(57)【要約】      （修正有）【課題】抗血管新生タンパク質を発現する幹細胞の提供。【解決手段】血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）遺伝子を保有する組換えベクターを有し、ＶＥＧＦＲポリペプチドを発現する、遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であって、ヒトの体内において血管新生を阻害する、幹細胞。当該幹細胞は、黄斑変性症、角膜血管形成、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、並びに脈絡膜新生血管形成に罹患している患者において治療するために、血管新生を阻害するのに使用される幹細胞。ＶＥＧＦＲ遺伝子がＶＥＧＦＲ１であり、ＶＥＧＦＲポリペプチドが可溶型のＶＥＧＦＲであり、ＶＥＧＦＲポリペプチドがヒトＦＬＴ−１タンパク質である、幹細胞。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）遺伝子を保有する組換えベクターを有し、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ポリペプチドを発現する、遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であって、ヒトの体において血管新生を阻害する、幹細胞。
【請求項２】
ＶＥＧＦＲ遺伝子がＶＥＧＦＲ１である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦＲポリペプチドが可溶型のＶＥＧＦＲである、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
ＶＥＧＦＲポリペプチドがヒトＦＬＴ−１タンパク質である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項５】
組換えベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項６】
プラスミドベクターがｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１である、請求項５に記載の幹細胞。
【請求項７】
間葉系幹細胞が臍帯から単離されている、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項８】
カチオン性脂質トランスフェクションによってプラスミドベクターがトランスフェクトされている、請求項６に記載の幹細胞。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項１０】
配列番号１と５０〜１００％の配列相同性を有するタンパク質を発現する、請求項９に記載の幹細胞。
【請求項１１】
黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成で構成される群から選択される疾患又は障害を有する患者において血管新生を阻害する、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の幹細胞遺伝子操作された間葉系幹細胞を産生するための方法であって、
ｉ．間葉系幹細胞に血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物をトランスフェクトするステップと、
ｉｉ．ステップ（ｉ）の前記遺伝子の間葉系幹細胞における発現について選択するステップと、
ｉｉｉ．ステップ（ｉｉ）において選択された幹細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）において使用されるトランスフェクション方法がカチオン性脂質トランスフェクションである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
間葉系幹細胞を９０〜９５％の密集度まで培養する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡとトランスフェクション試薬の比が１：２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
新しい血管の制御されない成長に関連する疾患又は障害を有する患者において血管新生を阻害するための、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を発現する遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用。
【請求項１７】
疾患又は障害が、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成で構成される群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＶＥＧＦＲがＶＥＧＦＲ−１である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
幹細胞を薬学的有効量で投与する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
可溶性血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を発現することが可能な遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２１】
発現されるＶＥＧＦＲがヒトＦＬＴ−１である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
間葉系幹細胞が臍帯から単離されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体が生理食塩水溶液である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
容器及びその容器に含有される組成物を含むキットであって、組成物が、請求項１に記載の遺伝子操作された幹細胞を含む、キット。
【請求項２５】
組成物が血管新生を阻害するのに使用できるものであることを示す添付文書をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
組成物が、黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症を治療するのに使用される、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯のワルトン膠様質から単離した間葉系幹細胞（ＷＪ−ＭＳＣ）を使用して、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を長期にわたって生成するための方法に関する。ＷＪ−ＭＳＣは、血管の制御できない成長に関連する疾患、特に、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、角膜血管形成及び癌の治療において、血管新生を阻害するために使用される。本発明は、細胞療法の分野に特に関連する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、現存する脈管構造から分岐する、体内の新しい血管の成長と定義される。血管新生は、子宮内で始まり、ヒトの生涯全体を通して起こる。血管は、生命維持に必要であり、全ての組織において栄養分及び代謝産物の拡散交換のために必要である。ヒトの体では、増殖因子と阻害因子のバランスが維持されることによって血管新生が制御されている。血管新生は、いくつもの増殖因子及び阻害因子によって制御されている。増殖因子の一部としてアンジオゲニン、アンジオポエチン−１、インターロイキン−８及び胎盤増殖因子が挙げられ、阻害因子としては、アンジオアレスチン（ａｎｇｉｏａｒｒｅｓｔｉｎ）、コンドロモジュリン、ヘパリナーゼ、インターロイキン−１２及びトロポニンＩが挙げられる。
【０００３】
しかし、増殖因子と阻害因子のバランスが狂うことにより、血管の異常な成長が引き起こされ、今度はそれにより、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生及び網膜新生血管形成を含めた多くの疾患が引き起こされる。
【０００４】
血管新生は血管の過剰な成長を伴う癌の拡散の主要な因子であることが公知であるので、抗血管新生治療は関心が高まっている論点の一つである。また、異常な血管は、斑及び損傷、出血、並びに漏出液の下で発達し、高齢者において黄斑変性症を引き起こす。血管の成長を阻害するために、抗血管新生剤が広範に使用されている。抗血管新生剤は、以下の３種に主に分類することができる：モノクローナル抗体、小分子チロシンキナーゼ阻害剤及びｍＴＯＲ（哺乳動物ラパマイシン標的）の阻害剤。
【０００５】
血管新生を制御する主要な増殖因子の１つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、抗血管新生薬の生産における研究コミュニティーの標的となっている。ベバシズマブ（ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（商標））は、ＶＥＧＦ−Ａを阻害するヒト化モノクローナル抗体である。ベバシズマブは、主に、転移性結腸直腸癌、肺癌、乳癌及び腎癌を治療するために、大きな用量で使用される。ペガプタニブナトリウム（マクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（商標））は、一本鎖核酸であるペグ化抗ＶＥＧＦアプタマーである、別の抗血管新生剤である。ペガプタニブナトリウムは、血管新生において決定的な役割を果たすタンパク質であるＶＥＧＦ１６５に特異的に結合する。ペガプタニブは、新生血管加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するために開発されたものである（Ｎｇ  ＥＷ及びＡｄａｍｉｓ  ＡＰ、２００５年）。
【０００６】
ＶＥＧＦを標的とする他の治療の形態も開発されている。この技術分野において関連性のある先行技術のうちの１つが国際公開第２００９／１４９２０５号に開示されている。この先行技術には、眼及び細胞の増殖障害を治療するために、可溶性ＶＥＧＦ受容体を眼に送達するための細胞療法が開示されている。この先行技術では、ＶＥＧＦ受容体を発現する新しい細胞株が組換え技術によって開発された。
【０００７】
この分野において関連性のある別の先行技術が欧州特許第１４２３０１２号に記載されている。この特許は、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）を発現する哺乳動物幹細胞を単離し、動員するための方法及び受容体の医薬への使用を教示するものである。抗血管新生の治療において使用するために、生後の哺乳動物幹細胞からＶＥＧＦＲ−１を単離する。さらに、国際公開第２００５／０００８９５号には、ＶＥＧＦトラップの産生が開示されている。ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦに結合する抗体であり、これらを、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞のような宿主−ベクター系を使用して発現させる。次いで、発現させたＶＥＧＦトラップタンパク質を精製し、ＡＭＤを有する患者に投与する。
【０００８】
しかし、これらの治療では、ある特定の限定を有する抗血管新生剤を使用する。そのような限定のうちの１つは、患者への注射の頻度が高いことである。抗血管新生剤は、ヒトの体内では自然のタンパク質分解に起因して長く持続せず、それにより、薬物を患者に頻繁に注射する必要がある。さらに、頻繁な注射は、疾患を治療する費用の増加ももたらす。また、抗血管新生薬には、患者に対して出血、高血圧、呼吸困難及びしびれを含めた負の副作用がある。これらの影響により、患者の生活の質が低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の先行技術は全て、抗血管新生薬の注射を頻繁に繰り返す必要があるので、血管新生に対する短期の治療をもたらすだけのものである。したがって、当該分野において、より長く持続し、治療による副作用を減少させることによって患者の生活の質を改善する抗血管新生の治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、いくつかの新規の特徴及び以下に十分に記載され、付随する説明及び図に例示されている部分の組合せからなり、本発明の範囲から逸脱すること又は本発明の利点を何ら犠牲にすることなく、詳細に種々の変化をなすことができることが理解される。
【００１１】
本発明は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）遺伝子を保有する組換えベクターを有し、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ポリペプチドを発現する、遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。本発明による幹細胞は、ヒトの体において、特に、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成に罹患している患者において血管新生を阻害するものである。
【００１２】
本発明及びその種々の実施形態は、本明細書では、例示目的でのみ示され、いかなる形でも本発明を限定するものではない付属図面と一緒に説明を読むことにより、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】継代３〜８からの、ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真である。
【図２】継代３〜８からの、ｓＦＬＴ−１プラスミドをトランスフェクトしたＷＪ−ＭＳＣのウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の創傷治癒の顕微鏡画像である。（ａ）は、０時間の時点における無処理の対照を示し、（ｂ）は、０時間の時点における、ｓＦＬＴ−１を用いて処理したＨＵＶＥＣ細胞を示し、（ｃ）は、０時間の時点における、ベバシズマブ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて処理したＨＵＶＥＣ細胞を示し、（ｄ）は、４８時間の時点における無処理の対照を示し、（ｅ）は、４８時間の時点における、ｓＦＬＴ−１（約２ｎｇ／ｍＬ）を用いて処理したＨＵＶＥＣ細胞を示し、（ｆ）は、４８時間の時点における、ベバシズマブ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて処理したＨＵＶＥＣ細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、特に黄斑変性症及び癌における、遺伝子操作された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）において血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を発現させることによる、血管新生の阻害に関する。ＭＳＣは、臍帯のワルトン膠様質から単離されている。以下、本明細書には本発明を本発明の好ましい実施形態に従って記載する。しかし、本発明の好ましい実施形態に対する説明に限定するのは、ただ単に本発明の考察を容易にするためであり、当業者が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく種々の改変及び等価物を考案し得ることが想定されていることが理解されるべきである。
【００１５】
「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」という用語は、本明細書では、様々な他の細胞に分化する能力を有する多分化能間質細胞として記載されている。これらの幹細胞は、骨髄、臍帯、臍帯血、末梢血、卵管、並びに胎児の肝臓及び肺に由来するものであり得る。多分化能及び低免疫原性に起因して、ＭＳＣは、治療剤の担体として適切なものである。特に、本発明は、臍帯のワルトン膠様質から単離された間葉系幹細胞（ＷＪ−ＭＳＣ）の使用に関連する。
【００１６】
「血管新生」又は「新生血管形成」という用語は、本明細書では、既存の血管から新しい血管が形成される生理的プロセスと定義される。新しい血管の成長は、血管新生促進性因子によって誘発される内皮細胞の増殖及び遊走によって駆動される。血管新生により、創傷治癒、毛髪及び脂肪組織の成長、神経再生、並びに筋肉及び骨の修復が容易になる。しかし、異常な血管の形成には、腫瘍の成長、及び転移、並びに血管腫などの有害作用がある。
【００１７】
「抗血管新生剤」又は「抗血管新生タンパク質」という用語は、本明細書では、血管新生を撹乱する化合物について述べるものである。血管新生には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのシグナリング分子が、正常な内皮細胞の表面上にある受容体に結合して、新しい血管の成長及び生存を促進する必要がある。本発明では、「抗血管新生剤」という用語は、ＶＥＧＦＲ、特にＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を指す。
【００１８】
「ＶＥＧＦＲポリペプチド」という用語は、本明細書では、ＶＥＧＦを非機能性にするためにＶＥＧＦに結合させることができるポリペプチドについて述べるものである。本発明において定義されるＶＥＧＦＲポリペプチドは、配列番号１の配列に対して、タンパク質配列に関して５０〜９９％の相同性を有する任意のポリペプチドである。
【００１９】
本明細書で使用される「血管新生を阻害すること」という用語は、新しい血管の形成の減少又は予防を意味する。血管新生の阻害は、新しい血管形成の速度を遅くすることを含む。この場合、阻害とは、抗血管新生剤を投与した際にそれ以上新しい血管の形成が生じないことも意味する。
【００２０】
「血管新生疾患又は障害」及び「血管新生関連疾患」という用語は、本発明において使用される場合、特に、新しい血管の成長が制御されていないこと又は増加していることによって引き起こされる任意の疾患又は障害を指す。疾患又は障害は、異常な血管増殖の直接の結果であり得る。この用語は、血液供給、したがって血管増殖が必要とされる病理学的進行を伴う疾患又は障害も指す。そのような疾患及び障害の例としては、これらに限定されないが、異常な血管増殖、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ、角膜血管形成、変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症並びに脈絡膜新生血管形成が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用される「治療有効量」又は「有効量」という用語は、疾患又は障害を治癒する又は少なくとも部分的に抑止するために血管新生疾患又は障害に罹患している患者に投与される組成物の十分な量を指す。
【００２２】
遺伝子操作されたＷＪ−ＭＳＣ及びそれを産生する方法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、臍帯、骨髄、脂肪組織又は筋肉などの出生後又は成体の組織に由来する。供給源の性質に起因して、ＭＳＣでは倫理的問題が提起されないので、ＭＳＣは胚性幹細胞よりも疾患の治療に対する許容度が高い。
【００２３】
本発明では、ＷＪ−ＭＳＣとして公知の、臍帯のワルトン膠様質から単離されるＭＳＣを特に使用する。ＷＪ−ＭＳＣは多分化能を有し、調達の際に非侵襲的である。ＷＪ−ＭＳＣは、容易にリソース可能であり、免疫原性が低い。さらに、ＷＪ−ＭＳＣは、活発に遊走し、傷害、炎症及び腫瘍の部位に向かうことが報告されており、これにより、これらの幹細胞が治療剤の担体として一意的に適するものになる。
【００２４】
本発明では、抗血管新生タンパク質の担体としての機能を果たす遺伝子操作されたＷＪ−ＭＳＣが産生される。抗血管新生タンパク質を発現するＷＪ−ＭＳＣを使用して、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症又は癌などの状態における血管新生を減少させる又は阻害する。
【００２５】
本発明で使用される抗血管新生タンパク質は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である。この受容体は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の３種類に分類することができる。本発明では、遺伝子操作された幹細胞は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２又はその両方の組合せを発現する。血管内皮増殖因子受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１）は、ヒトにおけるｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ−１）としても公知であり、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ及び胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）などの血管新生因子ＶＥＧＦに特異的な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＶＥＧＦＲ−１は、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）レベルでの選択的スプライシングを介して２つの形態：シグナル伝達可能な全長の膜結合受容体、及び、リガンドを隔離する又は全長受容体と二量体形成し、シグナル伝達を妨げることが可能な、短縮型可溶性受容体（ｓＶＥＧＦＲ−１）で発現する。
【００２６】
ヒトＶＥＧＦＲ−１遺伝子から、それぞれ全長受容体及び可溶性受容体に対応する、３．０ｋｂ及び２．４ｋｂの２種の主要な転写物が産生される。全長ＶＥＧＦＲ−１は、７つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜貫通領域、及びキナーゼ挿入配列を含有する細胞内チロシンキナーゼドメインを特徴とするおよそ１８０ｋＤａの糖タンパク質である。短縮型ｓＶＥＧＦＲ−１は、最初の６つの細胞外Ｉｇ様ドメインのみからなる。リガンド結合は、最初の３つのＮ末端Ｉｇ様ドメインの範囲内で起こり、第４のＩｇ様ドメインは、リン酸基転移を通じた活性化のための前提条件である受容体二量体化に関与する。ホモ二量体に添加して、ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦＲ−２と活性なヘテロ二量体を形成し得る。可溶型のＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦＲ−２と不活性なヘテロ二量体を形成する。ＶＥＧＦＲ−２は、ヒトにおけるＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）又はマウスにおけるＦＬＫ−１（胎児肝臓キナーゼ−１）として公知である。ＶＥＧＦＲ−１と同様に、ＶＥＧＦＲ−２は、細胞外ドメイン内に７つのＩｇ様反復を含有し、細胞内領域内にキナーゼ挿入ドメインを含有する。
【００２７】
これらの受容体は、血管新生において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６スプライスバリアント）、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄと結合する。ＶＥＧＦＲ−２の全長ｃＤＮＡは、１９ａａのシグナルペプチドを伴う１３５６アミノ酸（ａａ）の前駆タンパク質をコードする。成熟タンパク質は、７４５ａａの細胞外ドメイン、２５ａａの膜貫通ドメイン及び５６７ａａの細胞質ドメインで構成される。
【００２８】
ＰｌＧＦとＶＥＧＦのどちらとも高親和性で結合するＶＥＧＦＲ−１とは対照的に、ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦとは高親和性で結合するが、ＰｌＧＦとは結合しない。可溶型のＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２も、ＶＥＧＦに誘導される細胞増殖及び遊走を遮断するそれらの能力に関して互いと著しく異なる。可溶性ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２の両方を発現するヒト内皮細胞におけるＶＥＧＦとの結合について可溶性ＶＥＧＦＲ−１と競合することができない。これは、可溶性ＶＥＧＦＲ−２は細胞遊走を部分的に阻害することしかできないが、可溶性ＶＥＧＦＲ−１はＶＥＧＦに誘導される細胞増殖及び遊走をほぼ完全に遮断できることに起因する（Ｒｏｅｃｋｌ  Ｗ．ら、１９９８年）。
【００２９】
本発明は、抗血管新生タンパク質であるＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を発現するＷＪ−ＭＳＣを開示する。発現されるタンパク質は、全長型であっても短縮型であってもよい。タンパク質が短縮型である場合、これらのタンパク質のＶＥＧＦとの結合部位は機能性でなければならない。抗血管新生タンパク質は可溶型であることが好ましく、抗血管新生タンパク質は可溶型のＦＬＴ−１であることがより好ましい。発現されるタンパク質は、配列番号１に記載の配列、ＦＬＴ−１のタンパク質配列（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ１７９４８−１）を有する。本発明の別の実施形態では、タンパク質は、配列番号１と約５０％〜９９％相同である配列を有する。
【００３０】
さらに、本発明は、抗血管新生タンパク質を発現する遺伝子操作されたＭＳＣを産生するための方法を教示する。上記遺伝子操作されたＭＳＣは組換え技術を使用して産生される。幹細胞は、所望のタンパク質を発現し、所望のタンパク質をコードする遺伝子を保有する組換えベクターを有する宿主細胞である。幹細胞は、臍帯のワルトン膠様質を供給源とする間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００３１】
抗血管新生タンパク質を発現させるための遺伝子を有する組換えベクターを使用して幹細胞をトランスフェクトする。組換えベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターである。本発明で使用するベクターはプラスミドベクターであることが好ましく、プラスミドベクターは、インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（登録商標）から販売されているｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１であることがより好ましい。このプラスミドは、配列番号１の配列を有するタンパク質を発現する、可溶型のＦＬＴ−１タンパク質の遺伝子を保有する。
【００３２】
本発明によると、ＷＪ−ＭＳＣに、電気穿孔、脂質媒介性送達、微粒子銃粒子送達、及びウイルス媒介性送達などの当技術分野で公知の適切なトランスフェクション方法を使用して、ｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１ベクターをトランスフェクトする。幹細胞を化学的トランスフェクション方法によってトランスフェクトすることが好ましい。当業者には理解される通り、幹細胞をトランスフェクトすることは難しい。使用する細胞型に応じて電気穿孔のプロトコール及びパラメータを調整する必要がある。本発明によると、方法はカチオン性脂質トランスフェクション方法である。
【００３３】
トランスフェクトする前に、ＷＪ−ＭＳＣをＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）で構成される培養培地に播種して、トランスフェクション時の９０〜９５％集密を実現する。ＤＮＡ溶液と陽イオン性トランスフェクション試薬の比は１：２である。ＤＮＡ溶液及びトランスフェクション試薬を３７℃で５時間インキュベートした。
【００３４】
トランスフェクトされる幹細胞は、組換えベクターに対して利用可能な負の選択抗生物質マーカーを使用して選択する。ｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１ベクターに関しては、抗生物質マーカーはブラストサイジンである。トランスフェクトされない幹細胞は少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度のブラストサイジンにより死滅することが見いだされる。この濃度を、陽性にトランスフェクトされたＷＪ−ＭＳＣを選択するために使用する。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、遺伝子操作された幹細胞をＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）で構成される培養培地中に収集した。次いで、収集された幹細胞によって発現されるＶＥＧＦＲを、当技術分野で公知のタンパク質抽出（すなわち細胞溶解）及びタンパク質精製方法を使用して単離する。
【００３６】
遺伝子操作された幹細胞の使用
本発明のある実施形態によると、抗血管新生タンパク質を発現する遺伝子操作されたＭＳＣを使用して、ヒトの体における血管新生を阻害する。血管新生の阻害は、黄斑変性症、リンパ脈管新生及び子宮内膜症などの、血管の異常な形成によって直接引き起こされる疾患又は障害に罹患している患者において望まれる。また、進行のために血液供給を必要とする他の疾患及び障害、すなわち癌及び転移も、血管新生を阻害することによって治療することができる。
【００３７】
特に、本発明は、血管の異常な成長に関連する疾患を治療するために血管新生を阻害するためのＷＪ−ＭＳＣの使用を開示する。上記疾患としては、これらに限定されないが、黄斑変性症、癌、糖尿病性網膜症、リンパ脈管新生、網膜新生血管形成、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチ及び変形性関節症、アルツハイマー病、肥満症、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、角膜血管形成並びに脈絡膜新生血管形成が挙げられる。本発明は、黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症の治療を目的とすることがより好ましい。
【００３８】
治療に使用される遺伝子操作されたＭＳＣは、抗血管新生タンパク質、好ましくはＶＥＧＦＲを発現する。特に、ＶＥＧＦＲは、可溶性ヒトＦＬＴ−１である。ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦと結合して、内皮細胞の増殖及び血管透過性を阻害する。本発明のある実施形態によると、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ−１である。ＶＥＧＦＲ−２は、本発明に記載の方法に従って発現させることができる。血管新生を阻害するために両方の種類の受容体を患者に投与することも可能である。
【００３９】
治療に使用するＭＳＣは、静脈に注射することによって又は患者の患部に直接注射することによって患者に投与する。患者に投与されるＭＳＣは、薬学的有効量のものである。薬学的有効量は、患者を治療する認定医により決定され、医師の処方の通り増加させることができる。
【００４０】
最初に投与した際、患者の体内のＭＳＣは、患者の健康状態及び疾患の進行に応じておよそ１．５〜２ヶ月持続する。この期間の後、ＭＳＣの数は、薬学的有効量未満に減少する可能性がある。したがって、最初の注射から１．５〜２ヶ月後、又は幹細胞が枯渇し、細胞数が薬学的有効量を下回った時にＭＳＣを患者に再度注射する必要がある。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、発現したＶＥＧＦＲをＭＳＣから単離し、血管新生の阻害を伴う治療のために使用する。単離されたＶＥＧＦＲを使用して、静脈への注射又は体内の患部への注射によって患者に投与する。
【００４２】
医薬組成物そのキット
本発明の一実施形態では、血管新生を阻害するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、ＶＥＧＦＲを発現する遺伝子操作された幹細胞及び薬学的に許容される担体で構成される。上記医薬組成物は、血管新生の阻害を必要とする疾患の治療、特に黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症の治療に使用される。
【００４３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書で使用される場合、使用される投与量及び濃度でそれにさらされる細胞又は哺乳動物に対して非毒性である希釈剤、アジュバント、賦形剤、安定剤、ビヒクル又は支持体を包含する。多くの場合、担体は、水性ｐＨ緩衝溶液、抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、親水性ポリマー、アミノ酸、単糖、二糖、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、ナトリウムなどの塩形成性対イオン；並びにツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（登録商標）などの非イオン性界面活性物質であり、特に、静脈内に投与される組成物に関しては、好ましい担体は生理食塩水溶液である。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、種々の形態であり得る。これらとしては、例えば、凍結乾燥した調製物、液剤又は懸濁剤、注射剤及び注入剤などの液体剤形が挙げられる。医薬組成物は注射可能であることが好ましい。本発明の医薬組成物は、血管新生の阻害において有用なステロイド、非ステロイド性化合物、抗血管新生化合物、又は他の薬剤などの他の種類の治療と組み合わせることもできる。
【００４５】
容器及びその容器に含有される組成物を含むキットであって、組成物が、ＶＥＧＦＲを発現する遺伝子操作された間葉系幹細胞を培養培地中に含む、キット。本発明によると、培養培地は、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）である。上記キットは、場合によって、組成物が、血管新生を阻害するのに使用できるものであることを示す添付文書をさらに含む。キット内の組成物を使用して黄斑変性症、癌及び糖尿病性網膜症を治療する。
【００４６】
本発明のある実施形態が本明細書に記載されている。
【実施例】
【００４７】
プライマーの設計
この試験において使用するプライマーは、ｓＦＬＴ−１及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に基づいて設計した。ＧＡＰＤＨ遺伝子を、細胞における発現が一定である対照（ハウスキーピング遺伝子）として使用する。ＦａｓｔＰＣＲ  ４．０．１３ソフトウェア（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用してプライマーを設計した。全てのプライマーがＦｉｒｓｔ  Ｂａｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｌａｙｓｉａにより合成された。プライマー配列を表１に列挙する。
【表１】
2017023130.tif 000003
【００４８】
ｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１ベクターの概要
可溶型のヒトＦＬＴ−１（ＶＥＧＦＲ−１）ＯＲＦを発現するｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１（インビボジェン（登録商標）により製造されたもの）。ｐＢＬＡＳＴは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管新生抑制タンパク質及び血管新生タンパク質を産生する、血管新生抑制因子、血管新生因子、増殖因子、又は分化阻害剤ファミリーに由来する目的の遺伝子を含有する既成の発現ベクターである。
【００４９】
凍結ストックＷＪ−ＭＳＣの回収
ＷＪ−ＭＳＣを液体窒素から取り出し、３７℃のウォーターバスで継続的に旋回させることにより、わずかな量の氷が残る状態まで解凍した。アルコールを用いてバイアルをきれいにした後にキャップを開けた。細胞懸濁液１ｍＬを、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）５ｍＬを含有する２５ｃｍ２のＴ型フラスコに移した。Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）が１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）で補充した。フラスコを３７℃でインキュベートし、翌日、培地を除去し、新鮮な培地を添加した。継代培養のために、培地をフラスコから除去し、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）ですすぎ、フラスコを穏やかに前後に揺らした。予め温めたＴｒｙｐＬＥ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）１ｍｌをフラスコに添加し、３７℃で５分インキュベートした。フラスコを穏やかにたたいてフラスコ表面に接着した残りの細胞を取り除いた。完全成長培地５ｍＬを添加し、細胞をピペットによって繰り返し再懸濁させて、存在し得るあらゆる凝集塊を破壊した。血球計算器を使用して細胞を計数し、継代培養のために細胞を１：３の比で新しいフラスコに分割した。細胞濃度は次式によって決定した（Ｌｉｄｄｅｌｌ及びＣｒｙｅｒ、１９９１年）。
【数１】
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【００５０】
ＷＪ−ＭＳＣの凍結保存
ＷＪ−ＭＳＣを、細胞の９０％超が生存可能である対数期の間保管した。１ｍｌ当たり細胞５×１０５個の濃度の細胞を２００×ｇで１０分にわたって遠心分離した。遠心分離からのペレットを、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するチルド凍結培地２ｍＬに穏やかに再懸濁させた。細胞をクライオバイアルに分注し、スチロフォームの箱に入れた。細胞を−２０℃で１時間維持し、−８０℃に移して一晩置いた後、長期保管のために液体窒素に移した。
【００５１】
ブラストサイジンの濃度を決定する
ブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＵＳＡ）のＷＪ−ＭＳＣに対する毒性濃度を決定した後、安定にトランスフェクトした。ＷＪ−ＭＳＣを６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）に１ｍＬ当たり細胞１×１０５個の密度で播種し、９０％集密まで成長させた。２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの間の範囲の各濃度のブラストサイジンをＷＪ−ＭＳＣに添加し、５日間インキュベートした。細胞密集度の百分率を評価することによって細胞傷害効果を決定した。ＷＪ−ＭＳＣの成長を完全に阻害するブラストサイジンの最低濃度は１０μｇ／ｍＬであることが見いだされた。
【００５２】
ヒトＦＬＴ−１遺伝子を用いたＷＪ−ＭＳＣのトランスフェクション
カチオン性脂質トランスフェクションを使用してＷＪ−ＭＳＣを形質転換した。トランスフェクションの前日に、抗生物質を伴わないＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）を伴う６ウェルプレートにＷＪ−ＭＳＣを播種して、トランスフェクション時の９０〜９５％集密を実現した。精製したプラスミドＤＮＡ３μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  ｒｅｄｕｃｅｄ−ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）１００μＬに希釈してＤＮＡ溶液を調製し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）試薬６μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  ｒｅｄｕｃｅｄ−ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍに１００μＬに希釈して脂質溶液を調製した。希釈したＤＮＡを希釈した脂質試薬と穏やかに混合し、その後、両方の溶液を室温で３０分インキュベートした。次いで、両方の溶液を混合し、室温で１５分インキュベートしてＤＮＡ−脂質複合体を形成させた。複合体が形成されるのを待つ間、血清によりリポフェクタミン（登録商標）試薬の働きが低下し得るので、血清を伴わない予め温めたＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）培地でＷＪ−ＭＳＣをすすいだ。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地２ｍＬをＤＮＡ−脂質複合体に添加し、穏やかに混合した。すすいだ細胞の上にＤＮＡ−脂質複合体をゆっくりと乗せた。３７℃で５時間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を除去せずに、２０％血清を含有するＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）２ｍＬを細胞に添加した。翌日、細胞培地を除去し、１０％ＦＢＳ血清を伴うＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）ＥｎＧＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ、ＵＳ）を添加した。ＤＮＡ溶液とリポフェクタミン（登録商標）を３μｇ対６μｇの比の組合せで用いるとＦＬＴ−１遺伝子を用いたＷＪ−ＭＳＣのトランスフェクションの効率が高くなる。
【００５３】
ＷＪ−ＭＳＣからの全ＲＮＡの抽出
ＷＪ−ＭＳＣ細胞ホモジネートおよそ４００μＬとＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）７５０μＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ）（登録商標）中で混合し、室温（ＲＴ）で５分インキュベートすることによってＲＮＡ抽出を行った。クロロホルム２００μＬを添加し、１５秒間混合した。これを室温で１５分インキュベートした。次いで、混合物を４℃、１２０００×ｇで２０分にわたって遠心分離した。水相を新しい１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（登録商標）に移し、イソプロパノール８００μＬを添加することによってＲＮＡを沈殿させた。ＲＴで１０分インキュベートした後、混合物を４℃、１２０００×ｇで１５分にわたって遠心分離した。上清を除去し、得られたペレットを、１００％エタノール１ｍＬを添加することによって洗浄し、４℃、１２０００×ｇで１５分にわたって遠心分離した。再度上清を除去し、１００％エタノール１ｍＬを添加し、さらなる使用のために−７０℃で維持したか、又は、４℃、１２０００×ｇで５分にわたって遠心分離し、風乾し、ＲＮａｓｅフリー水２０μＬに懸濁させた。抽出したＲＮＡを、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）２μＬを用いて３７℃で３０分にわたって処理した。５０ｍＭのＥＤＴＡ２μＬ及び５６℃で１０分間の熱失活を用いて反応を停止させ、ＲＮＡをさらなる分析に供した。
【００５４】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
ＷＪ−ＭＳＣに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、ｍＲＮＡ転写物の存在を決定した。この分析は表１に列挙されているプライマーを使用することによって行った。ＡＭＶ／Ｔｆｌ  １×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）５μＬ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）０．５μＬ、３ｍＭのＭｇＳＯ４、３μＬ、０．５μＭの各プライマー（Ｖｉｖａｎｔｉｓ、Ｍａｌａｙｓｉａ）０．５μＬ、０．８μ／μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）０．５μＬ、０．１μ／μＬのＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）０．５μＬ、０．１Ｕ／μＬのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）０．５μＬ、ＲＮＡ（１０μｇ／μＬ）１μＬ及びヌクレアーゼフリー水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）１３μＬを含有するＲＴ−ＰＣＲ混合物、合計２５μＬ。アニーリング温度、ＭｇＳＯ４の濃度及びサイクリングパラメータについてアッセイを最適化した。再現性を実証するためにアッセイを２連で行った。混合物をＲＴでボルテックスし、微量遠心機で遠心分離することによって適正に混合した。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（登録商標）サーマルサイクラーＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳＡ）において、最初の実行に関して逆転写として４５℃で４５分を１サイクル、及び、３４サイクルまで、９５℃で２分の予備変性ステップ、９５℃で３０秒の変性、５０〜６５℃で４４秒のアニーリング、６８℃で２分の伸長、その後、６８℃で１０分の最終的な伸長で勾配ＰＣＲを実施した。全てのプライマーセットについて、５５℃のアニーリング温度が最大の産物収率及び特異性をもたらすと評価された。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルに流し、８０Ｖで５０分にわたって電気泳動に供した。ゲルレッド（ＧｅｌＲｅｄ）（商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ＵＳＡ）を用いてゲルを染色し、バイオスペクトラム（ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ）（登録商標）（ＵＶＰ、ＵＳＡ）の下で可視化した。
【００５５】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１２％分離ゲルを１つ、３０％単量体溶液［２９．２％（ｗ／ｖ）アクリルアミド、０．８％（ｗ／ｖ）ビスアクリルアミド］９４０μＬ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）９２０μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０μＬ、ｄＨ２Ｏ、９４０μＬ、１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）２３．５μＬ及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）３．８μＬの２．５ｍＬから調製した。全ての成分を混合し、２つのキャスティングガラス板の間にピペットで入れた。ゲルの上に１００％ブタノール０．１ｍＬを乗せ、およそ１５分にわたって重合させた。次いで、ブタノールを廃棄し、蒸留水（ｄＨ２Ｏ）ですすいだ。スタッキングゲル溶液［３０％単量体溶液４１５μＬ、０．５ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８）５８８．８μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、３６．２μＬ、ｄＨ２Ｏ、１．４６ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ、１６．７μＬ及びＴＥＭＥＤ、３．５μＬ］を分離ゲルの上部に乗せた。コームをスタッキングゲルに挿入し、約３０分にわたって重合させた。リザーバ槽に電気泳動緩衝液［２５ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３］を満たした。再現性を実証するためにアッセイを２連で行った。試料を等体積の２×試料緩衝液［０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１００％グリセロール、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール］と混合し、１００℃で１０分間の加熱の前後に短く遠心した。試料緩衝液が流れきるまで電気泳動装置を１６ｍＡの一定電流に設定した。次いで、ゲルを染色溶液［０．０２５％（ｗ／ｖ）クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ）（登録商標）ブリリアントブルー（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、７％（ｖ／ｖ）酢酸］中、３０分にわたって染色し、その後、脱染溶液［４０％（ｖ／ｖ）メタノール、７％（ｖ／ｖ）酢酸］中でバックグラウンド染色が透明になるまで脱染した。マジックマーク（ＭａｇｉｃＭａｒｋ）（商標）ＸＰウエスタンプロテインスタンダード（ＸＰ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に応じて試料サイズを測定した。
【００５６】
ウエスタンブロット
タンパク質試料を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを、前染色を伴わずに電気的転写に供した。電気泳動された試料を含有するポリアクリルアミドゲルを以下のステップでサンドイッチ位に配置した；まず、３ｍｍのクロマトグラフィー紙（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＳＡ）の３つの層、次いでニトロセルロースメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）、その後にポリアクリルアミドゲル、及び最終的にさらに３つのクロマトグラフィー紙の層。全ての層をＴｏｗｂｉｎ転写緩衝液［２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９０ｍＭのグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ８．０］（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９年）に予め浸漬した後、トランス−ブロットＳＤセミドライ電気泳動転写セル（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ＳＤ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ）（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）上に配置した。試料を１５Ｖの一定電圧で１５分にわたってメンブレンにブロットした。メンブレンを１：１０００に希釈したｓＦＬＴ−１に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）７ｍＬにおいてインキュベートし、そしてＲＴで１時間インキュベートしてｓＦＬＴ−１タンパク質を検出した。メンブレンを１×ＴＢＳＴ（１×ＴＢＳＴ５０ｍｌ中２．５ｇのミルク）１０ｍＬで洗浄し、このプロセスを３回繰り返した。次いで、メンブレンを、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）７ｍＬと１時間インキュベートした。再度メンブレンに１×ＴＢＳＴ１０ｍＬを広げ、これを３回繰り返した。その後、ブロットをＥＣＬミックス（ＥＣＬ  ｍｉｘ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）５ｍＬと一緒にインキュベートし、すぐに１０〜３０分にわたって化学発光にさらした。
【００５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイ
ｓＦＬＴ−１の抗血管新生活性をさらに理解するために、Ｌｉａｎｇら（２００７年）に従って創傷治癒アッセイを行った。このアッセイは、ｓＦＬＴ−１を用いて処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において試み、処理を伴わないＨＵＶＥＣ及び０．５ｍｇ／ｍＬを用いて処理したＨＵＶＥＣと比較した。ベバシズマブは、ＶＥＧＦ−Ａを阻害するモノクローナル抗体である。このアッセイは、ＦＬＴ−１遺伝子の抑制を踏まえた細胞遊走を可視化するために行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の遊走をある程度まで模倣するものである。
【００５８】
分析
ＷＪ−ＭＳＣの安定なトランスフェクション
ＷＪ−ＭＳＣに対するブラストサイジンの濃度の影響を１日目〜５日目に分析した。ＷＪ−ＭＳＣを１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで処理した場合に、細胞死が起こったことが示される、ＷＪ−ＭＳＣの円形化及び浮遊が引き起こされ、最小の生存細胞が観察された。ＷＪ−ＭＳＣの成長を完全に阻害するブラストサイジンの最低濃度は１０μｇ／ｍＬであることが見いだされた。この濃度を、陽性にトランスフェクトされたＷＪ−ＭＳＣの選択に使用し、４μｇ／ｍＬのブラストサイジン濃度を、ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトした後のＷＪ−ＭＳＣを維持するために使用した。
【００５９】
トランスフェクトされた細胞におけるｍＲＮＡ転写物の検出
トランスフェクトされたＷＪ−ＭＳＣを、ｓＦＬＴ−１  ｍＲＮＡ転写物の存在について分析した。抽出した全ＲＮＡを、表１に列挙されているプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、トランスフェクトされたＷＪ−ＭＳＣにおいてプラスミドが転写的に活性であることが明らかになった。増幅結果が転写物に関連するものであり、プラスミドＤＮＡに由来するものではないことを確実にするために、抽出したＲＮＡ試料を、ＲＴ部分を伴わないＰＣＲ増幅で処理した。試料から特異的なバンドは検出されず、これにより、増幅結果がプラスミドＤＮＡに由来するものではないことが示された。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、トランスフェクトされたＷＪ−ＭＳＣにおいてプラスミドが転写的に活性であることが明らかになった（図１）。
【００６０】
ＷＪ−ＭＳＣにおけるｐＭＡＸ−ＧＦＰのトランスフェクション効率
ＦＬＴ−１を発現するＷＪ−ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏにおける追跡を補助するために、ヌクレオフェクション法を使用して細胞にｐＭＡＸ−ＧＦＰをトランスフェクトした。得られた陽性クローンはわずかであったが（低トランスフェクション効率及び選択圧力の欠如に一部起因する）、ＷＪ−ＭＳＣの小さな集団が継代５まで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し続けた。
【００６１】
ウエスタンブロット分析
ＷＪ−ＭＳＣに対するブラストサイジン処理の２週間後に、細胞溶解物を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質試料のニトロセルロースメンブレンへの電気的転写を行い、一次抗体及び二次抗体を用いてプローブした。ＦＬＴ−１タンパク質の発現をウエスタンブロット分析によって確認した。ｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１をトランスフェクトした細胞におけるおよそ１６５ｋＤａの分子量種がｓＦＬＴ−１に対する一次抗体及びＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体と反応した（図２）。ＦＬＴ−１タンパク質は継代３において高度に発現し、継代８ではタンパク質レベルは低下した。継代８まで、各継代に１週間かかった。
【００６２】
本発明では、ｐＢＬＡＳＴ−ｈｓＦＬＴ−１プラスミドをＷＪ−ＭＳＣにトランスフェクトすることにより、ＦＬＴ−１タンパク質の発現を誘導することができ、この発現が継代８又は２ヶ月まで持続することも示された。他の抗血管新生剤の投与と比較して、ｓＦＬＴ−１を発現する遺伝子操作されたＷＪ−ＭＳＣは患者の中でより長く持続し、頻繁な注射が必要ない。
【００６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイ
ｓＦＬＴ−１を用いて処理したＨＵＶＥＣ細胞についての創傷の中心に向かう細胞の遊走は、０．５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを用いて処理したＨＵＶＥＣと比較して速かった。結論として、ｓＦＬＴ−１を用いて処理したＨＵＶＥＣについて、０．５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブと比較して、部分的な阻害が実現された。
【００６４】
図３は、０時間及び４８時間の時点におけるアッセイの結果を示す。（ｃ）及び（ｆ）から、ベバシズマブ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いた処理によりＨＵＶＥＣ遊走が有意に阻害されることが明らかであり、これにより、細胞遊走の阻害におけるベバシズマブの役割が例証される。ｓＦＬＴ−１処理を用いて再現した実験を用いて同様の効果が見いだされた。（ｅ）は、ＨＵＶＥＣ遊走がｓＦＬＴ−１処置を用いて部分的に阻害されたことを示す。対照である（ａ）及び（ｄ）では、いかなる処理もない中でＨＵＶＥＣ遊走は阻害されなかった。
【００６５】
このアッセイの結果により、ＦＬＴ−１タンパク質を発現する細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生が阻害され、同様にｉｎ  ｖｉｖｏでも血管新生の阻害が実現されることが実証される。これにより、遺伝子操作された細胞により患者における細胞遊走活性が低下し、それにより今度は血管新生の出現が減少するという潜在性が示される。
【図１】
2017023130.tif 000005
【図２】
2017023130.tif 000006
【図３】
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【配列表】
2017023130000001.app
【外国語明細書】
2017023130000001.pdf