(57)【要約】【課題】本発明は、サイレージの二次発酵を抑制し、好ましいサイレージ調製に有用な乳酸菌を提供することを課題とする。また本発明は二次発酵の抑制されたサイレージを製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】抗酵母作用を有するラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）をサイレージ調製用乳酸菌とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイレージ調製用乳酸菌であって、抗酵母作用を有するラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）。
【請求項２】
ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）が、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００６株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０８）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２１０）である請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を含有するサイレージ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を含有するサイレージ調製用添加剤。
【請求項５】
請求項４に記載のサイレージ調製用添加剤をサイレージ材料に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイレージ調製用の乳酸菌及びこの乳酸菌を用いた飼料調製用添加剤またはサイレージ調製用添加剤および当該添加剤を用いるサイレージの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイレージは牛にとって主食にあたる重要な飼料であり、この品質が酪農経営に大きく影響する。サイレージは生ものである牧草や飼料作物などを長期間貯蔵するために漬物の状態にする技術である。しかしサイレージの製造に当たっては、古くから２つの課題が指摘されている。１つは密封貯蔵中の酪酸菌が原因となる酪酸発酵を抑えること、もう１つはサイレージ開封後に酵母などが増えることで発熱、変敗する二次発酵を抑えることである。この２つの課題を解決するために、古くからサイレージ添加物の検討が行われているが両者の課題をともに解決できるようなサイレージ添加物はいまだ提供されていない。特に二次発酵の問題はＴＭＲ飼料の普及にともなって増大している。
【０００３】
従来、これら課題に対する提案がなされている。主な提案は、サイレージ中において乳酸産生能力の高い乳酸菌をサイレージ調製時に添加して、乳酸によるサイレージｐＨ低下を促進させ、これによって有害な微生物の増殖を抑制しようとするものである。特許文献１には、耐酸性と乳酸発酵能に優れた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）畜草１号株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９３０）又は好気性細菌と酪酸菌に対する抗菌作用を有する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＲＯ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９３１）をサイレージ用乳酸菌として用いることで有害微生物によるサイレージの品質低下を防止できることが記載されている。しかし特許文献１の発明で二次発酵を抑制できるとの記載もなく、効果は不明である。
【０００４】
特許文献２には、バクテリオシンを産生する乳酸菌エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＮＡＳ６２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７８１）を用いてサイレージ用乳酸菌として用いることで、バクテリオシンの抗菌作用により有害微生物を抑制しようとするものである。特許文献２にはサイレージ中の糸状菌が検出されず、発酵ＴＭＲ飼料中にも糸状菌が検出されないことが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、抗真菌作用を有するロイテリン生産能を有するホモ型発酵乳酸菌と、グリセロールと、ビタミンＢ１２を含む、サイレージ調製用添加剤が提案されている。ロイテリン（Ｒｅｕｔｅｒｉｎ）は、嫌気性雰囲気下にグリセリンを含有する培地中で、ラクトバチルス・ロイテリの産生する抗菌性物質である。上記培養上清中に、グリセリンの発酵産物であるβ−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（β−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）が検出され、このβ−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、水溶液中で単量体、水和物および二量体の形態で存在すると推定され、ロイテリンと称されている。ロイテリンは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母およびカビに対して抗菌性を示す。しかし、ロイテリンを生成させるためには、大量のグリセロールが必要なことから、実際のサイレージ調製の場面での実施は現実性が低い。
【０００６】
特許文献４には、抗菌性物質であるナイシン産生能を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｃｏｃｕｓｓ  ｌａｃｔｉｓ）と乳酸耐性を有する乳酸菌を用いたサイレージ生産用の組成物が開示されている。
特許文献５には、サイレージから分離したラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を添加したサイレージが異常な発酵を起こさなかったことが記載されている。
【０００７】
上記したとおり、種々のサイレージ調製のための乳酸菌やこれを用いたサイレージ製造のための添加剤が提案されているが、必ずしも満足できるものがないことが現実である。特にサイレージの二次発酵の問題は大きな課題である。
サイレージの二次発酵の問題とは、煎じ詰めて言えば、サイロあるいはロールラッピング開封後の好気的変敗である。これを完全に解決できたサイレージ用乳酸菌は、従来技術では見当たらない。開封前のサイロやロールラップサイレージ内は、炭酸ガス、窒素ガスなどで満たされ、一定の低いｐＨ環境下にあり安定状態にある。原料に付着し、詰め込み時に一緒にサイロやロール内に入った各種微生物は、この状況下では休眠状態にある。ところが、サイロを開封し、あるいはロールを開封してサイレージが空気にさらされる状態になると、空気のある状態で活動する微生物、すなわち好気性微生物が急速に増殖する。特に酵母が適度な湿度、温度、養分（酵母はサイレージ中に生成された乳酸などを養分とする）によって急速に活動を始め、サイレージの温度は急激に上昇する。そして、この発熱に刺激されたカビが増殖を始め、この結果、サイレージは茶褐色を呈し異臭を放つばかりではなく、牛の嗜好性の低下、消化率の低下、サイレージ乾物のロス、さらに乳牛の下痢、アルコール不安定乳の発生といった大きな損失を招く。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−０４１０６４号公報
【特許文献２】特開２０１１−４１４７４号公報
【特許文献３】特開２００８−３５７２８号公報
【特許文献４】国際公開第２０１３／００１８６２号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２８１９１７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、サイレージの二次発酵を抑制し、好ましいサイレージ調製に有用な乳酸菌を提供することを課題とする。また本発明は二次発酵の抑制されたサイレージを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために研究を重ね、サイレージや飼料調製用の乳酸菌のスクリーニングを繰り返した結果、従来サイレージ調製用の乳酸菌としてはあまり注目されていなかったラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）の中から、抗酵母作用を有する一群のラクトバチルス・ディオリヴォランスを見いだした。この一群のラクトバチルス・ディオリヴォランスは、乳酸産生能及び酢酸生産能が高くサイレージの品質が向上することを確認できた。この一群のラクトバチルス・ディオリヴォランスを活用することで上記課題を解決するに至ったものである。
【００１１】
本発明は、次の構成からなる発明である。
（１）サイレージ調製用乳酸菌であって、抗酵母作用を有するラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）。
（２）ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）が、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００６株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０８）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２１０）である（１）に記載の乳酸菌。
（３）（１）又は（２）に記載の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を含有するサイレージ。
（４）（１）又は（２）に記載の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を含有するサイレージ調製用添加剤。
（５）（４）に記載のサイレージ調製用添加剤をサイレージ材料に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、抗酵母作用を有し、実際のサイレージ発酵条件においては、酵母をはじめとする真菌の抑制作用を有し、また該乳酸菌の培養液中に抗真菌性物質を産生する特性を有する乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を提供することができる。この乳酸菌は、耐酸性に優れ、かつ良質な乳酸発酵を可能とするサイレージ用添加物を提供することができる。得られるサイレージは二次発酵が抑制されている。このため、ＴＭＲ飼料等に応用した場合、腐敗臭や変敗臭が抑制された飼料となり、安全性が高く家畜の採食性が改善され、肥育牛の体重増大や乳牛の乳量増加などが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランスの菌体破砕物が酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの生育を抑制することを示すグラフである。
【図２】本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランスの菌体破砕物が酵母Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの生育を抑制することを示すグラフである。
【図３】酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの生育抑制を指標とした乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランスの選抜試験の結果を示す。
【図４】Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの生育抑制を指標とした乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランスの選抜試験の結果を示す。
【図５】図３、図４で示した選抜試験の結果を散布図で示すものである。２種の酵母に対する抗酵母効果を一覧で評価するための図面である。
【図６】実施例１〜４、及び比較例のサイレージ用乳酸菌を添加し、２５℃で発酵させたサイレージの発酵品質を示すグラフである。
【図７】実施例１〜４、及び比較例のサイレージ用乳酸菌を添加し、１５℃で発酵させたサイレージの発酵品質を示すグラフである。
【図８】実施例１〜４、及び比較例のサイレージ用乳酸菌を添加して調製したサイレージの開封後３０℃到達時間を示すグラフである。
【図９】実施例１〜３、比較例１、比較例２のサイレージ用乳酸菌を添加して１５℃の保存条件で調製したサイレージの、開封後３０℃到達時間を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗酵母作用を有する新規な乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）に係る発明である。
また本発明は、前記の乳酸菌を含有する飼料調製用添加剤、前記菌株を添加することを
特徴とするサイレージ等の飼料やその調製方法に関する。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）は、ヘテロ発酵をする乳酸菌である。サイレージより分離される該乳酸菌を選別することで得ることができる。
通常は、サイレージより分離された乳酸菌株のなかで、乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）に分類された株を、デントコーンなどのサイレージ調製に用いる植物の細切材料に、サイレージから分離した酵母の培養液を添加し、ポリエチレンパウチ袋に、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を添加して、２５℃で２ヶ月間保存した後開封し、得られたサイレージ中の有機酸含量、酵母菌数、乳酸菌数、開封後３０℃に到達時間（二次発酵時間）を指標にして第１次選抜を行う。
【００１６】
次いで、サイレージとして好ましい有機酸含量、酵母菌数、乳酸菌数、開封後３０℃に到達時間（二次発酵時間）を示すラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）をＭＲＳ培地やＧＹＰ培地により培養して、菌体を回収した後破砕し、これをサイレージから分離される酵母であるＰｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓおよび／又はＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの増殖を指標として抗酵母作用（酵母増殖抑制作用）を確認して選別することができる。
【００１７】
上記の特性を有する抗酵母作用を有する乳酸菌ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）としては、抗酵母作用に加えて、乳酸生産量が高く、好ましい品質特性のサイレージ発酵作用を有するものが良い。
具体例としては、本発明者らが分離し、(独)製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに国際寄託したラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００６株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０８）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２１０）が例示できる。 
【００１８】
上記の乳酸菌の培養は、通常の乳酸菌用の培地を用いて行うことができる。培地としては、乳酸菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されない。例えばＧＹＰ培地、ＭＲＳ培地を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常、ｐＨ５．０〜７．０、２５〜４０℃、１０〜４８時間で培養することができる。培養した該乳酸菌は、培養液あるいは菌体を濃縮した濃縮液の状態で、サイレージを調製するための原料や、発酵終了後のサイレージまたはＴＭＲなどの発酵飼料に添加することもできる。これらの液を凍結品として使用しても良い。また培養した乳酸菌を適当な保護剤や基材とともに凍結乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥させた粉末の状態で、サイレージ調製用添加剤として使用することができる。乳酸菌の凍結乾燥粉末には、必要によりトレハロースや炭酸カルシウム粉末などを添加することができる。またサイレージの発酵を促進するための公知の成分、例えばセルラーゼなどを添加することができる。
【００１９】
本発明におけるサイレージ調製用添加剤は、様々なサイレージや発酵飼料の調製に使用することができる。サイレージや発酵飼料の調製に用いられる原料としては、通常飼料として利用されている原料であれば特に限定されるものではないが、例えば牧草や飼料作物としてアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラス、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガム、スーダングラス、ヒエ、トウモロコシ、飼料イネなどや、トウモロコシやコメの子実が主体のソフトグレインが挙げられる。食品製造副産物としてビール粕、発泡酒粕、豆腐粕、茶粕、焼酎粕、ウィスキー粕、ビートパルプ、バカス、コーヒー粕、ジュース粕、ケール粕、デンプン粕などが挙げられる。農産副産物として稲ワラ、麦ワラ、規格外野菜などが挙げられる。また、食品製造副産物、サイレージ、農産副産物、乾草、濃厚飼料、ビタミン・ミネラル製剤などを混合して調製する発酵ＴＭＲにも添加することができる。これらのサイレージや発酵飼料原料は水分を４０〜９０質量％に調節して使用することが望ましい。
【００２０】
サイレージ調製用添加剤としての使用量は、添加する菌数は、合計で原料１ｇあたり１０3〜１０7個、好ましくは１０4〜１０6個になるように添加する。本発明においては、サイレージや発酵飼料に使われる牧草や飼料作物であれば特に限定されるものではないが、例えばアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラスなどの牧草や、トウモロコシ、ソルガムなどの飼料作物が挙げられる。二次発酵を起こしやすいトウモロコシやソルガムを使用するのが望ましい。牧草や飼料作物の形態としては、刈り取った生草の状態で使用しても良いが、冷蔵や冷凍保存したものでも良いし、通風乾燥、凍結乾燥した牧草を粉砕した乾燥粉末の状態で使用しても良い。また、飼料として流通しているルーサンペレットやヘイキューブを利用しても良いし、トウモロコシやコメの子実が主体のソフトグレインを利用することも可能である。
サイレージや発酵飼料は、嫌気条件下で発酵させる。発酵用の容器は、嫌気状態がある程度保持できるものであれば特に限定されないが、例えばバンカーサイロ、スタックサイロ、トレンチサイロ、タワーサイロ、地下サイロ、ブロックサイロ、カップサイロ、ロールベール、フレコンバックなどが挙げられる。通常は外気温５〜３０℃程度、好ましくは１５〜２５℃で１週間〜２ヶ月放置することで発酵させてサイレージとすることができる。
【００２１】
本発明のサイレージ調製用添加物を用いて得られるサイレージや発酵飼料は、開封後の二次発酵が起きないため、牛の嗜好性、採食量が良好であり、飼料栄養価の低下が生じない。
【実施例】
【００２２】
次に実施例、比較例を挙げてさらに本発明を説明する。なお、以下の記載は本発明を説明するためのものであって、本発明を実施例に限定するものでないことは言うまでもないことである。
＜１．ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）の第１次選抜＞
雪印種苗株式会社において、サイレージから分離し、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）であることを確認した乳酸菌株１８株を用いた。雪印種苗株式会社での菌株名は次のとおりである。３、６６、１２６、１２８、１８３、１８７、３７９、５１８、５４７、５７４、５８６、６０２、６０３、６１７、７０７、７４６、７６７、小田２。
（１）サイレージの調製
この１８株を、ＧＹＰ液体培地で培養し、１．５×１０９ＣＦＵ/ｍＬの培養液を調製し、これを凍結乾燥して、乳酸菌粉末を得た。これ用いて１次選抜試験を行った。
１次選抜試験は、秋に採取し、サイレージ材料として冷凍保存しておいたデントコーン細切品３００ｇに、既存のサイレージから分離した酵母培養液（７．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を３ｍＬ添加し、さらに、上記の乳酸菌粉末３０ｍｇを１００ｍＬのイオン交換水に懸濁した液を１ｍＬ噴霧添加して混合後（１ｍｇ／ｋｇ相当）、これを１００ｇずつ秤量してポリエチレン製パウチ袋に密封した（３反復）。この密封した袋をサイレージ調製条件である２５℃で２ヶ月間保存した。
【００２３】
（２）サイレージの品質
所定の期間経過後開封してサイレージを取り出し、ｐＨ、有機酸含量（ＨＰＬＣ）、乳酸菌数、酵母菌数を測定した。また、２５℃の室温中で、開封後の品温上昇を測定しサイレージの二次発酵の指標である３０℃に到達する時間を測定した。測定結果を下記の表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１に示すように、試験した１８株のラクトバチルス・ディオリヴォランスは、サイレージ中に酢酸・プロピオン酸を産生し、酪酸を産生しない好ましい菌株であることが確認された。しかし冷凍保存したデントコーンを原料としたサイレージでは、酢酸が主体のサイレージとなったが、酵母抑制による二次発酵防止は確認できなかった。
【００２６】
＜２．ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）の第２次選抜＞
前記の第１次選抜に使用したラクトバチルス・ディオリヴォランス１８株を用い、デントコーンサイレージを調製し、開封後の二次発酵によって、３０℃に到達するまでの時間を指標にして２次選抜を行った。
（１）サイレージの調製
デントコーン（黄熟期）を刈り取り、クラッシャーを用いて細切し、さらに第１次選抜と同様に乳酸菌粉末をデントコーン１ｋｇあたり１ｍｇ添加し、良く混合後１Ｌ容量の密封ボトルに８００ｇを詰め込み、サイレージとした。サイレージの保管温度は２５℃、発酵期間は１０週間とした。
【００２７】
（２）サイレージの品質変化による菌株の選別
所定の期間経過後開封して、サイレージを取り出し、開封後の品温変化を測定しサイレージの二次発酵の指標である３０℃に到達する時間を測定し、二次発酵抑制する菌株を選択した。その結果、６０３株及び７６７株の２株が特に開封後のサイレージの品温を長時間（１００時間以上）上昇させないことが確認された。また６０３株、７６７株のサイレージは酵母の増殖が抑制されていることが確認された。
【００２８】
＜３．７６７株から７６７Ｓ株及び７６７Ｒ株の分離＞
７６７株をＭＲＳ平板培地で継代したところ、コロニーの形状が円滑（スムース）なクローンとコロニー周縁が粗面（ラフ）なクローンに分離した。前者を７６７Ｓ、後者を７６７Ｒとした。
以降記載の試験はこの７６７Ｓ、７６７Ｒ、６０３の３株を対象として説明する。
【００２９】
＜４．酵母生育抑制試験＞
７６７Ｓ、７６７Ｒ、６０３株は、サイレージ中において酵母の生育を抑制するとともに、酵母の純培養系において７６７Ｓ、７６７Ｒ、６０３株の菌の破砕物が増殖を抑制する。代表的な例を示して説明する。
（１）試験方法
１）乳酸菌の菌体破砕液の調製
ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ）液体培地とコーン粉末１０％煮汁培地を１：１で混合した。乳酸菌を接種し３７℃５日間培養した。培養液１０ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブに分注し、３５００ｒｐｍ×１５分間遠心分離した。次いで上清を廃棄し、沈殿部をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。再度、３５００ｒｐｍ×１５分間遠心分離し沈殿を、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁した。水を入れた５０ｍＬファルコンチューブを氷冷バットに入れ、１５ｍＬファルコンチューブをその中に入れた状態で、超音波破砕機で５分間細胞を破砕した。３５００ｒｐｍ×５分間遠心分離を行ない、上清を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌し菌体破砕液を得た。試験用の乳酸菌抽出液とした。なお本試験を行った乳酸菌はサイレージ中で酵母の生育を抑制することが知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ２３４７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＮＫ０１、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＴＪ４８（ＳＢＳ０００１）、そして上記で分離した７６７Ｓ、７６７Ｒ株である。
【００３０】
２）酵母の生育抑制試験
Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）をｐＨ４．０に調整し１８０μＬ、１００ｍＭの炭素源１０μＬ、試験乳酸菌の菌体破砕液１０μＬを９６ｗｅｌｌマイクロプレートに分注し、ＰＢＳ（−）で洗浄した酵母（ＹＰＤ  培地２７℃４８時間培養液、（酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（以下「Ｐｆ」）、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ（以下「Ｃｋ」）を２μＬ添加した。炭素源は、Ｐｆは乳酸、Ｃｋは酢酸である。なお酵母はいずれも本発明者らがサイレージから分離し同定したものを用いた。
２７℃で４８時間好気培養し、ピペッティングで培養液を撹拌したのちＯ．Ｄ．６００ｎｍを測定し、酵母の生育抑制作用を評価した。
【００３１】
（２）結果
酵母Ｐｆの生育抑制試験結果を図１、酵母Ｃｋの抑制試験結果を図２に示す。
７６７Ｓ、７６７Ｒ株の菌体破砕液は他の乳酸菌に比して明らかな酵母の生育を抑制することが確認できた。この試験が抗酵母作用のスクリーニングに使用できるものと判断した。
ついで、同様の試験をサイレージの品温上昇を抑制することで選抜した６０３株、５４７株について実施したところ、６０３株および５４７株も菌体破砕液が酵母の生育を顕著に抑制することが確認できた。この酵母抑制作用は、何らかの抗酵母作用を示す物質を乳酸菌体内に産生することによるものであることが予想される。
このような抗酵母作用物質を生産するラクトバチルス・ディオリヴォランスは従来まったく知られていなかった。
以上の試験結果から、本発明者らがサイレージから分離し、選抜したラクトバチルス・ディオリヴォランスは、良好なサイレージ発酵能力を有し、さらに抗酵母作用を有する新規な一群の微生物であることが確認された。
なお、本出願人によって７６７Ｓ株は、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００６株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０８）として、７６７Ｒ株はラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２０９）、６０３株は、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）ＳＢＳ−０００９株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２１０）として（独）製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに国際寄託された。
【００３２】
＜５．６０３株、５４７株、７６７Ｓ株、７６７Ｒ株の菌学的性質＞
上記６０３株、５４７株、７６７Ｓ株、７６７Ｒ株の４株は、ラクトバチルス・ディオリヴォランスに分類される。この４株のうち、さらにこれら４株の菌学的性質（糖資化性）をバージーズマニュアルに則って確認した。４８時間培養と５日間培養で資化性に相違が認められた。下記表２に４８時間培養後の資化性、表３に５日間培養の資化性を示す。なお表２は、ラクトバチルス・ディオリヴォランスの標準株であって、公開情報が提供されているＪＣＭ１２１８３株（理化学研究所バイオリソースセンター提供株）の糖資化性と対比して示す。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
なお７６７Ｓおよび７６７Ｒ株は、ラクトースの資化性を有しており、基準株には認められなかったスクロースの資化性があることが確認された。また５４７株および６０３株は、ガラクトース及びグルコースの資化性が低いことが特徴の一つである。
【００３６】
＜６．ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）の第３次選抜＞
上記のとおり、第２次選抜でサイレージ中の酵母抑制から７６７Ｓ株、７６７Ｒ株を選抜した。この試験を再度、本発明者がサイレージから分離したラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）の保存株に適用し、抗酵母作用により第３次選抜をおこなった。試験に供した株は次のとおりである。
１２６、１２８、１８３、１８７、５１８、５４７、５７４、５８６、６０２、６０３、６１７、７０７、７４６、７６７Ｓ、７６７Ｒ、小田２の１６株を対象とした。
（１）試験方法
１）乳酸菌の菌体破砕液の調製
上記の４．の試験と同様にＬｂ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓのＭＲＳ培養液の１００μＬを、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ）液体培地とコーン粉末１０％煮汁培地を１：１で混合したものに接種し、５日間３７℃で培養した。
培養液を３０００Ｇ×１５分間遠心分離し、上清を廃棄、沈殿物に１ｍＬのＰＢＳ（−）を加え、氷冷化で超音波破砕機を用い、細胞を破砕した。破砕液を３０００Ｇ×１５分間遠心分離し、破砕液の上清は、０．２２μｍのメンブランフィルターを用い、ろ過滅菌した。
次いで９６ウェルのマイクロプレートに、上記上清を１０μＬ、０．１％のグルコースを含むＹＮＢ培地（ｐＨ４．０）を１８０μＬ、１００ｍＭの炭素源（乳酸、酢酸）を１００μＬ加え、酵母のＹＰＤ培養液２μＬを接種し、２７℃で４８時間培養した。乳酸を炭素源としたときは、酵母はＰｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（Ｐｆ）を用い、酢酸を炭素源としたときは、酵母はＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｃｋ）を用いた。
培養終了後、各ウェルをピペッティングで十分に混合・撹拌し、マイクロプレートリーダーで６００ｎｍの波長で吸光度を測定した。先の抗酵母試験から、乳酸培地・酢酸培地の両方において、吸光度０．３５以下をスクリーニングした場合、抗酵母抑制作用ありと判定した。
【００３７】
２）結果
乳酸（ＬＡ）を炭素源とした場合の抗酵母作用の評価（吸光度）を図３、酢酸（ＡＡ）を炭素源とした場合の抗酵母作用の評価（吸光度）を図４に示す。また、ＡＡでの吸光度をＸ軸、ＬＡでの吸光度をＹ軸として、散布図を作成した。この散布図を図５に示す。散布図とすることで、タイプの異なる酵母菌種に対する効果を同時に判断することができた。
図３、図４、図５から明らかなように、酵母の生育の指標である吸光度０．３５以下となるラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）株として５４７、６０２、６０３、７０７、７６７Ｓ、７６７Ｒ株が選抜された。
さらに、下記に示す実施例を用いた試験結果から、Ｐｆ又はＣｋを試験酵母とすると抗酵母作用を有するラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を選抜できることが判明した。すなわち、上記の抗酵母効果試験は、サイレージの開封後の二次発酵（品温上昇）抑制作用を有する乳酸菌の選抜方法として優れているものと判断できる。
【００３８】
＜６．７６７Ｓ株、７６７Ｒ株、６０３株、５４７株を用いたサイレージ添加剤の製造＞
１．菌体の培養
乳酸菌の生育スピードなどを勘案して以下の実施例では７６７Ｓ株、７６７Ｒ株、６０３株、５４７株を用いてサイレージ添加剤を製造した。
下記の表４に示したグルコース・イーストエキス・ペプトン液体培地をｐＨ５．５に調整したのちに、１２１℃１５分間滅菌した。培地は、賦活培養用１０ｍＬ、接種用８Ｌ、本培養用１６００Ｌを各々調製した。
それぞれの菌のマイナス８０℃保存菌体から、一白金耳を、賦活培養用培地に接種し、２４時間３７℃で培養した。培養終了後に、接種用８Ｌに賦活培養液を８ｍＬ接種し、２４時間３７℃で培養した。さらに、培養終了後、本培養用１６００Ｌに、接種培養液を全量添加し、２４時間３７℃で培養した。
【００３９】
【表４】
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培地組成
【００４０】
２．菌体の凍結乾燥
本培養により菌体密度６．０×１０９ＣＦＵ／ｍＬの培養液１６００Ｌを得た。培養液のすべてを、連続式遠心分離器で遠心分離し、１．０×１０１１ＣＦＵ／ｍＬの菌体濃縮物４０Ｌを得た。１２１℃１５分間滅菌し放冷した８０Ｌの１５％トレハロース溶液に上記菌体濃縮物４０Ｌを加え、１５℃で３０分間懸濁したのち、マイナス３０℃で冷凍し、凍結乾燥まで保存した。凍結させた菌体を常法で凍結乾燥させた。得られた凍結乾燥粉末中の生菌数は、２．４×１０１１ＣＦＵ／ｇであった。
【００４１】
３．サイレージ調製用粉末の製造
回収した凍結乾燥粉末は、生菌数を測定後、２×１０１１ＣＦＵ／ｇとなるようにトレハロース粉末を混合した。このようにして調製した７６７Ｓ株の粉末を以下実施例１、７６７Ｒ株の粉末を実施例２、６０３株の粉末を実施例３、５４７株の粉末を実施例４とする。
なお、この粉末は、サイレージ調製用粉末の原体ともなるものである。これをさらにトレハロース、炭酸カルシウム、ゼオライトなどの粉末で５〜１０００倍希釈してサイレージ添加用剤とする。
【００４２】
＜７．サイレージ調製用粉末の効果試験（Ｉ）＞
（１）試験品
実施例１〜４の粉末を用いてサイレージを調製し効果を確認した。
さらに比較例として雪印種苗株式会社が販売するサイレージ調製用乳酸菌製材「サイロＳＰ」に用いているラクトバシラス・ブクネリ  ＮＫ−０１株を同様にして調製したものを用いた。
【００４３】
（２）サイレージの調製
トウモロコシサイレージを調製するに際し、実施例１〜４及び比較例の乳酸菌粉末をサイレージ原料当たり乳酸菌数１０６ＣＦＵ／ｇになるように添加混合し、これを約８００ｇ、１Ｌ容量の試験ボトルに詰め込み、密封し２５℃並びに１５℃の２条件で２ヶ月間保存してサイレージを調製した。２ヵ月後開封して以下の試験を行った。なお試験用ボトルは、各例とも３本とした。
【００４４】
（３）サイレージの品質試験
ボトル全てにおいて異常発酵したものは観察されなかった。サイレージ中のｐＨ、乳酸量（ＬＡ）、酢酸量（ＡＡ）、コハク酸量（ＳＡ）を常法により測定し、サイレージとしての品質を評価した。また発酵臭の良否も確認した。２５℃の保存サイレージの品質を図６、１５℃の保存サイレージの品質を図７に示す。
実施例１〜４の２５℃保存サイレージはいずれも低ｐＨを示し、比較例１、無添加に比して優れていた。またサイレージとしての好ましい臭いであり問題となる異常発酵を示さなかったことが確認された。
１５℃保存サイレージは、実施例比較例とも品質に大きな相違はなかった。
【００４５】
（４）開封後の二次発酵試験
開封後の３０℃到達時間、開封直後の酵母数、２５℃保管品開封２日経過後の酵母数、１５℃保管品開封３日後の酵母数
１）３０℃到達時間
実施例、比較例、無添加のサイレージの３０℃到達時間を測定した。測定結果は平均値及び標準偏差で示した。また各例のステューデントのｔ検定により有意差検定を行った（有意水準：５％）。結果を下記の表５及び図８に示す。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
表５及び図８に示すとおり、実施例のサイレージ添加用乳酸菌製剤を添加したサイレージはいずれも二次発酵を顕著に抑制した。またサイレージの好ましい調製温度である２５℃保存においてその効果は著しく、比較例の約６倍の時間となった。本発明の実施例品はサイレージの二次発酵を抑制する作用を有していることが裏付けられた。
１５℃保存のサイレージにおいては、比較例及び対照の無添加サイレージの二次発酵を約２０時間上回った。
【００４８】
２）２５℃保管サイレージの開封直後及び開封２日後の酵母数
２５℃に保管した実施例、比較例、無添加のサイレージの開封直後の酵母数及び開封後２日経過したサイレージの酵母数を測定した。測定結果は平均値及び標準偏差で示した。また各例のステューデントのｔ検定により有意差検定を行った（有意水準：５％）。結果を下記の表６に示す。
【００４９】
【表６】
2017163877.tif 000008
【００５０】
表６に示すとおり、実施例のサイレージ添加用乳酸菌製剤を添加したサイレージはいずれも開封直後の酵母数が比較例及び対照（無添加）の１／１０００以下に抑制されていた。その結果開封２日後の酵母数には、対照及び比較例に比して１／１０００００以下に抑制されていた。
【００５１】
３）１５℃保管サイレージの開封直後及び開封３日後の酵母数
１５℃に保管した実施例、比較例、無添加のサイレージの開封直後の酵母数及び開封後３日経過したサイレージの酵母数を測定した。測定結果は平均値及び標準偏差で示した。また各例のステューデントのｔ検定により有意差検定を行った（有意水準：５％）。結果を下記の表７に示す。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
表７に示すとおり、実施例のサイレージ添加用乳酸菌製剤を添加したサイレージはいずれも比較例に比して抑制されていたがその効果はあまり大きなものではなかった。開封３日目の酵母数も同様であった。
【００５４】
＜８．サイレージ調製用粉末の効果試験（ＩＩ）（１５℃発酵サイレージの試験）＞
低温時のサイレージ調製で発生する２次発酵について本発明品の抑制効果について再試験を実施した。
（１）試験品
実施例１〜３の粉末及び比較例１の粉末を用いてサイレージを調製し効果を確認した。
さらに比較例２として本発明に使用するラクトバチルス・ディオリヴォランスの標準株であるＪＣＭ１２１８３株（理化学研究所バイオリソースセンター提供株）を同様にして調製したものを用いサイレージを調製した。
【００５５】
（２）試験方法
サイレージの調製は、７．の試験と同様に実施し、低温地域のサイレージ発酵条件である１５℃で２ヶ月間保存してサイレージを調製した。２ヵ月後開封して開封後の二次発酵試験を実施した。すなわち、開封後の３０℃到達時間、を７．の試験と同様にして測定した。
【００５６】
（３）試験結果
３本のボトルの３０℃到達時間の平均値を図９に示す。
無添加、比較例１は約３０時間で３０℃に到達した。比較例２は３９時間で３０℃に到達した。一方実施例１〜３は３０℃に到達するまで５０時間以上経過する結果であった。すなわち、本発明のサイレージ添加剤は、低温で調製したサイレージの２次発酵を抑制し、その効果は、公知のサイレージ調製用菌株であるラクトバシラス・ブクネリＮＫ−０１株及びラクトバチルス・ディオリヴォランスの標準株であるＪＣＭ１２１８３株よりも優れていた。
本発明によるサイレージ調製用乳酸菌製剤は、サイレージ中の酵母の増殖を抑制し、二次発酵によるサイレージ温度の上昇を抑制し、開封後のサイレージの品質低下を抑制する。特に低温発酵させたサイレージにおいても高い効果があることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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