(57)【要約】【課題】本発明は、共重合ポリヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットの組成比を制御する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、１つ以上の広基質特異性のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株で主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子とすることを含む、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の広基質特異性のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株で主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子とすることを含む、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御する方法。
【請求項２】
共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株が、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と、さらに１つ以上のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が導入された株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共重合ＰＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）であり、共重合ＰＨＡ中の３−ヒドロキシヘキサン酸の分率を増加させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
広基質特異性のＰＨＡ重合酵素及びＰＨＡ顆粒結合タンパク質が、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）株由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
宿主がクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）株由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；及び
置換に使用されるＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；
置換に使用されるＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；及び
Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物油を基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリヒドロキシアルカン酸の１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を微生物により製造し、共重合体中のモノマーユニットの組成比を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会における必須材料である石油合成プラスチックは安価で加工しやすい反面、難分解性のため廃棄された際の処理が問題になっている。微生物がエネルギー源として細胞内に蓄積するポリヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と略記する。）は再生可能バイオマスを原料とし、かつ生分解性を有する環境低負荷型のプラスチック素材として期待されている。ポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸）（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）は多くの微生物が生合成する代表的なＰＨＡであるが、固くて脆いという物性のため実用化が困難である。
【０００３】
一方、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（以下、単に「Ａ．ｃａｖｉａｅ」と略記することがある。）は植物油や脂肪酸を原料として（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸と（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨｘと略記する)からなる共重合ポリエステルであるポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸）共重合体（以下、［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］と略記する。）を生合成する。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）は３ＨＨｘ分率の増加にしたがって柔軟性に富む優れた物性を示すことがわかっている。Ａ．ｃａｖｉａｅが植物油から生合成するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）の３ＨＨｘ分率は１０〜２０ｍｏｌ％であり、実用化に適した柔軟性を示すものの、その菌体内蓄積率は約１５重量％と低く、実生産に適用することは困難であった（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。
【０００４】
微生物ポリエステルの実用化のためには、多様な物性を実現する多様な組成の共重合体を効率よく生産する技術が必要である。これまでにＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を蓄積し、かつ増殖能の高い組換え株の作製や共重合組成の制御技術が探索され、効率的Ｐ（３ＨＢ）生産菌である水素細菌クプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（以下、単に「Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ」と略記することがある。）のＰ（３ＨＢ）生合成能欠失変異株へのＡ．ｃａｖｉａｅ株由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子の導入（特許文献３、非特許文献２）、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株染色体へのＡ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ重合酵素変異酵素遺伝子の導入（特許文献４、非特許文献３）、３ＨＢモノマーの供給酵素であるβ−ケトチオラーゼ遺伝子又はアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の不活性化（特許文献５）、脂肪酸β−酸化経路中の中間体である２−エノイル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（（Ｒ）−３ＨＡ−ＣｏＡ）に変換するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ）の導入（特許文献６、非特許文献３、非特許文献４）、β−酸化経路酵素の遺伝子破壊などによる改変（非特許文献５）が開示されている。しかしながら、共重合ＰＨＡの生合成を目的とした代謝改変では、第二、第三ユニット分率の増加は、第一ユニット分率の低下による相対的なものであり、結果的に生産量の低下を伴うことが多い。１０ｍｏｌ％程度に高い３ＨＨｘ分率の共重合ＰＨＡの生合成と高い生産性との両立にはさらなる技術開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献２】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献３】特許第３０６２４５９号公報
【特許文献４】特開２００８−８６２３８号広報
【特許文献５】特開２００８−２９２１８号広報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１１／１０５３７９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｏｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｃｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．＆  Ｄｏｉ，Ｙ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９：３３３−３３６（１９９８）
【非特許文献３】Ｍｉｆｕｎｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｄｅｇｒａｄ．Ｓｔａｂ．，９５：１３０５−１３１２（２０１０）
【非特許文献４】Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７８：４９３−５０２（２０１２）
【非特許文献５】Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１７：１８４−１９０（２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞内で生合成されたＰＨＡは菌体内で水不溶性の顆粒として存在し、その表面は脂質一重膜で覆われるとともに、ファシン（ｐｈａｓｉｎ）と呼ばれる顆粒結合タンパク質、ＰＨＡ重合酵素、分解酵素であるＰＨＡデポリメラーゼなどが結合している。顆粒結合タンパク質は両親媒性タンパク質であり、疎水性の高いポリエステル顆粒表面に結合することで顆粒を細胞質に維持し易くしているとともに、顆粒の体積に対する表面積の割合を調整する機能が提唱されている。さらに近年では、顆粒結合タンパク質はＰＨＡ重合酵素と相互作用することが見出されている（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：２４２５−２４３５（１９９５）；Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５１：８２５−８３３（２００５）；Ｃｈｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２２７６−２２８８（２０１２）参照）。そこで、本発明者らはこのＰＨＡ重合酵素と顆粒結合タンパク質の相互作用に着目し、ＰＨＡ生産菌であるＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株の顆粒結合タンパク質遺伝子座位の改変を行った。すなわち、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株細胞内での顆粒結合タンパク質を、重合に機能させる外来ＰＨＡ重合酵素と同一微生物種に由来するものとすることによってＰＨＡ重合酵素の重合特性が変化する可能性を考え、鋭意検討の結果、植物油原料から高３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を高い蓄積率で生合成する優れた生産株を提供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］１つ以上の広基質特異性のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株で主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子とすることを含む、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御する方法。
［２］共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株が、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と、さらに１つ以上のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が導入された株である、上記［１］に記載の方法。
［３］共重合ＰＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）であり、共重合ＰＨＡ中の３−ヒドロキシヘキサン酸の分率を増加させる、上記［１］及び［２］に記載の方法。
［４］広基質特異性のＰＨＡ重合酵素及びＰＨＡ顆粒結合タンパク質が、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）株由来である、上記［１］〜［３］に記載の方法。
［５］宿主がクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）株由来である、上記［１］〜［４］に記載の方法。
［６］広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；
置換に使用されるＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記［１］〜［５］に記載の方法。
［７］Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記［１］〜［６］に記載の方法。
［８］広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；
置換に使用されるＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子の１つが、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなり；及び
Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、上記［１］〜［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産菌の顆粒結合タンパク質遺伝子座の改変を行うことにより、優れた共重合ポリヒドロキシアルカン酸生産株及び高３ＨＨｘ分率の共重合ポリヒドロキシアルカン酸の効率的な製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株で主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子で置換することを含む、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御する方法に関する。
【００１１】
（１）宿主（微生物）
本発明において使用される宿主は、該宿主に導入されるＰＨＡ重合酵素の遺伝子（ｐｈａC）の生物種と異なればよく、特に限定されないが、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株、Ａ．ｃａｖｉａｅ株、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株が挙げられる。例えば、導入されるｐｈａCがＡ．ｃａｖｉａｅ株由来である場合、宿主としては、それ以外の微生物種（例えば、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株）であればよい。なお、本発明によれば、後述する広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子が、該遺伝子の生物種と異なる宿主にあらかじめ導入された組換え株を用いることができる。さらに、本発明の一実施形態では、上記組換え株に、後述するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子がさらに導入されていてもよい。共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御するという本発明の目的では、上記広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする外来遺伝子と、後述するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子の生物種は同じとするが、組換え株の生物種とは異なることが好ましい。
【００１２】
（２）広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする外来遺伝子（外来ｐｈａC）
本発明によれば、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御することを目的として、宿主に１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする外来遺伝子（以下、外来ｐｈａCと略記することがある）を導入することができる。ここで、本発明の共重合組成制御に使用される「広基質特異性のＰＨＡ重合酵素」とは、ＰＨＡを合成する重合活性が１種類の（Ｒ）−３ＨＡ−ＣｏＡだけに限定されない酵素をいう。ＰＨＡをあらかじめ合成できる微生物であっても、ＰＨＡ重合酵素の基質特異性により共重合ＰＨＡの生合成ができない、あるいはその共重合組成が制限されている微生物に、より広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を導入し、炭素源や培養条件を適したものとすることによって、多様な３−ヒドロキシアルカン酸ユニットが共重合されたＰＨＡを合成させることができる。一例として、炭素数４〜６の（Ｒ）−３ＨＡ−ＣｏＡに対して活性を示すＰＨＡ重合酵素の外来遺伝子を導入した組換え株は、このＰＨＡ重合酵素の基質特異性に応じて、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成することが報告されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献２、非特許文献３）。このような広基質特異性のＰＨＡ重合酵素を発現する菌株には、例えば、Ａ．ｃａｖｉａｅ  ＦＡ４４０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６）（特許第３０６２４５９号）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）ＷＱ株及び４ＡＫ５株（Ｌｕ，Ｘ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２４３：１４９−５５（２００５））などが知られている。
【００１３】
本発明で使用する外来ｐｈａＣには、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。なお、上記の通り、本発明によれば、宿主に導入される外来ｐｈａＣの数は、１つ以上であってもよい。具体的には、導入される遺伝子の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つであり、好ましくは１つ又は２つである。
【００１４】
本発明の一実施形態において、共重合組成制御に使用される広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子は、ｐｈａＣNSDGであることが好ましい。本明細書で使用するとき、「ｐｈａＣNSDG」とは、Ａ．ｃａｖｉａｅ株由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体（ＮＳＤＧ変異体）をコードする遺伝子である。なお、ｐｈａＣNSDG遺伝子のクローニングについては、通常の分子生物学的手法により行うことができる。例えば、Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２７７：２１７−２２２（２００７）；Ｋｉｃｈｉｓｅ，Ｔ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）；特開２００８−２９２１８；国際公開ＷＯ２０１１／１０５３６９を参照されたい。
【００１５】
本発明の一実施形態において、ｐｈａＣNSDG遺伝子は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。さらに、本発明の別の実施形態において、ｐｈａＣNSDG遺伝子は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸；又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。
【００１６】
ｐｈａＣNSDG遺伝子は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号１の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチドを設計し、Ａ．ｃａｖｉａｅ株の染色体ＤＮＡや、染色体ＤＮＡを含むプラスミドなどを鋳型として増幅した後に、通常の手法を用いて１４９番のアスパラギンをセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸をグリシンに置換することに相当した部位特異的変異を導入することによって調製できる。核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。なお、遺伝子に変異を導入する方法は、一般的に知られ、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｔ  ８．１−８．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）が挙げられる。本発明においては、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することができる。
【００１７】
本明細書において使用するとき、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識する。
【００１８】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号１に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
【００１９】
本発明のより好ましい態様では、広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子は、１つ又は２つのｐｈａＣNSDG遺伝子であって、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸であってもよい。なお、当業者に理解されるように、宿主の染色体上に導入された遺伝子が適切に転写され、さらには所望の活性を有するタンパク質に翻訳されるために、これらの遺伝子は染色体上で適切なプロモーターの制御下にあるように組み込まれる必要がある。
【００２０】
（３）ＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子（ｐｈａＰ）
本発明によれば、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質を、該ＰＨＡ重合酵素と同じ生物種に由来するものとすることによって、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御することができる。ここで、本発明に使用される「ＰＨＡ顆粒結合タンパク質」とは、細胞内に蓄積したＰＨＡ顆粒の表面に結合する活性を有するタンパク質を意味し、これまでに、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株におけるＰｈａＰ１（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，２４２５−２４３５（１９９５））、ＰｈａＰ２、ＰｈａＰ３、ＰｈａＰ４（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５１，８２５−８３３（２００５））、Ａ．ｃａｖｉａｅ  ＦＡ４４０株におけるＰｈａＰ（Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２，１４８−１５３（２００１））、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｏｒｉｆｉｃａｎｓ株のＰｈａＰ（Ｍａｅｈａｒａ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，２９１４−２９２１（１９９９））などが知られている。また、「主要な」ＰＨＡ顆粒結合タンパク質とは、その細胞内に複数のＰＨＡ顆粒結合タンパク質が存在する場合、最も多量に存在することを意味しており、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株においてはＰｈａＰ１が相当する（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，２４２５−２４３５（１９９５））。本発明における共重合組成制御の方法は、宿主に導入された広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする外来ｐｈａＣと、該組換え株で機能する主要なＰＨＡ顆粒結合タンパク質の遺伝子は、同じ生物種であることを特徴としており、すなわち、宿主となる共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株に存在しているｐｈａＰと、組成制御のために導入される外来ｐｈａＰの生物種とは互いに異なる。さらに、当業者に容易に理解されるように、例えば、広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする外来ｐｈａＣの由来がＡ．ｃａｖｉａｅ株である場合、宿主に導入される外来ｐｈａＰの由来はＡ．ｃａｖｉａｅ株である態様が本発明に含まれる。なお、宿主に導入される外来ｐｈａＣ及び外来ｐｈａＰは、同じ生物種であれば特に限定されない。
【００２１】
なお、本発明に使用されるｐｈａＰには、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、ＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の一実施形態において、共重合組成制御に使用されるＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子（ｐｈａＰ）は、Ａ．ｃａｖｉａｅ株由来又はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株由来であることが好ましい。本明細書で使用するとき、「ｐｈａＰAc」とは、Ａ．ｃａｖｉａｅ株に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐｈａＰAcとして、ＧｅｎＢａｎｋ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８８８２５中のヌクレオチド２１９７−２５４７（“ＯＲＦ１”）を利用することができる。本明細書では、該遺伝子の塩基配列を配列番号２として配列表に記載する。なお、ｐｈａＰAc遺伝子の単離及び同定は、通常の分子生物学的手法により行うことができる。また、本明細書で使用するとき、「ｐｈａＰ１Cn」とは、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株に由来する主要ＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐｈａＰ１Cnとして、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株のゲノム（ＮＣ ０１５７２６．１）中の１４１９０２５−１４１９６０３を利用することができる。本明細書では、該遺伝子の塩基配列を配列番号４として配列表に記載する。なお、ｐｈａＰAc遺伝子及びｐｈａＰ１Cn遺伝子の単離及び同定は、通常の分子生物学的手法により行うことができる。
【００２３】
本発明の一実施形態において、宿主に導入される外来ｐｈａＰは、（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。さらに、本発明の一実施形態において、外来ｐｈａＰは、（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸；又は（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＨＡ顆粒に結合する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。また、宿主の染色体上に存在する、置換されるｐｈａＰは、（ａ）配列番号４で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなる核酸であるものであってもよい。
【００２４】
なお、「ストリンジェントな条件」については、上述した通りであり、核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号２に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
【００２５】
本発明のより好ましい態様では、宿主に導入される外来ｐｈａＰは、ｐｈａＰAcであって、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸であってもよい。なお、当業者に理解されるように、宿主の染色体上に導入された遺伝子が適切に転写され、さらには所望の活性を有するタンパク質に翻訳されるために、これらの遺伝子は染色体上で適切なプロモーターの制御下にあるように組み込まれる必要がある。
【００２６】
（４）Ｒ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）
本発明による共重合組成制御方法においては、宿主として、広基質特異性ＰＨＡ重合酵素をコードする外来遺伝子の他に、共重合ＰＨＡの生合成を効率的に行うために、１つ以上のＲ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）をあらかじめ導入してある組換え株を用いてもよい。ここで、本発明に使用される「Ｒ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ」とは、脂肪酸β−酸化系中間体であるエノイル−ＣｏＡをＰＨＡモノマーである（Ｒ）−３ＨＡ−ＣｏＡに変換する酵素を意味し、この活性を有する限りにおいては、生物種の由来は特に限定されない。
【００２７】
なお、本発明に使用されるｐｈａＪは、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、Ｒ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
本発明の一実施形態において、本発明に使用されるｐｈａＪとして、Ａ．ｃａｖｉａｅ株由来のＲ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪAc）の塩基配列：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８８８２５中のヌクレオチド４４７５−４８７９（“ＯＲＦ３”）を利用することができる。なお、上記の通り、本発明によれば、Ｒ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の数は、１つ以上であってもよい。具体的には、導入される遺伝子の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つであり、好ましくは１つ又は２つである。
【００２９】
本発明の一実施形態において、宿主に導入されるｐｈａＪは、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪAcであることが好ましい。ｐｈａＪAcの単離及び同定は、通常の分子生物学的手法により行うことができ、例えば、特許文献３（前述）を参照してもよい。さらに、本発明の特定の実施形態において、ｐｈａＪは、（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体であるエノイル−ＣｏＡを（Ｒ）−３ＨＡ−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。さらに、本発明の一実施形態において、ｐｈａＪは、（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸；又は（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。
【００３０】
なお、「ストリンジェントな条件」については、上述した通りであり、核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号３に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
【００３１】
本発明のより好ましい態様では、宿主に導入されるＲ体特異エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子は、ｐｈａＪAcであって、配列番号３で表される塩基配列からなる核酸であってもよい。なお、当業者に理解されるように、宿主に導入された遺伝子が適切に転写され、さらには所望の活性を有するタンパク質に翻訳されるために、これらの遺伝子は適切なプロモーターの制御下にあるように組み込まれる必要がある。
【００３２】
（５）外来ｐｈａＣ、外来ｐｈａＣと由来を同じくする外来ｐｈａＰ、及びｐｈａＪの導入方法及び位置関係
本発明によれば、微生物細胞内で合成される共重合ＰＨＡの組成比を制御することができれば、外来ｐｈａＣ、外来ｐｈａＣと由来を同じくする外来ｐｈａＰ、及びｐｈａＪの宿主への導入方法は特に限定されず、宿主において自律複製可能なプラスミドベクターを用いた導入であってもよく、また、相同性組換えによる染色体への導入であってもよい。なお、外来ｐｈａＣと由来を同じくするｐｈａＰから発現したタンパク質を、該組換え株における主要な顆粒結合タンパク質とすることを達成する方法として、宿主に内在するｐｈａＰの全体又は一部を置換する相同性組換えによって外来ｐｈａＰを導入すること、あるいは内在ｐｈａＰの機能を変異・破壊・欠失によって喪失させた株に自律複製可能なプラスミドベクターによって外来ｐｈａＰを導入することのいずれあってもよい。また、組み込まれた遺伝子が適切に転写され、さらには所望の活性を有するタンパク質に翻訳されるために、これらの遺伝子は適切なプロモーターの制御下にあるように組み込まれる必要がある。また、所望の効果が達成される限りにおいて、導入される各遺伝子の数は限定されない。さらに、導入された各遺伝子の位置関係は特に限定されず、染色体上や自律複製ベクターにおいて互いに隣接するように配置されても離れていてもよく、さらに一部を相同性組換えにより染色体へ導入し、残りを自律複製ベクターで導入することや、複数の異なる和合性自律複製ベクターでそれぞれ導入することであってもよい。
【００３３】
本発明の別の態様において、本発明の目的が達成される限り、特に限定されないが、ｐｐｈａＣNSDGが染色体上に予め組み込まれた株を用いてもよい。このような微生物として、ＮＳＤＧ株が例示される（特許文献６参照）。ここで、「ＮＳＤＧ株」とは、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、野生株の一種であるＨ１６株（ＡＴＣＣ１６６９９株、ＤＳＭ４２８株）
の染色体上ｐｈａオペロン中の本来のｐｈａＣを、Ａ．ｃａｖｉａｅ由来ＰＨＡ重合酵素変異酵素の遺伝子であるｐｈａＣNSDGに相同性組換えにより置換した組換え株である。
【００３４】
本発明の別の態様において、本発明の目的が達成される限り、特に限定されないが、ｐｐｈａＣNSDGとｐｈａＪが染色体上に予め組み込まれた株を用いてもよい。このような微生物として、ＭＦ０２株が例示される（特許文献６参照）。ここで、ＭＦ０２株は、ＮＳＤＧ株の染色体上ｐｈａオペロン中のｐｈａＣNSDGとｐｈａＡ（β−ケトチオラーゼ遺伝子）の間にｐｈａＪAcが組み込まれた組換え株である。
【００３５】
（６）遺伝子置換ベクターの構築及び組換え微生物の作製
本発明によれば、ｐｈａＣNSDG、ｐｈａＰ、及びｐｈａＪを宿主の染色体に導入するための、これらの遺伝子の各々若しくはいずれかの組み合わせを相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクター、又は該遺伝子の各々若しくはいずれかの組み合わせを自律複製ベクターに組み込んだ発現ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、トーヨーボー社製等）を用いることもできる。
【００３６】
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体の制御方法に用いられるベクターとしては、微生物内で、微生物の染色体に既に組み込まれている微生物由来のポリエステル重合酵素遺伝子を外来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子によって置換することを目的として、限定されないが、相同性組換え用ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＪＱ２００（Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．及びＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｐ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｌｌｏｗ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｅｎｅ（１９９３）１２７：１５−２１を使用することが好ましい。あるいは、グラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＪＲＤ２１５（Ｍ１６１９８）（Ｄａｖｉｓｉｏｎ，Ｊ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ，５１，２７５−８０を参照）、ｐＪＢ８６１（Ｕ８２０００）、ｐＨＲＰ３１１（Ｐａｒａｌｅｓ，Ｒ．Ｅ．及びＨａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１３３，２３−３０を参照）が例示されるが、これらに限定されない。また、大腸菌用のプラスミドとして、例えば、ｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８１８３７）、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等を使用することができる。
【００３７】
また、当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同性組換えが起るように機能する領域（必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）等）が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。
【００３８】
一般的に、形質転換体は、組換えベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（アルカリゲネス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。
【００３９】
この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。
【００４０】
（７）共重合ＰＨＡの合成
本発明によれば、共重合ＰＨＡの合成は、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株の染色体上に存在するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子で置換することによって、該組換え株内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ＰＨＡを生成及び蓄積させ、組換え株又は培養物から目的とする共重合ＰＨＡを採取することにより行われる。なお、当業者にも理解されるように、共重合ＰＨＡを合成させるために、上記組換え株を適切な培養条件下に置くことが好ましい。このような組換え株の培養、遺伝子組換えを行う前の親株の培養条件に従ってもよい。また、本発明の特定の一実施形態において、炭素源として植物油又は脂肪酸を含有する培地中で組換え株を増殖させてもよい。
【００４１】
一例として、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株を宿主とした場合の培地として、該微生物株が資化し得る植物油又は炭素数６以上の中長鎖脂肪酸を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ＰＨＡを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ＰＨＡを調製することができる。また、植物油を炭素源として用いる場合、使用可能な植物油としては、一般的に市販されている植物油を使用することができ、その供給源は特に限定されない。好ましくは、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂である。なお、培地中の植物油の濃度は、０．１〜５％が好ましいが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４２】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００４３】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、必要であれば、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００４４】
（８）共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比の制御
本発明によれば、１つ以上の広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を該遺伝子の生物種と異なる宿主に導入することで共重合ＰＨＡ生産能を付与した組換え株において、該組換え株に存在するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子を、上記ＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子と同じ生物種に由来するＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子で置換することよって、共重合ＰＨＡ中のモノマーユニットの組成比を制御することができる。ここで、本明細書で使用するとき、「制御」とは、本発明によって生産される共重合ＰＨＡを構成するモノマーユニットの組成比を所望の値又は範囲に変化させることを意味する。より具体的には、このような組成比の制御は、宿主に導入される遺伝子（すなわち、外来ｐｈａＣ、外来ｐｈａＣと由来を同じくするｐｈａＰ、及びｐｈａＪ）の選択、生物種を適宜変更することによって行うことができる。また、一態様として、染色体上に導入されたこれらの遺伝子の発現を、調節因子（例えば、転写因子、プロモーター、エンハンサー）の活性を変化させることによって行うことができる。さらに、宿主に導入される遺伝子に変異を加え、遺伝子の機能を改変させてもよい。これらの改変は、宿主のゲノム情報、及び導入される遺伝子の塩基配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。また、組換え株の培養条件を適宜変更してもよい。
【００４５】
本発明の一態様において、共重合ＰＨＡがポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（以下、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）とする場合がある。）である場合、共重合ＰＨＡ中の３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の分率を制御することができ、好ましくは、３ＨＨｘの分率を増加させることができる。例えば、後述する実施例２において詳述されるように、宿主をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株とし、ｐｈａＣNSDG及びｐｈａＪAcを導入したＮＳＤＧ−ＰＡCnＪ株では、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）中の３ＨＨｘ分率は、６．５ｍｏｌ％であったのに対して、該株の染色体上に存在するｐｈａＰ１Cn遺伝子を、ｐｈａＣNSDG遺伝子と同じＡ．ｃａｖｉａｅ株由来のｐｈａＰ１Ac遺伝子で置換することによって、３ＨＨｘ分率を９．３ｍｏｌ％に増加させることができた。
【００４６】
（９）共重合ＰＨＡの精製と構造解析
本発明において、共重合ＰＨＡは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ＰＨＡを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ＰＨＡを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ＰＨＡを得ることができる。その後、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いて、得られた共重合ＰＨＡのモノマーユニットの組成比を確認することができる。
【００４７】
本発明の一態様において、共重合ＰＨＡがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）である場合、３ＨＨｘ分率は、少なくとも１％モル以上であればよく、例えば、１モル％、２モル％、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、８モル％、９モル％、１０モル％、又はそれ以上であってもよい。また、該３ＨＨｘ分率は、９９モル％以下であればよく、例えば、９９モル％、９８モル％、９７モル％、９６モル％、９５モル％、９４モル％、９３モル％、９２モル％、９１モル％、９０モル％、又はそれ以下であってもよい。３ＨＨｘ分率の取り得る範囲としては、限定されないが、例えば、１〜９９モル％、１〜９５モル％、１〜９０モル％、１〜８５モル％、１〜８０モル％、１〜７５モル％、１〜７０モル％、１〜６５モル％、１〜６０モル％、１〜５５モル％、１〜５０モル％、１〜４５モル％、１〜４０モル％、１〜３５モル％、１〜３０モル％、１〜２５モル％、１〜２０モル％、２〜９９モル％、２〜９５モル％、２〜９０モル％、２〜８５モル％、２〜８０モル％、２〜７５モル％、２〜７０モル％、２〜６５モル％、２〜６０モル％、２〜５５モル％、２〜５０モル％、２〜４５モル％、２〜４０モル％、２〜３５モル％、２〜３０モル％、２〜２５モル％、２〜２０モル％、３〜９９モル％、３〜９５モル％、３〜９０モル％、３〜８５モル％、３〜８０モル％、３〜７５モル％、３〜７０モル％、３〜６５モル％、３〜６０モル％、３〜５５モル％、３〜５０モル％、３〜４５モル％、３〜４０モル％、３〜３５モル％、３〜３０モル％、３〜２５モル％、３〜２０モル％、４〜９９モル％、４〜９５モル％、４〜９０モル％、４〜８５モル％、４〜８０モル％、４〜７５モル％、４〜７０モル％、４〜６５モル％、４〜６０モル％、４〜５５モル％、４〜５０モル％、４〜４５モル％、４〜４０モル％、４〜３５モル％、４〜３０モル％、４〜２５モル％、４〜２０モル％、５〜９９モル％、５〜９５モル％、５〜９０モル％、５〜８５モル％、５〜８０モル％、５〜７５モル％、５〜７０モル％、５〜６５モル％、５〜６０モル％、５〜５５モル％、５〜５０モル％、５〜４５モル％、５〜４０モル％、５〜３５モル％、５〜３０モル％、５〜２５モル％、５〜２０モル％が挙げられる。３ＨＨｘ分率は、好ましくは３〜９０モル％、より好ましくは４〜８０モル％、さらに好ましくは５〜７０モル％である。ここで、用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。また、本発明の制御方法によって得られる共重合ＰＨＡは、乾燥菌体重量あたり５０〜９５重量％、好ましくは７０〜９５重量％の割合で菌体に蓄積される。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：相同性組換え用ベクターの作製
本発明で使用した一連の組換えベクターの作製を以下の通りに行った。なお、以下の操作においては、特に断らない限り、ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼとしてはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を、５’−リン酸化反応にはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（トーヨーボー社製）を、５’−脱リン酸化反応にはウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（トーヨーボー社製）を、ＤＮＡ断片の連結にはＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）をそれぞれ用いた。
【００５０】
（１）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄの作製
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡ断片を鋳型として下記の配列１と配列２、及び配列３と配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によって、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ株由来のＰＨＡ顆粒結合タンパク質をコードする遺伝子ｐｈａＰ１Cnの上流領域（０．８４ｋｂ）と下流領域（０．８１ｋｂ）をそれぞれ増幅した。ＰＣＲは９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、６８℃で７０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＧ（配列番号５）
配列２：ＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣ（配列番号６）
配列３：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＣＴＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＡＣ（配列番号７）
配列４：ＴＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＣ（配列番号８）
【００５１】
次に、増幅したｐｈａＰ１Cnの下流断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、上流断片と連結した。この連結した断片を鋳型として前述の配列１及び配列３のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰ１Cnの上下流が連結された断片（１．６ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲは９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、６８℃で２分の反応を１サイクルとして、これを３０サイクル行った。増幅したｐｈａＰ１Cnの上下流連結断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、ベクタープラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをＨｉｎｃＩＩで切断し、脱リン酸化処理を施した断片と連結したｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄを作製した。
【００５２】
（２）ｐＥＥ３２−ＮＳＤＧの作製
Ａ．ｃａｖｉａｅ株由来のＰＨＡ重合酵素に二重アミノ酸変異を導入した変異型酵素遺伝子ｐｈａＣNSDGがクローニングされたｐＢＢＲＥＥ３２−ＮＳＤＧ（Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ（２００７））を鋳型とし、下記の配列５及び配列６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＣNSDG（１．８ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲは９８℃で２０秒、６１℃で２０秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列５：ＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧＧＣＣＣ（配列番号９）
配列６：ＴＣＡＴＧＣＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴ（配列番号１０）
【００５３】
次に、ｐｈａＰAc−ｐｈａＣAc−ｐｈａＪAcを含むＥＥ３２断片（特許文献３）をクローニングしたプラスミドｐＥＥ３２を鋳型として、下記の配列７及び配列８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＣAcを除く遺伝子領域（４．１ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６１℃で２０秒、６８℃で２分３０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列７：ＧＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号１１）
配列８：ＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＡＧＡ（配列番号１２）
【００５４】
続いて、増幅したｐｈａＣNSDG断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、ｐＥＥ３２からｐｈａＣAcを除いて開環したベクター断片と連結した。上下流の遺伝子と同じ向きにｐｈａＣNSDGが連結されたプラスミドを選抜し、ｐＥＥ３２−ＮＳＤＧとした。
【００５５】
（３）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcの作製
ｐＥＥ３２を鋳型として下記の配列９及び配列１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ用法によってｐｈａＰAc断片（０．３５ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲ用は９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、６８℃で５０秒の反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行った。
配列９：ＡＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号１３）
配列１０：ＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧ（配列番号１４）
【００５６】
次に、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄを鋳型として前述の配列２及び配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によって全領域（７．３ｋｂ）を増幅し、ｐｈａＰ１Cn上流領域とｐｈａＰ１Cn下流領域の連結部で開環したベクター断片を得た。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６３℃で２０秒、６８℃で４分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
【００５７】
続いて、増幅したｐｈａＰAc断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄからＰＣＲ増幅で開環したベクター断片と連結した。ｐｈａＰAcがプロモーター領域と同じ方向に連結されたプラスミドを選抜し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcとした。
【００５８】
（４）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪの作製
ｐＥＥ３２−ＮＳＤＧを鋳型として前述の配列６及び下記の配列１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰAc−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAc断片（２．６ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲは９８℃で２０秒、６１℃で２０秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１１：ＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＣ（配列番号１５）
【００５９】
次に、増幅したｐｈａＰAc−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAc断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、前述のｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄからＰＣＲ増幅で開環したベクター断片と連結した。ｐｈａＰAc−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAcがプロモーター領域と同じ方向に連結されたプラスミドを選抜し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪとした。
【００６０】
（５）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＪの作製
ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪを鋳型として前述の配列７及び配列１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＣNSDGを除いて開環したベクター断片（８．２ｋｂ）を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６８℃で４分３０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１２：ＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧ（配列番号１６）
次に、ｐｈａＣNSDGを除いて開環したベクター断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、両端を自己連結してｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＪを作製した。
【００６１】
（６）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＣＪの作製
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型として下記配列１３及び配列１４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰ１Cn断片（０．６  ｋｂ）（配列番号４）を増幅した。ＰＣＲは９８℃で２０秒、５４℃で２０秒、６８℃で５０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１３：ＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡＡ（配列番号１７）
配列１４：ＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号１８）
【００６２】
次に、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪを鋳型として前述の配列１及び配列３のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰ１Cn上流−ｐｈａＰAc−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAc−ｐｈａＰ１Cn下流断片（３．３ｋｂ）を増幅した。増幅した断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢのＨｉｎｃＩＩサイトに連結し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪとは逆向きに断片が連結されたプラスミドを選抜し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪ−Ｒとした。
【００６３】
続いて、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪ−Ｒを鋳型として前述の配列２及び下記の配列１５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰAcを除いて開環したベクター断片（９．７ｋｂｐ）を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、６８℃で５分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１５：ＴＡＡＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴ（配列番号１９）
【００６４】
その後、増幅したｐｈａＰ１Cn断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、Ｋ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪ−ＲからｐｈａＰAcを除いて開環したベクター断片と連結した。ｐｈａＰ１Cnがプロモーター領域や下流の遺伝子と同じ向きに連結されたプラスミドを選抜し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＣＪとした。
【００６５】
（７）ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＪの作製
ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＪを鋳型として前述の配列２及び配列１５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＰAcを除いて開環したベクター断片（７．９ｋｂｐ）を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、６８℃で５分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
【００６６】
次に、前述のｐｈａＰ１Cn増幅断片をキナーゼ処理により５’−リン酸化し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＪからｐｈａＰAcを除いて開環したベクター断片と連結した。ｐｈａＰ１Cnがプロモーター領域や下流の遺伝子と同じ向きに連結されたプラスミドを選抜し、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＪとした。
【００６７】
実施例２：ＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株及びＮＳＤＧ−ＰAcＪ株の作製とＰＨＡ生合成
Ａ．ｃａｖｉａｅ株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪAc）をＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株由来のＮＳＤＧ株のｐｈａＰ１Cnの下流に挿入したＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株、さらにこのｐｈａＰ１CnがｐｈａＣNSDGと同種のＡ．ｃａｖｉａｅ株に由来するｐｈａＰAcに置換されたＮＳＤＧ−ＰAcＪ株を作製し、その合成能について検討した。具体的には以下の通りである。
【００６８】
実施例１（７）で得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＪを用いて、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＮＳＤＧ株を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、ｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＪを大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％トリプトン、１％塩化ナトリウム、０．５％イーストエキス、ｐＨ７．２）３．０ｍｌ中で３７℃終夜培養した。これと並行して、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＮＳＤＧ株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％イーストエキス）３．０ｍｌ中で３０℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液０．２ｍｌに対して、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  ＮＳＤＧ株の培養液０．１ｍｌを混合し、３０℃で６時間培養した。この菌体混合液を０．２ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で３日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドが、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＪが染色体に取り込まれたＣ．ｎｅｃａｔｏｒ形質転換体（ポップイン株）である。さらに、ポップイン株をＮＲ培地で３０℃終夜培養した後、１０％スクロースを添加したＮＲ培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ由来ベクター上のｓａｃＢにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、１０％スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株（ポップアウト株）のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上のｐｈａＰ１Cn下流にｐｈａＪAcが挿入されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株とした。
【００６９】
実施例１（５）で得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＪを用いて、ＮＳＤＧ株を同様に接合伝達により形質転換した。得られたポップアウト株のコロニーの中から染色体上のｐｈａＰ１CnがｐｈａＰAcに置換され、さらにその下流にｐｈａＪAcが挿入されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをＮＳＤＧ−ＰAcＪ株とした。
【００７０】
ＮＲ培地（前述）で前培養した組換え株を１００ｍｌのＭＢ培地（０．９％リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、１％微量金属溶液）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２時間振とう培養した。炭素源として１％大豆油を用いた。なお、培地には０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシンが添加されている。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、付着した油分を除くために７０％エタノールで洗浄したのち、蒸留水で洗浄した。得られた菌体は凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００７１】
乾燥菌体１０〜３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく攪拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層０．５ｍｌをキャピラリーガラスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。下記に、作製した組換えＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株の染色体上の関連遺伝子の構成、及びＰＨＡ生産に関する結果を表１に示す。
【００７２】
【化１】
2017077184.tif 000002
【００７３】
【表１】
2017077184.tif 000003
【００７４】
ｐｈａＣNSDGを染色体上のｐｈａオペロン中に導入し、さらに染色体上のｐｈａＰ１Cn下流にｐｈａＪAcを挿入したＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株は、大豆油炭素源から３ＨＨｘ分率が６．５ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成した。ＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株ではＰＨＡ重合酵素がＡ．ｃａｖｉａｅ株由来であり、主要顆粒結合タンパク質がＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株由来と、互いに異なっている。一方で、染色体上のｐｈａＰ１Cnを、ｐｈａＣNSDGと同じＡ．ｃａｖｉａｅ株由来のｐｈａＰAcとしたＮＳＤＧ−ＰAcＪ株では、ＰＨＡ生産量がやや増加しつつ、３ＨＨｘ分率が６．５ｍｏｌ％から９．３ｍｏｌ％に増加した。
【００７５】
実施例３：ＮＳＤＧ−Ｐ１CnＣＪ株及びＮＳＤＧ−ＰAcＣＪ株の作製とＰＨＡ生合成
ＮＳＤＧ−Ｐ１CnＪ株のｐｈａＰ１CnとｐｈａＪAcの間、及びＮＳＤＧ−ＰAcＪ株のｐｈａＰAcとｐｈａＪAcの間にさらに１コピーのｐｈａＣNSDGが挿入されたＮＳＤＧ−Ｐ１CnＣＪ株、及びＮＳＤＧ−ＰAcＣＪ株を作製し、そのＰＨＡ生合成能について検討した。具体的には以下の通りである。
【００７６】
実施例１（６）で得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ1CnＣＪを用いて、ＮＳＤＧ株を同様に接合伝達により形質転換した。得られたポップアウト株のコロニーの中から染色体上のｐｈａＰ１Cnの下流にｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAcが挿入されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをＮＳＤＧ−Ｐ１ｕｄ−Ｐ１CnＣＪ株とした。同様に、実施例１（４）で得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcＣＪを用いて、ＮＳＤＧ株を同様に接合伝達により形質転換した。得られたポップアウト株のコロニーの中から染色体上のｐｈａＰ１CnがｐｈａＰAcに置換され、さらにその下流にｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAcが挿入されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをＮＳＤＧ−ＰAcＣＪ株とした。
【００７７】
実施例２と同様に、上記組換え株のＰＨＡ生産について検討した。下記に、作製した組換え株の染色体上の関連遺伝子の構成、及びＰＨＡ生産に関する結果を表２に示す。
【００７８】
【化２】
2017077184.tif 000004
【００７９】
【表２】
2017077184.tif 000005
【００８０】
ｐｈａＣNSDGを染色体上のｐｈａオペロン中に導入し、染色体上のｐｈａＰ１Cn下流にさらに１コピーのｐｈａＣNSDGとｐｈａＪAcを挿入したＮＳＤＧ−Ｐ１CnＣＪ株は、大豆油炭素源から３ＨＨｘ分率が１０．５ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成した。ＮＳＤＧ−Ｐ１CnＣＪ株ではＰＨＡ重合酵素がＡ．ｃａｖｉａｅ株由来であり、主要顆粒結合タンパク質がＣ．ｎｅｃａｔｏｒ株由来と、互いに異なっている。一方で、染色体上のｐｈａＰ１Cnを、ｐｈａＣNSDGと同じＡ．ｃａｖｉａｅ株由来のｐｈａＰAcとしたＮＳＤＧ−ＰAcＣＪ株ではＰＨＡ生産量がやや増加しつつ、３ＨＨｘ分率が１０．５ｍｏｌ％から１７．２ｍｏｌ％に増加した。
【００８１】
実施例４：ＭＦ０２−ＰAc株の作製とＰＨＡ生合成
以前に作製されたＭＦ０２株は、染色体ｐｈａオペロン中にｐｈａＣNSDG−ｐｈａＪAcを導入した株であり、大豆油から４．６ｍｏｌ％  ３ＨＨｘの共重合体を生合成する（特許文献６）。この株を親株として主要顆粒結合タンパク質遺伝子ｐｈａＰ１CnをｐｈａＰAcに置換したＭＦ０２−ＰAc株を作製し、そのＰＨＡ生合成能について検討した。具体的には以下の通りである。
【００８２】
実施例１（３）で得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓ−Ｐ１ｕｄ−ＰAcを用いて、ＭＦ０２株を同様に接合伝達により形質転換した。得られたポップアウト株のコロニーの中から染色体上のｐｈａＰ１CnがｐｈａＰAcに置換されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをＭＦ０２−ＰAc株とした。
【００８３】
【化３】
2017077184.tif 000006
【００８４】
【表３】
2017077184.tif 000007
【００８５】
その結果、ＰＨＡ重合酵素と主要顆粒結合タンパク質が異なる由来であるＭＦ０２株は大豆油炭素源から３ＨＨｘ分率が４．６ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成した。ＭＦ０２株染色体上のｐｈａＰ１Cnを、ｐｈａＣNSDGと同じ由来のｐｈａＰAcに置換することで、ＰＨＡ重合酵素と主要顆粒結合タンパク質の由来を同じＡ．ｃａｖｉａｅ由来としたＭＦ０２−ＰAc株ではＰＨＡ生産量がやや増加しつつ、３ＨＨｘ分率が４．６ｍｏｌ％から６．４ｍｏｌ％に増加した。
【００８６】
ＰＨＡ重合酵素と主要顆粒結合タンパク質の由来が異なる場合と比較すると、両者の由来が同じ微生物種である株ではＰＨＡ生産量を向上させたうえで、３ＨＨｘ分率を１．４〜１．７倍に増加させることができた。特に、ＮＳＤＧ−ＰAcＪ株では適度な結晶化度と柔軟性を示すと期待できる約９ｍｏｌ％  ３ＨＨｘ含有共重合ＰＨＡを従来株より高い効率で生合成可能である。またＮＳＤＧ−ＰAcＣＪ株では１７．２ｍｏｌ％という高い３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を効率的に生合成する。このような高い３ＨＨｘ分率の共重合ＰＨＡは高軟質性バイオプラスチックとしての新規用途の可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
ＰＨＡ生産菌の顆粒結合タンパク質遺伝子座の改変を行うことにより、優れた共重合ポリヒドロキシアルカン酸生産株及び高３ＨＨｘ分率の共重合ポリヒドロキシアルカン酸の効率的な製造方法を提供し、さらに、モノマーユニットの組成比を制御する方法を提供することができる。
【００８８】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【配列表】
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