(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＣＴＡタンパク質の定量を可能にする手段を提供する。【解決手段】ヒト由来ＴＣＴＡタンパク質の特定のアミノ酸配列を認識する、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識する、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号がNITE P-01747であるハイブリドーマにより産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
受託番号がNITE P-01747である、請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識するフラグメント。
【請求項６】
Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント又はFvフラグメントである、請求項５に記載のフラグメント。
【請求項７】
サンプル中のＴＣＴＡタンパク質の存在を検出する方法であって、
サンプルと、請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、請求項３若しくは４に記載のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体、又は、請求項５若しくは６に記載のモノクローナル抗体のフラグメントとを接触させる工程、及び、
該サンプル中における、該モノクローナル抗体又はフラグメントとＴＣＴＡタンパク質とのコンジュゲートの存在を検出する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ、骨粗鬆症やPaget病等の骨代謝疾患は、患者数が多く、その克服が強く求められている。
骨代謝疾患の機序に関し、Ｔ細胞性白血病転座関連遺伝子タンパク質（T cell leukemia translocation-associated gene protein）（以下、「ＴＣＴＡタンパク質」ともいう）がヒト破骨細胞の分化を制御していることが本発明者らによって見出されている（特許文献１及び非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４８５６６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kotake S et al., Bone. 2009; 45: 627-639.
【非特許文献２】Kotake S et al., Jpn. J. Clin. Immunol., 32(6) 466〜471 (2009)
【非特許文献３】Kotake S et al., J Biomed Biotechnol. 2012;2012:675317. doi: 10.1155/2012/675317. Epub 2011 Nov 24. Review. PMID: 22174563 Free PMC Article
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＣＴＡタンパク質は、骨代謝疾患の研究や当該疾患の診断及び治療方法の開発における重要な標的物質であるが、その定量手段は開発されていない。
そこで、本発明は、ＴＣＴＡタンパク質の定量手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意研究を行った結果、ＴＣＴＡタンパク質の特定アミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体が見出された。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記１〜７に関するものである。
１．配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識する、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体。
２．受託番号がNITE P-01747であるハイブリドーマにより産生される、前記１に記載のモノクローナル抗体。
３．前記１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
４．受託番号がNITE P-01747である、前記３に記載のハイブリドーマ。
５．前記１又は２に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識するフラグメント。
６．Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント又はFvフラグメントである、前記５に記載のフラグメント。
７．サンプル中のＴＣＴＡタンパク質の存在を検出する方法であって、
サンプルと、前記１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、前記３若しくは４に記載のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体、又は、前記５若しくは６に記載のモノクローナル抗体のフラグメントとを接触させる工程、及び、
該サンプル中における、該モノクローナル抗体又はフラグメントとＴＣＴＡタンパク質とのコンジュゲートの存在を検出する工程
を含む、方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、後述する実施例で示されるように、ＴＣＴＡタンパク質を特異的に認識することができる。したがって、本発明にしたがいＴＣＴＡタンパク質を正確に定量し、骨代謝疾患の研究や、骨代謝疾患の診断及び治療方法の開発を効率的に進めることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１−１は、ウェル番号4D8の競合阻害ELISA結果を示す。
【図１−２】図１−２は、ウェル番号5H2の競合阻害ELISA結果を示す。
【図２−１】図２−１は、クローン番号1D9、1D11、1E9及び2B6の競合阻害ELISA結果を示す。
【図２−２】図２−２は、クローン番号2D12、2E5、2F7、3B11及び3E11の競合阻害ELISA結果を示す。
【図３−１】図３−１は、クローン番号1F8、1F10、2C1及び2C11の競合阻害ELISA結果を示す。
【図３−２】図３−２は、クローン番号2G3、3F10、1C9、IE5及び2E4の競合阻害ELISA結果を示す。
【図４】図４は、ハイブリドーマ株1F10及び1E5から産生したモノクローナル抗体のdirect ELISAの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体に関する。
ＴＣＴＡタンパク質は、ヒトから単離されたＴ細胞性白血病転座関連遺伝子タンパク質（T cell leukemia translocation-associated gene protein）であり、そのアミノ酸配列はアクセッション番号「NP_071503.1」でGenBankに登録されている。具体的には、ＴＣＴＡタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（配列番号２）
MAESWSGQAL QALPATVLGA LGSEFLREWE AQDMRVTLFK LLLLWLVLSL LGIQLAWGFY 
GNTVTGLYHR PGLGGQNGST PDGSTHFPSW EMAANEPLKT HRE
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、ＴＣＴＡタンパク質の中のアミノ酸配列「SW EMAANEPLKT HR」（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体には、インタクトな免疫グロブリンだけでなく、インタクトな免疫グロブリンの一部分であって配列番号１のアミノ酸配列を認識する抗体フラグメントも含まれる。抗体フラグメントの例としてはFabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメントやFvフラグメント等が挙げられる。抗体フラグメントは、当該技術分野で公知の技術を用いて作成することができる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、本明細書に記載された認識配列である配列番号１で表されるアミノ酸配列を免疫源として用い、公知のハイブリドーマ法にしたがい作成することができる。
なお、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）に受託番号NITE P-01747（識別の表示 1F10）で寄託されている。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、ＴＣＴＡタンパク質の定量に用いることができる。
定量法としては、当該技術分野で用いられている「抗体を用いた目的タンパク質の定量法」を特に制限なく用いることができる。具体例としては、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）や、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等が挙げられる。目的タンパク質に対する特異性が高く、定量性が良く、かつ、安全性に優れる点でＥＬＩＳＡが好ましい。
ＥＬＩＳＡとしては、サンドイッチ法や、直接吸着法等が挙げられる。目的タンパク質に対する特異性が高い点でサンドイッチ法が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で用いられているサンドイッチ法へ特に制限なく用いることができるが、サンドイッチ法における捕獲抗体として好適に用いることができる。例えば、下記工程１〜６を含むサンドイッチ法において本発明のモノクローナル抗体を用いることができる。
１．本発明のモノクローナル抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。
２．固相をブロッキングする。
３．ＴＣＴＡタンパク質を含む試料溶液を固相へ添加して、捕獲抗体とＴＣＴＡタンパク質とのコンジュゲートを形成させる。
４．ビオチン標識されたＴＣＴＡタンパク質に対する抗体（一次抗体）を固相へ添加して、捕獲抗体とＴＣＴＡタンパク質と一次抗体とのコンジュゲートを形成させる。
５．アビジン標識された酵素を添加して、捕獲抗体とＴＣＴＡタンパク質と一次抗体と酵素とのコンジュゲートを形成させる。
６．酵素基質を添加して、酵素反応生成物を検出する。
上記のサンドイッチ法で用いる一次抗体は、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープ（配列番号１のアミノ酸配列）とは異なるエピトープを認識するＴＣＴＡタンパク質に対する抗体である。このような一次抗体としては、例えば、ＴＣＴＡタンパク質中のアミノ酸配列「GQNGSTPDGSTHFPSWEMAANEPLKTHRE」（配列番号３）を含むペプチド免疫源として用いたハイブリドーマ法により作成したポリクローナル抗体が挙げられる。
【００１５】
（実施例）
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１６】
ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
下記の手順Ａ及びＢに従い、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。
【００１７】
Ａ．ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
3.材料
3.1.ＴＣＴＡタンパク質由来のペプチド及びコンジュゲート
EPLKTHRE（配列番号４）（以下、「8 merペプチド」という）
C＋GQNGSTPDGSTHFPSWEMAANEPLKTHRE（配列番号５）（配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加したもの。以下、「30 merペプチド」という）
なお、システインは、ペプチドへＳＨ基を導入することでコンジュゲートの作成を容易にするために付加した。
C＋GQNGSTPDGSTHFPSWEMAANEPLKTHREのKLHコンジュゲート（配列番号５のペプチドとKLH(Keyhole limpet hemocyanin)とのコンジュゲート。以下、「KLHコンジュゲート」という）
C＋GQNGSTPDGSTHFPSWEMAANEPLKTHREのBSAコンジュゲート（配列番号５のペプチドとウシ血清アルブミン（BSA）とのコンジュゲート。以下、「BSAコンジュゲート」という）
なお、KLHやBSAは、上記のＴＣＴＡタンパク質由来のペプチド（合成ペプチド）が免疫動物によって抗原として認識されやすくなるように、抗原性刺激のあるキャリアタンパク質として用いた。
【００１８】
3.2.動物
Balb/cマウス，雌，6週齢，5匹（識別番号: #1〜#5）（日本チャールス・リバー）（以下、「マウス」という）
【００１９】
3.3.主な試薬
Adjubant Complete Freund（日本BD，Cat. No. 263810）（以下、「FCA」という）
Adjubant Incomplete Freund（日本BD，Cat. No. 263910）（以下、「FIA」という）
Peroxidase-Conjugated Goat Affinity Purified Antibody To Mouse IgG Fc（Cappel，Cat. No. 55566）（Peroxidase-Conjugated Goat Affinity Purified Antibody To Mouse IgG FcをPBSで希釈し，HRP標識抗マウスIgG抗体溶液とした）
ブロックエースTM粉末（DSファーマ，Cat. No. UK-B80）（ブロックエース粉末を1%濃度になるように蒸留水で調製し，ブロックエース溶液とした）
o-Phenylenediamine dihydrochloride（Sigma-Aldrich，Cat. No. P8287）（o-Phenylenediamine dihydrochlorideを50 mMクエン酸，100 mM Na2HPO4及びH2O2で調製し，OPDA/H2O2とした）
Albumin Bovine Fraction V Solution（7.5%）（Sigma-Aldrich，Cat. No. A8412）（以下、「BSA」という）
【００２０】
3.4.主な機器
96 wellプレート（Nunc，Cat. No. 439454）
マイクロプレートリーダー（SpectraMax 190，Molecular Devices）
電気融合装置（SSH-2，島津製作所）
【００２１】
4.作製方法
4.1.免疫及び採血
4.1.1. 1回目免疫
KLHコンジュゲート83.6 μg/匹を、FCAと共に、マウス5匹の腹腔内に投与した。
【００２２】
4.1.2. 2回目免疫
1回目免疫後10日目に、KLHコンジュゲート83.6 μg/匹を、FIAと共に、マウス5匹の腹腔内に投与した。
【００２３】
4.1.3. 3回目免疫
2回目免疫後10日目に、KLHコンジュゲート83.6 μg/匹を、FIAと共に、マウス5匹の腹腔内に投与した。
【００２４】
4.1.4.採血（1）
3回目免疫後9日目に、マウス5匹の尾静脈より部分採血した。
【００２５】
4.1.5. 4回目免疫
3回目免疫後11日目に、KLHコンジュゲート109.4 μg/匹を、FIAと共に、マウス#2及び#3の腹腔内に投与した。
【００２６】
4.1.6. 5回目免疫
4回目免疫後14日目に、KLHコンジュゲート105 μg/匹を、FIAと共に、マウス#2及び#3の腹腔内に投与した。
【００２７】
4.1.7.採血（2）
5回目免疫後17日目に、マウス5匹の尾静脈より部分採血した。
【００２８】
4.1.8.最終免疫
5回目免疫後21日目に、KLHコンジュゲート100 μg/匹を、PBSと共に、マウス#3及び#4の腹腔内に投与した。
【００２９】
4.2.抗体価の評価
4.2.1.抗体価の評価（1）
3回目免疫後に行った部分採血から得られた抗血清（ポリクローナル抗体）について、抗体価の評価を以下の方法で行った。
【００３０】
（1）50 μL/wellのBSAコンジュゲートを96 wellプレートに固相化（冷蔵で静置）
（2）200 μL/wellのPBSで洗浄
（3）200 μL/wellのブロックエース溶液を添加（室温，2時間）
（4）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（5）50 μL/wellの500倍希釈抗血清を添加（室温，1時間）
（6）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（7）50 μL/wellのHRP標識抗マウスIgG抗体溶液を添加（室温，1時間）
（8）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで2回洗浄
（9）100 μL/wellのOPDA/H2O2を添加（遮光，室温，30分間）
（10）100 μL/wellの1 mol/L H2SO4を添加
（11）吸光度測定：490 nm (Reference：595 nm)
【００３１】
4.2.2.抗体価の評価（2）
5回免疫したマウス#2及び#3、並びに、3回免疫したマウス#1、#4及び#5について、部分採血（項目4.1.7.）から得られた抗血清（ポリクローナル抗体）を用いて、抗体価の評価を以下の方法で行った。
【００３２】
（1）100 μL/wellのBSAコンジュゲートを96 wellプレートに固相化（冷蔵で静置）
（2）200 μL/wellのPBSで洗浄
（3）200 μL/wellのブロックエース溶液を添加（室温，2時間）
（4）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（5）100 μL/wellの500倍希釈抗血清を添加（室温，1時間）
（6）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（7）100 μL/wellのHRP標識抗マウスIgG抗体溶液を添加（室温，1時間）
（8）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで2回洗浄
（9）100 μL/wellのOPDA/H2O2を添加（遮光，室温，30分間）
（10）100 μL/wellの1 mol/L H2SO4を添加
（11）吸光度測定：490 nm (Reference：595 nm)
【００３３】
4.3.細胞融合及びスクリーニング
4.3.1.細胞融合
最終免疫後4日目に、マウス#3及び#4の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3U1とを電気細胞融合法で融合した。融合後、960ウェル（96 wellプレート10枚）に細胞を播種した。
【００３４】
4.3.2.スクリーニング
細胞融合後9日目及び13日目に、抗体産生ウェルのスクリーニングを以下の方法で行った。
【００３５】
（1）50或いは100 μL/wellの1 M、μg/mL BSAコンジュゲートを96 wellプレートに固相化（冷蔵で静置）
（2）200 μL/wellのPBSで洗浄
（3）200 μL/wellのブロックエース溶液を添加（室温，2時間）
（4）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（5）50或いは100 μL/wellの培養上清を添加（室温，1時間）
（6）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（7）50或いは100 μL/wellのHRP標識抗マウスIgG抗体溶液を添加（室温，1時間）
（8）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで2回洗浄
（9）100 μL/wellのOPDA/H2O2を添加（遮光，室温，30分間）
（10）100 μL/wellの1 mol/L H2SO4を添加
（11）吸光度測定：490 nm (Reference：595 nm)
【００３６】
4.3.3.競合阻害ELISA
4.3.2項で得られた抗体産生ウェルについて、競合阻害ELISAを以下の方法で行った。競合物質として、8 merペプチド、30 merペプチド、BSAコンジュゲート及びBSAを用いた。
【００３７】
（1）100 μL/wellの1 μg/mL BSAコンジュゲートを96 wellプレートに固相化（冷蔵で静置）
（2）200 μL/wellのPBSで洗浄
（3）200 μL/wellのブロックエース溶液を添加（室温，2時間）
（4）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（5）50 μL/wellの競合物質溶液を添加
（6）50 μL/wellの培養上清を添加（振とう，室温，1時間）
（7）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで洗浄
（8）100 μL/wellのHRP標識抗マウスIgG抗体溶液を添加（室温，1時間）
（9）200 μL/wellの0.05 % Tween20-PBSで2回洗浄
（10）100 μL/wellのOPDA/H2O2を添加（遮光，室温，30分間）
（11）100 μL/wellの1 mol/L H2SO4を添加
（12）吸光度測定：490 nm (Reference：595 nm)
【００３８】
4.4. 1回目クローニング及びスクリーニング
4.4.1.クローニング
抗体産生が認められ、且つ競合阻害ELISAにて30 merペプチド及び8 merペプチドに対して阻害反応が認められた2ウェル（ウェル番号4D8及び5H2）のハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングを行った。
【００３９】
4.4.2.スクリーニング
クローニング後10日目及び12日目に、4.3.2項と同様の方法で抗体産生クローンのスクリーニングを行った。
【００４０】
4.4.3.競合阻害ELISA
4.4.2項で得られた抗体産生クローンについて、4.3.3項と同様の方法で競合阻害ELISAを行った。競合物質として、8 merペプチド及び30 merペプチドを用いた。
【００４１】
4.5. 2回目クローニング及びスクリーニング
4.5.1.クローニング
4.4.3項にて30 merペプチド及び8 merペプチドに対して阻害反応が認められた2クローン（クローン番号：1D11及び3B11）のハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングを行った。
【００４２】
4.5.2.スクリーニング
クローニング後11日目及び14日目に、4.3.2項と同様の方法で抗体産生クローンのスクリーニングを行った。
【００４３】
4.5.3.競合阻害ELISA
4.5.2項で得られた抗体産生クローンについて、4.3.3項と同様の方法で競合阻害ELISAを行った。競合物質として、8 merペプチド及び30 merペプチドを用いた。また、競合物質なし（0 μg/mL）のときの吸光度を100%として、阻害率を算出した。
【００４４】
5.結果
5.1.抗体価の評価（1）
3回目免疫後の抗血清の評価結果を表1に示す。表1より、3回の免疫での抗体価の上昇は不十分であると判断し、マウス#2及び#3について追加免疫を行った。
【００４５】
表1. 抗血清評価結果（1）（抗血清500倍希釈）
2017014176.tif 000002
【００４６】
5.2.抗体価の評価（2）
5回免疫したマウス#2及び#3、並びに、3回免疫したマウス#1、#4及び#5の抗血清の評価結果を表2に示す。表2より、抗体価の高いマウス#3及び#4を細胞融合に用いることにした。
【００４７】
表2. 抗血清評価結果（2）（抗血清500倍希釈）
2017014176.tif 000003
【００４８】
5.3.細胞融合の結果
スクリーニング（項目4.3.2）の結果、6ウェルを選択し、抗体産生ウェルとした。競合阻害ELISA（項目4.3.3）により抗体の交差反応性を調べたところ、30 merペプチド及び8 merペプチドに対して明瞭な阻害反応を認めたウェルは、ウェル番号4D8及び5H2のウェルであった。結果を図1-1及び1-2に示す。
具体的には、4D8及び5H2ともに、競合物質として抗原（TCTAタンパク質由来ペプチド）を用いた場合には、競合物質濃度依存的なOD値の低下（特に、0〜1μg/mLの30merペプチド又はBSAコンジュゲートを用いた実験結果）が見られた。一方、競合物質として非抗原（BSA）を用いた場合には、抗原を用いた場合と比較してOD値の低下は僅かであった。これらの結果より、4D8及び5H2のウェル中には抗原を認識する抗体が存在することが理解される。
これらの結果に基づいて、4D8及び5H2について更にクローニングを行うことにした。
【００４９】
5.4. 1回目クローニングの結果
スクリーニング（項目4.4.2）の結果、19クローンを選択し、抗体産生クローンとした。競合阻害ELISA（項目4.4.3）により、30 merペプチド及び8 merペプチドに対して阻害反応を認めたクローンから9クローンに絞った。9クローンについて、さらに競合阻害ELISA（項目4.4.3）にて抗体の交差反応性を調べた結果を図2-1及び図2-2に示す。なお、図2-1及び図2-2中、競合物質濃度0 μg/mLの結果は、0.001 μg/mLの位置に示されている。この結果、競合物質濃度の変化によるOD値の低下割合が大きい（すなわち、抗原との親和性が大きい抗体を産生している）クローン番号1D11（ウェル番号4D8由来）及び3B11（ウェル番号4D8由来）について2回目のクローニングを行うことにした。
【００５０】
5.5. 2回目クローニングの結果
スクリーニング（項目4.5.2）の結果、9クローンを選択し、抗体産生クローンとした。競合阻害ELISA（項目4.5.3）により抗体の交差反応性を調べた結果を図3-1及び図3-2に示す。なお、図3-1及び図3-2中、競合物質濃度0 μg/mLの結果は、0.001 μg/mLの位置に示されている。30 merペプチド及び8 merペプチドに対して阻害反応を認めたクローンのうち、競合物質濃度の変化による阻害率の差が大きい（すなわち、抗原との親和性が大きい）1D11由来の1F10及び3B11由来の1E5を最終株として選択した。
【００５１】
図3-1及び図3-2は、ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体のいずれもが、30merペプチド及び8merペプチドを認識したことを示している。これらのモノクローナル抗体は、両ペプチドを共に認識することから、当該抗体が認識するエピトープは両ペプチドに共通の配列EPLKTHR（配列番号４）に含まれると考えられる。そして、この共通配列は配列番号１で表されるアミノ酸配列に含まれている。したがって、ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体のいずれもが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識することができる。
【００５２】
選択されたハイブリドーマ1F10を、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）に寄託した（受託番号NITE P-01747（識別の表示 1F10））。
【００５３】
Ｂ．モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いた精製モノクローナル抗体の取得
【００５４】
3.材料
3.1.ハイブリドーマ
項目Ａで作成したハイブリドーマ1F10及び1E5
【００５５】
3.2.動物
Balb/c nu/nuマウス，雌，6週齢，12匹（日本チャールス・リバー）（以下、「ヌードマウス」という）
【００５６】
3.3.主な試薬及び器具
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア・ジャパン，Cat. No. 17-5280-01）
透析膜（三光純薬，Cat. No. UC20-32-100）
Pierce(R) BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific，Cat. No. 23227）
Bovine Gamma Globlin Standard（Thermo Scientific，Cat. No. 23212）
【００５７】
3.4.主な機器
UVモニタ（280 nm）（AC-5200L，アトー）
マイクロプレートリーダー（SpectraMax 190，Molecular Devices）
【００５８】
4.作製方法
4.1.腹水作製
（1）ハイブリドーマ株1F10及び1E5のそれぞれについて、約107 cells/匹を、ヌードマウス各6匹に接種した。
（2）1週間後、各ハイブリドーマ株の追加接種を行った。
（3）追加接種後8日目から16日目にかけて腹水採取した。
【００５９】
4.2.プロテインA精製
（1）腹水をnProtein A Sepharose 4 Fast Flowカラムを用いて精製した。
（2）得られた溶出画分を、PBSを外液として透析した。
【００６０】
4.3.タンパク質定量
4.2項で得られたモノクローナル抗体について、Pierce(R) BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質定量を行った。標準溶液はBovine Gamma Globlin Standardを用いた。
【００６１】
5.結果
5.1.腹水作製及びプロテインA精製
1F10からは約24 mLの腹水が得られ、1E5からは約17 mLの腹水が得られた。得られた各腹水を、プロテインAを用いて精製し、得られた溶出画分を、PBSを外液として透析した。
【００６２】
5.2.タンパク質定量
透析後のモノクローナル抗体濃度は、1F10では1.2 mg/mLであり、1E5では3.0 mg/mLであった。
【００６３】
5.3.モノクローナル抗体作製量
1F10からは、抗体濃度が1.2 mg/mLの液体が約25 mL得られ、当該液体から約30 mgのモノクローナル抗体が得られた。
1E5からは、抗体濃度が3.0 mg/mLの液体が約8 mL得られ、当該液体から約24 mgのモノクローナル抗体が得られた。
【００６４】
Ｃ．モノクローナル抗体の評価
得られたモノクローナル抗体について、インタクトな完全長ＴＣＴＡタンパク質に対する結合性をdirect ELISAにより評価した。
抗原として、配列番号２で表されるアミノ酸配列（完全長ＴＣＴＡタンパク質のアミノ酸配列）を含むHuman TCTA-GST fusion proteinを使用した。
【００６５】
使用した試薬等
Human TCTA-gst fusion protein (Proteintech  Cat.No. ag7425)
BIO-RAD  αmsIgG-POD (BIO-RAD  Cat.No. 170-6516)
TMB Substrate Set(Biolegend  Cat.No.421101)
Nuncイムノプレート マキシソープ (Thermo Scientific Cat.No.439454)
anti-human TCTA mAb (ハイブリドーマ株1F10より産生)
anti-human TCTA mAb (ハイブリドーマ株1E5より産生)
Mouse IgG (Merck Millipore  Cat.No.PP54)
SuperBlock(TBS) Blocking Buffer (Thermo Scientific Cat.No.37535)
TMB Stop Solution (KPL  Cat.No.50-85-05)
PBS-T (0.05% Tween20 in PBS)
なお、Mouse IgGは、Human TCTA-gst fusion proteinが、前述のモノクローナル抗体以外の抗体に非特異的に結合しないことを確認するために使用した。
【００６６】
評価方法
（1）Nuncイムノプレート マキシソープに、抗原(TCTA-gst fusion protein) を固相化した。抗原(0.6μg/μl)はPBSで希釈して固相化した。希釈液における抗原の最高濃度は5000ng/ml（最小濃度は0)とした。プレートをシールして4℃でオーバーナイトインキュベートした。
（2）PBS-Tでプレートを洗浄(3回)した。
（3）SuperBlock(TBS) Blocking Bufferを300μl/wellで添加してブロッキングした。プレートをシールして、4℃でオーバーナイトインキュベートした。
（4）PBS-Tでプレートを洗浄(3回)した。
（5）SuperBlock(TBS) Blocking Buffer で希釈したanti-human TCTA mAb(10μg/ml 若しくは 2μg/ml)又は同濃度のmouse IgGを100μl/well添加した。振盪しながら、室温下で１時間インキュベートした。
（6）PBS-Tでプレートを洗浄(4回)した。
（7）SuperBlock(TBS) Blocking Buffer で10000倍希釈したαmsIgG-PODを100μl/well添加した。振盪しながら、室温下で１時間インキュベートした。
（8）PBS-Tでプレートを洗浄(6回)した。
（9）TMBを100μl/wellで添加した。発色を確認後、Stop Solutionを100μl/well添加して反応を停止し、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した(Reference：630nm)。
【００６７】
結果を図４に示す。ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体のいずれもが、human TCTA-GST fusion proteinに対して濃度依存的に結合した。一方、Mouse IgGでは、human TCTA-GST fusion proteinへの濃度依存的な結合はみられなかった。この結果は、ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体が、human TCTA-GST fusion protein（すなわち、インタクトな完全長ＴＣＴＡタンパク質）に結合できることを示している。
また、human TCTA-GST fusion proteinに含まれる配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含んでいる。そして、ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識することができる（図３−１及び図３−２）。
したがって、ハイブリドーマ1F10及び1E5から産生されたモノクローナル抗体は、いずれも、配列番号１で表されるアミノ酸配列を認識する、ＴＣＴＡタンパク質に対するモノクローナル抗体である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、ＴＣＴＡタンパク質が関与する骨代謝疾患の研究や、当該疾患の診断及び治療方法の開発に利用可能である。
【００６９】
[配列表フリーテキスト]
配列番号５：KLHコンジュゲート及びBSAコンジュゲート用のアミノ酸配列
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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