(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞等を賦活化することにより、感染症等の疾患を予防又は治療することができる新規免疫賦活化剤の提供。【解決手段】下記式(I)で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する免疫賦活化剤。2017075137.tif 000003【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化剤。
【請求項２】
T細胞を賦活化する、請求項1に記載の免疫賦活化剤。
【請求項３】
IL-2産生を誘導する、請求項1に記載の免疫賦活化剤。
【請求項４】
IFN産生を誘導する、請求項1に記載の免疫賦活化剤。
【請求項５】
免疫細胞の遊走を誘導する、請求項1に記載の免疫賦活化剤。
【請求項６】
免疫細胞の病変部への浸出・集積を誘導する、請求項1に記載の免疫賦活化剤。
【請求項７】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により感染症を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項８】
感染症が寄生虫感染である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
寄生虫が、トリパノソーマ原虫、マラリア原虫、およびトキソプラズマからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
感染症が細菌感染である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細菌が、肺炎球菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、炭疽菌、コレラ菌、およびピロリ菌からなる群から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
感染症がウイルス感染である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ウイルスが、ヒトT細胞白血病ウイルス、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルスからなる群から選択される、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により免疫不全疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
免疫不全疾患がHIV感染によるものである、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により、加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
免疫機能減弱に起因する疾患が肺炎である、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化によりウイルス関連腫瘍を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
ウイルス関連腫瘍が、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌、成人Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、頭頸部がんである、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の作用を増強するための医薬組成物。
【請求項２１】
感染症予防ワクチンの作用を増強するための、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
抗ウイルス剤の作用を増強するための、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体の作用を増強するための、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
がんワクチンの作用を増強するための、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
抗腫瘍免疫応答誘導剤の作用を増強するための、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-1抗体である、請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-L1抗体である、請求項26に記載の医薬組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミド(本明細書では、以下、この化合物を「化合物(I)」とも称する)またはその塩を有効成分として含有する、免疫賦活化により改善することができる疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、生体内外から起因する様々な疾患に対し、自己を防御する重要なメカニズムである。免疫系の機能低下により、細菌やウイルスによる感染症発生、腫瘍発生、傷病回復の遅延等、疾患への悪影響がもたらされる。従って、免疫系を賦活化する事は、様々な疾患の予防や治療に非常に重要である。従来、免疫賦活化の方法としては、古くは、死菌や抗原投与によるワクチンが知られており、その他にも、ペプチドグリカン、リポ多糖類、キチン、ラクトフェリン、シクロフォスファミド等を用いる方法も知られている。また、近年では、IL-6やTNF、IFNなどのタンパク質を投与することにより免疫系を賦活化するサイトカイン療法、免疫細胞を採取してその活性を惹起した後に生体に戻す免疫細胞療法などが存在する。これらは、特定の感染症や腫瘍の予防または治療に対して効果を発揮している。
【０００３】
上皮成長因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)は、腫瘍の増殖において非常に大きい役割を担っている。現在、様々なEGFRチロシンキナーゼ阻害剤が開発され、臨床で利用されている。EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の具体例としては、ゲフィチニブ(商品名イレッサ)、エルロチニブ(商品名タルセバ)、アファチニブ(商品名ジオトリフ)等が知られている。これらはEGFRチロシンキナーゼに高い選択的な阻害作用を有し、特にEGFR遺伝子変異を有する患者において腫瘍選択的に抗腫瘍効果を発揮し、患者の予後の改善に貢献すると考えられている。さらに最近においては耐性機序のひとつであるT790M変異に対して効果を有し、且つ変異型EGFRに対して選択性を高めたAZ9291を代表例とする第三世代型のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤が開発されている。それら化合物の抗腫瘍効果は、高選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害のみにより、腫瘍細胞に直接作用することに基づいているといっても過言ではない(非特許文献1および2)。
【０００４】
化合物(I)およびその塩は、EGFRチロシンキナーゼを高選択的に阻害し、腫瘍の増殖を抑制する効果があることが知られている(特許文献1)。しかし、本発明の化合物、および前述の既知のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤のいずれについても、免疫賦活化作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2013/125709号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Rev. Cancer, vol. 6, pp. 803-811(2006)
【非特許文献２】Journal of Thoracic Oncology ・ Vol. 3, No. 6, Supplement 2, June 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、免疫賦活化剤および免疫賦活化により改善することができる疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、化合物(I)の薬理作用の検討を重ねてきた結果、同化合物が免疫系を賦活化する作用を有することを見出し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
(1)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化剤。
(2)T細胞を賦活化する、(1)に記載の免疫賦活化剤。
(3)IL-2産生を誘導する、(1)に記載の免疫賦活化剤。
(4)IFN産生を誘導する、(1)に記載の免疫賦活化剤。
(5)免疫細胞の遊走を誘導する、(1)に記載の免疫賦活化剤。
(6)免疫細胞の病変部への浸出・集積を誘導する、(1)に記載の免疫賦活化剤。
【００１０】
(7)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により感染症を予防または治療するための医薬組成物。
(8)感染症が寄生虫感染である、(7)に記載の医薬組成物。
(9)寄生虫が、トリパノソーマ原虫、マラリア原虫、およびトキソプラズマからなる群から選択される、(8)に記載の医薬組成物。
(10)感染症が細菌感染である、(7)に記載の医薬組成物。
(11)細菌が、肺炎球菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、炭疽菌、コレラ菌、およびピロリ菌からなる群から選択される、(10)に記載の医薬組成物。
(12)感染症がウイルス感染である、(7)に記載の医薬組成物。
(13)ウイルスが、ヒトT細胞白血病ウイルス、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルスからなる群から選択される、(12)に記載の医薬組成物。
【００１１】
(14)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により免疫不全疾患を治療するための医薬組成物。
(15)免疫不全疾患がHIV感染によるものである、(14)に記載の医薬組成物。
【００１２】
(16)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化により、加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
(17)免疫機能減弱に起因する疾患が肺炎である、(16)に記載の医薬組成物。
【００１３】
(18)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫賦活化によりウイルス関連腫瘍を予防または治療するための医薬組成物。
(19)ウイルス関連腫瘍が、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌、成人Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、頭頸部がんである、(18)に記載の医薬組成物。
【００１４】
(20)(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を含む、免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の作用を増強するための医薬組成物。
(21)感染症予防ワクチンの作用を増強するための、(20)に記載の医薬組成物。
(22)抗ウイルス剤の作用を増強するための、(20)に記載の医薬組成物。
(23)抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体の作用を増強するための、(20)に記載の医薬組成物。
【００１５】
(24)がんワクチンの作用を増強するための、(20)に記載の医薬組成物。
(25)抗腫瘍免疫応答誘導剤の作用を増強するための、(20)に記載の医薬組成物。
(26)抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、(25)に記載の医薬組成物。
(27)抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-1抗体である、(26)に記載の医薬組成物。
(28)抗腫瘍免疫応答誘導剤が抗PD-L1抗体である、(26)に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドまたはその塩を有効成分として含有する、免疫賦活化剤、および免疫賦活化により改善することができる疾患を予防または治療するための新規医薬組成物が提供される。また、本発明により、各種感染症、免疫不全疾患、および腫瘍などの新たな治療法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例1における、抗CD3抗体および抗CD28抗体添加濃度を一定とし、化合物(I)添加濃度を可変させたときの、マウス脾細胞が産生した培養上清中のIL-2の濃度を示す。
【図２】実施例1における、抗CD3抗体添加濃度を可変させ、抗CD28抗体添加濃度を一定としたときの、化合物(I)添加の有無による、マウス脾細胞が産生した培養上清中のIL-2の濃度を示す。
【図３】実施例2における、化合物(I)を添加したとき、またはAZD9291を添加したときの、ヒト末梢血単核球細胞が産生した培養上清中のIL-2の濃度の推移を示す。
【図４】実施例3における、化合物(I)、AZD9291またはエルロチニブを添加したときの、混合リンパ球反応を誘導した際の3H-Thd取り込み量を示す。
【図５】実施例4における、各化合物を添加したときの、CD4およびCD8のそれぞれが陽性である細胞のCFSE量をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
【図６】実施例5における、抗PD-1抗体または化合物(I)を添加したときの、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、およびCD4およびCD8陰性かつNK1.1陽性の細胞の相対数を算出した結果を示す。
【図７】実施例6における、抗PD-1抗体および/または化合物(I)を添加したときの、CD4陽性かつCD69陽性の細胞、およびCD4陽性かつCD44陽性かつCD62L陰性の細胞の相対数を算出した結果を示す。
【図８】実施例6における、抗PD-1抗体および/または化合物(I)を添加したときの、CD4陽性細胞のCD44発現量およびCD4陽性細胞のCD62L発現量を算出した結果を示す。
【図９】実施例7における、各化合物を添加した群の、無処置群に対するヒト末梢血単核球が産生したサイトカイン濃度の相対比を示す。
【図１０】実施例8における、化合物(I)を投与したときのマウスメラノーマの移植14日目(投薬15日目)の各投与群の肺転移結節数を示す。
【図１１】実施例9における、抗PD-1抗体または化合物(I)を投与したときの、MC38腫瘍株の各投与群の腫瘍容積の経時変化を示す。
【図１２】実施例10における、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体もしくは化合物(I)を単独で、または抗PD-1抗体と抗PD-L1抗体のいずれかと化合物(I)を組み合わせて投与したときの、K1735M2腫瘍株の各個体の腫瘍容積の経時変化を示す。
【図１３】実施例11における、抗PD-1抗体もしくは化合物(I)、またはそれらの組み合わせを投与したときの、MC38腫瘍株の各投与群の腫瘍容積の経時変化を示す。
【図１４】実施例11においてサンプリングした腫瘍における、CD3、CD4およびCD8遺伝子の発現の相対比を示す。
【図１５】実施例11においてサンプリングした腫瘍における、NK1.1、IL-2およびIFN-γ遺伝子の発現の相対比を示す。
【図１６】実施例11においてサンプリングした腫瘍における、Perforin、Granzyme BおよびCD69遺伝子の発現の相対比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
化合物(I)である(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミドは、以下の構造式(I)により表される化合物である。化合物(I)は公知化合物であり、その製造方法は、特許文献1として挙げた国際公開第2013/125709号に開示されている。
【化１】
2017075137.tif 000002
【００１９】
化合物(I)は、遊離形態または塩形態のいずれであってもよい。塩形態である場合は結晶であってもよく、その場合、結晶形は単一であっても多形混合物であってもよく、また溶媒和物(例えば水和物)であっても無溶媒和物であってもよい。塩形態としては酸付加塩が挙げられ、具体例としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸および過塩素酸塩などの無機酸塩、メタンスルホン酸、イセチオン酸、ベンゼンスルホン酸およびp-トルエンスルホン酸などのスルホン酸塩、ならびにギ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、トリフルオロ酢酸などのその他の有機酸塩が挙げられる。
【００２０】
化合物(I)およびその塩は、ヒトおよびその他の哺乳動物、例えばサル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジに対して免疫賦活化作用を有する。本明細書において「免疫賦活化作用」とは、免疫細胞を活性化することを意味し、すなわち、免疫細胞の分裂や分化を誘導し、各種サイトカインの産生を誘導し、免疫細胞を遊走させ、免疫細胞を病変部（すなわち、病的変化の起こっている部分をいう。たとえば腫瘍組織、感染組織、炎症組織などである。）に浸出及び／又は集積させ、或いは、自己由来の異物的成分または外来性の異物の排除機能の亢進することを意味する。化合物(I)およびその塩は、免疫細胞の中でも特にT細胞を賦活化する作用を有する。誘導されるサイトカインとしては、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、IL-23、GM-CSF、IFN-γ、MCFA、MIP-1α、MIP-1β、TNF-αが挙げられ、特にIL-2である。また、化合物(I)およびその塩は、特に末梢血単核球に対してサイトカインの産生を誘導する作用を有し、サイトカインの中でも特にIL-2および/またはIFNの産生を誘導する。また、化合物(I)およびその塩は、免疫細胞を遊走させる。また、化合物(I)およびその塩は、免疫細胞の遊走・浸出及び/又は集積を誘導する。免疫細胞の遊走、病変部への浸出及び/又は集積は、病変部の組織染色や、病変部組織においての免疫細胞に特徴的な遺伝子（たとえばCD3、CD4、CD8、NK1.1、IL-2、IFN-γ、Perforin、Granzyme B、CD69等）の発現の変化によって測定できる。本発明は、化合物(I)またはその塩を含む免疫賦活化剤、および免疫賦活化剤としての化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、予防または治療を必要とする患者に投与することを含む、当該患者における免疫賦活化法に関する。
【００２１】
化合物(I)およびその塩の免疫賦活化作用によれば、化合物(I)は各種の感染症、免疫不全疾患、加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患、ウイルス関連腫瘍を予防または治療することができる。
【００２２】
化合物(I)およびその塩が予防または治療することができる感染症の具体例としては、寄生虫感染(例えば、トリパノソーマ原虫、マラリア原虫、およびトキソプラズマからなる群から選択される寄生虫による感染)、細菌感染(例えば、肺炎球菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、炭疽菌、コレラ菌、マイコプラズマ、およびピロリ菌(ヘリコバクターピロリ)からなる群から選択される細菌による感染)、ならびにウイルス感染(ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)、パピローマウイルス(HPV)、エプスタインバールウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、インフルエンザウイルス(FLU)、B型肝炎ウイルス(HBV)、ヘルペスウイルス、およびC型肝炎ウイルス(HCV)からなる群から選択されるウイルスによる感染)が挙げられる。本発明は、別の側面において、化合物(I)またはその塩を含む、免疫賦活化により感染症を予防または治療するための医薬組成物、および免疫賦活化により感染症を予防または治療するための化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、予防または治療を必要とする患者に投与することを含む、当該患者における感染症を免疫賦活化により予防または治療する方法に関する。
【００２３】
また、化合物(I)およびその塩が治療することができる免疫不全疾患の具体例としては、先天性免疫不全疾患および後天性免疫疾患、とりわけヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染による後天性免疫不全が挙げられる。従って、本発明は、別の側面において、化合物(I)またはその塩を含む、免疫賦活化により免疫不全疾患を治療するための医薬組成物、および免疫賦活化により免疫不全疾患を治療するための化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、当該患者における免疫不全疾患を免疫賦活化により治療する方法に関する。
【００２４】
また、化合物(I)およびその塩が予防又は治療できる加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患の具体例としては、肺炎が挙げられる。従って、本発明は、別の側面において、化合物(I)またはその塩を含む、免疫賦活化により加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患を予防または治療するための医薬組成物、および免疫賦活化により加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患を予防または治療するための化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、予防または治療を必要とする患者に投与することを含む、当該患者における加齢に伴う免疫機能減弱に起因する疾患を免疫賦活化により予防または治療する方法に関する。
【００２５】
また、化合物(I)およびその塩が予防または治療することができるウイルス関連腫瘍、すなわちウイルス感染によって発症する腫瘍の具体例としては、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌、成人Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、頭頸部がんが挙げられる。従って、本発明は、別の側面において、化合物(I)またはその塩を含む、免疫賦活化によりウイルス関連腫瘍を予防または治療するための医薬組成物、および免疫賦活化によりウイルス関連腫瘍を予防または治療するための化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、予防または治療を必要とする患者に投与することを含む、当該患者におけるウイルス関連腫瘍を免疫賦活化により予防または治療する方法に関する。
【００２６】
また、化合物(I)およびその塩の免疫賦活化作用によれば、免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の効果を増強することができる。免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の具体例としては、感染症予防ワクチン(例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳などの感染症予防ワクチン)、抗ウイルス剤(例えば、インフルエンザワクチン、B型肝炎ワクチン、インターフェロンα製剤、インターフェロンβ製剤、テラプレビル、リバビリン、シメプレビル、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素インヒビター(NRTI)(例えば、AZT(ジドブジン)、ddI(ジダノシン)、ddC(ザルシタビン)、d4T(スタブジン)、または3TC(ラミブジン))、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NNRTI)(例えば、ネビラピンまたはデラビルジン)、プロテアーゼインヒビター(サキナビル、リトナビル、インジナビル、またはネルフィナビル))、抗腫瘍免疫応答誘導剤(例えば、免疫賦活化作用を有するCD28様ファミリーのメンバーまたはCD28様ファミリーリガンドのメンバー等の調節剤、具体的には、プログラム細胞死-1(Programmed Death-1; PD-1)抑制剤、プログラム細胞死-L1(Programmed Death-Ligand 1; PD-L1)抑制剤、プログラム細胞死-L2(Programmed Death-Ligand 2; PD-L2)抑制剤、抗CTLA-4抑制剤、抗BTLA抑制剤、抗CD28調節剤、抗ICOS調節剤、抗ICOS-L調節剤、抗B7-1調節剤、抗B7-2調節剤、抗B7-H3調節剤、または抗B7-H4調節剤、より具体的には、抗PD-1抗体、PD-1ペプチド阻害剤、抗PD-1 RNAi、抗PD-1アンチセンスRNA、抗PD-L1抗体、PD-L1ペプチド阻害剤、抗PD-L1 RNAi、抗PD-L1アンチセンスRNA、抗PD-L2抗体、PD-L2ペプチド阻害剤、抗PD-L2 RNAi、抗PD-L2アンチセンスRNA、抗CTLA4抗体、中でも、抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体)、がんワクチン(例えば、シプロイセルT)が挙げられる。従って、本発明は、別の側面において、化合物(I)またはその塩を含む、免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の作用を増強するための医薬組成物、および免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬の作用を増強するための化合物(I)またはその塩、ならびに化合物(I)またはその塩の有効量を、免疫に作用することにより疾病を予防または治療する医薬と併用して患者に投与することを含む、当該医薬の作用の増強方法に関する。
【００２７】
本発明はまた、上記で挙げた免疫賦活化剤および医薬組成物の製造における、化合物(I)またはその塩の使用にも関する。
【００２８】
本発明の免疫賦活化剤および医薬組成物は、必要に応じて製薬上許容される希釈剤もしくは賦形剤、または補助剤を含有していてもよく、投与形態に適した剤型に製剤されていてもよい。剤型の具体例としては、経口剤(例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤など)、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤などが挙げられる。いずれの剤型も公知の製剤方法により製造することができる。本発明の免疫賦活化剤および医薬組成物は、投与が容易である経口剤であることが好ましい。補助剤の具体例としては、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤、矯味・矯臭剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤などの製剤添加物を含有していてもよい。
【００２９】
本発明の免疫賦活化剤および医薬組成物の投与量は、その投与目的、投与対象である患者の年齢、性別および体重、ならびに投与経路によっても異なるが、例えば体重50kgの成人の場合、化合物(I)またはその塩として、1日あたり0.05〜5000 mg、特に0.1〜1000 mgの範囲の投与量とすることが好ましい。投与頻度は、例えば2日に1回、1日1回、または1日あたり2〜3回とすることができる。
【００３０】
本発明に係る化合物(I)およびその塩は、後述する実施例により示されるように免疫賦活化作用を有し、ヒトおよび他の哺乳動物における生体機能の調節、保健強壮、自己由来の異物的成分または外来性の異物の排除機能の亢進に寄与する。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
(実施例1)抗CD3抗体および抗CD28抗体刺激マウス脾細胞における化合物(I)によるサイトカイン産生誘導
マウス脾臓を摘出し、フロストスライドグラスで破砕後、溶血処理を行い、脾細胞を調製した。これを完全培地(RPMI-1640、10% 熱不活性化FBS、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール)を用いて2×106 cells/mLに調製し、抗CD3抗体を終濃度3μg/mLとなるように、および抗CD28抗体を終濃度0.5μg/mLとなるようにそれぞれ添加し、さらに化合物(I)を各終濃度になるように添加した。この培養液を200μL/wellで96ウェルプレートへ播種後、37℃、5% CO2のインキュベーター内で2日間培養した。培地上清を回収し、そこに含まれるIL-2の濃度を、抗mIL-2抗体を用いたELISA法で測定した。
【００３３】
また、同様にして、抗CD3抗体の終濃度を可変とし、抗CD28抗体を終濃度0.5μg/mLとなるように添加し、さらに化合物(I)を終濃度0.0μMまたは0.1μMとなるように添加して培養し、培養上清中のIL-2濃度を測定した。
【００３４】
図1は、抗CD3抗体および抗CD28抗体の濃度を一定とし、化合物(I)の濃度を可変とした場合の、培養上清中のマウス脾細胞が産生したIL-2の濃度の推移を示したグラフである。グラフに示されるように、化合物(I)の添加量の増加に従ってマウス脾細胞が産生したIL-2の濃度が増加した。
【００３５】
図2は、抗CD3抗体の濃度を可変とし、抗CD28抗体の濃度を一定とした場合の、化合物(I)の添加の有無による、培養上清中のマウス脾細胞が産生したIL-2の濃度の差を示すグラフである。グラフに示されるように、化合物(I)を添加した場合では抗CD3抗体の刺激に伴ってIL-2産生が誘導されたが、化合物(I)を添加しない場合ではその誘導は弱かった。
【００３６】
これらの結果から、化合物(I)がマウス脾細胞においてIL-2産生の誘導を増強することが示され、化合物(I)が免疫賦活化作用を有することが示された。
【００３７】
(実施例2)ヒト末梢血単核球における化合物(I)によるサイトカイン産生誘導
ヒト末梢血単核球を、ヒト完全培地(RPMI-1640、10% 熱不活性化FBS、100 U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン)を用いて1×106cells/mLの細胞懸濁液に調製した。これにフィトヘマグルチニンM(PHA-M)を終濃度5μg/mLとなるように添加し、さらに化合物(I)またはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291を各終濃度になるように添加した。この培養液を200μL/wellで96ウェルプレートへ播種後、37℃、5% CO2のインキュベーター内で3日間培養した。培地上清を回収し、そこに含まれるIL-2濃度を、抗hIL-2抗体を用いたELISA法で測定した。
【００３８】
図3は、ヒト末梢血単核球細胞が産生した培養上清中のIL-2の濃度の推移を、化合物(I)を添加した場合およびAZD9291を添加した場合のそれぞれについて示したグラフである。グラフに示されるように、化合物(I)はヒト末梢血単核球細胞においてIL-2産生を誘導したのに対し、化合物(I)と同じEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291にはそのようなIL-2産生誘導作用はほとんどみられなかった。このことから、化合物(I)が免疫賦活化作用を有すること、およびその作用はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に共通するものではなく、化合物(I)に固有のものであることが示された。
【００３９】
(実施例3)混合リンパ球反応における化合物(I)によるT細胞の賦活化
混合リンパ球反応(Mixed Lymphocyte Reaction; MLR)は、例えばJ. Exp. Med. 127(5):879-90, 1968により知られているT細胞賦活化の代表的な実験手法である。この反応を用いて化合物(I)のT細胞賦活化への影響を検討した。
【００４０】
C57BL/6NマウスおよびBALB/cマウスからそれぞれ脾臓を摘出し、フロストスライドグラスで破砕後、溶血処理を行い、各脾細胞を調製した。調製したC57BL/6Nマウス脾細胞およびBALB/cマウス脾細胞を、完全培地(RPMI-1640、10% 熱不活性化FBS、100 U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール)を用いて調製した。BALB/cマウス脾細胞については30 GyのX線照射を行って増殖活性を失わせた。これら異系マウスの脾細胞を終濃度1×105 cells/wellずつ添加して混合し(Allogeneic; Alo)、さらに各濃度に調製した化合物(I)、またはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD09291もしくはエルロチニブを添加した。なお、対照として、C57BL/6Nマウス脾細胞同士を混合したもの(Syngeneic; Syn)も併せて用意した。これらの培養液を200 μL/wellで96ウェルプレートへ播種後、37℃、5% CO2のインキュベーター内で3日間培養した。培養開始2日目にトリチウム標識チミジン(3H-Thd)を添加した。取り込まれた3H-Thd量を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００４１】
図4は、混合リンパ球反応を誘導した際の3H-Thd取り込み量を、各化合物および濃度ごとに示したグラフである。取り込まれた3H-Thdの量は、混合リンパ球反応によって増殖したT細胞の指標となる。図4のグラフに示されるように、化合物(I)は、混合リンパ球反応により惹起されるC57BL/6Nマウス由来のT細胞の増殖を誘導した。一方、他のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤にはそのような活性はみられなかった。この結果から、化合物(I)が免疫賦活化作用を有すること、およびその作用はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に共通するものではなく、化合物(I)に固有のものであることが示された。
【００４２】
(実施例4)化合物(I)によるT細胞の増殖惹起
マウス脾臓を摘出し、フロストスライドグラスで破砕後、溶血処理を行い、脾細胞を調製した。これを5 mLの染色バッファー(0.5% BSA、2 mM EDTA、PBS(-))に懸濁し、5μM CFSE(5-カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル)で染色した。染色後、氷冷した完全培地(RPMI-1640)を用いて洗浄した。このようにCFSEで染色した脾細胞を、完全培地(RPMI-1640、10% 熱不活性化FBS、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール)を用いて1×106 cells/mLに調製し、抗CD3抗体1μg/mL、および抗CD28抗体1μg/mL添加し、さらに各濃度に調製した化合物(I)、またはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD09291、エルロチニブ、Co1686(ロシレチニブ)、イブルチニブ、スニチニブ、もしくはダサチニブを0.1μMの濃度で添加した。なお、対照としてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を加えないものも併せて用意した。これらの培養液を200μL/wellで96ウェルプレートへ播種後、37℃、5% CO2のインキュベーター内で3日間培養した。細胞を回収し、抗CD4抗体および抗CD8抗体を用いて染色し、CD4およびCD8のそれぞれが陽性である細胞のCFSE量をフローサイトメトリーにより解析した。図5にその解析結果を示す。
【００４３】
CFSEは、一旦細胞内に取り込まれた後は細胞内の量が一定となる性質を有する。従って、細胞分裂が生じると細胞当たりのCFSE量は半減するので、フローサイトメトリーによる解析では、細胞分裂が進行するほどCFSE染色強度が減弱し、グラフが左側(低値側)へシフトする。図5に示されるように、化合物(I)を添加したサンプルでは、CD4陽性細胞およびCD8陽性細胞のそれぞれの細胞あたりのCFSE量が減少しており、それらの細胞の増殖が増強したことを示していた。一方、他のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を添加したサンプルでは、そのような細胞増殖を増強する作用はみられなかった。なお、ダサニチブを添加した群では細胞死が誘導された。この結果から、化合物(I)が免疫賦活化作用を有すること、およびその作用は他のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に共通するものではなく、化合物(I)に固有のものであることが示された。
【００４４】
(実施例5)OVA発現マウス胸腺腫細胞株皮下移植モデルにおける末梢血免疫細胞解析
OVA発現マウス胸腺腫細胞株(EG.7-OVA)の細胞懸濁液を、PBS(-)および50% マトリゲルを用いて調製し、1x104cells/mouseで細胞株と同系のC57BL/6nマウス皮下に注射して移植した。移植後1日目に体重に基づいて群分けした後、化合物(I)を50 mg/kgで、または抗PD-1抗体を100μg/mouseで投与した。なお、対照としてそのいずれも投与しない群も併せて用意した。移植後14日目に末梢血を採取し、免疫細胞表面マーカーに対する抗体を用いてフローサイトメトリーによる解析を行い、全体に含まれるCD4陽性細胞、CD8陽性細胞、およびCD4およびCD8陰性かつNK1.1陽性の細胞の相対数を算出した。図6にその解析結果を示す。化合物(I)を投与した群では、いずれの細胞においても、対照群および抗PD-1抗体投与群と比較して細胞数が増加していた。この結果から、化合物(I)がin vivoにおいても免疫細胞サブセットの数を増加させる活性を有し、免疫賦活化作用を有することが示された。
【００４５】
(実施例6)マウス大腸癌細胞株皮下移植モデルにおける脾細胞中の免疫細胞解析
マウス大腸癌細胞株(colon26)の細胞懸濁液を、PBS(-)および50% マトリゲルを用いて調製し、2×103cells/mouseで細胞株と同系のBALB/cマウス皮下に注射して移植した。移植後1日目に体重に基づいて群分けした後、化合物(I)を50 mg/kgで、および/または抗PD-1抗体を100μg/mouseで投与した。なお、対照としてそのいずれも投与しない群も併せて用意した。移植後21日後に脾細胞を採取し、各種免疫細胞表面マーカーに対する抗体を用いてフローサイトメトリーによる解析を行った。
【００４６】
図7は、CD4陽性かつCD69陽性の細胞、およびCD4陽性かつCD44陽性かつCD62L陰性の細胞の相対数を算出した結果を示すグラフである。化合物(I)を投与した群では、対照群と比較して、CD4陽性かつCD69陽性細胞の割合、およびCD4陽性かつCD44陽性かつCD62L陰性細胞の割合が高かった。さらに、化合物(I)と抗PD-1抗体を併用した群では、その割合はより顕著に高かった。
【００４７】
図8は、CD4陽性細胞におけるCD44発現量、およびCD4陽性細胞におけるCD62L発現量を算出した結果を示すグラフである。CD44発現量とCD62L発現量は、それぞれの表面マーカーの平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity、MFI)で示す。化合物(I)を投与した群では、対照群と比較して、CD4陽性細胞におけるCD44の発現量が増加し、かつCD62Lの発現量が減少した。さらに、化合物(I)と抗PD-1抗体を併用した群では、それがより顕著であった。この結果から、化合物(I)の投与により、colon26を認識する脾細胞中のエフェクターメモリーT細胞数が増加したことが推察された。
【００４８】
以上の結果から、化合物(I)がin vivoにおいても免疫細胞の活性化を誘導し、免疫賦活化作用を有することが示された。
【００４９】
(実施例7)ヒト末梢血単核球における化合物(I)によるサイトカイン産生誘導
ヒト末梢血単核球を、ヒト完全培地(RPMI-1640、10% 熱不活性化FBS、100 U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン)を用いて1×105cells/mLの細胞懸濁液に調製した。これに化合物(I)またはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291もしくはエルロチニブ、あるいはサイトカインを誘導する陽性対照としてイミキモドを添加した。なお、対照としてEGFRチロシンキナーゼ阻害剤などを加えない無処置群も併せて用意した。この培養液を37℃、5% CO2のインキュベーター内で2日間培養した。培地上清を回収し、種々のサイトカインをBio-Plex Proヒトサイトカインアッセイキットを用いて測定した。
【００５０】
図9は、各化合物を添加した群の、無処置群に対する、サイトカイン濃度の相対比を示したグラフである。データから、化合物(I)が種々のサイトカイン産生を誘導しているのに対し、同じEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291もしくはエルロチニブではそのような誘導がみられなかったことがわかる。この結果から、化合物(I)がサイトカイン産生を誘導し、免疫賦活化作用を有すること、およびその作用はEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に共通するものではなく、化合物(I)に固有のものであることが示された。
【００５１】
(参考例1)in vitroモデルにおけるマウスメラノーマ細胞株およびマウス大腸がん細胞株の細胞増殖に対する化合物(I)の影響
マウスメラノーマ細胞株B16F10およびK1735M2ならびにマウス大腸がん細胞株MC38を3×103 cells/wellの濃度で96ウェルディッシュに播種した。24時間後、化合物(I)またはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブ、アファチニブ、AZD9291もしくはCo1686(ロシレチニブ)を所定の濃度に希釈して添加した。その後、3日間培養し、細胞数をCellTiter-Glo2.0(Promega、G9243)により計測した。化合物(I)は、いずれの細胞についても、その増殖を抑制しなかった。また、他のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤も同様に、いずれの細胞についてもその増殖を抑制しなかった。
【００５２】
(実施例8)in vivoモデルにおけるマウスメラノーマ細胞株の細胞増殖に対する化合物(I)の影響
マウスメラノーマ細胞株B16F10の細胞懸濁液をPBS(-)を用いて調製し、5×105cells/mouseの量でマウス尾部の静脈に注射した。このマウスモデルに対し、化合物(I)を12.5 mg/kgまたは50 mg/kgの用量で、B16F10移植の前日から経口投与した。移植14日目(投薬15日目)に肺転移結節数を評価した。図10にその結果を示す。化合物(I)投与群では非投与群に対して用量依存的に肺転移結節数の減少が認められた。この結果、および参考例1のin vitroモデルでは腫瘍増殖抑制効果が認められなかったとの結果から、この肺転移結節数の減少は化合物(I)の免疫賦活化作用によりもたらされたものと推察された。
【００５３】
(実施例9)in vivoモデルにおけるマウス大腸がん細胞株の細胞増殖に対する化合物(I)の影響
マウス大腸がん細胞株MC38の細胞懸濁液をPBS(-)および50%マトリゲルを用いて調製し、1×106 cells/mouseの量でマウス皮下に注射した。このマウスを、皮下の腫瘍容積の平均がおよそ50 mm3に達したときに群分けを行い、化合物(I)を50 mg/kgの用量で、または抗PD-1抗体を100μg/mouseの用量で投与し、経時的に腫瘍容積を測定した。腫瘍容積は、経皮的に測定した腫瘍の長径と短径から以下の式Aに従って算出した。
腫瘍容積(mm3)＝長径(mm)×短径(mm)2/2    …(式A)
【００５４】
図11に各群の腫瘍容積の経時変化を示す。化合物(I)投与群では非投与群と比較して腫瘍増殖の抑制が認められた。この結果、および参考例1のin vitroモデルでは腫瘍増殖抑制効果が認められなかったとの結果から、この腫瘍増殖の抑制は化合物(I)の免疫賦活化作用によりもたらされたものと推察された。
【００５５】
(実施例10)in vivoモデルにおける化合物(I)の抗腫瘍免疫応答誘導剤(抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体)の増強作用
マウスメラノーマ細胞株K1735M2の細胞懸濁液をPBS(-)および50%マトリゲルを用いて調製し、1×106 cells/mouseの量でマウス皮下に注射した。このマウスを、移植後1日目に体重を用いて群分けした後、化合物(I)を50 mg/kgの用量で、または抗PD-1抗体もしくは抗PD-L1抗体を100μg/mouseの用量で、それぞれ単独で、あるいは抗PD-1抗体と抗PD-L1抗体のいずれかと化合物(I)を組み合わせて投与し、経時的に腫瘍容積を測定した。腫瘍容積は、経皮的に測定した腫瘍の長径と短径から上記の式Aに従って算出した。
【００５６】
図12に、各個体の腫瘍容積の経時変化を示す。化合物(I)単独投与群および抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体単独投与群では十分な腫瘍増殖の抑制が認められなかった。一方、化合物(I)と抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体を併用した群では有意な腫瘍増殖の抑制が認められた。この結果から、化合物(I)が抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体の免疫賦活化作用を増強していることが示された。
【００５７】
(実施例11)in vivoモデルにおける化合物(I)のマウス大腸がん細胞株の細胞増殖に対する影響及び腫瘍部の免疫細胞への影響
マウス大腸がん細胞株MC38の細胞懸濁液をPBS(-)および50%マトリゲルを用いて調製し、1×106 cells/mouseの量でマウス皮下に注射した。このマウスを、皮下の腫瘍容積の平均がおよそ50 mm3に達したときに群分けを行い、化合物(I)を50 mg/kgの用量で、または抗PD-1抗体を50μg/mouseの用量で、それぞれ単独で、あるいは50 mg/kgの化合物(I)と50μg/mouseの抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、経時的に腫瘍容積を測定した。腫瘍容積は、経皮的に測定した腫瘍の長径と短径から以下の式Aに従って算出した。
腫瘍容積(mm3)＝長径(mm)×短径(mm)2/2    …(式A)
【００５８】
図13に各群の腫瘍容積の経時変化を示す。化合物(I)投与群では非投与群と比較して腫瘍増殖の抑制が認められた。この結果、および参考例1のin vitroモデルでは腫瘍増殖抑制効果が認められなかったとの結果から、この腫瘍増殖の抑制は化合物(I)の免疫賦活化作用によりもたらされたと思われる。また、化合物(I)が抗PD-1抗体の免疫賦活化作用を増強していることが示された。 
【００５９】
図14〜16に、化合物(I)投与の最終日における各群の腫瘍における免疫関連の遺伝子変動を示す。化合物(I)投与の最終日に各群の腫瘍をサンプリングし、cDNAを調製した。作製したcDNAから各種免疫関連遺伝子のプローブを用いてrealtimePCRで遺伝子発現確認を行い、その結果をプロットした。各プロットはβ-actinを対照とし、対照群の1例の値と比較したときの相対的な遺伝子発現割合を示す。化合物(I)投与群では非投与群と比較してCD3、CD4、CD8、NK1.1、IL-2、IFN-γ、Perforin、Granzyme BおよびCD69の遺伝子発現上昇が認められた。この結果から、化合物(I)は免疫賦活化作用により、腫瘍内に浸出する免疫細胞を増加させており、これが腫瘍増殖を抑制していると推察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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