(57)【要約】【課題】  安全性が高い、扱いが簡便である、および／またはコストが安価な、新たな多能性幹細胞の培養技術を提供すること。【解決手段】  ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて幹細胞を培養することで上記の課題を解決する。本発明者らは、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて幹細胞を培養することで、多能性幹細胞の未分化性を維持することが可能であること、また、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進することが可能であることを見いだした。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養方法であって、
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、環状分子としてシクロデキストリンを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記シクロデキストリンが、メトキシ基により修飾されていることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、該ＰＥＧの分子量が１５０００〜２５０００であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、環状分子と線状分子との分子数の比率が２０：１〜１０：１であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）およびＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含み、ＢＭＡモル分率が０．３〜０．４であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリロタキサンブロック共重合体が、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記培養器の素材が、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、および心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞から成る群より選択される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が、ヒト、マウス、またはラットの細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を添加する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に多能性幹細胞を播種する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養用のキットであって、
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、
多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地とを含む、キット。
【請求項１６】
前記細胞培養培地が、液体または乾燥粉末の形で提供される、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記細胞培養培地が、成分ごとに複数の容器に分けられているか、もしくは、１つの容器に全ての成分が含まれていることを特徴とする、請求項１５もしくは１６記載のキット。
【請求項１８】
多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器。
【請求項１９】
多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養方法であって、
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２０】
心筋細胞への分化を促進する刺激を多能性幹細胞に与える工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の培養方法に関する。詳細には、ポリロタキサンブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いた幹細胞の培養方法に関する。さらに詳細には、ポリロタキサンブロック共重合体表面を有する培養器を用いて多能性幹細胞を培養して、その未分化性を維持する方法、あるいは特定の細胞への分化を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）やヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、創薬や再生医療への応用が期待されている。多能性幹細胞を安全に、そして再現性良く培養し、増殖させることは，これらの細胞を医療応用する上では必須の基盤技術となる。特に、再生医療の産業利用上においては、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要があることから、天然および合成の高分子を用いて多能性幹細胞の増殖を支持すると同時に多分化能を維持する技術について広範な研究が行われている（非特許文献１）。
【０００３】
未分化状態でｈＰＳＣを維持するために現在最もよく使用されている手法は、フィーダー細胞上（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）や、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト脂肪由来細胞など）あるいは、マトリゲル上もしくはゲルトレックス上において培養を行うというものである。しかし、フィーダー細胞を用いたｈＰＳＣの培養は、時間がかかり、フィーダー細胞のロットごとにばらつきが生じるという問題があり、また労働集約的でもある。一方、マトリゲルとゲルトレックスは、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、へパラン硫酸プロテオグリカン、エナクチン、増殖因子などを含むマウスＥＨＳ肉腫から分離された基質により構成されており、多くのｈＥＳＣ株の多分化能を支持することが報告されている。しかし、これらは厳密な組成が明らかでなく、異種生物由来成分を含むものであるため、このような培養条件を用いた場合にはｈＰＳＣの臨床応用が妨げられる。また、ヒトには無いシアル酸のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）などの免疫原性エピトープや、異種感染ウイルスのヒトへの伝播に関する懸念がある（非特許文献２）。
【０００４】
ｈＥＳＣやｈｉＰＳＣなどの細胞の製造を、優良製造規範（ｃＧＭＰ）に適合した施設においてフィーダー細胞や異種生物由来成分を含まない条件下で大規模に行うことが現在求められているが、フィーダー細胞の存在が特にｈＰＳＣの利用を制限している。ｈＰＳＣの多分化能の維持のためには、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、Ｗｎｔ、およびアクチビン／Ｎｏｄａｌ経路が重要であると考えられており、さまざまな研究により、フィーダー細胞の関与しない代替的なｈＰＳＣ培養条件が試みられているが、ｈＰＳＣの自己複製能力の維持を担う主成分は明らかとされていない（非特許文献３）。
【０００５】
再生医療に向けた将来的な研究に必要とされる保存可能なｈＰＳＣ集団を作成するためには、ｈＰＳＣの多分化能が維持されるように増殖を制御することが重要な技術となる。近年、ｈＰＳＣを培養しつつ、その多分化能を維持するために、化学組成の明らかな培地と共に、細胞培養マトリクスの開発が進められている。これらのマトリクスは、化学組成が明らか、あるいは異種生物由来成分を含まないものであるが、特定の培地の組み合わせを必要とする。また、これらの細胞マトリクス上で多分化能を維持できるのは、特定のｈＰＳＣだけである。ｈＰＳＣ培養のために最適なマトリクスを決定することは、現在は容易でない（非特許文献４）。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を医療等に利用するために、これらの細胞を安全、簡便、安価に増殖させる培養技術がすでに十分に確立されているとは言えない。また、多能性幹細胞の分化を制御（促進）する技術にも、多様なニーズが存在している。
【０００６】
一方、培養器材に接着した細胞では、器材の物理化学的特性を反映して生理活性シグナルが細胞内へ伝達され、それによって細胞の増殖、分化、死滅など代謝活動が調節されることが知られている。そのため、材料表面の物理化学的因子を制御し、それに従った細胞機能制御に関する研究がここ十年ほど活発に行われてきた（非特許文献５〜７）。例えば、種々の弾力性を有するエラストマー表面上での間葉系幹細胞の分化特性は、接着しているエラストマーのヤング率が低くなることにより神経及び脂肪細胞への分化が促進され、高くなることにより骨芽細胞への分化が促進されることなどが知られている（非特許文献８）。また、ｈＥＳＣは物理刺激感受性であり、培養器上のマイクロポストアレイのマトリクス剛性が高まると、細胞骨格の収縮性が増加し、硬い基質によってｈＥＳＣの多能性の維持が促進されることが知られている（非特許文献９および１０）。しかしながら、このような器材の物理化学的特性を調整することで幹細胞の分化もしくは未分化維持を制御する技術も、この分野における多様なニーズを満たすまでに十分に確立されてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０２１５９号
【特許文献２】国際公開第０３／０７４０９９号
【特許文献３】特開２００５−１４３９２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Higuchi, A., Ling, Q., Kumar, S., Munusamy, M., Alarfajj, A., Umezawa, A.,Wu, G., 2014. Design of polymeric materials for culturing humanpluripotent stem cells: Progress toward feeder-free andxeno-free culturing. Progress in Polymer Science 39, 1348-1374.
【非特許文献２】Martin MJ, Muotri A, Gage F, Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med 2005;11:228-32.
【非特許文献３】Abraham S, Sheridan SD, Miller B, Rao RR. Stable propagation of human embryonic and induced pluripotent stem cells on decellularized human substrates. Biotechnol Prog 2010;26:1126-34.
【非特許文献４】Meng GL, Liu SY, Rancourt DE. Synergistic effect of medium, matrix,and exogenous factors on the adhesion and growth of humanpluripotent stem cells under defined, xeno-free conditions. Stem Cells Dev 2012;21:2036-48.
【非特許文献５】Ji-Hun Seo, Nobuhiko Yui. The effect of molecular mobility of supramolecular polymer surfaces on fibroblast adhesion. Biomaterials Volume 34, Issue 1, January 2013, Pages 55-63.
【非特許文献６】Ji-Hun Seo, Sachiro Kakinoki, Yuuki Inoue, Kwangwoo Nama, Tetsuji Yamaoka, Kazuhiko Ishihara, Akio Kishida, Nobuhiko Yui. The significance of hydrated surface molecular mobility in the control of the morphology of adhering fibroblasts. Biomaterials Volume 34, Issue 13, April 2013, Pages 3206-3214.
【非特許文献７】Ji-Hun Seo , Sachiro Kakinoki , Tetsuji Yamaoka , and Nobuhiko Yui. Directing Stem Cell Differentiation by Changing the Molecular Mobility of Supramolecular Surfaces. Adv Healthc Mater. 2015 Jan 28;4(2):215-22.
【非特許文献８】Adam J. Engler, Shamik Sen, H. Lee Sweeney, Dennis E. Discher. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell Volume 126, Issue 4, 25 August 2006, Pages 677-689
【非特許文献９】Higuchi A, Ling QD, Chang Y, Hsu ST, Umezawa A. Physical cuesof biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem Rev 2013;113:3297-328.
【非特許文献１０】Sun Y, Villa-Diaz LG, Lam RH, Chen W, Krebsbach PH, Fu J. Mechanics regulates fate decisions of human embryonic stem cells. PLoSONE 2012;7, e37178/1-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新たな多能性幹細胞の培養技術を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、安全性の高い多能性幹細胞の培養技術を提供することを目的の一つとし、扱いが簡便な多能性幹細胞の培養技術を提供することを別の目的の一つとし、さらに、コストが安価な多能性幹細胞の培養技術を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一つの態様において、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて、幹細胞を培養する方法を提供する。本発明者らは、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて幹細胞を培養することで、多能性幹細胞の未分化性を維持することが可能であること、また、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進することが可能であることを見いだした。
【００１１】
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本方法の一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本方法の一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。
【００１３】
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリン（以下、ＣＤともいう）はメトキシ基により修飾されていてもよい。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。
【００１４】
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。
【００１５】
本方法の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。
【００１６】
一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を添加する工程をさらに含む。一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞を播種する工程をさらに含む。
【００１７】
本方法の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が使用される。
【００１８】
本発明は、一つの態様において、細胞培養用のキットであって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地とを含む、キットを提供する。
【００１９】
本キットの一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本キットの一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。
【００２０】
本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてシクロデキストリン（α−、β−もしくはγ−シクロデキストリン）を含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。
【００２１】
本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。
【００２２】
本キットの一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。
【００２３】
本キットの一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が含められる。培養培地は、液体の形で提供されても、乾燥粉末の形で提供されてもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよい。
【００２４】
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器を提供する。
【００２５】
本培養器の一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本培養器の一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。
【００２６】
本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。
【００２７】
本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。
【００２８】
本培養器の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。
【００２９】
本培養器の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が含められている。
【００３０】
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。
【００３２】
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。
【００３３】
本方法の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、またはポリカーボネートを含む。
【００３４】
一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を添加する工程をさらに含む。一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞を播種する工程をさらに含む。
【００３５】
本方法の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するために調合された培地が使用される。
【００３６】
一つの態様において、本方法は、多能性幹細胞に心筋細胞への分化を促進する刺激を与える工程をさらに含む。
【００３７】
さらに、本発明は、さらなる態様において、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地とを含む、細胞培養用のキット、あるいは、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＲＡＦＴ重合によるポリロタキサン・ブロック共重合体の合成を模式的に示す図面である。例示的な反応の概要は以下のとおり。分子量２０ｋダルトンの両末端アミン化ＰＥＧ１ｇ溶液に（５ｍＬジクロロメタン）０．０１８ｇのジメチルアミノピリジンを溶解させ、その後、０．１４ｇの可逆付加開裂連鎖移動重合剤（ＲＡＦＴ剤）と０．０８２ｇのカルボジイミドを入れ、１２時間常温で反応させた後、再沈殿と透析にて末端ＲＡＦＴ剤機能化ＰＥＧ（ＲＡＦＴ−ＰＥＧ）の回収を行う。０．３５ｇのＲＡＦＴ−ＰＥＧを３．５ｇのα―ＣＤと２５ｍＬの純水で撹拌させ、遠心と凍結乾燥にて擬ポリロタキサンの包接錯体を得る。０．６ｇの得られた擬ポリロタキサンを０．３５４ｇのＭＰＣと０．６３３ｇのＢＭＡとともにエタノールートルエン（１：１）混合溶媒７ｍＬに溶解させ、０．８２ｍｇのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加えた後６０℃で一日重合させる。その後、再沈殿及び透析、凍結乾燥にてＰＲＸブロック共重合体（ＰＲＸ−ＰＭＢ）を回収する。２００ｍｇのＰＲＸ−ＰＭＢを７ｍＬの脱水ＤＭＳＯに分散させ、０．１５５ｇの水素化ナトリウムを入れ３０分間撹拌した後、０．１０２ｇのヨード化メタンを徐々にいれ、３時間常温で反応させる。反応溶液を６Ｎの塩酸溶液にて中化させ、透析と凍結乾燥にてメチル化ＰＲＸ−ＰＭＢを得る。
【図２】接着ｉＰＳ細胞（未分化８日目）の位相差像とＧＦＰ−Ｎａｎｏｇ蛍光発現（Ｂａｒ＝１００μｍ）を示す図面である。左から１番目と３番目の列は培養した細胞の位相差像、左から２番目と４番目はＧＦＰ−Ｎａｎｏｇの蛍光発現を示している。左２列の上段はガラス上で培養した細胞、中段はＰＲＸ−Ｂ上で培養した細胞、下段はゼラチン上で培養した細胞であり、右２列の上段はＰＲＸ−Ａ上で培養した細胞、中段は無可動のＲａｎｄｏｍ表面上で培養した細胞、下段はＳＮＬフィーダー細胞上で培養した細胞をそれぞれ示している。
【図３】ｉＰＳ細胞（未分化８日目）のＯｃｔ−４とアクチンの発現を示す図面である。左からガラス上、ＰＲＸ−Ａ上、ＰＲＸ−Ｂ上、Ｒａｎｄｏｍ表面上、ゼラチン表面上、ＳＮＬフィーダー細胞上で培養した細胞のタンパク質発現をウエスタンブロットにより調べたものであり、上段はＯｃｔ−４の発現、下段はアクチンの発現をそれぞれ示している。
【図４】接着ｉＰＳ細胞（心筋分化８日目）の位相差像とＧＦＰ−Ｎａｎｏｇ蛍光発現（Ｂａｒ＝１００μｍ）を示す図面である。左上２枚の写真はガラス上で培養した細胞の位相差像（左）とＧＦＰ−Ｎａｎｏｇ蛍光発現（右）を示している。同様に、右上２枚はゼラチン上で培養した細胞、中央はＰＲＸ−Ａ上、左下はＰＲＸ−Ｂ上、右下はＲａｎｄｏｍ表面上でそれぞれ培養した細胞の位相差像（左）とＧＦＰ−Ｎａｎｏｇ蛍光発現（右）を示している。
【図５】心筋分化ｉＰＳ細胞での拍動コロニー数を示す図面である。左から、ガラス上、ＰＲＸ−Ａ上、ＰＲＸ−Ｂ上、Ｒａｎｄｏｍ表面上、ゼラチン表面上でそれぞれ心筋分化後８日間、１２日間、または１７日間培養した細胞の拍動コロニー数を調べたもの。
【図６】心筋分化細胞での分化マーカー遺伝子の発現量（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図面である。上段左はα−ＭＨＣ遺伝子、上段右はＨＣＮ遺伝子、下段左はＴｎＴ２遺伝子の発現（心筋分化後８日、１２日および１７日）をそれぞれグラフで示している。右下は電気泳動のバンドの様子。
【図７】ｉＰＳ細胞（心筋分化１７日目）のＲａｃ１、ＲｈｏＡおよびＲＯＣＫの発現を示す図面である。左から、ガラス上、ＰＲＸ−Ａ上、ＰＲＸ−Ｂ上、Ｒａｎｄｏｍ表面上、ゼラチン表面上でそれぞれ培養した細胞のタンパク質発現をウエスタンブロットにより調べたものであり、最上段は活性Ｒａｃ１（Ｒａｃ１−ＧＴＰ）の発現、上から２段目は活性ＲＯＣＫ（ＲＯＣＫ−ＧＴＰ）の発現、３段目は活性ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡ−ＧＴＰ）の発現、最下段は全ＲｈｏＡの発現をそれぞれ示している。
【図８】ｉＰＳ細胞（未分化８日目、分化８日目、分化１７日目）のＥ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンの発現量（ＥＬＩＳＡ）を示す図面である。上のグラフは、未分化８日目でのカドヘリン発現を示している。左下のグラフは、分化８日目および分化１７日目のＥ−カドヘリンの発現量、右下のグラフは、分化８日目および分化１７日目のＮ−カドヘリンの発現量をそれぞれ示している。
【図９】ＰＲＸ−Ａ（左）とゼラチン（右）上でのｉＰＳ細胞（心筋分化１７日目）のＮ−カドヘリン発現を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面上で多能性幹細胞を培養すると、幹細胞を未分化状態で維持可能であることを見出した。ポリロタキサンを用いて表面を加工した培養器上でマウス線維芽細胞あるいはラット間葉系幹細胞を培養した際の挙動が以前に調べられているが（上記非特許文献５〜７を参照）、これらの文献が、細胞の変化の促進を示しているのとは対照的である。また、本発明者らは予想外なことに、ＰＲＸブロック共重合体表面上での培養により、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進することも可能なことをあわせて見出した。
【００４０】
ポリロタキサン（ＰＲＸ）
ロタキサンは、大環状分子を線状分子が貫通し、線状分子の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害でリングが軸から抜けなくなったものである。ポリロタキサンでは、複数の大環状分子の環内を１本の線状分子が貫いている。本発明は、一つの態様において、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて、幹細胞を培養する方法を提供するものである。本発明において用いられる線状分子や環状分子は特に限定されないが、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。また、線状分子の平均分子量は２００〜１０００００、特に１００００〜４００００あるいは１５０００〜２５０００であることが好ましく、例えば、分子量２００００のポリエチレングリコールが使用される。環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せが好ましい。なお、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せによるポリロタキサンの合成例は、上記の特許文献１〜３にも開示されており、その内容は参照により本明細書にも取り込まれる。好ましい環状分子の分子数と線状分子の分子数との比率は５０：１〜４：１であり、２０：１〜１０：１の比率がより好ましく、例えば、１２：１の比率が用いられる。すなわち、好ましくは線状分子１分子に４〜５０個の環状分子が含まれ、より好ましくは１０〜２０個の環状分子が含まれ、例えば、１２個の環状分子が含まれる。α−シクロデキストリンをポリエチレングリコールに貫通させる場合、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールの繰り返し単位（エチレンオキシド単位）の比の化学量論数は１：２といわれている。
【００４１】
本発明において用いられる嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、例えば１以上のベンゼン環を有する基、１以上の第三ブチルを有する基、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）、又はＭＰＣとＢＭＡとの組み合わせが好ましい。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられる。上記のうち、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが特に好ましい。
【００４２】
本発明において、ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．２〜０．５でよく、好ましくは０．３〜０．４である。ここで、モル分率とは、ＭＰＣとＢＭＡ（ＰＢＭ）の総重合度を１にした際の、それぞれのモノマーの重合度の割合を指す。
【００４３】
本発明のポリロタキサンとしては、上記線状分子がポリエチレングリコール、上記環状分子がα−シクロデキストリン、上記嵩高い置換基を有する部分がＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせであることが特に好ましい。この場合、ＰＥＧの分子量は約２００００であり、ＰＥＧ１分子に含まれるシクロデキストリンの数はおよそ１２個、例えば、９〜１５個でありうる。図１には、ＲＡＦＴ重合によるポリロタキサン・ブロック共重合体の合成の概略が模式的に示されている。
【００４４】
ＰＲＸブロック共重合体
ＰＲＸ部分の調製には、使用する環状分子であるシクロデキストリン（ＣＤ）の大きさと線状高分子鎖の断面の立体的相補性が必要であり、たとえば最も環サイズの小さなα−ＣＤではＰＥＧ、次に大きなβ−ＣＤではポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）やその共重合体などが用いられる（シクロデキストリンの空孔の内径はα体で０．４５〜０．６ｎｍ、β体で０．６〜０．８ｎｍ、γ体で０．８〜０．９５ｎｍ程度）。また、化学量論的にはα−ＣＤはＰＥＧの繰り返し単位であるＥＧの２ユニットを包接可能であることから、環状分子の数には、使用する線状高分子の分子量によって上限がある。例えば、実施例１の方法で合成した場合には、ＣＤの貫通率は概ね数〜６０％程度である。分子運動性が高いＰＲＸブロック共重合体は好ましくは、分子量２００００のＰＥＧ１分子あたり４〜５０個のα−ＣＤ分子を含み、より好ましくは８〜３０個のα−ＣＤ分子を含み、さらにより好ましくは１０〜２０個のα−ＣＤ分子を含む。
【００４５】
ＰＲＸとブロック共重合体を形成するために導入する連鎖は、重合反応可能なモノマーであれば何でも利用可能であるが、例えば、既存の材料への固定化、生体成分への影響を最小にすることを目的としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）とのランダム共重合体を導入することができる。生体適合性を目指したＭＰＣとＢＭＡの組成については以前に検討され、ＢＭＡモル分率０．３が最も優れた生体適合性を示すことが明らかになっているが、例えば、既存の材料への固定化を目的としつつ生体成分への影響を極小にする観点からＢＭＡモル分率０．４を目安として合成することもできる。
【００４６】
本発明に係るＣＤはメトキシ修飾されていることが好ましい。ＰＲＸのメトキシ修飾（ＯＭｅ化）は元々水溶性付与を目的としており、ＣＤ未修飾のＰＲＸでは水溶性が乏しいので生体環境下でのＣＤ運動性が期待できない。ＯＭｅ化の程度は数〜９０％以上まで広範囲にわたる。シクロデキストリンにメトキシ基を導入する場合、導入率（導入されたメトキシ基の数／シクロデキストリンの数）は５０％以上が好ましく、６０％以上、７０％以上もしくは８０％以上であってもよいが、９０％以上がより好ましい。範囲としては、導入率は５０〜１００％が好ましく、６０〜１００％、７０〜１００％もしくは８０〜１００％であってもよいが、９０〜１００％がより好ましい。
【００４７】
ＰＲＸ中のシクロデキストリンなどの環状分子は、メトキシの他にも、メチル、ヒドロキシプロピル、モノアセチル等の修飾基を含んでいてもよく、また、ＲＧＤモチーフを含むペプチド等のペプチドにより修飾されていてもよい。さらに、シクロデキストリンには、コラーゲンなどのタンパク質が結合されていてもよい。
【００４８】
細胞応答に最も影響力があるＣＤ運動性については、ＱＣＭ−Ｄ（Quartz Crystal Microbalance-Dissipation）測定によって得られるＰＲＸ共重合体の水中でのエネルギー散逸量をコーティング質量に相当する周波数変化で標準化した数値（Ｍｆ）を水和分子運動性の尺度として用いることができる。高分子をキャストした際の質量増加による共振周波数変化（△ｆ）に対する空気−水の環境変化時のエネルギー散逸量変化（△Ｄ）の割合が、水中での分子運動性因子（△Ｄ／△ｆ＝Ｍｆ）と定義されている（Inoue Y, Ye L, Ishihara K, Yui N: Preparation and surface properties of polyrotaxane-containing tri-block copolymers as a design for dynamic biomaterials surfaces. Colloid Surf. B: Biointerface 2012, 89: 223-227）。Ｍｆは汎用高分子では疎水性から親水性になるにつれて０．１〜０．２程度の値を示すが、ＰＲＸブロック共重合体ではＣＤ数を調整することによって親水性を保持したまま０．１〜１．０程度まで広範囲に変化させることができる。分子運動性が高いＰＲＸブロック共重合体のＭｆは好ましくは０．１以上であり、より好ましくは０．２以上であり、さらにより好ましくは０．３以上である。範囲としては、Ｍｆは好ましくは０．１〜１．０であり、より好ましくは０．２〜１．０であり、さらにより好ましくは０．３〜１．０である。
【００４９】
幹細胞
本発明において利用可能な多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞が挙げられる。また、ＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞も用いられうる。本発明において好ましく利用可能な多能性幹細胞は、霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。
【００５０】
ｉＰＳ細胞であるヒト皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞は、例えば、理研バイオリソースセンターおよびＡＴＣＣ社、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手可能である。ヒトｉＰＳＣ株は、２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４などが利用可能である。ＥＳ細胞であるヒト胚性幹細胞は、例えば、理研バイオリソースセンターより入手可能である。ヒトＥＳＣ株としては、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−３、Ｈ１、Ｈ９などが利用可能である。
【００５１】
培養培地
未分化維持用の培養培地としては、例えば、Primate ES Cell Medium＋4 ng/ml human basic FGF（ReproCELL社）およびhuman ES medium（ReproCell社）、Pluripotent Stem Cell SFM XF/FF（ATCC社）、DMEM/HamF12(2mM L-Glutamine)＋20%KSR+0.1mM NEAA＋0.1mM 2-Mercaptoethanol＋5ng/ml human bFGF等を利用することができる。また、mTeSR1（StemCell Technologies社）、TeSR2（StemCell Technologies社）、StemPro hESC SFM（Invitrogen社）、hESF-GRO（株式会社細胞科学研究所）等も挙げられる。本願の実施例においては、未分化培地として、Gibco社製ＤＭＥＭ、EQUITECH-BIO社製牛血清１５％、Gibco社製２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、Gibco社製ＮＥＡＡ  ０．１ｍＭ、Millipore社製ＬＩＦ  ０．１％の混合培地が用いられている。さらに、以下の文献に記載の培地も利用されうる：
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
【００５２】
心筋分化用の培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、２０％  ＦＢＳ（Gibco）、１％  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Sigma）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Sigma）、０．００１％  ２−メルカプトエタノール（GIBCO）、および０．００５Ｎ  ＮａＯＨ、並びに１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４（R&D Systems）含有、あるいは、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Sigma）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Sigma）、０．５ｍＭ  Ｌ−カルニチン（Sigma）、０．００１％  ２−メルカプトエタノール（GIBCO）、および１−２％ウシ血清アルブミン（Wako）、または０．４％ヒト血清アルブミン（Sigma）、並びに５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Axon）および２μＭ  ＢＩＯ（Calbiochem）含有）、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本願の実施例においては、分化誘導培地として、GIBCO社製αＭＥＭと０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％牛血清の混合培地が使用されている。
【００５３】
培養器
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化維持培養用の培養器を提供し、また、別の態様において、多能性幹細胞の心筋細胞分化促進用の培養器を提供する。培養器の素材としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネートなどのプラスチック素材やガラス素材が利用可能であるが、これらに限定されない。近年では、アクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）なども開発されている。形状においても、コンタミネーションやクロスコンタミネーションを引き起こさず、底面積の大きな容器形状であればよく、限定的な形状はない。これまでには、薄い円柱構造の培養皿や立方体様構造の培養フラスコなどが主に使用されている。また、メンブレンの形状に加工したセルカルチャーインサートなども使用されており、その形状は限定的ではない。培養器としては、例えば、２７φの直径を持つガラスボトムディシュ（IWAKI社製）等を利用できる。
【００５４】
コーティング方法
培養器へのポリロタキサンのコーティングは、例えば、ポリマー溶液（例えば、０．０５ｗｔ％、蒸留水：エタノール＝１：１混合溶媒）をキャストし、一晩程度乾燥させることで行うことができる。そのほかにもポリマー溶液に板状の表面を浸漬させ、クリーンベンチ内でフリースタンディングさせ乾燥させるディップコーティングや、スピンコーティング法によるコーティングも可能である。ポリロタキサンをコーティングした培養器は、多能性幹細胞の未分化維持培養用の培養器として、また、多能性幹細胞の心筋細胞分化促進用の培養器として使用できる。
【００５５】
キット
本発明に係るキットは、細胞培養用のキットであって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む。本発明に係るキットに含まれる多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地としては、例示的に本明細書中に記載のものが挙げられるが、それらに限定はされない。培養培地の形態は、液体、固体、ゲル、粉末など任意のものでよく、解凍して、あるいは水に溶解して用いるものでもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよく、キットに含まれる培養培地の種類、数等に制限はない。また、培地は任意のサプリメントを加えて用いるものであってもよい。さらに、本発明に係るキットには、培養器と培地に加えて、取扱説明書や他の付属品が含まれていてもよい。
【００５６】
培養培地を含むＰＲＸ表面被覆培養器
本発明の一つの態様により、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器が提供される。この培養器は、本発明に係るキットに含まれる培養器に、本発明に係るキットに含まれる培地を加えることでも作製されうる。この培養器に所望の細胞を播種して、培養に用いることができる。すなわち、この培養器中の細胞培養培地には、培養する細胞が含まれていてもよい。
【００５７】
細胞の培養
細胞の培養条件としては、細胞を維持または増幅し得る方法である限り特に制限されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換や継代を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎とすることができる。継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されず、細胞の集団が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過毎、好ましくは６〜１０日間経過毎とすることができる。
【００５８】
本発明に係る培養器上で培養した多能性幹細胞は、分化誘導を行って各種組織、細胞に分化させてもよい。例えば、多能性幹細胞は、中枢神経および感覚系の細胞、角膜、網膜、神経幹細胞、心筋細胞、インシュリン産生細胞、肝細胞、骨、軟骨、造血幹細胞、筋肉、血管、または腎臓の細胞などへと分化させることができる。特に、多能性幹細胞から心筋細胞への分化は、本発明に従って、ポリロタキサンをコーティングした培養器上での培養により、効率よく行うことができる。
【００５９】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：ＰＲＸブロック共重合体の合成
Ａ．ＰＥＧマクロＣＴＡ（4-(benzodithioyl)-4-cyanopentanoic acid）の調製
ＰＥＧ（分子量２００００，１ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）とジヂメチルアミノピリジン（０．００１８ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ＣＴＡ（０．１４ｇ，０．５ｍｍｏｌ）と水溶性カルボジイミド（０．０８２ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えて１２時間撹拌した。更にジクロロメタンを加えて、冷ジエチルエーテル中で沈殿させて回収した。得られた粗生成物を水に溶解して透析し凍結乾燥した。
【００６１】
Ｂ．ＣＤ包接錯体（擬ＰＲＸ）の調製
得られたＰＥＧマクロＣＴＡ（０．３５ｇ）をα−ＣＤ（３．５ｇ）水溶液（２５ｍｌ）に常温で加えて、生じた沈殿物を遠心分離で回収し、水（２５ｍＬ）を加えて再度遠心分離した上で凍結乾燥した。
【００６２】
Ｃ．ＰＲＸブロック共重合体の合成
ＣＤ包接錯体（０．６ｇ）をＭＰＣ（０．３５４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）およびＢＭＡ（０．６３３ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）とエタノール／トルエン（１／１）混合溶媒中でＡＩＢＮ（０．８２ｍｇ，５μｍｏｌ）を開始剤としてアルゴン雰囲気下で１５分間反応させ、更に６０℃で２４時間反応させた。溶媒１５ｍＬを加えて、生じた沈殿物を遠心分離で回収した。粗成物を引き続きエタノール、アセトン、ジメチルスルフォキシドで洗浄して未反応モノマーおよびＣＤを除去した。得られた沈殿物を更に４０℃で真空乾燥して最終生成物とした。
【００６３】
Ｄ．ＯＭｅ−ＰＲＸブロック共重合体の合成（ＰＲＸブロック共重合体のＯＭｅ化）
合成したＰＲＸブロック共重合体（２００ｍｇ）を脱水ジメチルスルフォキシド（７ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（０．１５５ｇ，６．３ｍｍｏｌ）を加えてアルゴン雰囲気下室温で３０分間反応させた。次にヨードメタン（０．１０２ｇ，０．７１９ｍｍｏｌ）を徐々に加えて室温で３時間反応させた。ｐＨを中性にしてから反応溶液を３日間透析し、凍結乾燥して目的物を得た。
【００６４】
Ｅ．ランダム共重合体（対照）の合成
ＰＲＸブロック共重合体と同様なＯＭｅおよびＯＨ基を有するランダム共重合体は、ＢＭＡ（０．６３３ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）、ＭＰＣ（０．３５４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）、ＨＥＭＡ（０．６３７ｇ，４．９ｍｍｏｌ）、ＭＥＡ（１．１０６ｇ，８．５１ｍｍｏｌ）をトルエン／エタノール混合溶媒（１／１）（８ｍＬ）中でＡＩＢＮ（０．４ｍｇ）を開始剤としてアルゴン雰囲気下６０℃で２４時間反応させて合成した。反応溶液は冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、水中で２日間透析してから凍結乾燥して目的物を得た。
【００６５】
実施例２：ＰＲＸ処理器材での人工多機能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の未分化特性評価
２７φの直径を持つガラスボトムディシュ（IWAKI社製）に、１５０μＬのポリマー溶液（０．０５ｗｔ％、蒸留水：エタノール＝１：１混合溶媒）をキャストし、一晩クリーンベンチで乾燥させた。用いたポリマーはＰＲＸ−Ａ（分子運動性が最も高いＰＲＸブロック共重合体であり、分子量２００００のＰＥＧ１分子あたりのα−ＣＤ貫通数１２、α−ＣＤへのメトキシ基導入率９０％のもの）、ＰＲＸ−Ｂ（分子運動性が低いＰＲＸブロック共重合体であり、α−ＣＤ貫通数１０４、α−ＣＤへのメトキシ基導入率６１％のもの）、そしてＲａｎｄｏｍ（非ＰＲＸ構造の汎用性メタクリレートポリマーであり、メトキシ基導入率１１ｍｏｌ％であってＰＲＸ−２と同様なメトキシ基を有するもの）の３種類である。比較対象として、未修飾のガラスボトムディシュ及び未分化維持のためのフィーダー細胞であるＳＮＬ（European Collection of Cell Cultures社製）をサンプル群に加えて実験を行った。マウス由来のｉＰＳ細胞（iPS-MEF-Ng-178B-5、京都大学ｉＰＳ細胞研究所ＣｉＲＡ樹立）を３．０ｘ１０４細胞／ｍＬ濃度で未分化培地（Gibco社製ＤＭＥＭ、EQUITECH-BIO社製牛血清１５％、Gibco社製２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、Gibco社製ＮＥＡＡ  ０．１ｍＭ、Millipore社製ＬＩＦ  ０．１％の混合培地）に分散させ、それぞれ１ｍＬずつサンプルディシュに播種した。播種後毎日培地交換を行いながら８日間接着の様子を観察した。なお、ウェスタンブロットによる未分化マーカータンパク質（Ｏｃｔ−４）の発現解析は以下の手順で行った。まず未分化培地で培養したｉＰＳ細胞（８日間）のトータルタンパク質をInvent Biotechnology社製Minute Detergent-Free protein extraction kitを用いて抽出した。その後、Pierce社製Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキットを用いて抽出タンパク質濃度を定量した。用いた検量線は濃度既知のウシ血清アルブミン（Pierce社製Standard）溶液で作製した。抽出タンパク質溶液は９００μｇ／ｍＬの濃度に調整し、１０μＬのタンパク質溶液を１０μＬのLamiel Buffer（BioRad社製）と混合し、それぞれ１０〜２０％アクリルアミドグラディエントゲル（BioRad社製）中２００Ｖで３０分間電気泳動させた。その後Biorad社製Turbo Blotting Systemを用いて、泳動ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、Wako製スキムミルク（５％）で１時間ブロッキングを行い、抗Ｏｃｔ４抗体（ウサギ由来、Cell Signaling Technology社製）及び抗アクチン抗体（ウサギ由来、Sigma-Aldrich社製）を希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間半反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Cell Signaling Technology社製ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、GE Healthcare社製Blotting Substrateで処理した後、GE Healthcare社製ImageQuant LAS500システムにて撮影を行った。
【００６６】
図２はｉＰＳ細胞の播種後８日目の様子を示す。全ての表面で播種したｉＰＳ細胞は安定に接着し、ほぼコンフルエントに増殖していることが確かめられた。なお定量結果でも、殆どの表面で同じレベルの細胞接着数が見られ（３次元に増殖するフィーダー細胞上での接着数を除く）、構築したＰＲＸ表面はｉＰＳ細胞の接着及び増殖にも十分効果的であることが示された。なお、ＧＦＰ−Ｎａｎｏｇの蛍光発現を観察したところ、フィーダー細胞であるＳＮＬ表面にて培養されたｉＰＳ細胞で最も強いＮａｎｏｇの発現が見られた。未処理のガラス表面、無可動のＲａｎｄｏｍ表面、ゼラチン表面では弱いＮａｎｏｇの発現が見られ、未分化能が大きく低下していることが確認された。しかし高い分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面ではやや強いＮａｎｏｇの発現が見られ、胚様細胞塊の形態も、より維持されていることが確認された。このことは、高い分子運動性表面に接着したｉＰＳ細胞の場合、材料表面との相互作用が弱く細胞−細胞間相互作用が強くなっているためと考えられ、高い分子運動性を有するＰＲＸ表面が未分化特性を維持する上で効果的であることを示している。
【００６７】
更に、それぞれの表面に接着したｉＰＳ細胞の未分化維持特性をタンパク質レベルで確認するため、ウエスタンブロットにて未分化マーカータンパク質の一種であるＯｃｔ−４の発現を調べた。図３は未分化８日目のｉＰＳ細胞でのＯｃｔ−４とアクチンの発現結果を示す。ＳＮＬ表面では、基板との相互作用が弱いために同じタンパク質総量に対してアクチン発現量が比較的低く検出された一方でＯｃｔ−４発現がアクチン発現に対して高く検出され、ＳＮＬ上では材料表面との相互作用を弱めながら未分化特性を維持するに適した環境が与えられているのが確認された。一方、高い分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面では、タンパク質総量に対するアクチン発現量が著しく低下した中でＯｃｔ−４発現が高く検出された。また、その程度はゼラチンなど基板との相互作用が強い表面と比べても著しかった。このことは、培養器材上へコーティングされたＰＲＸ表面の高い分子運動性によりｉＰＳ細胞の未分化性が維持されることを示している。
【００６８】
実施例３：ＰＲＸ処理器材でのｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化とＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子解析
上記の３種類のポリマー表面と未修飾のガラス表面、そしてゼラチン修飾ディシュ（０．１％ゼラチン溶液にてコーティング、Life Technology社製）にそれぞれ２．０ｘ１０４細胞／ｍＬのｉＰＳ細胞溶液を１ｍＬずつ播種し、心筋細胞へ分化させながら異なる培養器材での分化特性を調べることにした。分化誘導培地はGibco社製αＭＥＭと０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％牛血清の混合培地を使用しており、播種後２日ごとに培地交換を行った。播種７日目には１０ｎｇ／ｍＬのトリコスタチンＡ（Wako社製）含有の分化誘導培地に置換させ、１日インキュベーションした後にトリコスタチンＡ無含有の分化誘導培地に再び置換させながら分化の様子を観察した。
【００６９】
図４はｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化８日後（トリコスタチンＡ処理一日後）の接着形態を示す。全ての表面で分化培地でもｉＰＳ細胞が安定に接着及び増殖を見せていた。またＧＦＰ−Ｎａｎｏｇの発現が全ての表面でほとんど見られておらず、分化培地の影響で接着ｉＰＳ細胞の多分化能が消失していることが確認された。一般的に心筋細胞への分化に有利であることが知られているゼラチン（ポジティブコントロール）表面と比較して、最も分子運動性の高いＰＲＸ−Ａ表面では、分化８日目の段階で拍動コロニーが見られ始めた。その接着の様子でも、拍動が見られているゼラチンとＰＲＸ−Ａ表面では密集した細胞コロニーが広がっていることが特徴的にみられており、ｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化および拍動組織の形成において、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面が優れていることが示された。
【００７０】
図５は心筋分化後の８日目、１２日目、１７日目のｉＰＳ細胞での拍動コロニー数を示す。分化初期である８日目にはゼラチン表面で最も多い拍動コロニー数が見られたが、分化時間の延長とともにその数が減少していた。一方ＰＲＸ−Ａ表面では分化初期のコロニー数はゼラチンの２０％程度だったが、時間経過とともにコロニー数が増え、分化１７日目にはもっとも多いコロニー数を示した。この結果は、高い表面分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面が拍動コロニー数を増加させるのに最も有利な環境を提供していることを示している。
【００７１】
実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによる心筋細胞分化マーカーｍＲＮＡの発現量解析
分化誘導培地中で分化されたそれぞれのｉＰＳ細胞中の分化マーカー遺伝子の発現量を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量定量を行った。Ambion社製のPureLink RNA Mini kitを利用し、分化細胞中のトータルＲＮＡを抽出した後、Thermo社製のNanodrop2000を利用し、ＲＮＡの濃度定量を行った。トータルＲＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬに調整し、Applied Biosystems社製のｃＤＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡの合成を行った。５０ｎｇのｃＤＮＡを２５μＬのToyobo社製SYBR-RT-PCR Master mixと混合し、２μＬのプライマー溶液（２５μＭ）と混合した後、Applied Biosystems社製Step-One Puls RT-PCR機にてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲのプライマー及びＰＣＲ反応条件は以下のようである。
【００７２】
プライマー（Sigma-Aldrich社製）：
αＭＨＣ：
Ｆ−ＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡ
Ｒ−ＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣ
ＨＣＮ４：
Ｆ−ＣＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡ
Ｒ−ＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＣＧＡＡＡＣＧＣ
ＴｎＴ２：
Ｆ−ＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡ
Ｒ−ＣＧＣＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧ
ＧＡＰＤＨ：
Ｆ−ＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣ
Ｒ−ＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧ
反応条件：
９５℃２分後、４０サイクルの９５℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒
【００７３】
図６はそれぞれの表面で心筋分化したｉＰＳ細胞でのｍＲＮＡの発現量のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。いずれの結果も拍動コロニーの数が最も多くみられたＰＲＸ−Ａ表面での分化マーカー遺伝子の発現が分化１７日目では最も高くみられ、心筋細胞への高い分化能が遺伝子レベルにおいても確かめられた。
【００７４】
実施例５：ウエスタンブロットによる細胞内骨格系シグナルの発現定量
タンパク質レベルでの接着及び分化ｉＰＳ細胞の状態を解析するため、まず実施例２に記述されている方法で分化１７日目のｉＰＳ細胞のトータルタンパク質の抽出及び濃度定量を行った。活性ＲｈｏＡとＲＯＣＫのタンパク質発現を調べるため、１００μｇのトータルタンパク質をそれぞれAbcam社製RhoA Activation Assay kit及びROCK Assay kitを用いて反応させ、１０μＬ反応溶液を２．５μＬのLamiel Buffer（BioRad社製）と混合し、１２％アクリルアミドゲル中１５０Ｖで３０分間電気泳動させた。その後Biorad社製Turbo Blotting Systemを用いて、泳動ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、Wako製スキムミルク（５％）で１時間ブロッキングを行い、キット内の抗活性型ＲｈｏＡ抗体及び抗活性型ＲＯＣＫ抗体を希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間半反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Cell Signaling Technology社製ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、GE Healthcare社製Blotting Substrateで処理した後、GE Healthcare社製ImageQuant LAS500システムにて撮影を行った。
【００７５】
図７はウエスタンブロットによる分化１７日目の活性Ｒａｃ１、活性ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡ−ＧＴＰ）とＲＯＣＫ（ＲＯＣＫ−ＧＴＰ）のタンパク質発現を示す。細胞との相互作用が高いと予想されるゼラチン表面では高い活性ＲｈｏＡ発現が確認され、ゼラチン表面ではＲｈｏＡからなる骨格系シグナル伝達経路が支配的であることが確かめられた。
【００７６】
実施例６：ＥＬＩＳＡによるカドヘリン発現の定量
１０μｇのトータルタンパク質内のカドヘリン発現量をそれぞれBoster Biological Technology社製N-Cadherin ELISAキット及びRayBio社製E-Cadherin ELISAキットにて定量した。用いた検量線はキット内の濃度既知のマウス由来Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリン・スタンダードで作製し、４５０ｎｍでの吸収強度からタンパク質発現量を定量した。ｉＰＳ細胞の未分化維持及び細胞間相互作用の形成が必須である心筋細胞への分化促進にはカドヘリンの発現量増加が必要であると考えられる。特に心筋細胞への効率的な分化のためには、Ｎ−カドヘリンの多発現が必要とされる。図８に示すように、分子運動性の高いＰＲＸ−Ａの表面では未分化段階からＮ−カドヘリンの発現が最も多く見られ、心筋細胞への分化に有利な環境を構築していることがわかった。更に、心筋細胞への分化１７日目ではゼラチンとともに高いＮ−カドヘリンの発現が見られており、図５で示した最も多い拍動コロニーを形成した結果とも合致した結果が得られた。一方ゼラチンでは、ＰＲＸ−Ａと同様に高いＮ−カドヘリン発現を見せているものの、Ｅ−カドヘリン発現も高く、典型的な心筋分化細胞のカドヘリン発現とは異なる傾向が認められた。ＰＲＸ−Ａでは、未分化状態で高く検出されたＥ−カドヘリンの発現量が分化の際著しく低下すると同時にＮ−カドヘリンのみが高い発現量を維持していた。
【００７７】
実施例７：免疫染色によるＮ−カドヘリンの分布状態
心筋分化後に高く検出されたＮ−カドヘリン発現の分布状態を調べるため、免疫染色にて心筋分化細胞でのＮ−カドヘリン発現を観察した。心筋分化した細胞をＰＢＳで洗浄した後、４％ホルムアルデヒド（Merck社製）溶液にて１５分間室温で固定化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、５％ヤギ血清と０．３％トリトン−Ｘ１００を含んだブロッキング溶液に１時間接触させた。その後ウサギ抗Ｎ−カドヘリン抗体（Abcam社製）を希釈した溶液に接触させ、４℃で一晩反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Abcam社製）溶液にて常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、ＤＡＰＩ入りのProLong gold antifade溶液（Life Technology社製）にて封入し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行った。
【００７８】
図９は心筋分化１７日目のｉＰＳ細胞のＮ−カドヘリンの蛍光免疫染色像を示している。同様なＮ−カドヘリン発現量でも、ＰＲＸ−Ａ表面では核が小さく密集した構造を持っており、更にＮ−カドヘリンによって細胞の密集体が形成されていることがわかる。一方ゼラチン表面ではＮ−カドヘリンによる細胞の密集体形成がＰＲＸ−Ａほど緻密になっていないことが確認された。この結果は、分子運動性の高いＰＲＸブロック共重合体により簡便にコーティングされた表面では、幹細胞の接着挙動が制御され、細胞−細胞間相互作用の調節にまで影響を及ぼしていることを示唆している。即ち、分子運動性の高いＰＲＸブロック共重合体は、細胞間相互作用の制御が必須である幹細胞の未分化維持表面及び心筋細胞への分化誘導表面の作製に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
以上の結果により、ＰＲＸブロック共重合体の簡便なコーティングによって、細胞間相互作用を制御し、幹細胞の分化能を含む特性の調節が可能な表面が実現することが明らかとなった。接着ｉＰＳ細胞の未分化マーカータンパク質解析により、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面は、幹細胞を未分化状態で維持可能であることが見いだされた。これは、ＲｈｏＡ−ＲＯＣＫ活性の低下によって細胞内情報伝達系が調節されているためと考えられる。このことは、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要がある再生医療の産業利用上において極めて重要であるといえる。
【００８０】
また、本発明者らは、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面がｉＰＳ細胞などの幹細胞からの心筋細胞への分化に優れていることを見いだした。さらに、心筋細胞から間葉系分化組織を構築する上で細胞−細胞間相互作用を媒介するＮ−カドヘリン発現を誘導できることも見いだされた。このことは、細胞の分化誘導のみならず分化細胞による組織再生にも優れていることを示唆している。コラーゲン表面でみられる強いＥ−カドヘリン発現および弱いＮ−カドヘリン発現と比較すると、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面ではＥ−カドヘリン発現に比べてＮ−カドヘリン発現が高くなっており、上皮間葉転換に優れていることが示唆されている。
【図１】
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【図５】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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