(57)【要約】【課題】従来、敏感肌のような皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する、刺激や痒みといった評価には、動物やヒトを用いられるのが一般的であった。しかし、被験者の確保やダメージの軽減、試験費用の軽減等の点より、in vitroでの評価系の確立が求められてきた。そこで、皮膚刺激に対する感受性の高い表皮の状態を再現し、物質の有効性や安全性を評価できることを特徴とするin vitroでの敏感肌評価装置及びその評価方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】本発明者らは、表皮等価物と神経細胞とを共培養して敏感肌状態を再現する装置を用いることにより、物質の有効性と安全性を簡便に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮等価物と神経細胞とを用いて敏感肌状態を再現し、物質の有効性及び／又は安全性を評価することを特徴とする敏感肌評価用装置。
【請求項２】
前記表皮等価物が、再構成表皮であることを特徴とする請求項１に記載の敏感肌評価用装置。
【請求項３】
前記表皮等価物が、神経細胞と共培養であることを特徴とする請求項１又は２に記載の敏感肌評価用装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の敏感肌評価用装置を使用して、表皮等価物及び／又は神経細胞の水分量変化、ＲＯＳ産生量、ＮＧＦ産生量、セマフォリン３Ａ産生量、各種サイトカイン産生量、各種分泌酵素およびタンパク質量及び／又は活性、神経細胞形態変化から選択される１種又は２種以上の測定を同時に行うことを特徴とする評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮等価物と神経細胞とを用いてin vitroで敏感肌状態を再現し、物質の有効性や安全性を簡便に評価できることを特徴とする敏感肌評価用装置、及びこれを用いた評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の痒みは、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患、冬季の乾燥、あるいは敏感肌を自覚する多くの人が悩まされる皮膚トラブルの一つであり、その表皮においては神経線維末端が表皮まで侵入しており、皮膚刺激に対する感受性の高い状態であることが報告されている。さらに、皮膚刺激に対する感受性の高い表皮においては、神経線維の伸長を誘導するする因子（ＮＧＦ, nerve growth factor）、抑制する因子（セマフォリン３Ａ）の発現バランスが乱れることが報告されている（非特許文献１）。さらに、刺激されたヒト皮膚由来細胞による再構成組織である表皮等価物においても、ＮＧＦの増加とセマフォリン３Ａの減少の報告がある（非特許文献２）。
【０００３】
従来、物質の皮膚に対する痒みあるいは有効成分による鎮痒効果を評価する方法としては、動物に経皮あるいは経口あるいは注射等で適用したときの掻破行動を利用した測定がある。さらに、物質の皮膚に対する感受性の高い状態の皮膚に対する物質の皮膚刺激性を評価する方法としては、ある特定の物質を刺激と感じる人に適用したときの感度をスコア化するスティンギング試験がある。これらの評価方法は動物やヒトを使用するため、物質が、敏感肌に対して実際にどのようなメカニズムで痒みを初めとする刺激を惹起させるのかあるいは有効成分による鎮痒効果については、間接的に考察するのみであった。
【０００４】
ところで、皮膚を対象として、物質の有効性や安全性を容易に試験するための装置として、ヒト皮膚由来細胞による再構成組織である表皮等価物を用いて、サンプルが物理的、生物学的及び／又は化学的刺激に与える影響、又はサンプルが物理的、生物学的及び／又は化学的刺激に与える影響を検出システムと関連づけた装置や（特許文献１）、動物実験代替皮膚刺激性試験があるが、これらの対象は、健常皮膚であり、敏感肌を対象としていない。
また、未熟状態の表皮等価物を利用し、物質の皮膚刺激感受性の高い表皮に対する刺激性を容易に試験できることを特徴とするin vitroでの敏感肌評価装置及びその評価方法についての報告（非特許文献３）はあるが、表皮等価物が未熟であることと敏感肌の関係性については明確でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５２０１９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Dermatological Science６２（２０１１）９１−９７
【非特許文献２】SCCJ研究討論会（第７７回）講演要旨集
【非特許文献３】J. Soc. Cosmet. Chem. Jpa.４７（１）９−１８（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、従来、敏感肌のような皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する、刺激や痒みといった評価には、動物やヒトを用いられるのが一般的であった。しかし、被験者の確保やダメージの軽減、試験費用の軽減等の点より、in vitroでの評価系の確立が求められてきた。
そこで、皮膚刺激に対する感受性の高い表皮の状態を再現し、皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する、物質の有効性や安全性を評価できることを特徴とするin vitroでの敏感肌評価装置及びその評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、物質の皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する、物質の有効性や安全性を評価できることを特徴とするin vitroでの敏感肌評価装置及びその評価方法について鋭意研究した結果、表皮等価物と神経細胞とを共培養して敏感肌状態を再現する装置を用いることにより、物質の有効性と安全性を簡便に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
従来、物質の皮膚刺激に対して感受性の高い敏感肌のような皮膚においては、物質の有効性や安全性を評価することは困難があったが、表皮等価物と神経細胞とを用いて敏感肌状態を再現することで、簡便に評価することができる。従って、皮膚に塗布又は内服する物質、及びこれらの物質を含む外用組成物や内服組成物による、敏感肌への効果や作用を直接的に測定できることから、これらの開発を非常に効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係る、敏感肌評価用装置である。
【図２】本発明の実施例１に係る敏感肌評価用装置（セッティング）の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
本発明に係わるin vitroでの敏感肌評価用装置は、表皮等価物と神経細胞とを用いるものである。本発明に係わるin vitroでの敏感肌評価用装置は、物質の皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する効果及び／又は作用を直接的に測定することができる。
【００１２】
本発明で用いる表皮等価物としては、培養再構成表皮モデル又は未熟な状態の培養再構成表皮モデルを用いるのが望ましい。なお、種類の違う神経細胞を共培養するためには、培地の最適化やｐＨの選定など非常に煩雑な作業を要するが、再構成表皮を用いることで簡便に神経細胞との安定かつ効率的に共培養物を作成することができる。表皮等価物として未熟な状態の培養再構成表皮モデルを用いた場合、表皮等価物に適用した物質及び／又は物質を含む外用組成物及び／又は内服組成物による、細胞増殖促進作用及び／又は抑制作用、各種サイトカイン産生及び／又は抑制作用、ポリモーダル受容器としてのＴＲＰファミリー発現亢進及び／又は抑制作用、角層水分量変化、経表皮水分蒸散量変化などの安全性及び／又は有効性を評価することができる。
【００１３】
培養再構成表皮モデルの市販品としては、ＥＰＩＳＫＩＮＴＭ−ＬＭ、ＥＰＩＳＫＩＮＴＭ−ＳＭ、ＥＰＩＳＫＩＮＴＭ−ＲＨＥ、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＰＥ、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＣＥ、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＯＥ、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ、Ｔ−Ｓｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、ＥＰＩ−２００・２１２・２００Ｘ・６０６・６０６Ｘ・２０１・２９６、ＥＦＴ−４００・４１２、ＭＥＬ−３００・３１２・３０１・３００ＦＴ・６０６、ＭＬＮＭ−ＦＴ−Ａ３７５、ＥｐｉＯｃｕｌａｒＴＭ（ＭａｔＴｅｋ社製）、ＴＥＳＴＳＫＩＮＴＭ  ＬＳＥ−Ｈｉｇｈ、ＭＥＴＲＥＸＴＭ  ＬＤＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＬａｂＣｙｔｅＴＭ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ、ＬａｂＣｙｔｅＴＭ  ＥＰＩ−ＫＩＴ、ＬａｂＣｙｔｅＴＭ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）等が挙げられる。
【００１４】
本発明で用いる神経細胞としては、Ｎ１Ｅ-１１５細胞、ＰＣ-１２細胞などが挙げられる。神経細胞としてＮ１Ｅ-１１５細胞を用いた場合、表皮等価物を経皮吸収した物質が神経細胞の伸長促進及び／又は抑制作用、神経細胞表面に発現するＭＭＰ類の発現促進及び／又は抑制作用の評価をおこなうことができる。これらの評価をすることで、敏感肌に対する刺激緩和作用、鎮痒、鎮痛作用などの有効性を評価することができる。
さらに評価対象となる物質は、主に化粧品、医薬部外品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、そのまま表皮等価物の角層側から及び／又は培地側から適用することもできるし、水、油性成分、各種溶媒などに溶解又は分散物として、更に乳化製剤として角層側から適用することもできる。
【００１５】
化粧品、医薬部外品及び／又は医薬品に利用できる成分のうち、生理活性成分としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、トラネキサム酸及びその誘導体、エラグ酸、ルシノール、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アミノ酸、糖類、ムコ多糖、セラミド、ステロール及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体、レチノール及びそれらの誘導体、ビタミンＡ酸およびそれらの誘導体、トコトリエノール、ユビキノン、アロエ、オウゴン、各種ビタミン類やその誘導体、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ＳＯＤ、β−カロテン、カテキン、ポリフェノール、カフェイン、カカオ、セイヨウキズタ、ビスナジンなどのスリミング剤、カモミラ、シソ、カルニチン、リン脂質及びそれらの誘導体、機能性多糖などが挙げられる。
【００１６】
また、生理活性成分などがより効率的に吸収され、有効性がより発現される化粧品又は医薬品の剤型を検討するための方法としても利用できるため、化粧品又は医薬品の処方設計の検討に利用すると非常に効率的にそれらの開発を進めることができる。
さらに、経口あるいは注射等で摂取された有効成分を検討するための方法としても利用できるため、医薬品又は食品又はサプリメント等の効果の検討に利用すると非常に効率的にそれらの開発を進めることができる。
【００１７】
物質の評価を行うには、図１の表皮等価物や培地や神経細胞を回収する。物質の刺激緩和作用は例えば、刺激によって生成される表皮内ＲＯＳ（reactive oxygen species, 活性酸素種）レベルをＲＯＳ検出試薬による化学発光検出法で評価することができる。さらに、表皮中に発現している刺激を感知するＴＲＰＶ１（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1）や神経細胞伸長を誘導するＮＧＦ（nerve growth factor）やセマフォリン３Ａの遺伝子発現レベルをＰＣＲ法を用いて評価することができ、タンパク発現レベルを免疫酵素抗体反応を用いたＷＢ法や組織染色を用いて評価することもできる。また、物質による表皮角化状態の改善作用は例えば、表皮中に発現している角化に関わる因子ケラチン類、フィラグリン、トランスグルタミナーゼ、ＳＰＦ遺伝子の発現レベルはＰＣＲ法を用いて評価することができ、さらにタンパク発現レベルは免疫酵素抗体反応を用いたＷＢ法や組織染色を用いて評価することができ、脂質構成比もクロマトグラフィーによる分析を用いて評価することができる。さらに、角層の状態を評価する場合、例えば、角層タンパクの酸化レベルやタンパク中の遊離ＳＨレベルは化学染色法を用いて評価することができ、角層中の酵素活性についても疑似基質を用いた活性測定法により評価することができる。さらに、表皮等価物を透過した物質による神経細胞の伸長は例えば、予め細胞に取り込ませたカルセイン−ＡＭを用いた蛍光染色にて神経伸長を観察することができ、また神経線維が伸長するとき、あるいは表皮内に侵入するために発現しているＭＭＰ類の発現をＰＣＲ法や免疫酵素抗体反応を用いたＷＢ法や組織染色を用いて評価することもできる。
【００１８】
図１は、表皮等価物と、神経細胞とを用いて敏感肌状態つまり皮膚刺激に対する感受性の高い表皮の状態を再現し、皮膚刺激に対する感受性の高い皮膚に対する、物質の有効性及び／又は安全性を評価できることを特徴とする敏感肌評価用装置である。
本発明の敏感肌評価用装置は、（３）表皮等価物を支持する（２）バスケットを収容する（１）ウェルを含む。（１）ウェルが配置される（２）バスケットは、（１）ウェルを着脱可能に固定できてもよい。（２）バスケットは（３）表皮等価物を支持する（７）底壁を含む。（７）底壁は（８）貫通穴を有する。また、（２）バスケットに、（７）底膜を固定するための（９）インサートを有するものもある。バスケットという用語は制限的な意味で使用するものではなく、（１）ウェル内に配置された任意の支持体を含む。
（１）ウェルは、複数（例えば１２個）のウェルを有するプレートの一部を固定することができる。（１）ウェルには、（５）溶液（例えば、培地など）が充填されている。
（３）表皮等価物は、例えば前述の培養再構成表皮モデルなどである。
（４）神経細胞は、例えば前述のＮ１Ｅ−１１５細胞である。
評価対象となる（６）物質は、例えば化粧品、医薬部外品及び／又は医薬品に利用できる成分、それを含む溶液、溶解又は分散物、乳化製剤、また、化粧品、医薬品製剤などである。
表皮等価物は、例えば、０．２〜５ｃｍ２の範囲の面積を有する。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１．表皮乾燥刺激誘導神経細胞伸長に対する抑制作用
１．試験の概要
グリセリン水溶液を塗布した表皮等価物に乾燥刺激を与え、表皮等価物に対するＮＧＦおよびセマフォリン３Ａ発現および神経細胞伸長誘導抑制を評価した。
【００２０】
２．実験方法
試験開始前日に神経細胞を播種し、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製、表皮等価物）をプレインキュベーションした。試験当日ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７と神経細胞を共培養し、角層側から５％グリセリン水溶液を１時間適用した。１時間後にグリセリン水溶液を除去し、乾燥した空気を適用する。図２は、試験のセッティングである（表皮等価物３はＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７、神経細胞４はＮ１Ｅ−１１５細胞、評価対象となる物質６は乾燥した空気）。乾燥処理後、４８時間までインキュベーションし、４８時間後にＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７を回収し、表皮中のＮＧＦ、セマフォリン３Ａの遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲ法にて評価した。また、Ｎ１Ｅ−１１５細胞を回収し、神経伸長状態を顕微鏡観察にて評価した。いずれの評価も乾燥刺激なしを１００％とした相対値で示した。
【００２１】
３．結果
乾燥刺激によるＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＲＨＥ−Ｄ７組織中のＮＧＦおよびセマフォリン３Ａ遺伝子発現量変化を表１に、さらに、神経細胞の伸長状態を表２に示した。乾燥刺激によって、増加したＮＧＦの遺伝子発現および減少したセマフォリン３Ａの遺伝子発現に対して、５％グリセリン水溶液による抑制作用が認められた。また、同じく乾燥刺激によって神経細胞の伸長に対して、５％グリセリン水溶液による抑制作用が認められた。
本結果より、本敏感肌評価装置は、皮膚刺激に対する感受性の高い表皮の状態を再現し、保湿剤による刺激緩和作用を評価できることが明らかとなった。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
実施例２．角膜乾燥刺激誘導神経細胞伸長に対する抑制作用
１．試験の概要
抗酸化剤を塗布した表皮等価物に乾燥刺激を与え、表皮等価物に対するＲＯＳ生成および神経細胞伸長誘導抑制を評価した。
【００２５】
２．実験方法
試験開始前日に神経細胞を播種し、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＣＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製、表皮等価物）をプレインキュベーションした。試験当日ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＳＥと神経細胞を共培養し、角層側から０．１％グリシン亜鉛水溶液（抗酸化剤）を１時間適用した。１時間後にグリシン亜鉛水溶液を除去し、乾燥した空気を適用する。図２は、試験のセッティングである（表皮等価物３はＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＣＥ、神経細胞４はＮ１Ｅ−１１５細胞、評価対象となる物質６は乾燥した空気）。乾燥処理後、４８時間までインキュベーションし、４８時間後にＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＣＥ回収し、ＨＣＥ組織中のＲＯＳ生成量をＭＣＬＡ試薬による化学発光検出にて評価した。また、Ｎ１Ｅ−１１５細胞を回収し、神経伸長状態を顕微鏡観察にて評価した。いずれの評価も乾燥刺激なしを１００％とした相対値で示した。
【００２６】
３．結果
乾燥刺激によるＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＣＥ組織中のＲＯＳ生成量変化を表３に、さらに、神経細胞の伸長状態を表４に示した。乾燥刺激によって、増加したＲＯＳ生成に対して、０．１％グリシン亜鉛水溶液による抑制作用が認められた。また、同じく乾燥刺激によって神経細胞の伸長に対して、０．１％グリセリン水溶液による抑制作用が認められた。
本結果より、本敏感肌評価装置は、皮膚刺激に対する感受性の高い表皮の状態を再現し、抗酸化剤による刺激緩和作用を評価するできることが明らかとなった。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の表皮等価物と神経細胞とを共培養して敏感肌状態を再現した敏感肌評価用装置を用いることで、様々な物質の有効性や安全性を一度に簡便に評価することができる。
【符号の説明】
【００３０】
１  ウェル
２  バスケット
３  表皮等価物
４  神経細胞
５  溶液
６  物質
７  底壁
８  貫通穴
９  インサート
【図１】
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【図２】
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