(57)【要約】      （修正有）【課題】製造コストの低減を図る一方で、測定時の操作を容易にし得るバイオセンサを提供する。【解決手段】作用極３ｂを含む複数の電極と、作用極上に固定され、架橋剤，導電性高分子，及び作用極との間で電子授受を行う酵素とを含む検知層６と、を含み、作用極上が開放系とされているバイオセンサである。【選択図】図１
2017075940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用極を含む複数の電極と、
前記作用極上に固定され、架橋剤，導電性高分子，及び前記作用極との間で電子授受を行う酵素とを含む検知層と、
を含み、
前記作用極上が開放系とされている
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記検知層の前記作用極との接触面積が所定面積で規定されている
請求項１に記載のバイオセンサ。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、使い捨て型のバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来における使い捨て型のバイオセンサは、基材上の電極系に酵素及びメディエータを含む試薬を塗布し、スペーサ及びカバーで液体試料を引き込むキャピラリを形成したものが使用されている（例えば、特許文献１）。バイオセンサに電圧を印加することで、メディエータによる拡散電流により、試料中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２９０１６７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
使い捨て型のバイオセンサ、例えばグルコースセンサは、キャピラリ内に引き込まれた検体（液体試料）が試薬を溶解させて拡散させ、酵素反応により生じた電流を応答電流として検出する。このため、グルコースセンサの感度が試薬中の物質の拡散状況の影響を受ける。センサ間で検体による試薬の拡散状況にばらつきが出ないように、キャピラリの寸法（特に高さ）及び容積が規定されている。
【０００５】
しかし、キャピラリの形成には基板に積層するスペーサやカバーのような部品が必要であり、これらの部品の存在がバイオセンサの製造コストを高める要因となっている。また、キャピラリを有するバイオセンサでは、検体をキャピラリの吸引口に近づけて、検体をキャピラリ内に導入する。しかし、ユーザによるバイオセンサの扱い方によっては、適量の検体がキャピラリ内に導入されず、検体中の測定対象物質の濃度を適正に測定できない場合が起こり得る。
【０００６】
本発明は、製造コストの低減を図る一方で、測定時の操作を容易にし得るバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面は、作用極を含む複数の電極と、前記作用極上に固定され、架橋剤，導電性高分子，及び前記作用極との間で電子授受を行う酵素とを含む検知層を含み、前記作用極上が開放系とされていることを特徴とするバイオセンサである。
【０００８】
本発明に係るバイオセンサは、前記検知層の前記作用極との接触面積が所定面積で規定されている構成を採用するのが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、製造コストを低減できる一方で、測定時の操作が容易となるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施形態に係るバイオセンサの構成例を示す図である。
【図２】図２は、測定装置の構成例を示す図である。
【図３】図３は、測定装置における処理例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、試験１の結果、クロノアンペロメトリー法を用いたグルコース濃度の測定結果に基づく検量線を示すグラフである。
【図５】図５は、試験２の結果、すなわち、クロノアンペロメトリー法によるグルコース濃度の測定結果に基づく検量線を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例１のバイオセンサを用いたグルコース濃度の測定結果に基づくＳ／Ｂ（サンプル／ブランク）比を示すグラフである。
【図７】図７は、比較例１のバイオセンサを用いたＣＶ法及びＣＡ法による測定結果に基づくＳ／Ｂ比を示すグラフである。
【図８】図８は、第２実施形態におけるバイオセンサの構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照して本発明の実施形態に係る酵素電極について説明する。以下に説明する実施形態の構成は例示であり、本発明は実施形態の構成に限定されない。
【００１２】
〔第１実施形態〕
＜バイオセンサの構成＞
図１は、実施形態に係る使い捨て型のバイオセンサの構成例を模式的に示した図である。図１において、バイオセンサ１は、絶縁性基板２と、電極３,４と、絶縁層５と、試薬
層（以下、「検知層」という）６とを含む。バイオセンサ１は、スペーサやカバーにより形成されるキャピラリ（カバーがない場合もある）を有していない。すなわち、少なくとも作用極が開放系となっている。
【００１３】
＜＜絶縁性基板＞＞
絶縁性基板２は、長さ方向と幅方向とを有する矩形の平板状に形成されている。絶縁性基板２は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成することができる。
【００１４】
＜＜電極＞＞
電極３,４は、絶縁性基板２の片面２ａに形成されている。電極３は、一端部３ａと他
端部３ｂとを有し、他端部３ｂは、絶縁性基板２の幅方向に延びており、作用極として使用される。一端部３ａは、リード部（電極取り出し部）として使用される。電極４は、一端部４ａと他端部４ｂとを有しており、他端部４ｂは、他端部３ｂ（作用極）と所定の間隙が設けられた状態で絶縁性基板２の幅方向に延びており、対極として使用される。一端部４ａも、リード部（電極取り出し部）として使用される。
【００１５】
電極３,４のそれぞれは、例えば、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウムのよ
うな金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。例えば、電極３,
４は、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さを有する金属層として形成することができる。或いは、電極３,４は、炭素材料を含むインクをスクリーン印刷で絶縁性基板２上に
印刷することで形成することもできる。或いは、電極３,４は、スクリーン印刷により製
膜した銀／塩化銀電極として形成することもできる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン
印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極を参照極とした３電極系を用いてもよい。
【００１６】
電極３,４をなす電極材料及び絶縁性基板２の材料は、公知のあらゆる材料を適用する
ことができる。電極３,４及び絶縁性基板２の大きさ、厚さは適宜設定可能である。絶縁
性基板２と電極３,４との組合せは「基材」と呼ばれることもある。なお、実施形態では
、作用極及び対極を有する２極の電極系を例示するが、さらに参照極を含む３極の電極系であっても良い。
【００１７】
＜＜絶縁層＞＞
絶縁層５は、電極３,４の他端部３ｂ,４ｂを露出させる開口部５ａが形成される状態で、基材上に設けられている。また、電極３,４の一端部３ａ,４ａも露出させるように設けられている。開口部５ａにて露出した他端部３ｂが作用極として使用され、他端部４ｂが対極として使用される。以下、他端部３ｂを「作用極３ｂ」と表記し、他端部４ｂを「対極４ｂ」と表記する場合もある。
【００１８】
絶縁層５は、例えば、レジストインクのスクリーン印刷により形成することもできる。或いは、開口部５ａが形成された樹脂板を基材上に接着することで形成することもできる。なお、絶縁層５を設けない場合もあり得る。絶縁層５は、ノイズ電流の混入を抑止するためのものであり、絶縁層５によって形成される開口部５ａの段差は、電極（作用極３ｂ,対極４ｂ）上に付着させる試料の分布（広がり）範囲を規定するものではない。このよ
うに、バイオセンサ１は、電極（作用極３ｂ,対極４ｂ）を覆うキャピラリ（カバー乃至
スペーサ）を有しないものである。
【００１９】
＜＜検知層＞＞
検知層６は、作用極３ｂ（露出した他端部３ｂ）上に固定される。検知層６は、作用極３ｂと接触する酵素と、導電性高分子と、架橋剤７と、を含んでおり、電子伝達メディエータを含んでいない。検知層６は、糖と導電性粒子との少なくとも一方を含んでいても良い。
【００２０】
実施形態に係るバイオセンサを用いて測定されるのは、測定対象物質の拡散に依存する電流ではなく、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。これは、酵素と測定対象物質との反応によって、当該酵素から電極へ電子が移動することで生じる電流である。電荷移動律速電流は、時間に依存しない定常電流であり、好ましくは電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流である。
【００２１】
電荷移動律速電流を測定するため、作用極を“直接電子移動型の酵素電極”とする。ここで、“直接電子移動型の酵素電極”とは、試薬層で酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接に或いは導電性高分子を介して電極に伝達されることで、酵素と電極との間で直接電子移動の電子授受が行われるタイプの酵素電極である。
【００２２】
なお、電子伝達メディエータを用いる場合でも、電子伝達メディエータが固定化されており拡散しないような場合は電荷移動律速電流を測定することができる。
【００２３】
検知層６内において、酵素の分子は、架橋剤によって架橋され、さらに、導電性高分子によって複雑に絡み合った構造を有する。酵素反応により生じた電子は、直接的に、または、導電性を有する導電性高分子を伝って電極（作用極３ｂ）に移動することができる。このように、実施形態に係るバイオセンサでは、検知層６における直接電子移動によって酵素と作用極３ｂとの間で電子授受が行われる。
【００２４】
なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は１−２ｎｍと云われており、電極と酵素から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、メディエータの移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。よって、検知層６内では、酵素の活性部位（酵素反応
により電子を生じる部位）と、導電性高分子の導電性部位とが電子移動に好適な距離関係、すなわち、好適な電子移動が起こる程度に導電性部位が活性部位と近い状態となっている。
【００２５】
（酵素）  
酵素として、例えば、酸化還元酵素が適用される。酸化還元酵素は、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００２６】
また、酸化還元酵素は、触媒サブユニット及び触媒ドメインとして、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ（PQQGDH）が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つチトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）、グルコースオキシダーゼ（GOD）が挙
げられる。
【００２７】
また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニット若しくは、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達サブユニットとしては、例えば、電子授受の機能を持つヘムを有するサブユニットが挙げられる。このヘムを有するサブユニットを含む酸化還元酵素としては、チトクロムを含むものが挙げられ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼや、PQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。
【００２８】
また、電子伝達ドメインを含む酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh)が挙げられる。さらに、電子伝達ドメインは、電子授受の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、  "QHGDH" (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH)）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（Glucose-3-Dehydrogenase）（G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、上述したチトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとチトクロムとの融合蛋白質、及びチトクロムを含むドメインの例示であるPQQGDHのチトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。
【００２９】
また、酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子受容体の機能を持つヘムを有するチトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。
【００３０】
酵素として、電子伝達サブユニットを有しない酸化還元酵素を適用し得る。一例としては、チトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）が挙げられる。Ｃｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβと、触媒サブユニットαと、触媒サブユニットγとを有する。検知層６に含まれる酵素として、電子伝達サブユニットβを有しない（触媒サブユニットα及びγを有する）Ｃｙ−ＧＤＨを適用し得る。
【００３１】
電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨよりも安価に入手することができる。よって、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨが酵素として適用されることで、酵素電極の製造コストを抑えることができる。
【００３２】
また、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨは、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨよりも物質としての安定性が高い。このことは、電子伝達サブユニットβを有しないＣｙ−ＧＤＨが適用された酵素電極（バイオセンサ）は、電子伝達サブユニットβ，触媒サブユニットα及び触媒サブユニットγを有するＣｙ−ＧＤＨが適用された酵素電極（バイオセンサ）よりも長期保存が利くことを意味する。従って、製品寿命の長い、電荷移動律速測定型の酵素電極（バイオセンサ）を得ることができる。
【００３３】
（導電性高分子）  
導電性高分子としては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。これらの市販品として、例えば、ポリピロールとして、例えば、「ＳＳＰＹ」（３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチル）（化研産業株式会社製）等がある。また、ポリアニリンとして、例えば「ＡｑｕａＰＡＳＳ ０１−ｘ」（ティーエー
ケミカル社製）等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」（東ソー有機化学株式会社製）等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー１００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー３００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））として、例えば、「ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，）等が
ある。
【００３４】
また、様々な属性（例えば、水溶性）を有する導電性高分子を適用することができる。導電性高分子の官能基は、水酸基又はスルホ基を有することが好ましい。
【００３５】
（糖）  
検知層６は、酵素と架橋剤と導電性高分子に加えて糖を含むことができる。糖は酵素の基質とならない糖であり、糖の構成糖の数は、例えば、１〜６であり、好ましくは２〜６である。これらはＤ体、Ｌ体のいずれであってもよく、またその混合物であっても良く、１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。ただし、グルコースなどの糖を測定対象とするときは、糖として、測定対象の糖とは異なる糖であって、酵素の基質とならない糖を用いる。
【００３６】
二糖類としては、キシロビオース、アガロビオース、カラビオース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、セロビオース、トレハロース、ネオトレハロース、イソトレハロース、イヌロビオース、ビシアノース、イソプリメベロース、サンブビオース、プリメベロース、ソラビオース、メリビオース、ラクトース、リコビオース、エピセロビオース、スクロース、ツラノース、マルツロース、ラクツロース、エピゲンチビオース、ロビノ
ビオース、シラノビオース、ルチノース等が挙げられる。三糖類としては、グルコシルトレハロース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレンジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロースなどが挙げられる。
【００３７】
四糖類としては、マルトシルトレハロース、マルトテトラオース、スタキオースなどが挙げられる。五糖類としては、マルトトリオシルトレハロース、マルトペンタオース、ベルバスコースなどが挙げられる。六糖類としてはマルトヘキサオースなどが挙げられる。
【００３８】
（架橋剤）
架橋剤の種類として、具体的には、アルデヒド基含有化合物として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、シンナムアルデヒド、ニコチアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジプアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。カルボジイミド基含有化合物として、ヘキサメチレンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、１，１２−ジイソシアネートドデカン、ノルボルナンジイソシアネート、２，４−ビス−（８−イソシアネートオクチル）−１，３−ジオクチルシクロブタン、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどが挙げられる。またカルボジイミド基含有化合物はカルボジライトＶ−０２、カルボジライトＶ−０２−Ｌ２、カルボジライトＶ−０４、カルボジライトＶ−０６、カルボジライトＥ−０２、カルボジライトＶ−０１、カルボジライトＶ−０３、カルボジライトＶ−０５、カルボジライトＶ−０７、カルボジライトＶ−０９（何れも商品名、日清紡績株式会社製）などとして市販されている。
【００３９】
マレイミド基含有化合物として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジル−２−マレイミド酢酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ-スク
シニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミドメチル安息香酸、Ｎ−スクシニジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ-スクシニ
ジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ,Ｎ’−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｏ−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｍ−フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−p−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ヘキサメチレン−ジマレイミド、Ｎ−スクシニジルマレイミド
カルボン酸などが挙げられる。また、サンフェルＢＭ−Ｇ（三新化学工業株式会社製）などの市販品も挙げられる。
【００４０】
オキサゾリン基含有化合物として、２，２’−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−メチレン− ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（２−オキサ
ゾリン）、２，２’−トリメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−テトラメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ヘキサメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−オクタメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、２，２’−ｐ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、
２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、ビス
−（２−オキサゾリニルシクロヘキサン）スルフィド、ビス−（２−オキサゾリニルノルボルナン）スルフィドなどのオキサゾリン化合物が挙げられる。
【００４１】
また、付加重合性オキサゾリン化合物として２−ビニル−２−オキサゾリン、２−ビニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−５−エチル−２−オキサゾリンなどが挙げられ、これらの１種もしくは２種以上の化合物を重合または共重合したものを使用可能である。
【００４２】
また、オキサゾリン基含有化合物は、エポクロスＷＳ−５００、エポクロスＷＳ−７００、エポクロスＫ−１０１０Ｅ、エポクロスＫ−１０２０Ｅ、エポクロスＫ−１０３０Ｅ、エポクロスＫ−２０１０Ｅ、エポクロスＫ−２０２０Ｅ、エポクロスＫ−２０３０Ｅ、エポクロスＲＰＳ−１００５、エポクロスＲＡＳ−１００５ (いずれも株式会社日本触媒社製)、ＮＫリンカーＦＸ(新中村化学工業株式会社製)などとして市販されている。
【００４３】
エポキシ基含有化合物として、具体的には、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、などが挙げられ、これらの化合物を２種以上併用して用いることもできる。またエポキシ基含有化合物は、デナコールＥＸ−６１１、デナコールＥＸ−６１２、デナコールＥＸ−６１４、デナコールＥＸ−６１４Ｂ、デナコールＥＸ−５１２、デナコールＥＸ−５２１、デナコールＥＸ−４２１、デナコールＥＸ−３１３、デナコールＥＸ−３１４、デナコールＥＸ−３２１、デナコールＥＸ−８１０、デナコールＥＸ−８１１、デナコールＥＸ−８５０、デナコールＥＸ−８５１、デナコールＥＸ−８２１、デナコールＥＸ−８３０、デナコールＥＸ−８３２、デナコールＥＸ−８４１、デナコールＥＸ−８６１、デナコールＥＸ−９１１、デナコールＥＸ−９４１、デナコールＥＸ−９２０、デナコールＥＸ−１４５、デナコールＥＸ−１７１（いずれも商品名、ナガセケムテックス株式会社製）、ＳＲ−ＰＧ、ＳＲ−２ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧＳ、ＳＲ−ＧＬＧ、ＳＲ−ＤＧＥ、ＳＲ−４ＧＬ、ＳＲ−４ＧＬＳ、ＳＲ−ＳＥＰ（いずれも商品名、阪本薬品工業株式会社製）、エポライト２００Ｅ、エポライト４００Ｅ、エポライト４００Ｐ（いずれも共栄社化学株式会社製）、などとして市販されている。
【００４４】
架橋剤の種類は、上記化合物、市販品に限定されず、アルデヒド基、マレイミド基、カルボジイミド基、オキサゾリン基、エポキシ基の少なくとも１つの官能基を含む化合物であってもよい。また架橋剤の形態も限定されず、モノマー、ポリマーの何れの形態であっても良い。
【００４５】
（導電性粒子）  
検知層６は、さらに導電性粒子を含むことができる。導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、フラーレンから選択される微粒子（炭素微粒子）の１種以上を含有することができる。
【００４６】
なお、検知層６の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等
が挙げられる。
【００４７】
（バイオセンサの製造方法）  
上記したバイオセンサ１は、例えば、以下のようにして作製（製造）される。すなわち、絶縁性基板２の片面２ａに、電極３,４として機能する金属層を形成する。例えば、所
定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板２の片面２ａに、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜する。これによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層（電極３,４）
が形成される。金属層の代わりに、炭素材料を例えばスクリーン印刷することで、電極３,４を形成することもできる。
【００４８】
次に、電極３,４が形成された片面２ａに対し、レジストインクのスクリーン印刷によ
り、所定の露出パターンを有する（開口部５ａを有する）絶縁層５が形成される。
【００４９】
次に、作用極３ｂ上に検知層６が形成される。例えば、酵素、導電性高分子、架橋剤を少なくとも含有する溶液（試薬）が調製される。試薬に糖を加える場合には、糖の濃度は０．１〜２重量％が好ましく、０．２〜２重量％がより好ましい。溶液（試薬）は、作用極３ｂの表面に滴下される。溶液（試薬）が作用極３ｂ上で乾燥により固化することで、作用極３ｂ上に検知層６が形成される。このようにして、作用極３ｂ上が開放系とされたバイオセンサ１を得ることができる。
【００５０】
実施形態に係るバイオセンサ１を用いることにより、試料（検体）中に含まれる測定対象物質の濃度を電荷移動律速電流に基づいて測定することができる。ここで、測定対象物質としては、バイオセンサ１を用いた測定方法によって測定可能な物質であれば特に制限されないが、生体由来の物質であって疾患や健康状態の指標となりうる物質であることが好ましい。物質として、例えば、グルコースやコレステロールなどを例示することができる。試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されない。もっとも、生体試料が好ましい。生体試料は、例えば、血液、尿などである。
【００５１】
（測定装置）  
次に、実施形態に係るバイオセンサ１を用いて物質の濃度を測定する測定装置について説明する。ここでは、バイオセンサ１の一例であるグルコースセンサを使用したグルコース測定装置について例示する。但し、測定装置は、グルコース測定装置に限定されず、バイオセンサ１の測定対象物質によって測定装置の用途は変わる。
【００５２】
図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ１８，ポテンショスタット１９，電力供給装置１１が、筐体内に収容された基板２０上に設けられている。制御コンピュータ１８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（Central Processing Unit：中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access
Memory）,及びＲＯＭ（Read Only Memory））のような記録媒体と、通信ユニットとを含んでいる。
【００５３】
プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、制御コンピュータ１８は、出力部１０、制御部１２、演算部１３及び検出部１４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ１８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、プログラムやデータを記憶する補助記憶装置を含んでいても良い。
【００５４】
制御部１２は、電圧印加のタイミング，印加電圧値などを制御する。電力供給装置１１は、バッテリ１６を有しており、制御コンピュータ１８やポテンショスタット１９に動作
用の電力を供給する。なお、電力供給装置１１は、筐体の外部に置くこともできる。
【００５５】
ポテンショスタット１９は、作用極の電位を参照極に対して一定にする装置であり、制御部１２によって制御される。ポテンショスタット１９は、端子ＣＲ，Ｗを用いて、グルコースセンサ１７の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部１４に送る。
【００５６】
演算部１３は検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、記憶する。出力部１０は、表示ユニット１５との間でデータ通信を行い、演算部１３による測定対象物質の濃度の演算結果を表示ユニット１５に送信する。表示ユニット１５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたグルコース濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。
【００５７】
図３は、制御コンピュータ１８によるグルコース濃度測定処理の例を示すフローチャートである。制御コンピュータ１８のＣＰＵ（制御部１２）は、グルコース濃度測定の開始指示を受け付ける。すると、制御部１２は、ポテンショスタット１９を制御して、作用極への所定の電圧を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。
【００５８】
次に、ポテンショスタット１９は、電圧印加によって得られる応答電流、すなわち、試料内の測定対象物質（ここではグルコース）に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流、好ましくは、電気二重層の充電による過渡電流発生後、例えば、電圧印加から１〜２０秒後の定常電流を測定し、検出部１４へ送る（ステップＳ０２）。
【００５９】
演算部１３は、電流値に基づいて演算処理を行い、グルコース濃度を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ１８の演算部１３は、例えば、電極上に配置されたグルコースデヒドロゲナーゼに対応する、グルコース濃度の計算式またはグルコース濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてグルコース濃度を算出する。
【００６０】
出力部１０は、グルコース濃度の算出結果を、表示ユニット１５との間に形成された通信リンクを通じて表示ユニット１５へ送信する（ステップＳ０４）。その後、制御部１２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０５）、エラーがなければ測定を終了し、グルコース濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。また、算出結果を記憶媒体に保存し、後から算出結果を呼び出して、表示ユニット１５に表示し確認することも可能である。なお、図３の例では、算出結果の表示ユニット１５への送信（ステップＳ０４）後に、制御部１２による測定エラー検知（ステップＳ０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。
【００６１】
[実施例]
以下、酵素電極の実施例について説明する。
【００６２】
＜試験１＞
スペーサ厚の異なるキャピラリを有する複数のバイオセンサを作製し、グルコースの測定を行った。
（バイオセンサの作製）
絶縁性基板上の片面上に、カーボンインクを用いたスクリーン印刷により、作用極及び対極を形成し、銀／塩化銀（Ag/AgCl）のスクリーン印刷により参照極を形成することで
３電極からなる電極系を形成した。作用極上に下記の処方による試薬溶液を滴下し、乾燥により固化させて検知層を形成した。さらに、電極系が形成された絶縁性基板上にスペーサ及びカバーを用いたキャピラリを形成することで、スペーサの厚さがそれぞれ１５０μｍ,３００μｍ,４５０μｍであるバイオセンサを得た。
[試薬の処方]
・リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）： １０ｍＭ
・スクロース：０．５％
・酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ：γαβ）：４．５ｍｇ／ｍＬ
・導電性高分子：スルホン化ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ、三菱レイヨン株式会社製）：０．４％
・オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700（日本触媒）：６．０％
・Lion Paste W-311N (ライオン株式会社製): ２．４２％
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。
（試料）
検体（試料）として、試料中のグルコース濃度がそれぞれ０,１００mg/dL,２００mg/dL,４００mg/dL,８００mg/dLである２０ｍＭＨＥＰＥＳ溶液（pH7.0）を用意した。２３±
１℃の雰囲気下で、クロノアンペロメトリー法（＋６０mV vs. Ag/AgCl）により各バイオセンサを用いてグルコース濃度を測定した。
【００６３】
図４は、試験１の結果、クロノアンペロメトリー法を用いたグルコース濃度の測定結果に基づく検量線を示すグラフである。図４の結果によれば、スペーサの厚さに依存せず、同様の傾きを有する検量線が得られた。このことは、電極に付着させる試料の量が応答電流値に影響しないことを意味する。
【００６４】
＜試験２＞
次に、電子伝達メディエータを含む検知層を有するバイオセンサとして、キャピラリを有するバイオセンサとキャピラリを有しないバイオセンサを作製し、クロノアンペロメトリー法により測定した。
(試薬の処方)
・酵素（FAD-GDH）：１U
・メディエータ(Ru錯体、1-methoxy-PMS)：２００ｍＭ
・ACES緩衝液（ｐＨ７．５）： ０．１７ｍＭ
・スメクタイト（ルーセンタイトSWN）：０．２％
（試料）
検体（試料）として、試料中のグルコース濃度がそれぞれ１００mg/dL,３２１mg/dL,６２４mg/dLである全血を用意した。２４±１℃の雰囲気下で、クロノアンペロメトリー法
（＋２００mV vs. Ag/AgCl）により各バイオセンサを用いてグルコース応答電流を測定した。
【００６５】
図５は、試験２の結果、すなわち、クロノアンペロメトリー法によるグルコース濃度の測定結果に基づく検量線を示すグラフである。図５に示すように、キャピラリがない場合には、キャピラリがある場合と比較して応答電流値が高くなっており、キャピラリがないことによる応答電流値への影響が生じていることが分かる。
【００６６】
＜試験３＞
（実施例１）
次に、実施例１に係るバイオセンサを以下のように作成した。絶縁性基板２の片面２ａに、カーボンインクのスクリーン印刷によって形成される作用極３ｂと、銀／塩化銀インク（ercon社）のスクリーン印刷によって形成される対極４ｂとの２電極を形成した。電
極上にキャピラリは設けず、作用極３ｂ及び対極４ｂを開放系とした。 
【００６７】
作用極３ｂ上に以下の処方を有する試薬インクをスクリーン印刷で印刷し、乾燥により固化させることで、検知層６を形成した。
[処方]
・リン酸緩衝液（pH5.8）：１０ｍＭ
・スクロース：０．５％
・ＧＤＨ：７mg／mL
・導電性高分子：スルホン化ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ、三菱レイヨン株式会社製）：０．４０％
・オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700（日本触媒）：５．０％
・ケッチェンブラック：０．８％
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。
【００６８】
検体（試料）として、グルコース濃度が０（ブランク：Ｂ），３３６mg/dL（サンプル
：Ｓ）の全血を用いた。各試料を各バイオセンサの電極上に分注（点着）させ、２５℃の雰囲気下で、クロノアンペロメトリー法によるグルコース濃度の測定を行った。濃度測定は、複数の上記バイオセンサを用意し、試料の点着量を、１μL，２μL，４μLと変化さ
せて行った。
【００６９】
図６は、実施例１のバイオセンサを用いたグルコース濃度の測定結果に基づくＳ／Ｂ（サンプル／ブランク）比を示すグラフである。図６に示すように、Ｓ／Ｂ比は、１μＬ，２μＬ，４μＬのいずれにおいても、Ｓ／Ｂ比２０程度の水準を有し、検体量に対する依存性は伺えなかった。
【００７０】
＜試験４＞
（比較例１）
比較例１として、実施例１のバイオセンサにキャピラリを設けたものを用意した。キャピラリ高さが１０μｍ，３０μｍ，５０μｍ，１００μｍ，２００μｍである各バイオセンサを作成した。検知層６の処方は、実施例１と同じとした。検体（試料）として、０，３００mg/dLの水溶液を用い、電極を試料内に含浸することで、検体を電極に接触させた
。
【００７１】
比較例１に係るバイオセンサについて、２５℃の雰囲気下で、サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ法）及びクロノアンペロメトリー法（ＣＡ法）を用いて電極応答特性を調べた。図７は、比較例１のバイオセンサを用いたＣＶ法及びＣＡ法による測定結果に基づくＳ／Ｂ比を示すグラフである。図７に示すように、Ｓ／Ｂ比は、キャピラリの高さに依存していないことが確認された。
【００７２】
試験１から試験４によれば、応答電流値は、検体量及びキャピラリの高さに依存しないことが確認できた。よって、少なくとも作用極が開放系であるバイオセンサ１によれば、キャピラリにより検体量を調整乃至制御しなくても精度の高い濃度の測定を行うことができる。このように、キャピラリを要しないので、部品点数減少によりバイオセンサの製造コスト低減を図ることができる。また、検体量に依存しないので、バイオセンサ１のユーザによるバイオセンサ１の扱い方によって測定結果に差が生じるのを回避することができる。すなわち、ユーザのバイオセンサの扱いが容易となる。なお、実施形態に係るバイオセンサは、電極をキャピラリで覆う必要がない（開放系である）ことから、穿刺針にバイオセンサが設けられ、穿刺と同時に検体の電極への点着を可能とする構成を適用し得る。
【００７３】
〔第２実施形態〕
以下、第２実施形態を説明する。第２実施形態は、第１実施形態と同様の構成を有する
ので、主として相違点について説明し、共通点については説明を省略する。
【００７４】
第１実施形態で説明した電荷移動律速電流は、以下の式（１）で表される。式（１）から、電流は基質の濃度と酵素反応速度定数に比例することがわかる。式（１）は、定数項をＸとすると式（２）に展開できる。なお、式（１）、（２）には示していないが、定数項Ｘに補正係数などが含まれても良い。
【数１】
2017075940.tif 000003
【数２】
2017075940.tif 000004
【００７５】
式（１）は、酵素反応の初速度式と酵素から電極への電子移動速度の式を考慮し、これらが等価にある状態で式展開を行うことで導出されたものである。第１実施形態に係るバイオセンサは、例えば、上記式（１）、（２）を用いて測定対象物質（基質）の濃度を測定する。
【００７６】
式（１）は、酵素反応の初速度式におけるコットレル電流に含まれる拡散係数を含まない電荷移動律速による電流式である。式（１）からも分かるように、電流は酵素反応速度定数に比例する。第１実施形態に係る測定対象物質の測定方法では、電子受容物質などのメディエータによる酸化還元反応を介することなく、電極へ電子が移動する。このため、電荷移動律速電流は、物質の拡散の影響を受けず、時間の依存性もないことがわかる。
【００７７】
なお、電極系が、電荷移動律速であることは、サイクリックボルタンメトリーなどによってピークの有無や電圧の掃印方向による電流の増加傾向を調べることにより確認することができる。
【００７８】
第２実施形態に係るバイオセンサも、電荷移動律速電流を測定する“直接電子移動型の酵素電極”を含む。さらに、第２実施形態に係るバイオセンサでは、作用極との接触面積が所定面積で規定されている検知層が作用極上に形成される。すなわち、検知層の作用極との接触面積が所定面積で規定されている。単なる液体の検知層材料の滴下ではなく、複数の電極のうち作用極のみに検知層材料を塗布する（塗る）ことで、検知層と作用極との接触面積を規定することができる。これによって、式（１）中の「Ａ：電極面積」と、「ｎ：反応電子数」とを一定にすることができる。従って、バイオセンサの固体間での応答電流のばらつきを抑え、同時再現性の向上を図ることができる。
【００７９】
また、検知層と作用極との接触面積を規定するために、電極が形成された絶縁性基材上に絶縁層を形成することが例示できる。絶縁層は、その底面で作用極が露出するように形成され、検知層材料が充填される開口部を有する。開口部は、一繋がりの内壁面を有し、開口部に充填される検知層材料の拡散範囲が開口部内に規制される。充填された検知層材料が乾燥により固化することで、開口部に充填された（開口部を埋める）検知層が形成される。当該開口部の底面積は、検知層と作用極との接触面積に合致するサイズに規定され、少なくとも開口部の底を埋め尽くす量の検知層材料が開口部に充填される。これによって、作用極との接触面積が所定面積に規定された（所定面積で作用極と接する）検知層を作用極上に容易に形成することができる。絶縁層は、例えば、不導体インク（レジストインクともいう）のスクリーン印刷によって形成することができる。また、絶縁層は、作用極と検知層との接触面積を規定し得る開口部が形成できる限り、スクリーン印刷以外に、フォトレジストなどの種々のレジスト及び絶縁テープによる加工等を用いて形成し得る。
【００８０】
別の利用方法として、検知層と作用極との接触面積は、酵素の反応速度に応じて決定することができる。酵素の反応速度は、比活性が異なるロット間で異なる場合がある。このため、酵素の反応速度に応じた検知層と作用極との面積を予め実験等で求めておき、酵素のロット毎にその反応速度に応じた接触面積で検知層を形成する。これによって、ロット間における同時再現性のばらつきを抑えることができる。
【００８１】
図８は、第２実施形態におけるバイオセンサ１Ａの構成例を示す図である。バイオセンサ１Ａは、以下の点で、第１実施形態におけるバイオセンサ１（図１）と異なる構成を有する。
【００８２】
絶縁層５は、開口部５ａ（図１）の代わりに、開口部５ｂ及び開口部５ｃを有している。開口部５ｂは、対極４ｂ及びその周囲の絶縁性基板２の上面が露出するように形成されている。
【００８３】
一方、開口部５ｃは、作用極３ｂ上に形成され、作用極３ｂは、開口部５ｃで露出する部分を除き、絶縁層５によって被覆されている。開口部５ｃは、所定の底面積を有し、一繋がりの内壁面を有する。図８に示す例では、開口部５ｃは、平面形状が円形で、円柱の側面形状を有する一繋がりの内壁面を有している。
【００８４】
開口部５ｃの大きさ（底面積）は、作用極３ｂに形成され、作用極３ｂと接触する検知層６の接触面積に合わせて形成されている。検知層６は、検知層材料が開口部５ｃ内を満たすように充填されることで形成される。図８の例では、検知層６は、開口部５ｃを埋める円柱状である。
【００８５】
このように、底面積が規定された開口部５ｃを用いて検知層６を形成することで、作用極３ｂと検知層６との接触面積が規定される。検知層６の構成要素は、第１実施形態で説明した通りである。
【００８６】
なお、図８の例では、開口部５ｃの平面形状は円形であり、内壁面が円柱の側面である。但し、開口部５ｃがテーパ状に形成され、内壁面が円錐台の側面形状に形成されていても良い。充填される検知層材料の拡散範囲を規制する一繋がりの内壁面を形成できる限り、開口部５ｃの平面形状や内壁面の形状は、適宜設定可能である。例えば、開口部５ｃの平面形状は、楕円形，三角形，四角形，５以上の辺からなる多角形であっても良い。また、開口部５ｃの内壁面の形状は、平面形状に対応する柱の側面形状であっても、平面形状に対応しない柱の側面形状であっても良い。すなわち、開口部５ｃの形状は検知層６と作用極３ｂとの接触面積を所定面積に規定することができる限り適宜設定可能である。
【００８７】
このように、第２実施形態におけるバイオセンサによれば、作用極上が開放系（キャピラリを有しない）ことで、試料の点着が容易となっている。さらに、検知層６が所定面積で作用極３ｂと接する、すなわち、検知層６と作用極３ｂとの接触面積が規定されている。これによって、ＣＶ値（同時再現性）の向上を図ることができる。すなわち、バイオセンサ間の誤差を少なくし、正確度を安定させることができる。
【符号の説明】
【００８８】
１・・・バイオセンサ
２・・・絶縁性基板
３，４・・・電極
３ｂ・・・作用極
４ｂ・・・対極
５・・・絶縁層
６・・・検知層（試薬層）
Ｂ・・・測定装置
１０・・・出力部
１１・・・電力供給装置
１２・・・制御部
１３・・・演算部
１４・・・検出部
１５・・・表示ユニット
１６・・・バッテリ
１８・・・制御コンピュータ
１９・・・ポテンショスタット 
【図１】
2017075940.tif 000005
【図２】
2017075940.tif 000006
【図３】
2017075940.tif 000007
【図４】
2017075940.tif 000008
【図５】
2017075940.tif 000009
【図６】
2017075940.tif 000010
【図７】
2017075940.tif 000011
【図８】
2017075940.tif 000012