(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素の安定性を向上させ、組換え細胞によるイソプレンの生産性を向上させる技術を提供する。【解決手段】Populus nigra由来のイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列における、１００〜１０３番目の領域Ａ、２６１〜２６３番目の領域Ｂ、又は４６４〜４６６番目の領域Ｃに存在する少なくとも１つのアミノ酸がリジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列における、
１００〜１０３番目の領域Ａ、
２６１〜２６３番目の領域Ｂ、又は
４６４〜４６６番目の領域Ｃ、
に存在する少なくとも１つのアミノ酸がリジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシンに、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、１０３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシンに、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、それぞれ置換され、
前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ
前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなる、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドの部分断片からなり、前記領域Ａ、Ｂ、及びＣを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
配列番号６で表されるアミノ酸配列における、
１０６〜１０９番目の領域Ｄ、
２６６〜２６８番目の領域Ｅ、又は
４７２〜４７４番目の領域Ｆ、
に存在する少なくとも１つのアミノ酸がリジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、
前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ
前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなる、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれかに記載のポリペプチドの部分断片からなり、前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を有するプラスミド。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸を有し、細胞内で当該核酸を発現可能である組換え細胞。
【請求項１８】
合成ガス資化性菌である請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
メタノール資化性菌である請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の組換え細胞を培養し、その培養物からイソプレンを得ることを特徴とするイソプレンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、核酸、プラスミド、組換え細胞、並びに、イソプレンの生産方法に関し、さらに詳細には、アミノ酸変異が導入された改変型イソプレン合成酵素であるポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該核酸を有するプラスミド、当該核酸を有する組換え細胞、並びに、当該組換え細胞を利用したイソプレンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは合成ポリイソプレンのモノマー原料であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。
【０００３】
イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ、isoprene synthase；EC 4.2.3.27）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する作用を有する。
【０００４】
組換え細胞（組換え体）を用いたイソプレンの生産方法が知られている。例えば、特許文献１，２に記載の発明では、イソプレン合成酵素をコードする核酸（遺伝子）が導入された組換え細胞を用いてイソプレンを生産する。詳細には、当該組換え細胞をメタノールや合成ガスを炭素源として培養し、該培養物からイソプレンを取得する。また、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術も知られている（例えば、特許文献３，４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０６５２７１号
【特許文献２】国際公開第２０１４／１０４２０２号
【特許文献３】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献４】特表２０１１−５１８５６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在使用可能なイソプレン合成酵素のほとんどはポプラ等の植物由来のものである。しかし、植物由来のイソプレン合成酵素を細菌宿主内で発現させると、宿主が有するプロテアーゼの攻撃を受けてしまう。その結果、発現したイソプレン合成酵素が分解され、イソプレンの生産性が落ちてしまう。そのため、イソプレンの生産性を向上させるために、組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素の安定性を向上させるための方策が望まれている。
【０００７】
そこで本発明は、組換え細胞内におけるイソプレン合成酵素の安定性を向上させ、組換え細胞によるイソプレンの生産性を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、既存のイソプレン合成酵素にアミノ酸置換による変異を導入し、プロテアーゼ耐性を向上させることに成功した。そして、当該変異イソプレン合成酵素を発現する組換え体を作製し、当該組換え細胞を用いることにより、イソプレンの生産性を向上させることに成功した。
【０００９】
上記した知見に基づいて提供される本発明の１つの様相は、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列における、１００〜１０３番目の領域Ａ、２６１〜２６３番目の領域Ｂ、又は４６４〜４６６番目の領域Ｃ、に存在する少なくとも１つのアミノ酸がリジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。
【００１０】
本様相のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素における一部のアミノ酸が改変されたものであり、改変型イソプレン合成酵素と呼べるものである。本様相のポリペプチドはプロテアーゼ耐性が向上しているので、宿主細胞に導入した場合でも細胞内で安定的に発現する。
【００１１】
好ましくは、前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシンに、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、１０３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである。
【００１２】
好ましくは、前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである。
【００１３】
好ましくは、前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである。
【００１４】
好ましくは、前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシンに、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、それぞれ置換され、前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである。
【００１５】
本発明の他の様相は、上記のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなる、ポリペプチドである。
【００１６】
本発明の他の様相は、上記のポリペプチドの部分断片からなり、前記領域Ａ、Ｂ、及びＣを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドである。
【００１７】
本発明の他の様相は、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、配列番号６で表されるアミノ酸配列における、１０６〜１０９番目の領域Ｄ、２６６〜２６８番目の領域Ｅ、又は４７２〜４７４番目の領域Ｆ、に存在する少なくとも１つのアミノ酸がリジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。
【００１８】
本様相のポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素における一部のアミノ酸が改変されたものであり、改変型イソプレン合成酵素と呼べるものである。本様相のポリペプチドはプロテアーゼ耐性が向上しているので、宿主細胞に導入した場合でも細胞内で安定的に発現する。
【００１９】
好ましくは、前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである。
【００２０】
好ましくは、前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたものである。
【００２１】
好ましくは、前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである。
【００２２】
好ましくは、前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されたものである。
【００２３】
本発明の他の様相は、上記のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなる、ポリペプチドである。
【００２４】
本発明の他の様相は、上記したポリペプチドの部分断片からなり、前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドである。
【００２５】
本発明の他の様相は、上記のポリペプチドをコードする核酸である。
【００２６】
本発明の他の様相は、上記の核酸を有するプラスミドである。
【００２７】
本発明の他の様相は、上記の核酸を有し、細胞内で当該核酸を発現可能である組換え細胞である。
【００２８】
本発明の組換え細胞によれば、プロテアーゼ耐性が向上された改変型イソプレン合成酵素を発現可能であるので、イソプレン合成活性が安定的に発揮される。
【００２９】
好ましくは、前記組換え細胞が合成ガス資化性菌である。
【００３０】
かかる構成により、合成ガスからイソプレンを効率的に生産することができる。
【００３１】
好ましくは、メタノール資化性菌である。
【００３２】
かかる構成により、メタノールからイソプレンを効率的に生産することができる。
【００３３】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞を培養し、その培養物からイソプレンを得ることを特徴とするイソプレンの生産方法である。
【００３４】
本様相はイソプレンの生産方法に係るものであり、上記の組換え細胞を培養し、その培養物からイソプレンを得る。本様相によれば、発現されるイソプレン合成酵素のプロテアーゼ耐性が向上しているので、イソプレン合成活性が安定的に発揮され、高効率でイソプレンを生産することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のポリペプチドは改変型イソプレン合成酵素であり、プロテアーゼ耐性が向上している。そのため、宿主細胞に導入した場合でも、細胞内で安定的にイソプレン合成酵素活性を発現することができる。本発明のポリペプチドを用いることにより、組換え細胞によるイソプレン生産において、生産量を顕著に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】配列番号２で表されるアミノ酸配列における領域Ａ、Ｂ、及びＣを示す説明図である。
【図２】配列番号４で表されるアミノ酸配列における領域Ａ、Ｂ、及びＣを示す説明図である。
【図３】配列番号６で表されるアミノ酸配列における領域Ｄ、Ｅ、及びＦを示す説明図である。
【図４】アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を表す説明図である。
【図５】ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明のポリペプチドは、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素の一部のアミノ酸が置換され、プロテアーゼ耐性が向上したものである。
【００３８】
前述のように、イソプレン合成酵素（EC 4.2.3.27）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する作用を有する。なお、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの間の構造変換は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが触媒する。
【００３９】
本発明のポリペプチドの基礎となる既存のイソプレン合成酵素は、配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるものである。配列番号１はPopulus nigra由来のイソプレン合成酵素の遺伝子とアミノ酸配列、配列番号２はアミノ酸配列のみを表す。配列番号３はPopulus alba x Populus tremula由来のイソプレン合成酵素の遺伝子とアミノ酸配列、配列番号４はアミノ酸配列のみを表す。配列番号５はPueraria montana var. lobate由来のイソプレン合成酵素の遺伝子とアミノ酸配列、配列番号６はアミノ酸配列のみを表す。
【００４０】
本発明の１つの様相では、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列における、１００〜１０３番目の領域Ａ、２６１〜２６３番目の領域Ｂ、又は４６４〜４６６番目の領域Ｃに存在する少なくとも１つのアミノ酸が、リジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されている。
領域Ａは、「グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）−リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−アラニン（Ａｌａ，Ａ）−グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）」の配列からなる。
領域Ｂは、「リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）」の配列からなる。
領域Ｃは、「リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）」の配列からなる。
図１に配列番号２で表されるアミノ酸配列と領域Ａ、Ｂ、及びＣを示す。図２に配列番号４で表されるアミノ酸配列と領域Ａ、Ｂ、及びＣを示す。なお、領域Ａ、Ｂ、Ｃは、いずれもループ構造を形成する部位と考えられる。
上記した領域Ａ、Ｂ、Ｃにおけるアミノ酸置換は、１つの領域のみに起こっていてもよいし、複数の領域に起こっていてもよい。
【００４１】
本発明の別の様相では、配列番号６で表されるアミノ酸配列における、１０６〜１０９番目の領域Ｄ、２６６〜２６８番目の領域Ｅ、又は４７２〜４７４番目の領域Ｆに存在する少なくとも１つのアミノ酸が、リジンとアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されている。
領域Ｄは、「バリン（Ｖａｌ，Ｖ）−アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）−スレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）−グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）」の配列からなる。
領域Ｅは、「プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）−リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）−グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）」の配列からなる。
領域Ｆは、「セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）−アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）−ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）」の配列からなる。
図３に配列番号６で表されるアミノ酸配列と領域Ｄ、Ｅ、及びＦを示す。なお、領域Ｄ、Ｅ、Ｆは、いずれもループ構造を形成する部位と考えられる。
上記した領域Ｄ、Ｅ、Ｆにおけるアミノ酸置換は、１つの領域のみに起こっていてもよいし、複数の領域に起こっていてもよい。
【００４２】
本発明では、上記領域Ａ〜Ｆにおける置換後の「他のアミノ酸」がリジンとアルギニン以外のアミノ酸である。これは、リジンとアルギニンがプロテアーゼによる分解を受けやすいことを考慮して、「他のアミノ酸」からこれらを除外したものである。
【００４３】
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）に、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、１０３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されている。配列番号８に、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されたている。配列番号１０に、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されている。配列番号１２に、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。
上記した領域Ａ、Ｂ、Ｃにおけるアミノ酸置換は、１つの領域のみに起こっていてもよいし、複数の領域に起こっていてもよい。
【００４４】
さらに好ましい実施形態では、前記領域Ａにおける１００番目のアミノ酸がグリシンに、１０１番目のアミノ酸がグリシンに、１０２番目のアミノ酸がグリシンに、それぞれ置換され、前記領域Ｂにおける２６１番目のアミノ酸がグリシンに、２６２番目のアミノ酸がグリシンに、２６３番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ前記領域Ｃにおける４６４番目のアミノ酸がアラニンに、４６５番目のアミノ酸がアラニンに、４６６番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されている。すなわち、領域Ａ、Ｂ、Ｃの全てにアミノ酸置換が起こっている。配列番号１４に、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸配列の一例を示す。
【００４５】
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されている。
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換されている。
１つの好ましい実施形態では、前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されている。
上記した領域Ｄ、Ｅ、Ｆにおけるアミノ酸置換は、１つの領域のみに起こっていてもよいし、複数の領域に起こっていてもよい。
【００４６】
さらに好ましい実施形態では、前記領域Ｄにおける１０６番目のアミノ酸がグリシンに、１０７番目のアミノ酸がグリシンに、１０８番目のアミノ酸がグリシンに、１０９番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、前記領域Ｅにおける２６６番目のアミノ酸がグリシンに、２６７番目のアミノ酸がグリシンに、２６８番目のアミノ酸がセリンに、それぞれ置換され、かつ前記領域Ｆにおける４７２番目のアミノ酸がアラニンに、４７３番目のアミノ酸がアラニンに、４７４番目のアミノ酸がアラニンに、それぞれ置換されている。すなわち、領域Ｄ、Ｅ、Ｆの全てにアミノ酸置換が起こっている。
【００４７】
本発明のポリペプチドには、その機能に影響を与えない範囲において、上記領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅ，Ｆ以外の領域にさらなるアミノ酸置換等が起こっていてもよい。
【００４８】
例えば、上記のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ａ、Ｂ、及びＣ以外の領域Ｘのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなるポリペプチドであってもよい。
上記領域Ｘとは、上記ポリペプチドにおける領域Ａ、Ｂ、Ｃを除いた領域を指す。
【００４９】
同様に、本発明のポリペプチドは、上記のポリペプチドのアミノ酸配列の一部が改変された、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、
（ｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙにおいて、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦ以外の領域Ｙのアミノ酸配列の相同性が９０％以上のアミノ酸配列、
からなるポリペプチドであってもよい。
上記領域Ｙとは、上記ポリペプチドにおける領域Ｄ、Ｅ、Ｆを除いた領域を指す。
【００５０】
アミノ酸配列の相同性については、例えば、ＣｕｌｕｓｔａｌＷ等の市販の多重整列プログラムを用いて計算することができる。
【００５１】
さらに本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドの部分断片であって、同様の活性を有するものでもよい。
例えば、本発明のポリペプチドには、前記領域Ａ、Ｂ、及びＣを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドが含まれる。
同様に、本発明のポリペプチドには、前記領域Ｄ、Ｅ、及びＦを包含し、かつイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５２】
本発明は、上記のポリペプチドをコードする核酸を包含する。さらに本発明は、当該核酸を有するプラスミドを包含する。
【００５３】
本発明は、当該核酸を有し、細胞内で当該核酸を発現可能である組換え細胞を包含する。例えば、適宜の宿主細胞に上記のポリペプチドをコードする核酸を導入することにより、本発明の組換え細胞を作製することができる。本発明の組換え細胞の基礎となる宿主細胞としては特に限定はなく、例えば、大腸菌や枯草菌のような、外来遺伝子を発現させるための宿主として一般的に用いられている細菌が、本発明でも適用できる。
【００５４】
１つの実施形態として、合成ガス資化性菌を宿主細胞として用いることができる。例えば、Ｃ１化合物を資化する能力を有する細菌を宿主細胞として用いることができる。例えば、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアミド等を資化する能力を有する細菌を、宿主細胞として用いることができる。これにより、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアミド等のＣ１化合物を資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。
【００５５】
１つの実施形態として、一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する細菌を宿主細胞に用いることができる。これにより、一酸化炭素又は二酸化炭素を資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。前記宿主細胞は具体的には嫌気性原核細胞であり、特に、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する嫌気性原核細胞である。また、一酸化炭素脱水素酵素（Carbon monoxide dehydrogenase；EC 1.2.99.2）をさらに有する嫌気性原核細胞が好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する嫌気性原核細胞が好ましい。このような嫌気性原核細胞の例としては、図４に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性原核細胞が挙げられる。
このような嫌気性原核細胞を宿主細胞として用いることにより、一酸化炭素や二酸化炭素のようなガスを炭素源として、組換え細胞にイソプレンを生産させることが可能となる。
【００５６】
当該嫌気性原核細胞の具体例としては、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)、等のClostridium属細菌又はMoorella属細菌が挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明の組換え細胞における宿主細胞として好適である。なお、上記５種のClostridium属細菌又はMoorella属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
【００５７】
その他、Carboxydocella sporoducens sp. Nov.、Rhodopseudomonas gelatinosa、Eubacterium limosum，Butyribacterium methylotrophicum、等の原核細胞を宿主細胞として用いることができる。
【００５８】
なお、組換え細胞によって合成ガスからイソプレンを生産させる技術の基本構成については、国際公開第２０１４／０６５２７１号に記載されている。
【００５９】
１つの実施形態として、メチロトローフの一種であるメタノール資化性細菌を宿主細胞に用いることができる。これにより、メタノールを資化する能力を有する組換え細胞を得ることができる。
【００６０】
メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。メサノトローフは、メタンをメタンモノオキシダーゼの作用によってメタノールに変換し、メチルトローフと同一代謝でメタノールを異化することができる。
【００６１】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、図５に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。本発明で用いることができるメタノール資化性細菌は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。
【００６２】
メチロトローフは、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能と、ホルムアルデヒド固定化能を備えている。
【００６３】
当該メタノール資化性細菌の例としては、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属するメチロトローフが挙げられる。
【００６４】
なお、メチロトローフ以外の細菌であっても、メチロトローフの特徴である「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を付与することにより、メタノール資化性細菌と同様に扱うことができる。
【００６５】
メチロトローフである組換え細胞によってメタノールやメタンからイソプレンを生産させる技術の基本構成については、国際公開第２０１４／１０４２０２号に記載されている。
【００６６】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法については、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよく、例えば、自己複製プラスミド（ベクター）で目的遺伝子を導入する方法や、ゲノム導入法が採用可能である。
【００６７】
例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能な自己複製プラスミド（ベクター）を用いることができる。当該ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００６８】
宿主細胞が大腸菌である場合に使用可能な自己複製ベクターとしては、市販のpET（Novagen社）、pBAD（Life technologies社）、pGEM（Promega社）等が挙げられる。宿主がメタノール資化性細菌の場合には、pAYC32（Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167）、pRP301（Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34）、pBBR1、pBHR1（Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799）、pCM80（Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等のベクターが挙げられる。宿主がClostridium属細菌である場合には、pJIR（Brandshaw M., et al., Plasmid 40 (3), 233-237）、pIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）、pMTL（Ng, YK. Et al., PLoS One 2013, 8 (2), e56051）、pMVTcatMCS47（Berzin, V. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 167, 338-347）等のベクターが挙げられる。これらの自己複製ベクターは、電気穿孔法、接合法、化学的処理法等によって宿主細胞内へ導入することができる。
【００６９】
一方、ゲノム導入法は、相同組換え、トランスポゾン法（Martinerz-Garcia E. et al., BMC Microbiol. 11:38）、インテグラーゼ法（Miyazaki, R. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2014, 79 (14), 4440-4447）、Cre/loxP法（Bertram, R. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2009, 17 (3), 136-145）、Flp/FRT法（Al-Hinai, MA. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (22), 8112-8121）等の手法を使って行うことができる。
【００７０】
イソプレン生産能を向上させる観点から、組換え細胞には他の核酸が導入されてもよい。例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成経路であるメバロン酸経路経路（ＭＶＡ経路）や非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）で作用する酵素（群）をコードする核酸を導入することができる。これにより、ＤＭＡＰＰの供給源であるＩＰＰの合成能が強化され、結果的にイソプレンの合成能が強化される。
【００７１】
本発明は、上記の組換え細胞を培養し、その培養物からイソプレンを得るイソプレンの生産方法を包含する。
【００７２】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、組換え細胞が増殖可能な培地を用いて培養することができる。例えば、組換え細胞が大腸菌や枯草菌のような従属栄養微生物の場合は、グルコース、サッカロース等の炭素源が使用可能である。組換え細胞がメタノール資化性細菌の場合は、メタノールを０．１〜５．０％（ｖ／ｖ）含有する培地を用いることが好ましい。組換え細胞が合成ガス資化性菌の場合は、炭素源、エネルギー源として以下の組成のものが利用可能である。
・ＣＯ
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
【００７３】
また、組換え細胞がメタノール資化性菌や合成ガス資化性菌であっても、グルコースやサッカロース等の糖質炭素源を必要に応じて添加して培養しても良い。また、バッチ式、流加式、連続式等いかなる培養方法も適用可能である。また流加式、連続式培養では、さらに培養液の半透膜循環によって細胞密度を高めて培養することが可能となる。
【００７４】
組換え細胞により生産されたイソプレンは、例えば細胞外の気相から回収することができる。回収方法としては、例えば、固相吸着法や溶媒吸収法を採用することができる。
【００７５】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
〔実施例１〕
配列番号２の１００〜１０３番目（領域Ａ）に相当する「Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ」が「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。当該遺伝子の塩基配列と対応のアミノ酸配列を配列番号７に、アミノ酸配列のみを配列番号８に示す。
この遺伝子をｐＥＴ２１ベクターのＭＣＳ部位に導入し、プラスミドｐＳＫ１を作製した。１０ｎｇのｐＳＫ１を、氷上で溶解したNEB Express Competent E.coli（New England Biolabs Japan）５０μＬと混合し、氷上で３０分静置した。４２℃のウォーターバスで２０秒インキュベート後、再度氷上で５分間静置した。SOC bufferを１ｍＬ添加し、３７℃で１時間振とう培養した。LB/amp Agar（アンピシリン１００μｇ/ｍＬ）上に回復培養した大腸菌（組換え大腸菌）を５０μＬ展開し、終夜３７℃で静置培養した。得られたコロニーをLB/ampに植菌し、１６時間３７℃で振とう培養を行った。GCMS QP-2010 Ultra(株式会社島津製作所製)によって、気層成分のイソプレン濃度を測定した。
その結果、気相成分のイソプレン濃度は１０．４ｍｇ／Ｌであった。
【００７７】
〔実施例２〕
配列番号２の２６１〜２６３番目（領域Ｂ）に相当する「Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ」が「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。当該遺伝子の塩基配列と対応のアミノ酸配列を配列番号９に、アミノ酸配列のみを配列番号１０に示す。
この遺伝子をｐＥＴ２１ベクターのＭＣＳ部位に導入し、プラスミドｐＳＫ２を作製した。実施例１と同様にして、ｐＳＫ２をNEB Express Competent E.coliに導入し、組換え大腸菌を作製した。実施例１と同様にして組換え大腸菌を培養し、気相成分のイソプレン濃度を測定した。
その結果、イソプレン濃度は１５．２ｍｇ／Ｌであった。
【００７８】
〔実施例３〕
配列番号２の４６４〜４６６番目（領域Ｃ）に相当する「Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ」が「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ」に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。当該遺伝子の塩基配列と対応のアミノ酸配列を配列番号１１に、アミノ酸配列のみを配列番号１２に示す。
この遺伝子をｐＥＴ２１ベクターのＭＣＳ部位に導入し、プラスミドｐＳＫ３を作製した。実施例１と同様にして、ｐＳＫ３をNEB Express Competent E.coliに導入し、組換え大腸菌を作製した。実施例１と同様にして組換え大腸菌を培養し、気相成分のイソプレン濃度を測定した。
その結果、イソプレン濃度は１３．８ｍｇ／Ｌであった。
【００７９】
〔比較例１〕
アミノ酸置換が行われていない、配列番号２のアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素をコードする遺伝子（配列番号１）を用いて、実施例１〜３と同様の実験を行った。
その結果、気相成分のイソプレン濃度は０．８４ｍｇ／Ｌであった。
【００８０】
実施例１〜３及び比較例１の結果から、配列番号２の領域Ａ，Ｂ、又はＣにアミノ酸置換を施すことにより、組換え細胞（大腸菌）によるイソプレン生産能が向上することが示された。
【００８１】
〔実施例４〕
配列番号２の１００〜１０３番目（領域Ａ）に相当する「Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ」が「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」に置換され、配列番号２の２６１〜２６３番目（領域Ｂ）に相当する「Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ」が「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」に置換され、かつ配列番号２の４６４〜４６６番目（領域Ｃ）に相当する「Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ」が「Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ」に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。当該遺伝子の塩基配列と対応のアミノ酸配列を配列番号１３に、アミノ酸配列のみを配列番号１４に示す。
この遺伝子をｐＣＬ２ベクターのＭＣＳ部位に導入し、プラスミドｐＳＫ４（配列番号１５）を作製した。
【００８２】
Clostridium ljungdahlii（DSM13528株）を嫌気条件でYTF培地（16g tryptone, 10g yeast extract, 4g NaCl, 2mM Cysteine and 5g fructose / L, pH5.5）中、３７℃にて培養した。前培養として、YTF培地にグリシンを０．５ｍＬ添加した培地を用い、ＯＤ６００＝０．０５となるようにC. ljungdahlii菌液を添加し、３７℃で１６時間培養した。培養液を遠心機で５５００ｒｐｍ１５分遠心し、菌を沈殿させた。上清を除き、冷却したSMPバッファーで再分散させた。再び遠心、分散を行い、これを再度繰り返し、菌体を洗浄した。集菌した菌体に６０μＬのSMPバッファーを加え、再分散した。ここに、１０μｇのプラスミドｐＳＫ４を添加し、氷上で３０分静置した。その後、キュベットgenepulser（Biorad社）を用いてプラスミドを導入した。導入後の菌体を５ｍＬのYTF培地にて１６時間回復培養した。その後、滅菌脱酸素後のYTF/Chl Agar（クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）に混合し、プレートに播種した。このプレートを嫌気条件下３７℃で培養した。４日後に得られたコロニーをYTF/Chlに植菌し、ブチルゴム栓とアルミシールを用いて密閉した後、３７℃で２４時間振とう培養した。培養系の気相成分をGCMS QP-2010 Ultra(株式会社島津製作所製)によって分析し、イソプレン濃度を測定した。
その結果、イソプレン濃度は２０．３ｍｇ／Ｌであった。
【００８３】
〔比較例２〕
アミノ酸置換が行われていない、配列番号２のアミノ酸配列からなるイソプレン合成酵素をコードする遺伝子（配列番号１）を用いて、実施例４と同様の実験を行った。
その結果、イソプレン濃度は５μｇ／Ｌであった。
【００８４】
実施例４及び比較例２の結果から、配列番号２の領域Ａ，Ｂ、及びＣにアミノ酸置換を施すことにより、組換え細胞（Clostridium属細菌）によるイソプレン生産能が向上することが示された。
【図１】
2017163860.tif 000003
【図２】
2017163860.tif 000004
【図３】
2017163860.tif 000005
【図４】
2017163860.tif 000006
【図５】
2017163860.tif 000007
【配列表】
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