(57)【要約】【課題】３−ＭＣＰＤに３−ＭＣＰＤ還元酵素活性を有する酵素またはこの酵素を有する微生物を作用させて炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元する(S)-ムスコンの製造方法を提供する。【解決手段】３−メチルシクロペンタデセノン（以下、３−ＭＣＰＤ）に、３−ＭＣＰＤを(S)-３-メチルシクロペンタデカノン（以下、(S)-ムスコン）に還元する活性を有する酵素（以下、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素）、または前記酵素活性を有する微生物を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。３−ＭＣＰＤに、本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−メチルシクロペンタデセノン（以下、３−ＭＣＰＤ）に、３−ＭＣＰＤを(S)-３-メチルシクロペンタデカノン（以下、(S)-ムスコン）に還元する活性を有する酵素（以下、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素）、または前記酵素活性を有する微生物を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。
【請求項２】
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、ロドトルラ・ムチラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、カンジタ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジタ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、カンジタ・ピニ(Candida pini)、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、ロドトルラ・アウランチアカ(Rhodotorula aurantiaca)、デバリオマイセス・サブグロボサス(Debaryomyces subglobosus)、カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、クリプトコッカス・テレウス(Cryptococcus terreus)、ロドスポリジウム・トロイデス(Rhodosporidium toruroides)、カンジタ・マグノリア(Candida magnoliae)、ピキア・ナガニシ(Pichia naganishii)、ジゾサッカロミセス・ポンベ(Schizossacharomyces pombe)、および、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) からなる群より選ばれる少なくとも１種の微生物に由来する酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性を有する微生物が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、ロドトルラ・ムチラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、カンジタ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジタ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、カンジタ・ピニ(Candida pini)、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、ロドトルラ・アウランチアカ(Rhodotorula aurantiaca)、デバリオマイセス・サブグロボサス (Debaryomyces subglobosus)、カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、クリプトコッカス・テレウス(Cryptococcus terreus)、ロドスポリジウム・トロイデス(Rhodosporidium toruroides)、カンジタ・マグノリア(Candida magnoliae)、ピキア・ナガニシ(Pichia naganishii)、ジゾサッカロミセス・ポンベ(Schizossacharomyces pombe)、および、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物は、微生物の菌体、菌体からの抽出物、または菌体の破砕物である、請求項１〜３の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素が、下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項７】
前記作用は、４℃〜５５℃の温度で行う、請求項１〜６の何れかに記載の製造方法）。
【請求項８】
前記作用は、ｐＨを４．５〜１０．５の範囲で行う、請求項１〜７の何れかに記載の製造方法。
【請求項９】
下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項１０】
下記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
【請求項１２】
請求項１０に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む形質転換体。
【請求項１３】
３−ＭＣＰＤに、請求項１２に記載の形質転換体を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元するα,β-不飽和カルボニル還元酵素活性を有する微生物または酵素を用いて、３−メチルシクロペンタデセノン(３−ＭＣＰＤ)から(S)-３-メチルシクロペンタデカノン（(S)-ムスコン）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムスコン（３−メチルシクロペンタデカノン）は、香料として利用価値の高い化合物である。ムスコンの製造方法として、例えば、α,β-不飽和カルボニル化合物である３−ＭＣＰＤの炭素−炭素２重結合を還元する方法が有用である。この還元には化学的方法と、生物学的方法がある。
【０００３】
α,β-不飽和カルボニル化合物の炭素−炭素２重結合を還元する生物学的な方法としては、以下のような酵素を用いる方法が報告されている。ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来のエノン還元酵素であるp44、p90（非特許文献１）、カンジダ・カステリ(Candida castellii)、カザッタニア・スペンセロラム(Kazachstania spencerorum)、クリベロマイセス・マルキアナス(Kluyveromyces matrixianus)由来のLevodione還元酵素（非特許文献２）、サッカロマイセス・カールベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)由来のOld Yellow Enzyme（非特許文献３）、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)由来のYqjM（非特許文献４）が５員環エノンまたは６員環エノンを立体選択的に還元することが知られている。また、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida M10)由来のMorphinone reductase（非特許文献５）、ジギタリス・プルプレア(Digitalis purpurea)由来のprogesterone 5α-reductase（非特許文献６）は多環式化合物のエノンを還元することが知られている。しかし、３−ＭＣＰＤを還元する酵素は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tetrahedron: Asymmetry, 15巻, 2443〜2446 ページ (2004 年)
【非特許文献２】J. Biotechnol., 156巻, 279〜285 ページ (2011 年)
【非特許文献３】J. Mol. Catal. B: Enzyme, 4 2巻, 52〜54 ページ (2006 年)
【非特許文献４】Adv. Synth. Catal., 351巻, 3287〜3305 ページ (2009 年)
【非特許文献５】Biochem. J., 301巻, 97〜103 ページ (1994 年)
【非特許文献６】J. Plant. Physiol., 141巻, 269〜275 ページ (1993 年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、α,β-不飽和カルボニル化合物の炭素−炭素２重結合を還元する酵素は知られている。しかし、これらの酵素はいずれも５員環エノンや６員環エノンなどの小員環エノンと、一部の多環式化合物を基質とするもので、大員環エノンである３−ＭＣＰＤを還元するものは知られていない。そのため、３−ＭＣＰＤの炭素−炭素２重結合の還元による(S)-ムスコンの製造方法は、化学的な方法に限られていた。
【０００６】
そこで本発明は、３−ＭＣＰＤに３−ＭＣＰＤ還元酵素活性を有する酵素またはこの酵素を有する微生物を作用させて炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元する(S)-ムスコンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、３−ＭＣＰＤの炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元して(S)-ムスコンを生成する活性を有する酵素及びこの酵素活性を有する微生物が存在することを見出し、これらの酵素または微生物を用いることで、穏和な条件下で、３−ＭＣＰＤの炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元して(S)-ムスコンを生成することができることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下の通りである。
［１］
３−メチルシクロペンタデセノン（以下、３−ＭＣＰＤ）に、３−ＭＣＰＤを(S)-３-メチルシクロペンタデカノン（以下、(S)-ムスコン）に還元する活性を有する酵素（以下、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素）、または前記酵素活性を有する微生物を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。
［２］
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、ロドトルラ・ムチラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、カンジタ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジタ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、カンジタ・ピニ(Candida pini)、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、ロドトルラ・アウランチアカ(Rhodotorula aurantiaca)、デバリオマイセス・サブグロボサス(Debaryomyces subglobosus)、カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、クリプトコッカス・テレウス(Cryptococcus terreus)、ロドスポリジウム・トロイデス(Rhodosporidium toruroides)、カンジタ・マグノリア(Candida magnoliae)、ピキア・ナガニシ(Pichia naganishii)、ジゾサッカロミセス・ポンベ(Schizossacharomyces pombe)、および、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)からなる群より選ばれる少なくとも１種の微生物に由来する酵素である、［１］に記載の製造方法。
［３］
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性を有する微生物が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、ロドトルラ・ムチラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、カンジタ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジタ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、カンジタ・ピニ(Candida pini)、ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、ロドトルラ・アウランチアカ(Rhodotorula aurantiaca)、デバリオマイセス・サブグロボサス (Debaryomyces subglobosus)、カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、クリプトコッカス・テレウス(Cryptococcus terreus)、ロドスポリジウム・トロイデス(Rhodosporidium toruroides)、カンジタ・マグノリア(Candida magnoliae)、ピキア・ナガニシ(Pichia naganishii)、ジゾサッカロミセス・ポンベ(Schizossacharomyces pombe)、および、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］に記載の製造方法。
［４］
前記微生物は、微生物の菌体、菌体からの抽出物、または菌体の破砕物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
前記酵素が、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素である、［１］に記載の製造方法。
［６］
前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素が、下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
［７］
前記作用は、４℃〜５５℃の温度で行う、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法）。
［８］
前記作用は、ｐＨを４．５〜１０．５の範囲で行う、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
［１０］
下記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
［１１］
［１０］に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
［１２］
［１０］に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む形質転換体。
［１３］
３−ＭＣＰＤに、［１２］に記載の形質転換体を作用させて、(S)-ムスコンを得ることを含む、(S)-ムスコンの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、前記酵素、前記微生物菌体および細胞抽出物、前記酵素の遺伝子を含む形質転換体および細胞抽出物を用いることで、穏和な条件で、３−ＭＣＰＤを立体選択的に還元して、(S)-ムスコンを製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490菌体と３−ＭＣＰＤを反応した反応液、３−ＭＣＰＤ標準品、およびムスコン標準品のGC-MSクロマトグラムである。
【図２】スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490菌体と３−ＭＣＰＤを反応した反応液、(R/S)-ムスコン標準品、および(R)-ムスコン標準品のGC-MSクロマトグラムである。
【図３】スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490の菌体破砕液と３−ＭＣＰＤの酵素反応を行った反応液、(R/S)-ムスコン標準品、および(R)-ムスコン標準品のGC-MSクロマトグラムである。
【図４】スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 490  から精製した３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素のSDS-PAGEを示す写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例３で得られた酵素を示す。
【図５】実施例６で得られた酵素の至適pHを示す図である。
【図６】実施例６で得られた酵素の至適温度を示す図である。
【図７】実施例６で得られた酵素と３−ＭＣＰＤの酵素反応を行った場合の反応液と３−ＭＣＰＤ標準品、ムスコン標準品のGC-MSクロマトグラムである。
【図８】実施例６で得られた酵素と３−ＭＣＰＤの酵素反応を行った場合の反応液と(R/S)-ムスコン標準品、(R)-ムスコン標準品のGC-MSクロマトグラムである。
【図９】３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素のアミノ酸配列（配列番号１）である。
【図１０】３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素遺伝子の塩基配列（配列番号２）である。
【図１１】実施例４で精製した３−ＭＣＰＤのアミノ酸配列とスポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 6832株の機能未知酵素 (Accession number: CENE01000030)のアミノ酸配列のアライメント。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の(S)-ムスコンの製造方法は、３−ＭＣＰＤに、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素または前記酵素活性を有する微生物を作用させて(S)-ムスコンを得ることを含む。(S)-ムスコンは、単にムスコンと呼ぶことがある。
【００１２】
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素は、３−ＭＣＰＤを(S)-ムスコンに還元する活性を有する酵素であり、３−ＭＣＰＤの炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元して(S)-ムスコンを生成する反応は、以下の化学式で示される。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性は、本発明者らが実験的に確認した結果、例えば、以下の微生物が有することが判明した。本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素は、以下の微生物に由来する３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素であり、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素活性を有する微生物は、下記の微生物である。各微生物の酵素活性の具体例については後述する。
スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)またはスポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、
ロドトルラ・ムチラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、
カンジタ・アルビカンス(Candida albicans)、
カンジタ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、
カンジタ・ピニ(Candida pini)、
ロドトルラ・ミヌタ(Rhodotorula minuta)、
ロドトルラ・アウランチアカ(Rhodotorula aurantiaca)、
デバリオマイセス・サブグロボサス (Debaryomyces subglobosus)、
カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、
クリプトコッカス・テレウス(Cryptococcus terreus)、
ロドスポリジウム・トロイデス(Rhodosporidium toruroides)、
カンジタ・マグノリア(Candida magnoliae)、
ピキア・ナガニシ(Pichia naganishii)、
ジゾサッカロミセス・ポンベ(Schizossacharomyces pombe)、および、
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)。
【００１５】
前記微生物の中でも、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)が、(S)-ムスコンの生成収率が高いことから好ましく、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来する３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を用いることが、同様の理由で好ましい。スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来する３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素は、後述するように新規酵素である。
【００１６】
上記微生物は、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）。
【００１７】
上記微生物は、ＹＰＤ培地等の一般的な培地で培養することができる。培養は、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜３７℃の範囲で、好気的に２４〜７２時間で行うことができる。
【００１８】
培養により得られた菌体は、そのまま本発明の製造方法に用いることができ、あるいは微生物菌体の細胞抽出物（例えば、有機溶媒抽出物）、菌体の破砕物を用いることもできる。菌体の抽出あるいは破砕は公知の方法で実施できる。３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を用いる場合には、細胞抽出物または菌体破砕物から酵素を分離し、必要により適宜精製して用いることができる。酵素は粗酵素であっても精製酵素であっても良い。
【００１９】
還元反応は、菌体若しくは菌体抽出・破砕物または酵素と、基質である３−ＭＣＰＤとを混合して行う。反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス−塩酸緩衝液が挙げられる。 但し、これらの限定されるものではない。
【００２０】
基質である３−ＭＣＰＤは、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
【００２１】
反応時の温度は、微生物が有する還元酵素または還元酵素の至適温度及び温度安定性等を考慮して適宜決定することができ、通常、１０〜６０℃、好ましくは３０〜３５℃とする。
【００２２】
反応時のｐＨは、微生物が有する還元酵素または還元酵素の至適ｐＨ等を考慮して適宜決定することができ、通常、４．５〜１０．５、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲である。
【００２３】
反応液中の基質濃度は０．０００１〜２％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．０１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）である。
【００２４】
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、１〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。但し、この範囲に限定される意図ではない。
【００２５】
微生物の菌体を用いる場合には、還元反応を促進させるために、反応液にグルコースなどのエネルギー源を０．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）の割合で加えるのが好ましい。
【００２６】
菌体又は菌体破砕物を用いる場合には、一般に、生物学的方法による還元反応では必要とされているＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、通常は、反応液に直接これらを添加する。
【００２７】
反応終了後、生成した(S)-ムスコンを取り出す方法は特に限定されない。例えば、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度のカルボニル化合物を容易に得ることができる。
【００２８】
本発明は、下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質を包含する。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２９】
（１）の配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来する３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素である。
【００３０】
本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性の測定方法は、実施例の「活性測定の説明」の欄に記載がある。
【００３１】
本発明のタンパク質の（２）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「１から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から５０個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有する酵素であることを意味する。前記「１から５０個」の範囲は、前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質である割合が高いという観点から、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、一層好ましくは１から７個、さらに一層好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度であることができる。
【００３２】
本発明のタンパク質の（３）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における同一性は、前記アミノ酸配列の同一性を有するタンパク質が、前記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上である。
【００３３】
本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、上記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を産生することができる。
【００３４】
本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質は、上記タンパク質をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、生産方法により調製することができる。上記タンパク質をコードする遺伝子の取得方法は、特に限定されない。本発明のタンパク質の調製方法は、プラスミド及び形質転換体の項で後述する。
【００３５】
前述の本発明の(S)-ムスコンの製造方法においては、上記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質を用いることもできる。
【００３６】
本発明は、下記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子を包含する。
（４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００３７】
本発明の遺伝子において、「３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質」における「３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性」は、前述の通りである。
【００３８】
本明細書で言う「１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から５０個」の範囲は特には限定されないが、例えば、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３９】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有少なくともタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００４０】
例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて調製することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４１】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４２】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４３】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、既存の生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している、例えば、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)の培養物から得られた細胞から常法により作製することができる。ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００４４】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知の方法で行うことができる。
【００４５】
本発明は、上記本発明の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを包含する。さらに本発明は、宿主生物中に、本発明のプラスミドを前記本発明の遺伝子がコードする３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を発現可能に含む、形質転換体を包含する。
【００４６】
本発明において、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用して、本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有するタンパク質を発現させることで、調製することができ、かつ得られるタンパク質を３−ＭＣＰＤの立体選択的還元反応に利用することができる。
【００４７】
上記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子は適当なベクター中に挿入する。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。即ち、本発明のプラスミドに用いるベクターとしては、宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとして、例えば大腸菌の場合では、pUC19 (タカラバイオ社製)、酵母の場合では、pPCIZA(ライフテクノロジーズ社製)などが挙げられる。
【００４８】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosidase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌（E. coli）のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００４９】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００５０】
また、上記３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００５１】
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００５２】
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主生物に導入することによって形質転換体を作製することができる。用いる宿主生物は、該酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。このような宿主生物として、より具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や酵母（Pichia pastoris）が挙げられる。
【００５３】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌（E. coli）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００５４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００５５】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００５６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、公知の方法を用いて組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
【００５７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００５８】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００５９】
本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、上記のように公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のEscherichia coli JM109（以下、E. coli JM109）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。宿主微生物として酵母を用いる場合は、市販のPichia pastoris X-33株、GS-115株、KM71H株(ライフテクノロジーズ社製)などを用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００６０】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明で用いる３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明で用いる３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を精製標品として得ることができる。
【００６１】
前述の本発明の(S)-ムスコンの製造方法においては、上記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む形質転換体を、微生物菌体またはその細胞抽出物として作用させること、または前記形質転換体から得られるタンパク質（３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素）を用いることもできる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００６３】
活性測定の説明
本発明の３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の３−ＭＣＰＤに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。
20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、2 mM NADPH、1 mM ３−ＭＣＰＤ及び前記タンパク質を含む反応液中30℃で反応させた後、反応液を酢酸エチルで抽出し、GC-MSで生成したムスコン量を測定する。尚、３−ＭＣＰＤは特開2012-46444号公報に記載の方法に従って合成した。
【００６４】
1 Uは、1分間に1μmolのムスコンの生成を触媒する酵素量とした。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行った。
【００６５】
実施例１
(S)-ムスコン産生菌の探索
（１）ムスコン産生菌の探索
表１の組成を有する培地（１０ｍL）を用いて３０℃、２４時間培養した菌体を８，０００×ｇで遠心分離し、菌体を回収した後、表２の組成を有する反応液（１０ｍL）に懸濁し、３０℃、２４時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、４℃、２０，０００×ｇで１分間遠心分離し、得られた上清液を分析条件１でGC-MS分析を行った。
【００６６】
【表１】
2017153445.tif 000003
【００６７】
【表２】
2017153445.tif 000004
【００６８】
分析条件１
GC-MSシステム：島津製作所社製「GC/MS-QP2010 plus」
カラム：GLサイエンス社製「TC-70 column」（φ 0.25μm, 0.25 mm×60 m）
カラム初期温度：80℃
保持時間：3分
昇温速度：25℃/分
到達温度：290℃
キャリアガス：ヘリウム
流速：28 ml/m分
キャリアガス圧力：194 kPa
イオン源温度：200℃
【００６９】
その結果、図１に示すとおり、２２菌株の反応液からムスコン標準品と同様に12.6分に新たなピークが認められた。なお、３−ＭＣＰＤのピークは12.9分と13.3分に認められた。
【００７０】
（２）生成化合物の立体化学の確認
上記実施例１−（１）で得られた反応液の酢酸エチル抽出物を分析条件２でGC-MS分析を行った。
【００７１】
分析条件２
GC-MSシステム：島津製作所社製「GC/MS-QP2010 plus」
カラム：Chiral-separations社製「Cyclodextrin-3P column」（φ 0.25μm, 0.25 mm×60 m）
カラム初期温度：80℃
保持時間：5分
昇温速度：5℃/分
到達温度：230℃
キャリアガス：ヘリウム
流速：15.2 ml/分
キャリアガス圧力：150 kPa
イオン源温度：200℃
【００７２】
その結果、図２に示すとおり、６菌株の反応液から(R/S)-ムスコン標準品と同じ26.58分と26.64分にピークが認められた。また、１６菌株の反応液からは、(S)-ムスコン標準品と同様の26.64 分にピークが認められた。表３に、各菌株が生成したムスコンの収率とその立体化学を示す。
【００７３】
【表３】
2017153445.tif 000005
【００７４】
実施例２
菌体破砕液を用いたムスコンの生成実験
スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)株を、表１に示す組成の培地（５ｍL）を用いて３０℃、２４時間培養した後、菌体を８，０００×ｇで遠心分離し、回収した。得られた菌体（200 mg）を20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、多検体細胞破砕機（安井器械社製「マルチビーズショッカー」）を用い、菌体を２，７００ｒｐｍで６分間破砕した。次に、菌体破砕液を４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、1 mMの３−ＭＣＰＤと2 mMのNADPHを加え、３０℃で１５時間反応した。反応液を酢酸エチル（1 mL）で抽出し、４℃、２０，０００×ｇで１分間遠心分離し、得られた上清液を分析条件１でGC-MS分析を行い、定量した。その結果、収率2.4%でムスコンの生成を確認した。
次に、生成したムスコンの立体化学を上記実施例１−（２）と同様の方法で確認した。その結果、図３に示すとおり、(S)-ムスコン標準品と同様の26.62 分にのみピークが認められた。実施例１の菌体反応で認められた(R)-ムスコンと同様の26.57 分のピークは認められなかった。
【００７５】
実施例３
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の精製
スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)を表１の培地2 Lに植菌し、30℃で24時間振盪培養した。この培養液を4℃、10,000×ｇで20分間遠心分離して集菌し、20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) で洗浄した。さらに、洗浄した菌を同緩衝液に懸濁し、多検体細胞破砕機（安井器械社製「マルチビーズショッカー」）を用い、菌体を2,500 rpmで6分間破砕した。次に、菌体破砕液を４℃、20,000×gで30分間遠心分離することにより菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
【００７６】
この無細胞抽出液に硫安を添加し、40-75% 飽和硫安画分で得られた活性画分を回収した。
【００７７】
活性画分を20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)に溶かし、硫安を添加して20% 飽和とした後、20% 飽和硫安を含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で平衡化したToyopearl Butyl-650M(東ソー社製、5.6cm×7cm)に添加した。同緩衝液で洗浄後、20、15、10、5、0 % 飽和硫安で段階的に溶出を行い、溶出した画分を回収した。
【００７８】
得られた画分を20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)に対して透析した後、同緩衝液 (pH 7.0)で平衡化したQ Sepharose(GEヘルスケア社製、2.5cm×8cm)に添加した。同緩衝液で洗浄後、0-1.0 M 塩化ナトリウムで勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
【００７９】
活性画分として溶出した素通り画分を20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)で平衡化したTOYOPEARL AF-Blue HC-650(東ソー社製、1.5cm×3cm)に添加した。同緩衝液で洗浄後、１０ｍM NADPHで溶出を行い、溶出した画分を回収した。
得られた画分を限外濾過(メルクミリポア社製、Amicon(R)Ultra)により濃縮、20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で平衡化したMono Q 5/50 GL(GEヘルスケア社製、1 mL)に添加し、タンパク質精製用液体クロマトグラフィーシステム(GEヘルスケア社製、AKTAexplorer 10S)を用いて、0-0.1 M 塩化ナトリウムで勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
【００８０】
Mono Q 5/50 GLにより得られた活性画分を、SDS-PAGEにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図４）。精製酵素の３−ＭＣＰＤに対する比活性は74.9 mU/mgであった。精製の要約を表４に示す。
【００８１】
【表４】
2017153445.tif 000006
【００８２】
実施例４
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素のアミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、SDS-PAGEのゲルより、３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を含むゲル断片を切り出し、30% のアセトニトリルを含む25 mM 炭酸水素アンモニウムを用いて洗浄後、ヨードアセトアミドを用いた還元アルキル化、トリプシンを用いて37℃で終夜ゲル内消化を行った。消化したペプチドを抽出し、以下の分析条件でnanoLC/nanoESI-QTOFを用いて分析を行った。その結果、精製した酵素のアミノ酸配列（配列番号１）は、スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)CBS 6832株の機能未知酵素(Accession number: CENE01000030)のアミノ酸配列（配列番号５）と92％の同一性を有していた（図１１参照）。
【００８３】
分析条件
LC/MS
ＵＰＬＣシステム：Waters社製「nanoACQUITY UPLC」
Trapカラム：Waters社製「nanoACQUITY  symmetry C18」(φ5μm, 180μm×20 mm)
分析カラム：Waters社製「nanoACQUITY  CSH 130 C18」(φ1.7μm, 75μm×200 mm)
カラム温度：35℃
移動相：水（0.1 % ギ酸/アセトニトリル（0.1% ギ酸）
1% (0-1分)、1-50% (1-50分)、50-95 % (50-55分)、95% (55-75分)、95-99% (75-78分)アセトニトリル（0.1 % ギ酸）
流速：０．３μＬ／分
【００８４】
ＭＳシステム：Waters社製「SYNAPT G2-Si」
イオン化方法：nanoESI，ポジティブイオンモード
コーン電圧：３ kV
【００８５】
LC/MS/MS
フラグメンテーションモード: CID
トラップコリジョンエネルギー: ５，１５，２５，３５Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー：off
【００８６】
実施例５
スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来３−ＭＣＰＤ立体選択的還元活性を有する形質転換大腸菌の作製
スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)からTRIzol(Life Technology社)を用いてtotal RNAを抽出した後、PrimeScriptTM RT-PCR Kit(TAKARA社)を用いてcDNAを合成した。スポリジオボルス・サルモニカラーCBS 6832由来の目的酵素をコードする遺伝子配列を元にORFクローニング用のプライマー1（配列番号：3）、プライマー2（配列番号：4）を合成した。プライマーを各0.2 pmol、スポリジオボルス・サルモニカラーCBS 490由来染色体DNA 42 ng、PrimeSTAR MAX premix (TAKARA製)を含む25μLの反応液を用い、変性（98℃、10秒）、アニール（55℃、15秒）、伸張（72℃、8秒）を35サイクル、Thermal Cycler S02（GeneAtlas製）を用いて行った。PCR後、増幅した遺伝子と発現用ベクターpET28aをNco IとHind IIIで消化し、In Fusion(R)HD cloning Kit(Clontech社)を用いて、ライゲーションし、大腸菌E. coli BL21(DE3)株を形質転換した。
【００８７】
配列番号：3：GGAGATATACCATGGCGCCCATCACCAACAAGAAGACC
配列番号：4：TGCGGCCGCAAGCTTACTCGAGGGAGATGACGGCCTTGCC
【００８８】
実施例６
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の大腸菌による生産
３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素を発現するプラスミドpET28で形質転換された大腸菌E. coli BL21 (DE3)株を、カナマイシンを含む液体LB培地で３７℃で４時間振とう培養し、0.5 mM IPTGを加え、16℃でさらに16時間振とう培養を行った。菌体を遠心分離により集菌した後、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に懸濁し、超音波で１５分処理して菌体を破砕した。組換え３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の精製は、実施例３と同様の方法で行った。
【００８９】
実施例７
酵素反応によるムスコンの生成に与える温度条件の検討
実施例６で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて、３−ＭＣＰＤ還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図５に示した。反応の至適温度は３０℃であり、３０−３５℃において最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００９０】
実施例８
酵素反応によるムスコンの生成に与えるpH条件の検討
リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてｐＨを変化させて、実施例６で得られた酵素の３−ＭＣＰＤ還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図６に示した。反応の至適ｐＨは7.0−9.0であり、ｐＨ7.0−9.0で最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００９１】
実施例９
精製酵素を用いた３−ＭＣＰＤの還元
実施例６で得られた酵素 10 mU、20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、0.1 mM ３−ＭＣＰＤを含む反応液1 mLで、30℃で１時間反応させた後、酢酸エチルで抽出し、実施例２で用いた分析条件１で分析した（図７）。その結果、反応生成物はムスコン標準品と同様に12.4 分に溶出した。３−ＭＣＰＤは12.6 分と13.1分に溶出した。生成したムスコンをGC-MSで定量し、出発物質である３−ＭＣＰＤに対するモル収率を求めた結果、反応収率55%でムスコンが生成していた。また、生成したムスコンの立体化学を、実施例２で用いた分析条件２で分析した。その結果、反応生成物は(S)-ムスコン標準品と同様に26.42 分に溶出した。(R)-ムスコン標準品は26.47分に溶出した。GC-MSのイオンクロマトグラムを図８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、(S)-ムスコンの製造に関連する分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１：スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素のアミノ酸配列
配列番号２：スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor CBS 490)由来３−ＭＣＰＤ立体選択的還元酵素の塩基配列
配列番号３：ORFクローニング用のプライマー１
配列番号４：ORFクローニング用のプライマー２
配列番号５：スポリジオボルス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor )CBS 6832株の機能未知酵素( Accession number: CENE01000030)のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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