(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の見た目で判断したり、肌のシワやキメの状態あるいは肌荒れの観察、肌の水分量やメラニン量の測定などを機器を用いた分析方法で評価したりしていた肌年齢の評価方法に比べ、非浸襲的・簡便な方法で、より定量的に肌年齢を測定し、皮膚状態、特に肌年齢を明確かつ正確に診断する方法の提供。【解決手段】角層チェッカー等を用いて非侵襲的に安全・簡便に皮膚角層を採取し、当該皮膚角層中の酸化蛋白質分解酵素（ＯＰＨ）活性を、アシルアミノ酸遊離酵素（ＡＡＲＥ）を用いた検量線により求めるなどの方法で測定することにより、皮膚状態を診断する肌年齢の診断方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のＯＰＨ活性を測定する工程を含む、皮膚状態の診断方法。
【請求項２】
肌年齢の診断方法である、請求項１記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化蛋白質を分解する生体内酵素である酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：ＯＰＨ）の作用を活用して、皮膚状態を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での蛋白質糖化反応が皮膚老化、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などの加齢による機能低下や疾病に関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより肌などにくすみが生じることになる。このような加齢により生じる疾病や機能低下をもたらす要因となる蛋白質の糖化反応を抑制するための研究が種々行われている（特許文献１）。
【０００３】
また、加齢による疾病や機能低下をもたらす他の要因として、蛋白質の酸化反応も注目されている。生体内における蛋白質の酸化反応がもたらす細胞や組織への影響としては、例えば、組織コラーゲンなどの加齢変化、アルツハイマー病、白内障、皮膚老化などさまざまな疾患や機能低下が挙げられる。
【０００４】
生体内において蛋白質の酸化反応により生成される酸化蛋白質は、酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：以下、ＯＰＨと記す）という生体内酵素により分解除去される。ＯＰＨは生体組織中に広く分布し、酸化蛋白質を優先的に分解するセリンプロテアーゼの一種であり、蛋白質のＮ末端アシル化アミノ酸を遊離する酵素であるアシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino-acid-releasing enzyme：ＡＡＲＥ）として知られている。
【０００５】
ＯＰＨは加齢とともにその生体内活性の低下が示唆されており、その活性低下が上記のような皮膚老化や疾病などをもたらす一因と考えられている。そこで、疾患や老化を予防するためにＯＰＨの活性を促進させる作用物質についての研究がなされている（特許文献２）。
【０００６】
一方、皮膚の老化の度合いは実際の年齢と必ずしも一致せず、乖離して進むことがある。例えば実際の年齢より若々しい肌をしている人もいれば、肌の老化が進んで実際より老けて見える人もいる。そして、このような肌の老化を防ぐため多種類のスキンケア化粧品が開発されている。
【０００７】
しかしながら、肌年齢を正確に測定することは案外に難しく、肌のつややシワ、肌表面の粗さ、たるみなど見た目に依存するところが大きい。そのため、スキンケア化粧品を選ぶときの基準があいまいになり、誤った選択に気づかない人も多い。そこで、実際の年齢と必ずしも一致しない肌年齢や肌の健康状態を正確に把握する方法の開発が望まれている。
【０００８】
これまでは、レプリカ採取によるしわやキメの評価、マイクロスコープによる観察、キュートメーターによる肌弾力の測定など、機器を用いて客観的な評価を行うためのさまざまな方法が提案されている。しかしながらこれら機器測定法は煩雑であるばかりでなく、肌年齢を的確に測定するには、外観変化に基づく評価だけでは不十分であり、生化学的な加齢変化を調べることが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４１９５８４０号公報
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ２０１１／００４７３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、肌老化度を的確に測定するには外観変化に基づく評価だけでは不十分であり、また機器を使った評価は簡便ではない。そこで、生化学的な加齢変化を簡易的に調べる方法の開発が求められている。こうした技術的背景のもと、本発明者らは先に皮膚角層中にＯＰＨ活性が存在しているという知見を得た。本発明は、かかる皮膚角層中のＯＰＨ活性を用いた新しい皮膚状態の診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、非侵襲的に安全・簡便に角層採取ができる角層チェッカーを用いるなどの方法によって、皮膚角層中ＯＰＨ活性を測定することにより様々な皮膚状態を診断しうることを見いだし、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下に示す皮膚状態の診断方法に関する。
１）皮膚角層中のＯＰＨ活性を測定する工程を含む、皮膚状態の診断方法。
２）肌年齢の診断方法である、１）記載の診断方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の皮膚角層中のＯＰＨ活性を活用した皮膚状態の診断方法によれば、これまで肌の見た目で判断していた肌年齢を、非浸襲的・簡便な方法で測定することができる。また、従来の肌の見た目年齢を評価する方法に比べて、より定量的に肌年齢を測定することができ、皮膚状態を明確かつ正確に診断することが可能となる。そのため、その人の実際の皮膚状態に合った適切なスキンケア化粧品を選ぶための基準として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】年齢とＯＰＨ活性との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の皮膚状態の診断方法は、皮膚角層中のＯＰＨ活性を測定する工程を含む。
ＯＰＨ活性とは、酸化蛋白質分解酵素（oxidized protein hydrolase：ＯＰＨ）の作用である。ＯＰＨは生体組織中に広く分布するが、このたび皮膚角層中にも存在することが明らかとなった。
【００１６】
皮膚角層中のＯＰＨ活性の具体的な測定方法としては、例えばアシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino-acid-releasing enzyme：ＡＡＲＥ）を用いた検量線により求めることができる。また、そのほかに、人工的に糖化させた蛋白質の蛍光強度の減少を測定するという方法によって求めることができる。
また、皮膚角層は、非侵襲的に安全・簡便に角層採取ができる角層チェッカーを用いることができる。
【００１７】
本発明によれば、皮膚角質層中のＯＰＨ活性は肌年齢と良好な相関を有する。よって、これまで肌の見た目で判断していた肌年齢を、非浸襲的・簡便な方法で測定することができる。また、従来の肌の見た目年齢を評価する方法（肌のシワやキメの状態あるいは肌荒れの観察、肌の水分量やメラニン量の測定など）に比べて、より定量的に肌年齢を測定することができ、皮膚状態を明確かつ正確に診断することが可能となる。
【実施例】
【００１８】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例により何らの制限を受けるものではない。
【００１９】
＜実施例１＞（年齢と皮膚角層中のＯＰＨ活性との関係）
（１）皮膚角層の採取
パネラー５３名について、以下に示す方法でヒト皮膚角層のサンプルを採取した。
１）メーク落としシート（製造元；株式会社コーセー）を用いて、右頬部を洗浄した。
２）精製水を含ませたコットンを用いて、メーク落としシートで洗浄した前記右頬部（以下、「前記右頬部」という）を再度拭き取った。
３）角層チェッカー（アサヒバイオメッド製）を用いて、前記右頬部の皮膚角層サンプルを採取した。すなわち、前記角層チェッカー（粘着シート；２．５ｃｍ×２．５ｃｍ／１箇所）を前記右頬部の任意の２箇所に貼り付けて剥がし、それを３回繰り返して２箇所×３枚（計６枚）の皮膚角層サンプルを採取した。
【００２０】
（２）ＯＰＨ活性の測定
上で得られた各パネラーのヒト皮膚角層抽出液について、ＯＰＨ（酸化蛋白分解酵素）活性を、以下の方法で測定した。
【００２１】
実施例１に記載した方法にて採取したスキンチェッカー（皮膚角層）の２層目の角層の半分（２．５ｃｍ×１．２５ｃｍ）とφ４ｍｍのステンレスビーズ１個を２ｍＬスクリューキャップチューブに入れ、氷冷したTritonX-100を０．０２５％濃度の０．１Ｍ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液を３００μＬ加えた。ビーズ破砕機（タイテック（株）製、商品名「μＴ−１２」）にて３，０００ｒｐｎで５分間抽出した。その後遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、５分）し、上清をヒト皮膚角層抽出液とした。
【００２２】
９６穴マイクロプレート（透明）に、前記ヒト皮膚角層抽出液；１００μＬを、次いで１ｍＭ−ＡＡＰＡ（acetyl-L-alanine p-nitroaniline）０．１Ｍ−Tris-HClバッファー（ｐＨ７．４）溶液（少量のＤＭＳＯにてＡＡＰＡを溶解）；５０μＬを注入し、３７℃で１２０分間インキュベートした。インキュベート前後における、Ａｂｓ．４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２３】
またヒト皮膚角層抽出液について、４００μＬをスクリューキャップチューブに採取した後１００℃にて乾燥させ、８ＭのＫＯＨを４００μＬ加えて１００℃で８時間インキュベートした。
【００２４】
所定時間経過後、５ＭのＨＣｌを６００μＬ添加してボルテックスミキサーにて完全に混合させた後、４℃，１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離をした。この上澄み１００μＬに対してＯＰＡ（o-phthalaldehyde）溶液を５０μＬ加えて混合し、蛍光強度（Ｅｘ：340nm/Em：450nm）を測定してタンパク量を算出した。単位タンパクあたり、１時間あたりのｐＮＡ（p-nitroaniline）の生成量を酵素活性（ＯＰＨ活性）とした。
【００２５】
各パネラーの年齢とＯＰＨ活性の測定結果を表１に示す。また、各パネラーの年齢とＯＰＨ活性（単位；pNA(pmol/h/μg protein)との関係を表すグラフを図１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
上記結果より、皮膚角質層中のＯＰＨ活性は年齢とある程度の相関関係を示すことがわかる。
【００２８】
＜実施例２＞（肌の見た目年齢とＯＰＨ活性との関係）
（１）肌の見た目年齢の評価
パネラー３名［Ａ（年齢；６４歳男性）、Ｂ（年齢；６２歳男性）、Ｃ（年齢；４８歳男性）］について、従来の肌の見た目年齢の評価方法として多く採用されている方法で肌の見た目年齢を評価した。具体的には、各パネラーについて以下の各項目に関する評価を行った。
【００２９】
１）レプリカによるシワ個数（右目尻）とキメ個数（右目尻下）
２）肌水分量（右頬）
３）肌表面の粗さ（右頬及び右目尻の２箇所）
４）メラニン量（右頬及び右目尻の２箇所）
【００３０】
上記各評価項目について、具体的な評価方法は以下の通りである。
［レプリカによるシワ個数とキメ個数の測定］
シリコーンラバーを用いて皮膚表面のレプリカを採取し、これに角度３０度の平行光を照射し撮像して得られる陰影画像を基にして、皮膚の三次元形状を解析した。すなわち、前記平行光を照射して得られるシワ、キメ等の形状に応じた陰影画像をＣＣＤカメラで撮像し、コンピュータに取り込んで画像処理し、シワ・キメ等の形状及び定量解析を行った。解析には、反射用レプリカ３Ｄ解析システム「ASA-03RXD」（アサヒバイオメド株式会社製）を用いた。
【００３１】
なお、「キメ」とは、ヒトの肌表面に本来存在する「皮溝」とよばれる溝と、その溝に囲まれ隆起した「皮丘」とからなる網目構造である。若く状態の良い肌で肌年齢が低いほど、「皮溝」と「皮丘」がはっきりしていて網目構造が細かく明確に観察される。一方、年齢を重ねたり肌荒れを起こしたりして肌年齢が高くなった肌では、「皮溝」「皮丘」がはっきりしなくなり、肌表面がのっぺりとして網目構造が大きくなると同時にゆるく不明瞭になる。「キメ個数」は一定面積当りの「キメ」の数を表しており、肌年齢が高いほどキメ個数が減少する。
【００３２】
なお、「シワ」とは、上述した皮溝とは異なり、加齢や紫外線、乾燥等により後天的に生じる皮膚の表皮から真皮にまで及ぶ変形をいい、上記「キメ」と明確に区別される。
上記の方法で求められた一定面積あたりのシワの個数は、少ないほどシワの数が少なく、肌の見た目（見た目の肌年齢）が若いことを示している。また、一定面積あたりのキメの個数は、大きい程キメの数が多く、見た目の肌年齢が若いことを示している。
【００３３】
［肌水分量］
定圧センサープローブ接触高周波コンダクタンス交換方法（測定装置；商品名「SKICON-200EX」、株式会社ヤヨイ製）を用い、高周波正弦電流を用いて皮表の角層の水分を測定した。なお、測定条件としては、周波数；３．５MHｚ、時間；５秒程（安定するまで）、伝導度；０〜２０００μSである。このようにして得られた肌の水分量は、数値が高い程水分量が多く、肌の見た目（見た目の肌年齢）が若いことを示している。
【００３４】
「肌表面の粗さ・メラニン量］
肌表面を３Ｄで特定波長の光を照射して撮影し画像処理することで、肌表面の粗さ（凹凸度合い）やメラニン量を測定した（測定装置；商品名「ＡＮＴＥＲＡ３Ｄ」、ガデリウスメディカル株式会社製）。
このようにして得られた肌表面の粗さ（凹凸度合い）は、数値が少ない程肌が滑らかであり、見た目の肌年齢が若いことを示している。また、肌表面のメラニン量は数値が少ない程メラニンが少なく、見た目の肌年齢が若いことを示している。
【００３５】
上記各パネラー（Ａ、Ｂ、Ｃ）については、実施例１と同様の方法で右頬のＯＰＨ活性を測定した。各パネラーの評価結果及びＯＰＨ測定結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
表２から、実年齢が近いパネラーＡとＢを比較すると、実年齢がほぼ同じなのに対し、従来の機器による肌の見た目年齢の評価方法での評価と同様、ＯＰＨ活性が高い程肌の見た目年齢も高いことがわかる。またパネラーＢとＣを比較すると、ＯＰＨの活性がより高い程見た目年齢も若くなることがわかる。ＯＰＨ活性は機器による肌の見た目年齢の評価法に新たな生化学的視点を加えるとともに、簡易的に肌の見た目年齢を評価する方法として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、ヒト皮膚角層中のＯＰＨ活性を測定することにより、実際の年齢と必ずしも一致しない肌年齢や肌の健康状態を非侵襲的且つより簡便な方法で、より明確に把握することができる。そして、各人の実際の皮膚状態に合った適切なスキンケア化粧品を選ぶための基準として活用することができる。
【図１】
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