(57)【要約】      （修正有）【課題】反応性の高い抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第１領域と、特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第２領域と、特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第３領域と、を有する可変領域を備える、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。重鎖抗体の可変ドメインからなる抗体断片（ＶＨＨ抗体）である抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第１領域と、
配列番号４若しくは５のアミノ酸配列、又は配列番号４若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第２領域と、
配列番号６若しくは７のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第３領域と、
を有する可変領域を備える、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
【請求項２】
ＶＨＨ抗体である、請求項１に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
【請求項３】
前記可変領域は、前記第１領域と前記第２領域との間にフレームワークを備え、前記第２領域と前記第３領域との間に前記フレームワークとは別のフレームワークを備える、請求項１又は２に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
【請求項４】
前記可変領域は、第１フレームワーク、前記第１領域、第２フレームワーク、前記第２領域、第３フレームワーク、前記第３領域及び第４フレームワークをこの順に有し、
前記第１フレームワークが配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
前記第２フレームワークが配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
前記第３フレームワークが配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
前記第４フレームワークが配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、
請求項１から３のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
【請求項５】
ヒト化された、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を含む、検出キット。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体と、生体試料とを接触させ、前記抗サバイビン抗体又は前記抗体誘導体と前記生体試料中のサバイビンとの結合体を形成させる工程と、
前記結合体中のサバイビンを検出する工程と、
を備える、前記生体試料中のサバイビンの検出方法。
【請求項９】
前記生体試料中のサバイビンの濃度を算出する工程を更に備える、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が固相に固定されている、請求項８又は９に記載の検出方法。
【請求項１１】
患者由来の細胞を、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体で免疫染色する工程を備える、前記細胞中のサバイビンの検出方法。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を有効成分として含有する、癌の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体及びそれらの利用に関する。抗サバイビン抗体又は抗体誘導体、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸、検出キット、サバイビンの検出方法及び癌の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サバイビンは、アポトーシスの抑制と細胞分裂の調整機能を有する分子量約１６ｋＤａのタンパク質である。サバイビンタンパク質は、正常組織ではほとんど観察されないが、胎児の組織や多くの癌において高発現することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
ところで、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ等）の血清中には、重鎖抗体と呼ばれる、軽鎖を持たない特殊な抗体が存在することが知られている。重鎖抗体の可変領域ドメインからなる抗体断片は、ＶＨＨ抗体と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量のものである。
【０００４】
ＶＨＨ抗体は、例えば大腸菌等を用いて簡便に合成でき、リフォールディング能が高く、熱変性にも強いため、産業応用の観点から次世代抗体として注目されている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５２０４９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】O'Driscoll L., et al., Survivin: role in normal cells and in pathological conditions., Curr. Cancer Drug Targets., 3(2), 131-152, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、反応性の高い抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を提供する。本発明はまた、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸、検出キット、サバイビンの検出方法及び癌の治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施態様は、下記（１）から（６）を提供するものである。
（１）配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第１領域と、配列番号４若しくは５のアミノ酸配列、又は配列番号４若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第２領域と、配列番号６若しくは７のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第３領域と、を有する可変領域を備える、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体。
（２）（１）に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸。
（３）（１）に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を含む、検出キット。
（４）（１）に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体と、生体試料とを接触させ、前記抗サバイビン抗体又は前記抗体誘導体と前記生体試料中のサバイビンとの結合体を形成させる工程と、前記結合体中のサバイビンを検出する工程と、を備える、前記生体試料中のサバイビンの検出方法。
（５）患者由来の細胞を、（１）に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体で免疫染色する工程を備える、前記細胞中のサバイビンの検出方法。
（６）（１）に記載の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を有効成分として含有する、癌の治療剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＶＨＨ抗体ライブラリのスクリーニング工程を説明する概略図である。
【図２】サバイビンタンパク質をビーズに固定及び溶出した方法を説明する概略図である。
【図３】サバイビンタンパク質に対するアフィニティー選択前、並びに、１、３、４及び７サイクルのアフィニティー選択後のＶＨＨ抗体ライブラリ集団の塩基配列を解析した結果を示すグラフである。
【図４】２４クローンのＶＨＨ抗体の塩基配列解析の結果をまとめた図である。
【図５】プルダウンアッセイの工程を説明する概略図である。
【図６】実験例４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図７】実験例４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図８】（ａ）は実験例５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ｂ）は（ａ）のポリアクリルアミドゲルをウエスタンブロッティング解析した結果を示す写真である。
【図９】実験例６の結果を示すグラフである。
【図１０】実験例６の結果を示すグラフである。
【図１１】競合ＥＬＩＳＡ法による結合定数の測定方法を説明する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［抗サバイビン抗体又は抗体誘導体］
一実施態様において、本発明は、配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第１領域と、配列番号４若しくは５のアミノ酸配列、又は配列番号４若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第２領域と、配列番号６若しくは７のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる第３領域と、を有する可変領域を備える、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を提供する。
【００１１】
また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第１領域は、配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第２領域は、配列番号４若しくは５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第３領域は、配列番号６若しくは７のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６若しくは７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。
【００１２】
ここで、第１領域をＣＤＲ１、第２領域をＣＤＲ２、第３領域をＣＤＲ３と表現する場合もある。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）とは、相補性決定領域を意味する。第１領域を第１相補性決定領域、第２領域を第２相補性決定領域、第３領域を第３相補性決定領域と表現する場合もある。本明細書において、相補性決定領域とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域ともいう。抗体又は抗体誘導体の可変領域は、Ｎ末端側から順に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の３つの相補性決定領域を有する。
【００１３】
実施例において後述するように、発明者らはＶＨＨ抗体ライブラリのスクリーニングにより、反応性の高い抗サバイビン抗体を複数クローン得た。得られた抗サバイビン抗体の塩基配列の解析結果から、ＣＤＲ１が、配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１から３のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２が、配列番号４若しくは５のアミノ酸配列、又は配列番号４若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３が、配列番号６若しくは７のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる可変領域を備える抗体又は抗体誘導体は、サバイビンに対する反応性が高いことが明らかとなった。
【００１４】
アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸とは、上記アミノ酸に変異が導入されたアミノ酸を意味する。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に変異が導入されていても、サバイビンに対する結合能を有している限り、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の技術的範囲に属する。アミノ酸の変異が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加であれば、変異の数が少ないため、上記アミノ酸の機能が維持される蓋然性が高い。
【００１５】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３における数個とは、例えば２から５個、２から４個、２から３個、又は２個を意味する。また、抗体又は抗体誘導体の反応性が高いとは、抗体又は抗体誘導体とサバイビンタンパク質との結合定数ＫＤが、例えば１．０×１０−６Ｍ未満であり、例えば８．０×１０−７Ｍ未満であり、例えば６．０×１０−７Ｍ未満であることを意味する。抗体又は抗体誘導体の結合定数ＫＤは、ビアコア等の生物物理学的相互作用解析装置を用いた測定、競合ＥＬＩＳＡ法による測定等により測定することができる。
【００１６】
抗体としては、ラクダ科動物の重鎖抗体、ヒト抗体、マウス抗体等が挙げられる。抗体誘導体としては、ＶＨＨ抗体、アプタマー等が挙げられる。アプタマーとしては、アミノ酸配列を含むアプタマーやペプチドアプタマー等が挙げられる。中でも、ＶＨＨ抗体は、ＣＤＲ３が通常のＩｇＧ抗体と比べて長いという特徴があり、中和抗体として機能する抗体の割合が通常のＩｇＧ抗体に比べて高い。
【００１７】
本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の可変領域は、ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間にフレームワークを有し、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に上記フレームワークとは別のフレームワークを有するものであってもよい。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の可変領域は、第１フレームワーク、ＣＤＲ１、第２フレームワーク、ＣＤＲ２、第３フレームワーク、ＣＤＲ３及び第４フレームワークをこの順に有し、第１フレームワークが配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、第２フレームワークが配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、第３フレームワークが配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、第４フレームワークが配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００１８】
また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第１フレームワークは、配列番号８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第２フレームワークは、配列番号９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第３フレームワークは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。また、本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の第４フレームワークは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。
【００１９】
ここで、第１フレームワークをＦＲ１、第２フレームワークをＦＲ２、第３フレームワークをＦＲ３、第４フレームワークをＦＲ４と表現する場合もある。ＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ）とは、フレームワーク（フレームワーク領域）を意味する。本明細書において、フレームワークは相補性決定領域を除く領域であり、抗体の可変領域のうち、保存性の高い領域を含む。抗体又は抗体誘導体の可変領域は、ＣＤＲ及びＦＲから構成されており、Ｎ末端側から順に、第１フレームワーク、ＣＤＲ１、第２フレームワーク、ＣＤＲ２、第３フレームワーク、ＣＤＲ３及び第４フレームワークをこの順に有する。
【００２０】
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４における数個とは、例えば２から１０個、２から９個、２から８個、２から７個、２から６個、２から５個、２から４個、２から３個、又は２個を意味する。
【００２１】
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４は、システイン残基を有していてもよく、システイン残基を有しなくてもよい。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４にシステイン残基が存在すると、抗体又は抗体誘導体が、分子内又は分子間でジスルフィド結合を形成する場合がある。また、相補性決定領域を除く領域にシステイン残基を有しない場合、大腸菌等で生産する場合においてもジスルフィド結合形成のための工程を設ける必要がなく、大腸菌での発現とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  リフォールディングとが容易になる。また、また、ＳＨ基を用いてアプタマーを化学修飾することも容易である。
また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、システイン残基を有しないことが好ましい。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がシステイン残基を有しないことにより、抗体又は抗体誘導体が、分子内又は分子間でジスルフィド結合を形成することを抑制することができる。
【００２２】
上記の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体又は抗体誘導体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【００２３】
［核酸］
一実施態様において、本発明は、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸を提供する。
【００２４】
本実施態様の核酸はベクターに挿入されていてもよい。また、上記のベクターは発現ベクターであってもよい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００２５】
上述の発現ベクターにおいて、抗体又は抗体誘導体発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、融合タンパク質を発現する宿主に応じて、適宜選択することができる。
【００２６】
上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００２７】
［キット］
一実施態様において、本発明は、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を含む、検出キットを提供する。
【００２８】
本実施態様のキットによれば、患者由来の生体試料中のサバイビンタンパク質の存在又は量を検出することができる。本実施態様のキットは、創薬や診断薬用のツールとして使用可能である。例えば本実施態様のキットを診断キットとして、サバイビン関連疾患の診断を行うことができる。また、例えばサバイビン関連の創薬のスクリーニングを行うことができる。
【００２９】
サバイビン関連疾患とは、サバイビンタンパク質の発現が関連する疾患である。疾患としては、例えば腫瘍（癌）、感染症、及び食中毒からなる群から選ばれるものが挙げられる。ここで、上記腫瘍は、一般に、増殖がゆっくりで、周辺組織への浸潤性を有さず、宿主に悪影響を起こさない良性腫瘍と、原発巣は周辺組織への浸潤性を有し、転移巣を形成するとともに、宿主に悪影響を及ぼす悪性腫瘍とに分けられる。組織学的には、乳頭腫、腺腫、嚢腫、扁平上皮腫、移行上皮腫、肝細胞腫その他の良性腫瘍と、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肝細胞癌、未分化癌その他の悪性腫瘍とに分けられる。
【００３０】
癌としては、解剖学的には、上顎癌、咽頭癌、喉頭癌その他の頭頸部の癌、甲状腺癌、乳癌、肺癌その他の胸部の癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝癌その他の消化器の癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌その他の泌尿器の癌、子宮癌、卵巣その他の生殖器の癌、基底細胞癌、有蕀細胞癌その他の皮膚の癌、脈絡膜乳頭腫、神経鞘腫、星状細胞腫、神経線維腫、メラニン細胞性黒斑、髄膜腫その他の良性の神経性腫瘍、神経芽細胞腫、悪性褐色細胞腫、メラノーマ、悪性神経鞘腫その他の悪性の神経性腫瘍等が挙げられる。
【００３１】
サバイビンタンパク質は、サバイビンモノマーであってもよく、サバイビンダイマーであってもよい。サバイビンは、モノマー又はダイマーのいずれであっても本発明の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体と結合する。
【００３２】
生体試料としては、例えば採取された検体として、血液、血清、尿、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等が挙げられる。本実施態様の検出キットにおいて、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられる。固相において、本願発明の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が直接的又は間接的に固定される。固相においては、複数の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が、アレイ状に固定されていてもよい。検出キットにおいて使用される固相は、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体がアレイ状に固定された固相であってもよい。また、複数の異なる抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が固相に固定されていてもよい。同一の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が複数固相に固定されていてもよい。
【００３３】
この場合、固相に固定された抗サバイビン抗体又は抗体誘導体が、生体試料中のサバイビンタンパク質と結合し、当該サバイビンタンパク質を別の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体で検出すること等が挙げられる。
【００３４】
あるいは、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は、固相に固定されていなくてもよい。例えば、生体試料中のタンパク質を直接固相に固定し、蛍光、酵素等で標識された抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を反応させて、生体試料中のサバイビンタンパク質を検出すること等が挙げられる。
【００３５】
あるいは、生体試料、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体のいずれも固相に固定せず、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）等を利用して液相中で検出を行う、いわゆるホモジニアスアッセイにより、生体試料中のサバイビンタンパク質を検出してもよい。
【００３６】
あるいは、生体試料が組織又は細胞であり、本実施態様の検出キットが、免疫染色用の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体であってもよい。
【００３７】
［サバイビンの検出方法］
一実施態様において、本発明は、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体と、生体試料とを接触させ、前記抗サバイビン抗体又は前記抗体誘導体と前記生体試料中のサバイビンとの結合体を形成させる工程と、前記結合体中のサバイビンを検出する工程と、を備える、前記生体試料中のサバイビンの検出方法を提供する。
【００３８】
生体試料としては、上述したものと同様のものを使用することができる。上述したように、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
【００３９】
上記の結合体中のサバイビンを検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体とは異なるエピトープを認識する、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を反応させることにより行うことができる。あるいは、上述したホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のサバイビンを検出してもよい。
【００４０】
例えば、採取された検体（生体試料）が全血である場合には、全血から血清を抽出してサバイビンを検出するとよい。例えば、全血を１，０００×ｇで遠心することにより、血清と血球成分等に分離することができる。こうして得られた血清を、所望の量反応用のチューブに移し、必要に応じて適宜希釈した後、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を添加し、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体−サバイビンタンパク質結合体を形成させる。
【００４１】
上記抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は、予め固相に結合させておいてもよい。その後、血清を除去し、上記結合体中のサバイビンを検出することによって、精度よく、かつ簡便にサバイビンの血清中レベルを求めることができる。検体が血清である場合には遠心等の血清抽出処理は不要である。
【００４２】
採取された検体が組織片である場合には、常法に従ってホモジナイズし、遠心して上清を分離し、この上清を上記と同様に処理することにより、精度よく、かつ簡便にサバイビンの組織中レベルを求めることができる。
【００４３】
以上の手順によって、疾病のマーカーを検出することができ、正常値と対比することによって、疾病に罹患しているか否かを推定することが可能となる。また、例えば、対象となるマーカーは、特定の疾患マーカー以外にも、病気の予後マーカー、創薬マーカー、食品マーカー等であっても良い。
【００４４】
本実施態様の検出方法は、生体試料中のサバイビンの濃度を算出する工程を更に備えていてもよい。例えば、既知濃度のサバイビンタンパク質を含有する試料を、生体試料と同様の操作に供して、サバイビンタンパク質のシグナルを検出し、当該シグナル強度に基づいて検量線を作成し、当該検量線に基づいて、生体試料中のサバイビン濃度を算出すること等が挙げられる。
【００４５】
一実施態様において、本発明は、患者由来の細胞を、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体で免疫染色する工程を備える、前記細胞中のサバイビンの検出方法を提供する。細胞は、組織切片中の細胞であってもよく、培養された細胞であってもよい。また、細胞は、例えばホルマリン固定等により固定されていてもよい。
【００４６】
［癌の治療剤］
一実施態様において、本発明は、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を有効成分として含有する、癌の治療剤を提供する。
【００４７】
ここで、「有効成分として含有する」は、本実施形態の癌の治療剤を基準として、例えば１質量％以上、例えば１０質量％以上、例えば２０質量％以上、例えば３０質量％以上、例えば４０質量％以上、例えば５０質量％以上、例えば６０質量％以上、例えば７０質量％以上、例えば８０質量％以上、例えば９０質量％以上、例えば９５質量％以上（固形分換算）の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を含有することを意味する。
【００４８】
本実施態様の治療剤は、薬学的に許容される担体又は添加物を含む治療用組成物であってもよい。薬学的に許容される担体又は添加物としては、例えば、水等の溶媒；塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の塩；ヒト血清アルブミン等のタンパク質保護剤；界面活性剤；ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００４９】
治療用組成物は、静脈注射用又は点滴用であってもよい。治療用組成物は、液体で供給されてもよく、粉末で供給され、使用前に水や緩衝液等で溶解するように構成されていてもよい。
【００５０】
本実施態様の抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は、例えば、膜透過性ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。膜透過性ペプチドとは、対象化合物との化学的架橋体、又は、対象タンパク質との融合タンパク質を調製すると、例えば細胞の培養液に添加するだけで対象化合物又は対象タンパク質の細胞内への取り込みが促進されるペプチドである。
【００５１】
膜透過性ペプチドとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質由来のアルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴ、配列番号１２）、式Ｒｎ（Ｒはアルギニン残基を表す。ｎ＝６から１２程度。）で表されるオリゴアルギニン、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、配列番号１３）、ＴＰ−１０（配列番号１４）等が挙げられる。
【００５２】
［その他の実施態様］
一実施態様において、本発明は、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を患者に投与する工程を含む、サバイビン関連疾患の治療方法を提供する。
【００５３】
サバイビン関連疾患としては、例えば癌が挙げられる。抗サバイビン抗体又は抗体誘導体は、例えば、１から１０ｍｇ／ｋｇを１週間に１回程度の間隔で患者に投与されてもよい。投与方法としては、静脈注射、点滴等が挙げられる。
【００５４】
一実施態様において、本発明は、サバイビン関連疾患の治療のための、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を提供する。
【００５５】
一実施態様において、本発明は、サバイビン関連疾患の治療剤の製造のための、上述した抗サバイビン抗体又は抗体誘導体の使用を提供する。例えば、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を、上述した薬学的に許容される担体又は添加物と適宜組み合わせて混和し、適宜の容器に封入することによって、サバイビン関連疾患の治療剤を製造することができる。サバイビン関連疾患の治療剤は、必要に応じて凍結乾燥されてもよい。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
［実験例１］
（ＶＨＨ抗体ライブラリの作製）
ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングが可能なＶＨＨ抗体ライブラリを作製した。ｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法の１つであり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）とを連結したものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体構造は非常に安定であるため、核酸リンカーを用いたｃＤＮＡディスプレイ法では、ライブラリのスクリーニング条件の自由度が高い。
【００５８】
核酸リンカーとしては、ピューロマイシンを有するリンカーを使用した。ピューロマイシンは、アミノアシルｔＲＮＡの３’末端と類似した構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下では、リボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。
【００５９】
ＶＨＨ抗体ライブラリとしては、配列番号１５に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成して使用した。ＶＨＨ抗体ライブラリの多様性は、約１０１０であった。配列番号１５に示すＤＮＡ断片が備える主な構造を下記表１に示す。本ライブラリにおいて、ＣＤＲ１のアミノ酸の数は９個であり、ＣＤＲ２のアミノ酸の数は８個であり、ＣＤＲ３のアミノ酸の数は１３個であった。また、ＦＲ１のアミノ酸の数は２８個であり、ＦＲ２のアミノ酸の数は１３個であり、ＦＲ３のアミノ酸の数は４１個であり、ＦＲ４のアミノ酸の数は１４個であった。
【００６０】
【表１】
2017014112.tif 000002
【００６１】
［実験例２］
（ライブラリのスクリーニング）
図１は、ライブラリのスクリーニング工程を説明する概略図である。図１にはｃＤＮＡディスプレイセレクションサイクルの概略が記載されている。図１中、「Ｐｕ」はピューロマイシンを表し、「Ｆ」はフルオレセインを表し、「Ｂ」はビオチンを表す。以下、図１を参照しながらライブラリのスクリーニング工程を説明する。
【００６２】
まず、ＶＨＨ抗体ライブラリのＤＮＡ断片にＴ７ファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを反応させてｍＲＮＡ１００を合成した。続いて、合成したｍＲＮＡ１００と核酸リンカー１１０とをアニールさせ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼでライゲーションした。
【００６３】
続いて、無細胞タンパク質翻訳系を用いて上記のｍＲＮＡ１００を翻訳した。無細胞タンパク質翻訳系としては、ウサギ網状赤血球（商品名「Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ」、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。
【００６４】
その結果、図１に示すように、翻訳されたＶＨＨ抗体タンパク質１２０のＣ末端とピューロマイシンＰｕとが結合し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体が形成された。
【００６５】
続いて、ストレプトアビジン結合ビーズ１３０を用いてｍＲＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体を回収し、逆転写酵素（商品名「ＲｉｂｏＭＡＸ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７」、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて上記のｍＲＮＡ１００のｃＤＮＡ１４０を合成した。
【００６６】
続いて、ＲＮａｓｅＴ１を用いた消化により、ストレプトアビジン結合ビーズ１３０からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体を切り出し、ビーズに固定したサバイビンタンパク質を用いたアフィニティー選択を行った。
【００６７】
図２は、サバイビンタンパク質をビーズに固定及び溶出した方法を説明する概略図である。図２中、「Ｂ」はビオチンを表す。以下、図２を参照しながらサバイビンタンパク質をビーズに固定及び溶出した方法を説明する。
【００６８】
まず、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質２００（カタログ番号「ＳＵＲ０８０１」、ＡＴＧｅｎ社）を準備した。配列番号１６に、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質２００のアミノ酸配列を示す。続いて、ストレプトアビジン結合ビーズ１３０に、ビオチン標識したカルモジュリン結合ペプチド（以下、「ビオチン−ＣＢＰ」という場合がある。）２１０を結合させた。続いて、カルシウムイオンの存在下で上記のビオチン−ＣＢＰと上記の融合タンパク質２００とを接触させた。カルモジュリン結合ペプチド及びカルモジュリンは、カルシウムイオンの存在下で強固に結合する。したがって、上記の操作により、融合タンパク質２００がストレプトアビジン結合ビーズ１３０に固定された。
【００６９】
融合タンパク質２００のストレプトアビジン結合ビーズ１３０からの溶出は次のようにして行った。上記の融合タンパク質２００−ストレプトアビジン結合ビーズ１３０の複合体を、ＥＤＴＡを含むバッファーに懸濁した。これにより、バッファー中のカルシウムイオンがＥＤＴＡにキレートされた。その結果、カルモジュリン結合ペプチドとカルモジュリンとの結合が外れ、融合タンパク質２００がストレプトアビジン結合ビーズ１３０から溶出された。
【００７０】
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体のアフィニティー選択は、上述した融合タンパク質２００−ストレプトアビジン結合ビーズ１３０の複合体を使用して行った。
【００７１】
まず、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体をカルシウムイオンの存在下で融合タンパク質２００−ストレプトアビジン結合ビーズ１３０の複合体に結合させた。続いて、融合タンパク質２００−ストレプトアビジン結合ビーズ１３０の複合体に結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体をカルシウムイオンを含有するバッファー中で数回洗浄した。
【００７２】
続いて、カルシウムイオンの代わりにＥＤＴＡを含有するバッファーを添加し、ストレプトアビジン結合ビーズ１３０からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質を溶出し、回収した。
【００７３】
続いて、回収されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質を鋳型としたＰＣＲ反応により、アフィニティー選択されたＶＨＨ抗体ライブラリのＤＮＡ断片を増幅し、次のサイクルのアフィニティー選択に使用した。ＰＣＲ用のプライマーとしては、Ｐ−Ｆ（配列番号１７）及びＰ−Ｒ（配列番号１８）を使用した。
【００７４】
図３は、サバイビンタンパク質に対するアフィニティー選択前（図中、「Ｒ０」と示す。）、並びに、１、３、４及び７サイクルのアフィニティー選択後（図中、それぞれ、「Ｒ１」、「Ｒ３」、「Ｒ４」及び「Ｒ７」と示す。）のＶＨＨ抗体ライブラリ集団を、クローニングせずに塩基配列解析した結果を示すグラフである。
【００７５】
その結果、アフィニティー選択を４サイクル程度行うと、ＶＨＨ抗体ライブラリ集団を構成するＤＮＡ断片の塩基配列が収束していく様子が認められた。
【００７６】
［実験例３］
（抗体遺伝子のクローニング）
実験例２において、サバイビンタンパク質に対するアフィニティー選択を７サイクル行った後のＶＨＨ抗体ライブラリ集団を構成するＤＮＡ断片を、ランダムに２４クローン選択し、塩基配列を解析した。その結果、２４クローンのＶＨＨ抗体のＤＮＡ断片は、８種類の塩基配列からなるＤＮＡ断片の集団であることが明らかとなった。以下、これらの８種類のＤＮＡ断片をそれぞれＲ７−ＡからＲ７−Ｈという。
【００７７】
Ｒ７−Ａは配列番号１９に示す塩基配列を有しており、２４クローン中１７クローンが同一の塩基配列を有していた。Ｒ７−Ａのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。Ｒ７−ＡのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、４、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＡのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００７８】
２４クローン中、Ｒ７−Ｂ（塩基配列を配列番号２１に示し、アミノ酸配列を配列番号２２に示す。）、Ｒ７−Ｃ（塩基配列を配列番号２３に示し、アミノ酸配列を配列番号２４に示す。）、Ｒ７−Ｄ（塩基配列を配列番号２５に示し、アミノ酸配列を配列番号２６に示す。）、Ｒ７−Ｅ（塩基配列を配列番号２７に示し、アミノ酸配列を配列番号２８に示す。）、Ｒ７−Ｆ（塩基配列を配列番号２９に示し、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。）、Ｒ７−Ｇ（塩基配列を配列番号３１に示し、アミノ酸配列を配列番号３２に示す。）、Ｒ７−Ｈ（塩基配列を配列番号３３に示し、アミノ酸配列を配列番号３４に示す。）が、各１クローンずつ見出された。
【００７９】
Ｒ７−ＢのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２、５、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＢのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８０】
Ｒ７−ＣのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３、４、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８１】
Ｒ７−ＤのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、４、７に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＤのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８２】
Ｒ７−ＥのＣＤＲ１及び２は、それぞれ配列番号１及び４に示すアミノ酸配列を有していた。また、ＣＤＲ３は、配列番号６において、第２番目のアルギニン残基がセリン残基に置換したアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＥのＦＲ３は、配列番号１０において、第３６番目のイソロイシン残基がバリン残基に置換したアミノ酸配列を有していた。ＦＲ１、２、４は、それぞれ配列番号８、９、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８３】
Ｒ７−ＦのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、４、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＦのＦＲ１は、配列番号８において、第６番目のロイシン残基がメチオニン残基に置換したアミノ酸配列を有していた。また、ＦＲ２から４は、それぞれ配列番号９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８４】
Ｒ７−ＧのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、４、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＦのＦＲ１は、配列番号８において、第９番目のセリン残基がトレオニン残基に置換したアミノ酸配列を有していた。また、ＦＲ２から４は、それぞれ配列番号９、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８５】
Ｒ７−ＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、４、６に示すアミノ酸配列を有していた。また、Ｒ７−ＦのＦＲ２は、配列番号９において、第１０番目のアルギニン残基がセリン残基に置換したアミノ酸配列を有していた。また、ＦＲ１、３、４は、それぞれ配列番号８、１０、１１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８６】
Ｒ７−ＡからＲ７−ＨのＶＨＨ抗体の構造を表２及び図４にまとめた。図４中、アミノ酸変異が存在した場所を「＊」で示す。
【００８７】
【表２】
2017014112.tif 000003
【００８８】
［実験例４］
（プルダウンアッセイ）
実験例３でクローニングしたＤＮＡ断片Ｒ７−ＡからＲ７−Ｅがコードする各ＶＨＨ抗体について、サバイビンとの結合をプルダウンアッセイにより検討した。対照として、アフィニティー選択する前のＶＨＨ抗体ライブラリがコードするＶＨＨ抗体の集団、及び、プロテインＡのＢドメインを用いたプルダウンアッセイも行った。
【００８９】
図５は、プルダウンアッセイの工程を説明する概略図である。図５中、「Ｐｕ」はピューロマイシンを表し、「Ｆ」はフルオレセインを表し、「Ｂ」はビオチンを表す。以下、図５を参照しながらプルダウンアッセイの工程を説明する。
【００９０】
まず、ＶＨＨ抗体のＤＮＡ断片にＴ７ファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを反応させてｍＲＮＡ１００を合成した。続いて、合成したｍＲＮＡ１００と核酸リンカー１１０とをアニールさせ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼでライゲーションした。
【００９１】
続いて、無細胞タンパク質翻訳系を用いて上記のｍＲＮＡ１００を翻訳した。無細胞タンパク質翻訳系としては、ウサギ網状赤血球（商品名「Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ」、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。
【００９２】
その結果、図５に示すように、翻訳されたＶＨＨ抗体タンパク質１２０のＣ末端とピューロマイシンＰｕとが結合し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体が形成された。
【００９３】
続いて、得られたｍＲＮＡ−核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体にＲＮａｓｅＡを反応させてｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体を得た。
【００９４】
続いて、核酸リンカー−ＶＨＨ抗体タンパク質の複合体をストレプトアビジン結合磁性ビーズ１３５に結合させ、洗浄した後、フルオレセイン標識したプレイタンパク質１５０と接触させた。
【００９５】
プレイタンパク質１５０としては、それぞれフルオレセイン標識された、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質、カルモジュリン、又は、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質、カルモジュリン及びウサギＩｇＧの混合物を用いた。
【００９６】
その後、ストレプトアビジン結合磁性ビーズ１３５を回収して洗浄し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、ＶＨＨ抗体タンパク質１２０に結合したプレイタンパク質１５０を分離し、フルオレセインの蛍光を検出した。
【００９７】
図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１は、対照としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質の結果を示す。
【００９８】
レーン２は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、Ｒ７−ＡのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【００９９】
レーン３は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、Ｒ７−ＢのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１００】
レーン４は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、アフィニティー選択する前のＶＨＨ抗体ライブラリにコードされるＶＨＨ抗体の集団でプルダウンした結果である。
【０１０１】
レーン５は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、プロテインＡのＢドメインタンパク質でプルダウンした結果である。
【０１０２】
レーン６は、対照としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したカルモジュリンの結果を示す。
【０１０３】
レーン７は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのカルモジュリンを使用し、Ｒ７−ＡのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１０４】
レーン８は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのカルモジュリンを使用し、Ｒ７−ＢのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１０５】
レーン９は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのカルモジュリンを使用し、アフィニティー選択する前のＶＨＨ抗体ライブラリにコードされるＶＨＨ抗体の集団でプルダウンした結果である。
【０１０６】
レーン１０は、プレイタンパク質１５０として２００ｎＭのカルモジュリンを使用し、プロテインＡのＢドメインタンパク質でプルダウンした結果である。
【０１０７】
図７も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１は、対照としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質の結果を示す。
【０１０８】
レーン２は、プレイタンパク質１５０として１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、Ｒ７−ＢのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１０９】
レーン３は、プレイタンパク質１５０として１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、Ｒ７−ＤのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１１０】
レーン４は、プレイタンパク質１５０として１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、Ｒ７−ＥのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１１１】
レーン５は、プレイタンパク質１５０として１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、アフィニティー選択する前のＶＨＨ抗体ライブラリにコードされるＶＨＨ抗体の集団でプルダウンした結果である。
【０１１２】
レーン６は、プレイタンパク質１５０として１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質を使用し、プロテインＡのＢドメインタンパク質でプルダウンした結果である。
【０１１３】
レーン７は、対照としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質、カルモジュリン及びウサギＩｇＧの混合物の結果を示す。
【０１１４】
レーン８は、プレイタンパク質１５０として、１００ｎＭのサバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質、５００ｎＭのカルモジュリン及び１００ｎＭのウサギＩｇＧの混合物（以下、「プロテインミックス」という。）を使用し、Ｒ７−ＢのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１１５】
レーン９は、対照のプレイタンパク質１５０として、レーン８と同様のプロテインミックスを使用し、Ｒ７−ＤのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１１６】
レーン１０は、対照のプレイタンパク質１５０として、レーン８と同様のプロテインミックスを使用し、Ｒ７−ＥのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体でプルダウンした結果である。
【０１１７】
レーン１１は、対照のプレイタンパク質１５０として、レーン８と同様のプロテインミックスを使用し、アフィニティー選択する前のＶＨＨ抗体ライブラリにコードされるＶＨＨ抗体の集団でプルダウンした結果である。
【０１１８】
レーン１２は、対照のプレイタンパク質１５０として、レーン８と同様のプロテインミックスを使用し、プロテインＡのＢドメインタンパク質でプルダウンした結果である。
【０１１９】
以上の結果から、Ｒ７−Ａ、Ｒ７−Ｂ、Ｒ７−Ｄ及びＲ７−ＥのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体は、特異的にサバイビンに結合する一方、カルモジュリンやウサギＩｇＧには結合しないことが明らかとなった。結果は示していないが、Ｒ７−ＣのＤＮＡ断片にコードされるＶＨＨ抗体も、同様にサバイビンに対する特異的な反応性を示した。
【０１２０】
［実験例５］
（抗体遺伝子の発現）
実験例３において、２４クローン中最もクローン数が多かった、Ｒ７−ＡのＤＮＡ断片がコードするＶＨＨ抗体を発現させた。
【０１２１】
発現にはブレビバチルス分泌発現システム（型番「ＨＢ２００」及び「ＨＢ３００」、タカラバイオ社）を使用した。上記システムには、菌体外に発現産物を分泌させる機能を有するシグナル配列が異なるベクターが４種類用意されている。また、ベクターサイズやプロモーターが異なるベクターが２種類用意されている。
【０１２２】
これらの６種類のベクターそれぞれにＲ７−ＡのＤＮＡ断片を挿入した発現ベクターを作製した。ここで、ＶＨＨ抗体の発現の検出が容易なように、ＶＨＨ抗体のＣ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ×６）を配置した。
【０１２３】
上記の６種類のいずれの発現ベクターを用いても、ＶＨＨ抗体の発現性に大きな違いが認められなかった。そこで、培養上清取得後に精製又はバッファー交換が必要になる２ＳＹ培地ではなく、ＴＭ培地で形質転換体の培養を行った。
【０１２４】
より具体的には、１００ｍＬのＴＭ培地に形質転換体を接種し、３０℃で７０時間振とう培養した。続いて、培養物を３６５０×ｇ、４℃で３０分間遠心し、培養上清を回収した。
【０１２５】
回収した培養上清をポアサイズ０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を以下の精製に供した。まず、空のＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）にヒスチジンタグ標識タンパク質精製用担体であるＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）２ｍＬ（担体は１ｍＬ）を詰め、２０％エタノール、ミリＱ水及び洗浄バッファーで洗浄した。
【０１２６】
続いて、上記の担体に、上述した培養上清のろ液を合計１００ｍＬ通過させた。続いて、５０ｍＭのイミダゾールを含む洗浄バッファー１０ｍＬで３回洗浄した。続いて、カラムに２５０ｍＭのイミダゾール溶液１ｍＬを添加し、結合タンパク質を溶出した。同様の溶出を更に２回繰り返した。続いて、カラムに５００ｍＭのイミダゾール溶液１ｍＬを添加し、結合タンパク質を溶出した。同様の溶出を更に４回繰り返した。
【０１２７】
図８（ａ）はＶＨＨ抗体の精製の過程で適宜採取したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルー染色した結果を示す写真である。
【０１２８】
図中の「Ｅ（２５０ｍＭ）」は２５０ｍＭのイミダゾール溶液で溶出したフラクションであることを表し、数字はフラクション番号を表す。同様に、「Ｅ（５００ｍＭ）」は５００ｍＭのイミダゾール溶液で溶出したフラクションであることを表し、数字はフラクション番号を表す。
【０１２９】
図８（ｂ）は、図８（ａ）のポリアクリルアミドゲルを膜に転写して、ＨＲＰ標識抗ヒスチジンタグ抗体（インビトロジェン社）を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す写真である。
【０１３０】
その結果、図８（ｂ）の矢印で示す位置に、ＶＨＨ抗体（モノマー）のバンドが検出され、ＶＨＨ抗体が発現したことが確認された。
【０１３１】
［実験例６］
（結合定数ＫＤの測定１）
実験例５で精製したＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）を用いて、サバイビンに対する結合定数を測定した。結合定数の測定にはビアコア（型式「Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００」、ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を使用した。
【０１３２】
ビアコアのセンサーチップＳＡ（ストレプトアビジン）に、上述したビオチン−ＣＢＰ（ビオチン標識したカルモジュリン結合ペプチド）を固定化した。続いて、カルシウムイオンを含むバッファー中で、ビオチン−ＣＢＰと、サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質とを接触させることにより、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドとを結合させ、サバイビンをセンサーチップ上に固定化した。
【０１３３】
上記のセンサーチップに、精製したＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）を導入し、結合定数を測定した。バッファーには、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）及びＨＢＳ−Ｔ＋Ｃａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用した。
【０１３４】
濃度１００、５０、２５、１２．５及び６．２５ｎＭの５段階の希釈系列のＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）を調製し、結合定数を測定した。図９は、結合定数の測定結果（シングルサイクルフィッティング）を示すグラフである。縦軸はシグナル値（相対値）を示し、横軸は時間を示す。
【０１３５】
図１０は、図９の測定結果の表示を変えたものである。縦軸はシグナル値（相対値）を示し、横軸はＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）の濃度を示す。その結果、ＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）の結合定数ＫＤは２．５１×１０−８Ｍであることが算出された。
【０１３６】
［実験例７］
（結合定数ＫＤの測定２）
実験例５で精製したＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）を用いて、サバイビンに対する結合定数を測定した。結合定数の測定には競合ＥＬＩＳＡ法を使用した。
【０１３７】
Djavadi-Ohaniance L., et al., In Antibody Engineering (Eds.: McCafferty J., et al.), Chapter 4, 77-97, 1996, IRL Press, Oxford を参考にして、次のようにして結合定数を測定した。
【０１３８】
図１１は、競合ＥＬＩＳＡ法による結合定数の測定方法を説明する概略図である。まず、ＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）１０００の濃度を一定にし、抗原であるサバイビン１０１０の濃度を変化させた、抗原−ＶＨＨ抗体混合溶液を用意した。続いて、抗原とＶＨＨ抗体とを十分な時間反応させて平衡化させた。
【０１３９】
続いて、抗原を固体化したＥＬＩＳＡ用プレートに、平衡化させた上記の抗原−ＶＨＨ抗体混合溶液を添加し、抗原−ＶＨＨ抗体混合溶液中で抗原に結合していなかったＶＨＨ抗体をＥＬＩＳＡ用プレート上の抗原に結合させ、洗浄した。
【０１４０】
続いて、ＥＬＩＳＡ用プレートに結合したＶＨＨ抗体を検出した。まず、１次抗体として抗ヒスチジンタグ抗体を反応させ、洗浄した。なお、上述したように、ＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）のＣ末端にはヒスチジンタグが導入されているため、抗ヒスチジンタグ抗体で検出することができる。続いて、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を反応させ、洗浄した。続いて、基質液を添加し、発色量をプレートリーダーで測定した。
【０１４１】
その結果、ＶＨＨ抗体（Ｒ７−Ａ）の結合定数ＫＤは５．１６×１０−７Ｍであることが算出された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明によれば、反応性の高い抗サバイビン抗体又は抗体誘導体を提供することができる。また、抗サバイビン抗体又は抗体誘導体をコードする核酸、検出キット、サバイビンの検出方法及び癌の治療剤を提供することができる。
【符号の説明】
【０１４３】
１００…ｍＲＮＡ、１１０…核酸リンカー、１２０…ＶＨＨ抗体タンパク質、１３０…ストレプトアビジン結合ビーズ、１３５…ストレプトアビジン結合磁性ビーズ、１４０…ｃＤＮＡ、１５０…プレイタンパク質、２００…サバイビンとカルモジュリンとの融合タンパク質、２１０…ビオチン標識したカルモジュリン結合ペプチド、１０００…ＶＨＨ抗体、１０１０…サバイビン、Ｂ…ビオチン、Ｆ…フルオレセイン、Ｐｕ…ピューロマイシン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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