(57)【要約】      （修正有）【課題】眼疾患の治療に用いられる長時間患部の薬物濃度を維持できる放出制御組成物の提供。【解決手段】コラーゲン、アテロコラーゲン及びＡｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチドから選択される少なくとも１つであるペプチドヒドロゲルと、固体脂質及び液体脂質を含み、固体脂質が、トリベヘニン、グリセリルパルミトステアラート、ミリスチン酸トリグリセリド、パルミチン酸トリグリセリド及びステアリン酸トリグリセリドから選択される少なくとも１つであるナノ構造脂質キャリアーと、を含む、放出制御組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物。
【請求項２】
前記ペプチドヒドロゲルが、コラーゲン、アテロコラーゲン及びＡｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の放出制御組成物。
【請求項３】
前記脂質ナノ粒子が、ナノ構造脂質キャリアーである、請求項１又は２に記載の放出制御組成物。
【請求項４】
前記ナノ構造脂質キャリアーが、固体脂質及び液体脂質を含む、請求項３に記載の放出制御組成物。
【請求項５】
前記ナノ構造脂質キャリアーが、更に、界面活性剤を含む、請求項４に記載の放出制御組成物。
【請求項６】
前記固体脂質が、トリベヘニン、グリセリルパルミトステアラート、ミリスチン酸トリグリセリド、パルミチン酸トリグリセリド及びステアリン酸トリグリセリドからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項４又は５に記載の放出制御組成物。
【請求項７】
前記液体脂質が、Ｃ８−Ｃ１２  トリグリセリド、中鎖脂肪酸トリグリセリド及びスクアレンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ポリオキシル−３５ヒマシ油、ポリソルベート  ８０及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項９】
前記脂質ナノ粒子が、更に、四級アンモニウム化合物及び／又はＰＥＧ修飾リン脂質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項１０】
前記脂質ナノ粒子が、更に、薬物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項１１】
前記脂質ナノ粒子が、動的光散乱法より決定される平均粒子径５０ｎｍ〜５００ｎｍを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項１２】
投与形態が、局所投与である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項１３】
投与剤型が、注射剤、点眼剤、眼軟膏又は挿入剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【請求項１４】
眼科用である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の放出制御組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜、脈絡膜、視神経、硝子体及び強膜などの後眼部組織における眼疾患には難治性疾患が多く、その効果的な薬物治療法の開発が望まれている。投与形態としては、薬物を点眼投与して治療するのが一般的であるが、網膜、脈絡膜、視神経、硝子体及び強膜などの後眼部組織へは薬物が移行しにくい。そこで、後眼部疾患に対する薬物の投与形態として、硝子体内注射や結膜下注射などの局所投与が行われている。しかし、当該局所投与は患者への負担が大きいため、頻回投与を回避するべく、患部での薬物濃度を長時間持続させることが望まれている。
【０００３】
薬物送達システム（「ＤＤＳ」ともいう）製剤に使用される主な薬物送達担体の材料としては、天然に存在するポリマーや合成ポリマーが使用されている。天然に存在するポリマーとしては、例えば、ポリペプチドであるコラーゲン、多糖類であるヒアルロン酸やアルギン酸などが使用されている。合成ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」ともいう）、ポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」ともいう）、ポリ乳酸（「ＰＬＡ」ともいう）、ポリ乳酸共重合体などが使用されている。
【０００４】
コラーゲンは、３残基ごとにグリシン（Ｇｌｙ）が現れる繰り返しアミノ酸配列（Ｇｌｙ-Ｘ-Ｙ）を有し、Ｘ位やＹ位にはそれぞれプロリン（Ｐｒｏ）やヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が多く現れる。コラーゲンを酵素処理したアテロコラーゲンは、コラーゲンの抗原性を低くしたものであり、医療用のインプラント材料や組織工学用の足場材料に応用されている。例えば、特許文献１には、コラーゲン又はコラーゲン誘導体と共に注入後にｉｎ  ｓｉｔｕで共有結合を形成し得る架橋剤などを含有する徐放性の皮下用薬剤送達デポ剤が記載されている。
【０００５】
Ａｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチド（「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ」（登録商標）ともいう）は、１６個のアミノ酸配列の自己組織化ペプチドであり、ｐＨの変化又は溶液中の無機塩に反応することで、ナノファイバーを形成し、ゲル化（自己組織化）することが知られている。非特許文献１には、Ａｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチドが、親水性及び疎水性部分を有し、ピンドロール、キニーネ、チモロールの放出制御システムとして使用できることが記載されている。
【０００６】
一方、ＤＤＳ製剤の研究において、固体状態の脂質（固体脂質）から構成される固体脂質ナノ粒子（「ＳＬＣ」ともいう）や固体脂質及び液体脂質から構成されるナノ構造脂質キャリアー（「ＮＬＣ」ともいう）のような脂質ナノ粒子が注目されている。例えば、特許文献２には、固体脂質ナノ粒子及びナノ構造脂質キャリアーのような脂質ナノ粒子をポリマーによってコーティングしたものをＤＤＳとして使用することが記載されている。また、非特許文献２には、固体脂質ナノ粒子及びナノ構造脂質キャリアーのような脂質ナノ粒子を使用して、薬物や遺伝子治療用の遺伝子を網膜に送達することが記載されている。
【０００７】
しかしながら、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６-１３１６４８
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１１６９６３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４７４，  Ｉｓｓｕｅｓ  １‐２，  ２０  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  １０３−１１１
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｍａｒｃｈ  ２０１３，  ２９（２）：  １７３−１８８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、長期にわたって薬物を徐放することができる放出制御組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物が、長期にわたって薬物を徐放することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物。
（２）前記ペプチドヒドロゲルが、コラーゲン、アテロコラーゲン及びＡｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１つである、（１）に記載の放出制御組成物。
（３）前記脂質ナノ粒子が、ナノ構造脂質キャリアーである、（１）又は（２）に記載の放出制御組成物。
（４）前記ナノ構造脂質キャリアーが、固体脂質及び液体脂質を含む、（３）に記載の放出制御組成物。
（５）前記ナノ構造脂質キャリアーが、更に、界面活性剤を含む、（４）に記載の放出制御組成物。
（６）前記固体脂質が、トリベヘニン、グリセリルパルミトステアラート、ミリスチン酸トリグリセリド、パルミチン酸トリグリセリド及びステアリン酸トリグリセリドからなる群より選択される少なくとも１つである、（４）又は（５）に記載の放出制御組成物。
（７）前記液体脂質が、Ｃ８−Ｃ１２  トリグリセリド、中鎖脂肪酸トリグリセリド及びスクアレンからなる群より選択される少なくとも１つである、（４）〜（６）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（８）前記界面活性剤が、ポリオキシル−３５ヒマシ油、ポリソルベート  ８０及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群より選択される少なくとも１つである、（５）〜（７）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（９）前記脂質ナノ粒子が、更に、四級アンモニウム化合物及び／又はＰＥＧ修飾リン脂質を含む、（１）〜（８）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１０）前記脂質ナノ粒子が、更に、薬物を含む、（１）〜（９）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１１）前記脂質ナノ粒子が、動的光散乱法より決定される平均粒子径５０ｎｍ〜５００ｎｍを有する、（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１２）投与形態が、局所投与である、（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１３）投与剤型が、注射剤、点眼剤、眼軟膏又は挿入剤である、（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１４）眼科用である、（１）〜（１３）のいずれか一つに記載の放出制御組成物。
（１５）（１）〜（１４）のいずれか一つに記載の放出制御組成物の調製方法であって、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を混合する工程を含む、調製方法。
（１６）更に、固体脂質及び液体脂質を使用して脂質ナノ粒子を得る工程を含む、（１５）に記載の調製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、長期にわたって薬物を徐放することができる放出制御組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＲＰＥ１９を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す。
【図２】ＡＲＰＥ１９を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す。
【図３】ＨＵＶＥＣを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜放出制御組成物の構成＞
本発明の放出制御組成物は、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む。
【００１５】
＜ペプチドヒドロゲル＞
本発明の放出制御組成物に用いられるペプチドヒドロゲルは、ポリペプチド又はその誘導体であれば良く、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン又はＡｃ−（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ）４−ＣＯＮＨ２で表されるポリペプチドなどである。
【００１６】
＜ペプチドヒドロゲルの調製方法＞
本発明の放出制御組成物に用いられるペプチドヒドロゲルは、当該技術分野で公知の方法、例えば、ポリペプチドを溶媒（例えば、水など）に溶解するか、又はポリペプチドとクロスリンカー（架橋剤）を溶媒（例えば、水など）又は生体中で混合することによって、調製することができる。
【００１７】
＜脂質ナノ粒子の組成＞
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子として、固体状態の脂質（固体脂質）から構成される固体脂質ナノ粒子（「ＳＬＣ」）や固体脂質及び液体脂質から構成されるナノ構造脂質キャリアー（「ＮＬＣ」）を使用することができる。固体脂質ナノ粒子やナノ構造脂質キャリアーは、更に、界面活性剤を含むことができる。
【００１８】
＜固体脂質＞
本発明に用いられる固体脂質として、４０℃以上の融点を有する脂質を使用することができる。
【００１９】
本発明に用いられる固体脂質は、例えば、固体トリグリセリド、固体ジグリセリド、固体モノグリセリド、固体グリセリドの組み合わせ、長鎖脂肪族アルコール、中鎖長鎖脂肪酸又は長鎖脂肪酸の脂肪族アルコールエステル、ステロール、コレステロール、コレステロールエステル、脂肪族アミン、ワックス類、セラミド、水素化（硬化）植物油などである。
【００２０】
本発明に用いられる固体脂質は、具体的には、以下のような固体グリセリド、例えば、コンプリトール（登録商標）  ８８８  ＡＴＯ（「トリベヘニン」ともいう）、プレシロール（登録商標）  ＡＴＯ  ５（「グリセリルパルミトステアラート」ともいう）、ダイナサン（登録商標）  １１４（「ミリスチン酸トリグリセリド」ともいう）、ダイナサン（登録商標）  １１６（「パルミチン酸トリグリセリド」ともいう）、及びダイナサン（登録商標）  １１８（「ステアリン酸トリグリセリド」ともいう）などが挙げられ、好ましくはコンプリトール（登録商標）  ８８８  ＡＴＯ（「トリベヘニン」）である。
【００２１】
＜液体脂質＞
本発明に用いられる液体脂質は、融点が０℃未満、好ましくは室温で、液体又は半液体である。
【００２２】
本発明に用いられる液体脂質は、例えば、植物油、魚油、藻類油、石油由来の油、短鎖脂肪族アルコール、中鎖脂肪族アルコールまたは短鎖アルコールとの脂肪酸エステル、中鎖脂肪酸トリグリセリド、脂肪族アルコールエーテルなどが挙げられる。
【００２３】
本発明に用いられる液体脂質は、具体的には、例えば、ミグリオール（登録商標）  ８１２（「Ｃ８−Ｃ１２  トリグリセリド」ともいう）、Ｌａｂｒａｔａｃ（登録商標）  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ１３４９（「中鎖脂肪酸トリグリセリド」ともいう）、及びスクアレンなどであり、好ましくはミグリオール（登録商標）  ８１２（「Ｃ８−Ｃ１２  トリグリセリド」）である。
【００２４】
＜界面活性剤＞
本発明に用いられる界面活性剤は、例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤などが挙げられ、好ましくは非イオン性界面活性剤である。
【００２５】
本発明に用いられる非イオン性界面活性剤は、具体的には、例えば、コリフォール（登録商標）  ＥＬ（「ポリオキシル−３５ヒマシ油」ともいう）、ツイーン（登録商標）  ８０（「ポリソルベート  ８０」ともいう）、プルロニック（登録商標）  Ｆ６８（「ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール」ともいう）などが挙げられ、好ましくはコリフォール（登録商標）  ＥＬ（「ポリオキシル−３５ヒマシ油」）である。
【００２６】
＜脂質ナノ粒子に含まれるその他成分＞
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子は、例えば、リン酸塩などの緩衝剤や塩化ナトリウム、グリセロールなどの等張化剤などを適宜含むことができる。
【００２７】
また、本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子は、例えば、四級アンモニウム化合物及び／又はＰＥＧ修飾リン脂質を含むことができる。
【００２８】
＜四級アンモニウム化合物＞
本発明に用いられる四級アンモニウム化合物は、例えば、ベンザルコニウム塩化物が挙げられる。ベンザルコニウム塩化物は、［Ｃ６Ｈ５ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２Ｒ］Ｃｌで表される化学構造を有し、そのＲがＣ８Ｈ１７〜Ｃ１８Ｈ３７であるもの又はそれらの混合物である。例えば、ＲがＣ１２Ｈ２５であるＮ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアンモニウム塩化物、ＲがＣ１４Ｈ２９であるＮ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニウム塩化物、ＲがＣ１６Ｈ３３であるＮ−ベンジル−Ｎ−セチルジメチルアンモニウム塩化物（「ＣＫＣ」ともいう）が挙げられ、好ましくはＣＫＣである。
【００２９】
本発明に用いられるＰＥＧ修飾リン脂質は、リン脂質の修飾に用いられるＰＥＧの平均分子量が、例えば、３５０〜１００００であり、好ましくは１０００〜５０００であり、リン脂質が、例えば、ジ−Ｃ１２−２４アシル−グリセロ−ホスホエタノールアミンであるものが挙げられる。具体的には、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（「１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００]（アンモニウム塩）」ともいう）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００（「１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００]（ナトリウム塩）」ともいう）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−葉酸（「１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[葉酸（ポリエチレングリコール）−２０００]（アンモニウム塩）」ともいう）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＲＧＤ（「Ａｒｇ（Ｒ）−Ｇｌｙ（Ｇ）−Ａｓｐ（Ｄ）モチーフペプチドが複合された１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００]」ともいう）などが挙げられる。
【００３０】
＜脂質ナノ粒子に含まれる薬物＞
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子は、必要に応じて、薬物を含むことができる。薬物としては、例えば、ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、フルオロメトロン、ハイドロコルチゾン、フルオシノロンアセトニドなどのステロイド剤又はそれらの誘導体；プロゲステロンやテストステロンなどのホルモン剤又はそれらの誘導体；ブロモフェナック、ジクロフェナックなどの抗炎症剤；ＴＮＦ−α阻害剤、抗ＴＮＦ−α抗体、ＰＤＥ−ＩＶ阻害剤、ＩＣＥ阻害剤などのサイトカイン抑制剤；シクロスポリン、タクロリムスなどの免疫抑制剤；ガンシクロビル、アシクロビル、インターフェロンβなどの抗ウイルス剤；キノロン系化合物、クラリスロマイシン、エリスロマイシンなどの抗菌剤；カプトプリルなどのＡＣＥ阻害剤；プラバスタチン、シンバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤；フルオロウラシル、メトトレキサート、ＭＭＰ阻害剤などの抗癌剤；エンドスタチン、ＶＥＧＦ阻害剤、抗ＶＥＧＦ抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＫＣ阻害剤、接着因子阻害剤、血管静止性ステロイドなどの血管新生阻害剤；ＭＫ−８０１、チモロール、クレアチン、タウリン、ＢＤＮＦなどの神経保護剤・神経栄養因子、アセタゾラミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤、ウロキナーゼなどの血栓溶解剤、循環改善剤、抗真菌剤、カテキン、ビタミンＥなどの抗酸化剤、ビスホスホネートなどの骨吸収阻害剤、レチノイン酸及びその誘導体などの視機能維持に関わる薬剤などが挙げられる。
【００３１】
＜脂質ナノ粒子の調製方法＞
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子は、固体脂質及び液体脂質を使用して調製することができ、必要に応じて、界面活性剤及びその他の成分を更に使用して調製することができる。
【００３２】
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子の調製方法は、当該技術分野で公知の方法、例えば、高温若しくは低温高圧均質化法、又はマイクロエマルション法によって、調製することができる。
【００３３】
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子の調製方法は、例えば、以下の工程：
（１）固体脂質の融点より高い温度で加熱して、固体脂質及び液体脂質、必要に応じて、更に界面活性剤及びその他の成分を含む混合物を得る工程、
（２）得られた混合物と熱水又は界面活性剤を含む熱水を加えて撹拌する工程、
（３）超音波処理又は高圧ホモジナイザーによってエマルション溶液を得る工程、及び
（４）得られたエマルション溶液を冷却する工程
を含む。
【００３４】
＜脂質ナノ粒子中の各成分含有量＞
【００３５】
本発明に用いられる脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子中に、通常２０重量％〜８０重量％、好ましくは３５重量％〜６０重量％で、固体脂質を含有する。
【００３６】
本発明に用いられる脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子中に、通常５重量％〜５０重量％、好ましくは１０重量％〜３５重量％で、液体脂質を含有する。
【００３７】
本発明に用いられる脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子中に、通常５重量％〜３５重量％、好ましくは１０重量％〜２５重量％で、界面活性剤を含有する。
【００３８】
＜脂質ナノ粒子の平均粒子径＞
本発明の放出制御組成物に用いられる脂質ナノ粒子は、動的光散乱法より決定される平均粒子径が、通常５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、好ましくは７５ｎｍ〜３５０ｎｍであり、１００ｎｍ〜２５０ｎｍである。動的光散乱法の測定器としては、例えば、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＮａｎｏＺＳ又はＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用することができる。
【００３９】
＜放出制御組成物＞
本発明の放出制御組成物は、本発明に用いられる脂質ナノ粒子及び本発明に用いられるペプチドヒドロゲルを含むことができる。
【００４０】
本発明の放出制御組成物は、本発明に用いられる脂質ナノ粒子が、本発明に用いられるペプチドヒドロゲルに分散していることを特徴とする。
【００４１】
＜放出制御組成物の調製方法＞
本発明の放出制御組成物の調製方法は、前記ペプチドヒドロゲル及び前記脂質ナノ粒子を混合する工程を含む。
【００４２】
本発明の放出制御組成物の調製方法において、前記ペプチドヒドロゲルと前記脂質ナノ粒子の混合比は、例えば、１０：１〜１：１０であり、好ましくは５：１〜１：５であり、更に好ましくは２：１〜１：２である。
【００４３】
＜放出制御組成物の投与形態＞
本発明の放出制御組成物は、例えば、患者に対して局所投与される。局所投与としては、例えば、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢内投与、テノン嚢下投与、前房内投与、点眼投与などが挙げられる。
【００４４】
＜放出制御組成物の投与剤型＞
本発明の放出制御組成物は、医薬活性成分（例えば、医薬化合物又はその薬学的に許容される塩）と、必要に応じて薬学的に許容される添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。局所投与に適した剤型としては、例えば、点眼剤、眼軟膏、軟膏（眼軟膏を除く）、注射剤、眼内インプラント用製剤（涙点プラグを含む）、挿入剤、貼布剤などが挙げられる。なお、これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用いて調製することができる。更に、本発明の放出制御組成物は、マイクロスフェアーなどのＤＤＳ化製剤にすることもできる。
【００４５】
＜放出制御組成物の医薬用途＞
本発明の一態様は、放出制御組成物を含む、後眼部組織、例えば硝子体、網膜、脈絡膜、強膜又は視神経における疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物である。後眼部疾患としては、例えば、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、網膜色素変性症、増殖性硝子体網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、ぶどう膜炎、レーベル病、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、中心性漿液性脈絡網膜症、中心性滲出性脈絡網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、多発性脈絡膜炎、新生血管黄斑症、網膜動脈瘤、網膜血管腫状増殖、これらの疾患に起因する視神経障害、緑内障に起因する視神経障害及び虚血性視神経障害などが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例及び試験例を示すが、これらの例は本発明をより良く理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
＜試験例１：脂質ナノ粒子の消失／放出試験＞
＜ヒドロゲルの調製＞
ヒドロゲル前溶液は、Ｈｙｓｔｅｍ（登録商標）細胞培養スキャフォールドキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。５００μＬのＧｙｃｏｓｉｌ（登録商標）（チオール修飾ヒアルロン酸）ヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸ナトリウム誘導体）及び１μＬのクロスリンカー（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ（登録商標）；ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ））を混合して得た。
ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）は、クロスリンカーを使用せず、そのままヒドロゲル（ペプチドヒドロゲル）前溶液として使用した。
【００４８】
＜脂質ナノ粒子の調製＞
・脂質の前処理
１．必要に応じ、適当量の構成成分（ＰＥＧ修飾リン脂質など）をクロロホルムに溶解させ、得られた溶液をガラスバイアルにピペットで加えた。
２．溶液のクロロホルムを窒素ガス気流で留去した。
・脂質ナノ粒子の調製
３．０．６ｇのコンプリトール（登録商標）  ８８８  ＡＴＯを計量し、ガラスバイアルに加えた。
４．０．００１ｇのナイルレッド及び０．００２ｇＣＫＣを計量し、ガラスバイアルに加えた。
５．０．４ｇのミグリオール（登録商標）  ８１２を計量し、ピペットでガラスバイアルに加えた。
６．ホットプレート（１５０℃）上で、磁気回転子（１，０００ｒｐｍ）で３分間撹拌して、脂質を溶解した。
７．予め温めた（約８０〜９０℃）３％のコリフォール（登録商標）  ＥＬ配合ＰＢＳ又は２〜２．６％のグリセロール水溶液１０ｍＬを、３％のコリフォール（登録商標）  ＥＬと共に、常に撹拌している状態で（１，０００ｒｐｍ）脂質混合物に加えた。
８．ホットプレート上で、脂質混合物を磁気回転子で３分間撹拌した。
９．脂質混合物を、８０〜８５℃で１０〜３０分間ソニケートして、時々振盪して、均一なエマルション（脂質ナノ粒子）を得た。
１０．脂質混合物を氷上で３０分間、次いで室温で６０〜１２０分間、磁気回転子で撹拌した。
１１．得られた脂質ナノ粒子の物理化学的性質はＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＮａｎｏＺＳ又はＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）を用いて測定した。サイズ及びζ−ポテンシャル測定は、脂質ナノ粒子をミリＱ水で１／１０ｖ／ｖ比に希釈して実施した。表１に調製した脂質ナノ粒子の処方を示す。
【００４９】
【表１】
2017095386.tif 000002
【００５０】
＜ヒドロゲル（ペプチドヒドロゲル）及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物の調製＞
先に調製した脂質ナノ粒子とヒドロゲル（ペプチドヒドロゲル）を等量で使用して混合し、放出制御組成物を調製した。
【００５１】
＜脂質ナノ粒子の消失／放出試験：薬物の徐放効果＞
放出制御組成物、最終１００μＬを、３７℃で１．５ｍＬのＰＢＳ中に注入した。流出液（ＰＢＳ）のすべてを、各設定時間点でゆっくり回収した。更に、新しい１．５ｍＬのＰＢＳを加え、次いで水浴中に３７℃で設置して試験を続けた。回収したサンプル１００μＬに９００μＬのメタノールを加え、ナイルレッド放出量を蛍光マクロプレートリーダーにて定量した。
表２に結果を示す。本発明の放出制御組成物は、長期にわたって薬物を徐放することが示された。
【００５２】
【表２】
2017095386.tif 000003
【００５３】
＜試験例２：脂質ナノ粒子の消失／放出試験＞
＜ペプチドヒドロゲルの調製＞
・アテロコラーゲン溶液の調製
アテロコラーゲン１００ｍｇをミリＱ水７．８５ｍＬ及び１ＮＨＣｌ１５０μＬに分散させ、そして低温室（４〜５℃）で一晩穏やかに撹拌した。５×ＰＢＳ（０．０１Ｍリン酸緩衝液、０．００２７Ｍ塩化カルシウム及び０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、２５℃で）２ｍＬを加えて、低温室（４〜５℃）で１〜２時間撹拌した。使用するまで４〜５℃で放置した。ペプチドヒドロゲル前溶液として、１ｍＬのアテロコラーゲン（５又は１０ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
【００５４】
＜脂質ナノ粒子の調製＞
試験例１にしたがって、脂質ナノ粒子を調製した。表３に調製した脂質ナノ粒子の処方を示す。
【００５５】
【表３】
2017095386.tif 000004
【００５６】
＜ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物の調製＞
試験例１にしたがって、ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物を調製した。
【００５７】
＜脂質ナノ粒子の消失／放出試験：薬物の徐放効果＞
試験例１にしたがって、脂質ナノ粒子の消失／放出試験を行った。
表４に結果を示す。本発明の放出制御組成物は、長期にわたって薬物を徐放することが示された。
【００５８】
【表４】
2017095386.tif 000005
【００５９】
＜試験例３：脂質ナノ粒子の細胞への取り込み評価試験＞
＜脂質ナノ粒子の調製＞
【００６０】
・脂質の前処理
１．適当量のＰＥ−ＣＦ（「ジオレオイルグリセロホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシフルオレセイン・アンモニウム塩」ともいう）及びＰＥＧ修飾リン脂質をクロロホルムに溶解させ、得られた溶液をガラスバイアルにピペットで軽量して加えた。なお、ＰＥＧ修飾リン脂質である、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＲＧＤは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ（Ｍａｌはマレイミド基を示す）とＲＧＤ（アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の配列からなるペプチド）とを反応させて調製した。
２．溶液のクロロホルムを窒素ガス気流で留去した。
・脂質ナノ粒子の調製
３．０．６ｇのコンプリトール（登録商標）  ８８８  ＡＴＯを計量し、ガラスバイアルに加えた。
４．０．４ｇのミグリオール（登録商標）  ８１２を計量し、ピペットでガラスバイアルに加えた。
５．ホットプレート（１５０℃）上で、磁気回転子（１，０００ｒｐｍ）で３分間撹拌して、脂質を溶解した。
６．予め温めた（約８０〜９０℃）３％のコリフォール（登録商標）  ＥＬ配合ＰＢＳ又は２〜２．６％のグリセロール水溶液の適量を、常に撹拌している状態で（１，０００ｒｐｍ）脂質混合物に加えた。
７．ホットプレート上で、脂質混合物を磁気回転子で３分間撹拌した。
８．脂質混合物を、８０〜８５℃で１０〜３０分間ソニケートして、時々振盪して、均一なエマルションを得た。
９．脂質混合物を氷上で３０分間、次いで室温で６０〜１２０分間、磁気回転子で撹拌した。
１０．得られた脂質ナノ粒子の物理化学的性質はＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＮａｎｏＺＳ又はＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）  ＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）を用いて測定した。サイズ及びζ−ポテンシャル測定は、脂質ナノ粒子をミリＱ水で１／１０ｖ／ｖ比に希釈して実施した。表５に調製に使用した脂質ナノ粒子の処方を示す。
【００６１】
【表５】
2017095386.tif 000006
【００６２】
＜細胞取り込み試験＞
１．細胞（ＡＲＰＥ１９又はＨＵＶＥＣ）を、６穴又は１２穴プレートに播種した。
ＡＲＰＥ１９：１２穴プレートにウエルあたり１５０，０００細胞又は６穴プレートにウエルあたり５００，０００細胞を播種した。
ＨＵＶＥＣ：１２穴プレートにウエルあたり５０、０００細胞又は６穴プレートにウエルあたり８０，０００細胞を播種した。
２．翌日まで培養した後に、培地を無血清培地０．７５ｍＬ（１２穴プレート）又は１ｍＬ（６穴プレート）に交換し、脂質ナノ粒子（ＮＬＣ（処方８）、ＰＥＧ−ＮＬＣ（処方９）、Ｆｏｌ（葉酸）−ＰＥＧ−ＮＬＣ（処方１０）、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＮＬＣ（処方１１））を総脂質濃度０．００２、０．００５、０．０１又は０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。
３．３７℃で２．５時間又は２４時間培養した。
４．細胞を、ＰＢＳ２ｍＬで３回洗浄し、Ｔｒｙｐｌｅｘで細胞を剥離した。
５．水中の１％パラホルムアルデヒド（ＰＦА）で固定した。
６．細胞サンプルを、ＦАＣＳで分析した。
結果を図１（ＡＲＰＥ１９を使用した実験）、図２（ＡＲＰＥ１９を使用した実験）、図３（ＨＵＶＥＣを使用した実験）に示す。図１〜３中、「ＮＬＣ」は処方８の脂質ナノ粒子、「ＰＥＧ−ＮＬＣ」は処方９の脂質ナノ粒子、「Ｆｏｌ−ＰＥＧ−ＮＬＣ」は処方１０の脂質ナノ粒子、「ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＮＬＣ」は処方１１の脂質ナノ粒子を示す。脂質ナノ粒子は細胞に取り込まれることが示された。特に、脂質ナノ粒子の表面に葉酸やＲＧＤを導入することで、脂質ナノ粒子の細胞への取り込みが向上することが示された。
【００６３】
＜試験例４：脂質ナノ粒子の消失／放出試験（ウサギを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ試験）＞
＜ペプチドヒドロゲルの調製＞
試験例１及び２の記載に基づいて、ヒドロゲル前液（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標））を調製した。
【００６４】
＜脂質ナノ粒子の調製＞
試験例１にしたがって、脂質ナノ粒子を調製した。表６に調製した脂質ナノ粒子の処方を示す。
【００６５】
【表６】
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【００６６】
＜ペプチドヒドロゲル及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物の調製＞
試験例１にしたがって、ペプチドヒドロゲル（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標））及び脂質ナノ粒子を含む放出制御組成物を調製した。
【００６７】
＜脂質ナノ粒子の消失／放出試験（ウサギを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ試験）：薬物の徐放効果＞
体重約２ｋｇのウサギ（Ｋｂｓ：ＪＷ、オス）をケタラール（登録商標）筋注用５００ｍｇおよびセラクタール（登録商標）２％注射液の混合液（７：１）の約１ｍＬ／ｋｇ筋肉内注射にて全身麻酔を施した後、本発明の放出制御組成物（０．０１％色素）を５０μＬ／眼にて、毛様体扁平部から２７Ｇ注射針装着マイクロシリンジを用いて硝子体腔内に刺入して投与した。硝子体内投与後１、７、１４日にソムノペンチル（登録商標）注射液の過麻酔により安楽殺を施して眼球を摘出し、眼球を凍結させた。眼球凍結後、剃刀を用いて眼球を分割し、強膜側の眼球片より水晶体を除去した後、強膜をピンで留置して硝子体（本発明の放出制御組成物を含む）を分離し、チューブに入れ氷冷した。本チューブに２−プロパノール  ５ｍＬを加え、１０分間ホモジナイズ後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、４°Ｃ、１０分間）し、上清を分取してＰＥ−ＣＦ量の測定に用いた。ＰＥ−ＣＦ量は、ＦＬ−ＵＦＬＣシステムにて、分析カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．×５０ｍｍ）、移動相Ａ  ［５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／アセトニトリル（１／１）］  および移動相Ｂ（２−プロパノール）のグラディエントメソッドおよび蛍光検出（λｅｍ：４９０ｎｍ４、λｅｘ：５１５ｎｍ）にて定量した。
表７に結果を示す。表７中、「ＮＬＣ」は処方１２の脂質ナノ粒子、「ＮＬＣ＋Ｐｕｒａ」は処方１３の脂質ナノ粒子と１％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘを等量ずつ含む放出制御組成物を示す。本発明の放出制御組成物は、長期にわたって薬物を徐放することが示された。
【００６８】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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