(57)【要約】【課題】本発明は、藻類に貯蔵される油脂の蓄積量を増加させる方法および油脂の蓄積量が増加した藻類の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、非ストレス培養条件下の定常期においてTAGを合成する藻類細胞であって、該藻類細胞内においてPDATを過剰発現可能な状態にした藻類細胞である。さらに、当該藻類細胞を用いて、より多くのTAGを蓄積させる方法に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ストレス培養条件下の定常期においてTAGを合成する藻類細胞であって、該藻類細胞内においてPDATを過剰発現可能な状態にした藻類細胞。
【請求項２】
前記PDATが外来性であることを特徴とする請求項１に記載の藻類細胞。
【請求項３】
前記PDATが下記の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の藻類細胞。
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
外来性のPDATをコードする核酸を導入して、PDATを過剰発現可能な状態にすることを特徴とする請求項２または３に記載の藻類細胞。
【請求項５】
前記PDATをコードする核酸が下記の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードするDNAであることを特徴とする請求項４に記載の藻類細胞。
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
前記PDATをコードする核酸が、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAであることを特徴とする請求項４に記載の藻類細胞。
【請求項７】
前記藻類が、クラミドモナス・アシンメトリカ（Chlamydomonas asymmetrica）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、ギムノディニウム・サングイナム（Gymnodinium sanguineum）、パリエトクロリス・インシサ（Parietochloris incisa）であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の藻類細胞。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の藻類細胞を、非ストレス培養条件下で定常期まで培養し、該細胞内にTAGを蓄積させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類に貯蔵される油脂、特に、トリアシルグリセロールの蓄積量を増加させる方法および油脂（特に、トリアシルグリセロール）の蓄積量が増加した藻類に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化や化石燃料の枯渇、さらには、原子力エネルギーの利用における危険性が現実となってきた今日において、安全かつクリーンな再生可能エネルギーの利用が注目されている。化石燃料等を使用せずに太陽光や風力を利用してエネルギーを生み出す方法に加え、バイオマスを利用する方法も、現在のエネルギー問題を解決するための手段として重要である。
【０００３】
藻類は様々な環境ストレスに応答して細胞内に油脂を蓄積する。油脂は、細胞質中に脂肪滴（lipid droplet、LD）という細胞内小器官に蓄積され、その95%以上がトリアシルグリセロール（TAG；triacylglycerol）で構成される。TAGはバイオ燃料の原料として注目されている。藻類は陸上植物と較べ、油脂を蓄積する上で、生育が早い、単位面積当たりの油脂蓄積量が多い、食料と競合しない、などの利点があり、クラミドモナス（Chlamydomonas）、クロレラ（Chlorella）、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）などのモデル藻類を利用した油脂の増産が広く試みられている（非特許文献１）。
緑藻クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）は、土壌や淡水に生息して光合成をおこなう単細胞の真核生物である。窒素や硫黄などの欠乏条件、強光、塩など様々なストレスに応答して細胞内に多量の油脂を蓄積する。世代交代時間が8時間と早く、ドラフトゲノムも決定されているため、藻類のモデル生物として脂質合成系の解明に用いられている。
【０００４】
クラミドモナス・レインハーディは、窒素欠乏条件ではチラコイド膜を分解しTAGを合成するため、細胞分裂が止まってしまう。一方、リン酸欠乏条件ではチラコイド膜を保持したままTAGを合成するため、細胞分裂活性が維持される。このため、細胞当たりのTAG含量は窒素欠乏条件において多くなるが、培養液当たりの、TAG蓄積量は細胞分裂を行えるリン酸欠乏条件のほうが多い（非特許文献２）。従って、細胞分裂活性が維持されるリン酸欠乏条件におけるTAG含量をさらに増加させることができれば、藻類によるTAGの新たな工業的生産方法として期待される。
また、窒素欠乏条件やリン酸欠乏条件などのストレス条件にすることなく、TAG含量を増大させることができれば、培地を変更する手間を省くことができ、藻類を利用したTAGの生産の効率化を図ることが可能となる。
しかしながら、現在のところ、上記のような改善された方法は見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Huら, Plant J. 54, 621-639 2008.
【非特許文献２】Iwaiら, Plant Biotechnol. 12, 808-819 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、藻類のTAG含量を増加させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
通常条件下の定常期および栄養欠乏条件下でTAGを蓄積することができる藻類の１つにクラミドモナス・アシンメトリカ（Chlamydomonas asymmetrica）がある。上述のように、通常条件下の定常期においてTAGの合成量を増加させることができれば、藻類による効率的なTAGの合成が期待できる。そこで、発明者らは、クラミドモナス・アシンメトリカを定常期にTAGを合成する藻類の代表として選択し、クラミドモナス・アシンメトリカにおけるTAG合成系を増強させる方法につき鋭意研究を行った。
発明者らは、ジアシルグリセロール（DAG）に脂肪酸を付加してTAGを合成することが知られている、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（PDAT; Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase）をクラミドモナス・アシンメトリカ細胞内で過剰発現させたところ、通常条件下の定常期において、コントロールの細胞（PDATを発現していない細胞）と比較して、有意にTAG含有量が増加することを見出した。
以上の知見に基づき、本発明は完成された。
【０００８】
したがって、本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）非ストレス培養条件下の定常期においてTAGを合成する藻類細胞であって、該藻類細胞内においてPDATを過剰発現可能な状態にした藻類細胞。
（２）前記PDATが外来性であることを特徴とする上記（１）に記載の藻類細胞。
（３）前記PDATが下記の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質であることを特徴とする上記（２）に記載の藻類細胞。
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（４）外来性のPDATをコードする核酸を導入して、PDATを過剰発現可能な状態にすることを特徴とする上記（２）または（３）に記載の藻類細胞。
（５）前記PDATをコードする核酸が下記の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードするDNAであることを特徴とする上記（４）に記載の藻類細胞。
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（６）前記PDATをコードする核酸が、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAであることを特徴とする上記（４）に記載の藻類細胞。
（７）前記藻類が、クラミドモナス・アシンメトリカ（Chlamydomonas asymmetrica）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、ギムノディニウム・サングイナム（Gymnodinium sanguineum）、パリエトクロリス・インシサ（Parietochloris incisa）であることを特徴とする上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の藻類細胞。
（８）上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の藻類細胞を、非ストレス培養条件下で定常期まで培養し、該細胞内にTAGを蓄積させる方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、藻類の通常条件の培養下における定常期において、TAGの蓄積量を増加させることが可能となる。その結果、窒素欠乏条件などのストレス条件用の培地などに変更する必要がなく、効率的にTAGの蓄積量を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】クラミドモナス・アシンメトリカの生育過程の観察結果。（Ａ）クラミドモナス・アシンメトリカを通常条件（上図）、窒素欠乏条件（下図◆）およびリン酸欠乏条件（下図■）で培養した場合の、細胞の生育状況を確認した。（Ｂ）各培養条件の各時点における脂質の蓄積状態をNile red染色で確認した。”Chlorophyll”は、葉緑体自家蛍光をCy5フィルターを用いて確認した結果である。LOG；対数増殖期、通常条件13日目、STA；定常期、通常条件43日目、-N；窒素欠乏条件9日目、-P；リン欠乏条件30日目
【図２】脂質含量を測定した結果。（Ａ）培養液1 mlあたりのTAGの量。（Ｂ）1細胞あたりのTAGの量。（Ｃ）1細胞あたりのリン脂質の量。（Ｄ）1細胞あたりのグリセロ脂質の量。PC；ホスファチジルコリン、PE；ホスファチジルエタノールアミン、PI；ホスファチジルイノシトール、PG；ホスファチジルグリセロール、MGDG；モノガラクトシルジアシルグリセロース、DGDG；ジガラクトシルジアシルグリセロール、DGTS；ジアシルグリセロールN,N,N-トリメチルホモセリン、SQDG；スルホキノボシルジアシルグリセロール
【図３】TAGの脂肪酸組成の分析結果。
【図４】AtPDAT1Crを発現するクラミドモナス・アシンメトリカの生育状態と脂質の蓄積状態の確認結果。（Ａ）AtPDAT1Crを導入した細胞における、PDAT1の発現をRT-PCRで確認した。EV；empty vector（Ｂ）EVを導入したクラミドモナス・アシンメトリカとAtPDAT1Crを導入したクラミドモナス・アシンメトリカの生育状態を調べた結果である。（Ｃ）EVを導入したクラミドモナス・アシンメトリカとAtPDAT1Crを導入したクラミドモナス・アシンメトリカの脂質の蓄積状態をNile red染色で確認した。”Chlorophyll”は、葉緑体自家蛍光をCy5フィルターを用いて確認した結果である。
【図５】AtPDAT1Crを発現するクラミドモナス・アシンメトリカの脂質の分析結果。（Ａ）AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカに蓄積されるTAGの細胞あたりの含量を調べた結果である。（Ｂ）AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカに蓄積されるTAGの培養液あたりの含量を調べた結果である。（Ｃ）AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカに蓄積されるグリセロ脂質の分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の実施形態は、非ストレス培養条件下の定常期において TAGを合成する藻類であって、該藻類細胞内においてPDATを発現可能（特に、過剰発現可能）な状態にした藻類細胞である。
ここで、「非ストレス培養条件」とは、窒素欠乏状態、リン酸欠乏状態あるいは通常の培養条件よりも高い温度もしくは低い温度で培養するなどの藻類にストレスを与えるような培養条件ではなく、いわゆる、藻類を培養する際に通常使用される条件（通常条件）のことである。非ストレス培養条件は、培養対象の藻類によって異なるものであるが、当業者であれば容易に設定することが可能であり、例えば、HUSCAP Journals 第67巻(2009-03-31)、もしくは国立環境研究所のWeb サイト、藻類培養法http://mcc.nies.go.jp/method/method_j.html;jsessionid=16A2D678D65DF4A1801BEB867564などが参考になる。具体的には、例えば、クラミドモナス属を培養する場合には、C培地、Tris acetate-phosphate（TAP）培地、modified Bristol’s medium（MBM）培地等で、温度は、１５℃〜２５℃、好ましくは、２０℃程度である。クラミドモナス・アシンメトリカを通常培養する場合の培地の例として、表１にその組成を示す（実施例の箇所を参照のこと）。
【００１２】
また、「定常期」とは、藻類の培養において、藻類（細胞）の数と培養時間の関係を表現した「増殖曲線」の区分の一つで、増殖する藻類（細胞）と死滅する藻類（細胞）が平衡状態にあるため、それ以上見かけ上の藻類（細胞）が増えず、一定の値を保ち続ける期間のことである。静止期とも言う。非ストレス培養条件下の定常期において TAGを合成する藻類には、既知の藻類以外にも、今後このような性質（すなわち、非ストレス培養条件下の定常期において TAGを合成すること）を見出される藻類も含まれる。既知の藻類としては、例えば、明細書の実施例において記載されるクラミドモナス属のクラミドモナス・アシンメトリカ（Chlamydomonas asymmetrica）の他、クラミドモナス属のクラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、ギムノディニウム属のギムノディニウム・サングイナム（Gymnodinium sanguineum）、パリエトクロリス属のパリエトクロリス・インシサ（Parietochloris incisa）などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
「PDAT（Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase）とは、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのことで、リン脂質をアシル供与体として脂肪酸転移反応を触媒する活性（以下、「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」とする）を有する酵素のことである。本発明の実施形態で使用するPDATはいかなる由来のものであってもよい。ここでPDATの例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるシロイヌナズナ由来PDAT1の他、配列番号４（クラミドモナス・レインハーディ由来PDAT、遺伝子配列は配列番号５）、配列番号６（緑藻類Coccomyxa subellipsoidea 由来PDAT、遺伝子配列は配列番号７）、配列番号８（トウゴマ（Ricinus communis）由来PDAT、遺伝子配列は配列番号９）、配列番号１０（ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa FPsc）由来PDAT、遺伝子配列は配列番号１１）、配列番号１２（ダイズ（Glycine max）由来PDAT、遺伝子配列は配列番号１３）、配列番号１４（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来PDAT、遺伝子配列は配列番号１５）などが使用可能である。
また、本発明の実施形態においては、「実質的にPDATと同一のタンパク質」も「PDAT」として使用可能である。ここで、「実質的にPDATと同一のタンパク質」とは、PDATのアミノ酸配列として公知となっているアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸（好ましくは、１〜９個のアミノ酸、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸、さらに好ましくは、１〜３個のアミノ酸）が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のことである。例えば、シロイヌナズナ由来の「PDAT」と実質的に同一の「PDAT」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸（好ましくは、１〜９個のアミノ酸、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸、さらに好ましくは、１〜３個のアミノ酸）が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のことである。
上記アミノ酸の置換、欠失、挿入および付加は、ポリペプチドをコードする天然由来の核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。当該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公知の方法、または、それらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１４】
あるいは、「実質的にPDATと同一のタンパク質」とは、PDATのアミノ酸配列として公知となっているアミノ酸配列と、約70%以上、好ましくは約80%以上、約81%以上、約82%以上、約83%以上、約84%以上、約85%以上、約86%以上、約87%以上、約88%以上、約89%以上、より好ましくは約90%以上、約91%以上、約92%以上、約93%以上、約94%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、最も好ましくは約99%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のことである。例えば、シロイヌナズナ由来の「PDAT」と実質的に同一の「PDAT」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、約70%以上、好ましくは約80%以上、約81%以上、約82%以上、約83%以上、約84%以上、約85%以上、約86%以上、約87%以上、約88%以上、約89%以上、より好ましくは約90%以上、約91%以上、約92%以上、約93%以上、約94%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、最も好ましくは約99%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のことである。
【００１５】
藻類細胞内においてPDATを過剰発現可能な状態にすることは、当業者であれば容易に実施することができる。「過剰発現可能な状態」とは、使用する藻類細胞にPDATが存在する場合には、野生型の該藻類細胞内で発現しているPDATの量よりも有意に多く発現することが可能な状態のことであり、使用する藻類細胞にPDATが存在しない場合には、外来性のPDAT遺伝子等を該藻類細胞内に導入し、発現可能な状態にすることである。また、「過剰発現可能な状態」とは、すでにPDATが藻類細胞内において過剰発現している状態の他、プロモーター活性等を誘導すればPDATの発現が可能である状態を含む。
使用する藻類細胞にPDATが存在する場合、内在性PDAT遺伝子の発現量を公知の方法（例えば、プロモーターをより強力なものに置換するなど）によって増大させたり、PDAT遺伝子をさらに藻類細胞内に導入するなどの方法により、野生型に比べてPDATを有意に多く発現させることが可能である。
使用する藻類細胞にPDATが存在しない場合には、使用する藻類細胞に適したプロモーター（構成型および誘導型）等を含む発現用ベクターに、外来性（他の生物由来）のPDAT遺伝子（PDATをコードするDNA等）を挿入し、該藻類細胞に導入することで、PDATを過剰発現可能な状態にすることができる。藻類用の発現ベクターとしては、限定はしないが、例えば、pChlamyシリーズのベクター（Invitrogen社）、pOptシリーズのベクター(Chlamydomonas resource center)などを挙げることができる。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号２の塩基配列からなるDNA）を藻類細胞へ導入する場合、該DNAをプロモーター等との関係において、発現可能となるような位置関係で、発現ベクターに挿入する。
藻類細胞内での発現ベクターには、発現用途に適したプロモーター、例えば、HSP70A/RbcS2、beta-tubulin、PSAD、CaMV 35S、NIT1、Cyc6、SQD2などの過剰発現用プロモーターが含まれていることが望ましい。また、発現ベクターには、3’UTR、ターミネーターおよび選択マーカーなど、目的ポリペプチドの発現および発現株の選択に必要な構成要素が含まれていることが望ましい。選択マーカーとしては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Aph7’）、パロモマイシン耐性遺伝子(AphVIII)、ゼオシン耐性遺伝子(BLE)、スペクチノマイシン耐性遺伝子(aadA)およびエメシン耐性遺伝子(CRY1-1)などを使用することができる。
藻類細胞への発現ベクターの導入は、公知の方法によって行うことができ、例えば、エレクトロポレーション法、ボンバードメント法、グラスビーズ法およびアグロバクテリウム法などにより行うことができる。
【００１６】
本発明の実施形態において使用できる外来性のPDATをコードする核酸としては、例えば、シロイヌナズナ由来のPDATをコードするDNA配列を、用いる藻類において使用頻度の高いコドンに変更した塩基配列からなるDNAなどが望ましい。シロイヌナズナ由来のPDATをコードするDNA配列を、例えば、クラミドモナス・アシンメトリカにおいて使用頻度の高いコドンに変更した塩基配列として、配列番号２で表される塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
【００１７】
本発明の第２の実施形態は、本発明の第１の実施形態に記載の藻類細胞を、非ストレス培養条件下（通常培養条件下）で定常期まで培養し、該細胞内にTAGを蓄積させる方法である。
本発明の第２の実施形態において藻類細胞内に蓄積されたTAGは、公知の方法で容易に抽出することができる。例えば、TAGを藻類細胞から抽出液を調製し、その抽出液から有機溶媒によって脂質を抽出し、有機溶媒を除去したのち、得られた総脂質から適当な分離方法（例えば、薄層クロマトグラフィー（TLC）法）により、目的のTAGを分離することができる。
有機溶媒による抽出過程は、例えば、Bligh-Dyer抽出法（EG Bligh, WJ Dyer (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 137(8): 911-917）などにより行うことができる。
また、工業的な分離方法については、例えば、Journal of Microbilogical Methods 94:235-244, 2013、または、アメリカエネルギー省のロードマップ、"Energy Efficiency & Renewable energy, BIOMASS PROGRAM May 2010などに記載されている。
【００１８】
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
本実施例においては、クラミドモナス・アシンメトリカにシロイヌナズナ由来のPDATを発現させ、蓄積されるTAG含量を調べた。
【実施例】
【００１９】
１．実験方法
１−１．クラミドモナスのストレインの入手と培養条件
C. asymmetrica NIES-2207は、国立環境研究所（National Institute for Environmental Studied）から取得した。温度20℃、明期／暗期＝14時間／10時間、光強度30μmol m-2 s-1の条件のインキュベーター（ERB-13、荏原、東京)を使って培養した。培養に用いたC培地の組成を表１示す。
【表１】
2017192363.tif 000002
C培地からCa(NO3)2・4H2OとKNO3を除き、CaCl2とKClを終濃度がそれぞれ、0.64 mMおよび0.99 mMになるように加えたものを窒素欠乏培地（C-N培地）とした。また、C培地からβ-Na2glycerophosphateを除きNaClを終濃度0.46 mMになるように加えたものをリン酸欠乏培地（C-P培地）とした。
【００２０】
１−２．クラミドモナス・アシンメトリカの通常培養条件とストレス培養条件下での生育と脂質分析
１−２−１．クラミドモナス・アシンメトリカの通常条件および栄養ストレス条件での生育
クラミドモナス・アシンメトリカを30 mlのC培地で対数増殖期まで培養後、OD750 = 0.01になるように100 mlのC培地に植え継ぎ、温度20℃、明期／暗期=14 h／10 h、光強度30 μmol m-2 s-1の光条件のインキュベーター（ERB-13、荏原、東京）で培養した。培養は、6本のフィルターキャップ（C-40、AS ONE、大阪）でふたをした、300 ml三角フラスコで行った。このうち3本の三角フラスコを対数増殖期に回収し、残りの3本は定常期に集藻すると共に、一部は、C-N培地100 ml、3本と、C-P培地100 ml 3本にOD750値=0.25となるように植え継いだ。各株の濃度は750 nmの吸光度(Optical Density、OD750)を吸光度計（UV1800、SHIMADZU、京都）により測定した。C-N培地およびC-P培地に植え継いだ細胞を、温度20℃、明期／暗期=14 h／10 h、光強度30 μmol m-2 s-1の光条件下で培養し、生育が止まったところで回収した。通常条件培養13日目、43日目の細胞をそれぞれ対数増殖期、定常期の細胞として使用し、C-N培地での培養、9日目、C-P培地での培養30日目の細胞をそれぞれ窒素欠乏条件、リン酸欠乏条件として使用した。
【００２１】
１−２−２．クラミドモナス・アシンメトリカのNile red染色によるTAG蓄積状態の観察
対数増殖期（通常条件）、定常期（通常条件）、窒素欠乏条件、リン酸欠乏条件の各細胞培養液900 μl に、100 μl Dimethyl sulfoxide（終濃度 10 %）と中性脂質染色試薬であるNile red、1 μl (終濃度 1 μg/ml)を加え、落斜蛍光顕微鏡（ECLIPES Ti-U、Nikon、東京）で観察した。蛍光顕微鏡の条件は、Nile red蛍光をGFP-BPフィルター(excitation 480/40 nm / emission 535/50 nm)を用いてexposure 400 msで観察した。また、葉緑体自家蛍光をCy5 フィルター(excitation 620/60 nm / emission 700/75 nm)を用いてexposure 40 msで観察した。
【００２２】
１−２−３．クラミドモナス・アシンメトリカの脂質抽出
対数増殖期（通常条件）、定常期（通常条件）、窒素欠乏条件、リン酸欠乏条件の各細胞液50 mlを、ネジ口試験管に移し、遠心機（Himac CF 7D、HITACHI、東京）を用いて、1000 ×g 、20℃、15 min で遠心し、上清を捨てた。残ったペレットに合計 800μl となるよう0.6 mM Tris-HCl (pH = 7.5) を加え、懸濁した。懸濁液に 3 ml のメタノール：クロロホルム=2:1 を加え、ボルテックスとシェイクでよく懸濁した。懸濁後、Himac CF 7D（HITACHI、東京）を用いて、 900 ×g 、20℃、5 min で遠心し、上清を30 ml の遠心管に移した。その後、もとの 50 ml 遠心管に残ったペレットに 1.5 ml のメタノール：クロロホルム=2:1と 0.4 ml の水を加えてよく懸濁した。懸濁後、Himac CF 7Dを用いて、900 ×g 、20℃、5 min で遠心し、上清を先ほど一度目の上清を移した 30 ml 遠心管に移し、上清を合わせた。この上清に 1.5 ml のクロロホルムと1.5 ml の水を加え、ボルテックスで懸濁した。懸濁後、Himac CF 7Dで、 900 ×g 、20℃、7 min で遠心し、下層のクロロホルム層を新しい 30 ml の遠心管に移した。移したクロロホルム層の液に 0.9 % KCl 3 mlを加えよく懸濁した。その後、Himac CF 7Dで、 900 ×g 、20℃、10 min で遠心した。下層のクロロホルム層を、あらかじめ、デシケーターで10分乾燥させ、精密天秤で重さを測定しておいたナシ型フラスコに移した。その後、ナシ型フラスコをロータリーエバポレーター（EYELA N-1110、東京理化器械、東京）を用いてクロロホルムを除き脂質を減圧濃縮した。濃縮後にそれぞれのナシ型フラスコに少量の100 % エタノールを加え、再度ロータリーエバポレーターにより濃縮した。脂質を濃縮したナシ型フラスコを10分間、デシケーターで乾燥し、精密天秤を用いて抽出した総脂質量を測定した。脂質量を測定後、それぞれ脂質濃度が10 mg  ml-1となるようにクロロホルムをナシ型フラスコに加え、脂質サンプル保存用のバイアル瓶に脂質を移した。その後 10 mg ml-1の酸化防止剤BHT溶液を10 μl を加え、バイアルに窒素封入をして-30℃で保存した。
【００２３】
１−２−４．2次元薄層クロマトグラフィー（2D-TLC）による脂質の分離
抽出した脂質100 μl（脂質1 mg）を薄層クロマトグラフTLC Silica gel 60 25 Glass plates （Merck、Germany）を用いて脂質クラスの展開と抽出を行った。20 ×20 cm TLCプレートを130 ℃で5 時間加熱し活性化ものを使用した。1次：アセトン/トルエン/メタノール/水＝8：3：2：1（v/v/v）。2次-1：クロロホルム/アセトン/メタノール/酢酸/水＝10：4：2：3：1（v/v/v）。2次-2：n-ヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸＝80：30：1（v/v/v）。2次-1展開は下から14 cmまで展開が進んだところで展開を止め、乾燥させた後、2次-2展開の展開溶媒で中性脂質をTLCプレートの上端まで展開した。展開後、ドライヤーを使ってTLCプレートを乾かし、プレートに濃度 0.01 % のプリムリン試薬を噴霧した。噴霧後、再度ドライヤーでTLCプレートを乾かし、UVイルミネーター (Benchtop 2UV Transilluminator、UVP、UK)を用いて360 nmの紫外光でスポットを検出した。
【００２４】
１−２−５．ガスクロマトグラフィー（GC）による脂肪酸解析
検出した脂質のスポットを鉛筆で丸く囲み、剃刀を使って各脂質のスポットを掻き取り、ネジ口の長試験管に移した。内部標準物質としてペンタデカン酸15:0（Sigma）を5 μg/ml を 10 μl 、酸化防止剤BHT溶液、3 ml の5 % 塩酸メタノール液を加えた。ふたをきつく締め、ボルテックスで攪拌し、80 ℃で3時間加熱し各脂質の脂肪酸をメチルエステル化した。
加熱終了後、各長試験管に 3 ml ずつヘキサンを加え、ボルテックスで攪拌した。攪拌後、上部のヘキサン層をパスツールピペットで新しい 10 ml 試験管に移した。その後、EYELA MG-2200（東京理化器械、東京）を用いて窒素環流によってヘキサンを揮発させ、パスツールピペットで7 滴のヘキサンに溶かしてガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移し、ガスクロマトグラフ（GC-2014、SHIMADZU、京都）に供した。得られたガスクロマトグラフの解析は、GC solution（SHIMADZU、京都）を使用した。
【００２５】
１−３．AtPDAT1遺伝子のコドンの最適化
クラミドモナス・レインハーディのゲノムは、GC含率が高く、シロイヌナズナと使用頻度の高いコドンが異なるため、シロイヌナズナの遺伝子をクラミドモナス・レインハーディで効率よく発現させるためには、コドンの最適化が必要である。クラミドモナス・アシンメトリカはクラミドモナス・レインハーディの近縁種であるため、シロイヌナズナの遺伝子であるAtPDAT1（配列番号３）を、クラミドモナス・レインハーディのコドンに最適化させて使用した。コドンの最適化と合成はユーロフィンゲノミクス(USA, 旧オペロンバイオテクノロジー；https://eurofinsgenomics.jp/jp/home.aspx)に委託した。以後codon usageの変換を行ったAtPDAT1をAtPDAT1Crと（配列番号２）する。
【００２６】
１−４．AtPDAT1Cr発現プラスミドの作成
AtPDAT1Crを鋳型として、ポリメラーゼにKOD-FX（東洋紡、大阪）、プライマーセット1（AtPDAT1Cr）を用いて、PCR反応で増幅し、目的の長さ2,016 bpのPCR産物を得た。なお、プライマーセットについては表２（配列番号１６〜２７）に示す。
【表２】
2017192363.tif 000003
PCR反応はtotal 50 μlとし、94℃ 2分を1サイクル、98℃ 10秒、50℃ 30秒、 68℃ 3分を35サイクル、68℃ 5分を1サイクル、4℃ 静置、のプログラムで行った。PCR産物に10 × loading dyeを5 μl加え、エチジウムブロマイドを含む1％アガロースゲルで100V、40分電気泳動した。目的の長さのバンドをゲルから切り出しWizard SV PCR clean up Kit（Promega、USA）を用いて精製した。精製はキットのプロトコルに従った。精製したDNAをpChlamy_3_D_TOPOベクター（GeneArt（登録商標）Chlamydomonas TOPO（登録商標）Engineering Kits、Invitrogen、USA）にクローニングした。TOPOベクターへのクローニングはキットのプロトコルに従った。pChlamy_3_D_TOPOベクターは過剰発現プロモーター（HSP70A/RbcS2）と、その下流にクローニングサイトを持ち、また、ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ。クローニングしたプラスミドを大腸菌に形質転換し、LB液体培地で37℃、1時間培養した後、LB +アンピシリンプレート培地にプレーティングし37℃で16時間培養した。ポリメラーゼとしてEx-taq、プライマーセット2を用いたコロニーPCRによってプラスミド導入株を同定し、その株をLB + アンピシリン液体培地で37℃、一晩培養した。培養したサンプルからWizard Plus Miniprep DNA Purification System（Promega、USA）を用いてプラスミドを抽出し、シーケンシングにより配列を確認した。抽出はキットのプロトコルに従った。シーケンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI、UK）を用い、添付のプロトコルに従って行った。シーケンシングには配列確認用プライマー1を用いた。なお、配列確認用プライマーは表３に示す（配列番号２８〜３９）。
【表３】
2017192363.tif 000004
シーケンシングによる配列の確認にはDNAシーケンサーABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific、USA）を用いた。配列を確認しハイグロマイシン耐性のAtPDAT1Cr発現プラスミドpTY7を得た。
【００２７】
１−５．パロモマイシン耐性AtPDAT1Cr発現プラスミドの作成
１−４で作成したハイグロマイシン耐性AtPDAT1Cr発現プラスミドをKOD-FX（東洋紡、大阪）、プライマーセット3を用いてPCR反応で増幅し、2961 bpの目的のPCR産物を得た。このPCR産物はAtPDAT1Cr上流のプロモーター配列と、下流のターミネーター配列を含む。PCR反応はtotal 50 μlとし、94℃ 2分を1サイクル、98℃ 10秒、 50℃ 30秒、 68℃ 3分を35サイクル、68℃ 5分を1サイクル、4℃ 静置、のプログラムで行った。PCR産物に10 × loading dyeを5 μl加え、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで100V、40分電気泳動した。目的の長さのバンドをゲルから切り出しWizard SV PCR clean up Kit（Promega、USA）用いて精製した。精製したAtPDAT1CrをpBluescript SK+ + aphVIII（pTI3、パロモマイシン耐性遺伝子）ベクターに挿入した。pTI3は pBlusescript SK+ベクターのマルチクローニングサイトのClaI、EcoRV部位にパロモマイシン耐性遺伝子（aphVIII）を挿入したものである。pTI3へのAtPDAT1Crの挿入は、AtPDAT1CrとpTI3をEcoRVとSpeIで制限酵素処理した後、エチジウムブロマイドを含む1％アガロースゲルで100V、40分電気泳動し、目的の長さのバンドをゲルから切り出しWizard SV PCR clean up Kit（Promega、USA）を用いて精製した後、DNA Ligation Kit（TAKARA、滋賀）を用いてLigationした。Ligationはキットのプロトコルに従って行った。Ligationさせたプラスミドを大腸菌に形質転換し、LB液体培地で37℃、1時間培養した後、LB + アンピシリンプレート培地にプレーティングし37℃で16時間培養した。 Ex taq、プライマーセット4を用いたコロニーPCRによってプラスミド導入株を同定し、その株をLB + アンピシリン液体培地で37℃、一晩培養した。培養したサンプルからWizard Plus Miniprep DNA Purification System（Promega、USA）を用いてプラスミドを抽出し、シーケンシングにより配列を確認した。プライマーは配列確認用プライマー3を用いた。これによりパロモマイシン耐性AtPDAT1Cr発現プラスミドpTY14を得た。
【００２８】
１−６．クラミドモナス・アシンメトリカへのAtPDAT1Crの形質転換
１−６−１．形質転換用プラスミドの精製
形質転換に用いたプラスミドは以下の通りである。１−５で得たパロモマイシン耐性AtPDAT1Cr発現プラスミドを1 μg、buffer H 5 ml、水 36.7 μl、ScaI 1 μlの組成で、37℃、2時間反応させた後、反応産物に10 × loading dyeを5 μl加え、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで100V、40分電気泳動した。目的の長さのバンドをゲルから切り出しWizard SV PCR clean up Kit（Promega、USA）を用いて精製した。精製はキットのプロトコルに従った。また、コントロールとしてパロモマイシン耐性のプラスミドpTI3も同様に、ScaIで制限酵素処理した後、精製した。
【００２９】
１−６−２．形質転換
クラミドモナス・アシンメトリカをOD750 = 0.25まで培養し、100 mlを3,000 rpm、5分で遠心して集藻した。上清を捨てて、沈殿を60 mM sucroseを含むC培地（C + sucrose）、20 mlに懸濁し、3,000 rpm、5分遠心した。上清を捨て、沈殿を250 μlの C + sucrose培地に懸濁した。そこに１−６−１で精製したプラスミドを300 ngと、50 μgのキャリアーDNA（MATCHMAKER Library Construction & Screening Kit、TAKARA、滋賀）を加え、0.4 cmのエレクトロポレーション用のキュベットに移し、10 ℃で5分保温した。MicroPulser（BIO RAD、165-2100）、 manual mode、1.25 kV、20 msecでエレクトロポレーションし、10分静置した。20 mlの C + sucrose培地に懸濁し、通常条件で一晩培養した。培養後、3,000 rpm、 5分で遠心して集藻し、1 mlのC培地に懸濁し、パロモマイシン 10 μg/mlを含むCプレート培地にプレーティングし、培養した。 また、コントロールとしてパロモマイシン耐性プラスミド、pTI3も同様に形質転換した。
【００３０】
１−６−３．コロニーPCRによるクラミドモナス・アシンメトリカへのAtPDAT1Cr導入の確認
１−６−３−１．クラミドモナス・アシンメトリカからのクロモソーム抽出
形質転換体からDNAを抽出しコロニーPCRを行った。形質転換した菌体を0.5 mlのTEN bufferに懸濁し、2,000 rpmで5分間遠心した後、上清を除いた。氷冷した水150 μl、SDS-EB buffer 300 μlとphenol/CIA(1:1) 450 μlを加え10分間ボルテックスした。14,000 rpmで10分間遠心した後、上清を回収し、再度phenol/CIA(1:1) 450 μlを加えボルテックスした後、14,000 rpmで10分間遠心した。上清を回収し、イソプロパノール 450 μl、3 M 酢酸ナトリウム 5 μlを加え、氷上で20分間静置した後、4℃、14,000 rpmで10分間遠心した。上清を除き-30℃で冷70 %エタノールを200 μl加え、4℃、14,000 rpmで5分間遠心した。上清を捨て、デシケーターで10分間乾かした後、TEN buffer 40 μlに溶かし、55 ℃で10分間インキュベートした後、4℃で一晩静置した。
【００３１】
１−６−３−２．コロニーPCR
１−６−３−１で抽出したDNAを用いてコロニーPCRを行った。KOD-FX-Neo（TOYOBO、大阪）、プライマーセット4を用いたPCR反応で増幅し、2,000 bpの付近の目的のPCR産物を得た。PCR反応はtotal 10 μlとし、94℃ 2分を1サイクル、98℃ 10秒、 65℃ 30秒、 68℃ 2分を35サイクル、68℃ 5分を1サイクル、4℃ 静置、のプログラムで行った。
【００３２】
１−７．RT-PCRによるAtPDAT1Crの発現の確認
１−７−１．RNA抽出
AtPDAT1Crの導入を確認できた株を、30 mlのC培地で、温度20℃、明期/暗期＝14時間/10時間、光強度30 μmol m-2 s-1の条件で培養し、OD750 = 0.5まで生育させた。生育させた培養液を3,000 rpmで5分間遠心し、上清を捨てた。沈殿にTRizol（Thermo Fisher scientific, USA）を1 ml加えボルテックスした。65℃で5分間インキュベートした後、クロロホルムを200 μl加え15秒間ボルテックスした後、常温で2分間静置し、層が分かれたら、4℃、12,000 rpmで10分間遠心した。 上層のTRizol層を回収し、等量のイソプロパノールを加え、-80℃で20分間静置した後、4℃、14,000 rpmで15分間遠心した。上清を捨て冷70 %エタノールを200 μl加え、4℃、14,000 rpmで5分間遠心した。上清を捨て、65℃で1分間乾かした。DEPC処理水を42.5 μl加え、65℃で5分間インキュベートした後、DNasel処理（TAKARA、滋賀）を行った。RNAに10 × DNasel buffer 5 μl、Recombinant DNasel 2 μl、RNase inhibitor 0.5 μlを加え、37℃で30分間インキュベートした後、2.5 μlのEDTAを加え、80℃で2分間インキュベートした。DEPC処理水を加え100 μlにfill upした後、DEPC処理3 M 酢酸ナトリウム溶液 10 μl、冷100 %エタノール 250 μlを加え、-80℃で30分静置した後、4℃、14,000 rpmで15分間遠心した。上清を捨て冷70 %エタノールを200 μl加え、4℃、14,000 rpmで5分間遠心した。上層を捨て、65℃で1分間乾かしたのち、DEPC処理水を50 μl加え、65℃で5分間インキュベートした。タッピングでよく混ぜた後、RNA濃度を測定した。
【００３３】
１−７−２．cDNA合成
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche、Switzerland) を用いて行った。方法はキットのプロトコルに従って行った。
【００３４】
１−７−３．RT-PCR
１−７−２で合成したcDNAを用いてRT-PCRを行った。KOD-FX（TOYOBO、大阪）、プライマーセット5を用いたPCR反応で増幅した。PCR反応は94℃ 2分を1サイクル、98℃ 10秒、58℃ 30秒、68℃ 2分を35サイクル、68℃ 5分を1サイクル、4℃ 静置、のプログラムで行った。また、コントロールとしてアクチンのRT-PCRをKOD-FX、プライマーセット6を用いたPCR反応で増幅した。PCR反応は94℃ 2分を1サイクル、98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 2分を25サイクル、68℃ 5分を1サイクル、4℃ 静置、のプログラムで行った。
【００３５】
１−８．AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカの脂質分析
１−８−１．AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカの培養
100 mlのC培地で、温度20℃、明期/暗期＝14時間/10時間、光強度30 μmol m-2 s-1の条件で培養し、培養43日目で定常期の細胞を、脂質解析用に回収した。
１−８−２．脂質解析
１−２−２、１−２−３、１−２−４、１−２−５と同様の方法で、TAGの蛍光観察、脂質抽出、TLC展開、GC解析を行った。
【００３６】
２．結果
２−１．クラミドモナス・アシンメトリカ生育過程の観察およびストレス条件下での脂質解析
クラミドモナス・アシンメトリカを通常条件で培養すると、培養4日から20日まで直線的な生育がみられ、43日で定常期に入った（図１Ａ上図）。培養13日目で対数増殖期の細胞を回収し、43日目で定常期の細胞の一部を回収し、残りを、C-N培地とC-P培地にOD250が0.2になるように植え継いだ。窒素欠乏条件では、生育が見られなかったため9日目に細胞を回収した。リン酸欠乏条件では、生育が止まった30日目に細胞を回収した（図１Ａ下図）。
回収した対数増殖期（通常条件）、定常期（通常条件）、窒素欠乏条件およびリン酸欠乏条件の細胞をNile redで染色しTAGの蛍光を確認すると、対数増殖期ではTAGの蓄積が確認できなかった（図１Ｂ）。定常期、窒素欠乏条件とリン酸欠乏条件ではTAGの蓄積が確認できた。また窒素欠乏条件では、クロロフィル蛍光の減衰が見られたが、定常期、リン酸欠乏条件ではTAGを蓄積している細胞でも、クロロフィル蛍光の減衰は見られなかった（図１Ｂ）。
【００３７】
ガスクロマトグラフィーにより、各脂質クラスの細胞当たりの含量と、TAGの培養液当たりの含量、各脂質クラスの脂肪酸組成を決定した。窒素欠乏条件の培養液当たりのTAG蓄積量は、10.9 nmol ml-1、リン酸欠乏条件下では、9.2 nmol ml-1であった。これに対して、通常条件下の定常期の細胞では、18.8 nmol ml-1と最も多く蓄積した（図２Ａ）。細胞あたりのTAG蓄積量は窒素欠乏条件下が最も多かった（図２Ｂ）。細胞当たりの脂質含量を見ると、窒素欠乏条件でMGDGの含量が、リン酸欠乏条件でPCの含量が若干低下していた（図２Ｄ）。
【００３８】
TAGを構成する主な脂肪酸は、窒素欠乏条件とリン酸欠乏条件、いずれの条件においても変わらず16:0、16:4 (4,7,10,13)、18:1 (11)、18:2 (9,12)および18:3 (9,12,15)であった。この中で特にTAGには、MGDGに特徴的な16:4 (4,7,10,13)、18:3 (9,12,15) 、PGに特徴的な16:0、16:1(3)が多く含まれていた（図３）。
【００３９】
２−２．AtPDAT1Cr発現株の取得
これまでに、クラミドモナス・アシンメトリカにおける遺伝子導入法は確立されていなかったので、クラミドモナス・レインハーディの遺伝子導入法を参考にして、クラミドモナス・アシンメトリカへの遺伝子導入を試みた。まず、遺伝子導入マーカーとして使用するため、抗生物質に対するクラミドモナス・アシンメトリカの感受性を検討し、25 μg ml-1のハイグロマイシンおよび10 μg ml-1のパロモマイシンに感受性を示した。そこで、クラミドモナス・レインハーディにおけるハイグロマイシン耐性遺伝子aph7’をもちいて、クラミドモナス・アシンメトリカの遺伝子導入系の検討を行った。
クラミドモナス・レインハーディにおける一般的なエレクトロポレーション法では、ハイグロマイシン耐性のコロニーは得られなかったが、クラミドモナス・レインハーディのエレクトロポレーション法の検討をおこなった、Shimogawaraら, Genetics 148, 1821-1828 1998.を参考に条件検討を行った。その結果、クラミドモナス・レインハーディの遺伝子導入では用いられていないキャリアーDNA 50 μgの添加と、電圧の上昇（1.1 kv→1.25 kv）、キュベット内の温度の低下（16℃ →10℃）により、6.6 × 103コロニー/μg DNAの高効率の遺伝子導入法の確立に成功した。この結果から、クラミドモナス・レインハーディの遺伝子発現系が、クラミドモナス・アシンメトリカにおいても有効であることも示された。そこで、AtPDAT1Cr発現プラスミド、pTY14をクラミドモナス・アシンメトリカに導入し、抗生物質耐性コロニーからクロモソームを抽出し、PCRによってAtPDAT1Crの導入を確認した。遺伝子を導入したクラミドモナス・アシンメトリカにおけるAtPDAT1Cr発現をRT-PCRで検討し、2番のラインで最も強い発現を検出した（図４Ａ）。よって今後の実験では2番のラインを用いた。
【００４０】
２−３．AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカの脂質解析
AtPDAT1Cr発現クラミドモナス・アシンメトリカおよびパロモマイシン耐性プラスミド導入（Empty vector、EV）株を100 mlのC培地で培養したところ、WTと同程度の生育が見られた（図４Ｂ）。定常期に入った43日目の細胞を回収した。培養43日目で回収した細胞をNile redで染色し、TAGの蛍光を確認すると、EVと較べて、AtPDAT1Cr発現株でTAGの強い蛍光が確認できたが、クロロフィル蛍光の若干の減衰が見られた（図４Ｃ）。
ガスクロマトグラフィーにより、細胞あたり、および培養液あたりのTAG含量、各脂質の割合、各脂質の脂肪酸組成を決定した。TAG含量については、細胞当たり、培養液当たり共にAtPDAT1Cr発現株で高い値となった（図５ＡおよびＢ））。
各脂質の割合はAtPDAT1Cr発現株でEV発現株と較べて、TAGの含量が増え、MDGDの含量が減っていた（図５Ｃ）。各脂質の脂肪酸組成はAtPDAT1Cr発現株およびEV発現株で大きな違いはなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、藻類に貯蔵される油脂の蓄積量を増加させる方法および油脂の蓄積量が増加した藻類を提供する。従って、本発明は、バイオ燃料を効率的かつ安価に生産する方法として利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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