(57)【要約】【課題】優れた発毛及びメラニン産生能を有する白髪防止用皮膚外用剤を提供する。【解決手段】有効成分として、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物を含む発毛及び白髪防止用皮膚外用剤である。前記有効成分がナノ分散されたナノ分散物であることが好ましく、分散剤としては、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、サイコサポニンｄを含むことを特徴とする白髪防止用皮膚外用剤。
【請求項２】
有効成分として、ミシマサイコ属植物の抽出物を含むことを特徴とする白髪防止用皮膚外用剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の白髪防止用皮膚外用剤において、前記有効成分がナノ分散されたナノ分散物である白髪防止用皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項３に記載の白髪防止用皮膚外用剤において、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種を分散剤として含むナノ分散物である白髪防止用皮膚外用剤。
【請求項５】
体積平均粒径２００ｎｍ以下にナノ分散したナノ分散物である、請載求項３又は４に記の白髪防止用皮膚外用剤。
【請求項６】
有効成分として、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物と、分散剤として、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種とを含むナノ分散物であることを特徴とする白髪防止及び発毛用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れたメラニン産生能により白髪を防止し得る白髪防止用皮膚外用剤、並びに白髪防止剤のみならず発毛剤としても機能し得る白髪防止及び発毛用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、老化（加齢）に伴う白髪化に対し、髪を黒髪へと変化させる方法として、染毛が主として行われてきた。ところが近年においては、白髪化は、頭皮の毛包中の色素細胞が老化やストレスにより機能が低下することで起こることが分かってきた。そして、白髪化については、色素細胞におけるメラニン産生を促進させる成分が見出され、そのような成分を用いた白髪防止剤が提案されている（特許文献１〜５参照）。
【０００３】
特許文献１には、オタネニンジン、田七人参、タンジン、ユッカ、ビワ、キンギンカ及びサルサから選ばれる１種又は２種以上の植物抽出物を主成分とするメラニン産生促進剤が記載されている。
特許文献２には、植物抽出物を有効成分として含んでなるチロシナーゼ活性促進用組成物であって、有効成分が、アキノタムラソウ属（Salvia）、ハナスゲ属（Anemarrhena）及びサツマイモ属（Ipomoea）からなる群より選ばれる属に属する植物由来の抽出物の少なくとも１種からなる組成物を白髪防止組成物として用いる旨記載されている。
特許文献３には、６−ベンジルアミノプリン及び該物質を有効成分として含んでなるナンバンゲ抽出物が白髪防止組成物として有用な旨記載されている。
特許文献４には、ステルビン及び該物質を有効成分として含んでなるヤーバサンタ及びカワラヨモギ抽出物が白髪防止組成物として有用な旨記載されている。
特許文献５には、ペオノール及び該物質を有効成分として含んでなるボタンピ抽出物がメラニン産生能を有する旨記載されている。
一方、非特許文献１には、マウスＢ１６メラノーマ細胞を用いた試験系でのサイコサポニン類のメラニン産生促進能が報告されており、サイコサポニンｂ１及びｂ２はメラニン産生促進能を有するが、サイコサポニンａ、ｃ及びｄにはメラニン産生促進能が認められなかったと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２８８０９８号公報
【特許文献２】特開平９−２６３５４０号公報
【特許文献３】特開２０１３−１５９５９２号公報
【特許文献４】特開２０１３−１４７４９１号公報
【特許文献５】特開２００５−０１５４７２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金沢医科大学雑誌，２０，２２２（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記のようなメラニン産生促進剤や白髪防止組成物は、一定のメラニン産生の促進効果を有するものの、有効成分の含有量が少なかったり、細胞毒性を呈したりするため効果が十分とはいえず、さらに優れたメラニン産生促進効果を有するものの出現が嘱望されている。
【０００７】
本発明の目的は、優れたメラニン産生能を有する白髪防止用皮膚外用剤、並びに白髪防止剤のみならず発毛剤としても機能し得る白髪防止及び発毛用皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト皮膚三次元培養モデルを利用した試験系で鋭意検討したところ、前記の非特許文献１の記載に反して、サイコサポニンｄ又はサイコサポニンｄを含むミシマサイコ属植物の抽出物がメラニン産生能に非常に優れるとの知見を得て、それらのうちのいずれかを有効成分とする皮膚外用剤が白髪防止能に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の第１の態様による白髪防止用皮膚外用剤は、有効成分として、サイコサポニンｄを含むことを特徴とする。
【００１０】
第１の態様による白髪防止用皮膚外用剤は、有効成分たるサイコサポニンｄが非常に優れたメラニン産生能を有することから白髪防止効果に優れる。
【００１１】
本発明の第２の態様による白髪防止用皮膚外用剤は、有効成分として、ミシマサイコ属植物の抽出物を含むことを特徴とする。
【００１２】
第２の態様による白髪防止用皮膚外用剤は、ミシマサイコ属植物の抽出物が非常に優れたメラニン産生能を有することから白髪防止効果に優れる。ミシマサイコ属植物にはサイコサポニン類（サイコサポニンａ、サイコサポニンｂ１、サイコサポニンｂ２、サイコサポニンｃ及びサイコサポニンｄが主要成分）が含まれることが知られている。それらの成分はミシマサイコ属植物の根、茎、葉、花弁等のいずれにも含まれるが、中でも、有効成分のサイコサポニンｄが多く含まれる葉部の抽出物が好ましい。
【００１３】
本発明のいずれの態様においても、白髪防止用皮膚外用剤は溶液（例えばトニックやローション）、ジェル又はクリームの形態で用いられるが、好ましくは溶液の形態で用いられる。
【００１４】
本発明のいずれの態様においても、溶液（例えばトニック）の形態で用いる場合は前記有効成分をナノ分散したナノ分散物とすることが好ましい。ナノ分散することにより頭皮からの浸透性が向上し、白髪防止効果を顕著に高めることができる。
【００１５】
本発明の白髪防止用皮膚外用剤は、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種を分散剤として含むナノ分散物であることが好ましい。キラヤサポニン及びサルササポニンは高い分散性を有する非イオン性界面活性剤であり、分散剤として機能する一方、優れた発毛効果を有する。そして、それらの成分を分散剤として使用することで、皮膚外用剤の経時安定性が向上することはもちろんのこと、発毛剤として機能することとなる。
【００１６】
本発明の白髪防止用皮膚外用剤は、ナノ分散物とする場合、体積平均粒径２００ｎｍ以下にナノ分散したナノ分散物であることが好ましい。体積平均粒径２００ｎｍ以下にナノ分散することで、頭皮から毛根への浸透性が向上し、白髪防止化粧料として好適に使用することができる。
【００１７】
本発明の白髪防止用皮膚外用剤において、サイコサポニンｄの含有量は溶液（例えばトニック）の形態の場合、０．０１〜５質量％であることが好ましい。サイコサポニンｄの含有量を０．０１〜５質量％とすることでより優れたメラニン産生効果を奏し、白髪防止効果がさらに増大する。
【００１８】
一方、本発明の白髪防止及び発毛用皮膚外用剤は、有効成分として、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物と、分散剤として、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種とを含むナノ分散物であることを特徴とする。本発明の白髪防止及び発毛用皮膚外用剤は、上述の通り、有効成分のサイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物が白髪防止効果を奏し、分散剤のキラヤサポニン又はサルササポニンが発毛効果を奏することから、白髪防止剤のみならず発毛剤としても機能し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】管継手型フローマイクロリアクター装置の斜視図。
【図２】図１に示す管継手型フローマイクロリアクター装置の断面図。
【図３】基板型フローマイクロリアクター装置の斜視図。
【図４】図３に示す基板型フローマイクロリアクター装置の分解斜視図。
【図５】抽出物ＡのＨＰＬＣチャート。
【図６】実施例４３〜４６及び比較例１１〜１２における発毛試験結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の実施形態の白髪防止用皮膚外用剤は、有効成分として、サイコサポニンｄを含む白髪防止用皮膚外用剤であり、本発明の第２の実施形態の白髪防止用皮膚外用剤は、有効成分として、ミシマサイコ属植物の抽出物を含む白髪防止用皮膚外用剤である。
【００２１】
［有効成分］
第１の実施形態における有効成分はサイコサポニンｄである。サイコサポニンｄは、サイコサポニン類の中でも顕著なメラニン産生促進効果を奏する。従って、本実施形態の白髪防止用皮膚外用剤は優れた白髪防止効果を奏する。
【００２２】
第２の実施形態における有効成分はミシマサイコ属植物の抽出物である。当該抽出物には、サイコサポニンｄ以外に、前述の通り、種々のサイコサポニン類、例えば、サイコサポニンｂ１、ｂ２などを含有するが、それらも白髪防止効果を有するので混合物のまま使用することができる。ミシマサイコ属植物としては、ミシマサイコ、ツキヌキサイコ、キュウシュウサイコ、マンシュウサイコ、ホソバミシマサイコ、ダフリヤサイコ、トウサイコ等が挙げられる。そして、当該ミシマサイコ属植物の根、茎、葉、花弁等を抽出したものが本実施形態における有効成分である。ミシマサイコ属植物の組織の中でも、有効成分であるサイコサポニンｄは葉に最も多く含まれるため、葉の抽出物が好ましい。なお、ミシマサイコ属植物の有効成分の抽出は、メタノール、エタノール及びそれらと水の混合溶媒が好ましく用いられ、通常、組織を凍結乾燥して細胞を破砕した後、前記溶媒を用いて熱抽出することで効率良く抽出することができる。抽出時に少量のアルカリを用いると抽出効率が向上する。なお、抽出物には熱処理したもの、及び酸処理したものも含まれる。また、抽出物を吸着剤により脱色したものが好ましく用いられる。
【００２３】
第１の実施形態においては、メラニン産生促進効果、ひいては白髪防止効果をより優れたものとするため、サイコサポニンｄの含有量を０．０１〜  ５質量％とすることが好ましく、０．０３〜  ５質量％とすることがより好ましく、０．０５〜  ３質量％とすることがさらに好ましい。
同様に、第２の実施形態においては、メラニン産生促進効果、ひいては白髪防止効果をより優れたものとするため、ミシマサイコ属植物の抽出物の含有量を０．０２〜５０質量％とすることが好ましく、０．０５〜５０質量％とすることがより好ましく、０．１〜３０質量％とすることがさらに好ましい。
【００２４】
［溶媒］
第１の実施形態においては、後述するナノ分散物とする場合を除き、サイコサポニンｄを溶媒に溶解させて用いられる。使用し得る溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等が挙げられる。
また、第２の実施形態においては、上記溶媒によりミシマサイコ属植物を抽出し、そのままの状態で皮膚外用剤として使用することができる。
【００２５】
［他の成分］
いずれの形態においても、必要に応じて、他の成分として、界面活性剤、浸透促進剤、保湿剤、血行促進剤、抗炎症剤、抗酸化剤、紫外線防止剤、抗菌剤、細胞増殖促進剤、細胞分化誘導剤、香料、油脂、酵素、清涼剤、ビタミン剤、アミノ酸、タンパク質、糖質等を含むことが好ましい。
【００２６】
一方、いずれの形態においても、前記有効成分がナノ分散されたナノ分散物であることが好ましい。前記有効成分をナノ分散、すなわち体積平均粒径２００ｎｍ以下に分散させると頭皮から毛根への浸透性が向上し、白髪防止化粧料として好適に使用することができる。当該ナノ分散物の体積平均粒径としては、１００ｎｍ以下であることが浸透性向上の観点からより好ましい。
【００２７】
また、上記のようなナノ分散物とする場合、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種を分散剤として含むことが好ましい。キラヤサポニン及びサルササポニンはいずれも界面活性剤であり、優れた分散剤として機能する一方、発毛効果も有する。すなわち、キラヤサポニン及びサルササポニンを分散剤として用いると、白髪防止効果及び発毛効果の双方の効果を奏する。従って、本発明の白髪防止及び発毛用皮膚外用剤は、有効成分として、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物と、分散剤として、キラヤサポニン及びサルササポニンの少なくとも１種とを含むナノ分散物であることで、白髪防止剤のみならず発毛剤としても機能し得る。
【００２８】
［ナノ分散］
以下に、本実施形態の白髪防止用皮膚外用剤において、有効成分をナノ分散する手法について説明する。サイコサポニンｄ、ミシマサイコ属植物の抽出物及びその効果を促進する添加剤等の有効成分は一般に水に溶解しにくい化合物であるため、通常の方法では高濃度の水溶液を調製することは困難である。そこで、本実施形態においては、高濃度の水溶液を調製するため、界面活性剤や分散安定剤を用いたナノ分散技術を用いる。ナノ分散技術としては、強力な機械的攪拌（ホモジナイザー使用）による従来型の分散技術、再沈法と呼ばれる液・液混合による分散技術、及びマイクロサイズの流路中でのマイクロミキサー（フローマイクロリアクター）を用いた分散技術が代表的な方法として挙げられる。本発明において、ナノ分散物の製造方法に特に制限はないが、フローマイクロリアクターによる製造方法は、小サイズで、粒度分布ピークのシャープな微粒子分散液を与えると同時に、一般に分散安定性、保存安定性に優れた分散液を与えるので好ましい製造方法である。
【００２９】
また、フローマイクロリアクターによる製造方法を用いると、有効成分のナノ粒子の生成から分散安定化までを連続して行うことができ、効率良く安定な分散液を得ることができる。また大量生産（スケールアップ）したときにもその良好な特性を低下させずに分散液を得ることができるので好ましい。
【００３０】
以下に、フローマイクロリアクターを用いて有効成分たるミシマサイコ属植物の抽出物をナノ分散する方法について説明する。
【００３１】
フローマイクロリアクターは、マイクロスケールの流路中を反応場として、フローで物質生産や分析を行う装置であり、複数の液体を混合可能な微小な流路を備え、必要に応じて流路に連通し、この流路に液体を導入する導入路を備え、さらに必要に応じて流路及び導入路以外の構成を含む装置である。
【００３２】
本発明に用いられるフローマイクロリアクターとしては、複数の液体を混合可能な微小な流路を備える限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、基板型フローマイクロリアクターや管継手型のフローマイクロリアクターなどが挙げられる。
【００３３】
基板型フローマイクロリアクターとしては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、W.Ehrfeld, V.Hessel, H.Lowe著，「マイクロリアクターズ」，第３章（Wiley-VCH社刊）に記載されるフローマイクロリアクター（セグメント型マイクロミキサー）や特開２００５−２８８２５４号公報に開示されたフローマイクロリアクター（中心衝突型マイクロミキサー。H.  Nagasawa,  N.  Aoki  and  K.  Mae,  “Design  of  a  New    Micromixer  for  Instant  Mixing  Based  on  the  Collision  of  Micro  Segments,” Based  on  the  Collision  of  Micro  Segments,”にて性能が報告されている）などが挙げられる。
【００３４】
管継手型のフローマイクロリアクターは、金属（主にステンレス）もしくは樹脂（PEEKやテフロン（登録商標）等）の管内部にマイクロ流路を備えた管継手（T字型、V字型、十字型等）を金属もしくは樹脂チューブで接続した装置である。接続手段における接続方式としては特に制限はなく、公知のチューブ接続方式の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ねじ込み式、ユニオン式、突合せ溶接式、差込み溶接式、ソケット溶接式、フランジ式、食込み式、フレア式、メカニカル式などが挙げられる。
【００３５】
フローマイクロリアクターは、その微細構造によって精密に反応溶液の流れを制御するものであるから、微細加工技術によって製作されていることが好ましい。
微細加工技術としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ）Ｘ線リソグラフィと電気メッキを組み合わせたＬＩＧＡ技術、（ｂ）ＥＰＯＮ  ＳＵ８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、（ｃ）機械的マイクロ切削加工（ドリル径がマイクロオーダーのドリルを高速回転するマイクロドリル加工など）、（ｄ）Ｄｅｅｐ  ＲＩＥによるシリコンの高アスペクト比加工法、（ｅ）Ｈｏｔ  Ｅｍｂｏｓｓ加工法、（ｆ）光造形法、（ｇ）レーザー加工法及び（ｈ）イオンビーム法などが挙げられる。
【００３６】
フローマイクロリアクターは、上記のセグメント型や中心衝突型マイクロミキサーを単独で使用してもよいが、さらにそれにチューブで連結して複数使用してもよい。その選択は混合する溶液の数等に依拠する。
【００３７】
フローマイクロリアクターの流路内における液体の混合方式としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、層流（レイノルズ数Ｒｅ＜２３００）による混合、過渡状態（３０００≧Ｒｅ≧２３００）や乱流（Ｒｅ＞２３００）による混合が挙げられる。なお、フローマイクロリアクターの流路は微小であるため、導入路から導入された複数の液体同士はおのずと層流支配の流れとなりやすくなるが、強い運動エネルギー（流速や流路の形状（接液部分の３次元形状や流路の屈曲などの形状、壁面の粗さなど）による）を与えることで、一時的に過渡状態の流れ（渦流）や乱流状態を作ることができる。更に必要に応じてフローマイクロリアクター外部から振動エネルギーなどの混合促進のためのエネルギーを加えても層流から渦流もしくは乱流へと変化させることができる。
【００３８】
フローマイクロリアクター内の流路において、渦流や乱流による混合は、層流による混合と比べて、混合効率がよく混合速度が速くなるという利点を有している。
【００３９】
フローマイクロリアクター内流路の内径、断面積、長さ、断面形状としては、特に限定はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００９−０６７９９９号公報に記載の態様などを好ましい態様として挙げられる。
【００４０】
導入路は、上記流路に連通し、複数の液体を上記流路に導入する機能を有する。なお、導入路において、上記流路に連通する側とは別の一端は、通常、混合を所望する液体を含む容器に繋がっている。
【００４１】
導入路の内径としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、特開２００９−０６７９９９号公報に記載の態様などを好ましい態様として挙げられる。
なお、フローマイクロリアクターが複数の導入路を有する場合には、それぞれの導入路の内径が互いに異なっていてもよく、同じであってもよい。
【００４２】
上記流路及び導入路以外の構成としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、送液に使用するポンプ、温度調整手段、反応促進手段、センサー、製造された化合物を貯蔵するためのタンクなどが挙げられる。
【００４３】
ポンプとしては特に制限はなく、工業的に使用されうるものから適宜選択することができるが、送液時に脈動を生じないものが好ましく、例えば、プランジャーポンプ、ギアーポンプ、ロータリーポンプ、ダイヤフラムポンプなどが挙げられる。
【００４４】
温度調整手段としては特に制限はなく、反応温度に応じて適宜選択することができ、例えば、恒温槽、循環サーキュレーター、熱交換器などが挙げられる。
【００４５】
反応促進手段としては、混合する液体や所望する反応に応じて、適宜選択することができるが、例えば、振動エネルギー付与手段、加熱手段、光照射手段、電圧印加手段などが挙げられる。電圧印加手段を備えたフローマイクロリアクターとしては、例えば、特開２００６−１０４５３８号公報に開示されるマイクロフロー電気化学リアクターなどが挙げられる。センサーとしては特に制限はなく、例えば、温度センサー、流量センサー、流路内の圧力を測定するための圧力センサーなどが挙げられる。
【００４６】
複数個ある原料のフローマイクロリアクターに供給される流速は各々が同じ流量であっても異なる流量であってもよい。送液用のポンプは工業的に使用される送液ポンプのいずれでも使用可能だが、できるだけ送液時に脈動を生じない機種が望ましい。好ましくは、プランジャーポンプ、ギアーポンプ、ロータリーポンプ、ダイヤフラムポンプ等である。
【００４７】
本発明において、ナノ分散物の調製には、フローマイクロリアクター装置を使用することが好ましいが、とりわけ、層流から過渡状態の流れを容易に調整できる中心衝突型と呼ばれる溶液の合流態様を採用したフローマイクロリアクター装置を用いることが好ましい。
【００４８】
図１は、管継手型の中心衝突型フローマイクロイアクターの一例である。図２はその断面図である。本態様の装置においては、例えば２種類の溶液ａ、ｂが供給口１１及び供給口１２に連結したチューブを通じてそれぞれポンプなどにより注入される。注入された液体は導入流路１３ａ及び導入流路１３ｂをそれぞれ経由してマイクロ流路である流体合流点１３ｄにて中心衝突し、渦流もしくは乱流を形成して急速混合し、混合液c（分散液）は反応流路１３ｃを流れ、排出口１４に連結したチューブより捕集される。
【００４９】
図３は、基板型の中心衝突型フローマイクロリアクター装置の一例である。図４は、フローマイクロリアクター装置を構成する３つのパーツの分解斜視図である。フローマイクロリアクター装置８０は、主としてそれぞれが円柱状の形状をした供給ブロック８１、合流ブロック８２、及び反応ブロック８３により構成される。そして、フローマイクロリアクター装置８０を組み立てるには、円柱状をしたこれらのブロック８１、８２、８３を、この順番で互いの側面同士を合わせて円柱状になるようにし、この状態で各ブロック８１、８２、８３をボルト・ナット等により一体的に締結する。
【００５０】
供給ブロック８１の合流ブロック８２に対向する側面８４には、２本の環状溝８５、８６が同心状に穿設されており、フローマイクロリアクター装置８０を組み立て状態において、２本の環状溝８５、８６は溶液Ｂと溶液Ａとがそれぞれ流れるリング状流路を形成する。そして、供給ブロック８１の合流ブロック８２に対向しない反対側の側面９４から外側環状溝８６と内側環状溝８５に達する貫通孔８８、８７がそれぞれ形成される。かかる２本の貫通孔８８、８７のうち、外側の環状溝８６に連通する貫通孔８８には、溶液Ａを供給する供給手段（ポンプ及び連結チューブ等）が連結され、内側環状溝８５に連通する貫通孔８７には、溶液Ｂを供給する供給手段（ポンプ及び連結チューブ等）が連結される。
【００５１】
合流ブロック８２の反応ブロック８３に対向する側面８９の中心には円形状の合流穴９０が形成され、この合流穴９０から放射状に４本の長尺放射状溝９１、９１・・・と４本の短尺放射状溝９２、９２・・・が交互に穿設される。これら合流穴９０や放射状溝９１，９２はフローマイクロリアクター装置８０を組み立て状態において、合流領域（合流穴）９０となる円形状空間と溶液Ａ，Ｂが流れる放射状流路とを形成する。また、８本の放射状溝９１，９２のうち、長尺放射状溝９１の先端から合流ブロック８２の厚み方向にそれぞれ貫通穴９５、９５・・・が形成され、これらの貫通穴９５は供給ブロック８１に形成されている前述の外側環状溝８６に連通される。同様に、短尺放射状溝９２の先端から合流ブロック８２の厚み方向にそれぞれ貫通穴９６、９６・・・が形成され、これらの貫通穴９６は供給ブロック８１に形成されている内側環状溝８５に連通される。
また、反応ブロック８３の中心には、反応ブロック８３の厚み方向に合流穴９０に連通する１本の貫通孔９３が形成され、この貫通孔９３がマイクロ流路となる。
【００５２】
これにより、溶液Ａは供給ブロック８１の貫通孔８８→外側環状溝８６→合流ブロック８２の貫通孔９５→長尺放射状溝９１から構成される供給流路を流れて４つの分割流に分割されて合流領域（合流穴９０）に至る。一方、溶液Ｂは供給ブロック８１の貫通孔８７→内側環状溝８５→合流ブロック８２の貫通孔９６→短尺放射状溝９２から構成される供給流路を流れて４つの分割流に分割されて合流領域（合流穴９０）に至る。合流領域において溶液Ａの分割流と溶液Ｂの分割流とがそれぞれの運動エネルギーを有して合流した後、９０°流れ方向を変えてマイクロ流路９３に流入し、溶液Ｃが排出される。
【００５３】
その他、２液の接触角度や接触流路の数を適宜に調節した平面型フローマイクロリアクターや立体型フローマイクロリアクターを用いてもよい（例えば特開２００６−３４２３０４号公報の段落００５３〜００５６並びに図１〜図３参照）。
【００５４】
フローマイクロリアクター流路中のマイクロ空間でナノ微粒子形成（ナノ分散）を行う場合、均一に溶解した溶液を流路に投入することが好ましい。懸濁液を投入すると粒子径が大きくなったり、粒子分布が広い分散液になる。場合によっては容易に流路を閉塞してしまう。「均一に溶解」の意味は可視光線下で観測した場合に濁りが観測されない溶液であり、本発明では０．４５μｍ以下のミクロフィルターを通して得られる溶液、又は０．４５μｍのフィルターを通した場合に濾過される物を含まない溶液を均一に溶解した溶液と定義する。
【００５５】
次にフローマイクロリアクター流路中で有効成分を均一に溶解した溶液と水溶液を接触混合されナノ分散物を調製する方法について説明する。本発明において有効成分を溶解する溶媒は接触混合後、水に十分溶解して層分離しない有機溶媒である。その有機溶媒としては、アルコール系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒及びスルホシキド系溶媒がその例として挙げられるが、好ましくはアルコール系溶媒かスルホキシド系溶媒である。アルコール溶媒として好ましいものを上げれば、エタノール、プロピレングリコール、２−メチル−１，３−プロパンジオールもしくはグリセリンであり、スルホキシド系溶媒として好ましいものを上げればジメチルスルホキシドである。特に好ましくはアルコール系溶媒である。有機溶媒には有効成分が析出しない程度に水が含有していてもよい。
【００５６】
有機溶媒に溶解した有効成分と接触混合させる水溶液は、水単独もしくは分散剤や水に相分離しない程度の前記有機溶媒が溶解した水溶液である。水溶液中の有機溶媒の濃度は２０質量％以下であることが好ましく、特に好ましくは１０質量％以下である。
【００５７】
フローマイクロリアクター流路内における混合時の反応温度は、溶媒が凝固、あるいは気化しない範囲内であることが望ましいが、好ましくは、０〜９０℃、より好ましくは５〜５０℃である。特に好ましくは１０〜３０℃である。
【００５８】
フローマイクロリアクター流路内を流れる流体の速度（流速）は、有利には０．１ｍＬ〜３００Ｌ／ｈｒ、好ましくは０．２ｍＬ〜３０Ｌ／ｈｒ、更に好ましくは０．５ｍＬ〜１５Ｌ／ｈｒ、特に好ましくは１．０ｍＬ〜６Ｌ／ｈｒである。
【００５９】
本発明において、ナノ分散物を製造するに当たり、有効成分を含む有機溶媒溶液の中、及び／又は接触混合させる水溶液の中に分散剤を添加することができる。分散剤は、（１）析出した有効成分粒子に素早く吸着して微細な粒子を形成し（界面活性剤）、かつ（２）これらの粒子が再び凝集することを防ぐ作用を有するもの（分散安定剤）である。本発明では、このような分散剤（界面活性剤及び分散安定剤）として、アニオン性、カチオン性、両イオン性もしくはノニオン性界面活性剤、又は高分子分散剤を使用することができる。これらの分散剤は、単独あるいは併用して使用することができる。
【００６０】
本発明では、化粧品及び食品用途の分散剤の使用が好ましい。化粧品用途の分散剤としては、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、スルホコハク酸塩、カルボン酸塩もしくはスルホン酸塩などのアニオン性界面活性剤、アルキルアンモニウム塩などのカチオン界面活性剤、アルキル（アミド）ベタインもしくはアルキルジメチルアミンオキシドなどの両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレングリセリルエーテル脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルアルカノールアミド、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールもしくはサポニン（配糖体）などのノニオン性界面活性剤、及びポリピロリドン、ポリビニルアルコール、でんぷん由来多糖類もしくはゼラチンなどの高分子分散剤が挙げられる。
【００６１】
食品用途の分散剤としては、ポリグリセリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベートもしくはサポニン類などのノニオン性界面活性剤、及びでんぷん由来多糖類もしくはゼラチンなどの高分子分散剤が挙げられる
【００６２】
本発明では水に十分溶解する分散剤でなければならず、ノニオン性分散剤を用いる場合は界面活性剤の水と油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値であるＨＬＢ値が１０以上、好ましくは１５以上のものが使われる。尚、前記分散剤は、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６３】
本発明において、特に好ましい分散剤はノニオン性界面活性剤であるサポニン類、及び高分子分散剤であるでんぷん由来多糖類もしくはゼラチンである。サポニン類として具体的にはキラヤサポニンやサルササポニン、でんぷん由来多糖類としては具体的にはデキストラン、デキストリンもしくはヒドロキシルエチルセルロース等が挙げられる。
【００６４】
分散剤の配合量は、有効成分の均一分散性及び保存安定性をより一層向上させるために、有効成分に対して質量比で０．１〜５０当量の範囲であることが好ましく、より好ましくは１〜１０当量の範囲である。
【００６５】
水分散液に含まれる有効成分の粒径の計測法において、数値化して集団の平均の大きさを表現する方法があるが、よく使用されるものとして、分布の最大値を示すモード径、積分分布曲線の中央値に相当するメジアン径、及び各種の平均径（長さ平均、面積平均、重量平均、個数平均（Ｍｎ）、体積平均（Ｍｖ）など）がある。本発明では特に断らない限り、体積平均径（Ｍｖ）にて平均粒径を表すこととする。尚、本発明において、水分散物の粒径の測定は特に断らない限り動的光散乱法にて行った値をいう。本発明における水分散物の粒径は１％以下の濃度で測定し、高濃度の場合だけ１％以下に濃度調製して測定した。粒径は１〜３００ｎｍが好ましく、特に好ましくは５〜２００ｎｍである。
【００６６】
更に、分散液中の微粒子の粒径が揃っていること（すなわち単分散微粒子系）は、含まれる粒子の大きさが揃っているだけではなく、粒子内の化学組成や結晶構造にも粒子間の変動がないことを意味し、粒子の性能を決める重要な要素である。サイズが揃っていることを表す指標として種々の方法があるが、本発明においては体積平均径Ｍｖを個数平均径Ｍｎで除した値（Ｍｖ／Ｍｎ）を単分散性（粒子径分布幅が狭い意味）の指標として使用する。この値が１に近いほど単分散性に優れている粒子によりなる水分散液ということになる。本発明おいて、単分散性は１．２０〜１．８０であることが好ましく、１．２０〜１．６０であることがより好ましく、１．２０〜１．４０であることが特に好ましい。
【００６７】
以上の方法により製造された水分散液は有効成分を溶解するのに用いた有機溶媒を含むので、用途によっては、それを除去するなどの精製操作や濃厚化するための濃縮操作が必要になることがある。その操作は限外濾過法により行われることが好ましい。精製操作は適切な限外濾過膜（中空糸型が好ましい）を装着した循環式限外濾過装置を用いて液量を保持するよう蒸留水（少量の界面活性剤を含有していてもよい）を加えながら循環させることにより行われる。この操作により含有する有機溶媒や過剰の低分子分散剤などが除去され、溶媒としてはほとんど水のみで分散された分散液が得られる。精製がほぼ終了したら、蒸留水を加えることを止めると引き続き濃縮操作に入ることが出来る。循環式限外濾過装置での濃縮操作は循環可能な粘度まで可能であり、一般的には有効成分濃度１０質量％程度まで可能である。それ以上の濃度では一般に粘度がかなり高くなるので、循環式ではなく限外濾過用平膜等を用いた圧力濾過や減圧薄膜濃縮により濃厚化する。これにより３０質量％程度まで濃縮が可能になる。なお、本発明において限外濾過は、分散液に溶解している低分子量化合物や有機溶媒を除去するものであり、用いられる限外ろ過膜はこれらの目的に合うものなら特に制限はないが、効率よく行える中空糸膜やセラミック膜が好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
本発明に有用なサイコサポニン類は、ミシマサイコ属植物の抽出物を適当な吸着剤を用いて精製することによって高純度のものを得ることができるが、抽出物を簡単な操作で脱色したものをそのまま使用することもできる。以下、ミシマサイコからの抽出方法、ヒト皮膚三次元培養モデルを使用したメラニン色素産生試験、生成したメラニンの定量方法及び該分析結果について述べる。なお、抽出物は水に難溶であるため、溶解度に近い希薄濃度で試料溶液を調製した。一方、濃度を上げるためナノ分散物を調製した。
【００７０】
［ミシマサイコ抽出物の製法］
（１）抽出物Ａ
ミシマサイコ葉凍結乾燥品５０ｇにメタノール２００ｍｌを加え、６５℃で２時間加熱撹拌した。放冷後、減圧下に濾過し、第１の濾液を得た。残渣に再度、メタノールを２００ｍｌ加えて２時間加熱撹拌した後、減圧濾過し第２の濾液を得た。第１の濾液と第２の濾液とを合一し、１００ｍｌのｎ−ヘキサンで２回洗浄した。メタノール溶液を減圧溜去し、淡褐色の抽出物Ａを４．９ｇ得た。
抽出物ＡのＨＰＬＣチャートを図５に示した。図５において、ａ、ｂ１、ｂ２、及びｄは、それぞれ、サイコサポニンａ、サイコサポニンｂ１、サイコサポニンｂ２、サイコサポニンｄを示す。
【００７１】
（２）抽出物Ｂ
上記抽出物ＡをＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／水＝８０／２０）により精製してほぼ無色の精製品たる抽出物Ｂを得た。
【００７２】
（３）抽出物Ｃ
柴胡末（ミシマサイコ根部乾燥粉末）５０ｇにメタノール２００ｍｌを加え、６５℃で２時間加熱撹拌した。室温まで放冷後、減圧濾過し、第１の濾液を得た。残渣にメタノール２００ｍｌを加え、再度、６５℃で２時間加熱撹拌した。放冷後、減圧濾過し第２の濾液を得た。第１の濾液と第２の濾液とを合一し、メタノール溶液を上記抽出物Ａの調製と同様にｎ−ヘキサンで洗浄後、減圧溜去して淡褐色残渣たる抽出物Ｃを３．６ｇ得た。
【００７３】
（４）サイコサポニン類
サイコサポニンａ、サイコサポニンｂ１、サイコサポニンｂ２、サイコサポニンｃ及びサイコサポニンｄの高純度品は和光純薬工業製の試薬を使用した。なお、以下においては、サイコサポニンａを「ＳＳａ」、サイコサポニンｂ１を「ＳＳｂ１」、サイコサポニンｂ２を「ＳＳｂ２」、サイコサポニンｃを「ＳＳｃ」、サイコサポニンｄを「ＳＳｄ」と表記する場合がある。
【００７４】
［メラニン産生試験方法］
ヒト皮膚三次元培養モデルを使用したメラニン色素産生試験は以下のように行った。
ＭａｔＴｅｋ社製ヒト皮膚三次元培養モデルＭＥＬ−３００Ａ（８ｍｍ）及び培地としてＥＰＩ-１００ＮＭＭ１１３を用い、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で３週間培養した。その間、第１日目から１日おきに試料溶液を５０μｌずつ添加すると共に培地を交換した。
【００７５】
［メラニンの定量方法］
ヒト皮膚三次元培養モデルを３週間培養後、培養カップ中のメンブレンを打ち抜き、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加え、９０℃の湯浴中で３時間激しく振とうして細胞を分解した。０．４５μのフィルターを通して濾過し、濾液をマイクロプレートリーダーで吸光度測定した（波長：４０５ｎｍ）。
【００７６】
［実施例１］
８０ｍｇの抽出物Ａをプロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加え、透明溶液（試料１）を得た。６ウェルプレートにカルチャースタンドを置き、ＭａｔＴｅｋ社製ヒト皮膚三次元培養モデルカップＭＥＬ−３００Ａ（８ｍｍ）を設置した。培地として１ウェル当たり、ＥＰＩ-１００ＮＭＭ１１３を５ｍｌ添加し、皮膚モデルカップに試料１の５０μｌを加え、インキュベーター中、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で３週間培養した。その間、１日おきに皮膚モデルカップに試料溶液５０μｌを加え、培地を新鮮なもの５ｍｌで交換した。
３週間後、皮膚モデルカップのメンブレンを専用打ち抜き機で取り出し、前記メラニンの定量法に従って吸光度測定を行ったところ、４０５ｎｍの吸光度は０．３８であった。
【００７７】
［実施例２］
８０ｍｇの抽出物Ｂをプロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加え、溶液（試料２）を得た。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、吸光度は０．４５であった。
【００７８】
［実施例３］
８０ｍｇの抽出物Ｃをプロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加え、透明溶液（試料３）を得た。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、吸光度は０．３５であった。
【００７９】
［実施例４］
８ｍｇのサイコサポニンｄ（和光純薬工業製）を  プロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、超音波振とう機中で撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加え、透明溶液（試料４）を得た。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、吸光度は０．４５であった。
【００８０】
［実施例５］
８ｍｇのサイコサポニンｂ２（和光純薬工業製）を  プロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加え、透明溶液（試料５）を得た。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、吸光度は０．４３であった。
【００８１】
［実施例６〜１６］
各実施例において、実施例４と同様な方法で、表１に示すサイコサポニン類をプロピレングリコール１ｍｌに加熱溶解し、撹拌しながら１００ｍｌの水にゆっくり加えてサイコサポニン類の溶液（試料６〜１６）を得た。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量した。ただし、実施例１１においてのみ皮膚モデルカップへの試料の添加量を１００μｌとした。定量結果を表１に記した。また、表１において、
「ＳＳａ／ＳＳｄ」等の表記は、ＳＳａとＳＳｄとの混合物であることを示す。
【００８２】
［比較例１］
プロピレングリコール１ｍｌと水１００ｍｌを混合し、コントロール溶液とした。実施例１の試料１の代わりにコントロール溶液（比較試料１）を用いて、同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、４０５ｎｍの吸光度は０．２１であった。
【００８３】
［比較例２］
６−ベンジルアミノプリン（特開２０１３−１５９５９２号公報に記載の化合物）８ｍｇをプロピレングリコール１ｍｌに溶解し、撹拌しながら水１００ｍｌに加えて比較試料２を調製した。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、４０５ｎｍの吸光度は０．２６であった。
【００８４】
［比較例３］
ステルビン（特開２０１３−１４７４９１号公報に記載の化合物）８ｍｇをプロピレングリコール１．５ｍｌに溶解し、撹拌しながら水１００ｍｌに加えて比較試料３を調製した。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、４０５ｎｍの吸光度は０．２４であった。
【００８５】
［比較例４］
ペオノール（特開２００５−０１５４７２号公報に記載の化合物）８ｍｇをプロピレングリコール１ｍｌに溶解し、撹拌しながら水１００ｍｌに加えて比較試料４を調製した。実施例１と同様な方法で３週間培養、その後、生成したメラニンを比色定量したところ、４０５ｎｍの吸光度は０．２５であった。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
表１より、ミシマサイコ抽出物及びサイコサポニン類は、比較試料１〜４と比較して、メラニン産生促進能に優れることが分かる。中でも特に、サイコサポニンｂ２が優れたメラニン産生促進能を有するが、サイコサポニンｄにはサイコサポニンｂ２と同等以上のメラニン産生促進能を有する。
【００８８】
［実施例１７〜２０、比較例５〜６］
（ヒト試験）
〜ヘアートニックの調製〜
（１）ミシマサイコ葉抽出物（抽出物Ｂ）２ｇ及びキラヤニンＳ−１００溶液（丸善製薬製）１０ｇを５０％エタノール２００ｍｌに溶かしてヘアートニックＡを調製した。
（２）サイコサポニンｄ２００ｍｇ及びキラヤニンＳ−１００溶液（丸善製薬製）１０ｇを５０％エタノール２００ｍｌに溶かしてヘアートニックＢを調製した。
（３）ミシマサイコ葉抽出物を用いなかったこと以外は前記ヘアートニックＡと同様にしてヘアートニックＣを調製した。
【００８９】
頭髪全体の１／５〜１／４が白髪化した４０〜６０歳の男女各１５名を１０名ずつの３つのグループ（各グループは男性５名と女性５名とからなる）に分けた。実施例１７においては男性５名に対して前記ヘアートニックＡを用い、実施例１８においては女性５名に対して前記ヘアートニックＡを用いた。また、実施例１９においては男性５名に対して前記ヘアートニックＢを用い、実施例２０においては女性５名に対して前記ヘアートニックＢを用いた。さらに、比較例５においては、男性５名に対して前記ヘアートニックＣを用い、比較例６においては女性５名に対して前記ヘアートニックＣを用いた。
各実施例・比較例において、毎日、入浴後就寝前と起床後の２回／日、各ヘアートニックを１ｍｌ／回、３ヶ月間、一定部位に塗布、塗布部をマッサージを行って頭皮に浸透させた。
【００９０】
効果の判定は、試験前後に、毛根に近い部分（頭皮から３ｃｍの範囲）の写真撮影を行い、白毛が黒化した割合を測定して５０％以上黒化した時は◎、２０〜５０％が黒化した時は○、２０％未満の場合は×とした。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
表２より、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ葉抽出物の有無により明確な差異が認められたことが分かる。すなわち、ミシマサイコ葉抽出物又はサイコサポニンｄが白髪改善効果を有することが認められた。また、男女間で有意な差は認められなかった。
また、表２の結果から、ヒト試験においてもサイコサポニンｄ及びミシマサイコ抽出物が白髪防止効果を有することが裏付けられた。
【００９３】
［実施例２１］
１００ｍｇの抽出物Ａと、４００ｍｇのキラヤサポニン（丸善製薬製キラヤニンＳ−１００を濃縮して得た）とをプロピレングリコール２．５ｇと蒸留水０．２５ｇとに溶解した後（溶液体積は３．０ｍＬ）、０．４５μｍのミクロフィルター（ザルトリウス社製）を通すことでごみ等の不純物を除きＩa液を調製した。また、蒸留水（１４．０ｍＬ）をＩb液とした。Ｉa液とＩb液とを図１の管継手型フローマイクロリアクター装置を用いて下記の手順でナノ分散を行った。すなわち、流体合流点１３ｄの等価直径２５０μｍのＴ字管継手の二つの入り口１１、１２に１/１６インチのテフロンチューブを接続し、その先にそれぞれＩa液とＩb液を入れたシリンジを繋ぎ、シリンジポンプにセットした。排出口１４には１/１６インチのテフロンチューブを接続し、その出口には捕集用のサンプル瓶をセットした。Ｉa液を０．６ｍＬ／ｍｉｎ、Ｉb液を３．４ｍＬ／ｍｉｎの送液速度にて４分間送り出した。１分後に２分間管出口先端より抽出物Ａの０．５ｗ/ｖ％の分散液を捕集し試料１７とした。試料１７の粒子径測定を行ったところ体積平均粒径Ｍｖは３０ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．３０であった。
試料１７を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【００９４】
［実施例２２］
実施例２１の抽出物Ａを抽出物Ｂで置き換える以外は全く同様にして試料１８を調製した。試料１８の体積平均粒子径Ｍｖは２９ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．２３であった。
試料１８を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【００９５】
［実施例２３］
実施例２１の抽出物Ａを抽出物Ｃで置き換える以外は全く同様にして試料１９を調製した。試料１９の体積平均粒子径Ｍｖは３３ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．３４であった。
試料１９を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【００９６】
［実施例２４］
実施例２１において、抽出物Ｂを２００ｍｇ、キラヤサポニンを６００ｍｇに増量し、プロピレングリコールの量を若干減らして溶液体積を３．０ｍＬにする以外は全く同様にして１．０ｗ/ｖ％濃度の試料２０を調製した。試料２０の体積平均粒子径Ｍｖは５３ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．４０であった。
試料２０を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【００９７】
［実施例２５］
実施例２１において、キラヤサポニンをサルササポニン（丸善製薬（株）サラキープＡＬＳを濃縮して得たに）置き換える以外は全く同様にして試料２１を調製した。試料２１の体積平均粒子径Ｍｖは６０ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．５０であった。
試料２１を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【００９８】
［実施例２６〜３０］
実施例２１〜２５において、１ｂ液をクラスターデキストリン（グリコ栄養食品（株）製）１．０％水溶液に置き換える以外は全く同様にして対応する試料２２〜２６を調製した。試料２２〜２６の粒径データ及び実施例１と同様にして行ったメラニン産生試験結果を表３に示した。
【００９９】
［実施例３１］
実施例２１において、キラヤサポニンをＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０（日光ケミカルズ（株）製ポリオキシエチレンステロール）に置き換える以外は全く同様にして試料２７を調製した。試料２７の体積平均粒子径Ｍｖは７０ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．７０であった。
試料２７を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【０１００】
［実施例３２］
１００ｍｇの抽出物Ｂと、４００ｍｇのキラヤサポニン（丸善製薬製（株）キラヤニンＳ−１００を濃縮して得た）をプロピレングリコール（以下ＰＧ）２．５ｇと蒸留水０．２５ｇに溶解した後（溶液体積は３．０ｍＬ）、０．４５μｍのミクロフィルター（ザルトリウス社製）を通すことでごみ等の不純物を除きＩＡ液を調製した。また、ＩＢ液として１．０％のクラスターデキストリン水溶液を調製した。フローマイクロリアクター装置として、以下の分割数（流路本数）等を有する図３に示したような基板型フローマイクロリアクター装置を使用した。
（ｉ）供給流路本数（ｎ）・・・２種類の反応液それぞれについて４本に分割（合計８本の流路が合流する。）
（ｉｉ）放射状溝９１（４本）、９２（４本）の幅（Ｗ）・・・各１００μｍ
（ｉｉｉ）放射状溝９１、９２の深さ（Ｈ）・・・各１００μｍ
（ｉｖ）合流領域９０の直径（Ｄ）・・・３００μｍ
（ｖ）マイクロ流路９３の直径（Ｒ）・・・３００μｍ
（ｖｉ）合流領域９０において各放射状溝９１、９２とマイクロ流路９３との中心軸同士の交差角度・・・９０°
（ｖｉｉ）装置の材質・・・ステンレス（ＳＵＳ３１６）
（ｖｉｉｉ）流路加工法・・・マイクロ放電加工で行い、供給ブロック８１、合流ブロック８２、反応ブロック８３の３つのパーツの封止方法は鏡面研磨による金属面シールで行った。
【０１０１】
二つの入り口に、１/６インチのテフロンチューブを接続し、その先にそれぞれＩＡ液とＩＢ液を入れたシリンジを繋ぎ、シリンジポンプにセットした。リアクターの出口にも１/６インチのテフロンチューブを接続し、その出口に捕集用のサンプル瓶をセットした。Ｉa液を０．６ｍＬ／ｍｉｎ、Ｉb液を３．４ｍＬ／ｍｉｎの送液速度にて４分間送り出した。一分後に２分間管出口先端より抽出物Ａの０．５ｗ/ｖ％の分散液を捕集し試料２８を得た。試料２８の粒子径測定を行ったところ体積平均粒径Ｍｖは２５ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は１．２０であった。
試料２８を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【０１０２】
［実施例３３〜４２］
実施例２６において、抽出物Ｂを表３のサイコサポニン類で置き換える以外は全く同様にして試料２９〜３８を調製した。試料２９〜３８の粒径データ及びメラニン産生試験結果を表３に示した。
【０１０３】
［比較例７］
実施例２１においてキラヤサポニンを用いず、プロピレングリコールを増量してＩa液の溶液体積を３．０ｍｌにする以外は全く同様にして比較試料５を調製した。比較試料５の体積平均粒子径Ｍｖは３００ｎｍであり、単分散性の指標である体積平均粒径Ｍｖ／個数平均粒径Ｍｎの比は２．５３であった。
比較試料５を用いて実施例１と同様のメラニン産生試験を行った。その結果を表３に示した。
【０１０４】
［比較例８〜１０］
実施例２１、２５及び２６において抽出物Ａを除き、プロピレングリコールを増量してＩa液の溶液体積を３．０ｍＬにする以外は全く同様にして比較試料６〜８を調製した。比較試料６〜８の粒径データ及びメラニン産生試験結果を表３に示した。
【０１０５】
【表３】
2017100976.tif 000004
【０１０６】
表３より、サイコサポニン類及びミシマサイコの抽出物のナノ分散物が白髪防止効果を有することが分かる。特に、ナノ分散をしていない実施例１〜１６と、ナノ分散をして高濃度化した実施例２１〜４２とにおいて同じ成分同士で比較すると、ナノ分散をした実施例２１〜４２の方が白髪防止効果に優れることが分かる。
【０１０７】
［実施例４３〜４８、比較例１１〜１２］〜剃毛マウスを用いた発毛試験〜
（１）実験動物の飼育
生後８週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌマウスを日本チャールズ・リバー（株）から購入し、試験に用いた。５日間の予備飼育後、麻酔下、眠っているマウス背部を小動物用バリカンで剃毛した。
マウスは試験サンプル１種につき８匹を用い、試験開始前にデジタル写真撮影(Nikon COOLPIX S6100)及び観察を行った。
【０１０８】
（２）試料又は比較試料の塗布
各実施例・比較例において、試料１７〜２１、２３、２７と比較試料５をピペットマンにて１ｍｌ分取した後、手袋をした手で各マウスの剃毛した背部に３０日間毎日塗布し、その都度写真撮影及び観察を行った。各試料及び比較試料は表４に示した通りである。
【０１０９】
（３）発毛試験結果の解析
試験結果の解析は、各日のマウスのデジタル画像をパソコン上で「画像解析ソフトNIH-Image」を使って行った。最初にマウスの剃毛した範囲の画像面積をカウントし、次にその画像を二値化変換した画像から発毛した範囲の画像面積をカウントした。測定した剃毛部の面積カウント及び発毛部の面積カウントから下記の式で発毛比率を算出した。結果の解析には、各サンプルの全８匹のマウスのうち、最多発毛マウスの発毛比率と最少発毛マウスの発毛比率を除き、６匹のマウスの発毛比率の平均を取って試験サンプルの発毛比率とした。また、各マウスの皮膚の状態を観察し発疹、カブレ等の有無を調べた。結果を以下の表４に示した。
また、実施例４３、４４、４６、４７及び比較例１１〜１２については、図６において、経過日数に対する発毛比率をグラフで示した。
【０１１０】
【数１】
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【０１１１】
【表４】
2017100976.tif 000006
【０１１２】
表４及び図６より、キラヤサポニン又はサルササポニンを分散剤として用いることで、顕著な発毛効果を奏することが分かる。つまり、キラヤサポニン又はサルササポニンを用いることで、サイコサポニンｄ又はミシマサイコ属植物の抽出物による白髪防止能のみならず、発毛効果をも有する。すなわち、本発明の白髪防止及び発毛用皮膚外用剤は、白髪防止剤のみならず発毛剤としても機能し得る。
【符号の説明】
【０１１３】
１０、８０  反応装置本体
１１、１２  導入口
１３、  流路
１３ａ、１３ｂ  導入流路
１３ｃ  反応流路
１３ｄ  流体合流点
１４  排出口
８１  供給ブロック
８２  合流ブロック
８３  反応ブロック
８６  外側環状溝
８５  内側環状溝
８７、８８  供給ブロックの貫通孔
９０  合流穴（合流領域）
９１  長尺放射状溝
９２  短尺放射状溝
９３  反応ブロックの貫通孔（マイクロ流路）
９５、９６  合流ブロックの貫通孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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