(57)【要約】【課題】水産生物用の餌料生物および水産生物の養殖方法を提供する。【解決手段】ステロール含有藻体で栄養強化されたワムシおよびアルテミア等の餌料生物を魚類等の水産生物に給餌して、水産生物を養殖する。【選択図】図３
2017153437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロール含有藻体を含有する、ワムシまたはアルテミア用の栄養強化剤。
【請求項２】
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、請求項１に記載の栄養強化剤。
【請求項３】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項１または２に記載の栄養強化剤。
【請求項４】
餌料生物の製造方法であって、
ワムシまたはアルテミアにステロール含有藻体を取り込ませることを含む、方法。
【請求項５】
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
餌料生物であって、
ステロール含有藻体を含有するワムシまたはアルテミアである、餌料生物。
【請求項８】
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、請求項７に記載の餌料生物。
【請求項９】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項７または８に記載の餌料生物。
【請求項１０】
コレステロールを、前記餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．０２％（ｗ／ｗ）以上の濃度で含有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の餌料生物。
【請求項１１】
さらに、ドコサヘキサエン酸および／またはエイコサペンタエン酸を含有する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の餌料生物。
【請求項１２】
水産生物用の餌料生物である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の餌料生物。
【請求項１３】
前記水産生物が、魚類または甲殻類である、請求項１２に記載の餌料生物。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載の餌料生物を水産生物に給餌することを含む、水産生物を養殖する方法。
【請求項１５】
ワムシである前記餌料生物とアルテミアである前記餌料生物の両方が給餌される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ワムシである前記餌料生物が先に給餌され、アルテミアである前記餌料生物が後に給餌される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記水産生物が、魚類または甲殻類である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記餌料生物が、仔稚魚期の一部または全部の期間において魚類に給餌される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水産生物用の餌料生物および水産生物の養殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類や甲殻類等の水産生物の種苗生産には、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンが生物餌料として用いられている。ワムシとしては、例えば、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属藻類等の藻類やサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母を給餌して培養されたものが生物餌料として利用されている。また、アルテミアとしては、例えば、休眠卵を孵化させて得られる幼生が生物餌料として利用されている。しかしながら、このようにして得られるワムシやアルテミアは、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等の高度不飽和脂肪酸の含有量が低い点で、水産生物用の生物餌料として用いるには栄養面での不足がある。そのため、ワムシやアルテミアは、一般的に、栄養強化してから、具体的には、例えば、ＤＨＡやＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の含有量を高めてから、水産生物に給餌されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、水産生物用の餌料生物および水産生物の養殖方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は鋭意検討した結果、カクレクマノミ等の水産生物を飼育する際に、ステロール含有藻体で栄養強化されたワムシおよびアルテミアを給餌することにより飼育成績が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の通り例示できる。
［１］
ステロール含有藻体を含有する、ワムシまたはアルテミア用の栄養強化剤。
［２］
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、前記栄養強化剤。
［３］
前記ステロールが、コレステロールである、前記栄養強化剤。
［４］
餌料生物の製造方法であって、
ワムシまたはアルテミアにステロール含有藻体を取り込ませることを含む、方法。
［５］
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、前記方法。
［６］
前記ステロールが、コレステロールである、前記方法。
［７］
餌料生物であって、
ステロール含有藻体を含有するワムシまたはアルテミアである、餌料生物。
［８］
前記藻体が、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM
P-22290）、およびそれらの誘導株、ならびに配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有するオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類から選択される藻類の細胞である、前記餌料生物。
［９］
前記ステロールが、コレステロールである、前記餌料生物。
［１０］
コレステロールを、前記餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．０２％（ｗ／ｗ）以上の濃度で含有する、前記餌料生物。
［１１］
さらに、ドコサヘキサエン酸および／またはエイコサペンタエン酸を含有する、前記餌料生物。
［１２］
水産生物用の餌料生物である、前記餌料生物。
［１３］
前記水産生物が、魚類または甲殻類である、前記餌料生物。
［１４］
前記餌料生物を水産生物に給餌することを含む、水産生物を養殖する方法。
［１５］
ワムシである前記餌料生物とアルテミアである前記餌料生物の両方が給餌される、前記方法。
［１６］
ワムシである前記餌料生物が先に給餌され、アルテミアである前記餌料生物が後に給餌される、前記方法。
［１７］
前記水産生物が、魚類または甲殻類である、前記方法。
［１８］
前記餌料生物が、仔稚魚期の一部または全部の期間において魚類に給餌される、前記方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、魚類等の水産生物の養殖における飼育成績を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】18S rDNAの塩基配列に基づく、AJ7866株（FERM P-22289）の系統樹を示す図。
【図２】ワムシの栄養強化試験の結果を示す図。
【図３】クマノミの飼育試験の結果を示す図。
【図４】ワムシの栄養強化試験の結果を示す図。
【図５】ヒラメの飼育試験の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
＜１＞ステロール含有藻体
本発明においては、ステロール含有藻体を餌料生物の栄養強化に利用する。ステロール含有藻体で栄養強化された餌料生物を利用することにより、具体的には、ステロール含有藻体で栄養強化された餌料生物を水産生物に給餌して水産生物を養殖することにより、水産生物の飼育成績を改善することができる。すなわち、ステロール含有藻体で栄養強化さ
れた餌料生物を利用することにより、例えば、栄養強化されていない餌料生物を利用する場合と比較して、水産生物の飼育成績を改善することができる。養殖を「飼育」ともいう。水産生物の飼育成績を改善する効果を「飼育成績改善効果」ともいう。飼育成績の改善としては、体重の増加、体長の増加、肥満度の増加、生残率の増加、ストレステスト生残率の増加が挙げられる。本発明においては、１種の飼育成績改善効果が得られてもよく、２種またはそれ以上の飼育成績改善効果が得られてもよい。
【００１０】
「ステロール」とは、Ｃ−３位に水酸基を有するステロイド誘導体の総称である。「ステロイド」とは、シクロペンタノヒドロフェナントレン環骨格を有する化合物の総称である。すなわち、「ステロール」とは、具体的には、Ｃ−３位に水酸基を有するシクロペンタノヒドロフェナントレン環骨格を有する化合物の総称である。
【００１１】
ステロールとしては、動物ステロール、植物ステロール、真菌ステロールが挙げられる。「動物ステロール」、「植物ステロール」、「真菌ステロール」とは、それぞれ、動物、植物、真菌において見出されるステロールをいう。なお、ここでいう「植物」には、藻類も包含される。
【００１２】
動物ステロールとしては、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、グリコール酸、タウロコール酸、コール酸、エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、エストリオール、デヒドロエピアンドロステロン、メチルアンドロステンジオール、５β−プレグナン−３α，２０α−ジオール、プレグネノロン、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ジヒドロキシコレステロール、ジギトキシゲニン、デスモステロール、ラソステロールが挙げられる。
【００１３】
植物ステロールとしては、スチグマステロール、β−シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、ジオスゲニン、オレアノール酸、ベツリン酸、ウルソール酸、ヘコゲニン、サルササポゲニン、イソフコステロール、アベナステロール、Δ７−スチグマステノール、Δ７−カンペステノール、フコステロール、サルガステロールが挙げられる。
【００１４】
真菌ステロールとしては、エルゴステロールが挙げられる。
【００１５】
ステロールとしては、中でも、コレステロールが好ましい。
【００１６】
ステロールは、例えば、遊離型、脂肪酸エステル型、配糖体型等の形態で存在し得る。すなわち、「ステロール」とは、特記しない限り、遊離型のステロール、ステロール脂肪酸エステル、ステロール配糖体、またはそれらの混合物を意味してよい。
【００１７】
「藻体」とは、藻類の細胞をいう。すなわち、「ステロール含有藻体」とは、藻類の細胞であって、ステロールを含有するものをいう。ステロール含有藻体としては、ステロール生産能を有する藻類の細胞が挙げられ、より具体的には、ステロール生産能を有する藻類を培地で培養して得られる同藻類の細胞が挙げられる。
【００１８】
「ステロール生産能を有する藻類」とは、培地で培養した際にステロールを生産し藻体内に蓄積できる藻類をいう。ステロール生産能を有する藻類は、１種のステロールの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のステロールの生産能を有していてもよい。ステロール生産能を有する藻類は、例えば、コレステロールの生産能を有するのが好ましい。ステロール生産能を有する藻類は、例えば、培地で培養した際に２．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、２．７％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、３．０％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、３．３％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、または３．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上の量でステロー
ルを生成（蓄積）できる藻類であってもよい。また、ステロール生産能を有する藻類は、例えば、培地で培養した際に１．２％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、１．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、または２．０％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上の量でコレステロールを生成（蓄積）できる藻類であってもよい。なお、「％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）」とは、乾燥藻体重量（ＤＣＷ）に対する対象成分（ステロール等）の重量のパーセンテージを示す。培養条件は、ステロール生産能を有する藻類が十分に生育できるものであれば特に制限されない。そのような培養条件としては、後述する培養条件が挙げられる。また、そのような培養条件として、具体的には、実施例に記載の培養条件が挙げられる。ステロール量は、例えば、後述する手法により測定できる。なお、「ステロール量」とは、特記しない限り、遊離型のステロールの重量に換算した量をいう。
【００１９】
ステロール生産能を有する藻類は、さらに、高度不飽和脂肪酸の生産能を有していてもよい。高度不飽和脂肪酸としては、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が挙げられる。ステロール生産能を有する藻類は、１種の高度不飽和脂肪酸の生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上の高度不飽和脂肪酸の生産能を有していてもよい。ステロール生産能を有する藻類は、例えば、ＤＨＡおよびＥＰＡの片方または両方の生産能を有していてもよい。
【００２０】
ステロール等の成分の種類および量は、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により決定することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【００２１】
ステロール生産能を有する藻類としては、例えば、ラビリンチュラ類が挙げられる。ステロール生産能を有するラビリンチュラ類としては、例えば、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属藻類やトラウストキトリウム（Thraustochytrium）属藻類が挙げられる。
【００２２】
ステロール生産能を有する藻類として、具体的には、例えば、AJ7866株（FERM P-22289）、AJ7867株（FERM P-22304）、AJ7868株（FERM P-22290）、およびそれらの誘導株が挙げられる。また、ステロール生産能を有する藻類として、具体的には、例えば、配列番号３、４、または５に示す塩基配列を有する、オーランチオキトリウム属藻類等の藻類も挙げられる。
【００２３】
AJ7866株は、2015年8月5日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に、受託番号FERM P-22289の下に寄託されている。AJ7866株は、18S rDNA配列を指標とした分子系統解析により、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属と類縁関係にあると考えられる。AJ7866株の18S rDNAの塩基配列を配列番号３に示す。
【００２４】
AJ7867株は、2016年1月8日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に、受託番号FERM P-22304の下に寄託されている。AJ7867株は、18S rDNA配列を指標とした分子系統解析により、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属と類縁関係にあると考えられる。AJ7867株の18S rDNAの塩基配列を配列番号４に示す。
【００２５】
AJ7868株は、2015年8月5日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に、受託番号FERM P-22290の下に寄託されている。AJ7868株は、18S rDNA配列を指標とした分子系統解析により、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属と類縁関係にあると考えられ
る。AJ7868株の18S rDNAの塩基配列を配列番号５に示す。
【００２６】
上記「誘導株」とは、AJ7866株、AJ7867株、またはAJ7868株を親株（祖先株）として構築された株であって、且つ、親株（祖先株）と同等以上のステロール生成能を有するものをいう。誘導株は、例えば、親株と同等以上のコレステロールの生産能を有するのが好ましい。誘導株は、例えば、人為的な改変により育種されたものであってよい。人為的な改変としては、遺伝子工学的手法による改変や、突然変異処理による改変が挙げられる。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、誘導株は、例えば、親株（祖先株）の使用の際に自然に生じたものであってもよい。そのような誘導株としては、例えば、AJ7866株、AJ7867株、またはAJ7868株を培養する際に自然に生じた変異株が挙げられる。誘導株は、１種の改変により構築されてもよく、２種またはそれ以上の改変の組み合わせにより構築されてもよい。
【００２７】
「誘導株が親株と同等以上のステロール生成能を有する」とは、誘導株を培地で培養した際に、藻体乾燥重量当たり、親株を同条件で培養した際に生成（すなわち蓄積）するステロール量の、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の量でステロールを生成（蓄積）することを意味してよい。誘導株は、例えば、２．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、２．７％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、３．０％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、３．３％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、または３．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上の量でステロールを生成（蓄積）してもよい。また、誘導株は、例えば、１．２％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、１．５％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上、または２．０％（ｗ／ｗ−ＤＣＷ）以上の量でコレステロールを生成（蓄積）してもよい。培養条件は、ステロール生産能を有する藻類が十分に生育できるものであれば特に制限されない。
【００２８】
ステロール含有藻体は、例えば、ステロール生産能を有する藻類を培地で培養することにより得られる。培養条件は、ステロール生産能を有する藻類が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養藻類の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００２９】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、ステロール生産能を有する藻類を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、ステロール生産能を有する藻類を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有されるステロール生産能を有する藻類の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1〜50％（v/v）植菌することにより行ってよい。
【００３０】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【００３１】
使用する培地は、ステロール生産能を有する藻類が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養藻類の
培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地として、具体的には、例えば、0〜1×人工海水で調製したGPY培地（実施例）が挙げられる。
【００３２】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、塩酸、硫酸等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、２０〜３５℃、好ましくは２５℃〜３５℃であってよい。培養期間は、例えば、１０時間〜１２０時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいはステロール生産能を有する藻類の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下でステロール生産能を有する藻類を培養することにより、ステロールを含有する藻体（ステロール含有藻体）が生成する。
【００３８】
このようにして得られるステロール含有藻体を、餌料生物の栄養強化に利用することが
できる。「藻体を餌料生物の栄養強化に利用する」とは、具体的には、藻体を本発明の栄養強化剤の成分として利用することや、藻体を餌料生物に給餌することをいう。藻体は、培地に含まれたまま餌料生物の栄養強化に利用してもよく、培地から回収してから餌料生物の栄養強化に利用してもよい。また、藻体は、適宜処理を行ってから餌料生物の栄養強化に利用してもよい。処理としては、例えば、希釈、濃縮、凍結、融解、乾燥等が挙げられる。これらの処理は、適宜組み合わせて行ってもよい。
【００３９】
藻体を培地から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）を利用できる。具体的には、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過等の手法により、藻体を培地から回収することができる。また、その際、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。回収した藻体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した藻体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【００４０】
＜２＞本発明の栄養強化剤
本発明の栄養強化剤は、ステロール含有藻体を含有する栄養強化剤である。本発明の栄養強化剤は、餌料生物の栄養強化に用いることができる。すなわち、本発明の栄養強化剤は、具体的には、餌料生物用の栄養強化剤であってよい。
【００４１】
本発明の栄養強化剤は、ステロール含有藻体からなるものであってもよく、他の成分を含有するものであってもよい。他の成分としては、例えば、水分や培地成分が挙げられる。また、他の成分としては、賦形剤等の製剤化に用いられる成分も挙げられる。すなわち、上述したような態様のステロール含有藻体（培地に含まれたままの藻体、培地から回収した藻体、それらの処理物、等）をそのまま、あるいは他の成分と組み合わせて、本発明の栄養強化剤とすることができる。例えば、上述したような態様のステロール含有藻体を任意の形態で製剤化して、本発明の栄養強化剤とすることができる。
【００４２】
本発明の栄養強化剤の形状は、栄養強化対象の餌料生物がステロール含有藻体を摂餌できる限り、特に制限されない。本発明の栄養強化剤は、粉末状、顆粒状、ペレット状、キューブ状、ペースト状、液状等のいかなる形状であってもよい。本発明の栄養強化剤は、例えば、水中で分散し、栄養強化対象の餌料生物が摂餌できる形態となるように構成されていてもよい。
【００４３】
＜３＞本発明の餌料生物
本発明の餌料生物は、ステロール含有藻体で栄養強化された餌料生物である。「ステロール含有藻体で栄養強化された」とは、ステロール含有藻体を取り込んでいること、すなわち、ステロール含有藻体を含有していることをいう。すなわち、本発明の餌料生物は、言い換えると、ステロール含有藻体を取り込んだ餌料生物であってよく、また、ステロール含有藻体を含有する餌料生物であってよい。なお、本発明の餌料生物の元になる生物（ステロール含有藻体を取り込ませる生物）を、本発明の餌料生物と区別して、特に「原料生物」ともいう。本発明の餌料生物は、生餌として、水産生物の養殖に利用できる。すなわち、本発明の餌料生物は、具体的には、水産生物用の餌料生物であってよい。また、一態様においては、本発明の餌料生物を水産生物の養殖に利用することにより、ストレステスト生残率の増加等の効果が得られる。よって、本発明の餌料生物の一態様は、水産生物用のストレス緩和剤であってもよい。
【００４４】
本発明の餌料生物は、ワムシおよびアルテミアから選択される。すなわち、原料生物も、ワムシおよびアルテミアから選択される。特に、ワムシである本発明の餌料生物（ワムシを原料生物とする本発明の餌料生物）を「本発明のワムシ系餌料生物」、アルテミアで
ある本発明の餌料生物（アルテミアを原料生物とする本発明の餌料生物）を「本発明のアルテミア系餌料生物」ともいう。
【００４５】
「ワムシ」とは、輪形動物門（Rotifera）に属する生物の総称である。ワムシとして、具体的には、例えば、シオミズツボワムシ（Brachionus plicatilis sp.complex）が挙げられる。シオミズツボワムシは、例えば、海産魚類の種苗生産における餌料生物として一般的に用いられている。シオミズツボワムシは、分子系統解析によれば１４種以上の種からなる複合種とされているが、そのいずれを用いてもよい。また、シオミズツボワムシは、そのサイズに応じて、Ｌ型、Ｓ型、ＳＳ型の３つに大別され得るが、そのいずれを用いてもよい。ワムシのサイズは、給餌対象の水産生物の種類や生育ステージ等の諸条件に応じて適宜選択できる。なお、Ｌ型をBrachionus plicatilis、Ｓ型をBrachionus ibericus、ＳＳ型をBrachionus rotundiformisと分類する場合もあるが、本発明においてはいずれもシオミズツボワムシ（Brachionus plicatilis sp.complex）として扱うものとする。シオミズツボワムシとしては、例えば、市販品を用いることができる。市販のシオミズツボワムシとして、具体的には、例えば、クロレラ工業（株）から市販されているシオミズツボワムシが挙げられる。また、シオミズツボワムシは、例えば、各地の栽培漁業センターから入手することができる。
【００４６】
「アルテミア」とは、アルテミア（Artemia）属に属する生物の総称である。アルテミアは、ブラインシュリンプと呼ばれる場合もある。アルテミアとして、具体的には、例えば、Artemia franciscana、Artemia monica、Artemia persimilis、Artemia salina、Artemia sinica、Artemia tibetiana、Artemia urmianaが挙げられる。アルテミアとしては、例えば、市販品を用いることができる。市販のアルテミアとして、具体的には、例えば、太平洋貿易株式会社から市販されている、アメリカ・ユタ州ソルトレイク産のアルテミアや中国産のアルテミアが挙げられる。
【００４７】
本発明の餌料生物におけるステロール含有藻体の含有量（取り込み量）は、飼育成績改善効果が得られる限り、特に制限されない。本発明の餌料生物におけるステロール含有藻体の含有量は、例えば、所望のステロールの含有量が得られるような量であってよい。本発明の餌料生物におけるステロールの含有量は、例えば、餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．０２％（ｗ／ｗ）以上、０．０５％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、または０．１５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。また、本発明の餌料生物におけるコレステロールの含有量は、例えば、餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．０２％（ｗ／ｗ）以上、０．０５％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、または０．１５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【００４８】
本発明の餌料生物は、その他の成分を含有してよい。その他の成分としては、ＤＨＡやＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸が挙げられる。本発明の餌料生物におけるＤＨＡの含有量は、例えば、餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．２％（ｗ／ｗ）以上、０．５％（ｗ／ｗ）以上、または１％（ｗ／ｗ）以上であってよい。本発明の餌料生物におけるＥＰＡの含有量は、例えば、餌料生物の乾燥重量に対する重量として、０．０２％（ｗ／ｗ）以上、０．０５％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、または０．１５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【００４９】
＜４＞本発明の餌料生物の製造法
本発明の餌料生物は、例えば、原料生物をステロール含有藻体で栄養強化すること（すなわち、原料生物にステロール含有藻体を取り込ませること）により製造できる。すなわち、本発明の餌料生物の製造法は、例えば、餌料生物の製造方法であって、原料生物にステロール含有藻体を取り込ませることを含む方法であってよい。具体的には、原料生物を培養により生育（増殖や孵化、等）させ、次いで、生育した原料生物をステロール含有藻
体で栄養強化することができる。
【００５０】
原料生物の培養条件は、原料生物が生育（増殖や孵化、等）できるものであれば、特に制限されない。原料生物の培養条件は、原料生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。原料生物の培養は、例えば、原料生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００５１】
ワムシの場合、液体培地中で飼料を給餌して培養することができる。ワムシ用の飼料としては、例えば、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属藻類等の藻類やサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母が挙げられる。液体培地としては、適当な塩濃度の培地を用いることができる。培地の塩濃度は、例えば、海水の塩濃度の半分〜海水の塩濃度と同等であってよい。液体培地として、具体的には、例えば、濾過海水、人工海水、それらの希釈物が挙げられる。培養温度は、例えば、２０℃〜３０℃であってよく、好ましくは２５℃程度であってよい。培養は、ワムシが所望の程度に増殖するまで継続することができる。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。
【００５２】
アルテミアの場合、液体培地中で休眠卵を培養することにより、休眠卵を孵化させることができる。液体培地としては、適当な塩濃度の培地を用いることができる。培地の塩濃度は、例えば、海水の塩濃度の半分〜海水の塩濃度と同等であってよい。液体培地として、具体的には、例えば、濾過海水、人工海水、それらの希釈物が挙げられる。孵化温度は、例えば、２０℃〜３０℃であってよく、好ましくは２８℃程度であってよい。孵化の際には、培養槽に通気するのが好ましい。孵化後、卵殻と幼生を分離してもよい。孵化後、適宜、培養を継続することができる。孵化後の培養温度は、例えば、２０℃〜３０℃であってよく、好ましくは２５℃程度であってよい。培養は、アルテミアが所望の程度に生育するまで、例えばアルテミアが開口するまで、継続することができる。
【００５３】
栄養強化は、液体培地中で原料生物をステロール含有藻体と共存させることにより実施できる。栄養強化の条件は、原料生物が所望の程度にステロール含有藻体を取り込める限り、特に制限されない。栄養強化の条件は、原料生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。栄養強化は、例えば、栄養強化にステロール含有藻体を用いること以外は、原料生物の栄養強化に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００５４】
原料生物は、培養時の培地に含まれたまま栄養強化に供してもよく、培養時の培地から回収してから栄養強化に供してもよい。例えば、原料生物の培養液を、そのまま、あるいは希釈または濃縮してから、栄養強化に供してもよい。ステロール含有藻体としては、例えば、上述したような態様のステロール含有藻体（培地に含まれたままの藻体、培地から回収した藻体、それらの処理物、等）を利用することができる。また、ステロール含有藻体としては、例えば、本発明の栄養強化剤を用いることができる。液体培地としては、適当な塩濃度の培地を用いることができる。培地の塩濃度は、例えば、海水の塩濃度の半分〜海水の塩濃度と同等であってよい。液体培地として、具体的には、例えば、濾過海水、人工海水、それらの希釈物が挙げられる。栄養強化の温度は、例えば、２０℃〜３０℃であってよく、好ましくは２５℃程度であってよい。
【００５５】
なお、例えば本発明の餌料生物を水産生物に給餌した際に本発明の餌料生物の活性を保つ観点から、原料生物の培養時や栄養強化時の環境（塩濃度や温度、等）は、水産生物の養殖時の環境（塩濃度や温度、等）と近いのが好ましい。また、原料生物の培養時の環境と水産生物の養殖時の環境と差が大きい場合には、例えば、原料生物の栄養強化時の環境をそれらの間のいずれかの条件に設定して、餌料生物を水産生物の養殖時の環境に慣れさ
せてもよい。
【００５６】
栄養強化時の原料生物の培地中での密度は、原料生物が所望の程度にステロール含有藻体を取り込める限り、特に制限されない。栄養強化時の原料生物の培地中での密度は、ワムシの場合、例えば、５万個／Ｌ〜１００万個／Ｌ、または１０万個／Ｌ〜５０万個／Ｌであってよい。栄養強化時の原料生物の培地中での密度は、アルテミアの場合、例えば、１万個／Ｌ〜２０万個／Ｌ、または２万個／Ｌ〜１０万個／Ｌであってよい。
【００５７】
ステロール含有藻体の使用量は、原料生物が所望の程度にステロール含有藻体を取り込める限り、特に制限されない。ステロール含有藻体の使用量は、ワムシ３０万個に対し、例えば、１ｍｇ以上、５ｍｇ以上、または１０ｍｇ以上であってもよく、５００ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、１００ｍｇ以下、または５０ｍｇ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ステロール含有藻体の使用量は、ワムシ３０万個に対し、具体的には、例えば、１ｍｇ〜２００ｍｇ、５ｍｇ〜１００ｍｇ、または１０ｍｇ〜５０ｍｇであってもよい。また、ステロール含有藻体の使用量は、アルテミア５万個に対し、例えば、２ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、または２０ｍｇ以上であってもよく、１０００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、または１００ｍｇ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ステロール含有藻体の使用量は、アルテミア５万個に対し、具体的には、例えば、２ｍｇ〜５００ｍｇ、１０ｍｇ〜２００ｍｇ、または２０ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００５８】
栄養強化の時間は、原料生物が所望の程度にステロール含有藻体を取り込める限り、特に制限されない。栄養強化の時間は、例えば、１５分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、または５時間以上であってもよく、４８時間以下、２４時間以下、１２時間以下、または９時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。栄養強化の時間は、具体的には、例えば、３０分〜２４時間、１時間〜１２時間、または２時間〜９時間であってもよい。
【００５９】
栄養強化は、ステロール含有藻体を単独で用いて実施してもよいし、ステロール含有藻体と他の栄養強化剤とを併用して実施してもよい。
【００６０】
このようにして栄養強化を実施することにより、本発明の餌料生物が得られる。
【００６１】
本発明の餌料生物は、栄養強化時の培地に含まれたまま水産生物の養殖に用いてもよく、栄養強化時の培地から回収してから水産生物の養殖に用いてもよい。例えば、栄養強化後の培養液を、そのまま、あるいは希釈または濃縮してから、水産生物の養殖に用いてもよい。本発明の餌料生物を培地から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。具体的には、例えば、ガーゼ等を利用した濾過により、本発明の餌料生物を培地から回収することができる。回収した本発明の餌料生物は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した本発明の餌料生物は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、原料生物の培養や栄養強化に用いた培地が挙げられる。
【００６２】
＜５＞本発明の方法
本発明の方法は、本発明の餌料生物を水産生物に給餌することを含む、水産生物を養殖（飼育）する方法である。
【００６３】
本発明の方法により水産生物を養殖することで、水産生物の飼育成績を改善できる。すなわち、本発明の方法は、本発明の餌料生物を水産生物に給餌することを含む、水産生物の飼育成績を改善する方法であってもよい。
【００６４】
また、一態様においては、本発明の方法により水産生物を養殖することで、ストレステスト生残率の増加等の効果が得られる。よって、本発明の方法の一態様は、本発明の餌料生物を水産生物に給餌することを含む、水産生物のストレスを緩和する方法であってもよい。
【００６５】
水産生物は、本発明の餌料生物を摂餌できるものであれば特に制限されない。水産生物としては、一般的にワムシおよび／またはアルテミアを給餌して養殖されている水産生物が挙げられる。水産生物としては、例えば、魚類や甲殻類が挙げられる。また、水産生物としては、海産生物が挙げられる。魚類として、具体的には、例えば、マダイ、ヒラメ、カレイ、カンパチ、トラフグ、ブリ、マグロ、ウナギ、ティラピア、ナマズ、シーバス、アユ、ニジマス、タイセイヨウサケ、ギンザケ、マスノスケ、カクレクマノミが挙げられる。甲殻類として、具体的には、例えば、バナメイエビ、クルマエビ、ウシエビ、ホワイトレッグシュリンプ、ガザミが挙げられる。
【００６６】
本発明の餌料生物の給餌態様は、飼育成績改善効果が得られる限り、特に制限されない。
【００６７】
本発明の餌料生物の給餌量は、飼育成績改善効果が得られる限り、特に制限されない。本発明の餌料生物の給餌量は、対象の水産生物の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。本発明の餌料生物の給餌量は、例えば、飽食量であってよい。本発明の餌料生物は、１日１回または複数回に分けて給餌されてよい。また、本発明の餌料生物は、数日に１回給餌されてもよい。各給餌時の本発明の餌料生物の給餌量は、コレステロール等のステロールの量に換算して、一定であってもよく、そうでなくてもよい。各給餌時の本発明の餌料生物におけるコレステロール等のステロールの濃度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。
【００６８】
給餌する本発明の餌料生物の種類は、対象の水産生物の種類や生育ステージ等の諸条件に応じて適宜選択することができる。本発明の方法においては、ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の一方のみを給餌してもよく、両方を給餌してもよい。ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の両方を給餌する場合、ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の給餌期間の給餌期間は、一部または全部重複してもよく、全く重複しなくてもよい。ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料の給餌順は、適宜設定できる。例えば、ワムシ系の本発明の餌料を先に給餌し、アルテミア系の本発明の餌料を後に給餌してもよい。「ワムシ系の本発明の餌料を先に給餌し、アルテミア系の本発明の餌料を後に給餌する」とは、ワムシ系の本発明の餌料生物の給餌期間がアルテミア系の本発明の餌料生物よりも先に開始すること、ワムシ系の本発明の餌料生物の給餌期間がアルテミア系の本発明の餌料生物よりも先に終了すること、またはそれらの組み合わせをいう。「ワムシ系の本発明の餌料を先に給餌し、アルテミア系の本発明の餌料を後に給餌する」場合、ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の給餌期間は、一部重複してもよく、全く重複しなくてもよい。
【００６９】
本発明の餌料生物を給餌するタイミングや長さは、飼育成績改善効果が得られる限り、特に制限されない。本発明の餌料生物を給餌するタイミングや長さは、対象の水産生物の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。本発明の餌料生物は、例えば、特定の生育ステージにある水産生物に対して給餌することができる。本発明の餌料生物を給餌する生育ステージとしては、一般的にワムシおよび／またはアルテミアを給餌して養殖されている生育ステージが挙げられる。本発明の餌料生物を給餌する生育ステージとしては、例えば、魚類の場合、仔稚魚期が挙げられる。本発明の餌料生物を給餌する生育ステー
ジとしては、例えば、魚類の場合、より具体的には、仔稚魚期であって摂餌行動開始後の期間が挙げられる。また、本発明の餌料生物を給餌する生育ステージとしては、例えば、甲殻類の場合、幼生の期間が挙げられる。本発明の餌料生物を給餌する生育ステージとしては、例えば、甲殻類の場合、より具体的には、幼生の期間であって摂餌行動開始後の期間が挙げられる。本発明の餌料生物は、上記のような生育ステージの一部または全部の期間において、水産生物に給餌されてよい。すなわち、本発明の餌料生物は、例えば、魚類の場合、仔稚魚期の一部または全部の期間、より具体的には、仔稚魚期であって摂餌行動開始後の期間の一部または全部の期間において、魚類に給餌されてよい。ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の両方を給餌する場合、その少なくとも一方が、上記のような生育ステージの一部または全部の期間において、水産生物に給餌されてよい。また、ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の両方を給餌する場合、そのそれぞれが、上記のような生育ステージの一部または全部の期間において、水産生物に給餌されてよい。「生育ステージの一部の期間」とは、例えば、当該生育ステージの全期間の１０％以上、２０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、または９０％以上の期間であってよい。また、本発明の餌料生物は、上記のような生育ステージ以外の期間において、給餌されてもよく、給餌されなくてもよい。本発明の餌料生物を給餌する期間は、例えば、３日以上、５日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、２ヶ月以上、または３ヶ月以上であってもよく、１年以下、６ヶ月以下、４ヶ月以下、３ヶ月以下、２ヶ月以下、４週間以下、３週間以下、または２週間以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の両方を給餌する場合、その少なくとも一方を給餌する期間が、上記のような期間であってよい。また、ワムシ系の本発明の餌料生物とアルテミア系の本発明の餌料生物の両方を給餌する場合、そのそれぞれを給餌する期間が、上記のような期間であってよい。また、本発明の餌料生物は、任意の期間で給餌の継続と中断を繰り返してもよい。
【００７０】
水産生物の養殖（飼育）は、例えば、本発明の餌料生物を給餌すること以外は、水産生物を養殖（飼育）する通常の方法と同一の方法により行うことができる。すなわち、水産生物の養殖（飼育）は、例えば、本発明の餌料生物を給餌すること以外は、ワムシやアルテミア等の餌料生物を給餌して水産生物を養殖（飼育）する通常の方法と同一の方法により行うことができる。養殖（飼育）は、例えば、海上の生簀や陸上の水槽で行うことができる。なお、「養殖」には、種苗生産（稚魚生産等）のみを行う増養殖および成体（親魚等）までの生産を行う養殖のいずれもが包含される。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００７２】
＜実施例１＞ステロール含有藻体の調製
（１）ラビリンチュラのステロール蓄積株の取得
（１−１）水又は土壌サンプルの培養と株の単離
沖縄県の川の水を含んだ葉の腐敗物のサンプルを採取した。サンプルに松の花粉（宮崎県で採取）を適量添加し、室温で８日間静置した。0.5×人工海水で調製した0.1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ50mg/LとなるようにペニシリンGカルシウムやストレプトマイシン硫酸塩を加え、さらに終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに、前記静置後のサンプルを100μl播種した。各々のプレートを、28℃で4日間培養し、得られたコロニーを同培地で画線分離し、コロニーの純化を実施した。このようにして取得した株をAJ7866株と命名した。尚、1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）と1×人工海水の組成は以下のとおりである。
【００７３】
＜1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）の組成＞
酵母エキス             8.5 g
ペプトン               8.5 g
グルコース          11 g
リン酸二水素カリウム   2.0 g
トマトジュース末       3.7 g
ポリソルベート80       1.0 g
寒天                  15 g
超純水              1000 ml
【００７４】
＜1×人工海水の組成＞
NaCl                   30 g
KCl                     0.7 g
MgCl2・6H2O            10.8 g
MgSO4・7H2O             5.4 g
CaCl2・2H2O             1 g
超純水               1000 ml
【００７５】
（１−２）ステロール蓄積株の分子系統解析
上記のようにして単離されたAJ7866株について、ラビリンチュラの18S rDNA領域増幅用ユニバーサルプライマー（配列番号１、２）を用いて、18S rDNA領域の塩基配列を指標とした分子系統解析を行った。配列決定したAJ7866株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号３に示す。既知のラビリンチュラ類の18S rDNA領域の塩基配列のアラインメント・ファイル（Mayumi Ueda, et al., Seasonal dynamics of culturable thraustochytrids (Labyrinthulomycetes, Stramenopile) in estuarine and coastal waters., Aquatic Microbial Ecology. 2015 ;74:187-204）非特許文献2アラインメント・ファイルに上記の配列番号３を含めてアラインメントし系統解析を行った。系統解析は、MEGA 6.06を使用し、Tamura & Nei modelを適用した近隣結合（NJ）法により行った。なお、アラインメントによるギャップが含まれたサイトは、系統解析に含めていない。得られた系統樹を図１に示す。図中、各ノードの数値は、1000回のbootstrap re-samplingによる支持率を示す。この結果、AJ7866株はオーランチオキトリウム属と類縁関係にあることが明らかになったため、同株をAurantiochytrium sp. AJ7866株と命名した。
【００７６】
（２）ステロール含有藻体の調製
AJ7866株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、25℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を6白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGPY培地30 mLを入れた300ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度25℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地45mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに5ml植菌し、培養温度25℃、撹拌120rpm(ロータリー)にて、51時間培養を行った。
【００７７】
＜GPY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース            20 g/L
（Ｂ区）
ポリペプトン          10 g/L
酵母エキス             5 g/L
（Ｃ区）
ビタミンB1             2 mg/L
ビタミンB2             0.01 mg/L
ビタミンB12            0.01 mg/L
（Ｄ区）
MES                    8.79 g/L
Ｂ区はHClを用いてpH6.0に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.0に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、４区を混合した。
【００７８】
＜GTY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース            50 g/L
（Ｂ区）
トリプトン            10 g/L
酵母エキス             5 g/L
（Ｃ区）
ビタミンB1             2 mg/L
ビタミンB2             0.01 mg/L
ビタミンB12            0.01 mg/L
（Ｄ区）
MES                    8.79 g/L
Ｂ区はHClを用いてpH6.0に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.0に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、４区を混合した。
【００７９】
培養終了後、培養液を遠心分離し、濃縮し、凍結乾燥させることにより、ステロール含有藻体を得た。
【００８０】
＜実施例２＞ワムシの栄養強化試験
[実験手順]
実施例１で得られたステロール含有藻体（以下、「AJ7866株藻体」ともいう）を用いてシオミズツボワムシ（Brachionus plicatilis sp.complex、以下、単に「ワムシ」ともいう）の栄養強化の可否確認を行うとともに、定量的な栄養強化効果の検証をおこなった。なお、本試験で使用したワムシは、S型シオミズツボワムシである。
【００８１】
本試験では、強化剤無添加区（以下、コントロール区）、比較対象藻体（バイオクロミス；クロレラ工業（株）製）の添加区（以下、他社品区）、AJ7866株藻体の添加区（以下、藻体区）の３区を設定し、ワムシ強化試験を実施した。なお、比較対象藻体（バイオクロミス）は、DHAが豊富なアルテミア強化剤として販売されているものである。
【００８２】
強化剤の調製方法及びワムシの強化方法は以下に記す。
【００８３】
まず比較対象藻体及びAJ7866株藻体を、それぞれ、海水に懸濁し、バイオミキサー（日本精機製作所 BIO MIXER BM-2）を用いて3分間撹拌し、強化剤を得た。懸濁濃度は、それぞれ、海水1Lに対し65gである。
【００８４】
個体密度を30万個/Lに調整したワムシの培養液に、比較対象藻体及びAJ7866株藻体の添加量がそれぞれワムシ30万個あたり20mgとなるように強化剤を添加し、他社品区および藻体区とした。また、強化剤を添加していない区を、コントロール区とした。栄養強化処理時の液温は25±0.5℃（実測値）であった。強化開始（強化剤の添加）より3時間後及び6
時間後にワムシを回収し、含有成分測定分析用サンプルとした。具体的には、栄養強化槽よりサイホンにて強化後のワムシを含有する培養液を回収し、50μmミューラーガーゼを用いてワムシを回収した。その後、濾過海水で通水しながらワムシを洗浄し、緩く脱水してペースト状になったものを各サンプル50g程度遠沈管に取り、冷凍保存した。冷凍保存した分析用サンプルは、一般財団法人日本食品分析センターにて、コレステロール、ドコサヘキサエン酸（以下、DHA）、及びエイコサペンタエン酸（以下、EPA）の含有量の分析に使用した。
[結果]
結果を図２に示す。ワムシ中のコレステロールは、コントロール区では検出されず、他社品区でもほとんど検出されなかったが、藻体区の3時間強化後では0.12%、6時間強化後では0.17%検出された。DHAはコントロール区では検出されず、他社品区および藻体区で同程度検出された。EPAはコントロール区および他社品区では検出されなかったが、藻体区の3時間強化後では0.18%、6時間強化後では0.2%検出された。なお、図中、各成分の濃度は、ワムシ中の水分含有量分析結果を考慮し、ワムシ乾物重量あたりで計算した値である。
【００８５】
[考察結論]
ワムシにおいて、コレステロール、DHA、及びEPAは、いずれも、強化3時間後及び6時間後ともに、コントロール区では検出されなかったが、藻体区では検出された。また、藻体区では、他社品区と比べて、DHA含有量は同程度であったが、コレステロール含有量は高かった。また、EPAは、他社品区では検出されず、藻体区のみで検出された。このことから、コレステロールを含むAJ7866株藻体がワムシに取り込まれたということが確認できた。
【００８６】
＜実施例３＞クマノミの飼育試験
[実験手順]
実施例１で得られたステロール含有藻体（AJ7866株藻体）を用いて栄養強化されたワムシ及びアルテミア・フランシスカナ（Artemia franciscana、以下、単に「アルテミア」ともいう）を給餌する仔稚魚期のカクレクマノミ飼育試験を実施し、試験終了時における体長および体重の測定、生残率および肥満度の算出、並びにストレス耐性を評価した。
【００８７】
本試験では、実施例２で使用したものと同一のワムシ及び太平洋貿易（株）より購入したユタ産のアルテミアを使用した。また、強化剤の種類および調製方法は、実施例２と同一である。ワムシ及びアルテミアの強化方法は以下に記す。
【００８８】
ワムシ及びアルテミアの強化条件を表１に示す。表中、餌料生物強化剤の欄の「藻体」はAJ7866株藻体を示す。個体密度を30万個/Lに調整したワムシの培養液に、AJ7866株藻体（以下、藻体区）及び比較対象藻体（以下、他社品区）から調製した強化剤を、それぞれ、表１に記載の量で添加し、6時間栄養強化処理を施した。また、休眠卵を孵化させ個体密度を5万個/Lに調整したアルテミアの培養液に、AJ7866株藻体（以下、藻体区）及び比較対象藻体（以下、他社品区）から調製した強化剤を、それぞれ、表１に記載の量で添加し、6時間栄養強化処理を施した。栄養強化処理時の液温は25±0.5℃（実測値）であった。
【００８９】
【表１】
2017153437.tif 000003
【００９０】
クマノミ飼育試験の条件を表２に示す。クマノミ飼育試験に使用する飼育槽は30Lパンライト（有効水量30L）、飼育水は25±1℃に調温した天然濾過海水の連続注排水によるものとし、明暗周期は人工照明による12L：12Dとした。供試魚は4組の親魚ペアから産出され同日に孵化した仔魚を均質になるよう混合した上で1水槽あたり100個体ずつ用い、飼育槽は1試験区について3ロットもしくは2ロットの計8水槽設定した。通気量はおよそ100mL/minとし、投餌量（餌料生物投餌密度）は換水率を勘案した上で飽食給餌となるよう設定した。
【００９１】
【表２】
2017153437.tif 000004
【００９２】
試験期間1-9日目はワムシのみをカクレクマノミ仔魚に給餌し、試験開始後10-12日目はワムシとアルテミアを同時に給餌し、13日目から21日目（試験終了日）まではアルテミアのみを給餌した。試験21日目の試験終了時にカクレクマノミ仔魚を回収し、評価方法（表３）に基づいて、各試験区における、体長（0.01mm単位）および体重（個体平均）を測定し、生残率および肥満度を算出し、ストレス耐性を評価した。
【００９３】
【表３】
2017153437.tif 000005
【００９４】
[結果]
結果を図３に示す。結果は、コントロール区の平均値を100としたときの相対値として示す。藻体区及び他社品区は、コントロール区に比べ、どの項目においても値が高くなった。また、体重、体長、肥満度、およびストレス生残率については、他社品区よりも藻体区で高くなっていた。
【００９５】
[考察結論]
AJ7866株藻体を用いて栄養強化されたワムシ及びアルテミアを仔稚魚期のカクレクマノミに給餌することにより、無強化または比較対象藻体で強化したワムシ及びアルテミアを給餌した場合に比べ、カクレクマノミの体重、体長、肥満度、及びストレス耐性試験後の生残率が改善された。このことから、コレステロール等のステロール含有藻体は、カクレクマノミ等の水産生物の成長を促進し、ストレス耐性を高める効果を有することが示唆された。
【００９６】
＜実施例４＞AJ7867株を用いたワムシの栄養強化試験およびヒラメの飼育試験
（１）ステロール含有藻体の調製
実施例１と同様の手順により、ラビリンチュラのステロール蓄積株であるAJ7867株を得た。実施例１と同様の手順により、AJ7867株の分子系統解析を行ったところ、AJ7867株はオーランチオキトリウム属と類縁関係にあることが明らかになったため、同株をAurantiochytrium sp. AJ7867株と命名した。実施例１と同様の手順により、AJ7867株を培養し、ステロール含有藻体を得た。
【００９７】
（２）ワムシの栄養強化試験
[実験手順]
実施例４（１）で得られたステロール含有藻体（以下、「AJ7867株藻体」ともいう）を用いてワムシの栄養強化の可否確認を行うとともに、定量的な栄養強化効果の検証をおこなった。なお、本試験で使用したワムシは、S型シオミズツボワムシである。
【００９８】
本試験では、AJ7867株藻体の添加区（以下、藻体(mh)区）、比較対象藻体の添加区（以下、他社品区）の2区を設定し、ワムシ強化試験を実施した。なお、比較対象藻体は、DHA含有藻類を主体とした藻類を濃縮した市販のワムシ・アルテミア用強化剤で、液状である。比較対象藻体は、液中にDHAを0.7%、EPAを0.02%含有する。
【００９９】
強化剤の調製方法及びワムシの強化方法は以下に記す。
【０１００】
AJ7867株藻体を、滅菌海水に0.1g/mlとなるよう懸濁し、ミキサーで3分間撹拌し、強化剤を得た。比較対象藻体は、元から液状で提供されているため、そのまま強化剤として使用した。個体密度を2000個/mLに調整したワムシ培養液1Lに対して各強化剤（AJ7867株藻体懸濁物および比較対象藻体）を2ml添加し、藻体(mh)区および他社品区とした。強化開始（強化剤の添加）より6時間後及び16時間後にワムシを回収し、含有成分測定分析用サンプルとした。ワムシは栄養強化槽から穴の大きさ60μmのプランクトンネットを用いて濾し採り、海水で十分に洗浄し、さらに水道水にて洗浄し、冷凍保存した。冷凍保存した分析用サンプルは、一般財団法人日本食品分析センターにて、コレステロールおよびDHAの含有量の分析に使用した。
【０１０１】
[結果]
結果を図４に示す。ワムシ中のコレステロールは、他社品区ではほとんど検出されなかったが、藻体(mh)区の6時間強化では0.11%、16時間強化では0.17%検出された。DHAは、他社品区の6時間強化では1.38%、16時間強化では0.6%検出されたのに対し、藻体(mh)区の6時間強化では1.6%、16時間強化では0.68%検出された。なお、図中、各成分の濃度は、ワムシ中の水分含有量分析結果を考慮し、ワムシ乾物重量あたりで計算した値である。
【０１０２】
[結論]
ワムシにおいて、コレステロール及びDHAは、強化6時間及び16時間ともに、他社品区よりも藻体(mh)区で高い値で検出された。このことから、コレステロールを含むAJ7867株藻体がワムシに取り込まれたということが確認できた。
【０１０３】
（３）ヒラメの飼育試験
[実験手順]
実施例４（１）で得られたステロール含有藻体（AJ7867株藻体）を用いて栄養強化されたワムシ及びアルテミアを給餌する仔稚魚期のヒラメ飼育試験を実施し、試験終了時における体長、体重、及び生残率を評価した。
【０１０４】
本試験では、実施例４（２）で使用したものと同一のワムシ並びに市販のロシア産及びソルトレイク産のアルテミアを使用した。また、強化剤の種類および調製方法は、実施例４（２）と同一である。ワムシ及びアルテミアの強化方法は以下に記す。
【０１０５】
ワムシ及びアルテミアの強化条件を表４に示す。表中、餌料生物強化剤の欄の「藻体(mh)」はAJ7867株藻体を示す。ワムシ培養液に各強化剤、すなわちAJ7867株藻体懸濁物（以下、藻体(mh)区）および比較対象藻体（以下、他社品区）、を表４に記載の量で添加し、6時間栄養強化処理を施した。また、また、休眠卵を孵化させて得たアルテミアの培養液に、各強化剤、すなわちAJ7867株藻体懸濁物（以下、藻体(mh)区）および比較対象ナンノクロロプシス藻体（以下、他社品区）、を表４に記載の量で添加し、6時間栄養強化処理を施した。また、対照区として、淡水クロレラで6時間栄養強化したワムシおよびナンノクロロプシスで6時間栄養強化したアルテミアを調製した。なお、対照区のワムシの栄養強化に用いられた淡水クロレラは、市販のワムシ培養用餌料である生クロレラV12（クロレラ工業（株）製）である。また、対照区のアルテミアの栄養強化に用いられたナンノクロロプシスは、ナンノクロロプシスを主原料とした市販のアルテミア培養用餌料である。
【０１０６】
【表４】
2017153437.tif 000006
【０１０７】
ヒラメ飼育試験の条件を表５に示す。ヒラメ飼育試験に使用する飼育槽は30Lポリエチレン水槽、明暗周期は12L：12Dとした。供試魚は孵化後1日齢のヒラメを1水槽あたり600個体ずつ用い、飼育槽は1試験区について3ロット（藻体(mh)区及び他社品区）もしくは2ロット（対照区）の計8水槽設定した。14日齢の時点で、各水槽の飼育密度による影響をなくすため、試験区ごとにヒラメを一つにまとめ、そこからランダムに300尾を選択し、300尾/区、1ロットとなるよう30Lポリエチレン水槽に収容した。また、投餌回数および投餌量（餌料生物投餌密度）は表５の通りに設定した。試験期間3-13日目はワムシのみをヒラメ仔魚に給餌し、試験開始後14-20日目はワムシとアルテミアを同時に給餌し、21日目から試験終了35日目まではアルテミアのみを給餌した。試験期間一週間ごとに、各試験区の体長(mm)、湿体重(mg)、生残率(%)を測定した。なお、体長については、30尾/水槽をランダムに取り出して各個体を測定し、平均値を算出した。湿体重については、7・14・21日目は30尾/水槽をランダムに取り出して総体重を測定し、28・35日目は30尾/水槽をランダムに取り出して各個体を測定し、いずれも平均値を算出した。生残率は、斃死魚の尾数を水槽ごとに数えて算出し、2または3水槽/区である14日目は各試験区の平均値を算出した。
【０１０８】
【表５】
2017153437.tif 000007
【０１０９】
[結果]
結果を図５に示す。ワムシ時期（ワムシ給餌期）14日齢の生残率については、各試験区間で有意な差は認められなかった。ワムシ時期の湿重量および体長については、対照区および他社品区に比べ、藻体(mh)区が高い値を示した。アルテミア時期（アルテミア給餌期）の生残率については、21日齢の時点で対照区の生残率が約15%とかなり落ちていたため、対照区の試験を中止した。アルテミア時期の生残率については、21、28、および35日齢のいずれも、他社品区に比べ、藻体(AJ7867)区が高い値を示した。アルテミア時期の湿重量および体長については、他社品区に比べ、藻体(mh)区が低い値を示した。
【０１１０】
[結論]
AJ7867株藻体を用いて栄養強化されたワムシを仔稚魚期のヒラメに給餌すると、比較対象藻体を用いて栄養強化されたワムシを仔稚魚期のヒラメに給餌した場合に比べ、体重、体長、および生残率の値が高くなる傾向が見られた。AJ7867株藻体を用いて栄養強化されたアルテミアを仔稚魚期のヒラメに給餌すると、比較対象藻体を用いて栄養強化されたワムシを仔稚魚期のヒラメに給餌した場合に比べ、体重および体長の値が低くなる傾向が見られたが、生残率の値は高くなる傾向が見られた。ワムシ時期におけるAJ7867株藻体による栄養強化の効果は、AJ7867株藻体に含まれるコレステロールがヒラメに供給されることに起因すると推察される。一方、甲殻類であるアルテミアは藻体(mh)区及び他社品区で同程度の濃度でコレステロールを含有することから、アルテミア時期においてはAJ7867株藻体による栄養強化の効果が見られなかったと推察される。以上により、コレステロール等のステロール含有藻体で栄養強化したワムシを給餌することで、ヒラメ等の水産生物の成長を促進する効果が得られることが示唆された。
【０１１１】
＜配列表の説明＞
配列番号１、２：プライマー
配列番号３：AJ7866株（FERM P-22289）の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号４：AJ7867株（FERM P-22304）の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号５：AJ7868株（FERM P-22290）の18S rDNA領域の塩基配列
【図１】
2017153437.tif 000008
【図２】
2017153437.tif 000009
【図３】
2017153437.tif 000010
【図４】
2017153437.tif 000011
【図５】
2017153437.tif 000012
【配列表】
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