(57)【要約】      （修正有）【課題】分析精度および分析装置の品質安定性をともに向上させた高効率液体クロマトグラフィー（HPLC）のカラムを提供する。【解決手段】金属で構成された筒状のカラム外管５と、当該カラム外管の内表面に、当該内表面の形状に沿って密着した状態で配置されたカラム内管４と、を備え、当該カラム内管内の体積が9以上〜4200ｍｍ３以下であり、当該カラム内管は、少なくとも0.25Nの荷重が付与された耐摩耗試験後の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属で構成された筒状のカラム外管と、
当該カラム外管の内表面に、当該内表面の形状に沿って密着した状態で配置されたカラム内管と、を備え、
当該カラム内管内の体積が9以上〜4200ｍｍ３以下であり、当該カラム内管は、少なくとも0.25Nの荷重が付与された耐摩耗試験後の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下であることを特徴とする、カラム。
【請求項２】
2ｍｍ未満の内径を有する筒状のカラム外管と、
ポリエーテルエーテルケトンで構成され、筒状の形状を有し、前記カラム管の内側に配置されるとともに、カラム外管の内表面に、当該内表面の形状に沿って密着し、少なくとも0.25Nの荷重が付与された耐摩耗試験後の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下であるカラム内管と、
を備えることを特徴とする、カラム。
【請求項３】
前記カラム内管は、熱拡張性を有する樹脂で構成され、加熱処理により前記カラム外管の内表面に密着していることを特徴とする、請求項１または２に記載のカラム。
【請求項４】
前記カラム内管は、ポリエーテルエーテルケトンで構成されていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率液体クロマトグラフィー（以下、HPLCという）に用いられるカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、混合物を分離分析する方法として、クロマトグラフィーが知られている。HPLCはカラムクロマトグラフィーと呼ばれる分離法の一種であり、常圧下に比べ高圧にすることで短時間に分離分析できる。このHPLCでは、試料を分離するためのカラムと呼ばれる装置が用いられる。このカラムは筒状の形状を有しており、中に粒状の充填剤（例えばシリカゲル）が充填されている。
【０００３】
この従来のカラムには、金属のみ（例えばSUS）で構成されたものと、樹脂のみ（例えばポリエーテルエーテルケトン、以下PEEKという）で構成されたものと、金属製の外管と樹脂製の内管で構成されたものが知られている。しかし、金属のみで構成されたカラムでは、金属配位性の高い物質を分析する際にカラム内面で吸着が発生し、分析精度が悪化する虞がある。また、樹脂のみで構成されたカラムでは、耐圧性が悪いという問題があり、品質安定性を損なう虞がある。さらには、金属製の外管と樹脂製の内管で構成されたカラムでは、細径化できないという問題があった。これは、従来のカラムを製造する際、まず金属製の外管を準備し、この外管内に棒状の樹脂を充填した後、長手方向に孔を切削加工する必要があり、切削加工を行う器具のサイズに限界があるためである。このようなカラムにおいては、カラム内において充填される充填剤がカラム内の内表面の凹凸によって細密化および均一化が阻害され、分析精度が低下する虞がある。
また上記のように、高速液体クロマトク゛ラフィー（HPLC）用のカラムには、金属配位性の高い物質のカラム内面への吸着を防ぐため、不活性度が高い全体がPEEKで構成されたカラムが存在する（非特許文献１）。ここでHPLCの分析精度を向上させるためには、充填剤をより細密かつ均一に充填することが必要である。これは、図５（ａ）に示すように、充填剤が細密かつ均一に充填されたものと、図５（ｂ）に示すように、充填剤が不均一に充填されたものでは、充填剤の粒子同士の間の隙間にばらつきが生じ、カラム内を通過する試料の通過速度に影響を及ぼし、分析精度が低下するからである。このように、カラム内に充填材を充填する際にも、カラム内の内側と外側で充填材の流速が異なることにより、カラム内に充填材が十分に充填されず、分析結果においてピーク後部が裾を引くテーリング現象が生じ、分析結果の精度を著しく低下させる虞があった。
【０００４】
また、微量の試料を高精度かつ短時間で分析するためには、カラムの理論段数が高いことが必要である。理論段数とは、カラムの性能・効率を判断する指標の一つである。しかし、小型のカラムは内部の体積が小さいため、理論段数を高くするためには充填剤をできるだけ密に充填しなくてはならない。カラムに充填される充填剤は、溶剤に分散させた状態で流し込まれ、溶剤のみカラムから排出され、充填剤はカラム内に留る。図６示すように、充填剤はカラムの長さ方向に対して垂直な面を保ったまま充填されることが望ましいが、実際にはカラム内壁面での摩擦などにより、カラム中心を通る充填剤に比べて壁面に沿う充填剤は遅れて充填される。この差が大きいほどカラムの内壁面付近の充填剤の充填を密にすることは難しくなり、理論段数を高めることができない。理論段数が低下すると、分析精度を維持するためにはカラムの長手方向の長さをより長くし、理論段数増やす必要があるため、カラム内の体積が大きくなり、微量の試料を高精度かつ短時間で分析することができない。
【０００５】
ここで、カラム内壁面に沿う充填剤の流速が遅い要因の１つに内壁面の表面粗さがある。内壁面が滑らかなほど、カラム内壁面での流速の遅れは緩和できる。切削加工で形成された従来のカラムの内壁面表面粗さは、Ra＝0.25 μmである。この表面粗さの値は、内層のPEEKが切削加工によることに起因すると考えられる。
カラム内壁面が平滑であれば、上図のように内壁面付近での流速低下が抑えられ、カラムの底から均一かつ密に充填できるため単位体積当たりの充填剤を多くすることができる。つまり単位体積当たりの理論段数を高くできるため、必要な理論段数を得るためのカラム長は短くて済む。一方で内壁面の表面粗さが大きい場合は、充填剤の充填が均一ではないため密に充填することができない。そのため理論段数を稼ぐにはカラム長を長くする必要がある。また、カラム長が長いと、分析時に試料をカラムに通すために余計な圧力（好ましくは耐圧６０〜１００Ｍｐａ）が必要となるため、望ましくはない。
ここで、図７示すように、カラム内壁面粗さがRa＝0のとき、カラム内壁面に沿って充填剤が隙間なく並び、カラム底面に充填された1段目の並びがそのまま積み重なり、その段数が理論段数となる。ここで、同図の隙間Aにおけるカラム内壁面と充填剤との隙間に着目する。カラム内壁面は実際にはある程度の粗さがあり、隙間AにR/2を超える高さの凸部が存在すると充填剤の縦方向の並びが崩れることは明らかである。このとき、図８に示すように、1段目と2段目の充填剤の並び方は同じとは言えず、左図においては理論段数2とはならない。一方で右図のように、凸部がカラム内壁面と充填剤の隙間に比べて低ければ充填剤の並び方に影響を与えず、1段目と2段目の並び方は同じと見なせるので、理論段数は2となる。上で述べた凸部の高さの程度は、表面粗さRaの値で表わされる。充填剤の粒径と比較してRaを十分に低くすることができなければ、充填剤の並び方への影響は大きくなり、単位体積当たりの理論段数は小さくなり、分析精度が低下する虞れがある。
【０００６】
【非特許文献１】インターネット〈ＵＲＬ：http://www.idexcolumnhardware.com/jp/columns/bio-safe-column-systems-jp/〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、細経化されたカラムにおいて、カラムの内表面と充填材のそれぞれの接触角が大きく異なる場合には、充填剤を細密かつ均一に充填することができず、また分析精度が低下する虞れがある。
【０００８】
そこで、本発明は、分析精度を向上させ、かつ短時間で分析可能な高効率液体クロマトグラフィー（HPLC）のカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係るカラムは、金属で構成された筒状のカラム外管と、このカラム外管の内表面に、この内表面の形状に沿って密着した状態で配置されたカラム内管と、を備え、このカラム内管内の体積が9以上〜4200ｍｍ３以下であり、カラム内管は、少なくとも0.25Nの荷重が付与された耐摩耗試験後の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下であることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係るカラムは、カラム内管内の体積が9以上〜4200ｍｍ３以下と従来のカラム内の体積よりも小さく、生体試料に用いられる試料（例えば5000ｍｍ３）においても、カラム内全体に試料が流入され、精度よく分析することができるだけでなく、分析を要する試料が少量ですむため、短時間で分析を終えることができる。
また、カラム内管は、カラム外管の内表面に、この内表面の形状に沿って密着した状態で配置されている。ここで、カラム外管の内表面に、この内表面の形状に沿って密着した状態とは、図１０に示すように、カラム外管４０に対し、カラム内管５０の表面の凹凸により隙間が形成されたものではなく、カラム外管の形状に沿って隙間なくカラム内管が密着している状態をいう。また、カラム内管の内表面の算術平均粗さ（Ra）は0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｚ）は1.5μｍ以下である。このため、例えば２μｍの粒子径を有する充填剤が内表面の凹凸によって充填時の影響を受けず、滑らかに充填できるとともに、充填剤をより細密かつ均一に充填することができるため、分析精度をさらに向上させることができる。具体的には、内壁面粗さがRa＝0のカラムが存在するとき、充填剤の粒径を2 μmとするとカラムの長さ方向に充填剤は1 mm当たり500個が積み重なる。この積み重なった充填剤のそれぞれが属するカラムの長手方向の長さに対して垂直な面は全て同じ充填剤の並びをしている。つまり充填剤の並び方が同じ面が500段積み重なっているので、長さ方向1 mm当たり（＝単位長さ当たり）の理論段数は500となる。本発明カラムの耐摩耗試験後の内壁面粗さは実測値でRa＝0.1μｍ以下、Rｙ＝1.5μｍ以下であり、2 μmの充填剤と比較してRｙは十分小さい。ここで、耐摩耗試験とは、カラム内管に対し、研磨機（エアーグラインダ）に、所定の粗さ（♯１０００）の軸付砥石を用い、所定の圧力下（少なくとも0.25N）で研磨する試験をいう。この試験後のカラムにおいても、単位長さ当たりの理論段数は約400となる。ここでは内壁面粗さの影響を0.8掛けと仮定して、本発明カラムの単位長さ当たりの理論段数は500×0.8＝400程度となる。これに対し、上述した従来技術のようにカラム内の内壁面粗さがRa＝0.25 μm、Rｙ＝2.0 μmとする。Rｙ＝2.0 μmは充填剤の粒径と同等なので充填剤の並び方や積み重なり方を不均一にし、単位長さ当たりの理論段数は格段に低下する。本発明カラムに比べ約4倍のRaとRｙであることから理論段数は本発明カラムの約1/4に相当する100になる。
以上のように本発明にかかるカラムによれば、充填剤が内表面の凹凸によって充填時の影響を受けず、滑らかに充填できるとともに、充填剤をより細密かつ均一に充填することができるため、分析精度をさらに向上させることができる。
【００１１】
さらに、カラム内管は、熱拡張性を有する樹脂で構成され、加熱処理により前記カラム外管に密着していることを特徴とする。
【００１２】
またカラム内管は、ポリエーテルエーテルケトンで構成されていることを特徴とする。
【００１３】
カラム内管はポリエーテルエーテルケトン（以下、ＰＥＥＫという）で構成されているため、金属で構成されたものと比較して不活性度が高く、カラム内での試料の吸着が低減され、分析精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のカラムの構成を示す図である。
【図２】カラム本体の断面図である。
【図３】（ａ）は比較例における充填剤とカラム内管との関係を模式的に示す図であり、（ｂ）は実施形態における充填剤とカラム内管との関係を模式的に示す図である。
【図４】ＨＰＬＣの分析結果の違いを示す図であり、（ａ）は比較例の結果を示す図であり、（ｂ）は実施形態の結果を示す図である。
【図５】充填剤の理論段数による試料の通過速度を模式的に示す図であり、（ａ）は充填剤が細密かつ均一に充填されている図、（ｂ）は充填剤が不均一に充填されている図である。
【図６】カラム内管の表面粗さによる充填剤の充填状態を示す図である。
【図７】理論段数を説明するための図である。
【図８】カラム内管の表面粗さによる理論段数の差異を説明するための図である。
【図９】耐摩耗試験の構成を模式的に示す概念図である。
【図１０】比較例１のカラム外管とカラム内管の関わり合いを、模式的に示す部分拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下図面を参照して、本発明に係るカラムについて説明する。但し、本発明の技術的範囲はそれらの実施の形態に限定されず、特許請求の範囲に記載された発明との均等物に及ぶ点に留意されたい。
【００１６】
（実施形態に係るカラムの構成）
図１および図２は、実施形態に係るカラム１の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態に係るカラム１は、カラム本体２と、このカラム本体２の両端にそれぞれ設けられたナット３、３と、粒径２μｍのシリカゲルが充填された充填材（図示せず）とを備えている。なお、理解の容易のために、図１ではカラム本体２は全断面図であり、ナット３、３は片側断面図で示している。
【００１７】
図２は、カラムの径方向の断面図であり、同図に示すように、カラム本体２は、金属製（本実施形態ではSUS）の筒状のカラム外管４と、このカラム外管の内側に配置されたカラム内管５を有している。カラム内管４は、樹脂（本実施形態ではポリ・エーテル・エーテル・ケトン、以下、PEEKという）で構成され、筒状の形状を有し、カラム外管４の内表面に密着している。
【００１８】
ナット３、３はそれぞれ、カラム外管４の両端部においてそれぞれ螺合している。
【００１９】
（実施形態に係るカラムの製造方法）
本実施形態に係るカラムの製造においては、まず切削加工により製造されたカラム外管４およびナット３、３を準備する。このカラム外管４は内径１〜５ｍｍ（本実施形態では２ｍｍ）の貫通孔を有する。次に、押し出し成形によりカラム内管５を構成するＰＥＥＫ製のチューブを製造する。ここで製造されるチューブは、外径1.9ｍｍ、肉厚0.45ｍｍを有している。次に、上記のチューブをカラム外管４の貫通孔に挿通し、カラム外管４の片端を封止した上で、１５５℃の温度下において他端側からチューブ内に窒素ガスを注入し、所定時間（本実施形態では１５秒）経過後に、カラム外管４を浸水させ冷却する。これにより、カラム外管４の貫通穴の内側において、チューブ状のカラム内管５が内圧により拡張し、カラム外管４の内表面においてカラム内管５が密着するとともに、内径が１ｍｍのカラム内管５が形成される。
【００２０】
（比較例に係るカラムの構成）
次に、比較例１について説明する。比較例１はカラム内管が切削加工によって形成されている点が上記の実施形態と異なっており、その他の構成は同じである。比較例１に係るカラムの製造方法は、実施形態に係るカラム同じく、カラム外管４およびナット３、３を準備する。次に、外径２ｍｍの円柱状の樹脂棒（ＰＥＥＫ製）を作製する。次に、この樹脂棒をカラム外管４の貫通穴に挿通する。次にこの挿通された樹脂棒の長手方向の中心軸に沿って、内径１ｍｍの貫通穴を切削加工により形成することにより製造される。
次に、比較例２について説明する。比較例２はカラム内管がPEEK以外の樹脂で構成されている点が上記の実施形態と異なっており、その他の構成は同じである。比較例２に係るカラムの製造方法は、実施形態に係るカラムと同様に、カラム外管４およびナット３、３を準備する。次に、カラム内管として、押し出し成形によりカラム内管５を構成するパーフロロアルコキシアルカンポリマー（以下、「ＰＦＡ」という）製のチューブを製造する。ここで製造されるチューブは、外径1.9ｍｍ、肉厚0.45ｍｍを有している。次に、上記のチューブをカラム外管４の貫通孔に挿通し、カラム外管４の片端を封止した上で、１５５℃の温度下において他端側からチューブ内に窒素ガスを注入し、所定時間（本実施形態では１５秒）経過後に、カラム外管４を浸水させ冷却する。これにより、カラム外管４の貫通穴の内側において、チューブ状のカラム内管５が内圧により拡張し、カラム外管４の内表面においてカラム内管５が密着するとともに、内径が１ｍｍのカラム内管５が形成される。
【００２１】
（表面粗さの測定方法）
次に、カラム内管の内周面の表面粗さを測定する方法について説明する。測定方法は、表面粗さに関するＪＩＳ２００１年規格に準拠している。測定装置はサーフテストＳＪ−４０２（株式会社ミツトヨ）を用い、測定条件としてカットオフを０．２５ｍｍ、測定長を５ｍｍ、測定速度を０．５ｍｍ/ｓに設定した。測定した表面粗さの種類は、算術平均粗さ（Ｒａ）と最大高さ（Ｒｙ）である。
また、表面粗さの測定を行うにあたり、以下の耐摩耗試験を行った。図９は、耐摩耗試験の試験装置の構成を模式的に示す図である。本試験では、まずカラム内管５となるチューブを所定の試料長（50ｍｍ）で準備し、このチューブの中に芯材（ＳＵＳ製）１０を挿通する。次に、この芯材１０の両端をデジタルフォースゲージ（エー・アンド・デイ社製、AD-4932A）１１に連結する。次に、研磨機（下記の軸付砥石のみ図示）１２となるエアーグラインダ（TRUSCO社製、TMAG10SN）に、所定の粗さ（♯１０００）の軸付砥石（外径4ｍｍ）を取り付け、回転速度60000ｒｐｍにて回転させる。次に、芯材１０の両端を同図の矢印方向に引っ張り、所望の荷重（0.25N、0.49N、0.98N）が付与された状態で、上記の研磨機１２の砥石部分に所望の試験時間（5秒）押し付けた。この耐摩耗試験後の本実施形態、比較例１および比較例２のカラム内管５の表面粗さを以下に示す。
【００２２】
上記の表面粗さによって測定された実施形態および比較例に係るカラムの内周面の算術平均粗さ（Ｒａ）と最大高さ（Rｙ）を次の表１に示す。以下の測定結果は、一定のサンプル（ｎ数は３）から得られた結果の平均値を示す。本実施形態のカラムのように、カラム内管の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下となるためには、少なくとも0.25N以下の荷重が必要である。好ましくは、カラム内管の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下となるためには、0.49N以下の荷重が必要である。さらに好ましくは、カラム内管の内表面の算術平均粗さ（Ra）が0.1μｍ以下であり、かつ最大高さ（Rｙ）が1.5μｍ以下となるためには、0.98N以下の荷重が必要である。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
図３（ａ）に示すように、充填剤の粒子が、カラム内管５の内表面の凹凸に入り込み、詰まってしまう虞があるのに対し、図３（ｂ）に示すように、実施形態に係るカラムはカラム内管５の内表面が滑らかであり、カラム内管の内表面の凹凸に充填剤の粒子が入り込み、詰まってしまうことない。このように、カラム内管５の内周面の凹凸により、充填剤の配置が乱れ、理論段数に変化が生じることは図３からも明らかである。
【００２５】
次に、実施形態および比較例に係るカラムの充填剤の理論段数の違いについて述べる。カラム内管５の内径を1 mmにし、長さ100 mmとした場合、カラム内管５の内周面が完全に平滑であれば粒径2 μmの充填剤は図５（ａ）のように配置される。このとき、充填剤はカラムに対し長手方向に50,000段重なる。このように理想的に充填剤が5万段重なった状態を「理論段数：50,000」と定義する。実施形態に係るカラムにおいては、最大高さ（Ｒｙ）＝0.5 μmであることや、そもそも充填剤の粒径にもばらつきがあることを考えれば理想状態に比べて充填剤の配置にス゛レが生じるのは必至であり、理論段数は１００００程度となった。これに対し、比較例のカラムでは理論段数が２５００程度であった。これは、比較例のカラムでは、最大高さ（Ｒｙ）＝2.0 μmであり、これに相当する凹部が存在する段では、充填剤にス゛レが生じる余地が本発明と比べて4倍となる。しかも4倍という値は1軸方向に関してだけであり、「段」とは平面であるから2つの軸方向（前項の図における左右方向の軸と、紙面に対して前後方向の軸）にそれぞれ4倍ずつ、つまり本発明の16倍のス゛レが生じる。ただし、カラム内管の全てで凹部の深さが4倍という訳ではないこと、相殺されるス゛レもあることなどを考慮すると、単純に理論段数が16分の1になるというよりは、4分の1程度で収まったものである。
ここで、理論段数は一般に次式で表わされる。
2017215304.tif 000004
N：理論段数  tr：保持時間  W：ヒ゜ーク幅
【００２６】
したがって、保持時間ｔｒが同じであれば、ヒ゜ーク幅Ｗは理論段数Ｎの平方根に反比例する。つまり、HPLCで同一の物質を分析すると、実施形態に係るカラムは、比較例に係るカラムよりも半分のピーク幅を有する分析結果を得ることができる。図４は、ＨＰＬＣの分析結果を模式的に示すものであり、上記のように、ピーク幅を半減することができることにより、図４（ａ）に示すように、２つのピークが重なり合うような分析結果に対し、図４（ｂ）に示すようにピークの重なりが解消されるとともに、図４（ａ）では分析できなかったピークｃを分析でき、分析精度を向上させることができる。
【００２７】
以上のように、本発明に係るカラムによれば、充填剤を細密かつ均一に充填することができ、分析精度が向上する。
【図１】
2017215304.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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