(57)【要約】【課題】従来技術では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓとして誤検出されることがあり、Ｓ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓをＳ．ａｕｒｅｕｓと区別して迅速に検出する方法が求められていた。【解決手段】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有し、かつ、前記塩基配列をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列と対比させたときに１塩基以上のミスマッチを有するオリゴヌクレオチド。【選択図】図２
2017163969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ｘ）かつ（Ｙ）を特徴として有するオリゴヌクレオチド。
（Ｘ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の塩基配列をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列と対比させたときに１塩基以上のミスマッチを有する。
【請求項２】
前記（Ｘ）の代わりに以下の（Ｘ２）を特徴として有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
（Ｘ２）配列番号１あるいは配列番号９８で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
【請求項３】
以下の（１Ａ）または（２Ａ）で示される塩基配列からなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
（１Ａ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、配列番号１で示される塩基配列のうち下記の（Ｉ）で示される群のうち少なくとも一つの塩基を含む塩基配列。
（２Ａ）前記（１Ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（Ｉ）配列番号１で示される塩基配列の１５、３２、３５、４９、５２、５８、６２、７２、７８、８４、８８、９４、９６、９９、１０２、１０５、１１１、１２２、１５６、１６２、１６４、１６６、１６７、１６８、１７１、１７６、１７７、１８３、１８７、１８８、１９３、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０８、２０９、２１０、２１９、２２１、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２４２、２４３、３００、３０９、３１５、３１６、３１８、３３４、３３６、３４３、３５１、３６０、３６３、３７８、３８１、３８４、３９６、４１７、４２９、４３５、４４４、４５０、４５３、４７０、４７１、４７４、４９８、５０４、５１６、５１９、５２５、５４０、５４９、５５２、５５５、５６４、５８２および５８５番目からなる群。
【請求項４】
前記（Ｉ）で示される群が、２４２、２４３、３００、３０９、３５１、３６０、３６３、３９６、４５０、４５３、４９８、５０４、５５５および５６４番目からなる群である請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
以下の（１Ｂ）または（２Ｂ）で示される塩基配列からなる、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
（１Ｂ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、下記の（ＩＩ）で示される群のうち少なくとも一つである塩基配列。
（２Ｂ）前記（１Ｂ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（ＩＩ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群。
【請求項６】
前記（ＩＩ）で示される群が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８８からなる群である請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
１つ以上の標識物質で標識されている、請求項１〜請求項６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）の工程を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法。
（１）請求項３の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、請求項５の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅する第一工程。
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、請求項２〜請求項７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのうち第一工程で得られうる増幅産物にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる第二工程。
（３）第二工程で得られうる複合体を検出する第三工程。
【請求項９】
（３）の工程が融解曲線分析を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の（Ｐ）および（Ｑ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの検出キット。
（Ｐ）請求項３の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、請求項５の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（Ｑ）請求項２〜請求項７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。更に詳しくは、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中に含まれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ球菌とは、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）（以下、属名をＳ．と略記することもある。）に属するグラム陽性球菌である。特に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）はヒトに対して病原性を示すとともに、メチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ）などの薬剤耐性遺伝子を持つことで薬剤耐性を示すことが知られている（特許文献１）。したがって、治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等を目的として、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などの他のブドウ球菌とは区別して迅速に検出、分類できる方法が求められており、そのような方法として、各微生物が保有する遺伝子配列の差を利用し、一部の塩基配列を検出することにより分別検出できる方法が、多く提案されてきている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。
【０００３】
［Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓについて］
ところで、近年、これまでＳ．  ａｕｒｅｕｓに分類されていた菌株のいくつかが、全ゲノム解析の結果、系統学的に別種の菌であることが判明した（非特許文献１）。例えば、新しく分類されるようになった菌株の一つに、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓがある。Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓはヒトに対して病原性を示すことが明らかになっており（非特許文献１）、この菌種を正確に検出、同定することは臨床診断上、極めて重要である。
【０００４】
しかしながら、従来技術では、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓがＳ．  ａｕｒｅｕｓとして誤検出されると報告されてきた（非特許文献１、特許文献４）。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと同定された株のうち、実に４．１％はＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓであったという報告もある（非特許文献３）。また、臨床現場で一般的に用いられている同定感受性検査（例えば、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を用いてもＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを区別することは困難であると報告されてきた（非特許文献１）。
【０００５】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは院内感染症の代表的な原因菌として知られており、院内感染の監視と対策のために、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを区別することは非常に重要である。
【０００６】
なお、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｉｎｇ法（ＭＬＳＴ）や次世代シークエンシングを使用した全ゲノム解析等を行うことで、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓの同定が可能であった（非特許文献１、非特許文献３）。しかしながら、該方法らは高コスト、操作が煩雑、試験時間が長い等の課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−０４８６２０
【特許文献２】特表２０１３−５３５９５１
【特許文献３】特表２００１−５１８２８３
【特許文献４】特開２０１５−０７３４５７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５），６５，１５−２２
【非特許文献２】ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｕｌｙ １９９２，ｐ．１６５４−１６６０
【非特許文献３】ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｍａｒｃｈ ２０１５，ｐ．１００５−１００８
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．８  ｅ６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別して、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法及びそのためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究の結果、特定の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、簡便な方法で、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別して、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出できることを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明の概要は以下の通りである。
【００１１】
［項１］
以下の（Ｘ）かつ（Ｙ）を特徴として有するオリゴヌクレオチド。
（Ｘ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の塩基配列をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列と対比させたときに１塩基以上のミスマッチを有する。
［項２］
前記（Ｘ）の代わりに以下の（Ｘ２）を特徴として有する項１に記載のオリゴヌクレオチド。
（Ｘ２）配列番号１あるいは配列番号９８で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
［項３］
以下の（１Ａ）または（２Ａ）で示される塩基配列からなる、項２に記載のオリゴヌクレオチド。
（１Ａ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、配列番号１で示される塩基配列のうち下記の（Ｉ）で示される群のうち少なくとも一つの塩基を含む塩基配列。
（２Ａ）前記（１Ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（Ｉ）配列番号１で示される塩基配列の１５、３２、３５、４９、５２、５８、６２、７２、７８、８４、８８、９４、９６、９９、１０２、１０５、１１１、１２２、１５６、１６２、１６４、１６６、１６７、１６８、１７１、１７６、１７７、１８３、１８７、１８８、１９３、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０８、２０９、２１０、２１９、２２１、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２４２、２４３、３００、３０９、３１５、３１６、３１８、３３４、３３６、３４３、３５１、３６０、３６３、３７８、３８１、３８４、３９６、４１７、４２９、４３５、４４４、４５０、４５３、４７０、４７１、４７４、４９８、５０４、５１６、５１９、５２５、５４０、５４９、５５２、５５５、５６４、５８２および５８５番目からなる群。
［項４］
前記（Ｉ）で示される群が、２４２、２４３、３００、３０９、３５１、３６０、３６３、３９６、４５０、４５３、４９８、５０４、５５５および５６４番目からなる群である項３に記載のオリゴヌクレオチド。
［項５］
以下の（１Ｂ）または（２Ｂ）で示される塩基配列からなる、項３に記載のオリゴヌクレオチド。
（１Ｂ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、下記の（ＩＩ）で示される群のうち少なくとも一つである塩基配列。
（２Ｂ）前記（１Ｂ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（ＩＩ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群。
［項６］
前記（ＩＩ）で示される群が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８８からなる群である項５に記載のオリゴヌクレオチド。
［項７］
１つ以上の標識物質で標識されている、項１〜項６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
［項８］
以下の（１）〜（３）の工程を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法。
（１）項３の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、項５の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅する第一工程。
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、項２〜項７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのうち第一工程で得られうる増幅産物にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる第二工程。
（３）第二工程で得られうる複合体を検出する第三工程。
［項９］
（３）の工程が融解曲線分析を含む、項８に記載の方法。
［項１０］
以下の（Ｐ）および（Ｑ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの検出キット。
（Ｐ）項３の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、項５の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（Ｑ）項２〜項７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別して、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出することができるようになった。すなわち、本発明に記載の方法又はキットを使用することで、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓがＳ．  ａｕｒｅｕｓと誤判定されることなく、検出できるようになった。該方法及び該キットを使用することは、ブドウ球菌感染症に対する治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡの一部をアライメントした図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。「Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ」は配列番号１の塩基配列で示される合成オリゴヌクレオチドを鋳型として融解曲線分析を行った結果を示す。「Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ」は配列番号９１の塩基配列で示される合成オリゴヌクレオチドを鋳型として用いた場合、「水」は合成オリゴヌクレオチドの代わりに精製水を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【図３】実施例２の結果を示す図である。「検体１」「検体２」「検体３」はそれぞれの検体について核酸を増幅し、融解曲線分析を行った結果を示す。「水」は各検体の代わりに精製水を用いた場合の結果を示す。
【図４】参考例１の結果（検体１のシークエンス解析で得られた配列）を示す図である。Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノムＤＮＡの一部と高い相同性を示した。
【図５】参考例１の結果（検体２のシークエンス解析で得られた配列）を示す図である。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡの一部と高い相同性を示した。
【図６】実施例３の結果を示す図である。
【図７】比較例１の結果を示す図である。
【図８】Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡの一部をアライメントした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［オリゴヌクレオチド］
［１］
本発明の実施態様の一つは、以下の（Ｘ）かつ（Ｙ）を特徴として有するオリゴヌクレオチドである。
（Ｘ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
（Ｙ）前記（Ｘ）に記載の塩基配列をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列と対比させたときに１塩基以上のミスマッチを有する。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドの用途は特に限定されない。例えば、試料中に含まれるＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法において、プローブとして使用することができ、それによって、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓをＳ．  ａｕｒｅｕｓと区別して検出できる。
【００１６】
Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列は、非特許文献１により公知である。特徴（Ｘ）に関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記ゲノム配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有していれば、特に限定されない。好ましくは、後述の配列番号１または配列番号９８に記載の塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有していればよい。
【００１７】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列は、非特許文献１により公知である。特徴（Ｙ）に関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記ゲノム配列と対比させたときに１塩基以上のミスマッチを有していれば、特に限定されない。
【００１８】
塩基配列を対比したときのミスマッチの数はアラインメント解析によって判断することができる。アライメント解析は、当分野において一般的に行われており、本明細書においては、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）が提供する多重整列プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（クラスタルオメガ）を使用する。該プログラムでＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのゲノム配列及びＳ．  ａｕｒｅｕｓのゲノム配列を整列させることで、ミスマッチの数や位置を特定する。
【００１９】
前記対比において、前記ゲノム配列のどの部分と対比させるかについては、特に限定されない。例えば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓに特異的な遺伝子として知られているｎｕｃ遺伝子や、塩基配列の差を利用して他のブドウ球菌と区別できるｆｅｍＡ遺伝子、ｔｕｆ遺伝子等の中から選択すれば良い。これらの遺伝子との対比ができるオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの検出プローブとして使用する場合に、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別できるだけでなく、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属以外の微生物（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属等が挙げられる）と区別できる特異性を有する点で、好ましい。とりわけ、ｎｕｃ遺伝子、ｆｅｍＡ遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のなかでも、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓおよびＳ．  ａｕｒｅｕｓ以外の他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の微生物（例えば、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．  ｃａｐｒａｅ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓ．  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．  ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．  ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ、Ｓ．  ｄｅｌｐｈｉｎｉ、Ｓ．  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．  ｆｅｌｉｓ、Ｓ．  ｆｌｅｕｒｅｔｔｉｉ、Ｓ．  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．  ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．  ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓ．  ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｌｕｔｒａｅ、Ｓ．  ｍｕｓｃａｅ、Ｓ．  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ、Ｓ．  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓ．  ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓ．  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．  ｓｃｉｕｒｉ、Ｓ．  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓ．  ｓｕｃｃｉｎｕｓ、Ｓ．  ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ、Ｓ．  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓ．  ｘｙｌｏｓｕｓ等が挙げられる）と区別できる特異性を有するという意味で、より好ましい。
【００２０】
［１−１］
配列番号１で示される塩基配列は、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのｎｕｃ遺伝子の塩基配列である。ｎｕｃ遺伝子は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ同定マーカーとして従来から使用されてきた（非特許文献１、非特許文献２、特許文献４）。従来技術では、ｎｕｃ遺伝子をターゲットにした核酸増幅検査はＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓは区別できないと報告されてきた（非特許文献１、特許文献４）。
【００２１】
しかしながら、本発明者らは、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子配列をアライメント解析することによって、ｎｕｃ遺伝子の特定の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用することで、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別して検出できることを見出した。
【００２２】
Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ  ４株、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ４株のｎｕｃ遺伝子の塩基配列の一部（配列番号１の４１２番目から５９１番目に該当）をアライメント解析した結果を図１に示す。
【００２３】
アライメント解析の結果、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのｎｕｃ遺伝子において、その塩基配列がＳ．  ａｕｒｅｕｓと異なる箇所があることが明らかとなった。そのような箇所は、配列番号１の塩基配列においては、１５、３２、３５、４９、５２、５８、６２、７２、７８、８４、８８、９４、９６、９９、１０２、１０５、１１１、１２２、１５６、１６２、１６４、１６６、１６７、１６８、１７１、１７６、１７７、１８３、１８７、１８８、１９３、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０８、２０９、２１０、２１９、２２１、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２４２、２４３、３００、３０９、３１５、３１６、３１８、３３４、３３６、３４３、３５１、３６０、３６３、３７８、３８１、３８４、３９６、４１７、４２９、４３５、４４４、４５０、４５３、４７０、４７１、４７４、４９８、５０４、５１６、５１９、５２５、５４０、５４９、５５２、５５５、５６４、５８２および５８５番目に該当する。これらの箇所は、それぞれの菌種で株間差がないため、該塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別してＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして好ましい。
【００２４】
［１−２］
配列番号９８で示される塩基配列は、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのｆｅｍＡ遺伝子の塩基配列である。ｆｅｍＡ遺伝子も、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ同定マーカーとして従来から使用されてきた（特許文献２、特許文献３）。
【００２５】
Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ  ６株、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ６株のｆｅｍＡ遺伝子の塩基配列の一部（配列番号９８の４２１番目から６００番目に該当）をアライメント解析した結果を図８に示す。
【００２６】
アライメント解析の結果、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのｆｅｍＡ遺伝子において、その塩基配列がＳ．  ａｕｒｅｕｓと異なる箇所があることが明らかとなった。そのような箇所は、配列番号９８の塩基配列においては、６０、１０５、１２０、１３９、１５０、１７１、２０４、２３７、２５５、２７７、３１３、３９６、４２３、４５７、４９９、５０４、５１０、５１６、５４６、５４９、５５２、５９１、５９７、６０６、７５６、８０１、８０４、９８７、１０９８、１１６１、１１６７番目および１１９７番目に該当する。これらの箇所は、それぞれの菌種で株間差がないため、該塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別してＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして好ましい。
【００２７】
［２］
前記のオリゴヌクレオチドとして、具体的には、以下の（１Ａ）または（２Ａ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
（１Ａ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、配列番号１で示される塩基配列のうち下記の（Ｉ）で示される群のうち少なくとも一つの塩基を含む塩基配列。
（２Ａ）前記（１Ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（Ｉ）配列番号１で示される塩基配列の１５、３２、３５、４９、５２、５８、６２、７２、７８、８４、８８、９４、９６、９９、１０２、１０５、１１１、１２２、１５６、１６２、１６４、１６６、１６７、１６８、１７１、１７６、１７７、１８３、１８７、１８８、１９３、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０８、２０９、２１０、２１９、２２１、２２９、２３０、２３２、２３４、２３５、２４２、２４３、３００、３０９、３１５、３１６、３１８、３３４、３３６、３４３、３５１、３６０、３６３、３７８、３８１、３８４、３９６、４１７、４２９、４３５、４４４、４５０、４５３、４７０、４７１、４７４、４９８、５０４、５１６、５１９、５２５、５４０、５４９、５５２、５５５、５６４、５８２および５８５番目からなる群。
【００２８】
前記のオリゴヌクレオチドとして、以下の（３Ａ）または（４Ａ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
（３Ａ）配列番号９８で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、配列番号９８で示される塩基配列のうち下記の（ＩＩＩ）で示される群のうち少なくとも一つの塩基を含む塩基配列。
（４Ａ）前記（３Ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（ＩＩＩ）配列番号９８で示される塩基配列の６０、１０５、１２０、１３９、１５０、１７１、２０４、２３７、２５５、２７７、３１３、３９６、４２３、４５７、４９９、５０４、５１０、５１６、５４６、５４９、５５２、５９１、５９７、６０６、７５６、８０１、８０４、９８７、１０９８、１１６１、１１６７および１１９７番目からなる群。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号９８で示される塩基配列のうち、前記で見出された箇所のうち少なくとも一つの塩基を含む、少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列を有する。
【００３０】
本明細書において、「少なくとも連続した１０塩基」の塩基数は特に限定されない。
オリゴヌクレオチドプローブとしての使用を想定した場合、ターゲット核酸に対してハイブリダイズする領域の塩基数は、その検査法によって異なるが、好ましい上限は５０塩基であり、より好ましくは３５塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。一方、塩基数の好ましい下限は１０塩基であり、より好ましくは１５塩基である。長いオリゴヌクレオチドプローブは十分な特異性が得られないことがある。一方で、短いオリゴヌクレオチドプローブはハイブリダイゼーション効率が低下することがある。
【００３１】
また、本明細書において、「少なくとも一つ」の箇所数は特に限定されないが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓに対して数塩基の一塩基多型があることが好ましい。オリゴヌクレオチドが含む一塩基多型の数によって、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が変化する。Ｔｍとは、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖になっている割合が等しいときの温度をいう。オリゴヌクレオチドが標的核酸（例えば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓゲノム）に対して一塩基多型を含む場合、標的核酸との相互作用が弱くなるため一般的にＴｍ値は小さくなる。したがって、標的核酸に対してオリゴヌクレオチドの一塩基多型の数が多いほど一塩基多型がないときと比べてＴｍ値が小さくなるため、標的核酸（例えば、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓゲノムあるいはＳ．  ａｕｒｅｕｓゲノム）に対するオリゴヌクレオチドの一塩基多型を融解曲線分析等によって測定することで、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを明確に区別することができるようになる。しかしながら、一塩基多型の数が多すぎると、該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が低下する。そのため、好ましい一塩基多型の数は１箇所から４箇所である。より好ましくは、１箇所から３箇所であり、さらに好ましくは、１箇所から２箇所である。
【００３２】
特に、配列番号１で示される塩基配列の２４２、２４３、３００、３０９、３５１、３６０、３６３、３９６、４５０、４５３、４９８、５０４、５５５および５６４番目の塩基は、その前後の塩基配列が株間差なく一致しているため、目的に応じて一塩基多型を含んだ任意のオリゴヌクレオチドを設計しやすいという点でより好ましい。
【００３３】
［３］
前記の（１Ａ）または（２Ａ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとして、具体的には、以下の（１Ｂ）または（２Ｂ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
（１Ｂ）配列番号１で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、下記の（ＩＩ）で示される群のうち少なくとも一つである塩基配列。
（２Ｂ）前記（１Ｂ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（ＩＩ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群。
【００３４】
前記の（３Ａ）または（４Ａ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとして、具体的には、以下の（３Ｂ）または（４Ｂ）で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
（３Ｂ）配列番号９８で示される塩基配列の中の少なくとも連続した１０塩基からなる塩基配列であって、その配列が、下記の（ＩＶ）で示される群のうち少なくとも一つである塩基配列。
（４Ｂ）前記（３Ｂ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
（ＩＶ）配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２からなる群。
【００３５】
前記のオリゴヌクレオチドは、試料中に含まれるＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法において、プローブとして使用することができ、それによって、簡便、短時間にＳ．  ａｕｒｅｕｓと区別してＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出できる。
【００３６】
本発明者らは、該オリゴヌクレオチドがそれぞれの菌種で株間差がないことをアライメント解析によって見出した。したがって、該オリゴヌクレオチドはＳ．  ａｕｒｅｕｓと区別してＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして好ましい。
【００３７】
前記（ＩＩ）で示される群のうち、特に配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８８で示される塩基配列は、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとはミスマッチがなく、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとは１〜２塩基のミスマッチを含んでいるため、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを区別するためのヌクレオチドプローブとしてより好ましい。
【００３８】
前記（ＩＶ）で示される群のうち、特に配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２で示される塩基配列は、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとはミスマッチがなく、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとは１〜２塩基のミスマッチを含んでいるため、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを区別するためのヌクレオチドプローブとしてより好ましい。
【００３９】
また、融解曲線分析における一塩基多型でのＴｍ値の差は一般的に小さい。例えば、一つのミスマッチがある場合、ないときと比べてオリゴヌクレオチドプローブのＴｍ値の差は０．５〜３℃という報告がある（非特許文献４）。そのため、Ｔｍ値の差を大きくするために、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）などのヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドプローブが使用される（非特許文献４）。しかしながら、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブは、設計が難しい、価格が高い等の課題があるため、Ｔｍ値の差を大きくするために別の方法が求められてきた。
【００４０】
しかしながら、本発明者らは鋭意研究を続けた結果、請求項に記載のオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブと使用することで、融解曲線分析におけるＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓのＴｍ値の差が予想以上に大きくなることを見出した。該オリゴヌクレオチドはＬＮＡなどのヌクレオチドアナログを含まなくともＴｍ値の差が大きく、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを明確に区別することができるため、誤判定を容易に防ぐことができる。
【００４１】
例えば、配列番号６７、配列番号９７で示される塩基配列はそれぞれＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子配列の一部である。これらの領域に結合する蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号８８）を使用して融解曲線分析を行った結果、簡便、短時間にＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを分離できた（実施例１）。
【００４２】
さらに驚くべきことに、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓにおける融解曲線ピークの温度差は約５℃であった（図２）。配列番号８８で示される蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとはミスマッチがなく、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとは一つのミスマッチがある。一つのミスマッチであっても約５℃のＴｍ値の差があるため、ハイブリダイゼーション効率を低下させることなく、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを明確に区別することができる。
【００４３】
一方で、ｎｕｃ遺伝子の一部の塩基配列をターゲットにしてＳ．  ａｕｒｅｕｓを検出する技術はすでに公開されているが（例えば、特許文献４）、該文献に示されている塩基配列ではＳ．  ａｕｒｅｕｓとＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを分離することはできなかった（比較例１）（図７）。
【００４４】
［４］
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標識物質で標識されていることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブとして使用することができる。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプローブを使用した核酸検査法は、従来から実施されており、既に当該技術分野において確立されている（例えば、特許文献４）。
【００４６】
オリゴヌクレオチドプローブは、その目的に応じて、一つ以上の標識物質を付加することができる。標識物質には、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン、ペルオキシダーゼなどがあるが、本発明では請求項に記載の事項以外は特に限定されず、検査法に応じて公知の標識物質が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。また、オリゴヌクレオチドプローブの標識化のためにリンカーなどを付加してもよい。
【００４７】
例えば、蛍光物質で標識された蛍光オリゴヌクレオチドプローブには、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、モレキュラービーコン、サイクリングプローブ、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）等が挙げられるが、本発明においてこれらに限定されない。
【００４８】
また、オリゴヌクレオチドプローブを構成する塩基には、イノシン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡといったヌクレオチドアナログを含めてもよい。ヌクレオチドアナログを使用することで、特異性の向上などが期待できる。
【００４９】
［５］
［Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法］
本発明の別の実施態様の一つは、以下の（１）〜（３）の工程を含むＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法である。
（１）前記の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、前記の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅する第一工程。
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、前記の本発明のオリゴヌクレオチドのうち第一工程で得られうる増幅産物にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる第二工程。
（３）第二工程で得られうる複合体を検出する第三工程。
ここで、前記（１）で「…で示される塩基配列を含みうる核酸断片」としているのは、Ｓ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出する方法においては、通常、検出対象とする試料に当該核酸断片が必ず含まれることは想定していないからである。
【００５０】
［第一工程（核酸増幅工程）］
核酸増幅方法は、本発明において請求項に記載の事項以外は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）、ＡＢＣ−ＰＣＲを含む競合的ＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｒｅｄ  ＰＣＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃａｌｍｐ法、Ｉｍｍｕｎｏ  ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。なお、各方法における核酸増幅反応の条件は特に制限されず、それぞれの条件にて行うことができる。
【００５１】
核酸増幅酵素には、その核酸増幅方法に応じて、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等が使用できる。また、核酸増幅酵素は、天然由来酵素だけでなく、人工的にアミノ酸配列を改変した組換え体酵素を使用してもよい。例えば、核酸増幅方法にＰＣＲを用いる場合、使用できるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ等が挙げられるが、本発明においてこれらに限定されない。
【００５２】
核酸増幅反応の組成物には、その方法に応じていくつかの反応成分が必要である。一例として、ＰＣＲを用いた核酸増幅方法においては、測定試料、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応バッファー、マグネシウム塩が一般的に必要である。また、目的に応じてＵＮＧ（Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、ベタイン、グリセロール、糖類、アミノ酸、ペプチド、アミン、カリウム塩等を添加物として含めてもよいが、本発明においてこれらに限定されない。
【００５３】
オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸増幅反応において核酸増幅の起点として使用されるオリゴヌクレオチドであり、当該技術分野において常用されている（例えば、特許文献４、非特許文献２）。また、核酸増幅方法に応じて複数種類のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。オリゴヌクレオチドプライマーは、ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含んでいることを特徴とし、ターゲット核酸に対してハイブリダイズする領域の塩基数は、その核酸増幅方法によって異なるが、好ましい上限は５０塩基であり、より好ましくは３５塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。一方、塩基数の好ましい下限は１０塩基であり、より好ましくは１５塩基である。長いオリゴヌクレオチドプライマーは非特異産物の増加、アニーリング効率の低下が発生することがあり、短いオリゴヌクレオチドプライマーは十分な特異性が得られないことがある。
【００５４】
一般的に、特異性の高いオリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端がターゲット配列に対して相補的であることが重要であり、言い換えれば、３’末端が相補的であれば５’末端が相補的でなくとも有効なプライマーとしてはたらくとされている。このことから、本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーも３’末端がゲノム配列に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。
【００５５】
例えば、一般的なＰＣＲでは、少なくとも２本のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。それらのオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の相補鎖にそれぞれハイブリダイズできるように設計され、かつその増幅領域にオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズできる領域があることが好ましい。好ましいものとして、配列番号８９、配列番号９０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーの組合せが例示できる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドプライマーは、その目的に応じて、一つ以上の標識物質を付加することができる。標識物質には、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン、ペルオキシダーゼなどがあるが、本発明では請求項に記載の事項以外は特に限定されず、核酸増幅方法に応じて公知の標識物質が標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。また、オリゴヌクレオチドプライマーの標識化のためにリンカーなどを付加してもよい。
【００５７】
また、オリゴヌクレオチドプライマーを構成する塩基には、混合塩基のみならず、イノシン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡといったヌクレオチドアナログを含めてもよい。ヌクレオチドアナログ等を使用することで、特異性の向上などが期待できる。
【００５８】
［第二工程および第三工程（増幅産物を検出する工程）］
増幅産物の検出方法は、本発明において請求項に記載の事項以外は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。具体的な方法として、融解曲線分析、ＤＮＡプローブ法、核酸ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。中でも、Ｔｍ値の差を利用してＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓを区別して検出できることから、融解曲線分析が増幅産物の検出方法として好ましい。
【００５９】
融解曲線分析は、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度等を測定してモニタリングすることで、Ｔｍ値を測定する分析法である。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は塩基配列を測定する手法として使用できる。そのため、一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。
【００６０】
例えば、増幅産物を検出する方法として融解曲線分析を使用する場合、前記核酸増幅反応の組成物にさらに蛍光オリゴヌクレオチドプローブを加えてもよい。
【００６１】
１例として、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）を用いた融解曲線分析を行う場合、ＫＯＤポリメラーゼの濃度は０．００１〜１．０Ｕ／μＬ、より好ましくは０．０１〜０．１Ｕ／μＬ、プライマー濃度は０．０１〜１０μＭ、より好ましくは０．１μＭ〜８μＭであり、ｄＮＴＰｓ濃度は０．０１〜２ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭであり、反応バッファーのｐＨは２〜１３、より好ましくは４〜１０であり、マグネシウム塩濃度は０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは１．０〜５ｍＭであり、ＱＰｒｏｂｅ濃度は、０．０１〜２μＭ、より好ましくは０．１〜０．８μＭである。ＰＣＲや融解曲線分析は、公知の条件にて行うことができる。また、ＱＰｒｏｂｅは測定に応じて複数種類加えてもよい。
【００６２】
［試料について］
本発明において使用できる測定試料は、生体試料や食品だけでなく、調製した核酸等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６３】
生体試料としては、特に制限されないが、血液、血液培養液、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。生体試料を測定試料とする場合、各生体試料に応じて、希釈や懸濁などの前処理を行ってもよい。
【００６４】
食品としては、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられるが、これらに限定されない。食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できる。また、試料によって、細かく破砕する、精製水に懸濁させる等の前処理を行ってもよい。
【００６５】
また、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した洗浄液も試料として用いることができる。
【００６６】
調製した核酸とは、各試料から抽出したＤＮＡやＲＮＡ、人工合成した核酸等を指すが、これらに限定されない。核酸抽出には、各メーカーから販売されているキットを使用してもよい。
【００６７】
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。
【００６８】
［該方法を行うためのキットについて］
本発明の別の態様としては、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中に含まれるＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出するためのキットが挙げられる。
そのようなものとして、以下の（Ｐ）および（Ｑ）を含むＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの検出キットが例示できる。
（Ｐ）項３の（１Ａ）もしくは（２Ａ）で示される塩基配列、または、項５の（１Ｂ）もしくは（２Ｂ）で示される塩基配列を含みうる核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（Ｑ）項２〜項７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
本発明のキットに適用できるプライマー、および本発明のオリゴヌクレオチドについては、上述のとおりである。
【００６９】
本発明の方法を実施するためのキットに含まれる組成としては、請求項に記載の事項以外は特に限定されず、核酸増幅・核酸検出に必要な試薬を適宜用いることができる。核酸の増幅・検出法としては、前記の種々の方法を用いることができ、これらの方法は既に当該技術分野において確立されている。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：蛍光プローブを用いた融解曲線分析
（１）方法
配列番号８８で示される蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＱＰｒｏｂｅ（登録商標））を用いた融解曲線分析を行った。具体的には、配列番号１、配列番号９１で示される塩基配列の合成オリゴヌクレオチドを鋳型にして融解曲線分析を行った。試薬はジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用した。添付の「プライマー・プローブ希釈液」を使用して以下のようにプローブ、鋳型ＤＮＡ等を混合した。
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ  ０．３μＭ
鋳型合成オリゴヌクレオチド  １μＭ
測定装置にＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）（東洋紡社）を用いて融解曲線分析を行った。
（２）結果
測定結果を図２に示す。測定に用いた鋳型合成オリゴヌクレオチドによってＴｍ値が異なることが明らかになった。配列番号１、配列番号９１で示される塩基配列はそれぞれＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子であり、配列番号６７、配列番号９７で示される塩基配列をそれぞれ含んでいる。使用した蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号８８）はこれらの領域に結合するプローブであって、その一塩基多型によって融解曲線分析でのＴｍ値が異なった。したがって、Ｔｍ値を比較することによってＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓとＳ．  ａｕｒｅｕｓをそれぞれ分類できることが示された。
【００７２】
実施例２：融解曲線分析による生体試料の測定
（１）方法
生体試料（血液培養液）３検体を融解曲線分析によって測定した。
配列番号８９、配列番号９０で示されるプライマー、配列番号８８で示される蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＱＰｒｏｂｅ（登録商標））を用いて、核酸増幅とそれに続く融解曲線分析を行った。試薬はジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用し、測定機器はＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）（東洋紡社）を使用した。なお、増幅反応条件、融解曲線分析条件は以下に示す条件で行い、反応液の調製等はジーンキューブ（登録商標）テストベーシックの取扱説明書に従った。また、測定試料は、同定感受性検査で黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）あるいは表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）と判定された血液培養液検体を使用した。
増幅反応条件
９４℃ ３０秒
９８℃   １秒−６０℃   ３秒−６３℃   ５秒 （サイクル数５０回）
融解曲線分析条件
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
４０−７５℃ ０．０９℃／秒
（２）結果
測定結果を図３に示す。検体１及び検体２は、同定感受性検査で黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）と判定された検体であり、検体３は、同定感受性検査で表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）と判定された検体であった。検体１及び検体２を参考例１の方法でシークエンス解析を行ったところ、検体１で得られた配列はＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓと高い相同性を示した一方で、検体２で得られた配列はＳ．  ａｕｒｅｕｓと高い相同性を示した。したがって、融解曲線分析によって、生体試料に含まれるＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出できるとともにＳ．  ａｕｒｅｕｓと区別できることが示された。したがって、同定感受性検査で黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）として誤判定された株をＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓに正しく分類できた。また、該プライマー、該プローブは表皮ブドウ球菌を検出しないことが示された。
【００７３】
参考例１：シークエンス解析
（１）方法
実施例２で使用した検体１、検体２の２株について、シークエンス解析を行った。具体的には、非特許文献２で示されているプライマーセット（配列番号９２及び配列番号９３で示されるオリゴヌクレオチドプライマー）を用いて核酸増幅を行った後、得られた核酸増幅産物をシークエンス解析した。
（ａ）核酸増幅
反応液はＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）の取扱説明書に従って以下のように調製した。また、測定試料は反応液の１／４０容量に相当する量を加えた。
ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  １×
Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）  −Ｐｌｕｓ−  ０．０２５Ｕ／μＬ
プライマー  ０．２μＭ  ｅａｃｈ
ｄＮＴＰｓ  ０．２ｍＭ
また、核酸増幅反応は以下の条件で行った。
９４℃、１分−５５℃、３０秒−７２℃、１分３０秒（サイクル数３７回）
７２℃、３分３０秒
（ｂ）シークエンス解析
試薬はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、反応液の調製等は該試薬の取扱説明書に従った。測定機器は、３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
（２）結果
検体１及び検体２のシークエンス解析結果をそれぞれ図４、図５に示す。図４（検体１）で示される塩基配列の相同性検索を行ったところ、配列番号１で示される塩基配列の一部と高い相同性を示した。配列番号１で示される塩基配列はＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのｎｕｃ遺伝子であることから、この株はＳ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓに分類された。一方で、図５（検体２）で示される塩基配列の相同性検索を行ったところ、配列番号９１で示される塩基配列の一部と高い相同性を示した。配列番号９１で示される塩基配列はＳ．ａｕｒｅｕｓのｎｕｃ遺伝子であることから、この株はＳ．ａｕｒｅｕｓに分類された。以上の結果から、検体１はＳ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、検体２はＳ．ａｕｒｅｕｓであった。したがって、実施例２のように、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによってＳ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出できるとともにＳ．ａｕｒｅｕｓとは区別できることが示された。
【００７４】
実施例３および比較例１：従来技術との比較
（１）方法
配列番号８９、配列番号９０で示されるプライマー、配列番号８８で示される蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＱＰｒｏｂｅ（登録商標））を用いて、核酸増幅とそれに続く融解曲線分析を行った（実施例３）。同様にして、特許文献４に記載のプライマー、蛍光ヌクレオチドプローブ（配列番号９４、配列番号９５で示されるプライマー、配列番号９６で示されるプローブ）を用いて、核酸増幅とそれに続く融解曲線分析を行った（比較例１）。試薬はジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社）を使用し、測定機器はＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）（東洋紡社）を使用した。なお、増幅反応条件、融解曲線分析条件、反応液の調製等は実施例２と同様に行った。測定試料は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓあるいはＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの分離培養コロニーを使用した。
（２）結果
測定結果を図６、図７に示す。図６は本発明による測定結果（実施例３）であり、図７は特許文献４に記載の方法による測定結果（比較例１）である。図６では、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのピークのＴｍ値が異なるためそれぞれを分離可能であったのに対して、図７では、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓとＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓのピークがほぼ同じＴｍ値を示したため、菌種の分離はできなかった。したがって、本発明によって従来技術では困難であったＳ．  ａｕｒｅｕｓとＳ．  ａｒｇｅｎｔｅｕｓの分離を可能にしたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明に記載の方法又はキットを使用することで、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓと区別して、Ｓ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓを検出することができるようになった。本発明に記載の方法又はキットを使用することは、ブドウ球菌感染症に対する治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等に特に有用であり、本発明は研究用途のみならず臨床検査や環境検査、食品検査等にも大きく貢献することができる。
【図１】
2017163969.tif 000003
【図２】
2017163969.tif 000004
【図３】
2017163969.tif 000005
【図４】
2017163969.tif 000006
【図５】
2017163969.tif 000007
【図６】
2017163969.tif 000008
【図７】
2017163969.tif 000009
【図８】
2017163969.tif 000010
【配列表】
2017163969000001.app