(57)【要約】【課題】母体血中の胎児セルフリーDNAを検出する新たな手段を提供することを課題とする。【解決手段】（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数の一塩基多型の各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、（２）各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率と、一塩基多型位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値とを算出するステップ、（３）前記複数の一塩基多型の中から、ステップ（２）で算出した一塩基多型位置のマイナーアレル率が20％以下又は80％以上の一塩基多型を選抜するステップ、（４）以下の条件、即ち、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合はマイナーアレル率がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高く、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップを含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（４）を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法：
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数の一塩基多型の各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
（２）各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率と、一塩基多型位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値とを算出するステップ、
（３）前記複数の一塩基多型の中から、ステップ（２）で算出した一塩基多型位置のマイナーアレル率が20％以下又は80％以上の一塩基多型を選抜するステップ、
（４）以下の条件、即ち、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合はマイナーアレル率がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高く、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ。
【請求項２】
マルチプレックス核酸増幅反応がマルチプレックスPCRである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ステップ（２）における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
ステップ（２）において、前記平均値に加えて標準偏差を算出し、ステップ（４）の条件において、平均値±2×標準偏差を超える値を「有意に高い」とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
ステップ（３）で複数の一塩基多型を選抜し、選抜した一塩基多型の一つでもステップ（４）の条件を満足しないときは、前記サンプル中に胎児成分が含まれていないと判定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
以下のステップを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法：
（５）選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合は、マイナーアレル率×2、を胎児成分量として算出し、
選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は、100からマイナーアレル率を減じた値×2、を胎児成分量として算出するステップ。
【請求項７】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法：
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であり、マイナーアレル頻度が45％〜50％である一塩基多型を標的とした核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
（２）増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率を算出するステップ、
（３）以下の条件、即ち、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体の一塩基多型の場合は該一塩基多型位置のマイナーアレル率が基準値である0％よりも有意に高く、母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体の一塩基多型の場合は該一塩基多型位置のマイナーアレル率が基準値である100％よりも有意に低いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ。
【請求項８】
ステップ（１）において、複数の一塩基多型を標的とし、核酸増幅反応としてマルチプレックス核酸増幅反応を行う、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
ステップ（２）における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、請求項７又は８に記載の検出方法。
【請求項１０】
解析した一塩基多型の一つでもステップ（３）の条件を満足しないときは、前記サンプル中に胎児成分が含まれていないと判定する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１１】
ステップ（１）で標的とする一塩基多型を以下のステップ(i)〜(iii)で決定する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の検出方法：
(i)マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数の一塩基多型を特定し、各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を、母親由来DNAサンプルと父親由来DNAサンプルについて行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
(ii)各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型のマイナーアレル率が10％未満であればメジャーアレルのホモ接合体、一塩基多型のマイナーアレル率が90％を超えればマイナーアレルのホモ接合体、一塩基多型のマイナーアレル率が10％〜90%であればヘテロ接合体であると判定し、母親及び父親の遺伝子型を決定するステップ、
(iii)母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であった一塩基多型を選抜するステップ。
【請求項１２】
マルチプレックス核酸増幅反応がマルチプレックスPCRである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１３】
ステップ(ii)における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、請求項１１又は１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
ステップ(iii)において、母親及び父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体、又は母親及び父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体であった一塩基多型を評価用一塩基多型として選抜し、そのマイナーアレル率を算出し、該マイナーアレル率の基準値からのずれとの比較によって、ステップ（３）の条件おける有意性を評価する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１５】
以下のステップを更に含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の検出方法。
（４）ステップ（３）の判定に使用した一塩基多型のマイナーアレル率の基準値からのずれ×2、を胎児成分量として算出する。
【請求項１６】
母親が日本人である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１７】
検出結果が、無侵襲的出生前遺伝学的検査による胎児の性別判定に用いられる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１８】
無侵襲的出生前遺伝学的検査がX連鎖劣性遺伝性疾患を対象としたものである、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
以下のプライマーセットの2種類以上を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出キット：
配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４４）の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１００の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１２の配列からなるリバースプライマーのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は母体血セルフリー（cell free）DNA中の胎児成分の検出方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断として胎児の遺伝学的検査を行うには、羊水、絨毛、胎児血などの胎児成分を採取する侵襲的な検査が必要であったが、近年は母体血を用いた無侵襲的出生前遺伝学的検査（Non-Invasive Prenatal Testing：NIPT）が注目されている。これまでNIPTによる出生前診断では、21トリソミーなど染色体異数性の診断が主に行われているが、重篤なX連鎖劣性遺伝性疾患への臨床応用としてNIPTによる胎児の性別判定が考えられる。X連鎖劣性遺伝性疾患において、女児であれば保因者か健常者であるため、その後の羊水検査などの侵襲的検査は不要であり、NIPTによる性別判定の臨床的有用性は高いと思われる。
【０００３】
出生前診断に関する先行文献を以下に示す（特許文献１〜３）。特許文献１は妊娠6か月の母体血紫からSRY遺伝子1種類のプライマーでPCR分析により性別判定を行う技術を開示する。この技術では、胎児が男児であれば判定できるが、女児の場合は母体由来DNAか胎児由来DNAかの判別ができない。特許文献２は母体サンプルに存在する胎児ゲノム領域もしくは母親のゲノム領域を定量し、その相対存在量から異数性を判定する技術である。妊娠初期の母体血から非侵襲に出生前診断を行うことを特徴としている。特許文献３は母体血漿サンプル中の染色体異数性を検出するためのキットを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許公開１０３６４２９２３号
【特許文献２】特表２０１３−５３０７２７号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／０２０３０５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
NIPTでは、母体（妊婦）血漿中に存在する、微量の胎児由来のゲノムDNA（cell-free fetal DNA；cffDNA）を利用して遺伝学的検査や染色体検査を行う。例えば、母体血中のセルフリーDNAをサンプルとして検査することで胎児由来のY染色体の有無を知ることができれば、X染色体劣性遺伝の遺伝形式を持つ疾患の出生前診断に非常に有用な方法になる。セルフリーDNAは抽出できるDNA量が少なく、しかも、全体に占める胎児由来のセルフリーDNAの割合は低い（特に妊娠初期は胎児成分が少ない）。また、セルフリーDNAは断片化が進んでいる。そのため、PCR等の核酸増幅反応を利用してY染色体特異的な検出を試みた場合における、増幅が認めらないという結果が、胎児が女児であることを示すか、或いは偽陰性（母体血サンプル中に胎児成分が含まれていなかった場合や胎児成分が微量過ぎて検出できなかった場合）であるのか、判断し難い。即ち、従来の方法ではY染色体が検出された場合は胎児が男児であると判定できるものの、Y染色体が検出されない場合は偽陰性の可能性を排除できず、確定的な判定結果を得ることができなかった。
【０００６】
そこで本発明は、母体血中の胎児セルフリーDNA（cffDNA）を検出する新たな手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の条件を満たす一塩基多型と配列解読技術（シーケンス技術）に加え、特定の判定基準を採用した、極めて有用な検出法を創出することに成功した。主として当該成果に基づき、以下の発明が提供される。
［１］以下のステップ（１）〜（４）を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法：
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数の一塩基多型の各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
（２）各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率と、一塩基多型位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値とを算出するステップ、
（３）前記複数の一塩基多型の中から、ステップ（２）で算出した一塩基多型位置のマイナーアレル率が20％以下又は80％以上の一塩基多型を選抜するステップ、
（４）以下の条件、即ち、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合はマイナーアレル率がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高く、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ。
［２］マルチプレックス核酸増幅反応がマルチプレックスPCRである、［１］に記載の検出方法。
［３］ステップ（２）における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］ステップ（２）において、前記平均値に加えて標準偏差を算出し、ステップ（４）の条件において、平均値±2×標準偏差を超える値を「有意に高い」とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５］ステップ（３）で複数の一塩基多型を選抜し、選抜した一塩基多型の一つでもステップ（４）の条件を満足しないときは、前記サンプル中に胎児成分が含まれていないと判定する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［６］以下のステップを更に含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の検出方法：
（５）選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合は、マイナーアレル率×2、を胎児成分量として算出し、
選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は、100からマイナーアレル率を減じた値×2、を胎児成分量として算出するステップ。
［７］以下のステップ（１）〜（３）を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法：
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であり、マイナーアレル頻度が45％〜50％である一塩基多型を標的とした核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
（２）増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率を算出するステップ、
（３）以下の条件、即ち、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体の一塩基多型の場合は該一塩基多型位置のマイナーアレル率が基準値である0％よりも有意に高く、母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体の一塩基多型の場合は該一塩基多型位置のマイナーアレル率が基準値である100％よりも有意に低いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ。
［８］ステップ（１）において、複数の一塩基多型を標的とし、核酸増幅反応としてマルチプレックス核酸増幅反応を行う、［７］に記載の検出方法。
［９］ステップ（２）における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、［７］又は［８］に記載の検出方法。
［１０］解析した一塩基多型の一つでもステップ（３）の条件を満足しないときは、前記サンプル中に胎児成分が含まれていないと判定する、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１１］ステップ（１）で標的とする一塩基多型を以下のステップ(i)〜(iii)で決定する、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載の検出方法：
(i)マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数の一塩基多型を特定し、各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を、母親由来DNAサンプルと父親由来DNAサンプルについて行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ、
(ii)各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型のマイナーアレル率が10％未満であればメジャーアレルのホモ接合体、一塩基多型のマイナーアレル率が90％を超えればマイナーアレルのホモ接合体、一塩基多型のマイナーアレル率が10％〜90%であればヘテロ接合体であると判定し、母親及び父親の遺伝子型を決定するステップ、
(iii)母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であった一塩基多型を選抜するステップ。
［１２］マルチプレックス核酸増幅反応がマルチプレックスPCRである、［７］〜［１１］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１３］ステップ(ii)における配列の解読に次世代シーケンサーを用いる、［１１］又は［１２］に記載の検出方法。
［１４］ステップ(iii)において、母親及び父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体、又は母親及び父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体であった一塩基多型を評価用一塩基多型として選抜し、そのマイナーアレル率を算出し、該マイナーアレル率の基準値からのずれとの比較によって、ステップ（３）の条件おける有意性を評価する、［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１５］以下のステップを更に含む、［７］〜［１４］のいずれか一項に記載の検出方法。
（４）ステップ（３）の判定に使用した一塩基多型のマイナーアレル率の基準値からのずれ×2、を胎児成分量として算出する。
［１６］母親が日本人である、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１７］検出結果が、無侵襲的出生前遺伝学的検査による胎児の性別判定に用いられる、［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１８］無侵襲的出生前遺伝学的検査がX連鎖劣性遺伝性疾患を対象としたものである、［１７］に記載の検出方法。
［１９］以下のプライマーセットの2種類以上を含む、母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出キット：
配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号３８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４４）の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号４８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号４９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号５８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号５９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号６８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号７０の配列からなるリバースプライマーのセット、
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配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８０の配列からなるリバースプライマーのセット、
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配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号８８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９０の配列からなるリバースプライマーのセット、
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配列番号９３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号９８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号９９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１００の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０２の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０３の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０４の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０６の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０８の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１０の配列からなるリバースプライマーのセット、
配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１２の配列からなるリバースプライマーのセット。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】母体血中のセルフリーDNA濃度。インフォームドコンセントを得て、同意のもと妊婦から採血を行い、3mlの血漿からQIAGEN社のCirculating Nucleic Acid KitでセルフリーDNAを抽出した。抽出したセルフリーDNAの濃度を示した。
【図２】PCRの結果。QIAGEN社のCirculating Nucleic Acid Kitで抽出したセルフリーDNAを鋳型にして、Y染色体のPCRを行った。レーン１、２はコントロールとして使用したバルクDNA。レーン３〜７がセルフリーDNA。レーン８はDNAの代わりにDWを使用したネガティブコントロール。
【図３】常染色体を標的とした定量PCRとY染色体を標的とした定量PCRの結果。横軸はサイクル数（1〜50）。縦軸はDelta Rn。上段の胎児が男児の場合、常染色体とY染色体の増幅が確認できる。下段は胎児が女児と予想される場合、常染色体の増幅は確認できるが、Y染色体の増幅は確認できない。
【図４】マイナーアレル頻度（Minor Allele Frequency, MAF）及び解析に用いるSNP数と胎児成分の検出に利用可能なSNPが3個以上得られる確率の関係。各SNPのMAFが10%〜50%について、SNPを1〜60個用いた時の、胎児成分の検出に利用可能なSNPが3個以上得られる確率を示した。横軸はSNP数（1〜60個）。縦軸は利用可能なSNPが得られる確率。MAFが50%に近いほど、利用可能なSNPが得られる確率は高くなる。また、MAF50%を選択した時に、利用可能なSNPが3個以上得られる確率を約90%にするには40個のSNPを用いる必要がある。
【図５】Multiplex PCRの増幅産物を超並列型の次世代型DNAシーケンサーを用いて超深度解析し、SNP領域を含む各増幅産物のマイナーアレル率を計算した。ターゲットSNP箇所のマイナーアレル率が20〜80％以上の場合は母親の遺伝子型がヘテロ接合体であるとして、計算から除外した。マイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値を算出した。代表的な結果を図５Ａに示す。各PCR産物について、下記の計算を行う。ターゲットとしたSNP箇所を除いたマイナーアレル率の平均と標準偏差を求め、ターゲットSNP箇所のマイナーアレル率が平均±2×標準偏差より大きくなった場合、胎児成分が検出されたとした（図５Ｂ）。図６のトリオ解析の結果から、各SNPのマイナーアレル率が平均±2×標準偏差の値よりも高いのは、両親が異なるアレルタイプのホモ接合体であり、一方で値が低いものは、両親のSNPの遺伝子型が同一であることがわかる。
【図６】マルチプレックスPCRの増幅産物を超並列型の次世代型DNAシーケンサーを用いて超深度解析し、SNP領域のマイナーアレル率を計算した（図６Ａ）。ターゲットSNP箇所のマイナーアレル率が20〜80％以上の場合は母親の遺伝子型がヘテロ接合体であるとして、計算から除外した（図６Ｂ）。マイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値を算出した（図６Ｃ）。残りの各SNPの中から、両親の遺伝子型が異なるアレルのホモ接合体を■、同じアレルのホモ接合体の場合は●で示した（図６Ｄ）。これらの2群間のマイナーアレル率を比較した（図６Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法
本発明の第１の局面は母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出方法に関する。血中には、白血球細胞の核内にゲノムDNAとして存在するのではなく、遊離状態で存在するDNAが含まれている。当該DNAはセルフリーDNA又は循環無細胞DNAと呼ばれる。母体（妊婦）血の場合、母親由来のセルフリーDNAに胎児由来のセルフリーDNAが混在して認められることが知られている。母体血中の胎児由来セルフリーDNAは妊娠4週目を過ぎる頃から認められ始め、一般に、妊娠の経過とともにその存在量が増加する（Illanes S, Denbow M, Kailasam C, Finning K, Soothill PW. Early detection of cell-free fetal DNA in maternal plasma. Early Hum Dev. 2007; 83(9): 563-566.）。本発明では母体血中に混在する胎児由来のセルフリーDNAが検出対象（検出物）となる。
【００１０】
本発明は大別して2種類の方法（説明の便宜上、「第１の検出方法」と「第２の検出方法」と呼ぶ）を提供する。以下、各々の詳細を説明する。
【００１１】
１．第１の検出方法
第１の検出方法では以下のステップ（１）〜（４）を行う。
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、マイナーアレル頻度が45％〜50％である、複数の一塩基多型の各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を行い、一塩基多型位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ
（２）各増幅産物の配列を繰り返し解読し、一塩基多型位置のマイナーアレル率と、一塩基多型位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値とを算出するステップ
（３）前記複数の一塩基多型の中から、ステップ（２）で算出した一塩基多型位置のマイナーアレル率が20％以下又は80％以上の一塩基多型を選抜するステップ
（４）以下の条件、即ち、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が20％以下の場合はマイナーアレル率がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高く、選抜した一塩基多型のマイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値がステップ（２）で算出した平均値よりも有意に高いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ
【００１２】
ステップ（１）では特定の一塩基多型（以下、慣例に従い「一塩基多型」を「SNP」と呼ぶことがある）を標的とした核酸増幅反応を行う。サンプルには母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAを用いる。核酸増幅反応前のサンプルの調製（血漿又は血清の採取、血漿又は血清からのセルフリーDNAの抽出、精製など）は、採用する核酸増幅反応の種類や条件等を考慮しつつ、常法で行えばよい。
【００１３】
SNPの遺伝子型を構成するアレル（対立遺伝子）の内、人口の中で多く認められるものをメジャーアレル、少ないものをマイナーアレルと呼ぶ。本発明では、マイナーアレル頻度（以下、「MAF」と称することがある）が45％〜50％のSNPを標的とする。人種間でMAFが相違するSNPについては、本発明の検出方法を適用する母親の人種を考慮する。例えば、母親が日本人であれば、モンゴロイド（好ましくは日本人）のMAFに基づき、該当するSNPを選択する。日本人のアレル頻度については例えばIntegrative Japanese Genome Variation Database (https://ijgvd.megabank.tohoku.ac.jp)のデータベースを参照することができ、当該情報を利用して該当するSNPを選択することができる。
【００１４】
標的として採用することが可能なSNPを例示すると、rs6703258（chr1:96291103）、rs3768699（chr2:121732104）、rs2066804（chr2:191841759）、rs1447189（chr2:30885991）、rs3739100（chr2:47278901）、rs3732581（chr3:183558402）、rs10001845（chr4:154478222）、rs309559（chr5:82833369）、rs9479291（chr6:152644165）、rs2814694（chr6:63101210）、rs10231676（chr7:132056155）、rs6966456（chr7:67395007）、rs2458431（chr8:105367096）、rs7817014（chr8:110001390）、rs7842162（chr8:66556292）、rs2230806（chr9:107620867）、rs7021572（chr9:18950895）、rs77038916（chr10:71168727）、rs1806294（chr11:111264941）、rs11038361（chr11:45248372）、rs34729771（chr11:47463484）、rs10774867（chr12:116966200）、rs1630843（chr12:16387322）、rs1967401（chr12:22928066）、rs7958807（chr12:76287201）、rs9518825（chr13:103388370）、rs2210174（chr14:83600010）、rs8040336（chr15:44053617）、rs13337885（chr16:57653047）、rs4782441（chr16:89186529）、rs3785888（chr17:45005703）、rs6565532（chr17:79023453）、rs6503235（chr17:9515777）、rs11877086（chr18:43307338）、rs34889373（chr19:57607860）、rs490505（chr20:10068981）、rs1401046（chr21:21110627）、rs2832007（chr21:30106926）、rs72613652（chr21:46484612）、rs695648（chr22:43760187）、rs6704228（chr1:189992656）、rs158735(chr1:222366608)、rs34033604(chr2：121844723)、rs10226582（chr7：11239345）、rs2906331（chr8：194884）、rs1064416(chr8：441457)、rs12776774（chr10：80081518）、rs7940802(chr11：7767760)、rs7953251(chr12:10866397)、rs12231322(chr12：38597950)、rs308578(chr13：62733664)、rs6571339(chr14：30699691)、rs1381273(chr14：98649060)、rs35392886(chr16：51733063)、rs79902551(chr16：79310168)、rs7252410(chr19：32633058)である。尚、rs番号は、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のSNPデータベースでの登録番号であり、括弧内にその位置を示した。
【００１５】
複数のSNP、即ち2個以上のSNPを選択することになるが、効率的且つ信頼性の高い検出を実現するという観点から、好ましくは40〜60個、更に好ましくは40個〜50個のSNPをステップ（１）の標的とする。標的とするSNPの数と、SNPのMAFが約50%（45％〜50％）であるとの条件は検出効率と検出結果の信頼性に関係する。図４に示すように、MAFの値によって、胎児成分の検出に利用可能なSNP（即ち、後述のステップ（４）の判定に利用されるSNP）が得られる確率が異なる。図４では、胎児成分の検出に利用可能なSNPが3個以上得られる確率をMAFが10%〜50%の間で比較している。MAFが50%に近いほど利用可能なSNPが得られる確率が高くなる。MAF50%の場合、40個のSNPを用いると、利用可能なSNPが3個以上得られる確率が約90%（89.15929％）になる。従って、40個〜60個（より好ましくは40個〜50個）のSNPを標的とすれば、ステップ（４）の判定において妥当な数のSNPを利用できることになり、効率性と信頼性を両立することができる。
【００１６】
マルチプレックス核酸増幅反応とは、2種類以上のDNAを鋳型として用い、各々の鋳型に特異的なプライマーを併用することにより、2種類以上のDNAを同時に増幅させる反応である。マルチプレックス核酸増幅反応の代表はマルチプレックスPCR法であるが、２種類以上のSNPについて、SNP位置を含むDNA断片を同時に増幅できる限り、他の反応系を用いることもできる。
【００１７】
マルチプレックス核酸増幅反応としてマルチプレックスPCR法を用いる場合には、PCRに適したプライマーセットを用意する。本発明におけるプライマーの設計においては、特異的な増幅が可能であること、プライマー間の干渉を抑えること、標的SNP間の増幅産物の量の偏りを抑えることなどの観点から、以下の条件を考慮する。
(a)リピート配列上やGC含量が極端に低い又は極端に高い領域は除く
(b)各プライマーセット間でTm値を揃える
(c)プライマー間でダイマーが形成されないようにする
(d)実際にPCRを行い、増幅が認められたものをマルチプレックスPCRに使用する
【００１８】
上記条件を考慮して設計したプライマーの例を後述の実施例の欄に示した。
【００１９】
マルチプレックス核酸増幅反応によって得られるDNA断片、即ち増幅産物の長さは、セルフリーDNAの断片化や、増幅反応の効率、次世代シーケンサーによる増幅産物の解読長（次世代シーケンサーを用いる場合）、判定結果の信頼性などを考慮し、40bp〜120bpにするとよい。
【００２０】
ステップ（１）に続くステップ（２）では各増幅産物の配列を繰り返し解読する。そして、解読結果から、各SNP位置のマイナーアレル率を算出する。また、SNP位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値も算出する。マイナーアレル率は、マイナーアレルの検出数を検出総数で除した値（即ち、マイナーアレルが検出された割合）として算出することができる。配列の解読には各種方法を利用可能であるが、好ましくは次世代シーケンサーを用い、増幅産物を繰り返し解読する超深度解析を行う。次世代シーケンサーを利用すれば効率的に精度の高い結果を得ることができる。次世代シーケンサーとは、並列処理によって解析スピードを飛躍的に向上させた塩基配列解析（解読）装置であり、サンガー・シーケンシング法を利用した蛍光キャピラリーシーケンサー（「第1世代シーケンサー」と呼ばれる）と対照をなす。Illumina社（例えば、HiSeq 2500、HiSeq X Ten、NextSeq 500）、Roche(454)社（例えばGS FLX+ システム）、Life Technologies社（例えば5500xl SOLiD）、Ion Torrent社（例えばProton Sequencer）等のメーカーから各種次世代シーケンサーが販売されている。既存の超並列型次世代シーケンサーに限らず、今後開発・発売される次世代シーケンサーを利用することにしてもよい。
【００２１】
次世代シーケンサーでは解読した断片配列をリードと呼ばれる単位で出力し、リードの解析によって配列を決定する。一般にリード数が多い程、精度ないし信頼性の高い解析結果が得られる。リード数を、増幅産物あたり、例えば1,000リード〜1,000,000リード、好ましくは10,000リード〜1,000,000リードに設定する。
【００２２】
次世代シーケンサーを利用して増幅産物の配列を解読した場合、SNP位置のマイナーアレル率は、リファレンス（メジャーアレル）と異なるリードの数を全体のリード数で除した値として算出することができる。一方、SNP位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値を求めるためには、増幅産物の各々の塩基位置（但し、SNP位置を除く）について同様にマイナーアレル率を算出し、その平均を求めればよい。
【００２３】
ステップ（３）では、ステップ（２）で算出したSNP位置のマイナーアレル率に基づき、判定に利用するSNPを選抜する。具体的には、マイナーアレル率が20％以下又は80％以上のSNPを選抜する。マイナーアレル率が20％以下は母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体のSNPであることを表し、同80％以上は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体のSNPであることを表す。従って、当該基準で選抜することにより、本発明の検出方法における判定（ステップ（４））に利用できない、母親の遺伝子型がヘテロ接合体のSNPを除外することができる。尚、出産直前で胎児成分が最も含まれているときでも胎児成分が40％を越えることはなく、また出生前診断が行われる20週未満において胎児成分の平均は10％程度であるとの報告（Prenat Diagn. 2013 Jul;33(7):662-6. doi: 10.1002/pd.4119. Epub 2013 May 9. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. Wang E, Batey A, Struble C, Musci T, Song K, Oliphant A.）を考慮すれば、マイナーアレル率の基準値としての20％に代えて、より低い％（例えば、15％、10％、5％）を採用し、同様に80％に代えて、より高い％（例えば85％、90％、95％）を採用することにしてもよい。
【００２４】
好ましくは、上記の基準を満たす、2個以上のSNPを選抜する。この態様によれば、判定に使用するSNPの数が増大することによる、判定結果の信頼性の向上や偽陽性の回避などの効果が得られる。尚、この点に関する詳細は後述する。
【００２５】
ステップ（４）では、ステップ（３）で選抜したSNPを用い、以下の条件（ａ）及び（ｂ）に基づき、サンプル中に胎児成分が含まれているか否かを判定する。
（ａ）選抜したSNPのマイナーアレル率が20％以下の場合はマイナーアレル率がステップ（２）で算出した平均値（即ち、SNP位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値）よりも有意に高いこと
（ｂ）選抜したSNPのマイナーアレル率が80％以上の場合は100からマイナーアレル率を減じた値がステップ（２）で算出した平均値（SNP位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値）よりも有意に高いこと
【００２６】
ステップ（３）で選抜したSNPのマイナーアレル率が20％以下の場合には（ａ）が適用され、当該条件を満足したときにサンプル中に胎児成分が含まれると判定する。他方、ステップ（３）で選抜したSNPのマイナーアレル率が80％以上の場合には（ｂ）が適用され、当該条件を満足したときにサンプル中に胎児成分が含まれると判定する。
【００２７】
（ａ）及び（ｂ）における「有意に高い」とは、統計上の有意性をもって高いことを意味する。典型的には、ステップ（２）において、SNP位置以外の位置のマイナーアレル率の平均値に加えて標準偏差を算出し、平均値±2×標準偏差を超える値を「有意に高い」とする。
【００２８】
ステップ（３）で複数のSNPを選抜した場合には、各SNPについて上記条件（（ａ）、（ｂ））を満足するかを決定した上で判定する。即ち、選抜した全てのSNPによる総合評価によって最終的な判定結果を得る。この場合、条件を満足したSNPの割合と、条件を満足しなかったSNPの割合の大小関係に基づき、胎児成分が含まれる（前者が後者よりも大きい場合）又は含まれない（前者よりも後者が大きい場合）との判定結果を得たり、条件を満足したSNPの割合と、条件を満足しなかったSNPの割合に応じて、確度を伴った判定結果（例えば、「80％の確率で胎児成分が存在する」との判定結果）を得たりすることもできるが、好ましくは、偽陽性を回避すべく、選抜したSNPの一つでも条件を満足しないのであれば胎児成分が含まれていない（換言すれば、選抜したSNPの全てが条件を満たしたときに初めて胎児成分が含まれていると判定する）との判定結果を得ることにする。
【００２９】
以上の検出方法によれば、胎児成分の含有の有無という、定性的な判定を行うことができるが、以下のステップ（５）を追加で行えば定量的な判定も可能である。このように、本発明はサンプル中の胎児成分量を定量することにも利用できるものであり、その利用価値は高い。尚、ステップ（３）で複数のSNP選抜し、各SNPについて算出した値の平均値を胎児成分量とすれば、より信頼性の高い結果が得られる。
（５）選抜したSNPのマイナーアレル率が20％以下の場合は「マイナーアレル率×2」を胎児成分量として算出し、選抜したSNPのマイナーアレル率が80％以上の場合は「100からマイナーアレル率を減じた値×2」を胎児成分量として算出するステップ
【００３０】
２．第２の検出方法
第２の検出方法は母親の遺伝情報に加え父親の遺伝情報も用いて胎児成分を検出する。具体的には、第２の検出方法では以下のステップ（１）〜（３）を行う。
（１）母親由来血漿又は血清に含まれるセルフリーDNAをサンプルとして、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であり、マイナーアレル頻度が45％〜50％であるSNPを標的とした核酸増幅反応を行い、SNP位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ
（２）増幅産物の配列を繰り返し解読し、SNP位置のマイナーアレル率を算出するステップ
（３）以下の条件、即ち、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体のSNPの場合は当該SNP位置のマイナーアレル率が基準値である0％よりも有意に高く、母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体のSNPの場合は当該SNP位置のマイナーアレル率が基準値である100％よりも有意に低いこと、を満足したときに前記サンプル中に胎児成分が含まれると判定するステップ
【００３１】
説明の便宜上、第１の検出方法と共通する部分については重複する説明を省略し、以下では第２の検出方法に特有の構成を説明する。
【００３２】
ステップ（１）では、マイナーアレル頻度が45％〜50％であるという条件に加えて、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であるという条件を満たすSNPを標的とした核酸増幅反応を行う。後者の条件は、SNPに関して母親と父親の遺伝子型が相違し、且ついずれもヘテロ接合体ではないという条件と同義である。
【００３３】
上記の条件を満たす一つ以上（例えば1〜5個）のSNPが標的となる。複数のSNPが標的となる場合には、ステップ（１）の核酸増幅反応としてマルチプレックス核酸増幅反応を行うと良い。標的とするSNPは、例えば、以下のステップ(i)〜(iii)で決定することができる。
(i)マイナーアレル頻度が45％〜50％である複数のSNPを特定し、各々を標的としたマルチプレックス核酸増幅反応を、母親由来DNAサンプルと父親由来DNAサンプルについて行い、SNP位置を含むDNA断片からなる増幅産物を得るステップ
(ii)各増幅産物の配列を繰り返し解読し、SNPのマイナーアレル率が10％未満であればメジャーアレルのホモ接合体、SNPのマイナーアレル率が90％を超えればマイナーアレルのホモ接合体、SNPのマイナーアレル率が10％〜90%であればヘテロ接合体であると判定し、母親及び父親の遺伝子型を決定するステップ
(iii)母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であったSNPを選抜するステップ
【００３４】
ステップ(i)において特定され、マルチプレックス核酸増幅反応の標的となり得るSNPを例示すると、rs6703258（chr1:96291103）、rs3768699（chr2:121732104）、rs2066804（chr2:191841759）、rs1447189（chr2:30885991）、rs3739100（chr2:47278901）、rs3732581（chr3:183558402）、rs10001845（chr4:154478222）、rs309559（chr5:82833369）、rs9479291（chr6:152644165）、rs2814694（chr6:63101210）、rs10231676（chr7:132056155）、rs6966456（chr7:67395007）、rs2458431（chr8:105367096）、rs7817014（chr8:110001390）、rs7842162（chr8:66556292）、rs2230806（chr9:107620867）、rs7021572（chr9:18950895）、rs77038916（chr10:71168727）、rs1806294（chr11:111264941）、rs11038361（chr11:45248372）、rs34729771（chr11:47463484）、rs10774867（chr12:116966200）、rs1630843（chr12:16387322）、rs1967401（chr12:22928066）、rs7958807（chr12:76287201）、rs9518825（chr13:103388370）、rs2210174（chr14:83600010）、rs8040336（chr15:44053617）、rs13337885（chr16:57653047）、rs4782441（chr16:89186529）、rs3785888（chr17:45005703）、rs6565532（chr17:79023453）、rs6503235（chr17:9515777）、rs11877086（chr18:43307338）、rs34889373（chr19:57607860）、rs490505（chr20:10068981）、rs1401046（chr21:21110627）、rs2832007（chr21:30106926）、rs72613652（chr21:46484612）、rs695648（chr22:43760187）、rs6704228（chr1:189992656）、rs158735(chr1:222366608)、rs34033604(chr2：121844723)、rs10226582（chr7：11239345）、rs2906331（chr8：194884）、rs1064416(chr8：441457)、rs12776774（chr10：80081518）、rs7940802(chr11：7767760)、rs7953251(chr12:10866397)、rs12231322(chr12：38597950)、rs308578(chr13：62733664)、rs6571339(chr14：30699691)、rs1381273(chr14：98649060)、rs35392886(chr16：51733063)、rs79902551(chr16：79310168)、rs7252410(chr19：32633058)である。複数のSNP、即ち2個以上のSNPを標的にすることになるが、効率的且つ信頼性の高い検出を実現するという観点から、好ましくは40〜60個、更に好ましくは40個〜50個のSNPを標的とする。
【００３５】
母親由来DNAサンプルと父親由来DNAサンプルの採取源ないし由来は特に限定されない。例えば、血液、唾液等からDNAを抽出し、ステップ(i)に供する。好ましくは、血液から調製したDNAサンプル（即ち、白血球由来DNAサンプル）を用いる。この場合には、母親DNAサンプルと、ステップ（１）で用いる血漿又は血清サンプルを一度の採血によって調製することも可能であり、操作の簡便化が図られることはもとより、母親の負担も軽減される。尚、母親DNAサンプルと父親由来DNAサンプルの採取源ないし由来は同一である必要はない。
【００３６】
ステップ(i)におけるマルチプレックス核酸増幅反応として好適にはマルチプレックスPCR法が用いられるが、これに限定されるものではない。マルチプレックスPCR法を用いる場合に使用するプライマーセットについては、第１の検出方法のステップ（１）の場合と同様であるため、その説明を省略する。
【００３７】
マルチプレックス核酸増幅反応によって得られるDNA断片、即ち増幅産物の長さは、セルフリーDNAの断片化や、増幅反応の効率、次世代シーケンサーによる増幅産物の解読長（次世代シーケンサーを用いる場合）、判定結果の信頼性などを考慮し、40bp〜120bpにするとよい。
【００３８】
ステップ(ii)では各増幅産物の配列を繰り返し解読する。そして、解読結果から、SNP位置のマイナーアレル率を算出する。配列の解読には各種方法を利用可能であるが、好ましくは次世代シーケンサーを用い、増幅産物を繰り返し解読する超深度解析を行う。算出したマイナーアレル率は当該SNPの遺伝子型の判定に用いられる。具体的には、マイナーアレル率が10％未満であればメジャーアレルのホモ接合体であると判定し、マイナーアレル率が90％を超えればマイナーアレルのホモ接合体であると判定し、マイナーアレル率が10％〜90%であればヘテロ接合体であると判定する。このようにして各SNPに関する母親及び父親の遺伝子型を決定し、母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体、又は母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体且つ父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体であったSNPを選抜する（ステップ(iii)）。
【００３９】
ステップ（１）に続くステップ（２）では増幅産物の配列を繰り返し解読し、SNP位置のマイナーアレル率を算出する。このステップは、第１の検出方法のステップ（２）と同様に実施することができる。従って、好ましくは次世代シーケンサーを用い、増幅産物を繰り返し解読する超深度解析を行う。
【００４０】
ステップ（３）では、ステップ（２）で算出したマイナーアレル率を用い、以下の条件（Ａ）及び（Ｂ）に基づき、サンプル中に胎児成分が含まれているか否かを判定する。
（Ａ）母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体の遺伝子型のSNPの場合はマイナーアレル率が基準値である0％よりも有意に高いこと
（Ｂ）母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体の遺伝子型のSNPの場合はマイナーアレル率が基準値である100％よりも有意に低いこと
【００４１】
母親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体（父親の遺伝子型はマイナーアレルのホモ接合体となる）のSNPの場合には（Ａ）が適用され、当該条件を満足したときにサンプル中に胎児成分が含まれると判定する。他方、母親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体（父親の遺伝子型はメジャーアレルのホモ接合体となる）のSNPの場合には（Ｂ）が適用され、当該条件を満足したときにサンプル中に胎児成分が含まれると判定する。
【００４２】
（Ａ）及び（Ｂ）における「有意に高い／低い」か否かの判断、即ち、有意性の評価は、好ましくは、以下の方法で行う。まず、上記のステップ(iii)において、母親及び父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体、又は母親及び父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体であったSNPを評価用SNPとして選抜しておく。そして、選抜した評価用SNPのマイナーアレル率を算出する。当該マイナーアレル率の基準値（母親及び父親の遺伝子型がメジャーアレルのホモ接合体の場合は0％、母親及び父親の遺伝子型がマイナーアレルのホモ接合体の場合は100％）からのずれ（d％）との比較によって（Ａ）及び（Ｂ）における有意性を評価する。典型的には、（Ａ）の場合は、マイナーアレル率＞d％、（Ｂ）の場合は（100％−マイナーアレル率）＞d％であれば、有意性が認められると判断する。
【００４３】
信頼性のより高い判定結果を得るために、複数の評価用SNPを選抜し、それらのマイナーアレル率の基準値からのずれの平均値を評価に用いることが好ましい。
【００４４】
複数のSNPを解析してステップ（３）の判定を行う場合には、典型的には、全てのSNPによる総合評価によって最終的な判定結果を得る。この場合、第１の検出方法の場合と同様に、好ましくは、偽陽性を回避すべく、解析したSNPの一つでも上記条件（（Ａ）、（Ｂ））を満足しないのであれば胎児成分が含まれていない（換言すれば、解析したSNPの全てが条件を満たしたときに初めて胎児成分が含まれていると判定する）との判定結果を得ることにする。
【００４５】
第２の検出方法においても、以下のステップ（４）を追加で行うことにより、サンプル中の胎児成分量を定量することが可能である。尚、判定に使用したSNPが複数であれば、基準値からのずれの平均値を求め、当該平均×2を胎児成分として算出するとよい。
（４）「ステップ（３）の判定に使用したSNPのマイナーアレル率の基準値からのずれ×2」を胎児成分量として算出する。
【００４６】
本発明による検出結果は、母体血中に胎児成分が含まれていること（或いは含まれていないこと）の証明に利用できる。即ち、母体血中のセルフリーDNAを用いたY染色体特異的な検出の結果、Y染色体が検出されなかった場合において、セルフリーDNA中に胎児成分（cffDNA）が含まれているが女児であるためY染色体由来の核酸増幅産物が生じていないことを裏づけることができる。従って、本発明はNIPTを補完する有意義な情報を提供し、NIPTにおける判定不能例を減らすこと（不能例をゼロにすることも含む)が可能になる。このように、本発明による検出結果は、胎児の性別判定に用いることができるものであり、臨床上、極めて有意義な情報を与える。
【００４７】
本発明による検出結果が利用される無侵襲的出生前遺伝学的検査は、例えば、X連鎖劣性遺伝性疾患を対象としたものである。X連鎖劣性遺伝性疾患は特に限定されず、例えば、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファブリー病、グルコース-6-リン酸脱水素酵素欠損症、ハンター症候群、眼白子症、レッシュ・ナイハン症候群、ブルトン型無γグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、脆弱X症候群、副腎白質ジストロフィーを例示することができる。
【００４８】
２．検出キット
本発明の第２の局面は母体血セルフリーDNA中の胎児成分の検出キットに関する。本発明の検出キットを用いれば、上記検出方法を簡便に実施することができる。本発明の検出キットは、マルチプレックスPCR法に用いられるプライマーセットを必須の構成要素とする。具体的には、以下のプライマーセット（１）〜（４０）の中の2種類以上が検出キットに含有される。
（１）rs6703258用：CCATATGCGTATACATGCT（配列番号１）の配列からなるフォワードプライマーとCAGCATTAAGGGCAAAATGC（配列番号２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２）rs3768699用：CTCATTAAAATGGCCACATG（配列番号３）の配列からなるフォワードプライマーとAGCCTAGGTCTGGACTTGAG（配列番号４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３）rs2066804用：CAACCGCATGGAAGTCAGGT（配列番号５）の配列からなるフォワードプライマーとGGGATGTTCTATGGGATTTAC（配列番号６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４）rs1447189用：AGAGGGGCTGGAGGCTTCAG（配列番号７）の配列からなるフォワードプライマーとCTGAACTTCCTGATCTGCAC（配列番号８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５）rs3739100用：CGGCTCGTGCCCTCTTGCTC（配列番号９）の配列からなるフォワードプライマーとGACATGGCCTCCTCCAGCCG（配列番号１０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（６）rs3732581用：GTGATGGTCCATATCTTCCTG（配列番号１１）の配列からなるフォワードプライマーとGTAATGTGACTTGTTTTTCAGGTG（配列番号１２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（７）rs10001845用：CCTACTGAAGAAGGAAGCATTG（配列番号１３）の配列からなるフォワードプライマーとGGAAAAAGTTACTCACATGATAGG（配列番号１４配列からなるリバースプライマーのセット
（８）rs309559用：GCCTGATGTTTTCCCCACAGTCCC（配列番号１５）の配列からなるフォワードプライマーとTCTCTCTGTGACTGATTCTGCCCC（配列番号１６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（９）rs9479291用：ATGGTTCACCATCGTATCTC（配列番号１７）の配列からなるフォワードプライマーとCCCATCACTCTTGCTTTTCCG（配列番号１８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１０）rs2814694用：TCTTCCTCTGTCTCAGTTTC（配列番号１９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGTGGCTCTCTCACCACTC（配列番号２０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１１）rs10231676用：ATCCTCAGCTACCTCTTCTC（配列番号２１）の配列からなるフォワードプライマーとGATTAGGGAGATACAGGAATAGC（配列番号２２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１２）rs6966456用：TCTCGCTGCTGTTATGGAAC（配列番号２３）の配列からなるフォワードプライマーとGTGGTGACCTTATCATCACAG（配列番号２４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１３）rs2458431用：GAGTACAAAAATGGCATGCATCATG（配列番号２５）の配列からなるフォワードプライマーとCATGGATAATATCTTGAGTTCC（配列番号２６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１４）rs7817014用：TACACATGGGAAAAGCACAG（配列番号２７）の配列からなるフォワードプライマーとGTTATCTTCAGCCTTTTGGGC（配列番号２８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１５）rs7842162用：GGTTTCCTACCCTACATAGG（配列番号２９）の配列からなるフォワードプライマーとGTAATGTGCGTAGGCGTGATG（配列番号３０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１６）rs2230806用：TCGCTCTGCTGCAGCCAGTTT（配列番号３１）の配列からなるフォワードプライマーとAGTTTCTGAGCTTTGTGGCCTACC（配列番号３２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１７）rs7021572用：GGTATATTCGGAGAGAAGACATGG（配列番号３３）の配列からなるフォワードプライマーとCATCACTGTCCACATCTCCCTACC（配列番号３４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１８）rs77038916用：GTTGGCACCGTGCGCCTGAT（配列番号３５）の配列からなるフォワードプライマーとACAGCGTCATCGGCCTCACG（配列番号３６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（１９）rs1806294用：GGGAAGAAGTCAAGTTGATG（配列番号３７）の配列からなるフォワードプライマーとGAACTTCAAGCCACAGGAATG（配列番号３８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２０）rs11038361用：GCCTTCTCGGCCTTGGGCAT（配列番号３９）の配列からなるフォワードプライマーとACATGCTGGCACGGAGGCTG（配列番号４０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２１）rs34729771用：GTGCTGCAGCGCGATCTTCA（配列番号４１）の配列からなるフォワードプライマーとGGGCACTCCAGTGGTGGTGG（配列番号４２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２２）rs10774867用：GTTGAGTGGGTGTCCCAGC（配列番号４３）の配列からなるフォワードプライマーとGAAACTTGATGTTGGGCAG（配列番号４４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２３）rs1630843用：CCATAGCACTCTTACCTAGG（配列番号４５）の配列からなるフォワードプライマーとATTGGCACCAGAGTGCAGTAG（配列番号４６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２４）rs1967401用：GGTAGAAGAAACTCCTCAGC（配列番号４７）の配列からなるフォワードプライマーとGCCAAGAGTAAATGCTTGC（配列番号４８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２５）rs7958807用：AACAACAACAGAAACCCTGC（配列番号４９）の配列からなるフォワードプライマーとTCCTGACAACGATGGCTGTC（配列番号５０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２６）rs9518825用：GCCTCTGCCCTCAAATGTATCC（配列番号５１）の配列からなるフォワードプライマーとATAAAGAGGCAAAGGACAGAG（配列番号５２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２７）rs2210174用：GTCGATAATGTACACCTTCC（配列番号５３）の配列からなるフォワードプライマーとGCCATGTGCTTGTTCTTAAC（配列番号５４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２８）rs8040336用：GTGAATGATGAATAATTGCCTTCTC（配列番号５５）の配列からなるフォワードプライマーとCAAGTGGCTGACAATTCCATC（配列番号５６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（２９）rs13337885用：GACTATGGGAGAAACAGTG（配列番号５７）の配列からなるフォワードプライマーとGCTGCATGCACCTCAATGCAC（配列番号５８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３０）rs4782441用：CACAGGCAGAGCGAGGCTG（配列番号５９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGGTGGCGAGACGTGTC（配列番号６０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３１）rs3785888用：CAAGCTGAAGCCAAAGTTGG（配列番号６１）の配列からなるフォワードプライマーとATTCTGCATCGTGAGCAATGC（配列番号６２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３２）rs6565532用：ATACACTCGCTCAGTGACTC（配列番号６３）の配列からなるフォワードプライマーとCCAGGTGGAAAGAACTCTGT（配列番号６４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３３）rs6503235用：AAGCGACTTGTCACTTTGATGCTG（配列番号６５）の配列からなるフォワードプライマーとTCTCACAATGGAAAGACAATATCC（配列番号６６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３４）rs11877086用：AAGCTGGTGACGCAGCGCGCAGAG（配列番号６７）の配列からなるフォワードプライマーとTCTGCCAGGGCCAAGCTTAGCCG（配列番号６８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３５）rs34889373用：AGTGATCTGGTCTAGGGCAG（配列番号６９）の配列からなるフォワードプライマーとCCCTGTTGCCTACATATTTCTC（配列番号７０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３６）rs490505用：AACTGCATGAGCAAAAGTCC（配列番号７１）の配列からなるフォワードプライマーとCAGTTGCAACCTCTCATCTTAC（配列番号７２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３７）rs1401046用：AGCAGAGCATCTCCTGTGAG（配列番号７３）の配列からなるフォワードプライマーとCTGAGTGATTGATTTAGCAGGA（配列番号７４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３８）rs2832007用：GTGAAGGTGCAGTGAGGAAC（配列番号７５）の配列からなるフォワードプライマーとTGGCATGGGTTCAATCAGGA（配列番号７６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（３９）rs72613652用：GAAGTGGAATTCTAGAAAAC（配列番号７７）の配列からなるフォワードプライマーとGTTTGCTTGAATGGCATAC（配列番号７８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４０）rs695648用：GGCATTCTATGTCGGGATGG（配列番号７９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGCTGGAAACCTAAGTAGC（配列番号８０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４１）rs6704228用：CACCAGCCCACCAGAAATAT（配列番号８１）の配列からなるフォワードプライマーとTTGTTCCGAAACCATTTCTGA（配列番号８２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４２）rs158735用：TGTCCATCCTCACAAACCTTC（配列番号８３）の配列からなるフォワードプライマーとCGGGAAGCACAGGGACTAT（配列番号８４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４３）rs34033604用：GTCCATCTGTCCATCTGTCTGTC（配列番号８５）の配列からなるフォワードプライマーとAAGAACAGCCCACAGAGGTGA（配列番号８６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４４）rs10226582用：CCAGATGGCAGGAGAAAGACA（配列番号８７）の配列からなるフォワードプライマーとGGGCCTTGGAGTACAAATACAA（配列番号８８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４５）rs2906331用：ATGAGGCCTTATGACAGGAC（配列番号８９）の配列からなるフォワードプライマーとAAGTTTCAGCACGTAGTCAAG（配列番号９０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４６）rs1064416用：AAGAACGCGAGAGATGCTCT（配列番号９１）の配列からなるフォワードプライマーとTTCCACAAGAATAATCGACG（配列番号９２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４７）rs12776774用：TTTGCTCATACCTCCTGAGAACA（配列番号９３）の配列からなるフォワードプライマーとCTGCAAGGGGGTAGACACAGT（配列番号９４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４８）rs7940802用：GGCTTCTGTGGACATTGGG（配列番号９５）の配列からなるフォワードプライマーとAAATTGATGAGAATGATTGGCG（配列番号９６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（４９）rs7953251用：TCTCTGTCCAGCACAAAGGTACT（配列番号９７）の配列からなるフォワードプライマーとTTGCTGCCAAAATAGGAGAAGT（配列番号９８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５０）rs12231322用：GGGCAGCTATGTGGTGGAA（配列番号９９）の配列からなるフォワードプライマーとGGGATAAGCCAAGTGTTGCC（配列番号１００）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５１）rs308578用：CTTTTGGGTGCAGTCTTCTATGA（配列番号１０１）の配列からなるフォワードプライマーとACCAGAATGGTCTCAAGGTTGTATAA（配列番号１０２）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５２）rs6571339用：GTTCATTTGGGTAAATTTTGTTTCTC（配列番号１０３）の配列からなるフォワードプライマーとGATGCATAGGTCATATTAAAGGAGC（配列番号１０４）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５３）rs1381273用：CCAGATAAAACACTTAAAAATCCCA（配列番号１０５）の配列からなるフォワードプライマーとGCAGAAAAGGGCAGGTGAG（配列番号１０６）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５４）rs35392886用：CGCTTTCTTTACAGAAGAACCTCT（配列番号１０７）の配列からなるフォワードプライマーとCTTTCTTGGCTTCCACTATTAGCT（配列番号１０８）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５５）rs79902551用：GTGCATTTTGAGGCTTTTTATGT（配列番号１０９）の配列からなるフォワードプライマーとGGCCTGCTGCAAACATTTATT（配列番号１１０）の配列からなるリバースプライマーのセット
（５６）rs7252410用：GTCTCAGTCCCTGCAACATTCT（配列番号１１１）の配列からなるフォワードプライマーとTCACTCTGGACTCTACAAAGCCT（配列番号１１２）の配列からなるリバースプライマーのセット
【００４９】
上記プライマーセットの内、好ましくは１０種類以上、更に好ましくは２０種以上、更に更に好ましくは３０種以上、最も好ましくは全部を検出キットに含有させる。このようにプライマーセットの数を増やせば、それに応じて標的となるSNPの数も増加し、より有意義且つ信頼性の高い検出結果を得ることが可能となる。
【００５０】
マルチプレックスPCRを実施する際に必要な試薬（酵素、緩衝液など）や容器、器具等を本発明の検出キットに含めてもよい。尚、通常、本発明の検出キットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００５１】
母親が重篤なX連鎖劣性遺伝病の保因者である場合、男児のみが発症するため、羊水検査や絨毛検査のような出生前診断においては、胎児が疾患の責任変異を持っているかどうかと同時に性別判定が必要である。胎児が女児の場合は発症しないため、前もって胎児の性別が分かれば、羊水検査のような侵襲的検査を行う必要がない。近年、無侵襲出生前遺伝学的検査(NIPT)が注目されている。NIPTとは、母体血漿中に含まれている僅かな胎児DNAを利用して胎児の遺伝学的検査を行うものであり、妊娠初期に検査が可能である。胎児の性別判定を行うことにより、NIPTをX連鎖遺伝病の診断に応用することを目指し、以下の検討を行った。
【００５２】
１．母体血からのY染色体特異的な遺伝子のPCRによる検出
インフォームドコンセントの得られた妊娠9〜39週の妊婦の血漿（男児37人、女児33人）を使用した。妊婦の血漿からセルフリーDNAを抽出し（図１）、Y染色体に特異的な遺伝子をPCR若しくは定量PCRで増幅した。PCRの際には増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した（図２）。Y染色体由来のPCR産物が確認出来れば、胎児が男児であると判定することにした。
【００５３】
胎児由来セルフリーDNA（cffDNA）があることを証明するために、常染色体の定量PCRを行い、性別判定のためにY染色体の定量PCRを行った。結果を図３に示す。上段（胎児が男児の場合）、常染色体よりも数サイクル遅れてY染色体の増幅が見られた。Y染色体のPCR増幅が常染色体のPCRよりも遅れて増幅するのは、鋳型DNAとして使用したセルフリーDNAの大部分が母親由来のDNAだからである。一方で、下段（胎児が女児と予想される）の場合、常染色体の増幅は確認できたが、Y染色体のPCRで増幅が認められなかった。Y染色体の増幅が認められなかった原因として、Y染色体が存在しない（即ち女児である場合）からか、或いはサンプル中に胎児由来のセルフリーDNAが含まれていなかったからか、を判別することはできない。即ち、Y染色体の増幅が認められなかったからといって、女児であると確定することはできない。Y染色体由来のPCR産物が確認できない場合に女児であると判定するためには、妊婦の血漿から得られたセルフリーDNA中に胎児DNAが含まれているにも関わらず、Y染色体のPCR産物が生成しないことを証明する必要がある。
【００５４】
２．母体血中の胎児由来セルフリーDNA（cffDNA）の検出（cffDNAが存在することの証明）
妊婦の血漿から得られたセルフリーDNA中に胎児DNAが含まれているにも関わらず、Y染色体のPCR産物が生成しなかったことを証明するために、複数のSNPを標的としてマルチプレックスPCRを行い、超並列型の次世代型DNAシーケンサーを用いて超深度解析（ディープシーケンス）を行った。
（１）SNPの選抜
日本人SNPのデータベース（Integrative Japanese Genome Variation Database (https://ijgvd.megabank.tohoku.ac.jp）を参照し、日本人でマイナーアレル頻度（MAF）が約50％（45％〜50％）のSNPを360,085個抽出した。抽出したSNPの中から、(a)リピート配列上やGC含量が極端に低い又は極端に高い領域は除く、(b)各プライマーセット間でTm値を揃える、(c)プライマー間でダイマーが形成されないようにする、の条件で選抜し、以下の56個のSNPを特定した。
rs6703258（chr1:96291103）、rs3768699（chr2:121732104）、rs2066804（chr2:191841759）、rs1447189（chr2:30885991）、rs3739100（chr2:47278901）、rs3732581（chr3:183558402）、rs10001845（chr4:154478222）、rs309559（chr5:82833369）、rs9479291（chr6:152644165）、rs2814694（chr6:63101210）、rs10231676（chr7:132056155）、rs6966456（chr7:67395007）、rs2458431（chr8:105367096）、rs7817014（chr8:110001390）、rs7842162（chr8:66556292）、rs2230806（chr9:107620867）、rs7021572（chr9:18950895）、rs77038916（chr10:71168727）、rs1806294（chr11:111264941）、rs11038361（chr11:45248372）、rs34729771（chr11:47463484）、rs10774867（chr12:116966200）、rs1630843（chr12:16387322）、rs1967401（chr12:22928066）、rs7958807（chr12:76287201）、rs9518825（chr13:103388370）、rs2210174（chr14:83600010）、rs8040336（chr15:44053617）、rs13337885（chr16:57653047）、rs4782441（chr16:89186529）、rs3785888（chr17:45005703）、rs6565532（chr17:79023453）、rs6503235（chr17:9515777）、rs11877086（chr18:43307338）、rs34889373（chr19:57607860）、rs490505（chr20:10068981）、rs1401046（chr21:21110627）、rs2832007（chr21:30106926）、rs72613652（chr21:46484612）、rs695648（chr22:43760187）、rs6704228（chr1: 189992656）、rs158735(chr1: 222366608)、rs34033604(chr2：121844723)、rs10226582（chr7：11239345）、rs2906331（chr8：194884）、rs1064416(chr8：441457)、rs12776774（chr10：80081518）、rs7940802(chr11：7767760)、rs7953251(chr12: 10866397)、rs12231322(chr12：38597950)、rs308578(chr13：62733664)、rs6571339(chr14：30699691)、rs1381273(chr14：98649060)、rs35392886(chr16：51733063)、rs79902551(chr16：79310168)、rs7252410(chr19：32633058)
【００５５】
胎児成分の検出に利用可能なSNPが３個以上得られる確率をMAFが10%〜50%の間で比較した（図４）。MAFが50%に近いほど利用可能なSNPが得られる確率が高くなる。MAF50%の場合、40個のSNPを用いれば、利用可能なSNPが3個以上得られる確率が約90%（89.15929％）になる。
【００５６】
（２）プライマーの設計及び調製
選抜したSNP（56個）の各々についてプライマーセットを設計した。
【００５７】
以下、標的のSNP毎に設計したプライマーセットを示す。
rs6703258用：CCATATGCGTATACATGCT（配列番号１）の配列からなるフォワードプライマーとCAGCATTAAGGGCAAAATGC（配列番号２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs3768699用：CTCATTAAAATGGCCACATG（配列番号３）の配列からなるフォワードプライマーとAGCCTAGGTCTGGACTTGAG（配列番号４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2066804用：CAACCGCATGGAAGTCAGGT（配列番号５）の配列からなるフォワードプライマーとGGGATGTTCTATGGGATTTAC（配列番号６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1447189用：AGAGGGGCTGGAGGCTTCAG（配列番号７）の配列からなるフォワードプライマーとCTGAACTTCCTGATCTGCAC（配列番号８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs3739100用：CGGCTCGTGCCCTCTTGCTC（配列番号９）の配列からなるフォワードプライマーとGACATGGCCTCCTCCAGCCG（配列番号１０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs3732581用：GTGATGGTCCATATCTTCCTG（配列番号１１）の配列からなるフォワードプライマーとGTAATGTGACTTGTTTTTCAGGTG（配列番号１２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs10001845用：CCTACTGAAGAAGGAAGCATTG（配列番号１３）の配列からなるフォワードプライマーとGGAAAAAGTTACTCACATGATAGG（配列番号１４配列からなるリバースプライマーのセット
rs309559用：GCCTGATGTTTTCCCCACAGTCCC（配列番号１５）の配列からなるフォワードプライマーとTCTCTCTGTGACTGATTCTGCCCC（配列番号１６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs9479291用：ATGGTTCACCATCGTATCTC（配列番号１７）の配列からなるフォワードプライマーとCCCATCACTCTTGCTTTTCCG（配列番号１８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2814694用：TCTTCCTCTGTCTCAGTTTC（配列番号１９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGTGGCTCTCTCACCACTC（配列番号２０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs10231676用：ATCCTCAGCTACCTCTTCTC（配列番号２１）の配列からなるフォワードプライマーとGATTAGGGAGATACAGGAATAGC（配列番号２２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs6966456用：TCTCGCTGCTGTTATGGAAC（配列番号２３）の配列からなるフォワードプライマーとGTGGTGACCTTATCATCACAG（配列番号２４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2458431用：GAGTACAAAAATGGCATGCATCATG（配列番号２５）の配列からなるフォワードプライマーとCATGGATAATATCTTGAGTTCC（配列番号２６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7817014用：TACACATGGGAAAAGCACAG（配列番号２７）の配列からなるフォワードプライマーとGTTATCTTCAGCCTTTTGGGC（配列番号２８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7842162用：GGTTTCCTACCCTACATAGG（配列番号２９）の配列からなるフォワードプライマーとGTAATGTGCGTAGGCGTGATG（配列番号３０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2230806用：TCGCTCTGCTGCAGCCAGTTT（配列番号３１）の配列からなるフォワードプライマーとAGTTTCTGAGCTTTGTGGCCTACC（配列番号３２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7021572用：GGTATATTCGGAGAGAAGACATGG（配列番号３３）の配列からなるフォワードプライマーとCATCACTGTCCACATCTCCCTACC（配列番号３４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs77038916用：GTTGGCACCGTGCGCCTGAT（配列番号３５）の配列からなるフォワードプライマーとACAGCGTCATCGGCCTCACG（配列番号３６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1806294用：GGGAAGAAGTCAAGTTGATG（配列番号３７）の配列からなるフォワードプライマーとGAACTTCAAGCCACAGGAATG（配列番号３８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs11038361用：GCCTTCTCGGCCTTGGGCAT（配列番号３９）の配列からなるフォワードプライマーとACATGCTGGCACGGAGGCTG（配列番号４０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs34729771用：GTGCTGCAGCGCGATCTTCA（配列番号４１）の配列からなるフォワードプライマーとGGGCACTCCAGTGGTGGTGG（配列番号４２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs10774867用：GTTGAGTGGGTGTCCCAGC（配列番号４３）の配列からなるフォワードプライマーとGAAACTTGATGTTGGGCAG（配列番号４４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1630843用：CCATAGCACTCTTACCTAGG（配列番号４５）の配列からなるフォワードプライマーとATTGGCACCAGAGTGCAGTAG（配列番号４６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1967401用：GGTAGAAGAAACTCCTCAGC（配列番号４７）の配列からなるフォワードプライマーとGCCAAGAGTAAATGCTTGC（配列番号４８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7958807用：AACAACAACAGAAACCCTGC（配列番号４９）の配列からなるフォワードプライマーとTCCTGACAACGATGGCTGTC（配列番号５０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs9518825用：GCCTCTGCCCTCAAATGTATCC（配列番号５１）の配列からなるフォワードプライマーとATAAAGAGGCAAAGGACAGAG（配列番号５２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2210174用：GTCGATAATGTACACCTTCC（配列番号５３）の配列からなるフォワードプライマーとGCCATGTGCTTGTTCTTAAC（配列番号５４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs8040336用：GTGAATGATGAATAATTGCCTTCTC（配列番号５５）の配列からなるフォワードプライマーとCAAGTGGCTGACAATTCCATC（配列番号５６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs13337885用：GACTATGGGAGAAACAGTG（配列番号５７）の配列からなるフォワードプライマーとGCTGCATGCACCTCAATGCAC（配列番号５８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs4782441用：CACAGGCAGAGCGAGGCTG（配列番号５９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGGTGGCGAGACGTGTC（配列番号６０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs3785888用：CAAGCTGAAGCCAAAGTTGG（配列番号６１）の配列からなるフォワードプライマーとATTCTGCATCGTGAGCAATGC（配列番号６２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs6565532用：ATACACTCGCTCAGTGACTC（配列番号６３）の配列からなるフォワードプライマーとCCAGGTGGAAAGAACTCTGT（配列番号６４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs6503235用：AAGCGACTTGTCACTTTGATGCTG（配列番号６５）の配列からなるフォワードプライマーとTCTCACAATGGAAAGACAATATCC（配列番号６６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs11877086用：AAGCTGGTGACGCAGCGCGCAGAG（配列番号６７）の配列からなるフォワードプライマーとTCTGCCAGGGCCAAGCTTAGCCG（配列番号６８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs34889373用：AGTGATCTGGTCTAGGGCAG（配列番号６９）の配列からなるフォワードプライマーとCCCTGTTGCCTACATATTTCTC（配列番号７０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs490505用：AACTGCATGAGCAAAAGTCC（配列番号７１）の配列からなるフォワードプライマーとCAGTTGCAACCTCTCATCTTAC（配列番号７２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1401046用：AGCAGAGCATCTCCTGTGAG（配列番号７３）の配列からなるフォワードプライマーとCTGAGTGATTGATTTAGCAGGA（配列番号７４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2832007用：GTGAAGGTGCAGTGAGGAAC（配列番号７５）の配列からなるフォワードプライマーとTGGCATGGGTTCAATCAGGA（配列番号７６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs72613652用：GAAGTGGAATTCTAGAAAAC（配列番号７７）の配列からなるフォワードプライマーとGTTTGCTTGAATGGCATAC（配列番号７８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs695648用：GGCATTCTATGTCGGGATGG（配列番号７９）の配列からなるフォワードプライマーとCAGCTGGAAACCTAAGTAGC（配列番号８０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs6704228用：CACCAGCCCACCAGAAATAT（配列番号８１）の配列からなるフォワードプライマーとTTGTTCCGAAACCATTTCTGA（配列番号８２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs158735用：TGTCCATCCTCACAAACCTTC（配列番号８３）の配列からなるフォワードプライマーとCGGGAAGCACAGGGACTAT（配列番号８４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs34033604用：GTCCATCTGTCCATCTGTCTGTC（配列番号８５）の配列からなるフォワードプライマーとAAGAACAGCCCACAGAGGTGA（配列番号８６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs10226582用：CCAGATGGCAGGAGAAAGACA（配列番号８７）の配列からなるフォワードプライマーとGGGCCTTGGAGTACAAATACAA（配列番号８８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs2906331用：ATGAGGCCTTATGACAGGAC（配列番号８９）の配列からなるフォワードプライマーとAAGTTTCAGCACGTAGTCAAG（配列番号９０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1064416用：AAGAACGCGAGAGATGCTCT（配列番号９１）の配列からなるフォワードプライマーとTTCCACAAGAATAATCGACG（配列番号９２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs12776774用：TTTGCTCATACCTCCTGAGAACA（配列番号９３）の配列からなるフォワードプライマーとCTGCAAGGGGGTAGACACAGT（配列番号９４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7940802用：GGCTTCTGTGGACATTGGG（配列番号９５）の配列からなるフォワードプライマーとAAATTGATGAGAATGATTGGCG（配列番号９６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7953251用：TCTCTGTCCAGCACAAAGGTACT（配列番号９７）の配列からなるフォワードプライマーとTTGCTGCCAAAATAGGAGAAGT（配列番号９８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs12231322用：GGGCAGCTATGTGGTGGAA（配列番号９９）の配列からなるフォワードプライマーとGGGATAAGCCAAGTGTTGCC（配列番号１００）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs308578用：CTTTTGGGTGCAGTCTTCTATGA（配列番号１０１）の配列からなるフォワードプライマーとACCAGAATGGTCTCAAGGTTGTATAA（配列番号１０２）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs6571339用：GTTCATTTGGGTAAATTTTGTTTCTC（配列番号１０３）の配列からなるフォワードプライマーとGATGCATAGGTCATATTAAAGGAGC（配列番号１０４）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs1381273用：CCAGATAAAACACTTAAAAATCCCA（配列番号１０５）の配列からなるフォワードプライマーとGCAGAAAAGGGCAGGTGAG（配列番号１０６）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs35392886用：CGCTTTCTTTACAGAAGAACCTCT（配列番号１０７）の配列からなるフォワードプライマーとCTTTCTTGGCTTCCACTATTAGCT（配列番号１０８）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs79902551用：GTGCATTTTGAGGCTTTTTATGT（配列番号１０９）の配列からなるフォワードプライマーとGGCCTGCTGCAAACATTTATT（配列番号１１０）の配列からなるリバースプライマーのセット
rs7252410用：GTCTCAGTCCCTGCAACATTCT（配列番号１１１）の配列からなるフォワードプライマーとTCACTCTGGACTCTACAAAGCCT（配列番号１１２）の配列からなるリバースプライマーのセット
【００５８】
設計した各プライマーセットの調製は専門の業者に依頼した（逆相カラム精製グレード）。
【００５９】
（３）マルチプレックスPCRの条件の最適化
QIAGEN社のMultiplex PCR Kitを用いてマルチプレックスPCRを行った。プライマーの濃度は終濃度が0.1〜0.2μMに調製した。95℃/15分で初期活性化後に、変性94℃/30秒、アニーリング60℃/90秒、エクステンション72℃/60秒を30〜45サイクルで反応し、最終エクステンションは72℃/10分とした。増幅産物をアガロースゲル、若しくはアクリルアミド電気泳動で確認し、増幅産物の有無やプライマーダイマーの有無を確認した。
【００６０】
（４）マルチプレックスPCRと次世代シーケンサーによるSNPの解析
増幅産物をビーズで精製後、2nd PCRを行い、クラスター形成のための配列を付加し、ビーズ精子、サンプルをプーリングし、超並列型の次世代シーケンサーで増幅産物を超深度解析した（深度約5,000〜80,000リード）。得られたシーケンスデータは既存のマッピングツールを用いてリファレンス配列にマッピングした。続いて、既存の解析ツールを用いて各塩基のリード数とリファレンスとは異なる塩基の数をカウントした。総リード数に対するマイナーアレルを読んだリード数の割合(マイナーアレル率)から胎児成分を計算した。
【００６１】
（５）両親のゲノムDNAの解析（各SNPの遺伝子型の決定）
（４）と同じ方法でシーケンス解析用のサンプルを調製した。両親の遺伝子型決定の際には、100〜1,000リード程の深度で解析した。得られたシーケンスデータからの遺伝子型の決定は、（４）と同じ方法で行った。
【００６２】
（５）解析結果に基づく胎児成分の検出及び性別判断
（５−１）トリオ解析をしない場合
各PCR産物について、ターゲットとしたSNPのマイナーアレル率が20％以下の場合に、下記の計算を行う。ターゲットとしたSNP箇所を除いたマイナーアレル率の平均と標準偏差を求め、ターゲットSNP箇所のマイナーアレル率が平均±2×標準偏差より大きくなった場合、胎児成分が検出されたとした。一方でターゲットSNP箇所のマイナーアレル率が20％以上の場合は母親の遺伝子型がヘテロ接合体であるとして、計算から除外した。胎児成分が検出されたSNPについて、ターゲットSNP箇所の胎児アレルの割合の平均値×2を血漿に含まれる胎児成分とした。結果を図５Ａと図５Ｂに示す。図５Ａは増幅産物のマイナーアレル率を示し、図５Ｂは、それらの該当するSNPとSNP以外のマイナーアレル率を比較し、胎児成分を検出したものである。下記（５−２）のトリオ解析に用いた結果（図６）から、両親が異なるアレルタイプのホモ接合体であるSNP（rs3004192、rs6565532、rs4807565、rs10001845）の場合、マイナーアレル率がSNP以外の平均±2×標準偏差(%)よりも高い値を示していることがわかる。一方で、両親が同じアレルタイプのホモ接合体であるSNP（rs3741715、rs11038361、rs3768699、rs1967401）ではこのようにならない。
【００６３】
（５−２）トリオ解析をする場合
父親、母親の両方について、ターゲットとしたSNP位置のマイナーアレル率が20％以下の場合に、当該SNPのデータを胎児成分の解析に用いた。両親のSNPの遺伝子型が同一、もしくは異なるアレルタイプのホモ接合体であるSNPについて、セルフリーDNAのターゲットSNPのマイナーアレル率を求めた。ターゲットSNPにおいて、両親が異なるアレルタイプのホモ接合体のセルフリーDNAのマイナーアレル率が、両親が同じアレルタイプのホモ接合体のセルフリーDNAのマイナーアレル率に対して有意に高かった場合、胎児成分を検出したとして、その平均値×2を血漿に含まれる胎児成分とした。結果を図６Ａ−Ｅに示す。図６Ｅより、セルフリーDNA中に約13％の胎児成分が含まれていることがわかる。
【００６４】
（６）まとめ
妊婦の血漿から抽出したセルフリーDNAにおいて、胎児が男児の場合にのみ、Y染色体に特異的な遺伝子をPCRで増幅させる事ができた。増幅しなかった検体（サンプル）について複数のSNPを標的としてマルチプレックスPCRを行い、増幅産物を次世代シーケンサーで解析した。その結果、全ての検体で母親が持たない父親由来のアレルタイプを持つSPNを最低一つは検出し、セルフリーDNA中には胎児由来DNAが数％の割合で含まれていることを証明できた。これによって、Y染色体由来のPCR産物が確認できない場合に女児であると判定することができる。即ち、本法による検出結果は、胎児の性別判定に利用できる有意義な情報（材料）を提供するものであり、例えば、Y染色体PCRで、胎児由来DNAの割合が少ない時に発生しやすいFalse negative（偽陰性）の判別を可能にする。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば胎児の性別判断に有用な情報が得られる。言い換えれば、本発明はNIPTを補完する有意義な情報を提供するものであり、NIPTにおける判定不能例を減らすこと（不能例をゼロにすることも含む)が可能になる。従って、例えば、本発明はX連鎖劣性遺伝性疾患の出生前診断に利用、応用が図られるものであり、医療分野における多大な貢献を期待できる。
【００６６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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