(57)【要約】【課題】高信頼性の変異情報を、ＤＮＡサンプル由来のリード情報から得ること。【解決手段】次世代シーケンサーから得たリード情報に基づくゲノム変異情報と、ＳＮＰアレイ等の他の手段によって得られたゲノム変異情報との間の一致度が、リード情報の深度（リード深度）に密接に関連していることを見出し、当該一致度を指標として用いることによってリード深度の閾値を決定し、当該リード情報に基づいてゲノム変異情報をフィルタリングすることにより、高い信頼性のゲノム変異情報を得ることができることを見出した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータによる、遺伝子変異情報を選択する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を実行することを特徴とする、遺伝子変異情報の選択方法。
（１）各ＤＮＡサンプルについて以下を行う工程：
（１−１）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
（１−２）当該各サブセットの変異の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各ＤＮＡサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異の遺伝子型を比較することによって計算する、
（１−３）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する；
（２）各ＤＮＡサンプルについて、工程（１−１）における一次変異セット情報から、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異を除いて、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報を得る工程；
（３）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の工程（１）及び（２）を行った結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、目的の変異情報として選択する工程。
【請求項２】
遺伝子変異情報は、一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、又は、欠失についての遺伝子変異情報を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的生物がヒトであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
二次変異セット情報を得るためのマッピング以外の手段は、ＳＮＰアレイであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子型一致度の測定値は、適合率（precision）、及び／又は、検出率(power)であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記工程（１−３）の所定の閾値が、適合率０．９９５以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記工程（１−３）の所定の閾値が、適合率０．９９５以上、かつ、検出率０．９３以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記工程（１）〜（３）が行われて第一の特定変異情報を得て、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選ばれる１以上の工程において、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得、当該第二の特定変異情報が、目的の変異情報として選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
（Ａ）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、工程（３）中の変異部位中の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｂ）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から選択され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で計算され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｃ）工程（１）、又は、工程（１）〜（３）が、最初の工程（１）で用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を各ＤＮＡサンプルについて得、そして、最初の変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｄ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される。
【請求項９】
リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の比率が、工程（Ａ）において７％〜１５％を超えることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（Ｂ）中の二次変異セット情報が、ＳＮＰアレイを用いることによって得られることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（Ｂ）における遺伝子型一致度の測定値が、適合率、及び／又は、検出率、であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記工程（Ｂ）の所定の閾値が、適合率０．９９５以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記工程（Ｂ）の所定の閾値が、適合率０．９９５以上、かつ、検出率０．９３以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータシステムであって、少なくとも記録部と演算処理部を備え、下記の処理（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
（ｂ）当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行され、
（ｅ）各ＤＮＡサンプルについて一次変異セット情報から、前記（ｄ）により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行され、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報が抽出され、
（ｆ）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の処理（ａ）〜（ｅ）を行った結果、残っている変異情報が、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出されて、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定される処理；
が実行されることを特徴とするコンピュータシステム。
【請求項１５】
上記コンピュータシステムの実行により得られた特定変異情報を第一の特定変異情報として、さらに、下記（α）〜（δ）から選ばれる１以上の処理より、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得る処理が実行され、当該第二の特定変異情報が、目的の変異情報として抽出される処理が実行されることを特徴とする、請求項１４に記載のコンピュータシステム。
（α）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、請求項１４の処理（ｆ）によって得られた変異情報の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理；
（β）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から抽出され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出処理され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理；
（γ）最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各ＤＮＡサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、請求項１４の処理（ｆ）により最初に抽出された変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理；
（δ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される処理。
【請求項１６】
塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
（ｂ）前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能、
（ｅ）各ＤＮＡサンプルについて一次変異セット情報から、前記（ｄ）により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行し、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報を抽出する機能、
（ｆ）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の処理（ａ）〜（ｅ）を実行した結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定する機能；
を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１７】
上記コンピュータプログラムにおける（ａ）〜（ｆ）の機能を実現させるアルゴリズムに加えて、さらに、下記（α）〜（δ）から選ばれる１以上の機能の実現により、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報を、既存の第一の特定変異情報から除いて、新たな第二の特定変異情報を得る機能を実現させるアルゴリズムが含まれることを特徴とする、請求項１６に記載のコンピュータプログラム。
（α）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、機能（ｆ）によって得られる変異情報の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能；
（β）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報を、一次変異セット情報から抽出し、遺伝子型一致度の測定値を、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出し、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能；
（γ）最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各ＤＮＡサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、機能（ｆ）により最初に抽出した変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能；
（δ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムを行って、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報を、除かれるべき変異情報として定義する機能。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のコンピュータプログラムが、コンピュータ読み取り可能状態で保存されていることを特徴とする、デジタルメディア。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により得られたことを特徴とする、変異情報。
【請求項２０】
コンピュータによるリード深度の適正範囲を決定する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、当該一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
（２）当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各ＤＮＡサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
（３）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する。
【請求項２１】
遺伝子型一致度の測定値が、適合率、及び／又は、検出率、であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
塩基配列のデータからリード深度の適正範囲を算出するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
（ｂ）前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能；
を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２３】
請求項２２に記載のコンピュータプログラムが、コンピュータ読み取り可能状態で保存されていることを特徴とする、デジタルメディア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンピュータを用いる生物の変異情報の選択方法、当該方法を行うためのシステム、及びコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる次世代シーケンサー（ＮＧＳ）が導入される前は、マイクロアレイが、総合的ゲノム解析に主に用いられていた。しかしながら、マイクロアレイを用いる場合、未知のゲノム変異情報を完全に検出することは困難である。なぜならば、プローブを予め設計しなければならないからである。
【０００３】
従って、ＮＧＳを用いることによるゲノム変異情報を検出するための手段の確立が、当該産業において期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ＮＧＳによって提供されるリード情報に関しては、マッピングにおけるエラー等のリスクがある。
【０００５】
従って、リード情報から、このようなリスクを排除して、信頼性の高いゲノム変異情報を見出すことが課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ＮＧＳ等から得たリード情報に基づくゲノム変異情報と、ＳＮＰアレイ等の他の手段によって得られたゲノム変異情報との間の一致度が、リード情報の深度（リード深度）に密接に関連していることを見出した。そして、本発明者は、当該一致度を指標として用いることによってリード深度の閾値を決定し、当該リード情報に基づいてゲノム変異情報をフィルタリングすることにより、高い信頼性のゲノム変異情報を得ることができることを見出し、本発明を完成した。さらに、本発明者は、当該リード情報からのゲノム変異情報の信頼性を、上記基本的フィルタリング手段に加えて他のフィルタリング手段を用いることによって高めることができることを見出した。
【０００７】
本発明は、コンピュータによる、遺伝子変異情報を選択する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を実行することを特徴とする、遺伝子変異情報の選択方法（以下、本発明の選択方法ともいう）を提供する。
（１）各ＤＮＡサンプルについて以下を行う工程。
（１−１）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
（１−２）当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各ＤＮＡサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
（１−３）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する；
（２）各ＤＮＡサンプルについて、工程（１−１）における一次変異セット情報から、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報を除いて、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報を得る工程。
（３）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の工程（１）及び（２）を行った結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、目的の変異情報として選択する工程。
【０００８】
本発明において、「ＤＮＡサンプル」は、試験対象（標的生物）のＤＮＡを含むサンプルであり、当該ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が含まれる。ＤＮＡサンプルの供給源である生物は、当該生物がゲノムを有する限り特に限定されず、ヒトのような哺乳類、爬虫類、昆虫、植物、バクテリア、及びウイルスを含む。これらのうち、ヒトが好ましい。
【０００９】
「変異」という用語は、ゲノムのヌクレオチド配列の変異を意味し、具体的には、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、挿入、又は欠失を含む。また、「変異情報」とは、これらを表すデジタル情報である。
【００１０】
「リード情報」という用語は、ゲノムをシーケンサーで処理することにより得られるヌクレオチド配列に関するデジタル情報である。リード情報は、２つのタイプの情報に分けられる。当該一方は、単一の配列情報からなるシングルリード情報であり、他方は、ゲノム上で隣接した２領域の配列情報を含むペアエンドリード情報である。本発明において、リード情報は、両方のタイプのリード情報を含む。リード情報を提供するシーケンサーは、大量の情報を比較的短時間で提供できる、いわゆる「次世代シーケンサー」を含む「高性能シーケンサー」である。本発明を行った時点での次世代シーケンサーの例としては、Genome Sequence FLX（Roche(454)社）；Genome Analyzer IIx、HiSeq2000、HiSeq2500、及びMiSeq（Illumina社）；SOLiD（Applied Biosystem社）；並びにPacBio RS II（Pacific Biosciences社）が挙げられるが、これらに限定されず、現時点及び将来提供される全てのシーケンサーが含まれる。
【００１１】
一次変異セット情報を生成する際に用いられる、「マッピングアルゴリズム」という用語は、リファレンス配列中の位置―そこからリード配列が読まれる―を特定するためのアルゴリズムであり、例えば、ＢＷＡ−ＭＥＭ、及びＢｏｗｔｉｅ２が含まれる。本明細書、請求の範囲、及び図面においては、「マッピング」は、「アラインメント」と同義である。「変異コールアルゴリズム」は、マッピングを行ったリード情報から、さらに変異情報が見つかったリード情報を、抽出するためのアルゴリズムであり、例えば、Ｂｃｆｔｏｏｌｓ、及びＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＡＴＫ）が含まれる。この変異コールアルゴリズムを、マッピングを行ったリード情報に対して施すことにより、変異情報が抽出され、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けが行われる。「リファレンスホモ」とは、所定の部位で標準ゲノム配列（又は参照ゲノム配列）と同じ塩基がホモ接合の遺伝子型で存在する形態であり、「非リファレンスホモ」とは、標準ゲノム配列とは異なる塩基がホモ接合の遺伝子型で存在する形態である。「ヘテロ」とは、標準ゲノム配列と同じ塩基と異なる塩基がヘテロ接合の遺伝子型で存在する形態である。
【００１２】
「リード深度」という用語は、coverageと同義であり、ＤＮＡサンプルのマッピングの際に計算される、各変異部位（遺伝子座）に関する対応するリードの数を意味し、重複する部位の読み取りが、試験対象の変異部位についてどの程度行われたかを示す指標である。本明細書中、単に「深度」と記載することもある。
【００１３】
「二次変異セット情報」を得るための「マッピング以外の手段」は、特に限定されず、例えば、サンガーシーケンス、マスアレイ（登録商標）、及びＳＮＰアレイが含まれ、一次変異セット情報を得るために使用したシーケンサーと少なくとも同等の精度、好ましくはより高い精度を有している。これらの手段のなかで、ＳＮＰアレイが、安価でかつ、一度に高精度で多数の変異部位を決定できるために、好ましい。この場合、「一度に高精度で多数」は、好ましくは、約３００，０００〜約３，０００，０００ＳＮＰに対応している。
【００１４】
「二次変異セット情報」には、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けが、具体的な「マッピング以外の手段」に応じた手法により割り付けられている。例えば、ＳＮＰアレイの場合は、プローブ色素の色彩や蛍光色素の蛍光を基に、「ジェノタイプコール」というクラスタリングアルゴリズムが施されることにより、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けがなされる。また、サンガーシーケンスの場合は、プローブ色素の色彩や蛍光色素の蛍光を基にしたチャートの波形を解析することにより、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けがなされることが知られている。
【００１５】
上記工程（２−２）における「遺伝子型一致度の測定値」は、（１）適合率（precision）、及び／又は、（２）検出率(power)であることが好適である。すなわち、適合率と検出率の双方、又は、いずれか一方を測定値として用いることができる。具体的には、これらの測定指標値に対して所定の閾値を設定して、測定値が、当該適合率又は検出率の閾値以上である場合、あるいは、当該適合率及び検出率の双方の閾値以上のである場合を、「遺伝子型一致度が所定の閾値より高い」として認定することができる。好ましい態様としては、適合率と検出率いずれか一方であれば、適合率を優先させて閾値指標とすることが好適であり、適合率と検出率の双方を閾値の指標とすることがさらに好適である。ここで、これらの測定指標値について説明する。
【００１６】
＜指標値（適合率と検出率について）＞
これらの指標値は、工程（１）で行われる「変異コール」によって算出可能な値である。変異コールアルゴリズムの実行により、先行して行われるリード情報のマッピングやＳＮＰアレイの使用、に際して認められる、「リード情報が参照配列情報とマッチしない『非マッチング情報』」に対して、当該非マッチング情報が、エラーによるミスマッチなのか、又は、ＤＮＡサンプルが真に有する変異によるミスマッチなのか、についての判別が行われる。ここで、非マッチング情報が「エラーによるミスマッチ」ではないと変異コールアルゴリズムの実行により判定がなされる場合に、非マッチングが起こった部位には変異が存在すると判定される。さらに、ヒトのような２倍体生物においては、変異が同定された部位のリード情報がすべて非リファレンス型である場合は「非リファレンスホモ」であり、これは父母双方由来のＤＮＡに変異が存在したものとみなされる。また、変異が同定された部位のリード情報にリファレンス型と非リファレンス型が混在する場合「ヘテロ」であり、父母のいずれかにおいて変異が存在したものとみなされる。さらに変異コールアルゴリズムが変異と判定しない場合においても、全てのリード情報がリファレンス型である部位はリファレンスホモの状態にあるとみなすことができる。
【００１７】
これらのことをまとめると、例えば、標的生物がヒトの場合において、変異コールアルゴリズムを実行した場合の非マッチング情報としては、（ア）リファレンスホモ、（イ）ヘテロ、（ウ）非リファレンスホモの３通りの分類が可能であり、一次変異セット情報の場合と、二次変異セット情報の場合を組み合わせると、併せて９通りの場合が認められる。
【００１８】
下記表１において、これらの９通りについて図示し、かつ、これらを基に算出される適合率と検出率について説明する。ＮＧＳに基づく変異コールの結果が一次変異セット情報を生成し、ＳＮＰアレイに基づく変異コールの結果が二次変異セット情報を生成する。表中のアルファベット（ａ〜ｉ）は、各サブセットの中で変異情報として検出された遺伝子型の数である。例えば、下記表１中の「ｄ」は、ＮＧＳで「ヘテロ」と判定され、ＳＮＰアレイで「リファレンスホモ」と判定された遺伝子型の数である。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
ここで、適合率は、「一次変異セット情報（本例ではＮＳＧ）で、「ヘテロ又は非リファレンスホモ」と判定された内、二次変異セット情報（本例ではＳＮＰアレイ）においても同じ判定がなされた割合」であり、上記表１においては、「（ｅ＋ｉ）／（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｈ＋ｉ）」で表される値である。検出率は、「二次変異セット情報（本例ではＳＮＰアレイ）で、「ヘテロ又は非リファレンスホモ」と判定された内、一次変異セット情報（本例ではＮＳＧ）においても同じ判定がなされた割合」であり、上記表１においては、「（ｅ＋ｉ）／（ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ＋ｈ＋ｉ）」で表される値である。適合率と検出率共に、表示形式は限定されず、例えば、直接比率値表示であっても、百分率表示であってもよい。
【００２１】
上記工程（２−３）における適合率の閾値は、０．９９５以上であることが好適であり、さらに好適には０．９９８以上である。同じく検出率の閾値は、０．９３以上であることが好適であり、さらに好適には０．９５以上である。
【００２２】
さらに本発明の選択方法は、上記工程（１）〜（４）が行われて第一の特定変異情報を得て、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選ばれる１以上の工程において、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得、当該第二の特定変異情報を、目的の変異情報として選択される態様とすることも可能である。
（Ａ）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、工程（３）中の変異部位中の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｂ）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から選択され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で計算され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｃ）工程（１）、又は、工程（１）〜（４）が、最初の工程（１）とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって行われて、各ＤＮＡサンプルについて、異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を得、そして、最初の変異情報に含まれるが、異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される；
（Ｄ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される。
【００２３】
これらの追加工程（Ａ）〜（Ｄ）は、上述の本発明の選択方法が行われることを前提として、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）として示される４つのタイプの他のフィルタリング手段の一つがさらに行われるか、それらの二つから四つが組み合わせて行われる場合を規定している。これらの追加工程（Ａ）〜（Ｄ）を、本発明の選択方法に加味することにより、リード情報由来の、より高い信頼性を有する変異情報の入手が可能となる。なお、上記の追加工程（Ａ）における「特定の変異情報」とは、例えば、個別のＳＮＶ等の変異情報を意味するものである。
【００２４】
さらに本発明は、上記の本発明の選択方法を行うためのコンピュータシステムを提供し、コンピュータに本発明の選択方法を実行させるためのアルゴリズムを含むコンピュータプログラム、本発明のコンピュータプログラムを、コンピュータが読み取り可能な状態で保存されている、デジタルメディアを提供する。
【００２５】
また、本発明は、本発明の選択方法により得られた変異情報を提供する。
【００２６】
さらに本発明は、コンピュータによりリード深度の適正範囲を決定する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含む方法（以下、本発明の深度決定方法ともいう）を提供する。
（１）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、当該一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
（２）当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各ＤＮＡサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
（３）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する。
【００２７】
本発明の深度決定方法の個々の定義は、本発明の選択方法において述べた通りである。例えば、「遺伝子型一致度の測定値」は、上述した、「適合率（precision）及び／又は検出率(power)」であることが好適である。
【００２８】
さらに本発明は、本発明の深度決定方法を行うためのコンピュータシステム又はコンピュータ装置を提供し、コンピュータに本発明の深度決定方法を実行させるためのアルゴリズムを含むコンピュータプログラムを提供し、当該コンピュータプログラムが、コンピュータ読み取り可能状態で保存されている、デジタルメディアを提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、高信頼性の変異情報を、ＤＮＡサンプル由来のリード情報から得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のＳＮＶフィルターの全体像を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
上記した本発明の選択方法と深度決定方法は、具体的には、本発明のコンピュータシステムにおいて実行され、かつ、本発明のコンピュータプログラムのアルゴリズムを、コンピュータにおいて実現させることにより実行される。これらの形態により、高信頼性の変異情報を、ＤＮＡサンプル由来のリード情報から容易に得ることができる。
【００３２】
［本発明のコンピュータシステム］
コンピュータプシステムまたはコンピュータ装置は、主要には、本発明の選択方法の各工程を、コンピュータにおいて行うためのコンピュータシステムである。なお、コンピュータシステムは、コンピュータ装置と実質的に同義である。コンピュータシステムまたは装置は通常、記録部（ＨＤ）、演算処理部（ＣＰＵ）、操作部（キーボード）、及び表示部（ディスプレイ）を有している。記録部において、本発明の選択方法を行うための基礎を形成する電子情報が記録され、演算処理部によって必要な工程の処理が、一時記録部（メモリ）に読み出された電子情報に対して行われ、そして結果がまた記録部に記録される。演算処理部において、操作部の操作を促進するためのまたは処理結果を表示するための画像データが作成され、当該画像データがビデオＲＡＭを介して、表示部に表示される。このようにして、各工程を前進させる処理が行われ、そして、最後に、必要な変異情報が導き出される。本発明の深度決定方法を行うためのコンピュータシステム又は装置においても同様であり、適正リード深度を決定するための各工程の処理がコンピュータにおいて行われることにより、所望の適正リード深度が導き出される。
【００３３】
本発明のコンピュータシステム又は装置の主要な態様は、塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータシステムであって、少なくとも記録部と演算処理部を備え、下記の処理（ａ）〜（ｆ）が実行されることを特徴とするコンピュータシステム又は装置である。
（ａ）当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
（ｂ）当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行され、
（ｅ）各ＤＮＡサンプルについて一次変異セット情報から、前記（ｄ）により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行され、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報が抽出され、
（ｆ）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の処理（ａ）〜（ｅ）を行った結果、残っている変異情報が、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出されて、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定される処理。
【００３４】
上記処理（ａ）〜（ｆ）は、本発明の選択方法における各工程（１）〜（３）に対応する処理である。すなわち、処理（ａ）（ｂ）は、工程（１−１）に該当し、処理（ｃ）は工程（１−２）に該当し、処理（ｄ）は工程（１−３）に該当し、処理（ｅ）は工程（２）に該当し、処理（ｆ）は工程（３）に該当する。
【００３５】
処理（ａ）における「一次変異セット情報」は、上記のように、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた変異情報である。「マッピングアルゴリズム」と「変異コールアルゴリズム」については、上述した通りである。当該「一次変異セット情報」の確保手段は限定されず、例えば、同一のコンピュータ端末において、リード情報から、「マッピングアルゴリズム」と「変異コールアルゴリズム」に基づいて生成したものを用いても良いし、別途他所で生成された「一次変異セット情報」を本発明のコンピュータシステムに対して用いても良い。さらに、ＳＮＰアレイ等のマッピング以外の手段によって得られた「二次変異セット情報」についても、確保手段は全く限定されない。
【００３６】
処理（ａ）は、後述する実施例の「選択手順１」に該当する処理である。
【００３７】
リード深度範囲毎のサブセットへのグループ分け処理（処理（ｂ））、及び、一次変異セット情報と二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理（処理（ｃ））は、後述する実施例の「選択手順２（図１の「手順２」の真ん中のグラフ）」に該当する処理である。上述のように処理（ｃ）の「各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値」は、好適には適合率（precision）、及び／又は、検出率(power)として、さらに好適には適合率として、最も好適には適合率及び検出率として用いられる。適合率の閾値は、０．９９５以上であることが好適であり、さらに好適には０．９９８以上である。検出率の閾値は、０．９３以上であることが好適であり、さらに好適には０．９５以上である。
【００３８】
次いで、リード深度の適正範囲の決定処理（処理（ｄ））、及び、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理（処理（ｅ））は、後述する実施例の「選択手順２（図１の「手順２」）」に該当する処理である。
【００３９】
さらに、目的の特定変異情報の特定処理（処理（ｆ））の結果の一例が、後述する実施例の表２の「手順２」に示されている。
【００４０】
本発明のコンピュータシステムは、上記コンピュータシステムの実行により得られた特定変異情報を第一の特定変異情報として、さらに、下記（α）〜（δ）から選ばれる１以上の処理より、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得る処理が実行され、当該第二の特定変異情報が、目的の変異情報として抽出される処理が実行されるコンピュータシステムであることが好適である。
（α）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、上記処理（ｆ）によって得られた変異情報の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
（β）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から抽出され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出処理され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
（γ）最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各ＤＮＡサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、処理（ｆ）により最初に抽出された変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
（δ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される処理。
【００４１】
「変異部位毎のリード深度に基づく変異情報の除去」に関する追加処理αは、本発明の選択方法の追加工程（ａ）に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順３」（図１の「手順３」の、特に真ん中）に相当し、その結果の一例は、表２の「手順３」に記載されている。
【００４２】
「ゲノムの複雑性に基づく変異情報の除去」に関する追加処理βは、本発明の選択方法の追加工程（ｂ）に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順４」（図１の「手順４」の、特に左側の表と、右図）に相当し、その結果の一例は、表２の「手順４」に記載されている。
【００４３】
「解析手法の偏りに関する変異情報の除去」に関する追加処理γは、本発明の選択方法の追加工程（ｃ）に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順５」（図１の「手順５」の特に上図）に相当し、その結果の一例は、表２の「手順５」に記載されている。
【００４４】
「集団遺伝学的な変異情報の除去」に関する追加処理（δ）は、本発明の選択方法の追加工程（ｄ）に相当する処理であり、具体的には、ハーディ・ワインベルグ平衡検定を行い、当該平衡から逸脱した変異情報の除去が行われている。本追加処理（δ）は、後述する実施例の「選択手順６」（図１の「手順６」）に相当し、その結果の一例は、表２の「手順６」に記載されている。
【００４５】
本発明のコンピュータシステム又は装置は、本発明の選択方法のみならず、本発明の深度決定方法を実行するための態様とすることができる。具体的には、塩基配列のデータから特定リード深度の範囲を選択するコンピュータシステムであって、少なくとも記録部と演算処理部を備え、下記の処理（ａ）〜（ｄ）が実行されることを特徴とするコンピュータシステム又は装置である。
（ａ）当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
（ｂ）当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行される。
【００４６】
上記処理（ａ）〜（ｄ）は、本発明の選択方法を実行するためのコンピュータシステム又は装置における処理（ａ）〜（ｆ）のうちの（ａ）〜（ｄ）と実質的に同じである。
［本発明のコンピュータプログラム］
本発明のコンピュータプログラムの第１の態様は、本発明の選択方法を実行するためのアルゴリズムが含まれるコンピュータプログラムであり、具体的には、塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能（ａ）〜（ｆ）を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラムである。
（ａ）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能。
（ｂ）前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能。
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能。
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能、
（ｅ）各ＤＮＡサンプルについて一次変異セット情報から、前記（ｄ）により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行し、各ＤＮＡサンプルについて残っている変異情報を抽出する機能。
（ｆ）全てのＤＮＡサンプルの中の少なくとも１つのＤＮＡサンプルについて、上記の処理（ａ）〜（ｅ）を実行した結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定する機能。
【００４７】
上記機能（ａ）〜（ｆ）は、本発明のコンピュータシステム又は装置における、「処理（ａ）〜（ｆ）」にそのまま対応する。すなわち、本発明のコンピュータプログラムは、上記機能（ａ）〜（ｆ）を、コンピュータにおいて実現させることにより、コンピュータに上記処理（ａ）〜（ｆ）を行わせることができるアルゴリズムが含まれている。
【００４８】
機能（ａ）を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能（ａ）として記載された通りである。
【００４９】
機能（ｂ）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、一次変異セット情報に割り当てられたリード深度の値毎に区分けするアルゴリズムが挙げられ、当該区分けの程度は特に限定されず、「１」毎に行うことも可能であり、それより多くの値で行うことも可能である。後述する実施例では「１」毎に区分けが行われた。
【００５０】
機能（ｃ）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、前記機能（ｂ）によって得られる、一次変異セット情報に基づく、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセット毎に、個々の変異情報について、上述した、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」に分類処理し、さらに、二次変異セット情報についても、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」に分類処理し、上記の「適合率」及び／又は「検出率」を算出・合算（平均化）処理するアルゴリズムが挙げられる。
【００５１】
機能（ｄ）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、「適合率」及び／又は「検出率」についての所定の閾値（上記の通り）と、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセットについて算出・合算（平均化）処理された「適合率」及び／又は「検出率」の値を比較して、当該閾値を超える値を有するリード深度毎のサブセットを抽出して、当該サブセットのリード深度を統合して、リード深度の適正範囲を生成するアルゴリズムが挙げられる。
【００５２】
機能（ｅ）を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能（ｅ）として記載された通りである。
【００５３】
機能（ｆ）を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能（ｆ）として記載された通りである。
【００５４】
本発明のコンピュータプログラムには、コンピュータプログラムにおける（ａ）〜（ｆ）の機能を実現させるアルゴリズムに加えて、さらに、下記（α）〜（δ）から選ばれる１以上の機能の実現により、除かれるべき変異情報として定義された１以上の変異情報を、既存の第一の特定変異情報から除いて、新たな第二の特定変異情報を得る機能を実現させるアルゴリズムを含ませることができる。
（α）第一の特定変異情報が、２以上のＤＮＡサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、上記機能（ｆ）によって得られる変異情報の５％〜２０％を超える場合、当該特定の変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
（β）低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報を、一次変異セット情報から抽出し、遺伝子型一致度の測定値を、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出し、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
（γ）最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各ＤＮＡサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、上記機能（ｆ）により最初に抽出した変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
（δ）ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムを行って、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報を、除かれるべき変異情報として定義する機能。
【００５５】
上記追加機能（α）〜（δ）は、本発明のコンピュータシステム又は装置における、「追加処理（α）〜（δ）」にそのまま対応する。すなわち、本発明のコンピュータプログラムは、上記追加機能（α）〜（δ）を、コンピュータにおいて実現させることにより、コンピュータに上記処理（α）〜（δ）を行わせることができるアルゴリズムが含まれている。
【００５６】
追加機能（α）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、第一の特定変異情報における特定の変異情報（ＳＮＶの情報等）のリード深度をＤＮＡサンプル毎に抽出して、当該リード深度が上記適正範囲外のＤＮＡサンプル数の、全体のＤＮＡサンプル数に対する比率を算出して、当該算出値が、特定の閾値（下限値として５〜２０％のいずれか）を超えるか否かを判断して、超える場合には、当該特定の変異情報を「除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。
【００５７】
追加機能（β）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、所定の低複雑度領域における変異情報を、一次変異セットと二次変異セットにおいて抽出し、「適合率」及び／又は「検出率」についての所定の閾値（上記の通り）と、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセットについて算出・合算（平均化）処理された「適合率」及び／又は「検出率」の値を比較して、当該閾値以下の「適合率」及び／又は「検出率」の変異情報を、リード深度に係わらず「除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。
【００５８】
追加機能（γ）を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、「最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各ＤＮＡサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報」と、「上記機能（ｆ）により最初に抽出した変異情報」の一致又は不一致を抽出し、当該不一致の変異情報を「上記機能（ｆ）により最初に抽出した変異情報から除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。
【００５９】
追加機能（δ）を実現させるためのアルゴリズムは、上記追加機能（δ）として記載された通りである。
【００６０】
本発明のコンピュータプログラムは、本発明の選択方法のみならず、本発明の深度決定方法をコンピュータにおいて実現するためのアルゴリズムとすることができる。具体的には、塩基配列のデータからリード深度の適正範囲を算出するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能（ａ）〜（ｄ）を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラムである。
（ａ）マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の１以上の個体の各ＤＮＡサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各ＤＮＡサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
（ｂ）前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
（ｃ）各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
（ｄ）所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能；
【００６１】
上記機能（ａ）〜（ｄ）は、本発明の選択方法を実行するためのコンピュータプログラムにおける機能（ａ）〜（ｆ）のうちの（ａ）〜（ｄ）と実質的に同じである。
【００６２】
本発明のコンピュータプログラムは、Ｃ言語、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅrｌ、もしくはＰｙｔｈｏｎのような高級コンピュータ言語でのみならず、２進数によってもしくはアセンブリ言語でも記載されることが可能である。コンピュータプログラムは、必要に応じてもしくは前もって記録部に、又は、外部ハードウェアに、記録されており、記録されたアルゴリズムに従った演算処理は、必要に応じて演算処理部において行われる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明の実施例を説明する。
［全ゲノムのシークエンシング］
サンプル同士の混合を防ぐために、ライブラリ構築にはゲノムＤＮＡ検体を、９６穴プレートを使って取り扱った。ゲノムＤＮＡはラボラトリ自動化システム（Ｂｉｏｍｅｋ  ＮＸＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使って濃度２０ｎｇ／μＬになりように調製され、９６穴プレートＤＮＡ超音波破砕装置（Ｃｏｖａｒｉｓ  ＬＥ２２０，Ｃｏｖａｒｉｓ社）を使って平均５５０ｂｐになるように断片化をした。このようにして得られたＤＮＡはＢｒａｖｏリキッドハンドリング装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使ってＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲ−Ｆｒｅｅ  ＨＴ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）でライブラリ化を行った。最終的に、調製されたライブラリはバーコードラベルで識別された１．５ｍＬの試験管に移され、ライブラリ品質管理用に変性処理を行った。
【００６４】
ライブラリの定量化および品質管理は新規に開発した定量ＭｉＳｅｑ法（ｑＭｉＳｅｑ）で実施した。この手法ではまず、８μＬまたは１０μＬの調整済みライブラリを等量の０．１Ｎ  ＮａＯＨと一緒に５分間変性させた後、４９倍の体積の氷冷した「Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１緩衝液」で希釈を行う。次に、予めＨｉＳｅｑで解析済みの３つの対象サンプルを含む９６個の５０μＬ希釈済みライブラリを混合する。このうち６０μＬを、５４０μＬの氷冷したＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１緩衝液で希釈し、ＭｉＳｅｑの２５ｂｐペアエンドプロトコルで解析を行う。ＭｉＳｅｑシークエンサーの解析で決められたインデックス比はＨｉＳｅｑの実行にあたり実行条件を決めるための相対濃度として利用する。ｑＭｉＳｅｑ法の詳細は手法論文として既に公知である［Katsuoka F, et al. An efficient quantitation method of next-generation sequencing libraries by using MiSeq sequencer. Anal. Biochem. 466c, 27-29 (2014)］。また、ＤＮＡライブラリの品質管理を行うに際して、ＭｉＳｅｑ  ＱＣに加えてＦｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）も利用した。
【００６５】
前述のＤＮＡライブラリは製造者の手順書に従ってＨｉＳｅｑ２５００シークエンサーで解析に使った。解析はＴｒｕＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とｏｎｅ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ（２００  ｃｙｃｌｅｓ，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使って１６２ｂｐペアエンドのＲａｐｉｄ−Ｒｕｎ  Ｍｏｄｅで実行した。ｑＭｉＳｅｑの結果に基づきライブラリを適切な濃度に調整し、ｏｎ−ｂｏａｒｄクラスタ形成（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）が行われた。最初に報告されるクラスタ密度を確認し、その密度（約５５０から６５０Ｋ／ｍｍ2）によって解析を継続するかの判断を行う作業を反復的に行った。
【００６６】
［選択手順１］  各ＤＮＡサンプルのアライメントと変異コール
ＨｉＳｅｑシークエンサーから出力された各ゲノムＤＮＡサンプル（以下、ＤＮＡサンプルとも記載する）のシークエンスリードを、参照ゲノム配列（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にデコイ配列（ｈｓ３７ｄ５）とともにアライメントした。アライメントは“−Ｘ  ２０００”オプションを使ったＢｏｗｔｉｅ２（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１．０）と、標準オプションを使ったＢＷＡ−ＭＥＭ（ｖｅｒ．０．７．５ａ−ｒ４０５）で行った。変異コールは、これらのアライメント結果を使って「Ｂｃｆｔｏｏｌｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ」（ｖｅｒ．  ０．１．１７−ｄｅｖ）と「ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ」（ＧＡＴＫ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５−２）で行った（図１の「手順１」）。以後のフィルタリングで使うために、各ＤＮＡサンプルの全ＳＮＶ部位のリード深度を計算した（図１の「手順１」の中の最下行）。ここでリード深度は、各ＳＮＶポジションにおいて、マッピングクオリティ５以上でアラインメントが行われたシークエンスリードの数であることを確認する。
【００６７】
次にＳＮＰアレイで設計されている部位の適合率（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）と検出率（ｐｅｗｅｒ）（＝再現率（ｒｅｃａｌｌ））を評価するために、ＳＮＶコールと同一サンプルの解析を行った「ＨｕｍａｎＯｍｎｉ２．５−８  ＢｅａｄＣｈｉｐ」のジェノタイプコールとの比較を行った。Ｂｏｗｔｉｅ２のアライメントに対してＢｃｆｔｏｏｌｓの変異コーラーを使って得られたＳＮＶ（Ｂｏｗｔｉｅ２＋Ｂｃｆｔｏｏｌｓ）の適合率は、常にＢＷＡ−ＭＥＭのアライメントに対してＧＡＴＫの変異コーラーを適合して得られたＳＮＶ（ＢＷＡ−ＭＥＭ＋ＧＡＴＫ）より高かった。一方、検出率はＢＷＡ−ＭＥＭ＋ＧＡＴＫの方が、Ｂｏｗｔｉｅ２＋Ｂｃｆｔｏｏｌｓよりも高かった。この結果は先行研究の報告と一致している［Li H. Toward better understanding of artifacts in variant calling from high-coverage samples. Bioinformatics 30, 2843-2851 (2014)］。これらの結果から、「ＢＷＡ−ＭＥＭ＋ＧＡＴＫ」で得られたＳＮＶは高感度、つまり可能な限り多くのＳＮＶ候補を発見することを目指した結果であると考えることができる。一方、「Ｂｏｗｔｉｅ２＋Ｂｃｆｔｏｏｌｓ」で得られたＳＮＶは信頼度が高く、以下のフィルタリングステップにおける、高信頼のＳＮＶ候補として使うことにする。以下断りがない限り、「ＳＮＶ」は、「Ｂｏｗｔｉｅ２＋Ｂｃｆｔｏｏｌｓ」で変異コールされたバリアントを指すこととする。
【００６８】
［選択手順２］  ＤＮＡサンプル毎のリード深度に基づくＳＮＶのフィルタリング
極端にリード深度が高いまたは低い遺伝型をＤＮＡサンプル毎にフィルタリングした。ＤＮＡサンプル毎に、「ＨｕｍａｎＯｍｎｉ２．５−８  ＢｅａｄＣｈｉｐ」のジェノタイピング結果との比較から計算された、適合率と検出率に基づき、遺伝型を残すリード深度の範囲を決定した。ＮＧＳのリード深度によってＳＮＶをグループ分けし、グループごとに適合率と検出率を計算した（図１の「手順２」の真ん中のグラフ）。その際、複数の染色体にアラインメントされたリードの影響を排除するために、マッピングクオリティ５以上のリードのみを考慮した。その結果、適合度が０．９９８よりも大きく、かつ検出率が０．９５よりも大きなグループに属するＳＮＶのリード深度の範囲にある遺伝型を信頼できるＳＮＶとして残した（図１の「手順２」）。この選択手順２において、２％の分離サイトが取り除かれた（表２の「手順２」）。
【００６９】
【表２】
2017016665.tif 000004
【００７０】
表２における「既知変異」は、「ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ  １３８」において報告されているＳＮＶである。
【００７１】
［選択手順３］  ＳＮＶ部位毎のリード深度に基づくＳＮＶのフィルタリング
前記選択手順２で、リード深度に基づくフィルタリングが適用された結果、全ＤＮＡサンプルの１０％以上の遺伝型が存在しないＳＮＶは、部位全体を取り除いた。例えば、反復配列へのリードのアラインメントの結果、極端に高いまたは低いリード深度になるような部位はこのフィルタリングの対象になりうる。このフィルタリングによって残るＳＮＶ部位の割合を計算した（図１の「手順３」の真ん中）。この選択手順３において、４．９９％のＳＮＶ部位が取り除かれた（上記表２の「手順３」）。
【００７２】
［選択手順４］  ゲノムの複雑性に基づくフィルター
縦列型反復配列等の配列の複雑度が低い領域の正確な変異コールは、一般的に困難である。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラム[Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-4.0. 2013-2015 <http://www.repeatmasker.org>.]は５６％のゲノム領域がこのような低複雑性の領域だと判定している。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒで判定されたリピートのグループ毎に、同一サンプルのＳＮＰアレイジェノタイピングとの間の遺伝型の適合度の計算を行った（図１の「手順４」の左側の表）。各ゲノム領域のＳＮＶコールの適合度は、「ＨｕｍａｎＯｍｎｉ２．５−８  ＢｅａｄＣｈｉｐ」の解析で得られた遺伝型コールの結果に基づいて算出し、適合度が０．９９７以下になったゲノム領域（図１の「手順４」の右図）のＳＮＶは取り除いた。低複雑性のゲノム領域には、Ａｌｕ、ＥＲＶＫ、Ｌｏｗ＿ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ、Ｓｉｍｐｌｅ＿ｒｅｐｅａｔ、ＴｃＭａｒ−Ｍａｒｉｎｅｒ、ＣＲ１、ＤＮＡ、Ｄｅｕ、Ｄｏｎｇ−Ｒ４，ＥＲＶ、ＥＲＶ１、ＥＲＶＫ、ＥＲＶＬ，ＥＲＶＬ−ＭａＬＲ、ＧＥＮＣＯＤＥ、Ｇｙｐｓｙ、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ、Ｌ１、Ｌ２，ＬＴＲ、ＭＩＲ、Ｍｅｒｌｉｎ，ＭｕＤＲ，Ｐｅｎｅｌｏｐｅ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＲＮＡ、ＲＴＥ、ＲＴＥ−ＢｏｖＢ、ＳＩＮＥ、ＴｃＭａｒ、ＴｃＭａｒ−Ｔｃ２、ＴｃＭａｒ−Ｔｉｇｇｅｒ、ａｃｒｏ、ｃｅｎｔｒ、ｈＡＴ、ｈＡＴ−Ｂｌａｃｋｊａｃｋ、ｈＡＴ−Ｃｈａｌｉｅ、ｈＡＴ−Ｔｉｐ１００、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ、ｒＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｒｐＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｅｌｏ等が含まれる。この手順で１４．２２％のＳＮＶが取り除かれた（上記表２の「手順４」）。
【００７３】
［選択手順５］  解析手法の偏りに対するフィルター
上記選択手順１の解析手法の偏りを制御するために、異なる解析手法においても発見されたＳＮＶ部位のみを残した。具体的には、上述したように、高感度の検出が行われる「ＢＷＡ−ＭＥＭ＋ＧＡＴＫ」を「他の手法」として用い、当該「他の手法」では発見されなかったＳＮＶを、追加除外した。例えば、図１の「手順５」の上図において、最も左のＳＮＶは他の手法（「ＢＷＡ−ＭＥＭ＋ＧＡＴＫ」）では発見されなかったので、このＳＮＶは以後の解析から除外した。この手順で、０．５７％のＳＮＶが除去された（上記表２の「手順５」）。
【００７４】
［選択手順６］  集団遺伝学的なフィルタリング
上記選択手順５で得られたＳＮＶの遺伝型頻度から計算される、ハーディーワインバーグ平衡検定でｐ値が１０-5を下回るＳＮＶを除去した。このフィルターは遺伝型頻度が、ハーディーワインバーグ平衡から逸脱したＳＮＶの除去を意図している。ここで除去される多くの場合は、参照配列自体が不完全であったり、系統的なアラインメントエラーによるアーティファクトであることが想定される。この手順で１．０３％のＳＮＶが取り除かれ、最終的に当初のＳＮＶの内７７．２０％がフィルタリング後に残った（図１の「手順６」と上記表２の「手順６」）。
【図１】
2017016665.tif 000005