(57)【要約】      （修正有）【課題】分子認識素子側でセンサのシグナルを増幅することが可能なセンサ、それに用いる光開裂性マイクロカプセル、及びそれらを用いた被測定物質の測定方法を提供する。【解決手段】光開裂性マイクロカプセルは、内側から外側に向かって骨格層１、脂質二重膜２、外殻層３、抗体修飾層４の順の多層構造とされている。骨格層１はポリカリオン及びポリアニオンの高分子電解質が交互に積層されており、脂質二重膜２はカチオン型の両親媒性物質の２分子膜からなり、外殻層３は光触媒として機能するTiO2から構成されている。さらに、抗体修飾層４は自己組織化単分子膜に抗体５が結合している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に修飾されたマイクロカプセルであって、
該マイクロカプセルの内部には受光素子による検知を可能とするための物質が内包されており、該マイクロカプセルの殻壁は光触媒と、該光触媒への光照射によって分解される材料とを含むことを特徴とするセンサシグナル増幅用の光開裂性マイクロカプセル。
【請求項２】
前記受光素子による検知を可能とするための物質は、発光前駆体を発光させるための触媒、色素前駆体を色素に変換するための触媒、吸光物質及び蛍光物質のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の光開裂性マイクロカプセル。
【請求項３】
前記分子認識プローブは抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の光開裂性マイクロカプセル。
【請求項４】
前記抗体は抗原をサイトカインとする抗体であることを特徴とする請求項３に記載の光開裂性マイクロカプセル。
【請求項５】
前記マイクロカプセルは骨格層と、該骨格槽を被覆する脂質二重膜と、該脂質二重膜を被覆し光触媒を含有する外殻層とを備えることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光開裂性マイクロカプセル。
【請求項６】
前記請求項１乃至５のいずれかの光開裂性マイクロカプセルと、
前記被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に固定された固定部と、
該固定部又は被測定液に光を照射するための光照射部と、
前記受光素子による検知を可能とするための物質の作用によって生じた光を感知する光受光部と、
を備えることを特徴とするセンサ。
【請求項７】
被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に固定された固定部に被測定物質を含む測定液を接触させる第１工程と、
該固定部上の該被測定液を除去する第２工程と、
該被測定物質が該分子認識プローブに捕捉された該固定部に請求項１乃至５のいずれかの光開裂性マイクロカプセルを分散させたカプセル含有液を接触させる第３工程と、
該固定部上の該カプセル含有液を除去する第４工程と、
該固定部又は該除去されたカプセル含有液に光を照射して該光開裂性カプセルを開裂させて受光素子による検知を可能とするための物質を放出させる第５工程と、
該物質の作用によって生じた光の強度をセンシングする第６工程と、
を備えるの被測定物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光開裂性マイクロカプセル、それを用いたセンサ、及びそれを用いた被測定物質の測定方法に関し、バイオマーカーの高感度測定のために用いて好適である。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカーの高感度測定には，クロマトグラフィー，酵素標識免疫測定 (ELISA)，電気泳動などがあるが，多大な時間と煩雑な作業に対する労力やコストが必要である。バイオマーカーの可視化デバイスには，迅速で高感度な計測が求められる。化学反応は拡散現象なので，サンプル量が少ないほど迅速・高感度化に有利であり，微小な基板上に設けた分注槽，混合槽，反応槽，廃液槽など複数の液槽を，流路で繋いだ微細な流路システムを採用したバイオセンサが最適である。
【０００３】
バイオセンサは、目的物質のみを認識する部分（分子認識素子）と、認識した情報をシグナルに変換する部分（信号変換素子）とから構成されており、両素子の特性がセンサ性能を左右する。通常は信号変換素子がシグナルの増幅を兼ねており、分子認識素子側においてシグナル増幅を行うことについては、ほとんど報告されていない。
【０００４】
一方、本発明に関連する技術として、マイクロカプセルにフェロセン化合物を内包させておき、カプセルを破壊することによって放出されたフェロセン化合物をメディエータとして用い、その酸化電流をアンペロメトリックに測定するという電気化学センサがある（特許文献２）。
また、脂質二重層からなるマイクロカプセルの表面にSiO2-TiO2膜をコーティングし、TiO2の光触媒能を利用して光開裂を起こさせるマイクロカプセルの技術が知られている(非特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２１０４１７号公報
【特許文献２】特開２０１１−１４５０７９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tunable UV-Responsive Organic-Inorganic HybridCapsules Kiyofumi Katagiri , Kunihito Kournoto, Shogo IseyaMototsugu Sakai. Atsunori Matsuda,and Frank Caruso
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は分子認識素子側でセンサのシグナルを増幅することが可能なセンサ、それに用いる光開裂性マイクロカプセル、及びそれらを用いた被測定物質の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の光開裂性マイクロカプセルは、被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に修飾されたマイクロカプセルであって、該マイクロカプセルの内部には受光素子による検知を可能とするための物質が内包されており、該マイクロカプセルの殻壁は光触媒と、該光触媒への光照射によって分解される材料とを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の光開裂性マイクロカプセルでは、被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に修飾されているため、被測定液と接触させた場合に、分子認識プローブが被測定物質と結合してマイクロカプセル−被測定物質複合体を形成することができる。このため、この複合体を含んだ被測定液を被測定物質が固定化された固定部に接触させた場合、固定部に固定化された被測定物質に分子認識プローブを介してマイクロカプセルが固定化される反応と、測定液中に存在する被測定物質に分子認識プローブを介してマイクロカプセルが結合する反応とが起こる。さらに、このマイクロカプセルの内部には受光素子による検知を可能とするための物質が内包されており、該マイクロカプセルの殻壁は光触媒と、該光触媒への光照射によって分解される材料とを含むため、固定部に固定化されたマイクロカプセル、又は、固定部に固定化されず留去されたマイクロカプセルに光を照射すれば、カプセルの殻壁が光触媒の作用によって破壊され、内包されていた多数の物質が放出される。そして、この放出された多数の物質は、受光素子による検知を可能とするための物質であるため、放出された物質の量に応じてセンサのシグナルを増幅することができる。
【００１０】
本発明の光開裂性マイクロカプセルに内包させる物質としては、受光素子による検知を可能とする物質であれば特に限定はない。このような物質としては、例えば、発光前駆体を発光させるための触媒（例えば、アルカリホスファターゼのように、発光前駆体を分解して発光する反応を促進する酵素等）、色素前駆体を色素に変換するための触媒、吸光物質、蛍光物質等が挙げられる。
【００１１】
また、本発明の光開裂性マイクロカプセルの表面に修飾されている分子認識プローブとしては、被測定物質と特異的に結合することが可能なプローブであれば特に限定はない。このような分子認識プローブとして、例えば、抗原と特異的に結合して複合体を形成する抗体、基質と複合体を形成する酵素、特定の塩基配列にコードされる遺伝子等が挙げられる。
【００１２】
また、本発明の光開裂性マイクロカプセルは骨格層と、該骨格槽を被覆する脂質二重膜と、該脂質二重膜を被覆し光触媒を含有する外殻層とを備えた構造とすることができる。
【００１３】
本発明の光開裂性マイクロカプセルを用いれば、分子認識素子側でセンサのシグナルを増幅することが可能なセンサを構築することができる。すなわち、本発明の光開裂性マイクロカプセルと、被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に固定された固定部と、該固定部又は被測定液に光を照射するための光照射部と、前記受光素子による検知を可能とするための物質の作用によって生じた光を感知する光受光部とを備えるセンサである。
【００１４】
このセンサを用いて、次の方法により分子認識素子側でセンサのシグナルを増幅することができる。すなわち、
被測定物質と特異的に結合することが可能な分子認識プローブが表面に固定された固定部に被測定物質を含む測定液を接触させる第１工程と、
該固定部上の該被測定液を除去する第２工程と、
該被測定物質が該分子認識プローブに捕捉された該固定部に請求項１乃至４のいずれかの光開裂性マイクロカプセルを分散させたカプセル含有液を接触させる第３工程と、
該固定部上の該カプセル含有液を除去する第４工程と、
該固定部又は該除去されたカプセル含有液に光を照射して該光開裂性カプセルを開裂させて受光素子による検知を可能とするための物質を放出させる第５工程と、
該物質の作用によって生じた光の強度をセンシングする第６工程と、
を備えるの被測定物質の測定方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、例えばバイオセンサにおいて、分子認識素子側でセンサのシグナルを増幅することが可能となるため、被測定物質（がん等のバイオマーカー等）の高感度な測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施形態の光開裂性マイクロカプセルの模式断面図である。
【図２】実施形態の光開裂性マイクロカプセルに内包されているアルカリホスファターゼの模式図である。
【図３】実施形態の光開裂性マイクロカプセルを調製する工程図である。
【図４】遠心式センサ２０の平面図である。
【図５】光開裂性マイクロカプセルを用いたセンサによるサイトカインの測定を示す工程図である。
【図６】骨格層のモデルとなる積層膜のQCM法による測定結果を示すグラフである。
【図７】骨格層からなる中空粒子のSEM写真（(A)〜(C)）及びTEM写真(D)である。
【図８】カチオン高分子電過質及びアニオン高分子電解質を積層した場合の各ステップごとのゼータ電位を測定したグラフである。
【図９】シリコンウエハー上にTiO2層を形成し、さらにその表面に抗体を固定化する場合の工程図である。
【図１０】シリコンウエハー上にポリアニオン／ポリカチオン積層膜及びTiO2層が積層された多層構造のEDXによる解析結果を示すグラフである。
【図１１】遠心式イムノセンサの外観を示す写真である。
【図１２】コルチゾールの検量線の作成方法を示す模式工程図である。
【図１３】遠心式イムノセンサでコルチゾールの濃度を測定した場合の検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を具体化した実施形態について説明する。ただし、この発明はこの実施形態及び以下に示す実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００１８】
＜光開裂性マイクロカプセル＞
実施形態の光開裂性マイクロカプセルは、図１に示すように、内側から外側に向かって順に骨格層１、脂質二重膜２、外殻層３、抗体修飾層４の多層構造とされている。骨格層１はポリカチオン高分子電解質とポリアニオン高分子電解質とが交互に積層された構造とされており、脂質二重膜２はカチオン型の両親媒性物質の親水性基を両外側に向けた２分子膜からなる。また、外殻層３は光触媒として機能するTiO2から構成されている。さらに、抗体修飾層４はカルボキシデシルホスホン酸からなる自己組織化単分子膜(SAM膜：Self-Asssembled. Monolayers)からなり、カルボキシデシルホスホン酸のカルボキシ基にはコルチゾールを抗原とする抗体５がアミド結合しており、ホスホン酸基は外殻層３を形成するTiO2表面の水酸基とホスホン酸エステル結合によって固定されている。
一方、光開裂性マイクロカプセルの内部には、アルカリホスファターゼ６が水溶媒７中に分散されている。図２に示すように、アルカリホスファターゼ６は抗体と結合するエピトープ６ａを有している。
【００１９】
以上のように構成される実施形態の光開裂性マイクロカプセルは、図３に示す工程図に従い、次のようにして製造することができる。
（１）骨格層１の形成
まず、核となる中実粒子１０をビーカーに入れ、カチオン高分子電過質（又はアニオン高分子電解質）の水溶液を加えて撹拌した後、一定時間インキュベートする。このとき、カチオン高分子電解質（又はアニオン高分子電解質）は、中実粒子１０の表面に吸着される。そして、上澄み液を遠心分離して除去した後、アニオン高分子電解質（又はカチオン高分子電解質）の水溶液を加えて撹拌した後、一定時間インキュベートする。ここで、アニオン高分子電解質（又はカチオン高分子電解質）は、先に吸着したカチオン高分子電過質（又はアニオン高分子電解質）に静電引力で吸着する。こうして、中実粒子１０上にカチオン高分子電解質とアニオン高分子電解質とを交互に数回繰り返して積層させる(図３（ｂ）参照)。最後に、中実粒子１０を溶解する液で中実粒子１０を溶解除去し、カチオン高分子電解質とアニオン高分子電解質とが交互に積層した骨格層１からなる中空粒子１１を得る(図３（ｃ）参照)。
【００２０】
（２）脂質二重膜２の積層
次に、上記のようにして得られた中空粒子１１に脂質二重層を積層させる。
脂質二重膜の材料としては、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド等のカチオン型の両親媒性物質を用いることができる。これらのカチオン型の両親媒性物質を精製した後、相転移温度以上の温度（例えば60℃）で純水に溶解し、カチオン型の両親媒性物質からなるMLV（多層膜リポソーム、マルチラメラベシクル multilamellar vesicle) 分散液を調製する。このMLV分散液を相転移温度以上の温度で超音波処理をすることで，SUV（1枚膜リポソーム、スモールユニラメラベシクル small unilamellar vesicle）分散液を得る。そして上記のようにして得られた中空粒子１１を含む溶液に，SUV分散液を加え，一昼夜静置する。その後，スターラーで混合し，上澄みを除いて、図３（ｄ）に示す、脂質二重膜２が積層された中空粒子１３を得る。
【００２１】
（３）アルカリホスファターゼ６の内包
アルカリホスファターゼ６を溶解した溶液を脂質二重膜の相転移温度以上の温度に設定しておき、そこへ上記のようにして調製した脂質二重膜２が積層された中空粒子１３を浸す。ここで、中空粒子１３の脂質二重膜２は相転移温度以上の温度となるため、膜自体の透過性が上がり、中空粒子１３の中空部分にアルカリホスファターゼ６を溶解した溶液が侵入する。その後、溶液の温度を相転移温度以下とすることにより、脂質二重膜２の透過性が低下し、水溶媒７にアルカリホスファターゼ６が分散された液を内包する粒子１４を得る（図３（ｅ）参照）。
【００２２】
（４）外殻層３の形成
粒子１４へのTiO2からなる外殻層３の形成には、酸化チタン皮膜を形成するためによく知られたゾル−ゲル法を利用することができる。すなわち、チタンテトライソプロポキシド（Ti[OCH(CH3)2]4）等のチタンアルコラートを加水分解した後、酸化チタンゾル液とし、この液に中空粒子１４を添加してTiO2を中空粒子１４に吸着させた後、上澄みを除いた後、乾燥させることにより、表面にTiO2粒子からなる外殻層３が形成された粒子１５を得る。
【００２３】
（５）分子認識プローブによる表面修飾
最後に、粒子１５をカルボキシデシルホスホン酸の水溶液に浸漬し、外殻層３を構成するTiO2表面の水酸基とホスホン酸エステル結合させて自己組織化単分子膜(SAM膜：Self-Asssembled. Monolayers)とした後、サイトカインを抗原とする抗体５を自己組織化単分子膜に存在するカルボン酸基とアミド結合させることにより抗体修飾層４を形成させて、光開裂性マイクロカプセル１６を得る。
【００２４】
＜サイトカインの測定＞
次に、上記光開裂性マイクロカプセルを用いたサイトカインの測定について説明する。図４にセンシングにおける反応の場となる遠心式センサ２０の平面図を示す。この遠心式センサ２０は、プラスチックからなる円板２１の中央に丸穴２１ａが設けられており、図示しない回転駆動装置の回転軸に丸穴２１ａを挿入して任意の回転数で回転させることができる。円板２１には互いに直交する対称位置４か所に亜鈴形状のセンサ凹部２２が設けられているおり、測定部凹部２２は混合部２２ａと測定部２２ｂが細い溝２２ｃで連結されている。混合部２２ａの表面は、抗サイトカイン抗体（ただし、光開裂性マイクロカプセルの表面に固定化された抗体５とはエピトープを異にする抗体）が固定化されている。一方、測定部２２ｂの表面は抗アルカリホスファターゼ抗体が固定化されている。固定化において必要とされる抗体密度は，被測定物質の濃度で決定される。がんマーカーとして利用する場合のサイトカインでは、1〜100 pg/mL の濃度で光開裂性マイクロカプセルを捕捉できるように設計する。固定化効率は，SAMを構成する分子のアルキル鎖長で調整することができる。
【００２５】
以上のように構成された遠心式センサ２０を回転駆動装置に水平になるようにセットする。なお、遠心式センサの詳細については、次の文献に記載されている。
１）Tomoki Shimakura and Masaki Yamaguchi: Application of hydrophobic micropatterns to centrifugal fluid valve in flow channel, Journal of Adhesion Science and Technology, 29(23) (2015) 2565-2575
２）Masaki Yamaguchi, Hiroki Katagata, Yuki Tezuka, Daisuke Niwa, Vivek Shetty: Automated-immunosensor with centrifugal fluid valves for salivary cortisol measurement, Sensing and BioSensing Research, 1 (2014) 15-20
そして、混合部２２ａにサイトカインを含んだ測定液を所定量添加する(図５（ａ）上)。これにより、測定液中のサイトカインは、混合部２２ａに固定化されている抗サイトカイン抗体に対して、濃度に応じた割合で結合する(図５（ａ）下)。そして、回転駆動装置を駆動して測定液を除去した後、光開裂性マイクロカプセルの分散液を添加する。これにより、光開裂性マイクロカプセルの表面に修飾されている抗サイトカイン抗体が混合部２２ａに固定化されている抗サイトカイン抗体に結合しているサイトカインにおける別のエピトープを認識してさらに結合する（図５（ｂ）下）。そして、回転駆動装置を駆動して固定化されていない光開裂性マイクロカプセルを除去した後、水を添加し、図示しない高圧水銀ランプにて光照射する。これにより、サイトカインに結合している光開裂性マイクロカプセルの酸化チタン触媒の作用によってカプセルが破壊され、内包していたアルカリホスファターゼが放出される（図５（ｃ）下）。そして、回転駆動装置を駆動してアルカリホスファターゼを水と共に測定部２２ｂに移動させる（図５（ｄ）上）。こうして、測定部２２ｂに移動したアルカリホスファターゼは、測定部２２ｂに固定化されている抗アルカリホスファターゼ抗体と結合する（図５（ｄ）下）。最後に測定部２２ｂにアルカリホスファターゼ(ALP)によって発光する発光基質を添加し、アルカリホスファターゼの触媒作用によって発生した化学発光の光を光電子倍増管２３で受光し、光強度を図示しない測定装置で測定する。
【００２６】
この測定方法においては、発光強度を光電子増倍管 (波長185〜680 nm) で超高感度に検出するため、高感度測定が可能である。また、補足された被測定物質と放出された被測定物質の濃度比に応じて，被測定物質の数が増幅される仕組みであり，増幅率は内包する抗原のモル濃度，マイクロ粒子直径，および被測定抗原濃度などに関係する。このため、これらのファクターを調整することにより，シグナル増幅率を任意の範囲（例えば５〜１００倍）で調整することができる。
【００２７】
ところで、サイトカインには多くの種類が知られており、例えば、臓器選択性を制御しているケモカインにはMCP-1，MIP-1α，RANTES，MCP-2， TARC，ELC，SLC，MDC，MIP-3α，TECK，Gro-γ, IL-8, IP-10, SDF-1α, CXCL16 などの種類があり，その他のサイトカインでは IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, GM-CSF, TNF-α, TFG-β, EGF, PDGF, INF-γ, G-CSF などの種類がある。このため、測定対象に応じたサイトカインを選択することによって、様々なサイトカインの濃度を測定することができる。
【００２８】
＜実施形態の変形例＞
上記実施形態では、光開裂性マイクロカプセルに内包させる、受光素子による検知を可能とするための物質として、アルカリホスファターゼを用いたが、これの替りに色素前駆体を色素に変換するための触媒や、吸光物質や、蛍光物質等を用いてもよい。
【００２９】
＜試験例＞
（１）骨格層モデルの形成
本発明の光開裂性マイクロカプセルの調製における骨格層の形成工程（図３の工程図における（ａ）〜（ｃ））の基本となる技術として、水晶単結晶薄板にAu電極を貼り付けた水晶振動子を用意し、Au電極への交互積層法による骨格層形成試験を行った。すなわち、
１）水晶振動子のAu電極に3μLのピラニア溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１の混合溶液）を滴下し，5分間静置することで表面に付着した有機物質を取り除いた。その後，純水で3回洗浄し，N2ガスで乾燥させた。
２）そして、積層量の評価を行うため、QCM法（測定装置：FFINIX QN  （株）イニシアム製) を用い、共振周波数の変化F (Hz)を測定した（以下同様）。
３）さらに0.5M NaCl溶液にポリエチレンイミン(SigmaAldrich，CAS No. 9002-98-6、平均分子量 〜1,800 by GPC, 〜2,000 by LS、以下「PEI」と表記する)を1 mg/mLの濃度となるように添加した溶液中にAu電極を所定時間浸漬させたのち，純水で3回洗浄し，N2ガスで乾燥させてからQCMで共振周波数を計測した。
４） 次に、0.5M NaCl溶液にpoly(sodium 4-styrenesulfonate) (SigmaAldrich，CAS No.26062-79-3，平均分子量100,000-200,000、以下「PSS」と表記する) が1 mg/mLの濃度となるように添加した溶液にAu電極を所定時間浸漬させたのち，純水で3回洗浄し，N2ガスで乾燥させてからQCMで共振周波数を計測した。
５）さらに、所定濃度のNaCl溶液にPoly(diallyldimethylammonium chloride) (SigmaAldrich，CAS No.25704-18-1，平均分子量 〜70,000)、以下「PDDA」と表記する) が1 mg/mLの濃度となるように添加した溶液にAu電極を所定時間浸漬させたのち，純水で3回洗浄し，N2ガスで乾燥させてからQCMで共振周波数を計測した。
６）積層順をPEI（+）→PSS(−)→PDDA(+)→PSS(−)の順で合計７層となるように４）〜６）の工程を繰り返した。
【００３０】
以上のようにして水晶振動子のAu電極上に形成した、骨格層のモデルとなる積層膜をQCM法により測定した結果、共振周波数の減少量は７層の合計で 3.89 kHzであり、この値から推定した層の厚さは78 nmであった（図６参照）。
【００３１】
（２）骨格層からなる中空粒子の調製
架橋度が低く、塩酸に溶解する性質を持ったメラミンホルムアルデヒド縮合物からなるMF粒子(microParticles GmbH，カスタムメイド品(Weakly cross-linked MF particles diam (HCl-soluble))，2.86μm，SD = 0.06μm)をビーカーに入れ、カチオン高分子電過質（又はアニオン高分子電解質）の水溶液を加えて撹拌した後、一定時間インキュベートした。そして、上澄み液を遠心分離して除去する操作を３回繰り返した後、アニオン高分子電解質（又はカチオン高分子電解質）の水溶液を加えて撹拌した後、一定時間インキュベートした後上澄み液を遠心分離して除去する操作を３回繰り返した。こうして、FM粒子上にカチオン高分子電解質とアニオン高分子電解質とを交互に数回繰り返して積層させた。最後に、塩酸でMF粒子を溶解除去し、上澄み液を遠心分離して除去する操作を３回繰り返した。こうしてカチオン高分子電解質とアニオン高分子電解質とが交互に積層した骨格層からなる中空粒子を得た。
【００３２】
上記のようにして得られた中空粒子のSEM写真及びTEM写真を図７に示す。
(A)は骨格層を未積層のコア (melamine-formaldehyde; MF) 粒子，(B) は骨格層を積層後のMF粒子，(C) はHClでMF粒子を溶解した後のマイクロカプセル(骨格層) のSEM画像である(装置名：JSM−7001F，日本電子（株）製) 画像である。また，(D) はHClでMF粒子を溶解した後のマイクロカプセル(骨格層)のTEM画像 (装置名：JEM−2100，日本電子（株）製) である。未積層(A)と積層後(B)のMF粒子のTEM画像では，粒子の部分が黒みを帯びている。これは，粒子が厚く，電子が透過できなかったためである。積層後のMF粒子の外形(C)では，未積層のMF粒子と比較し少し凹凸がある。これらに対して，HClでMF粒子を溶解した後の中空マイクロカプセル(D)は，電子が透過し中空となっていることが観察された。なお，TEM画像において中空マイクロカプセルがつぶれた形態となっているのは、観察を真空系で行ったことによるものと考えられる。
【００３３】
骨格層からなる中空粒子の調製時における、カチオン高分子電過質及びアニオン高分子電解質の積層の様子を作製ステップごとのゼータ電位の測定によって確認した。ゼータ電位の測定にはゼータ電位計 (ゼータサイザーナノZS90 ，Malvern)を用いた。結果を図８に示す。未積層のMF粒子は，プラスの電荷を持っている。PSSの積層後はマイナス，PDDAの積層後はプラスとなっている。このことから，ゼータ電位がマイナスの時は最表面にPSS層が，プラスの時は最表面がPDDA層が形成されており、PSS層とPDDA層とが交互に積層されていることが分かった。
【００３４】
（３）カプセル表面への骨格層、TiO2層からなる殻壁の形成及び抗体の固定化
本発明の光開裂性マイクロカプセルの調製における骨格層表面への殻壁の形成及び抗体の固定化（図３の工程図における（ｆ）〜（ｇ））の基本となる技術として、シリコンウエハー上にTiO2層を形成し、さらにその表面に抗体を固定化した(図９に示す工程図参照)。すなわち、
１）まず、30%NH4OH：30%H2O2：水=1：1：5の混合比の溶液を75℃に保ち，シリコンウエハーをこの溶液に10分間浸漬させた。この操作によりシリコンウエハーの表層に存在するSiO2層の表面にシラノール基を形成させて親水性を高めておいた(図９（ｂ）参照)。そして、純水に15 min浸漬してSiO2表面を水和させ，負電荷を持たせた。
２）0.5M NaCl溶液にPEIを1 mg/mLの濃度となるように添加した溶液中にシラノール基を形成させたシリコンウエハーを５分間浸漬させたのち，純水で3回洗浄した。
３） 次に、0.5M NaCl溶液にPSSが1 mg/mLの濃度となるように添加した塩化ナトリウム水溶液に５分間浸漬させたのち，純水で3回洗浄した。
４）さらに、所定濃度のNaCl溶液にPDDAが1 mg/mLの濃度となるように添加した溶液にシリコンウエハーを５分間浸漬させたのち，純水で3回洗浄した。
５）積層順をPEI(+)→PSS(−)→PDDA(+)→PSS(−)の順で合計５層となるように４）〜６）の工程を繰り返した(図９（ｃ）参照)。
６）さらにPSS/PDDAを積層させたシリコンウエハーをTiO2の分散液(TiO2: 1.99重量%(テイカTKS-203を純水にて10倍に希釈)，ゼータ電位：-49.2 mV)に浸漬して10分間静置した後、純水で洗浄し、常温で乾燥させた。
こうして、シリコンウエハー上にポリアニオン／ポリカチオン積層膜及びTiO2層が積層された多層構造を調製した(図９（ｄ）参照)。このもののEDXによる解析結果を表１及び図１０に示す。これらの結果から、TiO2の層が形成されていることが分かった。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
上記のようにして形成した、図９（ｄ）に示すシリコンウエハー上にポリアニオン／ポリカチオン積層膜及びTiO2層が積層された多層構造の最上層であるTiO2膜上に自己組織化単分子膜(SAM膜)を形成した（図９（ｅ）参照）。
すなわち、図９（ｄ）に示す多層構造を構築したシリコンウエハーをカルボキシデシルホスホン酸(同人化学研究所製)のエタノール溶液に１２時間浸漬した。その後エタノールで洗浄し，窒素ガスを吹き付けながら室温で乾燥させ、さらに５０℃で３０分間加熱し乾燥させた。これにより、TiO2表面の水酸基とカルボキシデシルホスホン酸が脱水縮合してホスホン酸エステル結合が形成されることにより、自己組織化単分子膜(SAM膜)が形成された（図９（ｅ）参照）。
【００３７】
さらに、SAM膜のカルボキシル基をアミンカップリング法によって活性エステル化し、cort-3-BSAと結合させることによって固定化した。（図９（ｆ）参照）。以下に詳細を示す。
１）マイクロチューブに濃度が100 mmol/Lの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド (WSC) 溶液 200μLと、濃度が100 mmol/LのN-ヒドロキシこはく酸イミド (NHS)溶液 200 Μlとをピペッティングして混合した。
２）SAM 膜表面に１）で作成した混合液を滴下し，室温で10分間放置した後、リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。
３）Sample 溶液を パッド 表面に滴下し，室温で30分間放置した。Sample 溶液には付属のActivation Buffer に cort-3-BSAを10μg/mLで溶解したものを用いた。
５）リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。
６）自己組織化単分子膜(SAM膜)にBlocking 溶液を滴下し，室温で30分間放置した。
７）リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した後、常温にて乾燥させた後、撥水剤によって撥水処理し、さらにブロッキング処理(Milk protein)を施すことにより、コルチゾールがBSAを介してSAM膜上に固定化されたコルチゾール固定化シリコンウエハーを得た。
【００３８】
以上のようにして得られたコルチゾール固定化シリコンウエハーを用いて、コルチゾール含有試料のコルチゾール濃度の測定を行った。測定には図１１に示す遠心式イムノセンサを用いた（下記非特許文献１，２参照）。この遠心式イムノセンサは、分析用のディスクチップと、これを任意の回転速度で回転させるためのステッピングモータと、測定用の高電子倍増管とを備えている(図１１左)。そして、分析用ディスクチップは，各槽とそれらを結ぶ微細流路で構成されており，コンジュゲート槽や基質槽に滴下された溶液が遠心力によって反応槽に送液され，発光強度が測定される仕組みとされている(図１１右)。
１）Masaki Yamaguchi, Hiroki Katagata, Yuki Tezuka, Daisuke Niwa, Vivek Shettyc.  “Automated-immunosensor with centrifugal fluid valves for salivary cortisol measurement”. Sensing and Bio-Sensing Research 1, 15-20. (2014).
２）Masaki Yamaguchi，Yohei Matsuda，Shohei Sasaki，Makoto Sasaki，Yoshihiro Kadoma，Yoshikatsu Imai，Daisuke Niwa，Vivek Shetty：Immunosensor with fluid control mechanism for salivary cortisol analysis，Biosensors and Bioelectronics 41: 186-191, (2012).
【００３９】
コルチゾールの検量線を以下の方法で作成した。
１）コルチゾール固定化シリコンウエハーを図１１右の反応槽に両面テープで張り付ける。
２）サンプル (コルチゾール標準液 1.0，3.0，10 ng / mL) 30μLとコンジュゲート溶液 30μLを混合し，恒温室温 25℃で １分間、抗原抗体反応させる。（図１２（ａ）参照）。なお、ここでコンジュゲートとは、抗コルチゾール抗体に対してアルカリホスファターゼ(ALP)をアミド結合させたものであり、市販のアルカリホスファターゼ標識キットを用いて容易に調製することができる。
３）抗原抗体反応を行った反応液を分析用ディスクチップのコンジュゲート槽に 20μL分注し，遠心力によって流動させて反応槽に移動させ、25 ℃で 1 分間、コルチゾール固定化シリコンウエハーのコルチゾールと抗原抗体反応をさせる（図１２（ｂ）（ｃ））。
４）そして、緩衝液槽から緩衝液 30μLを遠心力によって導入して反応槽を洗浄した後，アルカリホスファターゼ(ALP)によって発光する発光基質30μL を分注し，発光強度特性を評価した（図１２（ｄ））。測定条件は以下のとおりである。
・コルチゾール標準液濃度：1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL
・測定温度  25℃、・測定回数：n = 3、
・発光強度の測定開始時：反応から300秒後の値
【００４０】
その結果、図１３に示すように，出力(発光強度) がコルチゾール濃度に反比例する検量線が得られ、検量線の決定係数R2＝0.99と求めらた。この測定方法では、測定溶液中のコルチゾール及びシリコンウエハーに固定化されたコルチゾールがアルカリホスファターゼ(ALP)修飾抗コルチゾール抗体と競争的に結合する反応を利用しており、測定されるのは、シリコンウエハーに固定化されたコルチゾールに結合されたアルカリホスファターゼ(ALP)修飾抗コルチゾール抗体である（図１２参照）。このため、測定溶液中のコルチゾールの濃度が高いほど、シリコンウエハーに固定化されたコルチゾールに結合されたアルカリホスファターゼ(ALP)修飾抗コルチゾール抗体は少なくなり、その結果出力(発光強度) がコルチゾール濃度に反比例する検量線となったのである。
【符号の説明】
【００４１】
１…骨格層、２…脂質二重膜、３…外殻層、４…抗体修飾層、５…抗体
６…アルカリホスファターゼ（６ａ…エピトープ）、７…水溶媒、１６…光開裂性マイクロカプセル、２２…センサ凹部（２２ａ…混合部，２２ｂ…測定部，２２ｃ…溝）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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