(57)【要約】【課題】生体由来試料や食品等に含まれるアミノ酸やペプチドを、迅速かつ簡便に、さらに特異的に検出し得る検出方法および検出試薬を提供する。【解決手段】アミノ酸および／またはペプチドと、式（Ｉ）2017133978.tif 000015（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）で表される化合物を、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中で、酸化剤の存在下に室温〜３７℃で反応させて呈色させ、アミノ酸および／またはペプチドを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸および／またはペプチドと、式（Ｉ）
【化１】
2017133978.tif 000013
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物を、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中で、酸化剤の存在下に室温〜３７℃で反応させて呈色させる、アミノ酸および／またはペプチドの検出方法。
【請求項２】
緩衝液のｐＨが７〜８である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
緩衝液がホウ酸緩衝液である、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
酸化剤が過ヨウ素酸塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール、３−クロロベンゼン−１，２−ジオール、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールおよび３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
ペプチドがオリゴペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
式（Ｉ）
【化２】
2017133978.tif 000014
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物、中性〜弱アルカリ性の緩衝液および酸化剤を含有する、アミノ酸および／またはペプチドの検出試薬。
【請求項８】
緩衝液のｐＨが７〜８である、請求項７に記載の検出試薬。
【請求項９】
緩衝液がホウ酸緩衝液である、請求項７または８に記載の検出試薬。
【請求項１０】
酸化剤が過ヨウ素酸塩である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項１１】
式（Ｉ）で表される化合物が、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール、３−クロロベンゼン−１，２−ジオール、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールおよび３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールからなる群より選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項１２】
ペプチドがオリゴペプチドである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸およびペプチドの検出方法、ならびにこれらの検出に使用する検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸やペプチドは、主要な生体成分であり、医薬品や化粧品などの原料、サプリメント、食品添加物等として広く利用されている。特に、食品中のアミノ酸やペプチドは、栄養素であると同時に、うま味や甘味等の成分、または種々の生理活性成分等として機能することが知られている。
【０００３】
アミノ酸やペプチドの検出方法としては、ニンヒドリンによる呈色反応や、チオール化合物の存在下に、ο−フタルアルデヒドで誘導体化して蛍光を検出する方法等が知られている。
しかし、ニンヒドリンによる呈色反応は加熱処理を要し、迅速な検出方法であるとはいえない。また、プロリン等のイミノ酸は、第１級アミンのアミノ酸とは異なる呈色（黄色）を示し、異なる吸収極大を有するため、２種類の波長で検出することを要する。
ο−フタルアルデヒドで誘導体化して蛍光を検出する方法においても、プロリン等の第２級アミンとして存在するアミノ酸を検出するには、次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、ο−フタルアルデヒドとの反応を可能とする処理を要する。
さらに、ニンヒドリンおよびο−フタルアルデヒドは、いずれも第１級アミノ基と反応するため、生体由来試料や食品中に存在する尿素、核酸塩基、クレアチニン等の物質も検出されてしまい、必ずしも特異性の高い方法であるとはいえなかった。
【０００４】
かかる事情に鑑み、本発明者らは、ペプチドに特異的な検出方法として、１，２−ジヒドロキシベンゼン（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）類縁体を蛍光試薬として用いる方法を開発し、すでに開示している（特許文献１、非特許文献１〜３）。
しかしながら、たとえば血液、血清、リンパ液、尿、細胞抽出液、細胞培養液等の生体由来試料や、食品中に存在するアミノ酸やペプチドを、迅速かつ特異的に検出する方法がさらに求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１９４１７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Kabashima, Z. Yu, T. Chang, Y. Nakagawa, K. Okumura, T. Shibata, J. Lu, M. Kai；Peptides 29 (2008) 356-363
【非特許文献２】H. Yasmin, T. Kabashima, MS. Rhman, T. Shibata, M. Kai；Sci. Rep. 13 (2014) 4950
【非特許文献３】H. Yasmin, T. Shibata, MS. Rhman, T. Kabashima, M. Kai；Anal. Chim. Acta 6 (2012) 162-166
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、生体由来試料や食品等に含まれるアミノ酸やペプチドを、迅速かつ簡便に、さらに特異的に検出し得る検出方法および検出試薬を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アミノ酸やペプチドが、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中、酸化剤の存在下に、特定の１，２−ジヒドロキシベンゼン類縁体と特異的に反応し、さらに、室温〜３７℃の温和な温度条件下でも、約１５分以内に独特の呈色が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］アミノ酸および／またはペプチドと、式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2017133978.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物を、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中で、酸化剤の存在下に室温〜３７℃で反応させて呈色させる、アミノ酸および／またはペプチドの検出方法。
［２］緩衝液のｐＨが７〜８である、［１］に記載の検出方法。
［３］緩衝液がホウ酸緩衝液である、［１］または［２］に記載の検出方法。
［４］酸化剤が過ヨウ素酸塩である、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］式（Ｉ）で表される化合物が、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール、３−クロロベンゼン−１，２−ジオール、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールおよび３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールからなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の検出方法。
［６］ペプチドがオリゴペプチドである、［１］〜［５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
2017133978.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物、中性〜弱アルカリ性の緩衝液および酸化剤を含有する、アミノ酸および／またはペプチドの検出試薬。
［８］緩衝液のｐＨが７〜８である、［７］に記載の検出試薬。
［９］緩衝液がホウ酸緩衝液である、［７］または［８］に記載の検出試薬。
［１０］酸化剤が過ヨウ素酸塩である、［７］〜［９］のいずれかに記載の検出試薬。
［１１］式（Ｉ）で表される化合物が、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール、３−クロロベンゼン−１，２−ジオール、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールおよび３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールからなる群より選択される、［７］〜［１０］のいずれかに記載の検出試薬。
［１２］ペプチドがオリゴペプチドである、［７］〜［１１］のいずれかに記載の検出試薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法は、アミノ酸およびペプチドに特異的で、温和な条件下、短時間で明確な呈色が得られるため、生体由来試料や食品中に存在するアミノ酸およびペプチドを、迅速かつ簡便に検出することができる。
また、本発明の検出方法により、従来そのままでは検出できなかったプロリン等のイミノ酸をも、容易に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の検出方法は、アミノ酸および／またはペプチドと、式（Ｉ）
【００１６】
【化３】
2017133978.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物を、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中で、酸化剤の存在下に室温〜３７℃で反応させて呈色させる。
【００１８】
本発明の検出方法により検出が可能なアミノ酸としては、たとえば、タンパク質を構成するアミノ酸が挙げられ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等のアルキル鎖を有する中性アミノ酸；セリン、トレオニン等の水酸基を有する中性アミノ酸；システイン、メチオニン等のイオウを含む中性アミノ酸；アスパラギン、グルタミン等のアミド基を有する中性アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族基を有する中性アミノ酸；プロリン等のイミノ基を有する中性アミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。
【００１９】
本発明の検出方法により検出が可能なペプチドとしては、植物、動物、細菌等の微生物において生合成されたペプチドや、植物、動物、微生物等に含まれるタンパク質が酵素的に分解されて生じたペプチド、自体公知のペプチド合成法により合成されたペプチド等が挙げられる。
本発明においては、２個のアミノ酸が結合したジペプチド、３個のアミノ酸が結合したトリペプチド等のオリゴペプチドが、特に好ましく検出される。
【００２０】
本発明の検出方法により、０．１ｍＭ以上のアミノ酸および０．１ｍＭ以上のペプチドの検出が可能である。
【００２１】
上記式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられ、フッ素原子がより好ましい。また、Ｒで示される炭素数１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、イソヘキソキシ等が例示され、メトキシ、エトキシ等が好ましく、メトキシがより好ましい。
【００２２】
本発明の検出方法において、式（Ｉ）で表される化合物として、好ましくは３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール、３−クロロベンゼン−１，２−ジオール、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールおよび３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールが挙げられ、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオールがより好ましい。
【００２３】
式（Ｉ）で表される化合物は、たとえば、化学的合成法、微生物が発現する酵素を用いた合成法（Vu P. Bui et al.; Green Chemistry, 2000, 2, 263-265）等、自体公知の方法により製造して用いることができるが、東京化成工業株式会社等より提供されている市販の製品を利用することもできる。
【００２４】
式（Ｉ）で表される化合物は水溶性を示すため、水に溶解させ、水溶液として用いることができる。
本発明の検出方法において、式（Ｉ）で表される化合物は、通常０．１ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは０．１８ｍＭ〜０．２ｍＭの最終濃度で用いられる。
【００２５】
本発明の検出方法において、アミノ酸および／またはペプチドと、式（Ｉ）で表される化合物とは、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中で、酸化剤の存在下に反応させる。
【００２６】
本発明において用いる緩衝液としては、反応液のｐＨを中性〜弱アルカリ性（６〜８）に維持し得るものであって、本発明の呈色反応を阻害しないものであれば、特に制限されることなく用いることができるが、ｐＨが７〜８であるものがより好ましく、ｐＨが８であるものがさらに好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、ホウ酸緩衝液がより好ましく用いられる。
また、使用する緩衝液の濃度としては、アミノ酸またはペプチドの呈色反応において、通常当業者が用いる濃度とすればよく、たとえば、１２５ｍＭ（最終濃度＝３１．２５ｍＭ）である。
【００２７】
本発明において、酸化剤としては特に限定されず、たとえば過酸化水素、過ヨウ素酸塩、過ホウ素酸塩、過塩素酸塩、ｍ−クロロ安息香酸等が挙げられる。かかる酸化剤は、適切な溶媒に溶解し、溶液として用いることが、検出の操作性等の点から好ましい。
本発明の検出方法に用いる酸化剤として、過ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸ナトリウム等の過ヨウ素酸塩が、水溶性であるためより好ましく用いられる。
本発明における酸化剤の添加量としては、本発明の呈色反応を進行させ、後述する呈色物質を生成させ得る量であれば特に限定されないが、アミノ酸やペプチドの検出を行う試料中に、酸化剤と反応する物質や、呈色物質の生成を妨げる物質が存在する場合には、そのような物質により酸化剤が消費されるため、通常よりも酸化剤の添加量を増やすことが好ましい。
かかる酸化剤の添加量は、検出の対象となる試料の種類等に応じて、当業者であれば適宜決定することができるが、たとえば、過ヨウ素酸塩水溶液の場合、１．２５ｍＭ（最終濃度＝０．３１ｍＭ）である。
【００２８】
本発明の検出方法における上記反応は、温和な条件下においても迅速に進行するため、室温〜３７℃で行うことができる。
なお、ここで「室温」は、第１６改正日本薬局方通則に定義される温度（１℃〜３０℃）を意味する。
反応時間としては、通常３０秒間〜１５分間であり、好ましくは３０秒間〜１２分間である。
【００２９】
本発明の検出方法において、試料溶液、化学式（Ｉ）で表される化合物の水溶液、緩衝液および酸化剤溶液の混合量比は、検出の対象となる試料の種類等に応じて、当業者であれば適宜決定することができるが、操作性の観点からは等容量ずつ混合することが好ましい。
【００３０】
本発明において、試料中のアミノ酸および／またはペプチドは、中性〜弱アルカリ性の緩衝液中、酸化剤の存在下に、化学式（Ｉ）で表される化合物と下記の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように反応し、式（ＩＩａ）〜式（ＩＩｃ）で表される呈色物質を生成すると推定される。
【００３１】
【化４】
2017133978.tif 000005
【００３２】
（式中、Ｒ１は水酸基またはアミノ酸残基を示し、Ｒ２は水素原子または直鎖アルキル基を示し、Ｒ３は水素原子；水酸基；カルバモイル基；カルボキシル基；メルカプト基；グアニジノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、アミノ基またはメチルチオ基により置換されていてもよい直鎖または分岐鎖アルキル基；水酸基により置換されていてもよいフェニル基；イミダゾリル基またはインドリル基を示す。）
【００３３】
すなわち、グリシンまたはＮ末端にグリシンを有するペプチドは、上記（Ａ）で示すような反応により、式（ＩＩａ）で示す呈色物質を生成すると考えられ、プロリンまたはＮ末端にプロリンを有するペプチドは、上記（Ｂ）で示すような反応により、式（ＩＩｂ）で示す呈色物質を生成すると考えられる。グリシンおよびプロリン以外のアミノ酸、またはグリシンおよびプロリン以外のアミノ酸をＮ末端に有するペプチドについては、上記（Ｃ）で示すような反応により、式（ＩＩｃ）で示す呈色物質を生成すると考えられる。
【００３４】
式（ＩＩａ）〜式（ＩＩｃ）で表される呈色物質は紫〜赤色の呈色を示し、４５０ｎｍ〜６００ｎｍに吸収極大を有する。
従って、本発明の検出方法では、吸光度計にて５００ｎｍ〜５５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、アミノ酸および／またはペプチドを定量することができる。
また、本発明の検出方法における呈色は明確であるため、視覚によっても容易に判定でき、本発明は、簡便なアミノ酸および／またはペプチドの検出方法としても有用である。
【００３５】
本発明の検出方法における上記呈色反応は、上記したアミノ酸およびペプチドに特異的に進行し、単糖、二糖等の糖類、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド等の核酸の構成成分、コレステロール等のステロール類、尿素、クレアチニン等のアミノ基を有する生体内代謝産物、タンパク質、アスコルビン酸等のラクトン環を有するカルボン酸、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸等の胆汁酸等、血液をはじめ生体組織から得られる生体由来試料や食品中に存在する物質とは反応しないか、反応しても紫〜赤色の呈色は得られない。
従って、本発明の検出方法によれば、生体由来試料や食品中に存在するアミノ酸やペプチドを特異的に検出することができる。
【００３６】
また、本発明の検出方法では、従来のアミノ酸検出方法では検出できなかったプロリン等のイミノ基を有するアミノ酸についても、特異的かつ明確な呈色が得られる。
従って、本発明の検出方法は、コラゲナーゼ処理を行うことにより、コラーゲンの検出方法に応用することができる。
【００３７】
さらに、本発明の検出方法は、微生物由来のプロテイナーゼＫ等、非特異的なタンパク質分解酵素を用いて処理することにより、尿や血清等の全タンパク質の定量方法としても応用することができる。
【００３８】
本発明はまた、式（Ｉ）
【００３９】
【化５】
2017133978.tif 000006
【００４０】
（式中、Ｒは、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルコキシ基を示す）
で表される化合物、中性〜弱アルカリ性の緩衝液および酸化剤を含有する、アミノ酸および／またはペプチドの検出試薬を提供する。
【００４１】
式（Ｉ）で表される化合物、中性〜弱アルカリ性の緩衝液及び酸化剤については、上記した通りである。
本発明においては、式（Ｉ）で表される化合物の水溶液、中性〜弱アルカリ性の緩衝液及び酸化剤の溶液をそれぞれ調製し、それらを、前記各成分の最終濃度が上記した範囲内となるように混合して検出試薬としてもよく、また、式（Ｉ）で表される化合物、中性〜弱アルカリ性の緩衝液および酸化剤を、それぞれ上記した範囲内の最終濃度となるように、水等の溶媒に溶解し、または前記溶媒により希釈して、検出試薬としてもよい。
【００４２】
本発明の検出試薬は、アミノ酸および／またはペプチドを含有する試料に添加して、室温〜３７℃で混合することにより、３０秒間〜１５分間程度で紫〜赤色の呈色を生じるため、アミノ酸および／またはペプチドの迅速かつ簡便な検出および定量に有用である。
【実施例】
【００４３】
さらに本発明について、実施例により詳細に説明する。
【００４４】
［実施例１］３−フルオロベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
３−フルオロベンゼン−１，２−ジオール（化学式（Ｉ）中、Ｒがフッ素原子である）（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｆ０２８２）の０．７５ｍＭ水溶液を調製し、前記水溶液２５０μＬ、１２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）２５０μＬ、および１．２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２５０μＬを混合し、実施例１の検出試薬とした。
【００４５】
［実施例２］３−メトキシベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
実施例１の検出試薬において、３−フルオロベンゼン−１，２−ジオールの代わりに、３−メトキシベンゼン−１，２−ジオール（化学式（Ｉ）中、Ｒがメトキシ基である）（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｍ０５２４）を用いて、実施例２の検出試薬とした。
【００４６】
［比較例１］１，２−ジヒドロキシベンゼン類縁体を含有しない試薬
水２５０μＬ、１２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）２５０μＬ、および１．２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２５０μＬを混合し、比較例１の試薬とした。
【００４７】
［実施例３］実施例１および２の各検出試薬によるアミノ酸、アミノ酸のアミド、およびジペプチドの検出
（１）試料
表１および表２に示すアミノ酸、すなわちＬ−プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ−リシン（Ｌｙｓ）、表２に示すアミノ酸のアミド、すなわちグリシンアミド（Ｇｌｙ−ＮＨ２）、Ｌ−アラニンアミド（Ａｌａ−ＮＨ２）、Ｌ−チロシンアミド（Ｔｙｒ−ＮＨ２）、Ｌ−アルギニンアミド（Ａｒｇ−ＮＨ２）、Ｌ−リシンアミド（Ｌｙｓ−ＮＨ２）、Ｌ−ロイシンアミド（Ｌｅｕ−ＮＨ２）、ならびに表１に示すジペプチド、すなわちＬ−プロリル−Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン（Ａｌａ−Ｐｒｏ）、Ｌ−プロリル−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）、Ｌ−アラニルグリシン（Ａｌａ−Ｇｌｙ）のそれぞれを、０．４ｍＭおよび４ｍＭの各濃度で含有する水溶液を調製し、試料とした。
（２）検出方法
上記試料の各２５０μＬを、実施例１および２の各検出試薬（７５０μＬ）、ならびに比較例１の試薬（７５０μＬ）にそれぞれ添加して混合し、３７℃にて混合液の色の変化を観察した。従って、アミノ酸、アミノ酸のアミドおよびジペプチドのそれぞれの最終濃度は、０．１ｍＭおよび１ｍＭである。
また、対照として、試料の代わりに同量の水を添加して、同様に混合液の色の変化を観察した。
（３）検出結果
検出結果を、表１、２に併せて示した。
【００４８】
【表１】
2017133978.tif 000007
【００４９】
【表２】
2017133978.tif 000008
【００５０】
表１、２に示されるように、試料としたアミノ酸、アミノ酸のアミド、およびジペプチドのほとんどについて、本発明の検出試薬と混合後瞬時（３０秒以内）に紫〜赤色の呈色が認められた。本発明の検出試薬と混合して３０秒以内に呈色が見られない場合においても、１１分〜１２分（７００秒〜７３０秒）後には呈色が認められた。
【００５１】
［実施例４］実施例１および２の各検出試薬による呈色反応の特異性の評価
（１）試料
表３に示す糖類（グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース）、ヌクレオチド（アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ））、核酸塩基（チミン、シトシン）、生体内代謝産物（尿素、クレアチニン）、タンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヘモグロビン、カタラーゼ、リゾチーム、インスリン）、コレステロール、アスコルビン酸、葉酸、リトコール酸のそれぞれを、表３に示す最終濃度の４倍の濃度で含有する水溶液を調製し、試料とした。
（２）評価方法
上記実施例１および２の各検出試薬（７５０μＬ）ならびに比較例１の試薬（７５０μＬ）に、上記試料溶液２５０μＬをそれぞれ添加して混合し、３７℃で混合液の呈色を観察した。
また、対照として、試料の代わりに同量の水を添加して、同様に混合液の色の変化を観察した。
（３）評価結果
評価結果を、表３に併せて示した。
【００５２】
【表３】
2017133978.tif 000009
【００５３】
表３に示されるように、構造中にグルタミン酸を有する葉酸について、実施例１の検出試薬と反応して赤色の呈色が見られた他は、糖類、ヌクレオチド、核酸塩基、生体内代謝産物、タンパク質等、生体由来試料や食品中に共存する物質については、アミノ酸やペプチドについて見られる紫〜赤色の特徴的な呈色は見られず、本発明の検出方法がアミノ酸およびペプチドに特異的であることが認められた。
【００５４】
［実施例５］３−クロロベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
３−クロロベンゼン−１，２−ジオール（化学式（Ｉ）中、Ｒが塩素原子である）（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｃ１２４６）の０．７５ｍＭ水溶液を調製し、前記水溶液２５０μＬ、１２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）２５０μＬ、および１．２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２５０μＬを混合し、実施例５の検出試薬とした。
【００５５】
［実施例６］３−クロロベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
実施例５の検出試薬において、ホウ酸緩衝液の代わりに、同濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ＝８）を用いて、実施例６の検出試薬とした。
【００５６】
［比較例２］１，２−ジヒドロキシベンゼン類縁体を含有しない試薬
水２５０μＬ、１２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝８）２５０μＬ、および１．２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２５０μＬを混合し、比較例２の試薬とした。
【００５７】
［実施例７］実施例５および６の各検出試薬によるアミノ酸およびジペプチドの検出
（１）試料
Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ−アラニルグリシン（Ａｌａ−Ｇｌｙ）およびグリシル−Ｌ−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の各４ｍＭ水溶液を調製し、試料とした。
（２）検出方法
上記試料各２５０μＬを実施例５および６の各検出試薬（７５０μＬ）、ならびに比較例１および２の各試薬（７５０μＬ）にそれぞれ添加して混合し、３７℃で混合液の呈色を観察した。
従って、混合液中の各アミノ酸およびジペプチドの最終濃度は１ｍＭである。
また、対照として、試料の代わりに同量の水を添加して、同様に混合液の色の変化を観察した。
（３）検出結果
検出結果を表４に示した。
【００５８】
【表４】
2017133978.tif 000010
【００５９】
表４に示される通り、３−クロロベンゼン−１，２−ジオールを含有する実施例５および６の各検出試薬を用いた場合にも、アミノ酸またはジペプチドを含有する試料溶液について、紫〜赤色の呈色が認められたが、ホウ酸緩衝液の代わりにリン酸緩衝液を含有する実施例６の検出試薬を用いた場合には、呈色の程度はやや弱かった。
【００６０】
［実施例８］３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
３−ブロモベンゼン−１，２−ジオール（化学式（Ｉ）中、Ｒが臭素原子である）（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｂ３７１０）の０．７５ｍＭ水溶液を調製し、前記水溶液２５０μＬ、１２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）２５０μＬ、および１．２５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２５０μＬを混合し、実施例８の検出試薬とした。
【００６１】
［実施例９］３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールを含有する検出試薬
実施例８の検出試薬において、ホウ酸緩衝液の代わりに、同濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ＝８）を用いて、実施例９の検出試薬とした。
【００６２】
［実施例１０］実施例８および９の各検出試薬によるアミノ酸およびジペプチドの検出
（１）試料
Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ−アラニルグリシン（Ａｌａ−Ｇｌｙ）およびグリシル−Ｌ−プロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の各４ｍＭ水溶液を調製し、試料とした。
（２）検出方法
上記試料各２５０μＬを実施例８および９の各検出試薬（７５０μＬ）、ならびに比較例１および２の各試薬（７５０μＬ）にそれぞれ添加して混合し、３７℃で混合液の呈色を観察した。
従って、混合液中の各アミノ酸およびジペプチドの最終濃度は１ｍＭである。
また、対照として、試料の代わりに同量の水を添加して、同様に混合液の色の変化を観察した。
（３）検出結果
検出結果を表５に示した。
【００６３】
【表５】
2017133978.tif 000011
【００６４】
表５に示される通り、３−ブロモベンゼン−１，２−ジオールを含有する実施例８および９の各検出試薬を用いた場合にも、アミノ酸またはジペプチドを含有する試料溶液について、紫〜赤色の呈色が認められたが、ホウ酸緩衝液の代わりにリン酸緩衝液を含有する実施例９の検出試薬を用いた場合には、呈色の程度はやや弱かった。
【００６５】
［比較例３］ニンヒドリン反応によるアミノ酸またはペプチドの検出
比較のため、一般的なアミノ酸またはペプチドの呈色反応であるニンヒドリン反応により、アミノ酸またはジペプチドの検出実験を行った。
（１）試料
Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）およびＬ−アラニルグリシン（Ａｌａ−Ｇｌｙ）の各４ｍＭ水溶液を調製し、試料とした。
（２）検出方法
上記試料の各０．１ｍＬに、０．４５Ｍトリクロロ酢酸を０．５ｍＬ加え、次いで氷酢酸０．２５ｍＬおよびＣｈｉｎａｒｄ’ｓ試薬（ニンヒドリン２．５ｇを、氷酢酸６０ｍＬおよび６Ｍリン酸４０ｍＬに加温しながら溶解して調製した）０．２５ｍＬを添加して混合し、９０℃で１０分間加熱した。
上記の加熱後、ならびに２０℃に冷却して２時間後および２０時間後に、混合液の呈色を観察した。
混合液中の各アミノ酸およびジペプチドの最終濃度は０．３６ｍＭである。
また、対照として、試料の代わりに同量の水を用いて同様に処理し、混合液の色の変化を観察した。
なお、比較のため、各試料にトリクロロ酢酸、氷酢酸およびＣｈｉｎａｒｄ’ｓ試薬を添加して混合した後、３７℃で１０分間静置した後の呈色も観察した。
（３）検出結果
検出結果を表６に示した。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
本比較実験にて行ったニンヒドリン反応の反応条件は、特にプロリンについて強く呈色させる条件であるが、表６に示されるように、最終濃度が０．３６ｍＭのプロリンについて、９０℃で１０分間の加熱処理後に弱い呈色が認められるにとどまった。
また、他のアミノ酸およびジペプチドについては、加熱処理後にも明確な呈色は認められなかった。
上記ニンヒドリン反応による検出方法に比べて、本発明の上記実施例１、２、５、６、８、９の各検出試薬を用いた検出方法の場合は、視覚における評価で約２倍〜約５倍程度強い呈色が認められる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上、詳述したように、本発明により、アミノ酸およびペプチド（特にオリゴペプチド）を迅速かつ簡便に、さらに特異的に検出し得る検出方法、ならびに検出試薬を提供し得る。
従って、本発明の検出方法および検出試薬を用いることにより、食品や生体由来試料中のアミノ酸やペプチドを、迅速かつ簡便に検出し、または定量することが可能となる。