(57)【要約】【課題】  穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在、および糠層の存在を簡便かつ高精度で評価しうる方法を提供すること。【解決手段】  数万個もの抗体の中から、糠層に含まれる未成熟なデンプン粒の判別に適した抗体の選抜を行った結果、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体に結合する抗体が同定された。そして、当該デンプン分解酵素または複合体を指標として、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在、引いては糠層の存在を簡便かつ高精度で評価しうることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価する方法。
【請求項２】
α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における糠層の存在を評価する方法。
【請求項３】
塩類および糖質を含む溶液による穀類の種子からの抽出物を試料として、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
溶液がさらに還元剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体の検出を、当該デンプン分解酵素又は複合体に結合する抗体により行う、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗体が、NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項７に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン分解酵素または当該酵素を含む複合体を指標として、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価する方法に関する。また、本発明は、デンプン分解酵素または当該酵素を含む複合体を指標として、穀類の種子における糠層の存在を評価する方法に関する。さらに、本発明は、当該方法に用いられる抗体および当該抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
コメの胚乳には成熟したデンプン粒が含まれており、胚乳の外側を覆っている糠層の構成要素であるアリューロン層には未成熟もしくは分解途上のデンプン粒が含まれていることが知られている。米粒の表面にあるアリューロン層には、未成熟なデンプン粒以外に脂質やタンパク質、ミネラルが高い割合で含まれていることから、日本酒を造る際には、このアリューロン層を含む糠層を除去するための丹念な精米が行われている。例えば、本醸造酒では元重量の60〜70%まで精米され、吟醸酒では軽快な風味を得るために35〜50%程度までの高精米が行われる。
【０００３】
この精米においては、一般に、70%までに半日、50%までに1日、35%までに丸2日もの時間を要する。このため吟醸酒製造においては、精米にかかる時間の削減、引いては労力やコストの削減が大きな課題となっている。
【０００４】
一方、コメの胚乳と糠層とを識別する方法の開発も行われている。例えば、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色法(MG法)では、米の外皮、胚芽、縦溝、アリューロン層がメチレンブルーで青く染まるが、胚乳が染まらないことに基づいて識別を行う。しかしながら、染めた際に滲みが生じるため、青く染まっている部分とそうでない部分の境界の判別が難しく、標準サンプルがないこともあり70%未満の精米歩合での糠層を判別することは困難である。
【０００５】
新MG法(非特許文献１)およびその改良法(非特許文献２)では、エオシンにより胚乳はピンクに染まり、アリューロン層は紫から青に染まるため、70%精米までは、ある程度の判別が可能である。しかしながら、70％未満に精米された酒米における糠層の判別は、色の滲みにより境界が不鮮明になることや、標準品が存在しないことから、熟練者にとっても困難である。
【０００６】
電子顕微鏡を利用した方法では、米粒の表面状態を倍率を変えながら観察することで、糠層の残存を判別することが可能である。しかしながら、サンプルの調製や観察した画像取得には時間と熟練が必要であり、装置も高価であることから、生産・製造現場での利用は極めて困難である。
【０００７】
このようにコメのアリューロン層の成分を簡便に定性・定量する方法がいまだ開発されていないことから、醸造現場では、重量比(精米歩合)により精米の進行を管理するとともに、白米の千粒重や形状表面の目視により精米の出来不出来を判断するに止まっているのが現状である。そして、この問題は、大麦などの他の穀類にも当てはまる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kumagai  T.,  J.  Brew.  Soc.  Japan,  (1999)  74(2)  99
【非特許文献２】井尻勉ら,  研究成果情報  経営・作業技術・水田-畑作物・流通-加工・情報  関東東海農業  (2000)  1999  38-39
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在、引いては糠層の存在を簡便かつ高精度で評価しうる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、デンプン分解酵素およびそれらを含む複合体に対する抗体(モノクローナルおよびポリクローナル抗体)を取得し、数万個もの抗体の中から、糠層に含まれる未成熟なデンプン粒の判別に適した抗体の選抜を行った。
【００１１】
その結果、遂に、ホールマウント免疫染色法などにより穀物のアリューロン層を染色することができ、しかもアリューロン層に含まれる未成熟なデンプン粒を目視で判別することができる抗体を取得することに成功した。これら抗体が認識するタンパク質について検討を行ったところ、特に、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体に結合することが判明した。
【００１２】
これら事実から、本発明者は、穀類のα-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を指標に、穀類の種子における未成熟なデンプン粒の存在を簡便かつ効率的に評価することが可能であることを見出した。
【００１３】
未成熟なデンプン粒内では、上記デンプン分解酵素やその複合体が緩くデンプンに結合していることから、抗体がそれらを容易に認識できる一方、成熟したデンプン粒内では、上記デンプン分解酵素やその複合体がデンプンに覆われていることから、抗体がそれらを容易に認識できないと考えられる。このことは、即ち、成熟したデンプン粒であっても、分解または損傷により、デンプン分解酵素やその複合体とそれを覆っているデンプンとの結合が緩くなれば、抗体がそれらを認識できることを意味する。従って、上記デンプン分解酵素やその複合体を指標とすることにより、穀類の種子における未成熟なデンプン粒の存在のみならず、分解もしくは損傷したデンプン粒の存在をも評価することが可能である。
【００１４】
実際、穀類の種子においてデンプン粒を損傷させたところ、当該穀類の種子を塩類および糖質を含む溶液で処理することにより、上記デンプン分解酵素や当該デンプン分解酵素を含む複合体が容易に溶出してくることが、イムノブロット法などにより確認された。
【００１５】
以上から本発明者は、穀類の種子そのものを試料としたホールマウント免疫染色法などによる検出のみならず、塩類および糖質を含む溶液による穀類の種子からの抽出物を試料としたイムノブロット法などによる検出によっても、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、上記知見に基づくものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【００１７】
［１］  α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価する方法。
【００１８】
［２］  α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における糠層の存在を評価する方法。
【００１９】
［３］  塩類および糖質を含む溶液による穀類の種子からの抽出物を試料として、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出する、［１］または［２］に記載の方法。
【００２０】
［４］  溶液がさらに還元剤を含む、［３］に記載の方法。
【００２１】
［５］  α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体の検出を、当該デンプン分解酵素又は複合体に結合する抗体により行う、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
【００２２】
［６］  抗体が、NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、［５］に記載の方法。
【００２３】
［７］  NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマ。
【００２４】
［８］  ［７］に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、穀類の種子における未成熟なデンプン粒や分解もしくは損傷したデンプン粒の存在、引いては、糠層の存在を評価することが可能となった。本発明によれば、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を抗体で検出することにより、穀類の種子の一粒で、かつ、目視により、糠層の存在を評価することが可能である。また、塩類および糖質を含む溶液による穀類の種子からの抽出物を試料としたイムノブロット法などによる検出によっても、糠層の存在を評価することが可能である。このように本発明は簡便かつ高精度な手法であることから、精米や精麦の過程で利用すれば、大幅に時間、労力、およびコストを削減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】MonoSカラムで分画したα-グルコシダーゼ、Resource  Qカラムで分画したプルラナーゼ、およびアフィニティ精製したβ-アミラーゼをSDS-PAGE後CBB染色を行った結果を示す写真である。Aはα-グルコシダーゼ分画の染色像、Bはプルラナーゼ分画の染色像、Cはβ-アミラーゼ分画の染色像を示す。
【図２】プルラナーゼを認識するモノクローナル抗体(2G11bC)および抗α-グルコシダーゼ-ポリクローナル抗体(52-2)で酒米2種(五百万石,山田錦)を免疫染色した結果を示す写真である。
【図３】3つのモノクローナル抗体(3D8cG,1D9eB,7L7dH)による免疫染色で五百万石の糠層を検出した結果を示す写真である。
【図４】60%搗精した酒米(糠臭米)を各モノクローナル抗体(2G11bC,3D8cG,1D9eB,7L7dH)でホールマウント免疫染色した結果を示す写真である。対照として、50%搗精した酒米(山田錦)を用いた。
【図５】搗精度の異なる二条大麦を各モノクローナル抗体(2G11bC,3D8cG,1D9eB,7L7dH)でホールマウント免疫染色した結果を示す写真である。
【図６】搗精した各酒米(五百万石、山田錦、アケボノ)に対する各モノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。1:2G11bC,  2:7L7dH,  3:1D9eB,  4:3D8cG。
【図７】90%搗精した米(コシヒカリ)のデンプン粒に対して、各モノクローナル抗体(1L1bdG,1L12hbG,1L7hdA,1L9cbH)を用いた免疫電顕を行った結果を示す写真である。
【図８】90%搗精した米(コシヒカリ)のデンプン粒に対して、各モノクローナル抗体(1L1bdG,1L12hbG,1L7hdA,1L9cbH)で免疫沈降を行い、得られた免疫沈降物に対して、SDS-PAGE解析(A)および抗プルラナーゼ抗体を用いたイムノブロット解析(B)を行った結果を示す写真である。
【図９】乾式粉砕した二条大麦を、各糖質(グルコース、マルトース、ソルビトール)を含む緩衝液で処理し、得られた抽出物に対して、SDS-PAGE解析(A)および抗βアミラーゼ抗体を用いたイムノブロット解析(B)を行った結果を示す写真である。図中、「G」は0.5Mグルコースを、「M」は0.5Mマルトースを、「S」は0.5Mソルビトールを示す。
【図１０】乾式粉砕した二条大麦(二品種)を、塩類(塩化ナトリウム)、糖質(グルコース)、および各濃度の還元剤(L-システイン)を含む緩衝液で処理し、得られた抽出物のβ-アミラーゼ活性を検出した結果を示すグラフである。
【図１１】湿式粉砕した米粉パンに向く米品種を、各濃度の塩類(塩化ナトリウム)および各濃度の糖質(グルコース)を含む緩衝液で処理し、得られた抽出物に対して、各モノクローナル抗体(1D9eB,1L1bdG,1L7hdA,1L9cbH,1L12hbG)を用いたイムノブロット解析を行った結果を示す写真である。図中のサイズマーカー(単位は、kDa)は、上から順に、175、80、58、46、30、25、17である。また、電気泳動の各レーン(B〜I)の意味は、次の通りである。B;0.1M塩化ナトリウム,  C;0.1M塩化ナトリウム+0.1Mグルコース,  D;0.1M塩化ナトリウム+0.3Mグルコース,  E;0.1M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース,  F;0.3M塩化ナトリウム+0.1Mグルコース,  G;0.3M塩化ナトリウム+0.3Mグルコース,  H;0.3M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース,  I;0.5M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価する方法を提供する。また、本発明は、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼ、およびプルラナーゼからなる群より選択されるデンプン分解酵素または当該デンプン分解酵素を含む複合体を検出することを特徴とする、穀類の種子における糠層の存在を評価する方法を提供する。
【００２８】
本発明において「α-グルコシダーゼ」とは、α-1,4グリコシド結合を非還元末端からグルコース単位で遊離するエキソ型の加水分解酵素(EC  No：3.2.1.20)を意味する。また、「β-アミラーゼ」とは、α-1,4グリコシド結合を非還元末端からマルトース単位で遊離するエキソ型の加水分解酵素(EC  No：3.2.1.2)を意味する。また、「プルラナーゼ」とは、アミロペクチンのα-1,6グリコシド結合を触媒する加水分解酵素(EC  No：3.2.1.41)を意味する。
【００２９】
これらのデンプン分解酵素は、穀類の種子中で、他のタンパク質と会合して複合体を形成しうることが、本実施例の免疫沈降法による解析で明らかとなった。例えば、プルラナーゼは、分子量が45kDaのタンパク質、40kDaのタンパク質、25kDaのタンパク質、および12〜20kDaのタンパク質(穀物アレルゲンであるRAG2及びそのホモログを含む)と複合体を形成していた。従って、本発明の方法においては、上記デンプン分解酵素を含む複合体を検出対象とすることもできる。
【００３０】
上記デンプン分解酵素または複合体を検出する対象となる「穀類」は、デンプン質を主体としている種子が食用に利用されている植物であり、例えば、イネ、大麦、小麦、ソルガム、オーツ麦などイネ科植物が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３１】
穀類の種子における「糠層」とは、穀類の種子において胚乳の外側を覆っている、果皮、種皮、およびアリューロン層(亜アリューロン層を含む)からなる層を意味する。胚乳には成熟したデンプン粒が含まれており、一方、糠層の中のアリューロン層には未成熟もしくは分解途上のデンプン粒が含まれている。
【００３２】
本発明において、上記デンプン分解酵素または複合体を検出するための試料としては、穀類の種子そのものを用いることができる他、例えば、穀類の種子からの抽出物を用いることもできる。後述の検出手法などに応じて、適切な試料を選択すればよい。
【００３３】
穀類の種子からの抽出物を用いる場合、塩類および糖質を含む溶液による穀類の種子からの抽出物を試料とすることが好ましい。塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられるが、これらに制限されない。好ましくは塩化ナトリウムである。糖質としては、例えば、グルコース、マルトース、スクロース、フラクトースなどの糖類、およびソルビトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖アルコールが挙げられるが、これらに制限されない。好ましくはグルコース、マルトース、またはソルビトールである。抽出のための溶液に含まれる塩類および糖質は、それぞれ、通常は1M以下であり、好ましくは0.1〜0.5Mである。
【００３４】
抽出のための溶液には、タンパク質のジスルフィド結合を還元して抽出を容易にするなどの目的で、さらに還元剤が含まれていてもよい。還元剤としては、L-システインが好ましいが、これに制限されない。
【００３５】
本発明における検出の手法としては、特に制限はないが、好ましくは、上記デンプン分解酵素または複合体に結合する抗体を利用した免疫学的手法である。免疫学的手法においては、当該抗体が標識されている場合には、直接的に上記デンプン分解酵素または複合体を検出することができる。一方、当該抗体が標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子(例えば、二次抗体やプロテインA)を当該抗体に作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的に上記デンプン分解酵素または複合体を検出することができる。標識としては、検出可能であれば特に制限はなく、例えば、酵素や蛍光色素などを用いることが可能である。
【００３６】
試料として穀類の種子そのものを用いる場合、本発明に用いられる免疫学的手法としては、上記デンプン分解酵素または複合体の存在を目視により簡便に判別できる点で、特にホールマウント免疫染色法が好ましい。一方、試料として穀類の種子からの抽出物を用いる場合、本発明に用いられる免疫学的手法としては、上記デンプン分解酵素または複合体の存在を簡便に検出できる点で、特にイムノブロット法が好ましい。
【００３７】
免疫染色法においては、例えば、標識としてアルカリフォスファターゼを、その発色基質としてブロモクロロインドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウムを用いることができる。また、標識としてホースラディッシュパーオキシダーゼを、その発色基質としてジアミノベンチジン/過酸化水素を用いることができる。
【００３８】
使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性で上記デンプン分解酵素または複合体を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体(数種〜数十種の抗体の混合物)やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、sc(Fv)2、dsFv、およびダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー)を用いることもできる。
【００３９】
本発明において特に好ましい抗体は、NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体(それぞれ本実施例における「2G11bC」、「3D8cG」、「1D9eB」、「7L7dH」に相当する)である。
【００４０】
なお、上記ハイブリドーマの寄託に関する情報は、以下の通りである。
【００４１】
(1)寄託機関
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物センター(〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)
(2)寄託日(受領日)
NITE  AP-02110：平成27年8月28日
NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102：平成27年8月11日
免疫学的手法に用いられる抗体の調製は、当業者に公知の方法で行うことができる。ポリクローナル抗体であれば、抗原(上記デンプン分解酵素、上記複合体、またはそれらを含む調製物など)で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段(例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど)によって、精製して取得することができる。
【００４２】
また、モノクローナル抗体であれば、ハイブリドーマ法や組換えDNA法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法(Kohler&Milstein,  Nature  1975;256:495)が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原で免疫された動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ)の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、上記デンプン分解酵素または複合体に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。上記デンプン分解酵素または複合体に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４３】
組換えDNA法は、上記抗体をコードするDNAをハイブリドーマやB細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞(例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など)に導入し、抗体を組換え抗体として産生させる手法である(例えば、P.J.Delves，Antibody  Production:Essential  Techniques,  1997  WILEY、P.Shepherd  and  C.Dean  Monoclonal  Antibodies,  2000  OXFORD  UNIVERSITY  PRESS、Vandamme  AM,  et  al.  Eur.  Ｊ.  Biochem.  1990;192:767-775)。抗体をコードするDNAの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい(WO94/11523号公報参照)。抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物(ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど)を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００４４】
こうして得られた抗体もしくはその遺伝子を基に、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、sc(Fv)2、dsFv、およびダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体(例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー)を調製することもできる。
【００４５】
免疫学的手法以外の方法としては、例えば、穀類の種子からの抽出物をSDS-PAGEなどの電気泳動により分離して染色する方法や、穀類の種子からの抽出物において上記デンプン分解酵素または複合体の活性を検出する方法が挙げられる。
【００４６】
本発明においては、上記デンプン分解酵素または複合体を指標として、穀類の種子における未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在を評価する。
【００４７】
未成熟なデンプン粒内では、上記デンプン分解酵素やその複合体は、緩くデンプンに結合していることから容易に検出できる一方、成熟したデンプン粒内では、上記デンプン分解酵素やその複合体は、デンプンに覆われていることから容易に検出できない。また、成熟したデンプン粒であっても、分解または損傷により、デンプン分解酵素やその複合体とそれを覆っているデンプンとの結合が緩くなれば、当該デンプン分解酵素やその複合体は容易に検出できるようになる。本発明における、未成熟なデンプン粒または分解もしくは損傷したデンプン粒の存在の評価は、かかる本発明者による知見に基づくものである。
【００４８】
また、本発明においては、上記デンプン分解酵素または複合体を指標として、穀類の種子における糠層の存在を評価する。穀類の種子においては、成熟したデンプン粒が含まれている胚乳とは対照的に、胚乳の外側を覆っている糠層の構成要素であるアリュ-ロン層には未成熟もしくは分解途上のデンプン粒が含まれている。従って、上記デンプン分解酵素または複合体を指標として、未成熟なデンプン粒や分解したデンプン粒の存在を評価できるということは、引いては、糠層の存在を評価できるということをも意味する。本発明における、糠層の存在の評価は、かかる本発明者による知見に基づくものである。
【００４９】
本発明において「存在の評価」とは、存在の有無の評価や存在する部位の評価のみならず、存在の程度の評価をも含む意である。従って、穀類の種子の搗精過程における糠層の存在の評価に際しては、例えば、糠層の残存の有無や部位の評価に加えて、糠層の残存率などによる残存の程度の評価を採用することもできる。これにより簡便かつ効率的に、精米や精麦の進行や質を管理することができる。
【００５０】
また、本発明は、上記本発明の方法に用いられる抗体および当該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、好ましくは、NITE  AP-02110、NITE  AP-02100、NITE  AP-02101、およびNITE  AP-02102のいずれかの寄託番号で特定されるハイブリドーマであり、抗体は好ましくは、当該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［材料と方法］
1.  抗原の精製
1.1  α-グルコシダーゼおよびプルラナーゼの精製
米種子からα-グルコシダーゼおよびプルラナーゼの精製を行った。α-グルコシダーゼは、文献(Mabashi  Y.  et  al.,  Food  Research  International  (2009)  42(1)  157-184)記載の方法に従った。すなわち、90%搗精米より調製した米粉400gに5mM  DTTおよび90mM塩化ナトリウムを含む20mM  マロン酸バッファー(pH5.2)1,000mlを加えて4℃で15時間、穏やかに振盪抽出を行い、遠心分離(4℃,15.000×g,30分)を行った。遠心後の上清は、濾過し、硫酸アンモニウムを飽和濃度の70%になるよう氷冷下で徐々に加え、4℃で3時間静置した。遠心分離(4℃,15,000×g,30分)後，上清を捨て、50mM  HEPES-NaOHバッファー(pH8.2)に懸濁し、同バッファーに対して透析を行った。その後、ポアサイズ0.45μmのシリンジフィルターで濾過を行い、陽イオンクロマトグラフィーに供した。陽イオン交換カラム(5ml  Econo-Pac  HighS  cartridge,  バイオラッド)を50mM  HEPES(pH8.2)にて平衡化した後にサンプルを供し、0〜0.5M塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出し、分画した。その後、20mM  Bicine-NaOH(pH9.0)で平衡化したMono  S  HR5/5カラム(GEヘルスケア)に流し、0〜0.5M塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出して精製した。
【００５３】
また、α-グルコシダーゼ精製途上において50mM  HEPES-NaOH(pH8.2)で平衡化した陽イオン交換体に結合しなかった画分を、25mM  Tris-HCl(pH8.0)で平衡化したResource  Q(GEヘルスケア)に吸着させ、0〜0.5M塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出することによりプルラナーゼを精製した。
【００５４】
1.2  α-シクロデキストリン固定化担体を用いたβ-アミラーゼ精製
β-アミラーゼは、文献(Totsuka,  A.  and  Fukazawa  C.  Protein  Express.  Purifi  (1993)  45,  333-336)記載の方法を改良して大麦から精製した。Epoxy-activated  Sepharose  6B(GE  Healthcare)2gをイオン交換水で膨潤させた後、吸引濾過を行い0.1N水酸化ナトリウムに置換した後、α-シクロデキストリン(Wako,  033-08332)200mgを添加し、45℃で16時間振とうした。反応終了後、吸引濾過を用いてSQ水100ml、2.5%  グルコース溶液50mlを担体に流して洗浄し、エポキシ基をブロックした後、カラムに充填した。粉砕した大麦10gを5mM  DTTを含む50mM酢酸ナトリウム(pH5.7)50mlで抽出した液に、硫酸アンモニウムを終濃度で1.5Mになるように加えてから、α-シクロデキストリン固定化担体カラムにロードした。1.5M硫酸アンモニウム,50mM酢酸バッファー(pH5.7)で洗浄した後、0.8M硫酸アンモニウム,  50mM酢酸バッファー(pH5.7)でカラムよりβ-アミラーゼを溶出した。β-アミラーゼ活性は、β-amyl3キット(megazyme)を用いて測定した。
【００５５】
2.  モノクローナル抗体の作製
2.1  免疫
抗原に等量のアジュバント(Titer  Max  GOLD,  フナコシCYT  G-1)を混合してエマルジョンを作製し、8周齢の雄BALB/cマウス腹腔内に100μl注射した。一週間後、上述のエマルジョンを再度注射し、さらに一週間後にも投与した。最後の注射から1週間後、採血し、ELISA解析により抗体価を測定した。抗体価が高くなっているのを確認できた個体については、上述のエマルジョンを用いて細胞融合の1週間前と3日前にブーストを行った。
【００５６】
2.2  細胞融合
最終免疫3日後のマウスより鼠径リンパ節、膝下リンパ節および脾臓を摘出し、ポリエチレングリコール(Roche，783-641)を用いて、ミエローマ細胞(P3U1)との細胞融合を行った。リンパ節細胞の場合は、ミエローマ細胞(1.5x107細胞)にリンパ節細胞(〜3x107細胞)を加えPEGにより融合させた後、GIT培地(Wako)に50μg/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、および1ng/ml  IL-6(Wako,  098-06041)を添加した培地(GIT/IL-6/PS)に、HT  supplement(Invitrogen,  11067-030)およびaminopterine(Sigma,  A-5159)を添加した培地にて混和し、96ウェルプレート5枚に200μl/ウェルずつ加えた。37℃  CO2(5%)のインキュベーターで10日間培地交換をせずに静置培養を行い、観察用に播いた5枚目のプレートでコロニーが確認できたら、残りの4枚のプレートについて、下記の一次・二次スクリーニングを行った。
【００５７】
2.3  Elisaによる1次・2次スクリーニング
96ウェル  ELSAプレート(Nunc-Immuno  Plate  MaxiSorp  Surface,  Nunc  442404)に抗原タンパク質50μl/ウェルを加えて4℃で一晩静置し、抗原タンパク質を吸着させた後、3.75%  BSA/PBS-T(0.1%  Tween20/PBS)200μl/ウェルを加え(最終BSA濃度3%)、室温で2時間置いてブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、PBS-Tで1回、PBSで3回の洗浄を行い、一次抗体(培養上清)を50μl/ウェル加え、室温で1時間反応させた。上述と同様に洗浄を行い、5000倍希釈した二次抗体(anti-mouse-IgG-HRP標識，Cappel)を50μl/ウェル加え、室温で30分間反応させた。上述と同様に洗浄を行い，遮光下で室温に戻しておいたTMB-ELISA溶液(PIERCE34022もしくはNacalai005298-80)を50μl/ウェル加えた。青色の発色が適当になったところへ1Mリン酸を50μl/ウェル加えて発色を停止させ、450nmの吸光度を測定した。測定値を検討し、陽性ウェルにコロニーが存在していることを観察して確認後、その細胞を24ウェルプレートに継代した。継代においては、24ウェルプレートに800μl/ウェルでGIT/IL-6/HT培地を入れておき、そこへ96ウェルプレートから細胞液を移した。
【００５８】
24ウェルプレートに継代した細胞のうちコンフルエント(60〜80%程度)に増殖したものについて、その培養上清を一次抗体としてELISAで確認した。陽性なものについてはクローニングを行い、その残りの細胞は6ウェルプレートに継代した。継代においては、6ウェルプレートに4ml/ウェルでGIT/IL-6/HT培地を入れておき、そこへ24ウェルプレートの細胞液を移した。6ウェルプレートに継代した細胞が増殖したら、その培養上清を用いて、後述の免疫染色や免疫沈降によるスクリーニングを行った。
【００５９】
2.4.  免疫染色によるスクリーニング
4%パラホルムアルデヒド/PBSで固定した玄米・玄麦をカミソリで2分割した切断片を用いて，蛍光免疫染色に適する抗体の選抜を行った。
【００６０】
固定後の玄米・大麦粒切断片を3回洗浄し、blocking  reagent(Roche,  11096176001)で室温にて2時間以上、ブロッキングを行った。洗浄後、細胞培養上清をチューブに加え、4℃で一晩麦粒断片を静置した。PBSで洗浄を行った後、anti-mouse  IgG  Alexa488標識抗体(Invitrogen,  A11001)を500倍希釈して室温で1時間遮光下にて静置した。上述と同様にPBSで洗浄後、窪んだアクリル板に米・大麦粒の断面を上にしておき、正立顕微鏡(Nikon,  Y-FL)で観察し、カラーCCD(IMAGING,  RETIGA-SRV)で撮影後、ImageJでファイル・色変換を行った。
【００６１】
2.5  クローニング
6ウェルプレート内の上清15mlをチューブに移して遠心分離(35℃,1,200rpm,5分)し、上清は新たな15mlチューブに移し、免疫沈降もしくは免疫染色で抗体活性を確認した。沈殿した細胞はGIT-HT培地2mlに懸濁した。細胞数を数え、105細胞/mlとなるように培地で希釈した。96ウェルプレートに150μl/ウェルで培地(GIT/IL-6/HT)を入れ、希釈した細胞液150μlを列1に入れた。ピペッティングして懸濁し，そのうち150μlを列2に入れた。同様にして列2から150μlをとって列3に入れ，これを列12まで繰り返して行った。残りの細胞培養液は遠心分離(35℃,1,200rpm,5分)して上清を除去し、沈殿細胞にセルバンカーBLC-1(Wako,  630-01601)2mlを加えて懸濁し、セラムチューブに0.5mlずつ分注し、-80℃で凍結保存した。このクローニングされたハイブリドーマから産生される抗体をモノクローナル抗体とした。
【００６２】
2.6  免疫沈降によるスクリーニング
免疫沈降にはDynadeads  Protein  G(Invitrogen)を使用した。Dynabeads  Protein  Gをボルテックスミキサーで懸濁し、2mlチューブに全必要量(50μl/tube×サンプル数)を移した。磁石に取り付け上清を除去し、Dynabeadsと同量のImmunopure  IgG  washing  buffer(Pierce,  21011)で懸濁後、2mlチューブに50μl/tubeで分注した。Washing  Buffer  300μl(量は可変)を加え、同量の培養上清を加えて室温で5〜30分間ローラーにて回転させて抗体を結合させた。磁石に取り付け、上清を除去し、200μlのWashing  bufferに再懸濁させ、Dynabeads-抗体複合体を洗浄した。抗原を含むサンプル40μlを加えて静かに再懸濁し、4℃で一晩、ローラーにて回転させた後、磁石に取り付けて上清を除去し、200μlのWashing  BufferでDynabeads-抗体抗原複合体を3回洗浄して磁石に取り付けて上清を除去した。Dynabeads-抗体抗原複合体にElution  Buffer(0.1M  Glycine-HCl(pH2.7))26μlを加えて懸濁し、磁石に取り付けた。0.5mlチューブにNu  PAGE  LDS  Sample  Buffer/NuPAGE  Reducing  Agent  mix  14μl(10:4)を入れ、Elution  Bufferに懸濁させたDynabeads-抗体抗原複合体の上清を加えて懸濁し、65℃で10分間インキュベートした。これをSDS-PAGEゲルにロードし、泳動後銀染色を行い、抗体が認識する抗原が単一であるかを確認した。
【００６３】
2.7  モノクローナル抗体の精製
モノクローナル産生細胞の培養上清100mlを0.22μmフィルター(Milipore)に通した後、添付の吸着バッファーもしくはPBSで平衡化したExtraPure  G(京都モノテック)シリンジタイプに10mlシリンジを用いてロードした。添付の洗浄バッファーもしくは上記のBinding  &  Washing  bufferで余分なタンパク質を除去した後、2ml溶出バッファーもしくは0.1M  Glycine-HCl(pH2.7)でIgG抗体を溶出し、0.2mlの中和バッファーで中和した。PBSで平衡化した、SephadexG-25カラム(GEヘルスケア，PD-10)で脱塩後、Centricon  YM-50(Amicon)で濃縮し、0.02%アジ化ナトリウムを添加した状態で4℃で保存した。
【００６４】
3.  凍結切片の作製と免疫染色
保冷容器にドライアイスとヘキサンを入れ十分冷却させた後、試料米3粒(4%PFAで固定済)を包埋容器の底面近くへ並べ入れ、SCEM(Leica)を入れて凍結させた。その後、包埋容器から凍結ブロックを取り出し、試料ディスクに凍結ブロックを固定してクライオスタット(Leica)で川本法(Kawamoto  and  Shimizu,  (2000)  Histochem.  Cell  Biol.  113;  331-339)の粘着フィルムを貼り付けて5μmで薄切し、blocking  reagent(Roche)でブロッキング後、一次抗体として精製モノクローナル抗体(10μg/ml)および各酵素に対するウサギポリクローナル抗体(500〜2000倍)を切片上に載せた。洗浄後anti-mouse  IgG  Alexa488標識抗体もしくはanti-rabbit  IgG  Alexa594標識抗体を各1,000倍希釈したものを加えて静置し、洗浄後SCMM(Leica)によりスライドにマウントし、倒立顕微鏡(Keyence  BZ-X700)で撮影し、画像処理はPhotoshop  Element  13.0(Adobe  Systems)で行った。
【００６５】
4.  ホールマウント免疫染色による残存糠層の可視化
4%PFAで固定した精白された酒米および大麦を、10%  正常ウマ血清で室温4時間以上ブロッキングした後、一次抗体(10-20μg/ml)で室温2時間静置後PBSで洗浄し、二次抗体anti-mouse-Alkaline  Phosphatase標識(cappel,  5,000倍希釈)で室温30分間反応後、PBSで洗浄した。ブロモクロロインドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウム試薬800μl(Roche)に洗浄した酒米もしくは大麦を入れて、40℃で60〜90分間反応させ、洗浄後は0.2M  Glycine-HCl  pH2.0中で保管し、実体顕微鏡下(キーエンスVHX70)で撮像した。
【００６６】
5.  ホールマウントElisaによる定量的評価
4%PFAで固定した精白酒米を10%  正常ウマ血清で室温4時間以上ブロッキングした後、一次抗体(10-20μg/ml)で室温一晩静置後PBSで洗浄し、二次抗体anti-mouse-Horseradish  Peroxidase標識(cappel,  5,000倍希釈)で室温30分間反応後PBSで洗浄した。TMB試薬400μl(ナカライ、ELISA  POD基質TMBキット)に洗浄した酒米5粒を入れて40度5〜30分間反応させ、等量の1Mリン酸を加えて反応を停止した後、450nmで吸光度を測定した。
【００６７】
6.  デンプン粒内のタンパク質の検出
(1)SDS-PAGEおよびイムノブロット
90%搗精米(コシヒカリ)より調製した米粉に5mM  DTTおよび90mM塩化ナトリウムを含む20mMマロン酸バッファー(pH5.2)を加えて4℃で15時間穏やかに振盪抽出し、遠心分離(4℃,15,000×g,30分)を行った。沈渣を80％塩化セシウムに懸濁して遠心(4℃,15,000×g,15分)を行い、沈殿からデンプン粒を調製した。このデンプン粒を抗原として、「2.モノクローナル抗体の作製」に記載されている方法に従って、モノクローナル抗体の作製を行った。得られたモノクローナル抗体につき、さらに、糠層及び胚乳部分にあるデンプン粒の認識を指標に選抜して、1L1bdG、1L12hbG、1L7hdA、および1L9cbHを得た。そして、上記の調製したデンプン粒を抗原溶液として各モノクローナル抗体で免疫沈降を行った。得られた免疫沈降物に対して、SDS-PAGE解析および抗プルラナーゼ抗体を用いたイムノブロット解析を行った。
【００６８】
(2)免疫電顕
次に、調製したデンプン粒をブロッキング後精製モノクローナル抗体(1L1bdG,1L12hbG,1L7hdA)と反応させ、HRP標識2次抗体と反応後基質ジアミノベンチジンと過酸化水素により発色させた。これをエタノール上昇系列(70,80,90,95,100％エタノール)で脱水し、酸化プロピレンに置換した後に樹脂浸透を行い、エポキシ樹脂Quetol  812に包埋して70℃で一晩重合させた。準超薄切片で試料の存在を確認した上で厚さ80〜100nmの超薄切片を作製した。得られた切片をグリッドに回収し、鉛染色液で染色して透過型電子顕微鏡で観察した。
【００６９】
1L9cbHについては、エポキシ樹脂に脱水処理した米デンプン粒を包埋後、上記同様に作製した超薄切片上で反応後、金コロイド標識2次抗体と反応させてから、上記と同様に電子顕微鏡で観察した。
【００７０】
7.  糖質、塩類、および還元剤の添加によるデンプン粒からのタンパク質の溶出
(1)SDA-PAGEおよびイムノブロット
サイクロテック1093(Foss  Japan)で乾式粉砕した二条大麦0.5gを15mlポリプロピレン遠心管に入れ、20mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)または50mM炭酸水素ナトリウムバッファー(pH8.4)に0.5Mグルコース、0.5Mマルトース、または0.5Mソルビトールを加えた溶液5mlで4℃で一晩150rpmにて振盪抽出した。遠心管で遠心分離(3,000g×5分,  4℃)を2回行い、上清について、Biorad  Protein  Assay  kitを用いてタンパク質濃度を測定した。各上清(タンパク量3μg)をSDS-PAGE(12.5%ポリアクリルアミドゲル)を行い、50%メタノール10%酢酸を含むCBB-250Rで固定と染色を行った。また、各上清(タンパク量0.5μg)をSDS-PAGE後、PVDF膜(Millipore)に転写し、転写後の膜をStarting  block  PBS  buffer(サーモフィッシャー)でブロッキングした。その後、抗βアミラーゼポリクローナル抗体を反応させ、洗浄後、anti-rabbit  HRP標識抗体(GEヘルスケア)を2,000倍希釈したものを加えて静置し、洗浄後、化学発光検出試薬(GEヘルスケア)を用いてCCDカメラタイプ画像解析装置(LAS-500，GEヘルスケア)により特異的なバンドを検出した。
【００７１】
(2)β-アミラーゼ比活性の測定
乾式粉砕した2種類の二条大麦品種各0.5gを15mlポリプロピレン遠心管に入れ、5mlのバッファー［50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)に、0.3Mグルコースもしくは0.3Mグルコース+0.1M塩化ナトリウム、および各濃度のL-cystein(1,3,10,30,90mM)を添加したもの］を添加し、4℃で一晩150rpmにて振盪抽出した。遠心分離(3,000g×5分,4℃)を2回行い、上清について、Megazyme  betamyl-3キット(K-beta3)を用いて50℃で10分間反応させ、400nmにおける吸光度変化を基に、βアミラーゼ活性を測定した。また、タンパク質濃度は上記と同じキットで測定した。
【００７２】
8.  イムノブロットによる溶出抗原の検出
湿式粉砕したデンプン損傷率がほぼ同じで品種が異なる米粉(品種１;デンプン損傷率2.2,  品種2;デンプン損傷率2.3)0.1gに、20mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)に下記濃度のグルコースおよび塩化ナトリウムを加えて調製したバッファー1mlを加え、室温で一晩振盪抽出した。
【００７３】
B;0.1M塩化ナトリウム,  C;0.1M塩化ナトリウム+0.1Mグルコース,  D;0.1M塩化ナトリウム+0.3Mグルコース,  E;0.1M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース,  F;0.3M塩化ナトリウム+0.1Mグルコース,  G;0.3M塩化ナトリウム+0.3Mグルコース,  H;0.3M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース,  I;0.5M塩化ナトリウム+0.5Mグルコース。
【００７４】
4℃で遠心後、上清10μgに対してSDS-PAGE(15%ポリアクリルアミドゲル)を行った後、PVDF膜に転写した。転写後の膜をStarting  block  PBS  bufferでブロッキング後、精製モノクローナル抗体(1〜10μg/ml)と反応させ、洗浄後、anti-mouse  HRP標識抗体(Cappel)を5,000倍希釈したものを加えて静置し、洗浄後、化学発光検出試薬を用いてCCDカメラタイプ画像解析装置により特異的なバンドを検出した。
【００７５】
［結果］
1.  モノクローナル抗体作製抗原の精製
MonoSカラムで分画したα-グルコシダーゼ、Resource  Qカラムで分画したプルラナーゼおよびアフィニティ精製したβ-アミラーゼをSDS-PAGE後CBB染色を行った結果を、図1に示す。α-グルコシダーゼ分画のメインは80kDaタンパク質、プルラナーゼ分画のメインは90kDaタンパク質、β-アミラーゼ分画は44kDaタンパク質であった。
【００７６】
2.  免疫沈降とイムノブロット法による確認
Dynadeads  Protein  Gを用いた免疫沈降の結果、2G11bCは90kDaタンパク質を、3D8cGは主に80kDaタンパク質を、7L7dHは44kDaタンパク質を沈降し、各酵素に対するポリクローナル抗体を用いたイムノブロット解析からそれぞれ、プルラナーゼ、α-グルコシダーゼ、β-アミラーゼであることが確認できた。1D9eBは、バンドの濃い順に45kDa,40kDa,25kDa,12kDa,90kDaのタンパク質を免疫沈降させ、90kDaタンパク質が抗プルナーゼ-ポリクローナル抗体で認識されたことから、プルラナーゼおよびそれと会合するタンパク質(45kDa,40kDa,25kDa,12kDa)の複合体を認識することが示された。
【００７７】
3.  免疫染色に適した抗体は糠層を検出
プルラナーゼを認識し免疫染色に適するモノクローナル抗体として2G11bC、α-グルコシダーゼを認識し免疫染色に適するモノクローナル抗体として3D8cG、β-アミラーゼ様タンパク質を認識し免疫染色に適するモノクローナル抗体として7L7dH、プルラナーゼを含む複合体を認識し免疫染色に適するモノクローナル抗体として1D9eBの取得に成功した。
【００７８】
図2に2G11bCと抗α-グルコシダーゼ-ポリクローナル抗体(52-2)で酒米2種を染色した結果を示す。山田錦は、糠層は3層ほどしか無く、胚乳には丸い大きなデンプン粒の数が多いのに対し、五百万石では糠層は5層ほどと厚く、胚乳には丸く大きなデンプン粒よりも粳米のように敷石状にデンプン粒が詰まっている部分が多かった。以上のことから、未熟なデンプン粒を可視化することで糠層部位を定量的に把握できる可能性が示された。
【００７９】
図3に、酒米の中で糠層の一番厚い五百万石の切片を2G11bC以外のモノクローナル抗体で間接蛍光免疫染色した結果を示す。モノクローナル抗体の種類によりアリューロン層や果皮の異なる部位が認識されることから、適切な抗体を利用することにより異なる搗精度の精米サンプルを評価できることが示された。
【００８０】
4.  糠層検出に適した抗体による残存糠層の可視化
糠層の判別に適した上記のモノクローナル抗体4種類を60%搗精した酒米に反応させた後、アルカリフォスファファターゼ標識抗体と反応させ、ブロモクロロインドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウムで発色させた。その結果を図4上段に、対照として50%搗精した山田錦を同様に反応させたものを図4下段に示す。紫から赤に着色している部位に糠層が残存している。50%搗精した大吟醸用の山田錦では糠層は検出されないが、糠臭が問題となっている酒米では、各抗体により、残存する糠層を目視で判別することができた。
【００８１】
図4に示した抗体を用いて、搗精度の異なる二条大麦をホールマウント染色した結果を図5に示す。青に着色している部位に糠層が残存している。
【００８２】
5.  抗体による残存糠層の定量的評価
玄米の初期重量に対して、40%の重量分が糠となるように異なる機器で搗精した60%酒米(五百万石、山田錦、アケボノ)を試料として、ホールマウントElisaによる測定を行った。5粒を一バッチとして5〜30分間  TMB基質400μlと反応させて吸光度を測定し、1次抗体を加えないで染色した米粒から得られたた値(バックグラウンド)を差し引いた。
【００８３】
その結果を図6に示す。特に、2G11bCは基質との反応時間が5分で十分な発色が得られることから、実用場面での利用が期待できる。MG法による目視で判断している現状に比べて、効率と再現性の面で優れていることが判明した。
【００８４】
6.  免疫電顕によるデンプン粒内のタンパク質の局在の確認
イネのデンプン粒内には、デンプンの蓄積に伴うグロースリングと呼ばれる構造が存在する。各モノクローナル抗体(1L1bdG、1L12hbG、1L7hdA、および1L9cbH)を用いて、調製したデンプン粒に対して免疫電顕を行った結果、このグロースリングに沿う形で、これら抗体で認識される抗原が存在していることが判明した(図7の囲み)。
【００８５】
さらに、これらの抗体が、12〜20kDaタンパク質を免疫沈降させ(図8A)、中でも1L1bdGは、プルラナーゼを含む酵素複合体を免疫沈降させることが判明した(図8B)。なお、免疫沈降された12〜20kDaタンパク質は、穀物アレルゲンであるRAG2に対する抗体に反応したことから(データは示していない)、当該タンパク質の中にRAG2及びそのホモログが含まれることが確認された。
【００８６】
このようにデンプン粒中には、デンプン分解酵素やその複合体が含まれることが明らかとなった事から、磨砕や粉砕などの物理的処理や酵素処理などに伴って、デンプン粒が損傷や分解を受けた場合、その程度に応じて、損傷や分解を受けたデンプン粒から溶液中に溶出される抗原の量や種類が変動すると考えられる。従って、溶出される抗原の量や種類を検出することにより、デンプン粒の損傷や分解の程度やデンプン粒の未成熟度を評価することが可能となると考えられる。この事は、粉砕処理した二条大麦を用いた以下の実験により、裏付けられた。
【００８７】
7.  糖質、塩類、および還元剤の添加によるデンプン粒からのタンパク質の溶出
乾式粉砕した二条大麦からのβアミラーゼ抽出時に、糖質(グルコース、マルトース、またはソルビトール)を添加したバッファー(酢酸ナトリウムバッファーまたは炭酸水素ナトリウムバッファー)を用いることで、βアミラ−ゼ溶出量が増加した(図9)。また、糖質(グルコース)および塩類(塩化ナトリウム)の添加により、塩類(塩化ナトリウム)単独の添加よりも、2つの大麦品種におけるβアミラ−ゼ活性が増大し、さらに還元剤であるL-システインを添加することにより、2つの大麦品種におけるβアミラ−ゼ活性が相加的に増大した(図10)。
【００８８】
8.  イムノブロットによる溶出抗原の検出
米2品種を湿式粉砕し、各濃度の塩類および糖質を含むバッファーで処理したところ、各モノクローナル抗体(1L1bdG、1L12hbG、1L7hdA、および1L9cbH)で認識されるタンパク質が溶出することが判明した(図11)。1D9eBで認識されるタンパク質は、品種1では主に分画(H)に、品種2では主に分画(C)に検出された。1L1bdGで認識されるタンパク質は、品種1では主に分画(G)に、品種2では主に分画(B)に検出された。1L9cbHまたは1L7hdAで認識されるタンパク質は、品種1では主に分画(E)に、品種2では主に分画(C)に検出された。1L12hbGで認識されるタンパク質は、品種1では主に分画(E)と(H)に、品種2では主に分画(C)と(G)に検出された。なお、品種１においては、「1.0M塩化ナトリウム+1.0Mグルコース」の条件であっても、1L12hbGで認識されるタンパク質の溶出が認められた。
【００８９】
酵素法で求めたデンプン損傷率が同じで品種違いのサンプルを塩類および糖質を含む溶液による抽出と抗体による検出とを組み合わせる本発明の手法により判別することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、穀類の種子における未成熟なデンプン粒や分解もしくは損傷したデンプン粒の存在、引いては、糠層の存在を簡便かつ効率的に評価することができる。本発明は、特に、不要な糠層の除去を行う穀類の搗精や使用用途に応じた穀類の粉砕において、その進行と質を管理する上で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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