(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな腎細胞癌マーカーを提供する。【解決手段】Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｒｅａｔｗａｌｌ（ＭＡＳＴＬ）タンパク質又はＭＡＳＴＬ遺伝子からなる腎細胞癌マーカー。ＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質、ＭＡＳＴＬ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、腎細胞癌診断薬。生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量を測定する工程と、測定されたＭＡＳＴＬタンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｒｅａｔｗａｌｌ（ＭＡＳＴＬ）タンパク質又はＭＡＳＴＬ遺伝子からなる腎細胞癌マーカー。
【請求項２】
ＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質、ＭＡＳＴＬ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、腎細胞癌診断薬。
【請求項３】
生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量を測定する工程と、
測定されたＭＡＳＴＬタンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、
を備える、生体試料の判定方法。
【請求項４】
生体試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量を測定する工程と、
測定されたＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、
を備える、生体試料の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌マーカー及びその使用に関する。より具体的には、腎細胞癌マーカー、腎細胞癌診断薬及び生体試料の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＲＣＣ）は腎実質に発生する尿細管由来の悪性腫瘍である。腎細胞癌は、成人悪性腫瘍の２〜３％を占め、罹患率・死亡率ともに増加傾向にある（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Marumo K., et al., The prevalence of renal cell carcinoma: a nation-wide survey in Japan in 1997, Int. J. Urol., 8, 359-365, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、現在、腎細胞癌の早期発見のための有効な診断マーカーは知られていない。このため、腎細胞癌の診断は、超音波検査、コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）、生検試料の病理検査等により行われている。そこで、本発明は、新たな腎細胞癌マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｒｅａｔｗａｌｌ（ＭＡＳＴＬ）タンパク質又はＭＡＳＴＬ遺伝子からなる腎細胞癌マーカー。
［２］ＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質、ＭＡＳＴＬ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、腎細胞癌診断薬。
［３］生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量を測定する工程と、測定されたＭＡＳＴＬタンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。
［４］生体試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量を測定する工程と、測定されたＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、新たな腎細胞癌マーカーを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［腎細胞癌マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＭＡＳＴＬタンパク質又はＭＡＳＴＬ遺伝子からなる腎細胞癌マーカーを提供する。
【０００８】
本明細書では、遺伝子名ＭＡＳＴＬにより特定される遺伝子にコードされるタンパク質をＭＡＳＴＬタンパク質という。ＭＡＳＴＬタンパク質は、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｒｅａｔｗａｌｌ、又はＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅとも呼ばれるものである。ヒトＭＡＳＴＬタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ９６ＧＸ５、Ｑ５Ｔ８Ｄ５、Ｑ５Ｔ８Ｄ７、Ｑ８ＮＣＤ６、Ｑ９６ＳＪ５等である。また、ヒトＭＡＳＴＬのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１１７２３０３である。また、マウスＭＡＳＴＬタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ８Ｃ０Ｐ０である。また、マウスＭＡＳＴＬのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿０２５９７９である。
【０００９】
実施例において後述するように、発明者らは、腎細胞癌患者の手術前血清及び手術後血清のエクソソーム分画に含まれるタンパク質を液体クロマトグラフィー質量（ＬＣ／ＭＳ）分析法により網羅的に分析、比較し、腎細胞癌患者の手術前血清に特異的に存在するタンパク質としてＭＡＳＴＬタンパク質を同定した。したがって、ＭＡＳＴＬタンパク質又はＭＡＳＴＬ遺伝子を、腎細胞癌マーカーとして利用することができる。
【００１０】
また、実施例において後述するように、ＭＡＳＴＬタンパク質は、膀胱癌患者の手術前血清中には検出されなかった。したがって、本実施形態のマーカーは腎細胞癌に特異的なマーカーである。
【００１１】
［腎細胞癌診断薬］
１実施形態において、本発明は、ＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質、ＭＡＳＴＬ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、腎細胞癌診断薬を提供する。本実施形態の腎細胞癌診断薬は、診断用キットであるということもできる。
【００１２】
（特異的結合物質）
ＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にＭＡＳＴＬタンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００１３】
抗ＭＡＳＴＬ抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
【００１４】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００１５】
本実施形態の腎細胞癌診断薬は、被検者由来の血清、血漿、尿を含む体液、組織等を試料に用い、試料中のＭＡＳＴＬタンパク質を検出するものであってもよい。特に、血清、血漿又は尿は低侵襲で採取可能な生体試料であるため、患者の負担が少なく、容易に腎細胞癌に罹患しているか否かを診断することができる。
【００１６】
ＭＡＳＴＬタンパク質の検出方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等が挙げられる。なお、逆相タンパク質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、検出対象物質に特異的な抗体等を反応させることにより、試料中の検出対象物質を検出する解析方法である。
【００１７】
（プライマーセット）
ＭＡＳＴＬ遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、ＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。
【００１８】
ＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡは、上述したＩＤで特定されるＲｅｆＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、ＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡは上述したＲｅｆＳｅｑ  ＩＤで特定されるものに限られるものではない。
【００１９】
例えば、被検者由来の組織等を試料に用い、本プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。
【００２０】
（プローブ）
プローブとしては、ＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、被検者由来の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＭＡＳＴＬ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、被検者が腎細胞癌に罹患しているか否かを判定することができる。
【００２１】
［生体試料の判定方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量を測定する工程と、測定されたＭＡＳＴＬタンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法を提供する。
【００２２】
本実施形態の判定方法により、生体試料が腎細胞癌患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の判定方法は、腎細胞癌の診断方法であるということもできる。本実施形態の判定方法によれば、腎細胞癌を特異的に検出することができる。
【００２３】
本実施形態の判定方法において、生体試料は、血清、血漿又は血清若しくは血漿から精製されたエクソソームであってもよい。生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量を測定する工程は、上述したＭＡＳＴＬタンパク質に対する特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＭＡＳＴＬタンパク質の存在量は、段階希釈した既知濃度のＭＡＳＴＬタンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【００２４】
本実施形態の判定方法では、生体試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量が、対照試料中のＭＡＳＴＬタンパク質の存在量と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する。対照としては、例えば健常人由来の生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人由来の生体試料中に存在するＭＡＳＴＬタンパク質の量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＭＡＳＴＬタンパク質の量が多い場合に、生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定してもよい。
【００２５】
本実施形態の判定方法は、生体試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量を測定する工程と、測定されたＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する工程と、を備えるものであってもよい。
【００２６】
本実施形態の判定方法において、生体試料は、被検者由来の組織等であってもよい。生体試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により行うことができる。あるいは、上述したプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、ＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量を測定してもよい。ここで、測定したＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量は、段階希釈した既知濃度のＭＡＳＴＬ遺伝子断片等を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【００２７】
また、本実施形態の判定方法では、生体試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量が、対照試料中のＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定する。対照としては、例えば健常人由来の生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人由来の生体試料におけるＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＭＡＳＴＬ遺伝子の発現量が多い場合に、生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定してもよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
２０症例の腎細胞癌患者の手術前血清と手術後血清を採取した。続いて、２０症例の手術前血清の混合血清試料、及び２０症例の手術後血清の混合血清試料を作製し、これらの混合血清を用いたプロテオーム解析を行い、腎細胞癌患者の手術前血清に特異的に存在するタンパク質を探索した。
【００３０】
具体的には、まず、手術前、手術後の各々の混合血清２００μＬにリン酸緩衝液１１００μＬを添加して、１９，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。続いて、回収した上清を１００，０００×ｇ、４℃で９０分間超遠心し、沈殿を回収した。続いて、回収した沈殿を２回洗浄し、エクソソーム画分とした。
【００３１】
続いて、回収したエクソソーム画分に界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウムを含む溶液を加えて加熱処理し、超音波破砕機で溶解後、トリプシン消化した。続いて、手術前血清由来のサンプルと手術後血清由来のサンプルを安定同位体標識試薬（型式「Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｔａｇ  ２−ｐｌｅｘ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）でそれぞれ標識して等量混合し、陽イオン交換カラムで８つのフラクションに分画した。続いて得られたフラクションの各々を液体クロマトグラフィー（型式「Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）及び四重極・フーリエ変換ハイブリッド質量分析計（型式「Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を組み合わせた液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により解析し、比較した。
【００３２】
その結果、腎細胞癌患者の手術前血清に手術後血清の約３．３倍多く含まれているタンパク質としてＭＡＳＴＬタンパク質を見出した。ＭＡＳＴＬタンパク質は、世界ヒトプロテオーム機構がまとめた、血中タンパク質リスト（Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｏｔｅｏｍｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ＨＰＰＰ）中の約２０００種類のタンパク質に含まれていなかった。更に、ＭＡＳＴＬタンパク質は、世界ヒトプロテオーム機構がまとめた、血中タンパク質データベース（Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ：ＰＰＤ）中の約１０５００種類のタンパク質にも含まれていなかった。したがって、ＭＡＳＴＬタンパク質が血液中に存在することは発明者らが今回初めて明らかにしたことである。
【００３３】
また、膀胱癌患者の手術前及び手術後の血清を用いて上記と同様の解析を行った結果、ＭＡＳＴＬタンパク質は、膀胱癌患者の手術前及び手術後の血清中には検出されないことが明らかとなった。この結果はＭＡＳＴＬタンパク質が腎細胞癌特異的なマーカーであることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、新たな腎細胞癌マーカーを提供することができる。