(57)【要約】【課題】  本発明は、白内障手術の後に発症する後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防・治療のための新規な医薬を提供する。【解決手段】  本発明は、４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン（リパスジル）若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする白内障術後合併症の予防治療剤。
【請求項２】
４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
【請求項３】
アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤である、請求項２に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
【請求項４】
４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞遊走阻害剤。
【請求項５】
細胞遊走阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤である、請求項４に記載の細胞遊走阻害剤。
【請求項６】
４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
細胞増殖抑制剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤である、請求項６に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮抑制剤。
【請求項９】
コラーゲンゲル収縮抑制が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のコラーゲンゲル収縮抑制である、請求項８に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防・治療に有用な新規の医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
水晶体は、眼内に入った光を屈折させて網膜に結像させるものであり、前面は後房水を介して虹彩後面に接し、後面は硝子体に接し、角膜と共に結像系を担っている。水晶体は透明な無血管組織であり、水晶体嚢（のう）という透明の薄い膜に包まれている。水晶体嚢の前面は前嚢、後面は後嚢、円盤の縁にあたる部分は赤道部と呼ばれている。赤道部にはＺｉｎｎ小帯が結合しており、水晶体の厚みの調節に関与している。
水晶体上皮細胞は、水晶体嚢の内側に並んでおり、赤道部近傍で細胞分裂がみられる（増殖帯上皮細胞）。赤道部の上皮細胞は細長い長方形となって線維細胞に分化し、後嚢側に伸展し、水晶体中心部に向かって移動し、水晶体中心部に圧縮されて脱水して水晶体核を形成する。このように、後嚢は線維であり、この点で前嚢とは異なっている。一般に、水晶体上皮細胞は適度に増殖しており、加齢と共に水晶体は重く厚くなってくるとされている。
また、上皮細胞から分化した線維細胞間には、棘突起、稜突起、ギャップ結合が存在し、上皮細胞の分裂異常や後嚢側への伸展異常がある場合には、水晶体線維による混濁を生ずることがある。
【０００３】
白内障は、水晶体の混濁によるものであり、水晶体の混濁により入射した光が散乱するために、霞んだり、物が二重に見えたり、まぶしく見えるなどの症状が出現し、進行すれば視力が低下し、眼鏡でも矯正できなくなる。白内障の原因として、先天的なものや、外傷、アトピーによるもの、薬剤や放射線によるものなどが挙げられるが、その多くは加齢によるもので、一般に老人性白内障（加齢白内障）と呼ばれており、主に皮質の混濁（皮質白内障）や核の硬化（核白内障）の進行よるとされている。光が水晶体を通過する面は瞳孔の大きさで変わるために、光が通過しないところに混濁が生じている場合には、自覚症状はほとんど無いが、瞳孔を開く検査（散瞳検査）で水晶体を観察すると、早い人では４０才代から、８０才代では大部分の人で白内障が発見される。
ごく初期の白内障は点眼薬で進行を遅らせることができる場合もあるが、一度混濁が生じた水晶体を元に戻すことはできず、進行した白内障に対しては、混濁した水晶体の核及び皮質を外科手術で取り除き（水晶体嚢外摘出術）、眼内レンズを挿入する方法が一般的に行われる。例えば、水晶体嚢の前面（前嚢）を円形に切開し、嚢の中身を超音波で破砕吸引し、残した嚢の中に眼内レンズを挿入する方法であり、嚢を残すことにより眼内レンズの挿入が容易となる。
【０００４】
この手術は、痛みもほとんど無く、比較的短時間で終わり、眼内レンズの挿入により視力も回復することから、白内障の治療方法として利用されている。また、老人性白内障の罹患率は６０才代で６０〜７０％、更に、８０才以上になるとほぼ１００％と言われており、高齢化社会が進展する今日において、白内障の治療の重要性は今後益々増大してきており、手術方法や眼内レンズの改良が行われている。
しかし、手術後しばらくすると、嚢の中に残っている水晶体の細胞の増殖や後嚢への移行などにより、水晶体を再び混濁させることがある。混濁が進行すると視機能が低下し、白内障の症状が出現することがある。これを「後発白内障」といい、その発生率は１９％を超えるとの報告もされている。しかし、現在のところ後発白内障の完全な予防・治療法は確立されていない。
後発白内障の発症機序は主として、水晶体嚢外摘出術時に完全に除去されずに残存した水晶体上皮細胞が、後嚢へ遊走、増殖して後嚢混濁（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ:ＰＣＯ）が生じるか、又は赤道部に残留した水晶体上皮細胞が異常に増殖するなどして、輪状タイプに混濁するゼンメリング輪状（Ｓｏｅｍｍｅｒｒｉｎｇ’ｓ  ｒｉｎｇ）白内障や、真珠様に混濁するエルシュニッヒ真珠（ Ｅｌｓｃｈｎｉｇ’ｓ  ｐｅａｒｌｓ）を形成することによると考えられている。白内障手術において水晶体上皮細胞を完全に除去することは不可能で後発白内障を完全に防止することは困難であり、後発白内障の予防・治療のための医薬の開発が望まれている。
【０００５】
また、前述の白内障手術時、水晶体嚢の前面（前嚢）を円形に切開した水晶体嚢の窓が、術後小さくなることがある。このような症状を「前嚢収縮」という。これは切開された窓の周囲に残った水晶体の細胞が炎症反応等により線維性の細胞に変化し、増殖し、巾着絞りのように切開した円形の窓を狭くすることにより起こる。通常はほとんど視機能に影響しないが、窓の大きさが瞳孔の中心部分にかかるほど進行してくると眼内に光が入りづらくなり、視機能の低下の原因となる。「前嚢収縮」も白内障手術後に発生する疾患であり、後発白内障と同様に有効な予防・治療方法は確立されておらず、前嚢収縮の予防・治療のための医薬の開発が望まれている。
【０００６】
後発白内障抑制剤としては各種の物質が報告されてきている。例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の治療剤として知られているＮ−（３，４−ジメトキシシンナモイル）アントラニル酸（一般名：トラニラスト）を用いる（特許文献１参照）、エチレンジアミン四酢酸を徐放性製剤として用いる（特許文献２参照）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）を用いる（特許文献３参照）、２−ピペラジノン誘導体などの非ペプチド性の細胞接着阻害活性とポリマーを含む徐放性製剤を用いる（特許文献４参照）、細胞接着阻害活性を有するポリペプチドと乳酸−グリコール酸重合体を用いる（特許文献５参照）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐなどのペプチドを用いる（特許文献６参照）、セリンプロテアーゼの酵素前駆体などの水晶体上皮細胞と水晶体嚢間の接着を調節するための接着斑変調物質を用いる（特許文献７参照）、Ｆａｓリガンドなどの細胞死受容体リガンドを固定化したポリマーを用いる（特許文献８参照）ことなどが報告されてきている。
また、セリントレオニンキナーゼ阻害剤の一種であるＨ−７が、ゼンメリング輪の解消には有効であったが、後嚢混濁（ＰＣＯ）には効果が無かったことも報告されている（非特許文献１参照）。
【０００７】
一方、ファスジル（ｆａｓｕｄｉｌ）やＹ−２７６３２などのＲｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ， Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ : ＲＯＣＫ）阻害剤（以下、ＲＯＣＫ阻害剤ともいう。）が緑内障などの治療に使用されることも報告されてきており（例えば、特許文献９参照）、軸性近視の予防または治療剤として有用であることも報告されてきている（特許文献１０参照）。
また、ＲＯＣＫ阻害剤であるＨＦ（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ）及びＹ−２７６３２は、ウシの水晶体細胞においてＰＤＧＦ−ＢＢやＴＧＦ−β２などのサイトカイン誘発の収縮を阻害したこと（非特許文献２参照）が、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２やＭＬ−７は、ＴＧＦ−β誘発の筋線維芽細胞の分化転換及び収縮を阻害し、これは緑内障濾過手術の術後の瘢痕に有用となること（非特許文献３参照）が、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２は、増殖は促進しないが、接着性を促進し、緑内障濾過手術後の抗瘢痕剤として有用であること（非特許文献４参照）が、ＲＯＣＫ阻害剤であるファスジルが、硝子体細胞含有コラーゲンゲルの収縮を阻害し、硝子体網膜疾患の治療に有用となること（非特許文献５参照）が、それぞれ報告されてきている。
しかしながら、ＲＯＣＫ阻害剤が後発白内障や前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防・治療に有用であることは未だ報告されてきていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ９８／１６２１４号公報
【特許文献２】特開平８−１７５９８４号公報
【特許文献３】特表平８−５０２０３３号公報
【特許文献４】特開平９−２３５２３９号公報
【特許文献５】特開平９−２９１０４０号公報
【特許文献６】特開平１０−１７４８７号公報
【特許文献７】特表２００２−５０２８２１号公報
【特許文献８】特表２００４−５１８６４９号公報
【特許文献９】ＷＯ  ００／０９１６２号公報
【特許文献１０】ＷＯ  ２０１０／０１０７０２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂａｏｈｅ  Ｔｉａｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａ.  Ｔｈｅｒ.,  ２６(６),  ２０１０,  ５３３−５３９.
【非特許文献２】Ｋｕｍｉｋｏ  Ｈｉｒａｙａｍａ,  ｅｔ  ａｌ.,  ＩＯＶＳ,  ４５(１１),  ２００４,  ３８９６−３９０３.
【非特許文献３】Ｔｏｂｉａｓ  Ｍｅｙｅｒ−ｔｅｒ−Ｖｅｈｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  ＩＯＶＳ,  ４７(１１),  ２００６,  ４８９５−４９０４.
【非特許文献４】Ｍｅｇｕｍｉ  Ｈｏｎｊｏ,  ｅｔ  ａｌ.,  ＩＯＶＳ,  ４８(１２),  ２００７,  ５５４９−５５５７.
【非特許文献５】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｋｉｔａ,  ｅｔ  ａｌ.,  ＰＮＡＳ,  １０５(４５),  ２００８,  １７５０４−１７５０９.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、白内障手術、特に混濁した水晶体を外科手術で取り除くための水晶体嚢外摘出術の後に発症する後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防・治療のための新規な医薬を提供する。
また、本発明は、アクチンストレスファイバーの形成阻害剤、特に白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤としての新規な医薬を提供する。
また、本発明は、細胞遊走阻害剤、特に白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤としての新規な医薬を提供する。
また、本発明は、細胞増殖抑制剤、特に白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤としての新規な医薬を提供する。
さらに、本発明は、コラーゲンゲル収縮抑制剤、特に白内障外科手術後のコラーゲンゲル収縮抑制剤としての新規な医薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、次式
【００１２】
【化１】
2017061440.tif 000002
【００１３】
で表される４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン（以下、リパスジルともいう。）について各種の作用を検討してきた。リパスジル塩酸塩２水和物を有効成分とする緑内障、高眼圧症の治療薬は商品名「グラナテック」（登録商標）として既に製造販売承認を受けている。
本発明者らは、リパスジルの２．０％点眼剤をウサギに１３週間反復点眼投与（２回／日）した投与群、及びリパスジルの４．０％点眼剤をイヌに１３週間反復点眼投与（４回／日）した投与群において、水晶体前部の縫合線部に混濁を伴った水晶体線維の変性像が認められることを観察してきた。これらの変化は、リパスジルのＲＯＣＫ阻害作用によりアクチンストレスファイバーの形成阻害が起き、水晶体線維細胞への分化、その後の伸展、遊走が阻害されたために生じた変化であると考えられた。
【００１４】
これらのことを証明するために本発明者らは、ヒト水晶体上皮細胞を用いて検証した。この結果、リパスジルによる、アクチンストレスファイバーの明らかな減少が認められたが、この変化は可逆的であった。また、細胞遊走阻害も確認され、この変化も可逆的であった。
さらに、ＲＯＣＫ阻害作用を有することが知られているＹ−２７６３２でも同様の変化が認められたことから、リパスジルによる、アクチンストレスファイバーの形成阻害作用及び細胞遊走阻害作用はＲＯＣＫ阻害作用に基づく作用と判断された。
以上のことから、リパスジルには、ヒト水晶体上皮細胞において、可逆的なアクチンストレスファイバーの形成阻害作用及び細胞遊走阻害作用が有り、アクチンストレスファイバーの形成阻害による、水晶体線維細胞への分化、その後の伸展、遊走が阻害されることが判明した。
【００１５】
さらに、本発明者らは、リパスジルのヒト水晶体上皮細胞の増殖抑制作用、線維芽細胞の増殖抑制作用、及びコラーゲンゲル収縮作用についても検討した。この結果、リパスジルは、細胞増殖抑制作用やコラーゲンゲル収縮抑制作用も有していることが分かった。
これらのことからすれば、リパスジルには、白内障の外科手術において前嚢切除後に水晶体の核及び皮質が摘出される際に完全に除去されずに残存した水晶体上皮細胞の増殖を抑制する作用があるだけでなく、アクチンストレスファイバーの形成阻害による水晶体上皮細胞の分化、伸展、遊走も阻害する作用、さらにはコラーゲン収縮抑制作用もあることから、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防及び／又は治療に有効であることが判明した。
【００１６】
即ち、本発明は、４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン（リパスジル）若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療剤に関する。
また、本発明は、リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするアクチンストレスファイバーの形成阻害剤、好ましくは水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤に関する。
また、本発明は、リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞遊走阻害剤、好ましくは水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤に関する。
また、本発明は、リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞増殖抑制剤、好ましくは水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤に関する。
さらに、本発明は、リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮抑制剤、好ましくは白内障外科手術後のコラーゲンゲル収縮抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防及び／又は治療のための薬剤を提供することができる。本発明のリパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物は、可逆的なアクチンストレスファイバーの形成阻害作用及び細胞遊走阻害作用を有しており、これらの性質を利用することにより、アクチンストレスファイバーの形成阻害剤、好ましくは水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤、また、細胞遊走阻害剤、好ましくは水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤、また、細胞増殖抑制剤、好ましくは水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤、より好ましくは白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤、及びコラーゲンゲル収縮抑制剤、好ましくは白内障外科手術後のコラーゲンゲル収縮抑制剤として利用できるだけでなく、これらのことから後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療剤として有用となる。
白内障手術後に発生する後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症は、外科手術による視機能の回復を台無しにするものであり、患者にとっては深刻な疾患であるが、従来これを予防又は治療するための有効な薬剤は開発されておらず、レーザーによる処置しかなかった。本発明は、これを点眼等の簡単な投与処置で予防・治療することができる新規な薬剤を提供するものである。
さらに、高齢化社会になり老人性白内障の患者の増加が懸念されるが、白内障手術後に発生する後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症を本発明の薬剤により簡便にかつ効果的に抑制することが可能となり、安心して白内障の手術を受けることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａは、本発明のリパスジルによる水晶体上皮細胞（ＨＬＥｐｉＣ）のアクチンストレスファイバーの形成阻害作用を観察したカラー写真であり、図１Ｂは本発明のリパスジル除去後におけるアクチンストレスファイバーの形成阻害の回復性を観察したカラー写真である。アクチンストレスファイバーは赤色で示されている。
【図２】図２Ａは、比較対照として用いたＹ−２７６３２によるＨＬＥｐｉＣのアクチンストレスファイバーの形成阻害作用を観察したカラー写真であり、図２ＢはＹ−２７６３２除去後におけるアクチンストレスファイバーの形成阻害の回復性を観察したカラー写真である。アクチンストレスファイバーは赤色で示されている。
【図３】図３Ａは、陽性対照として用いたＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｄ（以下、ＣＤともいう。）によるアクチンストレスファイバーの形成阻害作用を観察したカラー写真であり、図３ＢはＣＤ除去後におけるアクチンストレスファイバーの形成阻害の回復性を観察したカラー写真である。アクチンストレスファイバーは赤色で示されている。
【図４】図４は、本発明のリパスジルによるＨＬＥｐｉＣの遊走阻害作用を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図５】図５は、比較対照として用いたＹ−２７６３２による水晶体上皮細胞の遊走阻害作用を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図６】図６は、陽性対照として用いたＣＤによる水晶体上皮細胞の遊走阻害作用を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図７】図７は、本発明のリパスジル除去後におけるＨＬＥｐｉＣの遊走阻害の回復性を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図８】図８は、比較対照として用いたＹ−２７６３２除去後におけるＨＬＥｐｉＣの遊走阻害の回復性を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図９】図９は、陽性対照として用いたＣＤ除去後における水晶体上皮細胞の遊走阻害の回復性を観察したカラー写真である。緑色は細胞を示す。
【図１０】図１０は、ヒト水晶体上皮細胞（ＳＲＡ０１／０４）の細胞増殖（ＤＮＡ合成能）に対するリパスジルの作用を試験した結果を示す。結果は平均±標準偏差で示されており、＊印はｐ＜０．０５で、＊＊印はｐ＜０．０１で、＊＊＊印はｐ＜０．００１で、有意差があったことを示す。
【図１１】図１１は、ウサギ後発白内障モデルにおける、本発明のリパスジルによる水晶体上皮細胞の増殖抑制作用を試験した結果を示すグラフである。縦軸は増殖面積（ｍｍ２）を示し、左側は対照群（プラセボ）を示し、右側は薬剤投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の態様をより詳細に説明すれば次のようになる。
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
（１）４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療剤。
（２）溶媒和物が、水和物である、前記（１）に記載の予防及び／又は治療剤。
（３）治療が、水晶体嚢の混濁又は収縮の進行を阻止することである、前記（１）又は（２）に記載の予防治療剤。
（４）予防治療剤が、白内障手術中又は白内障手術後から投与されるものである、前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の予防治療剤。
（５）白内障手術が、水晶体嚢外摘出術を含むものである、前記（４）に記載の予防治療剤。
【００２０】
（６）リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物、及び薬学的に許容される担体を含有してなる後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のための医薬組成物。
（７）溶媒和物が、水和物である、前記（６）に記載の医薬組成物。
（８）治療が、水晶体嚢の混濁又は収縮の進行を阻止することである、前記（６）又は（７）に記載の医薬組成物。
（９）予防治療のための医薬組成物が、白内障手術中又は白内障手術後から投与されるものである、前記（６）から（８）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１０）白内障手術が、水晶体嚢外摘出術を含むものである、前記（９）に記載の医薬組成物。
【００２１】
（１１）リパスジル若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物、及び点眼薬に許容される担体を含有してなる後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のための点眼薬。
（１２）溶媒和物が、水和物である、前記（１１）に記載の点眼薬。
（１３）治療が、水晶体嚢の混濁又は収縮の進行を阻止することである、前記（１１）又は（１２）に記載の点眼薬。
（１４）予防治療のための点眼薬が、白内障手術中又は白内障手術後から投与されるものである、前記（１１）から（１３）のいずれか１項に記載の点眼薬。
（１５）白内障手術が、水晶体嚢外摘出術を含むものである、前記（１４）に記載の点眼薬。
【００２２】
（１６）４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（１７）溶媒和物が、水和物である、前記（１６）に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（１８）アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤である、前記（１６）又は（１７）に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（１９）アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤である、前記（１６）から（１８）のいずれか１項に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（２０）アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体の混濁を防止するものである、前記（１６）から（１９）のいずれか１項に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（２１）アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体の形態形成を阻害するものである、前記（１６）から（２０）のいずれか１項に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
（２２）アクチンストレスファイバーの形成阻害剤が、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のためのものである、前記（１６）から（２１）のいずれか１項に記載のアクチンストレスファイバーの形成阻害剤。
【００２３】
（２３）４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞遊走阻害剤。
（２４）溶媒和物が、水和物である、前記（２３）に記載の細胞遊走阻害剤。
（２５）細胞遊走阻害剤が、水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤である、前記（２３）又は（２４）に記載の細胞遊走阻害剤。
（２６）細胞遊走阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害剤である、前記（２３）から（２５）のいずれか１項に記載の細胞遊走阻害剤。
（２７）細胞遊走阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体の混濁を防止するものである、前記（２３）から（２６）のいずれか１項に記載の細胞遊走阻害剤。
（２８）細胞遊走阻害剤が、白内障外科手術後の水晶体の形態形成を阻害するものである、前記（２３）から（２７）のいずれか１項に記載の細胞遊走阻害剤。
（２９）細胞遊走阻害剤が、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のためものである、前記（２３）から（２８）のいずれか１項に記載の細胞遊走阻害剤。
【００２４】
（３０）４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
（３１）溶媒和物が、水和物である、前記（３０）に記載の細胞増殖抑制剤。
（３２）細胞増殖抑制剤が、水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤である、前記（３０）又は（３１）に記載の細胞増殖抑制剤。
（３３）細胞増殖抑制剤が、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の細胞増殖抑制剤である、前記（３０）から（３２）のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
（３４）細胞増殖抑制剤が、白内障外科手術後の水晶体の混濁を防止するものである、前記（３０）から（３３）のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
（３５）細胞増殖抑制剤が、白内障外科手術後の水晶体の形態形成を阻害するものである、前記（３０）から（３４）のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
（３６）細胞増殖抑制剤が、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のためものである、前記（３０）から（３４）のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
【００２５】
（３７）４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮抑制剤。
（３８）溶媒和物が、水和物である、前記（３７）に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
（３９）コラーゲンゲル収縮抑制剤が、白内障外科手術後のコラーゲンゲル収縮抑制剤である、前記（３７）又は（３８）に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
（４０）コラーゲンゲル収縮抑制剤が、白内障外科手術後のコラーゲンゲル収縮を防止するものである、前記（３７）から（３９）のいずれか１項に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
（４１）コラーゲンゲル収縮抑制剤が、白内障外科手術後の水晶体の形態形成を阻害するものである、前記（３７）から（４０）のいずれか１項に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
（４２）コラーゲンゲル収縮抑制剤が、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療のためものである、前記（３７）から（４１）のいずれか１項に記載のコラーゲンゲル収縮抑制剤。
【００２６】
後発白内障は、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞の増殖や、線維細胞への分化、その伸展、遊走により発症することが知られている。即ち、白内障外科手術後の水晶体上皮細胞による水晶体の形態形成が、混濁の原因となることが知られている。
また、水晶体の形態形成に必要な水晶体線維細胞の分化、伸展、遊走にはアクチンストレスファイバーの形成が重要であることが報告されている（Ｒａｏ, Ｐ.Ｖ. ａｎｄ Ｍａｄｄａｌａ, Ｒ.（２００６）:Ｓｅｍｉｎ. Ｃｅｌｌ. Ｄｅｖ. Ｂｉｏｌ., １７(６), ６９８−７１１）。
本発明のリパスジルは、アクチンストレスファイバーの形成を阻害することにより、水晶体線維細胞の分化、伸展、遊走を阻害し、水晶体の形態形成を阻害する。このことは、白内障外科手術後に残存している水晶体上皮細胞の水晶体線維細胞の分化、伸展、遊走を阻害し得るということであり、後発白内障の予防治療において有用な性質となる。
さらに、本発明のリパスジルは、細胞増殖を抑制することにより、水晶体上皮細胞の増殖を抑制することから、後発白内障の予防治療において有用な性質となる。
また、同様に、本発明のリパスジルはアクチンストレスファイバーの形成阻害に加え、コラーゲンゲルの収縮抑制作用を示すことから、白内障外科手術後の前嚢収縮をも予防治療できる可能性を示していることになる。
【００２７】
本発明に用いるリパスジルは、脳血管治療剤や、サブスタンスＰ拮抗作用、ロイコトリエンＤ４拮抗作用及びＲＯＣＫ阻害作用を有する化合物であり、公知の方法、例えば、国際特許公開第９９／２０６２０号公報に記載の方法により製造することができる。
【００２８】
リパスジルの塩としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、フッ化水素酸、臭化水素酸等の無機酸の塩、又は酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸との塩が挙げられ、特に塩酸塩が好ましい。
【００２９】
リパスジル又はその塩は、未溶媒和型のみならず水和物又は溶媒和物としても存在することができる。水和物が好ましいが、本発明においては、全ての結晶型及び水和若しくは溶媒和物を含むものである。
【００３０】
リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物は、後記する実施例に示すように、アクチンストレスファイバーの形成阻害作用、細胞遊走阻害作用、細胞増殖抑制作用、及びコラーゲン収縮抑制作用などを有し、後嚢部混濁、ゼンメリング輪状（Ｓｏｅｍｍｅｒｒｉｎｇ’ｓ ｒｉｎｇ）白内障、エルシュニッヒ真珠（Ｅｌｓｃｈｎｉｇ’ｓ ｐｅａｒｌｓ）形成、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症及びこれらによる視力、視機能低下の予防及び／又は治療のための薬剤として有用である。
本発明において「白内障術後」とは、水晶体嚢外摘出術などの白内障の治療や白内障による視覚機能の改善のための外科手術を行った後のことをいう。本発明においては、「白内障術後」のことを「白内障手術後」又は「白内障外科手術後」ともいう。
また、本発明において「白内障術後合併症」とは、水晶体嚢外摘出術などの白内障の治療や白内障による視覚機能の改善のための外科手術の後に発症又は発症する可能性がある諸症状を伴う疾患、より詳細には、前記の外科手術において完全に除去されなかった水晶体上皮細胞による水晶体線維細胞の増殖や分化、伸展、遊走などに起因して発症又は発症する可能性がある疾患を包含している。典型的な白内障術後合併症としては、後発白内障や前嚢収縮などが挙げられる。
本発明において、「予防治療」とは、予防及び／又は治療を意味する。ここで、治療とは、水晶体嚢における混濁又は収縮の進行の抑制を包含している。また、予防とは、必ずしも発症を前提にするものではなく、発症の可能性を抑制することも包含している。さらに、白内障手術時において、前嚢切除後に水晶体の核及び皮質が摘出される際に完全に除去されずに残存した水晶体上皮細胞の増殖や分化、伸展、遊走も阻害するために、前嚢切除後に直ちに投与することも、本発明における予防に包含される。
【００３１】
リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を製剤化する場合は、公知の方法に準じて製剤を調製することができる。例えば、リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の製剤は、例えば、国際公開特許公報（ＷＯ００／０９１６２号、ＷＯ９７／２３２２２号など）に記載の製剤例を参考にして調製することができる。
【００３２】
リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の製剤を調製する場合も、公知の方法に準じて調製することができる。例えば点眼剤は、等張化剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤などを必要に応じて使用して、調製することができる。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよく、ｐＨ４〜８の範囲が好ましい。
【００３３】
本発明の製剤は、眼科用製剤として用いるのが好ましく、斯かる眼科用製剤は、水性点眼剤、非水性点眼剤、懸濁性点眼剤、乳濁性点眼剤、眼軟膏等のいずれでもよい。このような製剤は、投与形態に適した組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体、例えば点眼剤の場合は点眼薬に許容される担体、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等を配合し、当業者に公知の（製剤）方法により製造できる。
本発明の有効成分は、点眼投与においても有効性を有しており、点眼薬とすることができる。本発明の点眼薬は、本発明の有効成分であるリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物、及び点眼薬に許容される担体を含有するものである。
【００３４】
点眼剤を調製する場合、例えば、所望な上記成分を滅菌精製水、生理食塩水等の水性溶剤、又は綿実油、大豆油、ゴマ油、落花生油等の植物油等の非水性溶剤に溶解又は懸濁させ、所定の浸透圧に調整し、濾過滅菌等の滅菌処理を施すことにより行うことができる。なお、眼軟膏剤を調製する場合は、前記各種の成分の他に、軟膏基剤を含むことができる。前記軟膏基剤としては、特に限定されないが、ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレン等の油性基剤；油相と水相とを界面活性剤等により乳化させた乳剤性基剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール等からなる水溶性基剤等が好ましく挙げられる。
【００３５】
リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防及び／又は治療のために用いる場合、その投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して、（Ｓ）−（−）−１−（４−フルオロ−５−イソキノリンスルホニル）−２−メチル−１，４−ホモピペラジン若しくはその塩又はそれらの溶媒和物として、１日０．０２５〜１００００μｇ、好ましくは０．０２５〜２０００μｇ、より好ましくは０．１〜２０００μｇ、さらに０．０２５〜２００μｇの範囲が挙げられる。
【００３６】
また、投与回数は、特に限定されないが、１回又は数回に分けて投与するのが好ましく、液体点眼剤の場合は、１回に１〜数滴点眼すればよい。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
アクチンストレスファイバーの形成阻害作用：
ヒト水晶体上皮細胞（ＨＬＥｐｉＣ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を培地（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で希釈し、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）コーティングＩｍａｇｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ ＣＧの各ウエルに１００μＬ／ｗｅｌｌ（約５０００個／ｃｍ２）分注し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で約５０％コンフルエントになるまで培養した。培地を吸引除去し、それぞれのウエルに３００μＬ／ｗｅｌｌで、次の試験物質、陽性対照、比較対照、又は培地（対照）をそれぞれの濃度で加えた。
試験物質：リパスジルを１０μＭ、１００μＭ、又は１ｍＭの濃度。
陽性対照：Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｄを２μＭの濃度。
比較対照：Ｙ−２７６３２を１ｍＭの濃度。
対照    ：培地のみ。
これらを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で約１時間処理した後、培地で１回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）（以下、固定液という。）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２分間固定した。培地で洗浄後、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２分間浸透した。培地で洗浄後、固定液を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２０分間固定した。
別途、１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社）３４７５μＬに１４μＭのＡｃｔｉｎ−ｓｔａｉｎＴＭ ５５５ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ, Ｉｎｃ.）（以下、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎという。）２５μＬを加え、１００ｎＭのＰｈａｌｌｏｉｄｉｎを作製した。
この１００ｎＭのＰｈａｌｌｏｉｄｉｎを、培地で洗浄後の各ウエルに２００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温、暗所で約６０分間染色した。
培地で洗浄後、Ｃｈａｍｂｅｒを外し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.）をカバーガラスに数滴落とし、スライドガラスを接着させ、室温、暗所で３０分間以上放置し、接着及び核染色を行った後、共焦点レーザ走査型顕微鏡で観察した。
【００３９】
観察した結果を、試験物質のリパスジル及び対照については図１Ａに、比較対照のＹ−２７６３２及び対照については図２Ａに、陽性対照及び対照については図３Ａに、それぞれカラー写真で示す。アクチンストレスファイバーはカラー写真では赤色に着色されている。
試験物質のリパスジルの１０μＭでは少しアクチンストレスファイバーが無くなっており、１００μＭ及び１ｍＭでは顕著にアクチンストレスファイバーが消失しているのが分かる（図１Ａ参照）。また、比較対照のＹ−２７６３２も同様にアクチンストレスファイバーが消失している（図２Ａ参照）。さらに、陽性対照のＣＤも顕著なアクチンストレスファイバーの消失が見られる（図３Ａ参照）。
このことから、本発明のリパスジルがアクチンストレスファイバーの形成阻害作用を有していることが分かった。
【実施例２】
【００４０】
アクチンストレスファイバーの形成阻害の回復性：
実施例１で試験物質、陽性対照、又は比較対照を除去した後、さらに約２４時間、再培養し、実施例１の操作に準じて処理した後、実施例１と同様に共焦点レーザ走査型顕微鏡で観察して、アクチンストレスファイバーの回復性を観察した。
観察した結果を、試験物質のリパスジル及び対照については図１Ｂに、比較対照のＹ−２７６３２及び対照については図２Ｂに、陽性対照及び対照については図３Ｂに、それぞれカラー写真で示す。アクチンストレスファイバーはカラー写真では赤色に着色されている。
試験物質のリパスジルの１００μＭ及び１ｍＭではアクチンストレスファイバーが回復しているのが分かる（図１Ｂ参照）。また、比較対照のＹ−２７６３２も同様にアクチンストレスファイバーが回復している（図２Ｂ参照）。さらに、陽性対照のＣＤもアクチンストレスファイバーが回復している（図３Ｂ参照）。
このことから、本発明のリパスジルがアクチンストレスファイバーの形成阻害作用を有しているが、この作用は可逆的であることが分かった。
【実施例３】
【００４１】
Ｇ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ, Ｉｎｃ.）を用いたＧ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比の定量：
ＨＬＥｐｉＣを培地（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ）で希釈し、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングＴ−７５フラスコに約５０００個／ｃｍ２分注し、約５０％コンフルエントになるまで炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。それぞれのフラスコに２０ｍＬで、次の試験物質、陽性対照、又は培地（対照）をそれぞれの濃度で加えた。
試験物質：リパスジルを１０μＭ、１００μＭ、又は１ｍＭの濃度。
陽性対照：ＣＤを２μＭの濃度。
対照    ：培地のみ。
これらを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で約１時間処理した。
Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｆ−ａｃｔｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２０ｍＬに、１００ｍＭ ＡＴＰ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ、１００×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｔｏｃｋを２００μＬ加え、ＬＡＳ２ ｂｕｆｆｅｒを作製し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃）で約３０分間インキュベートした。温めたＬＡＳ２ ｂｕｆｆｅｒを、培地を吸引除去した各フラスコに２．５ｍＬ加えた。
次いで、セルスクレーパーで接着したＨＬＥｐｉＣを完全にはがし、ＬＡＳ２ ｂｕｆｆｅｒと共にコニカルチューブに移し、マイクロピペットを用いてＨＬＥｐｉＣを粉砕した（以下、溶解液という。）。この溶解液を炭酸ガスインキュベーター（３７℃）で約１０分間インキュベートした後、１０分間（２０００ｒｐｍ、室温）遠心した。上清を超遠心用チューブに１．８ｍＬ分取し、超遠心機で１時間（１００，０００×ｇ、３７℃）遠心した。このとき、Ｆ−ａｃｔｉｎは沈殿し、Ｇ−ａｃｔｉｎは上清に残る。
Ｆ−ａｃｔｉｎ沈殿物を吸わないように注意しながら、上清をコニカルチューブに移した。
各サンプルの沈殿物にＦ−ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを１．８ｍＬ加え、氷冷下で１時間インキュベートし、ａｃｔｉｎを脱重合させた。
各上清サンプル、各沈殿物サンプルから１００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに分取し、５×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを２５μＬ加え、攪拌した。
各サンプルを沸騰した水浴中で５分間煮沸した。
各サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ウエスタンブロッティングした。
次いで、ウエスタンブロッティング検出試薬（ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）で処理し、ルミノ・イメージアナライザーを用いてタンパク質を検出した。解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いてＧ−ａｃｔｉｎ、Ｆ−ａｃｔｉｎ量を定量し、Ｇ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比を算出した。
結果を次の表１に示す。
【００４２】
【表１】
2017061440.tif 000003
【００４３】
無処理（Ｃｏｎｔｒｏｌ）細胞のＧ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比と比較し、アクチンストレスファイバーの形成に必要なＦ−ａｃｔｉｎ量の変動を評価した。
対照のＧ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比は、１．１６であった。本発明のリパスジルの１０μＭ、１００μＭ、及び１ｍＭでのＧ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比は、それぞれ１．９１、４．５５、２４．８７であり、対照と比較すると、１０μＭ処理ではわずかな高値であり、１００μＭ処理からは明らかな高値であった。
陽性対照のＣＤ２μＭ処理のＧ−ａｃｔｉｎ／Ｆ−ａｃｔｉｎ比は、２５．０３であり、対照と比較すると明らかな高値であった。
【実施例４】
【００４４】
細胞遊走阻害作用：
ＨＬＥｐｉＣを培地（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ）で希釈し、ストッパーを密着させたＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングＯｒｉｓＴＭ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅに５０μＬ／ｗｅｌｌ（２５０００個／ｗｅｌｌ）分注し、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。ストッパーを取り除き、培地で軽く洗浄した後、培地４９９５μＬに１０ｍＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ, Ｉｎｃ.）を５μＬ加えた溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で約３０分間染色した。培地で軽く洗浄した後、さらに培地を加え炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で約３０分間培養した。
培地で軽く洗浄後、試験物質、陽性対照、比較対照、又は培地（対照）を次に示すそれぞれの濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
試験物質：リパスジルを１０μＭ、１００μＭ、又は１ｍＭの濃度。
陽性対照：ＣＤを２μＭの濃度。
比較対照：Ｙ−２７６３２を１ｍＭの濃度。
対照    ：培地のみ。
これらを炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。処理後約２４時間及び処理後４８時間に、それぞれ共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いてＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅのＨＬＥｐｉＣの状態を観察した。
【００４５】
観察した結果を、試験物質のリパスジル及び対照については図４に、比較対照のＹ−２７６３２及び対照については図５に、陽性対照及び対照については図６に、それぞれカラー写真で示す。細胞はカラー写真では緑色に着色されている。
試験物質のリパスジルの１００μＭで細胞遊走阻害傾向が認められ、１ｍＭでは明確な細胞遊走阻害作用が認められた（図４参照）。また、比較対照のＹ−２７６３２も同様に細胞遊走阻害作用が認められた（図５参照）。さらに、陽性対照のＣＤも同様に細胞遊走阻害作用が認められた（図６参照）。
このことから、本発明のリパスジルが水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害作用を有していることが分かった。
また、併せて全体像の観察も行ったが、いずれの試薬のいずれの濃度での処理においても、ＨＬＥｐｉＣの状態に異常は認められなかった。
【実施例５】
【００４６】
細胞遊走阻害の回復性：
実施例４の操作に続いて、試験物質、陽性対照、又は比較対照を除去し、培地で軽く洗浄した後、培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。除去後約２４、４８、さらには約１１６時間に、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いてＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅのＨＬＥｐｉＣの状態を観察した。
【００４７】
観察した結果を、試験物質のリパスジル及び対照については図７に、比較対照のＹ−２７６３２及び対照については図８に、陽性対照及び対照については図９に、それぞれカラー写真で示す。細胞はカラー写真では緑色に着色されている。
除去前と比較すると、試験物質のリパスジルの１００μＭ処理では時間とともにＨＬＥｐｉＣが遊走するのが確認され、除去後約２４時間にはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅがＨＬＥｐｉＣで満たされているのが確認された。１ｍＭ処理では時間とともに少しずつＨＬＥｐｉＣが遊走するのが確認されたが、除去後約４８時間でもＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅはＨＬＥｐｉＣで満たされていなかった。しかし、１１６時間後ではＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｚｏｎｅが満たされるほどＨＬＥｐｉＣが遊走していることが確認された（図７参照）。
また、比較対照のＹ−２７６３２も同様に時間とともに少しずつＨＬＥｐｉＣが遊走するのが確認されたが、除去後約４８時間でもＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅはＨＬＥｐｉＣで満たされていなかった。しかし、１１６時間後ではＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｚｏｎｅが満たされるほどＨＬＥｐｉＣが遊走していることが確認された（図８参照）。
さらに、陽性対照のＣＤも同様に時間とともにＨＬＥｐｉＣが遊走するのが確認され、除去後約４８時間にはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ＺｏｎｅがＨＬＥｐｉＣで満たされているのが確認された（図９参照）。
このことから、本発明のリパスジルが水晶体上皮細胞の細胞遊走阻害作用を有しているが、この作用は可逆的であることが分かった。
【実施例６】
【００４８】
細胞増殖抑制作用
ヒト正常線維芽細胞（三光純薬株式会社）を２０００個／ｗｅｌｌで播種し、一晩培養した。翌日、培地（ＦＧＭ−２（三光純薬株式会社））を交換（１５０μＬ）した後、リパスジルを最終濃度が０．１μＭ、１μＭ、１０μＭとなるように１０μＬ添加した。２日間培養後、ＢｒｄＵ（５８．８倍希釈液：原液は１０００倍液）を１０μＬ添加し、２時間培養した。Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵ ｋｉｔ(Ｒｏｃｈｅ)のプロトコールに従い、固定・抗体添加、洗浄・発色及び反応停止後、プレートリーダを用いてＯＤ５４０−６２０を測定し、増殖に対する作用を評価した。リパスジル未添加時の値を１００％としたときの各条件のＢｒｄＵ取り込み率を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2017061440.tif 000004
【００５０】
ＢｒｄＵ取り込み率は、リパスジル０．１μＭで８０．０％、１μＭで５９．３％、１０μＭで１０．９％であり、顕著な細胞増殖抑制作用を有していることが分かった。
【実施例７】
【００５１】
ヒト水晶体上皮細胞株（ＨＬＥｓ，ＳＲＡ０１／０４）のＤＮＡ合成能に対するリパスジル塩酸塩２水和物の作用
ヒト水晶体上皮細胞 (ＳＲＡ０１／０４（理研セルバンク）)は、２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
ＳＲＡ０１／０４を２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を用いての濃度調整し、９６Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅに１００μＬ／ｗｅｌｌ（５０００個／ｗｅｌｌ）播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培地を５％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、ＴＧＦβを１０ｎｇ／ｍＬ（終濃度）、リパスジルを１０、３０または１００μＭ（終濃度）をそれぞれ添加し、さらに２４時間培養した。細胞増殖ＥＬＩＳＡ , ＢｒｄＵ発色キット(Ｒｏｃｈｅ) を用いて、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０  (ＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ) により細胞内の５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ (ＢｒｄＵ) 取込量を測定波長４５０ｎｍで測定し、細胞増殖性を評価した。
【００５２】
結果を図１０に示す。この結果、リパスジルはヒト水晶体上皮細胞のＤＮＡ合成能に対して用量依存的な阻害作用が確認され、３０μＭで統計学的に有意な低下を示した。
また、前記の実施例６の結果と併せると、本発明のリパスジルがヒト水晶体上皮細胞を含む細胞増殖抑制作用を有していることが示されることになる。
【実施例８】
【００５３】
ウサギ後発白内障モデルに対する作用
日本在来白色種ウサギ（雄性）１０羽を用いた。各ウサギに麻酔をして、ウサギの左眼角膜に約３ｍｍの切開創を開け、超音波乳化吸引装置で水晶体を吸引除去した。水晶体が除去された水晶体嚢の内側に眼内レンズを挿入した。手術後、抗菌剤や抗炎症剤などを用いて必要な処置をした後、３日間手術後の経過を観察した。
手術後の経過を観察した後、手術４日目から薬剤投与群（５羽）と対照群（５羽）に分けて、薬剤投与群には、リパスジルの２％点眼液を１日４回、２週間反復投与した。対照群はプラセボとした。
投与開始から２週間後にウサギの眼球を摘出し、パラフィン包埋した。包埋した標本を、視神経及び虹彩を基準にして、眼球の中心部付近で薄切し、薄切片をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色して顕微鏡で観察した。水晶体上皮細胞の増殖が認められる組織の面積を画像解析装置で測定し、その平均値を算出した。その結果を図１１に示す。対照群（プラセボ）では５．７ｍｍ２であったが、薬剤投与群では３．３ｍｍ２であり、リパスジルの２％点眼液を投与することにより、水晶体上皮細胞の増殖が抑制されていることが確認された。
【実施例９】
【００５４】
コラーゲンゲル収縮抑制作用
１５００００〜２０００００個／ｍＬの密度に培地で調整したＨＴ−１０８０細胞懸濁液（培地：Ｅ’ＭＥＭ(Ｓｉｇｍａ)／１０％ＦＢＳ／ＮＥＡＡ／ＰＣＳＭ）と、８：１：１に混合し冷却したコラーゲン・ゲル培養キット（新田ゼラチン）のＡ、Ｂ、Ｃ液（Ａ液：Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ(Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ３ｍｇ／ｍＬ)、Ｂ液：濃縮培養液、１０×ＭＥＭハンクス培養液、Ｃ液：再構成用緩衝液）を、１．４：１に混合し、４８Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅに５００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種してＣＯ２インキュベーター内でゲル化させ、細胞含有コラーゲンゲルを作成した。ゲル化後、リパスジルを０．１μＭ、１μＭ、１０μＭに調整した培地１ｍＬをゲル上に添加し、ゲルと壁面の間に注射針を差し込み、ゲルを壁面から脱着させ、ＣＯ２インキュベーター内で静置した。２、３日後にゲルの収縮を観察し、写真撮影してリパスジルの作用を評価した。
収縮がリパスジル未添加群とほぼ同程度の場合には（＋）、収縮が抑制されている場合には（＋＋）、収縮が顕著に抑制されている場合には（＋＋＋）とした。
結果を次の表３に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
リパスジルのコラーゲンゲル収縮に対する作用は、０．１μＭで（＋）、１μＭで（＋＋）、１０μＭで（＋＋＋）であり、用量依存的なコラーゲンゲル収縮抑制作用を有していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物は、後発白内障、前嚢収縮等の白内障術後合併症の予防治療剤、アクチンストレスファイバーの形成阻害剤、細胞遊走阻害剤、細胞増殖抑制剤やコラーゲンゲル収縮抑制剤などの医薬として有用であり、産業上の利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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