(57)【要約】      （修正有）【課題】培養細胞の撮像条件の最適化を図る。【解決手段】ＬＥＤランプ２の電流設定値を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞１１を撮像し、撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）を算出し、各観察像について、下記の（１）式で表される指標（Ｉ）を算出し、指標（Ｉ）が最大値である観察像を撮像したときのＬＥＤランプ２の電流設定値を最適値として設定する培養細胞の撮像方法。指標（Ｉ）＝（２５５−Ｌ）×（Ｌ＋Ｓ）・・・・（１）【選択図】図１
2017225354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、
観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ設定工程と、
観察像を取得する画像取得工程と
を有し、
前記明るさ設定工程は、
観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞を撮像する工程と、
撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出する工程と、
前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出する工程と、
前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定する工程と
を有することを特徴とする、培養細胞の撮像方法。
【請求項２】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、
観察像の焦点位置を設定する焦点位置設定工程と、
観察像を取得する画像取得工程と
を有し、
前記焦点位置設定工程は、
焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞を撮像する工程と、
撮像した各観察像について、観察像中の粒子数を計測する工程と、
前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定する工程と
を有することを特徴とする、培養細胞の撮像方法。
【請求項３】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、
観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ設定工程と、
観察像の焦点位置を設定する焦点位置設定工程と、
観察像を取得する画像取得工程と
を有し、
前記明るさ設定工程は、
観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞を撮像する工程と、
撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出する工程と、
前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出する工程と、
前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定する工程と
を有し、
前記焦点位置設定工程は、
焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞を撮像する工程と、
撮像した各観察像について、観察像中の粒子数を計測する工程と、
前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定する工程と
を有することを特徴とする、培養細胞の撮像方法。
【請求項４】
前記明るさ設定工程と、前記焦点位置設定工程とを交互に繰り返し、
２回目以降の前記明るさ設定工程において、
明るさを調節する撮像条件の変化範囲を、前回の前記明るさ設定工程において設定された明るさを調節する撮像条件を含み、かつ、前回の前記明るさ設定工程の明るさを調節する撮像条件の変化範囲よりも狭くし、
明るさを調節する撮像条件の変化の刻み幅を、前回の前記明るさ設定工程の明るさを調節する撮像条件の変化の刻み幅よりも狭くする
ことを特徴とする、請求項３記載の培養細胞の撮像方法。
【請求項５】
前記明るさ設定工程と、前記焦点位置設定工程とを交互に繰り返し、
２回目以降の前記焦点位置設定工程において、
焦点位置の変化範囲を、前回の前記焦点位置設定工程において設定された焦点位置を含み、かつ、前回の前記焦点位置設定工程の焦点位置の変化範囲よりも狭くし、
焦点位置の変化の刻み幅を、前回の前記焦点位置設定工程の焦点位置の変化の刻み幅よりも狭くする
ことを特徴とする、請求項３又は４記載の培養細胞の撮像方法。
【請求項６】
前記指標は、輝度階調の最大値である最大輝度と前記観察像の平均輝度との差と、前記平均輝度と前記観察像の平均彩度との和との積を含む
ことを特徴とする、請求項１、３〜５のいずれか一項に記載の培養細胞の撮像方法。
【請求項７】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、
前記培養細胞を照明する照明部と、
前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、
観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ制御部と
を備え、
前記明るさ制御部は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出し、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出し、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定する
ことを特徴とする、培養細胞の撮像装置。
【請求項８】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、
前記培養細胞を照明する照明部と、
前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、
観察像の焦点位置を設定する焦点位置制御部と
を備え、
前記焦点位置制御部は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、観察像中の粒子数を計測し、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの最適値として焦点位置を設定する
ことを特徴とする、培養細胞の撮像装置。
【請求項９】
培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、
前記培養細胞を照明する照明部と、
前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、
観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ制御部と、
観察像の焦点位置を設定する焦点位置制御部と
を備え、
前記明るさ制御部は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出し、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出し、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定し、
前記焦点位置制御部は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、観察像中の粒子数を計測し、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定することを特徴とする、培養細胞の撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の撮像方法及び装置に係り、より詳細には、培養細胞の撮像条件の最適化を図ることができる撮像方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養においては、培養中の細胞を所定時間ごとに撮像するタイムラプス撮像が行われることがある。撮像された観察像に対しては、培養細胞に関する様々な情報を抽出するために画像処理が行われる。その場合、観察像は、画像の明るさ及び焦点が画像処理に適切なものである必要がある。
【０００３】
観察像の明るさを調節する撮像条件及び焦点位置を調節して撮像する技術が、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載の観察システムでは、タイムラプス撮像を行う際に、観察像の輝度制御（図１３のＳ６４）とオートフォーカス制御（図１３のＳ６５）が実行されている。輝度制御にあたっては、観察像の平均輝度が、予め設定された所定範囲内に入るように、ＬＥＤ制御等が行われる（図１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１４１４０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、細胞培養を継続していると、細胞濃度が変化し、かつ乳酸等の細胞代謝産物が発生して培養液のｐＨが変化するため、培養液の濁度及び色調が変化する。その結果、観察像の平均輝度が所定範囲内であっても、観察像が画像処理に適切なものとならない場合が生じ得る。
【０００６】
また、細胞培養において培地を流加し、培養液の液深が変化した場合も、細胞濃度及び培養液のｐＨが変化するため、培養液の濁度及び色調が変化する。その結果、観察像の平均輝度が所定範囲内であっても、観察像が画像処理に適切なものとならない場合が生じ得る。また、培地を流加した後、培養液を撹拌するため、観察像の焦点位置が変化してしまう。そのうえ、撮像は培養細胞が培養液中で沈殿した状態で行うが、必ずしも培養液中で同一平面上に位置しているわけではなく、全ての培養細胞に同時に焦点を合わせることが困難な場合が生じ得る。
【０００７】
このように、継続的な細胞培養の過程では、培養容器の内部の色調や液深等の条件が変化していく。このため、画像処理するために最適な観察像の明るさや焦点位置が、細胞培養の初期段階と時間経過後とでは異なってしまうことがあった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑み成されたものであり、培養細胞の撮像条件の最適化を図ることができる培養細胞の撮像方法及び装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の第１の培養細胞の撮像方法は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ設定工程と、観察像を取得する画像取得工程とを有し、前記明るさ設定工程は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記培養細胞を撮像する工程と、撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出する工程と、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出する工程と、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定する工程とを有することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明の第２の培養細胞の撮像方法は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、観察像の焦点位置を設定する焦点位置設定工程と、観察像を取得する画像取得工程とを有し、前記焦点位置設定工程は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記培養細胞を撮像する工程と、撮像した各観察像について、観察像中の粒子数を計測する工程と、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定する工程とを有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明の第３の培養細胞の撮像方法は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像方法であって、観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ設定工程と、観察像の焦点位置を設定する焦点位置設定工程と、観察像を取得する画像取得工程とを有し、前記明るさ設定工程は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記培養細胞を撮像する工程と、撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出する工程と、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出する工程と、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定する工程とを有し、前記焦点位置設定工程は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記培養細胞を撮像する工程と、撮像した各観察像について、観察像中の粒子数を計測する工程と、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定する工程とを有することを特徴としている。
【００１２】
また、本発明の第１の培養細胞の撮像装置は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、前記培養細胞を照明する照明部と、前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ制御部とを備え、前記明るさ制御部は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出し、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出し、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定することを特徴としている。
【００１３】
また、本発明の第２の培養細胞の撮像装置は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、前記培養細胞を照明する照明部と、前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、観察像の焦点位置を設定する焦点位置制御部とを備え、前記焦点位置制御部は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、観察像中の粒子数を計測し、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定することを特徴としている。
【００１４】
また、本発明の第３の培養細胞の撮像装置は、培養容器内の培養細胞の観察像を撮像する撮像装置であって、前記培養細胞を照明する照明部と、前記培養細胞を撮像して観察像を生成する撮像部と、観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ制御部と、観察像の焦点位置を設定する焦点位置制御部とを備え、前記明るさ制御部は、観察像の明るさを調節する撮像条件を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度を算出し、前記各観察像について、前記平均輝度及び前記平均彩度に基づいて指標を算出し、前記指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を設定し、前記焦点位置制御部は、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて前記撮像部に前記培養細胞を撮像させ、前記撮像部によって撮像された各観察像について、観察像中の粒子数を計測し、前記粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の第１及び第３の培養細胞の撮像方法及び装置は、観察像の明るさを調節する撮像条件を変えて撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度及び平均彩度に基づいた指標が最大値である観察像を撮像したときの明るさを調節する撮像条件を最適値として設定し、その最適値で観察像を取得する。これにより、細胞培養を継続中に培養液の濁度及び色調が変化した場合であっても、培養細胞の撮像条件の最適化を図ることができる。
【００１６】
また、本発明の第２及び第３の培養細胞の撮像方法及び装置は、焦点位置を変えて撮像した観察像中の粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定し、その最適値で観察像を取得する。これにより、培養細胞が培養液中で同一平面上に位置していない場合であっても、培養細胞の撮像条件の最適化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の第１実施形態に係る培養細胞の撮像装置の模式図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係る培養細胞の撮像方法のフローチャートである。
【図３】観察像の明るさを調節する撮像条件を設定するフローチャートである。
【図４】（ａ）〜（ｅ）は、観察像の明るさを調節する撮像条件を変えて撮像した観察像である。
【図５】観察像の明るさを調節する撮像条件と指標との関係を示すグラフである。
【図６】観察像の焦点位置を設定するフローチャートである。
【図７】（ａ）〜（ｅ）は、焦点位置を変えて撮像した観察像である。
【図８】焦点位置と粒子数との関係を示すグラフである。
【図９】（ａ）〜（ｃ）は、焦点位置と粒子数との関係を示す観察像である。
【図１０】本発明の第２実施形態に係る培養細胞の撮像方法のフローチャートである。
【図１１】（ａ）〜（ｅ）は、明るさ設定と、焦点位置設定とを交互に繰り返して撮像した観察像である。
【図１２】（ａ）は、１回目の明るさ設定工程における明るさを調節する撮像条件と指標との関係を示すグラフであり、（ｂ）は、２回目の明るさ設定工程における明るさを調節する撮像条件と指標との関係を示すグラフであり、（ｃ）は、３回目の明るさ設定工程における明るさを調節する撮像条件と指標との関係を示すグラフである。
【図１３】（ａ）は、１回目の焦点位置設定工程における焦点位置と粒子数との関係を示すグラフであり、（ｂ）は、２回目の焦点位置設定工程における焦点位置と粒子数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。
［第１実施形態］
（撮像装置）
先ず、図１を参照して、第１実施形態の培養細胞の撮像装置（以下、撮像装置とも称する。）を説明する。図１は、本実施形態の撮像装置の模式図である。撮像装置は、培養容器１に収容された培養液１０中の培養細胞１１を、所定時間（例えば６０分）ごとにタイムラプス撮像する装置である。
【００１９】
図１に示すように、本実施形態の撮像装置は、培養容器１内の培養細胞１１の観察像を撮像する撮像装置であって、培養細胞１１を照明する照明部としてのＬＥＤランプ２と、培養細胞１１を撮像して観察像を生成する撮像部としてのＣＣＤカメラ３とを備えている。ＣＣＤカメラ３は、培養容器１を挟んでＬＥＤランプ２の反対側に配置され、透過像を撮像する。
【００２０】
本実施形態の撮像装置は、ＬＥＤランプ２の明るさを調節する調光器４と、ＣＣＤカメラ３を移動させるアクチュエータ５と、調光器４及びアクチュエータ５を制御するコンピュータである制御部６とを更に備えている。制御部６は、ＣＣＤカメラ３を制御して、自動的にタイムラプス撮像を実行する。
【００２１】
制御部６はまた、観察像の明るさを調節する撮像条件を設定する明るさ制御部としても機能する。制御部６が調光器４を制御することにより、ＬＥＤランプ２に印加する電流値が調節されて、観察像の明るさが調節される。したがって、本実施形態では、ＬＥＤランプ２の電流値が、観察像の明るさを調節する撮像条件となる。
なお、観察像の明るさは、ＬＥＤランプ２の電流値だけでなく、絞りの開度、ＣＣＤカメラのシャッター速度によって調節してもよいし、これらを組み合わせて調節してもよい。
【００２２】
制御部６はまた、観察像の焦点位置を設定する焦点位置制御部としても機能する。制御部６がアクチュエータ５を制御することにより、ＣＣＤカメラ３の位置が調節される。ＣＣＤカメラ３が、図１中の矢印の方向（ｚ軸方向）に移動することにより、ＣＣＤカメラ３と培養容器１との距離が調節される。したがって、本実施形態では、ＣＣＤカメラ３の位置によって、焦点位置が調節される。
なお、焦点位置は、ＣＣＤカメラ３を移動させるだけでなく、ＣＣＤカメラ３のレンズ等の光学系によって調節してもよいし、培養容器１を移動させて調節してもよいし、これらを組み合わせて調節してもよい。
【００２３】
（撮像方法）
次に、図２を参照して、本実施形態の撮像装置による撮像方法を説明する。図２のフローチャートに示すように、培養細胞１１の観察像を撮像する際の撮像条件を設定するにあたっては、まず、観察像の明るさを調節するための撮像条件として、ＬＥＤランプ２の電流値を設定し（Ｓ１）、続いて、ＣＣＤカメラ３を移動させて焦点位置を設定する（Ｓ２）。そして、ＬＥＤランプ２の電流値及びＣＣＤカメラ３の焦点位置を最適化した撮像条件で撮像した観察像を取得する（Ｓ３）。
【００２４】
（明るさ設定工程）
図３のフローチャートを参照して、図２の明るさ設定工程（Ｓ１）における、観察像の明るさを設定するために、ＬＥＤランプ２の電流値を設定する方法を説明する。
まず、観察像の明るさを調節する撮像条件として、ＬＥＤランプ２の電流設定値を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞１１を撮像し、複数の観察像を生成する（Ｓ１１）。本実施形態のＬＥＤランプ２の電流設定値は最小値が「０」、最大値が「１００」であり、ここでは、調光器４が、電流設定値を「１０」刻みで、「１０」から「１００」まで変化させ、ＣＣＤカメラ３が、各電流設定値で培養細胞１１を撮像し、合計１０枚の観察像が生成された。
【００２５】
図４（ａ）〜図４（ｅ）に、１０枚の観察像のうち、電流設定値が「１０」〜「５０」の場合の５枚の観察像を示す。図４の各観察像は黒白画像であるが、実際の画像では、培養液１０が黄色く変色している。
これらの観察像から分かるように、ＬＥＤランプ２の電流設定値が低すぎると、図４（ａ）に示すように、観察像中で培養細胞１１の粒子の判別が困難となる。一方、ＬＥＤランプ２の電流設定値が高すぎても、図４（ｅ）に示すように、観察像全体が白くなって小さい粒子が消えてしまい、粒子の判別が困難になる。また、図４には示していないが、ＬＥＤランプ２の電流設定値を更に高くすると、観察像全体が更に白くなり、粒子の判別が一層困難となる。
【００２６】
次に、図４（ａ）〜図４（ｅ）に示した観察像を含む、撮像した各観察像について、制御部６により、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）を算出する（Ｓ１２）。
【００２７】
ＨＬＳ色空間（ＨＳＬ色空間ともいう。）とは、色相（ｈｕｅ）、輝度（ｌｉｇｈｔｎｅｓｓ／ｌｕｍｉｎａｎｃｅ）及び彩度（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）の３成分で表される色空間をいう。色相は、色味を３６０度の角度で表す。輝度は、特許文献１に記載された「輝度」とは意味が異なり、白色を最大値とし、黒色を最小値として、色の明るさを表し、輝度が最大値と最小値との半分のときに純色となる。彩度は、純色を最大値とし、灰色を最低値として、色の鮮やかさを表す。
【００２８】
観察像の平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）は、ＣＣＤカメラ３のＲＧＢの各色の受光素子の受光強度を表したＲＧＢ表色系の画素ごとのデータを観察像全体で平均した値を、ＨＬＳ表色系に変換することにより算出される。下記の表１に、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの、観察像全体の平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）を示す。表１では、平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）を０〜２５５の２５６階調で表している。
【００２９】
【表１】
2017225354.tif 000003
【００３０】
次に、各観察像について、平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）に基づいて、制御部６が指標を算出する（Ｓ１３）。
ここで、指標は、下記の（１）式のように、輝度階調の最大値である最大輝度（２５５）と観察像の平均輝度（Ｌ）との差（２５５―Ｌ）と、平均輝度（Ｌ）と平均彩度（Ｓ）との和（Ｌ＋Ｓ）との積を含む。
指標（Ｉ）＝（２５５−Ｌ）×（Ｌ＋Ｓ）  ・・・・（１）
上記の式（１）は、本発明者が種々の実験及び検討を重ね、経験的に見出したものである。
【００３１】
表１に、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの指標（Ｉ）の値を示す。表１に示すように、ＬＥＤランプ２の電流設定値が「２０」のときに、指標（Ｉ）が、最大値「２５６５２」となっている。
【００３２】
また、図５のグラフに、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの指標（Ｉ）を示す。図５から、ＬＥＤランプ２の電流設定値が「２０」のときに、指標（Ｉ）が極大となっていることが分かる。
【００３３】
次に、指標（Ｉ）が最大値である観察像を撮像したときのＬＥＤランプ２の電流設定値を最適値として設定する（Ｓ１４）。ここでは、ＬＥＤランプ２の電流設定値「２０」が、明るさを調節する撮像条件の最適値として設定される。
【００３４】
（焦点位置設定工程）
次に、図６のフローチャートを参照して、図２の焦点位置設定工程（Ｓ２）における、焦点位置を設定する方法を説明する。
まず、焦点位置を所定の変化範囲内で所定の刻み幅で変えて培養細胞１１を撮像して、複数の観察像を生成する（Ｓ２１）。ここでは、アクチュエータ５が、ＣＣＤカメラ３を移動して、焦点位置を表すＺ座標（任意単位）が「２５０」刻みで、「０」から「９７５０」まで変化させ、ＣＣＤカメラ３が、各Ｚ座標で培養細胞１１を撮像し、合計４０枚の観察像が生成された。
【００３５】
図７（ａ）〜図７（ｅ）に、４０枚の観察像のうち、焦点位置のＺ座標が「０」、「３０００」、「４２５０」、「６０００」及び「９７５０」のときの５枚の観察像を代表して示す。
【００３６】
次に、図７（ａ）〜図７（ｅ）に示した観察像を含む、撮像した各観察像について、観察像中の粒子数を計測する（Ｓ２２）。観察像中の個々の粒子は、画像処理により計測される。
図８のグラフに、Ｚ座標の設定値ごとの、粒子数を示す。図８から、Ｚ座標が「４２５０」のときに、粒子数が極大となっていることが分かる。
【００３７】
また、表２に、焦点位置のＺ座標が「３０００」〜「６０００」のときの観察像中から計測された粒子数を示す。表２に示すように、Ｚ座標が「４２５０」のときに、粒子数が、最大値「６１１０」となっている。
【００３８】
【表２】
2017225354.tif 000004
【００３９】
図９（ａ）及び図９（ｃ）に、焦点が合っていないときの観察像を示し、図９（ｂ）に焦点が合っているときの観察像を示す。図９（ａ）及び図９（ｃ）に示すように、焦点が合っていないときには、個々の粒子の輪郭が不鮮明となり、隣接する粒子と一体となってしまっている。このため、画像処理の際に、個々の粒子を切り分けて抽出することが困難となり、計測される粒子数が減少する。また、図７（ａ）及び図７ （ｃ）に示したように、焦点が全く合っていない場合には、観察像中の粒子そのものの判別が困難となるため、計測される粒子数は大きく低下する。
【００４０】
一方、図９（ｂ）に示すように、焦点が合っているときには、個々の粒子の輪郭が鮮明となり、画像処理の際に、個々の粒子を隣接する粒子から切り分けて抽出することができる。このため、計測される粒子数が増加する。したがって、最も多くの粒子が計測されるときには、最も多くの粒子に焦点が合っていることになる。
【００４１】
次に、粒子数が最大値である観察像を撮像したときの焦点位置を最適値として設定する（Ｓ２３）。ここでは、Ｚ座標「４２５０」がＣＣＤカメラ３の焦点位置の最適値として設定される。
【００４２】
（画像取得工程）
次に、ＬＥＤランプ２の最適な電流設定値、及びＣＣＤカメラ３の最適な焦点位置の撮像条件で撮像された画像を取得する（図２のＳ３）。
なお、この画像の取得にあたっては、最適化した撮像条件で改めて観察像を撮像してもよいし、撮像条件を設定する過程で、最適化された撮像条件と同一条件で撮像された観察像のデータを選択して利用してもよい。
【００４３】
このように、本実施形態では、ＬＥＤランプ２の電流設定値を変えて撮像した各観察像について、ＨＬＳ色空間における観察像の平均輝度（Ｌ）及び平均彩度（Ｓ）に基づいた指標（Ｉ）が最大値となる撮像条件を設定した。さらに、本実施形態では、焦点位置を変えて撮像した観察像中の粒子数が最大となる撮像条件を設定した。これにより、細胞培養を継続中に培養液１０の色調が変化したり、透明度が低下したりした場合であっても、また、培養細胞１１が培養液１０中で同一平面上に位置していない場合であっても、培養細胞１１の撮像条件の最適化を図ることができる。
【００４４】
［第２実施形態］
第２実施形態の撮像装置は、第１実施形態のものと同一であるので、その詳細な説明を省略する。
本実施形態の撮像方法では、図１０のフローチャートに示すように、培養細胞１１の観察像を撮像する際の撮像条件を設定するにあたって、観察像の明るさを調節するための撮像条件としてＬＥＤランプ２の電流値を設定する明るさ設定工程（Ｓ１、Ｓ３及びＳ５）と、ＣＣＤカメラ３を移動させて焦点位置を設定する焦点位置設定工程（Ｓ２及びＳ４）とを交互に繰り返す。そして、最後に設定されたＬＥＤランプ２の電流値及びＣＣＤカメラ３の焦点位置で最適化した撮像条件で撮像した観察像を取得する（Ｓ６）。
【００４５】
図１１（ａ）〜図１１（ｅ）に、図１０のＳ１〜Ｓ５の各工程において最適化された撮像条件で撮像した観察像を示す。
図１１（ａ）に、１回目の明るさ設定工程（図１０のＳ１）において最適化されたＬＥＤランプ２の電流設定値で撮像した観察像を示す。この段階では未だ焦点が合っていないため、粒子が判別できない。
【００４６】
図１２（ａ）のグラフに、１回目の明るさ設定工程（Ｓ１）における、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの指標（Ｉ）を示す。１回目の明るさ設定工程（Ｓ１）では、ＬＥＤランプ２の電流設定値を「２」刻みで、「２」から「４０」まで変化させて、各電流設定値で培養細胞１１を撮像し、合計２０枚の観察像を生成している。
【００４７】
図１２（ａ）に示すように、ＬＥＤランプ２の電流設定値が「１４」のときに、指標（Ｉ）が極大となっている。図１１（ａ）に示した観察像は、電流設定値を「１４」とした撮像条件で撮像したものである。
【００４８】
次に、図１１（ｂ）に、１回目の焦点位置設定工程（図１０のＳ２）において最適化された焦点位置で撮像した観察像を示す。この段階では、焦点が合っているため、観察像中の粒子が判別できる。
【００４９】
図１３（ａ）のグラフに、１回目の焦点位置設定工程（Ｓ２）における、ＣＣＤカメラ３の焦点位置ごとの粒子数を示す。１回目の焦点位置設定工程（Ｓ２）では、焦点位置を表すＺ座標を「２５０」刻みで「０」から「９７５０」まで変化させて、各Ｚ座標で培養細胞１１を撮像し、合計４０枚の観察像を生成している。
【００５０】
図１３（ａ）に示すように、Ｚ座標が「３５００」のときに、粒子数が最大となっている。図１１（ｂ）に示した観察像は、電流設定値を「１４」としたまま、Ｚ座標を「３５００」とした撮像条件で撮像したものである。
【００５１】
次に、図１１（ｃ）に、２回目の明るさ設定工程（図１０のＳ３）において最適化されたＬＥＤランプ２の電流設定値で撮像した観察像を示す。１回目の焦点調節の結果、観察像の明るさが最適でなくなった場合であっても、２回目の明るさ調整によって、観察像の明るさが再び最適化される。
【００５２】
図１２（ｂ）のグラフに、２回目の明るさ設定工程（Ｓ３）における、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの指標（Ｉ）を示す。２回目の明るさ設定工程（Ｓ３）も、１回目の明るさ設定工程と同様に、ＬＥＤランプ２の電流設定値を「２」刻みで、「２」から「４０」まで変化させて、各電流設定値で培養細胞１１を撮像し、合計２０枚の観察像を生成している。
【００５３】
図１２（ｂ）に示すように、ＬＥＤランプ２の電流設定値が「１４」のときに、指標（Ｉ）が極大となっている。図１１（ｃ）に示した観察像は、Ｚ座標を「３５００」としたまま、電流設定値を「１４」とした撮像条件で撮像したものである。
【００５４】
図１１（ｄ）に、２回目の焦点位置設定工程（図１０のＳ４）において２回目の焦点調整によって最適化された焦点位置で撮像した観察像を示す。
【００５５】
図１３（ｂ）のグラフに、２回目の焦点位置設定工程（Ｓ４）における、ＣＣＤカメラ３の焦点位置ごとの粒子数を示す。２回目の焦点位置設定工程（Ｓ４）では、焦点位置を表すＺ座標の刻み幅を、１回目よりも狭い「１００」刻みとし、Ｚ座標の変化範囲を、１回目の最適値である「３５００」を含み、かつ、１回目よりも狭い範囲である「２８００」から「４２００」として、各Ｚ座標で培養細胞１１を撮像し、合計１５枚の観察像を生成している。
【００５６】
図１３（ｂ）に示すように、２回目の焦点位置設定工程（Ｓ４）では、Ｚ座標が「３６００」のときに、粒子数が最大となっている。図１１（ｄ）に示した観察像は、電流設定値を「１４」としたまま、Ｚ座標を「３６００」とした撮像条件で撮像したものである。
このように、２回目の焦点位置設定における刻み幅を、１回目のものよりも狭くしつつ、２回目の焦点位置設定における変化範囲を、１回目のものよりも狭くした結果、撮像枚数の増大を回避しつつ、ＣＣＤカメラ３の焦点位置の撮像条件の設定精度の向上を図ることができる。
【００５７】
次に、図１１（ｅ）に、３回目の明るさ設定工程（図１０のＳ５）において最適化されたＬＥＤランプ２の電流設定値で撮像した観察像を示す。
【００５８】
図１２（ｃ）のグラフに、３回目の明るさ設定工程（Ｓ５）における、ＬＥＤランプ２の電流設定値ごとの指標（Ｉ）を示す。３回目の明るさ設定工程（Ｓ５）では、ＬＥＤランプ２の電流設定値の刻み幅を、１回目よりも狭い「１」刻みとし、電流設定値の変化範囲を、２回目の最適値である「１４」を含む「９」から「１８」として、各電流設定値で培養細胞１１を撮像し、合計１０枚の観察像を生成している。
【００５９】
図１２（ｃ）に示すように、３回目の明るさ設定工程（Ｓ５）では、ＬＥＤランプ２の電流設定値が「１５」のときに、指標（Ｉ）が極大となっている。図１１（ｅ）に示した観察像は、Ｚ座標を「３６００」としたまま、電流設定値を「１５」とした撮像条件で撮像したものである。
このように、３回目の明るさ設定工程（Ｓ５）におけるＬＥＤランプ２の電流設定値の刻み幅を、２回目のものよりも狭くしつつ、３回目の明るさ設定工程（Ｓ５）における電流設定値の変化範囲を、２回目のものよりも狭くした結果、撮像枚数の増大を回避しつつ、ＬＥＤランプ２の電流設定値の撮像条件の設定精度の向上を図ることができる。
【００６０】
このようにして、図１１（ｅ）に示した観察像が最適画像として取得される（図１０のＳ６）。
【００６１】
以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は種々の変更及び変形を行うことができる。例えば、上述した各実施形態では、撮像部であるＣＣＤカメラを、培養容器を挟んで、ＬＥＤランプの反対側に配置し、透過光を撮像した観察像を生成した例を説明したが、本発明では、観察像は透過光像に限定されず、例えば、反射光像であってもよい。
【００６２】
また、上述した実施形態では、観察像の明るさを調節する撮像条件として、ＬＥＤランプの電流値を設定した例を説明したが、本発明では、観察像の明るさを調節する撮像条件は、これに限定されず、例えば、絞りの開度で明るさを調節してもよいし、ＣＣＤカメラのシャッター速度で明るさを調節してもよい。
【００６３】
また、ＨＳＶ表色系で指標を算出してもよい。ＨＳＶ表色系は、色相（ｈｕｅ）、彩度（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）及び明度（ｖａｌｕｅ）の３成分で表される。色相は、色味を３６０度の角度で表す。彩度は、純色を最大値とし、灰色を最低値として、色の鮮やかさを表す。明度は、色の明るさを表す。
【００６４】
また、上述した実施形態では、焦点位置を変化させるにあたり、撮像部としてのＣＣＤカメラを移動させた例を説明したが、本発明では、焦点位置の調節方法はこれに限定されず、ＣＣＤカメラの光学系を移動させて焦点位置を調節してもよいし、培養容器を移動させて焦点位置を調節してもよい。
【００６５】
また、上述した実施形態では、照明部としてＬＥＤランプを使用した例を説明したが、本発明では、照明部はこれに限定されない。また、上述した実施形態では、撮像部としてＣＣＤカメラを使用した例を説明したが、本発明では、撮像部はこれに限定されない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は培養細胞の自動タイムラプス撮像に適用して好適である。
【符号の説明】
【００６７】
１  培養容器
２  ＬＥＤランプ
３  ＣＣＤカメラ
４  調光器
５  アクチュエータ
６  制御部
１０  培養液
１１  培養細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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