(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトプロテインキナーゼCη（ＰＫＣη）ｍＲＮＡ、蛋白質の発現を抑制する方法を提供する。【解決手段】ＰＫＣηの発現抑制がＰＫＣηをコードする遺伝子のＲＮＡ干渉により行われ、ＲＮＡ干渉に、特定の塩基配列、別の特定の塩基配列、他の特定の塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるセンスオリゴヌクレオチド鎖と、それに相補的なオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを利用することを特徴とする、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＫＣηの発現を抑制するための方法であって、ＰＫＣηの発現抑制がＰＫＣηをコードする遺伝子のＲＮＡ干渉により行われ、ＲＮＡ干渉に、配列番号１、２，３のオリゴヌクレオチドからなるセンスオリゴヌクレオチド鎖と、それに相補的なオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖ＲＮＡを利用することを特徴とする、方法。     
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトプロテインキナーゼCη（ＰＫＣη）ｍＲＮＡ、蛋白質の発現を抑制する方法に関する。より、特定すると、本発明はＰＫＣηｍＲＮＡ、蛋白質の発現を効果的に抑制するshort interfering RNA(siRNA)の配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＫＣη遺伝子は上皮細胞特異的な発現を示すＰＫＣとして、マウス皮膚由来ｃＤＮＡライブラリーより、長田等により単離、同定された遺伝子である（非特許文献１）。ＰＫＣは、細胞膜に存在する脂質の代謝産物により活性化する蛋白リン酸化酵素であり、その類似関連遺伝子として、ＰＫＣα,ＰＫＣβ1, ＰＫＣβ2, ＰＫＣγ,ＰＫＣδ,ＰＫＣε,ＰＫＣη,ＰＫＣθ,ＰＫＣζ,ＰＫＣζがこれまでに同定されている(非特許文献２）。ＰＫＣはその活性化様式から３種類に大別される。即ち、活性化のためにカルシウムイオンとリン酸化脂質、ジアシルグリセロールを必要とするconventinal ＰＫＣ(ＰＫＣα,ＰＫＣβ1, ＰＫＣβ2, ＰＫＣγ)、活性化のためにカルシウムイオンを必要とせず、リン酸化脂質、ジアシルグリセロールを要求するnovelＰＫＣ(ＰＫＣδ,ＰＫＣε,ＰＫＣη,ＰＫＣθ)、リン酸化脂質のみを必要とするatypicalＰＫＣ(ＰＫＣζ,ＰＫＣλ)に分類される。
【０００３】
novelＰＫＣに属するＰＫＣηは、皮膚、食道、舌を含む扁平上皮組織の上皮細胞や小腸を構成する単層上皮細胞に発現するＰＫＣであり、特に上皮組織分化層に特異的に発現する。皮膚においては表皮顆粒層に局在する（非特許文献３）。また上皮組織に加えて、破骨細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４陽性胸腺細胞、ＣＤ８陽性胸腺細胞、マクロファージにも高発現する(非特許文献４)。その細胞内局在は非特許文献５に示されるが如く、主に粗面小胞体、ゴルジ体であるが、表皮ケラチノサイトの分化によって細胞膜に局在移行することも報告されている（非特許文献６）
【０００４】
ＰＫＣηは表皮ケラチノサイトの最終分化を誘導する酵素である。その過剰発現によってヒト表皮ケラチノサイトは増殖を阻害され、形態は扁平化し、その最終分化マーカー蛋白質であるトランスグルタミナーゼ１の酵素活性が上昇する。またそのキナーゼ欠損型変異体によって、上記の表皮分化の指標は抑制される（非特許文献７）。またＰＫＣηはヒトケラチノサイトに自然免疫を誘導し、IL-1α、IL-6などの炎症性サイトカインやＩＬ−８、ＭＩＰ−３などのケモカインを分泌する。ＰＫＣηのトランスジェニックマウスの皮膚は形態的、病理組織的に著しい炎症反応を示し、真皮中への顆粒球・T細胞の遊走・浸潤が生じる。さらに成長と共にIL-4等のTh2誘導性サイトカインも放出され、皮膚バリアが破壊されることで、外来刺激に対して脆弱になり、加速度的に症状を悪化させ、その結果、生後数ヶ月でアトピー性皮膚炎に類似した病態が出現する。またＰＫＣη蛋白質は、ヒト皮膚における慢性炎症性疾患である乾癬の皮膚において、正常細胞に比べて非常に高い発現を示す（非特許文献８）。これらのことは炎症性疾患の発症・維持にＰＫＣηが関与することを示している。
【０００５】
遺伝子多型（polymorphism）は、個体間での様々な疾患の罹患率や悪性化の程度に影響を与える。single nucleotide polymorphism:一塩基多型（ＳＮＰｓ）はゲノム上での最小の多型であり、その定義は「ある生物種集団のゲノム塩基配列中に一塩基が変異した多様性が見られ、その変異が集団内で1%以上の頻度で見られる時、これを一塩基多型と呼ぶ」とされる。ＰＫＣηの活性を左右するSNPsと、慢性難治性炎症疾患である脳梗塞や慢性関節リュウマチ、萎縮性胃炎の罹患率との間に強い相関関係が存在することが報告されている。即ち、ＰＫＣηの酵素活性が上昇することで上記に示された炎症性疾患の罹患率、悪性度が上昇する(非特許文献９，１０，１１)。
【０００６】
また、ＰＫＣηは悪性腫瘍、即ち癌細胞で高い発現を示す。ＰＫＣηが高発現する癌種として、乳癌、肺癌、グリオーマ、骨髄性白血病が報告されている(非特許文献１２，１３，１４)。特に肺癌ではその悪性度と予後に強い相関が認められた（非特許文献１５）。更に、ヒト腺癌細胞株ＰＣ９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ａ５４９の増殖は、ＰＫＣηの発現を抑制することで著しく阻害される。特に上皮増殖因子受容体に変異を有する肺腺癌細胞には顕著にアポトーシスが誘導される。
【０００７】
以上のことから、ＰＫＣηは難治性慢性炎症疾患、癌の分子標的治療戦略上、非常に魅力的な標的と言え、ＰＫＣηの発現を抑制する方法を考案することは、難治性慢性炎症性疾患や癌の治療或いは予防に大きく寄与するものと考えられる。
【０００８】
ＰＫＣη蛋白質は前述の如く、ゴルジ体、粗面小胞体、或いは細胞膜等、細胞内に局在するため、増殖因子受容体のように、その作用を抗体等で阻害する戦略が成立しないため、ＰＫＣηｍＲＮＡや蛋白質の生合成そのものを抑制することが必須となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】A phorbol ester receptor/protein kinase, nPKC eta, a new member of the protein kinase C family predominantly expressed in lung and skin.Osada S, Mizuno K, Saido TC, Akita Y, Suzuki K, Kuroki T, Ohno S.     J Biol Chem. 1990;265(36):22434-40.
【非特許文献２】Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Nishizuka Y. Science. 1992 23;258(5082):607-14. Review.
【非特許文献３】Predominant expression of nPKC eta, a Ca(2+)-independent isoform of protein kinase C in epithelial tissues, in association with epithelial differentiation.     Osada S, Hashimoto Y, Nomura S, Kohno Y, Chida K, Tajima O, Kubo K, Akimoto K, Koizumi H, Kitamura Y, et al.     Cell Growth Differ. 1993 ４(3):167-75.
【非特許文献４】The role of protein kinase ceta in T cell biology.     Fu G, Gascoigne NR.     Front Immunol. 2012;3:177.
【非特許文献５】PKCeta is localized in the Golgi, ER and nuclear envelope and translocates to the nuclear envelope upon PMA activation and serum-starvation: C1b domain and the pseudosubstrate containing fragment target PKCeta to the Golgi and the nuclear envelope.    Maissel A, Marom M, Shtutman M, Shahaf G, Livneh E.   Cell Signal. 2006 18(8):1127-39.
【非特許文献６】PKC-eta/Fyn-dependent pathway leading to keratinocyte growth arrest and differentiation.   Cabodi S, Calautti E, Talora C, Kuroki T, Stein PL, Dotto GP. Mol Cell. 2000;6(5):1121-9.
【非特許文献７】Induction of differentiation in normal human keratinocytes by adenovirus-mediated introduction of the eta and delta isoforms of protein kinase C.   Ohba M, Ishino K, Kashiwagi M, Kawabe S, Chida K, Huh NH, Kuroki T.   Mol Cell Biol. 1998 Sep;18(9):5199-207.
【非特許文献８】Differentiation-associated localization of nPKC eta, a Ca(++)-independent protein kinase C, in normal human skin and skin diseases.Koizumi H, Kohno Y, Osada S, Ohno S, Ohkawara A, Kuroki T.   J Invest Dermatol. 1993 Dec;101(6):858-63.
【非特許文献９】A nonsynonymous SNP in PRKCH (protein kinase  C eta) increases the risk of cerebral infarction.     Kubo M, Hata J, Ninomiya T, Matsuda K, Yonemoto K, Nakano T, Matsushita T, Yamazaki K, Ohnishi Y, Saito S, Kitazono T, Ibayashi S, Sueishi K, Iida M, Nakamura Y, Kiyohara Y.    Nat Genet. 2007 39(2):212-7.
【非特許文献１０】Association between PRKCH gene polymorphisms and subcortical silent brain infarction.     Serizawa M, Nabika T, Ochiai Y, Takahashi K, Yamaguchi S, Makaya M, Kobayashi S, Kato N. Atherosclerosis. 2008 Aug;199(2):340-5.
【非特許文献１１】PRKCH gene polymorphism is associated with the risk of severe gastric atrophy.     Goto Y, Hishida A, Matsuo K, Tajima K, Morita E, Naito M, Wakai K, Hamajima N. Gastric Cancer. 2010 13(2):90-4.
【非特許文献１２】The unique protein kinase Ceta: implications for breast cancer (review). Pal D, Basu A. Int J Oncol. 2014 Aug;45(2):493-8.
【非特許文献１３】PKCeta is a novel prognostic marker in non-small cell lung cancer.Krasnitsky E, Baumfeld Y, Freedman J, Sion-Vardy N, Ariad S, Novack V, Livneh E.Anticancer Res. 2012 Apr;32(4):1507-13.
【非特許文献１４】PKC eta as a therapeutic target in glioblastoma multiforme.Martin PM, Hussaini IM.   Expert Opin Ther Targets. 2005 Apr;9(2):299-313. Review.
【非特許文献１５】PKCeta is a novel prognostic marker in non-small cell lung cancer.Krasnitsky E, Baumfeld Y, Freedman J, Sion-Vardy N, Ariad S, Novack V, Livneh E.Anticancer Res. 2012 Apr;32(4):1507-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒトＰＫＣηｍＲＮＡ合成、蛋白質合成を特異的に強く抑制する物質を提供することを課題とする。    
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特定の蛋白質の生合成を阻害するためには、その蛋白質の生合成を指令するｍＲＮＡを標的とすることが考えられる。すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡの働きを抑制し、かつそのｍＲＮＡ自体を分解に導く戦略、つまりＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅを基本原理とする遺伝子発現制御システムを選択した。ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの現象は、１９９８年、Ｆｉｒｅらによって報告された、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに２本鎖ＲＮＡを導入し、ｉｎ ｖｉｖｏで特定遺伝子のノックダウンに成功したという発表により広く知られるようになった。使用された２本鎖ＲＮＡのターゲット遺伝子に対する特異性は、非常に高くターゲット配列に相補しない２本鎖ＲＮＡでは一切の発現制御効果を示さなかった。次いで、この実験系を哺乳動物に応用する試みがなされたが、２本鎖ＲＮＡの導入に伴う、インターフェロン作用が働くため、哺乳動物細胞の遺伝子をターゲットとした２本鎖ＲＮＡは使用できない事が大きな問題となった。その後、Ｔｕｓｃｈｌの研究グループがもっとも効率よく遺伝子をノックダウンする２本鎖ＲＮＡの研究をすすめ、３’末端に２塩基のオーバーハングを持った２１−ｍｅｒという短い２本鎖を用いると、哺乳類細胞で問題となっていたインターフェロン作用を引き起こさずにＲＮＡｉを機能させることができると報告した。このような短い２本鎖ＲＮＡをｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ。申請者はヒトＰＫＣηに作用し、ＰＫＣhｍＲＮＡ合成、蛋白質合成を特異的に抑制するｓｉＲＮＡの塩基配列を見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、ヒトＰＫＣηｍＲＮＡと蛋白質の生合成を強く抑制するｓｉＲＮＡ配列の決定からなる。
【００１３】
本発明によれば、ヒトＰＫＣη の機能を阻害することを特徴とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡが提供される
【００１４】
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、２又は３で示される塩基配列を標的配列とする。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを発現することができる発現ベクターが提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明者らは、慢性炎症性疾患、悪性腫瘍におけるＰＫＣηの役割に着目し、ＰＫＣηに特異的なｓｉＲＮＡについて研究を重ねた。その結果、他の遺伝子にホモロジーを示さない二本鎖ｓｉＲＮＡを見出し、本発明に到達した。
【００１７】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、他の遺伝子にホモロジーを示さない配列を標的配列として選択された配列であるから、ＰＫＣη遺伝子に特異的であり、オフターゲット効果を回避して使用できる。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、臨床応用可能であり、例えば、炎症性疾患・悪性腫瘍の治療、炎症性疾患・悪性腫瘍の予防、炎症性疾患・悪性腫瘍治療の医薬組成物、炎症性疾患・悪性腫瘍予防の医薬組成物、ＰＫＣh特異的阻害剤などに利用できる。なかでも、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を発揮するＰＫＣη遺伝子は、皮膚炎における治療標的分子となりうるから、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、皮膚炎の治療や予防、皮膚炎の医薬組成物などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＫＣηｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを感染後、７２時間後の不死化ケラチノサイト細胞株ＨａｃａＴにおけるＰＫＣηｍＲＮＡ発現量の比較（実施例１）
【図２】ＰＫＣηｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを感染後、７２時間後の肺腺癌細胞ＰＣ９におけるＰＫＣηｍＲＮＡ、蛋白質の発現変化（図２、実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＰＫＣηの機能を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡに関する。本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＰＫＣηの発現を特異的に抑制することができる。即ち、ｓｈＲＮＡが細胞に導入されると、ＲＮＡｉ現象が生じ、相同な配列を有するＲＮＡが分解される。このようなＲＮＡｉ現象は、線虫，昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００２０】
ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡは、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＰＫＣη遺伝子のｍＲＮＡを分解することにより、その発現を抑制することができる。
【００２１】
本発明では、ｓｉＲＮＡを用いてもよいし、当該ｓｉＲＮＡ を生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。本発明のｓｈＲＮＡ又はそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。本発明において用いられるｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はそれを発現する発現ベクターは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。
【００２２】
本発明の一例によれば、ｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００２３】
本発明の標的となるＰＫＣηのｍＲＮＡの配列は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースの登録番号ＮＭ_００６２５５から入手可能である。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＰＫＣη遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）、その他の多型、及び、変異体を含む。
【００２４】
本発明で用いるｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡは、ＰＫＣηｓｉ#１  ５'−GGA TTC AAA GAT TGC AGA ACA  −３’ (ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列９９８番目から１０１８番目：配列番号１)、ＰＫＣηｓｉ #２  ５’- GGT AAA TGC GGT GGA ACT TGC -３’(ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列１１９３番目から１２１３番目：配列番号２)、ＰＫＣηｓｉ #3  ５'−GCT TCTATG CTG CAG AAA TCA−３’（ ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列１６７５番目から１６９５番目：配列番号３）である
【００２５】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＰＫＣηの発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ、又はそれらの発現ベクターを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００２６】
本発明で用いる、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、ＰＫＣηの発現が抑制される。ここでは、例えば、各種のトランスフェクション試薬、例えば、Lipofectamine２０００（インビトロジェン）およびＸｔｒｅａｍｅ  ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ）などを用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はそれらの発現ベクターは、細胞内でＲＮＡｉ効果を生じることにより、ＰＫＣηを特異的に阻害することができる。即ち、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はそれらの発現ベクターは、ＰＫＣη阻害剤として有用である。
【００２８】
本発明の薬剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）などが挙げられる。
【００２９】
本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。 薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００３１】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水などが挙げられる。
【００３２】
さらに、本発明の薬剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。このような投与形態は、当該分野において公知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。
【００３３】
さらに本発明によれば、ＲＮＡｉによりＰＫＣηの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。さらに本発明によれば、上記した発現ベクターを含む細胞が提供される。本発明の細胞は、ＲＮＡｉを引き起こす因子を一過性発現しても安定に発現してもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは、治療に使用できるものである。
【００３４】
本発明のsiＲＮＡを、例えば、アトピー性皮膚炎の治療に利用する場合には、当該技術分野で公知の任意のドラッグ・デリバリー・システムを使用することが出来る。ＲＮＡ自体は不安定な物質であり、例えば、血液中に注入したような場合にはＲＮＡ分解酵素などによって分解されてしまう。また、RNAは通常皮膚角化層を通過することはできない。そこで、各種機能性リポソーム又は高分子ミセルなどのキャリア内にsiＲＮＡを封入したり、皮膚に親和性が高く、角層のバリアを容易に通過するナノ粒子基材、例えばナノエッグ、ナノキューブ（株式会社ナノエッグ）に封入する。又は、siＲＮＡの両端に、例えば、接着因子又は抗体分子などの標的誘導分子やＰＥＧを結合させることによってsiＲＮＡを修飾し、細胞内での安定性を高めることが可能である。
【００３５】
体内で効果的にsiＲＮＡを発現させて作用させる別の方法として、本発明siＲＮＡの発現ベクター、即ち、該siＲＮＡに対応するＤＮＡを外来ＤＮＡ断片として組み込んで得られる発現ＤＮＡベクターがある。このような発現ベクターとしては、当業者に公知の適当なベクター系を適宜選択し、当該技術分野で公知の適当な方法で作成することが出来る。このような本発明のsiＲＮＡに対応するＤＮＡ断片も当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。
【００３６】
尚、このような発現ベクターにおいては、プロモーターの下流に、siＲＮＡのセンス鎖に対応するＤＮＡ配列とアンチセンス鎖に対応するＤＮＡ配列が１本のＤＮＡにコードされている「ヘアピン型」又は「ステムループ型」と呼ばれる型のものがある。これは、体内で転写されてヘアピン（ステムループ）状のＲＮＡとなり、その後、酵素反応を受けてsiRNAが生成される。
【００３７】
このような発現ベクターの具体例として、例えば、アデノウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等の各種ウイルスベクターを挙げることが出来る。アデノウイルスベクターは、一般に遺伝子導入が著しく困難とされている表皮角化細胞等の初代培養細胞細胞を含む幅広い細胞への遺伝子導入が可能であり、且つ、導入効率がほぼ１００％である。導入遺伝子は通常、宿主細胞の染色体外に存在し、染色体への組み込みは稀である。従って、導入遺伝子の発現は一過性で通常１〜４週間である。また、インビボでの遺伝子導入効率も極めて高く、例えばマウス皮膚に対してはセロハンテープによる接着・剥離の繰り返し（テープストリッピング）の後、アデノウイルスを数時間接触させるだけで、表皮内へのほぼ１００％の遺伝子導入が可能である。またレンチウイルスベクターは、神経細胞のような非分裂細胞にも導入可能であり、更に、宿主染色体に導入遺伝子が組み込まれるために、１年以上にも及ぶ導入遺伝子の長期的発現が可能な系である。
【００３８】
以上のsiＲＮＡを活性成分として含有するキャリア、及び、siＲＮＡの発現ベクターは当業者に公知の方法で作成することが出来る。又、これらを含む組成物は、その目的、成分等に応じて、緩衝液及び補助剤等の当業者に公知の任意の成分が含まれており、更に、その使用・投与方法等に応じて、溶液、懸濁液又は乳濁液等の任意の形態とすることが出来る。
【００３９】
本発明方法において、細胞のトランスフェクションは当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、上記の本発明組成物を、例えば、注射等の適当な手段を用いてヒトを含む動物体内に適当な経路で投与することによって、インビボでトランスフェクションを行わせることも可能である。このような場合には、本発明方法はアトピー性皮膚炎患者への遺伝子治療方法として機能することになる。或いは、以下の実施例に示されるように、各種培養細胞系に対してインビトロでトランスフェクションを行うことも可能である。
【００４０】
以下に、本発明を、実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される物ではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１：ＰＫＣηｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターの構築）
培養細胞に安定的恒常的にＰＫＣηｓｈＲＮＡを発現させ、ＰＫＣηの発現を抑制させるためにＰＫＣhｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを構築した。
まずヒトＰＫＣhをコードする遺伝子の塩基配列番号９９８番目から１０１８番目に相補的な２１塩基のオリゴヌクレオチド（GGATTCAAAG ATTGCAGAAC A：配列番号１）を含む５６塩基のセンスオリゴヌクレオチド（GATCTGGATT CAAAGATTGC AGAACACGAA TGTTCTGCAA TCTTTGAATC CTTTTT:配列番号４）と、それと相補的な配列を含む５６塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド（CTAGAAAAAG GATTCAAAGA TTGCAGAACA TTCGTGTTCT GCAATCTTTG AATCCA:配列番号５）とからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを発現ユニットシャトルベクター（ｐＥＮＴＲ−Ｈ１）のマルチクローニングサイトのＢｇｌＩＩ部位とＸｂａＩ部位間に挿入した。同様に塩基配列１１９３番目から１２１３番目に相補的な２１塩基のオリゴヌクレオチド（GGTAAATGCGGTGGAACTTGC：配列番号２）を含む５６塩基のセンスオリゴヌクレオチド（GATCTGGTAA ATGCGGTGGA ACTTGCCGAA GCAAGTTCCA CCGCATTTAC CTTTTT : 配列番号６）と、それと相補的な配列を含む５６塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド（CTAGAAAAAG GTAAATGCGG TGGAACTTGC GCTTGCAAGT TCCACCGCAT TTACCA:配列番号７）、塩基配列１６７５番目から１６９５番目に相補的な２１塩基のオリゴヌクレオチド（GCTTCTATGC TGCAGAAA TC A：配列番号３）を含む５６塩基のセンスオリゴヌクレオチド（GATCTGCTTC TATGCTGCAG AAA TCACGAA TGATTTCTGC AGCATAGAAG CTTTTT:配列番号８）と、それと相補的な配列を含む５６塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド（CTAGAAAAAG CTTCTATGCT GCAGAAATCA TTCGTGATTT CTGCAGCATA GAAGCA:配列番号９）をそれぞれ、ｐＥＮＴＲ−Ｈ１に挿入し、計３種類のベクターを構築した。また陰性コントロールとして、ヒト内に相同な配列が存在しないＳｃｒａｍｂｌｅ配列（CAACAAGATGAAGAGCACCAA：配列番号１０）に相補的な２１塩基のオリゴヌクレオチドを含む５６塩基のセンスオリゴヌクレオチド（GATCTCAACA AGATGAAGAG CACCAACGAA TTGGTGCTCT TCATCTTGTT GTTTTT:配列番号１１）と、それと相補的な配列を含む５６塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド（CTAGAAAAAC AACAAGATGA AGAGCACCAA TTCGTTGGTG CTCTTCATCT TGTTGA:配列番号１２）も、ｐＥＮＴＲ−Ｈ１に挿入し、クローニングした。これらのベクターを、ＬＴＲ配列に挟まれた目的遺伝子発現ユニットベクター（ＣＳ−ＣＤＦ−ＲｆＡ−ＥＴＢｓｄＰ：）にＧａｔｅｗａｙＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（インビトジェン)を用いて組換え、クローニングした。これらの４種類のユニットベクターそれぞれと、ＨＩＶｇｐ蛋白質発現のためのヘルパーベクター（ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ）とＶＳＶ−Ｇ，Ｒｅｖ蛋白質を発現するためのヘルパーベクター（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ）とを、リン酸カルシウム法を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２〜３日間培養、培地中に生成されるレンチウイルスベクターを回収した。またこの行程により、構築したＰＫＣηｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを、配列番号１の配列を標的とする、ｓｈη＃１、配列番号２の配列を標的とするｓｈη＃２、配列番号３の配列を標的とするｓｈη＃３、陰性コントロールｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターをｓｈＳｃｒと命名する。
【００４２】
（実施例２．ＰＫＣηノックダウンＨａｃａＴ細胞の樹立）
ＨａｃａＴ細胞（H.Hans.et al. Evperimental Cell Reseach 239, 399, 1998）はＰＫＣhを発現するヒト不死化ケラチノサイトである。この細胞に、上記のＰＫＣηｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを感染させ、ＰＫＣηノックダウンＨａｃａＴ細胞を樹立した。ＨａｃａＴ細胞を６０ｍｍディッシュに２．５ｘ１０５個/ディッシュ
(ウシ胎児血清１０％/ＤＭＥＭ培地)の細胞密度で播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。ｓｈη＃１、ｓｈη＃２、ｓｈη＃３及びｓｈＳｃｒを多重感染度が１０となるように２ｍｌの培地に加え、更に最終濃度が6μg/mlとなるようにprotamine sulfateを添加し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。その後、新鮮な培地１０ｍｌに交換し、更に４８時間培養した。
【００４３】
ＰＫＣηの発現が抑制されていることを確認するために、以下の如くに定量リアルタイムＰＣＲ法により、ＰＫＣηｍＲＮＡの発現を測定した。
【００４４】
上記培養細胞から総RNAをRNAspin Mini (GE Healthcare)を用いて、添付の説明書に従って単離精製した。ＰＫＣηの発現レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより決定した。簡単には、総ＲＮＡをGoscript Reverse Transcript System (Promega)を用いてｃＤＮＡに変換させた。その資料をＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ試薬FastStartUniversal SYBR Green Master (Roche)と特異的なプライマーの存在下で、ABI StepOne System (Applied Biosystems)を用いて２−ステップＰＣＲを４０サイクル行い、増幅させた。内部標準としてグリセルアルデヒドー３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。
【００４５】
使用したプライマーは下記の通りである。
ＰＫＣh：
センスプライマー
５'−GGGCCAGACCAGCACCAAGC −３’ （配列番号１３）
アンチセンスプライマー
５’−GGGTGCAGTTGGCCACGAAGT −３' （配列番号１４）
【００４６】
ＧＡＰＤＨ：
センスプライマー
５’−TGCACCACCAACTGCTTAGC −３’ （配列番号１５）
アンチセンスプライマー
５’−GGCATGGACTGTGGTCATGAG−３’ （配列番号１６）
【００４７】
その結果、陰性コントロールウイルスベクターｓｈＳｃｒ導入ＨａＣａＴ細胞におけるＰＫＣηｍＲＮＡの発現と比較して、ＰＫＣηｓｈ＃１導入ＨａＣａＴ細胞では３４％、ＰＫＣηｓｈ＃２では５４％、ＰＫＣηｓｈ＃３では７７％抑制することが明らかとなった（図１）
【００４８】
（実施例３．ヒト腺癌細胞ＰＣ９でのＰＫＣηノックダウン）
ヒト腺癌細胞ＰＣ９にＰＫＣηｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター、ＰＫＣηｓｈ＃１、ＰＫＣηｓｈ＃２、ＰＫＣηｓｈ＃３を導入した時の、ＰＫＣη蛋白質の発現をウエスタンブロット法により解析した。ＰＣ９はウシ胎児血清１０％/ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。ＰＣ９細胞を６０ｍｍディッシュに１ｘ１０５個/ディッシュの細胞密度で播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。 ＰＫＣηｓｈη＃１、ＰＫＣηｓｈη＃２、ＰＫＣηｓｈ＃３及びｓｈＳｃｒを、多重感染度が１０となるように２ｍｌの上記培地に加え、更に最終濃度が6μg/mlとなるようにポリブレンを添加し、７２時間培養した。得られた培養物をPBSで２回洗浄し、その後0.2mLの可溶化液（50mM Tris-HCl、150mM NaCl、１mM EDTA、１％ Triton X-100 at pH 8.0、１mM PMSF）に溶解しつつセルスクレイパーで回収した。タンパク量をBCA Protein assayキット(Pierce  Biotechnology)によって測定した。その後、遠心分離（10000g、15分間）を行い、上澄み溶液はウエスタンブロット分析用に使用した。一定量（20μg）を10％アクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEを行った。ＰＤＶＦ膜に転写後、ブロッキング、１次抗体反応（anti-PKCη  polyclonal, 1:1000, Santa Cruz）、horse radish peroxidase標識２次抗体と反応、化学発光検出試薬で検出した。その結果、ＰＫＣηｓｈ＃１、ＰＫＣηｓｈ＃２ＰＫＣηｓｈ＃３によって、ＰＫＣη蛋白質が顕著に抑制されることが確認された(図２）
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のＰＫＣηを標的配列とするsiＲＮＡは、ＰＫＣη遺伝子発現抑制剤、ケラチノサイト分化誘導抑制剤として、ケラチノサイトの分化の解明等に利用することができる。さらに、皮膚炎の予防又は治療剤として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列１−３：ヒトＰＫＣηの一部をコードする配列
配列４−９：ヒトＰＫＣηの一部を含む人工塩基配列
配列１０−１１：ヒトゲノム上に存在しない配列
配列１２，１３：ヒトＰＫＣηの一部をコードする配列
配列１４，１５：ヒトＧＡＰＤＨの一部をコードする配列
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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