(57)【要約】【課題】γ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供する。【解決手段】変異型GAP1遺伝子を保持するように改変された、且つ／又は、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された、γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりγ-Glu-Abuを採取することにより、γ-Glu-Abuを製造する。また、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された、γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することにより、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスを製造する。【選択図】図１
2017046594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-Glu-Abuの製造法であって、
γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および
該培地よりγ-Glu-Abuを採取すること、を含み、
前記酵母が、下記（１）〜（２）から選択される１またはそれ以上の性質を有することを特徴とする、方法：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変され
ている。
【請求項２】
前記変異型GAP1遺伝子が、下記（Ａ）および（Ｂ）の変異を有する遺伝子である、請求項１に記載の方法：
（Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；（Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
【請求項３】
前記９位および１６位のリジン残基がアルギニン残基に置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型Gap1タンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、請求項２または３に記載の方法：
（ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項５】
YGL114w遺伝子の発現を上昇させることにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大した、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記YGL114w遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現
調節配列を改変することによって上昇した、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法であって、
γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含み、
前記酵母が、下記（３）の性質を有することを特徴とする、方法：
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変され
ている。
【請求項８】
YGL114w遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより
、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下した、請求項７に記載の
方法。
【請求項９】
前記YGL114w遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、
酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３０に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号３０に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
前記酵母が、さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素、α−ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記α−ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、サッカロミセス属酵母またはキャンディダ属酵母である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエまたはキャンディダ・ユティリスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
下記（１）、（２）、（３）、または、（１）および（２）の性質を有し、且つ、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変され
ている；
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変され
ている。
【請求項１６】
さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素、α−ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１５に記載の酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母においてγ-Glu-Abuの細胞内外の局在を制御する方法およびその利用に関する。本発明は、特に、γ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法に関する。γ-Glu-Abuやそれを含有する酵母エキスは食品分野にて有用である。
【背景技術】
【０００２】
γ-Glu-Abuは、コク味付与作用を有するペプチドである。「コク味」とは、甘味(sweet
taste)、塩味(salty taste)、酸味(sour taste)、苦味(bitter taste)、うま味(umami)
の５基本味だけでは表すことのできない、厚み(thickness)、ひろがり(growth (mouthfulness))、持続性(continuity)、まとまり(harmony)等の基本味の周辺の味(marginal tastes)や風味（marginal flavor）をも増強した味覚をいう。
【０００３】
γ-Glu-Abuは、γ−グルタミルシステイン合成酵素の作用により、Ｌ−グルタミン酸（L-Glu）およびα−アミノ酪酸（Abu）から生成する。また、Abuは、アミノ基転移酵素の
作用により、α−ケト酪酸（α-KB）から生成する。よって、例えば、α−ケト酪酸合成
酵素、アミノ基転移酵素、γ−グルタミルシステイン合成酵素等のγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性を増強することにより、細胞内のγ-Glu-Abuの蓄積量を増大させることができる（特許文献１）。
【０００４】
Gap1遺伝子は、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）であるGap1タンパク質をコードする遺伝子である。Gap1タンパク質は、全ての天然アミノ酸および
多くのアミノ酸アナログの輸送能を有する。Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてその局在が制御されることが知られている（非特許文献１）。すなわち、Gap1タンパク質は、アミノ酸がほとんど存在しない場合には、細胞膜に局在し、アミノ酸が多量に存在する場合には、ユビキチン化され、液胞で分解される。一方、第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換した変異型Gap1タンパク質は、ユビキチン化部位を持たないため、ユビキチン化による分解を受けない。そのためこの変異型Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に依存せず、細胞膜に常局在する（非特許文献２）。
【０００５】
YGL114W遺伝子は、ペプチドトランスポーターと予測されるタンパク質をコードする遺
伝子である。
【０００６】
しかしながら、γ-Glu-Abuの取り込みおよび／または排出に関わるトランスポーターは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2012/046731
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cain NE, Kaiser CA., Mol. Biol. Cell., 2011, Jun 1; 22(11): 1919-29.
【非特許文献２】Soetens O, De Craene JO, Andre B., J. Biol. Chem., 2001, Nov 23; 276(47): 43949-57.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵母においてγ-Glu-Abuの細胞内外の局在を制御する新規な技術を開発し、効率的なγ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ-Glu-Abuの生合成が強化された酵母において細胞膜常局在型GAP1遺伝子を発現させることにより、細胞外のγ-Glu-Abu蓄積量が向上することを見出した。また、本発明者は、γ-Glu-Abuの生合成が強化された酵母においてYGL114w遺伝子を高発現または破壊することにより、細胞内のγ-Glu-Abu濃度が、それぞれ低下または増大することを見出した。これらの知見に基づき、本
発明者は、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
γ-Glu-Abuの製造法であって、
γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および
該培地よりγ-Glu-Abuを採取すること、を含み、
前記酵母が、下記（１）〜（２）から選択される１またはそれ以上の性質を有することを特徴とする、方法：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変され
ている。
［２］
前記変異型GAP1遺伝子が、下記（Ａ）および（Ｂ）の変異を有する遺伝子である、［１］に記載の方法：
（Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；（Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
［３］
前記９位および１６位のリジン残基がアルギニン残基に置換されている、［２］に記載の方法。
［４］
前記野生型Gap1タンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、［２］または［３］に記載の方法：
（ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
［５］
YGL114w遺伝子の発現を上昇させることにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大した、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記YGL114w遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現
調節配列を改変することによって上昇した、［５］に記載の方法。
［７］
γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法であって、
γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含み、
前記酵母が、下記（３）の性質を有することを特徴とする、方法：
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変され
ている。
［８］
YGL114w遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより
、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下した、［７］に記載の方
法。
［９］
前記YGL114w遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、
［１］〜［８］のいずれかに記載の方法：
（Ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３０に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号３０に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１０］
前記酵母が、さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素、α−ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記α−ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素である、［１０］に記載の方法。
［１２］
前記アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素である、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
前記酵母が、サッカロミセス属酵母またはキャンディダ属酵母である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエまたはキャンディダ・ユティリスである、［１３］に記載の方法。
［１５］
下記（１）、（２）、（３）、または、（１）および（２）の性質を有し、且つ、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変され
ている；
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変され
ている。
［１６］
さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素、α−ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、［１５］に記載の酵母。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、酵母によるγ-Glu-Abuの生産を向上させることができ、γ-Glu-Abuを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】野生型GAP1遺伝子および細胞膜常局在型GAP1遺伝子の高発現がγ-Glu-Abu生産に与える影響を示す図。縦軸は培養上清中のγ-Glu-Abu濃度を示す。ＡはOD600 = 1.8時点、ＢはOD600 = 2.5時点でのγ-Glu-Abu濃度を示す。
【図２】YGL114w遺伝子の高発現および破壊がγ-Glu-Abu蓄積に与える影響を示す図。縦軸は菌体抽出液中のγ-Glu-Abu濃度を示す。ＡはYGL114w遺伝子の高発現の影響、ＢはYGL114w遺伝子の破壊の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明の酵母
＜１−１＞本発明の酵母
本発明の酵母は、γ-Glu-Abuの細胞内外における局在が制御された酵母である。本発明において、γ-Glu-Abuの局在制御は、GAP1遺伝子および／またはYGL114w遺伝子を利用し
て行うことができる。
【００１６】
本発明の酵母は、具体的には、下記（１）、（２）、（３）、または、（１）および（２）の性質を有する。当該性質を、「本発明の性質」ともいう。
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変され
ている；
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変され
ている。
【００１７】
本発明の性質は、γ-Glu-Abuの局在制御の態様に応じて適宜選択できる。
【００１８】
例えば、酵母を、変異型GAP1遺伝子を保持するように改変することにより、および／または、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変することに
より、γ-Glu-Abuの細胞外への生産を向上させることができる。すなわち、本発明の酵母の一態様は、変異型GAP1遺伝子を保持するように改変された、且つ／又は、YGL114w遺伝
子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された、γ-Glu-Abu生産能を有する酵母（以下、「γ-Glu-Abu生産型酵母」ともいう）であってよい。γ-Glu-Abu生産型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuの製造に利用できる。
【００１９】
また、例えば、酵母を、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下するよ
うに改変することにより、γ-Glu-Abuの細胞内への蓄積を向上させることができる。すなわち、本発明の酵母の別の態様は、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低
下するように改変された、γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母（以下、「γ-Glu-Abu蓄積型酵母」ともいう）であってよい。γ-Glu-Abu蓄積型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造に利用できる。
【００２０】
すなわち、本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有していてよい。本発明の酵母は、本来的にγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有していてもよく、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有するように改変されていてもよい。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母は、例えば、後述する酵母にγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与
することにより、または、後述する酵母のγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を増強することにより、取得できる。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与または増強する方法については後述する。
【００２１】
本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を、本発明の性質を有するように改変することによって得ることができる。また、本発明の酵母は、本発明の性質を有するように酵母を改変した後に、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与することによっても得ることができる。なお、本発明の酵母は、本発明の性質を有するように改変されたことにより、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を獲得したものであってもよい。本発明において、本発明の酵母を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００２２】
「γ-Glu-Abu生産能」とは、本発明の酵母を培地中で培養したときに、γ-Glu-Abuを、検出できる程度に培地中に生成および蓄積する能力をいう。本発明の酵母は、非改変株よりも多い量のγ-Glu-Abuを培地中に蓄積することができる酵母であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、本発明の酵母は、1 mg/L以上、5 mg/L以上、10 mg/L以上、または15 mg/L以上の量でγ-Glu-Abuを培地中に蓄積することができる酵母であってよい。
【００２３】
「γ-Glu-Abu蓄積能」とは、本発明の酵母を培地中で培養したときに、γ-Glu-Abuを、検出できる程度に細胞内に生成および蓄積する能力をいう。本発明の酵母は、非改変株よりも多い量のγ-Glu-Abuを細胞内に蓄積することができる酵母であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、本発明の酵母は、0.4μmol/g-DCW以上、1μmol/g-DCW以上、2μmol/g-DCW以上、3μmol/g-DCW以上、5μmol/g-DCW以上、または10μmol/g-DCW以上の量でγ-Glu-Abuを細胞内に蓄積することができる酵母であってよい。
【００２４】
本発明の酵母は、出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha
）等のハンゼヌラ属等に属する酵母を例示することができる。分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属等に属
する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
【００２５】
サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエY006株（FERM BP-11299）が挙げられる。Y006株は、平成22年8月18日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11299が付与されている。
【００２６】
また、サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエBY4743株（ATCC 201390）やサッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）も挙げられる。また、キャンディダ・ユティリスとしては、例えば、キャンディダ・ユティリスATCC
22023株を用いることができる。これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より入手できる。すなわち、各菌株に対応する登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
のカタログに記載されている。
【００２７】
＜１−２＞本発明において利用される遺伝子
＜１−２−１＞GAP1遺伝子およびGap1タンパク質
以下、GAP1遺伝子およびGap1タンパク質について説明する。GAP1遺伝子は、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）をコードする遺伝子である。すなわち
、同遺伝子にコードされるGap1タンパク質は、細胞膜を通してアミノ酸および／またはペプチドを細胞内から細胞外へ輸送する活性を有する。同活性を「アミノ酸トランスポーター活性」ともいう。Gap1タンパク質は、具体的には、例えば、γ-Glu-Abuを細胞外に排出する活性を有していてもよい。
【００２８】
本発明において、後述する「特定の変異」を有するGAP1遺伝子を変異型GAP1遺伝子、それによりコードされるタンパク質を変異型Gap1タンパク質ともいう。なお、変異型Gap1タンパク質は、細胞膜に常局在する。よって、変異型GAP1遺伝子を細胞膜常局在型GAP1遺伝子、変異型Gap1タンパク質を細胞膜常局在型Gap1タンパク質ともいう。また、本発明において、後述する「特定の変異」を有さないGAP1遺伝子を野生型GAP1遺伝子、それによりコードされるタンパク質を野生型Gap1タンパク質ともいう。なお、Gap1タンパク質にあっては、GAP1遺伝子における「特定の変異」により引き起こされるアミノ酸配列の変化を「特定の変異」ともいう。
【００２９】
野生型GAP1遺伝子としては、例えば、酵母のGAP1遺伝子が挙げられる。酵母のGAP1遺伝子として、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエのGAP1遺伝子が挙げられる。
【００３０】
サッカロミセス・セレビシエのGAP1遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGAP1遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_001143として登録されている染色体XIの配列中、515063〜516871の配列に相当する。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGap1タンパク質は、GenBank accession NP_012965として登録されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGAP1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするGap1タンパク質のアミノ酸
配列を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。
【００３１】
また、野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記Gap1タンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記Gap1タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性に対応する活性を有することをいう。すなわち、野生型Gap1タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、アミノ酸トランスポーター活性を有することをいう。
【００３２】
また、野生型GAP1遺伝子は、上記Gap1タンパク質やその保存的バリアントをコードする限り、上記GAP1遺伝子のバリアントであってもよい。
【００３３】
上記Gap1タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記の酵母のGAP1遺伝子（配列番号１９）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記Gap1タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、酵母の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することが
できる。
【００３４】
野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３５】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３６】
さらに、野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を
有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００３７】
また、野生型GAP1遺伝子は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士
がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００３８】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用い
る場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００３９】
また、野生型GAP1遺伝子は、上記のような野生型Gap1タンパク質をコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、野生型GAP1遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００４０】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００４１】
変異型Gap1タンパク質は、上述したような野生型Gap1タンパク質のアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有する。
【００４２】
すなわち、言い換えると、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、上述した酵母のGap1タンパク質やその保存的バリアントであってよい。
【００４３】
具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００４４】
また、具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００４５】
また、具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有す
るアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００４６】
また、言い換えると、変異型Gap1タンパク質は、上述した酵母のGap1タンパク質において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。
【００４７】
具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、配列番号２０に示すアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００４８】
変異型GAP1遺伝子は、上記のような変異型Gap1タンパク質をコードする限り、特に制限されない。
【００４９】
以下、変異型GAP1遺伝子が有する「特定の変異」について説明する。
【００５０】
「特定の変異」は、コードされるGap1タンパク質が細胞膜常局在型となる変異である。「特定の変異」としては、下記（Ａ）および（Ｂ）の組み合わせが挙げられる：
（Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；（Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
【００５１】
「他のアミノ酸」の種類は、リジン以外であれば特に制限されない。リジン以外のアミノ酸としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。９位のリジン残基は、例えば、アルギニン残基に置換されるのが好ましい。１６位のリジン残基は、例えば、アルギニン残基に置換されるのが好ましい。
【００５２】
本発明において、「野生型Gap1タンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番号２０におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。なお、アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、または付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」とは、配列番号２０における９位のリジン残基に相当するアミノ酸残基を意味し、９位よりもN
末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から８番目のアミノ酸残基が「野
生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」であるものとする。また、９位よりもN末端側
に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から１０番目のアミノ酸残基が「野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」であるものとする。
【００５３】
任意のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号２０におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のアミノ酸配列と配列番号２０のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられ
る（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【００５４】
変異型GAP1遺伝子は、野生型GAP1遺伝子を上述の「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを
用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる
方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T.
A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型GAP1遺伝子は、化学合成によっても取得できる。
【００５５】
以下、変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変する手法について説明する。
【００５６】
変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変することは、変異型GAP1遺伝子を酵母に導入することにより達成できる。また、変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変することは、自然変異や変異原処理により酵母が有する野生型GAP1遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
【００５７】
変異型GAP1遺伝子を酵母に導入する手法は特に制限されない。変異型GAP1遺伝子の導入は、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。本発明の酵母において、変異型GAP1遺伝子は、同酵母で機能するプロモーターの制御下で発現可能に
保持されていればよい。本発明の酵母において、変異型GAP1遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。使用可能なプロモーターやベクターについては、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法において例示する。本発明の酵母は、変異型GAP1遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の酵母は、１種類の変異型GAP1遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型GAP1遺伝子を有していてもよい。
【００５８】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、変異型GAP1遺伝子が染色体上に組み込まれる場合、本発明の酵母は、変異型GAP1遺伝子が組み込まれた染色体と変異型GAP1遺伝子を含まない染色体とをヘテロで有していてもよく、変異型GAP1遺伝子が組み込まれた染色体をホモで有していてもよい。
【００５９】
本発明の酵母は、野生型GAP1遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。野生型GAP1遺伝子を有さない酵母は、染色体上の野生型GAP1遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型GAP1遺伝子の破壊は、例えば、後述する遺伝子を破壊する手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型GAP1遺伝子のコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型GAP1遺伝子を破壊できる。また、染色体上の野生型GAP1遺伝子を変異型GAP1遺伝子で置換することにより、野生型GAP1遺伝子を有さず、且つ、変異型GAP1遺伝子を有するように改変された酵母を取得できる。
【００６０】
＜１−２−２＞YGL114W遺伝子およびYGL114Wタンパク質
以下、YGL114W遺伝子およびYGL114Wタンパク質について説明する。YGL114W遺伝子は、
ペプチドトランスポーターと予測されるタンパク質をコードする遺伝子である。すなわち、同遺伝子にコードされるYGL114Wタンパク質は、アミノ酸トランスポーター活性を有し
得る。YGL114Wタンパク質は、具体的には、例えば、γ-Glu-Abuを細胞外に排出する活性
を有していてもよい。
【００６１】
また、YGL114Wタンパク質は、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生
産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有する。同性質を「YGL114Wタンパク質の性質」ともいう。
【００６２】
YGL114W遺伝子としては、例えば、酵母のYGL114W遺伝子が挙げられる。酵母のYGL114W
遺伝子として、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエのYGL114W遺伝子が挙
げられる。
【００６３】
サッカロミセス・セレビシエのYGL114W遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、サッカロミセス・セ
レビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114W遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_001139として登録されている染色体VIIの配列中、293460〜295637の配列に相当する。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114Wタンパク質は、GenBank accession NP_011401として登録されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114W遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするYGL114Wタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３０および３１に示す。
【００６４】
YGL114W遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した
遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。YGL114W遺伝子やYGL114Wタンパク質のバリアントについては、先述した野生型GAP1遺伝子および野生型Gap1タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。YGL114Wタン
パク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、上述したYGL114Wタンパク質の性質を有することをいう。
【００６５】
タンパク質のバリアントが、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質を有するか否かは、例えば、酵母に同バリアントをコードする遺伝子を導入する等の手段により酵母における同バリアントの活性を増大させ、γ-Glu-Abu生産量が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
【００６６】
タンパク質のバリアントが、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するか否かは、例えば、酵母において同バリアントをコードする遺伝子を破壊する等の手段により酵母における同バリアントの活性を低下させ、γ-Glu-Abu蓄積量が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
【００６７】
＜１−３＞その他の改変
本発明の酵母は、さらに、他の改変を有していてもよい。例えば、本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能が付与または増強されるよう、改変されていてよい。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能は、例えば、γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性を増大させること、γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性を低下させること、ペプチド分解酵素の活性を低下させること、またはそれらの組み合わせにより、付与または増強できる。本発明において、本発明の酵母を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００６８】
すなわち、本発明の酵母は、細胞内のγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性が増大するよう、改変されていてよい。γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素としては、α−ケト酪酸合成酵素、アミノ基転移酵素、γ−グルタミルシステイン合成酵素（gamma glutamylcysteine synthetase）が挙げられる。本発明においては、γ-Glu-Abuの生合成に関与す
る１種の酵素の活性を増大させてもよく、γ-Glu-Abuの生合成に関与する２種またはそれ以上の酵素の活性を増大させてもよい。
【００６９】
ここでいう「α−ケト酪酸合成酵素」とは、Ｌ−スレオニンからα−ケト酪酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。α−ケト酪酸合成酵素としては、例えば、セリン／スレオニンデアミナーゼ（serine/threonine deaminase）やスレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）が挙げられる。セリン／スレオニンデアミナーゼをコ
ードする遺伝子としては、CHA1遺伝子が挙げられる。スレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子としては、ILV1遺伝子が挙げられる。これらの中では、例えば、CHA1遺伝子にコードされるセリン／スレオニンデアミナーゼの活性を増大させるのが好ましい。本発明においては、１種のα−ケト酪酸合成酵素の活性を増大させてもよく、２種またはそれ以上のα−ケト酪酸合成酵素の活性を増大させてもよい。
【００７０】
サッカロマイセス・セレビシエのCHA1遺伝子（システマティックネーム：YCL064C）お
よびILV1遺伝子（システマティックネーム：YER086W）の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロミセス・セ
レビシエS288C株（ATCC 26108）のCHA1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするCha1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２２および２３に示す。サッカロミ
セス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のILV1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコ
ードするIlv1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２４および２５に示す。
【００７１】
ここでいう「アミノ基転移酵素」とは、アミノ基転移反応により、α−ケト酪酸からAbuを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。アミノ基転移酵素としては
、例えば、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（alanine:glyoxylate a
minotransferase）、分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（branched-chain amino acid transaminase）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate amino transferase）、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（gamma-aminobutyrate transaminase）が挙げられる。アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、AGX1遺伝子が挙げられる。分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子としては、BAT1およびBAT2遺伝子が挙げられる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、AAT1およびAAT2遺伝子が挙げられる。γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子としては、UGA1遺伝子が挙げられる。これらの中では、例えば、BAT1にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させるのが好ましい。本発明においては、１種のアミノ基転移酵素の活性を増大させてもよく、２種またはそれ以上のアミノ基転移酵素の活性を増大させてもよい。
【００７２】
サッカロマイセス・セレビシエのAGX1遺伝子（システマティックネーム：YFL030W）、BAT1遺伝子（システマティックネーム：YHR208W）、BAT2遺伝子（システマティックネーム：YJR148W）、AAT1遺伝子（システマティックネーム：YKL106W）、AAT2遺伝子（システマティックネーム：YLR027C）、およびUGA1遺伝子（システマティックネーム：YGR019W）の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のBAT1遺伝子の塩基配列
、および同遺伝子がコードするBat1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２６および２７に示す。
【００７３】
ここでいう「γ−グルタミルシステイン合成酵素」とは、L-GluおよびAbuを基質として認識し、γ-Glu-Abuを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。γ−グルタミルシステイン合成酵素は、L-GluおよびL-Cysを基質として認識し、γ−グルタミルシステイン（γ-Glu-Cys）を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性の増強については、例えば、米国特許第7553638号、大竹康之ら（バイオサイエンスとインダストリー、第50巻第10号、第989〜994頁、1992年）等に開示されている。
【００７４】
また、本発明の酵母は、細胞内のグルタチオン合成酵素（glutathione synthase）の活性が低下するよう、改変されていてよい。ここでいう「グルタチオン合成酵素」とは、γ-Glu-AbuおよびGlyを基質として認識し、γ-Glu-Abu-Glyを生成する反応を触媒する活性
を有するタンパク質をいう。グルタチオン合成酵素は、γ-Glu-CysおよびGlyを基質とし
て認識し、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００７５】
γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子としては、GSH1遺伝子が挙げられる。グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子としては、GSH2遺伝子が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエのGSH1遺伝子およびGSH2遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、キャンディダ・ユティリスのGSH1遺伝子およびGSH2遺伝子の塩基配列は、米国特許第7553638号に開
示されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGSH1遺伝子の塩基
配列、および同遺伝子がコードするGsh1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２８および２９に示す。
【００７６】
また、本発明の酵母は、細胞内のペプチド分解酵素の活性が低下するよう、改変されていてよい。ここでいう「ペプチド分解酵素」とは、ペプチドのペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。ペプチド分解酵素としては、例えば、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、およびECM38遺伝子にコードされるタンパク質が
挙げられる（特開2012-213376）。なお、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、およびDUG3遺伝子に
それぞれコードされるDug1p、Dug2p、およびDug3pは、DUG複合体を形成して機能する。DUG複合体によるグルタチオンの分解には、Dug1p、Dug2p、およびDug3pの全てが必要であることが知られており（Ganguli D. et al., Genetics. 2007 Mar; 175(3): 1137-51）、Dug1p、Dug2p、およびDug3pから選択される１またはそれ以上のタンパク質の活性を低下さ
せることでDUG複合体の活性を低下させることができる。これらの内、少なくともDug2pの活性を低下させるのが好ましい。本発明においては、１種のペプチド分解酵素の活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上のペプチド分解酵素の活性を低下させてもよい。サッカロミセス・セレビシエのDUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、およびECM38遺伝子
の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。
【００７７】
なお、これら「他の改変」に使用される遺伝子も、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、先述した野生型GAP1遺伝子および野生型Gap1タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合は、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体が対応する活性を有することであってよい。すなわち、例えば、DUG複合体の各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは
、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体がペプチド分解活性を有することであってよい。
【００７８】
上述したような各種改変は、突然変異処理や遺伝子工学により実施できる。サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子工学の具体的手法は、多くの書籍に記されている。また、キャンディダ・ユティリスについても、近年各種の方法が報告されており、それらを用いてよい。例えば、ケミカルエンジニアリング1999年6月号（23p-28p、三沢典彦）、FEMS Microbiology Letters（Luis Rodriguez et al., 165 (1998) 335-340）、WO98/07873、特開平8-173170、WO95/32289、Journal of Bacteriology（KEIJI KONDO et al., Vol.177 No.24 (1995) 7171-7177）、WO98/14600、特開2006-75122、特開2006-75123、特開2007-089441、特開2006-101867などの先行文献にその具体的な手法が記されているので適宜参考に
することができる。
【００７９】
＜１−４＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【００８０】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、酵母が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【００８１】
タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば
、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【００８２】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００８３】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００８４】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入さ
れてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ARS
）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ARSを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開95/32289号パンフレットに記載されている。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。
【００８５】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００８６】
また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主微生物に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主微生物を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。酵母細胞内で機能するベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つマルチコピー型プラスミドが挙げられる。酵母細胞内で機能するベクターとして、具体的には、例えば、pAUR123（タカラバイオ社製）やpYES2（インビトロジェン社）が挙げられる。
【００８７】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の酵母で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモー
ターは、利用するベクターにもともと搭載されているプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００８８】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい。
【００９０】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【００９１】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターである、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。
【００９２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によって達成できる。すなわち、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベ
ース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28,
292 (2000)）に開示されている。
【００９３】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００９４】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００９５】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エ
チルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処
理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００９６】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、染色体の改変によりタンパク質の活性を増大させる場合には、本発明の酵母は、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体をホモで有していてもよい。
【００９７】
酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロ
ポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ラ
イン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００９８】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００９９】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１００】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et 
al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して
、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０１】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０２】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１０３】
＜１−５＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０１０４】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０５】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０６】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換してもよい。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、各種誘導型のプロモーターを利用することができる。すなわち、誘導型のプロモーターは、誘導物質の非存在下で、より弱いプロモーターとして機能し得る。誘導型のプロモーターとしては、例えば、ガラクトース誘導性のガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）のプロモーターが挙げられる。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タン
パク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低
下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１０７】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０１０８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１０９】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１１０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで微生物を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。
【０１１１】
用いる組換えＤＮＡの構造によっては、相同組換えの結果として、野生型遺伝子と欠失型遺伝子とが組換えＤＮＡの他の部分（例えば、ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入される場合がある。この状態では野生型遺伝子が機能するため、当該２個の遺伝子間で再度相同組換えを起こさせ、１コピーの遺伝子を、ベクター部分及びマーカー遺伝子とともに染色体ＤＮＡから脱落させ、欠失型遺伝子が残ったものを選抜する必要がある。
【０１１２】
また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡで酵母を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例
えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いることができる。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組み換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。
【０１１３】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１１４】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の内、一部を破壊し、残りの発現を低下させてもよい。
【０１１５】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合には、本発明の酵母は、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、タンパク質の活性が低下するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、タンパク質の活性が低下するように改変された染色体をホモで有していてもよい。通常は、本発明の酵母は、タンパク質の活性が低下するように改変された遺伝子をホモで有しているのが好ましい。
【０１１６】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１１７】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１１８】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株
と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１９】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１２０】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１２１】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えばペプチド分
解酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０１２２】
＜２＞本発明の方法
＜２−１＞γ-Glu-Abuの製造法
上述の通り、γ-Glu-Abu生産型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuの製造に利用できる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu生産型酵母）を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりγ-Glu-Abuを採取することを含む、γ-Glu-Abuの製造法である。
【０１２３】
使用する培地は、本発明の酵母が増殖でき、γ-Glu-Abuが生成蓄積される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、酵母の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地として、具体的には、例えば、SD培地、SG培地、SDTE培地が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する酵母の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１２４】
炭素源は、本発明の酵母が資化してγ-Glu-Abuを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２５】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２６】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２７】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１２８】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１２９】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、例えば、培地にAbuを補添してもよい
。
【０１３０】
培養条件は、本発明の酵母が増殖でき、γ-Glu-Abuが生成蓄積される限り、特に制限されない。培養は、例えば、酵母の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する酵母の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１３１】
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、25〜35℃、より好ましくは27〜33℃、さらに好ましくは28〜32℃であってよい。培養期間は、例えば、5時間以上、10時間以上、または15時間
以上であってよく、120時間以下、72時間以下、または48時間以下であってよい。培養は
、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous
culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。
【０１３２】
上記のようにして本発明の酵母を培養することにより、培地中にγ-Glu-Abuが蓄積する。
【０１３３】
γ-Glu-Abuが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１３４】
生成したγ-Glu-Abuの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収されるγ-Glu-Abuは、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。
【０１３５】
塩は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。例えば、カルボキシル基等の酸性基に対する塩としては、具体的には、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸、メチルマロン酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。なお、塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【０１３６】
尚、回収されるγ-Glu-Abuは、γ-Glu-Abu以外に、例えば、酵母菌体、培地成分、水分、及び酵母の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたγ-Glu-Abuの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０１３７】
＜２−２＞γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法
上述の通り、γ-Glu-Abu蓄積型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明の方法の別の態様は、本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu蓄積型酵母）を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法である。
【０１３８】
本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu蓄積型酵母）を原料として製造される酵母エキスを、「本発明の酵母エキス」ともいう。本発明の酵母エキスは、本発明の酵母を原料として用いる以外は、通常の酵母エキスと同様に製造することができる。以下、本発明の酵母エキスを製造する方法を説明する。
【０１３９】
まず、本発明の酵母を培地で培養する。培地および培養条件については、γ-Glu-Abuの製造法における培地および培養条件の記載を準用できる。本発明の酵母を培養することにより、酵母の細胞内にγ-Glu-Abuが蓄積し、γ-Glu-Abuを含有する酵母が得られる。
【０１４０】
得られた酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【０１４１】
上記のようにして、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキス（本発明の酵母エキス）が得られる。本発明の酵母エキスは、酵母エキス中の固形分全量に対し、γ-Glu-Abuを、好ましくは0.1重量%以上、より好ましくは1.0重量%以上、さらに好ましくは2.0重量%以上、特に好ましくは20重量%以上含有してよい。
【０１４２】
＜３＞本発明の飲食品
上記のようにして得られるγ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品の製造に用いることができる。すなわち、本発明は、本発明の方法により得られるγ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスを飲食品またはその原料に添加することを含む、飲食品の製造方法を提供する。このようにして製造される飲食品を、「本発明の飲食品」ともいう。また、一態様においては、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加により、飲食品に「コク味」を付与することができる。飲食品としては、例えば、アルコール飲料、パン食品、発酵食品調味料が挙げられる。
【０１４３】
本発明の飲食品は、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスを添加すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えば、アルコール飲料では米、大麦、コーンスターチ等が、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行われてもよい。すなわち、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品の原料に添加されてもよく、製造途中の飲食品に添加されてもよく、完成した飲食品に添加されてもよい。また、酵母エキスもしくはその濃縮物、またはそれらを乾燥したものは、それ自体で発酵食品調味料として用いることもできる。
【０１４４】
γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加量は特に制限されず、飲食品の種類や飲食品の摂取態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品またはその原料に対して、γ-Glu-Abu量に換算して、例えば、1 ppm（w/w）以上、100 ppm（w/w）以上、または1％（w/w）以上添加してよい。また、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品またはその原料に対して、γ-Glu-Abu量に換算して、例えば、100％（w/w）以下、10％（w/w）以下、または1％（w/w）以下添加してよ
い。
【実施例】
【０１４５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
【０１４６】
＜実施例１＞GAP1遺伝子の高発現株の構築
本実施例では、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）であるGap1がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価するため、γ-Glu-Abuを高含有する酵母
株（M006Y ura3-）を基に、野生型GAP1遺伝子および細胞膜常局在型GAP1遺伝子をそれぞ
れ高発現する酵母株を構築した。
【０１４７】
（１）γ-Glu-Abuを高含有する株の構築
γ-Glu-Abu生成に関与する分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子（BAT1）、セリン脱アミノ化酵素遺伝子（CHA1）、およびγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）の発現を増強することにより、γ-Glu-Abuを高含有する酵母株（M006Y ura3-株）を構築
した。手順を以下に示す。
【０１４８】
親株として、Saccharomyces cerevisiae AG1 ura3-株（特開2012-213376）を用いた。AG1 ura3-株は、Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）の発現増強株である。AG1 ura3-株は、URA3遺伝子を欠
損しており、ウラシル要求性を示す。
【０１４９】
Sofyanovichらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biotechnol.,
48, 218-227 (2011)）に基づき、AG1 ura3-株の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子（BAT1）のプロモーターを構成発現プロモーターであるグリセルアルデヒド3リン酸脱水
素酵素遺伝子（TDH3）のプロモーター領域（以下、pTDH3ともいう）に置換した株を作製
した。手順を以下に示す。5'端にBAT1の上流配列を有する配列番号１のプライマー（5’-
GCCAGGCGGTTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA -3’）、及びBAT1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配
列を有する配列番号２のプライマー（5’- TTGGATGCATCTAATGGGGCACCAGTAGCGAGTGTTCTGATGGAGAATTTCCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC -3’）を用い、pUC19-URA3-pTDH3-URA3プラスミド（前述のSofyanovichらの報告に記載）を鋳型にPCRを行い、TDH3プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でAG1 ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、BAT1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。以下にSD培地の調製方法を示す。SD平板培地はSD培地にBacto-agarを2%となるよう加えて作製した。
【０１５０】
[SD培地組成]
D(+)-グルコース                        20 g
10 x YNB                              100 mL
MilliQ水                          up to 1 L       
1 L
SD培地は、オートクレーブ滅菌したグルコースとフィルター滅菌したYNBを上記組成に
なるように混合し、オートクレーブ滅菌したMilliQ水でメスアップして調製した。
10 x YNBは次のようにして調製した。MilliQ水1 Lに対し17 gのDifco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate及び50 gの硫酸アンモニウムを溶解させ、pH5.2になるように調整し、フィルター滅菌した。ビタミンの分解を防ぐため冷暗所に保管した。
【０１５１】
URA3遺伝子が欠損した株は５−フルオロオロト酸（5-FOA）耐性を示すため、5-FOAを含有する培地を利用してURA3選択マーカーが除去された株を選抜できる。そこで、BAT1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量
を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのTDH3プロモータ
ー間の相同組換えにより、URA3が除去され、BAT1のプロモーターがTDH3プロモーターに置換された株（AG1 pTDH3-BAT1 ura3- 株）を取得した。なお、5-FOA平板培地は以下のように調製した。
【０１５２】
[5-FOA平板培地組成]
酵母生育培地パウチ SD/-Ura Broth        2 pouches
Uracil                                 50 mg
5-FOA                                   1 g
10 x YNB                              100 mL
Bacto-agar                             20 g
MilliQ水                          up to 1 L       
1 L
酵母生育培地パウチ  SD/-Ura Broth（クロンテック社）、Uracil、5-FOA、及び10 x YNBを混合し、MilliQ水で500 mLにメスアップしてフィルター滅菌したものと、Bacto-agarをMilliQ水で500 mLにメスアップしオートクレーブ滅菌したものとを混合して、5-FOA平
板培地を作製した。
【０１５３】
次に、同じくSofyanovichらの方法に基づき、上記の方法で得られたAG1 pTDH1-BAT1 ura3-株のセリン脱アミノ化酵素遺伝子（CHA1）のプロモーターを構成発現プロモーターで
あるpTDH3に置換した株を作製した。手順を以下に示す。なお、AG1 pTDH3-BAT1 ura3-株
はURA3遺伝子の欠損株でありウラシル要求性を示す。5'端にCHA1の上流配列を有する配列番号３のプライマー（5’- GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3’）、及びCHA1遺伝子の開始コドン
から始まる一部のORF内配列を有する配列番号４のプライマー（5’- TATTTCAAGAAAAATTGTGCAGAAGCCTTTCCGGGGAAGAATTGACGTAATAATGGTGTTTTATTGTAGACTATCGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC -3’）を用い、pUC19-URA3-pTDH3-URA3プラスミドを鋳型にPCRを行い、TDH3プロモー
ターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でAG1 pTDH1-BAT1 ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、CHA1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。更に、CHA1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのTDH3プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、CHA1のプロモーターがTDH3プ
ロモーターに置換された株（AG1 pTDH3-BAT1 pTDH3-CHA1 ura3- 株）を取得した。以下、本菌株をM006Y ura3-株と称する。M006Y ura3-株はウラシル要求性を示す。
【０１５４】
（２）GAP1遺伝子の高発現に用いる１コピープラスミドの作製
酵母用１コピープラスミドは、pUC19（invitrogen）をバックボーンに、酵母細胞内で
の自律複製が可能となるよう、出芽酵母の複製起点およびセントロメアをクローン化し、且つ、形質転換株を選択可能となるよう、選択マーカーとしてURA3遺伝子をクローン化して作製した。
【０１５５】
（２−１）選択マーカーURA3の導入
まず、AatII制限酵素認識配列を有する配列番号５で示されるプライマーおよびEcoRI制限酵素認識配列を有する配列番号６で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、URA3遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をpUC19のAatII-EcoRI部位にクローン化し、プラスミドpUC19-URA3を得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288C
のURA3遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。
【０１５６】
（２−２）複製起点（ARS）の導入
KpnI制限酵素認識配列を有する配列番号７で示されるプライマーおよびEcoRI制限酵素
認識配列を有する配列番号８で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、ARSを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をpUC19-URA3のKpnI-EcoRI部位にクローン化し
、プラスミドpUC19-URA3-ARSを得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのARSの塩基配列を配列番号１７に示す。
【０１５７】
（２−３）セントロメア（CEN）の導入
KpnI制限酵素認識配列を有する配列番号９および配列番号１０で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、CENを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次にこのDNA断片をpUC19-URA3-ARSのKpnI-KpnI部位にクローン化し、酵母用１コピープラスミドpUC19-URA3-ARS-CEN（以下、「YCp」ともいう）を得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのCENの塩基配列を配列番号１８に示す。
【０１５８】
（３）野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドは、YCpプラスミドに構成高発現プロモーターであ
るTDH3プロモーターをクローン化し、さらにそのプロモーター下流に野生型GAP1遺伝子をクローン化して作製した。
【０１５９】
（３−１）TDH3プロモーターの導入
まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号１１で示されるプライマーおよびBamHI
制限酵素認識配列を有する配列番号１２で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、TDH3プロモーターを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCpのSmaI-BamHI部
位にクローン化し、プラスミドYCp-TDH3pを得た。
【０１６０】
（３−２）野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
BamHI制限酵素認識配列を有する配列番号１３で示されるプライマーおよびSphI制限酵
素認識配列を有する配列番号１４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、野生型GAP1遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部
位にクローン化し、プラスミドYCp-GAP1を得た。
【０１６１】
（４）細胞膜常局在型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてユビキチン化され、液胞で分解される（非特許文献１）。一方、第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換した変異型Gap1タンパク質は、ユビキチン化部位を持たないため、ユビキチン化による分解を受けない。そのためこの変異型Gap1タンパク質は、細胞内外の基質濃度に依存せず、細胞膜に常局在する（非特許文献２）。そこで、細胞膜常局在型GAP1遺伝子高発現プラスミドとして、第９位および第１６位のリジンがアルギニンに置換された変異型Gap1タンパク質をコードする変異型GAP1遺伝子（以下、「gap1K9,16R」ともいう）の高発現プラスミドを、以下の手順で作製した。
【０１６２】
まず、BamHI制限酵素認識配列と第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換す
るように改変されたGAP1配列を有する配列番号１５で示されるプライマーおよびSphI制限酵素認識配列を有する配列番号１４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部位にクローン化し、プラスミドYCp-gap1K9,16Rを得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのゲノムDNAを鋳型とした場合に、配列番号１４および１５のプライマーを用いて取得できる変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）の塩基配列を配列番号２１に示す。
【０１６３】
（５）GAP1遺伝子の高発現株の構築
作製したYCp、YCp-GAP1、およびYCp-gap1K9,16Rで、M006Y ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、野生型GAP1遺伝子および変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）をそれぞれ高発現するM006Y YCp-GAP1株およびM006Y YCp-gap1K9,16R株を得た。また、対照株として、M006Y YCp株を得た。
【０１６４】
＜実施例２＞GAP1遺伝子の高発現株の菌体外γ-Glu-Abu濃度の解析
本実施例では、γ-Glu-Abuの生合成が強化され、且つ野生型GAP1遺伝子および変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）のそれぞれを高発現する株の菌体外γ-Glu-Abu濃度を測定し、Gap1がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価した。
【０１６５】
（１）培養およびサンプリング
実施例１で作製した株を、各々、500 mL容坂口フラスコに50 mL張り込んだSD培地に１
エーゼ分植菌し、30℃、120 rpmで24時間振とう培養した。
【０１６６】
得られた培養液の吸光度を測定し、OD600が0.02になるように、500 mL容坂口フラスコ
に70 mL張り込んだSD培地に植菌し、30℃、120 rpmで約16〜20時間振とう培養した（本培養）。なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した
。OD600が1.8および2.5になるタイミングで培養液をサンプリングした。培養液から遠心
分離により上清を回収し、γ-Glu-Abu濃度の測定に供した。
【０１６７】
上清中のγ-Glu-Abu濃度は、公知の方法（WO2011/129462の実施例１）に準じて、上清
中のγ-Glu-AbuをAQC試薬にて誘導体化し、LC-MS/MSにより測定した。WO2011/129462の実施例１に記載の測定条件からの変更点は、下記の通りである。
変更点１：サンプルの誘導体化時に使用する5μMの内部標準物質液として、5μMの3-methyl-His-d2（シグマ社、安定同位体で標識されている。）と5μMのGly-d2（シグマ社、安
定同位体で標識されている。）からなる標準液を用いた。γ-Glu-Abuの質量分析時には、これらの内、Gly-d2を内部標準物質として利用した。
変更点２：γ-Glu-Abuの質量分析時には、第一のマスアナライザーでの選択イオンを403.4、第二のマスアナライザーでの選択イオンを171.1とした。なお、γ-Glu-Abuの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第二のマスアナライザーでの選択イオンを、145.2、或いは、104.1に変更して定量した。
【０１６８】
γ-Glu-Abu濃度の測定の結果、図１に示すように、野生型GAP1遺伝子を高発現しても菌体外のγ-Glu-Abu濃度に影響は見られなかったが、細胞膜常局在型GAP1遺伝子であるgap1K9,16Rを高発現することにより菌体外γ-Glu-Abu濃度は上昇した。
【０１６９】
上述の通り、Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてユビキチン化され、液
胞で分解されることが知られている（非特許文献１）。そのため、γ-Glu-Abuの生成経路を増強した株において野生型GAP1遺伝子を高発現しても、Gap1タンパク質が細胞膜に局在せずに分解してしまうと推測される。従って、γ-Glu-Abuの生成経路の増強と排出の促進を両立させるためには、細胞膜常局在型GAP1遺伝子の高発現が有効である。
【０１７０】
＜実施例３＞YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株の構築
本実施例では、YGL114wタンパク質がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価する
ため、γ-Glu-Abuを高含有する酵母株（M006Y ura3-）を基に、YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株を構築した。
【０１７１】
（１）YGL114w遺伝子の高発現株の構築
BamHI制限酵素認識配列を有する配列番号３２で示されるプライマーおよびSphI制限酵
素認識配列を有する配列番号３３で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、YGL114w遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸
張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部位
にクローン化し、プラスミドYCp-YGL114wを得た。作製したYCp-YGL114wで、M006Y ura3-
株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、YGL114w遺伝子を高発現するM006Y YCp-YGL114w株を得た。
【０１７２】
（２）YGL114w遺伝子の破壊株の構築
まず、M006Y ura3-株に、常法（特開2012-213376）に基づきURA3遺伝子を相補し、M006Y株を得た。次に、YGL114w遺伝子の開始コドンより上流80塩基を付加した配列番号３４のプライマー及びYGL114w遺伝子の終止コドンより下流80塩基を付加した配列番号３５のプ
ライマーを用い、M006Y株のゲノムDNAを鋳型として、URA3遺伝子を含むDNA断片を増幅し
た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72
℃、2 min）、25 cycleとした。得られたDNA断片でM006Y ura3-株を形質転換し、ウラシ
ルを含有しないSD培地に塗布した。生育した形質転換体からYGL114w遺伝子を欠損したM006Y YGL114wΔ株を得た。
【０１７３】
＜実施例４＞YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株の菌体内γ-Glu-Abu含量の解析
（１）培養およびサンプリング
実施例３で作製した株および対照株（M006Y YCp株）を、各々、500 mL容坂口フラスコ
に50 mL張り込んだSD培地に１エーゼ分植菌し、30℃、120 rpmで24時間振とう培養した。
【０１７４】
得られた培養液の吸光度を測定し、OD600が0.02になるように、500 mL容坂口フラスコ
に70 mL張り込んだSD培地に植菌し、30℃、120 rpmで約16〜20時間振とう培養した（本培養）。なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した
。OD600が1.8になるタイミングで培養液をサンプリングした。
【０１７５】
40 ODunit（OD600が1である培養液1 mLに含まれる菌体を1 ODunitと定義する。）分の
培養液を分取し、遠心分離により上清を可能な限り取り除き、菌体を採取した。菌体は45
mLのmilliQ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、45 mLのmilliQ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地成分を完全に除去した。得
られた洗浄菌体は、約1.5 mLのmilliQ水に懸濁し、70℃で10分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキス分を含む画分と菌体残渣を分離した。
【０１７６】
エキス分を含む画分から10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5 mL 10
K（カタログ番号UFC501096））を用いて細胞デブリを除去し、得られた濾液を解析サンプルとした。
【０１７７】
サンプル中のγ-Glu-Abu濃度は、実施例２と同様の手法により測定した。
【０１７８】
γ-Glu-Abu濃度の測定の結果、図２に示すように、YGL114w遺伝子の高発現株であるM006Y YCp-YGL114w株では菌体内のγ-Glu-Abu濃度の低下が見られた（図２Ａ）。一方、YGL114w遺伝子の破壊株であるM006Y YGL114wΔ株では、菌体内のγ-Glu-Abu濃度の上昇が見られた（図２Ｂ）。
【０１７９】
YGL114wタンパク質は、ペプチドトランスポーターと予測されていたものの、実際の機
能は未知であった。上記結果から、YGL114wタンパク質が、γ-Glu-Abuの細胞外排出タン
パク質であることが明らかとなった。従って、γ-Glu-Abuの細胞外排出には、YGL114w遺
伝子の高発現が有効である。
【０１８０】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜１５：プライマー
配列番号１６：Saccharomyces cerevisiae S288CのURA3遺伝子の塩基配列
配列番号１７：Saccharomyces cerevisiae S288Cの複製起点（ARS）の塩基配列
配列番号１８：Saccharomyces cerevisiae S288Cのセントロメア（CEN）の塩基配列
配列番号１９：Saccharomyces cerevisiae S288Cの野生型GAP1遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Saccharomyces cerevisiae S288Cの野生型Gap1タンパク質のアミノ酸配列配列番号２１：Saccharomyces cerevisiae S288Cの変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）の塩基配列
配列番号２２：Saccharomyces cerevisiae S288CのCHA1遺伝子の塩基配列
配列番号２３：Saccharomyces cerevisiae S288CのCha1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４：Saccharomyces cerevisiae S288CのILV1遺伝子の塩基配列
配列番号２５：Saccharomyces cerevisiae S288CのIlv1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：Saccharomyces cerevisiae S288CのBAT1遺伝子の塩基配列
配列番号２７：Saccharomyces cerevisiae S288CのBat1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２８：Saccharomyces cerevisiae S288CのGSH1遺伝子の塩基配列
配列番号２９：Saccharomyces cerevisiae S288CのGsh1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３０：Saccharomyces cerevisiae S288CのYGL114W遺伝子の塩基配列
配列番号３１：Saccharomyces cerevisiae S288CのYGL114Wタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２〜３５：プライマー
【図１】
2017046594.tif 000003
【図２】
2017046594.tif 000004
【配列表】
2017046594000001.app