(57)【要約】      （修正有）【課題】膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するためのデンドリマーコンジュゲート、膜におけるレベル／細孔構造を決定する方法、並びにデンドリマーコンジュゲートを含むキットの提供。【解決手段】膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するための方法であって、デンドリマーとコンジュゲートさせた一本鎖ＤＮＡ（デンドリマーコンジュゲート）を含むチャレンジ溶液を微細孔膜に通して、デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を用意するステップとを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するための方法であって、
（ａ）  デンドリマーとコンジュゲートさせた一本鎖ＤＮＡ（デンドリマーコンジュゲート）を含むチャレンジ溶液を微細孔膜に通して、前記デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を用意するステップと、
（ｂ）  同体積の
（ｉ）  デンドリマーコンジュゲートを含む前記チャレンジ溶液、及び
（ｉｉ）  デンドリマーコンジュゲートを含む前記透過溶液
を得るステップと、
（ｃ）  （ｉ）をＰＣＲ試薬と合わせてチャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意し、（ｉｉ）をＰＣＲ試薬と合わせて透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意するステップと、
（ｄ）  前記チャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び前記透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬のそれぞれを使用し複数のＰＣＲサイクルを実行して、前記一本鎖ＤＮＡを増幅するステップと、
（ｅ）  デンドリマーコンジュゲート濃度と相関する一本鎖ＤＮＡ濃度を測定するステップと、
（ｆ）  前記チャレンジ溶液における前記デンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｏ）を定量し、
前記透過溶液における前記デンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｐ）を定量するステップと、
（ｇ）  前記ｑｕａｎｔＣｐ対前記ｑｕａｎｔＣｏの比較に基づいて、前記膜における前記保持レベル及び／又は前記細孔構造を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＰＣＲサイクルがｑＰＣＲサイクルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｇ）が、ｑｕａｎｔＣｐとｑｕａｎｔＣｏとの対数減少値を比較することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記デンドリマーコンジュゲートは、一本鎖ＤＮＡ対デンドリマーが１：１の比である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
一定流速で前記チャレンジ溶液を前記微細孔膜に通すステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
一定圧で前記チャレンジ溶液を前記微細孔膜に通すステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）が、
複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、前記反応チャンバーがチャネルを介して前記リザーバーに連結されており、前記反応チャンバーの少なくとも一部がプライマーを含む、回転式円形カートリッジと、
少なくとも２通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも２つの別個のゾーンを有する加熱プレートと、
を備える装置を使用することを含み、
前記方法が、
プライマーを除く、増幅反応を行うためのデンドリマーコンジュゲート及びＰＣＲ試薬を含有する流体で、前記リザーバーを少なくとも部分的に満たすステップと、
前記プライマーを含む前記反応チャンバーに前記流体を分配するステップと、
前記回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、前記加熱プレートの前記少なくとも２つの別個のゾーンにより規定された前記少なくとも２通りの温度にするステップであって、前記一本鎖ＤＮＡが増幅される、ステップと
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記加熱プレートが、少なくとも３通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも３つの別個のゾーンを有し、前記方法が、前記回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、前記加熱プレートの前記少なくとも３つの別個のゾーンにより規定された前記少なくとも３通りの温度にするステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応チャンバーの少なくとも一部が、前記プライマーに加えプローブも含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するためのキットであって、
一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートさせた複数のデンドリマーを含む溶液と、
乾燥プライマーを含有する複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、前記反応チャンバーがチャネルを介して前記リザーバーに連結されている、回転式円形カートリッジと、
ｑＰＣＲマスター混合物と、
を含むキット。
【請求項１１】
前記反応チャンバーが、前記乾燥プライマー及び乾燥プローブを含有する、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0002]膜完全性を決定するには、漏洩試験及び金コロイド試験（ｇｏｌｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）などの試験が使用できる。しかしこれらの試験は欠点を有することがある。例えば、金コロイド試験は、金コロイド検出用機器の限界により感度が限られること、及び／又は高いチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）濃度の金コロイドを必要とすることがある。加えて、完全性試験は膜に大きな穴又は裂け目があるか否かの決定を提供するものではあるが、膜における保持レベルを決定すること又は細孔構造を決定して細孔サイズ若しくは細孔等級を決定することを提供するものではない。
【０００２】
[0003]本発明は、従来技術の欠点の少なくとも一部の改善を提供する。これらを始めとする本発明の利点は、以下に示す記載から明らかとなろう。
【発明の概要】
【０００３】
[0004]本発明の実施形態は、膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するための方法であって、（ａ）デンドリマーとコンジュゲートさせた一本鎖ＤＮＡ（デンドリマーコンジュゲート）を含むチャレンジ溶液を微細孔膜に通して、デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を用意するステップと、（ｂ）同体積の（ｉ）デンドリマーコンジュゲートを含むチャレンジ溶液、及び（ｉｉ）デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を得るステップと、（ｃ）（ｉ）をＰＣＲ試薬と合わせてチャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬（ＰＣＲ  ｍｉｘ）を用意し、（ｉｉ）をＰＣＲ試薬と合わせて透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意するステップと、（ｄ）チャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬のそれぞれを使用し複数のＰＣＲサイクルを実行して、一本鎖ＤＮＡを増幅するステップと、（ｅ）デンドリマーコンジュゲート濃度と相関する一本鎖ＤＮＡ濃度を測定するステップと、（ｆ）チャレンジ溶液におけるデンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｏ）を定量し、透過溶液におけるデンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｐ）を定量するステップと、（ｇ）ｑｕａｎｔＣｐ対ｑｕａｎｔＣｏの比較に基づいて、膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】本発明の実施形態に従って、共有アミド結合により一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートさせたデンドリマー粒子（直径が５．４ｎｍであるものとして描画した）を含む例示的なデンドリマーコンジュゲートを示す図である。
【図２】本発明の実施形態の一般的な方法を説明する図である。
【図３】公称細孔等級値が異なる種々の微細孔ナイロンメディアを使用した、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図４】公称細孔等級値が異なる種々の微細孔高密度ポリエチレンメディアを使用した、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図５】公称細孔等級値が異なる種々の微細孔ナイロンメディアを使用した、５ｐｓｉの一定圧での保持試験の結果を示す図である。
【図６】公称細孔等級値が異なる種々の微細孔ポリアリールスルホンメディアを使用した、５ｐｓｉの一定圧での保持試験の結果を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に従って、マレイミド−チオール結合により一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートさせたデンドリマー粒子（直径が５．４ｎｍであるものとして描画した）を含む例示的なデンドリマーコンジュゲートを示す図である。
【図８】デンドリマーをコンジュゲートさせる別の化学反応、及び微細孔ナイロンメディアを使用した、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図９】別の配列をデンドリマー及び微細孔ナイロンメディアと共に使用した、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図１０】公称細孔等級値が異なる種々の微細孔ポリアリールスルホンメディアを使用した、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図１１】コンジュゲートについて様々なチャレンジ濃度を用いた、５ｍＬ／分の一定流速での保持試験の結果を示す図である。
【図１２】図１２Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ａ）は、複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、反応チャンバーがチャネルを介してリザーバーに連結されており、本発明の実施形態に従ってＰＣＲサイクルを行うのに使用できる例示的ＰＣＲ装置として適切な回転式円形カートリッジを示す上面図である。図１２Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｂ）は、ＰＣＲを行うために異なる温度に加熱することができる複数の別個のゾーンを有する加熱プレートの上に配置されたカートリッジを示す側断面図である。図１２Ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｃ）は、ＰＣＲを行うために異なる温度に加熱することができる４つの別個のゾーンを有する例示的な加熱プレートを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
[0017]本発明の実施形態に従って、膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するための方法であって、（ａ）デンドリマーとコンジュゲートさせた一本鎖ＤＮＡ（デンドリマーコンジュゲート）を含むチャレンジ溶液を微細孔膜に通して、デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を用意するステップと、（ｂ）同体積の（ｉ）デンドリマーコンジュゲートを含むチャレンジ溶液、及び（ｉｉ）デンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液を得るステップと、（ｃ）（ｉ）をＰＣＲ試薬と合わせてチャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意し、（ｉｉ）をＰＣＲ試薬と合わせて透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意するステップと、（ｄ）チャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬のそれぞれを使用し複数のＰＣＲサイクルを実行して、一本鎖ＤＮＡを増幅するステップと、（ｅ）デンドリマーコンジュゲート濃度と相関する一本鎖ＤＮＡ濃度を測定するステップと、（ｆ）チャレンジ溶液におけるデンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｏ）を定量し、透過溶液におけるデンドリマーコンジュゲート濃度（ｑｕａｎｔＣｐ）を定量するステップと、（ｇ）ｑｕａｎｔＣｐ対ｑｕａｎｔＣｏの比較に基づいて、膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するステップとを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、ＰＣＲサイクルはｑＰＣＲサイクルである。
【０００６】
[0018]通常、膜における保持レベル及び／又は細孔構造を決定するステップは、ｑｕａｎｔＣｐとｑｕａｎｔＣｏとの対数減少値（ｌｏｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を比較する、ｑｕａｎｔＣｐ対ｑｕａｎｔＣｏの比較に基づく。
【０００７】
[0019]本方法の一部の実施形態では、デンドリマーコンジュゲートは、一本鎖ＤＮＡ対デンドリマーが１：１の比である。
【０００８】
[0020]所望ならば、本方法の実施形態は、一定流速又は一定圧でチャレンジ溶液を微細孔膜に通すステップを含み得る。
【０００９】
[0021]本方法の実施形態は、特にＰＣＲ増幅を実行するにあたって、種々の装置を使用して実行できるが、例示的には、複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、反応チャンバーがチャネルを介してリザーバーに連結されており、反応チャンバーの少なくとも一部がプライマーを含む、回転式円形カートリッジと、少なくとも２通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも２つの別個のゾーンを有する加熱プレートと、を備える装置内で、同体積の、デンドリマーコンジュゲートを含むチャレンジ溶液、及びデンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液のそれぞれをＰＣＲ試薬と合わせて、それぞれチャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意することができ、チャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬のそれぞれを使用し複数のＰＣＲサイクルを実行して、一本鎖ＤＮＡを増幅することができる。本方法の実施形態は、プライマーを除く、増幅反応を行うためのデンドリマーコンジュゲート及びＰＣＲ試薬を含有する流体で、リザーバーを少なくとも部分的に満たすステップと、プライマーを含む反応チャンバーに上記流体を分配するステップと、回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、加熱プレートの少なくとも２つの別個のゾーンにより規定された少なくとも２通りの温度にするステップであって、一本鎖ＤＮＡが増幅される、ステップとを含み得る。
【００１０】
[0022]加熱プレートが、少なくとも３通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも３つの別個のゾーンを有する、本方法の一部の実施形態では、上記方法は、回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、加熱プレートの少なくとも３つの別個のゾーンにより規定された少なくとも３通りの温度にするステップを含む。
【００１１】
[0023]別の実施形態に従って、一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートさせた複数のデンドリマーを含む溶液と、複数の反応チャンバー（乾燥プライマー及び好ましくは乾燥プローブを含有する）、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、反応チャンバーがチャネルを介してリザーバーに連結されている、回転式円形カートリッジと、ｑＰＣＲマスター混合物とを含むキットを提供する。上記キットの一実施形態では、ｑＰＣＲマスター混合物は、標準色素、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２及びｄＮＴＰｓを含む。
【００１２】
[0024]粒子検出用機器（例えば、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）粒子計数器を含めた、金、シリカ及びラテックス粒子検出用機器）の感度が限られることにより、チャレンジ溶液における粒子が高レベルであることを必要とする他の試験とは対照的に、今や、より現実的な低い粒子チャレンジ濃度、例えば約１０００〜約１００００粒子／ｍＬを用いて試験を行うことができ、非常に密な細孔構造の高性能膜を試験して、篩い分けることに基づいた保持能のみを決定することができる点が有利である。
【００１３】
[0025]デンドリマーは、繰返し分岐した分子で、通常は非常に対称的な球状化合物であり、３つの主要部分、コア、内殻及び外殻を有すると考えることができる。デンドリマーは世代によって分類でき、世代とは、合成の際に実行される繰返し分岐サイクルの回数を指す。高世代デンドリマーであるほど、官能基も表面に多く露出している。本発明での使用に適したデンドリマー粒子には種々のものがあり、一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートさせるために、所望ならデンドリマーを官能化することができる。適切な官能基としては、例えばアミノ、ヒドロキシル及び／又はスクシンアミド酸官能基が挙げられる。適切なデンドリマーとしては、例えば市販のデンドリマーが挙げられる。一実施形態では、デンドリマーにはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、例えば第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマーなどが含まれる。
【００１４】
[0026]図１は、ＰＡＭＡＭデンドリマーに対してカルボキシル末端化一本鎖ＤＮＡ配列を反応させて、共有アミド結合によりアミノ官能化デンドリマーに固定することを図示する。
【００１５】
[0027]デンドリマー粒子は適切な任意の直径を有していてよく、これは典型的には直径が少なくとも約２ｎｍであるが、好ましくは、単分散的サイズの直径のものを得ることができれば、より短い直径の粒子を使用してもよい。
【００１６】
[0028]本発明の実施形態によると、一本鎖ＤＮＡは、特定のいかなる配列にも、又は特定のいかなる塩基数にも限定されない。しかしその配列は、チャレンジ溶液中にもともと存在する可能性が低い配列を選択すべきであり、また通常は、一本鎖ＤＮＡは長さが少なくとも約５０塩基である（例えば、ｑＰＣＲによる増幅を効率的にするため）。
【００１７】
[0029]ＤＮＡ対デンドリマーの比は、コンジュゲートのサイズを顕著に変化させることのないような比であるべきである。ＤＮＡ対デンドリマーの比を１：１として、例えば、ＰＣＲで測定したＤＮＡ濃度を、デンドリマー粒子の濃度と直接相関させ得るようにすることが好ましい。しかし、１０：１などの比、又はさらに高い比を用いることも可能である。
【００１８】
[0030]遊離ＤＮＡの存在（以降、「遊離ＤＮＡ濃度」と称する）は、本方法の感度に影響を与え得る。例えば、４以上の対数除去値（ＬＲＶ：ｌｏｇ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｖａｌｕｅ）が望ましい場合、０．００１％未満のレベルの遊離ＤＮＡ濃度；約３のＬＲＶが望ましいなら、約０．０１％のレベルの遊離ＤＮＡ濃度；約２のＬＲＶが望ましいなら、約０．１％のレベルの遊離ＤＮＡ濃度；約１のＬＲＶが望ましいなら、約１％のレベルの遊離ＤＮＡ濃度であることが好ましい可能性がある。
【００１９】
[0031]本発明の実施形態は、水溶液と共に使用するのに特に適している。
【００２０】
[0032]分析しようとする膜は、いかなる保持レベル、例えば対数除去値（ＬＲＶ）若しくは細孔構造、例えば細孔サイズ（例えば、バブルポイント、若しくは例えば米国特許第４３４０４７９号に記載のＫＬによって明らかにされる、又は毛管凝縮フローポロメトリーによって明らかにされる）、平均流量細孔（ＭＦＰ）径（例えば、ポロメーター、例えばＰｏｒｖａｉｒ  Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｏｒｖａｉｒ  ｐｌｃ、ノーフォーク、ＵＫ）、又はポロルックス（ＰＯＲＯＬＵＸ）（ベルギー）の商標の下で入手可能なポロメーターを使用してキャラクタライズする場合）、細孔等級、細孔直径（例えば、米国特許第４９２５５７２号に例えば記載されている、改変されたＯＳＵ  Ｆ２試験を用いてキャラクタライズする場合）、又は除去等級メディア（ｒｅｍｏｖａｌ  ｒａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）を有していてもよい。使用される細孔構造は、利用しようとする粒子のサイズ、処理しようとする流体の組成、及び処理後の流体の所望の流出レベルによって決まる。
【００２１】
[0033]本発明の実施形態は、疎水性膜及び親水性膜を分析するのに適している。
【００２２】
[0034]様々な膜、特にポリマー膜が本発明での使用に適しており、これらの膜は当技術分野において既知である。適したポリマーとしては、例えば、ポリ芳香族化合物（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃｓ）；スルホン（例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルスルホン、ビスフェノールＡポリスルホン、ポリアリールスルホン（ＰＡＳ）及びポリフェニルスルホンなどの芳香族ポリスルホンを含めた、ポリスルホン）、ポリアミド、ポリイミド、ポリハロゲン化ビニリデン（ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む）、ポリプロピレン及びポリメチルペンテンなどのポリオレフィン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル（ポリアルキルアクリロニトリルを含む）、セルロースポリマー（酢酸セルロース及び硝酸セルロースなど）、フルオロポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）など）及びポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）を挙げることができる。ポリマー膜は、例えば、疎水性ポリマー（例えばスルホンポリマー）及び親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）などの、ポリマーの混合物を含み得る。
【００２３】
[0035]疎水性であっても又は親水性であってもよいこの膜は、いかなる臨界ぬれ表面張力を有していてもよい（ＣＷＳＴ。例えば米国特許第４９２５５７２号で定義され、さらに例えば米国特許第５１５２９０５号、第５４４３７４３号、第５４７２６２１号及び第６０７４８６９号に開示されている）。
【００２４】
[0036]ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いたＤＮＡの増幅は、当技術分野で知られている装置及び方法を用いて行うことができる。適切な装置としては、それだけに限らないが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．製（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（登録商標）７９００ＨＴ、７３００、７５００、７５００  ｆａｓｔ、ステップワン（ＳｔｅｐＯｎｅ）（商標）及びステップワンプラス（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）、クォントスチューディオ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ）（登録商標））；Ｒｏｃｈｅ製（ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（登録商標）４８０、９６、１５３６、Ｃａｒｏｕｓｅｌ及びＮａｎｏシステム）；Ｑｉａｇｅｎ製（ローター−ジーンＱ（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ）（商標）システム）；及びＢｉｏ−Ｒａｄ製（ＣＦＸ（商標）及びクロモ（Ｃｈｒｏｍｏ）（商標）システム）の装置が挙げられる。
【００２５】
[0037]ＰＣＲを行うのに好ましい装置の１つが、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ポートワシントン、ニューヨーク、ＵＳＡから入手可能なＧＥＮＥＤＩＳＣプレートを例えば使用している米国特許第６８２１７７１号に記載されている（この装置は、複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、反応チャンバーがチャネルを介してリザーバーに連結されている、回転式円形カートリッジと、少なくとも２通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの別個のゾーンを有する加熱プレートとを備える）。図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃにそれぞれ、複数の反応チャンバー２５、及びリザーバー１０を有する回転式円形カートリッジ１００であって、反応チャンバーがチャネル１５を介してリザーバーに連結されており、本発明の実施形態に従ってＰＣＲサイクルを行うのに使用できる例示的ＰＣＲ装置として適切な回転式円形カートリッジ１００の上面図と、ＰＣＲを行うために異なる温度に加熱することができる複数の別個のゾーン（５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄ）を有する加熱プレート５０の上に配置されたカートリッジ１００の側断面図と、ＰＣＲを行うために異なる温度に加熱することができる４つの別個のゾーン（５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄ）を有する例示的な加熱プレート５０とを示す。図１２Ｂに、ＰＣＲ中に反応チャンバー内のシグナル（好ましくは蛍光色素）を検出するための検出器５００、好ましくは蛍光検出器も示す。
【００２６】
[0038]例示的には、複数の反応チャンバー、及びリザーバーを有する回転式円形カートリッジであって、反応チャンバーがチャネルを介してリザーバーに連結されており、反応チャンバーの少なくとも一部がプライマーを含む（反応チャンバーはプローブも含むことが好ましい）、回転式円形カートリッジと、複数通りの異なる温度に加熱することができる複数の別個のゾーンを有する加熱プレートと、を備える装置内で、同体積の、デンドリマーコンジュゲートを含むチャレンジ溶液、及びデンドリマーコンジュゲートを含む透過溶液のそれぞれをＰＣＲ試薬と合わせて、それぞれチャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬を用意することができ、チャレンジ溶液／ＰＣＲプレミックス試薬及び透過溶液／ＰＣＲプレミックス試薬のそれぞれを使用し複数のＰＣＲサイクルを実行して、一本鎖ＤＮＡを増幅することができる。本方法の実施形態は、プライマーを除く、増幅反応を行うためのデンドリマーコンジュゲート及びＰＣＲ試薬を含有する流体で、リザーバーを少なくとも部分的に満たすステップと、プライマーを含む反応チャンバーに上記流体を分配するステップと、回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、加熱プレートの別個のゾーンにより規定された異なる温度にするステップであって、一本鎖ＤＮＡが増幅される、ステップとを含み得る。
【００２７】
[0039]加熱プレートが、少なくとも３通りの異なる温度に加熱することができる少なくとも３つの別個のゾーンを有する、本方法の一部の実施形態では、上記方法は、回転式円形カートリッジを回転させて、連続的に各反応チャンバーの内容物を、加熱プレートの少なくとも３つの別個のゾーンにより規定された少なくとも３通りの温度にするステップを含む。
【実施例】
【００２８】
[0040]以下の実施例で本発明をさらに説明するが、無論これらは、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００２９】
実施例１
[0041]この実施例では、一定流速で試験した場合の、種々の微細孔親水性ナイロン膜における保持レベルの決定を示す。
【００３０】
[0042]図２に、この実施例で行われる方法をダイアグラムにまとめた概要図を示す。
【００３１】
[0043]直径が５．４ｎｍである市販の単分散的サイズの第５世代ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化させて、デンドリマー表面にエステル基を生成させる。活性化デンドリマーに対して、カルボキシル末端化している６６塩基長の一本鎖ＤＮＡ配列（５’から３’の向きに）ＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＡＴＧＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＴＴ（配列番号１）を反応させて、共有アミド結合により１：１の比でこのＤＮＡをこのデンドリマーに固定する。ｐＨ７．０では、デンドリマーのアミン基はプロトン化されてＮＨ３＋になっており、その量は、ＤＮＡにおける負電荷を帯びたリン酸基の約２倍であるため、デンドリマーコンジュゲートは正電荷を帯びている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、デンドリマーコンジュゲートが、中性ｐＨでは電極の正の側から負の側にしか移動しないことから、ＤＮＡ対デンドリマーが１：１の比であることが確認される。
【００３２】
[0044]遊離ＤＮＡは、１００ＫＤａカットオフ膜を使用してコンジュゲート溶液を２回、ｐＨ１０．２で透析することによって除去する。
【００３３】
[0045]ＤＮＡ−デンドリマーコンジュゲートのストックを１ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５）にスパイクして加えて、コンジュゲート濃度が１×１０８粒子／ｍＬの試験用チャレンジ溶液を調製する。
【００３４】
[0046]４７ｍｍ微細孔ナイロンフィルターディスクを、１ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．５）緩衝液で湿らせ、フィルターディスクをフィルターホルダーに装着し、適切な体積の試験用チャレンジ溶液で圧力シリンジを満たし、チューブをシリンジに取り付け、空気弁を介して圧力容器を連結する。
【００３５】
[0047]チャレンジ試験は、５ｍＬ／分の一定流速を維持するように圧力を制御することによって開始し、各１０ｍＬの体積で複数の透過画分を分取する。
【００３６】
[0048]細孔等級値が異なる５つの各種ナイロンフィルターディスクを試験する：４０ｎｍ、２０＋２５０ｎｍ（二重層）、２０ｎｍ、１０ｎｍ及び５ｎｍ。
【００３７】
[0049]ＤＮＡ（デンドリマーに付加したのと同じＤＮＡ配列）を超純水で連続希釈することによって、１×１０１１コピー／ｍＬ〜１×１０３コピー／ｍＬの範囲のＤＮＡ標準試料を調製する。試料、標準試料及びネガティブコントロールの数に応じて、適切な体積のｑＰＣＲ反応混合物（マスターミックス（標準色素、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２及びｄＮＴＰｓを含むマスターミックス）、プライマー及び超純水を含有する）も調製する。５μＬの試験用チャレンジ溶液及び透過画分（第２の透過画分を使用して、第１の透過画分における緩衝液による希釈の影響を避けるようにする）をそれぞれ、別個の２０μＬのｑＰＣＲ混合物に加え、９６ウェルプレートにおける特定のウェルに入れる。５μＬの超純水をネガティブコントロールとしてウェルに加える。
【００３８】
[0050]ｑＰＣＲを行うには以下の配列を使用する：フォワードプライマー：ＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧ（配列番号２）；リバースプライマー：ＡＡＴＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＣＡＴＡＣ（配列番号３）；及びプローブ：ＣＣＴＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＣＴ（配列番号４）。ここで、蛍光色素のフルオレセイン（ＦＡＭ６）をプローブの５’末端に付加し、クエンチャーのブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）をプローブの３’末端に付加しておく。
【００３９】
[0051]９６ウェルプレートをｑＰＣＲマシン（７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；アプライドバイオシステムズ、カールズバッド、カリフォルニア）にセットし、４０サイクルのｑＰＣＲを実行し（９５℃１５秒、及び６０℃６０秒）、特定の閾値サイクル数を用いて、各ウェルから蛍光曲線を作製する。
【００４０】
[0052]ソフトウェアが、既知のＤＮＡ標準試料の閾値サイクル数を、試験用チャレンジ溶液及び透過溶液の閾値サイクル数と対応付けて、これらの溶液におけるデンドリマーコンジュゲート濃度を計算する（ＤＮＡ対デンドリマーが１：１の比なので、ｑＰＣＲで測定したＤＮＡ濃度を、デンドリマー粒子の濃度と直接相関させ得るからである）。データを解析して、チャレンジ溶液及び透過画分におけるコンジュゲート濃度を定量し、メディアの性能を計算する。
【００４１】
[0053]膜の性能は、透過液におけるデンドリマーコンジュゲートの濃度、対、試験用チャレンジ溶液におけるデンドリマーコンジュゲートの濃度について、逆対数（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｌｏｇ）をとることによって計算する。
【００４２】
[0054]図３に示すように、４０ｎｍ、２０＋２５０ｎｍ（二重層）、２０ｎｍ、１０ｎｍ及び５ｎｍメディアのそれぞれの平均対数除去値（ＬＲＶ）は、０．０２±０．０１、０．０６±０．０２、０．０４±０．０１、０．１９±０．０１及び０．５２±０．１０である。
【００４３】
[0055]より大きい細孔等級のナイロンメディア（例えば４０ｎｍ、２５０＋２０ｎｍ、２０ｎｍ）が、コンジュゲートの９５％超を通すことから、コンジュゲートはメディアに吸着又は付着しないことが示唆される。したがって、より小さい細孔等級のナイロンメディア（例えば１０ｎｍ及び５ｎｍ）における保持値は、ふるい効果に大きく帰因している。これらの結果から、一定流速でのコンジュゲート試験によって、小さい各種細孔等級のナイロンメディア間の区別が可能であることも示される。
【００４４】
実施例２
[0056]この実施例では、一定流速で試験した場合の、微細孔疎水性高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）膜における保持レベルの決定を示す。
【００４５】
[0057]デンドリマーコンジュゲートは、実施例１に記載のように調製する。
【００４６】
[0058]ＤＮＡ−デンドリマーコンジュゲートのストックを、０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０（界面活性剤）を含有する１ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５）にスパイクし、コンジュゲート濃度が１×１０８粒子／ｍＬの試験用チャレンジ溶液を調製する。
【００４７】
[0059]４７ｍｍ微細孔ＨＤＰＥフィルターディスクを、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で湿らせ、フィルターホルダーに装着し、１５０ｍＬのＩＰＡを５０ｐｓｉでディスクに通してディスクをプライミングし、次に５００ｍＬの脱イオン（ＤＩ）水を通してディスクを洗浄する。
【００４８】
[0060]０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２０ｍＬの１ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５）をディスクに通す。
【００４９】
[0061]適切な体積の試験用チャレンジ溶液で圧力シリンジを満たし、チューブをシリンジに取り付け、空気弁を介して圧力容器を連結する。
【００５０】
[0062]チャレンジ試験は、５ｍＬ／分の一定流速を維持するように圧力を制御することによって開始し、各１０ｍＬの体積で複数の透過画分を分取する。
【００５１】
[0063]細孔等級値が異なる４つの各種ＨＤＰＥフィルターディスクを試験する：３０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ及び２ｎｍ。
【００５２】
[0064]５μＬの試験用チャレンジ溶液及び透過画分（第３の透過画分を使用して、第１又は第２の透過画分における緩衝液による希釈の影響を避けるようにする）をそれぞれ、別個の２０μＬのｑＰＣＲ混合物に加え、９６ウェルプレートにおける特定のウェルに入れる。５μＬの超純水をネガティブコントロールとしてウェルに加える。
【００５３】
[0065]ｑＰＣＲを行い、膜の性能は、実施例１に記載のように計算する。
【００５４】
[0066]図４に示すように、３０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ及び２ｎｍメディアのそれぞれの平均ＬＲＶは、０．０１±０．００１、０．０５±０．０３、０．１４±０．０４及び０．４０±０．１５である。
【００５５】
[0067]より大きい細孔等級のＨＤＰＥ（例えば３０ｎｍ）が、コンジュゲートの９５％超を通すことから、コンジュゲートはＨＤＰＥメディアに吸着又は付着しないことが示唆される。したがって、より小さい細孔等級のＨＤＰＥ（例えば１０ｎｍ、５ｎｍ及び２ｎｍ）における保持値は、ふるい効果に大きく帰因している。これらの結果から、一定流速でのコンジュゲート試験によって、小さい各種細孔等級のＨＤＰＥメディア間の区別が可能であることも示される。
【００５６】
実施例３
[0068]この実施例では、一定圧で試験した場合の、微細孔親水性ナイロン膜における保持レベルの決定を示す。
【００５７】
[0069]微細孔ナイロン膜は、実施例１に一般的に記載したように試験するが、ただし、チャレンジ試験は、５ｐｓｉの固定圧に制御器を維持し１ｍＬ／分の流速を得ることによって開始する。
【００５８】
[0070]図５に示すように、４０ｎｍ、１０ｎｍ及び５ｎｍメディアのそれぞれの平均ＬＲＶは、０．０４±０．０２、０．２０±０．０２及び０．６０±０．０７である。
【００５９】
[0071]より大きい細孔等級のナイロンメディア（例えば４０ｎｍ）が、コンジュゲートの９５％超を通すことから、コンジュゲートはメディアに吸着又は付着しないことが示唆される。したがって、より小さい細孔等級のナイロンメディア（例えば１０ｎｍ及び５ｎｍ）における保持値は、ふるい効果に大きく帰因している。これらの結果から、一定圧でのコンジュゲート試験によって、小さい各種細孔等級のナイロンメディア間の区別が可能であることも示される。
【００６０】
実施例４
[0072]この実施例では、一定圧で試験した場合の、微細孔ポリアリールスルホン（ＰＡＳ）膜における保持レベルの決定を示す。
【００６１】
[0073]ＰＡＳ膜を、実施例３に一般的に記載したように試験する。細孔等級値が異なる２つの各種ＰＡＳフィルターディスクを試験する：３０ｎｍ及び１０ｎｍ。
【００６２】
[0074]図６に示すように、３０ｎｍ及び１０ｎｍメディアのそれぞれの平均ＬＲＶは、０．０６±０．０３及び０．７２±０．０９である。
【００６３】
[0075]より大きい細孔等級のＰＡＳメディア（３０ｎｍ）が、コンジュゲートの９５％超を通すことから、コンジュゲートはメディアに吸着又は付着しないことが示唆される。したがって、より小さい細孔等級のメディア（１０ｎｍ）における保持値は、ふるい効果に大きく帰因している。これらの結果から、一定圧でのコンジュゲート試験によって、各種細孔等級のメディア間の区別が可能であることも示される。
【００６４】
実施例５
[0076]この実施例では、別のカルボキシル官能化ＰＡＭＡＭデンドリマーも、本発明の実施形態で使用できることを示す。
【００６５】
[0077]直径が５．４ｎｍである市販の単分散的サイズの第５世代ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、アミン反応性スクシンイミジルエステル（すなわちＮＨＳエステル）を片方の末端において、及びスルフヒドリル反応性基（例えばマレイミド）をもう片方の末端において含有するヘテロ二官能性クロスリンカーによって活性化させる。スルフヒドリル末端化しているオリゴは、実施例１に記載の配列番号１を用い、マレイミド−チオール結合を介して１：１の比でデンドリマーに共有結合的に固定する。
【００６６】
[0078]遊離ＤＮＡは、１００ＫＤａカットオフ膜を使用してコンジュゲート溶液を２回、ｐＨ１０．２で透析することによって除去する。
【００６７】
[0079]本実施例は、公称１０ｎｍ細孔等級のナイロン膜を使用し、実施例１に一般的に記載したように行う。
【００６８】
[0080]図８に示すように平均ＬＲＶは０．２０±０．０２であり、これは、この膜の細孔等級が１０ｎｍであることを裏付ける。この結果から、保持値は、コンジュゲートのサイズのみに依存し、コンジュゲート配列の性質、官能基、及びＤＮＡ−デンドリマー結合の種類には依存しないことが示される。
【００６９】
実施例６
[0081]この実施例では、別の一本鎖ＤＮＡ配列も、本発明の実施形態に従って使用できることを示す。
【００７０】
[0082]活性化デンドリマーを実施例１に記載のように調製し、これに対して、細菌のアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のゲノムに由来する、以下のカルボキシル末端化している長い一本鎖ＤＮＡ配列（５’から３’の向きに）ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号５）を反応させて、共有アミド結合により１：１の比でこのＤＮＡをこのデンドリマーに固定する。
【００７１】
[0083]本実施例は、公称１０ｎｍ細孔等級のナイロン膜を使用し、実施例１に一般的に記載したように行う。
【００７２】
[0084]ｑＰＣＲを行うには以下の配列を使用する：フォワードプライマー：ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣ（配列番号６）；リバースプライマー：ＣＣＣＧＧＡＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣ（配列番号７）；及びプローブ：ＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧ（配列番号８）。ここで、蛍光色素のフルオレセイン（ＦＡＭ６）をプローブの５’末端に付加し、クエンチャーのブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）をプローブの３’末端に付加しておく。
【００７３】
[0085]図９に示すように平均ＬＲＶは０．２４±０．０１であり、これは、この膜の細孔等級が１０ｎｍであることを裏付ける。この結果から、保持値は、コンジュゲートのサイズのみに依存し、コンジュゲート配列の性質、官能基、及びＤＮＡ−デンドリマー結合の種類には依存しないことが示される。このことは、類似した結果、つまり図３及び８に示した、１０ｎｍ細孔等級のナイロン膜によっても補強される。
【００７４】
実施例７
[0086]この実施例では、一定流速で試験した場合の、種々の微細孔ポリアリールスルホン（ＰＡＳ）膜における保持レベルの決定を示す。
【００７５】
[0087]ＰＡＳ膜を、実施例１に一般的に記載したように試験する。細孔等級値が異なる２つの各種ＰＡＳフィルターディスクを試験する：３０ｎｍ及び１０ｎｍ。
【００７６】
[0088]図１０に示すように、３０ｎｍ及び１０ｎｍメディアのそれぞれの平均ＬＲＶは、０．０５±０．０１及び０．２２±０．０１である。
【００７７】
[0089]より大きい細孔等級のＰＡＳメディア（３０ｎｍ）が、コンジュゲートの９５％超を通すことから、コンジュゲートはメディアに吸着又は付着しないことが示唆される。したがって、より小さい細孔等級のメディア（１０ｎｍ）における保持値は、ふるい効果に大きく帰因している。これらの結果から、一定圧でのコンジュゲート試験によって、各種細孔等級のメディア間の区別が可能であることも示される。
【００７８】
実施例８
[0090]この実施例では、様々なデンドリマーコンジュゲート濃度が、本発明の実施形態において膜を分析するために使用できること、及びこの試験がふるい性能を表すことを示す。
【００７９】
[0091]実施例１に一般的に記載したように、活性化デンドリマーを調製しこれに対して、カルボキシル末端化している長い一本鎖ＤＮＡ配列を反応させる。
【００８０】
[0092]異なる５つのＤＮＡ−デンドリマーコンジュゲートチャレンジ濃度を用意し、通常、公称１０ｎｍ細孔等級のナイロン膜を使用して、５ｍＬ／分の一定流速で、実施例１に一般的に記載したように本実施例を行う。チャレンジ濃度は２×１０４粒子／ｍＬ、２×１０５粒子／ｍＬ、２×１０６粒子／ｍＬ、２×１０７粒子／ｍＬ及び２×１０８粒子／ｍＬである。
【００８１】
[0093]図１１に示すように、２×１０４粒子／ｍＬ、２×１０５粒子／ｍＬ、２×１０６粒子／ｍＬ、２×１０７粒子／ｍＬ及び２×１０８粒子／ｍＬのチャレンジ濃度におけるＬＲＶはそれぞれ０．１８、０．１５、０．１４、０．１５及び０．１８である。
【００８２】
[0094]これらの結果は、この膜の細孔等級が１０ｎｍであることを裏付け、また本試験が、粒子チャレンジ濃度に依存することなく、メディアの真のふるい性能を表していることを示す。さらに、このような低いコンジュゲート濃度の定量は、ｑＰＣＲによってのみ可能である。
【００８３】
[0095]本明細書で言及する刊行物、特許出願及び特許を含めた全ての参考文献は、その各々が、参照により組み込まれることが個別にはっきりと明記され且つその全体が本明細書に記載されていた場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【００８４】
[0096]本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「１つの」及び「ある」及び「この」及び「少なくとも１つ」という用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書で別段の指定があるか又は文脈上明確に否定されているのでない限り、単数及び複数の双方を包含するものと解釈されたい。１つ又は複数の項目の列挙に続く、「少なくとも１つ」という用語の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書で別段の指定があるか又は文脈上明確に否定されているのでない限り、列挙された項目から選択された１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味するものと解釈されたい。「含む」、「有する」、「を含めた」及び「含有する」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「を含むが、これらだけに限らない」の意味）として解釈されたい。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指定がない限り、範囲内の別個の値それぞれを個別に指す簡略な方法として用いることを目的とするに過ぎず、別個の値はそれぞれ、本明細書で個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれている。本明細書に記載する方法はいずれも、本明細書で別段の指定があるか、それ以外の場合でも文脈上明確に否定されているのでない限り、適切な任意の順番で実行することができる。本明細書における、ありとあらゆる例又は例示的言い回し（例えば「など」）の使用は、本発明をより明確にすることを目的とするに過ぎず、別段の主張がない限り、本発明の範囲に対し限定を設けるものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、何らかの非請求要素が、本発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈すべきではない。
【００８５】
[0097]本発明を実施する上で本発明者らが知る限り最良の形態を含めて、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の改変が、上記記述を読めば当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこうした改変を適宜利用することを予想し、本発明が、本明細書に詳細に記載した以外のかたちで実施されることを意図する。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に列挙されている主題のあらゆる改変及び等価物を、適用法によって認められるものとして含む。さらに、本明細書で別段の指定があるか、それ以外の場合でも文脈上明確に否定されているのでない限り、上記要素の可能なあらゆる変形における任意の組合せが本発明に包含される。
【００８６】
［電子的に提出された資料の参照による組み込み］
[0001]本明細書と同時に提出された、以下に指定するコンピュータ読取可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表を、参照により本明細書にその全体を組み込む：２０１５年７月１０日に作成された「７２０４８４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」と称する１．６２キロバイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルを１つ。
【符号の説明】
【００８７】
１０…リザーバー、１５…チャネル、２５…反応チャンバー、５０…加熱プレート、５０Ａ…ゾーン、５０Ｂ…ゾーン、５０Ｃ…ゾーン、５０Ｄ…ゾーン、１００…回転式円形カートリッジ、５００…検出器。
【図１】
2017046683.tif 000002
【図２】
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【図３】
2017046683.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017046683.tif 000010
【図１０】
2017046683.tif 000011
【図１１】
2017046683.tif 000012
【図１２】
2017046683.tif 000013
【配列表】
2017046683000001.app
【外国語明細書】
2017046683000001.pdf