(57)【要約】【課題】カラム内を２種以上の有機溶媒で置換しても、カラム性能が低下しないサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供する。【解決手段】移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）である多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、第１の有機溶媒を移動相として、第１の高分子試料を分析した後、前記第１の有機溶媒を、前記第１の有機溶媒と異なる第２の有機溶媒に置換して、前記第２の有機溶媒を移動相として、第２の高分子試料を分析することを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、
体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）である多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、
第１の有機溶媒を移動相として、第１の高分子試料を分析した後、前記第１の有機溶媒を、前記第１の有機溶媒と異なる第２の有機溶媒に置換して、前記第２の有機溶媒を移動相として、第２の高分子試料を分析することを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項２】
前記有機溶媒は、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項３】
前記有機溶媒は、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項４】
前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径は５．０μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項５】
前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項６】
前記カラムは、長さ１ｃｍ当たりにおいて、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が圧力１．２ＭＰａ／ｃｍ〜６．７ＭＰａ／ｃｍで充填されてなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【請求項７】
内径が４．６ｍｍ以下、長さが１５０ｍｍ以下であり、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されるハウジングを備えたカラムを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体体クロマトグラフィーの主要な分離モードであるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、古くより、工業用ポリマー素材、高分子添加剤、生体高分子などの高分子試料の分析に用いられている。サイズ排除クロマトグラフィー分析方法の中でも、移動相として有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）においては、内径４．６ｍｍ〜８．０ｍｍ、かつ長さ１５０ｍｍ〜３００ｍｍのハウジングと、ハウジングに充填された体積平均粒子径が５μｍ以上の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填剤とを備えたカラムを用いる方法が広く知られている（例えば、非特許文献１参照）。有機溶媒としては、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどが用いられる。
【０００３】
これらの分析方法では、使用する移動相に合わせて、移動相と同一の有機溶媒が封入された専用の市販カラムを用いることができる。例えば、移動相としてテトラヒドロフランを用いる場合には、カラムとしてはＳｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＦ−８００シリーズ（商品名、内径８．０ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工株式会社製）を用いることができる。また、移動相としてクロロホルムを用いる場合には、カラムとしてはＳｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  Ｋ−８００シリーズ（商品名、内径８．０ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工株式会社製）を用いることができる。また、移動相としてジメチルホルムアミドを用いる場合には、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＤ−８００シリーズ（商品名、内径８．０ｍｍ、長さ３００ｍｍ、昭和電工株式会社製）を用いることができる。
【０００４】
しかし、移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、複数の高分子試料を分析する場合、各有機溶媒によるそれぞれの高分子試料の溶解性の差や分離性能の差などに合わせて、それぞれの高分子試料に適した移動相を用いることが多い。そのため、それぞれの有機溶媒に合せた、複数のカラムが必要となる。サイズ排除クロマトグラフィー用カラムは、一般的に高価であることから、複数のカラムを用意すると経済的な負担が大きくなる。また、同時に複数の移動相と、カラムとを用いて分析を行いたい場合には、複数の液体クロマトグラフィー分析装置が必要となることもある。
【０００５】
サイズ排除クロマトグラフィー用カラムの中には、別の有機溶媒に置換して用いることも可能なものはあるが（例えば、前記の各有機溶媒専用カラムでも、他の有機溶媒に置換することが可能となってはいるが）、特に溶出容量の大きいカラムでは、有機溶媒を置換するには流速の制限なども多い。また、有機溶媒の置換を繰り返すと、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮により、充填剤の充填状態が変化する。そのため、カラムの劣化が促進されるという課題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ．Ｓ．Ｗｕ，Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ,１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、カラム内を２種以上の有機溶媒で置換しても、カラム性能が低下しないサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、体積平均粒子径の粒度分布が制御された多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用いることにより、移動相に用いる２種以上の有機溶媒を置換して用いても、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響を抑制し、充填剤の充填状態の変化によるカラムの性能劣化を低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
［１］移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）である多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、第１の有機溶媒を移動相として、第１の高分子試料を分析した後、前記第１の有機溶媒を、前記第１の有機溶媒と異なる第２の有機溶媒に置換して、前記第２の有機溶媒を移動相として、第２の高分子試料を分析することを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１０】
［２］前記有機溶媒は、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種である［１］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１１】
［３］前記有機溶媒は、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される少なくとも１種である［２］に記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１２】
［４］前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径は５．０μｍ以下である［１］〜［３］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１３】
［５］前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下である［１］〜［４］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１４】
［６］前記カラムは、長さ１ｃｍ当たりにおいて、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が圧力１．２ＭＰａ／ｃｍ〜６．７ＭＰａ／ｃｍで充填されてなる［１］〜［５］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【００１５】
［７］内径が４．６ｍｍ以下、長さが１５０ｍｍ以下であり、前記多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されるハウジングを備えたカラムを用いる［１］〜［６］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、カラム内を２種以上の有機溶媒で置換しても、カラム性能が低下しないサイズ排除クロマトグラフィー分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例のカラムにおいて、有機溶媒の５サイクル置換前後におけるテトラヒドロフランによる標準ポリスチレンの較正曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１９】
［サイズ排除クロマトグラフィー分析方法］
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法であって、体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）である多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、第１の有機溶媒を移動相として、第１の高分子試料を分析した後、前記第１の有機溶媒を、前記第１の有機溶媒と異なる第２の有機溶媒に置換して、前記第２の有機溶媒を移動相として、第２の高分子試料を分析する。
【００２０】
ここで、本明細書において架橋重合体粒子の体積平均粒子径とは、２０００個以上の架橋重合体粒子を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径の球体とみなす。
前記粒度分布測定装置としては、例えば、フロー式粒子像分析装置（商品名：ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を使用することができる。
また、本明細書において均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）とは、上記と同様の方法で各粒子の体積を算出し、全架橋重合体粒子のうち、体積の小さい方から並べて、２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（２５％）に対する７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（７５％）の比をいう。すなわち、（その粒子径以下の存在比率が７５体積％となる粒子径）／（その粒子径以下の存在比率が２５体積％となる粒子径）である。
【００２１】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法は、移動相として有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）分析方法である。
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、例えば、円筒形状をなすハウジングと、そのハウジングの内部に充填された、体積平均粒子径の粒度分布が制御された多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填剤とを備えるカラムが用いられる。
ハウジングの材質は、特に限定されない。ハウジングとしては、十分なカラム性能を得るために高耐圧性および低デッドボリューム構造（分離に関係ない空間が小さい構造）であり、超高速液体クロマトグラフィー用に設計されたステンレス管を用いることが好ましい。
【００２２】
ステンレス管としては、その内面が高分子化合物で被覆されたものを用いることもできる。
ハウジングが耐え得る圧力（内圧）は、４０ＭＰａ以上であることが好ましく、６０ＭＰａ以上であることがより好ましく、７５ＭＰａ以上であることがさらに好ましい。
ハウジングが耐え得る圧力が４０ＭＰａ以上であれば、カラム内に、後述する流速で、有機溶媒のみを流すか、または、有機溶媒と高分子試料を同時に流しても、ハウジングが破損する可能性が低い。
【００２３】
ハウジングの大きさは、特に限定されないが、カラム内を有機溶媒で複数回置換する場合に、より有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響を抑制するためには、円筒型分析カラムのハウジングの内径は４．６ｍｍ以下であることが好ましく、０．５ｍｍ〜４．６ｍｍであることがより好ましく、１．０ｍｍ〜４．６ｍｍであることがさらに好ましい。
ハウジングの内径が０．５ｍｍ以上であれば、ハウジング内に、容易に多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を充填することができる。一方、ハウジングの内径が４．６ｍｍ以下であれば、カラムの溶出容量が大きくなり過ぎることがないため、カラム内を容易に有機溶媒で置換することができる。
【００２４】
また、同様の理由により、ハウジングの長さは１５０ｍｍ以下であることが好ましく、５０ｍｍ〜１５０ｍｍであることがより好ましい。
ハウジングの長さが５０ｍｍ以上であれば、カラム内において、分析対象の高分子試料の溶出時間（保持時間）を十分に確保することができるため、高分子試料に含まれる複数の成分（分子量の異なる高分子化合物）を分離することができる。一方、ハウジングの長さが１５０ｍｍ以下であれば、高分子試料の溶出時間が長くなり過ぎることを防止でき、カラム圧力（カラムの内圧）が大きくなることも防止できる。
【００２５】
本発明におけるカラム性能としては、例えば、高分子試料に含まれる成分の溶出容量（ｍＬ）、理論段数（半値幅法、Ｎ）、耐流速性等が挙げられる。
溶出容量は、高分子試料の溶出時間（ｍｉｎ）×流量（ｍＬ／ｍｉｎ）から算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
理論段数は、５．５４×（ピークの溶出時間／ピーク高さの５０％におけるピーク幅）２の計算式から算出することができる（２００６年４月改正の日本薬局方）。
耐流速性は、例えば、高流速で測定を続けた場合にカラム圧力や溶出容量、理論段数等の初期値からの変化率（％）として表すことができる。理論段数は、４０００以上であることが好ましく、５０００以上であることがより好ましい。
【００２６】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、一般的にサイズ排除クロマトグラフィー分析方法に用いられるものであれば、特に限定されない。本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、各種溶媒に対して化学的および物理的に安定で、分解・変質を起こさず、圧力に対して機械的強度の安定性も有することに加えて、カラム内を有機溶媒で複数回置換しても、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響を抑制できる十分な耐溶媒置換性（有機溶媒の置換を繰り返すことにより、溶出容量、理論段数などが低下し難い性能）を有する必要がある。
【００２７】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、体積平均粒子径の粒度分布における均一係数が１．１５以下（粒子全体体積の７５％／２５％比）であり、１．１０以下であることが好ましい。
均一係数が１．１５を超えると、カラム内を有機溶媒で複数回置換した場合に、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響により、充填剤の充填状態が変化して、カラム性能が大きく低下する可能性があり、また、カラム圧力が大きく上昇することがある。カラム圧力が高くなると、有機溶媒を容易に置換することができなくなる。
なお、均一係数は、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径の均一性を表わす指標であり、１に近いほど体積平均粒子径の均一性が高いことを表わす。カラムが十分な耐溶媒置換性を得るためには、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が均一であることが好ましい。
【００２８】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径は、５．０μｍ以下であることが好ましく、１．０μｍ〜５．０μｍであることがより好ましい。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が１．０μｍ以上であれば、カラム圧力が大きく上昇することを防止できるため、測定可能なカラム流速が制限されることがない。一方、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径が５．０μｍ以下であれば、十分なカラム性能（溶出容量、理論段数、耐流速性など）が得られる。
【００２９】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、６０ｎｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ〜６０ｎｍであることがより好ましく、５ｎｍ〜５０ｎｍであることがさらに好ましい。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、移動相として有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法による耐溶媒置換性に影響を及ぼす。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が１ｎｍ以上であれば、高分子試料に含まれる成分（高分子化合物）には、その分子量に応じて、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子とのサイズ排除効果が作用し、分離することができる。一方、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径が６０ｎｍ以下であれば、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の物理的強度が低下することがないため、カラム内を有機溶媒で複数回置換した場合に、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響により、充填剤の充填状態が変化して、カラム性能が低下することがない。
【００３０】
尚、本明細書において平均細孔径とは、窒素吸着測定を行い、窒素吸着等温線からＢＪＨ法により求めたものをいう。より具体的には、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子０．２ｇを窒素吸着させて測定を行い、体積平均で算出したものである。
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、例えば、高機能比表面積／細孔分布測定装置（型式名：ＡＳＡＰ ２０２０、マイクロメリティックス社製）を用いてガス吸着法により測定を行い算出された数値である。
【００３１】
本発明における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子は、測定対象の高分子試料に含まれる高分子化合物の分子量範囲に応じて、上記の均一係数、体積平均粒子径および平均細孔径が同一の１種を単独で用いてもよく、上記の均一係数、体積平均粒子径および平均細孔径のうち少なくとも１つが互いに異なる２種以上を混合して用いてもよい。
【００３２】
本発明におけるカラムは、長さ１ｃｍ当たりにおいて、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が圧力（充填圧力）１．２ＭＰａ／ｃｍ〜６．７ＭＰａ／ｃｍ（例えば、長さが１５ｃｍのカラムの場合、１８．０ＭＰａ〜１００．０ＭＰａ）で充填されてなることが好ましく、１．２ＭＰａ／ｃｍ〜５．０ＭＰａ／ｃｍ（例えば、長さが１５ｃｍのカラムの場合、１８．０ＭＰａ〜７５．０ＭＰａ）で充填されてなることがより好ましい。
多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の充填圧力が１．２ＭＰａ／ｃｍ以上であれば、ハウジング内において、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が密に充填されるため、カラム内を有機溶媒で複数回置換した場合に、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響により、カラム性能を維持することができる。一方、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の充填圧力が６．７ＭＰａ／ｃｍ以下であれば、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が圧縮されて変形することがないため、カラム性能を維持することができる。
【００３３】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、移動相として２種以上の有機溶媒が用いられる。本発明における有機溶媒としては、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法にて移動相として用いることができるものであれば特に限定されないが、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、本発明における有機溶媒としては、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
これらの有機溶媒は、１回の分析において、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、少なくとも２回の分析が行われるが、それぞれの回の分析において、少なくとも１種の有機溶媒が用いられ、前の分析と後の分析とでは互いに異なる有機溶媒が用いられる。移動相が混合溶媒の場合は、溶媒種が同一であっても、全体としての組成比等が異なれば互いに異なる有機溶媒である。
【００３４】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、例えば、次のようにして、上記の有機溶媒が用いられる。
まず、上記の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用い、そのカラム内を、好ましくはテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種からなる第１の有機溶媒で置換する（第１の溶媒置換）。
【００３５】
次に、第１の有機溶媒を移動相として、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法により、分析の対象となる成分を含む第１の高分子試料を分析する（第１の分析）。すなわち、第１の高分子試料に含まれる高分子化合物を分離する。
なお、第１の高分子試料に含まれる分析（分離）の対象となる成分は、１種でもよく、２種以上であってもよい。
【００３６】
第１の分析が終了した後、カラム内を、好ましくはテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種からなる第２の有機溶媒でカラム内を置換する（第２の溶媒置換）。第２の有機溶媒としては、１種の有機溶媒を用いる場合には第１の有機溶媒とは異なるものを用い、２種以上の有機溶媒を用いる場合には、少なくとも１種が第１の有機溶媒と同じものであってもよい。また、第２の有機溶媒として、２種以上の有機溶媒を用いる場合、それらの有機溶媒を混合して用いてもよく、また、それらの有機溶媒を単独に順に用いてもよい。また、２種以上の有機溶媒からなる混合溶媒を用いる場合には、その組成比が異なれば、異なる有機溶媒である。
【００３７】
次に、第２の有機溶媒を移動相として、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法により、第２の高分子試料を分析する（第２の分析）。すなわち、第２の高分子試料に含まれる高分子化合物を分離する。
なお、第２の高分子試料に含まれる分析（分離）の対象となる成分は、１種でもよく、２種以上であってもよい。また、第２の高分子試料は、第１の高分子試料と同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３８】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、上述のような第１の溶媒置換、第１の分析、第２の溶媒置換および第２の分析の操作を１つのサイクルとして、高分子試料の分析（高分子試料に含まれる高分子化合物の分離）が行われる。このサイクルを繰り返すことにより、カラムを交換することなく、多数の高分子試料料の分析を連続的に行うこともできる。
【００３９】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、分析時のカラム流速は、特に限定されない。カラム流速、すなわち、高分子試料の分析時において、カラム内を流れる高分子試料を含む移動相の線流速は、１．８ｃｍ／ｍｉｎ〜１８．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は０．３ｍＬ／ｍｉｎ〜３．０ｍＬ／ｍｉｎ）であることが好ましく、１．８ｃｍ／ｍｉｎ〜１２．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は０．３ｍＬ／ｍｉｎ〜２．０ｍＬ／ｍｉｎ）であることがより好ましい。
カラム流速が１．８ｃｍ／ｍｉｎ以上であれば、高分子試料に含まれる高分子化合物を、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子に吸着させて、高分子化合物を十分に分離することができる。一方、カラム流速が１８．０ｃｍ／ｍｉｎ以下であれば、高分子試料に含まれる高分子化合物を、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子に吸着させて、高分子試料を十分に分離することができ、また、高分子化合物の分子鎖を切断することなく、正確に分子量を測定することができる。
【００４０】
また、カラム内を有機溶媒で置換する場合には、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響を抑制するために、カラム内に置換される有機溶媒がカラム内を流れる際の線流速は、分析時のカラム流速（線流速）以下であることが好ましく、２／３以下であることがより好ましく、１／２以下であることがさらに好ましい。例えば、分析時のカラム流速が６．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ）である場合、カラム内に置換される有機溶媒の線流速は、６．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ）以下であることが好ましく、４．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は０．６７ｍＬ／ｍｉｎ）以下であることがより好ましく、３．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が４．６ｍｍの場合、流量は０．５０ｍＬ／ｍｉｎ）以下であることがさらに好ましい。
カラム内に置換される有機溶媒の線流速が、分析時のカラム流速以下であれば、有機溶媒を置換する際に、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響や圧力負荷の影響が大きくなることがなく、カラム性能が低下することがない。
【００４１】
また、移動相を変更する場合には、カラム内の有機溶媒を完全に置換する必要がある。置換する有機溶媒の通液量は、カラム容量（例えば、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの場合は２．５ｍＬ）の２．０倍（体積比）以上であることが好ましく、２．５倍（体積比）以上であることがより好ましく、３．０倍（体積比）以上であることがさらに好ましい。
置換する有機溶媒の通液量が、カラム容量の２．０倍（体積比）以上であれば、カラム内の有機溶媒を完全に置換することができる。
【００４２】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、分析の対象である高分子試料となる高分子化合物、すなわち、分析可能な高分子化合物の分子量（重量平均分子量）は、特に限定されない。本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法では、ポリスチレン換算において分子量が１００以上３００万以下、好ましくは３００以上２００万以下の高分子化合物を分析することができる。
【００４３】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー分析方法によれば、体積平均粒子径の粒度分布が制御された多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子が充填されたカラムを用いることにより、移動相に用いる２種以上の有機溶媒を置換して用いても、各有機溶媒による充填剤の膨潤や収縮の影響を抑制し、充填剤の充填状態の変化によるカラムの性能劣化を低減できる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
以下の実施例および比較例において、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の体積平均粒子径および均一係数は、上述した測定方法に基づいて、フロー式粒子像分析装置（型式名：ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を用いて静止画像として撮像された粒子により、二次元的に直径を測定して算出された数値である。また、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の平均細孔径は、上述した測定方法（ＢＪＨ法）に基づいて、高機能比表面積／細孔分布測定装置（型式名：ＡＳＡＰ ２０２０、マイクロメリティックス社製）を用いて、ガス吸着法により測定し、算出された数値である。
【００４６】
［実施例］
（カラムの作製）
充填剤として、均一係数が１．０５、体積平均粒子径が３．４μｍ、平均細孔径が５０ｎｍの多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を、トルエンとメタノールを質量比で８０：２０の割合で混合した混合溶媒に加えた後、超音波バスにて分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。
得られた充填剤スラリーを用いて、円筒形状であり、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの超高速液体クロマトグラフィー用ハウジング（株式会社杉山商事製）に、上記の多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を充填した。
すなわち、ハウジング内に、上記の充填剤スラリーを注入し、ハウジングの入口側から出口側に向かって、上記のトルエンとメタノールの混合溶媒を通液することにより、充填剤スラリーを３０ＭＰａ（定圧）にて３０分加圧し、ハウジング内に多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子からなる充填層を形成し、実施例の液体クロマトグラフィー用のカラムを得た。
【００４７】
（カラムの評価）
高速液体クロマトグラフ分析装置として高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用い、検出器として紫外検出器（波長：２５４ｎｍ）を用いて実施例のカラムを評価した。
カラムの温度を４０℃として、カラム内に、テトラヒドロフランを通液し、カラム内をテトラヒドロフランで置換した。テトラヒドロフランの線流速を３．０ｃｍ／ｍｉｎ（カラム内における流量を０．５ｍＬ／ｍｉｎ）とし、カラム内に通液する時間を１０分間とし、テトラヒドロフランの通液量をカラム容量の２倍とした。
次に、テトラヒドロフランの線流速を６．０ｃｍ／ｍｉｎ（カラム内における流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ）とし、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル５μＬを分離分析した。
次に、カラム内に、クロロホルム、ジメチルアセトアミドおよびテトラヒドロフランを、この順に通液し、カラム内をこれらの有機溶媒で置換した。このとき、それぞれの有機溶媒の線流速を３．０ｃｍ／ｍｉｎ（カラム内における流量を０．５ｍＬ／ｍｉｎ）とし、カラム内に通液する時間をそれぞれ１０分間とし、それぞれの有機溶媒の通液量をカラム容量の２倍とした。
次に、カラム内に、テトラヒドロフランを、このまま通液しながら、１０００ｐｐｍのフタル酸ジシクロへキシル５μＬを分離分析した。このとき、それぞれの有機溶媒の線流速を６．０ｃｍ／ｍｉｎ（カラム内における流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ）とした。
これらの操作を１つのサイクルとし、このサイクルを４回繰り返すことにより、フタル酸ジシクロへキシルの分離分析を５回行った。
サイクル毎におけるカラム圧力の変化率（１回目のカラム圧力に対する相対値）、フタル酸ジシクロへキシルの保持時間の変化率（１回目の保持時間に対する相対値）、および、理論段数の変化率（１回目の理論段数に対する相対値）を表１に示す。
なお、得られたクロマトグラムから、実施例のカラムの理論段数を算出した。理論段数の算出方法を、半値幅法（２００６年４月改正の日本薬局方）とした。
【００４８】
【表１】
2017215290.tif 000002
【００４９】
表１の結果から、クロロホルム、ジメチルアセトアミドおよびテトラヒドロフランの置換を５サイクル繰り返し行っても、カラムの理論段数の低下はみられなかった。
また、有機溶媒の５サイクル置換前後において、移動相としてテトラヒドロフランを用いて、重量平均分子量が５００、１３００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、７８．１万、１６３．６万の標準ポリスチレンを分析し、較正曲線（重ね書き）を作成した。結果を図１に示す。図１に示すように、有機溶媒置換前後において、それぞれの標準ポリスチレンの分析結果（分子量の測定結果）を示す点が完全に重なっており、較正曲線についても変化が見られなかった。
【００５０】
［比較例］
（カラムの作製）
充填剤として、均一係数が１．１８、体積平均粒子径が３．４μｍ、平均細孔径が５０ｎｍの多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子を用いたこと以外は実施例と同様にして、比較例の液体クロマトグラフィー用のカラムを得た。
【００５１】
（試作カラムの評価）
比較例のカラムを用いたこと以外は実施例と同様にして、フタル酸ジシクロへキシルの分離分析を５回行った。
サイクル毎におけるカラム圧力の変化率（１回目のカラム圧力に対する相対値）、フタル酸ジシクロへキシルの保持時間の変化率（１回目の保持時間に対する相対値）、および、理論段数の変化率（１回目の理論段数に対する相対値）を表２に示す。
【００５２】
【表２】
2017215290.tif 000003
【００５３】
表２の結果から、クロロホルム、ジメチルアセトアミドおよびテトラヒドロフランの置換を１サイクル行っただけで、カラムの理論段数が大幅に低下することが分かった。また、４サイクル後に、カラムにテトラヒドロフランを通液したところ、カラム圧力が大幅に上昇することが確認された。これらの現象はいずれも、カラム内を有機溶媒で置換した際に、多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の膨潤や収縮が生じたために、カラム内における多孔性スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子の充填状態が変化したことによると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、移動相として２種以上の有機溶媒を用いるサイズ排除クロマトグラフィー分析方法において、カラム内を有機溶媒で複数回置換しても、カラム性能が低下することを抑制することに寄与するものである。カラム性能の低下の抑制は、複数のカラムや複数の液体クロマトグラフィー分析装置を用意するという経済的な負担を削減することに寄与する。
【図１】
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