(57)【要約】【課題】生物学的試料中に存在する標的生体物質を効率よく回収できる手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、標的生体物質への結合能を有するタンパク質に標識物質Ａが結合された標識化タンパク質と、表面に標識物質Ｂが固相化された微粒子とからなり、かつ、該物質Ａと該物質Ｂとが互いに結合された状態のものである、タンパク質−微粒子複合体であって、前記標識化タンパク質は、該タンパク質１分子に対する前記物質Ａの平均結合分子数が１分子以上かつ６分子未満のものである、前記複合体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生体物質への結合能を有するタンパク質に標識物質Ａが結合された標識化タンパク質と、表面に標識物質Ｂが固相化された微粒子とからなり、かつ、該物質Ａと該物質Ｂとが互いに結合された状態のものである、タンパク質−微粒子複合体であって、
前記標識化タンパク質は、該タンパク質１分子に対する前記物質Ａの平均結合分子数が１分子以上かつ６分子未満のものである、
前記複合体。
【請求項２】
前記平均結合分子数が１〜２分子である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
標的生体物質への結合能を有するタンパク質が、抗体タンパク質又はその断片である、請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
前記抗体タンパク質が、がん細胞に特異的に発現する物質に対する抗体である、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
がん細胞に特異的に発現する物質が、MCT5又はLGR6である、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
抗体タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記微粒子が、磁気ビーズである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記微粒子は、平均粒子径が1μm未満の微粒子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記微粒子は、平均粒子径が50nm〜500nmの微粒子である、請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
前記物質Ａがビオチンを含む物質であり、前記物質Ｂがアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを含む物質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
標的生体物質を含む生物学的試料に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体を接触させる、標的生体物質の検出方法。
【請求項１２】
生物学的試料が血液である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
標的生体物質が、がん細胞に特異的に発現する物質である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載の複合体を含む、がんの検出用又は診断用試薬。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体に用いられる、標的生体物質への結合能を有するタンパク質に標識物質Ａが結合された標識化タンパク質であって、該タンパク質１分子に対する前記物質Ａの平均結合分子数が１分子以上かつ６分子未満でのものである、前記標識化タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的生体物質への結合能を有するタンパク質が微粒子表面に結合されてなるタンパク質−微粒子複合体、及びそれを用いた標的生体物質の検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、高い親和性と選択性を有しているために、研究、診断、医療の分野で幅広く利用されている。その形態の一つとしては、特定の分子及びその分子に結合したその他の分子を、抗体を用いて分離する目的で利用される。例えば、免疫沈降法と呼ばれる、可溶性の抗原と抗体が特異的に反応して不溶化し沈殿する反応を利用した、抗原の検出、分離、精製する方法が挙げられる。この方法は複数の抗体が認識する抗原が相互作用するその他の分子を複合体として同時に分離することが出来るため、タンパク質間相互作用の検出等に利用されている。また、分離の効率を高める為に、抗体を担体に固相化した固相化抗体も広く利用される。固相化抗体は、抗原の分離、精製に利用されるだけでなく、抗原が相互作用する核酸や脂質、糖、あるいは抗原を発現する細胞の回収に利用される。
【０００３】
細胞を回収する目的で、固相化抗体を利用する場合、可磁化物質（gFe2O3やFe3O4）が一様に分布した高分子ポリマーのコアを親水性ポリマーで覆った粒子が用いられ、分子ポリマー製磁気ビーズ、あるいは単に磁気ビーズと呼ばれている。磁気ビーズは溶液中では分散して存在するが、超常磁性体であるため、強力な磁石を近づけると凝集する性質を持っている。この性質を利用し、例えば、磁気ビーズに標的分子と特異的に結合する分子を結合させ、標的分子を含む混合溶液中に添加した後、磁石を近づけることで、標的分子のみを特異的に回収することが出来る。
【０００４】
磁気ビーズに抗体を固相化させた抗体固相化磁気ビーズは、生体から回収した溶液から特異的な分子や細胞を回収する、あるいは除去する目的で利用される。このビーズは単に抗体ビーズと呼ばれる場合もある。抗体ビーズは、例えば、血液に含まれる複数種類の細胞の中から赤血球や白血球等の細胞を分離する目的で利用される。さらに、特定の分化をした細胞にのみ発現する分子を認識する抗体を結合させた抗体ビーズは、特定の細胞のみを分離する目的で利用され、T細胞、B細胞、単球、上皮細胞等の分離に幅広く利用されている。
【０００５】
抗体ビーズを利用した臨床診断法も広く開発されている。例えば、進行性のがん患者では血液中にがん細胞が含まれる場合があることが知られている(非特許文献１：Clin Cancer Res 10: 6897-6904)。これらの細胞は、血中循環腫瘍細胞(CTC, Circulating Tumor Cells)と呼ばれ、ある種のがんの進行度合い、すなわち再発や転移を評価する方法として利用されている。
【０００６】
CellSearch system (Velidex社)はその先駆けとなった装置であり、2004年から臨床研究が報告されている (非特許文献１)。この方法では、EpCAM (上皮細胞接着分子)に結合する抗体を磁気ビーズに固相化した抗体ビーズが利用されている。CellSearch systemは、7.5 mlの血液中に含まれるがん細胞を抗体ビーズにより濃縮し、がん細胞に特異的に発現する物質（バイオマーカー）を利用してがん細胞数を検出する装置である。
【０００７】
CellSearch systemで検出されるCTCの数は、病態の進行状況と相関していることが報告されており、進行性の前立腺がん、乳がん、大腸がんを診断できる装置として承認されている。被験者から採取した血液から、密度勾配遠心法を用いて有核細胞を回収し、EpCAM抗体ビーズを用いてがん細胞を濃縮後、白血球共通抗原であるCD45を発現せず、がん細胞で広く発現が認められるcytokeratinを発現する細胞の個数を測定する。検出される個数が0個の場合はがんの罹患・転移の心配は少なく、1個の場合はがんが存在しており転移の可能性があると判断される。また、2個では転移がほぼ間違いなくあり、5個以上では生命の予後が短いと判断される (非特許文献２：Journal of Oncology Volume 2010 (2010), Article ID 617421)。
このように、従来ではがん組織を回収して組織生検を行っていた煩雑な手段を、血液検査で代替できる臨床診断上の利便性があることや、血行性転移を防止する新たな医薬品の開発につながるという期待、さらには患者のがんの性質に合わせた最適な治療法を選択できるオーダーメード医療が可能になるとの期待から、検出感度の向上やハイスループット化の技術開発、臨床研究が進められている。
【０００８】
CellSearch systemはCTCががんの悪性度の一つの指標になるという知見をもたらし、様々な研究がなされている。そのため、問題点も徐々に明らかになりつつある。例えば、がん細胞を回収するために利用する抗体ビーズは抗EpCAM抗体が固相化されているが、抗体のがん細胞結合性について課題がある。EpCAMは上皮細胞に発現する細胞であり、血球細胞にはほとんど発現していない事から、血液中に存在するがん細胞を含めた上皮由来の細胞には結合すると考えられている。しかし、がん細胞の全てがEpCAMを発現するわけではないことも明らかにされている。すなわち腫瘍細胞集団は不均一であるために、EpCAM発現量が一定でないことや、がん細胞が原発巣周囲の組織へ浸潤する能力を獲得する際に示す表現型の一つである上皮間葉転移(EMT, Epithelial Mesenchymal Transition)を起こした細胞ではEpCAMの発現が低下することが報告されている。さらに、腫瘍細胞が血液中で生き残る為に形成すると考えられている、循環腫瘍微小塞栓 (CTM, Circulating Tumor Microemboli) (がん細胞が複数個集まってクラスターを形成した凝集塊)の場合には、EpCAMの発現は低く、CellSearch systemでは検出できない事が報告されている(非特許文献９： American Journal of Pathology, March 2011, Vol. 178, 989-996)。
【０００９】
CTCが検出出来るがん種としては、進行性の乳がん、大腸がん、前立腺がんが挙げられる。それ以外にも、卵巣がん、胃がん、肺がん、膵臓がんでCTCの存在が指摘されている。しかしながら、がん患者全てでCTCが検出されているわけでは無い。例えば、CellSerach systemでは、1個以上のCTCが発見された患者は、乳がん患者で55〜71% (非特許文献３：Clin Cancer Res 2006;12(14): 4218-4224.)、大腸がん患者で27〜47% (非特許文献４：J Clin Oncol. 2008;26(19):3213-3221)、前立腺がん患者で61〜78% (非特許文献５：Clin Cancer Res 2008;14:6302-6309)であることが報告されている。一方、CTCを検出する新たな装置として、CTC iChipやISET、HD-CTC assay等が報告されており、前立腺がん患者の75〜90%からCTCが検出出来るという報告もある(非特許文献６：Mol Diagn Ther. 2014 18, p.389-402.)。このようにCTCが検出される割合は、用いる装置や方法により変動するため、がんの進行度や悪性度を正確に検出できる新たな装置や手法の開発が望まれている。
【００１０】
CTCを捕捉する際に利用する抗EpCAM抗体にも課題がある。抗EpCAM抗体は、装置の信頼性を高めるためにポリクローナル抗体ではなくモノクローナル抗体が利用されている。利用できる抗EpCAMモノクローナル抗体は数種類報告されているが、使用する抗体クローンが異なると検出されるがんの種類(原発臓器によるがんの違い)や進行ステージが変わる事が報告されていることから(非特許文献７：BMC Biotechnology 2010, 10, 35)、使用する抗EpCAMモノクローナル抗体の選択もCTCの検出感度に大きく影響を及ぼしてしまうという課題がある。
【００１１】
さらに、抗体を磁気ビーズに結合させた抗体ビーズの作製にも課題がある。EpCAMのように細胞によって発現に大きく変動する場合、あるいは発現そのものが低い場合には、抗体ビーズの結合量が少ない為に細胞を回収出来ないという問題がある。CellSeach systemはこの課題に対し、multivalent aggregatorと呼ばれる抗体ビーズを用いて対応している(非特許文献８：Journal of Magnetism & Magnetic Material, 2001, 225, p. 301-307)。すなわち、磁気ビーズ上に抗EpCAM抗体とStreptavidinの2種類を固相化した分子を利用している。抗EpCAM抗体はがん細胞との反応に利用され、Strepatvidinはbiotin化BSAを添加することによってビーズ間の架橋に利用される。つまり、EpCAM抗体ビーズを添加した後、biotin化BSAよって細胞が集まりやすいよう磁気ビーズを凝集体にし、磁石で回収するという方法を取っている。このように、特殊な抗体ビーズを利用することで初めて、細胞懸濁液中に存在する細胞を回収出来るようになっている。
【００１２】
抗体を固相化する担体及び固相化反応は様々な材料や方法が存在する。固相化担体の中で、磁気ビーズに絞った場合でも、様々な材料が利用できる。例えば、N-hydroxy-succinimide (NHS)を表面に結合させた磁気ビーズが利用できる。これらの磁気ビーズは抗体のようなタンパク質のアミノ基と反応することができ、固相担体の表面に共有結合で分子を固相化することが出来る。また、ビオチンとアビジンを介した固相化方法もよく用いられている。ビオチンとアビジンの親和定数は約10-15(M)と非常に結合が強いことを利用しており、例えば、抗体をビオチン化し、あらかじめ磁気ビーズにアビジンあるいはストレプトアビジンが固相化されたビーズと混合すると、抗体に結合したビオチンと担体表面に固相化されたアビジンが反応して、強固な結合を持つ抗体固相化ビーズを作製することが出来る。この他、抗体を固相化する場合、Protein Gがあらかじめ固相化してあるビーズも利用できる。
【００１３】
磁気ビーズの粒径も様々なものが選択できる。DynaBeads M450 (Dynal社)は粒径が4.5μmであり、M280は2.8 nmの粒径である。また、粒径が1μmのT1及びC1 Beads (Dynal社)、NHS-activated magnetic beads (PIEACE社)も利用できる。また、さらに粒径の小さなナノサイズの磁気ビーズも利用できる。ナノサイズの磁気ビーズにも粒径の異なる材料が供給されており、100〜500 nmのIMAG (BD社)、50〜100 nmのMACS (Miltenyi社)等が利用できる。CellSearch systemの場合、粒子の大部分が90〜150 nmナノサイズの磁気粒子を利用していることが報告されている(特許文献１：特許第5265855号)。粒径の小さな磁気ビーズが開発されている背景としては、ヒト細胞の大きさ(10〜30μm)に対し、大きな粒子を利用した場合には細胞と抗体固相化ビーズが均一に混合されず、抗原とビーズ上の抗体が期待通りに反応しない場合が生じるという知見に基づいている。しかしながら、粒径を小さくするほど磁気ビーズ自体の極性が低下して磁石への結合が弱まるため、抗体ビーズが細胞に結合していても、混合液から物理的に回収できなくなる。そのため、抗体固相化ビーズが効率よく細胞に結合し、効率よく回収できるような材料の調製方法と組み合わせが重要になる。
【００１４】
特許文献１及び特許文献２(特開2013-47688号)には、コロイド状ナノ粒子を用いた、癌の診断試験方法およびそのためのキットが公開されている。粒子の大部分が90〜150 nmの範囲の粒子サイズを持つビーズにストレプトアビジンを介してビオチン化抗体を結合させ、抗体固相化担体を作製している。この抗体ビーズはCellSearch systemに搭載されている抗体ビーズであるが、上述したようにビーズの粒径が小さいほど磁石への結合が弱まることから、EpCAMの発現が低い細胞ではビオチン化BSAを添加して複数のビーズを架橋することで、磁石に結合できるようにしている。このためより簡便な抗体ビーズの開発が求められている。
【００１５】
以上のように、CTCを検出することは、がんの進行度や悪性度を評価する上で非常に重要であるが、現在よりも高感度で、かつ特異的な装置や方法の開発が求められている。そのためには、進行性のがん細胞に特異的に発現する物質（バイオマーカー）の同定とモノクローナル抗体の取得、及び抗体ビーズの作製法が不可欠である。
【００１６】
がん細胞に特異的に発現する物質（バイオマーカー）としては、例えば、ヒト乳がん細胞細胞であるMCF7細胞の浸潤能を増加させる因子であるMCT5 (monocarboxylate transporter 5)や、ヒト乳がんと大腸がんで発現が亢進する因子であるLGR6 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 6)が知られている。MCT5は、487アミノ酸からなる膜タンパク質であり、NCBI (米国生物工学情報センター) Reference Sequences ［RefSeq］ ID：NM 004696.2、NP 004687.1として登録されている（配列番号1：塩基配列、配列番号2：アミノ酸配列）。LGR6は、967アミノ酸からなる膜タンパク質であり、７回膜貫通型の領域とＮ末端の長い細胞外領域からなる構造を有しており、NCBI (米国生物工学情報センター) Reference Sequences ［RefSeq］ ID：NM 001017403.1、NP 001017403.1として登録されている（配列番号7：塩基配列、配列番号8：アミノ酸配列）。また、抗MCT5モノクローナル抗体としては、例えば、「IMI4C4a抗体」が知られており、抗LGR6モノクローナル抗体としては、例えば、「Mu2C15抗体」が知られている。なお、「IMI4C4a抗体」及びこれを産生するハイブリドーマ細胞は、後述の参考例２に記載の方法で得られるものであり、「Mu2C15抗体」及びこれを産生するハイブリドーマ細胞は、特許文献３（WO2014/192974）に記載の方法で得られるものである（以下同様）。
【００１７】
なお、以下に、ヒトMCT5の塩基配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）、並びに、ヒトLGR6の塩基配列（配列番号７）及びアミノ酸配列（配列番号８）と共に、マウスMCT5の塩基配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）、ラットMCT5の塩基配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）、マウスLGR6の塩基配列（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）、並びに、ラットLGR6の塩基配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）について、列挙する。
【００１８】
ヒトMCT5塩基配列(配列番号1)
ATGCTGAAGAGGGAGGGGAAGGTCCAACCTTACACTAAAACCCTGGATGGAGGATGGGGATGGATGATTGTGATTCATTTTTTCCTGGTGAATGTGTTTGTGATGGGGATGACCAAGACTTTTGCAATTTTCTTTGTGGTCTTTCAAGAAGAGTTTGAAGGCACCTCAGAGCAAATTGGTTGGATTGGATCCATCATGTCATCTCTTCGTTTTTGTGCAGGTCCCCTGGTTGCTATTATTTGTGACATACTTGGAGAGAAAACTACCTCCATTCTTGGGGCTTTCGTTGTTACTGGTGGATATCTGATCAGCAGCTGGGCCACAAGTATTCCTTTTCTTTGTGTGACTATGGGACTTCTACCCGGTTTGGGTTCTGCTTTCTTATACCAAGTGGCTGCTGTGGTAACTACCAAATACTTCAAAAAACGATTGGCTCTTTCTACAGCTATTGCCCGTTCTGGGATGGGACTGACTTTTCTTTTGGCACCCTTTACAAAATTCCTGATAGATCTGTATGACTGGACAGGAGCCCTTATATTATTTGGAGCTATCGCATTGAATTTGGTGCCTTCTAGTATGCTCTTAAGACCCATCCATATCAAAAGTGAGAACAATTCTGGTATTAAAGATAAAGGCAGCAGTTTGTCTGCACATGGTCCAGAGGCACATGCAACAGAAACACACTGCCATGAGACAGAAGAGTCTACCATCAAGGACAGTACTACGCAGAAGGCTGGACTACCTAGCAAAAATTTAACAGTCTCACAAAATCAAAGTGAAGAGTTCTACAATGGGCCTAACAGGAACAGACTGTTATTAAAGAGTGATGAAGAAAGTGATAAGGTTATTTCGTGGAGCTGCAAACAACTGTTTGACATTTCTCTCTTTAGAAATCCTTTCTTCTACATATTTACTTGGTCTTTTCTCCTCAGTCAGTTAGCATACTTCATCCCTACCTTTCACCTGGTAGCCAGAGCCAAAACACTGGGGATTGACATCATGGATGCCTCTTACCTTGTTTCTGTAGCAGGTATCCTTGAGACGGTCAGTCAGATTATTTCTGGATGGGTTGCTGATCAAAACTGGATTAAGAAGTATCATTACCACAAGTCTTACCTCATCCTCTGCGGCATCACTAACCTGCTTGCTCCTTTAGCCACCACATTTCCACTACTTATGACCTACACCATCTGCTTTGCCATCTTTGCTGGTGGTTACCTGGCATTGATACTGCCTGTACTGGTTGATCTGTGTAGGAATTCTACAGTAAACAGGTTTTTGGGACTTGCCAGTTTCTTTGCTGGGATGGCTGTCCTTTCTGGACCACCTATAGCAGGCTGGTTATATGATTATACCCAGACATACAATGGCTCTTTCTACTTCTCTGGCATATGCTATCTCCTCTCTTCAGTTTCCTTTTTTTTTGTACCATTGGCCGAAAGATGGAAAAACAGTCTGACCTGA
【００１９】
ヒトMCT5アミノ酸配列（配列番号2）
MLKREGKVQPYTKTLDGGWGWMIVIHFFLVNVFVMGMTKTFAIFFVVFQEEFEGTSEQIGWIGSIMSSLRFCAGPLVAIICDILGEKTTSILGAFVVTGGYLISSWATSIPFLCVTMGLLPGLGSAFLYQVAAVVTTKYFKKRLALSTAIARSGMGLTFLLAPFTKFLIDLYDWTGALILFGAIALNLVPSSMLLRPIHIKSENNSGIKDKGSSLSAHGPEAHATETHCHETEESTIKDSTTQKAGLPSKNLTVSQNQSEEFYNGPNRNRLLLKSDEESDKVISWSCKQLFDISLFRNPFFYIFTWSFLLSQLAYFIPTFHLVARAKTLGIDIMDASYLVSVAGILETVSQIISGWVADQNWIKKYHYHKSYLILCGITNLLAPLATTFPLLMTYTICFAIFAGGYLALILPVLVDLCRNSTVNRFLGLASFFAGMAVLSGPPIAGWLYDYTQTYNGSFYFSGICYLLSSVSFFFVPLAERWKNSLT*
【００２０】
マウスMCT5塩基配列（配列番号3）
ATGGTGAAGAAGGAAAAAACGCCCTCCCCTTACACCAAACCCCTTGATGGAGGATGGGGGTGGATGGTCGTGCTTCATTTTTTCCTGGTAAATGTGTTTGTGATGGGAATGACCAAGACATTTGCAATTTTCTTTGTGGTTTTTCAAGAAGAGTTTGAAGGCACTTCAGAGCAAATTGGTTGGATTGGATCCATTATGTCATCACTCCGTTTCTCTGCAGGTCCCCTGGCTGCTATCATCTGTGACGTACTTGGAGAGAAAGCTACCTCCATTCTTGGGACGTTCCTTGTCTCTGGTGGCTATGTCATCAGCAGCTGGGCCACAGGCATTCCCTTTCTTTGTGTGACCATGGGGCTGCTACCTGGTTTGGGATCTGCTTTCTTGTACCAAGTAGCTGCTGTGGTAATTACCAAATATTTCAAAAAACGATTGGGCCTTTCTACAGCAATTGCCCGTTCTGGAATGGGGCTGACATTTTTGTTGGCACCCTTTACAAAATTCCTCATAGATCTTTATGACTGGACAGGCGCTCTTATTTTATTTGGAGCAATTATATTGAACTTGGTGCCTTCCAGCATGCTCTTAAGACCCATCCACAGCCAATCAAACAACAATTCTGACATTGAAAACAAAGGTAGCATTTTGTCTGCAACTGAACCAGAGGCATCATACAAGACAGAGACATCGAAGTGCAAGGAGACACAGGAGCCTTTCATCAAAGACAGTACTATGAAGAAATCTGAACAACCTACCACAACCTTAACTGTCTTAGGAAATCAAAGCGAAGAGTTCAGCAATAGGCCTCACAGGAACAGGCCGTTACTTATGAGCAATGGCAAAAGTCACAAGAAAAAGTTTGTTTCATGGAACTGCAAACAAAAACTTTTAGATATCTCGCTCTTTAGAAACCCTTTCTTCTACATTTTTACCTGGTCTTTTCTCCTGAGCCAATTAGCATATTTCATTCCCACTTTCCACCTAGTAGCCAGAGCAAAAACACTTGGGATTGACGTAATGGATGCCTCCTACCTTGTGTCTGTAGCTGGTATCACTGAGACAGTCAGTCAGCTCATTTCTGGATGGATTGCTGATCAAAATTGGATCAAGAAGTATCAATACCACAAGTCTTACCTCATTCTGTGTGGTGTGACTAACCTGCTTGCTCCTTTAGCCACCACATTCCCACTCCTTATGGCCTATACCATCCTTTTTGCCATTTTTGCTGGTGGCTACCTGGCACTAATACTGCCAGTATTGGTTGACCTATCTAAGAATTCTAGAGTACACAAGTTTTTGGGATATGCCAGTTTCTTTGCCGGGATAGCTGTACTTTCTGGACCACCAATAGCAGGCTGGATATATGATTACACACAGACTTACACAGGCTCTTTCTATTTCTCTGGCACCTGCTATATCCTCTCTTCAGTTTCCCTTTTTTTTGTACCACTGGCTGAAAGATGGAAACGCAAACAGTCTGACCTTCTGAGGACTACAATCAAGTAA
【００２１】
マウスMCT5アミノ酸配列（配列番号4）
MVKKEKTPSPYTKPLDGGWGWMVVLHFFLVNVFVMGMTKTFAIFFVVFQEEFEGTSEQIGWIGSIMSSLRFSAGPLAAIICDVLGEKATSILGTFLVSGGYVISSWATGIPFLCVTMGLLPGLGSAFLYQVAAVVITKYFKKRLGLSTAIARSGMGLTFLLAPFTKFLIDLYDWTGALILFGAIILNLVPSSMLLRPIHSQSNNNSDIENKGSILSATEPEASYKTETSKCKETQEPFIKDSTMKKSEQPTTTLTVLGNQSEEFSNRPHRNRPLLMSNGKSHKKKFVSWNCKQKLLDISLFRNPFFYIFTWSFLLSQLAYFIPTFHLVARAKTLGIDVMDASYLVSVAGITETVSQLISGWIADQNWIKKYQYHKSYLILCGVTNLLAPLATTFPLLMAYTILFAIFAGGYLALILPVLVDLSKNSRVHKFLGYASFFAGIAVLSGPPIAGWIYDYTQTYTGSFYFSGTCYILSSVSLFFVPLAERWKRKQSDLLRTTIK
【００２２】
ラットMCT5塩基配列（配列番号5）
ATGAAGAAGAGGGAAGAAAAGCCCTCCCCTTACACCAAACCCCTGGATGGAGGATGGGGATGGATGGTTGTGCTTCATTTTTTCCTGGTGAATGTGTTTGTGATGGGAATGACCAAGACATTTGCAATTTTCTTTGTGGTTTTTCAAGAAGAGTTTGAAGGCACTTCAGAGCAAATTGGTTGGATTGGATCTATTATGTCATCACTCCGTTTTTCTGCAGGTCCCCTGGCTGCTATTATTTGTGACATATTTGGAGAAAAAACTACCTCCATTCTTGGGACTTTCCTTGTTTCTGGTGGCTATCTCATCAGCAGCTGGGCCACAGGCATTCCCTTTCTTTGTGTGACCATGGGACTGCTACCTGGTTTGGGGTCTGCTTTCTTGTACCAAGTAGCTGCTGTGGTAATTACCAAATATTTCAAAAAACGATTGGGTCTTTCTACAGCAATTGCCCGTTCAGGGATGGGACTGACATTTTTGTTGGCACCCTTTACAAAACTCCTGATAGATCTTTATGACTGGACAGGTGCTCTTATATTATTTGGAGCTATTGCATTGAATCTGGTGCCTTCCAGCATGCTCCTAAGACCTGTCCACATCCAATCAGACAGCAATTCTGATATTAAAAACAAAGGTAGCATTTTGTCTGCAACTGGACCAGAGTTATCACACAAGACAGAAACACCAAACCGCAATAAGGCACAAGAGTCTCTCATCAAAGACAGTGCTGTGAAGAAATCTGGACAACCTACTACAACTTTAACTGTCTTAGAAAATCAAATTGAAGAGATTAGCACTAGGCCTCATAGGAACAGGCCGTTACTTATGAGCAATGACAAAACTTACAAGAAAAAGTTTGTTTCATGGAACTGCAAAGAAAAACTTCTAGATATTTCTCTCTTTAGAAATCCTTTCTTCTACATATTTACCTGGTCTTTTCTCCTGAGTCAACTAGCATATTTCATTCCTACCTTTCATCTGGTAGCCAGAGCAAAAACACTTGGAATCGACATAATGGATGCCTCCTACCTTGTGTCTGTAGCTGGTATCACTGAGACAGTCAGTCAGCTCATTTCTGGATGGATTGCAGATCAGAATTGGATCAAGAAGTATCAATACCACAAGGCTTACCTCATCCTGTGTGGTGTTACTAACCTGCTTGCTCCTTTAGCCACCACATTCCCACTCCTTATGGCCTATACCATCTTTTTTGCCATTTTTGCTGGTGGCTACCTGGCACTAATACTGCCAGTATTGGTTGACCTATCTAAGAATTCTAGAGTACACAGGTTTTTGGGATATGCCAGTTTCTTTGCTGGGATGGCTGTTCTTTCTGGACCACCAATAGCAGGCTGGATATACGATTATACACAGACATACGTGGGCTCTTTCTATTTCTCTGGCACCTGCTATATCCTCTCTTCAGTTTCCCTTTTTTTTGTACCACTGGCTGAAAGATGGAAACTCAAGCAGTCTGACCTTCTAAGGACTACAATCAAGTAA
【００２３】
ラットMCT5アミノ酸配列（配列番号6）
MKKREEKPSPYTKPLDGGWGWMVVLHFFLVNVFVMGMTKTFAIFFVVFQEEFEGTSEQIGWIGSIMSSLRFSAGPLAAIICDIFGEKTTSILGTFLVSGGYLISSWATGIPFLCVTMGLLPGLGSAFLYQVAAVVITKYFKKRLGLSTAIARSGMGLTFLLAPFTKLLIDLYDWTGALILFGAIALNLVPSSMLLRPVHIQSDSNSDIKNKGSILSATGPELSHKTETPNRNKAQESLIKDSAVKKSGQPTTTLTVLENQIEEISTRPHRNRPLLMSNDKTYKKKFVSWNCKEKLLDISLFRNPFFYIFTWSFLLSQLAYFIPTFHLVARAKTLGIDIMDASYLVSVAGITETVSQLISGWIADQNWIKKYQYHKAYLILCGVTNLLAPLATTFPLLMAYTIFFAIFAGGYLALILPVLVDLSKNSRVHRFLGYASFFAGMAVLSGPPIAGWIYDYTQTYVGSFYFSGTCYILSSVSLFFVPLAERWKLKQSDLLRTTIK
【００２４】
ヒトLGR6塩基配列(配列番号7)
ATGCCCAGCCCGCCGGGGCTCCGGGCGCTATGGCTTTGCGCCGCGCTGTGCGCTTCCCGGAGGGCCGGCGGCGCCCCCCAGCCCGGCCCGGGGCCCACCGCCTGCCCGGCCCCCTGCCACTGCCAGGAGGACGGCATCATGCTGTCTGCCGACTGCTCTGAGCTCGGGCTGTCCGCCGTTCCGGGGGACCTGGACCCCCTGACGGCTTACCTGGACCTCAGCATGAACAACCTCACAGAGCTTCAGCCTGGCCTCTTCCACCACCTGCGCTTCTTGGAGGAGCTGCGTCTCTCTGGGAACCATCTCTCACACATCCCAGGACAAGCATTCTCTGGTCTCTACAGCCTGAAAATCCTGATGCTGCAGAACAATCAGCTGGGAGGAATCCCCGCAGAGGCGCTGTGGGAGCTGCCGAGCCTGCAGTCGCTGCGCCTAGATGCCAACCTCATCTCCCTGGTCCCGGAGAGGAGCTTTGAGGGGCTGTCCTCCCTCCGCCACCTCTGGCTGGACGACAATGCACTCACGGAGATCCCTGTCAGGGCCCTCAACAACCTCCCTGCCCTGCAGGCCATGACCCTGGCCCTCAACCGCATCAGCCACATCCCCGACTACGCGTTCCAGAATCTCACCAGCCTTGTGGTGCTGCATTTGCATAACAACCGCATCCAGCATCTGGGGACCCACAGCTTCGAGGGGCTGCACAATCTGGAGACACTAGACCTGAATTATAACAAGCTGCAGGAGTTCCCTGTGGCCATCCGGACCCTGGGCAGACTGCAGGAACTGGGGTTCCATAACAACAACATCAAGGCCATCCCAGAAAAGGCCTTCATGGGGAACCCTCTGCTACAGACGATACACTTTTATGATAACCCAATCCAGTTTGTGGGAAGATCGGCATTCCAGTACCTGCCTAAACTCCACACACTATCTCTGAATGGTGCCATGGACATCCAGGAGTTTCCAGATCTCAAAGGCACCACCAGCCTGGAGATCCTGACCCTGACCCGCGCAGGCATCCGGCTGCTCCCATCGGGGATGTGCCAACAGCTGCCCAGGCTCCGAGTCCTGGAACTGTCTCACAATCAAATTGAGGAGCTGCCCAGCCTGCACAGGTGTCAGAAATTGGAGGAAATCGGCCTCCAACACAACCGCATCTGGGAAATTGGAGCTGACACCTTCAGCCAGCTGAGCTCCCTGCAAGCCCTGGATCTTAGCTGGAACGCCATCCGGTCCATCCACCCCGAGGCCTTCTCCACCCTGCACTCCCTGGTCAAGCTGGACCTGACAGACAACCAGCTGACCACACTGCCCCTGGCTGGACTTGGGGGCTTGATGCATCTGAAGCTCAAAGGGAACCTTGCTCTCTCCCAGGCCTTCTCCAAGGACAGTTTCCCAAAACTGAGGATCCTGGAGGTGCCTTATGCCTACCAGTGCTGTCCCTATGGGATGTGTGCCAGCTTCTTCAAGGCCTCTGGGCAGTGGGAGGCTGAAGACCTTCACCTTGATGATGAGGAGTCTTCAAAAAGGCCCCTGGGCCTCCTTGCCAGACAAGCAGAGAACCACTATGACCAGGACCTGGATGAGCTCCAGCTGGAGATGGAGGACTCAAAGCCACACCCCAGTGTCCAGTGTAGCCCTACTCCAGGCCCCTTCAAGCCCTGTGAGTACCTCTTTGAAAGCTGGGGCATCCGCCTGGCCGTGTGGGCCATCGTGTTGCTCTCCGTGCTCTGCAATGGACTGGTGCTGCTGACCGTGTTCGCTGGCGGGCCTGTCCCCCTGCCCCCGGTCAAGTTTGTGGTAGGTGCGATTGCAGGCGCCAACACCTTGACTGGCATTTCCTGTGGCCTTCTAGCCTCAGTCGATGCCCTGACCTTTGGTCAGTTCTCTGAGTACGGAGCCCGCTGGGAGACGGGGCTAGGCTGCCGGGCCACTGGCTTCCTGGCAGTACTTGGGTCGGAGGCATCGGTGCTGCTGCTCACTCTGGCCGCAGTGCAGTGCAGCGTCTCCGTCTCCTGTGTCCGGGCCTATGGGAAGTCCCCCTCCCTGGGCAGCGTTCGAGCAGGGGTCCTAGGCTGCCTGGCACTGGCAGGGCTGGCCGCCGCGCTGCCCCTGGCCTCAGTGGGAGAATACGGGGCCTCCCCACTCTGCCTGCCCTACGCGCCACCTGAGGGTCAGCCAGCAGCCCTGGGCTTCACCGTGGCCCTGGTGATGATGAACTCCTTCTGTTTCCTGGTCGTGGCCGGTGCCTACATCAAACTGTACTGTGACCTGCCGCGGGGCGACTTTGAGGCCGTGTGGGACTGCGCCATGGTGAGGCACGTGGCCTGGCTCATCTTCGCAGACGGGCTCCTCTACTGTCCCGTGGCCTTCCTCAGCTTTGCCTCCATGCTGGGCCTCTTCCCTGTCACGCCCGAGGCCGTCAAGTCTGTCCTGCTGGTGGTGCTGCCCCTGCCTGCCTGCCTCAACCCACTGCTGTACCTGCTCTTCAACCCCCACTTCCGGGATGACCTTCGGCGGCTTCGGCCCCGCGCAGGGGACTCAGGGCCCCTAGCCTATGCTGCGGCCGGGGAGCTGGAGAAGAGCTCCTGTGATTCTACCCAGGCCCTGGTAGCCTTCTCTGATGTGGATCTCATTCTGGAAGCTTCTGAAGCTGGGCGGCCCCCTGGGCTGGAGACCTATGGCTTCCCCTCAGTGACCCTCATCTCCTGTCAGCAGCCAGGGGCCCCCAGGCTGGAGGGCAGCCATTGTGTAGAGCCAGAGGGGAACCACTTTGGGAACCCCCAACCCTCCATGGATGGAGAACTGCTGCTGAGGGCAGAGGGATCTACGCCAGCAGGTGGAGGCTTGTCAGGGGGTGGCGGCTTTCAGCCCTCTGGCTTGGCCTTTGCTTCACACGTGTAA
【００２５】
ヒトLGR6アミノ酸配列（配列番号8）
MPSPPGLRALWLCAALCASRRAGGAPQPGPGPTACPAPCHCQEDGIMLSADCSELGLSAVPGDLDPLTAYLDLSMNNLTELQPGLFHHLRFLEELRLSGNHLSHIPGQAFSGLYSLKILMLQNNQLGGIPAEALWELPSLQSLRLDANLISLVPERSFEGLSSLRHLWLDDNALTEIPVRALNNLPALQAMTLALNRISHIPDYAFQNLTSLVVLHLHNNRIQHLGTHSFEGLHNLETLDLNYNKLQEFPVAIRTLGRLQELGFHNNNIKAIPEKAFMGNPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLPKLHTLSLNGAMDIQEFPDLKGTTSLEILTLTRAGIRLLPSGMCQQLPRLRVLELSHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLQHNRIWEIGADTFSQLSSLQALDLSWNAIRSIHPEAFSTLHSLVKLDLTDNQLTTLPLAGLGGLMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCPYGMCASFFKASGQWEAEDLHLDDEESSKRPLGLLARQAENHYDQDLDELQLEMEDSKPHPSVQCSPTPGPFKPCEYLFESWGIRLAVWAIVLLSVLCNGLVLLTVFAGGPVPLPPVKFVVGAIAGANTLTGISCGLLASVDALTFGQFSEYGARWETGLGCRATGFLAVLGSEASVLLLTLAAVQCSVSVSCVRAYGKSPSLGSVRAGVLGCLALAGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGQPAALGFTVALVMMNSFCFLVVAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFLSFASMLGLFPVTPEAVKSVLLVVLPLPACLNPLLYLLFNPHFRDDLRRLRPRAGDSGPLAYAAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGRPPGLETYGFPSVTLISCQQPGAPRLEGSHCVEPEGNHFGNPQPSMDGELLLRAEGSTPAGGGLSGGGGFQPSGLAFASHV
【００２６】
マウスLGR6塩基酸配列（配列番号9）
ATGCACAGCCCGCCTGGGCTCCTGGCGCTGTGGCTTTGCGCTGTGCTGTGCGCATCGGCGCGCGCGGGCAGCGACCCCCAGCCTGGCCCGGGGCGTCCCGCCTGCCCGGCTCCCTGCCACTGCCAGGAGGACGGCATCATGCTGTCCGCTGACTGCTCCGAGCTCGGGCTCTCAGTGGTGCCTGCGGACCTGGACCCCCTGACGGCTTACCTAGACCTCAGTATGAACAACCTCACGGAGCTTCAGCCGGGTCTCTTCCACCACCTGCGCTTCCTGGAGGAGCTGCGGCTCTCAGGGAACCACCTCTCACACATCCCGGGACAGGCATTCTCTGGCCTCCACAGCCTCAAAATTCTAATGCTGCAGAGCAACCAGCTCCGTGGGATCCCAGCAGAGGCACTATGGGAGCTGCCCAGCCTGCAGTCGCTGCGCCTAGATGCTAATCTCATCTCCCTGGTCCCTGAGAGAAGCTTTGAGGGGCTCTCCTCCCTCCGCCACCTCTGGCTGGATGACAATGCACTCACCGAGATCCCCGTCAGAGCTCTCAACAACCTTCCTGCCCTACAAGCCATGACCTTGGCTCTCAACCATATCCGCCACATCCCTGACTATGCCTTCCAGAACCTCACCAGTCTTGTGGTGCTGCATCTACATAACAACCGCATCCAGCATGTGGGGACCCACAGCTTCGAGGGGCTGCACAATCTGGAGACACTAGACCTGAACTATAATGAGCTGCAGGAGTTCCCCTTGGCTATCCGGACCCTGGGCAGGCTGCAGGAATTGGGTTTCCATAACAACAACATCAAGGCTATCCCAGAGAAAGCCTTCATGGGCAGCCCTCTCCTGCAGACAATACATTTTTATGACAACCCAATCCAGTTTGTGGGAAGGTCAGCATTCCAGTACCTGTCTAAACTGCATACGCTATCTTTGAATGGTGCCACTGATATCCAAGAGTTCCCAGACCTCAAAGGCACCACTAGCCTGGAGATCCTGACCCTGACCCGTGCGGGCATCAGACTGCTCCCACCGGGAGTGTGCCAACAGCTGCCTAGGCTCCGAATCCTGGAGCTGTCTCATAATCAGATCGAGGAGTTACCCAGCCTGCACAGGTGTCAGAAGCTGGAGGAAATTGGCCTCCGACATAACCGGATCAAGGAAATTGGTGCAGATACCTTCAGCCAGCTGGGCTCCTTGCAAGCTTTAGACCTGAGTTGGAATGCCATCCGTGCCATCCACCCTGAGGCTTTCTCAACCCTTCGATCCTTGGTTAAGCTGGACCTGACTGACAACCAGCTGACCACACTGCCCCTGGCTGGGCTGGGAGGCCTGATGCACCTGAAGCTCAAAGGGAACTTGGCCCTGTCTCAGGCCTTCTCCAAGGACAGTTTCCCAAAACTGAGGATCCTGGAGGTGCCCTACGCCTACCAGTGCTGTGCCTACGGCATCTGTGCCAGCTTCTTCAAGACCTCTGGGCAGTGGCAGGCCGAGGACTTTCATCCAGAGGAAGAGGAGGCACCAAAGAGGCCCCTGGGTCTCCTTGCTGGACAAGCTGAGAACCACTATGACCTAGACCTGGATGAGCTCCAGATGGGGACAGAGGACTCAAAGCCACACCCCAGTGTCCAGTGCAGCCCTGTTCCAGGCCCCTTCAAGCCCTGCGAGCACCTCTTTGAGAGCTGGGGCATCCGCCTTGCTGTGTGGGCCATCGTGTTACTCTCCGTACTCTGTAACGGGCTGGTGCTGCTGACAGTCTTTGCCAGCGGACCCAGCCCGCTGTCCCCCGTCAAGCTTGTGGTGGGTGCGATGGCAGGCGCCAACGCCCTGTCGGGCATTTCCTGTGGTCTCCTGGCCTCGGTGGACGCCTTGACCTATGGTCAGTTCGCTGAGTATGGAGCCCGCTGGGAGAGCGGTCTGGGCTGCCAGGCTACGGGCTTCCTGGCTGTCCTGGGTTCAGAGGCGTCGGTGCTGCTGCTCACACTGGCGGCCGTGCAGTGCAGCATCTCCGTGACCTGCGTCCGAGCCTACGGGAAGGCGCCGTCGCCTGGCAGCGTCCGCGCAGGCGCACTGGGATGCCTGGCGCTGGCCGGGCTGGCCGCAGCACTGCCGCTGGCCTCGGTGGGAGAGTATGGCGCCTCCCCACTCTGCCTGCCCTACGCCCCACCCGAGGGCCGGCCGGCTGCCCTGGGCTTCGCTGTAGCCCTGGTGATGATGAACTCGCTCTGCTTCCTGGTGGTGGCCGGCGCCTACATCAAGCTCTACTGTGACCTGCCACGGGGTGACTTTGAGGCCGTGTGGGACTGCGCCATGGTGCGCCACGTGGCCTGGCTCATCTTTGCAGATGGCCTCCTCTACTGCCCCGTGGCCTTCCTCAGCTTTGCCTCTATGCTGGGCCTCTTCCCTGTCACCCCCGAGGCTGTCAAGTCAGTCCTTCTGGTGGTGCTGCCTCTGCCTGCCTGCCTCAACCCACTGCTCTACCTGCTCTTCAACCCTCACTTCCGGGATGACCTTCGGCGGCTCTGGCCAAGCCCTCGGTCCCCAGGGCCCCTAGCCTACGCTGCAGCCGGTGAGCTGGAGAAGAGCTCCTGCGACTCCACCCAAGCGCTGGTGGCTTTCTCAGATGTGGATCTTATTCTGGAAGCTTCTGAGGCTGGGCAGCCTCCTGGGCTAGAGACCTATGGCTTCCCTTCAGTGACCCTCATCTCCCGACATCAGCCGGGGGCTACCAGGCTGGAGGGAAACCATTTTGTAGAGTCTGATGGAACCAAGTTTGGGAACCCACAACCTCCCATGAAGGGAGAACTGCTGCTGAAGGCAGAGGGAGCCACTTTGGCAGGCTGTGGCTCTTCCGTGGGTGGAGCCCTCTGGCCCTCTGGCTCTCTCTTTGCCTCTCACTTGTAA
【００２７】
マウスLGR6アミノ酸配列（配列番号10）
MHSPPGLLALWLCAVLCASARAGSDPQPGPGRPACPAPCHCQEDGIMLSADCSELGLSVVPADLDPLTAYLDLSMNNLTELQPGLFHHLRFLEELRLSGNHLSHIPGQAFSGLHSLKILMLQSNQLRGIPAEALWELPSLQSLRLDANLISLVPERSFEGLSSLRHLWLDDNALTEIPVRALNNLPALQAMTLALNHIRHIPDYAFQNLTSLVVLHLHNNRIQHVGTHSFEGLHNLETLDLNYNELQEFPLAIRTLGRLQELGFHNNNIKAIPEKAFMGSPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLSKLHTLSLNGATDIQEFPDLKGTTSLEILTLTRAGIRLLPPGVCQQLPRLRILELSHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLRHNRIKEIGADTFSQLGSLQALDLSWNAIRAIHPEAFSTLRSLVKLDLTDNQLTTLPLAGLGGLMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCAYGICASFFKTSGQWQAEDFHPEEEEAPKRPLGLLAGQAENHYDLDLDELQMGTEDSKPHPSVQCSPVPGPFKPCEHLFESWGIRLAVWAIVLLSVLCNGLVLLTVFASGPSPLSPVKLVVGAMAGANALSGISCGLLASVDALTYGQFAEYGARWESGLGCQATGFLAVLGSEASVLLLTLAAVQCSISVTCVRAYGKAPSPGSVRAGALGCLALAGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGRPAALGFAVALVMMNSLCFLVVAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFLSFASMLGLFPVTPEAVKSVLLVVLPLPACLNPLLYLLFNPHFRDDLRRLWPSPRSPGPLAYAAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGQPPGLETYGFPSVTLISRHQPGATRLEGNHFVESDGTKFGNPQPPMKGELLLKAEGATLAGCGSSVGGALWPSGSLFASHL
【００２８】
ラットLGR6塩基酸配列（配列番号11）
ATGCACAGCTCGCCGTTGCTCCTGGCGCTGTGTCTTTGCGTTGTGCTGTGCGCATTGGCGCGCGCGGGCAGCGACCCCCAGCCTGGCCCGGGGCGTCCCGCCTGCCCCGCTCCCTGCCACTGCCAGGAGGATGGCATCATGCTGTCAGCTGACTGCTCCGAGCTCGGTCTCTCAGAGGTGCCAGCGGACCTGGACCCCCTGACGGCTTACCTAGACCTCAGTATGAACAACCTCACGGAGCTTCAGCCGGGTCTCTTCCACCACCTGCGCTTCCTGGAGGAGCTGCGGCTCTCGGGGAACCACCTCTCACACATCCCAAGACAGGCATTCTCTGGCCTCCACAGCCTCAAAATTCTGATGCTGCAGAGCAACCAGCTCCGAGGGATCCCAGCAGAGGCGCTGTGGGAGCTGCCCAGCCTGCAGTCGCTGCGCCTAGATGCTAACCTCATCTCCCTGGTCCCTGAGAGAAGCTTTGAGGGGCTGTCCTCCCTCCGCCACCTCTGGTTGGATGACAATGCACTCACCGAGATCCCTGTCAGAGCTCTCAACAACCTTCCTGCCCTACAGGCCATGACCTTGGCTCTCAACCGCATCCGCCACATCCCTGACTATGCCTTCCAGAACCTCACCAGTCTTGTGGTGCTGCATCTACATAACAACCGCATCCAGCATGTGGGGACCCACAGCTTCGAGGGGCTGCACAATCTGGAGACACTAGACTTGAACTATAATGAGCTGCAGGAGTTCCCCGTGGCTATCCGGACCCTGGGCAGGCTGCAGGAATTGGGTTTCCACAACAACAACATCAAGGCTATCCCAGAGAAGGCCTTCATGGGCAACCCTCTCCTGCAGACAATACACTTTTATGACAACCCGATCCAGTTTGTGGGAAGGTCAGCATTCCAGTACCTGTCTAAACTGCATACGCTATCCTTGAATGGTGCCACTGACATCCAGGAGTTCCCAGACCTCAAAGGCACCACTAGCCTGGAGATTCTGACCCTGACCCGTGCAGGCATCAGACTGCTCCCAGCGGGAATGTGTCAACAGCTGCCTAGGCTCCGAATCCTGGAGCTGTCTCATAATCAGATTGAGGAGCTACCCAGCCTGCACAGGTGTCAGAAGTTGGAGGAAATTGGCCTCCAGCATAACCGGATCTGGGAAATTGGTGCAGATACCTTCAGCCAGCTGAGTTCCTTGCAAGCTCTAGATCTGAGTTGGAATGCCATCCGTGCCATTCACCCCGAGGCTTTCTCAACCCTTCGATCCTTGGTTAAGCTGGACCTGACTGACAACCAGCTGACCACACTGCCCCTGGCTGGGCTGGGAGGCCTGATGCACCTGAAGCTCAAGGGGAACTTGGCCCTGTCTCAGGCCTTCTCCAAGGACAGTTTCCCCAAACTGAGGATCCTGGAGGTGCCTTACGCCTACCAGTGCTGTGCCTATGGCCTCTGTGCCAACTTCTTCAAGACCTCTGGGCAGTGGCAGGCCGAGGACTTTCATGCAGAGGAAGAAGAGGCACCAAAGAGGCCCCTGGGTCTCCTTGCTGGACAAGCTGAGAACCACTATGACCTAGACCTGGATGAGCTCCAGATGGAGACAGAGGACTCAAAGCCACACCCCAGTGTCCAGTGCAGCCCTGTTCCAGGCCCCTTCAAGCCCTGCGAGCACCTCTTTGAGAGCTGGGGCATCCGCCTTGCTGTGTGGGCCATCGTGCTGCTCTCGGTACTCTGTAACGGGCTGGTGCTGCTTACAGTCTTTGCTGGCGGGCCCAGCCCGTTGTCTCCGGTCAAGCTTGTGGTGGGTGCGATCGCTGGCGCCAACGCCCTAACGGGCATTTCCTGCGGCCTCCTGGCCTCAGTGGACGCCTTGACCTTCGGCCAGTTCGCGGAGTATGGAGCCCGCTGGGAGACCGGGCTAGGCTGCCAGGCTACGGGCTTCCTAGCCGTCCTGGGGTCGGAGGCGTCGGTGCTGCTGCTCACGCTGGCGGCCGTGCAGTGCAGCGTCTCTGTGACCTGCGTCCGGGCCTACGGGAAGGCGCCGTCGCCCGGTAGCGTCCGCGCAGGCGCACTGGGATGCTTGGCGCTGGCTGGGCTGGCCGCCGCGCTGCCGCTGGCCTCGGTGGGGGAGTATGGTGCCTCCCCGCTCTGCCTGCCCTACGCCCCTCCCGAGGGCCGCCCGGCCGCCCTAGGCTTCGCCGTAGCCCTGGTGATGATGAACTCGCTCTGCTTCCTCGTGGTGGCCGGTGCCTACATCAAGCTCTACTGCGACCTGCCTCGGGGTGACTTTGAGGCCGTGTGGGACTGCGCCATGGTGCGGCATGTGGCCTGGCTCATCTTTGCAGATGGCCTTCTCTACTGCCCCGTGGCCTTCCTCAGCTTTGCCTCCATGCTGGGCCTCTTCCCGGTCACCCCTGAGGCTGTCAAGTCGGTTCTTCTGGTGGTGTTGCCTCTGCCCGCCTGCCTGAACCCACTGCTCTACCTGCTCTTCAACCCTCACTTCCGGGAAGACCTTCGGAGGCTCTGGCCGAGCCCTCGGTCCCCAGGGCCTCTAGCTTATACTGCAGCCGGTGAGCTGGAGAAGAGCTCCTGCGACTCCACCCAAGCCCTGGTGGCTTTCTCTGATGTGGATCTTATTCTGGAAGCTTCTGAGGCTGGGCAGCCTCCTGGGCTAGAGACCTATGGCTTCCCTTCAGTGACCCTCATCTCCCGTCATCAGCCAGGGGCTACCAGGCTGGAGGGAAACCATTTTGTGGAGCCTGATGGAACCAAGTTAGGGAACCCACAACCTCCCATGAATGAAGAACTGCTGCTGAGGGCAGAGGGAGCCACACTGGCAGACTGTTCTGCAGGTGGAGCCCTCTGGCCCTCTGGCCCTCTCTTTGCCTCTCACTTGTAA
【００２９】
ラットLGR6アミノ酸配列（配列番号12）
MHSSPLLLALCLCVVLCALARAGSDPQPGPGRPACPAPCHCQEDGIMLSADCSELGLSEVPADLDPLTAYLDLSMNNLTELQPGLFHHLRFLEELRLSGNHLSHIPRQAFSGLHSLKILMLQSNQLRGIPAEALWELPSLQSLRLDANLISLVPERSFEGLSSLRHLWLDDNALTEIPVRALNNLPALQAMTLALNRIRHIPDYAFQNLTSLVVLHLHNNRIQHVGTHSFEGLHNLETLDLNYNELQEFPVAIRTLGRLQELGFHNNNIKAIPEKAFMGNPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLSKLHTLSLNGATDIQEFPDLKGTTSLEILTLTRAGIRLLPAGMCQQLPRLRILELSHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLQHNRIWEIGADTFSQLSSLQALDLSWNAIRAIHPEAFSTLRSLVKLDLTDNQLTTLPLAGLGGLMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCAYGLCANFFKTSGQWQAEDFHAEEEEAPKRPLGLLAGQAENHYDLDLDELQMETEDSKPHPSVQCSPVPGPFKPCEHLFESWGIRLAVWAIVLLSVLCNGLVLLTVFAGGPSPLSPVKLVVGAIAGANALTGISCGLLASVDALTFGQFAEYGARWETGLGCQATGFLAVLGSEASVLLLTLAAVQCSVSVTCVRAYGKAPSPGSVRAGALGCLALAGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGRPAALGFAVALVMMNSLCFLVVAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFLSFASMLGLFPVTPEAVKSVLLVVLPLPACLNPLLYLLFNPHFREDLRRLWPSPRSPGPLAYTAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGQPPGLETYGFPSVTLISRHQPGATRLEGNHFVEPDGTKLGNPQPPMNEELLLRAEGATLADCSAGGALWPSGPLFASHL
【００３０】
【特許文献１】特許第5265855号
【特許文献２】特開2013-47688号公報
【特許文献３】WO 2014/192974
【００３１】
【非特許文献１】Clinical Cancer Research, 10, 6897-6904, 2004
【非特許文献２】Journal of Oncology 2010, Article ID 617421, 2010
【非特許文献３】Clinilical Cancer Research, 12, 4218-4224, 2006
【非特許文献４】Journal of Clinical Oncology, 26, 3213-3221, 2008
【非特許文献５】Clininical Cancer Research, 14, 6302-6309, 2008
【非特許文献６】Molecular Diagnosis and Therapy, 18, 389-402, 2014
【非特許文献７】BMC Biotechnology 10, 35, 2010
【非特許文献８】Journal of Magnetism & Magnetic Material, 225, 301-307, 2001
【非特許文献９】American Journal of physiology, March 2011, Vol. 178, 989-996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
このような状況において、例えば、血液を含む体液サンプル等の生物学的試料中に存在するがん細胞等の標的生体物質を効率よく回収できる抗体固相化ビーズ等の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、タンパク質−微粒子複合体、及びそれを用いた標的生体物質の検出方法等を提供するものである。
【００３４】
（１）標的生体物質への結合能を有するタンパク質に標識物質Ａが結合された標識化タンパク質と、表面に標識物質Ｂが固相化された微粒子とからなり、かつ、該物質Ａと該物質Ｂとが互いに結合された状態のものである、タンパク質−微粒子複合体であって、
前記標識化タンパク質は、該タンパク質１分子に対する前記物質Ａの平均結合分子数が１分子以上かつ６分子未満のものである、
前記複合体。
【００３５】
（２）前記平均結合分子数が１〜２分子である、上記（１）記載の複合体。
（３）標的生体物質への結合能を有するタンパク質が、抗体タンパク質又はその断片である、上記（１）又は（２）記載の複合体。
（４）前記抗体タンパク質が、がん細胞に特異的に発現する物質に対する抗体である、上記（３）記載の複合体。
（５）がん細胞に特異的に発現する物質が、MCT5又はLGR6である、上記（４）記載の複合体。
（６）抗体タンパク質が、モノクローナル抗体である、上記（３）〜（５）のいずれかに記載の複合体。
（７）前記微粒子が、磁気ビーズである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の複合体。
（８）前記微粒子は、平均粒子径が1μm未満の微粒子である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の複合体。
（９）前記微粒子は、平均粒子径が50nm〜500nmの微粒子である、上記（８）記載の複合体。
（１０）前記物質Ａがビオチンを含む物質であり、前記物質Ｂがアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを含む物質である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の複合体。
【００３６】
（１１）標的生体物質を含む生物学的試料に、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を接触させる、標的生体物質の検出方法。
（１２）生物学的試料が血液である、上記（１１）記載の方法。
（１３）標的生体物質が、がん細胞に特異的に発現する物質である、上記（１１）又は（１２）記載の方法。
（１４）上記（４）〜（１０）のいずれかに記載の複合体を含む、がんの検出用又は診断用試薬。
（１５）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の複合体に用いられる、標的生体物質への結合能を有するタンパク質に標識物質Ａが結合された標識化タンパク質であって、該タンパク質１分子に対する前記物質Ａの平均結合分子数が１分子以上かつ６分子未満でのものである、前記標識化タンパク質。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、血液を含む体液サンプル等の生物学的試料中に存在する、標的生体物質、例えばがん細胞に特異的に発現する物質（バイオマーカー）、ひいてはがん細胞を、効率よく高感度で検出できる、タンパク質−微粒子複合体（例えば、抗体固相化ビーズ）を提供することができる。併せて、当該複合体を用いた、生物学的試料中の標的生体物質の検出方法や、がんの検出用又は診断用試薬等を提供することもできる。
本発明のタンパク質−微粒子複合体（例えば、抗体固相化ビーズ）を用いれば、MCT5あるいはLGR6を有意に高く発現するがん細胞を、高い感度で回収することが出来る。がんの診断において、回収された細胞の個数を指標に、がんの悪性度を評価することができる。これは、術前においては、腫瘍部を処理する作業の一つの指標に利用することが出来る。すなわち悪性度が高いと判断されれば広範囲に切除を行い、術後の放射線治療や化学療法を十分行う選択肢を取ることになる。悪性度が低いと判断されれば、温存療法の選択が可能であり、患者のQOLを大幅に向上させることが出来る。
また、抗体ビーズによって回収された細胞が発現するバイオマーカーを調べることで、患者それぞれで、奏効性の高い治療薬を選択することが可能になり、オーダーメード医療の実現が容易になる。すなわち、がん細胞の悪性度(転移や再発の予見等)に有用な情報を得ることができるため、がんによる死亡率を低下させることが出来る。また、本発明によれば、従来の抗腫瘍抗体では検出できなかった浸潤能の高いがん細胞を高感度で検出することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ビオチン化したIMI4C4a抗体が抗原であるICD4組み換えタンパク質に結合するかを、ELISAを用いて解析した結果を示す図である。Negative controlは一次抗体を含まない場合、IMI4C4aは未標識の抗体、IMI4C4a-biotin-EZあるいはIMI4C4a-biotin-DJは、EZ-Link NHS-LC-LC-BiotinあるいはBiotin Labeling Kit-NH2をキット付属のマニュアルに従ってIMI4C4a抗体をビオチン標識した抗体を示す。
【図２】10μLのDynabeads MyOne Streptavidin T1を100μLに懸濁し、IMI4C4a-biotin-EZを添加した際に、ビーズに結合した抗体量を測定した結果を示す図である。
【図３】抗体ビーズを評価する実験の模式図を示す図である。標的分子を発現するTarget cellsを100あるいは200μLに懸濁し、作製した抗体ビーズを添加して反応させた後、血球計算版を用いて細胞数をカウントする。
【図４】粒径1μmのStreptavidin磁気ビーズ(T1ビーズ、Dynal社製)に従来の方法でビオチン化したIMI4C4a抗体を結合させ、図１で示される方法によって除去効率を算出した結果を示す図である。+Abはビオチン化抗体を添加した場合、-Abは抗体を添加しなかった場合の結果を示す。
【図５】粒径100〜500 nmの磁気ナノビーズに、IMI4C4a-biotin-EZを添加して作製した抗体ナノビーズを用いて、細胞除去試験を行った結果を示す図である。0、25、及び50μLの抗体ナノビーズを添加し、磁気スタンドによってビーズを回収後、残された細胞を、血球計算版を用いて測定した結果を示す図である。グラフ中の数値は、抗体ナノビーズを添加しない場合の細胞密度を100%とし、抗体ナノビーズによって取り除けなかった細胞の割合を示している。
【図６】HABA法を用いて標識試薬であるNHS-LC-LC-biotinの濃度測定を行った図である。NHS-LC-LC-biotinを段階的に希釈して測定を行った後、直線性のある部分から標識物質の濃度を算出した。標識物質を含まないHABA試薬の500 nmの吸収から、希釈した標識試薬を含んだサンプルの500 nmの吸収を差し引いた後、モル吸光係数(ε= 34,000M-1 cm-1）から希釈した標識物質の実際の濃度を算出し、その平均を元の標識物質の濃度とした。
【図７Ａ】NHS-LC-LC-Biotin濃度を変化させて標識したIMI4C4a抗体を、ナノビーズに結合させた場合に、ビーズ表面に結合した抗体量を測定した結果を示す図である。Condition #1はEZ-Link NHS-LC-LC-Biotin標識試薬付属のマニュアルに記載の方法で標識した抗体、Condition #2〜#5は#1よりも標識物質の濃度を低下させて標識した抗体を用いて作製した抗体ナノビーズである。Condition #6はビオチン化試薬を含まないよう抗体溶液を調製し、同様の実験を行った結果を示した。
【図７Ｂ】Condition #1〜#6でビオチン化したIMI4C4a抗体をナノビーズに結合させて作製した抗体ナノビーズを用い、MCF7-MCT5細胞の除去試験を行った結果を示す図である。
【図８Ａ】Condition #2,、#3、#6及び#7〜#10で標識したIMI4C4a抗体を用いて作製した抗体ナノビーズの、細胞除去試験を行った結果を示す図である。
【図８Ｂ】Condition #9、#0及び#11の条件で標識したIMI4C4a抗体を用いて作製した抗体ナノビーズの、細胞除去試験を行った結果を示す図である。
【図９】Condition #3を用いてIMI4C4a抗体を用いて作製した抗体ナノビーズを用い、サンプル中に含まれる細胞数を6.5, 3.2, 1.6, 1.0×105 cellsと変化させた場合の細胞除去試験を行った結果を示す図である。
【図１０】Condition #3を用いてIMI4C4a抗体を粒径の異なる磁気ビーズに結合させ、細胞除去試験を行った結果を示す図である。
【図１１】2種類以上の細胞から特定の細胞を濃縮、あるいは分離する実験の模式図を示した図である。本発明では、ヒトBリンパ芽球細胞株Raji細胞と、IMI4C4a抗体の抗原であるMCT5を発現するMCF7-MCT5細胞を混合し、MCF7-MCT5細胞の濃縮あるいは除去効率を解析した。
【図１２】IMI4C4a抗体ナノビーズを用いて、Raji細胞とMCF7-MCT5細胞の混合溶液からMCF7-MCT5細胞の濃縮あるいは除去を行い、それぞれのサンプルをFlow-cytometerで解析した結果を示す図である。図中のInputは細胞混合液を示し、Supernatantは抗体ナノビーズに結合しなかった細胞集団を、Beadsは細胞に結合した細胞集団を示す。
【図１３】Raji細胞に対するMCF7-MCT5細胞の混合比率を変化させた場合に、抗体ナノビーズによってMCF7-MCT5細胞が回収できるかを解析した結果を示す図である。
【図１４】IMI4C4a (抗MCT5抗体)、Mu2C15 (抗LGR6抗体)、Condition #3を用いてビオチン化標識し、MCF7-MCT5細胞を用いて細胞除去試験を行った結果を示す図である。図中のIntact cellsは細胞を固定化せずに解析した場合を示し、Fixed cellsは細胞を10%中性緩衝ホルマリン溶液で固定化して解析した場合を示す。
【図１５】Mu2C15 (抗LGR6抗体)を、Condition #3 (1 fold reagent/Ab)を用いてビオチン化標識した抗体、及びCondition #1と#2の間 (8 fold reagent/Ab)を用いて標識した抗体それぞれを、ナノビーズと結合させた後に、MCF7-MCT5細胞と30分間反応させた後の顕微鏡像を示す図である。Beads単独の場合を左パネルに、Condition #3を中央パネルに、Condidion #1と#2の間を右パネルに示す。  また、図の下には細胞と抗体ナノビーズにより起きるイメージを模式図にした図を示す。
【図１６】細胞表面に抗体ナノビーズが連続的に結合して、凝集塊を作るイメージの模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００４０】
1. 概要
本発明は、前述のとおり、標的生体物質への結合能を有するタンパク質が微粒子表面に結合されてなるタンパク質−微粒子複合体、及びそれを用いた標的生体物質の検出方法等に関する。また、例えば、標識されたタンパク質をナノサイズの粒径を持つ磁気ビーズに結合させる工程と、抗体固相化磁気ビーズ(以下では単に「抗体ビーズ」と呼ぶことがある)を用い、抗体が結合する抗原を発現する細胞を回収する工程を含む、がん等の疾患の検出用又は診断用試薬に関する。
本発明者は、抗体の標識条件に着目し、鋭意検討を行った結果、従来の方法で作製した抗体ビーズでは回収できなかったがん細胞を、効率よく回収できる抗体ビーズの作製条件を見出し、抗体ビーズの作製に成功した。これにより、例えば、血液試料中に存在するがん細胞を高感度に検出することが可能である。すなわち、本発明の抗体ビーズを用いることにより、従来の方法では検出することができなかったがん細胞を、簡便、高感度かつ高精度に検出することができるため、本発明の抗体ビーズはがん細胞の診断に極めて有用である。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
【００４１】
2. 標識される分子、標識に用いる分子
本発明において標識される分子は、特定の分子と結合する性質を持っていれば良く、タンパク質（例えば、抗体、レクチン、酵素等）のほか、核酸、脂質、低分子化合物が含まれる。好ましくはタンパク質であり、より好ましくは抗体である。
本発明で上記分子の標識に用いる分子（標識物質Ａ）としては、最終的に微粒子表面に固相化を行うために適した分子であれば良く、ビオチン、デスチオビオチン、2−イミノビオチン、3, 4−ジアミノビオチンが含まれる。好ましくはビオチンである。これらを標識する際には、市販の試薬を利用することが出来る。標識される分子の活性を損なわない方法で標識出来れば良く、標識される分子のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、糖鎖と反応する試薬が利用できる。好ましくはアミノ基である。アミノ基と反応するクロスリンカーとしては、N-ヒドロキシスクニニミド(NHS)基、及びエポキシ基を持つ試薬が利用でき、NHS-biotin、NHS-LC-biotin、NHS-LC-LC-biotin、sulfo-NHS-biotin、sulfo-NHS-LC-biotin、sulfo-NHS-LC-LC-biotinが利用できる。より好ましくはNHS-LC-LC-biotinである。この他、カルボキシル基と反応するカルボジイミド基、チオール基と反応するマレイミド基、糖鎖と反応するヒドラジド基を持つ分子も利用できる。
【００４２】
3. 抗体のビオチン化標識
抗体をビオチン化する場合、一般的にはpH 7.4から8.3の緩衝液中で、1分子の抗体あたり12分子の標識物質を用いて実施する。この場合、1分子あたり5〜6分子のビオチンを導入できる。これに対し、本発明では、標識物質の濃度を1分子あたり1から2分子の標識物質となるよう調製し、1分子あたり2分子以下のビオチンが導入された分子を作製する。標識される分子の1分子あたりに結合したビオチンの数は、使用する反応試薬の濃度によって調整することが出来る。より具体的には、NHS-LC-LC-biotinをDimethyl sulfoxide (DMSO)に1 mMとなるよう溶解する。この溶液を段階的に希釈し、溶液中に含まれるNHS-LC-LC-biotin濃度を正確に定量する。溶液中の標識分子は4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylicacid (HABA)によって定量する事が出来る。
ビオチン化試薬を1 mg/ml (6.7μM)のPBS (-) (137 mM Sodium chloride, 2.7 mM Potassium chloride, 8.1 mM Disodium hydrogen phosphate, 1.47 mM Potassium dihydrogen phosphate、pH 7.4)に調製した抗体溶液に、6.7〜13.3μMとなるように添加する。好ましくは10〜13.3μMであり、より好ましくは13.3μMである。
NHS-LC-LC-biotinのほとんどは室温で30分以内に抗体と反応する。標識された抗体1分子あたりのビオチン化分子数は、HABAによって定量することが出来る。
【００４３】
標識された分子の活性を解析する方法としては、抗体の場合はELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)、Flow-cytometry等が利用できる。
【００４４】
4. 固相化用担体
本発明で、上記標識分子を固相化する担体としては、ナノサイズの担体が利用できる。好ましくは、主に50〜500 nmの粒径を持つ担体（微粒子担体）であり、より好ましくは主に100〜150 nmの粒径を持つ担体（微粒子担体）である。
微粒子等の担体上に上記標識分子を固相化するためには、上記標識分子と相互作用する分子を担体上に（微粒子等の表面上に）あらかじめ固相化する方法が利用できる。標識分子と相互作用する分子、すなわち標識物質Ｂとしては、ビオチンに対しては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが利用できる。これらの分子を固相化する方法としては、既存のクロスリンカーが利用できる。また、あらかじめストレプトアビジンが固相化されている担体が利用できる。ストレプトアビジンが固相化されている担体としては、Dynabeads M280、M270、T1、C1 (Dynal社)、NHS-Activated Magnetic Beads (PIERCE社)、BD IMAG Streptavidin Particles Plus - DM (BD社)、MACS (Miltenyi社)などが利用できる。
【００４５】
5. タンパク質−微粒子複合体（抗体ビーズ）
本発明のタンパク質−微粒子複合体（例えば、抗体ビーズ）は、上記3.及び4.で記載した標識抗体と固相化用担体を用いて作製される。ビオチン化された抗体を、主に100〜500 nmの粒径を持つストレプトアビジン標識ビーズに固相化する。固相化に用いるビーズは、ビーズに結合した分子の回収を容易にするために磁気ビーズが好ましい。より好ましくは、BD IMAG Streptavidin Particles Plus - DMに抗体を固相化する。固相化に際しては、10μlのビーズあたり0.5〜2μgのビオチン化抗体を添加することが好ましいく、より好ましくは。1μgのビオチン化抗体を添加することが好ましい。
従来、担体に抗体を結合させる場合、一般的には抗体1分子あたりに多くのビオチンが結合している方が多くのストレプトアビジンとの反応性が増すため、活性を損なわない範囲で可能な限り多くビオチンを導入するのが一般的であるとされていた。市販されているキットもこの原理に基づいて標識物質の濃度が設定されている。しかしながら、本発明では、抗体タンパク質等の1分子に結合させる標識物質Ａの平均結合分子数（ビオチン数）を、1分子以上かつ6分子未満、好ましくは1〜2分子に減少させることで、効率よく細胞表面に結合する抗体ビーズの作製できることを見出した。
【００４６】
免疫細胞染色等で膜タンパク質を抗体で検出した場合、抗体特異的な結合が検出される一方で、同じ抗体を用いた抗体ビーズが細胞表面上に結合しない例が生じる。これは、固相化担体に結合した抗体の反応性の低下に依るものであるが、その原因はほとんど明らかにされていない。本発明では、この原因が、抗体ビーズの大きさに依存すると考えた。抗体1分子の大きさは10〜14 nm程度と考えられている。また、一般的な標識試薬で標識したビオチン化抗体では、抗体1分子あたり6分子以上のビオチンが結合することになり、この一般的なビオチン標識抗体に、例えば150 nmのナノビーズを混合した場合、抗体がビーズに結合するだけでなく、抗体によってナノビーズとナノビーズが架橋される。その結果、ナノビーズを利用した場合でも、作製した抗体ビーズは結果として大きなサイズのビーズが形成されることになる。他方、抗体1分子あたり、1分子以上かつ6分子未満、好ましくは1〜2分子のビオチンを標識した場合、抗体によるビーズ間の架橋が大幅に抑制され、抗体ビーズの大きさ自体がナノビーズ本来の大きさ(100〜200 nm程度)になる。
一方で、細胞膜表面上に存在する抗体が結合する分子(すなわち膜タンパク質)に関しては、細胞表面に均一に発現していない場合も多い。細胞膜は脂質二重層に膜タンパク質や脂質等が含まれているが、脂質分子が特異的に集まって、脂質ラフト(Lipid raft)と呼ばれる領域を形成する。膜タンパク質の中には、脂質ラフトを好んで集まる分子が存在し、膜を介したシグナル伝達、細胞接着あるいは細胞内小胞輸送、細胞の極性など重要な役割を果たしている。すなわち、膜タンパク質の分布は不均一であり、細胞膜上の特定の狭い部分に集中して存在することで、抗体ビーズが結合しにくい、あるいはほとんど結合しない分子が存在すると想定される。すなわち、通常の方法でビオチン化した抗体ビーズの場合、粒子径の小さなビーズを利用した場合でも、抗体により粒子が架橋されることで、作り出される抗体ビーズは、分子の大きさが大きいために、細胞膜上の狭い領域に存在する分子に結合出来ない可能性が想定される。
磁気ビーズの中には、粒子径が主に10〜100 nmからなる非常に小さなビーズも存在する。例えば、Streptavidin Micro Beads (Miltenyi社製)が挙げられる。このビーズを固相化担体として用いた場合には、ビオチン化抗体によるビーズ間の架橋は起きにくい一方で、ビーズが小さい為にビーズが結合した細胞を回収するためには、専用の磁気カラムを利用する必要がある。CellSearchシステムで利用される90〜150 nmの粒径を持つ抗EpCAM抗体ビーズも同様で、細胞と抗体ビーズを反応させた後にビオチン化BSAを添加してビーズを凝集させることによって、細胞を回収することが出来る。これらの事から、抗体によってビーズが架橋されることなく、かつ、効率よく磁石に結合し、回収できるような抗体ビーズの開発が求められている。
本発明においては、このような課題に対し、抗体1分子あたり1分子以上かつ6分子未満、好ましくは1〜2分子のビオチンを標識し、1μm未満、好ましくは50〜500 nmの粒径の固相化担体に結合させることで、細胞表面上の膜タンパク質に抗体が結合する反応を阻害せず、かつ磁石に容易に結合して回収できる抗体ビーズが得られることを見出した。
【００４７】
6. 抗体
本発明で使用される抗体は、抗体を生産するハイブリドーマ細胞を培養し、上清から精製することが出来る。さらに、抗体の断片やヒト-マウスキメラ化抗体等も使用することが出来る。これらは、抗体が認識する抗原に特異的に結合する。利用する抗体が認識する抗原は特に制限はないが、がん細胞に特異的に発現する抗原が好ましい。より好ましくは細胞の表面に存在する膜タンパク質を抗原とする抗体であり、さらに好ましくはMCT5 (monocarboxylate transporter 5)やLGR6 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 6)、EGFR1 (Epidermal growth factor receptor 1)、ERBB2 (v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2)である。
【００４８】
7. 抗体断片
本発明で利用できる抗体の断片は、抗体が認識する抗原に特異的に結合する。抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody（dibodies）、dsFv、scFv（single chain Fv）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体の重鎖可変領域（H鎖V領域）及び軽鎖可変領域（L鎖V領域）をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
【００４９】
8. 結合親和性
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも1×10-10 Mの解離定数(KD)を有しており、この解離定数に対し、例えば2〜5倍、5〜10倍、10〜100倍、100〜1000倍又は1000〜10,000倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、MCT5の結合親和性に関する解離定数(KD)が、1×10-10 M、5×10-11M、1×10-11 M、5×10-12 M、1×10-12M、5×10-13 M、1×10-13 M、5×10-14M、1×10-14 M、5×10-15 M、又は1×10-15Mであり、1×10-10 M〜1×10-13 Mであることがより好ましい。あるいはこれらのKDよりも低い値であり高親和性であってもよい。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばBiacore（登録商標）T200(GE Healthcare社）、ProteON XPR36 (Bio-Rad社)など）。
【００５０】
9. がんの検出用又は診断用試薬（がんの検出剤又は診断剤）
本発明のがんの検出用又は診断用試薬は、上記「5. タンパク質−微粒子複合体（抗体ビーズ）」に記載した固相化抗体を含有するものである。よって、上記「6. 抗体」に記載の抗体が結合する抗原が含まれるサンプルに利用することが出来る。抗体は抗原に対して特異的に結合することができるため、がんに特異的に発現する抗原を認識する抗体を利用した抗体ビーズはがんの検出又は診断のために使用することができる。
本発明における検出又は診断の対象となる癌種としては、例えば乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌、胃癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、舌癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してMCT5、LGR6、EGFR1、ERBB2が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌などが挙げられ、好ましくは乳癌、大腸癌である。
【００５１】
10. がんの検出又は診断方法
本発明のがんの検出又は診断方法は、上記「5. タンパク質−微粒子複合体（抗体ビーズ）」に記載した固相化抗体と、被験者から採取された生物学的試料や生体試料（以下、単に「生体試料」ともいう）とを接触させ、前記試料における抗体ビーズに固相化された抗体が結合する抗原を持つサンプルを検出する工程を含む方法である。この場合、抗体ビーズに結合したサンプルの量とがんの可能性とを関連づけることが好ましい。
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
【００５２】
血液を試料とする場合、全血をそのまま利用する、あるいは密度勾配遠心法により有核細胞のみを分離し利用する事が好ましい。密度勾配遠心法には、密度勾配形成用媒体が利用される。密度勾配形成用媒体とは、それ自身で又は遠心分離によって密度勾配を形成する液体状又は粒子状の物質を示す。例えば、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体(例えば後述のFicol)、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子(例えば後述のPercoll)、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール、ニコデンツ(nycodenz)が挙げられ、イオン性又は非イオン性のいずれのものも使用できる。また、Ficoll、Ficoll-PaqueやPercoll (いずれもGEヘルスケア  バイオサイエンス社製)、Lymphoprep、Polymorphoprep、OptiPrep (Axis-Shield PoC AS社製）、Lymphoseparl (免疫生物研究所製)等の密度勾配形成用として市販されている媒体も好適に使用できる。
【００５３】
糞便を試料とする場合、特開2005-46065号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便からがん細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を10μm以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中に含まれるがん細胞を、抗体ビーズを用いて回収し検出する。この他、上述した密度勾配遠心法による単核細胞の分離を行っても良い。
【００５４】
大腸癌や乳癌をはじめとする様々ながんにおいて、EpCAM抗体以外の抗体を用いた方法は未だ確率されていない。腫瘍細胞集団は不均一であるために、EpCAM発現量が一定でないことや、がん細胞が原発巣周囲の組織へ浸潤する能力を獲得する際に示す表現型の一つである上皮間葉転移(EMT, Epithelial Mesenchymal Transition)を起こした細胞ではEpCAMの発現が低下することが報告されている。さらに、腫瘍細胞が血液中で生き残る為に形成すると考えられている、循環腫瘍微小塞栓 (CTM, Circulating Tumor Microemboli) (がん細胞が複数個集まってクラスターを形成した凝集塊)の場合には、EpCAMの発現は低く、CellSearch systemでは検出できない事が報告されている(前掲非特許文献９：American Journal of Pathology, 178, 989-996, 2011)。これに対し、本発明によれば、従来、抗体ビーズに利用できないとされた抗体を用いて、細胞を回収することが出来る。
【００５５】
本発明は、様々な抗体を用いるに適用できる。例えば、IMI4C4a抗体が結合するMCT5は、乳がんの浸潤能と移動能に関係しており、がんの進行度に従って発現が亢進するものである。また、Mu2C15抗体が結合するLGR6は、大腸がん、及び乳がんの70%以上で特異的に発現するものである(前掲特許文献３：WO2014/192974)。この他、一部の大腸がんの患者で高発現するEGFR1と結合するヒトキメラ抗体cetuximab (商品名: Erbitux)(Annals of Oncology, 16, 102-108, 2005)、乳癌患者の20〜30%に発現するHer2 (Science, 235, 177-182, 1987)に対する抗体trastuzumab (商品名: Herceptin)などが利用できるが、がん細胞で特異的に発現する抗原をと結合する抗体であれば限定されない。また、がん細胞だけにとどまらず、特定の細胞表面に発現する分子を特異的に認識する抗体が利用できる。
【００５６】
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体ビーズと被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用チューブにおいて本発明の抗体ビーズと生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体ビーズを添加すること等が含まれる。
本発明において、抗体ビーズに結合した細胞の検出、測定又は評価には、例えば、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、免疫染色などが利用できる。
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置などが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び／又は評価し、その検出、測定又は評価結果とがんの可能性等とを関連づけることができる。
【００５７】
本発明においては、抗体ビーズによって回収された、又は回収された細胞を別の抗体を用いて染色することで検出された、細胞数の評価結果に基づいて、被験者ががんに罹患している可能性の有無、及びがんの進行状態を診断することができる。
本発明の検出又は診断方法を、蛍光顕微鏡下による解析で実施する場合は、例えば、血液に本発明の抗体ビーズを添加し、反応後に磁石を用いて抗体ビーズと反応した細胞を回収する。回収した細胞の中で正常細胞とがん細胞を見分けるために、蛍光標識された抗サイトケラチン抗体、抗CD45抗体等を用いて染色し、回収された細胞の中のがん細胞の数を解析することにより、がんに罹患している可能性や、がんの悪性度の高さを判定又は診断することが出来る。
【００５８】
本発明において、がん細胞の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、検出されるがん細胞の個数とがんの可能性とを関連付けることにより、がんに罹患している可能性や、がんの悪性度の高さを判定又は診断することが出来る。この場合、7.5 ml中の血液から検出される個数が0個の場合はがんの罹患・転移の心配は少なく、1個の場合はがんが存在しており転移の可能性があると判断される。また、2個では転移がほぼ間違いなくあり、5個以上では生命の予後が短いと判断される。
【００５９】
血液中に含まれるがん細胞の個数は、各種がん患者において検出されるため、がん細胞が検出されてもどのがんであるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「がんが疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する（精密検査を行う）ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてがん細胞が検出されたときは、癌種の主要資料（確定診断等）に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
すなわち、本発明は、がん細胞に対する抗体ビーズと、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるがん細胞を検出する工程を含む、がんの検出又は診断を補助する方法を提供する。
【００６０】
11. がんの検出用又は診断用キット
本発明の抗体ビーズは、がんの検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体ビーズを含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素及び基質（発色性基質等）、基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。本発明のキットを利用することにより、検診等におけるがん患者の高精度スクリーニング、がんの早期発見、がんの進行度の特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、がんによる死亡率を低下させることができる。
【００６１】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
（１）細胞
ヒト乳がんであるMCF7細胞にMCT5タンパク質を過剰発現させたMCF7-MCT5細胞は、及びヒトBリンパ芽球細胞株Raji細胞 (ATCC受託番号CCL86)を、それぞれ10%（v/v）の血清（Hyclone社製）を含むRPMI1640培地（Sigma社製）で80%コンフルエントを越えないように37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。なお、上記MCF7-MCT5細胞（すなわちMCT5安定発現株）は、後述の参考例１に示した方法で作製したものを用いた。
【００６３】
（２）抗体
IMI4C4a抗体を産生するハイブリドーマ細胞（後述の参考例２を参照）、及びMu2C15抗体を産生するハイブリドーマ細胞（前掲特許文献３：WO2014/192974を参照）を、それぞれ10 cm ディッシュ10枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地（Invitrogen社製）とEX CELL Sp2/0（ニチレイバイオサイエンス社製）とを1:1で混合した培地で10日間培養を行った。培養上清を回収し、Protein Gカラムを用いて精製した。培養上清100 mLに対し、0.5 mLのProtein Gカラム（GEヘルスケア社）を用いた。PBSで平衡化したProtein Gカラムに対し、培養液を1〜3 ml/minの流速で通過させた後、6 mLの洗浄バッファー（25mM Tris-HCl（pH7.4）、140 mM NaCl、10 mM KCl）で洗浄した。次に1 mLの溶出バッファー（0.1M Glycine（pH 3.0））で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris-HCl（pH7.4）を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30（Millipore社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。このようにして精製した抗体を実験に用いた。
IMI4C4a抗体（後述の参考例２を参照）及びMu2C15抗体（前掲特許文献３を参照）の濃度は、280 nmの吸収を測定し、それぞれ1 mg/mlとなるようPBS (-) (137 mM Sodium chloride, 2.7 mM Potassium chloride, 8.1 mM Disodium hydrogen phosphate, 1.47 mM Potassium dihydrogen phosphate、pH 7.4)に溶解した。
【００６４】
（３）市販の標識試薬を用いた抗体のビオチン化
抗体ビオチン化には、一般的なビオチン化キットBiotin Labeling Kit-NH2 (DOJINDO社製)、及びEZ-link NHS-LC-LC-biotin (PIERCE社製)を用いた。両キットに含まれる標識物質はNHS-LC-LC-biotinであり、同じ標識物質を利用して抗体を標識することになる。
Biotin Labeling Kit-NH2付属のマニュアルに従ってIMI4C4a抗体をビオチン化した(IMI4C4a-biotin-DJと記載することがある)。一方、NHS-LC-LC-biotinに添付のマニュアルに従った濃度で調製し、IMI4C4a抗体をビオチン化した(IMI4C4a-biotin-EZと記載することがある)。ビオチン標識反応後、限外濾過（Amicon Ultra、 30 kDa、Millipore社）あるいはゲル濾過(G25、Sigma-Aldrich社)を用いて、未反応の標識試薬を除去するとともに、溶液をPBS(-)に置換した。
【００６５】
（４）標識率の計算(HABA法)
上記（３）の方法で標識した抗体に関し、１分子あたりの抗体に標識されているビオチンの数をPierce Biotin Quantitation Kitを用い、付属のマニュアルに従って定量した。計算の結果、IMI4C4a-biotin-DJは抗体1分子あたり平均して5.03個、IMI4C4a-biotin-EZは4.94のビオチンが結合していることが示され、両キットによる標識効率の違いはない事が示された。
【００６６】
（５）ELISA
抗体をビオチン化標識した場合、抗体の抗原認識部位が修飾されることで抗体が失活する場合がある。そこで、ビオチン化した抗体の活性を解析した。
IMI4C4aの抗原であるICD4組み換えタンパク質をPBS(-)で希釈し、96ウエルのELISAプレート（Nunc社）に1ウエル当たり50 ngとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05% Tween 20を含むPBS(-)（以下、PBS-Tと記載する）350μLで3回洗浄した後、5%スキムミルクを含むPBS-Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をICD4結合ELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS-Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を10,000倍希釈したものを各ウエル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、0.5 mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。3 Nの硫酸で反応を停止した後、490 nmの吸収を、プレートリーダーを用いて測定した。測定結果を図１に示した。
ビオチン化したIMI4C4a-biotin-DJとIMI4C4a-biotin-EZそれぞれと、未標識のIMI4C4a抗体に活性の違いはほとんど見られず、標識による活性の低下が見られないことが示された。
以上の結果から、IMI4C4a-biotin-DJとIMI4C4a-biotin-EZには差がないと判断し、IMI4C4a-biotin-DJを用いて抗体ビーズの評価を行った。
【００６７】
（６）抗体ビーズの作製
抗体ビーズの作製法の一つとして、ビオチン化したIMI4C4a抗体をストレプトアビジンが標識された磁気ビーズに結合させた。磁気ビーズにはDynabeads MyOne Streptavidin T1 (Dynal社)を用いた。このストレプトアビジン結合ビーズは粒径が直径1μmであり、抗体を補足させるビーズとして一般的に利用されている。
10μLのDynabeads MyOne Streptavidin T1溶液を100μLのPBS(-)に懸濁し、IMI4C4a-biotin-EZを0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0μgとなるよう添加した後、ローテーターで15分間、室温で撹拌した。磁気スタンド(16-Tube SureBeads Magnetic Rack, Bio-Rad社)に5分間、室温で静置して上清を吸引後、100μLの1% BSAを含むPBS(-)溶液で2回洗浄した。10μlのPBS(-)に再懸濁して、これを抗体ビーズとした。
【００６８】
ストレプトアビジン結合ビーズに結合した抗体量を、HRP標識された二次抗体を用いて測定を行った。上記の抗体ビーズ溶液10μlをPBS (-)で100μlとし、ペルオキシダーゼ（以下、PODと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を10,000倍希釈したものを100μL添加し、1時間、室温で反応させた。磁気スタンドを用いてPBS(-)で2回洗浄を行った後、0.5 mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。3 Nの硫酸で反応を停止した後、磁気スタンドを用いてビーズを分離し、100μlの上清を回収して490 nmの吸収を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。測定の結果を図2に示した。
IMI4C4a-biotin-EZ濃度が0.125μg/100μLまでは、添加量に従ってストレプトアビジン結合ビーズに結合する抗体量は増加したが、0.25μg/mL以上では吸光度の低下が見られた。ここで、シグナルの低下が見られたサンプルではビーズの凝集が見られたた。すなわち、ビーズ表面に結合した抗体量が一定量を越えた場合にビーズが凝集し、二次抗体との反応性が低下した結果、シグナルの低下につながったと考えられる。ビーズの凝集は抗体ビーズ自体の抗原への反応性の低下につながることから、以降では、10μlのDynabeads MyOne Streptavidin T1を100μLに希釈した溶液に0.1μgのIMI4C4a-biotin-EZを加えるという条件を用いて抗体ビーズを調製して実験を行った。
【００６９】
（７）細胞除去試験
抗体ビーズの用途の一つとしては、2種類以上の細胞の集団の中から、抗体が結合する分子を発現する細胞を除去する手法が用いられる。そこで、MCT5を発現するMCF7-MCT5細胞と、ヒトBリンパ芽球細胞株Raji細胞を用いて、抗体ビーズを添加した場合の除去効率を算出することで、抗体ビーズを評価する実験系を構築し評価を行った。
【００７０】
まず、ビーズによる細胞除去試験を行う前に、均一な細胞集団から細胞を回収できるか検討を行った（図3）。MCF7-MCT5細胞を培養し、培養ディッシュから剥離した。この際、トリプシンを用いると細胞表面上のMCT5が分解されてしまうため、Accutase (Innova Cell Technologies, San Diego, CA)を用いて細胞を剥離し、1×106 cells/mLとなるよう培地で希釈しMCF7-MCT5細胞懸濁液とした。細胞懸濁液100μL、すなわち1×105 cellsの細胞に対し、上記（４）で作製した10μLの抗体ビーズを添加し、氷上で30分間反応させた。この際、ネガティブコントロールとして、IMI4C4a-biotin-EZを添加していビーズを用いて同様の実験を行った。磁気スタンド上に5分間、室温で静置し、ビーズを凝集させた後、溶液を回収した。溶液中の細胞数を、血球計算版を用いて測定した結果を図4に示した。
IMI4C4a-biotinを添加した場合(+Ab)としていない場合(-Ab)の細胞密度を解析した結果、双方にはほとんど変化が見られなかった。すなわち、上記（５）の結果から固相化した抗体の力価が低下していない事から、上記（３）で作製したビオチン化抗体をDynabeads MyOne Streptavidin T1に結合させた抗体ビーズでは、IMI4C4a抗体の抗原を発現するMCF7-MCT5細胞を回収出来なことが示された。
（８）ナノサイズのビーズを用いた細胞除去試験
ヒト培養細胞の直径は6〜20μm程度である。これらの細胞に1μmの粒径を持つビーズを反応させた場合、粒子が大きいために細胞表面の抗原に抗体が結合出来ない可能性があると考えた。そこで、直径1μmのDynabeads MyOne Streptavidin T1よりも粒径の小さな、ナノサイズのビーズを用いた細胞除去試験を検討した。
ビーズ粒子の直径が0.1〜0.5μmからなる、ストレプトアビジン結合ナノ磁気ビーズ（IMAG, BD社）に、上記（６）と同様にビオチン化した抗体を結合させ、上記（７）と同様の方法で細胞の除去効率を解析した。
1×105 cellsのMCF7-MCT5細胞を100μLの培地に懸濁されるよう準備した。また、10μlのストレプトアビジン結合ナノ磁気ビーズに対し、IMI4C4a-biotin-EZ濃度が0.125μg/100μLとなるような比率で調製した抗体ビーズを準備した。以降、ナノサイズのビーズに抗体を結合させた抗体ビーズを抗体ナノビーズと呼ぶことがある。MCF7-MCT5細胞懸濁液に、抗体ナノビーズを25あるいは50μl添加し、氷上で30分間反応させた後、磁気スタンドを用いてビーズを凝集させ、ビーズに結合していない細胞溶液を回収した。ビーズを添加していないネガティブコントロールと比較して、抗体ナノビーズによって除去された後に残された細胞数を、血球計算版を用いて計測した。この結果を図5に示した。
抗体ナノビーズの添加量を増やすにつれ、溶液に残存する細胞の数の減少が見られたが、50μlの抗体ナノビーズを添加した場合でも70%以上が残されていた。
以上のことから、一般的な抗体標識法でビオチン化したIMI4C4a抗体をビーズに結合させ、細胞を回収しようとしても、効率よく回収出来ないことが示された。
【実施例２】
【００７１】
実施例１（４）に記載の通り、一般的な方法でビオチン化を行った場合には１分子の抗体あたり約5分子のビオチンが結合する。このような抗体を用いて抗体ビーズを作製した場合、実施例１（６）に示されるよう、抗体濃度を上昇させるとビーズが凝集し、二次抗体との反応性も低下する。
すなわち、１分子あたりに結合しているビオチンの数が、抗体ビーズの性能に影響すると考えた。
【００７２】
（１）標識物質の濃度測定
標識反応の条件検討を行うために、標識物質の濃度を正確に定量した。今回、実施例１（４）に記載されるビオチンの定量方法がを利用した。
秤量したNHS-LC-LC-Biotinをdimethyl sulfoxide (DMSO)に0.5675 mg/mL、すなわち1.0 mMとなるよう溶解した。この溶液5μlを345、395、445、495、545、595、645μLのDMSO溶液に添加した。これらを90μLずつ分注した後、それぞれにBiotin Quantitation Kitに添付されているHABA dye (4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid)を10μL添加して、室温で10分間反応させた。反応後、吸光光度計(NanoDrop 1000、Thermo社)を用いて500 nmの吸光度を測定し、希釈倍率に対する吸光度としてプロットし、直線性のある部分を用いて濃度計算を行った。実験結果を図6に示した。100、110、120倍希釈の吸光度と、HABA dyeのモル吸光係数(ε= 34,000M-1 cm-1）から標識物質の実際の濃度を測定した結果をTable 1に示した。このように正確に定量を行った標識物質を用いて、以降の実験を行った。
【００７３】
【表１】
2017133884.tif 000002
【００７４】
（２）抗体のビオチン化方法の変更
抗体に結合させるビオチンの数を減少させるために、標識条件を検討した。ビオチン化試薬としては、EZ-link NHS-LC-LC-biotinを用いた。キット付属のマニュアルに記載される反応条件をCondition #1とし、Condition #2〜#6の条件で抗体の標識を行った。それぞれの標識条件をTable 2に記載した。この際、反応を行う際の緩衝液にはPBS (-)を用いた。1 mg/mLの抗体濃度になるよう調製したIMI4C4a抗体を上記#1〜#6の条件それぞれで、25μgずつビオチン化した。
【００７５】
【表２】
2017133884.tif 000003
【００７６】
上記の条件でビオチン化した抗体それぞれを用い、実施例１（８）記載の方法でナノサイズのビーズに抗体を結合させ、実施例１（６）記載の方法でビーズ表面に結合した抗体量を測定した。実験結果を図７Aに示した。Condition #1と#2では、ビーズ表面に結合する抗体量はほぼ同程度であったが、Condition #3〜#5では抗体の結合量はやや低下した。ビオチン化試薬を含まないCondition #6では、ビーズ表面に抗体はほとんど結合していないかった。
【００７７】
（３）細胞除去試験
上記（２）で作製した抗体ナノビーズを用い、実施例１（７）の方法で細胞の除去効率を評価した。この際、100μLの細胞懸濁液に添加する抗体ナノビーズの量を10μL及び50μLとしてそれぞれ解析を行った。結果を図７Bに示した。
一般的な標識方法であるNHS-LC-LC-Bioitinを抗体の12倍量、すなわち1 mg/mlの抗体に対して80.0μMとなるよう添加したCondition #1、及び抗体の6倍量を添加したCondition #2の場合では、ビオチン化を行っていない抗体を添加した場合(Condition #6)と同様に細胞の除去が全く起きなかった。一方、抗体の0.5〜2倍量、すなわち1 mg/mlの抗体に対して1.5〜13.3 mMとなるよう標識物質を添加した場合、明確に細胞が除去されることが示された。そこで、さらに詳細な条件を検討した。上記Condition #3に加え、Table 3に示される#7〜10の条件を追加して、新たにIMI4C4a抗体を標識し、同様の細胞除去試験を行った結果を図８Aに示した。抗体の1倍量から2倍量の間明確な細胞除去作用が見られた。さらに、別途Table 4に示されるように、Condition #11を加えて、抗体1分子に対して、1、2、2.5倍量となるようNHS-LC-LC-Biotinを添加して作製したビオチン化抗体を用いて実験を行った結果を図８Bに示した。図8Bの場合では、ビオチン化抗体を含まない抗体のみの場合も同時に実施した。この結果、Condition  #9, #3, #11のいずれの場合にも効率よく細胞が回収できる事が示された。すなわち、1 mg/mlの濃度に調製した抗体に対し、好ましくは最終濃度が3.3μM以上でありかつ40.0μM未満（抗体1分子に対し1分子以上かつ6分子未満）の標識物質を添加した場合に回収率の高い抗体が作製でき、より好ましくは最終濃度が6.7〜16.7μM（抗体1分子に対し1分子以上かつ2.5分子）であり、さらに好ましくは6.7〜16.7μM (抗体1分子に対し1から2分子)となるよう標識物質を添加して作製した標識抗体を作製し、抗体ビーズを作製することにより、細胞に高い結合能を持つ抗体ナノビーズが作製できることが明らかになった。
【００７８】
【表３】
2017133884.tif 000004
【００７９】
【表４】
2017133884.tif 000005
【００８０】
（４）抗体ナノビーズの評価
上記（２）のCondition #3、#8、及び#9を用いてビオチン化した抗体を用いて作製した抗体ナノビーズを用い、回収対象となる細胞数を増加させた場合の回収率を算出した。実験結果を図9に示した。細胞数が増加しても、抗体ナノビーズによって細胞が効率よく回収できることが示され、特にCondition #3で作製した抗体ビーズが最も良く細胞を回収できる事が示された。
【００８１】
（５）粒径の異なる抗体ビーズの評価
実施例２（２）のCondition #3で作製したビオチン化抗体を用い、粒径の異なる様々なビーズを用いた場合の細胞除去率を算出した。使用したストレプトアビジン結合ビーズは、Dynabeads M-280 Streptavidin (直径2.8 nm)、M-270 Streptavidin (直径2.8 nm)、Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (直径1.0 nm)、及びC1 (直径1.0 nm)の4種類を用いた。なお、M-270及びC1は表面が疎水性になるよう加工されたビーズである。実施例１（６）と同様の方法で抗体ビーズを作製し、実施例１（７）の方法を用いて細胞除去効率を算出した。実験結果を図１０に示した。
T1及びM-270、C1を用いた抗体ビーズでは細胞の除去が観察されたが、いずれの場合にも上記（２）のCondition #3で作製した抗体ナノビーズの方が、明確に細胞除去効率は高かった。
以上の事から、抗体をビオチン化する際に、1分子の抗体あたり1〜2分子となるよう標識物質を添加して作製したビオチン化抗体を0.1〜0.5μmの粒径を持つストレプトアビジン結合ビーズに固相化した場合に、効率よく細胞が回収できる事が示された。
【００８２】
（６）Flow-cytometry解析
上記（２）記載のCondition #3で標識した抗体ナノビーズを用い、2種類以上の細胞集団から特定の細胞集団を除去、あるいは濃縮できるか解析を行った（図１１）。
ヒトBリンパ芽球細胞株Raji細胞とMCF7-MCT5細胞をそれぞれ混合し1×105cells/100μlとなるよう調製した。この際、MCF7-MCT5細胞には、EGFPをコードする遺伝子が組み込まれており、細胞の存在は488 nmの励起によって生じる蛍光で検出することが出来る。この混合溶液に、50μLのIMI4C4aを固相化した抗体ナノビーズを添加し、4℃で1時間反応させた。磁気スタンドを用いて抗体ナノビーズを回収した後、抗体ナノビーズに結合しなかった細胞集団をFACS Calibur (BD社)を用いて解析した。実験結果を図１２に示した。
【００８３】
Raji細胞とMCF7-MCT5細胞とを46.47：53.53で混合した溶液にIMI4C4a抗体ナノビーズを添加して特定の細胞(MCF7-MCT5細胞)を除去した場合、上清に残された細胞集団では、92.15%がRaji細胞であり、7.85%がMCF7-MCT5細胞であったことから、効率よく細胞が除去できたと考えられる。一方、抗体ナノビーズに結合した細胞では、83.93%がMCF7-MCT5細胞であり、16.07%がRaji細胞であった。以上のことから、IMI4C4a抗体ナノビーズを用いることで、2つの細胞集団を抗体ビーズによって1種類ずつに分離出来ることが示された。
【００８４】
（７）蛍光顕微鏡解析
血液循環腫瘍細胞(CTC)を検出する際には、多量の血液細胞の中に極わずかに含まれる腫瘍細胞を検出する必要がある。そこで、上記（６）のRaji細胞とMCF7-MCT5細胞の混合比率を変更して調製した細胞集団の中から、IMI4C4a抗体ナノビーズによってMCF7-MCT5細胞が濃縮され検出できるかどうか解析を行った。
Raji細胞とMCF7-MCT5細胞をそれぞれ1×105 cells/mLとなるよう調製し、細胞混合溶液を作製した。この際、MCF7-MCT5細胞をRaji細胞溶液で連続的に希釈していく方法を用いることで、細胞希釈液を作製した。実験結果をTable 3に示した。この際、それぞれの理論的な細胞比率をTheoretical (%)として示した。実際に血球計算版を用いて測定した実験結果をInput cells及びCollected cellsに示した。また、可視光及び蛍光顕微鏡で観察した結果を図１３に示した。
【００８５】
【表５】
2017133884.tif 000006
【００８６】
Sample ID A〜Eの場合、Input cellsで2.4〜56.4%のMCF7-MCT5細胞が見られたサンプルでは、 IMI4C4a抗体ナノビーズによって効率よく細胞が回収できることが示された。さらに、血球計算版では細胞が含まれている事が検出できなかったSample ID Fにおいても、IMI4C4a抗体ナノビーズを添加することにより、細胞が十分検出できる事が示された。
以上のことから、IMI4C4a抗体ナノビーズを用いることで、溶液中にわずかに含まれるMCF7-MCT5細胞を回収することが出来ることが示された。
【実施例３】
【００８７】
（１）様々な抗体ナノビーズ
実施例２（２）記載の標識方法が、MCT5を認識するIMI4C4a抗体以外の抗体でも利用できるかを検討した。実施例２（２）記載のCondition #1 (一般法)及びCondition #3それぞれで、抗MCT5抗体であるクローン番号IMI4C4a抗体、抗LGR6抗体であるクローン番号Mu2C15抗体をビオチン化し、抗体ナノビーズを作製した。1×105cells/100μLのMCF7-MCT5細胞懸濁液に、それぞれの抗体ナノビーズを10μl添加し、実施例２（３）と同様の方法で細胞除去試験を行った。また、Mu2C15抗体はホルマリン固定した細胞と強く反応することが明らかになっていることから、MCF7-MCT5細胞を10%中性緩衝ホルマリン溶液(Wako社)を用いて10分間固定し、培地で洗浄後したサンプルを用いて、同様の実験を行った。実験結果を図１４に示した。
【００８８】
IMI4C4a抗体を用いて作製した抗体ナノビーズでは、固定していない細胞を明確に回収することが出来たが、ホルマリン固定した細胞の回収率は低かった。これは、IMI4C4a抗体自体がホルマリン固定した細胞と反応しにくいためであると考えられた。一方、Mu2C15抗体を用いて作製した抗体ナノビーズ（以降Mu2C15抗体ナノビーズと呼ぶことがある)では、固定しない細胞では細胞の除去が見られなかったが、ホルマリン固定した細胞では、一般法であるCondition #1では細胞の除去はほとんど見られないにも関わらず、Condition #3でビオチン化した抗体を用いた場合には、効率よい除去が観察された。
以上の結果より、一般法であるCondition #1で標識した抗体ナノビーズでは、抗体の特性に従って細胞が回収できないという問題があったが、実施例２（２）記載のCondition #3の標識方法で作製した抗体ナノビーズは抗体の特性そのままに、効果的に細胞と結合し、細胞の除去あるいは細胞の回収に利用できることが示された。
【実施例４】
【００８９】
実施例２（２）記載のCondition #3の標識方法、及びCondition #1とCondition #2の間に相当する8 fold reagent/Abとなるよう調製したEZ-link NHS-LC-LC-biotinを用いて抗LGR6抗体であるクローン番号Mu2C15抗体をビオチン化標識し、ナノ磁気ビーズと混合することで作製した抗体ビーズそれぞれを用い、実施例１（７）の方法に従って細胞へ抗体ナノビーズを添加した。添加30分後に、磁気スタンドで回収する前に、顕微鏡下で抗体ナノビーズと細胞との結合状態を観察した。結果を図１５に示した。抗体を含まないナノビーズのみの場合（図１５左パネル）、ナノビーズは顕微鏡の分解度以下で粒子は観察されなかった。Condition #3で標識した抗体ナノビーズの場合、細胞表面上で抗体ナノビーズが凝集し、場合によっては細胞と細胞を架橋している状態が観察された。一方、一般的なビオチン化標識濃度である8 fold reagent/Abとなるようビオチン化した抗体では、抗体ナノビーズ間で小さな凝集塊が形成され、細胞に結合せずに浮遊している抗体ビーズが多く見られた。
【００９０】
抗体ナノビーズを用いた細胞の回収は、Cell Serarch Systemで実用化されている。このシステムの場合、抗EpCAM抗体とStreptavidinを磁気ナノビーズ表面に結合させた粒子(Multivalent aggregaterと呼ばれる)を使用している。細胞を回収する際には、ビオチン化BSAを添加することで、細胞−磁気ナノビーズの凝集塊を形成させることが必要であると報告されている(前掲非特許文献８：Journal of Magnetism & Magnetic Material, 2001, 225, p. 301-307)。
【００９１】
一方、本発明の抗体ナノビーズの場合、抗体のビオチン化効率を変更するだけで、同様の細胞−磁気ナノビーズの凝集塊を形成させることが可能であることが示された。すなわち、本発明の方法では、Cell Search Systemで使用するビオチン化BSAを用いることなく、抗体のビオチン化標識率を低下させるという簡単な方法で、抗体ナノビーズが抗原のある時にのみ凝集するという状況を作り出すことが可能になり、本発明を完成させた。
【００９２】
［参考例１］MCF7-MCT5細胞株の樹立
（１）MCT5遺伝子のクローニング
MCF7細胞から作製された転移性を示すMCF7-14 (BMC Cancer 2010, 10, p.414)の中の、特定のクローン細胞（MCF7-14 CL6）を、受託番号：FERM BP-10944から樹立して用いた。
MCF7-14 CL6を培養し、Qiagen社のRNeasy Miniキットを用いて、total RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 2μgから、SuperScript III reverse transcriptase（Invitrogen）を用いて、逆転写（RT）反応を50℃で1時間行ってcDNAを合成し、85℃、5分間の加熱により、反応を停止させた。得られたcDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCR反応を行った。
【００９３】
プライマー配列
S16A4-F1 : 5'-AAAGGTACCATGCTGAAGAGGGAGGGGAAGG-3' (配列番号１３）
S16A4-R1：5'-AAATCTAGAGGTCAGACTGTTTTTCCATCTTTCG-3'（配列番号１４）
【００９４】
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および56℃、1分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを35サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素（ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ）を用いて、pEF6-myc/HisAベクター（Invitrogen社）へ組み込んだ。増幅断片をDNAシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれていることを確認した。以降では、この作製したベクターを「pEF6-MTC5-myc/HisA」と呼ぶ。
【００９５】
（２）MCT5安定発現株の作製
上記（１）で作製したpEF6-MCT5-mycHisAベクターを、制限酵素(PmeI)を用いて切断することで、MCT5の終始コドンの下流を切断した。一方で、pMXs-IGベクター(東京大学  北村俊雄教授よりライセンス購入した)を制限酵素(XhoI/SalI)で切断し、IRES-GFPをコードする遺伝子配列を切り出した。この遺伝子断片をKlenow fragment (Takara)を用いて平滑化し、制限酵素処理したpEF6-MCT5-mycHisAベクターと連結させた。以降ではこのベクターをpEF6-MCT5-IGと呼ぶ。
【００９６】
上記2種類のベクター(pEF6-MCT5-IG及びpEF6-IG)を、FUGENE6（ロシュアプライドサイエンス社製）を用いて、MCF7細胞へ遺伝子導入を行い、Blasticidin Sが25μg/mLとなるよう添加した、10％(v/v)の血清（Hyclone社）を含むRPMI1640培地（Sigma社）培地で培養し、薬剤に耐性を示す細胞を複数樹立した。この中から、蛍光顕微鏡下でEGFPの蛍光が見られる細胞を選択した結果、pEF6-SLC16A4-myc-IGベクターを導入した細胞として、MCF7-MCT5細胞株を樹立した。
【００９７】
［参考例２］IMI4C4aモノクローナル抗体、及びこれを産生するハイブリドーマの作製
（１）細胞培養
マウス骨髄腫株P3X63-Ag8（ATCC受託番号CRL-1580）、ヒト大腸癌細胞株HCT-116（ATCC受託番号CCL-247）、ヒト胎児腎細胞293Tを、それぞれ10%（v/v）の血清（Hyclone社製）を含むRPMI1640培地（Sigma社製）で80%コンフルエントを越えないように37℃、5%CO2下で48〜72時間培養および継代を行った。
【００９８】
（２）MCT5細胞内ドメイン4 (ICD4)遺伝子のクローニング
参考例１（１）で作製したプラスミドを鋳型とし、以下のプライマーを用い、KOD PLUS（TOYOBO社）を用いたPCR反応を行なうことで、MCT5のアミノ酸第196番目から第299番目をコードする塩基配列（配列番号１７）を含むDNAを増幅した。
【００９９】
プライマー配列
hSLC16A4 ICD4 F1：5'-Gcgcggatccgagacccatccatatcaaaagtg-3' (配列番号１５)
hSLC16A4 ICD4 R1：5'-gcgcgcgtcgacaggatttctaaagagagaaatgtc-3' (配列番号１６)
【０１００】
ICD4 DNA配列(配列番号１７)
agacccatccatatcaaaagtgagaacaattctggtattaaagataaaggcagcagtttgtctgcacatggtccagaggcacatgcaacagaaacacactgccatgagacagaagagtctaccatcaaggacagtactacgcagaaggctggactacctagcaaaaatttaacagtctcacaaaatcaaagtgaagagttctacaatgggcctaacaggaacagactgttattaaagagtgatgaagaaagtgataaggttatttcgtggagctgcaaacaactgtttgacatttctctctttagaaatcct
【０１０１】
ICD4 アミノ酸配列(配列番号１８)
RPIHIKSENNSGIKDKGSSLSAHGPEAHATETHCHETEESTIKDSTTQKAGLPSKNLTVSQNQSEEFYNGPNRNRLLLKSDEESDKVISWSCKQLFDISLFRNP
【０１０２】
PCR反応は、95℃、10分間のプレインキュベーションを行ない、次に95℃、15秒間のデナチュレーション、および58℃、1分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを40サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（BamHI及びSalI）で切断し、pET32bベクター（Invitrogen社）へ組み込んだ。これにより、N末端側にTrx-、S-及びHis-Tagを持ち、C末端側にHis-Tagを持つMCT5の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAを得た。
【０１０３】
このベクターでE. coli Rosseta gami (DE3) pLysS（Novagen社）を形質転換し、1％(w/v)のグルコースを含むLB培地（1％(w/v) トリプトン（Sigma社）、0.5％(w/v) Yeast extract（Sigma社）、0.5％(w/v) NaCl（Sigma社））で培養した。培地の濁度が600nmの波長で0.6となった後、1mM IPTG（WAKO社）を加え、16時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、SLC6A6細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約10mgのサンプルをBuffer A（1M塩酸グアニジン（Sigma社）、10mM DTT（Sigma社）、10mM EDTA（Sigma社））に溶解し、37℃で1時間反応させた。1LのBuffer B（50mM Tris、150mM NaCl、5％グリセロール、0.4mM 酸化型グルタチオン（Sigma社）、pH8.5）に緩やかに加え、4℃で18時間撹拌した。溶解したサンプルをNi sepharoseカラム（GE社）に供し、Buffer C（50mMリン酸カリウム緩衝液、150mM NaCl、200mM Imidazole、pH8.0）で溶出した。Imidazoleを含まないBuffer Cに透析して、精製しMCT5の細胞内領域部分タンパク質(ICD4)を得た。
【０１０４】
（３）免疫
上記で作製したICD4をフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl（約40μg/マウス）投与した。約3週間後、同じくICD4をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を7〜12回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてICD4約40μgを静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。
【０１０５】
（４）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株P3X63-Ag8と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、1×108個の脾臓細胞に対し0.25×108個の骨髄腫株となるように細胞を混合し、EP Buffer（0.3M Mannitol、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2)に細胞密度が0.25×108個/mLとなるよう再懸濁し、電気融合装置LF201（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞を1.6×105個/mLとなるようHAT培地（Invitrogen社製）に懸濁し、各ウエル200μLとなるよう96ウエルプレートに散布した。途中、HT培地を100μL添加し、11〜16日間培養後に顕微鏡下で観察すると、1ウエルあたり2〜12個のコロニーが形成された。
【０１０６】
（５）ELISA
ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、ICD4に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。ICD4をPBS(-)で希釈し、96ウエルのELISAプレート（Nunc社）に1ウエル当たり50 ngとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05% Tween 20を含むPBS(-)（以下、PBS-Tと記載する）350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS-Tを300μLずつ各ウエルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をICD4結合ELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS-Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、PODと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を10000倍希釈したものを各ウエル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、0.5 mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、20分間発色させた。1.5Nの硫酸で反応を停止した後、490nmの吸収を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。
【０１０７】
（６）モノクローナル抗体の取得
上記（５）で形成されたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の中から、上記（５）の方法でICD4に反応する抗体を選別した。また、ICD4を作製する際に付加したTrx-、S-、His-Tagに反応する抗体を除くために、pET32bベクターのみを大腸菌に導入し、上記（２）記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をTagと称する。
【０１０８】
ICD4に反応し、Tagに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、14クローンが取得された。この中から、特に力価の高かったクローンを選択し「IMI4C4a」と称した。なお、本明細書では、ハイブリドーマ細胞が産生する抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。ハイブリドーマ細胞「IMI4C4a」が生産する抗体に関する、培養上清を用いたELISAの結果では、当該抗体は、ICD4には反応するがTagには反応しないものであった。
【０１０９】
得られたIMI4C4a抗体については、重鎖可変領域（VH）の相補性決定領域（CDR）1〜3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１、２２、及び２３で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（VL）の相補性決定領域（CDR）1〜3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２６、２７及び２８で示されるアミノ酸配列である。また、重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列（配列番号１９に示す塩基配列によりコードされるもの）であり、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列は、配列番号２５で示されるアミノ酸配列（配列番号２４に示す塩基配列によりコードされるもの）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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