(57)【要約】【課題】溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットを提供すること。【解決手段】本発明の血糖値測定試薬は、グルコーストランスポーター阻害剤を含むことを特徴とする。本発明の血糖値測定チップは、血液が供給される供給口と、該供給口が一端に形成された流路と、該流路内に設けられた試薬と、を備え、前記血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置に装着可能な血糖値測定チップであって、前記試薬が、グルコーストランスポーター阻害剤を含む血糖値測定試薬であることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコーストランスポーター阻害剤を含むことを特徴とする血糖値測定試薬。
【請求項２】
前記グルコーストランスポーター阻害剤が、サイトカラシンＡ又はサイトカラシンＢであることを特徴とする請求項１に記載の血糖値測定試薬。
【請求項３】
極性溶媒をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の血糖値測定試薬。
【請求項４】
極性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の血糖値測定試薬。
【請求項５】
血液が供給される供給口と、該供給口が一端に形成された流路と、該流路内に設けられた試薬と、を備え、前記血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置に装着可能な血糖値測定チップであって、
前記試薬が、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の血糖値測定試薬であることを特徴とする血糖値測定チップ。
【請求項６】
請求項５に記載の血糖値測定チップと、血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置とを備える血糖値測定装置セットであって、
前記血糖値測定装置が、
前記血液と前記試薬との反応物に光を照射する照射部と、
前記反応物を透過又は前記反応物から反射した測定光を受光する受光部と、
前記測定光から得られる信号を処理する処理部と、
を備えることを特徴とする血糖値測定装置セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関し、特に、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、血液中のグルコース成分を測定する血糖値測定装置が広汎に利用されている（例えば、特許文献１及び２参照）。ここで、血液中のグルコース成分を測定する方法として、血液から赤血球を除いた後に、血漿中のグルコース量を測定する方法があるが、この方法の場合、血液から赤血球を除くために、赤血球除去膜を用いる必要があるので、測定にかかるコストが高くなる傾向があった。
そこで、測定にかかるコストを低減すべく、全血を検体とした血糖値測定が検討されている（例えば、特許文献３参照）。この特許文献３では、全血中における赤血球及び血漿におけるグルコース量を測定するのに溶血剤が用いられているが、溶血剤を用いた測定においては、血液検体間において溶血度にばらつきが生じて、測定精度が悪くなるという問題があった。
以上より、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定を精度よく行うことが強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０４９７０４号
【特許文献２】特許第４９９９００７号公報
【特許文献３】特公平７−３４７５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定にて、血漿中のグルコース量を精度よく測定することができないという問題があった。
【０００５】
本発明の目的は、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討した結果、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定では、血糖値測定試薬が反応中に、赤血球細胞膜表面に発現しているグルコーストランスポーター（例えば、ＧＬＵＴ１）を介して、赤血球から血漿にグルコースが流出することが、血漿中のグルコース量を精度よく測定することができない主な原因であることを知見した上で、グルコーストランスポーターの作用を阻害するグルコーストランスポーター阻害剤を血糖値測定試薬中に用いることで、グルコーストランスポーターの働きが血糖値測定に及ぼす影響を低減することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
本発明の第１の態様としての血糖値測定試薬は、グルコーストランスポーター阻害剤を含むことを特徴とするものである。
これにより、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる。
なお、赤血球から血漿へのグルコース流出には検体差があり、この検体差は、測定精度に悪影響を与える。よって、赤血球から血漿へのグルコース流出を低減させることにより、検体差の測定精度への悪影響を低減することができる。
【０００８】
本発明の１つの実施形態として、前記グルコーストランスポーター阻害剤が、サイトカラシンＡ又はサイトカラシンＢであることが好ましい。サイトカラシンＡ又はサイトカラシンＢは、少量であっても、本願発明の効果を奏することができる。これは、グルコーストランスポーターとの親和性が大きいためであると考えられる。
【０００９】
本発明の１つの実施形態として、前記グルコーストランスポーター阻害剤の含有量が、血液検体に溶解した際の濃度（血液検体中終濃度）で０．０１ｍＭ以上であることが好ましい。
【００１０】
本発明の１つの実施形態として、極性溶媒をさらに含むことが好ましい。ここで、前記極性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。また、極性溶媒の含有量が、血液検体に溶解した際の濃度（血液検体中終濃度）で０．１％ｖ／ｖ（体積／体積）〜１．０％ｖ／ｖ（体積／体積）であることがより好ましい。
【００１１】
本発明の第２の態様としての血糖値測定チップは、血液が供給される供給口と、該供給口が一端に形成された流路と、該流路内に設けられた試薬と、を備え、前記血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置に装着可能な血糖値測定チップであって、前記試薬が、本発明の第１の態様としての血糖値測定試薬であることを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の第３の態様としての血糖値測定装置セットは、本発明の第２の態様としての血糖値測定チップと、血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置とを備える血糖値測定装置セットであって、前記血糖値測定装置が、前記血液と前記試薬との反応物に光を照射する照射部と、前記反応物を透過又は前記反応物から反射した測定光を受光する受光部と、前記測定光から得られる信号を処理する処理部と、を備えることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る血糖値測定チップを示す平面図である。
【図２】図１における線Ｉ−Ｉに沿った断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る血糖値測定装置セットを示す平面図である。
【図４】図３に示す血糖値測定装置セットの血糖値測定装置及び血糖値測定チップを示す縦断面図である。
【図５】チップに２種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体（「ｃｏｎｔ−ＢＧ１００」）及びサイトカラシンＢを添加した血液検体（「ＣｙＢ−ＢＧ１００」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ＡＢＳ）を、横軸は点着後の時間（ｍｓｅｃ：ミリセコンド）を示す。
【図６】サイトカラシンＢを添加していない試薬を有するチップに４種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体２種（「検体１―ＢＧ１００」及び「検体２―ＢＧ１００」）、並びに、サイトカラシンＢを添加した血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」及び「検体２−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を、横軸は点着後の時間（秒）を示す。
【図７】サイトカラシンＢを添加した試薬を有するチップに４種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００」及び「検体２−ＢＧ１００」）、並びに、サイトカラシンＢを添加した血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」及び「検体２−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を、横軸は点着後の時間（秒）を示す。
【図８】サイトカラシンＢを添加していないチップを用いた場合（「ｃｏｎｔ」）における「サイトカラシンＢを添加していない血液検体とサイトカラシンＢを添加した血液検体との発色量との差分」と、サイトカラシンＢを添加したチップを用いた場合（「ＣｙＢ混」）における「サイトカラシンＢを添加していない血液検体とサイトカラシンＢを添加した血液検体との発色量との差分」と、を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（血糖値測定試薬）
本発明に係る血糖値測定試薬は、少なくとも、グルコーストランスポーター阻害剤（例えば、ＧＬＵＴ１阻害剤）を含有してなり、さらに必要に応じて、酵素、メディエータ（電子受容体）、色素、極性溶媒、緩衝剤、その他の成分を含有してなる。
なお、血液中のＤ−グルコースとメディエータ（又は、電子受容体）（例えば、後述するｍ−ＰＭＳ）とが酵素（例えば、後述するＧＤＨ）によって反応して、その反応により色素（例えば、後述するＷＳＴ−４）が発色する。
【００１６】
＜グルコーストランスポーター阻害剤＞
前記グルコーストランスポーター阻害剤としては、グルコーストランスポーターの作用を阻害するものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイトカラシンＢ（下記構造式（１）参照）、サイトカラシンＡ（下記構造式（２）参照）、フロレチン（下記構造式（３）参照）、レスベラトロール（下記構造式（４）参照）、フロリジン（下記構造式（５）参照）、Ｆａｓｅｎｔｉｎ（サンタクルーズバイオテクノロジー社製、Ｎ−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−３−オキソブタンアミド）（下記構造式（６）参照）、ＳＴＦ３１（サンタクルーズバイオテクノロジー社製、４−［［［［４−（１，１−ジメチルエチル）フェニル］スルホニル］アミノ］メチル］−Ｎ−３−ピリジニルベンズアミド）（下記構造式（７）参照）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＡは、グルコーストランスポーターに対する親和性が高く、試薬としての取り扱いが容易なため、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を確実に行うことができ、測定試薬の製造が容易になる点で、好ましい。また、特に光学測定において、測定を妨害することがないため、好ましい。
なお、グルコーストランスポーター阻害剤として例示した化合物（構造式（１）〜構造式（７））で示される化合物は全て天然由来化合物である。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
【化２】
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【００１９】
【化３】
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【００２０】
【化４】
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【００２１】
【化５】
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【００２２】
【化６】
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【００２３】
【化７】
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【００２４】
前記グルコーストランスポーター阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血液検体に溶解した際の濃度（血液検体中終濃度）で０．０１ｍＭ以上が好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭがより好ましい。
前記グルコーストランスポーター阻害剤の含有量又が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を確実に行うことができる。
【００２５】
＜酵素＞
前記酵素は、例えば、血液中のグルコースと反応して、グルコースから電子を引き抜く、などの役割を果たす。
前記酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が、前記反応速度及び特異性が良好である点で、好ましい。
なお、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の反応がスムーズに進むｐＨ領域（即ち、至適ｐＨ領域）は中性付近（約ｐＨ６．５〜７．０）であるが、酵素によって至適ｐＨ領域は異なる。
【００２６】
前記酵素の血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１Ｕ／μＬ以上が好ましく、４Ｕ／μＬ以上がより好ましく、８Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬが特に好ましい。
前記酵素の含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、速やかに反応を終えることができる。
【００２７】
＜メディエータ＞
前記メディエータは、例えば、（ｉ）酵素と血液中のグルコースとの反応を促進する、（ｉｉ）酵素がグルコースから引き抜いた電子を一旦受け取って色素に渡す、などの役割を果たす。
前記メディエータとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）、ＮＡＤ，ＦＡＤ、ＰＱＱ、フェリシアン化カリウム、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）が、反応性及び安定性の点で、好ましい。
【００２８】
前記メディエータの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍｏｌ％以上が好ましく、０．１ｍｏｌ％以上がより好ましく、０．３ｍｏｌ％〜３ｍｏｌ％が特に好ましい。
前記メディエータの血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭが特に好ましい。
前記メディエータの含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、速やかに反応を終えることができる。
【００２９】
＜色素＞
前記色素（還元系発色試薬）は、例えば、酵素とグルコースとの反応によって生じた電子や過酸化水素を受け取って（還元されて）発色する、などの役割を果たす。
前記色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、テトラゾリウム塩、リンモリブデンン酸ナトリウム、インディゴカルメン、ジクロロインドフェノール、レサズリン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＷＳＴ−４）等のテトラゾリウム塩が、発色スペクトル及び溶解性の点で、好ましい。
【００３０】
前記色素の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｏｌ％以上が好ましく、１５ｍｏｌ％以上がより好ましく、３０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％が特に好ましい。
前記色素の血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上がより好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭが特に好ましい。
前記色素の含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、高濃度の血糖値まで対応することができる。
【００３１】
＜極性溶媒＞
極性溶媒は、例えば、血液が入ったときに血液側にグルコーストランスポーター阻害剤（例えば、サイトカラシンＢ）を溶かし込む、などの役割を果たす。
なお、極性溶媒は、水不溶性のグルコーストランスポーター阻害剤（例えば、サイトカラシンＢ）を試薬水溶液に溶かし込むために用いられるものであるが、試薬水溶液をチップ基板上に塗布して乾燥した後も、高沸点の極性溶媒の場合は試薬中に残存する。
前記極性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタノール、エタノール、イソプロパノール、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、非プロトン性の極性溶媒を用いるのが好ましい。前記非プロトン性の極性溶媒の中でも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）が、水不溶性のグルコーストランスポーター阻害剤を効率よく溶解させることができる点で、好ましい。
【００３２】
前記極性溶媒の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血液検体に溶解した際の濃度（血液検体中終濃度）で、０．１％ｖ／ｖ以上が好ましく、０．１％ｖ／ｖ〜１．０％ｖ／ｖがより好ましく、０．５％ｖ／ｖ〜１．０％ｖ／ｖが特に好ましい。この濃度であれば、測定に悪影響を及ぼさない。
【００３３】
＜緩衝剤＞
前記緩衝剤は、例えば、試薬水溶液のｐＨを適正な範囲に調整する、などの役割を果たす。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リン酸緩衝液；３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）等のグッドバッファー；などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）が、緩衝能及び安定性が良好である点で、好ましい。
【００３４】
前記緩衝剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血液検体に溶解した際の濃度（血液検体中終濃度）で、５０ｍＭが好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましく、２００ｍＭ〜５００ｍＭが特に好ましい。
【００３５】
（血糖値測定チップ）
以下、本発明に係る血糖値測定チップを詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施形態に係る血糖値測定チップを示す平面図である。また、図２は、図１における線Ｉ−Ｉに沿った断面図である。
【００３６】
図１及び図２に示すように、本実施形態における血糖値測定チップ１００は、供給口１０と、流路２０と、試薬層３０と、を備え、後述する血糖値測定装置に装着可能である。
以下、本実施形態における血糖値測定チップ１００の各部材及び各部材により構成される特徴部の詳細について説明する。
【００３７】
＜＜供給口１０、流路２０、及び試薬層３０＞＞
図１及び図２に示すように、血糖値測定チップ１００は、底面部を形成する第１基材１と、天面部を形成する第２基材２と、これらの第１基材１及び第２基材２の間に、且つ、チップ厚み方向に対して直交する幅方向の両端に設けられた接着部３，４とを備える。
このように、接着部３，４において、第１基材１及び第２基材２の間に任意の厚みを有するスペーサ（図には示していない）を挟んだまま、第１基材１及び第２基材２を接着させることで、第１基材１と第２基材２との間に所定の大きさの空隙が形成される。この所定の大きさの空隙が、供給口１０が一端に形成された流路２０となり、血液を血糖値測定チップ１００内に流入することができる。さらに、流路２０内には、試薬層３０が設けられている。図１及び図２では、試薬層３０は、第１基材１上に形成されているが、これに限定されるものではなく、流路２０を閉塞することなく、流路２０内に設けられていればよい。
【００３８】
第１基材１の材質としては、特に制限はなく、目的（光の照射・受光）に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタアクリレート、ポリスチレン、環状ポリオレフィン、環状オレフィンコポリマー、ポリカーボネート等の透明な有機樹脂材料；ガラス、石英等の透明性な無機材料；などが挙げられる。
【００３９】
第２基材２の材質としては、特に制限はなく、目的（光の照射・受光）に応じて適宜選択することができ、例えば、親水処理ポリエステルフィルム等の透明な有機樹脂材料、などが挙げられる。
【００４０】
接着部３，４の厚みは、流路２０のチップ厚み方向の距離を所望の値にするために、適宜調整される。例えば、第１基材と第２基材との間に任意の厚みを有するスペーサを配置してから接着あるいは融着したり、第１基材と第２基材を接着させる接着部材としてスペーサの機能を兼ねる両面テープを用いてもよい。
【００４１】
−試薬層３０−
試薬層３０は、本発明に係る血糖値測定試薬からなる。
【００４２】
−試薬層３０の製造方法−
前記試薬層構造の製造方法は、少なくとも、塗布工程と、乾燥工程とを含み、必要に応じて、その他の工程を含む。
【００４３】
−−塗布工程−−
前記塗布工程は、本発明に係る血糖値測定試薬を含む塗布液を塗布する工程である。
前記塗布方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スプレー塗布法、インクジェット法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４４】
−−乾燥工程−−
前記乾燥工程は、塗布された塗布液を乾燥する工程である。
前記乾燥工程における、乾燥温度及び乾燥時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
（血糖値測定装置セット）
次に、本発明の一実施形態としての血糖値測定装置セットについて説明する。
本発明の一実施形態としての血糖値測定装置セットは、上述した血糖値測定チップと、該血糖値測定チップが装着され、血液中のグルコース成分を測定する血糖値測定装置とを備える。
以下、血液と血糖値測定試薬（発色試薬）との反応物を透過した光を測定する透過型の血糖値測定装置を備える血糖値測定装置セットについて説明するが、本発明は、これに限定されるものでなく、例えば、前記反応物から反射した光を測定する反射型の血糖値測定装置を備える血糖値測定装置セットであってもよい。
【００４６】
図３は本発明の一実施形態に係る血糖値測定装置セット５００を示す。血糖値測定装置セット５００は、血糖値測定装置１１０と、血糖値測定チップ１００と、を備えている。当該血糖値測定チップ１００は血糖値測定装置１１０の先端部に装着される。血糖値測定装置１１０は、測定結果や操作内容、などを表示するディスプレー１１１と、血糖値測定装置１１０の起動と終了を指示する電源ボタン１１２と、操作ボタン１１３と、血糖値測定チップ１００を取り外す取外レバー１１４と、を備えている。ディスプレー１１１は、液晶またはＬＥＤ等で構成される。
【００４７】
図４は血糖値測定装置セット５００の血糖値測定装置１１０の先端部と血糖値測定チップ１００を別々に示す縦断面図である。血糖値測定装置１１０に血糖値測定チップ１００を装着するため、血糖値測定装置１１０の先端に開口部２１が形成された装着部２２を設け、血糖値測定装置１１０の内部に血糖値測定チップ１００を装着する装着孔２３を区画する。また、血糖値測定装置１１０の内部には、血糖値測定チップ１００に採取した血液のグルコース成分（血糖値）を測定するための光学測定部２４を設ける。また、血糖値測定装置１１０は、測定光から得られる信号を処理し血糖値を算出する処理部２５と、取外レバー１１４（図３）と連動し血糖値測定チップ１００を取り外すイジェクトピン２６と、を備えている。以下、各構成について説明する。
【００４８】
測定の際は血糖値測定チップ１００が装着孔２３に装着される。装着作業はユーザーにより手作業で行われる。図示はしないが、手作業より生ずる装着位置のバラツキを最小限にするために、好ましくは、血糖値測定チップ１００を装着孔２３内の所定位置に固定するための適当なロック機構等を設置する。
【００４９】
光学測定部２４は、血糖値測定試薬（発色試薬）と血液との反応物に光を照射する照射部３１と、反応物を透過した光を測定光として受光する受光部３２と、を備えている。本実施形態では、照射部３１には、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いるが、ハロゲンランプ、レーザー等であってもよい。受光部３２には、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）を用いる。受光部３２は受光した光を所定の信号に変換できるものであればよく、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等であってもよい。
【００５０】
本実施形態では、照射部３１は、第１の波長を有する光を発する第１の発光素子５１と、第１の波長と異なる第２の波長を有する光を発する第２の発光素子５２とを含む。ここで、第１の波長は、血糖量に応じた発色度合を検出するための波長であり、例えば６００〜９００ｎｍの波長帯にある。第２の波長は、血液中の赤血球濃度を検出するための波長であり、例えば５１０〜５９０ｎｍの波長帯にある。
【００５１】
照射部３１と受光部３２の配置および両者の位置関係を説明する。血糖値測定装置１１０の内部には、第１の空間４１と第２の空間４２とが形成されている。照射部３１は当該第１の空間４１に、受光部３２は当該第２の空間４２に、それぞれ配置されている。血糖値測定チップ１００が血糖値測定装置１１０に装着されていない状態では、当該第１の空間４１と、当該第２の空間４２とは、装着孔２３を挟んで対向する（図４参照）。血糖値測定チップ１００が血糖値測定装置１１０に装着された状態では、当該第１の空間４１と、当該第２の空間４２とは、当該血糖値測定チップ１００上の試薬層３０が保持されている位置を挟んで対向する。なお、照射光３３のエネルギーロスを少なくするために、照射部３１は、照射光３３が血糖値測定チップ１００の底面に垂直に照射できる位置に配置されるのが好ましい。
【００５２】
図示はしないが、照射部３１に白色を照射するハロゲンランプを用いる場合は、特定の波長のみを照射光３３として抽出するために分光フィルタを設ける方法であってもよい。また、低エネルギーの照射で有効に実施するために、集光レンズを備える方法も好適である。
【００５３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
（実験例１）
＜血液検体の調製＞
血液（全血）に、高濃度のグルコース溶液（４０ｇ／ｄＬ）を添加して、（ｉ）グルコース濃度（ＢＧ）が１００ｍｇ／ｄＬ、ヘマトクリット値（Ｈｔ）が４０、及び、（ｉｉ）グルコース濃度（ＢＧ）が４００ｍｇ／ｄＬ、ヘマトクリット値（Ｈｔ）が４０、の２種類の第１血液検体を調製した。調製した第１血液検体について、遠心分離機（製造会社名：株式会社久保田製作所、商品名：テーブルトップ冷却遠心機  型式２８００）を用いて血漿のみを取り出し、グルコローダー（製造会社名：株式会社エイアンドティー、商品名：グルコース自動分析装置ＧＡ０５）で血漿グルコース値を測定した。測定結果を表１における「イニシャル」として示す。
上記２種類の第１血液検体のそれぞれに対して、サイトカラシンＢ（和光純薬株式会社製）を、サイトカラシンＢの血液検体中終濃度（ｆ．ｃ）が１２．５μＭ又は１２５μＭとなるように添加して、４種類の第２血液検体を調製した。
【００５５】
＜ＧＬＵＴ１の不活性化実験１＞
２種類の第１血液検体及び４種類の第２血液検体に、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、塩化ナトリウムの濃度が５質量％（血液検体中終濃度ｆ．ｃ）となるように添加し、その後、遠心分離機（製造会社名：株式会社久保田製作所、商品名：テーブルトップ冷却遠心機  型式２８００）を用いて血漿のみを取り出し、グルコローダー（製造会社名：株式会社エイアンドティー、商品名：グルコース自動分析装置ＧＡ０５）で血漿グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）を測定した。それぞれの測定結果を表１における「コントロール」（２種類の第１血液検体）、「ＣｙＢ１２．５μＭ」（２種類の第２血液検体）、「ＣｙＢ１２５μＭ」（２種類の第２血液検体）として示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
サイトカラシンＢ（ＣｙＢ）を添加していない第１血液検体（コントロール）では、第１血液検体に塩化ナトリウムを添加すると、赤血球は、浸透圧差によって水分を放出し、血漿中のグルコース濃度が十分に低下するはずである。しかしながら、赤血球が浸透圧差によって水分を放出すると、赤血球内のグルコースが濃縮されるので、赤血球内外で濃度勾配差が生じ、赤血球内から血漿にグルコースが流出し、血漿グルコース濃度があまり低下しなかった（イニシャルとコントロールとの差が、ＢＧ１００において６であり、ＢＧ４００において７６であった）。
一方、サイトカラシンＢ（ＣｙＢ）を添加した第２血液検体（ＣｙＢ１２．５μＭ又はＣｙＢ１２５μＭ）では、グルコースの赤血球から血漿への流出が抑制されているため、血漿グルコース濃度が十分に低下した(イニシャルとＣｙＢ１２．５μＭとの差が、ＢＧ１００において１６であり、ＢＧ４００において８８であり、イニシャルとＣｙＢ１２５μＭとの差が、ＢＧ１００において２７であり、ＢＧ４００において１０４である）。
【００５８】
＜ＧＬＵＴ１の不活性化実験２＞
＜＜チップの作製＞＞
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（製造会社名：東レ株式会社、商品名：ルミラーＴ６０、厚み１８８μｍ）にスペーサ及び接着部としての両面テープ（製造会社名：３Ｍ社、商品名：ポリエステルフィルム基材、両面粘着テープ９９６５、厚み：８０μｍ）を挟んだまま、材質が親水処理ポリエステルフィルム（製造会社名：３Ｍ社、商品名：親水処理ポリエステルフィルム９９０１Ｐ、厚み：１００μｍ）であるカバーフィルムを装着して、チップを作製した。
【００５９】
＜＜検体点着後の吸光度測定＞＞
（ｉ）グルコース濃度（ＢＧ）が１００ｍｇ／ｄＬ、ヘマトクリット値（Ｈｔ）が４０の第１血液検体３ｍｍ3と、（ｉｉ）該第１血液検体に対してサイトカラシンＢ（和光純薬株式会社製）を、サイトカラシンＢの血液検体中終濃度（ｆ．ｃ）が１２．５μＭとなるように添加して調製した第２血液検体３ｍｍ3とを、それぞれ、作製したチップに点着し、紫外可視分光光度計を用いて吸光度測定（６５０ｎｍ）を行った。結果を図５に示す。
なお、図５は、チップに２種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体（「ｃｏｎｔ−ＢＧ１００」）及びサイトカラシンＢを添加した血液検体（「ＣｙＢ−ＢＧ１００」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ＡＢＳ）を、横軸は点着後の時間（ｍｓｅｃ：ミリセコンド）を示す。
【００６０】
図５において、サイトカラシンＢを添加していない第１血液検体の測定結果（ｃｏｎｔ−ＢＧ１００）においては、まず、血漿中のグルコースが一気に反応して（消費されて）、吸光度（ＡＢＳ）が急激に上昇する。血漿中のグルコースの反応が終了した後、赤血球と血漿との間のグルコース濃度勾配により、赤血球から血漿へグルコースが放出されて、吸光度（ＡＢＳ）が徐々に上昇する。
一方、サイトカラシンＢを添加した第２血液検体の測定結果（ＣｙＢ−ＢＧ１００）においては、まず、血漿中のグルコースが一気に反応して（消費されて）、吸光度（ＡＢＳ）が急激に上昇する。その後、吸光度（ＡＢＳ）グラフがほぼフラットな状態となる。このグラフ挙動から、サイトカラシンＢを添加することにより、特に、反応時間が所定値以上の部分に影響する赤血球から血漿へのグルコース放出を抑制することができたことが分かる。これにより、赤血球から流出するグルコースの影響を低減した、精度の良い血糖値（血漿中のグルコース濃度）測定が行うことが可能となる。
【００６１】
（比較例１）
＜試薬水溶液の調製＞
まず、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、東洋紡株式会社製）４Ｕ／μＬと、メディエータとしての１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ、株式会社同仁化学研究所製）１ｍＭと、色素としての２−ベンゾ−チアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−〔４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル〕−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４、株式会社同仁化学研究所製）１００ｍＭと、および１，３−ベンゼンスルホン酸二ナトリウム３００ｍＭを含む試薬水溶液（ｐＨ６．５）を調製した。
【００６２】
＜試薬付チップの作製＞
調製した試薬水溶液を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（製造会社名：東レ株式会社、商品名：ルミラーＴ６０、厚み１８８μｍ）上に試薬水溶液を塗布して試薬層（膜厚２０μｍ）を形成し、２５℃で１０分間乾燥した。乾燥後、試薬層が形成されたＰＥＴフィルムにスペーサ及び接着部としての両面テープ（製造会社名：３Ｍ社、商品名：ポリエステルフィルム基材、両面粘着テープ９９６５、厚み：８０μｍ）を挟んだまま、材質が親水処理ポリエステルフィルム（製造会社名：３Ｍ社、商品名：親水処理ポリエステルフィルム９９０１Ｐ、厚み：１００μｍ）であるカバーフィルムを装着して、試薬付測定チップを作製した。
なお、形成された試薬層における試薬において、酵素としてのＧＤＨは、血液検体反応時の濃度が４Ｕ／μＬであり、メディエータとしてのｍＰＭＳは、血液検体反応時の濃度が１ｍＭであり、色素としてのＷＳＴ−４は、血液検体反応時の濃度が１００ｍＭである。
【００６３】
＜＜検体点着後の吸光度測定＞＞
（ｉ）グルコース濃度（ＢＧ）が１００ｍｇ／ｄＬ、ヘマトクリット値（Ｈｔ）が４０の第１血液検体（２検体）３ｍｍ3と、（ｉｉ）該第１血液検体に対してサイトカラシンＢ（和光純薬株式会社製）を、サイトカラシンＢの血液検体中終濃度（ｆ．ｃ）が１２．５μＭとなるように添加して調製した第２血液検体（２検体）３ｍｍ3とを、それぞれ、作製した試薬付チップに点着し、紫外可視分光光度計を用いて吸光度測定（６５０ｎｍ−８１０ｎｍ）を行った。結果を図６に示す。
なお、図６は、サイトカラシンＢを添加していない試薬を有するチップに４種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００」及び「検体２−ＢＧ１００」）、並びに、サイトカラシンＢを添加した血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」及び「検体２−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を、横軸は点着後の時間（秒）を示す。
【００６４】
（実施例１）
＜試薬水溶液の調製＞
まず、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、東洋紡株式会社製）４Ｕ／μＬと、メディエータとしての１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ、株式会社同仁化学研究所製）１ｍＭと、色素としての２−ベンゾ−チアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−〔４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル〕−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４、株式会社同仁化学研究所製）１００ｍＭと、１，３−ベンゼンスルホン酸二ナトリウム３００ｍＭと、サイトカラシンＢ  １２５μＭと、ＤＭＳＯ  ０．５％ｖ／ｖと、を含む試薬水溶液（ｐＨ６．５）を調製した。
【００６５】
＜試薬付チップの作製＞
調製した試薬水溶液を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（製造会社名：東レ株式会社、商品名：ルミラーＴ６０、厚み１８８μｍ）上に試薬水溶液を塗布して試薬層（膜厚２０μｍ）を形成し、２５℃で１０分間乾燥した。乾燥後、試薬層が形成されたＰＥＴフィルムにスペーサ及び接着部としての両面テープ（製造会社名：３Ｍ社、商品名：ポリエステルフィルム基材、両面粘着テープ９９６５、厚み：８０μｍ）を挟んだまま、材質が親水処理ポリエステルフィルム（製造会社名：３Ｍ社、商品名：親水処理ポリエステルフィルム９９０１Ｐ、厚み：１００μｍ）であるカバーフィルムを装着し、試薬付測定チップを作製した。
なお、形成された試薬層における試薬において、酵素としてのＧＤＨは、血液検体反応時の濃度が４Ｕ／μLであり、メディエータとしてのｍＰＭＳは、血液検体反応時の濃度が１ｍＭであり、色素としてのＷＳＴ−４は、血液検体反応時の濃度が１００ｍＭであり、グルコーストランスポーター阻害剤としてのサイトカラシンＢは、血液検体反応時の濃度が１２５μＭである。
【００６６】
＜＜検体点着後の吸光度測定＞＞
（ｉ）グルコース濃度（ＢＧ）が１００ｍｇ／ｄＬ、ヘマトクリット値（Ｈｔ）が４０の第１血液検体（２検体）３ｍｍ3と、（ｉｉ）該第１血液検体に対してサイトカラシンＢ（和光純薬株式会社製）を、サイトカラシンＢの血液検体中終濃度（ｆ．ｃ）が１２．５μＭとなるように添加して調製した第２血液検体（２検体）３ｍｍ3とを、それぞれ、作製した試薬付チップに点着し、紫外可視分光光度計を用いて吸光度測定（６５０ｎｍ−８１０ｎｍ）を行った。結果を図７に示す。
なお、図７は、サイトカラシンＢを添加した試薬を有するチップに４種の血液検体（サイトカラシンＢを添加していない血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００」及び「検体２−ＢＧ１００」）、並びに、サイトカラシンＢを添加した血液検体２種（「検体１−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」及び「検体２−ＢＧ１００＋ＣｙＢ」））の各々を点着した際における発色速度を示すグラフ（即ち、タイムコース）であり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を、横軸は点着後の時間（秒）を示す。
【００６７】
図８は、サイトカラシンＢを添加していないチップを用いた場合（「ｃｏｎｔ」）における「サイトカラシンＢを添加していない血液検体とサイトカラシンＢを添加した血液検体との発色量との差分」と、サイトカラシンＢを添加したチップを用いた場合（「ＣｙＢ混」）における「サイトカラシンＢを添加していない血液検体とサイトカラシンＢを添加した血液検体との発色量との差分」と、を示すグラフである。
図８より、試薬中にサイトカラシンＢが含まれていれば、血液検体中にサイトカラシンＢが含まれているか否かにかかわらず、血漿グルコース量を精度よく測定できることが分かった。また、赤血球から血漿へのグルコース流出には検体差があり、この検体差は、測定精度に悪影響を与えるものではあるが、赤血球から血漿へのグルコース流出を低減させることにより、検体差の測定精度への悪影響を低減することができた。
なお、図６〜図８において、下記式（１）〜式（４）が成り立つ。
（Ｃ−Ａ）−（Ｄ−Ｂ）＝Ｘ：式（１）
（Ｇ−Ｅ）−（Ｈ−Ｆ）＝Ｙ：式（２）
（Ｃ’−Ａ’）−（Ｄ’−Ｂ’）＝Ｘ’：式（３）
（Ｇ’−Ｅ’）−（Ｈ’−Ｆ’）＝Ｙ’：式（４）
【００６８】
グルコーストランスポーター阻害剤を含む血糖値測定試薬を用いた実施例１と、グルコーストランスポーター阻害剤を含む血糖値測定試薬を用いていない比較例１とを比較することにより、グルコーストランスポーター阻害剤を含む血糖値測定試薬を用いることで、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関し、特に、溶血剤を用いない全血を検体とした血糖値測定において、より精度の高い血糖値測定を行うことができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関する。
【符号の説明】
【００７０】
１：第１基材
２：第２基材
３：接着部
４：接着部
１０：供給口
２０：流路
２１：開口部
２２：装着部
２３：装着孔
２４：光学測定部
２５：処理部
２６：イジェクトピン
３０：試薬層
３１：照射部
３２：受光部
３３：照射光
４１：第１の空間
４２：第２の空間
５１：第１の発光素子
５２：第２の発光素子
１００：血糖値測定チップ
１１０：血糖値測定装置
１１１：ディスプレー
１１２：電源ボタン
１１３：操作ボタン
１１４：取外レバー
５００：血糖値測定装置セット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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