(57)【要約】【課題】本発明の目的は、膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療において、有用な薬剤を提供することにある。【解決手段】本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤に関するものである。該抽出物を有効成分とする薬剤は、ヒトにおいて膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療効果が高いことが認められた上、安全性も非常に高いことから、極めて有用性の高いものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸製剤と併用することを特徴とする請求項１に記載の改善又は治療剤。
【請求項３】
膝蓋軟骨軟化症による膝の痛みに対する請求項１又は２に記載の改善又は治療剤。
【請求項４】
炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の改善又は治療剤。
【請求項５】
注射剤である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の改善又は治療剤。
【請求項６】
経口剤である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の改善又は治療剤。
【請求項７】
膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤の製造のためのワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の使用。
【請求項８】
膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤がヒアルロン酸製剤と併用されるものである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
膝蓋軟骨軟化症による膝の痛みの改善又は治療剤の製造のための請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項７乃至９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤が注射剤である請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤が経口剤である請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物（以下「本抽出物」と表記することがある。）の新規な医薬用途に関するものである。より具体的には、本抽出物を有効成分として含有する膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膝蓋軟骨化症は膝蓋骨の裏側の軟骨が軟化し、膝蓋大腿関節の痛みが主症状の、臨床でよく見られる骨関節の疾患である。膝蓋軟骨化症患者の多くは明らかな外傷歴又は慢性的な微損傷の積み重ねがあり、病理特徴としては膝蓋骨の軟骨の軟化、亀裂、脱落、変性などが見られる。膝蓋軟骨化症による関節痛の特徴は、膝関節の前側の鈍痛や違和感から始まり、徐々に膝関節痛へ発展し、特に、階段の登り降りなどの運動をした時に痛みが酷くなることである。
【０００３】
中等度の膝蓋軟骨化症患者に対しては、経口非ステロイド性抗炎症剤及び物理療法を用いて治療が施される。しかし、長期にわたる物理療法は仕事に支障をきたし、費用もかさむため、患者のコンプライアンスが低い傾向にある。また、患者のほとんどが手術を拒むため、臨床ではヒアルロン酸製剤の関節内注射療法を選択するのが一般的である。関節内注射療法は効果が確かで、合併症も少ないため、臨床現場で広く用いられている。このような状況において、関節内注射療法の効果をさらに向上させる方法が臨床現場で求められている。
【０００４】
本発明に係る膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤の有効成分であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物については、鎮痛作用、鎮静作用、抗ストレス作用、抗アレルギー作用（特許文献１参照）、免疫促進作用、抗癌作用、肝硬変抑制作用（特許文献２参照）、特発性血小板減少性紫斑病に対する治療効果（特許文献３参照）、帯状疱疹後神経痛、脳浮腫、痴呆、脊髄小脳変性症等への治療効果（特許文献４参照）、レイノー症候群、糖尿病性神経障害、スモン後遺症等への治療効果（特許文献５参照）、カリクレイン産生阻害作用、末梢循環障害改善作用（特許文献６参照）、骨萎縮改善作用（特許文献７参照）、敗血症やエンドトキシンショックの治療に有効な一酸化窒素産生抑制作用（特許文献８参照）、骨粗鬆症に対する治療効果（特許文献９参照）、Ｎｅｆ作用抑制作用やケモカイン産生抑制作用に基づくエイズ治療効果（特許文献１０、１１参照）、脳梗塞等の虚血性疾患に対する治療効果（特許文献１２参照）、線維筋痛症に対する治療効果（特許文献１３参照）、感染症に対する治療効果（特許文献１４参照）、抗癌剤による末梢神経障害の予防又は軽減作用（特許文献１５参照）、慢性前立腺炎、間質性膀胱炎及び／又は排尿障害の治療効果（特許文献１６参照）、BDNF等の神経栄養因子の産生促進作用（特許文献1７参照）、軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成促進作用（特許文献１８参照）など非常に多岐に及ぶ作用・効果が知られている。しかし、本抽出物が、膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療に有効であることはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５３−１０１５１５号公報
【特許文献２】特開昭５５−８７７２４号公報
【特許文献３】特開平１−２６５０２８号公報
【特許文献４】特開平１−３１９４２２号公報
【特許文献５】特開平２−２８１１９号公報
【特許文献６】特開平７−９７３３６号公報
【特許文献７】特開平８−２９１０７７号公報
【特許文献８】特開平１０−１９４９７８号公報
【特許文献９】特開平１１−８０００５号公報
【特許文献１０】特開平１１−１３９９７７号公報
【特許文献１１】特開２０００−３３６０３４号公報
【特許文献１２】特開２０００−１６９４２号公報
【特許文献１３】国際公開ＷＯ２００４／０３９３８３号公報
【特許文献１４】特開２００４−３００１４６号公報
【特許文献１５】国際公開ＷＯ２００９／０２８６０５号公報
【特許文献１６】国際公開ＷＯ２０１１／１１１７７０号公報
【特許文献１７】国際公開ＷＯ２０１１／１６２３１７号公報
【特許文献１８】国際公開ＷＯ２０１２／０５１１７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療に有効で且つ安全性が高い薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、有効な治療法が求められている膝蓋軟骨軟化症の薬剤治療について鋭意研究を行った結果、本抽出物を有効成分として含有する製剤が膝蓋軟骨軟化症に対して優れた改善又は治療効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００８】
本抽出物は、膝蓋軟骨軟化症を改善又は治療するという優れた薬理作用を有する。また、該抽出物を有効成分として含有する薬剤は、副作用等の問題点の少ない安全性の高い薬剤であるため、本発明は極めて有用性の高いものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した動物の炎症組織から抽出分離した非蛋白性の活性物質を含有する抽出物である。本抽出物は、抽出された状態では液体であるが、乾燥することにより固体にすることもできる。本抽出物を有効成分として含有する薬剤（以下「本製剤」という。）は、医薬品として非常に有用なものである。この場合、本抽出物が本製剤の有効成分であるから、本抽出物は本製剤の原薬ということになる。本製剤として出願人が日本において製造し販売している具体的な商品に「ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液含有製剤」（商品名：ノイロトロピン／NEUROTROPIN〔登録商標〕）がある。この製剤には、注射剤と錠剤があり、いずれも医療用医薬品（ethical drug）である。
【００１０】
ノイロトロピンの注射剤の適応症は、「腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、蕁麻疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン（SMON）後遺症状の冷感・異常知覚・痛み」である。ノイロトロピンの錠剤の適応症は、「帯状疱疹後神経痛、腰痛症、頸肩腕症候群、肩関節周囲炎、変形性関節症」である。本製剤は、出願人が創製し、医薬品として開発したものであり、その有効性と安全性における優れた特長が評価され、長年にわたり販売されて、日本の医薬品市場で確固たる地位を確立しているものである。
【００１１】
本発明におけるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物はワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。即ち、例えば、以下のような工程である。
（A）ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液又はフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過又は遠心分離することによって抽出液（濾液又は上清）を得る。
（B）前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過又は遠心分離する。
（C）得られた濾液又は上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（D）前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固又は凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。
【００１２】
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの炎症皮膚組織が好ましい。ウサギはウサギ目に属するものであればいかなるものでもよい。例としては、アナウサギ、カイウサギ（アナウサギを家畜化したもの）、ノウサギ（ニホンノウサギ）、ナキウサギ、ユキウサギ等がある。これらのうち、カイウサギが使用するには好適である。日本では過去から飼育され家畜又は実験用動物として繁用されている家兎（イエウサギ）と呼ばれるものがあるが、これもカイウサギの別称である。カイウサギには、多数の品種（ブリード）が存在するが、日本白色種やニュージーランド白色種（ニュージーランドホワイト）といった品種が好適に用いられ得る。
【００１３】
ワクシニアウイルス（vaccinia virus）は、いかなる株のものであってもよい。例としては、リスター（Lister）株、大連（Dairen）株、池田（Ikeda）株、ＥＭ−６３株、ニューヨーク市公衆衛生局（New York City Board of Health）株等が挙げられる。
【００１４】
本抽出物の基本的な抽出工程としては、例えば、以下のような工程が用いられる。
工程（A）について
ウサギの皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取する。採取した皮膚組織はフェノール溶液等で洗浄、消毒を行なう。この炎症皮膚組織を破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加える。ここで、破砕とは、ミンチ機等を使用してミンチ状に細かく砕くことを意味する。また、抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、フェノール等の殺菌・防腐剤、グリセリン等の安定化剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。得られた懸濁液を、5日乃至12日間放置する。その間、適宜攪拌しながら又は攪拌せずに、30乃至45℃に加温してもよい。得られた液を固液分離（濾過又は遠心分離等）によって組織片を除去して粗抽出液（濾液又は上清）を得る。
【００１５】
工程（B）について
工程（A）で得られた粗抽出液について除蛋白処理を行う。除蛋白は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤（例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒など）による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去した濾液又は上清を得る。
【００１６】
工程（C）について
工程（B）で得られた濾液又は上清を、酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、活性成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
【００１７】
工程（D）について
工程（C）で得られた吸着剤から活性成分を溶出（脱離）させるには、当該吸着剤に溶出溶媒を加え、塩基性、好ましくはpH9乃至12に調整し、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去する。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。溶出溶媒の量は適宜設定することができる。このようにして得られた溶出液を、原薬として用いるために、適宜pHを中性付近に調整するなどして、最終的にワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（本抽出物）を得ることができる。
【００１８】
本抽出物は、できた時点では液体であるので、適宜濃縮・希釈することによって所望の濃度のものにすることもできる。本抽出物から製剤を製造する場合には、加熱滅菌処理を施すのが好ましい。注射剤にするためには、例えば塩化ナトリウム等を加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することができる。また、液体の状態の本抽出物に適切な濃縮乾固等の操作を行うことによって、錠剤等の経口用固形製剤を製造することもできる。本抽出物からこのような経口用固形製剤を製造する具体的な方法は、日本特許第3818657号や同第4883798号の明細書に記載されている。本製剤はこうして得られる注射剤や経口用固形製剤等である。
【００１９】
治療の必要な患者へ薬学的に有効な量を投与する方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられ、投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販の製剤で認められている投与量は、基本的には内服では1日16NU、注射剤では1日3.6乃至7.2NUを投与するよう医療用医薬品としては示されているが、疾患の種類、重傷度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である（NU：ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100 mg／kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。）
【００２０】
以下に、本抽出物の製造方法の例、並びに本抽出物の新規な薬理作用、膝蓋軟骨軟化症に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１（本抽出物の製造）
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種し、発痘した皮膚を切り取り採取した。採取した皮膚はフェノール溶液で洗浄・消毒を行なった後、余分のフェノール溶液を除去し、破砕して、フェノール溶液を加え混合し、3〜7日間放置した後、さらに3〜4日間攪拌しながら35〜40℃に加温した。その後、固液分離して得た抽出液を塩酸でpH4.5〜5.2に調整し、90〜100℃で30分間、加熱処理した後、濾過して除蛋白した。さらに、濾液を水酸化ナトリウムでpH9.0〜9.5に調整し、90〜100℃で15分間、加熱処理した後、固液分離した。
【００２２】
得られた除蛋白液を塩酸でpH4.0〜4.3に調整し、除蛋白液質量の2％量の活性炭を加えて2時間撹拌した後、固液分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.5〜10とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。遠心分離で沈澱した活性炭に再び水を加えた後、水酸化ナトリウムでpH10.5〜11とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、本抽出物を得た。
【００２３】
実施例２（試験方法）
次に、上記実施例１で得られた本抽出物を有効成分として含有する製剤（本製剤）の膝蓋軟骨軟化症に対する作用（改善又は治療効果）についての試験結果の一例を示す。
【００２４】
本製剤の膝蓋軟骨軟化症に対する効果を調べるために、以下の通りヒトにおいて試験を行った。
【００２５】
（１）  試験（試験期間：2011年1月から2012年9月）
膝蓋軟骨軟化症と診断された患者60例を30例ずつ、無作為に本製剤投与群と対照群の2組に群分けした。対照群に対して、ヒアルロン酸2.0mLを毎週1回、関節内注射により5回投与した。本製剤投与群に対してはヒアルロン酸2.0mL及び「ノイロトロピン注射液3.6単位」（本製剤のうち注射剤の商品名）1管を毎週1回、関節内注射により5回投与した。関節内注射については、膝蓋大腿関節の外側穿刺法を用いた。仰臥位にて患者の膝関節を15〜20度屈曲させて、皮膚を通常の方法で消毒し、膝蓋骨の外縁上1/3と大腿骨の外側顆の間を穿刺部位として、5mL注射器を用いて膝蓋大腿関節腔に沿って膝関節嚢に入れて、注射器を引いて関節液があったことを確認した後、できるだけ完全に関節液を吸い取り、針を残したままで、徐々に関節内に注射した。基本的に他の薬剤は併用しなかった。治療の終了後に治療効果の判定を行った。
【００２６】
（２）  治療効果の判定
治療効果判定のため、次の診断基準を用いた。
「治癒」は、完全に回復した状態とした。
「著効」は、関節痛や腫れなどの主な症状が消失し、関節機能もほぼ回復し、普通に活動が出来る状態とした。
「有効」は、関節痛や腫れなどの主な症状がほぼ消失し、関節機能もほぼ回復、又は明らかに改善され、日常生活の自立度がアップし、独立した生活がほぼでき、又は作業や仕事をする能力が一部回復した状態とした。
「無効」は、関節痛や腫れなどの主な症状の改善が見られなく、関節活動機能は治療前と比べて改善が見られない状態とした。
上記の診断基準を用いて治療効果の判定を行い、それぞれの群における全症例数に対する治癒率、著効率、有効率及びそれらを合計した総合有効率を算出した。結果を表１に示す。
また、二群に対して、治療前と治療後1ヶ月の膝関節Lysholmスコアにて評価した。結果を表２に示す。
【００２７】
（３）  統計解析
二群間の治療効果の判定についてはカイ２乗検定を用いて検定した。同一群の治療前後のLysholmスコアに対しては対応のあるｔ検定を、二群の治療前後のLysholmスコアに対しては独立したサンプルのｔ検定を用いた。いずれの検定においても、p＜0.05であった場合を「有意」とした。
【００２８】
【表１】
2017014204.tif 000002
【００２９】
【表２】
2017014204.tif 000003
【００３０】
上記表１及び表２の試験結果を統計解析した。その結果、膝蓋軟骨軟化症患者に本製剤を投与した群では、対照群と比較して総合有効率が有意に向上した。このことから、本製剤は、膝蓋軟骨軟化症の症状を全般的に改善又は治療する効果を有する薬剤であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上のとおり、本製剤は膝蓋軟骨軟化症の症状に対して優れた改善又は治療効果を有することが認められた。また、本製剤は長年に亘って使用され、非常に安全性の高い薬剤として認められている。従って、本製剤は膝蓋軟骨軟化症の改善又は治療剤として極めて有用性の高いものである。