(57)【要約】【課題】煩雑な手順を必要とせず、高額な装置又は消耗品を必要とせずに、迅速且つ高感度に微生物の検出を行う。【解決手段】被検試料１ａを、基材１ｂ表面に脱離可能に定着させる工程と、基材表面に定着された被検試料１ａを、固化させることの可能な液状材料１ｃにより覆い、被検試料１ａを覆う液状材料１ｃを固化させて被検試料１ａを基材１ｂ表面に固定する工程と、固化状態の液状材料１ｃを、被検試料１ａを含んだ状態で基材１ｂから脱離させる工程と、検出対象微生物を標識する試薬を用いて、固化状態の液状材料１ｃの、基材１ｂ側の面から被検試料１ａの標識を行った後、検出対象微生物１ｆの検出を行う工程と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料を、基材表面に脱離可能に定着させる工程と、
前記基材表面に定着された前記被検試料を、固化させることの可能な液状材料により覆い、前記被検試料を覆う液状材料を固化させて前記被検試料を前記基材表面に固定する工程と、
固化状態の前記液状材料を、前記被検試料を含んだ状態で前記基材から脱離させる工程と、
検出対象微生物を標識する試薬を用いて、固化状態の前記液状材料の、前記基材側の面から前記被検試料の標識を行った後、前記検出対象微生物の検出を行う工程と、
を含むことを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項２】
被検試料を、基材表面に定着させる工程と、
前記基材表面に定着された前記被検試料を、固化させることの可能な液状材料により覆い、前記被検試料を覆う液状材料を固化させて前記被検試料を前記基材表面に固定する工程と、
固化状態の前記液状材料中に、検出対象微生物を標識する試薬を拡散させ、固化状態の前記液状材料の、前記試薬を拡散させた側の面から前記検出対象微生物の検出を行う工程と、
を含むことを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項３】
前記基材の、前記被検試料が定着される表面は、
ガラス、金属、樹脂、紙、及びハイドロゲルのいずれかからなることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の微生物の検出方法。
【請求項４】
前記基材の、前記被検試料が定着される表面は、
親水処理が施されていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項５】
前記液状材料は、
加熱、光照射、二液混合、乾燥、及び水添加のいずれかを行うことにより硬化する樹脂であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項６】
前記液状材料は、
分散媒が水であり、加熱、冷却、及び多価イオンの添加の少なくとも１つを行うことによって流動性を失うゲルであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項７】
ゲル化剤として、多糖類、ポリウロン酸、たんぱく質、及び合成高分子のうちの少なくとも一種を用いることを特徴とする請求項６に記載の微生物の検出方法。
【請求項８】
前記被検試料を標識する試薬が、
前記検出対象微生物の核、核様体、ミトコンドリア、及びリボソームのうちのいずれかに由来する核酸を染色することを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項９】
前記被検試料を標識する試薬が、
前記検出対象微生物に特異的な核酸の塩基配列とハイブリダイズすることで、蛍光、発光、又は発色シグナルを発するプローブを含むことを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項１０】
前記被検試料を標識する試薬が、
前記検出対象微生物の細胞壁又は細胞膜中の、脂質、糖質及び蛋白質のうちの少なくとも１種を染色することを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【請求項１１】
前記標識による標識反応のシグナルを、光学的に検出すること又は顕微鏡観察すること、のうちの少なくとも一方により前記検出対象微生物を検出することを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や食品等の分野での製造工程の管理において、衛生管理、汚染原因の究明、バイオハザード対策の観点から、環境中に存在する微生物の菌数確認や、微生物種の同定等の試験が重要視されている。従来、それらの微生物試験では、培養法が一般的に用いられてきたが、培養法は培地や実験器具の滅菌処理が必要であるほか、無菌環境での操作には手技の熟練が求められる。また、培養法では、微生物が増殖して検出可能なコロニーが形成されるまでに数日を要す上に、検出された微生物種の同定のためには、増菌培養、選択分離培養、鑑別培養と、繰り返し培養を行う必要がある。従って、試験結果が得られるまでに多大な労力及び時間が必要である。
【０００３】
近年では、微生物の簡易・迅速検出方法として、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法やイムノクロマト法等の免疫学的検出法、ＤＮＡプローブ法やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法等の遺伝子検出法を用いたキットが開発され、市販されている。
しかし、ＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法、ＤＮＡプローブ法は検出感度に課題があり、増菌培養などの培養法との併用が望ましいとされている。また、ＰＣＲ法は試料中の夾雑物が核酸増幅を阻害する場合があり、試料によっては適用できない場合がある。さらに、一般的に遺伝子検出法は生菌と死菌の判別が出来ないという課題がある。
【０００４】
生菌・死菌を判別する方法としては、発光酵素であるルシフェラーゼ等を利用してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出する方法が知られている（例えば、非特許文献１）。しかし、ＡＴＰ測定法は食品残渣等に由来する遊離のＡＴＰの影響を受けるため、清浄度の指標にはなるものの、微生物の菌数の定量はできない。
また、例えば非特許文献２には、生菌選択的な遺伝子検出法として、損傷のある細胞膜のみ透過し、可視光の曝露によって核酸と共有結合するエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）を用いたＥＭＡ−ＰＣＲ法が提案されている。この方法では、細胞膜損傷のある死菌ではＥＭＡが核酸を修飾するためＰＣＲによる核酸増幅が阻害されるが、細胞膜に損傷のない生菌はＥＭＡの影響を受けずに核酸が増幅される。
【０００５】
さらに、例えば特許文献１の技術では、ＰＣＲ阻害作用抑制物質を添加することによって試料の適用範囲を広げ、微生物細胞内での反応を実現している。しかし、特許文献１に検出方法として例示されている電気泳動やリアルタイムＰＣＲ法には、反応後の処理に数時間を要する、また検量線の作成が必要な相対定量である、といった点で、迅速性と定量性の両立には課題がある。
生体由来の試料を高感度に検出し、絶対定量する方法として、デジタルＥＬＩＳＡやデジタルＰＣＲに代表される、デジタル解析手法が挙げられる（例えば、特許文献２及び特許文献３参照。）。この手法は、検体及び試薬を含む反応溶液をきわめて多数の微小スケールに分離して反応させ、各微小溶液から得られる蛍光などのシグナルを２値化して、検出分子の有無だけを判別する手法である。デジタル解析手法は、反応溶液を微小スケールに分離する方法として、反応液をオイル中で分散して形成される微小な液滴（油中水滴）を反応場とするエマルジョン方式と、ガラスや樹脂の基板上に形成された微小なウェルを反応場とするマイクロウェル方式に大別される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４８２５３１３号
【特許文献２】米国登録特許第６３９１５５９号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０８４６７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】五十君靜信，江崎孝行，高鳥浩介，土戸哲明  監修（２０１３）微生物の簡易迅速検査法，Ｐ．１９．
【非特許文献２】Ｒｕｄｉ，Ｋ．，Ｎａｔｅｒｓｔａｄ，Ｋ．，Ｄｒｏｍｔｏｒｐ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｌｏ，Ｈ．（２００５）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４０，ｐｐ．３０１−３０６.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、エマルジョン方式のデジタル解析では、微小液滴の調製装置、反応時の温調装置及びフローサイトメーターと呼ばれる検出装置が必要であるため、高額な設備が必要であるとともに、試験に要する手順が煩雑となるという課題がある。一方、マイクロウェル方式のデジタル解析では、基材上に直径、高さともに数μｍという微小なウェルを、数万個と大量に有するチップ或いはプレートが消耗品として必要であり、試験費用が高額となる。
そこで、本発明は、煩雑な手順を必要とせず、高額な装置或いは消耗品を必要としない、迅速且つ高感度な微生物検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によれば、被検試料を、基材表面に脱離可能に定着させる工程と、前記基材表面に定着された前記被検試料を、固化させることの可能な液状材料により覆い、前記被検試料を覆う液状材料を固化させて前記被検試料を前記基材表面に固定する工程と、固化状態の前記液状材料を、前記被検試料を含んだ状態で前記基材から脱離させる工程と、検出対象微生物を標識する試薬を用いて、固化状態の前記液状材料の、前記基材側の面から前記被検試料の標識を行った後、前記検出対象微生物の検出を行う工程と、を含むことを特徴とする微生物の検出方法、が提供される。
【００１０】
また、本発明の他の態様によれば、被検試料を、基材表面に定着させる工程と、前記基材表面に定着された前記被検試料を、固化させることの可能な液状材料により覆い、前記被検試料を覆う液状材料を固化させて前記被検試料を前記基材表面に固定する工程と、固化状態の前記液状材料中に、検出対象微生物を標識する試薬を拡散させ、固化状態の前記液状材料の、前記試薬を拡散させた側の面から前記検出対象微生物の検出を行う工程と、を含むことを特徴とする微生物の検出方法、が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の一態様によれば、煩雑な手順や高度な手技を必要とする培養を行うことなく、迅速且つ高感度な微生物検出を安価に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第一実施形態に係る微生物の検出方法の検出工程の一例を示す断面図である。
【図２】本発明の第二実施形態に係る微生物の検出方法の検出工程の一例を示す断面図である。
【図３】ＰＥＴ膜基材上でＵＶ硬化樹脂を用いて固定したマイクロビーズの顕微鏡画像の一例である。
【図４】ガラス板上でアガロースゲルを用いて固定したマイクロビーズの顕微鏡画像の一例である。
【図５】アガロースゲル基材上で固化した後に機械的に剥離したＵＶ硬化樹脂の、基材側表面の顕微鏡画像の一例である。
【図６】アガロースゲル基材上でビオチンコートされたマイクロビーズを固定した後に脱離したＵＶ硬化樹脂の、基材側表面の顕微鏡画像の一例である。
【図７】アガロースゲル基材上でビオチンコートされたマイクロビーズを固定した後に脱離したＵＶ硬化樹脂の、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン処理後の基材側表面の顕微鏡画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明の一実施形態を説明する。
なお、以下の詳細な説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するように特定の具体的な構成について記載されている。しかしながら、このような特定の具体的な構成に限定されることなく他の実施態様が実施できることは明らかであろう。また、以下の実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
以下に、本発明に係る微生物の検出方法の第一の実施形態を、図１を参照しながら説明する。図１（ａ）〜（ｄ）は、本発明に係る微生物の検出方法の第一の実施形態を工程順に示す、断面を表す模式図である。
【００１４】
まず、第１工程として、図１（ａ）に示すように、被検試料１ａを基材１ｂの表面に定着させる。このとき、基材１ｂ表面に定着した被検試料１ａが、基材１ｂ表面から脱離可能な強度で、可逆的に定着させる。基材１ｂへの被検試料１ａの定着の方法は、被検試料１ａの形態によって異なる。例えば被検試料１ａが空気中の浮遊菌である場合には、基材１ｂの表面を上向きにして一定時間開放状態とすることで、落下菌として被検試料１ａを捕捉する。またはエアサンプラーにより空気を捕集することによって、被検試料１ａとしての浮遊菌を基材１ｂへ定着させる。
【００１５】
被検試料１ａが例えば固体上の付着菌である場合には、固体上の付着菌を含むホモジナイズ懸濁液又はスワブ抽出液を基材１ｂの表面へ滴下し、必要であれば溶媒又は分散媒を揮発させることによって、被検試料１ａとしての固体上の付着菌を基材１ｂの表面に定着させることができる。ただし、検出対象である微生物を、脱離可能な強度で、基材１ｂ表面に可逆的に定着させることが出来れば、特にこの方法に限定されない。
被検試料１ａと接触する、基材１ｂの表面部分は、微生物の細胞を破壊せず、且つ微生物の定着を妨げない材料であれば、制限なく使用することが出来るが、ガラス、金属、樹脂、紙、ハイドロゲルからなる薄膜が好適に用いられる。さらに好ましくは、親水処理を施された表面を有する基材が用いられる。検出対象である微生物細胞と基材表面との親和性を高めるために実施される親水処理の方法として、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理、又はフッ素ガス処理が挙げられるが、所望の効果が得られる処理方法であれば、特に限定されない。
【００１６】
次に、第２工程として、図１（ｂ）に示すように、任意の方法で固化させることが可能である液状材料１ｃによって、基材１ｂ上の被検試料１ａを流動しないように固定する。基材１ｂ上に定着された被検試料１ａを覆うように液状材料１ｃを滴下又は塗布した後に、液状材料１ｃに固化処理を加えて液状材料１ｃを固化状態にし、被検試料１ａが流動しないように固定する。液状材料１ｃとして、加熱、光照射、二液混合、乾燥、及び水添加のうちから選択される少なくとも１つの固化処理によって硬化させることができる樹脂が好適に用いられる。ただし、樹脂の固化処理を行う際に加えられたり副次的に発生したりする、熱又は機械的応力によって、被検試料１ａである微生物の細胞体、つまり菌体の形状が破壊され得る場合は、これを除く。また、固化処理として光照射を行う場合には、被検試料中の核酸が断片化されない波長の光を用いることが望ましいが、核酸以外の物質を標識及び検出する場合は、特に限定されない。
【００１７】
また、好適に用いられる別の液状材料１ｃとして、加熱、冷却、又は多価イオンの添加の少なくとも１つの方法から選択される固化処理によって流動性を失わせることができるハイドロゲルが挙げられる。ここで、ハイドロゲルは、その形状を保ちつつ基材１ｂから脱離させることが可能な強度を発揮し得る濃度範囲で、ゲル化剤を含む。ゲル化剤として、多糖類、ポリウロン酸、たんぱく質、合成高分子が好適に用いられるが、所望の効果が得られる物質であれば、特に限定されない。ただし、ハイドロゲルの固化処理を行う際に加えられたり副次的に発生したりする、熱又は機械的応力によって、被検試料である菌体の形状が破壊され得る場合は、これを除く。
【００１８】
次に、第３工程として、図１（ｃ）に示すように、固化状態の液状材料１ｃを、基材１ｂから脱離させる。このとき、液状材料１ｃ中で固定されている被検試料１ａの形状が維持され、且つ被検試料１ａの一部分が、固化状態の液状材料１ｃの基材側表面１ｄに露出した状態で、固化状態の液状材料１ｃを基材１ｂから脱離させる。
被検試料１ａを含んだ状態で、固化状態の液状材料１ｃを基材１ｂから脱離させる方法は、機械的な剥離や、基材１ｂの融解又は溶解等による除去が例として挙げられる。ただし、固化状態の液状材料１ｃの基材側表面１ｄ上で、被検試料１ａの一部分が、固化状態の液状材料１ｃの外側へ露出した状態で脱離することができる方法であれば、特に限定されない。
【００１９】
そして、第４工程として、図１（ｄ）に示すように、基材１ｂから脱離させた、固化状態の液状材料１ｃ中に固定された被検試料１ａの菌体を反応室、基材側表面１ｄに露出した被検試料１ａの一部分を反応室の開口部として、検出対象微生物を標識する試薬１ｅを用いて被検試料１ａの標識及び検出を行う。つまり、固化状態の液状材料１ｃの基材側表面１ｄにおいて、被検試料１ａとしての菌体が露出して存在する部分は、被検試料１ａを取り除くと、開口した凹部となる。これはすなわち、固化した液状材料１ｃに凹部が形成されていることと同等であり、この凹部に被検試料１ａとしての菌体が、一部が露出するように埋め込まれた状態と同等である。したがって、固化状態の液状材料１ｃの、被検試料１ａの部分に形成される凹部を反応室、凹部の開口部分を反応室の開口部とみなすことができる。そこで、固化状態の液状材料１ｃに形成される凹部を反応室、凹部の開口部分を反応室の開口部として、標識試薬１ｅを用いて被検試料１ａの標識及び検出を行う。
【００２０】
具体的には、まず、第３工程において基材１ｂより脱離した、固化状態の液状材料１ｃを上下反転させ、基材側表面１ｄを上面とする。次に、基材側表面１ｄ上に、標識試薬１ｅを滴下、塗布又は送液する。そして、被検試料１ａ中の、標識試薬１ｅによって標識された粒子、すなわち検出対象微生物１ｆのシグナル検出を行う。
このシグナル検出には、光学的検出及び顕微鏡観察の少なくとも一方が好適に用いられる。より好適には、基材側表面１ｄの顕微鏡観察及び撮像データの画像解析が用いられる。
【００２１】
このようにして、被検試料１ａに対して、標識試薬１ｅによる標識及び検出を行う方法においては、被検試料１ａは固化状態の液状材料１ｃに形成された反応室に存在し、被検試料１ａのうち検出対象微生物１ｆを含む被検試料１ａはシグナルを発することになるため、基材側表面１ｄの顕微鏡観察及び撮像データの画像解析によって得られるシグナル数は、基材側表面１ｄの面積当たりに存在する被検試料１ａのうち、検出対象微生物１ｆを含む被検試料１ａの数、つまり、基材側表面１ｄの面積当たりに存在する検出対象微生物１ｆの菌数に対応する。したがって、標識試薬１ｅの処理によって発せられるシグナルをカウントし、基材側表面１ｄの面積当たりの検出対象微生物１ｆの数を測定することで、検出対象微生物１ｆの絶対定量を行うことが可能となる。
【００２２】
標識試薬１ｅとしては、検出対象微生物１ｆの核、核様体、ミトコンドリア、又はリボソームに由来する核酸を染色する試薬が好適に用いられる。さらに好ましくは、検出対象微生物１ｆに特異的な核酸の塩基配列とハイブリダイズすることで、蛍光、発光、又は発色シグナルを発する核酸プローブが用いられる。また、本発明に好適に用いることができる別の標識試薬１ｅとして、検出対象微生物１ｆの細胞壁、細胞膜、又は細胞質の、脂質、糖質、蛋白質からなる群の少なくとも１種を染色する試薬が挙げられる。ただし、検出対象微生物１ｆに由来する物質を標識することができ、被検試料１ａに含まれる他の微生物と無生物由来のパーティクル等と判別可能なシグナルを得ることができる試薬であれば、特に限定されない。
【００２３】
次に、本発明に係る微生物の検出方法の第二の実施形態を、図２を参照しながら説明する。図２（ａ）〜（ｃ）は、本発明に係る微生物の検出方法の第二の実施形態を工程順に示す、断面を表す模式図である。
まず、第１工程として、図２（ａ）に示すように、被検試料２ａを任意の方法で基材２ｂの表面に定着させる。基材２ｂへの被検試料２ａの定着方法は、被検試料２ａの形態によって異なる。例えば被検試料２ａが空気中の浮遊菌である場合には、基材２ｂの表面を一定時間上向きにし、開放状態とすることで、落下菌として被検試料２ａを捕捉する。又は、エアサンプラーにより空気を捕集することによって、被検試料２ａを基材２ｂへ定着させてもよい。
【００２４】
被検試料２ａが固体上の付着菌である場合、固体上の付着菌である被検試料２ａを含むホモジナイズ懸濁液又はスワブ抽出液を基材２ｂ上へ滴下し、必要であれば溶媒又は分散媒を揮発させることによって定着させることができる。ただし、検出対象である微生物を基材２ｂ表面上に留めることが出来れば、特にこの方法に限定されない。
被検試料２ａと接触する、基材２ｂの表面部分は、微生物の細胞を破壊せず、且つ微生物の定着を妨げない材料であれば、制限なく使用することが出来るが、ガラス、金属、樹脂、紙、ハイドロゲルからなる薄膜が好適に用いられる。さらに好ましくは、親水処理を施された表面を有する基材が用いられる。検出対象である微生物細胞と基材表面との親和性を高めるために実施される親水処理の方法として、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理、又はフッ素ガス処理が挙げられるが、所望の効果が得られる処理方法であれば、特に限定されない。
【００２５】
次に、第２工程として、図２（ｂ）に示すように、任意の方法で固化させることが可能である液状材料２ｃによって、基材２ｂ上の被検試料２ａを、流動しないように固定する。基材２ｂ上に定着された被検試料２ａを覆うように液状材料２ｃを滴下又は塗布した後に、液状材料２ｃに固化処理を加えて固化状態にし、被検試料２ａが流動しないように固定する。液状材料２ｃとして、加熱、光照射、二液混合、乾燥又は水添加から選択される少なくとも１つの固化処理によって硬化させることができる樹脂が好適に用いられる。ただし、液状材料２ｃとしての樹脂は、固化処理後に、検出対象微生物を標識するための試薬を、樹脂内部へと浸透及び拡散させることが可能である材料である場合に限定される。さらに、この液状材料２ｃとしての樹脂は、固化処理を行う際に加えられたり副次的に発生したりする、熱又は機械的応力によって、被検試料である微生物の細胞体、つまり菌体の形状が破壊され得る場合は、これを除く。また、固化処理として光照射を行う場合には、被検試料中の核酸が断片化されない波長の光を用いることが望ましいが、核酸以外の物質を標識及び検出する場合は、特に限定されない。
【００２６】
また、本発明に好適に用いられる別の液状材料として、加熱、冷却、又は多価イオンの添加の中から選択される少なくとも１つの固化処理によって流動性を失わせることができるハイドロゲルが挙げられる。このハイドロゲルは、固化処理後に、検出対象微生物を標識するための試薬を、樹脂内部へと浸透及び拡散させることが可能である材料である場合に限定される。ハイドロゲルを形成するためのゲル化剤として、多糖類、ポリウロン酸、たんぱく質、合成高分子が好適に用いられるが、所望の効果が得られる物質であれば、特に限定されない。ただし、固化処理を行う際に加えられたり副次的に発生したりする、熱又は機械的応力によって、被検試料である菌体の形状が破壊され得る場合は、これを除く。
【００２７】
そして、第３工程として、図２（ｃ）に示すように、固化状態の液状材料２ｃ中に固定された被検試料２ａの菌体を反応室として、検出対象微生物を標識する試薬２ｅを用いて被検試料２ａの標識及び検出を行う。つまり、固化状態の液状材料２ｃにおいて、被検試料２ａとしての菌体が存在する部分は、被検試料２ａを収容する反応室が形成されていることになる。そこで、固化状態の液状材料２ｃに形成された反応室に、被検試料２ａが収容されたことと同等の状態とみなして、標識試薬２ｅを用いて被検試料２ａの標識及び検出を行う。
【００２８】
具体的には、まず、基材２ｂ上で固化状態の液状材料２ｃを覆うように、標識試薬２ｅを滴下、塗布又は送液する。そして、被検試料２ａ中の、標識試薬２ｅによって標識された粒子、すなわち検出対象微生物２ｆのシグナル検出を行う。シグナル検出には、光学的検出及び顕微鏡観察の少なくとも一方が好適に用いられる。より好適には、固化状態の液状材料２ｃの顕微鏡観察、及び撮像データの画像解析が用いられる。つまり、図２（ｃ）において、固化状態の液状材料２ｃを、基材２ｂ側から又は標識試薬２ｅが塗布された側から観察する。したがって、基材２ｂ又は固化状態の液状材料２ｃの少なくとも一方は、それらを通して被検試料２ａを観察できる材質、すなわち、光透過性に優れ屈折率が小さい材質であることが必要である。
【００２９】
このようにして、被検試料２ａに対して、標識試薬２ｅによる標識及び検出を行う方法においては、被検試料２ａは固化状態の液状材料２ｃに形成された反応室に存在し、被検試料２ａのうち検出対象微生物２ｆを含む被検試料２ａはシグナルを発することになるため、固化状態の液状材料２ｃの顕微鏡観察及び撮像データの画像解析によって得られるシグナル数は、基材２ｂの面積当たりに存在する被検試料２ａのうち、検出対象微生物２ｆを含む被検試料２ａの数、つまり、基材２ｂの面積当たりに存在する検出対象微生物２ｆの菌数に対応する。したがって、標識試薬２ｅの処理によって発せられるシグナルをカウントし、基材２ｂの面積当たりに存在する検出対象微生物２ｆの数を測定することによって、検出対象微生物２ｆの絶対定量を行うことが可能となる。
【００３０】
標識試薬２ｅは、固化状態の液状材料２ｃ中を浸透及び拡散することが可能な試薬が選択される。標識試薬２ｅは、検出対象微生物２ｆの核、核様体、ミトコンドリア、又はリボソームに由来する核酸を染色する試薬が好適に用いられる。さらに好ましくは、検出対象微生物２ｆに特異的な核酸の塩基配列とハイブリダイズすることで、蛍光、発光、又は発色シグナルを発する核酸プローブが用いられる。また、本発明に好適に用いることができる別の標識試薬として、検出対象微生物２ｆの細胞壁、細胞膜、又は細胞質の、脂質、糖質、蛋白質からなる群の少なくとも１種を染色する試薬が挙げられる。ただし、検出対象の微生物に由来する物質を標識でき、被検試料中の微生物と無生物由来のパーティクル等と判別可能なシグナルを得ることができる試薬であれば、特に限定されない。
【００３１】
このように、上記第一及び第二実施形態に係る微生物の検出方法によれば、煩雑な手順や高度な手技を必要とすることなく簡易な工程で微生物の絶対定量を行うことができ、迅速且つ高感度な微生物検出を行うことができる。また、高額な装置や多くの消耗品を必要とすることなく、微生物検出を行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下に、上記実施形態における微生物の検出方法を用いて、微生物検出を行った場合の実施例を説明するが、以下の実施例は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲で多くの変形が当分野において通常の知識を有する者により可能である。
＜被検試料の固定＞
図１（ｂ）及び図２（ｂ）に示すように、基材１ｂ、２ｂ上の被検試料１ａ、２ａを液状材料１ｃ、２ｃで覆い、液状材料１ｃ、２ｃに固化処理を加えることで被検試料１ａ、２ａの固定を行った。本実施例では、簡便のために、直径６μｍのポリスチレン製マイクロビーズを、検出対象である微生物の菌体に見立て、被検試料１ａ、２ａとした。さらに、液状材料１ｃ、２ｃ内に固定されたこれらの被検試料１ａ、２ａを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００３３】
（材料）
検出対象である微生物に見立てたマイクロビーズを、空気中、基材上、又は液状材料中に存在する塵埃などのパーティクルと明確に区別するために、マイクロビーズは蛍光色素を内包するものを使用した。蛍光色素は、４５８ｎｍに励起波長ピーク、５４０ｎｍに発光波長ピークを有し、一般にフルオレセインフィルターと呼ばれる蛍光顕微鏡フィルターセットにて観察可能である。水中に分散された状態で市販されているマイクロビーズは、遠心分離、上清除去及びエタノール置換によって脱水乾燥させた後に使用した。被検試料を定着させる基材としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）膜及びガラス板を使用した。固化させることが可能な液状材料としては、ＵＶ硬化樹脂及びアガロースゲルを使用した。アガロースゲルは加熱及び攪拌によってアガロース粉末が塊とならないように溶解させた２．０ｗｔ％水溶液を使用した。
【００３４】
（方法）
まず、脱水乾燥させたマイクロビーズを、マイクロピペットを用いて、基材としてのＰＥＴ膜上と、ガラス板上とのそれぞれに適当量落下させた。その後、ＰＥＴ膜状のマイクロビーズを覆うように、適当量のＵＶ硬化樹脂を滴下し、滴下されたＵＶ硬化樹脂をＵＶ照射によって固化させた。また、ガラス板上のマイクロビーズを覆うように、適当量のアガロース水溶液を滴下し、室温に冷却することでアガロース水溶液を固化させ、ゲルを形成した。固化させたＰＥＴ膜上のＵＶ硬化樹脂及びガラス板上のアガロースゲルを、フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡にて観察した。
【００３５】
（結果）
図３はＰＥＴ膜基材上でＵＶ硬化樹脂を用いて固定したマイクロビーズの顕微鏡画像であり、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は蛍光画像である。図３中、ＵＶ硬化樹脂で覆われた領域３ａの外側に存在するマイクロビーズ、すなわちＵＶ硬化樹脂で覆われていないマイクロビーズ３ｂと、ＵＶ硬化樹脂で覆われた領域３ａの内側に存在するマイクロビーズ、すなわちＵＶ硬化樹脂で覆われているマイクロビーズ３ｃとは、明視野画像（図３（ａ））においては、ともにその粒子１つ１つが判別可能であった。一方で、蛍光画像（図３（ｂ））においては、ＵＶ硬化樹脂で覆われていないマイクロビーズ３ｂは、このマイクロビーズ３ｂの１粒子ずつの蛍光シグナルを捉えることが出来ていたものの、ＵＶ硬化樹脂で覆われているマイクロビーズ３ｃについては、シグナル／ノイズ比が低下してこのマイクロビーズ３ｃのビーズ粒子の形状を判別することが難しくなっていたり、複数個のマイクロビーズ３ｃが近接している場合にその蛍光シグナルを１つの巨大な粒子のシグナルと捉えてしまっていたりと、実際のビーズ粒子数と得られた蛍光シグナル数との対応が正確でなかった。
【００３６】
蛍光画像（図３（ｂ））では、ＵＶ硬化樹脂で覆われた領域３ａ全体が蛍光を発していることから、ＵＶ硬化樹脂の自家蛍光が、使用したマイクロビーズの発する蛍光シグナルに干渉してしまったものと考えられる。したがって、液状材料としてＵＶ硬化樹脂を用い、且つ蛍光標識試薬を用いて検出を行う場合は、目的の蛍光波長に対して自家蛍光の干渉が小さいＵＶ硬化樹脂を選択することが好ましい。また、図３におけるＵＶ硬化樹脂で覆われていないマイクロビーズ３ｂのように、固定のための液状材料によって覆われていない被検試料が存在すると、蛍光シグナルの得られ方がばらつくため、定量性の低下が懸念される。よって、液状材料は、基材上の検出範囲を完全に覆うように滴下することが望ましい。
【００３７】
図４はガラス板上でアガロースゲルを用いて固定したマイクロビーズの顕微鏡画像であり、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は蛍光画像である。図４中で、粒子４ａはその直径が６μｍ程度であり、明視野画像（図４（ａ））及び蛍光画像（図４（ｂ））の何れにおいても観察可能であったことから、本実施例において検出対象微生物に見立てて基材上に落下させたマイクロビーズであることがわかる。一方で、粒子４ｂはその直径が１０μｍ以上と大きく、明視野画像（図４（ａ））では観察可能であったにもかかわらず、蛍光画像（図４（ｂ））では観察することが出来なかった。マイクロビーズとは直径が異なり、且つ蛍光シグナルを発さないことから、この粒子４ｂはゲル形成時に発生した気泡、又はアガロース水溶液中や基材上に存在した塵埃などのパーティクル由来であることが推察される。
以上より、基材上の被検試料を、任意の方法で固化させることが可能である液状材料によって固定することが可能であり、固化状態の液状材料中に含まれる被検試料は、顕微鏡にて観察可能であることが示された。
【００３８】
＜固化材料の脱離＞
図１（ｃ）に示すように、基材上で、被検試料を固定するために固化された液状材料の、基材からの脱離を行った。本実施例では、簡便のために、直径６μｍのポリスチレン製マイクロビーズを、検出対象である微生物の菌体に見立て、被検試料とした。さらに、液状材料内に固定されたこれらの被検試料を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００３９】
（材料）
検出対象である微生物に見立てたマイクロビーズを、空気中、基材上、又は液状材料中に存在する塵埃などのパーティクルと明確に区別するために、マイクロビーズは蛍光色素を内包するものを使用した。蛍光色素は、４５８ｎｍに励起波長ピーク、５４０ｎｍに発光波長ピークを有し、一般にフルオレセインフィルターと呼ばれる蛍光顕微鏡フィルターセットにて観察可能である。水中に分散された状態で市販されている該マイクロビーズは、遠心分離、上清除去及びエタノール置換によって脱水乾燥させた後に使用した。被検試料を定着させる基材として、アガロースゲルを用いた。固化させることが可能な液状材料としては、ＵＶ硬化樹脂を使用した。アガロースゲルは加熱及び攪拌によってアガロース粉末が塊とならないように溶解させた２．０ｗｔ％水溶液を使用した。
【００４０】
（方法）
２．０ｗｔ％アガロース水溶液を室温に冷却し、固化させて形成したゲルを基材として、基材上に、マイクロピペットを用いて、乾燥させたマイクロビーズを適当量落下させた。基材上のマイクロビーズを覆うように、適当量のＵＶ硬化樹脂を滴下し、ＵＶ硬化樹脂が均一な厚さの膜となるように、ガラス板を乗せて調整した。その後、ＵＶ照射によってこのＵＶ硬化樹脂を十分に固化させた後、アガロースゲルの基材から機械的に剥離した。剥離したＵＶ硬化樹脂の、アガロースゲル基材側表面を、フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡にて観察した。
【００４１】
（結果）
図５は、アガロースゲル基材上で固化した後に機械的に剥離したＵＶ硬化樹脂の、基材側表面の顕微鏡画像であり、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は蛍光画像である。図５中の粒子５ａは、その直径が６μｍ程度であり、明視野画像（図５（ａ））及び蛍光画像（図５（ｂ））の何れにおいても観察可能であったことから、本実施例において検出対象微生物に見立てて基材上に落下させたマイクロビーズであることがわかる。したがって、基材上に存在する被検試料を、任意の方法で固化させることが可能である液状材料を用いて固定し、液状材料中に被検試料を把持した状態を保ったまま、固化状態の液状材料を基材から脱離させることが可能であることが示された。
また、本実験例から、検出対象微生物（細胞）の内部に存在する特異的な物質（タンパク、質、脂質、核、核様体、ミトコンドリア、リポソーム、核酸など）を検出することが可能であることが示された。
【００４２】
＜被検試料の標識及び検出＞
図１（ｄ）に示すように、基材から脱離させた固化状態の液状材料を、固化状態の液状材料中に固定された被検試料の菌体に相当する液状材料部分を反応室とし、固化状態の液状材料の基材側表面に被検試料の一部分が露出した液状材料の表面部分を反応室の開口部として、検出対象微生物を標識する試薬を用いて被検試料の標識及び検出を行った。本実施例では、簡便のために、直径３μｍのポリスチレン製マイクロビーズを、検出対象である微生物の菌体に見立て、被検試料とした。
【００４３】
（材料）
検出対象である微生物に見立てたマイクロビーズは、標識試薬による反応の有無を確認するために、マイクロビーズの表面がビオチンコートされたものを選択した。標識試薬としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）によって蛍光標識されたストレプトアビジンを使用した。標識試薬は、４５８ｎｍに励起波長ピーク、５４０ｎｍに発光波長ピークを有するため、標識試薬にて処理したビオチンコートマイクロビーズは、一般にフルオレセインフィルターと呼ばれる蛍光顕微鏡フィルターセットにて観察可能である。被検試料を定着させる基材として、アガロースゲルを用いた。固化させることが可能な液状材料としては、ＵＶ硬化樹脂を使用した。アガロースゲルは加熱及び攪拌によってアガロース粉末が塊とならないように溶解させた２．０ｗｔ％水溶液を使用した。
【００４４】
（方法）
２．０ｗｔ％アガロース水溶液を室温に冷却し、固化させて形成したゲルを基材として、この基材上に、マイクロピペットを用いて、マイクロビーズを適当量落下させた。基材上のマイクロビーズを覆うように、適当量のＵＶ硬化樹脂を滴下し、ＵＶ硬化樹脂が均一な厚さの膜となるように、ガラス板を乗せて調整した。その後、ＵＶ照射によってこのＵＶ硬化樹脂を十分に固化させた後、アガロースゲルの基材から機械的に剥離した。剥離したＵＶ硬化樹脂の、アガロースゲル基材側表面を、フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡にて観察した。さらに、剥離したＵＶ硬化樹脂のアガロースゲル基材側表面に、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを滴下し、室温にて５分間インキュベートした。その後、十分量の精製水にて３回洗浄し、再度フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡での観察に供した。
【００４５】
（結果）
図６はアガロースゲル基材上でビオチンコートされたマイクロビーズを固定した後に剥離したＵＶ硬化樹脂の、基材側表面の顕微鏡画像であり、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は蛍光画像である。図６中で、マイクロビーズ６ａは明視野画像（図６（ａ））では観察可能であったものの、蛍光画像（図６（ｂ））ではその存在が確認出来なかった。すなわち、マイクロビーズは、標識試薬を塗布していない未処理の状態では蛍光シグナルを発していないことが確認された。
【００４６】
図７はアガロースゲル基材上でビオチンコートされたマイクロビーズを固定した後に剥離したＵＶ硬化樹脂の、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン処理後の基材側表面の顕微鏡画像であり、（ａ）は明視野画像、（ｂ）は蛍光画像である。図７中、マイクロビーズ７ａは明視野画像（図７（ａ））及び蛍光画像（図７（ｂ））の何れにおいても観察可能であった。すなわち、ＵＶ硬化樹脂中に内包されている未処理のビオチンコートマイクロビーズを、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン処理によって染色し、蛍光顕微鏡にて検出することが可能であった。したがって、基材から剥離させた、固化状態の液状材料中に内包されている被検試料は、固化状態の液状材料の被検試料に相当する部分を反応室とし、露出している被検試料の基材側表面部分を反応室の開口部として、反応室に収容された被検試料としての菌体を標識することで、標識反応に供することが可能であることが示された。
【００４７】
また、本実験例から、検出対象微生物（細胞）の表面に存在する特異的な物質（タンパク、糖質、脂質など）を検出することが可能であることが示された。
以上、特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、これら説明によって発明を限定するものではない。本発明の説明を参照することにより、当業者には、開示された実施形態の種々の変形例とともに本発明の別の実施形態も明らかである。したがって、特許請求の範囲は、本発明の範囲及び要旨に含まれるこれらの変形例又は実施形態も網羅すると解すべきである。
【符号の説明】
【００４８】
１ａ、２ａ  被検試料
１ｂ、２ｂ  基材
１ｃ、２ｃ  液状材料
１ｄ  固化状態の液状材料の基材側表面
１ｅ、２ｅ  標識試薬
１ｆ、２ｆ  検出対象微生物
３ａ  ＵＶ硬化樹脂で覆われた領域
３ｂ  ＵＶ硬化樹脂で覆われていない蛍光マイクロビーズ
３ｃ  ＵＶ硬化樹脂で覆われている蛍光マイクロビーズ
４ａ  アガロースゲルで固定された蛍光マイクロビーズ
４ｂ  蛍光ビーズ以外のパーティクル
５ａ  基材から剥離したＵＶ硬化樹脂中に把持されている蛍光ビーズ
６ａ  基材から剥離したＵＶ硬化樹脂中に把持されているビオチンコートビーズ
７ａ  基材から剥離したＵＶ硬化樹脂中に把持され、蛍光染色されたビオチンコートビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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