(57)【要約】【課題】本発明は、閉鎖系培養容器の細胞接着面から効率的または選択的に細胞を剥離させる細胞培養システムを提供すること。【解決手段】細胞培養容器と押圧体とを備えた細胞培養システムであって、細胞培養容器は、一方の基板と、一方の基板に対向して配置された他方の基板と、一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも１の基板により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁とを備え、一方の基板は伸縮性材料からなり、押圧体は、一方の基板の外方に設置され、一方の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、細胞培養システム。【選択図】図１
2017046591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器と押圧体とを備えた細胞培養システムであって、
細胞培養容器は、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と
を備え、
一方の基板は伸縮性材料からなり、
押圧体は、一方の基板の外方に設置され、一方の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
【請求項２】
細胞培養容器と押圧体とを備えた細胞培養システムであって、
細胞培養容器は、
第一の基板と、
第一の基板に対向して配置された第二の基板と、
第一の基板と第二の基板との間に介在されて、第一の基板および第二の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と
を備え、
第一の基板は伸縮性材料からなり、
押圧体は、第一の基板の外方に設置され、第一の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞培養システムであって、
細胞培養容器の他方の基板が伸縮性材料からなり、
他方の基板の外方に押圧体をさらに備え、
他方の基板の外方に設置された押圧体は、他方の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
【請求項４】
伸縮性材料が、透明である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項５】
伸縮性材料が、ポリジメチルシロキサンまたはシリコーンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項６】
一方の基板が、０．０２ｍｍ〜０．２ｍｍの厚みを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項７】
押圧体は、培養室全体の平面形状に対応する押圧面を有し、これにより、押圧体によって培養室全体の平面形状に対応する一方の基板を押圧することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項８】
押圧体は、培養室全体の平面形状より小さく、かつ、０．１２ｍｍ２〜９ｍｍ２の押圧面を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養システム。
【請求項９】
押圧体に、押圧体を稼働させて細胞接着面に接着した細胞を一方の基板により擦り剥がす押圧体稼働手段をさらに備えた、請求項８に記載の細胞培養システム。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養システムで培養した細胞を剥離する方法であって、
一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離する工程を含んでなる、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞培養システムで培養した細胞を剥離する方法であって、
一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、押圧体稼働手段を動作させて一方の基板により細胞を擦り剥がすことによって細胞を剥離する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
培養室へ細胞回収液を送液しながら押圧体稼働手段を動作させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞回収液を送液する前に、細胞剥離液を送液して細胞接着を弱めることをさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
細胞回収液を送液する前に、他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることをさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養システムおよび細胞の剥離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養には、開放系培養と閉鎖系培養の２種類が存在する。開放系培養は、培地交換や継代はディッシュの蓋を開けて行う、通常のディッシュを用いた培養である。開放系培養は、安価で操作が簡便なため研究用の細胞培養にはよく用いられているが、細菌や細胞等のコンタミネーションの可能性が高く、また、ウイルスベクターなどを用いる場合には培養作業者の感染リスクが高いなど、安全性の面において多くの問題を抱えており、治療用の細胞培養に用いる器材としては万全とは言い難い。
【０００３】
このような問題に対応するため、例えば、医療用途の細胞培養では、閉鎖系培養が試みられている。閉鎖系培養では、最小限の開口部を備えた閉鎖系培養容器が用いられ、コンタミネーションの発生率や感染リスクを大きく低減する工夫がなされている（特許文献１）。また、閉鎖系培養容器では、培養容器の内壁面に付着している培養細胞を内壁面から剥離させる手段として、細胞剥離液と振動により細胞を剥離するもの（特許文献２）および細胞剥離液により剥離した細胞を容器を傾けて回収するもの（特許文献３）が開発されている。
【０００４】
ところで、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞の培養では、培養途中で分化を開始した細胞は、周囲の細胞に悪影響を及ぼすと考えられており、速やかに培養容器内から取り除くべきであるとされている。また、分化を開始した細胞は、未分化細胞の収率や純度を上げるためにも速やかに取り除くべきである。分化を開始した細胞の除去は、開放系培養では、例えば、ディッシュの蓋を開けてアスピレータやマイクロピペットをディッシュに挿入し、分化を開始した細胞を吸引除去することにより行われている（非特許文献１）。しかし、培養系が外界と接するため開放系培養ではコンタミネーションの発生が懸念される。そこで、多能性幹細胞の閉鎖系培養が試みられている。閉鎖系培養ではコンタミネーションの発生可能性は低いが、培養容器内にアスピレータを挿入することはできず、培養途中に分化を開始した細胞を選択的に除去することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２３３４８２号公報
【特許文献２】特開２００８−０７９５５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２３５５４１号公報
【特許文献４】特開２００５−０９５１６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】”Bulk passaging of hESC”、Human Embryonic Stem Cell Protocols 2004、オーストラリア、BresaGen社発行、p. 12-13
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、閉鎖系培養容器の細胞接着面から効率的または選択的に細胞を剥離させる細胞培養システムを提供する。
【０００８】
本発明では以下の発明が提供される。
（１）細胞培養容器と押圧体とを備えた細胞培養システムであって、
細胞培養容器は、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と
を備え、
一方の基板は伸縮性材料からなり、
押圧体は、一方の基板の外方に設置され、一方の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
（２）細胞培養容器と押圧体とを備えた細胞培養システムであって、
細胞培養容器は、
第一の基板と、
第一の基板に対向して配置された第二の基板と、
第一の基板と第二の基板との間に介在されて、第一の基板および第二の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と
を備え、
第一の基板は伸縮性材料からなり、
押圧体は、第一の基板の外方に設置され、第一の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
（３）上記（１）または（２）に記載の細胞培養システムであって、
細胞培養容器の他方の基板が伸縮性材料からなり、
他方の基板の外方に押圧体をさらに備え、
他方の基板の外方に設置された押圧体は、他方の基板を培養室に向けて押圧して培養室内へ引込める押圧体である、
細胞培養システム。
（４）伸縮性材料が、透明である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養システム。
（５）伸縮性材料が、ポリジメチルシロキサンまたはシリコーンである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養システム。
（６）一方の基板が、０．０２ｍｍ〜０．２ｍｍの厚みを有する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養システム。
（７）押圧体は、培養室全体の平面形状に対応する押圧面を有し、これにより、押圧体によって培養室全体の平面形状に対応する一方の基板を押圧することができる、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞培養システム。
（８）押圧体は、培養室全体の平面形状より小さく、かつ、０．１２ｍｍ２〜９ｍｍ２の押圧面を有する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞培養システム。
（９）押圧体に、押圧体を稼働させて細胞接着面に接着した細胞を一方の基板により擦り剥がす押圧体稼働手段をさらに備えた、上記（８）に記載の細胞培養システム。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞培養システムで培養した細胞を剥離する方法であって、
一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離する工程を含んでなる、方法。
（１１）上記（９）に記載の細胞培養システムで培養した細胞を剥離する方法であって、
一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、押圧体稼働手段を動作させて一方の基板により細胞を擦り剥がすことによって細胞を剥離する工程を含んでなる、方法。
（１２）培養室へ細胞回収液を送液しながら押圧体稼働手段を動作させる、上記（１１）に記載の方法。
（１３）細胞回収液を送液する前に、細胞剥離液を送液して細胞接着を弱めることをさらに含んでなる、上記（１０）に記載の方法。
（１４）細胞回収液を送液する前に、他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることをさらに含んでなる、上記（１０）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の第一の実施形態による細胞培養システムの平面図である。
【図２】図２は、図１のＡ−Ａ断面図である。
【図３】図３は、図１のＢ−Ｂ断面図である。
【図４】図４は、本発明の第一の実施形態による細胞培養システムおよびその動作の一例を示す図である。
【図５】図５は、本発明の第二、第四および第五の実施形態による細胞培養システムおよびその動作の一例を示す図である。
【図６】図６は、円筒内を粘性液体が流れるときに発生する剪断応力と流路の幅および流量との関係を示す図である。
【図７】図７は、本発明の第六の実施形態による細胞培養システムおよびその動作の一例を示す図である。
【図８】図８は、本発明の第三の実施形態による細胞培養システムおよびその動作の一例を示す図である。
【図９】図９は、本発明の細胞培養システムの変形例を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１で作製した細胞培養容器の図面ある。
【図１１】図１１は、実施例２で培養したｉＰＳ細胞および本発明の細胞培養システムを用いた細胞剥離実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第一の実施形態
本発明の第一の実施形態である細胞培養システム１００は、接着細胞の培養に用いる培養システムである。接着細胞としては特に限定されないが、多能性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、体細胞および生殖細胞などの接着細胞が挙げられ、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の培養に用いることができる。
【００１１】
本発明の第一の実施形態である細胞培養システム１００は、細胞培養容器１０と押圧体１８とを備えている。
【００１２】
細胞培養システム１００に備わる細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、一方の基板１５と、一方の基板に対向して配置された他方の基板２０と、一方の基板と他方の基板との間に介在されて、培養室１７と流路１３とを形成する側壁１６とを備えている。また、培養室１７に接する一方の基板１５および他方の基板２０のうち少なくとも一方、例えば、他方の基板２０が細胞接着面２０ａを形成する。一方の基板１５は、少なくとも培養室１７の平面形状に対応する領域では伸縮性材料からなる。本明細書では、一方の基板を第一の基板といい、他方の基板を第二の基板ということがある。
【００１３】
細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、細胞培養容器１０内に複数の培養室１７を備えていてもよいが、特に限定されず、培養室１７は１つのみであってもよい。細胞培養容器１０が培養室１７を複数備えている場合には、それぞれの培養室１７は図１に示されるように流路１３によって直列に連結されていてもよいし、あるいは、培養室１７はそれぞれ独立して入口１１および出口１２を備えていてもよい。また、培養室１７は、入口１１につながる流路１３および／または出口１２につながる流路１３を複数備えていてもよい。また、入口１１と出口１２は必ずしも別々に設けられている必要はなく、一体として設けられていてもよい。ここで、入口１１とは、送液される溶液の入口であり、出口１２とは送液される溶液の出口である。
【００１４】
好ましい実施形態では、培養室１７は、溶液が導入される一方の流路１３と溶液が排出される他方の流路１３とを対向して備える。このようにすることで、培養室１７内において、送液される溶液に一方向性の安定した流れを生じさせることができる。
【００１５】
細胞培養容器１０の一方の基板１５は、伸縮性材料で形成される。これにより、後述するように、押圧体により一方の基板１５を培養室１７内へ押し込むことが可能である。伸縮性材料は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましく、無色透明であることがより好ましい。このような伸縮性材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはシリコーンを用いることができる。
【００１６】
一方の基板１５は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍ、または０．０２ｍｍ〜０．２ｍｍの膜厚を有する。また、一方の基板１５の硬度は、タイプＡデュロメーター硬度で２０〜６５、好ましくは２０〜３０とすることができる。
【００１７】
細胞接着面以外の培養室の内面は、細胞非接着性であることが好ましく、細胞の接着を防ぐ目的で、細胞非接着コーティングがなされていてもよい。細胞非接着コーティングは、細胞非接着性を有するコーティングであれば特に限定されないが、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリ乳酸；ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類、およびこれらの細胞非接着性の誘導体によるコーティングが挙げられる。透明性が高く視認性がよいという観点では、ポリエチレングリコールが好ましい。
【００１８】
他方の基板２０の細胞接着面２０ａは、細胞接着性であることが好ましく、細胞接着性を付与する目的で細胞接着性コーティングがなされていてもよい。他方の基板２０の厚みおよび硬度は、一方の基板と同じでも、異なっていてもよい。
【００１９】
また、他方の基板２０は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましい。他方の基板２０は、特に限定されないが、培養室内の酸素濃度および二酸化炭素濃度を保つ観点から、ガス透過膜であることが好ましく、例えば、細胞培養用のガス透過膜としてポリスチレン製ガス透過膜が市販されている。ガス透過膜は、培養室１７内の培地に酸素などを供給する上で重要な役割を果たす。また、可撓性も備えた膜を用いると、超音波振動により効果的に細胞を膜表面から剥離できるため、細胞の剥離方法に選択肢が増える点で有利である。他方の基板２０は、非伸縮性材料で形成されていてもよいが、一方の基板１５と同様に伸縮性材料で形成されていてもよい。このように一方の基板および他方の基板の両方を伸縮性材料とすると、一方の基板１５に向けて押圧体を押し込む際に生じる培養室１７の容積変動を、他方の基板２０側が外方に膨らむことで吸収することができる。従って、ゴム栓などにより封止され得る入口１１および出口１２からの液漏れリスクを抑制できる。
【００２０】
細胞培養容器１０の側壁１６は、特に限定されないが、例えば、プラスチック製とすることができ、例えば、ポリスチレン製、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製またはアクリル製とすることができる。
【００２１】
また、第一の実施形態である細胞培養システム１００では、細胞培養容器１０の一方の基板１５外方に押圧体１８が設けられ、細胞培養容器１０と押圧体１８とにより細胞培養システム１００が構成される。
【００２２】
第一の実施形態である細胞培養システム１００では、接着細胞を播種し、一方の基板１５または他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａに接着させて培養することができる。なお、細胞は、一方の基板１５の細胞接着面１５ａおよび他方の基板２０の細胞接着面２０ａに接着させて培養してもよく、この場合、培養した細胞は、一方の基板１５および他方の基板２０に接着しているが、いずれの細胞接着面に接着した細胞も、押圧体１８を用いて剥離させることができる。
【００２３】
押圧体１８は、細胞培養容器１０が複数の培養室１７を備えている場合には、１つの押圧体により複数の培養室１７を一度に押圧してもよいし、各培養室１７に対応して設置された複数の押圧体１８により各培養室１７を個別に押圧してもよい。
【００２４】
押圧体１８は、図１〜３に示すように、細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に設置され、押圧体１８を培養室１７に向けて稼働させる押圧体稼働手段１８Ａにより、一方の基板１５を培養室１７に向けて押圧することができる。これにより、一方の基板１５を培養室１７内へ押し込むことができる。押圧体１８は、一方の基板１５を他方の基板２０に接触する程度まで培養室１７内に押し込むように稼働させてもよい。
【００２５】
本発明の細胞培養システム１００では、押圧体１８は、各培養室１７の平面形状よりも小さい押圧面を有し、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５の一部を押圧することができる。これにより、一方の基板１５の押圧された部分（または、他方の基板２０において該押圧された部分に対応する部分）に接着した細胞のみを領域特異的に剥離することができる。押圧体１８の押圧面の形状は、特に限定されないが、円形や矩形とすることができる。例えば、多能性幹細胞を培養するための細胞培養システムでは、押圧体１８の押圧面を、直径０．４ｍｍ〜３．４ｍｍ程度（面積で０．１２ｍｍ２〜９ｍｍ２程度）の円形の押圧面とすることができる。このようにすることで、細胞を領域選択的に剥離することができ、例えば、多能性幹細胞が接着培養中に形成するコロニー１つ１つを選択的に剥離することができる。また、押圧体１８の押圧面を矩形とすると円形よりも剪断応力を高めやすい。例えば、押圧体１８の押圧面を矩形とした場合は、一辺０．３５ｍｍ〜３ｍｍ程度（面積で０．１２ｍｍ２〜９ｍｍ２）の押圧面、例えば、正方形の押圧面とすることができる。
【００２６】
押圧体１８の押圧面は、平面形状であってもよいし、曲面形状、例えば、球面形状であってもよい。押圧体１８の全体形状は特に限定されないが、例えば、ブロック形状とすることができる。従って、好ましい一つの実施形態では、押圧体１８はブロックである。一方の基板または他方の基板が破れるリスクを低減する観点では、押圧体１８の押圧面は、角が丸められていることが好ましい。
【００２７】
押圧体稼働手段１８Ａは、好ましくは、押圧体１８を稼働させて細胞接着面に接着した細胞を一方の基板１５により擦り剥がすことができる。この場合、押圧体稼働手段１８Ａは、一方の基板１５と他方の基板２０との間に細胞を挟み込み、擦り剥がすように押圧体１８を稼働させる。押圧体稼働手段１８Ａは、特に限定されないが、例えば、押圧体１８を、一方の基板１５と他方の基板２０を接触させた状態で他方の基板２０の細胞接着面２０ａに沿って稼働させることができる（図４）。押圧体１８の稼働は、単純な直進運動によってもよいし、回転運動、往復運動などの運動を伴ってもよい。押圧体稼働手段１８Ａを駆動させるためには、電磁駆動のアクチュエータまたは圧電振動子などを用いることができる。すなわち、本実施形態の細胞培養システムは、押圧体に、押圧体を稼働させて細胞接着面に接着した細胞を一方の基板１５により擦り剥がす押圧体稼働手段を備えている。また、細胞接着面に接着した細胞を一方の基板１５により擦り剥がす際には、押圧体１８を固定し、培養容器１０を稼動させることもできる。
【００２８】
第一の実施形態の細胞培養システムは、密閉容器と、密閉容器に設けられ、密閉容器に細胞培養容器を出し入れするための扉と、密閉容器内を加熱する加熱部と、密閉容器内の温度に基づいて加熱部を制御することにより密閉容器内の温度を制御する温度制御部をさらに備えていてもよい。第一の実施形態の細胞培養システムはまた、細胞培養容器の載置台を備えていてもよい。細胞培養システムはさらに、密閉容器内を加湿する加湿部と、密閉容器内の湿度に基づいて加湿部を制御することにより密閉容器内の湿度を制御する湿度制御部をさらに備えていてもよい。
【００２９】
第一の実施形態の細胞培養システムは、細胞培養容器１０を少なくとも１以上備えている。第一の実施形態の細胞培養システムにおいて、細胞培養容器１０はディスポーザブルとしてもよく、細胞培養容器１０は使用後には破棄して新しい細胞培養容器１０に入れ替えることができる。
【００３０】
第一の実施形態の細胞培養システムに備わる細胞培養容器は、好ましくは閉鎖系細胞培養容器である。従って、本発明の細胞継代培養システムは、好ましくは閉鎖系細胞培養システムである。
【００３１】
次に、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により、押圧体１８を用いた細胞の剥離方法について説明する。ここで、図４では、図１のＡ−Ａ断面を見本として、第一の実施形態の細胞培養システムの動作を例示する。第一の実施形態の細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。そして、第一の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、押圧体稼働手段を動作させて一方の基板により細胞を擦り剥がすことによって細胞を剥離することができる。
【００３２】
まず、図４（ａ）に示すように、他方の基板２０の細胞接着面２０ａ上で細胞を培養する。図４（ａ）では、培養室１７は培地１で満たされている。次に、図４（ｂ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、培養室１７の容積が変動するが、培養室１７内の内圧の上昇は、押圧体により押圧されていない他方の基板が外方に膨らむことにより押えられ得る。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体による基板を押圧は、余分な培地を抜出しながら行ってもよい。次に、図４（ｃ）に示すように、引込んだ押圧体１８を押圧体稼働手段１８Ａにより動作させて、一方の基板を介して細胞を擦り剥がす。擦り剥がす際には、細胞培養培地を送液して、細胞を剥離と共に除去してもよい。次に、図４（ｄ）に示すように、擦り剥がした細胞のみが基板から剥離され、回収または除去される。このようにすることで、第一の実施形態である細胞培養システム１００では、領域選択的に細胞を剥離することができる。このように、第一の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、押圧体稼働手段を動作させて一方の基板により細胞を擦り剥がすことによって細胞を剥離する工程を含んでなる、培養した細胞の剥離方法が提供される。第一の実施形態である細胞培養システムは、細胞接着面から特定の細胞、例えば、不良な多能性幹細胞コロニーを剥離して除去する際に用いることができる。
【００３３】
第一の実施形態の変形例
次に第一の実施形態の変形例について説明する。第一の実施形態の変形例では、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料であることと、他方の基板２０の外方にさらに押圧体１８’を備えることとが異なるのみであり、その他の部分は、第一の実施形態と同一である。従って、第一の実施形態の変形例では、押圧体１８’とその駆動方法についてのみ説明する。
【００３４】
具体的には、図９Ａ（ａ）に示すように、第一の実施形態の変形例では、押圧体１８に加えて、他方の基板２０の外方に押圧体１８’を備える。押圧体１８’は、押圧体１８とは、他方の基板２０の外方に設置されている点でのみ異なり、その他は第一の実施形態の細胞培養システムの押圧体１８と同様である。但し、押圧体１８と押圧体１８’とは形状、例えば、押圧面の形状が異なっていてもよく、例えば、押圧体１８’の押圧面は、培養室１７の平面形状に対応する形状であってもよい。第一の実施形態の変形例では、細胞培養容器の他方の基板２０が、一方の基板１５と同様に伸縮性材料からなるため、押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込むことができる。すなわち、第一の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第一の実施形態の細胞培養システムである。
【００３５】
第一の実施形態の細胞培養システムの変形例において、細胞接着面に接着した細胞を剥離する際には、押圧体１８および押圧体１８’のいずれか、または両方を培養室１７に向けて押し込むことができる。特に、押圧体１８を一方の基板１５の外方および他方の基板２０の外方にそれぞれ設けると、図９Ａ（ｂ）に示すように、培養室１７を挟み込むようにそれぞれ一方の基板１５および他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込むことができる。このようにすると、一方の基板１５および他方の基板２０の伸縮性材料の変形量を、一方の基板１５および他方の基板２０の一方のみを押し込む場合に対して低減（例えば、半減）でき、一方の基板１５および他方の基板２０が破れるリスクを低減できる。また、第一の実施形態の細胞培養システムの変形例において、一方の基板１５および他方の基板２０の一方のみを押し込む場合は、押圧体により押圧されていない側の基板が外方に膨らむことにより培養室内の内圧の上昇を防ぐことができる。
【００３６】
その後、押圧体１８を押圧体稼働手段１８Ａにより駆動させて細胞を細胞接着面から擦り剥がすことができる。細胞を細胞接着面から擦り剥がす際には、押圧体１８’は、押圧体稼働手段１８Ａ’により駆動され、押圧体稼働手段１８Ａ’は、好ましくは一方の基板１５と他方の基板２０とを接触させる程度に押圧体１８’により他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込むことができる。押圧体稼働手段１８Ａ’は、細胞接着面に接着した細胞を一方の基板１５と他方の基板２０とに挟んですりはがす際に、他方の基板２０に対して平行に駆動させることもできるが、他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込んだ状態で静止していてもよい。
【００３７】
このように、他方の基板２０の外方に押圧体１８’を備える場合には、押圧体１８’を押圧体稼働手段１８Ａ’により駆動させて培養室１７に押し込むことにより、一方の基板２０の外方に設置された押圧体１８を押し込む距離を低減することができる。
【００３８】
第二の実施形態
次に、図５により、第二の実施形態の細胞培養システム１００について説明する。図５に示す第二の実施形態の細胞培養システムは、押圧体１８の形状と駆動方法が異なるのみであり、その他の構成は、図１〜３に示す第一の実施形態の細胞培養システムと同様である。図５において、図１〜３に示す第一の実施形態の細胞培養システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００３９】
図５に示す第二の実施形態の細胞培養システムにおいて、押圧体１８は、本発明の細胞培養システムにおける一方の基板１５側の外方に配置される。押圧体１８は、各培養室１７の平面形状（例えば、図１）に対応する形状の押圧面を有し、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５を培養室１７に向けて押圧することができる。
【００４０】
押圧体１８は、一方の基板１５を押圧して、一方の基板１５と他方の基板２０とを０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させることができ、より好ましくは、接近する距離を自由に調節することができ、さらに好ましくは、一方の基板１５を他方の基板２０に接触させるために必要な距離だけ培養室１７に向けて移動させることができる。このようにすることで、一方の基板１５または他方の基板２０に接着した細胞に対して送液により強い剪断力を発生させることができ、細胞接着面から細胞を剥離することができる。
【００４１】
次に、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により、押圧体１８を用いた細胞の剥離方法について説明する。ここで、図５では、図１のＡ−Ａ断面を見本として、本発明の細胞培養システムの動作を例示する。本発明の細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。そして、第二の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養室に向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することができる。
【００４２】
まず、図５（ａ）に示すように、他方の基板２０の細胞接着面２０ａ上で細胞を培養する。図５（ａ）では、培養室１７は培地１で満たされている。次に、図５（ｂ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、一方の基板１５と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体による基板を押圧は、余分な培地を抜出しながら行うことができる。次に、図５（ｃ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に引込んだ状態で、細胞回収液を送液する送液手段を稼働させて、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液する。すると、送液により細胞培養面２０ａに生じる剪断応力が増大して、図５（ｄ）に示すように、押圧体１８による押圧面に対応する細胞接着面２０ａから細胞を剥離させ、細胞を回収することができる。押圧体１８により押圧を終了する際には、内圧の低下を防ぐため、培地を送液しながら行うことができる。このようにすることで、第二の実施形態である細胞培養システム１００では、細胞培養面全域から細胞を剥離することができる。
【００４３】
細胞回収液は、例えば、細胞培養培地またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水とすることができる。
【００４４】
第二の実施形態の細胞培養システムにおいて、剪断応力を利用して細胞接着面から細胞を剥離する原理は以下のように説明される。すなわち、円筒内を粘性液体が流れるときに発生する剪断応力は以下の式により表すことができる。
【数１】
2017046591.tif 000003
｛式中、ａは定数であり、τは剪断応力（ｍＰａ）を示し、μは送液される液体の粘性係数（ｍＰａ・分）を示し、Ｑは流量（μＬ／分）を示し、πは円周率を示し、ｒは円筒の半径（ｍｍ）を示す。｝
【００４５】
図６は、様々な半径を有する円筒内を流れる粘性流体の流量と、粘性流体が側壁に対して生じる剪断応力を示す図である。図６では、粘性液体の粘性係数μは０．６８５ｍＰａ・秒とし、円筒半径が１ｍｍ、２ｍｍおよび３ｍｍの場合でシミュレーションをした場合の流量Ｑと剪断応力τとの関係が示されている。図６に示されるように、円筒の半径が小さくなると急激に粘性流体による円筒側壁への剪断応力が急激に増加する。このように、流路の径が狭くなると、流路の側壁に対して生じる剪断応力が増加する。
【００４６】
従って、第二の実施形態の細胞培養システムにおいて、一方の基板１５と他方の基板２０との距離を接近させれば、培養室１７の細胞培養面に生じる剪断応力を増加させることができることは、当業者であれば十分に理解できる。すなわち、押圧体１８を用いて一方の基板１５を培養室１７に向けて押圧して、一方の基板１５を培養室１７に押し込むことにより、押圧体１８により引込まれた部分に対応する細胞接着面２０ａで流体により生じる剪断応力が増加し、これにより、細胞接着面２０ａから細胞を剥離させることができる（図５）。送液は入口１１から行い、押圧体１８は、押圧体１８により引込まれた部分に対応する細胞接着面２０ａで送液により生じる剪断力を増加させるように培養室１７に向けて一方の基板１５を押し込むことができる。このように、第二の実施形態の細胞培養システムによれば、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離する工程を含んでなる、培養した細胞を剥離する方法を提供する。第二の実施形態の細胞培養システムは、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。
【００４７】
第二の実施形態の変形例
次に第二の実施形態の変形例について説明する。第二の実施形態の変形例では、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料であることと、他方の基板２０の外方にさらに押圧体１８’を備えることとが異なるのみであり、その他の部分は、第二の実施形態と同一である。従って、第二の実施形態の変形例では、押圧体１８’とその駆動方法についてのみ説明する。
【００４８】
具体的には、図９Ｂ（ｄ）に示すように、第二の実施形態の変形例では、押圧体１８に加えて、他方の基板２０の外方に押圧体１８’を備える。押圧体１８’は、押圧体１８とは、他方の基板２０の外方に設置されている点でのみ異なり、その他は第一の実施形態の細胞培養システムの押圧体１８と同様である。但し、押圧体１８と押圧体１８’とは形状、例えば、押圧面の形状が異なっていてもよく、例えば、押圧体１８’の押圧面は、培養室１７の平面形状に対応する形状であってもよい。すなわち、第二の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第二の実施形態の細胞培養システムである。
【００４９】
第二の実施形態の細胞培養システムの変形例において、細胞接着面に接着した細胞を剥離する際には、押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込むことができる。従って、押圧体１８および押圧体１８’のいずれか、または両方を培養室１７に向けて押し込むことができる。この際、一方の基板１５と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体による基板の押圧は、余分な培地を抜出しながら行うことができる。以降は、第二の実施形態の細胞培養システムの動作例と同様である。すなわち、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に押し込んだ状態で、細胞回収液を送液する送液手段を稼働させて、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液する。すると、送液により細胞培養面２０ａに生じる剪断応力が増大して、押圧体１８による押圧面に対応する細胞接着面２０ａから細胞を剥離させ、細胞を回収することができる。押圧体１８により押圧を終了する際には、内圧の低下を防ぐため、培地を送液しながら行うことができる。このようにすることで、第二の実施形態である細胞培養システムの変形例では、細胞培養面全域から細胞を剥離することができる。押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に押し込む際には、押圧体１８’により他方の基板２０を押圧して培養室１７に押し込んでもよい。押圧体１８および押圧体１８’のいずれか、または両方による押圧は、細胞接着面２０ａで送液により生じる剪断力を増加させるように行なうことができる。
【００５０】
特に、押圧体１８を一方の基板１５の外方および他方の基板２０の外方にそれぞれ設けると、図９Ｂ（ｅ）に示すように、培養室１７を挟み込むようにそれぞれ一方の基板１５および他方の基板２０を培養室１７に向けて押し込むことができる。このようにすると、一方の基板１５および他方の基板２０の伸縮性材料の変形量を、一方の基板１５のみを伸縮性材料とした場合に対して低減（例えば、半減）でき、一方の基板１５および他方の基板２０が破れるリスクを低減できる。
【００５１】
第三の実施形態
次に、図８により、第三の実施形態の細胞培養システム１００について説明する。図８に示す第三の実施形態の細胞培養システムは、押圧体１８の駆動方法が異なるのみであり、その他の構成は、図１〜３に示す第一の実施形態の細胞培養システムと同様である。図８において、図１〜３に示す第一の実施形態の細胞培養システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００５２】
第三の実施形態の細胞培養システム１００では、押圧体１８は、第一の実施形態の細胞培養システム１００と同様の形状を有し、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５の一部を押圧することができる。
【００５３】
次に、図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により、押圧体１８を用いた細胞の剥離方法について説明する。ここで、図８では、図１のＡ−Ａ断面を見本として、本発明の細胞培養システムの動作を例示する。第三の実施形態の細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。
【００５４】
まず、図８（ａ）に示すように、他方の基板２０の細胞接着面２０ａ上で細胞を培養する。図８（ａ）では、培養室１７は培地１で満たされている。次に、図８（ｂ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５の一部を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、一方の基板１５の一部と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体１８による一方の基板１５の押圧は、余分な培地を抜出しながら行うことができる。次に、図８（ｃ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５の一部を押圧して培養室１７に引込んだ状態で、細胞回収液を送液する送液手段を稼働させて、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液する。すると、細胞培養面２０ａの押圧された部分に生じる剪断応力が増大して、図８（ｄ）に示すように、押圧体１８による押圧面に対応する細胞接着面２０ａの一部から細胞を剥離させ、細胞を回収することができる。押圧体１８により押圧を終了する際には、内圧の低下を防ぐため、培地を送液しながら行うことができる。このようにすることで、第三の実施形態である細胞培養システム１００では、領域選択的に細胞を剥離することができる。第三の実施形態の細胞培養システムでは、第一の実施形態の細胞培養システムとは異なり、細胞を磨り潰さない。従って、第三の実施形態の細胞培養システムでは、細胞培養表面に接着している特定の細胞を剥離し、その後、剥離した細胞を回収して継代してもよい。もちろん、第三の実施形態の細胞培養システムで剥離した特定の細胞、例えば、不良な多能性幹細胞コロニーは、除去してもよい。
【００５５】
第三の実施形態の変形例
次に、第三の実施形態の細胞培養システムの変形例を説明する。第三の実施形態の細胞培養システムの変形例は、押圧体１８の駆動方法が異なるのみであり、その他の部分は第一の実施形態の細胞培養システムの変形例を同一である。すなわち、第三の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第三の実施形態の細胞培養システムである。従って、第三の実施形態の細胞培養システムの変形例では、押圧体１８の駆動方法についてのみ説明する。
【００５６】
第三の実施形態の細胞培養システムの変形例では、細胞培養容器の細胞接着表面から細胞を剥離させる際には、押圧体１８は、一方の基板１５の一部を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、一方の基板１５の一部と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。この際、特に限定されないが、押圧体１８’を培養室１７に押し込んでもよい（図９Ａ（ｃ））。このようにすることで、一方の基板１５および他方の基板２０が破損するリスクを低減することができる。第三の実施形態の細胞培養システムの変形例では、第一の実施形態の細胞培養システムの変形例とは異なり、細胞を磨り潰さない。従って、第三の実施形態の細胞培養システムの変形例では、細胞培養表面に接着している特定の細胞を剥離し、その後、剥離した細胞を回収して継代してもよい。もちろん、第三の実施形態の細胞培養システムの変形例で剥離した特定の細胞、例えば、不良な多能性幹細胞コロニーは、除去してもよい。
【００５７】
第四の実施形態
次に、図５により、第四の実施形態の細胞培養システム１００について説明する。第四の実施形態の細胞培養システムの構成は、図５に示す第二の実施形態の細胞培養システムと同一である。異なるのは、図５（ａ）または５（ｂ）、好ましくは図５（ｂ）において、細胞接着を弱めるために、さらに細胞を剥離する際に細胞剥離液を送液する点のみである。すなわち、第二の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することができるが、第四の実施形態の細胞培養システムでは、細胞回収液の送液の前に細胞剥離液を送液して細胞接着を弱めることをさらに含んでなる。
【００５８】
細胞剥離液としては、様々な細胞剥離液が知られ、当業者であれば適当な細胞剥離液を細胞剥離液として選択することができる。例えば、細胞剥離液には、トリプシンなどのタンパク質分解酵素および２価金属イオンキレート剤の少なくともいずれか一方を含む、細胞培養培地または生理食塩水とすることができる。また、細胞培養培地を用いる場合には、血清を含まないものを用いることができる。このように構成することで、細胞剥離液のみで細胞を剥離するよりも、確実に細胞を剥離させることができるだけでなく、特に図５（ｂ）において一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませてから細胞剥離液を送液する場合には、使用する細胞剥離液の液量を低減することができる。特に細胞の大量培養の際には、高価な薬液を大量に使用するため、薬液量の削減によるコストダウンのメリットは大きい。このように、第四の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませることと、その後、細胞剥離液を送液して細胞接着を弱めることと、その後、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することとを含んでなる、培養した細胞を剥離する方法が提供される。第四の実施形態の細胞培養システムは、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。
【００５９】
第四の実施形態の変形例
次に第四の実施形態の細胞培養システムの変形例を説明する。第四の実施形態の細胞培養システムの変形例では、押圧体１８’および押圧体駆動機構１８Ａ’をさらに備える点が異なるのみであり（図９Ｂ（ｄ））、その他の構成は第四の実施形態の細胞培養システムと同一である。すなわち、第四の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第四の実施形態の細胞培養システムである。但し、細胞培養容器内の細胞接着表面から細胞を剥離する際には、図９Ｂ（ｅ）に示すように、押圧体１８と押圧体１８’を培養室１７に押し込みながら第四の実施形態において説明する細胞剥離液の送液の工程を行ってもよい。このようにすることで、一方の基板１５および他方の基板２０が破損するリスクを低減することができ、かつ、使用する薬液量を削減することができる。第四の実施形態の細胞培養システムの変形例は、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。
【００６０】
第五の実施形態
次に図５により、第五の実施形態の細胞培養システム１００について説明する。第三の実施形態の細胞培養システムは、押圧体１８の駆動方法が異なるのみであり、その他の構成は、図８に示す第三の実施形態の細胞培養システムと同様である。
【００６１】
第五の実施形態の細胞培養システム１００における押圧体の駆動方法は、押圧体１８が高周波振動を行う点でのみ、第二の実施形態の細胞培養システムと異なる。すなわち、第二の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することができるが、第五の実施形態の細胞培養システムでは、細胞回収液の送液の前に他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることをさらに含んでなる。なお、第五の実施形態の細胞培養システム１００では、押圧体１８は、図５に示す第二の実施形態の細胞培養システム１００と同様の形状を有していてもよい。
【００６２】
次に、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により、押圧体１８を用いた細胞の剥離方法について説明する。ここで、図５では、図１のＡ−Ａ断面を見本として、本発明の細胞培養システムの動作を例示する。本発明の細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。
【００６３】
まず、図５（ａ）に示すように、他方の基板２０の細胞接着面２０ａ上で細胞を培養する。図５（ａ）では、培養室１７は培地１で満たされている。次に、図５（ｂ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、一方の基板１５と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体による基板を押圧は、余分な培地を抜出しながら行うことができる。次に、図５（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すいずれか１以上の工程で、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に引込んだ状態で、押圧体駆動部１８Ａを駆動して押圧体１８から高周波振動を発生させる。すると、高周波振動が細胞接着面２０ａに伝わり、細胞接着面２０ａと細胞との接着が弱まる。高周波振動は、送液の開始前に付与してもよいし、送液と同時に付与してもよい。その後、細胞回収液を送液する送液手段により、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液する。すると、送液により細胞培養面２０ａに生じる剪断応力により、図５（ｄ）に示すように、押圧体１８による押圧面に対応する細胞接着面２０ａから細胞を剥離させ、細胞を回収することができる。押圧体１８により押圧を終了する際には、内圧の低下を防ぐため、培地を送液しながら行うことができる。このようにすることで、第五の実施形態である細胞培養システム１００では、細胞培養面全域から細胞を剥離することができる。このように、第五の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませることと、その後、細胞回収液の送液の前に他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることと、その後、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することとを含んでなる。
【００６４】
高周波振動としては超音波を用いることができ、超音波は、例えば、圧電素子、プラスチック超音波溶着機、市販の細胞破砕用の超音波発生器、または超音波洗浄機用の超音波発生器を高周波振動発生源として用いて発生させることができる。高周波は、例えば、２０Ｈｚ〜１０ＧＨｚであることが好ましく、１６ｋＨｚ〜１０ＧＨｚであることがより好ましく、１６ｋＨｚ〜１ＧＨｚであることがさらに好ましく、２０ｋＨｚ〜１００ｋＨＨｚであることがさらに好ましい。例えば、７０ｋＨｚの高周波振動は一定の円形部（例えば、φ２ｍｍ）に集中して高周波振動を与えることができる。
【００６５】
第五の実施態様の細胞培養システムは、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。また、第五の実施態様の細胞培養システムは、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５の一部を培養室１７に向けて押圧し（例えば、図８（ｂ））、その状態で押圧体１８から高周波振動を発生させて細胞培養表面に接着している細胞接着面２０ａと特定の細胞との接着を弱め、その後、細胞回収液を送液して剥離した細胞を回収してもよい。領域特異的に剥離した細胞は、回収して継代してもよいし、剥離した細胞（例えば、不良な多能性幹細胞コロニー）を除去してもよい。
【００６６】
第五の実施形態の変形例
次に第五の実施形態の細胞培養システムの変形例を説明する。第五の実施形態の細胞培養システムの変形例では、押圧体１８’および押圧体駆動機構１８Ａ’をさらに備える点が異なるのみであり、その他の構成は第五の実施形態の細胞培養システムと同一である。すなわち、第五の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第五の実施形態の細胞培養システムである。但し、細胞培養容器内の細胞接着表面から細胞を剥離する際には、押圧体１８と押圧体１８’を培養室１７に押し込みながら第五の実施形態において説明する細胞回収液の送液の工程を行ってもよい（図９Ｂ（ｅ））。このようにすることで、一方の基板１５および他方の基板２０が破損するリスクを低減することができる。第五の実施態様の細胞培養システムの変形例は、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。また、第五の実施態様の細胞培養システムの変形例は、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５の一部を培養室１７に向けて押圧し（例えば、図９Ａ（ｃ））、その状態で押圧体１８から高周波振動を発生させて細胞培養表面に接着している細胞接着面２０ａと特定の細胞との接着を弱め、その後、細胞回収液を送液して剥離した細胞を回収してもよい。領域特異的に剥離した細胞は、回収して継代してもよいし、剥離した細胞（例えば、不良な多能性幹細胞コロニー）を除去してもよい。
【００６７】
第六の実施形態
次に、図７により、第六の実施形態の細胞培養システム１００について説明する。第六の実施形態の細胞培養システムは、細胞接着面２０ａに高周波振動を付与する高周波振動発生部１９をさらに備える点が異なるのみであり、その他の構成は、図５に示す第二の実施形態の細胞培養システムと同様である。図７において、図５に示す第二の実施形態の細胞培養システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００６８】
図７（ａ）に示すように、第六の実施形態の細胞培養システムにおいて、高周波振動発生部１９は、本発明の細胞培養システムの他方の基板２０の外方に設置される。高周波振動発生部１９は、各培養室１７の平面形状（例えば、図１）に対応する形状の押圧面を有し、細胞接着面２０ａ全体に高周波振動を付与することができる。あるいは、高周波振動発生部１９は、各培養室１７の平面形状よりも小さい押圧面を有し、高周波振動により、細胞接着面２０ａの細胞接着を領域特異的に弱めることができる。すなわち、第二の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませ、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することができるが、第六の実施形態の細胞培養システムでは、細胞回収液の送液の前に他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることをさらに含んでなる。
【００６９】
高周波振動発生部１９は、高周波振動としては超音波を用いることができ、超音波は、例えば、圧電素子、プラスチック超音波溶着機、市販の細胞破砕用の超音波発生器、または超音波洗浄機用の超音波発生器を高周波振動発生源として用いて発生させることができる。高周波は、例えば、２０Ｈｚ〜１０ＧＨｚであることが好ましく、１６ｋＨｚ〜１０ＧＨｚであることがより好ましく、１６ｋＨｚ〜１ＧＨｚであることがさらに好ましく、２０ｋＨｚ〜１００ｋＨＨｚであることがさらに好ましい。例えば、７０ｋＨｚの高周波振動は一定の円形部（例えば、φ２ｍｍ）に集中して高周波振動を与えることができる。高周波振動は、高周波振動発生源を培養容器の外方から細胞接着面を有する一方の基板１５または他方の基板２０に近接させるか接触させると、細胞を剥離させることができる。高周波振動を付与して細胞接着面から剥離した細胞は、その後も良好に培養することができる。高周波振動は、細胞と細胞接着面との接着を弱めるためにも用いることができる。高周波振動は、押圧体１８で一方の基板１５に押圧する前に一方の基板１５または他方の基板２０に付与することができる。高周波振動により細胞接着面から細胞を剥がす観点では、細胞接着面は、超音波振動により発生する摩擦や熱により破損するリスクを減らせるため、伸縮性材料で形成されていることが好ましい。
【００７０】
高周波振動発生部１９は、高周波振動発生部１９は、細胞培養容器１０が複数の培養室１７を備えている場合には、１つの高周波振動発生部１９により複数の培養室１７に高周波振動を付与してもよいし、各培養室１７に対して個別に高周波振動を付与してもよい。
【００７１】
次に、図７（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）により、高周波振動発生部１９を用いた細胞の剥離方法について説明する。ここで、図７では、図１のＡ−Ａ断面を見本として、本発明の細胞培養システムの動作を例示する。本発明の細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。
【００７２】
まず、図７（ｂ）に示すように、他方の基板２０の細胞接着面２０ａ上で細胞を培養する。図７（ｂ）では、培養室１７は培地１で満たされている。図７（ｂ）では、高周波振動発生部１９は、他方の基板２０の外方に設置され、他方の基板２０に対して高周波振動を付与し、細胞接着面２０ａと細胞との接着を弱める。高周波振動は、好ましくは０．５秒程度与えればよい。次に、図７（ｃ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に向けて押し込む。この際、一方の基板１５と他方の基板２０とを、例えば、０．１ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの距離にまで接近させる。培養室内の内圧の上昇を防ぐため、押圧体による基板を押圧は、余分な培地を抜出しながら行うことができる。次に、図７（ｄ）に示すように、押圧体１８により一方の基板１５を押圧して培養室１７に引込んだ状態で、細胞回収液を送液する送液手段を稼働させて、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液する。すると、送液により細胞培養面２０ａに生じる剪断応力が増大して、図７（ｅ）に示すように、押圧体１８による押圧面に対応する細胞接着面２０ａから細胞を剥離させ、細胞を回収することができる。押圧体１８により押圧を終了する際には、内圧の低下を防ぐため、培地を送液しながら行うことができる。このようにすることで、第五の実施形態である細胞培養システム１００では、細胞培養面全域から細胞を剥離することができる。図７（ｂ）において領域特異的に細胞の接着を弱めた場合には、図７（ｅ）では、細胞接着が弱まった細胞が優先的に剥離することになる。なお、高周波振動発生部１９は、発振処理後に他方の基板２０から降下してわずかに離れるようにしてもよいし、ずっと接触させたまま発振処理時のみ発振させてもよい。このように、第六の実施形態の細胞培養システムでは、一方の基板を押圧体により培養しつに向けて押圧して細胞培養容器内へ引込ませることと、その後、細胞回収液の送液の前に他方の基板の細胞接着面に高周波振動を与えて細胞接着を弱めることと、その後、培養室へ細胞回収液を送液することによって細胞を剥離することとを含んでなる。第六の実施態様の細胞培養システムは、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。また、第六の実施態様の細胞培養システムは、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５を培養室１７に向けて押圧し、高周波振動により領域特異的に細胞の接着を弱めて細胞培養表面に接着している特定の細胞を剥離し、その後、剥離した細胞を回収して継代してもよいし、剥離した細胞、例えば、不良な多能性幹細胞コロニーを除去してもよい。
【００７３】
第六の実施形態の変形例
次に、第六の実施形態の細胞培養システムの変形例を説明する。第六の実施形態の細胞培養システムの変形例は、高周波振動発生部１９が押圧体１８’としての機能を有している点が異なるのみであり、その他の構成は第六の実施形態の細胞培養システムと同一である。すなわち、第六の実施形態の細胞培養システムの変形例は、細胞培養容器１０の他方の基板２０が伸縮性材料からなり、他方の基板２０の外方に押圧体１８’をさらに備え、他方の基板２０の外方に設置された押圧体１８’は、他方の基板２０を培養室１７に向けて押圧して培養室１７内へ引込める押圧体である、第六の実施形態の細胞培養システムである。
【００７４】
第六の実施形態の細胞培養システムの変形例では、図９Ｂ（ｆ）に示すように、押圧体１８と高周波振動発生部１９の両方を培養室１７に押し込みながら、細胞回収液を流路１３および培養室１７に送液して培養室内の細胞接着面に接着した細胞を剥離することができる。また、第六の実施形態の細胞培養システムの変形例では、図９Ｂ（ｆ）に示すように、押圧体１８と高周波振動発生部１９の両方を培養室１７に押し込みながら、高周波振動発生部１９に高周波振動を発生させてもよい。このようにすることで、一方の基板１５および他方の基板２０が破損するリスクを低減することができる。第六の実施態様の細胞培養システムの変形例は、例えば、細胞培養表面に接着している細胞全体を剥離して回収する際、例えば、細胞の継代の際に用いることができる。また、第六の実施態様の細胞培養システムの変形例は、培養室１７全体の平面形状に対応する一方の基板１５を培養室１７に向けて押圧し、高周波振動により領域特異的に細胞の接着を弱めて細胞培養表面に接着している特定の細胞を剥離し、その後、剥離した細胞を回収して継代してもよいし、剥離した細胞、例えば、不良な多能性幹細胞コロニーを除去してもよい。
【００７５】
以上の実施形態においては、矛盾のない範囲ですべてのあらゆる組み合わせが可能である。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明の具体的実施例について説明する。本具体的実施例は、上述した図５の第四の実施形態に対応した方法で細胞の剥離を試みた。
【００７７】
実施例１：細胞培養容器の作製
本実施例では、はじめに培養容器（図１０参照）を試作した。
【００７８】
本実施例で作製した細胞培養容器は、図１０（ａ）に示される平面図、図１０（ｂ）に示される正面図、図１０（ｃ）に示される側面図および図１０（ｄ）に示される底面図を設計図として作製した。この細胞培養容器のＡ−Ａ断面図は図１０（ｅ）に、Ｂ−Ｂ断面図は図１０（ｆ）に示す。
【００７９】
細胞培養容器のフレーム（流路溝を形成した硬い枠）はポリカーボネートの機械加工で作製した。このフレームにＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）の薄膜をシリコーン系接着剤（セメダイン  スーパーＸ）で上下両面に各１枚、合わせて２枚貼り付けた（図１０（ａ）〜（ｅ））。
【００８０】
ＰＤＭＳ薄膜はスピンコート法により作製した。具体的には、まず、東レ・ダウコーニング社製ＳＩＬＰＯＴ  １８４  １０ｍＬを鏡面シリコン（Ｓｉ）ウェハ基板上に滴下して、真空脱泡処理を行った。次いで、１０００ｒｐｍ／３０秒のスピンコート条件でＳｉウェハ上に広げた。その後、大気雰囲気で１２０℃／２時間の熱処理後、ＳｉウェハからＰＤＭＳ薄膜を剥がした。
【００８１】
上記条件により０．０６５ｍｍ厚の透明ＰＤＭＳ薄膜を作製できた。
【００８２】
容器の出入り口はイソプロピレン製のゴム栓を着脱可能に設置した。流路寸法は、培養室と培養室をつなぐ曲がり部は１ｍｍ幅で１ｍｍ深さとし、培養室は５ｍｍ幅で３ｍｍ深さとした。曲がり部と培養室をつなぐテーパー部は、頂角６０°で広がる形状とし、深さは３ｍｍとした。容器全体の寸法は、１２７．６ｍｍ×８５．４ｍｍ×１０ｍｍ（Ｈ）（ゴム栓部を除く）とした。
【００８３】
実施例２：押圧体による押圧と酵素処理による細胞の剥離
本実施例では、実施例１で作製した細胞培養容器とブロック形状の押圧体を用いて、細胞の剥離実験を行った。
【００８４】
細胞は以下のように調製した。まず、ｉＰＳ細胞を実施例１で作製した細胞培養容器に播種し、通常のｉＰＳ細胞培養プロトコルによりＰＤＭＳ上で接着培養した（例えば、図１１（ａ）を参照）。直径２ｍｍ程度となったｉＰＳ細胞コロニーに対して、剥離実験を実施した。
【００８５】
次に、剥離実験は、以下のように行った。まず、培地を抜きながら押圧体１８を他方の基板２０に対して１．０ｍｍの距離まで接近させた状態で、コラゲナーゼＩＶ溶液（インビトロジェン社製コラゲナーゼＩＶを１００Ｕ／ｍＬの濃度に調整してハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ液）に溶かした液）にトリプシンを１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した細胞剥離液を２ｍＬ／ｍｉｎで供給することにより培地を細胞剥離液に交換した（例えば、図５（ｂ））。次いで、細胞剥離液処理を３７℃で１０分間行った。この時点では、ｉＰＳ細胞は細胞培養表面に接着していた（図１１（ｂ））。さらに、細胞剥離液を抜きながら押圧体１８を培養室内に押し込んで一方の基板１５を他方の基板２０から０．２ｍｍの距離まで接近させた状態で培地を１０ｍＬ／ｍｉｎで送液した。すると、培地の送液により剪断応力が発生し、ｉＰＳ細胞コロニーが培養容器外に回収された（例えば、図５（ｃ）および（ｄ）並びに図１１（ｃ））。ここで、図１１（ａ）は、培養直後の細胞の位相差顕微鏡像を示し、図１１（ｂ）は、細胞剥離液処理後の細胞の位相差顕微鏡像を示し、図１１（ｃ）は、送液により細胞を回収した後の細胞接着表面の位相差顕微鏡像を示す。
【００８６】
上記、実験において、押圧体１８を培養室内に押し込んで一方の基板１５を他方の基板２０との距離を１．０ｍｍとした場合は、１０ｍＬ／ｍｉｎの培地供給では細胞コロニーは培養容器外に回収されず、細胞コロニーの一部は千切れるがそのほとんどは培養基材面に接着したままであった。従って、一方の基板１５を他方の基板２０との距離を０．２ｍｍに近づけたことにより培地送液時に発生する剪断応力が高くなり、コロニーを回収できたと考えられる。このようにして、押圧体により培養室内の容積を減らして溶液供給を行うことにより発生する剪断応力を用いて細胞を剥離させて回収することができることが確認できた。
【００８７】
以上のように本発明によれば、細胞剥離液や培地の使用量を削減でき、かつ所望の剪断応力を与えることができ、閉鎖系培養において高効率に細胞を剥離、回収できる。
【００８８】
本発明の細胞培養システムでは、押圧体の押圧面により一方の基板を押圧して一方の基板を培養室に押し込むと、培養室に液体を送液した際に生じる剪断応力が押圧面により押圧した領域で増加する。そして、この剪断力を利用すると、培養室への送液により押圧面と接触して培養室に押し込まれた領域に対応する細胞接着面から細胞を剥離することができた。培養室全体の平面形状に対応する押圧面を有する押圧体を用いると、培養室の平面形状に対応する細胞接着面から、細胞を剥離することができた。また、本発明によれば、例えば、細胞を剥離するための酵素を含む細胞剥離液を用いてもよいが、押圧することにより、培養室の容積を低減させることができるため、高価な酵素の使用量を低減させることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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