(57)【要約】【課題】癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれにコードされるポリペプチドの検出方法、並びにそのためのプライマーセット、及び検出用キットを提供することを課題とする。【解決手段】前記検出方法では、ＤＮＡＪＢ１遺伝子の一部とＰＲＫＡＣＡ遺伝子の一部との融合遺伝子、又はそれにコードされる融合蛋白質を検出する。前記プライマーセットは、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるセンスプライマーと、ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ドナジェーホモログサブファミリーＢメンバー１（ＤＮＡＪＢ１）遺伝子とプロテインキナーゼサイクリックエーエムピーディペンデントキャタリティックアルファ（ＰＲＫＡＣＡ）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＲＫＡＣＡキナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子又は当該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドナジェーホモログサブファミリーＢメンバー１（ＤｎａＪ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ  ｍｅｍｂｅｒ  １；ＤＮＡＪＢ１）遺伝子は、染色体１９番短腕に存在し、コードする蛋白質は、別名Ｈｓｐ４０として知られるヒートショック蛋白であり、アミノ末端側にＪドメインを有する。ＤＮＡＪＢ１は、同様にヒートショック蛋白であるＨｓｃ７０のＡＴＰ加水分解活性制御を通して、そのシャペロンとしての機能を制御する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、２７１巻、ｐ．１９６１７−１９６２４）。癌との関連としては、大腸癌の悪性度とＨｓｐ４０ファミリーの一つであるＤＮＡＪＡ３の発現量が相関することが知られている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００８年、２１巻、ｐ．１９−３１）。
【０００３】
プロテインキナーゼサイクリックエーエムピーディペンデントキャタリティックアルファ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ、ａｌｐｈａ；ＰＲＫＡＣＡ）遺伝子は、ＤＮＡＪＢ１遺伝子と同じ染色体１９番短腕に存在し、コードする蛋白質は、中心部にキナーゼドメインを有するセリンスレオニンキナーゼであり、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）複合体の活性ドメインとして機能する。具体的には、ｃＡＭＰがＰＫＡ複合体の制御サブユニットに結合することで、当該制御サブユニットから遊離したＰＲＫＡＣＡは活性化し、下流の蛋白質をリン酸化し、各種シグナルを伝達する。その一つが転写因子ＣＲＥＢのリン酸化であり、その結果、ＣＲＥＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）との結合を誘導し、標的遺伝子の転写を活性化する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００２年、ｐ．８５６−８５８）。癌との関連としては、高い確率で腫瘍が発生する疾患であるカーニー複合体（Ｃａｒｎｅｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）では、しばしばＰＫＡ複合体の制御サブユニットであるＰＲＫＡＲ１Ａの不活性化変異が発見されること（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０００年、９巻、ｐ．３０３７−３０４６）、ＣＲＥＢの機能を欠損させると、メラノーマ細胞株の増殖と転移が抑制されること（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９７年、１５巻、ｐ．２０６９−２０７５）、メラノーマにおいて薬剤耐性にＰＫＡやＣＲＥＢの活性化が関与すること（Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年、５０４巻、ｐ．１３８−１４２）が報告されている。また、ＰＲＫＡＣＡをノックダウンすると低酸素状態における腫瘍細胞の遊走や浸潤が阻害され、一方、ＰＲＫＡＣＡを欠失した腫瘍細胞において、ＰＲＫＡＣＡを過剰発現させると細胞の遊走や浸潤がレスキューされること（非特許文献１）が報告されている。
【０００４】
しかし、これまでにＤＮＡＪＢ１の融合遺伝子又はＰＲＫＡＣＡの融合遺伝子についてはいかなる報告もなされていない。
【０００５】
癌の原因遺伝子となる新たな融合遺伝子を同定し、その検出を可能とすることは、癌の検出や癌患者を層別化するうえで意義がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「セルラー・シグナリング（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、（（英国）、２０１２年、２４巻、ｐ．２３９６−２４０６）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれにコードされるポリペプチドの検出方法、及びそのためのプライマーセット又は検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は肝癌患者から得た検体からキナーゼであるＰＲＫＡＣＡ遺伝子の一部とＤＮＡＪＢ１遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１）、当該融合遺伝子が一部の肝癌患者検体に存在すること（実施例２）、また当該融合遺伝子を発現させるためレトロウイルスを作製し（実施例３）、当該レトロウイルス感染細胞が腫瘍形成能を有し、当該融合遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例４）。本発明者は、これらの知見から、当該融合遺伝子又はそれにコードされる融合蛋白質の検出方法を構築し、そのためのプライマーセットを提供し、当該融合遺伝子又はそれにコードされる融合蛋白質を検出することにより、ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌患者（特には肝臓癌患者）を選別することを可能とした。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２０］に関する。
［１］被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ドナジェーホモログサブファミリーＢメンバー１（ＤＮＡＪＢ１）遺伝子とプロテインキナーゼサイクリックエーエムピーディペンデントキャタリティックアルファ（ＰＲＫＡＣＡ）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［２］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［４］以下のプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法：
ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、前記ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［５］前記センスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［４］に記載の方法。
［６］前記センスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程をさらに包含する、［４］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合にＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［７］に記載の方法。
［９］増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する、［４］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記増幅された核酸断片が前記ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分の塩基配列とＰＲＫＡＣＡをコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合にＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［９］に記載の方法。
［１１］前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記被験者から得た試料、前記ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるプローブ、及び前記ポリヌクレオチドのＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程を包含する、［１１］に記載の方法。
［１３］前記ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及び前記ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計される複数種のプローブを用いる、［１２］に記載の方法。
［１４］配列番号１又は３の塩基番号１〜２１１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１又は３の塩基番号２１２〜１２２１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いる、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］前記ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルと前記ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとのシグナルの重なりを検出する工程をさらに包含する、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記２つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合にＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［１６］に記載の方法。
［１８］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記被験者が癌患者である、［１］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記癌が肝臓癌である、［１９］に記載の方法。
【００１０】
また、本発明は、以下の［２１］〜［２３］に関する。
［２１］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［１］〜［１７］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２２］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２１］に記載の方法。
［２３］前記癌が肝臓癌である、［２１］又は［２２］に記載の方法。
【００１１】
また、本発明は、以下の［２４］〜［２８］に関する。
［２４］被験者における癌を診断する方法であって、前記［１］〜［１７］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２５］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２４］に記載の方法。
［２６］前記融合遺伝子が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］前記癌が肝臓癌である、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２８］前記融合遺伝子が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が肝臓癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２７］に記載の方法。
【００１２】
また、本発明は、以下の［２９］〜［３２］に関する。
［２９］ＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［１］〜［１７］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［３０］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２９］に記載の方法。
［３１］前記融合遺伝子が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［２９］又は［３０］に記載の方法。
［３２］前記癌が肝臓癌である、［２９］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
【００１３】
また、本発明は、以下の［３３］〜［３７］に関する。
［３３］被験者から得た試料中のＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［３４］前記センスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［３３］に記載のプライマーセット。
［３５］前記センスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、［３３］又は［３４］に記載のプライマーセット。
［３６］前記被験者が癌患者である、［３３］〜［３５］のいずれかに記載のプライマーセット。
［３７］前記癌が肝臓癌である、［３６］に記載のプライマーセット。
【００１４】
また、本発明は、以下の［３８］〜［４３］に関する。
［３８］被験者から得た試料中のＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、プローブ。
［３９］［３８］に記載のプローブを複数含むプローブセットであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるプローブ、及び前記ポリヌクレオチドのＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるプローブを含む、プローブセット。
［４０］前記ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及び前記ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計される複数種のプローブを含む、［３９］に記載のプローブセット。
［４１］配列番号１又は３の塩基番号１〜２１１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１又は３の塩基番号２１２〜１２２１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含む、［３９］又は［４０］のプローブセット。
［４２］前記被験者が癌患者である、［３８］〜［４１］のいずれかに記載のプローブ又はプローブセット。
［４３］前記癌が肝臓癌である、［４２］に記載のプローブ又はプローブセット。
【００１５】
また、本発明は、以下の［４４］〜［４８］に関する。
［４４］被験者から得た試料中のＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、前記［３３］〜［３５］のいずれかに記載のプライマーセットを含む、融合遺伝子の検出用キット。
［４５］被験者から得た試料中のＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、［３８］〜［４１］のいずれかに記載のプローブ又はプローブセットを含む、検出用キット。
［４６］ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬をさらに含む、［４５］に記載の検出用キット。
［４７］前記被験者が癌患者である、［４４］〜［４６］のいずれかに記載の検出用キット。
［４８］前記癌が肝臓癌である、［４７］に記載の検出用キット。
【００１６】
また、本発明は、以下の［４９］〜［５６］に関する。
［４９］被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドの存在を検出する工程を含む、ＤＮＡＪＢ１とＰＲＫＡＣＡとの融合蛋白質の検出方法：
配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５０］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［４９］に記載の方法。
［５１］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［４９］に記載の方法。
［５２］前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料に該ポリペプチドのＤＮＡＪＢ１遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程を含むことを特徴とする、［４９］〜［５１］のいずれかに記載の方法。
［５３］下記ｉ）〜ｖ）に記載の工程をさらに包含する、［５２］に記載の方法：
ｉ）前記一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉ）該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｉｉ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｉｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、ｖ）該標識シグナルを検出する工程。
［５４］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４９］〜［５３］のいずれかに記載の方法。
［５５］前記被験者が癌患者である、［４９］〜［５４］のいずれかに記載の方法。
［５６］前記癌が肝臓癌である、［５５］に記載の方法。
【００１７】
また、本発明は、以下の［５７］〜［５９］に関する。
［５７］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［４９］〜［５３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［５８］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［５７］に記載の方法。
［５９］前記癌が肝臓癌である、［５７］又は［５８］に記載の方法。
【００１８】
また、本発明は、以下の［６０］〜［６４］に関する。
［６０］被験者における癌を診断する方法であって、前記［４９］〜［５３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［６１］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［６０］に記載の方法。
［６２］前記融合蛋白質が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［６０］又は［６１］に記載の方法。
［６３］前記癌が肝臓癌である、［６０］又は［６１］に記載の方法。
［６４］前記融合蛋白質が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が肝臓癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［６３］に記載の方法。
【００１９】
また、本発明は、以下の［６５］〜［６８］に関する。
［６５］ＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［４９］〜［５３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［６６］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［６５］に記載の方法。
［６７］前記融合蛋白質が前記被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［６５］又は［６６］に記載の方法。
［６８］前記癌が肝臓癌である、［６５］〜［６７］のいずれかに記載の方法。
【００２０】
また、本発明は、以下の［６９］〜［７２］に関する。
［６９］被験者から得た試料中のＤＮＡＪＢ１とＰＲＫＡＣＡとの融合蛋白質を検出するための検出用キットであって、前記［４９］〜［５１］のいずれかに記載のポリペプチドのＤＮＡＪＢ１遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む、融合蛋白質の検出用キット。
［７０］前記一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、［６９］に記載の検出用キット。
［７１］前記被験者が癌患者である、［６９］又は［７０］に記載の検出用キット。
［７２］前記癌が肝臓癌である、［７１］に記載の検出用キット。
【００２１】
また、本発明は、以下の［７３］に関する。
［７３］下記（１）〜（３）に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の検出方法は、ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肝臓癌）を検出する方法として利用できる。本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、融合遺伝子の検出方法と、融合遺伝子にコードされる融合蛋白質の検出方法とが含まれる。本発明の融合遺伝子の検出方法又は本発明の融合蛋白質の検出方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出する工程を含む。
【００２４】
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞、組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好ましくは、生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、又はその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、蛋白質）やｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。また、試料をフォルマリン固定してパラフィンに包埋して安定化した標本（ＦＦＰＥ）を用いることができる。ＦＦＰＥを薄くスライスしたＦＦＰＥ切片を用いてもよい。ＦＦＰＥ切片を用いれば、そこに存在するポリヌクレオチドやポリペプチドを直接検出することができる。
【００２５】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、「ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子」を検出する方法であり、当該融合遺伝子は、ＤＮＡＪＢ１遺伝子の一部とＰＲＫＡＣＡ遺伝子の一部とを含む融合遺伝子である。例示的なＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子としては、配列番号１又は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＤＮＡＪＢ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６１４５．１）の塩基番号４１（コーディングシーケンス（以下、ＣＤＳ）の５’末端に対応）から２５１とＰＲＫＡＣＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２７３０．３）の塩基番号２４７から１２５６（ＣＤＳの３’末端に対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基番号１２のシトシンがチミンに置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１又は３に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２１１の配列はＤＮＡＪＢ１遺伝子に由来し、塩基番号２１２〜１２２１の配列はＰＲＫＡＣＡ遺伝子に由来する。配列番号１又は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを「融合ポリヌクレオチド」とも称する。配列番号１又は３の塩基番号１〜１２２１にコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２６】
本発明の融合遺伝子の検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリヌクレオチド（以下、「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）としては、下記（１）〜（４）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド；又は
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２７】
前記（１）のポリペプチドにおいて、前記「配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性」は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
【００２８】
前記（２）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列に置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸の個数は、好ましくは１〜数個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２９】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００３０】
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後記実施例４に記載の方法で確認することができる。具体的な方法としては、当該ポリペプチドをコードする遺伝子を１８４Ａ１細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−８７９８）に導入し、超低接着平底プレートを用いて足場非依存的な細胞増殖作用を確認する方法が挙げられる。また、当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、一定期間観察し、腫瘍形成を確認することによって評価する方法を用いることもできる。
【００３１】
検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドがより好ましい。「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号１又は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。
【００３２】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含し得る。
【００３３】
使用する核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡからｃＤＮＡの調製の方法は当該分野で公知であり、市販のＤＮＡ抽出キット、ＲＮＡ抽出キット、ｃＤＮＡ合成キットを用いて簡便に行うことができる。
【００３４】
被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程は、公知の核酸増幅方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｌａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ  ＴＭＡ  ｓｙｓｔｅｍ）等が挙げられ、好ましい方法としては、ＰＣＲが挙げられる。
【００３５】
具体的には、被験者から得た試料中の核酸（例えば、ｍＲＮＡ等）を、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計されるプライマーセットを用いて核酸増幅反応に供して増幅させる。使用されるプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、例えば、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用して、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて当業者に容易に設計され得る。より具体的には、プライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＤＮＡＪＢ１遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるセンスプライマー（５’−プライマー）と、検出対象ポリヌクレオチドのＰＲＫＡＣＡをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＰＲＫＡＣＡ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるアンチセンスプライマー（３’−プライマー）を含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。あるいは、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を含む領域に対応するように設計してもよい。
【００３６】
本明細書において、検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、検出対象ポリヌクレオチドにおけるＤＮＡＪＢ１遺伝子由来の部分とＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来の部分とが融合した点を意味し、検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合点を含む領域」とは、例えば、検出対象ポリヌクレオチドが配列番号１又は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである場合、塩基番号２１１及び２１２の塩基を含む領域を意味する。
【００３７】
１つの実施形態において、前記センスプライマーは、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーが、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。
【００３８】
具体的な実施形態において、前記センスプライマーは、配列番号１又は３の塩基番号１から２１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーは、配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる。
【００３９】
核酸を増幅させる工程において、増幅させる核酸断片のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、増幅させる核酸断片の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが好ましい。また、使用される各プライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、より好ましくは１８〜２４塩基、さらに好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００４０】
プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程をさらに包含する。目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程は、例えば、電気泳動法を用いて実施することができる。電気泳動法では、例えば、核酸断片をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを確認できる。
【００４２】
また、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６（１０），９８６，１９９６）を実施することにより、増幅された核酸断片について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００（ライフテクノロジーズ社）を用いることができる。
【００４３】
目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。本発明の融合遺伝子の検出方法は、目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合に当該融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する。核酸断片の塩基配列を決定する工程は、例えば、サンガーシーケンス法（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００（ライフテクノロジーズ社）を用いることができる）、一塩基合成反応法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）を含む次世代シーケンス法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２６巻、ｐ．１１３５−１１４５）（例えば、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いることができる）等の当該分野で公知の配列決定法を用いることができる。
【００４５】
前記核酸断片の塩基配列を決定する工程には、核酸断片の全長の配列を決定する工程だけでなく、核酸断片の両端の部分配列を決定する工程も含まれる。
【００４６】
配列決定した核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分の塩基配列とＰＲＫＡＣＡをコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。
【００４７】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、増幅された核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分の塩基配列とＰＲＫＡＣＡをコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に当該融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
【００４８】
被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて、公知のハイブリダイゼーション方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法、インサイチュハイブリダイゼーション等が挙げられ、好ましい方法としては、インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法、又は、シルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法で実施することができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。
【００４９】
１つの実施形態において、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチド（具体的な例として、配列番号１又は３の塩基番号１９６〜２２７の配列）又はそれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
１つの実施形態において、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、公知のＲＮＡ  ＦＩＳＨ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０１２年、１４巻、１号、ｐ．２２−２９）に従って実施することができる。より具体的には、被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片）、検出対象ポリヌクレオチドのＤＮＡＪＢ１をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＤＮＡＪＢ１遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及び検出対象ポリヌクレオチドのＰＲＫＡＣＡをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＰＲＫＡＣＡ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【００５１】
１つの実施形態において、前記インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、前記ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計される複数種の検出プローブ、及び前記ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計される複数種の検出プローブを用いる。
【００５２】
１つの実施形態において、前記インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、以下のプローブを用いる：
配列番号１又は３の塩基番号１〜２１１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１５〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号１又は３の塩基番号２１２〜１２２１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１５〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）。
【００５３】
本明細書において「隣接したプローブペア」とは、検出対象ポリヌクレオチドに隣り合ってハイブリダイズする２種のプローブからなる。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも１６塩基、好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基である。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、前記インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程に加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する。ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程は、例えば、試料中の核酸にハイブリダイズしたプローブに、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬をハイブリダイズさせることにより行うことができる。
【００５５】
前記インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用されるハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬としては、ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ、Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ、及びＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＱＴがあり、これらはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社より入手できる。
【００５６】
より好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、前記ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルと前記ＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとのシグナルの重なりを検出する工程をさらに包含する。ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるプローブとＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるプローブを検出する蛍光試薬又は発色試薬を別にすることにより、当該異なる２つのプローブからのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあるか否かを観察することができる。当該２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。
【００５７】
本発明の融合遺伝子の検出方法は、前記２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合にＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
【００５８】
各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００５９】
本明細書中において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００６０】
本発明の融合蛋白質の検出方法は、「ＤＮＡＪＢ１とＰＲＫＡＣＡとの融合蛋白質」を検出する方法であり、当該融合蛋白質は、ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質である。
【００６１】
本発明の融合蛋白質の検出方法における「ポリペプチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリペプチド（以下、「検出対象ポリペプチド」と称する）としては、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００６２】
例えば、ポリペプチドの存在を検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法あるいはこれらを組み合わせた検出方法により実施することができる。また、本工程は、適宜前処理（例えば、パラフィンの除去）してある被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片）に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫組織染色技術による検出方法により実施してもよい。又は、本工程は、前記の各検出方法において、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体に代えて、融合蛋白質の融合部を認識する抗体を用いて実施してもよい。これらの手法としては、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織染色等の手法が挙げられる。
【００６３】
本明細書において、融合蛋白質の「融合部」とは、検出対象ポリペプチドにおけるＤＮＡＪＢ１遺伝子由来の部分とＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来の部分とが融合した部分を意味する。
【００６４】
免疫組織染色技術を利用した検出は、例えば、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年、３巻、１２号、ｐ．９９５−１０００）に従って実施することができる。より具体的には、前記検出対象ポリペプチドのＤＮＡＪＢ１遺伝子由来部分を認識する抗体と、前記検出対象ポリペプチドのＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来部分を認識する抗体を用いて、当該二つの抗体が同一分子を認識していることを上記技術によって検出することにより、検出対象ポリペプチドの存在を検出することができる。さらに具体的には、検出は、ｉ）被験者から得た試料に前記検出対象ポリペプチドのＤＮＡＪＢ１遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び前記検出対象ポリペプチドのＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該二次抗体が連結した該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程により、実施することができる。ある態様としては、ＰＬＡプローブやＤｕｏｌｉｎｋ  ＩＩ試薬キットならびにＤｕｏｌｉｎｋ  ＩＩ  Ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ試薬キット（Ｏｌｉｎｋ社）に含まれる試薬を用いることができる。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の検出方法は、被験者から試料を得る工程を包含する。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の検出方法における被験者は癌患者であり、より具体的な実施形態において、当該癌が肝臓癌である。
【００６７】
本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌（特には肝臓癌）に罹患している可能性が高いと判定できる。
【００６８】
また、本発明の検出方法における検出工程は、被験者における癌（特には肝臓癌）の存在の検出方法、又は被験者における癌（特には肝臓癌）の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、本発明の検出工程に加えて、検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が癌（特には肝臓癌）に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。また、当該検出工程は、ＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象となる被験者（肝臓癌などの癌患者）を同定する方法にも使用することができる。本発明の同定方法は、当該検出工程に加えて、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に被験者がＰＲＫＡＣＡ阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程を含んでもよい。
【００６９】
《本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キット》
本発明は、本発明の検出方法で使用されるプライマーセット、プローブ及びプローブセットを包含する。
【００７０】
本発明のプライマーセットは、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。
【００７１】
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドの融合点を含む領域に対応するように設計してもよい。
【００７２】
本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１又は３の塩基番号１から２１１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００７３】
本発明のプライマーセットのより具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１又は３の塩基番号１から２１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１又は３の塩基番号２１２から１２２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００７４】
前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される核酸断片の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、より好ましくは１８〜２４塩基、さらに好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００７５】
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００７６】
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。
【００７７】
１つの実施形態において、本発明のプローブは、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチド（具体的な例として、配列番号１又は３の塩基番号１９６〜２２７の配列）又はそれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＤＮＡＪＢ１遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及びＰＲＫＡＣＡをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）のＰＲＫＡＣＡ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを含む、プローブセットである。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＤＮＡＪＢ１をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＰＲＫＡＣＡをコードする部分から設計される複数種のプローブを含む。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、以下を含む：
配列番号１又は３の塩基番号１〜２１１の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１５〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号１又は３の塩基番号２１２〜１２２１の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１５〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）。
【００８１】
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００８２】
本発明は、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットを含む、検出用キットを包含する。本発明の検出用キットには、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットに加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬等、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために該プライマーセット、プローブ又はプローブセットと共に用いる構成要素を含んでもよい。
【００８３】
本発明はまた、検出対象ポリペプチドを検出するための検出用キットを包含する。好ましくは、当該検出用キットは、検出対象ポリペプチドのＤＮＡＪＢ１遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び検出対象ポリペプチドのＰＲＫＡＣＡ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む。より好ましくは、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。
【００８４】
本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットは、本発明の検出方法、診断方法、及び患者の同定方法に使用することができる。１つの実施形態において、本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットに関して、被験者は癌患者であり、より具体的な実施形態において、当該癌が肝臓癌である。
【実施例】
【００８５】
特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００８６】
［実施例１］ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３の単離
肝細胞癌患者肝癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）ＬＶ０３及びＬＶ１５に対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ；ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー；ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００８７】
次に、配列番号４に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｆｕｌｌ  ｆｗｄ０１及び配列番号５に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｆｕｌｌ  ｒｅｖ０１のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号６に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｆｕｌｌ  ｆｗｄ０２及び配列番号７に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｆｕｌｌ  ｒｅｖ０２のプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、約１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。ｒＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ産物の３'末端にＡを付加後、クローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートをダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列を決定した。この結果、ＬＶ０３由来の約１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物には、ＮＣＢＩに登録されているＤＮＡＪＢ１（ＮＭ＿００６１４５．１）の塩基番号４１（ＣＤＳの５’末端に対応）から２５１とＰＲＫＡＣＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２７３０．３）の塩基番号２４７から１２５６（ＣＤＳの３’末端に対応）までとが融合している転写産物（配列番号１）が存在していることが明らかになった。また、ＬＶ１５由来の約１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物には、配列番号１の塩基番号１２のシトシンがチミンに置換された転写産物（配列番号３）が存在していることが明らかになった。配列番号１又は３に示される塩基配列によりコードされるポリペプチドは同一であり、当該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。この配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３とも称する。
【００８８】
配列番号８に示されるＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＢａｍＨＩ＿Ｆ及び配列番号９に示されるＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＮｏｔＩ＿Ｒのプライマーを用いて、上記のＬＶ０３由来のＰＣＲ産物を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を用いてグラジエントＰＣＲ（９８℃２分、続いて９８℃１５秒、５５℃〜６０℃１５秒、６８℃２分を２５サイクル、続いて６８℃７分）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、上記グラジエントＰＣＲにおいてアニーリングを５５℃〜６０℃の範囲で行った全ての条件で、約１．２ｋｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ産物の３'末端にＡを付加後、クローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートをダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列を決定し、配列番号１に示される転写産物が存在していることを確認した。
【００８９】
ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を蛋白質として発現するため、上記クローニングベクターより制限酵素ＮｏｔＩで３７℃、２時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＢａｍＨＩで３７℃、２時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミド（ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）を構築した。
【００９０】
［実施例２］ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３の検出
肝癌臨床検体（米国アステランド社）１８検体に対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ；ライフテクノロジーズ社）及びランダムプライマー（ランダムプライマーズ；ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００９１】
次に、配列番号１０に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｐａｒｔ  ｆｗｄ０１及び配列番号１１に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｐａｒｔ  ｒｅｖ０１のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１２に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｐａｒｔ  ｆｗｄ０２及び配列番号１３に示されるＤＮＡＪ−ＰＲＫＡ＿ｐａｒｔ  ｒｅｖ０２のプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、上述のサンプルＬＶ０３及びＬＶ１５を含む複数検体で、約３００ｂｐのＰＣＲ産物を得たことがわかった。
【００９２】
その後、ＰＣＲ産物をダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列決定した。この結果、約３００ｂｐのＰＣＲ産物は、実施例１で同定されたＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３のＤＮＡＪＢ１をコードする部分の塩基配列とＰＲＫＡＣＡをコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む配列であることが明らかになった。以上のことより、本発明の検出方法により、肝癌臨床検体由来の試料中のＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子の存在を検出することができ、当該融合遺伝子陽性の患者を選択できることが示された。
【００９３】
[実施例３]ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３のレトロウイルス液の作製
１０％牛胎児血清（Ｓｉｇｍａ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地；Ｓｉｇｍａ社）で５％ＣＯ2、３７℃の条件で培養したＧＰ２−２９３細胞（クロンテック社；６３１４５８）にＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ（実施例１）４μｇ、ｐ１０Ａ１エンベロープベクター（クロンテック社）１μｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした２４時間後に１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ2、３７℃でさらに２４時間培養した後の培養上清を採取しレトロウイルス溶液を作製した。同様に、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏの代わりに空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを用いてレトロウイルス溶液を作製した。
【００９４】
[実施例４]ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３の足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例３においてＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作製したレトロウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１６μｇ／ｍＬになるよう添加したのち、ヒト不死化乳腺上皮細胞株である１８４Ａ１細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−８７９８）に添加し感染させた。５％ＣＯ2、３７℃で８時間感染させた後に最終濃度５μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）を含む乳腺上皮細胞専用培地（ＭＥＧＭ（登録商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）；ロンザ社）に交換し、さらに１６時間後に最終濃度５μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）及び最終濃度０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ社）を含む乳腺上皮細胞専用培地（ロンザ社）に交換し、５％ＣＯ2、３７℃で２週間培養を続け、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３を安定発現する１８４Ａ１細胞（ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３発現／１８４Ａ１細胞と命名した。）を取得した。同様に、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを用いて作製したレトロウイルス（実施例３）を感染させた１８４Ａ１細胞（Ｍｏｃｋ／１８４Ａ１細胞と命名した。）を取得した。
【００９５】
ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３発現／１８４Ａ１細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、９６ウェル超低接着平底プレート（コーニング社）にＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３発現／１８４Ａ１細胞及びＭｏｃｋ／１８４Ａ１細胞を、それぞれ１ウェル当り２×１０3個となるように最終濃度５μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）及び最終濃度０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ社）を含む乳腺上皮細胞専用培地（ロンザ社）で播種し、５％ＣＯ2、３７℃で培養した。播種当日（Ｄａｙ１）、４日目（Ｄａｙ４）、７日目（Ｄａｙ７）、１１日目（Ｄａｙ１１）及び１４日目（Ｄａｙ１４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（ＡＲＶＯ；パーキンエルマー社）を用いた。Ｍｏｃｋ／１８４Ａ１細胞はＤａｙ１からＤａｙ１４まで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３発現／１８４Ａ１細胞はＤａｙ１からＤａｙ１４までで約２．０倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３発現／１８４Ａ１細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなり、ＤＮＡＪＢ１−ＰＲＫＡＣＡ−Ｄ１Ｐ３にコードされるポリペプチドは腫瘍形成能を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の検出方法は、ＤＮＡＪＢ１遺伝子とＰＲＫＡＣＡ遺伝子との融合遺伝子を検出する方法であり、被験者における癌を検出及び診断する方法として有用である。また、本発明のプライマーセット及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号８及び９で表される塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【配列表】
2017077183000001.app