(57)【要約】【課題】ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができる核酸増幅反応用カートリッジを提供する。【解決手段】反応液と、前記反応液とは比重が異なり前記反応液と混和しない液体と、が導入される容器を含み、前記容器は、前記反応液が移動する流路を有し、前記反応液は、修飾蛍光プローブを含み、前記反応液の液滴の直径Ｌと、前記流路の幅となる前記容器の内幅Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下である、核酸増幅反応用カートリッジ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液と、前記反応液とは比重が異なり前記反応液と混和しない液体と、が導入される容器を含み、
前記容器は、前記反応液が移動する流路を有し、
前記反応液は、修飾蛍光プローブを含み、
前記反応液の液滴の直径Ｌと、前記流路の幅となる前記容器の内幅Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下である、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２】
請求項１において、
前記反応液の体積は、０．１μＬ以上２．０μＬ以下である、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記容器内に、核酸の増幅に使用される試薬が凍結乾燥されて配置される、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記修飾蛍光プローブは、人工核酸を含む、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項５】
請求項４において、
前記人工核酸は、ＬＮＡ、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、またはＴＮＡである、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項６】
請求項４または５において、
前記人工核酸は、ＬＮＡである、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記修飾蛍光プローブは、マイナーグループバインダー分子を含む、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の核酸増幅反応用カートリッジを装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応用カートリッジの前記流路に温度勾配を形成する温度勾配形成部と、
を含む、核酸増幅装置。
【請求項９】
容器の流路に温度勾配を形成する工程と、
核酸を含む反応液を前記流路を往動させて、前記反応液に温度サイクルを付与する工程と、
を含み、
前記反応液は、修飾蛍光プローブを含み、
前記反応液の液滴の直径Ｌと、前記流路となる前記容器の内幅Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下である、核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応用カートリッジ、核酸増幅装置、および核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
例えば特許文献１には、反応液滴と、反応液滴と混和せず反応液よりも比重の小さい液体（オイル等）とが、充填された反応容器を、回転軸の回りに回転させ、比重差により反応液を移動させて熱サイクルを行う核酸増幅装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような核酸増幅装置において、ＰＣＲによる産物の生成時間の短縮化が求められている。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、ＰＣＲの反応時間（変性の時間や、アニーリング／伸長の時間）を短縮させると（ＰＣＲを高速化させると）、反応液を所望の温度にすることができず、核酸増幅効率が低下する場合がった。
【０００７】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができる核酸増幅反応用カートリッジを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができる核酸増幅装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができる核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジは、
反応液と、前記反応液とは比重が異なり前記反応液と混和しない液体と、が導入される容器を含み、
前記容器は、前記反応液が移動する流路を有し、
前記反応液は、修飾蛍光プローブを含み、
前記反応液の液滴の直径Ｌと、前記流路の幅となる前記容器の内幅Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下である。
【０００９】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照））。
【００１０】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記反応液の体積は、０．１μＬ以上２．０μＬ以下であってもよい。
【００１１】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができることができる。
【００１２】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記容器内に、核酸の増幅に使用される試薬が凍結乾燥されて配置されてもよい。
【００１３】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、核酸の増幅に使用される試薬を凍結乾燥された状態で収容することができる。
【００１４】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記修飾蛍光プローブは、人工核酸を含んでもよい。
【００１５】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、反応液の蛍光強度を高くすることができる。
【００１６】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記人工核酸は、ＬＮＡ、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、またはＴＮＡであってもよい。
【００１７】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、反応液の蛍光強度を高くすることができる。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記人工核酸は、ＬＮＡであってもよい。
【００１９】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、反応液の蛍光強度を高くすることができる。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジにおいて、
前記修飾蛍光プローブは、マイナーグループバインダー分子を含んでもよい。
【００２１】
このような核酸増幅反応用カートリッジでは、反応液の蛍光強度を高くすることができる。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅装置は、
本発明に係る核酸増幅反応用カートリッジを装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応用カートリッジの前記流路に温度勾配を形成する温度勾配形成部と、
を含む。
【００２３】
このような核酸増幅装置では、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができることができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅方法は、
容器の流路に温度勾配を形成する工程と、
核酸を含む反応液を前記流路を往動させて、前記反応液に温度サイクルを付与する工程と、
を含み、
前記反応液は、修飾蛍光プローブを含み、
前記反応液の液滴の直径Ｌと、前記流路となる前記容器の内幅Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下である。
【００２５】
このような核酸増幅方法では、ＰＣＲを高速化させても、効率よくＰＣＲを行うことができることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図３】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図４】マイナーグループバインダー分子を含む修飾蛍光プローブを説明するための図。
【図５】本実施形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す斜視図。
【図６】本実施形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す斜視図。
【図７】本実施形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す分解斜視図。
【図８】本実施形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す断面図。
【図９】本実施形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す断面図。
【図１０】人工核酸を含む修飾蛍光プローブを用いた場合のＰＣＲ結果を示すグラフ。
【図１１】マイナーグループバインダー分子を含む修飾蛍光プローブを用いた場合のＰＣＲ結果を示すグラフ。
【図１２】ＴａｑＭａｎ（登録商標）蛍光プローブを用いた場合のＰＣＲ結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２８】
１．  核酸増幅反応用カートリッジ
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジについて、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジ１０を模式的に示す断面図である。
【００２９】
核酸増幅反応用カートリッジ１０は、図１に示すように、容器１２と、キャップ１４と、を含む。
【００３０】
容器１２は、図１に示すように、例えば、円筒状の側壁部１２ａと、半球状の底部１２ｂと、を有している。キャップ１４は、容器１２の底部１２ｂに対向する端部の開口を塞ぐ。キャップ１４は、容器１２に対して、着脱可能である。容器１２およびキャップ１４の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。
【００３１】
核酸増幅反応用カートリッジ１０は、反応液２０と、反応液２０と混和しない液体３０と、が導入される。核酸増幅反応用カートリッジ１０は、反応液２０が移動する流路１６を有する。流路１６は、容器１２によって形成されている。流路１６は、円筒状の側壁部１２ａの中心軸（図示せず）に沿って延在している。以下、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容される反応液２０および液体３０について、説明する。
【００３２】
１．１．  反応液
反応液２０は、流路１６に配置される。反応液２０は、液体３０の中に液滴の状態で保持される。図示の例では、反応液２０の形状は、球状である。反応液２０は、液体３０よりも比重が大きい。反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の移動に伴い、流路１６を、容器１２に対して相対的に移動する。
【００３３】
反応液２０の液滴の直径Ｌと、流路１６の幅となる内幅Ｄと、比（Ｌ／Ｄ）は、０．２８以上０．８７以下であり、好ましくは、０．４９以上０．８７以下であり、より好ましくは０．７０以上０．７９以下である。比（Ｌ／Ｄ）を上記範囲にすることにより、効率よくＰＣＲを行うことができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。側壁部１２ａの内壁は、反応液２０が付着しない程度の撥水性を有していることが好ましい。
【００３４】
なお、内幅Ｄとは、流路１６の延在方向と直交する方向における容器１２の断面が円形の場合は、該断面の直径（内径）であり、該断面が楕円形の場合は、該断面の短軸の長さであり、該断面が多角形である場合は、該断面の対角線のうち最小の長さのことである。
【００３５】
反応液２０の体積は、例えば、０．１μＬ以上２．０μＬ以下であり、好ましくは、０．５μＬ以上２．０μＬ以下であり、より好ましくは、１．５μＬ以上２．０μＬ以下である。反応液２０の体積を上記範囲にすることにより、効率よくＰＣＲを行うことができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００３６】
反応液２０は、例えば、鋳型核酸溶液２２が試薬２４と接触することによって形成される。具体的には、図２に示すように、容器１２の底部１２ｂに凍結乾燥された試薬２４が固定されている。このような核酸増幅反応用カートリッジ１０に、例えばピペット２を用いて鋳型核酸溶液２２を導入すると、導入された鋳型核酸溶液２２は、図３に示すように、底部１２ｂまで沈降する。試薬２４は、鋳型核酸溶液２２の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液２２に取り込まれて、図１に示すように反応液２０となる。したがって、反応液２０は、鋳型核酸および試薬２４の成分を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００３７】
鋳型核酸溶液２２は、鋳型核酸を含む溶液である。鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入するときは、キャップ１４は、容器１２から取り外され、鋳型核酸溶液２２の導入後に再び容器１２に取り付けられる。
【００３８】
鋳型核酸溶液２２は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液２２における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００３９】
試薬２４は、容器１２の底部１２ｂに凍結乾燥されている。試薬２４は、核酸の増幅反応に使用される試薬である。試薬２４は、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および修飾蛍光プローブを含む。
【００４０】
プライマーは、鋳型核酸にアニールするよう設計されている。試薬２４は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応液２０に含まれるプライマーの濃度は、例えば、０．４μＭ以上３．２μＭ以下である。
【００４１】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）ポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。反応液２０に含まれるＤＮＡポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上４Ｕ以下である。
【００４２】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、およびｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する。反応液２０に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．１２５ｍＭ以上１．０ｍＭ以下である。
【００４３】
修飾蛍光プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブ（蛍光プローブ）であって、人工核酸またはマイナーグループバインダー分子を含む蛍光標識プローブである。反応液２０に含まれる修飾蛍光プローブの濃度は、例えば、０．１５μＭ以上１．２μＭ以下である。
【００４４】
修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸の種類は、特に限定されないが、例えば、天然核酸のみからなるプローブに比べて、プローブと相補鎖とのＴｍ値を高くし、鋳型核酸との結合力を高める人工核酸が好ましい。具体的には、人工核酸は、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が好ましい。ＬＮＡの化学式を下記式（１）に示す。
【００４５】
【化１】
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【００４６】
なお、式（１）において、Ｂａｓｅ（塩基）は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）等が挙げられるが、特に限定されない。また、塩基は、メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。
【００４７】
また、Ｔｍ値とは、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値の算出方法としては、特に限定されず、例えば、ＧＣ％法、最近接塩基対法、またはＷａｌｌａｃｅ法等を用いる。
【００４８】
修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸は、ＬＮＡを修飾したＬＮＡアナログであってもよく、具合的には、３’アミノ− ２’，４’− ＢＮＡ、２’，４’− ＢＮＡＣＯＣ、または２’，４’− ＢＮＡＮＣであってもよい。また、修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸は、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、またはこれらを修飾したアナログであってもよい。
【００４９】
修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸の数は、特に限定されず、１つの修飾蛍光プローブは、複数の人工核酸を含んでいてもよい。
【００５０】
図４は、マイナーグループバインダー（ＭＧＢ：ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）分子を含む修飾蛍光プローブを説明するための図である。ＭＧＢ分子を含む修飾蛍光プローブは、図４に示すように、プローブＰ１と、プローブＰ１の５’末端側に付加されたレポーターＰ２と、プローブＰ１の３’末端側に付加されたクエンチャーＰ３と、クエンチャーＰ３に付加されたＭＧＢ分子Ｐ４と、で構成されている。
【００５１】
上記のような人工核酸またはＭＧＢ分子を含む修飾蛍光プローブを用いることにより、一般的な加水分解型プローブを用いる場合に比べて、核酸増幅の立ち上がりを高感度に検知し、同じサイクル数に対する核酸増幅反応産物を高感度に検知することができる。
【００５２】
１．２．  液体
液体３０は、図１に示すように、流路１６に配置されている。図示の例では、流路１６は、反応液２０および液体３０で充填されている（満たされている）。液体３０は、反応液２０とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体３０は、反応液２０よりも比重が異なる。具体的には、液体３０は、反応液２０よりも比重が小さい。そのため、反応液２０は、重力の作用によって、重力の作用する方向に移動する。液体３０は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。
【００５３】
なお、上記では、凍結乾燥された試薬２４が容器１２の底部１２ｂに固定されおり、鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入して、鋳型核酸溶液２２が試薬２４と接触することにより反応液２０が形成される例ついて説明した。しかしながら、反応液２０は、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬２４と、を含む溶液を容器１２外で調製し、該溶液を、液体３０によって充填された容器１２内に導入されることで、容器１２内に反応液２０が配置されてもよい。
【００５４】
２．  核酸増幅装置
２．１．  構成
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置について、図面を参照しながら説明する。図５および図６は、本実施形態に係る核酸増幅装置１００を模式的に示す斜視図であり、図５は、蓋体７０を開いた状態を示し、図６は、蓋体７０を閉じた状態を示している。図７は、本実施形態に係る核酸増幅装置１００の本体部５０を模式的に示す分解斜視図である。図８および図９は、本実施形態に係る核酸増幅装置１００を模式的に示す図６のＡ−Ａ船断面図である。なお、便宜上、図５では、核酸増幅反応用カートリッジ１０を簡略化して図示している。
【００５５】
核酸増幅装置１００は、図５〜図９に示すように、本体部５０と、移動機構６０と、蓋体７０と、蛍光測定器８０と、を含む。なお、便宜上、図５および図６では、蛍光測定器８０の図示を省略している。核酸増幅装置１００は、例えば、昇降式ＰＣＲ装置である。
【００５６】
本体部５０は、図７に示すように、装着部５１と、第１加熱部５２と、第２加熱部５３と、スペーサー５４と、底板５５と、フランジ５６と、固定板５７と、を有している。
【００５７】
装着部５１は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着可能な構造を有している。装着部５１は、図５に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１０を差し込んで（挿入して）装着するスロット構造を有している。図７に示す例では、装着部５１は、第１加熱部５２の第１ヒートブロック５２ｂ、スペーサー５４、および第２加熱部５３の第２ヒートブロック５３ｂを貫通する貫通孔である。装着部５１の数は、複数であってもよく、図示の例の例では、２０個である。
【００５８】
第１加熱部５２は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、流路１６の第１領域１６ａを第１温度に加熱する。図７に示す例では、第１加熱部５２は、第２加熱部５３よりも蓋体７０側に位置している。
【００５９】
第１加熱部５２は、例えば、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材と、を有している。図示の例では、第１加熱部５２は、第１ヒーター５２ａと、第１ヒートブロック５２ｂと、を有している。第１ヒーター５２ａは、例えば、カートリッジヒーターであり、導線５８によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター５２ａは、第１ヒートブロック５２ｂに設けられた穴に挿入されており、第１ヒーター５２ａが発熱することで第１ヒートブロック５２ｂが加熱される。第１ヒートブロック５２ｂは、第１ヒーター５２ａから発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材である。第１ヒートブロック５２ｂは、例えば、アルミニウム製のブロックである。流路１６の第１領域１６ａは、第１ヒートブロック５２ｂによって囲まれる領域である。
【００６０】
第２加熱部５３は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、流路１６の第２領域１６ｂを、第１温度とは異なる第２温度に加熱する。第２加熱部５３は、第２ヒーター５３ａと、第２ヒートブロック５３ｂと、を有している。第２加熱部５３は、加熱する核酸増幅反応用カートリッジ１０の領域および加熱する温度が第１加熱部５２と異なる以外は、第１加熱部５２と同様の構造および機能を有している。流路１６の第２領域１６ｂは、第２ヒートブロック５３ｂによって囲まれる領域である。
【００６１】
第１加熱部５２および第２加熱部５３の温度は、図示しない温度センサーおよび後述する制御部によって制御される。例えば、第１加熱部５２を第１温度に、第２加熱部５３を第２温度に制御することで、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａを第１温度に、第２領域１６ｂを第２温度に加熱することができる。本実施形態における温度センサーは、例えば、熱電対である。
【００６２】
スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間に設けられている。スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間を断熱する機能を有している。
【００６３】
底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を保持する部材である。底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の高さ方向の位置を決定する。すなわち、核酸増幅反応用カートリッジ１０を底板５５に接触する位置まで差し込むことで、加熱部５２，５３に対して核酸増幅反応用カートリッジ１０を所定の位置に保持することができる。図７に示す例では、底板５５には、蛍光測定器８０からの励起光、および反応液２０の蛍光を通すための貫通孔５５ａが設けられている。
【００６４】
フランジ５６および固定板５７は、加熱部５２，５３およびスペーサー５４を固定するための部材である。図示の例では、２枚の固定板５７がフランジ５６に嵌め合わされており、加熱部５２，５３、スペーサー５４、および底板５５は、固定板５７に固定されている。
【００６５】
移動機構６０は、図５および図６に示すように、本体部５０を回転させる機構である。移動機構６０は、例えば、図示しないモーターおよび駆動軸を有している。駆動軸は、本体部５０のフランジ５６に接続されている。駆動軸は、装着部５１の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体部５０が回転する。
【００６６】
蓋体７０は、装着部５１を覆っている。図５に示す例では、固定板５７には磁石部７２が設けられ、蓋体７０は、磁石部７２によって本体部５０に固定されることができる。なお、スペーサー５４、底板５５、フランジ５６、固定板５７、および蓋体７０の材質は、例えば、断熱材である。
【００６７】
蛍光測定器８０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容される反応液２０の蛍光強度（蛍光輝度）を測定する測定器である。蛍光測定器８０は、図８および図９に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１０の底部１２ｂに対して、所定距離を隔てて対向して配置されている。蛍光測定器８０は、制御部（図示せず）からの入力信号に基づいて、反応液２０に含まれる修飾蛍光プローブの蛍光色素に対応する励起光を反応液２０に照射し、反応液２０で発光する蛍光強度を測定する。なお、蛍光測定器８０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよいし、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよい。
【００６８】
核酸増幅装置１００は、図示しない制御部を含む。制御部は、移動機構６０や蛍光測定器８０を制御する。制御部は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）等のプロセッサー、およびＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）やＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等の記憶装置を含む。記憶装置には、上記制御のための各種プログラム、データ等が記憶されている。記憶装置は、さらに各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有している。
【００６９】
２．２．  熱サイクル処理
次に、図８および図９を参照しながら、核酸増幅装置１００を用いた熱サイクル処理について説明する。図８および図９においては、矢印ｇの方向が重力の作用する方向（重力作用方向）である。なお、図８では、加熱部５２，５３の配置が第１配置である状態を示し、図９では、加熱部５２，５３の配置が第２配置である状態を示している。
【００７０】
まず、核酸増幅反応用カートリッジ１０を、核酸増幅装置１００の装着部５１に装着する。具体的には、液体３０が充填された流路１６に反応液２０を導入した後、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着部５１に装着する。例えば、装着部５１に核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着したら、蓋体７０によって装着部５１を覆う。
【００７１】
ここで、加熱部５２，５３の配置は、第１配置である。図８に示すように、第１配置においては、重力作用方向における流路１６の最下部に第１領域１６ａが位置する。そのため、液体３０よりも比重の大きい反応液２０は、第１領域１６ａに位置する。
【００７２】
次に、制御部は、操作部（図示せず）から熱サイクル処理を開始する旨の信号を受けると、加熱部５２，５３を制御して、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａおよび第２領域１６ｂを加熱させる。具体的には、第１加熱部５２は、第１領域１６ａを第１温度に加熱し、第２加熱部５３は、第２領域１６ｂを第１温度よりも低い第２温度に加熱する。これにより、流路１６の第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、加熱部５２，５３は、第１領域１６ａから第２領域１６ｂに向けて温度が低くなる温度勾配を形成する温度勾配形成部である。第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、９５℃以上１００℃以下である。第２の温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５０℃以上７５℃以下である。
【００７３】
加熱部５２，５３の配置は、第１配置であるので、核酸増幅反応用カートリッジ１０を加熱すると、反応液２０は、第１温度に加熱される。制御部は、第１加熱部５２が第１温度に到達して第１の時間（第１の期間）が経過したら、移動機構６０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第１配置から第２配置へ切換える。第１の時間は、変性反応のための時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。
【００７４】
第２の配置は、図９に示すように、第２領域１６ｂを重力作用方向において流路１６の最下部に位置させる配置である。具体的には、制御部は、移動機構６０を制御して本体部５０を１８０°回転させる。これにより、加熱部５２，５３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００７５】
第２配置では、第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの重力の作用する方向における位置関係が第１の配置とは逆になる。そのため、反応液２０は、重力の作用によって第１領域１６ａから第２領域１６ｂへと移動する。制御部は、加熱部５２，５３の配置を第２配置とした後に移動機構６０の動作を停止させる。これにより、加熱部５２，５３の配置は、第２配置に保持される。制御部は、第２配置において第２の時間（第２の期間）が経過したら、再度移動機構６０を制御して、本体部５０を１８０°回転させる。第２の時間は、アニーリング反応および伸長反応のための時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。
【００７６】
そして、制御部は、サイクル回数が所定の回数となるまで、第１配置と第２配置との位置を入れ替えながら加熱部５２，５３を回転させることにより、反応液２０を流路１６を往動（往復運動）させて、反応液２０に温度サイクルを付与する。これにより、核酸増幅反応が行われる。制御部は、サイクル回数が所定の回数に到達すると、熱サイクル処理を終了する。
【００７７】
制御部は、熱サイクル処理と同時期に増幅解析処理を行う。これにより、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、制御部は、蛍光測定器８０に対して第２の時間（アニーリング反応および伸長反応を行う時間）ごとに測定指示を与えるための信号を入力し、蛍光測定器８０の測定結果として蛍光測定器８０から与えられる蛍光強度を示すデータを、記憶部（図示せず）に記憶する。さらに、制御部は、操作部（図示せず）から入力される信号に基づいて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を示すデータを記憶部から読み出し、該データに基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成してもよい。そして、制御部は、増幅曲線を生成した場合、該増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部（図示せず）に表示させてもよい。
【００７８】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【００７９】
３．１．  試料の調製
３．１．１．  実施例１
鋳型核酸として、肺炎マイコプラズマの培養菌から抽出したＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ、Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）２５コピーを用いた。上記鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の混合試薬溶液を調製した。なお、下記における各試薬の液量（体積）は、混合試薬１０μＬに対する値である。すなわち、例えばポリメラーゼは、混合試薬絵容器１０μＬに対して０．４μＬということである。
【００８０】
＜混合試薬溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ（ポリメラーゼ）                    ０．４μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                      ０．５μＬ
バッファー                                                ２．０μＬ
マイコプラズマ検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      ０．８μＬ
マイコプラズマ検出用リバースプライマー（２０μＭ）        ０．８μＬ
マイコプラズマ検出用蛍光プローブ（１０μＭ）              ０．６μＬ
テンプレートＤＮＡ                                        １．０μＬ
水                                              ｕｐ  ｔｏ  １０μＬ
【００８１】
なお、バッファーの組成は下記のとおりである。
【００８２】
ＭｇＣｌ２：２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：２５０ｍＭ
ＫＣｌ：１２５ｍＭ
【００８３】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2017163918.tif 000004
【００８５】
実施例１では、蛍光プローブとしては、ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの一部の塩基をＬＮＡで修飾した修飾蛍光プローブを用いた。修飾蛍光プローブの配列を表２に示す。表２中、破線で囲まれた塩基がＬＮＡで修飾された塩基である。すなわち、「ＦＡＭ」と接続する塩基（「Ｃ」）を左から１番目の塩基とすると、左から８番目の塩基（「Ｇ」）と、左から９番目の塩基（「Ａ」）と、左から１０番目の塩基（「Ａ」）と、をＬＮＡで修飾した人工核酸とした。なお、表２中、「ＦＡＭ」は、レポーターであり、「ＢＨＱ１」および「ＮＦＱ」は、クエンチャーである。
【００８６】
【表２】
2017163918.tif 000005
【００８７】
上記のような組成の混合試薬溶液から、反応液を採取した。採取する反応液の量を、０．１μＬ、０．２μＬ、０．５μＬ、１．０μＬ、１．５μＬ、２．０μＬ、２．８μＬ、３．０μＬ、３．５μＬと変化させた。
【００８８】
３．１．２．  実施例２
蛍光プローブとして、ＭＧＢ分子を含む修飾蛍光プローブを用いたこと以外は、実施例１と同じである（表２参照）。
【００８９】
３．１．３．  比較例１
蛍光プローブとして、ＴａｑＭａｎ蛍光プローブを用いたこと以外は、実施例１と同じである（表２参照）。
【００９０】
３．２．  ＰＣＲ結果
上記のような反応液に対して、ＰＣＲを行った。液体３０としては、シリコーンオイルを用いた。核酸増幅反応用カートリッジの容器の内径を、２ｍｍとした。第１温度（変性反応のための温度）を９８℃、第１の時間（変性反応のための期間）を４秒、第２温度（アニーリング反応および伸長反応のための温度）を５４℃、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための期間）を６秒とした。また、９８℃で１０秒間加熱させてホットスタートさせた。
【００９１】
図１０は、実施例１のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１１は、実施例２のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１２は、比較例１のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１０〜図１２において、横軸は熱サイクルのサイクル数を示し、縦軸は蛍光測定装置で測定した蛍光強度を示している。なお、反応液に対して第１温度と第２温度とを１回ずつ付与した場合を、１サイクル（１回）とカウントした。
【００９２】
図１０〜図１２に示すように、ＬＮＡを含む修飾蛍光プローブを用いた実験例１、およびＭＧＢ分子を含む修飾蛍光プローブを用いた実験例２は、ＴａｑＭａｎ蛍光プローブを用いた比較例１よりも蛍光強度が高かった。これにより、修飾蛍光プローブが人工核酸やＭＧＢ分子を含むことにより、ＰＣＲにおける蛍光強度を高くすることができることがわかった。さらに、ＭＧＢ分子を含む修飾蛍光プローブを用いた実験例２は、ＬＮＡを含む修飾蛍光プローブを用いた実験例１よりも蛍光強度が高かった。
【００９３】
さらに、図１０および図１１に示すように、反応液の体積を、０．１μＬ以上２．０μＬ以下、好ましくは０．５μＬ以上２．０μＬ以下、より好ましくは１．５μＬ以上２．０μＬ以下とすることにより、ＰＣＲにおける蛍光強度を、より高くすることができ、効率よくＰＣＲを行うことができることがわかった。
【００９４】
なお、実施例１，２では、２．８μＬ、３．０μＬ、および３．５μＬの反応液において、蛍光は確認されなかった。また、比較例１では、０．１μＬ、２．８μＬ、３．０μＬ、および３．５μＬの反応液において、蛍光は確認されなかった。
【００９５】
３．３．  反応液の落下時間測定
実施例１で使用した装置をもとにヒートブロックの一部にスリットを設け、反応液の移動を観察できる装置を準備し、反応液がシリコーンオイルとの比重差によって落下する様子を動画撮影して、静止画へ変換した。そして、該静止画から、反応液が核酸増幅反応用カートリッジの端へ到達したタイミングを判断し、昇降式ＰＣＲ装置の加熱部の回転開始から核酸増幅反応用カートリッジの端に到達するまでのフレーム数をカウントして、１フレーム当たりの時間から、反応液の落下（移動）時間を算出した。さらに、反応液の液滴の直径Ｌと、核酸増幅反応用カートリッジの容器の内径Ｄと、の比（Ｌ／Ｄ）を算出した。算出結果を、表３に示す。
【００９６】
【表３】
2017163918.tif 000006
【００９７】
ここで、図１０より、０．１μＬ〜２．８μＬの反応液で、蛍光が確認された。しがたて、表３より、比（Ｌ／Ｄ）が０．２８以上０．８７以下で、蛍光が確認されたこととなる。すなわち、比（Ｌ／Ｄ）を０．２８以上０．８７以下とすることにより、第２の時間が１０秒以下という高速条件においても（ＰＣＲを高速化させても）、効率よくＰＣＲを行うことができることがわかった。さらに、好ましくは０．４９以上０．８７以下、より好ましくは０．７０以上０．７９以下とすることにより、ＰＣＲを高速化させても、より効率よくＰＣＲを行うことができることがわかった。
【００９８】
なお、０．１μＬの反応液の場合は、落下時間が１７．５秒かかった（表３参照）。ここで、「３．２．  ＰＣＲ結果」に示したように、ＰＣＲにおける第１の時間は４秒、第２の時間は６秒であるため、０．１μＬの反応液の場合、反応液は、核酸増幅反応用カートリッジの端まで移動していない。しかしながら、図１０に示すように、０．１μＬの反応液は、蛍光が確認された。これは、ＬＮＡを含む修飾蛍光プローブを用いることにより、反応液を核酸増幅反応用カートリッジの端まで移動させなくても蛍光を検出できる程度に、感度が高くなったためであると考えられる。
【００９９】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１００】
２…ピペット、１０…核酸増幅反応用カートリッジ、１２…容器、１２ａ…側壁部、１２ｂ…底部、１４…キャップ、１６…流路、１６ａ…第１領域、１６ｂ…第２領域、２０…反応液、２２…鋳型核酸溶液、２４…試薬、３０…液体、５０…本体部、５１…装着部、５２…第１加熱部、５２ａ…第１ヒーター、５２ｂ…第１ヒートブロック、５３…第２加熱部、５３ａ…第２ヒーター、５３ｂ…第２ヒートブロック、５４…スペーサー、５５…底板、５５ａ…貫通孔、５６…フランジ、５７…固定板、５８…導線、６０…移動機構、７０…蓋体、７２…磁石部、８０…蛍光測定器、１００…核酸増幅装置
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの蛍光プローブの配列である。
【図１】
2017163918.tif 000007
【図２】
2017163918.tif 000008
【図３】
2017163918.tif 000009
【図４】
2017163918.tif 000010
【図５】
2017163918.tif 000011
【図６】
2017163918.tif 000012
【図７】
2017163918.tif 000013
【図８】
2017163918.tif 000014
【図９】
2017163918.tif 000015
【図１０】
2017163918.tif 000016
【図１１】
2017163918.tif 000017
【図１２】
2017163918.tif 000018
【配列表】
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