(57)【要約】【課題】メタノール等からイソ酪酸を生産することができる一連の技術を提供する。【解決手段】メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能な組換え細胞であって、外来遺伝子として、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子、からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、イソ酪酸を生産可能である組換え細胞が提供される。外来遺伝子として、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子をさらに有する態様が好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能な組換え細胞であって、
外来遺伝子として、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子、からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有し、
当該遺伝子が発現し、イソ酪酸を生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
前記外来遺伝子として、少なくとも前記（iii）で定義された遺伝子を有する、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
前記（iii）で定義された酵素が、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ、及びスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はその機能的断片である、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
前記（iii）で定義された酵素が、下記（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、（ｃ−３）のいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
外来遺伝子として、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項６】
前記第２の酵素が、２―ケト酸デカルボキシラーゼ又はその機能的断片である、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記第２の酵素が、下記（ｄ−１）、（ｄ−２）、（ｄ−３）のいずれかである、請求項５又は６に記載の組換え細胞。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項９】
真核細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１０】
Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである、請求項９に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
細菌である、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１２】
Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、又はMethyloversatilis属に属するものである、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記外来遺伝子として、少なくとも前記（i）で定義された遺伝子を有する、請求項２〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１４】
真核細胞である、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Aspergillus属、Yarrowia属、Trichoderma属Fusarium属、又はMucor属に属するものである、請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
細菌である、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１７】
Escherichia属、Pantoea属、Enterobacter属、Bacillus属、Listeria属、又はCorynebacterium属に属するものである、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
アーキアである、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
前記外来遺伝子として、少なくとも前記（ii）で定義された遺伝子を有する、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
前記（i）で定義された遺伝子が、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、
前記（ii）で定義された遺伝子が、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である、請求項１〜１９に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソ酪酸を生産させる、イソ酪酸の生産方法。
【請求項２２】
前記組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からイソ酪酸を取得する、請求項２１に記載のイソ酪酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノール等からイソ酪酸を生産可能な組換え細胞、並びに、当該組換え細胞を用いるイソ酪酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソ酪酸は汎用透明樹脂のモノマーであるメタクリル酸、メタクリル酸メチルの前駆体として期待されている他、乳化剤、潤滑剤として使用されている。しかしながら、その製造法は石油化学に依存するため、持続的な供給は保証されず、また現在のプロセスでは高価かつ、供給能力は限定的であることから、上記のような汎用ポリマーの前駆体としては実用化されていない。
【０００３】
イソ酪酸の生合成経路の例を図１に示す。イソ酪酸はピルビン酸を出発物質として生合成が可能である。詳細には、ピルビン酸を基質として、アセト乳酸合成酵素（acetolactate synthase; AlsS）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ketol-acid reductoisomerase; IlvC）、及びジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase; IlvD）の作用で、２−ケトイソ吉草酸（ケトバリン）が合成される。次に、２―ケト酸デカルボキシラーゼ（2-keto acid decarboxylase; KivD）の作用によって、２−ケトイソ吉草酸がイソブチルアルデヒドに変換される。そして、イソ酪酸合成酵素、具体的には、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（phenylacetaldehyde dehydrogenase; FeaB）、アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ（aldehyde dehydrogenase B; AldB）、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（succinate semialdehyde dehydrogenase; AldH）の作用によって、イソブチルアルデヒドがイソ酪酸に変換される。
【０００４】
また、植物資源等の再生可能資源からの化学品生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。イソ酪酸に関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１）。しかしながら、大腸菌のような従属栄養生物による物質生産は、増殖に必要な炭素源を糖類等の可溶性有機物に依存しており、これらを安価に大量に確保することは困難であり、生産量は限定的となる。また、このような可溶性有機原料を利用する物質生産は、食との競合も懸念される。
【０００５】
一方、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物から得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から金属触媒反応によって安価に製造される。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから、次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。さらにメタノールを発酵原料として利用する場合は、蒸留等によって高度に精製される必要はなく、水、硫黄分が含まれていても問題ない。
【０００６】
メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。
【０００７】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。図２に示されるように、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
【０００８】
また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
【０００９】
上記メチロトローフの化学品生産プロセスへの応用例としては、メタノールからのＳＣＰ（single cell protein）、生分解性プラスチック、アミノ酸等の生産技術が挙げられる。しかし、イソ酪酸等の、石油に由来する基幹化学品の製造に応用された例は見当たらない。前述のとおり、汎用高分子材料製品に利用されるモノマー化合物は現在全て石油に依存しているが、現在と同質の石油が永久に安価に供給される可能性は極めて低く、新たな効率的な代替プロセスの開発が急務である。なお、微生物による化学品生産のための炭素源を確保する目的で、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニン等を含むハードバイオマスを糖化する技術も検討されているが、糖化のための酵素処理等が必要であり、コスト面で大きな問題がある。
【００１０】
なお、特許文献２には、組換え体によるメタノール等からイソプレンを生産する技術が開示されている。特許文献３には、組換え体によるメタノール等から１，４−ブタンジオールを生産する技術が開示されている。しかし、イソ酪酸についての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１４−５０６４６６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１０４２０２号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１１２６２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、メタノール等からイソ酪酸を生産するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの様相は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能な組換え細胞であって、外来遺伝子として、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子、からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、イソ酪酸を生産可能である組換え細胞である。
【００１４】
図１に示すように、イソ酪酸は、ピルビン酸からイソブチルアルデヒドを経由して生合成可能である。そして本様相の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能であり、外来遺伝子として、上記（i）〜（iii）で定義された少なくとも１つの遺伝子を有している。そのため本様相の組換え細胞では、宿主細胞に対して、上記（i）〜（iii）で定義された少なくとも１つの機能が付与又は増強されている。本様相の組換え細胞によれば、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎として、メタノール等の炭素源から合成されたイソブチルアルデヒドを、「イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素」の作用によってイソ酪酸に変換することができる。
【００１５】
好ましくは、前記外来遺伝子として、少なくとも前記（iii）で定義された遺伝子を有する。
【００１６】
本様相の組換え細胞は、例えば、メチロトローフである宿主細胞に、（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子、を導入することにより得ることができる。
【００１７】
好ましくは、前記（iii）で定義された酵素が、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ、及びスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はその機能的断片である。
【００１８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼの「機能的断片」とは、アルデヒドデヒドロゲナーゼの部分配列を有するポリペプチドであって、アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を有するものを指す。
【００１９】
好ましくは、前記（iii）で定義された酵素が、下記（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ｂ−１）、（ｂ−２）、（ｂ−３）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、（ｃ−３）のいずれかである。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００２０】
好ましくは、外来遺伝子として、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が発現する。
【００２１】
本様相の組換え細胞は、外来遺伝子として、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子を有している。かかる構成により、イソ酪酸の前駆体であるイソブチルアルデヒドが効率よく供給され、イソ酪酸の合成能が向上する。
【００２２】
好ましくは、前記第２の酵素が、２―ケト酸デカルボキシラーゼ又はその機能的断片である。
【００２３】
２―ケト酸デカルボキシラーゼの「機能的断片」とは、２―ケト酸デカルボキシラーゼの部分配列を有するポリペプチドであって、２―ケト酸デカルボキシラーゼの活性を有するものを指す。
【００２４】
好ましくは、前記第２の酵素が、下記（ｄ−１）、（ｄ−２）、（ｄ−３）のいずれかである。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【００２５】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００２６】
好ましくは、組換え細胞が真核細胞である。
【００２７】
好ましくは、組換え細胞がPichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである。
【００２８】
好ましくは、組換え細胞が細菌である。
【００２９】
好ましくは、組換え細胞がMethylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、又はMethyloversatilis属に属するものである。
【００３０】
好ましくは、前記外来遺伝子として、少なくとも前記（i）で定義された遺伝子を有する。
【００３１】
本様相の組換え細胞は、前記外来遺伝子として少なくとも上記（i）で定義された遺伝子を有するので、宿主細胞に対して、上記（i）で定義された機能が付与又は増強されている。かかる構成により、宿主細胞が非メチロトローフであっても、組換え細胞がメチロトローフとして機能することができる。
本様相の組換え細胞は、例えば、リブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフを宿主細胞として用い、当該宿主細胞に（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子を導入することにより得ることができる。なお、宿主細胞はメトロトローフであってもよい。
【００３２】
好ましくは、組換え細胞が真核細胞である。
【００３３】
好ましくは、組換え細胞がSaccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Aspergillus属、Yarrowia属、Trichoderma属Fusarium属、又はMucor属に属するものである。
【００３４】
好ましくは、組換え細胞が細菌である。
【００３５】
好ましくは、組換え細胞がEscherichia属、Pantoea属、Enterobacter属、Bacillus属、Listeria属、又はCorynebacterium属に属するものである。
【００３６】
好ましくは、組換え細胞がアーキアである。
【００３７】
好ましくは、前記外来遺伝子として、少なくとも前記（ii）で定義された遺伝子を有する。
【００３８】
本様相の組換え細胞は、前記外来遺伝子として少なくとも上記（ii）で定義された遺伝子を有するので、宿主細胞に対して、上記（ii）で定義された機能が付与又は増強されている。かかる構成により、宿主細胞が非メチロトローフであっても、組換え細胞がメチロトローフとして機能することができる。
本様相の組換え細胞は、例えば、非メチロトローフである宿主細胞に、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子を導入することにより、得ることができる。なお、宿主細胞はメトロトローフであってもよい。
【００３９】
好ましくは、前記（i）で定義された遺伝子が、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記（ii）で定義された遺伝子が、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である。
【００４０】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソ酪酸を生産させる、イソ酪酸の生産方法である。
【００４１】
本様相はイソ酪酸の生産方法に係るものである。本様相では、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソ酪酸を生産させる。本様相によれば、メタノール等からイソ酪酸を生産することができる。
【００４２】
好ましくは、前記組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からイソ酪酸を取得する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の組換え細胞によれば、メタノール等からイソ酪酸を生産することができる。
【００４４】
本発明のイソ酪酸の生産方法についても同様であり、メタノール等からイソ酪酸を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ピルビン酸からイソ酪酸に至る代謝経路を表す説明図である。
【図２】ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００４７】
本発明の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能な組換え細胞であって、
外来遺伝子として、
（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、
（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び
（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、イソ酪酸を生産可能なものである。外来遺伝子として上記（i）〜（iii）で定義された遺伝子を有することにより、上記（i）〜（iii）で定義された機能が宿主細胞に対して付与又は増強される。
【００４８】
また別の表現をすれば、本発明の組換え細胞は、メチロトローフとしての機能を備え、かつイソ酪酸を生産可能なものである。
本発明の組換え細胞は、例えば、メチロトローフ又は非メチロトローフである宿主細胞に、上記（i）〜（iii）の少なくとも１つの遺伝子が導入されてなる、上記Ｃ１化合物からイソ酪酸を生産可能な組換え細胞である。
【００４９】
上述したように、メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物を指す。一般にメチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路、具体的には、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能（経路）とホルムアルデヒド固定化能（ホルムアルデヒドの固定化経路）とを、本来的に保有している。
【００５０】
ホルムアルデヒドの固定化経路としては、図１に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、キシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が挙げられる。一般に、メチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路を保有している。
【００５１】
ここで、各々のホルムアルデヒド固定化経路（図２）について説明する。
セリン経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine hydroxymethyltransferase）によるグリシンと５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸からのセリン生成反応である。５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、ホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸の結合によって生じる。セリン経路では、１分子のホルムアルデヒドから１分子のアセチルＣｏＡが直接生成する。
【００５２】
ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」と略記することがある）によるリブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸の生成反応と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下「ＰＨＩ」と略記することがある）によるＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸からのフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）の生成反応である。
本経路で生成するＦ６Ｐ等は解糖系へも供され、その後アセチルＣｏＡや、グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸を生成する。Ｆ６Ｐの場合、１分子あたり、２分子のＧ３Ｐに変換され、次いで２分子のピルビン酸を経て２分子のアセチルＣｏＡが生成する。
【００５３】
ＸｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（dihydroxyacetone synthase）によるキシルロース５リン酸（Ｘｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）の生成反応である。本経路で生成したＧ３Ｐは解糖系にも供され、ピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換される。ジヒドロキシアセトンもリン酸化によって解糖系へ供され、Ｇ３Ｐ、ピルビン酸、及びアセチルＣｏＡへと変換され得る。
【００５４】
本発明の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能である。
例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼを有する組換え細胞の場合には、メタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００５５】
また、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼに加えてメタンモノオキシゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、メタンをメタノールに変換し、続いてメタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００５６】
さらに、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００５７】
一般に、細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼを有しているので、メタン又はメタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、アルコールオキシダーゼを有しているので、メタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、メチロトローフはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有しており、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００５８】
上記メタノールデヒドロゲナーゼには、グラム陰性細菌のメチロトローフに見出されるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ: pyrroloquinoline quinone）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＮＡＤ（Ｐ）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＤＭＮＡ（N,N'-dimethyl-4-nitrosoaniline）依存型メタノールオキシドリダクターゼ（Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471）が含まれ、酵母でのメタノールからホルムアルデヒドへの変換は、通常、酸素依存型であるアルコールオキシダーゼによって触媒される。
【００５９】
また、アミンオキシダーゼ（amine oxidase）やメチルアミンデヒドロゲナーゼ（methylamine dehydrogenase）を有する組換え細胞の場合には、メチルアミンをホルムアルデヒドに変換することができる。これらの酵素については、一部のメチロトローフやArthrobacter属細菌が有していることが知られている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
またホルムアミドをホルムアルデヒドに変換する酵素が、一部の微生物で見出されている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
【００６０】
そして、ホルムアルデヒドを経由してイソ酪酸を生産することができる。
【００６１】
本発明の組換え細胞における宿主細胞としては、例えば、メチロトローフを用いることができる。一般にメチロトローフは、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を有している。したがって、宿主細胞がメチロトローフの場合には、宿主細胞に、上記（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子を導入すればよい。
【００６２】
宿主細胞として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
【００６３】
メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
【００６４】
メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
【００６５】
宿主細胞として非メチロトローフを用いることもできる。この場合の宿主細胞と導入遺伝子の組み合わせとしては、例えば、以下の態様が挙げられる。本発明はいずれの態様も包含する。
【００６６】
１つの態様では、任意の宿主細胞に、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子を導入する。
別の態様では、「ホルムアルデヒド固定化能」を有する宿主細胞に、上記（i）で定義された遺伝子と上記（iii）で定義された遺伝子を導入する。
また別の態様では、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を有する宿主細胞に、上記（ii）で定義された遺伝子と上記（iii）で定義された遺伝子を導入する。
また別の態様では、「イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素」を有する宿主細胞に、上記（i）で定義された遺伝子と上記（ii）で定義された遺伝子を導入する。
【００６７】
各態様について詳述すると、宿主細胞が非メチロトローフである場合には、メタノール等をホルムアルデヒドに変換する経路を有しているとは限らないので、少なくとも「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する必要がある。さらに、「メタンをメタノールに変換する機能」を付与することが好ましい。これらの機能付与は、例えば、上記した酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、実現することができる。
【００６８】
例えば、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
【００６９】
また、メタノール資化性を付与するプラスミドが知られている。例えば、Bacillus methanolicusのメタノール資化性は、メタノール代謝に関わる酵素群をコードするプラスミドに依存している（Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238）。このようなプラスミドを近縁の非メチロトローフに導入することで、メタノール資化能を付与することが可能である。さらには、このようなプラスミドを改変することで、様々な非メチロトローフにメタノール資化性を付与することも可能である。
【００７０】
上記のようにして非メチロトローフに対して「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与し、さらに「ホルムアルデヒドの固定化能」を付与することにより、非メチロトローフをメチロトローフと同様に取り扱うことが可能となる。ホルムアルデヒド固定化能の付与は、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を非メチロトローフに導入することにより、実現することができる。
【００７１】
ホルムアルデヒド固定化能としてＲｕＭＰ経路を付与する場合について、さらに説明する。
ＲｕＭＰ経路の付与は、例えば、上記した３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）遺伝子を導入することにより、実現することができる。すなわち、ＨＰＳ／ＰＨＩによるホルムアルデヒド固定化反応の基質又は生成物である、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）は、ペントースリン酸経路、及びカルビン回路の代謝中間体として全ての生物に普遍的に存在する。したがって、ＨＰＳ／ＰＨＩの導入により、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び酵母等をはじめとする全ての生物にホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能である。
【００７２】
元々ＲｕＭＰ経路を有している宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。これにより、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。例えば、枯草菌のように、元々ＲｕＭＰ経路もしくはこれと同質の経路を有する微生物に、例えばメタノールデヒドロゲナーゼ (例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）等のアルコール脱水素酵素、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）、等の酵素をコードする遺伝子を導入することで、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能（すなわちメタノール資化性）を付与すると共に、ホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。
【００７３】
好ましい実施形態では、外来遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ）をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ）をコードする遺伝子とを有する。
【００７４】
なお、メチロトローフである宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。すなわち、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、あるいはＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへＨＰＳ／ＰＨＩを導入することで、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。その結果、組換え細胞のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性及び資化能を高めることが可能となる。これにより、組換え細胞の培養効率やイソ酪酸の生産効率を向上させることが可能となる。
【００７５】
一方、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
【００７６】
非メチロトローフである宿主細胞の例として、真核細胞では、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Aspergillus属、Yarrowia属、Trichoderma属Fusarium属、又はMucor属に属するものが挙げられる。
細菌では、Escherichia属、Pantoea属、Enterobacter属、Bacillus属、Listeria属、又はCorynebacterium属に属するものが挙げられる。
アーキアでは、Methanosarcina属、Methanococcus属、又はThermococcus属に属するものが挙げられる。
【００７７】
次に、上記（iii）で定義された酵素について説明する。
「イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素」としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。
好ましい実施形態では、前記酵素が、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（phenylacetaldehyde dehydrogenase; 以下「FeaB」と略記することがある）、アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ（aldehyde dehydrogenase B; 以下「AldB」と略記することがある）、及びスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（succinate semialdehyde dehydrogenase; 以下「AldH」と略記することがある）からなる群より選ばれた少なくとも１つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はその機能的断片である。
【００７８】
上記フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FeaB）としては、イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有するものであれば特に限定はない。例としては、大腸菌由来のフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Gene ID: 945933）があり、その他の生物由来ではWP_000138640.1、WP_015964561.1、WP_028017554.1、WP_048284376.1、WP_034495388.1、CEL82223.1等がある。配列番号１に大腸菌由来フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Gene ID: 945933）のアミノ酸配列を示す。フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼはPadAと略記されることもある。
【００７９】
上記アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ（AldB)としては、イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有するものであれば特に限定はない。例としては、大腸菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼＢ（Gene ID: 948104）があり、その他の生物由来ではWP_012135724.1、WP_059357124.1、WP_034499412.1、WP_002440728.1、WP_019844175.1、WP_021013956.1等がある。配列番号２に大腸菌由来アルデヒドデヒドロゲナーゼＢ（Gene ID: 948104）のアミノ酸配列を示す。
【００８０】
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（AldH）としては、イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有するものであれば特に限定はない。例としては、大腸菌由来のスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Gene ID: 947003）があり、その他の生物由来ではWP_039066006.1、WP_012904717.1、WP_045375437.1、WP_032719712.1、WP_034459267.1等がある。配列番号３に大腸菌由来スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Gene ID: 947003）のアミノ酸配列を示す。
【００８１】
上記FeaB（PadA）、AldB、AldHの由来としては特に限定はされないが、原核生物由来のものが好ましい。
【００８２】
さらに、イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素には、以下のタンパク質が含まれる。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
なお、（ａ−３）、（ｂ−３）、（ｃ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００８３】
好ましい実施形態では、外来遺伝子として、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子をさらに有する。例えば、２―ケト酸デカルボキシラーゼ又はその機能的断片をコードする遺伝子をさらに有する。
【００８４】
「２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素」としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。
好ましい実施形態では、前記第２の酵素が２―ケト酸デカルボキシラーゼ（2-keto acid decarboxylase; 以下「KivD」と略記することがある）又はその機能的断片である。
【００８５】
上記２―ケト酸デカルボキシラーゼ（KivD）としては、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有するものであれば特に限定はない。一例として、Lactococcus lactis由来のスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。配列番号４に当該Lactococcus lactis由来２―ケト酸デカルボキシラーゼ（GenBank: ADA65057.1）のアミノ酸配列を示す。
【００８６】
上記KivDの由来としては特に限定はされないが、原核生物由来のものが好ましい。
【００８７】
さらに、２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素には、以下のタンパク質が含まれる。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
なお、（ｄ−３）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００８８】
本発明の組換え細胞においては、上記（i）で定義された遺伝子、上記（ii）で定義された遺伝子、上記（iii）で定義された遺伝子（FeaB、AldB、AldH等）、「２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子」（KivD等）に加えて、さらに他の遺伝子を外来遺伝子として有していてもよい。当該遺伝子の例としては、ピルビン酸から２−イソ吉草酸に至る合成経路に関与する酵素群である、アセト乳酸合成酵素（AlsS）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（IlvC）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（IlvD）、をコードする各遺伝子が挙げられる（図１）。
【００８９】
本発明の組換え細胞は、イソ酪酸合成と競合する代謝系を下方制御されたものでもよい。例えば、図１に示されるように、組換え細胞が、イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換可能なアルコールデヒドロゲナーゼ活性等を有する場合、当該酵素の活性を下方制御することが好ましい。酵素活性の下方制御とは、酵素遺伝子の欠損・変異、転写抑制、翻訳抑制等により、細胞内における当該酵素の活性を転写又は翻訳レベルで減少（消失を含む）させる制御を指す。
【００９０】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００９１】
例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４−２２９６６２号公報）。一般に、宿主細胞による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
【００９２】
メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
【００９３】
Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
【００９４】
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の酵素を融合タンパク質の形で発現させるべく、複数種の遺伝子を連結させた融合遺伝子を導入してもよい。
複数種の遺伝子を導入する例としては、上記（i）〜（iii）で定義された２以上の遺伝子を導入する態様が挙げられる。さらに、これらに加えて「２−ケトイソ吉草酸をイソブチルアルデヒドに変換する作用を有する第２の酵素をコードする遺伝子」を導入する態様が挙げられる。さらに、ピルビン酸から２−イソ吉草酸に至る合成経路に関与する酵素群をコードする遺伝子（AlsS、IlvC、IlvD等）を導入する態様が挙げられる。
【００９５】
以上のようにメチロトローフ等で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
【００９６】
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、さらにイソ酪酸の生産性を向上させることが可能となる。
【００９７】
本発明のイソ酪酸の生産方法では、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソ酪酸を生産させる。
【００９８】
１つの好ましい実施形態では、上記の組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物からイソ酪酸を取得する。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
【００９９】
なお、偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、イソ酪酸生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。微生物の培養法としては、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％（ｖ/ｖ）濃度、酵母の場合は３．０％（ｖ/ｖ）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
【０１００】
培養を行わずにイソ酪酸の生産を行うこともできる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、イソ酪酸を生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、イソ酪酸を連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０１】
生産されたイソ酪酸は、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、細胞外に放出されたイソ酪酸を回収し、単離精製することにより、純化されたイソ酪酸を取得することができる。
【０１０２】
培養液中に多量に存在するイソ酪酸は、そのまま等電点沈殿、イオン交換樹脂吸着等を行うことにより、高純度で回収可能である。イソ酪酸をメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）等の合成前駆体として使用する場合は、さらに電気透析法、イオン交換樹脂法等によって脱塩処理を行うことができる。
【０１０３】
本発明は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を唯一の炭素源として増殖可能な宿主細胞に、（i）メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子、（ii）ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子、及び（iii）イソブチルアルデヒドをイソ酪酸に変換する作用を有する酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を導入し、当該遺伝子が発現してイソ酪酸を生産可能である組換え細胞を製造する組換え細胞の製造方法、を包含する。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１０５】
（１）プラスミド構築
Lactococcus lactis由来の２−ケト酸デカルボキシラーゼKivDの推定アミノ酸配列（配列番号４）、及びEscherichia coli由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼFeaB（PadA）の推定アミノ酸配列（配列番号１）の情報をGenScript社に提供し、メチロトローフ細菌Methylobacterium extorquensのコドン使用頻度に最適化した、２−ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子とアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子との融合遺伝子（配列番号５）を人工合成により作製した。この際、２−ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子上流に制限酵素XbaI認識配列、ターミネーター下流に制限酵素BamHI認識配列を、それぞれ付加した。作製した人工合成遺伝子を含むプラスミドを制限酵素XbaIおよび制限酵素BamHIで消化し、得られたＤＮＡ断片をMethylobacterium用ベクターｐＣＭ８０プラスミド（GenBank: AF327716.1）の制限酵素XbaIおよび制限酵素BamHI部位に連結して、プラスミドpKivD_PadA_Mexを作製した。
【０１０６】
（２）Methylobacterium extorquensによるイソ酪酸生産
野生型メチロトローフ細菌Methylobacterium extorquensを、プラスミドpKivD_PadA_Mexで形質転換した。野生型株および得られた形質転換体（組換え細胞）を、１２５ｍＭのメタノールを唯一の炭素源とする最小塩培地（A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomicrobium spp.（Attwood M M et al. 1972））で培養した。培養液１００ｍＬを３０℃で振とう培養した。培養液のＯＤ６００が２．０の時点で、培養液を遠心し、上清を回収した。０．２２μｍフィルターでろ過した培養上精を、GL-7400（ＧＬサイエンス社）、及びAminex HPX 87Hカラム（Bio-Rad社）を用いた高速液体クロマトグラフィーに供し、イソ酪酸を定量した。移動相として、５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4を流速０．６ｍＬ／分で用いた。カラム温度は３５℃、検出温度は５０℃とした。分析の結果、野生型メチロトローフ細菌Methylobacterium extorquensでは、イソ酪酸はほとんど検出されなかった。一方、形質転換体では、１１３ｍｇ／Ｌのイソ酪酸が検出された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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