(57)【要約】【課題】ジカルボン酸の製造法を提供する。【解決手段】yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されたジカルボン酸生産能を有する細菌を培地で培養し、該培地よりジカルボン酸を採取することにより、ジカルボン酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカルボン酸生産能を有する細菌を培地で培養し、ジカルボン酸を該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりジカルボン酸を採取すること、を含むジカルボン酸の製造法であって、
前記細菌が、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記yeeA遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法：
（Ａ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１、３、または５に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１、３、または５に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ynfM遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号７、９、１１、１３、または１５に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号７、９、１１、１３、または１５に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記yjjP遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有する
アミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７または１９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１７または１９に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記yjjB遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２１または２３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２１または２３に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア属細菌またはエンテロバクター属細菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア・アナナティスまたはエンテロバクター・アエロゲネスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ジカルボン酸が、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたジカルボン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸等のジカルボン酸は、例えば、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物を利用した発酵法により製造されている。具体的には、例えば、sucE1遺伝子（特許文献１）やybjL遺伝子（特許文献２）等のトランスポーターをコードする遺伝子の発現を増強した微生物を利用してコハク酸等のジカルボン酸を製造する方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2008/126896
【特許文献２】WO2008/133161
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、細菌のジカルボン酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なジカルボン酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ジカルボン酸排出担体をコードする遺伝子としてyeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子を見出し、さらに、それらの遺伝子の発現が増大するように細菌を改変することにより、細菌のジカルボン酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
ジカルボン酸生産能を有する細菌を培地で培養し、ジカルボン酸を該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりジカルボン酸を採取すること、を含むジカルボン酸の製造法であって、
前記細菌が、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、前記方法。
［３］
前記yeeA 遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１、３、または５に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１、３、または５に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［４］
前記ynfM遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号７、９、１１、１３、または１５に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号７、９、１１、１３、または１５に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［５］
前記yjjP遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７または１９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１７または１９に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［６］
前記yjjB遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２１または２３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２１または２３に示す塩基配列の相補配列配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［７］
前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、前記方法。
［８］
前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア属細菌またはエンテロバクター属細菌である、前記方法。
［９］
前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア・アナナティスまたはエンテロバクター・アエロゲネスである、前記方法。
［１０］
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
［１１］
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
［１２］
前記ジカルボン酸が、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸からなる群より選択される、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細菌のジカルボン酸生産能を向上させることができ、ジカルボン酸を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】イタコン酸生産菌ITC01株（+CAD）とその対照株（-CAD）を用いたイタコン酸生産培養の結果を示す図。（Ａ）生育、（Ｂ）イタコン酸蓄積量。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の方法は、ジカルボン酸生産能を有する細菌を培地で培養し、ジカルボン酸を該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりジカルボン酸を採取すること、を含むジカルボン酸の製造法であって、前記細菌が、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、方法である。同方法に用いられる細菌を「本発明の細菌」ともいう。また、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子を総称して「ジカルボン酸排出担体遺伝子」ともいう。
【００１１】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、ジカルボン酸生産能を有する細菌であって、且つ、ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように改変された細菌である。
【００１２】
＜１−１＞ジカルボン酸生産能を有する細菌
本発明において、「ジカルボン酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするジカルボン酸を生成し、回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。ジカルボン酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするジカルボン酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、ジカルボン酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするジカルボン酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００１３】
ジカルボン酸としては、炭素数が３つから８つのジカルボン酸（Ｃ3−Ｃ8ジカルボン酸）が挙げられる。ジカルボン酸として、具体的には、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ；別名２−オキソグルタル酸）、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、マロン酸、ア
ジピン酸、グルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸が挙げられる。本発明の細菌は、１種のジカルボン酸の生産能のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のジカルボン酸の生産能を有していてもよい。
【００１４】
本発明において、発現が増強されるジカルボン酸排出担体遺伝子と生産されるジカルボン酸の組み合わせは、特に制限されない。yeeA遺伝子の発現が増強される場合、ジカルボン酸は、例えば、α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸から選択されてもよい。また、ynfM遺伝子の発現が増強される場合、ジカルボン酸は、例えば、α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸から選択されてもよい。また、yjjPB遺伝子の発現が増強される場合、ジカルボン酸は、例えば、コハク酸であってもよい。
【００１５】
細菌としては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。
【００１６】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００１７】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００１８】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００１９】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルテ
ィ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２０】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２１】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
【００２２】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２３】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２４】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００２５】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００２６】
本発明の細菌は、本来的にジカルボン酸生産能を有するものであってもよく、ジカルボン酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。ジカルボン酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にジカルボン酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のジカルボン酸生産能を増強することにより、取得できる。
【００２７】
以下、ジカルボン酸生産菌、およびジカルボン酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなジカルボン酸生産菌が有する性質およびジカルボン酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２８】
ジカルボン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、目的のジカルボン酸の生合成経路から分岐して目的のジカルボン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法が挙げられる。なお、ここでいう「目的のジカルボン酸の生合成経路から分岐して目的のジカルボン酸以外の化合物を生成する反応を触
媒する酵素」には、目的のジカルボン酸の分解に関与する酵素も含まれる。活性を低下させる酵素は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。酵素活性は、後述するように、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることや、同酵素をコードする遺伝子を破壊することにより、低下させることができる。
【００２９】
例えば、コハク酸の生産能は、乳酸の生合成系酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる（国際公開2005/052135号公報、国際公開2005/116227号パンフレット、米国特許5,770,435号公報、米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開99/53035号公報、Alam, K. Y.and Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217）。α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸等の他のジカルボン酸についても同様である。乳酸の生合成系酵素としては、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）が挙げられる。Pantoea ananatis AJ13355株のldhA遺伝子の塩基配列を配列番号１０１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０２に示す。なお、酵素名の後のカッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の一例である（以下の記載においても同様）。
【００３０】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、ピルビン酸から乳酸を生成する反応を触媒する酵素をいう。また、同反応を触媒する活性を、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性」ともいう。乳酸デヒドロゲナーゼは、Ｌ−乳酸を生成するＬ型乳酸脱水素酵素（L-LDH； EC 1.1.1.27）と、Ｄ−乳酸を生成するＤ型乳酸脱水酵素（D-LDH； EC1.1.1.28）に大別されるが、そのいずれの活性を低下させてもよい。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（L. Kanarek and R.L. Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)）により乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した腸内細菌の変異株の具体的な製造方法としては、Alam, K. Y., Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217に記載されている方法等が挙げられる。
【００３１】
また、コハク酸の生産能は、酢酸の生合成系酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/052135号公報、国際公開99/53035号公報、国際公開2006/031424号公報、国際公開2005/113745号公報、国際公開2005/113744号公報）。α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸等の他のジカルボン酸についても同様である。酢酸の生合成系酵素としては、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、酢酸キナーゼ（ack）、ピルビン酸オキシダーゼ（poxB）、アセチルCoA合成酵素（acs）、アセチルCoAハイドロラーゼが挙げられる。
【００３２】
「ホスホトランスアセチラーゼ」とは、アセチルＣｏＡとリン酸からＣｏＡとアセチルリン酸を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 2.3.1.8）。また、同反応を触媒する活性を、「ホスホトランスアセチラーゼ活性」ともいう。ホスホトランスアセチラーゼ活性が低下したことは、公知の方法（Klotzsch, H.R., Meth. Enzymol. 12, 381-386(1969)）によりホスホトランスアセチラーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００３３】
また、コハク酸の生産能は、ギ酸の生合成系酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/116227号公報、国際公開2005/52135号公報、Donnelly, M.I. et al. 1998. Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72: 187-198）。α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸等の他のジカルボン酸についても同様である。ギ酸の生合成系酵素としては、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ（pflB, pflD, tdcE）が挙げられる。
【００３４】
「ピルビン酸・ギ酸リアーゼ」とは、ピルビン酸とＣｏＡからＣｏＡとアセチルＣｏＡとギ酸を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 2.3.1.54）。また、同反応を触媒する活性を、「ピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性」ともいう。ピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性が
低下したことは、公知の方法（Knappe, J. & Blaschkowski, H.P., Meth. Enzymol. 41, 508-518(1975)）によりピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００３５】
また、コハク酸の生産能は、エタノールの生合成系酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる（国際公開2006/031424号公報）。α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸等の他のジカルボン酸についても同様である。エタノールの生合成系酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE）が挙げられる。Pantoea ananatis AJ13355株のadhE遺伝子の塩基配列を配列番号１０３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０４に示す。
【００３６】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、アルデヒドからアルコールを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、またはEC 1.1.1.71）。また、同反応を触媒する活性を、「アルコールデヒドロゲナーゼ活性」ともいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Lutstorf, U.M., Schurch, P.M. & von Wartburg, J.P., Eur. J. Biochem. 17, 497-508(1970)）によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下した腸内細菌の変異株の具体的な製造方法としては、Sanchez, A. M., Bennett, G. N., San, K.-Y., Biotechnol. Prog. 21, 358-365(2005)に記載されている方法等が挙げられる。
【００３７】
また、コハク酸の生産能は、2,3-ブタンジオールの生合成系酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる。α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸等の他のジカルボン酸についても同様である。2,3-ブタンジオールの生合成系酵素としては、アセト乳酸シンターゼ（budB, ilvB, ilvG, ilvI）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（budA）、アセトインレダクターゼ（budC, butA）が挙げられる。Pantoea ananatis AJ13355株のbudB、budA、budC遺伝子の塩基配列を配列番号１０５、１０７、１０９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０６、１０８、１１０に、それぞれ示す。
【００３８】
「アセト乳酸シンターゼ」とは、２分子のピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ2を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 2.2.1.6）。また、同反応を触媒する活性を、「アセト乳酸シンターゼ活性」ともいう。アセト乳酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）には、ＡＨＡＳ
Ｉ〜ＩＩＩのアイソザイムが知られているが、いずれのアイソザイムの活性を低下させてもよい。アセト乳酸シンターゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（F.C. Stormer and H.E. Umbarger, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964)）によりアセト乳酸シンターゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００３９】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」とは、アセト乳酸を脱炭酸してアセトインを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 4.1.1.5）。また、同反応を触媒する活性を、「アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性」ともいう。なお、例えば、E. coliやCorynebacterium glutamicumは、アセト乳酸デカルボキシラーゼを有していない。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Juni E., J. Biol. Chem., 195(2): 715-726(1952)）によりアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００４０】
「アセトインレダクターゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、アセトインから2,3-ブタンジオールを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 1.1.1.4）。また、同反応を触媒する活性を、「アセトインレダクターゼ活性」ともいう。なお、例えば、E. coliは、アセトインレダクターゼを有していない。アセトインレダクターゼ活性
が低下したことは、例えば、公知の方法（K. Blomqvist et al., J Bacteriol., 175, 5,
1392-1404(1993)）によりアセトインレダクターゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００４１】
また、コハク酸の生産能は、ピルビン酸キナーゼ、グルコースPTS（ptsG）、ArcAタンパク質（arcA）、IclRタンパク質（iclR）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh）、グルタミンシンセターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）から選択される酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる（国際公開2006/107127号公報、国際公開2007/07933号公報、特開2005-168401）。また、コハク酸の生産能は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhA）の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる。Pantoea ananatis AJ13355株のsdhA遺伝子の塩基配列を配列番号１１１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１２に示す。
【００４２】
「コハク酸デヒドロゲナーゼ」とは、キノンを電子受容体としてコハク酸を酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 1.3.5.1）。また、同反応を触媒する活性を、「コハク酸デヒドロゲナーゼ」ともいう。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Tatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch. Microbiol. 183: 317-324(2005)）によりコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００４３】
また、リンゴ酸の生産能は、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）（mdh）、マレートキノンオキシドレダクターゼ（malate-qunone oxidoreductase）（mqo）、マリックエンザイム（malic enzyme）（sfcA, maeB）から選択される酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる。Pantoea ananatis AJ13355株のmdh、mqo1、mqo2、sfcA、maeB遺伝子の塩基配列を配列番号１１３、１１５、１１７、１１９、１２１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１４、１１６、１１８、１２０、１２２に、それぞれ示す。
【００４４】
「マレートキノンオキシドレダクターゼ」とは、キノンを電子受容体としてリンゴ酸を酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「マレートキノンオキシドレダクターゼ活性」ともいう。マレートキノンオキシドレダクターゼは、ＮＡＤ型マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）と共役してリンゴ酸とオキサロ酢酸間でのサイクルを形成し、ＮＡＤＨの正味の酸化をもたらす。なお、例えば、Pantoea属細菌には、２コピーのマレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子を有するものがある。そのような場合、いずれか片方の遺伝子を破壊等してもよく、両方の遺伝子を破壊等してもよい。マレートキノンオキシドレダクターゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Hoyt JC et al. (1988) Biochim Biophys Acta. 14;966(1):30-5.；Mackintosh, C et al. (1988) Biochem. J. 250, 25-31）によりマレートキノンオキシドレダクターゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００４５】
また、イタコン酸の生産能は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icd）およびイソクエン酸リアーゼ（aceA）から選択される酵素の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる。
【００４６】
「イソクエン酸リアーゼ」とは、イソクエン酸からグリオキシル酸とコハク酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素（EC 4.1.3.1）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「イソクエン酸リアーゼ活性」ともいう。なお、例えば、コリネバクテリウム属細菌には、２コピーのイソクエン酸リアーゼ遺伝子を有するものがある。そのような場合、いずれか片方の遺伝子を破壊等してもよく、両方の遺伝子を破壊等してもよい。イソクエン酸リアーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Hoyt JC et al. (1988) Biochim Bi
ophys Acta. 14;966(1):30-5.；Mackintosh, C et al. (1988) Biochem. J. 250, 25-31）によりイソクエン酸リアーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【００４７】
イソクエン酸リアーゼをコードするaceA遺伝子は、通常、aceBAK遺伝子からなるオペロンを形成している。aceB遺伝子は、マレートシンターゼをコードする遺伝子である。aceK遺伝子は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ  キナーゼ／ホスファターゼをコードする遺伝子である。イソクエン酸リアーゼ活性を低下させる場合には、aceBAK遺伝子をまとめて破壊等してもよい。Pantoea ananatis AJ13355株のaceB、aceA、aceK遺伝子の塩基配列を配列番号１２３、１２５、１２７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２４、１２６、１２８に、それぞれ示す。
【００４８】
また、α−ＫＧの生産能は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA, odhA）の活性を低下させることにより、付与又は増強することができる。Pantoea ananatis AJ13355株のsucA遺伝子の塩基配列を配列番号１２９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３０に示す。
【００４９】
ジカルボン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、目的のジカルボン酸の生合成系酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法も挙げられる。活性を増大させる酵素は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。酵素活性は、後述するように、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより、増大させることができる。
【００５０】
例えば、ジカルボン酸生産能は、TCAサイクルの補充経路の酵素の活性を増大させることにより、付与又は増強することができる。TCAサイクルの補充経路の酵素としては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）が挙げられる。
【００５１】
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムやブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）やシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母のpyc遺伝子が挙げられる（WO2009/072562）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_001343536.1）、ハエモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_248516.1）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）のpckA遺伝子（GenBank Accession No.
NP_246481.1）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_089485.1）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_072243）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. ZP_01981004.1）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. AB016600）が挙げられる（WO2009/072562）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムやブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）のppc遺伝子が挙げられる。また、酵素活性は、例えば、フィードバック阻害の低減または解除によっても、増大させることができる。例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）の活性は、コハク酸生合成経路の中間産物であ
るＬ−リンゴ酸により阻害される（Masato Yano and Katsura Izui, Eur. Biochem. FEBS, 247, 74-81, 1997）。Ｌ−リンゴ酸による阻害は、例えば、PEPCに1アミノ酸置換による脱感作変異を導入することにより低減することができる。1アミノ酸置換による脱感作変異としては、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリ由来のPEPCタンパク質の６２０番目のアミノ酸をリジンからセリンへ置換する変異が挙げられる（同文献）。
【００５２】
また、イタコン酸の生産能は、cis-アコニット酸デカルボキシラーゼ（cis-aconitate decarboxylase；CAD）の活性を増大させることにより、付与又は増強することができる。cis-アコニット酸デカルボキシラーゼ（CAD）とは、cis-アコニット酸を脱炭酸してイタコン酸を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 4.1.1.6）。cis-アコニット酸デカルボキシラーゼ遺伝子（CAD遺伝子）としては、Aspergillus terreusのCAD遺伝子が挙げられる（特開2013-051900）。E. coliのコドン使用頻度に至適化したAspergillus terreusのCAD遺伝子の塩基配列を配列番号４９に示す。配列番号４９に示す塩基配列中、９１位〜１５６３位がコード領域である。
【００５３】
ジカルボン酸生産菌としては、発酵ハンドブック（共立出版）に記載されている細菌が挙げられる。
【００５４】
腸内細菌科に属するコハク酸生産菌として、具体的には、以下の株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ SS373株（国際公開99/06532号公報）
エシェリヒア・コリ AFP111株（国際公開97/6528号公報）
エシェリヒア・コリ NZN111株（米国特許6,159,738号公報）
エシェリヒア・コリ AFP184株（国際公開2005/116227号公報）
エシェリヒア・コリ SBS100MG株、SBS110MG株、SBS440MG株、SBS550MG株、SBS660MG株（国際公開2006/031424号公報）
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637株（FERM BP-10955）
エンテロバクター・アエロゲネス VP-1株（J Biosci Bioeng. 2004;97(4):227-32）
【００５５】
コリネ型細菌に属するコハク酸生産菌として、具体的には、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAB-41株（特開平11−113588号公報）
ブレビバクテリウム・フラバムAB-41株/PC増幅株（特開平11−196888号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ110655株（FERM BP-10951）
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh（国際公開2005/021770号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, ach, pta, ack)（国際公開2005/113744号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)（国際公開2005/113745号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカムR ldh-/pCRB-1 PC株（国際公開2005/010182号公報）
【００５６】
なお、ジカルボン酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、ジカルボン酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するジカルボン酸排出担体遺伝子およびジカルボン酸排出担体のバリアントに関する記載を準用できる。
【００５７】
＜１−２＞ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現の増強
本発明の細菌は、ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように改変されている
。ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように細菌を改変することによって、細菌のジカルボン酸生産能を向上させることができる。
【００５８】
本発明の細菌は、ジカルボン酸生産能を有する細菌を、ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように細菌を改変した後に、ジカルボン酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、ジカルボン酸排出担体遺伝子の発現が増大するように改変されたことにより、ジカルボン酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００５９】
ジカルボン酸排出担体遺伝子は、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子から選択される。これらの遺伝子がジカルボン酸排出担体遺伝子であることは知られていなかったが、本願の実施例より、これらの遺伝子はジカルボン酸排出担体遺伝子であると推定される。yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子にコードされるタンパク質を、それぞれ、YeeAタンパク質、YnfMタンパク質、YjjPタンパク質、およびYjjBタンパク質ともいう。本発明においては、１種のジカルボン酸排出担体遺伝子の発現を増強してもよく、２種またはそれ以上のジカルボン酸排出担体遺伝子の発現を増強してもよい。例えば、yjjP遺伝子とyjjB遺伝子の発現を増強してもよい。
【００６０】
＜yeeA遺伝子＞
yeeA遺伝子は、conserved inner membrane proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyeeA遺伝子は、b2008またはECK2002とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_416512.1）を配列番号２に示す。また、Pantoea ananatis AJ13355株のyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、Enterobacter aerogenes AJ110637株のyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号５、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００６１】
＜ynfM遺伝子＞
ynfM遺伝子は、predicted transport protein YnfMと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のynfM遺伝子はb1596またはECK1591とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_416113.1）を配列番号８に示す。また、Pantoea ananatis AJ13355株のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、Enterobacter aerogenes AJ110637株のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_602116.1）を配列番号１４に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００６２】
＜yjjP遺伝子＞
yjjP遺伝子は、predicted inner membrane structural proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjP遺伝子は、b4364またはECK4354とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjP遺伝子の塩基配列を配列番号１７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Acession No NP_418784.4）を配列番号１８に示す。また、Enterobacter aerogenes AJ110637株のyjjP遺伝
子の塩基配列を配列番号１９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【００６３】
＜yjjB遺伝子＞
yjjB遺伝子は、conserved inner membrane proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjB遺伝子は、b3463またはECK4353とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjB遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_418783.2）を配列番号２２に示す。また、Enterobacter aerogenes AJ110637株のyjjB遺伝子の塩基配列を配列番号２３、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
【００６４】
ジカルボン酸排出担体遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記例示したジカルボン酸排出担体遺伝子（すなわち、yeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、ジカルボン酸排出担体は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記例示したジカルボン酸排出担体（すなわち、YeeAタンパク質、YnfMタンパク質、YjjPタンパク質、およびYjjBタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。すなわち、「yeeA遺伝子」、「ynfM遺伝子」、「yjjP遺伝子」、および「yjjB遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したyeeA遺伝子、ynfM遺伝子、yjjP遺伝子、およびyjjB遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「YeeAタンパク質」、「YnfMタンパク質」、「YjjPタンパク質」、および「YjjBタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したYeeAタンパク質、YnfMタンパク質、YjjPタンパク質、およびYjjBタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したジカルボン酸排出担体遺伝子やジカルボン酸排出担体のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００６５】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることであってよい。ジカルボン酸排出担体遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがジカルボン酸排出活性を有するタンパク質をコードすることであってよい。また、ジカルボン酸排出担体についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがジカルボン酸排出活性を有することであってよい。
【００６６】
ジカルボン酸排出担体が排出するジカルボン酸としては、上述したジカルボン酸が挙げられる。ジカルボン酸排出担体は、１種のジカルボン酸の排出活性のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のジカルボン酸の排出活性を有していてもよい。本発明において、ジカルボン酸排出担体とそれが排出するジカルボン酸の組み合わせは、特に制限されない。yeeA遺伝子およびYeeAタンパク質についての「ジカルボン酸排出活性」とは、例えば、α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸から選択されるジカルボン酸を排出する活性を意味してもよい。また、ynfM遺伝子およびYnfMタンパク質についての「ジカルボン酸排出活性」とは、例えば、α−ＫＧ、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸から選択されるジカルボン酸を排出する活性を意味してもよい。また、yjjP遺伝子、yjjB遺伝子、YjjPタンパク質、およびYjjBタンパク質についての「ジカルボン酸排出活性」とは、例えば、コハク酸を排出する活性を意味してもよい。
【００６７】
タンパク質のバリアントがジカルボン酸排出活性を有することは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をP.ananatis SC17(0)ΔsdhA株等のコハク酸耐性が低い株に導入し
、コハク酸耐性が向上することを確認することにより、確認できる。また、タンパク質のバリアントがジカルボン酸排出活性を有することは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をジカルボン酸生産菌に導入し、ジカルボン酸生産量が向上することを確認することにより、確認できる。
【００６８】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００６９】
ジカルボン酸排出遺伝子のホモログは、例えば、上記例示したジカルボン酸排出遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、ジカルボン酸排出遺伝子のホモログは、例えば、細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知のジカルボン酸排出遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００７０】
ジカルボン酸排出遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記アミノ酸配列（例えば、YeeAタンパク質について配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列、YnfMタンパク質について配列番号８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列、YjjPタンパク質について配列番号１８または２０に示すアミノ酸配列、YjjBタンパク質について配列番号２２または２４に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００７１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７２】
また、ジカルボン酸排出遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」
（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００７３】
また、ジカルボン酸排出遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記塩基配列（例えば、yeeA遺伝子について配列番号１、３、または５に示す塩基配列、ynfM遺伝子について配列番号７、９、１１、１３、または１５に示す塩基配列、yjjP遺伝子について配列番号１７または１９に示す塩基配列、yjjB遺伝子について配列番号２１または２３に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００７４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００７５】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、ジカルボン酸排出遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、ジカルボン酸排出遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００７６】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００７７】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００７８】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００７９】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００８０】
＜１−３＞遺伝子の発現を増大（上昇）させる手法
以下に、ジカルボン酸排出遺伝子等の遺伝子の発現を増大（上昇）させる手法について説明する。
【００８１】
「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株に対して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現の上昇の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。また、結果として遺伝子の発現が上昇する限り、宿主が本来有する標的の遺伝子の発現を弱化させる、または宿主が本来有する標的の遺伝子を破壊する、等の改変を行った上で、好適な標的の遺伝子を導入してもよい。
【００８２】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００８３】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的とし
て相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【００８４】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００８５】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。
【００８６】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００８７】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、
およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００８８】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００８９】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、それらの遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、それらの遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、ジカルボン酸排出遺伝子から選択される２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、それらの遺伝子は、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、ジカルボン酸排出遺伝子から選択される２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、当該２またはそれ以上の遺伝子の両方が同一の生物に由来するものであってもよく、当該２またはそれ以上の遺伝子のそれぞれが異なる生物に由来するものであってもよい。
【００９１】
導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【００９２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【００９３】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で利用できるより強
力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（（EF-Tu））プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００９４】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００９５】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じうる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【００９６】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００９７】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わ
せで用いてもよい。
【００９８】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
【００９９】
遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。
【０１００】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０１】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０２】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０３】
上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、ジカルボン酸排出遺伝子の発現増強に加えて、任意の遺伝子、例えばジカルボン酸生合成系酵素をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１０４】
＜１−４＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【０１０５】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパ
ク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【０１０６】
タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０１０７】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。遺伝子の発現を上昇させる手法については上述した通りである。
【０１０８】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の解除も含まれる。すなわち、タンパク質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が解除された変異型タンパク質をコードする遺伝子を細菌に保持させることにより、タンパク質の活性を増大させることができる。なお、本発明において、「フィードバック阻害の解除」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含される。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０１０９】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０１１０】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる
。タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。
【０１１１】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばジカルボン酸の生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１１２】
＜１−５＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０１１３】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１４】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株に対して低下していることを意味する。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１５】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、ＳＤ配列（ＲＢＳ）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するよう
な遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１１６】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【０１１７】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０１１８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１１９】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１２０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１２１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ
）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１２２】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０１２３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１２４】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１２５】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１２６】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１２７】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１２８】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えば目的のジカルボン酸の生合成経路から分岐して目的のジカルボン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０１２９】
＜２＞本発明のジカルボン酸の製造法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、ジカルボン酸を該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりジカルボン酸を採取すること、を含むジカルボン酸の製造法である。本発明においては、１種のジカルボン酸が製造されてもよく、２種またはそれ以上のジカルボン酸が製造されてもよい。
【０１３０】
使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、ジカルボン酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するジカルボン酸の種類等の諸
条件に応じて適宜設定してよい。
【０１３１】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、植物由来原料を好適に用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、生成物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の５炭糖、グルコース等の６炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して５炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して６炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、本発明の微生物にグルコース等の６炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、６炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３２】
培地中での炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、ジカルボン酸が生産される限り、特に制限されない。培地中での炭素源の濃度は、ジカルボン酸の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くするのが好ましい。培地中での炭素源の初発濃度は、例えば、通常1〜30%(w/v)、好ましくは3〜10%(w/v)であってよい。また、発酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で添加してもよい。
【０１３３】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３４】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３５】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３６】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１３７】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、イタコン酸生産菌は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損等によりＬ−グルタミン酸を要求する場合がある。そのような場合には、Ｌ−グルタミン酸を培地に補添することが好ましい。
【０１３８】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、ジカルボン酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するジカルボン酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１３９】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。
【０１４０】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１４１】
培養は、好気条件で行ってもよく、微好気条件で行ってもよく、嫌気条件で行ってもよい。培養は、微好気条件または嫌気条件で行うのが好ましい。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。微好気条件とは、培養系に酸素が供給されているが、液体培地中の溶存酸素濃度が0.33ppm未満であることをいう。嫌気条件とは、培養系に酸素が供給されない条件をいう。培養は、その全期間において上記で選択された条件で行われてもよく、一部の期間のみ上記で選択された条件で行われてもよい。すなわち、「好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において好気条件で培養が行われることをいう。また、「微好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において微好気条件で培養が行われることをいう。また、「嫌気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において嫌気条件で培養が行われることをいう。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。なお、「培養の全期間」とは、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合には、本培養の全期間を意味してよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。また、通気量や攪拌速度を低下させる、容器を密閉して無通気で培養する、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の手段により、液体培地中の溶存酸素濃度を低下させ、微好気条件または嫌気条件を達成できる。
【０１４２】
培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム
、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。
【０１４３】
培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン、炭酸ガス、またはそれらの組み合わせが含有されていてよい。これらの成分は、例えば、本発明の細菌の代謝により供給されてもよく、pH調整に用いられる炭酸塩および／または重炭酸塩から供給されてもよい。また、これらの成分は、必要に応じて、炭酸、重炭酸、それらの塩、または炭酸ガスを別途添加することにより供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムが挙げられる。炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンは、例えば、0.001〜5M、好ましくは0.1〜3M、さらに好ましくは1〜2Mの濃度で添加してよい。炭酸ガスを含有させる場合は、例えば、溶液1L当たり50mg〜25g、好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは150mg〜10gの炭酸ガスを含有させてよい。
【０１４４】
培養温度は、例えば、２０〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１０時間〜１２０時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。
【０１４５】
このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中にジカルボン酸が蓄積する。
【０１４６】
ジカルボン酸が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１４７】
生成したジカルボン酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にジカルボン酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってジカルボン酸を回収することができる。回収されるジカルボン酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明における「ジカルボン酸」という用語は、フリー体のアミノ酸、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【０１４８】
また、ジカルボン酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したジカルボン酸は、培地中に溶解しているジカルボン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１４９】
尚、回収されるジカルボン酸は、ジカルボン酸以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたジカルボン酸の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０１５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１５１】
＜参考例＞P. ananatisにおける遺伝子操作法
＜１＞P. ananatis SC17(0)/RSFRedTER株の構築
P. ananatis SC17(0)株（VKPM B-9246）をLB液体培地にて終夜培養した。SC17(0)株は、2005年9月21日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。培養液100μLを新たなLB液体培地4 ｍLに植菌し、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。エレクトロポレーション法により、RSFRedTER（WO2008/090770A1）をコンピテントセルに導入した。RSFRedTERをRSF-Red-TERともいう。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。エレクトロポレーション後、SOC培地（バクトトリプトン20 g/L、イーストエキストラクト5 g/L、NaCl 0.5 g/L、グルコース10 g/L）で2時間培養し、25 mg/Lのクロラムフェニコール（Cm）を含むLB寒天培地に塗布し、34℃で16時間培養を行った。その結果、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、SC17(0)/RSFRedTER株と命名した。
【０１５２】
＜２＞P. ananatis SC17(0)株由来の遺伝子破壊株の構築
SC17(0)/RSFRedTER株を25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地にて終夜培養した。培養液1mLを終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。λファージのattLとattR配列に挟まれた薬剤耐性遺伝子（薬剤耐性遺伝子カセット）を有するプラスミドを鋳型とするＰＣＲにより、両端に目的遺伝子の内部配列に相補的な50bpの配列を有し、その間に薬剤耐性遺伝子カセットを有する、目的遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製し、エレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。エレクトロポレーション後、すぐに氷上で冷やしておいたSOC培地を加え、34℃で2時間振盪回復培養を行い、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含むLB寒天培地上で目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子カセットに置換された株を選択した。
【０１５３】
＜３＞RSFRedTERプラスミドの除去
RSFRedTERを保持する株より同プラスミドを除去する場合には、同株を薬剤を含まない培地で画線培養を行い、出現したコロニーをM9成分（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布することにより、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。
【０１５４】
＜４＞薬剤耐性遺伝子の除去
薬剤耐性遺伝子を保持する株より同遺伝子を除去する場合には、pMW-intxis-sacB(Cm)プラスミドをエレクトロポレーションにより同株に導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で形質転換体を選択した。得られた形質転換体を薬剤を含まない寒天培地上で画線培養を行い、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地と含まない培地にレプリカし、薬剤耐性遺伝子が除去された株を選択した。
【０１５５】
＜５＞pMW-intxis-sacB(Cm)の構築
薬剤耐性遺伝子除去用プラスミドpMW-intxis-sacB(Cm)は、pMW-intxis-ts（WO2007/037460）のPstI-SphIサイトにRSFRedTER（WO2008/090770A1）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子とsacB遺伝子を挿入することにより構築した。具体的にはRSFRedTERを鋳型として、配列番号２５と配列番号２６のプライマーを用いて、PCRによりクロラムフェニコール耐性遺伝子とsacB遺伝子を含む約4.0 kbの断片を増幅し、これを精製した。一方で、pM
W-intxis-tsをPstIとSphIで処理し、更に末端をTakara社製BKL kitを用いて平滑化およびリン酸化した。これら２つの断片をライゲーション反応により連結し、E. coli DH5α株を形質転換し、25 mg/Lクロラムフェニコール、100 mg/Lアンピシリンを含むＬアガロースプレート（10 g/L Bacto trypton, 5 g/L Bacto Yeast extract, 5 g/L NaCl, 2%アガロース）で形質転換体を選択することにより、DH5α/pMW-intxis-sacB(Cm)株を得た。同株から、常法によりプラスミドpMW-intxis-sacB(Cm)を得た。
【０１５６】
＜実施例１＞P. ananatisコハク酸生産株及びα-KG生産株におけるyeeA遺伝子増幅効果の評価
本実施例では、ジカルボン酸排出担体遺伝子のスクリーニングによりyeeA遺伝子を取得し、P. ananatis SC17(0)株由来のコハク酸生産株及びα-KG生産株を宿主としてyeeA遺伝子増幅がジカルボン酸生産に与える効果を評価した。
【０１５７】
＜１−１＞ジカルボン酸排出担体遺伝子のスクリーニング
＜１−１−１＞P. ananatis SC17(0)ΔsdhA株の構築
まずSC17(0)を親株としてコハク酸デヒドロゲナーゼをコードするsdhA遺伝子の破壊株を以下の手順で構築した。配列番号２７と２８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attR（WO2008/090770A1）を鋳型としてPCR反応を行い、カナマイシン（Km）耐性遺伝子を有するsdhA遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をSC17(0)/RSFRedTER株のコンピテントセルに導入し、40mg/Lカナマイシンと20mMリンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で形質転換体を選択することにより、sdhA遺伝子がKm耐性遺伝子に置換されたSC17(0)ΔsdhA::Km株を得た。同株からKm耐性遺伝子を除去し、sdhA遺伝子を欠損したSC17(0)ΔsdhA株を得た。
【０１５８】
＜１−１−２＞ジカルボン酸排出担体遺伝子のスクリーニング
SC17(0)ΔsdhA株にP. ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）のゲノムライブラリを導入し、コハク酸耐性を指標としてジカルボン酸排出担体遺伝子をスクリーニングした。AJ13355株は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。その結果、yeeA遺伝子を含むプラスミドが導入された株でコハク酸耐性の向上が認められ、yeeA遺伝子がジカルボン酸排出担体遺伝子であると推測された。
【０１５９】
＜１−２＞コハク酸生産株におけるyeeA遺伝子増幅効果の評価
＜１−２−１＞コハク酸生産菌P. ananatis SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株の構築
RSFPPプラスミドはRSFPPGプラスミド（WO2010/027022A1）よりgdhA遺伝子を含む領域を除去することにより取得した。具体的には、RSFPPGプラスミドを制限酵素NspVで処理し、75℃10分間加熱処理をして酵素を失活させたのちに、タカラバイオ社製DNA ligation kitを用いて、セルフライゲーションした。このDNA溶液でE. coli DH5α株を形質転換し、12.5 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB寒天培地で選択することにより、DH5α/RSFPP株を取得した。同株から、常法によりプラスミドRSFPPを得た。RSFPPプラスミドは、メチルクエン酸シンターゼをコードするprpC遺伝子と、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするppc遺伝子の発現プラスミドである。RSFPPプラスミドは、TCAサイクルへの炭素の引き込みを強化するために用いることができる。
【０１６０】
SC17(0)ΔsdhA株にRSFPPプラスミドを導入し、12.5mg/Lのテトラサイクリンを含むLBGM9培地上で選択することにより、コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株を構築した。
【０１６１】
＜１−２−２＞コハク酸生産株におけるyeeA遺伝子増幅効果の評価
コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株に、スクリーニングで得られたyeeA遺伝子を含むプラスミドを導入することにより、yeeA遺伝子増幅株（yeeA増幅株）を作成した。また、コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株にpSTV28を導入し、対照株（ベクター対照株）を作成した。これらの株を、MS 3% Sucrose for Succinate培地を用い、34℃で20.5時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、並びにα-KGおよびコハク酸の培地中への蓄積量を測定した。以下にMS 3% Sucrose for Succinate培地の組成を示す。
【０１６２】
〔MS 3% Sucrose for Succinate培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース                 30 g/L
MgSO4・7H20                      0.5 g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                       5.0 g/L
KH2PO4                          2.0 g/L
酵母エキス                      2.0 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・5H2O                      0.01 g/L
（KOHにてpH6.5に調整）
〔Ｃ区〕
CaCO3                          20 g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン12.5 mg/L、クロラムフェニコール 25 mg/Lとなるように添加した。
【０１６３】
結果を表１に示す。表中、データは、各株３連で培養した結果の平均値±標準偏差として示す。yeeA増幅株のコハク酸蓄積量は、対照株とほぼ同等であった。一方、yeeA増幅株のα-KG蓄積量は、対照株よりも高かった。この結果から、YeeAは、コハク酸のみではなく、α-KGも基質として認識すると示唆された。
【０１６４】
【表１】
2017216881.tif 000002
【０１６５】
＜１−３＞α-KG生産株におけるyeeA遺伝子増幅効果の評価
＜１−３−１＞α-KG生産菌P. ananatis SC17sucA/RSFPP株の構築
【０１６６】
P. ananatis SC17sucA株（WO2005/085419）にRSFPPプラスミドを導入することにより、α-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株（SC17sucA/RSFPP株ともいう）を構築した。SC17sucA株は、P. ananatis SC17株のsucA遺伝子欠損株であり、AJ417株ともいう。SC17sucA株（AJ417株）は、2004年2月26日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-8646が付与されている。
【０１６７】
＜１−３−２＞α-KG生産株におけるyeeA遺伝子増幅効果の評価
α-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株に、スクリーニングで得られたyeeA遺伝子を含むプラスミドを導入することにより、yeeA遺伝子増幅株（yeeA増幅株）を作成した。また、α-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株にpSTV28を導入し、対照株（ベクター対照株）を作成した。
【０１６８】
これらの株を、Lys、Met、DAP各200mg/Lを補填したMS 3% Sucrose for Succinate培地を用い、34℃で23時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、並びにGlu、α-KG、および酢酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表２に示す。表中、データは、各株４連で培養した結果の平均値±標準偏差として示す。yeeA増幅株においては、対照株と比べて、Gluの蓄積量が減少し、α-KGおよび酢酸の蓄積量が増加した。このことから、yeeA遺伝子を増幅することによって菌体内のα-KG濃度が低下し、Gluへの変換が抑制されているものと思われる。
【０１６９】
【表２】
2017216881.tif 000003
【０１７０】
＜１−４＞yeeA遺伝子単独増幅効果の検証
スクリーニングで得られたyeeA遺伝子を含むプラスミドには、yeeA遺伝子の周辺の遺伝子も含まれている。そこで、yeeA遺伝子のみを増幅した場合にも、上記プラスミドを導入した場合と同様の効果が得られるかどうかを検証した。
【０１７１】
配列番号２９と３０に示したプライマーを用い、P. ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、yeeA遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をHindIIIおよびKpnIで処理した後に、pMW219の同サイトに導入し、yeeA遺伝子の発現プラスミドpMW-PanyeeAを得た。pMW-PanyeeAをコハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株及びα-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株に導入し、yeeA遺伝子増幅株を作成した。また、コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株及びα-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株にpMW218を導入し、対照株を作成した。
【０１７２】
これらの株を、Lys、Met、DAP各200mg/Lを補填したMS 3% Sucrose for Succinate培地を用い、34℃で18.5時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、並びにα-KGおよびコハク酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表３に示す。表中、データは、各株３連で培養した結果の平均値±標準偏差として示す。コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株でyeeA遺伝子を単独増幅した際には、スクリーニングで得られたプラスミドを導入した際と同様、α-KGの蓄積量が増加し、コハク酸の蓄積量はほとんど変化しなかった。α-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株でyeeA遺伝子を単独増幅した際にも、スクリーニングで得られたプラスミドを導入した際と同様、α-KGの蓄積量が増加した。これらの結果から、yeeA遺伝子がジカルボン酸排出担体遺伝子であると再度確認された。
【０１７３】
【表３】
2017216881.tif 000004
【０１７４】
＜実施例２＞P. ananatisコハク酸生産株及びα-KG生産株におけるynfM遺伝子増幅効果の評価
本実施例では、P. ananatis SC17(0)株由来のコハク酸生産株及びα-KG生産株を宿主としてynfM遺伝子増幅がジカルボン酸生産に与える効果を評価した。
【０１７５】
配列番号３１と３２に示したプライマーを用い、P. ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、ynfM遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をEcoRIおよびPstIで処理した後に、pMW218の同サイトに導入し、ynfM遺伝子の発現プラスミドpMW-PanynfMを得た。pMW-PanynfMをコハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株及びα-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株に導入し、ynfM遺伝子増幅株を作成した。また、コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株及びα-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株にpMW218を導入し、対照株を作成した。
【０１７６】
これらの株を、Lys、Met、DAP各200mg/Lを補填したMS 3% Sucrose for Succinate培地を用い、34℃で18.5時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、並びにα-KGおよびコハク酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表４に示す。表中、データは、各株３連で培養した結果の平均値±標準偏差として示す。コハク酸生産菌SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株でynfM遺伝子を増幅した際には、α-KGの蓄積量がやや増加し、コハク酸の蓄積量は大きくは変わらなかった。また、α-KG生産菌SC17sucA/RSFPP株でynfM遺伝子を増幅した際には、α-KGの蓄積量が大幅に増加した。
【０１７７】
【表４】
2017216881.tif 000005
【０１７８】
＜実施例３＞P. ananatisリンゴ酸生産株におけるyeeA遺伝子及びynfM遺伝子の増幅効果の評価
本実施例では、P. ananatis SC17(0)株由来のリンゴ酸生産株を宿主としてyeeA遺伝子増幅及びynfM遺伝子増幅がジカルボン酸生産に与える効果を評価した。
【０１７９】
＜３−１＞リンゴ酸生産菌P. ananatis SC17(0)Δm5/RSFPP株の構築
P. ananatisには、リンゴ酸の分解系の候補として、malate dehydrogenase（mdh）、malate-qunone oxidoreductase（mqo1およびmqo2）、malic enzyme（sfcAおよびmaeB）の3酵素、計5遺伝子が存在する。そこで、まず、これら5つの遺伝子の重複欠損株を構築した
。
【０１８０】
配列番号３３と３４に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、mdh遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、mdh遺伝子がカナマイシン（Km）耐性遺伝子に置換されたSC17(0)Δmdh::Km株を得た。この株よりKm耐性遺伝子を除去し、mdh遺伝子を欠損したSC17(0)Δmdhを得た。
【０１８１】
配列番号３５と３６に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attR（WO2005/010175）を鋳型としてPCR反応を行い、mqo1遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、mqo1遺伝子がテトラサイクリン（Tet）耐性遺伝子に置換されたSC17(0)Δmqo::Tet株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)Δmdh株を形質転換することにより、SC17(0)ΔmdhΔmqo::Tet株を得た。
【０１８２】
配列番号３７と３８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、mqo2遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、mqo2遺伝子がKm耐性遺伝子に置換されたSC17(0)Δmqo2::Km株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)ΔmdhΔmqo::Tet株を形質転換することにより、SC17(0)ΔmdhΔmqo::TetΔmqo2::Km株を得た。この株より薬剤耐性遺伝子を除去し、mdh、mqo1、mqo2遺伝子を欠損したSC17(0)Δm3株を得た。
【０１８３】
配列番号３９と４０に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、sfcA遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、sfcA遺伝子がKm耐性遺伝子に置換されたSC17(0)ΔsfcA::Km株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)Δm3株を形質転換することにより、SC17(0)Δm3ΔsfcA::Km株を得た。
【０１８４】
配列番号４１と４２に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、maeB遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、maeB遺伝子がTet耐性遺伝子に置換されたSC17(0)ΔmaeB::Tet株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)Δm3ΔsfcA::Km株を形質転換することにより、SC17(0)Δm3ΔsfcA::KmΔmaeB::Tet株を得た。この株より薬剤耐性遺伝子を除去し、mdh、mqo1、mqo2、sfcA、maeB遺伝子を欠損したSC17(0)Δm5株を得た。
【０１８５】
SC17(0)Δm5株にRSFPPプラスミドを導入することにより、リンゴ酸生産菌SC17(0)Δm5/RSFPP株を構築した。
【０１８６】
これらの株を、MS 3% Sucrose for Succinate培地を用い34℃で19時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、及び有機酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表５に示す。表中、データは、平均値±標準偏差として示す。RSFPPの導入株においては、RSFPPの非導入株と比較して、酢酸の蓄積量が減少し、生育、消費糖量、およびリンゴ酸の蓄積量が増加した。
【０１８７】
【表５】
2017216881.tif 000006
【０１８８】
＜３−２＞リンゴ酸生産菌におけるyeeA遺伝子及びynfM遺伝子の増幅効果の評価
pMW-PanyeeAおよびpMW-PanynfMをリンゴ酸生産菌SC17(0)Δm5/RSFPP株に導入し、yeeA遺伝子増幅株およびynfM遺伝子増幅株をそれぞれ作成した。また、リンゴ酸生産菌SC17(0)Δm5/RSFPP株にpMW218を導入し、対照株を作成した。
【０１８９】
これらの株を、MS 3% Sucrose for Succinate培地を用い34℃で18.5時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、並びに有機酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表６に示す。表中、データは、平均値±標準偏差として示す。yeeA遺伝子増幅株およびynfM遺伝子増幅株では、対照株と比較して、生育、消費糖量、およびリンゴ酸等の各種ジカルボン酸の蓄積量が顕著に増加した。特にyeeA増幅株において高い効果が得られた。これらの結果より、これらのジカルボン酸排出担体が様々なジカルボン酸を排出する輸送体であることが強く示唆された。
【０１９０】
【表６】
2017216881.tif 000007
【０１９１】
＜実施例４＞P. ananatisイタコン酸生産株におけるyeeA遺伝子及びynfM遺伝子の増幅効果の評価
本実施例では、P. ananatis SC17(0)株由来のイタコン酸生産株を宿主としてyeeA遺伝子増幅及びynfM遺伝子増幅がイタコン酸生産に与える効果を評価した。
【０１９２】
＜４−１＞イタコン酸生産菌ITC01株の構築
イタコン酸は、TCAサイクルにおけるクエン酸−イソクエン酸変換の中間体であるcis-アコニット酸の脱炭酸により生成する。cis-アコニット酸の脱炭酸は、cis-アコニット酸デカルボキシラーゼ（cis-aconitate decarboxylase；CAD）により触媒される。そこで、CADを強化し、イソクエン酸の分解系であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ICDH）およびイソクエン酸リアーゼ（ICL）を遮断した。
【０１９３】
配列番号４３と４４に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、icd遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。icd遺伝子は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ICDH）をコードする遺伝子である。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、icd遺伝子がKm耐性遺伝子に置換されたSC17(0)Δicd::Km株を得た。この株よりKm耐性遺伝子を除去し、icd遺伝子を欠損したSC17(0)Δicdを得た。
【０１９４】
配列番号４５と４６に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、sdhA遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。sdhA遺伝子は、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換し、sdhA遺伝子がKm耐性遺伝子に置換されたSC17(0)ΔsdhA::Km株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)Δicd株を形質転換することにより、SC17(0)ΔicdΔsdhA::Km株を得た。
【０１９５】
配列番号４７と４８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、aceBAK遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。同ＤＮＡ断片は、両端に、aceB遺伝子の内部配列に相補的な配列と、aceK遺伝子の内部配列に相補的な配列を、それぞれ有する。aceB遺伝子は、マレートシンターゼをコードする遺伝子である。aceA遺伝子は
、イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子である。aceK遺伝子は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ  キナーゼ／ホスファターゼをコードする遺伝子である。得られたＤＮＡ断片でSC17(0)/RSFRedTER株を形質転換しaceB-aceA-aceK遺伝子がTet耐性遺伝子に置換されたSC17(0)ΔaceBAK::Tet株を得た。この株より染色体を抽出し、SC17(0)ΔicdΔsdhA::Km株を形質転換することにより、SC17(0)ΔicdΔsdhA::KmΔaceBAK株を得た。この株より薬剤耐性遺伝子を除去し、icd、sdhA、aceBAK遺伝子を欠損したSC17(0)ΔicdΔsdhAΔaceBAK株を得た。
【０１９６】
cis-aconitate decarboxylase（CAD）遺伝子に関しては、Aspergillus terreusのCAD遺伝子の塩基配列を基に、E. coliのコドン使用頻度に至適化した塩基配列（配列番号４９）を設計して用いた。尚、CAD遺伝子の塩基配列の至適化および合成はGenscript社に依頼し、pSTV28のHindIII−KpnIサイトにCAD遺伝子が導入されたpSTV-CADを得た。SC17(0)ΔicdΔsdhAΔaceBAK株にpSTV-CADプラスミドとRSFPPプラスミドを導入し、イタコン酸生産菌ITC01（SC17(0)ΔicdΔsdhAΔaceBAK/RSFPP+pSTV-CAD）株を構築した。SC17(0)ΔicdΔsdhAΔaceBAK株にpSTV28プラスミドとRSFPPプラスミドを導入し、対照株（-CAD）を構築した。これらの株を、グルタミン酸を終濃度5g/Lで補填したMS 3% Sucrose for Succinate培地を用い34℃にて振盪培養し、生育とイタコン酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を図１に示す。対照株（-CAD）は全くイタコン酸を生成しなかったのに対し、ITC01株は約9g/Lのイタコン酸を蓄積した。
【０１９７】
＜４−２＞イタコン酸生産菌におけるyeeA遺伝子及びynfM遺伝子の増幅効果の評価
pMW-PanyeeAおよびpMW-PanynfMをイタコン酸生産菌ITC01株に導入し、yeeA遺伝子増幅株およびynfM遺伝子増幅株をそれぞれ作成した。また、イタコン酸生産菌ITC01株にpMW219を導入し、対照株を作成した。
【０１９８】
これらの株を、グルタミン酸を終濃度5g/Lで補填したMS 3% Sucrose for Succinate培地を用いて34℃で48時間振盪培養を行った。培養後、生育、消費糖量、グルタミン酸残存量、及びイタコン酸の培地中への蓄積量を測定した。結果を表７に示す。表中、データは、平均値±標準偏差として示す。yeeA遺伝子増幅株およびynfM遺伝子増幅株では、対照株と比較して、消費糖量が増加し、イタコン酸蓄積量も増加した。なお、yeeA遺伝子増幅株およびynfM遺伝子増幅株においては、添加していたGluはすべて消費されており、そのほとんどがコハク酸に変換されていた（データ示さず）。
【０１９９】
【表７】
2017216881.tif 000008
【０２００】
＜実施例５＞E. aerogenesによるコハク酸生産におけるyjjPB遺伝子の増幅効果の評価
本実施例では、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株（FERM BP-10955）由来のコハク酸生産株を宿主としてyjjPB遺伝子増幅がコハク酸生産に与える効果を評価した。AJ110637（FERM BP-10955）は、2007年8月22日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-10955が付与されている。
【０２０１】
＜５−１＞E. aerogenes ES06株の構築
エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637（FERM BP-10955）株から構築したES04株（US2010-0297716A1）のゲノム上のpoxB遺伝子を、アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株由来のpckA遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスES06株を構築した。手順を以下に示す。
【０２０２】
λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片の構築
アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株（ATCC 55618）のゲノムDNAの全塩基配列（GenBank Accession No. CP000746）は既に公開されており、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子（遺伝子名pckA：登録番号Asuc_0221）も明らかになっている。アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株由来pckA遺伝子の塩基配列を配列番号５０に、同遺伝子がコードするホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのアミノ酸配列を配列番号５１に示す。アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号５２と５３に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・90sec.、30cycle）を実施し、pckAのORF領域を含むDNA断片を取得した。また、λattL-Kmr-λattR-Ptac（WO2008/090770A1）を含むDNA断片を鋳型に、配列番号５４と５５に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・90sec.、30cycle）を実施し、λattL-Kmr-λattR-Ptacを含むDNA断片を取得した。次に、pckAのORF領域を含むDNA断片とλattL-Kmr-λattR-Ptacを含むDNA断片を鋳型にして、配列番号５３と５４に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・180sec.、35cycle）を行い、両端にピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（遺伝子名poxB）の組み換え配列を有したλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片を得た。
【０２０３】
ES04/RSFRedTER株の構築
ES04株（US20100297716A1）をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液100μLを新たなLB液体培地4 ｍLに植菌し、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとし、エレクトロポレーション法により、RSFRedTER（WO2008/090770A1）を導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE
PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。SOC培地（バクトトリプトン20 g/L、イーストエキストラクト5 g/L、NaCl 0.5 g/L、グルコース10 g/L）で2時間培養後、40 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。その結果、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、ES04/RSFRedTER株と命名した。
【０２０４】
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株の構築
ES04/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液1 mLを、終濃度1 mMのIPTGと40 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100 mLに植菌して、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片をWizard PCR Prep
DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。SOC培地で2時間培養後、カナマイシン50 mg/Lを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号５６と５７に記載したプライマーを用いてコロニーPCR（TaKaRa Speed star（登録商標）  92℃・10sec.、56℃・10sec.、72℃・30sec.、40cycle）を行い、ゲノム上のpoxB遺伝子がλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子に置換している事を確認した。得られた株を、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させ、ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株を得た。
【０２０５】
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株からのカナマイシン耐性遺伝子除去
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、RSF-int-xis（US20100297716A1）プラスミドを用いた。ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株にRSF-int-xisをエレクトロポレーション法で導入し、40 mg/Lクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後30℃で培養し、ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA/RSF-int-xis株を得た。得られたプラスミド保持株を、40 mg/Lクロラムフェニコール及び1 mM IPTGを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、50 mg/Lのカナマイシンを加えた培地に塗布し、37℃で一晩培養し、生育出来ない事を確認する事で、カナマイシン耐性遺伝子が除去された株である事を確認した。次に、得られた株からRSF-int-xisプラスミドを脱落させるため、10%シュークロース及び1 mM IPTGを添加したLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール感受性を示した株をES06株と命名した。
【０２０６】
＜５−２＞E. aerogenes ES06ΔyeeA株の構築
ES06ΔyeeA株は、λ-red法により作成した。具体的には、配列番号５８と５９に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aerogenesのyeeA遺伝子内部配列と相補的な50 bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。ES06株にエレクトロポレーションによりRSFRedTERを導入して得られたES06/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1 mMのIPTGと25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100 mLに1 mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔyeeA::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1
g/L Na2HPO4・12H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔyeeA::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株をLB寒天培地上で純化したのち、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシン、クロラムフェニコールに対して感受性となったものをES06ΔyeeA株とした。
【０２０７】
＜５−３＞E. aerogenes ES06ΔyeeAΔynfM株の構築
ES06ΔyeeAΔynfM株は、ES06ΔyeeA株より上述のλ-red法により作成した。具体的には、配列番号６０と６１に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aerogenesのynfM遺伝子内部配列と相補的な50 bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。ES06ΔyeeA株にエレクトロポレーションによりRSFRedTERを導入して得られたES06ΔyeeA/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1 mMのIPTGと25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100 mLに1 mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔyeeAΔynfM::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1 g/L Na2HPO4・12H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacB
プラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔyeeAΔynfM::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株をLB寒天培地上で純化したのち、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをES06ΔyeeAΔynfM株とした。
【０２０８】
＜５−４＞E. aerogenes sdhA破壊株の構築
コハク酸デヒドロゲナーゼのサブユニットをコードするsdhA遺伝子を欠損したES06ΔsdhA株は、ES06株より上述のλ-red法により作成した。具体的には、配列番号６２と６３に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aeronegenesのsdhA遺伝子内部配列と相補的な50 bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。ES06/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1 mMのIPTGと25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100 mLに1 mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40 mg/Lのカナマイシンと20 mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔsdhA::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1 g/L Na2HPO4・12H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25 mg/Lのクロラムフェニコールと20 mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔsdhA::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株を20 mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で純化したのち、40 mg/Lのカナマイシンと20 mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをES06ΔsdhA株とした。また、ES06ΔyeeA株、ES06ΔyeeAΔynfM株からも同様にしてsdhA遺伝子を欠損した株を誘導し、それぞれES06ΔsdhAΔyeeA株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM株とした。
【０２０９】
＜５−５＞pSTV28::AeyjjPBプラスミドの構築
pSTV28::AeyjjPBプラスミドは、E. aerogenes AJ110637（FERM BP-10955）株由来yjjPB遺伝子をpSTVベクターに搭載したプラスミドである。具体的には以下の手順で構築した。
【０２１０】
E. aerogenes AJ110637株由来yjjPB遺伝子を増幅するためのプライマーS3とS4（配列番号６４と６５）を設計した。これらのプライマーを用いて、E. aerogenes AJ110637株のゲノムを鋳型にPCRを行い、yjjPB遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片をIn Fusion HD cloning kit（clontech社製）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpSTV28ベクターに挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびCm 25μg/mLを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpSTV28::AeyjjPBと命名した。
【０２１１】
＜５−６＞pSTV28::AeyjjPプラスミドの構築
pSTV28::AeyjjPプラスミドは、E. aerogenes AJ110637株由来yjjP遺伝子をpSTVベクターに搭載したプラスミドである。具体的には以下の手順で構築した。
【０２１２】
E. aerogenes AJ110637株由来yjjP遺伝子を増幅するためのプライマーS3とS5（配列番号６４と６６）を設計した。これらのプライマーを用いて、E. aerogenes AJ110637株のゲノムを鋳型にPCRを行い、yjjP遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断
片をIn Fusion HD cloning kit（clontech社製）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpSTV28ベクターに挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびCm 25μg/mLを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpSTV28::AeyjjPと命名した。
【０２１３】
＜５−７＞pSTV28::AePtac1000yjjBプラスミドの構築
pSTV28:: AePtac1000yjjBプラスミドは、Ptac1000プロモーター（配列番号６７）とE. aerogenes AJ110637株由来yjjB遺伝子を連結し、pSTVベクターに搭載したプラスミドである。具体的には以下の手順で構築した。
【０２１４】
まず、Ptac1000プロモーター断片を増幅するプライマーS6とS7（配列番号６８と６９）を設計した。これらのプライマーを用いて、λattL-Kmr-λattR-Ptac（WO2008/090770A1）を鋳型にPCRを行い、Ptac1000プロモーターを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、E. aerogenes AJ110637株由来yjjB遺伝子を増幅するプライマーS8とS4（配列番号７０と６５）を設計した。これらのプライマーを用いて、E. aerogenes AJ110637株のゲノムを鋳型にPCRを行い、yjjB遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られた両断片をIn Fusion HD cloning kit（clontech社製）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpSTV28ベクターに挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびCm 25μg/mLを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpSTV28::AePtac1000yjjBと命名した。
【０２１５】
＜５−８＞E. aerogenes評価株の構築
ES06ΔsdhA株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM株、及びES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM株に、RSFPPプラスミド、並びにpSTV28ベクター、pSTV28-AeyjjPBプラスミド、pSTV28-AeyjjPプラスミド、及びpSTV28-AePtac1000yjjBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、12.5 mg/Lのテトラサイクリン、25 mg/Lクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で選択したのち、LB寒天培地上で純化することにより、対照株としてES06ΔsdhA/RSFPP+pSTV28株及びES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP+pSTV28株を、ジカルボン酸排出担体遺伝子増幅株としてES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP+pSTV28-AeyjjPB株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP +pSTV28-AeyjjP株、及びES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP+pSTV28-AePtac1000yjjB株を得た。
【０２１６】
＜５−９＞コハク酸生産能の評価
次にこれらの株のコハク酸生産能の評価を行った。これらの株をテトラサイクリン12.5
mg/L、クロラムフェニコール 25 mg/L、及び寒天15 g/Lを添加したLBGM9培地プレートにて34℃終夜培養を行った。得られた菌体を、コハク酸生産培地5 mLを張り込んだ試験管に適量植菌し、120 rpm、34℃にて振盪培養を行った。以下にコハク酸生産培地の組成を示す。
【０２１７】
〔コハク酸生産培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース                 30 g/L
MgSO4・7H20                      0.5 g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                       5.0 g/L
KH2PO4                          2.0 g/L
酵母エキス                      2.0 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・5H2O                      0.01 g/L
（KOHにてpH6.5に調整）
〔Ｃ区〕
CaCO3                          20 g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン12.5 mg/L、クロラムフェニコール 25 mg/Lとなるように添加した。
【０２１８】
結果を表８に示す。対照のES06ΔsdhA/RSFPP株と比べ、yeeA遺伝子とynfM遺伝子を欠損したES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株では、コハク酸生産能が低下した。ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株を宿主としてyjjPB遺伝子を増幅することにより、yeeA遺伝子とynfM遺伝子を欠損していないES06ΔsdhA/RSFPP株よりも、コハク酸生成能が向上した。以上の結果から、エンテロバクター・アエロゲネスにおいて、yjjPB遺伝子を増幅することによりコハク酸生産能が向上することが明らかとなった。
【０２１９】
【表８】
2017216881.tif 000009
【０２２０】
＜実施例６＞コリネ型細菌によるコハク酸生産におけるynfM遺伝子の増幅効果の評価
本実施例では、Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) 2256株（ATCC 13869）由来のコハク酸生産株を宿主としてynfM遺伝子増幅がコハク酸生産に与える効果を評価した。
【０２２１】
＜６−１＞ynfM遺伝子発現用プラスミドpVK9::PmsrA-ynfMの構築
B. lactofermentum 2256株由来のynfM遺伝子を発現させるためのプラスミドpVK9::PmsrA-ynfMを以下の手順で作製した。
【０２２２】
まず、クロスオーバーPCRによってynfM遺伝子をB. lactofermentum 2256株由来msrA遺伝子のプロモーターと連結した。具体的には、B. lactofermentum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７１と７２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、msrA遺伝子のプロモーター領域を含むPCR産物を得た。一方、B. lactofermentum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７３と７４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、ynfM遺伝子のorf領域を含むPCR産物を得た。配列番号７２と７３は一部が相補的な配列となっている。次に、両PCR産物をIn Fusion HD cloning kit（clontech社製）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpVK9ベクター（WO2013/069634）に挿入した。なお、pVK9はコリネバクテリウム及びE. coliのシャトルベクターである。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン 40μg/mLを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換
体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9::PmsrA-ynfMと命名した。
【０２２３】
＜６−２＞B. lactofermentum 2256ΔsdhA株の構築
＜６−２−１＞sdhA遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔsdhAの構築
B. lactofermentum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７５と７６の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sdhA遺伝子のN末端側コード領域を含むＤＮＡ断片を得た。一方、B. lactofermentum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号７７と７８の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sdhA遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号７６と７７は相補的な配列となっている。次に、両PCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、配列番号７９と８０の合成DNAをプライマーとしてクロスオーバーPCRを行い、sdhA欠損用ＤＮＡ断片を得た。次に、該ＤＮＡ断片をBamHIにて処理し、pBS4Sベクター（WO2007/046389）のBamHI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mLおよびKm 40μg/mLを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpΔsdhA56と命名した。
【０２２４】
＜６−２−２＞B. lactofermentum 2256ΔsdhA株の構築
上記で得られたpΔsdhA56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pΔsdhA56を電気パルス法にてB. lactofermentum 2256株に導入した。菌体をカナマイシン25μg/mLを含むCM-Dex寒天培地上に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpΔsdhA56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のsdhA遺伝子と欠損型のsdhA遺伝子の両方を有する。
【０２２５】
該1回組換え株をCM-Dex液体培地で一夜培養し、培養液をS10寒天培地（スクロース 100
g/L、ポリペプトン 10 g/L、酵母エキス 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・4-5H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆蛋白加水分解液1.2 g/L、寒天 20 g/L、NaOHを用いてpH7.5に調整：オートクレーブ120℃20分）上に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をDM-Dex寒天培地上で純化した。これらの株よりゲノムDNAを調整し、配列番号７５と７８に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによって野生型sdhA遺伝子の欠損を確認し、該株を2256ΔsdhA株とした。
【０２２６】
＜６−３＞コハク酸生産能の評価
2256ΔsdhA株に、pVK9プラスミド及びpVK9::PmsrA-ynfMプラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、対照株として2256ΔsdhA/pVK9株を、ynfM遺伝子増幅株として2256ΔsdhA/ pVK9::PmsrA-ynfMを得た。
【０２２７】
次にこれらの株のコハク酸生産能の評価を行った。
これらの株を25 mg/Lのカナマイシン及び寒天15 g/Lを添加したCM-Dex培地プレートにて31.5℃で終夜培養を行った。得られた菌体を、コハク酸生産培地5 mLを張り込んだ試験管に適量植菌し、120 rpm、31.5℃にて振盪培養を行った。以下にコハク酸生産培地の組成を示す。
【０２２８】
〔コハク酸生産培地組成〕
グルコース                     60 g/L
硫安                            6 g/L
KH2PO4                          0.54 g/L
FeSO4・7H2O                    12 mg/L
MnSO4・5H2O                    12 mg/L
VB1                           120 mg/L
Biotin                        120 mg/L
豆濃（T-N換算）                68 mg/L
KOHにてpH7.0に調整した後、120℃、20分オートクレーブにて滅菌した後、180℃ 3時間以上乾熱滅菌し放冷したMgCO3を50g/Lとなるように添加した。
【０２２９】
結果を表９に示す。対照の2256ΔsdhA/pVK9株と比べ、ynfM遺伝子を増強した2256ΔsdhA/pVK9::PmsrA-ynfMでは、コハク酸生産能が向上した。以上の結果から、コリネ型細菌において、ynfM遺伝子を増幅することによりコハク酸生産能が向上することが明らかとなった。
【０２３０】
【表９】
2017216881.tif 000010
【０２３１】
＜実施例７＞P. ananatisによる嫌気条件下でのコハク酸生産におけるyjjPB遺伝子の増幅効果の評価
本実施例では、P. ananatis SC17(0)株由来のコハク酸生産株を宿主としてyjjPB遺伝子増幅が嫌気条件下でのコハク酸生産に与える効果を評価した。
【０２３２】
＜７−１＞P. ananatis FKPS13株の構築
P. ananatis SC17(0)株のゲノム上のbudABC遺伝子をTetr遺伝子で置換することにより、P. ananatis FKSP13株（SC17(0) ΔbudABC::Tetr株）を構築した。手順を以下に示す。
【０２３３】
配列番号８１と８２に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、budABC遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をWizard
PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製し、エレクトロポレーション法によりSC17(0)/RSFRedTER株のコンピテントセルに導入した。SOC培地で2時間培養後、25 mg/Lのクロラムフェニコールと12.5mg/Lテトラサイクリンを含むLB培地に塗布し、34℃で16時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号８３と８４に示すプライマーを用いてコロニーPCR（TaKaRa Speed star（登録商標）  92℃・10sec.、56℃・10sec.、72℃・30sec.、40cycle）を行い、ゲノム上のbudABC遺伝子がTet耐性遺伝子に置換された事を確認した。得られた株を、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させ、SC17(0) ΔbudABC::Tetr株を得た。この株をFKSP13と命名した。
【０２３４】
＜７−２＞P. ananatis YDSP24の構築
嫌気条件下でコハク酸を培地中に蓄積する株として、アルコールデヒドロゲナーゼadhE遺伝子と乳酸デヒドロゲナーゼldhE遺伝子を欠損し、ピルビン酸カルボキシラーゼpyc遺伝子を増幅したYDSP24株を作成した。その際に、λ-red法と薬剤耐性遺伝子の除去をより簡便にするため、プラスミドRSFRedIXを作成し、導入した。
【０２３５】
＜７−２−１＞RSFRedIXの構築
RSFParaIX（Appl Environ Microbiol. 2014 Nov 21. pii: AEM.03213-14.）プラスミドを鋳型として、配列番号８５と８６に示すプライマーを用いてPCR反応を行い、araC遺伝子とその逆向きにParaBADプロモーター下流にλ-phage由来のxis-int遺伝子が連結されたＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をPromega社製Wizard PCR Prep.kitを用いて精製し、その後NotIで消化した。この消化断片とRSFRedTERをNotIで消化した断片をTakara DNA Ligation kitを用いて連結し、E. coli DH5α株を形質転換し、25mg/Lのクロラムフェニコールを含有するLB寒天培地上に塗布し、形質転換体を得た。形質転換体から目的のプラスミドRSFRedIXを得た。RSFRedIXは、Placプロモーター下流にgam、bet、exoの各λ-Red遺伝子、ParaBADプロモーター下流にint-xis遺伝子を搭載しており、RSFRedIXによれば、ＩＰＴＧ誘導によりλ-Redシステムによる組み込みを、アラビノース誘導により薬剤耐性遺伝子の除去を、それぞれ行うことができる。
【０２３６】
＜７−２−２＞SC17(0) ΔbudABC::Tetr株からのテトラサイクリン耐性遺伝子除去
【０２３７】
SC17(0) ΔbudABC::Tetr株にRSFRedIXをエレクトロポレーション法で導入し、25 mg/Lクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後34℃で培養し、SC17(0) ΔbudABC::Tetr
/RSFRedIX株を得た。SC17(0) ΔbudABC::Tetr /RSFRedIX株を、25 mg/Lクロラムフェニコール及び10mMアラビノースを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、12.5mg/Lのテトラサイクリンを加えたLB培地に塗布し、34℃で16時間培養し、生育出来ない事を確認する事で、テトラサイクリン耐性遺伝子が除去された株である事を確認し、SC17(0) ΔbudABC/RSFRedIX株と命名した。
【０２３８】
＜７−２−３＞P. ananatis SC17(0) ΔbudABC ΔadhE::Tetr/RSFRedIX株の構築
配列番号８７と８８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、adhE遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を増幅した。SC17(0) ΔbudABC /RSFRedIX株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1 mMのIPTGと25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100 mLに1 mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したＤＮＡ断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製し、エレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。12.5mg/Lのテトラサイクリンと25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で、34度にて16時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号８９と９０に示すプライマーを用いてコロニーPCRを行い、ゲノム上のadhE遺伝子がTet耐性遺伝子に置換している事を確認し、SC17(0), ΔbudABC ΔadhE::Tetr/RSFRedIX株を得た。
【０２３９】
＜７−２−４＞P. ananatis SC17(0),ppc::P4071-pyc::Km株およびSC17(0),ldh::P4071-pyc::Km株の構築
SC17(0), ΔbudABC ΔadhE::Tetr/RSFRedIX株の乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子（GenBank accession number NC_017531.1として登録されているP. ananatis AJ13355株ゲノム配列の塩基番号1621607〜1622599に相当）を欠損し、同時にピルビン酸カルボキシラーゼを増強するために、まずSC17(0),ppc::P4071-pyc::Km株を構築した。次に、そのゲノムDNAを鋳型としてPCRによって調製した、ldh遺伝子の上流と下流に相同な配列を有したλattL-Kmr-λattR-P4071-pyc遺伝子断片をλ-red法によってSC17(0)株に対して導入することでSC17(0), Δldh::P4071-pyc::Km株を構築した。
【０２４０】
SC17(0),ppc::P4071-pyc::Kmr株の構築
まず、以下の通り、SC17(0)のゲノム上のldh遺伝子領域をpyc遺伝子を含む配列で置換
した。Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) 2256株（ATCC 13869）株の染色体DNAを鋳型として、配列番号９１と９２に記載した合成DNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、pyc遺伝子のorf領域を含むDNA断片を増幅した。また、λattL-Kmr-λattR-Ptac（WO2008/090770A1）を含むDNA断片を鋳型に、配列番号９３と９４に記載した合成DNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、λattL-Kmr-λattR-P4071を含むDNA断片を増幅した。次に、pyc遺伝子のORF領域を含むDNA断片とλattL-Kmr-λattR-P4071を含むDNA断片を鋳型にして、配列番号９２と９３に記載した合成DNAをプライマーとして用いてPCR反応を行い、両端にppc遺伝子の上流と下流に相同な配列を有したλattL-Kmr-λattR-P4071-pyc遺伝子断片を得た。λattL-Kmr-λattR-P4071-pyc遺伝子断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製し、上記のλ-red法により、SC17(0)/RSF-Rsd-TER株に導入した。40 mg/Lのカナマイシンを含むLBプレート上で形質転換体を選択することにより、ppc遺伝子領域に目的の形質が導入されているSC17(0),ppc::P4071-pyc::Kmr/RSF-Red-TER株を得た。得られた株を10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLBアガロースプレートにて純化し、RSF-Red-TERプラスミドを脱落させた株を得た。得られた株をSC17(0),ppc::P4071-pyc::Kmr株と命名した。
【０２４１】
SC17(0),ldh::P4071-pyc::Km株の構築
SC17(0),ppc::P4071-pyc::Kmr株においては、ppc遺伝子領域にpyc遺伝子が挿入されているため、ppc遺伝子が欠損されている。そこで、pyc遺伝子の挿入位置をppc遺伝子領域からldh遺伝子領域に変更するため、以下の操作を行った。SC17(0),ppc::P4071-pyc::Km株のゲノムを抽出し、これを鋳型にして、配列番号９５と９６に示すプライマーを用いてPCR反応を行い、両端にP. ananatisのldh遺伝子の上流と下流に相同な配列を有したλattL-Kmr-λattR-P4071-pyc遺伝子断片を得た。これを上記のλ-red法により、SC17(0)/RSF-Rsd-TER株に導入した。40 mg/Lのカナマイシンを含むLBアガロースプレート上で形質転換体を選択し、配列番号９７と９８に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにてゲノム構造を確認し、ldh遺伝子領域に目的の形質が導入されているSC17(0),ldh::P4071-pyc::Km/RSFRed-TER株を得た。同株ではppc遺伝子の代わりにldh遺伝子が欠損している。得られた株を10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLアガロースプレートにて純化し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。得られた株をSC17(0),ldh::P4071-pyc::Km株と命名した。
【０２４２】
＜７−２−５＞P. ananatis YDSP24の構築
SC17(0), ΔbudABC ΔadhE::Tetr /RSFRedIX株のldhA遺伝子を上述のλ-red法により欠損し、同時にピルビン酸カルボキシラーゼを増強した。手順を以下に示す。
【０２４３】
SC17(0), ldh::P4071-pyc::Kmrのゲノムを抽出し、700μgを電気パルス法にて、SC17(0), ΔbudABC ΔadhE::Tetr /RSFRedIX株に導入した。菌体を12.5mg/Lのテトラサイクリンと50μg/mLカナマイシンを含むLBアガロースプレート上に塗布し、34℃にて約16時間培養した。生育してきたテトラサイクリンとカナマイシンの耐性株について、配列番号９７と９８に示す合成DNAをプライマーとするPCRによってldh遺伝子領域にP4071-pyc::Kmの形質が導入されていることを確認し、SC17(0) ΔbudABC ΔadhE::Tetr ldh::P4071-pyc::Kmr /RSFRedIX株とした。この株を25 mg/Lクロラムフェニコール及び10mMアラビノースを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、12.5mg/Lのテトラサイクリン、および40μg/mLカナマイシンを加えたLB培地に塗布して34度で一晩培養し、生育出来ない事を確認する事で、テトラサイクリン耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子がともに除去された株である事を確認した。得られた株を、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedIXプラスミドを脱落させ、ΔSC17(0), ΔbudABC ΔadhE ΔldhA P4071-pyc株を得た。この株をYDSP24株と命名した。
【０２４４】
＜７−３＞pSTV28-yjjPBの構築
E. coli W3110株（ATCC 27325）のゲノムDNAを鋳型として、配列番号９９と１００の合成DNAをプライマーとして常法に従ってPCRを行い、yjjPB遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片をIn Fusion HD cloning kit（clontech社製）を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpSTV28ベクターに挿入した。得られたE.coli yjjPB遺伝子発現用プラスミドをpSTV28-yjjPBと命名した。
【０２４５】
＜７−４＞P. ananatis YDSP27株およびYDSP26株の構築
P. ananatis YDSP24株に対し、上記方法で作成したpSTV28-yjjPBを導入することでE.coli由来のyjjPBを発現する株を作成し、YDSP27と命名した。また、YDSP24に対してpSTV28を導入した株をベクターコントロールとし、YDSP26と命名した。
【０２４６】
具体的には、YDSP24株をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液100μLを新たなLB液体培地4 ｍLに植菌し、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとし、エレクトロポレーション法によりpSTV28-yjjPB、またはpSTV28を導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20 kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。SOC培地（バクトトリプトン20 g/L、イーストエキストラクト5 g/L、NaCl 0.5
g/L、グルコース10 g/L）で2時間培養後、40 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB培地にそれぞれ塗布し、16時間培養を行った。その結果、それぞれの培地からクロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、SC17(0) ΔbudABC ΔadhE ΔldhA p4071-pyc/pSTV-yjjPB株（YDSP27株）及びSC17(0) ΔbudABC ΔadhE ΔldhA p4071-pyc/pSTV28株（YDSP26株）を得た。
【０２４７】
＜７−５＞嫌気条件下でのコハク酸生産能の評価
次にこれらの株のコハク酸生産能の評価を行った。これらの株をクロラムフェニコール
25 mg/L、及び寒天15 g/Lを添加したLBGM9培地プレートにて34℃終夜培養を行った。得られた菌体を、0.85％NaCl水溶液3回WashしてOD600＝100の菌液を調整した。コハク酸生産培地1.3 mLを張り込んだ1.5mlチューブ(エッペン)に上記の菌液を0.1ml植菌し、エッペンシェーカー(eppendolf社製、thermomixer comfort)で1400 rpm、34度で48時間振盪培養を行った。以下にコハク酸生産培地の組成を示す。
【０２４８】
〔生産培地組成〕
〔Ａ区〕
グルコース                     20 g/L
MgSO4・7H20                      1.0 g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                       1.0 g/L
KH2PO4                          1.0 g/L
酵母エキス                     2.0 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・5H2O                      0.01 g/L
ビオチン                      0.001 g/L
(pH調整なし)
〔Ｃ区〕
CaCO3                            50 g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコール 25 mg/Lとなるように添加した。
【０２４９】
結果を表１０に示す。対照のYDSP26株と比べ、E.coli由来のyjjPB遺伝子を発現させたYDSP27株では、コハク酸炭素収率が上昇した。以上の結果から、P. ananatisにおいて、yj
jPB遺伝子を増幅することによりコハク酸の炭素収率が向上することが明らかとなった。
【０２５０】
【表１０】
2017216881.tif 000011
【０２５１】
＜配列表の説明＞
配列番号１：E. coli MG1655のyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号２：E. coli MG1655のYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Pantoea ananatis AJ13355のyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号４：Pantoea ananatis AJ13355のYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Enterobacter aerogenes AJ110637のyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号６：Enterobacter aerogenes AJ110637のYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：E. coli MG1655のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号８：E. coli MG1655のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：Pantoea ananatis AJ13355のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Pantoea ananatis AJ13355のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：Enterobacter aerogenes AJ110637のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１２：Enterobacter aerogenes AJ110637のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１４：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のYnfMタンパク質のアミノ酸配列配列番号１５：Corynebacterium glutamicum ATCC13869のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Corynebacterium glutamicum ATCC13869のYnfMタンパク質のアミノ酸配列配列番号１７：E. coli MG1655のyjjP遺伝子の塩基配列
配列番号１８：E. coli MG1655のYjjPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：Enterobacter aerogenes AJ110637のyjjP遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Enterobacter aerogenes AJ110637のYjjPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：E. coli MG1655のyjjB遺伝子の塩基配列
配列番号２２：E. coli MG1655のYjjBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Enterobacter aerogenes AJ110637のyjjB遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Enterobacter aerogenes AJ110637のYjjBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５〜４８：プライマー
配列番号４９：E. coliのコドン使用頻度に至適化したAspergillus terreusのCAD遺伝子の塩基配列
配列番号５０：Actinobacillus succinogenes 130ZのpckA遺伝子の塩基配列
配列番号５１：Actinobacillus succinogenes 130ZのPckAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５２〜６６：プライマー
配列番号６７：Ptac1000プロモーターの塩基配列
配列番号６８〜１００：プライマー
配列番号１０１：Pantoea ananatis AJ13355のldhA遺伝子の塩基配列
配列番号１０２：Pantoea ananatis AJ13355のLdhAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０３：Pantoea ananatis AJ13355のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号１０４：Pantoea ananatis AJ13355のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０５：Pantoea ananatis AJ13355のbudB遺伝子の塩基配列
配列番号１０６：Pantoea ananatis AJ13355のBudBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０７：Pantoea ananatis AJ13355のbudA遺伝子の塩基配列
配列番号１０８：Pantoea ananatis AJ13355のBudAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０９：Pantoea ananatis AJ13355のbudC遺伝子の塩基配列
配列番号１１０：Pantoea ananatis AJ13355のBudCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１１：Pantoea ananatis AJ13355のsdhA遺伝子の塩基配列
配列番号１１２：Pantoea ananatis AJ13355のSdhAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１３：Pantoea ananatis AJ13355のmdh遺伝子の塩基配列
配列番号１１４：Pantoea ananatis AJ13355のMdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１５：Pantoea ananatis AJ13355のmqo1遺伝子の塩基配列
配列番号１１６：Pantoea ananatis AJ13355のMqo1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１７：Pantoea ananatis AJ13355のmqo2遺伝子の塩基配列
配列番号１１８：Pantoea ananatis AJ13355のMqo2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１９：Pantoea ananatis AJ13355のsfcA遺伝子の塩基配列
配列番号１２０：Pantoea ananatis AJ13355のSfcAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２１：Pantoea ananatis AJ13355のmaeB遺伝子の塩基配列
配列番号１２２：Pantoea ananatis AJ13355のMaeBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２３：Pantoea ananatis AJ13355のaceB遺伝子の塩基配列
配列番号１２４：Pantoea ananatis AJ13355のAceBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２５：Pantoea ananatis AJ13355のaceA遺伝子の塩基配列
配列番号１２６：Pantoea ananatis AJ13355のAceAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２７：Pantoea ananatis AJ13355のaceK遺伝子の塩基配列
配列番号１２８：Pantoea ananatis AJ13355のAceKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２９：Pantoea ananatis AJ13355のsucA遺伝子の塩基配列
配列番号１３０：Pantoea ananatis AJ13355のSucAタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2017216881.tif 000012
【配列表】
2017216881000001.app