(57)【要約】【課題】赤血球をその他の血液構成成分から分離し血液から白血球を精製するための機構を含むデバイスおよび／または方法論を提供する。【解決手段】分離および精製態様を別々のコンポーネントにてまたは同一のコンポーネント内において提供することができる。分離態様は、赤血球凝集などにより、赤血球を血液中の他の細胞から分離することを補助する。好適な凝集デバイスまたはデバイスコンポーネントは、血液と高分子量ポリマー（例えば、デキストラン）を含有する溶液との相互作用を制御して分離を達成するための、少なくとも１つの小寸法を有するチャンバー（例えば、マイクロ流体チップ）を使用する。【選択図】図１
2017102114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液成分を分離するための方法であって、
高分子量多糖の溶液が存在するマイクロ流体チャンバーに血液試料をロードするステップであり、血液試料は、溶液よりも高い密度を持ち、マイクロ流体チャンバーの寸法は、エネルギー的に不安定であるにもかかわらず、より低密度の溶液の上にある、より高密度の血液試料を安定化できるステップ；
血液試料中に存在する赤血球を、溶液と血液試料との間に形成される界面にて凝集させるステップであり、赤血球は、凝集すると、血液試料から出て溶液中へと沈降し、赤血球分離試料が残るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
高分子量多糖がデキストランを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液試料および溶液が、赤血球凝集ステップの一部として混合されない、請求項１記載の方法。
【請求項４】
マイクロ流体チャンバーが、より高密度の血液層をより低密度の溶液の上に維持するのに十分な表面張力を生じさせる寸法を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１種または複数の血液成分を結合させるように構成された親和性表面の上に、赤血球分離試料のうち少なくとも赤血球除去部分を流すステップ
を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
１種または複数の血液成分が１種または複数の白血球種を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種または複数の血液成分が、血漿タンパク質、脂質、循環核酸、循環腫瘍細胞、ウイルス、または細菌のうち１種または複数を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
赤血球を凝集させるステップが、２０分以下の間実行される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
赤血球を凝集させるステップにより、赤血球の約９５〜約９９％が、赤血球分離試料の赤血球濃縮部分へと分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
血液試料が、１００μｌ以下の全血である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
マイクロ流体チャンバーが、少なくとも１つの寸法において４５０μｍ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
マイクロ流体チャンバーが、少なくとも１つの寸法において２２５μｍ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
溶液が、１００〜１，５００ｋＤａの分子量にて１〜１０％のデキストラン濃度を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
血液試料を受容するように構成されたローディングポート；
ローディングポートにロードされると血液試料を受容し高分子量多糖の溶液を保持するように構成された凝集チャンバーであり、少なくとも１つの寸法において、凝集チャンバー内にて溶液の上に血液試料を安定化するのに十分な、存在する場合、血液試料と溶液との間の表面張力を生じさせる大きさを有し、血液試料は溶液よりも高い密度を有する凝集チャンバー；および
赤血球分離試料を吐出するように構成された凝集チャンバー出口
を含む、血液成分分離デバイス。
【請求項１５】
凝集チャンバーの少なくとも１つの寸法が、４５０μｍ以下である、請求項１４記載の血液成分分離デバイス。
【請求項１６】
凝集チャンバーの少なくとも１つの寸法が、２２５μｍ以下である、請求項１４記載の血液成分分離デバイス。
【請求項１７】
１つまたは複数のローディングウェル；
各ローディングウェルに対して少なくとも１つの各々の赤血球凝集チャネルであって、各凝集チャネルが少なくとも１つの４５０μｍ以下の寸法を有する、赤血球凝集チャネル；および
赤血球凝集チャネルの１つまたは複数からの吐出物を受容するように構成され、吐出物中の少なくとも１種の白血球種と差次的に結合するように構成された、少なくとも１つの各々の白血球捕捉チャネル
を備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
各白血球捕捉チャネルが、少なくとも１種の対象白血球種と結合するように構成された抗体被覆表面を備える、請求項１７記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
白血球捕捉チャネルによって捕捉された白血球を処理または分析するための試薬を保持するように構成された１つまたは複数の試薬ウェル；および
試薬ウェルからの試薬の流量を計測するように構成された１つまたは複数のマイクロバルブ
を更に備える、請求項１７記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
１つまたは複数のローディングウェル；
各ローディングウェルに対して少なくとも１つの各々の赤血球凝集チャネルであって、各凝集チャネルが少なくとも１つの４５０μｍ以下の寸法を有し、各赤血球凝集チャネルが、少なくとも１つの対象白血球種と結合するように構成された抗体被覆表面を備える、赤血球凝集チャネル
を備える、マイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書にて開示される主題は、赤血球凝集および白血球単離に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の研究および医療上の文脈において、初期組成物の特定の成分を１種または複数の精製および／または分離構成成分に分離または単離することが望ましい場合がある。例えば、全血は様々な分子量および細胞構成成分を有する複合組成物である。様々な文脈において、研究目的もしくは診断目的などで、または医学的処置もしくは医学的に有用な組成物の調製における１つの前段階もしくはステップとして、全血構成成分の１種または複数を単離または分離することが望ましい場合がある。血液成分を分離するための最も一般的な方法としては、高効率分離を実現するために密度勾配媒体および遠心分離機を使用するものが挙げられる。その他の一般的な方法としては、デキストラン溶液中での赤血球（ＲＢＣ）溶解および赤血球凝集が挙げられるが、分離性能はそれほど良好ではない。
【０００３】
例えば、全血試料から白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（即ち、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）またはＷＢＣ）を分離または精製することが望ましい場合がある。大量の白血球精製に対するアプローチがいくつか存在する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度分離は、そのような技法の１つであるが、実験室設備（遠心分離機）、所望の細胞層を特定し取り出す技能を有する作業者を必要とし、細胞層のサイズが小さくなると細胞層の位置特定および取出しの困難が大きくなり、血液量の下限がより低くなる。赤血球溶解は、白血球精製のための別のアプローチである。この技術も、希釈された細胞の再濃縮のために遠心分離機（および実験室）を必要とし、遠心分離により白血球が損傷する可能性もある。
【０００４】
マイクロ流体アプローチも存在する。決定論的横置換法はそのような技術の１つであり、決定論的横置換法では、白血球および赤血球が小さな柱の列の間を通過するときそれら細胞の変形性およびサイズ特性が異なることが利用される。このようなデバイスでは、柱のサイズおよび間隔は微小であり（約２０〜４０μｍ）良好に制御されなければならず、これらのデバイスの製作において高い信頼性を実現することはコストのかかる試みになっている。加えて、分離は部分的にサイズに基づくので、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（即ち、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））とサイズが類似する小さな白血球について、純度とのトレードオフが存在する。クロスフロー分離は、サイズおよび／または変形による赤血球取出しのために小さな側面チャネルを用いるが、小さなデバイス寸法を必要とし、付随コストおよび信頼性の問題（デバイスの詰まりの可能性など）をもたらす。流体力学的技術も存在するが、一般に、それらは高流動性アプローチであり、少量試料（例えば、１００μｌ以下）では良好に作用しない場合があり、多くの場合、細胞を損傷させ得る試料希釈または高流動速度を含む。
【０００５】
従って、大規模な実験室設備（例えば、遠心分離機）を必要とせず、少量の投入量（即ち、少量試料）での高い純度および低い絶対的細胞喪失量を実現する、白血球分離および／または精製アプローチが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０３０２４８３号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、血液成分を分離するための方法が提供される。このアプローチに従えば、血液試料は、高分子量多糖の溶液が存在するマイクロ流体チャンバーにロードされる。血液試料は、溶液よりも高い密度を有する。マイクロ流体チャンバーの寸法は、エネルギー的に不安定であるにもかかわらず、より低密度の溶液の上にある、より高密度の血液試料を安定化できるものである。血液試料中に存在する赤血球は、溶液と血液試料との間に形成される界面にて凝集する。赤血球は、凝集すると、血液試料から出て溶液中へと沈降し、赤血球分離試料が残る。
【０００８】
更なる態様では、血液成分分離デバイスが提供される。デバイスは、血液試料を受容するように構成されたローディングポート；ローディングポートにロードされると血液試料を受容し高分子量多糖の溶液を保持するように構成された凝集チャンバーであって、少なくとも１つの寸法において、凝集チャンバー内にて溶液の上に血液試料を安定化するのに十分な、存在する場合、血液試料と溶液との間の表面張力を生じさせる大きさを有し、血液試料は溶液よりも高い密度を有する、凝集チャンバー；および赤血球分離試料を吐出するように構成された凝集チャンバー出口を備える。
【０００９】
別の態様では、マイクロ流体デバイスが提供される。デバイスは、１つまたは複数のローディングウェル；各ローディングウェルに対して少なくとも１つの各々の赤血球凝集チャネルであって、各凝集チャネルが少なくとも１つの４５０μｍ以下の寸法を有する、赤血球凝集チャネル；赤血球凝集チャネルの１つまたは複数からの吐出物を受容するように構成され、吐出物中の少なくとも１種の白血球種と差次的に結合するように構成された、少なくとも１つの各々の白血球捕捉チャネルを備える。
【００１０】
追加的態様では、マイクロ流体デバイスが提供される。デバイスは、１つまたは複数のローディングウェル；各ローディングウェルに対して少なくとも１つの各々の赤血球凝集チャネルであって、各凝集チャネルが少なくとも１つの４５０μｍ以下の寸法を有し、各赤血球凝集チャネルが少なくとも１種の対象白血球種と結合するように構成された抗体被覆表面を備える、赤血球凝集チャネルを備える。
【００１１】
本発明の上記およびその他の特徴、態様、ならびに利点は、図面全体にわたって同じ文字は同じ部分を表す以下の添付図面を参照しながら、以下の詳細な説明を読めば、より良く理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の態様に従う、白血球回収率に対する抽出量の効果を示す。
【図２】本開示の態様に従う、異なる密度および／または質量オスモル濃度のデキストラン溶液を用いた分離の後に白血球の位置を測定するために使用した分離デバイスの画像化の結果を示す。
【図３】本開示の態様に従う、白血球回収率に対する各種Ａおよびｋの効果を示す。
【図４】本開示の態様に従う、白血球抽出曲線を示す。
【図５】本開示の態様に従う、デキストラン溶液の密度を調整することの効果を示す。
【図６】本開示の態様に従う、デキストラン溶液の質量オスモル濃度を調整することの効果を示す。
【図７】本開示の態様に従う、非凝集および凝集赤血球に対する白血球の空間的関係を示す。
【図８】本開示の態様に従う、白血球結合の概念図を示す。
【図９】本開示の態様に従う、デバイスの赤血球凝集および白血球捕捉コンポーネントを示す。
【図１０】本開示の態様に従う、赤血球凝集媒体の密度の関数としての捕捉細胞の百分率に対する効果を示す。
【図１１】従来の方法により調製された白血球のＮＦ−κＢ局在化と、本開示の態様に従う統合型マイクロ流体デバイスにより調製された白血球との比較を示す。
【図１２】本開示の態様に従う、流体カートリッジまたはチップとして具体化された白血球捕捉デバイスの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１つまたは複数の具体的実施形態を以下に記載する。これらの実施形態の簡潔な説明を示す意図から、実際の実施態様の全ての特徴を明細書に記載しているわけではない。いずれかのエンジニアリングまたは設計プロジェクト内において、そのような実際の実施態様を展開する際には、実施態様ごとに変化し得る、システム関連およびビジネス関連の制約の順守などの開発者の具体的目標を達成するために、実施態様固有の多くの決定を行わなければならないことを理解すべきである。更に、そのような開発努力は複雑であり時間を要するものであるが、それにもかかわらず、本開示の利益を受ける当業者にとっては、設計、製作、および製造の定型的業務であると理解すべきである。
【００１４】
本発明の各種実施形態の要素に言及するとき、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、要素が１つまたは複数存在することを意味する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、対象を包含することを意味し、列挙された要素以外の追加要素が存在し得ることを意味する。更に、以下の考察における任意の数値の例は、非限定的例であり、従って、追加の数値、範囲、および百分率が、開示された実施形態の範囲に含まれることを意味する。
【００１５】
血液を高分子量デキストランなどの特定のポリマーと混合すると、赤血球が凝集し溶液から沈降し、赤血球を血液の他の構成成分から分離することができる。本発明のアプローチに従えば、血液試料（全血、希釈血液、または濃縮血液）とポリマー含有溶液との間の相互作用を制御するために、マイクロ流体チャンバーが使用される。血液は約１．０６ｇ／ｄｌの密度を有し、デキストラン溶液の密度はその組成に依存して変わるが、赤血球沈降のために典型的に用いられる濃度では、デキストラン溶液は血液よりも密度が低い。
【００１６】
マクロスケールでは、手作業により血液をデキストラン溶液の上に層化しようとすると、血液は底部に流れる傾向があり、２種の流体間の相互作用は限定され、従って、有意味な量の赤血球の凝集および沈降は生じない。マクロスケールでは、流体を混合して均一な赤血球凝集を達成することにより、上記の欠陥に部分的に対処することができる。
【００１７】
逆に、本発明のアプローチに従い、マイクロ流体チャンバーを使用し、デキストラン溶液（またはその他の高分子量ポリマーの溶液）の上に全血を層化することを制御し、混合せずに２種の流体間の有意な相互作用をもたらすことができる。血液とデキストランは、流体の界面にて相互作用し、界面における赤血球凝集体の形成につながる。次に、これらの凝集体は、重力によりデキストラン溶液中に沈降する。このプロセスは継続し、凝集した赤血球の大部分はデバイス底部に沈降する一方で、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（即ち、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の大部分およびその他の血液成分は上清に留まる。これらの原理に従い、赤血球を試料から凝集させ、赤血球の大部分を白血球およびその他の血液成分から分離することができる。本明細書でも考察しているように、抽出された赤血球分離流体を更に処理して分析のために白血球を精製および単離することができる。
【００１８】
本発明のアプローチに従えば、デキストランの上に血液を層化する方法は、全血から、特に少量の血液（例えば１００μｌ以下の全血）から、短時間（例えば１０、１５、または２０分）で高純度（例えば９５〜９９％の赤血球除去）にて白血球を分離することを可能にする。本発明のアプローチは、白血球試料の活性化／変性を最小限に抑えるため、低剪断性でありラベルフリーになっている。本方法は、血漿または血小板分離に適用してもよい。逆に、凝集した赤血球を収集し放出するなどして赤血球を分離するために、本アプローチを用いることも可能である。ある種の用途について特に注目すべき点は、本発明のアプローチでは、少量の不均質試料（例えば１０００：１）を取得し、高純度の（例えば赤血球数が劇的に低減された）分離試料を送達できることであり、白血球を捕捉するために親和性表面上にて試料を処理し、高収率（例えば、高い百分率の白血球が回収される）および高密度（白血球は表面に集まる）を得ることができる。
【００１９】
赤血球凝集：動作原理−本明細書で考察しているように、記載されたマイクロ流体デバイスの赤血球除去効率は、表面張力（通常、チャネル形状の関数）、血液／デキストラン界面の不安定性（即ち、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性）、ならびにデキストラン凝集特性（デキストランの濃度および分子量）の間の相互作用の関数である。デキストランは以下の実施例に記載されており、全体を通じて凝集媒体として扱われているが、デキストランは好適な溶液の単なる一例として提示されたものであり、赤血球凝集を誘導するために、デキストランの代わりにまたはデキストランに追加して、その他の高分子量ポリマーを用いてもよいことを理解すべきである。チャンバー高さは一因子であり、チャネル高さ４５０μｍでは、急速な血液流（全血の密度媒介性降下）が見られ、チャネル高さ２２５μｍでは、赤血球のはるかに多くの凝集媒介性沈降が見られる（白血球の大部分はデバイス上部に留まり、後に回収される）。白血球の抽出効率を高めるなどして、マイクロ流体に基づいた分離デバイスの性能を調整するために、デキストラン溶液の密度を調節または修正することもできる。典型的な結合キネティクスにおいて役割を果たす、温度などの他の因子を調節または調整し、上記分離デバイスの性能に影響を及ぼすこともできる。
【００２０】
特定の実施態様およびデバイスの例を考察する前に、ここで取り上げている血液成分分離デバイスの一般的動作原理を簡単に考察する。本発明の分離デバイスの動作に関係する原理の１つは、より高密度の流体がより低密度の流体の上に層化されているときに現れる、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ（ＲＴ）不安定性である。この状態はエネルギー的に好ましくない状態であり、界面に対する微小な摂動が不安定性に成長し、上部の流体が下部の流体に流れ込み、下部の流体が上昇して上部の流体と入れ換わる。その結果、系はエネルギー的に好ましい状態に回復する（即ち、低密度の流体が高密度の流体の頂上に位置する）。（表面張力を無視できる）大きなスケールでは、そのような不安定性が成長する速度は、主に２種の流体間の密度不一致の程度によって決定される（より小さな密度不一致は、より安定した界面を意味する）。より小さなスケールでは、表面張力が界面を安定させる役割を果たし、従って、他の場合ではエネルギー的に好ましくない状態を維持することを可能にする。
【００２１】
本発明の血液成分分離との関連において、デキストラン凝集の時間尺度は比較的固定しているが、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性成長の時間尺度は、界面構造、例えば、マイクロ流体チャンバーまたはチャネルの寸法の設計により、操作することができる。急速に成長するＲａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性では、血液全体（全内容物）が沈下しデキストランが浮上する。マイクロ流体界面により加えられる表面張力の力学のために遅延するなどして、より遅く成長する不安定性では、デキストラン凝集の効果はより顕著になる。より遅いケースでは、赤血球は凝集しデキストラン溶液へと沈降し、残りの血液内容物（例えば、血漿、血小板、白血球）は後に残される。デキストランおよび得られた血漿は同程度の密度を有する（下記表１を参照されたい）ので、より多くの赤血球が血液から分離するにつれて、密度不一致は変化する。血漿中の個々の血小板および白血球の沈降は比較的遅いため、赤血球が沈降する際に白血球が赤血球凝集体にトラップされない限り、白血球精製および回収率は非常に高くなり得る。白血球のトラップはそれ自体、赤血球凝集速度の関数となる場合があり、凝集時間が短くなると、白血球のトラップが多くなる。従って、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性の成長を遅延させることにより、デキストラン媒介性赤血球凝集が優位となり、赤血球が血漿から除去される一方、残留細胞の大部分は血液試料が占める元の部分に局在化して残り、その部分から残留細胞を回収することができる。
【００２２】
【表１】
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（界面構造の設計および定寸により制御できる）表面張力に加えて、（１種または複数の密度調整添加剤の添加などを通じて）全血の密度に対するデキストラン溶液の密度を調整することにより、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性の成長を制御することができる。そのような文脈において、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性の成長を遅延させるためにデキストラン溶液の密度を上げることと、赤血球凝集体の沈降速度を低下させ得る粘度増大との間で均衡をとることができる。
【００２３】
種々のデキストラン溶液の凝集特性に関して、好適な溶液は、１００〜１，５００ｋＤａの分子量にて１〜１０％のデキストラン濃度を有し得る。凝集性は、分子量５００〜１，０００ｋＤａにおいてデキストラン濃度約３％にてピークに達し、濃度または分子量の上昇または降下に伴い、低下する。その他の種々の因子、例えば、血漿タンパク質含有量、細胞齢、ヘマトクリットレベルも、凝集に影響を及ぼす。このような因子は、試料全体にわたる本来的変動の一部として受容され得る。上記の考察に関して、３％のデキストラン濃度は、通常、本明細書で考察する分離に用いられる所与の緩衝液において好適となるが、その他の濃度および範囲も記載されており、特定の文脈および状況において有用であり得る。当然理解される通り、デキストラン濃度を上げると、赤血球凝集体のサイズが大きくなり、溶液の密度、質量オスモル濃度、および粘度も高くなる。
【００２４】
上記のようなデキストラン溶液の密度に加えて、本発明のアプローチにおける別の因子は、分離デバイス内に備えられたマイクロ流体チャネルに関係する構造的側面である。一実施態様において、マイクロ流体チャンバーまたはチャネルの少なくとも１つの寸法（例えば高さ）は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性の成長を安定化および／または制御するように作用する表面張力を導入するのに十分小さなスケールに設定される。特に、より長いマイクロ流体チャネルは、より短いまたは狭いチャネルよりも小さい表面張力を有する。従って、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ界面不安定性は、より短いチャネルまたはチャンバー（例えば、高さ２２５μｍ）よりも、より長いチャネルまたはチャンバー（例えば高さ４５０μｍ）において、より速く成長する。即ち、より短いチャネルは、より長時間にわたり、より高密度の血液がより低密度のデキストラン溶液の上で層化されているという不安定性を維持することができる。
【００２５】
動作時において、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性およびチャネル高さ相互作用（即ち、表面張力因子）は、進行する赤血球凝集によって更に複雑になる。本開示を裏付けるために実施された研究に基づくと、より長いチャネル（例えば、長さ約４５０μｍ）は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性のより速い成長を示し、デバイス最上部へのデキストランの上昇はより迅速である（底部に沈降する血液の流れが大きくなる）。対照的に、より短いチャネル（例えば、高さ約２２５μｍ）は、赤血球凝集とＲａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性との間の均衡を促進し、界面における血液の流れは小さくなる。ある研究では、赤血球凝集および沈降は、より長いチャネル内では約８分以内に完了したが、より短いチャネル内では約１５分以内に完了した。ただし、白血球の５０％は、（より大きな流動効果のため）より長いチャネルの沈降ペレット中に取り込まれて喪失したが、より短いチャネルでは２０〜３０％の喪失だった。これを踏まえて、実験は、高効率の赤血球除去を達成すると同時に白血球回収率を最大にするため、マイクロ流体チャネルの高さを４５０μｍ未満とすべきであることを示唆している。より短いチャネルは、沈降時間を増大させ得るが、凝集赤血球の沈降ペレット中に取り込まれて喪失する白血球が減少するため、白血球回収率は増大し得る。従って、動作の点で、白血球回収率と沈降時間との間のトレードオフが存在する。
【００２６】
赤血球凝集：研究および実験の所見−上記ではデキストラン溶液の密度が一般的な理論的文脈において考察されているが、ある研究では、実験状況において密度とデバイス性能との間の関係を観察するため、デキストラン溶液の密度が調整された。上記の研究では、グルコースなどの低分子量種を用いてデキストラン溶液の密度が調整された。特に、異なるデキストラン密度（例えば、密度１．０２ｇ／ｍＬと密度１．０５ｇ／ｍＬ）を用いた同一のデバイスが試験され、赤血球凝集および白血球回収率に関して性能の顕著な差異が生じることが観察された。凝集した赤血球は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性の成長がより遅く溶液の粘度が高くなったため、より高密度のデキストラン溶液の中を、より遅く沈降した。沈降が完了した後、より高密度のデキストラン溶液において白血球収集量の１０〜１５％の増加が観察された。しかし、ＲＢＣ：ＷＢＣの比率は、より低密度のデキストランと比較して、ほぼ倍になった（ただし、２０：１未満）。密度調整は低分子量種（グルコースなど）を用いて行われたという点に留意すべきである。これにより、５００ｋＤａのデキストランを用いる密度調整に関して予想される、溶液の凝集性増大の可能性が最小に抑えられる。低分子量種は、密度増大に伴う粘度増大も最小限に抑える。このことは、赤血球凝集体の沈降速度に対する影響を最小にすることに役立った。
【００２７】
赤血球凝集および／または白血球回収率に関する更なる一因子は、抽出量に関係する。特に、下流側での試料処理に要する時間を最小にするため、白血球およびその他の血液成分が抽出される量を最小にすることが有利であり得る。一般に、好適な抽出量は、少なくとも投入量（例えば、一実施態様では３０μＬ）程度になると見込まれるが、分離時に若干の白血球が沈殿するか、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性によりデキストランに置き換えられるため、若干の追加量を抽出する必要がある。デバイス上部から抽出された試料量の関数としての回収白血球の総数に関する研究結果を表す、図１に示されているように、絶対的抽出数は（大部分は血液試料間の変動性により）変動するが、いくつかの基本的傾向は明らかである。例えば、図示されている結果によれば、所与の実験において回収される白血球の大部分は、１００μＬまでの範囲において回収されている。１００，０００個の細胞が回収可能な実験では、この目標は、概して最初の５０〜６０μＬの抽出物において達成された。
【００２８】
抽出量に関係するこれらの実験は、３％デキストラン溶液（密度増大なし）を用いて実施された。デキストラン溶液の密度を増大させることにより、より小さい量において、より多くの白血球を抽出することができた。デキストラン溶液の密度／質量オスモル濃度を増大させることの効果は、白血球を染色し、沈降完了後に分離デバイスのイメージングを行うことで、より容易に理解できる。このイメージングの結果は図２に示されており、ここで、Ｘ軸は、分離を停止した時点における（白血球がまだ分離デバイス内にある状態での）分離デバイス内での白血球の位置を表している。図２に示されるように、デキストランの密度が増大したとき、デバイス上部においてより高濃度の白血球が見られた。特に、デバイス（中心線に沿って上部から底部）のイメージングにより、異なるデキストラン密度に伴うデバイス内での沈降後の白血球の相対的位置が明らかになった。より高密度のデキストランデバイスでは、より多くの白血球がデバイス上部（視野（ＦＯＶ）０〜２５）に見つかったのに対して、より低密度のデバイスでは、白血球はより広い範囲に分散していた。
【００２９】
上記の凝集および分離因子（例えば、デキストラン溶液の密度および質量オスモル濃度、マイクロ流体チャネルの寸法、試料サイズ等）を踏まえて、異なる密度および質量オスモル濃度のデキストラン溶液を用いていくつかの実験が更に実施され、これにより凝集プロセスの一般化モデルを推定することが可能となった。量Ｖの関数としての白血球抽出率（ＷＢＣ％）を表す曲線の形状は、実験全体を通じて一定であるように見え、下記の形式の漸近式：
％ＷＢＣｓＥｘｔｒａｃｔｅｄ（Ｖ）＝Ａ（１−ｅ-kV）
として推定することができる。
式中、ＡはＷＢＣ抽出量の漸近上限であり、ｋは漸近線が接近する量を記述する速度定数であり、Ｖは抽出物の量である。Ａおよびｋを変化させたとき観察された効果は図３に示されており、Ａを変化させたことの効果は左側、ｋを変化させたことの効果は右側に示されている。パラメーターＡの理論的上限値は１（即ち、回収率１００％）である。
【００３０】
本開示を裏付けるために行われた実験では、以下で更に詳細に考察するように、パラメーターＡは、本発明の赤血球除去デバイスにおいて典型的である条件で、０．５〜約０．８の範囲に及ぶことが観察された。パラメーターｋは、３０μＬの血液投入量のとき、最大約０．１になり、抽出物３０μＬ中の回収可能な白血球の１００％が抽出されると予想される。実際には、白血球の沈降は赤血球凝集に伴って生じるため、ｋ＜０．１となることが予想される。観察されたｋの値は、実験状況に依存して、一般に０．０２〜０．０５の範囲となった。
【００３１】
本発明の分離デバイスの通常の動作条件におけるＡおよびｋ値の予想範囲については、原点（即ち、ゼロ点）から開始する抽出量約５０〜１００μＬのアリコートの２つの基準点から、白血球抽出曲線（図４）を推定することができる。特に、上記の３つの点を用いた推定曲線は、より多く（例えば４または５個）の基準点を用いて推定した曲線とほぼ同一であることがわかった。抽出モデルおよび２点フィッティングにより、標準化された実験プロセスおよび異なる実験条件における結果を比較する単純な数値機構（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が得られる。
【００３２】
抽出モデルに基づいて、白血球抽出に対する密度および質量オスモル濃度の効果をより明確に理解することができる。デキストランベースの凝集媒体の密度はパラメーターｋに影響する（抽出量を決定する）一方で、媒体の質量オスモル濃度は主にパラメーターＡに影響する（最終的抽出効率を決定する）。実験は、両方のパラメーターが沈降時間に影響する（密度増大により沈降時間が長くなり、質量オスモル濃度増大により沈降時間が短くなる）ことを示している。
【００３３】
デキストラン溶液の密度を調整することの効果は図５に示されている。図５には、パラメーターｋに対する密度の効果（左）、沈降時間（右上）、および固定質量オスモル濃度（生理学的、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）でのパラメーターＡ（右下）が示されており、Ｆｉｃｏｌｌの百分率を上げると溶液の密度が上がることがわかる。パラメーターｋに対しては密度の明確な影響があり、パラメーターＡに対しては影響がないことに留意してほしい。特に、図５に示されているように、密度増大に伴うパラメーターｋの増加率は約６％の糖添加時に漸減し、一方で沈降時間は上昇を続けている。この観察結果を考慮して、本明細書で考察しているデバイスの特定の実施態様において、密度を増大させパラメーターｋを最大にしながら沈降時間増大を抑えるため、分離媒体に６％の糖を添加するべきである。
【００３４】
溶液の質量オスモル濃度を調整することの効果は図６に示されている。図６には、パラメーターＡに対する質量オスモル濃度の効果（左）、沈降時間（右上）、および密度を上げるためデキストラン溶液に６％の糖を添加した際のパラメーターｋ（右下）が示されている。比率を変えたＦｉｃｏｌｌ−７０（質量オスモル濃度への影響は最小限である）およびグルコース（質量オスモル濃度をわずかに上昇させる）を使用して６％の添加糖を構成した。パラメーターＡに対しては質量オスモル濃度の影響があり、パラメーターｋに対しては比較的影響がないことに留意してほしい。特に、図６に示されるように、質量オスモル濃度増大は、特定の実施態様において有用であり得る。６００ｍＯｓｍ／ｋｇのデキストラン溶液は、場合によって、細胞に対する質量オスモル濃度増大が大きすぎる可能性があるが、より小さな増大（例えば、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ）は許容可能であり得る。質量オスモル濃度増大が下流のアッセイにとって有害である場合、試料投入量をわずかに増大させて生理学的質量オスモル濃度の条件下にて許容可能な白血球抽出を行うことができる。
【００３５】
白血球単離：動作原理−全血が流れて通過する表面上にて白血球を捕捉する効率は、潜在的結合点をブロックする圧倒的数の赤血球のために、通常極めて低い。特に、全血中において、赤血球の数は、約１０００：１の比率で白血球を上回っている。上述したように、最初に赤血球を凝集させ部分的に分離することにより、赤血球凝集体が白血球結合のための空間を空けるため、高効率の白血球捕捉を実現することができる。この概念の概要図が図７に示されており、図７では、非凝集赤血球１０８（上部）および凝集赤血球１１０（下部）の間に位置する白血球１０４が示されている。更に、赤血球凝集体１１０の大部分は（赤血球凝集デバイスまたはデバイス区画における事前の部分分離により）最初にデバイス内を通過するため、白血球の大部分は、赤血球の結合競合力がほとんどなくなった後に流れ込むことになる。即ち、白血球が結合部位に曝露される前に行われる赤血球凝集により、潜在的結合部位に対する白血球の相対的数または濃度は増大する。
【００３６】
従って、本発明のアプローチに従えば、赤血球が凝集した試料を処理して、残留する白血球を収集（即ち、単離および精製）することができる。一実施態様において、本明細書で考察するマイクロ流体デバイスは、赤血球凝集デバイスまたは（統合型実施態様における）デバイス区画の吐出物を受容し、デバイス内を通過し得る赤血球、赤血球凝集体、またはその他の血液成分の捕捉を最小限に抑えながら、白血球を固定する。本明細書では例示として白血球捕捉を一般的に考察しているが、関係し得る血漿タンパク質、脂質、循環核酸、循環腫瘍細胞、ウイルス、または細菌のいずれか１つまたは複数を捕捉する代わりにまたはそれらを捕捉することに加えて、赤血球が分離されまたは凝集して除去された試料を処理することもできると理解すべきである。
【００３７】
赤血球凝集および白血球捕捉デバイスまたは（統合型デバイスの）各区画を統合することにより、赤血球凝集後に、血液／デキストラン混合物全体が白血球捕捉デバイス内を通過できるようになり、白血球捕捉効率が最大化される。これにより、凝集赤血球と共に沈降し得る白血球を喪失する可能性が最小限に抑えられる。本明細書で考察する特定の実施態様では、赤血球凝集コンポーネントの出口を白血球捕捉コンポーネントの入口に接続し、コンポーネント間に流れの連続性が存在するようにすることで、統合が行われる。あるいは、他の実施態様では、上記の機能が同一容器内で実施されるように、白血球捕捉コンポーネント、例えば抗体被覆壁などの親和性表面が、赤血球凝集コンポーネントの壁面または表面として提供されてもよい。
【００３８】
白血球が固定された後、凝集コンポーネントまたは分離収集コンポーネントにて、（刺激を与えるか細胞活動のリアルタイムモニタリング等を行うことで）生細胞アッセイを行ってもよく、および／または特定の時点で白血球の分析を可能にするため（細胞を固定することにより）生化学的状態を凍結することもできる。更に、白血球を表面から脱離させ、更なる分析のために捕捉デバイスから放出させてもよい。更に、対象白血球種上のタンパク質に特異的な抗体などの適切な捕捉抗体を選択することにより、異なる白血球亜種を捕捉することもできる。選択的捕捉アプローチを用いると、捕捉チャネルに沿って異なる位置に異なる抗体を固定することにより、白血球亜種を表面上にて空間的に隔離することができる。
【００３９】
上記のことを踏まえて、白血球捕捉アプローチの例が図８に示されており、ここでは、デバイス表面１００が、白血球１０４に対する親和性を有する抗体１０２で被覆されている。例えば、このようなアプローチでは、抗ＣＤ４５抗体で被覆された表面を用いた親和性捕捉により、白血球を固定することができる。凝集赤血球１１０を含有する全血１０６（例えば、上述の赤血球凝集デバイスまたは区画からの吐出物）は表面１００の上を通過するため、白血球１０４は抗体１０２に結合する一方で、凝集赤血球１１０およびその他の血液成分は通過する。上記のように、表面１００は、赤血球凝集デバイスの表面であるか、赤血球凝集デバイスと流体連通した別個の白血球収集デバイスの表面であり得る。
【００４０】
白血球単離：研究および実験の所見−図９および１０に示されるように、赤血球凝集デバイスと白血球捕捉デバイスとの間の直接接続を含む実験は、８０％を超える白血球回収率を示した。特に、図９は、吐出物が白血球捕捉デバイスまたは区画１２２に直接供給される（上記の考察に従って動作する）赤血球凝集デバイスまたは区画１２０の例を示している。この直接的統合により、典型的にマクロスケール方法を用いてモジュール間を流体が移動する場合に顕著になる細胞損失が最小限に抑えられる。しかし、上記のように、代替的実施態様では、白血球捕獲表面は、赤血球凝集区画にも備えることができる。実験データはまた、白血球亜種の相対的捕捉率が全血中での百分率と同等であることを示している。図１０に示されるように、これらの例では、赤血球凝集媒体の密度を下げる（３％の代わりに０．７５％のデキストラン−５００を使用する）ことで、白血球回収率が８０％超に改善した。白血球は、より低密度の０．７５％デキストラン溶液中において、より速く沈降し、捕捉率の改善およびワークフロー時間の短縮が可能になる。
【００４１】
本発明のアプローチに基づいて行われた研究により、本明細書に記載された総合型血液試料調製ワークフローは、白血球に優しく、生化学的活性化を生じないように見えることが示されている。例えば、図１１は、従来の方法により調製された白血球のＮＦ−κＢ局在化（即ち、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体を用いた遠心分離）と、本明細書で考察する統合型マイクロ流体デバイスにより調製された白血球との比較を示している。これらの結果において明らかなように、このバイオマーカーは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離のケースにおいて明らかに活性化されており、マイクロ流体デバイスのケースでは活性化されていない。
【００４２】
特に、画像内の円で囲われた細胞は、ＣＤ１４＋単球である（左の列）。本明細書に記載された統合型流体デバイスにより調製された単球は、膜結合ＣＤ１４とＮＦ−κＢとの重なりの高い百分率を示し、ＮＦ−κＢが細胞質中において局在化していることを示唆している（中央の列）。対照的に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離により均一に調製された単球は、ＣＤ１４との重なりが最小である核内ＮＦ−κＢを示している（右の列）。統合型流体モジュールにより調製され次いでリポ多糖体（ＬＰＳ）により活性化された単球は、予想された核内ＮＦ−κＢを示し、ＬＰＳ活性化を裏付けている。全ての画像は倍率２０倍で得られたものである。
【００４３】
統合型赤血球凝集および白血球捕捉デバイスのサンプル−以上を踏まえて、白血球捕捉デバイスは、赤血球凝集チャネルと白血球捕捉チャネルとを結合して、精製され固定された白血球に対する以後の分析のための試薬を収容する流体カートリッジ２００（図１２）とすることができる。そのような例において、マイクロ流体チップまたはカートリッジ２００は、試薬切換用のマイクロバルブを組み込んでいる。この設計は、全血ローディングから白血球捕捉および分析までのプロセスの完全な自動化を可能にする。
【００４４】
図１２は、そのようなカートリッジ２００の設計レンダリングを示し、赤血球凝集チャネル２０２、白血球捕捉チャネル２０４、および捕捉白血球の分析用の試薬（試薬ウェル２０６）を組み込んだ流体カートリッジの各種層を示している。一実施態様において、赤血球凝集チャネル２０２は、幅約５ｍｍおよび高さ０．２２５ｍｍである。図示された例では、本明細書で考察された処理のために、全血を血液試料ローディングウェル２１０にロードすることができる。ウェル２１０にロードされた血液は、ローディング前に抗凝固剤により処理されても、そうでなくてもよい。図１２には４列の平行な捕捉モジュールが示されているが、より多く（例えば６列）のモジュールを捕捉スライドに取り付けることもできる。上記のように、別個の白血球捕捉チャネル２０４を備える代わりに、白血球または対象血液成分に特異的な１つまたは複数の親和性表面（例えば、抗体被覆表面）を備えるように赤血球凝集チャネル２０２を作製し、赤血球凝集および血液成分捕捉が同一チャンバー内で行われるようにしてもよい。
【００４５】
上記の考察を踏まえて、要約すると、本発明の技術的効果は、以下の項目：（１）赤血球を他の血液構成成分から分離する機構、および（２）第１の態様の吐出物を親和性捕捉表面の上に流すことにより血液から白血球を精製する機構のいずれかまたは両方からなる本発明のアプローチに従うデバイスおよび／または方法論を含む。第１の（「分離」）部分は、赤血球凝集などにより、赤血球を血液中の他の細胞から分離することを支援する。好適な凝集デバイスまたはデバイスコンポーネントは、血液と高分子量ポリマー（例えば、デキストラン）を含有する溶液との相互作用を制御して分離を達成するための小寸法を少なくとも１つ持つチャンバー（例えば、マイクロ流体チップ）を使用する。このプロセスは手を使わずに有効に操作できる。このことは血液とポリマー溶液を混合する操作と対照的である。このアプローチは、試料の低希釈による（現地試験等にも利用できる）少量の血液からの赤血球の効率的分離を実現するという点で独特のものである。
【００４６】
一実施態様において、分離コンポーネントは、デキストランの存在下にて赤血球凝集プロセスを制御することにより機能する。全血は、マイクロ流体チャネル内にて制御された方式でデキストラン溶液に導入される。試料のローディング後、血液とデキストランは、界面にてゆっくりと混合し始める。デキストランにより赤血球が凝集するに従い、赤血球凝集体は重力により沈降し、デキストラン溶液に入りデバイス底部に向かって移動する（白血球の大部分は後に残る）。赤血球除去効率は、（チャネル形状により制御される）表面張力、血液／デキストラン界面の不安定性（Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｔａｙｌｏｒ不安定性）、およびデキストラン凝集特性（例えば、デキストラン濃度および分子量、ならびに溶液密度、温度、質量オスモル濃度等）の間の相互作用の関数である。マイクロ流体デバイスの使用により、表面張力を制御し、他の場合には不安定な界面においてある程度の安定を実現するために用いるが可能になり、重力に基づいて白血球の位置から赤血球を分離する非混合アプローチが可能になる。これは、最初に血液を均一に分散させて単純に同じ量内で分割する混合アプローチと対照的である。特に、本発明のアプローチは、より低密度の分離媒体の上に血液を層化させるために、マイクロ流体デバイスとの関連において、表面張力を利用する。
【００４７】
第２の（「捕捉」）部分は、別個の区画またはコンポーネントとして提供される場合、白血球の高純度試料を単離するため、親和性捕捉表面の上に分離（即ち、凝集）デバイスの吐出物を流す。あるいは、上記のように、凝集が生じるものと同一のチャンバー内に親和性捕捉表面を提供してもよい。好適な捕捉抗体の例はＣＤ４５（汎白血球）であるが、白血球亜種、ＣＴＣ、血小板、細菌、遊離ＤＮＡ等のいずれかを捕捉するために（単独でまたは組み合わせて）使用できる多種多様な抗体またはその他の連結剤（例えばＤＮＡ）がある。（凝集および沈降を通じた物理的分離による）赤血球隔離は、全血または希釈血液に期待されるものよりも高い捕捉効率を実現する。これらのデバイスは、高度に自動化され、比較的高速であり、非常に少ない血液量で動作することができ、白血球の活性化を最小限に抑えることができるように見える。
【００４８】
捕捉態様は、分離された試料を親和性表面に送達することを最適化することで機能する。これにより、結合部位の物理的競合が最小限に抑えられる。分離ステージは赤血球を凝集させ、赤血球は重力により分離デバイスの底部に移動する。設定時間後に、分離デバイスの内容物は、デバイス底部に流れ始め、捕捉デバイスに入るか排出され廃棄される（捕捉表面が凝集チャンバーと統合されている場合）。最初に凝集赤血球が親和性表面の上を通過する。赤血球は親和性表面に結合しない（高純度の白血球捕捉を可能にする）。上述のように、凝集赤血球は、非凝集赤血球よりも少ない表面積を占め、随伴してトラップされる白血球が表面に結合する可能性を高める（回収）。赤血球が通過した後に、（分離ステージの上部または上清部分から）白血球の多くがそれに続く。赤血球がなければ、これらの白血球は親和性表面と自由に相互作用し、非常に高い効率の白血球捕捉が実現する。
【００４９】
このアプローチは、赤血球から白血球の分離ができ、非常に少ない量（例えば３０μｌ）の血液からでさえ白血球を分離できる、簡便で高度な自動化が可能なアプローチである。このアプローチは、実験室設備（遠心分離機など）または訓練を受けた作業員を必要としない。赤血球は白血球に対して約１０００：１の比率で数が多く、結合キネティクスまたはバックグラウンドノイズに関する重大な問題を生じるため、白血球から赤血球を除去することは、多くの白血球特異的アッセイにとって必要である。より大きな血液量を扱うために、本明細書に記載された複数の分離デバイスを並列化することもできる。細胞の活性化は最小限に抑えられ、高忠実度の下流側使用が可能になる。捕捉ステージを追加することにより、少量の全血を、少ない細胞喪失量で、２時間のうちに、活性化が最小限に抑えられ、表面に結合した、カスタマイズ可能な白血球個体群へと転化するという高度に自動化された機構が実現される。更なる操作（生細胞アッセイ）および調製ステップ（固定、ＦＩＳＨ、免疫細胞化学的染色等）は、この種の試料を扱うために容易に自動化される。そのような試料（結合試料または非結合試料）は、多種多様な用途にとって有用であり得る。
本明細書では、最良の形態を含む複数の例を用いて本発明を開示し、更に、いずれかのデバイスまたはシステムを製作して使用し、ならびに組み込まれた方法を実施することを含めて、当業者が本発明を実施できるようにしている。本発明の特許性の範囲は、特許請求の範囲によって画定され、当業者が想到する他の例も含み得る。そのような他の例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、またはそれらが特許請求の範囲の文言とわずかに異なる同等の構造要素を有する場合、特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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