(57)【要約】【課題】本来耐塩性の低い真核藻類に、高塩濃度環境下での生育を可能とするために耐塩性を付与する方法を提供する。【解決手段】真核藻類に、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることを特徴とする、真核藻類の耐塩化方法；前記バクテリアが含む前記耐塩性付与遺伝子が、耐塩性真核藻類又は耐塩性シアノバクテリアに由来する、ＤｎａＫ遺伝子、１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｍａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ遺伝子、及びＭａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記記載の真核藻類の耐塩化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核藻類に、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることを特徴とする、真核藻類の耐塩化方法。
【請求項２】
前記バクテリアが含む前記耐塩性付与遺伝子が、耐塩性真核藻類又は耐塩性シアノバクテリアに由来する、ＤｎａＫ遺伝子、１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｍａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ遺伝子、及びＭａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の真核藻類の耐塩化方法。
【請求項３】
前記バクテリアを、前記真核藻類の内部に共生させる、請求項１又は２に記載の真核藻類の耐塩化方法。
【請求項４】
前記バクテリアが、２種類以上のバクテリアからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真核藻類の耐塩化方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の真核藻類の耐塩化方法により得られた耐塩性真核藻類を、塩化ナトリウム濃度が１質量％以上である液体培地で培養する、耐塩性真核藻類の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本来耐塩性の低い真核藻類に、高塩濃度環境下での生育を可能とするために耐塩性を付与するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの微生物による生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が進んでいる。特に、藻類は、光と二酸化炭素を用いて光合成を行い、糖を生合成し、また、アミノ酸やバイオプラスチック原料などの化合物をつくることも知られている。そこで、藻類を用いて有用化合物や代替エネルギーを生産することは、今後のサスティナブルな社会を実現するために必要な技術と考えられている。
【０００３】
しかし、有用化合物の合成工場として利用可能な藻類の多くが、淡水でしか培養することができず、このため、藻類を工業的に大量に培養するためには多量の淡水が必要であるという問題がある。近年、世界的に水不足が深刻な問題となっていることから、淡水を用いた藻類の大量培養は現実的にはかなり困難である。地球上に最も多く存在する水資源は海水であり、海水を農業用水として利用できれば、この問題を解決できる。そこで、有用な藻類が海水で培養可能となるように耐塩化する方法の開発が期待されている。
【０００４】
淡水性真核藻類を耐塩化する方法としては、例えば非特許文献１には、淡水性単細胞シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）が、窒素源となる塩化アンモニウムとリン源となるリン酸水素カリウムを添加することによって海水中で培養できたこと、ただし、増殖速度は本来の７割程度に抑えられていたこと、が報告されている。
【０００５】
海産藻類を解析することにより、藻類の耐塩性のメカニズムの解析も進んでいる。例えば、耐塩性に関与する因子として、海産シアノバクテリアであるアファノセケ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）が有しているＤｎａＫ（非特許文献２参照。）、汽水産紅藻であるカログロッサ・コンティニュア（Caloglossa continua、別称：アヤギヌ）が有しているＭ１Ｐａｓｅ（Mannitol-1-phosphatase）及びＭ１ＰＤＨ（Mannitol-1-phosphate dehydrogenase）（特許文献１参照。）、並びに海産緑藻であるウルバ・ペルツサ（Ulva pertusa、別称：アナアオサ）が有している１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ（非特許文献３参照。）等が知られている。
【０００６】
一方で、非特許文献４には、珪藻ロパロディア・ギッバ（Rhopalodia gibba）には、単細胞性の窒素固定シアノバクテリア（Cyanothece sp.）が共生していることが報告されている。また、特許文献２には、光合成によって炭化水素を生産する緑藻の一種であるボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）を工業上量産する方法として、ボツリオコッカス・ブラウニーを、ボツリオコッカス・ブラウニーの増殖を促進する作用を有する特定のアスティカカウリス・エキセントリカス(Asticcacaulis excentricus)を共培養する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−６７１５７号公報
【特許文献２】特開２０１０−２５２７００号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Iijima et al, Frontiers in Microbiology, 2015, Vol.6, Article326.
【非特許文献２】Waditee et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, vol.99, p.4109-4114.
【非特許文献３】Wang, et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2004, vol.36, p.111-117.
【非特許文献４】Kneip et al., BMC Evolutionary Biology, 2008, 8:30 doi：10.1186/1471-2148-8-30
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献２、非特許文献４及び５に記載されているように、バクテリアを共生させることによって真核藻類の機能や特性に何等かの影響が与えられることが知られている。
しかし、バクテリアを用いて真核藻類に対して耐塩性を付与する方法については未だ知られていない。
【００１０】
本発明は、本来耐塩性の低い真核藻類に、高塩濃度環境下での生育を可能とするために耐塩性を付与する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る真核藻類の耐塩化方法及び耐塩性真核藻類の培養方法の培養方法は、下記［１］〜［５］である。
［１］  真核藻類に、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることを特徴とする、真核藻類の耐塩化方法。
［２］  前記バクテリアが含む前記耐塩性付与遺伝子が、耐塩性真核藻類又は耐塩性シアノバクテリアに由来する、ＤｎａＫ遺伝子、１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｍａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ遺伝子、及びＭａｎｎｉｔｏｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［１］の真核藻類の耐塩化方法。
［３］  前記バクテリアを、前記真核藻類の内部に共生させる、前記［１］又は［２］の真核藻類の耐塩化方法。
［４］  前記バクテリアが、２種類以上のバクテリアからなる、前記［１］〜［３］のいずれかの真核藻類の耐塩化方法。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかの真核藻類の耐塩化方法により得られた耐塩性真核藻類を、塩化ナトリウム濃度が１質量％以上である液体培地で培養する、耐塩性真核藻類の培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る真核藻類の耐塩化方法により、本来耐塩性の低い真核藻類に、高塩濃度の液体培地中で培養可能にできるように耐塩性を付与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る真核藻類の耐塩化方法（以下、単に「本発明に係る耐塩化方法」ということがある。）は、真核藻類に、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることを特徴とする。一般的に、生物の特性の改変には、有用な遺伝子を導入する形質転換技術が用いられている。しかし、真核藻類の多くは固い外殻や細胞壁があるため、動物細胞やバクテリアとは異なり、遺伝子導入効率が極端に低い。このため、汎用されている形質転換技術では、耐塩性に関与する遺伝子を真核藻類に導入して耐塩性真核藻類を得ることは困難である。これに対して、本発明に係る耐塩化方法では、真核藻類自体に耐塩性付与遺伝子を導入するのではなく、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることによって、真核藻類に耐塩性を付与する。共生するバクテリアが産生する耐塩性付与遺伝子の発現産物が、真核藻類に取り込まれることによって、当該真核藻類に耐塩性が付与される。つまり、本発明に係る耐塩化方法により、真核藻類に対して形質転換技術を用いる従来の方法よりも比較的簡便に、耐塩性真核藻類を得ることができる。
【００１４】
なお、本発明及び本願明細書において、「真核藻類とバクテリアが共生する」とは、バクテリアが真核藻類の内部に存在している状態、又はバクテリアと真核藻類が接着しており、バクテリアが産生した物質が真核藻類に直接影響を与えられるほど密接な関係を有している状態を意味する。
【００１５】
本発明に係る耐塩化方法において、耐塩性を付与する真核藻類としては、本来淡水域に生息する真核藻類であればよく、単細胞真核藻類であってもよく、多細胞真核藻類であってもよい。淡水域に生息する真核藻類としては、具体的には、スピルリナ、クロレラ、ヘマトコッカス、ミドリムシ（ユーグレナ）等が挙げられる。
【００１６】
本発明に係る耐塩化方法において用いられる耐塩性付与遺伝子は、真核藻類内における当該遺伝子がコードするタンパク質の量が増大することによって、当該真核藻類の耐塩性が向上する遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、真核藻類内の塩濃度を調節する機能を有するタンパク質をコードするものであってもよく、高塩環境によるストレスを軽減する機能を有するタンパク質をコードするものであってもよい。当該遺伝子としては、耐塩性の低い生物に由来する遺伝子であってもよいが、より充分な耐塩性を付与可能であることから、耐塩性の高い生物に由来する遺伝子であることが好ましく、耐塩性真核藻類又は耐塩性シアノバクテリアに由来する遺伝子であることがより好ましい。
【００１７】
本発明において用いられる耐塩性付与遺伝子としては、例えば、耐塩性真核藻類又は耐塩性シアノバクテリアに由来する遺伝子のうち、ＤｎａＫ遺伝子、１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｍ１Ｐａｓｅ遺伝子、又はＭ１ＰＤＨ遺伝子が挙げられ、アファノセケ・ハロフィチカが有しているＤｎａＫ遺伝子（非特許文献２）、ウルバ・ペルツサが有している１９ｋＤａ  Ｌｅｃｔｉｎ遺伝子（非特許文献３）、カログロッサ・コンティニュアが有しているＭ１Ｐａｓｅ遺伝子及びＭ１ＰＤＨ遺伝子（特許文献１）が好ましい。本発明において、真核藻類と共生させるバクテリアが含む耐塩性付与遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００１８】
なお、ＤｎａＫは、ＨＳＰ７０としても知られている分子シャペロンであり、耐塩性シアノバクテリアに由来するＤｎａＫは、淡水産シアノバクテリアに由来するＤｎａＫよりも、高塩濃度環境下におけるフォールディング活性が高いこと、耐塩性シアノバクテリアに由来するＤｎａＫ遺伝子を導入した植物体は、導入前よりも耐塩性が高くなることが報告されている（非特許文献２）。また、Ｍ１Ｐａｓｅ及びＭ１ＰＤＨは、マンニトール合成に関与する酵素である。マンニトールは、浸透圧調整物質や活性酸素消去物質として生体内で機能しており、マンニトール合成を促進することによって植物の耐塩性が向上することが知られている（特許文献１）。
【００１９】
本発明において用いられるバクテリアは、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアであって、真核藻類と共生可能なものであれば特に限定されるものではなく、天然型バクテリアであってもよく、遺伝子に各種変異が導入されているものであってもよい。当該バクテリアとしては、例えば、元々耐塩性付与遺伝子を有しているものを用いることができる。元々耐塩性付与遺伝子を有しているバクテリアとしては、アファノセケ・ハロフィチカ等の海産シアノバクテリアが挙げられる。また、アスティカカウリス・エキセントリカス等の真核藻類の共生菌として知られているバクテリアに、耐塩性付与遺伝子を遺伝子導入したバクテリアも、本発明において用いることができる。
【００２０】
バクテリアへの耐塩性付与遺伝子の遺伝子導入は、各種バクテリアに対して行われている遺伝子導入方法の中から適宜選択して行うことができる。バクテリアに対して行われている遺伝子導入方法としては、例えば、単にＤＮＡを細胞と混合するだけで細胞内に取り込ませ、相同組換えによりゲノムに組込まれる自然形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法等が挙げられる。これらの遺伝子導入法は、当該遺伝子をコードする領域とプロモーターとターミネーターを含む発現カセットを組込んだベクターを用い、常法により行うことができる。当該ベクターとしては、線状ＤＮＡ、プラスミド、ファージ等が用いられる。
【００２１】
本発明において、耐塩性を付与する目的の真核藻類に共生させるバクテリアは、１種類であってもよく、２種類以上を組み合わせたバクテリア群であってもよい。複数のバクテリアを共生させる場合、少なくとも１種類のバクテリアが耐塩性付与遺伝子を含んでいればよく、全てのバクテリアが耐塩性付与遺伝子を含んでいる必要はない。例えば、Ｍ１Ｐａｓｅ遺伝子のみを含むバクテリアと、Ｍ１ＰＤＨ遺伝子のみを含むバクテリアを、共に真核藻類に共生させてもよく、Ｍ１Ｐａｓｅ遺伝子とＭ１ＰＤＨ遺伝子の両方を含むバクテリアを単独で真核藻類に共生させてもよく、Ｍ１Ｐａｓｅ遺伝子とＭ１ＰＤＨ遺伝子の両方を含むバクテリアを耐塩性付与遺伝子を含んでいないバクテリアと共に真核藻類に共生させてもよい。真核藻類と耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアの種類によっては、複数種を組み合わせてなるバクテリア群のほうが、１種類のみの場合よりも、安定して真核藻類に共生できる場合がある。
【００２２】
耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを真核藻類に共生させる方法は特に限定されるものではない。例えば、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを真核藻類と共に培養することによって、真核藻類にバクテリアを共生させることができる。また、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等により、真核藻類の内部に直接バクテリアを注入してもよい。
【００２３】
本発明に係る耐塩化方法により、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることによって耐塩性が付与された真核藻類（以下、「本発明に係る耐塩性真核藻類」ということがある。）は耐塩性付与前には増殖が不可能であるほど高塩濃度の液体培地中でも増殖が可能である。本発明に係る耐塩性真核藻類としては、塩化ナトリウム濃度が０．５質量％以上の液体培地中でも増殖が可能なものが好ましく、塩化ナトリウム濃度が０．７質量％以上の液体培地中でも増殖が可能なものがより好ましく、塩化ナトリウム濃度が１質量％以上の液体培地中でも増殖が可能なものがさらに好ましい。
【００２４】
本発明に係る耐塩性真核藻類の培養に用いる液体培地の塩化ナトリウム濃度としては、１質量％以上であることが好ましく、１〜４質量％であることがより好ましく、１．５〜３．８質量％であることがさらに好ましく、２〜３．５質量％あることがよりさらに好ましい。
【００２５】
本発明に係る耐塩性真核藻類の培養に用いる液体培地としては、塩化ナトリウムに加えて塩化マグネシウムを含むことが好ましく、０．５質量％以下の塩化マグネシウムを含有することがより好ましく、０．１〜０．５質量％の塩化マグネシウムを含有することがさらに好ましい。
【００２６】
本発明に係る耐塩性真核藻類の培養に用いる液体培地は、塩化ナトリウム濃度以外は、耐塩性付与前のバクテリアの培養に用いられる液体培地と同様の組成の物を用いることができる。例えば、耐塩性真核藻類の培養に用いる液体培地は、塩化ナトリウムや塩化マグネシウム以外にも、真核藻類とバクテリアの生育に必要な各種栄養成分を含有していることが好ましい。当該栄養成分は、培養する真核藻類とバクテリアの種類に応じて適宜調整することができる。特に、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫黄、鉄、マンガン、銅、モリブデン、ホウ素等の真核藻類の増殖に必要な元素を塩類として含有していることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る耐塩性真核藻類の培養に用いる液体培地としては、市販されている液肥に塩化ナトリウムをはじめとする不足の塩類を添加した溶液や、市販されている濃縮された液肥を、水に代えて海水で希釈した溶液を用いることができる。また、海水に、窒素やリン等の不足の塩類を適宜添加した溶液を用いることもできる。
【００２８】
本発明に係る耐塩性真核藻類の培養温度や培養時間等の条件は、耐塩性付与前のバクテリアの培養と同様に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明に係る耐塩化方法により、従来の遺伝子組換え技術では形質転換効率が非常に低い真核藻類について、耐塩性付与遺伝子を含むバクテリアを共生させることによって、簡便に耐塩性真核藻類を得ることができる。当該耐塩化方法により、有用化合物の産生のための場として工業上利用されている淡水産真核藻類を耐塩化することができ、海水等を利用した大量培養が可能になる。