(57)【要約】【課題】細胞、特に多能性幹細胞の効率的かつ均質な継代培養のための細胞培養容器、その細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法、および、その培養容器を用いた細胞継代培養システムを提供すること。【解決手段】細胞培養容器であって、一方の基板と、一方の基板に対向して配置された他方の基板と、一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、を備え、一方の基板は伸縮性材料からなる、細胞培養容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は伸縮性材料からなる、
細胞培養容器。
【請求項２】
一方の基板の内壁は細胞非接着性を持ち、他方の基板の内壁は細胞接着性を持つ、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
伸縮性材料が、ポリジメチルシロキサンまたはシリコーンである、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
一方の基板が、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍの厚みを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
細胞継代培養システムであって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の凹凸形状を有する対向面を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
【請求項６】
真空源は、対向面の各凹状部底面に接続されている、請求項５に記載の継代培養システム。
【請求項７】
細胞継代培養システムであって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の複数の突起を有する対向面を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
【請求項８】
細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の開口を形成する硬質フレーム部と、フレームの各開口内に延びる伸縮部からなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
【請求項９】
細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の硬質部と、硬質部分間に延びる伸縮部とからなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
【請求項１０】
細胞培養システムであって、
請求項８または９に記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に、一方の基板との間に真空室を形成する囲い体とを備え、
真空室に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより真空室を真空引きすることにより一方の基板に凹凸形状が形成される、
細胞継代培養システム。
【請求項１１】
請求項５〜７および１０のいずれか一項に記載の細胞継代培養システムであって、
囲い体は、細胞培養容器に対して取り外し自在となっており、選択された所望の囲い体を細胞培養容器に対して取り付けることができる、
細胞継代培養システム。
【請求項１２】
請求項５〜７、１０および１１のいずれか一項に記載の細胞継代培養システムであって、
細胞培養容器と囲い体を、真空室を形成するように接触させた状態で保持する固定具をさらに備え、
固定具は、回転機構に連結され、この回転機構により細胞培養容器と囲い体を回転させて天地反転させる、
細胞継代培養システム。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養容器を準備することと、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成するよう接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成させるように接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
複数の突起は、平面上、格子形状の各交点に配置されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各突起は、Ｒ０．４ｍｍ〜０．６ｍｍの丸み形状の先端を有する円柱体からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各突起は、１ｍｍ〜５ｍｍの間隔で配置された、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
各突起は、配置間隔以上の高さを有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜４、８および９のいずれか一項に記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程
をさらに含んでなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（Ｅ）において、
真空室の真空引きを解除し一方の基板に形成した凹凸形状を解消して、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、
真空室に気体を供給して一方の基板を培養室内に押し込むことにより工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、または、
真空室の真空引きの操作と真空室に気体を供給する操作を繰り返して一方の基板に振動を与えることにより、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させる、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜４、８および９のいずれか一項に記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程と、
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程および（Ｅ’）細胞を培養する工程、または、（Ｆ）工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板を細胞接着面として用いて培養する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２３】
閉鎖系の細胞培養容器であって、
伸縮性材料からなる第一の面と、
前記第一の面に対向して配置された第二の面と、
前記第一の面と前記第二の面との間に配置された側壁と、
前記第一の面、前記第二の面、および、前記側壁によって画設された前記溶液の流路を兼ねる培養室と、
溶液の注入口と、
を備えた閉鎖系の細胞培養容器。
【請求項２４】
前記第一の面は、細胞集塊を形成するように凹状に変形可能であることを特徴とする請求項２３に記載の閉鎖系の細胞培養容器。
【請求項２５】
前記第二の面は、細胞接着性を持つことを特徴とする請求項２３から２４に記載の閉鎖系の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器に関する。本発明はまた、本発明の細胞培養容器を用いた細胞継代培養方法に関する。本発明はさらに、本発明の細胞培養容器を備えた細胞継代培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
接着培養では、細胞は、酵素処理またはセルスクレイパーなどを用いて培養容器の接着面から剥離し、新鮮な培地を含む培養容器に継代される。多能性幹細胞は、単一細胞にまで解離させると死滅してしまうことが知られており（非特許文献１）、継代の際には、細胞塊の状態で継代することが必須となっている。そのため、多能性幹細胞の継代においては、培養容器から細胞を剥離する際には、多能性幹細胞をコロニーとして剥離し、ピペッティング等で適当な大きさの細胞塊に砕き、その後に新しい培養容器に播種している。
【０００３】
しかしながら、このような方法には、ピペッティングの技術によって細胞塊の大きさが変化し、また、得られる細胞塊のサイズが均等にはなりにくいという問題がある。継代の際のピペッティング操作により細胞塊のサイズがばらつくと、継代後の培養において生じるコロニーのサイズにもばらつきが生じ、細胞の品質管理の観点では万全とは言い切れない。また、各コロニーのサイズにばらつきが生じていると、あるコロニーが継代すべき一定サイズに達したとしても、他のコロニーでは細胞が十分に増殖できていないという問題が起こりうる。そして、培養中のコロニーサイズのばらつきは、細胞の生産効率の観点で悪影響を及ぼす。
【０００４】
ここで、多能性幹細胞から一定サイズの細胞集塊を得る手法が知られている（非特許文献２）。これらの方法で得られる細胞集塊は胚様体構造を有しているが、胚様体は、細胞を分化させるときに形成させるものである。特に、細胞に胚様体を形成させて培養すると細胞が分化を開始するが、この手法は、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の一つとして知られる。従って、非引用文献２などの方法では、得られた細胞集塊は、分化し易い状態に変化していると考えられている。また、胚様体の形成は、細胞を分化させるための前処理として有用であることも知られている（非特許文献２および３）。
【０００５】
一方、多能性幹細胞は、分化し易いことでも知られ、細胞の未分化状態を維持することは、多能性幹細胞の継代培養において最も重要な課題である。多能性幹細胞は特に、一度分化を開始すると未分化状態に戻すことが困難である。そのため、多能性幹細胞は、維持培養において、細胞を分化しやすい状態に変化させてはならない。
【０００６】
大量の多能性幹細胞の維持培養のためには、できるだけ簡便な手段で多能性幹細胞を効率的かつ均質に継代できる方法を確立する必要があるが、未分化状態を維持させたまま多能性幹細胞を均質に継代培養する方法は確立されていない。大量の多能性幹細胞の維持培養のためにはまた、全自動化に適した多能性幹細胞の継代培養の方法を確立する必要があるが、そのような方法も知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Watanabe, K., et al., “A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells”, Nature biotechnology, (2007) 25: 681.
【非特許文献２】Yasukawa A., et al., “COMBINATORIAL DIFFERENTIATION INDUCTION OF EMBRIONIC BODIES IN “PASCL (PNEUMATICALLY ACTUATED SPHEROIDS CULTURE LAB-ON-CHIP)”, MEMS (2013) 20-24.
【非特許文献３】島崎琢也、岡田洋平、吉崎崇仁および岡野栄之著、蛋白質核酸酵素、共立出版、２００６年、第５１巻、第１３号、１８５４〜１８６１頁
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、細胞、特に多能性幹細胞の効率的かつ均質な継代培養のための細胞培養容器、その細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法、および、その培養容器を用いた細胞継代培養システムを提供する。
【０００９】
（１）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は伸縮性材料からなる、
細胞培養容器。
（２）一方の基板の内壁は細胞非接着性を持ち、他方の基板の内壁は細胞接着性を持つ、上記（１）に記載の細胞培養容器。
（３）伸縮性材料が、ポリジメチルシロキサンまたはシリコーンである、上記（１）または（２）に記載の細胞培養容器。
（４）一方の基板が、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍの厚みを有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）細胞継代培養システムであって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の凹凸形状を有する対向面を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
（６）真空源は、対向面の各凹状部底面に接続されている、上記（５）に記載の継代培養システム。
（７）細胞継代培養システムであって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の凹凸形状を有する対向面を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
（８）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の開口を形成する硬質フレーム部と、フレームの各開口内に延びる伸縮部からなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
（９）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の硬質部と、硬質部分間に延びる伸縮部とからなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
（１０）細胞培養システムであって、
上記（８）または（９）に記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に、一方の基板との間に真空室を形成する囲い体とを備え、
真空室に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより真空室を真空引きすることにより一方の基板に凹凸形状が形成される、
細胞継代培養システム。
（１１）上記（５）〜（７）および（１０）のいずれかに記載の細胞継代培養システムであって、囲い体は、細胞培養容器に対して取り外し自在となっており、選択された所望の囲い体を細胞培養容器に対して取り付けることができる、
細胞継代培養システム。
（１２）上記（５）〜（７）、（１０）および（１１）のいずれかに記載の細胞継代培養システムであって、
細胞培養容器と囲い体を、真空室を形成するように接触させた状態で保持する固定具をさらに備え、
固定具は、回転機構に連結され、この回転機構により細胞培養容器と囲い体を回転させて天地反転させる、
細胞継代培養システム。
【００１０】
（１３）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器を準備することと、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成するよう接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
（１４）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成させるように接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
（１５）複数の突起は、平面上、格子形状の各交点に配置されている、上記（１４）に記載の方法。
（１６）各突起は、Ｒ０．４ｍｍ〜０．６ｍｍの丸み形状の先端を有する円柱体からなる、上記（１５）に記載の方法。
（１７）各突起は、１ｍｍ〜５ｍｍの間隔で配置された、上記（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）各突起は、配置間隔以上の高さを有する、上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）上記（１）〜（４）、（８）および（９）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなる、方法。
（２０）（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程
をさらに含んでなる上記（１９）に記載の方法。
（２１）工程（Ｅ）において、
真空室の真空引きを解除し一方の基板に形成した凹凸形状を解消して、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、
真空室に気体を供給して一方の基板を培養室内に押し込むことにより工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、または、
真空室の真空引きの操作と真空室に気体を供給する操作を繰り返して一方の基板に振動を与えることにより、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させる、
上記（２０）に記載の方法。
（２２）上記（１）〜（４）、（８）および（９）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程と、
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程および（Ｅ’）細胞を培養する工程、または、（Ｆ）工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板を細胞接着面として用いて培養する工程と
を含んでなる、方法。
（２３）閉鎖系の細胞培養容器であって、
伸縮性材料からなる第一の面と、
前記第一の面に対向して配置された第二の面と、
前記第一の面と前記第二の面との間に配置された側壁と、
前記第一の面、前記第二の面、および、前記側壁によって画設された前記溶液の流路を兼ねる培養室と、
溶液の注入口と、
を備えた閉鎖系の細胞培養容器。
（２４）前記第一の面は、細胞集塊を形成するように凹状に変形可能であることを特徴とする上記（２３）に記載の閉鎖系の細胞培養容器。
（２５）前記第二の面は、細胞接着性を持つことを特徴とする上記（２３）または（２４）に記載の閉鎖系の細胞培養容器。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の第一の実施形態における細胞培養容器の上方平面図である。
【図２】図２は、図１の細胞培養容器のＡ−Ａ断面における側方断面図である。
【図３】図３は、図１の細胞培養容器のＢ−Ｂ断面における側方断面図である。
【図４】図４は、本発明の第一の実施形態における細胞継代培養システムを説明する図である。
【図５】図５は、第三の実施形態における細胞培養容器およびその変形例並びに細胞継代培養システムを説明する図である。
【図６】図６は、第三の実施形態の変形例における細胞培養容器および細胞継代培養システムを説明する図である。
【図７】図７は、本発明の第二の実施形態における細胞継代培養システムを説明する図である。
【図８】図８は、第二の実施形態における細胞培養容器および細胞培養システムを用いて細胞を継代培養する方法を示す図である。
【図９】図９は、図８（ｃ）において、一方の基板１５から細胞集塊を解離させて他方の基板２０に播種する工程を説明する図である。
【図１０】図１０は、第二の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５上に細胞集塊を形成させ、その後、そのまま一方の基板１５を細胞接着面１５ａとして用いて培養することを説明する図である。
【図１１】図１１は、単一細胞レベルにまで分散させたヒトｉＰＳ細胞を、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ  ８００に播種した直後および１日後の細胞の状態（図１Ａ）並びに得られた細胞集塊（図１Ｂ）を示す図である。
【図１２】図１２は、遠心分離を行ってまたは行わずに得られた細胞集塊の継代後の細胞の位相差顕微鏡像である。
【図１３】図１３は、得られた細胞集塊の継代後の成長曲線を示す図である。
【図１４】図１４は、継代後のコロニーの位相差顕微鏡像および蛍光免疫染色像を示す図である。
【図１５】図１５は、培養容器の培養面に落下させた細胞集塊の培養面上での配置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
第一の実施形態
以下、第一の実施形態について説明する。
【００１３】
（細胞培養容器）
本発明の第一の実施形態における細胞培養容器は、浮遊細胞または接着細胞用の細胞培養容器である。接着細胞としては特に限定されないが、多能性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、体細胞および生殖細胞などの接着細胞が挙げられ、好ましくは、多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。浮遊細胞としては、血球系細胞、好ましくは、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１４】
本発明の第一の実施形態における細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、一方の基板１５と、一方の基板に対向して配置された他方の基板２０と、一方の基板と他方の基板との間に介在されて、培養室１７と流路１３とを形成する側壁１６とを備えている。また、培養室１７に接する一方の基板１５および他方の基板２０のうち少なくとも一方、例えば、他方の基板２０が細胞接着面２０ａを形成する。一方の基板１５は、少なくとも培養室１７の平面形状に対応する領域（すなわち、培養室１７に面した領域）では伸縮性材料からなる。
【００１５】
細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、細胞培養容器１０内に複数の培養室１７を備えていてもよいが、特に限定されず、培養室１７は１つのみであってもよい。細胞培養容器１０が培養室１７を複数備えている場合には、それぞれの培養室１７は図１に示されるように流路１３によって連結されていてもよいが、特に限定されず、培養室がそれぞれ独立して入口１１および出口１２を備えていてもよい。ここで、入口１１とは、送液される溶液の入口であり、出口１２とは送液される溶液の出口である。また、入口１１と出口１２は必ずしも別々に設けられている必要はなく、一体として設けられていてもよい。
【００１６】
培養室１７は、対向して設置された２つの流路１３と接続され、一方の流路１３から溶液が導入され、他方の流路１３から溶液が廃液される。このようにすることで、培養室１７内において送液される溶液に一方向性の安定した流れを生じさせることができる。細胞培養容器１０が複数の培養室１７を備える場合には、送液される溶液の流れが一方向性を示すように、例えば、図１のような流路配置で培養室１７および流路１３を配置することができる。一方向性の安定した流れは、細胞懸濁液を培養容器内に均一に播種する上で、または細胞培養液を均一に灌流する上で好ましい。
【００１７】
細胞培養容器１０の一方の基板１５は、伸縮性材料で形成される。これにより、後述するように、一方の基板１５に凹凸形状を形成させたり、凹凸形状を解消させたりすることが可能である。一方の基板１５は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましく、無色透明であることがより好ましい。このような伸縮性材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）およびシリコーンが挙げられる。
【００１８】
一方の基板１５は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍ、０．０５ｍｍ〜０．１ｍｍの厚みを有する。また、一方の基板１５の硬度は、タイプＡデュロメーター硬度で２０〜６５、好ましくは２０〜３０とすることができる。
【００１９】
細胞接着面以外の培養室１７の内面、例えば、細胞接着面２０ａ以外の培養室１７の内面は、細胞非接着性であることが好ましく、細胞の接着を防ぐ目的で、細胞非接着コーティングがなされていてもよい。培養室１７と接する領域において細胞の接着を防ぐことにより、例えば、後述するように細胞集塊を形成した後に、細胞集塊を効率良く一方の基板１５から剥離することができる。細胞非接着コーティングは、細胞非接着性を有するコーティングであれば特に限定されないが、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリ乳酸；ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類、およびこれらの細胞非接着性の誘導体によるコーティングが挙げられる。透明性が高く視認性がよいという観点では、ポリエチレングリコールが好ましい。
【００２０】
他方の基板２０の細胞接着面２０ａは、細胞接着性であることが好ましく、細胞接着性を付与する目的で細胞接着性コーティングがなされていてもよい。例えば、マトリゲル（商標）（ＢＤファルコン社製）などの細胞接着性の基底膜マトリックスを用いると接着面に細胞接着性コーティングを施すことができる。コーティングは、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、市販されているコーティング剤を用いる場合には製造者マニュアルの記載に従ってコーティングすることができる。
【００２１】
また、他方の基板２０は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましい。他方の基板２０は、特に限定されないが、培養室内の酸素濃度および二酸化炭素濃度を保つ観点から、ガス透過膜であることが好ましく、例えば、細胞培養用のガス透過膜として細胞培養用にポリスチレン製ガス透過膜が市販されている。ガス透過膜は、培養室１７内の培地に酸素などを供給する上で重要な役割を果たす。また、ガス透過膜を用いると、超音波振動により効果的に細胞を膜表面から剥離できるため、細胞の剥離方法に選択肢が増える点で有利である。他方の基板２０は、非伸縮性材料で形成されていてもよいが、一方の基板１５と同様に伸縮性材料で形成されていてもよい。このように一方の基板１５および他方の基板２０の両面ともを伸縮性材料とすると、一方の基板１５が凹凸形状を形成することによる培養室１７の容積変動を、他方の基板２０が伸縮することにより吸収することができる。これにより、ゴム栓等を用いて出口および入口を封止してから一方の基板１５に凹凸を形成させても、出口および入口からの液漏れリスクを抑制できる。
【００２２】
細胞培養容器１０の側壁１６は、特に限定されないが、例えば、プラスチック製とすることができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または、アクリルとすることができる。他方の基板２０が伸縮性でない場合、他方の基板２０は、例えば、プラスチック製とすることができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または、アクリルとすることができる。
【００２３】
細胞培養容器１０の一方の基板１５は、伸縮性材料から形成され、後述するように様々な凹凸形状を形成させることができ、また、容易に解消させることができる。これにより、細胞培養容器１０は、必要なときにだけ凹凸形状を形成させることができ、培養細胞の観察時には凹凸形状を解消させることで高い視認性を確保することができる。凹凸形状を解消させることで、培地、試薬および試料を節約することができる。
【００２４】
（細胞継代培養システム）
次に、図１〜４により、第一の実施形態における細胞継代培養システムについて説明する。
【００２５】
本発明の第一の実施形態における細胞継代培養システムは、図４に示すように、本発明の第一の実施形態における細胞培養容器１０（図１〜３参照）と、細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に設けられ、一方の基板１５に対向する対向面に凹凸形状３２を有する囲い体３０とを備えている。第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体の対向面に真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させることにより囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面を真空引きして一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面に吸着させ、一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。真空源９２は、好ましくは、対向面の各凹状部底面３３に接続する。
【００２６】
すなわち、一方の基板に形成される凹凸形状３４は、一方の基板１５と、一方の基板に対応する対向面に凹凸形状３２を有する囲い体３０とを、一方の基板と囲い体との間に真空室３５を形成させるように接触させ、真空室３５を真空引きすることにより、一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面に吸着させて形成される形状であり、凹凸形状３２に対応する形状である。一方の基板に形成される凹凸形状３４は、細胞集塊を形成させるために用いるマイクロウェルとして用いることができる。
【００２７】
本実施形態における細胞継代培養システムは、図４（ｃ）に示すように、細胞培養容器１０と囲い体３０とを保持する固定具８０を備えている。固定具８０は、一方の基板１５と囲い体３０との間に真空室３５を形成させるように接触させた状態で細胞培養容器１０と囲い体３０とを動かないように固定することができる。固定具８０としては、例えば、細胞培養容器１０と囲い体３０とを挟持する固定具、例えば、クランプを用いることができる。固定具８０は、細胞培養容器１０と囲い体３０とを回転により天地反転させる回転機構８０Ａに回転軸８１を介して連結され得る。
【００２８】
後述するように、回転機構８０Ａを備えた固定具８０を有する本実施形態における細胞継代培養システムは、接着系細胞の培養に好ましく用いることができる。従って、回転機構８０Ａを備えた固定具８０を有する本実施形態における細胞培養継代システムは、接着系細胞の培養のための細胞培養継代システムとすることができる。接着系細胞の培養のための細胞培養継代システムにおいては、細胞培養容器として、好ましくは、一方の基板１５の内面が細胞非接着性を持ち、他方の基板２０の内面が細胞接着性を持つ細胞培養容器を用いる。
【００２９】
本実施形態における細胞継代培養システムは、真空室３５を真空引きした後に、真空ライン９１を塞いでその真空状態を維持するバルブ９０を備えていてもよい。真空源９２の駆動中にバルブ９０を閉じることにより、真空源９２による真空引きを停止した後でも一方の基板１５上の凹凸形状３４を維持することができる。その後、細胞培養容器１０と囲い体３０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体３０とバルブ９０を別の場所に搬送してもよい。真空ライン９１およびバルブ９０は、囲い体３０から取り外し自在に取り付けられていてもよいし、囲い体３０と一体となっていてもよい。なお、真空とは大気圧から減圧された状態を指す。
【００３０】
マイクロウェルの形状としては、市販されているＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（STEM CELL TECHNOLOGIES社製）のプレート底面に刻まれたマイクロウェルの形状（すなわち、四角錐形状）が挙げられる。マイクロウェルを用いた細胞培養では以下の原理を用いて細胞集塊を形成させることができる。まず、細胞をマイクロウェル内に播種すると細胞は細胞培養液中で重力により自然と沈降する。従って、傾斜を有するマイクロウェル（凹み）中に細胞を播種すると、マイクロウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。細胞は、その後、隣り合う細胞と細胞接着を形成して細胞集塊を形成する。従って、細胞に細胞集塊を形成させるためには、マイクロウェルは、細胞が沈んだときに集まる形状、例えば、その内周が底面に近づくほどすぼんだ形状を有していることが好ましい。すなわち、マイクロウェルは、例えば、錐形状、丸底、Ｖ底およびＵ底を有していることが好ましい。また、培養室に向けて開口する各ウェルの開口部の形状は、加工の容易性やウェルを大量に配置できる形状を考慮して適宜選択することができるが、例えば、三角形、四角形若しくは六角形などの多角形の形状または円の形状を有することができる。
【００３１】
本明細書では、細胞集塊を形成させるためのウェルは、通常の細胞培養に用いるマルチプレートの培養室を区画するためのウェルと区別するために「マイクロウェル」と呼ぶ。「マイクロウェル」は、一辺または直径１ｍｍ以上の開口部を有するウェルを除外することを意図する用語ではなく、「マイクロウェル」には、一辺または直径１ｍｍ以上の開口部を有するウェルが含まれる。本明細書では、マイクロウェルを「凹み」と呼ぶことがある。マイクロウェルの開口部の大きさは、形成させる細胞集塊の大きさにより決定することができ、例えば、直径１００μｍ〜３ｍｍ、直径２００μｍ〜８００μｍ、または直径４００μｍ〜６００μｍの円と同等の面積を有する開口部を備えることができる。
【００３２】
本発明では、形成させる細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。形成させる細胞集塊の大きさを揃える観点からは、細胞培養容器の一方の基板に形成させるマイクロウェルの形状は均一であることが好ましい。このようにすることで、細胞を比較的均一にマイクロウェル中に分散させることが容易となり、結果として均一な大きさの細胞集塊を形成させることが可能となる。
【００３３】
細胞集塊を大量に取得可能とする観点では、マイクロウェルは、容器の底面に多数配置されていることが好ましく、マイクロウェルは隙間無く（隣り合うウェルの間に平坦な部分が存在しないように）またはマイクロウェル間の隙間を最小限とするように配置されていることが好ましい。
【００３４】
また、後述するように、形成した細胞集塊を培養面に均一に播種する観点では、マイクロウェルは平面上に等間隔で整列されていることが好ましい。
【００３５】
凹凸形状３４は、囲い体３０の凹凸形状３２によって決定されるので、囲い体３０の凹凸形状３２は、凹凸形状３２に吸着して形成される凹み３４の形状および配置が上記マイクロウェルの形状および配置となるように形成されていることが好ましい。
【００３６】
第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体は取り外し自在であり、囲い体を所望の囲い体に取り替えることができる。これにより、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、異なる凹凸形状３２を有する囲い体３０を用いることで、同一の細胞培養容器１０の一方の基板１５に様々な凹凸形状３４を形成させることができる。例えば、大きな細胞集塊を得たい場合には、凹凸形状の一つ一つの凹みが大きい囲い体を用いることができるし、小さな細胞集塊を得たい場合には、一つ一つの凹みが小さい囲い体を用いることができる。
【００３７】
第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、一方の基板１５の凹凸形状３４を用いて形成させた細胞集塊は、細胞培養容器を天地反転することにより他方の基板２０に播種することができる。従って、第一の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞培養容器１０と囲い体３０とを回転させて天地反転させる細胞培養容器の回転機構８０Ａをさらに備えていてもよい。
【００３８】
第一の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞剥離液および細胞回収液などの溶液を流路および培養室に送液する送液手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムはさらに、培養室の温度または培養室周辺の温度を制御する温度制御手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムはさらにまた、培養室周辺の湿度を制御する湿度制御手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、細胞培養容器は細胞継代培養システムの他の部分から取り外し可能な細胞培養容器であってもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムは、内部の温度および湿度を細胞の培養に適した温度および湿度に制御することができる雰囲気制御手段を備えたインキュベーターを備えていてもよい。
【００３９】
（第一の実施形態における作用）
次に、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）により、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いて、第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法を説明する。第一の実施形態における細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。
【００４０】
ここで、図４（ａ）は、第一の実施形態における細胞培養システムに用いられる囲い体３０の平面図であり、図４（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図である。図４（ｃ）は、第一の実施形態における細胞培養システムにおいて、第一の実施形態における細胞培養容器と囲い体３０とを接触させた状態の、図４（ａ）に示すＡ−Ａ断面における側方断面図である。また、図４（ｄ）は、第一の実施形態における細胞培養システムにおいて、一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２に吸着させて一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させた状態の細胞継代培養システムの上方平面図であり、図４（ｅ）はそのＡ−Ａ断面における側方断面図である。通常は、細胞培養容器１０の培養室１７および流路１３は細胞培養培地で満たされている。
【００４１】
まず、図４（ｃ）に示すように、第一の実施形態における細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に真空室３５が形成されるように囲い体３０を接触させる。次に、囲い体３０の各凹状部底面３３に接続された真空源９２を動作させ、囲い体３０の凹凸形状を有する対向面を真空引きする。すると、図４（ｄ）および（ｅ）に示すように、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成される。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５を真空引きした後に、その真空状態を維持するバルブ９０を備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じることができる。すると、真空室３５の真空引きを停止しても、凹凸形状３４を維持することができる。その後、細胞培養容器１０と囲い体６０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体６０とバルブ９０を別の場所（例えば、インキュベーター）まで搬送してもよい。一方の基板１５に凹凸形状３４を形成および解消させると凹凸形状の形成に伴い培養室１７の容積が変動し、必要培地量が変化するため、凹凸形状の形成および解消の際には、培養室１７への培地の送液または培養室１７からの培地の排出により培養室１７中の培地量を調整してもよい。例えば、一方の基板１５に陰圧を付与する場合、凹凸形状の形成に伴い必要培地量は増加する。従って、凹凸形状の形成の際には、培養室１７へ培地を送液して必要培地量の増加分を補ってもよい。
【００４２】
また、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、一方の基板１５は伸縮性材料からなり、一方の基板１５に形成させた凹凸形状３４は、真空引きを解除することにより容易に解消される。一方の基板１５の陰圧を解除する際には、凹凸形状の解消に伴い、必要培地量は減少する。従って、凹凸形状の解消の際には、培養室１７から培地を排出して必要培地量の減少分を調整してもよい。
【００４３】
このようにして、第一の実施形態における細胞培養容器１０と囲い体３０を備えた第一の実施形態における細胞継代培養システムは、一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させ、形成させた凹凸形状３４を解消させることができる。
【００４４】
上述の通り、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、細胞培養容器の一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。そして、凹凸形状３４は囲い体の対向面の凹凸形状３２に対応した形状となる。後述するように、凹凸形状を一定の形状とし、この凹凸形状により形成される凹み（マイクロウェル）に細胞を播種すると、細胞は一定の大きさの細胞集塊を形成するが、細胞に一定の大きさの細胞集塊を形成させてから培養により細胞を増殖させることで、それぞれの細胞集塊が同じ増殖速度を示し、各コロニーの継代のタイミングを同期させることが可能になる。従って、この方法は、全自動の細胞の継代培養システムを確立する上で非常に有利である。
【００４５】
以下、図８〜１０により第一の実施形態において細胞を継代培養する方法を説明する。例えば、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いれば、多能性幹細胞の閉鎖系培養を簡便に行うことができる。
【００４６】
図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）により、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた場合の細胞を継代培養する方法を説明する。図８では、後述する第二の実施形態における細胞継代培養システムが図示されているが、一方の基板１５に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、細胞を継代培養する原理および工程は第一の実施形態において細胞を継代培養する方法と変わらない。
【００４７】
ここで、図８は、第二の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５上に細胞集塊を形成させ、細胞集塊を他方の基板２０上に播種する方法を示す図である。まず、図８（ａ）に示すように、第二の実施形態における細胞培養容器が細胞懸濁液で満たす。次に、図８（ｂ）に示すように、真空室６４を真空引きして細胞培養容器の一方の基板に多数のマイクロウェルを形成させる。すると、細胞懸濁液中の細胞は、形成させたマイクロウェルに落下して、細胞集塊を形成する。なお、マイクロウェルを形成は、培養室１７の容積増大に対応するため、培養室１７に培地または細胞懸濁液をさらに送液しながら行うことができる。その後、図８（ｃ）に示すように、回転機構８０Ａを駆動させて固定具８０を回転させることにより、本発明の細胞培養容器１０および囲い体６０を天地反転して、形成させた細胞集塊を他方の基板２０上に播種する。一部の細胞集塊が依然一方の基板１５に付着して他方の基板２０上に播種されていない場合（例えば、図８（ｃ））には、その後さらに図８（ｄ）に示すように、真空室６４の真空引きを解除して一方の基板１５の凹凸形状を解消し、それにより、一方の基板１５に付着した細胞集塊を他方の基板２０上に落下させる。図８（ｅ）は、その後、細胞を培養し、各細胞集塊がコロニーを形成した状態を示す図である。図８（ｂ）〜（ｅ）では、培養室１７は培地で満たされている。なお、図８（ｃ）〜（ｄ）の工程は、繰り返して行ってもよい。
【００４８】
従って、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程と、
（Ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなる。上記工程（Ｂ）および（Ｃ）はどちらを先に行ってもよい。
【００４９】
すなわち、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（ｂ）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程と、
（ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させて、凹凸形状の凹み３４に細胞を播種する工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなるものとしてよい。
【００５０】
また、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、一方の基板１５に凹凸形状を形成させた後に細胞懸濁液を培養室１７内に注入してもよい。すなわち、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（ｂ’）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させる工程と、
（ｃ’）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入して、一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種する工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなるものとしてもよい。
【００５１】
本発明の細胞の継代方法は、工程（Ａ）〜（Ｄ）の後に、（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
本発明の細胞の継代方法はまた、工程（Ｅ）の後に、培養の工程、すなわち、（Ｅ’）播種した細胞を他方の基板２０上で培養する工程をさらに含んでいてもよく、あるいは、工程（Ａ）〜（Ｄ）の後に、（Ｆ）工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板１５上で培養する工程をさらに含んでいてもよく、従って、細胞を継代し培養する方法とすることができる。本発明の細胞の継代方法はまた、（Ｇ）培養した細胞を回収する工程をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
以下、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法について、各工程を詳細に説明する。
【００５４】
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程
（細胞接着面からの細胞の剥離）
第一の実施形態では、接着培養において、生理学的にまたは物理的に細胞接着面から剥離させた多能性幹細胞を用いることができる。本発明では、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させる酵素としては、常法で用いられる酵素を用いることができ、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼまたはコラゲナーゼなどの酵素を用いることができる。多能性幹細胞の細胞接着面からの剥離はまた、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二価イオン（特にＭｇ２＋）のキレート剤など、細胞剥離作用を有する化学物質を用いて行ってもよく、これらを上記酵素と組み合わせて用いて行ってもよい。本発明ではまた、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させるために、細胞の接着表面に高周波振動などの振動を与えてもよく、および／または、セルスクレイパーを用いてもよい。本発明では更に、上記の生理学的な剥離法と物理的な剥離法を組み合わせて細胞を剥離してもよい。当業者であれば、細胞接着面からの多能性幹細胞の剥離は上記のような周知の剥離法を用いて適宜行うことができるであろう。
【００５５】
第一の実施形態では、細胞塊は単一細胞レベルにまで解離させることができる。細胞塊の解離は、細胞の培養面からの剥離と同時に行ってもよいし、細胞塊として剥離させた後に行ってもよい。
【００５６】
（細胞の分散）
接着面から剥離させた細胞が細胞塊の形状を保っている場合には、剥離させた細胞塊は、例えば、ピペッティングの水流により単一細胞レベルにまで解離させてから分散させることができる。本明細書では、「単一細胞レベルにまで分散させる」とは、細胞塊１つ当りに含まれる細胞数の平均が、１〜１００個、好ましくは、１〜１０個となるように細胞塊を解離させてから分散させることを意味し、完全に単一細胞にまで解離させてから分散させることを含むものとする。従って、本発明では、細胞塊は完全に単一細胞にまで解離させてから分散させてもよいし、大部分が単一細胞となるように解離させてから分散させてもよいし、大部分が１〜１００個、好ましくは、１〜１０個の細胞からなる細胞塊となるように解離させてから分散させてもよい。分散後の細胞塊が大きい場合は、細胞塊をマイクロウェルに播種する際に、それぞれのマイクロウェルに播種される細胞数にばらつきが生じやすくなるため、分散後の細胞塊は小さい方が好ましい。
【００５７】
また、培養面から剥離させた細胞塊は、酵素を用いてさらに処理することにより単一細胞レベルにまで分散させてもよい。細胞を単一細胞レベルにまで解離させるために用いることができる酵素としては、細胞−細胞間の結合を切断することのできる酵素や細胞−細胞外基質（ＥＣＭ）間の結合を切断することのできる酵素を挙げることができ、これらの酵素は、当業者に周知である。酵素や水流を用いた細胞塊の解離は、自動化が可能であり、工程（Ａ）は自動化が可能である。
【００５８】
細胞を単一細胞レベルにまで解離させ分散させた後は、分散させた細胞の懸濁液に、細胞を分散させたことによる細胞への悪影響（例えば、細胞死等）を抑制する化合物、例えば、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。
【００５９】
以下、工程（Ｂ）を行った後に工程（Ｃ）を行う場合の方法、すなわち、工程（ｂ）および（ｃ）について説明する。
【００６０】
（ｂ）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程
本工程では、工程（Ａ）で分散させた細胞の懸濁液を細胞培養容器１０の入口１１から培養室１７に注入することができる。細胞の懸濁液は、入口１１に接続された注入装置（図示せず）により細胞培養容器内に注入される。
【００６１】
（ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させて、凹凸形状の凹み３４に細胞を播種する工程
工程（Ａ）で分散させて得られた細胞または細胞塊（以下、単に「細胞」ということがある）は、細胞集塊を形成させた後に継代するとその後良好に増殖させることができる。細胞集塊の形成は、得られた細胞を一方の基板１５上に凹凸形状（マイクロウェル）を形成させてその凹みに播種することにより行うことができる。工程（Ａ）で分散させて得られた細胞は、培養液中では重力により自然と沈む。従って、傾斜を有するウェル（凹み）中に細胞を播種すると、ウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。その後、細胞は、隣り合う細胞と接着して細胞集塊を形成する。工程（ｂ）で細胞の懸濁液が注入した後に一方の基板１５上に凹凸形状させれば、懸濁液中の細胞は、その凹凸形状に落下して、ウェルの底に集まる。
【００６２】
第一の実施形態では、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。ここで、作製する細胞集塊の大きさは、凹凸形状の各凹みに播種される細胞数により決定されるので、工程（ｃ）では、各凹みに播種される細胞数は一定量に揃えられていることが好ましい。ここで、一定量とは、工程（ｃ）で各マイクロウェルに播種される細胞数の平均が、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であることを意味する。工程（ｃ）で各マイクロウェルに播種される細胞数を一定量に揃えるためには、細胞懸濁液中の細胞の濃度を調整した後に、懸濁液中で細胞を十分に懸濁してから培養室に送液すればよい。送液された細胞は、重力によりマイクロウェル中に自然落下し得る。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、固定具８０を備える場合には、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体６０とを接触させた後に、固定具８０により、細胞培養容器１０と囲い体６０を固定する。また、第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５の真空状態を維持するバルブを備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じて真空室３５と真空源９２とをつなぐ真空ライン（ガスの流路）９１を塞いで真空引きを停止すると、真空引き停止後も凹凸形状３４を維持することができる。 
【００６３】
一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させると、培養室１７が体積変化を起こす。培養室１７が体積変化に対応するためには、培養室１７への送液を行いながら一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。
【００６４】
第一の実施形態では、凹みへの細胞の接着を防ぎたい場合（例えば、以下の工程（Ｅ）を実施する場合）には、一方の基板１５の表面は、細胞に対して非接着性のコーティングを施しておくことができる。
【００６５】
各凹みに播種する細胞の数は、適宜調整することができる。また、マイクロウェルへの細胞の播種は、細胞を十分に懸濁することにより均一に行うことができる。これらの操作は自動化が可能であるから、工程（ｃ）において、一定量の細胞をマイクロウェルに播種する工程も全自動化が可能である。
【００６６】
次に、工程（Ｃ）を行った後に工程（Ｂ）を行う場合の方法、すなわち、工程（ｂ’）および（ｃ’）について説明する。
【００６７】
（ｂ’）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させる工程
第一の実施形態における細胞培養容器は、上記のように、一方の基板１５に凹凸形状を形成させることができる。すなわち、上述のように、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体とを接触させて、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成させ、真空室を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させることができる。工程（ｂ’）は全自動化が可能である。
【００６８】
（ｃ’）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入して、工程（ｂ’）で形成させた凹凸形状の凹みに播種する工程
工程（Ａ）で分散させて得られた細胞または細胞塊（以下、単に「細胞」ということがある）は、細胞集塊を形成させた後に継代するとその後良好に増殖させることができる。細胞集塊の形成は、得られた細胞を一方の基板１５上のマイクロウェルに播種することにより行うことができる。一方の基板１５上のマイクロウェルへの細胞の播種は、一方の基板１５を下にして培養室１７内に細胞懸濁液を送液することにより行うことができる。工程（Ａ）で分散させて得られた細胞は、培養液中では重力により自然と沈む。従って、傾斜を有するウェル（凹み）中に細胞を播種すると、ウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。その後、細胞は、隣り合う細胞と接着して細胞集塊を形成する。
【００６９】
第一の実施形態では、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。ここで、作製する細胞集塊の大きさは、凹凸形状の各凹みに播種される細胞数により決定されるので、工程（ｃ’）では、各凹みに播種される細胞数は一定量に揃えられていることが好ましい。ここで、一定量とは、工程（ｃ’）で各マイクロウェルに播種される細胞数の平均が、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であることを意味する。工程（ｃ’）で各マイクロウェルに播種される細胞数を一定量に揃えるためには、細胞懸濁液中の細胞の濃度を調整した後に、懸濁液中で細胞を十分に懸濁してから培養室に送液すればよい。送液された細胞は、重力によりマイクロウェル中に自然落下し得る。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、固定具８０を備える場合には、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体６０とを接触させた後に、固定具８０により、細胞培養容器１０と囲い体６０を固定する。また、第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５の真空状態を維持するバルブを備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じて真空室３５と真空源９２とをつなぐ真空ライン（ガスの流路）９１を塞いで真空引きを停止すると、真空引き停止後も凹凸形状３４を維持することができる。
【００７０】
第一の実施形態では、凹みへの細胞の接着を防ぎたい場合（例えば、以下の工程（Ｅ）を実施する場合）には、一方の基板１５の表面は、細胞に対して非接着性のコーティングを施しておくことができる。
【００７１】
各凹みに播種する細胞の数は、適宜調整することができる。また、マイクロウェルへの細胞の播種は、細胞を十分に懸濁することにより均一に行うことができる。これらの操作は自動化が可能であるから、工程（ｃ’）において、一定量の細胞をマイクロウェルに播種する工程も全自動化が可能である。
【００７２】
さらに、上記工程（Ｂ）および（Ｃ）に続く工程について説明する。
【００７３】
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程
図８（ｂ）に示すように、一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞は、そのまま静置しておくことで重力により各凹みの底に集まり、細胞同士が接着し、細胞集塊を形成する。細胞は、本発明の細胞培養容器を遠心分離の手法を用いて遠心することによって凹みの底に集めてもよい。
【００７４】
遠心分離の手法を用いる場合には、特に限定されないが、４００ｇ〜３０００ｇで１分〜１０分間の遠心分離を行うことができる。このようにすることで、細胞を凹みの底面に効果的に集めることができる。
【００７５】
第一の実施形態によれば、遠心分離の手法を用いて細胞集塊を形成させると、細胞を密に凝集させることができると考えられるが、第一の実施形態では、必ずしも遠心分離の手法を用いる必要は無い。すなわち、凹みに単一細胞レベルまで分散させた細胞を播種した後、遠心分離の手法を用いることなく、例えば、凹み中で細胞を静置するだけでも数時間以内に多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることができる。このように、第一の実施形態では、遠心分離の手法を用いることなく細胞集塊を形成させることができる。
【００７６】
第一の実施形態では、凹み中で静置することにより多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることができる。静置時間は、多能性幹細胞が細胞集塊を形成させるために必要な時間以上であればよく、例えば、８時間以上である。細胞集塊の形成時間を短縮する観点では、静置時間は、例えば、８時間〜２４時間、好ましくは８時間〜１６時間、さらに好ましくは８時間〜１２時間とすることができる。細胞培養容器１０は、真空室３５の真空状態を維持するバルブ９０を備える場合には、バルブ９０を閉じて真空室３５の真空状態を維持したまま、静置中は、細胞培養容器１０と囲い体６０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体６０とバルブ９０をインキュベーターまで搬送してインキュベーター内で静置してもよい。第一の実施形態では、静置時間が短いほど細胞集塊中の細胞間の結合は緩いため、細胞集塊が壊れやすい一方、培養容器への播種後は細胞集塊が素早く展開するという利点がある。
【００７７】
第一の実施形態では、工程（Ｄ）で作製する細胞集塊は、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。上記のように、それぞれの細胞集塊に含まれる平均細胞数は、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であり、細胞集塊の平均直径は、凹みのサイズと播種する細胞数により適宜調整することができる。また、凹みは、作製したい細胞集塊のサイズより大きいサイズのものを選択することができる。
【００７８】
凹みに播種された細胞は、遠心分離工程を行って、あるいは行わずに単に静置するだけで細胞集塊を形成する。従って、工程（Ｄ）は全自動化が可能である。
【００７９】
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程
第一の実施形態における細胞培養容器において工程（Ｄ）により一方の基板１５に形成された凹凸形状の凹みの中で形成された細胞集塊は、その後、細胞培養容器の他方の基板２０に播種することができる。工程（Ｅ）は、例えば、接着系細胞の培養の際に好ましく行うことができ、他方の基板２０の細胞接着面２０ａは細胞接着性とすることができる。
【００８０】
図８（ｃ）に示すように、第一の実施形態では、工程（Ｅ）において、細胞集塊の精密播種が可能である。具体的には、固定具８０により細胞培養容器１０と囲い体６０とを固定した状態で、固定具８０に備わった回転機構を駆動させて細胞培養容器１０を天地反転させて細胞集塊を他方の基板２０上に落下させることにより、細胞集塊を細胞培養容器の培養面（例えば、他方の基板２０）に精密播種することができる。工程（Ｅ）において細胞培養容器を天地反転させると、細胞集塊は、各凹みからほぼ垂直に培養容器の培養面に落下するため、天地反転させた凹みの配置と鏡映しの配置で培養面上に播種されることになる。従って、凹みは、培養面上に落下した後の細胞集塊の配置に基づいて設計することができる。これにより、培養容器の培養面上に細胞集塊を均一に播種することができ、細胞を培養面上で均一に増殖させ得る。播種された細胞集塊は、播種後速やかに展開し、その後、多能性を維持した状態で良好に培養することができる。細胞集塊を培養容器の培養面上に均一に播種する観点では、細胞集塊を含む細胞懸濁液は、十分に懸濁してから播種することが好ましい。
【００８１】
重力による細胞集塊の沈降速度はそれほど速くないので、凹みの表面と細胞集塊とが接着していない場合であっても、第一の実施形態における細胞培養容器を天地反転させれば、比較的良好に細胞集塊を他方の基板の培養面上で整列させることができる。
【００８２】
図８（ｃ）に示すように、天地反転した後にも依然細胞集塊が凹みの表面に接着している場合には、一方の基板１５に付与している陰圧を解除して、一方の基板に形成させた凹凸形状を解消し、それにより細胞集塊と一方の基板１５との接触面の面積を低減させることにより解離させてもよい。
【００８３】
図９に示すように、天地反転した後にも依然として細胞集塊が凹みの表面に接着している場合には、細胞集塊と一方の基板との解離は、様々な手法で行い得る。
【００８４】
ここで、図９（ａ）は、図８（ｄ）に対応する状態を示す図である。図９（ａ）では、一方の基板１５の凹凸形状を解消した後も依然として一部の細胞集塊が一方の基板１５に接着し続けている。図９（ｂ）は、真空室に気体を供給して一方の基板１５を培養室１７に押し込み、これにより細胞集塊を一方の基板１５から解離し、他方の基板２０上へ落下させる方法を説明する図である。図９（ｃ）は、真空室の真空引きと真空室への気体の供給を繰り返し、これにより細胞集塊を一方の基板１５から解離し、他方の基板２０上へ落下させる方法を説明する図である。図９（ａ）、（ｂ）および（ｃ）では、培養室１７は培地で満たされている。また、図９（ａ）、（ｂ）および（ｃ）では、細胞培養容器１０と囲い体６０とは、固定具８０により固定されている。
【００８５】
図９（ｂ）に示すように、一方の基板と細胞集塊との接着は、真空室に気体を供給して一方の基板１５を培養室１７内に押し込んで細胞集塊と一方の基板１５との接触面の面積を低減させることにより解離させてもよく、図９（ｃ）に示すように、真空室の真空引きと真空室への気体の供給を繰り返すことにより解離させてもよい。
【００８６】
工程（Ｅ）の後には、（Ｅ’）細胞を他方の基板２０上で培養する工程をさらに行ってもよい。また、工程（Ｅ）では、培養細胞の顕微鏡観察を容易にする観点で、一方の基板１５に外方から陰圧を付与することにより形成させていた凹凸形状を解消する工程をさらに行ってもよい。凹凸形状を解消する工程を行う際には、培養室１７の体積が変化するため、必要培地量が変化する。工程（Ｅ）凹凸形状を解消する工程を行う際には、好ましくは、培地を培養室１７へ送液して、または培養室１７から排出して培養室１７の培地量を適正量に調節することができる。
【００８７】
一方の基板１５からの細胞集塊の剥離の状況は、例えば、ＣＣＤカメラ（図示せず）などを用いてモニターすることができる。
【００８８】
（Ｆ）凹みに播種して形成させた細胞集塊を一方の基板上で培養する工程
工程（Ｆ）では、第一の実施形態における細胞培養容器を天地反転させることなく、細胞を培養する（例えば、図１０）。工程（Ｆ）は、一方の基板１５は、例えば、細胞非接着コーティングがなされており、例えば、浮遊系細胞の細胞培養で好ましく行うことができる。
【００８９】
ここで、図１０（ａ）は、第一の実施形態における細胞培養容器に細胞懸濁液が満たされた状態を示す図である。図１０（ｂ）に示すように、真空室６４を真空引きして第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に多数のマイクロウェルを形成させ、形成させたマイクロウェルに細胞を播種して、細胞から細胞集塊を形成させる。次に、図１０（ｃ）に示すように、培養容器の天地反転操作をせずに、真空室の真空引きを解除して一方の基板に形成された凹凸形状を解消し、そのまま、一方の基板上１５上の細胞接着表面１５ａで細胞を培養する。図１０（ｂ）および（ｃ）では、培養室１７は培地で満たされている。
【００９０】
工程（Ｆ）では、細胞を培養する工程をさらに行ってもよい。工程（Ｆ）では、培養中の細胞の顕微鏡観察を容易にする観点で、一方の基板１５に外方から陰圧を付与することにより形成させていた凹凸形状を解消する工程をさらに行ってもよい。凹凸形状を解消する工程を行う際には、培養室１７の体積が変化するため、必要培地量が変化する。工程（Ｆ）凹凸形状を解消する工程を行う際には、好ましくは、培地を培養室１７へ送液して、または培養室１７から排出して培養室１７の培地量を適正量に調節することができる。
【００９１】
（Ｇ）培養した細胞を回収する工程
第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５または他方の基板２０に接着した細胞は、例えば、流路１３および培養室１７に細胞剥離液を送液することにより、および／または、細胞が接着した一方の基板１５または他方の基板２０に高周波振動を付与することにより、一方の基板１５または他方の基板２０から剥離して回収することができる。工程（Ｅ）または工程（Ｆ）で一方の基板１５の凹凸形状を解消した場合には、細胞剥離液の送液量を低減できる。
【００９２】
細胞剥離液としては、様々な細胞剥離液が知られ、当業者であれば適当な細胞剥離液を選択して用いることができる。例えば、細胞剥離液は、トリプシンおよび／または２価金属イオンキレート剤を含む、細胞培養培地または生理食塩水とすることができる。また、細胞培養培地を用いる場合には、血清を含まないものを用いることができる。
【００９３】
高周波振動付与手段は、高周波振動として超音波を用いることができ、超音波は、例えば、市販の細胞破砕用の超音波発生器および超音波洗浄機用の超音波発生器を高周波振動発生源として用いて発生させることができる。高周波振動は、高周波振動発生源を閉鎖系培養容器の外方から一方の基板１５または他方の基板２０に近接させるか接触させると、一方の基板１５または他方の基板２０の培養室１７に接する面から細胞を剥離させることができる。高周波振動を細胞接着面に付与して剥離した細胞には物理的ダメージはほとんど見られず、その後も剥離した細胞を良好に培養することができる。高周波振動は、細胞と細胞接着面との接着を弱めるためにも用いることができるであろう。すなわち、細胞剥離液の送液と同時に高周波振動を与えることも可能である。
【００９４】
このようにして、第一の実施形態では、第一の実施形態における細胞培養容器を用いて細胞を継代培養することができる。また、第一の実施形態では、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いて細胞を継代培養することができる。
【００９５】
第二の実施形態
以下、第二の実施形態について説明する。
【００９６】
（細胞培養容器）
第二の実施形態における細胞培養容器は、第一に実施形態における細胞培養容器１０と同じである。
【００９７】
（細胞継代培養システム）
以下、図７により、第二の実施形態における細胞継代培養システムを説明する。第二の実施形態における細胞継代培養システムは、囲い体の構造が異なるのみであり、その他の構成は、図４に示す第一の実施形態における細胞継代培養システムと同様である。
【００９８】
第二の実施形態における細胞継代培養システムは、図７（ｄ）に示すように、細胞培養容器１０と、細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体６０とを備えている。第二の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体の対向面に真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させることにより囲い体の複数の突起を有する対向面を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させることができる。
【００９９】
ここで、図７（ａ）は、囲い体６０の上方平面図を示し、図７（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図７（ｃ）は、一方の基板１５と囲い体６０とを、一方の基板１５と囲い体６０との間に真空室６４を形成させるように接触させ、その後、真空源９２を動作させることにより一方の基板に突起により凹凸形状を形成させている状態の細胞継代培養システムの上方平面図を示し、図７（ｄ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。
【０１００】
まず、図７に示すように囲い体６０は、細胞培養容器１０の一方の基板１５と接触させて真空室６４を形成するように接触させた場合に、一方の基板１５に対向する対向面に複数の突起６１を有する。真空室６４は、真空源９２との接続口６２を介して、真空源９２と接続され、この真空源９２を動作させて真空室６４を真空引きすることにより一方の基板１５に突起６１により凹み６５を形成させることができる（図７（ｃ）および（ｄ））。
【０１０１】
突起６１は、すべてが同じ高さを有する必要は必ずしも無いが、好ましくは図７（ｂ）および（ｄ）に示すように、すべての突起６１が同じ高さを有し、より好ましくは囲い体の側壁６３とほぼ同じ高さであり、これにより、一方の基板１５と囲い体６０とを接触させると、突起６１は、一方の基板１５に接触するか、一方の基板１５の近傍に複数の突起６１の先端部が位置する。
【０１０２】
突起６１の形状は、真空室６４を真空引きしたときに一方の基板１５に凹み６５が形成される形状であれば特に限定されない。突起６１の形状は、成形の容易さや必要な材料量の低減の観点からは、例えば、錐形状（例えば、円錐）または柱状（例えば、円柱）とすることができる。また、突起６１との接触による一方の基板１５の損傷を防ぐ観点で、例えば、突起１６の先端部は、Ｒ０．３ｍｍ〜０．７ｍｍ、またはＲ０．４ｍｍ〜０．６ｍｍの丸み形状とすることができる。
【０１０３】
突起６１の配置は、形成する凹み６５の平面配置に応じて当業者であれば適宜設定することができる。例えば、突起６１は碁盤の目状に整列させることにより、碁盤状に整列した凹み６５を形成させることができる（例えば、図７）。また、例えば、突起６１はハニカム状に平面を埋め尽くした平行六角形（例えば、正六角形）の各頂点に配置することで、一方の基板１５にハニカム状に整列した凹み６５を形成させることができる。
【０１０４】
突起６１の配置間隔は、例えば０．４ｍｍ〜５ｍｍ、例えば０．８ｍｍ〜３ｍｍ、または例えば１ｍｍ〜２ｍｍとすることができる。このようにすることで、一方の基板１５に形成される凹み６５に細胞を播種して、多能性幹細胞に５０μｍ〜３５０μｍ程度の直径を有する細胞集塊（細胞数で約２５個〜約３，５００個）を形成させることができる。
【０１０５】
囲い体６０は、真空源９２との接続口６２を一つ有していても複数有していてもよい。囲い体６０と本発明の細胞培養容器１０との接合面には、真空室６４の気密性を向上させる観点で、Ｏリングなどのシール材を介在させることができる（例えば、図８（ｂ）のシール材２１）。
【０１０６】
（第二の実施形態における作用）
次に、図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により細胞培養容器１０の一方の基板１５に凹凸形状を形成させる方法を説明する。
【０１０７】
まず、図７（ｃ）および（ｄ）に示すように、細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に真空室６４が形成されるように囲い体６０を接触させる。次に、囲い体６０の一方の基板に対向する面には真空源９２との接続口６２が設けられ、真空源９２を動作させ、真空室６４を真空引きする。すると、図７（ｃ）および（ｄ）に示すように、一方の基板１５に凹凸形状６５が形成される。細胞培養容器１０では、一方の基板１５は伸縮性材料からなり、一方の基板１５に形成させた凹凸形状６５は、真空引きを解除することにより容易に解消される。このようにして、細胞培養容器１０と囲い体６０を備えた第二の実施形態における細胞培養システムは、一方の基板１５に凹凸形状を形成させ、形成させた凹凸形状を解消させることができる。
【０１０８】
次に、第二の実施形態における細胞の継代方法を説明する。第二の実施形態における細胞の継代培養方法は、工程（Ｂ）において細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、それ以外の部分は、第一の実施形態と同様である。
【０１０９】
具体的には、第二の実施形態における細胞の継代培養方法では、工程（Ｂ）において第二の実施形態における継代培養システムに備わる囲い体６０を用いて細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる。
【０１１０】
第三の実施形態
以下、第三の実施形態について説明する。
【０１１１】
（細胞培養容器）
以下、図５により、本発明の第三の実施形態について説明する。図５に示す第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板１５の形状が異なるのみであり、その他の構成は、図１〜３に示す第一の実施形態における細胞培養容器と同様である。図５において、図１〜３に示す第一の実施形態における細胞培養システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【０１１２】
ここで、図５（ａ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の一方の基板１５Ａの上方平面図を示し、図５（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図５（ｅ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０において一方の基板１５Ａに一方の基板１５Ａの外方から陰圧を付与して一方の基板１５Ａに凹凸形状を形成させることができることを示す図である。図５（ｆ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の、図２のＡ−Ａ断面に相当する断面での側方断面図である。
【０１１３】
第三の実施形態における細胞培養容器では、一方の基板１５Ａは、複数の開口を形成する硬質フレーム部４２と、フレームの各開口内に延びる伸縮部４１からなり、一方の基板１５Ａに外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部４１が伸びて、一方の基板１５Ａに凹み４３（マイクロウェル）凹凸形状を形成する（例えば、図５（ｅ））。硬質フレーム部４２および伸縮部４１は、凹み４３の所望の形状および配置に応じて設計することができ、図５（ａ）および（ｂ）に示すように碁盤状に硬質フレーム部４２および伸縮部４１を配置すると凹みは碁盤状に形成される。
【０１１４】
一方の基板１５Ａにおいては、少なくとも伸縮部４１は、伸縮性材料からなり、一定の陰圧により伸縮部４１を細胞培養容器４０の外方に引込むことができる。硬質フレーム部４２は、一定の陰圧により実質的に形態変化を起こさない程度の硬度を有する限り、材質は問わず、材質は伸縮部４１と同一でも異なっていてもよい。好ましい態様では、硬質フレーム部４２は、伸縮部４１と同じ伸縮性材料からなるが、一定の陰圧により形態変化を実質的に起こさない程度の厚みを有する。このようにすることで、一方の基板１５の外方から細胞培養容器４０に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ａは、各伸縮部４１において凹み４３を形成することができる。なお、培養室１７に面する部分の平面性を確保する観点で、一方の基板１５Ａの凹凸加工は、細胞培養容器４０の外方に施されることが好ましい（図５（ｅ））。
【０１１５】
本発明の細胞培養容器４０では、硬質フレーム部と伸縮部の硬度は、一方の基板１５に付与する陰圧との関係で適宜設定することができ、例えば、伸縮部の硬度をタイプＡデュロメーター硬度で２０〜６５、好ましくは、２０〜３０（単位）とすることができる。
【０１１６】
第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板１５Ａに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ａに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。
【０１１７】
（細胞継代培養システム）
以下、図５により、第三の実施形態における細胞継代培養システムについて説明する。第三の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞培養容器および囲い体の構造において異なるのみであり、その他の構成は、図１に示す第一の実施形態における細胞継代培養システムと同様である。
【０１１８】
すなわち、第三の実施形態における細胞継代培養システムは、第三の実施形態における細胞培養容器と、細胞培養容器の一方の基板の外方に、一方の基板との間に真空室を形成する囲い体４５とを備えている。第三の実施形態における細胞継代培養システムでは、真空室４４には、真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させて真空室を真空引きすることにより一方の基板に凹凸形状４３が形成される。囲い体４５は、一方の基板１５Ａまたは１５Ｂと囲い体との間に真空室４４を形成するが、囲い体３０または囲い体６０とは異なり、一方の基板に向かう対向面に一方の基板にウェルを形成させるための凹凸形状を有する必要は無い。
【０１１９】
（第三の実施形態の作用）
次に、第三の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法を説明する。第三の実施形態における細胞継代培養システムでは、第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板に対して外方から陰圧を付与するだけで、一方の基板に所望の凹凸形状が形成されるように構成されている。
【０１２０】
次に、第三の実施形態における細胞の継代培養方法を説明する。第三の実施形態における細胞の継代培養方法は、工程（Ｂ）において細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、その他の構成は、第一の実施形態と同様である。
【０１２１】
具体的には、第三の実施形態における細胞の継代培養方法では、工程（Ｂ）において、第三の実施形態における細胞培養容器と第三の実施形態の継代培養システムに備わる囲い体４５を用いて、細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる。
【０１２２】
（第三の実施形態の変形例）
次に、第三の実施形態の変形例を説明する。第三の実施形態の変形例では、細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）に示す第三の実施形態と同一である。具体的には、第三の実施形態の変形例では、図５（ａ）および（ｂ）に示す第一の基板１５Ａの代わりに、図５（ｃ）および（ｄ）に示す構造を有する第一の基板１５Ｂを備えた細胞培養容器を用いる。
【０１２３】
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造を図５（ｃ）および（ｄ）により説明する。ここで、図５（ｃ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の一方の基板１５Ｂの上方平面図を示し、図５（ｄ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。
【０１２４】
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器では、図５（ｃ）および（ｄ）に示すように、一方の基板１５Ｂは、一方の基板１５Ｂに陰圧を付与して形成させる凹みの底端を鋭くする観点で、伸縮部４１ｂは厚みを徐々に変化させることができ、具体的には、凹みの底端部を形成する部分が最も薄くなるように加工することができる。
【０１２５】
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器は、一方の基板１５Ｂに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｂに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。
【０１２６】
次に、第三の実施形態のさらなる変形例を説明する。第三の実施形態のさらなる変形例では、用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）に示す第三の実施形態と同一である。具体的には、第三の実施形態のさらなる変形例では、図５（ａ）および（ｂ）に示す一方の基板１５Ａの代わりに、図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｃを備えた細胞培養容器を用いる。
【０１２７】
ここで、図６（ａ）は、第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０の一方の基板１５Ｃの上方平面図を示し、図６（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図６（ｅ）は、第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０の、図２のＡ−Ａ断面に対応する断面における側方断面図である。
【０１２８】
一方の基板１５Ｃは、複数の開口を形成する硬質部５２と、硬質部の各開口内に延びる伸縮部５１からなり、一方の基板１５Ｃに外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部５１が伸びて、一方の基板１５Ｃに凹み５３（マイクロウェル）凹凸形状を形成する（例えば、図６（ｄ））。硬質部５２および伸縮部５１は、凹み５３の所望の形状および配置に応じて設計することができ、図５（ａ）および（ｂ）に示すように碁盤状に硬質部５２および伸縮部５１を配置すると凹みは碁盤状に形成される。
【０１２９】
一方の基板１５Ｃにおいては、少なくとも伸縮部５１は、伸縮性材料からなり、一定の陰圧により伸縮部５１を細胞培養容器５０の外方に引込むことができる。硬質部５２は、一定の陰圧により実質的に形態変化を起こさない程度の硬度を有する限り、材質は問わず、材質は伸縮部５１と同一でも異なっていてもよい。好ましい態様では、硬質部５２は、伸縮部５１と同じ伸縮性材料からなるが、一定の陰圧により形態変化を実質的に起こさない程度の厚みを有する。このようにすることで、一方の基板１５の外方から細胞培養容器５０に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ｃは、各伸縮部５１において凹み５３を形成することができる。
【０１３０】
第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０は、一方の基板１５Ｃに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｃに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。
【０１３１】
次に、第三の実施形態のさらなる変形例を説明する。第三の実施形態のさらなる変形例では、用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する第一の基板１５Ｃを備えた細胞培養容器と同じである。具体的には、第三の実施形態のさらなる変形例では、図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｃの代わりに、図６（ｃ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｄを備えた細胞培養容器を用いる。
【０１３２】
ここで、図６（ｃ）は、第五の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５Ｄの、図６（ｂ）に対応する側方断面図である。
【０１３３】
第三の実施形態のさらなる変形例では、細胞培養容器では、図６（ｃ）に示すように伸縮部５１は、形成されるマイクロウェルの底端を鋭くする観点で、例えば、膜の硬度を徐々に変化させる、具体的には、５１ｂから５１ａにかけて膜の硬度が徐々に低くなり、マイクロウェルの底端を形成する部分（例えば、５１ａ）が最も硬度が低くなるように加工することができる。このようにすることで、一方の基板１５Ｄの外方から細胞培養容器に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ｄは、伸縮部５１において凹み５３を形成することができる。硬質部５２および伸縮部５１を有する一方の基板１５Ｄは、当業者であればインサート成形手法などの公知の手法により容易に作製することができる。
【０１３４】
第三の実施形態のさらなる変形例では、一方の基板１５Ｄに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｄに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：ヒトｉＰＳ細胞の単一細胞化とその後の継代方法の検討
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、継代の際に単一細胞にまでばらばらにすると細胞死が誘導される。また、胚様体様にすると細胞が分化を開始することが懸念される。本実施例では、単一細胞にまでばらばらにした後に、速やかに細胞集塊を形成させてから、継代を行った場合に細胞死や分化の問題が生じるか否かを検討した。
【０１３６】
本実施例では、細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人  先端医療振興財団  細胞評価グループ  川真田研究室による樹立株）を用いた。培養は、フィーダーレスの条件で行った。培地は、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）にｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４−０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを添加した培地を用いた。また、培養容器としては、１０ｍｍ細胞培養ディッシュ（ＢＤ社製、製品番号：ＲＥＦ３５３００３）を用い、ｉＰＳ細胞の培養容器への接着性を担保するため、製造業者の取扱説明書に記載の方法に従って、培養前に培養容器内をＥＣＭでコーティングした。ＥＣＭは、ＢＤマトリゲル（ＢＤ社製、製品番号：３５６２３４）を用いた。
【０１３７】
細胞は常法によりコンフルエントになるまで培養した。その後、継代のために培地を吸引除去し、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：１４１９０）で細胞を１回洗浄した。その後、１ｍＬのアキュターゼ溶液（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：ＡＴ１０４）で３７℃で５分間処理し、細胞をチューブに回収した。
【０１３８】
遠心分離（４４０ｇ、５分）により細胞を回収し、上清を吸引除去して細胞を１ｍＬの培地に再懸濁し、培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（ＳＴＥＭＧＥＮＴ社製、製品番号：０４−００１２）を最終濃度１０μＭとなるように添加して細胞懸濁液を得た。その後、細胞は、単一細胞レベルになるまでピペッティングの水流により細胞塊を砕いた。細胞懸濁液中の細胞濃度を調整し、細胞懸濁液をアグリウェル（ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ）  ８００（STEMCELL Technologies社製）のウェルに注入した。その後、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ  ８００の遠心分離（２０００ｇ、５分）を行い、または、行わないで、３７℃で一晩培養して細胞集塊を形成させた。遠心を行った場合および行わなかった場合の播種直後および１日後の細胞の状態は、図１１Ａに示される通りであった。すなわち、遠心を行った場合には、播種直後から逆ピラミッド形状のウェルの底に細胞が集まっていたが（図１１Ａ−左上）、遠心を行わなかった場合には、細胞は集まっていなかった（図１１Ａ−右上）。しかし、１日経過すると遠心を行った場合（図１１Ａ−左下）も行わなかった場合（図１１Ａ−右下）も細胞はウェルの底に集まり細胞集塊を形成していた。また、得られた細胞集塊は、ほぼ均一なサイズを有していた（図１１Ｂ）。また、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌのウェル中での静置時間は８時間および１２時間でもそれぞれ細胞集塊を形成し、８時間〜１２時間で十分であった（データ省略）。
【０１３９】
得られた細胞集塊は、できるだけ壊さないようにピペットで回収し、６ウェルプレートに播種した（３００個の細胞集塊／ウェル）。播種後の細胞の成長を位相差顕微鏡にて観察すると、遠心分離を行った場合でも行わなかった場合でも、細胞集塊は良好に展開し、その後も細胞は良好に成長した（図１２）。
【０１４０】
本実施例で得られた細胞集塊は人工的に集積させた立体構造を有することから、通常の継代培養とは状況が大きく異なるが、本実施例では、意外にもこのように作製した多層の細胞集塊であっても培養をすると自然に展開し、その後、通常の培養で見られる多能性幹細胞のコロニーを形成し好適に培養を行うことが可能であった。
【０１４１】
細胞集塊の形成の際に遠心を行わなかった場合には、遠心を行った場合よりも細胞の展開が早かった（図１２、播種２日後）。図１２では、細胞集塊または細胞コロニーの色の濃い部分は細胞が多層になっている部分である。このように、ｉＰＳ細胞の継代培養においては、遠心分離を行わない方がよい結果となり得ることが示唆された。
【０１４２】
さらに詳細に解析するために、６ウェルプレートに播種してからの細胞の成長を成長曲線により比較したが、細胞の成長速度に関しては両者に大きな違いは見られなかった（図１３）。細胞の成長は、ディッシュ上の細胞が占める面積（ｍｍ２）を測定することにより求めた。
【０１４３】
その後、継続して培養した細胞が未分化状態を保っていることを確認するために、６ウェルプレートに播種して５日後に細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定してから蛍光免疫染色を行った。核染色は、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含むリン酸緩衝生理食塩水で細胞を１５分ほどインキュベートして行った。蛍光免疫染色は、Ｎａｎｏｇの発現を確認するために抗体として抗Ｎａｎｏｇ抗体（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＡＢ０００３Ｐ）を用い、Ｏｃｔ３／４は、抗Ｏｃｔ３／４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、製品番号：ｓｃ−５２７９）を用いて常法に従って免疫染色した。明視野画像は、位相差顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ−８１）を用いて取得した。
【０１４４】
その結果、すべての未分化マーカーが良好に発現していることが明らかとなった（図１４）。
【０１４５】
これらの結果から、細胞を単一細胞レベルまでばらばらにくずして培養した場合でも、その後、細胞集塊を形成させることにより細胞死を起こすことがないこと、細胞集塊は迅速に（〜１日）形成すること、得られた細胞集塊からは良好な多能性幹細胞コロニーが得られ、また、良好な未分化状態で培養できることが示された。
【０１４６】
実施例２：培養容器の培養面への細胞集塊の播種方法の検討
上記実施例では、マイクロウェル中で形成された細胞集塊は、ピペットで回収することにより新しい培養容器に継代したが、細胞集塊を壊さないために時間をかけた慎重なピペッティング操作が求められた。そこで、本実施例では、より簡便な細胞集塊の播種法を検討した。
【０１４７】
ここで発明者らは、マイクロウェルを有する面と培養面とを備え、これら２つの面が対向して配置された閉鎖系培養容器を用いることを検討した。この閉鎖系培養容器のマイクロウェルを有する面は、角取平面底形状で開口部が１０００μｍ×１０００μｍの四角形形状のマイクロウェルが碁盤状に整列したものとした。また、培養面は、ＢＤマトリゲル（商標）によりコーティングしたものとした。
【０１４８】
次に、実施例１に記載の方法により、単一細胞にまで分散させたｉＰＳ細胞の細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を上述の閉鎖系培養容器に注入し、マイクロウェルを有する面を下にして３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間静置した。光学顕微鏡を用いて細胞集塊が形成されたのを確認した後に、培養面が下になるよう閉鎖系培養容器を天地反転させると、細胞集塊はマイクロウェル内から培養面に垂直に落下した。図１５は、培養面に落下した細胞集塊の配置を示す図である。図１５に示されるように、細胞集塊は培養面上で規則正しく整列した。これらの細胞集塊の配置は、用いたマイクロウェルの配置パターンを反映しており、図１５の細胞集塊の間隔は、本実施例で用いた閉鎖系培養容器のマイクロウェルのピッチ（１０００μｍ）と一致した。
【０１４９】
このことから、マイクロウェル中の細胞集塊は、マイクロウェルの配置パターンを維持したまま、培養容器の培養面に落下させることが可能であることが明らかとなった。マイクロウェルの配置を変えることにより、細胞集塊の播種位置は自在に制御し得るものと考えられる。また、播種および播種位置の制御は、容器を天地反転させるという、非常に容易な操作により行うことができることが明らかとなった。
【０１５０】
実施例１によれば、多能性幹細胞は単一細胞にまで分散させても、その後すぐに細胞集塊を形成させることにより、未分化状態を維持させたまま良好に培養することが可能であった。また、細胞懸濁液を複数のマイクロウェルが配置された面を有する培養容器に播種することにより、簡便に均一なサイズの細胞集塊を形成させることができた。さらに、細胞集塊は、培養容器への播種後速やかに展開し、細胞は良好に増殖した。形成させた細胞集塊のサイズは均一であったため、細胞集塊の展開速度およびその後の増殖速度も均一であった。また、実施例２によれば、マイクロウェル中の細胞集塊は、簡便な操作により培養容器の培養面に播種することができた。播種した細胞集塊の配置パターンは、マイクロウェルの配置パターンを反映しており、簡便な操作により細胞集塊の精密播種が可能であることが示された。このように、本発明の方法により、均一な細胞集塊の形成や細胞集塊の均一な播種などが極めて単純な機械的操作により可能となった。本発明の方法は、これにより多能性幹細胞の品質維持を容易なものとするのみならず、多能性幹細胞の継代培養の全自動化への途を切り拓くものであると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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