(57)【要約】【課題】サルモネラ属菌の血清型判別を迅速に行うためのプライマー及びプローブを提供する。【解決手段】サルモネラ属菌に特異的なサルモネラのエンテロトキシン遺伝子（ｓｔｎ）の一塩基多型様配列を指標とし、高解像度融解曲線分析法（ＨＲＭ法）によりサルモネラ属菌の血清型を迅速に判別するためのプローブ及びプライマー並びにその使用に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ属菌のサルモネラ  エンテロトキシン遺伝子に認められる一塩基多型様配列を検出するための表２に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【請求項２】
サルモネラ属菌の血清型を判別するために用いる請求項１に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【請求項３】
エンテロトキシン遺伝子の８５、１１８、１６３、１８０，２６０、３０６、３１３、３７６、４５６、５６５、７１２、７３２位の少なくとも一か所に認められる一塩基多型様配列を含む遺伝子断片を増幅し、増幅産物内の一塩基多型様配列を検出するための請求項２に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【請求項４】
増幅産物の検出法が高解像度融解曲線分析法（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ：ＨＲＭ法）である、請求項１から３に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブを用いることを特徴とするサルモネラ属菌の血清型を判別する方法。
【請求項６】
請求項４に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブを含む、サルモネラ属菌の血清型を判別するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモネラ属菌に特異的なサルモネラ  エンテロトキシン遺伝子（ｓｔｎ）の一塩基多型様配列を指標としてサルモネラ属菌の血清型を判別する際に使用するプローブ及びプライマー並びにその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラはグラム陰性通性嫌気性桿菌の腸内細菌科の一属（サルモネラ属）に属し、主にヒトや動物の消化管に生息する腸内細菌の一種であり、その一部はヒトや動物に感染して病原性を示す。
【０００３】
ヒトに対して病原性を持つサルモネラ属菌には腸チフスやパラチフスを起こすもの（チフス菌 Ｓ．Ｔｙｐｈｉとパラチフス菌  Ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）と、感染型食中毒を起こすもの（食中毒性サルモネラ：ネズミチフス菌Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍや腸炎菌Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなど）が知られている。チフス性サルモネラはヒトのみに感染する細菌で、患者の糞便や糞便によって汚染された土壌や水の中に残存しているものが感染源になる。これに対して食中毒性サルモネラ属菌はペットや家畜の腸管に常在菌として存在しており、食用肉や鶏卵が食中毒の感染源となることもある。
【０００４】
食中毒性サルモネラ属菌に感染すると１２から４８時間の間に吐き気や下痢の症状があらわれ、続いて水様性下痢、発熱、嘔吐が始まる。これらの症状は1週間以内に治まるが、治癒後もサルモネラ属菌が検出されることがある。また一部の感染者では下痢や嘔吐の症状が治まった数週間から数ヶ月後に股関節、膝、アキレス腱などに痛みと腫れを伴う反応性関節炎を発症することが知られている。
【０００５】
サルモネラ属菌の血清型判別法は本菌の最も基本的な分類法であるが、サルモネラのＯ抗原６７種類とＨ抗原８０種類および一部の菌の持つＫ抗原の抗原性の組み合わせで分類され、これら抗原の組み合わせにより、２，５００以上もの血清型が存在する。従来の血清型判別法（型別血清を用いた凝集法）は判定までに４〜５日を要し、さらに手技的にも非常に煩雑である（非特許文献１）。このため、迅速かつ簡便な手法の開発が求められているところである。
【０００６】
２０００年代半ば頃よりサルモネラ属菌の血清型判別のための迅速法の開発に関する複数の報告がなされはじめている。サルモネラ属菌の血清型判別はＯ抗原およびＨ抗原の組み合わせにより行われるため、既報の迅速法もそれら抗原の合成にかかわる遺伝子群を標的としたＰＣＲ法あるいはリアルタイムＰＣＲ法によるものが多い（特許文献１、特許文献２）。
【０００７】
Ｚｅｉｎｚｉｎｇｅｒらは、サルモネラ属菌の三つの遺伝子ｆｌｉＢ，ｇｙｒＢ，及びｙｃｆＱにみられる配列多型置換に着目し、高解像度融解曲線分析法（ＨＲＭ法）により３９種の血清型の迅速なタイピングを可能とした。これはオーストリアで２００８年から２００９年の２年間で分離されたヒト由来のサルモネラ属菌の９４％以上、非ヒト由来の８５％以上をカバーできると報告している（非特許文献２）。
【０００８】
高解像度融解曲線分析法（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ：ＨＲＭ法）は比較的新しい一塩基多型解析にも利用可能なリアルタイムＰＣＲ技術である。ＨＲＭ法では非標識プローブを利用するため従来に比べて安価での一塩基多型解析が可能となっている。ＨＲＭ法により一塩基多型部位のジェノタイピングを行うためには一塩基多型部位を含む領域を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および一塩基多型部位に結合するプローブが必要となる。これらのプライマーおよびプローブは各々の一塩基多型部位について個々に設計が必要であるが、一塩基多型の検出効率はプライマーおよびプローブ結合部位の微細な変更により大きく影響される。
【０００９】
さらに、ＨＲＭ解析用プライマーおよびプローブ構築のための予測（設計）ツールが確立されていないため、各々のプライマーおよびプローブの一塩多型検出効率は、作製されたプライマーおよびプローブを用いて実際にＨＲＭ解析を行う事によってのみ検証可能である。このため、効果的な一塩基多型の検出が可能なプライマーおよびプローブの獲得のためには実際に数多くのプライマーおよびプローブを設計・合成し、それらを用いた非常に多くの試行が必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１２−１７０３８０号公法
【特許文献２】特開２０１１−２３４７３９号公法
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】クラスＩＩＩ細菌検査シリーズ  サルモネラ菌キット  サルモネラ免疫血清「生研」  使用説明書
【非特許文献２】Ｊ．  Ｚｅｉｎｚｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２０１２，  ７８（９）：３３５２−３３６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
サルモネラ属菌の血清型は２，５００種以上に細分化されており、それゆえ似通っていて区別が難しいものもある。このため、一種類の解析手法のみを用いて血清型を判定した場合、一定の割合で誤った判定結果を含んでしまうのが現状である。この理由から本菌の血清型の判定は複数の解析手法を複合的に用いて検証されることが望ましい。
【００１３】
前記したように、非特許文献２を含む先行研究では標的遺伝子群の配列多型を指標としたサルモネラ属菌の血清型の迅速な判別法を記載しているが、先行研究の標的遺伝子群とは全く独立した遺伝子（ｓｔｎ遺伝子）を解析に加え、凝集法や既存の迅速法と共に使用することで判定結果の精度を大きく上昇させることができる。
【００１４】
図１は本発明の概要を示す模式図である。従来のサルモネラ属菌の血清型別法は操作が煩雑である事や判定までに長時間を要する事、試験結果が明瞭ではなく判定が難しい場合がある事などが問題となっていた。このため、近年、ＰＣＲ法あるいはリアルタイムＰＣＲ法を用いた迅速法が開発されてきた。本発明では、先行研究とは完全に独立した遺伝子（ｓｔｎ遺伝子）をターゲットとする事で、既報の迅速法とは独立した判定結果を得る事を可能とした。本発明の特許請求項に含まれる１２種類のプライマー／プローブセットを用いて血清型と相関のあるｓｔｎ遺伝子内の一塩基多型様配列を解析することで１．５時間以内に少なくとも９種類（ＷＨＯへの報告事例の約６５％をカバーする）の血清型を同時に判別する事が可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明においてはｓｔｎ遺伝子を血清型別の指標とする。ｓｔｎ遺伝子は既報の迅速血清型別法で標的とされた遺伝子群とは全く独立した遺伝子座に存在する遺伝子である。このため、本発明を用いた解析により得られる結果は既存の血清型別法により得られる結果とは完全に独立した判定結果を与える。発明者らは様々な分離株に由来するｓｔｎ遺伝子の配列解析を行い、ｓｔｎ遺伝子の配列多型が血清型の指標となる事を示し、かつｓｔｎ遺伝子の配列多型の迅速な解析に利用できるプローブ及びプライマーを作製して迅速な血清型判別法の構築に成功したことで、本発明を完成させた。
【００１６】
（１）サルモネラ属菌のサルモネラ  エンテロトキシン遺伝子に認められる一塩基多型様配列を検出するための表２に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【００１７】
（２）サルモネラ属菌の血清型を判別するために用いる（１）に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【００１８】
（３）エンテロトキシン遺伝子の８５、１１８、１６３、１８０，２６０、３０６、３１３、３７６、４５６、５６５、７１２、７３２位の少なくとも一か所に認められる一塩基多型様配列を含む遺伝子断片を増幅し、増幅産物内の一塩基多型様配列を検出するための（２）に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。なお、すべての塩基番号はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のエンテロトキシン遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＫＦ０３２２４６）に対応している。
【００１９】
（４）増幅産物の検出法が高解像度融解解析法である、（２）に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブ。
【００２０】
（５）（２）に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブを用いることを特徴とするサルモネラ属菌の血清型を判別する方法。
【００２１】
（６）（２）に記載の遺伝子増幅用プライマーおよびプローブを含む、サルモネラ属菌の血清型を判別するためのキット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では既存の迅速法における標的遺伝子群とは全く独立した遺伝子であるｓｔｎを標的とした。これにより既存法とは完全に独立した判定結果を得る事が可能となり、凝集法や既存の迅速法と共に使用する事で判定結果の精度上昇に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の概要を示す模式図。
【図２】表２の各プライマー／プローブセットを利用して得られる標準的なＴｍ  Ｃａｌｌｉｎｇの結果。
【図３】表２の各プライマー／プローブセットを利用して得られた解析結果例。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明に係るプライマー及びプローブ、並びにこれらを利用するサルモネラ属菌の血清型判別法について詳細に記載する。
【００２５】
タイの下痢患者から分離されたサルモネラ属菌株１５１株（２４種類の血清型を含む）に由来するｓｔｎ遺伝子配列および、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて得られた２４９株（４７種類の血清型を含む）に由来するｓｔｎ遺伝子配列を比較した結果、ｓｔｎ遺伝の中に観られる一塩基多型様配列（計７３箇所）の使用塩基と血清型の間に相関が確認された。
【００２６】
さらに、これらの一塩基多型様配列の中から選抜された１２箇所の使用塩基の組み合わせパターンに基づき少なくとも表１に示す９種類の血清型が同定可能である事が明らかとなった。９種類の血清型は分離頻度の最も高い血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓや高病原性である血清型Ｔｙｐｈｉを含んでおり、２００１年から２０１０年の１０年間にＷＨＯに報告されたサルモネラ属菌分離事例の６５．４％をカバーするものであった。表１は血清型判定に有効なｓｔｎ遺伝子内の一塩基多型様箇所の使用塩基の組み合せパターンとそれぞれの組み合わせパターンに対応する血清型を示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
本発明では表１に挙げた９種類の血清型について迅速に同定する方法を構築するために、表１に示された１２箇所の一塩基多型様配列に対してリアルタイムＰＣＲを用いた使用塩基の迅速判別法を開発した。
【００２９】
解析手法として高解像度融解曲線分析法（ＨＲＭ法）を用い、それぞれの箇所に対して１から２７組のプローブ及びプライマーのセットを用いた計２２６パターンのトライアルを行った。その結果、各箇所の使用塩基を明確に判定可能なプローブ／プライマーセット（表２）およびＰＣＲ条件の構築に至った。表３にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ  （Ｒｏｃｈｅ）を利用した際のＰＣＲおよび融解曲線分析の条件を示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
【表３】
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【００３２】
図２にはそれぞれの一塩基多型様箇所に対して、表２に示したプローブ／プライマーセットを用いて得られた標準的な融解曲線分析の結果を示す。
【００３３】
解析は１．５時間以内に完了し、各箇所において融解曲線のピークの出現位置に基づく使用塩基の判定が可能である。得られた結果を表１に示す各々の一塩基多型様箇所の使用塩基と照らし合わせることで表１に挙げた９種類の血清型の同定が可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
サルモネラ属菌分離株に対して表２に示すプローブ／プライマーセットおよび高解像度融解曲線分析法（ＨＲＭ法）を用いて、表１に示す１２箇所の使用塩基を同時に決定する方法を以下に示す。下記手法においては、各プローブ／プライマーセットに対して別々の反応チューブ内で反応を行う必要があるが、共通のＰＣＲ条件（表３）を使用するため、１２箇所に対する解析を同時に遂行可能である。
【００３６】
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天培地上に発育した新鮮なサルモネラ属菌の単離コロニー（１集落）を蒸留水（１００μｌ）に懸濁し、１００℃で１０分間加熱処理を行った後に２０，０００  ｘｇで５分間の遠心分離操作により得られた上清をゲノム遺伝子粗抽出試料とした。ＨＲＭ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ（以下、ＨＲＭキット）を用いた非対称ＰＣＲにより行った。すなわち、得られたゲノム遺伝子粗抽出液２．０μＬ  にプローブ（６μｍｏｌ／Ｌ）を０．８μＬ、プローブと同鎖に結合するプライマー（６μｍｏｌ／Ｌ）を０．２μＬ、プローブと逆鎖に結合するプライマー（６μｍｏｌ／Ｌ）を１．０μＬ、ＤＭＳＯを１．０μＬ、ＭｇＣｌ２，  ２５ｍＭ  （ＨＲＭキットに付属）を２．４μＬ、Ｈ２Ｏ，  ＰＣＲ-ｇｒａｄｅ（ＨＲＭキットに付属）を２．６μＬ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，  ２Ｘ  ｃｏｎｃ．  （ＨＲＭキットに付属）を１０．０μＬと良く混合し、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて解析した。
【００３７】
リアルタイムＰＣＲ装置としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ  （Ｒｏｃｈｅ）および専用解析ソフトウェアＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｏｆｔｗｅｒｅ−１．１を使用した。ＰＣＲおよび融解曲線分析の条件は表３に示す通りである。解析結果の判定（使用塩基の判定）はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｏｆｔｗｅｒｅ−１．１においてＲｅｓｏＬｉｇｈｔ  ＤｙｅをＴａｒｇｅｔとしたＴｍ  Ｃａｌｌｉｎｇにより得られた波形（図２および図３）に基づいて行った。
【００３８】
一例として図３にタイの下痢患者より分離されたサルモネラ属菌分離株に対する解析結果を示す。図３の結果を標準的な解析結果例（図２）と比較することで各箇所の使用塩基が判明し、判明した使用塩基のパターンを表１と照合する事で血清型の決定が可能であった（図３に示す株は血清型Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓと判明）。
【００３９】
上記の操作は、ＰＣＲ試料の調製に約１５分、ＰＣＲ反応に約１時間、解析に約５分を要し、全ての解析が１時間２０分程度（作業時間は約２０分）で完了する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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