(57)【要約】【課題】ＧＬＰ−１分泌促進活性に優れるＧＬＰ−１分泌促進用組成物、及び該組成物の製造方法を提供すること。【解決手段】米胚乳グロブリンを有効成分として含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物、米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量が１５質量％以上であるＧＬＰ−１分泌促進用組成物、通常の国産米であるコシヒカリと比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種のアルカリ抽出米胚乳タンパク質を含有するＧＬＰ−１分泌促進用組成物、米胚乳タンパク質に米胚乳グロブリンを添加する工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法、及び通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種からアルカリ抽出米胚乳タンパク質を得る工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米胚乳グロブリンを有効成分として含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物。
【請求項２】
前記米胚乳グロブリンの少なくとも一部が米胚乳グロブリン精製品である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量が１５質量％以上であるＧＬＰ−１分泌促進用組成物。
【請求項４】
通常の国産米であるコシヒカリと比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種のアルカリ抽出米胚乳タンパク質を含有するＧＬＰ−１分泌促進用組成物。
【請求項５】
ＧＬＰ−１分泌促進用食品である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
医薬品である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
米胚乳タンパク質に米胚乳グロブリンを添加する工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法。
【請求項８】
通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種からアルカリ抽出米胚乳タンパク質を得る工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインクレチンの１種であるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の腸からの分泌を促進させるために用いられるＧＬＰ−１分泌促進用組成物、及び該組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１は腸の上皮に存在するＬ−細胞から内分泌されるホルモンであり、糖分の摂取に伴うインスリン分泌を促進して食後の血糖値の上昇を抑制する作用を有する。またＧＬＰ−１はインスリン分泌を司る膵臓β細胞の増殖を促進する作用やこれを保護する作用を有し、また肝臓、脂肪細胞、心血管系、神経系への様々な作用が報告されている。分泌されたＧＬＰ−１は上記の活性を有するものの、血中や組織中に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）の作用により短時間の内に不活性型に変換されることが知られている。それゆえＤＰＰ−ＩＶの作用を受けないＧＬＰ−１受容体アゴニストの探索やＤＰＰ−ＩＶを阻害してＧＬＰ−１の作用を持続させる検討が２型糖尿病に対する医薬品の分野において注目されている。食品分野においては摂取に伴ってＧＬＰ−１の分泌を高める食事成分の検討が進められている。
ＧＬＰ−１の分泌を促進する成分としてアミノ酸であるグルタミンや乳清タンパク質が知られている。
また本発明者らの検討によりトウモロコシタンパク質であるゼインの加水分解物や米胚乳タンパク質並びに米糠タンパク質の加水分解物がＧＬＰ−１の分泌を強力に促進することが判明している（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１８２７４２号公報
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔ  ２０１５；６：２５２５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、食事成分によるＧＬＰ−１分泌促進機能が発揮されるには多量の該食事成分を摂取することが要求される。また、そのために糖質や脂質を多量に摂取することも糖・脂質代謝改善を目的とする上ではふさわしくない。このため、ＧＬＰ−１分泌促進活性が高い成分が求められている。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＧＬＰ−１分泌促進活性に優れるＧＬＰ−１分泌促進用組成物、及び該組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、米胚乳タンパク質の中で食塩水に溶解可能なタンパク質画分であるグロブリンに強いＧＬＰ−１分泌促進活性が存在すること、米胚乳グロブリンのペプシン消化物を投与した動物の門脈血におけるＧＬＰ−１濃度が、米胚乳グロブリンのペプシン消化物を投与しない動物やグロブリン以外のタンパク質のペプシン消化物を投与した動物の門脈血と比較して有意に高いこと、さらにグロブリンのペプシン消化物を投与した動物の糖負荷試験において糖を腹腔内投与した動物の血糖値上昇が有意に抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
具体的には、本発明は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、米胚乳グロブリンを有効成分として含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物である。
本発明の第２の態様は、米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量が１５質量％以上であるＧＬＰ−１分泌促進用組成物である。
本発明の第３の態様は、通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種のアルカリ抽出米胚乳タンパク質を含有するＧＬＰ−１分泌促進用組成物である。
本発明の第４の態様は、米胚乳タンパク質に米胚乳グロブリンを添加する工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法である。
本発明の第５の態様は、通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種からアルカリ抽出米胚乳タンパク質を得る工程を含むＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＧＬＰ−１分泌促進用組成物はＧＬＰ−１分泌促進活性に優れる。
本発明によれば、米胚乳グロブリンを摂取することによりＧＬＰ−１分泌量が増加し、その結果として食後血糖値の上昇を抑制できることからＧＬＰ−１分泌低下に起因する糖尿病の予防や治療に貢献する食品又は医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各試料についてＧＬＵＴａｇ細胞によるＧＬＰ−１分泌量を比較した結果を示す図である。
【図２】各種試料投与１５分後における門脈血中のＧＬＰ−１濃度を示す図である。
【図３】腹腔内糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）における各種試料投与後の血糖値を比較したグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
＜ＧＬＰ−１分泌促進用組成物、及び該組成物の製造方法＞
本発明の第１の態様に係るＧＬＰ−１分泌促進用組成物は、米胚乳グロブリンを有効成分として含む。
本発明の第２の態様に係るＧＬＰ−１分泌促進用組成物は、米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量が１５質量％以上である。
本発明の第３の態様に係るＧＬＰ−１分泌促進用組成物は、通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種のアルカリ抽出米胚乳タンパク質を含有する。
本発明の第４の態様に係るＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法は、米胚乳タンパク質に米胚乳グロブリンを添加する工程を含む。
本発明の第５の態様に係るＧＬＰ−１分泌促進用組成物の製造方法は、通常の国産米と比較して米胚乳グロブリンの含有量が１．５倍以上である米品種からアルカリ抽出米胚乳タンパク質を得る工程を含む。
【００１３】
（米胚乳タンパク質）
本発明において「米胚乳タンパク質」とは米胚乳より抽出された米タンパク質を指す。
米胚乳タンパク質は精白米又は米粉をアルカリで処理して抽出されるタンパク質溶液を中和して沈殿物を回収することにより、又は精白米又は米粉にアミラーゼを作用させて澱粉質を加水分解した後に残存する成分を回収する方法により調製することができる。
（米胚乳グロブリン）
本発明において「米胚乳グロブリン」とは精白米、米粉又は米胚乳タンパク質から食塩水により抽出されるグロブリンを指す。
本発明において「米胚乳グロブリン」は、米胚乳グロブリンが消化酵素（例えば、ペプシン）等のタンパク質分解酵素によって部分的に分解された消化物であってもよい。
米胚乳グロブリンの主成分は分子量２６，０００ダルトンのα−グロブリンである。米胚乳グロブリンは米胚乳又はその粉砕物を０．５〜５Ｍの食塩水に浸漬することにより抽出されるが、この条件では純水で抽出されるアルブミンも同時に抽出されることから、原料を予め水で抽出してアルブミンを除去した原料を用いて、０．５〜５Ｍの食塩水に浸漬することにより抽出することが好ましい。
【００１４】
精白米又は米粉を水で抽出して遠心分離や濾過等で抽出液を除去した後の残渣に０．５〜５Ｍの食塩水を加えて抽出し、遠心分離又は濾過により抽出液を回収する。米胚乳タンパク質を原料とする場合でも同様に水抽出後に食塩水抽出を行うことが好ましい。
抽出されたグロブリンを抽出液より回収する方法としては、透析膜を用いて透析後に乾燥させる方法、限外濾過膜を用いて脱塩及び濃縮後に乾燥させる方法等が挙げられるが、食塩水中のグロブリンは酸性条件下での溶解性が低いことからグロブリン抽出液に酸を加えてグロブリンを沈殿させ、これを遠心分離や濾過により回収することによっても米胚乳グロブリンの精製品の回収が可能である。
本発明における米胚乳グロブリンの少なくとも一部は、上述のようにして得られた米胚乳グロブリンの精製品であることが好ましい。
【００１５】
米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量は通常１０質量％前後であるが、米胚乳タンパク質のより少ない摂取量でＧＬＰ−１の分泌を促進させるためには、本発明の組成物として米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量が１５質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、５０質量％以上であることがさらに好ましく、８０質量％以上であることが特に好ましい。
米胚乳グロブリンの含有量の上限値としては特に制限はないが、９８質量％以下であることが好ましい。
米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの上記含有量を達成する方法は特に制限はないが、米胚乳タンパク質に米胚乳グロブリンを添加することが挙げられる。
米胚乳タンパク質量に対する米胚乳グロブリンの含有量は、得られた米胚乳グロブリンの精製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、２６ｋダルトンのα−グロブリンの含有量をデンシトメーターにより測定することにより算出することができる。
【００１６】
米の品種の中には春陽やＬＧＣ１、ＬＧＣソフト等の低グルテリン米が知られている。これら低グルテリン米の多くは米胚乳グロブリンの含有量が通常の国産米（コシヒカリ、ササニシキ等）と比較して１．５倍以上（例えば、約１．５〜２倍）である。このような品種の米から抽出した米胚乳タンパク質であれば通常の米胚乳タンパク質の摂取と比較してより少ない摂取量でＧＬＰ−１の分泌を促進させることができることから、食塩水を用いて米胚乳グロブリンの分別抽出を行わなくとも通常の米胚乳タンパク質を抽出する方法で回収される組成物をそのまま用いることもできる。
【００１７】
米胚乳グロブリンをそのまま、又はタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン等の消化酵素）を用いて分解して得られるペプチドを含有する組成物をＧＬＰ−１分泌促進用の食品又は医薬品として用いることができる。
本発明のＧＬＰ−１分泌促進用組成物の形態としては、米胚乳グロブリンを有効成分として含んでいる限り特に制限はなく、米菓組成物、粉（パウダー）、液体（例えば、飲料）、サプリメント等の食品、医薬品等が挙げられ、米そのものであってもよい。
例えば、本発明のＧＬＰ−１分泌促進用組成物の形態が米である場合、米を通常の主食として摂取することでＧＬＰ−１の分泌を促進できる。
ここで、米菓組成物とは、米粒又は米粉を原料として製造される米菓の少なくとも一部を組成する組成物である。米菓組成物としては、米又は米粉を原料とした例えば、せんべい類、ライスクラッカー類、あられ類、おかき類、かきもち、ライススナック、シリアルなどが挙げられる。
【００１８】
本発明のＧＬＰ−１分泌促進用組成物の形態が医薬品である場合、経口的に投与することができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
経口投与した場合の投与量としては特に制限はないが、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
【００１９】
上記食品又は医薬品は、食後血糖値の上昇を抑制できることからＧＬＰ−１分泌低下に起因する糖尿病の予防や治療に貢献し得る。
特に、本発明の組成物は、ＧＬＰ−１分泌に基づき、投与後、遅くとも３０分以内（好ましくは１５分以内）に即効性の血糖値上昇抑制効果を発揮する。したがって、食後直ぐに投与してもよいが、食後１５分以上経過後（好ましくは３０分以上経過後、更に好ましくは１時間以上経過後）の血糖値が十分に上昇してしまった後であっても即効性の血糖値上昇抑制効果が期待される。また、米由来であることからも、患者にストレスをかけないＧＬＰ−１分泌低下に起因する血糖値上昇を抑制する食品又は医薬品として期待される。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
［米胚乳タンパク質の調製］
国産精白米由来の米粉（製品名「パウダーライスＤＫ」、新潟製粉株式会社製）５０ｋｇを、２００Ｌの０．２％水酸化ナトリウム溶液に懸濁して２０℃で一夜放置した。得られた懸濁液を、遠心分離機（製品名「Ｈ−１３０Ｉ」、株式会社コクサン製）に、流速約５Ｌ／分で給液し、回転数１，４００ｒｐｍで遠心分離した。流出する遠心上清を集め、これを再度同一条件にて遠心分離を行うことにより澱粉粒が除去されたタンパク質抽出液を得た。この抽出液に６Ｎ塩酸を添加してｐＨを５．５に調整した。タンパク質の凝集体を上記の条件で遠心分離により回収し、１００Ｌの水に懸濁した後に、同様の遠心分離操作をもう１度実施して湿タンパク質を得た。これを３０Ｌの水に懸濁し、８０℃で３０分加熱殺菌後にホモジナイズを行い、噴霧乾燥することにより米タンパク質粉末（タンパク質純度９０％）を得た。該米タンパク質粉末が米胚乳タンパク質に相当する。
【００２２】
［タンパク質の分画］
５０ｋｇのパウダーライスＤＫを、２００Ｌの水道水に懸濁して２０℃で一夜放置した。得られた懸濁液を、上記と同様の条件で遠心分離した。流出する遠心上清を集め、これを再度同一条件にて遠心分離を行うことにより上清を回収してアルブミン抽出液とした。この液を分画分子量５０，０００の限外濾過膜（旭化成社製ＡＨＰ３０１０）で濃縮し、硫酸アンモニウムを５０％飽和となるように添加した後に沈殿を回収した。沈殿を遠心分離により回収し、蒸留水に懸濁後に限外濾過膜（旭化成社製ＡＨＰ１０１０）を用いて脱塩を行い、これを凍結乾燥してアルブミン画分とした。
【００２３】
アルブミン抽出液を分離した際に得られた沈殿に０．２％水酸化ナトリウム溶液に懸濁して２０℃で一夜放置した。得られた懸濁液を、上記同様の遠心分離機で処理して上清を集め、これを再度同一条件にて遠心分離を行うことにより澱粉粒が除去されたタンパク質抽出液を得た。この液１６０Ｌに３．２ｋｇの食塩を添加溶解し、さらに６Ｎ塩酸を加えてｐＨ１０．０に調整した。上記と同様の条件で遠心分離を行って沈殿（残渣画分）を回収するとともに、上清をさらに連続式ローターＱＮＳを備えたコクサン社製冷却高速遠心分離機Ｈ−２０００Ｂに流速約２Ｌ／分で供給し、回転数１５，０００ｒｐｍで連続遠心分離を行ってグルテリンの沈殿を除去した。遠心上清のｐＨを３．０に調整し、析出した沈殿を同様の連続遠心分離により回収した。沈殿を蒸留水５Ｌに懸濁して１時間室温で撹拌した後に再度遠心分離により沈殿を回収し、これを凍結乾燥してグロブリン画分を得た。
上記残渣画分は１００Ｌの水に再度懸濁した後に同様の条件で遠心分離して沈殿を回収し、これを凍結乾燥することによりグルテリン＋プロラミン画分とした。
【００２４】
［米ペプチドの調製］
米胚乳タンパク質、アルブミン画分、グロブリン画分、グルテリン＋プロラミン画分それぞれ２ｇを１００ｍｌＬの蒸留水に懸濁し、リン酸を加えてｐＨ１．８５に調整した。これにペプシン（ブタ胃由来、シグマ社製）１０ｍｇを添加して３７℃で３０分間反応させた。反応液に水酸化カルシウムを加えてｐＨ７．０に中和した。沸騰水中で１０分間処理して酵素を失活させ、遠心分離により上清を回収した。回収した上清を一夜冷凍後に解凍し、再度遠心分離を行って沈殿を除去し、これを凍結乾燥してペプチドを回収した。
本明細書では米胚乳タンパク質、アルブミン画分、グロブリン画分、グルテリン＋プロラミン画分から得られたペプチドをそれぞれＲＥＰＨ、ＡｌｂｕｍｉｎＨ（ＡｌｂＨ）、ＧｌｏｂｕｌｉｎＨ（ＧｌｂＨ）、Ｇｌｕｔｅｌｉｎ＋ＰｒｏｌａｍｉｎＨ（ＧｌｕＰｒｏＨ）と称する。
【００２５】
［細胞試験］
マウス大腸由来ＧＬＵＴａｇ細胞（トロント大学のＤｒｕｃｋｅｒ博士提供）を４８ウェルプレートに、サブコンフルエントになるまで２日間培養し、Ｈｅｐｅｓバッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、  １．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．１％  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を用いてウェルを洗浄した。
【００２６】
試料（ＲＥＰＨ、ＡｌｂｕｍｉｎＨ、ＧｌｏｂｕｌｉｎＨ、Ｇｌｕｔｅｌｉｎ＋ＰｒｏｌａｍｉｎＨ）を濃度５ｍｇ／ｍＬで同バッファーに溶解した溶液をそれぞれ８０μＬ添加して３７℃にて６０分間インキュベーションした。
陰性対照としてペプチドを含有しないバッファーを同様に添加してインキュベートした（図１中、試料Ｂｌｋ）。
上清を回収後、遠心分離（８００×ｇ、４℃で５分間）し、その上清６０μＬを回収し、上清中のＧＬＰ−１濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（ＥＺＧＬＰ１Ｔ−３６Ｋ、ミリポア社製）にて測定した。
図１は各試料についてＧＬＵＴａｇ細胞によるＧＬＰ−１分泌量を比較した結果を示す図である。
図１に示した結果から明らかなように、全ての試料で陰性対照の試料Ｂｌｋと比較して有意に高いＧＬＰ−１の分泌が認められたが、５ｍｇ／ｍＬの添加量で比較した場合にはＧｌｏｂｕｌｉｎＨが他と比較して特に高いＧＬＰ−１を分泌したことが分かる。
【００２７】
［門脈血中のＧＬＰ−１測定］
９週齢のＳＤ系雄ラットを１週間馴化して１０週齢で試験に供した。動物は試験前日より一夜絶食させ、米タンパク質及びその各画分のペプシン消化物０．５ｇを１０ｍＬの蒸留水に溶解した溶液をラット体重ｋｇ当り１０ｍＬ強制経口投与した。１５分後に麻酔下で開腹し、門脈血を採取してＧＬＰ−１濃度を測定した。各群の動物数６〜７匹における試験結果を統計解析した結果を図２に示した。
図２に示した結果から明らかなように、ＧｌｏｂｕｌｉｎＨ投与群でのみ有意に高い濃度のＧＬＰ−１が認められた。
【００２８】
［腹腔内糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）］
７週齢のＳＤ系雄ラットを１週間馴化して８週齢で試験に供した。動物は前日より一夜絶食させ、米タンパク質及びその各画分のペプシン消化物０．５ｇを１０ｍＬの蒸留水に溶解した溶液をラット体重ｋｇ当り１０ｍＬ強制経口投与した（各群の動物数は６〜９匹）。直後にグルコースを１ｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内に投与した。１５、３０、６０、９０、１２０分後に尾静脈より採血し、グルコース濃度を測定した。
図３に示した結果から明らかなように、全ての試料投与群で投与３０分及び６０分後に対照群と比べて有意に低い血糖値を示し、ＧｌｏｂｕｌｉｎＨ投与群では投与１５分後でも有意に低い血糖値を示したことから、ＧｌｏｂｕｌｉｎＨによる迅速な血糖値への効果にＧＬＰ−１分泌活性が寄与していると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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