(57)【要約】【課題】新規なウレアーゼ活性阻害剤、ウレアーゼ阻害用組成物、ウレアーゼ阻害用組成物の製造方法、飲食物の製造方法、飲食物および土壌改良剤を提供すること。【解決手段】ワサビの葉とエタノール水溶液等の溶媒とを接触させた抽出液から、ヘキサン等を用いた分配抽出を行った後、ヘキサン層をカラムクロマトグラフィーによる分画により活性成分１、２を得る。活性成分１は、ジアシルホスファチジルエタノールであり、活性成分２は、スルホキノボシルジアシルグリセロールである。これらの活性成分１、２は、ウレアーゼ活性阻害剤として機能する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式１で示されるジアシルホスファチジルエタノール、および以下の化学式２で示されるスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とするウレアーゼ阻害用組成物。
【化１】
2017153447.tif 000005
【化２】
2017153447.tif 000006
【請求項２】
前記ジアシル化合物は、ワサビの葉由来であることを特徴とする請求項１記載のウレア
ーゼ阻害用組成物。
【請求項３】
ワサビの葉と溶媒とを接触させた抽出液から、以下の化学式３で示されるジアシルホスファチジルエタノール、および以下の化学式４で示されるスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有する組成物を得ることを特徴とするウレアーゼ阻害用組成物の製造方法。
【化３】
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【化４】
2017153447.tif 000008
【請求項４】
前記溶媒は、エタノール水溶液であることを特徴とする請求項３に記載のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抽出液に分配抽出を行って得た層から前記組成物を得ることを特徴とする請求項３または４に記載のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記分配抽出に用いた非極性溶媒の層からカラムクロマトグラフィーによる分画により前記組成物を得ることを特徴とする請求項５に記載のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法。
【請求項７】
前記カラムクロマトグラフィーでは、シリカゲルが固定相として充填されたカラムを用いた分離操作の後、オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型シリカゲルが固定相として充填されたカラムを用いた分離操作を行うことを特徴とする請求項６に記載のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項３乃至７の何れか一項に記載の方法により得た前記ウレアーゼ阻害用組成物を配合することを特徴とする飲食物の製造方法。
【請求項９】
ウレアーゼ阻害用組成物の抽出物を含む飲食物であって、
前記ウレアーゼ阻害用組成物は、以下の化学式５で示されるジアシルホスファチジルエタノール、および以下の化学式６で示されるスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とする飲食物。
【化５】
2017153447.tif 000009
【化６】
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【請求項１０】
ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した飲食物であって、
ワサビの葉を含有することを特徴とする飲食物。
【請求項１１】
以下の化学式７で示されるジアシルホスファチジルエタノール、および以下の化学式８
で示されるスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とする土壌改良剤。
【化７】
2017153447.tif 000011
【化８】
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【請求項１２】
ワサビの葉を含有することを特徴とする土壌改良剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼ阻害用組成物、ウレアーゼ阻害用組成物の製造方法、飲食物の製造方法、飲食物および土壌改良剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ）は、ヒト胃粘膜から分離培養されたグラム陰性の螺旋状短桿菌であり、胃や十二指腸の疾患に対し影響を及ぼすことが認められている。ピロリ菌にはウレアーゼやムチナーゼなどの病原因子が存在している。ウレアーゼは、尿素をアンモニアと二酸化炭素に加水分解する酵素であり、ピロリ菌は、ウレアーゼを利用して胃粘膜中の尿素からアンモニアを生成し、菌体表面を局所的に中和することにより、強酸性下での感染、増殖を可能にしている。従って、ウレアーゼの活性を阻害すれば、ピロリ菌の感染および定着の防止、胃十二指腸疾患の予防につながると考えられる。
【０００３】
一方、ピロリ菌のウレアーゼを阻害する技術が提案されている（特許文献１、２参照）。例えば、特許文献１には、プロアントシアニジンまたはその塩を、ウレアーゼ活性阻害剤として用いることが提案されている。また、特許文献２には、植物抽出物をウレアーゼ活性阻害剤として用いることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１５９６６９号公報
【特許文献２】特開平８−１１９８７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここに、本願発明者は、未だ着目されていない植物にウレアーゼ阻害能力を見出したものであり、本願発明の課題は、新規なウレアーゼ活性阻害剤、ウレアーゼ阻害用組成物、ウレアーゼ阻害用組成物の製造方法、飲食物の製造方法、飲食物および土壌改良剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本願発明者は、種々検討を行った結果、ワサビの葉に含まれる特性成分がウレアーゼ阻害能力を有するという新たな知見を得、かかる知見に基づいて、本願発明に到達した。
【０００７】
より具体的には、本発明に係るウレアーゼ阻害用組成物は、以下の化学式１で示されるジアシルホスファチジルエタノール、および以下の化学式２で示されるスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とする。
【０００８】
【化１】
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【０００９】
【化２】
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【００１０】
本発明では、ワサビの葉に含まれる特性成分（ジアシルホスファチジルエタノール、およびスルホキノボシルジアシルグリセロール）を利用しており、新規なウレアーゼ活性阻害剤を実現することができる。
【００１１】
本発明において、前記ジアシル化合物は、ワサビの葉由来である態様を採用することができる。
【００１２】
本発明のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法は、ワサビの葉と溶媒とを接触させた抽出液から、前記のジアシルホスファチジルエタノール、および前記のスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有する組成物を得ることを特徴とする。
【００１３】
本発明のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法においては、例えば、前記溶媒がエタノール水溶液である態様を採用することができる。
【００１４】
本発明のウレアーゼ阻害用組成物の製造方法においては、前記抽出液に分配抽出を行って得た層から前記組成物を得る態様を採用することができる。
【００１５】
この場合、前記分配抽出に用いた非極性溶媒の層からカラムクロマトグラフィーによる分画により前記組成物を得る態様を採用することができる。
【００１６】
本発明において、前記カラムクロマトグラフィーでは、シリカゲルが固定相として充填されたカラムを用いた分離操作の後、オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型シリカゲルが固定相として充填されたカラムを用いた分離操作を行う態様を採用することができる。
【００１７】
本発明は以下の態様として構成することができる。例えば、本発明に係る飲食物の製造方法では、本発明に係る上記のウレアーゼ阻害用組成物を配合して飲食物を製造することを特徴とする。また、本発明は、ウレアーゼ阻害用組成物の抽出物を含む飲食物であって、前記ウレアーゼ阻害用組成物は、前記のジアシルホスファチジルエタノール、および前記のスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とする。また、本発明に係る土壌改良剤は、前記のジアシルホスファチジルエタノール、および前記のスルホキノボシルジアシルグリセロールのうちの少なくとも一方のジアシル化合物を含有することを特徴とする。
【００１８】
本発明は、さらに以下の態様として構成することができる。例えば、本発明は、ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した飲食物であって、ワサビの葉を含有することを特徴とする。また、本発明に係る土壌改良剤は、ワサビの葉を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、ワサビの葉に含まれる特性成分（ジアシルホスファチジルエタノール、およびスルホキノボシルジアシルグリセロール）を利用しており、新規なウレアーゼ活性阻害剤、ウレアーゼ阻害用組成物、ウレアーゼ阻害用組成物の製造方法、飲食物および土壌改良剤を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第１工程で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図２】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で行う第２工程の説明図である。
【図３】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第２工程で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図４】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で行うカラムクロマトグラフィーによる分画工程の説明図である。
【図５】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第３工程で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図６】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第３工程で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図７】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第４工程で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図８】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図９】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図１０】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図１１】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【図１２】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１をアルカリ加水分解後にメチル化した成分のＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す説明図である。
【図１３】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２をアルカリ加水分解後にメチル化した成分のＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す説明図である。
【図１４】本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた組成物のウレアーゼ阻害活性の評価方法を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明では、ワサビの葉に含まれる特性成分がウレアーゼ阻害能力を有するという新たな知見を得、かかる知見に基づいて、本願発明に到達した。ワサビは、アブラナ科ワサビ属の植物で日本原産の香辛料である。ワサビの地下茎に多く含まれるアリルイソチオシアネートは、抗酸化作用、抗菌作用等の機能性が報告されているが、ワサビの葉については、アリルイソチオシアネートが地下茎程に多く含まれていない。本願発明者は、ワサビの葉を活用すべく、ワサビの葉に含まれる成分について検討した結果、ワサビの葉に含まれる特性成分がウレアーゼ阻害能力を有するという新たな知見を得るとともに、ワサビの葉に含まれる成分のうち、ウレアーゼ阻害能力を有する特性成分を特定した。
【００２２】
［ウレアーゼ阻害活性およびワサビの特定成分］
（ワサビの葉からの抽出液：工程ＳＴ１）
図１は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第１工程ＳＴ１で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【００２３】
まず、ワサビの乾燥葉中の成分を、５０％アセトン水溶液、７０％エタノール水溶液、メタノール、熱水、水の計５種の溶媒で抽出し、ウレアーゼ阻害活性を評価した。ウレアーゼの活性試験は、後述する方法に従い、試料１００μｌを加えた時の吸光度と未添加のコントロールとの比較から阻害率を求めた。
【００２４】
図１には、工程ＳＴ１で得た各抽出物のウレアーゼ阻害活性を示してある。比較のために、ウレアーゼ阻害活性が確認されているシナモンメタノール抽出物を比較として用いた。その結果、１００倍希釈においてメタノール抽出液および７０％エタノール抽出液（７０％エタノール水溶液で抽出した液）でそれぞれ９３．６％、９４．２％の阻害率を示し、７０％エタノール抽出液では、シナモンと同程度の活性が認められた。１０００倍希釈
では７０％エタノール抽出液の阻害率が高く、７０％エタノール抽出液で１６．０％、メタノール抽出液で１２．２％の阻害率を示した。
【００２５】
そこで、以下に説明するように、７０％エタノール抽出物に含まれるウレアーゼ阻害活性成分の検索を行った。
【００２６】
（分配抽出：工程ＳＴ２）
図２は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で行う第２工程の説明図である。図３は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第２工程ＳＴ２で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【００２７】
本形態では、図２に示すように、ワサビの葉１００ｇを用いて抽出液（７０％エタノール抽出物）を調製し（工程ＳＴ１）、阻害活性試験を行ったところ、２５０万倍の希釈率で９４．８％の阻害率を示した。この抽出液を、図２に示すように、ヘキサン、酢酸エチル、水飽和ブタノールで順次分配抽出した（工程ＳＴ２）。得られた各抽出液の液量を５Ｌとして２５０万倍の希釈率で阻害活性の評価を行い、阻害活性を比較した。その結果を図３に示す。その結果、ヘキサン層（非極性溶媒の層）では６０．０％、酢酸エチル層では４３．１％の阻害率を示し、両画分のウレアーゼ阻害活性を確認した。
【００２８】
（カラムクロマトグラフィーによる分画）
図４は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で行うカラムクロマトグラフィーによる分画工程の説明図である。図５は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第３工程ＳＴ３で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。図６は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第３工程ＳＴ４で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。図７は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法において第４工程ＳＴ５で得た組成物のウレアーゼ阻害活性を示すグラフである。
【００２９】
本形態では、図４に示すように、第２工程ＳＴ２で得たヘキサン層に対してカラムクロマトグラフィーによる分画を行った。まず、工程ＳＴ３では、ヘキサン層（非極性溶媒の層）をＷａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００（全多孔性破砕状シリカゲル、「Ｗａｋｏｇｅｌ」は、和光純薬工業株式会社の登録商標）を充填したカラムを用いて分画した。得られた画分のウレアーゼ阻害活性を図５に示す。Ｆｒ．１~１６のうち、Ｆｒ．１（１００％Ｈｅｘａｎｅ溶出画分）およびＦｒ．１４（３０％ＭｅＯＨ溶出画分）に活性が認められた。このうち、１００％Ｈｅｘａｎｅ溶出画分は低極性のワックスであることが示唆され、分画が困難であると考えられた。そこで、３０％ＭｅＯＨ溶出画分の分画を進めた。
【００３０】
まず、工程ＳＴ４では、３０％ＭｅＯＨ溶出画分（Ｆｒ．１４）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画したところ、図６に示すように、２０％ＭｅＯＨ溶出画分（Ｆｒ．１４−５）にウレアーゼ阻害活性が認められた。
【００３１】
次に、工程ＳＴ５では、Ｆｒ．１４−５を単一の溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分画を進めた。得られた画分をＴＬＣ分析にて同様のスポットを示す画分に合一し、活性測定を行った結果、図７に示すように、Ｆｒ．１４−５−３、４、６にウレアーゼ阻害活性が認められた。
【００３２】
次に、工程ＳＴ６および工程ＳＴ７では、Ｆｒ．１４−５−３、４〜６をＯＤＳカラムクロマトグラフィーによって精製し、逆相ＴＬＣ分析にてそれぞれ単一のスポットを示す画分を得た。工程ＳＴ６において、Ｆｒ．１４−５−３から活性成分１（２．８ｍｇ）、工程ＳＴ７において、Ｆｒ．１４−５−４〜６から活性成分２（４．０ｍｇ）をそれぞれ
得た。
【００３３】
（活性成分１）
図８は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。図９は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【００３４】
活性成分１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを得た（図８参照）。このスペクトルにおいて、１８０−１７０ｐｐｍのエステルカルボニル炭素のシグナル、１３０ｐｐｍ付近のオレフィン炭素のシグナル、７０−６０ｐｐｍ付近の範囲の酸素原子が結合したと考えられる炭素のシグナル、４０−２０ｐｐｍのメチレン炭素のシグナル、１４．７ｐｐｍと１４．５ｐｐｍのメチル基のシグナルが観測された。これらのことからグリセリンおよび脂肪酸の存在が示唆された。
【００３５】
また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た（図９参照）。このスペクトルにおいて、５．２６−５．４２ｐｐｍのシグナルからシス配置の２重結合の存在が示唆された。３．９７ｐｐｍ、４．１７ｐｐｍ、４．４３ｐｐｍ、５．２ｐｐｍの互いにカップリングしたシグナルからいずれも水酸基を持つ炭素に結合した水素のものであると考えられ、グリセロールの部分構造の存在が示唆された。０．８~２．８ｐｐｍの範囲のシグナルから、脂肪酸の存在が示唆され、カルボニル基に隣接したメチレンおよび二重結合の両側のメチレンのシグナルの数および積分値から２種の脂肪酸が結合していると判断した。さらに、１．２５ｐｐｍのメチル基のシグナル、３．９ｐｐｍのメチレンのシグナルから水酸基に結合したエチル基の存在が示された。
【００３６】
以上のことから活性成分１は２つの脂肪酸がグリセロールに結合したジアシルホスファチジルエタノールであると考えられた。また、文献値のスペクトルデータと比較したところ良い一致を示したことから、活性成分１は、ジアシルホスファチジルエタノールであると同定した。
【００３７】
（活性成分２）
図１０は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。図１１は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
【００３８】
活性成分２の１Ｈ−ＮＭＲ分析および１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った（図１０および図１１）。活性成分２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて活性成分１と同様に、１８０−１７０ｐｐｍのエステルカルボニル炭素のシグナル、１３０ｐｐｍ付近のオレフィン炭素のシグナル、７１．７、６７．１、６４．３ｐｐｍの酸素原子が結合したと考えられる３つの炭素のシグナル、４０−２０ｐｐｍのメチレン炭素のシグナル、１４．７ｐｐｍと１４．５ｐｐｍのメチル基のシグナルが観測された。これらのことから活性成分２も、活性成分１と同様、グリセリン及び脂肪酸を含むことが示唆され、脂質関連化合物であることが推定された。また、活性成分１と比較して１００−５０ｐｐｍにグリセリンのシグナルを除く６本のシグナル（１００．０、７５．０、７４．９、７３．５、６９．９、５４．２ｐｐｍ）が観測され、糖の存在が示唆された。５４．２ｐｐｍのメチレン炭素のシグナルが高磁場シフトしていることから、糖の６位炭素にスルホン基が結合していることが考えられ、糖部分はスルホキノボースであると示唆された。
【００３９】
活性成分２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータにおいても、５．２６−５．４２ｐｐｍの
シグナルからシス配置の２重結合、０．８~２．８ｐｐｍの範囲のシグナルから脂肪酸の部分構造、グリセロールの部分構造が予想され、グリセロールおよび脂肪酸の存在が示唆された。１３Ｃ−ＮＭＲにおいて存在が示唆されたスルホキノボース部分のシグナルも確認された。また、糖の結合様式はアノメリックプロトンのＪ値からα結合であると決定した。
【００４０】
これらのスペクトルデータを、単離されたスルホキノボシルジアシルグリセロールのスペクトルデータと比較したところ、良い一致を示し、以上の結果から、活性成分２は、スルホキノボシルジアシルグリセロールであると同定した。
【００４１】
（脂肪酸部分の構造）
図１２は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分１をアルカリ加水分解後にメチル化した成分のＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す説明図である。図１３は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた活性成分２をアルカリ加水分解後にメチル化した成分のＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す説明図である。
【００４２】
脂肪酸部分の構造を決定するために活性成分のアルカリ及び酵素加水分解を行った。アルカリ加水分解ではＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）を用いて加水分解し、ジエチルエーテル抽出して脂肪酸を得た。これを三フッ化ホウ素メタノールによってメチル化し、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析計）を用いて分析を行った。その結果、活性成分１、２のいずれにおいても、所定位置にピークが認められた。（図１２および図１３参照）。
【００４３】
これらのピークのＭＳのフラグメントパターンからそれぞれパルミチン酸メチル、リノレン酸メチル、リノール酸メチルであると同定した。このことから活性成分１、２の脂肪酸はパルミチン酸、リノレン酸およびリノール酸から構成されることが明らかとなった。
【００４４】
［具体的操作の内容］
（ａ）ウレアーゼ阻害効果の評価）
図１４は、本発明を適用したウレアーゼ阻害用組成物の製造方法で得られた組成物のウレアーゼ阻害活性の評価方法を示す説明図である。
【００４５】
（試薬の調製）
０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液
酢酸水溶液（２８．６ｍｌ／４００ｍｌ）と酢酸ナトリウム水溶液（２０．５１ｇ／２００ｍｌ）を調製し、それぞれ約３８０ｍｌと約１２０ｍｌを混合して約５００ｍｌ（ｐＨ４．１）に調整した。これを使用時に１０倍希釈し、エタノールと４：１で混合したものを０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液とした。
酵素溶液
ウレアーゼ粉末１５ｍｇを純水に溶解し、１００ｍｌとしたものをエッペンチューブに分注し、液体窒素で凍結した。これを冷凍して、使用する直前に氷上で融解し、１０倍希釈したものを酵素溶液とした。
基質溶液
尿素０．３ｇを５０ｍｌの純水に溶解したものを用いた。
発色試薬
フェノール５ｇとニトロプルシドナトリウム２５ｍｇを純水に溶解し、５００ｍｌとしたものをＡ液とした。水酸化ナトリウム水溶液（５ｇ／５００ｍｌ）１９．７ｍｌと次亜塩素酸ナトリウム０．３ｍｌを混合したものをＢ液とした。
【００４６】
（ウレアーゼ阻害活性の測定）
活性試験では、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液２．５ｍｌ、サンプル溶液０．１ｍｌ、酵素溶液０．４ｍｌを混合し、３７℃、５分間プレインキュベートした後、基質である０．６％尿素溶液１ｍｌを加えて酵素反応を開始した。これを３７℃で５分間の酵素反応の後、反応液２００μｌを採取し、純水で１０倍希釈した。この溶液に発色試薬Ａ液およびＢ液を各１ｍｌずつ加えて３７℃でさらに３０分間インキュベートした。得られた反応液の吸光度（６４０ｎｍ）を測定し、発生したアンモニアを定量した（図１４）。コントロールはサンプル溶液の代わりに純水０．１ｍｌを用いて同様の操作を行い、下記の式を用いて阻害率を算出した。
阻害率（％）＝（ＡＣ−ＡI）／ＡＣ×１００
Ａ１：サンプル添加時の吸光度
Ａ２：酵素反応０時間での吸光度
Ａ３：サンプルの吸光度
Ａ１’：コントロールの吸光度
ＡI：サンプル添加時の真の吸光度
ＡI=Ａ１−(Ａ２+Ａ３)
ＡＣ：コントロールの真の吸光度
ＡＣ=Ａ１’−Ａ２
【００４７】
（ｂ）ワサビの葉の抽出溶媒の検討（工程ＳＴ１）
ワサビの葉０．５ｇに水、熱水、メタノール、７０％エタノール水溶液または５０％アセトン水溶液をそれぞれ１０ｍｌ加え抽出した。各溶媒を添加後、室温で２４時間振とう抽出を行った。水に浸漬し、恒温槽中で、１００℃、２時間抽出を行ったものを熱水抽出物とした。その後、１０,０００×Ｇ、１０分間遠心分離を行い、その上清を抽出液とした。得られた抽出液を純水で１００倍および１０００倍に希釈し、活性を測定した。また、当研究室でウレアーゼ阻害を確認したシナモンをワサビの葉と同条件でメタノール抽出し、同じ希釈倍率で調製したものを比較として用いた。
【００４８】
（ｃ）ワサビの葉の７０％エタノール抽出液の調製
ワサビの葉１００ｇに７０％エタノール２．５Ｌを加え、５日間常温で浸漬抽出を行った後、吸引濾過によって残渣を濾別した。その残渣に７０％エタノール２．５Ｌを再度加え、５日間抽出後、抽出液と残渣に濾別した。それぞれ得られた濾液を合一し、７０％エタノール抽出液とした。この抽出液の一部（１００μｌ）を５０倍に希釈して活性を測定した。
【００４９】
（ｄ）７０％エタノール抽出液の分配抽出（工程ＳＴ２）
上記の（ｃ）で得られた７０％エタノール抽出液５Ｌを１Ｌまで減圧濃縮し、これを１Ｌのヘキサンで３回分配抽出を行った。この上層をヘキサン層とし、下層に酢酸エチル１Ｌを用いて３回分配抽出を行った。この上層を酢酸エチル層とし、下層に水飽和ブタノール５００ｍｌを用いて３回分配抽出を行った。その上層をブタノール層とし、下層を水層とした。得られたヘキサン層、酢酸エチル層、ブタノール層、水層の液量を５Ｌに換算し、この溶液１００mｌをそれぞれ５０倍に希釈して活性測定を行った。
【００５０】
（ｅ）ヘキサン層の分離・精製
（ｅ−１）ヘキサン層のカラムクロマトグラフィーによる分画（工程ＳＴ３）
上記の（ｄ）で得られたヘキサン抽出物（５．９ｇ）を同量のＷａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００に吸着させた後、乾固し、あらかじめヘキサンで充填したＷａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００（１００ｇ）のカラムに付加した。ヘキサン−酢酸エチル−メタノール混合溶媒系のステップワイズで１６画分に分画した。溶離液の組成はＨｅｘａｎｅ（ヘキサン）：ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）（=１００：０、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０
、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（メタノール）=９０：１０、８０：２０、７０：３０、０：１００とし、各４００ｍｌとした。得られた各画分の一部（１０μｌ）を溶媒留去後、エタノール１０μｌで溶解し、さらに５０倍に希釈したサンプルを調製して阻害活性試験に用いた。
【００５１】
（ｅ−２）３０％ＭｅＯＨ溶出画分の分離（工程ＳＴ４）
上記のｅ−１で得られた３０％ＭｅＯＨ溶出画分（Ｆｒ．１４、２７０ｍｇ）を濃縮後、シリカゲルカラム（１５ｇ、溶離液ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨのステップワイズ）で分画した。溶離液の組成は、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ=１００：０、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００とし、各々６０ｍｌ溶出させた。得られた画分の一部（１０μｌ）をそれぞれ５０倍に希釈し、阻害活性試験を行った。
【００５２】
（ｅ−３）Ｆｒ．１４−５の分画（工程ＳＴ５）
上記のｅ−２で得られたＦｒ．１４−５（８１ｍｇ）をシリカゲルカラム（４ｇ、溶離液＝Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ＭｅＯＨ、７：３）で分画した。各溶出液はＴＬＣ分析（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ＭｅＯＨ、８：２、１％Ｈ２Ｏ）によるスポットを指標として、同様のスポットを示す画分をそれぞれ合一し、計７画分とした。得られた画分の一部（５μｌ）をそれぞれ５００倍に希釈し、阻害活性試験を行った。
【００５３】
（ｅ−４）Ｆｒ．１４−５−３の精製（工程ＳＴ６）、活性成分１
上記のｅ−３で得られたＦｒ．１４−５−３（７．４ｍｇ）をＯＤＳカラム（１ｇ、溶離液＝Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨのステップワイズ）で分画した。溶離液の組成はＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ=１０：９０、８：９２、６：９４、４：９６、２：９８、０：１００、各１０ｍｌとして溶出させ、溶離液はそれぞれ２ｍｌずつ分取した。得られた画分は逆相ＴＬＣ分析（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ=１：９、１％酢酸）で成分の分離状態を確認し、スポットごとにまとめ、計４画分を得た。このうち単一のスポットを示したＦｒ．１４−５−３−３を活性成分１とした。ＯＤＳカラムとは、オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型シリカゲルが固定相として充填されたカラムである。
【００５４】
（ｅ−５）Ｆｒ．１４−５−４〜６の精製（工程ＳＴ７）、活性成分２
上記のｅ−３で得られたＦｒ．１４−５−４〜６（１３．３ｍｇ）をＯＤＳカラム（１．３ｇ、溶離液＝Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨステップワイズ）で分画した。溶離液の組成はＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ=５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００、各１０ｍｌとして溶出させ、溶離液はそれぞれ２ｍｌずつ分取した。得られた画分は逆相ＴＬＣ分析（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ=１：９、１％酢酸）で成分の分離状態を確認し、スポットごとにまとめた。このうち単一のスポットを示したＦｒ．１４−５−６を活性成分２とした。
【００５５】
（ｆ）活性成分のアルカリ加水分解
上記のｅ−４、５で得られた活性成分１、２にそれぞれ１M  ＮａＯＨを加えて、４０℃で１時間反応を行った。その後、２M  ＨＣｌを約０．２５ｍｌ加えてｐＨを約２に調整した。得られた加水分解物は等量のジエチルエーテルを用いて３回抽出を行い、遊離脂肪酸画分を得た。
【００５６】
（ｇ）脂肪酸のメチル化
上記の（ｆ）で得られたそれぞれの脂肪酸画分は三フッ化ホウ素メタノール溶液を用いて脂肪酸のメチル化を行った。各脂肪酸画分に三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノール溶液０．２ｍｌを加え、８０℃で２時間反応した。その後、反応液に等量の水、ヘキサンを加えて脂肪酸メチルエステルを抽出した。
【００５７】
（ｈ）ＧＣ−ＭＳ分析
上記の（ｇ）で得られたヘキサン層の脂肪酸メチルエステルをＧＣ−ＭＳ分析した。カラムにＳＬＢ−５ｍｓ（０．２５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｍ）を用い、キャリアガスにヘリウム（流速１．８６ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、カラム温度１８０℃、注入量１μｌでＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【００５８】
（ｉ）構造解析
活性成分１、２をＣD３ＯDに溶解してそれぞれ１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。１Ｈ−ＮＭＲ測定の際、ケミカルシフト値はＴＭＳ（テトラメチルシラン）を内部標準とし、（ｐｐｍ）で示した。
【００５９】
（本形態の効果）
以上説明したように、ワサビの葉から得られたジアシル化合物（ワサビの葉由来のジアシル化合物）は、ジアシルホスファチジルエタノール、およびスルホキノボシルジアシルグリセロールのいずれもウレアーゼ阻害機能を有している。従って、ジアシルホスファチジルエタノールを含有する組成物、スルホキノボシルジアシルグリセロールを含有する組成物、ジアシルホスファチジルエタノールを含有する組成物、スルホキノボシルジアシルグリセロールおよびジアシルホスファチジルエタノールを含む組成物は、ウレアーゼ阻害用組成物として利用することができる。
【００６０】
また、上記のジアシル化合物（ウレアーゼ阻害用組成物）を飲料や食品等の飲食物に配合すれば、ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した飲食物として提供することができる。すなわち、飲食物の製造方法では、上記の工程により抽出したジアシル化合物（ウレアーゼ阻害用組成物）の抽出物を配合して、飲料や食品等の飲食物を製造する。また、上記のジアシル化合物（ウレアーゼ阻害用組成物）を土壌改良剤に配合すれば、ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した土壌改良剤として提供することができる。
【００６１】
また、上記のジアシル化合物は、最終精製しなくても、工程ＳＴ１、工程ＳＴ２、工程ＳＴ３、工程ＳＴ４、工程ＳＴ５で得られた組成物から溶媒を除去した状態でも、ウレアーゼ阻害用組成物、飲食物および土壌改良剤等に用いることができる。
【００６２】
さらに、上記の工程を行わないワサビの葉をそのままの状態あるいは乾燥させた状態で、飲食物や土壌改良剤に配合すれば、ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した飲食物や、ウレアーゼの活性を阻害する効果を有する旨を表示した土壌改良剤として提供することができる。
【符号の説明】
【００６３】
ＳＴ１…第１工程、ＳＴ２…第２工程、ＳＴ３…第３工程、ＳＴ４…第４工程、ＳＴ５…第５工程、ＳＴ６…第６工程、ＳＴ７…第７工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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