(57)【要約】【課題】従来はクマザサ原料として枯葉を含有しない青葉のみを原料として用いるため、クマザサを収穫する際、もしくは収穫後に、枯葉や葉の枯れた部位を選別し、除去する作業が必要であった。つまり、従来の方法には、枯葉や葉の枯れた部位の選別除去作業に多大な時間とコストが必要であるという問題、収穫したクマザサの全てを原料とすることができないという問題がある。また、青葉を原料とするクマザサ抽出物はササ独特の臭みが不快感を与えるという課題がある。【解決手段】枯葉を含むクマザサを原料とするクマザサ抽出物。【選択図】図１
2017075101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、圧力は各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理して得られるクマザサ抽出物。
【請求項２】
枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度８０〜９９℃により熱水処理して得られるクマザサ抽出物。
【請求項３】
前記クマザサは、枯葉を１０質量％以上含有する請求項１または２に記載のクマザサ抽出物。
【請求項４】
前記クマザサは、粉砕物である請求項１または２に記載のクマザサ抽出物。
【請求項５】
前記粉砕物は、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるｂ*値が１０以上である請求項４に記載のクマザサ抽出物。
【請求項６】
前記亜臨界処理は、処理時間１０〜３０分で行う請求項１に記載のクマザサ抽出物。
【請求項７】
前記熱水処理は、処理時間６０〜１８０分で行う請求項２に記載のクマザサ抽出物。
【請求項８】
クマザサからクマザサ抽出物を得るクマザサ抽出物の製造方法において、
枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、圧力は各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理して得られるクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項９】
クマザサからクマザサ抽出物を得るクマザサ抽出物の製造方法において、
枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度８０〜９９℃により熱水処理して得られるクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項１０】
枯葉を１０質量％以上含有する請求項８または９に記載のクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記クマザサは、粉砕物である請求項８または９に記載のクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項１２】
前記粉砕物は、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるｂ*値が１０以上である請求項１１に記載のクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項１３】
前記亜臨界処理は、処理時間１０〜３０分で行う請求項８に記載のクマザサ抽出物の製造方法。
【請求項１４】
前記熱水処理は、処理時間６０〜１８０分で行う請求項９に記載のクマザサ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクマザサ抽出物に関する。より詳細には、枯葉を含むクマザサを原料とするクマザサ抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、クマザサおよびクマザサ抽出物には、防腐作用、抗ストレス活性、抗炎症作用等の優れた機能性を有することが知られている。そこで、特許文献１では、クマザサの生薬を用いて、煮沸させることで水溶性物質を抽出することが行われていて、特許文献２では、乾燥させた笹の葉を蒸煮して、水性溶媒により抽出することが行われ、それぞれで機能性成分を抽出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５０−１６０４１４号公報
【特許文献２】特開２００６−５６８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のクマザサ抽出物は、生薬としたクマザサ、あるいは予め乾燥されたクマザサが原料として用いられている。外観上優れるクマザサの青葉を選別し、原料として使っている。しかしながら、青葉を原料とするクマザサ抽出物は、ササ独特の臭みを有するので、喫食等の口に入れる際に不快感を与えるという課題があった。また、クマザサを収穫する際、もしくは収穫後に、青葉とならない枯葉や葉の枯れた部位を分別、除去することが必要であった。これら、枯葉や葉の枯れた部位の選別除去作業に時間とコストが必要であり、その手間を割愛することが求められている。
【０００５】
本発明は、クマザサ抽出物であるにもかかわらず、ササ独特の臭みを抑えることができ、かつ、従来のクマザサ抽出物で得られた機能性の効果が同等程度であるクマザサ抽出物を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、圧力は各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理して得られるクマザサ抽出物に関する。
【０００７】
また、本発明は、枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度８０〜９９℃により熱水処理して得られるクマザサ抽出物に関する。
【０００８】
本発明は、クマザサからクマザサ抽出物を得るクマザサ抽出物の製造方法において、枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度１４０〜２３０℃、圧力は各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理して得られるクマザサ抽出物の製造方法に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、クマザサからクマザサ抽出物を得るクマザサ抽出物の製造方法において、枯葉を含むクマザサを抽出溶媒に水を用いて、温度８０〜９９℃により熱水処理して得られるクマザサ抽出物の製造方法に関する。
【００１０】
クマザサは、枯葉を１０質量％以上含有することが好ましい。
【００１１】
クマザサは、粉砕物であることが好ましい。
【００１２】
粉砕物は、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるｂ*値が１０以上であることが好ましい。
【００１３】
亜臨界処理は、処理時間１０〜３０分で行うことが好ましい。
【００１４】
熱水処理は、処理時間６０〜１８０分で行うことが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のクマザサ抽出物およびクマザサ抽出物の製造方法により得られたクマザサ抽出物は、枯葉を含むクマザサの原料を用いて抽出したクマザサ抽出物であり、ササ特有の臭みを抑えることができ、かつ、従来のクマザサ抽出物で得られた機能性の効果が同等程度を有するクマザサ抽出物である。また、本発明のクマザサ抽出物は、工程を簡便化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例および比較例の抗糖化活性を示すグラフである。
【図２】実施例および比較例のＳＯＤ様活性を示すグラフである。
【図３】実施例および比較例のエラスターゼ阻害活性を示すグラフである。
【図４】実施例および比較例のα−グルコシダーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図５】実施例３および比較例３の抗菌性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のクマザサ抽出物は、枯葉を含むクマザサを原料とすることを特徴とするクマザサ抽出物である。
【００１８】
原料
本発明のクマザサ抽出物の原料となるクマザサは、イネ科ササ族に属する植物を表す広義のクマザサである。イネ科ササ族に属する植物としては、クマザサ（Ｓａｓａ  ｖｅｉｔｃｈｉｉ、狭義のクマザサ）の他、チシマザサ（Ｓａｓａ  ｋｕｒｉｌｅｎｓｉｓ）、クマイザサ（Ｓａｓａ  ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）、イブキザサ（Ｓａｓａ  ｔｓｂｏｉａｎａ）、トクガワザサ（Ｓａｓａ  ｔｏｋｕｇａｗａｎａ）、チマキザサ（Ｓａｓａ  ｐａｌｍａｔａ）、シナノザサ（Ｓａｓａ  ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）、オオバザサ（Ｓａｓａ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、ミヤコザサ（Ｓａｓａ  ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）、ウンゼンザサ（Ｓａｓａ  ｇｒａｃｉｌｌｉｍａ）、スズタケ（Ｓａｓａｍｏｒｐｈａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）などが挙げられる。本発明のクマザサ原料としては、前記のイネ科ササ族に属する植物の１種のみを用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。
【００１９】
本発明におけるクマザサ原料は枯葉を含むクマザサを原料とすることから、クマザサを収穫時、あるいは収穫した後、枯葉部位を選別除去して、青葉部位のみとする必要がないため、製造工程が簡便となり作業効率に優れる。また、抽出工程で乾燥させた原料を用いる場合、クマザサの枯葉は絶乾状態に近いため、乾燥を省略または簡素化することができるという点においても、製造工程が簡便となり作業効率に優れる。さらに、通常は廃棄物として処理されていたクマザサの枯葉および枯れた桿を、資源として利用することができるという点でも優れる。特に、クマザサの一部の種は、数十年に一度、花を咲かせた後、一斉に枯れるササ枯れとも呼ばれる現象を起こすが、このササ枯れにより発生した大量の枯葉を有効に利用することもできる。
【００２０】
本発明におけるクマザサの枯葉または枯葉部位とは、茶色く変色している葉または部位であり、さらに、葉だけでなく枯れた桿を含んでもよい。具体的には、Ｌ*ａ*ｂ*表色系によるｂ*値が１０以上のものを、本発明における枯葉および枯葉部位とする。
【００２１】
本発明における枯葉のクマザサ原料中の含有量は、１０質量％以上が好ましい。また、クマザサの枯葉は、１００質量％が好ましい。
【００２２】
枯葉のクマザサ原料中の含有量は、枯葉と青葉を分別し乾燥した後、それぞれの乾燥重量を測定する方法、もしくは後述するｂ*値の相関（通常ｂ*値は線形となる）により測定することができる。
【００２３】
また、クマザサ原料中の枯葉含有量の目安として、クマザサ原料を乾燥させた後、ミキサーなどにより、粒子径が１〜３ｍｍ程度の粒子となるまで粉砕した粉砕物（クマザサ原料の乾燥粉砕物）のＬ*ａ*ｂ*表色系によるｂ*値を用いることができる。本発明におけるクマザサ原料の乾燥粉砕物のｂ*値は、１０以上が好ましく、１５以上がより好ましい。前記ｂ*値が１０未満の場合はクマザサの青葉を９０質量％以上含有するため、ササ独特の臭みが抽出物に残る傾向がある。
【００２４】
後述の抽出工程に供するクマザサは、枯葉を含んでいれば特に限定されず、生の状態のものや乾燥したもの、粉砕物などが好適に用いられる。抽出効率に優れるという理由からは、乾燥後、粒径が１〜３ｍｍになるまでミキサー等により粉砕した乾燥粉砕物を用いることが好ましい。なお、原料を使用する際には、抽出工程の前に土などの汚れを洗浄することが好ましい。また葉部のみならず、クマザサを構成する茎部も含んでもかまわない。この場合、本発明により枯葉と青葉部分を分別する必要がない上に、茎部も混在しても良く、さらに作業効率に優れる。
【００２５】
製造方法
本発明のクマザサ抽出物の製造方法の一例として、原料の枯葉を含むクマザサを抽出処理する抽出工程、抽出液と原料残渣とを分離して抽出液を得る固液分離工程、抽出液を乾燥させてクマザサ抽出物を得る乾燥工程を説明する。
【００２６】
抽出工程
抽出工程は、クマザサ原料を抽出処理することで抽出処理物を得る工程であり、本明細書においては、亜臨界処理もしくは熱水処理による抽出工程を指す。抽出に用いる抽出溶媒としては、水溶性成分の抽出効率や安全性の観点から水を用いることが最も好ましい。また、亜臨界処理は短時間、高抽出率という点で優れていて、熱水処理は、操作が簡便であり安全で、かつ、不純物が抑制できるという点で優れている。
【００２７】
亜臨界処理とは、所定温度および圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出溶媒としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明ではクマザサ）とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度および圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００２８】
亜臨界処理に用いる抽出溶媒として水を用いる場合、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水または水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にした、いわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器にクマザサと抽出溶媒である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる抽出物を亜臨界処理物とすることができる。
【００２９】
亜臨界処理に用いる抽出溶媒は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。抽出溶媒が水の場合の処理条件について次に説明する。
【００３０】
亜臨界処理温度は、抽出率を高めるという理由から１４０〜２３０℃の間が好ましく、１６０〜２３０℃の間がより好ましく、１８０〜２３０℃の間がさらに好ましい。亜臨界処理の温度が１４０℃未満の場合は、抽出率が低下する傾向がある。また、亜臨界処理の温度が２３０℃を超える場合は、過分解してしまい、機能性成分の効果が低下する傾向がある。
【００３１】
亜臨界処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上で行うことが好ましい。各温度での飽和蒸気圧は、日本機械学会蒸気表（１９６８年）を参照するなどして決定することができる。１４０〜１６０℃間の１０℃間隔における飽和蒸気圧を例示すると、１４０℃：０．３６ＭＰａ（３．６９ａｔ）、１５０℃：０．４８ＭＰａ（４．８５ａｔ）、１６０℃：０．６２ＭＰａ（６．３０ａｔ）、１７０℃：０．７９ＭＰａ（８．０８ａｔ）、１８０℃：１．００ＭＰａ（１０．２２ａｔ）、１９０℃：１．２５ＭＰａ（１２．８０ａｔ）、２００℃：１．５５ＭＰａ（１５．６８ａｔ）、２１０℃：１．９０ＭＰａ（１９．４５ａｔ）、２２０℃：２．３２ＭＰａ（２３．６６ａｔ）、２３０℃：２．７９ＭＰａ（２８．５３ａｔ）である。この圧力にすることにより、クマザサの機能性成分が効率的に得られやすくなる。なお、亜臨界処理の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが好ましい。
【００３２】
亜臨界処理時間は、１０〜３０分の間で行うことがより好ましい。この処理時間の範囲にすることにより、クマザサの機能性成分が効率的に得られやすくなる。亜臨界処理時間が５分未満の場合は、得られる抽出物が不十分となる傾向がある。また、亜臨界処理時間が３０分を超える場合は、過分解してしまい、機能性成分の効果が低下する傾向がある。
【００３３】
すなわち、抽出溶媒を水とした場合におけるクマザサの亜臨界処理による抽出条件としては、処理温度は１４０〜２００℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は５〜６０分で行うことが好ましい。この条件で行うことにより、クマザサの機能性成分を効率的に抽出することができる。
【００３４】
熱水処理による抽出工程を行う場合の処理温度は、大気中で煮沸させながら行う場合が一般的には望ましいが、より簡便な取り扱いのためには沸騰しない温度であり且つ抽出率が高いという理由から８０〜９９℃の間が好ましく、９０〜９９℃の間がより好ましい。熱水処理温度を９０〜９９℃の範囲とすることで抽出率を高め、効率的に抽出することができる。
【００３５】
また、熱水処理による抽出工程を行う場合の処理時間は抽出率を高めて、不純物を抑制できるという理由から３０〜１８０分の間が好ましい。
【００３６】
固液分離工程
固液分離工程は、亜臨界処理物もしくは熱水処理物をクマザサ抽出液と原料残渣（固体物）とに分離する工程である。具体的な固液分離工程としては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水などが挙げられる。なかでも、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過が好ましい。
【００３７】
固液分離工程により得られたクマザサ抽出液としてそのまま、もしくは濃縮された状態で目的の使用に供することもできるが、より取り扱い性、保存性を高めるために乾燥させることが望ましい。抽出液を乾燥させることにより固形状のクマザサ抽出物が得られる。乾燥方法としては一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。一般的で簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。また、適宜、活性炭、イオン交換樹脂等の吸着剤を用いた脱色を乾燥工程の前に行ってもよい。このようにして得られたクマザサ抽出物はそのまま目的の使用に供することもできるし、他の成分を処方、配合して粉末、カプセル、錠剤の形態に加工してもよく、水、アルコールなどの可溶性溶媒に溶解させて液体の形態で使用してもよいのはもちろんのことである。
【００３８】
活性成分を特定するために、また、より機能性の高い成分を選択的に得るために固液分離工程および乾燥工程を経た抽出物に対し有機溶剤（アルコール類、ケトン類、アセトン類等）による抽出を行ってもよい。なかでも、人体への影響が少なく、食品および化粧品への使用が容易であるという理由からエタノールが好ましい。
【００３９】
クマザサ抽出物
本発明のクマザサ抽出物は、抗糖化活性、ＳＯＤ様活性、エラスターゼ阻害活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性、抗菌性に優れた機能性を有する。また、前述の機能性以外にも、防腐作用、抗ストレス活性、抗炎症作用等の優れた機能性を有する。
【００４０】
本発明のクマザサ抽出物は、枯葉を含むクマザサを原料とするクマザサ抽出物であり、ササ独特の臭みが抑制されているのであり、香りが重要な要素となる健康食品やサプリメントなどの食品、化粧料などに好適に用いることができる。また、本発明のクマザサ抽出物は、枯葉を含むクマザサを原料とするクマザサ抽出物であるにもかかわらず、枯葉を含まないクマザサ（青葉）を原料とした従来のクマザサ抽出物と同程度の機能性を示すクマザサ抽出物であることから、従来のクマザサ抽出物と同様に使用することができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００４２】
＜クマザサ抽出物の調製＞
実施例および比較例のクマザサ抽出物の調製工程を説明する。
【００４３】
クマザサの乾燥粉砕物Ａの調製
岐阜県高山市で採取したクマザサの、枯葉となっているものを選別した原材料を用意した。枯葉を選別した原材料を水で洗浄後、熱風乾燥機にて絶乾状態としたものをミキサー（象印マホービン株式会社製のヘルシーミックスＢＭ−ＲＳ０８）にて粒子径が１〜３ｍｍとなるまで粉砕し、クマザサの乾燥粉砕物Ａを得た。クマザサ枯葉の乾燥粉砕物ＡのＬ*ａ*ｂ*表色系を色彩色差計（コニカミノルタ株式会社製  スペクトロメーター  ＣＭ−３６００ｄ、光源：Ｄ６５  視野：１０度  方式：ＳＣＩ）により測定した結果、Ｌ*値＝６０．３２、ａ*値＝１．９４、ｂ*値＝２０．７５であった。
【００４４】
クマザサの乾燥粉砕物Ｂの調製
岐阜県高山市で採取したクマザサの、青葉となっているものを選別した原材料を用意した。青葉を選別した原材料を水で洗浄後、熱風乾燥機にて絶乾状態としたものをミキサー（象印社製のヘルシーミックスＢＭ−ＲＳ０８）にて粒子径が１〜３ｍｍとなるまで粉砕し、クマザサの乾燥粉砕物Ｂを得た。得られた乾燥粉砕物のＬ*ａ*ｂ*表色系を前記色彩色差計により測定した結果は、Ｌ*値＝４９．０５、ａ*値＝−５．４５、ｂ*値＝９．０７であった。
【００４５】
実施例１（クマザサ枯葉、熱水処理）
１０００ｍｌ容のビーカーにクマザサの乾燥粉砕物Ａを２０ｇおよび水を４００ｇ入れ、処理温度９５℃、大気圧下、処理時間１５０分で熱水処理を行い、熱水処理物を得た。熱水処理時間後、セルロース製ろ紙（孔径：７μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ａ）で吸引ろ過し、ろ液（熱水抽出液）を得た。そして、熱水抽出液を凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製のＦＤＵ−２２００）により乾燥させて粉末状態の熱水抽出物を得た。
【００４６】
比較例１（クマザサ青葉、熱水処理）
クマザサ枯葉の乾燥粉砕物Ａに代えてクマザサ青葉の乾燥粉砕物Ｂを用いたこと以外は、実施例１と同様に熱水処理、固液分離工程および乾燥工程を行い、粉末状態の熱水抽出物を得た。
【００４７】
実施例２（クマザサ枯葉、亜臨界処理）
容積２ｌの耐圧容器に、クマザサ枯葉の乾燥粉砕物Ａを５０ｇ入れ、処理温度１５５℃、処理圧力０．５６ＭＰａ、処理時間１０分で亜臨界処理を行った。亜臨界処理の終了後、処理缶内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（孔径：７μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ａ）で吸引ろ過し、ろ液（亜臨界抽出液）を得た。そして、亜臨界抽出液を前記凍結乾燥機により乾燥させて粉末状態の亜臨界抽出物を得た。
【００４８】
比較例２（クマザサ青葉、亜臨界処理）
クマザサ枯葉の乾燥粉砕物Ａに代えてクマザサ青葉の乾燥粉砕物Ｂを用いたこと以外は、実施例２と同様に亜臨界処理、固液分離工程および乾燥工程を行い、粉末状態の亜臨界抽出物を得た。
【００４９】
実施例３（クマザサ枯葉、亜臨界処理）
容積２ｌの耐圧容器に、クマザサ枯葉の乾燥粉砕物Ａを５０ｇ入れ、処理温度１９５℃、処理圧力１．４８ＭＰａ、処理時間３０分で亜臨界処理を行った。亜臨界処理の終了後、処理缶内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ａ、孔径：７μｍ）で吸引ろ過し、ろ液（亜臨界抽出液）を得た。そして、亜臨界抽出液を前記凍結乾燥機により乾燥させて粉末状態の亜臨界抽出物を得た。
【００５０】
比較例３（クマザサ青葉、亜臨界処理）
クマザサ枯葉の乾燥粉砕物Ａに代えてクマザサ青葉の乾燥粉砕物Ｂを用いたこと以外は、実施例３と同様に亜臨界処理、固液分離工程および乾燥工程を行い、粉末状態の亜臨界抽出物を得た。
【００５１】
＜評価＞
各実施例および比較例で調製した抽出物について、下記０〜５の評価を行った。
【００５２】
０．抽出物の臭い評価
不特定に抽出した５人の方が、各実施例および各比較例に対して、直に臭いを嗅ぎ、ササ独特の臭みがあり、不快と感じたと判断した場合は、×とし、臭いが不快と感じなかったと判断した場合は、○として、不快と感じた人数をカウントした結果は、表１に示した。
【００５３】
１．抗糖化試験
次の試薬を調製し使用した。なお、全てのリン酸緩衝液はｐＨ＝７．４、０．１Ｍの同じものを使用した。
ウシ血清由来アルブミン溶液：ウシ血清由来アルブミンを１０ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝液
フルクトース溶液：２Ｍのフルクトースを含有するリン酸緩衝液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
各チューブに１００μｌの各サンプル溶液、５００μｌのリン酸緩衝液、１００μｌの純水および２００μｌのウシ血清由来アルブミン溶液を加えた。さらに、１００μｌのフルクトース溶液を加え、密封後、６０℃の湯浴中で４０時間静置させた。その後、蛍光プレートリーダー（Ｅｘ：３７０ｎｍ／Ｅｍ：４４０ｎｍ、ＴＥＣＡＮ製のＩｎｆｉｎｉｔ ２００）により、蛍光光度を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
１００μｌのサンプル溶液に替えて１００μｌの純水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、蛍光光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
１００μｌのフルクトース溶液に替えて１００μｌの純水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、蛍光光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
１００μｌのサンプル溶液に替えて１００μｌの純水を使用したこと、および１００μｌのフルクトース溶液に替えて１００μｌの純水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、蛍光光度（ＣＢ）を測定した。
［糖化阻害率とＩＣ５０値の算出］
各測定結果を用いて、下記の式により各クマザサ抽出物の糖化阻害率（％）を算出し、ＩＣ５０値（終濃度）（ＩＣ５０値とは阻害率が５０％となる際の各系のサンプル濃度で、値が小さい、つまりサンプル濃度が低いほど、そのサンプルに効果があることを示している。）を求めた。結果を表１および図３に示す。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
上記の測定を各サンプルにつき３回繰り返し、求めたＩＣ５０値の平均値を表１および図１に記載した。図１には、平均値に加え各測定の誤差範囲も示した。なお、実施例は比較例に対し平均値統計（ｔ検定）で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られている。
【００５４】
２．ＳＯＤ様活性試験
各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、サンプル溶液を調製した。得られたサンプル溶液のＳＯＤ様活性をＳＯＤ測定キット（株式会社同仁化学研究所）を用いて測定し、ＳＯＤ阻害率を求め、ＩＣ５０値（終濃度）を算出した。上記の測定を各サンプルにつき３回繰り返し、求めたＩＣ５０値の平均値を表１および図２に記載した。図２には、平均値に加え各測定の誤差範囲も示した。なお、実施例は比較例に対し平均値統計（ｔ検定）で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られている。
【００５５】
３．エラスターゼ阻害活性試験
次の試薬を調製し使用した。なお、全てのＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液はｐＨ＝８．８、０．０５ｍｏｌ／ｌの同じものを使用した。
酵素溶液：ブタ由来膵臓エラスターゼを０．５ｕｎｉｔ／ｍｌ含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液
基質溶液：ＳＴＡＮＡ（Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide）を１ｍｍｏｌ／ｌ含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに５０μｌの各サンプル溶液および１００μｌの基質溶液を入れた。その後、各ウェルに５０μｌの酵素溶液を加え、３７℃で１５分静置させた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）使用し、４０５ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
５０μｌのサンプル溶液に替えて５０μｌの純水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
５０μｌの酵素溶液に替えて５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
５０μｌのサンプル溶液に替えて５０μｌの純水を使用したこと、および５０μｌの酵素溶液に替えて５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［エラスターゼ阻害率とＩＣ５０値の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各クマザサ抽出物のエラスターゼ阻害率（％）を算出し、ＩＣ５０値（終濃度）を求めた。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
上記の測定を各サンプルにつき３回繰り返し、求めたＩＣ５０値の平均値を表１および図３に記載した。図３には、平均値に加え各測定の誤差範囲も示した。なお、実施例は比較例に対し平均値統計（ｔ検定）で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られている。
【００５６】
４．α−グルコシダーゼ阻害活性試験
次の試薬を調製し使用した。なお、全てのリン酸緩衝液はｐＨ＝７．０、０.１Ｍの同じものを使用した。
アルブミン溶液：ウシ血清由来アルブミンを０．２質量％含有する１０ｍＭリン酸緩衝液
酵素溶液：αグルコシダーゼを０．２５ｕｎｉｔ／ｍｌ含有するアルブミン溶液
基質溶液：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシドを１ｍｍｏｌ／ｌ含有するリン酸緩衝液
反応停止液：０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に溶解させ、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに２５μｌの各サンプル溶液、２５μｌの基質溶液および２５μｌのリン酸緩衝液を順に入れた。さらに、２５μｌの酵素溶液を加え、３７℃で１５分間静置させた後、２００μｌの反応停止液を加えた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）使用し、４０５ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの純水を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
２５μｌの酵素溶液に替えて２５μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの純水を使用したこと、および２５μｌの酵素溶液に替えて２５μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［α−グルコシダーゼ阻害率とＩＣ５０値の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各クマザサ抽出物のα−グルコシダーゼ阻害率（％）を算出し、ＩＣ５０値（終濃度）を求めた。結果を表１および図５に示す。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
上記の測定を各サンプルにつき３回繰り返し、求めたＩＣ５０値の平均値を表１および図４に記載した。図４には、平均値に加え各測定の誤差範囲も示した。なお、実施例は比較例に対し平均値統計（ｔ検定）で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られている。
【００５７】
５．黄色ブドウ球菌に対する抗菌性試験
黄色ブドウ球菌に対する抗菌試験として最小発育阻止濃度法（ＭＩＣ法）を用いた。ＭＩＣ法は、各ウェルにサンプルの濃度を振った培地を作成し、それぞれ菌を加えて培養し菌の発育を目視により観察する方法である。菌の発育が抑えられたウェルは濁りが無く、菌が発育したウェルは濁りがある。濁りが見られない最も低濃度のサンプル濃度をＭＩＣと言い、その濃度にて抗菌性を比較する。
今回の試験では、濃度を６段階になるよう普通ブイヨン培地に加え、６種類の濃度の試験液を調製した。このとき、濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ、３．７５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．８７５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌで作製した。これらの試験液を２４ウェル平底プレートのウェル（培養面積１．８ｃｍ2）に各濃度につき３ウェルずつ、それぞれ４００μｌ添加し、更に各細菌の懸濁液をそれぞれ４μｌ加えた。その後、３５℃、２４時間好気条件下で振とう培養した。培養した後、目視により各ウェルの濁りの有無を確認し、濁りの無い最小発育阻止濃度を求めた。その結果を表１および図５に記載した。なお、実施例は比較例に対し平均値統計（ｔ検定）で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られている。
【００５８】
【表１】
2017075101.tif 000003
【００５９】
表１および図１〜５の結果は、平均の差が誤差の５％範囲内であるかどうかの統計処理（ｔ検定）を行っている。その検定の結果、実施例は比較例に対し平均値統計で９５％信頼性区間において有意差なしという結果が得られた。したがって枯葉を含むクマザサを原料とするクマザサ抽出物は、枯葉を含まないクマザサを原料としたクマザサ抽出物と同等程度の機能性を示すクマザサ抽出物であることがわかる。
【図１】
2017075101.tif 000004
【図２】
2017075101.tif 000005
【図３】
2017075101.tif 000006
【図４】
2017075101.tif 000007
【図５】
2017075101.tif 000008