(57)【要約】      （修正有）【課題】悪液質の治療又は予防に有用な新規薬剤の提供。【解決手段】インターフェロン−βを有効成分として含有する悪液質の治療剤又は予防剤。前記インターフェロン−βは、ポリエチレングリコール等のポリオキシアルキレングリコールと共有結合していることが好ましい。【効果】前記共有結合体をヒトを含む哺乳動物に投与した場合、血中半減期が長く、生体に持続的に作用するため、悪液質に対する優れた治療効果又は予防効果を期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−βを有効成分として含有する、悪液質の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
前記インターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合している、請求項１記載の悪液質の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項２記載の悪液質の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
前記悪液質は、がん悪液質である、請求項１〜３のいずれか一項記載の悪液質の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪液質の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪液質とは、基礎疾患に関連して生ずる複合的代謝異常の症候群のことであり、脂肪量の減少の有無に関わらず筋肉量の減少を特徴とするものであると定義されている（非特許文献１）。悪液質が発症する基礎疾患としては、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌疾患、感染症又は後天性免疫不全症候群等の慢性疾患が挙げられ、著しい体重減少、貧血、浮腫、食欲不振、全身衰弱又は倦怠感等を主症状とすることが知られている（非特許文献２及び３）。中でも悪性腫瘍を基礎疾患とする悪液質は、がん悪液質と呼ばれ、悪性腫瘍死因の約２０％を占めると言われている（非特許文献４）。
【０００３】
がん悪液質では、症状の進行に伴って患者の体力が著しく減弱するため、抗腫瘍剤の投与ができなくなり、逆に、悪液質の症状を改善するために栄養補給を行うと、かえって悪性腫瘍の増悪を加速させることになるため、がん悪液質の発症は、悪性腫瘍の治療に重大な支障を来たしている。仮に、患者に体力があり、抗腫瘍剤の投与が可能であったとしても、骨髄毒性等の副作用が生じ、悪液質は改善しないことが報告されている（非特許文献５）。
【０００４】
悪液質では、活性化された免疫システムや腫瘍細胞から産生されるインターロイキン−１（以下、ＩＬ−１）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子（以下、ＴＮＦ−α）等の炎症性サイトカインが病態形成に深く関わっていることが知られており（非特許文献６）、悪液質患者の血中のＩＬ−６濃度は、体重減少の程度及び生存率と関連しているため、ＩＬ−６で誘発される血中Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）濃度は、血中アルブミン濃度と共に悪液質の診断マーカーとされている（非特許文献７）。
【０００５】
悪液質の治療には、酢酸メゲステロールやメドロキシプロゲステロン等の食欲刺激剤（非特許文献８）が主に使用され、これら以外にも、デキサメサゾンやプレドニゾロン等のステロイド系抗炎症薬１，２−ジフェニルピロール誘導体（特許文献１）、カルボン酸アミド誘導体（特許文献２）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（特許文献３）、グレリン様低分子化合物（特許文献４）及びアンドロゲン受容体モジュレーター（特許文献５）等の薬剤が有効とされている。さらに、慢性炎症の改善をする場合には、サリドマイドが使用されるケースもあり、最近では、臨床試験段階にある抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−６抗体及び抗ＩＬ−６受容体抗体が悪液質の治療に有効であると考えられている（非特許文献８及び９）。
【０００６】
一方、インターフェロン−βについては、癌治療薬、多発性硬化症治療薬、慢性Ｂ型肝炎治療薬及び慢性Ｃ型肝炎治療薬としての用途が広く知られ、虚血性再灌流傷害又は多臓器不全治療薬としての用途（特許文献６）、癌性腹水及び癌性胸水の治療薬としての用途（特許文献７）も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−９５６８５号公報
【特許文献２】特開平５−４３４６６号公報
【特許文献３】国際公開第９８／０５１３２９号
【特許文献４】国際公開第０５／０９７２６１号
【特許文献５】国際公開第０２／０６６４７５号
【特許文献６】国際公開第０７／０４２６０２号
【特許文献７】国際公開第１３／１２９５４９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｅａｒｏｎら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１１年、第１２巻、ｐ．４８９−４９５
【非特許文献２】Ｋｅｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９８８年、第１２巻、ｐ．２８６−２９８
【非特許文献３】Ｌaｈｄｅｖｉｒｔａら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９８８年、第８５巻、ｐ．２８９−２９１
【非特許文献４】Ｔｉｓｄａｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、１９９７年、第８９巻、ｐ．１７６３−１７７３
【非特許文献５】Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１２巻、ｐ．２１３−２２５
【非特許文献６】Ａｒｇｉｌeｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｃａｒｅ、２００３年、第６巻、ｐ．４０１−４０６
【非特許文献７】ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１３ 年、第３９巻、ｐ．５３４−５４０
【非特許文献８】Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｇｉｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３年、第７巻、ｐ．６４５−６５６
【非特許文献９】安藤ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１３年、第３１巻、ｅ６９−７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、悪液質の治療に使用される食欲刺激剤は、代謝異常に対する改善効果認められないため治療効果が限定的であり、ステロイド系抗炎症薬は、副作用が強いために長期的な使用が困難であるといった問題点がある。
【００１０】
また、インターフェロン−βについては、悪液質の治療効果又は予防効果については一切の報告がなく、悪液質の治療に有効な医薬の創出が期待されている。
【００１１】
そこで本発明は、悪液質の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、インターフェロン−βが悪液質に対する優れた治療効果又は予防効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、インターフェロン−βを有効成分として含有する、悪液質の治療剤又は予防剤を提供する。
【００１４】
上記のインターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合していることが好ましく、ポリエチレングリコールと共有結合していることがより好ましい。
【００１５】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、投与された場合、血中半減期が長く、生体に持続的に作用するため、悪液質に対する優れた治療効果又は予防効果を期待できる。
【００１６】
また上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、がん悪液質の治療剤又は予防剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の悪液質の治療剤又は予防剤は、慢性疾患における悪液質の治療又は予防に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−Ａ】悪液質モデルにおけるマウス・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の血漿中アルブミン量に及ぼす作用を示す図である。
【図１−Ｂ】悪液質モデルにおけるマウス・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の血漿中マウスＩＬ−６量に及ぼす作用を示す図である。
【図１−Ｃ】悪液質モデルにおけるマウス・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の血漿中ヒトＩＬ−６量に及ぼす作用を示す図である。
【図１−Ｄ】悪液質モデルにおけるマウス・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の腫瘍重量に及ぼす作用を示す図である。
【図２】悪液質モデルにおけるマウス・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体及びヒト・インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体の混合液を投与したときの体重低下改善作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の悪液質の治療剤又は予防剤は、インターフェロン−βを有効成分として含有することを特徴とする。
【００２０】
上記のインターフェロン−βは、天然に存在するインターフェロン−β（以下、天然型インターフェロン−β）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型インターフェロン−βのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インターフェロン−βとしての生物活性（以下、インターフェロン活性）を有するインターフェロン−βのアミノ酸変異体を包含し、さらに、天然型インターフェロン−βの糖鎖部分が改変されたインターフェロン−β及び糖鎖部分を有しないインターフェロン−βをも包含する。
【００２１】
上記のインターフェロン−βは、天然型インターフェロン−βのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製された組換え型インターフェロン−βも包含する。
【００２２】
上記のインターフェロン−βは、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、インターフェロン−βを発現する天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得ることができる。また、インターフェロン−βとして、市販のインターフェロン−βも用いることができる。
【００２３】
上記のインターフェロン−βはＩ型インターフェロンに属するため、他のＩ型インターフェロンであるインターフェロン−α、インターフェロン−ω、インターフェロン−ε及びインターフェロン−κについても、悪液質の治療剤又は予防剤として期待できる。また、インターフェロン−λについても同様の効果が期待できる。
【００２４】
上記のインターフェロン−βは、化学的に修飾されたものも包含する。この化学的な修飾は、インターフェロン−βがインターフェロン活性を有することができる限り、任意のものであってよい。例えば、上記のインターフェロン−βは、インターフェロン−βとポリマーとの共有結合体、インターフェロン−βと脂質との共有結合体、及び、インターフェロン−βと他のタンパク質との融合タンパクをも包含する。
【００２５】
インターフェロン−βとポリマーとの共有結合体は、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体であることが好ましい。
【００２６】
上記のポリアルキレングリコールは、インターフェロン−β１分子に対して、１分子又は２分子以上が結合することができるが、インターフェロン−β１分子に結合するポリアルキレングリコールの分子量の合計は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。ただし、インターフェロン−β１分子に分子量２０，０００のポリアルキレングリコール２分子が共有結合している場合は、インターフェロン−β１分子に分子量４０，０００のポリアルキレングリコールが共有結合したことを意味する。
【００２７】
また、上記のポリアルキレングリコール１分子に対して、インターフェロン−β１分子又は２分子以上が結合することもできるが、この場合であっても、ポリアルキレングリコール１分子の分子量は、５，０００以上５２０，０００以下が好ましく、１０，０００以上２００，０００以下がより好ましく、３９、０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。
【００２８】
なお、ポリアルキレングリコールは、１個の分子が多数の繰り返しユニットからできており、ポリアルキレングリコールの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるポリアルキレングリコールの分子量とは、平均分子量の意味である。
【００２９】
ポリアルキレングリコールとしては、薬物キャリアとして許容される高分子化合物であり、生体に対して不活性若しくは極めて低活性であり、かつ、無毒若しくは極めて低毒性であるものが好ましく使用できる。
【００３０】
「インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体」とは、インターフェロン−β１分子に対してポリアルキレングリコール１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、又は、ポリアルキレングリコール１分子に対してインターフェロン−β１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、を意味するが、インターフェロン−β１分子に対してポリアルキレングリコール１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているものが好ましい。なお、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとが直接結合したものであっても、リンカー等を介して結合したものであってもよい。
【００３１】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体の投与量は、インターフェロン力価（ユニット；以下、Ｕ）又は質量（ｇ）で表すことができる。インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールを共有結合する前のインターフェロン−βの比活性（重量あたりのインターフェロン活性）と比較して、その比活性が１０％以上維持されているものが好ましい。
【００３２】
ここで、タンパク質に高分子化合物を結合させることを、タンパク質を高分子化合物で化学修飾する又は修飾するともいい、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールで化学修飾したインターフェロン−β、又は、単に、修飾したインターフェロン−βともいう。特に、インターフェロン−βとポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）との共有結合体は、ＰＥＧ修飾インターフェロン−β、ＰＥＧ化インターフェロン−β又はＰＥＧ結合インターフェロン−βとも呼ばれる。
【００３３】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合部位としては、例えば、インターフェロン−βのアミノ基、チオール基、Ｎ末端、Ｃ末端又は糖鎖が挙げられ、また、公知の遺伝子組換え技術を用いてインターフェロン−βに導入した非天然アミノ酸も共有結合部位とすることができる。
【００３４】
インターフェロン−βのインターフェロン活性は、公知の生物学的測定法により測定できる。具体的には、インターフェロンに感受性の高い細胞（例えば、ＦＬ細胞）に対してインターフェロン−βを含む検体を作用させた後に、これら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）又は水ほう性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶと略される。）等を一定量添加して感染させ、インターフェロン−βにより誘導されたウイルス抵抗性の程度（以下、抗ウイルス活性）を測定することで、インターフェロン活性を測定できる。抗ウイルス活性は、ウイルス増殖の抑制を指標に測定されるものであり、ウイルス増殖の結果として細胞を破壊させる細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥと略される。）を５０％阻止する検体の希釈倍率から、インターフェロン力価（Ｕ）として算出される（小林茂保ら著、「免疫生化学実験法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年、ｐ．２４５）。
【００３５】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、公知の方法で作製することができる。例えば、インターフェロンのアミノ基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号に記載されている。インターフェロンのチオール基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、国際公開第１９９９／５５３７７号に記載されている。インターフェロンのＮ末端に高分子を共有結合する方法は、国際公開第２０００／２３１１４号及び特開平９−２５２９８号に記載されている。インターフェロンの糖鎖にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、１９７８年のＭａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第１７９巻、ｐ．３０１）、米国特許第４１０１３８０号又は米国特許第４１７９３３７号に記載されている。インターフェロンに導入した非天然アミノ酸にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、２００４年のＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（第１４巻、ｐ．５７４３−５７４５）に記載されている。なお、インターフェロン−βのＣ末端にポリアルキレングリコールを共有結合する場合は、インターフェロン−βのＣ末端又はその近傍にシステインや非天然アミノ酸を導入することで可能となる。
【００３６】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの結合の方法に応じて、共有結合反応に使用するポリアルキレングリコールの末端を活性化する必要があるが、末端がヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたポリアルキレングリコール誘導体をインターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合の形成に用いることができ、これらのポリアルキレングリコール誘導体は公知の方法により合成できる。
【００３７】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体であることが好ましい。また、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、１分子のインターフェロン−βに、分子量５，０００以上２４０，０００以下（好ましくは分子量１０，０００以上８０，０００以下、より好ましくは分子量３９，０００以上４５，０００以下）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体であることが好ましい。
【００３８】
インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の好ましい例としては、ヒト・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができ、例えば、特許第４８５０５１４号に記載された方法により作製できる。ヒト・インターフェロン−βにおけるＰＥＧの結合部位としては、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の第１９番目又は第１３４番目のリジンのアミノ基が好ましく、この部位にＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体がより好ましい。具体的には、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４０，０００以上（好ましくは、分子量４２，０００）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体を例示できる。
【００３９】
ここで、「ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジン」とは、１６６アミノ酸からなるヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端のアミノ酸（メチオニン）を１番としたときに、１３４番目に位置するアミノ酸であるリジンを意味する。すなわち、本明細書では、インターフェロン−βのＮ末端のアミノ酸を１番として、インターフェロン−βのアミノ酸残基の位置を表す。
【００４０】
「悪液質」とは、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌疾患、感染症又は後天性免疫不全症候群等の慢性疾患において、著しい体重減少、貧血、浮腫、食欲不振、全身衰弱又は倦怠感等を主症状とする全身性の症候群を包含する。例えば、がん悪液質、結核性悪液質、糖尿病性悪液質、血液疾患性悪液質、内分泌疾患性悪液質、感染症性悪液質又は後天性免疫不全症候群による悪液質が挙げられる。本発明の悪液質の治療剤又は予防剤は、悪液質の中でも、悪性腫瘍によるがん悪液質に好ましく用いることができる。
【００４１】
「悪性腫瘍」（がん、悪性新生物とも呼ばれる）とは、上皮組織由来の癌（癌腫とも呼ぶ）、非上皮性組織由来の肉腫及び造血器由来のものを包含する。例えば、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、胃がん、肝細胞がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、子宮頸がん、子宮体がん、食道がん、膵がん、前立腺がん、大腸がん、乳がん、肺がん、膀胱がん又は卵巣がんが挙げられる。
【００４２】
本発明の悪液質の治療剤又は予防剤は、インターフェロン−βを有効成分として含有し、悪液質の改善作用、すなわち悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌疾患、感染症又は後天性免疫不全症候群等の慢性疾患において発現する著しい体重減少、貧血、浮腫、食欲不振、全身衰弱又は倦怠感等を主症状とする全身性の症候群を改善する作用を有する。
【００４３】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤の有効成分であるインターフェロン−βが、悪液質の治療又は予防に有効であることは、例えば、実施例に記載の、悪液質モデル動物（坦がんによる悪液質を発症した動物）における、低アルブミン血症改善作用、高ＩＬ−６血症改善作用、体重低下改善作用、骨格筋重量低下改善作用又は肝肥大抑制作用等により評価することができる。
【００４４】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）、特にヒトに対する悪液質の治療剤又は予防剤として用いることができる。
【００４５】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤の投与形態としては、有効成分であるインターフェロン−βをそのまま又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００４６】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤の経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体又は賦形剤を含有するものである。錠剤用の担体及び賦形剤としては、例えば、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【００４７】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤の非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤又は局所徐放剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。溶液製剤は、例えば、インターフェロン−βを、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解又は抽出液に懸濁及び乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製することができる。固体製剤は、例えば、インターフェロン−βに、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース又はグルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらにこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、例えば、インターフェロン−βを、グリセリン、ＰＥＧ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸若しくはコンドロイチン硫酸等の増粘剤又は多糖に溶解して調製することができる。
【００４８】
いずれの製剤においても、安定化剤として、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクログロブリン又はアミノ酸等を添加することができ、また、分散剤又は吸収促進剤として、インターフェロン活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤等を添加することができる。また、微量金属又は有機酸塩も必要に応じて添加することができる。
【００４９】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、有効成分であるインターフェロン−βを、１０，０００Ｕ〜１，８００万Ｕ／回の用量で、１日に１回又は２回の投与間隔で連日投与することができる。また、２日以上の期間を隔てて１回の投与間隔でもよく、さらに、２日〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することができる。また、インターフェロン−βのうち、化学的に修飾したインターフェロン−β（例えば、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体）を有効成分とする場合は、１週間に１回又は２回〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することが好ましく、１週間に１回又は２回の投与間隔で間歇投与することが特に好ましい。
【００５０】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、インターフェロン−βを単独で、又は、疾患の治療若しくは予防、症状の減少若しくは抑制に対して用いられる一種類若しくはそれ以上の薬剤と組み合わせて投与することができる。組み合わせる薬剤は、低分子化合物であってもよく、また、高分子のタンパク質、ポリペプチド、抗体又はワクチン等であってもよい。この際、上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、組み合わせる薬剤と同時又は時間差をおいて投与することができる。なお、組み合わせる方法はそれぞれの薬剤を併用してもよいし、合剤とすることもできる。組み合わせる薬剤の投与量は、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜選択することができる。また、上記の悪液質の治療剤又は予防剤と組み合わせる薬剤との配合比は、投与対象、投与対象の年齢、体重、症状、投与時間、剤形、投与方法又は薬剤の組み合わせ等により、適宜選択することができる。
【００５１】
上記の悪液質の治療剤又は予防剤は、化学療法剤、免疫療法剤又は利尿剤等の薬剤と組み合わせて用いることができる。
【００５２】
化学療法剤としては、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ニムスチン、ラニムスチン若しくはテモゾロマイド等のアルキル化剤、メトトレキサート、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、アンシタビン、エノシタビン、シタラビンオクホスファート、ゲムシタビン、メルカプトプリン若しくはフルダラビン等の核酸代謝拮抗薬、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン若しくはペプロマイシン等の抗腫瘍性抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル若しくはドセタキセル等の微小管阻害剤、シスプラチン、カルボプラチン若しくはネダプラチン等の白金製剤、イリノテカン、ノギテカン若しくはエトポシド等のトポイソメラーゼ阻害薬、又は、トラスツズマブ、リツキシマブ若しくはイマニチブ等の分子標的治療薬等が挙げられる。
【００５３】
免疫療法剤としては、ムラミルジペプチド誘導体、レンチナン、シゾフィラン、ウベニメクス、ピシバニール、クレスチン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子又はエリスロポエチン等が挙げられる。
【００５４】
利尿剤としては、サリチル酸ナトリウムテオブロミン若しくはサリチル酸カルシウムテオブロミン等のキサンチン誘導体製剤、エチアジド、シクロペンチアジド、トリクロルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ペンフルチジド、ポリチアジド若しくはメチクロチアジド等のチアジド系製剤、スピロノラクトン若しくはトリアムテレン等の抗アルドステロン製剤、アセタゾラミド等の炭酸脱水素酵素阻害剤、クロルタリドン、メフルシド若しくはインダパミド等のクロルベンゼンスルホンアミド系製剤、アゾセミド、イソソルビド、エタクリン酸、ピレタニド、ブメタニド又はフロセミド等が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を示して本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）  インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の調製：
組換え型ヒト・インターフェロンβは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８０年、第８巻、ｐ．４０５７−４０７４）に記載の方法に従って作製し、組み換え型マウス・インターフェロン−βは、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８６年、第６巻、ｐ．５１９−５２６）に記載の方法に従って作製した。
【００５７】
特許第４８５０５１４号の実施例６に記載の方法に従って、組換え型ヒト・インターフェロンβのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」、及びに分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「マウス・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」を調製した。具体的には、まず、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した組換え型ヒト・インターフェロン−β（最終濃度２００μｇ／ｍＬ）に、エチレングリコールを（最終濃度２０％）添加した後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調整した。これに、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ＰＥＧ（分子量４２，０００、日油株式会社製；品番６１Ｇ９９１２２Ｂ０１）を加え混合し、４℃で一晩、結合反応させた。この結合反応溶液に５倍容の１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ  ６５０（Ｓ）；東ソー株式会社）に供した。下記の展開溶媒で、タンパク質を溶出及び分画した。
≪展開溶媒≫
溶媒Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶媒Ｂ：１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
【００５８】
上記溶媒Ａ、Ｂの混合液を陽イオン交換カラムの樹脂量に対して４０倍量通液させる間に溶媒Ｂの送液比率を０％から６５％に連続的に上昇させて溶出を行った。溶出された分画は、さらに、ＳＰ−５ＰＷカラム（東ソ株式会社）に供し、組換え型ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号２）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「ヒト・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」（以下、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」）を単離した。また、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの調製方法と同一の方法で、組み換え型マウス・インターフェロンβに分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「マウス・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」（以下、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β）を調製した。
【００５９】
（実施例２）悪液質モデルにおけるインターフェロン−βの低アルブミン血症改善作用及び高ＩＬ−６血症改善作用：
Ｈｕｙｎｈらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００７年、第６巻、Ｐ．２９５９−２９６６）に従って、卵巣癌細胞の腹膜播種による悪液質モデルマウスを作製し、悪液質における低アルブミン血症及び高ＩＬ−６血症に対する、インターフェロン−βの作用を検討した。インターフェロン−βとして、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βを用いた。
【００６０】
ヒト卵巣癌細胞株ＯＶ−９０（ＣＲＬ−１１７３２；Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１５％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養し維持した。ＯＶ−９０細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにて回収後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＯＶ−９０細胞懸濁液を調製した。雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ．−１７/ｌｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ−ｊｃｌ；日本クレア）の腹腔内に、ＯＶ−９０細胞懸濁液（５×１０６細胞／匹）を移植した。なお、ヒト卵巣癌細胞を移植しなかった同一週齢の雌性ＳＣＩＤマウスを、対照群とした（ｎ＝５）。
【００６１】
細胞懸濁液移植の４４日後に、実施例１で作製したＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β（溶媒：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５））を、１０万Ｕ／匹／回の用量となるように、皮下投与（全身投与）した。投与間隔は、ヒトにおける週１回の投与に相当する隔日投与とした（ｎ＝１１）。溶媒投与群として、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの代わりに、同容量の、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を、同様に投与した（ｎ＝１１）。
【００６２】
３回目の投与が終了した翌日（投与開始日から５日後）に、対照群、溶媒投与群及びＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β投与群の各個体からイソフルラン吸入麻酔下にて腋下静脈から採血した。採取した血液に抗凝固剤としてＥＤＴＡを添加した後、血漿を得た。
【００６３】
採血した個体は、麻酔下にて安楽死させ、開腹した後、腹腔内の腫瘍塊をピンセットとハサミを用いて摘出し、その重量を測定した。
【００６４】
血漿中のアルブミン濃度測定は、ｍｏｕｓｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂ）を用い、キットに添付の説明書に従って行った。なお、血漿は希釈液（Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、０．１４％  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、１００万倍希釈して測定に使用した。
【００６５】
血漿中のマウスＩＬ−６の濃度測定は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ｋｉｔ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、また、血漿中のヒトＩＬ−６の濃度測定は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、キットに添付の説明書に従って行った。なお、血漿は生理食塩水（大塚製薬工場）を用いて、５倍希釈して測定に使用した。
【００６６】
統計解析は、溶媒投与群とＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β投与群との間の２群間で行い、等分散性の検定（Ｆ検定）によりＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定又はＷｅｌｃｈ検定を選択して行った。統計解析の結果、Ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意であると判断した。
【００６７】
その結果を図１に示す。図１−Ａの縦軸は、血漿中アルブミン濃度（平均値±標準誤差；ｎ＝５〜１１）、図１−Ｂの縦軸は、血漿中マウスＩＬ−６濃度（平均値±標準誤差；ｎ＝５〜１１）、図１−Ｃの縦軸は、血漿中ヒトＩＬ−６濃度（平均値±標準誤差；ｎ＝５〜１１）、図１−Ｄの縦軸は、腹腔内の腫瘍重量（平均値±標準誤差；ｎ＝５〜１１）をそれぞれ示し、横軸の「対照」は対照群、「溶媒」は溶媒投与群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β投与群を示す。また、図中の記号＊（アスタリスク）は、溶媒群と比較して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であることを示す。
【００６８】
溶媒投与群は対照群と比較して、血漿中アルブミン濃度の低下（図１−Ａ）、及び、血漿中マウスＩＬ−６濃度の増加（図１Ｂ）が認められ、ヒト卵巣癌細胞を移植したマウスは悪液質を発症していることが示された。ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β投与により、この血漿中アルブミン濃度の低下は改善し（溶媒投与群と比較して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５））（図１−Ａ）、また、血漿中マウスＩＬ−６濃度の増加は抑制された（図１−Ｂ）。したがって、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βは、悪液質における低アルブミン血症及び高ＩＬ−６血症を改善することが示された。
【００６９】
一方、移植したヒト卵巣癌細胞由来である血漿中ヒトＩＬ−６濃度及び腹腔内の腫瘍重量は、溶媒投与群とＰＥＧ−ｍＩＦＮ−β投与群との間で有意な変化は認められなかった（図１−Ｃ及び図１−Ｄ）。
【００７０】
インターフェロン−βには癌細胞の増殖を抑制する作用（以下、抗腫瘍作用）を有することが知られている。しかし、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの投与により、血漿中ヒトＩＬ−６濃度及び腹腔内の腫瘍重量は変化なかったことから、ＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βの投与で認められた悪液質改善作用は、抗腫瘍作用が十分に現れない場合において認められており、インターフェロン−βの抗腫瘍作用の結果として二次的に起こる作用ではなく、これとは独立した作用であることが示された。
【００７１】
したがって、インターフェロン−βは、悪液質改善作用を示し、その作用は抗腫瘍作用とは独立した作用であることが示された。
【００７２】
（実施例３）悪液質モデルにおけるインターフェロン−βの体重低下改善作用：
悪液質における体重低下に対する、インターフェロン−βの作用を検討した。インターフェロン−βとして、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βを用いた。
【００７３】
実施例２と同様の方法で、ヒト卵巣癌細胞株ＯＶ−９０の細胞懸濁液（５×１０６細胞／匹）を雌性ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ．−１７/ｌｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ−ｊｃｌ；日本クレア）の腹腔内に移植した。なお、ヒト卵巣癌細胞を移植しなかった同一週齢の雌性ＳＣＩＤマウスを対照群とした（ｎ＝４）。
【００７４】
細胞懸濁液移植の４６日後に、実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βとを混合して調製した混合液（以下、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ）を、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＰＥＧ−ｍＩＦＮ−βのそれぞれが５００００Ｕ／匹／回の用量となるように、皮下投与（全身投与）した。投与間隔は、ヒトにおける週１回の投与に相当する隔日投与とした（ｎ＝６）。溶媒投与群として、同容量の、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を同様に投与した（ｎ＝７）。被験物質及び溶媒の投与は、６日間に３回行った。
【００７５】
投与開始日から６日後に、対照群、溶媒投与群、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群の各個体の体重を測定した。
【００７６】
統計解析は、溶媒投与群に対する、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群との間の２群間で行い、等分散性の検定（Ｆ検定）によりＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定又はＷｅｌｃｈ検定を選択して行った。統計解析の結果、Ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意であると判断した。
【００７７】
その結果を図２に示す。図２の縦軸は、体重（平均値±標準誤差；ｎ＝４〜７）を示し、横軸の「対照」は対照群、「溶媒」は溶媒投与群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群を示す。また、図中の記号＊（アスタリスク）は、溶媒群と比較して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であることを示す。
【００７８】
溶媒投与群は、対照群と比較して体重の低下が認められ、ヒト卵巣癌細胞を移植したマウスは悪液質を発症していることが示された。
【００７９】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓ投与群では、溶媒投与群と比較して体重が統計学的に有意に増加した（図２）。したがって、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βｓは、悪液質における体重低下対する改善作用を有することが示された。
【００８０】
実施例２及び３から、インターフェロン−βが、抗腫瘍作用とは独立して悪液質改善作用を有し、悪液質の治療又は予防に有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の悪液質の治療剤又は予防剤は、慢性疾患における悪液質の治療剤又は予防剤として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１：  ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図２】
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【配列表】
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