(57)【要約】  【課題】糖類含有非可食原料に含まれる種々の発酵阻害物質の存在下でも、効率的に有機酸を生産することができる有機酸の製造方法を提供する。  【解決手段】有機酸生産能を有する微生物を、水性媒体中で、糖類含有非可食原料  に作用させることにより有機酸を生産させる工程を有する、有機酸の製造方法であって、該有機酸生産能を有する微生物として、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、およびフマレートヒドラターゼのそれぞれをコードする遺伝子、ホスホトランスフェラーゼシステムを構成するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が非改変株と比較して増強された微生物を用いることを特徴とする、有機酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸生産能を有する微生物を、水性媒体中で、糖類含有非可食原料  に作用させることにより有機酸を生産させる工程（以下、「発酵工程」という）を有する、有機酸の製造方法であって、
該有機酸生産能を有する微生物として、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、およびフマレートヒドラターゼをコードする遺伝子、ホスホトランスフェラーゼシステムを構成するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が非改変株と比較して増強された微生物を用いることを特徴とする、有機酸の製造方法。
【請求項２】
前記ホスホトランスフェラーゼシステムを構成するタンパク質をコードする遺伝子が、ｐｔｓＩ，  ｐｔｓＨ、およびｐｔｓＧからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
前記酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子が、トランスクリプショナルレギュレーターのｗｈｃＥ、チオレドキシンレダクターゼのｔｒｘＢ、およびシグマ因子のｓｉｇＨからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１に記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
前記糖類含有非可食原料が、リグノセルロース系バイオマスを糖化して得られる糖化物および／または廃糖蜜を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
前記糖類含有非可食原料が発酵阻害物質を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
前記糖化物が、発酵阻害物質を副生する糖化工程を経て生産される、請求項４に記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
前記糖化工程が、酸分解法、水熱分解法、亜臨界・超臨界水中分解法、および酵素法のいずれかを含む、請求項６に記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
前記有機酸が、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、および酢酸のいずれかである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項９】
前記水性媒体が、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガスからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１０】
前記発酵工程を、嫌気的雰囲気下で行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１１】
前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子の発現を増強された、有機酸生産能を有する微生物を用いた有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類を原料とした有機酸の発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスは、広く利用されており、また前記各プロセスを経て得られた生産物は、種々の工業原料として利用されている。
これら発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの原料として使用される糖類として、現在はサトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデなどの可食資源に由来するものが挙げられる。
【０００３】
しかしこれらの可食資源由来の糖類は、今後の世界人口増加による可食資源価格の高騰、および天候不順や気候変動による可食資源の供給不足といった懸念がある。また食料不足の際に、可食資源を食用用途と競合して工業原料に利用することに対する懸念もある。そこで、非可食資源や不純物を含有するより低純度の糖類などから、効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵生産原料や化学変換原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。
【０００４】
非可食資源から糖液を得る方法としては、非可食資源中のセルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法（特許文献１）や、非可食資源の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応により加水分解する方法（特許文献２）、または亜臨界や超臨界水による加水分解方法等が一般的に知られている。
【０００５】
しかし、これらの手法を用いた場合、非可食資源中のセルロース、ヘミセルロースが加水分解され、グルコースやキシロースといった糖が得られると共に、これらの糖の過分解反応なども進行するため、各種副生物も生成する。具体的には例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、シリンガアルデヒド等のアルデヒド化合物や、蟻酸、レブリン酸、バニリン酸、フェルラ酸、酢酸等のカルボン酸誘導体や、ベンゾキノン等の共役カルボニル化合物や、バニリン、グアヤコール等のフェノール性化合物等が生成する。
【０００６】
これらの副生物は、微生物を利用した発酵生産プロセスで反応を阻害する性質を有し、発酵生産性を低下させるものがあることが知られている（非特許文献１）。なお、前記のような作用を及ぼす物質を総称し、以下「発酵阻害物質」という。そのため、これらの発酵阻害物質の存在は、非可食資源由来の糖液を発酵原料として利用する際の大きな課題であった。
一方で、有機酸の生産性を向上させる微生物の改変はよく検討されている。例えば、非特許文献２では、微生物を利用した乳酸の発酵生産において、グルコースから乳酸への合成経路上の解糖系酵素であるＧＬＫやＰＦＫ、ＧＡＰＤＨを増強した微生物を用いることで、乳酸の生産性を向上させている。
【０００７】
また、特許文献３では、酵母を用いたエタノール発酵生産において、発酵阻害物質の一つである酢酸に対し、酢酸応答転写因子の遺伝子Ｈａａ１を増強することで酵母に対し発酵阻害耐性を付与した改変が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５９４号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１４／０３０７４５Ａ１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ２（１），２００９，Ｐ２６
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９７，２０１３，Ｐ６６９３−Ｐ６７０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、非可食資源から得られた糖液を原料とした際の、発酵阻害物質の影響を低減させるような微生物の改変はあまり知られていない。特許文献３では、発酵によって製造される発酵生産物はエタノールのみにとどまっており、有機酸生産に関する検討は一切なされていない。また、増強している遺伝子も酢酸応答遺伝子Ｈａａ１のみであり、アルデヒド化合物、酢酸以外のカルボン酸誘導体、共役カルボニル化合物やフェノール性化合物等といった発酵阻害物質に対して影響を及ぼし得る遺伝子に関する検討はされていない。
本発明の課題は、糖類含有非可食原料に含まれる種々の発酵阻害物質の存在下でも、効率的に有機酸を生産することができる有機酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、微生物を用いた有機酸の発酵生産において、後述の特定の遺伝子を増強した微生物が、発酵阻害物質を含む糖類含有非可食原料を利用した発酵生産において、発酵阻害耐性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］  有機酸生産能を有する微生物を、水性媒体中で、糖類含有非可食原料に作用させることにより有機酸を生産させる工程（以下、「発酵工程」という）を有する、有機酸の製造方法であって、該有機酸生産能を有する微生物として、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、およびフマレートヒドラターゼをコードする遺伝子、ホスホトランスフェラーゼシステムを構成するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が非改変株と比較して増強された微生物を用いることを特徴とする、有機酸の製造方法。
［２］  前記ホスホトランスフェラーゼシステムを構成するタンパク質をコードする遺伝子が、ｐｔｓＩ，ｐｔｓＨ、および  ｐｔｓＧからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］に記載の有機酸の製造方法。
［３］  前記酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子が、トランスクリプショナルレギュレーターのｗｈｃＥ、チオレドキシンレダクターゼのｔｒｘＢ、およびシグマ因子のｓｉｇＨからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］に記載の有機酸の製造方法。
［４］  前記糖類含有非可食原料が、リグノセルロース系バイオマスを糖化して得られる糖化物および／または廃糖蜜を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
［５］  前記糖類含有非可食原料が発酵阻害物質を含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
［６］  前記糖化物が、発酵阻害物質を副生する糖化工程を経て生産される、［４］に記
載の有機酸の製造方法。
［７］  前記糖化工程が、酸分解法、水熱分解法、亜臨界・超臨界水中分解法、および酵素法のいずれかを含む、［６］に記載の有機酸の製造方法。
［８］  前記有機酸が、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、および酢酸のいずれかである、［１］〜［７］のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
［９］  前記水性媒体が、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガスからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
［１０］  前記発酵工程を、嫌気的雰囲気下で行う、［１］〜［１０］のいずれかに記載の有機酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の有機酸の製造方法によれば、非可食資源由来の発酵阻害物質を含む糖類含有非可食原料を用いた有機酸の発酵生産であっても、有機酸の生産速度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨの構造を示す図。
【図２】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｐｔｓＩを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図３】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｆｕｍＣを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図４】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｐｇｋを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図５】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｗｈｃＥを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図６】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｔｒｘＢを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図７】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｇａｐＡを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図８】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｐｔｓＨを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図９】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｐｔｓＧを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図１０】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｓｉｇＨを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【図１１】大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨにｐｆｋを挿入したプラスミドの構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内であれば種々変更して実施することができる。
本発明は、有機酸生産能を有する微生物を、水性媒体中で、糖類含有非可食原料に作用させることにより有機酸を生産させる工程（以下、「発酵工程」という）を有する、有機酸の製造方法であって、有機酸生産能を有する微生物として、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、およびフマレートヒドラターゼのそれぞれをコードする遺伝子、ホスホトランスフェラーゼシステム（以下、ＰＴＳともいう）を構成するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が非改変型と比較して増強された微生物を用いることを特徴とする有機
酸の製造方法である（以下、「本発明の製造方法」ともいう）。
以下、本発明の製造方法について詳細に説明する。
【００１６】
＜糖類含有非可食原料＞
本発明の製造方法で用いる糖類含有非可食原料は、後述する糖類を含んでいる非可食原料であれば特に制限はないが、必要に応じて水等を含んでいてもよく、好ましくは水を含んでいてもよい。
本明細書において非可食原料とは、食用用途として用いられる可食原料以外であれば特に限定されず、通常であれば廃棄、焼却処理をされるものをいう。これらは食用用途と競合しないので、安定的な供給、資源の有効利用を図ることができる。非可食原料としては、具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、米ぬか、植物油カス、ササ、タケ、パルプ類、古紙、食品廃棄物、水産物残渣、家畜廃棄物等や、それらの処理物が挙げられる。また、砂糖の製造工程で発生する糖蜜から砂糖を回収した後に残る廃糖蜜も非可食原料として使用可能である。
糖類含有非可食原料としては、これらの非可食原料を単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１７】
糖類含有非可食原料としては、特に限定はされないが、例えば、１種類以上の糖類を構成成分として含む植物体またはその一部を糖類まで分解したもの、１種類以上の前記糖類を構成成分として含む植物体またはその一部から糖類を抽出したもの等を用いることができる。具体的には、後述するようなリグノセルロース系バイオマス分解原料、廃糖蜜等が好ましく用いられる。特に好ましくは、糖類含有非可食原料が、後述するリグノセルロース系バイオマスを糖化して得られる糖化物および／または廃糖蜜を含むことである。
本発明の効果を顕著に奏することから、糖類含有非可食原料としては後に詳述する発酵阻害物質を含有することが好ましい。
【００１８】
（糖類）
糖類含有非可食原料に含まれる糖類は、特に限定されず、いわゆる一般的な糖を用いることができるが、微生物が炭素源としても活用することができる糖が好ましい。
具体的には、グリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類等が挙げられる。
【００１９】
上述した糖類の中でも、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖類が好ましい。これらの中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類からなる群から選ばれる少なくとも一種がより好ましい。これらは自然界、植物の構成成分となっていることから豊富に存在し、原料の入手が容易なためである。
ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。ヘキソース、およびペントースを構成成分とする二糖類としては、スクロースが好ましい。グルコース、キシロース、スクロースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が容易なためである。
【００２０】
なお、本発明で用いる糖類含有非可食原料には、１種類の糖が単独で含有されていてもよいし、２種類以上の糖が含有されていてもよい。
本発明で用いる糖類含有非可食原料は、必要に応じて水等で希釈して糖の濃度を下げて用いてもよいし、濃縮して糖の濃度を高めて用いてもよく、反応開始後に、糖類含有非可食原料を追加することもできる。
【００２１】
本発明における糖類含有非可食原料中に含まれる糖類の濃度としては、糖類含有非可食原料の由来や、含有する糖の種類等によって大きく変動するため、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮して、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上であり、また、通常８０質量％以下、好ましくは７０質量％以下である。但し、糖類を２種類以上含む場合は、その合計の濃度を示す。
【００２２】
（リグノセルロース系バイオマス分解原料）
本発明の効果を顕著に奏することから、特に好ましい糖類含有非可食原料としてリグノセルロース系バイオマス分解原料を用いることができ、例えば、リグノセルロース系バイオマスの糖化物が挙げられる。即ち、糖類含有非可食原料としては、リグノセルロース系バイオマスを糖化したものが好ましい。
リグノセルロース系バイオマスとしては、バガス、コーンストーバー、麦わら、稲わら、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ササ、ススキ等の草木系バイオマスや、廃木材、オガ粉、樹皮、古紙等の木質系バイオマスなどを好適に用いることができる。中でも、大量に入手可能という点においてバガス、コーンストーバー、麦わらが好ましい。
【００２３】
（糖化工程）
本明細書において、リグノセルロース系バイオマスを糖化して糖化物を得る工程を糖化工程と称する。リグノセルロース系バイオマスの糖化とは、リグノセルロース系バイオマス中の多糖類をオリゴ糖、または単糖に分解することをいい、単糖がさらに過分解することを含む。糖化工程では、上記の糖化を促進するために、加水分解処理によってリグニンを除去または軟化させ、セルロースやヘミセルロースを取り出しやすくする前処理を行ってもよい。
【００２４】
本発明で用いる糖化方法としては、特に限定されず、例えば、酸分解法や水熱分解法、亜臨界・超臨界水中分解法、酵素法などが挙げられる。
酸分解法としてはさらに、濃硫酸や濃塩酸などの濃酸を使う濃酸法と希硫酸や希塩酸などを使う希酸法がある。
濃酸法とは、濃硫酸や濃硝酸を用いてリグノセルロース系バイオマスの主要成分であるセルロースやヘミセルロースを同時に糖化する方法で、例えば、「工業化学雑誌  ６０．５（１９５７）：５５０−５５４」に記載の方法がある。
【００２５】
希酸法とは、リグノセルロース系バイオマスを、希硫酸を用いて１５０〜１８０℃×加水分解処理することで、ヘミセルロースが加水分解される第一糖化工程と第一糖化工程後に固形分として得られるリグニンとセルロースからなる残渣を、希硫酸を用いて２３０℃〜２５０℃×１〜３分間加水分解する第二糖化工程からなる方法であり、例えば、ＷＯ２０１３／１８７３８５や「木質系バイオエタノールのための環境低負荷型生産技術の開発（Ｋ２２０４３）平成２２年度循環型社会形成促進科学研究費補助金：Ｋ２０２４  Ｋ２１４６  Ｋ２２０４３：総合研究報告書（２０１１）」に記載の方法がある。
【００２６】
水熱分解法とは、圧力をかけ加熱した水でバイオマスを処理する方法で、２００℃程度でヘミセルロースが選択的に加水分解され、２６０℃以上にすると残ったセルロースが加
水分解される。例えば、「日本エネルギー学会誌  ７７．３（１９９８）：２４１−２４７」に記載の方法がある。
亜臨界・超臨界水中分解法とは、亜臨界水、もしくは超臨界水中でセルロースを加水分解する方法で、例えば「Ｉｎｄ，Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３９，２８８３−２９９０（２０００）」に記載の方法がある。
【００２７】
酵素法とは、セルラーゼやヘミセルラーゼを用いてセルロースやヘミセルロースを分解する方法で、例えば、ＷＯ  ２０１３／１１１７６２Ａ１に記載の方法がある。
上記糖化方法は、単独で実施しても良いし、２つ以上を組み合わせて実施しても良い。
糖化工程においては、必要に応じて糖化の前に前処理を実施することが好ましい。前処理方法としては、具体的には、蒸煮法、アルカリ分解法、水蒸気爆砕法、希硫酸前処理法などが挙げられる。
【００２８】
蒸煮法とは、バイオマスに高温スチームを当て、高温高圧化にて蒸す方法である。蒸煮処理の処理温度としては、１４０〜２２０℃とすることが好ましい。蒸煮処理の処理時間としては、３〜２０分とすることが好ましい。
アルカリ分解法とは、アンモニアやライムなどのアルカリによる加水分解を利用した方法で、「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６．１８（２００５）：２００７−２０１３」や「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２３．４（２００７）：８４６−８５０」や「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６．１８（２００５）：１９９４−２００６」に記載の方法である。
【００２９】
水蒸気爆砕法とは、リグノセルロース系バイオマスを高温高圧下で、水蒸気で蒸煮した後、瞬間的に大気圧に開放し資料を破砕する方法で、特開２００６−２３９７２９に記載されている方法である。
希硫酸前処理法とは、植物バイオマスを希硫酸中に浸漬する方法である。希硫酸の濃度は、例えば０．２〜２％とすることができる。また、希硫酸処理においては、希硫酸に植物バイオマスを浸漬した状態で、例えば１４０〜２２０℃とすることが好ましい。また、希硫酸処理は、上記温度とした状態で３〜２０分間行うことが好ましい。
上記前処理方法は、単独で実施しても良いし、２つ以上を組み合わせて実施しても良い。また上記前処理工程と上記糖化工程は、それぞれ独立に実施してもよく、同時に実施してもよい。
【００３０】
（糖化物）
上記糖化工程を経て得られる糖化物は、糖化において多糖類が分解して生成した単糖を主成分とし、他に、分解されずに残ったオリゴ糖や多糖、および過分解して生成した副生物を含有する。
過分解して生成した副生物としては、特に限定されないが、例えばフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、シリンガアルデヒド等のアルデヒド化合物や、蟻酸、レブリン酸、酢酸等のカルボン酸誘導体が挙げられる。
【００３１】
また、上記糖化物は糖類が過分解されて生成する副生物以外に、リグノセルロースに含まれるリグニン等が分解して生成する副生物を含有し、特に限定されないが、例えばバニリン、グアヤコール等のフェノール性化合物やバニリン酸、フェルラ酸等のカルボンサン誘導体や、ベンゾキノン等の共役カルボニル化合物が挙げられる。
上記副生物は、微生物の発酵生産を阻害することが知られており、発酵阻害物質と言われている。本発明に製造方法においては、本発明の効果が顕著に表れる点で、糖化物が発酵阻害物質を副生する糖化工程を経て生産されることが好ましい。
【００３２】
（廃糖蜜）
また、本発明の効果が高いことから好ましい糖類含有非可食原料として、廃糖蜜が挙げられる。廃糖蜜とは、砂糖の製造工程で発生する糖蜜からの砂糖を回収する過程で生成する副産物であって、製糖過程における糖結晶化工程後に残った糖成分を含む溶液のことを指す。一般的に、糖結晶化工程は、複数回行うことが通常であり、結晶化の回数が多くなるに伴い、糖成分以外の製糖作物に由来する成分が廃糖蜜中に濃縮されるという特徴も有しており、その結果として、発酵阻害物質も多く含まれることが知られている。廃糖蜜に含まれる発酵阻害物質としては、上記発酵阻害物質と同様である。
【００３３】
（その他）
本発明で用いる糖類含有非可食原料は、本発明の効果が得られる範囲内で、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、特に限定されないが、例えば、非可食有原料から糖類を得た際に生じる、糖類以外の副生成物や不純物等が挙げられる。具体的には、糖類以外のカルボニル化合物、脂肪族共役アルコール等のアルコール化合物、キシリトール、リビトール、ソルビトール、イノシトール、グリセロール等の糖アルコール、アルカリ金属化合物、アルカリ土類金属化合物、窒素化合物、硫黄化合物、ハロゲン化合物、硫酸イオン等の無機化合物等が挙げられる。
【００３４】
＜有機酸生産能を有する微生物＞
本発明で用いる有機酸生産能を有する微生物（以下、「本発明の微生物」と称することがある。）は、目的とする有機酸を生産する能力を有する微生物であれば、特に限定はされない。本発明における「有機酸生産能を有する微生物」とは、該微生物を培地中で培養したときに、該培地中に有機酸を生成蓄積することができる微生物をいう。
【００３５】
本発明の微生物は、以下１）〜６）の特定の遺伝子群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が増強するように改変されていることを特徴とする。
１）ホスホグリセレートキナーゼ（以下、ＰＧＫとも呼ぶ）をコードする遺伝子（以下、ｐｇｋとも呼ぶ）
２）ホスホフルクトキナーゼ（以下、ＰＦＫとも呼ぶ）をコードする遺伝子（以下、ｐｆｋとも呼ぶ）
３）グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＡＰＤＨとも呼ぶ）  をコードする遺伝子（以下、ｇａｐＡとも呼ぶ）
４）フマレートヒドラターゼ（以下、ＦＨとも呼ぶ）をコードする遺伝子（以下、ｆｕｍＣとも呼ぶ）
５）ホスホトランスフェラーゼシステム（以下、ＰＴＳとも呼ぶ）を構成するタンパク質をコードする遺伝子
６）酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子
【００３６】
本発明者らの検討によれば、微生物による有機酸生産では、非可食原料由来の発酵阻害物質により上記遺伝子が転写阻害を受ける、あるいは、上記遺伝子から発現したタンパク質の働きが阻害を受けるため、有機酸を生産する代謝経路が阻害されて有機酸生産性が低下すると推測された。そこで、本発明の微生物では、発酵阻害物質の作用により遺伝子転写やタンパク質の働きが低減してしまうタンパク質をコードする遺伝子の発現を強制的に増強することにより、該微生物を用いて有機酸を製造する本発明の製造方法においては、非可食資源由来の発酵阻害物質の影響を低減して有機酸生産効率を高めることができる。
以下、本発明の微生物で改変される遺伝子について、詳細に説明する。
【００３７】
１）ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｋ）
「ｐｇｋ」とは、１，３−ビスホスホグリセリン酸へリン酸を転移させ、３−ホスホグリセリン酸を生成する反応を可逆的に触媒する活性（ＥＣ：２．７．２．３：以下、ＰＧＫ活性という）を有する解糖系の酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
ＰＧＫ活性は、例えば、Ｆｉｆｉｓらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７５，Ｐ３１１，１９７８）によって測定することができる。
【００３８】
２）ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋ）
「ｐｆｋ」とは、Ｄーフルクトースー６−リン酸へリン酸を転移させ、Ｄ−フルクトース−１，６−ビスリン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１１：以下、ＰＦＫ活性という）を有する解糖系の酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＰＦＫ活性は、例えば、Ｈｏｆｍａｎｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９０，Ｐ４９，１９８２）によって測定することができる。
【００３９】
３）グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇａｐＡ）
「ｇａｐＡ」とは、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸へリン酸を転移させ、１，３−ビスホスホグリセリン酸を生成する反応を可逆的に触媒する活性（ＥＣ：１．２．１．１２：以下、ＧＡＰＤＨ活性という）を有する解糖系の酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＧＡＰＤＨ活性は、例えば、Ｂｙｅｒｓらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．８９，Ｐ３２６，１９８２）によって測定することができる。
【００４０】
４）フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子（ｆｕｍＣ）
「ｆｕｍＣ」とは、フマル酸からリンゴ酸への水添反応を可逆的に触媒する活性（ＥＣ：４．２．１．２：以下、ＦＨ活性という）を有するＴＣＡ回路の酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＦＨ活性は、例えば、Ｇｅｎｄａらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０，Ｐ１１０２，２００６）によって測定することができる。
【００４１】
５）ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）を構成するタンパク質をコードする遺伝子
本発明におけるＰＴＳを構成するタンパク質をコードする遺伝子は、特に限定されないが、具体的にはｐｔｓＩ，ｐｔｓＨ，ｐｔｓＧ，ｐｔｓＳ，ｐｔｓＦなどが挙げられ、好ましくは、ｐｔｓＩ，ｐｔｓＨ，ｐｔｓＧ、より好ましくはｐｔｓＩが挙げられる。
「ｐｔｓＩ」とは、ホスホエノールピルビン酸のリン酸基をリン酸輸送タンパク質であるＨＰｒへ転移させる活性（ＥＣ：２．７．３．９：以下、ＰｔｓＩ活性という）を有するＰＴＳを構成するタンパク質（ＰＴＳＩともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＰＴＳＩ活性は、例えば、Ｊａｆｆｏｒらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３１，Ｐ９８８，１９７７）によって測定することができる。
【００４２】
「ｐｔｓＨ」とは、ＨＰｒのリン酸基をヘキソーストランスポーターやスクローストランスポーターへ転移させる活性を有するＰＴＳを構成するタンパク質（ＰＴＳＨともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＰＴＳＨ活性は、公知の一般的な方法により測定することができる。
「ｐｔｓＧ」とは、ＰＴＳを介してグルコースを細胞質内へ輸送する活性（ＥＣ：２．７．１．６９：以下、ＰＴＳＧ活性という）を有するＰＴＳを構成するタンパク質（ＰＴＳＧともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＰＴＳＧ活性は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９  Ｊａｎ；１７１（１）：２６３−７１に記載の方法により測定することができる。
【００４３】
「ｐｔｓＳ」とは、ＰＴＳを介してスクロースを細胞質内へ輸送する活性（ＥＣ：２．７．１．６９：以下、ＰＴＳＳ活性という）を有するＰＴＳを構成するタンパク質（ＰＴＳＳともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＰＴＳＳ活性は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９  Ｊａｎ；１７１（１）：２６３−７１に記載の方法により測定することが
できる。
「ｐｔｓＦ」とは、ＰＴＳを介してフルクトースを細胞質内へ輸送する活性（ＥＣ：２．７．１．６９：以下、ＰＴＳＦ活性という）を有するＰＴＳを構成するタンパク質（ＰＴＳＦともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＰＴＳＦ活性は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９  Ｊａｎ；１７１（１）：２６３−７１に記載の方法により測定することができる。
【００４４】
６）酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子
本発明における酸化ストレス応答因子をコードする遺伝子は、特に限定されないが、具体的には、ｓｉｇＨ，ｓｉｇＭ，ｗｈｃＥ，ｔｒｘＡ，ｔｒｘＢなどが挙げられ、より好ましくは、ｗｈｃＥ，ｔｒｘＢが挙げられる。
「ｓｉｇＨ」とは、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５４．
２（２０１１）：１０１−１１３」に記載されている通り、微生物における転写を制御するシグマ因子であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０．３の配列中にＮｃｇｌ０７３３の番号で登録されている遺伝子またはホモログ遺伝子である。
【００４５】
「ｓｉｇＭ」とは、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５４．
２（２０１１）：１０１−１１３」に記載されている通り、微生物における転写を制御するシグマ因子であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０．３の配列中にＮｃｇｌ２９８３の番号で登録されている遺伝子またはホモログ遺伝子である。
「ｗｈｃＥ」とは、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３３７．３（２００５）：７５７−７
６４」に記載されている通り、微生物の熱ストレスや酸化ストレス条件下での生存に関係するタンパク質をコードする遺伝子であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０．３の配列中にＮｃｇｌ０７３４の番号で登録されている遺伝子またはホモログ遺伝子である。
【００４６】
「ｔｒｘＡ」とは、チオール基を介した生体内における主要な抗酸化活性を有するタンパク質であるチオレドキシン（ＴＲＸＡともいう）をコードする遺伝子を意味する。ＴＲＸＡ活性は、公知の一般的な方法により測定することができる。
「ｔｒｘＢ」とは、チオレドキシンを還元する活性（ＥＣ：１．８．１．９：以下、ＴＲＸＢ活性という）を有するタンパク質であるチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲＸＢ）をコードする遺伝子を意味する。ＴＲＸＢ活性は、Ｐｉｇｉｅｔらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，Ｐ６３６７，１９７７）によって測定することができる。
【００４７】
「前記遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの発現が増強するように改変する」とは、野生株などの非改変株と比較して、前記遺伝子の発現量が増加したことを意味する。前記遺伝子の発現量は、非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上増強されていることが好ましく、２倍以上増強されていることがより好ましい。
また、野生株などの非改変株と比較して、前記遺伝子から発現される酵素の活性が増強した場合や通常の培養条件、例えば、糖類を主たる炭素源とする培養条件で培養した時と比較してこれらの酵素の活性が増強した場合も含む。前記タンパク質の活性は、非改変株または通常の培養条件と比較して、単位菌体重量当たり、１．５倍以上増強されていることが好ましく、２倍以上増強されていることがより好ましい。
前記遺伝子の発現が増強されたことは、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲなどによってｍＲＮＡの量を測定することなどによって確認することができる。
【００４８】
（本発明の微生物の作製方法）
前記遺伝子の発現を増強した株は、親株をＮ−メチル−Ｎ‘−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理やＵＶ
照射等によって、前記遺伝子の発現が増強した株を選択することによって得ることができる。
また、前記遺伝子を用いて改変しても良い。具体的には、染色体上の前記遺伝子を増幅したり、前記遺伝子におけるプロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。
【００４９】
前記遺伝子を用いて、それぞれの発現もしくは活性が増強するように改変する場合、用いることのできる遺伝子は特に限定されないが、例えば、
ｐｇｋ遺伝子は配列番号１の塩基番号１〜１２１８の塩基配列、
ｐｆｋ遺伝子は配列番号２の塩基番号１〜１０４１の塩基配列、
ｇａｐＡ遺伝子は配列番号３の塩基番号１〜１００５の塩基配列、
ｆｕｍＣ遺伝子は配列番号４の塩基番号１〜１４１０の塩基配列、
ｐｔｓＩ遺伝子は配列番号５の塩基番号１〜１７０７の塩基配列、
ｐｔｓＨ遺伝子は配列番号６の塩基番号１〜２７０の塩基配列、
ｐｔｓＧ遺伝子は配列番号７の塩基番号１〜２０５２の塩基配列、
ｐｔｓＳ遺伝子は配列番号８の塩基番号１〜１９８６の塩基配列、
ｐｔｓＦ遺伝子は配列番号９の塩基番号１〜２０６７の塩基配列、
ｓｉｇＨ遺伝子は配列番号１０の塩基番号１〜６２１の塩基配列、
ｓｉｇＭ遺伝子は配列番号１１の塩基番号１〜６０６の塩基配列、
ｗｈｃＥ遺伝子は配列番号１２の塩基番号１〜２７０の塩基配列、
ｔｒｘＡ遺伝子は配列番号１３の塩基番号１〜３２４の塩基配列、
ｔｒｘＢ遺伝子は配列番号１４の塩基番号１〜９５４の塩基配列、
に示す塩基配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来の遺伝子を挙げることができる。
【００５０】
また、これらの遺伝子は、上記塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または上記塩基は入れると９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのようなホモログであっても良い。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５１】
また、
ｐｇｋ遺伝子は配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＧＫ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｐｆｋ遺伝子は配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＦＫ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｇａｐＡ遺伝子は配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＧＡＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｆｕｍＣ遺伝子は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＦＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｐｔｓＩ遺伝子は配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＴＳＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｐｔｓＨ遺伝子は配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、
ｐｔｓＧ遺伝子は配列番号７のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＴＳＧ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｐｔｓＳ遺伝子は配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＴＳＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｐｔｓＦ遺伝子は配列番号９のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＰＴＳＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良く、
ｓｉｇＨ遺伝子は配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、
ｓｉｇＭ  遺伝子は配列番号１１のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、
ｗｈｃＥ遺伝子は配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、
ｔｒｘＡ遺伝子は配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、
ｔｒｘＢ遺伝子は配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有し、ＴＲＸＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。
【００５２】
また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２以外の細菌、または、他の微生物または動植物由来の前記遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来の前記遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジーなどに基づいて、それぞれの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したもの等を使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００５３】
前記１〜６）の遺伝子の発現を高めるためには、例えば、上記のようなＤＮＡを宿主微生物で機能しうるプラスミドに発現可能に組み込み、宿主微生物に導入すればよい。なお、前記のそれぞれの遺伝子は、別々のプラスミドを用いて導入しても良いし、同一プラスミドに両遺伝子を搭載して導入しても良い。
前記１〜６）の遺伝子をプラスミドに組み込む遺伝子発現カセットは、例えば以下の方法で構築しえる。遺伝子発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節因子を含み得る。プロモーターまたはターミネーターは、発現させる遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものであっても良い。プロモーターおよびターミネーターの選択は、当業者によって適宜選択され得る。例えば、プロモーターとしてはＨＣＥ（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなど、ターミネーターとしては、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターが挙げられる。
【００５４】
発現カセットは、必要に応じて、更なる調節因子（例えばオペレーターおよびエンハンサー）などをさらに含み得る。オペレーター、エンハンサーなどの発現調節因子についても当業者によって適宜選択されえる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
各種塩基配列を含むＤＮＡの合成および連結は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。
前記１〜６）の遺伝子、または該遺伝子を含む発現カセットは、プラスミドの形態のベクターに挿入され得る。ＤＮＡの取得が簡易化の点から、コリネ型細菌と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクターは例えば、コリネ型細菌および大腸菌の複製開始点および選択マーカーなどを有しえる。プラスミドベクターの例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７７，２００７，Ｐ５３３−５４１に記載のｐＣＨなどが挙げられる。ｐＣＨは、コリネバクテリウムと大腸菌のシャトルベクターであり、その模式図を図１に示す。
【００５５】
図１の記号は以下のとおりである。「ＨＣＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ」ＨＣＥプロモーター；「ｒｒｎＢＴ１Ｔ２  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター；「Ｋｍ」カナマイシン耐性マーカー；「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｐＡ」コリネバクテリウム複製起点；「Ｅ．ｃｏｌｉ  ｏｒｉ」大腸菌複製起点；「ＯＲＦ４」および「ＯＲＦ５」は共に、ｐＣＨの出発プラスミドであるコリネバクテリウムプラスミドｐＢＬ１の複製起点ｒｅｐＡの近傍に位置する機能未知ポリペプチドをコードするオープンリディングフレームである。ｐＣＨでは、ＨＣＥプロモーターとｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターとの間に前記１〜６）の遺伝子が挿入され得る。
【００５６】
本発明における、遺伝子の「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入するだけでなく、発現させることも意味する。「形質転換」は、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子または、ＤＮＡの導入、または形質転換のために、当業者が通常用いる手法が用いられ得、コリネバクテリウムに関しては、例えば、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）が用いられ得る。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で存在しても良く、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれても良い。
また、前記１〜６）の遺伝子の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上で前記遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。
以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、前記１〜６）の遺伝子の発現増強を達成することができる。
【００５７】
（有機酸）
本発明の微生物が生産する有機酸としては、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機酸であれば特に限定されないが、具体的には、酢酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、シス−アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸、レブリン酸、キナ酸、シキミ酸、アクリル酸、メタクリル等のカルボン酸類；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン等のアミノ酸類；安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族カルボン酸類；イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド等が挙げられる。
これらの中でも、カルボン酸およびアミノ酸が好ましく、カルボン酸がより好ましい。カルボン酸の中でも本発明の効果が顕著に見られることから、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、および酢酸のいずれかであることが特に好ましい。
【００５８】
（微生物）
本発明で用いる微生物は、目的とする有機酸を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉ
ｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
【００５９】
上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌である。
【００６０】
本発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ  Ｗ，Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｗ，Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＨ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１，Ｖｏｌ．４１，ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株と同一の株とする。
【００６１】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００６２】
本発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられる。また、本発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる
【００６３】
また、本発明に使用可能なアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。また本発明に使用可能なマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００６４】
また本発明で使用可能なバスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｂａｓｆｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙
げられる。また、本発明で使用可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）等が挙げられる。また、本発明で使用可能なザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）等が挙げられる。
【００６５】
また本発明で使用可能な糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等が挙げられる。このうち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）等が挙げられる。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属では、リゾパス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
【００６６】
また、本発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００６７】
上記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）等が挙げられる。また、上記シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。また、上記カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。また、上記ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等が挙げられる。
【００６８】
また上記クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。また上記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等が挙げられる。また上記チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
【００６９】
本発明で用いる微生物は、本来的に有機酸生産能を有する微生物であっても、育種により有機酸生産能を付与したものであってもよい。
例えば、上述した微生物にコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産能を付与したい場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減する改変、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強する改変などを必要に応じて行なう。
以下、製造の目的とする有機酸がカルボン酸である場合の本発明で用いる微生物につい
て具体的に説明する。
【００７０】
目的とする有機酸がカルボン酸である場合は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨとも呼ぶ）活性が低減するように改変された微生物を用いることが好ましい。ここで、「ＬＤＨ活性」とは、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２７）をいう。「ＬＤＨ活性が低減された」とは、非改変株と比較してＬＤＨ活性が低下していることをいう。ＬＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫａｎａｒｅｋらの方法（Ｋａｎａｒｅｋ  Ｌ，Ｈｉｌｌ  ＲＬ，Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１９６４，Ｖｏｌ．２３９，ｐ４２０２−４２０６）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００７１】
ＬＤＨ活性が低減した株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。  また、ＬＤＨをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊したり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。
ＬＤＨ活性が低減した株の具体的な作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ  Ａ，Ｔａｕｃｈ  Ａ，Ｊａｇｅｒ  Ｗ，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，Ｐｕｈｌｅｒ  Ａ，Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（１）
，ｐ６９−７３）等が挙げられる。
【００７２】
また、目的とする有機酸がカルボン酸である場合は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＰＣ活性」とは、ピルビン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：６．４．１．１）をいう。「ＰＣ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＰＣ活性が上昇していることをいう。ＰＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＰＣ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＦｉｓｈｅｒらの方法（Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＨ，Ｍａｇａｓａｎｉｋ  Ｂ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８４，Ｖｏｌ．１５８（１），ｐ５５−６２）により、ＰＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００７３】
ＰＣ活性が増強した株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＰＣ活性が増強した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＰＣをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、ｐｃ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、プラスミドを用いたり、公知の相同組換え法によって染色体上で多コピー化させたりすることなどによって達成できる。なお、ＰＣ活性の増強は、染色体上またはプラスミド上でｐｃ遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても達成できる。
【００７４】
ＰＣ活性の増強に用いるｐｃ遺伝子としては、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｐｃ遺伝子を使用
することもできる。微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＰＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７５】
上記のようにして単離されたＰＣをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＰＣ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＰＣ活性増強株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＰＣをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＰＣ活性増強株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００７６】
染色体上またはプラスミド上にＰＣ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｐｃ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
なお、本発明に用いる微生物は、有機酸生産能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００７７】
＜有機酸の製造方法＞
本発明の製造方法は、本発明の微生物またはその処理物を水性媒体中で、糖類含有非可食原料に作用させることにより、有機酸を生産させる工程（以下、「発酵工程」という。）を含むが、前記発酵工程の後に、生産された有機酸を回収する工程（以下、「回収工程」という。）を有することが好ましい。
本発明の製造方法に本発明の微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いてもよいが、発酵工程に先立ち、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。即ち、後述する種培養や本培養を行なうことで、本発明の微生物を予め増殖させた後に、発酵工程を行なうことができる。
なお、後述する種培養や本培養と、後述する発酵工程は、区別することなく、同時に行なうこともできる。また、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、糖類含有非可食原料と反応させることによって有機酸を生産させることもできる。
【００７８】
（種培養）
種培養は、本培養に供する前記微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物等が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
【００７９】
種培養においては、必要に応じて、前記培地に炭素源を添加してもよい。種培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００８０】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【００８１】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【００８２】
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
【００８３】
（本培養）
本培養は、後述する有機酸生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【００８４】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００８５】
また、本培養においては、前記培地に炭素源を添加することが好ましい。本培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロース
が好ましい。
【００８６】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
前記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記炭素源の減少にあわせ、炭素源を追加で添加してもよい。
【００８７】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【００８８】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
また、本培養においては、より有機酸の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
本培養後の菌体は、後述する有機酸生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【００８９】
＜発酵工程＞
発酵工程では、上述の有機酸生産能を有する微生物を水性媒体中、糖類含有非可食原料に作用させることにより、有機酸を生産させる。この発酵工程で起こる反応を、以下、「有機酸生産反応」という。
【００９０】
（水性媒体）
水性媒体とは、発酵工程における有機酸生産反応を行う水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、前記微生物またはその処理物と糖類含有非可食原料とを反応させることにより有機酸生産反応を行うことができる。本明細書において、水性媒体とは、反応容器に含まれる液体全てを意味する。
【００９１】
水性媒体としては、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００９２】
また、水性媒体には、例えば上述した糖類含有非可食原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。
【００９３】
水性媒体中における炭酸イオンまたは重炭酸イオンの濃度は、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。
【００９４】
有機酸生産反応中の水性媒体のｐＨは、用いる上記微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。
【００９５】
水性媒体のｐＨは、生産される有機酸が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。生産される有機酸が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。
【００９６】
（糖類含有非可食原料）
本発明で用いる糖類含有非可食原料の種類および好ましい糖類含有非可食原料の例は上述した通りである。
前記糖類含有非可食原料の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くすると生産性の点で有利であり、好ましい。水性媒体中に含まれる糖類含有非可食原料の濃度は、そこに含まれる糖類の濃度で、水性媒体に対して、通常５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、一方、通常３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下である。また、有機酸の生産反応の進行に伴う前記糖類含有非可食原料の減少にあわせて、糖類含有非可食原料の追加で添加してもよい。
【００９７】
（その他の条件）
有機酸生産反応に用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
有機酸生産反応の時間は、特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。
【００９８】
有機酸生産反応の温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常２℃〜２０℃、好ましくは７℃〜１５℃高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機酸生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【００９９】
有機酸生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なうことが好ましい。ここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
本発明の有機酸の製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
【０１００】
＜回収工程＞
本発明は、上記の有機酸生成反応により有機酸が生成し、反応液中に蓄積させることができる。蓄積させた有機化合物は、常法に従って、水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、蓄積させた有機酸がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸である場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化（晶析）あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、カルボン酸を回収することができる。
【実施例】
【０１０１】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
ＬＣの分析方法を以下に示す。
【０１０２】
（液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析１）
オートサンプラー：島津製作所  ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴ  
ポンプ：島津製作所製  ＬＣ−２０ＡＢ
カラムオーブン：島津製作所製  ＣＴＯ−２０ＡＣ
ＰＤＡ検出器：島津製作所製  ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（ＵＶ２１０ｎｍ）
ＲＩ検出器：島津製作所製  ＲＩＤ−１０Ａ
カラム：信和化工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ＩＤ×３００ｍｍ
温度：６０℃
移動相：０．１８質量％過塩素酸溶液  １．０ｍＬ／分
検出方法：ＵＶ（２１０ｎｍ），ＲＩ
注入量：１０μＬ
本実施例における、乳酸、コハク酸は前記ＬＣ分析１により定量した。
【０１０３】
（液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析２）
オートサンプラー：島津製作所  ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴ  
ポンプ：島津製作所製  ＬＣ−２０ＡＢ
カラムオーブン：島津製作所製  ＣＴＯ−２０ＡＣ
ＲＩ検出器：島津製作所製  ＲＩＤ−１０Ａ
カラム：島津製作所製  Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｐｂ  ７．８ＩＤ×２５０ｍｍ
温度：８０℃
移動相：超純水  ０．６ｍＬ／分
検出方法：ＲＩ
注入量：１０μＬ
本実施例における、グルコース、キシロースは、前記ＬＣ分析２により定量した。
コリネバクテリウム・グルタミカムを用いた全ての形質転換は、エレクトロポレーション法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１４４，ｐ１８１−１８５，１９９３）によって行った。
【０１０４】
［製造例１］
＜遺伝子増強プラスミドの構築＞
（Ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ビオチン  ２００μｇ、チアミン  １００μｇ、イーストエキストラクト  １ｇ、カザミノ酸  １ｇ、グルコース  ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を対数増殖期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１０５】
（Ｂ）遺伝子（ｐｇｋ，ｐｆｋ，ｇａｐＡ，ｆｕｍＣ，ｐｔｓＩ，ｐｔｓＨ，ｐｔｓＧ，ｓｉｇＨ，ｗｈｃＥ，ｔｒｘＢ）断片の調整
ｐｇｋ，ｐｆｋ，ｇａｐＡ，ｆｕｍＣ，ｐｔｓＩ，ｐｔｓＨ，ｐｔｓＧ，ｓｉｇＨ，ｗｈｃＥ，およびｔｒｘＢの各遺伝子断片の取得は、製造例１（Ａ）の方法で抽出したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１５から配列番号３４）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１０６】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｕｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５ｕｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ１０ｕｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ  各々プライマー
５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して５０μｌとした。）、反応温度条件：ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分／１ｋｂからなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は３分とした。なお、配列番号１５〜３４のプライマーを表１で示す組合せで、各遺伝子のクローニングに使用した。
【０１０７】
【表１】
2017192325.tif 000002
【０１０８】
ＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、表１の目的の塩基長の断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。
プライマー対は、フォワード（Ｆｗ）プライマーについて、付加配列−制限酵素部位−開始コドン―各遺伝子の５’末端配列、そしてリバース（Ｒｖ）プライマーについて、付加配列−制限酵素部位−終止コドン−各遺伝子の３’末端配列とした。
【０１０９】
（Ｃ）コリネ型細菌発現プラスミドの構築
製造例１（Ｂ）で調整したそれぞれの遺伝子断片を、大腸菌−コリネバクテリウムシャトルプラスミドｐＣＨ（その構成は図１に示す通りである）のＨＣＥプロモーターの下流にある制限酵素部位を用いて、ＨＣＥプロモーター下に組み込んだ。
ｐｔｓＩ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｐｔｓＩ、
ｆｕｍＣ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｆｕｍＣ、
ｐｇｋ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｐｇｋ、
ｗｈｃＥ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｗｈｃＥ、
ｔｒｘＢ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｔｒｘＢ、
ｇａｐＡ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｇａｐＡ、
ｐｔｓＨ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｐｔｓＨ、
ｐｔｓＧ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｐｔｓＧ、
ｓｉｇＨ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｓｉｇＨ、
ｐｆｋ断片をｐＣＨへ組み込んだプラスミドをｐＣＨ／ｐｆｋ
と命名した。これらのプラスミドの模式図を図２〜１１に示す。
【０１１０】
［製造例２］
＜形質転換コリネバクテリウム株の作製＞
製造例１（Ｃ）で作製したプラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の形質転換を行った。コントロールとして、プラスミドｐＣＨを用いた。得られた形質転換体を２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地〔トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、及び寒天  １５ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。この培地上に生育した株をそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ（コントロール）、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｐｔｓＩ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｆｕｍＣ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｐｇｋ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｗｈｃＥ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｔｒｘＢ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｇａｐＡ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｐｔｓＨ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｐｔｓＧ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｓｉｇＨ、
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨ／ｐｆｋ、
と命名した。
【０１１１】
［製造例３］
＜バガス糖化物の調整＞
実施例および比較例で用いる糖類含有非可食原料として、バガス糖化物を以下の方法で調整した。
まずバガスに硫酸及び水を加えて混合し、バガス混合物を得た。硫酸の添加量は、バガスの乾燥質量に対し２質量％であり、水の添加量は、前記バガス混合物の合計質量に対する含水率が６０質量％となるように調整した。次にドラムミキサー（杉山重工株式会社製）にて前記バガス混合物を２０分間混合、撹拌の後に取り出し、希硫酸処理混合物を得た。前記希硫酸処理混合物を加水分解装置（株式会社ヤスジマ製）にて、上記を投入し、１８０℃で１５分間煮沸処理した。得られた蒸煮処理物の含水率は６４．６質量％であった。前記蒸煮処理物を乾燥質量２００ｇ／Ｌとなるように糖化装置に仕込み、１０Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨを６．０に調整した。そこに糖化酵素として１５ＦＰＵ分のＣＴｅｃ２（ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、温度５０℃、撹拌速度２００ｒｐｍにて７２時間撹拌しながら、加水分解を行った。その後、遠心分離（１００００ｇ、１０分間）を行い、未分解セルロース及びリグニンを分解除去し、バガス糖化物を作製した。得られたバガス糖化物の組成を表２に示した。
【０１１２】
【表２】
2017192325.tif 000003
【０１１３】
［比較例１］
＜形質転換コリネバクテリウム株による乳酸生産試験＞
（Ａ）種培養
Ａ培地１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、試験管に１０ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０重量％グルコース水溶液を８００μｌ添加した。有機酸生産能を有する微生物として、製造例２で作製した株である、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＨを接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間培養した。
【０１１４】
（Ｂ）本培養
２Ｌの三角フラスコに５００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４０ｍＬ添加した後、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０２となるように接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで、１６時間培養した。
【０１１５】
（Ｃ）発酵工程（乳酸生産反応）
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を９２６０×ｇ、７分間の遠心分離により集菌した。集菌した菌体は、菌体懸濁培地［硫酸マグネシウム・７水和物：４００ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１６ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：１６ｍｇ、リン酸二水素アンモニウム１６８．８ｍｇ、リン酸水素二アンモニウム１５１．６ｍｇ、塩化カリウム２９８．２ｍｇ、Ｄ−ビオチン１６０μｇ、塩酸チアミン１６０μｇを蒸留水１Ｌに溶解］でＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）が２０になるように懸濁して菌体溶液を調製した。前記懸濁液を１００ｍｌに分注し、遠心分離（４℃、９２６０×ｇ、１０ｍｉｎ）により集菌した。得られた菌体を少量のＡ培地で懸濁後、１５０ｍＬ反応器に反応炭素源として基質溶液Ｂ（前記菌体懸濁培地と同じ濃度になるように各成分をバガス糖化物原液１００ｍｌに溶解）、または基質溶液Ｍ（前記菌体懸濁培地と同じ濃度になるように各成分を溶解し、かつ、前記バガス糖化物原液と同じ濃度になるようにＧｌｕｃｏｓｅとＸｙｌｏｓｅを溶解）と混合し、嫌気的雰囲気下において、３５℃、撹拌条件２００ｒｐｍで２４時間反応させた。なお、中和剤［アンモニア水（２８％）：９７ｇ、炭酸水素アンモニウム：３２ｇ、蒸留水２５０ｍＬに溶解］を加えることでｐＨは７．６に維持した。
その結果、２４時間後の乳酸蓄積量を表３に示した。
【０１１６】
［実施例１〜９］
表３に示す通り、有機酸生産能を有する微生物を製造例２で作製したそれぞれの菌株とし、（Ｃ）発酵工程における反応炭素源を選択した以外は、比較例１と同様にして乳酸生産を行った。
結果として、２４時間後の乳酸蓄積量を表３に示した。
【０１１７】
【表３】
2017192325.tif 000004
【０１１８】
［比較例２、実施例１０］
有機酸生産能を有する微生物を、表４に示す通り、製造例２で作製したそれぞれの菌株とし、（Ｃ）発酵工程における反応炭素源を選択し、かつ乳酸生産反応の時間を１０時間とした以外は比較例１と同様にして乳酸生産を行った。
結果として、１０時間後の乳酸蓄積量を表４に示した。
【０１１９】
【表４】
2017192325.tif 000005
【０１２０】
以上の通り、比較例１では糖類含有非可食原料である基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度が３８．９ｇ／Ｌになったのに対し、試薬糖原料である基質溶液Ｍを用いた時の乳酸の蓄積濃度は２５．８ｇ／Ｌと顕著に低下した。これは、糖類含有非可食原料として用いたバガス糖化物に含まれる発酵阻害物に起因する。一方で、実施例１〜９のｐｔｓＩ、
ｆｕｍＣ、ｐｇｋ、ｗｈｃＥ、ｔｒｘＢ、ｇａｐＡ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＧ、ｓｉｇＨの増強株において基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度は、比較例１の基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度に比べて、それぞれ、２１．３％、１６．７％、２５．６％、１６．３％、１７．８％、８．５％、１０．１％、９．３％、７．８％向上した。これは、上記の各遺伝子が増強されたことで、発酵阻害効果が低減されたからと考えられる。
【０１２１】
また、比較例２では糖類含有非可食原料である基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度が２４．２ｇ／Ｌになったのに対し、試薬糖原料である基質溶液Ｍを用いた時の乳酸の蓄積濃度は１８．７ｇ／Ｌと顕著に低下した。これは、糖類含有非可食原料として用いたバガス糖化物に含まれる発酵阻害物に起因する。一方で、実施例１０のｐｆｋの増強株において基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度は、比較例２の基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度に比べて、９．１％向上した。これは、ｐｆｋ遺伝子が増強されたことで、発酵阻害効果が低減されたからと考えられる。
【０１２２】
＜形質転換コリネバクテリウム株における各遺伝子発現の確認＞
実施例１〜６の有機酸生産試験開始後６ｈの反応液を１ｍＬ採取し、遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により菌体を回収した。回収した菌体は、公知のＲＮＡ抽出法によりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ化を行い、リアルタイム定量ＰＣＲ法によって遺伝子発現量を確認した。結果は表５に示した。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
実施例１〜６で用いた微生物における各遺伝子発現量は、非増強のＢｌａｎｋと比較して、それぞれ、９２倍、２９倍、３４倍、４．２倍、３．４倍、４４倍と有意に増強されていた。
【０１２５】
［実施例１１〜１３、比較例３］
＜形質転換コリネバクテリウム株によるコハク酸生産＞
表６に示す通り、有機酸生産能を有する微生物を製造例２で作製したそれぞれの菌株とし、（Ｃ）発酵工程における反応炭素源を選択した、かつコハク酸生産反応の時間を６時間とした以外は、比較例１と同様にして乳酸生産を行った。
結果として、６時間後のコハク酸蓄積量を表６に示した。
【０１２６】
【表６】
2017192325.tif 000007
【０１２７】
以上の通り、比較例３では糖類含有非可食原料である基質溶液Ｂを用いた時のコハクの蓄積濃度が１．８５ｇ／Ｌになったのに対し、試薬糖原料である基質溶液Ｍを用いた時の乳酸の蓄積濃度は１．０７ｇ／Ｌと顕著に低下した。これは、糖類含有非可食原料として用いたバガス糖化物に含まれる発酵阻害物に起因する。一方で、実施例１１〜１３のｆｕｍＣ，ｐｇｋ，ｗｈｃＥの増強株において基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度は、比較例２の基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度に比べて、それぞれ、３７．４％、４８．６％、２９．０％向上した。これは、上記の各遺伝子が増強されたことで、発酵阻害効果が低減されたからと考えられる。
【０１２８】
［実施例１４、比較例４］
表７に示す通り、有機酸生産能を有する微生物を製造例２で作製したそれぞれの菌株とし、（Ｃ）発酵工程における反応炭素源を選択した、かつコハク酸生産反応の時間を１０時間とした以外は、比較例１と同様にして乳酸生産を行った。
結果として、１０間後のコハク酸蓄積量を表６に示した。
【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
比較例４では糖類含有非可食原料である基質溶液Ｂを用いた時のコハクの蓄積濃度が３．２８ｇ／Ｌになったのに対し、試薬糖原料である基質溶液Ｍを用いた時の乳酸の蓄積濃度は２．３１ｇ／Ｌと顕著に低下した。これは、糖類含有非可食原料として用いたバガス糖化物に含まれる発酵阻害物に起因する。一方で、実施例１４のｐｆｋの増強株において基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度は、比較例４の基質溶液Ｂを用いた時の乳酸の蓄積濃度に比べて、２０．８％向上した。これは、ｐｆｋ遺伝子が増強されたことで、発酵阻害効果が低減されたからと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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