(57)【要約】【課題】フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを生産できる酵素及びその遺伝子、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法を提供すること。【解決手段】ヤンバルトサカヤスデから得られるモノオキシゲナーゼ（シトクロムＰ４５０）遺伝子、この遺伝子の発現により産生される酵素、この酵素を用いるフェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から３０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
モノオキシゲナーゼ活性が、フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを生成する酵素活性である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする遺伝子、又は下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から３０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を搭載したベクターである、組換えベクター。
【請求項５】
宿主細胞を請求項３に記載の遺伝子または請求項４に記載の組換えベクターで形質転換させた、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の生産方法。
【請求項７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、フェニルアセトニトリルに請求項１又は２に記載のタンパク質を作用させて、（Ｒ）-マンデロニトリルを生成させる工程を含む、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法。
【請求項８】
シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、４-ヒドロキシフェニルアセトニトリル、２-メチルフェニルアセトニトリル、又は３-メチルフェニルアセトニトリルに請求項１に記載のタンパク質を作用させて、4-ヒドロキシマンデロニトリル、2-メチルマンデロニトリル、又は3-メチルマンデロニトリルを生成させる工程を含む、
マンデロニトリル類の製造方法。
【請求項９】
L-フェニルアラニンに、L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する活性を有する酵素群を作用させてフェニルアセトニトリルを生成させ、生成したフェニルアセトニトリルに、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、請求項１又は２に記載のタンパク質を作用させて（Ｒ）-マンデロニトリルを生成させる工程を含む、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法。
【請求項１０】
前記フェニルアセトニトリルの生成及び（Ｒ）-マンデロニトリルの生成を１つの反応容器内で行う請求項７〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する活性を有する酵素群が、フェニルアラニン N-モノオキシゲナーゼとアルドキシムデヒドラターゼの組合せである請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、モノオキシゲナーゼ活性を保持する、粗抽出物、精製物、ミクロソーム画分、又は菌体の形態である請求項７〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程は、ｐＨ７以下で行う、請求項７〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
前記工程は、２５℃以下の温度で行う、請求項７〜１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規モノオキシゲナーゼ、及びこれを用いる（Ｒ）−マンデロニトリル類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性マンデロニトリルは、医薬やファインケミカルの製造において重要な中間体である。（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法としては、ベンズアルデヒドとシアニドドナーにヒドロキシニトリルリアーゼを作用させる方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、シアン化合物は人体に対して強い毒性がある。
【０００３】
フェニルアセトニトリルのα位をＲ選択的に水酸化することができれば、シアン化合物を使わずに（Ｒ）-マンデロニトリルを製造できる。ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ）由来のＣＹＰ７１ＡＮ２４はフェニルアセトニトリルのα位を水酸化し、マンデロニトリルに変換する（非特許文献１）。しかし、その活性は弱く、反応生成物としてマンデロニトリルではなく、その分解産物であるベンズアルデヒドが生じる。そのため、マンデロニトリルの立体化学が不明であるだけでなく、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造には不適であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−２１７５９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８６，２１５〜２２３  （２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造には一般的にシアン化合物が使われるが、有害なシアン化合物の使用は好ましくない。
そこで本発明は、有害なシアン化合物を使用することなく（Ｒ）-マンデロニトリルを製造する方法と、当該製造方法に使用できる新規モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、および、当該モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ヤンバルトサカヤスデから得られるモノオキシゲナーゼ（シトクロムＰ４５０）遺伝子を見出し、当該遺伝子の発現により産生される酵素を用いれば、フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを製造できることを見出して、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、人体に有害なシアン化合物を用いることなく、入手容易なフェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを製造することができ、原料を変えることで、（Ｒ）-マンデロニトリル以外のマンデロニトリル類を製造ることもできる。さらに、L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する活性を有する酵素群と組合せることで、L-フェニルアラニンから(R)-マンデロニトリルを製造することもできる。（Ｒ）-マンデロニトリル及びその他のマンデロニトリル類は医薬やファインケミカルの製造における重要な中間体であることから、本発明は、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例３においてマンデロニトリルを、キラルカラムを用いて分離したクロマトグラムである。クロマトグラム１は（Ｒ，Ｓ）-マンデロニトリルの標品であり、クロマトグラム２はＢ０Ｃ１ＬとフェニルアセトニトリルをＮＡＤＰＨ存在下でインキュベートした際の反応生成物、クロマトグラム３はＢ０Ｃ１ＬとフェニルアセトニトリルをＮＡＤＰＨ非存在下でインキュベートした際の反応生成物である。
【図２】図２は、実施例４においてｐＨのＢ０Ｃ１Ｌに対する影響を調査した結果である。（Ａ）に、各ｐＨにおけるＢ０Ｃ１Ｌの相対活性を示した。（Ｂ）に、各ｐＨにおける（Ｒ）-マンデロニトリルとその分解産物であるベンズアルデヒドの割合を示した。（Ｃ）に、各ｐＨにおけるＢ０Ｃ１Ｌの安定性を示した。
【図３】図３は、実施例４において温度のＢ０Ｃ１Ｌに対する影響を調査した結果である。（Ａ）に、各温度におけるＢ０Ｃ１Ｌの相対活性を示した。（Ｂ）に、各温度におけるマンデロニトリルとその分解産物であるベンズアルデヒドの割合を示した。（Ｃ）に、各温度におけるＢ０Ｃ１Ｌの安定性を示した。
【図４】図４は、実施例５において組換え酵母から調製したＢ０Ｃ１Ｌ発現ミクロソームのＣＯ差スペクトルである。
【図５】図５は、実施例６においてＢ０Ｃ１Ｌを用いた（Ｒ）-マンデロニトリル生産を示した図である。
【図６】図６は、Ｂ０Ｃ１Ｌのアミノ酸配列（上）及び塩基配列（下）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜新規モノオキシゲナーゼ＞
本発明は、下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質に関する。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から３０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００１１】
本発明のタンパク質の（１）における、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヤンバルトサカヤスデ由来P450のアミノ酸配列である。実施例１にアミノ酸配列決定については詳述する。モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質（１）は、シトクロムＰ４５０であり、ＮＡＤＰＨおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトニトリル（Ｉ）を（Ｒ）-マンデロニトリル（ＩＩ）に変換する活性を有するシトクロムＰ４５０（以下、「Ｂ０Ｃ１Ｌ」と略記する）である。シトクロムＰ４５０は、ＮＡＤＰＨの存在下で基質を水酸化する酵素の総称であり、還元状態で一酸化炭素と結合して４５０ｎｍに吸収極大を示す色素という意味で命名されている。
【００１２】
本発明のタンパク質の（２）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から３０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「１から３０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から３０個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素であることを意味する。前記「１から３０個」の範囲は、前記モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である割合が高いという観点から、例えば、１から２５個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１から１０個、一層好ましくは１から７個、さらに一層好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度であることができる。
【００１３】
本発明のタンパク質の（３）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における同一性は、前記アミノ酸配列の同一性を有するタンパク質が、モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上である。さらに、アミノ酸配列の同一性は、特に好ましい中でも、９９．３％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上であることがとりわけ好ましい。
【００１４】
なお、本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌとアミノ酸配列の同一性が最も高い既知のシトクロムＰ４５０は、Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ由来のｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  １８ａ１-ｌｉｋｅ（ＸＰ＿００２７３１６６０）であり、その同一性は３４％である。
【００１５】
本発明のタンパク質が有するモノオキシゲナーゼ活性は、例えば、フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを生成する酵素活性であることができ、フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを生成する酵素活性は、下記の方法で決定することができる。
酵素活性の測定のための反応は、５０μＬのミクロソーム、50 mM リン酸カリウム緩衝液（ｐH 6.0）、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  フェニルアセトニトリル（基質）を含む反応液２００μＬで、３０℃、10分間行った。（R）-マンデロニトリルの生成の有無は高速液体クロマトグラフィーにより明らかにした。カラムはキラルセル  ＯＪ-Ｈ（ダイセル化学社製）、移動相はヘキサン：イソプロパノール  ８５：１５を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００１６】
本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌはフェニルアセトニトリルを基質として（R）-マンデロニトリルを生成する活性を有するのに対して、従来のシトクロムＰ４５０は、この活性は有しなかった。
【００１７】
本発明のモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、上記モノオキシゲナーゼを産生することができる。より具体的には、上記タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、生産方法により調製することができる。上記タンパク質をコードする遺伝子の取得方法、及び本発明のタンパク質の調製方法は、後述する。
【００１８】
上記アミノ酸配列（１）〜（３）を有するシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）は、ＮＡＤＰＨおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトニトリル化合物（Ｉ）を（Ｒ）-マンデロニトリル誘導体（ＩＩ）に変換するモノオキシゲナーゼ活性を有する。本発明のタンパク質において「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸配列（１）〜（３）で特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、上記モノオキシゲナーゼ活性が維持されていることを意味する。
【００１９】
アミノ酸配列（１）〜（３）で特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、公知のＨＡやＦｌａｇなど末端部における付加配列、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。また、本発明のＢ０Ｃ１Ｌは、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよく、Ｎ−グリコシル化などの各種修飾を受けていてもよい。
【００２０】
＜新規モノオキシゲナーゼ遺伝子＞
本発明は、前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子、又は下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から３０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【００２１】
上記塩基配列（１）〜（３）のいずれかの塩基配列を有する遺伝子は、前述したシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子（以下、「Ｂ０Ｃ１Ｌ遺伝子」と略記する）である。Ｂ０Ｃ１Ｌ遺伝子において、それぞれ上記塩基配列（１）〜（３）を「有する」とは、これら塩基配列が含まれており、且つ、コードされているタンパク質が上記の活性を有するものである限り、いかなる核酸であってもよいとの意味である。例えば、各塩基配列に５'ＵＴＲや３'ＵＴＲ、開始コドン、終止コドンなどを加えた核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
上記塩基配列（１）（配列番号１）を有するシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）遺伝子は、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）の核酸から特定されたものである。
【００２３】
本発明に係る塩基配列（２）の「１から３０個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有する塩基配列」における「１から３０個」の範囲は、欠失などを有する塩基配列を有する核酸にコードされるタンパク質が、ＮＡＤＰＨおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトニトリルを（Ｒ）-マンデロニトリルに変換する活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記「１から３０個」の範囲は、前記酵素活性を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、１個以上、２５個以下、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、よりさらに好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、さらには１個または２個であることができる。
【００２４】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば９０％以上、好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２６】
本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌ遺伝子（配列番号２）を得る方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法が採用される。例えば、これら各遺伝子を有する生物のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明のＢ０Ｃ１Ｌをコードする遺伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって公知手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、本発明に係るＢ０Ｃ１ＬをコードするＤＮＡ（配列番号２）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。なお、ゲノミックライブラリーの作成に用いるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクターなどが挙げられる。
【００２７】
また、本発明のＢ０Ｃ１Ｌ遺伝子は、特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００２８】
本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌは、ヤスデに含まれている場合があり、その場合には、ヤスデから精製することができる。本発明のシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）が含まれているヤスデは、例えば、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）またはゲノムの少なくとも一部がデータベース化されているヤスデから、上記Ｂ０Ｃ１Ｌ遺伝子の塩基配列を有するものを検索することにより見出すことができる。かかる相同性検索では、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴＮを好適に用いることができる。
【００２９】
ＥＳＴまたはゲノムがデータベース化されていないヤスデの場合には、例えば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニングベクターを使用して対象となるヤスデからゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌ遺伝子の塩基配列の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明に係る遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、目的とする遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポリヌクレオチドの長さは、１００ｂｐ以上が好ましい。
【００３０】
より具体的には、配列番号２に記載の遺伝子がコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８，５０３（１９７５））やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０〜１３５４（１９８５）；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７-４９１（１９８８））を利用する方法が挙げられる。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により製造できるＢ０Ｃ１Ｌと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた、本発明の遺伝子の範囲に含まれる。
【００３１】
このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション／洗浄条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、０．２％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を用いれば、より同一性の高い遺伝子の効率的な単離を期待することができる。これにより単離された遺伝子は、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、本発明のＢ０Ｃ１Ｌのアミノ酸配列（配列番号２）と高い同一性を有すると考えられる。高い同一性とは、アミノ酸配列全体で９９％以上、好ましくは９９．２％以上、さらに好ましくは９９．４％以上、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、特に好ましくは９９．９％以上である。
【００３２】
配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：２４４４〜２４４８（１９８８））やＢＬＡＳＴＰ検索により決定することができる。
【００３３】
上記塩基配列（２）の塩基配列は、上記塩基配列（１）の塩基配列を有する核酸に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて得ることができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９や、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００３４】
ある遺伝子が本発明のＢ０Ｃ１Ｌと同等の機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、後記の実施例に記載のようにシトクロムＰ４５０レダクターゼとともに目的の遺伝子を導入した宿主細胞からミクロソーム画分を調製し、かかるミクロソーム画分に、本発明のシトクロムＰ４５０の基質であるフェニルアセトニトリルを添加し、反応生成物が（R）-マンデロニトリルであるかを同定することにより決定できる。或いは、シトクロムＰ４５０レダクターゼとともに目的の遺伝子を導入した酵母の菌体を含む懸濁液にフェニルアセトニトリルを添加し、懸濁液中に（R）-マンデロニトリルが生成しているかどうかを確認することにより決定することができる。或いは、目的の遺伝子を好適な宿主細胞にて発現させ、単離精製した酵素標品に、シトクロムＰ４５０レダクターゼの存在下で、フェニルアセトニトリルを添加し、（R）-マンデロニトリルを生成するかを同定することによって決定することもできる。
【００３５】
生成物が（R）-マンデロニトリルであるかの同定方法は、（R）-マンデロニトリル標品と、生成物とを、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳなどにより解析し、その結果同じ生成物であるか否かを判定することにより同定することができる。
【００３６】
本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌをヤスデから精製する場合には、例えば、各活性を測定しつつ、一般的な抽出、塩析、クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて用いればよい。また、本発明に係るＢ０Ｃ１Ｌ遺伝子を用いて形質転換した場合には、Ｂ０Ｃ１Ｌは、形質転換体から同様に精製してもよい。また、本発明における精製は、酵素が単離されるまでの精製に限定されるものではなく、菌体破砕液などの粗精製も含まれるものとする。
【００３７】
＜ベクター＞
本発明は、前記本発明の遺伝子を搭載したベクターである、組換えベクターを包含する。本発明に係るベクターは、上記本発明の遺伝子を含む。かかるベクターは、公知の形質転換方法によって宿主に発現可能に導入されることによって、当該宿主において組み込まれた遺伝子あるいは遺伝子断片を発現させて本発明のＢ０Ｃ１Ｌの製造に利用できるものである。なお、本発明のＢ０Ｃ１Ｌは、下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、ヤスデから単離、精製したものでもよく、その起源は特に限定されない。
【００３８】
本発明において使用することができるベクターとしては、従来から細菌や真菌などの形質転換に使用されているベクターを挙げることができる。例えば細菌用ベクターとしては、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ系などを挙げることができ、酵母用ベクターとしては、ｐＧＹＲ、ｐＦＬＤ、ｐＹＥＳ２などを挙げることができ、植物用ベクターとしては、ｐＢＩ１２１を挙げることができ、昆虫培養細胞発現ベクターとしては、ｐＦａｓｔｂａｃ１を挙げることができる。
【００３９】
本発明に係るベクターは、上記Ｂ０Ｃ１Ｌ遺伝子の他に、遺伝子を発現させるための従来公知の構成的プロモーター、発現誘導性プロモーター、形質転換体の選抜を容易にする薬剤耐性遺伝子を含んでいることが好ましい。構成的プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターやカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを挙げることができる。発現誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｌａｃプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーターを挙げることができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシンに対する抵抗性遺伝子を挙げることができる。
【００４０】
宿主細胞が内在性のシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を有さない場合は、本発明のＢ０Ｃ１Ｌの活性を宿主細胞内で発揮させるために、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を含むベクターを使用するのが好ましい。
【００４１】
＜形質転換体＞
本発明は、宿主細胞を本発明の遺伝子または本発明の組換えベクターで形質転換させた、形質転換体を包含する。本発明に係る形質転換体は、例えば、上記本発明の遺伝子を含む上記ベクターにより形質転換されているものである。当該形質転換体は、上記ベクターを対象の宿主細胞に導入することにより調製される。
【００４２】
本発明に係る形質転換体は、上記ベクターに含まれた上記本発明の遺伝子が導入されたものである。より具体的にいえば、本発明に係る形質転換体は、本発明のＢ０Ｃ１Ｌをコードする遺伝子が導入されたものである。ここで、「遺伝子またはベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法により、本発明のＢ０Ｃ１Ｌ遺伝子が、例えばプロモーターの作用により発現可能に導入されることを意味する。
【００４３】
本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子を直接、或いは上記遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、あるいは、植物細胞や昆虫細胞などを挙げることができる。後記の実施例に記載のように、宿主細胞としては、酵母が好ましい。さらに、上記ベクターに組み込まれた本発明遺伝子が節足動物の一種であるヤンバルトサカヤスデ由来のものであることから、上記宿主としては、昆虫培養細胞も好ましい。なお、形質転換は一過性でもよいが、好ましくは安定に上記遺伝子が組み込まれるものである。
【００４４】
本発明の遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーター、例えば、大腸菌ではＬａｃプロモーター、酵母では、ＧＡＰＤＨプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーター、植物細胞では、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、昆虫細胞では、バキュロウイルスプロモーターの下流域に連結して使用する。なお、宿主細胞が内在性のシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を有さない場合は、本発明のＢ０Ｃ１Ｌの活性を宿主細胞内で発揮させるためにはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を導入することが好ましい。昆虫細胞では、シトクロムＰ４５０レダクターゼを導入しなくても、内在性のシトクロムＰ４５０レダクターゼだけで本発明の酵素の活性を発揮せしめることができ、酵母でも低い活性であれば内在性のシトクロムＰ４５０レダクターゼだけで発揮せしめることができる。
【００４５】
上記形質転換宿主細胞を含む形質転換体を作製する方法としては、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、形質転換植物を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．，ｐｐ６６-７４（１９９５））、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，１５０３〜１５０７（１９９２））、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９５７〜９６２（１９９１））およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１-２８２（１９９４））などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法は、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択されることが好ましい。即ち、例えば宿主が酵母である場合は、塩化リチウム法が好ましい。
【００４６】
組換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母等の真菌細胞、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。特に、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を有するベクターを用いることができ、さらに取り扱いが容易であることから酵母発現系が好ましい。シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子としては、公知の遺伝子を用いることができる。
【００４７】
宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．＆  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５８〜１６２（１９７０）；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７〜５８０（１９８３））を用いることができる。また、酵母への導入には、塩化リチウム法（Ｉｔｏ  Ｈ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｙ，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ．＆  Ｋｉｍｕｒａ  Ａ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｋａｌｉ  ｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５３，１６３〜１６８（１９８３））が挙げられる。宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、当該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
【００４８】
＜タンパク質の生産方法＞
本発明は、前記本発明の形質転換体を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の生産方法を包含する。
【００４９】
前記本発明の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
【００５０】
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５１】
＜（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法（１）＞
本発明は、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、フェニルアセトニトリルに本発明のタンパク質を作用させて、（Ｒ）-マンデロニトリルを生成させる工程を含む、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法を包含する。本発明のタンパク質は、フェニルアセトニトリルを（Ｒ）-マンデロニトリルに変換するモノオキシゲナーゼ活性を保持していればよく、精製物であっても、粗抽出物であっても、ミクロソーム画分であっても、菌体であっても構わない。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、酵素（精製物又は粗抽出物）として反応系に添加することも可能であるが、ミクロソーム画分や菌体を用いる場合には、菌体に内在するシトクロムＰ４５０レダクターゼを利用すること、あるいは、菌体に外来遺伝子として導入したシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子が菌体内で発現したシトクロムＰ４５０レダクターゼを利用することもできる。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、公知のシトクロムＰ４５０レダクターゼであれば制限なく利用できる。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈを利用して、本発明のシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）を還元し、還元されたシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）がフェニルアセトニトリルから（Ｒ）マンデロニトリルを生成する。
【００５２】
例えば、本発明の遺伝子を、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子と共に酵母などの宿主細胞に導入した形質転換体は、それ自体（菌体）、その培養液、その菌体破砕液などをフェニルアセトニトリルから（Ｒ）−マンデロニトリルの製造に利用することができる。
【００５３】
フェニルアセトニトリルから（Ｒ）マンデロニトリルの製造の製造工程は、本発明のシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）の至適ｐＨ及び（Ｒ）−マンデロニトリルの分解を防ぐために、ｐＨ７以下で行うことが好ましく、ｐＨ５〜６の範囲がより好ましい。さらに、上記工程は、同様の理由で、２５℃以下の温度で行うことが好ましく、１５〜２０℃の温度で行うことがより好ましい。生成した（Ｒ）−マンデロニトリルは、常法により、反応液から分離し、必要により精製することができる。
【００５４】
＜（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法（２）＞
本発明は、L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換するために必要な酵素、本発明のタンパク質シトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、及びL-フェニルアラニンを共存させて、（Ｒ）-マンデロニトリルを生成させる工程を含む、（Ｒ）-マンデロニトリルの製造方法を包含する。
【００５５】
L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する酵素群は、例えば、フェニルアラニン N-モノオキシゲナーゼとアルドキシムデヒドラターゼであることができる。何れの酵素も市販品又は文献記載にしたがって、入手することができる。L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する酵素群はL-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへ変換し、さらに生成したフェニルアセトニトリルは、シトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）により、（Ｒ）-マンデロニトリルに変換される。L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する酵素及びシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）は、精製物であっても、粗抽出物であっても、ミクロソーム画分であっても、菌体であっても構わない。L-フェニルアラニンからのフェニルアセトニトリルの生成反応、及び（Ｒ）-マンデロニトリルの生成は、別の反応容器で順次行うこともできるが、１つの反応容器内で行うこともできる。１つの反応容器内で行う場合、L-フェニルアラニンをフェニルアセトニトリルへと変換する酵素及びシトクロムＰ４５０（Ｂ０Ｃ１Ｌ）は、別々の宿主（形質転換体）由来であっても、１つの宿主（形質転換体）に共用発現させた物であってもよい。
【００５６】
前記工程は、（Ｒ）マンデロニトリルの分解を防ぐために、ｐＨ７以下で行うことが好ましく、ｐＨ５〜６の範囲がより好ましい。さらに、上記工程は、同様の理由で、２５℃以下の温度で行うことが好ましく、１５〜２０℃の温度で行うことがより好ましい。生成した（Ｒ）−マンデロニトリルは、常法により、反応液から分離し、必要により精製することができる。
【００５７】
＜マンデロニトリル類の製造方法＞
本発明は、レダクターゼおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈの存在下、４-ヒドロキシフェニルアセトニトリル、２-メチルフェニルアセトニトリル、又は３-メチルフェニルアセトニトリルに本発明のタンパク質を作用させて、4-ヒドロキシマンデロニトリル、2-メチルマンデロニトリル、又は3-メチルマンデロニトリルを生成させる工程を含む、マンデロニトリル類の製造方法を包含する。この方法は、フェニルアセトニトリルに代えて、４-ヒドロキシフェニルアセトニトリル、２-メチルフェニルアセトニトリル、又は３-メチルフェニルアセトニトリルを用いることで、4-ヒドロキシマンデロニトリル、2-メチルマンデロニトリル、又は3-メチルマンデロニトリルを生成させる方法である。原料化合物が異なる以外は、上記本発明の方法と同様の方法及び条件で実施することができる。
【００５８】
生成した4-ヒドロキシマンデロニトリル、2-メチルマンデロニトリル、又は3-メチルマンデロニトリルは、常法により、反応液から分離し、必要により精製することができる。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
実施例１：ヤンバルトサカヤスデトランスクリプトームデータを用いたシトクロムＰ４５０遺伝子のクローニング
ヤンバルトサカヤスデのトランスクリプトームデータ中の全コンティグを、ＢＬＡＳＴ２ＧＯを用いてＮＣＢＩのＮｏｎｅ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅに対してＢｌａｓｔｘ解析することでアノテーションした。なお、閾値（Ｅ-ｖａｌｕｅ）は１０-3以下とした。シトクロムＰ４５０とアノテーションされたコンティグのクローニングは以下のように行った。
ヤンバルトサカヤスデからＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＧｅｎｅｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応することでｃＤＮＡを合成した。シトクロムＰ４５０と相同性の認められた36のコンティグについて５’-および３’-ＲＡＣＥをすることで、各シトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡ全長を決定した。この操作により、Ｂ０Ｃ１Ｌのアミノ酸配列及び塩基配列である、配列番号1のアミノ酸配列及び配列番号２の塩基配列も特定された。その後、各シトクロムＰ４５０のコーディングシークエンスをＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ-ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へつなぎこみ、実施例２で用いた。
【００６１】
実施例２：ヤンバルトサカヤスデ由来シトクロムＰ４５０の調製
以下の通り、酵母発現系を用い、36種のヤンバルトサカヤスデ由来シトクロムＰ４５０を組換えタンパク質として生産した。
（１）ヤンバルトサカヤスデ由来シトクロムＰ４５０発現ベクターの構築
36種のヤンバルトサカヤスデ由来シトクロムＰ４５０を酵母由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼと共発現させるため、酵母由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含むｐＧＹＲベクター（Ｔ．Ｓａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐｐ．１６４９７-１６５０２（１９９２））へ各シトクロムＰ４５０遺伝子を下記の方法により導入した。
インサートＤＮＡは実施例1で得た各プラスミドDNAを鋳型とし、各種プライマーとＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  を用いてＰＣＲにより調製した。インサートＤＮＡをｐＧＹＲベクターのＨｉｎｄＩＩＩサイトへＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてつなぎこんだ。PCRによる変異がないことをインサートの配列をシークエンスし、確認した。
【００６２】
（２）各シトクロムＰ４５０の発現
上記で得られた36種のシトクロムＰ４５０遺伝子発現プラスミドを酵母に導入し、形質転換した。形質転換酵母を培養した後、各シトクロムＰ４５０が局在していると考えられるミクロソーム画分を調製し、その活性を確認することにした。反応産物は、HPLC解析にて同定した。具体的には以下の手順に従った。
【００６３】
（ａ）各シトクロムＰ４５０発現プラスミドによる酵母の形質転換
発現用には、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株を用いた。ＡＨ２２株は、Ｌ−ヒスチジンとＬ−ロイシン以外の全ての必須アミノ酸を生合成することができる。ｐＧＹＲはＬ−ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）を持つため、培地にＬ−ヒスチジンを添加するとプラスミドを持った酵母のみが増殖できる。
【００６４】
上記発現プラスミドを使い、酵母ＡＨ２２株を塩化リチウム法で形質転換した。以下に方法を示す
酵母ＡＨ２２株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１％イーストエクストラクト，２％ポリペプトン，２％グルコース）に植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。培養液５００μＬを回収し、３，０００×ｇ，４℃で２分間遠心分離し、上清を除いた。菌体を５００μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、３，０００×ｇ，４℃で２分間、再度遠心分離した。上清を除き、１００μＬの酢酸リチウム溶液（２Ｍ酢酸リチウム１０μＬ、５０％ＰＥＧ４０００  ８０μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ  １０μＬ）に懸濁し、ＤＮＡ溶液（サケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ、各発現プラスミド  １０μＬ）を加えた。４０℃で３０分間インキュベートし、室温で８分間静置した。反応液を３，０００×ｇ，４℃で２分間遠心分離し、上清を取り除き、１ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ（０．６７％  イーストナイトロジェンベースアミノ酸不含，２％グルコース，２０μｇ／ｍＬ  Ｌ−ヒスチジン）に懸濁し、３０℃で５時間回復培養を行った。培養液１００μＬをＳＤ−Ｈｉｓ寒天培地に展開し、３０℃で３日間培養することで、形質転換体のコロニーを得た。
【００６５】
（ｂ）各形質転換体の培養とミクロソーム画分の調製
上記（ａ）で得た36種の形質転換体のコロニーを３ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ培地に植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。培養液を１５０ｍＬの濃縮ＳＤ−Ｈｉｓ培地（８％グルコース，５．４％イーストナイトロジェンベースアミノ酸不含，１６０μｇ／ｍＬ  Ｌ−ヒスチジン）に植継ぎ、２８℃で３日間培養した。組換え酵母の培養に用いる濃縮ＳＤ−Ｈｉｓ培地は、通常酵母の培養に用いるＳＤ−Ｈｉｓ培地より濃縮されているが、これは少ない培地量でできる限り多くの菌体を得るためである。
【００６６】
培地を５，０００×ｇ，４℃で５分間遠心分離して酵母を集菌し、上清を除き、２０％  グリセロール，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳの溶液（ｐＨ７．６）に懸濁した。当該懸濁液を５，０００×ｇ，４℃で５分間、再度遠心分離し、上清を除いた後に０．１ｍＭ  ＤＴＴ，２０％グリセロール、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液（ｐＨ７．６）に懸濁した。ビーズショッカー（安井機器社製）を用いて酵母を破砕し、破砕液を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することにより、細胞残渣とビーズを沈殿させた。上清を回収し、１５０，０００×ｇ、２℃で６０分間超遠心分離することでミクロソーム画分を沈殿させた。得られたミクロソーム画分を、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％グリセロール、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液（ｐＨ７．６）１ｍＬに懸濁し、ダウンス型ホモジナイザーを用いて溶液が均一になるまでホモジナイズした。
【００６７】
実施例３：組換えタンパク質を用いた酵素反応
36種の形質転換体から得たミクロソームを用いた酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  フェニルアセトニトリル（基質）を含む反応液２００μＬで、３０℃、10分間行った。
（R）-マンデロニトリルの生成の有無は高速液体クロマトグラフィーにより明らかにした。カラムはキラルセル  ＯＪ-Ｈ（ダイセル化学社製）、移動相はヘキサン：イソプロパノール  ８５：１５を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。その結果、供試した36種のヤンバルトサカヤスデ由来シトクロムP450のうち、B0C1Lだけがフェニルアセトニトリルを基質とし、図１に示したとおり、（Ｒ）-マンデロニトリルが検出されたが、（Ｓ）-マンデロニトリルは検出されなかった。以上のことから、Ｂ０Ｃ１Ｌがフェニルアセトニトリルを（Ｒ）-マンデロニトリルに変換するシトクロムＰ４５０であることが明らかとなった。
【００６８】
実施例４：Ｂ０Ｃ１Ｌの温度およびｐＨの影響
（ａ）至適ｐＨとｐＨ安定性
本酵素の至適ｐＨとｐＨ安定性を検討した。至適ｐＨの検討にはｐＨ５．０〜６．０域では５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５では５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．１〜８．５域ではトリス-塩酸緩衝液を使用した。酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、各種緩衝液、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  フェニルアセトニトリル（基質）を含む反応液２００μＬで、３０℃、5分間行った。生成物である(R)-マンデロニトリルおよびその分解物であるベンズアルデヒドは超高速液体クロマトグラフィーにより定量した。カラムはコスモシル  ２．５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（ナカライテスク社製）、移動相は０．１％ギ酸を含む２５％アセトニトリルを用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。測定結果を図２-Ａに示した。Ｂ０Ｃ１Ｌの至適ｐＨは６〜７と推定された。
【００６９】
各ｐＨにおけるマンデロニトリルとベンズアルデヒドの比を図２-Ｂに示した。低ｐＨ６以下においてマンデロニトリルの分解を防ぐことができると考えられた。
各ｐＨの緩衝液（上記緩衝液を使用）を４０℃で１５分加熱した後、残存活性を測定することで、ｐＨ安定性を検討した。結果を図２-Ｃに示した。本酵素はｐＨ５〜７で安定であると結論した。
【００７０】
（ｂ）至適温度と温度安定性
至適温度を検討した。酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．５）、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  フェニルアセトニトリル（基質）を含む反応液２００μＬ、各温度で、５分間行った。結果を図３-Ａに示した。至適温度は３５〜４０℃であり、４５℃で急激に酵素活性を示さなくなった。
各温度におけるマンデロニトリルとベンズアルデヒドの比を図３-Ｂに示した。２５°Ｃ以下でマンデロニトリルの分解を防ぐことができると考えられた。
Ｂ０Ｃ１Ｌの温度安定性を検討するため、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、各温度で１５分間加熱後、酵素活性を測定した。結果を図３-Ｃに示した。２０℃以下で安定であり、活性は８０％以上保持されていた。３５°Ｃにおいて残存活性は５０％以下となった。
【００７１】
実施例５Ｂ０Ｃ１Ｌの基質特異性
B0C1Lの定量はＣＯ差スペクトル法（Ｏｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９，ｐｐ．２３７０-２３７８（１９６４））により行った。図４の通り、Ｂ０Ｃ１ＬはシトクロムＰ４５０に特徴的な４５０ｎｍの極大吸収を示した。
【００７２】
酵素反応は、２０ｎＭのＢ０Ｃ１Ｌ、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよび基質として１ｍＭ  各種ニトリル  （フェニルアセトニトリル、４-ヒドロキシフェニルアセトニトリル、２-メチルフェニルアセトニトリル、３-メチルフェニルアセトニトリル、４-メチルフェニルアセトニトリル、インドール３-アセトニトリル、フェニルプロピオニトリル）を含む反応液２００μｌを用いて、３５℃で５分間行った。生成物は超高速液体クロマトグラフィーで定量した。
【００７３】
結果を表１に示す。Ｂ０Ｃ１Ｌはフェニルアセトニトリルに加え、４-ヒドロキシフェニルアセトニトリル、２-メチルフェニルアセトニトリル、３-メチルフェニルアセトニトリルに対して活性を示した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
ウメ由来のＣＹＰ７１ＡＮ２４もフェニルアセトニトリルをマンデロニトリルに変換することが報告されているが、ＣＹＰ７１ＡＮ２４のフェニルアセトニトリルに対するＫcat／Ｋmは１．３であり、Ｂ０Ｃ１ＬのＫcat／Ｋmは約１５倍の２０．１と明らかに高いことが示された。
【００７６】
実施例６：(R)-マンデロニトリルの生産
Ｂ０Ｃ１Ｌを用いてフェニルアセトニトリルから、（Ｒ）-マンデロニトリルの生産を行った。(R)-マンデロニトリルの分解を防ぐためにＢ０Ｃ１Ｌの至適温度、至適ｐＨではなく、ｐＨ６．０、２０℃で反応を行った。反応液は５００ｎＭのＢ０Ｃ１Ｌ、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、２ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよび基質として０．２５ｍＭフェニルアセトニトリルを含む反応液用いて行った。経時的に反応液を採取し、上記の条件で生成物を定量した。その結果を図5に示した。反応１０分後に０．１２ｍＭの（Ｒ）-マンデロニトリルが収率約５０％で得られた。以上のことから、Ｂ０Ｃ１Ｌを用いることで、フェニルアセトニトリルから（Ｒ）-マンデロニトリルを生産できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
（Ｒ）-マンデロニトリルは医薬やファインケミカルの製造における重要な中間体であることから、本発明は、医薬やファインケミカルの製造に関連する分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１：Ｂ０Ｃ１Ｌタンパク質
配列番号２：Ｂ０Ｃ１Ｌ遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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