上、更には１７．５ｍｇ／ｇ以上、更には１７ｍｇ／ｇ以上であることが好ましい。
【０１５８】
上記「実施例７」においては、担体への固定化が確認されたのは、１８ｍｇ／ｇまでであった。しかしながら、多孔質担体の細孔の形状、細孔の配置の態様（例えば、ランダムな内部細孔か否か、または整然と配置された細孔か否か）、および／又は内部細孔のサイズ、等により、より多量のＨａｓＡを担体に固定化することができる。
【０１５９】
いずれにせよ、後述する「実施例１７」に示した、ＦＴＩＲ測定に基づくキャリブレーションカーブを用いる測定法によって、多孔質担体に固定化されたＨａｓＡの量を定量することができる。すなわち、上記したキャリブレーションカーブ測定におけるものと同様のＦＴＩＲ測定条件により、ＨａｓＡ量が未知のサンプルのＦＴＩＲ測定値を求め、該ＨａｓＡ量未知サンプルのＦＴＩＲ測定値と、上記キャリブレーションカーブとから、該ＨａｓＡ量未知サンプルのＨａｓＡ量を決定することができる。このようなＦＴＩＲ測定におけるキャリブレーションカーブを用いる定量法の詳細に関しては、必要に応じて、例えば、以下の参考文献を参照することができる。
・参考文献：全反射型赤外分光法による血糖値の測定（唐津孝ら）：ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ、Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ２，ｐｐ１４９−１５４（２００５）
【０１６０】
（ＨａｓＡの固定化量の測定）
固定化用担体（１グラム）当たりの「ＨａｓＡの固定化量」は、（「実施例７」に準ずる）以下の方法により、好適に測定することができる。
【０１６１】
＜ＨａｓＡの固定化量の測定方法＞
大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（１．８ｍｇ／ｍＬ）５倍量を、（評価対象たる）固定化用担体（１，０００ｍｇ）に吸着固定化させる。
（１）ＨａｓＡ溶液：実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）の方法より大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）を調製する。
（２）固定化：上記（１）の操作で得られたＨａｓＡ溶液５ｍＬに対して、上記「固定化用担体」（１０００ｍｇ）を投下し、２０〜４０時間撹拌する。撹拌は振とう機を使用する。この操作により、蛍光菌ＨａｓＡが担体に固定化される。なお、該「撹拌」操作の終点は、厳密な濁度計（散乱光濁度チェッカーＴＳＣ−１０：ＯＰＴＥＸ社製）の数値により判定できるが、透明度目視チェックからも判断できる。上記固定化の後、ろ過により固定化酵素を得る。
【０１６２】
＜透明度目視チェックを用いた終点の決定法＞
透明度目視チェックを用いた終点の決定法については、例えば、大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）において、蛍光菌ＨａｓＡタンパク質を溶解している透明な50ｍMリン酸緩衝液の原液と比較して、透明度を比較する。その透明度が、原液と同等レベルと判定された場合においては、５０ｈのインキュベーション前（例えば、２０ｈ程度）であっても終点とできる。
【０１６３】
＜散乱光濁度チェッカーを使用した終点の決定法＞
散乱光濁度チェッカー（ＴＳＣ−１０、ＯＰＴＥＸ社製）を使用した終点の決定法については、例えば、大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）において、蛍光菌ＨａｓＡタンパク質を溶解している透明な５０ｍＭリン酸緩衝液の原液を予め散乱光濁度チェッカーで測定し、数値として記録しておき、該懸濁液のトヨナイト吸着後の透明度を数値にて比較する。その透明度が、原液と同等レベル、又は、顕著に減少レベルにある数値を持って、終点と判定できる。場合によっては、５０ｈのインキュベーション前（例えば、２０ｈ程度）であっても終点とできる。
ここに、「透明度が原液と同等レベルである」とは、以下の状態を言う。すなわち、上記の散乱光濁度チェッカーにより測定した原液の濁度をＴ１とし、同様に該散乱光濁度チェッカーにより測定した該懸濁液の濁度をＴ２とした場合に、それらの相対比Ｔｒ＝１００×（Ｔ２−Ｔ１）／Ｔ１の値が、絶対値で２０％以下（すなわち、Ｔｒ＝−２０〜＋２０％の範囲内）である場合に、「透明度が原液と同等レベルである」とすることが好ましい。このＴｒの値は、更には絶対値で１５％以下であることが好ましく、更には絶対値で１０％以下、特に絶対値で５％以下であることが好ましい。
・上記した散乱光濁度チェッカーによる装置・測定法の詳細に関しては、必要に応じて、下記のサイトを参照することができる。
ＵＲＬ：  http://www.optex.co.jp/env/products/tsc10/
【０１６４】
上記「振とう機を用いる撹拌」の条件は、以下の通りである。
振とう機：ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＲＥＣＩＰＲＰＯ ＳＨＡＫＥＲ ＮＲ−１０
振とう方法：「８の字振盪」、５００〜７００回／分（rpm）
【０１６５】
次いで、上記で得られたＨａｓＡ固定化担体における「ＨａｓＡ量」を、（実施例１７に記載した）ＦＴＩＲ法により測定する。
【０１６６】
（好適なＨａｓＡの固定化）
本発明において好適に使用可能な「ＨａｓＡの固定化」であるか否かは、以下の方法により求めた「ＨａｓＡ量」の比（ＨＡ−ｒ）＝１００×（ＨＡ−ｂ）／（ＨＡ−ａ）の値により評価することができる。本発明においては、上記の比（ＨＡ−ｒ）は、１０％以上であることが好ましい。この上記の比（ＨＡ−ｒ）は、更には１５％以上であることが好ましく、更には１８％以上、更には２０％以上、更には２５％以上であることが好ましく、更には２８％以上、更には３０％以上、更には３５％以上であることが好ましく、更には３８％以上、更には４０％以上、更には４５％以上であることが好ましく、更には４８％以上、更には５０％以上、更には５５％以上であることが好ましく、更には５８％以上、更には６０％以上であることが好ましい。
【０１６７】
＜好適なＨａｓＡ固定化の判定方法＞
・最初の「固定化」直後の「ＨａｓＡ固定化担体」（すなわち、評価対象）における「ＨａｓＡ」量を、（実施例１７に記載した）ＦＴＩＲにより定量し、その固定化用担体（１グラム）当たりの「ＨａｓＡ量」を「ＨＡ−ａ」（ｍｇ／ｇ）とする。
・上記（Ｈａ測定後の）ＨａｓＡ固定化担体を、後述する実施例１５に記載の「ワンポッド」反応に供する。
・更に、該使用後のＨａｓＡ固定化担体を、（後述する実施例＊＊      ＊＊に記載の）洗浄操作（１回）に供する。
・上記洗浄後のＨａｓＡ固定化担体における「ＨａｓＡ」量を、上記と同様にＦＴＩＲにより定量し、その固定化用担体（１グラム）当たりの「ＨａｓＡ量」を「ＨＡ−ｂ」（ｍｇ／ｇ）とする。
・上記により得られた２種類の「ＨａｓＡ量」の比（ＨＡ−ｒ）＝＝１００×（ＨＡ−ｂ）／（ＨＡ−ａ）により求める。
【０１６８】
（ＨａｓＡの概要）
本発明のＨａｓＡの製法、物性および反応性の概要は、以下の通りである（これらの詳細は、順次後述する）。なお、本発明の好ましい一態様において、本発明の固定化ＨａｓＡは、少なくともヘムを含有する。
【０１６９】
＜製法＞
本発明において、ＨａｓＡの製法は、特に制限されない。すなわち、該ＨａｓＡは、動植物由来のものであっても良い。
【０１７０】
（好ましい製法）
後述するＨａｓＡの遺伝子工学的手法により、ＨａｓＡリン酸緩衝液を好適に得ることができる。次いで、該ＨａｓＡ溶液にゼオライト担体を添加・吸着固定化に供して、本発明の不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡを得ることができる。図３には、ＦＴＩＲ：１４５０ｃｍ-１〜１７５０ｃｍ-１に特有となるＨａｓＡの吸収により、固定化ＨａｓＡ（トヨナイト２００（１ｇ）中に吸着されたＨａｓＡ量：１８ｍｇ／ｇ）を確認できる。
図１７（Ｔ２００の棒グラフ）に示したように、トヨナイト２００（１ｇ）吸着操作後のＨａｓＡリン酸緩衝液（１８ｍｇ／１０ｍＬ）残液が透明（濁度計（散乱光濁度チェッカーＴＳＣ−１０：ＯＰＴＥＸ社製）である理由から、ＨａｓＡが全て担体に吸着している「１８ｍｇ／１ｇ」と考えた。なお、ＨａｓＡ量を「１８ｍｇ／ｇ」より増大させようとしても、吸着操作後の「白濁」するのみであり、この図１７（Ｔ２００の棒グラフ）の系では、「１８ｍｇ／ｇ」が最大値と考えている。なお、このような「吸着されたＨａｓＡ量」の測定・計算方法は、後述する。
【０１７１】
（好ましい遺伝子工学的製法）
図１の第１工程の操作は、先ず、Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(ＨａｓＡ; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図８)を遺伝子合成する。合成した遺伝子（ＨａｓＡ）を発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ（＋）；図８）に挿入する。作製した発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ／ＨａｓＡ）を大腸菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を用いて、それぞれについて発現培養（ＴＢ培地、誘導温度２点：３０℃）を行い、得られた発現物を用いて、Ｎｉアフィニティーカラムにより精製を行う（図１１）。精製物をウェスタンブロッティングにより確認後、濃度・純度を測定する。精製後のリン酸緩衝液溶媒中蛍光菌ＨａｓＡは、多孔質セラミック抗体を加えて、１〜２日撹拌・吸着させ、不斉酸化反応を触媒できる固定化ＨａｓＡを作成する。
【０１７２】
また、図１１は、蛍光菌ＨａｓＡを大腸菌発現させた「ＨａｓＡｐｆ」、図７はそのヘム付近の分子レベルの結晶構造を示しているが、図１３のUV吸収による５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中ヘムの存在確認、図１４のＥＳＲ結果よるＨａｓＡタンパク質中のアミノ酸Ｈｉｓ―３２とＴｙｒ―７２がヘムに配位した６配位のＥＳＲスペクトル（図１４（ａ））、更には、溶存酸素吸収による、「ヘム→ヒドロキシヘム（ＦｅＩＩＩ−Ｏ−Ｏ−：図１４（ｂ））」と、引き続く、活性型活性酸素種「オキソフェリック型ヘム（ＦｅＩＶ＝O：図１５（ｃ））」の形成による再合成系は支持されている。
【０１７３】
図４と図１２は、微生物発現させた「蛍光菌ＨａｓＡ：図１１」を５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（４ｍＬ）中で反応させた場合のタイムコースを示している。図４は酵素０．６ｍｇ相当を、基質Ｒａｃ-２（０.６ｍｇ）で作用させる一方で、図１２は、固定化ＨａｓＡ（５ｍｇ：ＨａｓＡ−０.０９ｍｇ相当）で作用させている。ゼオライト固定した図１２の活性強度は、図４に比べて訳６倍高く、セラミック抗体へのＨａｓＡ固定の少量により、ＨａｓＡ少量化を実現した結果である。
【０１７４】
図１６、セラミック抗体の４種類のトヨナイトにおける、ＨａｓＡの吸着性を調べた結果であるが、図１７のＨａｓＡ残差における不斉酸化活性がT２００において殆どないことから、トヨナイト２００（T２００）で顕著な吸着性を示しており、セラミック抗体１.０gに対して、凡そ１８ｍｇのＨａｓＡを吸着できることを示した。更に、図２０のように、ＨａｓＡは水酸基を持つ担体（T２００）に強く固定化されるだけでなく、図２１と図２２に示すように、有機溶媒ヘキサンで生成物を抽出後、更に基質添加した場合においても３回は連続再利用が可能なことから、セラミック抗体へのＨａｓＡ固定が、有機溶媒耐性の効果に元づく連続再利用の有効性を示した。
【０１７５】
尚、図２４は、トヨナイト２００に固定化した蛍光菌ＨａｓＡ（以下、SanCat-Superと称す場合がある）の量（０.５ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、６ｍｇ）における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中での初速度を求め、更には、図２５の「ユニット」（Ｕｎｉｔ）を求めることを目的とした図である。酵素活性の単位を示し、１ユニットは、１時間当たり１μモルの基質を変化させることができる酵素量（単位：μモル／ｈ）とする。また、「比活性」は、酵素の単位質量当たりの活性を示す。酵素１ｇあたりの比活性は、単位Ｕｎｉｔ／ｇで表した。この結果から、蛍光菌ＨａｓＡの瞬間速度により算出した比活性は、概ね、３０〜４５Ｕｎｉｔ／ｇ（／時間）であった。
【０１７６】
図２５の結果から、Ｕｎｉｔ（ｍｇ／ｍｉｎ）では、蛍光菌ＨａｓＡの比活性は０．７５±０．０２ｍＵであった。本ＨａｓＡによる反応が、従来のチトクロームP４５０だけでなく、図２３に示すように、活性酸素種の再合成系（Ｆｅ２++Ｏ２→Ｆｅ３+−Ｏ−Ｏ−→Ｆｅ４+＝Ｏ（oxidizing  Ｒａｃ-１／-２）→Ｆｅ２++H２O）に元づくフェントン反応にあることを指示する成果である。
【０１７７】
図２６は、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中（３００ｍＬ）の基質Ｒａｃ−２（１００ｍｇ）の、固定化ＨａｓＡによるＮａＢＨ４（５０ｍｇ×３回）によるデラセミ化反応を示した模式図である。このワンポット反応系として、基質Ｒａｃ−２（４５ｍｇ）を４０時間反応後、残りのＲａｃ−２（５５ｍｇ）を添加し２０時間、撹拌・反応する。その後、NaBH４を１０時間置きに４回（５０ｍｇ×３回）添加することで、凡そ１００時間を要し、＞９９％ｅｅで収率８５％以上のＳ−２を生合成できる。以上の結果、セラミック抗体へのＨａｓＡ固定により、NaBH４添加に耐え得る機能を保持したことを示す結果である。図２７は、そのサイクリックなデラセミ化反応を図式化して示した図である。
【０１７８】
（光学活性アルコールの製造方法）
本発明の好ましい一態様において、光学活性アルコールの製造方法は、基質たるラセミ体アルコールに、固定化ＨａｓＡを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることが特徴である。
【０１７９】
また、ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得ることができ、更に、生成ケトンはNaBH４添加によりワンポットでデラセミ化反応できることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法もまた、本発明により提供される。
【０１８０】
（推定メカニズム）
本発明者の知見によれば、本発明の好ましい一態様において、微生物発現から作られたＨａｓＡが提供されるのは、以下の理由によるものと推定される。
【０１８１】
（推定メカニズムの関連文献）
上記した本発明の「推定メカニズム」のサポートに関しては、薬物代謝や解毒、ホルモンの生合成などに関連したヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群にある。例えば、以下の文献を挙げることができる。非特許文献１では、鉄結合蛋白質には、長鎖カルボン酸をエポキシ化と水酸化によって、二酸化炭素と水に分解するチトクロームＰ４５０が紹介されている。チトクロームＰ４５０を生体触媒とする有機合成反応例として、ここでは水酸化反応についての報告がなされている。
【０１８２】
【化６】
2017221171.tif 000008
【０１８３】
Ｐ４５０によるエポキシ化反応として、例えば、枯草菌由来Ｐ４５０ＢＳβによる、スチレンのエポキシ化反応があり、更には、非特許文献２のＰ４５０ｂｍ−３を使ったアルケン類のエポキシ化反応がある。
【０１８４】
【化７】
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【０１８５】
更に、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、内在性の生理活性物質であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を基質とする。ＥＥＴは膜リン脂質から切り出されたアラキドン酸がシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）によってエポキシ化された脂肪酸である。即ち、Ｐ４５０はＥＥＴ  の合成酵素である。例えば、次のような脱メチル化反応を触媒することが知られている（非特許文献３を参照）。
【０１８６】
【化８】
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【０１８７】
【化９】
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【０１８８】
一方、ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素Ｐ４５０は、活性酸素種による鉄電子移動系の基質酸化として良く知られている一方で、２級アルコールの不斉脱水素酵素に関わる報告は未だない。本特許は、Ｐ４５０以外のヘムタンパク質を使って、不斉酸化反応を触媒する反応を見出した点にある。
【０１８９】
ヘモグロビンから「ヘム」を奪うタンパク質として、コレラ菌由来ＨｕｔＺ（非特許文献４を参照）、緑膿菌や結核菌由来ヘモフォア（ＨａｓＡ；Heme Acquisition System A）（非特許文献５を参照）が知られている。鉄及び鉄補欠分子族の代謝調節に関わるタンパク質としては、鉄イオウクラスタ（４Ｆｅ−４Ｓ、２Ｆｅ-２S型）の鉄代謝制御タンパク質（IRP: Iron Regulatory Protein）（非特許文献７を参照）、鉄応答性エレメント（IRE：Iron Responsive Element）の関与が知られている（非特許文献６を参照）。
【０１９０】
ヘムと鉄の摂取に関与するタンパク質として、タンパク質の酸化修飾の進行を促しその転写抑制を解消させる、ヘム生合成の抑制的な転写調節因子（IRR:  Iron Responsive Regulator）の仕組みも報告されている（非特許文献８を参照）。
【０１９１】
また、鉄イオウクラスタ（４Ｆｅ−４Ｓ、２Ｆｅ−２Ｓ型）のような構造は、アミノ酸システインは、空気酸化に伴うジスルフィド結合形成を形成し、フェントン反応を発現する（非特許文献９を参照）。これらのＰ４５０反応を動かすためには、還元剤酵素ＮＡＤ（Ｐ）と酸化剤（例えば、Ｈ２Ｏ２やｍＣＰＢＡ）が必要であり、活性酸素種の再合成系サイクル（Ｆｅ２++Ｏ２→Ｆｅ３+−Ｏ−Ｏ−→Ｆｅ４+＝Ｏ（oxidizing  Ｒａｃ-１／-２）→Ｆｅ２++H２O）が発現する。
【０１９２】
（各種検討）
以下、本発明の好ましい一態様における、微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（ＨａｓＡｐｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）の固定化体に関する種々の検討を記す。
【０１９３】
固定化ＨａｓＡは、Ｒａｃ−１よりナプロキセン前駆体（S-１、＞９９％ｅｅ）をＮＡＤ（Ｐ）非添加にて、溶存酸素の活性酸素種への変換を通じて不斉酸化・合成できる。図１０（非特許文献：V.V.Thakur, A. Sudalai, Indian J. Chem. ２００５, ４４B, ５５７-５６１）に従い、S-１は平易に医薬品“ナプロキセン”へ化学合成できる。S-１からの有機合成プロセスは、１）水酸基（−ＯＨ）のブロモ化（−Ｂｒ）→２）ニトリル化（−ＣＮ）→３）カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の有機合成である。
【０１９４】
図１０には、ナプロキセン合成の従来方法によるフロー図を示している。ナプロキセンは、芳香族カルボン酸に分類される有機化合物で、鎮痛、解熱、抗炎症薬として用いられる非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の一種である。
【０１９５】
本発明の固定化ＨａｓＡは、該Ｐ４５０のようなシステイン５配位型且つ、自由に酸素と結合できる分子構造でははなく、近傍ヒツチジンと遠位チロシンの６配位型であり、酸素配位による活性酸素種を通じサイクル（Ｆｅ２++Ｏ２→Ｆｅ３+−Ｏ−Ｏ−→Ｆｅ４+＝Ｏ（oxidizing  Ｒａｃ-１／-２）→Ｆｅ２++Ｈ２Ｏ）は盲点となっていた。更に、還元剤酵素ＮＡＤ（Ｐ）と酸化剤（例えば、Ｈ２Ｏ２やｍＣＰＢＡ）が不要、且つ、有益な不斉酸化反応を見出したことは、学術的にも新規な領域となろう。
【０１９６】
図１は、工程１のフローを示す。Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(ＨａｓＡ; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図８)を遺伝子合成、これを発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ（＋）；図８）に挿入、発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ／ＨａｓＡ）を大腸菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３））に挿入して形質転換体を作製、発現培養（ＴＢ培地、誘導温度２点：３０℃、２４ｈ）、発現物のＮｉアフィニティーカラム精製を行う（図１１）、そして、ゼオライト固定化である。
【０１９７】
図２は、大腸菌などの微生物に、蛍光菌由来ＨａｓＡ遺伝子を発現させて得られるＨａｓＡｐｆの製造方法に関するが、緑膿菌や結核菌由来ＨａｓＡ遺伝子により発現した場合においても、蛍光菌由来ＨａｓＡと同様のタイムコース、図４に示す不斉酸化反応を実現可能である。
【０１９８】
本発明で示す不斉酸化反応を触媒する固定化ＨａｓＡｐｆの構成は、（１）大腸菌発現させたＨａｓＡと（２）その土台となるセラミック抗体であり、酸化機能としては、溶存酸素存在下、ＮＡＤ（Ｐ）非添加の中で２級アルコール脱水素反応することを特徴としている。従って、本発明は、従来の２級アルコール脱水素酵素とは明確に異なる反応系を提供している。
【０１９９】
更に、固定化ＨａｓＡは、固定化していないＨａｓＡ酵素に比べて、１）少量のＨａｓＡ量で不斉酸化（６倍以上の力価）でき、２）有機溶媒耐性となり連続再利用ができ、３）、ＮａＢＨ４サイクリック−デラセミ化反応できる、新たなメリットが得られる。
【０２００】
以上から、この発見は、従来の煩雑で煩わしい酵素の精製や単離の工程を含む、従来の亜鉛と補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）電子移動系の２級アルコール脱水素酵素と比べて、不斉酸化反応が、１）補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）添加を要しない点、２）酸素依存的な不斉酸化反応である点、３）５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９）溶媒系の極めて温和な反応系である点、４）更に固定化することで、少量で高活性化でき、コスト的にも操作的にも優位な、しかも連続再利用やＮａＢＨ４サイクリック−デラセミ化反応の応用により、高選択的で高収率に光学活性アルコール（収率＞８０％、９９％ｅｅ以上）が得られる不斉有機合成試薬を提供している。
【０２０１】
（ＨａｓＡの固定化）
本発明のＨａｓＡは、必要に応じて、種々の担体に固定化することができる。このように固定化した該複合体は、該固定化複合体を反応に供した後の、反応溶液と酵素の分離が容易であること、該複合体の再利用が容易であること、連続反応槽（流動槽，カラムなど）における使用が容易であること、等の利点を有する。
【０２０２】
上記固定化に使用すべき「担体」は、該担体に対する本発明のＨａｓＡの固定化が可能である限り、多孔質であるか否かは、特に制限されない。また、該多孔質材料は、例えば、有機質、無機質、有機−無機ハイブリッドのいずれであっても良い。例えば、無機質担体は、タンパク質等の固定に最適な細孔が容易であり、固定した酵素の高い活性発現、長期反応安定性の確保、圧力変形しない、高い耐薬品性等の点から好ましい。他方、有機質担体は、その可撓性（例えば、フィルム状とすること）が容易である。有機−無機ハイブリッド担体は、無機−有機の利点を、適宜、併せ有することが可能である。
【０２０３】
上記「固定化」メカニズムも特に制限されないが、本発明のＨａｓＡ複合体への分子レベルでの相互的適合性の点からは、該「固定化」メカニズムは、「吸着」であることが好ましい。
【０２０４】
上記固定化に使用すべき「担体」は、該担体の表面積が大きいもの（例えば、微粒子状および／又は多孔質の担体）であることが好ましい。本発明において好適に使用可能な担体であるか否かは、後述する「蛍光菌ＨａｓＡの吸着性」を利用するスクリーニングにより、好適に判別することができる。
【０２０５】
（多孔質担体）
多孔質担体としては、例えば、以下の物性を有するものが好適に使用可能である。
・比表面積：２〜３８ｍ２／ｇが好ましく、１０〜３０ｍ２／ｇが更に好ましく、１５〜２５ｍ２／ｇが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、比表面積＝２０ｍ２／ｇ）
・平均細孔径：３０〜１３０ｎｍが好ましく、５０〜１１０ｎｍが更に好ましく、７０〜１００ｎｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、平均細孔径＝８０ｎｍ）
・平均粒径：１０５〜２１０μｍが好ましく、１２５〜１９０μｍが更に好ましく、１４５〜１７０μｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、平均粒径＝１５５μｍ）
・見かけ嵩密度：０．１８〜１．１８ｇ／ｍが好ましく、０．３８〜０．９８ｇ／ｍが更に好ましく、０．５８〜０．７８ｇ／ｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、見かけ嵩密度＝０．６８ｇ／ｍ）
【０２０６】
上記した多孔質担体へのＨａｓＡの固定化方法、多孔質担体の各物性の測定方法に関しては、例えば、特許文献３、非特許文献１０を参照することができる。
有機−無機ハイブリッド担体は、無機−有機の利点を、適宜、併せ有することが可能である。極めて温和な反応系である点、４）更には、両鏡像体の使い分けが可能と報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０２０７】
（好適な担体）
本発明のＨａｓＡを固定化した態様においては、該固定化したＨａｓＡを第１回目の反応に供した後に、該複合体を回収し、更に該回収した複合体を第２回目の反応に供することが容易である。この場合、回収した複合体（すなわち、２回以上の反応に供すべきＨａｓＡ）は、後述する実施例１２（および図２１〜２２）に記載した「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」（％）によって、その有用性を判断することができる。
【０２０８】
より具体的には、実施例１２（または、図２１〜２２）に記載した方法によって、回収した固定化ＨａｓＡについて「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上であることが好ましい。この値は、３５％以上であることが好ましく、更には４０％以上であることが好ましく、特に４５％以上であることが好ましい。
【０２０９】
（ＨａｓＡの吸着性を利用する担体スクリーニング）
基本的には、後述する「実施例１２」の条件を使用することが好ましい。すなわち、担体スクリーニングは、以下の方法で行うことが好ましい。なお、以下の記載から明らかなように、このスクリーニング方法においては、遠心管（いわゆる「スピッツ管」；長さ１８ｍｍ、容量１５ｍＬ程度）を用いて簡便に行うことができる。例えば「振とう機による攪拌」を使用した場合には、１００本程度の遠心管を一度に攪拌することにより、１００種類程度の担体サンプルを一度にスクリーニングすることができる。
【０２１０】
（１）大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液：実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）の方法より、大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）を調製する。
（２）固定化：上記（１）の操作で得られたＨａｓＡ溶液５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、２０〜４０時間、振とう機（例えば、東洋電化工業株式会社製、商品名トヨナイト２００、２００Ａ、２００Ｐ、２００Ｍ）を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分（rpm：rotation per minute）の条件で、２４〜４８時間撹拌する。この操作により、蛍光菌ＨａｓＡが担体サンプルに固定化される。
（３）固定化ＨａｓＡの後処理：
上記（２）の操作で得られた固定化ＨａｓＡは低温風またはデシケータ中で乾燥し（例えば、２４〜４８時間程度）、ＨａｓＡに適した暗所・低温条件下で保管する。
【０２１１】
実施例１２に記載したように、ＨａｓＡｐｆの「トヨナイト」固定化担体への吸着性は、トヨナイト２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順で良好に進行したことが判明した。茶色ＨａｓＡｐｆ溶液は次の様に変化した（図２３を参照）。
・Ｔ２００・・・ＨａｓＡ溶液が透明となった。
・Ｔ２００Ａ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｐ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色（ほぼ透明）となった。
・Ｔ２００Ｍ・・・ＨａｓＡ溶液は薄茶色（やや濃い目）だった。
【０２１２】
すなわち、上記「実施例１２」と同様にして、担体サンプルの使用可能性が簡便に「色」でも判断できる。上記の例では、「トヨナイト２００、トヨナイト２００Ｐおよびトヨナイト２００Ａ」が、このスクリーニングにおいて「使用可能」と判断できる。
【０２１３】
（ケトン変換率による担体の評価）
上記の「担体サンプル」の評価においては、実施例１２（図１７）に示す方法・条件により、各種「担体」吸着−４８時間後の「ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度」（生成ケトンへの変換率）を測定することができる。この測定値の例は、図１７における、各棒グラフのグループ（例えば、トヨナイト−２００に対するグループ）のうちの、最も左側の棒グラフによって示される。例えば、トヨナイト−２００に対する上記の「ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度」（生成ケトンへの変換率）は、約１３％と読み取れる。この生成ケトンへの変換率は、以下の方法によって、測定することができる。
【０２１４】
・（最も左側の棒グラフ）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、各ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水（４ｍＬ／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【０２１５】
より具体的には、図１７（トヨナイト−２００に対する「最も左側の棒グラフ」）の場合に、生成したケトン変換率（％）は、ＧＣ（ガスクロマトグラム）によるシグナル％：即ち、ｒａｃ−１不斉酸化に基づく生成ケトン％又は、不斉酸化されて減った分の基質（Ｒ−１）％によって計算することができる。
【０２１６】
上記した「生成ケトンへの変換率」が小さい程、「より多くのＨａｓＡ」が、担体に固定化されていることとなる。本発明においては、該「生成ケトンへの変換率」が４５％以下であることが好ましい。更には、該「生成ケトンへの変換率」は、４０％以下であることが好ましく、３５％以下、更には３０％以下、更には２５％以下、更には２２％以下、更には２０％以下、更には２０％以下、更には１８％以下、特に１６％以下であることが好ましい。
【０２１７】
（担体の具体例）
本発明ＨａｓＡの固定化においては、例えば、以下のような市販の担体（例えば、有機物ないしタンパク質の固定化に使用可能な担体）が好適に使用可能である。
・「トヨナイト」（Toyonite；東洋電化工業（株）；カオリナイト物質を酸性水熱処理後、造粒焼成し、表面を有機官能基で修飾した多孔質セラミックス球状担体）
トヨナイト−２００（有機官能基として水酸基を持つ担体）、２００Ａ（有機官能基としてアミノ基を持つ担体）、２００Ｐ（有機官能基としてフェニルアミノ基を持つ担体），２００Ｍ（メタクリロ基を持つ担体）
【実施例】
【０２１８】
次に、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これは説明のためのものであって、これにより限定して解すべきではない。
【０２１９】
尚、各実施例において、不斉酸化反応を有する固定化ＨａｓＡは、実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）記載の方法により得た。
【０２２０】
実施例１（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法（ＨａｓＡ遺伝子合成））
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(ＨａｓＡ; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図８)を遺伝子合成する。必要に応じて、大腸菌用に配列を最適化して合成を行う。目的遺伝子の両末端には、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加して合成を行った。受託メーカー依頼して、合成遺伝子をｐＵＣ−５７ベクターに挿入した形で得ることもできる。
【０２２１】
実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法（ＨａｓＡベクターの構築））
３７℃で３時間以上、制限酵素（ＮＥＢ）処理してｐＵＣ−５７から切断した蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子は、アガロースゲルから切り離して精製（ＤＮＡ精製Ｋｉｔ：ＢＥＸ  ＤＮＡ生成キットＩ（ＰＣＲ＆ＧＥＬ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ））され、ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ；図１５）、ｐＥＴ−４７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、又はｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケア）へ導入された。ベクター導入時の試薬として、Ｌｉｇａｔｉｏｎ試薬（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ））、大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ））、抗生物質（アンシピリン又はカナマイシン）、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））を使った。
【０２２２】
ベクターと蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子の連結は、シーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて、シーケンス試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｅｓ  ｖ１．１  ｃｙｃぇＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使って確認した。
【０２２３】
実施例３（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法（形質転換体の構築とＨａｓＡ発現））
構築した発現ベクターは、大腸菌ＢＬ（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）又はＢＬ２１、Ｒｏｓｅｔｔａ２、ＳＨｕｆｆｌｅ（ＮＥＢ）に形質転換し、クローニングする。クローン体をピックアップして、２ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）にて３７℃、一晩、培養する。１０ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）に、前培養液を１ｍＬ添加し、３７℃にて培養する。発現誘導前のサンプルとして、菌体を一部改修しておく。ＯＤ＝１．０付近になったら、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、３０℃で１６ｈ、引き続き培養した。
【０２２４】
実施例４（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法（ＨａｓＡ発現体の精製とその純度確認））
その後、発現大腸菌を遠心分離にて回収し、１ｍＬの大腸菌溶解バッファー（BugBuster Protein Extraction Reagent （Ｎｏｖａｇｅｎ））又は超音波破砕によって、溶菌する。大腸菌溶解液を遠心分離し、可溶性画分の上清を回収する。不溶性画分の沈殿物は、変性バッファー（８Ｍ  Ｕｒｅａ，ＰＢＳ）１ｍＬにて可溶化する。可溶化後、遠心分離を行い、上清を不溶性画分として回収する。
【０２２５】
発現誘導前のサンプル、発現誘導後の可溶性画分、発現誘導後の不溶性画分をそれぞれ２×サンプルバッファーと等量混合し、９９℃で５分、熱処理を行い、泳動サンプルとした。５−２０％グラジエントゲルで２０ｍＡ、７０分ほどＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動の結果、蛍光菌ＨａｓＡが好適に発現できていることを確認した。
【０２２６】
大腸菌のグリセロールストックから植菌し、１０ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）にて３７℃、一晩、培養した。１００ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）に、前培養液を１０ｍＬ添加し、３７℃にて培養した。ＯＤ＝１．０付近になったら、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、３０℃で１６ｈ、引き続き培養した。
【０２２７】
発現大腸菌を遠心分離して回収し、１０ｍＬの大腸菌溶出バッファー（BugBuster Protein Extraction Reagent （Ｎｏｖａｇｅｎ））又は超音波洗浄することで溶菌した。大腸菌溶解液を遠心分離し、可溶性の上清を回収する。Ｎｉアフィニティーカラムに１ｍＬのレジン（TALON Metal Affinity Resin（タカラバイオ））を添加し、平衡化する。上清を平衡化したレジンに添加し、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質を結合させる。カラムに１０ｍＬの洗浄バッファーを添加し、レジンを洗浄する。カラムに３ｍＬの溶出バッファーを添加して、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質を溶出した。
【０２２８】
尚、その際、平衡化／洗浄バッファー（５０ｍＭ  Sodium phosphate、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）、溶出バッファー（１５０ｍＭ、５０ｍＭ  sodium phosphate，３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）を使用した。
【０２２９】
実施例４（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法（発現体の収率））
４Ｌ三角フラスコ中ＴＢ培地２Ｌ（３０℃、２４ｈ）の培養条件にて、該ＨａｓＡ形質転換体を培養し、菌体を遠心沈殿させて回収、これを超音波破砕が、Ｎｉ−アフィニティーカラムにて精製して得られるＨａｓＡ量はおよそ１９８ｍｇであった。図１１のように精製されたＨａｓＡは、続いて、ＦＴＩＲやＥＳＴなどの測定に用いることができる。
【０２３０】
前記のＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法より調製された大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ量は、１回目（６００ｍＬフラスコ培養規模）で凡そ３６ｍｇ（１．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、液量２０ｍｌ）、２回目（４０００ｍＬフラスコ培養規模）で凡そ２００ｍｇ（１．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、液量１１０ｍｌ）であった。図１１には、その蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【０２３１】
尚、上述の大腸菌発現からの蛍光菌ＨａｓＡ産生プロセスは、緑膿菌由来ＨａｓＡや結核菌由来ＨａｓＡについても対応している。即ち、緑膿菌や結核菌由来の大腸菌発についても、ＨａｓＡ濃度（２０μＭ）にて５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９）溶媒中、３日以上、栓をせずに７００ｒｐｍにて撹拌することで、不斉酸化反応を発現する。
【０２３２】
実施例５（蛍光菌ＨａｓＡの不斉酸化反応）
ＨａｓＡ反応系での連続再利用は、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９）溶媒系の有機溶媒濃度が３％以上となると活性が激減するデメリットが有る為、１）有機溶媒耐性、且つ２）連続再利用の有効性の固定化酵素を見出す必要性があった。そこで、実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）より得られる大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（１．８ｍｇ／ｍＬ）×５倍量を、酵素固定化担体−東洋電化工業製トヨナイト（１０００ｍｇ）に吸着固定化することで、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用の有効性、そして３）有機合成反応後の容易分離を可能にすることができた。トヨナイトを使った詳しい手順は次の通りである。
【０２３３】
先ず、図５には、大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（凡そ０．４ｍｇ／４ｍＬ−５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９））による基質ｒａｃ−１（凡そ０．３６ｍｇ／４ｍＬ−５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９））の不斉酸化反応に供した結果を示している。具体的な反応操作方法としては、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９；２０ｍＬ）に対して、大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（１．８ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加して、４ｍＬづつ５本のスピッツ管に分注し、触媒濃度としておよそ０．３６ｍｇ／４ｍＬ溶液を調製し、予め４０℃環境下として撹拌子を挿入した。
【０２３４】
実施例６（蛍光菌ＨａｓＡを固定化する固定化担体の物性）
そこで、該ＨａｓＡｐｆを更に、固定化担体トヨナイトに吸着固定化させたＨａｓＡｐｆを用いた連続再利用の有効性について詳しく述べる。先ず、トヨナイトはリパーゼ不斉加水分解酵素を吸着固定化した実績があるため、トヨナイト固定化担体の概要について説明する。図１８と図１９と図２０は、Toyoniteの細孔分布、ＳＥＭ写真、トヨナイトの種類について、「東洋電化工業株式会社発行の冊子「酵素固定化用担体Ｔｏｙｏｎｉｔｅ」又はその英語版の「New Inorganic Carriers for Immobilization of Wnzymes」パンフレットから、及び、論文「M. Kamori, T. Hori, Y. Yamashita, Y. Hirose, Y. Naoshima, J. Mol. Cat. B, Enzyme 9(4-6) (2000)  269-274」から引用したものである。
【０２３５】
トヨナイトは、カオリナイト物質を酸性水熱処理後、造粒焼成し、表面を有機官能基で修飾した多孔質セラミックス球状担体で（図１８と図１９）、酵素の固定化力が強く活性発現及び長期安定性に優れ、医薬や農薬の中間体、化学品等の工業スケールの製造に適し、東洋電化工業より発売されている酵素固定化担体である。
【０２３６】
Toyonite特徴を要約すれば、以下の通りである：
（１）酵素の固定化が容易：  微細な細孔（細孔分布及びSEM写真）と担体表面の有機官能基の効果により、粗酵素溶液に投入撹拌するだけで酵素蛋白を容易に固定化できる。
（２）高い活性の発現: それぞれの酵素に応じた表面修飾タイプの選択により、酵素と結合力を高め、多量の酵素を固定化でき、高い活性を発現する。そのため、バイオリアクター及び関連装置のコンパクト化が可能。
（３）長期反応安定化の確保: 表面を修飾した有機官能基が酵素と強固に結合する為、活性の低下が非常に少なく長期くり返し使用が可能。
（４）圧力変形しない：強度に優れた球状のセラミックス担体は、カラムに充填しても圧力変形をしない。そのため、工業スケールにおける圧密の心配がない。
（５）強い耐薬品性：  カオリナイト質セラミックス担体であるため、酸、アルカリ、有機溶媒等の耐薬品性に優れている。
【０２３７】
物性：平均粒径−１５５±１５μｍ、見かけ嵩密度−０．６８±０．１５ｇ／ｍＬ、耐薬品性−酸、アルカリ  ｐＨ２〜１０で使用可能、耐熱性−１２０℃の加熱殺菌が可能である。
【０２３８】
Toyoniteの種類：トヨナイトは、２００と２００−Ａと２００−Ｐと２００−Ｍの４種類の有機官能基を持った担体が有り（図２０）、酵素の種類によって選択することができる。また、酵素の性質に応じて種々の官能基で表面を修飾することにより固定化の性能を向上させることが可能である。タイプ１：Toyonite２００−有機官能基として水酸基を持つ担体、タイプ２：Toyonite２００Ａ−有機官能基としてアミノ基を持つ担体、タイプ３：Toyonite２００Ｐ−有機官能基としてフェニルアミノ基を持つ担体、タイプ４：Toyonite２００Ｍ−有機官能基としてメタクリロ基を持つ担体の４種類がある。
【０２３９】
本題のＨａｓＡｐｆのトヨナイトへの吸着固定化について述べるが、先ず、図１６のように、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体への吸着性（結論として、２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ）を検討した実施例（吸着固定化手順、反応操作方法など）を詳述する。
【０２４０】
実施例７（酵素固定化担体−蛍光菌ＨａｓＡのトヨナイトへの吸着性）
大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（１．８ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬ量を、酵素固定化担体−東洋電化工業製トヨナイト（１，０００ｍｇ）に吸着固定化させた。
（１）ＨａｓＡ溶液：実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）の方法より大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）×１０ｍＬを調製する。
（２）固定化：上記（１）の操作で得られたＨａｓＡ溶液１０ｍＬに対して、トヨナイト（１０００ｍｇ）を投下し、２０〜４０時間撹拌する。撹拌は撹拌羽根または振とう機を使用する。この操作により、蛍光菌ＨａｓＡが担体に固定化される。なお、該「撹拌」操作の終点は、厳密な濁度計（散乱光濁度チェッカーTSC-10：OPTEX社製）の数値により判定できるが、透明度目視チェックからも判断できる。
【０２４１】
＜振とう機を用いた撹拌の条件＞
振とう機：ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＲＥＣＩＰＲＰＯ ＳＨＡＫＥＲ ＮＲ−１０
振とう方法：「８の字振盪」、５００〜７００回／分（rpm）
【０２４２】
なお、上記の「振とう機を用いた撹拌の条件」に反して、マグネティックスターラを使用した「攪拌子を用いる固定化」の場合、担体粒子を破壊したり、撹拌子が摩耗する恐れがあるため、好ましい手法ではない。
【０２４３】
上記固定化の後、ろ過により固定化酵素を得る。上記「ろ過」の条件は、以下の通りである。「ろ過」で使用する「ろ紙」としては、その生地が紙系よりは「Glass Microfibre Filters GF/B (Whatman社製)」のような、吸湿性が高く乾燥（水分気化）しやすい素材を使用する方が好ましい。更には乾燥後、固定化酵素と「ろ紙」の吸着性が弱い素材であることが、固定化酵素を好適に回収しやすい理由から特に好ましい。
【０２４４】
（３）固定化ＨａｓＡの後処理：上記（２）の操作で得られた固定化酵素は低温風またはデシケータ中で乾燥し、それぞれの酵素に適した条件で保管した。
【０２４５】
図１６のように、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体への吸着性はトヨナイト２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順で良好に進行した。茶色ＨａｓＡｐｆ溶液は次の様に変化した。
・Ｔ２００・・・ＨａｓＡ溶液が透明となった。
・Ｔ２００Ａ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｐ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｍ・・・ＨａｓＡ溶液は薄茶色（やや濃い目）とだった。
【０２４６】
次に、各種トヨナイト吸着−４８時間後の１）ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度、２）各種トヨナイトによる活性強度、３）その光学純度の結果を図１７に示した。茶色ＨａｓＡ溶液のオリジナルな不斉酸化反応を図５に示すが、図１７では、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト吸着率を示す。青・赤・黄色グラフの具体的な説明は次の通りである。
１．（青）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、の各ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水（４ｍＬ／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた生成ケトン％結果である。
２．（赤）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、ＨａｓＡ固定化担体（１０ｍｇ分／イオン交換水（４ｍＬ）／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた生成ケトン％結果である。
３．（緑）−ＨａｓＡ固定化担体（１０ｍｇ分：赤スケール）における、Ｓ−アルコールの光学純度を示す。
【０２４７】
以上の結果から、ＨａｓＡｐｆはトヨナイト固定化担体と好適に吸着固定化され、トヨナイトがリパーゼのときと同様に、固定化剤として利用可能であることが示された。トヨナイトのＨａｓＡｐｆ吸着性については、ＨａｓＡｐｆ溶液濁度の色の変化から、Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順であった。この吸着性の違いは、トヨナイト４種類の有機官能基の効果にあり、更に基質濃度を０．８ｍＭから１．２ｍＭと２．０ｍＭへ変化させ、ヘキサン（有機溶媒）抽出後の反応溶液の連続再利用を４回まで繰り返すことより、１）有機溶媒への耐性、及び２）連続再利用の効果を確認することにした。
【０２４８】
実施例８（酵素固定化担体による反応）
図１２は、各スピッツ管に基質ｒａｃ−１／ＩＰＡ（２−プロパノール）溶液（４０，０００ｐｐｍ：１０μＬ）をそれぞれ加えることで、基質濃度（およそ０．４ｍｇ）／４ｍＬ溶液として、４０℃で撹拌／反応を開始、任意に反応追跡を行った結果である。図５との違いは固定化ＨａｓＡｐｆであり、図５は固定化せず、図１２ではゼオライト固定化した結果を示している。固定化することで、反応時間が２０時間短縮されたている。
【０２４９】
【表１】
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【０２５０】
実施例９（蛍光菌ＨａｓＡ反応（０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ）のＵＶスペクトル）
図１３は、図５の不斉酸化反応開始後０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後のＵＶスペクトルを測定した結果を示す。蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／ヘムの状態を知る目的であるが、生成ケトンのスペクトル（３５０ｎｍ）が反応時間が進むにつれ、徐々に強い吸光度を示す一方、ヘム（ポルフィリン鉄錯体）スペクトル（４１０ｎｍ）の示す吸収強度差が殆どない点から、不斉酸化反応に伴うＨａｓＡｐｆ／ヘムのノンヘム型への変化は、７２ｈ反応期間中、生じないことが確認された。
【０２５１】
実施例１０（蛍光菌ＨａｓＡ反応（０ｈ、５０ｈ、１００ｈ）のESR測定）
そこで、この不斉変換時におけるＨａｓＡpf／ヘムの構造的変化を更にESRスペクトルにて確認した。図１４は、図５の不斉酸化反応開始後０ｈ、５０ｈ、１００ｈ後のＥＳＲスペクトルをモニタリングした結果である。０ｈ後のＥＳＲシグナル（ｇ＝２．８、２．２２、１．７２）が確認できることより、蛍光菌ＨａｓＡｐｆヘムは、近接ヒツチジン（proximal site）と末端チロシン（distal site）の６配位の低スピン状態にあり、チトクロームＰ４５０のように近接システイン且つ酸素分子が自由配位できる末端オープン構造にないことが確認できた。５０ｈ後の状態から、ＥＳＲシグナル（ｇ＝２．８、２．２２、１．７２）が消失しており、低スピン状態の酸化型ヘムの信号ｇ＝２．８，２．２２，１．７２が消失する点から、ＯＨ−などの強い配位子場を与える配位子がヘムの上下に結合して歪みが生じ、活性酸素種生成に伴う酸化反応がおこることが確認できた。
【０２５２】
図１５より、不斉酸化反応開始１００ｈ後のＥＳＲシグナルｇ＝４．３と２．０を示すことから、オキソフェリル種（ＦｅＩＶ＝Ｏ）が確認されるに至り、以上の結果から、ヘモフォアＨａｓＡｐｆ／ヘムはチトクローム−Ｐ４５０と同様に、活性酸素種生成に伴う酸化反応機構（ＦｅＩＩ＋Ｏ２→ＦｅＩＩＩ-Ｏ-Ｏ-→ＦｅＩＶ＝Ｏ（oxidizing rac-1）→ＦｅＩＩ＋Ｈ２Ｏ）を有することを明確化できた。図９にＥＰＲシグナルを示しているが、チトクロームＰ４５０のように酸素分子が自由配位できる５配位型高スピン状態末端オープン構造にないＨａｓＡにあっても酸化的触媒機能は起こり得ることが明確化された。
【０２５３】
実施例１１（酵素固定化担体−連続再利用の有効性）
図２１と図２２は、試験管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）中にて、基質ｒａｃ−１（０．８  ｍＭ、１．２  ｍＭ、２．０  ｍＭ；  ０．２４〜０．４８  ｍｇ相当）／トヨナイト固定化ＨａｓＡｐｆ担体（３０ｍｇ）／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９：４ｍＬ）にて、４０℃の環境にて撹拌（７００ｒｐｍ）反応させ、反応時間５０ｈ又は７２ｈ後にヘキサン（４ｍＬ）抽出して、ＳとＲ体の比率の光学純度（％ｅｅ）と生成ケトンへの変換率（％）を確認した結果を示している。
【０２５４】
本実施例は、溶媒中に占める有機溶媒濃度３％以上で失活するＨａｓＡ反応系について、ＨａｓＡｐｆ固定化トヨナイト担体で固定化することで解決することを目的とした。即ち、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用の有効性の固定化酵素、３）反応後処理の容易分離を可能にすること目的とした試験である。
【０２５５】
図２１と図２２に示すように、ヘキサン抽出後の固定化ＨａｓＡｐｆについて、更に、基質ｒａｃ−１  （０．８  ｍＭ、１．２  ｍＭ、２．０  ｍＭ；  ０．２４〜０．４８  ｍｇ相当）を添加したみたところ、酵素等の失活は確認されず、繰り返し４回以上、連続再利用が可能であることを発見した。同時に、基質濃度を０．８ｍＭから１．２ｍＭや２．０ｍＭに変えてみた時の結果の方かを以下の様にまとめる。
【０２５６】
実施例１２（トヨナイト固定化担体の種類：吸着性と反応性）
ＨａｓＡｐｆ固定化担体としてトヨナイト２００、トヨナイト２００Ａ、トヨナイト２００Ｐ、トヨナイト２００Ｍの４種類についての評価を行った結果、
１.  トヨナイト固定化担体にＨａｓＡｐｆを吸着させることにより、ヘキサン抽出後も不斉酸化活性が少なくとも４回以上は再現でき、有機溶媒に耐性となっていることを示した。
２.  基質濃度１．２ｍＭ／７２ｈを参考とする結果から、各固定化担体の活性強度順は、”Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＝Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ”であり、ＨａｓＡ吸着性”Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ”と同様の順となった。以上から、ＨａｓＡ活性はトヨナイトへの吸着率に依存していることと判定できた。
３.  トヨナイト２００が最もＨａｓＡ吸着率が高いことが判った。
【０２５７】
基質中濃度系（１．２ｍＭ、７２ｈ）において、トヨナイト２００には若干に劣るが、２００Ａも２００Ｐも２００Ｍも、光学純度（＞９５％ｅｅ）で得られる点で、好適なラセミアルコールの分割剤となることが判った。しかし、トヨナイト２００ＭはＨａｓＡ吸着量が低い為、基質濃度の上昇につれ、活性が低下する。従って、踏み込んだ考察としては、以下のように追記できる。
【０２５８】
４．ＨａｓＡ吸着量が活性強度を示す要因であり、トヨナイト固定化担体の有機官能基の種類
による効果は、吸着性に依存するとことが判った。
５．基質濃度１．２  ｍＭは、固定化ＨａｓＡ同様に最適濃度である一方、固定化ＨａｓＡｐｆは、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用有効性、３）反応後の容易分離のメリットを持つ。
６.  不斉酸化反応におけて使用するＨａｓＡｐｆ量が図５（０．３６ｍｇ）に対して、図２１・図２２の固定化ＨａｓＡｐｆ量は（０．０９ｍｇ：１０ｍｇ）であり、凡そ４倍の酵素量で同様の活性を賄えることを確認した。
【０２５９】
７.  更に、図５（０．３６ｍｇ）に対する基質濃度は０．８ｍＭ／４ｍＬ−水系なのに対し、図２１・図２２の固定化ＨａｓＡｐｆ量は（０．０９ｍｇ：１０ｍｇ）は、１．２ｍＭ／４ｍＬ−５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９）であり、約１．５倍濃度の基質ラセミアルコールの分離に寄与できることを確認した。
【０２６０】
以上の結果から、図２３に示すように、ＨａｓＡｐｆは、１）溶存酸素をヘムが活性酸素種に変えて、２）基質ラセミ２級アルコールの一方のみを立体選択的に酸化する反応機構を有する。更に、３）カオリナイト物質由来固定化担体（トヨナイト）に固定化することで、１）連続再利用の有効性、２）ワンポットによるＮａＢＨ４−デラセミ化反応を触媒するようになり、３）ＨａｓＡ少量での高活性化と４）基質溶液との分離が易しくなるなど簡便化に寄与する。
【０２６１】
活性酸素種再合成系による不斉酸化反応については、図２１や図２２のＥＳＲスペクトルでｇ＝２．８、２．２２、１．７２が消失する知見があり、従来のチトクロームＰ４５０のような、ヘムにシステインが配位した５配位型のみが酸素を配位できる活性型ヘムタンパクだけでなく、毒物分解に寄与できるという新しい概念を、本発明データは言及している。
【０２６２】
実施例１３（トヨナイト固定化ＨａｓＡの活性強度の算出）
図２４と図２５は、トヨナイト２００に固定化した蛍光菌ＨａｓＡ（以下、SanCat-Superと称す場合がある）の量（０.５ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、６ｍｇ）における５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中での初速度を求め、更には、図２５の「ユニット」（Ｕｎｉｔ）を求めることを目的とした図である。酵素活性の単位を示し、１ユニットは、１時間当たり１μモルの基質を変化させることができる酵素量（単位：μモル／ｈ）とする。また、「比活性」は、酵素の単位質量当たりの活性を示す。酵素１ｇあたりの比活性は、単位Ｕｎｉｔ／ｇで表した。この結果から、蛍光菌ＨａｓＡの瞬間速度により算出した比活性は、概ね、３０〜４５Ｕｎｉｔ／ｇ（／時間）であった。
【０２６３】
更に、図９の基質消化系に対する活性中心の再合成回転数をTurnover number(TON)又はS/C（Substrate/Catalyst mol）など表現している；従って、SanCat-super を２ｍｇ(酵素２７μg相当量：０.００１８μM)が、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０、４ｍＬ）中、基質０.６ｍｇ相当量：１.２ｍＭ）を４０℃消化できるので、S/C (Substrate/Enzyme mol)] =は、凡そ１,０００,０００であった。即ち、固定化ＨａｓＡに吸着しているＨａｓＡ−１分子に対し、基質１００万分子を不斉酸化できることを確認した。
【０２６４】
尚、基質溶液の調製は、例えば、基質（１ｇ）を２−プロパノール（２５ｍＬ）溶解し、２４０ｍＭ：４０,０００ｐｐｍを使用でき、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０、４ｍＬ）の調製方法としては、１００ｍＭグリシン（７.５g/L）５０ｍＬに対し、１００ｍＭ水酸化ナトリウム（４.０g/L）８.８ｍＬを加へ、脱イオン水にて１００ｍＬに調整（ｐＨ９.０: １００ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０）、脱イオン水１００ｍＬを加えて５０ｍＭ緩衝液（２００ｍＬ）とすれば得られる。
【０２６５】
実施例１４（最適な固定化ＨａｓＡ量と溶媒量テスト）
固定化ＨａｓＡｐｆ（５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ）を生体触媒として、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０；４００ｍＬ）、反応環境は４０℃にて基質ｒａｃ−２（１００ｍｇ）を作用させた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４：５０ｍｇ）を任意に反応系に投入し、１）デラセミ化を検討すると同時に、２）基質／触媒／溶媒の最適な反応スケールを確かめることにした。
【０２６６】
先ずは、固定化ＨａｓＡｐｆ（２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ）の最適量について調べた結果を次に示す。
【０２６７】
結果から、基質１００ｍｇを５０ｍｇ以上の固定化ＨａｓＡｐｆにて分割合成できることが判った。従って、基質（１００ｍｇ）に対して、固定化ＨａｓＡｐｆ量が５０ｍｇ以上であれば完全に光学分割できることを導いた。更に、固定化ＨａｓＡｐｆ量１００ｍｇ／基質１００ｍｇにおいて、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（４００ｍＬ→３００ｍＬ→２５０ｍＬ→２００ｍＬ）として検討した場合、２００ｍＬ以上であれば、完全に光学分割できることを確認した。得られた結果を、以下の表に示す。
【０２６８】
【表２】
2017221171.tif 000013
【０２６９】
【表３】
2017221171.tif 000014
【０２７０】
実施例１５（固定化ＨａｓＡとＮａＢＨ４を用いるサイクリック−デラセミ化反応）
次に、図２６に示す通り、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４：５０ｍｇ）を定期的に投与することにより、サイクリックデラセミ化反応を生じさせる。即ち、図２６に示すように、ＨａｓＡｐｆはＲ−２のみをケトンに不斉酸化し、生成ケトンはＮａＢＨ４によりラセミのS体とR体へ均等に還元され、そのサイクルを継続させることで最終的に、S-アルコールの化学収率を向上させる方法である。
【０２７１】
鋭意、検討を重ねた結果、次のような反応操作手順を組めば、固定化ＨａｓＡｐｆ（１００ｍｇ）を収率９０％以上、光学純度９８％ｅｅ以上でデラセミ化合成できることを明確化した。
【０２７２】
（サイクリック−デラセミ化反応におけるワンポット反応操作）
（１）基質（４５ｍｇ）／水（３００ｍＬ）／固定化ＨａｓＡ  （２５ｍｇ〜１５０ｍｇ）  ａｔ  ４０℃→４０〜６０時間
（２）   基質（５５ｍｇ）添加  →  ２０時間
（３）ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  １０時間
（４）ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  １０時間
（５）ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  １０時間後、修了。
【０２７３】
サイクリックデラセミ化反応の結果は次の様にまとめられ、即ち、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加が１回きりであれば、基質ｒａｃ−２（１００ｍｇ）を作用させた場合に、固定化ＨａｓＡｐｆ（２５ｍｇ）で収率７５％程度は得られるが、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）×３回では力価が足らずに、９１％ｅｅで収率８０％程度の成果に至る。一方、固定化ＨａｓＡｐｆ量を１００ｍｇへアップさせると、力価が十分となり、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）×３回でも、９９％ｅｅ以上で収率９０％以上の成果に至る。得られた結果を、以下の表に示す。
【０２７４】
【表４】
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【０２７５】
以上の結果から、固定化ＨａｓＡｐｆは、ＮａＢＨ４によるサイクリックデラセミ化反応が可能であり、目的の光学活性アルコールの収量をこの添加のみで向上させ得ることを新たに見出した。更に、基質１００ｍｇ反応における最適なＮａＢＨ４サイクリックデラセミ化反応条件は、５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒中（３００ｍＬ）で、固定化ＨａｓＡ量（１００ｍｇ）であり、ワンポットで、１０時間おきにＮａＢＨ４（５０ｍｇ）×３回で、９９％ｅｅ以上で収率９０％以上の成果に至ることをここに示した。
【０２７６】
実施例１６（固定化ＨａｓＡを用いた各種基質のスクリーニング）
図３５に示すように、固定化ＨａｓＡによる基質メタ位・パラ位置換Ｒａｃ−１−フェニルエタノール類とＲａｃ−２の基質特異性の検討を行った。反応条件は、固定化ＨａｓＡ（５ｍｇ）と５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（ｐＨ９：４ｍＬ）を１８ｍｍφスピッツ管中（キャップをせず）に入れ、撹拌子挿入後に４０℃にて不斉酸化反応（７００ｒｐｍ撹拌）にてさせた結果である。基質溶液（４０，０００ｐｐｍ、１５μＬ）は、基質濃度１．２ｍＭになるように添加した。その結果を次の表にまとめた。得られた結果を、以下の表に示す。
【０２７７】
【表５】
2017221171.tif 000016
【０２７８】
更に、図３６に示すように、香料であるＲ−１−オクテン−３−オールの合成検討を行った。図３６は、固定化ＨａｓＡ（５ｍｇ）と５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒（ｐＨ９：４ｍＬ）を１８ｍｍφスピッツ管中（キャップをせず）に入れ、撹拌子挿入後に４０℃にて不斉酸化反応（７００ｒｐｍ撹拌）にて、基質ラセミ−１−オクテン−３−オールを光学分割した結果を示す。
【０２７９】
この結果から、固定化ＨａｓＡは、基質ラセミ−１−オクテン−３−オールのＳ体のみをケトンに不斉酸化して、６０時間反応後、化学収率が８５％以上、Ｒ−１−オクテン−３−オール（９８．２％ｅｅ）を得た。ＧＣクロマトは、デラセミ化により得られることが判った。
【０２８０】
以上、ＨａｓＡの活性中心は、ヘム鉄電子トランスファーシステムによる活性酸素種によるものである。この反応は、チトクロームＰ４５０にてよく知られていたが、本発明により、６配位型ＨａｓＡ用のヘムタンパクについても適応されうることを新規に証明した結果である。更に、ＨａｓＡ不斉酸化反応は、還元剤のＮＡＤ（Ｐ）を要せず、酸化剤のＨ２Ｏ２やｍＣＰＢＡについても必要ないことが特徴的な新触媒の発見である。
【０２８１】
この発見は、従来の煩雑で煩わしい補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）依存的な２級アルコール脱水素酵素と比べて、不斉酸化反応時に、１）補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）添加を要しないので低反応コスト、２）酸素供給のみにてラセミ体の片方の鏡像体のみを選択的に不斉酸化、３）５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液溶媒系、といった極めて環境に優しく低コスト変換系、しかもＮＡＤ（Ｐ）サイクリックデラセミ化を導入することで、光学活性アルコール（収率＞８０％、９９％ｅｅ以上）が得られることをここに実証した。環境に優しく、低コスト生産を実現可能な新規の不斉有機合成試薬の提供に成功した。
実施例１７（多孔質セラミック担体への吸着量の測定）
【０２８２】
（吸着量測定用サンプルの調製）
サンプルは、多孔質セラミック担体（トヨナイト２００）１ｇに対して、大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡタンパク質溶液（濃度１．８ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬ分を、５０ｍＬ遠沈管中で２日間振とうさせて吸着固定化させたサンプルが５番（１８ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）、該タンパク質溶液５ｍＬ分に５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液５ｍＬ分を加えて、濃度を半減させて吸着固定化させたサンプルが４番（１８ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）、以下、同様の要領にて、サンプル２番（２．２５ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）〜３番（４．５ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）を調製した。
１．  Toyonite２００    （酵素を吸着させていないブランク）
２．  Immobilized-HasApf（２．２５ｍｇ／ｍＬ）    （２．２５ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）
３．  Immobilized-HasApf（４．５ｍｇ／ｍＬ）    （４．５ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）
４．  Immobilized-HasApf（９ｍｇ／ｍＬ）    （９ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）
５．  Immobilized-HasApf（１８ｍｇ／ｍＬ）    （１８ｍｇ／ｍＬ吸着サンプル）
【０２８３】
（ＦＴＩＲ測定）
ダイヤモンドＡＴＲを使用したＡＴＲ法に元づく装置（５５００ａポータブルＦＴＩＲ）を用いて、ＦＴＩＲ測定パラメータ（分解能８ｃｍ−１、積算回数６４回）における吸光度解析に基づき、ＨａｓＡ吸収波長のシグナルを探索した。測定方法は、測定部はでサンプルを結晶上部に置き、上からプレス（トルクレンチタイプ）をして結晶と密着させる測定方法である。装置本体の制御ソフトは、ＭｉｃｒｏＬａｂソフトウェア、キャリブレーション作成およびデータ処理はＰａｎｏｒａｍａソフトウェアを用いた。このデータ処理の概略は、以下の通りである。
・ＦＴＩＲ測定の測定領域：上記の５サンプルは、１７５０ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１の範囲内において、各ＨａｓＡ濃度違いを読み込める顕著な波長を確認した。
・サンプル量：１７５０ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１範囲における「ベースライン」より上の吸収ピークを対象の面積値（定量域）とした。
・ピーク重複箇所（ピークのテーリング箇所）の処理：２〜５のサンプル面積値は、それぞれ、トヨナイト２００を減算した面積値を用いて検量線（キャリブレーション・カーブ）を作成した。
・なお、このようなＦＴＩＲ測定におけるキャリブレーションカーブを用いる定量法の詳細に関しては、必要に応じて、例えば、以下の参考文献を参照することができる。
・参考文献：全反射型赤外分光法による血糖値の測定（唐津孝ら）：ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ、Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ２，ｐｐ１４９−１５４（２００５）
【０２８４】
図１に示すように、１７５０ｃｍ−１〜１４５０ｃｍ−１の拡大表示において、５サンプルの各シグナルの縦軸の示す強度は、各濃度に従って相対的に増加することを確認した。
・測定機器：５５００ａポータブルＦＴＩＲ；株式会社エス・ティ・ジャパン製
・サンプル量：測定機器の「ダイヤモンド結晶」上に、液体サンプル１〜２滴を滴下する（サンプル量は、約１００μＬ（マイクロリットル））
・装置の概要：図３０および図３１に示す。
・測定原理の概要：ＭＬシリーズ装置内部の光源から出た赤外光は干渉計に入る。そしてＺｎＳｅ結晶に入った赤外光はレンズにより集光され、ＺｎＳｅとほぼ同じ屈折率のダイヤモンド結晶に入射する（図３０および図３１を参照）。エバネッセンス波によりダイヤモンドに接触した試料表面の赤外スペクトルを測定できる（図３０および図３１参照）。効率よくダイヤモンドへ光を導入することで、１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の微小な試料も測定することが可能である。洗浄はダイヤモンドの表面を拭きとるだけで簡単である。
・上記ＦＴＩＲ装置の詳細に関しては、以下のＵＲＬを参照することができる。
『 http://www.stjapan.co.jp/WP/wp-content/uploads/2013/09/A2-5500ML-FTIR-マイクロラボ-日本語カタログ-6p.pdf 』
【０２８５】
（定量（キャリブレーション）方法）
図２に示す４本のシグナルデータは、図１のToyonite２００シグナルピークから各濃度違いの４サンプルのピーク面積を減算した結果を示している。減算することにより、より正確な定量（キャリブレーション）値を求めることを目的とした。図３に示す（拡大図を、図３２に示す）グラフは、キャリブレーション結果作成された検量線の様子を示すが、各濃度違いＨａｓＡ（２．２５ｍｇ／ｍＬ→４．５ｍｇ／ｍＬ→９ｍｇ／ｍＬ→１８ｍｇ／ｍＬ）が多孔質セラミック担体（トヨナイト２００）１ｇに吸着される量をＦＴＩＲ強度で示す。
以上から、トヨナイト２００に吸着固定化されるＨａｓＡ量は、濃度に比例していることが明確化された。
【０２８６】
（定量（キャリブレーション）方法）
図３６〜図３９のデータは、装置内キャリブレーション手順を紹介したものである。図３６は「スペクトルの選択と数値入力（この場合スペクトルを４つ全て）」モードを示し、次の図３７では「スペクトルの前処理（ベースライン補正（ＴｗｏＰｏｉｎｔ：赤いラインが入った部分）」にて、１８２５〜１４００cm−１付近でベースを決めている。
更に、図３８はキャリブレーションを行う領域設定であり、実際に検量で確認する領域設定で、１７９９〜１４０１ｃｍ−１を使用している（緑色の領域）。図３９はキャリブレーションに適した因子数の確認であり、ファクター３まで確認して、検量線では１が最適となっている（緑のライン部分）。
【産業上の利用可能性】
【０２８７】
上述したように、本発明によれば、ラセミ−２級アルコールのそれぞれの鏡像体を立体選択的に酸化できる不斉酸化反応を触媒することができ、非選択的酸化を触媒することができるＨａｓＡとその固定化体、およびその製造方法を提供することができる。
【０２８８】
本発明の不斉酸化反応を有するＨａｓＡとその固定化体は、医薬品や香料や食品等のファインケミカル分野において合成される光学活性アルコールなどの光学異性体を製造安価で、環境に優しく、且つ平易に生産することができる新規な不斉酸化触媒である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月12日(2016.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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