(57)【要約】【課題】  抗酸化作用を有するフェルラ酸のような生理活性物質の溶解性を高め、生体内における生理活性物質の利用性を高める。【解決手段】  紫黒米のような有色素米の米糠をセルラーゼ酵素剤などで酵素処理を行い米糠の酵素処理物を得る。さらには当該米糠酵素処理物の抽出物、好ましくは水抽出物を得る。当該米糠酵素処理物又は水抽出物を、生理活性物質の溶解補助剤又は吸収促進剤として用いる。当該米糠酵素処理物や抽出物を用いて製造された医薬組成物や食品組成物を摂取することで、それらに含まれる生理活性物質の生物学的利用能が高められる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼによる米糠酵素処理物及び／又は当該米糠酵素処理物の抽出物を含む吸収促進剤又は溶解補助剤。
【請求項２】
米糠をセルラーゼによって酵素処理を行う工程を有する米糠由来の吸収促進剤又は溶解補助剤の製造方法。
【請求項３】
セルラーゼで酵素処理された米糠酵素処理物をさらに溶媒で抽出する工程を有する請求項２に記載の米糠由来の吸収促進剤又は溶解補助剤の製造方法。
【請求項４】
セルラーゼによる米糠酵素処理物及び／又は当該米糠酵素処理物の抽出物を用いて溶質を含水溶媒に溶解する方法。
【請求項５】
セルラーゼによる米糠酵素処理物及び／又は当該米糠酵素処理物の抽出物を用いて生理活性物質の体内への吸収量を増大させる方法。
【請求項６】
セルラーゼによる米糠酵素処理物及び／又は当該米糠酵素処理物の抽出物を加える工程を有する医薬組成物又は食品組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は米糠酵素処理物の利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粳米や有色米などの米糠を酵素処理して生理活性物質を得ようとする試みが行われている。例えば、特許文献１（特開平９−１３２５３３号公報）には、米糠に液化型アミラーゼを作用させた後に、セルラーゼ、プロテアーゼ及び糖化型アミラーゼによる酵素処理を行い、さらにその処理液を発酵させることで、潰瘍抑制剤や肝臓障害抑制剤が得られることが示されている。特許文献２（特開２０１３−２０３６９６号公報）には、１００℃超で加熱処理した米糠を、ペクチナーゼ及びマンナナーゼに加え、セルラーゼ及び／又はクロロゲン酸エステラーゼで酵素処理することで、高血圧の予防又は治療剤が得られることが示されている。
【０００３】
一方、特許文献３（特表２００３−５２６３５５公報）には、米糠を加圧押出機で加圧押出した処理物をセルラーゼなどの細胞壁加水分解酵素で処理することで、抗酸化物質であるフェルラ酸を製造することが示されている。さらに特許文献４（特開２００６−１６６８３４号公報）には、予めエタノールと振とうした後の米糠処理物をドリセラーゼ処理することで、フェルラ酸を抽出することが示されている。そして、フェルラ酸を含有する米糠酵素処理物が血圧上昇抑制作用や腎機能を改善することが示されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献３や４は米糠からフェルラ酸を効率良く抽出し、得られたフェルラ酸を含む生成物をすることを開示するものであって、米糠の酵素処理物とフェルラ酸との相互作用については何ら示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１３２５３３号公報
【特許文献２】特開２０１３−２０３６９６号公報
【特許文献３】特表２００３−５２６３５５公報
【特許文献４】特開２００６−１６６８３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は米糠の酵素処理物中におけるフェルラ酸の挙動に着目してなされたものであり、本発明の課題はフェルラ酸のような生理活性物質の体内吸収効率を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明においては、米糠の酵素処理物あるいはその抽出物を、生理活性物質をはじめとする種々の媒質と共に用いることで水を含む溶媒に対する溶解度や腸管からの吸収量を高める。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、フェルラ酸などの各種媒質の水に対する溶解度が向上する。これにより、例えばより多くの生理活性物質を食品中に配合することができ、例えばフェルラ酸のもつ抗酸化作用をさらに活用できる。また、ヒトを含めた動物における体内吸収量が高まるので、当該生理活性物質の有用性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は膜透過試験後のＨＰＬＣ分析によるクロマトグラフである。上の線はインサート内側を、下の線はインサート外側を、破線は溶媒中のアセトニトリル比を示す。
【図２】図２は膜透過液のＨＰＬＣ分析によるクロマトグラフである。実線は膜透過液を、破線は溶媒中のアセトニトリル比を示す。
【図３】図３は高い抗酸化活性が認められた画分（Fr.6）のESI/MS分析結果を示すチャート及びクロマトグラムである。
【図４】図４は経口投与時の血漿中濃度を示すグラフである。
【図５】図５は最大血漿中濃度時における抗酸化活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る吸収促進剤又は溶解補助剤は、米糠を酵素処理した酵素処理物及び／又はその抽出物（以下両者を含めて「酵素処理物等」という）を含む。本発明において米糠は当業者が用いる意味で用いられ、玄米を白米に精米する過程で除去される米の果皮、種皮、糊粉層、胚芽等を含む総称である。本発明においては糠が付着した玄米を用いても差し支えない。また、用いられる玄米は、例えば粳米、糯米、有色米（紫黒米や赤米など）、酒米であり、それらの品種は問われない。
【００１１】
酵素処理はセルラーゼを用いて行われる。セルラーゼは、β-1,4-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素である。セルラーゼには、分子内部からグルコシド結合を分解するエンド型セルラーゼと、糖鎖の還元末端又は非還元末端のいずれかの末端からグルコシド結合を分解するエキソ型セルラーゼがあるが、何れの型のセルラーゼも用いられ得る。また、酵素処理を行うセルラーゼは単一の酵素である必要はなく、複数種の混合酵素であってもよい。微生物から得られるセルラーゼの多くは複数種のセルラーゼを含み、セルラーゼ酵素剤として上市されているセルラーゼも用いられ得る。また、本発明に係る吸収促進剤又は溶解補助剤はセルラーゼによる酵素処理物がその本質であると考えられるので、酵素処理ではセルラーゼのみを用いるのが望ましいが、吸収促進作用や溶解補助作用を失活させない範囲でペクチナーゼやマンナナーゼ、アミラーゼなどのセルラーゼ以外の酵素を作用させても差し支えない。
【００１２】
酵素処理の条件は適宜当業者が決定できる事項であり、例えば２０〜４０℃で２〜４８時間程度、セルラーゼと米糠を接触させる。好ましくは使用されるセルラーゼに適した条件が選択される。
【００１３】
得られた酵素処理物はそのまま本発明に係る吸収促進剤又は溶解補助剤として用いられる他、さらに適当な抽出溶媒で抽出される。用いられる抽出溶媒は親水性溶媒又は親油性溶媒のいずれでもよい。親油性溶媒や親油性溶媒は当業者が通常用いる意味で用いられる。抽出溶媒は例えば水であり、メタノールやエタノール、イソプロパノールなどのアルコールであり、アセトンなどのケトンであり、エチルエーテルなどのエーテルであり、グリセリンなどの多価アルコールであり、酢酸エチルなどのエステルであり、ヘキサンやヘプタンなどのアルカンであり、ベンゼンやキシレンなどの芳香族炭化水素であり得る。これらのうち親水性溶媒が好ましく、水又は水とその他の親水性溶媒との混液、好ましくは水である。抽出液はそのまま用いられる他、適宜濃縮や凍結乾燥などの操作が施されることもある。
【００１４】
得られた酵素処理物等は、各種物質の吸収促進剤や溶解補助剤として用いられる。本発明における吸収促進剤は、生理活性物質と酵素処理物等をヒトを含む動物に経口投与若しくは摂取させた場合に、酵素処理物等を用いない場合に比べて吸収量を増大させることを意味する。吸収量を増大させるとは、主としてバイオアベイラビリティ（生物学的利用能）を向上させることを意味する。さらに具体的に言うと、血中濃度の最高濃度が高まること、生物学的利用率が向上すること、吸収速度が向上することの少なくとも何れかが該当することを意味する。従って、本発明に係る酵素処理物等と併用することで、生理活性物質、特に難溶性物質のバイオアベイラビリティが高められる。
【００１５】
また、本発明における溶解補助剤は、媒質となり得る各種物質と酵素処理物等を含水溶媒、すなわち水又は水と親水性溶媒の混液に溶解した場合に、酵素処理物等を用いない場合に比べて溶解量、言い換えると飽和濃度を増大させる作用を有する。従って、本発明に係る溶解補助剤を用いることで、当該溶解補助剤を用いない場合に比べて多くの量の各種物質を溶解させることができる。
【００１６】
本発明に係る吸収促進剤や溶解補助剤が併用される対象物質は特に限定されないが、吸収促進作用を期待する場合には、経口投与され得る生理活性物質が好ましい物質である。生理活性物質は、医薬品であるか否かを問わず、例えば抗酸化物質、具体的にはフェニル酸やフラボノイド（例えばヘスペリジン）のようなポリフェノール、リボフラビンであり得る。また、生理活性物質は種々の医薬品でもあり、例えば抗生物質や抗がん剤であり得る。
【００１７】
本発明に係る酵素処理物等は、好ましくは種々の医薬用素材や食品用素材と共にそれぞれ医薬組成物や食品組成物の製造に用いられ得る。これらの医薬組成物や食品組成物を摂取することで、これらの組成物に含まれる生理活性物質の作用がさらに発揮されることが期待される。また、溶解補助剤は医薬組成物や食品組成物の製造以外の工業用用途にも使用され得る。もちろん、酵素処理物等と対象物質を含む組成物とすることなく、両者を併用することでも吸収促進作用等が期待されるのは言うまでもない。
【００１８】
次に記の実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、本発明は下記の実施例に限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００１９】
〔紫黒米糠の酵素処理〕
紫黒米（品種「朝紫」）の米糠約20gに、トリコデルマ由来セルラーゼ製剤（エイチビィアイ株式会社製「セルロシンＴ２」：セルラーゼ９５％、デキストリン５％含有）1gを40℃の酢酸緩衝液（0.02M、pH4)50.0mL中で4時間作用させた。反応物を回収後、凍結乾燥した。この酵素処理物5ｇを100mLの超純水に入れ、室温で5分間攪拌した。続いて、20℃で8.0×1000rpm（9.87×1000g）の条件で5分間遠心した。その上清を採取し、残った沈澱に再度超純水を100mL加えて室温で5分間攪拌し、先ほどと同じ条件で遠心を行った。上記の操作を計4回行い、採取した4回分の上清をエバポレーターで濃縮して凍結乾燥して、酵素処理物の水抽出物を得た。沈殿物も凍結乾燥した。
【００２０】
〔Caco2細胞膜を用いた膜透過試験〕
前記調整した水抽出物を100mg/mLの濃度になるように超純水に溶解して、透過試験用のサンプル溶液を調製した。３週間インサートで培養したCaco-2細胞の単層膜のTEER値を測定して細胞の状態に問題が無いかを確認した後、インサートの外側の培地を吸い取り、PBS(-)（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline：GIBCO社製）で3回洗浄した。インサート内の培地も全て吸い取り、PBS(-)で1回洗浄した後、インサートの内側に1mL、外側に2mLのPBS(-)を入れた。その後、37℃、CO2濃度5％で1時間インキュベートした。その1時間後に細胞膜を顕微鏡で観察するとともにTEER値を測定した。この時のTEER値を透過前のTEER値とし、細胞膜が正常であることを確認した。インサート内のPBS(-)を100μL取り出し、サンプル溶液を100μL加えた。そして、37℃、CO2濃度5％のインキュベーターの中で２時間放置した。その後、細胞膜を顕微鏡で確認した後、インサート内側（Apical：AP側)及び外側(Basolatera：BL側）のPBS(-)をそれぞれ回収し、10000rpmで5分間遠心分離して得られた上清を分析用サンプルとした。なお、透過後の細胞膜の生存率が７０％以上であることを確認した。
【００２１】
分析用サンプルについて下記の条件でHPLC分析を行ったところ、図１に示すチャートが得られた。この結果、酵素処理米糠の水抽出物中には、Caco2細胞を透過する物質が存在することが見いだされた。なお、30分以降にはピークは観察されなかった。
（HPLC条件）
カラム：Cadenza CD-C18(3μm) 150×4.6mm I.D.
温度：35℃
溶媒：A)0.05v/v％ HCOOH aq
：B)Acetonitrile in 0.05v/v％ HCOOH(ACN)
検出：UV 270nm
流速：1.0mL/min
グラジエント：０−５分    ACN３％
５−４５分  ACN３−５０％
４５−５０分  ACN５０−８０％
５０−６５分  ACN８０％
【００２２】
次に、BL側の分析用サンプルについて下記条件でHPLC分取を行い、図２に示すFr.1〜Fr.7の各画分について、PAO抗酸化能測定キット（日研ザイル社製）を用いて抗酸化能を測定した。なお、スタンダードにはTroloxを用い、各サンプル1g当たりのTrolox μmol当量を算出した。その結果、Fr.6に高い抗酸化能（935μmol/g）が認められた。当該Fr.６についてESI/MS分析を行ったところ、図３に示すように、分子量（m/z）が193であるフェルラ酸のピークが認められ、フェルラ酸がCaCo2膜を良好に透過することが確認された。
（HPLC条件）
カラム：Cadenza CD-C18(3μm) 250×10mm I.D.
温度：35℃
溶媒：A)0.05v/v％ HCOOH aq
：B)Acetonitrile in 0.05v/v％ HCOOH(ACN)
検出：UV 270nm
流速：2.5mL/min
グラジエント：  ０−１０分  ACN  ３％
１０−２０分  ACN  ３−９％
２０−３５分  ACN  ９−１５％
３５−６０分  ACN１５−３２％
６０−８０分  ACN３２−８２％
８０−９０分  ACN８２％
【００２３】
〔フェルラ酸の溶解度試験〕
上記で得られた酵素処理物を200mg/mLとなるように超純水に懸濁させ、20℃で8.0×1000rpm（9.87×1000g）の条件で5分間遠心した。その上清をフィルター(0.45μm)でろ過し、酵素処理物の水溶液を作成した。10mg/mLになるようにフェルラ酸を当該水溶液又は超純水に懸濁させ、ボルテックスで1min攪拌後、5minの超音波処理を行ったのち、40℃の恒温槽中で10minの加熱を行った。得られた懸濁液を15000rpm 10minの遠心分離を行い、上清をフィルター(0.45μm)でろ過した後、HPLC分析を行い各溶液中のフェルラ酸濃度を測定した。
【００２４】
その結果を表１に示した。このことから、紫黒米米糠の酵素処理物は水に対するフェルラ酸の溶解度（20℃、0.89mg/mL）を１０倍程度向上させることが分かった。
【００２５】
【表１】
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【実施例２】
【００２６】
〔フェルラ酸の膜透過性評価〕
上記で得た酵素処理物の水抽出物をHBSS（Hank's Balanced Salt Solution、Gibco社製）に100mg/mLになるように懸濁させ、1分間ボルテックスで撹拌した。その後、5分間超音波処理し、40℃で10分間加熱した。25℃、15000rpm、10分の条件で遠心して上清をフィルターろ過した物を米糠水溶液とした。フェルラ酸を7mg/mLの濃度になるように米糠水溶液に溶解して、評価用サンプルとした。また、フェルラ酸を0.1％(v/v)DMSO in HBSSに1mMになるように溶解して、対照用サンプルとした。
【００２７】
実施例１の膜透過性試験と同様にして膜透過性試験を行った。インサートの内側には1mL、外側には2mLのHBSSを入れ、37℃、５％CO2濃度で1時間プレインキュベートした。その後、インサート内のHBSSを100μLを取り出し、各サンプル溶液を100μL加えた。37℃、５％CO2濃度のインキュベーター内で静置し、サンプル添加後10分、20分後にBL側の液を100μLずつ回収し、30分後には全量の液を回収した。回収した液中のフェルラ酸濃度を、ＨＰＬＣにより求め、次の計算式により膜透過係数Ｐapp（cm/sec)を求めた。これによる膜等価係数（Ｐapp  AP→BL）は1.34±0.03（n=3)であり、対照（HBSS：0.91±0.03)に比べて統計的有意差（Welch's t-test：P<0.01）が見られた。
Ｐapp＝（ΔＱ／Δｔ）／（Ａ・Ｃ０）
ΔＱ／Δｔ：化合物透過速度の傾き（mol or g/sec）
Ａ：トランスウェルインサートの表面積（cm2）
Ｃ０：化合物添加時の濃度（mol or g/cm3）
【００２８】
〔経口投与試験〕
溶解度試験で作製した酵素処理物の水溶液又は超純水に、5mg/mLの濃度となるようにフェルラ酸を加え、懸濁させ、ボルテックスで1min攪拌後、5minの超音波処理を行ったのち、40℃の恒温槽中で10minの加熱を行い、投与サンプルを得た。経口投与開始12時間前から絶食、同2時間前から絶飲させたラット（Kwl:Wister、SPF、9週令の雄）に投与サンプルを1ml経口投与した。経口投与後0、5、10、15、30、60分の時点で尾動脈又は尾静脈から血液を約100μlずつ採取した。採取した血液を遠心して、上清を血漿として回収した。回収した血漿に対し、下記の除蛋白処理を行い、下記の条件にてHPLC分析により血漿中のフェルラ酸を測定した。その結果を表２及び図４に示した。また、ピーク濃度における抗酸化活性をPAO抗酸化能測定キットを用いて測定した。その結果を図５に示した。
（HPLC条件）
カラム：Accucore C18（2.6μm) 150×4.6mm I.D.
温度：50℃
溶媒：A)0.1v/v% HCOOH aq
：B)Acetonitrile in 0.1v/v％ HCOOH(ACN)
検出：UV322nm
流速：1.3mL/min
グラジエント：０−１５分  ACN８％
１５−１５.１分  ACN８−１００％
【００２９】
（除蛋白処理）
血漿50μlに対し、１M HClを5μL、酢酸エチルを150μLを加えて激しくボルテックスで2min攪拌後、４℃で15000rpm 5minの遠心分離を行い100μLの上清を回収した。再抽出処理として、残渣に酢酸エチル100μLを加えてボルテックスで2min攪拌した後、遠心して上清を先のものと合わせて回収した。再抽出処理は2回繰り返した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
酵素処理物（米糠水溶液）とフェルラ酸を同時に摂取させることで、フェルラ酸のみを摂取させた場合に比べて、血漿中の最大濃度（Cmax)は高くなり、生物学的利用率の指標となるAUC(0-60min）も格段に大きくなった。また、フェルラ酸のみを摂取した場合ではフェルラ酸が最大濃度となる時間における抗酸化能は検出されなかったが、同時摂取することで抗酸化活性（55μmol TE/mL）が検出された。このことから、酵素処理米糠にはフェルラ酸の膜透過性を向上し、ラット体内への吸収量を増加させることで、フェルラ酸による血中の抗酸化能を向上させる効果があると言える。
【実施例３】
【００３２】
〔ヘスペリジン及びリボフラビンの溶解度試験〕
実施例１と同様の方法にてヘスペリジン及びリボフラビンの溶解度試験を行った。その結果を表３に示した。リボフラビンでは約１０倍、ヘスペリジンでも約２.２倍に溶解度が向上した。
【００３３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明はフェルラ酸をはじめとする種々の抗酸化物質の生体内利用効率を高める。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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