(57)【要約】      （修正有）【課題】ウリ科植物からウリ科野菜果実汚斑細菌病菌をその近縁種である褐条病菌と識別可能に検出する方法の提供。【解決手段】ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および／または褐条病菌の検出方法であって、ウリ科植物体から得られたＤＮＡに対し、A）特定のヌクレオチド配列からなるプライマー、および特定のヌクレオチド配列のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるプライマー、およびB）特定の配列のヌクレオチドからなり、特定の配列に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、特定の配列の位置１２７に対応する塩基ＧまたはAを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブを用いて核酸増幅反応を行うことを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ａ）植物体から得られたＤＮＡ、
ｂ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドからなるプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるプライマー、
ｃ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
ｅ）ＲＮａｓｅＨ
を含む組成物を核酸増幅反応に供試する工程； ならびに
２）該組成物中に生じる蛍光を検出する工程
を含む、該植物体におけるウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）および／または褐条病菌（Acidovorax avenae subsp. avenae）の検出方法。
【請求項２】
１）ａ）植物体から得られたＤＮＡ、
ｂ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、ここで、該２つのキメラプライマーはいずれも、３’末端の塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡである、
ｃ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、および
ｅ）ＲＮａｓｅＨ
を含む組成物を等温核酸増幅反応に供試する工程； ならびに
２）該組成物中に生じる蛍光を検出する工程
を含む、該植物体におけるウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および／または褐条病菌の検出方法。
【請求項３】
前記キメラプローブｃを用いてウリ科野菜果実汚斑細菌病菌を検出するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラプローブａを用いて褐条病菌を検出するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラプローブｃおよびａを用いてウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および褐条病菌を同時に検出するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
Ａ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドからなるプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに
Ｂ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
を含む、ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および／または褐条病菌の検出用キット。
【請求項７】
Ａ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、ここで、該２つのキメラプライマーはいずれも、３’末端の塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡである、ならびに
Ｂ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
を含む、ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および／または褐条病菌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、核酸増幅に基づくウリ科野菜果実汚斑細菌病菌および褐条病菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウリ科野菜果実汚斑細菌病は、スイカやメロン等のウリ科作物に感染し、大きな被害をもたらし得る重要病害である（非特許文献１および２）。本病の原因菌であるウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli、以下「Aac」とも称する）は強い病原性を持ち、感染すると幼苗から果実まで全ての段階で被害を与える。特にスイカでは果実にAacが感染すると表面に病斑を形成し、内部が軟化し、最後には腐敗果となる。また、発病苗や保菌苗からAacが伝染する結果、Aacに感染していても発病しない状態の苗（無病徴保菌苗）が多くつくられる可能性が高く、この無病徴保菌苗を定植すると収穫時の発病を招く。また、本病は細菌病であり、定植後の完全な防除は困難である。一方、本病の主な伝染源は種子であり、育苗期の感染を防止すれば圃場へ定植した後の発病は起こらないと考えられる。したがって、本病の発病予防のためには、育苗期に重点を置き、Aacを持たない種子を使用して、Aac汚染のない健全な苗を作ることが重要である。
【０００３】
Aacに汚染されていない健全種子を供給するため、ウリ科野菜果実汚斑細菌病の検出方法の確立が強く望まれている。しかし、検出にあたって他の病原菌との識別が問題となっている。Aacと近縁である褐条病菌（Acidovorax avenae subsp. avenae、以下「Aaa」とも称する）はイネ科植物に褐条病を引き起こすことが知られており、この病気も種子伝染性であると考えられている。Aaaは、ウリ科野菜果実汚斑細菌病を引き起こすAacと極めて近縁であり（非特許文献３）、ウリ科作物からも日和見的に検出されることがあるため（非特許文献４）、AacとAaaを識別できる診断法が望まれている。
【０００４】
Aacの診断法には圃場での検査に適したラテックス凝集反応や、圃場での迅速診断に有効なイムノストリップ、実験室での大量診断に有効なELISA法など、さまざまな方法がある（非特許文献２）。しかし、現在までAacとAaaを効果的に識別する方法は開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所「ウリ科野菜果実汚斑細菌病防除マニュアル(一般栽培用)」
【非特許文献２】独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所「ウリ科野菜果実汚斑細菌病防除マニュアル(種子生産・検査用)」
【非特許文献３】Schaad et al. (2008), Reclassification of subspecies of Acidovorax avenae as A. Avenae (Manns 1905) emend., A. cattleyae (Pavarino, 1911) comb. Nov., A. citrulli (Schaad et al., 1978) comb. nov., and proposal of A. oryzae sp. nov., Systematic and Applied Microbiology 31, 434-446
【非特許文献４】牧住ら（2011）ウリ科作物の種子健全性検査で分離される果実汚斑細菌病菌に類似したAcidovorax属細菌について. 植物防疫 65巻10号, 579-582.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願の目的は、ウリ科植物の植物体からウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）を検出する方法であって、Aacとその近縁種である褐条病菌（Aaa）を識別することが可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願は、核酸増幅とプローブを用いた病原菌特異的塩基配列の検出に基づく、ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出方法を提供する。具体的には、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様１）
１）ａ）植物体から得られたＤＮＡ、
ｂ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドからなるプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるプライマー、
ｃ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
ｅ）ＲＮａｓｅＨ
を含む組成物を核酸増幅反応に供試する工程； ならびに
２）該組成物中に生じる蛍光を検出する工程
を含む、該植物体におけるウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出方法。
【０００８】
また、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様２）
１）ａ）植物体から得られたＤＮＡ、
ｂ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、ここで、該２つのキメラプライマーはいずれも、３’末端の塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡである、
ｃ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
ｄ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、および
ｅ）ＲＮａｓｅＨ
を含む組成物を等温核酸増幅反応に供試する工程； ならびに
２）該組成物中に生じる蛍光を検出する工程
を含む、該植物体におけるウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出方法。
【０００９】
また、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様３）
Ａ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドからなるプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるプライマー、ならびに
Ｂ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
を含む、ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出用キット。
【００１０】
さらに、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様４）
Ａ）配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、および配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、ここで、該２つのキメラプライマーはいずれも、３’末端の塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡである、ならびに
Ｂ）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブｃ、および／または配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブａ、ここで、該キメラプローブｃおよびａはいずれも、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、且つ、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されている、
を含む、ウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本願に係るウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出方法により、簡易な操作で短時間にAacを特異的に検出することが可能になる。また、保菌種子からAacを検出することができ、Aac汚染苗の発生を未然に防止することが可能になる。さらに、該方法はAacとAaaを正確に識別して検出することができるため、これらの病原菌が混在している場合であってもAacの感染を高い精度で診断することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域中においてAacとAaaの間で塩基配列が明確に異なる部位を示す。MAFF株は農業生物資源ジーンバンクの登録番号、その他はNCBIのAccession番号である。
【図２−１】図２は、AacおよびAaaが有する１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の部分配列のアラインメントを示す。最下段は、AacおよびAaaのコンセンサス配列（配列番号１）である。該コンセンサス配列を基準にしてAacとAaaを識別する塩基、プローブ、およびプライマーの位置を示すために、便宜上、コンセンサス配列にギャップが生じる箇所の配列をアラインメントから削除してある。アラインメント上部のバーがプローブの位置、矢印がプライマーの位置をそれぞれ表し、アラインメント下部の矢印がAacとAaaを識別する塩基の位置を表す。
【図２−２】図２−１のつづき。
【図２−３】図２−１、図２−２のつづき。
【図２−４】図２−１、図２−２、図２−３のつづき。
【図３】図３は、AacおよびAaaそれぞれ４菌株に対してCycleavePCRを行なった結果を示す。ａではAac検出用プローブ１（CL_cit16S_1-1（配列番号７）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用い、ｂではAaa検出用プローブ（CL_ave16S_1-1（配列番号１１）、5’末端にEclipse標識、3’末端にFAM標識）を用いている。Aac株およびAaa株ともに、６桁の数字はMAFF番号を表す。
【図４】図４は、４種類のAac検出用プローブを用いたAacの検出結果を比較するグラフである。グラフ中の数字はプローブ番号に対応する： Aac検出用プローブ１はCL_cit16S_1-1（配列番号７）（3’末端にROX標識）、Aac検出用プローブ２はCL_cit16S_2（配列番号８）（3’末端にROX標識）、Aac検出用プローブ３はCL_cit16S_3（配列番号９）（3’末端にROX標識）、Aac検出用プローブ４はCL_cit16S_4（配列番号１０）（3’末端にROX標識）である。いずれのプローブも5’末端にEclipse標識を有する。菌株はATCC29625株（Aac）およびATCC19860株（Aaa）を用いた。ｂはａの蛍光強度の低い部分を拡大して示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、MAFF730196株のＤＮＡ量を１０nｇから１ｆｇまで１／１０ずつ８段階に調整してCycleavePCRを行った結果を示す。プローブは、Aac検出用プローブ４（CL_cit16S_4（配列番号１０）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用いた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ATCC19860株のＤＮＡ量を１００ｎｇから１ｆｇまで１／１０ずつ９段階に調整してCycleavePCRを行った結果を示す。プローブは、Aaa検出用プローブCL_ave16S_1-1（配列番号１１）（5’末端にEclipse標識、3’末端にFAM標識）を用いた。
【図６Ａ】図６Ａは、Sweat-bag seedling法（特許第4633645号）を用いてAacで汚染したキュウリ種子からの検出を行なった結果を示す。キュウリ種子約900粒をSweat Bagに入れ、Aac培養液をスパイクした。2週間室温で培養した後、Sweat Bagを潰して懸濁液を抽出し、その懸濁液2 mlを遠心し、沈殿に簡易抽出液を加えDNAを抽出した。これを鋳型としてCycleave PCRを実施した。プローブは、Aac検出用プローブ4（CL_cit16S_4（配列番号１０）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用いた。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａと同じくSweat-bag seedling法（特許第4633645号）を用いてAacで汚染したキュウリ種子からの検出を行なった結果を示す。この実験では、キュウリ種子約900粒をSweat Bagで2週間室温培養した後でAac培養液をスパイクした。Sweat Bagを潰して懸濁液を抽出し、その懸濁液2 mlを遠心し、沈殿に簡易抽出液を加えDNAを抽出した。これを鋳型としてCycleave PCRを実施した。プローブは、Aac検出用プローブ4（CL_cit16S_4（配列番号１０）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（態様１）キメラプローブを用いたAacおよび／またはAaaの検出方法
本願が提供する態様１は、植物体から得られたＤＮＡを試料とし、ｒＲＮＡ遺伝子の１６ＳサブユニットをコードするＤＮＡ領域（以下、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域と称する）に含まれる塩基配列を増幅するプライマー、AacまたはAaaのいずれかに特異的な配列を有する蛍光標識されたＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ、およびＲＮａｓｅＨの存在下で核酸増幅反応を行って蛍光を検出することにより、該植物体の表面または内部におけるAacおよび／またはAaaの存在を検出する方法である。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ（サイクリングプローブとも称される）とＲＮａｓｅＨを組み合わせた核酸検出方法は一般にサイクリングプローブ法と称され、例としてタカラバイオ社が提供するCycleave(登録商標)PCR法が挙げられる。
【００１４】
被験植物は、Aacおよび／またはAaaが感染するものであれば特に限定されない。例えばウリ科植物、例えばスイカ、メロン、カボチャ、トウガン、キュウリ等に態様１の方法を適用することができる。また、被験植物は、イネ科植物、例えばイネ、キビ、サトウキビ、トウモロコシ等であってもよい。
【００１５】
植物体からのＤＮＡ取得方法
核酸増幅反応に供するＤＮＡは、公知のＤＮＡ抽出方法（例えばフェノール・クロロホルム法、ＣＴＡＢ法等）を用いて、植物体の組織から抽出することができる。これにより、植物のＤＮＡと共に、該組織の表面または内部に存在する菌（例えばAac）のＤＮＡが抽出される。また、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、illustra DNA Extraction Kit PHYTOPURE (GE Healthcare）、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）、簡易法であるDNA Extraction Reagent（GenCheck）等）を用いてＤＮＡ抽出を行ってもよい。
【００１６】
ＤＮＡ抽出に供する植物組織は特に限定されず、地上部であっても地下部であってもよい。例えば、葉、茎、果実、種子、根等からＤＮＡを抽出することができる。AacおよびAaaは種子感染が問題となるため、種子からＤＮＡを抽出することが好ましい。また、ＤＮＡ抽出に用いるサンプル量や抽出条件は、抽出の方法や抽出に供する組織に応じて適宜決定できる。
【００１７】
本願の態様１の方法は、１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列中に、AacとAaaの間で明確に異なる箇所（一塩基）が存在することを利用してAacとAaaを識別する。かかる特定の一塩基とは配列番号１の位置１２７に対応する塩基であり、Aacは該位置に塩基Ｇを有し、Aaaは該位置に塩基Ａを有する。かかる一塩基の違いを、後述のキメラプローブによって検出する。
【００１８】
プライマー
本願の態様１において用いるプライマーは、上記特定の一塩基（配列番号１の位置１２７）を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の部分配列を増幅するものであれば特に限定されない。一つの態様において、かかるプライマーはＤＮＡからなるプライマーである。
forward側プライマーは、例えば配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個、好ましくは１７〜２５個、より好ましくは１８〜２５個のヌクレオチドからなるものである。一つの態様において、forward側プライマーは配列番号３または４に示すオリゴヌクレオチドである。別の態様において、forward側プライマーは配列番号６に示すオリゴヌクレオチドである。
reverse側プライマーは、例えば配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個、好ましくは１７〜２５個、より好ましくは１８〜２５個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるものである。ここにいう「相補的な」ヌクレオチドとは、あるヌクレオチド鎖の「逆相補鎖」に相当するヌクレオチド鎖を意味し、例えば5’-AGTCAG-3’に相補的なヌクレオチド鎖は5’-CTGACT-3’である。一つの態様において、reverse側プライマーは配列番号５に示すオリゴヌクレオチドである。
プライマーを用いて増幅する配列（ターゲット配列）の長さは、例えば７０〜３００ｂｐであり、好ましくは８０〜２００ｂｐ、より好ましくは１００〜１７０ｂｐである。
【００１９】
キメラプローブ
本明細書において、「ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ」とは、ＤＮＡ塩基（デオキシリボヌクレオチド）およびＲＮＡ塩基（リボヌクレオチド）を含むプローブを意味する。
本願の態様１において用いるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、１）配列番号１に含まれる連続する７〜２５個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含むこと、２）配列番号１の位置１２７に対応する塩基を含む１個または連続する複数個、例えば１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡであること、および３）５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されていることを特徴とする。かかるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、好ましくは７〜２０個、より好ましくは７〜１４個、さらに好ましくは９〜１２個の連続するヌクレオチドからなるものである。一つの態様において、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、配列番号１の位置１２７に対応する塩基または該塩基より１塩基３’側に位置する塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡであるものである。
【００２０】
核酸増幅反応によって生じたＤＮＡ増幅産物にＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブがハイブリダイズし、該プローブのＲＮＡ部分またはその近傍（例えば１塩基５’側）に塩基のミスマッチが存在しない場合、ＲＮａｓｅＨの作用によってＲＮＡ部分で該プローブが切断され、蛍光物質と消光物質が分離する結果、蛍光が生じる。しかし、ＲＮＡ部分またはその近傍（例えば１塩基５’側）に塩基のミスマッチが存在すると、ＲＮａｓｅＨがプローブを切断することができず、蛍光は生じない。配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ｇを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ（本願において、キメラプローブｃとも称する）は、Aac由来のＤＮＡが増幅された場合にのみ蛍光を生じる。配列番号１の位置１２７に対応する塩基Ａを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ（本願において、キメラプローブａとも称する）は、Aaa由来のＤＮＡが増幅された場合にのみ蛍光を生じる。波長の異なる蛍光物質でそれぞれ標識されたキメラプローブｃおよびａを用いれば、一つの反応系でAacおよびAaaを同時に検出することができる。
【００２１】
一つの態様において、Aac検出用のキメラプローブｃは、配列番号７〜１０のいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるものである。一つの好ましい態様において、Aac検出用のキメラプローブｃは、配列番号７、８および１０のいずれか、特に配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。一つの好ましい態様において、Aaa検出用のキメラプローブａは、配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００２２】
プローブの標識
上記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブに用いる標識は、蛍光物質と消光物質（クエンチャーとも称する）である。ここにいう消光物質とは、蛍光物質の発する蛍光を消光（クエンチ）する作用を有する物質をいい、吸収したエネルギー（蛍光）を熱として放出するもの（例えばEclipse(登録商標)等のダーククエンチャー）や、別波長の蛍光として放出するもの（例えばTAMRA等）が存在する。
【００２３】
態様１において用い得る蛍光物質としては、FAM、ROX、HEX、TET、VIC(登録商標)、Yakima-Yellow(登録商標)、MAX、JOE、FITC、Cy3、Cy5等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの態様において、蛍光物質はFAM、ROXまたはHEXである。態様１において用い得る消光物質としては、Eclipse(登録商標) Dark Quencher（以下、単に「Eclipse(登録商標)」とも称する）、Dabcyl、Black Hole Quencer(登録商標) 1 (BHQ1)、Black Hole Quencer(登録商標) 2 (BHQ2)、Iowa Black(登録商標) FQ、Iowa Black(登録商標) RQ、TAMRA等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの態様において、消光物質はEclipse(登録商標)である。
【００２４】
蛍光物質および消光物質は、前者をプローブの５’末端、後者をプローブの３’末端に配置してもよく、これと逆の配置であってもよい。一つの態様において、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、５’末端が消光物質（例えばEclipse(登録商標)）で標識され、３’末端が蛍光物質（例えばFAM、ROXまたはHEX）で標識されたものである。
【００２５】
また、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、配列番号１の相補鎖側に設計したものであってもよい。例えば、配列番号１の相補鎖である配列番号２に含まれる連続する７〜２５個、好ましくは７〜２０個、より好ましくは７〜１４個、さらに好ましくは９〜１２個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号２の位置２７４に対応する塩基Ｃを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ、および配列番号２に含まれる連続する７〜２５個、好ましくは７〜２０個、より好ましくは７〜１４個、さらに好ましくは９〜１２個のヌクレオチドからなり、且つ、配列番号２の位置２７４に対応する塩基ＴまたはＵを含むＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブを用いることが可能である。一つの態様において、かかる相補鎖側ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、配列番号２の位置２７４に対応する塩基を含む１個または連続する複数個、例えば１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡである。別の態様において、相補鎖側ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブは、配列番号２の位置２７４に対応する塩基または該塩基より１塩基３’側に位置する塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡである。相補鎖側ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブについても、５’および３’末端の一方が蛍光物質で標識され、他方が消光物質で標識されているものを用い得る。
【００２６】
ＤＮＡポリメラーゼ
態様１において使用するＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性であることが望ましい。本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性であるとは、例えば一般的なＰＣＲ反応条件に供してもその活性を保持していることを意味する。態様１において使用し得るＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ(登録商標) ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ＲＮａｓｅＨ
本明細書において、ＲＮａｓｅＨとは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的に切断するエンドヌクレアーゼをいう。態様１において使用するＲＮａｓｅＨは、耐熱性であることが望ましい。本明細書において、ＲＮａｓｅＨが耐熱性であるとは、例えば６０℃以上の温度で１５分間保持した後においてもＲＮａｓｅＨ活性を有することを意味する。
態様１において使用し得るＲＮａｓｅＨとしては、例えば特許第3910142号に記載されるBacillus caldotenax由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、B. caldotenax由来のＲＮａｓｅＨＩＩＩ、Pyrococcus furiosus由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、Thermotoga maritima由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、Archaeoglobus fulgidus由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、Thermococcus litoralis由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、Thermococcus celer由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、Pyrococcus horikoshii由来のＲＮａｓｅＨＩＩ等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの態様において、ＲＮａｓｅＨは、配列番号１５または１６のアミノ酸配列を有するThermococcus litoralis由来のＲＮａｓｅＨＩＩ（本明細書において「Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨＩＩ」とも称する）である。
【００２８】
核酸増幅方法
本願の態様１において用いる核酸増幅方法は、特定のプライマーペアを用いて、試料中に存在するＤＮＡ分子に含まれる特定の領域（塩基配列）を増幅する方法であれば特に限定されない。典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-1354,1985)によりＤＮＡを増幅することができる。反応系におけるプライマーの濃度は、目的のＤＮＡ配列を増幅し得る条件であれば特に制限されない。例えば、プライマーは０．１〜２μＭの濃度で使用することができる。
【００２９】
ＰＣＲの条件
ＰＣＲ法において、温度サイクル、ＤＮＡポリメラーゼおよび反応液の組成（ｄＮＴＰや緩衝液）等の条件は、目的とする配列が増幅される限り、特に限定されない。例えば、次のサイクル条件でＰＣＲ反応を行うことができる： [９５℃で３０秒］を１回、次いで［９５℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で３０秒］のサイクルを５０回反復し、３０℃に冷却して終了。
【００３０】
蛍光の検出
本願の態様１では、特定の配列を有するＤＮＡ領域の増幅を、プローブから生じる蛍光によって検出する。一つの好ましい態様において、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて核酸増幅反応を行うことにより、該反応の進行と同時に蛍光の検出を行うことができる。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば核酸増幅リアルタイムモニタリング装置Line Gene（BioFlux社）、7500 real-time PCR system（アプライドバイオシステムズ社）等を用いることができる。別の態様において、サーマルサイクラー（例えば蛍光検出機能を持たないもの）を用いて核酸増幅反応を行い、該反応終了後のサンプルに励起光（例えばＵＶ）を照射して、目視またはデジタルカメラ等の光学機器により蛍光を検出することも可能である。
また、目的とする領域が増幅されたかどうかは、ＤＮＡ増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動等によって確認すること、および／またはＤＮＡ増幅産物の塩基配列を解読すること等によって確かめることができる。
【００３１】
（態様２）キメラプローブと等温核酸増幅反応を用いたAacおよび／またはAaaの検出方法
本願が提供する態様２は、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーを用いること、および鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて等温核酸増幅反応を行うことを除き、上記態様１と同様の方法により植物体の表面または内部におけるAacおよび／またはAaaの存在を検出するものである。
【００３２】
等温核酸増幅法のうちＤＮＡを増幅する方法としてはＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（特許第3433929号及び第3883476号）、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（特許第3313358号）等が知られている。本願の態様２は、典型的にはＩＣＡＮ法によってAacおよび／またはAaaの存在を検出する方法である。
【００３３】
キメラプライマー
本明細書において、「ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー」とは、ＤＮＡ塩基（デオキシリボヌクレオチド）およびＲＮＡ塩基（リボヌクレオチド）を含むプライマーを意味する。
本願の態様２において用いるプライマーは、３’末端側にＲＮＡ塩基を有するＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーであって、AacとAaaを識別可能な特定の一塩基（配列番号１の位置１２７）を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の部分配列を増幅するものであれば特に限定されない。例えば、該ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーは、３’末端の塩基を含む１個または連続する複数個、例えば１個または連続する２〜３個の塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡである。一つの態様において、該ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーは、３’末端の塩基を含む連続する３個の塩基のみがＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡである。
【００３４】
態様２において、forward側キメラプライマーは、例えば配列番号１の位置１〜１２６に含まれる連続する１５〜３０個、好ましくは１７〜２５個、より好ましくは１８〜２５個のヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列からなるものである。ここにいう「相当する」ヌクレオチド配列には、全ての塩基が同一である配列の他、塩基Ｔを塩基Ｕに置き換えた配列も含まれる。一つの態様において、forward側キメラプライマーは配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドである。別の態様において、forward側キメラプライマーは配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドである。
reverse側キメラプライマーは、例えば配列番号１の位置１２８〜４００に含まれる連続する１５〜３０個、好ましくは１７〜２５個、より好ましくは１８〜２５個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列からなるものである。ＲＮＡ部分については塩基Ａと塩基Ｕが「相補的な」関係である。一つの態様において、reverse側キメラプライマーは配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドである。
キメラプライマーを用いて増幅する配列（ターゲット配列）の長さは、例えば７０〜３００ｂｐであり、好ましくは８０〜２００ｂｐ、より好ましくは１００〜１７０ｂｐである。
【００３５】
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
態様２においては、等温核酸増幅反応を行うため、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる。かかるＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｃａ ＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第5,436,326号および5,753,482号に記載）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン社）、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
等温核酸増幅の反応条件
態様２に係る等温核酸増幅反応は、上述のＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅＨを試料ＤＮＡと共存させることにより、ＰＣＲのような段階的な温度変化を必要とせず、典型的には一定の温度で核酸増幅を達成し得るものである。等温核酸増幅反応を行う温度条件は、プライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖合成反応及び鎖置換反応、並びにＲＮａｓｅＨによる伸長鎖およびプローブの切断反応を行い得る温度であればよく、例えば３０℃〜７５℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃の範囲内の温度である。例えば、かかる範囲内の一定の温度に反応液を維持することで、サーマルサイクラーを使用せずに核酸増幅反応を行うことができる。もちろん、反応温度の維持のためにサーマルサイクラーを用いてもよい。一つの態様において、等温核酸増幅反応は以下の条件にて行い得る：（１）６０℃で１００分間保持、または（２）７０℃で５分間保持した後、５７℃で９０〜１２０分間保持。
【００３７】
本願の態様２において、被験植物、植物体からのＤＮＡ取得方法、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブの構成（標識を含む）、使用するＲＮａｓｅＨ、および蛍光の検出については上記態様１と同様である。一つの態様において、サーマルサイクラーあるいは適当なインキュベーター等を用いて等温核酸増幅反応を行い、該反応終了後のサンプルに励起光（例えばＵＶ）を照射して、目視またはデジタルカメラ等の光学機器により蛍光を検出することができる。別の態様において、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて等温核酸増幅反応を行い、該反応の進行と同時に蛍光の検出を行うこともできる。
【００３８】
（態様３）Aacおよび／またはAaaの検出用キット
本願が提供する態様３は、上記態様１と同じプライマーおよびプローブを用いてAacおよび／またはAaaを検出するためのキットである。具体的使用方法としては、キットに含まれるプライマーおよびＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブを、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨおよび植物体から得たＤＮＡ試料と共に核酸増幅反応に供し、反応混合物中に生じる蛍光を測定することにより、該植物体におけるAacおよび／またはAaaの存在を検出することができる。該キットは、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮａｓｅＨをさらに含むものであってもよい。また、該キットは、ｄＮＴＰおよび緩衝液等の核酸増幅反応液を通常構成する各種成分をさらに含むものであってもよい。プライマー、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅＨの好適な態様については、上記態様１と同様である。
【００３９】
（態様４）Aacおよび／またはAaaの検出用キット（等温核酸増幅）
本願が提供する態様４は、上記態様２と同じプライマーおよびプローブを用いてAacおよび／またはAaaを検出するためのキットである。具体的使用方法としては、キットに含まれるＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーおよびＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブを、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨおよび植物体から得たＤＮＡ試料と共に等温核酸増幅反応に供し、反応混合物中に生じる蛍光を測定することにより、該植物体におけるAacおよび／またはAaaの存在を検出することができる。該キットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮａｓｅＨをさらに含むものであってもよい。また、該キットは、ｄＮＴＰおよび緩衝液等の核酸増幅反応液を通常構成する各種成分をさらに含むものであってもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマー、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブ、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅＨの好適な態様については、上記態様２と同様である。
【００４０】
以下、実施例により、本願が提供する態様を説明する。
【実施例】
【００４１】
１．材料および方法
１−１．試料
実験に供試したウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および褐条病菌（Aaa）の株を表１に示す。農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクからAacを１１株とAaaを７株、アメリカのAmerican Type Culture Collection（ATCC）からAacとAaaをそれぞれ１株ずつ入手した。以下、農業生物資源ジーンバンクの株をMAFF株、ATCCの株をATCC株と称する。なお、本実施例において用いた二つのATCC株は、それぞれAacおよびAaaの基準株（type strain）である。
【００４２】
【表１】
2017023084.tif 000002
【００４３】
１−２．菌株の培養
入手した凍結乾燥状態の菌株は、寒天NB培地で５日間培養した後、細菌のコロニーをかき取り、液体NB培地またはLB培地に加え、インキュベーターでさらに一晩培養した。  
【００４４】
１−３．菌株からのＤＮＡ抽出
培養した菌株からのＤＮＡ抽出は、細菌ＤＮＡ抽出キットIllustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit（GE Healthcare）を用い、該キットに添付のマニュアルに従って行なった。精製したＤＮＡは−６０℃で保存した。
【００４５】
１−４．CycleavePCR法
以下の実施例において、CycleavePCRの反応は、CycleavePCR Starter Kit（タカラバイオ社）を用いて行なった。反応液の組成は以下の通りである。
・CycleavePCR Reaction Mix (2 x conc)・・・12.5 μL（総量の半分）
・プライマー・・・最終濃度 0.25 μM 
・プローブ・・・最終濃度 0.2 μM 
・テンプレートDNA・・・ 1 ng 
・滅菌蒸留水・・・総量 25 μLとなるように入れた
【００４６】
ＤＮＡ増幅および蛍光強度の測定は、核酸増幅リアルタイムモニタリング装置Line Gene（BioFlux社）、または7500 real-time PCR system（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。増幅反応は、初期変性過程として９５℃で３０秒を１回、次に増幅過程として［９５℃で１０秒（変性）、５５℃で２０秒（アニーリング）、７２℃で３０秒（伸長反応）］の３ステップを５０回繰り返し、３０℃まで冷却して反応を終了するプログラムで行った。反応終了後は、電気泳動により増幅産物をチェックした。
【００４７】
２．結果
２−１．プライマーとプローブの設計
AacとAaaを遺伝子レベルで識別するため、両菌のrDNA領域の塩基配列をNCBIデータベースから取得した。Aacについては、基準株であるアメリカのスイカ由来のATCC29625株の他、ハンガリーのスイカ由来、中国のマスクメロン由来、中国のハミウリ由来、その他由来が不明の菌株の配列を得た。Aaaについては、基準株であるアメリカのトウモロコシ由来のATCC19860株の他、中国のトウモロコシ由来、韓国のキビ由来、中国のイネ由来、中国のキビ由来、イギリスのサトウキビ由来、ルリゴクラクチョウカ由来の菌株の配列を得た。Clustalアルゴリズムを用いてこれらの配列をアライメントし、AacとAaaの配列を比較した結果、16S rDNA領域中に両者で明確に異なる配列が１箇所見出された（図１）。そこで、この１塩基の違いをサイクリングプローブ法で識別するため、表２および３に示す構成のプライマーおよびプローブを設計した。AacとAaaの間で異なる該１塩基の位置、ならびに設計したプライマーおよびプローブの位置を図２に示す。
【００４８】
【表２】
2017023084.tif 000003
【００４９】
【表３】
2017023084.tif 000004
【００５０】
２−２．AacとAaaの識別  
AacおよびAaaのMAFF株に対して、Aac検出用およびAaa検出用のプローブを用いてCycleavePCRを行った結果を図３に示す。Aac検出用プローブ１（CL_cit16S_1-1（配列番号７））およびAaa検出用プローブ（CL_ave16S_1-1（配列番号１１））は、それぞれ目的の菌種の蛍光強度を増加させ、目的以外の菌種では顕著な蛍光強度の増加はみられなかった。反応後の電気泳動では、どちらのプローブを用いてもすべての菌株で十分な増幅産物が得られており、設計したプライマーは全ての菌株に対して有効であった。従って、蛍光強度の違いはプローブの違い、すなわちAaaとAacの１塩基の違いにより生じたと考えられ、この方法によりAacとAaaを明確に識別できることが示された。図３で示した菌株以外についても、表１に示した菌株は全て同様の結果であった。
【００５１】
２−３．Aac検出用プローブのバリエーション
上記プローブ１（CL_cit16S_1-1（配列番号７））とは構成の異なるプローブの性能を確認するため、表３に示すAac検出用プローブ４種を用いてCycleavePCRを行なった。結果を図４に示す。プローブ２（CL_cit16S_2（配列番号８））では、プローブ１と比べて大きな違いが見られなかったものの、Aacに対しては蛍光強度がわずかに増加し、Aaaに対しては蛍光強度がわずかに減少しており、若干の改善がみられた。プローブ４（CL_cit16S_4（配列番号１０））では、Aacに対して蛍光強度の顕著な増加が認められた。Aaaに対しても蛍光強度が増加していたが、その程度はわずかであり、プローブ１と比較して大きな改善である。プローブ３（CL_cit16S_3（配列番号９））では、プローブ１と比較して蛍光強度が低かったものの、Aacに対してのみ蛍光強度の増大がみられた。かかる結果から、これらのプローブ１〜４はいずれもAac検出用として利用できることが示された。
【００５２】
２−４．検出感度の測定
Acidovorax菌の検出感度を測定するため、MAFF730196株（Aac）およびATCC19860株（Aaa）のＤＮＡ量を変えてCycleavePCRを行った。MAFF730196株の測定では、反応液中のＤＮＡ量を１０nｇから１ｆｇまで１／１０ずつ８段階に調整したものを２本ずつ用意した。プローブは、Aac検出用プローブ4（CL_cit16S_4（配列番号１０）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用いた。ATCC19860株の測定では、反応液中のＤＮＡ量を１００ｎｇから１ｆｇまで１／１０ずつ９段階に調整したものを２本ずつ用意した。プローブは、Aaa検出用プローブCL_ave16S_1-1（配列番号１１）（5’末端にEclipse標識、3’末端にFAM標識）を用いた。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。MAFF730196（Aac）およびATCC19860株（Aaa）ともに１ｆｇまで検出できることが示された。
【００５３】
２−５．人工汚染種子からの検出
現状では、ウリ科野菜果実汚斑細菌病の発病株からの種子伝染等により実際にAacに感染した種子を入手することが困難な状況にある。そこで、非感染種子に人為的にAacを接種して作製した人工汚染種子を作成し、CycleavePCRによる菌株の検出試験を行なった。
【００５４】
実験にはキュウリ種子を供試し、Aacの菌株としてMAFF730196を用いた。Aacの接種は、Sweat-bag seedling法（特許第4633645号）により次のように行なった。キュウリ種子約900粒/subsampleをSweat Bagに入れ、Aac培養液（1, 10, 102, 106 cfu/ml/subsample）をスパイクした。2週間室温で培養した後、Sweat Bagを潰して懸濁液を抽出し、その懸濁液2 mlを遠心し、沈殿に簡易抽出液を加えDNAを抽出した。また、Sweat-bag seedlingによるAacの増殖効果を確かめるために、種子の培養後にAacを混入させた試料を用意し（Aacの量は1, 10, 102, 103, 104, 105 cfu/ml/subsample）、DNA抽出を行なった。
【００５５】
図６Ａおよび６Ｂは、それぞれSweat-bag seedlingの前および後で菌をスパイクした種子におけるCycleavePCRの結果を示す。プローブは、Aac検出用プローブ4（CL_cit16S_4（配列番号１０）、5’末端にEclipse標識、3’末端にROX標識）を用いた。Aacと種子を一緒に2週間培養した場合、1 cfu/ml/subsampleまでAacが検出された（図６Ａ）。また、Sweat-bag seedling後にAacを混入させた場合でも1 cfu/ml/subsampleまでAacが検出された（図６B）。しかし、Sweat-bag seedling前にスパイクした場合と比較すると、増幅に時間を要し、かつAacが105 cfu/ml/subsample未満では反応終了時点で増幅が最大値に達していない。これはSweat-bag seedlingによりAacが増殖し、それが検出感度に表れていると考えられた。これらの実験結果から、本願に係るAacおよび／またはAaaの検出方法は種子検査においても適用できると考えられる。
【００５６】
２−６．蛍光標識について
本実施例においては、表３に示した各々の塩基配列につき、蛍光波長が異なる３種類の蛍光物質（FAM、ROX、およびHEX）でそれぞれ標識した３種類のプローブを作成してCycleavePCRによるAcidovorax菌の検出試験を行った。その結果、いずれの蛍光標識を有するプローブを用いた場合でも同等にAacおよびAaaを検出することができた（データ示さず）。AacとAaaの識別にあたり、それぞれの検出用プローブに異なる蛍光標識を用いることは、次の二つの理由から有効である。まず、１つの反応液で両方の測定ができ、効率的である。さらに、実験ミスや判断ミスによりAacとAaaの測定結果を混同することを防ぐこともできる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本願に係るウリ科野菜果実汚斑細菌病菌（Aac）および／または褐条病菌（Aaa）の検出方法により、簡易な操作で短時間にAacを特異的に検出することが可能になる。また、保菌種子からAacを検出することができ、Aac汚染苗の発生を未然に防止することが可能になる。さらに、該方法はAacとAaaを正確に識別して検出することができるため、これらの病原菌が混在している場合であってもAacの感染を高い精度で診断することが可能である。
【００５８】
参考文献
１． Burdman S. and Kots N. Molecular, physiological, and host-range characterization of Acidovorax avenae subsp. citrulli isolates from watermelon and melon in Israel. Plant Disease. 89:1339-1347 (2005)
２． 小宮友紀子, 白川隆, 我孫子和雄.  Dot Immuno-Binding AssayおよびTissue Printing Immunoassayによるスイカ果実汚斑細菌病の血清学的診断法. 日植病報68:291-296（2002）
３． 野菜茶業研究所.『ウリ科野菜果実汚斑細菌病防除マニュアル(種子生産・検査用)』. 独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所（2009）
【図１】
2017023084.tif 000005
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2017023084.tif 000014
【図６Ｂ】
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【配列表】
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