(57)【要約】【課題】ＤＮＡ切断を起こさない抗癌剤を提供する。【解決手段】下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。）。    ［化１］2017075113.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤。
【化１】
2017075113.tif 000007
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項２】
ＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤である、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
Ａｋｔリン酸化抑制剤である、請求項１又は２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
ｐ５３安定化剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項５】
アポトーシス誘導化剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの合成及び修復にはトポイソメラーゼが必要である。トポイソメラーゼはＤＮＡのよじれを解消する酵素であり、ＤＮＡの一本鎖又は二本鎖を切断し、ＤＮＡの複製で生じるよじれを解消する。
【０００３】
トポイソメラーゼは、ＤＮＡの切断が一本鎖であるトポイソメラーゼＩと、ＤＮＡの切断が二本鎖であるトポイソメラーゼＩＩとに分類される。
【０００４】
トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼの活性を阻害する化合物である。トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡの切断段階でトポイソメラーゼの活性を阻害するＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤と、ＤＮＡ切断段階以外の段階でトポイソメラーゼの活性を阻害する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤とに分類される。
【０００５】
癌細胞は盛んにＤＮＡ合成を行っているため、トポイソメラーゼ阻害剤が抗癌剤として利用されている。ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ損傷監視機構（ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）により癌細胞のアポトーシスを誘導する。一方、酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡよじれ解消監視機構（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）により細胞分裂阻害を誘導する。現在、抗癌剤に用いられているトポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡ切断型である。
【０００６】
ところで、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールはトポイソメラーゼ阻害剤であり、ＤＮＡ切断を起こさないこと、ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞の細胞増殖をＧ２／Ｍ期で停止させたことが報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yasuaki Fukuda, et al., 3EZ, 20Ac-ingenol, a catalytic inhibitor of topoisomerases, downregulates p-Akt and induces DSBs and apoptosis of DT40 cells, Arch. Pharm. Res. (2013) 36:1029-1038
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤が抗癌剤として働く作用機構は、ＤＮＡ損傷により誘導される監視機構を利用したものであり、多くの副作用の原因となっている。
【０００９】
例えば、ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤処理により発生するＤＮＡ切断は、２〜３年後に二次癌を発生させる場合がある。
【００１０】
また、トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ合成が速い細胞にアポトーシスを誘導させる傾向にある。このため、増殖が速い正常な骨髄造血幹細胞、未分化細胞が減少し、骨髄抑制、白血球減少等が発生する場合がある。
【００１１】
また、心臓ではトポイソメラーゼＩＩ活性が高いことが知られている。このため、トポイソメラーゼＩＩを阻害するトポイソメラーゼ阻害剤を投与すると、心臓でアポトーシスを起こす細胞が多く発生し、心臓障害が発生する場合がある。
【００１２】
一方、従来の酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は、細胞増殖阻害活性が低く（ＩＣ５０＝５〜５０μＭ）、細胞周期停止後に多核細胞が発生する場合があり、また、これらの多核細胞が二次癌を発生させる場合がある。
【００１３】
本発明は、ＤＮＡ切断を起こさない抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の通りである。
［１］下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤。
【化１】
2017075113.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
［２］ＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ）／ＡＴＲ（Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ）活性化剤である、［１］に記載の抗癌剤。
［３］Ａｋｔリン酸化抑制剤である、［１］又は［２］に記載の抗癌剤。
［４］ｐ５３安定化剤である、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗癌剤。
［５］アポトーシス誘導化剤である、［１］〜［４］のいずれかに記載の抗癌剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＤＮＡ切断を起こさない抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実験例１の結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｅ）は、実験例２のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図３】実験例２のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図４】実験例３のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５】実験例４のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図６】実験例５のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図７】実験例６のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図８】実験例７のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】（ａ）〜（ｅ）は、実験例７のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図１０】実験例８の結果を示すグラフである。
【図１１】実験例９のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１２】実験例９のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１３】実験例９のＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【化２】
2017075113.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【００１８】
式（１）において、脂肪族基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、飽和していてもよく、不飽和であってもよく、置換されていてもよく、未置換であってもよい。また、脂肪族基の炭素数は、例えば１〜２０であってもよく、例えば１〜１６であってもよい。脂肪族基の置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、エーテル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基等が挙げられる。
【００１９】
式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒが脂肪族基であるものとしては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、２，３−ジメチルブタン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸等の炭素原子数１〜１６の飽和脂肪酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基；２，４−デカジエン酸等の炭素原子数１〜１６の不飽和脂肪酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００２０】
また、式（１）において、芳香族基及びヘテロ芳香族基は、置換されていてもよく、未置換であってもよい。また、芳香族基及びヘテロ芳香族基の炭素数は、例えば１〜８であってもよく、例えば１〜６であってもよい。芳香族基及びヘテロ芳香族基の置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、エーテル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基等が挙げられる。
【００２１】
式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒが芳香族基であるものとしては、安息香酸、フタル酸、サリチル酸、アントラニル酸等の芳香族カルボン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００２２】
また、式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒがヘテロ芳香族基であるものとしては、フランカルボン酸、チオフェンカルボン酸、ピリジンカルボン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸等のヘテロ芳香族カルボン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００２３】
上記式（１）で表される化合物は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９が水素原子であり、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１がメチル基であり、Ｒ１が下記式（２）若しくは（３）で表される基又は水素原子であり、Ｒ４がアセチル基であってもよい。下記式（２）及び（３）において、Ｒ１２は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。
【００２４】
【化３】
2017075113.tif 000004
【００２５】
上記式（１）で表される化合物は、下記式（４）で表される３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールであってもよく、下記式（５）で表される３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノールであってもよく、下記式（６）で表される２０Ａｃ−インゲノールであってもよい。
【００２６】
【化４】
2017075113.tif 000005
【００２７】
実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物は、癌細胞にアポトーシスを誘導する。また、０．０１μＭという低濃度においても急性白血病細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞の増殖を顕著に抑制する。
【００２８】
非特許文献１に記載されているように、上記式（１）で表される化合物は、ＤＮＡ切断を起こさない酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤である。したがって、長期間使用しても二次癌の発生を起こしにくい。現在までに、抗癌剤として有効な酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は知られていない。
【００２９】
また、従来のトポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ合成が速い細胞にアポトーシスを誘導させる傾向にあり、ヒト又は非ヒト動物に投与すると、増殖が速い正常な骨髄造血幹細胞、未分化細胞が減少し、骨髄抑制、白血球減少等が発生する場合がある。
【００３０】
これに対し、上記式（１）で表される化合物は、ＤＮＡ切断を起こさず、ＤＮＡよじれ解消監視機構を誘導するものと考えられる。そして、幹細胞、未分化細胞等ではＤＮＡよじれ解消監視機構が欠損していることが知られている。したがって、上記式（１）で表される化合物は、幹細胞、未分化細胞等のアポトーシスを誘導せず、ヒト又は非ヒト動物に投与しても、骨髄抑制、白血球減少が発生しないことが期待できる。
【００３１】
また、上記式（１）で表される化合物は、心臓で活性が高いトポイソメラーゼＩＩではなく、トポイソメラーゼＩを主な標的とすることから、ヒト又は非ヒト動物に投与した場合においても、心臓への副作用が少ないと考えられる。
【００３２】
以上のことから、本実施形態の抗癌剤は、副作用が少ない抗癌剤として有用である。本実施形態の抗癌剤が対象とする癌としては、ＰＩ３（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ）キナーゼ／Ａｋｔ経路が活性化し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化が上昇した（リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞内濃度が上昇した）癌、が挙げられ、より具体的には、白血病、リンパ腫、膵臓癌、脳腫瘍等が挙げられる。後述するように、例えば、白血病、リンパ腫、膵臓癌、脳腫瘍等において、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路が活性化し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化が上昇している場合があることが知られている。
【００３３】
本実施形態の抗癌剤は、上記式（１）で表される化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であってもよい。
【００３４】
医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
【００３５】
薬学的に許容される担体としては例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００３６】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤；等が挙げられる。
【００３７】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３８】
注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００３９】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００４０】
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
【００４１】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
【００４２】
［ＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤］
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含有するＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤（ＡＴＭ活性化剤又はＡＴＲ活性化剤）を提供する。
【００４３】
ＡＴＭ及びＡＴＲは、ＤＮＡ損傷を監視するセンサーであり、ＤＮＡ損傷応答経路の上流で働く因子である。
【００４４】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、０．５μＭ程度の低濃度で、細胞におけるＡＴＭ及びＡＴＲの発現を上方制御することを明らかにした。
【００４５】
したがって、上記式（１）で表される化合物は、ＡＴＭ又はＡＴＲの活性化剤であるということができる。ここで、活性化とは、ＡＴＭ又はＡＴＲの機能を上昇させることを表し、ＡＴＭ又はＡＴＲのリン酸化レベルを上昇させることであってもよく、ＡＴＭ又はＡＴＲのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を上昇させることであってもよい。
【００４６】
本実施形態のＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤は、細胞中のＡＴＭ又はＡＴＲを活性化させる新たな研究用試薬として有用である。また、後述する実施例において示すように、本実施形態のＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤は、細胞中のＡＴＭ又はＡＴＲとＰＴＥＮとを同時に活性化させる新たな研究用試薬としても有用である。本明細書において、研究用試薬は医薬としての使用を除外したものであってもよい。上記式（１）で表される化合物は、ＡＴＭ／ＡＴＲを活性化する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤であるといえる。現在までに、ＡＴＭ／ＡＴＲの発現を上方制御する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は知られていない。
【００４７】
本実施形態のＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤がＡＴＭ／ＡＴＲを活性化する対象とする細胞としては、ヒト又は非ヒト動物の細胞が挙げられる。より具体的には、例えば、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路が活性化した細胞が挙げられる。
【００４８】
ＰＴＥＮは、イノシトールリン脂質であるホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸の脱リン酸化反応を触媒する酵素である。初代白血病細胞では、ＰＴＥＮ遺伝子の変異はほとんど検出されないが、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路は活性化されている場合が多いことが知られている。
【００４９】
ここで、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路の活性化とは、ＰＩ３キナーゼによりイノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基がリン酸化され、Ａｋｔがリン酸化される経路が促進されることを意味する。Ａｋｔがリン酸化され活性化することにより、様々な細胞の生存、増殖を活性化するシグナルが伝達される。また、Ａｋｔの活性化により、ＭＤＭ２がリン酸化されて細胞質から核に移行し、ｐ５３の発現の低下、又はｐ５３の安定化作用の低下によりｐ５３の活動を抑制的に調整している場合がある。また、Ａｋｔの活性化により、Ｂａｄがリン酸化されアポトーシス誘導活性を阻害している場合がある。なお、ＰＩ３キナーゼ遺伝子及びＡｋｔ遺伝子は、膵臓癌を含む多くの種類の癌細胞で変異しており、それによりＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路が活性化している場合があることが知られている。
【００５０】
［Ａｋｔリン酸化抑制剤］
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含有するＡｋｔリン酸化抑制剤を提供する。
【００５１】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、０．５μＭ程度の低濃度で、細胞におけるリン酸化Ａｋｔの濃度を下方制御することを明らかにした。
【００５２】
したがって、上記式（１）で表される化合物は、Ａｋｔリン酸化抑制剤であるということができる。「Ａｋｔリン酸化抑制剤」は、「Ａｋｔ活性化抑制剤」、「Ａｋｔ不活性化剤」等といい換えることができる。ここで、Ａｋｔリン酸化を抑制するとは、ホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰＩＰ３）の脱リン酸化酵素の活性化を行うことであってもよいし、ＰＩ３キナーゼの活性を低下させることであってもよいし、リン酸化Ａｋｔの脱リン酸化を行うことであってもよいし、Ａｋｔのリン酸化を阻害することであってもよい。
【００５３】
本実施形態のＡｋｔリン酸化抑制剤は、細胞中のＡｋｔのリン酸化を抑制する新たな研究用試薬として有用である。また、後述する実施例において示すように、本実施形態のＡｋｔリン酸化抑制剤は、細胞中のＡＴＭ又はＡＴＲの活性化によりｐ５３を安定化する。また、ｐ５３の安定化によるフィードバックループによって、Ａｋｔのリン酸化も抑制されることが知られている。したがって、本実施形態のＡｋｔリン酸化抑制剤は、ＰＴＥＮの活性化によりＰＴＥＮの脱リン酸化活性依存的なＡｋｔのリン酸化の抑制と、ＰＴＥＮの脱リン酸化活性非依存的なｐ５３の安定化と、ＡＴＭ又はＡＴＲの活性化によるｐ５３の安定化と、ｐ５３の安定化によるＡｋｔのリン酸化の抑制とを同時に行う新たな研究用試薬としても有用である。
【００５４】
本実施形態のＰＴＥＮ活性化剤がＰＴＥＮを活性化する対象とする細胞としては、上述したＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤が対象とする細胞と同様のものが挙げられる。
【００５５】
［ｐ５３安定化剤］
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含有するｐ５３安定化剤を提供する。
【００５６】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、０．５μＭ程度の低濃度で細胞中のｐ５３を安定化し、ｐ５３の細胞内濃度を上昇させることを明らかにした。
【００５７】
したがって、上記式（１）で表される化合物は、ｐ５３安定化剤であるということができる。ここで、安定化とは、ｐ５３の細胞内濃度が上昇することを表し、ｐ５３のリン酸化レベル又はアセチル化レベルを上昇させることであってもよく、ｐ５３のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を上昇させることであってもよい。
【００５８】
本実施形態のｐ５３安定化剤は、細胞中のｐ５３を安定化させる新たな研究用試薬として有用である。
【００５９】
本実施形態のｐ５３安定化剤がｐ５３を安定化する対象とする細胞としては、上述したＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤が対象とする細胞と同様のものが挙げられる。
【００６０】
［アポトーシス誘導化剤］
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘導化剤（アポトーシス誘導剤）を提供する。
【００６１】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、アポトーシスの誘導を引き起こすことを明らかにした。
【００６２】
したがって、上記式（１）で表される化合物は、アポトーシス誘導化剤であるということができる。
【００６３】
本実施形態のアポトーシス誘導化剤がアポトーシスを誘導する対象とする細胞としては、上述したＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤が対象とする細胞と同様のものが挙げられる。
【００６４】
（その他の実施形態）
１実施形態において、本発明は、対象に上記式（１）で表される化合物を投与する工程を備える、癌の治療方法を提供する。
【００６５】
１実施形態において、本発明は、対象に上記式（１）で表される化合物を投与する工程を備える、対象の細胞におけるＡＴＭ／ＡＴＲを活性化する方法を提供する。
【００６６】
１実施形態において、本発明は、対象に上記式（１）で表される化合物を投与する工程を備える、対象の細胞におけるＡｋｔのリン酸化を抑制する方法を提供する。
【００６７】
１実施形態において、本発明は、対象に上記式（１）で表される化合物を投与する工程を備える、対象の細胞におけるｐ５３を安定化する方法を提供する。
【００６８】
１実施形態において、本発明は、対象に上記式（１）で表される化合物を投与する工程を備える、対象の細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００６９】
１実施形態において、本発明は、癌の治療のための上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００７０】
１実施形態において、本発明は、ＡＴＭ／ＡＴＲ活性化、Ａｋｔリン酸化の抑制、ｐ５３安定化又はアポトーシスの誘導のための上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００７１】
１実施形態において、本発明は、抗癌剤の製造のための上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００７２】
１実施形態において、本発明は、ＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤、Ａｋｔリン酸化抑制、ｐ５３安定化剤又はアポトーシス誘導化剤の製造のための上記式（１）で表される化合物を提供する。
【実施例】
【００７３】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００７４】
［実験例１］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＢＡＬＬ−１細胞の増殖を抑制した）
ヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞、不死化ヒトＢ細胞株であるＨＥＶ００１１細胞及び急性白血病細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞に、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを０．０１、０．１、０．５、１μＭの濃度で４８時間暴露した後、ＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。対照として薬剤に暴露しなかった各細胞を用いた。図１は結果を示すグラフである。
【００７５】
その結果、対照の細胞と比較して、ＢＡＬＬ−１細胞の顕著な増殖抑制が認められた。具体的には、０．０１μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下において、ＢＡＬＬ−１細胞の増殖は対照の約３０％に抑制された。一方、ＭＣＦ−７細胞及びＨＥＶ００１１細胞の増殖は、０．０１〜１μＭの濃度範囲において、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの影響をあまり受けなかった。
【００７６】
後述する実験例において示すように、ＢＡＬＬ−１細胞ではＡｋｔタンパク質のリン酸化が上昇しており、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞内濃度が高いことから、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールが有効に作用したものと考えられる。これに対し、ＭＣＦ−７細胞では、リン酸化Ａｋｔタンパク質の存在が検出されないことが報告されている。また、ＨＥＶ００１１細胞は、正常な不死化細胞である。
【００７７】
続いて、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールによる増殖抑制効果を、上記のＢＡＬＬ−１細胞、他の白血病細胞であるＴ細胞急性白血病細胞株ＴＫＧ０３７７細胞及び骨髄性白血病細胞株ＴＫＧ０２１０細胞の間で比較した。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを、これらの細胞に、０．５、１、５、１０、２０μＭの濃度で４８時間暴露した後、ＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。対照として薬剤に暴露しなかった各細胞を用いた。図１４は結果を示すグラフである。
【００７８】
その結果、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下において、ＢＡＬＬ−１細胞の増殖は対照の約４０％に抑制された。一方、ＴＫＧ０３７７細胞及びＴＫＧ０２１０細胞の増殖は、０．５〜２０μＭの濃度範囲において、対照の８０〜９０％の増殖であった。すなわち、これらの細胞は、ＢＡＬＬ−１細胞の顕著な増殖抑制と比較して３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの影響をあまり受けなかった。
【００７９】
［実験例２］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は細胞増殖をＳ期で停止させた）
ＢＡＬＬ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで処理し、６、１２、２４及び４８時間後にフローサイトメトリーを用いて細胞周期を解析した。図２（ａ）〜（ｅ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。なお、本解析においては生細胞にゲートをかけた。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、Ｓ期の細胞の割合が、６時間後で６８％に、１２時間後及び２４時間後で７５％に増加したことが明らかとなった。一方、対照の細胞では、Ｓ期の細胞の割合が５３％に留まっていた。この結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで処理により、ＢＡＬＬ−１細胞の細胞増殖がＳ期で停止したことを示す。
【００８０】
続いて、ＢＡＬＬ−１細胞を３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで処理し、Ｓ期で出現することが知られているサイクリンＡタンパク質の存在量の変化をウエスタンブロッティングにより検討した。
【００８１】
具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで処理し、３、６、１２、２４及び４８時間後に抗サイクリンＡ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングを行った。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【００８２】
その結果、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、サイクリンＡタンパク質の存在量が増加したことが明らかとなった。この結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＢＡＬＬ−１細胞の細胞増殖がＳ期で停止したことを更に補強するものである。
【００８３】
上述したように、非特許文献１には、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールがＤＴ４０細胞の細胞増殖をＧ２／Ｍ期で停止させたことが報告されている。これに対し、ＢＡＬＬ−１細胞ではＳ期停止が観察され、ＤＴ４０細胞とは全く異なる細胞増殖阻害が起こることが明らかとなった。
【００８４】
［実験例３］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＡＴＲ、ＡＴＭの発現を誘導し、ｐ５３タンパク質の細胞内濃度を上昇させた）
ＢＡＬＬ−１細胞に３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを投与し、ＤＮＡ損傷を監視するキナーゼが活性化されるか否かを検討した。具体的には、ＡＴＲ、ＡＴＭ及びｐ５３タンパク質を、抗ＡＴＲ抗体（サンタクルーズ社）、抗ＡＴＭ抗体（ミリポア社）、抗ｐ５３抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図４は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【００８５】
その結果、ＡＴＲタンパク質の発現は、３時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によりわずかに増加し、６〜１２時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により次第に増加した。
【００８６】
ＡＴＭタンパク質の発現レベルも、６時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により増加した。また、ｐ５３タンパク質の細胞内濃度も３時間及び６時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により上昇し、２４時間後まで更に増加した。一方、対照であるアクチンの発現量には変化が認められなかった。ｐ５３タンパク質の細胞内濃度の上昇は、ＡＴＭ／ＡＴＲによるリン酸化によりｐ５３が安定化されたことによるものと考えられた。
【００８７】
［実験例４］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＰＴＥＮタンパク質の発現を上方制御し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化を下方制御した）
癌抑制因子であるＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ依存性パスウェイを負に制御することが知られている。そこで、ＢＡＬＬ−１細胞に３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを投与し、ＰＴＥＮタンパク質の発現量の変化及びリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）の量の変化をウエスタンブロッティングにより検討した。抗体としては、抗ＰＴＥＮ抗体（サンタクルーズ社）及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３、セルシグナリングテクノロジー社）を用いた。また、ＢＡＬＬ−１細胞にＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤である１０−ヒドロキシカンプトテシンを投与した試料についても同様の検討を行った。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図５は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【００８８】
その結果、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで３時間処理すると、ＢＡＬＬ−１細胞中のＰＴＥＮタンパク質の発現レベルは、非処理の対照細胞と比較して明確に上昇した。そして、この上昇は４８時間後まで続いた。さらに、ＰＴＥＮタンパク質の時間依存的発現上昇はリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）レベルを３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理後３〜４８時間にかけて阻害した。
【００８９】
ＰＴＥＮタンパク質は、０．２μＭの１０−ヒドロキシカンプトテシン処理２４時間後のＢＡＬＬ−１細胞においても検出された。
【００９０】
したがって、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、ＰＴＥＮを活性化し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化を下方制御する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤であるといえる。現在までに、ＰＴＥＮを活性化し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化を下方制御する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は知られていない。
【００９１】
［実験例５］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はｐ２１タンパク質の発現を誘導した）
ｐ２１タンパク質は、転写因子であるｐ５３タンパク質のターゲットの１つである。そこで、ＢＡＬＬ−１細胞に３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを投与し、ｐ２１タンパク質の発現量の変化をウエスタンブロッティングにより検討した。抗体としては、抗ｐ２１抗体（サンタクルーズ社）を用いた。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図６は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【００９２】
その結果、ＢＡＬＬ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで１２時間処理すると、ｐ２１タンパク質の発現が誘導されることが明らかになった。
【００９３】
ｐ２１タンパク質の発現が誘導されたことは、ｐ５３タンパク質が活性化されていることを強く支持する。また、ｐ２１タンパク質は、ＤＮＡ合成を進行させるサイクリンＡ−ＣＤＫの阻害剤でもあるため、ｐ２１タンパク質の発現が誘導されたことは、Ｓ期停止を支持するものである。
【００９４】
［実験例６］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は、Ｈ２ＡＸタンパク質のリン酸化、Ｂａｘタンパク質の発現上昇、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現低下を誘導した）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は、ＤＮＡ損傷を起こさないことが明らかにされている。そこで、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＤＮＡ損傷応答を示すか否かについて検討した。
【００９５】
ＢＡＬＬ−１細胞に３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを投与し、Ｈ２ＡＸタンパク質のリン酸化並びにＢａｘタンパク質及びＢｃｌ−２タンパク質の発現量の変化をウエスタンブロッティングにより検討した。抗体としては、抗リン酸化Ｈ２ＡＸ抗体（γＨ２ＡＸ抗体、Ｓｅｒ１３９、ミリポア社）、抗Ｂａｘ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）、抗Ｂｃｌ−２抗体（サンタクルーズ社）を用いた。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図７は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【００９６】
その結果、ＢＡＬＬ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで１２時間処理すると、Ｈ２ＡＸタンパク質のリン酸化が誘導されることが明らかになった。この結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＤＮＡ損傷応答に類似した応答を誘導することを示す。
【００９７】
ところで、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）によりトポイソメラーゼ１−ＤＮＡ複合体が形成され、カスパーゼにより二次的にＤＮＡ損傷が発生することが知られている。
【００９８】
また、発明者らは、３ＥＺ，２０Ａｃインゲノールによる細胞増殖阻害が、カスパーゼの阻害で抑制されることを見出した。
【００９９】
以上のことから、上記のＤＮＡ損傷応答に類似した応答は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールによる直接的なトポイソメラーゼ損傷効果だけでなく、ＲＯＳの発生により誘導される、ＤＮＡ損傷応答に類似した二次的なＤＮＡ損傷に由来するものであってもよい。
【０１００】
また、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比は、アポトーシス誘導及びアポトーシス抑制のバランスを決定することが知られている。図７に示すように、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで２４時間処理すると、Ｂａｘタンパク質の発現上昇を誘導することが明らかとなった。また、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで１２時間処理すると、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現低下を誘導することが明らかとなった。以上の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるＢＡＬＬ−１細胞のアポトーシスの誘導は、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比の顕著な低下と関連していることが明らかとなった。
【０１０１】
［実験例７］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は、カスパーゼ３の活性化を誘導し、サブＧ１期の細胞集団を増加させた）
ＢＡＬＬ−１細胞を３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理することにより誘導されるアポトーシスに、カスパーゼ３が関連しているか否かを検討するために、切断されたカスパーゼ３に特異的な抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いたウエスタンブロッティングを行った。また、対照として抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。図８は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【０１０２】
その結果、０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで１２時間処理すると、カスパーゼ３が活性化し、２４時間後には更に活性化が進むことが明らかとなった。
【０１０３】
上述したＢｃｌ−２／Ｂａｘ比の低下と合わせて、この結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理したＢＡＬＬ−１細胞では、カスパーゼに媒介されるアポトーシスが生じることを示す。
【０１０４】
続いて、フローサイトメトリー解析により、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理したＢＡＬＬ−１細胞のアポトーシスを検討した。図９（ａ）〜（ｅ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【０１０５】
その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理の２４時間後に約１６％の細胞にアポトーシスが認められ、４８時間後にその割合は顕著に上昇し、約３３％の細胞がアポトーシスを起こしたサブＧ１期にあることが明らかとなった。一方、対照である未処理のＢＡＬＬ−１細胞では、サブＧ１期の細胞の割合は約４．８％しか存在しなかった。
【０１０６】
以上の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、ＤＮＡのよじれ解消の阻害からの情報伝達によりアポトーシスの誘導を引き起こすことが明らかとなった。このような化合物は現在までに知られていない。したがって、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、ＤＮＡのよじれ解消の阻害からアポトーシスの誘導を引き起こす情報伝達経路を解析する研究試薬として非常に有用であると考えられる。
【０１０７】
［実験例８］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールに類似する化合物の検討）
ＢＡＬＬ−１細胞に、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール、３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノール、２０Ａｃ−インゲノール及びインゲノールを０．０１、０．０５、０．１、０．５、１μＭの濃度で４８時間暴露した後、ＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。対照として薬剤に暴露しなかった細胞を用いた。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール、３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノール、２０Ａｃ−インゲノールの化学式は上述した通りである。下記式（７）にインゲノールの化学式を示す。
【０１０８】
【化５】
2017075113.tif 000006
【０１０９】
図１０は結果を示すグラフである。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール及び３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下において、ＢＡＬＬ−１細胞の顕著な増殖抑制が認められた。また、２０Ａｃ−インゲノールの存在下においても、ＢＡＬＬ−１細胞の増殖抑制が認められた。一方、インゲノールはＢＡＬＬ−１細胞の増殖にあまり影響を及ぼさなかった。
【０１１０】
［実験例９］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は、ＡＴＲタンパク質を高発現することにより細胞増殖を抑制した）
ＢＡＬＬ−１細胞を３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理し、ＡＴＲの発現量の変化について検討した。具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞の培地に０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを添加し、１２、２４、４８時間後のＡＴＲタンパク質を抗ＡＴＲ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。対照には、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理していないＢＡＬＬ−１細胞を用いた。
【０１１１】
図１１は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＡＴＲタンパク質の発現量が増加することが明らかとなった。
【０１１２】
続いて、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを用いてＡＴＲの発現をノックダウンし、同様の実験を行った。具体的には、まず、ＢＡＬＬ−１細胞の培地にＡＴＲに対するｓｉＲＮＡ（商品名「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＡＴＲｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を終濃度５０ｎＭとなるように添加し４８時間培養した。その後、培地に０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを添加し、１２、２４、４８時間培養後の細胞中のＡＴＲタンパク質を、抗ＡＴＲ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。対照としては、ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ（商品名「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を終濃度５０ｎＭとなるように培地に添加して４８時間培養したＢＡＬＬ−１細胞を用いた。
【０１１３】
図１２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＡＴＲをノックダウンすると、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行っても、時間の経過と共に、ＡＴＲタンパク質の発現量が減少することが示された。
【０１１４】
続いて、ＡＴＲのノックダウン及び３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理が、ＢＡＬＬ−１細胞の増殖に及ぼす影響について検討した。具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞を、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡの存在下又は非存在下で４８時間培養後、培地に０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを添加し、更に４８時間培養した。続いて、ＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を測定した。対照には、ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ（商品名「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を終濃度５０ｎＭとなるように培地に添加して４８時間培養後、更に４８時間培養したＢＡＬＬ−１細胞を用いた。
【０１１５】
図１３は、結果を示すグラフである。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理したＢＡＬＬ−１細胞の増殖率は対照の５６％に低下した。一方、ＡＴＲをノックダウンしたうえで３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理したＢＡＬＬ−１細胞の増殖率は対照の７７％であった。この結果は、ＡＴＲのノックダウンにより、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理による増殖抑制効果が一部阻害されたことを示す。
【０１１６】
以上の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は、ＡＴＲタンパク質を高発現することにより細胞増殖を抑制することが明らかとなった。この結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理が、ＰＴＥＮやリン酸化Ａｋｔとは独立した抗癌作用も有することを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、ＤＮＡ切断を起こさない抗癌剤を提供することができる。また、ＤＮＡ切断を起こさない、ＡＴＭ／ＡＴＲ活性化剤、Ａｋｔリン酸化抑制剤、ｐ５３安定化剤及びアポトーシス誘導化剤を提供することができる。
【図９】
2017075113.tif 000009
【図１０】
2017075113.tif 000010
【図１３】
2017075113.tif 000011
【図１４】
2017075113.tif 000012
【図１】
2017075113.tif 000013
【図２】
2017075113.tif 000014
【図３】
2017075113.tif 000015
【図４】
2017075113.tif 000016
【図５】
2017075113.tif 000017
【図６】
2017075113.tif 000018
【図７】
2017075113.tif 000019
【図８】
2017075113.tif 000020
【図１１】
2017075113.tif 000021
【図１２】
2017075113.tif 000022