(57)【要約】【課題】遺伝子組換え手法を用いずに、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を製造すること。【解決手段】本発明は、β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程を含む、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の選抜方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程を含む、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の選抜方法。
【請求項２】
β−１，３−グルカンに結合する染料がコンゴレッドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
麹菌をβ−１，３−グルカンに結合する染料の存在下で培養する工程、
上記培養工程で得られた培養液をろ過する工程、及び
上記ろ過工程で得られたろ液から麹菌を回収する工程
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
下記工程（１）〜（３）を１回行うか、または２回以上繰り返す、請求項１又は２に記載の方法。
（１）麹菌に変異原を作用させる工程、
（２）前記変異工程により得られた麹菌に、β−１，３−グルカンに結合する染料を作用させる工程及び
（３）β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程。
【請求項５】
前記培養工程におけるβ−１，３−グルカンに結合する染料の濃度が2.5〜80μｇ／ｍｌである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記麹菌がアスペルギルス  オリゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により得られる麹菌。
【請求項８】
[α−１，３−グルカンの発現量]／[β−１，３−グルカン及びキチンの発現量]の比率が１．２９より小さい麹菌。
【請求項９】
α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓをコードする遺伝子に変異を有さない、請求項８に記載の麹菌。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の麹菌を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌の非遺伝子組換え細胞壁変異株の作製方法、当該方法により得られた糸状菌の細胞壁変異株、当該細胞壁変異株を用いた米製品およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌とは、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成されているものの総称であり、有機酸、色素、農薬原体等の化成品、ペニシリン、スタチン類等の医薬品等の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼの産業用酵素等の発酵生産に使用されている。上記のように、糸状菌は、多種多様な有用物質を生産できるという利点を有する。糸状菌のうち麹菌等は、酒、味噌、醤油等の製造にも広く用いられている。
【０００３】
また、本発明者らは、遺伝子組換え技術を用いてα−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を製造し、当該変異型を用いた物質生産方法により有用物質の単位体積当たりの生産量を飛躍的に上昇させることができることをすでに見出している（特許文献１）。
【０００４】
一方、食品の分野においては、依然として非遺伝子組換え生物を用いた製造方法を採用することが所望される場合が多い。しかし、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を製造することは非常に困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2014/073674パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、遺伝子組換え手法を用いずに、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を製造すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意研究した結果、β−グルカンを染色し得る所定の色素の存在下で麹菌を培養した場合に、α−１，３−グルカンの発現量が低減した株が当該色素で染色され、かつ生育が選択的に阻害されるものの完全には死滅しないため、α−１，３−グルカンの発現量が低減した株を効率的に選択できることを見出した。また、本発明者らは、かかる方法により得られた麹菌が非常に高い免疫賦活活性を有することを乱した。本発明はこれらの新規の知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程を含む、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の選抜方法。
【０００９】
項２．β−１，３−グルカンに結合する染料がコンゴレッドである、項１に記載の方法。
【００１０】
項３．麹菌をβ−１，３−グルカンに結合する染料の存在下で培養する工程、
上記培養工程で得られた培養液をろ過する工程、及び
上記ろ過工程で得られたろ液から麹菌を回収する工程
を含む、項１又は２に記載の方法。
【００１１】
項４．下記工程（１）〜（３）を１回行うか、または２回以上繰り返す、項１又は２に記載の方法。
（１）麹菌に変異原を作用させる工程、
（２）前記変異工程により得られた麹菌に、β−１，３−グルカンに結合する染料を作用させる工程及び
（３）β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程。
【００１２】
項５．前記培養工程におけるβ−１，３−グルカンに結合する染料の濃度が2.5〜80μｇ／ｍｌである、項３に記載の方法。
【００１３】
項６．前記麹菌がアスペルギルス  オリゼである、項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００１４】
項７．項１〜６のいずれか１項に記載の方法により得られる麹菌。
【００１５】
項８．[α−１，３−グルカンの発現量]／[β−１，３−グルカン及びキチンの発現量]の比率が１．２９より小さい麹菌。
【００１６】
項９．アスペルギルス  オリゼである、項８に記載の麹菌。
【００１７】
項１０．α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓをコードする遺伝子に変異を有さない、項８又は９に記載の麹菌。
【００１８】
項１１．項８〜９のいずれか１項に記載の麹菌を含む食品。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、遺伝子組換え手法を用いずに、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を製造することができる。また、本発明にかかる麹菌は、高い免疫賦活活性を奏するため、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】参考例１におけるＣＲ感受性試験の結果を示す。
【図２】参考例３におけるCR含有培地中での麹菌の生育性状を示す。
【図３】CR感受性を利用した細胞壁AG低減変異株の選抜法及び変異原処理からのＣＲ濃縮手順を示す。
【図４】実施例２（２−１）におけるLysing Enzymesに対する感受性の評価方法及びその結果を示す。
【図５】実施例２（２−２）におけるAG低減候補株の細胞壁分析方法及びその結果を示す。
【図６】実施例２（２−２）におけるAG低減候補株の細胞壁分析結果を示す。
【図７】実施例２（２−２）におけるAG低減候補株の細胞壁分析結果を示す。
【図８】実施例２（２−３）における細胞応答試験の概要及び結果を示す。
【図９】実施例２（２−３）における樹状細胞試験の結果を示す。
【図１０】実施例２（２−３）における樹状細胞試験の結果を示す。
【図１１】実施例１におけるAG合成能欠損変異麹菌の育種のための麹菌の変異処理方法を示す。
【図１２】実施例３におけるＣＲ感受性を利用した液体培地による候補株の選抜における培養容器の写真を示す。
【図１３】実施例３におけるＣＲ感受性を利用した液体培地による候補株の選抜における培養容器の写真を示す。
【図１４】実施例３におけるＣＲ感受性を利用した液体培地による候補株の選抜における培養容器の写真を示す。
【図１５】実施例３におけるＣＲ感受性試験の結果を示す。
【図１６】実施例３におけるLysing Enzymes感受性試験の結果を示す。
【図１７】実施例４（４−１）における製麹方法及び回収した米麹の写真を示す。
【図１８】実施例４（４−１）で得られた米麹の水分量、菌体量を示す。
【図１９】実施例４（４−１）で得られた米麹の酵素活性を示す。
【図２０】実施例４（４−２）における甘酒の製法及び分析結果を示す。
【図２１】実施例４（４−２）で得られた甘酒の官能試験結果を示す。
【図２２】実施例５における樹状細胞試験の結果を示す。
【図２３】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２４】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの塩基配列（配列番号２）を示す。
【図２５】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの塩基配列（配列番号２）を示す。
【図２６】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図２７】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの塩基配列（配列番号４）を示す。
【図２８】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの塩基配列（配列番号４）を示す。
【図２９】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図３０】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの塩基配列（配列番号６）を示す。
【図３１】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの塩基配列（配列番号６）を示す。
【図３２】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３３】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３４】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３５】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３６】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３７】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３８】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図３９】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４０】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４１】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４２】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４３】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４４】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４５】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４６】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４７】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４８】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図４９】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５０】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５１】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５２】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５３】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５４】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５５】実施例６におけるAGS遺伝子の塩基配列の解析結果を示す。
【図５６】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５７】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５８】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５９】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図６０】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図６１】実施例６におけるAGSアミノ酸配列のアライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、２本鎖DNA、１本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００２２】
麹菌の選抜方法
本発明は、β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性（陽性）の麹菌を回収する工程を含む、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の選抜方法を提供する。本明細書において、α−１，３−グルカンを単にＡＧと示すこともある。また、本明細書において、β−１，３−グルカンを単にＢＧと示すこともある。
【００２３】
本発明において、「α−１，３−グルカンの発現量が低減した」とは、親株と比べて、細胞壁を構成するβ−１，３−グルカン及びキチンとの関係で相対的にα−１，３−グルカンの発現量が低減したこと、具体的にはβ−１，３−グルカン及びキチンの発現量に対するα−１，３−グルカンの発現量の比率（[ＡＧの発現量]／[ＢＧ及びキチンの発現量]）が減少したことを意味する。より具体的には、本発明の方法に供する麹菌の[ＡＧの発現量]／[ＢＧ及びキチンの発現量]の比率よりも、本発明の方法により得られた麹菌の当該比率の方が少ないことを意味し、本発明の方法により得られた麹菌の[ＡＧの発現量]／[ＢＧ及びキチンの発現量] の比率が本発明の方法に供する麹菌の当該比率の８０％以下であることが好ましく、６０％以下であることがより好ましい。尚、本発明において、本発明の方法に供する麹菌（本発明の方法に供する前の麹菌）を単に親株と示すこともある。
【００２４】
本発明において、α−１，３−グルカンの発現量、ならびにβ−１，３−グルカン及びキチンの発現量は、本願実施例２に記載の方法により測定することができる。
【００２５】
β−１，３−グルカンに結合する染料としては、特に限定されないが、例えば、コンゴレッド、カルコフロールホワイト、アニリンブルー等が挙げられ、コンゴレッド等が好ましい。本明細書において、コンゴレッドを単にＣＲと示すこともある。
【００２６】
麹菌としては、アスペルギルス（Aspergillus）属に属するものであれば特に限定されず、例えば、アスペルギルス  ニドランス（Aspergillus nidulans)）、アスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス  リュウチューエンシス（Aspergillus luchuensis）、アスペルギルス  カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス  フミガタス（Aspergillus fumigatus）等が挙げられ、アスペルギルス  オリゼが好ましい。
【００２７】
本発明の方法においては、β−１，３−グルカンに結合する染料に麹菌を作用させ、染色された株を回収する。β−１，３−グルカンに結合する染料に麹菌を作用させる方法としては、例えば、β−１，３−グルカンに結合する染料を含む液体培地中で麹菌を培養する方法、β−１，３−グルカンに結合する染料を含む寒天培地上又は当該寒天培地中で麹菌を培養する方法等が挙げられる。
【００２８】
当該実施形態においては、液体培地を用いる。培養工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、CD最小培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、PDA培地等が挙げられる。培地中のβ−１，３−グルカンに結合する染料の濃度としては、例えば、1〜200μｇ／ｍｌ、好ましくは2.5〜80μｇ／ｍｌの範囲で適宜設定できる。β−１，３−グルカンに結合する染料としてコンゴレッドを用いる場合の培地中の濃度としては、例えば、1〜200μｇ／ｍｌ、好ましくは2.5〜80μｇ／ｍｌの範囲で適宜設定できる。上記染料の濃度を上記範囲とすることにより、上記染料によりα−１，３−グルカンの発現量が低減した株が当該色素で染色され、かつ生育が選択的に阻害されるものの完全には死滅せず、一方で、α−１，３−グルカンの発現量が低減していない株の生育が大きく抑制はされないことで、α−１，３−グルカンの発現量が低減した株を選択することができるようになるため好ましい。
【００２９】
上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、0.5〜10％、より好ましくは1〜4％の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、20〜45℃、より好ましくは25〜37℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、12〜72時間、より好ましくは24〜48時間の範囲で適宜設定できる。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、培地として液体培地を用い、麹菌をβ−１，３−グルカンに結合する染料の存在下で培養する工程、及び
上記培養液からβ−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を含む部分を分離する工程、及び
β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を回収する工程
を含む。
【００３１】
培養工程に用いる培地、染料濃度、培養温度、時間等の条件は前述した条件に準じて適宜設定できる。当該培養工程により、β−１，３−グルカンに結合する染料に対し陰性の麹菌は当該染料による影響を受けないため増殖、凝集し、塊となる。一方、β−１，３−グルカンに結合する染料（例えば、コンゴレッド）に対し感受性の麹菌は、同時に生育も抑制されるため塊を生じ難くなる。そのため、例えば、ろ過により、凝集塊を取り除くことにより、簡便にβ−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を選抜することができる。
【００３２】
かかる方法によりα−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を得ることができるのは、細胞壁のうちα−１，３−グルカンはβ−１，３−グルカン層の表面を覆っているため、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌においてはβ−１，３−グルカン層の少なくとも一部が表面に露出しているためと考えられる。
【００３３】
上記培養液からβ−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を含む部分を分離する分離工程としては、特に限定されず、例えば、ろ過、遠心分離、スライドカルチャー分離、メンブレン培養回収等が挙げられ、ろ過等が好ましい。ろ過工程を行う場合、例えば、チーズクロス、ナイロンメッシュ、ミラクロース等を用いた方法を適宜採用することができる。また、本発明において、分離工程は、β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を含む部分を完全に分離する工程に限られず、分離工程を経て残存した培養液側に、比較的少量のβ−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌が残っていてもよい。
【００３４】
培養液から麹菌を回収する工程としては特に限定されず、回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法（遠心分離、ろ過、スライドカルチャー分離等）を適宜用いることができる。また、上記分離工程（例えば、ろ過等）で得られた、β−１，３−グルカンに結合する染料に対し感受性の麹菌を含む部分（例えば、ろ液）をそのまま、もしくは任意選択で洗浄して用いることも、本発明の方法における回収工程に含まれ得る。
【００３５】
本発明においては、上記工程に加えて、麹菌に変異原を作用させる工程をさらに含んでいてもよい。変異原としては、特に限定されず、例えば、ニトロソグアニジン（MNNG）およびメタンスルホン酸エチル（EMS）、メタンスルホン酸メチル（MMS）、紫外線（UV）等が挙げられ、MNNG、EMS等が好ましい。変異原を作用させる方法としては特に限定されないが、例えば、麹菌懸濁液に変異原を添加し、所定の時間反応させることにより行うことができる。変異原の濃度としては、麹菌懸濁液に、最終濃度として、例えば、0.05〜10 ％、好ましくは例えば、０．１〜２％となるように添加する。反応時間は特に限定されないが、例えば、５〜１２０分、好ましくは例えば、１５〜９０分の範囲で適宜設定できる。反応温度も特に限定されないが、例えば、16〜42℃、好ましくは例えば、25〜35℃の範囲で適宜設定できる。上記工程によりα−１，３−グルカンの発現量が低減するような変異が生じることが期待できる。
【００３６】
本発明においては、麹菌に変異原を作用させる工程は、β−１，３−グルカンに結合する染料に接触させ、回収した当該染料に感受性の麹菌に対して行ってもよいし、最初に麹菌に変異原を作用させ、その後に、当該工程に供した麹菌にβ−１，３−グルカンに結合する染料に接触させてもよいし、それらの両方を行ってもよい。また、変異原を作用させる工程と染料に接触させる工程とを繰り返し行ってもよい。
【００３７】
従って、例えば、一実施形態において、本発明は、工程（１）〜（３）を１回行うか、または２回以上繰り返す方法を提供する：
（１）麹菌に変異原を作用させる工程、
（２）前記変異工程により得られた麹菌にコンゴレッドを作用させる工程及び
（３）コンゴレット感受性の麹菌を回収する工程。
【００３８】
本実施形態には、（１）〜（３）を一回行う方法（（１）→（２）→（３））、（１）〜（３）をこの順に単に繰り返す方法（（１）→（２）→（３）→（１）→（２）→（３）→・・・）だけでなく、工程（１）１回に対し、工程（２）、（３）を２回以上繰り返す方法（例えば、（１）→（２）→（３）→（２）→（３）→・・・）も含まれる。
【００３９】
従って、一実施形態において、本発明は、工程（Ａ）〜（Ｂ）を１回行うか、または２回以上繰り返す方法を提供すると言い換えることもできる：
（Ａ）麹菌に変異原を作用させる工程、
（Ｂ）前記変異工程により得られた麹菌にコンゴレッドを作用させ、コンゴレット感受性の麹菌を回収する処理を１回以上（例えば、１〜５回、１〜３回、１〜２回等）行う工程。
【００４０】
これまで記載してきたように本発明の方法は麹菌に変異を生じさせる工程を含んでいてもよい。従って、本発明において、「α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の選抜方法」とは、「α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌の製造方法」といいかえることもできる。
【００４１】
また、本発明の方法は、上記染料への接触工程を経た麹菌を、当該染料への感受性試験に供し、親株より染料への感受性が高いものを選択する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、染料を含む固体培地上で、所定時間、所定温度で当該麹菌を培養してコロニーを形成させる。コロニーの直径が短いほど、当該染料に対する感受性が高いことを意味する。種々の濃度の染料を含む複数の培地で評価することが好ましい。同様に親株についても染料を含む固体培地上で培養、コロニーを形成させ、親株よりも染料に対する感受性が高い株を選択する。また、親株の選択の際に、上記複数の候補株から染料への感受性の高いものを選抜する工程を含んでもよい。
【００４２】
菌体
本発明の方法によれば、遺伝子組換え手法を用いずに、α−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を製造することができる。また、好ましい実施形態において、上記麹菌は、β−１，３−グルカンの発現量がα−１，３−グルカンの発現量よりも高い。従って、本発明は、β−１，３−グルカンの発現量がα−１，３−グルカンの発現量よりも高い非遺伝子組換え麹菌であって、アスペルギルス  オリゼである、麹菌を提供する。本発明において、「非遺伝子組換え」とは、「非組換え」、「天然由来の」といった用語で言い換えることもできる。
【００４３】
また、本発明は、[α−１，３−グルカン（ＡＧ）の発現量]／[β−１，３−グルカン（ＢＧ）及びキチンの発現量] の比率（重量比）が１．２９未満である麹菌も提供する。本発明においては、[ＡＧの発現量]／[ＢＧ及びキチンの発現量] の比率（重量比）が、１．２以下であることが好ましく、１．０以下であることがより好ましく、０．９以下であることがさらに好ましく、０．８以下であることがさらにより好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明にかかる麹菌としては、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓをコードする遺伝子に変異を有さないものが挙げられる。本発明において、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓをコードする遺伝子に変異を有さないとは、本発明にかかる麹菌が有するａｇｓをコードするＤＮＡの塩基配列が、親株である麹菌が有するａｇｓをコードするＤＮＡの塩基配列と同一である場合だけでなく、イントロンの部位の変異又はエキソンにおける変異であってもコードするアミノ酸配列が変化しない変異である、サイレント変異を加えたものを有する場合も含まれる。典型的には、本発明にかかる麹菌が有するａｇｓをコードするＤＮＡの塩基配列は、親株である麹菌が有するａｇｓをコードするＤＮＡの塩基配列と同一である。本発明にかかる麹菌は、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓをコードする遺伝子に変異を有さないにもかかわらず、意外にもα−１，３−グルカンの発現量が減少している。
【００４５】
麹菌が有するα−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓとしては、例えば、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡ（Genbank accession No. XM_658397）、ａｇｓＢ（Genbank accession No. XM_655819）、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣ、アスペルギルス  フミガタスのａｇｓ１（Genbank accession No. XM_743319）、アスペルギルス  ニガーのａｇｓＥ（Genbank accession No.AY530790）などが挙げられる。ここで、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣは、アスペルギルスデータベースAspGD（http://www.aspergillusgenome.org）に、遺伝子番号agsA（AO090026000523）、agsB（AO090003001500）、agsC（AO090010000106）で登録されている。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡのアミノ酸配列（配列番号１）を図２３に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）を図２４〜２５に示す。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢのアミノ酸配列（配列番号３）を図２６に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４）を図２７〜２８に示す。また、後述する実施例６に記載のアスペルギルス  オリゼ  RIB161_60E-2株のａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１９）を図４４〜４９に示す。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣのアミノ酸配列（配列番号５）を図２９に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６）を図３０〜３１に示す。
【００４６】
従って、本発明にかかる麹菌としては、例えば、配列番号２で表されるａｇｓＡの塩基配列、配列番号４又は１９で表されるａｇｓＢの塩基配列及び配列番号６で表されるａｇｓＣの塩基配列を含む核酸分子を有するか、又は本発明の効果を棄損しない範囲でこれらのａｇｓＡ、ａｇｓＢ及びａｇｓＣの塩基配列に対し１個若しくは数個の核酸分子が欠失、置換若しくは付加された（例えば、サイレント変異が加えられた）塩基配列を含む核酸分子を有するアスペルギルス  オリゼ等が挙げられる。ここで、「ａｇｓＡ、ａｇｓＢ及びａｇｓＣの塩基配列に対し１個若しくは数個の核酸分子が欠失、置換若しくは付加された」とは、ａｇｓＡの塩基配列、ａｇｓＢの塩基配列及びａｇｓＣの塩基配列からなる塩基配列全体に対し、１個若しくは数個の核酸分子が欠失、置換若しくは付加されていればよく、ａｇｓＡの塩基配列、ａｇｓＢの塩基配列及びａｇｓＣの塩基配列の３つの塩基配列全てに１個若しくは数個の核酸分子が欠失、置換若しくは付加されていなくてもよい。
【００４７】
また、これらの本発明の菌体は、例えば、前述した麹菌の選抜方法により得ることができる。従って、本発明は、上記方法により得られた菌体も提供する。本発明の菌体は、市場に所望されている非遺伝子組み換え生物でありながら、従来の麹菌と同様の発酵作用を備えつつ高い免疫賦活活性を奏するため非常に有用である。
【００４８】
食品
本発明は、前記麹菌を含む食品も提供する。食品としては、麹菌が含まれているものであれば特に限定されず、麹菌を使用して発酵させ、当該麹菌が残存した食品、別の食品に麹菌を添加、混合した食品、麹菌自体を食品としたもの等、広く含まれる。より具体的には、例えば、甘酒、酒等の飲料；味噌、塩麹、醤油等の調味料等が挙げられる。これらの食品のうち、甘酒等の飲料が好ましい。本発明の食品は、当該食品に含まれる麹菌に起因して、免疫賦活活性が高いため非常に有用である。
【００４９】
食品の製法
当該工程により得られた麹菌を用いる、食品の製造方法を提供する。本発明の方法は、前記方法によりα−１，３−グルカンの発現量が低減した麹菌を選抜する工程を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の食品の製造方法は、麹菌の少なくとも一部（全部又は一部）として前述した本発明の麹菌を使用する以外は、公知の方法に準じて行うことができる。例えば、米麹の製造方法としては、原料となる米を蒸してα化し、これに麹菌を散布し、所定の期間、所定の温度に保持することにより製造することができる。また、甘酒の製造方法としては、例えば、原料となる米、米麹または米麹のみに加水をして保温し糖化させることで製造することができる。
【００５１】
以下、本発明を参考例、実施例、比較例を用いて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００５２】
参考例１  低AG含量麹菌候補株の選抜
酒類総合研究所の麹菌コレクションのうち甘酒製造に利用できることが予想される麹菌について、２４株の分譲を受けた。入手麹菌リストを表１に示す。尚、下記表１に示す麹菌はいずれもアスペルギルス  オリゼである。
【００５３】
【表１】
2017077194.tif 000002
【００５４】
次に、入手した菌株２４株の中から生育が良好で分生子の形成に異常のない１６菌株について、CR感受性の試験を行った。平板希釈培養法により、０〜８０μg/ｍｌのCRを含む寒天培地上で生育したコロニー直径を計測し、CRを含まない培地での成長量を基準に生育率を算出した。結果を図１に示す。これら菌株のうち、相対的に高いCR感受性を示したRIB647株をAG含量の低い麹菌の候補株として選抜した。また、分生子における核数が比較的少ないRIB161株を後述の実施例５で用いる候補株として選抜した。
【００５５】
参考例２  変異原処理
本発明において、変異原処理は下記手順にて行った。
（ｉ）分生子の準備 
1 x 108 個/ ml  となるように調製。 
１回の処理に 10 ml 使用する。 
（乾燥胞子だと、0.1 g / 10 ml が目安） 
MNNG：  0.1M Phosphate Buffer (pH 6.4)
EMS:   0.1M Phosphate Buffer (pH 8.0)
各 Buffer とも 0.02% tween 20 (v/v)入り。 
（ｉｉ）変異原の準備 
MNNG： 20 mg / ml in SDW（4℃保存、24時間以内に使用）。50 % wet powderなので、実際は２倍量計りとる。 
EMS:  溶液なのでそのまま使用。 
（ｉｉｉ）変異原性処理
前記分生子懸濁液 10 ml にMNNG 処理の場合、溶液 1 mlを添加する（EMS 処理の場合、0.15 ml  を添加する）。次いで、32℃、所定時間（１５分又は３０分）反応させる（サーモミンダー使用、スターラで撹拌）。次いで、遠心により、分生子を回収する（3,000 x g、10 min）。SDWによる洗浄（遠心-分生子回収）を２回行う。次いで、1 x 108個/ ml となるよう SDW に懸濁する。得られた懸濁液を分生子形成培地（モルト培地）へ添加する（大シャーレ１枚あたり １ ml）。
【００５６】
参考例３  細胞壁AG合成能欠損変異麹菌の育種
CR感受性を利用した細胞壁AG合成能欠損変異麹菌選抜法の確立
WO2014/073674に記載の方法により、遺伝子組換え技術を用いて麹菌の近縁種Aspergillus nidulansのAG完全欠損株を得た。当該AG完全欠損株は高いCR感受性を示す。この形質を利用して細胞壁AG低減変異麹菌株を選抜するため、まずCR含有培地中での生育性状を観察した。具体的には、下記組成の培地にCRを所定量配合した培地を用いた：
Czapek-Dox(CD) medium [0.6% NaNO3, 0.052% KCl, 0.152% KH2PO4, 0.0001%
FeSO4・7H2O, 0.00088% ZnSO4・7H2O, 0.00004% CuSO4・5H2O, 0.000015%
MnSO4・4H2O, 0.00001% Na2B4O7・10H2O, 0.000005% (NH4)6Mo7O24・4H2O,
0.059% MgSO4・7H2O, and 2% glucose]
上記培地100ｍｌに、1 x 108個/ mlの野生株（ABPU1）及びＡＧ欠損株を、１ｍｌ添加し、30℃で培養した。結果を図２及び表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
図２に示すように１μg/mlのCRを含む培地では、１６時間あるいは２０時間の培養においても野生株とAG欠損株の間に顕著な生育の差異は認められないが、AG欠損株は５μg/mlのCRを含む培地においてほとんど生育が不可であることが明らかになった。また、CR添加培養における菌糸の塊（菌糸玉）のサイズを計測したところ、５μg/mlのCRで培養した際、最も菌糸玉サイズに隔たりが生じることが明らかになった（表２）。この結果から、CR処理の濃度は５μg/mlに決定した。また、CR処理後の濃縮フィルター等の検討も行い、CR感受性を利用した細胞壁AG低減変異株の選抜法を確立した（図３）。さらに、麹菌のAG低減株においても本法が効果的であることを確認した。
【００５９】
実施例１  細胞壁AG合成能欠損変異麹菌の育種のための麹菌の変異処理
参考例２に記載の変異処理及び参考例３で確立したＣＲ濃縮法を図１１に記載のように組み合わせて、変異及びＣＲ濃縮処理を2ロット実施した。変異処理1ロット目として、親株のKaoriに化学変異原のMNNGとEMSを使用して10、15、又は30分処理を実施した。ここで、Kaori はヒグチモヤシ（樋口松之助商店）より購入した麹菌（アスペルギルス  オリゼ）である。また、変異処理2ロット目は新規変異原処理として親株のKaoriにMNNGとEMSで30分処理し（変異処理1ロット目で処理時間30分が有効と思われたため）、追加変異原処理として変異処理1ロット目の第二候補株の2株についてMNNGとEMSで15、30分間処理を行った（追加変異原処理のため、目的外の遺伝子変異への影響を考慮して15分の処理も採用）。
【００６０】
実施例２  細胞壁AG合成能欠損変異麹菌の育種
（２−１）：  細胞壁分解酵素を用いたAG低減株の確認法の確立とAG低減候補株の確認
麹菌コレクションからのAG 低減候補株（Kaori）およびCR 濃縮法により選抜したAG 低減候補株（ 30m（１）−２MNNG）について、AG が低減しているか否かを確認するため、細胞壁分解酵素に対する感受性の評価を試みた。また、30m（１）-2MNNG株は、上記実施例１に記載の方法のうち、１ロット目の方法により、MNNGを用いて３０分処理し、ＣＲ培地で２回濃縮し、ＡＧ低減株選抜試験に供して製造した菌株である（本明細書において、30m（１）-2MNNG株は、30m（１）-2M株又はkaori_30（１）-2M株と示すこともある）。まず、一定量の菌体をβ-1,3-グルカナーゼおよびキチナーゼ活性を有する酵素試薬Lysing Enzymes溶液に懸濁し、所定時間後に遊離するプロトプラスト数を計測した。細胞表層のＡＧが低減すると細胞内層のβ-1,3-グルカンやキチンが露出し、本酵素剤に対して感受性が高まる。つまり、ＡＧが低減するとプロトプラストの遊離が促進されるので、遊離するプロトプラスト数を計測し、Lysing Enzymesに対する感受性を評価する手法である（図４左）。本法を用いて、参考例３と同様の方法により得たA. nidulansの野生株およびAG合成酵素遺伝子変異株を評価すると、AG合成能欠損株（ΔagsB 株および ΔagsAΔagsB 株）は、野生株と比較して短時間でプロトプラストの遊離が確認できた（図４右上）。したがって、本法がAG 低減株を評価するのに有効であることが示唆された。また、CR濃縮によって選抜した第一候補株（30m（１）-2MNNG株）について本法を適用した。その結果、30m（１）-2MNNG株は、親株のKaoriと比較して短時間でプロトプラストが遊離することが明らかになった（図４右下）。この結果は、本候補株の細胞壁AGが低減していることを強く示唆している。
【００６１】
（２−２）：  AG低減候補株の細胞壁分析
30m（１）−２MNNG及び各種麹菌株について細胞壁AG が低減しているか否かを確認するため、細胞壁成分の分析を試みた。まず、熱水アルカリ抽出法（図５左）により、細胞壁多糖成分を分画した。菌体の凍結乾燥粉末を熱水抽出（121℃、60分 x 2回）し、遠心分離により沈殿した残渣に対してアルカリ処理（１N NaOH、24時間）を行った（熱水抽出画分はHW画分とした）。アルカリ処理後、遠心分離した上清を中和・透析し、さらに遠心分離した上清をＡＳ１（Alkali soluble上清）画分とし、沈殿をＡＳ２（Alkali soluble沈殿）画分とした。アルカリ処理後の残渣は、AI（Alkali insoluble）画分とし、それぞれの画分の凍結乾燥後重量を測定した（図５右表）。本法を用いると細胞壁AGは主にAS2画分に分画され、β-グルカン類やキチンはAI画分に分画される。麹菌野生株（RIB40）に対し、遺伝子組換え体のAoΔagsB株はAS2画分の重量比に顕著な減少が認められた。また、麹菌コレクションから選抜したCR感受性株（RIB647株）については、各画分とも野生型株との差異は認められなかった。次に、AGが含まれるAS2画分およびβ-グルカン類やキチンが含まれるAI画分を構成する糖を分析した。まず、各画分を硫酸加水分解（1N H2SO4）し、中和後の上清について、イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）により構成単糖を分析した（図６、７）。その結果、AS2画分は主にグルコースから構成されており（AG由来）、AI画分からはグルコースおよびグルコサミンが著量検出された（β-グルカン類およびキチン由来）。この構成糖の比率と先に測定した画分比率から全画分中に占めるグルコースの割合を算出したところ（表３）、CR濃縮により得られた第一の候補株（30m（１）-2MNNG株）において顕著なAS2画分のグルコース量減少が認められた（親株のKaoriと比較して約40%減少）。したがって、30m（１）-2MNNG株はAG低減株といえる。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
（２−３）：  細胞応答試験の条件検討
細胞壁AG低減麹菌の機能を評価するため、細胞応答試験の条件を検討した。麹菌を用いた細胞応答試験は前例がないため、まずは精製した麹菌のAGについて免疫応答試験を実施した。（２−２）で記載した方法で抽出したAGは不溶性の多糖であるため、そのまま免疫応答試験には持込めない。そこで、不溶性AGをオリゴ糖化することで可溶性とし、免疫細胞の刺激性を評価した。具体的な方法としては、Miyamoto et al. (2009) Infect. Immun. 77, 3056-3064.に記載の方法にしたがって樹状細胞を調製し、１x105細胞／mlとなるように調整した。これに糖濃度が1〜10μg／mlとなるようAGオリゴ糖を添加し、２４時間３７℃、５％CO2インキュベーターで培養した。培養上清中のTNFの産生量をBD Biosciences社製のELISAキットにより測定した。  その結果、AGのオリゴ糖は免疫細胞を刺激しないことを確認した（図８）。したがって、免疫応答性の無いAGが低減すれば、免疫刺激活性の高いβ-グルカン類が露出し、免疫賦活生が高まることが予想される。次に、菌体成分を用いた免疫応答性を評価するため、A. nidulansの野生株とＡＧ欠損株を用いて評価法を確立した。これら菌株の分生子を回収し、上清に免疫刺激活性の高いバクテリア由来のリポ多糖が混入していないことを確認した後、樹状細胞試験を実施した。具体的な方法としては、Miyamoto et al. (2009) Infect. Immun. 77, 3056-3064.に記載の方法にしたがって樹状細胞を調製し、１x105細胞／mlとなるように調整した。これにMOI(multiplicity of infection、細胞１に対する接種分生子数)が0.1から30になるように麹菌の分生子を添加し、２４時間３７℃、５％CO2インキュベーターで培養した。培養上清中のTNFの産生量をBD Biosciences社製のELISAキットにより測定した。その結果、ＡＧ欠損株は野生株と比較して樹状細胞刺激性が高いことが実証された（図９）。本法を用いた免疫応答性評価は、AG低減株の機能性評価法として有効であると判断し、CR濃縮により選抜したAG低減候補株およびβ-グルカン類増加株について本試験を実施した（図１０）。その結果、AG低減候補株30m（１）-2MNNG株において、親株のKaoriより高い樹状細胞刺激性（TNEαの産生誘導性）が観察された。TNEαの産生がCard9ノックアウトマウス由来の細胞では計測されなかったことから、麹菌の分生子による樹状細胞刺激はβ-グルカンに起因すると考えられるため、AG低減によるβ-グルカンの露出あるいはβ-グルカンの相対的な増量によりAG低減株が樹状細胞高刺激性を示したと考えられる。
【００６４】
実施例３  細胞壁AG合成能欠損変異麹菌の育種
（３−１）CR感受性を利用した変異株の濃縮
変異処理をした分生子を用いて、図３のようにCRを利用した濃縮操作を実施した。具体的にはCongo Red(CR) 5μg/mlを添加した培地で20h、30℃で震盪培養し、その後、分生子を回収してモルト寒天培地で30℃培養し、新たに形成された分生子を回収、同様の作業を繰り返した。
【００６５】
（３−２）候補株の選抜試験
（３−１）のCR濃縮を2回終了した分生子について、CR 5μg/mlの培地で40h、30℃で震盪培養を行い、麹菌Aspergillus oryzaeのAG合成遺伝子破壊菌株のΔagsBと同様の状態を示す[液体培地にCRの色素が残り（菌体に吸着する色素が少ない）、菌体増殖の少ない]株を選抜した。このCR液体培地による選抜試験により、変異処理1、2ロットを通して合計8株の候補株を選抜した（図１２〜１４）。また、CR濃度0〜80μg/mlの寒天培地でコロニーを形成させ、その直径を計測しCR感受性による成長率の比較試験を実施した。その結果、CR80μg/ml添加時に親株のKaoriよりも成長率の低い株として、変異処理1ロット目から1株（30m（１）-2MNNG）、変異処理2ロット目から3株（30m（３）’-2MNNG、15m（２）”-2EMS、30m（１）”-2EMS）を選抜した（図１５）。また、変異処理2ロット目の候補株については図３のようにLysing Enzymes感受性試験を実施してAGの低減を評価した。その結果、選抜した候補株3株は反応2hで親株のKaoriよりも遊離プロトプラスト数が増加(図１６)しており、AG低減の可能性が示唆された。これらの試験から最終的に、4株（30m（１）-2MNNG、30m（３）’-2MNNG、15m（２）”-2EMS、30m（１）”-2EMS）の候補株を選抜した。
【００６６】
実施例４  BG甘酒飲料商品への適用性確認試験
（４−１）  候補株による製麹試験
変異処理1、2ロット目から選抜した4株と親株のKaoriの合計5株について製麹を行った。製麹試験については図１７のようにα化米を使用してシャーレ法で実施し、やや破精落ち（麹菌が米に均一に生育していない）はしているものの親株と同等の状貌の米麹が得られた。得られた米麹について赤外線水分計により水分量を測定し、麹菌菌体量と酵素活性の測定を実施した（図１８、１９）。麹菌菌体量はYatalaseを作用させて遊離したN-アセチルグルコサミンを比色定量して測定し、酵素活性をキッコーマン社製のキットにより測定した。その結果、乾燥麹重量当たりの麹菌菌体量は親株よりも約10〜20％多く、酵素活性は水分の少なかった15m（２）”-2 EMSのグルコアミラーゼが多いがαアミラーゼは親株と比較し4株とも低い（約10〜30%低い）結果となった。
【００６７】
（４−２）候補株で製麹した米麹での甘酒試作
米麹を糖化させて作成した甘酒の成分分析と官能評価を実施した。得られた米麹を糖化させて甘酒を試作した結果、成分は候補株4株ともに親株のKaoriと遜色はなく、パネラー4名で官能評価を実施したところ、有意差はなく風香味の総合評価としては親株と遜色なしという評価結果であった（図２０、２１）。
【００６８】
実施例５
参考例１に記載のRIB161を親株とし、MNNGを使用して60分処理をする以外、実施例２の１ロット目と同様の処理を行い、RIB161_60M-2を作製した。また、参考例１に記載のRIB161を親株とし、EMSを使用して60分処理をする以外、実施例１の１ロット目と同様の処理を行い、RIB161_60E-2を作製した。さらに、参考例１に記載のRIB161を親株とし、EMSを使用して90分処理をする以外、実施例１の１ロット目と同様の処理を行い、RIB161_90E-2を作製した。上記で得られた菌株、及びKaori_30（１）-2Mについて、実施例２、（２−３）に記載の方法に従い、樹状細胞試験を行った。結果を図２２に示す。図２２に示すように、Kaori_30（１）-2M、RIB161_60M-2、RIB161_60E-2及びRIB161_90E-2のいずれも野生株と比較して高い樹状細胞刺激性を示した。
【００６９】
実施例６
Hagiwara et al. (2008) Current Genetics 54: 325-338に記載の方法にしたがって、麹菌kaori_30（１）-2MおよびRIB161_60E-2株からgenomic DNAを抽出した。抽出したDNAを100 ng/μLに調整し、これをテンプレートにPCR反応によってAGS遺伝子を増幅した。使用したPCR酵素は、Takara社製PrimeStar HS DNA polymeraseであり、反応溶液作製法は付属の取扱説明書に従った。PCRの温度設定条件は、（１）95℃2分、（２）98℃10秒、55℃5秒、72℃4分× 30サイクル、（３）72℃10分である。麹菌の３種のAGS遺伝子は、それぞれ約7.5kbであることから、PCR効率を考慮して分割して増幅した。アガロースゲル電気泳動により増幅した断片を分離し、GE社製illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitにより精製した。精製したDNA断片のシーケンス解析については、北海道システムサイエンス社に委託した。また、得られた配列のマルチプルアライメントはゲノムネットで提供されているClustalW（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）を使用して行った。各種パラメータは初期値のまま変更せず使用した。
【００７０】
agsA、agsB、agsC各遺伝子の分割増幅（前半、後半と記載）に使用したプライマーの配列は以下の通りである： 
agsA前半
agsA-F1: 5’- CTAGAAAGCGGACACTGACTGATACCA-3’（配列番号７）
agsA-R1: 5’- AGTCAACTCCACCCACGCATGGAAC-3’ （配列番号８）
agsA後半
agsA-F2: 5’- AAGTCGGGATTCTTGCAAAGCACAC-3’ （配列番号９）
agsA-R2: 5’- TCACATACTCTACCAACAAACACGCAGT-3’ （配列番号１０）
agsB前半
agsB-F1: 5’- GACACGACAGTTCGTCTGAGAGCTTATG-3’ （配列番号１１）
agsB-R1: 5’- GGTTTATCCACTGGGTATTCGACTC-3’ （配列番号１２）
agsB後半
agsB-F2: 5’- TATTGGCGGCGCTGCTTCTGGCAAG-3’ （配列番号１３）
agsB-R2: 5’- GACCTAGTCCAAGCTGTTGATGCATAGAC-3’ （配列番号１４）
agsC前半
agsC-F1: 5’- GACCCAGATACATATCACGCATGGGAAGTG-3’ （配列番号１５）
agsC-R1: 5’- GCGTGTCCTGAGGATATTCAATGTC-3’ （配列番号１６）
agsC後半
agsC-F2: 5’- AGAAAAGTTCTCCGGCGACGACGAG-3’ （配列番号１７）
agsC-R2: 5’- GACATTGAGGTCCTTAGCCACTGTG-3’ （配列番号１８）
結果
麹菌kaori_30（１）-2MおよびRIB161_60E-2株におけるagsA遺伝子及びagsC遺伝子の塩基配列の解析結果をそれぞれ図３２〜３７及び図５０〜５５に示す。各図において、RIB40に対し塩基配列が異なる箇所がある場合、網かけがされる。ここでRIB40は麹菌の野生株におけるデータベース上の配列を示している。図３２〜３７及び図５０〜５５から明らかなように、解析したkaori_30（１）-2MおよびRIB161_60E-2の塩基配列はRIB40と全て一致した。したがって、麹菌kaori_30（１）-2MおよびRIB161_60E-2株において、agsA及びagsC各遺伝子は野生株と同様に機能を欠損していないことが示唆された。尚、agsA及びagsCのアミノ酸配列のアライメントを図５６〜５７及び図６０〜６１に示す。
【００７１】
次に、kaori_30（１）-2M、その親株であるKaori及びRIB40（データベース状の配列）のagsB遺伝子の塩基配列の解析結果を図３８〜４３に示す。図３８〜４３においても、RIB40に対し塩基配列が異なる箇所がある場合、網かけがされる。図３８〜４３から明らかなように、解析したkaori及びkaori_30（１）-2Mの塩基配列はRIB40と全て一致した。さらに、RIB161_60E-2、その親株であるRIB161及びRIB40のagsB遺伝子の塩基配列の解析結果を図４４〜４９に示す。また、agsBのアミノ酸配列のアラインメントを図５８〜５９に示す。図４４〜４９においても、RIB40に対し塩基配列が異なる箇所がある場合、網かけがされる。図４４〜４９に示されるように、RIB161_60E-2のagsBの塩基配列は、RIB40のものと一部相違していた。しかし、図５８〜５９に示されるように、RIB161_60E-2のアミノ酸配列は、RIB40及びkaori_30（１）-2Mと完全に一致していた。従って、RIB161_60E-2とRIB40とのags Bの塩基配列の相違は、アミノ酸配列には反映されない（同義置換あるいはイントロン内の塩基の相違）ことが明らかとなった。
【００７２】
また、図４４〜４９に示されるように、親株RIB161とRIB161_60E-2とのagsBの塩基配列は完全に一致していた。従って、親株RIB161が本来有するags Bの塩基配列が変化していないこと、従って、RIB161_60E-2とRIB40とのags Bの塩基配列の相違は、親株RIB161を実施例５記載の方法で変異原に供したことにより変異が誘発されたことを意味するものではないことが明らかとなった。
【００７３】
これらのことから明らかなように、agsB遺伝子についても野生株と同様に機能を欠損していないことが示唆された。尚、本明細書において、RIB161及びRIB161_60E-2のagsB遺伝子の塩基配列を配列番号１９とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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