(57)【要約】【課題】幅広い保存条件において、特異的に結合する抗体による結合能の安定性に優れる肝型脂肪酸結合蛋白質、該蛋白質を用いた標品、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該蛋白質の検量線を作成する方法、及び該蛋白質を定量する方法の提供を提供すること。【解決手段】配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項４】
請求項３記載の細胞を培養し、請求項１記載の蛋白質を回収する工程を含む請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の蛋白質からなる肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項６】
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上はメチオニンであり、前記メチオニンの少なくとも１つが６６．７％超の酸化率を有する肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項７】
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目のメチオニンの酸化率が９．３％以上、７４番目のメチオニンの酸化率が５７％超、又は１１３番目のメチオニンの酸化率が６６．７％超である肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項８】
アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２αよりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を０．３５μＭ以上含み、かつ配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなる肝型脂肪酸結合蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項９】
販売に供される請求項５から８いずれか記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項１０】
請求項５から９いずれか記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いて、肝型脂肪酸結合蛋白質の検量線を作成する方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法で作成した検量線を用いて、試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的に結合する抗体による結合能が安定化された肝型脂肪酸結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いた標品、該蛋白質の検量線を作成する方法、及び該蛋白質を定量する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸結合蛋白質（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＦＡＢＰともいう。）は細胞内脂質結合蛋白質ファミリーに属する分子量約１４ｋＤａの蛋白質で、脂肪酸をはじめとする疎水性リガンドと可逆的に結合し細胞内輸送を担うことが知られている（例えば、非特許文献１）。その中でも肝型脂肪酸結合蛋白質（Ｌ−ｔｙｐｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、単に「Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質」ともいう。）は肝臓や腎臓の近位尿細管細胞の細胞質に局在しており、尿細管障害による虚血・酸化ストレスに応答して尿中への排泄量が増加する（例えば、非特許文献２）。そのため尿中の腎臓組織由来Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質を検出することで腎疾患の検査が可能である（例えば、特許文献１）。
また、図１５に示したように、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質は、逆平行βシートが２枚直行したβバレル構造に２本のαへリックスが蓋をするような形で安定化され、２分子の遊離脂肪酸（例えば、オレイン酸）と結合することが知られている（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＬＫＫ）（非特許文献３）。
そして、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質は遊離脂肪酸をミトコンドリアやペルオキシソームへ輸送し、β酸化を促進する機構を有している（非特許文献４）。
脂肪酸リガンドの結合親和性としては、脂肪酸の炭素鎖が伸長し、二重結合が増えるほど高くなる傾向が見られ（非特許文献５、６）、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質は特に過酸化物に対して結合親和性が高いことなどが報告されている（非特許文献７）。
また、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の抗酸化機構を研究した報告では、ＡＡＰＨによってラットＬ−ＦＡＢＰ蛋白質のメチオニン残基が酸化されていたことが示されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２４２０２６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｕｒｕｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，７：４８９−５０３，２００８
【非特許文献２】Ｋａｍｉｊｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１４３：２３−３０，２００４
【非特許文献３】Ｃａｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，１０２：２５８５−２５９４，２０１２
【非特許文献４】Ｖｅｅｒｋａｍｐ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，４９：８８７−９０６，１９９３
【非特許文献５】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３３：８６５−８７６，２００１
【非特許文献６】Ｎｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．，Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ａ．Ａ．：Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４３：６４６−６５３，２００２
【非特許文献７】Ｒａｚａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１６１：４４８−４５５，１９８９
【非特許文献８】Ｙａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，５０：２４４５−２４５４，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のようなＬ−ＦＡＢＰ蛋白質を検出するための検査キットとしては、例えば、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用した検査キットが開発されている。
ここで、図１は、Ｌ−ＦＡＢＰの保存安定性を示す図であり、図１におけるグラフはＬ−ＦＡＢＰを４℃、２５℃又は３７℃で保存した場合の保存日数によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（−８０℃保管サンプルを１００とした場合の割合（％））を示す。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用した上記検査キットにおいて、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰ蛋白質を使用した従来の測定標準物質（標品）では、上記Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質を室温（２５℃）以上で長期保存すると、図１に示したように、抗体結合能が変化してしまい、ＥＬＩＳＡ法等の抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によるＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の正確な測定を行うことができない問題があった。
このようにＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の不安定性のため、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質標品の製造条件や測定環境に厳密な管理が求められ、また標品は低温保存が要求され、更なる操作性、安定性の向上が望まれていた。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、幅広い保存条件において、特異的に結合する抗体による結合能の安定性に優れる肝型脂肪酸結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いた標品、該蛋白質の検量線を作成する方法、及び該蛋白質を定量する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述した問題点を解決すべく鋭意検討した結果、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質は酸化剤である２，２’−アゾビス２−アミジノプロパン（以下、ＡＡＰＨと略記）処理によってメチオニン残基の酸化修飾及び構造変化が生じ、その結果、ＥＬＩＳＡにおける抗体結合能が変化し、ＥＬＩＳＡ測定値が大きく変動することを見出した。また、驚くべきことに、ＡＡＰＨ無添加の場合（Ｈ２Ｏを添加）においても室温で１時間反応させることによりＥＬＩＳＡ測定値が上昇しており、空気酸化による影響が生じていることも見出した。
【０００８】
更に、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質中のメチオニン残基を遺伝子改変技術により別のアミノ酸に変異させたＬ−ＦＡＢＰ蛋白質が、酸化反応や脂肪酸の添加、室温以上の温度における長期保存においても抗体結合能が変化せずに安定化されることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質である。
本発明の第２の態様は、
上記第１の態様に係る蛋白質をコードするＤＮＡである。
本発明の第３の態様は、
上記第２の態様に係るＤＮＡで形質転換された細胞である。
本発明の第４の態様は、
上記第３の態様に係る細胞を培養し、上記第１の態様に係る蛋白質を回収する工程を含む上記第１の態様に係る蛋白質の製造方法である。
【００１０】
本発明の第５の態様は、
上記第１の態様に係る蛋白質からなる肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。
本発明の第６の態様は、
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上はメチオニンであり、前記メチオニンの少なくとも１つが６６．７％超の酸化率を有する肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。
本発明の第７の態様は、
アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２αよりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を０．３５μＭ以上含み、かつ配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなる肝型脂肪酸結合蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。
【００１１】
本発明の第８の態様は、
上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いて、肝型脂肪酸結合蛋白質の検量線を作成する方法である。
本発明の第９の態様は、
上記第８の態様に係る方法で作成した検量線を用いて、試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、幅広い保存条件において、特異的に結合する抗体による結合能の安定性に優れる肝型脂肪酸結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いた標品、該蛋白質の検量線を作成する方法、及び該蛋白質を定量する方法を提供することができる。
本発明の肝型脂肪酸結合蛋白質の製造方法は、得られる肝型脂肪酸結合蛋白質が酸化や脂肪酸結合状態による抗体結合能の変化を抑制することができることから、由来生物種や蛋白質発現方法によらない肝型脂肪酸結合蛋白質標品を提供することができる。すなわち肝型脂肪酸結合蛋白質標品の製造条件、保存条件、操作性における安定性と汎用性を提供することができる。
【００１３】
本発明の肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、上記安定性に優れる肝型脂肪酸結合蛋白質からなるので、温度や酸化の程度によらずに、正確な検出ないし定量を可能とする。
また、本発明の肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、幅広い保存条件において、特異的に結合する抗体による結合能の安定性に優れることから、測定用標準物質又は精度管理用物質としての肝型脂肪酸結合蛋白質の製造管理を容易にし、免疫学的手法における測定の操作性、汎用性が向上することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の保存安定性を示す図である。
【図２】（ａ）は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる分子量測定結果を示す図であり、（ｂ）は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰと非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰのＣＤスペクトルを示す図である。
【図３】Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のＡＡＰＨ処理によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（無処理を１００とした場合の割合（％））を示す図である。
【図４】各種濃度のＡＡＰＨをヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質に添加し、３７℃で１．５時間反応させた後のＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】（ａ）は、配列番号１に示したヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す図であり、（ｂ）は、ヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質のトリプシン消化によって生じ得る各種ペプチド断片の推定分子量を示す図である。
【図６】（ａ）は、上記各種濃度（４０ｍＭ、２００ｍＭ）のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１を含むペプチド断片Ｎｏ．１のＭＳスペクトルを示す図であり、（ｂ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１９を含むペプチド断片Ｎｏ．２のＭＳスペクトルを示す図であり、（ｃ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ７４を含むペプチド断片Ｎｏ．９及びペプチド断片Ｎｏ．１０のＭＳスペクトルを示す図であり、（ｄ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１１３を含むペプチド断片Ｎｏ．１４及びペプチド断片１５のＭＳスペクトルを示す図である。
【図７】ＣＯＲＹＮＥＸ（登録商標）により発現したＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ及び精製蛋白質を示す図である。
【図８】各種濃度のＡＡＰＨ処理による変異Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のＥＬＩＳＡ測定値の変化（無処理の場合を１００とした場合の割合（％））を示す図である。
【図９】変異Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のＡＡＰＨ処理によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（無処理サンプルを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１０】変異Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の室温長期保存（２５℃）によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（−８０℃保存サンプルを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１１】変異Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の３７℃長期保存によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（−８０℃保存サンプルを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１２】クローン２とは認識部位が異なる標識抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定におけるＡＡＰＨの影響（無処理サンプルを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１３】各種濃度の各種脂肪酸によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（脂肪酸添加濃度０μＭを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１４】Ｌ−ＦＡＢＰ変異蛋白質の脂肪酸添加処理によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（無処理サンプルを１００とした割合（％））を示す図である。
【図１５】Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の遊離脂肪酸との結合を示す立体構造モデルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００１６】
＜安定化された肝型脂肪酸結合蛋白質＞
本発明の第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質は、
配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された変異肝型脂肪酸結合蛋白質である。
第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質は、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンがメチオニン以外の非極性アミノ酸に置換されることにより、肝型脂肪酸結合蛋白質に対する特異的に結合する抗体の結合能を安定化することができる。
メチオニン以外にも、ジスルフィド結合や酸素の直接付加を受けるシステイン残基や、カルボニル化するリシン残基、アルギニン残基、プロリン残基、ニトロ化されるチロシン残基等の酸化修飾が知られているが（Ｔｏｄａ  Ｔ．，ｅｔａｌ．，基礎老化研究，３５（３）；１７−２２，２０１１）、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンを置換するアミノ酸が非極性アミノ酸であることにより酸化修飾を防ぐことができる。
【００１７】
配列番号１は、野生型ヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴともいう。）のアミノ酸配列を表す。
本明細書で言う「相同性９０％以上のアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９０％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上である。
配列表の配列番号１に記載した野生型ヒト肝型脂肪酸結合蛋白質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異が野生型ヒト肝型脂肪酸結合蛋白質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全て肝型脂肪酸結合蛋白質の範囲内に属し得る。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
【００１８】
上記第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されているため（Ｖｅｅｒｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｍａａｔｍａｎ，  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３４：１７−５２，１９９５）、例えば、それらを基にプライマーを設計し、ＰＣＲ法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングし、これを用いて遺伝子組換えを行うことより、上記第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質を調製することができる。
【００１９】
第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質は、１９番目、７４番目、１１３番目の２つ以上のメチオニンがメチオニン以外の非極性アミノ酸に置換されることが好ましく、１９番目のメチオニンを含む２つ以上のメチオニンがメチオニン以外の非極性アミノ酸に置換されることがより好ましく、１９番目、７４番目、１１３番目のメチオニン全てがメチオニン以外の非極性アミノ酸に置換されることが更に好ましい。
【００２０】
１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンを置換する非極性アミノ酸としては、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが同一の非極性アミノ酸で置換されてもよく、異なる非極性アミノ酸で置換されていてもよい。１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンを置換する非極性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンであることが好ましく、抗体の結合性を大きく変化させないメチオニンと類似した構造である観点から、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンであることがより好ましく、ロイシン、イソロイシン、バリンであることが更に好ましく、ロイシン、イソロイシンであることが特に好ましく、ロイシンであることが最も好ましい。
【００２１】
＜安定化された肝型脂肪酸結合蛋白質をコードするＤＮＡ＞
本発明の第２の態様に係るＤＮＡは、上記第１の態様に係る変異肝型脂肪酸結合蛋白質をコードするＤＮＡである。
上記第１の態様に係る変異肝型脂肪酸結合蛋白質をコードするＤＮＡ（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの任意の方法で作製することができる。上述のように、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されているため、例えば、それらを基にプライマーを設計し、ＰＣＲ法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングし、これを用いて遺伝子組換えにより得ることができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２２】
＜形質転換細胞＞
本発明の第３の態様に係る細胞は、上記第２の態様に係るＤＮＡで形質転換された細胞である。
上記第２の態様に係るＤＮＡ又は上記第２の態様に係るＤＮＡ含む組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって上記第３の態様に係る形質転換細胞を作製することができる。
上記第２の態様に係るＤＮＡ含む組み換えベクターは、適当な宿主ベクター系による一般的遺伝子組み換え技術によって調製することができる。適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。
上記第２の態様に係るＤＮＡ又は上記第２の態様に係るＤＮＡ含む組み換えベクターを導入される宿主細胞は、細菌、酵母等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、コリネバクテリウム属細菌（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、バチルス属細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトマイセス属細菌等のグラム陽性菌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
上記第２の態様に係るＤＮＡで形質転換された細胞としては、上記第１の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質を効率よく製造し、かつ後述の肝型脂肪酸結合蛋白質の精製が煩雑な工程を要することがないことから、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いたタンパク質分泌発現系（ＣＯＲＹＮＥＸ（登録商標）：味の素株式会社製）であることが好ましい。
【００２３】
＜安定化された肝型脂肪酸結合蛋白質の製造方法＞
本発明の第４の態様に係る蛋白質の製造方法は、上記第３の態様に係る形質転換細胞を培養し、上記第１の態様に係る蛋白質を回収する工程を含む蛋白質の製造方法である。
上記第３の態様に係る形質転換細胞は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。上記第３の態様に係る形質転換細胞の培養物から、上記第１の態様に係る蛋白質を回収するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、上記第１の態様に係る蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
上記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いたタンパク質分泌発現系（ＣＯＲＹＮＥＸ（登録商標）：味の素株式会社製）を用いることにより、細胞を破砕して無細胞抽出液を得るような煩雑な工程を要することがなく、任意の遠心分離後、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＨｉＴｒａｐＱ  ＦＦ５ｍＬ  ＦＰＬＣカラム）による精製等により精製標品を得ることができる。
【００２４】
＜肝型脂肪酸結合蛋白質標品＞
本発明の第５の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、上記第１の態様に係る安定化された蛋白質からなる肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。上記第１の態様に係る安定化された蛋白質からなることから、特異的に結合する抗体による結合能の変動が抑制され得る。
【００２５】
また、本発明の第６の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上はメチオニンであり、前記メチオニンの少なくとも１つが６６．７％超の酸化率を有する肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。
１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上はメチオニンであり、前記メチオニンの少なくとも１つが６６．７％超の酸化率であることにより、更なる酸化率の増大が抑制され結果、特異的に結合する抗体による結合能の変動が抑制され得る。
特異的に結合する抗体による結合能の変動が更に抑制され得る観点から、上記第６の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、１９番目のメチオニンの酸化率が９．３％以上、７４番目のメチオニンの酸化率が５７％超、又は１１３番目のメチオニンの酸化率が６６．７％超であることが好ましい。
上記酸化率を有する肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、ＡＡＰＨ等の酸化剤等を用いて製造することができるし、空気酸化によって製造することもできる。
上記酸化率の測定方法としては、例えば、後述する図６（ｂ）におけるＭｅｔ１９を含むペプチド断片のＭＳスペクトル、図６（ｃ）におけるＭｅｔ７４を含むペプチド断片のＭＳスペクトル、図６（ｄ）におけるＭｅｔ１１３を含むペプチド断片のＭＳスペクトルにおける酸化無処理の場合のピークと、酸化処理後のピークとの比較から算出することができる。
【００２６】
また、本発明の第７の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２αよりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を、脂肪酸が複数種の場合は合計含有量として０．３５μＭ以上含み、かつ配列表の配列番号１と相同性９０％以上のアミノ酸配列からなる肝型脂肪酸結合蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品である。
図１３を参照して後述するように、本発明者らは、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質に結合する脂肪酸の種類（図１３（ｂ））や濃度によってＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の抗体結合能が変化することを見出した。
本発明の第７の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２αよりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を、脂肪酸が複数種の場合は合計含有量として０．３５μＭ以上含むことにより、標品となるＬ−ＦＡＢＰ蛋白質を発現する際、又は標品として使用されるアッセイ系において、由来の異なる生物種による発現系や発現部位ないし臓器によって結合している脂肪酸の種類（例えば、アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２α等）、結合量、過酸化の程度が異なる場合であっても、特異的に結合する抗体による結合能の変動が抑制され、測定用標準物質又は精度管理用物質としての標品として機能し得る。
特異的に結合する抗体による結合能の変動が更に抑制される観点から、アラキドン酸、オレイン酸、８−イソプロスタグランジンＦ２α及び２，３−ジノル−８−イソプロスタグランジンＦ２αよりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を、脂肪酸が複数種の場合は合計含有量として０．７μＭ以上含むことが好ましく、３．５μＭ以上含むことがより好ましく、７．０μＭ以上含むことが更に好ましい。
上記少なくとも１種の脂肪酸を、脂肪酸が複数種の場合は合計含有量として０．３５μＭ以上含む上記第７の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、肝型脂肪酸結合蛋白質標品を含有する液に、上記少なくとも１種の脂肪酸を脂肪酸が複数種の場合は合計含有量として０．３５μＭ以上添加すること、又はそのような含有量になるような細胞培養、蛋白質単離ないし精製条件により調製することができる。また、上記少なくとも１種の脂肪酸の含有量は、上記添加量に相当する。
【００２７】
上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、実用的及び商業的に利用される観点から、販売に供される肝型脂肪酸結合蛋白質標品であることが好ましい。販売に供される肝型脂肪酸結合蛋白質標品とは、販売済みの蛋白質、具体的には販売後に長期放置された肝型脂肪酸結合蛋白質標品ではない。
上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肝型脂肪酸結合蛋白質を測定するためのキットの測定用標準物質又は精度管理用物質として有用であり、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質に特異的に結合する抗Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質抗体による特異的に結合を利用したＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の検出ないし定量等の測定の標準物質（標品）として用いることが好ましい。
上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品が用いられるＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の検出ないし定量等の測定としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、ラテックス凝集法（ＬＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などを採用したアッセイ等が挙げられ、抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したアッセイであることが好ましい。
認識部位が異なる２種類の抗体は、一方を、マイクロプレートのウェル中の表面に結合させた固相化抗体として用い、他方を、検出ないし定量のための標識抗体として用いることが好ましい。上記標識抗体における標識としては特に制限はなく、例えば、パーオキシダーゼ標識等の酵素標識、蛍光標識、紫外線標識、放射線標識等が挙げられる。
【００２８】
抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質）に対する認識部位が異なる抗体としては、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン１、クローン２、クローンＬ及びクローンＦよりなる群から選択される抗体を含む抗体が挙げられ、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせ、又は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を含む組み合わせであることが好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせであることがより好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、任意の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を標識抗体として用いることが更に好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を標識抗体として用いることが特に好ましい。
【００２９】
そのようなアッセイに用いられるＬ−ＦＡＢＰ蛋白質測定キットとしては、標品として上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品を含み、試薬として上記抗Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて前処理液（任意の緩衝液、任意の界面活性剤等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質測定キットとして、抗原に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットであることが好ましく、固相に任意の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、標識抗体に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を使用しているキットであることがより好ましい。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたＬ−ＦＡＢＰ蛋白質測定キットの具体的態様として、例えば、下記（１）〜（９）を含むキットが挙げられる。
（１）Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固相化マイクロプレート……抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体結合ウェル
（２）前処理液
（３）反応緩衝液
（４）酵素標識抗体……パーオキシダーゼ標識抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体〔クローン２産生細胞株由来〕
（５）酵素基質液
（６）洗浄剤（任意の緩衝液、界面活性剤等）
（７）反応停止液（１Ｎ硫酸等）
（８）標準緩衝液（任意の緩衝液等）
（９）肝型脂肪酸結合蛋白質標品
（９）肝型脂肪酸結合蛋白質標品としては、従来は、任意の緩衝液にリコンビナントヒトＬ−ＦＡＢＰを混合させた液が用いられてきたが、任意の緩衝液に上記肝型脂肪酸結合蛋白質標品を混合した液が好ましく、標品の濃度としては特に制限はなく、例えば、１０〜１００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、５０〜５０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００〜１０００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２００〜８００ｎｇ／ｍＬが更に好ましく、３００〜６００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
肝型脂肪酸結合蛋白質標品として、従来のリコンビナントヒトＬ−ＦＡＢＰを用いたこと以外は上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用したＬ−ＦＡＢＰ蛋白質測定キットと同様のキットの市販品としては、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＴＭＢ」（シミックホールディングス社製）が挙げられる。
【００３０】
安定化されたＬ−ＦＡＢＰ蛋白質からなる肝型脂肪酸結合蛋白質標品の保存溶液はタンパク吸着防止を目的としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する蛋白質保存緩衝液とすることが好ましい。例えば、下記蛋白質保存緩衝液が挙げられる。
（蛋白質保存緩衝液）
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３
【００３１】
＜検量線を作成する方法及び肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法＞
本発明の第８の態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質の検量線を作成する方法は、上記第５〜７のいずれかの態様に係る肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いる。
具体的には、測定される上記標識の強度（例えば、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、上記標品の量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成することができる。
本発明の第９の態様に係る試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法は、上記第８の態様に係る方法で作成した検量線を用いる。
具体的には、上記検量線の作成と同様な条件により、標識抗体等により標識された試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質の標識強度を測定し、上記検量線に基づき（例えば、対比し）、試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を検出ないし定量することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
参考例
＜酸化によるＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の構造変化＞
Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質をＡＡＰＨ処理した。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。
図２（ａ）は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる分子量測定結果を示す図であり、図２（ｂ）は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰと非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰのＣＤスペクトルを示す図である。
図２（ａ）から明らかなように、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰでは理論分子量よりおおよそ酸素分子２〜３分子に相当する分子量増加が観測されている。
図２（ｂ）に示したように、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰでは３５０ｎｍ付近（図中矢印）に蛍光ピークが出現しており、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質中に存在する芳香族アミノ酸周辺が極性の高い環境に変化したことを意味しており、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰと非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰでは構造変化を生じていると考えられる。
【００３４】
＜酸化によるＥＬＩＳＡ測定値の変化＞
ＡＡＰＨを所定の濃度になるようＬ−ＦＡＢＰ蛋白質溶液に添加し、室温で１時間反応させ、ＥＬＩＳＡ測定を行った。結果を図３に示す。
図３から、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質のＡＡＰＨ処理によりＥＬＩＳＡ測定値の変化（無処理を１００とした場合の割合（％））が生じていることがわかる。
また、驚くべきことに、図３に示したように、ＡＡＰＨ無添加サンプル（Ｈ２Ｏを添加）においても室温で１時間反応させることによりＥＬＩＳＡ測定値が上昇しており、空気酸化による影響が生じていると考えられる。
【００３５】
＜ヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の酸化＞
各種濃度（４０ｍＭ、２００ｍＭ）のＡＡＰＨをヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質に添加し、３７℃で１．５時間反応させた。結果を図４に示す。
図４は、各種濃度（４０ｍＭ、２００ｍＭ）のＡＡＰＨをヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質に添加し、３７℃で１．５時間反応させた後のＭＳスペクトルを示す図である。
図４に示したように、ＡＡＰＨ処理によりＬ−ＦＡＢＰに酸素分子１〜３分子に相当する分子量増加が観測された。
【００３６】
＜ヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質が含有するメチオニンの酸化＞
図５（ａ）は、配列番号１に示したヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す図であり、図５（ｂ）は、ヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質のトリプシン消化によって生じ得る各種ペプチド断片の推定分子量を示す図である。
上記各種濃度（４０ｍＭ、２００ｍＭ）のＡＡＰＨにより反応した後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られた各種ペプチド断片のＭＳスペクトルを測定した。
図６（ａ）は、上記各種濃度（４０ｍＭ、２００ｍＭ）のＡＡＰＨにより反応した後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１を含むペプチド断片Ｎｏ．１のＭＳスペクトルを示す図であり、図６（ｂ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１９を含むペプチド断片Ｎｏ．２のＭＳスペクトルを示す図であり、図６（ｃ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ７４を含むペプチド断片Ｎｏ．９及びペプチド断片Ｎｏ．１０のＭＳスペクトルを示す図であり、図６（ｄ）は、上記各種濃度のＡＡＰＨと反応後のヒトＬ−ＦＡＢＰ蛋白質をトリプシン消化して得られたＭｅｔ１１３を含むペプチド断片Ｎｏ．１４及びペプチド断片１５のＭＳスペクトルを示す図である。
図６（ａ）〜（ｄ）に示した結果から、酸化修飾部位は１９番目、７４番目、１１３番目のメチオニン残基（以下、それぞれＭｅｔ１９、Ｍｅｔ７４、Ｍｅｔ１１３ともいう。）であることが明らかになった。
【００３７】
実施例１
＜変異Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の製造方法＞
Ｍｅｔ１９をロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌともいう。）、
Ｍｅｔ７４をロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌともいう。）、
Ｍｅｔ１１３をロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１１３Ｌともいう。）、
Ｍｅｔ１９及びＭｅｔ７４をそれぞれロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌともいう。）、
Ｍｅｔ１９及びＭｅｔ１１３をそれぞれロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ１１３Ｌともいう。）、
Ｍｅｔ７４及びＭｅｔ１１３をそれぞれロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌともいう。）、
３つのメチオニン残基（Ｍｅｔ１９、Ｍｅｔ７４、Ｍｅｔ１１３）をそれぞれロイシン残基に変異させた変異蛋白質（以下、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌともいう。）を製造した。
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ、
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌ、
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１１３Ｌ、
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ、
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ１１３Ｌ、
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ、及び
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは、それぞれ、グラム陽性細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いたタンパク質分泌発現系（ＣＯＲＹＮＥＸ（登録商標）：味の素株式会社製）を利用して発現を行った。
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号２に示した。
蛋白質発現に用いたＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの遺伝子配列を後記配列表の配列番号３に示した。
【００３８】
上述した方法により発現を行ったＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ等は、まず遠心式フィルターユニット  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５、３ｋＤａ（ミリポア社製）を用いバッファーＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１ｍＭ  ＤＴＴ）とバッファー交換を行った。
次に、ＨｉＴｒａｐＱ  ＦＦカラム、５ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い精製を行った。ＨｉＴｒａｐＱ  ＦＦカラムに吸着したＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは、バッファーＡで洗浄後、バッファーＡとバッファーＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１ｍＭ  ＤＴＴ，２Ｍ  ＮａＣｌ）による直線的濃度勾配法により溶出させ、バッファーＢが３．１％となるピークを含むフラクションを回収した。回収した蛋白質に関してはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳｉｌｖｅｒ  ＳｔａｉｎＩＩ  Ｋｉｔ  Ｗａｋｏ（和光純薬株式会社製）による蛋白質染色を行い、精製度合いの確認を行った。Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌについての精製結果を図７に示す。
【００３９】
上述の操作により得たＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ等は−８０℃にて保管した。
【００４０】
ＡＡＰＨを所定の最終濃度（０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ）になるようＬ−ＦＡＢＰ蛋白質溶液（Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１１３Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ１１３Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ、及びＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの各溶液）に添加し、室温で１時間反応させ、ＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を無処理サンプルと比較した。比較結果を図８に示す。
図８に示した結果から明らかなように、１９番目のメチオニンのロイシンへの置換が酸化に対する安定性に寄与が大きいことが分かる（Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ）。
特に、１９番目のメチオニンを含む２つ以上のメチオニンのロイシンへの置換が酸化に対する安定性に寄与が特に大きいことが分かる（Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ１１３Ｌ）。
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌが最も酸化に対する安定性に優れることが分かる。
次に、酸化安定性を確認したＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌ等はサンプルの長期保存のため上述した蛋白質保存緩衝液に溶解し、−８０℃にて保管し、以下実施例２〜６に使用した。
【００４１】
実施例２
＜酸化による安定性＞
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌに対してＡＡＰＨを最終濃度０〜５ｍＭとなるよう添加し、室温で１時間反応させた。また空気酸化の影響を考慮し、蛋白質溶液にＨ２Ｏのみを添加し、添加直後に測定を実施した無処理サンプルを比較対象とした。
【００４２】
これらの反応溶液及び無処理サンプルを「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＴＭＢ」（シミックホールディングス株式会社製）を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を無処理サンプルと比較した。上記診断用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。結果を図９に示す。
【００４３】
図９に示したＥＬＩＳＡ測定の結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴは１１２〜１２１％の測定値の上昇が確認され、ばらつきを表す変動係数（ＣＶ）は５．８％であった。
一方、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは１０２〜１０７％の上昇までしか認められず、ＣＶは２．４％であった。
以上の結果からＡＡＰＨに対してＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの抗体結合能は安定的であり、ＥＬＩＳＡ測定値の変動は小さいことが明らかとなった。
つまり、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは酸化反応に対して安定化したといえる。また室温に１時間置くだけでもＬ−ＦＡＢＰ  ＷＴの抗体結合能が上昇するが、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは上昇しないことから、空気酸化に対しても安定化したといえる。
【００４４】
実施例３
＜室温での安定性＞
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌを室温（２５℃）にて保存し、１週間ごとに４週間後まで「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＴＭＢ」を使用して定法に従いＥＬＩＳＡ測定を実施した。−８０℃にて保存しているサンプルに関しても測定を実施し、比較対象とした。室温保存サンプルの標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）について−８０℃保存サンプルの標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を１００とした割合（％）を比較した。結果を図１０に示す。
【００４５】
図１０に示したＥＬＩＳＡ測定の結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴは１１０〜１２８％の測定値の上昇が確認され、ＣＶは１０．５％であった。
一方、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは１０１〜１１１％の上昇までしか認められず、ＣＶは４．７％であった。
以上の結果から室温での長期保存に対してＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの抗体結合能は安定的であり、ＥＬＩＳＡ測定値の変動は小さいことが明らかとなった。つまり、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは室温での長期保存に安定化されたといえる。
【００４６】
実施例４
＜３７℃での安定性＞
Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌを３７℃で保存し、１週間ごとに４週間後まで「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＴＭＢ」を使用して定法に従いＥＬＩＳＡ測定を実施した。−８０℃にて保存しているサンプルに関しても測定を実施し、比較対象とした。室温保存サンプルの標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）について−８０℃保存サンプルの標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を１００とした割合（％）を比較した。結果を図１１に示す。
【００４７】
図１１に示したＥＬＩＳＡ測定の結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴは１１７〜１４３％の測定値の上昇が確認され、ＣＶは１４．５％であった。
一方、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは１０４〜１１３％の上昇までしか認められず、ＣＶは４．８％であった。
以上の結果から３７℃での長期保存に対してＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの抗体結合能は安定的であり、ＥＬＩＳＡ測定値の変動は小さいことが明らかとなった。つまり、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは３７℃での長期保存にも安定化されたといえる。
【００４８】
実施例５
＜クローン２とは認識部位が異なる標識抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定における酸化安定性＞
ＡＡＰＨを所定の最終濃度（０〜４ｍＭ）になるようＬ−ＦＡＢＰ蛋白質溶液に添加し、室温で１時間反応させ、ＥＬＩＳＡ測定を実施した。標識抗体としてクローン１、クローン２、クローンＦを用い、発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を無処理サンプルと比較した。結果を図１２に示す。
図１２に示した結果から明らかなように、クローン１及びクローンＦによる標識抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰ測定方法では、クローン２と同様に酸化によってＬ−ＦＡＢＰ  ＷＴの抗体結合能が変化すること、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌでは酸化による抗体結合能の変化が抑制されることを分かる。
したがって、抗原認識部位が異なる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン１、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＦによるＥＬＩＳＡ測定系においても安定化されたＬ−ＦＡＢＰ蛋白質が有効である。
【００４９】
実施例６
＜脂肪酸添加による安定性＞
図１３（ａ）は、Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の脂肪酸添加処理によるＥＬＩＳＡ測定値の変化（脂肪酸添加濃度０μＭを１００とした割合（％））を示す図である。
図１３（ａ）から明らかなように、結合する脂肪酸の種類（図１３（ｂ））や濃度によってＬ−ＦＡＢＰ蛋白質の抗体結合能が変化することが明らかとなった。
【００５０】
次に、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌに対して各種脂肪酸を最終濃度０〜７００μＭとなるよう添加し、室温で１．５時間反応させた。また空気酸化の影響を考慮し、蛋白質溶液にＤＭＳＯ（終濃度５％）のみを添加し、添加直後に測定を実施した無処理サンプルを比較対象サンプルとした。
【００５１】
これらの反応溶液及び無処理サンプルを「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＴＭＢ」を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色（ＯＤ４５０ｎｍ）を無処理サンプルと比較した。上記診断用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。結果を図１４（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００５２】
図１４（ａ）は各種濃度のアラキドン酸添加によるＥＬＩＳＡ測定値の変化を示す図であり、図１４（ｂ）は各種濃度のオレイン酸添加によるＥＬＩＳＡ測定値の変化を示す図であり、図１４（ｃ）は各種濃度の８−イソプロスタグランジンＦ２α添加によるＥＬＩＳＡ測定値の変化を示す図である。
図１４（ａ）〜（ｃ）に示したＥＬＩＳＡ測定の結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴはアラキドン酸に関しては１０４〜２２０％の測定値の上昇（ＣＶ３４．０％）、オレイン酸に関しては１００〜１２４％の測定値の上昇、（ＣＶ１０．４％）、８−イソプロスタグランジンＦ２αに関しては９５〜１１８％の測定値の変動（ＣＶ６．８％）が確認された。
一方、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌはアラキドン酸に関しては８８〜１０３％の測定値の変動（ＣＶ６．１％）、オレイン酸に関しては９２〜１０７％の測定値の変動、（ＣＶ５．１％）、８−イソプロスタグランジンＦ２αに関しては９６〜１０１％の測定値の上昇（ＣＶ２．３％）が確認された。
以上の結果から脂肪酸添加に対してＬ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌの抗体結合能は安定的であり、ＥＬＩＳＡ測定値の変動は小さいことが明らかとなった。つまり、Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌは脂肪酸添加に対して安定化したといえる。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号１：Ｌ−ＦＡＢＰ  ＷＴのアミノ酸配列
配列番号２：Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３Ｌのアミノ酸配列
配列番号３：Ｌ−ＦＡＢＰ  Ｍ１９Ｌ／Ｍ７４Ｌ／Ｍ１１３ＬのＤＮＡ配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月26日(2016.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１と同一性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質であって、少なくとも１９番目のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項４】
請求項３記載の細胞を培養し、請求項１記載の蛋白質を回収する工程を含む請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項６】
配列表の配列番号１と同一性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１１３番目のメチオニンが６６．７％超の酸化率を有する肝型脂肪酸結合蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項７】
測定用標準物質又は精度管理用物質として用いられる、請求項５又は６記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項８】
販売に供される請求項５から７いずれか記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項９】
請求項５から８いずれか記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いて、肝型脂肪酸結合蛋白質の検量線を作成する方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法で作成した検量線を用いて、試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月18日(2016.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１と同一性９０％以上のアミノ酸配列からなり、１９番目、７４番目、１１３番目の１つ以上のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質であって、少なくとも１９番目のメチオニンが、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換された肝型脂肪酸結合蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項４】
請求項３記載の細胞を培養し、請求項１記載の蛋白質を回収する工程を含む請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の蛋白質を含む肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項６】
測定用標準物質又は精度管理用物質として用いられる、請求項５記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項７】
販売に供される請求項５又は６記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品。
【請求項８】
請求項５から７いずれか記載の肝型脂肪酸結合蛋白質標品を用いて、肝型脂肪酸結合蛋白質の検量線を作成する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法で作成した検量線を用いて、試料中の肝型脂肪酸結合蛋白質を定量する方法。