(57)【要約】【課題】  精度の高い体由来の汚染物に対する洗浄評価方法を提供する。【解決手段】  生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、複製工程を繰り返して増幅させ、増幅されたＤＮＡを定量することによって評価することを特徴とする洗浄評価方法を提供する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、複製工程を繰り返して増幅させ、増幅されたＤＮＡを定量することによって評価することを特徴とする洗浄評価方法。
【請求項２】
生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態で複製工程を繰り返すことによって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光強度を用いて評価することを特徴とする洗浄評価方法。
【請求項３】
生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数を用いて評価することを特徴とする洗浄評価方法。
【請求項４】
前記サイクル数と前記汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価することを特徴とする請求項３に記載の洗浄評価方法。
【請求項５】
前記サイクル数と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価することを特徴とする請求項３に記載の洗浄評価方法。
【請求項６】
生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態でＬＡＭＰ法によって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光強度を用いて評価することを特徴とする洗浄評価方法。
【請求項７】
前記蛍光強度と前記汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価することを特徴とする請求項６に記載の洗浄評価方法。
【請求項８】
前記蛍光強度と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価することを特徴とする請求項６に記載の洗浄評価方法。
【請求項９】
前記汚染物が、医療器具、若しくは滅菌処理後の医療器具に付着してなることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の洗浄評価方法。
【請求項１０】
前記汚染物が、血液、リンパ液、唾液、分泌液、組織液、その他の体液、及び骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の洗浄評価方法。
【請求項１１】
ＤＮＡの複製工程に用いられるプライマーの反応によって、前記汚染物がヒト由来であるか、微生物由来であるかを特定することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の洗浄評価方法。
【請求項１２】
前記汚染物は、界面活性剤、アルカリ性の液体、酸性の液体、及びイオン交換水から選ばれる一の抽出液を使用して、前記汚染物が付着した評価対象から抽出される
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の洗浄評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の汚染物が付着した医療器具等の洗浄評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療機関の外来診療、手術部、検査部、病棟等で使用された医療器具には、血液、体液、組織片等の蛋白質を主成分とする蛋白質汚れが付着しており、一般的に、これらの汚染された医療器具は、殺菌消毒工程、洗浄工程、滅菌工程を経て再使用される。特に、医療器具の円滑な作動性維持や医療器具による感染防止等のために、医療器具の蛋白質汚れを取り除くための洗浄が重要であり、不可欠である。
【０００３】
医療機関で使用されて蛋白質汚れが付着した医療器具の洗浄方法には、各医療機関の所有する洗浄設備に基づき、浸漬洗浄や、超音波洗浄機、ウォッシャーディスインフェクター等による機械洗浄が行われている。また、内視鏡スコープのような医療器具の構造に応じた内視鏡専用洗浄機等も使用されている。
【０００４】
しかし、上記のような洗浄を行っても、医療器具に蛋白質汚れが残存している場合があり、医療器具の清浄度を確認する必要がある。現在、医療機関で行われている医療器具の清浄度の確認方法では、洗浄後の医療器具を蛋白質染色剤であるアミドブラック１０Ｂ染色液に浸漬した後に水洗いをして、医療器具表面にアミドブラック１０Ｂが染着した青色の染色跡があるか否かを調べることにより、医療器具表面の蛋白質の有無を肉眼で定性的に判断することができる。
【０００５】
さらに洗浄後の医療器具の清浄度を確認する別の方法として、アルカリ性溶液等の抽出液に医療器具を浸漬して、蛋白質を抽出することにより得られた蛋白質溶出液と蛋白質染色剤とを接触させた接触液から蛋白質を検出する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４５２７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記で提案されている蛋白質の検出方法では、より精度の高い洗浄評価が必要である場合や、大量の抽出液を用いなければ蛋白質の抽出ができない場合には、正確な蛋白質の有無の検出若しくは蛋白質量の検量を行うことができないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、上記課題を解決する手段として本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、複製工程を繰り返して増幅させ、増幅されたＤＮＡを定量することによって評価することを目的とする。
【０００９】
特に、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態で複製工程を繰り返すことによって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光強度を用いて評価することを特徴とする洗浄評価方法であることが好ましい。また、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、当該ＤＮＡに蛍光物質を付加しながら複製工程を繰り返すことによって増幅させ、増幅されたＤＮＡに付加された前記蛍光物質から測定される蛍光強度を用いて評価することを特徴とする洗浄評価方法であってもよい。さらに、前記蛍光強度と前記汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価する洗浄評価方法であることが好ましい。さらに好ましくは、前記蛍光強度と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価する洗浄評価方法である。
【００１０】
特に前記複製工程として、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）若しくはＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用い、前記リアルタイムＰＣＲによるサイクル数を用いた評価方法、若しくは前記ＬＡＭＰ法による蛍光強度を用いた評価方法が望ましい。
【００１１】
また、本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記リアルタイムＰＣＲによって複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数と前記汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価する方法としても好ましい。
【００１２】
さらにまた、本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態でＬＡＭＰ法によって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光物質から測定される蛍光強度と前記汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価することとしても好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記リアルタイムＰＣＲによって複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価する方法としても好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態でＬＡＭＰ法によって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光物質から測定される蛍光強度と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価する方法としても好ましい。
【００１５】
ここで、換算ＤＮＡ量とは、予めＤＮＡ量のわかっている汚染物とＤＮＡの複製工程から得られたＤＮＡの複製数量を示すパラメータとの相関に基づいて算出したＤＮＡ量をいう。ここで、前記パラメータとしては、汚染物中に蛍光物質を添加した状態で複製工程を繰り返すことによって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光強度であることが好ましく、より好ましくは、前記リアルタイムＰＣＲにおけるサイクル数であることが好ましい。また、前記パラメータは、前記ＬＡＭＰ法によって測定される蛍光強度であっても好ましい。さらに、換算ＤＮＡ量には、前記相関から直接算出される換算ＤＮＡ量以外に、当該直接算出された換算ＤＮＡ量に何らかの係数をかけて求めた値も含む。
【００１６】
さらに、前記汚染物が、医療器具、若しくは滅菌処理後の医療器具に付着してなるものであっても好ましい。医療器具の滅菌処理としては、オートクレーブに医療器具を投入し、１２１℃〜１３４℃で２０分間の水蒸気による処理であることが好ましい。当該滅菌処理を行うと、医療器具に残存していた蛋白質は変性して直接検出することは困難となるが、ＤＮＡであれば変性せずに残存するものがあるため、本発明によれば、蛋白質が変性するような高熱による滅菌処理を行った医療器具に対しても精密な洗浄評価を行うことができる。
【００１７】
さらにまた、前記汚染物が、血液、リンパ液、唾液、分泌液、組織液、その他の体液、及び骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る洗浄評価方法は、前記リアルタイムＰＣＲ若しくはＬＡＭＰ法に用いられるプライマーの反応によって、前記汚染物がヒト由来であるか、微生物由来であるかを特定するものであっても好ましい。
【００１９】
さらにまた、前記汚染物は、界面活性剤、アルカリ性の液体、酸性の液体、及びイオン交換水から選ばれる一の抽出液を使用して、前記汚染物が付着した評価対象から抽出されることとしても好ましい。
【００２０】
なお、前記生体には人間、動物、及び細菌などの微生物を含み、かつ、ウイルスも含むものとする。
【００２１】
ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の配列から６つの領域を選んで組み合わせた４種類のプライマーを用いて、鎖置換反応を利用して増幅させる方法である。対象となるＤＮＡは、約６５℃の反応温度において周期的な屈曲構造を繰り返し構成しながら伸長することによって増幅させることができる。ＬＡＭＰ法における複製工程の繰り返しとは、前記屈曲構造の形成数に基づくものとすることができる。ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅過程において、蛍光物質として例えばカルセインを汚染物質に添加しておくことで、ＤＮＡの増幅時間と共に強まるカルセインからの蛍光強度によって汚染物質中のＤＮＡ量を定量することができる。従って、ＬＡＭＰ法における複製工程の当初ＤＮＡ量が多ければ一定の蛍光強度に達するまでの時間が短くなり、ＤＮＡ量を当該時間によって定量することが可能となる。カルセインの励起には紫外線を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る洗浄評価方法によれば、生物由来の汚染物の残留に伴う洗浄評価を従来の蛋白質を抽出して洗浄評価するよりも約１０倍の高い精度で行うことができる。
【００２３】
本発明によれば、従来では検出できなかった蛋白質が変性するような高熱による洗浄を経た後の評価対象であっても、残留した汚染物を高い精度で検出して洗浄評価することができる。
【００２４】
また、対象となる汚染物は蛋白質に由来するものに限らず、多種の生体由来の汚染物の洗浄評価を行うことができる。従って、評価対象の使用目的にかかわらず洗浄評価を行うことができる。
【００２５】
さらに、本発明によれば、洗浄評価を従来よりも高精度に行うことができると共に、汚染物がヒト由来であるか、微生物由来であるかを特定できる。これにより、評価対象に感染症の原因となる細菌によって汚染されていた可能性の有無を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】サイクル数に対する蛍光強度の関係を示す増幅曲線の概略図である。
【図２】ＣＢＢ法に基づく吸光度に対する羊血清アルブミン濃度の検量線を示すグラフである。
【図３】希釈試料の羊血液量（希釈試料５．０ｍｌ中）とＣｔ値の平均値との関係を表すグラフである。
【図４】ＣＢＢ法に基づく蛋白質量に対するＣｔ値（サイクル数）の関係を示すグラフである。
【図５】羊血液に由来のＣｔ値とＤＮＡ量との検量線を示すグラフである。
【図６】羊血液量と換算ＤＮＡ量との関係を示すグラフである。
【図７】評価プレートの洗浄時間に対するＣｔ値の変化を示すグラフである。
【図８】評価プレートから抽出したＤＮＡ回収液１μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）の、評価プレートの洗浄時間に対する変化を示すグラフである。
【図９】各評価プレートから抽出された換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）の洗浄時間に対する変化を示すグラフである。
【図１０】評価対象の鉗子から得たＣｔ値を示すグラフである。
【図１１】評価対象の鉗子から抽出したＤＮＡ回収液１μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を示すグラフである。
【図１２】評価対象の鉗子から抽出された換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を示すグラフである。
【図１３】疑似汚染物が塗布されたステンレス板からＤＮＡを抽出して得たＣｔ値の平均値を、抽出液の種類ごとに比較したグラフである。
【図１４】疑似汚染物が塗布されたステンレス板からＤＮＡを抽出して得たＤＮＡ回収液１μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を、抽出液の種類ごとに比較したグラフである。
【図１５】疑似汚染物が塗布されたステンレス板からＤＮＡを抽出して得た換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を、抽出液の種類ごとに比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について詳しく説明する。本発明に係る洗浄評価方法は、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、複製工程を繰り返して増幅させ、増幅されたＤＮＡを定量することによって評価するものである。特に、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数を用いて洗浄評価すること、又は前記汚染物中に蛍光物質を添加した状態でＬＡＭＰ法によって増幅させ、ＤＮＡの増幅に伴って増強される前記蛍光物質からの蛍光強度を用いて洗浄評価することを特徴とする。
【００２８】
ＤＮＡとは、生体内に存在するデオキシリボ核酸をいう。本発明に用いられるＤＮＡは、細胞内の核内及びミトコンドリアに由来するもののいずれでも用いることができ、より好ましくはミトコンドリアに由来するＤＮＡを用いることが好ましい。核内のＤＮＡは各細胞に１つしかないものであるが、ミトコンドリアは細胞に１〜数千個存在しており、さらに、ミトコンドリア１個につき５〜６個のＤＮＡが存在する。従って、ミトコンドリア由来のＤＮＡを用いることで、核内由来のＤＮＡを用いるより場合よりも少量の汚染物であってもＤＮＡを感知することができ、洗浄評価方法の感度の向上を図ることができるからである。
【００２９】
ＰＣＲとは、ポリメラーゼ連鎖反応をいう。ＰＣＲによれば、汚染物中に含まれていたＤＮＡを、プライマー及び酵素ポリメラーゼの働きによって複製することができる。そして、リアルタイムＰＣＲは、前記ＤＮＡをＰＣＲによって増幅させると共に蛍光物質をＤＮＡ中において付加させ、増幅後のＤＮＡと付加した蛍光物質から得られる蛍光強度が所定強度に達するまでのサイクル数によって、ＤＮＡ量を評価する方法をいう。
【００３０】
前記ＤＮＡに付加された蛍光物質から得られる蛍光強度は、ＤＮＡのサイクル数の増加に伴って強くなり、図１に示すような変曲点Ｐを有する曲線を描く。変曲点Ｐは、ＤＮＡが指数対数的に増幅していく領域から、ＤＮＡの増幅効率が減衰して指数対数的には増幅しなくなってきた領域への境界点をいう。ここで、変曲点Ｐにおける蛍光強度を１とした場合に、蛍光強度が１以下である特定の蛍光強度Ｔに対応するサイクル数をＣｔ値とする。
【００３１】
本発明の評価対象は、生体由来の汚染物が付着したものであれば特に限定されないが、より好ましい評価対象は医療器具である。医療器具は、治療や手術に用いられた際に血液などの汚染物が付着するので、殺菌消毒工程、洗浄工程、滅菌工程を経て再使用されることが通常行われている。しかし、汚染物が医療器具表面に残留したまま使用すると、再使用時における医療器具の円滑な作動性が維持できなくなるだけでなく、感染症を発生させる等の重大な事故の原因となる恐れがある。従って医療器具は、十分な洗浄とその洗浄の評価を行うことが重要となる。このため、以下の本発明の説明において、評価対象を医療器具として説明する。なお、本発明において「医療器具」とは、手術、検査、治療等で使用されたものだけでなく、生体由来の汚染物が付着している可能性がある衣服等も含まれる。
【００３２】
医療器具としては、手術、検査、治療等に用いられるものであれば特に限定されず、例えば、鑷子、鉗子、剪刀、吸引管、内視鏡、カテーテル、注射針等が挙げられる。
【００３３】
増幅させるＤＮＡには、評価対象である医療器具等にアルカリ性溶液などの抽出液を接触させることによって、抽出液中に評価対象に付着していた生体由来の汚染物を溶出させて得た汚染物溶出液に含まれるものを用いる。ここで、前記生体由来の汚染物は、血液、リンパ液、唾液、分泌液、組織液、その他の体液、及び骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００３４】
医療器具から汚染物を抽出する方法としては、抽出液が注入された袋の中に医療器具を入れて抽出液と医療器具とを接触させ、この袋を恒温水槽に投入して抽出する方法が好ましい。前記抽出液としては、界面活性剤、アルカリ性の液体、酸性の液体、またはイオン交換水を用いることができるが、特にアルカリ性溶液であることが好ましい。なお、抽出液がアルカリ性溶液である場合は、前記袋には耐アルカリ性の袋を用いる。
【００３５】
ここで、医療器具のうち、汚染物が付着した恐れのある部分であって洗浄評価を必要とする部分を洗浄溶液にさらせばよい。医療器具全体を抽出液に浸漬させることができればより好ましい。その医療器具全体における洗浄評価をすることができるからである。医療器具を抽出液に浸漬させる態様として、容器や袋等に、所定量の洗浄溶液を貯留し、この中に、医療器具を入れる態様等が挙げられる。抽出液に浸漬された医療器具が入れられた容器や袋等を振盪させてもよい。
【００３６】
なお、医療器具を洗浄溶液に接触させ得る操作であれば、洗浄溶液に医療器具を浸漬することに限定されるものではない。例えば、前記袋に入れることができない大きさの医療器具である場合には、前記抽出液を医療器具の全体に吹き付ける等して接触させた後、医療器具の表面を伝って下方から滴下する汚染物溶出液を回収容器に貯留して回収することによって抽出する方法であっても好ましい。このように医療器具の表面を伝って滴下する汚染物溶出液を回収容器に貯留する方法であれば、評価対象である医療器具の大きさにかかわらず洗浄評価を行うことができる。
【００３７】
なお、上記のいずれの抽出方法にも医療器具以外の評価対象物を用いることもできる。
【００３８】
抽出液のうち、アルカリ性溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム等を溶媒に溶かしたものが挙げられ、これらを単独で又は２種以上を混合して使用することができる。これらの中でも、蛋白質の抽出を良好に行う観点から、水酸化ナトリウム、若しくは水酸化カリウムが好ましい。
【００３９】
アルカリ性溶液の溶媒としては、例えば、水道水、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を混合して使用することができる。アルカリ性溶液の濃度としては、蛋白質の抽出を良好に行う観点から、好ましくは０．０５〜２Ｎであり、より好ましくは０．１〜１Ｎであり、特に好ましくは０．１５〜０．７５Ｎである。
【００４０】
抽出温度としては、好ましくは２５〜９０℃であり、より好ましくは３０〜８０℃であり、特に好ましくは４０〜７０℃である。また、抽出時間としては、前記袋内のアルカリ性溶液に医療器具を浸漬させて汚染物を抽出する場合は、好ましくは２０分以上であり、より好ましくは２０〜６０分である。
【００４１】
洗浄溶液の使用量としては、評価対象となる医療器具の大きさ、表面積、使用状況等に応じて調節すればよく、特に限定されるものではない。
【００４２】
汚染物の抽出工程は、使用後の医療器具について洗浄を終えた段階で行ってもよいし、洗浄後の滅菌工程が済んだ段階で行ってもよい。
【００４３】
本発明に係る洗浄評価方法は、前記サイクル数と汚染物中の蛋白質量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の蛋白質量によって評価するものであっても好ましい。
【００４４】
この洗浄評価方法によれば、前記汚染物の抽出方法と同様の方法によって抽出された蛋白質を蛋白質染色剤に接触させたうえで吸光度測定により算出した蛋白質量と、サイクル数との相関から得られる検量線を導き出したうえで、従来の方法では検出することが困難だった微量の評価対象に残留した汚染物を、蛋白質量として提示して評価することができる。
【００４５】
前記サイクル数と汚染物中の蛋白質量との相関から得られる検量線を導くために用いられる蛋白質染色剤としては、蛋白質と化学量論的に結合して発色するものであれば特に限定されず、例えば、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０、アミドブラック１０Ｂ、アシッドオレンジ１２、バッファローブラック、オレンジＧ、ブロモフェノールブルー等の酸性色素；サフラニンＯ等の塩基性色素；ビシコニン酸等のキレート色素；エオシンＹ等の蛍光色素等が挙げられる。これらの中でも、検出精度をより良好にする観点から、蛋白質との結合性に特に優れるクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０が好ましく用いられる。このクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０は、蛋白質と結合すると赤色（吸収波長：４６５ｎｍ）から青色（吸収波長：５９５ｎｍ）に変化するものであるが、蛋白質との結合は約２分間で平衡になり、その結合物質は室温で約１時間は安定な分散状態を維持するので、後述する吸光度測定を迅速、かつ、正確に行うことができるという利点も備えている。
【００４６】
また、蛋白質と蛋白質染色剤との接触工程において、蛋白質染色剤は、水、アルコール等の溶媒に溶解させた状態で使用するのが好ましい。この蛋白質染色剤溶液は、蛋白質染色剤として酸性色素を用いる場合は、酢酸、燐酸、硫酸等の酸成分を添加して、ｐＨ０．５〜４とすることが好ましく、蛋白質染色剤溶液として塩基性色素を用いる場合は、酢酸等の弱酸成分等を添加して、ｐＨ３〜８とすることが好ましい。なお、蛋白質染色剤溶液は、市販品を用いてもよく、例えば、上記クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の溶液である、ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｃｏｏｍａｓｉｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（商品名）等が挙げられる。
【００４７】
蛋白質染色剤の使用量としては、検出対象となる蛋白質の種類、量等に応じて調節すればよく、特に限定されるものではない。
【００４８】
ここで、汚染物溶出液と蛋白質染色剤とを接触させる態様としては、具体的には、上述した抽出工程で得られた汚染物溶出液の一部又は全部に、所定量の蛋白質染色剤を添加する態様等が挙げられるが、所定量の汚染物溶出液と蛋白質染色剤とを接触させ得る操作であれば特に限定されるものではない。
【００４９】
こうして、汚染物溶出液と蛋白質染色剤とを接触させた接触液の特定波長における吸光度を測定することにより、接触液中の蛋白質量を導き出すことができる。
【００５０】
前記吸光度測定による蛋白質量の検出方法は、まず上述した抽出条件、汚染物溶出液と蛋白質染色剤との接触条件等を一定にして蛋白質染色剤に特有の吸収波長における吸光度を測定する。つぎに、当該吸光度を、予め作成した同じ蛋白質染色剤によって測定した吸光度と蛋白質量との相関（例えば、検量線、相関数式等）と対比することにより、付着蛋白質量を定量するものである。
【００５１】
また、本発明に係る洗浄評価方法は、前記サイクル数と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づいて得られる前記汚染物中の換算ＤＮＡ量によって評価するものであっても好ましい。
【００５２】
この洗浄評価方法によれば、従来の方法では検出することが困難だった微量の評価対象に残留した汚染物を、換算ＤＮＡ量として提示することで洗浄評価することができる。
【実施例】
【００５３】
以下において、実施例に基づき本発明について詳しく説明することとする。
【００５４】
＜比較例：ＣＢＢ法に基づく吸光度に対する羊血清アルブミン濃度の検量線の作成＞
１−１．ＣＢＢ法に基づく吸光度に対する羊血清アルブミン濃度の検量線の作成
蛋白質染色剤として、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（蛋白質と結合した場合、波長５９５ｎｍに吸収極大を有する）を使用した場合の蛋白質の検出方法（以下、ＣＢＢ法という。）について説明する。
【００５５】
２ｍｇ／ｍｌの羊血清アルブミン溶液（和光純薬工業株式会社製）を、表１に示す各濃度となるように、０．２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で希釈し、各希釈液を得た。次いで、９５％エタノール５０ｍｌに、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０を１００ｍｇ溶解し、この溶液に８５％（ｗ／ｖ）の燐酸１００ｍｌを加え、更に水を加えて全体量を１ｌとし、ｐＨ１．４３（２５℃）のクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０溶液を調製した。このクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０溶液３ｍｌ中に、前記各希釈液１ｍｌを添加して、２５℃で２０分間反応させて抵触液を得た後、得られた接触液の５９５ｎｍにおける吸光度を吸光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製、ＵＶ−２４５０  ＵＶ−ＶＩＳＩＢＬＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ）を用いて測定した。表１にその結果を示し、図２に、表１の測定結果から作成した検量線を示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
＜ＣＢＢ法に基づく蛋白質量の測定＞
２−１．全羊血希釈試料の調製
生体由来の汚染物としてヘパリン処理羊全血液（(株)日本生物材料センター製）からなる全羊血１００μｌを５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを原液とした。原液５００μｌを４．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを羊血１０μｌ試料とした。なお、当該「羊血１０μｌ試料」とは、試料５．０ｍｌ中に全羊血が１０μｌ含まれている試料を意味し、この「２−１．全羊血希釈試料の調製」中で調製された希釈試料の名称は同様とする。前記羊血１０μｌ試料５００μｌを４．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを羊血１μｌ試料とした。前記羊血１０μｌ試料５００μｌ及び羊血１μｌ試料５００μｌをそれぞれ４．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを、それぞれ羊血０．１μｌ試料及び羊血０．０１μｌ試料として調製した。また、前記羊血１０μｌ試料１．５ｍｌを３．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを羊血３μｌ試料とした。前記羊血１μｌ試料１．５ｍｌを３．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを羊血０．３μｌ試料とした。同様に前記羊血０．１μｌ試料１．５ｍｌを３．５ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合したものを羊血０．０３μｌ試料として調製した。なお、全羊血を含まない０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を陰性対照試料（羊血０μｌ試料）とした。
【００５８】
また、前記原液を４液調製し、それぞれについて前記各希釈試料を調製することによって、各羊血液量についての希釈試料を４試料ずつ調製した。
【００５９】
２−２．汚染物抽出工程
調製した羊血液量ごとの各希釈試料を、それぞれチャック付きポリエチレン製のポリ袋（外形寸法：１７０ｍｍ×１２０ｍｍ、厚さ：０．０４ｍｍ）に投入し、５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。
【００６０】
２−３．蛋白質量の測定
次いで、「１−１．ＣＢＢ法に基づく吸光度に対する羊血清アルブミン濃度の検量線の作成」で調製したクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０溶液３ｍｌ中に、「２−２．汚染物抽出工程」を行った各希釈試料１ｍｌを添加して、２５℃で２０分間反応させて接触液を得た後、得られた接触液の５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた吸光度を表２及び図２に示す。
【００６１】
【表２】
2017216983.tif 000004
【００６２】
各接触液から得られた吸光度に基づいて図２の検量線から蛋白質量（アルブミン質量）を得た。また羊血液量ごとに４液ずつ調製されてなる各接触液から得られた蛋白質量の平均値（μｇ）、標準偏差、及び変動係数（％）を表３に示す。
【００６３】
【表３】
2017216983.tif 000005
【００６４】
表３の結果から、ＣＢＢ法による蛋白質量の測定では、希釈試料５．０ｍｌ中の羊血液量０．１μｌ（羊血０．１μｌ試料）以下の羊血液量である希釈試料に基づいて得られる変動係数が２０を超え、羊血液量０．０３μｌ（羊血０．０３μｌ試料）以下の羊血液量である希釈試料にあっては測定値がマイナスになるなど、有意な蛋白質量を測定できていないと考えられる。従って、ＣＢＢ法による洗浄評価方法の検出限界は羊血０．３μｌ試料までと評価することができる。
【００６５】
＜実施例１：リアルタイムＰＣＲに基づくＣｔ値の測定＞
３−１．全羊血希釈試料の調製
「２−１．全羊血希釈試料の調製」に準じて作業を行い、生体由来の汚染物としてヘパリン処理羊全血液（(株)日本生物材料センター製）からなる全羊血を含む羊血１０μｌ試料、羊血３μｌ試料、羊血１μｌ試料、羊血０．３μｌ試料、羊血０．１μｌ試料、羊血０．０３μｌ試料、羊血０．０１μｌ試料、及び全羊血を含まない陰性対照試料（羊血０μｌ試料）を調製した。また４液調製した原液（「２−１．全羊血希釈試料の調製」参照）から、それぞれについて前記各希釈試料を調製することによって、各羊血液量についての希釈試料を４試料ずつ調製した。なお、この調整工程で使用した０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液は本発明の実施の形態で述べた前記抽出液、希釈試料は同じく前記汚染物溶出液に相当する。
【００６６】
３−２．汚染物抽出工程
調製した各希釈試料を、それぞれチャック付きポリエチレン製のポリ袋（外形寸法：１７０ｍｍ×１２０ｍｍ、厚さ：０．０４ｍｍ）に投入し、５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。
【００６７】
３−３．Ｃｔ値の測定
３−３−１
「３−２．汚染物抽出工程」を完了した各希釈試料をそれぞれ２００μｌずつ取り、それぞれの希釈試料に２００μｌの０．２Ｎ塩酸水溶液を混合して中和した。中和した後、各試料から１００μｌずつを取り、核酸抽出キット（キアゲン社製ＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）によりＤＮＡを分離後、遠心分離器によってＤＮＡの抽出を行った。回収されたＤＮＡは５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に混合してＤＮＡ回収液とした。
【００６８】
３−３−２
ＤＮＡ回収液から取った１０μｌに対して、滅菌水１．７２５μｌ、脊椎動物ミトコンドリアＤＮＡ用プライマー（Ｈ２７１４）を０．２μｌ、プライマーＨ２５１３を０．２μｌ、リアルタイムＰＣＲ用ＤＮＡ増幅キット中の蛍光物質（ＳＹＢＡＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を１２．５μｌ、及びＲｅｆｅｒｅｃｅ  Ｄｙｅ（ＲＯＸ）を１／５００に希釈した溶液を０．３７５μｌ加え、全体で２５μｌの反応液を作成した。前記脊椎動物ミトコンドリアＤＮＡ用プライマーは、Kitanoらの文献(International  Journal  of  Legal  Medicine  121,423-427(2007))に記載されている１６ＳｒＤＮＡ領域のユニバーサル・プライマー、Ｌ２５１３（５´−ＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣ−３´）およびＨ２７１４（５´−ＣＴＣＣＡＴＡＧＧＧＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＴＴ−３´）（５０μＭ）を使用した（ライフテクノロジージャパン社製）。
【００６９】
３−３−３
前記反応液をリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｍｘ３０００Ｐ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ）にセットし、２分のボイル（９５℃）の後、（ａ）９５℃を１０秒、（ｂ）６０℃での再結合を２０秒、（ｃ）さらに７２℃の伸長反応を３０秒行った時点で１サイクル完了とした。１サイクルが完了するとリアルタイムＰＣＲ装置内で前記蛍光物質からの蛍光強度を、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍ（ＦＡＭ／ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉフィルターを使用。）で測定した。なお、参照用蛍光色素にはＲＯＸ（ＲＯＸ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）フィルターを使用。）を用いた。蛍光強度測定には、ＤＮＡの増幅過程においてＤＮＡの二本鎖に入り込ませた前記蛍光物質からの蛍光強度を測定するインターカレーション法を用いた。なお、この蛍光物質がＤＮＡの二本鎖に入り込んだ状態も蛍光物質がＤＮＡへ付加された状態に含む。さらに、前記（ａ）〜（ｃ）の操作を４０サイクル繰り返し、サイクルごとの蛍光強度を測定してサイクル数に対する蛍光強度を示す図１のような増幅曲線を作成した。
【００７０】
３−３−４
得られた増幅曲線から、変曲点Ｐにおける蛍光強度を１としたときに、０．３２５となる蛍光強度Ｔのサイクル数をＤＮＡ回収液１μｌあたりのＣｔ値として算出した。
【００７１】
３−４．実験結果
得られたＣｔ値、及び「３−１．全羊血希釈試料の調製」で各羊血液量について４液ずつ調製した試料からそれぞれ得た前記反応液に基づくＣｔ値の平均値、標準偏差、及び変動係数（％）を算出し、表４に示す。また、測定対象となった希釈試料の羊血液量（希釈試料５．０ｍｌ中）とＣｔ値の平均値との関係を表すグラフを図３に示す。
【００７２】
【表４】
2017216983.tif 000006
【００７３】
表４の結果から、リアルタイムＰＣＲ法を用いたＣｔ値に基づく洗浄評価方法では、全ての試料において変動係数が最大でも２前後に留まっていた。また、全ての試料から得られたＣｔ値の標準偏差も１より低いため、十分に精度の高い数値が得られたと考えられる。但し、羊血０．０１μｌ試料から得られた平均値が陰性対照試料（羊血０μｌ試料）から得られた平均値とほぼ同一であったことから、羊血０．０１μｌ試料から得られた数値自体は有効な値ではない可能性が高い。このことから、リアルタイムＰＣＲ法を用いた洗浄評価方法を採用した場合の参照できる数値が検出できる検出限界は羊血０．０３μｌ試料まで（Ｃｔ値の平均値で約３０まで）と評価することができる。一方で、ＣＢＢ法での評価とは異なり、０．０１μｌ試料よりも羊血液量が少ない試料においても、汚染物量が陰性対照試料と同程度まで洗浄されているとの評価は可能である。
【００７４】
表３及び表４の結果から、リアルタイムＰＣＲを用いた洗浄評価方法によれば、比較例であるＣＢＢ法を用いた場合よりも約１０倍の精度で洗浄評価を行うことが可能であることがわかった。また、前記検出限界以下の測定値によっても、評価対象が汚染物と接触する前の状態と同程度まで洗浄ができているとの評価を行うことが可能であることもわかった。
【００７５】
さらに表４から得た図３のグラフから、希釈試料中の羊血液量（希釈試料５．０ｍｌ中）とＣｔ値とは相関係数が約０．９９となる高い相関を有することが分かった。従って、この関係から、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによる複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数によって洗浄評価を行うことが可能であることがわかった。
【００７６】
さらに、表３及び表４から羊血０．３μｌ試料、羊血１．０μｌ試料、羊血３．０μｌ試料、及び羊血１０．０μｌ試料における蛋白質量に対するＣｔ値（サイクル数）をグラフとして図４に示した。
【００７７】
図４から、蛋白質量とＣｔ値とは相関係数が約０．９９となる高い相関を有することが分かった。この結果から、未知の生体由来の汚染物であって、特に汚染物が蛋白質であることが明らかな場合に、サイクル数と汚染物中の蛋白質量との相関に基づき、前記汚染物中の蛋白質量によって洗浄評価を行うことが可能であることがわかった。
【００７８】
＜リアルタイムＰＣＲに基づく換算ＤＮＡ量での洗浄評価＞
次に、予め吸光度からＤＮＡ量が２．０×１０７個（ｃｏｐｉｅｓ）であることが分かっている羊血液試料を用意した。この試料から１０倍希釈を繰り返すことにより、２．０×１０６個、２．０×１０５個、２．０×１０４個、２．０×１０３個である試料を調製した。これらの調製試料を、前述の「３−３．Ｃｔ値の測定」における希釈試料（但し、「３−２．汚染物抽出工程」は行わない。）に置きかえて同様の方法を用いてＣｔ値を測定した。測定結果から得られたＣｔ値とＤＮＡ量との検量線を図５に示す。
【００７９】
図５から、羊血液量に対応して得られたＣｔ値と羊血液試料中のＤＮＡ量には高い相関があることが確認できた。当該相関関係を式１に示す。
【００８０】
【数１】
2017216983.tif 000007
【００８１】
表４において４液ずつ調製された陰性対照試料、羊血０．０１μｌ試料、羊血０．０３μｌ試料、羊血０．１μｌ試料、羊血０．３μｌ試料、羊血１．０μｌ試料、羊血３．０μｌ試料、及び羊血１０．０μｌ試料に対応するＣｔ値を式１に代入してリアルタイムＰＣＲの測定試料中（１．０μｌ）の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を算出し、続けて前記換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を５０００倍することにより希釈試料（５．０ｍｌ）中に含まれていた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ）を算出して表５に示した。また、検出限界である羊血０．０３μｌ試料以上の羊血液量を含む試料の羊血液量と表５に示した対応する換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ）との関係をグラフに示したものを図６に示す。
【００８２】
【表５】
2017216983.tif 000008
【００８３】
表５及び図６から、各希釈試料の羊血液量とリアルタイムＰＣＲ法で測定したＣｔ値（サイクル数）から求めた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ）とは相関係数が約０．９９となる高い相関を有することが分かった。この相関関係を用いれば、羊由来の汚染物であって、特に汚染物が蛋白質であるかどうか不明であっても、ＤＮＡを有する汚染物である場合には、生体由来の汚染物に含まれるＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによる複製工程を繰り返して増幅させ、前記複製工程のサイクル数と前記汚染物中のＤＮＡ量との相関に基づき、前記汚染物中のＤＮＡ量によって洗浄評価を行うことが可能であることがわかった。また、汚染物中に含まれていたＤＮＡ量を評価の目安とすることで、測定作業の技術的知識が十分でない者にも理解しやすい目安を提示しながら洗浄評価することが可能となった。また、この評価方法は羊以外の生体由来の汚染物に対しても、その生体由来の汚染物に対応する検量線を作成することによって、同様に使用することができる。
【００８４】
なお、リアルタイムＰＣＲの測定試料中（１．０μｌ）の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を５０００倍して求めた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ）は、実際に洗浄評価を行う現場においては評価対象となった器具、器械等に残留していた汚染物に含まれていたＤＮＡ量に相当するため、以下の実施例においては「換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）」と表記することがある。
【００８５】
＜実施例２：生体由来汚染物を塗布したステンレス板のリアルタイムＰＣＲに基づく洗浄評価＞
４−１．疑似汚染物の塗布
縦７５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．４ｍｍの直方体薄板状のステンレス板に疑似汚染物（ヘパリン処理羊血液（(株)日本生物材料センター製）：１％硫酸プロタミン液＝１０：１混合物）５０μｌを塗布し、２４時間室温において乾燥させたものを所定数量用意した。
【００８６】
４−２．洗浄工程
前記疑似汚染物を塗布したステンレス板を、４０℃の１％中性蛋白質分解酵素洗浄剤（株式会社イヌイメデイックス製  Ｍ−ＥＸ２）を溜めた洗浄用容器に投入し、所定の洗浄時間経過後取り出した。洗浄時間は、３ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎとした。また、各洗浄時間で洗浄したステンレス板を５枚ずつ作製した。さらに、前記疑似汚染物を塗布した後、洗浄剤での洗浄を行わない洗浄時間０ｍｉｎのステンレス板も５枚作成した。それぞれのステンレス板を、水を溜めたすすぎ用水槽に２回出し入れしてすすぎを行い、評価プレート０、評価プレート３、評価プレート１０、及び評価プレート２０とした。
【００８７】
４−３．対照試料
さらに、対照試料として、前記ステンレス板に対して「４−１．疑似汚染物の塗布」を行わない状態の対照試料ｂ１と、何の試料も入れない０．２Ｎ水酸化ナトリウム抽出液のみの対照試料ｂ２を用意した。
【００８８】
４−４．汚染物抽出工程
抽出液として０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍｌ入れたチャック付きポリエチレン製のポリ袋（外形寸法：１７０ｍｍ×１２０ｍｍ、厚さ：０．０４ｍｍ）に、前記洗浄工程で用意した評価プレート０〜２０、及び対照試料ｂ１を１枚ずつ投入し、５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。対照試料ｂ２も同様に５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。
【００８９】
４−５．Ｃｔ値の測定
「４−４．汚染物抽出工程」の完了後ポリ袋からステンレス板を取り出し、ポリ袋内に残留した液体を汚染物溶出液として１００μｌ取り出した。汚染物溶出液１００μｌに、１００μｌの０．２Ｎ塩酸水溶液を混合して中和した。中和後の溶液について、核酸抽出キット（キアゲン社製ＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）によりＤＮＡを分離後、遠心分離器によってＤＮＡの抽出を行った。回収されたＤＮＡは５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に混合してＤＮＡ回収液とした。このＤＮＡ回収液について、前記「３−３．Ｃｔ値の測定」の３−３−２〜３−３−４に従ってＣｔ値を測定した。
【００９０】
４−５．実験結果
得られたＣｔ値、及び５枚ずつ調製した評価プレート０〜２０からそれぞれ得たＣｔ値の平均値、及び標準偏差を算出し、表６に示す。また、表６から得られたＣｔ値の平均値をグラフに示したものを図７に示す。なお、図７中の線分はバラツキの範囲を示す。
【００９１】
【表６】
2017216983.tif 000009
【００９２】
表６より、洗浄時間０分、及び３分の評価プレートから得られたＣｔ値の平均は３０以下であり、時間に対する変化も明らかであるので、洗浄時間に対する洗浄の効果を定量的に判定できると考えられる。
【００９３】
さらに、洗浄時間１０分〜２０分ではＣｔ値の平均値がさらに上昇して飽和しているので洗浄時間３分の場合よりも洗浄の効果が現れていると考えられる。但し、Ｃｔ値の平均値が３０を超えているため、定量的な評価は難しいと思われる。しかし、洗浄時間１０分〜２０分のＣｔ値の平均は、対照試料ｂ１、ｂ２から得たＣｔ値ともほぼ同程度となったことから、評価プレートが疑似汚染物を塗布する前の状態まで洗浄できている、若しくは何の試料も入れない０．２Ｎ水酸化ナトリウム抽出液と同程度まで洗浄できている、と評価できるものと考えられる。
【００９４】
さらに、表６のＣｔ値を前記式１に当てはめることによりＤＮＡ回収液1μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を算出した。得られた結果を表７及び図８に示す。なお、図８中の線分はバラツキの範囲を示す。
【００９５】
【表７】
2017216983.tif 000010
【００９６】
さらに表７の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）の各値を５０００倍することにより、各評価プレートの全体から抽出された疑似汚染物由来の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を算出した。得られた値を表８及び図９に示す。
【００９７】
【表８】
2017216983.tif 000011
【００９８】
表８の結果から、本発明に係る評価方法を用いることによって、洗浄後の評価プレート（評価対象）に残留していた具体的な換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を一覧に表すことができた。特に、表６におけるＣｔ値との比較から洗浄時間３分までの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）及び換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）は定量的にも評価でき、洗浄時間１０分以上の評価プレートから得られた値についても十分に清潔な対照試料（ｂ１）における値と比較することにより、十分な洗浄効果が得られていることを把握するための目安として利用できる。特に、換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）よれば、評価対象に付着していた汚染物の量を直接的に捉えることができ、評価工程に関する知識が十分にない者でも洗浄評価の結果を理解することが容易である。
【００９９】
この検討により、本発明の方法を用いれば、実際に汚染物が付着した物質を評価対象として洗浄評価することができることが分かった。
【０１００】
また、汚染物中に含まれていた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を評価の目安とすることで、測定作業の技術的知識が十分でない者にも理解しやすい目安を提示しながら洗浄評価することが可能となった。
【０１０１】
＜実施例３：生体由来汚染物を塗布した鉗子のリアルタイムＰＣＲに基づく洗浄評価＞
５−１．疑似汚染物の塗布
実際の医療現場で用いられる鉗子を評価対象として洗浄評価を行った。鉗子のボックスロック部分（２本の腕部材が交差して枢着されている部分）に「４−１．疑似汚染物の塗布」で用いた疑似汚染物を５０μｌ塗布し、２４時間室温において乾燥させたものを５本用意した。
【０１０２】
５−２．洗浄工程
評価用鉗子を、洗浄工程及び滅菌工程にかけて洗浄し、評価用鉗子とした。洗浄は、表９の上段に示す条件からなる洗浄工程と、ウォッシャーディスインフェクター（シャープ株式会社製  ジェットウォッシャー超音波洗浄装置ＭＵ−５１００）を使用して表９の下段に示す条件からなる滅菌工程とによって行った。なお、滅菌工程に用いた洗浄剤は０．３％中性蛋白質分解酵素洗浄剤（株式会社イヌイメデイックス製  Ｍ−ＥＸ１）である。
【０１０３】
【表９】
2017216983.tif 000012
【０１０４】
５−３．対照試料
さらに対照試料として、「５−１．疑似汚染物の塗布」のみ行い「５−２．洗浄工程」は行わない鉗子を対照鉗子ｂ３とし、「５−１．疑似汚染物の塗布」を行う前に準備した何も処理していない状態の鉗子を対照鉗子ｂ４とし、各５本ずつ用意した。
【０１０５】
５−４．汚染物抽出工程
抽出液として０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍｌ入れたチャック付きポリエチレン製のポリ袋（外形寸法：１７０ｍｍ×１２０ｍｍ、厚さ：０．０４ｍｍ）に、前記評価用鉗子、対照鉗子ｂ３、及び対照鉗子ｂ４を１本ずつ投入し、５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。前記ポリ袋内の０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液は、鉗子が入れられた後前記ポリ袋内が排気され、ポリ袋の内壁と鉗子の全体を薄く覆うことで鉗子に残存する疑似汚染物を抽出させることができる。
【０１０６】
５−５．Ｃｔ値の測定
「５−４．汚染物抽出工程」の完了後ポリ袋から鉗子を取り出し、ポリ袋内に残留した液体から汚染物溶出液として１００μｌ取り出した。この汚染物溶出液について、前記「４−５．Ｃｔ値の測定」に従ってＣｔ値を測定した。
【０１０７】
５−６．実験結果
得られたＣｔ値、及び５つずつ調製した評価用鉗子、及び対照鉗子ｂ３、ｂ４から得た汚染物溶出液に基づくＣｔ値の平均値、及び標準偏差を算出し、表１０に示す。また、表１０から得られたＣｔ値の平均値をグラフに示したものを図１０に示す。なお、図１０中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１０８】
【表１０】
2017216983.tif 000013
【０１０９】
表１０、及び図８より、評価用鉗子は、対照鉗子ｂ３よりも明らかに大きいＣｔ値を示し、疑似汚染物を塗布する前の状態である対照鉗子ｂ４と同等のＣｔ値を示すことが分かった。評価用鉗子のＣｔ値の平均値は３０を超えているので定量的な評価は難しいが、対照鉗子ｂ４のＣｔ値の平均値と同程度であることから、前記洗浄工程を行うことにより、鉗子について疑似汚染物が付着する前の状態まで洗浄できていることが評価できた。
【０１１０】
さらに、表１０のＣｔ値を前記式１に当てはめることによりＤＮＡ回収液1μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を算出した。得られた結果を表１１及び図１１に示す。なお、図１１中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１１１】
【表１１】
2017216983.tif 000014
【０１１２】
さらに表１１の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）の各値を５０００倍することにより、評価用鉗子、及び対照鉗子ｂ３、ｂ４の全体から抽出された疑似汚染物由来の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を算出した。得られた値を表１２及び図１２に示す。なお、図１２中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１１３】
【表１２】
2017216983.tif 000015
【０１１４】
表１２の結果から、本発明に係る評価方法を用いることによって、鉗子に付着していた汚染物の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を一覧に表すことができた。特に、表６におけるＣｔ値との比較から、一度疑似汚染物を塗布し、「５−２．洗浄工程」による洗浄を行った評価用鉗子は、疑似汚染物を塗布する前の状態である対照鉗子ｂ４と同程度の汚染状態まで洗浄できていると評価することができた。表１２で評価用鉗子から得られた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）の値についても十分に清潔な対照試料（ｂ４）における値と比較することにより、十分な洗浄効果が得られていることを把握するための目安として利用できる。
【０１１５】
この検討により、本発明の方法を用いれば、実際の汚染物が付着した医療器具を評価対象として洗浄評価することができることが分かった。
【０１１６】
また、汚染物中に含まれていた換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を評価の目安とすることで、測定作業の技術的知識が十分でない者にも理解しやすい目安を提示しながら洗浄評価することが可能となった。
【０１１７】
＜実施例４：抽出液の検討＞
６−１．抽出液の調製
評価対象を洗浄するための抽出液の種類について検討する。検討対象とした抽出液は、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ／０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテル、１％ポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテル／０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％クエン酸、１％メディポールＥＸ３（中性蛋白質分解酵素洗浄剤（株式会社イヌイメデイックス製）、１％メディポールＺ（アルカリ性洗浄剤（株式会社イヌイメデイックス製））、０．２Ｎ  ＮａＯＨ、イオン交換水、及びＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（対照）とした。前記各抽出液をチャック付きポリエチレン製のポリ袋（外形寸法：１７０ｍｍ×１２０ｍｍ、厚さ：０．０４ｍｍ）に入れたものを、１種の抽出液につき３つずつ用意した。
【０１１８】
６−２．疑似汚染物の塗布
評価対象として、縦７５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．４ｍｍの直方体薄板状のステンレス板を複数用意し、このステンレス板にそれぞれ「４−１．疑似汚染物の塗布」で用いた疑似汚染物を５０μｌ塗布し、２４時間室温において乾燥させたものを抽出液評価試料とした。
【０１１９】
６−３．汚染物抽出工程
「６−１．抽出液の調製」で用意した各ポリ袋中に前記抽出液評価試料を１枚ずつ投入して各洗浄溶液中に浸漬させ、５０℃の恒温槽において、３０分間加熱処理を行った。
【０１２０】
６−４．Ｃｔ値の測定
「６−３．汚染物抽出工程」の完了後ポリ袋からステンレス板を取り出し、ポリ袋内に残留した液体から汚染物溶出液として１００μｌ取り出した。この汚染物溶出液について、前記「４−５．Ｃｔ値の測定」に従ってＣｔ値を測定した。
【０１２１】
６−５．実験結果
得られたＣｔ値、及び抽出液の種類ごとに得たＣｔ値の平均値、及び標準偏差を算出し、表１３に示す。また、表１３から得られたＣｔ値の平均値をグラフに示したものを図１３に示す。なお、図１３中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１２２】
【表１３】
2017216983.tif 000016
【０１２３】
表１３及び図１３のグラフから、対照としたＴＥ  ＢｕｆｆｅｒのＣｔ値の平均値は３０．０２でありわずかに３０を超える値であった。これに対し、検討対象とした抽出液から得られたＣｔ値の平均値は、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒよりも低い値が得られた。これにより、検討対象とした抽出液は、本発明に係る評価方法に使用する抽出液として有効であると判断できるものであった。また、この結果から抽出液として特に好ましいのは、Ｃｔ値の平均値が２５を下回った１％ＳＤＳ、１％ＳＤＳ／０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％クエン酸、１％メディポールＥＸ３、１％メディポールＺ、０．２Ｎ  ＮａＯＨである。
【０１２４】
さらに、表１３のＣｔ値を前記式１に当てはめることにより抽出液の種類ごとの汚染物溶出液1μｌあたりの換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）を算出した。得られた結果を表１４及び図１４に示す。なお、図１４中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１２５】
【表１４】
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【０１２６】
さらに表１４の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ−ｋｉｔ抽出液）の各値を５０００倍することにより、抽出液の種類ごとの汚染物溶出液由来の換算ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／器械）を算出した。得られた値を表１５及び図１５に示す。なお、図１５中の線分はバラツキの範囲を示す。
【０１２７】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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