(57)【要約】      （修正有）【課題】歯周病及び齲蝕（虫歯）のリスクを簡便な方法で同時に判定する方法の提供。【解決手段】被験者の唾液等の口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法。好ましくは、検出の対象となる１種類又は２種類以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ、総量指標プローブ、及び、１種類又は複数種類の絶対量指標プローブとを搭載したＤＮＡチップを用いて細菌数を測定する判定方法。前記細菌が歯周病のリスクに対し、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ  ｃｏｍｉｔａｎｓ及び齲蝕のリスクに対しては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓである判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法。
【請求項２】
ＤＮＡチップを用いて、口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法。
【請求項３】
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌うちの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．５％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａのうち少なくとも１種類である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．０１％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を、歯周病のリスクが「中リスク」、
総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．００１％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．００１％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．０５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総菌数に対して２．５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総連鎖球菌数に対して０．１％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総連鎖球菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総連鎖球菌数に対して５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
口腔内試料を被験者から採取する工程、
採取した口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌のＤＮＡを得る工程、
得られた細菌のＤＮＡを、ＤＮＡチップに搭載したプローブとハイブリダイゼーションさせる工程、
ＤＮＡチップ中のサンプルが発する蛍光強度から、細菌の菌数を算出する工程、
を含む、 請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
口腔内試料が被験者の唾液である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡチップが、以下の、プローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したものである、
請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
（ａ）検出の対象となる１種類又は２種類以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【請求項１２】
プローブ（ｂ）が前記１種類又は２種類以上の細菌が共通に有する塩基配列を含むものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プローブ（ｃ）が人工配列の外部添加コントロールＤＮＡを補足する塩基配列を含むものである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌うち少なくとも１種である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａのうち少なくとも１種である、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
プローブ（ａ）が、以下のいずれかの配列である、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
（ア）配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列
（イ）（ア）の相補配列
（ウ）（ア）又は（イ）の配列と実質的に同一の配列
【請求項１７】
ＤＮＡチップが繊維型マイクロアレイである、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
を含む検出対象菌種の菌数を算定する方法を用いる、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病及び齲蝕のリスクの判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口内の２大疾患である歯周病及び齲蝕（虫歯）は、複数の細菌が関与する細菌感染症である。
歯周病は原因細菌（細菌因子）、免疫（宿主因子）、生活習慣が関与して進行する多因子疾患であるが、発症には、必ず歯周病原性細菌が関与する。
特に、歯周病原性細菌としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，  Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ，  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ，  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ，  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ，  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ等が報告されている。このうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，  Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ，  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３菌は、”Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ”と呼ばれ、慢性歯周炎の原因菌として重要視されている。その他、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓは侵襲性歯周炎の原因菌として、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは思春期性あるいは妊娠性歯周炎の原因菌として報告されている（非特許文献１及び２）。
【０００３】
歯周病の細菌検査として、歯垢あるいは唾液中の”Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ”の３種類の細菌を合計した値とリスクの関連が報告されている。具体的には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種の細菌数の合計が、総菌数に対して０．５％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．５％以上５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して０．５％以上の場合を、「高リスク」であると判定する（非特許文献３）。
【０００４】
より詳細には、歯垢検体に対し、細菌培養検査を行い、歯周疾患のリスク判定を1菌種ごとに判定する報告もある。Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓが０％の場合に「低リスク」、０．０１％未満の場合に「中リスク」、０．０１％以上の場合に「高リスク」と判定する。また、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが０％の場合に「低リスク」、０．５％未満の場合に「中リスク」、０．５％以上の場合に「高リスク」と判定する。また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａが０％の場合に「低リスク」、０．５％未満の場合に「中リスク」、０．５％以上の場合に「高リスク」と判定する。その他の病原性菌が５％未満の場合に「低リスク」、５％以上の場合に「高リスク」と判定する。それぞれの細菌の存在によるリスクは他の細菌とは独立していると考えられ、２種もしくはそれ以上の菌種が同時に存在した場合、歯周組織破壊のリスクは高くなる（非特許文献４）。
【０００５】
齲蝕は、原因細菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓが知られており、この原因細菌が糖類を代謝することにより乳酸を産生し、この結果、口内環境が酸性になり、エナメル質の脱灰が起こることが知られている。
齲蝕の細菌検査としては、ミュータンス連鎖球菌群と乳酸杆菌を培養して検査するキットが市販されており、診断の一つの材料として利用されている。培養した結果から、目視で、およそのコロニー数として判定する。
【０００６】
培養評価では、１０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス１」、１０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上５０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス２」、５０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上１００００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス３」、１００００００ＣＦＵ／ｍＬ以上で「クラス４」と分類されている。
歯周病または齲蝕の原因菌の細菌検査法としては、顕微鏡による観察法、培養法、酵素活性法、免疫学的手法、ＤＮＡプローブ法、ＰＣＲ法、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ法がある。
【０００７】
歯周病または齲蝕のどちらか一項目に関連し、細菌数を算出する方法はこれまでにも多く報告されている。たとえば、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、唾液中におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ及び／又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓの菌体数を検出する方法が挙げられる（特許文献１）。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の比率を算出するなどがあげられる（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２５２８１２号
【特許文献２】特開２００８−２０６５１６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ３７，  １４２６−３０，  １９９９
【非特許文献２】細菌検査を用いた歯周治療のコンセプト  医学情報社
【非特許文献３】歯周疾患者における抗菌療法の診療ガイドライン  日本歯周病学会編集
【非特許文献４】Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおける細菌検査法、歯界展望
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これまで、歯周病になるリスクと齲蝕になるリスクを同時に判定できる方法はなかった。従って、患者がそれらのリスクを知りたい場合には、歯周病又は齲蝕を別々に診断又は検査するしかなかったため、患者にとっては負担であった。
そこで本発明は、簡便な方法で、歯周病及び齲蝕両方のリスクを同時に判定することができる方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌数の割合又は口腔内試料中に存在する特定の細菌数を求めることにより、歯周病及び齲蝕両方のリスクを同時に判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１２】
（１）口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法。
（２）ＤＮＡチップを用いて、口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法。
（３）口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌うちの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．５％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、（１）又は（２）記載の方法。
【００１３】
（４）細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａのうち少なくとも１種類である、（３）記載の方法。
【００１４】
（５）口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．０１％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を、歯周病のリスクが「中リスク」、
総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．００１％未満の場合を、歯周病のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．００１％以上の場合を、歯周病のリスクが「高リスク」
であると判定する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（７）口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．０５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総菌数に対して２．５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する、（１）又は（２）記載の方法。
（８）口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総連鎖球菌数に対して０．１％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総連鎖球菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総連鎖球菌数に対して５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する、（１）又は（２）記載の方法。
（９）口腔内試料を被験者から採取する工程、
採取した口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌のＤＮＡを得る工程、
得られた細菌のＤＮＡを、ＤＮＡチップに搭載したプローブとハイブリダイゼーションさせる工程、
ＤＮＡチップ中のサンプルが発する蛍光強度から、細菌の菌数を算出する工程、
を含む、（２）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（１０）口腔内試料が被験者の唾液である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ＤＮＡチップが、以下の、プローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したものである、（２）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（ａ）検出の対象となる１種類又は２種類以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
（１２）プローブ（ｂ）が前記１種類又は２種類以上の細菌が共通に有する塩基配列を含むものである、（１１）に記載の方法。
（１３）プローブ（ｃ）が人工配列の外部添加コントロールＤＮＡを補足する塩基配列を含むものである、（１１）又は（１２）に記載の方法。
【００１７】
（１４）細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌うち少なくとも１種である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（１５）細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａのうち少なくとも１種である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１６）プローブ（ａ）が、以下のいずれかの配列である、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（ア）配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列
（イ）（ア）の相補配列
（ウ）（ア）又は（イ）の配列と実質的に同一の配列
（１７）ＤＮＡチップが繊維型マイクロアレイである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１８）（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
を含む検出対象菌種の菌数を算定する方法を用いる、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、簡便な方法で歯周病及び齲蝕のリスクを同時に判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法は、口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び齲蝕のリスクを判定する方法である。
本明細書において、ＤＮＡチップを用いて口腔内試料中の細菌の菌数を測定する方法を中心に述べるが、ＤＮＡチップを用いる方法以外の方法、例えば、インベーダー法、リアルタイムＰＣＲ法、インベーダーＰＣＲ法等によって口腔内試料中の細菌の菌数を測定することもできる。
【００２３】
１．歯周病及び齲蝕のリスクの判定方法
（１）口腔内試料を被験者から採取する工程
本発明において、測定の対象とする口腔内試料としては、唾液、歯垢等が挙げられるが、唾液が好ましい。唾液は採取する際に非侵襲性で体に負担がなく、またさらに採取方法が容易であれば、年齢に関係なく、子供、成人及び老人のいずれにも利用しやすいからである。
口腔内試料として唾液を使用する場合、唾液を採取する方法は特には限定されず、例えば、容器に直接唾液を流し込む方法、あるいは綿棒やその他紙状のものに唾液をしみこませる方法等が挙げられる。唾液採取を容易にするために、採取前にガムをかんでも良い。
【００２４】
採取した試料を輸送する場合は、採取した試料を密閉容器に入れて凍結させ輸送する方法や、ケース付き綿棒を用いて綿棒で試料を採取しケースに収納して輸送する方法が好ましい。
採取する唾液の量は特には限定されず、口腔内試料に存在する細菌のＤＮＡを検出する方法に応じて適宜選択することができる。例えば、ＤＮＡチップを用いて試料中の遺伝子を検出する場合は、被験者の唾液であれば０．１ｍＬ以上が好ましく、０．５ｍＬ以上がより好ましい。
【００２５】
口腔内試料として歯垢を使用する場合、歯垢を採取する方法は特には限定されず、例えば、ブラッシング、綿棒による歯面擦過、ペーパーポイント法等が挙げられる。得られた歯垢は、必要に応じて液体に溶解又は懸濁すればよい。採取する歯垢の量は特には限定されず、例えば、ペーパーポイント１本分あれば良い。
【００２６】
（２）採取した口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌のＤＮＡを得る工程
被験者から採取した唾液から、細菌のＤＮＡを抽出する。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販のＤＮＡ抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼＫ処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法、簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。
得られたＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲにて、細菌およびコントロールＤＮＡを増幅する。反応液組成の例としては、増幅コントロールＤＮＡをおよそ０．５ｐｇ以下、プライマー４種類をそれぞれ０．２μＭ、ＥｘＴａｑ、試料をおよそ１０ｐｇ以下、総液量２０μＬが挙げられる。この時、プライマーの片末端にＣｙ−５等の色素を付与することにより、標識されたＤＮＡを得ることができる。
本工程では、唾液から（細菌のＤＮＡを抽出する工程を経ずに）細菌およびコントロールＤＮＡを増幅させることも可能である。
【００２７】
（３）得られた細菌のＤＮＡを、ＤＮＡチップに搭載したプローブとハイブリダイゼーションさせる工程
標識されたＤＮＡサンプルとＤＮＡチップ（オーラルケアチップともいう）をハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションは、エアインキュベーターを利用しても良い。あるいは、自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン製）を利用しても良い。反応条件の例としては、５０℃、２時間が挙げられる。
検出には、例えばＧｅｎｏｐａｌ  Ｒｅａｄｅｒ（三菱レイヨン製）を用いることができる。装置取扱い説明書に従って以下の露光時間を４０秒、４秒、１秒、０．１秒の各条件にてＤＮＡマイクロアレイの撮像を行い、検出された蛍光シグナル強度を得る。細菌のＤＮＡ量に応じた、蛍光シグナル強度を得ることが出来る。
【００２８】
（４）細菌の菌数の算出
プローブが搭載されていない複数のスポットの平均値をバックグラウンド値とする。プローブが搭載されているシグナル強度の数値から、バックグラウンド値を減算し、正味シグナル値を算出する。続いて、コントロールＤＮＡのシグナル値を利用して、異なるチップ間のシグナル強度を補正する。
あらかじめ取得しておいたシグナル強度から各細菌のＰＣＲテンプレート濃度を算出する式を利用して、細菌の菌数を計算する。
【００２９】
（５）歯周病及び齲蝕のリスクの判定
（５−１）歯周病のリスク判定
（５−１−１）判定基準１
口腔内試料中として唾液中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌のうちの少なくとも１種の細菌の菌数が総菌数に対して、０．５％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．５％以上の場合を「高リスク」であると判定する。
【００３０】
それぞれの細菌の存在によるリスクは他の細菌とは独立していると考えられ、２種もしくはそれ以上の菌種が同時に存在した場合、歯周組織破壊のリスクは高くなる。
これは、歯肉縁下プラークにおける歯垢検体に対し、細菌培養検査を行い、歯周疾患の再発の予測に関する研究結果をもとにした（非特許文献２及び４）。唾液検体の場合は、基準値を歯垢の場合の１０分の１とする。
すなわち、口腔内試料として歯垢検体を用いる場合は、上述した細菌のうちの少なくとも１種の細菌の菌数が総菌数に対して、５％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して５％以上の場合を「高リスク」であると判定する。
【００３１】
（５−１−２）判定基準２
口腔内試料中として唾液中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、総菌数に対して０．０１％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．０１％以上０．５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して０．５％以上の場合を、「高リスク」であると判定する。
口腔内試料として歯垢を用いる場合は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、総菌数に対して０．１％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して５％以上の場合を、「高リスク」であると判定する。
【００３２】
これは、歯周病の細菌検査として、歯垢あるいは唾液中の”Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ”の３種類の細菌を合計した値を用いて、歯周病のリスクを４段階に分類する報告をもとにした。３種類の細菌数を基準にしており、複数の臨床研究報告および総説からまとめた参考値で、日本歯周病学会のガイドラインとされており、十分根拠のある値と考えられる。唾液の場合を想定し、基準値を歯垢の場合の１０分の１とした。４段階の分類のうち、中央の２段階をひとつにし、検査を受ける者が分かりやすいよう、３段階に分類した（非特許文献３）。
【００３３】
（５−１−３）判定基準３
口腔内試料として唾液中に含まれる細菌のうち、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓが、総菌数に対して０．００１％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．００１％以上の場合を「高リスク」であると判定する。
これは、歯肉縁下プラークにおける歯垢検体に対し、細菌培養検査を行い、歯周疾患の再発の予測に関する研究結果をもとにした（非特許文献２及び４）。唾液検体の場合は、基準値を歯垢の場合の１０分の１とする。
従って、口腔内試料として歯垢を使用する場合は、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓが、総菌数に対して０．０１％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．０１％以上の場合を「高リスク」であると判定する。
【００３４】
（５−２）齲蝕のリスク判定
（５−２−１）判定基準４
口腔内試料中に含まれる菌数が、総菌数のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が１％未満の場合を「低リスク」、総菌数のうち、連鎖球菌の数が１％以上５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して５％以上の場合を「高リスク」であると判定する。
【００３５】
（５−２−２）判定基準５
また、口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．０５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総菌数に対して２．５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する。
（５−２−３）判定基準６
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総連鎖球菌数に対して０．１％未満の場合を、齲蝕のリスクが「低リスク」、
総連鎖球菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を、齲蝕のリスクが「中リスク」、
総連鎖球菌数に対して５％以上の場合を、齲蝕のリスクが「高リスク」
であると判定する。
【００３６】
この判定基準は、例えば、Ｉｖｏｃｌａｒ  ｖｉｖａｄｅｎｔ社製カリエスリスクテスト等のキットを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの培養評価の齲蝕リスク４段階判定（Ｊ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｄｅｎｔ．２０００，２，４−１７）に基づいて定めた。
この培養評価は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓを培養して生じたコロニーを目視で判定した結果が、
１０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス０」、
１０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上５０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス１」、
５０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上１００００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス２」、
１００００００ＣＦＵ／ｍＬ以上で「クラス３」、
と分類するものである。
ＣＦＵとは培養時にコロニー形成する単位であり、およそ１ＣＦＵは１００ゲノムコピーであることが知られている。また、ヒトのだ液１ｍＬ中にはおよそ１０００００００００ゲノムコピーの細菌が含まれている。
従って、この数値に基づいて、「クラス０」の場合を本明細書では「低リスク」、「クラス１」の場合を本明細書では「中リスク」、「クラス３及び４」の場合を本明細書では「高リスク」とする上記の基準を設定した。
【００３７】
培養評価では、
１０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス１」、
１０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上５０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス２」、
５０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上１００００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス３」、
１００００００ＣＦＵ／ｍＬ以上で「クラス４」、
と分類されており、目視で判定する内容であった。
ＣＦＵとは培養時にコロニー形成する単位であり、およそ１ＣＦＵは１００ゲノムコピーであることが知られている。また、ヒトのだ液１ｍＬ中にはおよそ１０００００００００ゲノムコピーの細菌が含まれている。これらの数値を利用して、上記の基準を設定した。
【００３８】
（６）その他
本発明により得られた歯周病及びは齲蝕のリスク判定は、あくまでリスクの判定であり、正確な病態を表すものではない。すなわち、正確な病態の診断は歯科医による診断が必要である。
しかし、本発明によれば、歯周病及び齲蝕のリスクを簡便に判定することができるため、歯周病や齲蝕の早期発見・早期治療が可能になると共に、これらの予防も可能となる。
【００３９】
２．ＤＮＡチップ
本発明において、検出対象菌種の細菌の菌数（以下、「絶対量」ということがある。）を推定する方法（絶対量推定方法）は、以下の工程を含む。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
【００４０】
ここで本発明の絶対量推定方法に使用することができるデバイスは、
以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したデバイスである。
（ａ）検出の対象となる複数種類の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【００４１】
（イ）デバイス
プローブが独立にかつ位置を特定できるように固定化されているアレイタイプのデバイスであればどのような種類のデバイスであっても使用可能である。アレイのタイプも特に限定されないが、後述の総量指標プローブでのシグナルを安定的に取得する目的からすると、単に平面基板上にプローブを固定化しているものよりも、プローブ固定化量の多いアレイが適している。このようなアレイとしては、ＤＮＡマイクロアレイ好ましい。特に、ゲルを介して三次元的にプローブを固定化する繊維型ＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。
デバイスについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  ７６７−７７３（１９９１）等参照）。
【００４２】
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、オリゴヌクレオチドプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるデバイスが好ましく例示できる。このデバイスは、貫通孔基板にオリゴヌクレオチドプローブを固定化したタイプのものと説明することができる（特許第３５１０８８２号公報等を参照、図１）。
支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。
【００４３】
（ロ）プローブ
本明細書では、細菌由来の核酸をハイブリダイゼーション反応により捕捉し、捕捉された核酸を蛍光や化学発光、着色、ＲＩ等で測定し、細菌の有無を判別することや量を測定することを検出と呼ぶ。
プローブは検出対象となる細菌の持つ核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉するものであり、当該捕捉対象核酸に特異的な配列の相補配列から構成されるオリゴＤＮＡが用いられることが多いが、捕捉対象核酸に特異的な配列とハイブリダイゼーションするものであれば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＰＮＡやＬＮＡなどを含んでいてもよい。用途に応じてｃＤＮＡを固定化する場合もある。
【００４４】
一般的に多種類のプローブを一括搭載しているデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を使用する場合、多種類のプローブを同一条件下でハイブリダイゼーション反応に供するため、プローブ間のハイブリダイゼーション効率を揃えることが重要となる。このような目的のため、プローブは設計時にＧＣ含量や配列長を調整し、Ｔｍ値を可能な範囲で一定に揃える必要がある。デバイスに搭載されるプローブの種類や数は特に限定されない。
細菌特異的プローブ（前記プローブ（ａ））は、鋳型となる塩基配列又はプローブの塩基配列中に、細菌の種類によって特異的な塩基配列を含むものである。
デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に対してサンプルをハイブリダイゼーションさせる際、多くの場合は検出感度を向上させ、検出可能な標識を付加するために、ＰＣＲやＬＡＭＰ法などの核酸増幅手法を適用する。増幅反応においては、後の工程におけるデバイスとのハイブリダイゼーションに必要な範囲を増幅させることが重要であり、ハイブリダイゼーションに必要でない部分は試薬コスト等の観点からなるべく増幅させないことが望ましい。
【００４５】
上述のＰＣＲ法では、プライマー対で挟まれた範囲のみを増幅するため、ハイブリダイゼーションに不必要な配列を除外した上で増幅反応を行うのに適している。ここで「対」とは、増幅反応に最低限必要なプライマーのセットであり、その種類は増幅反応の方法によって異なる場合がある。一般的なＰＣＲの場合は、プライマー対はフォワードプライマーとリバースプライマーの２種類のオリゴＤＮＡから構成される。
特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて2対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。例えば、細菌増幅用プライマー対（配列番号１、２）や、コントロールＤＮＡ用プライマー対（配列番号９１、９２）を利用することが可能である。
【００４６】
口内細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌などを、検出対象菌種とすることができる。
【００４７】
より具体的には、例えば、現在歯周病や虫歯や日和見感染に関連していると考えられる、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＩＩ、及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａなどの細菌を検出対象菌種とすることが好ましく、より好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａであり、特に好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓである。
【００４８】
これらについては、例えば、後述の表１に示すプライマー（配列番号１、２）を用いて増幅する場合、配列番号３〜５９に記載の配列（表２−１、表２−２））をプローブとすることが可能である。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。
ここで、実質的に同一とは、配列番号３〜５９に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
【００４９】
【表１】
2017023093.tif 000002
【００５０】
【表２−１】
2017023093.tif 000003
【００５１】
【表２−２】
2017023093.tif 000004
【００５２】
プローブの長さとしては、例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。
より詳細には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【００５３】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５４】
（ハ）総量指標プローブ（前記プローブ（ｂ））
デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載するプローブの種類がどれだけ多くても、被検試料の中には、未同定の細菌が混在する可能性が高く、増幅される核酸の中には、特異的なプローブが搭載されていない検出対象ではない細菌（「非検出対象細菌」という）由来の核酸が存在する。
従って、すべての細菌を検出対象細菌として検出することは困難であり、菌叢を解析する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌叢の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそもサンプル中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を評価することもきわめて重要となる。
【００５５】
非検出対象細菌は、(i)正体は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び(ii)存在や種類が不明である細菌の和として理解できる。その一方で、(ii)については存在も不可知で特異的な配列も不明であるため、必ずしも実際に検出できるとは限らない。このため、(ii)の中でも、増幅できた菌については非検出対象細菌を含むすべての検出対象細菌とする。増幅できた菌については必ずプライマー配列に対する相補配列を持っているので、プライマーと同じ配列をもつプローブに対してハイブリすることができる。
従って、本発明において全ての検出対象細菌とは特定のプライマー対で増幅できた細菌を意味する。
このような細菌の総量を評価するに際しては、例えば、デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）とは独立に細菌数を測定することも可能である。この場合、デバイス中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことが操作の簡便性を向上させる観点から有利となる。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブ（総菌量プローブ）としてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである（例えば表２−１の配列番号６０に示す配列）。
【００５６】
総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、シグナル強度が頭打ち（検出できるシグナル強度の許容範囲を超えるシグナルが出てしまうこと）になりやすい。
そのような状況を防ぐためには、個々の菌種特異的な増幅産物を捕捉するプローブに比較して、ハイブリダイゼーション効率を落とすことで対応が可能である。ＰＣＲを実施するに際しては、二種類のオリゴＤＮＡを一つのプライマー対とし、そのうちの一方を蛍光標識し、他方を基本的に無標識として使用する。例えば無標識の方のオリゴＤＮＡと同じものをプローブとして用いると、増幅された全ＰＣＲ産物がハイブリダイゼーションすることになるので、このハイブリダイゼーションシグナルを測定する。プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。
【００５７】
また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、あるいは総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。
一方で、プライマー対と同じもしくは一部同じ配列を総量指標プローブとすることも可能である。例えば、フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、リバースプライマーを構成する配列の全部もしくは一部を含むプローブを使用することで、増幅産物の総量を評価することが可能となる。
フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、フォワードプライマーから伸長した側の鎖をハイブリダイゼーションに供してシグナル検出する。この場合、上記同様、当該プローブの捕捉対象となる増幅産物の多さから、シグナル強度が頭打ちすることが懸念されるが、上記と同様にプローブの長さやＧＣ含量を調整することでその影響を抑えることが可能である。
【００５８】
（ニ）ハイブリダイゼーション効率係数
本明細書において、ハイブリダイゼーション効率係数とは、各菌種におけるプローブのシグナル強度から、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率係数を算出する。複数の細菌に対してハイブリダイゼーションを形成するプローブについてはその平均値をハイブリダイゼーション効率係数とする。
【００５９】
（ホ）コントロールＤＮＡ
本明細書において、コントロールＤＮＡとは、被検サンプル中に含まれる細菌のＤＮＡが増幅されないように人工的に設計された核酸を意味する。増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、サンプル中に一定量添加する核酸である。コントロールＤＮＡは、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。
従って、コントロールＤＮＡに特異的なプローブをデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを評価することができる。コントロールＤＮＡ用プローブの例を表２−１、２−２に示す（配列番号６１〜９０）。
【００６０】
また、コントロール用ＤＮＡを複数設計し、それぞれについて濃度を変えた混合物を使用すれば、当該濃度に対する検出結果、例えば蛍光強度との対応付けにより、サンプル中に含まれる細菌やその総量を定量することが可能である。
コントロールＤＮＡを増幅反応前に添加するのであれば、上記特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
【００６１】
（ヘ）コントロールＤＮＡの設計
例えば、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社のソフトウェアー「ＥＸＣＥＬ」のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くすることも可能である。
【００６２】
コントロールＤＮＡを複数用いて検出対象細菌等を定量する場合、増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、コントロールＤＮＡの増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、コントロールＤＮＡ由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
【００６３】
また、コントロールＤＮＡを複数使用する場合においては、各コントロールＤＮＡ間においては、プローブによって捕捉される配列やその付近以外は同じ塩基配列で構成されることが望ましい。
コントロールＤＮＡを添加したうえで増幅反応をＰＣＲ等で実施する場合  １種類又は複数種類の絶対量指標プローブ（前記プローブ（ｃ））は、特定のプライマー対を用いて増幅されたプローブであって被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にはいずれもハイブリダイズせず、コントロールとして作製したコントロールＤＮＡ核酸にハイブリダイズするプローブである。
絶対量指標プローブは、所定のコントロールＤＮＡ１と、当該コントロールＤＮＡ１とは異なる少なくとも１種類のコントロールＤＮＡ２との混合物に含まれている。この場合、コントロールＤＮＡ２は、コントロールＤＮＡ１に対し２のｎ乗（ｎは任意の整数）の濃度比で混合されている。これはＰＣＲ自体がnサイクル後に２n倍の増幅産物量となるためである。コントロールＤＮＡの種類は１種類以上であるが、５０種類以下であることが好ましい。
【００６４】
またデバイス（例えば、ＤＮＡチップ）のダイナミックレンジが１０４程度であることを考慮すると、濃度段階を２ｎ倍のステップで１５種類用意すれば２１５＞１０４であるため、デバイス（例えば、ＤＮＡチップ）のダイナミックレンジ内においては十分な指標とすることができる。ただし、各１５種類の濃度ステップにおけるコントロールＤＮＡを複数用意する場合においては、より多種類のコントロールＤＮＡを用意することも可能であるため、例えば各濃度段階において３種類のコントロールＤＮＡを作製する場合などを考慮すると４５種類程度のコントロールＤＮＡを、２のｎ乗の濃度ステップにて混合することが望ましい。
本発明において、複数種類の絶対量指標プローブを用いる場合、複数種類のコントロールＤＮＡ核酸が増幅されてそれぞれのプローブで複数種類のコントロールＤＮＡを検出する。ｋ種類（第１番〜第ｋ番）のコントロールＤＮＡを使用する場合、第１番からみた第ｋ−１番の濃度比と、第１番からみた第ｋ番の濃度比を２のｎ乗（ｎは任意の整数）で表すことができる。
【００６５】
例えば、第１番からみた第２番のときのｎを３とし、第１番からみた第３番のときのｎも３とすると、第１番からみた第２番の濃度比も、第１番からみた第３番の濃度比も、２の３乗＝８倍となって同じ濃度比にすることができる。また、第１番からみた第２番のときのｎを２とし第１番からみた第３番のときのｎを３として、別の濃度比にすることもできる。
すなわち、複数種類の絶対量指標プローブを、同一濃度で使用してもよく、異なる濃度で使用してもよい。
基本的には、複数種類の絶対量指標プローブはどのような組み合わせで入れてもよい。１５種類の場合に、濃度１のものを７種類、濃度２のもの（濃度１に対する濃度比が２のもの、以下同様）を８種類入れてもよく、濃度１のものを７種類、濃度４のものを８種類入れてもよい。濃度１のものを２種類、濃度４のものを３種類、濃度８のものを１種類・・・でもよい。後述する実施例のように、濃度１のものを１種類、濃度２のものを１種類、濃度４のものを１種類、濃度８のものを１種類、・・・濃度１５のものを１種類でもよい。
【００６６】
検量線を引くために、濃度が２段階以上あることが必要であるが、その２段階が、２のｎ乗（ｎは整数）の濃度比になっていればよい。
一方で、サンプル中に含まれるコントロールＤＮＡはあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
【００６７】
複数のコントロールＤＮＡをハイブリダイゼーションによって検出するために、複数のコントロールＤＮＡそれぞれに特異的な配列の相補配列をプローブとして個別にデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載する必要がある。
上記デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて実際に未知サンプル（実サンプル）の細菌叢に含まれる検出対象菌種の有無や量を解析する場合、上記のデバイスに含まれる検出対象菌種に対するプローブそれぞれについて、絶対量指標プローブのシグナルと、総量指標プローブのシグナル強度を基に補正する係数で処理することで、検出対象細菌由来の核酸を絶対定量することが可能となる。
【００６８】
３．検出対象菌種の絶対量推定方法
（３−１）検出対象細菌
菌叢の中に未知の細菌がいる可能性は否定できない。このため、デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて全ての細菌種を検出対象とすることは困難である。過去に同定済みの細菌の中からある現象を評価するに際して、検出するにふさわしい細菌が対象となる。
例えば、口内細菌は数百種類存在し、同定されている菌も多い。しかし、歯周病を評価するに際しては、これらの同定される菌が必ずしも検出対象として適しているとは限らない。
【００６９】
従って、歯周病を評価する場合は、歯周ポケットの中に存在する下記の細菌、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍなどが歯周病を評価することに適している菌であると言える。
さらに好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａが、特に好ましくはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが歯周病を評価することに適している。
【００７０】
これらの細菌の個々について、上記特定のプライマー対で増幅される塩基配列の中から、当該細菌に特異的な配列をプローブとして選抜する。すなわち、特定のプライマー対で増幅された塩基配列の中には、プローブとして使用できるものと使用できないものが含まれているので、そのうち使用できるプローブを選別する。基本的には一種類のプライマー対で多種類の菌を増幅し、増幅配列内で、菌種によって配列の多様性が認められる部分でプローブを作製する。
本来のプローブとして使用できる配列と同じ作用効果を有するプローブも実質的に同一の配列であるプローブとして使用できる。
従って、これらの検出対象細菌は上記特定のプライマー対によって増幅される核酸配列を持っている必要があり、また、これらの核酸を基に当該細菌を検出するために、増幅された配列内に、他の細菌とは異なる菌種特異的な配列を含んでいる必要がある。
【００７１】
一方でその特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、菌叢解析の目的に応じて当適宜判断が可能である。
複数の細菌を一括に増幅し、さらに特異的な配列を基にして検出するに際しては、プライマー対については菌種間で保存された配列から設計する必要があり、鋳型（プライマーによって増幅される範囲）として細菌特異的な配列を持っている遺伝子を使用する必要がある。このような鋳型となる遺伝子としては１６ＳｒＲＮＡが挙げられる。本発明においては、１６ＳｒＲＮＡそのものを検出対象としてもよいし、転写もととなるゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡを検出対象とすることも可能である。
【００７２】
例えば、まず検出対象細菌を単離する。このとき、すでに菌株として販売されているものを使用してもよい。また、細菌は生きていても死んでいてもよく、さらに細菌そのものではなく細菌から抽出されたゲノムＤＮＡであってもよい。
【００７３】
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
これら単離された細菌もしくは核酸の１種類について、本発明のデバイスによって処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＡと、総量指標プローブで検出されるシグナルＢが得られる。
また別途、上記とは異なる単離された細菌もしくは核酸を用いて同様に本発明のデバイスによる処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＣと、総量指標プローブで検出されるシグナルＤが得られるとする。
【００７４】
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
ここで、シグナルＢおよびシグナルＤについては、同じ配列の総量指標プローブから得られるシグナルであるため、理論上ハイブリダイゼーションの効率は同じといえる。一方で、シグナルＡとシグナルＢにおいてはプローブ配列自体が異なるが、検出対象とする核酸は同じであり、ハイブリダイゼーションに供された量や実験条件も同一である。このことは、シグナルＣとシグナルＤについても同様のことが言える。
【００７５】
従って、シグナルＢとシグナルＤの値が一致する場合のシグナルＡとシグナルＣの強度比が、それぞれのプローブのハイブリダイゼーション効率の違いとなる。従って、Ａ／Ｂの値とＣ／Ｄの値は、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率の違いを補正したうえで比較が可能な値となる。例えば実サンプルを用いてＤＮＡマイクロアレイでデータを取得した際に、あらかじめ取得しておいたこれらの個々の値の逆数を、それぞれのプローブのシグナル強度に乗算することで、各プローブ間のハイブリダイゼーション効率を補正したうえで、シグナル強度を比較することが可能となる。
【００７６】
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
これらのシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較することで、異なるチップ間の補正が可能となる。
【実施例１】
【００７７】
＜ＤＮＡの調製＞
成人健常者５名（２０歳代から５０歳代の男女）の協力により唾液評価試験を実施した。この５名を被験者Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅとし、１日３回（起床後、午前、午後）５日間の唾液を評価した。
唾液採取は、γコレクトスワブＲＩ（栄研化学）を１分間口に含み唾液を採取する方法とした。γコレクトスワブＲＩをチューブ中の水に浸漬し室温で５分静置し、細菌成分を溶出させた。その後、γコレクトスワブＲＩを取り出し、チューブを遠心分離機にかけた。得られたペレットに対し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００７８】
＜ＤＮＡの評価＞
ＤＮＡを１０ｐｇ程度に希釈し、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＰＣＲを行い、増幅、標識した。プライマーには配列番号１，２，９１，９２を利用した。
ＰＣＲ液組成（２０μＬ系）は表３に示すとおりである。
【００７９】
【表３】
2017023093.tif 000005
ＰＣＲ条件は表４に示すとおりである。
【００８０】
【表４】
2017023093.tif 000006
【００８１】
ＰＣＲ終了後、それぞれにハイブリダイゼーション反応液１８０μＬ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ４８μＬ，  １Ｍ  ＮａＣｌ  ４８μＬ，  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ２０μＬ，  水  ６５μＬ）を添加した。ハイブリ前処理として、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００にて９４℃１分反応させ、４℃で待機させた。
自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン）にて、５０℃２時間ハイブリダイゼーションした。その後洗浄した。
測定に使用したＤＮＡチップに搭載したプローブは表５に示すとおりである。
【００８２】
【表５】
2017023093.tif 000007
検出には、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン）を用いて、露光時間０．１、１，４，４０秒で評価した。
【００８３】
＜結果＞
１ｍＬ唾液中の細菌数として表６に示す結果が得られた。
【００８４】
【表６】
2017023093.tif 000008
【００８５】
＜判定＞
歯周病のリスク判定
被験者Ａは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
口腔内試料中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌数の合計が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して０．５％以上の場合を「高リスク」であると判定する基準（本明細書中の判定基準２）に基づいて、被験者Ａの歯周病に対する判定は「低リスク」であった。
【００８６】
被験者Ｂは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
被験者Ａと同様の基準に基づいて、「低リスク」と判定された。
【００８７】
被験者Ｃは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が３５７７８１２となり、総菌量に対する割合は１．７％であった。
被験者Ａと同様の基準に基づいて、「高リスク」と判定された。
被験者Ｄは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
【００８８】
被験者Ａと同様の基準をもとにすると、「低リスク」に分類された。
被験者Ｅは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が３３９２４１となり、総菌量に対する割合は０．４％であった。
被験者Ａと同様の基準に基づいて、「中リスク」と判定された。
【００８９】
（２）齲蝕のリスク判定
被験者Ａは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
口腔内試料中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が、
総菌数に対して０．０５％未満の場合を「低リスク」、総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を「中リスク」、総菌数に対して２．５％以上の場合を「高リスク」であると判定する基準（本明細書中の判定基準５）に基づいて、「低リスク」であると判定された。
【００９０】
被験者Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が１８８６２となり、総菌量に対する割合は０．０１％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「低リスク」と判定された。
被験者Ｃは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「低リスク」と判定された。
【００９１】
被験者Ｄは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が  １７７３６となり、総菌量に対する割合は０．０５％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「中リスク」と判定された。
被験者Ｅは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの細菌数が  １８８０８となり、総菌量に対する割合は０．０２％であった。
被験者Ａと同様の基準に基づいて、「低リスク」と判定された。
１度のサンプリングで、歯周病及び齲蝕に関連する細菌の情報を包括的に取得することができ、歯周病及び齲蝕のリスクの判定を同時に行うことができた（表７）。
被験者Ａ及びＢは、歯周病のリスクも齲蝕のリスクも低いことが分かった。被験者Ｃは、歯周病のリスクは高いが齲蝕のリスクは低いことが分かった。被験者Ｄは、歯周病のリスクは低いが齲蝕のリスクは中程度であることが分かった。被験者Ｅは、歯周病のリスクは中程度であるが齲蝕のリスクは低いことが分かった。
【００９２】
【表７】
2017023093.tif 000009
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１〜９２：合成核酸
【配列表】
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