(57)【要約】【課題】筋萎縮阻害効果が高い新規な筋萎縮阻害剤、食品又は医薬品を提供する。【解決手段】アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースからなる群より選択される少なくとも１種のアガロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする筋萎縮阻害剤である。この場合において、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより筋萎縮を阻害する作用を有することが好ましく、さらに、筋萎縮原因遺伝子がＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎから選択される１以上の遺伝子であることが好ましい。また、上記のアガロオリゴ糖は、アガロビオース及びアガロテトラオースからなる群より選択される少なくとも１種であることが特に好ましい。さらに、本発明は、上記の筋萎縮阻害剤を含有することを特徴とする食品又は医薬品である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースからなる群より選択される少なくとも１種のアガロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする筋萎縮阻害剤。
【請求項２】
筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより筋萎縮を阻害する作用を有することを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮阻害剤。
【請求項３】
前記筋萎縮原因遺伝子がＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎから選択される１以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の筋萎縮阻害剤。
【請求項４】
前記アガロオリゴ糖は、アガロビオース及びアガロテトラオースからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の筋萎縮阻害剤を含有することを特徴とする食品。
【請求項６】
前記筋萎縮阻害剤を１ｍｇ以上含有することを特徴とする請求項５に記載の食品。
【請求項７】
請求項１〜４に記載の筋萎縮阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項８】
前記筋萎縮阻害剤を１ｍｇ以上含有することを特徴とする請求項７に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮阻害剤及びこれを含む食品並びに医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は人体で最も大きな体積を占める組織であり、糖・脂質・アミノ酸の体内への取込みやエネルギー代謝、運動など、身体の活動において重要な役割を果たす。骨格筋の量と質は、その機能の発現に重要であり、骨格筋に含まれるタンパク質の量と質は、合成と分解により厳密に制御され、恒常性が維持されている。また、身体活動の程度やホルモン、成長因子、ストレスや栄養状態によっても筋量が調節されている。
【０００３】
運動時においては、骨格筋量及び骨格筋力の低下により、運動時のパフォーマンス（すなわち、運動量）が低下し、また、運動後における疲労抵抗性が低下する。また、サルコペニアに代表される進行性かつ全身性の骨格筋量及び骨格筋力の低下を特徴とする症候群は、特に高齢者で多く発症し、推定患者は４５０万人とも言われている。このような症候群に罹患した患者は、骨格筋量と骨格筋力の低下により、転倒、口腔機能の低下、認知機能の低下、尿失禁、筋肉の衰弱による寝たきり、歩行障害や関節障害など、身体的な活動が制限されることによりＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ：生活の質）が低下する。運動時のパフォーマンス向上及び高齢者のＱＯＬ向上において、筋萎縮を防ぐことは意義深いと考えられる。これらの問題を解決するためには、手軽に摂取することにより筋萎縮を阻害することができる素材の開発が必要であった。
【０００４】
近年の研究で、筋萎縮にはグルココルチコイドが関与していることがわかってきた。グルココルチコイドは、視床下部−下垂体系の制御を受けて副腎皮質から分泌される核内受容体型リガンド依存性転写因子であり、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）との結合を介して標的遺伝子発現を調節する。グルココルチコイドは、骨格筋において蛋白質の同化抑制と異化亢進をもたらし、筋萎縮を引き起こすことが知られている。
【０００５】
骨格筋におけるＧＲ標的遺伝子群の一つであるＡｔｒｏｇｉｎ−１は、骨格筋や心筋で発現し、また本遺伝子をノックアウトしたマウスが筋萎縮に抵抗性を示したことにより、筋萎縮原因遺伝子（Ａｔｒｏｇｅｎｅｓ）として注目されている（非特許文献１参照）。Ａｔｒｏｇｉｎ−１は、筋肉へのグルココルチコイド処理、筋肉の不使用や酸化ストレスなど、少なくとも１３種類の筋萎縮で発現が上昇し、筋萎縮現象のマーカーであるとされている（非特許文献２参照）。
【０００６】
同様に、骨格筋におけるＧＲ標的遺伝子群の一つであるＭｙｏｓｔａｔｉｎは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する２６ｋＤａの糖タンパク質であり、筋肉増殖の負の制御因子としての機能を担っている（非特許文献３参照）。Ｍｙｏｓｔａｔｉｎは、主に骨格筋で合成され、骨格筋の増殖を抑制する。Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ発現レベルの低下は、筋肉量の増加と体脂肪減少をもたらし、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ発現レベル上昇は、筋肉量の減少及び消耗をもたらすことが報告されている。
【０００７】
筋萎縮に影響を及ぼす要因には、グルココルチコイドの他に、炎症性サイトカインの濃度増加がある。たとえば、インターロイキン（ＩＬ）‐１βは炎症性サイトカインの一種であり、異化の働きを持つことにより筋萎縮との関連が考えられている（非特許文献４参照）。ＩＬ‐１βはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋萎縮を引き起こすため、ＩＬ‐１β処理された筋管細胞は筋萎縮のメカニズムを検討するために用いられる評価系である。炎症性サイトカインとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αなども知られている。
【０００８】
ＩＬ−１βやＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの血中濃度は、加齢に伴い増加する場合や、急激な運動に伴い増加する場合等がある。これら炎症性サイトカインは、筋萎縮原因遺伝子の発現を直接的に増加させ、筋萎縮（筋異化）作用を引き起こすと考えられている。実験的にも、筋肉の細胞に炎症性サイトカインを作用させると、筋萎縮原因遺伝子の発現が増加することが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００９】
一方、これまでに筋萎縮阻害作用をもつ成分に関しては、一部のポリフェノールが効果的であるという報告がある以外はほとんど明らかにはなっていない。骨格筋の筋萎縮に関するポリフェノールの作用については、酸化ストレスの関与が示唆されている廃用性筋萎縮の抑制を目的として、果実ポリフェノール（具体的にはりんごポリフェノール）を有効成分として含有することを特徴とする廃用性筋萎縮抑制組成物が報告されている（特許文献１参照）。りんごポリフェノールの主成分はプロシアニジンやプロアントシアニジンである。また、プロアントシアニジンを有効成分として含有する筋肉萎縮抑制剤（特許文献２参照）、果実由来ポリフェノールを有効成分とする廃用性筋萎縮時の筋繊維タイプの移行を抑制する筋繊維タイプ移行抑制剤（特許文献３参照）、カテキン類を有効成分とする筋機能低下抑制剤（特許文献４参照）も知られている。
【００１０】
しかしながら、これらの文献には、ポリフェノール等による筋萎縮抑制効果については記載されているが、ポリフェノール等が筋萎縮原因遺伝子に作用するとの記載はなく、したがって、ヒトに対する作用は限定的であった。また、ポリフェノールは、植物中の含有量が少ないため大量に抽出物を得ることが困難な場合があった。さらに、ポリフェノールには水に溶解しないものも多いため、抽出には有機溶媒を使用せざるを得ず、水を主体とする食品や医薬品には使用しづらいという問題があった。さらに、ポリフェノールの筋萎縮阻害効果は低く、まだ改善の余地があった。
【００１１】
ところで、本発明者らは、これまで寒天について研究を行ってきた。寒天は、テングサ、オゴノリなどの紅藻海藻から抽出される粘質物を脱水乾燥したものである。寒天は多糖類の一種であり、アガロースとアガロペクチンから構成される。アガロースの繰り返し単位であるアガロビオースは、１，３位で結合したβ‐Ｄ‐ガラクトピラノースと１，４位で結合した３，６アンヒドロ‐α‐Ｌ‐ガラクトピラノースが交互に結合した構造となっている。アガロペクチンは、寒天中のアガロース以外のイオン性の多糖類の総称であり、その構造はアガロースと同じ結合様式をしているが、部分的に硫酸エステル、メトキシル基、ピルビン酸基、カルボキシル基を多く含んでいる。寒天の重量平均分子量（Ｍｗ）は、一般的なもので２０万〜４０万である。この寒天を酸や酵素で分解することによりアガロオリゴ糖（アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、等）を製造することができる。ここで、アガロオリゴ糖とは、２糖であるアガロビオース（２糖）の繰り返しからなり、アガロテトラオース（４糖）、アガロヘキサオース（６糖）、アガロオクタオース（８糖）、アガロデカオース（１０糖）等の総称である。
【００１２】
従来、アガロオリゴ糖は、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、多発性硬化症、膠原病、自己免疫疾患、リウマチ等様々な疾患の予防薬であり、さらには活性酸素産生を抑制する抗酸化剤であることなどが知られている（特許文献５参照）。また、アガロオリゴ糖には、メタロプロテアーゼ産生抑制により皮膚や骨の老化を防止すること（特許文献６参照）、血糖低下作用があること（特許文献７参照）も知られている。しかしながら、これまでアガロオリゴ糖に筋萎縮阻害効果があることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−８９３８７号公報（請求項１など）
【特許文献２】特開２００２−３３８４６４号公報（請求項１など）
【特許文献３】特開２００６−３２８０３１号公報（請求項１など）
【特許文献４】特開２００８−１３４７３号公報（請求項１など）
【特許文献５】特許第４００７７６０号公報（請求項１、実施例６など）
【特許文献６】特開２０１１−２１３７０７号公報（請求項１など）
【特許文献７】特開２００４−１４９４７１号公報（請求項１など）
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２００１年、ｖｏｌ．２９４、ｐ．１７０４
【非特許文献２】“Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．”、２００３年、ｖｏｌ．３５、ｐ．６９８−７０５
【非特許文献３】“Ｊ．Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ  ２”、２０１１年、ｐ．１４３−１５１
【非特許文献４】“Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．”、２００９年、ｖｏｌ．２９３（３）、Ｃ７０６‐Ｃ７１４
【非特許文献５】“Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ”、２００５年、ｖｏｌ．１９（３）、ｐ．３６２‐３７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、筋萎縮阻害効果が高い新規な筋萎縮阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、このような筋萎縮阻害剤を含有する食品及び医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、炎症性サイトカインであるＩＬ‐１βによる骨格筋萎縮系において、筋萎縮原因遺伝子の発現に対するアガロオリゴ糖の作用を検討し、アガロオリゴ糖が筋萎縮を阻害する可能性を持つことを見出した。さらに本発明者らは、アガロオリゴ糖を経口投与することによるヒト試験を行い、筋萎縮阻害活性を確認し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち本発明は、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースからなる群より選択される少なくとも１種のアガロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする筋萎縮阻害剤である。
【００１８】
この場合において、筋萎縮阻害剤は、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより筋萎縮を阻害する作用を有すること、さらには前記筋萎縮原因遺伝子がＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎから選択される１以上の遺伝子であることが好ましい。あるいは、筋萎縮阻害剤は、前記アガロオリゴ糖は、アガロビオース及びアガロテトラオースからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、上記の筋萎縮阻害剤を含有することを特徴とする食品に関する。あるいは、本発明は、上記の筋萎縮阻害剤を含有することを特徴とする医薬品に関する。これらの場合において、前記筋萎縮阻害剤を１ｍｇ以上含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、筋萎縮阻害効果が高い新規な筋萎縮阻害剤を提供することができる。また、本発明によれば、筋萎縮阻害効果が高い食品及び医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例の筋萎縮阻害効果を示すグラフである。
【図２】実施例の筋萎縮阻害効果を示すグラフである。
【図３】実施例の筋萎縮阻害効果を示すグラフである。
【図４】実施例の筋萎縮阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．筋萎縮阻害剤
以下、本発明の筋萎縮阻害剤について説明する。本発明の筋萎縮阻害剤（以下、単に「筋萎縮阻害剤」ということがある）は、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースからなる群より選択される少なくとも１種のアガロオリゴ糖を有効成分とする。
【００２３】
筋萎縮阻害剤としては、これらのアガロオリゴ糖のうちいずれか１種類のみを含んでいてもよく、これらアガロオリゴ糖の２種類以上を含んでいてもよい。
【００２４】
特に、筋萎縮阻害剤に含まれるアガロオリゴ糖としては、アガロビオース及びアガロテトラオースからなる群より選択される少なくとも１種類であることが好ましい。この場合において、アガロビオースとアガロテトラオースは、単独であってもよく、これら２種類のアガロオリゴ糖のどちらも含む組成物であってもよい。この場合において、アガロビオースとアガロテトラオースの含有量は、１〜１００質量％の範囲内であることが好ましく、１０〜１００質量％の範囲内であることがより好ましく、５０〜１００質量％の範囲内であることが特に好ましい。
【００２５】
また、筋萎縮阻害剤は、アガロオリゴ糖の一種であるアガロデカオースを含んでいてもよい。アガロデカオースの含有量としては、１〜２０質量％の範囲内であることが好ましく、５〜１５質量％の範囲内であることが特に好ましい。なお、筋萎縮阻害剤に含まれるアガロオリゴ糖の構成は、後述する実施例における高速液体クロマトグラフィーと同様の方法で測定することができる。
【００２６】
筋萎縮阻害剤に含まれるアガロオリゴ糖は、寒天を加水分解することにより製造することができる。その具体的な方法としては、酸分解の方法を挙げることができる。酸分解の方法としては、特許第４７９６６９７号公報に記載された固体酸を使用したり、硫酸や塩酸などの鉱酸を使用したり、酢酸やクエン酸などの有機酸を使用したりする方法などを挙げることができるが、いずれの方法でもかまわない。なお、酸で加水分解され製造されるアガロオリゴ糖は、一般に「アガロオリゴ糖」と呼ばれる。
【００２７】
これに対し、β−アガラーゼで酵素分解し製造されるものは、寒天分子主鎖の切断場所の違いから「ネオアガロオリゴ糖」と呼ばれる。寒天をα−アガラーゼで酵素分解することで製造される糖化合物は、酸で加水分解を行った場合と同様にアガロオリゴ糖となる。アガロオリゴ糖でもネオアガロオリゴ糖でも、筋萎縮阻害効果を示す。よって、本発明における「アガロオリゴ糖」とは、酸分解による「アガロオリゴ糖」と酵素分解による「ネオアガロオリゴ糖」の両方が含まれる。
【００２８】
酸分解によってアガロオリゴ糖を製造する手順としては、まず寒天溶液を用意し、これに酸を添加して酸分解する。寒天溶液の溶媒としては、水を挙げることができる。寒天溶液に含まれる寒天の含有量としては、特に制限はないが、通常は０．１〜５０質量％の範囲内であり、１〜１０質量％の範囲内が好ましい。酸分解の温度としては、特に制限はないが、通常は１０〜１５０℃の範囲内であり、好ましくは５０〜１００℃の範囲内である。酸分解は、静置した状態で行ってもよく、撹拌下で行ってもよい。
【００２９】
次に、得られた酸分解物から不要成分を除去する。不要成分の除去は、ろ紙や活性炭などを使用することができる。また、必要に応じて、水酸化ナトリウムなどのアルカリでｐＨを調整してもよい。このようにして得られたアガロオリゴ糖溶液は、真空凍結乾燥などで粉末状にして保存することができる。
【００３０】
なお、アガロオリゴ糖は、寒天だけでなく、寒天の原料であるテングサ科、オゴノリ科、イギス科などの紅藻類を熱水抽出して得た溶液を使用して製造することもできる。テングサ科の紅藻類としては、マクサ、オニグサ、オオブサ、ヒラクサ、オバクサ、ユイキリ等を挙げることができる。また、オゴノリ科の紅藻類としては、オゴノリ、オオオゴノリ等を挙げることができる。さらに、イギス科の紅藻類としては、イギス、エゴノリ等を挙げることができる。アガロオリゴ糖の原料としては、これらの紅藻類の１種類又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。
【００３１】
筋萎縮阻害剤は、骨格筋などの組織における筋萎縮を阻害する効果がある。骨格筋は、グルココルチコイド長期投与・ガン・糖尿病・エイズなどの病気、加齢、栄養不足、あるいはギプス固定や寝たきりによって骨格筋を長い間使用しない場合などによって萎縮し、骨格筋機能が低下することが知られ、その結果、ＱＯＬの低下がもたらされる。
【００３２】
筋萎縮阻害剤は、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制する作用を有している。筋萎縮原因遺伝子としては、Ａｔｒｏｇｉｎ‐１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎを挙げることができる。これらの遺伝子は、ＧＲ標的遺伝子であり、筋萎縮の初期に誘導され、種々の筋萎縮に関与している。したがって、本発明の筋萎縮阻害剤は、Ａｔｒｏｇｉｎ‐１発現抑制剤又はＭｙｏｓｔａｔｉｎ発現抑制剤ということもできる。
【００３３】
筋萎縮阻害剤による筋萎縮阻害効果は、筋委縮原因遺伝子の発現量を測定することで評価することができる。筋委縮原因遺伝子の発現量は、ヒトだけでなくマウスを使って評価することができる。この評価法としては、例えば、これらの筋萎縮原因遺伝子に相補的なｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などで定量的に測定する方法などを挙げることができる。
【００３４】
筋萎縮阻害剤を摂取することにより、筋萎縮阻害効果が得られる。これにより、健康増進、運動機能向上、筋力向上、ＱＯＬ向上等、さらには疲労抵抗性向上効果により運動の持続が可能となり結果的に、健康増進、運動機能向上、筋力向上、ＱＯＬ向上を実現することができる。筋萎縮阻害剤の摂取方法としては、経口摂取、皮下注射等、各種の方法を挙げることができる。
【００３５】
したがって、筋萎縮阻害剤を使用する方法の発明として、ヒト又は哺乳動物（ヒト以外）の筋萎縮阻害方法であって、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースからなる群より選択される少なくとも１種のアガロオリゴ糖を有効成分して摂取することを特徴とする筋萎縮阻害方法ということができる。
【００３６】
２．食品・医薬品
筋萎縮阻害剤は、食品又は医薬品に含有して摂取することが好ましい。食品としては、一般的な食品のほか、栄養補助食品、機能性食品、飲料などを挙げることができる。一般的な食品としては、特に限定されないが、例えば、キャンディー、ゼリー、ケーキ、チョコレート等の菓子、ハンバーグ、蒲鉾、はんぺん、さつま揚げ等の肉製品、ドレッシング、マヨネーズなどの調味料、清涼飲料、コーヒー、スポーツドリンク、ビール等の飲料などが挙げられる。また、医薬品としては、特に限定されないが、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、ゼリー剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、乳剤、ローション剤などを挙げることができる。
【００３７】
食品又は医薬品に含まれる筋萎縮阻害剤の含有量としては、特に制限はないが、通常は１ｍｇ以上であり、１０〜１００００ｍｇの範囲内が好ましく、１００〜１０００ｍｇの範囲内が特に好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。
【００３９】
（１）アガロオリゴ糖の調整
アガロオリゴ糖１〜３の３種類を用意した。各アガロオリゴ糖の調整方法と構成糖の構成比は以下のとおりである。
（ａ）アガロオリゴ糖１
（調整方法）
市販のアガロオリゴ糖（アガオリゴ：タカラバイオ社製）を購入した。
（構成糖）
アガロオリゴ糖１に含まれるオリゴ糖の構成比を、高速液体クロマトグラフィーで測定した。測定条件はカラムＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ‐ＧＥＬ  ＡＬＰＨＡ‐２５００を直列２本連結、溶媒Ｈ２Ｏ、流速０．３ｍｌ／分、温度６０℃の条件で溶出、検出はＲＩ（示差屈折）とした。結果は以下のとおりであった（数値は質量％、以下同じ）。
２糖（アガロビオース）：２６．２
４糖（アガロテトラオース）：２７．７
６糖（アガロヘキサオース）：２３．１
８糖（アガロオクタオース）：１８．９
１０糖（アガロデカオース）：４．１
【００４０】
（ｂ）アガロオリゴ糖２
（調整方法）
寒天（ウルトラ寒天ＡＸ‐３０：伊那食品工業社製）５０ｇを精製水１０００ｇに加熱溶解した後、濃硫酸２ｇを添加し９０℃で３時間撹拌した。水酸化ナトリウムでｐＨを３．５に調整後、活性炭処理し、ろ紙でろ過、さらに０．１μｍのフィルターでろ過して溶液を得た。この溶液を真空凍結乾燥により粉末化した。
（構成糖）
アガロオリゴ糖２に含まれるオリゴ糖の構成比をアガロオリゴ糖１と同様の方法で測定したところ、結果は以下のとおりであった。
２糖（アガロビオース）：３１．５
４糖（アガロテトラオース）：３０．１
６糖（アガロヘキサオース）：２１．２
８糖（アガロオクタオース）：１１．６
１０糖（アガロデカオース）：５．６
【００４１】
（ｃ）アガロオリゴ糖３
（調整方法）
特開平２‐６５７８９号公報の実施例１に記載された製造方法によりネオアガロオリゴ糖を製造した。
（構成糖）
アガロオリゴ糖３に含まれるオリゴ糖の構成比をアガロオリゴ糖１と同様の方法で測定したところ、結果は以下のとおりであった。
２糖（アガロビオース）：１．５
４糖（アガロテトラオース）：３７．５
６糖（アガロヘキサオース）：４１．３
８糖（アガロオクタオース）：６．３
１０糖（アガロデカオース）：１３．４
【００４２】
（２）アガロオリゴ糖によるＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制効果
マウス骨格筋由来Ｃ２Ｃ１２細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞の密度を調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地には、１０％牛血清を含むＤＭＥＭを使用した。１０５／ｃｍ２に達した時点で、２％牛血清を含むＤＭＥＭに培地を交換し、アガロオリゴ糖１を終濃度１μｇ／ｍｌ（実施例１）、１０μｇ／ｍｌ（実施例２）、５０μｇ／ｍｌ（実施例３）、１００μｇ／ｍｌ（実施例４）になるように培地に添加した系を調製した。比較として、アガロオリゴ糖無添加の系も調製した（比較例１）。添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養５日後に筋管細胞に分化したことを確認した。
【００４３】
その後ＩＬ‐１βを添加して筋萎縮を誘導し、２４時間後にセルスクレーパーで筋管細胞を回収した。回収した細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（チオシアニン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム）、クロロホルム、イソプロパノールを用いて全ＲＮＡを単離した。次いで逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、それを鋳型にＡｔｒｏｇｉｎ‐１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎのそれぞれのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。結果を図１（ａ）及び図１（ｂ）に示す。なお、図の縦軸は各遺伝子のｃＤＮＡの発現量を示している。また、図の横軸の「ＩＬ−１β」は「＋」が添加、「−」が無添加を示し、「ＡＯＳ」はアガロオリゴ糖１の添加量を示している。
【００４４】
この図に示すように、Ａｔｒｏｇｉｎ−１では、アガロオリゴ糖が無添加の場合（図中で「ＡＯＳ」が「０」）と比べて、アガロオリゴ糖１を５０μｇ/ｍｌ以上添加した場合（図中で「ＡＯＳ」が「５０」と「１００」）では、遺伝子の発現量が低下することがわかった。また、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎでは、アガロオリゴ糖が無添加の場合（図中で「ＡＯＳ」が「０」）と比べて、アガロオリゴ糖１を１μｇ/ｍｌ以上添加した場合（図中で「ＡＯＳ」が「１」、「１０」、「５０」、「１００」）では、遺伝子の発現量が低下することがわかった。したがって、骨格筋由来細胞にアガロオリゴ糖を添加することにより筋萎縮を促進する遺伝子の活性が抑制されることがわかった。
【００４５】
特に、アガロオリゴ糖の濃度が５０μｇ／ｍｌ以上の場合は、いずれの遺伝子についても発現量が低下していることから、５０μｇ／ｍｌ未満の場合と比較して、より好ましい添加量であることがわかった。また、Ａｔｒｏｇｉｎ−１とＭｙｏｓｔａｔｉｎとの比較では、アガロオリゴ糖は特にＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制において効果が高いことがわかった。
【００４６】
（３）アガロオリゴ糖１〜３とポリフェノールとの比較
上記「（２）アガロオリゴ糖によるＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制効果」と同様に、マウス骨格筋由来Ｃ２Ｃ１２細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞の密度を調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地には、１０％牛血清を含むＤＭＥＭを使用した。細胞密度が１０５／ｃｍ２に達した時点で、２％牛血清を含むＤＭＥＭに培地を交換し、アガロオリゴ糖１〜３（それぞれ実施例５〜８）を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように培地に添加した系を調製した。比較として、無添加（比較例１）、プロアントシアニジン（比較例２）及びエピガロカテキン（比較例３）を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように培地に添加した系も調製した。添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養５日後に筋管細胞に分化したことを確認した。
【００４７】
その後ＩＬ‐１βを添加して筋萎縮を誘導し、２４時間後にセルスクレーパーで筋管細胞を回収した。回収した細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（チオシアニン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム）、クロロホルム、イソプロパノールを用いて全ＲＮＡを単離した。次いで逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、それを鋳型にＡｔｒｏｇｉｎ‐１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎのそれぞれのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。結果を図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す。なお、図の縦軸は各遺伝子のｃＤＮＡの発現量を示している。また、図の横軸の「ＩＬ−１β」は「＋」が添加、「−」が無添加を示し、「添加物質」は「無」が無添加を示し、それ以外はそれぞれに記載された物質を添加したことを示している。
【００４８】
この図に示すように、Ａｔｒｏｇｉｎ−１とＭｙｏｓｔａｔｉｎの両方において、アガロオリゴ糖１〜３を添加することにより筋萎縮を促進する遺伝子の活性が抑制されること、さらにはプロアントシアニジン・エピガロカテキンよりもその効果が高いことがわかった。また、Ａｔｒｏｇｉｎ−１とＭｙｏｓｔａｔｉｎとの比較では、アガロオリゴ糖は特にＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制において効果が高いことがわかった。さらに、アガロオリゴ糖１〜３を比較すると、いずれの遺伝子においても発現量が低いアガロオリゴ糖２が特に好ましいことがわかった。
【００４９】
（４）アガロオリゴ糖中のアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースの単離及び各成分の効果の検証
アガロオリゴ糖１の０．０２４ｇをカラムＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ‐ＧＥＬ  ＡＬＰＨＡ‐２５００（直列２本連結）に導入し、溶媒Ｈ２Ｏ、流速０．３ｍｌ／分、温度６０℃の条件で溶出させ、溶出液を０．５ｍｌずつフラクションコレクターにて回収した。回収したフラクションの内、フラクション１１にアガロビオースが、同じく１２と１３にアガロテトラオースが、同じく１４と１５にアガロヘキサオースが、同じく１８と１９にアガロオクタオースが含有されていた。それぞれのフラクションを乾燥し、アガロビオース０．００４９ｇ、アガロテトラオース０，００４８ｇ、アガロヘキサオース０，００１７ｇ及びアガロオクタオース０，０００３ｇを得た。
【００５０】
上記「（２）アガロオリゴ糖によるＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制効果」と同様に、マウス骨格筋由来Ｃ２Ｃ１２細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞の密度を調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地には、１０％牛血清を含むＤＭＥＭを使用した。細胞密度が１０５／ｃｍ２に達した時点で、２％牛血清を含むＤＭＥＭに培地を交換し、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースをそれぞれ終濃度１０及び５０μＭになるように培地に添加した系を調製した（実施例９〜１７）。比較として、無添加の系も調製した（比較例１）。添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養５日後に筋管細胞に分化したことを確認した。
【００５１】
その後ＩＬ‐１βを添加して筋萎縮を誘導し、２４時間後にセルスクレーパーで筋管細胞を回収した。回収した細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（チオシアニン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム）、クロロホルム、イソプロパノールを用いて全ＲＮＡを単離した。次いで逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、それを鋳型にＡｔｒｏｇｉｎ‐１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎのそれぞれのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。結果を図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す。なお、図の縦軸は各遺伝子のｃＤＮＡの発現量を示している。また、図の横軸の「ＩＬ−１β」は「＋」が添加、「−」が無添加を示し、「添加物質」は「無」が無添加を示し、それ以外はそれぞれに記載された物質を添加したことを示している。
【００５２】
この図に示すように、Ａｔｒｏｇｉｎ−１とＭｙｏｓｔａｔｉｎの両方において、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースを添加することにより筋萎縮を促進する遺伝子の活性が抑制されること、さらにはアガロヘキサオース及びアガロオクタオースよりもその効果が高いことがわかった。
【００５３】
（６）アガロオリゴ糖の構成比率を変更したときの効果の検証
アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース及びアガロオクタオースの配合割合を変えたアガロオリゴ糖４〜１０を表１のように作製した（実施例１８〜２４）。
【００５４】
【表１】
2017095409.tif 000003
【００５５】
上記「（２）アガロオリゴ糖によるＡｔｒｏｇｉｎ−１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現抑制効果」と同様に、マウス骨格筋由来Ｃ２Ｃ１２細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞の密度を調整し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地には、１０％牛血清を含むＤＭＥＭを使用した。細胞密度が１０５／ｃｍ２に達した時点で、２％牛血清を含むＤＭＥＭに培地を交換し、アガロオリゴ糖４〜１０をそれぞれ終濃度５０μＭになるように培地に添加した系を調製した。比較として、無添加の系も調製した（比較例１）。添加後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養５日後に筋管細胞に分化したことを確認した。
【００５６】
その後ＩＬ‐１βを添加して筋萎縮を誘導し、２４時間後にセルスクレーパーで筋管細胞を回収した。回収した細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（チオシアニン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム）、クロロホルム、イソプロパノールを用いて全ＲＮＡを単離した。次いで逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、それを鋳型にＡｔｒｏｇｉｎ‐１及びＭｙｏｓｔａｔｉｎのそれぞれのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。結果を図４（ａ）及び図４（ｂ）に示す。なお、図の縦軸は各遺伝子のｃＤＮＡの発現量を示している。また、図の横軸の「ＩＬ−１β」は「＋」が添加、「−」が無添加を示し、「添加物質」は「無」が無添加を示し、それ以外はそれぞれに記載された物質を添加したことを示している。
【００５７】
この図に示すように、Ａｔｒｏｇｉｎ−１とＭｙｏｓｔａｔｉｎの両方において、アガロオリゴ糖４〜１０を添加することにより、筋委縮を促進する遺伝子の活性が抑制されることがわかった。特に、アガロビオース又はアガロテトラオースの配合割合が高いアガロオリゴ糖を添加することにより、筋萎縮を促進する遺伝子の活性抑制効果が高いことがわかった。
【００５８】
（６）食品及び医薬品の作製
（ａ）実施例２５（飲料）
以下の配合で筋萎縮の阻害を目的とした飲料を作製した。
アガロオリゴ糖１                    ２．５ｇ
ショ糖                            ５０．０ｇ
クエン酸                            ５．０ｇ
オレンジ果汁（５倍濃縮）        ２００．０ｇ
オレンジ香料                            適量
（ｂ）実施例２６（医薬品）
以下の配合で筋萎縮の阻害を目的とした錠剤（１錠０．３ｇ）を作製した。
アガロオリゴ糖１                  ５０．０％
乳糖                              ３０．０％
結晶セルロース                    １９．５％
ステアリン酸マグネシウム            ０．５％
（ｃ）実施例２７（医薬品）
以下の配合で筋萎縮の阻害を目的とした散剤を作製した。
アガロオリゴ糖１                  ５０．０％
乳糖                              ４０．０％
コーンスターチ                      ９．７％
ステアリン酸マグネシウム            ０．３％
【００５９】
（７）筋肉疲労軽減試験
健常成人９名で筋肉疲労軽減試験を行った。具体的には、毎日ランニングを行なっている９人を選択し、実施例２５〜２７の飲料と医薬品を下記に示す被験者グループごとに１被験者あたりアガロオリゴ糖の摂取量が５００ｍｇとなるように飲料と医薬品を摂取してもらい、トレッドミル（中旺ヘルス社製）で１０ｋｍのランニングを行なってもらった。ランニング終了直後、１日後と２日後の筋肉疲労についての意識調査を行なった。なお、被験者９人には本試験の１０日前に本発明品を摂取しない状態で１０ｋｍランニングを行なってもらい、そのときとの比較で回答してもらった。
【００６０】
（摂取品目）
被験者１〜３：実施例２５
被験者４〜６：実施例２６
被験者７〜９：実施例２７
（結果）
摂取しない時に比べ筋肉疲労感が少ない    ７人／９人
摂取しない時と変わらない                ２人／９人
摂取しない時に比べ筋肉疲労感が多い      ０人／９人
【００６１】
以上のように、ほとんどの被験者が、筋肉疲労感が少ないとの感想であった。このように、アガロオリゴ糖を配合した食品と医薬品には筋萎縮阻害効果が認められることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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