(57)【要約】      （修正有）【課題】高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加の抑制方法及びそのための組成物の提供。【解決手段】下記式(I)で表される化合物、又はその塩を有効成分として含有する組成物。2017052720.tif 000014【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)で表される化合物、又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするエピゲノムの異常を有する疾患の予防又は治療のための組成物。
【化１】
2017052720.tif 000010
[R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【請求項２】
前記式(I)の化合物は、下記式(II)で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【化２】
2017052720.tif 000011
【請求項３】
エピゲノムの異常は、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エピゲノムの異常を有する疾患は、糖尿病、腎疾患及び循環器疾患からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は医薬組成物であることを特徴とする、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は経口投与用に錠剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、シロップ剤及びゲル剤からなる群から選択される形態で製剤化されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は食飲料組成物中で使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、下記式(I)で表される化合物、又はその塩を含有する食品組成物又は飲料組成物を摂取させることを特徴とする、方法（ヒトに対する医療行為を除く）。
【化３】
2017052720.tif 000012
[R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【請求項９】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、前記式(I)の化合物は、下記式(II)で表されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【化４】
2017052720.tif 000013
【請求項１０】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、前記食品組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つを乾燥重量当たり470 mg/g以上を含有することを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、前記食品組成物又は前記飲料組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つの配合量が、カテキン類の総配合量に対して、55重量％以上配合されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、前記食品組成物又は飲料組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つの配合量が、(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンの配合量と比較して、各々40.0倍以上及び5.0倍以上の高濃度で配合されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記請求項８〜１２に記載の方法で使用されることを特徴とする、食品組成物。
【請求項１４】
前記請求項８、９、１１又は１２に記載の方法で使用されることを特徴とする、飲料組成物。
【請求項１５】
茶葉又は茶葉の粉砕物の水溶媒による抽出物から、(-)-エピガロカテキン、(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンを実質的に含まない機能性茶飲料組成物であって、(-)-没食子酸エピガロカテキンを含有することを特徴とする、機能性茶飲料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(-)-没食子酸エピガロカテキン及びその誘導体の高血糖が惹起するエピゲノム異常の抑制方法及びその組成物、並びに、該エピゲノム異常が関与する疾患の予防又は治療のための組成物並びに健康の維持及び増進のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡメチル化、ヒストンの化学的修飾及び非翻訳性ＲＮＡによる制御などのエピジェネティクスによるゲノム制御系（エピゲノム）は遺伝子発現を調節することで細胞の機能を長期にわたり維持している。エピゲノムの破綻は細胞に異常を引き起こし、様々な慢性疾患の原因となる。糖尿病の原因、症状である高血糖が引き起こすエピゲノム異常を抑制できる成分は、エピゲノム破綻を介した糖尿病発症の予防手段となる。しかし、エピジェネティクスの主要なメカニズムであるヒストン修飾はメチル化、アセチル化及びリン酸化をはじめとして百種類を超え、そもそもどの修飾が糖尿病のリスク因子となりうるのか不明であった。
【０００３】
細胞に取り込まれたグルコースの一部はヘキソサミン合成経路を経てUDP-GlcNAc(uridine diphosphate N-acetylglucosamine)に変換され、タンパク質のO-GlcNAc(O-linked β-N-acetylglucosamine)修飾の供与体として使われる（非特許文献１）。そして、UDP-GlcNAc量はグルコース量に比例して増減することが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、エピジェネティクスにおけるUDP-GlcNAcの関与、さらに、疾患との関連については、ほとんど明らかにされていない。また、これらの機序に基づく健康の維持及び増進のための方法、疾患の予防及び治療方法並びにそのための組成物も知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Buse M.G., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290:E1-E8, 2006
【非特許文献２】Tepperman H.M., et al., J. Nutr. 111: 1734-1741, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ヒストンのO-GlcNAc修飾を選択的に定量する方法を確立した（特願2015-177176）。そこで、本発明は、高血糖状態がヒト血管内皮細胞のヒストンO-GlcNAc修飾を異常に増加させることを明らかにし、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する化合物を見出し、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加の抑制方法及びそのための組成物、該ヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加が関与する疾病に対する予防又は治療のための組成物、並びに健康の維持及び増進のための方法及び組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
食飲料中に含まれる各種成分をスクリーニングし、その中の一部の化合物にエピゲノムの異常の惹起を顕著に抑制する作用を見出し、その構造活性相関を明らかにすることにより本発明を完成させた。
【０００８】
具体的には、本発明は、下記式(I)で表される化合物、又はその塩を有効成分として含有する、エピゲノムの異常を有する疾患の予防又は治療のための組成物を提供する。
【化１】
2017052720.tif 000002
[R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【０００９】
前記組成物の発明において、前記式(I)の化合物は、下記式(II)で表される場合がある。
【化２】
2017052720.tif 000003
【００１０】
前記組成物の発明において、エピゲノムの異常は、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加である場合がある。
【００１１】
前記組成物の発明において、前記エピゲノムの異常を有する疾患は、糖尿病、腎疾患及び循環器疾患からなる群より選択される場合がある。
【００１２】
前記組成物の発明において、前記組成物は医薬組成物である場合がある。
【００１３】
前記組成物の発明において、前記医薬組成物は経口投与用に錠剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、シロップ剤及びゲル剤からなる群から選択される形態で製剤化される場合がある。
【００１４】
前記組成物の発明において、前記医薬組成物は食飲料組成物中で使用される場合がある。
【００１５】
また、本発明は、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法であって、下記式(I)で表される化合物、又はその塩を含有する食品組成物又は飲料組成物を摂取させる方法（ヒトに対する医療行為を除く）を提供する。
【化３】
2017052720.tif 000004
[R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【００１６】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法において、前記式(I)の化合物は、下記式(II)で表される場合がある。
【化４】
2017052720.tif 000005
【００１７】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法において、前記食品組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つを乾燥重量当たり470 mg/g以上を含有する場合がある。
【００１８】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法において、前記食品組成物又は前記飲料組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つの配合量が、カテキン類の総配合量に対して、55重量％以上配合される場合がある。
【００１９】
高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法において、前記食品組成物又は飲料組成物に、前記式(I)又は(II)で表される化合物の少なくとも１つの配合量が、(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンの配合量と比較して、各々40.0倍以上及び5.0倍以上の高濃度で配合される場合がある。
【００２０】
また、本発明は、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法で使用される食品組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための前記方法で使用される飲料組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明は、茶葉又は茶葉の粉砕物の水溶媒による抽出物から、(-)-エピガロカテキン、(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンを実質的に含まない機能性茶飲料組成物であって、(-)-没食子酸エピガロカテキンを含有する機能性茶飲料組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、前記式(I) 又は式(II)で表される化合物、又はその塩の有効用量を、それを必要とするヒトに投与することを含む、エピゲノムの異常を有する疾患の予防又は治療のための方法を提供する。ただし、R1〜R8及びXは、前記組成物の発明における式(I)の場合と同一である。
【００２４】
また、本発明は、エピゲノムの異常を有する疾患の予防又は治療のための方法に使用する前記式(I)又は式(II)で表される化合物、又はその塩を提供する。ただし、R1〜R8及びXは、前記組成物の発明における式(I)の場合と同一である。
【００２５】
また、本発明は、エピゲノムの異常を有する疾患の予防又は治療用の医薬を製造するための前記式(I) 又は式(II)で表される化合物、又はその塩の使用を提供する。ただし、R1〜R8及びXは、前記組成物の発明における式(I)の場合と同一である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する化合物を見出し、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加が関与する疾病に対する予防若しくは治療のための組成物又は健康の維持及び増進のための組成物若しくは方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】DGALECについて、グルコース濃度依存的なヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を評価した顕微鏡写真での観察像を表す図。
【図１Ｂ】DGALECについて、グルコース濃度依存的なヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を評価した結果を表す図（平均値±標準偏差）。
【図２Ａ】食飲料中に存在する各種フラボノイド化合物について、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を評価した結果を表す図（平均値±標準偏差）。
【図２Ｂ】(-)-没食子酸エピガロカテキンについて、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を評価した結果を表す蛍光顕微鏡写真の図。
【図３】各種カテキン誘導体化合物について、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を評価した結果を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する活性を有する化合物
本発明において、下記式(I)で表される化合物に顕著な高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する活性を有する。
【化５】
2017052720.tif 000006
R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【００２９】
本発明の高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する組成物の活性成分として、前記式(I)の化合物の塩又は溶媒和物も使用できる。
【００３０】
特に、前記式(I)で表される化合物の中で、下記式(II)の化合物、又はその塩又は溶媒和物が、特に好ましい。
【化６】
2017052720.tif 000007
【００３１】
前記式(I)及び式(II)で表される化合物の中、
(-)-没食子酸エピガロカテキン:(-)-Epigallocatechin gallate （IUPAC名：[(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl]3,4,5-trihydroxybenzoate）（以下、「化合物１」と記載）は、茶葉等に多く含まれ、抽出、精製された化合物が市販されている。この市販品を入手して使用することができる。
【００３２】
3-O-(4-O-没食子酸)エピガロカテキン、IUPAC名：[(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl] 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzoate（以下、「化合物２」と記載）は、市販されている。この市販品を入手して使用することができる。
【００３３】
3-O-(3-O-没食子酸)エピガロカテキン、IUPAC名：[(2R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2H-chromen-3-yl] 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzoate（以下、「化合物３」と記載）は、市販されている。この市販品を入手して使用することができる。
【００３４】
没食子酸ジデオキシエピガロカテキン、 IUPAC名：[(2R,3R)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「化合物４」と記載）は、公知の方法(Furuta Tら、Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:3095-8)で合成し、使用できる。
【００３５】
没食子酸4',4''-ジメチルエビガロカテキン、IUPAC名：[(2R,3R)-2-(3,5-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl] 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzoate（以下、「化合物５」と記載）は、市販されている。この市販品を入手して使用することができる。
【００３６】
ヨード−没食子酸エビガロカテキン、IUPAC名：[(2R,3R)-5,7-dihydroxy-6-iodanyl-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「化合物６」と記載）は、公知の方法(Toksoz F.ら, Med Chem Res published online: 16 December 2010、DOI: 10.1007/s00044-010-9535-7)で合成し、使用できる。
【００３７】
5,3',5'-トリメチルエーテル没食子酸エピガロカテキン、IUPAC名：[(2R,3R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-5-methoxy-3,4-dihydro-2H-chromen-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「化合物７」と記載）は、公知（Harborne、 The Handbook of Natural Flavonoids, 2, (1999), 355）の方法で合成し、使用できる。
【００３８】
構造式(I)における化合物１〜７の各置換基を表1に示す。
【００３９】
【表１】
2017052720.tif 000008
【００４０】
すなわち、化合物１〜７は、全て、前記式(I)で表される基本骨格を有する。そして、実施例で示されるように、本基本骨格を有する化合物に、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を顕著に抑制する効果が認められた。また、前記式(I)に類似する構造を有する他のカテキン類化合物、イソフラボン類化合物及びフラボン類化合物は、式(I)で示される化合物と相違し、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する効果を示さなかった。
【００４１】
本明細書において、「カテキン類」とは、前記式(I)及び(II)の化合物、並びに、茶葉に含まれカテキン骨格を有する主要な化合物である(-)-カテキン、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン、(-)-エピガロカテキン、(-)-没食子酸カテキン、(-)-没食子酸エピカテキン、(-)-没食子酸ガロカテキン並びに(-)-没食子酸エピガロカテキン等をいう。
【００４２】
本明細書において、茶葉に含まれる「総カテキン量」とは、前記式(I)及び(II)の化合物、並びに、茶葉に含まれカテキン骨格を有する主要な化合物である(-)-カテキン、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン、(-)-エピガロカテキン、(-)-没食子酸カテキン、(-)-没食子酸エピカテキン及び(-)-没食子酸ガロカテキン並びに(-)-没食子酸エピガロカテキン総重量をいう。
【００４３】
より具体的には、式(II)で表される(-)-没食子酸エピガロカテキンを配合成分の例として、その態様を以下に説明する。
【００４４】
(-)-没食子酸エピガロカテキンは、前記のとおり、100％に近い純度の製品が市販されており、これを利用することができる。また、茶葉にも多く含まれるため、茶葉より精製又は粗精製し、これを配合する組成物を調製するために、本発明の (-)-没食子酸エピガロカテキンが提供される。
【００４５】
高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加の基づくエピゲノム異常を含む疾患としては、糖尿病、腎疾患、高血圧症、動脈硬化症、不整脈、心筋梗塞及び脳血管障害などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
糖尿病としては、１型糖尿病及び２型糖尿病が挙げられる。また、これの疾患の合併症である糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症及び糖尿病性腎症なども含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
前記腎疾患として、蛋白尿症、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節性糸球体腎炎、微小変化群、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎臓損傷、膠原病性血管疾患、ストレス、激しい運動、良性起立性（体位性）蛋白尿症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、サルコイドーシス、アルポート症候群、糖尿病、薬物が原因である腎臓損傷、ファブリー病、感染、アミノ酸尿症、ファンコニー症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球貧血、血色素尿症、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、糖尿病性腎症（ＤＮ）、ループス腎炎及びウェゲナー肉芽腫症又は糖原病Ｉ型などの疾患を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
前記蛋白尿症は腎蛋白尿症である場合がある。前記腎蛋白尿症は、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群（例えば、内因性腎不全）、腎炎症候群、腎臓の毒性病変、膜性糸球体腎炎のような糸球体疾患、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、ＩｇＡ腎症（例えば、ベルジェ病）、ＩｇＭ腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、微小変化群、高血圧性腎硬化症及び間質性腎炎などを含むがあるが、これらに限定されない。
【００４９】
前記腎蛋白尿症は糖尿病性腎症である場合がある。前記腎蛋白尿症は、子癇前症、子癇、膠原病性血管疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）、脱水、激しい運動、ストレス、良性起立性（体位性）蛋白尿症、サルコイドーシス、アルポート症候群、糖尿病、ファブリー病、感染（例えば、ＨＩＶ、梅毒、肝炎、連鎖球菌感染後の感染）、アミノ酸尿症、ファンコニー症候群、重金属の摂取、鎌状赤血球貧血、血色素尿症、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿、臓器拒絶反応、エボラ出血熱及び爪膝蓋症候群を含むがあるが、これらに限定されない。
【００５０】
循環器疾患としては、高血圧症、動脈硬化症、不整脈、心筋梗塞、狭心症、心不全及び脳血管障害などが挙げられるが、これらに限定されない。また、脳血管障害としては、脳出血、脳梗塞、ラクナ梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、クモ膜下出血及び血管性認知症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明におけるエピゲノムの異常に対する予防又は治療効果はin vitroにおける作用のことであるが、in vitroでその作用が認められた場合、in vivoや実際の生体内においても前記の各種疾患におけるエピゲノムの異常の予防又は治療効果を奏するものと予想できる。
【００５２】
前記式(I)若しくは(II)の化合物、又はそれらの塩若しくは溶媒和物は、これらを含有する医薬組成物、食飲料組成物、食品組成物、飲料組成物若しくは機能性茶飲料組成物又は高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する方法などとして提供される。
【００５３】
２．高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する化合物を含有する組成物
（１）医薬組成物
前記式(I)又は式(II)で表される化合物、又はその塩若しくは溶媒和物に、薬学的に許容可能な医薬品添加剤を添加することにより、本発明の医薬組成物を製造することができる。
【００５４】
本発明の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する医薬製剤として、経口用製剤又は非経口用製剤を調製し、使用することができる。
【００５５】
上記式１又は式(I)及び(II)に記載の化合物、好ましくは、式(II)に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の少なくとも一つを、例えば、生理食塩水等の溶媒で所定の濃度及び用量に希釈して、薬学的に許容可能な添加剤を加え、医薬製剤として、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加の基づくエピゲノム異常を含む疾患を有する患者に投与することができる。
【００５６】
前記製剤の調製に使用される薬学的に許容可能な医薬品添加剤は、当業者に公知の、安定化剤、抗酸化剤、pH調整剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤、界面活性剤等の添加物を添加して、調製することができる。これらの医薬品添加剤の種類及びその用法・用量は、医薬品添加物事典2007（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、2007年7月）などに記載され、これらの記載に従って調製し、使用することができる。
【００５７】
より具体的には、安定化剤として酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等の有機酸が、抗酸化剤として例えばアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン又は没食子酸プロピル等が、pH調整剤として希塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液等が、緩衝剤としてクエン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸若しくはアスコルビン酸又はその塩類、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、アスパラギン酸、アラニン若しくはアルギニンまたはその塩類、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、リン酸若しくはホウ酸またはその塩類が、懸濁剤又は乳化剤としてレシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン共重合物等が、界面活性剤として例えばポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が使用できるが、これらに限定されない。
【００５８】
上記各製剤中の本発明の式(I)又は(II)の化合物の配合量は、その使用形態により異なるが、医薬品、例えば錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤等の場合は、通常0.1〜95重量％、さらに5〜80重量％、特に10〜80重量％とするのが好ましい。
【００５９】
投与量は、ヒト成人に対して、前記式(I)又は(II)の化合物として、通常約１〜50mg/kg/day、好ましくは2〜30mg/kg/day、もっとも好ましくは3〜15mg/kg/dayで経口投与できるが、投与対象の疾患や症状により適宜変化させ、投与対象の年齢、性別、投与方法 (例. 経口、非経口)などによっても適宜調節する。
【００６０】
本発明は、上記に説明の構成をとることにより、公知の食飲料組成物とは異質で、しかも優れた高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制する効果を発揮することができ、ヒストンO-GlcNAc修飾の異常が惹起する疾患の予防又は治療に有用である。
【００６１】
（２）医薬組成物を含む食飲料組成物
本発明のもう一つの態様は、医薬組成物を含む食飲料組成物である。本態様の食飲料組成物は、食飲料組成物中に前記式(I)又は(II)の化合物を含有する前記医薬組成物を配合することにより、提供される。食飲料組成物に配合する場合には、式(I)又は(II)の化合物が、0.01〜30重量％、好ましくは0.05〜10重量％、特に好ましくは0.1〜5重量％である。
【００６２】
（３）高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法（医療行為を除く）並びに該方法に使用するための食品組成物及び飲料組成物
本発明のもう一つの態様は、健康の維持及び増進のための医療行為を除く、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制するための方法、並びに、該方法で使用される食品組成物及び飲料組成物である。
【００６３】
前記式(I)又は(II)の化合物を含有する食品組成物は、例えば、茶葉の粉茶を含有する食品が挙げられる。また、前記式(I)又は(II)の化合物を含有する食飲料組成物は、例えば、天然の茶葉の粉茶を水抽出した茶飲料が挙げられる。これらの食品組成物又は飲料組成物を摂取することにより、健康の維持及び増進のために、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制することができる。
【００６４】
前記食品組成物及び飲料組成物は、機能性食飲料組成物として使用される場合がある。該機能性食飲料組成物は、式(I)又は(II)の化合物の含有量が高く、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの含有量が低い又は実質的に含有しない食品組成物又は飲料組成物が好ましい。
【００６５】
「機能性食飲料組成物」とは、特定の保健の目的が期待でき、健康の維持及び増進に役立つ機能性を有する食品組成物又は飲料組成物をいい、本明細書において、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加の抑制効果に基づく健康維持及び増進が期待できる食飲料組成物を機能性食飲料組成物という。
【００６６】
本発明の機能性食飲料組成物は、前記式(I)又は(II)で表される化合物を配合する組成物として提供される。これらの化合物を配合する本発明の組成物は、式(I)又は(II)で表される化合物が、その構造が近似するが、式(I)又は(II)に含まれない化合物と比較して、より高い割合で配合される。特に、実施例中に示されるように、式(I)又は(II)で表される化合物以外であって、一般にカテキン類として分類され構造が近似する(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンは、実施例で、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を統計学的有意に促進する作用を、(-)-エピガロカテキンは、促進する傾向を示す。そこで、本発明の食飲料組成物においては、式(I)又は(II)で表される化合物の効果がより発揮されるように、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を促進する化合物よりも、高い配合割合となるように式(I)又は(II)で表される化合物を配合する。また、嗜好性や安定性の向上を目的に、甘味料、香料、酸化防止剤及び／又は着色料等を適宜、配合することができる。
【００６７】
食品組成物に含まれる式(I)又は(II)の化合物の含有量は、乾燥重量当たり、47重量％以上、50重量％以上、55重量％以上、60重量％以上、65重量％以上又は70重量％以上が好ましい。
【００６８】
例えば、(-)-没食子酸エピガロカテキンを配合する食品組成物は、組成物中に乾燥総重量当たり、47重量％以上、50重量％以上、55重量％以上、60重量％以上、65重量％以上又は70重量％以上の(-)-没食子酸エピガロカテキンの配合量となるように、(-)-没食子酸エピガロカテキンを添加することにより調製される。
【００６９】
また、飲料組成物に含まれる式(I)又は(II)の化合物の含有量は、0.01〜30重量％、好ましくは0.05〜10重量％、特に好ましくは0.1〜5重量％である。
【００７０】
一方、上記のように(-)-没食子酸エピガロカテキンを含むカテキン類は、茶葉に多く含まれるが、(-)-没食子酸エピガロカテキンは、生葉抽出液にはほとんど含まれず、生葉の加工に伴って生成し、荒茶、仕上げ茶、じん粉、どろ粉に対する抽出液の順で(-)-没食子酸エピガロカテキンの含量が増加する。さらに、実施例で高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を促進する作用又はその傾向を認めた(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンは、(-)-没食子酸エピガロカテキンと同様に、茶葉の加工によって、その抽出液中の濃度が大きく相違する。また、抽出回数によっても、これらの成分の抽出濃度は各成分毎に変化し、抽出液中に含まれる各成分間の組成比は相違する（(-)-ガロカテキンは、非測定；岡崎貴世、四国大学紀要、（Ｂ）35:19〜22、2012）。
【００７１】
この報告を基にカテキン類の成分の組成比を算出すると、(-)-没食子酸エピガロカテキン／(-)-エピカテキンの比が2.14〜4.38である。
【００７２】
また、市販の茶飲料中のカテキン類濃度は、カテキンが0.4〜9.6mg/100mL、エピカテキンが0.7〜11.3mg/100mL、ガロカテキンが1.8〜37.0mg/100mL、エピガロカテキンが3.8〜45.7mg/100mL、没食子酸カテキンが0.2〜7.0mg/100mL、没食子酸エピカテキンが0.9〜10.5mg/100mL、没食子酸ガロカテキンが0.9〜35.0mg/100mL、没食子酸エピガロカテキンが7.2〜42.7mg/100mL、及び総カテキン量が29.6〜174mg/100mLと報告されている（萩原拓幸ら、大阪市立環科研報告、73、45-49、2011）。
【００７３】
本報告を基に総カテキン量に対する各カテキンの割合を算定すると、カテキンが0.8〜7.9重量％、エピカテキンが1.1〜11.0重量％、ガロカテキンが4.7〜34.6重量％、エピガロカテキンが5.7〜44.5重量％、没食子酸カテキンが0.3〜7.4重量％、没食子酸エピカテキンが2.1〜8.6重量％、没食子酸ガロカテキンが1.5〜36.8重量％、没食子酸エピガロカテキンが13.9〜39.0重量％である。
【００７４】
さらに、没食子酸エピガロカテキン／エピカテキン及び没食子酸エピガロカテキン／ガロカテキンの含量比は、各々1.4〜30.6及び0.5〜4.6である。
【００７５】
茶飲料や粉茶を添加した食品などの食飲料組成物をヒトが摂取する場合に、実施例で有効性を認めた(-)-没食子酸エピガロカテキン、並びに、悪化作用を認めた(-)-エピカテキン及び(-)-エピガロカテキンを通常同時に摂取する。
【００７６】
そこで、高血糖が惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加を抑制するための本発明の食品組成物は、これらのカテキン類を含む食飲料組成物に有効性を認めた(-)-没食子酸エピガロカテキンを添加する場合に、(-)-没食子酸エピガロカテキンの食品組成物中の配合量と、悪化作用を認めた(-)-エピカテキン及び(-)-エピガロカテキンの配合量との比を基に調製することが好ましい。
【００７７】
したがって、前記食品組成物及び飲料組成物において、没食子酸エピガロカテキンは、総カテキン量に対して、重量比で40重量％以上、50重量％以上、60重量％以上、70重量％以上、80重量％以上又は90重量％以上であることが好ましい。
【００７８】
また、本発明の食飲料組成物を、(-)-没食子酸エピガロカテキンの食品組成物中の配合量と、悪化作用を認めた(-)-エピカテキン及び(-)-ガロカテキンの配合量との比を調製する場合の例として、(-)-没食子酸エピガロカテキン／(-)-エピカテキンの重量比率が40倍以上、80倍以上又は120倍以上であり、(-)-没食子酸エピガロカテキン／(-)-ガロカテキンの重量比率が5.0倍以上10倍以上又は20倍以上、及び、(-)-没食子酸エピガロカテキン／(-)-エピガロカテキンの重量比率が10倍以上、20倍以上又は50倍以上となるように調製することが好ましい。
【００７９】
（４）機能性茶飲料組成物
本発明のもう一つの態様は、機能性茶飲料組成物である。機能性茶飲料組成物は、茶葉、茶葉粉砕物又は粉茶等より水抽出した茶飲料中の式(I)及び(II)の含量の低下を抑制し、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの含量を低下させる又は実質的に含まない茶飲料組成物である。
【００８０】
「機能性茶飲料組成物」とは、特定の保健の目的が期待でき、健康の維持及び増進に役立つ機能性を有する茶飲料組成物をいう。本明細書において、高血糖が惹起するヒストンのO-GlcNAc修飾の増加を抑制効果が記載できる、茶飲料組成物を機能性茶飲料組成物という。
【００８１】
例えば、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの分子量は、それぞれ290.27、306.27及び306.27である一方、式(II)の化合物は、分子量458.37であり、分子量が約1.5倍相違する。また、式(II)以外の式(I)に含まれる化合物においても、その分子量は426以上であり、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの分子量とは大きく相違するため、分子篩クロマトグラフィー等を利用することにより、茶葉、茶葉粉砕物又は粉茶等より水抽出した茶飲料中の式(I)及び(II)の含量の低下を抑制し、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの含量を低下させる又は実質的に含まない茶飲料組成物を得ることができる。
【００８２】
また、式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンとの物性等の化学的特性の相違を利用し、分子篩以外のイオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー等を利用することにより、茶葉、茶葉粉砕物又は粉茶等より水抽出した茶飲料中の式(I)及び(II)の含量の低下を抑制し、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンの含量を低下させる又は実質的に含まない茶飲料組成物を得ることができる。また、嗜好性や安定性の向上を目的に、甘味料、香料、酸化防止剤及び／又は着色料等を適宜、機能性茶飲料に配合することができる。
【００８３】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例】
【００８４】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００８５】
(1)O-GlcNAc(O-linked N-acetylglucosamine)化ヒストンの検出
O-GlcNAc化ヒストンの検出はヒト血管内皮細胞EA.hy926をAmerican Type Culture Collection（ATCC）より入手し実施した。培養用プラスチック10cmディッシュに、液体窒素中で凍結保存したEA.hy926細胞を1×106個播種し、37℃、5％CO2下インキュベートした。その際の培養液として、10%FBS(Biowest SAS社、仏国)、1×Penicillin-Streptomycin（和光純薬工業株式会社、大阪）及び5mMのグルコースを含むDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、和光純薬工業株式会社）を用いた。3日後に、培養したEA.hy926細胞をPBS（Phosphate Buffered Salts、タカラバイオ株式会社、滋賀）で洗浄し、0.05%Trypsin-EDTA（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社、東京）を加え、5分間インキュベート後、培養液を加えた後、上清を分取して遠心分離（1,000rpm、3分間）し、細胞を採取した。得られた細胞の6分の1を新たな10cmディッシュに播種し、O-GlcNAc化ヒストンの検出実験を行うまで継代培養した。
【００８６】
O-GlcNAc化ヒストンの検出実験では、継代の際、4ウェルプレートに1ウェル当たり1×104個の密度で細胞を播種した。その際、正常血糖条件の培養液として、10%FBS、1×Penicillin-Streptomycin及び5mMのグルコースを含むDMEMを用いた。また高血糖条件の培養液として、10%FBS、1×Penicillin-Streptomycin及び25mMのグルコースを含むDMEMを用いた。
【００８７】
化合物の作用評価実験として、高血糖条件の培養液に、(-)-没食子酸エピガロカテキン（LKT Laboratories, Inc、ミネソタ州、米国）、（＋）-カテキン水和物（東京化成工業株式会社、東京）、アピゲニン（和光純薬工業株式会社）、ダイゼイン（フジッコ株式会社、兵庫）、ゲニステイン（東京化成工業株式会社）、ルテオリン（東京化成工業株式会社）、(-)-エピカテキン（和光純薬工業株式会社）、(-)-ガロカテキン（和光純薬工業株式会社）、(-)-エピガロカテキン（和光純薬工業株式会社）、(-)-没食子酸カテキン（和光純薬工業株式会社）、(-)-没食子酸エピカテキン（和光純薬工業株式会社）、(-)-没食子酸ガロカテキン（和光純薬工業株式会社）、没食子酸一水和物（和光純薬工業株式会社）を、0.4μg/ml又は2.0μg/mlの濃度で添加した。4日間培養後、以下に記述の免疫染色を行った。
【００８８】
各ウェルの培地を除去し、PBSで2回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を含むPBSを添加し、4℃で30分間静置し固定した。パラホルムアルデヒドを除去後、PBSで2回洗浄した。0.2%Triton X-100（和光純薬工業株式会社）を含むPBSを添加し、室温で30分間静置し透過処理を施した。5%BSA（和光純薬工業株式会社）、0.1%Tween 20（和光純薬工業株式会社）を含むPBSを添加し4℃で一晩ブロッキングを行った。5%BSA、0.1%Tween 20を含むPBSで希釈した一次抗体を添加し、4℃で一晩静置し抗原抗体反応を行った。なお、一次抗体にはO-GlcNAc化ヒストンに選択的に結合するマウスモノクローナル抗O-GlcNAc化ヒストン抗体を作製し、1 μg/mlの濃度に希釈して用いた（本抗体の作製方法及び特性は、特願2015-177176に記載されている）。
【００８９】
一次抗体を除去し、0.1%Tween 20を含むPBSで3回洗浄を行った。溶液を除去後、5%BSA、0.1%Tween 20を含むPBSで希釈した二次抗体を添加し室温で30分間静置した。なお、二次抗体にはAlexa Fluor 488標識ゴートポリクローナル抗マウスIgG抗体  (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国）を1000倍希釈で使用した。
【００９０】
二次抗体を除去し、0.2%Tween 20を含むPBSで3回洗浄した後、細胞核の蛍光染色剤であるDAPI（4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride、株式会社  同仁化学研究所、熊本）を1,000倍希釈で添加した。細胞核の蛍光像を共焦点顕微鏡FLUOVIEW-FV10i（オリンパス工業株式会社、東京）を使用して撮影した。また、１細胞核当たりのO-GlcNAc化ヒストンのスポットの数をCellProfilerソフトウェア（Carpenter et al., Genome Biol., 2006, 7, R100）を用いて計測し、各実験区当たり50〜100個の細胞核についてO-GlcNAc化ヒストンのスポット数を計測して集計し、その結果を平均値±標準偏差として図に示した。有意差検定は全てウィルコクソンの順位和検定を用い、Benjamini-Hochberg法で補正し、ｐ<0.05を統計学的有意とし、p<0.1を改善傾向ありと判断した(post-hoc解析）。
【００９１】
(2)O-GlcNAc化ヒストンのスポット数の計測結果
正常血糖条件と比較して、高血糖条件で培養したEA.hy926細胞では、O-GlcNAc化ヒストンのスポット数が有意に増加した（25mM:p<2.2×10-16）（図１Ａ、図１Ｂ）。すなわち、高血糖によりO-GlcNAc化ヒストンの異常な増加が引き起こされた。高血糖条件で食品含有成分であるイソフラボン類化合物（ダイゼイン、ゲニステイン）、フラボン類化合物（アピゲニン、ルテオリン）、カテキン類化合物（(-)-没食子酸エピガロカテキン、（＋）-カテキン）の６化合物（「ＤＧＡＬＥＣ」と記載）を各0.4μg/ml又は2.0μg/mlとなるように混合して添加したところ、スポット数の減少が認められた（共にp<2.2×10-16）。このとき、各2.0μg/mlの条件と比較して、各0.4μg/mlの条件でより有意に強い（p=1.8×10-4）抑制効果が認められた（図１Ａ、図１Ｂ）。
【００９２】
次に、6化合物のうち活性を有する化合物を明らかにするために、それぞれの化合物を0.4μg/mlの濃度で単独添加したところ、(-)-没食子酸エピガロカテキンのみが有意な（p=0.006）スポット数の減少効果を示した（図２Ａ、図２Ｂ）。
【００９３】
さらに、(-)-没食子酸エピガロカテキンおよびその類縁体化合物７種類（(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン、(-)-エピガロカテキン、(-)没食子酸カテキン、(-)-没食子酸エピカテキン、(-)-没食子酸ガロカテキン、没食子酸）について、0.4μg/mlの濃度で添加して活性を比較したところ、(-)-没食子酸エピガロカテキンのみが有意な（p<2.2×10-16）O-GlcNAc化ヒストンのスポット数の減少効果を示した。一方、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン、(-)-エピガロカテキンの単独投与ではスポット数は有意に増加した（各  p=8.0×10-5、0.042、0.056）（図３）。
【００９４】
＜構造活性相関＞
各種のカテキン誘導体の結果において、高濃度のグルコースが惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する作用を評価した化合物の中で、(-)-没食子酸エピガロカテキンのみが統計学的有意な抑制効果を示した。一方、(-)-エピカテキン、(-)-ガロカテキン及び(-)-エピガロカテキンは、逆にO-GlcNAc修飾の異常増加を促進させた。すなわち、(-)-没食子酸エピガロカテキンは抑制効果を示し、(-)-エピガロカテキンは促進効果を示したところから、抑制効果の活性発現には、カテキン誘導体が没食子酸エステルである必要があることが示された。
【００９５】
一方、没食子酸エステルであるカテキン誘導体の中で、(-)-エピガロカテキンの没食子酸エステルのみが抑制作用を発現し、エピカテキン及びガロカテキンの没食子酸エステル並びに没食子酸自体は、この抑制作用を認めなかった。本結果は、(-)-没食子酸エピガロカテキンの2H-クロメン基の２位に配位するトリヒドロキシフェニル基において、２つのメタ位の両方にヒドロキシ基を有すること、及び、該トリヒドロキシフェニル基は(-)-エピカテキンと同様の立体配位を有することが活性発現に必要であることを示している。
【００９６】
したがって、下記式(I)で表される化合物は、高濃度のグルコースが惹起するヒストンO-GlcNAc修飾の異常増加に対する抑制作用を有することが示唆された。
【化７】
2017052720.tif 000009
[R1及びR2は、各々独立して、H、-OH又は-OCH3であり、
R3、R4、R5、R6、R7及びR8は、各々独立して、-OH、-OCH3、-OC2H5、-O(CH2)2CH3、-OCH(CH3)2、-O-nBu又は-O-tBuであり、
Xは、H、F、Cl、I又はBrである。]
【図１Ａ】
2017052720.tif 000015
【図１Ｂ】
2017052720.tif 000016
【図２Ａ】
2017052720.tif 000017
【図２Ｂ】
2017052720.tif 000018
【図３】
2017052720.tif 000019