(57)【要約】【課題】  ジスフェルリン異常症の治療薬のスクリーニング系を提供する。【解決手段】  ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするための方法であって、ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞を被験化合物と接触させる工程と、前記細胞を界面活性剤又は膜孔形成毒素と接触させる工程と、前記工程後の細胞の細胞死又は細胞生存を検出する工程とを含み、細胞死の減少及び／又は細胞生存の増加が前記治療薬の指標となる、方法、あるいは、該方法と関連するキットが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするための方法であって、
ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞を被験化合物と接触させる工程と、
前記細胞を界面活性剤又は膜孔形成毒素と接触させる工程と、
前記工程後の細胞の細胞死又は細胞生存を検出する工程とを含み、
細胞死の減少及び／又は細胞生存の増加が前記治療薬の指標となる、方法。
【請求項２】
ジスフェルリン活性の減弱がジスフェルリン発現レベルの低下による、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ジスフェルリン活性の減弱がジスフェルリン遺伝子の変異による、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ジスフェルリン遺伝子の変異がミスセンス変異、ナンセンス変異、又はスプライシング異常である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞が、線維芽細胞、筋芽細胞又は筋管細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤がサポニン又はジギトニンである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
膜孔形成毒素がストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、炭疽菌毒素、アルファヘモリジン、アエロリシン、α毒素、β毒素、Ｃｒｙ５Ｂ、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ニューモリシン（ＰＬＹ）、パーフリンゴリシン（ＰＬＹ）、ジフテリア毒素、又はコレラ菌シトリシン（Ｖｃｃ）である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞死又は細胞生存を検出する工程が、乳酸脱水素酵素活性、ミトコンドリア脱水素酵素活性、アルカリもしくは酸性ホスファターゼ活性又はエステラーゼ活性の測定、細胞質染色、核染色、あるいは［３Ｈ］−チミジン取り込みもしくは５１Ｃｒ放出アッセイを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ジスフェルリン異常症が三好型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、遠位型前脛骨筋ミオパチー（ＤＭＡＴ）、又は近位筋優位ジスフェルリノパチーである、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞、界面活性剤、及び／又は膜孔形成毒素を含む、ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジスフェルリン異常症の治療薬のスクリーニング方法（薬剤の探索方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋の細胞膜は機械的負荷により絶え間なく損傷を受けているため、細胞膜の修復は筋線維の維持にとって重要である。ジスフェルリンは筋細胞膜の損傷部位にカルシウムイオン依存的に凝集し、筋細胞膜の修復に関与することが知られている。ジスフェルリン遺伝子の変異は一般に機能性ジスフェルリンタンパク質の発現レベルの低下あるいは欠損をもたらす。その結果、患者骨格筋では筋細胞膜の修復不全による筋壊死が生じ、ジスフェルリン異常症と総称される筋ジストロフィーが発症する。本疾患の治療薬や治療薬のドラッグスクリーニング系は現在までに開発されていない。
【０００３】
以下の文献は、それぞれが参照により本明細書に援用される。
【非特許文献１】Dysferlinopathies. Amato AA1, Brown RH Jr.  Handb Clin Neurol. 2011; 101: 111-8.
【非特許文献２】Muscular dystrophy in dysferlin-deficient mouse models. Hornsey MA1, Laval SH, Barresi R, Lochmuller H, Bushby K. Neuromuscul Disord. 2013 May; 23(5): 377-87.
【非特許文献３】The C2A domain in dysferlin is important for association with MG53 (TRIM72). Matsuda C, Miyake K, Kameyama K, Keduka E, Takeshima H, Imamura T, Araki N, Nishino I, Hayashi Y. PLoS Curr. 2012 Nov 5; 4: e5035add8caff4.
【非特許文献４】Dysferlin interacts with affixin (beta-parvin) at the sarcolemma. Matsuda C, Kameyama K, Tagawa K, Ogawa M, Suzuki A, Yamaji S, Okamoto H, Nishino I, Hayashi YK. J Neuropathol Exp Neurol. 2005 Apr;64(4):334-40.
【非特許文献５】The sarcolemmal proteins dysferlin and caveolin-3 interact in skeletal muscle. Matsuda C, Hayashi YK, Ogawa M, Aoki M, Murayama K, Nishino I, Nonaka I, Arahata K, Brown RH Jr. Hum Mol Genet. 2001 Aug 15; 10(17): 1761-6.
【非特許文献６】Dysferlin is a surface membrane-associated protein that is absent in Miyoshi myopathy. Matsuda C, Aoki M, Hayashi YK, Ho MF, Arahata K, Brown RH Jr. Neurology. 1999 Sep 22; 53(5): 1119-22.
【非特許文献７】Cloning of the mouse dysferlin gene and genomic characterization of the SJL-Dysf mutation. Neuroreport. 2001 Mar 5; 12(3): 625-9.
【発明の概要】
【０００４】
難治性希少疾患である筋ジストロフィーの治療法の開発は、患者数が少ないため遅れており、患者のＱＯＬ向上のため解決すべき課題の一つである。ジスフェルリン異常症は筋ジストロフィーの１種であり、現在までに治療法は確立されていない。本発明者らは、ジスフェルリン異常症の治療薬開発を目的としてドラッグスクリーニングの系を確立した。
【０００５】
すなわち、本発明によると、ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、好ましくは、ジスフェルリン活性の減弱した動物細胞（特に哺乳動物細胞）を被験化合物と接触させる工程を含む。また、この方法は、好ましくは、ジスフェルリン活性の減弱した動物細胞（特に哺乳動物細胞）を界面活性剤又は膜孔形成毒素と接触させる工程を含む。この方法は、好ましくは、上記工程後の細胞の細胞死又は細胞生存を検出する工程を含む。この方法では、好ましくは、細胞死の減少及び／又は細胞生存の増加が上記治療薬の（有効性の）指標となる。
【０００６】
上記発明のある態様において、ジスフェルリン活性の減弱は、ジスフェルリン発現レベル（ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）の低下及び／又はジスフェルリン遺伝子の変異の結果生じたものである。この態様において、ジスフェルリン遺伝子の変異には、ミスセンス変異、ナンセンス変異、又はスプライシング異常が含まれる。
【０００７】
上記発明のある態様において、動物細胞（特に哺乳動物細胞）は、線維芽細胞、筋芽細胞又は筋管細胞である。
代表的な界面活性剤としてはサポニン又はジギトニン、代表的な膜孔形成毒としてはストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、炭疽菌毒素、アルファヘモリジン、アエロリシン、α毒素、β毒素、Ｃｒｙ５Ｂ、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ニューモリシン（ＰＬＹ）、パーフリンゴリシン（ＰＬＹ）、ジフテリア毒素、又はコレラ菌シトリシン（Ｖｃｃ）が挙げられる。
【０００８】
上記発明のある態様において、細胞死又は細胞生存を検出する工程は、乳酸脱水素酵素活性、ミトコンドリア脱水素酵素活性、アルカリもしくは酸性ホスファターゼ活性又はエステラーゼ活性の測定、細胞質染色、核染色、あるいは［３Ｈ］−チミジン取り込みもしくは５１Ｃｒ放出アッセイを含む。
【０００９】
上記発明のある態様において、ジスフェルリン異常症は、三好型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、遠位型前脛骨筋ミオパチー（ＤＭＡＴ）、又は近位筋優位ジスフェルリノパチーである。
【００１０】
また、本発明によれば、ジスフェルリン活性の減弱した動物細胞（特に哺乳動物細胞）、界面活性剤、及び／又は膜孔形成毒素を含む、ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするためのキットが提供される。上記キットは、好ましくは、上記発明の方法に用いられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、より簡易で経済的なジスフェルリン異常症の治療薬のスクリーニング系が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例に記載の既存薬ライブラリーを用いたスクリーニングのスクリーニング過程における結果を示す図である。
【図２】実施例に記載の既存薬ライブラリーを用いたスクリーニングのスクリーニング過程における結果を示す図である。
【図３】実施例に記載の既存薬ライブラリーを用いたスクリーニングのスクリーニング過程における結果を示す図である。
【図４】ヒト及びマウス細胞の膜修復アッセイの結果を示す図である。パネルは、ヒト及びマウス細胞におけるレーザー損傷後のＦＭ１−４３色素の細胞内への流入を示す。細胞膜が修復されれば、ＦＭ色素は損傷部位に留まるが、細胞膜修復不全の場合、ＦＭ色素は細胞内へ流入する。
【図５】レーザー損傷後のＦＭ１−４３流入の定量化を示す図である。損傷部位におけるＦＭ１−４３の相対的蛍光強度のタイムコースである。データは、平均±標準偏差（エラーバー）で表される。レーザーにより誘導された損傷の数はｎ＝５である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔用語の説明〕
本明細書中においては、特記のない限り、各用語は以下に示す意味を有する。
【００１４】
「ジスフェルリン異常症」（ディスファーリノパシー、ジスフェルリノパチー、ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ）という用語は、ジスフェルリン遺伝子の変異による常染色体劣性遺伝の筋ジストロフィーを意味する。ジスフェルリン異常症の患者においては、ジスフェルリン遺伝子の変異により、患者骨格筋において筋細胞膜の修復不全による筋壊死が生じ、筋ジストロフィーが発症する。本疾患の治療薬は現在までに開発されていない。ジスフェルリン異常症は、臨床的にはすなわち三好型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、遠位型前脛骨筋ミオパチー（ＤＭＡＴ）、及び近位筋優位ジスフェルリノパチーが含まれる。
【００１５】
「ジスフェルリン」（ディスファーリン、ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ）は、筋細胞膜の損傷部位にカルシウムイオン依存的に凝集し、筋細胞膜の修復に関与する。ジスフェルリン遺伝子の変異は機能性ジスフェルリンタンパク質の発現レベルの低下あるいは欠損をもたらし、筋ジストロフィーの原因となる。典型的なジスフェルリンの配列を配列番号：１（ヒトジスフェルリン）及び２（マウスジスフェルリン）に示す。特記しない限り、ジスフェルリン（又は変異体ジスフェルリン）という用語には、配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列と、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（ジスフェルリン）や、配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列において１又は複数（例えば、１〜６００、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００、１〜１００、１〜２０、１〜１０、１〜５又は１〜３個）のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド（ジスフェルリン）が含まれる。ジスフェルリンが、それぞれの目的について要求される特徴を保持する範囲内であれば、欠失、挿入及び置換はどのように組合せてもよい。ある配列に対し、変異を導入する方法としては、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸／ヌクレオチド配列変異体の場合）、部位特異的変異、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット変異導入などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、ポリペプチド（タンパク質）のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、二つのアミノ酸配列間のアミノ酸残基が同一であるアミノ酸残基数パーセントとして定義される。％アミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。
【００１７】
「ジスフェルリン活性」という用語は、ジスフェルリンの有する何れかの生物学的活性を意味する。発明の目的に反しない限り、ジスフェルリンの有する何れの生物学的活性を指標として用いてもよいが、ジスフェルリン異常症と関連する生物学的活性を用いることが好ましい。そのような活性としては、細胞（例えば、筋細胞、筋芽細胞、線維芽細胞等）における細胞膜損傷時の細胞死抑制活性又はモデル動物もしくは患者におけるジスフェルリン異常症発症阻止活性が挙げられる。また、より分子レベルでの活性を指標としてもよく、例えば、細胞膜修復活性や他のインビトロの活性などを指標としてもよい。
【００１８】
ジスフェルリン活性の「減弱」とは、（１）あるジスフェルリン分子そのものの（例えば、インビトロでの）活性が野生型（例えば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）のジスフェルリンと比較して減弱していること、又は、（２）ある細胞が、ジスフェルリン及び／又は他の関連分子を正常に発現する細胞（正常細胞）と比較して、その細胞の有するジスフェルリン活性において減弱しているか、の何れかを意味する。減弱した活性というとき、好ましくは、野生型又は正常細胞の５０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、さらにより好ましくは１０％以下である。あるいは、モデル動物又は患者においてジスフェルリン異常症を発症させ得るジスフェルリン変異等について、「ジスフェルリン活性を減弱させる」変異とみなすこともできる。活性の減弱は、ジスフェルリンの変異（変異体ジスフェルリン）による機能的欠失、種々の要因によるジスフェルリンの発現低下、又は、ジスフェルリン関連分子の機能的欠失もしくは発現低下等、様々な機構が存在し得る。
【００１９】
「哺乳動物」には、これに限定されるものではないが、一般的に用いられ得る実験動物や治療の対象となる動物、すなわち、霊長類（ヒトなど）をはじめとして、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、水牛、ラクダなどが含まれる。なお、「動物」には、哺乳動物の他、鳥類（ニワトリ）や魚類（ゼブラフィッシュ）なども含まれる。
【００２０】
本発明における「線維芽細胞」、「筋芽細胞」、「筋管細胞」としては、発明の目的に明らかに反するものでない限り、一般にこれらの細胞として知られる任意の細胞を用いることができる。
線維芽細胞は、結合組織を構成する細胞の一種であり、真皮を構成する成分（例えば、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸など）を産生する。筋芽細胞は、筋線維の由来となる単核細胞であり、増殖して互いに融合したものが「筋管細胞」となる。
【００２１】
本発明における「線維芽細胞」、「筋芽細胞」、「筋管細胞」としては、生体内から採取された上記細胞やその初代培養細胞、継代培養された細胞や株化された細胞株、あるいは、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、あるいは間葉系幹細胞）から分化させた細胞の何れも用いることができる。また、未分化の正常ｉＰＳ細胞もジスフェルリンを発現しているため、本発明に用いることが可能である。線維芽細胞は増殖が早く、培養用ディッシュのコーティングも不要であり、接着性も強く、培養や取り扱いが容易である。
【００２２】
「被験化合物」という用語は、本発明において、治療薬の候補として試験される化合物を意味する。本発明を適用可能な被験化合物は、その構造・由来・物性等により限定されるものではなく、例えば、アミノ酸、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド、グリコペプチドを含む）、タンパク質（糖タンパク質を含む；例えば、抗体など）、脂質、炭水化物（糖を含む）、ステロイド、プロテオグリカン、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸及び二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含む）、低分子化合物（無機及び有機化合物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーを含む）等、任意の物質が含まれる。その由来についても、天然由来であっても、人工物であってもよい。また、新規化合物であっても、公知化合物であってもよい。本発明に用いられる被験化合物は複数であってよく、複数の被験化合物の混合物の形態の被験化合物（ライブラリー等）や複合体の形態の被験化合物であってもよい。
【００２３】
「治療」とは、ある疾患又は症状の減少、緩和または軽減を意味し、将来的な疾患又は症状の発症に対する防御（予防）や進行の抑制も含む。治療の望ましい効果には、症状の寛解、疾病の任意の直接的または間接的病理的結果の低減、症状悪化の進行速度の低減、疾病状態の回復または緩和、予後の改善が含まれる。
【００２４】
「界面活性剤」とは、親水性基と親油性基とを有し、界面活性化能を有する化合物を意味し、本発明の文脈においては、その界面活性化能により、細胞の脂質二重膜に損傷を与えることのできる化合物を意味する。本発明においては、細胞膜傷害性以外の生理活性を実質的に有さないか、少ない界面活性剤が好ましい（特に本発明の各工程に直接与える影響の少ないものが好ましい）。本発明には弱い界面活性剤（特に、すぐに細胞が死滅しない程度の弱い界面活性剤）が特に適し、適する界面活性剤の例としては、これに限定されるものではないが、両親媒性界面活性剤、例えばサポニン、及び非イオン性界面活性剤、例えばジギトニンなどが挙げられる。
【００２５】
「膜孔形成毒素」（ＰＦＴ）とは、細胞に孔を開けて損傷を与える毒素（主にタンパク質）を意味する。膜孔形成毒素は、一般に、細胞膜上の標的分子に結合すると集合して膜に孔を形成し、細胞膜に障害を与える。膜孔形成毒素には、細菌性の毒素が多く含まれる。本発明においては、細胞膜傷害性以外の生理活性を実質的に有さないか、少ない膜孔形成毒素が好ましい（特に本発明の各工程に直接与える影響の少ないものが好ましい）。膜孔形成毒素の例としては、これに限定されるものではないが、（レンサ球菌の）ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、炭疽菌毒素、（黄色ブドウ球菌の）アルファヘモリジン、アエロリシン、α毒素、β毒素、Ｃｒｙ５Ｂ、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ニューモリシン（ＰＬＹ）、パーフリンゴリシン（ＰＬＹ）、ジフテリア毒素、及びコレラ菌シトリシン（Ｖｃｃ）などが含まれる。
【００２６】
〔実施形態〕
以下、本発明を実施するための形態を用いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
これらの態様は、単独でも、複数を組み合わせてもよい。また、各態様の定義や詳細については、前述の「用語の説明」も参照できる。
本明細書で用いられる公知の技術及び手順は、当業者には十分に理解されるものであり、常法に従い実施することができる。
【００２７】
本発明のある態様は、ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするための方法であって、ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞を被験化合物と接触させる工程と、前記細胞を界面活性剤又は膜孔形成毒素と接触させる工程と、前記工程後の細胞の細胞死又は細胞生存を検出する工程とを含む方法である。この方法では、細胞死の減少及び／又は細胞生存の増加を上記治療薬の指標として用いることができる。
【００２８】
本発明のある別の態様は、ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞、界面活性剤、及び／又は膜孔形成毒素を含む、ジスフェルリン異常症の治療薬をスクリーニングするためのキットである。このキットは、好ましくは、上記態様の方法において用いられる。また、このキットは、細胞死及び／又は細胞生存を検出するための薬剤（手段）を更に含んでいてもよく、別個に市販される薬剤（手段）と組み合わせて用いられてもよい。
【００２９】
難治性希少疾患である筋ジストロフィーの治療法の開発は、患者数が少ないため遅れており、患者のＱＯＬ向上のため解決すべき課題の一つである。ジスフェルリン異常症は筋ジストロフィーの１種であり、現在までに治療法は確立されていない。本発明は、ジスフェルリン異常症が呈する分子病態を基盤としたより簡易な薬剤スクリーニング系を提供することにより、ジスフェルリン異常症の治療薬開発に寄与する。本発明に係る治療薬は、筋壊死や筋萎縮などの治療に有用である。
【００３０】
ジスフェルリン異常症は骨格筋細胞膜の修復不全を特徴としており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの病態（細胞膜の修復異常）再現は、筋線維や筋管細胞を共焦点顕微鏡下でレーザーあるいはマイクロキャピラリにより細胞膜を損傷することにより行われてきた。すなわち、ジスフェルリン異常症の病態再現にはレーザーアッセイ系が不可欠と考えられていた。この手法には熟練した技術が必要であり、顕微鏡下で細胞１つずつを処理するものであるため、ドラッグスクリーニングへの応用は困難であった。実際にジスフェルリン異常症治療薬のドラッグスクリーニング系や治療薬は現在までに報告されていない。
【００３１】
そこで、本発明者らは、実際に応用可能なスクリーニング系の構築を検討し、本発明に至った。本発明では、界面活性剤あるいは膜孔形成毒素を利用することで、簡便に（簡便な操作で）、一度に大量（例えば３８４プレート上にまいた細胞等）の細胞に均一に細胞膜損傷を加えることに成功した。これにより初めてジスフェルリン異常症の治療薬を、産業上実用可能な形でスクリーニングすることが可能となった。従来、界面活性剤又は膜孔形成毒素は、細胞膜の微細な形態変化の研究に用いられているのみであり、ドラッグスクリーニングへの応用は報告されていない。
【００３２】
上記態様のスクリーニング方法について、典型的には、以下の手順が行われる：哺乳動物細胞をプレート（例えば３８４穴プレート）に播種し、接着後、被験化合物を培地に添加し、一晩（例えば、１６時間）インキュベートする。その後、界面活性剤又は膜孔形成毒素を培地に添加し、一定時間（例えば、３７度において１〜２時間）インキュベートし、細胞膜に損傷を与える。細胞の生存率又は死亡率等を算出し、細胞死を軽減する薬剤を選択する。
【００３３】
ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞を調製する方法としては、生物学活性の減弱した細胞を調製するために用いることのできる方法ならば、限定されず任意のものを用いるがことができるが、典型的には、以下の方法が挙げられる（なお、ジスフェルリンはユビキタスに発現しており、多くの組織由来の哺乳動物細胞が本発明に用いられ得る）。
【００３４】
（１）モデル動物又は患者由来の細胞
（疾患）モデル動物（例えば、ＳＪＬマウス；以下同じ）やジスフェルリン異常症を発症した（発症するであろう）患者（特に、皮膚、骨格筋、心筋）から採取した細胞、又はその初代培養細胞もしくは継代培養細胞（細胞細胞）を、ジスフェルリン活性の減弱した細胞として用いることができる。
【００３５】
（２）モデル動物又は患者由来の細胞の分化
特定の種類の細胞を用いる場合、（疾患）モデル動物やジスフェルリン異常症を発症した（発症するであろう）患者から、特定の種類の細胞（例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、筋管細胞）への分化能を有する細胞（例えば、ＥＳ細胞、受精卵、間葉系幹細胞等）を採取・調製し、常法に従い、特定の種類の細胞へと分化させたものを、ジスフェルリン活性の減弱した細胞として用いることができる。あるいは、ｉＰＳ細胞技術等の技術を用いて、（疾患）モデル動物やジスフェルリン異常症を発症した（発症するであろう）患者から採取した細胞に、特定の種類の細胞への分化能を付与し、その後、特定の種類の細胞へと分化させて、ジスフェルリン活性の減弱した細胞として用いることもできる。
【００３６】
（３）モデル動物又は患者で同定された変異の導入
（疾患）モデル動物又は患者において同定された遺伝子変異（特にジスフェルリン遺伝子の変異）、もしくは、他のジスフェルリン活性が減弱する遺伝子変異を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術等のゲノム編集技術等を用いて細胞に導入し、上記（１）又は（２）のように細胞を調製し、ジスフェルリン活性の減弱した細胞として用いることができる。
【００３７】
（４）ジスフェルリンの発現量（発現レベル）の低下
ｓｉＲＮＡ技術又はアンチセンス技術等の発現量低下技術により、ジスフェルリンの発現量を低下させた細胞を、ジスフェルリン活性の減弱した細胞として用いることができる。
【００３８】
（疾患）モデル動物としては、これに限定されるものではないが、以下の動物を好適に用いることができる：
ＳＪＬマウス（チャールスリバー社；スプライシング異常により、ジスフェルリン遺伝子にエキソン４５における１７１塩基（アミノ酸１６２８?１６８５残基）の欠損がある）、Ａ／Ｊマウス（米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより市販、１９８０年頃、自然発生した変異体で、イントロン４にレトロトランスポゾンの挿入があり、ｄｙｓｆｅｒｌｉｎタンパク質は欠損している。なお、日本クレアでもＡ／Ｊマウスを市販しているが、同社のマウスは１９８０年以前に東京大学医科学研究所がＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから分与を受けたものを繁殖させたものであり、ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ遺伝子に変異はない。したがって日本クレア社のＡ／Ｊマウスは使用できない）、ジスフェルリンノックアウトマウス（米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。その他のマウスモデルについては、http://www.jain-foundation.org/scientific-resources/research-tools/mouse-models-dysferlin-deficiency 等を参照することができる。
【００３９】
また、日本人患者ではＷ９９９Ｃミスセンス変異が比較的高頻度に見られる。患者におけるその他の変異については、例えば、参照により本明細書に援用されるhttp://www.umd.be/DYSF/W_DYSF/images/RecurrentMutations.pdfを参照することができる。なお、患者由来細胞（例えば、患者皮膚由来線維芽細胞）でも、ジスフェルリン活性の減弱が見られることは、本発明者らが確認済みである（実施例、及び参照により本明細書に援用されるDysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. Matsuda C, Kiyosue K, Nishino I, Goto Y, Hayashi YK 2015 Oct 29;7.）。
【００４０】
当然ながら、ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞は上記に限定されるものではなく、例えば、ランダムスクリーニングの結果同定されたジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞等であっても、本発明に使用することができる。
【００４１】
なお、これらの細胞におけるジスフェルリン活性については、何れかの活性を対象とし、常法に従って測定することができる。典型的には、細胞膜損傷時の細胞死抑制活性又はモデル動物もしくは患者におけるジスフェルリン異常症発症阻止活性や、細胞膜修復活性を常法により測定することができる。ジスフェルリン活性測定は、例えば、実施例や後述する「ヒット薬の検証実験系」を参考に、測定することもできる。
【００４２】
被験化合物の効果及び有効性は、様々な条件で検討することができ、そのような条件としては、被験化合物で処理する時間又は期間、被験化合物の量の多少、処理回数などが挙げられる。例えば、被験化合物の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定してもよい。被験化合物の処理期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間の期間にわたって処理を行うこともできる。さらに、複数の化合物の相加作用、相乗作用などを検討する場合などには、複数の被験化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
ここで、細胞を被験化合物と接触させる工程と、細胞界面活性剤又は膜孔形成毒素と接触させる工程の前後は、特に特定されないが、細胞死を防止するという効果を十分に発揮させる観点からは、細胞を被験化合物と接触させる工程が先に行われる方が好ましい。
【００４４】
細胞死又は細胞生存の検出は、死細胞数や生細胞数（又は生存率）を直接又は間接に測定してもよいが、細胞増殖（率）を測定してもよく、あるいは、細胞増殖や細胞死のマーカー（量）などを測定してもよい。このような細胞死又は細胞生存の検出（細胞増殖の検出を含む）は、当技術分野で多くの方法が知られており、それら既知の方法により適切に行うことができる。検出工程は、例えば、接触／損傷の直後、３０分後、１時間後、３時間後、５時間後、１０時間後、１５時間後、２０時間後、２４時間（１日）後、２〜１０日後、１０〜２０日後、２０〜３０日後、１ヶ月〜６ヵ月後に行うことができる。
【００４５】
ある被験化合物について、細胞死の減少及び／又は細胞生存の増加が観察されるとき、その被験化合物が治療剤（の候補）として同定されることになる。指標とする細胞死又は細胞生存としては、上記したものの他に、全細胞数に対する生細胞数の比である生存率や、何れかの細胞生存の指標と細胞死の指標との比など、（本発明の目的に反しない範囲で）何らかの数学的処理を行った値を用いてもよく、特定の実施態様に限定されるものではない。
【００４６】
本発明の好ましい態様は、ジスフェルリン活性の減弱が、ジスフェルリン発現レベルの低下及び／又はジスフェルリン遺伝子の変異の結果生じたものである、上記何れかの態様の方法又はキットである。この態様において、ジスフェルリン遺伝子の変異には、ミスセンス変異、ナンセンス変異、又はスプライシング異常が含まれる。例えば、ＳＪＬマウス（チャールスリバー社）では、スプライシング異常により、ジスフェルリン遺伝子にエキソン４５における１７１塩基（アミノ酸１６２８〜１６８５残基）の欠損があることが知られている（非特許文献７；野生型マウスジスフェルリンのｍＲＮＡ、アミノ酸配列；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１０７７６９４．２；ＳＪＬマウスジスフェルリンのｍＲＮＡ、アミノ酸配列：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ１８８２９０；ＳＪＬマウスの遺伝情報；Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；Ｊ：５７７６４）。上記欠損により、ＳＪＬマウスでは、ジスフェルリンタンパク質の発現レベルが低下している。
【００４７】
また、日本人患者ではＷ９９９Ｃミスセンス変異が比較的高頻度に見られる。更なるジスフェルリン遺伝子の変異については、例えば、ジスフェルリン異常症患者の変異のデータベース、例えば、 http://www.umd.be/DYSF/W_DYSF/images/RecurrentMutations.pdfを参照することができる。上記データベースでは、ジスフェルリン異常症患者において、変異のホットスポットは存在せず、遺伝子全域に変異が分布している。
【００４８】
本発明の好ましい態様は、哺乳動物細胞が、線維芽細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞である、上記何れかの態様の方法又はキットである。スクリーニングでプレートの洗浄操作を行う際には、ある程度接着性の強い培養細胞が有利であるが、これらの細胞はこの条件を満たし、かつジスフェルリンも十分に発現している。
【００４９】
線維芽細胞は、（１）増殖が早い、（２）接着性が強く、培養用ディッシュのコーティングが不要である、（３）コンフルエントに達しても分化することがない、等の理由から、培養がより簡便であるため、これを用いた本発明は、簡便かつ効率的なスクリーニングを可能とする。
【００５０】
筋芽細胞又は筋管細胞は、発現しているタンパク質が骨格筋と類似しているため、筋ジストロフィーの病態再現という点において、より生体に近い。また、ジスフェルリンの発現量も高い（骨格筋や心筋では細胞膜が運動や呼吸により絶え間なく損傷を受けているため、常に細胞膜修復が必要であるためと考えられている）。
【００５１】
本発明における線維芽細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞としては、「用語の説明」にて述べたように、様々な細胞を用いることができ、それらは公知の方法で調製することができるが、生体内から採取された皮膚由来の線維芽細胞及び骨格筋由来の筋芽細胞の調製の一例を以下に記す。
【００５２】
〔線維芽細胞の調製例〕
皮膚を細切し、５０ｍｌ円錐底チューブに移した後、１ｇあたり４ｍｌのＤｉｓｐａｓｅ２（２．４ＩＵ／ｍｌ）−ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＸＩ（０．２％）溶液を加え、３７℃、４５〜６０分間インキュベートし、途中１５分ごとにピペットを用いてピペッティングする。上清を８０μｍのフィルターに通して細胞塊を除き、細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐底チューブに移し、さらにＤｉｓｐａｓｅ２（２．４ＩＵ／ｍｌ）−ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＸＩ（０．２％）処理後のチューブに増殖培地を加え、その上清を同様にフィルターに通して回収する。増殖培地を加え、合計３０ｍｌとし、数回ピペッティングを行い、１，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心する。上清を捨て沈殿細胞に増殖培地２０ｍｌを加え、再度懸濁した後、１，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心する。沈殿細胞を増殖培地２５ｍｌに懸濁し、コーティングなしの１５ｃｍ培養皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度で９０分間培養後、未付着細胞を含む上清を回収する。この上清を用いて培養皿の底面を洗い、１８０度向きを変えてもう一度３７℃、５％ＣＯ２濃度で９０分間培養し、上清を回収する。回収した上清をコーティングなし培養皿に移し、３７℃、５％ＣＯ２濃度で一晩培養する。翌日コンフルエント以上になっているようなら継代を行い、それ以下なら培地交換に留める。
【００５３】
〔筋芽細胞の調製例〕
生体から採取した骨格筋を細切し、５０ｍｌ円錐底チューブに移した後、Ｄｉｓｐａｓｅ２（２．４ＩＵ／ｍｌ）−ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ（０．１％）溶液を加え、３７℃、６０分間震盪しながらインキュベートする。上清を５０μｍのフィルターに通して細胞塊を除き、コートしていない培養皿に播種する。５％ＣＯ２濃度で３０分間培養し、上清を回収することにより線維芽細胞を除き、筋芽細胞を効率よく培養することが可能になる。回収した筋芽細胞は３７℃、５％ＣＯ２濃度において１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養する。
【００５４】
〔筋芽細胞から筋管細胞への分化例〕
筋芽細胞をコラーゲンＩあるいはゼラチンでコートした培養皿に播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養する。コンフルエントに達したら、分化用培地（２％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地）に切り替え、１週間程度培養を継続すると筋管細胞が形成される。
【００５５】
上記何れかの態様の方法又はキットにおいて、界面活性剤には、これに限定されるものではないが、両親媒性界面活性剤、例えばサポニン、及び非イオン性界面活性剤、例えばジギトニンが含まれる。代表的な界面活性剤はサポニンである。上記態様の方法又はキットにおいて、膜孔形成毒には、これに限定されるものではないが、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、炭疽菌毒素、アルファヘモリジン、アエロリシン、α毒素、β毒素、Ｃｒｙ５Ｂ、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ニューモリシン（ＰＬＹ）、パーフリンゴリシン（ＰＬＹ）、ジフテリア毒素、及びコレラ菌シトリシン（Ｖｃｃ）が含まれる。代表的な膜孔形成毒はストレプトリジンＯである。これらの代表的な薬剤を用いた場合、より確実かつ簡便に本発明のスクリーニング方法を実施することができる。また、サポニン、ストレプトリジンＯ共に溶血作用を有し、すなわち、溶血作用を持つ界面活性剤もしくは膜孔形成毒素又は他の物質は、本発明に好適に用いることができる。
【００５６】
界面活性剤又は膜孔形成毒の添加量は、スクリーニングの他の工程を妨害しないとともに、すぐに細胞が死滅せず、弱く作用する程度の添加量が好ましい。具体的な添加量は、種々の実験条件を考慮の上、本明細書及び当該技術分野の通常の知識に基づき、当業者が適宜設定することができるが、特に効果的な添加量の一例として、界面活性剤：０．０００１〜０．０１％、より好ましくは０．０００５〜０．００５％、特に０．０００５〜０．００２％；膜孔形成毒：１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０〜５００ｍｇ、更に好ましくは５０〜５００ｍｇ、特に１００〜２００ｍｇ／ｍＬを用いることができる。
【００５７】
本発明の好ましい他の態様は、細胞死又は細胞生存を検出する工程が、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性（死細胞の検出）、ミトコンドリア脱水素酵素活性（生細胞の検出；各種ＷＳＴ試薬）、アルカリもしくは酸性ホスファターゼ活性又はエステラーゼ活性の測定、細胞質染色、核染色（例えば、臭化ヨード（死細胞の核検出））、あるいは［３Ｈ］−チミジン取り込みもしくは５１Ｃｒ放出アッセイを含む、上記何れかの態様の方法である。また、本発明の好ましい他の態様は、細胞死又は細胞生存を検出するための薬剤（手段）が、乳酸脱水素酵素活性、ミトコンドリア脱水素酵素活性、アルカリもしくは酸性ホスファターゼ活性又はエステラーゼ活性の測定薬剤（測定キット）、細胞質染色剤、核染色剤、あるいは［３Ｈ］−チミジンもしくは５１Ｃｒを含む、上記何れかの態様のキットである。これらの検出手段は当該技術分野でよく知られており、広く用いられているため、より確実かつ簡便に本発明を実施することができる。
【００５８】
細胞死又は細胞生存の検出手段は、被験化合物により直接影響（阻害・促進）されないものが好ましい。被験化合物が細胞死又は細胞生存の検出手段に直接影響する可能性を考慮し、二種類以上の検出手段を併用することが好ましい。例えば、ＬＤＨを阻害する被験化合物については、ＬＤＨアッセイとＷＳＴアッセイとを組み合わせて行う、等が考えられる。他の観点から複数の手段を組み合わせてもよく、例えば、ヘキスト（全細胞の核検出；ヘキスト３３３４２）染色と臭化ヨード染色とを組み合わせて生存率を測定してもよい。
【００５９】
本発明の好ましい他の態様は、ジスフェルリン異常症が、三好型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）、又は遠位型前脛骨筋ミオパチー（ＤＭＡＴ）、近位筋優位ジスフェルリノパチーである、上記何れかの態様の方法又はキットである。本発明の特性からこれらの疾患に限定されることはなく、本願出願時点で未知の疾患／異常も含め、ジスフェルリンの異常に起因する任意の疾患（または、細胞膜の修復異常を呈する疾患）の治療薬のスクリーニングに用いることができる。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法等によりスクリーニングが行われた後、更に細胞系あるいは実験動物、あるいはヒト（臨床試験）において、確認実験、検証実験、あるいは有効性の評価が行われてもよい。例えば、上記何れかの態様のスクリーニング方法を一次スクリーニングとして、当該一次スクリーニングで選択された被験化合物を、実験動物に投与し、被験物質が実験動物における筋細胞死を緩解・軽減するか否かを判定する二次スクリーニングを行っても良い。実験動物としては、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＪＬマウス、Ａ／Ｊマウス（米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ジスフェルリンノックアウトマウス（米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いることができるが、これに限定されるものではなく、細胞膜修復機構に欠陥をもつ、又はジスフェルリン異常症のモデルとなる動物であれば何でも利用することが可能である（例えば、マウスモデルについては、http://www.jain-foundation.org/scientific-resources/research-tools/mouse-models-dysferlin-deficiency （参照によりここに援用される）等を参照することができる）。個体又は細胞系においてジスフェルリン異常症に対して評価する方法は、既知のいずれのものを用いることができる。
【００６１】
これに限定されるものではないが、例えば、以下のようにして、ヒット薬の検証実験を行うことができる：
ジスフェルリン活性の減弱した細胞（好ましくは、線維芽細胞又は筋芽細胞）を培養用ディッシュに播種し、ヒット薬剤を添加後、一晩培養する。筋芽細胞は分化培地中で１週間程度培養し、筋管細胞に分化後の使用も可能である。培地を除き、１Ｍ  ＦＭ１−４３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液を添加し、ＵＶレーザー（オリンパス）または２光子レーザーによる細胞膜損傷実験を行うことにより、ヒット薬の効果を検証する。レーザーによる細胞膜損傷実験は、当技術分野で公知の方法であり、細胞膜が修復されると蛍光色素であるＦＭ１−４３は細胞膜に留まるが、細胞膜の修復不全の場合は細胞内にＦＭ１−４３が流入するため、流入した蛍光色素を定量することにより、細胞膜修復を定量化することが可能である。
【００６２】
なお、上記態様により説明される各方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００６３】
さらに、上記実施の形態では、創薬のためのスクリーニングを念頭において説明したが、本発明をこのような目的に限定する趣旨ではない。本発明は、薬剤のスクリーニング以外にも、ジスフェルリン活性の減弱した哺乳動物細胞（例えば、ＳＪＬマウスの胎児皮膚より単離した細胞）を、細胞膜修復異常モデル細胞又はジスフェルリン異常症モデル細胞として利用する方法などの幅広い用途が想定されるものであり、それらの用途を排除することを意図するものではない。更に、本発明には、上記スクリーニング工程を含む医薬の製造方法（ヒット化合物を調製（合成）する工程を更に含んでもよい）も含まれる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により、本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明もしくは定法に従い使用した。
【００６５】
〔初代培養線維芽細胞〕
ＩＲＢの許可に基づき、ＮＣＮＰ ＢｉｏＢａｎｋから３つのヒト初代培養線維芽細胞を得た。コントロールの線維芽細胞は、ジスフェルリンに変異を有さない。患者由来の２つの線維芽細胞のジスフェルリン変異は、以下の表１に要約される。
【００６６】
【表１】
2017192339.tif 000002
【００６７】
マウス線維芽細胞の単離について、ＳＪＬ／Ｊ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１０代以上交配させて得られた、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの背景を持つＳＪＬマウス（ＳＪＬ／Ｂ６）を用いた。ＳＪＬ／６Ｊマウスのジェノタイピングは、Nat Genet. 1999 Oct;23(2):141-2（参照により本明細書に援用される）に記載されるように行った。ＳＪＬ／６Ｊ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の皮膚を、細かく切り刻み、その後、０．４％ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する０．２５％トリプシン（Ｓｉｇｍａ）中でトリプシン処理した。トリプシン処理された皮膚は、遠心分離により沈降させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。線維芽細胞は全て、加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３代までのマウス線維細胞（急速に増殖する）を実験に用いた。
【００６８】
〔膜修復アッセイ〕
ヒト及びマウス線維芽細胞を、ガラス底ディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ）にまいた。レーザー損傷の前に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＴｙｒｏｄｅ液で細胞をリンスし、その後、２．５ｍＭのＦＭ１−４３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する同様の溶液中でインキュベートした。線維芽細胞は、レーザー共焦点顕微鏡ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ１０００ＭＰＥ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、２０秒間、１００％最大出力（４０５−ｎｍ  ＵＶレーザー）で、細胞膜の１０ｍｍ（ヒト）又は６ｍｍ（マウス）直径の円形領域を照射することにより、損傷させた。画像は、５秒間隔でキャプチャーした。開口崩壊部を介したＦＭ１−４３の流入の程度と動力学に基づいたリシール解析を、Nature. 2003 May 8;423(6936):168-72に記載されるようにして行った。
【００６９】
〔膜修復実験の結果〕
線維芽細胞の膜修復能を調べるために、ＵＶレーザーを用いた膜修復アッセイを行った。正常ヒト及びマウス線維芽細胞は、ＵＶレーザー照射の後に、ＦＭ１−４３の限局された蓄積を示した（図４及び５）。これは完全な膜修復を示す。対照的に、患者及びＳＪＬ／６Ｊマウス由来の線維芽細胞は、細胞へのＦＭ１−４３の継続的な流入を示した（図４及び５）。これは減弱した膜修復を示す。これらの結果は、ジスフェルリン遺伝子における変異が、（筋線維で観察される現象と同様に）線維芽細胞における不完全な膜修復につながることを示す。
【００７０】
〔スクリーニング系１〕
ＳＪＬマウス線維芽細胞を３８４プレートに播種し、接着後、既存薬ライブラリーの薬剤（１μＭ）を添加し、一晩インキュベートする。細胞膜を損傷するためにサポニン（０．００１％）又はＳＬＯ（１００−２００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で一定時間（サポニン：１時間、ＳＬＯ：２時間）インキュベートした後、培養上清の一部を回収する。培養上清には死細胞から漏出したＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）が含まれており、市販のＬＤＨアッセイキット（和光純薬工業）を用いて細胞死を定量化する。また、残った培養上清にＷＳＴ−８試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、同仁化学研究所）を添加し、生細胞を定量する。スクリーニングでは細胞死を軽減し、生細胞を増加させる薬剤を選択する。ヒット基準の一例は、ＬＤＨ＜３０％、かつＷＳＴ８＞７０％。
【００７１】
〔スクリーニング系２〕
ＳＪＬマウス線維芽細胞を３８４プレートに播種し、接着後、既存薬ライブラリーの薬剤（１μＭ）を添加し、一晩インキュベートする。細胞膜を損傷するためにサポニン（０．００１％）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。この際、死細胞の核を検出するＰＩ（臭化ヨード）と全ての細胞核を染色するヘキスト３３３４２を加える。細胞イメージング装置（Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ；パーキンエルマー社）を用いて核の染色像を解析し、ＰＩ陽性細胞数とヘキスト３３３４２陽性細胞数の比より細胞の生存率を決定する。スクリーニングでは細胞死を軽減する薬剤を選択する。
【００７２】
〔既存薬ライブラリーを用いたスクリーニングの結果〕
上記スクリーニング系１及び２を用い、既存薬ライブラリー（約５０００化合物）のスクリーニングを行った結果、複数のヒット薬を得た。スクリーニング過程における結果を図１〜３に示し、ヒット薬の一部を下記の表１に示す。ヒット薬（Ｎｏ．５）カルベノキソロンナトリウムは甘草成分である。ヒット薬（Ｎｏ．８）ＰＭＰＡはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）の強力かつ選択的な阻害剤としても知られる。ヒット薬（Ｎｏ．９）ＯＭＤＭ−２はアナンタミドの細胞内取り込み阻害剤としても知られる。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
なお、本明細書に引用された特許、特許出願、及び出版物の開示内容は全て、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2017192339.tif 000008
【配列表】
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