(57)【要約】【課題】  無血清環境下で動物細胞を培養できるようにする。【解決手段】  基礎培地がＥ−ＲＤＦであり、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする、動物細胞培養用の無血清培地で、動物細胞を培養する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする、動物細胞培養用の無血清培地。
【請求項２】
基礎培地がＥ−ＲＤＦである請求項１に記載の培地。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の培地で動物細胞を培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞の培養に適した無血清培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の進歩により、動物細胞を用いてタンパク質を製造することが可能となった。このような製造を工業的規模で行うためには、動物細胞を効率よく培養することが必要となる。そのため、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（非特許文献１）やＦ１２培地（非特許文献２）、ＲＰＭＩ１６４０培地（非特許文献３）等、様々な培地が開発された。しかしこれらの培地を用いても、それ単独で動物細胞を培養することはできない。これらの培地に血清成分を添加して使用しなければ、細胞が増殖しない。
【０００３】
細胞培養に使用される血清成分は、主にウシ胎児から調整される。しかし、ウシ胎児の使用にはコストや安全性（ウイルス・狂牛病などの感染リスク）、生命倫理上の課題がある。また血清には、アルブミンや抗体を初めとして様々なタンパク質が含まれている。そのため血清存在下で細胞培養を行うと、目的タンパク質の精製が煩雑なものとなる。特に、血清中のタンパク質と類似した性質（表面電荷や分子量・立体構造など）を有するものを製造する場合、その分離・精製は非常に困難なものとなる。
【０００４】
このような課題を克服するため、近年、血清成分を添加しなくても動物細胞を培養・増殖させられる培地（無血清培地）が開発された（特許文献１、非特許文献４）。そしてその結果、細胞から分泌される目的タンパク質の精製作業が容易になった。また精製産物の安全性も高まり、動物細胞を用いて医薬品を作ることも可能になった。しかしこのような培地が開発されたとはいえ、その組成は公開されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０４７１７６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ，Ｊ．Ｊ．（１９７０）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ６，８９
【非特許文献２】Ｈａｍ，Ｒ．Ｏ．（１９６５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５３，２８８
【非特許文献３】Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（１９８０）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３９，２８５
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｈ．  （１９８０）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３９，３６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、無血清環境下で動物細胞を培養できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする動物細胞培養用の無血清培地。
（２）基礎培地がＥ−ＲＤＦである（１）に記載の培地。
（３）（１）または（２）に記載の培地で動物細胞を培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
【０００９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】
本発明では血清の代替物として、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、・硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを培地へ添加する。これらの化合物を培地へ添加することにより、無血清環境下でも動物細胞を培養することが可能となる。動物細胞としては特に限定されないが、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞などがあげられる。
【００１１】
ＣＨＯ細胞の中でも、具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞・ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞・ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などにおいて好ましく適応可能である。
【００１２】
また細胞株のみではなく、本法が適応できる培地（基礎培地）の種類も非常に幅広い。具体的には、Ｅ−ＲＤＦ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などがある。またこれらの培地以外でも、細胞の培養に適した培地であれば何でもよく、特にその種類が限定されるわけではない。
【００１３】
以上の通り、本発明の培地で動物細胞を培養することにより、無血清環境下で動物細胞を培養することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を用いることで、動物細胞を無血清環境下で培養してタンパク質を生産することが可能となった。
【実施例】
【００１５】
以下、ウサギ抗Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ抗体の実験例を用いて本発明について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】
（１）ウサギモノクローナル抗体の取得
以下の方法により抗Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅウサギモノクローナル抗体を取得した（特開２０１３−８３４４８号公報、特開２０１３−１２４２２４号公報、特開２００９−２４０３００号公報参照）。まず、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅにリンカーを生やしてＢＳＡと結合させた。そしてこのＢＳＡ−Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅを抗原としてウサギに免疫した。その後、免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離した。そしてこの細胞から抗体遺伝子をクローニングしてモノクローナル抗体を取得した。
【００１７】
（２）抗体安定発現細胞株の樹立
取得した抗体遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。そしてこの細胞を４００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように血清含有培地へ懸濁した。この細胞懸濁液を３８４ｗｅｌｌプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注して３７℃・５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。その後培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、各ｗｅｌｌ中のＣＨＯ細胞によって発現した抗体の量を調べた。尚、ＥＬＩＳＡの実施手順は以下の通りである。
【００１８】
まずＧｏａｔ−抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧを０．５μｇ／ｍｌとなるようにＣａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６）へ溶かした。そしてこれを５０μｌ／ｗｅｌｌずつＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ｗｅｌｌ）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で各ｗｅｌｌを３回洗浄した。その後Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７．５）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて室温で１時間静置し、ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで各ｗｅｌｌを１回洗浄した。
【００１９】
このプレートにＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ｐＨ７．５）を４８μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、その後、培養上清を２μｌ／ｗｅｌｌずつ加えた。次にこのプレートを室温で１時間静置し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで各ｗｅｌｌを３回洗浄した。そしてこのプレートにＧｏａｔ−抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含むＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて室温で１時間静置し、ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで各ｗｅｌｌを３回洗浄した。最後にこのプレートへ５０μｌ／ｗｅｌｌずつＡＬＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｐＨ９．８）を加えて３０分静置し、蛍光強度を測定して（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４６５ｎｍ）抗体の発現量を調べた。尚、本実施例で行った３８４ｗｅｌｌプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２０】
ＥＬＩＳＡで強いシグナルを発したｗｅｌｌを選び、そこにいる細胞を継代して１週間培養した。その後この培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現が一過性でないことを確認した。尚このＥＬＩＳＡの手順は先程と全く同じだが、９６ｗｅｌｌプレートを用いて実施している。そのため、各ｗｅｌｌに分注するＢｕｆｆｅｒ量を２倍に増やして実験を行った。また培養上清を添加するステップでは、各ｗｅｌｌに７０μｌずつＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、培養上清を３０μｌずつ加えた。尚、本実施例で行った９６ｗｅｌｌプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２１】
次に、抗体を安定的に発現する細胞の単クローン化に取り組んだ。実験手法は以下の通りである。まず、先程のＥＬＩＳＡで安定的に抗体を発現していることが確認できた細胞群を４０ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように血清含有培地へ懸濁した。次にこの懸濁液を次々と２倍ずつ希釈してゆき、希釈系列を作成した。そしてこれをそれぞれ５０μｌ／ｗｅｌｌずつ３８４ｗｅｌｌプレートに分注して３７℃・５％ＣＯ２条件下で１０日間培養した。その後３８４ｗｅｌｌプレートでＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現量が高いｗｅｌｌを調べた。そしてこのｗｅｌｌを顕微鏡で観察し、ｗｅｌｌ中にある細胞のコロニー数を調べた。観察したｗｅｌｌの中でコロニー数が１つだけのものを選び、抗体安定発現細胞株として凍結保存した。
【００２２】
尚本実施例で使用している血清含有培地は、特に断りがない限り、Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）に１０％のウシ血清（ＦＣＳ）を添加したものである。
【００２３】
（３）無血清培地の比較
凍結保存していた抗体安定発現細胞株を解凍した。そしてこの細胞を血清含有培地へ懸濁してディッシュへ播き、３７℃・５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。その後ディッシュから培地を除去し、ＰＢＳでその表面を洗浄した。そしてここへトリプシン溶液を加えて３７℃で５分間静置し、ディッシュから細胞を剥がした。その後このディッシュへ血清含有培地を加え、剥がれた細胞を懸濁してから回収した。次にこの細胞懸濁液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけた。遠心後は上清を捨て、ペレットとして細胞を回収した。そしてこのペレットにＥ−ＲＤＦ培地を加えてよく懸濁し、２分割してから遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて細胞を洗った。遠心後は再び上清を捨て、ペレットとして細胞を回収した。
【００２４】
そしてこの２分割してあるペレットに対して、一方にはＥ−ＲＤＦ培地を加えてよく懸濁し、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整した。そしてもう一方のペレットは、インスリン（１０ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（６．７μｇ／ｌ）、エタノールアミン（６ｍｇ／ｌ）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（０．１ｗ／ｖ％）、硫酸鉄７水和物（２ｍｇ／ｌ）、プトレスシン（０．３２ｍｇ／ｌ）及びピルビン酸ナトリウム（１．１ｇ／ｌ）とを加えたＥ−ＲＤＦ培地で懸濁し、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整した。その後これらの細胞懸濁液をそれぞれ３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコへ別々に入れた。これらの三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。培養を開始してから４日後、培養液中の細胞密度を測定した。そして、細胞の生育の差を比較した。結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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表１から明らかなように、Ｅ−ＲＤＦ培地では全く細胞が増殖していなかった（生細胞数：０、死細胞数：２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。一方Ｅ−ＲＤＦ培地に上述の８種の添加剤を加えた培地では、細胞の増殖が確認できた（生細胞数：１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数：１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。
【００２６】
尚Ｅ−ＲＤＦ培地に添加剤を加えた培地で培養した場合、３−４日おきに同じ組成の新たな培地へ細胞を継代すると、継続的に無血清環境下で培養可能なことも確認できた。
【００２７】
以上の通り、動物細胞培養用の無血清培地を新たに開発することができた。本発明を用いることにより、無血清環境下でも動物細胞を培養することが可能となった。