(57)【要約】【課題】フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供すること。【解決手段】フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。
【請求項２】
商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法。
【請求項３】
商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法。
【請求項４】
前記水溶液は、エタノール又はメタノールを含む、請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
フルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。
【請求項６】
商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法。
【請求項７】
商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法。
【請求項８】
前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液の温度が５℃〜７５℃である、請求項１〜７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液から結晶化したフルオレセインナトリウムを分離し、乾燥させる操作／ステップを伴う、請求項１〜８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
除塵操作を伴う、請求項１〜９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム。
【請求項１２】
実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム。
【請求項１３】
ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上のピークを有さない、フルオレセインナトリウム。
【請求項１４】
請求項１１〜１３の何れか１項記載のフルオレセインナトリウムを含む、眼科用診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルオレセインナトリウムの精製方法、高純度フルオレセインナトリウム及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、フルオレセインナトリウムは、眼科学における診断試薬として広く使われている。フルオレセイン点眼剤はドライアイ、角膜の擦過傷、潰瘍、角膜ヘルペスなどの診断に効果的であり、フルオレセイン造影剤は加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などの識別に利用されている。
【０００３】
市販されている商用グレードのフルオレセインナトリウムは、医薬品として用いるには純度が低いので、医薬品グレードとするためには精製するなどして純度を高めることが求められる。
【０００４】
特許文献１には、商用グレードのフルオレセインナトリウムをＯ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインに転化させ、次に、当該Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインに転化させてフルオレセインに戻し、ナトリウム塩を形成し、最終不純物を除去して、実質的に純粋なフルオレセインを調製する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５３８４３６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示されるフルオレセインの調製方法は、化学構造の変化を伴うフルオレセインの調製方法であり、フルオレセインナトリウムを直接的に得る調製方法ではない。
【０００７】
フルオレセインナトリウムの純度を高めるために、再結晶化する手法が考えられる。しかしながら、従来からのフルオレセインナトリウムの再結晶化方法では、再結晶化したフルオレセインナトリウムに有機溶媒が残留し、有機溶媒を除去することが困難であった。
【０００８】
本発明は、フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、精製に供するフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えてフルオレセインナトリウムを結晶化させることにより、実質的に有機溶媒を含有せず、かつ、純度が９９．５％を超える、フルオレセインナトリウムが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１０】
（１）本発明は、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法である。
【００１１】
（２）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
【００１２】
（３）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
【００１３】
（４）また、本発明は、前記水溶液は、エタノール又はメタノールを含む、（１）〜（３）の何れか１項に記載の方法である。
【００１４】
（５）また、本発明は、フルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法である。
【００１５】
（６）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
【００１６】
（７）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えるステップ、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
【００１７】
（８）また、本発明は、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液の温度が５℃〜７５℃である、（１）〜（７）の何れか１項に記載の方法である。
【００１８】
（９）また、本発明は、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液から結晶化したフルオレセインナトリウムを分離し、乾燥させる操作／ステップを伴う、（１）〜（８）の何れか１項記載の方法である。
【００１９】
（１０）また、本発明は、除塵操作を伴う、（１）〜（５）の何れか１項に記載の方法である。
【００２０】
（１１）また、本発明は、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムである。
【００２１】
（１２）また、本発明は、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムである。
【００２２】
（１３）また、本発明は、ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上のピークを有さない、フルオレセインナトリウムである。
【００２３】
（１４）また、本発明は、（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを含む、眼科用診断試薬である。
（１５）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断のための試薬の製造のための（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
（１６）また、本発明は、眼科用診断試薬ないし眼疾患診断試薬を製造するための、（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
（１７）また、本発明は、眼科用診断試薬ないし眼疾患診断試薬としての使用のための（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムである。
（１８）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断のための（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
（１９）また、本発明は、（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを用いて眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法である。
（２０）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断を必要とする対象に（１１）〜（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを適用することにより、眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法である。
（２１）また、本発明は、前記眼科用診断ないし眼疾患の診断が角結膜障害、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、及び眼内の炎症からなる群より選択される少なくとも１つの診断である、（１４）〜（２０）の何れか１項に記載の発明である。
（２２）また、本発明は、前記角結膜障害がドライアイ、角結膜の擦過傷、潰瘍、及び角膜ヘルペスからなる群より選択される少なくとも１つである（２１）に記載の発明である。
（２３）また、本発明は、前記試薬が点眼剤及び／又は造影剤である、（１４）〜（１７）の何れか１項に記載の発明である。
（２４）また、本発明は、前記フルオレセインナトリウムが点眼剤及び／又は造影剤に含まれる、（１４）〜（２２）の何れか１項に記載の発明である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供できるという優れた効果がある。本明細書において、「実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム」は、実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウムを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施例１で得られた医薬品グレードのフルオレセインナトリウムの外観写真である。
【図２】本発明の実施例１で用いた試薬Ａ（商用グレードのフルオレセインナトリウム）の外観写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００２７】
＜フルオレセインナトリウムを精製する方法＞
本発明のフルオレセインナトリウムを精製する方法は、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む。具体的には、本発明のフルオレセインナトリウムを精製する方法は、精製に供するフルオレセインナトリウムに水を加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程、前記水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加える工程、及び、前記２−プロパノール又は２−ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させる工程を含む。精製に供するフルオレセインナトリウムにメタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とを加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程を含む。上記水溶液に溶解させるフルオレセインナトリウムは、典型例としては、精製に供するフルオレセインナトリウム（通常、精製に供するフルオレセインナトリウム組成物である。以下、同様。）であり、これは下記のように表される。
【００２８】
精製に供するフルオレセインナトリウムは、フルオレセインナトリウム以外に、フルオレセインの合成時に生じる副生成物、異性体など、また、酸化生成物、及び分解生成物などを含有する市販のフルオレセインナトリウムであってもよいし、純度が９９．５％以下、例えば、９９．３％以下、９９．２％以下、通常、市販品によくある９０〜９７％程度、具体的には、９０.０％以上９９．５％以下、９３．０％以上９９．０％以下、９６．０％以上９８．５％以下、より具体的には、９３．０％以上９４．０％以下又は９７．０％以上９８．０％以下、さらに具体的には９３．０％以上９３．９％以下又は９７．０％以上９７．９％以下である通常純度のフルオレセインナトリウムであってもよい。本明細書において、これらの市販のフルオレセインナトリウム、通常純度のフルオレセインナトリウムを「商用グレードのフルオレセインナトリウム」と総称する。本明細書において、化合物としてのフルオレセインナトリウムと、該フルオレセインナトリウム以外の成分とを含むものを「フルオレセインナトリウム組成物」ということがある。該フルオレセインナトリウム以外の成分としては、例えば、上述の副生成物、異性体、酸化生成物、分解生成物などの不純物が挙げられ、また、精製に用いる水、２−プロパノール、２−ブタノールなどの溶媒などが挙げられる。
【００２９】
フルオレセインナトリウムの純度とは、かかるフルオレセインナトリウム組成物中のフルオレセインナトリウムの含有率であり、高速液体クロマドグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて後述する条件により分析した分析結果から得られるものである。本明細書において、純度が９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム（具体的には、フルオレセインナトリウム組成物である。）を「高純度フルオレセインナトリウム」ということがある。通常、高純度フルオレセインナトリウムは、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）を含む。本明細書において、「医薬品グレードのフルオレセインナトリウム」とは、純度が９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）を意味する。
【００３０】
本発明によれば、商用グレードのフルオレセインナトリウムから、実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。
【００３１】
ここで、「実質的に有機溶媒を含有しない」とは、フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）に含有される有機溶媒が０．５質量％以下であることをいう。残留する有機溶媒の含有量は核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）の測定結果に基づいて定量することができる。核磁気共鳴スペクトルでは、溶媒として重水を用い、例えばエタノールは、フルオレセイン由来の７．８ｐｐｍ付近のピークの積分値を１としたとき、３．６５ｐｐｍ付近のピークの積分値をＡとし、また、２−プロパノールは、フルオレセイン由来の７．８ｐｐｍ付近のピークの積分値を１としたとき、１．１７ｐｐｍ付近のピークの積分値をＢとすると、エタノールと２−プロパノールの質量％はそれぞれ、以下の計算式で算出できる。
2017095453.tif 000002
【００３２】
次に、フルオレセインナトリウムを精製する方法の好ましい例について具体的に説明する。
実製造における現実的な量でフルオレセインナトリウムを溶解できる有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどが好ましい。具体的には、上述の、精製に供するフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程は、精製に供するフルオレセインナトリウムにメタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とを加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程であることが好ましい。かかる工程において、精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、メタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とは実質的に同時に加えてもよいが、前者を加えた後、後者の水を加えることが好ましく、具体的には、まず初めに、精製に供するフルオレセインナトリウムを少量の良溶媒となるメタノール又はエタノールに溶解させた後、水を加えて水溶液とすることが好ましい。該水溶液を得る工程において、より具体的には、精製に供するフルオレセインナトリウムをメタノール又はエタノールに溶解させた後、ガラスフィルターなどの濾材を用いて濾過し、好ましくはさらに、先に用いたメタノール又はエタノールで洗浄して得られる濾液又は該濾液の濃縮物（湿固体であってもよい）に水を加えてもよいし、該濾液の濃縮物（湿固体であってもよい）若しくは乾固物に対し、先に用いたメタノール又はエタノールを加えてフルオレセインナトリウムの溶液を得た後、該溶液に水を加えてもよい。そして、この水溶液に貧溶媒となる２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて熟成し、再結晶化させることによってフルオレセインナトリウムを精製することができる。
熟成温度は、５℃以上７５℃以下が好ましく、６５℃以上（かつ７５℃以下）に加温した後、１５℃以下（かつ５℃以上）まで冷却（自然冷却も含む）することがより好ましい。熟成時間は、回収量にもよるが、１時間以上が好ましく、３時間以上２４時間以内がより好ましい。上記条件で熟成することにより、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム、又は高純度フルオレセインナトリウムを得ることが可能となる。
【００３３】
また、精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、貧溶媒である２−プロパノール又は２−ブタノールの添加量は、５ｖ／ｗ以上２０ｖ／ｗ以下が好ましく、８ｖ／ｗ以上１０ｖ／ｗ以下がより好ましい。精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、良溶媒であるメタノール又はエタノールの添加量は、０ｖ／ｗ以上３ｖ／ｗ以下が好ましく、０．１ｖ／ｗ以上２．０ｖ／ｗ以下がより好ましい。良溶媒としては、メタノール単独又はエタノール単独に限られず、メタノールとエタノールの混合溶媒であってもよい。貧溶媒としては、２−プロパノール単独又は２−ブタノール単独に限られず、２−プロパノールと２−ブタノールとの混合溶媒であってもよい。水（Ｈ２０）の添加量は、０．３ｖ／ｗ以上２．０ｖ／ｗ以下が好ましく、１．３ｖ／ｗ以上１．８ｖ／ｗ以下がより好ましい。なお、「溶媒量（ｖ／ｗ）」は、精製に供するフルオレセインナトリウムの質量（ｇ）に対する溶媒の体積（ｍＬ）を表す。溶媒を上記範囲の添加量とすることにより、フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物であってもよい。）に含まれる有機溶媒を実質的になくすことが可能となり、後述するように、所望の結晶形態を有する、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。
【００３４】
熟成後、再結晶化して析出したフルオレセインナトリウムを固液分離で取り出し、先に使用した２−プロパノール又は２−ブタノールにより洗浄して湿固体を取り出し、乾燥させることにより、所望の実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。固液分離や乾燥は、効率良く溶媒を除去するために、減圧下で行うことが好ましい。減圧する場合は、０．０１ＭＰａ以下が好ましく、０．００５ＭＰａ以下がより好ましい。乾燥温度は、３０℃以上１００℃以下が好ましく、８０℃程度がより好ましい。また、乾燥温度が２−プロパノール又は２−ブタノールの沸点を超える場合には、常圧で乾燥してもよい。
【００３５】
上記固液分離の際には、得られるフルオレセインナトリウムを医薬品として用いる場合、前処理として、除塵操作を行う必要がある。除塵操作は、製造管理及び品質管理基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）を満たす操作であれば特に限定されないが、濾紙を用いた粗濾過若しくはガラスフィルターを用いた精密濾過がより好ましい。除塵操作は、固液分離に先立ち、フルオレセインナトリウムの再結晶化又はそれ以前において行うことが好ましく、熟成後かつ再結晶化以前において行うことがより好ましい。
【００３６】
なお、上述した精製方法は、１回に限らず、さらに純度を上げるために、上述した精製方法を２回以上繰り返してもよい。上述した精製方法を繰り返す場合、繰り返す回数は、上記範囲内であれば特に限定されないが、工業性、効率などの点で、１０回以下が好ましく、８回以下がより好ましく、５回以下がさらに好ましい。
【００３７】
フルオレセインナトリウムの純度が上がりにくい場合や、さらに純度を上げたい場合には、固液分離され洗浄された湿固体（以下、試料という）を容器に入れ、加湿・加温下静置した後、減圧乾燥してもよい。試料の厚みは、０．５ｍｍ〜４ｃｍが好ましく、温度は１５℃〜８０℃が好ましく、湿度は３０％ＲＨ〜１００％ＲＨが好ましい。静置時間は、５時間〜４８時間が好ましく、１０時間〜２０時間がより好ましい。減圧は、０．０１ＭＰａ以下が好ましく、０．００５ＭＰａ以下がより好ましい。乾燥温度は、３０℃以上１００℃以下が好ましく、７０℃以上９０℃以下がより好ましい。
【００３８】
＜実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法＞
本発明の実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２−プロパノール又は２−ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む。当該方法は、上述したフルオレセインナトリウムを精製する方法で説明した条件と同様の条件により、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインを製造する方法である。
【００３９】
本発明によれば、商用グレードのフルオレセインナトリウムから、医薬品グレードの実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造することができる。
【００４０】
＜実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウム＞
フルオレセインナトリウムは、下記の式で示される。
【化１】
2017095453.tif 000003
【００４１】
本発明においてフルオレセインナトリウムの純度は、高速液体クロマドグラフィ（ＨＰＬＣ）により下記の条件により分析した時のフルオレセインナトリウム成分の面積百分率（以下、ＨＰＬＣ純度ということがある）から定量したものである。
装置：Ｗａｔｅｒｓ製ＨＰＬＣ  （Ｗａｔｅｒｓ  ２９９８  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｅｒ，  Ｗａｔｅｒｓ  ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ、ＳＭＣ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈｅａｔｅｒ）
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ８  ４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度：４５℃
検出波長：ＵＶ  ２８０ｎｍ
移動相Ａ：１％酢酸水溶液（ｐＨ２．８）
移動相Ｂ：メタノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
クランジェント条件：下記の表１の通りである。
【００４２】
【表１】
2017095453.tif 000004
【００４３】
また、本発明の高純度フルオレセインナトリウムは、実質的に有機溶媒を含有しないことを特徴とする。残留する有機溶媒の含有量は、上述したように、核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）を測定し、測定した核磁気共鳴スペクトルに基づいて含有量を定量することができる。
【００４４】
フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）が含有する有機溶媒の量は、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、フルオレセインナトリウムの結晶形態に依存していることがわかった。本発明の実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムの結晶形態（以下、結晶形態Ａという）は、有機溶媒を含有しにくい結晶形態を有している。
この結晶形態Ａは、ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上の回折ピークを有さないことによって特徴付けられる。さらに、結晶形態Ａを特徴付ける相対強度が２５％以上の回折ピークとして、回折角（２θ±０．２°）９．７°、１４．０°の回折ピークが挙げられ、さらに、回折角（２θ±０．２°）２２．６°の回折ピークが挙げられる。なお、粉末Ｘ線回折においては、回折角の値は±０．２°の測定誤差を生じる。回折角（２θ±０．２°）２６．４°の回折ピークの相対強度は、５０％以上であってよく、７０％以上であってもよい。
【００４５】
結晶形態Ａを有するフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回析装置（ＲＩＮＴ−ＵｌｔｉｍａＩＩＩ：リガク社製）を用いて下記の測定条件でＸ線回析した。結晶形態Ａの粉末Ｘ線回析データを表２に示す。
（測定条件）
Ｘ線源：  Ｃｕ
電圧：  ４０ｋＶ
電流：  ４０ｍＡ
発散スリット：  １．０ｍｍ
発散縦制限スリット：  １０ｍｍ
散乱スリット：  開放
受光スリット：  開放
第１スリット：  なし
第２スリット：  なし
入射スリット：  なし
受光スリット：  なし
走査モード：  連続
サンプリング幅：  ０．０２００°
走査範囲：  ５．００００°−４０．００００°
積算回数：  １
スキャンスピード：  ４．０００°／ｍｉｎ．
走査軸：  ２θ／θ
θオフセット：  ０．００００°
【００４６】
【表２】
2017095453.tif 000005
【００４７】
＜眼科用診断試薬＞
上述した実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムは、眼科用検査用試薬として用いることができる。眼科用検査用試薬は、通常、眼疾患の診断のための試薬であり、眼科用診断試薬ともいう。具体的には、点眼剤として、角結膜障害の診断、例えばドライアイ、角結膜の擦過傷、潰瘍、角膜ヘルペスなどの診断に有効である。また、造影剤として、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などの識別にも有効である。
実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム若しくは高純度フルオレセインナトリウムを用いて眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法もまた、本発明の一つである。かかる診断方法は、通常、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム若しくは高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を点眼剤として眼に滴下し、例えば、黄緑色に染色すれば角結膜障害があると診断することができ、また、造影剤として眼に滴下し、例えば、血管の状態を把握することができ、病変を検出できれば加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などであると診断することができる。
【００４８】
以下、実施例を基に本発明をさらに詳細に説明する。
【００４９】
［実施例１］
市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ａ］１ｇを特級エタノール（濃度９９．５体積％）２ｍＬに加えて１時間かけて撹拌溶解させ、水１．４ｍＬを加えて、７５℃まで加熱した。特級２−プロパノール（濃度９９．７体積％）１０ｍＬを加えた後、約１８時間かけて撹拌冷却して１２℃とした。析出した固体を減圧下で固液分離し、特級２−プロパノール１ｍＬで３回洗浄した。得られた湿固体を減圧下８０℃で乾燥し、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率３５．７％）を得た。減圧は０．１ｋＰａ以上、１ｋＰａ以下の範囲内で行った（以下、同様）。
【００５０】
［実施例２］
実施例１の［試薬Ａ］の代わりに市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｂ］を用いること以外は、実施例１と同様な操作を行うことにより、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４４．１％）を得た。
【００５１】
［実施例３］
実施例１の［試薬Ａ］の代わりに市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｃ］を用いること以外は、実施例１と同様な操作を行うことにより、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４２．１％）を得た。
【００５２】
実施例１〜３で得た各フルオレセインナトリウムの純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量し、残留溶媒の質量を核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）を用いて定量した。結果を表３に示す。表中の％は、質量％を示す。また、図１に実施例１で得られた医薬品グレードのフルオレセインナトリウムの写真を示し、図２に試薬Ａの商用グレードのフルオレセインナトリウムの写真を示す。
【００５３】
【表３】
2017095453.tif 000006
【００５４】
［結果・考察］
図２に示す試薬Ａの商用グレードのフルオレセインナトリウムの茶褐色の粉末は、図１に示す高純度フルオレセインナトリウムの橙色の粉末に精製された。他の実施例でも同様であった。表３から明らかなように、商用グレードのフルオレセインナトリウム（試薬Ａ〜Ｃ）から、残留溶媒が０．２％以下である、高純度フルオレセインナトリウムを得られることが確認された。したがって、実施例１〜実施例３により得られるフルオレセインナトリウムは医薬品グレードのフルオレセインナトリウムとして適用できる。
【００５５】
［実施例４］
市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｄ：純度９９．２％）２０ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）２００ｍＬの混合溶液を室温で１時間１５分間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール２０ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮・乾固し、特級２‐プロパノール（濃度９９．７体積％）４０ｍＬを加えて減圧下濃縮する操作を３回繰り返した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）にてエタノール、２−プロパノールの残存量を確認後、これらの有機溶媒が含まれるフルオレセインナトリウムを原料として使用し、添加する各有機溶媒の総量が表４中にあるエタノール量、２−プロパノール量となるようにした。そして、表４に示すように原料１ｇとエタノールの混合液に水を加え、各温度で、特級２−プロパノールを加えて数時間〜２４時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２−プロパノール１ｍＬで数回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。
【００５６】
実施例４−１〜実施例４−１７における、核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）により定量された残留溶媒の質量、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した純度、及び収率を表４に示す。表中、２−プロパノールを「ＩＰＡ」、エタノールを「ＥｔＯＨ」、また検出不能なものを「Ｎ．Ｄ．」と表記する。
【００５７】
［実施例４−１８］
実施例４‐４で得られた結晶形態Ａのフルオレセインナトリウム０．５９ｇを５ｍＬのバイアル管に充填し、深さ１．５ｃｍ程度であることを確認した。５０℃、１００％ＲＨにした乾燥機内へ、このバイアルを１５時間静置した。１Ｈ−ＮＭＲにて２−プロパノールの質量％を確認したところ、０．０２８％に低減できた。これを８０℃で減圧乾燥し、０．５２ｇ回収した（回収率：８８．１％）。
【００５８】
【表４】
2017095453.tif 000007
【００５９】
［結果・考察］
表４の結果から明らかなように、実施例４−１〜実施例４−１７におけるフルオレセインナトリウムは、何れも純度が９９．５％を超え、残留溶媒の含有量も極めて少ない。さらに、実施例４−１８の操作を加えたフルオレセインナトリウムは、さらに残留溶媒の含有量を低減させることができた。また、実施例４−１〜実施例４−１８におけるフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回折の分析結果から、表２に示す特有のピークを有する、結晶形態Ａであることが確認された。
【００６０】
［実施例５］
市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｆ：純度９３．７％、茶褐色）１ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）１０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール１ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、濃縮残渣２．３ｇを取得した。この残渣に特級エタノール０．４７ｍＬ、水１．４ｍＬを加え、外温７５℃で、特級２−プロパノール（濃度９９．７体積％）９．５ｍＬを加えて溶解した後、外温１２．５℃で１５時間３７分間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２−プロパノール１ｍＬで３回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥し、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４７．３％、純度９９．６％、エタノール含有量：検出されず、２−プロパノール含有量：０．２１質量％）を得た。
【００６１】
［結果・考察］
実施例５におけるフルオレセインナトリウムは、何れも純度が９９．５％を超え、残留溶媒の含有量も極めて少ない。実施例５におけるフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回折の分析結果から、表２に示す特有のピークを有する、結晶形態Ａであることが確認された。
【００６２】
［実施例６］
市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｅ：純度９９．４％）０．９８ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）１０ｍＬの混合溶液を室温で２時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール１ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）にてエタノールの残存量を確認後、３ｖ／ｗになるようにエタノールを添加した。この混合液に水１．５ｍＬを加え、内温７５度まで加熱し、特級２−ブタノール９．８０ｍＬを加えた後、１２．５℃へ冷却し、１４時間撹拌した。析出した固体を減圧濾過し、特級２−ブタノール２ｍＬで４回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥して結晶形態Ａとして０．７６ｇ（収率：７６．３％、純度９９．６％、エタノール含有量：０．０４４質量％、２−ブタノール含有量：０．３１質量％）を得た。
【００６３】
［比較例１］
フルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｄ］５ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）５０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール５ｍＬで４回洗浄した。濾液を１１．４ｇになるまで濃縮し、特級２−プロパノール（濃度９９．７％）５０ｍＬを加え、５分割した後、８０℃で２４時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２−プロパノール１ｍＬで２回洗浄し、湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
2017095453.tif 000008
【００６５】
結晶形態Ｂを有するフルオレセインナトリウムのＸ線回析データを表６に示す、
【表６】
2017095453.tif 000009
【００６６】
［結果・考察］
表５及び表６の結果から明らかなように、再結晶化の際に、フルオレセインナトリウム水溶液を用いない比較例１では、残留溶媒の含有量が多く、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムは得られなかった。
【００６７】
［比較例２］
フルオレセインナトリウム［試薬Ｄ］５gと特級エタノール５０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール５ｍＬで４回洗浄した。濾液を１３．０ｇになるまで濃縮し、特級２−ブタノール５０ｍＬを加え、５分割した後、１５℃、９５℃の各温度で２２時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２−ブタノール２ｍＬで２回洗浄し、湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。結果を表７に示す。
【００６８】
【表７】
2017095453.tif 000010
【００６９】
結晶形態Ｃを有するフルオレセインナトリウムのＸ線回析データを表８に示す。
【表８】
2017095453.tif 000011
【００７０】
［結果・考察］
表７及び表８の結果から明らかなように、再結晶化の際に、フルオレセインナトリウム水溶液を用いない比較例２では、何れの温度においても、残留溶媒の含有量が多く、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムは得られなかった。
【図１】
2017095453.tif 000012
【図２】
2017095453.tif 000013