(57)【要約】【課題】微生物を用いて不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造する方法において、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの生産効率をより高めることができる新たな方法を提供する。【解決手段】ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法であって、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物をグルコース及び不飽和脂肪酸又はそのエステルを含有する培地中で培養する工程を含み、該培地中のグルコース濃度を１〜２０ｇ／Ｌに維持すること、及び／又は該培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることを特徴とする、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法であって、
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物をグルコース及び不飽和脂肪酸又はそのエステルを含有する培地中で培養する工程を含み、
該培地中のグルコース濃度を１〜２０ｇ／Ｌに維持すること、及び／又は
該培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルが、
一般式（Ｉ）：
【化１】
2017023091.tif 000008
［式中、Ｒは水素原子、アルカリ金属、又は炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは１〜１４の整数を示す。］
で表わされる化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸又はそのエステルが、
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2017023091.tif 000009
［式中、Ｒ及びｎは前記に同じ。］
で表わされる化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記カンジダ属に属する微生物が、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、カンジダ・スクシフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｕｃｃｉｐｈｉｌａ）、カンジダ・ピグナリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｉｇｎａｌｉａｅ）、及びカンジダ・ニトラトフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記カンジダ属に属する微生物が、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の野生株又はその変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ヤロウイア属に属する微生物が、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アルコール脱水素酵素阻害剤が４−メチルピラゾール及び／又はＮ−エチルマレイミドである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、微生物を用いて不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミツバチのローヤルゼリーには、タンパク質、中鎖脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸などが含まれており、中でも、ローヤリゼリー由来のヒドロキシ脂肪酸は多様な生理活性を有することが知られている。例えば、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸は、天然ではローヤルゼリーにのみ含まれるヒドロキシ不飽和脂肪酸であることからローヤルゼリー酸とも称されており、用量依存的に形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１の産生を誘導してヒト皮膚繊維芽細胞のコラーゲン産生能を高める作用を有すること（非特許文献１）、神経幹細胞から神経細胞への発生を促進すること（非特許文献２）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）と結合してアゴニストとして作用すること（非特許文献３）等がこれまでに報告されている。
【０００３】
しかしながら、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸等のヒドロキシ不飽和脂肪酸はローヤルゼリーにごく微量しか含まれておらず、さらにはローヤルゼリー自体が希少であるため、ヒドロキシ不飽和脂肪酸を工業的に大量に生産し、安定的に供給することは困難である。ヒドロキシ不飽和脂肪酸を生産する方法としては、例えば、化学的に合成する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１に記載の合成方法は、ジオール化合物を出発物質としてヒドロキシ不飽和脂肪酸を合成する方法であり、当該方法では多くの工程を要するため、煩雑かつ高コストであり、また生産効率も低いという問題がある。
【０００４】
このような問題点を解決するため、本発明者らは、特定の微生物を用いることにより、低コストで、簡便な操作によりヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造することができる画期的な方法を開発した。本発明者らが開発した方法では、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を、不飽和脂肪酸又はそのエステルを含有する培地中で培養するという簡便な操作によって、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造することが可能である（特許文献２）。さらに、本発明者らは、より効率良くヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造することが可能な手法の開発を進めており、例えば、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの生産能をより高めた微生物変異体の作製に成功している（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０２６９２号公報
【特許文献２】特開２００８−１３６４８８号公報
【特許文献３】特開２０１１−１５５９０８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（４），７６７−７７３（２００４）
【非特許文献２】Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（５），２６１−２６６（２００７）
【非特許文献３】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌｉｓｔ，１２８，１３−３４（１９８６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記した従来技術の問題点及び現状に鑑みてなされたものであり、微生物を用いて不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造する方法において、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの生産効率をより高めることができる新たな方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルをより効率良く製造することができる新たな手法を開発するために鋭意検討を重ねる中で、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を不飽和脂肪酸又はそのエステルを含有する培地中で培養を続けると、生成物であるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの量が経時的に減少してしまうという問題が生じることが確認された（下記参考例参照）。
【０００９】
具体的には、微生物に不飽和脂肪酸であるトランス−２−デセン酸からヒドロキシ不飽和脂肪酸である１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を生成させる場合、培養開始からしばらくの間は培地中に含まれる１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量が経時的に増加するが、ある時点を境に急激に減少してしまう現象が確認された。
【００１０】
本発明者らは、このような現象の解析を進めた結果、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の減少に伴って、不飽和ジカルボン酸であるトランス−２−デセン二酸が検出されることを見出した。なお、当該現象は、必ずしも明確ではないが、微生物が生来有するω酸化系によってヒドロキシ不飽和脂肪酸がジカルボン酸などに代謝される、より具体的には、微生物に含まれるアルコール脱水素酵素やアルデヒド脱水素酵素の作用によりヒドロキシ不飽和脂肪酸のヒドロキシル基が酸化され、不飽和ジカルボン酸などに変換されるものと本発明者らは推察している。
【００１１】
さらに、培地から１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を精製する際に当該培地中にトランス−２−デセン二酸が含まれている場合、トランス−２−デセン二酸と１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸とを分離して精製することは非常に困難であり、高純度の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を得ることができないという問題が生じることが確認された。
【００１２】
本発明者らは、上記した問題点を解決すべくさらに鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、培地中のグルコース濃度を特定の濃度範囲に維持することにより、生産されたヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの量の減少を抑制できることを見出した。さらに驚くべきことに、培養液中にアルコール脱水素酵素阻害剤を配合することによっても生産されたヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの量の減少を抑制できることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらなる研究を重ねることにより本発明を完成させるに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、代表的には以下の項に記載の主題を包含する。
【００１４】
項１．
ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法であって、
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物をグルコース及び不飽和脂肪酸又はそのエステルを含有する培地中で培養する工程を含み、
該培地中のグルコース濃度を１〜２０ｇ／Ｌに維持すること、及び／又は
該培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることを特徴とする、方法。
【００１５】
項２．
前記ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルが、
一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化１】
2017023091.tif 000002
【００１７】
［式中、Ｒは水素原子、アルカリ金属、又は炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは１〜１４の整数を示す。］
で表わされる化合物である、上記項１に記載の方法。
【００１８】
項３．
前記不飽和脂肪酸又はそのエステルが、
一般式（ＩＩ）：
【００１９】
【化２】
2017023091.tif 000003
【００２０】
［式中、Ｒ及びｎは前記に同じ。］
で表わされる化合物である、上記項１又は２に記載の方法。
【００２１】
項４．
前記カンジダ属に属する微生物が、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、カンジダ・スクシフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｕｃｃｉｐｈｉｌａ）、カンジダ・ピグナリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｉｇｎａｌｉａｅ）、及びカンジダ・ニトラトフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項５．
前記カンジダ属に属する微生物が、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の野生株又はその変異体である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２３】
項６．
前記ヤロウイア属に属する微生物が、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２４】
項７．
前記アルコール脱水素酵素阻害剤が４−メチルピラゾール及び／又はＮ−エチルマレイミドである、上記項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法は、微生物を用いて不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを製造する方法において、微生物によるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの代謝を抑制することができる。よって、本発明の方法によれば、自然界において希少であるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】参考例における培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定結果、並びにＨＰＬＣ分析による２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量結果を示す図である。図１中、（Ａ）は培養液の濁度（ＯＤ６６０）の測定結果を、（Ｂ）はグルコース濃度の測定結果を、（Ｃ）は２ＤＡＥｔのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｄ）は１０ＨＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｅ）は２ＤＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、それぞれ示す。また、図１の（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）中の「↓」は、２ＤＡＥｔを１０ｍＬ追添加したことを示す。
【図２】実施例１における培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定結果、並びにＨＰＬＣ分析による２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量結果を示す図である。図２中、（Ａ）は培養液の濁度（ＯＤ６６０）の測定結果を、（Ｂ）はグルコース濃度の測定結果を、（Ｃ）は２ＤＡＥｔのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｄ）は１０ＨＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｅ）は２ＤＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、それぞれ示す。また、図２の（Ａ）及び（Ｂ）における「↓」は、グルコースを追添加したことを示し、（Ｃ）及び（Ｅ）における「↓」は、２ＤＡＥｔを１０ｍＬ追添加したことを示す。
【図３】実施例２における培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定結果、並びにＨＰＬＣ分析による２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量結果を示す図である。図３中、（Ａ）は培養液の濁度（ＯＤ６６０）の測定結果を、（Ｂ）はグルコース濃度の測定結果を、（Ｃ）は２ＤＡＥｔのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｄ）は１０ＨＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、（Ｅ）は２ＤＤＡのＨＰＬＣ分析によるピーク面積を、それぞれ示す。また、図３の（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）における「↓」は、２ＤＡＥｔを１０ｍＬ追添加したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法に関する。なお、以下において、本発明のヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの製造方法を単に「本発明の方法」と記載する場合がある。
【００２９】
本発明の方法により製造されるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルは、一価の低級〜中級不飽和脂肪酸の炭化水素鎖の末端（即ち、カルボキシル基側ではない末端）にヒドロキシ基を有する化合物又はそのエステルである。なお、本明細書において、「低級」とは炭素数が１〜７であることを意味し、「中級」とは炭素数が８〜１７であることを意味する。より具体的には、本発明の方法により製造されるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルは、下記式（Ｉ）で表わされる。
【００３０】
【化３】
2017023091.tif 000004
【００３１】
上記式（Ｉ）におけるＲは、水素原子、アルカリ金属、又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。また、Ｒがアルカリ金属である場合とは、ヒドロキシ不飽和脂肪酸のアルカリ金属塩であることを示す。ヒドロキシ不飽和脂肪酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
【００３２】
上記式（Ｉ）におけるｎは、１〜１４の整数、好ましくは４〜１４の整数、より好ましくは８〜１２の整数を示す。
【００３３】
上記式（Ｉ）で表わされる化合物のうち、ヒドロキシ不飽和脂肪酸の具体例としては、８−ヒドロキシ−トランス−２−オクテン酸、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸、１２−ヒドロキシ−トランス−ドデセン酸などが挙げられ、ヒドロキシ不飽和脂肪酸のエステルの具体例としては、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸メチル、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸エチル、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸プロピル、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸ブチルなどが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法では、不飽和脂肪酸又はそのエステル及びグルコースを含有する培地中で後述する微生物を培養する工程を含む。
【００３５】
本発明の方法において用いる培地に含まれる不飽和脂肪酸又はそのエステルは、後述する微生物によりヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルへと変換されるものであって、一価の低級〜中級不飽和脂肪酸又はそのエステルである。より具体的には、本発明の方法において用いる不飽和脂肪酸又はそのエステルは、下記式（ＩＩ）で表わされる。
【００３６】
【化４】
2017023091.tif 000005
【００３７】
上記式（ＩＩ）におけるＲは、上記式（Ｉ）におけるＲと同様である。具体的には、Ｒは水素原子、アルカリ金属、又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。また、Ｒがアルカリ金属である場合とは、不飽和脂肪酸のアルカリ金属塩であることを示す。不飽和脂肪酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
【００３８】
また、上記式（ＩＩ）におけるｎは、上記式（Ｉ）におけるｎと同様であり、具体的には、ｎは１〜１４の整数、好ましくは４〜１４の整数、より好ましくは８〜１２の整数を示す。
【００３９】
上記式（ＩＩ）で表わされる化合物のうち、不飽和脂肪酸の具体例としては、トランス−２−オクテン酸、トランス−２−デセン酸、トランス−２−ドデセン酸などが挙げられ、不飽和脂肪酸のエステルの具体例としては、トランス−２−デセン酸メチル、トランス−２−デセン酸エチル、トランス−２−デセン酸プロピル、トランス−２−デセン酸ブチルなどが挙げられる。
【００４０】
本発明の方法において用いる微生物は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物である。当該微生物は、不飽和脂肪酸又はそのエステルを、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルに変換する能力を有する。なお、以下において、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物をまとめて単に「微生物」と記載する場合がある。
【００４１】
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物としては、例えば、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、カンジダ・スクシフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｕｃｃｉｐｈｉｌａ）、カンジダ・ピグナリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｉｇｎａｌｉａｅ）、カンジダ・ニトラトフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ）などが挙げられる。これらの中でも、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）は、不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルへの変換能が高いため好ましい。これらのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物は、野生株であってもよいし、変異株であってもよい。
【００４２】
また、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）の中でも、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）  ＫＵ８３株又はその変異株は、不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルへのより高い変換能を有しており、また系内におけるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの量が増加した場合であっても生育が良好であるため、より好ましい。さらに、ＫＵ８３株の中でも、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）  ＫＵ８３−２６株又はその変異株が一層好ましい。
【００４３】
カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）  ＫＵ８３株は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＫＵ８３と命名・表示され、受託日：２００６年１０月４日、受領番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２６６として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８、千葉県木更津市かずか鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００４４】
カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）  ＫＵ８３−２６株は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ＫＵ８３−２６と命名・表示され、受託日：２００９年１２月２４日、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−８５５として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８、千葉県木更津市かずか鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００４５】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物としては、例えば、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）などが挙げられる。これらのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物は、野生株であってもよいし、変異株であってもよい。
【００４６】
本発明の方法において用いる培地は、不飽和脂肪酸又はそのエステル及びグルコースを含有するものであれば特に制限されない。
【００４７】
当該培地における不飽和脂肪酸又はそのエステルの濃度は、微生物の働きによりヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルへと変換される限りにおいて特に制限されず、例えば、０．１〜１００ｇ／Ｌ程度、好ましくは０．５〜５０ｇ／Ｌ程度、より好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ程度である。
【００４８】
なお、後述するように、本発明の方法では、当該培地中のグルコース濃度を特定の濃度範囲に維持することを特徴としている。そのため、培養開始時におけるグルコース濃度（グルコース開始濃度）は微生物が良好に生育する限りにおいて特に制限されず、例えば、１〜２００ｇ／Ｌ程度、好ましくは４０〜１２０ｇ／Ｌ程度、より好ましくは４０〜８０ｇ／Ｌ程度である。
【００４９】
また、当該培地には、微生物の生育を良好にしたり、不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルへの変換効率を高めたりする等の観点から、必要に応じて、その他の成分が含まれていてもよい。
【００５０】
その他の成分としては、例えば、酵母エキス、ポリペプトン、尿素、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）などが挙げられる。
【００５１】
具体的な培地の組成としては特に制限されないが、例えば、イーストアンドモールド培地（ＹＭ培地）を基本培地とし、さらに、グルコースを３０〜２００ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．５〜５０ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウムを０．５〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物を０．１〜１０ｇ／Ｌ、酵母エキスを０．１〜５０ｇ／Ｌ、ポリペプトンを０．１〜５０ｇ／Ｌ、尿素を０．３〜３０ｇ／Ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物を０．００１〜０．１ｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を０．００１〜０．１ｇ／Ｌ、及び硫酸亜鉛七水和物を０．００１〜０．１ｇ／Ｌとなるように配合した培地などを挙げることができる。
【００５２】
また、培地のｐＨは、微生物が良好に生育できる範囲であれば特に制限されず、例えば、５〜８程度、好ましくは６．５〜７．５程度とすればよい。また、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）などを用いてｐＨを調整することができる。
【００５３】
微生物を上記した培地中で培養する方法としては、特に制限されず、例えば、上記した培地を液体培地とし、撹拌、振盪等して培養する方法などが挙げられる。
【００５４】
また、培養温度、培養時間等の培養条件についても特に制限されず、公知の培養条件を適用することができる。例えば、２０〜３７℃程度、好ましくは２４〜３０℃程度、より好ましくは２７〜２９℃程度の培養温度で、１２〜１２０時間程度、好ましくは２４〜６０時間程度培養すればよい。
【００５５】
さらに、本発明の方法は、培地中のグルコース濃度を特定の濃度範囲に維持すること、及び／又は培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることを特徴とする。
【００５６】
培地中のグルコース濃度は、１〜２０ｇ／Ｌ程度、好ましくは１〜１０ｇ／Ｌ程度、より好ましくは２〜１０ｇ／Ｌ程度、特に好ましくは２〜６ｇ／Ｌ程度に維持する。
【００５７】
ここで、「グルコース濃度をＸ〜Ｙｇ／Ｌに維持する」とは、培養開始から培養終了までの間、培地中のグルコース濃度がＸ〜Ｙｇ／Ｌとなるように調整することを意味する。従って、培養を行っている間、一時的に培地中のグルコース濃度がＸ％未満となっていてもよいし、あるいはＹ％を超えていてもよい。
【００５８】
微生物の培養を続けると培地のグルコース濃度が低下するため、グルコース濃度を上記した範囲に維持する具体的な方法としては、例えば、グルコースを培地に添加する方法が挙げられる。この場合、粉末の状態で培地に添加してもよいし、グルコースを含む溶液を調製し、当該溶液を培地に添加してもよい。
【００５９】
また、グルコース濃度を維持する方法としては特に制限されないが、具体的な例をいくつか挙げると、一定時間ごとに培地中のグルコース濃度を測定したり、経時的にグルコース濃度をモニタリングしておき、グルコース濃度が上記した濃度範囲に満たない場合に上記した濃度範囲となるようにグルコースを添加する方法、あるいは微生物のグルコース消費速度等が経験的に分かっているような場合には、当該消費速度からグルコース濃度が上記した濃度範囲未満となる時間を概算し、当該時間毎にグルコースを添加する方法などが挙げられる。より具体的に説明すると、１２時間でグルコースが消費されることが分かっている場合には、１２時間毎にグルコースを添加する方法などが挙げられる。
【００６０】
培地に含まれるアルコール脱水素酵素阻害剤は、アルコール脱水素酵素の阻害作用を有する物質であれば特に制限されないが、入手の容易性等の観点からは、４−メチルピラゾール、Ｎ−エチルマレイミドを用いることが好ましい。
【００６１】
アルコール脱水素酵素阻害剤が培地に含まれる状態となるタイミングについては特に制限されず、培養開始前に培地に添加してもよいし、培養中に培地に添加してもよい。中でも、培養開始前に培地に添加しておくことが好ましい。また、アルコール脱水素酵素阻害剤を添加する方法としても特に制限されず、粉末の状態で培地に添加してもよいし、アルコール脱水素酵素阻害剤を含む溶液を調製し、当該溶液を培地に添加してもよい。
【００６２】
培地に含まれるアルコール脱水素酵素阻害剤の濃度としては、アルコール脱水素酵素阻害作用を発揮できる限りにおいて特に制限されず、例えば、０．１〜２ｇ／Ｌ程度、好ましくは０．１〜１ｇ／Ｌ程度である。
【００６３】
また、本発明の方法では、培地中のグルコース濃度を特定の濃度範囲に維持すること、及び培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることのいずれか一方が達成されていればよく、これら両方が達成されていてもよい。
【００６４】
このように、培地中のグルコース濃度を特定の濃度範囲に維持すること、及び／又は培地にアルコール脱水素酵素阻害剤が含まれることにより、微生物によるヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルのから不飽和ジカルボン酸への代謝を抑制することができる。
【００６５】
以上の本発明の方法では、微生物の作用により不飽和脂肪酸又はそのエステルからヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルが産生され、培地中にヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルが蓄積する。当該培地からヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを単離又は精製することにより、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを得ることができる。
【００６６】
培地からヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを得る方法としては特に制限されず、常法に従って行えばよい。例えば、適切な溶離液が用いられたＨＰＬＣなどの分取手段に供し、波長２１５ｎｍにおける吸光度をモニターし、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルの標品と同じ保持時間を示す画分を分取することにより、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを単離することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、参考例及び実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、下記の参考例、並びに実施例１及び２で用いた培地は、予めオートクレーブ中で、１２０℃、１５分間滅菌処理を施したものである。
【００６８】
参考例
ＹＭ  ｂｒｏｔｈ（ＢＤバイオサイエンス社製）２１ｇを蒸留水１Ｌに溶解したＹＭ培地１２０ｍＬを３００ｍＬ容バッフル付きフラスコに分注し、カンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）  ＫＵ８３−２６−２−１０６株（以下、「ＫＵ−１０６株」と記載する。）の凍結保存菌体懸濁液０．２５ｍＬを当該ＹＭ培地に播種し、２８℃、撹拌速度１４０ｒｐｍの条件下で２４時間振盪することにより前培養を行った。
【００６９】
次いで、予めオートクレーブを行ったトランス−２−デセン酸エチル（２ＤＡＥｔ）１０ｍＬ、及び下記表１に記載のＬＭ改良培地２５００ｍＬを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、上記で得られた前培養液１２０ｍＬを添加してｐＨを７．５に調整した後、２８℃、撹拌速度３５０ｒｐｍ、通気量３．５ｍＬ／ｍｉｎ（１．４４ｖｖｍ）の条件下で９６時間培養を行った。なお、培養継続中に培養液が発泡した場合には消泡剤を添加した。また、培養継続中に、後述するトランス−２−デセン酸エチル（２ＤＡＥｔ）の定量において、培養液中の２ＤＡＥｔがほぼ消費されたことが確認された時点で２ＤＡＥｔを１０ｍＬ追添加した。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
培養開始から０、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、及び９６時間の各時点で培養液５０ｍＬを回収して培養液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した後、１４４００×ｇの条件で５分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収した上清について、グルコース濃度の測定をグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて行った。さらに、回収した上清について、下記の方法に従って、トランス−２−デセン酸エチル（２ＤＡＥｔ）、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸（１０ＨＤＡ）、及びトランス−２−デセン二酸（２ＤＤＡ）の定量を行った。
【００７２】
＜２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量＞
上記で回収した上清５ｍＬを６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した後、アセトフェノン（５０００ｒｐｍ）１ｍＬを内部標準として添加し、等量の酢酸エチルを加えて１分撹拌して抽出を行った。当該抽出操作を２回繰り返した後、抽出液を減圧乾固し、メタノール５ｍＬに溶解してフィルターろ過し、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析の条件を下記表２に示す。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
上記した各時点における培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定結果、並びに２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量結果を図１に示す。
【００７５】
図１（Ａ）から明らかなように培養液の濁度は７２時間の時点まで上昇したことが確認された。なお、必ずしも明確ではないが、図１（Ｂ）よりグルコース濃度は３３時間の時点でほぼ消費されていたことから、ＫＵ−１０６株は、追添加した２ＤＡＥｔを消費して増殖を続けたものと推察される。
【００７６】
また、図１（Ｃ）〜（Ｅ）から明らかなように、培養開始から３３時間の時点までは２ＤＡＥｔのピーク面積の減少に伴って１０ＨＤＡのピーク面積が増加することが確認された。なお、培養開始から３３時間の時点までは、２ＤＤＡのピーク面積の増加はほとんど確認されなかった。これに対して、グルコースがほぼ消費された３３時間の時点付近からは、１０ＨＤＡのピーク面積が減少し、９６時間の時点ではピーク面積がほぼ０であることが確認された。さらに、１０ＨＤＡのピーク面積の減少に伴って、２ＤＤＡのピーク面積が増加することが確認された。当該結果から、グルコースが存在する間は２ＤＡＥｔが１０ＨＤＡに変換され、１０ＨＤＡから２ＤＤＡへの変換は抑制されているが、グルコースが枯渇すると１０ＨＤＡから２ＤＤＡへの変換が促進されることが示唆された。
【００７７】
実施例１
上記参考例と同様にして培養開始から０、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、及び９６時間の各時点の培養液中におけるグルコース濃度を測定し、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ未満であることが確認された時点でグルコースを培養液に添加したこと以外は上記参考例と同様にして培養を行い、培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定、並びに２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量を行った。なお、グルコースは、２４時間経過時点に４０ｇ、３５時間経過時点に１２０ｇ、４８時間経過時点に８０ｇ、及び７４時間経過時点に８０ｇをそれぞれ培養液に追添加し、培養液中のグルコース濃度が１〜２０ｇ／Ｌ程度の範囲内となるように維持した。結果を図２に示す。
【００７８】
図２（Ａ）から明らかなように培養液の濁度は４８時間の時点まで上昇し、その後、緩やかに低下したことが確認された。
【００７９】
また、図２（Ｃ）〜（Ｅ）から明らかなように、１０ＨＤＡのピーク面積は培養開始から９６時間の時点まで継続的に増加することが確認された。なお、培養開始から９６時間の時点まで２ＤＤＡのピーク面積の継続的な増加が確認されたが、当該２ＤＤＡのピーク面積の増加度合いは、グルコースの追添加を行わなかった上記参考例の場合よりもはるかに低いことが確認された。以上の結果から、培養液中におけるグルコース濃度を維持することにより、１０ＨＤＡの減少を抑制でき、さらに、１０ＨＤＡから２ＤＤＡへの変換を抑制できることが分かった。
【００８０】
実施例２
アルコール脱水素酵素阻害剤である４−メチルピラゾールを１ｇ／Ｌ添加したＬＭ改良培地を用いたこと以外は上記参考例と同様にして培養を行い、培養液の濁度（ＯＤ６６０）及びグルコース濃度の測定、並びに２ＤＡＥｔ、１０ＨＤＡ及び２ＤＤＡの定量を行った。結果を図３に示す。
【００８１】
図３（Ａ）から明らかなように、培養液の濁度は２４時間まで上昇し、その後緩やかに低下したことが確認された。さらに、図１（Ｂ）と図３（Ｂ）とを比較すると、４−メチルピラゾールの添加により、グルコースの消費速度が低下することが確認された。
【００８２】
また、図３（Ｃ）〜（Ｄ）から明らかなように、１０ＨＤＡのピーク面積は培養開始から９６時間の時点まで継続的に増加することが確認された。なお、培養開始から９６時間の時点まで２ＤＤＡのピーク面積の緩やかな増加が確認されたが、当該２ＤＤＡのピーク面積の増加度合いは、上記参考例の場合よりもはるかに低く、また、実施例１の場合よりも低いことが確認された。以上の結果から、培養液に４−メチルピラゾールなどのアルコール脱水素酵素阻害剤を添加することにより、１０ＨＤＡの減少を抑制でき、さらに、１０ＨＤＡから２ＤＤＡへの変換を抑制できることが分かった。
【００８３】
以上の実施例１及び２の結果から、培養液中におけるグルコースの濃度を１〜２０ｇ／Ｌの範囲内に維持すること、及び／又は培養液にアルコール脱水素酵素阻害剤を添加することにより、ヒドロキシ不飽和脂肪酸又はそのエステルを効率良く生産することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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