(57)【要約】【課題】  ヒートブロックやインキュベーターといった理化学機器や加温のための専用装置を用いることなく、４０℃以上の一定温度条件下で生化学的反応を利用した標的物質の検出が可能なキットを提供すること。【解決の手段】  ４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な加温手段と、前記加温手段での加温による生化学的反応により試料中に含まれる標的物質を検出可能な試薬とを含む、検出キットにより前記課題を解決する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な加温手段と、前記加温手段での加温による生化学的反応により試料中に含まれる標的物質を検出可能な試薬とを含む、検出キット。
【請求項２】
標的物質が核酸であり、生化学的反応が核酸増幅反応である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、試料中に含まれる標的物質の検出方法。
（１）標的物質と生化学的反応が可能な試薬と、標的物質を含む試料とを混合する工程
（２）（１）の工程で調製した混合液を、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な加温手段で加温し、標的物質と生化学的反応させる工程
（３）前記生化学的反応で得られた物質を特異的に検出する工程
【請求項４】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、試料中に含まれる標的核酸の検出方法。
（１）標的核酸中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー、および核酸増幅酵素を含む溶液と、標的核酸を含む試料とを混合する工程
（２）（１）の工程で調製した混合液を、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な加温手段で加温し、標的核酸を増幅する工程
（３）増幅した核酸を特異的に検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる標的物質を検出するためのキットに関する。特に本発明は、検出に際し、核酸増幅反応、抗原抗体反応、酵素反応といった一定温度での反応が必要な検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅反応、抗原抗体反応、酵素反応といった生化学的反応を利用した測定キットは、公衆衛生や臨床検査などの分野で日常的に実施される。前述した生化学的反応は、一定の温度条件下で所定時間反応させる必要がある。例えば、核酸増幅反応であるＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法では、４０℃から５０℃で１０分から３０分間、反応液を加温させる必要がある。しかしながら従来、一定温度で所定時間、反応液を加温するには、ヒートブロックやインキュベーターなどの理化学機器や、ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）などの専用装置を必要とした。
【０００３】
一方で前述した機器や装置を用いない、簡易的な加温手段として、空気との接触により鉄粉等が酸化する際に発生する反応熱を利用した使い捨てカイロ（特許文献１）や、過冷却状態の酢酸ナトリウム飽和水溶液からの相転移を利用した潜熱蓄熱材（特許文献２）といった自発的加温手段が知られている。また前述した自発的加温手段を用いた生化学的反応の例として、一定時間、３０℃から４０℃の範囲を維持可能な加温手段（ヒートパック）を用いたトリプシン処理（特許文献３）が知られている。しかしながら、４０℃以上の一定温度を所定時間維持可能な自発的加温手段を用いた生化学的反応については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−０６０８８７号公報
【特許文献２】特開平４−００４２８５号公報
【特許文献３】特表２０１５−５１９９０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、前述した理化学機器や専用装置を用いることなく、４０℃以上の一定温度条件下で生化学的反応を利用した標的物質の検出が可能なキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち本発明の第一の態様は、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な自発的加温手段と、前記加温手段での加温による生化学的反応により試料中に含まれる標的物質を検出可能な試薬とを含む、検出キットである。
【０００８】
また本発明の第二の態様は、標的物質が核酸であり、生化学的反応が核酸増幅反応である、前記第一の態様に記載のキットである。
【０００９】
さらに本発明の第三の態様は、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、試料中に含まれる標的物質の検出方法である。
（１）標的物質と生化学的反応が可能な試薬と、標的物質を含む試料とを混合する工程
（２）（１）の工程で調製した混合液を、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な自発的加温手段で加温し、標的物質と生化学的反応させる工程
（３）前記生化学的反応で得られた物質を特異的に検出する工程
また本発明の第四の態様は、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、試料中に含まれる標的核酸の検出方法である。
（１）標的核酸中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー、および核酸増幅酵素を含む溶液と、標的核酸を含む試料とを混合する工程
（２）（１）の工程で調製した混合液を、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な自発的加温手段で加温し、標的核酸を増幅する工程
（３）増幅した核酸を特異的に検出する工程
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の検出キットは、４０℃以上の一定温度で所定時間加温が必要な生化学的反応を利用して試料中に含まれる標的物質を検出するキットである。前記生化学的反応の具体例として、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（４０℃から５０℃、好ましくは４６℃前後）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（４２℃前後）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（４１℃前後）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法（６０℃前後）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（６５℃前後）といった等温で核酸を増幅する反応があげられる。
【００１１】
本発明の検出キットに備える自発的加温手段は、物理的または化学的に発熱させることで４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な手段である。自発的加温手段の一例として、過冷却状態の酢酸ナトリウムを含む溶液を封入したパウチがあげられ、当該パウチに適切な刺激を与えたり、極微量の酢酸ナトリウム粉末を添加することで、パウチ内に酢酸ナトリウムの結晶が生じ（酢酸ナトリウムが相転移し）、熱が発生する。なお前記例の自発的加温手段は、使用後のパウチを熱湯にさらすなどの熱を加えることで酢酸ナトリウムの結晶を溶解させた後、室温に戻すことで繰り返し利用ができる点で、好ましい自発的加温手段といえる。自発的加温手段の別の例としては、鉄粉などの酸化熱を利用した方法があげられるが、１回しか利用できないのが欠点である。
【００１２】
本発明において一定温度とは、標的物質を検出するための生化学的反応を実施できる温度範囲のことをいう。一例として、生化学的反応がＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法による核酸増幅反応の場合４０℃から５０℃の間（好ましくは、ＴＲＣ法は４６℃前後、ＮＡＳＢＡ法では４１℃前後、ＴＭＡ法では４２℃前後）が、ＩＣＡＮ法による核酸増幅反応では５５℃から６５℃の間（好ましくは６０℃前後）が、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応では６０℃から７０℃の間（好ましくは６５℃前後）が、それぞれ一定温度といえる。また本発明において所定時間とは、生化学的反応により標的物質を検出するのに必要な時間以上の時間のことをいい、少なくとも５分間、好ましくは１０分間、より好ましくは２０分間、さらに好ましくは３０分間、前述した一定温度を維持できればよい。
【００１３】
本発明の検出キットに備える、試料中に含まれる標的物質を検出可能な試薬とは、前述した自発的加温手段で得られる温度条件下で生化学的反応を行なうことで、前記標的物質を特異的に検出可能な試薬のことをいう。標的物質が核酸である場合、前記試薬には、標的核酸中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するプライマー、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するプライマー、および核酸増幅酵素が含まれる。なお本発明において特定塩基配列とは、標的核酸中、前記プライマーセットにより増幅される領域のことをいう。
【００１４】
本発明において試料とは、鼻腔や咽頭等のぬぐい液、うがい液、組織洗浄液、血液、尿、糞便、嘔吐物といった臨床検体、細胞や微生物やウイルス等の培養液、食品、飲料水、環境水といった環境試料があげられる。なお標的物質が核酸の場合、細胞や微生物やウイルス等から任意の方法で核酸抽出して得られた溶液も、本発明における試料といえる。
【００１５】
本発明の検出キットで標的物質を特異的に検出するには、生化学的反応で得られた生成物を何らかの方法で特異的に検出すればよい。標的物質が核酸であり、生化学的反応が核酸増幅反応である場合の一例として、核酸増幅反応により増幅された特定塩基配列を、当該配列と特異的にハイブリダイズ可能なＴａｑＭａｎ（商品名）プローブやインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドなどの蛍光プローブを用いて検出する方法があげられる。この他の例としては、前記増幅した特定塩基配列を電気泳動で分離後エチジウムブロミドやＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（商品名）で染色する方法や、Ｄ−ＱＵＩＣＫ（カネカ製）のように前記増幅した特定塩基配列を色素により検出する方法や、前記特定塩基配列の増幅に伴い副産物として生成するピロリン酸マグネシウムを濁度により検出する方法や、前記特定塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能な、固相に固定化されたオリゴヌクレオチドおよび標識物質を結合したオリゴヌクレオチドを用いて、固相の特定位置に着色物質を集積させることで検出するハイブリダイゼーション法や、前記集積をクロマトグラフィーを用いて行なう、核酸クロマトグラフィー法があげられる。中でも、目視で検出可能な方法は蛍光検出器等の特殊な理化学装置を必要としない点で好ましく、核酸クロマトグラフィー法による目視検出はさらに好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、４０℃以上の一定温度で所定時間維持可能な自発的加温手段と前記加温手段での加温による生化学的反応により試料中に含まれる標的物質を検出可能な試薬とを含む検出キット、および当該キットを用いた標的物質の検出方法である。本発明により、これまでヒートブロックやインキュベーターといった理化学機器や加温のための専用装置を必要とした、４０℃以上の一定温度で所定時間反応が必要な生化学的反応を利用した標的物質の検出においても、安価かつ容易に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で作製した自発的加温手段における、相転移発生前後の温度変化を示した図。
【図２】実施例３の結果を示した図。（＋）は標的核酸を含む試料での結果であり、（−）は標的核酸を含まない試料（注射用水）での結果である。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１９】
実施例１  本発明の検出キットに備える自発的加温手段の作製
加熱した超純水に適量の酢酸ナトリウムを添加し溶解後、当該溶解液を可撓性容器に封入し、室温放置することで、本発明の検出キットに備える自発的加温手段となる、過冷却状態の酢酸ナトリウム水溶液を封入した可撓性容器（パウチ）を調製した。
【００２０】
前記パウチの封を一旦解除し、酢酸ナトリウムの粉末を極少量添加した後、再び封することで、前記パウチ内の溶液全体に酢酸ナトリウムの結晶を発生させ（酢酸ナトリウムの相転移を発生させ）、発熱させた。相転移発生前後のパウチ（加温手段）表面の温度変化を示した図を図１に示す。相転移発生によりパウチ（加温手段）の表面温度は室温付近から４６℃付近まで急激に上昇し、その後約２０分間は４５℃付近を維持していた。
【００２１】
実施例２  本発明の検出キットによる標的核酸検出（蛍光検出）
実施例１で作製した自発的加温手段および核酸増幅試薬を用いて試料中に含まれる標的核酸の検出を試みた。
（１）以下に示す方法により以降の実施例で使用する標的核酸を含む試料を調製した。
（１−１）配列番号１（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（１−２）（１−１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡ配列の５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（１−３）（１−２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
（１−４）（１−３）で得られた標準ＲＮＡ溶液を、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、これを標的核酸を含む試料とした。
（２）以下の組成の反応液１４μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注後、（１）で調製した試料、または注射用水（標的核酸を含まない試料）を５μＬ添加した。
【００２２】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
７０ｍＭ  トレハロース
２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号２）：５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合している
０．２μＭ  第一のプライマー（配列番号３）：５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号４）が付加されている
０．２μＭ  第二のプライマー（配列番号５）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を、発熱させた実施例１で作製した自発的加温手段で４分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。
【００２３】
開始液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを、発熱させた実施例１で作製した自発的加温手段で１５分間保温することで、核酸増幅反応を実施した。
（５）（４）の反応後のＰＣＲチューブをＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した。
【００２４】
Ｎ＝３で測定した結果、標的核酸を含む試料を添加したときの蛍光強度値は標的核酸を含ない試料（注射用水）を添加したときの蛍光強度値に対し、それぞれ２．３５倍、２．４５倍、２．６５倍となった。このことから試料中に標的核酸が含まれているか否かを、本発明の検出キットにより明確に識別できることが示された。
【００２５】
実施例３  本発明の検出キットによる標的核酸検出（目視検出）
実施例２では試料中に含まれる標的核酸の検出を蛍光を用いて行なったが、本実施例では核酸クロマトグラフィーを用いた目視検出で行なった。
（１）以下に示す方法で、標識物質を結合した標的核酸検出用オリゴヌクレオチドを作製した。
（１−１）ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ（メルク製）、直径５００ｎｍ）１．４×１０１０個に対し、３’末端側をアミノ基で修飾した配列番号６に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを１５０ｎｇ添加し、３０分室温で静置した。
（１−２）さらに水溶性カルボジイミドを終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、室温で２時間反応させ、ラテックス粒子を当該オリゴヌクレオチドに結合させた。
（１−３）遠心により得られた沈殿（標識物質を結合したオリゴヌクレオチド）を、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＳＤＳを含む溶液により洗浄し、バッファー（０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中に保存した。
（２）以下に示す方法で、標的核酸捕捉用オリゴヌクレオチドをメンブレンに固定させた。
（２−１）配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド５０μＭを塗布機を用いて、メンブレン（ニトロセルロースメンブレンＨＦ１２０（メルク製）を台紙（メルク製）に結合させたもの）に塗布した。
（２−２）ＵＶを２分間照射後、３７℃で２時間乾燥することで、前記オリゴヌクレオチドをメンブレンに固定させた。
（３）実施例２（４）の反応後の反応液に、（１）で作製した標識物質を結合した標的核酸検出用オリゴヌクレオチド溶液（ラテックス粒子として１０９個）およびＴｗｅｅｎ  ２０（展開液としての終濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））を含む溶液３μＬを添加することで展開液を調製後、（２）で作製した標的核酸捕捉用オリゴヌクレオチドを固定したメンブレンを挿入し、展開させた。核酸クロマトグラフィーの結果を図２に示す。標的核酸を含む試料で核酸増幅反応を行なった反応液を展開させたときは標的核酸捕捉用オリゴヌクレオチドを固定した位置に目視可能なバンドを確認した（図２の（＋））。一方標的核酸を含まない試料（注射用水）では前記バンドは確認できなかった（図２の（−））。
【図１】
2017046633.tif 000003
【図２】
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【配列表】
2017046633000001.app