(57)【要約】【課題】エラスチンやコラーゲンを容易に分解して、低分子化することが可能なエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法を提供する。【解決手段】エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程を含む、エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程を含むことを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法。
【請求項２】
請求項１に記載のエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法であって、
前記エラスチンが、魚のエラスチンであり、前記コラーゲンが、魚のコラーゲンであることを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法。
【請求項３】
請求項２に記載のエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法であって、
前記魚のエラスチンが、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチンのうち少なくとも１つであり、前記魚のコラーゲンが、鯛コラーゲンであることを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法。
【請求項４】
エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程を含むことを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載のエラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法であって、
前記エラスチンが、魚のエラスチンであり、前記コラーゲンが、魚のコラーゲンであることを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載のエラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法であって、
前記魚のエラスチンが、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチンのうち少なくとも１つであり、前記魚のコラーゲンが、鯛コラーゲンであることを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のエラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法であって、
前記製品が、血小板凝集阻害剤であることを特徴とする、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチン分解物およびコラーゲン分解物のうちの少なくとも１つ（以下、単に「エラスチン・コラーゲン分解物」と呼ぶ場合がある。）の調製方法、および、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆菌（Bacillus subtilis natto）は、世界的に一般的安全性の認められた菌株であり、ナットウキナーゼとはその菌株が大豆（Soybean）から生産した血栓溶解（線溶）酵素である（例えば、非特許文献１，２参照）。その分子構造は２７５残基が一本鎖でつながったポリペプチドである（分子量２７，７２４、ｐＩ８．７（例えば、非特許文献３−５参照））。
【０００３】
ナットウキナーゼは血栓（フィブリン）をよく溶かす一方で、強いエラスターゼ活性を持つ。このことは、納豆のエラスチン分解酵素の一次構造がナットウキナーゼのＮ末端と一致することで当初は予想されてきたが（例えば、非特許文献６，７参照）、現在はアミノ酸組成とともにその抗原性の面からも確認されている（非特許文献８，９参照）。また、納豆菌にはかなり強いエラスターゼ活性およびコラゲナーゼ活性が認められる（特許文献１参照）。本発明者らは、エラスタチナールがナットウキナーゼに対して非常に強く阻害することを明らかにした（Ｋｍ＝３．９１×１０−３Ｍ、Ｋｉ＝６．００×１０−６Ｍ）。
【０００４】
カツオは特に人間にはない特殊な臓器を持ち、その一つがカツオ動脈球のエラスチンである。しかし、カツオ等の魚等のエラスチンやコラーゲンは、水に対して溶解しにくく、これらを容易に分解して、低分子化（可溶化）できれば、化粧品、食品等への応用も可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１４９０２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H. Sumi, H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara and H. Muraki, A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean in food of the Japanese diet, Experientia, 43, 1110-1111, 1987
【非特許文献２】H. Sumi, H. Hamada, H. Nakanishi and H. Hiratani, Enhancement of fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase, Acta. Haematol., 84: 139-143, 1990
【非特許文献３】須見洋行，ナットウキナーゼ，木内幹監修，納豆の研究法．東京，恒星社厚生閣， p.158-160，2010
【非特許文献４】須見洋行，内藤佐和，矢田貝智恵子，大杉忠則，吉田悦男，柳澤泰任，丸山眞杉，ナットウキナーゼによる血流改善作用と冷え性への可能性，Food Style 21，62-64，2012
【非特許文献５】Y. Yanagisawa, T. Chatake, K. Chiba, S. Naito, T. Ohsugi, H. Sumi, I. Yasuda and Y. Morimoto, Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto, Acta. Cryst. F66, 1670-1673, 2010
【非特許文献６】須見洋行，吉川美佐子，馬場智子，松原主典，久保田英史，納豆中のエラスターゼ活性とナットウキナーゼ，農化誌，73，1187-1190，1999
【非特許文献７】H. Sumi, N. Nakajima and C. Yatagai, A unique strong fibrinolytic enzyme (katsuwokinase) in skipjack “Shiokara” a Japanese traditional fermented food, Comp. Biochem. Physiol., 112B(3), 543-547, 1995
【非特許文献８】H. Sumi, S. Naito, J. Saito and M. Maruyama, Elastase activity and elastatinal inhibition of nattokianse, XXIII Congress of ISTH, P-TU-269, Kyoto, 2011
【非特許文献９】H. Sumi, S. Naito, C. Yatagai, L. Zhang, J. Saito and M. Maruyama, Anti-platelet aggregation activity of highly purified nattokinase, 21st International Congress on Fibrinolysis & Proteolysis, P-07, Brighton, UK, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、エラスチンやコラーゲンを容易に分解して、低分子化することが可能なエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法、および、その方法により得られる分解物を含む製品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程を含む、エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法である。
【０００９】
前記エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法において、前記エラスチンが、魚のエラスチンであり、前記コラーゲンが、魚のコラーゲンであることが好ましい。
【００１０】
前記エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法において、前記魚のエラスチンが、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチンのうち少なくとも１つであり、前記魚のコラーゲンが、鯛コラーゲンであることが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程を含む、エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法である。
【００１２】
前記エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法において、前記エラスチンが、魚のエラスチンであり、前記コラーゲンが、魚のコラーゲンであることが好ましい。
【００１３】
前記エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法において、前記魚のエラスチンが、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチンのうち少なくとも１つであり、前記魚のコラーゲンが、鯛コラーゲンであることが好ましい。
【００１４】
前記エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法において、前記製品が、血小板凝集阻害剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、エラスチンやコラーゲンを容易に分解して、低分子化することが可能なエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法、および、その方法により得られる分解物を含む製品の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例で用いた精製ナットウキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。
【図２】実施例で用いた精製ナットウキナーゼの血小板凝集阻害効果を示すグラフである。
【図３】実施例で用いた精製ナットウキナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびルンブロキナーゼのエラスチンの可溶化の様子を示す写真である。
【図４】実施例における、カツオエラスチン存在下でのナットウキナーゼのヒト血小板凝集反応に対する影響を示すグラフである。
【図５】実施例における、鯛コラーゲン存在下でのナットウキナーゼのヒト血小板凝集反応に対する影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
＜エラスチン・コラーゲン分解物の調製方法＞
本実施形態に係るエラスチン・コラーゲン分解物の調製方法は、エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程（分解物調製工程）を含む方法である。
【００１９】
エラスチンやコラーゲンを、ナットウキナーゼを用いて分解することによって、低分子化（可溶化）された、エラスチン分解物またはコラーゲン分解物を容易に調製することができることがわかった。特にカツオ、キハダ、ハマチのエラスチン等の魚のエラスチン、鯛のコラーゲン等の魚のコラーゲンを容易に可溶化することがわかった。すなわち、ナットウキナーゼは強い、エラスチン分解能またはコラーゲン分解能を示し、特に、強い、魚エラスチン分解能または魚コラーゲン分解能を示す。また、このようにして得られた分解物（低分子物質：Conjugate）は優れた血小板凝集阻害能を持つことがわかった。魚のエラスチン等のエラスチンや魚のコラーゲン等のコラーゲンとナットウキナーゼとの関係、すなわち、魚のエラスチン等のエラスチンや魚のコラーゲン等のコラーゲンがナットウキナーゼにより低分子化（可溶化）されることは従来、全く知られていなかった。この分解物は食品分野、化粧品分野等への応用が可能であり、利用価値が大きいと考えられる。
【００２０】
ナットウキナーゼは、納豆菌が大豆（Soybean）から生産する血栓溶解（線溶）酵素であり、その分子構造は２７５残基が一本鎖でつながったポリペプチドである（分子量２７，７２４、ｐＩ８．７）。ナットウキナーゼは、納豆菌（学名：Bacillus subtilis natto）が産生する酵素である。
【００２１】
エラスチン、コラーゲンは、結合組織繊維を構成するタンパク質である。
【００２２】
エラスチンとしては、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチン、マグロエラスチン、タラエラスチン等の魚由来の魚エラスチン、ブタエラスチン等の動物由来の動物エラスチン等が挙げられ、魚のエラスチン、特に、カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチンの分解に、本実施形態に係る分解物の調製方法を好適に適用することができる。
【００２３】
コラーゲンとしては、鯛コラーゲン、タラコラーゲン、コイコラーゲン等の魚由来の魚コラーゲン、ブタコラーゲン等の動物由来の動物コラーゲン等が挙げられ、魚のコラーゲン、特に、鯛コラーゲンの分解に、本実施形態に係る分解物の調製方法を好適に適用することができる。
【００２４】
分解反応（低分子化反応）におけるナットウキナーゼの添加量は、エラスチンやコラーゲンを分解して低分子化することができればよく、特に制限はないが、例えば、分解対象であるエラスチンやコラーゲンの量に対して、０．０５重量％〜２０重量％の範囲であり、１．０重量％〜５．０重量％の範囲であることが好ましい。ナットウキナーゼの添加量がエラスチンやコラーゲンの量に対して、０．０５重量％未満であると、魚等に含まれる不純物により酵素活性が阻害される可能性がある。
【００２５】
分解反応は、エラスチンやコラーゲンを分解して低分子化することができればよく、特に制限はないが、例えば、水、有機溶媒等の溶液中でエラスチンやコラーゲンをナットウキナーゼとともに所定の時間、所定の温度で加熱する方法等で行われればよく、特に制限はない。
【００２６】
反応温度は、エラスチンやコラーゲンを分解して低分子化することができればよく、特に制限はないが、例えば、１０℃〜６０℃の範囲であり、好ましくは、２５℃〜４０℃の範囲である。反応温度が１０℃未満であると、反応が起こりにくい場合があり、６０℃を超えると、酵素が変性（失活）する場合がある。
【００２７】
反応時間は、エラスチンやコラーゲンを分解して低分子化することができればよく、特に制限はないが、例えば、０．１時間〜２４時間の範囲であり、好ましくは、１５分〜１２０分の範囲である。反応時間が０．１時間未満であると、反応が起こりにくい場合があり、２４時間を超えると、酵素が変性（失活）する場合がある。
【００２８】
反応時のｐＨは、エラスチンやコラーゲンを分解して低分子化することができればよく、特に制限はないが、例えば、３．０〜１０．０の範囲であり、好ましくは、６．５〜８．５の範囲である。
【００２９】
得られた分解物を、例えば、ゲルろ過法、イオン交換法等により、精製してもよい。
【００３０】
＜エラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法＞
本実施形態に係るエラスチン・コラーゲン分解物を含む製品の製造方法は、エラスチンおよびコラーゲンのうち少なくとも１つを、ナットウキナーゼを用いて分解して、低分子化された分解物を調製する工程（分解物調製工程）を含む。分解物調製工程により得られた分解物を、必要に応じてその他の材料と混合して（混合工程）、エラスチン分解物およびコラーゲン分解物のうちの少なくとも１つを含む製品を得ることができる。
【００３１】
本実施形態に係るエラスチン・コラーゲン分解物を含む製品としては、例えば、食品、飲料、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料等が挙げられる。本実施形態に係るエラスチン・コラーゲン分解物を含ませることにより、食品、化粧品等の製品に、伸縮性、弾力性（プリプリ感）等の物性を付与することができる。なお、製品の形態または製品の調製加工方法には特に制限はない。
【００３２】
本実施形態に係るエラスチン・コラーゲン分解物は、水等の液体に混合するだけではなく、固形分や粉体等に直接混合してもよい。エラスチン分解物、コラーゲン分解物の混合量は、対象物の種類や状態等や、用いるエラスチン・コラーゲン分解物の含有量等に応じて適宜調整すればよい。
【００３３】
食品としては、例えば、加工食品、菓子、保健機能食品、健康食品、ダイエット用食品等が挙げられる。
【００３４】
飲料としては、例えば、清涼飲料水、果実飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、粉末飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、炭酸飲料、栄養飲料、ゼリー飲料等が挙げられる。
【００３５】
医薬品としては、例えば、錠剤、カプセル、皮膚用外用剤、軟膏等が挙げられる。
【００３６】
医薬部外品としては、例えば、化粧品、滋養強壮ドリンク等の薬事法における医薬部外品等が挙げられる。
【００３７】
化粧品としては、例えば、美白用化粧品、乾燥肌用化粧品等が挙げられる。
【００３８】
飼料としては、例えば、畜産、ペットフード等の家畜用飼料や養殖魚用飼料等が挙げられる。
【００３９】
本実施形態で得られる、エラスチン・コラーゲン分解物（低分子物質）は、血小板凝集阻害能を有するため、特に、血小板凝集阻害剤として食品用途、医薬品用途、医薬部外品用途等で利用することが好適である。
【００４０】
ナットウキナーゼによる魚のエラスチン等のエラスチンあるいは魚のコラーゲン等のコラーゲンの分解物（低分子物質）は、特に循環改善への効果が期待される。ナットウキナーゼによる直接的な血小板凝集阻害作用に加えて、魚のエラスチン等のエラスチンあるいは魚のコラーゲン等のコラーゲンの分解物の凝集阻害作用がさらに加わるものと考えられる。老化ネズミ等に見られる老化は、血管の弾力性が衰え、血中エラスターゼ活性が弱いと考えられている。ナットウキナーゼによる魚のエラスチン等のエラスチンあるいは魚のコラーゲン等のコラーゲンの低分子化（可溶化）は、血小板凝集惹起を引き起こしにくくするため、いわゆる血液に対してサラサラ効果を持つことが考えられる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
本実施例では、魚のエラスチンを中心にその低分子化（可溶化）を試験した。また、分解物（低分子物質：Conjugate）の血小板凝集阻害効果を明らかにした。
【００４３】
［実験材料および方法］
精製ナットウキナーゼはオルガノフードテック社製の、計算分子量２７，７２４、ｐＩ８．７のSDS-poly acrylamide電気泳動で単一のタンパク帯を示すものを用いた。エラスチン、トリプシン、キモトリプシンは、いずれもSigma-Aldrich Corporationより購入したものを用いた。ルンブロキナーゼは、ミミズ酵素より調製した（H. Sumi, N. Nakajima and H. Mihara，A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthworm Lumbricus rubellus autolysate，Comp. Biochem. Physiol., 106B, 763-766, 1993参照）。血小板凝集惹起物質としてアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を使用した。鯛のコラーゲンは、ヤマキ株式会社より提供されたものを、また、各種魚エラスチンは、林兼産業株式会社より提供されたものを用いた。
【００４４】
［エラスチン平板法］
Sbarraらの方法（Sbarra, A. J., Gilfillan, R. F., Bardawil, W. A., A plate assay for elastase, Nature, 188:322-323, 1960参照）で、内径９０ｍｍのシャーレ内にエラスチン平板を作製した。所定量のエラスチンを０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）に加え、ホモジナイズし、ろ過後のエラスチン溶液を、１重量％寒天溶液に加えてエラスチン平板を作製した。そのエラスチン平板上に直径６ｍｍの穴を４つ開け、一方のエラスチン平板には、試料として、ナットウキナーゼ（２．５，５，１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）それぞれと、対照（Control）として、無添加のものをそれぞれの穴に３０μＬ入れた。もう一方のエラスチン平板には、試料として、トリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）、キモトリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）およびルンブロキナーゼ（５０ｍｇ／ｍＬ水溶液）それぞれと、対照（Control）として、無添加のものをそれぞれの穴に３０μＬ入れた。３７℃、２４時間インキュベーション後に生じる溶解面積（ｍｍ２）を測定した。
【００４５】
［血小板凝集活性］
健常成人より３．８％チトラート採血し、得られた血液より１，０００ｒｐｍ、１０分、および３，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離でＰＲＰ（多血小板血漿）、ＰＰＰ（乏血小板血漿）を得た。ナットウキナーゼの血小板凝集は、血小板数２２０×１０６／ｍＬで、Nikkou Bioscience社製アグリゴメータ（HEMA TRACER 601）を用いて測定した（H. Sumi, C. Yatagai and K. Matsubara，Anti-platelet aggregation and plasma fibrinolysis accelerating activities in mushroom extracts (Pleurotus ostreatus and Lentinus edodes)，Nippon shokuhin kagaku kogaku kaishi，43：318-321，1996参照）。いずれも血小板凝集阻害率を４回の平均値から算出した。
【００４６】
［結果］
図１に、用いた精製ナットウキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。SDS-poly acrylamide電気泳動では、分子量２７ｋＤａの単一のバンドを示した。
【００４７】
図２に、用いた精製ナットウキナーゼの血小板凝集阻害効果のグラフを示す。ヒト血小板に対する凝集惹起物質にはＡＤＰ（２．５μＭ）を使用した。１が対照（Control）、２が精製ナットウキナーゼ（Nattokinase）：４ｍｇ／ｍＬ、３が精製ナットウキナーゼ（Nattokinase）：８ｍｇ／ｍＬの結果を示す。
【００４８】
ナットウキナーゼはヒト血中の血小板に対し、ＡＤＰによる凝集能を強く阻害した。すなわち、純化（精製）したナットウキナーゼは、血小板凝集阻害剤として働く訳である（図１，２参照）。
【００４９】
図３は、用いた精製ナットウキナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびルンブロキナーゼのエラスチンの可溶化の様子を示す写真である。試料３０μＬをＢＳＢ（ｐＨ８．８）中で３７℃、２４時間後に生じる溶解窓を測定した。図３ａにおいて、（１）精製ナットウキナーゼ：１０ｍｇ／ｍＬ、（２）精製ナットウキナーゼ：５ｍｇ／ｍＬ、（３）精製ナットウキナーゼ：２．５ｍｇ／ｍＬ、（４）対照（Control）を示し、図３ｂにおいて、（１）トリプシン（Trypsin）：１０ｍｇ／ｍＬ、（２）キモトリプシン（Chymotrypsin）：１０ｍｇ／ｍＬ、（３）ルンブロキナーゼ（Lumbrokinase）：５０ｍｇ／ｍＬ、（４）対照（Control）を示す。
【００５０】
このように、ナットウキナーゼ（約３，４００ＩＵ／ｇ）は容易にエラスチンを可溶化した（図３ａ参照）。Sigmaのエラスチンは一般的に水に不溶性であるが、Sbarraのエラスチン平板に対する感度は非常に高く、これは一般のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、ルンブロキナーゼでは見られない強いものであった（図３ｂ参照）。この結果より、ナットウキナーゼはエラスチン分解酵素でもあることを示す。
【００５１】
＜実施例１、比較例１〜３＞
ナットウキナーゼによる各種魚エラスチンの分解（低分子化）を検討した。
【００５２】
カツオのエラスチン１ｇ（ｗｅｔ  ｗｔ．）／４ｍＬ  ＢＳＢに対してナットウキナーゼ（０．１ｍＬ（実施例１−１）、０．２ｍＬ（実施例１−２）、０．５ｍＬ（実施例１−３））をそれぞれ加え、振とう培養装置で、１００ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃で２４時間インキュベーションした。ナットウキナーゼを加えないものを対照（Control）とした（比較例１）。その結果、比較例１（対照）では、エラスチンの固体がそのまま残存していたのに対し、ナットウキナーゼを加えた実施例１−１〜１−３では、エラスチンが分解されて黄色の液体になっていた。
【００５３】
次に、それぞれの反応液を遠心分離後、９５℃で、５分間加熱処理し、その上清のＡＤＰによる血小板凝集活性を測定した。
【００５４】
図４は、カツオエラスチン存在下でのナットウキナーゼのヒト血小板凝集反応に対する影響を示すグラフである。図４において、（１）対照（Control）（ＡＤＰのみ）（比較例２）、（２）ＡＤＰ＋カツオエラスチン（比較例３）、（３）ＡＤＰ＋カツオエラスチン＋ナットウキナーゼ０．１ｍＬ（実施例１−１）、（４）ＡＤＰ＋カツオエラスチン＋ナットウキナーゼ０．２ｍＬ（実施例１−２）、（５）ＡＤＰ＋カツオエラスチン＋ナットウキナーゼ０．５ｍＬ（実施例１−３）を示す。
【００５５】
その結果、（１）では、ＡＤＰによるヒト血小板の凝集惹起反応が見られた（１０μＭで７２．１％の凝集率）。（２）では、ＡＤＰによるヒト血小板の凝集惹起反応に対してカツオエラスチンの凝集阻害反応が加わった。（３），（４），（５）では、ナットウキナーゼが凝集阻害反応を高めていること（さらに阻害率が高くなること）がわかった（図４参照）。これは、ナットウキナーゼがカツオエラスチンを分解して生成した分解物（低分子物質）が、血小板凝集阻害効果を有するためと考えられる。
【００５６】
＜実施例２，３＞
カツオエラスチンの代わりに、ハマチエラスチン（実施例２）、キハダエラスチン（実施例３）を用いて、実施例１と同様にして調べてみたところ、ハマチエラスチン（対照が８６．０％の凝集率に対して、ＡＤＰ＋ハマチエラスチン＋ナットウキナーゼ０．２ｍＬでは５．１％の阻害率）、キハダエラスチン（対照が８２．２％の凝集率に対して、ＡＤＰ＋キハダエラスチン＋ナットウキナーゼ０．２ｍＬでは９．０％の阻害率）であり、ハマチエラスチン、キハダエラスチンがカツオエラスチンと同様の血小板凝集阻害効果を示すことがわかった。
【００５７】
＜実施例４、比較例４，５＞
カツオエラスチンの代わりに、鯛コラーゲンを用いて、実施例１と同様にして調べてみたところ、ほぼ同じ条件下でナットウキナーゼはコラーゲンの血小板凝集反応に対しても抑制的に働くことがわかった。
【００５８】
図５は、鯛コラーゲン存在下でのナットウキナーゼのヒト血小板凝集反応に対する影響を示すグラフである。図５において、（１）は対照（Control）（ＡＤＰのみ）（比較例４）、（２）ＡＤＰ＋鯛コラーゲン（比較例５）、（３）ＡＤＰ＋鯛コラーゲン＋ナットウキナーゼ０．１ｍＬ（実施例４−１）、（４）ＡＤＰ＋鯛コラーゲン＋ナットウキナーゼ０．２ｍＬ（実施例４−２）を示す。
【００５９】
その結果、（１）では、ＡＤＰによるヒト血小板の凝集惹起反応が見られた（１０μＭで７０．０％の凝集率）。（２）では、ＡＤＰによるヒト血小板の凝集惹起反応に対して鯛コラーゲンの凝集阻害反応が加わった。（３），（４）では、ナットウキナーゼが凝集阻害反応を高めていること（さらに阻害率が高くなること）がわかった。これは、ナットウキナーゼが鯛コラーゲンを分解して生成した分解物（低分子物質）が、血小板凝集阻害効果を有するためと考えられる。
【００６０】
このように、ナットウキナーゼを用いることにより、魚のエラスチン（カツオエラスチン、ハマチエラスチン、キハダエラスチン）等のエラスチンや魚のコラーゲン（鯛コラーゲン）等のコラーゲンを容易に分解して、低分子化（可溶化）することが可能となった。また、得られた分解物は、優れた血小板凝集阻害能を有していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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