(57)【要約】【課題】緩衝塩を由来とした汚染によるゴーストピーク及びベースラインノイズの発生を抑制する液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法は、前記液体クロマトグラフィー分析装置に移動相として用いるキャリア溶液を通液し、分析を開始する前に、前記液体クロマトグラフィー分析装置に通液開始時に５０℃以上に加温された水を通液し、前記液体クロマトグラフィー分析装置を洗浄する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法であって、
前記液体クロマトグラフィー分析装置に移動相として用いるキャリア溶液を通液し、分析を開始する前に、
前記液体クロマトグラフィー分析装置に通液開始時において５０℃以上に加温された水を通液し、前記液体クロマトグラフィー分析装置を洗浄することを特徴とする、液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法。
【請求項２】
通液する前記水の導電率が、２５℃における測定値で１．０μＳ／ｃｍ以下である請求項１に記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法。
【請求項３】
前記液体クロマトグラフィー分析装置に加温された水を通液する前に、前記液体クロマトグラフィー分析装置からカラムを取り外し、カラム以外の機器に通液する、請求項１又は２のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法。
【請求項４】
前記加温された水を通液する部分が、送液ポンプ、検出器及び移動相通液配管から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法により前処理を行った後に、分析を行う液体クロマトグラフィー分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法及び液体クロマトグラフィー分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や食品、化粧品などの有効成分や不純物の同定や定量を行う方法として液体クロマトグラフィー法が用いられている。液体クロマトグラフィーは逆相分配、順相分配、親水性相互作用、サイズ排除、イオン交換等の分離モードを有し、移動相と固定相との相互作用に基づき液体試料中の各種成分を分離、溶出させることができる。
固定相はシリカゲル、ポリマーなどの充填剤からなり、充填剤の代表例としてオクタデシル基を導入したシリカゲル（ＯＤＳ）やポリスチレン、アクリレート等のポリマー樹脂が挙げられる。また、移動相には水や有機溶媒を単独または混合して使用される。多くの場合、固定相と測定成分による相互作用を緩衝する目的で移動相にはリン酸ナトリウムやぎ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸ナトリウムなどの緩衝塩が添加される。
【０００３】
液体クロマトグラフィーにおける課題の一つとして、分析時にクロマトグラム上に試料成分に含まれないゴーストピークと呼ばれる不明なピークやベースラインノイズが不規則に出現することがある。これは、近年、ＵＶやＲＩなどの汎用検出器の高性能化、新規高性能検出器の登場、質量分析計の普及などによって急速に検出の高感度化が進んできた結果、従来は検出されなかった上記ゴーストピークが検出されるようになったことによるものである。分析目的とする成分ピークとゴーストピークやベースラインノイズとが重なってしまうと、成分の同定や定量性が大きく損なわれることがある。またゴーストピークやベースラインノイズが出現した場合、原因究明と解消に時間を要するという課題もある。
【０００４】
ゴーストピーク及びベースラインノイズの原因としては、種々の原因が提言されている。例えば、カラム内に流入する不純物による汚染、分析試料による液体クロマトグラフィー分析装置の汚染、移動相に添加される緩衝塩を由来とした汚染、移動相に用いる水溶液を構成する水の汚染等が原因として知られている。
【０００５】
例えば特許文献１では、カラム内に流入する不純物を低減するために、専用の液体クロマトグラフィー用フィルターを設けることが記載されている。このフィルターを、主に固定相が充填された分析用カラムの手前に一体型タイプ、もしくはフィルターのみ交換可能なガードフィルターとして接続することで、汚染物質をフィルターにて捕集することができる。
【０００６】
この他にも、分析試料を由来としたゴーストピークおよびベースラインノイズは、試料を注入するためのシリンジやインジェクターの汚染に伴うものもある。これらの汚染は、シリンジやインジェクターを有機溶媒などで洗浄することで解消することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−３０１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、移動相中の緩衝塩を由来とした汚染物質を原因とするゴーストピークおよびベースラインノイズの発生は、完全には抑制することができなかった。
【０００９】
例えば特許文献１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターでは、移動相に溶解していない浮揚成分を捕集することはできる。しかしながら、移動相中に溶解可能な緩衝塩を由来とした汚染物質は除去することができず、緩衝塩に由来としたゴーストピークおよびベースラインノイズを完全には抑制することはできない。
【００１０】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、ゴーストピークおよびベースラインノイズの発生が移動相中の緩衝塩を由来とした汚染物質が原因であることを見出し、５０℃以上に加温された水をあらかじめ液体クロマトグラフィー分析装置、例えば送液ポンプ、検出器および移動相通液配管に通液して前処理を行うことで、液体クロマトグラフィーにおいて試料中に含まれる成分とは関係なくクロマトグラム上に不規則に発生するゴーストピークおよびベースラインノイズを抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、あらかじめ加温された水を通液し前処理することで移動相中の緩衝塩を由来とした液体クロマトグラフ分析装置の汚染によるゴーストピークおよびベースラインノイズの発生を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を提供する。
【００１２】
（１）本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法は、前記液体クロマトグラフィー分析装置に移動相として用いるキャリア溶液を通液し、分析を開始する前に、前記液体クロマトグラフィー分析装置へ通液開始時に５０℃以上に加温された水を通液し、前記液体クロマトグラフィー分析装置を洗浄する。
【００１３】
（２）上記（１）に記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法において、通液する前記水の導電率が、２５℃における測定値で１．０μＳ／ｃｍ以下であってもよい。
【００１４】
（３）上記（１）又は（２）のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法において、前記液体クロマトグラフィー分析装置に加温された水を通液する前に、前記液体クロマトグラフィー分析装置からカラムを取り外してもよい。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の液体クロマトグラフィー分析装置の目処理方法において、前記加温された水を通液する部分が、送液ポンプ、検出器及び移動相通液配管であってもよい。
【００１６】
（５）本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析方法は、上記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法により前処理を行った後に、分析を行う。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィーにおける前処理方法は、通液開始時に５０℃以上に加温された水をあらかじめ液体クロマトグラフ分析装置に通液し前処理を行うことで、分析装置の汚染に由来としたゴーストピークおよびベースラインノイズの発生を抑制させ分析再現性を向上させることができる。
そのため、本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィーにおける前処理方法を施した液体クロマトグラフィー分析方法は、食品、化粧品、環境、農業、医療、工業材料等の幅広い分野に有用であり、特にこれらの分野において製品品質試験などで高い分析精度が要求される場合、多検体分析や繰り返し分析に用いる場合に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】比較例１のブランクのクロマトグラムである。
【図２】実施例１の加温した水による通液洗浄後のクロマトグラムである。
【図３】比較例２の室温の水による通液洗浄後のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィーにおける前処理方法は、通液開始時に５０℃以上に加温された水をあらかじめ液体クロマトグラフ分析装置に通液し前処理を行う。前処理によって、装置内に蓄積した緩衝塩が洗浄され、装置内に蓄積した緩衝塩を由来とした汚染物質によるゴーストピークおよびベースラインノイズの発生を抑制できる。その結果、分析再現性を向上させることができる。
【００２０】
液体クロマトグラフィー分析装置は、一般に公知のものである。一般の液体クロマトグラフィー分析装置において、移動相に用いられるキャリア溶液は、溶離液用の貯留槽から送液ポンプにより移動相通液配管を通ってカラムへ送液され、カラムを通過後に検出器へ送られる。そのため、前処理用に加温された水は、少なくとも送液ポンプ、検出器及び移動相通液配管を通液することが好ましい。液体クロマトグラフィー分析装置に加温された水を通液することができれば、装置内に蓄積した緩衝塩を由来とした汚染物質によるゴーストピークおよびベースラインノイズの発生を充分抑制することができる。
【００２１】
これに対しカラムには、加温された水を通液しないことが好ましい。すなわち、液体クロマトグラフィー分析装置に加温された水を通液する前に、液体クロマトグラフィー分析装置からカラムを取り外すことが好ましい。測定対象以外を通液することで、カラム内に、想定していない汚染物質等が蓄積する恐れを避けることができる。カラム自体は、通常複数回の使用毎に交換する部材であるため、加温された水を通液しなくても、問題は生じない。
【００２２】
カラムを取り外した場合は、始めに移動相貯留槽からカラム入口部分までを通液し、続いてカラム出口部分から検出器側の通液を行うことで、液体クロマトグラフィー分析装置の洗浄を行うことができる。このように通液を行うことで、送液ポンプ、検出器及び移動相通液配管を通液することができる。
【００２３】
前処理に用いる水は液体クロマトグラフィーの移動相に用いられるものであれば種類に制約なく使用することができる。水由来の装置汚染を抑制するためには、純度が一定以上な品質があることが好ましい。
純度の指標としては例えば比電気抵抗の逆数である導電率を指標として用いることができる。２５℃における導電率が１．０μＳ／ｃｍ以下の水は、純水として扱うことができる。導電率は工業用比抵抗計（例えば堀場製作所製ＨＥ−４８０Ｒ）を用いるか、市販の超純水製造装置（例えばメルクミリポア社製Ｍｉｌｌ−Ｑ）を使用することにより容易に測定することが可能である。
【００２４】
前処理に用いる水の導電率は、２５℃において１．０μＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、０．１μＳ／ｃｍ以下であることが特に好ましい。水の導電率が、１．０μＳ／ｃｍ以下であれば、水中に含まれるイオン性成分などが装置汚染の要因となる可能性をより避けることができる。
０．１μＳ／ｃｍ以下の品質を持つ水としては超純水、イオン交換水、または液体クロマトグラフィー用精製水などが挙げられる。
【００２５】
また前処理に用いる水の導電率は、実際の通液する際の５０℃以上に加温された状態においても１．０μＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、０．１μＳ／ｃｍ以下であることが特に好ましい。超純水測定装置などから採集後、一定期間経過すると空気中の汚染物質などの溶解により導電率が上昇することがある。そのため、実際の通液する際の５０℃以上に加温された状態においても、水の導電率が一定値以下であることが好ましい。
【００２６】
水を加温する加温方法には、特に制約はない。ポット等を使用した加温、水浴等を用いた加温などを用いることができる。水の加温は超純水測定装置などから採集した後、１０分以内に行うことが好ましい。加温までの時間を短縮することで、水の導電率が悪化することを避けることができる。
【００２７】
前処理を行う水の水温は、液体クロマトグラフィー分析装置に通液開始する際に５０℃以上に加温されていれば、前処理中に水温が温度変化してもよい。尚、ここで通液する水の温度は、前処理用の水の貯留槽の中にある水を測定した値である。
洗浄効果をより高めるためには、前処理中の水温が通液開始時に５０℃以上であることが好ましく、５０〜９０℃であることがさらに好ましく、６０〜８５℃であることが特に好ましい。前処理中の水温が５０℃以上であれば、緩衝塩を由来とした汚染物質の溶解度を高めることができ、液体クロマトグラフィー分析装置の洗浄効果をより高めることができる。また前処理中の水温が、９０℃以下であれば、水が沸騰してしまうことを避けることができると共に、液体クロマトグラフィー分析装置の仕様温度以上となることを避けることができる。
一方、通液中の水温については特に制限はないが、通液終了時に２０℃以上であることが好ましく、３０℃以上であることがさらに好ましい。２０℃未満まで下がってしまうと十分な洗浄効果が得られなくなる可能性がある。
【００２８】
加温された水を通液する時間（洗浄時間）は特に限定されるものではないが、汚染物質の低減の観点からは５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましく、２０分以上がさらに好ましい。加温された水を通液する時間を充分確保することで、装置内に蓄積された緩衝塩を由来とした汚染物質を充分に除去することができる。
一方で作業効率の観点からはより短時間で洗浄を完了できることが好ましいため、洗浄時間は３０分以内であることが好ましく、２０分以内がより好ましく、１０分以内がさらに好ましい。
また、加温された水を通液する際に、通液開始から通液終了までの平均の流速は、０．０２〜６．５０ＣＶ／ｍｉｎ（ここで、ＣＶはカラム容量を表す。）が好ましい。
【００２９】
本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法は、逆相分配、順相分配、親水性相互作用、サイズ排除、イオン交換等の各種分離モードに対して制約なく用いることができる。特に移動相へ緩衝塩を添加することが多い逆相分配、親水性相互作用、イオン交換の各分離モードに好ましく用いることができる。
また、単一移動相を用いて分析を行うイソクラティック法、複数の移動相を順次置換させることで分析を行うグラジエント法のいずれに対しても用いることができる。特にグラジエント法のように、同じ液体クロマトグラフィー分析装置において複数の異なる移動相を切り替えて分析に用いる場合に、本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法に基づいて洗浄を行うことが好ましい。グラジエント法の場合には、全ての移動相ラインに対して加温した水の通液を行うことが好ましい。
【００３０】
上述のように、本発明の一態様に係る液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法を用いることで、装置内に蓄積した緩衝塩が洗浄され、装置内に蓄積した緩衝塩を由来とした汚染物質によるゴーストピークおよびベースラインノイズの発生を抑制することができる。
また上述の液体クロマトグラフィー分析装置の前処理方法を行った後に、液体クロマトグラフィー分析装置を用いて分析を行うことで、分析再現性の高い液体クロマトグラフィー分析方法を実現することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
【００３２】
次に示す実施例および比較例において、以下の分析装置を用いた。
液体クロマトグラフィー分析装置：Ｎｅｘｅｒａ−ｉ（島津製作所製、ＰＤＡ検出器使用）
カラム：逆相クロマトグラフィー用カラムＳｈｏｄｅｘ  ＯＤＰ２  ＨＰ−４Ｄ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ。昭和電工製）
【００３３】
（ブランクの測定：比較例１）
まず、前記分析装置からカラムを取り外した状態で、溶離液用貯留槽に蓄えてあった２５ｍｍｏｌ／Ｌのぎ酸アンモニウム水溶液を、送液ポンプ、検出器および移動相通液配管に流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで３０分通液した。そして、通液後の液体クロマトグラフィー分析装置にカラムを取り付け、トルエン１０００ｐｐｍを測定した。この際、移動相にＣＨ３ＣＮ／水＝４５／５５を用い、カラム温度４０℃、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ２５４ｎｍとした。
【００３４】
この結果、１０．０分近傍にぎ酸アンモニウム由来であるゴーストピークおよびベースラインノイズが出現し、トルエンはゴーストピークと重なっていることが確認された。得られたクロマトグラムを図１に示す。図１における横軸は保持時間であり、縦軸は信号強度である。また図１に示す符号１は、ぎ酸ナトリウム由来のゴーストピークとトルエンのピークが重なったピークである。
【００３５】
（加温した水による洗浄：実施例１）
まず、前記分析装置からカラムを取り外した状態で、溶離液用貯留槽に蓄えてあった２５ｍｍｏｌ／Ｌのぎ酸アンモニウム水溶液を、送液ポンプ、検出器および移動相通液配管に流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで３０分通液した。
次いで、カラムを取り外したままの状態で、前処理用の水の貯留槽に蓄えてあった加温した水を、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ（０．２０ＣＶ／ｍｉｎ）で液体クロマトグラフィー分析装置に２０分通液した。通液した部分は、送液ポンプ、検出器及び移動相通液配管である。また通液した水は、超純水製造装置Ｍｉｌｌ−Ｑ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ３（メルクミリポア社製）から５００ｍＬ採取した超純水（２５℃における導電率：０．０５４９μＳ／ｃｍ）であり、採取後速やかに電気ポットにて加温し、前処理用の水の貯留槽に蓄えた。通液時の前記前処理用の水の貯留槽の水の温度は通液開始時８１．３℃、終了時６２．８℃であった。
【００３６】
加温した水を通液後、再度カラムを取り付け、ブランクと同じ移動相、測定条件でトルエン１０００ｐｐｍを測定した。この結果、ブランクで溶出していたぎ酸アンモニウム由来のゴーストピークおよびベースラインノイズは解消され、９．４分にトルエン単独のピークが確認できた。得られたクロマトグラムを図２に示す。図２における横軸は保持時間であり、縦軸は信号強度である。また図２に示す符号２は、トルエンのピークである。
【００３７】
（室温の水による洗浄：比較例２）
超純水を加温せずに室温状態で使用した以外は、実施例１と同様の操作を行った。通液時の前処理用の水の貯留槽の水の温度は通液開始時、終了時ともに２６．６℃であった。
【００３８】
室温の水を通液後、カラムを取り付けブランクと同じ移動相、測定条件にてトルエン１０００ｐｐｍを測定した。しかし、８．５分近傍にぎ酸アンモニウム由来であるゴーストピークおよびベースラインノイズが出現し、トルエンはゴーストピークと重なっていることが確認された。得られたクロマトグラムを図３に示す。図３における横軸は保持時間であり、縦軸は信号強度である。図３に示す符号１は、ぎ酸ナトリウム由来のゴーストピークとトルエンのピークが重なったピークである。
【符号の説明】
【００３９】
１…ぎ酸ナトリウム由来のゴーストピーク（含トルエン）、２…トルエンのピーク
【図１】
2017133971.tif 000002
【図２】
2017133971.tif 000003
【図３】
2017133971.tif 000004