(57)【要約】    【課題】  補体第３成分の活性化をより効果的に行い得る物質及びその物質の製造方法並びにその物質を有効成分とする補体第３成分活性化剤の提供。    【解決手段】  クロレラの細胞壁破砕物を熱水抽出して得られた抽出液から分子量１０，０００以下の低分子物質を除去し、得られた粗多糖を分画し、精製して得られるペプチドヘテロ多糖体及びその製法並びにペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質(a)乃至(e)を有するペプチドへテロ多糖体。
(a) 平均分子量：１００万
(b) 比旋光度：〔α〕Ｄ -11.6 （測定温度２５℃）
(c) 窒素含量5.39%、蛋白質含量29.5%、多糖含量70.3%
(d) 糖組成（モル比）：Gal:GIc:Man:Xyl:Rha:Ara:Fru=32:25:13:8:7:5:3
(e) アミノ酸組成（モル％）：
Glu 15.1
Asp 13.8
Ala 9.9
Leu 8.9
Thr 6.5
Lys 6.2
Va1 5.9
Gly 5.8
Pro 5.5
Ser 5.4
Arg 4.8
Phe 3.6
Ileu 3.1
Tyr 2.1
His 1.7
Met 1.6
Cys 0.1
合計 100%
【請求項２】
クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液由来である請求項１記載のペプチドへテロ多糖体。
【請求項３】
クロレラの細胞壁破砕物を熱水抽出して得られた抽出液から分子量１０，０００以下の低分子物質を除去し、分子量１０，０００以下の低分子物質が除去された液を得、
この液に無水エタノールを加え、その沈殿物として粗多糖を得、
得られた粗多糖を水に溶解させ、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた画分を更にゲル濾過法に供して精製することによって請求項１記載のペプチドヘテロ多糖体を得ることを特徴とするペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【請求項４】
熱水抽出が、９５乃至１００℃の熱水により行われる請求項３記載のペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【請求項５】
上記クロレラがクロレラ・ピレノイドサである請求項３又は４記載のペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤。
【請求項７】
補体を活性化する経路が補体第２経路である請求項６記載の補体第３成分活性化剤。
【請求項８】
経口投与剤である請求項６又は７記載の補体第３成分活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラから得られるペプチドヘテロ多糖体及びその製造方法並びに前記ペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
防御機構の中で一番原始的な機構は、マクロファージに代表される食作用と補体の活性化に始まる一連の防御機構である。
【０００３】
補体とマクロファージは、病原微生物を含む外因性の異物の侵入、自己由来の異物的成分、老廃物、過剰生産物、不用となった活性化物などを処理し、生体の恒常性（ホメオスターシス）を保つうえで大変重要な役割を果たしている。
【０００４】
補体第３成分（C3）を中心とした補体活性化経路は、リンパ球、マクロファージ、赤血球、血小板、顆粒性白血球、肥満細胞などの細胞性因子に作用し、これらの生物学的活性に重要な役割を果たしている。特に生体防御反応において補体は、免疫溶血、溶菌、食作用、オプソニン化、走化性、免疫細胞溶解、および補体依存性細胞溶解など多彩な役割を示す。さらに、体液性免疫の主因子である補体は、細胞性免疫にも関与している。
【０００５】
クロレラの細胞壁破砕物から熱水で抽出された、分子量１万以上の多糖体を有効成分とする補体第３成分の活性化については、特開２０１５−４４７５３号公報に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−４４７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、補体第３成分の活性化をより効果的に行い得る物質及びその物質の製造方法並びにその物質を有効成分とする補体第３成分活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のペプチドヘテロ多糖体及びその製造方法並びに補体第３成分活性化剤は、次のように表すことができる。
【０００９】
(1) 下記理化学的性質(a)乃至(e)を有するペプチドへテロ多糖体。
(a) 平均分子量：１００万
(b) 比旋光度：〔α〕Ｄ -11.6 （測定温度２５℃）
(c) 窒素含量5.39%、蛋白質含量29.5%、多糖含量70.3%
(d) 糖組成（モル比）：Gal:GIc:Man:Xyl:Rha:Ara:Fru=32:25:13:8:7:5:3
(e) アミノ酸組成（モル％）：
Glu 15.1
Asp 13.8
Ala 9.9
Leu 8.9
Thr 6.5
Lys 6.2
Va1 5.9
Gly 5.8
Pro 5.5
Ser 5.4
Arg 4.8
Phe 3.6
Ileu 3.1
Tyr 2.1
His 1.7
Met 1.6
Cys 0.1
合計 100%
【００１０】
(2) クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液由来である上記(1)記載のペプチドへテロ多糖体。
【００１１】
(3) クロレラの細胞壁破砕物を熱水抽出して得られた抽出液から分子量１０，０００以下の低分子物質を除去し、分子量１０，０００以下の低分子物質が除去された液を得、
この液に無水エタノールを加え、その沈殿物として粗多糖を得、
得られた粗多糖を水に溶解させ、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた画分を更にゲル濾過法に供して精製することによって上記(1)記載のペプチドヘテロ多糖体を得ることを特徴とするペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【００１２】
(4) 熱水抽出が、９５乃至１００℃の熱水により行われる上記(3)記載のペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【００１３】
(5) 上記クロレラがクロレラ・ピレノイドサである上記(3)又は(4)記載のペプチドヘテロ多糖体の製造方法。
【００１４】
(6) 上記(1)又は(2)記載のペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤。
【００１５】
上記(2)乃至(4)の何れか１項に製造方法により得られたペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤。
【００１６】
(7) 補体を活性化する経路が補体第２経路である上記(6)記載の補体第３成分活性化剤。
【００１７】
(8) 経口投与剤である上記(6)又は(7)記載の補体第３成分活性化剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のペプチドヘテロ多糖体及び本発明の製造法により得られたペプチドヘテロ多糖体並びに本発明のペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする補体第３成分活性化剤は、補体第３成分（C3）を効果的に活性化し得、更に、マクロファージを効果的に活性化し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】デキストランについての抗原抗体交叉免疫電気泳動パターンである。
【図２】カワラタケ由来のATSOについての抗原抗体交叉免疫電気泳動パターンである。
【図３】FA-1aについての抗原抗体交叉免疫電気泳動パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
(1) 本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００２１】
(2) 本発明のペプチドヘテロ多糖体の製造に用い得るクロレラ（好ましくはクロレラ・ピレノイドサ）の細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００２２】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００２３】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
【００２４】
(3) 本発明のペプチドヘテロ多糖体は、例えば次のように製造することができる。
【００２５】
クロレラ（好ましくはクロレラ・ピレノイドサ）の細胞壁破砕物（例えば、細胞壁破砕物を真空乾燥した後、粉砕した物）を、熱水抽出（例えば９５−１００℃の熱水による抽出。抽出時間は例えば２時間であるがこれに限らない。）し、抽出液を、例えば抽出後静置して上澄として、得る。
【００２６】
得られた抽出液（好ましくは遠心分離による上澄液）から分子量１０，０００以下の低分子物質を、例えば透析濾過又は限外濾過により、除去し、分子量１０，０００以下の低分子物質が除去された液を得る。
【００２７】
この液に（例えば３倍体積量の）無水エタノールを加え，その沈殿物（例えば遠心分離を行った沈殿物）として粗多糖（FA）を得る。この粗多糖（FA）は、前記沈殿物を無水エタノールで洗浄し、次いで無水エーテルで洗浄し、乾燥（好ましくは真空乾燥）させたものであることが好ましい。
【００２８】
得られた粗多糖（FA）を水に溶解させ、イオン交換クロマトグラフィー［例えば、和光純薬工業社製のDEAE-Cellulose（Cl−）を使用］及び必要な勾配溶離［例えば、（gradient elution with 0→1.0M NaCl）］に供して分画し、画分（FA-1）を得る。
【００２９】
FA-1をゲル濾過法に供して精製することによって、すなわち、例えば和光純薬工業社製のSephadex G-50等を使用したゲル濾過法及び必要な勾配溶離[例えば（gradient elution with 0→2.0M NaCl）］により精製することによって、FA-1a、すなわち本発明のペプチドヘテロ多糖体を得ることができる。
【００３０】
(4) 本発明のペプチドヘテロ多糖体は、下記理化学的性質(a)乃至(e)を有する。好ましくはクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液由来のペプチドヘテロ多糖体である。
(a) 平均分子量：１００万
(b) 比旋光度：〔α〕Ｄ -11.6 （測定温度２５℃）
(c) 窒素含量5.39%、蛋白質含量29.5%、多糖含量70.3%
(d) 糖組成（モル比）：Gal:GIc:Man:Xyl:Rha:Ara:Fru=32:25:13:8:7:5:3
(e) アミノ酸組成（モル％）：
Glu 15.1
Asp 13.8
Ala 9.9
Leu 8.9
Thr 6.5
Lys 6.2
Va1 5.9
Gly 5.8
Pro 5.5
Ser 5.4
Arg 4.8
Phe 3.6
Ileu 3.1
Tyr 2.1
His 1.7
Met 1.6
Cys 0.1
合計 100%
【００３１】
(5) 本発明の補体第３成分活性化剤は、上記(4)記載のペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする。或いは、上記(3)記載の製造方法により得られたペプチドヘテロ多糖体を有効成分とする。
【００３２】
本発明の補体第３成分活性化剤が補体を活性化する経路としては、補体第２経路を挙げることができる。
【００３３】
本発明の補体第３成分活性化剤は、経口投与の他、補体第３成分活性化剤として通常採用し得る他の各種剤形において適用可能である。
【００３４】
本発明の補体第３成分活性化剤における経口投与の形態に特に限定はないが、
例えば、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、水に溶解した液剤若しくはその他の液剤とすることができる。
【００３５】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００３６】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００３７】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００３８】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００３９】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００４０】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００４１】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【００４２】
なお、本発明の補体第３成分活性化剤のヒトの服用量は、有効成分であるペプチドヘテロ多糖体の含有量において、例えば３ｍｇ乃至２５０ｍｇ／日程度が好ましい。
【実施例】
【００４３】
ペプチドへテロ多糖体の補体第３成分活性化効果について試験を行った。
【００４４】
１．被験物質の製造
【００４５】
(1) 細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）の乾燥粉末（以下、単に「クロレラ」とも言う。）を、次のように製造した。
【００４６】
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］  WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末が得られた。
【００４７】
(2) 得られた細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末を水に懸濁させた後、９５乃至１００℃で２時間煮沸した。
【００４８】
これを常温に冷却した後、静置状態で上澄をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（日本真空技術社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過して第１の濾過残渣を得た。
【００４９】
前記静置状態における沈殿物を、再度、９５乃至１００℃で２時間にわたり水で煮沸し、これを常温に冷却した後、静置状態で上澄をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（日本真空技術社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過して第２の濾過残渣を得、第１の濾過残渣と第２の濾過残渣を混合した。
【００５０】
この混合物を３℃で１２時間静置した後、室温で10,000 rpmで２０分間遠心分離処理し、上澄と沈殿に分けた。
【００５１】
この上澄を回収して３℃でダイアフィルターＧ−１０Ｔ（日本真空技術社製：分画分子量１００００）を用いて限外濾過することにより、非濾過画分（M.W. 10,000以上）と濾過画分（M.W. 10,000以下) を得た。
【００５２】
この非濾過画分に、容量の３倍の無水エタノールを加えて室温で10,000 rpmで遠心分離処理し、上澄と沈殿に分けた。
【００５３】
沈殿は、無水エタノールで３回洗浄後、無水エーテルで１回洗浄した。その後、４０℃で真空乾燥してFA（粗多糖）を得た。
【００５４】
FAを水に溶解させ、イオン交換クロマトグラフィー［和光純薬工業社製のDEAE-Cellulose（Cl−）を使用］及び勾配溶離［（gradient elution with 0→1.0M NaCl）］に供して画分FA-1、FA-2、FA-3に分画した。
【００５５】
画分FA-1を、ゲル濾過法［和光純薬工業社製のSephadex G-50を使用］及び勾配溶離（gradient elution with 0→2.0M NaCl）により精製することによって、FA-1aを得た。
【００５６】
クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末４００ｇからの粗多糖FAおよび本発明のペプチドヘテロ多糖体FA-1aの収量は、真空凍結乾燥粉末でそれぞれ１５．６３ｇ及び２５３．２７ｍｇであった。
【００５７】
FA-1aを下記のように分析した結果、下記理化学的性質(a)乃至(e)を有するペプチドヘテロ多糖体であることが判明した。
【００５８】
(i) 糖組成の分析  
【００５９】
全糖については，フェノール硫酸法（比色法）により分析した。
【００６０】
構成糖組成の分析は次のように行った。
【００６１】
検体であるFA-1a（２mg）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，０．５mＬ）に溶解させ、その溶液に対し水酸化ナトリウム（２０mｇ）及びヨウ化メチル（０．２mＬ）を添加した。
【００６２】
これを撹拝した後、クロロホルム（１．５mＬ）で抽出を行い、減圧乾固してメチル化多糖を得た。
【００６３】
これに対し８０％ギ酸（１mＬ）を添加し滅圧乾固した後、２Ｎトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）によりメチル化多糖を得た。
【００６４】
これに８０％ギ酸（１mＬ）を添加し滅圧乾固した後、２Ｎトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）によりメチル化多糖を加水分解し、滅圧乾固して部分メチル化多糖を得た。
【００６５】
この部分メチル化多糖に少量の蒸留水と水酸化ホウ素ナトリウム（５mｇ）を添加し、一晩放置後、酢酸で水酸化ホウ素ナトリウムを分解した。
【００６６】
更にホウ酸を除去して部分メチル化アルジトールを得た。これに無水酢酸・ピリジン（１：１）混合液（１mＬ）を加え４時間加熱後、冷却乾固した。続いてクロロホルム（２ｍＬ）と蒸留水（１ｍＬ）を添加して混合後、クロロホルム層を回収して無水硫酸ナトリウム（１．５ｇ）を添加し、脱水処理を行った後、減圧乾固した。
【００６７】
これを蒸留水２００μＬに溶解させ、その溶液３０μＬを高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬＣ）分析（島津LC-9A型）に供し、構成糖の同定・定量を行つた。
【００６８】
(ii) 全窒素の定量
【００６９】
セミミクロナルダール法により測定した。
【００７０】
(iii) タンパクの定量
【００７１】
タンパク定量はLowry法により行なった。
【００７２】
(iv) アミノ酸分析
【００７３】
検体（1mg）を６Ｎ塩酸（1mL）と共に封管し，110℃，20時間の加水分解処理後，日立８３５型アミノ酸自動分析装置に供した。
【００７４】
(v) 平均分子量の測定
【００７５】
平均分子量の測定は，ゲル濾過法（Sephadex G-100、和光純薬工業）により行った。
【００７６】
ゲル濾過用多糖分子量マーカーには，α−１，６結合の直鎖状多糖類pullulanキットShodex standard P-82（昭和電工）および標準デキストラン（Sigma-Aldrich）を用いた。
【００７７】
(vi) 比旋光度の測定
【００７８】
比旋光度の測定には円木分光自動旋光計（DIP-360型）を用い、測定温度は２５℃とした。
(a) 平均分子量：１００万
(b) 比旋光度：〔α〕Ｄ -11.6 （測定温度２５℃）
(c) 窒素含量5.39%、蛋白質含量29.5%、多糖含量70.3%
(d) 糖組成（モル比）：Gal:GIc:Man:Xyl:Rha:Ara:Fru=32:25:13:8:7:5:3
(e) アミノ酸組成（モル％）：
Glu 15.1
Asp 13.8
Ala 9.9
Leu 8.9
Thr 6.5
Lys 6.2
Va1 5.9
Gly 5.8
Pro 5.5
Ser 5.4
Arg 4.8
Phe 3.6
Ileu 3.1
Tyr 2.1
His 1.7
Met 1.6
Cys 0.1
合計 100%
【００７９】
２．交叉免疫電気泳動法による補体活性能の測定
【００８０】
(1) 材料
【００８１】
ヒト新鮮自家血清0.2mLを分注した蓋付き遠心管（2mL）に、被検物質であるFA-1a  200μg、陰性対照としてデキストラン（分子量228,000；半井化学薬品製）200μg，陽性対照としてカワラタケ由来のATSO  200μgを加え、これらを被検血清とした。
【００８２】
陽性対照として用いたカワラタケ由来のATSOは、β-1,3グルコシド結合をもつ直鎖のグルコース残基３個に対して１個の割合で、１分子のグルコースがβ-1,6グルコシド結合を介して分岐する多糖体であり、抗腫瘍活性と補体C3活性を示す。本発明のペプチドヘテロ多糖体であるFA-1aは、β(1,3)(1,6)グルカン構造を有するATSOとは異なる物質である。
【００８３】
なお、FA-1aに、抗原特異性をもった多糖体とりン脂質、すなわち０抗原（内毒素エンドトキシン）のリピドＡが結合してできたリポ多糖体の混在する可能性については、リムルス試験を実施して陰性であったことにより否定された。
【００８４】
(2) 測定方法
【００８５】
各被検血清の補体活性能は，抗原・抗体交叉免疫泳動法（antigen-antibody Crossed immunoelectrophoresis [志村圭志郎、塩見俊朗、伊藤均、成瀬千助  ATSOの添加によりConvertしたC3の抗原・抗体交差電気泳動像による残余C3活性の測定  医学のあゆみ 1977 103 20-22]、[Shimura K, Ito H, Hibasami H  Screening of host-mediated antitumor polysaccharides by crossed immunoelectrophoresis using fresh human serum Jpn. J. Pharmacol 1983 33 403-408])により測定した。
【００８６】
電気泳動はTricine veronal buffer（TVB）（pH8.6,μ=0.05）の条件下で行なった。支持体として、agarose A-45（ナカライテクス）をTVBで1.2%に溶解して調製した1.2% agarose-TVBを用いた。
【００８７】
抗ヒト血清については、human C3（Gene Tex.Inc.）をFreund's complete adjuvant（Difco Lab.）と共にウサギに免疫して作製した。抗ヒト血清は、1.2% agarose-TVBで１０倍希釈したものを76×76mmのスライドガラス上に5mL流し固め、これをimunoplateとして用いた。
【００８８】
これとは別に、スライドガラス上で被検血清5μLを含む1.2% agarose-TVB（6-7mm幅）を電気泳動した後、これを抗ヒト血清10%を含むimmunoplate上に載せ、二次元的に展開泳動を行った。なお、泳動条件は1.2mA/cm, 5時間とした。
【００８９】
(3) 測定結果
【００９０】
このようにヒト新鮮自家血清を用いて行なった二次元の抗原抗体交叉免疫電気泳動パターンをそれぞれ図１乃至図３に示す。図１乃至図３において、右が陽極（＋）、左が陰極（−）である。
【００９１】
図１乃至図３に示されるように、デキストラン（陰性対照）、ATSO（陽性対照）、FA-1aで、Tr（トランスフェリン）とα２-M（マクログロブリン）のピークの変動はほとんど認めらわなかった。
【００９２】
陰性対照であるデキストランでは、C3（native C3）がＴｒの（−）側の内側に沿って直立し（＋）側に裾野を形成するパターンとして出現した（図１）。
【００９３】
これに対し、ATSOとFA-1aでは、native C3のピークは低下し、変換C3（converted C3）は三峰性を示して（＋）側にシフトした（図２及び図３における文字が添えられていない矢印）。デキストラン、ATSO及びFA-1aの泳動パターンを比較すると、安定なα２-Mのピークと変換C3のピークの高さの比率は、デキストランで最も低く、ATSOとFA-1aはほぼ同程度であった。
【００９４】
以上の結果から、FA-1aもATSOと同様に補体第３成分(C3)活性化剤として作用することが確認された。
【００９５】
補体活性化経路としては，古典経路（C1assical pathway）といわわるC1→C4→C2→C3→C5→C6→C7→C8→C9の順で活性化する経路と、補体第２経路（alternative pathway）といわわるC1、C4、C2を活性化することなく，C3以降（C3→C5→C6→C7→C8→C9）を活性化する径路が知られている。
【００９６】
補体第１成分のC1は、C1q、C1r、C1sの３つの成分がCa2+を介して結合した複合体である。Ca2+キレート試薬エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）N, N, N', N'−四酢酸（EGTA）10mM存在下でFA-1a及びATSOのそれぞれについて電気泳動を行っても、同様の泳動パターンが認められた。
【００９７】
このことより、FA-1aとATSOは、何れも補体第２経路に働き、補体C3を活性化することか明らかとなった。
【００９８】
なお、上記の分子量１万未満の多糖体からなる濾過画分（M.W. 10,000以下) が、陰性対照であるデキストランと同様の泳動パターンを示すことは、特願２０１３−１７５４４０（特開２０１５−４４７５３号公報）に開示した通りである。
【００９９】
３．生体内補体C3活性の測定
【０１００】
(1) 実験動物および飼育条件
【０１０１】
６適齢のICR/Slc雌マウス（日本エスエルシー社製）を、温度２３±２℃、相対湿度５５±５％、明暗サイクル１２時間（８時開始）のバリアシステム環境下で飼育し、固型飼料（クレアCE-7，日本クレア社製）と水道水を自由に摂収させた。
【０１０２】
７日間の予備飼育の後、一般症状観察及び尿検査で異常が認められなかったマウスを１群１０匹としてプラスチックケージに５匹ずつ飼育して試験に供した。
【０１０３】
(2) 測定方法
【０１０４】
各群のマウスに、被検物質としてFA-1a（50mg/kg）及びATSO(150mg/kg)、対照物質としてデキストラン(250mg/kg)を、１日２回、７日間連日、胃カテーテルにより強制的に経口投与した。
【０１０５】
最終投与２時間後に、次のようにして腹腔内マクロファージを採取し、細胞数測定を行なった。
【０１０６】
エーテル麻酔下のマウスを脱血した後、腹腔内にリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline, PBS)3mLを注射器で注入した。軽く腹部を揉んでから腹部の皮膚を剥ぎ、ピンセットで腹膜をつかみ、ハサミで少し切り口を開け、駒込ピペットで腹腔滲出細胞浮遊液を全て遠心管に採取し、直ちに氷水中に保存した。
【０１０７】
採取した腹腔滲出細胞浮遊液は、各々遠心管に入れて遠心分離（225×g，３分間）し、上清を捨て氷冷したPBS 3mLを加えて腹腔滲出細胞を再浮遊させた。同様の操作を３回行い、細胞を洗浄した。
【０１０８】
最後の上清を捨てた後、無血清培地（cosmedium 001，コスモ・バイオ社製）2mLを入れてピペットで細胞を浮遊させ、ペトリ皿（3.5×10mm）に移し、ＣＯ２インキュベーターで37℃，２時間インキュベートした。
【０１０９】
この腹腔滲出細胞浮遊液の一部をメランジュールにとり、Turk液で希釈して血球計算盤で細胞数を計測した。
【０１１０】
採取した腹腔内マクロファージの一部はEagle培地（ニッスイ社製）に浮遊させ、カバースリップに付着させた。PBSでカバースリップに付着しない細胞を洗い落とし、直ちにエタノールで固定した。次いで，このカバースリップを、抗マウスC3F(ab')2と反応させ、よく洗浄した後にフルオレセインイソチオアネート（FITC）標識抗ウサギ免疫グロブリンG(IgG)と反応させて、マクロファージの補体レセプター（CR）に結合するC3 cleavage抗原の存在を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１１】
また、残りの腹腔内マクロファージをEagle培地に浮遊させ、ラテックスビーズ（1.1μｍ，Sigma-Aldrich）を加えてよく混合した後、カバースリップを置いたシャーレに注ぎ、37℃で２時間インキュベートした。PBSで洗浄後、エタノールで直ちに固定し、ギムザ染色を行って抗体非依存性のラテックスビーズの貪食能を顕微鏡下で観察した。
【０１１２】
(3) 結果
【０１１３】
結果を表１に示す。
【０１１４】
デキストラン投与群とFA-1a及びATSO投与群との比較はStudentのt検定、比率の差の検定にはχ２検定を用いた。統計処理はDunnettのt検定で行い、５％未満を有意差あり（＊）と判定した。貪食能の亢進率以外の数値は、平均値±標準偏差を表す。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
デキストラン投与マウスでは、蛍光陽性細胞が22.5%認められた。これに対し、FA-1a投与マウスでは51.4%、ATSO投与マウスでは63.7%と著明に増加した。
【０１１７】
また、ラテックスビーズの貪食はデキストラン投与マウスの腹腔内マクロファージが取り込む総数を対照とした場合、FA-1a投与マウスでは2.7倍、ATSO投与マウスでは4.2倍を示した。
【０１１８】
マウスに対するFA-1a経口投与により、C3蛍光陽性細胞数および腹腔内マクロファージ数の増加、更に腹腔内マクロファージの抗体非依存性貪食能の上昇が認められた。この結果から、生体内補体活性化によって生成したC3 cleavage抗原は，マクロファージのCR1あるいはCR3レセプターと結合し、これが引き金となってマクロファージのカスケード的活性化に関与しているものと考えられる。また、FA-1a経口投与により、補体C3より変換されたC3 Cleavage（C3ａ、C3ｂ、ｉC3ｂ）の一つであるC3ｂがマクロファージの細胞膜上に存在するC3ｂ受容体に結合し、その結果としてマクロファージの活性化が引き起こされたと考えられる。
【０１１９】
４．以上のように、FA-1aは、抗体非依存性の貪食能を亢進し、異物排除機構を促進させるので、抗癌剤投与時に見られる免疫抑制作用の軽減や病原微生物による感染防御の面から、生体防御機構に有利に作用すると考えられ、Fa-1aは免疫応答を非特異的に増強又は修飾する物質として、補助免疫化学療法(adjuvant immuno-chemotherapy)においても有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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