(57)【要約】【課題】大腸がんの転移を簡便にかつ精度よく検出するための方法、及び該方法に用いるキットを提供すること。【解決手段】被験者に由来する体液試料において、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の量を測定し、その測定値を指標にすることを特徴とする、大腸がんの転移検出方法、ならびにＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質に対する抗体又はその断片を含有してなる、大腸がんの転移を検出するためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に由来する体液試料において、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の量を測定し、その測定値を指標にすることを特徴とする、大腸がんの転移検出方法。
【請求項２】
前記測定値を基準値と対比して、その値が基準値よりも大きいと認められる場合を大腸がんの転移の存在の指標とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記体液試料が血液試料である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記体液試料が膜小胞画分である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質がエクソソームに由来するものである、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
前記測定を質量分析法により行う、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析法がMALDI-TOF MS法である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記測定が抗体を用いて行う、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項９】
前記抗体を使用する方法がELISA法である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質に対する抗体又はその断片を含有してなる、大腸がんの転移を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸がんの転移検出方法に関する。さらに詳しくは、サンプル中の特定のマーカーの量を測定することで、転移のある大腸がんを検出する方法、及び該方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸がん患者の３０〜４０％においては再発や転移が見られる。大腸がんの転移としては、肝臓への転移によるものが最も多い。大腸がんのスクリーニングには便潜血検査が主に使われている。この検査が陽性であった場合、その多くは内視鏡検査を行い、組織を採取して確定診断を行う。一方で、そのような組織診断は作業が煩雑であることから簡易な検査方法として、あるいは、切除術を受けた大腸がん患者の術後管理においては組織採取ができないことから、生体試料を用いたがんマーカー測定を行うことが主流となっている。
【０００３】
特許文献１では、大腸がんの患者の血液で発現量が変化したＲＮＡが挙げられており、そのうちの一つとしてＣＤ１７７に由来のＲＮＡが開示されている。特許文献２では、大腸組織由来のサンプルの位置などの情報を基に発現遺伝子を解析した結果、ＣＥＡＣＡＭ１が大腸の右側腫瘍及び左側腫瘍でその発現が低下していることが報告されている。
【０００４】
また、非特許文献１には、ＣＥＡＣＡＭ１の遺伝子の発現パターンと大腸がんの進行について報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１５６５２９号公報
【特許文献２】特開２００７−２２４００９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pathol. Oncol. Res. （2011） 17:67-74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
大腸がんの転移症例に対して行われる化学療法や分子標的治療法は、その抑制効果、或いは延命効果が必ずしも十分とは言えないのが現状である。また、手術後の患者には転移の有無に関わらず抗がん剤投与をするなど、患者に経済的・精神的な負担を強いている問題がある。一方、大腸がんの転移に対して特異性を有するマーカーは臨床において使用されていない。そこで、転移のある大腸がんを事前に予測できるようなマーカーが求められている。
【０００８】
本発明の課題は、大腸がんの転移を簡便にかつ精度よく検出するための方法、及び該方法に用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の〔１〕〜〔６〕に関する。
〔１〕  被験者に由来する体液試料において、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の量を測定し、その測定値を指標にすることを特徴とする、大腸がんの転移検出方法。
〔２〕  ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の量を測定する工程と、
前記工程における測定値と基準値とを対比する工程
とを含み、前記測定値が基準値よりも大きいと認められる場合が大腸がんの転移の存在の指標となる、大腸がんの転移検出方法。
〔３〕  治療後の被験者に由来する体液試料中のＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の量を測定する工程と、
前記工程における測定値と、治療前の測定値とを対比する工程と、
を含み、治療後における測定値が治療前における測定値より小さいと認められる場合に、前記治療が転移のある大腸がんの治療効果を有すると評価する工程を含む、転移のある大腸がんの治療の評価方法。
〔４〕  ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質に対する抗体又はその断片を含有してなる、大腸がんの転移を検出するためのキット。
〔５〕  ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質の転移のある大腸がんのマーカーとしての使用。
〔６〕  ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質を、被験者に由来する体液試料中から検出することを特徴とする、大腸がんの転移又は大腸がんの転移の疑いの情報を提供する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法もしくはキットにより、大腸がんの転移の有無を簡便にかつ精度よく判断することができる。また、本発明の方法もしくはキットにより、大腸がんの転移を特異的に検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、大腸がんのマーカー候補を示す図である。
【図２】図２は、健常者群、転移のない大腸がん患者群、及び転移のある大腸がん患者群それぞれの個体について、抽出された膜小胞画分における各マーカーの発現量を確認した結果を示す図である。
【図３】図３は、健常者群、転移のない大腸がん患者群、及び転移のある大腸がん患者群それぞれの個体検体について、エクソソームに由来する各マーカーの発現量を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、被験者における大腸がんの転移を検出するための方法であって、体液試料中の特定のマーカーの量を測定することで、転移のある大腸がんに罹患している可能性を判断することを特徴とする。従って、本発明は、大腸がんの転移検出用の情報を提供する方法でもある。具体的には、被験者に由来する体液試料において、後述の特定のマーカーの量を測定する工程と、前記工程における測定値を基準値と対比して、ここで、前記被験者における測定値が基準値よりも大きいと認められる場合に、被験者が大腸がんが転移している、もしくは転移のある大腸がんに罹患していると判断する工程を含む。
【００１３】
本発明における測定対象のタンパク質としては、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１が挙げられる。
【００１４】
本明細書におけるＣＥＡＣＡＭ８とは、ヒト由来のＣＥＡＣＡＭ８（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ８）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｐ３１９９７）のことであり、野生型については配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する３４９残基のポリペプチドであるが、この変異体又は、野生型及び／又は変異型のタンパク質の断片であってもよい。
【００１５】
本明細書におけるＣＥＡＣＡＭ１とは、ヒト由来のＣＥＡＣＡＭ１（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｐ１３６８８）のことであり、野生型については配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する５２６残基のポリペプチドであるが、この変異体又は、野生型及び／又は変異型のタンパク質の断片であってもよい。
【００１６】
本明細書におけるＣＤ１７７とは、ヒト由来のＣＤ１７７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｑ８Ｎ６Ｑ３）のことであり、野生型については配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する４３７残基のポリペプチドであるが、この変異体又は、野生型及び／又は変異型のタンパク質の断片であってもよい。
【００１７】
本明細書におけるＣ５ＡＲ１とは、ヒト由来のＣ５ＡＲ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｐ２１７３０）のことであり、野生型については配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する３５０残基のポリペプチドであるが、この変異体又は、野生型及び／又は変異型のタンパク質の断片であってもよい。
【００１８】
これらのタンパク質はいずれのタンパク質もその存在自体は公知であったが、転移のある大腸がん患者の体液試料中において、健常者や転移のない大腸がん患者よりも多く存在することを本発明者らが初めて見出して、本発明を完成するに至った（以降、これら４種類のタンパク質をまとめて、本発明のマーカーと記載することもある）。なお、前述のとおり本発明のマーカーのなかでも、ＣＥＡＣＡＭ１やＣＤ１７７については、大腸がんとの関係についての報告があるが、エクソソーム由来の試料で検出可能であることや、転移の有無との関連までは検証されていない。また、特許文献２においては、大腸がんに罹患している場合にはＣＥＡＣＡＭ１の発現量が低下することが報告されており、本発明者らの発見とはその傾向は異なっている。さらに、非特許文献１によれば、大腸がん患者の各ステージにおけるＣＥＡＣＡＭ１の発現パターンには有意差がないと報告されている。
【００１９】
本発明のマーカーを、転移のある大腸がんのマーカータンパク質として同定した方法は、後述の実施例にて詳述するが、以下に簡単に説明する。先ず、大腸の良性腫瘍と大腸がんの患者群（転移の有無については区別しない）の腫瘍組織から調製した膜画分を用いて、公知のプロテオミクス手法により変動シグナルを生じるタンパク質を分離・同定し、候補タンパク質として選択した。次に、これらのタンパク質については以下の検証を行った。具体的には、大腸がんの患者群を転移の有無により２群に分けて、健常者群、転移のない大腸がん患者群、転移のある大腸がん患者群の各群の体液試料を用いて、前記候補タンパク質の量の群間比較を行った結果、本発明のマーカーを同定した。なお、大腸がんの患者群における転移の有無の判断は、画像診断により行った。
【００２０】
本明細書において、「大腸がんが転移している又は大腸がんの転移」とは、大腸がんの原発細胞が移動し、身体の他の部分に到達してがんを形成する、あるいは形成し得る状態にあることを意味する。また、本明細書において「転移のある大腸がん」とは、大腸がんの原発細胞が身体の他の部分において転移巣を形成している、あるいはその可能性がある原発性の大腸がんのことである。このとき、転移の程度又は転移巣の状態は特に限定されない。また「転移のない大腸がん」とは、転移巣の形成が見られない大腸がんをさす。
【００２１】
本発明の方法には、具体的には、タンパク質量の測定工程（工程Ａ）及び大腸がんの転移決定工程（工程Ｂ）が含まれる。以下に、本発明における各工程について詳細に説明する。
【００２２】
工程Ａとは、被験者に由来する体液試料において、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１からなる群から選択される１つ又は２つ以上のタンパク質の量を測定する工程をさす。
【００２３】
本明細書で用いられる「体液試料」としては、例えば、血液、尿、唾液、乳汁、鼻汁、脳脊髄液などが例示されるが、好ましくは、血液である。本明細書中「血液」としては、全血、血清、及び血漿を用いることができる。なお、体液試料の採取方法や調製方法は特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明のマーカーは、体液試料から調製されるエクソソーム、あるいは膜小胞画分からも検出されることから、これらを調製してから測定対象として用いることができる。膜小胞画分及びエクソソームのいずれも体液試料を超遠心法などにより凝集することで得られることが知られている。また、エクソソームは小胞顆粒であり、特異的に発現している抗原（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１４７、ＥＰＣＡＭなど）が知られているので、これらに特異的に結合できる抗体を用いて免疫沈降させることで捕捉できることが知られている（例えば、国際公報２０１３／０９９９２５号）。
【００２５】
本発明のマーカーの測定は、公知の方法に従って行うことができる。具体的には、例えば、質量分析方法や測定対象のマーカーを特異的に認識できる抗体を用いる方法が好適例として挙げられる。
【００２６】
質量分析法としては、MALDI（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法）型質量分析装置、ESI（エレクトロスプレイイオン化法）型質量分析装置等を用いる質量分析方法が挙げられ、タンパク質の一部のペプチドから定量する方法であってもよい。なかでも、MALDI型質量分析装置を用いるMALDI-TOF MS法が好ましい。
【００２７】
抗体を用いる方法（免疫学的測定法）としては、例えば、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（ELISA、EIA）、発光免疫測定法、蛍光免疫測定法（エクソスクリーン法等）が挙げられる。かかる方法において用いる抗体は、本発明のマーカーを良好な感度及び特異性で検出又は捕捉することができるという特徴を有する。このような抗体は、当業者に周知の方法により作製することができ、例えば、モノクローナル抗体又はその断片を好適に用いることができる。また、前記モノクローナル抗体又はその断片は、通常公知の方法に従って、標識化や固相化して用いることができる。なお、本明細書において、「モノクローナル抗体の断片」としては、前記のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様に目的のタンパク質に対して特異的な結合性を有する断片を意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる。
【００２８】
かくして、マーカー量を測定することができる。得られた測定値を用いて、以下の工程Ｂを行う。
【００２９】
工程Ｂとは、工程Ａで得られたマーカーの量に基づいてインビトロで大腸がんの転移を決定（又は評価）する工程である。決定方法の一例として、被験者のマーカーの量が基準値と比較して統計学的に有意に多いときに、大腸がんが転移している、もしくは転移のある大腸がんに罹患していると決定（又は評価）する方法が挙げられる。本明細書中「決定」とは、本発明の検出方法において得られた測定結果に基づいて、大腸がんの転移、もしくは転移のある大腸がんの罹患を評価することを指し、評価には、医師による判定を含まないことを意図している。
【００３０】
「基準値」とは、例えば、健常者におけるマーカー量の測定値とすることができる。好ましくは、複数の転移のある大腸がん患者由来であることが確認された試料（陽性試料）に含まれるマーカー量と、複数の健常者由来（もしくは転移のない大腸がん患者由来）であることが確認された試料（陰性試料）に含まれるマーカー量とを測定して対比し、その結果に基づき最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値とする。
【００３１】
「健常者」とは、少なくとも大腸がん（転移の有無をとわない）に罹患していない個体、好ましくは健康な個体をいう。さらに、健常者は、被験者と同一の生物種であることを要する。例えば、検出に供する被験者がヒト（被検者）の場合には、健常者もヒト（本明細書では、以降「健常者」とする）でなければばらない。健常者の身体的条件は、被験者のそれと同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、身長、体重等が該当する。
【００３２】
健常者由来の体液試料としては、被験者由来の体液試料と同種の試料であることが好ましく、例えば、被験者由来の体液試料が血液である場合、健常者由来の体液試料も血液が好ましい。
【００３３】
健常者の体液試料におけるマーカーの量は、前記工程で説明をした被験者の体液試料におけるマーカーの量の測定方法と同様の方法で測定することが好ましい。健常者の体液試料におけるマーカーの量は、被験者の体液試料におけるマーカーの量を測定する都度、新たに測定することもできるが、予め測定しておいたマーカーの量を利用することもできる。特に、健常者の様々な身体的条件におけるマーカーの量を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被験者の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被験者との比較に最適な身体的条件を有する健常者のマーカーの量を即座に利用できるので便利である。
【００３４】
「統計学的に有意」とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合が挙げられる。それ故、測定値について「統計学的に有意に大きい」とは、被験者と健常者のそれぞれから得られたマーカーの量的差異を統計学的に処理したときに両者間に有意差があり、かつ被験者の前記マーカーの量が健常者のそれと比較して相対的に多いことをいう。例えば、体液試料中のマーカーの量に関して、被験者が健常者の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上多い場合が該当する。量的差異が３倍以上であれば信頼度は高く、統計学的にも有意に多いといえる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【００３５】
被験者の体液中のマーカーの量が基準値よりも統計学的に有意に多い場合、その被験者は大腸がんが転移している、もしくは転移のある大腸がんに罹患していると評価する。本発明において対象となる大腸がんの病期は、特に限定はなく、早期癌から末期癌に及ぶ。
【００３６】
このように、本発明の大腸がんの転移検出方法によれば、体液試料中のマーカーを、抗体を用いて免疫学的に測定する態様を含む。本発明の方法によって、被験者が転移のある大腸がんに罹患しているか否か、あるいは、大腸がんの転移の有無を決定又は評価することができるだけでなく、転移のある大腸がん患者と健常者の識別、あるいは、転移のある大腸がん患者と転移のない大腸がん患者の識別を可能にする。
【００３７】
また、前記解析において、例えば、被験者が転移のある大腸がん患者であると判断された場合においては、健常者のマーカー量を被験者の治療前のマーカー量に設定し、治療後のマーカー量を被験者のマーカー量として対比することで、治療後のマーカー量が減少していることが示された場合は、当該治療が転移のある大腸がんの治療に有効である可能性が高いと判断することができる。従って、本発明はまた、がん治療を受ける前と受けた後において、本発明のマーカー量を測定し、治療後の値が治療前のそれより小さい場合に、当該治療が効果を有すると判断することを特徴とする評価方法を提供することができる。ここでの「転移のある大腸がん」の治療の評価とは、原発巣である大腸がんの治療に加えて、転移先のがんの治療を評価することも含む。
【００３８】
本発明の別の態様では、大腸がんの転移（転移のある大腸がん）を検出するためのキット（以下、「大腸がん転移検出用キット」ともいう）が提供される。「大腸がん転移検出用キット」とは、転移のある大腸がんの罹患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度、あるいは大腸がんの転移の有無を評価するために、また大腸がんの転移の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。
【００３９】
本態様のキットは、その構成物として、大腸がんの罹患に関連して体液試料中、好ましくは、血液、血清、血漿、膜小胞画分、あるいはエクソソームにおいて発現が変動する本発明のマーカーを特異的に認識し、また結合可能な物質が包含される。具体的には、例えば、抗体若しくはその断片又はそれらの化学修飾誘導体が含まれる。これらの抗体は、固相担体に結合されていてもよい。その他、例えば、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのタンパク質、使用説明書等を含んでいてもよい。なお、本発明のマーカーを認識できる抗体又はその断片としては、前述の通りである。
【００４０】
これらのキットは、体液試料中の本発明のタンパク質量を測定する際に抗体を用いる方法（例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、エクソスクリーン法等）であれば、用いることができる。なお、体液試料がエクソソームである場合、本発明のタンパク質が定量されるのであれば、エクソソームに由来しないタンパク質も前記抗体により同時に検出されることがあってもよい。
【００４１】
本発明のキットを用いて、例えば、健常者と被験者の血液サンプル中に存在する本発明のタンパク質量を測定して、両者の発現量に有意差が生じた場合には、被験者における大腸がんの転移の決定及び／又は診断を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
【００４３】
実施例１（組織を用いたバイオマーカー候補膜タンパク質の選定）
大腸の良性腫瘍と大腸がん患者組織（「転移なし」及び「転移あり」を含む）から、常法に従って調製した膜画分についてｉｓｏｂａｒｉｃ  Ｔａｇｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ法（以下、「iTRAQ（登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）法」という）によるプロテオーム解析を行った。ここで見られた変動シグナルからタンパク質を同定し、さらなる検証のため、より定量精度の高いＳｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法（以下、「SRM法」という）によるプロテオーム解析を行った（結果は表示せず）。なお、このSRM法を行うに当たっては、iTRAQ法によるプロテオーム解析で同定された配列の安定同位体標識ペプチド（グライナー社から購入。以下、「SIペプチド」という）を混和させ、内部標準として用いることによって定量精度を向上させた。
【００４４】
実施例２（混合血液中の膜小胞画分における候補タンパク質発現の確認）
続いて、健常者4名の血清を混合した検体、転移のない大腸がん患者4名の血清を混合した検体、及び転移のある大腸がん患者4名の血清を混合した検体、の計3検体について膜小胞画分を調製し、実施例１において選択された候補タンパク質の発現量を調べた。なお、大腸がんの転移の有無は、病理所見及び開腹所見によって確認した。
【００４５】
膜小胞画分の調製は、次の方法で行った。具体的には、血清100μLにPBS 550μLを加え、2,000×g、4℃で30分間遠心後、0.22μmのspinカラムを用いてフィルター濾過した。その後、100,000×g、4℃で90分間超遠心後、沈殿物をPBSで洗浄し、再び100,000×g、4℃で90分間超遠心を行った。さらに、その沈殿物を50mM DTTを含むPBSで洗浄し、100,000×g、4℃で90分間超遠心後の沈殿物を膜小胞画分として得た。
【００４６】
得られた膜小胞画分は、界面活性剤（デオキシコール酸及びラウロイルサルコシン酸）を含むＰｈａｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ溶液（以下、「PTS溶液」という）で可溶化し、トリプシン消化後、酢酸エチルを加えて酸性条件にすること（相間移動溶解法（PTS法）という）で質量分析の際に悪影響となる界面活性剤を除いた。トリプシン消化したサンプルに、試験例１で用いたSIペプチドを内部標準ペプチドとして添加後、TSQ vantage質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、SRM法で測定し、プロテオーム解析を行った。
【００４７】
その結果、健常者及び転移のない大腸がん患者に比べて、転移のある大腸がん患者で増加したタンパク質として9種類、健常者に比べてがん患者（転移あり、転移なしを含む）で増加したタンパク質として1種類、健常者に比べてがん患者（転移あり、転移なしを含む）で減少したタンパク質として1種類を抽出することができた（図１）。
【００４８】
実施例３（個別検体での血液中の膜小胞画分における候補タンパク質発現の確認）
実施例２で抽出された候補タンパク質について、個別の血清サンプルを用いて検証と、さらなる絞り込みを行った。試験には、健常者20名、転移の認められないStage1又はStage2の大腸がん患者18名、及び転移のあるStage4の大腸がん患者19名の血清を用いた
【００４９】
具体的には、実施例２と同様にして膜小胞画分を調製し、血清40μLに相当する膜画分を界面活性剤（デオキシコール酸及びラウロイルサルコシン酸）を含むPTS溶液で可溶化し、トリプシン消化後、酢酸エチルを加えて界面活性剤を除いた。ここに、SIペプチドを添加してSRM法によるプロテオーム解析を行った。なお、ここで用いたSIペプチドは、アミノ酸配列情報をもとに、それぞれのタンパク質に特異的なペプチド配列（トリプシン消化断片）の安定同位体標識ペプチド（グライナー社から購入）を用いた。また、個別検体では混合検体の結果と同様の変化を示さなかった候補や、一部検体でのみ検出された候補を除外した。結果を図２に示す。図中の有意差検定は、Mann-Whitney U test検定に従って行った。
【００５０】
図２より、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１が、健常者に比べて、転移のある大腸がん患者で有意な増加が見られた。これは、血液中の膜小胞画分中に存在するＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１を測定することによって、転移のある大腸がんを検出することが可能であることを示している。さらに、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１は、転移の認められない大腸がん患者に比べても、転移のある大腸がん患者で増加する傾向を示し、なかでも、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、及びＣＤ１７７が有意な増加を示した。このことから、血液中の膜小胞画分中に存在するＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１の量を測定することによって、転移のある大腸がんと転移のない大腸がんを区別して、転移のある大腸がんを検出できることが示唆される。
【００５１】
実施例４（エクソソームにおけるにおける候補タンパク質発現の確認）
エクソソームのマーカータンパク質としてＣＤ６３を採用し、抗ＣＤ６３抗体を用いた免疫沈降法により血清からエクソソームを調製し、それに候補タンパク質が発現していないかを調べた。試験には、健常者2名、転移の認められないStage1又はStage2の大腸がん患者2名、及び転移のあるStage4の大腸がん患者2名の血清を供した。なお、抗ＣＤ６３抗体としては、Ａｎｔｉ  ＣＤ６３  ｆｏｒ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  （コスモバイオ社）を用いた。
【００５２】
先ず、抗体を用いた血清膜小胞画分の調製は次のとおりに行った。血清100μLにPBS 100μLを加えた後、磁気ビーズに抗ＣＤ６３抗体を共有結合させたレジンを加え、一晩4℃で反応させた。PBSで数回洗浄することで非特異的な結合物を除き、エクソソームを調製した。
【００５３】
次に、得られたエクソソームを界面活性剤（デオキシコール酸及びラウロイルサルコシン酸）を含むPTS溶液で可溶化し、トリプシン消化後、酢酸エチルを加えて界面活性剤を除いた。トリプシン消化したサンプルに、実施例３で用いたＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１のSIペプチドを内部標準ペプチドとして添加後、TSQ vantage質量分析計を用いてSRM法で測定、プロテオーム解析を行った。この時、超遠心法により調製した膜小胞画分も同時に測定を行い、比較対照とした。結果を図３に示す。なお、図３中、CD63-IP-SRMは、抗ＣＤ６３抗体で免疫沈降したエクソソームをSRM法により処理したサンプルであり、Centrifugation-SRMは、超遠心によるSRM法により処理した各サンプルを示す。
【００５４】
図３より、エクソソームにおいてもＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１７７、及びＣ５ＡＲ１は発現しており、それらの量は、超遠心法で調製した膜小胞画分のそれらの量と同じような傾向を示していた。健常者と転移の認められる大腸がん患者との間で明確な差があり、同様に、転移の認められない大腸がん患者と転移の認められる大腸がん患者との間でも明確な差が認められることが示された。このことは、血清エクソソーム上のこれらのタンパク質を定量することによって、転移のある大腸がんを検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の方法により、サンプル提供者が転移のある大腸がんの可能性が高いか否か、あるいは大腸がんが転移しているか否かを判定することができる。これにより、サンプル提供者は大腸がんの進行を阻止する手段を講じることができるため、有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列表の配列番号１は、ＣＥＡＣＡＭ８タンパク質のアミノ酸配列である。
配列表の配列番号２は、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列表の配列番号３は、ＣＤ１７７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列表の配列番号４は、Ｃ５ＡＲ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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