(57)【要約】      （修正有）【課題】エレクトロスプレーイオン化の感度を高める方法を提供する。【解決手段】本発明は、ネブライザーを有するエレクトロスプレーイオン源によって第１の液体ストリームをイオン化する方法を提供するものであり、第１の液体ストリームは、分析対象を含んでもよい。本方法は、ａ）ネブライザーに第１の液体ストリームを供給するステップと、ｂ）沸点が比較的低い共溶媒と、沸点が比較的高い増強溶媒とを含む第２の液体ストリームを、第１の液体ストリームに添加するステップと、ｃ）その結果として生じる液体を霧状化しイオン化するステップとを含んでもよい。【選択図】図１（１）
2017215317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネブライザーを有するエレクトロスプレーイオン源によって、第１の液体ストリームをイオン化する方法であって、前記第１の液体ストリームは分析対象を含んでもよく、本方法が、
ａ）前記ネブライザーに前記第１の液体ストリームを供給するステップと、
ｂ）沸点が４℃〜１１０℃である共溶媒と、沸点が１５０℃〜３００℃である増強溶媒とを含む第２の液体ストリームを、前記ネブライザー内で、前記ネブライザーの供給口で、又は前記ネブライザーの上流側で、前記第１の液体ストリームに添加するステップと、
ｃ）その結果として生じる液体を霧状化しイオン化するステップと
を含み、前記増強溶媒がＤＭＳＯである場合には、前記エレクトロスプレーイオン源が負イオンモードで稼働する方法。
【請求項２】
前記エレクトロスプレーイオン源が負イオンモードで作動する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エレクトロスプレーイオン源が正イオンモードで作動し、前記増強溶媒がＤＭＳＯではない請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記共溶媒の沸点が４℃〜７０℃である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記共溶媒が、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびＴＨＦからなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記増強溶媒の沸点が１５０℃〜２００℃である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記増強溶媒が、ＤＭＳＯ、２−（２−メトキシエトキシ）エタノールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の液体ストリームにおける前記共溶媒に対する前記増強溶媒の相対濃度（ｖ／ｖ）が、１％〜２５％（増強溶媒）：７５％〜９９％（共溶媒）の範囲である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｃ）ステップの前記結果として生じる液体における前記増強溶媒と前記共溶媒とを組み合わせた濃度が、１％〜９０％の範囲にある請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記最終的な液体が、５０μｌ／分〜４００μｌ／分の範囲の流量で霧状化される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記霧状化がガスアシストによる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の液体ストリームを生成するためにサンプルを分離するステップをさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離することが、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動によって行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の液体ストリームが、分析対象が分離されていないサンプルを含むものである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
イオン化サンプルを質量分析によって分析するステップを更に含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［相互参照］
本出願は、ここに引用することで本明細書の一部をなすものである、２０１６年６月２１日に出願した米国仮出願第６２／３５２，８３１号および２０１６年５月１３日に出願した米国仮出願第６２／３３６，５２４号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）は、広く使用されている電界脱離イオン化法であり、一般的には分析対象のフラグメンテーションがほとんど生じずに気相イオンを生成する手段を提供するものである（例えば、Ｆｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９  ２４６：６４−７０を参照）。さらに、ＥＳＩは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やキャピラリー電気泳動システムなどのオンライン液相分離技法と直接互換性がある。
【０００３】
エレクトロスプレーイオン化の感度を高めることが望まれている。この分野における大部分の開発が、溶媒および電解質組成、より優れた乾燥、より優れたネブライゼーション、または微細化による（例えば、ナノスプレーによる）より優れたイオン化効率に焦点を合わせていた。本開示は、溶媒の混合物を使用するエレクトロスプレーイオン化の感度を高めるための代替法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｆｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９  ２４６：６４−７０
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、とりわけ、エレクトロスプレーイオン源によって第１の液体ストリームをイオン化するための方法を提供する。一部の実施形態において、この方法は、イオン源のネブライザーに第１の液体ストリームを供給するステップと、沸点が比較的低い共溶媒（co-solvent）と、沸点が比較的高い増強溶媒（enhancement solvent）とを含む第２の液体ストリームを、第１の液体ストリームに添加するステップと、その結果として生じる液体を霧状化（nebulize）してイオン化するステップとを含んでもよい。
【０００６】
この方法の実施の仕方次第によっては、この方法の結果として、第１の液体ストリーム内の分析対象のイオンの検出感度を増加させることができる。この増強は、正イオンモードおよび負イオンモードで観測することができる。エレクトロスプレーイオン源を正イオンモードで作動させる場合には、増強溶媒はＤＭＳＯであるべきではない。というのは、この溶媒は、正イオンモードでイオン抑制の原因となると考えられているからである。
【０００７】
以下に記載する図面は、説明を目的としていることが当業者には理解されよう。これらの図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１（１）および図１（２）は、質量および元素組成が様々な各種生体関連分子についての質量分析計の増加した応答（検出感度）を示す一連のグラフである。この実施例においては、一次液体ストリームが、流量４００μＬ／分の水とメタノールとの混合物である。次いで、ネブライゼーションに先立って、分析対象を含有する一次液体ストリームに、一次ストリームの１２．５％〜１００％の流量で二次液体ストリームを添加する。この例において、アセトンは共溶媒、増強溶媒がＤＭＳＯであって、９：１の比率で存在する。対象の化合物を負イオン化モードで検出し、増強溶媒および共溶媒の混合物を一次液体ストリームに添加することによって、質量分析計におけるすべての化合物の応答を増加させる。一部の化合物（例えば、ＡＤＰ、ＧＤＰ）は、他の化合物よりも、最大の応答増加を実現するために二次液体ストリームの流量が大きい必要があると観測されている。
【図２】図２（１）および図２（２）は、質量分析計における各種生体関連分子の応答を増加させるために、共溶媒の存在下、増強溶媒が必要となることを示す一連のグラフである。この実施例においては、増強溶媒が存在しない（すなわち、検出される信号の増強も減衰も観測されない）場合、一次液体ストリーム（共溶媒）へのアセトンのみの導入では、化合物の応答は変化しない。次いで、アセトン共溶媒に添加した場合に質量分析計おける分析対象の応答を改善する、沸点がより高い様々な増強溶媒を示している。ここでは、プロピレングリコール、ジエチレングリコールメチルエーテルおよびＤＭＳＯが増強溶媒として示され、アセトン共溶媒対増強溶媒の比率が９：１で、一次液体ストリームと等しく４００μＬ／分で二次液体ストリームを添加する。ＤＭＳＯでは、より低い源温度で質量分析計を作動させる場合に感度増強がより著しくなるような、温度依存性が一部の分析対象について観測される。
【図３】図３（１）および図３（２）は、質量分析計における各種生体関連分子の応答を増加させるために、増強溶媒の存在下、共溶媒が必要となることを示す一連のグラフである。この実施例においては、一次液体ストリームは４００μＬ／分で、二次液体ストリームは図のように変動させる。二次液体ストリームがメタノールおよび水で、一次液体ストリームと同等である場合（標示：４００μＬ／分ＭｅＯＨ：水）、または増強溶媒としてのＤＭＳＯが補充されているメタノールおよび水である場合（標示：４００μＬ／分ＭｅＯＨ：水＋１０％ＤＭＳＯ）には、増強は見られない。ＤＭＳＯはまた、二次液体ストリームがメタノールとＤＭＳＯとの９：１の組合せで構成される場合（標示：４００μＬ／分で９０：１０のＭｅＯＨ：ＤＭＳＯ）には、分析対象応答を増強することもない。一方、増強溶媒、この場合にはＤＭＳＯが、適当な低沸点共溶媒、この場合にはアセトンと共に存在する場合（標示：４００μＬ／分で９０：１０のアセトン：ＤＭＳＯ）には、対象の化合物すべての応答増加が観測される。
【図４】図４（１）および図４（２）は、正イオン化モードにおいて、また代替の計器源により、感度増強も観測されることを示す一連のグラフである。この実施例においては、一次液体ストリームは、流量４００μＬ／分の水とアセトニトリルとの混合物である。増強溶媒はジエチレングリコールメチルエーテル（ＤＧＭＥ）、共溶媒はアセトンで、アセトン：ＤＧＭＥの比率は９：１である。増強溶媒と共溶媒との混合物を、計器のネブライザーへの全流量が８００μＬ／分となるよう４００μＬ／分で一次液体ストリームに添加する。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ（ＥＳＩ）源とＡｇｉｌｅｎｔ  ＪｅｔＳｔｒｅａｍ（ＡＪＳ）源との両方についてのデータを示し、ＡＪＳ源については、ノズル電圧０Ｖ〜５００Ｖを評価する。データは、ＥＳＩ源条件に対する倍率変化として表示され、両源設計を用いることで、正モードでかなりイオン化する代表的化合物のパネルについてポストカラム溶媒添加の増強効果が見られることを実証している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［定義］
例示的な実施形態を詳細に説明する前に、その説明において使用する用語の意味および範囲を説明および明確にするために、以下の定義を規定する。
【００１０】
用語「分析対象」は、特徴的分子組成を有する共有結合原子群または非共有結合原子群を指す。用語分析対象には、微生物によって生成される、または生体にとって重要な分子である生体分子が含まれ、タンパク質、ペプチド、脂質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、炭水化物、多糖類、糖たんぱく質、リポタンパク質、代謝産物、糖類、ならびにこれらの誘導体、変異体および複合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
用語「分析対象イオン」とは、液体サンプル中の分析対象をイオン化することによって生成される一価または多価イオンを指す。分析対象イオンは正電荷を有していても、負電荷を有していても、または正電荷と負電荷との組合せを有していてもよい。帯電液滴からの溶媒および／または液体キャリアの蒸発によって分析対象イオンを形成することができる。
【００１２】
用語「キャリア液体」は、分析対象が第１の液体ストリームに溶解している液体について言及するために使用する。エレクトロスプレーイオン化に先立って液体クロマトグラフィーを使用して分析対象を分離した場合、キャリア液体は、相対的に極性の溶媒（例えば、水）と相対的に非極性の溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）との混合物を含有することがある。特定の例において、キャリア液体は、化学種の液滴への分散を助けることができる。キャリア液体は、アセトニトリル、ジクロロメタン（メタノールと混合する場合）、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、エタノール、プロパノール、メタノール、ニトロメタン、トルエン（メタノールまたはアセトニトリルと混合する場合）および水を含有することができる。エレクトロスプレーイオン化が正モードで行われるか、または負モードで行われるかによっては、キャリア液体は他の化合物（例えば、ＴＦＡ、酢酸アンモニウム等）を含有することもできる。
【００１３】
用語「キャリアガス」は、「ガスアシスト」ネブライゼーション法において帯電液滴、分析対象イオンおよび／または試薬イオンの形成および／または輸送を助けるガスを指す。一般的なキャリアガスとしては、窒素、酸素、アルゴン、空気、ヘリウム、水、六フッ化硫黄、三フッ化窒素、二酸化炭素および水蒸気が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
用語「質量分析」とは、単純な、また複雑な混合物中の分子を同定し定量化するためにイオンの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定する分析技術を指す。一部の質量分析法においては、例えば、飛行時間（ＴＯＦ）、ｏｒｂｉｔｒａｐ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、四重極またはイオントラップを用いてイオンを互いに分離し、次いでイオン検出器を用いて検出することができる。
【００１５】
用語「流体連通」とは、流体（例えば、ガス、蒸気または液体）が一方の要素からもう一方の要素へと流れることができるような、２つ以上の要素の構成を指す。チューブ、チャネル、バルブ、ポンプ、これらの任意の組合せなど1つまたは複数の追加の要素を介して、要素が流体連通することができる。
【００１６】
用語「正イオンモード」とは、第２の要素（例えば、対向プレート）に対して正電圧で設けられている第１の電気的バイアス要素を備えるネブライザーの作動を指し、第１の電気的バイアス要素と第２の要素とはある距離だけ離されているが、自立的ガス放電を引き起こすほど十分に近い。
【００１７】
用語「負イオンモード」とは、第２の要素（例えば、対向プレート）に対して負電圧で設けられている第１の電気的バイアス要素を備えるコロナ放電の作動を指し、第１の電気的バイアス要素と第２の要素とはある距離だけ離されているが、自立的ガス放電を引き起こすほど十分に近い。
【００１８】
他の用語定義が本明細書を通して出現することがある。
【００１９】
［例示的な実施形態についての説明］
様々な実施形態について詳細に説明する前に、本開示の教示は、記載されている特定の実施形態に限定されず、当然、それらにバリエーションがあることを理解されたい。また、本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書中で使用する専門用語は特定の実施形態について説明することのみを目的とし、限定的であることを意図しないことも理解されたい。
【００２０】
本明細書中で使用する節の見出しは、組織上の目的のためのみで、決して記載の主題を限定すると解釈されるものではない。本教示について、様々な実施形態に関連して説明するが、本教示をそのような実施形態に限定することを意図していない。むしろ、本教示には、当業者によって評価されるであろう様々な代替形態、変更形態および等価形態が包含される。
【００２１】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用するすべての科学技術用語が、本開示が属する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されている方法および材料と同様または等価である任意の方法および材料を、本教示の実施または試験において使用することもできるが、その一部の例示的な方法および材料について今から説明する。
【００２２】
任意の出版物の引用は、出願日よりも前であるその開示についてであって、本願の特許請求の範囲が先行発明を理由にそのような出版物に先行する権利がないことを認めていると解釈すべきではない。さらに、提供されている公開日は、第三者的な機関によって確認することが必要となることがある実際の公開日とは異なることがある。
【００２３】
本開示を読み取ると当業者には明らかとなるように、本明細書中に記載および説明する個々の実施形態のそれぞれが、本教示の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に区別する、または組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。列挙されている任意の方法を、列挙されている事象の順序で、または論理的に可能である他の任意の順序で実施することができる。
【００２４】
本明細書中で参照される特許および出版物はすべて、そのような特許および出版物の中で開示されているすべての配列を含め、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。
【００２５】
従来のエレクトロスプレーイオン化においては、キャリア液体および分析対象を含有する第１の液体ストリーム（すなわち、溶液）を、高電位で保持され、地面近くに設けられている対向プレートに向けられているネブライザーを通してポンプで送り込む。ネブライザー先端における電界により、出現する液体の表面が帯電し、結果的に帯電液滴の連続またはパルスストリームが生じる。その後帯電液滴から溶媒が蒸発することにより、溶液中にイオンとして存在する種からの分析対象イオンの形成が促進される。溶液中のカチオンおよびアニオンと結合することによって、エレクトロスプレープロセス中に極性分析対象を脱離および／またはイオン化することもできる。
【００２６】
本方法においては、ネブライザーから第１の液体ストリームが出現するよりも前に（例えば、ネブライザー内で又はネブライザーの上流側で）、第１の液体ストリームに第２の液体ストリームを添加する。ここで、第２の液体ストリームは共溶媒および増強溶媒を含む。共溶媒の沸点は比較的低く（例えば、沸点４℃〜１１０℃）、増強溶媒の沸点は比較的高い（例えば、沸点１５０℃〜３００℃）。この方法の実施の仕方次第によっては、第１液体ストリームに第２の液体ストリームを添加した結果として、分析対象（すなわち、第１の液体ストリームの中の分析対象）のイオンの検出感度を増加させることができる。この感度増加は、少なくとも２倍増加、例えば、少なくとも２倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍の感度増加となることがある。
【００２７】
上述のように、この増強は、正イオンモードおよび負イオンモードで観測することができる。しかしながら、エレクトロスプレーイオン源を、正イオンモードで作動させる場合には、増強溶媒はＤＭＳＯであるべきではない。そのような場合として、一部の実施形態においては、ネブライザーの電位が、下流の構成要素（例えば、質量分析計のイオン光学系への入口）に対して大きな正電位（例えば、約１，０００Ｖ〜約１０，０００Ｖ）であっても、大きな負電位（例えば、−１，０００Ｖ〜約−１０，０００Ｖ）であってもよい。一部の実施形態においては、ネブライザーを約＋／−２０００〜５０００Ｖの電位で保持して、効果的なコロナ放電を提供することができる。
【００２８】
共溶媒は、４℃〜１１０℃の沸点（例えば、４℃〜７０℃、４℃〜６０℃、４℃〜５０℃、４℃〜３０℃の沸点）を有する任意の適切な溶媒でよい。アセトン（沸点：５６．０５℃）、アセトニトリル（沸点：８１．６５℃）、メタノール（沸点：６４．６℃）、エタノール（沸点：７８．５℃）、イソプロパノール（沸点：８２．４℃）およびＴＨＦ（沸点：６５℃）が適切な共溶媒の例であるが、ある状況下では、他の共溶媒（例えば、２−ブタノン（沸点：７９．６℃）、クロロフォルム（沸点：６１．２℃）、酢酸エチル（沸点：７７℃）、ヘプタン（沸点：９８℃）、およびメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（沸点：５５．２℃））を利用することもできる。一部の実施形態においては、増強溶媒に、また第１の液体ストリームに混和できることから、共溶媒を選択することができる。例えば、水に混和できる（第１の液体ストリームが水性である場合には）ことから共溶媒を選択することができる。
【００２９】
増強溶媒は、共溶媒の沸点よりも高い少なくとも４０℃、少なくとも６０℃、少なくとも８０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１２０℃または少なくとも１４０℃の沸点を有するとして選択することができる。一部の実施形態においては、増強溶媒の沸点は１５０℃〜３００℃、例えば、１５０℃〜２５０℃、１５０℃〜２３０℃または１５０℃〜２００℃である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；沸点：１８９℃）、２−（２−メトキシエトキシ）エタノール（沸点：１９４℃）およびプロピレングリコール（沸点：１８８．２℃）が適切な共溶媒の例であるが、ある状況下では、他の増強溶媒（例えば、ｍ−キシレン（沸点：１３９．１℃）、ｐ−キシレン（沸点：１３８．４℃）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）（沸点：２０２℃）、エチレングリコール（沸点：１９５℃））を利用することもできる。理想的には、イオン化装置の増強溶媒が分析対象のイオン化に干渉することはない。
【００３０】
適切な溶媒およびそれらの沸点は、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，８７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｅ  ２６，２００６）またはＶｏｇｅｌ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ；Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９，１９９６）から入手することができる。
【００３１】
一部の実施形態においては、増強溶媒と共溶媒とを混ぜ合わせ、リザーバーに保存し、第１の液体ストリームへと導入する第２の液体ストリームとして輸送する。一般論として、第２の液体ストリームにおいては、増強溶媒と共溶媒との相対濃度（ｖ：ｖ）は１％〜２５％（増強溶媒）：７５％〜９９％（共溶媒）、例えば、３％〜２０％（増強溶媒）：８０％〜９７％（共溶媒）、５％〜１５％（増強溶媒）：８０％〜９５％（共溶媒）または約１０％（増強溶媒）：９０％（共溶媒）でよい。増強溶媒は、結果として生じる液体ストリーム（すなわち、第１の液体ストリームと第２の液体ストリームとを組み合わせることから得られる液体ストリーム）の１％〜２０％、例えば、２％〜１０％を占めることができる。
【００３２】
一部の実施形態においては、結果として生じる液体（すなわち、第１の液体ストリームと第２の液体ストリームとを組み合わせることから得られる液体ストリーム）における増強溶媒と共溶媒とを組み合わせた濃度は、１％〜９０％、例えば、５％〜８０％、４０％〜６０％の範囲にある。一部の実施形態においては、結果として得られる液体の体積の約５０％が、第２の液体ストリームからである。
【００３３】
第１の液体ストリーム内の分析対象は、互いに分離していてもいなくてもよい。分析対象が互いに分離している実施形態においては、例えば、親和力、イオン交換、サイズ排除、膨張層吸着、逆相または疎水性等によって液相分析対象を互いに分離する計器から第１の液体ストリームを出力することができる。例えば、一部の実施形態においては、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、マイクロもしくはナノ液体クロマトグラフまたは超高圧液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）デバイス、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）もしくはキャピラリー電気泳動クロマトグラフ（ＣＥＣ）装置などの分析分離デバイスによって、サンプル内の分析対象を分離することができる。一方、任意の手動または自動の噴射または分配ポンプシステムを使用することができる。例えば、特定の実施形態においてナノまたはマイクロポンプを利用することによって、ＬＣ−ＭＣシステムに対象サンプルを適用することができる。明らかではあるが、液体クロマトグラィは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行うことができ、この用語、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、分析対象を含有する液体サンプルが、加圧下（例えば、少なくとも１０バール、例えば、５０〜３５０バール）固体吸着材で充填されているカラムを通過するクロマトグラフィー法を包含することを意図している。これらの実施形態においては、ネブライザーは分離デバイスと流体連通するこことができる。液体内の分析対象を分離するための方法は周知である。
【００３４】
やはり明らかではあるが、イオン化サンプルは、質量分析によって分析することができる。任意のＥＳＩ−ＭＳシステムを用いる分析対象検出の感度は、分析対象のイオン化効率に強く依存する。イオン化効率は、エレクトロスプレーイオン化界面にあるネブライザーの先端における移動相の帯電液滴スプレーの効率的な発生によって、また液滴が質量分析計に向かって移動する際の効率的な蒸発によって決まる。帯電液滴は標的イオン、すなわち、分析対象のイオンを含有する。上述のように、第１の液体ストリームに第２の液体ストリームを添加すると、結果としてイオン化分析対象の検出感度が増加する。この感度増加の理由は明らかではない。しかしながら、特定の理論に束縛されることはないが、第２の流体ストリームの添加により差動乾燥効果が生じると考えられる。具体的には、沸点が比較的低い共溶媒を使用すると、結果としてより小さな最初の液滴が形成され、またイオン化装置の（沸点がより高い）増強溶媒が、形成され放出されるイオンのために残される本質的に唯一の溶媒となるまで、その液滴が急速に乾燥する。
【００３５】
対象の方法において使用する質量分析システムは、サンプルをイオン化するためのイオン源と、イオンを分離する質量分析計と、イオンを検出する検出器とを一般には含有する任意の便利な質量分析システムでよい。ある特定の場合には、質量分析計は、前駆イオンを分離し、前駆イオンを分裂させ、また分裂した前駆イオンを分析することができる所謂「タンデム」質量分析計でよい。このようなシステムは、当技術分野において周知で（例えば、米国特許第７，５３４，９９６号、第７，５３１，７９３号、第７，５０７，９５３号、第７，１４５，１３３号、第７，２２９，８３４号、第６，９２４，４７８号を参照）、各種構成で実施することができる。特定の実施形態においては、空間的に分離している個々の質量分析計を用いて、または特定の場合には、異なる選択ステップが時間的に分離している単一の質量分析計を用いてタンデム質量分析を行うことができる。「空間的」タンデムＭＳは、計器構成要素（ＱｑＱまたはＱＴＯＦ）の物理的分離を伴い、一方「時間的」タンデムＭＳはイオントラップの使用を伴う。飛行時間（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、四重極、もしくは二重収束磁場電場セクター質量分析計、またはこれらのハイブリッドを含め、異なる各種質量分析計のいずれかを利用することができる。一実施形態においては、質量分析計はセクター、透過型四重極、または飛行時間質量分析計でよい。
【００３６】
上述の方法を使用して生体サンプルを分析することができ、ここで、本明細書中で使用する「生体サンプル」とは、微生物全体またはその組織のサブセットから調製されるホモジネート、溶解物または抽出物を指すことがある。例えば、血漿、血清、 髄液、リンパ液、皮膚の外表部、気道、腸管、泌尿生殖器、涙液、唾液、母乳、血液細胞、腫瘍、臓器が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態において、「生体サンプル」が、動物、植物または菌類からの細胞を含有することになる。「生体サンプル」が、細胞と共にタンパク質や核酸分子などの細胞成分を含有する微生物がその中で増殖する栄養素培養液やゲルなどの培地を指すこともある。本発明の生体サンプルは細胞を含む。用語「細胞」は、その従来の意味で、少なくとも核および細胞膜を有する真核および原核両方の生体の基本構造単位を指すために使用される。特定の実施形態において、細胞には、細菌からなどの原核細胞が含まれる。他の実施形態においては、細胞には、動物、植物または菌類からの生体サンプルから得られる細胞などの真核細胞が含まれる。
【００３７】
大腸菌細胞などの細菌細胞、下等真核生物、例えば、酵母や、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物）や動物（例えば、昆虫、両生類または哺乳動物等）などの高等真核生物の細胞などの真核細胞を含めた、異なる各種細胞のいずれかからの分析対象、例えば、代謝産物を分析するために、本方法を使用することができる。これらの細胞は培養細胞であっても、または特定の実施形態においては、組織からの細胞であってもよい。
【００３８】
上述の方法は、メタボロミクス研究、すなわち、特定の細胞過程に関連している不同性化学的指紋の体系的研究、およびその代謝産物プロファイルの研究に使用することができる。メタボロームとは、単一微生物などの生体サンプル内に見られる小分子代謝産物（代謝中間体、ホルモンおよび他のシグナル伝達分子、二次代謝産物など）の完全一式を表す。
【００３９】
創薬、研究および診断の各種用途において、本方法を利用することができる。例えば、疾患または状態の診断または監視（代謝産物プロファイルの存在が疾患または状態を示す場合）、薬剤標的の発見（例えば、疾患または状態に関連している代謝産物プロファイルの場合、また薬物治療の標的となることがある場合）、薬剤スクリーニング（代謝産物プロファイルを評価することによって薬剤の効果を監視する場合）、薬剤感受性の判断（薬剤感受性が特定の代謝産物プロファイルに関連している場合）、基礎研究（サンプルにおける代謝産物プロファイルを、または特定の実施形態においては、２つ以上のサンプルにおける特定の代謝産物の相対量を同定することが望ましい場合）を含むがこれらに限定されない各種用途において、対象の方法を利用することができる。
【００４０】
特定の実施形態においては、２つ以上の異なるサンプル中の分析対象一式の相対量を、上記方法を用いて得ることができ、また比較することができる。これらの実施形態においては、上述の方法から得られる結果を、通常対照分析対象の総量に対して正規化し、比較する。これは、比率を比較することによって、または他の任意の手段よって行うことができる。特定の実施形態においては、２つ以上の異なるサンプルの核酸プロファイルを比較して、特定の疾患または状態に関連している分析対象を同定することができる。
【００４１】
一部の例では、「実験」サンプル、すなわち、対象サンプルと、実験サンプルと比較することができる「対照」サンプルとから異なるサンプルを構成することができる。多くの実施形態において、異なるサンプルは細胞型の対であって、一方の細胞型が対象の細胞型、例えば、異常細胞、他方が対照、例えば、正常細胞である。２つの細胞分画を比較した場合、これらの分画は通常、２つの細胞それぞれからの同じ分画である。しかしながら、特定の実施形態においては、同じ細胞の２つの分画を比較することができる。例示的な細胞型対として、例えば、処理される（例えば、ペプチド、ホルモン、温度変化、成長条件、物理ストレス、細胞形質転換などの環境要因または化学的要因等で）細胞と、正常細胞（例えば、不死ではない、感染していない、または処理していないこと以外は、そうでなければ実験細胞と同一である細胞等）との対、組織生検により（例えば、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、皮膚がんなど、疾患がある、または病原体に感染している組織等から）単離される細胞と、同じ組織、通常同じ患者からの正常細胞との対、病原体に感染している、組織培養において成長する不死の細胞（例えば、増殖突然変異体もしくは不死化導入遺伝子を有する細胞）、またはがんを患っている、疾患がある、高齢の哺乳動物、もしくは状態にさらされている哺乳動物から単離される細胞と、同種の哺乳動物、好ましくは健康もしくは若い同じ家族からの細胞との対、同じ哺乳動物からの分化細胞と未分化細胞（例えば、ある哺乳動物において、一方の細胞が他方の前駆細胞である）との対が挙げられる。
【００４２】
［例示的な態様］
本発明の様々な態様が、本開示および最先端技術に基づき当業者には明らかとなるはずであるが、以下に限定されるものではない。
【００４３】
１．ネブライザーを有するエレクトロスプレーイオン源によって、第１の液体ストリームをイオン化する方法であって、第１の液体ストリームは分析対象を含んでもよく、この方法は、
ａ）ネブライザーに第１の液体ストリームを供給するステップと、
ｂ）沸点が４℃〜１１０℃である共溶媒と、沸点が１５０℃〜３００℃である増強溶媒とを含む第２の液体ストリームを、ネブライザー内で、ネブライザーの供給口で、又はネブライザーの上流側で、第１の液体ストリームに添加するステップと、
ｃ）その結果として生じる液体を霧状化しイオン化するステップと
を含み、増強溶媒がＤＭＳＯである場合には、ネブライザーが負イオンモードで稼働する方法。
２．増強溶媒がＤＭＳＯを含む態様１の方法。
３．増強溶媒が２−（２−メトキシエトキシ）エタノールを含む態様１または２の方法。
４．増強溶媒がプロピレングリコールを含む態様１、２または３の方法。
５．共溶媒が、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびＴＨＦからなる群から選択される先行する態様のいずれかの方法。
６．第１の液体ストリームを生成するためにサンプルを分離するステップを更に含む先行する態様のいずれかの方法。
７．分離するステップが、液体クロマトグラフィーによって行われる態様６の方法。
８．分離するステップが、超臨界流体クロマトグラフィーによって行われる態様６の方法。
９．分離するステップが、キャピラリー電気泳動によって行われる態様６の方法。
１０．第１の液体ストリームは、分析対象が分離されていないサンプルを含むものである態様１〜５のいずれかの方法。
１１．霧状化がガスアシストによる先行する態様のいずれかの方法。
１２．分析対象をイオン化し、質量分析を行うステップを更に含む先行する態様のいずれかの方法。
１３．共溶媒の沸点が４℃〜３０℃である先行する態様のいずれかの方法。
１４．共溶媒の沸点が４℃〜５０℃である先行する態様のいずれかの方法。
１５．共溶媒の沸点が４℃〜６０℃である先行する態様のいずれかの方法。
１６．共溶媒の沸点が４℃〜７０℃である先行する態様のいずれかの方法。
１７．増強溶媒の沸点が１５０℃〜２００℃である先行する態様のいずれかの方法。
１８．増強溶媒の沸点が１５０℃〜２３０℃である先行する態様のいずれかの方法。
１９．増強溶媒の沸点が１５０℃〜２５０℃である先行する態様のいずれかの方法。
２０．結果としてエレクトロスプレー感度の増加が生じる先行する態様のいずれかの方法。
２１．増加が少なくとも２倍である態様２０の方法。
２２．増加が少なくとも３倍である態様２０の方法。
２３．増加が少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍である態様２０の方法。
２４．ネブライザーが負イオンモードで作動する先行する態様の方法。
２５．結果として分析対象の一価イオンの増加が生じる先行する態様のいずれかの方法。
２６．増加が少なくとも２倍である態様２４の方法。
２７．増加が少なくとも３倍である態様２４の方法。
２８．増加が少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍である態様２４の方法。
２９．エレクトロスプレーが正イオンモードで作動し、増強溶媒がＤＭＳＯではない態様２５〜２８のいずれかの方法。
３０．増強溶媒対共溶媒比が１：１０００〜１：４の範囲にある先行する態様いずれかの方法。
３１．増強溶媒対共溶媒比が１：２００〜１：５の範囲にある先行する態様いずれかの方法。
３２．増強溶媒対共溶媒比が１：２０〜１：６の範囲にある先行する態様いずれかの方法。
３３．増強溶媒対共溶媒比が１：１の範囲にある先行する態様いずれかの方法。
３４．（ｃ）ステップの結果として生じる液体における増強溶媒と共溶媒とを組み合わせた最終的な濃度が、１％〜９０％の範囲である先行する態様いずれかの方法。
３５．（ｃ）ステップの結果として生じる液体における増強溶媒と共溶媒とを組み合わせた最終的な濃度が、２０％〜８０％の範囲にある、先行する態様いずれかの方法。
３６．（ｃ）ステップの結果として生じる液体における増強溶媒と共溶媒とを組み合わせた最終的な濃度が、３０％〜７０％の範囲にある、先行する態様いずれかの方法。
３７．（ｃ）ステップの結果として生じる液体における増強溶媒と共溶媒とを組み合わせた最終的な濃度が、４０％〜６０％の範囲にある、先行する態様いずれかの方法。
３８．最終的な液体が、５０μｌ／分〜４００μｌ／分の範囲の流量で霧状化される先行する態様いずれかの方法。
【００４４】
本方法をさらに説明するために、本発明を説明するために提供されているという理解の下で具体例を挙げており、本発明の範囲を限定するものという解釈はすべきではない。
【実施例】
【００４５】
この方法の有用性を実証するために、対象の化合物についての応答（信号強度）を代表的なデータで示す。選択する化合物は典型的には、細胞や組織抽出物などの生体サンプルのメタボロミクス解析における対象である。実施例のデータに示す化合物も、それら化合物の生物学的関連性から、またそれら化合物は典型的なサンプルマトリクスにおいて上手く検出され、対象の質量範囲に及ぶことから選択した。負イオン化モード評価については、図示する化合物がフマル酸塩、Ｌ−アスパラギン酸、２−ヒドロキシグルタル酸塩、クエン酸、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＤＰおよびＧＴＰである。正イオン化モード評価については、図示する化合物がＬ−オルニチン、クレアチニン、プトレシン、アルギニノコハク酸塩、キヌレニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸塩およびスペルミジンである。
【００４６】
一次液体ストリームを構成する液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＩｎｆｉｎｉｔｙバイナリＵＨＰＬＣポンプによって提供された。負モード分析については、移動相Ａが、５ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルオクチルアミンおよび５．５ｍＭの酢酸を含有する水であった。移動相Ｂが、５ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルオクチルアミンおよび５．５ｍＭの酢酸を含有する９０％メタノール１０％水であった。ＬＣ分離では、サーモスタットカラムコンパートメントによって３０℃で保持されるＣｏｒｔｅｃｓ  Ｃ１８＋カラム（１５０×２．１ｍｍ、２．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。正モード分析については、移動相Ａが、０．１％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を０．１％ギ酸（ＦＡ）と共に含有する水、移動相Ｂが、０．１％ＨＦＢＡを０．１％ＦＡと共に含有するアセトニトリルであった。ＬＣ分離では、４０℃で保持されるＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（５０．０×２．１ｍｍ、１．８μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。
【００４７】
負モード分析に使用するサンプルは、培養細胞株（ＣＳ−１）から調製し、タンパク質から清澄し、移動相Ａ内で乾燥および再懸濁させた８０％水メタノール抽出物であった。注入に先立ってサンプルを４℃で保持し、注入量は１５μＬであった。初期ＬＣ条件はＢが１０％で、８．０分でＢが１００％に増大した。流量は４００μＬ／分で、注入間に５分の再平衡時間があった。正モード分析に使用するサンプルは、５０：５０のアセトニトリル：水の中において１ｍｇ／ｍＬで調製し、その後さらに移動相Ａ内で最終濃度約５μｇ／ｍＬまで希釈した、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈからの化学標準物質の混合物で構成し、注入量は５μＬであった。初期条件はＢが１分間０％で、８分でＢが２５％に、９分でＢが１００％に増大した。流量は４００μＬ／分で、注入間には４分の再平衡時間があった。
【００４８】
検出は、質量Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０飛行時間型分析計を用いて行った。負イオン化モード評価には、Ａｇｉｌｅｎｔデュアルエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を使用し、ＭＳ源パラメータは、ガス温度が２８０℃、乾燥ガスが１３Ｌ／分、ネブライザー圧力が４５ｐｓｉｇ、キャピラリー電圧が３，５００Ｖ、フラグメンタ電圧が１７５Ｖ、スキマ電圧が６５Ｖ、八重極１ＲＦ電圧が７５０Ｖであった。正モード評価には、ＡｇｉｌｅｎｔデュアルＥＳＩ源とＡｇｉｌｅｎｔデュアルＪｅｔＳｔｒｅａｍ源（ＡＪＳ）との両方を使用した。ＥＳＩ源条件は上記の通りで、ＡＪＳ源条件は、ガス温度が２５０℃、乾燥ガスが１３Ｌ／分、ネブライザー圧力が４５ｐｓｉｇ、シースガス温度が２２５℃、シースガス流量が１２Ｌ／分、ＶＣａｐが３５００Ｖ、ノズル電圧が述べた通り０〜１０００Ｖ、フラグメンタ電圧が１７５Ｖ、スキマ電圧が６５Ｖ、八重極１ＲＦ電圧が７５０Ｖであった。活性質量軸校正により、ｍ／ｚが５０〜１７００の質量範囲にわたってデータを取得した。
【００４９】
本方法の有用性を実証するために、二次液体ストリームを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０バイナリポンプを用いて添加し、単純なティーユニオンによって一次液体ストリームに結合し、ＬＣカラムよりも後、かつ質量分析計のネブライザーよりも前の一次ストリームに配置する。これにより、図面を伴う説明に従って、ポストカラムポンプによって供給される溶媒の混合物を変化させることによって、共溶媒と増強溶媒との組合せを一次液体ストリームに導入することができる。総合的には、提供されるデータにより、共溶媒がアセトンで、かつ増強溶媒が負モードではＤＭＳＯ、プロピレングリコールまたはジエチレングリコールメチルエーテル（ＤＧＭＥ）、正モードではＤＧＭＥである場合には、対象の化合物についての検出の増強が実証される。提供されるデータにより、低沸点共溶媒（この場合にはアセトン）と高沸点増強溶媒（この場合にはＤＭＳＯまたはＤＧＭＥ）の両方の組合せが、個別に添加した場合にはいずれも信号増強は反復されないため、この効果を発揮するためには必要となることも示される。最後に、提供されるデータにより、２種類の異なる設計の質量分析計源を使用した場合、正イオン化モードと負イオン化モードとの両方で増強が見られることも実証される。したがって、本方法は一般的に適用可能な技術となる可能性が高い。
【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【図３（１）】
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【図３（２）】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【外国語明細書】
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