(57)【要約】【課題】有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物であって、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用に適したプラセンタ抽出物を提供すること。【解決手段】波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、窒素含有量が０．１０質量％以上であり、全固形分中における分子量が１０００以下の低分子化ペプチドの含有量が４０〜９９．５質量％である本発明のプラセンタ抽出物によれば、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用に適したプラセンタ抽出物を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、
窒素含有量が０．１０質量％以上であり、
全固形分中における分子量が１０００以下の低分子化ペプチドの含有量が４０〜９９．５質量％であるプラセンタ抽出物。
【請求項２】
前記吸光度が０．０１〜０．１５である請求項１に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項３】
前記窒素含有量が０．１０〜１．０質量％である請求項１または２に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項４】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における全ペプチドの含有量が５０〜９９．５質量％である請求項１〜３のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項５】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における分子量が１０００以下の低分子化ペプチドの含有量が５０〜９９．５質量％である請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項６】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における遊離アミノ酸の含有量が０．０１〜３０質量％である請求項１〜５のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項７】
前記プラセンタ抽出物がプラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出されるプラセンタ抽出物である請求項１〜６のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項８】
前記プラセンタ抽出物が活性炭処理を経て抽出されるプラセンタ抽出物である請求項１〜７のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項９】
亜臨界処理の温度が１６０〜２００℃であり、
圧力が飽和蒸気圧以上である請求項７に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項１０】
亜臨界処理の時間が５〜３０分である請求項７または９に記載のプラセンタ抽出物。
【請求項１１】
波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、
窒素含有量が０．１０質量％以上であるプラセンタ抽出物を得るプラセンタ抽出物の製造方法であって、
プラセンタを亜臨界処理して亜臨界処理物を得る抽出工程、
前記亜臨界処理物を抽出液と原料残渣に分離する固液分離工程を含むことを特徴とするプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１２】
前記亜臨界処理による抽出工程の後、脱色工程を含む請求項１１に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１３】
前記亜臨界処理における亜臨界処理の温度が１６０〜２００℃であり、圧力が飽和蒸気圧以上である請求項１１または１２に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１４】
前記亜臨界処理における亜臨界処理の時間が５〜３０分である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１５】
前記脱色工程における処理温度が０〜８０℃である請求項１２に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１６】
前記脱色工程における処理時間が３〜１２０分である請求項１２または１５に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【請求項１７】
前記脱色工程における処理回数が２〜１０回である請求項１２、１５または１６に記載のプラセンタ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプラセンタを原料とするプラセンタ抽出物およびプラセンタ抽出物の製造方法に関する。特に、特定の吸光度および窒素含有量を示すプラセンタ抽出物およびプラセンタ抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラセンタとは哺乳類の胎盤のことであり、近年、抗酸化性やコラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ阻害活性、血圧上昇抑制作用、エラスターゼ阻害作用、チロシナーゼ阻害作用に代表される優れた機能性から、健康食品、化粧品素材、医薬品などとして使用されている。これらの使用において、プラセンタの優れた機能性を発揮するためには、プラセンタ中の蛋白質を、吸収性や機能性に優れたペプチドまで低分子化、可溶化する必要がある。
【０００３】
従来、プラセンタを低分子化および可溶化したプラセンタ抽出物を得る方法として酵素処理による方法が知られている。例えば、特許文献１には、人胎盤組織から水溶性プロテインなどの高分子蛋白質を抽出する際に除去される残渣物を蛋白質分解酵素で加水分解させた上清に酵母抽出物を加えることを含むメラニン生成抑制剤の製造方法が開示されている。また、特許文献２には、ブタおよび／またはウマの胎盤を酵素処理により加水分解して得られる水溶性成分、およびフェノール誘導体を含有する化粧料組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５３−１４２５１５号公報
【特許文献２】特開２００２−２１２０４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の酵素処理による抽出方法では、酵素の添加は当然のことであるがその他の補助剤も添加することが必要となる。具体的には、酵素に加え、ｐＨ調整剤や酵素安定化剤などの酵素反応の補助剤がプラセンタ原料に添加される。これらの添加剤の含有により有効成分の濃度が希釈されるという問題や、非プラセンタ由来の成分が混入するという問題がある。
【０００６】
さらに、プラセンタ抽出物を化粧品や食品など、特に液体製品に配合するには、低分子化ペプチドなどの有効成分濃度が高いものが要求され、同時に色や臭いが少ないことも要求される。そのため、酵素処理したプラセンタ抽出物にイオン交換樹脂や活性炭などによる脱色工程を施すことが一般的である。しかしながら、酵素処理したプラセンタ抽出物に脱色工程を行うと、その色や臭いと併せて、有効成分も著しく減少してしまうという問題がある。
【０００７】
有効成分の濃度を高くするための手段として、酵素処理による抽出工程および脱色工程を経て得られた抽出物を濃縮する方法が考えられるが、有効成分濃度と併せて色や臭いも濃くなるため、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用には適さない。また、有効成分の減少を阻止するための手段として、脱色工程を簡易な方法とすることが考えられるが、この場合は、脱色が不完全となり、黄色〜茶色に着色されたプラセンタ抽出物となるため、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用には適さない。
【０００８】
本発明は、有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、窒素含有量が０．１０質量％以上であり、全固形分中における分子量が１０００以下の低分子化ペプチドの含有量が４０〜９９．５質量％であるプラセンタ抽出物に関する。
【００１０】
前記吸光度が０．０１〜０．１５であることが好ましい。
【００１１】
前記窒素含有量が０．１０〜１．０質量％であることが好ましい。
【００１２】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における全ペプチドの含有量が５０〜９９．５質量％であることが好ましい。
【００１３】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における分子量が１０００以下の低分子化ペプチドの含有量が５０〜９９．５質量％であることが好ましい。
【００１４】
前記プラセンタ抽出物の全固形分中における遊離アミノ酸の含有量が０．０１〜３０質量％であることが好ましい。
【００１５】
前記プラセンタ抽出物がプラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出されるプラセンタ抽出物であることが好ましい。
【００１６】
前記プラセンタ抽出物が活性炭処理を経て抽出されるプラセンタ抽出物であることが好ましい。
【００１７】
亜臨界処理の温度が１６０〜２００℃であり、圧力が飽和蒸気圧以上であることが好ましい。
【００１８】
亜臨界処理の時間が５〜３０分であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、窒素含有量が０．１０質量％以上であるプラセンタ抽出物を得るプラセンタ抽出物の製造方法であって、プラセンタを亜臨界処理して亜臨界処理物を得る抽出工程、前記亜臨界処理物を抽出液と原料残渣に分離する固液分離工程を含むことを特徴とするプラセンタ抽出物の製造方法に関する。
【００２０】
前記亜臨界処理による抽出工程の後、脱色工程を含むプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【００２１】
前記亜臨界処理における亜臨界処理の温度が１６０〜２００℃であり、圧力が飽和蒸気圧以上であるプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【００２２】
前記亜臨界処理における亜臨界処理の時間が５〜３０分であるプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【００２３】
前記脱色工程における処理温度が０〜８０℃であるプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【００２４】
前記脱色工程における処理時間が３〜１２０分であるプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【００２５】
前記脱色工程における処理回数が２〜１０回であるプラセンタ抽出物の製造方法であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、窒素含有量が０．１０質量％以上である本発明のプラセンタ抽出物によれば、有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物であって、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用に適したプラセンタ抽出物を提供することができる。また、本発明のプラセンタ抽出物の製造方法では、波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１５以下であり、窒素含有量が０．１０質量％以上であり、有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物であって、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用に適したプラセンタ抽出物を得る製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プラセンタ抽出物の分子量分布測定における溶離時間−分子量（常用対数）での検量線の一例を示すグラフである。
【図２】プラセンタ抽出物を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果の一例を示すグラフである。
【図３】実施例および比較例のＡＣＥ阻害活性を示すグラフである。
【図４】実施例および比較例のエラスターゼ阻害活性を示すグラフである。
【図５】実施例および比較例のチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図６】実施例および比較例のコラゲナーゼ阻害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のプラセンタ抽出物は、プラセンタを原料とする抽出物であり、波長３９０ｎｍにおける吸光度が０．１０以下であり、窒素含有量が０．１質量％以上であることを特徴とする。波長３９０ｎｍにおける吸光度および窒素含有量がこの範囲にある本発明のプラセンタ抽出物は、有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物であって、見た目および風味が重要な要素となる化粧品や食品への使用に適したプラセンタ抽出物である。
【００２９】
本発明のプラセンタ抽出物における波長３９０ｎｍにおける吸光度は抽出物の黄色〜茶色への着色の指標である。この吸光度は、市販の可視紫外分光光度計（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １３００等）により測定することができる。
【００３０】
前記吸光度の測定は、シングルビーム方式で行うものであり、レファレンス溶液（水）を入れたセルを用意し、レファレンス溶液のセルを可視紫外分光光度計にセットし、波長３９０ｎｍにて測定を行い、測定結果が０．００となることを確認する。その後、試料溶液をレファレンス溶液で用いたセルと同一のセルに入れたセルを用意し、可視紫外分光光度計にセットし、波長３９０ｎｍにて測定を行い、測定結果が試料溶液の吸光度となる。
【００３１】
本発明のプラセンタ抽出物では、波長３９０ｎｍにおける吸光度は、０．１５以下であり、０．１０以下が好ましく、０．０８以下がより好ましい。当該吸光度が０．１５を超える場合は、プラセンタ抽出物の黄色味が濃くなり特異な臭いがきつくなる傾向がある。また、当該吸光度の数値が０に近いほど着色がなく透明に近いプラセンタ抽出物であることを示すが、亜臨界処理を経たプラセンタ抽出物に、脱色工程を行ったとしても、０．０１より小さくならないことが確認されていることから、本発明のプラセンタ抽出物の波長３９０ｎｍにおける吸光度の下限は、０．０１である。これらの範囲が実用的な有効成分の濃度であり、かつ着色の少ないプラセンタ抽出物となり、化粧品などへの適用がしやすい。なお、吸光度を上記の数値範囲内にするには、プラセンタを亜臨界処理した後、脱色処理を行うことで調整することができる。
【００３２】
本発明のプラセンタ抽出物の窒素含有量は抽出物中に含まれる遊離アミノ酸およびペプチドの窒素量であり、プラセンタ抽出物中の有効成分含有量の指標である。この窒素含有量は、ケルダール法（被検液に硫酸を加え、液中の有機体窒素を硫酸アンモニウムに変換し、液体をアルカリ性にして加熱し、発生するアンモニアを滴定によって定量する方法）によって測定することができる。具体的にはＪＩＳ  Ｋ０１０２  ４４に記載の方法に準拠して行うことができる。
【００３３】
ケルダール法による窒素含有量の測定は、以下の手順で行う。
１．試料溶液の適量（３〜１０ｍｌ）をビーカー５００ｍｌにとり、硫酸（１＋３５）を加えて弱酸性とし、加熱して３０ｍｌになるまで濃縮させて被検液を用意する。
２．被検液を放冷後、少量の水を加えてケルダールフラスコ２００ｍｌに洗い移す。
３．硫酸１０ｍｌ、硫酸カリウム５ｇ及び硫酸銅（ＩＩ）五水和物２ｇを加え、加熱し、硫酸の白煙を発生させ、引き続き、約３０分間加熱し有機物を分解させる。
４．放冷後、少量の水を加えて、加熱して溶かし、水で蒸留フラスコに洗い移して約３００ｍｌとする。
５．蒸留フラスコを連結し、受器にはメスシリンダー（有栓形）２００ｍｌを用い、硫酸（２５ｍｍｏｌ／ｌ）５０ｍｌを入れる。蒸留フラスコ上部から注入ロートから水酸化ナトリウム溶液（５００ｇ／ｌ）４０ｍｌ加えた後、蒸留フラスコを加熱し、留出速度５〜７ｍｌ／ｍｉｎで蒸留を行い、約１４０ｍｌを留出した時点で蒸留を止め、冷却器及び逆流止めを外し、冷却器の内容物及び逆流止めの内外を少量の水で洗い、洗液は受器のメスシリンダー２００ｍｌに入れ、水を２００ｍｌの標線まで加えて、中和測定用サンプルを用意する。
６．空試験として水３０ｍｌをとり、３〜５の操作を行い、中和測定用空試験サンプルを用意する。
７．中和測定用サンプルで得た液を全量使い、５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液で溶液の色が灰紫（ｐＨ４．８）になるまで滴定する。同じく中和測定用空試験サンプルを同様に水酸化ナトリウム溶液で滴定を行う。
８．硫酸（２５ｍｍｏｌ／ｌ）を正しく三角フラスコ５００ｍｌにとり、メチルレッド−ブロモクレゾールグリーン混合溶液５〜７滴を加え、５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液で溶液の色が灰紫（ｐＨ４．８）になるまで滴定し、硫酸（２５ｍｍｏｌ／ｌ）に相当する５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液の滴定量（ｍｌ）を求める。
【００３４】
以下の式によりアンモニウムイオン濃度を求める。
式Ｘ  Ａ＝（ｂ−ａ）×ｆ×１０００／Ｆ×０．９０２
Ａ：アンモニウムイオン（ＮＨ4+ｍｇ／ｌ）
ｂ：硫酸（２５ｍｍｏｌ／ｌ）５０ｍｌに相当する５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（ｍｌ）
ａ：滴定に要した５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（ｍｌ）
ｆ：５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液のファクター
Ｆ：試料（ｍｌ）
なお、０．９０２は、５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌのアンモニウムイオン相当量である。
【００３５】
以下の式Ｙにより窒素含有量の濃度を算出する。
式Ｙ  Ｎ＝（ｂ１−ａ１）×ｆ×（１０００×０．７００）／Ｖ×０．７７６６
Ｎ：窒素含有量（ｍｇ／ｌ）
ｂ１：空試験の滴定に要した５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（ｍｌ）
ａ１：滴定に要した５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（ｍｌ）
ｆ：５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液のファクター
Ｖ：試料溶液の量（ｍｌ）
Ａ：式Ｘで求めたアンモニウムイオン濃度（ＮＨ4+ｍｇ／ｌ）
なお、０．７００は、５０ｍｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌの窒素相当量（ｍｇ）、０．７７６６は、アンモニウムイオンを窒素相当量に換算するときの係数である。また、本発明のプラセンタ抽出物における窒素含有量は質量％で示す。
【００３６】
本発明のプラセンタ抽出物の窒素含有量は、０．１０質量％以上であり、０．１５質量％以上が好ましく、０．２０質量％以上がより好ましい。窒素含有量が０．１０質量％未満の場合は、有効成分の濃度が十分ではなく、プラセンタ抽出物の優れた機能が不十分となる傾向がある。また、窒素含有量の上限は特に限定されないが、１．０質量％以下とすることができる。これらは実用的な有効成分の濃度であり、かつ着色の少ないプラセンタ抽出物となり、化粧品などへの適用がしやすい。なお、窒素含有量を上記の数値範囲内にするには、プラセンタを亜臨界処理した後、脱色処理を行うことで調整することができる。
【００３７】
本発明のプラセンタ抽出物における抽出成分は、遊離アミノ酸、分子量１０００以下の低分子ペプチド、分子量１０００超で分子量３０００以下のペプチド、分子量３０００超のペプチド、その他成分の５つに大別される。
【００３８】
なお、本明細書中の遊離アミノ酸、ペプチドおよびその他の成分の含有量は、プラセンタ抽出物の全固形分に対する各成分の質量％で示す。プラセンタ抽出物が水分などの液体成分を含む場合、プラセンタ抽出物を乾燥もしくは凍結乾燥させて液体成分を除去した状態のものを、プラセンタ抽出物の全固形分とする。
【００３９】
遊離アミノ酸とは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの１８種類からなるアミノ酸が単独で存在するアミノ酸を指す。
【００４０】
遊離アミノ酸は機能性ペプチドの体内への吸収を阻害し、機能性ペプチドの吸収性や機能性を低下させる恐れがある、また、遊離アミノ酸の含有率が高い場合は相対的にペプチドの含有率が低くなり、プラセンタ抽出物の機能性が低下する恐れがある。よって、プラセンタ抽出物の全固形分中の遊離アミノ酸の含有量は、少なければ少ないほど好ましいが、亜臨界処理を経たプラセンタ抽出物を、脱色工程を行ったとしても、０．０１より小さくならないことが確認されていることから、遊離アミノ酸の含有量の下限値は０．０１質量％である。プラセンタ抽出物の機能性を十分に発揮できるという理由から、プラセンタ抽出物の全固形分中の遊離アミノ酸の含有量は、３０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、５質量％以下がもっとも好ましい。
【００４１】
分子量１０００以下の低分子ペプチドとは、前記１８種類のアミノ酸のうち少なくとも１種が２分子以上結合したペプチドであって、分子量１０００以下のすべてのペプチドを指す。これらの分子量１０００以下の低分子ペプチドは、人体への吸収性が非常によく、吸収された成分が抗酸化性やコラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、血圧上昇抑制作用に代表されるプラセンタ抽出物の優れた機能性を発揮しやすい成分である。
【００４２】
分子量１０００超で分子量３０００以下のペプチドとは、前記１８種類のアミノ酸のうち少なくとも１種が２分子以上結合したペプチドであって、分子量１０００超で３０００以下のすべてのペプチドを指す。これらの分子量１０００超で３０００以下の低分子ペプチドは、人体への吸収性は比較的よいものの、分子量１０００以下のペプチドに比べ機能性を発揮しにくい成分である。
【００４３】
分子量３０００超のペプチドとは、前記１８種類のアミノ酸のうち少なくとも１種が２分子以上結合したペプチドの内、分子量３０００超のすべてのペプチドを指す。分子量３０００超のペプチドは機能性が発揮される場合もあるが、人体への吸収が悪く、食品や化粧品分野への応用は限られている。
【００４４】
その他成分とは、ミネラルに代表される無機成分や脂質、炭水化物などでペプチド、アミノ酸以外のすべての成分を指す。これらのその他の成分は、分離、抽出で全てを取り除くことが困難であり、プラセンタ抽出物の全固形分中に０．５質量％以上含まれる。
【００４５】
分子量１０００以下のペプチドは人体への吸収性がよく、吸収された成分が抗酸化性やコラゲナーゼ阻害、エラスターゼ阻害、チロシナーゼ阻害等の優れた機能性を発揮しやすい成分であることから、プラセンタ抽出物の全タンパク（ペプチド、遊離アミノ酸を含む）中の分子量１０００以下の成分（遊離アミノ酸、分子量１０００以下の低分子ペプチドおよび分子量１０００以下のその他成分の合計）の含有量は１００％が好ましく、分子量１０００超の成分は含有していないことが好ましい。プラセンタの亜臨界処理を行い、加水分解をさせることでプラセンタ抽出物の全タンパク中の分子量１０００以下の成分の含有量は５０％に近くなる。また、亜臨界処理と脱色工程とを経たプラセンタ抽出物は、プラセンタ抽出物の全タンパク中の分子量１０００以下の成分の含有量が、１００％に近くなる。
【００４６】
本発明のプラセンタ抽出物における全固形分中の全ペプチド（分子量１０００以下の低分子ペプチドおよび分子量１０００超のペプチドの合計）の含有量は、人体に吸収された成分が抗酸化性やコラーゲン産生促進能等の機能性を発揮しやすいことから、５０質量％以上が好ましい。亜臨界処理を経たプラセンタ抽出物においては、プラセンタ抽出物の全固形分中における全ペプチドの含有量を５０質量％以上にすることができる。さらに、プラセンタ抽出物の全固形分中の全ペプチドの含有量は、５５質量％以上がより好ましい。ペプチドの含有量が５０質量％未満の場合は、プラセンタ抽出物の機能性が低下する恐れがある。また、ペプチドの含有量上限は多ければ多いほど好ましいが、全固形分から前記その他の成分を除いた９９．５質量％が上限であると推測される。
【００４７】
ペプチドのなかでも、特に分子量が１０００以下の低分子化ペプチドをプラセンタ抽出物の全固形分中に、４０〜９９．５質量％含有することが、プラセンタ抽出物の機能性をより強く発揮できるという理由から好ましく、５０〜９９．５質量％含有することがより好ましい。言い換えると、プラセンタ抽出物の全固形分中に、分子量が１０００以下の低分子化ペプチドを４０〜９９．５質量％含有することが好ましく、亜臨界処理を経たプラセンタ抽出物におけるプラセンタ抽出物の全固形分中に、分子量が１０００以下の低分子化ペプチドを４０〜９９．５質量％含有することができるのである。
【００４８】
本発明のプラセンタ抽出物における分子量分布測定は、高速液体クロマトグラフィーの分離モードを利用し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、高速液体クロマトグラフィーに注入されたサンプル溶液は、機器内で分離され、分子量の大きい成分から順に溶出されるということを利用して分子量を測定する方法により行う。そのためには、分子量が特定され、かつ、分子量が異なる標準試薬を複数用意し、それぞれの標準試薬を高速液体クロマトグラフィーにより測定し、ピークの溶離時間（Ｘ）と分子量の常用対数値（Ｙ）との関係により検量線を作成することで、溶離時間と分子量の関係を求めることができる。そして、この検量線より溶離時間を分子量に変換することができる。
【００４９】
前記検量線について事例を踏まえて説明をする。検量線を作成するためには７点の標準試薬を用いる。標準試薬の分子量ごとの高速液体クロマトグラフィーでのピークの溶離時間は、標準試薬１：分子量１２，５００（試薬名：CytochromeC）については、溶離時間７．４７分であり、標準試薬２：分子量６，５１２（試薬名：Aprotinin）については、溶離時間９．９８分であり、標準試薬３：分子量１，４２３（試薬名：Bacitracin）については溶離時間１０．１５分であり、標準試薬４：分子量１０４６（試薬名：AngiotensinII）については、溶離時間１０．４４分であり、標準試薬５：分子量４５１（試薬名：Gly-Gly-Tyr-Arg）については溶離時間１１．３６分であり、標準試薬６：分子量１８９（試薬名：Gly-Gly-Gly）については溶離時間１２．１３分であり、標準試薬７：分子量７５（試薬名：グリシン）については溶離時間１２．２５分であった。この測定結果および各標準試薬の分子量に基づき、Ｘ軸上に溶離時間、Ｙ軸上に分子量の常用対数値をプロットし、その結果より検量線を作成した。作成した検量線を図１に示す。図１の検量線により、高速液体クロマトグラフィーでのピークの溶離時間に対して、該当する分子量を確認することができる。そして、確認された分子量および各ピークのピーク面積に基づき、分子量分布を算出することができる。なお、今回の検量線では、溶離時間１０．０分のところで分子量が３０００、溶離時間１０．７分のところで分子量が１０００であることが確認された。よって、プラセンタ抽出物を拘束クロマトグラフィーで測定した結果、検出されたピークの溶離時間が１０．０分以内であれば、分子量３０００超であり、ピークの溶離時間が１０．０分を越えていれば、分子量３０００以下となり、さらに溶離時間が１０．７分を越えていれば、分子量１０００以下となる。
【００５０】
ここで、ブタ胎盤に蒸留水２００ｇを入れて、処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界処理を行ったプラセンタ抽出物を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果を図２に示す。図２では、検出されたピークが溶離時間１０．７分を越えていることから、抽出物の分子量は１０００以下であることを確認することができる。
【００５１】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法は、原料のプラセンタを亜臨界処理して亜臨界処理物を得る抽出工程、抽出液と原料残渣とを分離する固液分離工程を含んでいる。さらに、活性炭処理による脱色工程を含んでもよい。当該製造方法によれば、有効成分の濃度が高く、着色が少なく、かつ機能性に優れたプラセンタ抽出物を製造することができる。
【００５２】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては、原料となるプラセンタは、哺乳類の胎盤であれば特に限定されず、入手容易性の観点からは、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イノシシ等のプラセンタが好ましい。原料となるプラセンタは、血液やその他の部位が混在していることがあるため、抽出工程の前に洗浄などの精製工程を行うことが好ましい。
【００５３】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における抽出工程は、プラセンタ原料を亜臨界処理することで、亜臨界処理物を得る工程である。亜臨界処理とは、所定温度および圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出剤としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明ではプラセンタ）とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度および圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００５４】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法において、亜臨界処理に用いる抽出剤として水を用いる場合、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水または水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にしたいわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器にプラセンタと抽出剤である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる抽出物を亜臨界処理物とすることができる。
【００５５】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における亜臨界処理に用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。抽出剤が水の場合の処理条件について次に説明する。
【００５６】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法におけるプラセンタの亜臨界処理温度は、１６０〜２００℃の間が好ましい。この温度範囲にすることにより、機能性成分である分子量１０００以下である低分子ペプチドを生成しやすい。分子量分布は、高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布測定にて測定可能である。亜臨界処理の温度が１６０℃未満の場合は、分子量１０００以下の低分子ペプチドを生成させることが難しくなる傾向がある。また、亜臨界処理の温度が２００℃を超える場合は、生成された低分子ペプチドがさらに亜臨界反応を起こしてしまい、遊離アミノ酸の生成量が増え、分子量１０００以下である低分子ペプチドの生成量を減少させる傾向が見られる。
【００５７】
さらに、本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における亜臨界処理の温度は、１８０〜１９５℃にすることがより好ましい。この範囲にすることで、分子量１０００以下である低分子ペプチドをより短時間で生成しやすくなる。
【００５８】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法におけるプラセンタの亜臨界処理圧力は、亜臨界の処理温度の飽和蒸気圧以上（その一例としては、１６０℃のときには０．６１ＭＰａ以上、２００℃以上のときには１．５５ＭＰａ以上）で行うことが好ましい。この圧力にすることにより、分子量１０００以下の低分子ペプチドを生成しやすくなる傾向がある。亜臨界処理の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが好ましい。
【００５９】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法におけるプラセンタの亜臨界処理時間は、５〜３０分の間で行うことが好ましい。この処理時間の範囲にすることにより、低分子ペプチドを生成しやすくなる傾向がある。亜臨界処理時間が５分未満の場合は、低分子ペプチドを生成させることが困難となる傾向がある。亜臨界の処理時間が３０分を超える場合は、生成された低分子ペプチドがさらに過分解してしまい、遊離アミノ酸の生成量が増え、低分子ペプチドの生成量を減少させる傾向がある。
【００６０】
さらに、本発明のプラセンタ抽出物の製造方法におけるプラセンタの亜臨界処理時間を１０〜３０分にすることがより好ましい。この範囲であれば、低分子ペプチドをより効率的に生成しやすくなる傾向がある。
【００６１】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における亜臨界処理の抽出剤を水とした場合におけるプラセンタの亜臨界処理による加水分解条件としては、処理温度は１６０〜２００℃、処理圧力は処理温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は５〜３０分で行うことが好ましい。この条件で行うことで、低分子ペプチドを高効率で生成させることができる。さらに、処理温度は１８０〜１９５℃、処理圧力は処理温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は１０〜３０分で行うことが、分子量１０００以下の低分子ペプチドを最大限の効率で得ることができるという理由から好ましい。
【００６２】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における固液分離工程は、亜臨界処理物を抽出液と原料残渣（固体物）とに分離する工程である。具体的な固液分離工程としては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水などが挙げられる。なかでも、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過が好ましい。
【００６３】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における固液分離工程により得られた抽出液は、そのまま次の脱色工程に移行し、脱色を行うこともできるが、本抽出液を乾燥させる乾燥工程を経て保存性のよい固形状にしてもよい。この乾燥工程としては、一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。一般的で簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。得られた固形物は水に可溶であるので脱色をしたいときには再度水に溶かし、脱色工程に移行することができる。
【００６４】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における脱色工程は、前記固液分離工程で得られた抽出液（前記乾燥工程により得られた固形物を水に溶かした抽出液を含む、以下同様）の褐変を取り除き、色を薄くする工程である。
【００６５】
一般的に胎盤の主要組織である蛋白質を酵素処理や高温処理で低分子化すると、蛋白質のアミノ基と、同じく原料中に含まれる糖分とが反応（いわゆる、メイラード反応）して、メラノイジンという物質を生成し、蛋白質が褐変して黒味を生じる。プラセンタに限らず、この反応は蛋白を含む成分については一般的であり、例えば、魚や肉の焦げ、コーヒーや味噌の着色などがある。
【００６６】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては抽出液の褐変を取り除く脱色工程としては、活性炭、イオン交換樹脂等の吸着剤を用いる方法などが挙げられる。なかでも、簡便に効率よく脱色できるという理由から、生成したメラノイジンを活性炭の細穴に吸着させて脱色する活性炭処理が好ましい。
【００６７】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における活性炭処理による脱色工程は、固液分離工程で得られた抽出液に所定量の活性炭を添加し、所定時間撹拌したものを、脱色後の抽出液と活性炭とに固液分離する工程である。
【００６８】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における活性炭処理の処理温度は、０〜８０℃が好ましく、１０〜７０℃がより好ましい。処理温度が０℃未満の場合は抽出液が凍結してしまう恐れがあり、凍結しない場合でも吸着量が低下してしまう傾向がある。また、処理温度が８０℃を超える場合は、液体の蒸発により固形分濃度が変化し、効率のよい脱色の再現が得られなくなる傾向がある。
【００６９】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における活性炭処理の処理時間は、３分以上が好ましく、５分以上がより好ましい。処理時間が３分未満の場合は、吸着が思うように進行せず、脱色が不十分となる傾向がある。また、脱色工程の処理時間は１２０分以内が好ましく、６０分以内がより好ましい。脱色工程の処理時間が１２０分を超える場合は、吸着反応が平衡に達してしまい、脱色の効果に変化がなく効率が悪くなる傾向がある。脱色工程の処理時間が３分未満の場合は、抽出液の褐変が取り除けない。
【００７０】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては、活性炭処理による脱色工程における固液分離方法は特に限定されず、固液分離工程として挙げた各種方法が採用できるが、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過やデカンテーションが好ましい。
【００７１】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては、活性炭処理に用いる活性炭としては特に限定されず、市販されている活性炭を、生成するメラノイジンの性質や入手のしやすさなどにより適宜選択して用いることができる。メラノイジン吸着用の活性炭としては、市販のメラノイジンやカラメル吸着用活性炭を用いることができ、製造法としては一般的な薬品（亜鉛）や水蒸気賦活処理などをして細孔径を制御しているものを用いることができる。例えば、日本エンバイロケミカルズ株式会社製の白鷹シリーズおよびカルボラフィンシリーズなどが挙げられる。
【００７２】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法における使用する活性炭の添加量は、生成したメラノイジンの量に応じ（すなわち、色の濃さに応じ）適宜調節することができるが、脱色しようとする液体１００質量部に対し、０．１〜３０質量部が好ましい。０．１質量部未満の場合は、脱色性能が不十分となり、色度を下げる効果が不十分となる傾向がある。また、３０質量部を超える場合は、脱色性能は向上するが、脱色と同時に液体成分の浸み込みによる収量ロスが起こってしまい、最終的に十分な量が確保できなくなる傾向がある。なお、より効率よく脱色操作を行うことができるという理由からは、活性炭の添加量を１〜１０質量部とすることがより好ましい。
【００７３】
また、本発明のプラセンタ抽出物の製造方法において、活性炭の量を調整する代わりに活性炭使用量を少なめにして複数回、繰り返し活性炭処理を行うこともできる。さらに、活性炭処理を複数回行うことにより、脱色挙動・過程がより詳細に判明し、必要最小限の量の活性炭を使用することができるからである。繰り返し回数はメラノイジンの量に応じ（すなわち、色の濃さに応じ）適宜選択することができるが工程の煩雑さを考えると２〜１０回程度が好ましく、２〜５回程度がより好ましい。複数回行うことで抽出液の褐色をより取り除くことができる。複数回使用する活性炭の量は最初は多く、回数を重ねるごとに少なく添加することが望ましい。少なく添加することにより望ましい吸光度に正確に近づけることができる。
【００７４】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては、抽出剤を水とし、亜臨界処理温度は１９０〜１９５℃、亜臨界処理圧力は亜臨界処理温度の飽和蒸気圧以上、亜臨界処理時間は２０〜３０分の条件でプラセンタを亜臨界処理して、プラセンタの亜臨界処理物を得た後、２〜５回の活性炭処理により脱色することが望ましい。前記条件下の製造方法で得られたプラセンタ抽出物は、波長３９０ｎｍにおける吸光度を０．１５以下の範囲にすることができ、プラセンタ抽出物の窒素含有量を０．１５〜０．３０質量％の範囲にすることができる。
【００７５】
従来の抽出方法である酵素処理による方法では、酵素の添加は当然のことであるがその他の補助剤を用いることが必要となる。具体的には、酵素に加え、ｐＨ調整剤や酵素安定化剤などの酵素反応の補助剤がプラセンタ原料に添加され、これらの添加剤の含有により有効成分の濃度が希釈されてしまい、抽出物あたりの有効成分濃度が低くなってしまう。
【００７６】
一方、亜臨界処理により得られるプラセンタ抽出物では、プラセンタ抽出の手段として亜臨界水抽出を用いており、基本的には水のみの使用で蛋白質およびペプチドの低分子化を達成しており、水以外の添加物は一切使用しないことが可能である。従ってこの抽出法を用いて得られたプラセンタ抽出液は基本的に低分子化されたペプチド濃度が高くなり、従来技術に比べて有効成分濃度の高い抽出液を得ることができる。従って、従来技術と亜臨界処理により得られるプラセンタ抽出物を、同じ活性炭処理にて脱色操作を行えば、必然的に活性炭処理によって取り除かれるメラノイジン以外の主要成分、すなわちペプチドの吸着量は変わらないので結果的に得られる脱色後の溶液中のペプチド量は本発明のほうが多くなる。すなわち脱色しても有効成分の濃度を高いまま保つことができる。
【００７７】
また、プラセンタを構成する蛋白質は種々のアミノ酸、いわゆる生体を構成する約２０種のアミノ酸が主に結合して構成されており、当然のごとく様々な種類のペプチド結合が存在するのに対し、従来技術の酵素処理では酵素の基質特異性により、特定のペプチド結合の切断による低分子化のみが行われる。すなわち、酵素処理による方法では特定のペプチド結合しか切断することができないので、低分子化の度合いに限りがあり、ある一定以下の分子量に達することができない。
【００７８】
本発明のプラセンタ抽出物の製造方法においては、亜臨界水処理による抽出では高温高圧下における水の加水分解力にてペプチド結合を切断するため、ペプチド結合の種類に関係なく、ランダムにペプチド結合を切断することで蛋白質を低分子化することができる。従って温度と時間の条件によって従来からの酵素処理よりも低分子ペプチドの多い分子量分布にすることが可能である。
【００７９】
さらには、酵素処理による方法で得られた低分子ペプチドのサイズが、メラノイジン吸着用活性炭の細孔径に吸着するサイズに合致し、メラノイジンの吸着と共に低分子ペプチドも吸着されてしまい、脱色と共に有効成分であるペプチド量が減少してしまっていることが推測される。一方、亜臨界水処理による抽出により生成した低分子ペプチドのサイズは前述のように従来法よりもさらに低分子のペプチドとして存在するため、同様の活性炭処理を行えばメラノイジンの吸着は起こるものの、低分子ペプチドの吸着は起こりにくくなり、結果的に有効成分である低分子ペプチドが多いにもかかわらず、脱色された抽出物を得ることが可能となる。
【００８０】
なお、このようにして得られた本発明のプラセンタ抽出物は、その使用目的に応じ適時希釈や濃縮を行ってもよい。希釈は単なる加水、エタノールなどの有機溶剤の添加、その他有効成分を含む液体や食品添加物、香料、腐敗防止のためのフェノキシエタノールやブタンジオール、グリセリン、固形の防腐剤もしくはそれらを溶解させた有機溶剤や天然の防腐剤などを添加して行うことができる。希釈物は透明度は高まるものの窒素量は減少するが、従来の抽出物に比較してより窒素量を高く保ったまま希釈することができる。濃縮は熱濃縮、減圧濃縮など一般的な濃縮方法で行うことができ、前述の乾燥方法により乾燥させた後、適量の水などの溶媒を加え溶解させることもできる。濃縮物は窒素量は高まるものの透明度は減少するが、従来の抽出物に比べてより透明度を高く保ったまま濃縮を行うことができる。
【００８１】
吸光度と固形分濃度、あるいは窒素濃度との関係は一般にランベルト・ベールの法則によって比例関係にあることが知られている。本発明のプラセンタ抽出物は希釈・濃縮によって、吸光度／固形分濃度あるいは吸光度／窒素濃度の値は一定値となる。一例を示すと上記のように得られた本発明のプラセンタ抽出物が吸光度０．１２、窒素濃度０．２４であれば、この液は希釈、濃縮を行っても吸光度／固形分濃度は１／２になり、本発明と同等の抽出物といえる。もちろん同じ吸光度であれば窒素濃度は高い方が望ましく、同じ窒素量であれば吸光度は低いことが望ましい。したがって上記例により吸光度／固形分濃度が１／２以下の抽出物は本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００８３】
実施例１
＜抽出工程＞
容積２ｌの耐圧容器に、ブタ胎盤（東京芝浦臓器株式会社）２００ｇ、蒸留水２００ｇを入れて、処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界処理を行った。ブタ胎盤は水による洗浄を行い、血液および他の部位を取り除いたものを使用した。
＜固液分離工程＞
亜臨界処理を終了後、耐圧容器内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液を回収した。回収したろ液は茶褐色であった。
＜脱色工程（活性炭処理）１回目＞
得られたろ液５０ｇをビーカーに量り取り、３０℃の恒温水槽中でスターラーを用いて攪拌した。別途、ろ液１００質量部に対し５質量部の活性炭（市販のメラノイジン吸着用活性炭を使用）を、ろ液を撹拌中のビーカーに添加した。さらに３０分間攪拌後、恒温槽からビーカーを取り出し、固液分離工程と同様のろ紙で吸引ろ過を行い、ろ液を回収した。回収したろ液は少し濃い黄色であった。
＜脱色工程（活性炭処理）２回目＞
脱色工程１回目で得られたろ液１００質量部に対し２質量部の活性炭を用いて１回目と同様の脱色工程を行い、再度ろ液を回収した。得られた抽出液の色は見た目には無色であった。
【００８４】
比較例１
実施例１の固液分離工程を経て得られた茶褐色の液体を比較例２の試料とした。
【００８５】
比較例２
実施例１の脱色工程（活性炭処理）１回目を経て得られた黄色い液体を比較例２の試料とした。
【００８６】
比較例３
酵素処理で作製された市販のプラセンタエキス粉末（純度１００％）を１．５ｇ量り取り、水を加えて合計１００ｇとなるよう調整し、比較例３の試料とした。
【００８７】
固形分測定
実施例１および比較例１〜３の各試料を適量量り取り、１０５℃の乾燥機で一晩乾燥して水分を取り除き、乾燥前後の重量差から各抽出液中の固形分（蒸発残分）を求めた。結果を表１に示す。
【００８８】
吸光度測定
実施例１および比較例１〜３の各試料の３９０ｎｍにおける吸光度を可視紫外分光光度計（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００）を用いて測定した。結果を表１に示す。
【００８９】
窒素含有量測定
実施例１および比較例１〜３の各試料の窒素含有量をケルダール法（被検液に硫酸を加え、液中の有機体窒素を硫酸アンモニウムに変換し、液体をアルカリ性にして加熱し、発生するアンモニアを滴定によって定量する方法）によって求めた。具体的にはＪＩＳＫ０１０２４４に記載の方法に準拠して行った。結果を表１に示す。
【００９０】
分子量分布測定
実施例１および比較例１〜３の各試料を、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過し、高速液体クロマトグラフィー（アジレントテクノロジー社製ＨＰ１１００シリーズ）による測定を行った。
【００９１】
分析条件については、カラム（東ソー社製品番：ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎＳＷＸＬ（６．０ｍｍＩ．Ｄ．×４０ｍｍ）およびＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用い、溶離液を０．１ｗ／ｖ％ＴＦＡｉｎＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ＝４５／５５、カラム温度３５℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２２０ｎｍ、導入量２０μｌ、分析時間３０ｍｉｎにて分子量分布測定用の標準試薬としてＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ（和光純薬工業）分子量１２，５００、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＣＡＬＢＯＣＨＥＭ）分子量６５１２、Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ（Ｄｒ．Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ）分子量１，４２３、ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ（ペプチド研究所）分子量１，０２６、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（ペプチド研究所）分子量４５１、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ペプチド研究所）分子量１８９により同様な測定で検量線を作成し、溶離時間に対する分子量位置を決め、分子量分布から分子量分画範囲におけるピーク面積を求め、分子量比率を求めた。結果を表１に示す。
【００９２】
なお、今回得られた分子量は、すべての試料においてその上限が用いたカラムの限外排除分子量（約１０万）以下であり、溶出が開始する時間から算出される最大の分子量は約２万であった。よって上記実施例および比較例において原料中に含まれていたタンパク質は、すべて分子量約１０万以下、さらには約１万以下のペプチドの形態に変換されて試料中に含まれていることが分かった。さらに実施例１の分子量分布はほぼ１００％が分子量１０００以下のもので構成されており、これは亜臨界処理後の活性炭量を調整することにより達成されている。
【００９３】
構成アミノ酸量および遊離アミノ酸量の測定
実施例１および比較例１〜３の各試料の構成アミノ酸と遊離アミノ酸の分析を行った（なお、分析は一般財団法人食品分析開発センターＳＵＮＡＴＥＣに依頼した）。
【００９４】
構成アミノ酸の分析は、各抽出液を過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解処理した試料を分析することで行った。アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの計１８種類を測定した。なお、トリプトファン以外の分析はアミノ酸自動分析機にて測定し、トリプトファンは高速クロマトグラフ法にて測定した。また、遊離アミノ酸の分析は、各抽出液をそのまま（過ギ酸酸化処理および塩酸加水分解処理を行わずに）各アミノ酸について同様の分析を行った。
【００９５】
上記の分析により得られた１８種類の構成アミノ酸量および遊離アミノ酸量を各々合計し、その結果より、各抽出物中の構成アミノ酸量および遊離アミノ酸量を算出した。さらに各抽出液中のペプチド量（構成アミノ酸量−遊離アミノ酸量）を算出した。各結果を表１に示す。
【００９６】
官能評価
実施例１および比較例１〜３の各試料のにおいをそれぞれ嗅ぎ、プラセンタエキス独特の生臭さ、および亜臨界処理などの高温処理で発生すると考えられる焦げ臭さの評価を行った。５人のモニタにそれぞれの抽出物を嗅いでもらい、生臭さおよび焦げ臭さの感じる度合いを３段階で評価させた。スコアは３：強く感じる、２：普通に感じる、１：あまり感じないとし、５人の平均スコアを計算して評価スコアとした。
【００９７】
結果
表１に実施例１および比較例１〜３の分子量分布割合、固形分量、窒素含有量、吸光度（３９０ｎｍ）、構成アミン酸量、遊離アミノ酸量、ペプチド量、全固形分量に対するペプチド量、全固形分量に対する遊離アミノ酸量、および官能評価の結果を示す。
【００９８】
【表１】
2017100998.tif 000003
【００９９】
表２には、それぞれ同様に比較例１〜３の固形分が実施例１と同じ値（１．５質量％）となるように、水で希釈した希釈品の窒素量、吸光度および官能評価の結果を示す。比較例１〜３を水で薄めて実施例１と同じ固形分濃度にしても（比較例１は１．５／６．９≒およそ４．５倍希釈、比較例２は１．５／２．９≒およそ２倍希釈、比較例３は実施例１と同じ固形分であるので希釈操作は行っていない）、若干色目は薄くはなったが比較例１の希釈品は茶色いままであり、比較例２の希釈品は黄色いままであった。においの質も若干弱くなったが表１と同様の傾向を示している。なお、吸光度と固形分濃度、あるいは窒素濃度との関係は一般にランベルト・ベールの法則によって比例関係にあることから計算でもこれら希釈水の値を求めることができる。
【０１００】
【表２】
2017100998.tif 000004
【０１０１】
表３には、それぞれ同様に比較例１〜３の窒素量を実施例１に合わせたときの固形分、および吸光度の値を示す。また、表４には同様に比較例１，２の吸光度を実施例１に合わせたときの固形分、および窒素量の値を示す。表３および４の結果より、比較例１〜３は窒素量を本発明の範囲（０．１〜１．０質量％）に合わせた場合、吸光度（３９０ｎｍ）が著しく高くなり、本発明の範囲の上限である０．１５をはるかに超えることがわかる。また、比較例１〜３の吸光度を本発明の範囲（０．１５以下）に合わせた場合、窒素量が本発明の範囲の下限である０．１質量％よりはるかに低いことがわかる。以上より、比較例１〜３の各抽出液を希釈によって本発明の数値に合わせることは困難であることがわかる。
【０１０２】
【表３】
2017100998.tif 000005
【０１０３】
【表４】
2017100998.tif 000006
【０１０４】
機能性評価
実施例１および比較例１〜３の各試料を用いて、機能性評価（ＡＣＥ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性）を行った。なお、機能性の比較を厳密にするためには各機能性試験において固形分濃度を合わせて行う必要があるため、それぞれの抽出物は凍結乾燥を行い、粉末試料としたものをそれぞれの機能性評価の出発サンプルとした。機能性評価結果を、図３〜６に示す（図３：ＡＣＥ阻害活性、図４：エラスターゼ阻害活性、図５：チロシナーゼ阻害活性、図６：コラゲナーゼ阻害活性）。
【０１０５】
機能性  血圧上昇抑制  ＡＣＥ阻害活性評価
ＡＣＥ阻害活性測定は株式会社同仁化学研究所製ＡＣＥ−Ｋｉｔ  ＷＳＴを使用して実施した。
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．２０μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに各試験サンプル溶液２０μｌ、キット内付属のサブストレート  バッファー２０μｌを入れて、その後、キット内付属のＥｎｚｙｍｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ溶液２０μｌを加えて全量を６０μｌ（＝０．０６ｍｌ）とし、温度３７℃、４０分培養してアンジオテンシン変換酵素を生成させた。培養後、各ウェルにキット内付属のＩｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ溶液２００μｌを加え、室温で、１０分間静置させた。その後、吸光プレートリーダー  マルチスキャンＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、４５０ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
２０μｌのサンプル溶液に替えて２０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
２０μｌのＥｎｚｙｍｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ溶液に替えて２０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
２０μｌのサンプル溶液に替えて２０μｌの蒸留水を使用したこと、および２０μｌのＥｎｚｙｍｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ溶液に替えて２０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［ＡＣＥ阻害率の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各抽出物のエラスターゼ阻害率（％）を算出した。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【０１０６】
ＡＣＥ阻害活性試験結果
図３の結果より、比較例１がわずかではあるが一番活性が高く、実施例１および比較例２および３はほぼ同等の活性を示した。いずれも各固形分濃度が上昇するにつれ阻害率が上昇していることがわかる。また、表１の結果より、実施例１のプラセンタ抽出物は１０００以下のペプチドの含有量がほぼ１００％であることから、比較例１〜３に比べて人体への吸収が非常によく、ＡＣＥ阻害活性（血圧上昇抑制）にすべてが寄与する抽出物であることがわかる。
【０１０７】
機能性  美肌効果  エラスターゼ阻害活性評価
次の試薬を調製し使用した。なお、全てのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液はｐＨ＝８．８、０．０５ｍｏｌ／ｌの同じものを使用した。
酵素溶液：ブタ由来膵臓エラスターゼを０．５ｕｎｉｔ／ｍｌ含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
基質溶液：ＳＴＡＮＡ（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ  ｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を１ｍｍｏｌ／ｌ含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．２０μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに５０μｌの各サンプル溶液および１００μｌの基質溶液を入れた。その後、各ウェルに５０μｌの酵素溶液を加え、３７℃で１５分静置させた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）使用し、４０５ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
５０μｌのサンプル溶液に替えて５０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
５０μｌの酵素溶液に替えて５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
５０μｌのサンプル溶液に替えて５０μｌの蒸留水を使用したこと、および５０μｌの酵素溶液に替えて５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［エラスターゼ阻害率の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各抽出物のエラスターゼ阻害率（％）を算出した。
【０１０８】
エラスターゼ阻害活性試験結果
図４の結果より、いずれも各固形分濃度が上昇するにつれ阻害率が上昇していることがわかる。阻害率において最も効果を有するものは比較例１であり、実施例１、比較例２および比較例３はほぼ同等の活性を示している。しかしながら、表１の結果より比較例１の１０００以下のペプチドは５０％程度であり、比較例２の１０００以下のペプチドは８０％程度であるのに対し、実施例１のプラセンタ抽出物は１０００以下のペプチドの含有量がほぼ１００％であることから、比較例１〜３に比べて人体への吸収がよく、美肌効果の一つであるエラスターゼ阻害活性にすべてが寄与する抽出物であるということがわかる。
【０１０９】
機能性  美肌効果  コラゲナーゼ阻害活性評価
次の試薬を調製し、使用した。なお、全ての０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、２０ｍＭ塩化カルシウム緩衝液はｐＨ＝７．１の同じものを使用した。
酵素溶液：Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｃ−９８９１  ＳＩＧＭＡ製  ０．１ｍｇ／ｍｌ（蒸留水）
基質溶液：４−Ｐｈｅｍｙｌａｚｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ  ＢａｃｈｅｍＡＧ製  ０．５  ｍｍｏｌ／ｌ含有する緩衝液
反応停止液：クエン酸  ２５ｍｍｏｌ／ｌ（蒸留水）
サンプル溶液：各試験用プラセンタ抽出物の濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．２０μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
１０μｌの各サンプル溶液に１０μｌの酵素溶液を入れ混合し、８０μｌの基質溶液を加え、全量を１００μｌとし、さらに３７℃で３０分静置させた。その後、その反応溶液に２００μｌの反応停止液を加え、良く混合した。この混合液に１ｍｌの酢酸エチルを加え、１分間よく混合した後、遠心分離を室温にて３０００ｒｐｍ、１０分間行った。その後、遠心後の上澄み液を回収して分光光度計（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＧｅｎｅＱｕａｎｔ１３００）を用いて、３２０ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
１０μｌのサンプル溶液に替えて１０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
１０μｌの酵素溶液に替えて１０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
１０μｌのサンプル溶液に替えて１０μｌの蒸留水を使用したこと、および１０μｌの酵素溶液に替えて１０μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［コラゲナーゼ阻害率の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各試験用プラセンタ抽出物のコラゲナーゼ阻害率（％）を算出した。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【０１１０】
コラゲナ―ゼ阻害活性試験
図５の結果より、いずれも各固形分濃度が上昇するにつれ阻害率が上昇していることがわかる。実施例１と比較例１はほぼ同程度の阻害率を示し、比較例２および３はこれらより活性が劣っている。特に比較例２は低濃度付近では全く活性を示していない。表１の結果より実施例１のプラセンタ抽出物は１０００以下のペプチドの含有量がほぼ１００％であることから、比較例１〜３に比べて人体への吸収がよく、美肌効果の一つであるコラゲナーゼ阻害活性にすべてが寄与する抽出物であるということがわかる。
【０１１１】
機能性  美白効果  チロシナーゼ阻害活性評価
次の試薬を調製し使用した。なお、全てのリン酸緩衝液はｐＨ＝６．７、０．１ｍｏｌ／ｌの同じものを使用した。
酵素溶液：マッシュルーム由来チロシナーゼを３０ｕｎｉｔ／ｍｌ含有するリン酸緩衝液
基質溶液：Ｌ−ＤＯＰＡ（３−（３，４−ジヒドロフェニル）−Ｌ−アラニン）を１ｍｍｏｌ／ｌ含有するリン酸緩衝液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．２０μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに２５μｌの各サンプル溶液および１００μｌ酵素溶液を加え、３７度で１０分間静置させた。その後、その１２５μｌの反応液に１２５μｌの基質溶液を加え、３７℃で１５分静置させた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用し、４９０ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの蒸留水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
１００μｌの酵素溶液に替えて１００μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの蒸留水を使用したこと、および１００μｌの酵素溶液に替えて１００μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［チロシナーゼ阻害率の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各抽出物のチロシナーゼ阻害率（％）を算出した。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【０１１２】
チロシナーゼ阻害活性試験
図６の結果より、いずれも各固形分濃度が上昇するにつれ阻害率が上昇していることがわかる。比較例１が阻害率が最も高く、ついで実施例１、最も活性の劣るものは比較例２であった。特に比較例２は低濃度付近では全く活性を示しておらず、比較例３に至っては全濃度範囲で活性を示していない。表１の結果より実施例１のプラセンタ抽出物は１０００以下のペプチドの含有量がほぼ１００％であることから、比較例１〜３に比べて人体への吸収がよく、美白効果の一つであるチロシナーゼ阻害活性にすべてが寄与する抽出物であるということがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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