(57)【要約】      （修正有）【課題】卵巣がんの予後予測用マーカー及びキット並びに予後予測方法を提供する。【解決手段】マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物を含む卵巣がん予後予測マーカー，キット及びそれらのマーカー又はキットを用いた卵巣がんの予後予測方法であって，被検者から採取した生体試料におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルをマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物からなる卵巣がん予後予測マーカーを検出し，卵巣がん予後予測マーカーの検出値を得る方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物を含む卵巣がん予後予測マーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の卵巣がん予後予測マーカーであって，
被検者の体液試料における前記マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の発現量を用いて，前記被検者における卵巣がんの予後を評価するための，卵巣がん予後予測マーカー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の卵巣がん予後予測マーカーを含む，卵巣がん予後予測用検査キット。
【請求項４】
卵巣がんの予後を予測するための方法であって，
被検者から採取した生体試料におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む，方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって，
前記マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程は，マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物からなる卵巣がん予後予測マーカーを検出し，卵巣がん予後予測マーカーの検出値を得る工程を含む，方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって，
前記生体試料が，前記被験者の腹水，腹水から回収されるエクソソーム，及び卵巣がん組織サンプルのいずれか１つ又は２つ以上である，方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって，
前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値が陽性か否かを判定する工程であって，
前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値と，前記生体試料における内部標準遺伝子転写物の検出値とを比較し，前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値が前記生体試料における内部標準遺伝子転写物の検出値より所定比率以上である場合に，前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値を陽性と判断する工程を，さらに含む，
方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって，前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値が陽性か否かを判定する工程であって，
前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値が，良性腫瘍又は卵巣がん転移陰性症例の卵巣がん予後予測マーカーの検出値の平均値より所定比率以上である場合に，前記卵巣がん予後予測マーカーの検出値を陽性と判断する工程を，さらに含む，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，卵巣がんに罹患した患者の中から予後不良患者群を検出するためのマーカー及びその検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは，婦人科悪性腫瘍の中で最も予後不良ながん種であり，罹患率死亡率ともに上昇の一途を辿っている。２０１０年には，世界で約１６万人が卵巣がんにより死亡している。卵巣がん細胞は，腹膜の主要構成細胞である中皮細胞と親和性が高く，極めて腹膜転移を起こしやすいことが知られており，腹膜転移が重要な予後因子の一つとなっている。腹膜転移に対する薬物治療は現在も確立されておらず，またその分子メカニズムもほとんど明らかにされていない。２０１４年の統計データによると，女性の累積罹患リスクは全がん種で約４６％（２人に1人がんに罹患）であるのに対し，そのうち卵巣がんは約１％（８７人に1人がんに罹患）であった。また，女性の累積死亡リスクは全がん種で約１６％（６人に1人がんで死亡）であるのに対し，そのうち卵巣がんは約０．５％（１８８人に1人がんで死亡）であった。このように，卵巣がんは罹患後の予後が悪いがんに分類され，早期発見と卵巣がんの特徴に合わせた適切な処置を選択する重要性が認識されている。予後の悪さの１つとして，卵巣がんは，初期は自覚症状に乏しいことが多く，臨床病期が進んだ段階で発見されること，もう１つの原因として，卵巣がんは進行が早く，腫瘍が小さい段階でも遠隔転移やリンパ節にも転移しやすい，悪性度の高い腫瘍であることがあげられる。
【０００３】
前者を解決するためには，有効な早期診断マーカーが確立される必要がある。現在は，内診やエコー検査で発見された後，画像診断や血液腫瘍マーカーの測定により，良性と悪性の判定がなされる。使用される代表的な卵巣がん検査マーカーはとしてＣＡ１２５等が存在するが，初期の卵巣がんにおいては検出感度が約５０％，特異性が約７０％であるとされ，マーカー精度としては十分とは言い難い。
【０００４】
また，後者を解決するためには，腹膜播種やリンパ節転移をするサブタイプを的確に判定し，その後の適切な治療プロトコルを策定することが重要となる。卵巣がんの予後予測診断を行い，標準治療を行えばその後に悪性化しないサブタイプを判別できれば，必要のない患者に過剰な治療を選択する事態が回避され，予後悪化の高リスク患者に限定したより積極的なアプローチが可能となる。さらに，卵巣から発生する腫瘍には，良性と悪性以外にも，組織学的には良性に類似した所見でありながら，悪性と似た経過をたどる境界悪性腫瘍が存在しており，治療選択の取り扱いを複雑なものとしている。この観点においても，予後が悪いタイプを的確に判定し，治療につなげる基準となるマーカーが有効となる。
【０００５】
近年，ＣＡ１２５を上回るマーカー候補として，血液循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が注目されている。ｃｆＤＮＡは，検出感度は依然として十分ではなく，より感度の優れたマーカーが必要とされるが，特異性においては卵巣がん患者を高い精度で判別できる（非特許文献１）。
卵巣がん予後予測マーカーとしては，卵巣がん組織におけるＤＮＡメチル化プロファイルを特定の遺伝子領域について解析することにより，高メチル化，低メチル化の群間において，カプランマイヤー生存曲線等に差が確認されている（特許文献１）。しかしながら，ＤＮＡメチル化解析は一般の診断技術に活用するには解析の原理上操作が煩雑となり，検査費の高コスト化等の課題を残していることや，良性腫瘍と悪性腫瘍の識別力に不備があるため，疑陽性の問題が懸念されることなどから，がん発症後の予後予測マーカー技術については，さらなる技術的躍進が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１４−５２５２６９公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】PLoS One. 2016 Jun 2;11(6):e0155495. doi: 10.1371/journal.pone.0155495. Circulating Cell Free DNA as the Diagnostic Marker for Ovarian Cancer: A Systematic Review and Meta−Analysis.  Zhou Q1, Li W1, Leng B1, Zheng W1, He Z1, Zuo M1, Chen A1.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は，卵巣がんの悪性度を判定し，予後経過を高精度に予測する技術を提供することを目的とする。なお，本発明は，好ましくは，臨床病期の初期（ステージＩ）においても正確な識別力を有するマーカー技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の側面は，卵巣がんの予後診断マーカーに関する。具体的に説明すると，このマーカーは，マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物を含む卵巣がん予後予測マーカーである。
【００１０】
このマーカーの好ましい例は，被検者の体液試料におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の発現量を用いて，被検者における卵巣がんの予後を評価するための，卵巣がん予後予測マーカーである。
【００１１】
このマーカーは，卵巣がん予後予測用検査キットの一要素として用いられる。このため，本発明は，卵巣がん予後予測用検査キットをも提供する。
【００１２】
本発明の第２の側面は，卵巣がんの予後を予測するための方法に関する。この方法は，被検者から採取した生体試料におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む。
【００１３】
具体的に説明すると，マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程は，マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物からなる卵巣がん予後予測マーカーを検出し，卵巣がん予後予測マーカーの検出値を得る工程を含む。
【００１４】
生体試料の例は，被験者の腹水，腹水から回収されるエクソソーム，及び卵巣がん組織サンプルのいずれか１つ又は２つ以上である。
【００１５】
上記の方法は，卵巣がん予後予測マーカーの検出値が陽性か否かを判定する工程をさらに含むものが好ましい。この工程は，卵巣がん予後予測マーカーの検出値と，生体試料における内部標準遺伝子転写物（例えば，ＧＡＰＤＨ遺伝子）の検出値とを比較し，卵巣がん予後予測マーカーの検出値が生体試料における内部標準遺伝子転写物の検出値より所定比率以上である場合に，卵巣がん予後予測マーカーの検出値を陽性と判断する工程である。
【００１６】
上記の方法の例は，卵巣がん予後予測マーカーの検出値が陽性か否かを判定する工程であって，上記とは別のものをさらに含む。この工程は，卵巣がん予後予測マーカーの検出値が，良性腫瘍又は卵巣がん転移陰性症例の卵巣がん予後予測マーカーの検出値の平均値より所定比率以上である場合に，卵巣がん予後予測マーカーの検出値を陽性と判断する工程である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は，卵巣がん予後予測マーカーや，そのようなマーカーを含むキットを提供できる。さらに，本発明は，卵巣がんの予後を予測するための方法をも提供できる。
【００１８】
腹水及び腹水から回収されるエクソソーム，または卵巣がん組織サンプル中のＭＭＰ１遺伝子転写産物発現レベルを測定することにより，卵巣がん患者の悪性度を判定することができる。例えば，卵巣がん病期Ｉ期の患者において，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量が高い患者群は再発による死亡のリスクが高く，低い患者は再発無く治癒の経過をたどるという診断が可能である。現状の標準治療においては，卵巣がん病期Ｉ期の患者は原発腫瘍を摘出して，基本的に外科手術療法のみで終了するケースがほとんどである。卵巣がん細胞は，腹膜の主要構成細胞である中皮細胞と親和性が高く，極めて腹膜転移を起こしやすいことが知られており，腹膜転移が重要な予後因子の一つとなっている。病期がステージＩの卵巣がんは，がん病巣が片側もしくは両側の卵巣のみに停まっている状態を指し，一見すると５年生存率も高く維持されるが，その後病期が進行すると，悪性化の一途をたどる傾向がある。本発明による効果として，早期卵がん癌患者のＭＭＰ１遺伝子転写産物レベルを把握することで，拡大手術（リンパ節大網切除等）や後治療（化学療法）を行うべきという判断が可能となり，それら追加治療により，婦人科悪性腫瘍の中で最も予後不良のがんの１つである卵巣がんについて，患者予後を改善することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は，良性腫瘍，境界悪性腫瘍，悪性腫瘍の３つの患者群で手術の採に採取した腹水から精製した，エクソソーム中のＭＭＰ１遺伝子転写産物を示す。
【図２】図２は，卵巣がん病期ステージ１患者を対象に，卵巣がんの予後予測因子としてＭＭＰ１遺伝子転写産物の性能を評価した結果を示す。
【図３】図３は，高度転移型（ＥＳ−２）および非転移型（ＲＧＭ−１）卵巣がん細胞株の同所移植マウスモデルにおける腫瘍進行を比較した結果を示す。
【図４】図４は，中度転移型卵巣がん細胞株（Ａ２７８０）の同所移植マウスモデルにおける，卵巣がん細胞株由来エクソソーム移植に伴う，Ａ２７８０細胞株の原発腫瘍への影響，及び転移促進作用を評価した結果を示す。
【図５】図５は，高度転移型（ＥＳ−２）および非転移型（ＲＭＧ−１）卵巣がん細胞株における，細胞及びエクソソーム中のＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量を検証した結果を示す。さらに，それらのＭＭＰ１遺伝子転写産物が全長型であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の側面は，卵巣がん予後予測マーカーに関する。この卵巣がん予後予測マーカーは，マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物を含む。すなわち，卵巣がん患者におけるＭＭＰ１遺伝子転写産物は，予後不良リスクの高い患者群と，予後不良リスクの低い患者群を精度よく判定することができる。
【００２１】
卵巣がんは，例えば，上皮性腫瘍，胚細胞腫瘍，性索間質性腫瘍，転移性卵巣腫瘍，及び組織型による分類(漿液性腺がん，明細胞腺がん，類内膜腺がん，移行上皮がん，粘液性腺がん，及び混在型)に分類される。また，卵巣がんも他の癌と同様進行の程度によってＩ期〜ＩＶ期に分類される。本発明の予後予測マーカーは，それぞれの癌患者の転写産物と，健常人又は良性腫瘍患者の転写産物とを比較することで，卵巣がん患者の転帰が悪性化するリスクを特定できる。
【００２２】
卵巣にできる腫瘍のうち，大部分は良性腫瘍とされ，比較的悪性度が低い境界型悪性腫瘍と呼ばれる卵巣がんも存在する。悪性腫瘍はそれら以外の場合が該当する。良性腫瘍は基本的に悪性化の危険性はないが，境界型悪性腫瘍では，病期が進行して悪性腫瘍の場合と同じ術式や化学療法を必要とする場合がある。境界型悪性腫瘍もしくは悪性腫瘍と診断された場合，開腹により病理学的所見により進行期を確定し，組織型や進行期に応じた治療をするが，適切な予後予測が行われていないことも一因となり，卵巣がん治療の成績は他のがんに比べて低い。
【００２３】
卵巣がんの予後は，卵巣がんのたどる経過についての医学上の見通しをいう。予後予測は，患者が薬剤に芳しくまたは芳しくなく反応する可能性，そのような反応の程度，原発性癌の手術による除去および／または化学療法の後一定期間再発なしに生存する可能性のいずれかを意味する。本発明の方法を臨床的に利用し，特定の患者に対して最も適切な治療法を選択することによって治療法を決定できる。卵巣がんの予後予測の時期は，卵巣がんの治療前，治療中，及び治療後のいずれであってもよい。
【００２４】
本発明において「長期生存」とは，手術またはその他の治療の後３年以上，好ましくは５年以上，より好ましくは８年以上，最も好ましくは１０年以上生存することを意味する。
【００２５】
マーカーは，いわゆる腫瘍マーカーである。本発明のマーカーは，例えば，卵巣がん細胞もしくは卵巣がん細胞から分泌されるエクソソームの目印（マーカー）になる物質であって，卵巣がんの予後診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称である。マーカーとなる物質の例は，遺伝子の転写産物であるＲＮＡ鎖である。遺伝子の転写産物は，例えば，遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖，すなわち，ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖，及び転写後細胞内で修飾されたＲＮＡ鎖を意味する。転写産物に含まれるＲＮＡ鎖の例は，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。これらのＲＮＡ鎖は，転写後，細胞内でプロセッシングされたものも含む。
【００２６】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の例は，配列番号３及び４のプライマー対を用いて増幅される塩基配列を有するものか，配列番号５及び６のプライマー対を用いて増幅される塩基配列を有するものである。
【００２７】
本発明は，卵巣がん予後予測マーカーを含むキットをも提供する。このキットは，予後関連遺伝子であるＭＭＰ１遺伝子の転写産物に対する，プライマー及び核酸プローブを適宜含んでいてもよい。ＭＭＰ１遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＭ００１１４５９３８等であり，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の定量に使用されるプライマー配列は，同遺伝子配列領域内で設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せにより決定できる。
本明細書において「ＭＭＰ１遺伝子」とは，マトリックスメタロプロテイナーゼ１タンパク質をコードする遺伝子である。ＭＭＰ１遺伝子は，Ｉ型，ＩＩ型，及びＩＩＩ型の間質コラーゲンを分解できる分泌型酵素をコードする。この遺伝子は，ヒト染色体１１ｑ２２．３に座上するＭＭＰ遺伝子クラスターの一部である。
【００２８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１，別名：ＣＬＧ，ＣＬＧＮ，ＥＣ３．４．２４．７）は，線維芽細胞コラゲナーゼ，間質コラゲナーゼ，マトリックスメタロペプチダーゼ−１，又はマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＨＧＮＣ：７１５５１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：４３１２２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０３９５６３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９６６１１７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４２１）としても知られる。
【００２９】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物を逆転写したcＤＮＡ
を増幅するためのフォワードプライマー，及びリバースプライマーの例は，以下のものである。すなわち，配列番号３及び４のプライマー対，及び配列番号５及び６のプライマー対である。
【００３０】
本発明の卵巣がん予後予測キットは，本発明のマーカーとなる遺伝子発現解析用の試薬を少なくとも含んでもよい。そして，このキットは，本発明の卵巣がんの検査方法を実施するために必要とされる各種機材，資材，試薬及び遺伝子増幅するためのプライマー類ならびに遺伝子増幅に係る試薬等を含んでもよい。
【００３１】
このような遺伝子発現解析用の試薬の例は，核酸抽出液，各種酵素類，緩衝液，洗浄液，溶出液等も含まれる。具体的には，核酸を精製する際に検体を懸濁するための抽出液を少なくとも含み，さらに遺伝子転写産物を検出するための，逆転写反応用プライマー，ＰＣＲ用プライマー，逆転写酵素，リアルタイムＰＣＲ用酵素などを含む。キット要素として，さらに多数検体の同時処理が可能なマイクロタイタープレート，ＤＮＡ増幅用機器等の必要な機材一式などを含んでもよい。
【００３２】
キットに含まれるプライマーは，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。例えば，プライマーのサイズは，少なくとも約１２塩基長以上，好ましくは約１５〜１００塩基長，より好ましくは約１６〜５０塩基長，さらにより好ましくは約１８〜３５塩基長である。また，遺伝子増幅法の種類に応じて最適とされる増幅断片のサイズが異なる。このため，キットに含まれるプライマーの設計箇所は特に限定されない。このようなプライマーは，公知の方法により作製することができる。
【００３３】
キットに含まれる核酸プローブは，予後関連遺伝子の転写産物の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ，ＲＮＡ，修飾核酸またはそれらのキメラ分子などであり得るが，安定性，簡便性等を考慮するとＤＮＡプローブが，感度を考慮するとＲＮＡプローブが好ましい。核酸プローブはまた，１本鎖または２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは，予後関連遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが，例えば約１５または１６塩基長以上，好ましくは約１５〜１０００塩基長，より好ましくは約２０〜５００塩基長，さらにより好ましくは約２０〜８０塩基長である。核酸プローブは，核酸アレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは，自体公知の方法により作製することができる。
【００３４】
キットは，ＭＭＰ１遺伝子転写産物と試薬との複合体を測定する手段を含んでもよい。この場合，キットに含まれる試薬および測定手段は，互いに隔離された形態，例えば，異なる容器に格納された形態で提供され得る。測定用手段は，試薬の種類に応じて，標識用物質で標識された検出物質であってもよい。標識用物質の例は，ＦＩＴＣ及びＦＡＭ等の蛍光物質，ルミノール，ルシフェリン及びルシゲニン等の発光物質，３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ，及び１２３Ｉ等の放射性同位体，並びにビオチン及びストレプトアビジン等の親和性物質である。キットは，逆転写酵素，核酸抽出液又は核酸抽出装置をさらに含んでもよい。キットは，卵巣がん患者から生体試料を採取し得る手段をさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明の卵巣がん予後予測マーカーは，特に腹水及び腹水から回収されるエクソソーム，または卵巣がん組織サンプルを用いて測定されることが好ましい。
【００３６】
本発明の卵巣がん予後予測マーカーは，良性腫瘍に擬陽性を示すことなく，境界型悪性腫瘍及び悪性腫瘍患者における，予後不良予測患者を高精度に検出することができる。
【００３７】
ステージＩの患者を対象に本発明を適用すると，早期がんであるステージＩ患者についても，卵巣がんの進行に関して予後を正確に判定することができる。
【００３８】
次に，卵巣がん予後予測方法について説明する。この方法は，卵巣がんを発症した対象の予後の悪性度合いを検出する方法である。この方法は，対象からの試験サンプル中のＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現レベルを測定する。
【００３９】
ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現レベルを測定する方法は公知の一般的な分子生物学的手法を用いて実施可能である。そのような方法の例は，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ，マイクロアレイ解析法，ノーザンプロット分析法，及び次世代シーケンス法である。
【００４０】
次に，卵巣がん患者における腹水および腹水から回収されるエクソソーム，または卵巣がん組織サンプル中における，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量を定量する。定量の方法は，内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子等転写産物の発現量に対する，相対値をもって精度良く判定することができる。ＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物を内部標準とする場合，ＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物に対するＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量が，所定の閾値を上回る場合，卵巣がんの予後不良高リスク対象と判定することができる。この場合における予後不良対象の閾値は，０．７％を設定することができる。
【実施例】
【００４１】
実施例は，以下の方針に基づいて行った。本発明を実施するために，対象の腹水からエクソソームを調製し，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量を測定した。ＧＡＰＤＨ遺伝子等転写産物の発現量に対する，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量が０．７％に設定した閾値を上回る場合，卵巣がんの予後不良高リスク対象と判定した。
【００４２】
この閾値は，例えば，０．５％以上１．５％の範囲で変更しても構わない。
【００４３】
良性腫瘍の対象においては，閾値である０．７％以下を示した。その設定根拠として，病期ステージＩの卵巣がん患者の卵巣腫瘍組織における，ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量が高い群と低い群に分類し，両群のカプランマイヤー生存曲線を解析すると，発現量が高い群において，顕著な生存率の低下を認め，一方で低発現群においては，生存率の低下は認められなかった。
【００４４】
卵巣腫瘍組織そのものだけでなく，腹水に存在するエクソソームについても，卵巣がんの予後予測評価のための試験サンプルと成り得ることを示した実施例として，マウスを用いた評価を実施した。ここでは，移植時に予後不良を示す卵巣がん細胞の高転移株に由来するエクソソームを，中等度転移株をマウスに移植した卵巣がん腹膜播種モデルに投与した場合，卵巣がん細胞株の腹腔への転移を促進し，一方で卵巣がん細胞非転移株に由来するエクソソームを，中等度転移株をマウスに移植した卵巣がん腹膜播種モデルに投与した場合，そのような転移促進は認められないことを確認した。さらに，高転移株に由来するエクソソームには，非転移株に由来するエクソソームと比較して，顕著なＭＭＰ１遺伝子産物の高発現を認めた。エクソソームにおけるＭＭＰ１遺伝子産物の高発現は，腹膜播種などの転帰となるリスクを評価するための，予後不良マーカーとなることを確認した。
【００４５】
［実施例１］
境界型悪性腫瘍と悪性腫瘍の卵巣がん患者，および良性腫瘍を卵巣に生じた患者における，ＭＭＰ１遺伝子転写産物発現解析を実施した。その結果を図１に示す。
【００４６】
エクソソームの分離：境界型悪性腫瘍７名，悪性腫瘍４１名，および良性腫瘍１２名を対象に，腫瘍摘出の外科手術時もしくは，腹壁穿刺で採取された腹水を，２，０００×g（４℃／１０分間）遠心分離に供した。沈殿画分を除いた上澄み画分を０．４５μmフィルターに供し，ＴＳＬ−５５ローター（ベックマンコールター社）を用いて４９，０００ｒｐｍ（４℃／３５分間）の遠心分離に供した。沈殿画分をＰＢＳ（−）で洗浄し，再度４９，０００ｒｐｍ（４℃／３５分間）の遠心分離に供し，エクソソーム画分とした。
【００４７】
トータルRNAの精製：QIAzolとmiRNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用して使用説明書に従い，エクソソームからトータルRNAを抽出し，トータルRNA濃度を測定した。
【００４８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：精製した1μgのトータルＲＮＡから，High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社）によりｃＤＮＡを合成し，Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のリアルタイムＰＣＲ機器を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。解析にはＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物でノーマライゼーションを行った。用いたＰＣＲプライマーは以下の通りである。
【００４９】
配列番号１）ＧＡＰＤＨ-Fw：  gcaccgtcaaggctgagaac
配列番号２）ＧＡＰＤＨ-Rv：  tggtgaagacgccagtgga
配列番号３）ＭＭＰ１-Fw：  aggtctctgagggtcaagca
配列番号４）ＭＭＰ１-Rv：  ctggttgaaaagcatgagca
【００５０】
PCR反応条件は，下記で実施した。
50℃／2min
↓  95℃／2min
↓（95℃／15sec→60℃／30sec）×40サイクル
【００５１】
予後リスク評価：ＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物の発現量に対するＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量の比率を算出した。境界型悪性腫瘍群（LPM），悪性腫瘍群（Cancer），および良性腫瘍群群（Control）ごとの発現量比のプロットを描写した。悪性腫瘍群（Cancer）のオレンジ色で囲んだ対象群は，良性腫瘍群群（Control）に対してＭＭＰ１遺伝子転写産物が高発現で有ることを示す。その割合は，悪性腫瘍群（Cancer）全体の27%であることが示された。これらの結果により，それらを判定する基準値として，ＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物に対するＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現比率が，0.7%以上となる対象において，これらＭＭＰ１遺伝子転写産物高発現対象は，その後の卵巣がん予後が不良となるリスクを保有する対象と判定することができる（図１）。
【００５２】
［実施例２］
種々のがん臨床検体における遺伝子発現解析データを提供する公的なマイクロアレイデータセットを提供するカプランマイヤープロッターにおいて，1582名の卵巣がん患者の中で，卵巣がん病期がステージＩの７４名の患者群を抽出し，ＭＭＰ１遺伝子転写産物カプランマイヤー生存曲線解析を実施した（ＭＭＰ１プローブ：２０４４７５＿ａｔ）。その結果を図２に示す。ステージＩ卵巣がん患者において，腫瘍組織にけるＭＭＰ１遺伝子の高発現は，その後の予後悪化と極めて強い相関性を見出した（ハザード比：３．６×１０８,ログランクテスト:ｐ＝０．０１４）。
【００５３】
［実施例３］
ルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト卵巣がん細胞株のＲＭＧ−１およびＥＳ−２を，ＣＢ１７／ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウスの左卵巣へ正所移植を行ない，最大８週間まで経時的にIVISシステムを用いてインビボイメージングを行なった。それにより，非転移株のＲＭＧ−１と，高転移株のＥＳ−２のマウスにおける増殖性と浸潤性を評価した。
【００５４】
細胞調製： ＲＭＧ−１細胞株は，１０％非動化ＦＢＳおよび１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培地で培養し，ＥＳ−２細胞株は，１０％非動化ＦＢＳおよび１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で培養した。培養条件は３７℃／５％ ＣＯ２濃度で設定した。両細胞は，ルシフェラーゼ遺伝子を導入してルシフェラーゼタンパク質を発現するよう改変したものを使用した。
【００５５】
細胞移植：調製したＲＭＧ−１細胞株およびＥＳ−２細胞株をT細胞とB細胞を欠損した免疫不全マウスであるＣＢ１７／ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウスの左卵巣へ正所移植を行なった。移植細胞数は，１×１０６細胞で移植した。
【００５６】
インビボイメージング：卵巣がん細胞株移植後１週間から，１週間おきにルシフェラーゼの発光をIＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて検出することにより，がん細胞の増殖と浸潤を評価した。ルシフェラーゼ活性の検出のために，Ｄ−ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与をし，約10分後にマウスの全身における発光を検出し，ＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ ４．４ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で画像解析を行なった。その結果を図３に示す。図３に示されるように，高転移株のＥＳ−２においては，原発腫瘍と腹腔への転移浸潤が細胞移植から２週間後には観察され，一方の非転移株のＲＭＧ−１においては，８週間の観察期間の間，原発腫瘍の増大のみが観察された。これにより，ＲＧＭ−１は非転移性の低悪性度の卵巣がん細胞株であることを確認し，一方で，ＥＳ−２は高転移性の高悪性度の卵巣がん細胞株であることが確認された。
【００５７】
［実施例４］
転移における悪性度が異なる卵巣がん細胞株と，ヒト卵巣表層上皮細胞に由来するエクソソームによる，卵巣がん細胞の転移浸潤に与える影響を評価した。
【００５８】
細胞調製： Ａ２７８０細胞株は，１０％非動化ＦＢＳおよび１％  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０ 培地で培養した。培養条件は３７℃／５％  ＣＯ２濃度で設定した。Ａ２７８０細胞株は，ルシフェラーゼ遺伝子を導入してルシフェラーゼタンパク質を発現するよう改変したものを使用した。
【００５９】
エクソソームの調製： ヒト卵巣表層上皮細胞（ＨＯＳＥ１）およびＲＧＭ−１は，10％非動化ＦＢＳおよび１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培地で培養し， ＥＳ−２細胞株は，10％非動化FBSおよび１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で培養した。培養条件は３７℃／５％ＣＯ２濃度で設定した。細胞が約９０％の増殖度に到達した時点で，細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し，無血清培地に置換した。ＥＳ−２については，アドバンスドDＭＥＭ培地にて，ＲＧＭ−１およびＨＯＳＥ１については，アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。その後４８時間の培養を行い，培養上清を回収した。培養上清は２，０００×ｇ（４℃／１０ｍｉｎ）の遠心分離に供し，細胞残渣等を除去し，上澄み画分を０．２２μｍフィルター（ミリポア社）に供して清浄化した。この上澄み画分を， ＳＷ４１Ｔｉローター（ベックマンコールター社）を用いて3５，０００ｒｐｍ（４℃／７０分間）の遠心分離に供した。沈殿画分をＰＳＢ（−）で洗浄し，再度３５，０００ｒｐｍ（４度／７０分間）の遠心分離に供し，エクソソーム画分とした。
【００６０】
モデルマウスの作製：調製したＡ２７８０細胞株を，Ｔ細胞とＢ細胞を欠損した免疫不全マウスであるＣＢ１７／ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウスの左卵巣へ正所移植を行なった。移植細胞数は，１×１０６細胞で移植した。そのマウスに対して，ＥＳ−２，ＲＧＭ−１，ＨＯＳＥ１から調製したエクソソームを，５μｇ腹腔内へ投与した。投与回数と頻度は，A2780細胞移植の3日後から13日後まで毎日（合計６回：合計投与エクソソーム量30μg）とした(図４ａ）。
【００６１】
転移の評価：Ａ２７８０細胞移植の21日後，原発腫瘍と転移腫瘍の評価を行なった。具体的には，Ａ２７８０細胞株によるルシフェラーゼの発光を，ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ者）を用いて検出することにより，がん細胞の増殖と浸潤を評価した。ルシフェラーゼ活性の検出のために，D−ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与をし，約１０分後にマウスの全身における発光を検出た。検出においては，マウスの全身，摘出した原発腫瘍，および原発腫瘍を摘出した後の腹腔を検証し，ＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ ４．４ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で画像解析を行なった。その結果を図４bに示す。ＨＯＳＥ１由来エクソソーム投与群，ＲＭＧ−１エクソソーム投与群については，腹腔への転移がＰＢＳ（−）投与群の中央値とほとんど同じであったのに対して，ＥＳ−２由来エクソソーム投与群については，腹腔への転移が顕著に促進される結果となった。一方で，原発腫瘍における腫瘍の増大においては，ＨＯＳＥ１由来エクソソーム投与群，ＲＭＧ−１エクソソーム投与群，ＥＳ−２由来エクソソーム投与群の群間で，有意な差は検出されなかった。
【００６２】
［実施例５］  
卵巣がん細胞株およびそれらに由来するエクソソーム画分に含まれるＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量比較を実施した。
細胞の調製：ヒト卵巣表層上皮細胞（ＨＯＳＥ１）およびＲＧＭ−１は，１０％非動化FBSおよび1％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培地で培養し， ＥＳ−２細胞株は，１０％非動化ＦＢＳおよび１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社）を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で培養した。培養条件は３７℃／５％  ＣＯ２濃度で設定した。
【００６３】
エクソソームの調製：細胞が約90％の増殖度に到達した時点で，細胞をPBS(-)で洗浄し，無血清培地に置換した。ＥＳ−２については，アドバンスドDMEM培地にて，ＲＧＭ−１およびＨＯＳＥ１については，アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。その後48時間の培養を行い，培養上清を回収した。培養上清は２，０００×g（４℃／１０ｍｉｎ）の遠心分離に供し，細胞残渣等を除去し，上澄み画分を０．２２μｍフィルター（ミリポア社）に供して清浄化した。この上澄み画分を， ＳＷ４１Ｔｉローター（ベックマンコールター社）を用いて３５，０００ｒｐｍ（4℃／７０分間）の遠心分離に供した。沈殿画分をＰＳＢ（−）で洗浄し，再度３５，０００ｒｐｍ（4℃／70分間）の遠心分離に供し，エクソソーム画分とした。
【００６４】
トータルRNAの精製：ＱＩＡｚｏｌとｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して使用説明書に従い，エクソソームからトータルRNAを抽出し，トータルRNA濃度を測定した。
【００６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：精製した1μgのトータルＲＮＡから，Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりｃＤＮＡを合成し，Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のリアルPCR機器を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。解析にはＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物でノーマライゼーションを行った。用いたPCRプライマーは以下の通りであった。
【００６６】
配列番号１）ＧＡＰＤＨ−Ｆｗ：  gcaccgtcaaggctgagaac
配列番号２）ＧＡＰＤＨ−Ｒｖ：  tggtgaagacgccagtgga
配列番号３）ＭＭＰ１−Ｆｗ：  aggtctctgagggtcaagca
配列番号４）ＭＭＰ１−Ｒｖ：  ctggttgaaaagcatgagca
PCR反応条件は，下記で実施した。
50℃／2min
↓  95℃／2min
↓（95℃／15sec→60℃／30sec）×40
【００６７】
定量結果：ＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量比較を行なった結果，高転移卵巣がん細胞株のES2については，細胞およびエクソソームにおけるＭＭＰ１遺伝子転写産物の発現量が，ＲＭＧ−１やHOSE1と比較してそれぞれ約22倍と約65倍の高発現を示した(図５)。
【００６８】
ＭＭＰ１遺伝子転写産物の確認：エクソソームに含有されるＭＭＰ１遺伝子転写産物が全長型であることを検証する目的で，トータルＲＮＡから，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）をメーカー説明書に記載の方法に従い使用して，ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをテンプレートに，Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いてPCR反応を行なった。用いたPCRプライマーは以下の通りであり，増幅されるDNA断片は1,528塩基対となる。
【００６９】
配列番号５）ＭＭＰ１−Ｆｕｌｌ−Ｆｗ：  gatattggagcagcaagagg
配列番号６）ＭＭＰ１−Ｆｕｌｌ−Ｒｖ：  caccttctttggactcacac
【００７０】
PCR反応条件は，下記で実施した。
（９８℃／１０sec→６０℃／３０sec→７２℃／２min）×３０サイクル
その結果，ＥＳ２由来エクソソームには全長型のＭＭＰ１遺伝子転写産物が含有されることが明らかとなった。
【００７１】
上述の実施例の要点を整理すると，ステージＩにおける卵巣がんの予後不良群の卵巣腫瘍組織において，ＭＭＰ１遺伝子転写産物が高発現であることを実施例２で示し，また，卵巣がん悪性腫瘍患者の腹水に由来するエクソソームにおいては，良性腫瘍患者では認められないＭＭＰ１遺伝子転写産物の高発現が約27%の患者で検出されることを実施例２で示した。さらに，腹腔への高転移性卵巣がん細胞株であることを実施例３で示したＥＳ２について，ＥＳ２に由来するエクソソームは，非転移性卵巣がん細胞株のＲＭＧ−１に由来するエクソソームには認められない機能として，中等度転移性卵巣がん細胞株であるＡ２７８０の腹腔への転移を促進する機能を有することを示した。実施例５においてはＥＳ−２に由来するエクソソームには，ＲＭＧ−１に由来するエクソソームと比較して，ＭＭＰ１遺伝子転写産物が極めて高発現することを見出した。これらの複合的な見識を組合せ，本発明として，卵巣がんを有する対象からの腹水及び腹水から回収されるエクソソーム，または卵巣がん組織サンプルにおいて，ＭＭＰ１遺伝子転写産物は，卵巣がん患者の高精度な予後予測マーカーとして活用できることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は，卵巣がん発症後の予後リスク評価に関するものであり，本発明によるマーカーを用いた検査等によって，予後不良と想定される患者を検出することができる。卵巣がん診療において，腹水採取は通常実施される必要検査であり，新たな侵襲的なサンプリングを行うことなく，既存の診療から生じる生体サンプルを用いて腹水もしくは腹水中のエクソソームを得るのは容易なことであるため，患者負担を増大させるものではなく，医療現場においても受入が容易な検査となる。そこから得られる情報は，予後不良と想定される患者の転帰を改善するために，その後の積極的な治療介入を判断するのに重要な情報となり得る。このため，医療検査産業，医療機器産業，医療用分析産業そしてがん治療分野の医療産業等において，本発明は効果的に利用されうる。
配列表フリーテキスト
【００７３】
SEQ ID NO:1 ; A PCR primer specific to transcriptional product of GAPDH gene.
SEQ ID NO:2 ; A PCR primer specific to transcriptional product of GAPDH gene
SEQ ID NO:3 ; A PCR primer specific to transcriptional product of MMP-1 gene.
SEQ ID NO:4 ; A PCR primer specific to transcriptional product of MMP-1 gene.
SEQ ID NO:5 ; A PCR primer specific to transcriptional product of MMP-1 gene.
SEQ ID NO:6 ; A PCR primer specific to transcriptional product of MMP-1 gene.
【図１】
2017225352.tif 000003
【図２】
2017225352.tif 000004
【図３】
2017225352.tif 000005
【図４】
2017225352.tif 000006
【図５】
2017225352.tif 000007
【配列表】
2017225352000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月20日(2017.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣がんの予後を予測するための方法であって， 
被検者から採取した腹水，腹水から回収されるエクソソームにおける全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値を得ることにより，全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む，方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって， 
前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値と，前記生体試料における内部標準遺伝子転写物の検出値とを比較し，前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値が前記生体試料における内部標準遺伝子転写物の検出値より所定比率以上である場合に，前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値を陽性と判断する工程を，さらに含む，
方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月11日(2017.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣がんの予後を予測するための方法であって， 
被検者から採取した腹水又は腹水から回収されるエクソソームにおける全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値を得ることにより，全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む，方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって， 
前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値と，前記被検者から採取した腹水又は腹水から回収されるエクソソームにおける内部標準遺伝子転写物の検出値とを比較し，前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値が前記被検者から採取した腹水又は腹水から回収されるエクソソームにおける内部標準遺伝子転写物の検出値より所定比率以上である場合に，前記全長型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１遺伝子の転写産物の検出値を陽性と判断する工程を，さらに含む，
方法。