(57)【要約】【課題】害虫駆除成分のスクリーニング方法、害虫駆除剤、毒餌剤、および害虫抵抗性を有する遺伝子組み換え植物を提供する。【解決手段】本発明は、Ｈｅｎｔａｉ  ｆａｃｔｏｒ（Ｈｆ）の阻害物質を選択することを含む害虫駆除成分のスクリーニング方法、Ｈｆの阻害物質を含む害虫駆除剤、前記害虫駆除剤を含む毒餌剤、およびＨｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組み換え植物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｎｔａｉ  ｆａｃｔｏｒ（Ｈｆ）の阻害物質を選択することを含む、害虫駆除成分のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｈｆの阻害物質が、Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害する物質である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｈｆを発現する細胞と、Ｈｆの阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してＨｆをコードする遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程
を含む、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｈｆをコードする遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞と、候補物質とを接触させる工程、および、
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してレポーター遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程、
を含む、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｈｆの阻害物質を含む、害虫駆除剤。
【請求項６】
Ｈｆの阻害物質が、Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡまたはその発現ベクターである、請求項５に記載の害虫駆除剤。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の害虫駆除剤。
【請求項８】
ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列を含む、請求項７に記載の害虫駆除剤。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の害虫駆除剤を含む、毒餌剤。
【請求項１０】
Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組み換え植物。
【請求項１１】
ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子組み換え植物。
【請求項１２】
ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子組み換え植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、害虫駆除成分のスクリーニング方法、害虫駆除剤、毒餌剤、および害虫抵抗性を有する遺伝子組み換え植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幼若ホルモン（ＪＨ）は、昆虫の変態抑制、性成熟、寿命などに関わる重要なホルモンであり、脳の後部にあるアラタ体で合成され、分泌される。多くの昆虫の若齢幼虫期体内には高濃度のＪＨが存在しており、幼虫脱皮が繰り返されるが、それぞれの種に固有の終齢幼虫の大きさに達するとＪＨ濃度が著しく減少し、変態に至る。ＪＨの合成過程は前期経路と後期経路に分けられ、後期経路で機能するメチルトランスフェラーゼ（Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼ：ＪＨＡＭＴ）がＪＨ合成に重要であることが知られている。ＪＨＡＭＴの発現はＪＨ合成と相関しており、ＪＨＡＭＴの発現低下に伴いＪＨ量が著しく減少する。そのため、ＪＨＡＭＴの発現抑制が昆虫の変態に必須と考えられるが、その発現抑制機構はいまだ不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chieka Minakuchi, Toshiki Namiki, Michiyo Yoshiyama and Tetsuro Shinoda, RNAi-mediated knockdown of juvenile hormone acid O-methyltransferase gene causes precocious metamorphosis in the red flour beetle Tribolium castaneum. FEBS J. 275, 2919-2931 (2008).
【非特許文献２】Wenfeng Li, Zachary Y. Huang, Fang Liu, Zhiguo Li, Limin Yan, Shaowu Zhang, Shenglu Chen, Boxiong Zhong and Songkun Su, Molecular cloning and characterization of juvenile hormone acid methyltransferase in the honey bee, Apis mellifera, and its differential expression during caste differentiation. PLoS One 8, e68544 (2013).
【非特許文献３】Tetsuro Shinoda and Kyo Itoyama, Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11986-11991 (2003).
【非特許文献４】Ryusuke Niwa, Teruyuki Niimi, Naoko Honda, Michiyo Yoshiyama, Kyo Itoyama, Hiroshi Kataoka and Tetsuro Shinoda, Juvenile hormone acid O-methyltransferase in Drosophila melanogaster. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 714-720 (2008).
【非特許文献５】Marek Jindra, Subba R. Palli and Lynn M. Riddiford, The juvenile hormone signaling pathway in insect development. Annu. Rev. Entomol. 58, 181-204 (2013).
【非特許文献６】Jianhua Huang, Ling Tian, Cheng Peng, Mohamed Abdou, Di Wen, Ying Wang, Sheng Li and Jian Wang, DPP-mediated TGFβ signaling regulates juvenile hormone biosynthesis by activating the expression of juvenile hormone acid methyltransferase. Development 138, 2283-2291 (2011).
【非特許文献７】Laurel A. Raftery and David J. Sutherland, TGF-β Family Signal Transduction in Drosophila Development: From Mad to Smads. Developmental Biology 210, 251-268 (1999).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＲＮＡｉ法によりＴＧＦ−βファミリー遺伝子の遺伝子機能解析を行い、ＪＨＡＭＴの発現解析とＪＨ濃度の測定、およびＪＨ量の変化に依存した体サイズの変化を解析した。その結果、ＪＨの合成停止をもたらすＪＨＡＭＴの発現消失を誘導するＴＧＦ−βファミリー遺伝子を同定し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、Ｈｅｎｔａｉ  ｆａｃｔｏｒ（Ｈｆ）の阻害物質を選択することを含む害虫駆除成分のスクリーニング方法に関する。
【０００６】
一態様において、本発明は、Ｈｆの阻害物質を含む害虫駆除剤に関する。
【０００７】
一態様において、本発明は、前記害虫駆除剤を含む毒餌剤に関する。
【０００８】
一態様において、本発明は、Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組み換え植物に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規な害虫駆除成分のスクリーニング方法、害虫駆除剤、毒餌剤、および害虫抵抗性を有する遺伝子組み換え植物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】グリラス・ビマクラツス（Ｇｒｙｌｌｕｓ  ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）においてＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄの消失により得られた表現型（１）。ａ：ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照；写真左）またはＧｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡ（写真右）を３齢の１日目に注射した雄および雌成虫の表現型。Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡの注射後に生じた成虫は、早熟変態を示した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００１１】
ｂ、ｃ：ＤｓＲｅｄ２またはＧｂ’ｍａｄに対するＲＮＡｉで処理した成虫（雄および雌）の体長（ｂ）および体重（ｃ）。
【００１２】
ｄ：Ｇｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ幼虫において観察された過剰脱皮（３’−３’’−４ｔｈ−４’−４’’）の間の形態学的変化。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを３齢の１日目に注射した。３ｒｄ−４ｔｈ−５ｔｈに代えて、３ｒｄ−３’−３’’−４ｔｈ−４’−４’’−５ｔｈや３ｒｄ−３’−４ｔｈ−４’−４’’−４’’’−５ｔｈなどの発達を経た幼虫は、その後６齢で脱皮した。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は、対照の幼虫よりも顕著に小さかった。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は正常に４齢から８齢へ脱皮し、次いで成虫へ脱皮した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００１３】
ｅ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射することにより生じた成虫の変態。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は、大きな成虫に脱皮した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００１４】
【図１Ｂ】グリラス・ビマクラツスにおいてＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄの消失により得られた表現型（２）。ｆ〜ｈ：３齢の１日目にＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）を注射した３（ｆ）、４（ｇ）および５（ｈ）齢幼虫の側面の様子。胸部２（Ｔ２）および胸部３（Ｔ３）の翅芽（アスタリスク）の形態学的変化は正常に維持されていた。Ｔ１〜３：胸部１〜３。スケールバー：１ｍｍ。
【００１５】
ｉ：３齢の１日目にＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡを注射した６齢幼虫の翅芽（アスタリスク）の背面の様子。スケールバー：２ｍｍ。
【００１６】
ｊ〜ｍ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した過剰脱皮３’（ｊ）、３’’（ｋ）、４’（ｌ）および４’’（ｍ）齢幼虫の側面の様子。得られた３’〜３’’および４’〜４’’齢幼虫の翅芽（アスタリスク）の形状は、それぞれ３（ｆ）および４（ｇ）齢幼虫に非常に類似していた。
【００１７】
ｎ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した過剰脱皮４’’齢幼虫の背面の様子。スケールバー：２ｍｍ。
【００１８】
ｏ〜ｒ：３齢の１日目にＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）を注射した３（ｏ）、４（ｐ）、５（ｑ）および６（ｒ）齢幼虫の腹側の様子。腹部８（Ａｂｄ８）（矢頭）の産卵管（矢印）の形態学的変化はパネルｏ〜ｒでは正常に認められた。Ａｂｄ７、８；腹部７、８。スケールバー：１ｍｍ。
【００１９】
ｓ〜ｖ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した過剰脱皮３’（ｓ）、３’’（ｔ）、４’（ｕ）および４’’（ｖ）齢幼虫の腹側の様子。得られた３’〜３’’および４’〜４’’齢幼虫の腹部８（Ａｂｄ８）（矢頭）の産卵管（矢印）の形状は、それぞれ３（ｏ）および４（ｐ）齢幼虫に非常に類似していた。
【００２０】
【図１Ｃ】グリラス・ビマクラツスにおいてＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄの消失により得られた表現型（３）。ｗ、ｘ：ＤｓＲｅｄ２（対照）またはＧｂ’ｈｆに対するＲＮＡｉで処理した幼虫および成虫の体長（ｗ）および体重（ｘ）。
【００２１】
【図２Ａ】グリラス・ビマクラツスにおけるＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｄｐｐ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１転写物の発育に伴う発現プロファイル（１）。ａ〜ｄ：グリラス・ビマクラツスの頭部におけるＧｂ’ｈｆ（ａ）、Ｇｂ’ｄｐｐ（ｂ）、Ｇｂ’ｊｈａｍｔ（ｃ）およびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１（ｄ）の時間的発現のｑＰＣＲ解析。ｍＲＮＡレベルでの相対的な倍率変化をプロットし、３齢の１日目（Ｄ１  ３ｒｄ）の頭部における平均発現レベルを１に設定した。これらのｍＲＮＡのレベルを内部Ｇｂ’β−アクチンｍＲＮＡのレベルに正規化した。発育段階は、脱皮後の日数（Ｄ）で規定した。幼虫は、３齢から５齢の間は性別がなく、６齢から８齢の間および成虫段階で性別が分かれた（三角および点線が雄；四角および実線が雌）。Ｇｂ’ｈｆ  ｍＲＮＡレベルは、幼虫段階全ておよび成虫段階において雌雄の間に明らかな差はなかった。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２２】
【図２Ｂ】グリラス・ビマクラツスにおけるＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｄｐｐ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１転写物の発育に伴う発現プロファイル（２）。ｅ〜ｋ：７齢の３日目のＣＡ−ＣＣ（アラタ体−側心体）複合体におけるＧｂ’ｈｆ（ｅ）、Ｇｂ’ｂａｂｏｏｎ（ｆ）、Ｇｂ’ｄｐｐ（ｇ）、Ｇｂ’ｔｋｖ（ｈ）、Ｇｂ’ｊｈａｍｔ（ｉ）およびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１（ｊ）の発現を、ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションによって調べた。Ｇｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｂａｂｏｏｎ、Ｇｂ’ｄｐｐおよびＧｂ’ｔｋｖの発現は、ＣＡおよびＣＣでは認められたが、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１発現はＣＡに限定された。Ｇｂ’ｈｆセンスプローブを使用した対照実験の結果をｋに示した。
【００２３】
ｌ、ｍ：ＣＡ（ｌ）およびＣＣ（ｍ）におけるＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｄｐｐ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１の発現のｑＰＣＲ解析。ＲＮＡは７齢幼虫のＣＡおよびＣＣから収集した。Ｇｂ’ｊｈａｍｔの発現レベルを１に設定した。これらのｍＲＮＡのレベルを内部Ｇｂ’β−アクチンｍＲＮＡのレベルに正規化した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２４】
【図３Ａ】Ｇｂ’ｊｈａｍｔの発現およびＪＨ生合成に対するＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄ消失の効果（１）。ａ〜ｃ：ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを３齢の１日目に注射し、過剰脱皮３、３’、４および４’齢の１日目および５日目の頭部におけるＧｂ’ｈｆ（ａ）、Ｇｂ’ｊｈａｍｔ（ｂ）およびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１（ｃ）の転写レベルを測定した。３齢対照幼虫の１日目（Ｄ１  ３ｒｄ）の転写レベルを各グラフの１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２５】
ｄ：Ｇｂ’ｈｆまたはＤｓＲｅｄ２に対するＲＮＡｉで処理した３齢幼虫の５日目ならびに３’齢および４齢幼虫の１日目および５日目の頭部におけるＧｂ’ｂｒｋ  ｍＲＮＡの発現。３齢対照幼虫の５日目（Ｄ５  ３ｒｄ）の転写レベルを１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２６】
【図３Ｂ】Ｇｂ’ｊｈａｍｔの発現およびＪＨ生合成に対するＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄ消失の効果（２）。ｅ：４齢および６齢の１日目のＧｂ’ｍａｄ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１の発現に対する、ＲＮＡｉによるＧｂ’ｍａｄ低下の効果。Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡを３齢の１日目に注射し、４齢対照幼虫（Ｄ１  ４ｔｈ）の１日目のこれらの遺伝子の転写レベルを１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２７】
ｆ：４〜８齢の雄（三角および点線）ならびに雌（四角および実線）幼虫の体液中におけるＪＨ力価の発育に伴う変化。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２８】
ｇ：３齢でＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡまたはＧｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡで処理した幼虫の体液におけるＪＨ力価の測定。体液は、得られた３’齢および４齢のＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ幼虫の５日目、または４齢および６齢のＧｂ’ｍａｄ  ＲＮＡｉ幼虫の１日目に収集し、分析した。ＪＨ力価は、Ｇｂ’ｈｆ消失により３’齢および４齢の５日目において増加したが、Ｇｂ’ｍａｄ消失により４齢および６齢の１日目において減少した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００２９】
【図３Ｃ】Ｇｂ’ｊｈａｍｔの発現およびＪＨ生合成に対するＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄ消失の効果（３）。ｈ：ｊｈａｍｔ発現およびＪＨ作用の調節におけるＤｐｐ／Ｈｆシグナルの説明図。ｊｈａｍｔの発現は、ＣＡ細胞において２つのＴＧＦ−βファミリーメンバーの機能によって調節される。第１に、ｊｈａｍｔ遺伝子の転写は、Ｄｐｐ／Ｔｋｖ／Ｍａｄシグナル経路によって直接制御される。第２に、Ｈｆ／Ｂａｂｏ／Ｓｍｏｘシグナルは、ｂｒｋの発現を制御することによってｊｈａｍｔ発現を抑制する。ＣＡ細胞において、ＪＨＡＭＴはＪＨ酸をＪＨに変換し、生じたＪＨが体液中に放出される。ＪＨは、ＪＨ感受性脂肪体細胞においてＪＨ受容体として作用するＭｅｔを介してｂｒｏａｄ（ｂｒ）の発現抑制に関与し得る。
【００３０】
【図４Ａ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階においてＲＮＡｉによるＧｂ’ｍａｄおよびＧｂ’ｔｋｖの消失により得られた表現型（１）。ａ、ｂ：３齢幼虫の１日目にＧｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡ（ａの右）またはＧｂ’ｔｋｖ  ｄｓＲＮＡ（ｂの右）を注射した効果。ＲＮＡｉ幼虫は小さなサイズで発育し、７齢で早熟成虫変態を行った。スケールバー：１０ｍｍ。
【００３１】
【図４Ｂ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階においてＲＮＡｉによるＧｂ’ｍａｄおよびＧｂ’ｔｋｖの消失により得られた表現型（２）。ｃ：６齢Ｇｂ’ｍａｄ  ＲＮＡｉ幼虫の翅芽（アスタリスク）は異常な成長を示し、横に伸びた。スケールバー：２ｍｍ。
【００３２】
ｄ：Ｇｂ’ｍａｄ  ＲＮＡｉの６齢幼虫の産卵管の形態（矢印）は、対照（図７ｊ）よりも小さかった。スケールバー：１ｍｍ。
【００３３】
ｅ：Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡの注射により生じた早熟成虫。翅は、著しく縮小し、皺がよった。スケールバー：２ｍｍ。
【００３４】
ｆ：Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡの注射後に生じた成虫の産卵管は、先端で開裂し、異常に短くなった。スケールバー：２ｍｍ。
【００３５】
【図５Ａ】Ｇｂ’Ｈｆのアミノ酸配列およびグリラス・ビマクラツスにおける発現（１）。ａ：Ｇｂ’Ｈｆのアミノ酸配列（配列番号１）。予測されるプロセシング部位を下線で示す。Ｃ末端領域の保存されたシステイン残基をアスタリスクで示す。
【００３６】
ｂ：Ｇｂ’Ｈｆと、そのドロソフィラ・メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、トリボリウム・カスタネウム（Ｔ．ｃａｓｔａｎｅｕｍ）およびボンビックス・モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）のオルソログのＴＧＦ−βファミリードメインのアミノ酸配列（配列番号４〜７）のマルチプルアラインメント。
【００３７】
ｃ：グリラス・ビマクラツスのＴＧＦ−βファミリーメンバー間のペアワイズ比較。数字は、プロセシング部位からＣ末端までのアミノ酸の同一性（％）を表す。Ｃ末端領域において、Ｇｂ’ＨｆはＧｂ’アクチビンβに最も類似する（アミノ酸同一性４２％）。
【００３８】
【図５Ｂ】Ｇｂ’Ｈｆのアミノ酸配列およびグリラス・ビマクラツスにおける発現（２）。ｄ：グリラス・ビマクラツスの３齢、６齢および８齢幼虫の頭部、胸部１、胸部２および３、脚部ならびに腹部におけるＧｂ’ｈｆ発現の相対的倍率。３齢の頭部における平均発現レベルを１に設定した。Ｇｂ’ｈｆ  ｍＲＮＡの発現レベルを内部Ｇｂ’β−アクチンｍＲＮＡのレベルに正規化した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００３９】
【図６Ａ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階においてＲＮＡｉによるＧｂ’ｓｍｏｘおよびＧｂ’ｂａｂｏの消失またはＪＨアナログ（ＪＨＡ）処理後に得られた表現型（１）。ａ、ｂ：３齢幼虫の１日目に投与したＧｂ’ｓｍｏｘ  ｄｓＲＮＡ（ａの右）またはＧｂ’ｂａｂｏ  ｄｓＲＮＡ（ｂの右）の効果。３ｒｄ−４ｔｈ−５ｔｈに代えて、３ｒｄ−３’−３’’−４ｔｈ−４’−４’’−５ｔｈや３ｒｄ−３’−４ｔｈ−４’−４’’−５ｔｈなどの発達系を経たＲＮＡｉ幼虫は、その後、ＤｓＲｅｄ２  ＲＮＡｉ（対照；ａ、ｂの左）と比較して大きなサイズの成虫になった。スケールバー：１０ｍｍ。
【００４０】
ｃ：３齢におけるメトプレン（ＪＨＡ）注射の効果。３ｒｄ−３’−４ｔｈ−４’−５ｔｈなどの発達を経たＪＨＡ処理幼虫（ｃの右）は、その後、エタノール注射（対照；ｃの左）と比較して大きなサイズの成虫になった。スケールバー：１０ｍｍ。
【００４１】
【図６Ｂ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階においてＲＮＡｉによるＧｂ’ｓｍｏｘおよびＧｂ’ｂａｂｏの消失またはＪＨアナログ（ＪＨＡ）処理後に得られた表現型（２）。ｄ、ｅ：エタノール（対照）、メトプレンまたはＧｂ’ｓｍｏｘに対するＲＮＡｉで処理した幼虫および成虫の体長（ｄ）および体重（ｅ）。
【００４２】
【図７Ａ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階におけるＧｂ’ｈｆのＲＮＡｉによるノックダウン（１）。ａ、ｂ：Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを４齢の１日目に注射した。４ｒｄ−５ｔｈに代えて、４ｔｈ−４’−４’’−４’’’−５ｔｈなどの発達を経たＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ幼虫（ａの右）は、その後、ＤｓＲｅｄ２  ＲＮＡｉ（対照；ａの左）と比較して大きなサイズの成虫になった。４齢のＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉで得られた表現型は、３齢のＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した表現型と類似していた（ｂ）。スケールバー：１０ｍｍ。
【００４３】
ｃ：３齢または４齢幼虫へのＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡの注射後に生じた５齢幼虫に、再度Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した（図７Ｃ  ｎの矢頭）。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを２回投与した５齢幼虫は、５ｔｈ−６ｔｈ−７ｔｈ−８ｔｈ−成虫に代えて、５ｔｈ−５’−５’’または５ｔｈ−５’−６ｔｈなどの過剰脱皮を開始したが、その後発育を停止し、死滅した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００４４】
【図７Ｂ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階におけるＧｂ’ｈｆのＲＮＡｉによるノックダウン（２）。ｄ：５齢（左）および６齢（中央）対照幼虫ならびに５齢時にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを投与して得られた５’幼虫（右）。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを５齢幼虫の１日目に注射した。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は、５ｔｈ−６ｔｈ−７ｔｈ−８ｔｈ−成虫に代えて、５ｔｈ−５’−５’’または５ｔｈ−５’−６ｔｈなどの過剰脱皮をした後、死滅した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００４５】
ｅ〜ｈ：翅芽（ｅ、ｇ）および産卵管（ｆ、ｈの矢印）の発育に対する５齢時のＤｓＲｅｄ２  ＲＮＡｉ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉの効果。得られた５’齢幼虫における翅芽形態（ｇ）は異常で、産卵管（ｈ）は対照よりも小さかった。Ｔ１〜３；胸部１〜３。スケールバー：２ｍｍ（ｅ）；１ｍｍ（ｆ）。
【００４６】
ｉ〜ｌ：翅芽（ｉ、ｋのアスタリスク）および産卵管（ｊ、ｌの矢印）の発育に対する６齢時のＤｓＲｅｄ２  ＲＮＡｉ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉの効果。得られた６’齢幼虫における翅芽形態（ｋ）は異常で、産卵管（ｌ）は対照よりも小さかった。スケールバー：２ｍｍ（ｉ）；１ｍｍ（ｊ）。
【００４７】
ｍ：５齢幼虫の１日目にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した後のＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１転写物のレベルを、ｑＰＣＲ解析により調べた。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）を注射した５齢幼虫の５日目の各転写レベルを１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００４８】
【図７Ｃ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階におけるＧｂ’ｈｆのＲＮＡｉによるノックダウン（３）。ｎ：発育中の様々な段階においてＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉにより誘導された異なるライフステージおよび過剰脱皮を比較した図。
【００４９】
【図８】グリラス・ビマクラツスＪＨエステラーゼ（Ｇｂ’ｊｈｅ）の時間的発現。ａ：グリラス・ビマクラツスの頭部におけるＧｂ’ｊｈｅの時間的発現のｑＰＣＲ解析。ｍＲＮＡレベルでの相対的倍率の変化をプロットし、３齢の１日目（Ｄ１  ３ｒｄ）の平均発現レベルを１に設定した。これらのｍＲＮＡのレベルを内部Ｇｂ’β−アクチンｍＲＮＡのレベルに正規化した。発育段階は、脱皮後の日数（Ｄ）で規定した。幼虫は、３齢から５齢段階の間は性別がなく、６齢から８齢段階の間および成虫段階で性別が分かれた（三角および点線が雄；四角および実線が雌）。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００５０】
ｂ：ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを３齢の１日目に注射し、過剰脱皮３’、４’および４’’齢の１日目および５日目の頭部におけるＧｂ’ｊｈｅの転写レベルを測定した。４齢対照幼虫の１日目の転写レベルを１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。
【００５１】
【図９Ａ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階におけるＧｂ’ｍａｄまたはＧｂ’ｊｈａｍｔ  ｄｓＲＮＡを用いたデュアルＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ表現型の回復（１）。ａ、ｂ：Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡの注射により生じる過剰脱皮（ａ、ｂの中央）は、Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡ（ａの右）またはＧｂ’ｊｈａｍｔ  ｄｓＲＮＡ（ｂの右）の同時注射により阻害され、ほぼ正常な体サイズの成虫が最終的に形成された。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理対照（ａ、ｂの左）を比較のために示す。
【００５２】
【図９Ｂ】グリラス・ビマクラツスの幼虫段階におけるＧｂ’ｍａｄまたはＧｂ’ｊｈａｍｔ  ｄｓＲＮＡを用いたデュアルＲＮＡｉによるＧｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ表現型の回復（２）。ｃ、ｄ：Ｇｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｊｈａｍｔに対するデュアルＲＮＡｉで処理した幼虫および成虫の体長（ｃ）および体重（ｄ）。
【００５３】
ｅ：３齢幼虫の１日目にＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｊｈａｍｔのｄｓＲＮＡを注射した後のＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１転写物のレベルを、ｑＰＣＲ解析により調べた。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）を注射した５齢幼虫の５日目の各転写物レベルを１に設定した。データは平均±ｓ．ｄ．である。スケールバー；ａ、ｂでは１０ｍｍ。
【００５４】
【図１０】Ｇｂ’ｈｆ  全長配列のｄｓＲＮＡを注射することにより観察された過剰脱皮幼虫。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ（対照）またはＧｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡを３齢の１日目に注射した。ａ：ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は正常に成虫変態するのに対し、Ｇｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡ処理幼虫は成虫に変態できず、若齢幼虫で死亡した。スケールバー：１０ｍｍ。
【００５５】
ｂ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡを注射して得られた３’齢幼虫の側面の様子。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理幼虫（対照）が変態する時期において、Ｇｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡ処理幼虫の胸部２（Ｔ２）および胸部３（Ｔ３）の翅芽（アスタリスク）の形態は３齢幼虫に非常に類似していた。スケールバー：１ｍｍ。
【００５６】
ｃ：３齢の１日目にＧｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡを注射して得られた３’齢幼虫の腹側の様子。３’齢幼虫の腹部８（Ａｂｄ８）（矢頭）の産卵管（矢印）の形状は、３齢幼虫に非常に類似していた。スケールバー：１ｍｍ。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明のスクリーニング方法は、昆虫を対象とした害虫駆除成分をスクリーニングする。本明細書における「昆虫」とは、節足動物門、昆虫綱に属する生物を意味する。本明細書における「昆虫」の例としては、直翅目（バッタ目）、チョウ目、コウチュウ目、網翅目、半翅目（カメムシ目）に属する昆虫が挙げられる。
直翅目（バッタ目）に属する昆虫としては、以下が例示される：
キリギリス亜目に属する昆虫、好ましくは、コオロギ上科のコオロギ科に属する昆虫、より好ましくは、フタホシコオロギ属（コオロギ属）に属する昆虫；および、
バッタ亜目に属する昆虫、好ましくは、バッタ上科のバッタ科またはイナゴ科に属する昆虫、より好ましくは、トノサマバッタおよびコバネイナゴ。
チョウ目に属する昆虫としては、ヤガ科に属する昆虫、好ましくは、ハスモンヨトウおよびヨトウガが例示される。
コウチュウ目に属する昆虫としては、ゴミムシダマシ科に属する昆虫、好ましくは、コクヌストモドキが例示される。
網翅目に属する昆虫としては、ゴキブリ亜目に属する昆虫、好ましくは、ゴキブリ亜科に属する昆虫、より好ましくは、ゴキブリ属に属する昆虫が例示される。
半翅目（カメムシ目）に属する昆虫としては、以下が例示される：
カメムシ亜目に属する昆虫、好ましくは、カメムシ科に属する昆虫、より好ましくは、アオクサカメムシおよびチャバネアオカメムシ；および
ヨコバイ亜目に属する昆虫、好ましくは、アブラムシ上科のアブラムシ科に属する昆虫、より好ましくは、アブラムシ、コガネムシ、セジロウンカ、トビイロウンカ、およびヒメトビウンカ。
好ましい態様において、昆虫は以下から選択される：
直翅目（バッタ目）に属する昆虫、好ましくはキリギリス亜目に属する昆虫、より好ましくは、コオロギ上科のコオロギ科に属する昆虫、さらにより好ましくは、フタホシコオロギ属（コオロギ属）に属する昆虫；
コウチュウ目に属する昆虫、好ましくは、ゴミムシダマシ科に属する昆虫、より好ましくは、コクヌストモドキ；および
網翅目に属する昆虫、好ましくはゴキブリ亜目に属する昆虫、より好ましくは、ゴキブリ亜科に属する昆虫、さらにより好ましくは、ゴキブリ属に属する昆虫。
さらに好ましい態様において、昆虫は、直翅目（バッタ目）に属する昆虫、好ましくはキリギリス亜目に属する昆虫、より好ましくは、コオロギ上科のコオロギ科に属する昆虫、さらにより好ましくは、フタホシコオロギ属（コオロギ属）に属する昆虫である。
【００５８】
Ｈｅｎｔａｉ  ｆａｃｔｏｒ（Ｈｆ）は、ＴＧＦ−βファミリーに属するタンパク質である。本明細書におけるＨｆは、本発明の対象となる昆虫におけるあらゆるオルソログを包含する。グリラス・ビマクラツスのＨｆのアミノ酸配列を配列番号１に示す。本発明の対象となる昆虫におけるＨｆのオルソログのアミノ酸配列も公知であり、例えば、トリボリウム・カスタネウム（Ｔ．  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）（コクヌストモドキ）の配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＸＭ＿９６１７２６に、ボンビックス・モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）（カイコガ）の配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＸＭ＿０１２６９０９１４に開示されている）。Ｈｆはまた、Ｍｙｏｇｌｉａｎｉｎ、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＦ）１１、ＧＤＦ８、またはＭｙｏｓｔａｔｉｎと称されることもある。
【００５９】
Ｈｆの阻害物質には、Ｈｆの機能を阻害する物質、およびＨｆをコードする遺伝子（以下、「ｈｆ遺伝子」とも記載する）の発現を阻害する物質が含まれる。Ｈｆの機能を阻害する物質は、例えば、Ｈｆまたはその受容体であるＢａｂｏに結合し、ＨｆとＢａｂｏとの結合を阻害して、Ｈｆのシグナル伝達を阻害する物質である。
【００６０】
ｈｆ遺伝子の発現を阻害する物質には、ｈｆ遺伝子からのｍＲＮＡの発現を阻害する物質、およびｈｆ  ｍＲＮＡからのＨｆタンパク質発現を阻害する物質が含まれる。ｈｆ遺伝子の発現を阻害する物質には、ｈｆ遺伝子の、プロモーターまたはエンハンサーなどの転写調節配列に作用する物質が含まれる。また、ｈｆ遺伝子の発現を阻害する物質には、ｈｆ遺伝子の配列に基づき設計された、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、並びにこれらを発現するベクターが含まれる。
【００６１】
一態様において、本発明のスクリーニング方法は、
Ｈｆを発現する細胞と、Ｈｆの阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してｈｆ遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程
を含む。
【００６２】
候補物質は、低分子化合物、ペプチド、抗体、もしくは核酸分子、または微生物、植物、もしくは動物の細胞抽出物もしくは培養上清であってよい。候補物質は、低分子化合物、ペプチド、または抗体のライブラリーなど、ライブラリーの形態で提供されてもよい。
【００６３】
「Ｈｆを発現する細胞と、Ｈｆの阻害物質の候補物質とを接触させる工程」は、例えば以下のように実施することができる。Ｈｆは、脳やアラタ体において内在的に発現している。カイコにおいては、脳（ｂｒａｉｎ）−アラタ体（ＣＡ）−側心体（ＣＣ）複合体の器官培養法が確立している（下記文献１−４）。よって、まず、この方法に準じて対象とする昆虫において脳（ｂｒａｉｎ）−アラタ体（ＣＡ）−側心体（ＣＣ）複合体の器官培養を行う。そして、この器官培養系にＨｆの阻害物質の候補物質を添加することにより、「Ｈｆを発現する細胞と、Ｈｆの阻害物質の候補物質とを接触させる工程」を実施することができる。
1.Pratt, G.E., Tobe, S.S., Juvenile hormones radiobiosynthesised by corpora allata of adult female locusts in vitro. Life Sci. 14, 575-586 (1974) 
2.Kinjoh, T., Kaneko, Y., Itoyama, K., Mita, K., Hiruma, K., Shinoda, T., Control of juvenile hormone biosynthesis in Bombyx mori: Cloning of the enzymes in the mevalonate pathway and assessment of their developmental expression in the corpora allata. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 808-818 (2007) 
3.Kaneko, Y., Kinjoh, T., Kiuchi, M., and Hiruma, K., Stage-specific regulation of juvenile hormone biosynthesis by ecdysteroid in Bombyx mori. Mol. Cell. Endocrinol. 335. 204-210 (2011)
4.Kaneko, Y., Furuta, K., Kuwano, E., and Hiruma, K., An anti-juvenile hormone agent, ethyl 4-(2-benzylhexyloxy)benzoate, inhibits juvenile hormone synthesis through the suppression of the transcription of juvenile hormone biosynthetic enzymes in the corpora allata in Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 41. 788-794 (2011)
【００６４】
ｈｆ遺伝子の発現レベルは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００６５】
Ｈｆの阻害物質は、レポーターアッセイによって選択することもできる。一態様において、本発明のスクリーニング方法は、
ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子のヌクレオチド配列を含む細胞と、候補物質とを接触させる工程、および、
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してレポーター遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程、を含む。
【００６６】
「ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列」は当業者が適宜決定可能であるが、例えば、ｈｆ遺伝子の転写開始点から上流５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、または２ｋｂの配列を「ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列」として用いることができる。
【００６７】
「機能的に連結された」とは、天然においてｈｆ遺伝子の発現を誘導する分子に応答して、ｈｆ遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するように連結されていることを意味する。
【００６８】
レポーター遺伝子としては、限定はされないが、ＧＦＰ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子が例示される。
【００６９】
「ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子のヌクレオチド配列を含む細胞」は、例えば、細胞のゲノム上のｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列に機能的に連結されるように、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列がノックインされた細胞である。かかる細胞は、ゲノム編集技術であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、細胞のゲノム上のｈｆ遺伝子座にレポーター遺伝子を組み込むことにより、あるいは細胞のゲノム上のｈｆ遺伝子とレポーター遺伝子とを連結して融合タンパクとして発現するようにすることにより、得ることができる。細胞としては、ＮＩＳＥＳ−Ｂｏｍｏ−ＢＥＮ５（農業生物資源研究所・農業生物資源ジーンバンク・微生物遺伝資源部門・微生物遺伝資源利用マニュアル（１４）−昆虫培養細胞株−）（カイコ培養細胞株）を用いることができる。
【００７０】
「ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子のヌクレオチド配列を含む細胞と、候補物質とを接触させる工程」は、下記のとおり実施することもできる。まず、前記のとおりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによりレポーター遺伝子のヌクレオチド配列をノックインした昆虫の系統を作製し、この系統から脳（ｂｒａｉｎ）−アラタ体（ＣＡ）−側心体（ＣＣ）複合体を単離して器官培養を行う。この器官培養系を用いれば、レポーター遺伝子によりｈｆ遺伝子の発現をトレースすることができる。よって、この器官培養系にＨｆの阻害物質の候補物質を添加することにより、「ｈｆ遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子のヌクレオチド配列を含む細胞と、候補物質とを接触させる工程」を実施することができる。
【００７１】
昆虫の幼虫段階でＨｆを阻害すると、幼虫段階で死滅するか、あるいは、過剰脱皮を経て成虫となっても産卵官に異常を有し生殖不能となる。すなわち、本発明のスクリーニング方法により得られた害虫駆除成分は、Ｈｆ阻害による殺虫および繁殖抑制作用により、害虫駆除効果を発揮する。よって、本発明のスクリーニング方法により得られた害虫駆除成分は、害虫駆除剤の有効成分とすることができる。
【００７２】
一態様において、本発明の害虫駆除剤は、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む。ｄｓＲＮＡは、ｈｆ遺伝子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列およびその相補鎖を含み、昆虫に摂取されると昆虫体内でＲＮＡｉを誘導し、ｈｆ遺伝子の発現を阻害する。
【００７３】
ｄｓＲＮＡの長さは、特に限定されないが、例えば、約５０〜２０００ｂｐ、好ましくは約１００〜１０００ｂｐ、より好ましくは２００〜１０００ｂｐである。一態様において、ｄｓＲＮＡの長さは、約２００〜６００ｂｐ、より好ましくは約３００〜６００ｂｐである。
【００７４】
ｄｓＲＮＡの配列は、標的遺伝子の配列の全体または一部と１００％同一であってもよく、標的遺伝子に対するＲＮＡｉを誘導しうる限り、標的遺伝子の配列の全体または一部に対して欠失、置換、挿入を有する配列であってもよい。例えば、一態様において、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の配列の全体または一部と少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性をする配列を含み、標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する。当業者は、常套的な方法により、ＲＮＡｉを誘導するｄｓＲＮＡの配列を決定することができる。例えば、一般的に種間で保存されたタンパク質の機能ドメインを標的として設計するが、タンパク質のファミリーが多数存在し、機能ドメインの塩基配列の相同性が高い場合は、その領域以外で設計する。また、オフターゲットを回避するため、標的遺伝子のｄｓＲＮＡ配列が他の遺伝子と類似した配列でないことを確認する。
【００７５】
「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、ＤＤＢＪ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）ｖｅｒ．１２）を用いて求めることもできる。
【００７６】
本明細書における「ｄｓＲＮＡ」には、完全または部分的に二本鎖のＲＮＡが含まれる。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子に対するＲＮＡｉを誘導しうる限り、二本鎖部分の一方または両末端に短い一本鎖突出部（オーバーハング）を含んでいてもよく、内部に部分的に非相補的な領域を含んでいてもよい。
【００７７】
ｄｓＲＮＡは、別個の二本のＲＮＡ鎖で形成されていてもよく、部分的に自己相補的な配列を含む一本のポリヌクレオチドから形成されるステムループまたはヘアピン構造を有していてもよい。当業者は、ＲＮＡｉ誘導活性に影響しないループの配列を適宜決定することができる。
【００７８】
一態様において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２または３の配列、好ましくは配列番号２の配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有し、ｈｆ遺伝子の発現を阻害する活性を有する。
【００７９】
好ましい態様において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２または３の配列、好ましくは配列番号２の配列を含む。さらに好ましい態様において、ｄｓＲＮＡは配列番号２または３の配列、好ましくは配列番号２の配列からなる。
【００８０】
本発明の害虫駆除剤は、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現するベクターを含んでいてもよい。前記ベクターは、昆虫に摂取されると昆虫体内でｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現してＲＮＡｉを誘導し、害虫駆除効果を発揮する。
【００８１】
本発明の害虫駆除剤が適用される植物としては、アルファルファ、リンゴ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、マメ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、柑橘類、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ナス、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、レタス、レモン、メロン、オクラ、タマネギ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、カキ、パイナップル、ジャガイモ、カボチャ、ダイコン、コメ、ライ麦、ダイズ、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タバコ、トマト、スイカ、コムギなどが例示される。
【００８２】
本発明の害虫駆除剤は、保護対象の植物へ散布してもよく、害虫の餌に散布または配合してもよい。それゆえ、一態様において、本発明の害虫駆除剤を含む毒餌剤が提供される。
【００８３】
ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを遺伝子組み換えにより植物で発現させると、当該植物を摂取した害虫体内にｄｓＲＮＡが取り込まれ、ＲＮＡｉが誘導される。すなわち、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現させることにより、植物に害虫抵抗性を付与することができる。
【００８４】
遺伝子組み換えにより害虫抵抗性を付与しうる植物としては、アルファルファ、リンゴ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、マメ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、柑橘類、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ナス、イチジク、ブドウ、グレープフルーツ、レタス、レモン、メロン、オクラ、タマネギ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、カキ、パイナップル、ジャガイモ、カボチャ、ダイコン、コメ、ライ麦、ダイズ、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タバコ、トマト、スイカ、コムギなどが例示される。
【００８５】
本明細書における「遺伝子組み換え植物」は、害虫抵抗性を付与することが望まれるあらゆる成長段階の植物を含み、その種子をも包含する意味である。「遺伝子組み換え植物」には、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを植物全体で発現するものも、組織特異的に発現するものも含まれる。また、「遺伝子組み換え植物」には、前記ｄｓＲＮＡを構成的に発現するものも、特定の条件下で発現するものも含まれる。
【００８６】
遺伝子組み換え植物は、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現可能なベクターにより植物細胞を形質転換することで、得ることができる。前記ベクターは、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列とを含む。
【００８７】
ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーターなどの構成的プロモーター、または葉特異的プロモーター、茎特異的プロモーター、根特異的プロモーター、または種子特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターの制御下に発現させることができる。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ウイルスベクターなどが例示される。
【００８８】
ベクターは、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ウイルスベクター法などの周知の方法より植物細胞へ導入することができる。得られた形質転換細胞から常套的手法により植物体を再生することで、遺伝子組み換え植物を得ることができる。
【００８９】
本発明の遺伝子組み換え植物は、害虫駆除剤の原料とすることもできる。例えば、本発明の遺伝子組み換え植物を凍結乾燥等により処理して、ｈｆ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを得ることができる。また、処理した遺伝子組み換え植物を害虫の餌として用いることもできる。すなわち一態様において、本発明の害虫駆除剤を含む毒餌剤は、本発明の遺伝子組み換え植物から製造される。
【００９０】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は如何なる意味においても本実施例に限定されない。
【実施例】
【００９１】
実施例１
１．方法
動物
フタホシコオロギ、グリルス・ビマクラツス（Ｇｒｙｌｌｕｓ  ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ、以下、Ｇ．ビマクラツスとも記載する）の成虫および幼虫は、標準的条件下で２８℃、７０％で飼育した。
【００９２】
クローニング
コオロギのＤｐｐ／Ｈｆシグナル関連遺伝子は、３齢幼虫のｃＤＮＡ試料から、以下の遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした：Ｇｂ’ｈｆ  Ｆｗ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣ−３’）（配列番号８）およびＧｂ’ｈｆ  Ｒｖ（５’−ＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＡＴＣＧＡＣＡＡＣＣ−３’）（配列番号９）（ＴＧＦ−βファミリードメインに対する）；Ｇｂ’ｂａｂｏ  Ｆｗ（５’−ＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号１０）およびＧｂ’ｂａｂｏ  Ｒｖ（５’−ＴＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＧ−３’）（配列番号１１）；Ｇｂ’ｓｍｏｘ  Ｆｗ（５’−ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＣＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２）およびＧｂ’ｓｍｏｘ  Ｒｖ（５’−ＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＣ−３’）（配列番号１３）；Ｇｂ’ｄｐｐ  Ｆｗ（５’−ＴＴＡＴＧＴＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣＧ−３’）（配列番号１４）およびＧｂ’ｄｐｐ  Ｒｖ（５’−ＣＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡＧＧ−３’）（配列番号１５）；Ｇｂ’ｍａｄ  Ｆｗ（５’−ＣＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号１６）およびＧｂ’ｍａｄ  Ｒｖ（５’−ＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣ−３’）（配列番号１７）；Ｇｂ’ｔｋｖ  Ｆｗ（５’−ＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＴ−３’）（配列番号１８）およびＧｂ’ｔｋｖ  Ｒｖ（５’−ＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡ−３’）（配列番号１９）。Ｇｂ’ｈｆのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する推定完全長ｃＤＮＡ（８６４ｂｐ）は、Ｇｂ’ｈｆ−ＯＲＦ  Ｆｗ（５’−ＴＣＣＴＧＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＧＴＴ−３’）（配列番号２０）プライマーおよびＧｂ’ｈｆ  Ｒｖプライマーを用いて増幅した。Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１の一部分は、遺伝子特異的プライマー（Ｇｂ’ｊｈａｍｔ  Ｆｗ（５’−ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣ−３’）（配列番号２１）およびＧｂ’ｊｈａｍｔ  Ｒｖ（５’−ＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＡＴＴＡＧ−３’）（配列番号２２）；Ｇｂ’ＣＹＰ１５Ａ１  Ｆｗ（５’−ＧＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴ−３’）（配列番号２３）およびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１  Ｒｖ（５’−ＡＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＧ−３’）（配列番号２４））を使用して、ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲ条件はいずれも以下の通りである：９８℃２分３０秒、次いで９４℃３０秒４０サイクル、５５℃３０秒、７２℃１分、次いで７２℃５分。増幅後、ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、ＡＢＩ−３００を使用して配列決定した。ｃＤＮＡ断片を含有するこれらの組換えベクターを、ｄｓＲＮＡ合成およびＲＮＡプローブ合成のために使用した。
【００９３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ｄｓＲＮＡ合成のための鋳型ｃＤＮＡ断片は、前述の通り、ＲＴ−ＰＣＲにより調製した。このｄｓＲＮＡ合成のための鋳型（Ｇｂ’ｈｆ（３２３ｂｐ）、Ｇｂ’ｂａｂｏ（３８９ｂｐ）、Ｇｂ’ｓｍｏｘ（４１５ｂｐ）、Ｇｂ’ｄｐｐ（３３３ｂｐ）、Ｇｂ’ｍａｄ（３７９ｂｐ）、Ｇｂ’ｔｋｖ（３１３ｂｐ）およびＧｂ’ｊｈａｍｔ（５２３ｂｐ））を、Ｔ７プロモーター配列プライマーおよびＳｐ６プロモーター配列プライマーを用いて、５’末端側にＴ７を配置して増幅した。ｄｓＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して合成した。脱皮後２４時間以内の幼虫の腹側腹部に、２０μＭ濃度のｄｓＲＮＡを０．２〜０．５μｌの容量で注射した。ＲＮＡｉ実験では、ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡを陰性対照として注射した。デュアルＲＮＡｉは、２種類の標的遺伝子、Ｇｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｊｈａｍｔまたはＧｂ’ｈｆおよびＧｂ’ｍａｄのｄｓＲＮＡ混合物を注射することにより実施した。各ｄｓＲＮＡの最終濃度は、２０μＭに調整した。Ｇｂ’ｈｆに対するｄｓＲＮＡ（３２３ｂｐ）の配列を配列番号２に示す。
【００９４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡは、Ｇ．ビマクラツスの頭部からＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、大阪、日本）を使用して抽出した。全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。以下のｑＰＣＲプライマーを各プライマー濃度０．４μＭで使用し、ＡＢＩ  ７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃１０分、次いで９５℃１５秒、６０℃３０秒および７２℃３０秒４０サイクル反復の条件でＰＣＲを行った：Ｇｂ’ｈｆ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＧＣＣＧＣＴＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号２５）およびＧｂ’ｈｆ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＧＴＡＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＣ−３’）（配列番号２６）；Ｇｂ’ｄｐｐ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣ−３’）（配列番号２７）およびＧｂ’ｄｐｐ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＣＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧ−３’）（配列番号２８）；Ｇｂ’ｊｈａｍｔ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧ−３’）（配列番号２９）およびＧｂ’ｊｈａｍｔ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＴＧＴＡＡＧＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号３０）；Ｇｂ’ＣＹＰ１５Ａ１−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＣ−３’）（配列番号３１）およびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＣ−３’）（配列番号３２）；Ｇｂ’ｍａｄ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＣＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’）（配列番号３３）およびＧｂ’ｍａｄ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡ−３’）（配列番号３４）；Ｇｂ’ｊｈｅ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴ−３’）（配列番号３５）およびＧｂ’ｊｈｅ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＣＧＧＴＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＴＡＣＡＣ−３’）（配列番号３６）およびＧｂ’ｂｒｋ−ｑＰＣＲ  Ｆｗ（５’−ＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＴ−３’）（配列番号３７）およびＧｂ’ｂｒｋ−ｑＰＣＲ  Ｒｖ（５’−ＴＧＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＧ−３’）（配列番号３８）。グリルスβ−アクチン（Ｇｂ’アクチン）遺伝子を参照遺伝子として選択し、そのプライマー（５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧＴ−３’（配列番号３９）および５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＴ−３’（配列番号４０））を以前の報告から採用した。ｑＰＣＲ反応はいずれも、技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）としてトリプリケートで実施した。
【００９５】
インサイツハイブリダイゼーション
ＲＴ−ＰＣＲによって得られたＧｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｂａｂｏ、Ｇｂ’ｄｐｐ、Ｇｂ’ｔｋｖ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔまたはＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１のｃＤＮＡ断片に対するジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識アンチセンスＲＮＡプローブを、ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションに使用した。Ｇ．ビマクラツスのＣＣ−ＣＡ複合体をリンゲル溶液中で解体し、ＰＢＴ（ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００含有）中４％パラホルムアルデヒドで４℃で１時間固定してからＰＢＴで洗浄した。この組織をタンパク質キナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）５μｇ／ｍｌで室温で５分間処理してから、グルタルアルデヒド０．２％、トリトンＸ−１００  ０．１％およびパラホルムアルデヒド４％を含有する溶液で室温で２０分間再固定した。ハイブリダイゼーションは６０℃で一晩実施した。アルカリホスファターゼ反応は、室温で一晩実施した。
【００９６】
幼若ホルモン（ＪＨ）抽出
Ｇ．ビマクラツスの幼虫を解剖して体液（５μｌ）を収集し、ＪＨアナログであるフェノキシカルブ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、大阪、日本）を内部標準として含有するメタノール／イソオクタン（１：１、ｖ／ｖ）を用いて抽出した。体液−ＭｅＯＨ／イソオクタン溶媒比は、１：１０（ｖ／ｖ）であった。混合物を２０秒間ボルテックスし、室温で３０分間静置した。試料は、８，５００ｇで４℃で１５分間遠心した。イソオクタン相を氷上でマイクロ反応容器（ＳＩＧＭＡ）に移し、メタノール相をボルテックスし、１０，０００ｇにて４℃で３０分間遠心し、イソオクタン相と一緒にして、−２０℃で保存するか、または５０μｌまで濃縮してＬＣ−ＭＳ分析用にオートサンプラー用バイアルに移した。
【００９７】
液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）
ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）−ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒシステム（Ｗａｔｅｒｓ）にヴァンガードプレカラムで保護した５０ｘ２．１ｍｍ  Ｃ１８逆相カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ＯＤＳ−１．７μｍ；Ｗａｔｅｒｓ）を装着し、１００％メタノールで流速０．３ｍｌ／分で溶出した。質量分析法は、ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によってマイクロＴＯＦで以下の条件下で実施した：エレクトロスプレーキャピラリーは２．８ｋＶ、試料コーンは３０Ｖ、脱溶媒和およびイオン源温度はそれぞれ３５０℃および１２０℃に設定した。窒素の流速は、コーンでは５０Ｌ／ｈｒ、脱溶媒和では８５０Ｌ／ｈｒであった。標準ＪＨ  ＩＩＩのイオン化によって、［Ｍ＋ＣＨ２Ｏ］＋、［Ｍ＋ＯＨ］＋、［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンが生成した。ＪＨ、メトプレンおよびフェノキシカルブの定量は、［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンをモニターすることによって実施した。メトプレンの検量線を作成し、体液試料については同濃度の内部標準フェノキシカルブを含めた。次に、各試料のＪＨ力価をクロマトグラムデータの分析後に算出した。時間シークエンスおよびモニターしたイオンは以下の通りであった：０．５９分、ｍ／ｚ３３３（メトプレン）；０．４７分、ｍ／ｚ３２４（フェノキシカルブ）；０．４７〜０．５２分、ｍ／ｚ２８９（ＪＨ  ＩＩＩ）；０．４９〜０．５２分、ｍ／ｚ３０３（ＪＨ  ＩＩ）；０．４８〜０．５０分、ｍ／ｚ３１７（ＪＨ  Ｉ）。
【００９８】
ホルモン処理
ＪＨアナログであるメトプレンを新たに脱皮した３齢または５齢幼虫の腹側腹部に注射した。メトプレンをエタノール（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、大阪、日本）に溶解して１００μｇ／μｌとし、メトプレン溶液約０．２μｌ（約２０μｇ／幼虫）を注射した。同じ容量のエタノールを対照として注射した。
【００９９】
２．結果
ショウジョウバエにおいて、アラタ体（ＣＡ）におけるＤｐｐ／Ｔｋｖ／ＭａｄによるＴＧＦ−βシグナルが、脳由来神経伝達物質シグナルとｊｈａｍｔの転写変化とを結びつけること報告されている。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄｍ）ｄｐｐ（Ｄｍ’ｄｐｐ）が欠如していると、早期幼虫段階においても早熟変態が引き起こされ、受容体遺伝子であるＤｍ’ｔｋｖおよびシグナル伝達因子であるＤｍ’ｍａｄの突然変異体と類似の表現型を引き起こすことが報告された。Ｄｐｐシグナルがコオロギの変態の調節に関与するかを調べるため、Ｇｒｙｌｌｕｓ  ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ（Ｇｂ）Ｄｐｐ（Ｇｂ’ｄｐｐ）、Ｇｂ’ｔｋｖまたはＧｂ’ｍａｄに対するＲＮＡｉ解析を実施した。３齢幼虫に標的遺伝子の２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を注射した。幼体において、コオロギ幼虫のライフサイクルは８齢まで進み、最終齢（８齢）幼虫が脱皮して成虫となる。Ｇｂ’ｍａｄまたはＧｂ’ｔｋｖに対するＲＮＡｉで処理すると、幼虫は雌雄とも、最終齢の一つ前の７齢において早熟成虫変態を示した（図１ａ、図４ａ、Ｇｂ’ｍａｄについて雄ｎ＝１２／１５、雌ｎ＝１４／１６；および図４ｂ、Ｇｂ’ｔｋｖについて雄ｎ＝１０／１２、雌ｎ＝１２／１５）。また、Ｇｂ’ｍａｄ  ｍＲＮＡの消失は、６齢幼虫および早熟成虫段階における翅芽（図４ｃ、ｅ）および産卵管（図４ｄ、ｆ）の異形成を引き起こした。さらに、処理した成虫の全体的な体サイズおよび体重が減少した（図１ｂ、ｃ）。一方、Ｇｂ’ｄｐｐに対するＲＮＡｉの場合、ＲＮＡｉ処理幼虫においてＧｂ’ｄｐｐ転写物の量は著しく減少したが（データは示さず）、処理した幼虫は正常に発育し、成虫になった（データは示さず；ｎ＝３３）。
【０１００】
ショウジョウバエにおいては、Ｄｐｐ／Ｔｋｖ／Ｍａｄシグナル経路がＴＧＦ−β／アクチビン（ＴＧＦ−β／Ｂａｂｏｏｎ／Ｓｍｏｘ）シグナル経路と関連し、その関係は発育中も保存されることが知られているので、これは他のリガンドによる重複性によるものと推測した。Ｇｂ’ｄｐｐについて重複するリガンドを同定するために、以下のＡＢＣファミリーメンバーのコオロギホモログに対するＲＮＡｉを実施した：Ｇｂ’Ｈｆ、Ｉ型受容体Ｂａｂｏｏｎ（Ｇｂ’ｂａｂｏ）およびシグナル伝達因子Ｓｍｏｘ／Ｓｍａｄ２（Ｇｂ’ｓｍｏｘ）。対照（ＤｓＲｅｄ２  ＲＮＡｉ；ｎ＝３３）の幼虫は正常に脱皮し成虫となったが、Ｇｂ’Ｈｆに対するＲＮＡｉで処理した幼虫は成虫にならず、幼虫脱皮を繰り返した（図１ｄ）。そこで、このＡＢＣホモログを「Ｈｅｎｔａｉ（日本語で「変態」を意味する）ｆａｃｔｏｒ」（Ｈｆ）と称している。Ｇｂ’Ｈｆの予測アミノ酸配列は、ＡＢＣファミリーメンバーの特徴を含む（図５ａ、ｂ、ｃ）。
【０１０１】
３齢開始時（１日目）にＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射すると、幼虫５９匹中５２匹において幼虫の過剰脱皮（３’齢幼虫）が起こった。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを注射した幼虫では、ある幼虫齢から次の齢への形態移行が阻害されたが、各齢における過剰脱皮の回数は１〜３回に制限された（図１ｄ、ｅ）。６齢の幼虫が過剰脱皮後に成虫になったとき、その体サイズおよび体重は対照よりも顕著に大きかった（図１ｅ、ｗ、ｘ）。これらの場合、変態のための発育期間は対照の約２倍であった（図７ｎ）。３齢の間にＧｂ’ｂａｂｏまたはＧｂ’ｓｍｏｘに対するＲＮＡｉ実験を実施すると、類似の表現型が観察された（Ｇｂ’ｂａｂｏ：ｎ＝１０／１５；Ｇｂ’ｓｍｏｘ：ｎ＝１７／２２）（図６ａ、ｂ、ｄ、ｅ）。また、対照の幼虫は正常な翅芽（図１ｆ〜ｉ）と産卵管（図１ｏ〜ｒ）を有していたが、過剰脱皮幼虫では、翅芽（図１ｊ〜ｎ）および雌の産卵管原基（図１ｓ〜ｖ）の形態が長期間変化しなかった。これらの結果は、Ｇｂ’ｈｆに対するＲＮＡｉが「そのままの状態（ｓｔａｔｕｓ  ｑｕｏ）」を維持することを示す。その後、ＲＮＡｉの効果が消失して適切に脱皮すると、翅および産卵管は正常に形成された。
【０１０２】
Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡを４齢、５齢、または６齢幼虫に脱皮後２４時間以内に注射した場合も、「そのままの状態」の維持が認められた（図７ａ、ｂ（４齢）（５齢時のＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡの２回目の投与については図７ｃ）、ｎ＝１５／１５；図７ｄ（５齢）、ｎ＝１４／１５；図７ｋ、ｌ（６齢）、ｎ＝１０／１０）。これらの結果は、Ｇｂ’ｈｆの機能の１つが異なる幼虫齢の間に生じる脱皮の特徴を決定することであり、Ｇｂ’ｈｆの機能が欠如すると発育の停止および６齢幼虫での死滅が引き起こされることを示唆している（翅芽および産卵管の変化については図７ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ；Ｇｂ’ｈｆ転写物の相対量については図７ｍ；時間依存性については図７ｎを参照）。
【０１０３】
ＪＨＡであるメトプレンを３齢に適用した場合も、正常な幼虫の脱皮が阻害され、過剰脱皮が生じて大きな成虫が形成された（図６ｃ；ｎ＝１７／２３）。ＲＮＡｉにより得られた動物はＪＨＡの適用後に観察された動物と類似していたことから、Ｇｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉによる表現型は、一定のＪＨ力価によるものと推測した。
【０１０４】
次に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、Ｇｂ’ｈｆ  ｍＲＮＡの空間的および時間的発現パターンを測定した。Ｇｂ’ｈｆ  ｍＲＮＡは頭部および胸部１に特異的に高く（図５ｄ）、Ｇｂ’ｈｆ転写物の相対量はそれぞれの齢において周期的な変化を示し、非常に高いピークが３日目に出現することを見出した（図２ａ）。さらに、この相対量のピークの高さは、発育段階を通じて段階的な増加を示したが、成虫期にはゼロになった。Ｇｂ’ｊｈａｍｔ転写物の相対量も、頭部において周期的変化を示した（図２ｃ）。Ｇｂ’ｊｈａｍｔ転写物のピークは各齢の１日目に出現したが、その後、Ｇｂ’ｈｆの発現増加に続いて３日目には減少し、脱皮前の最終日には完全に消失した。この変化は、ＪＨサイクルに密接に結びついた脱皮に関連する可能性がある。一方、Ｇｂ’ｄｐｐ  ｍＲＮＡは、幼虫段階を通して頭部において構成的に発現した（図２ｂ）。ＪＨ生合成に必須のチトクロームＰ４５０遺伝子であるＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１の時間的な発現パターンでは、転写物の相対量のわずかな変化が認められ、特に、８齢の雌において高レベルの発現が認められた（図２ｄ）。これらの結果は、Ｇｂ’ｄｐｐがＧｂ’ｊｈａｍｔの発現調節に関与し、Ｇｂ’ｈｆがＧｂ’ｊｈａｍｔの発現の律速因子として作用することを示唆する。
【０１０５】
Ｇｂ’ｈｆ、Ｇｂ’ｂａｂｏ、Ｇｂ’ｄｐｐ、Ｇｂ’ｔｋｖ、Ｇｂ’ｊｈａｍｔおよびＧｂ’ＣＹＰ１５Ａ１が頭部のどこで発現するのかを調べるため、次に、ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションを実施した。これらの遺伝子は、７齢の３日目にアラタ体（ＣＡ）において優位に発現しており（図２ｅ〜ｋ）、このことはＣＡにおけるこれら転写物のｑＰＣＲ検出により確認された（図２ｌ、ｍ）。これらの結果は、ＣＡにおけるＧｂ’ｈｆがＧｂ’ｊｈａｍｔの発現およびＪＨ生合成の調節と関連することを示唆する。
【０１０６】
Ｇｂ’ｈｆとＧｂ’ｄｐｐの発現がいずれもＣＡにおいて検出されたので、これらのシグナルがＧｂ’ｊｈａｍｔ転写物の調節に関与するかを調べた。まず、Ｇｂ’ｈｆに対するＲＮＡｉが過剰脱皮幼虫の頭部において非常によく作用することを確認した（図３ａ）。この場合、Ｇｂ’ｊｈａｍｔの発現増加が過剰齢（３’−４ｔｈ−４’）の１日目に検出された。さらに、これらの過剰脱皮幼虫の５日目におけるＧｂ’ｊｈａｍｔ  ｍＲＮＡのレベルは、検出不可能な対照のレベルと比較して著しく高かった（図３ｂ）。一方、Ｇｂ’ＣＹＰ１５Ａ１転写物は、過剰齢のそれぞれにおいて顕著な変化は認められなかった（図３ｃ）。これに対して、Ｇｂ’ｍａｄ  ｄｓＲＮＡを３齢のうちに注射すると、Ｇｂ’ｍａｄおよびＧｂ’ｊｈａｍｔの転写物のレベルは、４齢および６齢のいずれの１日目においても減少したが、Ｇｂ’ＣＹＰ１５Ａ１  ｍＲＮＡのレベルには明らかな効果は認められなかった（図３ｅ）。
【０１０７】
さらに、その後のＧｂ’ｊｈａｍｔ発現抑制に関与するＧｂ’Ｈｆシグナル経路について調べた。最近の研究により、ショウジョウバエにおいてＤｐｐ応答と拮抗するＢｒｉｎｋｅｒ（Ｂｒｋ）と呼ばれる核タンパク質が発見された。そこで、Ｇｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉ処理幼虫におけるＧｂ’ｂｒｋのｍＲＮＡレベルについて調べた。Ｇｂ’ｂｒｋの発現は、３齢および過剰齢の５日目に著しく減少した（図３ｄ）。これにより、Ｇｂ’ｂｒｋ発現はＧｂ’Ｈｆシグナルによって誘導されること、Ｇｂ’Ｂｒｋは活性化Ｇｂ’Ｍａｄよりも優位でありＧｂ’ｊｈａｍｔ発現を抑制することが示唆された（図３ｈ）。
【０１０８】
ＲＮＡｉ実験の結果からＧｂ’ＨｆがＧｂ’ｊｈａｍｔの発現抑制に重要な役割を果たすことが示されたため、各幼虫齢の体液中におけるＪＨ濃度の依存性を調べたところ、ＪＨの産生の周期的変化が見出された（図３ｆ）。この変化は、Ｇｂ’ｊｈａｍｔの時間的発現プロファイルと一致した。最終齢（８齢）では、ＪＨは１日目でも低レベルに減衰し、その後７日目には合成されず、成虫へと脱皮した。
【０１０９】
次に、ＪＨ力価の周期的変化がＧｂ’ｈｆの機能に依存するかを調べた。Ｇｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡの注射によりＧｂ’ｊｈａｍｔ転写物が上昇した過剰齢（３’および４ｔｈ）の５日目に、ＪＨ力価を定量した。
【０１１０】
ＪＨ濃度は、Ｇｂ’ｈｆ  ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉより構成的に高レベルとなり（図３ｇ）、Ｇｂ’ｍａｄに対するＲＮＡｉにより低下した（図３ｇ）。このことから、Ｇｂ’ＭａｄおよびＧｂ’ＨｆがＧｂ’ｊｈａｍｔの発現調節を介してＪＨ生合成の制御に重要な役割を果たすことが示唆された（図３ｈ）。他方、ＪＨ分解の基本経路においてＪＨエステラーゼ（ＪＨＥ）が重要な役割を果たすことが多くの昆虫で報告されている。そこで、コオロギの幼虫および成虫の頭部におけるＧｂ’ｊｈｅ  ｍＲＮＡの発現パターンを調べたところ、Ｇｂ’ｊｈｅ  ｍＲＮＡは幼虫段階では低レベルであり、成虫頭部（特に雌）（図８ａ）、およびＧｂ’ｈｆ  ｄｓＲＮＡで処理した過剰脱皮幼虫（図８ｂ）でピークになることが見出された。この結果から、体液のＪＨ力価の増加には、Ｇｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉによって生じたＧｂ’ｊｈｅ  ｍＲＮＡの抑制が影響している可能性が示唆された。
【０１１１】
次に、Ｇｂ’ｈｆ  ＲＮＡｉによって生じたＪＨ力価の増加がＧｂ’ｍａｄまたはＧｂ’ｊｈａｍｔのＲＮＡｉノックダウンによって阻害され得るかを調べた。Ｇｂ’ｈｆとＧｂ’ｊｈａｍｔとの関係は、Ｇｂ’ｈｆとＧｂ’ｊｈａｍｔまたはＧｂ’ｍａｄの、２つの異なるｄｓＲＮＡの同時注射によるデュアルＲＮＡｉ実験によって調べた。過剰脱皮表現型は、Ｇｂ’ｊｈａｍｔ発現のデュアルＲＮＡｉノックダウンによって回復し、過剰脱皮がＧｂ’ｊｈａｍｔの発現変化によって引き起こされることが示唆された。これらの結果は、Ｇｂ’ＨｆシグナルがＧｂ’Ｄｐｐシグナルにより誘導されるＧｂ’ｊｈａｍｔの発現を抑制するように作用し、これによりＪＨ生合成を阻害し、その結果変態を引き起こすことを示唆している（Ｇｂ’ｍａｄ（ｎ＝９／１２）またはＧｂ’ｊｈａｍｔ（ｎ＝１５／１６）に対するデュアルＲＮＡｉについては図９ａ、ｂ；全体の体サイズについては図９ｃ、ｄ；転写物の相対量については図９ｅを参照）。
【０１１２】
実施例２
実施例１で用いたＧｂ’ｈｆに対するｄｓＲＮＡ（３２３ｂｐ）と同様に、Ｇｂ’ｈｆの全長配列のｄｓＲＮＡ（８６４ｂｐ）（配列番号３）を３齢開始時（１日目）に注射した場合も、幼虫の過剰脱皮が観察された。ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理幼虫は正常に成虫変態したのに対し、Ｇｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡ処理幼虫は成虫に変態できず、若齢幼虫で死亡した（図１０ａ）。また、ＤｓＲｅｄ２  ｄｓＲＮＡ処理幼虫（対照）が変態する時期において、Ｇｂ’ｈｆ  全長配列ｄｓＲＮＡ処理幼虫の胸部２（Ｔ２）および胸部３（Ｔ３）の翅芽の形態は３齢幼虫に非常に類似しており（図１０ｂ）、３’齢幼虫の腹部８（Ａｂｄ８）の産卵管（矢印）の形状は３齢幼虫に非常に類似していた（図１０ｃ）。
【０１１３】
本発明の態様を以下に例示する。
１．Ｈｅｎｔａｉ  ｆａｃｔｏｒ（Ｈｆ）の阻害物質を選択することを含む、害虫駆除成分のスクリーニング方法。
２．Ｈｆの阻害物質が、Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害する物質である、前記１に記載のスクリーニング方法。
３．Ｈｆを発現する細胞と、Ｈｆの阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してＨｆをコードする遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程
を含む、前記１または２に記載のスクリーニング方法。
４．Ｈｆをコードする遺伝子のプロモーターを含む配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む細胞と、候補物質とを接触させる工程、および、
前記候補物質が前記候補物質の非存在下と比較してレポーター遺伝子の発現を減少させた場合に、前記候補物質を害虫駆除成分として選択する工程、
を含む、前記１または２に記載のスクリーニング方法。
５．Ｈｆの阻害物質を含む、害虫駆除剤。
６．Ｈｆの阻害物質が、Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡまたはその発現ベクターである、前記５に記載の害虫駆除剤。
７．ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、前記６に記載の害虫駆除剤。
８．ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列を含む、前記７に記載の害虫駆除剤。
９．前記５〜８のいずれかに記載の害虫駆除剤を含む、毒餌剤。
１０．Ｈｆをコードする遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを発現する遺伝子組み換え植物。
１１．ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、前記１０に記載の遺伝子組み換え植物。
１２．ｄｓＲＮＡが配列番号２または３の配列を含む、前記１１に記載の遺伝子組み換え植物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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