(57)【要約】      （修正有）【課題】ガラクトサミン−６−リン酸の合成の為の、スルフォロバス属に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素、およびその製造方法等の提供。【解決手段】スルフォロバス属に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素。前記アミノ酸配列を有する異性化酵素は、温度２５〜９８℃で反応し、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法。また、前記異性化酵素は、アミノ糖リン酸の分子内転移酵素であってもよく、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造できる。前記異性化する酵素をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、前記発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体及び前記形質転換体を培養して、ガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素。
【請求項２】
前記異性化酵素は、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、請求項１記載の異性化酵素。
【請求項３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素。
【請求項４】
前記異性化酵素は、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、請求項１記載の異性化酵素。
【請求項５】
温度２５〜９８℃で酵素活性を発揮する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の異性化酵素。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の異性化酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６または７記載のＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培地中で培養し、
得られた培養物からアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質を分離することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法。
【請求項１１】
グルコサミン−６−リン酸に、請求項１〜３のいずれか１項、または請求項５に記載の異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法。
【請求項１２】
ガラクトサミン−１−リン酸に、請求項１、４または５に記載の異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ糖リン酸の異性化酵素、前記酵素をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、前記発現ベクターを導入してなる形質転換体、前記形質転換体を培養してなるアミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法、および前記異性化酵素を作用させるガラクトサミン−６−リン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖リン酸化合物は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＴＤＰ−Ｇｌｃ等の糖ヌクレオチドの合成や、修飾糖合成の基質となる重要な化合物である。例えば、グルコース−６−リン酸、マンノース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、マンノース−１−リン酸に、リン酸基分子内転移活性を有する酵素製剤を作用させ、グルコース−１−リン酸、マンノース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸およびマンノース−６−リン酸を生成する方法がある（特許文献１）。特許文献１記載の酵素製剤は、超好熱アーキア(Sulfolobus tokodaii)に由来する特定アミノ酸配列を有することを特徴とし、この酵素をコードする遺伝子は、ＳＴ０２４２と特定されている。また、マンノース−６−リン酸またはフルクトース−６−リン酸に糖異性化酵素製剤を作用させ、フルクトース−６−リン酸またはマンノース−６−リン酸を製造する方法もある（特許文献２）。特許文献２記載の酵素製剤は、超好熱アーキア（Pyrococcus horikoshii)に由来する特定アミノ酸配列を有することを特徴とする。その他、糖ヌクレオチド合成活性を有する酵素として結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（非特許文献１参照）、シュードモナス菌(Pseudomonas aeruginosa)（非特許文献２参照）、サルモネラ菌(Salmonella enterica)（非特許文献３参照）由来のＲｍｌＡ（Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase）がある。また、超好熱アーキア(Sulfolobus tokodaii)由来のＳＴ０４５２タンパク質（非特許文献４参照）も知られている。
【０００３】
一方、アミノ糖リン酸を製造しうる酵素として、フルクトース−６−リン酸とアンモニアからグルコサミン−６−リン酸を生成する改変されたグルコサミン−６−リン酸合成酵素がある（特許文献３）。ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで特定されるアミノ酸配列中で、グルコサミン−６−リン酸合成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列の所定番目のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換した、改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素である。特許文献３の表１には、グルコサミン−６−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を有する複数の微生物とＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒとが列記されている。例えば、このような微生物として大腸菌（Escherichia coli）があり、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒはＡＡＣ７６７５２である。特許文献３記載の改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素は、例えば、大腸菌由来のＡＡＣ７６７５２で示されるグルコサミン−６−リン酸合成酵素を改変したものとなる。実施例では、この合成酵素をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換体の粗抽出液にアンモニアとフルクトース−６−リン酸とを加えて３４℃、４時間反応させ、グルコサミン−６−リン酸を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４６５４４８号公報
【特許文献２】特許第４４６９９５４号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／１１１５０７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yufang Ma, Jonathan A. Mills, John T. Belisle, Vara Vissa, Mark Howell, Kelly Bowlin, Michael S. Scherman and Michael McNeil "Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis in mycobacteria: cloning, sequencing and expression of the Mycobacterium tuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase“ (1997) Microbiology, 143, 937-945.
【非特許文献２】Wulf Blankenfeldt, Miryam Asuncion, Joseph S. Lam and James H. Naismith “The structural basis of the catalytic mechanism and regulation of glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (RmlA)" (2000) EMBO J., 19, 6652-6663.
【非特許文献３】Lennart Lindquist, Rudorf Kaiser, Peter R. Reeves and Alf A. Lindberg "Purification, characterization and HPLC assay of Salmonella glucose-1-phosphate thymidylyltransferase from the cloned rfbA gene" (1993) Eur. J. Biochem., 211, 763-770.
【非特許文献４】Zhang Z, Tsujimura M, Akutsu JI, Sasaki M, Tajima H. and Kawarabayasi Y. “Identification of an extremely thermostable enzyme with dual sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities from an acidothermophilic archaeon, Sulfolobus tokodaii strain7” (2005) J Biol Chem. 280, 9698-9705.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
使用原料種が少なく、かつ１段反応で目的物を製造する酵素として異性化酵素がある。異性化反応によれば、例えば基質の糖を異なる糖に異性化でき、または置換基を分子内転移することができる。しかしながら、アミノ糖リン酸を製造するための異性化酵素は知られていない。したがって、例えば前記特許文献３では、グルコサミン−６−リン酸を合成するために、フルクトース−６−リン酸とアンモニアとを必要としている。また、特許文献３記載の改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素は、グルコサミン−６−リン酸の製造に限定され、例えばガラクトサミン−６−リン酸などの他のアミノ糖リン酸化合物を製造することはできない。したがって、簡便にアミノ糖リン酸化合物を製造できる酵素として、アミノ糖リン酸の異性化酵素の開発が望まれる。
【０００７】
一方、ガラクトサミン−６−リン酸を含む代謝経路は、微生物その他の生物で見出されていない。このためガラクトサミン−６−リン酸の合成および分解に関する酵素も不明である。特に、異性化酵素をアミノ糖リン酸化合物に作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造することは知られておらず、ガラクトサミン−６−リン酸研究が遅滞する一因ともなっている。したがって、ガラクトサミン−６−リン酸その他のアミノ糖リン酸化合物の安定供給のためにも、アミノ糖リン酸を合成しうる異性化酵素の開発が望まれる。
【０００８】
上記現状に鑑みて、本発明は、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記異性化酵素をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体、前記形質転換体を培養する異性化酵素の製造方法、前記酵素を作用させるガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、超好熱アーキアのスルフォロバス属（genus Sulfolobus）の菌体抽出物にガラクトサミン−６−リン酸を生成する異性化酵素が存在すること、前記超好熱アーキアの菌体抽出物に含まれる当該酵素を用いて遺伝子工学的手段によりリコンビナントを製造しうること、当該酵素および／またはリコンビナントを使用するとガラクトサミン−６−リン酸を安定的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。更に、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）由来の糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素が、アミノ糖リン酸化合物において、リン酸基分子内転移活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち本発明は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、前記異性化酵素が、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、前記異性化酵素を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供するものである。
【００１４】
また本発明は、前記異性化酵素が、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、前記異性化酵素を提供するものである。
【００１５】
また本発明は、温度２５〜９８℃で酵素活性を発揮する、前記異性化酵素を提供するものである。
【００１６】
また本発明は、前記異性化酵素をコードするＤＮＡを提供するものである。
【００１７】
また本発明は、配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡを提供するものである。
【００１８】
また本発明は、前記ＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクターを提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、前記形質転換体を培地中で培養し、
得られた培養物からアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質を分離することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、グルコサミン−６−リン酸に、前記異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、ガラクトサミン−１−リン酸に、前記異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化できるアミノ糖リン酸の異性化酵素等が提供される。
【００２４】
また、本発明によれば、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸にリン酸基の糖分子内転移できるアミノ糖リン酸のアミノ糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例２の結果を示す図であり、グルコサミン−６−リン酸に実施例１の工程（２）で得た粗抽出液を添加して３０分、６０分、および１２０分反応させた際の反応液のＨＰＬＣによる分析結果を説明する図である。
【図２】実施例３および実施例４の結果を示す図である。
【図３】実施例３において、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素によって、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成する反応を説明する図である。
【図４】ＳＴ２２４５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】ＳＴ２２４５タンパク質と、スルフォロバス・トーコーダイイに含まれるアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素との反応生成物をＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。図５Ａは、ＳＴ２２４５タンパク質の結果を示し、図５Ｂは天然タンパク質画分の結果を示し、図５Ｃは、基質（グルコサミン−６−リン酸）のピークを示す。
【図６】ＳＴ２２４５タンパク質の反応温度の違いによる活性変化を説明する図である。
【図７】ＳＴ２２４５タンパク質のｐＨの違いによる活性変化を説明する図である。
【図８】本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素によるグルコサミン−６−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を説明する図である。
【図９】本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素によるガラクトサミン−１−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を説明する図である。
【図１０】ガラクトサミン−１−リン酸およびグルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成される関係を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第一は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
（１）スルフォロバス属（genus Sulfolobus）
スルフォロバス属は、好気・好酸・好熱性のアーキアとして知られ、陸上の温泉などに広く生息する。硫黄を好むことから命名された。スルフォロバス属に属する微生物として、スルフォロバス・トーコーダイイ（Sulfolobus tokodaii）、スルフォロバス・アチドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）などがある。本発明では、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）を好適に使用することができる。スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）は、スルフォロバス属の１種であり、７５〜８０℃で生育しうる。例えば、スルフォロバス・トーコーダイイ  ストレイン７（S.tokodaii strain7）は、大分県別府温泉で採取された超好熱のアーキアであり、単独で硫化水素を分解する特徴を有している。生育限界温度は８７℃、ｐＨ２〜３の酸性を好むことが知られている。
【００２８】
本発明では、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）として、その菌体抽出物がアミノ糖リン酸の異性化酵素活性を有するものを広く使用することができる。このような活性は、例えば、グルコサミン−６−リン酸を基質として添加した際の反応生成物を分析することで確認することができる。その際、ガラクトサミン−１−リン酸を基質として添加し、ガラクトサミン−６−リン酸を生成するアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移酵素を比較分析することで確認することができる。スルフォロバス属の中でも、スルフォロバス・トーコーダイイを好適に使用することができる。スルフォロバス・トーコーダイイとしては、スルフォロバス・トーコーダイイ  ストレイン７  ＪＣＭ登録番号:ＪＣＭ１０５４５（S.tokodaii strain7 JCM10545）がある。なお、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)のゲノムの全塩基配列および遺伝子情報は公知である。
【００２９】
（２）アミノ糖リン酸の異性化酵素
本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する。本発明において、「スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来」とは、スルフォロバス属のいずれかの種の培養物から抽出した異性化酵素と、この異性化酵素の遺伝子配列に基づき、必要に応じて改変を加え、遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質とを含むことを意味する。なお、リコンビナントタンパク質では、このタンパク質をコードするＤＮＡが、少なくとも、スルフォロバス属のいずれかの種に含まれるアミノ糖リン酸の異性化酵素をコードするＤＮＡと２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものである。
【００３０】
本発明において、アミノ糖リン酸の異性化酵素とは、基質であるアミノ糖リン酸化合物を糖部分が異なるアミノ糖化合物に変換するエピメラーゼと、基質であるアミノ糖リン酸化合物のリン酸基を分子内転移により変換するムターゼとを含む。前者をアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素とし、後者をアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素とする。本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は、１種の異性化酵素が、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性とアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性との双方を有するものであってもよい。
【００３１】
（３）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素
本発明では、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を天然に含むスルフォロバス属由来生物として、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)がある。スルフォロバス属の生物に、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素が存在することは知られていない。また、スルフォロバス属以外の生物においても、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素が存在することは知られていない。このため、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)の全ゲノム遺伝子情報を検索して、本発明のエピメラーゼ酵素を検出することはできない。遺伝子情報に基づく検索では、相同性を評価することが基準であるが、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素は従前存在しないからである。しかしながら、スルフォロバス・トーコーダイイの菌体抽出物に、グルコサミン−１−リン酸とグルコサミン−６−リン酸とを添加して反応させたところ、グルコサミン−６−リン酸を添加した場合のみ、未知のアミノ糖リン酸化合物を生成することが確認された。以下、便宜のため、スルフォロバス属としてスルフォロバス・トーコーダイイを使用する場合で説明する。
【００３２】
本発明のエピメラーゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から分離することができる。異性化しうるアミノ糖リン酸としてはアミノ糖６リン酸があり、例えば、グルコサミン−６−リン酸、ガラクトサミン−６−リン酸などがある。異性化反応により、ガラクトサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−リン酸などを製造することができる。より好ましくは、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化するエピメラーゼ酵素である。
【００３３】
本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度は、２５〜９８℃であり、好ましくは３５〜９８℃であり、より好ましくは６０〜９５℃である。至適温度が５０℃以上であれば、他の酵素反応の影響を受けず、本発明のエピメラーゼ酵素の分離精製が容易であり、かつ本エピメラーゼ酵素を使用し、効率的に目的のアミノ糖リン酸、例えばアミノ糖６リン酸を製造することができる。
【００３４】
前記したように、本発明のエピメラーゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から抽出したエピメラーゼ酵素に基づき、遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質であってもよい。このようなリコンビナントタンパク質は、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）から分離したアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の遺伝子を用い、遺伝子工学的手法により調製することができる。具体的には、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を指標に複数段階で精製してエピメラーゼ酵素を分離する。次いで、例えばＮ末端アミノ酸配列を解析し、これをスルフォロバス・トーコーダイイの全ゲノム情報と比較し、これによりエピメラーゼ酵素の遺伝子領域を特定する。このようなエピメラーゼ酵素のアミノ酸配列として配列番号３がある。本酵素遺伝子領域をＰＣＲ反応で増幅・抽出し、タンパク質発現プラスミドに挿入して発現ベクターを調製し、発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、これを培養すれば、リコンビナントタンパク質を得ることができる。このような遺伝子領域としてＳＴ２２４５がある。ＳＴ２２４５遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号４に示す。後記する実施例に示すように、得られたリコンビナントタンパク質を加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製すると、少なくともグルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化するエピメラーゼ活性を有することが判明した。
【００３５】
従って、本発明のエピメラーゼ酵素は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうることを条件に、前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは、１以上２００以下、より好ましくは１以上１００以下、特に好ましくは１以上５０以下である。また、配列番号４に示すＤＮＡを用いて遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質であってもよい。いずれも、アミノ糖リン酸の異性化活性を有するからである。
【００３６】
なお、本発明のエピメラーゼ酵素は、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、抗体のＦc部分、免疫グロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリンなどをＮ末端あるいはＣ末端側にさらに結合したものであってもよい。
【００３７】
（４）アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素
本発明の、スルフォロバスに由来するアミノ糖リン酸の異性化酵素を用いたアミノ糖リン酸の製造は、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性を利用するものであってもよい。本発明のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素によって反応しうるアミノ糖リン酸としては、グルコサミン−１−リン酸、ガラクトサミン−１−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、ガラクトサミン−６−リン酸などがある。リン酸基分子内転移反応により１位または６位に結合したリン酸基が、６位または１位に分子内転移する。これにより、例えば、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。
【００３８】
本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)から抽出されたタンパク質である。特許文献１には、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)に由来する糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素が記載され、ＳＴ０２４２タンパク質と称されている。しかしながら、ＳＴ０２４２タンパク質にアミノ糖リン酸化合物を基質として用いたところ、アミノ糖リン酸化合物においても、リン酸基分子内転移ムターゼ活性を有することが判明したのである。本発明は、このＳＴ０２４２タンパク質を、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素として使用するものである。なお、酵素は基質を厳格に特定するため、糖リン酸化合物に加えてアミノ糖リン酸においてリン酸基の分子内転移活性があることは推定することができなかった。ＳＴ０２４２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、このタンパク質をコードするＤＮＡ配列を配列番号６に示す。本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、特許文献１記載の手法に従い、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)から抽出されたものであってもよく、前記配列番号６に示すＤＮＡ配列に基づき、遺伝子工学的手法により製造したリコンビナントタンパク質であってもよい。
【００３９】
本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の至適温度は、２５〜９８℃であり、好ましくは３５〜９８℃であり、より好ましくは６０〜９５℃である。至適温度が５０℃以上であれば、他の酵素反応の影響を受けず、本発明のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の分離精製が容易であり、かつ本リン酸基分子内転移ムターゼ酵素を使用し、効率的に目的のアミノ糖リン酸、例えばアミノ糖６リン酸を製造することができる。
【００４０】
なお、本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、抗体のＦc部分、免疫グロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリンなどをＮ末端あるいはＣ末端側にさらに結合したものであってもよい。
【００４１】
（５）ＤＮＡ
本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素に関するＤＮＡは、配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡである。なお、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション溶液１リットル中に５２．５９ｇのＮａＣｌ、２６．４６ｇのクエン酸ナトリウム、１ｇのフィコール（Ｔｙｐｅ  ４００）、１ｇのポリビニルピロリドン、１ｇのウシ血清アルブミン、５ｇのＳＤＳ、１ｇの断片化鮭精子ＤＮＡ、５００ｍｌのホルムアミドを含み、温度４２℃で行う。その後の洗浄は、洗浄用溶液１リットル中に１７．５３ｇのＮａＣｌ、８．８２ｇのクエン酸ナトリウム、５ｇのＳＤＳを含み、温度６８℃で行う条件である。本発明のＤＮＡを使用すれば、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を遺伝子工学的に製造することができる。
【００４２】
（６）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の製造方法
本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を得るには、スルフォロバス・トーコーダイイを培養し、培養物からアミノ糖リン酸の異性化活性を指標に、ＤＥＡＥ、ＨｉＴｒａｐＱ、ＨｉＴｒａｐＰなどを用いたイオン交換クロマト、ＨｉＴｒａｐ−Ｐｈｅｎｙｌカラム、ＨｉＴｒａｐ−Ｂｕｔｈｙｌカラムなどを用いた疎水性クロマト、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラムを用いた親水性クロマト、デキストラン担体を用いたゲルろ過、その他の公知の方法を組み合わせて分離精製することができる。
【００４３】
一方、前記ＤＮＡを用いて、通常の遺伝子工学的手法を適用して製造することもできる。たとえば、前記したＤＮＡから発現ベクターを調製し、この発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、エピメラーゼ活性を有する形質転換体を得てこれを培養し、培養物に含まれるエピメラーゼ酵素を分離回収してもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＨＹ４８１等のタンパク質発現プラスミドベクターを好適に使用することができる。また、発現ベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌などの微生物、酵母、ラン藻、放線菌などの従来公知の種々の宿主を使用することができる。得られた形質転換体の培養は、宿主細胞の培養条件に準じて行うことができる。
【００４４】
形質転換体から本発明のエピメラーゼ酵素を分離するには、アミノ糖リン酸の異性化活性を指標に、公知の方法を組み合わせて分離精製すればよい。その際、大腸菌等の非分泌型細胞を用いる場合は本発明のエピメラーゼ酵素は菌体内に生成されるので、培養液や菌体破砕物等の培養処理物から、エピメラーゼ酵素を分離精製する。一方、宿主として枯草菌等分泌型の系を用いる場合には、培養液中に本エピメラーゼ酵素が生成蓄積される。したがって、菌体を破砕することなく培養液を分離精製し、本発明のエピメラーゼ酵素を製造することができる。
なお、分離精製に際し、本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度が５０℃以上であれば、培養液を加熱処理し、およびカラムクロマトグラムをおこなえば、効率的に単離精製することができる。
【００４５】
（７）グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法
本発明の製造方法では、グルコサミン−６−リン酸に前記アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を作用させる。予め、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の至適温度や指摘ｐＨ等を測定し、好適な培養条件で培養することが望ましい。これにより、効率的にガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。より好ましくは、反応温度６０〜９５℃で保温・反応させる。なお、グルコサミン−６−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を図８に示す。
【００４６】
なお、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を使用する場合に限定されず、例えば、前記形質転換体の培養液や菌体抽出液、その他の粗酵素を使用してもよい。前記したように、形質転換体の宿主が枯草菌等分泌型細胞であれば、培養液中に本酵素が生成蓄積されるため、この培養液にグルコサミン−６−リン酸を添加して反応させ、ガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。特に、本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度が５０℃以上の場合には、他の酵素の影響を受けることなく異性化反応のみが進行するため、効率的である。
【００４７】
（８）ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法
本発明の製造方法は、ガラクトサミン−１−リン酸に前記アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素を作用させる。予め、本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の至適温度や指摘ｐＨ等を測定し、好適な条件で反応させることが望ましい。これにより、効率的にガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。より好ましくは、反応温度６０〜９５℃で保温・反応させる。なお、ガラクトサミン−１−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を図９に示す。
【００４８】
なお、本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素を使用すれば、グルコサミン−６−リン酸にアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造し、およびガラクトサミン−１−リン酸に本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素を作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。これら３者の関係を図１０に示す。図１０において、（１）の反応はアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素により、（２）の反応はアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素により触媒される。本発明の酵素による反応により、アミノ糖リン酸化合物を１段階で製造することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
（実施例１）
以下により、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を製造した。
（１）菌の培養
次の方法で、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）を培養した。
１．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２８ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１．８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、０．０１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇの酵母エキスを１Ｌの蒸留水に溶かし、１０規定Ｈ２ＳＯ４溶液を用いてｐＨを３．５に調整した。この溶液を加圧殺菌した後、ＪＣＭ１０５４５を植菌した。この培養液２．５Ｌを８０℃で４日間培養した。
【００５１】
（２）粗抽出液の調製
ＪＣＭ１０５４５の培養終了後、６，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって菌体を集菌した。蒸留水で２回洗浄した後、超音波処理（氷中、２０秒破砕・４０秒休止×２０回）により菌体を破砕し、破砕物を１００００ｒｐｍ、２０分で遠心分離した。上清をろ過し、これをスルフォロバス・トーコーダイイ菌体の粗抽出液とした。
【００５２】
（３）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質の精製
上記（２）で得た粗抽出液の硫酸アンモニウム飽和濃度３０−６０％で沈殿する画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解し、次いでＴｏｙｏＰｅａｒｌ-ＤＥＡＥカラムに吸着させた。溶離液として、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−０．５ＭＮａＣｌを使用し、１２０分掛けて溶出した。次いで、最終画分を分離し透析した。透析後の画分をＨｉＴｒａｐＱカラムに吸着させ、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−１ＭＮａＣｌで１２０分かけて溶出した。各０．８ｍＬを分画し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性が検出された画分（第２０〜３０番目）を集め透析した。透析後の画分をＨｉＴｒａｐ−Ｐｈｅｎｙｌカラムに吸着させ２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−２０％エタノールで溶出した。次いで、最終画分を透析し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を確認しつつ精製し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質を含む画分を得た。
【００５３】
（４）目的遺伝子の同定
上記（３）で得た画分のタンパク質のＮ末端配列を解析した。この解析結果とスルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）のゲノム全遺伝子情報とを比較した。この結果、上記（３）で得たタンパク質をコードしている遺伝子を、スルフォロバス・トーコーダイイのＳＴ２２４５遺伝子（以下、単にＳＴ２２４５遺伝子と称する。）と同定した。なお、以下、ＳＴ２２４５遺伝子で発現されるリコンビナントタンパク質を、ＳＴ２２４５タンパク質と称する。
【００５４】
（５）ＳＴ２２４５遺伝子を導入した発現プラスミドの構築
ＳＴ２２４５遺伝子領域の前後に制限酵素（ＮｃｏＩとＸｈｏＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成し、遺伝子の前後に制限酵素サイトが導入されたＤＮＡをＰＣＲで増幅した。なお、合成されるＳＴ２２４５タンパク質のＣ末端にヒスチジン残基をタグとして結合するように、プライマーを設計した。
【００５５】
ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りである。センスプライマーの下線部はＮｃｏＩサイトを示し、アンチセンスプライマーの下線部は、ＸｈｏＩサイトを示す。
センスプライマー：5'- CATGCCATGGATAATCCATATGAGAATTGG -3'（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5'- CCGCTCGAGTAAATTCTGATCTGCATTAAT-3'（配列番号２）
【００５６】
ＰＣＲ反応の後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩとを用いて３７℃、２時間反応させ分解した。次いで、その構造遺伝子領域断片を精製した。得られた断片と同一制限酵素で切断したｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とを、Ｔ４リガーゼ存在下に１６℃、２時間反応させて連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入して形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを得てこれを精製した。塩基配列を確認し、これを発現プラスミドｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５とした。発現プラスミドｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５を用いると、ＳＴ２２４５タンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質が生産される。
【００５７】
（６）組換え遺伝子の発現
大腸菌（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ）のコンピテントセルを融解し、これに上記発現プラスミド１０ｎｇを含む溶液を加え氷中に３０分間放置し、次いで４２℃に３０秒間加熱してヒートショックを与えた。その後、ＳＯＣ培地０．９ｍｌを加え、３７℃で１時間振とう培養した。培養後に、適量をカナマイシン含有ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１晩培養して形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ／ｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５を得た。
【００５８】
この形質転換体を、２リットルのカナマイシン含有ＬＢ培地中で３７℃、一晩培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で５時間培養した。培養後遠心分離（６，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により集菌した。
【００５９】
（７）ＳＴ２２４５タンパク質の分離
２リットル培養液から集菌した菌体に２倍量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、プロテアーゼ阻害剤（Roche社製、Complete EDTA-free）１錠、０．５ｍｇのＤＮａｓｅ  ＲＱ１（プロメガ社製）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を超音波破砕（氷中、２０秒破砕・４０秒休止×４０回）し、７５℃で１０分保温した後、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分）により上清液を得た。この上清液を用いＮｉ−カラム（Novagen社製,His・Bind metal chelation resin & His・Bind buffer kitを使用）による親和性クロマトグラムを行った。ここで得られた０．５Ｍイミダゾール溶出画分（２０ｍｌ）を、再度７５℃で１０分加熱処理し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分）により得た上清液を、セントリプレップＹＭ−５０（ミリポア社）で２ｍｌまで濃縮し、これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌで透析し、ＳＴ２２４５タンパク質を得た。
【００６０】
（実施例２）
グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を合成した。
実施例１の工程（２）で得たスルフォロバス・トーコーダイイ菌体の粗抽出液を使用し、グルコサミン−６−リン酸を異性化した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのグルコサミン−６−リン酸を含む溶液１３５μｌに、実施例１の（２）で得た粗抽出液１５μｌ（０．０１３５ｍｇ）を加えた。この酵素反応液を８０℃で保温し反応させた。反応３０分、６０分、および１２０分後に、反応チューブを氷上に移して反応を停止させ、その一部を保存した。
反応液を、電気化学検出器（Ｔｈｅｒｍｏ社製、イオンクロマトグラフィー）を装着したＨＰＬＣを用いて分析した。Ａ溶媒として１００ｍＭのＮａＯＨを、Ｂ溶液として１００ｍＭＮａＯＨ-１Ｍの酢酸Ｎａを使用した。Ａ：Ｂ＝９：１でカラムを飽和し、その後２０分かけて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで混合比をＡ：Ｂ＝８：２まで変化させて。その後３０分かけてＡ：Ｂ＝５：５の混合比となる液を溶離液として使用した。なお、検出器は、電気化学検出器（金電極、パルストアンベロメトリー）である。結果を図１に示す。反応３０分の反応液には、基質（グルコサミン−６−リン酸）と、反応生成物（ガラクトサミン−６−リン酸）とが含まれるが、反応時間に対応してグルコサミン−６−リン酸が低減し、ガラクトサミン−６−リン酸量が増加した。このため、反応１２０分の反応液には基質は存在せず、反応生成物（ガラクトサミン−６−リン酸）のみが存在する結果となった。
【００６１】
（実施例３）
ＳＴ２２４５タンパク質の酵素反応をＨＰＬＣにより確認した。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのグルコサミン−６−リン酸を含む溶液１３５μｌに、実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質を２μｇ加えた。この酵素反応液を８０℃で保温し反応させた。反応３０分後に、反応チューブを氷上に移して反応を停止させた。この反応液について、実施例２と同様に分析した。結果を図２の（２）に示す。なお、図２において、（５）は、ガラクトサミン−１−リン酸基質のピークを示し、（４）はグルコサミン−６−リン酸基質のピークを示し、（３）はガラクトサミン−１−リン酸に実施例４で得たＳＴ０２４２タンパク質を作用させた反応液のチャートを示し、（２）はグルコサミン−６−リン酸にＳＴ２２４５タンパク質を作用させた反応液のチャートを示し、（１）は上記（２）と（３）との混合液のチャートである。後記するように、実施例４で得たＳＴ０２４２タンパク質は、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性を有し、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成する。図２に示すように、（１）、（２）、（３）は、いずれもガラクトサミン−６−リン酸のピークを有する。反応生成物、基質および触媒反応との関係から推定し、前記ＳＴ２２４５タンパク質は、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成するエピメラーゼ酵素と同定される。なお、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン６−リン酸が生成する反応を図３に示す。
【００６２】
(実施例４）
特許文献１の実施例１に従い、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）由来の遺伝子（ＳＴ０２４２）を特定し、およびＳＴ０２４２遺伝子を用いてリコンビナントタンパク質を製造した。これをＳＴ０２４２タンパク質と称する。
５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０μＭグルコース１，６ビスリン酸、０．４ｍＭガラクトサミン−１−リン酸を含む溶液０．２ｍｌに、ＳＴ０２４２タンパク質２μｇを添加し、温度６５〜８０℃で２０分反応させた。反応液を実施例３と同様にして分析した。結果を、図２に併せて記載する。図２の（１）、（２）、（３）には、いずれもガラクトサミン−６−リン酸のピークが含まれる。反応生成物、基質および触媒反応との関係から推定し、前記ＳＴ０２４２タンパク質は、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成するリン酸基分子内転移ムターゼ酵素と同定される。なお、グルコサミン−６−リン酸およびガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成される反応は図１０に示されている。図１０における反応（１）は、実施例３のＳＴ２２４５タンパク質によって触媒され、同（２）はＳＴ０２４２タンパク質によって触媒される。
【００６３】
（実施例５）
以下により、ＳＴ２２４５タンパク質の分子量、天然物との反応同一性、温度依存性、ｐＨ依存性等を評価した。
（１）分子量
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。結果を図４に示す。図４の左カラムは、ＳＴ２２４５タンパク質の単一バンドを示し、右カラムは分子量マーカーである。図４から、ＳＴ２２４５タンパク質の分子量は、約３５ｋＤａと推定された。なお、ＳＴ２２４５タンパク質は配列番号３に示すように３１１アミノ酸残基より構成され、そのアミノ酸配列から予測される分子量は約３５，０００Ｄａである。
【００６４】
（２）リコンビナントと天然酵素との反応同一性
実施例１の工程（３）で得たアミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するスルフォロバス・トーコーダイイ抽出タンパク質を含む画分（以下、天然タンパク質画分と称する。）と、実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質を用い、それぞれグルコサミン−６−リン酸を基質とした反応を行い、得られた反応生成物を分析した。分析は、実施例２と同様に、電気化学検出器を装着したＨＰＬＣで行った。結果を図５に示す。図５Ａは、ＳＴ２２４５タンパク質の結果を示し、図５Ｂは天然タンパク質画分の結果を示し、図５Ｃは、基質（グルコサミン−６−リン酸）のピークを示す。図５に示すように、ＳＴ２２４５タンパク質と天然タンパク質画分とによる反応生成物は、同一の位置に反応生成物のピークが検出された。このことから、ＳＴ２２４５タンパク質は、菌体内に存在するアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の活性と同一のものであることが示された。
【００６５】
（実施例６）
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質の温度依存性を評価した。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭグルコサミン−６−リン酸、２μｇのＳＴ２２４５タンパク質からなる酵素反応液１５０μｌを、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５℃で保温し、反応液の酵素活性を評価した。結果を図６に示す。ＳＴ２２４５タンパク質は、８０〜９５℃で非常に高い反応を示した。
【００６６】
（実施例７）
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質のｐＨ依存性を評価した。
５０ｍＭ緩衝液、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭグルコサミン−６−リン酸、２μｇのＳＴ２２４５タンパク質からなる酵素反応液１５０μｌを、前記緩衝液としてリン酸バッファーを用いてｐＨ６．０、ｐＨ６．４、ｐＨ６．８、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０に調整し、またはＴｒｉｓ緩衝液を用いてｐＨ６．８、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０に調整し、反応活性を評価した。結果を図７に示す。その結果、図７に示すようにｐＨ７．０からｐＨ８．０程度のｐＨが本酵素の反応を進めるのに最適であることが示された。
【００６７】
（結果）
本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素によれば、従来生産が困難であったガラクトサミン−６−リン酸を、グルコサミン−６−リン酸からエピメラーゼ活性により、または、ガラクトサミン−１−リン酸からリン酸基分子内転移ムターゼ活性により合成することが可能となった。また、本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は耐熱性に優れるため、本酵素の至適温度条件では他の酵素が失活する。このため、選択的な酵素反応を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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