(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫抑制作用を有する新規化合物及びその製造方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物（１４，１５−デヒドロキシ−６Ｚ−エルタカルシオール）。前記化合物は、麹菌発酵生成物に含まれる１４−デヒドロエルゴステロールに紫外線領域の波長を有する光照射することにより製造する方法。2017014139.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2017014139.tif 000004
で表される化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を含んでなる組成物。
【請求項３】
免疫抑制、炎症抑制および／または樹状細胞の成熟抑制のための、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
１４−デヒドロエルゴステロールに光照射する工程を含んでなる、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
紫外線領域の波長を有する光を照射する、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
光照射する工程が極性溶媒中で行われる、請求項４または５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物１４，１５−デヒドロキシ−６Ｚ−エルタカルシオール並びにその製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド骨格を有する化合物群は、免疫や炎症を抑制する効果があることが知られている。例えば、特許文献１にはステロールと脂肪酸のエステル化合物が抗体産生を抑制することが、特許文献２には３−メチレンステロイド誘導体が自己免疫疾患を治療できることがそれぞれ開示されている。また、特許文献３には、エルゴステロール類似体である１４−デヒドロエルゴステロールが免疫抑制効果を有することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平７−１０９２９２号公報
【特許文献２】特表２００３−５１７４７２号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１５０８６７号公報
【発明の開示】
【０００４】
本発明者らは、麹菌発酵生成物に含まれる１４−デヒドロエルゴステロール（以下、単に「１４−ＤＨＥ」ということがある）に光を照射することにより、１４−ＤＨＥが有するステロイド骨格中のＢ環が開環され、新規化合物、すなわち、１４，１５−デヒドロキシ−６Ｚ−エルタカルシオール（以下、単に「１４，１５−ＤＨＥ」ということがある）が得られることを見出した。本発明者らは、また、該新規化合物が免疫抑制作用を有することや溶液中で高い安定性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、免疫抑制作用を有する新規化合物とその製造方法および用途を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
2017014139.tif 000002
で表される化合物。
（２）前記（１）に記載の化合物を含んでなる組成物。
（３）免疫抑制、炎症抑制および／または樹状細胞の成熟抑制のための、前記（２）に記載の組成物。
（４）１４−デヒドロエルゴステロールに光照射する工程を含んでなる、前記（１）に記載の化合物の製造方法。
（５）紫外線領域の波長を有する光を照射する、前記（４）に記載の製造方法。
（６）光照射する工程が極性溶媒中で行われる、前記（４）または（５）に記載の製造方法。
【０００７】
本発明において有効成分として用いられる１４，１５−デヒドロキシ−６Ｚ−エルタカルシオールは、免疫抑制作用を有しつつ、溶液中での安定性が高いことから飲料適性の点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１（２）で得られた各サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。Ａ：未処理、Ｂ：ＵＶ処理（溶媒：エタノール）、Ｃ：ＵＶ処理（溶媒：ジクロロメタン）、Ｄ：加熱処理（９０℃）、Ｅ：加熱（１２１℃）＋加圧処理サンプル、Ｆ：酸処理。図１Ａ、Ｄ、ＥおよびＦでは、いずれも１１．５分付近にピークが認められ、検出波長が３２０ｎｍのとき最も大きいピークを示し、検出波長が２２５ｎｍおよび２６５ｎｍのときは３２０ｎｍのときよりも小さいピークを示した。また、図１Ｂおよび１Ｃでは、いずれも９．５分付近にピークが認められ、検出波長が２２５ｎｍのとき最も大きいピークを示し、検出波長が２６５ｎｍのときは２２５ｎｍのときよりも小さいピークを示し、検出波長が３２０ｎｍのとき最も小さいピークを示した。。
【図２】１４−ＤＨＥへのＵＶ照射時間がＨＰＬＣクロマトグラムに与える影響を示した図である（実施例１（３））。
【図３】実施例３の抗炎症作用確認試験の結果を示した図である。縦軸は樹状細胞におけるＣＤ８６の相対的発現量を示す。
【図４】実施例５の安定性確認試験の結果を示した図である。保存開始当日（0day）と保存開始から１週間（1w）、２週間（2w）、３週間（3w）および４週間（4w）経過後の残存率を示す。
【発明の具体的説明】
【０００９】
式（Ｉ）の化合物およびその製造方法
式（Ｉ）の化合物は、１４−ＤＨＥに何らかの処置を施して製造することができる。例えば酵素を作用させて製造してもよいが、主として１４−ＤＨＥに光を照射することにより製造することができる。本発明の製造方法で用いられる１４−ＤＨＥは、下記の構造式で表される化合物であり、下記の物理化学的特性を有する。
（構造式）
【化２】
2017014139.tif 000003
（物理化学的特性）
（１）分子量：394.63
（２）分子式：C28H42O(高分解能APCI-Orbitrap法による観測値:m/z 395.33057(M+H)+、理論値:395.33139)
（３）溶剤に対する溶解性：水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
（４）紫外吸収スペクトル(MeCN)：391nm
（５）1H-NMR(CD3OD)： 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9Hz),5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m),2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m),1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m),1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m),1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz).
（６）13C-NMR(CD3OD)：149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s),120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s).
【００１０】
麹菌が原料を発酵させることにより産出した発酵物である麹菌発酵生成物は１４−ＤＨＥを含有する。よって、本発明の製造方法において出発物質となる１４−ＤＨＥとしては麹菌発酵生成物やそれを含有する組成物を用いることもできるし、麹菌発酵生成物から単離した１４−ＤＨＥを用いることもできる。麹菌発酵生成物からの１４−ＤＨＥの単離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００１１】
麹菌発酵生成物は、原料に麹菌を接種し培養し、場合によっては、菌体を含む発酵産物を溶媒を用いて抽出することにより調製することができる。溶媒を用いて抽出して得られた麹菌発酵生成物には１４−ＤＨＥが含まれていることから、本発明では溶媒を用いて抽出された麹菌発酵エキスを好ましくは用いることができる。
【００１２】
麹菌は、１４−ＤＨＥを産生することができるものであれば特に限定されないが、例えば、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー）、黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）、紅麹菌（モナスカス・アンカ）、醤油用麹菌（アスペルギルス・ソーヤ）、白麹菌（アスペルギルス・カワチ）、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）などが挙げられる。特に、アスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌である麹菌は１４−ＤＨＥ高産生であるため好ましい。本発明で用いる麹菌としては、とりわけ狭義の黒麹菌であるアスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・ニガー、ならびに狭義の白麹菌であるアスペルギルス・カワチ、さらにこれらの菌種から誘導された亜種が好ましい。本発明で用いる麹菌は、特に好ましくは、白麹菌（アスペルギルス・カワチ）である。これらの麹菌の種麹は、秋田今野社、樋口もやし社、日本醸造工業社などから入手することができる。
【００１３】
麹菌を用いて発酵させるための原料としては、穀物由来材料が１４−ＤＨＥ高生産のために好ましい。穀物としては、植物分類表においてイネ科に分類されるすべての植物が挙げられる。本発明において穀物として利用できる植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、アワ、ヒエ、トウモロコシなどが挙げられ、好ましくは、イネ、オオムギ、コムギおよびライムギである。本発明において発酵原料とする材料としては、上記のような穀物植物の種子が好ましく、より好ましくはそれらを発芽させた麦芽（特に大麦麦芽）や発芽玄米などである。あるいは、それらの種子の外皮、例えば、穀類種子全粒粉、穀類植物のフスマ、米糠なども発酵原料として用いることができる。
【００１４】
麹菌を用いた発酵は、原料に麹菌を接種して培養することにより行うものであって、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、従来の蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法などを挙げることができる。また、固体原料に麹菌を接種して培養するのみならず、原料成分を水などの溶媒に溶解させた液体原料（液体培地）に麹菌を接種して培養して発酵を行ってもよい。培養（発酵）条件の詳細については、例えば、発酵ハンドブック（（財）バイオインダストリー協会、発酵と代謝研究会編、２００１年）を参照することができる。
【００１５】
上記培養工程において、好ましくは、麦芽エキスを含む液体培地に麹菌を接種し培養することができる。麦芽エキスは、麦、特に大麦の種子を発芽させ、場合により焙煎した後、それを水などの溶媒により抽出して得られる抽出物であり、マルトース、グルコース、フルクトースなどの還元糖を多く含み、その他ペプチド、アミノ酸、プリン、ビタミンなどを含むことが知られている。培地には、麦芽エキスの他に、マルトース、グルコース、ショ糖、乳糖などの糖やデンプン、あるいは酵母エキスを含有させてもよい。培地は液状のものを使用し、液体培養とすると、培養の制御が比較的容易である点、副産物の産生が少ない点、固体培養よりも１４−ＤＨＥを多く産生する傾向がある点などで有利である。
【００１６】
麹菌発酵生成物は、培養工程を経て（発酵）得られた菌体を含む発酵産物を適切な溶媒を用い、一般的な手法により抽出することができる。溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタンなどが挙げられる。中でもエタノール、メタノール、酢酸エチルおよびヘキサンが好ましく、より好ましくはエタノールである。これらの溶媒は２種類以上を混合して用いてもよく、また２種類以上の有機溶媒を用いて２段階以上の溶媒抽出工程を行なってもよい。あるいは、そのような有機溶媒に代えて、またはそれらと組み合わせて、食用油脂を抽出溶媒として用いることができる。食用油脂は、好ましくは植物性油脂であり、例えば大豆油、ナタネ油、オリーブ油、パーム油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油、綿実油、ピーナッツオイル、グレープシードオイル、えごま油、つばき油、亜麻仁油などが挙げられる。
【００１７】
本発明で用いられる麹菌発酵生成物は、より好ましくは、原料に麹菌を接種し培養する工程、菌体を含む発酵産物をエタノールと水を含む浸漬液に浸漬する工程、および浸漬工程後に得られた菌体を含む混合物に食用油脂を加えて抽出する工程を含んでなる方法に従って調製することができる。この方法により調製された麹菌発酵生成物は１４−ＤＨＥを高濃度で含有する点で有利である。
【００１８】
浸漬工程において、培養により得られた菌体を含む発酵産物を浸漬するエタノールと水を含む浸漬液中のエタノールの濃度は２０（ｗ／ｗ）％以上、特に３０（ｗ／ｗ）％以上、とりわけ４０（ｗ／ｗ）％以上であることが好ましく、かつ９５（ｗ／ｗ）％以下、特に９０（ｗ／ｗ）％以下、とりわけ８０（ｗ／ｗ）％以下であることが好ましい。浸漬液は、水とエタノールとからなるエタノール水溶液であってもよい。エタノールと水を含む浸漬液は、発酵産物に含まれる菌体の細胞膜または細胞壁を弱め、菌体内部に蓄えられた１４−ＤＨＥが抽出されやすくする効果を奏すると考えられる。浸漬は、１時間以上、特に６時間以上、とりわけ１２時間以上、さらには２４時間以上の時間をかけて行うことが好ましい。
【００１９】
エタノールと水を含む浸漬液に浸漬した発酵産物は、次いで食用油脂を用いた抽出工程に供される。抽出工程に用いることができる食用油脂は、ラードまたはヘットなどの動物性油脂であってもよいが、植物性油脂を用いることがより好ましい。抽出に用いることができる植物性油脂の具体例としては、大豆油、ナタネ油、オリーブ油、パーム油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油、綿実油、ピーナッツオイル、グレープシードオイル、えごま油、つばき油、亜麻仁油などが挙げられる。食用油脂は、培養産物１ｇに対して１０ｍＬ以下、特に８ｍＬ以下、とりわけ６ｍＬ以下の量で用いると、得られる麹菌発酵エキス中の１４−ＤＨＥ濃度が高くなるため好ましい。
【００２０】
エタノールと水を含む浸漬液に浸漬した発酵産物の抽出は、浸漬工程後に得られた菌体を含む混合物と、食用油脂とを直接混合して行うことができる。具体的には、例えば浸漬後の浸漬液と発酵産物の混合物を、必要に応じて攪拌した後、その中に食用油脂を加えてさらに攪拌し、油層を回収することにより行うことができる。この抽出工程により、目的の１４−ＤＨＥ含有麹菌発酵エキスを得ることができる。従って、得られた麹菌発酵エキスには、発酵産物から抽出された１４−ＤＨＥの他に、抽出に用いた食用油脂、ならびに浸漬液に由来するエタノールおよび水が含まれ得る。なお、この抽出工程においては、菌体を破壊するための超音波処理などは特に必要ない。エタノールと水を含む浸漬液に浸漬したことにより、菌体の細胞膜または細胞壁は十分弱まっており、単に食用油脂を加えて攪拌するだけで菌体に蓄えられた１４−ＤＨＥを抽出することができる。より効率的に１４−ＤＨＥが抽出できるよう、抽出工程は必要に応じて複数回繰り返してもよい。
【００２１】
上記方法により調製された麹菌発酵生成物は、１４−ＤＨＥを１０ｎｇ／ｍｇ以上、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｇ以上、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｇ以上含有することができる。
【００２２】
本発明の製造方法において、１４−ＤＨＥに照射する光は、好ましくは、紫外線領域の波長を有する光であり、より好ましくは、１００〜４００ｎｍの波長を有する光であり、さらに好ましくは、２００〜３００ｎｍの波長を有する光である。
【００２３】
１４−ＤＨＥに光を照射する工程は、１４−ＤＨＥに光を照射することができれば特に限定されないが、例えば、ＵＶ灯をオンにしたクリーンベンチに放置することにより行うことができる。
【００２４】
１４−ＤＨＥに光を照射する時間は光源の種類と光源からの距離により適宜決定することができるが、例えば、ＵＶ強度３０〜５０μＷ／ｃｍ２のＵＶ灯を使用する場合には、光照射時間を１分〜１０時間、好ましくは、０．５〜２時間とすることができる。
【００２５】
１４−ＤＨＥに光を照射する工程は、１４−ＤＨＥまたはそれを含む麹菌発酵生成物を溶媒に溶解して行うことができる。溶媒としては、１４−ＤＨＥを溶解することができれば特に制限はないが、好ましくは極性溶媒であり、より好ましくは極性が高い溶媒（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル等）である。
【００２６】
本発明の製造方法によれば、１４−ＤＨＥに光を照射することにより、１４−ＤＨＥ中のステロイド骨格のＢ環が開環され、１４，１５−ＤＨＥ、すなわち、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物の用途
後記実施例に示されるように、１４，１５−ＤＨＥは樹状細胞の成熟抑制作用を有する（実施例３）。樹状細胞の成熟抑制作用は免疫抑制作用や炎症抑制（抗炎症）作用の指標となるものである。従って、１４，１５−ＤＨＥは免疫抑制（好ましくは、樹状細胞により媒介される免疫反応の抑制）のための組成物として使用することができるとともに、免疫抑制方法（好ましくは、樹状細胞により媒介される免疫反応の抑制方法）に使用することができ、さらには免疫抑制剤（好ましくは、樹状細胞により媒介される免疫反応の抑制剤）としても使用することができる。また、１４，１５−ＤＨＥは炎症抑制のための組成物として使用することができるとともに、炎症抑制方法に使用することができ、さらには炎症抑制剤（抗炎症剤）としても使用することができる。また、１４，１５−ＤＨＥは樹状細胞の成熟抑制のための組成物として使用することができるとともに、樹状細胞の成熟抑制方法に使用することができ、さらには樹状細胞の成熟抑制剤としても使用することができる。
【００２８】
上記の本発明の免疫抑制方法、炎症抑制方法および樹状細胞の成熟抑制方法は、有効量の１４，１５−ＤＨＥをヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することにより実施することができる。
【００２９】
本発明における１４，１５−ＤＨＥの使用はヒトおよび非ヒト動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【００３０】
本発明においては、また、樹状細胞により媒介される免疫反応の抑制がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防または改善に１４，１５−ＤＨＥを使用することができる。
【００３１】
樹状細胞により媒介される免疫反応の抑制がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状としては、細胞又は臓器・組織移植に伴う移植片拒絶及び移植片対宿主病、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変）、乾癬、突発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群（例えば、糸球体腎炎）、悪性貧血、橋本病、尋常性白斑、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症をはじめとする自己免疫疾患、並びに接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息をはじめとするアレルギー性疾患等が挙げられる。従って、１４−ＤＨＥはこれらの疾患および症状の治療剤、予防剤および改善剤として使用できるとともに、これらの疾患および症状の治療方法、予防方法および改善方法に使用することができる。
【００３２】
本発明の免疫抑制、炎症抑制または樹状細胞の成熟抑制のための組成物および用剤並びに本発明の治療剤および予防剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料などの形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。また本発明の免疫抑制方法、炎症抑制方法および樹状細胞の成熟抑制方法並びに本発明の治療方法および予防方法は下記の記載に従って実施することができる。
【００３３】
本発明の有効成分である１４，１５−ＤＨＥはヒトおよび非ヒト動物に経口投与または非経口投与することができ、好ましくは経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターを担体として使用できる。
【００３４】
経口剤の製造方法は特に限定されずいずれの方法をも使用することができる。有効成分に賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）、安定化剤および／または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）などの製剤用添加剤を配合して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社）などを用いることができる。カプセル剤は有効成分をそのまままたは有効成分に例えば安定化剤、分散剤、着色剤および／または保存剤などの製剤用添加剤を配合して製造してもよい。また、カプセルはソフトカプセルでもハードカプセルでもよく、カプセルの素材は特に限定されず例えばゼラチンや植物性繊維や澱粉などを用いることができ、付着防止措置を施してもよい。
【００３５】
非経口剤のうち注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（アトラスパウダー社））、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などの製剤用添加剤と共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００３６】
本発明の有効成分である１４，１５−ＤＨＥはヒトおよび非ヒト動物に経口摂取させることができる。１４，１５−ＤＨＥを経口摂取させる場合には１４，１５−ＤＨＥは単離、精製または粗精製された形態のものであっても、１４，１５−ＤＨＥを含む食品あるいは食品の原料の形態であってもよい。
【００３７】
本発明の有効成分である１４，１５−ＤＨＥを食品として提供する場合には、１４，１５−ＤＨＥをそのまま食品に含有させることができ、該食品は１４，１５−ＤＨＥを有効量含有した食品である。本明細書において、１４，１５−ＤＨＥを「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で１４，１５−ＤＨＥが摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であってもよい。
【００３８】
本発明で提供される食品としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイなどのアルコール飲料；果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、清涼飲料水、牛乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、スポーツ飲料、ミネラルウォーターなどの非アルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
茶飲料としては、例えば、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボス茶、ローズ茶、キク茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）、穀物茶が挙げられる。
【００４０】
果汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる果物としては、例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、アサイー、ブルーベリー、およびウメが挙げられる。また、野菜汁入り飲料や果汁および野菜汁入り飲料に用いられる野菜としては、例えば、トマト、ニンジン、セロリ、キュウリ、およびスイカが挙げられる。
【００４１】
本発明で提供される食品としては、好ましくは、飲料の形態の食品である。
【００４２】
１４，１５−ＤＨＥは炎症抑制作用など各種作用を有するため、日常摂取する食品や飲料、さらにはサプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。この場合、１４，１５−ＤＨＥは１食当たりに摂取する量が予め定められた単位包装形態で提供することができ、１食当たりの単位包装形態としては、例えば、パック、包装、缶、ボトル等で一定量を規定する形態が挙げられる。１４，１５−ＤＨＥの各種作用をよりよく発揮させるためには、１４，１５−ＤＨＥを１食当たり５０〜１０００００μｇ、好ましくは１００〜５００００μｇ摂取させることが望ましい。
【００４３】
本発明において１４，１５−ＤＨＥを食品の形態で提供する場合には、例えば１容器当たり１４，１５−ＤＨＥを５０〜１０００００μｇ、好ましくは１００〜５００００μｇ含有させることができる。また、１４，１５−ＤＨＥをサプリメントの形態で提供する場合、例えば１粒あるいは１カプセル当たり１４，１５−ＤＨＥを１０〜１０００μｇ、好ましくは２０〜５００μｇ、より好ましくは１００〜４００μｇ含有させることができる。また、飲料とする場合、例えば、１容器当たり１４，１５−ＤＨＥを２０〜１００００μｇ／１００〜５００ｍＬ、好ましくは１００〜１０００μｇ／１００〜５００ｍＬ、より好ましくは２００〜５００μｇ／１００〜５００ｍＬ含有させることができる。１包装単位当たりの１４，１５−ＤＨＥの含有量が１食当たりの摂取量に達しない場合には、１４，１５−ＤＨＥが１食当たり５０〜１０００００μｇ、好ましくは１００〜５００００μｇ摂取されるように、摂取量に関する説明事項が記載された文書等を一緒に提供することが好ましい。
【００４４】
１４，１５−ＤＨＥを含有する本発明の医薬品および食品は、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に摂取させ、あるいは投与することができる。１４，１５−ＤＨＥの摂取量または投与量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。例えば、１４，１５−ＤＨＥをヒトに摂取させる、または投与する場合、成人１日当たり、１〜１０００００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは２〜１０００００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは４〜５００００μｇ／ｋｇ体重の範囲となるように、１日１回または数回に分けて摂取させる、または投与することができる。
【実施例】
【００４５】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１：新規化合物の調製
（１）１４−ＤＨＥの調製
白麹菌（製品評価技術基盤機構より入手したAspergillus kawachii  ＮＢＲＣ４３０８）をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ−ＢＤ社製）に植菌し、２５℃で７日間静置培養した。０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む麦芽エキス培地（Ｄｉｆｃｏ−ＢＤ社製；製品名Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂｒｏｔｈ）に胞子を形成した菌体を懸濁し、フィルター濾過を行なったものを胞子溶液とした。オートクレーブ滅菌後の麦芽エキス培地１５０ｍＬを容量５００ｍＬの坂口フラスコに入れ、そこに１．０×１０５胞子／ｍＬの濃度になるように胞子溶液を添加し、１４０ｓｐｍ、３０℃で２０時間振盪培養を行ったものを前培養液とした。次に、５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に麦芽エキス培地３．０Ｌを張り、オートクレーブ滅菌処理した後、前培養液３７ｍＬ（胞子数で１．２５×１０３個／ｍＬ）を添加し、３０℃、４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍ（培養液１Ｌへの１分当たりの通気量（Ｌ））の条件で１４４時間培養を行った。なお、前培養、本培養の際にそれぞれシリコーンオイルを添加して消泡した。
【００４７】
培地から回収した菌体を５９（ｗ／ｗ）％エタノールにて一晩浸漬後、これにヘキサンを加えた後に４００ｒｐｍで攪拌し、１２，０００ｒｐｍで遠心分離して上清（ヘキサン層）を得た。これをドライアップした後１００％エタノールで１０ｍｇ／ｍＬとし、０．２２μｍ径ＰＴＦＥ膜でフィルター濾過したものをＨＰＬＣサンプルとした（粗抽出物）。
【００４８】
粗抽出物をＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（４．６×１５０ｍｍ）（野村化学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（移動層；アセトニトリル／２−プロパノール＝９９／１、流速；１．０ｍＬ／分、検出波長；３２０ｎｍ、２６５ｎｍ）に供して分析した。１４−ＤＨＥのピークのみ（１１．５分付近、３２０ｎｍ）を分取し、１４−ＤＨＥを単離・精製した。以下、このように単離・精製した１４−ＤＨＥを「１４−ＤＨＥ分取物」という。
【００４９】
（２）新規化合物の調製条件の検討
１４−ＤＨＥ分取物を以下の処理に供した。
処理１
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるようエタノールに溶解したものを、ＵＶ灯（波長約２５５ｎｍ）をオンにしたクリーンベンチ（日立社製）に２時間放置した。なお、実施例全体を通じて、使用したＵＶ灯のＵＶ波長は約２５４ｎｍ、ＵＶ強度は４０μＷ／ｃｍ２であり、ＵＶ灯から１４−ＤＨＥ分取物までの距離は約４５ｃｍであった。
処理２
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるようジクロロメタンに溶解したものを、ＵＶ灯をオンにしたクリーンベンチに２時間放置した。
処理３
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるようエタノールに溶解したものを９０℃で２０分間放置した。
処理４
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるようエタノールに溶解したものを、オートクレーブ（トミー精工社製）を用いて１２１℃、２気圧で２０分間処理した。
処理５
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるよう５％酢酸溶液に溶解したものを２０分間放置した。
【００５０】
なお、いずれの処理においても容器には密閉容器を用い、ヘッドスペースは窒素ガスで置換をした。また、処理３〜５は遮光下で行った。
【００５１】
得られた反応産物は高速液体クロマトグラフィーに供して評価した。高速液体クロマトグラフィーの条件は実施例１（１）で用いたものと同様である。
【００５２】
未処理サンプル（１４−ＤＨＥ分取物）のクロマトグラムを図１Ａに、処理１〜５に供したサンプルのクロマトグラムを図１Ｂ〜Ｆにそれぞれ示す。図１Ｂおよび図１Ｃでは、図１Ａと同じ位置（１１．５分付近）にピークは存在せず、９．５分付近にピークが出現した。一方、図１Ｄ〜Ｆでは、ピーク位置が図１Ａと同じ位置に存在した。これらのことから、１４−ＤＨＥにＵＶ処理を施すと極性が高くなるような構造変化が生じ、新規化合物が得られることが明らかとなった。
【００５３】
なお、処理時の溶媒がジクロロメタンの場合（図１Ｃ）には、溶媒がエタノールの場合（図１Ｂ）と比較して、９．５分付近のピーク高が若干低く、かつ、溶出時間の早い位置（２〜６分）のピークがわずかに高くなった。このことから、ジクロロメタンのような極性の低い溶媒中では、生成された構造変換物（９．５分付近、最も大きい２２５ｎｍのピークと、次に大きい２６５ｎｍのピーク）の分解が進む可能性が示唆された。
【００５４】
（３）ＵＶ照射時間の検討
１４−ＤＨＥ分取物を１ｍｇ／ｍＬになるようエタノールに溶解したものを、ＵＶ灯（波長約２５５ｎｍ）をオンにしたクリーンベンチに放置し、ＵＶ照射時間ごとの反応産物の変化を高速液体クロマトグラフィーによりモニターした。高速液体クロマトグラフィーの条件は、カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（１０×２５０ｍｍ）（野村化学社製）、移動層；アセトニトリル／２−プロパノール＝９９／１、流速；３．０ｍＬ／分、検出波長；３２０ｎｍ、２４０ｎｍ）であった。
【００５５】
ＵＶ照射時間ごとの変化を図２に示す。１４−ＤＨＥは照射開始から１時間で構造変化が完了した。このことから、ＵＶ照射による構造変換のために必要な時間は非常に短時間であることが分かった。
【００５６】
実施例２：新規化合物の構造解析
１４−ＤＨＥ分取物を重メタノールに１ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、ＵＶ灯（波長約２５５ｎｍ）をオンにしたクリーンベンチに３時間放置した。ＵＶ照射したサンプルを高速液体クロマトグラフィーに供して分析し、ピーク（９．５分付近、２６５ｎｍ）のみを分取し、精製した。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は実施例１（１）で用いたものと同様である。分取物を核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定で構造を確認した。
【００５７】
測定の結果は以下の通りである。
（１）1H-NMR(CDCl3)：1.20 &#8211; 1.40 (2H), 1.60 (1H, m), 1.85 (1H, m), 3.85 (1H, m), 2.05 (1H, m), 2.40 (1H, m), 6.09 (1H, d, J=11.2 Hz), 5.94 (1H, d, J=11.2 Hz), 5.59 (1H, m), 2.05 &#8211; 2.15 (2H), 1.97 (1H, m), 2.26 (1H, m), 5.44 (1H, m), 2.05 (1H, m), 2.20 (1H, m), 1.60 (1H, m), 0.90 (3H, s), 1.63 (3H, s), 2.27 (1H, m), 1.05 (3H, d, J=6.8 Hz), 5.27 (1H, m), 5.21 (1H, m), 1.86 (1H, m), 1.47 (1H, m), 0.83 (3H, d, J=6.5 Hz), 0.85 (3H, d, J=6.5 Hz), 0.93 (3H, d, J=7.3 Hz).
（２）13C-NMR(CDCl3)：29.7 (t), 31.0 (t), 67.5 (d), 37.5 (t), 125.7 (s), 130.1 (d), 128.8 (d), 131.7 (s), 126.8 (d), 130.1 (s), 24.1 (t), 36.2 (t), 45.2 (s), 147.8 (s), 120.9 (d), 29.9 (t), 56.9 (d), 15.5 (q), 19.7 (q), 38.8 (d), 21.0 (q), 135.4 (d), 132.2 (d), 42.8 (d), 33.1 (d), 19.7 (q), 20.0 (q), 17.7 (q).
（物理化学的特性）
（１）分子量：394.63
（２）分子式：C28H42O(高分解能APCI-Orbitrap法による観測値:m/z 395.3302(M+H)+)
（３）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、メタノールに易溶
【００５８】
上記測定結果から、得られた化合物は１４−ＤＨＥのステロイドＢ環が開環した新規化合物であることが判明した（ＩＵＰＡＣ名：１４，１５-デヒドロキシ-６Ｚ-エルタカルシオール（１４，１５−ｄｅｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｚ−ｅｒｔａｃａｌｃｉｏｌ）（仮称）、ＣＡＳ名：３β，６Ｚ，２２Ｅ）−９，１０−セコエルゴスタ−５（１０），６，８，１４，２２−ペンタエン−３−オール（３β，６Ｚ，２２Ｅ）−９，１０−ｓｅｃｏｅｒｇｏｓｔａ−５（１０），６，８，１４，２２−ｐｅｎｔａｅｎ−３−ｏｌ））。以下、この新規化合物を「１４，１５−ＤＨＥ」という。
【００５９】
実施例３：１４，１５−ＤＨＥの抗炎症作用の検証
１４，１５−ＤＨＥについて抗炎症作用を確認する試験を行った。抗炎症作用確認試験は、マウス骨髄由来樹状細胞を用いて、ＬＰＳ刺激に応答してのＣＤ８６の発現に対する１４，１５−ＤＨＥの影響を評価することで行った。なお、ＣＤ８６は、抗原刺激により樹状細胞等に発現する補助刺激分子であり、樹状細胞の成熟化の指標としても知られている。
【００６０】
具体的には、まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールズリバー社より入手）の大腿骨から骨髄細胞を常法に従って回収し、赤血球除去処理を行った。次に得られた骨髄細胞を、１０％ＦＣＳ、２μＭ  β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に、１×１０６細胞／ｍＬになるように懸濁した。得られた細胞懸濁液に、樹状細胞（ＤＣ）誘導サイトカインとしてＦｌｔ−３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度１００ｎｇ／ｍＬで添加した。続いて、エタノールに溶解した１４，１５−ＤＨＥ、１４−ＤＨＥをそれぞれ終濃度０、１、３、５μＭになるように添加した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて１週間、細胞を培養し、最終日の７日目にＬＰＳ（シグマアルドリッチ社製）を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した。また、対照としてＬＰＳ非添加試料を作製した。
【００６１】
培養８日目に細胞を回収し、ＣＤ８６の発現量をフローサイトメーターを用いて解析した。すなわち、細胞を回収し、洗浄した後、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ−Ｃｙ７、抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗Ｂ２２０−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ８６−ＰＥの各抗体（すべて、ベクトンディッキンソン社から入手）を用いて３０分間、４℃にて染色し、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）を用いて解析した。ＣＤ８６の発現量は平均蛍光強度（ＭＦＩ）として評価した。
【００６２】
なお、Ｆｌｔ−３Ｌを添加して樹状細胞を培養すると、通常、ミエロイドＤＣ（ｍＤＣ）とプラスマサイトイドＤＣ（ｐＤＣ）が生成される。本実施例では、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−で定義されるｍＤＣにゲートを設定して解析を行った。
【００６３】
その結果を図３に示す。樹状細胞においてはＬＰＳ刺激によりＣＤ８６の発現量が上昇するが、１４，１５−ＤＨＥを添加することにより、ＣＤ８６の発現量の上昇が抑制されることが確認された。ＣＤ８６は樹状細胞の成熟および炎症の指標となるものであることから、１４，１５−ＤＨＥは抗炎症作用を有することが分かった。１４−ＤＨＥは抗炎症作用を有することが知られているところ（特許文献３）、１４，１５−ＤＨＥについても１４−ＤＨＥと同等の抗炎症作用を有することが明らかとなった。
【００６４】
実施例４：１４，１５−ＤＨＥエキスの調製
（１）１４−ＤＨＥエキスの調製
実施例１と同じ方法で白麹菌を培養し、培養菌体を回収し、菌体１ｇに対して４ｍＬの５９（ｗ／ｗ）％エタノール水溶液を加え一晩浸漬した。浸漬液を攪拌した後、１ｍＬのナタネ油（ｗａｋｏ社製）を加え、さらに攪拌し、上清（油層）を回収した。
【００６５】
得られたエキス（上清）を高速液体クロマトグラフィーに供し、１４−ＤＨＥを定量した。高速液体クロマトグラフィーの条件は、カラム；Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ（ｉｍｔａｋｔ社製）、移動相；ヘキサン／イソプロパノール＝９９／１、１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長；３２０ｎｍであった。
【００６６】
得られたエキス中の１４−ＤＨＥ濃度が３５０μｇ／ｍＬとなるように適宜ナタネ油を添加し、これを１４−ＤＨＥエキスとした。
【００６７】
（２）１４，１５−ＤＨＥエキスの調製
１４−ＤＨＥエキスを密封容器に充填し、ヘッドスペースを窒素置換した。これをＵＶ灯をオンにしたクリーンベンチ内に３時間放置した。
【００６８】
得られたエキスを実施例４（１）と同じ条件の高速液体クロマトグラフィーに供し、１４−ＤＨＥが消失していること、１４，１５−ＤＨＥが生成されていること、およびその濃度を確認した。
【００６９】
得られたエキス中の１４，１５−ＤＨＥ濃度が３５０μｇ／ｍＬとなるように適宜ナタネ油を添加し、これを１４，１５−ＤＨＥエキスとした。
【００７０】
実施例５：１４，１５−ＤＨＥの安定性の検証
１４，１５−ＤＨＥを含有する乳化液を調製し、飲料中での安定性を確認する試験を行った。
【００７１】
（１）１４，１５−ＤＨＥまたは１４−ＤＨＥを含有する乳化液の調製
ショ糖パルミチン酸エステル製剤Ｐ−１６７０（三菱化学社製）を終濃度０．１５（ｗ／ｖ）％、実施例４で得られた１４，１５−ＤＨＥエキスまたは１４−ＤＨＥエキスを終濃度１（ｗ／ｖ）％となるように添加して乳化液を調製した。計算は乳化液の最終ボリュームを２Ｌとして行った。具体的な操作は以下のとおりである。
【００７２】
まず、消泡液を調製した。すなわち、３ｇのＰ−１６７０を常温の水１５０ｍＬに分散させた。その後、１．５Ｌの６０℃の熱水を攪拌しながら添加した。
【００７３】
上記消泡液に、別に調製しておいた２０ｇの１４，１５−ＤＨＥエキス（１４，１５−ＤＨＥとして３５０μｇ／ｍＬ含有）または１４−ＤＨＥエキス（１４−ＤＨＥとして３５０μｇ／ｍＬ含有）を添加し、さらに２Ｌになるように熱水を追加しさらに攪拌した。この攪拌はハンドミキサーを用いた。その後、混合液をすみやかに一段均質圧力１５ＭＰａ、二段均質圧力５ＭＰａで均質化した。この二段均質化工程を２回繰り返した後、１０℃まで冷却した。なお、均質化処理にはイズミフードマシナリ社製の高圧ホモジナイザーを用いた。
【００７４】
（２）安定性確認試験
実施例５（１）で調製した乳化液をペットボトルに充填し、暗所で４０℃の条件下で４週間保存した。
【００７５】
乳化液に等量の酢酸エチルを加え、激しく攪拌、超音波処理を行い、１４，１５−ＤＨＥまたは１４−ＤＨＥを含有する乳化液中の１４，１５−ＤＨＥまたは１４−ＤＨＥを酢酸エチル層に回収し、高速液体クロマトグラフィーに供することで、残存している１４，１５−ＤＨＥまたは１４−ＤＨＥ濃度を定量評価した。具体的には、実施例１（１）と同じ条件で高速液体クロマトグラフィーに供して分析し、保存開始日（１日目）のピーク面積値を１００％として、保存期間（１週間目、２週間目、３週間目および４週間目）で得られるそれぞれの化合物のピーク面積値の割合を残存率として評価した。
【００７６】
その結果を図４に示す。１４−ＤＨＥは乳化液中において４０℃、３週間で残存量がほぼ０になってしまうのに対し、１４，１５−ＤＨＥは４週間後でも６０％以上が残存していることが分かった。このことから、１４，１５−ＤＨＥは１４−ＤＨＥよりも飲料中での安定性が高いことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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