(57)【要約】      （修正有）【課題】ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為の技術の提供。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４を検出し、それ以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さない、核酸増幅用プライマー。前記プライマーがＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴの塩基配列とＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＴＴＣＧの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドを組み合わせて核酸増幅に用いる核酸増幅用プライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為の、請求項４に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項６】
前記ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さない、請求項５に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項７】
前記ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応を示さない、請求項５又は６に記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キット。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為の、請求項８に記載の核酸増幅用キット。
【請求項１０】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の前記試料中における有無を判断することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出方法。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、前記試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の量を、前記処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、オリゴヌクレオチドに関する。より詳しくは、本技術は、特定の配列を有するオリゴヌクレオチド及び当該オリゴヌクレオチドからなる核酸増幅用プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であり、腸内細菌叢を構成する主要な菌の１つである。ビフィズス菌は、ヒトでは特に離乳前の乳児腸管内に多く生息しており、乳児の腸内環境を良好に維持することに貢献していると考えられている。また、ビフィズス菌は、乳糖やブドウ糖を分解して乳酸と酢酸を産生することによって、大腸の蠕動運動を促進させ、大腸菌やウェルシュ菌などの有害菌を抑制し、さらに、腐敗産物を抑制するなど、便性を適性に保つことに貢献していると考えられている。このため、ビフィズス菌を添加した発酵乳を飲用すること、又は、製剤化したビフィズス菌を投与することにより、腸内環境を良好に維持することが考案されている。
【０００３】
ヒトに投与されるビフィズス菌としては、生理的観点からヒト腸管に生息するものであることが望ましい。ヒト腸管に生息するビフィズス菌として、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が知られている。非特許文献１及び特許文献１には、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が肥満誘導モデルマウスにおいて体重増加や体脂肪の蓄積を抑制し、血糖値や総コレステロール値を低下させる作用を有することが示されている。また、非特許文献２には、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）値が高めの被験者において、体脂肪量を減少させると共に肝機能の悪化を改善するなどの抗メタボリックシンドローム効果を有することが示されている。
【０００４】
ところで、ビフィズス菌の有用性をより詳細に評価するためには、糞便などに含まれるビフィズス菌の菌種や菌株を特定し、菌種ごとや菌株ごとの存在量を算出した上で、臨床的な効果を判定する必要がある。これにより、摂取されたビフィズス菌の腸への移行や腸内での生存状況を評価し、その臨床的な効果を判定することが可能となる。
【０００５】
従来、糞便中や環境中のビフィズス菌は、検体を嫌気培養してコロニーを分離した後、グラム染色や検鏡による菌型の観察などの形態学検査、又は、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性、酸素耐性、糖発酵性などの生化学検査により同定が行われてきた。上述した検体の培養は、菌数測定や菌種の同定に通常用いられる標準的な方法で行われるが、必ずしも糞便中の全てのビフィズス菌を培養できるわけではない。また、当該培養は、嫌気装置を用いる必要があり、数日から１週間程度の期間を要するため、手間がかかり複雑である。加えて、検体に含まれるビフィズス菌は嫌気的かつ低温で保存され、生菌のまま分析に供される必要があるため、分析を行う者は習熟した技術を必要とされる。
【０００６】
そこで近年、微生物の同定法としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いる手法が提案されている。非特許文献３には、被検菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した後、これと近縁の菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を整列させ、塩基配列の違いを解析する方法が開示されている。
【０００７】
また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特異的配列が既に知られている菌と被検菌とが同一種であるか否かを、その特異的配列を検出するプローブを用いて判断する方法が知られている。特許文献２には、ビフィドバクテリウム属細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガムの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を検出するオリゴヌクレオチド及びその誘導体を、プローブとして用いる方法が開示されている。
【０００８】
一方、特許文献３及び非特許文献４には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を検出しうるＰＣＲプライマーを用いてビフィズス菌を解析する方法が開示されている。また、非特許文献５では、ビフィズス菌の菌種間の比較を行うために、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の中間に位置するＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒの塩基配列を使用することが可能であると報告されている。
【０００９】
また、染色体ＤＮＡの多型性を用いて菌株を同定する方法も知られている。例えば、非特許文献６には、制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを切断し、その切断ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離後、染色を行い、泳動パターンにより菌株の違いを比較するＰＦＧＥ法が開示されている。また、非特許文献７には、１０塩基長程度のＰＣＲプライマーを用いＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）によってＰＣＲを行い、アガロース電気泳動によって分離後、染色を行い、泳動パターンを比較する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開２０１１／０３４１６６号
【特許文献２】特開平６−１９７７６３号公報
【特許文献３】特開平１１−１２３０９３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bioscience, biotechnology, and biochemistry Vol. 74 p. 1656-1661 (2010)
【非特許文献２】Journal of nutritional science Vol. 4 e17 (7 pages) (2015)
【非特許文献３】Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Vol.32 p155-216 (1985)
【非特許文献４】Systematic and Applied Microbiology Vol.25 p.536(2002)
【非特許文献５】International Journal of systematic Bacteriology Vol.46 p.102-111 (1996)
【非特許文献６】International Journal of Food Microbiology Vol.29 p11-29(1996)
【非特許文献７】International Journal of Food Microbiology Vol.43, p185-193 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述の通り、非特許文献１、２及び特許文献１においてビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の有用性が示されている。このような有用性を臨床的に評価するためには、摂取されたビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が腸内に到達したか否かを判断する必要がある。そこで、糞便などの試料からビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）のみを検出することが可能な技術が求められている。
【００１３】
しかしながら、非特許文献３の方法は、比較対照として、土壌、汚泥、糞便、食品などに存在する菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定し、多数配列間での系統的な解析を行う必要があり、多大な労力と時間を要する。特許文献３及び非特許文献４の方法は、ビフィドバクテリウム・ブレーベを検出することは可能であるが、ビフィドバクテリウム・ブレーベの中から特定の菌株のみを検出することはできない。非特許文献５に記載されているＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒの塩基配列は、同属同種異株間の比較に応用可能であるか詳細に検討されてはいない。非特許文献６の方法は、複雑な工程が必要であり、実施に数日要するなどルーティーンワークには適していない。非特許文献７の方法は、短いＰＣＲプライマーを使用して低温でアニーリングを行うため、再現性に劣る場合や使用する機器によって結果が異なる場合がある。
【００１４】
そこで、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出に関する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
また、本技術は、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。
【００１６】
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーも提供する。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さないものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応を示さないものでありうる。
【００１７】
本技術は、前記核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キットも提供する。
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
【００１８】
本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出方法も提供する。当該検出方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の前記試料中における有無を判断することを含む。
また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の定量方法も提供する。当該定量方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、前記試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の量を、前記処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む。
【発明の効果】
【００１９】
本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出することができる。本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を他のビフィドバクテリウム属細菌から区別して検出でき且つ他のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌からも区別して検出できる。なお、本技術により奏される効果は、ここに記載された効果に必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２１】
＜１．オリゴヌクレオチド＞
本技術は、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。また、本技術は、以下の配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
2017216980.tif 000002
これらオリゴヌクレオチドによって、他方のオリゴヌクレオチドと組み合わせて核酸増幅に用いた場合にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出ができるという効果が奏される。なお、本明細書内に記載の塩基配列は、他に言及されない限り、左端が５’端であり、右端が３’端である。
【００２２】
本技術のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡに特異的な配列に対応する。その結果、本技術のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことによって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡ中の特定の領域が増幅される。ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４は、２００９年８月２５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５として寄託されている。
【００２３】
本技術のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことによって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の核酸、特には染色体ＤＮＡが特異的に増幅される。当該核酸増幅において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。また、当該核酸増幅において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。よって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出することが可能になるという効果が奏される。
【００２４】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。当該オリゴヌクレオチド対を核酸増幅に用いることで、上記で述べた効果が奏される。
【００２５】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに、これらオリゴヌクレオチドの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。これらオリゴヌクレオチドについても、上記で述べた効果が奏されうる。
【００２６】
本技術のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の合成方法や装置により製造されうる。合成方法としては例えば固相法が挙げられ、装置としては自動オリゴヌクレオチド合成装置が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
＜２．核酸増幅用プライマー＞
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーを提供する。本技術の核酸増幅用プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の核酸、特にはＤＮＡ、より特には染色体ＤＮＡ中の特定の領域が特異的に増幅されるので、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出が可能となる。よって、本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
【００２８】
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の核酸が特異的に増幅され、それ以外の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。
【００２９】
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。
【００３０】
このように、本技術の核酸増幅用プライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の核酸が特異的に増幅されうる。より特には、本技術の核酸増幅用プライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の核酸のみが増幅されうる。
【００３１】
本技術において、核酸増幅とは、試料中の核酸のうち増幅したい核酸（標的核酸）を、当該標的核酸の塩基配列の相補性を利用して増幅することをいう。核酸増幅方法の具体例として、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、及び３ＳＲなどが挙げられるがこれらに限定されない。本技術において、核酸増幅は好ましくはＰＣＲである。
【００３２】
本技術において、ＰＣＲは、一般的に行われているＰＣＲと同様の方法により行われてよい。典型的には、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、並びにその他の必要成分を含む反応液を用意し、変性工程、アニーリング工程、及び伸長反応工程に各々適した温度で当該反応液を所定時間保温するという一連の工程を２０〜４０サイクル繰り返すことにより行われうる。各工程における温度や保温時間並びにサイクル数は当業者により適宜定められうる。
【００３３】
ＰＣＲの反応条件は、使用する酵素や装置等に応じて当業者により適宜設定されうる。具体的には、例えば９５℃３分間加温後、変性工程：９０〜９８℃で１０〜４０秒、アニーリング工程：５０〜６５℃で２０〜４０秒、及び伸長反応工程：７０〜７５℃で２０〜４０秒の一連の工程を２０〜４０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する反応条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０２〜１０８コピーの染色体ＤＮＡに対しプライマー０．２〜２μｍｏｌであることが好ましい。
【００３４】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いることができるものであれば特に制限されない。ＤＮＡポリメラーゼとしては例えば、市販入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ、及びＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）などのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）などのＤＮＡポリメラーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。上記ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼは、これらの酵素と緩衝液とからなる組成物であってもよい。
【００３５】
本技術の核酸増幅用プライマーによる細菌の検出は、細菌の核酸が増幅されることにより行われるので、細菌の培養が行われなくてもよい。その結果、本技術により、細菌の検出を迅速、簡便、低コスト且つ高精度に行うことが可能になる。
【００３６】
また、検出に先立ち細菌の培養が行われてもよい。細菌の培養を行う場合は、例えば糞便、食品、又は土壌から得た細菌が、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養されうる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から細菌を抽出してもよい。
【００３７】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いて増幅される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。増幅される核酸は、細菌から抽出されたものでありうる。細菌からの核酸の抽出は、当業者に既知の方法により行われてよい。例えば、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ＫｉｔやＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３  ｐ２０８−２１８（１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１  ｐ５２７９−５２８０（１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等にも記載されている。
【００３８】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いてビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）のＤＮＡがＰＣＲにより増幅される場合、例えば１００〜２００ｂｐ、特には１１０〜１７０ｂｐ、より特には１２０〜１５０ｂｐの増幅産物が得られうるが、通常は１３８ｂｐの増幅産物が得られる。そのため、得られた増幅産物がビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来のものであるかをより確かに確認するために、増幅産物の長さが決定されてもよい。増幅産物の長さの決定は、当業者により適宜行われてよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行われうる。
【００３９】
＜３．核酸増幅用キット＞
本技術は、核酸増幅用キットも提供する。当該核酸増幅用キットは、本技術の核酸増幅用プライマーを含む。当該核酸増幅用キットは、核酸増幅に必要な他の要素も含みうる。当該他の要素として、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び／又は緩衝剤が挙げられるがこれらに限定されない。本技術の核酸増幅用キットは、陽性対照として、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡ又は本技術の核酸増幅用プライマーによって増幅され得る染色体ＤＮＡ断片、及び／又は、陰性対照として、本技術の核酸増幅用プライマーの塩基配列のうち１、２、３、４又は５塩基についてミスマッチを有する塩基配列を含むＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
【００４０】
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用キットは、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が存在するか又はこの細菌由来の核酸が存在するかを調査する為に用いられうる。当該調査の為に、本技術の核酸増幅用キットによる試料の核酸増幅反応が行われうる。当該核酸増幅反応によって増幅産物が得られた場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸が存在することが確認され、増幅産物が得られない場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸が存在しないことが確認されうる。本技術において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来の核酸とは、例えばこの細菌に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡ、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。
【００４１】
＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出方法及び定量方法＞
本技術は、以下に述べるとおり、本技術のオリゴヌクレオチド対を用いたビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出方法及び定量方法も提供する。
【００４２】
すなわち、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無によりビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の当該試料中における有無を判断することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の検出方法も提供する。本技術の検出方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の検出方法において、試料は細菌を１種類だけ含んでもよく、又は複数種類の細菌を含んでもよい。前者の場合、増幅産物が得られることによって、試料の細菌がビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）であると同定される。後者の場合は、増幅産物が得られることによって、試料がこの細菌を含むと判定されうる。
【００４３】
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、当該試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）由来核酸の量を、当該処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の定量方法も提供する。本技術の定量方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の定量方法によって、試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の存在量を定量することが可能となる。
【００４４】
前記検出方法又は定量方法が適用されうる試料としては、糞便、食品、及び土壌、並びにこれらから得られた試料、例えばこれらをＤＮＡ抽出キットにより処理して得られたＤＮＡ含有試料などを挙げることができるがこれらに限定されない。試料は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）のみを含むもの若しくは含まないものであってよく、又はこの細菌と他の細菌とを含むものであってもよい。他の細菌は、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌、又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌でありうる。試料に含まれる細菌は、分離された単一の種類の細菌からなってよく、又は、複数種類の細菌を含むものであってもよい。
【００４５】
前記検出方法において、増幅産物の有無の決定は、当業者に既知の手法により行われうる。例えば、ＱＩＡｘｃｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて増幅反応後の溶液を電気泳動することにより増幅産物を検出することができる。或いは、アガロース電気泳動又はキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイド又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うことにより、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく増幅産物を検出することもできる。これらの手法により増幅産物の有無を調査し、その結果によりビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸の当該試料中における有無が判断されうる。必要に応じて、増幅産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによって、増幅産物の有無又は量を確認することもできる。
【００４６】
前記定量方法において、Ｃｔ値に基づきビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸の量を定量することは、当業者により適宜行われうる。Ｃｔ値（Threshold Cycle）は、増幅産物が或る量に達したときのサイクル数である。当該定量は例えば、段階希釈した核酸含有量が既知の複数の参照試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、その結果からＣｔ値と核酸含有量との関係を示す検量線を作成し、一方で、被検試料についてもリアルタイムＰＣＲを行ってＣｔ値を得、前記検量線に被検試料のＣｔ値を当てはめることにより行われうる。リアルタイムＰＣＲにより、経時的に増幅反応を検出することができる。
【００４７】
前記定量方法において、増幅産物の検出は蛍光により検出されうる。検出方法としては、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光物質としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４８】
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【実施例】
【００４９】
［プライマーの設計及び合成］
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、米国国立バイオテクノロジー情報センター）に完全長ゲノム配列が公開されているビフィドバクテリウム・ブレーベ１０株のゲノム配列と、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）のゲノム配列とを、ゲノム配列の比較ソフトであるＭａｕｖｅ（http://darlinglab.org/mauve/mauve.html）を用いて比較した。その結果、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）に特異的であり、他のビフィドバクテリウム・ブレーベにおいて相同性を示す領域が存在しないと判断されたゲノム領域を９１領域抽出した。さらに、上記９１領域の塩基配列を対象として、ＮＣＢＩの塩基配列データベース（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）及びＷｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｃｏｎｔｉｇｓ（ｗｇｓ））に対してＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索を行った。当該相同性検索において上記データベース上の塩基配列と相同性が高い（アイデンティティー９５％以上）と判断された領域を除外し、最終的にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）に特異的な１領域を見出した。ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）に特異的な当該領域を増幅するために用いられるプライマーとして、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した（以下それぞれ「プライマー１」及び「プライマー２」という。）。
2017216980.tif 000003
【００５０】
比較例で用いられるプライマーとして、以下の配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した（以下それぞれ「プライマー３」及び「プライマー４」という。）。プライマー３及びプライマー４は、特許文献３においてそれぞれＢｉＢＲＥ−１及びＢｉＢＲＥ−２として記載されているビフィドバクテリウム・ブレーベを同定するためのプライマーである。
2017216980.tif 000004
【００５１】
プライマー１〜４として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社において合成されたものを用いた。プライマー１及びプライマー３がフォワードプライマーであり、プライマー２及びプライマー４がリバースプライマーである。
【００５２】
［被検細菌の染色体ＤＮＡの調製］
下記表１に列記したビフィドバクテリウム属細菌をそれぞれＭＲＳ液体培地（０．５％のＬ−システイン塩酸塩一水和物を添加した）中において３７℃で嫌気的に培養した。培養後の菌液１ｍＬを７，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。こうして得られた菌体沈殿物から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて付属のプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。
【００５３】
【表１】
2017216980.tif 000005
【００５４】
［ＰＣＲによる被検細菌の検出］
下記表２に記載の組成のＰＣＲ反応液を調製し、Ｖｅｒｉｔｉ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）において上記フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５５】
【表２】
2017216980.tif 000006
【００５６】
上記ＰＣＲで用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせは、下記表３に示されるとおりであった。
【００５７】
【表３】
2017216980.tif 000007
【００５８】
プライマー１及びプライマー２を用いた実施例１のＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間加温後、変性９５℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で３５サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱であった。プライマー３及びプライマー４を用いた比較例１のＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間加温後、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で３５サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱であった。
【００５９】
上記ＰＣＲ後、ＱＩＡｘｃｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ後の反応液の電気泳動を行った。増幅産物の検出はデータ解析ソフトであるＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒを用いてＤＮＡマーカー（ＱＸ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｒ  １５ｂｐ／５ｋｂ（ＱＩＡＧＥＮ））を指標として検出した。比較例１のプライマーを用いたＰＣＲの結果を下記表４に、実施例１のプライマーを用いたＰＣＲの結果を下記表５に示す。表４及５中、「＋」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されたことを、「−」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されなかったことを示す。なお、「ＲＦＵ」は、ＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒにより補正された蛍光強度の単位を表す。
【００６０】
【表４】
2017216980.tif 000008
【００６１】
表４に示されるとおり、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌において増幅産物が得られた。すなわち、比較例１のプライマーを用いたＰＣＲでは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出できなかった。
【００６２】
なお、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌のうち、本出願人が保有する３１種類についても、比較例１のプライマーを用いた上記ＰＣＲを行った。その結果、これら３１種類の細菌を用いたいずれの場合においても、増幅産物が検出された。
【００６３】
【表５】
2017216980.tif 000009
【００６４】
表５に示される通り、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）においてのみ増幅産物が得られた。増幅産物の長さは１３８ｂｐであった。この結果から、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることが確認された。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることも確認された。
【００６５】
なお、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌のうち、本出願人が保有する３１種類についても、実施例１のプライマーを用いた上記ＰＣＲを行った。その結果、これら３１種類の細菌を用いたいずれの場合においても、増幅産物が検出されなかった。この結果からも、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）の特異的な検出が可能になる。よって、本技術は、この細菌のより確実な有効性評価に利用でき、例えば腸への到達状況や腸内での生存状況の評価に利用できる。また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７５）又は当該菌を含む飲食品を工業的に製造する場合に菌数の測定や発酵状態の管理にも利用できる。
【配列表】
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