(57)【要約】【課題】試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチドを供給するステップ；試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップ；および前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップを含む、試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法に関する。本発明はさらに、ヒト個体が肝細胞癌を患うリスクを評価するための方法、ならびに本発明による方法において有用な部品および抗体のキット、ならびにそのような抗体の産生において免疫抗原として有用なペプチドに関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法であって、
−固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチドを供給するステップと、
−試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップと、
−前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
試料においてＡＧＰの量を定量化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、前記のフコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体と、任意の結合したフコシル化ＡＧＰを接触させることにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の検出抗体が、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１（配列番号３）を含むエピトープに特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰの検出が、前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体、および第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体と接触させることにより実施され、かつ第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第１の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第２の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の検出抗体が、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の抗体であり、または請求項２４に記載の方法によって産生される、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、フコース結合性ペプチドを固相から遊離させて、ペプチド：ＡＧＰ複合体を固相から分離し、分離された画分においてＡＧＰを検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
分離された画分におけるＡＧＰの検出がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＧＰが、肝細胞癌を示すグリコシル化パターンを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト個体が肝細胞癌（ＨＣＣ）を患うリスクを評価するための方法であって、前記個体由来の試料においてフコシル化ＡＧＰを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を用いて検出するステップを含み、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示している、方法。
【請求項１５】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度の少なくとも１つを測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度を測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
肝硬変および／または肝炎を患っているが、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド、および前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある少なくとも第１の検出抗体を含む部品のキット。
【請求項１９】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１８に記載の部品のキット。
【請求項２０】
第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体をさらに含み、第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１９に記載の部品のキット。
【請求項２１】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の部品のキット。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法における、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の部品のキットの使用。
【請求項２３】
配列番号３によるアミノ酸配列と８８％、９４％、または１００％などの少なくとも８３％同一性を有するアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
【請求項２４】
配列番号３によるアミノ酸配列と８８％、９４％、または１００％などの少なくとも８３％同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、免疫抗原として用いられることを特徴とする、抗体を産生するための方法。
【請求項２５】
ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜１８９と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力がある抗体。
【請求項２６】
ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力があるＩｇＧ抗体。
【請求項２７】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２５または２６に記載の抗体。
【請求項２８】
ポリクローナル抗体である、請求項２５または２６に記載の抗体。
【請求項２９】
ウサギポリクローナル抗体である、請求項２５または２６に記載の抗体。
【請求項３０】
モノクローナル抗体である、請求項２５または２６に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオマーカー、およびバイオマーカーの検出に用いるアッセイの分野、ならびにそのようなアッセイにおいて有用な抗体に関する。特に、本発明は、原発性肝臓癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）を示すバイオマーカーを検出するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
原発性肝臓癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）は、最も高頻度で見られるヒト癌の１つであり、３番目に致死性が高い。ＨＣＣのたいていの症例は、肝硬変を背景に発症し、硬変およびＨＣＣを発症する主な原因は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。ＨＢＶおよびＨＣＶ感染は、世界中の全ＨＣＣ症例の８０％より多くと関連している１−３。ＨＣＣの発症の非ウイルス性背景には、アルコール性疾患、糖尿病、ならびに代謝性疾患および自己免疫性疾患によって引き起こされる肝硬変が挙げられる。
【０００３】
ＨＣＣ腫瘍が初期に検出された場合には、外科的切除、移植術、または高周波アブレーションを用いる治癒的処置を施すことができる。しかしながら、治癒の可能性のある処置に適している初期においては、ＨＣＣ腫瘍の３０％が検出されるのみである。
【０００４】
ＨＣＣの進行を診断および測定するために最もよく用いられる血清バイオマーカーは、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）である。しかしながら、ＨＣＣを検出するＡＦＰの診断能力は限られている。肝硬変と肝炎のどちらもＡＦＰのレベルの上昇をもたらし得、ＨＣＣと診断された患者の半数近くは、ＡＦＰのレベルの上昇を示さない。別のバイオマーカーである、デス−γ−カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）は、いくつかの臨床研究において、診断感度がＡＦＰより若干高いことが示されている４。しかしながら、ＡＦＰとＤＣＰのどちらも、スクリーニングマーカーとして用いられるには不十分な診断感度および特異性を示し、監視においてそれらを診断マーカーとして用いることは、国際ガイドラインでは推奨されていない５。超音波は、より高い診断感度および特異性を示しているが（６０〜８０％）、高い費用と、初期において腫瘍を検出できないことを欠点にもつ６。
【０００５】
血清糖タンパク質のグルコシル化変化が、肝臓疾患ならびにＨＣＣの発症および進行と関連することが示されている。最もよく研究された例は、ＡＦＰのコアフコシル化型である、ＡＦＰ−Ｌ３の増加であり、それは、単独でＡＦＰを用いるより、ＨＣＣに対してより高い特異性を示している７。
【０００６】
血漿タンパク質のフコシル化の増加は、ＨＣＣに関連づけられた一般的な所見であり、質量分析研究により、肝硬変患者とＨＣＣ患者との間でのフコシル化パターンの特定の違いが明らかにされている８−１３。しかしながら、フコースに対して幅広い特異性を有するヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）由来のフコース結合性レクチン（ＡＡＬ）などのレクチンを用いる研究は、ＨＣＣを有する患者と肝硬変を有する患者とを区別するのに問題がある場合が多い１４，１５。
【０００７】
フコース結合性レクチンＡＡＬは、疾患に関連づけられた血漿タンパク質のフコシル化変化を研究するために広く用いられている。ＡＡＬは、２つの同一のサブユニットで構成され、各サブユニットは、フコースに対する５つの結合部位を含有する１６。ＡＡＬは、フコシル化オリゴ糖に対する幅広い特異性を示し、ＳＬｅｘおよびＳＬｅａなどのシアリル化構造およびフコシル化構造を含む、α１−６、α１−２、α１−３、およびα１−４連結したフコースを有するオリゴ糖に結合する。５つの異なる結合部位は、結合特異性および親和性が異なる。
【０００８】
ＡＡＬに由来した１価フコース結合性ペプチドは国際公開第２００９／１３６８５９号から知られている。結合部位２のみを含むＡＡＬの組換え型、Ｓ２が作製されている１７。この組換え型は、ＡＡＬと比較して、フコシル化オリゴ糖に対してより限定された結合性を示し、シアリル化／フコシル化オリゴ糖に対する結合性が低下していた。それはまた、フコシル化構造に対する親和性の全般的な低下を示し、多フコシル化オリゴ糖およびα１−６連結型フコースを含有するオリゴ糖に対して最も高い親和性を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３６８５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、原発性肝臓癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）に特異的なグリコシル化パターンを有するα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）をアッセイするためのアッセイに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様において、本発明は、以下のステップを含む、試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法に関する：
−固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチドを供給するステップ；
−試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップ；および
−前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップ。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ヒト個体が肝細胞癌（ＨＣＣ）を患うリスクを評価するための方法であって、上記態様による方法を用いて前記個体由来の試料においてフコシル化ＡＧＰを検出するステップを含み、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較して、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、その個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示す、方法に関する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド、および前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある少なくとも第１の検出抗体を含む部品のキットに関する。
【００１４】
本発明はまた、上記態様による方法における、本発明によるキットの使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、配列番号３によるアミノ酸配列と８８％、９４％、または１００％などの少なくとも８３％同一性を有するアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および抗体の産生におけるそれの使用に関する。そのような抗体は、上記態様による方法において有用である。
【００１５】
本発明はまた、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜１８９と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力がある抗体、およびヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力があるＩｇＧ抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】上部パネル：固体支持体上に固定化された抗体＃０５８を用いた標準ＥＬＩＳＡの図解。下部パネル：肝細胞癌（ＨＣＣ）、硬変を有する患者から得られた試料、ならびに陰性および陽性対照についての測定された吸光度値。
【図１Ｂ】上部パネル：固体支持体上に固定化されたＳ２を用いた逆ＥＬＩＳＡの図解。下部パネル：肝細胞癌（ＨＣＣ）、硬変を有する患者から得られた試料、ならびに陰性および陽性対照についての測定された吸光度値。
【図２】逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡにおけるウサギポリクローナル抗体＃０５８と市販の抗ＡＧＰ抗体の比較。肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者、硬変を有する患者、肝炎を有する患者から得られた試料、および正常対照について分析を実施した。
【図３】患者血漿試料由来の、ＡＡＬで濃縮された、およびＳ２で濃縮されたα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）のウェスタンブロット分析。レーン１〜４は硬変試料、レーン５〜８はＨＣＣ試料、レーン９は肝炎試料、レーン１０は正常血漿試料を表す。ＡＧＰは、抗ヒトＡＧＰ抗体０５８を用いて検出された。
【図４Ａ】逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡアッセイにおける患者試料由来の異なる濃度の精製ＡＧＰの結合。ＨＣＣ試料（黒色三角形）、硬変試料（黒色四角形）、および正常試料（黒色円形）由来のＡＧＰの結合を、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡにおいて分析した。
【図４Ｂ】逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡにおけるマトリックス効果の分析。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈された（円形）、および正常血漿中に希釈された（黒色四角形）、ＨＣＣ患者試料由来の異なる濃度の精製ＡＧＰの結合。
【図４Ｃ】逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡアッセイにおける異なる濃度のｄｓＡＧＰの結合。
【図５Ａ】肝炎、硬変、およびＨＣＣを有する患者におけるＳ２結合ＡＧＰのレベルの散布図。
【図５Ｂ】肝炎、硬変、およびＨＣＣを有する患者におけるＡＧＰのレベルの散布図。
【図５Ｃ】肝炎、硬変、およびＨＣＣを有する患者におけるＡＦＰのレベルの散布図。
【図６】ＡＧＰおよびＳ２結合ＡＧＰのレベルの相関プロット。ｒスクエア値は０．１１である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書に用いられる全ての用語および単語は、一般的に、当業者によりそれらに一般的に与えられた意味を有するものと解釈されるべきである。明瞭にするために、いくつかの用語を下記で明確に定義する。
【００１８】
抗体に関して本明細書で用いられる場合、「特異性」は、特定のエピトープに、類似しているが非同一のエピトープと比較して有意により高い親和性で結合する抗体の質を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「親和性」は、物質間または粒子間における、それらを化学的に結合させ、そのまま留まらせる引力を意味する。親和性は、２つの物質が強い、もしくは弱い化学結合を形成して、分子もしくは複合体を形成する傾向、または抗原−抗体複合体の熱力学的結合強度を表す。複合体における２つの物質間の非共有結合性結合の強度は、複合体の解離定数により測定される。免疫学の範囲内では、親和性は、単一の抗原結合部位と単一の抗原決定基との間の相互作用の強度の熱力学的表現、およびしたがって、それらの間での立体化学的適合性の熱力学的表現である。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「ＡＧＰ」は、α１−酸性糖タンパク質（別名オロソムコイド）を意味する。ＡＧＰは、２．８〜３．８のｐＩを有する４１〜４３ｋＤａの糖タンパク質である。成熟ヒトＡＧＰについて、ペプチド部分は、２つのジスルフィド架橋を有する１８３個のアミノ酸の単鎖である。糖含有量は、分子量の４５％に相当し、５〜６個の、高度にシアリル化された複合型Ｎ結合型グリカンの形で付着している。ヒトＡＧＰの配列は、配列番号２として提供され、その配列において、残基１〜１８は、成熟タンパク質中には存在しないシグナルペプチドである。本開示のＡＧＰにおける特定のアミノ酸位置は、配列番号２による配列を用いて参照される。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「ＨＣＣ」は、肝細胞癌を意味する。ＨＣＣは、肝臓の原発性悪性腫瘍であり、主に、基礎慢性肝臓疾患および／または肝硬変を有する患者に起こる。原発性悪性腫瘍とは、ＨＣＣが転移性肝臓癌と区別されるべきであることが意図され、その転移性肝臓癌とは、別の器官から生じ、その後、転移を通して肝臓へ広がっている。ＨＣＣは肝臓癌の大部分を占める。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「同一性」は、２つのアミノ酸配列が、アラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度を意味する。同一性は、パーセンテージとして表される。アラインメントは、同一性および保存の最大レベルを達成するように、２つまたはそれより多くのアミノ酸配列のアミノ酸残基をうまく整合させる工程または結果である。アミノ酸配列のアラインメントは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／上で利用可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａなどのいくつかの利用可能なツールによりなされ得る。
【００２３】
配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有するペプチドは、本開示において、まとめて「Ｓ２」または「Ｓ２ペプチド」と呼ばれる。
【００２４】
配列
配列番号１は、結合部位２のみを含むヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）の組換え型のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号２は、ヒトα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）の配列を示す。
配列番号３は、ヒトα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）のアミノ酸残基１８３〜２０１を示す。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、下記でＳ２−ペプチドと表示された、配列番号１によるアミノ酸配列を有する１価フコース結合性ペプチドが、肝細胞癌を示すグリコシル化パターンを有するα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）の存在をアッセイすることにおいて有用である結合特性を示すことを同定している。
【００２７】
肝炎、硬変、およびＨＣＣを有する患者由来の血漿においてＡＡＬ結合ＡＧＰの量に差があるかどうかを分析するために、レクチンアガロースビーズ沈降を用いた。正常と比較して、硬変患者試料とＨＣＣ患者試料の両方においてＡＡＬ結合ＡＧＰの増加があり、それは、フコシル化の増加と一致している。しかしながら、Ｓ２−ペプチドを用いて免疫沈降を実施した場合、硬変患者と肝炎患者の両方と比較して、ＨＣＣ患者はそれらの血漿においてレクチン結合ＡＧＰのレベルが増加する傾向があった。
【００２８】
したがって、第１の態様において、本発明は、以下のステップを含む、試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法に関する：
−固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド（Ｓ２−ペプチド）を供給するステップ；
−試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップ；および
−前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップ。
【００２９】
固相は、生物学的アッセイにおいて有用ないかなる型のものでもよい。現在、好ましい実施形態には、ストレプトアビジンが共有結合的に付着している、ポリスチレンマイクロタイタープレートおよびアガロースビーズが挙げられる。固体支持体の他の型には、ゲルマトリックス、セルロースおよびニトロセルロースマトリックス、ゲルビーズ、磁気ビーズ、プラスチック（例えば、ポリスチレン）ビーズ、ならびに平面基板（スライド）が挙げられる。Ｓ２−ペプチドは、標準技術を用いて固相に固定化することができる。
【００３０】
ポリスチレンで構成された固相を用いる場合、Ｓ２−ペプチドは、当技術分野において知られているような、および実施例に記載されたような受動的吸着によって固定化することができる。Ｓ２−ペプチドはまた、例えば、実施例にも記載されているようにＳ２−ペプチドをビオチン化し、共有結合的に付着したストレプトアビジン部分を有する固相を用いることにより、固相上に可逆的に固定化することができる。
【００３１】
１価フコース結合性ペプチドは、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと１００％同一ではない場合、好ましくは、実施例１に開示された条件下で、配列番号１によるアミノ酸配列を有するペプチドと本質的に同じ、またはより高い、肝細胞癌を示すグリコシル化パターンを有するフコシル化ＡＧＰに対する親和性を示す。
【００３２】
本方法に用いられる試料は、好ましくは、血漿、血清、または血液試料である。試料は、好ましくは、ＨＣＣを患っているのではないかと疑われるヒト個体由来である。試料に任意で存在するフコシル化ＡＧＰがＳ２−ペプチドに結合することを可能にするのに適した条件下で、固体支持体上に固定化されたＳ２−ペプチドと試料を接触させる。例示的な条件は、実施例に提供されている。
【００３３】
一実施形態において、任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出は、前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体と、任意の結合したフコシル化ＡＧＰを接触させることにより実施される。
【００３４】
一実施形態において、第１の検出抗体は、第１の検出抗体に対する特異性を示す第２の検出抗体を用いることにより検出される。例えば、第１の検出抗体が、ある特定の種において産生されたポリクローナルＩｇＧ抗体である場合には、第２の検出抗体は、当技術分野において一般的に用いられているように、この種由来のＩｇＧ抗体に対して産生された抗体であり得る。この実施形態において、第２の検出抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされている。
【００３５】
上記実施形態に用いられる検出可能な標識は、選択されたアッセイ形式において適したいかなる検出可能な標識であってもよく、それらには、非限定的に、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアが挙げられる。
【００３６】
一実施形態において、Ｓ２−ペプチドは、固相に可逆的に固定化されている。その後、任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出は、Ｓ２−ペプチドを固相から遊離させ、かつＳ２−ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰと共にＳ２−ペプチドを溶出し、またはフコシル化ＡＧＰをＳ２−ペプチドから遊離させることにより、実施され得る。その後、フコシル化ＡＧＰは、検出することができ、任意で、溶出液において定量化することができる。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、ヒト個体が肝細胞癌（ＨＣＣ）を患うリスクを評価するための方法であって、上記のような方法を用いて前記個体由来の試料においてフコシル化ＡＧＰを検出するステップを含み、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較して、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、その個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示す、方法に関する。
【００３８】
前の態様に関して、試料は、好ましくは、血液、血清、または血漿の試料である。
この態様の一実施形態において、本発明は、試料において総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度の１つまたは両方を測定することをさらに含む。総ＡＧＰおよび総ＡＦＰについてのアッセイは、いくつかの供給業者、例えば、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、およびＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。これらの１つまたは２つの追加のバイオマーカーの組み合わせを用いることにより、Ｓ２−ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰのみの測定と比較して、一方の側のＨＣＣと他方の側の硬変および肝炎との間のさらに確実な区別が可能になる。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、本発明による方法を実施するための部品のキットに関する。そのようなキットは、好ましくは、固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド、および前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある少なくとも第１の検出抗体を含む。
【００４０】
第１の検出抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされていてもよく、またはキットは、第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体を含んでもよく、その場合、第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている。検出可能な標識は上記で開示されている通りである。
【００４１】
一実施形態において、試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するために用いられる方法は、逆ＥＬＩＳＡにおいて具体化される。
【００４２】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、血清などの分析混合物から成分を検出および定量化するための周知の方法であり、１９７１年に最初に報告された。それ以後、その方法は、さらに発達し、広く用いられている。直接的ＥＬＩＳＡは別として、３つのバリエーション；間接的ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、および競合的ＥＬＩＳＡが一般的に用いられている。ＥＬＩＳＡ分析および標準プロトコールの詳細な開示は、ウェブサイトＥＬＩＳＡエンサイクロペディア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｌｉｓａ−ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｃｏｍ／）で見出すことができる。
【００４３】
一般的に、ＥＬＩＳＡ分析は、以下のステップを含む。ＥＬＩＳＡ全手順中の全ての洗浄ステップは、緩衝溶液で行われる。緩衝溶液は、好ましくは、Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）である。
【００４４】
固体支持体調製：固体支持体は、抗原または捕獲抗体の固体支持体への受動的吸着によってコーティングされる。固体についての材料は、通常、ポリスチレンであり、通常、ポリスチレンのチューブまたはマイクロタイタープレートが用いられる。好ましくは、９６ウェルマイクロタイタープレート（マイクロプレート）が用いられる。
【００４５】
抗原または抗体は、ポリスチレン表面への受動的吸着により固体支持体に固定化される。これは、通常、一晩などの長時間にわたって、４℃で実施される。ｐＨ７でのコーティングがいくつかの適用について許容でき得るが、アルカリ条件が固定化ステップについて好ましい。固定化ステップ後、固体支持体を洗浄し、通常、分析に影響する可能性がある、いかなる他の未知の分子であれ、それらが固体支持体に固定化されることを阻害するために、タンパク質でブロッキングする。ブロッキングは、通常、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることにより実施される。ブロッキング後、固体支持体を洗浄する。
【００４６】
アッセイ手順：液体の形での、試験されるべき試料を固体支持体に加え、その後、インキュベートする。固体支持体上に固定化された抗原または捕獲抗体に対する親和性または特異性を有するいかなる抗体または抗原もそれらに結合することになる。液体試料を除去し、結合していない分子を全て除去するために固体支持体を洗浄する。
【００４７】
その後、少なくとも１つの検出抗体を加えるが、その抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。それは、試験試料由来の抗原に結合する第１の検出抗体、続いて、第１の検出抗体に対して方向づけられた第２の酵素コンジュゲート化検出抗体であり得る。試験試料由来の抗体が固体支持体上の抗原に結合している場合には、酵素コンジュゲートされた第２の検出抗体を、検出のためにすぐに加えてもよい。
【００４８】
第２の検出抗体として、通常、試料由来の抗体に対する、または第１の検出抗体に対する特異性を有するＩｇＧ免疫グロブリンが用いられる。例えば、第１の検出抗体がウサギ由来である場合には、第２の検出抗体は抗ウサギとなる。この第２の検出抗体は、それにコンジュゲートされた酵素を有する。この目的のためにいくつかの酵素が用いられており、それらには、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、およびｐ−ニトロフェニルホスファターゼが挙げられる。市販されているコンジュゲートは、ペルオキシダーゼとのグルタルアルデヒド連結方法を用いて調製されている。しかしながら、二次的な試薬は、抗体の代わりに、ＥＬＩＳＡ分析に用いるのに適している限り、抗原に特異的に結合し、かつ酵素にコンジュゲートされ得る任意の他の分子に関係してもよい。これは、例えば、フルオロフォアであり得る。
【００４９】
抗体を加えた後、および第１の検出抗体の添加と第２の検出抗体の添加の間で、固体支持体を再び、洗浄する。
【００５０】
その後、基質溶液を加え、固体支持体をしばらくインキュベートしておく。基質は、酵素に有色の反応産物を生じさせることになる。必要とされる時間は、検出のために選択された酵素および基質の組み合わせに依存する。
【００５１】
上記の酵素に有色反応産物を生じさせるために用いられ得る基質は、用いられる酵素に依存して異なる。４−ニトロフェニルリン酸はＡＰについて一般的に用いられる基質である。ＨＲＰに関して一般的に用いられる基質は、５−アミノサリチル酸、３，３’−ジアミノベンジジン、２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリジン−６−スルホン酸］二アンモニウム塩、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。ｐ−ニトロフェニルホスファターゼに関して用いられる基質は、通常、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムである。
【００５２】
必要とされる時間の経過後、停止溶液を加えて反応を停止させる。その後すぐに、有色反応産物の測定を、産物からの透過光の強度、すなわち光学密度を分光光度計により測定することにより検出する。読み取りは、好ましくは、マイクロプレートリーダーで行われる。反応産物の検出は、用いられる酵素および基質に依存して、色素生産性、化学蛍光性、または化学発光性であり得る。
【００５３】
基質は市販されており、当業者は、検出抗体にコンジュゲートされた酵素に応じて基質溶液を容易に調製し得る。マイクロプレートリーダーもまた容易に商業的に入手できる。
【００５４】
結果の計算：分析に含まれる平均ゼロ標準吸光度を用いて、各ウェルまたはチューブについての平均吸光度を計算する。平均吸光度を、標準曲線において濃度に対してプロットする。
【００５５】
本発明者らは、抗原検出剤として第１の検出抗体がマイクロプレート上に固定化されている標準ＥＬＩＳＡを構築した（図１Ａ参照）。用いられる第１の検出抗体は、ヒト血漿由来α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）に対して方向づけられた抗体であった。その後、固体支持体を患者血漿試料とインキュベートした。その時、患者血漿試料中に存在する任意のα１−酸性糖タンパク質が第１の検出抗体に結合している。その後、ビオチンとコンジュゲートされた１価フコース結合性ペプチドを加える。ビオチンコンジュゲート化フコース結合性ペプチドは、検出のためのＴｒｉｓ緩衝液中の、酵素としてのアルカリホスファターゼに連結されたストレプトアビジンおよびｐＮＰＰ基質を用いて、フコシル化されている任意のＡＧＰに結合し、これを検出する（図１Ａ参照）。
【００５６】
しかしながら、この標準ＥＬＩＳＡは、満足なシグナル対バックグラウンド比を示さなかった。
【００５７】
したがって、本発明者らは、本発明による方法を開発し、それらのうち、１つの好ましい実施形態が図１Ｂの上部パネルに模式的に開示されており、その場合、シグナル対ノイズ比が大幅に改善された。これは、図１Ａおよび図１Ｂ、それぞれの下部パネルに提供された結果を比較することによりわかる。ヒト血漿由来ＡＧＰに対して方向づけられた抗体を固体支持体に固定化する代わりに、Ｓ２−ペプチドを固体支持体上に固定化する。そのようにすることにより、前記支持体を患者血漿試料とインキュベートした場合、フコシル化タンパク質のみが、固体支持体に結合することになる。その後、ヒト血漿由来ＡＧＰに対して方向づけられた第１の検出抗体を加え、その結果、第１の検出抗体は、固体支持体上に吸着されているＳ２−ペプチドに結合した任意のＡＧＰに結合することになる。最後に、Ｓ２−ペプチドに結合したＡＧＰを検出することができるように、第１の検出抗体に対して方向づけられたＨＲＰコンジュゲートされた第２の検出抗体を加える。その後、ＥＬＩＳＡ分析についての標準手順であるように、検出を実施する。このモデルをＳ２−逆ＥＬＩＳＡと呼ぶ。
【００５８】
一態様において、本発明は、配列番号３によるアミノ酸配列と８８％、９４％、または１００％などの少なくとも８３％同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが免疫原として用いられることを特徴とする、抗体を産生するための方法に関する。そのような抗体は、ヒトＡＧＰのＣ末端部分に位置するエピトープに対する特異性を示し、本発明による方法およびキットにおいて第１の検出抗体として有用である。
【００５９】
一態様において、本発明はまた、配列番号３によるアミノ酸配列と８８％、９４％、または１００％などの少なくとも８３％同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、および抗体の産生における免疫抗原としてのそれの使用に関する。
【００６０】
本出願での方法において産生され、かつ用いられる抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００６１】
モノクローナル抗体は、抗原内の単一のエピトープを認識する抗体の集団を表す。それらは、典型的には、免疫化哺乳動物の単一のＢ細胞から産生され、それにより、お互いに同一で、かつ全てが特定の抗原の同じエピトープを認識する、抗体のクローン集団を生じる。モノクローナル抗体の産生は、Ｋｏｈｌｅｒおよび共同研究者らにより最初に報告された１８。原則として、この方法は以下のステップを含む。
【００６２】
哺乳動物を、関心対象となる抗原で免疫化し、その結果、哺乳動物は、前記抗原に対して抗体を発生する。これに続いて、免疫応答をブーストし、かつ特定の免疫抗原に対する抗体のより高い力価を生じさせるために、２次および３次の注射を行う。哺乳動物は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、またはウマであり得る。注射後、血液を脾臓から収集し、抗体産生Ｂ細胞を単離する。抗体を採取するためにＢ細胞を用いることができるが、その欠点は、これらの細胞が有限の寿命をもち、最終的には、抗体の産生を停止することになることである。
【００６３】
特定の抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞が形成され、したがって、Ｂ細胞の限られた寿命を克服することができる。Ｂ細胞と骨髄腫細胞の融合は、ポリエチレングリコール、ウイルスを用いることにより、または両方の細胞型を含む細胞培養物のエレクトロポレーションにより行われ得る。融合後、ハイブリドーマの選択を行わなければならない。これは、ヒポキサンチンからのヌクレオチドの合成に関与する酵素である、ＨＧＰＲＴ、すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを用いることにより行われる。骨髄腫細胞はＨＧＰＲＴ−であり、Ｂ細胞はＨＧＰＲＴ＋である。ＨＧＰＲＴ＋細胞のみを維持することができるＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地中で培養物を成長させる。別の骨髄腫細胞と融合し、または全く融合していない骨髄腫細胞は、それらがＨＧＰＲＴ−であるため、ＨＡＴ培地において死ぬ。別のＢ細胞と融合し、または全く融合していないＢ細胞は、それらが無制限に分裂する能力をもたないため、死ぬ。Ｂ細胞と骨髄腫細胞との間でのハイブリドーマのみが、ＨＧＰＲＴ＋と癌性の両方であるので、生存する。
【００６４】
用いられる哺乳動物由来のＢ細胞の最初の収集物は、不均一であり、すなわち、それらが全て、同じ抗体を産生するわけではない。したがって、ハイブリドーマ集団は、単一の抗体を産生するわけではない。したがって、各ハイブリドーマを培養し、当技術分野内において周知で、かつ当業者によく知られた方法を用いてスクリーニングする。いったん、正しい抗体を産生する、ある特定のハイブリドーマが検出されたならば、その不死化Ｂ細胞−骨髄腫ハイブリドーマは、非常に特異的なモノクローナル抗体の一定した供給を提供することができる。モノクローナル抗体は１つのエピトープを認識するだけなので、それらは一般的に、非特異性抗原との交差反応性は低い。
【００６５】
ポリクローナル抗体は、１つの単一免疫化動物の免疫応答により活性化されている複数個のＢ細胞クローンから収集された抗体の集団を表す。伝統的には、ヤギ、ヒツジ、マウス、またはウサギなどの哺乳動物に、一次免疫応答を誘発する、関心対象となる特定の抗原を注射する。これに続いて、その特定の免疫抗原に対する抗体のより高い力価を生じる、二次および三次の注射を行う。抗体を含有する血清を哺乳動物から収集し、典型的には、問題の抗原に対して産生された抗体を濃縮するためにアフィニティ精製する。この工程により、関心対象となる抗原の全てのエピトープに対する高い力価、高い親和性のポリクローナル抗体の産生がもたらされる。ポリクローナル抗体の産生は、例えば、Ｍａｒｌｉｅｓ  Ｌｅｅｎａａｒｓおよび共同研究者らにより報告されている１９。
【００６６】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに例証するために含まれ、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲とは、添付された特許請求の範囲の範囲である。
【実施例１】
【００６７】
実施例１  標準ＥＬＩＳＡと逆ＥＬＩＳＡの比較
患者試料
ＨＣＣを有する１人の患者および硬変を有する２人の患者由来の血漿試料を、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ、ＳｗｅｄｅｎのＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。正常対照は、健康な供血者由来の血漿プールであった。陽性対照は、２μｇ／ｍｌの濃度でのｄｓＡＧＰであった。
【００６８】
抗体の産生
ポリクローナル抗ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体０５８の産生は、Ａｇｒｉｓｅｒａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｖａｎｎａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行われた。手短に述べれば、ヒトα１−酸性糖タンパク質のＣ末端アミノ酸１８３〜２０１に対応する合成ペプチドがＡｇｒｉｓｅｒａによって合成された。そのペプチドを、それの末端システインを介して、マレイミド架橋剤を用いてＫＬＨにコンジュゲートし、ウサギをＫＬＨコンジュゲート化ペプチドで４回、免疫化した。２ｍＬのＵｌｔｒａＬｉｎｋヨードアセチル樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に連結された合成ペプチドを用いて、血清から抗ＡＧＰ抗体を精製した。
【００６９】
標準レクチンＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中１０μｇ／ｍＬの抗体０５８で、４℃で一晩、コーティングした。ウェルを、ＰＢＳ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中３％ＢＳＡで１時間、ブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１：５０に希釈した患者血漿試料を加え、かつ２００ｒｐｍで振盪しながら１時間、インキュベートする前に、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で３回、洗浄した。上記のようにウェルを洗浄した後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍＬでビオチン化Ｓ２−ペプチドを加え、室温（ＲＴ）で穏やかに振盪しながら１時間、インキュベートした。結合したＳ２−ペプチドを、アルカリホスファターゼコンジュゲート化ＥｘｔｒａｖｉｄｉｎｅおよびｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。３０分後、結合したＳ２−ペプチドの量を、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて４９０ｎｍで測定した。
【００７０】
逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中５μｇ／ｍＬのＳ２で、４℃で一晩、コーティングした。ウェルを、ＰＢＳ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中３％ＢＳＡで１時間、ブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１：５０に希釈した患者血漿試料を加え、かつ２００ｒｐｍで振盪しながら１時間、インキュベートする前に、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で３回、洗浄した。上記のようにウェルを洗浄した後、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトα１−酸性糖タンパク質０５８を加え、室温（ＲＴ）で穏やかに振盪しながら１時間、インキュベートした。結合した抗ヒトα１−酸性糖タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）およびＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。３０分後、２５μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、反応を停止させ、結合した抗ＡＧＰの量を、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて４９０ｎｍで測定した。
【００７１】
結果
標準ＥＬＩＳＡについての結果は、図１Ａに示されており、逆ＥＬＩＳＡについては図１Ｂに示されている。逆ＥＬＩＳＡは、標準ＥＬＩＳＡと比較してより高いシグナル強度を示した。ＨＣＣ試料および陽性対照試料に関する標準ＥＬＩＳＡにおけるシグナル対バックグラウンド比は、それぞれ、１．０５および１．３８であり、一方、同じＨＣＣ試料および同じ陽性対照に関するシグナル対ノイズ比は、それぞれ、５．１および５．２に改善された（図１）。
【実施例２】
【００７２】
実施例２  検出抗体の比較
患者試料
ＨＣＣを有する１人の患者、硬変を有する１人の患者、肝炎を有する１人の患者由来の血漿試料、および健康な供血者由来の血漿プール（正常）について分析を実施した。
【００７３】
アッセイ
（上記で例示されているような）逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡを用いて、市販の抗ＡＧＰ抗体をＡｂ−０５８と比較した。０５８抗体（図２における試料１２）を、以下のリストによるいくつかの市販のポリクローナルまたはモノクローナル抗ＡＧＰ抗体と比較した。
【００７４】
検出抗体
検出用に以下の抗体を用いた。
１．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ３６９４）
・供給源：ポリクローナルヤギＩｇＧ
・免疫原：ヒト血漿由来α１−酸性糖タンパク質
２．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（ＡＧＰ−１／２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−５１０１８）
・供給源：ポリクローナルヤギＩｇＧ
・免疫原：ヒト起源のＡＧＰ−１の内部領域内に位置するペプチド
３．ＯＲＭ  １ポリクローナル抗体、ヒト種およびマウス種（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、カタログ番号１６４３９−１−ＡＰ）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：Ａｇ９７５８、オロソムコイド１
４．ＯＲＭ  ２ポリクローナル抗体、ヒト種（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、カタログ番号１１１９９−１−ＡＰ）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：Ａｇ１６６７、オロソムコイド２
５．抗−ＯＲＭ  １／オロソムコイド抗体（ＬＳＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ２９２７２２）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された組換えヒトα１−ＡＧＰ（アミノ酸１９〜２０１）
６．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（ＡＧＰ−１（２９Ａ１）、カタログ番号ｓｃ−６９７５３）
・供給源：モノクローナルマウスＩｇＧ
・免疫原：ヒト起源の精製α１−ＡＧＰ
７．モノクローナル抗ＯＲＭ  １抗体、クローン２Ｆ９−１Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＷＨ０００５００４Ｍ１−１００μｇ）
・供給源：モノクローナルマウスＩｇＧ
・免疫原：ＯＲＭ  １（ＡＡＨ２６２３８、アミノ酸１８〜アミノ酸２０２）ＧＳＴ−タグを有する完全長組換えタンパク質
８．ＯＲＭ  １モノクローナル抗体、ヒト種（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、カタログ番号６６０９７−１−Ｉｇ）
・供給源：モノクローナルマウスＩｇＧ
・免疫原：Ａｇ１９２４８、オロソムコイド１α
９．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ１−９５３０）
・供給源：ポリクローナルニワトリＩｇＹ
・免疫原：ヒトα１−酸性糖タンパク質の残基１４９〜１６０および１９０〜２０１に対応する合成ペプチドの混合物
１０．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−０５３４）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：精製ヒトα１−酸性糖タンパク質
１１．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｑ０３２６）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：精製ヒトα１−酸性糖タンパク質
１２．ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体、アフィニティ精製＃０５８（Ａｇｒｉｓｅｒａ）
・供給源：ポリクローナルウサギＩｇＧ
・免疫原：アミノ酸１８３〜２０１に対応する合成ペプチドＣＥＰ  １９
結果
結果は、図２に示されている。これらの結果は、種々の検出抗体が、シグナル対バックグラウンド比、および非ＨＣＣ試料からＨＣＣ試料を区別することにおける性能の点で異なることを示している。０５８抗体（番号１２）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のポリクローナルＩｇＧ抗体（番号１）のみ、ならびに、より少ない程度ではあるが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のポリクローナルＩｇＹ抗体（番号９）もまた、非ＨＣＣ試料からＨＣＣ試料を区別することについての選択性を示すが、他の抗体はそのような選択性を示していない。しかしながら、０５８抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のポリクローナルＩｇＧ抗体と比較して、若干より良いシグナル対バックグラウンド比を示した。
【００７５】
アッセイ番号１、９、および１２における一次検出抗体は、ＡＧＰの非グリコシル化Ｃ末端部分に位置するエピトープに対する親和性を有すると仮定されている。このエピトープは、肝細胞癌を示すグリコシル化パターンを有するＡＧＰがＳ２−ペプチドに結合している時、結合に利用可能であり得るが、ＡＧＰが硬変、肝炎から生じるグリコシル化パターン、またはＨＣＣ、硬変、もしくは肝炎に罹っていない個体から生じる正常なグリコシル化パターンを有する場合、同じ程度では利用できない。さらに、試験された抗体のいくつかは、０５８とは対照的に、高いバックグラウンド染色を示し、それは、抗体が、コーティングされたＳ２に直接、非特異的に結合することを示しており、それにより、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡにおけるそれらの使用が制限される。
【実施例３】
【００７６】
実施例３  精製ＡＧＰ試料を用いた逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡの確証
ＡＧＰの精製
ＡＧＰを、Ａｓａｏらによる２段階イオン交換クロマトグラフィー法を用いて、血漿試料から単離した２０。１ｍＬの血漿試料を、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４で平衡化されたＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。脱塩されたピークを、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。ＡＧＰを含有する画分を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ７で溶出し、プールし、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４で平衡化された、２つの連結されたＨｉＴｒａｐ脱塩カラムに適用した。脱塩されたピークを、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＡＧＰを２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４．８で溶出した。溶出された画分を、水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００７７】
ポリクローナル抗ヒトα１−酸性糖タンパク質０５８の産生
ポリクローナル抗ヒトα１−酸性糖タンパク質抗体０５８の産生は、実施例１に記載されているようにＡｇｒｉｓｅｒａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｖａｎｎａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって行われた。
【００７８】
脱シアリル化ＡＧＰ（ｄｓＡＧＰ）の作製
ＡＧＰ（１．７ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を、０．３ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中に溶解した。ノイラミニダーゼ（６０ｍＵ、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｖ型、Ｓｉｇｍａ）を加え、試料を３７℃で４時間、インキュベートした。脱シアリル化ＡＧＰを、５ｍｇの固定化抗ＡＧＰ抗体（ＤＡＫＯ、Ａ００１１）を有する５ｍｌカラム（ＮＨＳ活性化ＨｉｇｈＴｒａｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。試料を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で１．３ｍｌに希釈し、カラムに注入した。ＰＢＳでの２０分間の洗浄（流速５ｍｌ／分）後、ｄｓＡＧＰを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．５で溶出した。溶出を、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターした。陽性画分をプールし、２ＬのミリＱ水の３回の交換に対して透析した。その後、透析されたｄｓＡＧＰを凍結乾燥した。
【００７９】
血漿試料からのＳ２結合性糖タンパク質およびＡＡＬ結合性糖タンパク質の濃縮
Ｓ２−ペプチドおよび組換えＡＡＬを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ  ＮＨ−ＬＣビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコールに従ってビオチン化した。１タンパク質試料あたり５モル倍過剰のビオチン試薬をビオチン化に用いた。ビオチン／タンパク質比を、ＨＡＢＡ／アビジンアッセイを用いて決定し、１Ｓ２分子あたり１ビオチン部分および１ＡＡＬ分子あたり２ビオチン部分と算出した。ＥＺｖｉｅｗ  Ｒｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコールに従い、血漿試料からＳ２結合性糖タンパク質およびＡＡＬ結合性糖タンパク質を濃縮した。簡単に述べれば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で平衡化された２０μＬのＥＺｖｉｅｗ  Ｒｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを、１０μｇのＳ２またはＡＡＬと混合し、室温で１時間、インキュベートした。そのレクチンゲルを、１μＬの血漿試料を加える前に、ＰＢＳで１回、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１回、およびＰＢＳで３回、洗浄した。１時間のインキュベーション後、レクチンゲルを洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と混合した。濃縮された糖タンパク質を、勾配（４〜２０％）Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上、変性条件下で分離し、ウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで１時間、ブロッキングし、ＰＢＳ中３％ＢＳＡにおける１μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトα１−酸性糖タンパク質０５８とインキュベートし、続いて、ＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて１：２００００希釈されたヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート化抗体とインキュベートした。ＥＣＬ基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を、濃縮されたＡＧＰの検出に用いた。
【００８０】
逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中５μｇ／ｍＬのＳ２−ペプチドで、４℃で一晩、コーティングした。ウェルを、ＰＢＳ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中３％ＢＳＡで１時間、ブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈した精製ＡＧＰ試料を加え、かつ２００ｒｐｍで振盪しながら１時間、インキュベートする前に、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で３回、洗浄した。上記のようにウェルを洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡにおける１μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトα１−酸性糖タンパク質０５８を加え、室温（ＲＴ）で穏やかに振盪しながら１時間、インキュベートした。結合した抗ヒトα１−酸性糖タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）およびＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。３０分後、２５μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、反応を停止させ、結合した抗ＡＧＰの量を、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて４９０ｎｍで測定した。
【００８１】
結果
上記のように、組換え完全長ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）をアガロースビーズに結合させ、それを用いて、ＨＣＣを有する４人の患者、硬変を有する４人の患者、慢性肝炎を有する２人の患者由来の血漿試料、および正常血漿のプール由来の血漿試料においてフコシル化グリコフォームを捕獲した。捕獲された糖タンパク質を、抗体０５８を用いるウェスタンブロットにより分析した。
【００８２】
全ての患者試料および正常対照においてＡＧＰが検出された。しかしながら、肝炎試料および正常対照と比較して、ＨＣＣ患者由来の試料および硬変試料においてより多くのＡＡＬ結合ＡＧＰが検出された。硬変試料とＨＣＣ試料との間において、ＡＡＬ結合ＡＧＰの量の間で目に見える差はなかった（図３、上部パネル）。
【００８３】
同じ試料から血漿糖タンパク質を濃縮するためにＳ２−ペプチドを用いた場合、正常試料および肝炎試料において目に見えるＡＧＰ染色はほとんどなく、または全くなかった。さらに、天然ＡＡＬとは対照的に、Ｓ２は、硬変試料と比較してＨＣＣ試料においてより多くのＡＧＰを結合した。硬変試料は、Ｓ２結合ＡＧＰの染色を全く示さず、またはわずかに示したが、ＨＣＣ患者由来の全ての試料は、Ｓ２結合ＡＧＰの染色を示し、それは、Ｓ２がＨＣＣグリコシル化に対してより特異的であり得ることを示している（図３、下部パネル）。
【００８４】
ＨＣＣを有する１人の患者、硬変を有する１人の患者から、および正常プールから、上記のようにＡＧＰを精製し、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡを用いて、ＡＧＰの結合を測定した。上記のように、マイクロタイターウェルをＳ２−ペプチドでコーティングし、０５８抗体を用いて、増加濃度の精製ＡＧＰ試料を測定した。
【００８５】
全ての３つの試料からのシグナルにおいて用量依存的増加があった。しかしながら、正常プールから単離されたＡＧＰは、レクチン沈降データと一致して、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡにおいて非常に低い吸光度値を示した。硬変患者由来の試料は、中間の吸光度値を示し、一方、ＨＣＣ患者から精製されたＡＧＰ（ＨＣＣ−ＡＧＰ）は、高い吸光度値を示した。したがって、その分析は、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡが、異なる試料間でグリコシル化の違いを特異的に検出し得ることを示した（図４Ａ）。
【００８６】
マトリックス効果を評価するために精製ＨＣＣ−ＡＧＰを添加した正常血漿試料を用いて、逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡをさらに確証した。正常血漿試料の１：５０の血漿希釈溶液を用いると、バックグラウンドシグナルは、血漿がアッセイから取り除かれた対照試料と同じであった（ＯＤ＝０．２）。これは、正常血漿試料由来のＡＧＰがＳ２−ペプチドに本質的に結合しなかったことを示す。ＨＣＣ−ＡＧＰの正常血漿試料への増加濃度での添加は、加えられた血漿がない試料に関して見られた吸光度の増加に相関する、吸光度の用量依存的増加を示した。これは、Ｓ２結合ＡＧＰの増加が血漿試料において正確に測定できたことを示している（図４Ｂ）。
【００８７】
逆レクチンアッセイにおいてＳ２のコーティング濃度、ならびに第１および第２の検出抗体の希釈度を最適化するために、異なるコーティング濃度および抗体濃度を用いて、ＨＣＣ血漿試料および正常試料（バックグラウンド）について吸光度値を測定した。５μｇ／ｍｌのＳ２のコーティング濃度、１：２００の第１検出抗体濃度、および１：４００００の第２検出抗体濃度が、１０を超える最適なシグナル対バックグラウンド比を示すことが見出された（データ未呈示）。
【００８８】
脱シアリル化型のＡＧＰ（ｄｓＡＧＰ）を用いて標準曲線を構築した。正常なシアリル化型のＡＧＰとは対照的に、Ｓ２は、ｄｓＡＧＰ上の露出した末端Ｌｅｘ構造に対する親和性を有することになる。ｄｓＡＧＰは、患者試料におけるＳ２結合型のＡＧＰを反映していないが、それは、逆レクチンアッセイにおいて得られる吸光度値を関連づけるために用いることができる（図４Ｃ）。
【００８９】
アッセイのアッセイ内精度を、同じプレート（９６ウェル）上のｄｓＡＧＰ試料の反復分析により決定した。アッセイ内変動の変動係数（ＣＶ）は１．２％であった（未呈示）。
【００９０】
アッセイ間変動性を、３つの異なるプレート上で中間の吸光度値および高い吸光度値をもつ２つのＨＣＣ試料を分析することにより決定した。ＨＣＣについてのＣＶ（中間）およびＨＣＣについてのＣＶ（高い）は、それぞれ、２．８％および５．０％であった（未呈示）。
【実施例４】
【００９１】
実施例４  患者試料を用いた逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡの確証
患者試料
肝硬変を有する３２人の患者由来の血漿試料、ＨＣＣを有する２８人の患者由来の血漿試料、および慢性肝炎を有する３２人の患者由来の血漿試料が本研究に含まれた。全ての含まれたＨＣＣ試料は、処置前（１ヶ月間未満のソラフェニブ処置）に収集された。ＨＣＣ試料のうちの５つは再発性ＨＣＣを有する患者由来であった。肝硬変を有する患者のいずれも、試料採取から６ヶ月後、ＨＣＣのいかなる徴候も示さなかった。肝炎を有する患者は非硬変性と決定された。肝臓疾患の徴候がない供血者由来の血清のプールからなる正常試料は、対照として用いられた。
【００９２】
全ての患者から書面による同意が得られ、本研究はＬｉｎｋｏｐｉｎｇ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔにおける倫理委員会によって認可された。
【００９３】
逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡ
１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１：５０に希釈された血漿試料を用いて、上記のように逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡを実施した。
【００９４】
総ＡＦＰおよび総ＡＧＰの分析
総ＡＦＰ濃度は、Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの臨床ルーチン検査室においてＣＯＢＡＳ  ｅ６０２アナライザー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で決定され、総ＡＧＰ濃度は、Ｋａｌｍａｒ  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの臨床ルーチン検査室においてＢＮ  ＰｒｏＳｐｅｃシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で決定された。
【００９５】
統計解析
全統計解析を、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  ２３を用いて実施した。群間の統計的有意差を、ＡＮＯＶＡにおいてチューキーの多重比較検定を用いて決定した。２項ロジスティック回帰分析を用いて、複数のマーカーの組み合わせを評価した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると定義した。受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線および列散布図を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で作成した。
【００９６】
結果
逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡを用いて、肝炎患者、硬変患者、およびＨＣＣ患者由来の患者血清においてＳ２結合ＡＧＰを決定した。肝炎患者（ｐ＝０．００１）および硬変患者（ｐ＝０．００５）の両方の由来の血漿と比較して、ＨＣＣ患者由来の血漿においてＳ２結合ＡＧＰの有意な増加があった。硬変患者を肝炎患者と比較した場合、Ｓ２結合ＡＧＰのレベルにおいて有意な増加はなかった（図５Ａ）。
【００９７】
逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡ設定において、患者試料におけるＡＧＰの濃度の変化が、検出されるグリコシル化変化に影響を及ぼす可能性があった。したがって、ＡＧＰの濃度を全試料において測定した。ＡＧＰ濃度は０．３ｍｇ／ｍｌから３．９ｍｇ／ｍｌまでの変動を示した。ＨＣＣ試料と肝炎試料との間（ｐ＝０．００８）およびＨＣＣ試料と硬変試料との間（ｐ＝０．０２）でＡＧＰ濃度の有意な増加があったが、硬変患者と肝炎患者との間でＡＧＰ濃度の有意な差はなかった（図５Ｂ）。しかしながら、Ｓ２結合ＡＧＰシグナルとＡＧＰ濃度の間に相関はなく（図６）、ＡＧＰの濃度差が逆Ｓ２−ＥＬＩＳＡの診断性能に影響しなかったことを示している。
【００９８】
比較のために、ＡＦＰのレベルもまた試料において測定した。ＡＦＰの平均値は、硬変を有する患者および肝炎を有する患者、それぞれにおける４ｎｇ／ｍｌおよび６ｎｇ／ｍｌと比較して、ＨＣＣを有する患者において５５８１ｎｇ／ｍｌであった。しかしながら、これらの差は有意であるとは認められなかった（ｐ＝０．１、図５Ｃ）。
【００９９】
各マーカーの異なる患者集団間を区別する全体的性能を決定するために、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析を実施した。ＨＣＣを肝炎から区別する場合、Ｓ２結合ＡＧＰについての曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９４であった。ＨＣＣの硬変からの区別は、０．７７のＡＵＣを示した（表１）。ＡＦＰはＳ２結合ＡＧＰと類似した性能をもち、ＨＣＣと硬変の区別については０．７７のＡＵＣ、およびＨＣＣと肝炎の区別については０．８２のＡＵＣであった（表１）。ＡＧＰ濃度のＲＯＣ分析により、ＡＧＰ濃度単独では、ＨＣＣを肝炎から区別すること（ＡＵＣ  ０．６６）、およびＨＣＣを硬変から区別すること（ＡＵＣ  ０．６５）の性能が弱かった。
【０１００】
ＨＣＣ患者を硬変患者と比較した場合、Ｓ２結合ＡＧＰ、総ＡＦＰ、および総ＡＧＰのいずれの平均値も増加があったので、これらのマーカーの性能を、ロジスティック回帰分析を用いる任意の２つまたは３つ全てのマーカーの組み合わせを用いてさらに分析した。全ての３つのマーカーの組み合わせが最も優れた区別を示し、ＨＣＣと硬変との間での区別について０．８６のＡＵＣ、およびＨＣＣと肝炎との間の区別について０．９５のＡＵＣであった（表１）。Ｓ２結合ＡＧＰとＡＦＰの組み合わせおよびＳ２結合ＡＧＰとＡＧＰの組み合わせもまた、単独で用いられるマーカーのどれよりも良い性能を示した（表１）。
【０１０１】
【表１】
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参考文献
2017203762.tif 000004
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月16日(2016.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法であって、
−固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチドを供給するステップと、
−試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップと、
−前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
試料においてＡＧＰの量を定量化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、前記のフコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体と、任意の結合したフコシル化ＡＧＰを接触させることにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の検出抗体が、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１（配列番号３）を含むエピトープに特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰの検出が、前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体、および第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体と接触させることにより実施され、かつ第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第１の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第２の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の検出抗体が、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜１８９と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力がある抗体である、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、フコース結合性ペプチドを固相から遊離させて、ペプチド：ＡＧＰ複合体を固相から分離し、分離された画分においてＡＧＰを検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
分離された画分におけるＡＧＰの検出がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＧＰが、肝細胞癌を示すグリコシル化パターンを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト個体が肝細胞癌（ＨＣＣ）を患うリスクを評価するための方法であって、前記個体由来の試料においてフコシル化ＡＧＰを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を用いて検出するステップを含み、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示している、方法。
【請求項１５】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度の少なくとも１つを測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度を測定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
肝硬変および／または肝炎を患っているが、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも８０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド、および前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある少なくとも第１の検出抗体を含む部品を構成要素とするキット。
【請求項１９】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体をさらに含み、第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項１９または２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法における、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２３】
ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜１８９と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力がある抗体。
【請求項２４】
ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力があるＩｇＧ抗体。
【請求項２５】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項２３または２４に記載の抗体。
【請求項２６】
ポリクローナル抗体である、請求項２３または２４に記載の抗体。
【請求項２７】
ウサギポリクローナル抗体である、請求項２３または２４に記載の抗体。
【請求項２８】
モノクローナル抗体である、請求項２３または２４に記載の抗体。
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月29日(2017.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体が肝細胞癌（ＨＣＣ）を患うリスクを評価するための方法であって、
−固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも９０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチドを供給するステップと、
−試料を固定化フコース結合性ペプチドと接触させるステップと、
−前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰを検出するステップとを含む、試料においてフコシル化α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を検出するための方法を用いて前記個体から試料におけるフコシル化ＡＧＰを検出するステップを含み、
ここにおいて、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示しており、肝硬変および／または肝炎を患っているが、ＨＣＣを患っていないヒト個体に由来した参照濃度と比較しての、フコシル化ＡＧＰの濃度の増加が、個体がＨＣＣを患うリスクの増加を示している、方法。
【請求項２】
試料においてＡＧＰの量を定量化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、前記のフコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体と、任意の結合したフコシル化ＡＧＰを接触させることにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の検出抗体が、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜２０１（配列番号３）を含むエピトープに特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記フコース結合性ペプチドに結合した任意のフコシル化ＡＧＰの検出が、前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある第１の検出抗体、および第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体と接触させることにより実施され、かつ第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第１の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第２の検出抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
第１の検出抗体が、ヒトＡＧＰのアミノ酸残基１８３〜１８９と少なくとも一部分、重複するエピトープに特異的に結合する能力がある抗体である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
任意の結合したフコシル化ＡＧＰの検出が、フコース結合性ペプチドを固相から遊離させて、ペプチド：ＡＧＰ複合体を固相から分離し、分離された画分においてＡＧＰを検出することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
分離された画分におけるＡＧＰの検出がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度の少なくとも１つを測定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
総ＡＧＰ濃度および総α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度を測定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法における、固相に固定化された、配列番号１によるアミノ酸を有するペプチドと９０％、９５％、９９％、または１００％同一性などの少なくとも９０％同一性を有する１価フコース結合性ペプチド、および前記フコース結合性ペプチドに結合したフコシル化ＡＧＰに特異的に結合する能力がある少なくとも第１の検出抗体を含む部品を構成要素とするキットの使用。
【請求項１６】
第１の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
第１の検出抗体に特異的に結合する能力がある第２の検出抗体をさらに含み、第２の検出抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼを含む酵素、ならびにフルオロフォアからなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の使用。