(57)【要約】【課題】コンフォメーション病の予防及び／又は治療効果が改善されたセルロースエーテル類を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物及びその製造方法を提供する。【解決手段】コンフォメーション病医薬組成物は、既報の未改質セルロースエーテル類に対して、コンフォメーション病の予防及び又は治療効果が高いセルロースエーテル類改質体を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物であって、セルロースエーテル類改質体が、未改質セルロースエーテル類のリンパ液親和性修飾体、ジアルキルアミノエチル修飾体、リポソーム混合修飾体、及びこれらの組み合わせの修飾体から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を含んでなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、及びこれらの混合物から選ばれる一種以上の未改質セルロースエーテル類に対して、コンフォメーション病の予防及び又は治療効果が高いセルロースエーテル類改質体を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物であって、
前記セルロースエーテル類改質体が、未改質セルロースエーテル類のリンパ液親和性修飾体、ジアルキルアミノエチル修飾体、リポソーム混合修飾体、及びこれらの組み合わせの修飾体から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を含んでなることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物。
【化１】
2017203029.tif 000010
【請求項２】
前記未改質セルロースエーテル類が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースから選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項１に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項３】
前記リンパ液親和性修飾体が、コレステロール修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項４】
前記リンパ液親和性修飾体が、炭素数が１８以上の脂肪族修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項５】
前記リンパ液親和性修飾体が、炭素数が１８の脂肪族修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項６】
前記ジアルキルアミノエチル修飾体が、ジエチルアミノエチル修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項７】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項８】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項９】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類とＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病医薬組成物
。
【請求項１０】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項３に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１１】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項３に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１２】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項３に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１３】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項４又は５に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１４】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項４又は５に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１５】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体とＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項４又は５に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１６】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項６に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１７】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項６に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１８】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることを特徴とする請求項６に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【請求項１９】
請求項３に記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記コレステロール修飾体は、前記未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中でコレステリルクロロホルメート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＣＯ−Ｃｌ）との縮合反応を行い、反応溶液について疎水性の有機溶剤による沈殿・溶解の繰り返しと透析で精製して得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２０】
請求項４又は５に記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体は、前記未改質セルロースエーテル類に
よる、炭素数が１８又は１８以上の脂肪鎖を有するグリシジルエーテルのエポキシ開環反応によって得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２１】
請求項６に記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記ジエチルアミノエチル修飾体は、前記未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライドによって置換反応させて得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２２】
請求項７、１０、１３、１６のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記リポソーム混合修飾体は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとを混合し懸濁させた混合懸濁液について超遠心分離して得られた超遠心沈殿物を生理食塩水で再懸濁した後、再度超遠心分離した超遠心上清として得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２３】
請求項８、１１、１４、１７のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとを混合し懸濁させた混合懸濁液について超遠心分離して得られた超遠心沈殿物を生理食塩水で再懸濁した後、再度超遠心分離した超遠心上清として得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２４】
請求項９、１２、１５、１８のいずれかに記載のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法であって、
前記リポソーム混合修飾体は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体と、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとの混合脂質とを疎水性の有機溶剤中で混合した後、前記有機溶剤を除去して脂質フィルムを作製し、この脂質フィルムに生理食塩水或いはショ糖水溶液を加えて撹拌分散して得た懸濁液を遠心分離して沈殿物を除いた後の懸濁上清を超遠心分離して得られた超遠心沈殿物について生理食塩水で再懸濁した再懸濁液として得ることを特徴とするコンフォメーション病医薬組成物の製造方法。
【請求項２５】
前記セルロースエーテル類はマクロファージへの取り込み率が低く分子内疎水環境が高いセルロースエーテル類を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のコンフォメーション病医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンフォメーション病医薬組成物及びその製造方法に係り、より詳しくは、コンフォメーション病の予防及び／又は治療効果が改善されたセルロースエーテル類を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンフォメーション病は、特定の宿主蛋白質についてその立体構造（コンフォメーション）が変化されて難溶性となって細胞や組織に蓄積し病的状態をもたらす疾患群であり、各種疾患例が報告されている〔非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照〕。これには、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症に代表される神経難病が含まれる。コンフォメーション病では、特定の蛋白質が本来のコンフォメーションとは異なるβシート構造と呼ばれる構造成分に富むコンフォメーションをとって難分解性となる。コンフォメーション病のうちこのような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞外の組織に蓄積して難溶性物質（アミロイド）を形成する疾患群はアミロイドーシスと呼ばれる。一方、このような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞内に蓄積して「インクルージョン・ボディ（封入体）」と呼ばれる難溶性物質を形成する疾患群もある。前者には各種アミロイドーシスの疾患が含まれ、後者にはポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病、ピック病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型痴呆などが含まれる。また、どちらも見られるものとしてはアルツハイマー病やプリオン病などがある。これらのコンフォメーション病の原因蛋白質は疾患によって異なり、蛋白質の一次構造上の共通点はないものの、コンフォメーションの異常化のメカニズムや異常化蛋白質の沈着を促進するメカニズムには共通の因子が関与していると考えられており、コンフォメーション病全般あるいは複数のコンフォメーション病に共通した治療化合物の開発が可能である〔非特許文献４、非特許文献５参照〕。実際に、これまでにアルツハイマー病、アミロイドーシス全般、プリオン病に共通する薬効を示すことが期待される薬物開発の報告が多数ある〔例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９参照〕。しかし、これらコンフォメーション病については、原因及びその作用機構が徐々に解明されつつあるが、現在まで予防及び治療に決定的に有効な医薬品は見出されていない。
【０００３】
ここでプリオン病についてより詳細に説明すると、プリオン病は病原因子プリオンにより中枢神経が侵される致死性疾患であり、ヒトでは急速に進行する認知機能障害とミオクローヌスと呼ばれる全身性の痙攣発作を主な症状とするクロイツフェルト・ヤコブ病や、家族性に発生し失調性歩行や認知機能障害を主な症状とするゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、家族性に発生し失調性歩行や自律神経障害・不眠を主な症状とする致死性家族性不眠症などがある。これまでにフルパーチン、キナクリン、ドキシサイクリン、ペントサンポリサルフェートなどが臨床治験で試されたが、症状を改善し疾病の進行を抑制するほどの治療効果は観察されておらず、プリオン病に対する確定した治療予防薬はない。一方、プリオン病の病原因子は通常のウイルスや細菌に対する滅菌処置には耐性であるため、プリオン病（牛海綿状脳症）に罹患した牛に由来する製品から人にプリオンが感染することや、プリオン病患者に由来する生物製剤やプリオン病患者に用いられた手術器具等から他の人にプリオンが感染することが知られており、これらは大きな社会的・経済的な問題となってきた。また、原因不明で発症する孤発性プリオン病は高齢者に発生する病気であり、高齢社会にあって発生率は右肩上がりに上昇している。このような状況にあり、プリオン病は希少疾患ながら、その予防・治療薬の開発が待望されている。また、動物プリオン病としては、ヒツジのスクレイピー、牛の牛海綿状脳症が知られているが、定型的な疾患以外に非定型スクレイピー（Ｎｏｒ９８  スクレイピーと呼ばれるも
のなど）や非定型牛海綿状脳症（Ｈ型ＡＢＳＥ、Ｌ型ＡＢＳＥと呼ばれるものなど）が散発的に発生している。また、シカ類では慢性消耗性疾患（以下、ＣＷＤ）と呼ばれるプリオン病が家畜のシカ類だけでなく野生のシカ類で流行しており、北米や韓国や北欧では家畜衛生や畜産産業にとって重大なリスクとなっている。特に野生獣のＣＷＤの問題は、罹患獣の淘汰が困難であるばかりでなく、ＣＷＤプリオンは唾液や排泄物中に分泌され、かつプリオンが分解されにくい性質を持つことから、罹患獣が生息する原野はＣＷＤプリオンで汚染され水平感染が拡大し易い状況にあることも、ＣＷＤの流行阻止を困難にしている理由であり、ワクチンのような働きをもつ予防剤の開発が待望されている。しかしながら、プリオンは免疫系で排除されないため、ワクチンの開発は進んでいない。
【０００４】
本発明者らは、コンフォメーション病の予防及び／又は治療用の医薬組成物として、特に、プリオン感染前投与でもプリオン感染後投与でも、プリオンに対する医薬組成物としてワクチン様の高い予防効果を持つセルロースエーテル類（以下、ＣＥ化合物と略称することもある）を有効成分として含有する組成物を提案している（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１のＣＥ化合物（以下、既報のＣＥ化合物、又は未改質ＣＥ化合物と呼称することもある）には最適化の余地があり、同じ投与量でも一層すぐれた効力、或いは少ない投与量で既報のＣＥ化合物と同等程度の効力を期待できるものが必要とされている。また、動物の系統やプリオン株によっては既報のＣＥ化合物では十分な効力が発揮され難いことがあり、このような点でも既報のＣＥ化合物よりも広範囲に効力を発揮するものが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００７／１２３１８７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎ  Ｗ  Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９７年、３５０号、１３４−１３８頁
【非特許文献２】石原得博（監修）、池田修一（編集）、「アミロイドーシスの基礎と臨床」２００５年３月金原出版（株）発行、第８頁〜１３頁
【非特許文献３】岩坪威、細胞工学、２００１年、２０巻１１号、１４７４−１４７７頁
【非特許文献４】Ｊａｒｒｅｔｔ  ＪＴ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  ＰＴ  Ｊｒ，Ｃｅｌｌ，１９９３年、７３巻、１０５５−１０５８頁
【非特許文献５】Ｇｅｒｖａｉｓ  Ｆ，  Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ  Ｃ，  Ｋｏｎｇ  Ｘ，  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｉｍｍｕｎ．，Ｅｎｄｏｃ．＆  Ｍｅｔａｂ．Ａｇｅｎｔｓ，２００３年、３巻、３６１−３７０頁
【非特許文献６】Ｗａｔｓｏｎ  ＪＤ，Ｌａｎｄｅｒ  ＤＡ，  Ｓｅｌｋｏｅ  ＪＤ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年、５０巻、３１６１７−３１６２４頁
【非特許文献７】Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ  Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５年、１巻、１４３−１４８頁
【非特許文献８】Ｚｈｕ  Ｈ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１年、７巻、５１７−５２２頁
【非特許文献９】堂浦克美、ファルマシア、２００２年、７巻、６３５−６３９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイオアベイラビリティーが改善され、また、より広範囲に効力を発揮することができるセルロースエーテル類改質体を有効成分として含有するコンフォメーション
病医薬組成物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明によるコンフォメーション病医薬組成物は、
下記一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表される構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、及びこれらの混合物から選ばれる一種以上の未改質セルロースエーテル類に対して、コンフォメーション病の予防及び又は治療効果が高いセルロースエーテル類改質体を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物であって、
前記セルロースエーテル類改質体が、未改質セルロースエーテル類のリンパ液親和性修飾体、ジアルキルアミノエチル修飾体、リポソーム混合修飾体、及びこれらの組み合わせの修飾体から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を含んでなることを特徴とする。
【０００９】
【化１】
2017203029.tif 000002
【００１０】
このようなコンフォメーション病医薬組成物において、前記未改質セルロースエーテル類が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースから選ばれる一種以上でマクロファージへの取り込み率が低く（０．０１％以下が好ましい）分子内疎水環境が高い（ピレン標識法ではＩＩＩ／Ｉ比が０．９以上、ＩＶ／Ｉ比が０．５以上が好ましい）ことが好ましく、また、前記リンパ液親和性修飾体が、コレステロール修飾体であることが好適であり、また、前記リンパ液親和性修飾体が、炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体であることが好ましく、さらには、前記ジアルキルアミノエチル修飾体が、ジエチルアミノエチル修飾体であることが好ましい。
【００１１】
前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いは未改質セルロースエーテル類とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることが好ましく、また、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類とＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好適である。そして、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いは未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であるであることが好ましく、また、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体とＤＰＰＣとコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好適である。さらには、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いは未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることが好ましく、また、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修
飾体とＤＰＰＣとコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好適である。また、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いは未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であることが好ましく、さらには、前記リポソーム混合修飾体が、未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とＤＰＰＣとコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好適である。
【００１２】
本発明によるコンフォメーション病医薬組成物の製造方法は、未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中でコレステリルクロロホルメート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＣＯ−Ｃｌ）との縮合反応を行い、反応溶液について疎水性の有機溶剤による沈殿・溶解の繰り返しと透析で精製してコレステロール修飾体を得ることを特徴とする。また、未改質セルロースエーテル類を、炭素数が１８又は１８以上の脂肪族鎖を有するグリシジルエーテルのエポキシ開環反応によって得られる炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体を得ることを特徴とする。さらに、未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライドによって置換反応させてジエチルアミノエチル修飾体を得ることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による別のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとを混合し懸濁させた混合懸濁液について超遠心分離して得られた超遠心沈殿物を生理食塩水で再懸濁した後、再度超遠心分離した超遠心上清としてリポソーム混合修飾体を得ることを特徴とする。
【００１４】
本発明によるまた別のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とアニオンタイプ中空リポソームとを混合し懸濁させた混合懸濁液について超遠心分離して得られた超遠心沈殿物を生理食塩水で再懸濁した後、再度超遠心分離した超遠心上清としてリポソーム混合修飾体を得ることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明によるさらに別のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体と、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとの混合脂質とを疎水性の有機溶剤中で混合した後、前記有機溶剤を（蒸発）除去して脂質フィルムを作製し、この脂質フィルムに生理食塩水或いは（１０重量％）ショ糖水溶液を加えて撹拌分散して得た懸濁液を（低速）遠心分離して沈殿物を除いた後の懸濁上清を超遠心分離して得られた超遠心沈殿物について生理食塩水で再懸濁した再懸濁液としてリポソーム混合修飾体を得ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のコンフォメーション病医薬組成物及びその製造方法によれば、既報の未改質セルロースエーテル類（ＣＥ化合物）の中からコンフォメーション病への最大の予防及び又は治療効果を生み出すものを容易に選抜でき、さらにコンフォメーション病の予防及び又は治療効果が高く、同じ投与量でも一層すぐれた効力を発揮し、また、より少ない投与量
で既報のＣＥ化合物と同等程度の効力を発揮するセルロースエーテル類改質体（ＣＥ化合物改質体）を得ることができる。このようなＣＥ化合物のうち、マクロファージへの取り込み率が低く分子内疎水環境が高いものがより効率が高く、またＣＥ化合物改質体のうち、未改質ＣＥ化合物のリンパ液親和性修飾体である未改質ＣＥ化合物のコレステロール修飾体及び炭素数が１８の脂肪族修飾体（Ｃ１８修飾体）、並びに未改質ＣＥ化合物のジエチルアミノエチル修飾体（ＤＥＡＥ修飾体）がより効力が高く、さらに、ＤＥＡＥ修飾体は、動物の系統やプリオン株による治療効果への影響が既報のＣＥ化合物よりも少ない点でも優れている。そして、未改質ＣＥ化合物及び上記各修飾体についてのリポソーム混合修飾体（リポソーム化ＣＥ化合物）は、元のＣＥ化合物量の１００分の１程度の量でも同等程度の抗プリオン効果を発揮し、格段にＣＥ化合物のバイオアベイラビリティーを改善する。さらに、リポソーム化ＣＥ化合物を生体腹腔内に投与することによって、リポソーム化ＣＥ化合物を選択的にリンパ濾胞に分布させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】動物実験の評価に用いた未改質ＨＰＭＣ化合物の化学構造的性質を示す表である。ここでＡＧＵは無水グルコース単位。
【図１ｂ】未改質ＨＰＭＣ化合物（１％水溶液）の分子量分布の累積モル質量を示すグラフである。
【図１ｃ】未改質ＣＥ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、ＨＰＭＣ化合物のプリオン脳内感染直後、脳内感染６ヶ月前、１２ヶ月前、１９ヶ月前の皮下単回投与マウスの生存曲線。溶媒対照との統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；動物匹数。
【図１ｄ】未改質ＣＥ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、ＨＰＭＣ化合物の皮下単回投与のタイミングと効力の関係を示す。ここで、効力として生存日数（溶媒対照群を１００％とした値）の中央値、第１四分位点、第３四分位点を示す。統計的有意差はログランク解析の結果を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図１ｅ】未改質ＣＥ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、ＨＰＭＣ化合物の数平均分子量と効力の関係を示す。ここで、効力として生存日数（溶媒対照群を１００％とした値）の中央値、第１四分位点、第３四分位点を示し、統計的有意差はログランク解析の結果を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図２ａ】ＣＥ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、プリオン脳内感染後のＨＰＭＣ化合物の脳室内持続投与マウスの生存曲線。溶媒対照との統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；匹数。
【図２ｂ】ＨＰＭＣ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、ＨＰＭＣ化合物の数平均分子量と効力の関係を示す。ここで、効力として生存日数（溶媒対照群を１００％とした値）の中央値、第１四分位点、第３四分位点を示し、統計的有意差はログランク解析の結果を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２ｃ】ＨＰＭＣ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、プリオン脳内感染後２０日目、４０日目の６０ＳＨ−５０の脳室内単回投与マウスの生存曲線。溶媒対照との統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；匹数。
【図２ｄ】ＨＰＭＣ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、プリオン脳内感染後４０日目の６０ＳＨ−５０の腰椎からの髄腔内単回投与マウスの生存曲線。溶媒対照との統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；匹数。
【図３】ＣＥ化合物の治療予防効果を示すグラフであり、プリオン腹腔内感染直後、腹腔感染１３か月前のＨＰＭＣ化合物の皮下単回投与シリアンハムスターの生存曲線。溶媒対照との統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｆｏｌｄ；倍、ｎ；匹数。
【図４ａ】ピレン結合ＴＣ−５ＲＷの蛍光スペクトルであり、ピレン周辺の微細構造を反映する３つの蛍光ピーク（ピークＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）を示す。
【図４ｂ】ＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標（ピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比、或いはピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比）を示すグラフである。蛍光強度比測定値の平均と標準偏差を示す。
【図４ｃ】ＨＰＭＣ化合物のピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比の線形回帰分析結果を示すグラフである。また、ピアソンの相関係数解析の結果を示す。
【図４ｄ】プリオン脳内感染直後の投与或いは脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力とピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比との線形回帰分析の結果を示すグラフである。また、ピアソンの相関係数解析の結果を示す。
【図４ｅ】プリオン脳内感染直後の投与或いは脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比との線形回帰分析の結果を示すグラフである。また、ピアソンの相関係数解析の結果を示す。
【図５ａ】ＨＰＭＣ化合物の腹腔マクロファージへの取り込み率を示すグラフである。マクロファージへの取り込み率測定値の平均と標準偏差の値で示した。
【図５ｂ】ＨＰＭＣ化合物の治療予防効力とマクロファージへの取り込み率に関する線形回帰分析の結果を示すグラフであり、プリオン脳内感染直後と脳内感染１２ヶ月前の治療予防効力を示す。また、ピアソン相関係数解析の結果を示す。
【図５ｃ】ＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標とマクロファージへの取り込み率に関する線形回帰分析の結果を示すグラフであり、分子内疎水環境指標としてピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比を示す。また、ピアソン相関係数解析の結果を示す。
【図６】ＣＥ化合物の治療予防効果を規定する因子として、プリオン脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力（生存期間の中央値）に関する、ＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標とマクロファージ取り込み率に基づく重回帰分析の結果を示すグラフであり、分子内疎水環境指標としてピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比を示す。
【図７ａ】Ｃ１８修飾ＣＥ化合物や他の修飾ＣＥ化合物と未改質ＣＥ化合物との治療予防効果の比較において、マウス実験での評価に用いた未改質ＣＥ化合物（メチルセルロース；ＳＭ−４）由来の修飾ＣＥ化合物の化学構造的性質を示す表である（ＡＧＵ；無水グルコース単位）。
【図７ｂ】ＳＭ−４由来の修飾ＣＥ化合物を脳内感染直後に単回皮下投与したマウスの生存曲線であり、ＳＭ−４を対照とした統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；動物匹数、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群。
【図８】コレステロール修飾ＣＥ化合物や他の修飾ＣＥ化合物と未修飾ＣＥ化合物との治療予防効果の比較において、ＴＣ−５ＲＷ由来の修飾ＣＥ化合物を脳内感染直後に単回皮下投与したマウスの生存曲線である。また、ＴＣ−５ＲＷを対照とした統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここで、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；動物匹数、Ｖｅｈｉｃｌｅ；溶媒群。
【図９】ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物と他のＣＥ化合物との治療予防効果の比較において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣ５７ＢＬ／１０マウスにおけるＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲ、ＴＣ−５ＲＷの治療予防効果を示すグラフである。また、溶媒群を対照とした統計的有意差はログランク解析の結果を示す。ここでＶｅｈｉｃｌｅ；溶媒群、ｍｅｄｉａｎ；中央値、ｄ；日間、ｎ；動物匹数。
【図１０】ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物と他のＣＥ化合物との抗プリオン効果の比較において、ＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞とＮ１６７プリオン持続感染細胞におけるＨＰＭＣ化合物やＳＭ−４関連化合物のＰｒＰｒｅｓ形成阻害効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１１ａ】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（日油株式会社製品を用いた検討）において、ノニオンタイプリポソームを用いたリポソーム化ＴＣ−５ＲＷ、ＴＣ−ＣｈｏｌのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１１ｂ】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（日油株式会社製品を用いた検討）において、ノニオンタイプリポソームを用いたリポソーム化ＳＭＲ関連化合物のＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１１ｃ】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（日油株式会社製品を用いた検討）において、アニオンタイプリポソームを用いたリポソーム化ＳＭ−４関連化合物のＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１２】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（自家調製品を用いた検討）において、自家調製にてリポソーム化したＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ−ＣｈｏｌのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１３ａ】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（脂質組成に関する検討（１）及びリポソーム処理に関する検討）において、ＤＰＰＣ対コレステロール比が異なる組成でリポソーム化したＴＣ−５ＲＷのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１３ｂ】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（脂質組成に関する検討（１）及びリポソーム処理に関する検討）において、各種リポソーム処理方法によるリポソーム化ＴＣ−５ＲＷの抗プリオン効果への影響の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１３ｃ】図１３ａ、ｂのウエスタンブロットのデータを定量したグラフである。
【図１４】リポソーム化ＣＥ化合物の効果（脂質組成に関する検討（２））において、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が１０対０と６対４の組成でリポソーム化したＴＣ−５ＲＷと陰性対照化合物ＤＸＲのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果の評価を行った結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。
【図１５ａ】ＣＥ化合物のリポソーム組成物としての利点確認実験における、ＴＣ−５ＲＷのリポソームの凝集抑制・分散改善の効果について顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真である。
【図１５ｂ】ＣＥ化合物のリポソーム組成物としての利点確認実験における、各種リポソーム処理におけるＴＣ−５ＲＷと陰性対照化合物ＤＸＲのリポソーム形態の比較について顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真である。
【図１６ａ】リポソーム化ＣＥ化合物の投与マウスにおける分布確認実験における、リポソーム化ＳＭＲ−ＤＥＡＥの分布（脾臓）の顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真である。蛍光像では、形態がわかり易いように核をＤＡＰＩで薄く染めている。
【図１６ｂ】リポソーム化ＣＥ化合物の投与マウスにおける分布確認実験における、リポソーム化していないＳＭＲ−ＤＥＡＥの分布（腎臓と肝臓）の顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真である。核をＤＡＰＩで薄く染めている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明によるコンフォメーション病医薬組成物及びその製造方法の実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
本実施形態のコンフォメーション病医薬組成物は、一般式（１）〔式中、少なくとも１つのＲはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＯＭから選ばれ、他のＲはＨであり、ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａから選ばれる。〕で表され
る構造単位を有するセルロースエーテル、前記セルロースエーテルのアルカリ金属塩、及びこれらの混合物から選ばれる一種以上の未改質セルロースエーテル類に対して、コンフォメーション病の予防及び又は治療効果が高いセルロースエーテル類改質体を有効成分として含有するコンフォメーション病医薬組成物である。また、セルロースエーテル類改質体が、未改質セルロースエーテル類のリンパ液親和性修飾体、ジアルキルアミノエチル修飾体、リポソーム混合修飾体、及びこれらの組み合わせの修飾体から選ばれる一種以上のセルロースエーテル類を含んでなるものである。
【００２０】
【化２】
2017203029.tif 000003
【００２１】
未改質セルロースエーテル類は、特許文献１に記載しているセルロースエーテル類の何れをも含むものであり、以下、「既報（未修飾）のＣＥ化合物」、「未改質ＣＥ化合物」などと略称することがある。このような、未改質ＣＥ化合物のうち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）から選ばれる一種以上が好ましい。ヒドロキシプロピルメチルセルロースとしては、図１ａに、夫々の、メチル基、ヒドロキシプロピル基の修飾含量（モル／ＡＧＵ（無水グルコース単位））、粘度、及び数平均分子量と共に示した、ＨＰＭＣ６０２、ＴＣ−５ＲＷ、６０ＳＨ−５０、６０ＳＨ−４００、６０ＳＨ−４Ｋ、６０ＳＨ−１０Ｋの他、ＴＣ−５ＥＷ（何れも信越化学工業株式会社製、商品名）が好適に使用できる。また、メチルセルロースとしては、図７ａに、還元末端基、メチル基の修飾含量（モル／ＡＧＵ（無水グルコース単位））と共に示したＳＭ−４（信越化学工業株式会社製、商品名）が好適に使用できる。
【００２２】
セルロースエーテル類改質体としての未改質セルロースエーテル類のリンパ液親和性修飾体は、未改質セルロースエーテル類と比べて生体内でリンパ液に移行し易くかつリンパ液中にとどまり易いという性質を有する修飾体として定義され、上述のような未改質ＣＥ化合物のコレステロール修飾体或いは炭素数が１８又は１８以上（例えば、３０以下）の脂肪族修飾体であることが好ましい。
【００２３】
未改質ＣＥ化合物のコレステロール修飾体（コレステロール修飾ＣＥ化合物）は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）から選ばれる一種以上の未改質ＣＥ化合物をコレステロール修飾したコレステロール修飾ＣＥ化合物が好ましく、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＴＣ−５ＲＷ）をコレステロール修飾したコレステロール修飾ＣＥ化合物（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）がより好ましく、後述する製造方法によって得ることができる。
コレステロール修飾体は、例えば、下記の一般式で表される。
【化３】
2017203029.tif 000004
式中、Ｒは一般式（１）におけるＲと同様に定義され、Ｒ１は、コレステロール骨格を含む基を表す。コレステロール骨格は直接酸素原子に結合してもよいし、アルキレン基やエステル基などを介して酸素原子に結合してもよい。
【００２４】
また、未改質ＣＥ化合物の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体のうち、炭素数が１８の脂肪族修飾体が好ましい。炭素数が１８の脂肪族修飾体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）から選ばれる一種以上の未改質ＣＥ化合物を炭素数が１８の脂肪族修飾したＣ１８脂肪族修飾ＣＥ化合物が好ましく、メチルセルロース（ＳＭ−４）をＣ１８脂肪族修飾したＣ１８化ＣＥ化合物（ＳＭＲ−Ｃ１８）がより好ましく、後述する製造方法によって得ることができる。
炭素数が１８または１８以上の脂肪族修飾体は、例えば、下記の一般式で表される。
【化４】
2017203029.tif 000005
式中、Ｒは一般式（１）におけるＲと同様に定義され、Ｒ２は、炭素数１８または１８以上（例えば、３０以下）の脂肪族炭化水素基を含む基を表す。炭素数１８または１８以上の脂肪族炭化水素基は直接酸素原子に結合してもよいし、置換アルキレン基やアルキレンエーテル基などを介して酸素原子に結合してもよい。
【００２５】
未改質セルロースエーテル類のジアルキルアミノエチル修飾体は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）から選ばれる一種以上の未改質ＣＥ化合物をジアルキルアミノエチル修飾したジアルキルアミノエチル修飾ＣＥ化合物が好ましく、ジエチルアミノエチル修飾したジエチルアミノエチル修飾ＣＥ化合物（ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物）がより好ましい。ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物は、メチルセルロース（ＳＭ−４）をジエチルアミノエチル修飾したＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物（ＳＭＲ−ＤＥＡＥ）がより好ましく、後述する製造方法によって得ることができる。
ジアルキルアミノエチル修飾体は、例えば、下記の一般式で表される。
【化５】
2017203029.tif 000006
式中、Ｒは一般式（１）におけるＲと同様に定義され、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、直鎖または分岐を有するアルキル基（炭素数は例えば、１〜５）を表す。
【００２６】
未改質セルロースエーテル類のリポソーム混合修飾体（リポソーム化修飾体）は、上述のような未改質セルロースエーテル類とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いはノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いはＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好ましい。また、上記各種修飾体をさらにリポソーム化修飾したリポソーム混合修飾体についても、各種修飾ＣＥ化合物とノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いはノニオンタイプ中空リポソームとのリポソーム混合修飾体であること、或いはＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとのリポソーム混合修飾体であることが好ましく、上記いずれのリポソーム混合修飾体とも、後述する製造方法によって得ることができる。
【００２７】
本実施形態のコンフォメーション病医薬組成物の製造方法は、未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中でコレステリルクロロホルメート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＣＯ−Ｃｌ）との縮合反応を行い、反応溶液について疎水性の有機溶剤による沈殿・溶解の繰り返しと透析で精製してコレステロール修飾体を得るものである。ここで、例えば、未改質ＨＰＭＣ化合物（ＴＣ−５ＲＷ）のコレステロール修飾体を製造する場合、未改質ＨＰＭＣ化合物２ｇに対してコレステリルクロロホルメート０．１ｇを用いて縮合反応を行い、疎水性の有機溶剤としてヘキサンとクロロホルムを用いることが好適である。
【化６】
2017203029.tif 000007
【００２８】
また、未改質セルロースエーテル類のヒドロキシ基によって、炭素数が１８又は１８以上の脂肪鎖を有するグリシジルエーテルのエポキシ開環反応によって置換反応を行い、炭素数が１８又は１８以上の脂肪鎖修飾体を得るものである。この製造方法において炭素数が１８又は１８以上の脂肪鎖を有するグリシジルエーテルとしてステアリルグリシジルエーテルを用いることが好適である。
【化７】
2017203029.tif 000008
また、未改質セルロースエーテル類をＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロライドによって置換反応させてジエチルアミノエチル修飾体を得るものである。
【化８】
2017203029.tif 000009
【００２９】
また、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体とノニオンタイプ中空リポソームとを混合し懸濁させた混合懸濁液について超遠心分離して得られた超遠心沈殿物を生理食塩水で再懸濁した後、再度超遠心分離した超遠心上清としてリポソーム混合修飾体を得ることができる。この製造方法とは別のリポソーム混合修飾体の製造方法は、ノニオンタイプ中空リポソームを用いる代わりに、アニオンタイプ中空リポソームを用いるものである。
【００３０】
また、上記製造方法とはさらに別のリポソーム混合修飾体の製造方法は、未改質セルロースエーテル類及び／又は未改質セルロースエーテル類のコレステロール修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類の炭素数が１８又は１８以上の脂肪族修飾体及び／又は未改質セルロースエーテル類のジエチルアミノエチル修飾体と、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とコレステロールとの混合脂質とを疎水性の有機溶剤中で混合した後、前記有機溶剤を（蒸発）除去して脂質フィルムを作製し、この脂質フィルムに生理食塩水或いはショ糖水溶液を加えて撹拌分散して得た懸濁液を低速遠心分離して沈殿物を除いた後の懸濁上清を超遠心分離して得られた超遠心沈殿物について生理食塩水で再懸濁した再懸濁液としてリポソーム混合修飾体を得るものである。この製造方法において、疎水性の有機溶剤としてクロロホルムを用い、ショ糖水溶液には１０重量％のショ糖水溶液を用い、低速遠心分離は３，０００ｇで５分間行なうことが好適である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これにより本発明を限定するものではない。
【００３２】
〔実施例１〕
メチル基修飾率ならびにヒドロキシプロピル基修飾率がほぼ等しいヒドロキシプロピルメチルセルロース化合物（以下、ＨＰＭＣ化合物）群について、プリオン病早発マウスにおける脳内感染直後、脳内感染６ヶ月前、１２ヶ月前、１９ヶ月前に単回皮下投与した場合の治療予防効果を示している。
【００３３】
［方法］
メチル基修飾率ならびにヒドロキシプロピル基修飾率がほぼ等しいＨＰＭＣ化合物６種類を信越化学工業社から分与を受けた。これらの化合物を早発系マウスであるＴｇ７マウス［Ｒａｃｅ，Ｒ．，Ｍ．  Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，ａｎｄ  Ｂ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏ，Ｅｎｔｒｙ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｃｒａｐｉｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（２）：ｐ．８２８−３３．］（６−１０週令オス）の背部皮下に４ｇ／ｋｇ体重を単回投与した。単回投与のタイミングは、１％の２６３Ｋプリオン脳乳液（同プリオンに罹患したハムスターの病末期の脳を生理食塩水でホモジネートして遠心後に得られた上清を生理食塩水で１％に希釈したもの）２０μＬを脳内に接種して感染させた（以下、脳内感染と呼ぶ）直後、或いは脳内感染６ヶ月前、１２ヶ月前、１９ヶ月前である。無動性、毛づくろい行動の消失、運動失調、パラシュート反応の消失、尻尾の固縮、猫背、約１０％／週の体重減少が観察された時点を病末期として、人道的エンドポイントとして動物を安楽死させた。感染時から病末期までを生存期間とした。プリオン病であることは脳に蓄積した異常なプリオン蛋白を免疫組織化学法或いはウエス
タンブロット法で検出して確認した。生存率は、カプラン・マイアー法で解析し、生存率の違いが統計的に有意であるかどうかはログランク法で解析しＰ値を示した。
【００３４】
［結果］
信越化学工業株式会社製品に添付されていた資料をもとにまとめた各化合物の化学的性質を図１（ａ）に示す。また、各化合物の１％水溶液をゲル浸透クロマトグラフィーと動的光散乱法で解析した分子量分布の累積モル質量を図１（ｂ）に示す。図１（ｃ）に示すように、ＨＰＭＣ化合物は脳内感染６ヶ月前、１２ヶ月前の単回投与でも脳内感染直後と同等程度或いはそれ以上に生存日数が延長する個体が観察された。溶媒コントロール群の生存日数の中央値を１００％として、ＨＰＭＣ化合物投与群の生存日数の中央値や第１四分位点と第３四分位点を％で表してグラフ化すると、図１（ｄ）に示すように感染前投与タイミングに対する効力の推移がより一層明確であり、効力が高い６０ＳＨ−５０では感染直後の投与と感染前６ヶ月投与の間で、また感染直後の投与と感染前１２ヶ月前投与の間で有意な効力の差は認められなかった。
また、同様に図１（ｅ）に示すように、ＨＰＭＣ化合物の数平均分子量と効力（溶媒コントロール群の生存日数の中央値を１００％として、ＨＰＭＣ化合物投与群の生存日数の中央値や第１四分位点と第３四分位点を％で表したもの）の関係では、脳内感染直後の投与でも脳内感染１２か月前投与でも１０＾４．５程度の数平均分子量のものの効力が優れていた。
【００３５】
〔実施例２〕
実施例１で用いたＨＰＭＣ化合物群について、プリオン病早発マウスにおける脳内感染後に脳室内持続投与した場合の治療予防効果を示している。
【００３６】
［方法］
実施例１で用いたＨＰＭＣ化合物４種類を早発系マウスであるＴｇ７マウス（６−１０週令オス）の脳室内にアルゼ社のミニ浸透圧ポンプと脳内インフュージョンキットを用いて１５０μｇ／日の割合で４週間持続注入した。注入開始のタイミングは、１％の２６３Ｋプリオン脳乳液２０μＬを脳内に接種して感染させた３日目である。病末期の人道的エンドポイントの設定、生存期間の定義、プリオン病の確認、生存率の統計解析は実施例１と同様である。
【００３７】
［結果］
図２（ａ）に示すように、ＨＰＭＣ化合物は脳室内持続投与で長期にわたり効果が発揮される。特に６０ＳＨ−５０が優れており、溶媒コントロール群の生存日数の中間値が６２日であるのに対して、６０ＳＨ−５０投与群の生存日数の中間値は６２日＋１７６日であり４倍近くまで生存期間が延長した。溶媒コントロール群の生存日数の中央値を１００％として、ＨＰＭＣ化合物投与群の生存日数の中央値や第１四分位点と第３四分位点を％で表してＨＰＭＣ化合物の数平均分子量との関係をグラフ化すると、図２（ｂ）に示すように１０＾４．３周辺の数平均分子量のものの効力が優れていた。これは、図１（ｅ）と同様である。
【００３８】
〔実施例３〕
実施例１や実施例２で特に効力が高かったＨＰＭＣ化合物について、プリオン病早発マウスにおける脳内感染後に脳室内単回投与した場合の治療予防効果を示している。
【００３９】
［方法］
実施例１のごとく２６３Ｋプリオンを脳内感染させたＴｇ７マウス（６−１０週令オス）の脳室内に６０ＳＨ−５０の０．２ｍｇを脳室内に単回投与した。投与のタイミングは１％の２６３Ｋプリオン脳乳液２０μＬを脳内に接種して感染させた２０日目あるいは４
０日目である。病末期の人道的エンドポイントの設定、生存期間の定義、プリオン病の確認、生存率の統計解析は実施例１と同様である。
【００４０】
［結果］
図２（ｃ）に示すように、溶媒コントロール群に比して、脳内感染２０日目（２０ｄｐｉ）の脳室内単回投与だけでなく、脳内感染４０日目（４０ｄｐｉ）の脳室内単回投与においても、統計的に有意な生存期間の延長が観察された。
【００４１】
〔実施例４〕
実施例１や実施例２で特に効力が高かったＨＰＭＣ化合物について、プリオン病早発マウスにおける脳内感染後に腰椎から髄腔内へ単回投与した場合の治療予防効果を示している。
【００４２】
［方法］
実施例１のごとく２６３Ｋプリオンを脳内感染させたＴｇ７マウス（６−１０週令オス）の脳室内に６０ＳＨ−５０の０．２ｍｇを腰椎から髄腔内に単回投与した。投与のタイミングは１％の２６３Ｋプリオン脳乳液２０μＬを脳内に接種して感染させた４０日目である。病末期の人道的エンドポイントの設定、生存期間の定義、プリオン病の確認、生存率の統計解析は実施例１と同様である。
【００４３】
［結果］
図２（ｄ）に示すように、脳内感染４０日目の腰椎からの髄腔内単回投与において、溶媒コントロール群に比して統計的に有意な生存期間の延長が観察された。
【００４４】
〔実施例５〕
実施例１で効力が高かったＨＰＭＣ化合物の４種類について、シリアンハムスターにおける腹腔内感染直後、腹腔内感染１３ヶ月前に単回皮下投与した場合の治療予防効果を示している。
【００４５】
［方法］
ＨＰＭＣ化合物をシリアンハムスター（オス）の背部皮下に４ｇ／ｋｇ体重を単回投与した。単回投与のタイミングは、１％の２６３Ｋプリオン脳乳液１００μＬを腹腔内に接種して感染させた（以下、腹腔内感染と呼ぶ）直後、或いは腹腔内感染１３ヶ月前である。なお、腹腔内感染は全てのハムスターで１４．５ヶ月令となるようにした。病末期の人道的エンドポイントの設定、生存期間の定義、生存率の統計解析は実施例１と同様である。
【００４６】
［結果］
図３に示すように、腹腔内感染の場合には、調べた４種類のいずれのＨＰＭＣ化合物も感染直後の皮下単回投与においてハムスターを寿命一杯まで生存させることができた。また、腹腔内感染の１３ヶ月前の皮下単回投与においてもハムスターを寿命一杯まで生存させることができた。溶媒コントロール群では２６３Ｋプリオン株感染ハムスターに特有の失調症状が病末期に出現したが、ＨＰＭＣ化合物を投与したハムスターではこの特有の失調症状は観察されず寿命による衰弱だけが観察された。
【００４７】
〔実施例６〕
実施例１で用いたメチル基修飾率ならびにヒドロキシプロピル基修飾率がほぼ等しいＨＰＭＣ化合物群について、ピレンをプローブとした分子内疎水環境解析を行った結果を示している。また、その結果と実施例１で示した効力との関係を解析した結果を示している。
【００４８】
［方法］
まずピレンをプローブとしてＨＰＭＣ化合物に結合させる反応を以下のように実施した。１０ｍｇ／１．０ｍＬの濃度で１−ピレンブチリルクロライドを溶解させたジクロロメタン液に０．２０ｇ／２０ｍＬの濃度で各ＨＰＭＣ化合物を溶解させたＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦ）をガラス試験管内で混合し、窒素パージを行い試験管を密閉して、６０℃で撹拌して一晩反応させた。反応用液に３０ｍＬのヘキサンを混合し、次いで１０ｍＬのクロロホルムを混合して、ピレンが結合したＨＰＭＣ化合物を沈殿させた。沈殿物は遠心で回収し、２０ｍＬのＤＭＦに溶解した。この沈殿溶解による精製を２回繰り返した後に、沈殿物を５ｍＬのヘキサンで洗浄し乾燥させた。乾燥物を１６０ｍＬの脱イオン水に溶解し、アセチルセルロース透析膜（分子量カットオフ、３５００Ｄａ）中に容れて脱イオン水で２日間透析した。その後、ポアサイズ０．４５μｍの膜（ミリポア社製）を透過させて精製し乾燥させた。得られた乾燥物（ピレンが結合したＨＰＭＣ化合物）を超純水で１．０ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解し、ＦＰ−６５００スペクトロフルオロメーター（ＪＡＳＣＯ株式会社）でピレンの蛍光スペクトルを詳細に解析した。具体的には、３１０ｎｍの励起光をあて、反射光を３５０〜５００ｎｍの範囲で０．２ｎｍデータポイント間隔でスキャンを行い、蛍光スペクトルを記録した。
【００４９】
［結果］
図４（ａ）にピレン結合ＴＣ−５ＲＷの蛍光スペクトルを示しているが、ピレン周辺の微細構造を反映する３つの蛍光ピーク（ピークＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）が明瞭に観察された。一方で、ピレンのエキシマー蛍光（約４６０ｎｍでピークが出現）は見られなかった。このことは、化合物内のピレンの密度が十分に低く、ピレン同士の間で相互作用が起こっていないことを示している。既報告では［Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｋ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｖｉｂｒｏｎｉｃ  Ｂａｎｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｙｒｅｎｅ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｅｌｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９７７．  ９９（７）：  ｐ．２０３９−２０４４．、及び、Ｗｉｎｎｉｋ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｍ．Ａ．
Ｗｉｎｎｉｋ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｔａｚｕｋｅ，  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｗｉｔｈ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  −  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａ  Ｌｏｏｋ  ａｔ  Ｐｙｒｅｎｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７．９１（３）：ｐ．５９４−５９７．］、ピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比、或いはピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比は、ピレン結合物質の物質分子内疎水性環境を反映していることが知られている。そこで、図４（ｂ）にＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標として、ピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比、或いはピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比を独立した３回の実験結果から得られた平均と標準偏差の値で示した。
【００５０】
図４（ｃ）には、各ＨＰＭＣ化合物のピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比の線形回帰分析の結果を示す。ピアソン相関係数を用いて統計的に相関の程度を評価した。ピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比が強く相関していることが示された。
次に、実施例１で示したＨＰＭＣ化合物の治療予防効力とピレン解析で得られた分子内疎水環境指標との関係を示す。図４（ｄ）は脳内感染直後の投与或いは脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力とピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比との線形回帰分析の結果を表わしているが、特に脳内感染１２ヶ月前投与の効力とピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比との間には強い相関が見られた。脳内感染直後投与の効力とピークＩＩＩ
／ピークＩの蛍光強度比との間にも、その傾向は見られた。図４（ｅ）は、脳内感染直後の投与或いは脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力とピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比との線形回帰分析の結果を表わしているが、結果は図４（ｄ）と同様であった。したがって、強い分子内疎水環境をもつＨＰＭＣ化合物ほど、予防効果に優れていることが分かった。
【００５１】
〔実施例７〕
実施例１で用いたメチル基修飾率ならびにヒドロキシプロピル基修飾率がほぼ等しいＨＰＭＣ化合物群について、マクロファージへの取り込み率を解析した結果を示している。また、マクロファージへの取り込み率と実施例１で示した効力との関係を解析した結果を示している。
【００５２】
［方法］
まずＨＰＭＣ化合物をフルオレセインで標識した。０．３ｇ／３０ｍＬの濃度で各ＨＰＭＣ化合物をＤＭＦに溶解し、その溶液にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｚｉｄｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅを１．５ｍｇ加えて溶解した。この溶液をガラス試験管内に容れ、窒素パージを行い試験管を密閉して、９０℃で撹拌して３時間反応させた。フルオレセイン標識ＨＰＭＣ化合物の回収は、実施例６で行ったように沈殿・溶解による精製プロセスを繰り返して回収ならびに精製を行った。その後に、回収した乾燥物をＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解し室温で８時間放置して、アセチル保護基を除去した。その後に実施例６のように透析で標識ＨＰＭＣ化合物の精製を行い乾燥させた。これを超純水に溶解しゲルろ過クロマトグラフィー（カラムは昭和電工社製のＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱで、蛍光検出器を用い４９４ｎｍの励起光を照射し、５２０ｎｍの反射光を検出した）で分析したが、低分子量分画に蛍光シグナルは観察されなかった。腹腔マクロファージはチオグリコレートを用いた一般的な方法でＴｇ７マウスの腹腔内から回収した。フルオレセイン標識ＨＰＭＣ化合物を腹腔マクロファージ細胞（３×１０５個）を播種した培養細胞液中に終濃度１ｍｇ／ｍＬで加え、１日間培養を行った。その後、培養液を捨て細胞をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）で丁寧に２回洗浄し、細胞溶解液［デオキシコール酸ナトリウム（終濃度０．５％）とオクチルフェニルエーテル（商品名：ＮＰ−４０、和光純薬工業社製、終濃度０．５％）を添加したＰＢＳ、ｐＨ６．５］を用いて細胞を溶解し、軽く遠心分離して高分子核酸を除いて細胞溶解液を調製した。細胞溶解液中のフルオレセイン標識ＨＰＭＣ化合物の量は、上述したゲルろ過クロマトグラフィーで高分子量画分の蛍光強度を検出して測定した。
【００５３】
［結果］
図５（ａ）にＨＰＭＣ化合物の腹腔マクロファージへの取り込み率（培養液中に加えた量に対する腹腔マクロファージ細胞溶解液中の量を％で示している）、独立した３回の実験結果から得られた平均と標準偏差の値で示した。図５（ｂ）には、実施例１で示したＨＰＭＣ化合物の治療予防効力とＨＰＭＣ化合物のマクロファージへの取り込み率に関する線形回帰分析の結果を示す。ピアソン相関係数を用いて統計的に相関の程度を評価した。特に脳内感染１２ヶ月前投与の効力とマクロファージへの取り込み率との間には強い逆の相関が見られた。脳内感染直後投与の効力とマクロファージへの取り込み率との間にも、その傾向は見られた。したがって、マクロファージへの取り込み率が低いＨＰＭＣ化合物ほど、予防効果に優れていることが分かった。図５（ｃ）には、実施例６で示したＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標とＨＰＭＣ化合物のマクロファージへの取り込み率に関する線形回帰分析の結果を示す。ピアソン相関係数を用いて統計的に相関の程度を評価した。ピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比、或いはピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比とマクロファージへの取り込み率との間には強い逆の相関が見られた。したがって、マクロファージへの取り込み率が低いＨＰＭＣ化合物ほど、強い分子内疎水環境をもつことが分かった。
【００５４】
〔実施例８〕
実施例６及び実施例７から、ＣＥの治療予防効果を規定する２つの因子が明らかとなった。そこで、これら２因子に基づいてＨＰＭＣ化合物の治療予防効力を統計的に予測できることを示している。
【００５５】
［方法］
実施例６と実施例７の結果から、ＨＰＭＣ化合物の分子内疎水環境指標とマクロファージ取り込み率に基づいて、ＨＰＭＣ化合物の治療予防効力を重回帰分析で予測した。重回帰分析は、統計解析アドインソフトウェア（エクセル統計、社会情報サービス社製）を用いて行った。
【００５６】
［結果］
図６に示すように、脳内感染前１２ヶ月前投与のＨＰＭＣ化合物の効力の実測値（生存期間の中央値）は分子内疎水環境指標とマクロファージ取り込み率に基づいて予測した値とほぼ一致した。分子内疎水環境指標としてピークＩＩＩ／ピークＩの蛍光強度比を用いた場合でも、ピークＩＶ／ピークＩの蛍光強度比を用いた場合でも結果は同様であった。
【００５７】
〔実施例９〕
ＣＥ化合物としてメチルセルロースの代表的化合物であるＳＭ−４（信越化学工業社製）を基に構造活性相関解析を行い、Ｃ１８修飾体、ＤＥＡＥ修飾体や他の修飾体との治療予防効果の比較を行った結果を示している。
【００５８】
［方法］
ＳＭ−４をもとに各種の修飾体を名糖産業株式会社で作製した。Ｃ１８修飾体は以下の方法で作製した。ＳＭＲ−Ｃ１８を得るために、ＳＭ−４（２．０ｇ）を水（１６ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（６ｍＬ）に溶解させ、４８％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム水溶液（７４５μＬ）を添加した後、ステアリルグリシジルエーテル（６８５ｍｇ）との縮合反応を室温で一晩行った。生成物はエタノールとヘキサンによる沈殿溶解の繰り返しと透析で精製した。
ジエチルアミノエチル修飾体は以下の方法で作製した。ＳＭＲ−ＤＥＡＥを得るために、ＳＭ−４（１２．０ｇ）を水（９６ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（３６ｍＬ）に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム（１８８ｍｇ）添加し、還元反応を室温で一晩行った。酢酸（２８５μＬ）を添加して還元反応を停止させたのち、４８％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム水溶液（５．９ｍＬ）とジエチルアミノエチルクロライド（８．７ｇ）を添加し、さらに水（４８ｍＬ）を添加し、室温で一晩置換反応させた。生成物はエタノールとヘキサンによる沈殿溶解の繰り返しと透析で精製した。分子量カット３，５００の透析膜を用いて透析を行い、エバポレーターによって濃縮後、凍結乾燥によってＳＭＲ−ＤＥＡＥ粉末（１０．２ｇ）を得た。各化合物を実施例１と同様に２６３Ｋプリオンに脳内感染させたＴｇ７マウスの背部皮下に脳内感染翌日に単回投与（２ｇ／ｋｇ体重）し、実施例１のように生存期間を調べて効力を評価した。生存率は、カプラン・マイアー法で解析し、生存率の違いが統計的に有意であるかどうかはログランク法で解析しＰ値を示した。
【００５９】
［結果］
各化合物の化学的性質を図７（ａ）に示す。また、図７（ｂ）に各化合物を投与したマウスの生存曲線を示す。修飾導入率の低いＣ１８修飾体が他の修飾体に比べて極めて優れていた。同様な疎水性修飾体としてプロピル基を導入したものを検討したが、これらは未修飾体よりも逆に効果が低く、プロピル基の導入率が高いものほど効果は低かった。修飾導入率の低いＣ１８修飾体の効果が優れていたことは、実施例６の結果（分子内疎水環境が高いものほど効力が高い）と矛盾しない。一方、Ｃ１８修飾体よりも効果は劣るものの
、Ｃ１８修飾体に次いでＤＥＡＥ修飾体が優れていた。
【００６０】
〔実施例１０〕
ＣＥ化合物としてＨＰＭＣの代表的化合物であるＴＣ−５ＲＷ（信越化学工業社製）を基に構造活性相関解析を行い、コレステロール修飾体や他の修飾体との治療予防効果の比較を行った結果を示している。
【００６１】
［方法］
ＴＣ−５ＲＷをもとに、４種類の修飾体（ＴＣ−ＳＯ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−ＣＯ、ＴＣ−ＯＨ）を以下の方法で作製した。ＴＣ−ＳＯを得るために、ＴＣ−５ＲＷ（２．０ｇ）をＮ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ溶液中でＣ６Ｈ５ＮＳＯ４（３．２ｇ）と縮合反応を室温で一晩行った。また、ＴＣ−Ｃｈｏｌを得るためにＴＣ−５ＲＷ２．０ｇをＤＭＦ溶液中でコレステリルクロロホルメート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＣＯ−Ｃｌ）０．１０ｇと縮合反応を室温で一晩行った。生成物は実施例６で行ったようにヘキサンとクロロホルムによる沈殿・溶解の繰り返しと透析で精製した。ＴＣ−ＳＯの硫酸基の導入率は不明であるが、ゲル濾過クロマトグラフィーではＴＣ−５ＲＷと分子サイズの差異は明らかではなかった。ＴＣ−Ｃｈｏｌのコレステロール導入率については、コレステロール測定キット（バイオビジョン社製）では０．０００１ｍｏｌ／ＡＧＵ［ＡＧＵ；無水グルコース単位］程度であったが、名糖産業株式会社で実施されたプロトン核磁気共鳴法による積分値比較分析では０．００３ｍｏｌ／ＡＧＵという測定値であった。これらの測定値から修飾率は極めて低いことが推測されたが、ＴＣ−ＳＯやＴＣ−Ｃｈｏｌの光沢・手触り・水への溶解性は、未修飾ＴＣ−５ＲＷとは明瞭に異なっていた。一方、ＴＣ−ＣＯを得るために、ＮａＩＯ４で処理したＴＣ−５ＲＷ（２．０ｇ）を（ＣＨ３）２ＮＨＢＨ４（０．３０ｇ）水溶液と室温で８時間還元反応させた。同様にＴＣ−ＯＨを得るために、ＮａＩＯ４で処理したＴＣ−５ＲＷ（２．０ｇ）をＮａＣｌＯ４（０．４５ｇ）水溶液と室温で８時間酸化反応させた。反応液を透析で精製し、目的の修飾物を得た。ＮａＩＯ４で処理したＴＣ−５ＲＷを薄相クロマトグラフィーで解析し、酸化・還元による修飾率は０．００１６ｍｏｌ／ＡＧＵという測定値であった。
これらの各化合物を実施例１と同様に２６３Ｋプリオンに脳内感染させたＴｇ７マウスの背部皮下に脳内感染翌日に単回投与（４ｇ／ｋｇ体重）し、実施例１のように生存期間を調べて効力を評価した。生存率は、カプラン・マイアー法で解析し、生存率の違いが統計的に有意であるかどうかはログランク法で解析しＰ値を示した。
【００６２】
［結果］
図８に各化合物を投与したマウスの生存曲線を示す。コレステロール修飾体（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）が未修飾体や他の修飾体に比べて優れていた。ＴＣ−ＯＨは未修飾体とほぼ同程度の効力であったが、陰性荷電をもつＴＣ−ＣＯやＴＣ−ＳＯは未修飾体よりも効力が低かった。修飾導入率が低い脂溶性修飾体であるコレステロール修飾体の効果が優れていたことは、実施例９と同様で、実施例６の結果（分子内疎水環境が高いものほど効力が高い）と矛盾しない。
【００６３】
〔実施例１１〕
ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物の治療予防作用が、他のＣＥ化合物よりも動物の系統による影響を受けにくいことを示している。
【００６４】
［方法］
実施例１のように動物における効果の評価を行った。ＨＰＭＣ化合物の投与効果が乏しいＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／１０マウスにおいて６−１０週令オスの背部皮下に１ｇ／ｋｇ体重を単回投与した。１％のＲＭＬプリオン脳乳液（同プリオンに罹患したマウスの病末期の脳を生理食塩水でホモジネートして遠心後に得られた上清を生理食塩水
で１％に希釈したもの）２０μＬを脳内に接種して感染させた翌日に、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲを投与（対照として分子サイズが近いＴＣ−５ＲＷを倍の２ｇ／ｋｇ体重を投与）し、感染時から病末期まで生存期間を観察した。生存率は、カプラン・マイアー法で解析し、生存率の違いが統計的に有意であるかどうかはログランク法で解析しＰ値を示した。
【００６５】
［結果］
図９に示すように、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲに分子サイズが近いＨＰＭＣ化合物であるＴＣ−５ＲＷは、倍量を投与してもＲＭＬプリオンを脳内感染させたＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／１０マウスでは統計的に有意な生存期間の延長が観察されなかったが、ＳＭＲではＴＣ−５ＲＷよりは有効である傾向が見られた。一方、それらの化合物に比べて、ＳＭＲ−ＤＥＡＥではこれらのマウスでも顕著な効果が観察された。
【００６６】
〔実施例１２〕
ＤＥＡＥ修飾ＣＥ化合物の抗プリオン作用（以下、ＰｒＰｒｅｓ形成阻害作用と同義）が、他の修飾ＣＥ化合物や未修飾ＣＥ化合物よりもプリオン株による影響を受けにくいことを示している。
【００６７】
［方法］
マウスの神経芽腫細胞であるＮ２ａ細胞にスクレイピープリオンＲＭＬ株を持続感染させたＳｃＮ２ａ細胞或いはスクレイピープリオン２２Ｌ株を持続感染させたＮ１６７細胞を、６ウエル培養用ディッシュ（ヌンク社製）にコンフルエント状態（ディッシュに細胞がびっしりと生えた状態）の１０％相当数の細胞を播種し、培養液［終濃度１０％となるように牛胎児血清を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（ギブコ社製）］中で培養した。細胞播種後にＨＰＭＣ化合物、ＳＭ−４修飾化合物ならびにＴＣ−５ＲＷ修飾化合物の中で主なものを培養液中に終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ或いは１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３日間培養した後に培養上清を除き、ＰＢＳで細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、０．５ｍＬの細胞溶解液［デオキシコール酸ナトリウム（終濃度０．５％）とオクチルフェニルエーテル（商品名：ＮＰ−４０、和光純薬工業社製、終濃度０．５％）を添加したＰＢＳ］を用いて細胞を溶解し、軽く遠心分離して高分子核酸を除いた（以下、細胞溶解液と呼ぶ）。
【００６８】
プリオンの本体は異常型プリオン蛋白質（以下、ＰｒＰｓｃ）であり、神経細胞等で正常に発現している正常型プリオン蛋白質の高次構造が変化し、重合化して難溶性となり蛋白質分解処理や通常の滅菌処理に抵抗性となる性質を持っている。ＰｒＰｓｃの測定には、ＰｒＰｓｃ中でタンパク質分解酵素処理に耐性なコアの部分（以下、ＰｒＰｒｅｓ）を検出することが一般に良く使われている。そこで、ＰｒＰｒｅｓの検出には、ＳｃＮ２ａ細胞の細胞溶解液やＮ１６７細胞の細胞溶解液をトリチラキウム  アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフロライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて蛋白質分解反応をとめた。その後、１８，０００×ｇ、４℃で５分間遠心をして上清を除いた。この沈殿全量に対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー［１％ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェート）、０．０５％ブロモフェノールブルー、４％グリセロール、１％  ２−メルカプトエタノール、２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８］２０μＬを加えて懸濁し、９５℃で５分間の熱変性処理を加えて試料を調製した（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルと呼ぶ）。試料ごとにタンパク質量に差が無いことは細胞骨格タンパク質であるβアクチンの発現量を調べた。βアクチンの検出には、細胞溶解液２０μＬに５倍濃厚なＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー５μＬを加えて懸濁し、９５℃で５分間の熱変性処理を加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプ
ルを調製した。
【００６９】
調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルをＮｉｓｈｉｚａｗａ  Ｋらの方法［Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｄ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２０１４．  ８８（８）：  ｐ．  ４０８３−９９．］に準じ、１５％  トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質とβアクチンを検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をナイロンメンブラン（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレイン）にブロッティングし、一次抗体としてプリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体［ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈）］或いはβアクチンに対するマウスモノクローナル抗体［シグマ  アルドリッチ社製、１０，０００倍希釈］を使用し、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体［プロメガ社製（２００００倍希釈）］を使用し、抗原抗体反応物は化学発光検出試薬（アマーシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して検出した。
【００７０】
［結果］
図１０に示すように、ＨＰＭＣ化合物やＳＭ−４関連化合物を添加して培養したＳｃＮ２ａ細胞では、２６３Ｋプリオン感染Ｔｇ７マウスでの治療予防効果とほぼ一致するようにＰｒＰｒｅｓ形成阻害効果が見られた。マウスでの治療予防効果が高いものほど、ＰｒＰｒｅｓ形成阻害効果が高かった。一方、２２Ｌプリオンが感染しているＮ１６７細胞では、細胞障害を起こさない濃度の範囲内で明らかなＰｒＰｒｅｓ形成阻害効果を示すのはＳＭＲ−ＤＥＡＥのみであった。
【００７１】
〔実施例１３〕
リポソーム化用市販品（日油株式会社製）を用いて、ＣＥ化合物の組成形態としてリポソームとの混合物（以下、リポソーム化ＣＥ化合物）が抗プリオン作用において、ＣＥ水溶液よりも優れていることを示している。
【００７２】
［方法］
中空リポソームのノニオンタイプであるＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＥＬ−０１−Ｎ（日油株式会社製）をＣＥ化合物の水溶液（ＴＣ−５ＲＷ、ＴＣ−Ｃｈｏｌの場合は２５ｍｇ／ｍＬ、ＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ビオチン標識ＳＭＲ、フルオレセイン標識ＳＭＲの場合は３０ｍｇ／ｍＬ、以下、図中ではＣＥ水溶液と呼ぶ）で復水し、生理食塩水で２倍に希釈した後に超遠心（１００，０００×ｇ、１０分、２５℃）して沈殿物を回収し、復水時の半量（ＴＣ−５ＲＷ、ＴＣ−Ｃｈｏｌの場合）或いは等量（ＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ビオチン標識ＳＭＲ、フルオレセイン標識ＳＭＲの場合）の生理食塩水に再懸濁した（以下、図中ではリポソームと呼ぶ）。また、超遠心後の上清は図中ではリポソーム上清と呼ぶ。これらの試料を実施例１２と同様にＳｃＮ２ａ細胞を用いて抗プリオン効果（ＰｒＰｒｅｓ形成阻害効果）を評価した。リポソーム中のＣＥ含量は、薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。また、ビオチン標識物についてはビオチン・アビジン法によるビオチンの測定、フルオレセイン標識物については蛍光強度から測定を行い、薄相クロマトグラフィーを用いた測定値とほぼ一致することを確認した。
次に、中空リポソームのアニオンタイプであるＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＥＬ−０１−Ａ（日油株式会社製）についても上記と同様に検討を行った。ＣＥ化合物の水溶液（ＳＭ−４、ＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭ−Ｃ１８、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ−Ｃｈｏｌの５０ｍｇ／ｍ
Ｌ）で復水し、生理食塩水で２倍に希釈した後に超遠心（１００，０００×ｇ、１０分、２５℃）して沈殿物を回収し、復水時と等量の生理食塩水に再懸濁した。これらの試料についてＳｃＮ２ａ細胞を用いて抗プリオン効果を評価した。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。
【００７３】
［結果］
図１１（ａ）には、ノニオンタイプリポソームを用いてリポソーム化したＴＣ−５ＲＷとＴＣ−ＣｈｏｌのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。リポソーム化ＣＥは、ＣＥ水溶液の１００分の１程度の原末量でほぼ同等な抗プリオン効果を発揮した。
図１１（ｂ）には、ノニオンタイプリポソームを用いてリポソーム化したＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ビオチン標識ＳＭＲ、フルオレセイン標識ＳＭＲのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。図１１（ａ）の結果と同様にリポソーム化ＣＥは、ＣＥ水溶液の１００分の１程度の原末量でほぼ同等な抗プリオン効果を発揮した。
図１１（ｃ）には、アニオンタイプリポソームを用いてリポソーム化したＳＭ−４、ＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭ−Ｃ１８、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ−ＣｈｏｌのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。図１１（ａ）の結果と同様にリポソーム化ＣＥは、ＣＥ水溶液の１００分の１程度の原末量でほぼ同等な抗プリオン効果を発揮した。
【００７４】
〔実施例１４〕
Ｂａｎｇｈａｍ  Ａ．Ｄ．らの方法［Ｂａｎｇｈａｍ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍ．Ｍ．  Ｓｔａｎｄｉｓｈ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．  Ｗａｔｋｉｎｓ，  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｖａｌｅｎｔ  ｉｏｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｌａｍｅｌｌａｅ  ｏｆ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １９６５．  １３（１）：  ｐ．  ２３８−５２．］に準じて調製した自家調製品を用いて、リポソーム化ＣＥ化合物がＣＥ水溶液よりも抗プリオン作用に優れていることを示している。
【００７５】
［方法］
Ｂａｎｇｈａｍ  Ａ．Ｄ．らの方法（脂質組成は原法とは異なる）にて調製したリポソーム化ＣＥの有効性を上記と同様に検討を行った。具体的には、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｌｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（以下、ＤＰＰＣ）とコレステロールを６対４のモル比で混合した脂質の１μｍｏｌに対して２．４ｍｇのＣＥ化合物（ＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ−Ｃｈｏｌ）をクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり２００μＬの生理食塩水或いは１０％ショ糖水溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させた後に、超音波処理を行い十分に懸濁させた。得られた懸濁液を低速遠心（３，０００×ｇ、５分）を行い沈殿物を分けた後に、上清液をさらに超遠心［１００，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得た。それらの沈殿物は生理食塩水に再懸濁し、リポソーム化ＣＥ試料とした。これらの試料を上記と同様にＳｃＮ２ａ細胞を用いて抗プリオン効果を評価した。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。
【００７６】
［結果］
図１２には、Ｂａｎｇｈａｍ  Ａ．Ｄ．らの方法にてリポソーム化したＳＭＲ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ、ＳＭＲ−ＤＥＡＥ−ＣｈｏｌのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。超遠心沈殿物として精製したリポソーム化ＣＥは、ＣＥ水溶液の１００分の１程度の原末量或いは精製前リポソーム化ＣＥ液とほぼ同等な抗プリオン作用を発揮した。一方、低速遠心沈殿物中のリポソーム化ＣＥにはほとんど効果を認めな
かった。
【００７７】
〔実施例１５〕
Ｂａｎｇｈａｍ  Ａ．Ｄ．らの方法による自家調製品において、ＤＰＰＣ対コレステロールの脂質組成がリポソーム化ＣＥの抗プリオン作用に及ぼす影響を示している。また、リポソーム処理方法がリポソーム化ＣＥの抗プリオン作用に及ぼす影響も示している。
【００７８】
［方法］
メチルセルロースだけでなくＨＰＭＣについても、自家調製によるリポソーム化の抗プリオン効果を検討するとともに、ＤＰＰＣ対コレステロール比の検討も併せて行い、さらにリポソームの処理方法が抗プリオン作用に与える影響についても調べた。具体的には、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比を８対２、６対４、２対８、０対１０で混合した脂質の１μｍｏｌに対して２．５ｍｇのＴＣ−５ＲＷ（或いは陰性対照化合物として平均分子量７０キロダルトンのデキストランから修飾合成されたヒドロキシプロピルメチルデキストラン（以下、ＤＸＲ）をクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり１００μＬの生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させたものをマルチラメラーベジクル（以下、ＭＶＬ）の原液とした。ＭＶＬの原液を液体窒素で３回凍結融解を繰り返したものをラージユニラメラーベジクル（以下、ＬＵＶ）の原液とした。ＬＵＶの原液をポアサイズ０．１μｍのポリカーボネートフィルターにて押し出し（エクストルージョン）処理したものをスモールユニラメラーベジクル（以下、ＳＵＬ）のＥ型（以下、ＳＵＬ−Ｅ）の原液とした。ＬＵＶの原液を超音波処理装置にて３０分処理したものをＳＵＬのＳ型（以下、ＳＵＬ−Ｓ）の原液とした。これらの原液を超遠心［１５０，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得ることで精製し、それらの沈殿物を生理食塩水に再懸濁してリポソーム化ＣＥ試料とした。これらの試料を上記と同様にＳｃＮ２ａ細胞を用いて抗プリオン効果を評価した。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。
【００７９】
［結果］
図１３（ａ）には、ＤＰＰＣ対コレステロール比が異なる組成でリポソーム化したＴＣ−５ＲＷのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。なお、検討したリポソーム化ＴＣ−５ＲＷは全てＭＬＶタイプである。自家調製リポソームにおいてもメチルセルロースだけでなくＨＰＭＣであるＴＣ−５ＲＷでも同様に、ＴＣ−５ＲＷ水溶液の１００分の１の原末量で同等な抗プリオン効果が観察された。図１３（ａ）のウエスタンブロットのデータのシグナルを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアーを用いてシグナルの強さを定量した結果を図１３（ｂ）に示したが、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比として最適なのは６対４であった。なお、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が８対２のリポソームでは、陰性対照化合物でもＰｒＰｒｅｓの減少が観察された。一方、図１３（ｃ）にリポソーム処理方法によるリポソーム化ＴＣ−５ＲＷの抗プリオン作用への影響を示している。なお、検討したリポソーム化ＴＣ−５ＲＷのリポソーム脂質組成は全てＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が６対４である。リポソーム処理方法としては、ＭＬＶタイプが他のどのタイプよりも優れていた。
【００８０】
〔実施例１６〕
実施例１５で観察されたＤＰＰＣ対コレステロール比の異なる脂質組成の影響を、さらにモル比を広範囲に変更し、かつ脂質とＣＥとの量比も一定範囲で変更した場合の、リポソーム化ＣＥの抗プリオン作用に及ぼす影響を示している。
【００８１】
［方法］
ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比を１０対０、８対２、６対４、２対８、０対１０で
混ぜた脂質の１μｍｏｌに対して０．６ｍｇ、１．２ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇのＴＣ−５ＲＷ（或いは陰性対照化合物ＤＸＲ）をクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり１００μＬの生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させた後に、超遠心［１５０，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得ることで精製し、それらの沈殿物を生理食塩水に再懸濁してリポソーム化ＣＥ試料とした。これらの試料を上記と同様にＳｃＮ２ａ細胞を用いて抗プリオン効果を評価した。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。
【００８２】
［結果］
脂質フィルムに生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させてリポソーム化ＣＥの原液を作製する際に、ＤＰＰＣのみからなる脂質フィルムよりもＤＰＰＣ・コレステロール混合からなる脂質フィルムの方が、分散状態が良好（すなわち、より長期間にわたり浮遊状態を保てる懸濁液の状態）であった。また、ＴＣ−５ＲＷと脂質との混合液の粘性はコレステロールの割合が高くなるほど下がり、扱いやすくなった。しかし、ＴＣ−５ＲＷとコレステロールのみからなる混合液の脂質フィルムは、生理食塩水を加えＶｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけても塊のままで懸濁されず分散液にならなかった。図１４には、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が１０対０と６対４の組成でリポソーム化したＴＣ−５ＲＷと陰性対照化合物ＤＸＲのＳｃＮ２ａプリオン持続感染細胞における抗プリオン効果を示している。実施例１５において、最適なＤＰＰＣ対コレステロールのモル比は６対４であり、８対２では陰性対照化合物でもＰｒＰｒｅｓの減少が観察されたが、本実施例においても、図１４で破線で囲っている箇所［左側］に示すようにＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が１０対０で明らかに陰性対照化合物でＰｒＰｒｅｓの減少が見られた。また、図１４の別の破線で囲っている箇所［右側］に示すように、脂質対ＴＣ−５ＲＷの量比では、ＴＣ−５ＲＷ含量を高くしてリポソーム化したものの方が、等量のＴＣ−５ＲＷ量をリポソーム化ＴＣ−５ＲＷとして培養液に加えているにもかかわらず抗プリオン作用は優れていた。
【００８３】
〔実施例１７〕
ＣＥ化合物の存在はリポソームの凝集を抑制し分散を促進させるため、ＣＥ化合物がリポソーム組成物として優れていることを示している。
【００８４】
［方法］
ＤＰＰＣ１μｍｏｌに対して０．３ｍｇ、０．６ｍｇ、１．２ｍｇ、２．４ｍｇのＴＣ−５ＲＷをクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり１００μＬの生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させた。この分散液をポアサイズ０．１μｍまたは０．８μｍのポリカーボネートフィルターで押し出し（エクストルージョン）処理を行った後に、超遠心［１５０，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得ることで精製し、それらの沈殿物を生理食塩水に再懸濁してリポソーム化ＣＥ試料とした。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。リポソームの形態は、位相差顕微鏡（対物レンズ４０倍）で観察して写真を撮った。
次に、実施例１５と同様の方法で各種処理リポソームを作製して、リポソームの形態を調べた。具体的には、ＤＰＰＣ対コレステロールのモル比が６対４で混ぜた脂質の１μｍｏｌに対して２．５ｍｇのＴＣ−５ＲＷ（或いは陰性対照化合物ＤＸＲ）をクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり１００μＬの生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させＭＶＬ原液を調製した。ＭＶＬ原液を液体窒素で３回凍結融解を繰り返しＬＵＶ原液を調製した。ＬＵＶの原液をポアサイズ０．１μｍのポリカーボネートフィルターにて押し出し（エクストルージョン）処理しＳＵＬ−Ｅ原液を調製した。ＬＵＶの原液を超
音波処理装置にて３０分処理しＳＵＬ−Ｓ原液を調製した。これらの原液を超遠心［１５０，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得ることで精製し、それらの沈殿物を生理食塩水に再懸濁して各種リポソーム化ＣＥ試料とした。リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。また、リポソームの形態は、上記のように位相差顕微鏡（対物レンズ４０倍）で観察して写真を撮った。
【００８５】
［結果］
図１５（ａ）に示すように、少なくともＤＰＰＣ１μｍｏｌあたりＴＣ−５ＲＷ量として０．６ｍｇ以上の量があれば、ＴＣ−５ＲＷはリポソームの凝集を抑え、分散を改善した。また、図１５（ｂ）からわかるように、いずれのリポソーム処理（ＭＬＶ、ＬＵＶ、ＳＵＶ−Ｅ、ＳＵＶ−Ｓ）においても、陰性対照化合物であるＤＸＲにはＣＥ化合物と同様な効果は認められなかった。これらの結果に、実施例１６で観察されたリポソーム組成としてＣＥ含量が高い方がリポソーム化ＣＥの抗プリオン作用が優れていたことも考え合わせると、ＣＥ化合物がリポソーム組成物として優れており、ＣＥ化合物とリポソームの相性が良いことを示している。
【００８６】
〔実施例１８〕
リポソーム化ＣＥ化合物をマウスに投与した際に、リンパ濾胞に選択的に分布することを示している。
【００８７】
［方法］
ＤＰＰＣ：コレステロール：ローダミンＤＨＰＥ（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ  １，２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ、ＣＡＳ  Ｎｏ：１２６１１１−９９−７）をモル比で５９．５：４０：０．５で混合した脂質の１μｍｏｌに対して１．２ｍｇのＳＭＲ−ＤＥＡＥをクロロホルム中で混合した後に、クロロホルムを蒸発させ脂質フィルムを作製した。このフィルムに脂質１μｍｏｌ当たり２００μＬの生理食塩水を加え、Ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置にかけて撹拌分散させた後に、凍結融解を行い、さらに超音波処理を行い十分に懸濁させた。得られた懸濁液を超遠心［１５０，０００×ｇ、６０分］を行い沈殿物を得ることで精製した。沈殿物は生理食塩水に再懸濁し、リポソーム化ＣＥ試料とした。なお、リポソーム中のＣＥ含量は、上記と同様に薄相クロマトグラフィーを用いて測定した。調製したリポソーム化ＣＥ１００μＬ（ＳＭＲ−ＤＥＡＥ含量は約５μｇ）をｄｄＹマウスの腹腔内に投与し、翌日に脾臓、肝臓、リンパ組織を摘出し、凍結切片を作製して、共焦点レーザー顕微鏡にてローダミン蛍光を観察した。また、対照実験としてローダミン標識ＳＭＲ−ＤＥＡＥ水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをｄｄＹマウスの腹腔内へ投与し、２週間後に肝臓、腎臓を摘出し、凍結切片を作製して、共焦点レーザー顕微鏡にてローダミン蛍光を観察した。
【００８８】
［結果］
図１６（ａ）に示すように、脾臓のリンパ濾胞にローダミン蛍光が観察され、リポソーム化ＣＥの集積が示唆された。この結果は、リンパ濾胞はプリオンが増殖する場所であることから、リポソーム化によりＣＥを効率的にプリオン増殖の場所に送達させることが可能であることを示している。肝臓やリンパ組織ではローダミン蛍光は観察されなかった。
一方、図１６（ｂ）に示すように、ローダミン蛍光が腎臓の糸球体や肝臓の類洞（クッパー細胞）に観察された。したがって、ＣＥ水溶液ではプリオン増殖の場所でない腎臓の糸球体や肝臓の類洞に集積するなど、効率的な薬剤送達が出来ていなかった。
【図１ａ】
2017203029.tif 000011
【図１ｂ】
2017203029.tif 000012
【図１ｃ】
2017203029.tif 000013
【図１ｄ】
2017203029.tif 000014
【図１ｅ】
2017203029.tif 000015
【図２ａ】
2017203029.tif 000016
【図２ｂ】
2017203029.tif 000017
【図２ｃ】
2017203029.tif 000018
【図２ｄ】
2017203029.tif 000019
【図３】
2017203029.tif 000020
【図４ａ】
2017203029.tif 000021
【図４ｂ】
2017203029.tif 000022
【図４ｃ】
2017203029.tif 000023
【図４ｄ】
2017203029.tif 000024
【図４ｅ】
2017203029.tif 000025
【図５ａ】
2017203029.tif 000026
【図５ｂ】
2017203029.tif 000027
【図５ｃ】
2017203029.tif 000028
【図６】
2017203029.tif 000029
【図７ａ】
2017203029.tif 000030
【図７ｂ】
2017203029.tif 000031
【図８】
2017203029.tif 000032
【図９】
2017203029.tif 000033
【図１０】
2017203029.tif 000034
【図１１ａ】
2017203029.tif 000035
【図１１ｂ】
2017203029.tif 000036
【図１１ｃ】
2017203029.tif 000037
【図１２】
2017203029.tif 000038
【図１３ａ】
2017203029.tif 000039
【図１３ｂ】
2017203029.tif 000040
【図１３ｃ】
2017203029.tif 000041
【図１４】
2017203029.tif 000042
【図１５ａ】
2017203029.tif 000043
【図１５ｂ】
2017203029.tif 000044
【図１６ａ】
2017203029.tif 000045
【図１６ｂ】
2017203029.tif 000046