(57)【要約】【課題】ユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）を特異的に検出する技術を確立すること。【解決手段】フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）に存在するトランスポソンHopおよびHan間の領域の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドから構成されるユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーセット、当該プライマーセットを含むキット、ならびに当該プライマーセットを用いてフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）を検出する方法。【選択図】図３
2017163861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a),(b),または(c)のオリゴヌクレオチドと、(d)のオリゴヌクレオチドとから構成される、ユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーセット。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号２に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(c) 配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号３に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(d) 配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号４に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを含む、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用キット。
【請求項３】
試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユリ類に根腐れなどの病害をもたらす病原菌フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイの検出用プライマーセット、及び当該プライマーセットを用いて当該病原菌を特異的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シンテッポウユリ（Lilium×formolongi）は、ユリ科ユリ属の多年生草本植物であり、
テッポウユリ（Lilium longiflorum）とタカサゴユリ（Lilium formosanum）の交雑種である。シンテッポウユリは昭和後半から作付けが急増し、切り花として人気が高く、全国各地で栽培されている。シンテッポウユリは、実生繁殖が可能であるため、播種後１年以内に早期開花する性質を有する。シンテッポウユリの栽培は、冬季に播種し、春に定植し、夏から秋にかけて花を収穫する１年１作体系と、株を据え置いて越冬し、翌年の夏から秋にかけて再び収穫する２年１作体系により行われているが、個々の農家の栽培面積が比較的小さい我が国では、連作せざるを得ないことも少なくない。しかしながら、２年１作体系の圃場（連作圃場）では、根・茎盤の褐変や地上部枯草などの成育不良が発生し、シンテッポウユリは連作に弱い作物とされている。この連作障害の原因については、植物病原菌フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）が主因であることが連作圃場で育成したシンテッポウユリの根のARISA法による糸状菌相の解析および分離菌の病原性試験により確認されている。
【０００３】
しかしながら、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）は、侵す植物の種類が違う種内群があり、分化型として区別されているが、同種の分化型は、病原性を調べる以外に識別する方法がない。よって、フザリウム・オキシスポラムの分化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）を迅速かつ正確に識別する手段を確立することは、シンテッポウユリをはじめとするユリ類の病害対策のために非常に重要である。
【０００４】
近年、分子生物学的手法で様々な病原菌を検出する技術が開発されている。早期検出には特異的プライマーによるPCR法が実用的であるが、従来プライマーの設計に用いられているリボゾームDNAやElongation factor遺伝子はフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の分化型間の相同性がほぼ100％であるため、これらの領域から分化型を区別して検出することができない。これに対し、トランスポゾン（転移因子、別名：トランスポーサブルエレメント）は多数の種類が存在し、分化型によって種類が異なることが知られている。また、トランスポゾンの場所やトランスポゾンの間に存在するイントロンと想定される領域の長さも分化型によって様々であることが知られており、イントロンと想定される領域の塩基配列の違いは分化型を検出するのに利用できると考えられる。例えば、これまでイチゴ萎黄病の病原菌であるFusarium oxysporum f.sp.fragariaeの２つのトランスポゾン間（skippyおよびhan間）のイントロン領域にプライマーを設計した例が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Suga et al., Plant Disease, 2013, 97(5):619-625, Development of PCR Primers to Identify Fusarium oxysporum f. sp. fragariae.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）を特異的に検出する技術を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）に存在する5種類のトランスポゾンhan、hop、hornet、skippyおよびimplaのうち、hopおよびhanの間に存在するイントロン領域と想定される約500bpの塩基配列を含む領域が、シンテッポウユリに病原性を示す菌株において特異的であることを見出し、当該領域の塩基配列に基づいて複数のプライマーを設計した。また、設計したプライマーを組み合わせてシンテッポウユリから分離したF. oxysporum 菌株（病原性菌株、非病原性菌株）および F. oxysporumの9種類の分化型から得た DNAを鋳型としてPCRを行ったところ、病原性菌株と F. oxysporum f. sp. lilii のみで増幅産物が得られることを確認し、シンテッポウユリに病原性がある菌株はF. oxysporum f. sp. liliiであることを明らかにするとともに、同菌の検出が可能であるプライマーセットを確立した。本発明をかかる知見により完成させたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の(a),(b),または(c)のオリゴヌクレオチドと、(d)のオリゴヌクレオチドとから構成される、ユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーセット。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(b) 配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号２に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(c) 配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号３に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
(d) 配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号４に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーとして配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同一の機能を有するオリゴヌクレオチド
（２）（１）に記載のプライマーセットを含む、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用キット。
（３）試料より抽出したDNAを鋳型とし、（１）に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、得られた増幅産物を検出する工程を含む、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプライマーセットによれば、シンテッポウユリの連作障害の原因菌であるフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）の特異的検出を迅速かつ簡便に行うことができる。シンテッポウユリは、秋田県や福島県をはじめ東北地方における主力植物であるため、安定した生産と出荷が望まれる。本発明の検出手段を用いることにより、シンテッポウユリの保菌検定や土壌消毒の要否を判定するための圃場診断、作付前の土壌診断等の生産現場の要求に迅速に対応することできる。
また、病原菌の特定および感染診断を短時間に正確に行うことによって、早期に防除対策をとることができ、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）による感染が原因となるシンテッポウユリをはじめとするユリ類の連作障害を未然に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、プライマーセットhopRC/hanFCによる、Fusarium oxysporum菌株より抽出したDNAのPCR増幅産物の電気泳動図を示す（レーン1: A1-41(病原性株）、レーン2: A2-41(病原性株）、レーン3: A2-51(病原性株）、レーン4: D2-11(病原性株）、レーン5:  F.o.f.sp. cucumerinum、レーン6: F.o.f.sp. lycopersici race1、レーン7: F.o.f.sp. lycopersici race2、レーン8: F.o.f.sp. melonis 2、レーン9: F.o.f.sp. melonis 3、レーン10: F.o.f.sp. fragariae 1、レーン11: F.o.f.sp. fragariae 2、レーン12: A2-3(非病原性株）、レーン13: D1-1(非病原性株）、レーン14: D2-4(非病原性株）、レーン15:Negative control、白三角印：増幅産物)。
【図２】図２は、シンテッポウユリに病原性を示すフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum：A1-41）のトランスポゾンhan,およびhop間の塩基配列およびプライマー設計部位を示す。
【図３】図３は、本発明のフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーセット(Ａ．LhopF1/LhopR1、Ｂ．LhopF2/LhopR1、Ｃ．LhopF3/LhopR1)による、Fusarium oxysporum菌株より抽出したDNAのPCR増幅産物の電気泳動図を示す（レーン1: A1-41(病原性株）、レーン2: A2-41(病原性株）、レーン3: A2-51(病原性株）、レーン4: D2-11(病原性株）、レーン5: F.o.f.sp. lilii、レーン 6: F.o.f.sp. gradioli、レーン 7: F.o.f.sp. tulipae、レーン8:  F.o.f.sp. cucumerinum、レーン9: F.o.f.sp. lycopersici race1、レーン10: F.o.f.sp. lycopersici race2、レーン11: F.o.f.sp. melonis 2、レーン12: F.o.f.sp. melonis 3、レーン13: F.o.f.sp. fragariae 1、レーン14: Negative control)。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）検出用プライマーセット
本発明のフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）、以下、F. oxysporum f. sp. liliiと表記する）検出用プライマーセットは、シンテッポウユリに病原性を示すF. oxysporumのトランスポゾンhopおよびhanの間に存在するイントロン領域の塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドのペアから構成されるプライマーセットである。
【００１２】
本発明のプライマーセットによって検出されるフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（F. oxysporum f. sp. lilii）によって侵されるユリ類には、ユリ科ユリ属の植物が含まれ、園芸用または食用を問わない。例えば、テッポウユリ（Lilium longiflorum）、オニユリ（Lilium lancifolium）、ササユリ（Lilium japonicum）、カノコユリ(Lilium speciosum)、コオニユリ（Lilium leichtlinii）、ヒメユリ（Lilium concolor）、タカサゴユリ（Lilium formosanum）、コマユリ（Lilium amabile）、ウケユリ（Lilium alexandrae）、ニワシロユリ（Lilium candidum）、ヤマユリ（Lilium auratum）、マツバユリ（Lilium cernuum）、タケシマユリ（Lilium hansonii）、キカノコユリ（Lilium henryi)、ハカタユリ(Lilium brownii)、スカシユリ(Lilium maculatum)、マルタゴンリリー（Lilium martagon）、クルマユリ（Lilium medeloides）、ウコンユリ（Lilium nepalense）、タモトユリ（Lilium nobilissimum）、イトハユリ（Lilium pumilum）、リーガルリリー（Lilium regale）、オトメユリ（Lilium rubellum）、またはこれらの交雑種(例えば、テッポウユリ（Lillum longiflorum）とタカサゴユリ（Lilium formosanum）の交雑種であるシンテッポウユリ）等が挙げられるが、これらに限定はされない。上記のユリ類のうち、ヤマユリ、コオニユリ、オニユリは、その鱗茎（ユリ根）が食用とされている。
【００１３】
プライマーの設計は、特定した塩基配列に対して、オリゴヌクレオチドの長さ、GC含量、Tm値、オリゴヌクレオチド間の相補性、オリゴヌクレオチド内の二次構造などを考慮して行うが、例えば、「PCR法最前線−基礎技術から応用まで」（蛋白質・核酸・酵素 臨時増刊号 1996年 共立出版株式会社）や、「バイオ実験イラストレイテッド3 本当にふえるPCR：細胞工学別紙 目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著 株式会社秀潤社）、「PCRテクノロジー−DNA増幅の原理と応用−」（Henry A Erlich編、加藤邦之進 監修、宝酒造株式会社）等を参考にすればよい。
【００１４】
具体的に採用したプライマーの設計基準は以下のとおりである。
(1) プライマー長は鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングが可能とするために、15〜30bpの範囲であること。
(2) 増幅される領域の塩基数が、300〜500bpであること。
(3) アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR増幅産物を得るため、Tm値が50〜70℃、好ましくは55〜65℃で互いに近似したプライマーを選定すること。
(4) プライマーの3’末端の塩基配列と鋳型DNA配列との相同性が高いこと。
(5) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないように、両プライマー間の相補的配列を避けること。
(6) プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列を避けること。
(7) 鋳型DNAとの安定な結合を確保するため、GC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。
【００１５】
プライマーの設計は、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００１６】
上記基準に基づいて、フォワード用として以下の3種のオリゴヌクレオチド(LhopF1、LhopF2、LhopF3)、リバース用として以下の1種のオリゴヌクレオチド（LhopR1）を設計した。
【００１７】
LhopF1: 5’-TTGACAYYTTGGGGAGGGAGATTT-3’（配列番号1）
LhopF2: 5’-GCTTMGGACTTGACAYYTTGGGGA-3’（配列番号2）
LhopF3: 5’-CTGCCYTGRCTATMYYYAAGCTTM-3’（配列番号3）
LhopR1: 5’-GTAGCCTACAGCTATCTAT-3’ （配列番号4）
【００１８】
上記フォワード用の3種のオリゴヌクレオチド(LhopF1、LhopF2、LhopF3)の配列において、YはCまたはT、MはAまたはC、RはAまたはGを表す。LhopF1、LhopF2、LhopF3は、Y、M、Rで示された部位に、それぞれ指定された２種のいずれかの塩基を用いたプライマーとしてもよく、同時に含んでいる縮重プライマーとしてもよい。縮重プライマー中の各プライマーの割合はいかなる割合でもよいが、各プライマーが等量で存在することが好ましい。
【００１９】
LhopF1の好ましい例として、5’-TTGAGACTTTGGGGAGGGAGATTT-3’（配列番号５）、LhopF2の好ましい例として、5’-GCTTTGGACTTGAGACTTTGGGGA-3’（配列番号６）、LhopF3の好ましい例として、5’-CTGCCTTGACTATCTCTAAGCTTT-3’（配列番号７）からなるオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
したがって、本発明のF. oxysporum f. sp. lilii検出用プライマーセットは、LhopF1とLhopR1、LhopF2とLhopR1、LhopF3とLhopR1のいずれかの組み合わせより構成される。
【００２１】
また、プライマーセットを構成する配列番号１〜４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと実質的に同一の機能を有する範囲で、その塩基配列に改変を加えたオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２２】
そのような改変オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜４に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなり、かつF. oxysporum f. sp. lilii検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号１〜４に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含めばよいが、全長は30塩基以下が好ましい。連続する少なくとも15塩基のオリゴヌクレオチド中の存在部位（3’末端側、5’末端側）についても特に限定はされない。また、改変オリゴヌクレオチドの他の例としては、配列番号１〜４の塩基配列に対して90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、F. oxysporum f. sp. lilii検出用プライマーとして機能しうるオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変には、欠失、置換、挿入、又は付加が含まれ、改変させる塩基の数は、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個である。また、塩基の付加は、３'側でも５'側でもよい。
【００２３】
プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００２４】
上記のプライマーセットを用いてPCR増幅を行うと、試料にF. oxysporum f. sp. liliiが含まれる場合は、他のF. oxyporumでは認められない特異的な増幅産物が得られる。従って、F. oxysporum f. sp. liliiを、ユリ類には病原性を示さないF. oxyporumと区別して特異的に検出することができる。
【００２５】
また、上記オリゴヌクレオチドは、これらをプライマーとするPCR増幅産物の検出を容易にするために、標識物質をつけたオリゴヌクレオチドであってもよい。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる蛍光物質（FITC、ROC等）、放射性物質、化学発光物質（例えば、DNP）、酵素基質、ビオチン・アビジン系標識等を用いることができる。標識方法は末端標識でも、配列の途中への標識でもよい。また、ヌクレオチドの糖、リン酸基、塩基部分のいずれへの標識であってもよい。
【００２６】
上記のプライマーセットはキット化することもできる。本発明のキットは、上記プライマーセットを少なくとも含むものであればよく、必要に応じて、PCRの陽性コントロールとなる標的配列を含むDNA分子、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬（プライマーセットを除く）、標識物質、滅菌水、標品（標準菌株など）、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。
【００２７】
２．フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイ（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）の検出方法
本発明によればまた、上記のプライマーセットを用いてユリ類に病原性を示すF. oxyporum f. sp. liliiを検出する方法が提供される。本方法は、試料より抽出したDNAを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、該PCRによって得られた増幅産物の有無を検出する工程を含む。ここで、F. oxyporum f. sp. liliiの検出には、当該F. oxyporum f. sp. liliiの有無の判定及び定量を包含するものとする。
【００２８】
試料としては、ユリ類の組織(根、花、苗）や種子、ユリ類を栽培する圃場土壌等があげられる。
【００２９】
試料からのDNAの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール/クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法などにより行うことができる。また、試薬メーカーより販売されている各種DNA抽出キットを用いてもよい。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行うことが望ましい。
【００３０】
次に、上記の操作で得られたDNA試料を鋳型とし、前記のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅産物の有無を検出する。PCR増幅は前記のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、鋳型DNAの変性、プライマーへの鋳型へのアニーリング、および耐熱性酵素（TaqポリメラーゼやThermus themophilis由来のTth DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、前記のプライマーセットに挟まれる特定の遺伝子配列を含む断片を増幅させる。PCR反応液の組成（鋳型DNA量、緩衝液の種類、プライマー濃度、DNAポリメラーゼの種類や濃度、dNTP濃度等）、PCR反応条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、前記のプライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択および設定することができる。プライマーのTmに基づいて適当なPCR反応条件を選択する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、最初に94℃で5分間の変性反応、次に94℃で50秒間（変性）、55℃で50秒間（アニーリング）、72℃で60秒間（伸長）を1サイクルとして30サイクル、最後に72℃で1分間の伸長反応により実施することができる。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することも可能である。これらPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
【００３１】
PCR増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやリアルタイムPCR等の方法を用いて行う。例えば、アガロースゲル電気泳動では、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出し、その大きさに基づいてユリ類に病原性を示すF. oxysporum f. sp. liliiを検出する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて当該PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。また、DNAハイブリダイゼーションでは、マイクロアレイなどの固定化担体にPCR増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によりPCR増幅産物を確認する。検出用の固定化担体は、検出すべき上記F. oxysporum f. sp. liliiの配列とハイブリダイズしうる配列を有するDNA断片が固定化されている支持体である。支持体としては、例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコンチップなどを用いることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
(実施例１) F. oxysporum f. sp. lilii菌株に特異的なプライマーの設計領域の選抜
1.方法
(1)プライマー設計領域の候補及び使用プライマー
既報（Suga et al., Plant Disease, 2013, 97(5):619-625, Development of PCR Primers to Identify Fusarium oxysporum f. sp. fragariae.）の方法に基づいて、異なる2つのトランスポゾン、および異なる2つのトランスポゾン間に存在するイントロンと想定される領域を増幅し、その塩基配列からユリ類に病原性を示す菌株を特異的に検出するプライマーに適すると思われる領域の選抜を試みた。
【００３４】
トランスポゾンの増幅には、上記Suga et al.(2013）に記載の方法を参考に、han、hop、hornet、skippyおよびimplaの5種類のトランスポゾンを増幅させるプライマーhanF/R、hopF/R、hornetF/R、skippyF/RおよびimplaF/Rを用いた。また、トランスポゾン間のイントロンと想定される領域の増幅には、上記のプライマーの塩基配列を逆方向に増幅させるプライマー（complementary sequence primer）hanFC/RC、hopFC/RC、hornetFC/RC、skippyFC/RCおよびimplaFC/RCを、合計25通りの組み合わせで使用した。
【００３５】
(2) 供試菌株
シンテッポウユリに病原性を示す供試菌4菌株（A1-41、A2-41、A2-51、D2-11）、シンテッポウユリに病原性を示さない供試菌3菌株（A2-3、D1-1、D2-4）、およびF. oxysporumの分化型の標準菌株7菌株（F. oxysporum f. sp. cucumerinum、F. o. f. sp. lycopersici race1、F. o. f. sp. lycopersici race2、F. o. f. sp. melonis 2、F. o. f. sp. melonis 3、F. o. f. sp. fragariae 1、F. o. f. sp. fragariae 2）を使用した。
【００３６】
(3) DNAサンプル（菌体からのDNA抽出）
PDB液体培地で生育した各供試菌の菌体をミクロスパーテル1杯分とり、蓋付きの2.0 ml凍結保存用チューブに入れ、菌体が底に位置するようにメタルコーンを加えた。蓋をしてマイクロチューブを液体窒素に5分間浸して冷却処理し、バグクラッシャー(TAITEC社)で10秒間攪拌した。菌体が粉末状になっていることを確認したら、PEX solution 300 μlを加え、蓋をして再度バグクラッシャーで10秒間攪拌した。メタルコーンを取り出したマイクロチューブを60℃に設定したヒートブロックに30分間静置した後、15,000 rpm室温5分間で遠心分離した。上清160 μlを1.5 mlマイクロチューブに移し、99.5% エタノール400 μlを加えて混合後、15,000 rpm室温5分間で遠心分離した。上清を取り除き、70% エタノール600 μlを加えて混合後、15,000 rpm室温1分間で遠心分離した。上清を全て除去して、5分間吸引乾燥した後、滅菌水100 μlを加えてDNAを溶解させ、使用時まで-30℃で保存した。
【００３７】
(4) PCR法および電気泳動
PCR 混合液の組成は10×buffer 2μl、2 mM dNTP Mix（アプライドバイオシステムス社, USA）2 μl、20 μl BSA（仔牛血清アルブミン：1 mg/ml, バイオラブズ社, USA）2 μl、20 μMフォワードプライマー 0.2 μl、20 μM リバースプライマー 0.2 μl、5U/μl Ampli TaqGold DNA Polymerase（アプライドバイオシステムス社, USA） 0.1 μl、滅菌水（SDW：Sterile Distilled Water）12.5 μl、そして鋳型DNA溶液1 μlの合計20 μlとした。PCRは95℃10分間を1サイクル、94℃1分間、55℃1分間および72℃2分間を35サイクル、72℃7分間を1サイクルの反応条件により行った。PCR産物は100 base Ladder (タカラバイオ) を分子量マーカーとして電気泳動 (2.0%アガロースゲル、泳動量6 μl、50分間、100V)を行った。ゲルはエチジウムブロマイド溶液(臭化エチジウム10 μl＋TAE (Tris Acetir acid EDTA溶液) 100 ml)で10分間染色し、UVイルミネーター上で紫外線照射 (302 nm) し、バンドの有無を観察した。
【００３８】
2．結果
5種類のトランスポゾンを増幅させるプライマー（hanF/R, hopF/R, hornetF/R, skippyF/RおよびimplaF/R）を使用してPCRをした結果、全ての組み合わせでシンテッポウユリに病原性を示す菌株からDNA断片が増幅されなかった。
【００３９】
5つのトランスポゾン間のイントロン領域と想定した領域を増幅させるためのプライマー（hanFC/RC、hopFC/RC、hornetFC/RC、skippyFC/RCおよびimplaFC/RC）を使用した結果、han FC/hop RCおよびhop FC/han RCによる組み合わせによって、シンテッポウユリに病原性を示す菌株からDNA断片が増幅された。これら2種類の組み合わせのうち、hop-han間を増幅するプライマーhop RC/han FCによるPCRでは、病原性を示す菌株から増幅されたDNA断片は他の菌株と異なる長さであった（図１）。han-hop間を増幅するプライマーhan RC/hopFC、hornet-han間を増幅するhan FC/hornet RC、impla-han間を増幅するプライマーhan FC/impla RCおよびskippy-han間を増幅するプライマーhanFC/skippy RCでは、他の分化型のF. oxysporumでは増幅されたが、病原性を示す菌株で増幅が確認されなかった。これら以外の組み合わせでは、全ての菌株で増幅が確認されなかった。
【００４０】
以上の結果から、hop RC/han FC間のイントロン領域の増幅産物の塩基配列がプライマーの設計に適していると想定した。
【００４１】
(実施例２) F. oxysporum f. sp. lilii菌株に特異的なプライマーの設計
１．方法
(1) PCR産物の精製
ユリ類に病原性を示す菌株にプライマーを設計するために、実施例１においてプライマーhopFC/hanRCを使用したPCRで増幅が確認された5種類のPCR産物（A2-41, A2-51, F. oxysporum f. sp. lycopersici race1, F. oxysporum f. sp. melonis 3, F. oxysporum f. sp. fragariae 2から増幅；図１の白三角印で示したPCT産物）を使用した。
【００４２】
塩基配列の解析に使用する際、サンプルはillustra GFX PCR DNA and Gel Band Durificatiob Kit (GE Healthcare) によって精製した。まず、DNAを増幅されたPCR産物17μlとCaputure buffer 2 100 μlを混合した。この混合液をエコノスピンチューブのカラムに移して1分間静置した後、15000 rpmで1分間遠心分離した。遠心後、上清を捨て、Wash buffer 500 μlを加えて15000 rpmで1分間遠心分離し、カラム内のDNAを洗浄した。遠心分離によって水分を除去したカラムを1.5 mlチューブに移し、20 μlのSDWを入れて1分間静置してDNAを溶解させ、15000 rpmで1分間遠心分離した。カラムを取り外し、PCR産物と同様の方法で濾過した液体の電気泳動および染色を行った。染色後、増幅産物の有無からDNAの精製の成否を確認した。
【００４３】
(2)塩基配列解析
200 ml PCR用チューブに5 mMに希釈したフォワードプライマー（han RC）1 μl、(1)で純化精製したDNA 5 μlを入れ、混合した後にFlash遠心して塩基配列解析に使用した。リバースプライマー（hopFC）についても、同様の操作を行った。調製したサンプルを秋田県立大学バイオテクノロジーセンターで塩基配列を解析し、BlastまたはFusarium IDで検索して供試菌と相同性の高い菌を記録した（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。解析した塩基配列をマルチシーケンスにかけ、シンテッポウユリに病原性を示す供試菌のみが特異的にもつ塩基配列を特定した。特定した塩基配列を基に、一番目の塩基がアデニン（A）以外、GC含量を50 ％、プライマーの長さ約20 bpとなるようにプライマーを設計した（図２）。
【００４４】
２．結果
その結果、以下のフォワードプライマー3種類（LhopF1、LhopF2、LhopF3）、リバースプライマー2種類（LhopR1、LhopR1）を設計した。
(フォワード)
LhopF1: 5’-TTGAGACTTTGGGGAGGGAGATTT-3’ 
LhopF2: 5’-GCTTTGGACTTGAGACTTTGGGGA-3’
LhopF3: 5’-CTGCCTTGACTATCTCTAAGCTTT-3’
(リバース)
LhopR1: 5’-GTAGCCTACAGCTATCTAT-3’
LhopR2: 5’-TCTACCAAATCTATCTACA-3’
【００４５】
(実施例３）設計したプライマーの特異性確認（１）
１．方法
設計したフォワードプライマー3種類（LhopF1、LhopF2、LhopF3；以下、それぞれF1、F2、F3と表記する）およびリバースプライマー2種類（LhopR1、LhopR2；以下、それぞれR1、R2と表記する）を使用して、シンテッポウユリに病原性を示す菌株のみが増幅されるか検証した。
【００４６】
(1) 供試菌株
シンテッポウユリに病原性を示す供試菌8菌株（A1-41、A2-41、A2-51、D2-11、1bk-1、1bk-2、3b-1、3b-6）、シンテッポウユリに病原性を示さない供試菌5菌株（A2-3、D1-1、D2-4、1b-1、1r-2）、およびF. oxysporumの分化型の標準菌株9菌株（F.o.f.sp. cucumerinum、 F.o.f.sp. lycopersici race1、F.o.f.sp. lycopersici race2、F.o.f.sp. melonis 2, F.o.f.sp. melonis 3、F.o.f.sp. fragariae 1、F.o.f.sp. lilii、F.o.f.sp. gladioli、F.o.f.sp. tulipae）を使用した。
【００４７】
(2) DNAサンプル（菌体からのDNA抽出）
実施例１と同様にして供試菌株からDNA抽出を行った。
【００４８】
(3) PCR法および電気泳動
実施例２で設計したフォワードプライマー3種類（F1、F2、F3）およびリバースプライマー2種類（R1、R2）の全ての組み合わせ(F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2、F3/R1、F3/R2)を用いて実施例１の方法に従ってPCRを行い、電気泳動により増幅を確認した。
【００４９】
２．結果
結果を下記表１に示す。
【００５０】
【表１】
2017163861.tif 000003
【００５１】
表１に示すように、F1/R1、F2/R1、F2/R2、F3/R1の組み合わせは病原性を示す菌株でのみ増幅産物が得られた。そのうち、F1/R1、F2/R1およびF3/R1の組み合わせは病原性を示す菌株の増幅産物が濃く得られた(図３Ａ〜Ｃ)。
【００５２】
(実施例４）設計したプライマーの特異性確認（２）
連作圃場で生育したシンテッポウユリの根から抽出したDNAをサンプルとして、設計したプライマーを用いてPCRによる検出を行った。
【００５３】
１．方法
(1) 供試植物
福島県農業技術センターの連作圃場で採取したシンテッポウユリ26株から得た根26サンプルを使用した。
【００５４】
(2) DNAサンプル（植物組織からのDNA抽出）
抽出にはDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン株式会社）を使用した。水道水で洗浄した
シンテッポウユリの根0.1 gを2.0 mlマイクロチューブに入れ、メタルコーン（小）を加えた。チューブに蓋をして液体窒素に約2分浸けた後、ビーズショッカー（MB455AU, 安井器械株式会社）で1,500 rpmで30秒間粉砕した。根が粉末状になっていることを確認したら、メタルコーンを取り出し、AP1 buffer 400 μl加えてボルテックスで混合した。さらにRNase(100 mg/ml) 2 μlを加えボルテックスで混合し、65℃に設定したヒートブロックに10分間静置した。AP2 buffer 130 μlを混合し、氷上で5分間静置した後、15,000 rpmで5分間遠心分離した。QIAshredder Miniスピンカラムを準備し、ろ液を350 μl移して15,000 rpmで2分間遠心分離をした。カラムを除去し、ろ液を新しい1.5 mlチューブに300 μl移し、AP/3 buffer 500 μlを加えた。混合液を新しいスピンカラム（DNeasy Miniスピンカラム）に400 μl移して8,000 rpmで1分間遠心分離し、ろ液を除去した。残った混合液をカラムに入れ、再度同様の操作を行った。カラム洗浄するためにAW buffer 500 μlを加えて8,000 rpmで1分間遠心分離した。ろ液を捨て、再度AW buffer 500 μlを加えて15,000 rpmで2分間遠心分離による再度の洗浄と乾燥を行った。新しい1.5 mlチューブにカラムを乗せ、AE buffer 100 μlを加えカラム内のDNAを溶解させ、室温で5分間静置した後8,000 rpmで1分間遠心分離した。再度同様の操作を行い、全量200 μlのDNA溶液として使用時まで-30℃で保存した。
【００５５】
(3) PCR法および電気泳動
実施例３において有効性が確認された3種類のプライマーセット（F1/R1、F2/R1、F3/R1）を用いて実施例１と同様にしてPCRを行い、電気泳動により増幅を確認した。
【００５６】
２．結果
3種類のプライマーの組み合わせのうち、2種類の組み合わせ（F2/R1, F3/R1）で増幅
が確認された。これら2種類のプライマーの組み合わせによって無処理圃場で生育したシンテッポウユリ26株の根のうち、22株の根からDNA断片が検出された（検出率約84 %）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によれば、ユリ類に病原性を示すフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リリイの特定及び感染の診断を迅速かつ簡便に行うことができる。本発明は、園芸分野、農業分野、アグリビジネスの分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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