(57)【要約】【課題】遺伝子組み換え手法を用いず、高水分吸収且つ低糊化温度の胚乳澱粉をもつ新規イネ変異体を提供する。【解決手段】  イネスターチシンターゼＳＳＩＩａの遺伝子座が劣性ホモであり、非遺伝子組み換え体のイネ変異体を得る。当該イネ変異体は、野生型と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている。また、精米を、過剰に水分を与えて簡易炊飯した際、炊飯後の水分増加率が野生型の１．１倍以上である。また、この変異体は、ＳＳＩＩａタンパク質を欠損する。さらに、このイネ変異体のイネ種子は、イネでは類い希な高水分吸収かつ低糊化温度の胚乳澱粉を含んでおり、炊飯した際、良食味である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャポニカ米由来のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａの遺伝子座が劣性ホモであり、
遺伝的に固定されており、
非遺伝子組み換え体である
ことを特徴とするイネ変異体。
【請求項２】
精米後のイネ種子に過剰に水分を与えて簡易炊飯した際、炊飯後の水分増加率が野生型の１．１倍以上である
ことを特徴とする請求項１に記載のイネ変異体。
【請求項３】
イネスターチシンターゼＳＳＩＩａタンパク質を欠損する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のイネ変異体。
【請求項４】
前記イネ種子を炊飯した炊飯米の水分増加率が、親系統である金南風よりも多い
ことを特徴とする請求項２又は３に記載のイネ変異体。
【請求項５】
前記イネ種子の胚乳の澱粉は、親系統イネの澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ６〜１２以下が増加され、ＤＰ１３〜２４が減少される
ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項６】
前記イネ種子の胚乳の澱粉は、前記ジャポニカ米の野生型イネを用いて製造される澱粉よりも糊化開始温度が６℃以上低い
ことを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項７】
前記イネ種子の胚乳の澱粉は、アミロースの割合が１０％〜２０％であり、前記ジャポニカ米の良食味品種と同等である
ことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項８】
前記イネ種子は、粉末化することで米粉及び澱粉としても利用可能である
ことを特徴とする請求項２乃至７のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項９】
請求項２乃至８のいずれか１項に記載のイネ変異体の前記イネ種子、及び／又は請求項８に記載の米粉を含んで製造された
ことを特徴とする食品。
【請求項１０】
非遺伝子組み換えの方式により、
ジャポニカ米由来のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａ遺伝子の劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させる
ことを特徴とするイネ変異体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ変異体、食品、及びイネ変異体の作出方法に係り、特にイネスターチシンターゼに変異を備えるイネ変異体、食品、及びイネ変異体の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖及びα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。
【０００３】
澱粉の生合成には、少なくとも４種類の酵素が関与していることが分かっている。この４種類の酵素は、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付加した余分な枝分かれ構造をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）である。なお、澱粉生合成に関与する酵素は、他にもあると考えられている（非特許文献１参照）。
【０００４】
これら、植物の澱粉生合成に関与している少なくとも４種類の酵素について、高等植物の場合は、多数のアイソザイムが存在し、澱粉生合成に関与している。アイソザイムは、同様の酵素反応を触媒するアミノ酸配列の異なる酵素群のことである。たとえば、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）には、１１種類ものＳＳ、３種類ものＢＥ、４種類ものＤＢＥが存在する。
近年、これらのアイソザイムは、組織特異性や、微妙な基質特異性によって、役割分担をしていることが分かってきた。
このようなアイソザイムの働きや役割を解明することは、アイソザイムの機能解明につながる。そして、アイソザイムの機能解明は、植物の澱粉生合成メカニズムの全体像の解明には欠かせない。
【０００５】
このため、従来から各アイソザイムの変異体が開発されてきた。特定のアイソザイムが欠失した変異体の表現型を調べることで、そのアイソザイムの働きや役割を知ることができる。
たとえば、各アイソザイムの機能を明確にするために、イネにおいて既に単離され、分析されている変異体には、ＳＳＩ（非特許文献２、特許文献１）、ＳＳＩＩａ（非特許文献３、特許文献２）、ＳＳＩＩＩａ（非特許文献４、特許文献３）、ＧＢＳＳＩ（非特許文献５）、ＢＥＩ（非特許文献６）、ＢＥＩＩｂ（非特許文献７）、ＩＳＡ１（非特許文献８）、ＰＵＬ（非特許文献９、特許文献４）、ＰＨＯ（非特許文献１０）等の変異体がある。
これらの変異体は、胚乳に蓄積する澱粉の構造が野生型とは異なることがある。その構造の違いに伴い、澱粉粒の大きさや熱糊化温度、熱糊化粘度が異なる等の物性を示すことがある。
【０００６】
さらに、従来から、様々なジャポニカ米を基にした変異体が単離されてきた。この中で、アミロペクチンの短鎖が豊富な変異体としては、イソアミラーゼ１（ｓｕｇａｒｙ−１）変異体が挙げられる（非特許文献８）。しかしながら、この変異体は、アミロペクチンの短鎖が極端に多くなるため、澱粉ではなく、可用性のフィトグリコーゲンを蓄積する。このため、完熟種子は、扁平となり、十分な収量が得られないデメリットがあった。また、アミロペクチンの短鎖が増加する別の変異体として、枝作り酵素ＢＥＩ変異体がある（非特許文献１０）。
【０００７】
一方、イネ品種は大きく、インディカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｄｉｃａ）品種と、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａ）品種とに分類される。インディカ米とジャポニカ米の澱粉は、その性質が明らかに異なっている。タイ米に代表されるインディカ米は、食感がパサパサしており、糊化温度がジャポニカ米と比べて高い。この原因は、主として２種類のスターチシンターゼの配列の塩基置換によるものである。そのスターチシンターゼの一つは、ＳＳＩＩａ遺伝子であり、もう一つはＧＢＳＳＩ遺伝子である。インディカ米は両遺伝子の野生型であり、ジャポニカ米は、塩基置換により変異型である。
【０００８】
具体的には、ジャポニカ米のＳＳＩＩａ遺伝子は、野生型（インディカ米）の配列と比べて４か所の塩基置換が生じており、そのうちの２か所の塩基置換が原因で、活性が野生型の１０％にまで低下している（非特許文献３）。ＳＳＩＩａの活性の大幅な低下により、ジャポニカ米の澱粉は、インディカ米の澱粉と比べて糊化温度が低い（非特許文献３）。また、我が国の従来の通常の栽培用のジャポニカ米の種子は、アミロペクチンの重合度（ＤＰ）６〜１２の短鎖が、インディカ米と比べて格段に多くなり、それにより糊化開始温度が低下するという澱粉の性質を持っているためである。
また、ジャポニカ米のＧＢＳＳＩ遺伝子は、野生型（インディカ米）の配列と比べて１か所の塩基置換が生じており、それが原因で正常なＧＢＳＳＩ遺伝子の発現量が野生型の１０％にまで低下している（非特許文献５及び非特許文献１１）。ＧＢＳＳＩ遺伝子の発現量の低下により、ジャポニカ米の澱粉は、インディカ米の澱粉と比べてアミロース含量が低い（非特許文献５）。
多くのジャポニカ米は、このような性質によって、インディカ米よりも加熱する際に煮えやすく、澱粉の老化もしにくいため、日本人が好む食味の炊飯米として食されてきた。これに加え、加工品としてもジャポニカ米の米粉が広く使われてきた。
【０００９】
なお、上述の非特許文献のイネの澱粉生合成を分析するための各アイソザイムに関する変異体は、全て、ジャポニカ米に分類される「日本晴」、「台中６５号」、「金南風」のいずれかの品種に由来する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−０７９２６０号公報
【特許文献２】特開２００５−２６９９２８号公報
【特許文献３】特開２００６−０５１０２３号公報
【特許文献４】特開２００７−０２０４７５号公報
【特許文献５】特開２０１１−０５５７６４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、ｐ．７１８−７２５
【非特許文献２】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｉ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ，  ２００６年、１４０、ｐ．１０７０−１０８４
【非特許文献３】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｒｃｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．  、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００５年、５８、ｐ．２１３−２２７
【非特許文献４】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＳＩＩＩａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）；  ｔｈｅ  ｆｕｃｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＳＩＩＩａ  ａｎｄ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ＳＳＩＩＩａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００７年４月、１４４、４、ｐ．２００９−２０２３
【非特許文献５】Ｙ．  Ｓａｎｏ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｘｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ、１９８４年、６８、ｐ．４６７−４７３
【非特許文献６】Ｈ．  Ｓａｔｏｈ他、Ｓｔａｒｃｈ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｉ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、１３３、ｐ．１１１１−１１２１
【非特許文献７】Ａ．  Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、ｐ．４５９−４７２
【非特許文献８】Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  α−ｐｏｌｙｇｌｕｃａｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｙ−１  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、イギリス、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９９７年、１２、ｐ．１４３−１５３
【非特許文献９】Ｎ．  Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＵＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＵＬ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年３月、６０、３、ｐ．１００９−１０２３
【非特許文献１０】Ｈ．  Ｓａｔｏｈ他、Ｐｌａｓｔｉｄｉｃ  α−ｇｌｕｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、２０、ｐ．１８３３−１８４９
【非特許文献１１】Ｉｓｓｈｉｋｉ  Ｍ他、Ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｗａｘｙ  ｌｏｃｕｓ  ｈａｓ  ａ  ＧＴ  ｔｏ  ＴＴ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ５'  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｔｒｏｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １５、１９９８年、ｐ．１３３−１３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、ジャポニカ米を元親として多くの澱粉変異体が開発されてきたが、これらの多くは、糊化温度がむしろ上昇するものが多く、糊化温度が低下するものは、少なかった。
また、ジャポニカ米から開発された変異体の中には、難消化性澱粉を多く含む変異体が多数あり、低カロリー米としての利用が期待されているが、これらの米は炊飯米としては食味がすぐれず、良食味を兼ね備えた低カロリー米の開発が切望されていた。
このため、おかゆのようにならず粒感がある米、又は糊化温度が低下することで老化しにくい実用性を高めた、且つ、低カロリー化が実現できるイネ変異体の作出が求められていた。
【００１３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のイネ変異体は、ジャポニカ米由来のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａの遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、精米後のイネ種子に過剰に水分を与えて簡易炊飯した際、炊飯後の水分増加率が野生型の１．１倍以上であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＳＳＩＩａタンパク質を欠損することを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子を炊飯した炊飯米の水分増加率が、親系統である金南風よりも多いことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳の澱粉は、親系統イネの澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ６〜１２以下が増加され、ＤＰ１３〜２４が減少されることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳の澱粉は、前記ジャポニカ米の野生型イネを用いて製造される澱粉よりも糊化開始温度が６℃以上低いことを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子の胚乳の澱粉は、アミロースの割合が１０％〜２０％であり、前記ジャポニカ米の良食味品種と同等であることを特徴とする。
本発明のイネ変異体は、前記イネ種子は、粉末化することで米粉及び澱粉としても利用可能であることを特徴とする。
本発明の食品は、前記イネ変異体の前記イネ種子、及び／又は前記米粉を含んで製造されたことを特徴とする。
本発明のイネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａ遺伝子の劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、イネ種子が、従来よりも水分吸収率が高く低糊化温度であるため、実用性が高く、炊飯の際に水分を多く含むことで低カロリーとなるイネ変異体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の完熟玄米の形態を示す写真である。
【図３】本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の完熟胚乳澱粉の鎖長分布解析のグラフである。
【図４Ａ】本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の登熟種子から抽出したＳＳＩＩａ遺伝子のｍＲＮＡ配列及び変異箇所のゲノムＤＮＡ塩基配列の構造を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ａに係るｍＲＮＡが翻訳された際のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜実施の形態＞
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
上述したように、従来から、いくつかの澱粉生合成に係るアイソザイムの変異体については、研究が進んでいた。たとえば、澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つイネ変異体において、ΔＢＥＩＩｂにおいては、澱粉の構造、物性が明らかになっており、各酵素の機能もある程度明確になっている。さらに、インディカ米とジャポニカ米の澱粉構造や物性の違いも、イネスターチシンターゼであるＳＳＩＩａやＧＢＳＳＩ遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）により異なることが明らかになってきている。ジャポニカ米のＳＳＩＩａ活性がインディカ米の１０％低下することで、その糊化温度が低下することも明らかになっている。
しかしながら、従来、ＳＳＩＩａ活性がゼロ、即ち、ＳＳＩＩａタンパク質を完全に欠いた変異体は存在せず、具体的な性質も知られていなかった。
【００１８】
これに着目した本発明の発明者らは、鋭意実験を行い、イネの澱粉の代謝系を網羅的に研究して有益な表現型をもつ新規変異体を探索し、ＳＳＩＩａ活性がゼロであるΔＳＳＩＩａの系統（ＥＭ２０４）を作出した。そして、作出したＥＭ２０４について解析したところ、ジャポニカ米である金南風のＳＳＩＩａ遺伝子の第５イントロンと第６エキソンの境界領域に生じたＳＮＰのため、金南風では翻訳されるはずの第６エキソンが翻訳されず、ＳＳＩＩａタンパク質の欠損につながっていた。また、ＥＭ２０４のアミロペクチンの鎖長分布は、ジャポニカ米である金南風よりもさらにＤＰ６〜１２が減少し、ＤＰ１３〜２４が増加していた。このようなアミロペクチンの構造変化から、ＥＭ２０４は金南風と比べて糊化開始温度及び糊化ピーク温度が有意に低く、十分に水分を与えて炊飯した際、水分増加率が有意に高かった。
このため、本発明の実施の形態に係るイネ変異体であるＥＭ２０４のイネ種子は、老化しにくい澱粉素材として利用でき、良食味且つ低カロリーとなった。
【００１９】
より具体的に説明すると、上述のように、従来、ＳＳＩＩａタンパク質が欠損した変異体は見つかっていないため、ＳＳＩＩａが完全に欠損したイネがどのような澱粉を蓄積するかは、不明であった。また、そのようなイネの胚乳澱粉がどのような性質を示すかも不明であった。突然変異源処理した何千、何万という系統の中から、ＳＳＩＩａタンパク質が欠損した変異体を見出すには、相当な実験を要する。また、遺伝子型をホモに固定させるために、抗体や分子マーカー等を用いて選抜し、澱粉構造を決定するため、大変な時間、手間が必要であった。このような理由から、通常、当業者は、このような変異体を単離することは、ほとんど不可能であった。
【００２０】
これに対して、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来のＳＳＩＩａ遺伝子の二重劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させることを特徴とする。すなわち、本実施形態では、非遺伝子組み換えの方式により、ＳＳＩＩａタンパク質が欠損し、その活性がゼロである変異体を作出し、遺伝的に固定させたことを特徴とする。
具体的に説明すると、本実施形態のイネ変異体であるＥＭ２０４は、突然変異源であるＭＮＵ（メチルニトロソウレア）を開花直後に処理した集団（ＥＭ系統）の中から、ＳＳＩＩａ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより見出した。すなわち、同抗体を用いて劣性ホモの種子を選抜し、その自殖種子の澱粉構造及び物性等について調べ、ＳＳＩＩａ活性がゼロである系統（ＥＭ２０４）を見出した。
【００２１】
また、作出された本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、ジャポニカ米由来のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａの遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態のイネ変異体であるＥＭ２０４は、既に遺伝的に固定された系統であり、この種子を植えて自殖によって稔った種子は全て同型質になる。このため安定して生産が可能である。
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、遺伝的に固定されているため、優良品種に対しても、ＥＭ２０４の性質を交配によって取り入れることができる。上述したように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体であるＥＭ２０４のイネ種子は、良食味且つ低カロリー、又は、老化しにくい澱粉素材として利用できるという性質がある。このため、例えば、優良品種にＥＭ２０４を交配し、ウエスタンブロッティングや分子マーカーでＳＳＩＩａが欠損していることを確かめながら、交配を繰り返すことで、当該優良品種に高水分吸収や低糊化温度の澱粉の性質を付与することが可能となる。また、将来的に優良品種と戻し交配することで農業的形質を向上させることも可能である。
さらに、本実施形態のイネ変異体は、非遺伝子組み換え体（非組換え体）であるため、一般の水田での栽培も可能となり、大規模栽培も可能である。
結果として、栽培用作物として、実用性が高い高水分吸収且つ糊化温度が低い胚乳澱粉を有するイネ変異体を提供することができる。
【００２２】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、イネスターチシンターゼＳＳＩＩａタンパク質が欠損することを特徴とする。ここで、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のＳＳＩＩａ遺伝子は、野生型における第６エキソンが翻訳されず、ＳＳＩＩａ活性がなくなることで実現されることを特徴とする。
具体的には、本発明者らが本実施形態のＥＭ２０４系統のｃＤＮＡ及びゲノム構造について調べたところ、ＥＭ２０４では、ＳＳＩＩａ遺伝子の第５イントロンと第６エキソンの境界領域に生じたＳＮＰのため、金南風では翻訳されるはずの第６エキソンが翻訳されず、ＳＳＩＩａタンパク質の欠損につながっていた。その結果としてＳＳＩＩａ活性がゼロとなる。
なお、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネスターチシンターゼＳＳＩＩａタンパク質を欠損させる方式として、イネ変異体のゲノム配列内に、他の種類の点突然変異、デリーション変異、トランスポゾンやレトロポゾンの挿入や引き抜きによる変異、偽遺伝子による発現制御等の変異を起こさせて、同等の結果を得ることも可能である。また、ＳＳＩＩａのゲノム配列の変異は、他のエキソン−イントロン境界の変異であっても、エキソン−イントロン境界でない領域、例えば、発現制御領域の変異であってもよい。
【００２３】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、精米後のイネ種子に過剰に水分を与えて簡易炊飯した際、炊飯後の水分増加率が野生型の１．１倍以上であることを特徴とする。
具体的には、本発明の実施の形態に係るイネ変異体であるＥＭ２０４の精米は、過剰な水分で炊飯した際に、金南風と比べて過剰に水分を吸収する。後述の実施例で説明するように、炊飯すると、野生型である金南風の精米の水分増加率は３０５±６％であるのに対し、ＥＭ２０４の精米の水分増加率は３６６±７％（平均±標準誤差、ｎ＝４）であった。すなわち、ＥＭ２０４は、炊飯時に野生型の約１．２倍の水分増加率を示す。ＥＭ２０４変異体米は、このように過剰な水分で炊飯した際に、炊飯米が通常より多くの水分を含むため、その分低カロリーとなる。たとえば、通常の炊飯器で炊飯した炊飯米の水分含量は６０％であるものの、ＥＭ２０４のような高水分吸収米で炊飯し、７０％の水分含量の炊飯米で、且つ、粒感があり、食味が良好であれば、２５％のカロリーオフが実現できることになる。
【００２４】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子の胚乳の澱粉は、親系統イネを用の澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ６〜１２以下が増加され、ＤＰ１３〜２４が減少されることを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子の胚乳の澱粉は、ジャポニカ米の野生型イネである金南風を用いて製造される澱粉よりも、糊化開始温度が６℃以上高いことを特徴とする。
具体的には、後述の実施例で示すように、ＥＭ２０４のアミロペクチンの鎖長分布は、ジャポニカ米である金南風よりも更にＤＰ６〜１２が減少し、ＤＰ１３〜２４が増加している。また、このようなアミロペクチンの構造変化から、ＥＭ２０４は金南風と比べて糊化開始温度が６℃程度低く、糊化ピーク温度が３℃程度、有意に低くなる。このため、上述したように、十分に水分を与えて炊飯した際、水分増加率が有意に高くなる。
また、ＥＭ２０４のイネ種子の澱粉は、金南風より糊化開始温度及び糊化ピーク温度が低いため澱粉が老化されにくくなる。澱粉の老化は、糊化した澱粉を冷却すると保持されていた水分が離水する現象である。ＥＭ２０４については、アミロペクチンの短鎖が相対的に多くなることに起因して、糊化開始温度及び糊化ピーク温度が低くなり、澱粉の老化がされにくくなると考えられる。澱粉の老化は、加工食品として利用する場合、澱粉性食品の劣化につながる。このため、本実施形態のＥＭ２０４は、澱粉の老化を抑えられることで、加工製品として使用する際に品質を高めることができる。
【００２５】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子の胚乳の澱粉は、アミロースの割合が１０％〜２０％であり、前記ジャポニカ米の良食味品種と同等であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態の変異米は、製造した澱粉のアミロースの割合が金南風と同等の１０％〜２０％であるため、炊飯した際の味わいがよく、実用的な食用米として用いることが可能である。実際に、ＥＭ２０４を７０％の水分含量になるように炊飯した際、芳、味、硬さ等の総合評価が、金南風より優れていた。
【００２６】
このように、本実施形態のイネ変異体は、金南風よりも水分吸収率が高く、糊化温度が低くなる。このため、低カロリー性を備えた炊飯米や加工食品として提供する際に、老化しにくい性質により、製品品質や美味しさを向上させることができる。
このため、本実施形態のＥＭ２０４の精米（イネ種子）は、低糖質の食品として提供でき、更に、各種健康食品やダイエット食品等に利用可能である。
【００２７】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子は、粉末化することで米粉としても利用可能であることを特徴とする。
すなわち、本実施形態の変異体米は、粉砕機等で粉砕して、米粉として使用することができる。また、本実施形態の変異体米から抽出した澱粉自体を、糊化温度が低い、老化しにくい澱粉として使用することも可能である。すなわち、本実施形態のイネ種子から製造される米粉及び澱粉は、高水分のため、低カロリー（低糖質）食品として提供することができる。
本発明の実施の形態に係るＥＭ２０４変異体米を粉砕した粉砕物である米粉は、パンや麺等に混合させて利用することができる。また、ソフトせんべい等の米菓等、様々な菓子に利用することができる。
また、このような本実施形態の変異体米及びこの粉末等を用いた食品は、麺、パン、ピラフ、かゆ、米菓等の米由来のダイエット素材として用いることが可能である。
【００２８】
以上のように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法においては、類い希な高水分吸収性及び低糊化温度をもつイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法を得ることができる。さらに、本発明は、当該澱粉を利用する飲食品及び工業製品に用いることができる。
【実施例】
【００２９】
以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００３０】
〔実験方法と材料〕
（ΔＳＳＩＩａであるＥＭ２０４変異体の単離）
胚を、突然変異源であるＭＮＵ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ、メタンニトロソウレア）処理を用いて選抜した。ＭＮＵ処理は、文献（Ｍ．Ｙａｎｏ他、Ｈｉｇｈ  ａｍｙｌｏｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ，  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ、１９８５年、６９、ｐ．２５３−２５７）に記載された方法に従って、金南風の開花初期の頴花をＭＮＵ処理することで作出した変異集団の中から高水分吸収米を選抜し、その中から、ウエスタンブロティングでＥＭ２０４を単離し、その澱粉の性質を調べた。
【００３１】
以下で、本実施例のＥＭ２０４変異体の作出法について説明する。本発明の発明者らは、九州大学が保有するジャポニカ米である金南風及び台中６５号（野生型）のＭＮＵ変異集団１５００系統の中から、簡易炊飯法により野生型の水分増加率が高い系統を１０系統選抜した。これら１０系統のイネＳＳＩＩａ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＳＳＩＩａタンパク質が欠損したＥＭ２０４を見出した。この結果については後述する。
【００３２】
ウエスタンブロッティングに用いる全タンパク質の抽出法について説明する。登熟種子１粒又は乳鉢で粉砕した完熟種子半粒分の米粉に４００μＬのＵｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ６．８、８Ｍ  Ｕｒｅａ、４％  ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール、１０μＬ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒカクテル（ｓｕｇｍａ）を加え、３０分室温で攪拌し、遠心分離することで上清を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１２％β−メルカプトエタノール  ０．２％ブロモフェノールブルー）を１／３量加えたもの１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。
【００３３】
ウエスタンブロッティングのためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法について説明する。電気泳動槽にアクリルアミドゲルをセットして泳動バッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ＳＤＳ）を注ぎ、ゲルのウェルに分子量マーカー（Ｃａｔ＃１６１−０３７３、Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を５μＬ、調製したサンプルを１０μＬずつアプライして、室温で電気泳動を行った。ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）フロントダイが濃縮ゲルを通過するまではゲル１枚あたり１０ｍＡの定常電流を流し、分離ゲルに到達した後ゲル１枚あたり２０ｍＡの電流を流して電気泳動を行い、ＢＰＢフロントダイがゲルの下から１ｃｍ程度になるまで電流を流し停止した。
【００３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に分離されたタンパク質を転写するためのメンブレン（ＰＶＤＦ膜、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＩＰＶＨ００１０）１枚と、ろ紙６枚をゲルと同じ程度の大きさに切り、メンブレンは１００％  ｍｅｔｈａｎｏｌに２０秒浸してから、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ、０．１％  ＳＤＳ）に浸した。ろ紙はそのまま、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒが湿るぐらい浸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒの入ったプラスチックケースに移して１５分間浸とうした。ブロッティング用電極の陽極側にｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙を３枚泡が入らないように重ね、その上にメンブレンを泡が入らないように重ね、次にゲルを泡が入らないように重ね、更にろ紙３枚を泡が入らないように重ねた。上部電極板（陰極）をセットし、メンブレン１枚当たり８０ｍＡの電流で１時間流した。１時間後、通電を止めてメンブレンをプラスチック容器に移し、ブロッキング液（４％スキムミルク／ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ））１５ｍＬを入れ、３０分間浸とうした（ブロッキング）。３０分後、１次抗体（本実験では４％スキムミルク／ＴＢＳで抗ＰＵＬ血清（非特許文献９）を７５０倍希釈したもの、抗ＳＳＩＩａ血清（非特許文献３）を２５０倍希釈したもの、抗ＧＢＳＳＩ血清（非特許文献２）を２５００倍希釈したものを添加して４℃で一晩ゆっくり浸とうさせた。
翌日、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、洗浄した。その後、４％スキムミルク／ＴＢＳ１０ｍＬと共に、抗ウサギヤギ血清パーオキシダーゼ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を５０００倍希釈した２次抗体を添加して約２時間ゆっくり浸とうさせた。その後、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２で１回洗い、ＴＢＳで１回洗った後、新しいＴＢＳに浸し、検出に用いた。
ウエスタンブロッティングを行ったメンブレンにＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｅｃｅ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｒｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１ｍＬかけることで発色させ、Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｓ４０００（富士フイルム株式会社製）で発色したバンドを写真に撮り、その画像データをソフトウェア：ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅを用いて、検出したバンドの明るさやコントラストを編集した。写真撮影後、メンブレンを蒸留水で十分に洗浄した後乾燥させ保存した。
【００３５】
（簡易炊飯法による水分増加率）
次に、簡易炊飯法による水分増加率の求め方について説明する。玄米をその重量が９０％になるまで精米し、１．５ｍＬのマイクロチューブに１粒入れ、重量を測定した。蒸留水１４０μＬを添加し、室温で３０分静置した。ヒートブロックを用いて１００℃で４０分間加熱した。その後、３０分間室温で静置した。キムワイプで炊飯米の付着水を軽くふき取り、重量を測定した。炊飯後の重量を炊飯米の重量で割り、１００をかけて１００を引くことで水分増加率を算出した。
【００３６】
（鎖長分布解析）
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末を用いた。
各々に５ｍＬのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２,５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍＬ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μＬ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸９．６μＬで中和した後、蒸留水を１０８９μＬ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μＬ、２％のアジ化ナトリウムを１５μＬ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を２μＬ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。
次に、イソアミラーゼを２μＬ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で濾過した。
次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９４、２０５−２１３（１９８１）参照）の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸）を２μＬ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン）を２μＬ添加し、５５℃で９０分間反応させた。
分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌｅ  ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌｅ  ％）のグラフを作成した。
【００３７】
（澱粉の精製方法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ  ２８：２４１−２４４（１９８１））を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍＬ加えて一晩４℃で放置した。
翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍＬ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
【００３８】
（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉及びアミロペクチン１０ｍｇに蒸留水０．２５ｍＬを加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えて、３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．６５ｍＬを加え、５ＮのＨＣｌを９０μＬ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１．５ｍＬ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μＬ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、３７℃で２４時間揺らしながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍＬ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍＬ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍＬ加えて、４℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
【００３９】
使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５Ｓ（３００×２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５０Ｓ（３００×２０ｍｍ）３本（両カラムとも、ＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍＬずつ分取し、６８本に分画し、各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλ  ｍａｘを求めた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＲＩ８０２０、ＴＯＳＯＨ社製）で検出した。
【００４０】
（示差走査熱量測定器ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）による糊化温度の測定）
１０５℃で２時間乾燥させた澱粉、約３ｍｇに、蒸留水９μＬを加えて混合し、昇温速度３℃／分で５℃から２００℃までの温度変化させたときの示差走査熱量をＤＳＣ６１００（セイコーインスツルメンス社製）で測定した。
その後、同機種のアプリケーションソフトを用いて、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量を算出した。
【００４１】
（登熟胚乳からのｍＲＮＡの抽出法及びｃＤＮＡ合成と塩基配列の決定）
本実施形態のＥＭ２０４系統の葉身ＤＮＡ及び登熟胚乳のｍＲＮＡからＳＳＩＩａ遺伝子を単離し、その変異位置を特定した。
具体的には、開花後１０日から１５日目の金南風及びＥＭ２０４の登熟種子を採取し、冷凍保存していた種子３粒の籾、胚を除去した。液体窒素で凍結したのち、マルチビーズショッカー（安井器械）で粉砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＦＷＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。
【００４２】
次に、トータルＲＮＡから、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、ＲＯ２６Ａ）を用いて、ｃＤＮＡを合成し、ＳＳＩＩａ領域を以下のプライマーを用いて増幅させた。
ＳＳＩＩａ＿ｃＤＮＡＦ：    ５'−ＡＡＧＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＡＡ−３'
ＳＳＩＩａ＿ｃＤＮＡ２Ｒ：  ５'−ＣＡＴＣＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴＧＣ−３'
０．８％アガロースゲルに、ＰＣＲ後の溶液を全量アプライし、２．７ｋｂ付近のバンドを切り出した。切り出したバンドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
上記のプライマーと下記のプライマーを用いて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ．３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  キット（ＡＢ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳＳＩＩａ遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
ＳＳＩＩａ＿ｃＤＮＡ１Ｆ：  ５'−ＣＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＧＴＡＧＡＣＡＡＧ−３'
ＳＳＩＩａ＿ｃＤＮＡ２Ｆ：  ５'−ＧＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧ−３'
【００４３】
得られた塩基配列を編集し、既にデータベースに公開されている日本晴ＳＳＩＩａ配列（ＡＢ１１５９１５）と比較し、エキソン及びイントロンの位置を想定した。その結果、エキソン６に相当するアミノ酸断片（１５残基）が欠失していることが明らかになった。この結果は、図４Ａ、図４Ｂを参照して後述する。この欠失の原因を探るため、この近傍のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）塩基配列を決定した。
ｇＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、マルチビーズショッカー（安井器械）で粉砕した金南風及びＥＭ２０４の葉身（５０ｍｇ）から抽出した。エキソン６の近傍領域を以下のプライマーで増幅した。
ＳＳＩＩａ＿ｇＤＮＡＦ：  ５'−ＣＣＡＶＡＡＶＧＴＡＴＴＣＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡ−３'
ＳＳＩＩａ＿ｇＤＮＡＲ：  ５'−ＧＡＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴ−３'
０．８％アガロースゲルに、ＰＣＲ後の溶液を全量アプライし、０．７６ｋｂ付近のバンドを切り出した。切り出したバンドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。上記のプライマー用いて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  キット（ＡＢ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳＳＩＩａ遺伝子のｇＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【００４４】
〔結果〕
まず、図１を参照して、ＥＭ２０４がＳＳＩＩａタンパク質を欠損していることを説明する。図１は、金南風（野生型）及びＥＭ２０４の完熟種子及び登熟種子から抽出した全タンパク質のウエスタンブロッティングを示す。１次抗体として抗イネＳＳＩＩａ血清及びコントロールのために、抗イネプルラナーゼ（ＰＵＬ）血清及び抗イネ結合型澱粉合成酵素（ＧＢＳＳＩ）血清も同時に用いた。図１の各レーンは、ＥＭ２０４（完熟種子）、ＥＭ２０４（登熟種子）がそれぞれ２検体ずつ、金南風（完熟種子）、金南風（登熟種子）である。
結果として、ＰＵＬやＧＢＳＳＩがいずれの種子からもバンドが得られているのに対し、ＳＳＩＩａバンドは、ＥＭ２０４では得られなかった。なお、これら３種の血清によって、ＳＳＩＩａ、ＰＵＬ、ＧＢＳＳＩと、それ以外の非特異的タンパク質（＊印）も反応するが、ＳＳＩＩａバンド（矢頭の位置）は、ＥＭ２０４の完熟及び登熟種子のいずれにおいても検出されなかった。このことから、ＥＭ２０４は、ＳＳＩＩａタンパク質を欠損していることが明らかになった。
【００４５】
次に、精米に過剰な水を加えて簡易炊飯した際の水分増加率を調べた。
下記の表１に、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の精米の水分増加率について示す：
【００４６】
【表１】
2017153452.tif 000003
【００４７】
表１において、数値は平均±標準誤差を示す。また、試験の検体数ｎ＝４である。「＊」は、Ｔ検定により金南風に対して有意差があったことを示す（Ｐ＜０．０１）。
金南風は水分増加率が３０５％であったのに対し、ＥＭ２０４は３６６％であり、ＥＭ２０４は金南風の約１．２倍と有意に高い値を示した。
【００４８】
次に、図２により、単離したＥＭ２０４の玄米の形態観察の結果を示す。
図２の金南風及びＥＭ２０４において、上図は完熟玄米の上から光を当てて撮影した写真、下図は完熟玄米の下から光を当てて撮影した写真である。
親系統である金南風は、玄米が透明であるのに対し、ＥＭ２０４は、中央部分が濁る心白乃至白濁の特徴を示した。
【００４９】
次に、金南風及びＥＭ２０４の玄米１粒重を測定した。
下記の表２に、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の玄米平均１粒重（ｍｇ）を示す：
【００５０】
【表２】
2017153452.tif 000004
【００５１】
表２において、各数値は、平均±標準誤差を示す（ｎ＝２０）。また、表の中カッコ［］内の値は、金南風（野生型）を１００％とした時の値（％）を示す。「＊」は、Ｔ検定により金南風と有意差があったことを示す（Ｐ＜０．０５）。
結果として、金南風が１９．４ｍｇであるのに対し、ＥＭ２０４は、１６．５ｍｇと、野生型の８５％程度であった。
【００５２】
次に、図３を参照して、アミロペクチンの鎖長分布解析について説明する。
図３はＥＭ２０４の胚乳澱粉の鎖長分布から金南風の鎖長分布Ｍｏｌａｒ％を引いた差分をモル比（ΔＭｏｌａｒ％）にて示すグラフである。横軸は、ＤＰ（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、グルコースの重合度を示す値である。縦軸は、ΔＭｏｌａｒ（％）を示す。ＥＭ２０４の胚乳澱粉の鎖長はＤＰ６〜１２において、金南風より多く、ＤＰ１３以上の鎖は少なかった。このように、ＥＭ２０４のアミロペクチンの鎖長分布パターンは、親系統の金南風よりＤＰ１２以下の短鎖の割合が多い、アミロペクチン構造をしていることが分かった。
【００５３】
次に、表３を参照して、ゲル濾過による各フラクションの割合について説明する。
下記の表３に、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の完熟胚乳の澱粉のゲル濾過による各フラクションの割合を示す：
【００５４】
【表３】
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【００５５】
表３は、ゲル濾過により検出される３つのフラクションの割合を示している。表３によると、澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉ、Ｆｒ．Ｉ）が見かけのアミロース含量、２番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ、Ｆｒ．ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖の含量、３番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ、Ｆｒ．ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖の含量をそれぞれ示す。また、アミロペクチンの長鎖に対する短鎖の割合（ＩＩＩ／ＩＩ）も示す。実験の検体数ｎ＝３である。
【００５６】
結果として、ＥＭ２０４胚乳澱粉の見かけのアミロース含量は、金南風と類似していた。具体的には、ＥＭ２０４は、アミロペクチンの長鎖がやや少なく、短鎖の割合がやや多かったものの、その割合は金南風と類似しており、有意差は見られなかった。
以上のことから、ＥＭ２０４の胚乳澱粉は、金南風と同等のアミロース含量の１０％〜２０％であることが明らかであった。
【００５７】
次に、下記の表４を参照して、ＥＭ２０４の澱粉の糊化温度について説明する。
表４は、本発明の実施の形態に係るΔＳＳＩＩａ（ＥＭ２０４）、それらの親変異体（金南風）の完熟胚乳の澱粉の示差走査熱分析装置（ＤＳＣ）による熱糊化特性を示す。
具体的に、表４は、ＥＭ２０４及びそれらの親変異体（金南風）の糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化熱量を示差走査熱量分析器（ＤＳＣ）で測定した結果を示す：
【００５８】
【表４】
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【００５９】
表４において、各値は、平均±標準誤差を示す。また、検体数ｎ＝３であり、「＊」は、Ｔ検定により金南風と有意差があったことを示す（Ｐ＜０．０５）。
結果として、ＥＭ２０４の糊化開始温度は、金南風より６．２℃低く、糊化ピーク温度は、３．３℃低かった。これらには、統計的有意差が見られた。一方、ＥＭ２０４の糊化終了温度は金南風より１．０℃低く、糊化熱量は、２．１ｍＪ／ｍｇ低かったが、これらには有意差は見られなかった。以上のことから、ＥＭ２０４胚乳澱粉の糊化開始温度及び糊化ピーク温度は、親系統である金南風より有意に低いことが明らかになった。
【００６０】
次に、図４Ａ、図４Ｂを参照して、ＥＭ２０４のＳＳＩＩａ遺伝子の塩基配列の変異について説明する。
【００６１】
図４Ａは、金南風のイネＳＳＩＩａ遺伝子の構造と、ＥＭ２０４の欠損部位をあらわした図である。具体的には、ＥＭ２０４は、金南風と比べると、エキソン６の１５アミノ酸が欠損していた。この欠損の原因は、ゲノムＤＮＡ塩基配列により、明らかにされた。すなわち、イントロン５とエキソン６の境界領域について、金南風が「Ｇ」であるのに対し、ＥＭ２０４は「Ａ」に変異しており、その結果、イントロン５が終了せず、エキソン６と共にスプライスされたと考えられる。
図４Ｂは、金南風とＥＭ２０４のアミノ酸配列を比較した図である。ＥＭ２０４では、エキソン６に相当する１５残基のアミノ酸が欠損しており、エキソン５とエキソン７が直接連結した短い配列となっている。図１のウエスタンブロッティングで、ＥＭ２０４で検出されている非特異的（＊）と示したＳＳＩＩａバンドよりわずかに低分子量の薄いバンドは、その短い配列のタンパクに相当すると考えられる。また、当該バンドが薄いのは、不安定化したタンパク質が一部分解されたためであると考えられる。また、完熟種子ではこのバンドが完全に欠失していた。
この図４Ｂに示す配列は、配列表として添付される。具体的には、配列番号１が、ＥＭ２０４のｃＤＮＡ、配列番号２がＥＭ２０４のゲノムＤＮＡ（エキソン４〜６に当たる箇所）、配列番号３がアミノ酸配列を示す。
【００６２】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、ジャポニカ米由来のＳＳＩＩａタンパク質が欠損し、その活性がゼロになり、その種子が高水分吸収かつ糊化温度の低い澱粉の性質をもつイネ変異体を提供でき、当該イネ変異体の種子の澱粉は、イネでは類い希な高水分吸収と低糊化温度澱粉であるため、産業上利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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