(57)【要約】      （修正有）【課題】測定対象物の生成、拡散条件を均一化できるようにし、正確な測定を可能にする方法を提供する。【解決手段】測定対象物を含む電解液中に測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極１１と対極が設けられ、作用極と対極の間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極の間に流れる電流を測定する方法において、電解液槽の底面に作用極と測定対象物消却用細線電極２１を設け、測定対象物消却用細線電極と対極の間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極の間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップを実行する。【選択図】図３
2017198493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を含む電解液中に、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加して前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、
前記電解液を収容する電解液槽の底面に前記作用極を設け、
前記底面に、前記底面の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極を設け、
前記測定対象物消却用細線電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して前記測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、
前記消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、
前記新しい測定対象物を拡散させた後に前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加して前記電流を測定する電気化学測定ステップとを実行することを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却ステップでは前記作用極にも前記消却用電圧を印加することを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の電気化学測定方法において、
前記底面における前記作用極のまわりに前記測定対象物消却用細線電極と共に前記消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、
前記測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において前記測定対象物消却用底面電極に接合されていることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項４】
請求項３記載の電気化学測定方法において、
前記測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記測定対象物消却用細線電極は前記測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続していることを特徴とする電気化学測定方法。
【請求項５】
電解液と前記電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、前記電解液槽の底面に設けられ、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記電解液槽に設けられた対極と、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、前記測定用電圧を印加している時に前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置において、
前記底面に、前記底面の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなり、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用細線電極が設けられ、
前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加していない時に、前記測定対象物消却用細線電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有することを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項６】
請求項５記載の電気化学測定装置において、
前記底面における前記作用極のまわりに前記測定対象物消却用細線電極と共に前記消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、
前記測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において前記測定対象物消却用底面電極に接合されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項７】
請求項６記載の電気化学測定装置において、
前記測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記測定対象物消却用細線電極は前記測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続していることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項８】
電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであって、
アレイ状に配列されて前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極が前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に位置し、
前記センサ領域上に細線よりなる第２の電極が設けられ、
前記第２の電極は前記センサ領域の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記センサ領域の他点に帰還する形状に延伸されていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項９】
請求項８記載のトランスデューサにおいて、
前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように第３の電極が前記ＬＳＩチップに形成され、
前記第３の電極は前記第１の電極と導通することなく、前記センサ領域に全面配置され、
前記第２の電極は前記一点及び前記他点において前記第３の電極に接合されていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項１０】
請求項９記載のトランスデューサにおいて、
前記第２の電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記第２の電極は前記第３の電極の上で細線によって相互に連続していることを特徴とするトランスデューサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は細胞や細胞塊、組織片その他の生体試料及び生体関連物質を含む非生体試料（以下、本願では一括して単に「生体試料」という。）に由来する化学物質（化学反応生成物）を測定する電気化学測定方法、電気化学測定装置及び電気化学測定に用いるトランスデューサに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や細胞塊、組織片等の生体試料で起こる化学反応によって生成される物質を定量することは、医療、創薬等の現場において生体試料の生死判定、機能性評価等に必要な技術である。生体試料から放出される化学反応生成物の定量方法の１つに電気化学測定があり、例えば非特許文献１では肝細胞の分化の進行状態の観察を電気化学測定によって行っている。
【０００３】
電気化学測定は、外部電源とつながった２つ以上の電極が挿入されている電解液内の測定対象物に対し、電極を介して測定対象物から電子を奪うか、もしくは測定対象物へ電子を供与することで、酸化もしくは還元反応をおこさせると同時に、電極間を流れる電流を測定して酸化還元反応の有無、即ち測定対象物の有無を検出する方法である。
【０００４】
一般的な電気化学測定装置は、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極、作用極と外部電源を介してつながり、作用極で生じる電子移動を補償する対極、測定系内のイオンを介した電子の移動を可能とし、測定系全体を閉回路とするための電解液、電圧の基準を取るための参照極等で構成される。
【０００５】
非特許文献１では、マウスの胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）より作製
したＥＳ細胞塊である胚様体（embryoid body：ＥＢ）に対し、ＥＳ細胞の細胞膜に存在
する未分化マーカーであるアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase:ＡＬＰ）を電気化学測定にて間接的に測定している。
【０００６】
機能が限定されていない幹細胞が、機能が限定された体細胞に変化する反応は、一般に分化とよばれており、分化が起こっていないことを示す物質は未分化マーカーと呼ばれている。
【０００７】
ＡＬＰは細胞の未分化マーカーであると同時に、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する性質をもつ。ＡＬＰは例えば、リン酸エステル化合物ｐ−アミノフェニルホスフェート（p-aminophenyl phosphate：ＰＡＰＰ）をｐ−アミノフェノール（p-aminophenol：ＰＡＰ）へ変化させる反応の酵素として働く。酵素反応によって生成されたＰＡＰは電気化学的活性のある物質であり、参照極を基準として作用極へ電圧印加することによって、ｐ−キノンイミン(p-quinone imine:ＰＱＩ)へ酸化される。即ち、酵素反応、酸化還元反応の２回の反応によって、ＡＬＰの存在は電気化学測定における電流値として検出される。
【０００８】
非特許文献１では、φ４０μｍの作用極を２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に備えた多点電極電流測定装置を用いて測定している。この装置は４００個の電極から得られる電極電流値により数μｍ〜数百μｍの生体試料の反応の様子を２次元的かつ経時的にイメージングしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ”  ２０１３年，４８巻，ｐ．１２−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した非特許文献１における測定は、
・ＰＡＰＰを４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ含有した電解液にマウスＥＢを投入
・投入直後から酵素反応が開始し、細胞膜内ＡＬＰによってＰＡＰＰはＰＡＰへ変化
・ＰＡＰはＥＢ表面から電極付近まで拡散し、電極表面に到達
・拡散が安定するのを待ち、電極に電圧を印加
・ＰＡＰはＰＱＩへ変化
・電極間電流値を取得
といった過程で行われており、図１はこの過程を横軸を時間として示したものである。
【００１１】
図１において、ＥＢを電解液に投入し、酵素反応が始まった瞬間から電圧印加までの時間Ａは、ＥＢ表面からＰＡＰが拡散を開始し、電解液内のＰＡＰ濃度分布が安定する時間を想定して設けられており、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂは、電極でおこる酸化還元反応によって電極付近のＰＡＰ濃度分布の変化が安定する時間を想定して設けられている。
【００１２】
ところで、このような過程を経るＥＢのＡＬＰ活性測定では、測定の不確かさが生じうるものとなっている。
【００１３】
例えば、複数のＥＢを同時測定する場合において、ピペット等でアレイ状の電極上へＥＢを配置する際、複数回に分けて配置を行った場合にはＥＢがＰＡＰＰに触れるタイミングに違いが生じるため、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａは、各々のＥＢで違い、ＥＢまわりのＰＡＰ濃度分布及び電流値は仮に全てのＥＢが同様の活性（単位時間あたりのＰＡＰ放出速度）を持っていたとしても違う値を示す。即ち、測定電流値には、ＥＢの持つＡＬＰ活性の大きさの違いと、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの長さによる違いの双方が混在することになる。
【００１４】
また、仮に、複数のＥＢを同時にＰＡＰＰ溶液に入れたとしても、ある時に行ったＥＢ群の測定結果と、違う時に行ったＥＢ群の測定結果は、例えばＥＢ投入時の作業者の入れ方に基因する液揺れの違いなどにより、それらＥＢ群間の測定結果の比較が難しいことが考えられる。
【００１５】
この発明の目的はこのような問題に鑑み、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定条件の均一化を図れるようにし、よって正確な測定を可能とし、複数回測定の各回間及び１回の測定の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行えるようにした電気化学測定方法、電気化学測定装置及びその電気化学測定に用いるトランスデューサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１の発明によれば、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、電解液を収容する電解液槽の底面に作用極を設け、前記底面に、前記底面の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極を設け、測定対象物消却用細線電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行する。
【００１７】
請求項２の発明では請求項１の発明において、測定対象物消却ステップでは作用極にも消却用電圧を印加する。
【００１８】
請求項３の発明では請求項１又は２の発明において、前記底面における作用極のまわりに測定対象物消却用細線電極と共に消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において測定対象物消却用底面電極に接合されている。
【００１９】
請求項４の発明では請求項３の発明において、測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する測定対象物消却用細線電極は測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続されている。
【００２０】
請求項５の発明によれば、電解液と電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、電解液槽の底面に設けられ、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、電解液槽に設けられた対極と、作用極と対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置において、前記底面に、前記底面の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなり、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用細線電極が設けられ、作用極と対極との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用細線電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有するものとされる。
【００２１】
請求項６の発明では請求項５の発明において、前記底面における作用極のまわりに測定対象物消却用細線電極と共に消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において測定対象物消却用底面電極に接合されているものとされる。
【００２２】
請求項７の発明では請求項６の発明において、測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する測定対象物消却用細線電極は測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続しているものとされる。
【００２３】
請求項８の発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極が電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に位置し、センサ領域上に細線よりなる第２の電極が設けられ、第２の電極はセンサ領域の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再びセンサ領域の他点に帰還する形状に延伸されているものとされる。
【００２４】
請求項９の発明では請求項８の発明において、複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように第３の電極がＬＳＩチップに形成され、第３の電極は第１の電極と導通することなく、センサ領域に全面配置され、第２の電極は前記一点及び前記他点において第３の電極に接合されているものとされる。
【００２５】
請求項１０の発明では請求項９の発明において、第２の電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する第２の電極は第３の電極の上で細線によって相互に連続しているものとされる。
【発明の効果】
【００２６】
この発明による電気化学測定方法は、電解液中に生成、拡散した測定対象物を一旦、消却した後に、再度、測定対象物を生成、拡散させて測定を行うものとなっており、またこの発明による電気化学測定装置はこのような測定を行えるものとなっている。よって、この発明による電気化学測定方法、電気化学測定装置によれば、測定対象物の生成、拡散条件の均一化を図ることができ、即ち測定条件の均一化を図ることができ、正確な測定が可能となる。
【００２７】
これにより、例えば複数回繰り返される測定の各回間や１回で複数のサンプル（生体試料）を測定する場合の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行うことが可能となる。
【００２８】
また、この発明によるトランスデューサはこのような電気化学測定に用いて好適なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】電気化学測定の従来の測定過程の一具体例を示すチャート。
【図２】図１に示した電気化学測定における酵素反応の時間Ａの違いによって生じる電流値の計算結果の違いを示すグラフ。
【図３】この発明における測定対象物消却用細線電極の一例を示す斜視図。
【図４】図３に示した測定対象物消却用細線電極の平面図。
【図５】Ａは図４の部分拡大図、ＢはＡに対応する正面図。
【図６】この発明における測定対象物消却用細線電極の一例及び測定対象物消却用底面電極を示す斜視図。
【図７】この発明による電気化学測定の測定過程を従来の測定過程と共に示したチャート。
【図８】図３に示した測定対象物消却用細線電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフ。
【図９】図６に示した測定対象物消却用細線電極及び測定対象物消却用底面電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフ。
【図１０】対流がある場合の測定対象物消却ステップの実行有無による電流値の計算結果の違いを示すグラフ。
【図１１】この発明における測定対象物消却用細線電極の他の例を示す斜視図。
【図１２】測定対象物消却用細線電極の連続形成例を説明するための図。
【図１３】この発明による電気化学測定装置の一実施例の構成を説明するための図。
【図１４】Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図、Ｂはその断面図。
【図１５】図１４Ａに示したトランスデューサの斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
最初に、マウスＥＢのＡＬＰ活性測定を例として、有限要素法による数値解析を行った結果について説明する。数値解析ソフトとして、ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  Ｖｅｒ４．４を用いた。以下に、解析モデル形状、境界条件を示す。
【００３１】
＜解析モデル形状＞
２．３ｍｍ×２．３ｍｍ×１．３ｍｍの解析空間を用意し、φ４０μｍの電極（作用極）を解析空間底面にアレイ状に設置した。
【００３２】
２．３ｍｍ×２．３ｍｍの解析空間底面の中心に原点を置き、電極アレイ全体の中心と解析空間底面の中心を合わせて電極を２５０μｍピッチで８×８＝６４個設置し、そのうち中心付近の４行目５列目の電極上へ中心を合わせてφ３００μｍのＥＢを模した球体を配置した。球体と直下の電極の間隔は解析メッシュの切りやすさを考慮し、３μｍの距離をとった。
【００３３】
＜境界条件＞
解析空間内は濃度４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌの基質ＰＡＰＰを設定して空間内濃度初期値とし、解析空間４辺の壁と天井は、解析空間外が濃度４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌの解放境界として設定した。ＥＢ表面（球体表面）は下記に示すミカエリス・メンテンの式（１）に従って、表面付近のＰＡＰＰの濃度に依存してＰＡＰが放出される境界とし、酵素反応のモデルとした。
【００３４】
【数１】
2017198493.tif 000003
【００３５】
ｖ：ＰＡＰ放出速度［ｍｏｌ／ｓ］
［Ｓ］：基質ＰＡＰＰ濃度（４．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ）
Ｖｍａｘ：ＰＡＰＰ濃度最大時反応速度（３．３３×１０−１２ｍｏｌ／ｓ）
Ｋｍ：ミカエリス・メンテン定数（１．７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ）
【００３６】
ＰＡＰの酸化還元反応を表現する為、電極上では電圧印加時にＰＡＰ濃度をゼロとして設定し、ＰＡＰ濃度勾配より電流値を計算した。電流値は電極に垂直な方向の濃度勾配に比例し、式（２）に従う。
【００３７】
【数２】
2017198493.tif 000004
【００３８】
ｉ：電極上の任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）における電流密度［Ａ／ｍ２］
Ｃ：任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）におけるＰＡＰ濃度［ｍｏｌ］
ｚ：電極に垂直な成分
ｘ，ｙ：電極に水平な成分
Ｆ：ファラデー定数（９６４８５Ｃ／ｍｏｌ）
Ｄ：酸化還元種ＰＡＰ拡散係数（６．４７×１０−１０ｍ２／ｓ）
ｎ：反応電子数（ｎ＝２）
【００３９】
なお、ＰＡＰ濃度分布の影響を視覚的に分かりやすく評価するため、６４個の電極の内、ＥＢが載っている電極と同じ列の７個（Ｙ軸に沿う７個）の電極の電流値を評価に使用した。
【００４０】
最初に、図１に示した過程に従うものとし、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａが３秒、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂが０．１秒の場合の電流値と、時間Ａが２０秒、時間Ｂが０．１秒の場合の電流値を計算した。結果を図２に示す。図２に示すように酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの違いが電流値に違いとなって現れた。なお、図２はＥＢ直下の電極位置をｙ＝０μｍとし、ＥＢ直下の電極と両側３個ずつの電極からの電流値をプロットしている（後述する図８〜１０のグラフも同様）。
【００４１】
この発明は、電解液中に測定対象物消却用電極を設け、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行するものであり、以下、数値解析に用いた測定対象物消却用電極の２つの構成（構成１，２）について説明する。
【００４２】
・構成１：作用極と同極性の測定対象物消却用細線電極を作用極が設置されている底面（解析空間底面）上に設ける。図３〜５はこの測定対象物消却用細線電極の配置、構成を示したものであり、図３〜５中、１１はφ４０μｍの作用極を示し、２１は測定対象物消却用細線電極を示す。また、３１はφ３００μｍのＥＢを示す。ＥＢ３１は作用極１１の直上に位置している。
【００４３】
測定対象物消却用細線電極２１は底面１０の一点から上方（Ｚ方向）の空間に延びて再び底面１０の他点に帰還する形状に延伸された太さ３３μｍの細線（ワイヤ）よりなり、逆Ｕ字形状をなすものとした。逆Ｕ字の両脚部の間隔は１２０μｍとし、底面１０からの逆Ｕ字の中央部の細線中心の高さは３００μｍとした。
【００４４】
測定対象物消却用細線電極２１は図４に示したように、作用極１１の１行置きの配列（１，３，５，７行）において隣接する作用極１１間にそれぞれ位置するように配置し、さらに作用極１１の１列置きの配列（２，４，６，８列）において隣接する作用極１１間にそれぞれ位置するように配置した。これにより、計５６本の測定対象物消却用細線電極２１を底面１０上に設けた。
【００４５】
なお、このような測定対象物消却用細線電極２１は例えばワイヤボンディングによって形成することができる。図３〜５には測定対象物消却用細線電極２１を実際に設置する際に必要なボンディング用のパッド２２も併せて示している。
【００４６】
・構成２：図６に示したように、構成１の５６本の測定対象物消却用細線電極２１に加え、作用極１１と同極性の測定対象物消却用底面電極２３を底面１０に配置。測定対象物消却用底面電極２３はφ４０μｍの作用極１１のまわりに同心の環状に２０μｍの隙間をあけて底面１０に全面配置した。
【００４７】
なお、この構成では図３〜５に示していたパッド２２は不要となり、逆Ｕ字形状をなす測定対象物消却用細線電極２１はその両端を測定対象物消却用底面電極２３に接合（ボンディング）することで設置することができる。
【００４８】
上記したように、測定対象物消却用電極は構成１では測定対象物消却用細線電極２１よりなるものとし、構成２では測定対象物消却用細線電極２１と測定対象物消却用底面電極２３の両者よりなるものとした。
【００４９】
測定対象物消却用電極は、作用極と同じく、電圧印加時にＰＡＰ濃度がゼロとなるように解析境界条件を設定することで測定対象物消却用電極への電圧印加を再現した。
【００５０】
図７（Ａ）は上述の図２に示した計算結果の過程を示したものであり、図７（Ｂ）は測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを含む過程、即ちこの発明による電気化学測定方法の過程を示したものである。
【００５１】
酵素反応開始から３秒後と２０秒後の状態に対し、作用極と測定対象物消却用電極に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して１０秒の測定対象物消却ステップ（ＰＡＰ濃度分布消却ステップ）を実行した後に、消却用電圧の印加を停止し、再度、酵素反応を３秒起こさせて新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップを経た後に、作用極に測定用電圧を印加し、電気化学測定ステップを実行するものとし、０．１秒後の電流値を計算した。
【００５２】
図８及び９は測定対象物消却用電極が構成１及び構成２の場合の電流値の計算結果をそれぞれ示したものである。
【００５３】
測定対象物消却ステップ後の反応（測定対象物の生成、拡散・・・測定対象物拡散ステップ）は、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒であるか、２０秒であるかに関わらず、一定であるので、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒、２０秒の双方の結果が一致することが望ましい。構成１，２各々の結果は、図２に示した結果よりも十分に３秒と２０秒の結果が近いものとなっている。
【００５４】
次に、例えば電解液に対流が存在する場合、電解液の流れはＥＢの形成するＰＡＰ濃度分布を乱してしまい、測定に影響を与えることが考えられる。この点に関し、電解液に対流がある場合のこの発明による電気化学測定方法の効果について計算した結果について説明する。なお、測定対象物消却用電極の構成は構成２とした。
【００５５】
計算は下記３つのケース（ケース１〜３）について行った。
・ケース１：酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
・ケース２：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合において、酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
・ケース３：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合で、１０秒の対流の後、作用極及び作用極と同極性の測定対象物消却用電極を用いて１０秒の測定対象物消却ステップを実行し、その後、消却用電圧の印加を停止して、再度、酵素反応をおこさせ、１０秒の測定対象物拡散ステップを経た後に作用極に電圧を印加、電圧印加後０．１秒の電流値
【００５６】
図１０はこれらケース１〜３の電流値の計算結果を示したものであり、測定対象物消却ステップがなければ、対流によってケース２のように結果が歪み、本来の位置（ＥＢが存在する位置）からずれた位置に電流値のピークが生じるのに対し、測定対象物消却ステップを実行したケース３ではケース１の本来得られるはずの電流値に近い電流値が得られることがわかり、対流や液揺れの影響を除去することが可能であることがわかる。
【００５７】
以上数値解析を行った結果について説明したが、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とを設け、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定において、上述したように測定対象物消却ステップを実行すれば、電解液中の少なくとも測定に影響を与える範囲内に存在していた測定対象物はすべて酸化又は還元されることで消却され、その生成及び拡散の過程は初期化されて電解液中の状態がリセットされることになる。よって、後続する測定対象物拡散ステップの時間を一定に制御することで、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定対象物の生成、拡散の条件を均一化することができ、つまり測定条件の均一化を図ることが可能となる。
【００５８】
また、このように測定対象物消却ステップを実行することにより、電解液の液揺れや対流等の影響を排除することができ、さらには測定対象物を発生させるサンプル（生体試料）を電解液に投入した後、測定者の望むタイミングで測定を行うことが可能である。
【００５９】
なお、上記においては測定対象物消却用電極及び作用極の双方に消却用電圧を印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしているが、例えば消却用電圧を測定対象物消却用電極だけに印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしてもよい。
【００６０】
上述した例では測定対象物焼却用細線電極２１は逆Ｕ字形状をなし、個々に独立した逆Ｕ字形状をなす測定対象物消却用細線電極２１を多数配置する構成としているが、測定対象物消却用細線電極は図１１に示したような形状、構成としてもよい。
【００６１】
図１１では測定対象物消却用細線電極２５はＵ字と逆Ｕ字の繰り返しによる波形形状を有するものとされ、即ち図３及び６に示した測定対象物消却用細線電極２１の配列において互いに隣接するものが細線によって（細線が延長されて）相互に連続された構成となっている。
【００６２】
測定対象物消却用細線電極２５は作用極１１の配列に対し、前述した測定対象物消却用細線電極２１の配置と同じ行、列に配置されており、即ちＸ方向に延伸する４本の測定対象物消却用細線電極２５とＹ方向に延伸する４本の測定対象物消却用細線電極２５が互いに交差するように配置されている。
【００６３】
底面１０には測定対象物消却用底面電極２３が配置されており、測定対象物消却用細線電極２５はＵ字の中央部分が隣接する作用極１１間に位置し、逆Ｕ字の中央部分が作用極１１の上方に位置するように設けられ、測定対象物消却用底面電極２３に接するＵ字の中央部分がそれぞれ測定対象物消却用底面電極２３に接合（ボンディング）される。
【００６４】
なお、測定対象物消却用細線電極２５の波形の繰り返しピッチはこの例に限らず、例えば拡大してもよく、それに応じて隣接する逆Ｕ字形状をつなぐ部分を１点ではなく、２点でボンディングしてもよい。また、図１１では底面１０と離間した上方（測定対象物消却用底面電極２３と離間した上方）で、互いに直交する測定対象物消却用細線電極２５は交差しているが、底面１０上で交差させるようにしてもよい。
【００６５】
一方、このように波形形状をなす測定対象物消却用細線電極の直交２方向の形成において、交差を生じないように形成することもできる。図１２はその形成例を模式的に示したものであり、図１２では４行、４列の格子をなすように波形形状をなす測定対象物消却用細線電極を形成する場合を示している。
【００６６】
図１２中、×印はワイヤボンディング箇所を示し、矢印はワイヤの延伸方向（＝ボンディングの順序）を示す。この例では、
・ａ１からａ２まで実線ａで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
・ｂ１からｂ２まで破線ｂで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
・ｃ１からｃ２まで破線ｃで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
・ｄ１からｄ２まで実線ｄで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
するものとなっており、このようにワイヤを延伸すれば、波形形状をなす測定対象物消却用細線電極の交差が生じないようにすることができる。
【００６７】
次に、この発明による電気化学測定装置の構成について説明する。
【００６８】
図１３は電気化学測定装置の構成を模式的に示したものである。電気化学測定装置は電解液４１と電解液４１中で測定対象物を発生させる生体試料３０とを収容する電解液槽４０を備え、電解液槽４０には作用極１１と測定対象物消却用細線電極２１と対極５０と参照極６０とが設けられた構成となっている。作用極１１及び測定対象物消却用細線電極２１は図１３では簡略化して示しているが、前述したように作用極１１は所定のピッチでアレイ状に多数配列された構成とされ、測定対象物消却用細線電極２１は図３〜５に示した構成を有するものとされる。なお、測定対象物消却用底面電極２３を合わせ持つ構成としてもよく、また測定対象物消却用細線電極２１を図１１に示した測定対象物消却用細線電極２５としてもよい。図１３中、９０は塩橋を示す。
【００６９】
作用極１１、測定対象物消却用細線電極２１、対極５０及び参照極６０はこの例では図１３に示したようにポテンショスタット７０に接続されている。ポテンショスタット７０は可変電源７１と電圧計７２と電流計７３とを含んで構成されており、このポテンショスタット７０により作用極１１と対極５０との間への測定用電圧の印加及び測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極１１と対極５０との間に流れる電極間電流の測定が行われる。
【００７０】
また、作用極１１と対極５０との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用細線電極２１と対極５０との間への測定用電圧と同極性の消却用電圧の印加もポテンショスタット７０により行われる。作用極１１への測定用電圧の印加はスイッチ８１をＯＮ，スイッチ８２，８３をＯＦＦにすることに行われ、測定対象物消却用細線電極２１への消却用電圧の印加はスイッチ８２，８３をＯＮ，スイッチ８１をＯＦＦにすることにより行われる。なお、スイッチ８１をＯＮとして作用極１１にも消却用電圧を印加するようにしてもよい。
【００７１】
図１３では測定対象物消却用細線電極２１はポテンショスタット７０から消却用電圧が印加されるものとなっているが、これに限らず、消却用電圧の印加はポテンショスタット７０とは別の電源を用いて行うようにしてもよい。
【００７２】
次に、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるこの発明によるトランスデューサの構成について図１４及び図１５を参照して説明する。
【００７３】
このトランスデューサはバイオＬＳＩチップと称されるもので、電解液４１と電解液４１中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽４０がＬＳＩチップ１００上に搭載された構成となっている。電解液槽４０の中央には穴４２が形成されており、ＬＳＩチップ１００はこの穴４２の下端に穴４２を塞ぐように配置されている。
【００７４】
ＬＳＩチップ１００及び電解液槽４０は基板１１０上に搭載固定されており、基板１１０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン１１１が形成されている。図１４Ｂ中、１２０はＬＳＩチップ１００と配線パターン１１１とを接続するボンディングワイヤを示す。
【００７５】
ＬＳＩチップ１００の上面にはセンサ領域１０１が構成されている。図１４Ａではセンサ領域１０１をハッチングを付して示しており、電解液槽４０の底面の穴４２の位置にセンサ領域１０１は画定されている。詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域１０１にφ４０μｍの作用極（第１の電極）が２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に配列されて形成されている。また、センサ領域１０１上にはセンサ領域１０１の一点から上方の電解液槽４０内の空間に延びて再びセンサ領域１０１の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極（第２の電極）が形成されている。測定対象物消却用細線電極は例えば前述の図３に示した測定対象物消却用細線電極２１の構成を有するものとされる。
【００７６】
さらに、測定対象物消却用細線電極（第２の電極）に加え、測定対象物消却用底面電極（第３の電極）が作用極（第１の電極）のまわりに位置するようにセンサ領域１０１に全面形成されている構成としてもよく、この場合は前述の図６に示した測定対象物消却用細線電極２１及び測定対象物消却用底面電極２３の構成を有するものとなり、また前述の図１１に示した測定対象物消却用細線電極２５及び測定対象物消却用底面電極２３の構成を有するものとしてもよい。
【００７７】
ＬＳＩチップ１００は各作用極及び測定対象物消却用電極への電圧印加機能、各作用極での反応を電流値として検出し、増幅する機能、さらにはスイッチング機能を備えている。
【００７８】
ＬＳＩチップが備える電極パッドは一般にＣｕを含むＡｌ合金によって形成されているが、この例ではセンサ領域１０１に位置する作用極、測定対象物消却用底面電極さらには測定対象物消却用底面電極がない場合に測定対象物消却用細線電極をボンディングするためのパッドは、いずれもＡｌ合金の上に、Ｔｉ／Ｐｔ、Ｔｉ／Ｐｔ／Ａｕ、Ｃｒ／Ａｕの何れかのメッキを施して形成される。また、測定対象物消却用細線電極を構成する細線にはＡｕ線を用いるのが好ましい。
【００７９】
なお、対極及び参照極はトランスデューサとは別部品とされ、測定時（使用時）に電解液４１中に投入される。
【符号の説明】
【００８０】
１０    底面                              １１    作用極
２１    測定対象物消却用細線電極          ２２    パッド
２３    測定対象物消却用底面電極          ２５    測定対象物消却用細線電極
３０    生体試料                          ３１    ＥＢ
４０    電解液槽                          ４１    電解液
４２    穴                                ５０    対極
６０    参照極                            ７０    ポテンショスタット
７１    可変電源                          ７２    電圧計
７３    電流計                            ８１，８２，８３    スイッチ
９０    塩橋                              １００    ＬＳＩチップ
１０１    センサ領域                      １１０    基板
１１１    配線パターン                    １２０    ボンディングワイヤ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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