(57)【要約】      （修正有）【課題】今までにない光学的性質を有するホスホール化合物の提供。【解決手段】式（１）で表されるホスホール化合物。2017052863.tif 000035（Ｒ１はアルキル基、アリール基等；Ｒ２はＨ、アリール基、Ｆ等；Ｒ３はＨ、アリール基等；Ａｒは置換／非置換の炭化水素芳香環等；ｎは０又は１；ｍは１〜３の整数；π１及びπ２はπ共役ユニットで、π共役ユニットは２価のアルケニル基、２価の炭化水素芳香環等；右端の環構造はπ１又はπ２のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合）【効果】大員環部位がＮａ結合能力を持ち、Ｎａ＋が大員環部位に結合することにより蛍光極大波長が短波長側にシフトする。【選択図】図１
2017052863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）： 
【化１】
2017052863.tif 000030
（式（１）中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又は置換アミノ基であり、Ｒ２は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、カルボニル基、イミノ基、シアノ基又はフッ素原子であり、Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒは炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環又は置換ヘテロ芳香環であり、ｎは０又は１であり、ｍは１〜３の整数であり、π１及びπ２は同じであっても異なっていてもよいπ共役ユニットであって、該π共役ユニットは、２価のアルケニル基、２価の置換アルケニル基、２価のアルキニル基、２価の置換アルキニル基、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環であり、
【化２】
2017052863.tif 000031
はπ１又はπ２のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合している）
で表されるホスホール化合物。
【請求項２】
Ｒ１はアリール基又は置換アリール基であり、Ｒ２は水素原子、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒはベンゼン環又はナフタレン環であり、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π1はベンゼン環であり、
【化３】
2017052863.tif 000032
はベンゼン環であるπ1のパラ位に結合している、請求項１に記載のホスホール化合物。
【請求項３】
Ｒ３は、アリール基又は置換アリール基である、請求項２に記載のホスホール化合物。
【請求項４】
下記式（２）： 
【化４】
2017052863.tif 000033
（式（２）中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又は置換アミノ基であり、Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ４及びＲ５は同じであっても異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒは炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環又は置換ヘテロ芳香環であり、ｎは０又は１であり、ｍは１〜３の整数であり、π１及びπ２は同じであっても異なっていてもよいπ共役ユニットであって、該π共役ユニットは、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環であり、
【化５】
2017052863.tif 000034
はπ１又はπ２のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合している）
で表されるホスホール化合物。
【請求項５】
Ｒ１はアリール基又は置換アリール基であり、Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ４及びＲ５は同じものであって、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒはベンゼン環又はナフタレン環であり、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π１はベンゼン環である、請求項４に記載のホスホール化合物。
【請求項６】
Ｒ３は、アリール基又は置換アリール基である、請求項５に記載のホスホール化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のホスホール化合物を含有する蛍光色素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホール化合物及びそれを含有する蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光性有機化合物は、有機ＥＬ素子の発光材料又は生体蛍光イメージングのための蛍光色素として重要であり、これまでに報告された例は、基礎研究及び応用の両面で枚挙に暇がない。中でも、周囲の環境によって蛍光色が劇的に変化する色素（例えばアクリロダン）は、蛍光プローブの中でも部位特異的な可視化に実用化されている。このような蛍光特性を実現するためには、電子供与性の高い（ドナー型）π共役ユニットと電子受容性の高い（アクセプター型）π共役ユニットを組み合わせるという分子設計が有効であることが多く示されている。得られる蛍光色素の発光色又は発光効率、および溶媒効果の大きさは、ドナーおよびアクセプターにどのようなπ共役ユニットを用いるかに大きく依存する。一方で、近年、新たな電子受容性π共役ユニットとして、ホスホール化合物が注目されつつある。例えば、非特許文献１には、２−アルケニルベンゾ［ｂ］ホスホールオキシド及び２−アルキニルベンゾ［ｂ］ホスホールオキシドの合成例と共にそれらの光学データが報告されている。また、非特許文献２には、２−アリールベンゾ［ｂ］ホスホールオキシドの合成例と共にこれらの電気化学特性が報告されている。非特許文献１及び２に記載された化合物の一例を以下に示す。
【０００３】
【化１】
2017052863.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Organic Letters, 2013, vol.15, No.17, p4458-4461
【非特許文献２】Chem. Asian J., 2009, vol.4, p1729-1740
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
溶媒の極性に応じて蛍光色が劇的に変化する従来の化合物は、多くが極性の低い溶媒中では強い蛍光を示すものの、極性の高いアルコールなどのプロトン性溶媒中では蛍光がみられない。このため、今までにない光学的性質を有する環境応答性の蛍光化合物の開発が望まれていた。
【０００６】
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、今までにない光学的性質を有するホスホール化合物を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決するために、本発明者らは、種々の新規なホスホール化合物を合成し、その光物性を調べたところ、ある種のホスホール化合物が今までにない光学的性質を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、下記項１〜項７に示すホスホール化合物及び蛍光色素に係る。
１．下記式（１）： 
【０００９】
【化２】
2017052863.tif 000004
【００１０】
（式（１）中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又は置換アミノ基であり、Ｒ２は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、カルボニル基、イミノ基、シアノ基又はフッ素原子であり、Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒは炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環又は置換ヘテロ芳香環であり、ｎは０又は１であり、ｍは１〜３の整数であり、π１及びπ２は同じであっても異なっていてもよいπ共役ユニットであって、該π共役ユニットは、２価のアルケニル基、２価の置換アルケニル基、２価のアルキニル基、２価の置換アルキニル基、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環であり、
【００１１】
【化３】
2017052863.tif 000005
【００１２】
はπ１又はπ２のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合している）
で表されるホスホール化合物。
２．Ｒ１はアリール基又は置換アリール基であり、Ｒ２は水素原子、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒはベンゼン環又はナフタレン環であり、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π1はベンゼン環であり、
【００１３】
【化４】
2017052863.tif 000006
【００１４】
はベンゼン環であるπ1のパラ位に結合している、上記項１に記載のホスホール化合物。
３．Ｒ３は、アリール基又は置換アリール基である、上記項２に記載のホスホール化合物。
４．下記式（２）： 
【００１５】
【化５】
2017052863.tif 000007
【００１６】
（式（２）中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又は置換アミノ基であり、Ｒ３は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ４及びＲ５は同じであっても異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒは炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環又は置換ヘテロ芳香環であり、ｎは０又は１であり、ｍは１〜３の整数であり、π１及びπ２は同じであっても異なっていてもよいπ共役ユニットであって、該π共役ユニットは、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環であり、
【００１７】
【化６】
2017052863.tif 000008
【００１８】
はπ１又はπ２のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合している）
で表されるホスホール化合物。
５．Ｒ１はアリール基又は置換アリール基であり、Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ｒ４及びＲ５は同じものであって、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であり、Ａｒはベンゼン環又はナフタレン環であり、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π１はベンゼン環である、上記項４に記載のホスホール化合物。
６．Ｒ３は、アリール基又は置換アリール基である、上記項５に記載のホスホール化合物。
７．上記項１〜６のいずれか１項に記載のホスホール化合物を含有する蛍光色素。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のホスホール化合物は、ナトリウムイオンの結合に伴い、蛍光極大波長が短波長側にシフトするという性質を有する。このような性質を有することから、本発明のホスホール化合物は、例えば、レシオイメージングを行うことにより、細胞内ナトリウムイオンの変化を定量的に解析することができる新たなタイプの蛍光プローブ用色素として利用できることが期待される。本発明のホスホール化合物は、イメージング画像取得時の４０５ｎｍの可視光レーザー光源を使用できることから、生体へのダメージを大幅に軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】１％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中におけるＮａ＋の添加の前後でのＮａＧＹの吸収スペクトル（破線）及び発光スペクトル（実線）を示すグラフである。
【図２】（ａ）は、種々の濃度のＮａ＋の存在下でのＮａＧＹ（２５μＭ）の発光スペクトルを示すグラフである。（ｂ）は、Ｎａ＋濃度と、５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）との関係を示すグラフである。
【図３】種々の金属イオンの添加に応答したＮａＧＹの金属イオン選択性を示すグラフである。
【図４】ＮａＧＹ（２５μＭ）における、ｐＨと、５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）との関係を示すグラフである。
【図５】ＮａＧＹ（１０μＭ）を用いて可視化した細胞質のＮａ＋レベルの増加に伴う生きたＨｅＬａ細胞の蛍光強度比イメージ（λｅｘ＝４０５ｎｍ）を示している。（ａ）は、ベースのＤＭＥＭ培地を用いてインキュベートした細胞（０分）であり、（ｂ）は、１４０ｍＭ  Ｎａ＋を含むＫ＋フリーＤＭＥＭを用いてインキュベートした後の細胞（３５分）である。（ｃ）は、細胞外Ｋ＋の不在下でインキュベーション中の細胞の平均Ｉ５６５−５７４／Ｉ６６２−６８９（Ｎ＞２０）の変化を示すグラフである。エラーバー＝Ｓ．Ｅ．である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のホスホール化合物は、上記式（１）又は上記式（２）で表されるものである。本発明のホスホール化合物は、電位を受け取る能力が高いホスホールＰ−オキシド部位と、電子を供与する能力が高いπ共役系ユニットを有しており、該π共役系ユニットは、酸素原子及び窒素原子を含有する大員環部位を有している。この大員環部位がナトリウム結合能を有することから、本発明のホスホール化合物の大員環部位にナトリウムイオンが結合することにより、蛍光極大波長が短波長側にシフトする。
【００２２】
Ｒ１は、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基又は置換アミノ基である。
【００２３】
アルキル基としては、例えば、炭素数１〜２０の分岐を有していてもよいアルキル基及び環状のアルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｓｅｃ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。置換アルキル基としては、例えば炭素数１〜２０の分岐を有していてもよいアルキル基及び環状のアルキル基のいずれか１つ以上の水素原子がハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、モノ又はジアリールアミノ基などで置換されたものが挙げられる。ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられる。
【００２４】
アリール基としては、例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、トリメチルフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基などのほか、チエニル基、フリル基、ピリジル基などが挙げられる。置換アリール基としては、例えば、アリール基の１つ以上の水素原子がハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基などで置換されたものが挙げられる。アルキル基の例示については、既に記載したとおりである。アルケニル基としては、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基などが挙げられる。
【００２５】
アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アルコキシ基は、−ＯＲで表される基であり、ここではＲはアルキル基のみならず、アルキル鎖が酸素原子を介してエーテル結合した基、アルキル鎖にカルボキシル基が結合した基、アルキル鎖が−ＣＯＯ−を介してエステル結合した基等も含むものとする。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、−Ｏ（（ＣＨ２）ｐＯ）ｑＣＨ３（ｐは１〜３の整数、ｑは１〜１０の整数）、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＣ２Ｈ５、−Ｏ（（ＣＨ２）ｒ−ＣＯＯ）ｓＣＨ３ （ｒは１〜３の整数、ｓは１〜１０の整数）などが挙げられる。
【００２６】
カルボニル基は、例えば、フォルミル基、アシル基（メチルカルボニル基、エチルカルボニル基など）などが挙げられる。
【００２７】
アミノ基は、−ＮＨ2である。置換アミノ基としては、アミノ基の１つ以上の水素原子がアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基で置換されたものなどが挙げられる。アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基の例示については、既に記載したとおりである。
【００２８】
Ｒ２は水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、カルボニル基、イミノ基、シアノ基又はフッ素原子である。アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、カルボニル基の例示については、既に記載したとおりである。イミノ基としては、例えば、アルキルイミノ基、置換アルキルイミノ基、アリールイミノ基、置換アリールイミノ基、スルホニルイミノ基などが挙げられる。スルホニルイミノ基は、イミノ基の窒素原子に−ＳＯ２Ｒが結合したものであり、Ｒとしてはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基などが挙げられる。イミノ基中のアルキル、置換アルキル等の例示は、既に記載したアルキル基、置換アルキル基等と同様である。
【００２９】
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基である。アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基の例示については、既に記載したとおりである。
【００３０】
Ｒ４及びＲ５は同じであっても異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基である。アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基の例示については、既に記載したとおりである。
【００３１】
Ａｒは炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環又は置換ヘテロ芳香環である。
【００３２】
炭化水素芳香環としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環などが挙げられる。置換炭化水素芳香環としては、例えば、炭化水素芳香環の１つ以上の水素原子がハロゲン原子、アルキル基、パーフルオロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基などで置換されたものが挙げられる。パーフルオロアルキル基としては、例えばトリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基などが挙げられる。その他の置換基の例示は既に記載したとおりである。
【００３３】
ヘテロ芳香環としては、例えば、チオフェン環、チアゾール環、ピロール環、イミダゾール環、フラン環、オキサゾール環、ピリジン環などのほか、ヘテロ芳香環と炭化水素芳香環との縮合環、ヘテロ芳香環同士の縮合環などが挙げられる。置換ヘテロ芳香環としては、例えば、ヘテロ芳香環の１つ以上の水素原子がハロゲン原子、アルキル基、パーフルオロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基などで置換されたものが挙げられる。これらの置換基の例示は既に記載したとおりである。
【００３４】
π1及びπ2は、同じであっても異なっていてもよいπ共役ユニットであって、該π共役ユニットは、上記式（１）では、２価のアルケニル基、２価の置換アルケニル基、２価のアルキニル基、２価の置換アルキニル基、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環であり、上記式（２）では、２価の炭化水素芳香環、２価の置換炭化水素芳香環、２価のヘテロ芳香環又は２価の置換ヘテロ芳香環である。
【００３５】
アルケニル基としては、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基などが挙げられる。置換アルケニル基としては、アルケニル基のいずれか１つ以上の水素原子がハロゲン原子で置換されたものなどが挙げられる。
【００３６】
アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。置換アルキニル基としては、アルキニル基のいずれか１つ以上の水素原子がハロゲン原子で置換されたものなどが挙げられる。
【００３７】
炭化水素芳香環、置換炭化水素芳香環、ヘテロ芳香環及び置換ヘテロ芳香環の例示については、既に記載したとおりである。
【００３８】
【化７】
2017052863.tif 000009
【００３９】
はπ1又はπ2のうちホスホール骨格側へ電子を供与可能な位置に結合している。例えば、式（１）では、ｎがゼロでπ1がベンゼン環の場合、
【００４０】
【化８】
2017052863.tif 000010
【００４１】
はベンゼン環のパラ位に結合していることが好ましい。また、ｎが１でπ1及びπ2がベンゼン環の場合には、π2のベンゼン環はπ1のベンゼン環のパラ位に結合し、
【００４２】
【化９】
2017052863.tif 000011
【００４３】
はπ2がベンゼン環のパラ位に結合していることが好ましい。
【００４４】
Ｒ１はアリール基又は置換アリール基であることが好ましい。Ｒ２は水素原子、アリール基又は置換アリール基であることが好ましい。Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であることが好ましい。Ｒ４及びＲ５は同じものであって、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基であることが好ましい。Ａｒはベンゼン環又はナフタレン環であることが好ましい。式（１）では、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π1はベンゼン環であり、
【００４５】
【化１０】
2017052863.tif 000012
【００４６】
はベンゼン環であるπ1のパラ位に結合していることが好ましい。式（２）では、ｎはゼロであり、ｍは２であり、π1はベンゼン環であり、
【００４７】
【化１１】
2017052863.tif 000013
【００４８】
はインデン環の５位又は６位に結合していることが好ましい。これらの場合、Ｒ４及びＲ５は、アルキル基又は置換アルキル基であり、ベンゼン環であるπ1に結合してアルキレン鎖又は置換アルキレン鎖を形成していてもよい。特に、本発明のホスホール化合物は、下記式（１’）又は（２’）で表されるものが好ましい。式（１’）及び（２’）において、Ｒ６は、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、パーフルオロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、又はニトロ基である。
【００４９】
【化１２】
2017052863.tif 000014
【００５０】
本発明のホスホール化合物は、ベンゾホスホールＰ−オキシド蛍光色素分子に基づくＮａ＋のレシオメトリック蛍光プローブとして使用することができる。このプローブは、可視光（λｅｘ＝４０５ｎｍ）を用いて励起させることができ、Ｎａ＋と錯体形成することで発光スペクトルに短波長側へのシフト（浅色シフト）を示すものである。レシオメトリック分析は、細胞間Ｎａ＋濃度の変化をモニターするのに適するＮａ＋解離定数（Ｋｄ＝１６．０±１．２ｍＭ）を示し、このプローブを用いることにより、生きている哺乳動物細胞においてＮａ＋／Ｋ＋ポンプをブロックすることにより起きる細胞間Ｎａ＋動力学のレシオメトリック可視化が可能となる。それゆえ、このプローブは、例えば電位に誘発されたＮａ＋の流入に関連した、ニューロン細胞におけるＮａ＋動力学の観測における診断ツールとして使用されることが期待できる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明する。
【００５２】
１．一般操作
1Ｈ、13Ｃ｛1Ｈ｝及び31Ｐ｛1Ｈ｝ＮＭＲスペクトルは、核磁気共鳴装置Ａ−４００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ）を用いて、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重ジクロロメタン（ＣＤ２Ｃｌ２）、ＤＭＳＯ−ｄ６又はＴＨＦ−ｄ８中で測定した（共鳴周波数1Ｈ：４００ＭＨｚ、13Ｃ：１００ＭＨｚ、及び31Ｐ：１６２ＭＨｚ）。化合物２、３、５及び７を除く化合物の13Ｃ｛1Ｈ｝ＮＭＲスペクトル（１５０ＭＨｚ）は、ＵｌｔｒａＣＯＯＬプローブを備えた核磁気共鳴装置ＥＣＡ  ６００  ＩＩ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ）を用いて測定した。1Ｈ  ＮＭＲのケミカルシフト値は、ＣＨＣｌ３（δ７．２６ｐｐｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２（δ５．３０ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ（δ２．５０ｐｐｍ）、又はＴＨＦ（δ１．７２ｐｐｍ）］のシグナルを内部標準として用いてδｐｐｍで記録した。また、13Ｃ  ＮＭＲのケミカルシフト値は、ＣＤＣｌ３（δ７７．１６ｐｐｍ）、ＣＤ２Ｃｌ２（δ５３．８４ｐｐｍ）、及びＤＭＳＯ−ｄ６（δ３９．５２ｐｐｍ）の溶媒シグナルを内部標準として用いて記録した。31Ｐ  ＮＭＲのケミカルシフト値は、Ｈ3ＰＯ4のシグナル（δ０．００ｐｐｍ）を外部標準として用いて記録した。質量スペクトルは、ｍｉｃｒＯＴＯＦ  Ｆｏｃｕｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のイオン化法で測定した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０Ｆ254（Ｍｅｒｃｋ）を０．２５ｍｍの厚さで塗布した板を用いて行った。カラムクロマトグラフィーは、ＰＳＱ１００Ｂ又はＰＳＱ６０Ｂ（富士シリシア化学）を用いて行った。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲルカラム（ＺＩＰ  Ｓｐｈｅｒｅ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を備えたＩｓｏｒｅｒａ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて行った。分取リサイクルＨＰＬＣには、シリカゲルカラム（ＹＭＣ-Ａｃｔｕｓ  ＳＩＬ  ＳＬ１２Ｓ０５-２５２０ＷＸ、ＹＭＣ  ＴＥＣＨＮＯＳ）又は逆相シリカゲルカラム（ＹＭＣ-ＤｉｓｐｏＰａｃｋ  ＡＴ  ＯＤＳ、ＹＭＣ  ＴＥＣＨＮＯＳ）を備えたＬＣ-Ｆｏｒｔｅ/Ｒ（ＹＭＣ  ＴＥＣＨＮＯＳ）を用いて行った。分取リサイクル型ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、ポリスチレンゲルカラム（ＪＡＩＧＥＬ  １Ｈ及び２Ｈ、日本分析化学工業）を備えたＬＣ−９１８（日本分析化学工業）を使用し、溶離液としてクロロホルムを用いて行った。
【００５３】
アセトニトリルは、使用の前には３Åモレキュラーシーブ上で保存した。塩化ジグリコリルは、使用する前に蒸留した。無水ＤＭＦ、無水ＴＨＦ、及び無水トルエンは、関東化学から購入した溶媒を、有機溶媒精製装置（Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｎｔｏｕｒ社製）を用いてさらに精製したものを用いた。ｔｅｒｔ−ブチル２−メトキシフェニルカルバメートは、公知文献（例えば、I. Nakamura, U. Yamaguchi, D. Song, S. Konta, Y. Yamamoto, Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46, 2284-2287）に記載の方法に従って調製した。ｔｅｒｔ−ブチル（２，４−ジメトキシフェニル）カルバメートは、公知文献（例えば、T. Hashimoto, H. Nakatsu, Y. Takiguchi, K. Maruoka, J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 16010-16013）に記載の方法に従って調製した。３−ブロモ−１−フェニル−２−トリメチルシリルベンゾ［ｂ］ホスホール−Ｐ−オキシドは、公知文献（例えば、A. Fukazawa, Y. Ichihashi, Y. Kosaka, S. Yamaguchi, Chem. Asian. J., 2009, 4, 1729-1740）に記載の方法に従って調製した。他のすべての化学製品は、民間の供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。すべての実験は、特に記述のない限り、アルゴン雰囲気下で行った。
【００５４】
２．合成
本発明のホスホール化合物の具体例である、ＮａＧＹ−Ｅｔ、ＮａＧＹ、及びＮａＧＹ−ＡＭ（ＮａＧＹのアセトキシメチルエステル）を、以下のスキームに従って合成した。
【００５５】
【化１３】
2017052863.tif 000015
【００５６】
（ａ）ｔｅｒｔ−ブチル（８−クロロ−３，６−ジオキサオクチル）（２−メトキシフェニル）カルバメート（化合物２）の合成
無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の１，２−ビス（２−クロロエトキシ）エタン（１．３８ｍＬ、８．８０ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中５５％、２１２ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−メトキシフェニルカルバメート（４３９ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。周囲温度で２日間攪拌した後、混合物を０℃で水でクエンチした。得られた有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３で３回抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、ヘキサン／酢酸エチル  ３：１、Ｒf＝０．３３）に付すことにより、化合物２を無色油状物として６３６ｍｇ（１．７１ｍｍｏｌ、収率７７％）得た。
【００５７】
【数１】
2017052863.tif 000016
【００５８】
（ｂ）Ｎ，Ｎ’−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（２，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ’−（２−メトキシフェニル）−４，７−ジオキサ−１，１０−ジアザデカン（化合物３）の合成
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２（１５．１ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（鉱油中５５％、３．０１ｇ、６９．０ｍｍｏｌ）及びＫＩ（１．５０ｇ、９．０５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｔｅｒｔ−ブチル（２，４−ジメトキシフェニル）カルバメート（１２．８ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下した。周囲温度で１１日間攪拌した後、混合物を水でクエンチした。得られた有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３で３回抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルのプラグ（ＰＳＱ  １００Ｂ、ヘキサン／酢酸エチル  ２：１）で濾過し、揮発性物質を減圧下で除去した。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＰＳＱ  ６０Ｂ、ヘキサン／酢酸エチル  ３：１、Ｒf＝０．１４）に付すことにより、化合物３を無色油状物として１５．５ｇ（２６．２ｍｍｏｌ、収率６８％）得た。
【００５９】
【数２】
2017052863.tif 000017
【００６０】
（ｃ）１−（２−メトキシフェニル）−１０−（２，４−ジメトキシフェニル）−４，７−ジオキサ−１，１０−ジアザデカン（化合物４）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２（８５ｍＬ）中の化合物３（９．７８ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリフルオロ酢酸（１５．０ｍＬ）を大気下で添加した。周囲温度で１．５時間攪拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。得られた油状物をＮａＨＣＯ３水溶液で中和した。有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で５回抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＺＩＰ  Ｓｐｈｅｒｅ  ４５ｇ、ヘキサン／酢酸エチル  １：３、Ｒf＝０．３２）に付すことにより、化合物４を無色油状物として５．６７ｇ（１４．５ｍｍｏｌ、収率８８％）得た。
【００６１】
【数３】
2017052863.tif 000018
【００６２】
（ｄ）７−（２−メトキシフェニル）−１３−（２，４−ジメトキシフェニル）−１，４，７−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン−８，１２−ジオン（化合物５）の合成
無水トルエン（１Ｌ）を入れたフラスコに、無水ピリジン（２０ｍＬ）及び無水トルエン（８０ｍＬ）の混合物中の化合物４（４．６７ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）の溶液、及び無水トルエン（１００ｍＬ）中の塩化ジグリコリル（２．０８ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）の溶液を、１００℃で２４時間かけて同時に滴下した。溶液をさらに１００℃で２日間攪拌し、その後すべての揮発性物質を減圧下で除去した。水及びＣＨ２Ｃｌ２を添加した後、有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。有機層を合わせて水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、クロロホルム／メタノール  １９：１、Ｒf＝０．３４）に付し、その後ＧＰＣに付すことにより、化合物５を無色固体として２．０４ｇ（４．１８ｍｍｏｌ、収率３５％）得た。
【００６３】
【数４】
2017052863.tif 000019
【００６４】
（ｅ）７−（２−メトキシフェニル）−１３−（２，４−ジメトキシフェニル）−１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン（化合物６）の合成
無水ＴＨＦ（１８ｍＬ）中の化合物５（８７０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及びＮａＢＨ４（５０３ｍｇ、１３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＢＦ３・ＯＥｔ２（８．４ｍＬ、６７ｍｍｏｌ）を室温で注意深く添加した。４時間還流しながら攪拌した後、混合物をＫ２ＣＯ３水溶液で中和し、水層をＣＨＣｌ３で３回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン  ５：５：１、Ｒf＝０．４９）に付すことにより、化合物６を無色油状物として７７０ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ、収率９４％）得た。
【００６５】
【数５】
2017052863.tif 000020
【００６６】
（ｆ）７−（４−ブロモ−２−メトキシフェニル）−１３−（２，４−ジメトキシフェニル）−１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン（化合物７）の合成
無水ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の化合物６（８００ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中のＮ−ブロモスクシンイミド（３２５ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を−３０℃で１０分間かけて滴下した。室温で１６時間攪拌した後、混合物をＫ２ＣＯ３水溶液でクエンチした。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、得られた混合物をＣＨＣｌ３で５回抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン  ５：５：１、Ｒf＝０．４９）に付すことにより、化合物７を無色油状物として７８４ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ、収率８５％）得た。
【００６７】
【数６】
2017052863.tif 000021
【００６８】
（ｇ）２−トリメチルシリル−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシフェニル）−１−フェニルベンゾ［ｂ］ホスホール−Ｐ−オキシド（化合物８）の合成
脱気したトルエン（３２ｍＬ）及び脱気したＨ２Ｏ（８ｍＬ）の混合物中の３−ブロモ−１−フェニル−２−トリメチルシリルベンゾ［ｂ］ホスホール−Ｐ−オキシド（１．４８ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）、４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ）フェニルボロン酸（１．３０ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（８９ｍｇ、７７μｍｏｌ）、及びＫ３ＰＯ４（３．７７ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）の溶液を９０℃で１２時間攪拌した。次いで、有機層を分離し、水層を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、ＣＨＣｌ３／酢酸エチル  ５：１）により、その後ＧＰＣにより精製することにより、化合物８を無色油状物として１．７８ｇ（３．４３ｍｍｏｌ、収率８５％）得た。
【００６９】
【数７】
2017052863.tif 000022
【００７０】
（ｈ）２−ブロモ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−フェニルベンゾ［ｂ］ホスホール−Ｐ−オキシド（化合物９）の合成
ＣＨ３ＣＮ（１５ｍＬ）中のＮ−ブロモスクシンイミド（８５４ｍｇ、４．８０ｍｍｏｌ）及び化合物８（１．６９ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）の溶液を、大気下で１５時間還流しながら攪拌した。Ｎａ２ＳＯ３水溶液を添加し、次いで、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。得られた混合物をＣＨＣｌ３で４回抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。次いで、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のテトラ（ｎ−ブチル）アンモニウムフルオリド（９５２ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を大気下、周囲温度で１．５時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去した後、水を添加して混合物をＣＨＣｌ３で４回抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＺＩＰ  Ｓｐｈｅｒｅ  ３０ｇ、ＣＨＣｌ３／酢酸エチル  ４：１、Ｒf＝０．２８）に付すことにより、化合物９を無色固体として９１７ｍｇ（２．３１ｍｍｏｌ、収率７０％）得た。
【００７１】
【数８】
2017052863.tif 000023
【００７２】
（ｉ）２−ブロモ−３−（４−エトキシカルボニルメチルオキシフェニル）−１−フェニルベンゾ［ｂ］ホスホール−Ｐ−オキシド（化合物１０）の合成
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のブロモ酢酸エチル（３００μＬ、２．７１ｍｍｏｌ）、化合物９（９１６ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、及びＫ２ＣＯ３（７４９ｍｇ、５．４２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、大気下、５０℃で１６時間攪拌した。水を添加した後、水層をＣＨＣｌ３で抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、ＣＨＣｌ３／酢酸エチル  ９：１、Ｒf＝０．３２）に付し、その後ＧＰＣに付すことにより、化合物１０を無色油状物として９８８ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ、収率８５％）得た。
【００７３】
【数９】
2017052863.tif 000024
【００７４】
（ｊ）ＮａＧＹ−Ｅｔの合成
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中の化合物７（５３９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボラン（２６３ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（７３．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、及びＫＯＡｃ（２０６ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、１００℃で２４時間加熱した。化合物７が完全に消失した後、脱気した１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）及び水（１．０ｍＬ）中の化合物１０（５２０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）及びＫ３ＰＯ４（１．１２ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。１００℃で１７時間攪拌した後、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。水及びＣＨＣｌ３を添加した後、有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３で５回抽出した。有機層を合わせて水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ  １００Ｂ、溶離剤をヘキサン／ＣＨＣｌ３／Ｅｔ３Ｎ  ４：６：１からＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ  ９：１：１へ徐々に変化させた）に付した。粗生成物をさらにＧＰＣ及びＨＰＬＣ（ヘキサン／ＣＨＣｌ３／Ｅｔ３Ｎ  ４：６：１）により精製することにより、ＮａＧＹ−Ｅｔを黄色固体として１０３ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ、収率１２％）得た。
【００７５】
【数１０】
2017052863.tif 000025
【００７６】
（ｋ）ＮａＧＹの合成
ＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）中のＮａＧＹ−Ｅｔ（１３ｍｇ、１５μｍｏｌ）及びＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１．３ｍｇ、３０μｍｏｌ）の溶液を、大気下、周囲温度で９０分間攪拌した。次いですべての揮発性物質を減圧下で除去した。水及びＣＨＣｌ３を添加した後、有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３で３回抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、減圧下で濃縮した。粗混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣ（溶離剤を、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ  ４：１から０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ  １：１へ徐々に変化させた）に付した。得られた生成物を凍結乾燥することにより、ＮａＧＹを黄色固体として１０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ、収率８３％）得た。
【００７７】
【数１１】
2017052863.tif 000026
【００７８】
（ｌ）ＮａＧＹ−ＡＭの合成
ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）中のＮａＧＹ（４９．８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、酢酸ブロモメチル（７０μＬ、０．７１ｍｍｏｌ）、及びエチルジ（イソプロピル）アミン（３０μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１８時間攪拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去した後、混合物をヘキサンで３回洗浄し、逆相ＨＰＬＣ（溶離剤を、５ｍＭギ酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ  １：１から５ｍＭギ酸アンモニウムを含むＣＨ３ＣＮへ徐々に変化させた）により精製した。得られた生成物を凍結乾燥することにより、ＮａＧＹ−ＡＭを黄色固体として５．１ｍｇ（収率９％）得た。しかしながら、量が足りず、13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを測定できなかった。
【００７９】
【数１２】
2017052863.tif 000027
【００８０】
３．光物理的測定
ＮａＧＹのすべての分光計測を、１％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中で行った。ＮａＧＹの紫外可視吸収スペクトルの計測は、分光光度計ＵＶ−３１５０（島津製作所）を使用し、１ｃｍ角の石英キュベットを用いて、０．２ｎｍの分解能で行った。発光スペクトル（２５μＭ  ＮａＧＹ）は、分光蛍光光度計Ｆ−４５００（日立）を使用し、１０ｎｍのスリット幅で測定した。光電子増倍管の電圧は７００Ｖであった。絶対蛍光量子収率は、較正積分球システムＰＭＡ−１１（浜松ホトニクス）で決定した。
【００８１】
（１）Ｎａ＋の添加の前後でＮａＧＹの吸収スペクトル及び発光スペクトルを測定した。ＮａＧＹの分光計測を、共溶媒として１％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で行った。添加するＮａ＋濃度は２００ｍＭであった。発光スペクトルは励起波長４０５ｎｍで測定した。その結果を図１に示す。図１において、破線は吸収スペクトルを示し、実線は発光スペクトルを示す。
【００８２】
図１より、ＮａＧＹでは、３９４ｎｍの最大値を中心とした幅広い吸収バンド（ε＝５．６３×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）が観測された。Ｎａ＋の濃度が増加すると、吸収最大値は浅色的に３７１ｎｍまでシフトした。その一方で、モル吸収係数は維持された。滴定の間に、２つの異なる等吸収点が３３７ｎｍ及び３７４ｎｍで観測され、これは溶液中でのＮａＧＹのＮａ＋フリー形態とＮａ＋結合形態との間の信号平衡を示している。吸収スペクトル中の浅色シフトは、Ｎａ＋イオンがドナー窒素原子へ配位したためであり、これがＮａＧＹの分子内電荷移動（ＩＣＴ）特性を減少させたと考えられる。
【００８３】
（２）種々のＮａ＋濃度の存在下でＮａＧＹの発光スペクトルを測定した。具体的には、ＮａＣｌ（０、５、２０、３０、４０、６５、１００、又は２００ｍＭ）を添加して、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中でＮａＧＹ（２５μＭ）の発光スペクトルを測定した。すべてのスペクトルは、４０５ｎｍの励起波長で記録した。その結果を図２（ａ）に示す。
【００８４】
図２（ａ）より、Ｎａ＋の不在下では、ＮａＧＹは赤領域に幅広い発光バンドを示し（△λｅｍ＝６５６ｎｍ；図２（ａ）中の（ｉ））、非常に大きいＳｔｏｋｅｓシフト（１０１００ｃｍ−１）が同時に起こった。このＳｔｏｋｅｓシフトは、おそらく励起状態におけるより明白なＩＣＴ特性に起因する。これは、水性媒体中でのＮａＧＹの低い蛍光量子収率（ΦＦ＝０．０１６）の部分的な要因であろう。Ｎａ＋の濃度が増加するにつれて、発光スペクトルは浅色シフトを示し、２００ｍＭのＮａ＋濃度で最大発光波長が６２０ｎｍに達した（図２（ａ）中の（ｉｉ））。その一方で、量子収率（ΦＦ＝０．０２８）はＮａ＋フリーのＮａＧＹのそれに匹敵した。
【００８５】
Ｎａ＋の結合が、４０５ｎｍでの励起で５７５ｎｍ及び７００ｎｍで蛍光強度に最も大きい変化をもたらすことがわかったので（図示せず）、Ｎａ＋の濃度に対する５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）をプロットした。その結果を図２（ｂ）に示す。この結果から、以下のようにして解離定数を算出したところ、Ｋｄ＝１６．０±１．２ｍＭであった。これは吸収滴定から得られた値と良く一致している。この非線形適合解析により、ＮａＧＹは５〜６０ｍＭのＮａ＋濃度の検出に適しており、これは細胞間Ｎａ＋濃度変動をモニターするのに最適な範囲であることが明らかとなった。
【００８６】
解離定数（Ｋｄ）の決定
ＮａＧＹのＮａ＋を用いた吸収分光滴定を、１％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中で行った。ＮａＧＹ（１００μＭ）の最初の吸収スペクトルを測定し、溶液に適量のＮａＣｌを直接添加した。４１０ｎｍでの吸光度（Ａ４１０）を合計［Ｎａ＋］に対してプロットし、実験データを以下の方程式（ｅｑ．１）：
【００８７】
【数１３】
2017052863.tif 000028
【００８８】
（ここで、Ａ０は４１０ｎｍでの最初の吸光度値を表し、Ａ∞は４１０ｎｍでの最後の吸光度値を表す。）を用いて、非線形最小二乗法曲線適合法により分析した。
【００８９】
Ｎａ＋を用いたＮａＧＹの蛍光でのレシオメトリック滴定は、用いたＮａＧＹの濃度を２５μＭにしたことを除き、上述の実験手順に従って行った。５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）を合計［Ｎａ＋］に対してプロットした。データを以下の方程式（ｅｑ．２）：
【００９０】
【数１４】
2017052863.tif 000029
【００９１】
（ここで、Ｒｍｉｎは最小比値を表し、Ｒｍａｘは最大比値を表す。Ｓｆ２という表現は、７００ｎｍでのＮａ＋フリー形態の発光強度であり、Ｓｂ２という表現は、７００ｎｍでのＮａ＋結合形態の発光強度である）を用いて曲線適合法により分析した。
【００９２】
（３）生物学系におけるＮａＧＹの性能をテストするために、種々の生物学的に関連する金属イオンの存在下で発光スペクトルを測定した。具体的には、ＮａＧＹの蛍光スペクトルを、１５０ｍＭ  Ｎａ＋及びＫ＋、１０ｍＭ  Ｃａ２＋及びＭｇ２＋、又は０．１ｍＭ  Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋の存在下で測定した。使用したすべての金属源は塩化物塩であった。Ｎａ＋及びＫ＋については、各塩化物塩をキュベット中の２５μＭ  ＮａＧＹ（２．０ｍＬ）の溶液に直接添加した。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋については、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１Ｍストック溶液を調製した。Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋については、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中の金属塩の１０ｍＭストック溶液を調製した。Ｆｅ３＋については、１ｍＭ  ＨＣｌ水溶液（ｐＨ〜３）中の１ｍＭストック溶液を調製した。続いて、２０μＬのストック溶液を２．０ｍＬの試料に添加した。指示された金属イオンを含む各溶液に、ＮａＣｌ（１７．５３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を直接添加した。試料を５分間攪拌し、発光スペクトルを測定した。５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）を計算した。結果を図３に示す。なお、図３において、灰色の棒は、１５０ｍＭ  Ｎａ＋又はＫ＋、１０ｍＭ  Ｃａ２＋又はＭｇ２＋、又は０．１ｍＭ  Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋又はＺｎ２＋のいずれかの存在下での５７５ｎｍと７００ｎｍとの間の蛍光強度比（Ｉ５７５／Ｉ７００）を表す。黒色の棒は、溶液に２００ｍＭ  Ｎａ＋を添加した後の測定結果を表す。
【００９３】
図３より、ＮａＧＹはＮａ＋に対して高い選択性を示すことがわかった。１０ｍＭ  Ｍｇ２＋又はＣａ２＋を添加しても（これらの金属イオンは、ｍＭの範囲で細胞質中に存在する）蛍光特性における顕著な変化は観測されず、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋を含む０．１ｍＭの生物学的に微量の金属を添加した場合でも顕著な変化は観測されなかった。さらに、これらの金属イオンの存在は、Ｎａ＋の錯体形成を妨げなかった。
【００９４】
（４）ＮａＧＹ（２５μＭ）の発光スペクトルを、種々のｐＨ値において緩衝液中で測定した。各ｐＨ緩衝液は、ｐＨ５．５〜７ではＭＥＳを、ｐＨ７．５及び８ではＨＥＰＥＳを用いて調製し、ｐＨ値は、Ｍｅ４ＮＯＨ・５Ｈ２Ｏを用いて調整した。結果を図４に示す。
【００９５】
図４より、ＮａＧＹの発光スペクトルは広い範囲のｐＨ値（ｐＨ５−８）で一定であり、それゆえその蛍光特性は細胞間のｐＨ変化により影響されないことがわかった。さらに、トリパンブルー分析により、ＮａＧＹの細胞毒性が無視できる程度であることが明らかとなった（図示せず）。
【００９６】
４．細胞培養実験
ＨｅＬａ細胞（理化学研究所  細胞材料開発室（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）、日本）を、５％ＣＯ２／９５％空気のインキュベーター中で３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ）及び１％抗生物質−抗真菌溶液（ＡＡ、シグマ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）中で培養した。イメージングの前に、細胞（５×１０４）を３日間、ガラス底の８ウェルプレートに播種した。細胞間Ｎａ＋のレシオメトリックイメージングのために、インキュベーション培地を細胞から除去し、次いで細胞を３７℃で３０分間ＤＭＥＭ中で１０μＭ  ＮａＧＹ−ＡＭをインキュベートし、ＤＭＥＭで３回洗い流した。プレートを２０μＬのＤＭＥＭで満たした後、ＧａＡｓＰマルチチャンネルスペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡ＬＳＭ  ７８０（ツァイス）を用いて、４０５ｎｍレーザーで蛍光イメージを記録した。細胞間Ｎａ＋のレシオメトリックイメージングのために、それぞれＮａ＋結合形態に対応する５６５−５７４ｎｍの範囲での積分発光強度（Ｉ５６５−５７４）、及びＮａ＋フリー形態に対応する６６２−６８９ｎｍの範囲での積分発光強度（Ｉ６６２−６８９）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて採取し、比イメージ（Ｉ５６５−５７４及びＩ６６２−６８９）をピクセルベースで得た。
【００９７】
生体内でのＮａ＋動力学のイメージングを以下のように行った。取得開始前に、細胞を３７℃で３０分間ＮａＧＹ（１０μＭ）で染色した。インキュベーション培地を、取得開始後１０分で細胞から除去し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１４０ｍＭ  Ｎａ＋を含むＫ＋フリーの培地を細胞に添加した。結果を図５に示す。
【００９８】
図５（ａ）及び（ｂ）は、Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプの阻害による、すなわちＮａ＋／Ｋ＋ポンプ活性は細胞間Ｎａ＋濃度に敏感であることから、インキュベーション培地を１４０ｍＭ  Ｎａ＋を含むＫ＋フリーＤＭＥＭに置き換えることによる、疑似カラー化した比のイメージの変化を示している。図５（ｃ）から、インキュベーション期間の間に、Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプをブロックした後、Ｉ５６５−５７４／Ｉ６６２−６８９比は直線的に増加したことがわかる。この結果は、Ｄｅｐｓａらによる、同じＫ＋培地中で４０分間のインキュベーション期間にＨｅＬａ細胞中のＮａ＋濃度が１０ｍＭから３５ｍＭに直線的に増加したという報告と良く一致しており、ＮａＧＹが生体細胞中において生物学的に関連する濃度範囲内でＮａ＋濃度の変化を調べることができることを示唆している。
【００９９】
以上より、本発明のホスホール化合物は、ベンゾホスホール−Ｐ−オキシド蛍光色素分子に基づくＮａ＋のレシオメトリック蛍光プローブとして使用することができる。このプローブは、可視光（λｅｘ＝４０５ｎｍ）を用いて励起させることができ、Ｎａ＋と錯体形成することで発光スペクトルに浅色シフトを示すものである。レシオメトリック分析は、細胞間Ｎａ＋濃度の変化をモニターするのに適するＮａ＋解離定数（Ｋｄ＝１６．０±１．２ｍＭ）を示した。このプローブを用いることにより、生きている哺乳動物細胞においてＮａ＋／Ｋ＋ポンプをブロックすることにより起きる細胞間Ｎａ＋動力学のレシオメトリック可視化が証明された。それゆえ、このプローブは、例えば電位に誘発されたＮａ＋の流入に関連した、ニューロン細胞におけるＮａ＋動力学の観測における診断ツールとして使用されることが期待できる。
【０１００】
なお、本発明は上述した実施例に何ら限定されることはなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の態様で実施し得ることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明は、化学産業に利用可能であり、例えば、生体蛍光イメージングのための蛍光色素などに利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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