(57)【要約】【課題】アルコール飲料中の酢酸エステルの基質は増加させることなく、酢酸エステルを効率良く生産することができるアルコール飲料製造用酵母、並びに、アルコール飲料中に酢酸エステルを高含有させることができる該酵母を用いたアルコール飲料の製造方法を提供すること。【解決手段】オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損したオートファジー機能欠損酵母を用いるアルコール飲料の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損したオートファジー機能欠損酵母を用いることを特徴とするアルコール飲料の製造方法。
【請求項２】
オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損していることを特徴とするアルコール飲料製造用オートファジー機能欠損酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー機能欠損酵母を用いたアルコール飲料の製造方法、及びアルコール飲料製造用オートファジー機能欠損酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒、ビール、ワイン、焼酎等のアルコール飲料においての品質の良否を決定する重要な要素のひとつとしては、芳香性が挙げられる。これらの芳香性を特徴づける重要な要素として、酢酸イソアミル、酢酸イソブチル等の酢酸エステルが知られている。酢酸イソアミルはバナナ様の香り、酢酸イソブチルは果実様の香りを有し、清酒においては吟醸酒等に特徴的な香りである。
【０００３】
清酒中に前記酢酸エステルを効率良く生産するための従来から知られている技術としては、高度精白米を使用して低温で発酵させる吟醸仕込みがある。しかしながら、吟醸酒においても、より芳香性の高い物が望まれている。
【０００４】
また、酢酸イソアミルの基質となるイソアミルアルコールの濃度を高めることによって、酢酸イソアミルを多く生産する方法も知られている（特許文献１参照）。しかしながら、アルコール飲料中にイソアミルアルコールが多く含まれると、特有のアルコール様の香りが強くなり、味わいが重たくなってしまうという問題がある。また、イソアミルアルコールは、清酒の劣化臭の原因物質のひとつである生ヒネ香（ムレ臭）といわれるイソバレルアルデヒドの前駆物質でもあり、その生産量は抑えることが望ましい。
【０００５】
また、アルコール飲料の製造において、酢酸エステルを生成するアルコールアセチルトランスフェラーゼの活性を高める方法（特許文献２参照）や、酢酸エステルを分解するエステラーゼ活性を欠損させる方法（特許文献３参照）も知られている。しかしながら、いずれも酢酸イソアミルに重点が置かれている。酢酸エステルは、それぞれ特徴的な香りを有し、また、複数の酢酸エステルの組成比の違いによっても多様な香りを形成する。昨今のトレンドとして特徴のある香りが重視されていることから、複数の酢酸エステルに着目し、香りの多様性を創出する方法が求められている。
【０００６】
一方で、出芽酵母は、オートファジー研究のモデル生物として最も広く利用されているもののひとつである。オートファジーとは、ユビキチン−プロテアソーム分解系と並ぶ主要なタンパク質分解経路のひとつである。オートファジーは、窒素飢餓をはじめとする栄養源飢餓や各種ストレスで誘導されることが知られており、栄養源のリサクルによって環境の変化に適応するための生理的応答であると考えられている。オートファジーには、細胞質成分を非選択的に分解する非選択的オートファジーと、ミトコンドリア、ペルオキシソームなどを選択的に分解する選択的オートファジーとに大別できる。
【０００７】
前記酵母におけるオートファジー研究の多くは、栄養豊富な合成培地での培養後、飢餓条件に強制的にシフトさせるような極端な条件のものであり、アルコール飲料のような発酵食品等の産業利用環境下におけるオートファジーの生理的機能に関する知見は非常に限られている。例えば、前記選択的オートファジーに関しては、酵母のミトコンドリアのオートファジー（マイトファジー）関連タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、エタノールの生産性を向上させる方法が知られている（特許文献４参照）。
【０００８】
しかしながら、清酒醪等のアルコール飲料の発酵下のような、高エタノール、低温、低窒素源、濃糖等の様々なストレス因子が絡み合う複雑なストレス環境下における酵母の非選択的オートファジーの機能は、未だ解明されておらず、オートファジーと酢酸エステル生産との関係も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭６２−６６６９号公報
【特許文献２】特開平６−６２８４９号公報
【特許文献３】特開平９−２３４０７７号公報
【特許文献４】特開２０１４−７６０４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アルコール飲料中の酢酸エステルの基質は増加させることなく、酢酸エステルを効率良く生産することができるアルコール飲料製造用酵母、並びに、アルコール飲料中に酢酸エステルを高含有させることができる該酵母を用いたアルコール飲料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する手段として、本発明者らは、酵母のオートファジーの機能を欠損させたオートファジー機能欠損酵母が、酢酸エステルを効率良く生産することができること、さらに驚くべきことに、該オートファジー機能欠損酵母を用いて製造したアルコール飲料中の酢酸エステルの基質は、親株と比較して大きく変化しないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損したオートファジー機能欠損酵母を用いることを特徴とするアルコール飲料の製造方法である。
＜２＞  オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損していることを特徴とするアルコール飲料製造用オートファジー機能欠損酵母である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、アルコール飲料中の酢酸エステルの基質は増加させることなく、酢酸エステルを効率良く生産することができるアルコール飲料製造用酵母、並びに、アルコール飲料中に酢酸エステルを高含有させることができる該酵母を用いたアルコール飲料の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異株の作製」におけるコンストラクト１の作製の概略模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異株の作製」におけるコンストラクト１の作製の概略模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異株の分離」における形質転換体の有無を確認する方法の概略説明図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異株の作製」におけるコンストラクト２の作製の概略模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異株の作製」におけるコンストラクト２の作製の概略模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１の「ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異株の分離」における形質転換体の有無を確認する方法の概略説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（オートファジー機能欠損酵母）
本発明のオートファジー機能欠損酵母は、オートファジーの機能が欠損している酵母である。前記オートファジー機能欠損酵母は、アルコール飲料の製造方法に好適に用いることができ、「アルコール飲料製造用オートファジー機能欠損酵母」とも称することがある。
【００１６】
本発明において、「オートファジーの機能の欠損」とは、オートファジーの機能が喪失又は失活していることを意味する。ただし、本発明において、オートファジーの機能から選択的オートファジーは除くこととする。
本発明において、「選択的オートファジー」とは、ミトコンドリア、ペルオキシソームなどを選択的に分解するオートファジーの機能を意味する。
【００１７】
酵母において、オートファジーが誘導されると、細胞質の一部が二重膜構造の隔離膜で取り囲まれてオートファゴソームが形成される。続いてこのオートファゴソームの外膜と液胞とが融合した後、オートファゴソームの内部構造が液胞内に取り込まれて一重膜構造のオートファジックボディーが形成される。このように、オートファジックボディーは、オートファゴソームが正常に形成されていることの指標になる。したがって、前記オートファジーの機能の欠損は、オートファジックボディーを指標とすることができ、形態観察においてオートファジックボディーが確認されない場合、オートファジーの機能が欠損していると判断することができる。
【００１８】
なお、通常、オートファジックボディーは、液胞内のプロテアーゼにより速やかに分解されてしまうため、その形態を観察することはできないが、オートファジーの進行過程においてＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ：セリンプロテアーゼ阻害剤）を添加することにより、液胞中のプロテアーゼが不活化されるため、オートファジーの機能が欠損していない場合は、液胞内でオートファゴソームが分解されずに蓄積されたオートファジックボディーを光学顕微鏡にて観察することができる。したがって、ＰＭＳＦの存在下でオートファジックボディーの有無を観察することにより、オートファジーの機能の欠損を確認することができる。
【００１９】
前記オートファジー機能欠損酵母の性質としては、オートファジーの機能が欠損している限り、特に制限はないが、酢酸エステルを高生産する性質も有する。これにより、アルコール飲料に特徴的な芳香性を付与できる点で好ましい。
【００２０】
前記酢酸エステルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸イソアミル（酢酸３−メチルブチル）、酢酸イソブチル（酢酸２−メチルプロピル）、酢酸エチル（エチルアセテート）などが挙げられる。これらの中でも、酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルの少なくともいずれかが高生産されることが好ましく、酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルの両方が高生産されることが、アルコール飲料の芳香性を高めることができる点で特に好ましい。
【００２１】
前記酢酸イソアミルは、アセチル−ＣｏＡ、イソアミルアルコール（３−メチル−１−ブタノール）、及び活性アミルアルコール（２−メチル−１−ブタノール）を基質として、アルコールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＴＦａｓｅ)によって生産される。
【００２２】
前記酢酸イソブチルは、アセチル−ＣｏＡ及びイソブチルアルコール（２−メチルプロパン−１−オール）を基質として、アルコールアセチルトランスフェラーゼによって生産される。
【００２３】
本発明のオートファジー機能欠損酵母は、前記酢酸エステルの基質は増加させることなく、酢酸エステルを効率良く生産することができるため、味わいを重たくすることなく、吟醸酒などに特徴的な芳香性を付与できる点で有利である。
【００２４】
前記酢酸エステルの生産効率は、Ｅ／Ａ（エステル／アルコール）比を指標とすることができ、値が大きい程、酢酸エステルの生産効率が良いことを示す。酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルのＥ／Ａ比は、それぞれ下記式より算出することができる。
・酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比＝酢酸イソアミルの濃度／（イソアミルアルコールの濃度＋活性アミルアルコールの濃度）×１００
・酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比＝酢酸イソブチルの濃度／イソブチルアルコールの濃度×１００
【００２５】
本発明において、「酢酸エステルを高生産する」とは、オートファジー機能欠損酵母を用いて得られた発酵物のＥ／Ａ比が、同条件で親株を用いて得られた発酵物のＥ／Ａ比よりも大きいことを意味する。
【００２６】
酢酸イソアミルに関する、前記親株のＥ／Ａ比に対する前記オートファジー機能欠損酵母のＥ／Ａ比（オートファジー機能欠損酵母のＥ／Ａ比／親株のＥ／Ａ比）としては、１超えであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．３以上が好ましく、１．６以上がより好ましい。
【００２７】
酢酸イソブチルに関する、前記親株のＥ／Ａ比に対する前記オートファジー機能欠損酵母のＥ／Ａ比（オートファジー機能欠損酵母のＥ／Ａ比／親株のＥ／Ａ比）としては、１超えであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．７以上が好ましく、２．２以上がより好ましく、２．７以上が特に好ましい。
【００２８】
前記オートファジー機能欠損酵母は、オートファジー機能を欠損し、酢酸エステルを高生産すること以外は、きょうかい７０１号酵母等の代表的な各種アルコール飲料製造用酵母の性質と同等の性質を有しているため、酵母の保存管理、酵母醪管理等の品質管理も容易に行うことができる。
【００２９】
酵母のオートファジーの機能を欠損させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子工学を用いる方法、変異剤処理などで突然変異処理を行う方法などが挙げられる。これらの中でも、遺伝子工学を用いる方法が、前記オートファジーの機能を特異的に欠損させることができ、効率良くオートファジー機能欠損酵母を育種できる点で好ましい。
【００３０】
前記遺伝子工学を用いる方法の具体例としては、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が機能しないように、該遺伝子の全部を変異させる方法、オートファゴソームを形成しないように該遺伝子の一部を変異させる方法、該遺伝子の転写を抑制する方法、該遺伝子の転写産物の翻訳を抑制する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の全部を変異させる方法が好ましい。
【００３１】
前記変異としては、例えば、欠損、任意の塩基配列への置換などが挙げられる。これらの中でも、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の全部を欠損させることが好ましい。
【００３２】
前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、親株を栄養要求性変異株に形質転換し（以下、「栄養要求性変異株作製工程」と称することがある）、該栄養要求性変異株の栄養要求性をマーカーとしてオートファジー機能欠損酵母を作製し（以下、「オートファジー機能欠損酵母作製工程」と称することがある）、前記オートファジー機能欠損酵母を選択分離する（以下、「選択分離工程」と称することがある）方法などが挙げられる。以下に、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損させる方法の一例について、具体例を挙げて説明する。
【００３３】
＜栄養要求性変異株作製工程＞
前記栄養要求性変異株作製工程は、栄養要求性マーカー遺伝子を含むプラスミドを少なくとも１つ用いて、栄養要求性を有しない親株としての前記酵母を形質転換し、栄養要求性変異株を作製する工程である。
【００３４】
＜＜親株＞＞
前記親株としては、アルコール発酵する酵母であれば、特に制限はなく、公知の酵母の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母などが挙げられる。前記酵母は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記親株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。
【００３５】
前記酵母の具体例としては、公益財団法人日本醸造協会より市販されている、清酒用酵母、焼酎用酵母、ワイン用酵母などが挙げられる。
【００３６】
前記公益財団法人日本醸造協会より市販されている清酒用酵母としては、例えば、きょうかい６号酵母、きょうかい７号酵母、きょうかい９号酵母、きょうかい１０号酵母、きょうかい１１号酵母、きょうかい１４号酵母等の泡あり酵母；きょうかい６０１号酵母、きょうかい７０１号酵母、きょうかい９０１号酵母、きょうかい１００１号酵母、きょうかい１４０１号酵母、きょうかい１５０１号酵母等の泡なし酵母などが挙げられる。
【００３７】
前記公益財団法人日本醸造協会より市販されている焼酎用酵母としては、例えば、焼酎用１号、焼酎用２号、焼酎用３号などが挙げられる。
【００３８】
前記公益財団法人日本醸造協会より市販されているワイン用酵母としては、例えば、ブドウ酒用きょうかい１号、ブドウ酒用きょうかい２号、ブドウ酒用きょうかい３号、ブドウ酒用きょうかい４号などが挙げられる。
【００３９】
＜＜栄養要求性マーカー遺伝子を含むプラスミド＞＞
前記「栄養要求性マーカー遺伝子」とは、親株の生育に必須の栄養成分の生合成に関わる遺伝子が機能しないように変異させた遺伝子である。したがって、前記栄養要求性マーカー遺伝子を用いて前記親株を形質転換することにより、該親株に栄養要求性を付与することができ、これにより栄養要求性変異株を作製することができる。
【００４０】
前記栄養要求性マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルの生合成に関わるＵＲＡ３遺伝子を変異させた変異ｕｒａ３遺伝子、トリプトファンの生合成に関わるＴＲＰ１遺伝子を変異させた変異ｔｒｐ１遺伝子、ヒスチジンの生合成に関わるＨＩＳ３遺伝子を変異させた変異ｈｉｓ３遺伝子、ロイシンの生合成に関わるＬＥＵ２遺伝子を変異させた変異ｌｅｕ２遺伝子、アデニンの生合成に関わるＡＤＥ２遺伝子を変異させた変異ａｄｅ２遺伝子、リジンの生合成に関わるＬＹＳ２遺伝子を変異させた変異ｌｙｓ２遺伝子、メチオニン生合成に関わるＭＥＴ１７遺伝子を変異させた変異ｍｅｔ１７遺伝子などが挙げられる。
【００４１】
前記栄養要求性マーカー遺伝子を含むプラスミドは、１つの栄養要求性マーカー遺伝子を含んでいてもよく、複数の栄養要求性マーカー遺伝子を含んでいてもよい。
また、前記オートファジー機能欠損酵母の育種方法において、前記栄養要求性マーカー遺伝子を含むプラスミドは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４２】
前記栄養要求性マーカー遺伝子を含むプラスミドの具体例としては、北本らの方法（Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒａｃｉｌ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓａｋｅ  ｙｅａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＲＡ３  ａｎｄ  ＴＲＰ１  ｇｅｎｅｓ．”，  Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９０，  ５４（１１），  ２９７９−２９８７）に記載のｐＵＲＡ３６、ｐＵＲＡ３８、ｐＴＲＰ１２、ｐＴＲＰ１４などが挙げられる。
【００４３】
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
＜オートファジー機能欠損酵母作製工程＞
前記オートファジー機能欠損酵母作製工程は、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を補完する遺伝子を含むコンストラクトを少なくとも１つ用いて、前記栄養要求性変異株を形質転換し、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損させた栄養要求性を有しないオートファジー機能欠損酵母を作製する工程である。
【００４５】
＜＜オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子＞＞
前記オートファジーの発現に関わる遺伝子としては、オートファゴソーム形成に必要な遺伝子の中から適宜選択することができ、例えば、ＡＴＧ１遺伝子、ＡＴＧ２遺伝子、ＡＴＧ３遺伝子、ＡＴＧ４遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ８遺伝子、ＡＴＧ９遺伝子、ＡＴＧ１０遺伝子、ＡＴＧ１２遺伝子、ＡＴＧ１３遺伝子、ＡＴＧ１４遺伝子、ＡＴＧ１６遺伝子、ＡＴＧ１７遺伝子、ＡＴＧ１８遺伝子、ＡＴＧ２９遺伝子、ＡＴＧ３１遺伝子などが挙げられる。
【００４６】
前記オートファジーの発現に関わる遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢデータベースに格納されている以下のアクセッション番号より取得することができる。
・ＡＴＧ１遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ５３１０４
・ＡＴＧ２遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ５３８５５
・ＡＴＧ３遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ４０３４４
・ＡＴＧ４遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ５３８６７
・ＡＴＧ５遺伝子  ：アクセッション番号  Ｑ１２３８０
・ＡＴＧ６遺伝子  ：アクセッション番号  Ｑ０２９４８
・ＡＴＧ７遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ３８８６２
・ＡＴＧ８遺伝子  ：アクセッション番号  Ｐ３８１８２
・ＡＴＧ９遺伝子  ：アクセッション番号  Ｑ１２１４２
・ＡＴＧ１０遺伝子：アクセッション番号  Ｑ０７８７９
・ＡＴＧ１２遺伝子：アクセッション番号  Ｐ３８３１６
・ＡＴＧ１３遺伝子：アクセッション番号  Ｑ０６６２８
・ＡＴＧ１４遺伝子：アクセッション番号  Ｐ３８２７０
・ＡＴＧ１６遺伝子：アクセッション番号  Ｑ０３８１８
・ＡＴＧ１７遺伝子：アクセッション番号  Ｑ０６４１０
・ＡＴＧ１８遺伝子：アクセッション番号  Ｐ４３６０１
・ＡＴＧ２９遺伝子：アクセッション番号  Ｑ１２０９２
・ＡＴＧ３１遺伝子：アクセッション番号  Ｑ１２４２１
【００４７】
＜＜栄養要求性を補完する遺伝子を含むコンストラクト＞＞
前記栄養要求性を補完する遺伝子を含むコンストラクトとしては、前記栄養要求性変異株における栄養要求性を補完する遺伝子と、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子に隣接する上流領域及び下流領域とを含むことが好ましい。
本発明において、「栄養要求性を補完する遺伝子」とは、前記栄養要求性変異株における栄養要求性を消失し得る遺伝子を意味する。
【００４８】
前記栄養要求性変異株における栄養要求性を補完する遺伝子としては、前記栄養要求性変異株における栄養要求性により適宜選択することができ、例えば、ウラシル要求性株である場合はＵＲＡ３遺伝子、トリプトファン要求性株である場合はＴＲＰ１遺伝子、ヒスチジン要求性株である場合はＨＩＳ３遺伝子、ロイシン要求性株である場合はＬＥＵ２遺伝子、アデニン要求性株である場合はＡＤＥ２遺伝子、リジン要求性株である場合はＬＹＳ２遺伝子、メチオニン要求性株である場合はＭＥＴ１７遺伝子などが挙げられる。
【００４９】
前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子に隣接する上流領域及び下流領域としては、例えば、前記オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する該ＯＲＦの上流領域及び下流領域などが挙げられる。
【００５０】
前記形質転換において、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を補完する遺伝子を含むコンストラクトが導入される位置としては、該栄養要求性変異株のオートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損させることができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記栄養要求性変異株において標的とするオートファジーの発現に関わる遺伝子の全部と置換するように導入されることが好ましい。
【００５１】
そのため、前記栄養要求性を補完する遺伝子を含むコンストラクトは、標的とする前記オートファジーの発現に関わる遺伝子のＯＲＦに隣接する該ＯＲＦの上流領域と、前記栄養要求性変異株における栄養要求性を補完する遺伝子と、標的とする前記オートファジーの発現に関わる遺伝子のＯＲＦに隣接する該ＯＲＦの下流領域と、をこの順で含むコンストラクトであることが好ましい。このようなコンストラクトを用いて前記栄養要求性変異株を形質転換することによって、前記栄養要求性変異株の染色体上の前記標的とするオートファジーの発現に関わる遺伝子と、前記コンストラクトにおける該標的遺伝子のＯＲＦに隣接する該ＯＲＦの上流領域及び下流領域との間で相同組換えが生じる。これにより、前記栄養要求性変異株の染色体上の前記標的とするオートファジーの発現に関わる遺伝子は欠損し、これに代えて該コンストラクトに含まれていた栄養要求性を補完する遺伝子が導入（置換）されるため、オートファジーの機能が欠損し、栄養要求性が消失したオートファジー機能欠損酵母を得ることができる。
【００５２】
前記標的とするオートファジーの発現に関わる遺伝子が複数である場合、上述の形質転換を繰り返すことで、複数のオートファジーの発現に関わる遺伝子が欠損したオートファジー機能欠損酵母を得ることができる。
【００５３】
＜選択分離工程＞
前記選択分離工程は、栄養非添加培地を用いて前記オートファジー機能欠損酵母を選択分離する工程である。
【００５４】
前記栄養非添加培地としては、特に制限はなく、前記栄養要求性を補完する遺伝子の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記栄養要求性を補完する遺伝子がＵＲＡ３遺伝子である場合はウラシル非添加培地、前記栄養要求性を補完する遺伝子がＴＲＰ１遺伝子である場合はトリプトファン非添加培地などが挙げられる。
【００５５】
前記オートファジー機能欠損酵母作製工程において、前記標的とするオートファジーの発現に関わる遺伝子は欠損し、これに代えて前記コンストラクトに含まれていた栄養要求性を補完する遺伝子が導入されるため、この形質転換体（即ち、オートファジー機能欠損酵母）を、前記栄養要求性を補完する遺伝子に対応する栄養の非添加培地で培養することにより、該オートファジー機能欠損酵母をポジティブに選択することができる。
即ち、前記コンストラクトが導入されていない酵母は前記栄養要求性変異株の栄養要求性を維持しているため、前記栄養非添加培地では致死となる。したがって、前記栄養非添加培地で生育した株は、オートファジーの発現に関わる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が脱落したものとして同定することができる。
【００５６】
（アルコール飲料の製造方法及びアルコール飲料）
本発明のアルコール飲料の製造方法は、オートファジーの機能（ただし、選択的オートファジーを除く）が欠損したオートファジー機能欠損酵母を用いてアルコール飲料を製造する方法である。
また、本発明は、前記アルコール飲料の製造方法により製造されたアルコール飲料にも関する。
【００５７】
前記アルコール飲料の製造方法に用いる前記オートファジー機能欠損酵母には、本発明の前記オートファジー機能欠損酵母（アルコール飲料製造用オートファジー機能欠損酵母）が好適に用いられるが、自然突然変異によりオートファジー機能の欠損が生じたオートファジー機能欠損酵母を用いてもよい。また、以下に詳述する本発明の組成物を用いてもよい。
【００５８】
前記アルコール飲料の製造方法としては、前記オートファジー機能欠損酵母を用いる限り、特に制限はなく、目的とするアルコール飲料の種類などに応じて、公知の製造方法の中から適宜選択することができる。
【００５９】
前記アルコール飲料の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒、ビール、ワイン、焼酎などが挙げられる。これらの中でも、清酒が好ましい。
【００６０】
前記アルコール飲料の種類が清酒の場合、使用する蒸米（以下、「掛米」と称することがある）の精製歩合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３８％〜９０％であることが好ましく、３８％〜７８％であることがより好ましく、３８％〜５０％であることが特に好ましい。また、前記掛米は、アルファ化米であってもよい。
【００６１】
また、前記アルコール飲料の種類が清酒の場合、使用する麹（以下、麹に使用する米を「麹米」と称することがある）の精製歩合としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３８％〜９０％であることが好ましく、３８％〜７５％であることがより好ましく、３８％〜５０％であることが特に好ましい。
【００６２】
前記アルコール飲料のアルコール濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
前記アルコール飲料の製造方法は、前記オートファジー機能欠損酵母を用いるため、アルコール飲料中の前記酢酸エステルの基質を増加させることなく、酢酸エステルを効率良く生産することができる。したがって、前記アルコール飲料の製造方法により製造されたアルコール飲料は、酢酸エステルを多く含有するものである。
【００６４】
（組成物）
本発明の組成物は、本発明の前記オートファジー機能欠損酵母（アルコール飲料製造用酵母）を含む組成物であり、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記組成物は、前記オートファジー機能欠損酵母を含むため、アルコール飲料製造用組成物として、アルコール飲料の製造に好適に用いられる。
【００６５】
＜オートファジー機能欠損酵母＞
前記組成物における前記オートファジー機能欠損酵母の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記組成物は、前記オートファジー機能欠損酵母そのものであってもよい。
【００６６】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、アルコール飲料に使用し得る成分の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００６８】
（実施例１：オートファジー機能欠損酵母の育種方法）
オートファジー機能欠損酵母は、公益財団法人日本醸造協会から市販されている清酒用泡なし酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるきょうかい７０１号酵母（以下、「Ｋ７０１」と略記することがある）を親株として用い、以下に示す方法で、Ｋ７０１をウラシル要求性かつトリプトファン要求性の株に変異させ、該変異株のＡＴＧ１遺伝子を、ＵＲＡ３遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子で置換させることで作製した。
【００６９】
＜栄養要求性株の作製＞
ウラシル非要求性かつトリプトファン非要求性のＫ７０１を、北本らの方法（Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒａｃｉｌ  ａｎｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓａｋｅ  ｙｅａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＲＡ３  ａｎｄ  ＴＲＰ１  ｇｅｎｅｓ．”，  Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９０，  ５４（１１），  ２９７９−２９８７）に基づき形質転換し、ウラシル要求性かつトリプトファン要求性の変異株Ｋ７０１−Ａを作製した。
【００７０】
＜ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異株の作製＞
ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異株の作製の概略模式図を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
Ｋ７０１−Ａから常法により染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＡＦプライマー（配列番号１）及びＡＲプライマー（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片１（４７９ｂｐ）を増幅した。
同様に、前記Ｋ７０１−Ａの染色体ＤＮＡを鋳型としてＣＦプライマー（配列番号３）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片２（６７９ｂｐ）を増幅した。
また、プラスミドＹＩｐ５（Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １９７９，  ｐ．１０３５−９．）を鋳型としてＢＦプライマー（配列番号５）及びＢＲプライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片３を増幅した。
なお、ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）を用いて行った。また、各ＰＣＲ産物の精製は、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。以下、特記しない限り、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製は全て同じキットを用いて実施した。
【００７１】
次に、前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片１、前記ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片３、及び前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片２の３つのＤＮＡ断片を、それぞれ５０ｎｇ／μＬに調整し、これを用いてＤＮＡ断片１：ＤＮＡ断片３：ＤＮＡ断片２＝１：２：１（体積比）の割合で混合し、これを鋳型としてＡＦプライマー（配列番号１）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いてフュージョンＰＣＲを行った。これにより、前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片１、前記ＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡ断片３、及び前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片２がこの順で結合した「コンストラクト１」を作製した。次に、コンストラクト１を含むＰＣＲ産物を鋳型として、ＡＦプライマー（配列番号１）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いて再度ＰＣＲを行い、コンストラクト１を更に増幅した。
【００７２】
前記Ｋ７０１−ＡをＹＰＤ液体培地［１質量％酵母エキス、２質量％ペプトン、２質量％グルコース］３ｍＬで３０℃にて一晩、前培養を行った。この前培養液５μＬを、前記ＹＰＤ液体培地１００ｍＬに添加し、３０℃にて一晩培養した。次いで、全量を集菌した後、０．１Ｍ  酢酸リチウム（ＬｉＯＡｃ）／ＴＥ（１０ｍＭ  トリス塩酸、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０）３０ｍＬに懸濁し、０．７２μｇ／μＬに調製した前記コンストラクト１を１０μＬ添加し、この懸濁物９０μＬを、４０ｇ／Ｌトリプトファンを添加したＳＤ固形培地［０．１７質量％アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まないニトロゲンベース（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、０．５質量％硫酸アンモニウム、２質量％グルコース、２質量％アガー］に接種し、３０℃で３日間培養した。ここで育成した酵母は、コンストラクト１で形質転換された形質転換体である。
【００７３】
＜ＡＴＧ１遺伝子ヘテロ変異の分離＞
ＡＴＧ１遺伝子とＵＲＡ３遺伝子とはＤＮＡの長さが異なるため、Ｆ１プライマー（配列番号７）及びＲ１プライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲ法で増幅したＰＣＲ産物の長さを確認することで形質転換の有無を確認することができる。
即ち、野生型（Ｋ７０１）又はＫ７０１−Ａの場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、５，３０８ｂｐに１本検出され、ＵＲＡ３遺伝子によるＡＴＧ１ヘテロ変異型の場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、５，３０８ｂｐ及び２，８４８ｂｐにそれぞれ１本ずつ検出され、ＵＲＡ３遺伝子によるＡＴＧ１ホモ変異型の場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、２，８４８に１本検出される（図１Ｃ参照）。
【００７４】
前記コンストラクト１で形質転換された形質転換体を更に、４０ｇ／Ｌトリプトファンを添加した前記ＳＤ固形培地に接種して育成した。育成したコロニーと、Ｆ１プライマー（配列番号７）及びＲ１プライマー（配列番号８）を用いて、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）によりコロニーＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の長さをアガロース電気泳動にて確認した。その結果より、５，３０８ｂｐ及び２，８４８ｂｐにそれぞれ１本のバンドが検出された株を、ＡＴＧ１ヘテロ変異株（以下、「Ｋ７０１−Ｂ」と称することがある）として分離した。
【００７５】
＜ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異株の作製＞
ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異株の作製の概略模式図を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
Ｋ７０１−Ａから常法により染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＡＦプライマー（配列番号１）及びＡＲプライマー２（配列番号９）を用いてＰＣＲを行い、ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片４（４８２ｂｐ）を増幅した。
同様に、前記Ｋ７０１−Ａの染色体ＤＮＡを鋳型としてＣＦプライマー２（配列番号１０）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片５（６８０ｂｐ）を増幅した。
また、プラスミドｐＲＳ３１４（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ  （１９８９）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：  １９−２７）を鋳型としてＢＦプライマー２（配列番号１１）及びＢＲプライマー２（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、ＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片６を増幅した。
【００７６】
次に、前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片４、ＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片６、及び前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片５の３つのＤＮＡ断片を、それぞれ５０ｎｇ／μＬに調整し、これを用いてＤＮＡ断片４：ＤＮＡ断片６：ＤＮＡ断片５＝１：２：１（体積比）の割合で混合し、これを鋳型としてＡＦプライマー（配列番号１）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いてフュージョンＰＣＲを行った。これにより、前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する上流領域を含むＤＮＡ断片４、前記ＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片６、及び前記ＡＴＧ１遺伝子のＯＲＦに隣接する下流領域を含むＤＮＡ断片５がこの順で結合した「コンストラクト２」を作製した。次に、コンストラクト２を含むＰＣＲ産物を鋳型として、ＡＦプライマー（配列番号１）及びＣＲプライマー（配列番号４）を用いて再度ＰＣＲを行い、コンストラクト２を更に増幅した。
【００７７】
前記Ｋ７０１−Ｂを前記ＹＰＤ液体培地３ｍＬで３０℃にて一晩、前培養を行った。この前培養液５μＬを前記ＹＰＤ液体培地１００ｍＬに添加し、３０℃にて一晩培養した。次いで、全量を集菌した後、前記ＬｉＯＡｃ／ＴＥ  ３０ｍＬに懸濁し、０．４１μｇ／μＬに調製した前記コンストラクト２を１５μＬ添加し、この懸濁物９０μＬを、前記ＳＤ固形培地（トリプトファンを含まない）に接種し、３０℃で３日間培養した。ここで育成した酵母は、コンストラクト２で形質転換された形質転換体である。
【００７８】
＜ＡＴＧ１遺伝子ホモ変異の分離＞
野生型（Ｋ７０１）又はＫ７０１−Ａの場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、前述の通り５，３０８ｂｐに１本検出され、ＴＲＰ１遺伝子によるＡＴＧ１ヘテロ変異型の場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、５，３０８ｂｐ及び２，７２７ｂｐにそれぞれ１本ずつ検出され、ＴＲＰ１遺伝子によるＡＴＧ１ホモ変異型の場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、２，７２７に１本検出され、ＵＲＡ３遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子によるＡＴＧ１ホモ変異型の場合、Ｆ１プライマー及びＲ１プライマーで増幅されるＰＣＲ産物のバンドは、２，８４８ｂｐ（ＡＴＧ１遺伝子のＵＡＲ３遺伝子への置換）及び２，７２７ｂｐ（ＡＴＧ１遺伝子のＴＲＰ１遺伝子への置換）に１本ずつ検出される（図２Ｃ参照）。
【００７９】
前記コンストラクト２で形質転換された形質転換体を更に、前記ＳＤ固形培地に接種して育成した。育成したコロニーと、Ｆ１プライマー（配列番号７）及びＲ１プライマー（配列番号８）を用いて、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）によりコロニーＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の長さをアガロース電気泳動にて確認した。その結果より、２，８４８ｂｐ及び２，７２７ｂｐにそれぞれ１本のバンドが検出された株を、ＡＴＧ１ホモ変異株（以下、「Ｋ７０１Δａｔｇ１」と称することがある）として分離した。
【００８０】
なお、ＵＲＡ３遺伝子によるＡＴＧ１ヘテロ形質株しか得られなかった場合は、その株を親株として、別の遺伝子（ここでは、ＴＲＰ１遺伝子）でもう一方のＡＴＧ１遺伝子を破壊することができる。
【００８１】
＜オートファジー機能の欠損の確認＞
Ｋ７０１Δａｔｇ１のオートファジー機能を以下の方法で確認した。
Ｋ７０１Δａｔｇ１を前記ＹＰＤ液体培地  ３ｍＬで３０℃にて一晩培養した後、集菌して蒸留水で洗浄し、前記ＳＤ液体培地  ３ｍＬに懸濁した。次に、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（和光純薬工業株式会社製）を添加し、３０℃で４時間振盪培養した。この培養液を用いて、光学顕微鏡（１，０００倍）にてオートファジックボディーの形態観察を行った。
その結果、Ｋ７０１Δａｔｇ１では、オートファジックボディーは観察されず、オートファジー機能が欠損していることが確認された。
【００８２】
（試験例１：清酒製造試験１）
実施例１で得られたオートファジー機能欠損酵母のＫ７０１Δａｔｇ１と親株のＫ７０１の醸造特性の違いを確認するため、普通酒仕込みによる清酒製造を小規模化した小仕込み試験を行った。
【００８３】
＜酵母懸濁液の調製＞
親株であるＫ７０１、実施例１で得られたＫ７０１Δａｔｇ１を前記ＹＰＤ液体培地で３０℃にて一晩振盪培養した。培養液から各株を集菌し、これを洗菌した後、水に懸濁し、各株の酵母懸濁液を調製した。これらをそれぞれ、以下の小仕込み試験に使用した。
【００８４】
＜小仕込み試験＞
掛米として精米歩合７７％のアルファ化米（セブンライス工業株式会社製）を、また麹米として精米歩合７０％の白鶴錦を使用し、表１に示す仕込み配合にて、１５℃一定の温度で総米１ｋｇの仕込みを行った。留添後１４日目で上槽した。なお、アルファ化米は、アルファ化米の重量に０．３を乗じた体積の水を外水として添加して使用した。
【００８５】
【表１】
2017046671.tif 000002
表１における掛米及び麹米は、いずれも白米重量換算した値で示す。
【００８６】
−製成酒の一般分析−
国税庁所定分析法に従って製成酒の日本酒度、アルコール度数、酸度、及びアミノ酸度（以下、「一般分析値」と称することがある）の一般分析を行った。結果を下記表２に示す。
【００８７】
【表２】
2017046671.tif 000003
【００８８】
−製成酒の香気成分の分析−
ヘッドスペース（Ｈｅａｄ  Ｓｐａｃｅ）法を用いたガスクロマトグラフィーにより、以下に示す分析条件にて製成酒の香気成分の分析を行った。結果を下記表３に示す。
−−分析条件−−
［ＧＣ］
・分析装置：ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ（株式会社島津製作所製）
・カラム：ＤＢ−６２４［長さ６０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚１．４０μｍ］（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）
・キャリアガス：Ｈｅ（２００℃、圧力１５０ｋＰａ）
・検出器：ＦＩＤ１（株式会社島津製作所製）、２５０℃
・ニードル温度：１８０℃
・カラム温度：４０℃
・オーブン温度パターン：４０℃で２分間保持、４０℃から２２０℃まで５℃／分で昇温、２２０℃から２５０℃まで３０℃／分で昇温、２５０℃で５分間保持
［Ｈｅａｄｓｐａｃｅ  ｓａｍｐｌｅｒ］
・装置：Ｔｕｒｂｏ  Ｍａｔｒｉｘ  ４０  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）
・オーブン温度：８０℃
・ニードル温度：１８０℃
・トランスファー温度：２００℃
・保温時間：３０分間
・加圧時間：３分間
・引き抜き時間：１分間
・キャリアガス圧力：３００ｋＰａ
【００８９】
【表３】
2017046671.tif 000004
【００９０】
次に、上記表３の結果より、酢酸エステルの生産効率（Ｅ／Ａ比）を算出した結果を下記表４に示す。酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比及び酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比は、それぞれ下記式により算出した。Ｅ／Ａ比が高い程、酢酸エステルの生産効率が良いことを表す。
・酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比＝酢酸イソアミルの濃度／（イソアミルアルコールの濃度＋活性アミルアルコールの濃度）×１００
・酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比＝酢酸イソブチルの濃度／イソブチルアルコールの濃度×１００
【００９１】
【表４】
2017046671.tif 000005
【００９２】
表３及び表４の結果より、親株（Ｋ７０１）、及びオートファジー機能欠損酵母（Ｋ７０１Δａｔｇ１）で得られた製成酒において、基質アルコールであるイソアミルアルコール、活性アミルアルコール、及びイソブチルアルコールの濃度は、いずれも差がなかった。一方、オートファジー機能欠損酵母で得られた製成酒の酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比は、親株で得られた製成酒の酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比の１．３倍であり、オートファジー機能欠損酵母で得られた製成酒の酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比は、親株で得られた製成酒の酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比の１．７倍であった。
以上の結果より、オートファジー機能欠損酵母により得られた普通酒仕込みによる製成酒は、酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルの生産効率が向上していることが分かった。
【００９３】
（試験例２：清酒製造試験２）
実施例１で得られたオートファジー機能欠損酵母と親株の醸造特性の違いを確認するため、吟醸仕込みによる清酒製造の小仕込み試験を行った。
【００９４】
＜小仕込み試験＞
掛米として精米歩合５０％の山田錦を、また麹米としても精米歩合５０％の山田錦を使用し、表５に示す仕込み配合にて総米８００ｇの仕込みを行った。温度条件は、初添は１２℃、中添は１１℃、留添以降は１０℃の条件で行った。留添後２８日目で上槽した。なお、酵母懸濁液は、試験例１に記載の方法で調製したものを使用した。
【００９５】
【表５】
2017046671.tif 000006
表５における掛米及び麹米は、いずれも白米重量換算した値で示す。
【００９６】
−製成酒の一般分析−
試験例１に記載の方法で、製成酒の日本酒度、アルコール度数、酸度、及びアミノ酸度の一般分析を行った。結果を下記表６に示す。
【００９７】
【表６】
2017046671.tif 000007
【００９８】
−製成酒の香気成分の分析−
試験例１に記載の方法で、製成酒の香気成分の分析を行った。結果を下記表７に示す。
【００９９】
【表７】
2017046671.tif 000008
【０１００】
次に、上記表７の結果より、試験例１に記載の式を用いて酢酸エステルの生産効率（Ｅ／Ａ比）を算出した結果を下記表８に示す。
【０１０１】
【表８】
2017046671.tif 000009
【０１０２】
表７及び表８の結果より、親株（Ｋ７０１）、及びオートファジー機能欠損酵母（Ｋ７０１Δａｔｇ１）で得られた製成酒において、基質アルコールであるイソアミルアルコール、活性アミルアルコール、及びイソブチルアルコールの濃度は、いずれも差がなかった。一方、オートファジー機能欠損酵母で得られた製成酒の酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比は、親株で得られた製成酒の酢酸イソアミルに関するＥ／Ａ比の１．６倍であり、オートファジー機能欠損酵母で得られた製成酒の酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比は、親株で得られた製成酒の酢酸イソブチルに関するＥ／Ａ比の２．８倍であった。
以上の結果より、オートファジー機能欠損酵母により得られた吟醸仕込みによる製成酒は、酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルの生産効率が向上していることが分かった。
【０１０３】
（試験例３：清酒製造試験３）
次に、原料米の精米歩合及び発酵温度の影響について検討した。
＜小仕込み試験＞
試験例２における掛米及び麹米の精米歩合、並びに温度条件を以下のように変えた以外は、試験例２と同様の方法で仕込みを行った。
（条件１）掛米：精米歩合３８％の山田錦、麹米：精製歩合３８％の山田錦、温度条件：初添は１２℃、中添は１１℃、留添以降は１０℃で行った。
（条件２）掛米：精米歩合７８％の山田錦、麹米：精製歩合７５％の山田錦、温度条件：初添は１２℃、中添は１１℃、留添以降は１０℃で行った。
（条件３）掛米：精米歩合３８％の山田錦、麹米：精製歩合３８％の山田錦、温度条件：１５℃一定で行った。
（条件４）掛米：精米歩合７８％の山田錦、麹米：精製歩合７５％の山田錦、温度条件：１５℃一定で行った。
【０１０４】
−製成酒の一般分析−
試験例１に記載の方法で、製成酒の日本酒度及びアルコール度数の一般分析を行った。結果を下記表９に示す。
【０１０５】
【表９】
2017046671.tif 000010
【０１０６】
−製成酒の香気成分の分析−
試験例１に記載の方法で、製成酒の香気成分の分析を行った。結果を下記表１０及び１１に示す。
【０１０７】
【表１０】
2017046671.tif 000011
【０１０８】
【表１１】
2017046671.tif 000012
【０１０９】
次に、上記表１０及び１１の結果より、試験例１に記載の式を用いて酢酸エステルの生産効率（Ｅ／Ａ比）を算出した結果を下記表１２に示す。
【０１１０】
【表１２】
2017046671.tif 000013
【０１１１】
表１０及び１１の結果より、いずれの条件下でも、親株（Ｋ７０１）、及びオートファジー機能欠損酵母（Ｋ７０１Δａｔｇ１）で得られた製成酒において、基質アルコールであるイソアミルアルコール、活性アミルアルコール、及びイソブチルアルコールの濃度には差がなかった。一方、オートファジー機能欠損酵母で得られた製成酒では、いずれの条件下でも酢酸イソアミル及び酢酸イソブチルの生産量が多く、Ｅ／Ａ比が顕著に高かった（表１２）。
【図１Ａ】
2017046671.tif 000014
【図１Ｂ】
2017046671.tif 000015
【図１Ｃ】
2017046671.tif 000016
【図２Ａ】
2017046671.tif 000017
【図２Ｂ】
2017046671.tif 000018
【図２Ｃ】
2017046671.tif 000019
【配列表】
2017046671000001.app