(57)【要約】【課題】本発明の課題は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療に効果的な医薬を提供することにある。【解決手段】成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アゴニストを含有してなる糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アゴニストを含有してなる糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項２】
ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、活性型グレリンである請求項１に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項３】
ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、ウリモレリン（Ulimorelin）、アナモレリン（Anamorelin）、マシモレリン（Macimorelin）、カプロモレリン（Capromorelin）、イパモレリン（Ipamorelin）、ＭＫ−６７７、ＧＨＲＰ−２、ＧＨＲＰ−６、及びＪＭＶ−１８４３からなる群から選択される、請求項１に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項４】
非経口投与剤である請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項５】
注射剤である請求項４に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項６】
経口投与剤である請求項１又は３に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項７】
１２週間以上の期間にわたって継続的に投与するためのものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項８】
糖尿病性腎症が１型糖尿病に起因するものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項９】
糖尿病性腎症が第１期〜第３期のいずれかの病期であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項１０】
糖尿病性腎症が第１期又は第２期の病期であることを特徴とする、請求項９に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項１１】
アルブミン尿症状を改善するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【請求項１２】
体重減少症状を防止又は改善するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療において効果的な医薬に関する。具体的には、本発明は、活性型グレリン等の成長ホルモン分泌促進因子（Growth Hormone Secretagogue：ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アゴニストを有効成分として含有する糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤に関する。さらには、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用投与するための物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、種々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群である。糖尿病における糖代謝異常の分類は、成因分類を主体としており、(I)１型、(II)２型、(III)その他の特定の機序、疾患によるもの、及び(IV)妊娠糖尿病に分類される。１型は発症機構として膵臓のβ細胞破壊を特徴とする。また、２型は、インスリン分泌低下とインスリン感受性の低下の両者が発症にかかわる。前者に起因する１型糖尿病、及び後者に起因する２型糖尿病が全糖尿病患者の大多数を占める。
わが国の糖尿病有病者数は、平成19年国民健康・栄養調査において、「糖尿病が強く疑われる人」は約890万人、「糖尿病の可能性が否定できない人」が約1,320万人であり、両者を合わせると約2,210万人と推計された。有病者数は極めて多く、その対策が強く望まれる疾患の一つである。また、前記の調査によれば、「糖尿病が強く疑われる人」は10年前の1997年と比べて約1.3倍に増えており、わが国の人口構成の高齢化に伴って、増加ペースは加速することが予想される。この点からも糖尿病対策は喫緊の課題と言える。
糖尿病は、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症（糖尿病腎症）、糖尿病神経障害、動脈硬化性疾患（冠動脈疾患、脳血管障害、下肢閉塞性動脈硬化症）、感染症、糖尿病性下肢虚血疾患、歯周病、及び認知症などを合併症として伴うことが知られている。
【０００３】
糖尿病の合併症の一つである糖尿病性腎症は、発症すると長期間の経過を経て末期腎不全に進展する疾患である。腎機能が極めて低下した場合には、患者は人工透析等の代替手段の使用を余儀なくされることになる。我が国で新規に人工透析が導入された患者において、その原因の第１位は糖尿病性腎症となっている。それゆえ、数多く知られる糖尿病の合併症の中でも糖尿病性腎症をコントロールすることはとりわけ重要なことであり、糖尿病性腎症の進展を防止し、治療することは、患者のＱＯＬの維持や向上は言うに及ばず増大する一方の医療費抑制にも直結する大きなテーマであると言える。
【０００４】
糖尿病性腎症は、その症状により病期の分類がなされている。２０１３年１２月に糖尿病性腎症合同委員会から公表された改訂版の糖尿病性腎症病期分類によれば、以下のように分類される。
第１期（腎症前期）：正常アルブミン尿（３０ｍｇ／ｇＣｒ未満）、ｅＧＦＲ値３０（ｍｌ／分／１．７３ｍ２）以上、
第２期（早期腎症期）：微量アルブミン尿（３０〜２９９ｍｇ／ｇＣｒ）、ｅＧＦＲ値３０（ｍｌ／分／１．７３ｍ２）以上、
第３期（顕性腎症期）：顕性アルブミン尿（３００ｍｇ／ｇＣｒ以上）あるいは持続性タンパク尿（０．５ｇ／ｇＣｒ以上）、ｅＧＦＲ値３０（ｍｌ／分／１．７３ｍ２）以上、
第４期（腎不全期）：ｅＧＦＲ値３０（ｍｌ／分／１．７３ｍ２）未満（ここで、尿アルブミン値、及び尿タンパク値は問わない）、
第５期（透析療法期）：透析治療中
【０００５】
糖尿病性腎症は、必ずしも第１期から順次第５期まで進展するものではない。しかしながら、通例では第１期から順に病期に沿って症状が進展するので、糖尿病性腎症の病期が判定された段階でそれ以降の病期への進展を抑止し、症状を維持・改善することが望まれる。予防・治療の目標を上記の病期に沿って表現すると、第４期への進展を防止すること、好ましくは第３期への進展を防止すること、より好ましくは第２期への進展を防止することと言うことができる。
【０００６】
糖尿病性腎症の治療薬として、レニン・アンジオテンシン系の阻害薬が既に知られている。しかしながら、当該阻害薬は糖尿病性腎症の進行を遅らせる効果が認められてはいるものの、基本的にその進行を止めることまでは出来ない。最終的には末期腎不全に至る例が多数であるため、当該阻害薬は糖尿病性腎症の治療において十分なものとは言えなかった。また、当該阻害薬によって血清クレアチニン値が上昇（ＧＦＲ値が低下）することや、血清カリウム値が上昇することがあるため、一部の患者には使用困難であるという問題も当該阻害薬について知られていた。言い換えれば、糖尿病性腎症の治療分野において、既存の医薬によって十分に満足な治療効果が得られているとは言えなかった。また、レニン・アンジオテンシン系の阻害薬以外で効果が確認され、臨床応用に至っている薬剤は存在しないので、治療上の選択肢が十分にある状況ではないということにも問題があった。
糖尿病性腎症の進展防止や治療に有効な医薬として確立したものが豊富に提供されていないことの理由は必ずしも明らかでない。糖尿病性腎症は、その進展の機序が多岐に亘っており、糸球体過剰濾過、活性酸素の上昇、腎臓の炎症、腎ミトコンドリア機能異常などが挙げられているが、それらのどれか一つを抑制しても充分ではなく、逆に一つの病的経路の抑制のみでは別の経路の活性化を引き起こし結果として進展を抑制することはできないと考えられる。それゆえ、現状では、糖尿病性腎症の進展機序の特定経路の抑制に主として働く物質の発見に留まっており、複数経路に対して多面的に作用する物質が見出されていないことが、いまだ十分に効果的な薬剤の発見に至っていないことの理由と捉えることが可能である。
【０００７】
グレリン（Ghrelin）は、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内因性リガンドとして児島、寒川らによって発見されたペプチドホルモンである（特許文献１、非特許文献１）。グレリンは主として胃で生産され、ＧＨＳ受容体リガンド（ＧＨＳ−Ｒアゴニスト）として成長ホルモン分泌促進に働く。その他、グレリンには、摂食亢進作用（摂食障害改善作用）、胃酸分泌・胃蠕動亢進作用、心機能改善・心血管保護作用、血圧降下作用、血管拡張作用、炎症性サイトカイン低下作用、骨格筋量増加作用など、様々な作用があることが報告されている（非特許文献２）。さらに、グレリンには抗酸化作用があり、臓器障害に対する抑制効果が認められている。例えば、腎臓については、急性腎障害である虚血・再灌流障害、及びエンドトキシンによる腎障害において、グレリン投与により障害の程度が抑制されることが報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。また、アンジオテンシンＩＩ投与による高血圧マウスにおいて生じた腎障害がグレリン投与により抑制されることも報告されている（非特許文献５）。
【０００８】
グレリンは２８アミノ酸残基からなるポリペプチドである。グレリン遺伝子は、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラット等の様々な生物種からクローニングされており、それらがコードするグレリンポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって、それらの配列間には高度な配列保存性が見出されている（非特許文献６）。
グレリンの修飾体に関して、ポリペプチド鎖のＮ末端から３番目のセリン残基において、その側鎖がオクタン酸によってエステル化されたアシル化グレリンがあり、これが生体中の活性型グレリンとして知られている。また、同じくアシル化修飾を受けたグレリンであるが、オルタナティブスプライシングにより生じたものであって、Ｎ末端側から１４番目のグルタミン残基を有しない分子種であるdes-Gln14-Ghrelinもまた活性型のグレリン分子種の一つとして知られている。他に、Ｃ末端である２８位のアルギニン残基を有しない分子種もマイナーな成分としてヒトの胃抽出物から見出されている。また、グレリンの側鎖は前記のように基本的にはオクタン酸によりアシル化されるが、デカン酸あるいは不飽和脂肪酸であるデケン酸によりアシル化されることもあると知られている。これらの天然に見いだされるアシル化グレリン分子種は、いずれも活性型グレリンと考えられる。一方、脱アシル化されたdes acyl Ghrelin（非アシル化グレリン）は非活性型のグレリンと考えられている。ただし、高齢者の成長ホルモン欠損症治療や脂質異常症治療等において非アシル化グレリンが有効であるという報告もあり、非アシル化グレリンが生理活性を全く有しないグレリン分子種であるという訳ではない（特許文献２、特許文献３）。
【０００９】
グレリンを用いた治療に関して、慢性閉塞性肺疾患の治療、胃・食道癌術後の体重減少の改善、肝胆道膵切除術後の癌患者のＱＯＬ改善、糖尿病性神経障害における神経症状の改善など、様々な臨床的な試みが提案されてきている（臨床研究（試験）情報-国立保健医療院ウェブサイト）。しかしながら、グレリンを糖尿病性腎症の進展防止や治療に適用する事は未だ報告されておらず、糖尿病性腎症に対してグレリンがいかなる作用をもたらすか明らかでなく、またその作用を示唆する知見も得られていなかった。むしろ、グレリンには食欲亢進機能があり、体重増加をもたらすものでもあるため、過食を避け食生活を節制的にすることが一般的に求められる糖尿病の状況においては、特に腎症の合併が懸念され腎負荷の増大を抑止することが望まれる状況においては尚更、グレリンの投与を忌避する技術的背景があったということもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ  ０１／０７４７５  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ０１／８７３３５  Ａ２
【特許文献３】特表２００９−５０２９３４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】細田他、ファルマシア(2002) vol. 38, pp. 925-929
【非特許文献２】寒川他、循環器専門医(2012) vol. 20, pp. 149-155
【非特許文献３】Takeda et al., J. Am. Soc. Nephrol. (2006) vol. 17, pp. 113-121
【非特許文献４】Wang et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. (2009) vol. 297, pp. F1032-F1037
【非特許文献５】Fujimura et al., PLoS ONE (2014) vol. 9, e94373
【非特許文献６】Hosoda et al., J. Pharmacol. Sci. (2006) vol. 100, pp. 398-410
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療に効果的な医薬を提供することにある。糖尿病性腎症としては、特に１型糖尿病に起因する糖尿病性腎症を好ましい治療上の対象とする。また、本発明は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用投与するための物質のスクリーニング方法の提供をもう一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、鋭意研究した結果、活性型グレリンに代表される成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アゴニストを継続的に投与することにより、インスリン分泌欠損に起因した糖尿病性腎症の症状進展が防止され、腎機能が改善することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、ＧＨＳ−Ｒアゴニスト、好ましくは内因性アゴニストである活性型グレリンを有効成分として含有する糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤に関する。また、本発明は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用投与するための物質のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
より詳細には、本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アゴニストを含有してなる糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（２）ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、活性型グレリンである前記（１）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（３）ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、ウリモレリン（Ulimorelin）、アナモレリン（Anamorelin）、マシモレリン（Macimorelin）、カプロモレリン（Capromorelin）、イパモレリン（Ipamorelin）、ＭＫ−６７７、ＧＨＲＰ−２、ＧＨＲＰ−６、及びＪＭＶ−１８４３からなる群から選択される、前記（１）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（４）非経口投与剤である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（５）注射剤である前記（４）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（６）経口投与剤である前記（１）又は（３）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（７）１２週間以上の期間にわたって継続的に投与するためのものである、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（８）糖尿病性腎症が１型糖尿病に起因するものである、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（９）糖尿病性腎症が第１期〜第３期のいずれかの病期であることを特徴とする、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（１０）糖尿病性腎症が第１期又は第２期の病期であることを特徴とする、前記（９）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（１１）アルブミン尿症状を改善するものである、前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（１２）体重減少症状を防止又は改善するものである、前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤。
（１３）糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、１型糖尿病モデル非ヒト動物において誘発させた糖尿病性腎症を呈する動物に対して、［１］活性型グレリンと共に被検物質を投与するか、又は［２］活性型グレリン投与、及び活性型グレリンとは独立した経路による被検物質の投与を行う工程を含み、活性型グレリン単独投与の対照と比して有意に腎症状の改善をさせる物質を選抜することを特徴とする、方法。
（１４）腎症状の改善としてアルブミン尿（Ａｌｂ／Ｃｒで算出されるアルブミン指数）の改善を指標とすることを特徴とする、前記（１３）に記載のスクリーニング方法。
（１５）腎症状の改善として体重減少の改善を指標とすることを特徴とする、前記（１３）又は（１４）に記載のスクリーニング方法。
（１６）非ヒト動物が齧歯目動物である、前記（１３）から（１５）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１７）齧歯目動物がモルモット、ハムスター、ラット、又はマウスのいずれかである、前記（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８）糖尿病性腎症がストレプトゾシン（ＳＴＺ）投与により誘発させたものである、前記（１３）〜（１７）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１９）ＧＨＳ−Ｒアゴニストを投与することを特徴とする、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療方法。
（２０）ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、活性型グレリンである前記（１９）に記載の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療方法。
（２１）糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤の製造のための、ＧＨＳ−Ｒアゴニストの使用。
（２２）ＧＨＳ−Ｒアゴニストが、活性型グレリンである前記（２１）に記載の使用。
（２３）糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療方法における使用のための、ＧＨＳ−Ｒアゴニスト。
（２４）糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療方法における使用のための、活性型グレリン。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＧＨＳ−Ｒアゴニストを有効成分として含む糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤によれば、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療を効果的に行うことができる。すなわち、糖尿病、特に１型糖尿病を患う糖尿病性腎症患者の腎症の進展を抑制し、症状を改善することができる。その結果として、糖尿病性腎症患者の病期を第４期あるいは第５期にまで進展することを防ぎ、人工透析と必要とする末期腎不全を回避することが可能となり、患者のＱＯＬを維持あるいは向上させることができる。より好ましくは、糖尿病性腎症患者の病期を第１期又は第２期にとどめ、それら以降の病期へと腎症の進展を防止することが可能である。また、ＧＨＳ−Ｒアゴニストとして活性型グレリンを使用する場合、グレリンは内因性の生体に存在するホルモンなので、その投与はホルモン補充であり安全性は担保される。グレリンは様々な食欲不振、消耗状態の患者に対して有効性が認められているところ、糖尿病も腎症が進展するとタンパク・エネルギー消耗状態を呈し、栄養障害、筋力低下などで患者のＱＯＬは低下するので、グレリン投与はこのタンパク−エネルギー消耗状態を軽快させることが期待できる。糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療と全身症状としてのタンパク−エネルギー消耗状態の改善を共に達成させる薬剤は未だ提供されていないので、本発明の技術的意義は大きい。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、活性型グレリン単独投与の場合と比して相加的又は相乗的な治療効果を奏する糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療のための、活性型グレリンと組み合わせて投与することを特徴とする物質が選抜可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、コントロール（バッファーのみ投与）群、ＳＴＺ及び生理食塩水（ＳＴＺ＋ＮＳ）投与群、又はＳＴＺ及びグレリン（ＳＴＺ＋Ｇ）投与群のマウスの、２４週齢時における尿アルブミン（Ａｌｂ／Ｃｒ）値（μｇ／ｍｇ・Ｃｒ）を示す図である。*はP<0.05、**はP<0.01で、それぞれ有意差があることを示す。
【図２】図２は、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞の電子顕微鏡写真を示す。下段の図はそれぞれ細胞の一部をより拡大して示すものである。上段の図中、バーはそれぞれ５μｍを示す。下段の図中、バーはそれぞれ１μｍを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞ミトコンドリアの面積（ｎｍ２）に関する計測結果を示すものである。図２の電子顕微鏡写真及び同一サンプルの別視野で得られた観察像に基づき、各群約２，０００個のミトコンドリアについて面積を１ミトコンドリアずつ計測し、それぞれ平均値と標準誤差を算出した。以下の図３Ｂ〜図３Ｅでも同様のサンプル数について１ミトコンドリアずつ計測と算出を行った。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、**は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01で有意差があることを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞ミトコンドリアの周囲長（ｎｍ）に関する計測結果を示すものである。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、**は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01で有意差があることを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞ミトコンドリアの短径（最小径）（ｎｍ）に関する計測結果を示すものである。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、**は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01で有意差があることを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞ミトコンドリアの長径（最大径）（ｎｍ）に関する計測結果を示すものである。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、**は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01で有意差があることを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞ミトコンドリアの長径／短径比に関する計測結果を示すものである。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、*は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.05で有意差があることを示す。
【図４】図４は、コントロール群、ＳＴＺ＋ＮＳ群、又はＳＴＺ＋Ｇ群のマウスの２４週齢時における近位尿細管細胞のミトコンドリアを示す電子顕微鏡写真である。図中、バーはそれぞれ１μｍを示す。
【図５】図５は、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における糸球体の電子顕微鏡写真を示す。図中、バーはそれぞれ１μｍを示す。図中、矢印は糸球体基底膜の閉鎖スリット孔（Close slit pore）を示し、矢頭は糸球体基底膜が局所的に肥厚して凹凸が顕著になっている代表的な部分を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における糸球体基底膜の膜厚（ｎｍ）に関する計測結果を示すものである。図５の電子顕微鏡写真及び同一サンプルの別視野で得られた観察像に基づき、各群約２０視野に含まれる合計約２００箇所の糸球体基底膜について膜厚を１箇所ずつ計測し、それぞれ平均値と標準誤差を算出した。図６Ｂ及び図６Ｃについても同様のサンプル数について計測と算出を行った。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、**は、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01で有意差があることを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における糸球体基底膜の開放スリット孔密度（Open slit pore density）（個／ｍｍＧＢＭ）に関する計測結果を示すものである（ここで、ＧＢＭは糸球体基底膜（Glomerular Basement Membrane）を示す。）。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、*はP<0.05、**はP<0.01で、それぞれ有意差があることを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、コントロール群（左）、ＳＴＺ＋ＮＳ群（中央）、又はＳＴＺ＋Ｇ群（右）のマウスの２４週齢時における糸球体基底膜の閉鎖スリット孔密度（Close slit pore density）（個／ｍｍＧＢＭ）に関する計測結果を示すものである。図においてバーの高さで平均値を示す。また、図において、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、*はP<0.05、**はP<0.01で、それぞれ有意差があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１）糖尿病性腎症モデル
本発明者らは、インスリン分泌欠損を呈する１型糖尿病に起因した糖尿病性腎症に対するＧＨＳ−Ｒアゴニストの作用を検討するために、モデル動物種として選択したマウスへストレプトゾシン（ＳＴＺ）を投与し、人為的なインスリン分泌欠損と高血糖とを誘発させて実験を行った。ＳＴＺは膵臓β細胞を傷害しインスリン分泌欠損を誘発させるために慣用される物質である。ＳＴＺは商品化されているので、LGM Pharma社等のメーカーから適宜入手することができる。本発明者はマウスに対して50mg/kg体重の用量を5日間連続して注射する手法を採用したが、投与用量、投与経路、投与期間はいずれも当業者が適宜調整可能である。投与用量は、例えば1〜1000mg/kg体重、好ましくは3〜300mg/kg体重、より好ましくは10〜100mg/kg体重の範囲で目的に応じて当業者が適宜調整可能である。投与経路は、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、座剤による直腸への注入などが任意に選択できる。投与回数は単回投与から継続的投与まで任意に選択可能である。継続投与の場合は連日投与でなくても良く、任意に投与頻度を調整できる。投与期間は、単回か、あるいは３週間以内の継続投与、好ましくは単回又は１０日以内の継続投与、より好ましくは単回又は１週間以内の継続投与が選択される。継続投与の場合、投与は１日１回行う。また、一日分の投与量を一日の中で複数回に分けて投与しても良い。モデル動物は非ヒト動物であれば任意であるが、扱いの簡便さから齧歯目動物、例えばモルモット、ハムスター、ラット又はマウスが好ましい。より好ましくはラット又はマウス、さらに好ましくはマウスが用いられる。糖尿病症状は血糖値をモニターすることにより確認できる。血糖値の測定は公知の手法を適宜採用できる。体重変化を指標として加えても良い。腎機能に関しても公知の指標を任意に選択して評価可能である。例えば、アルブミン尿（Ａｌｂ／Ｃｒ値：アルブミン指数）や糸球体ろ過量（ＧＦＲ）を指標とできる。測定は、採取した尿サンプルを材料としてＥＬＩＳＡ法など周知の手法を通じて行うことができる。マウスのアルブミン尿であれば、通常１０〜３０（μｇ／ｍｇ・Ｃｒ）程度を示すので、この範囲を大きく超えるような数値が計測された場合は顕著な腎機能低下があると判定できる。なお、ヒトにおいては、３０（ｍｇ／ｇ・Ｃｒ）未満で正常アルブミン尿、３０〜２９９で微量アルブミン尿、３００以上で顕性アルブミン尿と判別される（糖尿病性腎症病期分類：2013年12月糖尿病性腎症合同委員会）。モデル動物における腎症の進展とヒトの糖尿病性腎症の進展との相関はモデル動物種ごとに当業者が見出すことができる。例えば、本発明で作出した糖尿病性腎症モデルマウスにおいて６０μｇ／ｍｇ・Ｃｒ程度のアルブミン尿が検出された場合、本発明及び従来の知見に基づいて、ヒト糖尿病性腎症の病期で言えば第２期〜第３期）にあると推定することができる。
【００１９】
（２）グレリン活性
本明細書において、「グレリン活性」とは、in vivoにおける成長ホルモン分泌促進活性、若しくは食欲亢進作用、又は、ＧＨＳ−Ｒを発現する細胞のin vitroにおける抗アポトーシス活性、抗酸化ストレス抑制活性、若しくは抗線維化作用のうち少なくとも１つの活性を、ＧＨＳ−Ｒを介して発現する活性を言う。
また、本明細書において「ＧＨＳ−Ｒアゴニスト」とは、内因性ＧＨＳ−Ｒアゴニストである活性型グレリン、又は活性型グレリン以外の物質であって、前記グレリン活性を有する物質を意味する。
【００２０】
（３）ＧＨＳ−Ｒアゴニストとしての活性型グレリン
本発明の医薬は、その有効成分としてＧＨＳ−Ｒアゴニストを含む。好ましいＧＨＳ−Ｒアゴニストとして活性型グレリンを挙げることができる。
グレリンは２８アミノ酸残基からなるポリペプチドである。グレリンのアミノ酸配列は生物種間で高度に保存されているので、ヒトにおいて本発明で意図する生理活性を有する限りいかなる生物種に由来するグレリン分子種であっても任意に使用できるが、最も好ましいのはヒト配列のグレリンである。
NH2-GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR-COOH（配列番号１）
ヒト由来の天然のグレリンとして、１４位のグルタミン残基や２８位のアルギニン残基を有しないものなど、配列番号１のアミノ酸配列からなるグレリンとは一部配列が異なるものも知られている。このような変異型グレリン分子種も本発明で意図する生理活性を有する限り用いることができる。さらに、天然の変異型でなくとも、本発明で意図する生理活性を有する限り、人為的にアミノ酸残基の欠失・置換・付加等を導入した変異型分子種を任意に用いることができる。だだし、本発明の医薬はヒトに継続的に投与することが予定されているので、免疫原性の問題を考慮すれば、天然のヒト配列のグレリンを用いることが望まれる。特に、主要な分子種である配列番号１のアミノ酸配列からなるヒト配列グレリンが最も好ましい。
グレリンは、３位のセリン残基の側鎖がアシル化されたものであるアシル化グレリンが活性型グレリンとして知られている。本発明の医薬は有効成分としてこの活性型であるアシル化グレリンを用いる。天然のヒト活性型グレリンは主にｎ−オクタノイル基（Ｃ８：０）でアシル化されているので、ｎ−オクタノイル基で修飾されたグレリン分子種を用いることが最も好ましい。また、ｎ−デカノイル基など、他のアシル基で修飾されたヒト天然型の別のグレリン分子種であっても良い。また、アシル化グレリンとして天然に見出されたものでなくとも、所望の活性がある限り任意の構造のアシル基で修飾されたものであっても良い。
アシル化された活性型グレリンは商品化されているので、Sigma-Aldrich社、株式会社ペプチド研究所等から購入し、使用することができる。また、グレリン遺伝子は、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラット等の様々な生物種からクローニングされているので、遺伝子組換え体ポリペプチドを調製し、これを公知の方法でアシル化することで活性型グレリンを調製することも可能である。また、グレリンは２８アミノ酸からなる比較的短いポリペプチド鎖により構成されるので、遺伝子組換え体ポリペプチドの調製方法に代えて公知の化学合成法を採用し、グレリンポリペプチドを調製することも可能である。
本明細書において、「活性型グレリン」とは、ｎ−オクタノイル化された配列番号１のアミノ酸配列からなるヒト配列グレリンのヒトＧＨ分泌促進活性を１とした場合に、０．２０以上、好ましくは０．３５以上、より好ましくは０．５０以上、さらに好ましくは０．６５以上、最も好ましくは０．８０以上のアゴニスト活性を有するグレリン分子種を言う。
【００２１】
（４）活性型グレリン以外のＧＨＳ−Ｒアゴニスト
活性型グレリン以外のＧＨＳ−Ｒアゴニストを本発明の医薬の有効成分とすることもできる。例えば、公知のＧＨＳ−Ｒアゴニストとして、ウリモレリン（Ulimorelin）、アナモレリン（Anamorelin）、マシモレリン（Macimorelin）、カプロモレリン（Capromorelin）、イパモレリン（ipamorelin）、ＭＫ−６７７、Ｌ−６９２，４２９、成長ホルモン放出ペプチド−２（ＧＨＲＰ−２）、及び成長ホルモン放出ペプチド−６（ＧＨＲＰ−６）、Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-CHO（ＪＭＶ−１８４３；別名ＥＰ−１５７２）を挙げることができる。これらは、例えばＷＯ  ２０１３／１７５８０５  Ａ１、ＷＯ  ２００６／００９６７４  Ａ１、ＷＯ  ２０１１／０４１３６９  Ａ１、Holst B et al., Mol. Endocrinol., (2005) vol. 19, pp. 2400-2411、Guerlavais V et al., J. Med. Chem. (2003) vol. 46, pp. 1191-1203、ＷＯ  ９９／５８５０１  Ａ１、ＷＯ  ０１／３４５９３  Ａ１、ＷＯ  ０１／９６３００  Ａ１、ＷＯ  ９７／２４３６９  Ａ１、ＷＯ  ９５／１７４２３  Ａ１などに記載されたものであり、これらの文献を参照することなどにより適宜入手することができる。これらのうち、ＧＨＲＰ-２、ＧＨＲＰ−６、及びＪＭＶ−１８４３はペプチド性のアゴニストであるが、それ以外は非ペプチド性のＧＨＳ−Ｒアゴニストであるので、活性型グレリンとは異なり経口投与によっても所望の作用を発揮させることができる。投与量は基本的に活性型グレリンの投与量を参考として、それとほぼ同程度の用量とすることができる。ただし、活性型グレリンよりも１０倍以上、又は１００倍以上の高い生理活性を示すＧＨＳ−Ｒアゴニストについては、その投与量を活性型グレリンのそれよりも１桁、又は２桁程度低い用量とすることができる。
【００２２】
（５）本発明の医薬の調製
本発明の医薬において有効成分とするＧＨＳ−Ｒアゴニストは、アゴニスト化合物それ自体はもちろんのこと、その塩若しくは溶媒和物の形態の化合物を用いることもできる。塩及び溶媒和物形態の化合物は常法により製造することができる。
前記の塩としては、薬学的に許容できるものであれば特に制限はないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリアルキルアミン塩等の有機塩基塩；塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
前記の溶媒和物としては、水和物、アルコール和物（例えば、エタノール和物）等が挙げられる。
本発明の医薬は、注射剤、座剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤等の剤型とすることができる。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。例えば、経口投与用製剤とする場合には、トラガントガム、アラビアガム、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、オリーブ油、大豆油、ＰＥＧ４００等の溶解剤；澱粉、マンニトール、乳糖等の賦形剤；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。また、注射用の製剤とする場合は、例えば、無菌的に保存した活性型グレリンの乾燥物又は保存溶液を、静脈注射用の生理食塩水又は緩衝液によって溶解又は希釈して調製することができる。
【００２３】
（６）本発明の医薬の投与形態
本発明の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤としての有効成分となＧＨＳ−Ｒアゴニスト、好ましくは活性型グレリンの有効投与量は、患者の状態、症状など諸事情により適宜変更される。通常は０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．００３〜１ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．００３〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．００３〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられる。これを１日１〜数回に分けて投与することができるが、逆に数日分の用量を１回に投与することにより投与間隔を２日〜４週間以内の範囲とすることもできる。患者の利便性と薬物代謝のスピードを勘案すると、１日〜３週間に一度の投与が好ましい。さらに、１日〜１週間に一度の投与間隔がより好ましく例示される。
本発明の医薬の投与方法としては、特に限定されるものではない。投与方法としては皮下注射、筋肉注射、又は静脈投与が好ましいが、これに限定されるものでは無い。直腸投与、経鼻投与などの経粘膜投与することもできる。一方、非ペプチド性の化合物を有効成分とする医薬の場合は、経口投与が好ましく例示される。また、本発明の医薬は、前記した投与形態に応じて、公知の各種の手法により製剤化方法を最適化することができる。
投与期間は、患者の病状に応じて適宜調整できる。ただし、糖尿病、あるいは糖尿病性腎症は継続的なコントロールを要する疾患であるので、継続的な投与を行うことが適切であり、６週間以上、好ましくは９週間以上、より好ましくは１２週間以上の期間で投与が行われる。
投与期間中の投与用量は適宜調整できるが、継続的に一定量を投与するか、又は投与当初のみ比較的高用量で投与した後により少ない維持量の一定投与に移行する投与形態とすることが好ましい。
【００２４】
（７）本発明のスクリーニング方法
糖尿病性腎症モデル動物を用いて、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用するための物質の探索を行うことができる。例えば、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）を利用して糖尿病性腎症モデルマウスを作出し、マウスを２群（ＳＴＺ＋Ｇ群、及びＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群）に分割する。いずれの群の個体に対しても、グレリン投与を行うが、ＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群の個体に対しては更にグレリンと共に、あるいはグレリンとは独立の経路で被検物質（Ｓ）の投与も行う。投与は原則として継続的に行うが、目的に応じて試験期間は短縮しても良い。被検物質の投与間隔は原則としてグレリンと同一とするが、これと別異の投与間隔を設定しても良い。投与期間中、及び／又は投与終了段階において、アルブミン尿（Ａｌｂ／Ｃｒ値：アルブミン指数）を測定する。また、体重、摂食量、血清アルブミン量等の１又は複数の項目についても併せて測定しても良い。さらに、腎機能の評価のために糸球体ろ過量（ＧＦＲ値）を算出することや、尿素窒素（ＢＵＮ）値の測定を行い、アルブミン尿と共に、あるいはアルブミン尿に代えて腎機能の評価に用いても良い。この実験系において、ＳＴＺ投与を行っていないコントロール群も設定し、３群を並行して扱っても良い。
ＳＴＺ＋Ｇ群、及びＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群の結果を比較し、後者の群において有意に腎機能が良好である場合について、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用するために効果的な候補物質として物質Ｓを選抜する。
選抜において有意差に関する閾値を変化させ、より高次の選抜段階でより厳しい閾値の設定を行うことにより、その選抜を多段階で行うこともできる。
なお、グレリンと組み合わせて使用するための物質の選抜方法として記載しているが、グレリンに代えて他のＧＨＳ−Ｒアゴニストを使用することや、ＧＨＳ−Ｒアゴニストと組み合わせて使用するための物質の探索をすることも適宜実施することができる。
【００２５】
（８）本発明の医薬のヒト糖尿病性腎症に対する評価指標
本発明のＧＨＳ−Ｒアゴニストを有効成分として含む医薬は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療を目的とするものである。それゆえ、医薬としての効果は、第一に腎機能を示す評価指標に基づいて判断される。腎機能は、アルブミン尿（Ａｌｂ／Ｃｒ値：アルブミン指数）、尿タンパク値（ｇ／ｇＣｒ）、ＧＦＲ値、ｅＧＦＲ値、血清クレアチニン値など、腎機能の指標として公知の指標の中から１又は複数のものを任意に選択して評価することが可能である。本発明では腎症の中でも特に糖尿病性腎症に注目するものであるので、糖尿病性腎症合同委員会2013年12月公表の改訂版糖尿病性腎症病期分類に留意し、当該病期分類に使用される尿アルブミン値、尿タンパク値、及びｅＧＦＲ値が評価項目として特に好ましく使用される。尿中のアルブミンレベル、尿中又は血清中クレアチニンレベル等の測定は、いずれもＥＬＩＳＡ法など周知慣用の手法により適宜実施することができる。推算糸球体ろ過量を示すｅＧＦＲ値は、血清クレアチニンレベルの測定値、被験者の年齢及び性別を用いて算出する。算出に用いる計算式は公知であり、当業者は適宜実施することができる。
本発明の医薬は、ヒトにおいて尿アルブミン値を３００未満、より好ましくは１００未満、更に好ましくは３０（ｍｇ／ｇＣｒ）未満に抑制できるものであることが望ましい。また、ｅＧＦＲ値を３０以上、好ましくは６０（ｍｌ／分／１．７３ｍ２）以上に維持できる医薬であることが望ましい。また、尿タンパク値が０．５未満、好ましくは０．０５（ｇ／Ｃｒ）未満に抑制できるものであることが望ましい。尿アルブミン値、ｅＧＦＲ値、尿タンパク値のいずれかの指標について前記の条件を満たせば本発明の医薬として所望の機能を備えるものと言えるが、前記の複数の指標について所望の機能を備える医薬がより好ましく、それぞれの指標においてより高いレベルの効果を兼ね備える医薬であることが更に望ましい。
本発明の医薬は、糖尿病性腎症の患者において、病期として第４期への進展を防止すること、好ましくは第３期への進展を防止すること、より好ましくは第２期への進展を防止することのために使用することができる。
【００２６】
（９）本発明の糖尿病性腎症の進展防止剤について
本発明のＧＨＳ−Ｒアゴニストを有効成分として含む医薬は、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療を目的とするものである。ここで、前記の糖尿病性腎症の第１期〜第５期のいずれの病期の段階にあっても糖尿病性腎症とみなし、より進展した病期へと進行することを防止し、さらには症状を改善することを本発明の目的としている。しかしながら、前記の第１期の状態、あるいは第１期及び第２期の状態にある対象は、いまだ糖尿病性腎症を発症していないと見なす（言い換えれば、第２期、あるいは第３期以降に分類される病期へと進展して初めて糖尿病性腎症を発症したと見なす）ことも、臨床の現場では行われ得る。このような考え方に立てば、本発明の医薬は、糖尿病性腎症の予防及び／又は治療剤であると言うことができる。つまり、本明細書において、「糖尿病性腎症の進展防止」とは、「糖尿病性腎症の予防」の概念を包含するものと理解すべきである。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  活性型グレリンの調製
ＧＨＳ−Ｒアゴニストとして活性型グレリンを使用することにした。
活性型グレリンは株式会社ペプチド研究所の4373-s Ghrelin(Rat)を購入し、使用した。当該活性型グレリンは、グレリンポリペプチドとして、２８アミノ酸からなるラット配列のグレリンポリペプチドを含む。ラットとマウスのアミノ酸配列は同一であるので、マウスへ投与する場合、当該活性型グレリンは異種分子の導入にはあたらず、内生ホルモンの補充に相当することとなる。入手した活性型グレリンは生理食塩水に溶解後、マウスへの投与に使用した。
以下の実施例の記述において、単にグレリンと記載されているものは、すべて上記の活性型グレリンを意味する。
【００２９】
実施例２  糖尿病性腎症モデルマウスの作出
膵臓のインスリン分泌機能を阻害し人為的に１型糖尿病状態を誘導する作用が知られるストレプトゾシン（ＳＴＺ）を用いて糖尿病性腎症モデル動物を作出した。
Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウス（日本クレア社）のオスを購入し実験に使用した。飼育開始後２週間馴らした後、飼育動物は３群（ｎ＝７）に分け、それぞれコントロール群、ＳＴＺ＋ＮＳ群、及びＳＴＺ＋Ｇ群とした。各群とも、飼育中は継続的に普通食（クレア社、CREA Rodent Diet CE-2）を給餌した。８週齢の時点においてＳＴＺ＋ＮＳ群、及びＳＴＺ＋Ｇ群に対してストレプトゾシン（ＳＴＺ：シグマ社、S0130）の投与を開始した。投与量は50 mg/kg体重で、１日一回、５日間連続して腹腔内に注射することによって投与した。一方、コントロール群はＳＴＺの代わりに生理食塩水のみを１日一回、５日間連続して投与したことを除き、前２群と同様の処置を行った。飼育期間中、血糖値、体重、及び摂食量の測定は定期的に行った。ＳＴＺ投与を行ったＳＴＺ＋ＮＳ群、及びＳＴＺ＋Ｇ群では、いずれも１２週齢より前の段階で300 mg/dL以上の血糖値が示され、高血糖である実験的糖尿病が発症したことが確認できた。本実施例を含め、実施例として記載された全ての動物実験は慶應大学医学部動物実験委員会の審査を受けたものであり（承認番号14102-(0)）、慶應義塾動物実験規程に従って実行された。
飼育開始後１２週齢の時点で、ＳＴＺ投与を受けた群（ＳＴＺ＋ＮＳ群、及びＳＴＺ＋Ｇ群）の個体は300 mg/dL以上の血糖値となり１型糖尿病症状を呈している。糸球体ろ過量（ＧＦＲ）や尿アルブミン値（Ａｌｂ／Ｃｒ）には顕著な変化はなく（データ示さず）、ヒト糖尿病性腎症の１期の病期に相当するものと考えられる。ただし、１２週齢の時点で尿アルブミンが上昇する例も認められるので、当該時点でヒトの糖尿病性腎症の１期から２期への移行期にさしかかっており、１期又は２期の病期に相当すると捉えることも可能である。
【００３０】
実施例３  糖尿病性腎症モデルマウスに対するグレリンの効果
【００３１】
（１）方法
前記のモデルマウスの作出から継続して実験を行った。
１２週齢を迎えた時点から、ＳＴＺ＋Ｇ群の個体に対しては、グレリンの腹腔内投与を開始し、２４週齢まで連日行った。投与はグレリン１０μｇを含む０．２ｍＬの溶液を１日一回（約300μｇ/kg体重/day）注射することで行った。一方、ＳＴＺ＋ＮＳ群については、グレリン溶液に代えて０．２ｍＬの生理食塩水を１日一回投与したことを除き、上記のＳＴＺ＋Ｇ群と同一の処置を行った。また、コントロール群の個体に対しては上記のいずれの注射も行わなかった。
グレリン投与は２４週齢まで継続して実施し、その間、体重、及び摂食量の測定を毎週行った。また、２４週齢において尿アルブミン値（Ａｌｂ／Ｃｒ）の測定を行った。２４週齢の時点で投与実験を終了し、各群のマウス個体から全身麻酔下で腎臓を摘出した。摘出した腎臓組織を常法に従って固定し、糸球体や尿細管細胞を含む部位について電子顕微鏡観察用の薄層切片を作製した。電子顕微鏡観察において、腎近位尿細管細胞を含む組織像を撮影し、尿細管細胞のミトコンドリアや糸球体基底膜の肥厚について定量的及び定性的解析を行った。
【００３２】
（２）結果と考察
（２−１）体重
コントロール群の体重は、８週齢時点で平均約23グラムであり、１２週齢にかけて平均約26.5グラムにまで増加した。その後の増加は鈍化したものの、体重は持続的な増加傾向を示し、２４週齢では平均約27.5グラムに達した。
ＳＴＺ＋ＮＳ群及びＳＴＺ＋Ｇ群は、８週齢のＳＴＺ投与開始時点でいずれも約23グラムを示し、投与開始後９週齢にかけて平均約21.5グラムまで一過的な体重減少を示した。その後、１２週齢にかけて体重は徐々に回復し、平均23-23.5グラムに達した。１２週齢においてＳＴＺ＋Ｇ群ではグレリン投与を、ＳＴＺ＋ＮＳ群では生理食塩水投与を開始したところ、前者の群では体重増加傾向が維持され、２４週齢において平均約25.7グラムに達した。一方、後者の群は体重がほぼ変化しないまま維持され、２４週齢において平均約23.5グラムとなった。２４週齢時点での体重についてＳＴＺ＋ＮＳ群とその余の２群について比較すると、コントロール群、及びＳＴＺ＋Ｇ群はいずれも有意に大きな体重値を示した（対コントロール群でP<0.01、対ＳＴＺ＋Ｇ群でP<0.05の有意差）。
ＳＴＺにより糖尿病が誘発された個体群ではコントロール群の個体と比して体重が小さいやせ傾向が示されたが、これは生体エネルギー代謝が消耗性となっていることを示すと考えられる。グレリンの投与はそのやせを軽減させる効果をもたらしたと認められる。
ＳＴＺ誘発性の糖尿病は１型糖尿病モデルであるが、２型糖尿病においても腎不全が進展するとインスリンの分泌が低下し、１型糖尿病に近い病態を示すようになる。それゆえ、腎不全が進行して消耗性の病態を示す状況においてもグレリン投与が有効であることは、２型糖尿病に起因する腎症（腎不全）患者においても本発明の薬剤が有意な効果を示すことを合理的に期待させる。
（２−２）摂食量
摂食量は、８週齢以降一貫して、コントロール群がその余の２群に対して低値を示した。本実施例の系において摂食量と体重の変動とは相関がなく、ＳＴＺによる糖尿病状態では摂食が促進されるにも関わらず体重増大には結びつかないことが明らかとなった。また、ＳＴＺ＋ＮＳ群とＳＴＺ＋Ｇ群との間に摂食量の有意差はなく（傾向としては、ＳＴＺ＋Ｇ群の方が若干摂食量が低かった）、本実施例の系でグレリンは摂食活動を有意に促進しないことが明らかとなった。また、本実施例で示されたグレリンの作用が、摂食活動の促進がもたらす栄養の豊富化に起因するものではなく、それと別異のメカニズムに起因するものであることが強く示唆された。
（２−３）アルブミン尿
尿アルブミン値を測定し、腎機能の評価を行った。２４週齢における尿サンプルについて、アルブミン量をクレアチニン量で除したＡｌｂ／Ｃｒ（アルブミン指数）を算出したところ、コントロール群は13.00±0.55、ＳＴＺ＋ＮＳ群は58.15±8.39、ＳＴＺ＋Ｇ群は33.38±8.34（単位はいずれもμｇ/ｍｇ・Ｃｒ）となった（図１）。ＳＴＺ＋ＮＳ群のアルブミン指数は対コントロール群（P<0.01）、対ＮＳＴ＋Ｇ群（P<0.05）のいずれと比べても有意に高かった。このことから、ＳＴＺの投与によって糖尿病性腎症が誘発され腎機能が低下するものの、グレリン投与によって当該腎機能の低下が改善するか、又は糖尿病性腎症の症状進行が抑制されることが強く示唆された。
（２−４）尿細管細胞ミトコンドリアのサイズ
２４週齢における尿細管細胞を電子顕微鏡で観察した（図２）。当該観察により、ＳＴＺ＋ＮＳ群の観察像から大きく膨潤したミトコンドリアが見いだされた（図２中央。特に、中央下段。）。尿細管細胞のミトコンドリアの膨潤化（swelling）は、早期糖尿病性腎症で観察される変化として報告されている。よって、ＳＴＺ＋ＮＳ群の尿細管細胞の電子顕微鏡像において大きく膨潤したミトコンドリアが観察されたことは、同群の個体において尿細管細胞がストレスを受けて変化し、糖尿病性腎症の病態を呈していることが理解される。
糖尿病性腎症における尿細管細胞ミトコンドリアの形態変化、及びグレリン投与が当該形態変化に与える影響をより詳細に検討するため、電子顕微鏡観察像を用いてミトコンドリアサイズを測定した（図３）。
図３Ａは面積（ｎｍ２）、図３Ｂは周囲長（ｎｍ）、図３Ｃは短径（最小径）（ｎｍ）、図３Ｄは長径（最大径）（ｎｍ）、図３Ｅは長径／短径比をそれぞれ示したものである。図３Ａ〜図３Ｄのいずれにおいても、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.01の信頼度で有意差が認められ、ＳＴＺ＋ＮＳ群で大きな値が示された。このことから、糖尿病性腎症が誘発された腎尿細管細胞においてミトコンドリアサイズが長径方向にも短径方向にも拡大されることが明らかとなった。また、図３Ｅに示される長径／短径比でも有意差が認められたことから、ミトコンドリアサイズの拡大は長径方向がより顕著であることが明らかになった。そして、ＳＴＺ＋Ｇ群ではいずれの指標においてもコントロール群とほぼ同等の値を示していることから、ＳＴＺの投与によって糖尿病性腎症が誘発されることにより尿細管細胞ミトコンドリアの膨潤がもたらされるが、グレリン投与によって当該膨潤が回復するか、又は膨潤化が抑制されることが強く示唆された。
（２−５）尿細管細胞ミトコンドリアのクリステ構造
２４週齢における尿細管細胞ミトコンドリアを電子顕微鏡で観察した（図４）。コントロールでは、ミトコンドリアの内膜（クリステ）構造は、ミトコンドリア短径方向にきれいに整列していることが見て取れる（図４左）。一方、ＳＴＺ＋ＮＳ群では、図２と同様にミトコンドリアの膨潤傾向が認められるが、形態変化はそれにとどまらず、クリステの整列が乱れていることも観察された（図４中央）。そして、ＳＴＺ＋Ｇ群では、ミトコンドリアの形態に関してコントロール群とほぼ同等の観察像が得られ、クリステの整列の顕著な乱れは観察されなかった。
ミトコンドリアのクリステの整列が乱れ、ミトコンドリア内部が不整に見えることは、ミトコンドリアが何らかの障害を受けた際の特徴として報告があり、その不整とミトコンドリアの機能異常との関連が示唆されている。このことから、ＳＴＺの投与によって糖尿病性腎症が誘発されることにより尿細管細胞に障害が起こり、尿細管細胞ミトコンドリアクリステの整列の乱れがもたらされるが、グレリン投与によって当該乱れが回復するか、又は当該乱れの発生が抑制されることが強く示唆された。
（２−６）糸球体基底膜の構造変化
２４週齢における糸球体細胞を電子顕微鏡で観察した（図５）。当該観察により、ＳＴＺ＋ＮＳ群の観察像において糸球体基底膜に肥厚が認められた（図５中央）。ＳＴＺ＋ＮＳ群の糸球体基底膜では、図５中央の観察像において矢頭で指示された箇所のように、局所的な肥厚によって基底膜の凹凸が顕著な箇所が複数認められた。一方、その余の群ではこのような局所的な肥厚はごく稀にしか観察されなかった。糸球体基底膜の肥厚は、糖尿病性腎症の進行に伴って顕著に観察される腎の変化である。
糖尿病性腎症における糸球体基底膜の形態変化、及びグレリン投与が当該形態変化に与える影響をより詳細に検討するため、電子顕微鏡観察像を用いて基底膜の膜厚を測定した（図６Ａ）。また、併せて開放スリット孔密度（Open slit pore density）、及び閉鎖スリット孔密度（Close slit pore density）の測定も行った（図６Ｂ及び図６Ｃ）。
図６Ａは基底膜の膜厚（ｎｍ）、図６Ｂは単位基底膜長あたりの開放スリット孔密度（個／ｍｍＧＢＭ）、図６Ｃは単位基底膜長あたりの閉鎖スリット孔密度（個／ｍｍＧＢＭ）をそれぞれ示したものである。図６Ａ〜図６Ｃのいずれにおいても、ＳＴＺ＋ＮＳ群とコントロール群又はＳＴＺ＋Ｇ群との間について、P<0.05、又はP<0.01の信頼度で有意差が認められた。
糸球体基底膜の膜厚は、ＳＴＺ＋ＮＳ群において他の２群と比して有意に大きな値が示された。このことから、ＳＴＺ＋ＮＳ群において糖尿病性腎症が誘発されており、その糸球体において基底膜が肥厚していることが明らかとなった。一方、ＳＴＺ＋Ｇ群では肥厚が認められず、コントロール群とほぼ同等の値を示していることから、ＳＴＺの投与によって糖尿病性腎症が誘発されることにより糸球体基底膜の肥厚がもたらされるが、グレリン投与によって当該肥厚が回復するか、又は肥厚が抑制されることが強く示唆された。
開放スリット孔は、糸球体基底膜の外側でタコ足細胞の足突起が作る規則正しいスリット構造を示すものである。タコ足細胞の足突起同士が融合・消失していき、開放スリット孔が減って閉鎖スリット孔が増えることは、正常なスリット構造が壊れていくことを意味する。この正常なスリット構造の破壊が糖尿病性腎症を含む多くの腎疾患においてタンパク尿が出現する主たる原因であると考えられている。ＳＴＺ＋ＮＳ群で開放スリット孔密度が低下し、閉鎖スリット孔密度が上昇したことは、糖尿病性腎症が進行し、タンパク尿を認める病期に入ったことを示している（ヒトの糖尿病性腎症の病期で言えば３期に相当する。）。一方、ＳＴＺ＋Ｇ群では、ＳＴＺ＋ＮＳ群と比して、開放スリット孔密度は有意に高く、閉鎖スリット孔密度は有意に低いことが明らかとなった。開放スリット孔密度及び閉鎖スリット孔密度に関して、ＳＴＺ＋Ｇ群ではＳＴＺ＋ＮＳ群よりも変化が抑えられたことになり、これはＳＴＺ＋Ｇ群では糖尿病性腎症の進行が抑制されたことを意味する。
【００３３】
実施例４  糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用するための物質のスクリーニング方法
糖尿病性腎症モデルマウスを用いて、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用するための物質の探索を行う。実施例２と同様の手法でＳＴＺを利用して糖尿病性腎症モデルマウスを作出し、１２週齢の時点でマウスを２群（ＳＴＺ＋Ｇ群、及びＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群）に分割する。いずれの群の個体に対しても、実施例３と同様にグレリン投与を行うが、ＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群の個体に対しては更にグレリンと共に、あるいはグレリンとは独立の経路で被検物質（Ｓ）の投与も行う。投与は原則として２４週齢まで継続して行うが、目的に応じて試験期間は短縮しても良い。被検物質の投与間隔は原則としてグレリンと同一とするが、これと別異の投与間隔を設定しても良い。投与期間中、及び／又は投与終了段階において、実施例３と同様の手法でアルブミン尿（Ａｌｂ／Ｃｒ値：アルブミン指数）を測定する。また、体重、摂食量、血清アルブミン量等の１又は複数の項目についても併せて測定しても良い。さらに、腎機能の評価のために糸球体ろ過量（ＧＦＲ値）を算出することや、尿素窒素（ＢＵＮ）値の測定を行い、アルブミン尿と共に、あるいはアルブミン尿に代えて腎機能の評価に用いても良い。この実験系において、ＳＴＺ投与を行っていないコントロール群も設定し、実施例３と同様に３群のマウスを並行して扱っても良い。
ＳＴＺ＋Ｇ群、及びＳＴＺ＋Ｇ＋Ｓ群の結果を比較し、後者の群において有意に腎機能が良好である場合について、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療においてグレリンと併用するために効果的な候補物質として物質Ｓを選抜する。
選抜において有意差に関する閾値を変化させ、より高次の選抜段階でより厳しい閾値の設定を行うことにより、その選抜を多段階で行うこともできる。
当該選抜を行うことで、より効果的な糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療のためのグレリンとの組合せ医薬を作出することや、低用量グレリンを含む糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療のためのグレリンとの組合せ医薬を作出することができる。あるいは、注射剤としてのグレリン投与の頻度を低下させつつも、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療に十分有効な経口投与剤を作出することも可能となる。
なお、本実施例はグレリンと組み合わせて使用するための物質の選抜方法として記載しているが、グレリンに代えて他のＧＨＳ−Ｒアゴニストを使用することや、ＧＨＳ−Ｒアゴニストと組み合わせて使用するための物質の探索を妨げるものではない。このような物質の探索もまた本願の目的とするところであり、当該実施例の手法に沿ってその探索は実施可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療剤は、糖尿病性腎症におけるアルブミン尿の改善や尿細管細胞ミトコンドリアの膨潤やクリステ構造の乱れを修復する作用を有し、糖尿病性腎症の進展防止及び／又は治療に有用であることから、産業上利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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