(57)【要約】【課題】本発明は、正確性、安全性、簡便性、制御性に優れた防腐性評価方法を提供することを目的とする。【解決手段】菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体の表面に菌液を滴下する、菌液滴下工程と、菌を培養する、培養工程と、菌の生育度から被験体の防腐性を評価する、防腐性評価工程とを含むことを特徴とする、防腐性評価方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、
被験体の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、
前記菌を培養する、培養工程と、
前記菌の生育度から前記被験体の防腐性を評価する、防腐性評価工程と
を含むことを特徴とする、防腐性評価方法。
【請求項２】
前記防腐性評価工程において、前記菌の生育度を前記菌の生育段階に応じて定められた生育スコアを用いて評価する、請求項１に記載の防腐性評価方法。
【請求項３】
前記菌液滴下工程において、前記被験体の表面の複数の箇所に前記菌液を滴下する、請求項１又は２に記載の防腐性評価方法。
【請求項４】
前記菌液滴下工程において、前記被験体の表面の前記複数の箇所に、互いに異なる種類の前記菌を与える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の防腐性評価方法。
【請求項５】
前記培養工程において、複数の湿度条件を用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の防腐性評価方法。
【請求項６】
前記菌が、カビである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の防腐性評価方法。
【請求項７】
前記被験体が、粉体の化粧料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の防腐性評価方法。
【請求項８】
菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、
被験体を構成する原料の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、
前記菌を培養する、培養工程と、
前記菌の生育度から前記原料の栄養源性を評価する、栄養源性評価工程と
を含むことを特徴とする、栄養源性評価方法。
【請求項９】
菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、
被験体を構成する原料と防腐剤との混合物を調製する、混合物調製工程と、
前記混合物の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、
前記菌を培養する、培養工程と、
前記菌の生育度から前記原料の防腐剤不活化度を評価する、防腐剤不活化度評価工程と
を含むことを特徴とする、防腐剤不活化度評価方法。
【請求項１０】
請求項８の栄養源性評価方法及び／又は請求項９の防腐剤不活化度評価方法を用いて、前記製剤に含める原料及び防腐剤の配合を決定する
ことを特徴とする、製剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項８の栄養源性評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の栄養源性を評価し、
前記各原料の栄養源性を前記各原料の前記製剤中における配合割合に乗じて合算することによって、前記製剤の栄養源性の指数を算出し、
前記製剤の栄養源性の指数を、栄養源性の指数の最高値の３分の１以下とする
ことを特徴とする、製剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項９の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の防腐剤不活化度を評価し、
前記各原料の防腐剤不活化度を前記各原料の前記製剤中における配合量に乗じて合算することによって、前記製剤の防腐剤不活化度を算出し、
前記製剤の前記防腐剤不活化度を０．４以下とする
ことを特徴とする、製剤の製造方法。
【請求項１３】
請求項９の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の防腐剤不活化度を評価し、
前記各原料の防腐剤不活化度を前記各原料の前記製剤中における配合量に乗じて合算することによって、前記製剤の防腐剤不活化度を算出し、
前記製剤の前記防腐剤不活化度に基づいて、前記製剤に添加する防腐剤の配合量を決定する
ことを特徴とする、製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、防腐性評価方法、栄養源性評価方法、防腐剤不活化度評価方法、製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧料等の製品には、製品の外部から菌が混入してきた後にも製品の品質を保持することができるように、十分な防腐性が求められる。
製品の防腐性を高めるための手法としては、製品中に防腐剤を配合する手法が一般的であり、防腐剤の配合量を増加させることによって、製品の防腐性もそれに応じて高めることは可能である。
しかしながら、防腐剤の配合量を増加させると、製品に触れる消費者の生体に対する影響もまた強まることとなる。
従って、製品の品質の保持、及び消費者に対する安全性の向上の観点から、製品中に配合する防腐剤の量を必要最小限とすることが望まれている。
【０００３】
化粧料等の製品の防腐性を評価する方法としては、日本薬局方参考情報に記載の保存効力試験法（例えば、特許文献１参照）や、ＪＩＳ  Ｚ  ２９１１のカビ抵抗性試験（例えば、特許文献２参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２３１４９６号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８５１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来公知の保存効力試験法では、カテゴリーＩＩ製剤（粉体等）については特別な手技が必要となり、かかる手技を用いると、正確性や簡便性が得られない懸念があり、また、従来公知のＪＩＳ  Ｚ  ２９１１のカビ抵抗性試験では、安全性や制御性が不良となるという問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、正確性、安全性、簡便性、制御性に優れた防腐性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。本発明は、実際の使用条件と同様の条件下で、被験体の防腐性を評価することを指向している。
【０００８】
本発明の防腐性評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、前記菌を培養する、培養工程と、前記菌の生育度から前記被験体の防腐性を評価する、防腐性評価工程とを含むことを特徴とする。
ここで、前記防腐性評価工程において、前記菌の生育度を前記菌の生育段階に応じて定められた生育スコアを用いて評価することが好ましい。
前記菌液滴下工程において、前記被験体の表面の複数の箇所に前記菌液を滴下することが好ましい。
前記菌液滴下工程において、前記被験体の表面の前記複数の箇所に、互いに異なる種類の前記菌を与えることが好ましい。
前記培養工程において、複数の湿度条件を用いることが好ましい。
そして、前記菌は、カビであることが好ましい。前記被験体は、粉体の化粧料であることが好ましい。
【０００９】
本発明の栄養源性評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体を構成する原料の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、前記菌を培養する、培養工程と、前記菌の生育度から前記原料の栄養源性を評価する、栄養源性評価工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の防腐剤不活化度評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体を構成する原料と防腐剤との混合物を調製する、混合物調製工程と、前記混合物の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、前記菌を培養する、培養工程と、前記菌の生育度から前記原料の防腐剤不活化度を評価する、防腐剤不活化度評価工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の製剤の製造方法は、上記の栄養源性評価方法及び／又は上記の防腐剤不活化度評価方法を用いて、前記製剤に含める原料及び防腐剤の配合を決定することを特徴とする。
ここで、本発明の製剤の製造方法は、上記の栄養源性評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の栄養源性を評価し、前記各原料の栄養源性を前記各原料の前記製剤中における配合割合に乗じて合算することによって、前記製剤の栄養源性の指数を算出し、前記製剤の栄養源性の指数を、栄養源性の指数の最高値の３分の１以下とすることを特徴とするものとしてよい。
また、本発明の製剤の製造方法は、上記の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の防腐剤不活化度を評価し、前記各原料の防腐剤不活化度を前記各原料の前記製剤中における配合量に乗じて合算することによって、前記製剤の防腐剤不活化度を算出し、前記製剤の前記防腐剤不活化度を０．４以下とすることを特徴とするものとしてよい。
更に、本発明の製剤の製造方法は、上記の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の防腐剤不活化度を評価し、前記各原料の防腐剤不活化度を前記各原料の前記製剤中における配合量に乗じて合算することによって、前記製剤の防腐剤不活化度を算出し、前記製剤の前記防腐剤不活化度に基づいて、前記製剤に添加する防腐剤の配合量を決定することを特徴とするものとしてよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、正確性、安全性、簡便性に優れた防腐性評価方法を提供することができる。
本発明の栄養源性評価方法、本発明の防腐剤不活化度評価方法、本発明の製剤の製造方法によれば、上記本発明の防腐性評価方法の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は、本発明の一例のカビの防腐性評価方法の概略について示す図である。（ｂ）は、本発明の一例のカビの防腐性評価方法の防腐性評価工程において用いられる生育スコアを示す図である。
【図２】被験体処方（パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）（防腐剤）：０．２質量％、ブドウ糖ペプトン（ＧＰ）培地：０．０５質量％、タルク：残量）について、菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号：９６４２）（以下、「カビ１」ともいう。）（図中、上）、Ａｓｐｅｒｇｕｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：６３４６）（以下、「カビ２」ともいう。）（図中、左）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ＮＢＲＣ番号：６３５２）（以下、「カビ３」ともいう。）（図中、右）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（製剤に生育した菌を単離したもの）（以下、「カビ４」ともいう。）（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア０と評価される状態を示す図である。（ａ）は、全体図であり、（ｂ）に、拡大図である。
【図３】被験体処方（ＭＰ：０．１質量％、カルミン：１質量％、タルク：残量）について、菌としてカビ４を用いて、９６ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア１と評価される状態を示す図である。（ａ）は、部分図であり、（ｂ）は、（ａ）に表す四角枠の拡大図であり、（ｃ）は、（ｂ）に表す四角枠の拡大図である。
【図４】（ａ）は、被験体処方（ＭＰ：０．２質量％、カルミン：１０質量％、タルク：残量）について、菌として、カビ１（図中、上）、カビ２（図中、左）、カビ３（図中、右）、カビ４（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態（但し、カビ４についてはスコア３と評価される状態）を示す全体図である。（ｂ）は、被験体処方（ＭＰ：０．１質量％、カルミン：０．１質量％、タルク：残量）について、菌を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態を示す拡大図である。
【図５】被験体処方（ＭＰ：０．1質量％、カルミン：1質量％、タルク：残量）について、菌としてカビ４を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態を示す図である。（ａ）は、部分図であり、（ｂ）は、（ａ）に表す四角枠の拡大図であり、（ｃ）は、（ａ）に表す四角枠の拡大図であり、（ｄ）は、（ｂ）に表す四角枠の拡大図である。
【図６】被験体処方（カルミン：１０質量％、タルク：残量）について、菌として、カビ１（図中、上）、カビ２（図中、左）、カビ３（図中、右）、カビ４（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、２週間の条件で培養した場合において、スコア３と評価される状態を示す図である。
【図７】（ａ）は、本発明の一例の酵母及び細菌の防腐性評価方法の概略について示す図である。（ｂ）は、本発明の一例の酵母及び細菌の防腐性評価方法の防腐性評価工程において用いられる生育スコアを示す図である。
【図８】被験体処方（ブドウ糖ペプトン（ＧＰ）培地：０．０５質量％、タルク：残量）に対して、菌として、（ａ）カンジダ：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ番号：１５９４）、（ｂ）黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：１３２７６）を接種し、菌を接種した部位からそれぞれ一定量の被験体処方を取り、カンテン平板培地に０．０３〜０．３ｍｇ／ｃｍ２になるよう塗沫した後、カンジダについては２５±２．５℃、黄色ブドウ球菌については３２±２．５℃で、３日間の条件で培養した場合において、特定の接種菌数の場合のスコアを０として菌の生育度に応じてスコアを付したときに、スコア−２〜１と評価される状態を示す。
【図９】（試験Ａ：防腐性評価方法）における比較例Ａ１のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍの場合の生菌数の推移を示す図である。
【図１０】（試験Ａ：防腐性評価方法）における比較例Ａ１のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの場合の生菌数の推移を示す図である。
【図１１】（試験Ａ：防腐性評価方法）における比較例Ａ２のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号：９６４２）の場合の生菌数の推移を示す図である。
【図１２】（試験Ａ：防腐性評価方法）における比較例Ａ２のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの場合の生菌数の推移を示す図である。
【図１３】（試験Ｃ：防腐剤不活化度評価方法１）における試験条件及び試験結果の詳細を示す図である。
【図１４】（試験Ｃ：防腐剤不活化度評価方法１）における試験条件及び試験結果の詳細を示す図である。
【図１５】（試験Ｄ：防腐剤不活化度評価方法２）における試験条件及び試験結果の詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して、本発明の防腐性評価方法、本発明の栄養源性評価方法、本発明の防腐剤不活化度評価方法、本発明の製剤の製造方法の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１５】
（防腐性評価方法）
図１（ａ）及び図７（ａ）に、本発明の一例の防腐性評価方法の概略について示す。図１（ａ）に、本発明の一例のカビの防腐性評価方法の概略について示し、図７（ａ）に、本発明の一例の酵母及び細菌の防腐性評価方法の概略について示す。
本発明の実施形態（以下、「本実施形態」ともいう。）の防腐性評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体の表面に菌液を滴下する、菌液滴下工程と、菌を培養する、培養工程と、菌の生育度から被験体の防腐性を評価する、防腐性評価工程とを含む。
【００１６】
従来公知の保存効力試験法では、カテゴリーＩＩ製剤については、試験菌を製剤と均一に混和する際、及び混合試料中の生菌数を測定する際に、特別な手技が必要となる。例えば、製剤に界面活性剤を加えて均一な混和を達成する手法を用いた場合、菌は生育後に生育時の環境とは異なる環境に所定時間曝されることとなり、製剤中で生育していた菌の数を厳密な意味で測定することにはならない。また、かかる手法を用いた場合、試験者の技量により試験結果にバラツキが生じることもある。
本実施形態の防腐性評価方法によれば、特別な手技を要することなく、菌が生育する被験体の表面において直接的に菌の生育度を測定することができるため、被験体の防腐性をより正確により簡便に評価することが可能となる。
【００１７】
従来公知のＪＩＳ  Ｚ  ２９１１のカビ抵抗性試験では、繊維製品や塗膜等の試料に菌液を噴霧して、菌の生育度から試料のカビ抵抗性を評価する。菌を噴霧する操作は、ヒトが菌を吸引するおそれを生じさせ、また、試料に播種される接種菌数の制御を困難にしている。
本実施形態の防腐性評価方法によれば、菌液を滴下するため、ヒトが菌に暴露されるリスクを低減することができ、また、接種菌数の制御も容易となる。
【００１８】
そして、本実施形態の防腐性評価方法によれば、実際の使用条件と同様の条件下で、つまり、実際の使用時に生じる状態に近い状態で、被験体の防腐性を評価することが可能となる
【００１９】
以下、本実施形態の防腐性評価方法の各工程について詳細に記載する。
【００２０】
本実施形態の防腐性評価方法では、まず、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する（菌液調製工程）。
【００２１】
使用可能な菌の種類としては、細菌及び真菌が挙げられる。
細菌としては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、芽胞菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。
真菌としては、カビ、酵母が挙げられ、このうち酵母としては、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）等が挙げられる。本発明においては、防腐性をより正確に評価することができることから、カビが好ましい。
特に、カビとしては、アスペルギルス  ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）（学術上の名称変更前の名称で、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））、アスペルギルス  テレウス（Ａｓｐｅｒｇｕｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ペニシリウム  シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ユーロチウム  トノヒルム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｔｏｎｏｐｈｉｌｕｍ）、ペニシリウム  ピノヒルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、リゾープス  オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クラドスポリウム  クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、オーレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、トリコデルマ  ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｎｓ）、ケトミウム  グロボスム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ミロテシウム  ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）等が挙げられる。
菌の種類は、１種単独としても、２種以上の組み合わせとしてもよい。
また、製剤の使用中に生育した菌等の環境中から単離された菌も、任意に選択し、使用することができる。
【００２２】
菌を懸濁させるのに用いる水溶液としては、特に限定されないが、スルホこはく酸ジオクチルナトリウム水溶液、ポリソルベート８０水溶液、ペプトン食塩液、グルコース・ペプトン水、精製水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液、こはく酸緩衝液、硝酸アンモニウム水溶液、硫酸マグネシウム水溶液、リン酸二水素カリウム水溶液、塩化カリウム水溶液、硫酸鉄（ＩＩ）水溶液等が挙げられる。
これらの水溶液は、１種単独としても、２種以上の組み合わせとしてもよい。
溶質の濃度や組み合わせは、目的に応じて、適宜選択してよい。
【００２３】
菌液（菌懸濁液）における菌の濃度としては、１．０×１０４〜１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬとしてよく、評価の精度を高める観点から、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬとすることが好ましい。
【００２４】
また、本実施形態では、用いる菌の種類を複数としつつ、菌液調製工程において、複数種の菌ごとに菌液を調製することが好ましい。かかる手法によれば、複数種の菌を混合して菌液を調製する従来公知のカビ抵抗性試験と比較して、防腐性評価試験自体をより自由に設計することが可能となる。
【００２５】
本実施形態の防腐性評価方法では、次いで、被験体の表面に菌液を滴下する（菌液滴下工程）。
【００２６】
被験体としては、手や指の力で容易に、分離可能なもの、必要量を採取することが可能なもの、分取可能なものが好ましい。
被験体は、具体的には、固体、半固体、粉体としてよく、液体やゲル状体は適さない。
被験体の剤型は特に限定されないが、水性、水中油型、油中水型、油性型、粉体型等を挙げることができ、これらの中でも油性型や粉体型が好ましい。また、前述の通り、被験体は固形や半固形が好ましく、より好ましくは粉体固形である。なお、粉体型とは、粉体を主成分として配合し、必要に応じて、油性成分、水性成分、界面活性剤成分等を粉体中に分散させた状態のものを意味し、具体的には、粉末状のものや、それを固形状に成形したものが挙げられ、いずれの性状のものであっても良い。粉体型被験体中の粉体の配合量は、特に限定されないが、一般的に５０〜１００質量％であることが好ましい。
被験体は、化粧料としてよく、固形、半固形、粉体の化粧料が好ましく、水性よりも油性であることが好ましく、具体的には、ファンデーション（プレストタイプやノンプレスタイプのファンデーション、アイカラー、フェイスカラー、アイブロー、ボディパウダー；油性固形のファンデーション、口紅、リップクリーム：溶解して使用するスキンケアパウダー、洗顔パウダー等が挙げられる。
なお、化粧料には、化粧品のみならず医薬部外品も含む。
【００２７】
菌液の滴下量としては、０．０１〜１０ｍＬとしてよく、０．０２〜１ｍＬとすることが好ましく、０．１ｍＬとすることがより好ましい。
滴下領域の直径（最大径）としては、０．１〜１０ｃｍとしてよく、０．５〜５ｃｍ、とすることが好ましく、１ｃｍとすることがより好ましい。なお、滴下領域は通常円形となる。
滴下領域の面積としては、０．０１〜１００ｃｍ２としてよく、０．２５〜３０ｃｍ２とすることが好ましい。
【００２８】
この菌液滴下工程では、被験体の表面の複数の箇所に菌液を滴下することが好ましい。かかる手法によれば、被験体１つ当たりで得られる防腐性評価結果の数を増やすことができ、防腐性評価試験の経済性を高めることができる。
【００２９】
そして、本実施形態では、用いる菌の種類を複数としつつ、前述の菌液調製工程において、複数種の菌ごとに菌液を調製し、この菌液滴下工程において、被験体の表面の複数の箇所に、互いに異なる種類の前記菌を与えることが更に好ましい。
かかる手法によれば、被験体１つを用いて複数種の菌についての防腐性評価を行うことが可能となる。
【００３０】
本実施形態の防腐性評価方法では、続いて、菌を培養する（培養工程）。
【００３１】
培養条件としては、相対湿度は、６０〜１００％とすることが好ましく、９６％、１００％が特に好ましく、
培養温度は、０〜５０℃とすることが好ましく、１５〜３７℃とすることがより好ましく、２５℃とすることが特に好ましい。培養温度として室温や常温を用いても構わない。
培養時間は、１〜６０日間とするとすることが好ましく、７〜３０日間とすることがより好ましい。
試験に用いる培養条件の数は、試験の精度を高める観点から、２つ以上とすることが好ましい。例えば、室温で相対湿度９６％（９６ＲＨ％）の条件、及び室温で相対湿度１００％（１００ＲＨ％）の条件の２条件とすることが好ましい。
【００３２】
そして、本実施形態の防腐性評価方法では、菌の生育度から被験体の防腐性を評価する（防腐性評価工程）。
【００３３】
この防腐性評価工程では、菌の生育度を菌の生育段階に応じて定められた生育スコアを用いて評価することが、防腐性評価試験の精度を高める観点から、好ましい。
そして、生育スコアのスコアは、目視及び実体顕微鏡を用いた観察から付けることができる。
【００３４】
本実施形態で用いられる生育スコアは、用いる菌の種類に応じて適宜定めてよい。係る手法によれば、菌の種類により生活史や生育状況が異なることを考慮しつつ、防腐性評価試験を自由に設計することが可能となる。
また、用いる菌の種類、湿度条件、生育度合等に応じて、生育スコアのスコア値に比重をかけてもよく、複数の菌種間で、生育スコアのスコア値を補正してもよい。
【００３５】
図１（ｂ）に、本発明の一例のカビの防腐性評価方法の防腐性評価工程において用いられる生育スコアを示す。
この一例の生育スコアは、カビの生育段階に応じて定められたものであり、具体的には、図１（ｂ）に示す通り、「菌糸成長なし：スコア０、菌糸成長あり：スコア１、胞子形成あり：スコア２、広範囲に菌糸成長・胞子形成あり：スコア３」というものである。
【００３６】
以下、図２〜図６に、カビのスコア０〜スコア３の状態のより具体的な例を示す。
【００３７】
図２に、被験体処方（パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）（防腐剤）：０．２質量％、ブドウ糖ペプトン（ＧＰ）培地：０．０５質量％、タルク：残量）について、菌として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号：９６４２）（以下、「カビ１」ともいう。）（図中、上）、Ａｓｐｅｒｇｕｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：６３４６）（以下、「カビ２」ともいう。）（図中、左）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ＮＢＲＣ番号：６３５２）（以下、「カビ３」ともいう。）（図中、右）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（製剤に生育した菌を単離したもの）（以下、「カビ４」ともいう。）（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア０と評価される状態を示す。（ａ）に、全体図を示し、（ｂ）に、拡大図を示す。
【００３８】
図３に、被験体処方（ＭＰ：０．１質量％、カルミン：１質量％、タルク：残量）について、菌としてカビ４を用いて、９６ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア１と評価される状態を示す。（ａ）に、部分図を示し、（ｂ）に、（ａ）に表す四角枠の拡大図を示し、（ｃ）に、（ｂ）に表す四角枠の拡大図を示す。
【００３９】
図４（ａ）に、被験体処方（ＭＰ：０．２質量％、カルミン：１０質量％、タルク：残量）について、菌として、カビ１（図中、上）、カビ２（図中、左）、カビ３（図中、右）、カビ４（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態（但し、カビ４についてはスコア３と評価される状態）の全体図を示し、図４（ｂ）に、被験体処方（ＭＰ：０．１質量％、カルミン：０．１質量％、タルク：残量）について、菌を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態の拡大図を示す。
【００４０】
図５に、被験体処方（ＭＰ：０．1質量％、カルミン：1質量％、タルク：残量）について、菌としてカビ４を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、１週間の条件で培養した場合において、スコア２と評価される状態を示す。（ａ）に、部分図を示し、（ｂ）に、（ａ）に表す四角枠の拡大図を示し、（ｃ）に、（ａ）に表す四角枠の拡大図を示し、（ｄ）に、（ｂ）に表す四角枠の拡大図を示す。
【００４１】
図６に、被験体処方（カルミン：１０質量％、タルク：残量）について、菌として、カビ１（図中、上）、カビ２（図中、左）、カビ３（図中、右）、カビ４（図中、下）を用いて、１００ＲＨ％、２５℃、２週間の条件で培養した場合において、スコア３と評価される状態を示す。
【００４２】
図７（ｂ）に、本発明の一例の細菌及び酵母の防腐性評価方法の防腐性評価工程において用いられる生育スコアを示す。
この一例の生育スコアは、細菌及び酵母の生育段階に応じて定められたものであり、具体的には、図７（ｂ）に示す通り、「検出なしもしくはわずかに検出：スコア−２、接種菌数に対して減少：スコア−１、接種菌数に対して増減なし：スコア０、接種菌数に対して増殖あり：スコア１」というものである。
【００４３】
以下、図８に、細菌及び酵母のスコア−２〜１の状態のより具体的な例を示す。
【００４４】
図８に、被験体処方（ブドウ糖ペプトン（ＧＰ）培地：０．０５質量％、タルク：残量）に対して、菌として、（ａ）カンジダ：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ番号：１５９４）、（ｂ）黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：１３２７６）を接種し、菌を接種した部位からそれぞれ一定量の被験体処方を取り、カンテン平板培地に０．０３〜０．３ｍｇ／ｃｍ２になるよう塗沫した後、カンジダについては２５±２．５℃、黄色ブドウ球菌については３２±２．５℃で、３日間の条件で培養した場合において、特定の接種菌数の場合のスコアを０として菌の生育度に応じてスコアを付したときに、スコア−２〜１と評価される状態を示す。
【００４５】
実施においては、例えば、被験体処方に特定の接種菌数（例えば、１０６ＣＦＵ程度）の菌を接種し、菌を接種した部位の一定量（例えば、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に、当該部位から一定量）の被験体処方を取り、カンテン平板培地に塗沫した後、カンジダについては２５±２．５℃、黄色ブドウ球菌については３２±２．５℃で、３日間の条件で培養する。
また別途、上述の特定の接種菌数（例えば、１０６ＣＦＵ程度）、それより少ない接種菌数（例えば、１０４ＣＦＵ程度）、それより更に少ない接種菌数（例えば、１０２ＣＦＵ程度）それより多い接種菌数（例えば、１０８ＣＦＵ程度）の菌を、それぞれカンテン平板培地に直接接種し、同様の条件で培養し、それぞれ、スコア０、スコア−１、スコア−２、スコア１を付す。
そして、被験体処方に接種した菌を培養した場合についてその菌の生育度からスコアを定めてよい。
【００４６】
そして、本実施形態では、カビについては図１（ｂ）に示す生育スコア（０〜３）を使用し、そのカビを９６ＲＨ％及び１００ＲＨ％の２条件の下で培養し、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後の４回スコアを定めることによって、満点２４（３×２×４＝２４）の総合生育スコアを各カビごとに算出してよい。
この例のカビについての総合生育スコアは、最高値の３分の１である８以下であることが好ましく、最高値の５分の１である４．８以下であることがより好ましい。
【００４７】
細菌及び酵母については図７（ｂ）に示す生育スコア（−２〜１）を使用し、その細菌及び酵母を９６ＲＨ％及び１００ＲＨ％の２条件の下で培養し、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後の４回スコアを定めることによって、満点８（１×２×４＝８）の総合生育スコアを各細菌及び酵母ごとに算出してよい。
この例の細菌及び酵母についての総合生育スコアは、０以下であることが好ましく、−８以下であることがより好ましい。
【００４８】
複数種の菌を用いる場合には、前述のように各菌種ごとに算出した総合生育スコアを、平均して用いてもよく、加算して用いてもよい。
【００４９】
（栄養源性評価方法）
本発明の実施形態の栄養源性評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体を構成する原料の表面に菌液を滴下する、菌液滴下工程と、菌を培養する、培養工程と、菌の生育度から原料の栄養源性を評価する、栄養源性評価工程とを含む。
【００５０】
被験体を構成する原料としては、前述の本実施形態の防腐性評価方法における被験体を構成するものである限り特に限定されることなく、粉体、油性成分、水性成分等を用いることができ、粉体や油性成分を用いることが好適である。
粉体としては、球状、板状、針状等の形状；煙霧状、微粒子、顔料級等の粒子径；多孔質、無孔質等の粒子構造；等により特に限定されず、無機粉体類、光輝性粉体類、有機粉体類、色素粉体類、複合粉体類等が挙げられる。
具体的には、酸化チタン、黒色酸化チタン、コンジョウ、群青、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、シリカ、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マイカ、合成マイカ、セリサイト、合成セリサイト、タルク、カオリン、炭化珪素、硫酸バリウム、ベントナイト、スメクタイト、ヒドロキシアパタイト、窒化硼素等の無機粉体類；オキシ塩化ビスマス、酸化チタン被覆マイカ、酸化鉄被覆マイカ、酸化鉄被覆マイカチタン、有機顔料被覆マイカチタン、アルミニウムパウダー、ポリエチレンテレフタレート・アルミニウム・エポキシ積層末、ポリエチレンテレフタレート・ポリオレフィン積層フィルム末、ポリエチレンテレフタレート・ポリメチルメタクリレート積層フィルム末等の光輝性粉体類；ナイロンパウダー、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリル−メタクリル酸共重合体、塩化ビニリデン−メタクリル酸共重合体、ポリエチレン、ポリスチレン、アクリル酸アルキル共重合体、オルガノポリシロキサンエラストマー、ポリメチルシルセスキオキサン、ポリウレタン、ウール、シルク、結晶セルロース、Ｎ−アシルリジン等の有機粉体類；カルミン、有機タール系顔料、有機色素のレーキ顔料等の色素粉体類；微粒子酸化チタン被覆マイカチタン、微粒子酸化亜鉛被覆マイカチタン、硫酸バリウム被覆マイカチタン、酸化チタン含有シリカ、酸化亜鉛含有シリカ等の複合粉体類等が挙げられる。
これら粉体は、フッ素系化合物、シリコーン系化合物、金属石鹸、レシチン、水素添加レシチン、コラーゲン、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、ワックス、ロウ、界面活性剤等の１種又は２種以上を用いて表面処理を施してあっても良い。例えば、二酸化ケイ素処理、酸化アルミニウム処理、ジメチルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、トリメチルシロキシケイ酸等のシリコーン化合物による処理、パーフルオロポリエーテルリン酸、パーフルオロアルキルリン酸、弗素変性シリコーン等の弗素化合物による処理、ラウリン酸亜鉛等の金属石鹸処理、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸等のアミノ酸処理、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、ワックス等の油処理、水素添加リン脂質による処理、シランカップリング剤であるＮ−オクチルシリル化処理、チタネートカップリング剤であるイソプロピルトリイソステアロイルチタネート処理等が挙げられる。
【００５１】
油性成分としては、特に限定されず、例えば、動物油、植物油、合成油等の起源や、固形油、半固形油、液体油、揮発性油等の性状を問わず、炭化水素類、油脂類、高級アルコール類、ロウ類、硬化油類、エステル油類、脂肪酸類、シリコーン油類、フッ素系油類、ラノリン誘導体類、油性ゲル化剤類、油溶性紫外線吸収剤類等が挙げられる。具体的には、流動パラフィン、スクワラン、ワセリン、ポリイソブチレン、ポリブテン、パラフィンワックス、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス、フィッシャトロプスワックス等の炭化水素類、オリーブ油、ヒマシ油、ホホバ油、ミンク油、マカデミアンナッツ油等の植物油類、ミツロウ、カルナウバワックス、キャンデリラワックス、ゲイロウ、モクロウ等のロウ類、モンタンワックス、２−エチルヘキサン酸セチル、イソステアリン酸イソトリデシル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、トリオクタン酸セチル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、ジイソステアリン酸ポリグリセリル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、トリベヘン酸グリセリル、ロジン酸ペンタエリトリットエステル、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、コレステロール脂肪酸エステル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸ジ（コレステリル・ベヘニル・オクチルドデシル）、マカデミアンナッツ脂肪酸フィトステリル等のエステル類、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール類、パーフルオロポリエーテル、パーフルオロデカン、パーフルオロオクタン等のフッ素系油剤類、ラノリン、酢酸ラノリン、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラノリンアルコール等のラノリン誘導体、デキストリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、デンプン脂肪酸エステル、１２−ヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム等の油性ゲル化剤類、パラアミノ安息香酸エチル、パラメトキシケイ皮酸−２−エチルヘキシル、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、オクチルトリアゾン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、オキシベンゾン等の油溶性紫外線吸収剤類等が挙げられる。これらの油剤は必要に応じて１種又は２種以上を用いることができる。
【００５２】
これらの原料は、１種単独としても、２種以上の組み合わせとしてもよい。
【００５３】
本実施形態の栄養源性評価方法における、菌液調製工程、菌液滴下工程、培養工程については、前述の本実施形態の防腐性評価方法におけるものと同様としてよい。
【００５４】
本実施形態の栄養源性評価方法では、菌液調製工程、菌液滴下工程、培養工程の後に、菌の生育度から原料の栄養源性を評価する（栄養源性評価工程）。
【００５５】
この栄養源性評価工程では、前述の本実施形態の防腐性評価方法の場合と同様に、菌の生育度を菌の生育段階に応じて定められた生育スコアを用いて評価することが、栄養源性評価試験の精度を高める観点から、好ましい。
【００５６】
より具体的には、例えば、栄養源性評価工程では、１種の菌を用いて、前述の本実施形態の防腐性評価方法の場合と同様に、その菌についての総合生育スコアを算出し、この総合生育スコアを評価に供された原料の栄養源性の指数（栄養源性スコア）としてよい。
また、例えば、複数種の菌を用いて、上記の通り、総合生育スコアを各菌種ごとに算出し、この総合生育スコアの平均を評価に供された原料の栄養源性の指数としてもよい。
【００５７】
なお、前述の通り、用いる菌の種類、湿度条件、生育度合等に応じて、生育スコアのスコア値に比重をかけてもよく、また、複数の菌種間で、生育スコアのスコア値を補正してもよく、栄養源性の指数に比重・補正をかけることも可能である。
【００５８】
（防腐剤不活化度評価方法）
本発明の実施形態の防腐剤不活化度評価方法は、菌を水溶液に懸濁させて菌液を調製する、菌液調製工程と、被験体を構成する原料と防腐剤との混合物を調製する、混合物調製工程と、前記混合物の表面に前記菌液を滴下する、菌液滴下工程と、菌を培養する、培養工程と、菌の生育度から原料の防腐剤不活化度を評価する、防腐剤不活化度評価工程とを含む。
【００５９】
防腐剤としては、特に限定されることなく、従来公知のものとしてよく、例えば、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル（以上４種についての別名：パラベン）、クロルフェネシン、フェノキシエタノール；安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸及びこれらの塩；プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、ジプロピレングリコール等のアルカンジオール類、ＰＥＧ−１ラウリルグリコール等が挙げられる。
防腐剤は、１種単独としても、２種以上の組み合わせとしてもよい。
【００６０】
本実施形態の防腐剤不活化度評価方法における、菌液調製工程については、前述の本実施形態の防腐性評価方法におけるものと同様としてよい。
【００６１】
本実施形態の防腐剤不活化度評価方法における、混合物調製工程では、被験体を構成する原料と防腐剤との混合物を調製する。
ここで、混合物は、１つとしても複数としてもよいが、原料の配合量の条件を異ならせつつ、防腐剤の配合量の条件を同じとして、複数調製することが好ましい。複数の混合物のうちの１つは、原料を含まない（原料の配合量が０質量％）ものとしてもよい。かかる手法によれば、複数の混合物についての評価結果を比較することによって防腐剤不活化度を評価することが可能となる。
【００６２】
本実施形態の防腐剤不活化度評価方法における、菌液滴下工程、培養工程については、前述の本実施形態の防腐性評価方法におけるものと同様としてよい。
【００６３】
本実施形態の防腐剤不活化度評価方法では、菌液調製工程、混合物調製工程、菌液滴下工程、培養工程の後に、菌の生育度から原料の防腐剤不活化度を評価する（防腐剤不活化度評価工程）。
【００６４】
この防腐剤不活化度評価工程では、詳細には、原料を含む被験体において菌の生育度が所定程度に抑えられる、すなわち菌の生育が抑制されたと（所定の判断基準に従って）判断される防腐剤の配合量を定め、このときの防腐剤の配合量の原料の配合量に対する割合を防腐剤不活化度として評価することができる。
【００６５】
防腐剤不活化度評価工程では、前述の本実施形態の防腐性評価方法の場合と同様に、菌の生育度を菌の生育段階に応じて定められた生育スコアを用いて評価することが、防腐剤不活化度評価方法の精度を高める観点から、好ましい。
【００６６】
より具体的には、例えば、複数種のカビを用いることとし、そして、前述の混合物調製工程において、評価対象である原料（例えば、ナイロン）の配合量（質量％）を変化させ、且つ、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ））の配合量（質量％）を変化させることによって、複数の混合物を調製する。そして、防腐剤不活化度評価工程において、複数の混合物について、前述の本実施形態の防腐性評価方法の場合と同様に、その菌についての満点２４の総合生育スコアを算出する。ここで、第１の原料配合量とした場合と、第２の原料配合量とした場合とにおいて、総合生育スコアが１以下となったとき、そのときの防腐剤の配合量をそれぞれ求め、第１の原料配合量とした場合の防腐剤の配合量と第２の原料配合量とした場合の防腐剤の配合量との差に対する、第１の原料配合量と第２の原料配合量との差の割合を、評価に供された原料の防腐剤不活化度としてよい。
なお、本実施形態では、１種のカビを用いて、上記と同様に、原料の防腐剤不活化度を求めることもできる。
【００６７】
また、本実施形態では、例えば、複数種の細菌及び酵母を用い、満点８の総合生育スコアを算出し、総合生育スコアが−１２以下となったときの原料の配合量及び防腐剤の配合量から、上記の通り、評価に供された原料の防腐剤不活化度を求めてもよい。
【００６８】
ここで、原料の配合量を変化させて調製した複数の混合物の数は、２以上としてよく、評価の精度を高める観点から、３以上とすることが好ましく、５以上とすることが更に好ましい。３以上とした場合、比較結果が複数得られることとなり、この場合、複数の比較結果を平均して、評価に供された原料の防腐剤不活化度を求めてもよい。
【００６９】
なお、前述の通り、用いる菌の種類、湿度条件、生育度合等に応じて、生育スコアのスコア値に比重をかけてもよく、また、複数の菌種間で、生育スコアのスコア値を補正してもよく、防腐剤不活化度に比重・補正をかけることも可能である。
【００７０】
（製剤の製造方法）
本発明の実施形態の製剤の製造方法は、前述の本実施形態の栄養源性評価方法及び／又は前述の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤に含める原料及び防腐剤の配合を決定することを特徴とし、具体的態様は下記に詳述するが、特にこれらに限定されない。
【００７１】
本実施形態の製剤の製造方法の一例は、前述の本実施形態の栄養源性評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の栄養源性を評価し、各原料の栄養源性を各原料の製剤中における配合割合に乗じて合算することによって、製剤の栄養源性の指数（栄養源性スコア）を算出し、製剤の栄養源性の指数を最高値の３分の１以下とすることが好ましい。この方法によれば、製剤の防腐性を十分に高められることを確かめながら、製剤を製造することが可能となる。
上記製剤の栄養源性の指数は最高値の５分の１以下とすることが更に好ましい。
【００７２】
カビについて総合生育スコアの最高値を２４とした場合、上記製剤の栄養源性の指数は、最高値の３分の１である８以下とすることが好ましく、最高値の５分の１である４．８以下とすることが更に好ましい。
細菌及び酵母について総合生育スコアの最高値を８とした場合、上記製剤の栄養源性の指数は、０以下とすることが好ましく、−８以下とすることが更に好ましい。
【００７３】
本実施形態の製剤の製造方法の別の例は、前述の本実施形態の防腐剤不活化度評価方法を用いて、製剤を構成する各原料の防腐剤不活化度を評価し、各原料の防腐剤不活化度を各原料の製剤中における配合量に乗じて合算することによって、製剤の防腐剤不活化度を算出し、製剤の防腐剤不活化度を０．４以下とすることが好ましい。
上記製剤の防腐剤不活化度は、０．１以下とすることが更に好ましい。
【００７４】
本実施形態の製剤の製造方法の更なる例は、上記別の例の場合と同様に算出した製剤の防腐剤不活化度に基づいて、製剤に添加する防腐剤の配合量を決定することが好ましい。この方法によれば、防腐性を十分に高められるように配慮しながら、製剤を製造することが可能となる。
この方法では、例えば、試行品製剤の防腐剤不活化度が０．３となった場合、防腐剤の効果が十分高められるように試行製剤中の防腐剤は製剤１００質量％中に０．３質量％以上含有させるといったように、防腐剤不活化度に基づいて、製剤に添加する防腐剤の配合量を決定することができる。
【００７５】
上記本発明の栄養源性評価方法、上記本発明の防腐剤不活化度評価方法、上記本発明の製剤の製造方法によれば、前述の本発明の防腐性評価方法の効果を得ることができる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００７７】
（試薬及び材料）
−菌−
−−真菌−−
・カビ１：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号：９６４２）
・カビ２：Ａｓｐｅｒｇｕｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：６３４６）
・カビ３：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ＮＢＲＣ番号：６３５２）
・カビ４：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（製剤に生育した菌を単離したもの）
・カンジダ：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ番号：１５９４）
−−細菌−−
・緑膿菌：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＮＢＲＣ番号：１３２７５）
・黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：１３２７６）
・大腸菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＮＢＲＣ番号：３９７２）
−原料−
・カルミン、ポリスチレン、コンジョウ、酸化チタン、グンジョウＡ、タルク、ポリウレタン、グンジョウＢ、シリコーン処理酸化チタン、酸化鉄、酸化亜鉛、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、流動パラフィン、シリコーン油、ジエチルヘキサン酸ネオペンチルグリコール、トリエチルヘキサノイン、シリカ、ジイソステアリン酸グリセリル−２、ポリエチレン、カナバウロウ、マイクロクリスタリンワックスについては、市販のものを用いた。
・ＰＭＭＡ（松本油脂製薬株式会社製、品番：マツモトマイクロスフェアーＭ−１０１）
・ナイロン（東レ株式会社製、品番：ＳＰ−５００）
・マイカ（株式会社山口雲母工業所製、品番：ＭＩＣＡ  ＰＯＷＤＥＲ  Ｙ−２３００）
−防腐剤−
・パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）
−その他−
・ブドウ糖ペプトン（ＧＰ）培地（栄研化学株式会社製、品番：Ｅ−ＭＦ０８）
【００７８】
（試験Ａ：防腐性評価方法）
［実施例Ａ１］
被験体として、表１に示す処方の混合物を用いた。被験体は、粉体の堆積物として存在していた。
菌として、カビ１〜カビ３、カンジダ、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌を用いた。
菌液（菌懸濁液）における菌の濃度は、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬとした。
被験体の表面に菌液０．１ｍＬを滴下したところ、直径約１ｃｍの円形の領域が滴下領域となった。
菌液は被験体である混合物の表層で濾され、１．０×１０４〜１．０×１０５ＣＦＵの菌は被験体の表層に存在していた。
被験体の表面の滴下領域及びそれに相当する表層における菌の濃度は、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬとなった。
各菌を、９６ＲＨ％、１００ＲＨ％の２つの湿度条件、２５℃の温度条件の下で、培養した。
そして、カビについては、各湿度条件で、培養開始から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後の時点において、被験体の菌の滴下領域を目視で又は実体顕微鏡で観察し、図１（ｂ）に示すカビの生育スコアに照らして０〜３のスコアを付けて、満点２４の総合生育スコアを算出した。
細菌及び酵母については、被験体の菌の滴下領域を滅菌したミクロスパーテル等を用いて採取し、細菌はＳＣＤＬＰカンテン平板培地に、酵母はＳＤＬＰカンテン平板培地に、０．０３〜０．３ｍｇ／ｃｍ２なるよう塗布した。細菌は３２．５±２．５℃で、酵母は２５±２．５℃で、３日間培養し、検出したコロニーを目視で観察し、図８に示す細菌及び酵母の生育スコアと同様に用意した生育スコアに照らして−２〜１のスコアを付けて、総合生育スコアを算出した。
試験条件及び試験結果の詳細を表１に示す。
【００７９】
（保存効力試験）
［比較例Ａ１］
本発明の比較例として従来公知の保存効力試験を、日本薬局方参考情報に基づいて、行った。
実施例Ａ１と同様に被験体を準備した。
菌として、カビ１〜カビ３、カンジダ、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌を用いた。
菌液（菌懸濁液）における菌の濃度は、１．０×１０７〜１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬとした。
被験体１０ｇに菌液０．０５ｍＬ（約０．０５ｇ）を添加した（菌は被験体中で２００倍に希釈された）。
被験体中における菌の濃度は、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｇとなった。
各菌を、保存効力試験の所定の条件下で、培養した。
そして、培養開始から所定期間経過後に、各菌の生菌数を測定した。
試験条件及び試験結果の詳細を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2017046689.tif 000003
【００８１】
また、特に、比較例Ａ１の結果の詳細を表２、図９、図１０にも示す。
【００８２】
【表２】
2017046689.tif 000004
【００８３】
図９に、比較例Ａ１のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ＮＢＲＣ番号：６３５２）の場合の生菌数の推移を示す。図中、縦軸には、生菌数を常用対数（ｌｏｇ）で表し、横軸には、培養日数を表す。
図１０に、比較例Ａ１のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ番号：１５９４）の場合の生菌数の推移を示す。図中、縦軸には、生菌数を常用対数（ｌｏｇ）で表し、横軸には、培養日数を表す。
【００８４】
実施例Ａ１と比較例Ａ１との比較により、本発明の防腐性評価方法での１〜３回目の結果と、従来の保存効力試験の１〜３回目の結果とを比較すると、本発明の防腐性評価方法では結果のバラツキが小さいことがわかる。より具体的には、表２に示す実施例Ａ１の結果と、表２及び図９に示す比較例Ａ１の結果とから、従来の保存効力試験では、カビにおいても、酵母・細菌においても、試験者によるバラつき（異なる試験者間、同じ試験者での異なる試験回間におけるバラつき）、経時によるバラつき（徐々に菌数が減るのが通常であるところ菌数が上下するバラつき）が大きいことがわかる。
【００８５】
［実施例Ａ２〜Ａ４］、［比較例Ａ２〜Ａ４］
表１に示す試験条件としたこと以外は、実施例Ａ１及び比較例Ａ１と同様に、試験を行った。
【００８６】
試験条件及び試験結果の詳細を表３に示す。
【００８７】
【表３】
2017046689.tif 000005
【００８８】
また、特に比較例Ａ２の結果の詳細を表４、図１１、図１２にも示す。
【００８９】
【表４】
2017046689.tif 000006
【００９０】
図１１に、比較例Ａ２のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号：９６４２）の場合の生菌数の推移を示す。図中、縦軸には、生菌数を常用対数（ｌｏｇ）で表し、横軸には、培養日数を表す。
図１２に、比較例Ａ２のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ番号：１３２７６）の場合の生菌数の推移を示す。図中、縦軸には、生菌数を常用対数（ｌｏｇ）で表し、横軸には、培養日数を表す。
【００９１】
実施例Ａ１〜Ａ４の結果と、比較例Ａ１〜Ａ４の結果と比較して、本発明の防腐性評価方法において菌の生育を抑える効果が見られる場合には、従来の保存効力試験においてもその効果が見られることがわかり、本発明の防腐性評価方法の有効性が実証された。
【００９２】
（試験Ｂ：栄養源性評価方法）
［実施例Ｂ１〜実施例Ｂ１４］
原料として、表５に示すものを用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ａの実施例Ａ１と同様に、各菌について総合生育スコアを算出した。そして、総合生育スコアの平均を算出した。
ここで、この総合生育スコアの平均を原料の栄養源性の指数とした。指数が大きいほど、栄養源性が高いことを示す。
試験条件及び試験結果の詳細を表５に示す。
【００９３】
【表５−１】
2017046689.tif 000007
【表５−２】
2017046689.tif 000008
【００９４】
（試験Ｃ：防腐剤不活化度評価方法１）
［実施例Ｃ１〜実施例Ｃ３、実施例ＣＸ］
被験体として、表６に示す処方の混合物を用いた。被験体中における各原料の配合量を５質量％とし、原料を含まない被験体も準備した。
防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ａの実施例Ａ１と同様に、各処方における各菌について総合生育スコアを算出した。そして、総合生育スコアの平均を算出した。
【００９５】
特に、原料としてナイロン（配合量５質量％）、ＰＭＭＡ（配合量５質量％）、ポリスチレン（配合量５質量％）を用いた実施例Ｃ１、実施例Ｃ２、実施例Ｃ３については、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が、それぞれ、０．５０質量％、０．２５質量％、０．２０質量％であった。
一方、原料を含まない実施例ＣＸについては、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が０．１５質量％であった。
これらの結果から、配合量５質量％のナイロンは、実施例Ｃ１におけるＭＰの配合量と実施例ＣＸにおけるＭＰの配合量との差である０．３５質量％のＭＰを不活化したことがわかった。ナイロンのＭＰ不活化度は、０．０７（＝０．３５質量％／５質量％）であった。
ＰＭＭＡ、ポリスチレンのＭＰ不活化度は、それぞれ、０．０２、０であった。
試験条件及び試験結果の詳細を表６及び図１３に示す。
【００９６】
【表６−１】
2017046689.tif 000009
【表６−２】
2017046689.tif 000010
【００９７】
［実施例Ｃ４〜実施例Ｃ５、実施例ＣＸ］
被験体として、表７に示す処方の混合物を用いた。被験体中におけるナイロンの配合量を１質量％、３質量％、５質量％、０質量％とした。
上記以外は、実施例Ｃ１〜実施例Ｃ３と同様に、各処方における各菌について総合生育スコアを算出した。そして、総合生育スコアの平均を算出した。
【００９８】
原料として１質量％のナイロンを用いた実施例Ｃ４については、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が０．２５質量％であった。
原料として３質量％のナイロンを用いた実施例Ｃ５については、０．４０質量％であった。
原料として５質量％のナイロンを用いた実施例Ｃ１については、前述の通り、０．５０質量％であった。
一方、原料を含まない実施例ＣＸについては、前述の通り、０．１５質量％であった。
実施例ＣＸと実施例Ｃ４との結果から、配合量１質量％のナイロンは、０．１質量％のＭＰを不活化したことがわかり、ナイロンのＭＰ不活化度は、０．１となった。
実施例Ｃ４と実施例Ｃ５との結果から、配合量２質量％のナイロンは、０．１５質量％のＭＰを不活化したことがわかり、ナイロンのＭＰ不活化度は、０．０７５となった。
実施例Ｃ５と実施例Ｃ１との結果から、配合量２質量％のナイロンは、０．１０質量％のＭＰを不活化したことがわかり、ナイロンのＭＰ不活化度は、０．０５となった。
これら３つの比較結果を平均して用いることによって、ナイロンのＭＰ不活化度は、０．０７５と求められた。
ナイロンの配合量の条件を複数とすることで、より精度よくナイロンのＭＰ不活化度を求めることができた。
試験条件及び試験結果の詳細を表７及び図１４に示す。
【００９９】
【表７−１】
2017046689.tif 000011
【表７−２】
2017046689.tif 000012
【０１００】
（試験Ｄ：防腐剤不活化度評価方法２）
［実施例Ｄ１〜実施例Ｄ４、実施例ＤＸ］
被験体として、表８に示す処方の混合物を用いた。被験体中における各原料の配合量を５質量％、１０質量％とし、原料を含まない被験体も準備した。
防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ａの実施例Ａ１と同様に、各処方における各菌について総合生育スコアを算出した。そして、総合生育スコアの平均を算出した。
【０１０１】
特に、原料としてパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル（配合量１０質量％）、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル（配合量１０質量％）、流動パラフィン（配合量１０質量％）を用いた実施例Ｄ１、実施例Ｄ３、実施例Ｄ４については、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が、それぞれ、０．５質量％、０．３質量％、０．１５質量％であった。
一方、原料を含まない実施例ＤＸについては、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が０．１５質量％であった。
これらの結果から、配合量１０質量％のパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、流動パラフィンは、それぞれ、０．３５質量％、０．１５質量％、０質量％のＭＰを不活化したことがわかった。
パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、流動パラフィンのＭＰ不活化度は、それぞれ、０．０３５、０．０１５、０であった。
試験条件及び試験結果の詳細を表８及び図１５に示す。
【０１０２】
また、原料として１０質量％のパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルを用いた実施例Ｄ１については、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が０．５質量％であった。
原料として５質量％のパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルを用いた実施例Ｄ２については、０．３質量％であった。
一方、原料を含まない実施例ＤＸについては、前述の通り、総合生育スコアの平均が１以下となったときのＭＰの配合量が０．１５質量％であった。
実施例ＤＸと実施例Ｄ２との結果から、配合量５質量％のパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルは、０．１５質量％のＭＰを不活化したことがわかり、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルのＭＰ不活化度は、０．０３となった。
実施例Ｄ１と実施例Ｄ２との結果から、配合量５質量％のパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルは、０．２質量％のＭＰを不活化したことがわかり、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルのＭＰ不活化度は、０．０４となった。
これら２つの比較結果を平均して用いることによって、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシルのＭＰ不活化度は、０．０３５と求められた。
試験条件及び試験結果の詳細を表８及び図１５に示す。
【０１０３】
【表８−１】
2017046689.tif 000013
【表８−２】
2017046689.tif 000014
【表８−３】
2017046689.tif 000015
【０１０４】
（試験Ｅ：製剤の製造方法１（アイカラー））
［実施例Ｅ１〜実施例Ｅ５］
アイカラーの製造を行うにあたり、表９に示す処方の防腐性評価を行った。
防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ｂの実施例Ｂの各原料の栄養原性の指数を用いて、各処方の栄養源性の指数を算出した。また、各処方を用いて防腐性評価も行い、総合生育スコアを求めた。
【０１０５】
実施例Ｅ１では、処方の栄養源性の指数が合計で１０．１であり、栄養源性の指数の最高値である２４の３分の１である８を超えた。なお、この処方の総合生育スコアは２４であり、防腐性が低かった。
実施例Ｅ２では、実施例Ｅ１の栄養源性評価の結果を受けて、０．３質量％のＭＰを配合したところ、総合生育スコアは１６に低下したが、防腐性はいまだ低かった。
実施例Ｅ３では、処方の栄養源性の指数が合計で７．７であり、栄養源性の指数の最高値の３分の１に満たなかった。なお、この処方の総合生育スコアは１２であり、防腐性が高くなかった。
実施例Ｅ４では、実施例Ｅ３の栄養源性評価の結果を受けて、０．３質量％のＭＰを配合したところ、総合生育スコアは７に低下し、防腐性が改善された。
実施例Ｅ５では、処方の栄養源性の指数が合計で４．５であり、栄養源性の指数の最高値の３分の１にはるかに満たなかった。なお、この処方の総合生育スコアは３であり、防腐性が高かった。実施例Ｅ５の処方では、ＭＰを配合しなくても高い防腐性が得られることがわかった。
【０１０６】
【表９】
2017046689.tif 000016
【０１０７】
（実施例Ｆ：製剤の製造方法１（粉末固型ファンデーション））
［実施例Ｆ１〜実施例Ｆ３］
粉末固型ファンデーションの製造を行うにあたり、表１０に示す処方の防腐性評価を行った。
防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ｃ、Ｄで求めた各原料の防腐剤不活化度を用いて、各処方の防腐剤不活化度を算出した。また、各処方の栄養源性の指数を算出し、さらに防腐性評価も行い、総合生育スコアを求めた。
【０１０８】
実施例Ｆ１では、処方の防腐剤不活化度が０．７０であり、基準値とした０．４を超えた。
ここで、０．４質量％のＭＰを配合し、防腐剤不活化度を考慮して算出される実質的なメチルパラベンの配合量（実質メチルパラベン）を−０．３０とした（言い換えると、メチルパラベン配合後の処方の防腐剤不活化度を０．３０とした）。
なお、この処方の栄養源性の指数は８．２であり、栄養源性の指数の最高値である２４の３分の１である８を超え、また、この処方の総合生育スコアは２０であり、防腐性が低かった。
【０１０９】
実施例Ｆ２では、処方の防腐剤不活化度が０．３２であり、基準値とした０．４に満たなかった。
ここで、０．４質量％のＭＰを配合し、防腐剤不活化度を考慮して算出される実質的なメチルパラベンの配合量（実質メチルパラベン）を０．０８とした。
なお、この処方の栄養源性の指数は８．３であり、栄養源性の指数の最高値である２４の３分の１である８を超えていたが、この処方の総合生育スコアは８であり、防腐性が高かった。
【０１１０】
実施例Ｆ３では、処方の防腐剤不活化度が０．０９であり、基準値とした０．４に満たなかった。
ここで、０．４質量％のＭＰを配合し、防腐剤不活化度を考慮して算出される実質的なメチルパラベンの配合量（実質メチルパラベン）を０．３１とした。
なお、この処方の栄養源性の指数は８．２であり、栄養源性の指数の最高値である２４の３分の１である８を超えていたが、この処方の総合生育スコアは１であり、防腐性が高かった。
【０１１１】
【表１０】
2017046689.tif 000017
【０１１２】
（実施例Ｇ：防腐性評価方法（油性固型ファンデーション））
［実施例Ｇ１］
被験体として、表１１に示す処方の混合物を用いた。被験体は、粉体を油剤に分散した固体物として存在していた。
防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
菌液（菌懸濁液）における菌の濃度は、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬとした。
被験体の表面に菌液０．１ｍＬを滴下したところ、直径約１ｃｍの円形の領域が滴下領域となった。
菌液は被験体である混合物の表層に留まり、１．０×１０４〜１．０×１０５ＣＦＵの菌は被験体の表層に存在していた。
被験体の表面の滴下領域及びそれに相当する表層における菌の濃度は、１．０×１０５〜１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬとなった。
各菌を、９６ＲＨ％、１００ＲＨ％の２つの湿度条件、２５℃の温度条件の下で、培養した。
そして、カビについては、各湿度条件で、培養開始から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後の時点において、被験体の菌の滴下領域を目視で又は実体顕微鏡で観察し、図１（ｂ）に示すカビの生育スコアに照らして０〜３のスコアを付けて、満点２４の総合生育スコアを算出した。
【０１１３】
実施例Ｇ１では、総合生育スコアは７であり、防腐性が高かった。
【０１１４】
【表１１】
2017046689.tif 000018
【０１１５】
（実施例Ｈ：防腐性評価方法（栄養源含有菌液を用いた場合））
［実施例Ｈ１］
被験体として、表１２に示す処方の混合物を用いた。被験体は、粉体の堆積物として存在していた。
防腐剤として、ケイ酸（アンモニウム／銀／亜鉛・Ａｌ）及びパラオキシ安息香酸メチル（ＭＰ）を用いた。
菌として、カビ１〜カビ４を用いた。
上記以外は、試験Ａの実施例Ａ１と同様に、各処方における各菌について総合生育スコアを算出した。そして、総合生育スコアの平均を算出した。
【０１１６】
実施例Ｈ１では、総合生育スコアは１３であり、防腐性が高くなかった。これは、菌液の調製に用いた水溶液に栄養源が含まれていたためと考えられる。しかしながら、栄養源を含有する菌液を用いた場合にも防腐性評価方法を実施することが可能であることが示された。本発明の防腐性評価方法は、製剤の使用環境や文化の違いや使用方法の違い等により、外的要因による栄養源付加を考慮して、高い防腐力、すなわち殺菌力の付与が必要である場合にも、適応可能であるといえる。
【０１１７】
【表１２−１】
2017046689.tif 000019
【表１２−２】
2017046689.tif 000020
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の防腐性評価方法によれば、被験体の防腐性をより正確により簡便に評価することが可能となる。また、本発明の防腐性評価方法によれば、ヒトが菌に暴露されるリスクを低減することができ、接種菌数の制御も容易となる。
本発明の栄養源性評価方法、本発明の防腐剤不活化度評価方法、本発明の製剤の製造方法によれば、上記本発明の防腐性評価方法の効果を得ることができる。
本発明は、特に、継続的に使用されるファンデーションの防腐性を高い精度で評価するために好適に用いることができる。
【図１】
2017046689.tif 000021
【図７】
2017046689.tif 000022
【図９】
2017046689.tif 000023
【図１０】
2017046689.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
2017046689.tif 000026
【図１３】
2017046689.tif 000027
【図１４】
2017046689.tif 000028
【図１５】
2017046689.tif 000029
【図２】
2017046689.tif 000030
【図３】
2017046689.tif 000031
【図４】
2017046689.tif 000032
【図５】
2017046689.tif 000033
【図６】
2017046689.tif 000034
【図８】
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