(57)【要約】【課題】菌が液体に含有されているかどうかを判定する新規な方法を提供すること。【解決手段】本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：（ａ）暗視野顕微鏡を用いて膜を撮像することによって、前記膜の裏側の面の暗視野像を得る工程、ここで、前記膜の表側の面は前記液体に接しており、（ｂ）前記暗視野像に含まれる白色領域の面積ＳＡを算出する工程、および（ｃ）前記面積ＳＡが第１閾値Ｓ１以上である場合には前記判定を中止し、前記面積ＳＡが第１閾値Ｓ１未満である場合には、前記判定を続行する工程。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌が液体に含有されているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  暗視野顕微鏡を用いて膜を撮像することによって、前記膜の裏側の面の暗視野像を得る工程、
ここで、前記膜の表側の面は前記液体に接しており、
（ｂ）  前記暗視野像に含まれる白色領域の面積ＳＡを算出する工程、および
（ｃ）  前記面積ＳＡが閾値Ｓ１以上である場合には前記判定を中止し、前記面積ＳＡが閾値Ｓ１未満である場合には、前記判定を続行する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。特許文献２は、傷検査方法を開示している。特許文献３は、膜材料の欠陥の光学的観察方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２８７３３７号公報
【特許文献２】特開２００１−２３５４３２号公報
【特許文献３】特開２０１３−１１７３９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  暗視野顕微鏡を用いて膜を撮像することによって、前記膜の裏側の面の暗視野像を得る工程、
ここで、前記膜の表側の面は前記液体に接しており、
（ｂ）  前記暗視野像に含まれる白色領域の面積ＳＡを算出する工程、および
（ｃ）  前記面積ＳＡが第１閾値Ｓ１以上である場合には前記判定を中止し、前記面積ＳＡが第１閾値Ｓ１未満である場合には、前記判定を続行する工程。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する新規な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施形態における膜支持体を示す全体断面図
【図２】実施形態における画像解析手段を示すフローチャート
【図３】実施形態における膜を撮像した模式図
【図４】実施形態のフローチャートを示す図
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態が説明される。
【０００９】
まず、菌が液体に含有されているかどうかを判定する方法が説明される。菌の例は、糸状菌である。
【００１０】
被験材料の菌を選択的に増菌培養させる培地で、好ましくはＰＤＡ培地またはＧＰ培地またはＳＣＤ培地で６〜７２時間、菌増殖に適した温度で好ましくは２０〜２５℃で培養した後、図４に示すように微多孔膜１（以下、単に「膜１」という）と押さえリング２とベース３からなる微多孔膜支持体４（松下エコシステムズ製ろ過チップ。以下、単に「膜支持体４」という）に被験材料を所要時間培養した培養液をろ過し、菌が捕集されている側に生死細胞もしくは生細胞を発色させる化合物をろ過して、発色受光レンズを有する微生物計測装置（図示せず）で菌を撮像する。また、菌が捕集されている側に生死細胞もしくは生細胞を蛍光させる化合物をろ過して、励起光を照射する光源と、励起光によって蛍光した光を受光する蛍光受光レンズを有する微生物計測装置（図示せず）で菌を撮像する。
【００１１】
図１では、菌１３が捕集されている反対側に菌１３を選択的に増菌培養させる培地１４で、好ましくはＰＤＡ培地またはＧＰ培地またはＳＣＤ培地を付着させ、６〜７２時間、菌増殖に適した温度で好ましくは２０〜２５℃で培養した後、培地１４を除去し生死細胞もしくは生細胞を発色もしくは蛍光させる化合物をろ過して、微生物計測装置（図示せず）で菌１３を撮像５する。なお使用する培地１４は培養中に膜１の菌１３が捕集されている側に培地１４が漏れてくるのを防止する為に増粘剤を含有させ培地１４に粘性を持たせた液体培地を使用することで、培地成分が均等に膜１に密着し、また、膜１の菌１３を捕集した面に培地１４が漏れ出すのを防ぎ培養効果を高めることができる。液体培地１４は、膜１の表側の面に接している。１０〜３０μｍの膜１は励起光を照射すると菌１３の発光以上に背景である膜１が反射するため、菌１３と背景の区別がつかなくなる。そのため、背景消光効果を有する墨汁を膜１にろ過することで反射を抑えることが可能となる。
【００１２】
そして、図２に示すように撮像５をした画像を輝度測定６により発光点の輝度を測定し、基準の輝度値を境に２値化７をして基準値以上の輝度値がある発光点を輝点化し、形状判断８で輝点化された形状の面積と菌特有の分岐点を認識してその発光が菌か否かを判断し、菌と判断した輝点を計量９する。これにより画像解析手段１０を使用して菌の特徴的な形状である菌糸の分裂などを認識し解析させることにより、菌以外の微生物または被験材料中の夾雑物を誤って計量９しないようになり、膜１に捕集された菌を精度よく計量９することが可能となる。
【００１３】
上記構成において、被験材料中における菌の陰陽性判別を行う菌計量方法を提供できる。
【００１４】
また、膜１のポアサイズを細菌または夾雑物が通過し、培養された菌が通過しないポアサイズの膜１で好ましくは１０〜３０μｍのポアサイズの膜１を使用することにより、図３に示すような菌以外の微生物１１または被験材料中の夾雑物１２が膜１を通過し微多孔膜上には培養された菌１３が捕集されるようになり菌以外の微生物１１または被験材料中の夾雑物１２の影響を受けずに精度よく菌１３を計量することができ、また、膜１のポアサイズを大きくすることで被験材料中の夾雑物１２の影響でろ過が困難であった被験材料のろ過性が容易になり、大量ろ過することが可能となる。
【００１５】
菌の数を計量することで、菌が液体に含有されているかどうかが判定される。
【００１６】
図４は、本実施形態のフローチャートを示す図である。本実施形態では、さらに、暗視野顕微鏡を用いて膜１を撮像５する際に、膜１の裏側の面の暗視野像も得る。上述したように、膜１の表側の面は液体、すなわち液体培地１４に接している。言うまでもないが、膜１の撮像の際には、撮像装置（図示せず）のピントを膜１の裏側に合わせる。
【００１７】
次に、暗視野像に含まれる白色領域の面積ＳＡを算出する。面積ＳＡが閾値Ｓ１以上である場合には判定を中止する。このような場合では、膜１に傷または剥がれがある可能性が高く、判定を続行するために適さないからである。判定を続行するために適さない場合には、膜１を含め膜支持体４を別の支持体に交換することが望ましい。一方、面積ＳＡが閾値Ｓ１未満である場合には、傷または剥がれの問題はないので、判定を続行すればよい。
【００１８】
閾値Ｓ１の例は、暗視野像の全体の面積の５分の１である。膜１を表側から裏側に通過した菌もまた、暗視野像において白色領域として反映される。しかし、菌に由来の白色領域の面積は、傷や剥がれに由来する白色領域の面積よりもずっと小さい。従って、閾値Ｓ１の値が著しく小さい値でない限り、白色領域の面積を膜１に傷または剥がれがある可能性が高いかどうかの判定に利用することができる。この観点を踏まえ、おおよそであるが、閾値Ｓ１は、暗視野像の全体の面積の１０分の１以上が望ましい。
【００１９】
本発明は、コンピュータのような電気回路構成(circuitry)を用いて実施され得る。言い換えれば、本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する装置であって、
当該装置は、
暗視野顕微鏡、および
コンピュータのような電気回路構成
を具備し、
当該電気回路構成は、動作時に、
（ａ）  暗視野顕微鏡を用いて膜を撮像することによって、前記膜の裏側の面の暗視野像を得、
ここで、前記膜の表側の面は前記液体に接しており、
（ｂ）  前記暗視野像に含まれる白色領域の面積ＳＡを算出し、かつ
（ｃ）  前記面積ＳＡが閾値Ｓ１以上である場合には前記判定を中止し、前記面積ＳＡが閾値Ｓ１未満である場合には、前記判定を続行する。
【００２０】
コンピュータは中央処理装置およびメモリを具備し、工程（ａ）〜工程（ｃ）を実行するためのプログラムがメモリに格納されている。中央処理装置は、メモリからプログラムを呼び出し、工程（ａ）〜工程（ｃ）を実行する。このようなメモリを備えたコンピュータに代えて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を実行するＩＣチップが用いられ得る。本明細書において用いられる用語「電気回路構成」は、このようなＩＣチップも包含する。なお、工程（ａ）〜工程（ｃ）を実行するためのプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭのような媒体に固定され得る。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、菌が液体に含有されているかどうかを判定する新規な方法を提供する。
【符号の説明】
【００２２】
１  膜
２  押さえリング
３  ベース
４  微多孔膜支持体
５  撮像
６  輝度測定
７  ２値化
８  形状判断
９  計量
１０  画像解析手段
１１  糸状菌以外の微生物
１２  夾雑物
１３  糸状菌
１４  培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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