(57)【要約】【課題】現存のバイオセンシングよりも、より高感度なバイオセンシングを実現することを目的とする。【解決手段】上記目的を達成するため、本発明は、リガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用い、かつ、洗浄液によるＢ／Ｆ分離工程を含む、アフィニティ反応を利用したバイオセンシングにおいて、Ｂ／Ｆ分離工程で、反応容器内のアフィニティ反応の反応場から上方に位置する内壁の一部に洗浄液を接触させるように吐出することを含む、洗浄方法を提供する。【選択図】図４
2017142073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用い、かつ、洗浄液によるＢ／Ｆ分離工程を含む、アフィニティ反応を利用したバイオセンシングにおいて、
Ｂ／Ｆ分離工程で、反応容器内のアフィニティ反応の反応場から上方に位置する内壁の一部に洗浄液を接触させるように吐出することを含む、洗浄方法。
【請求項２】
前記洗浄液は、反応容器の内壁に対して傾けた分注器の先端部から吐出される、請求項１に記載の洗浄方法。
【請求項３】
前記分注器の先端部は、分注器用プローブ、分注器用ノズル又は分注器用チップから選択される請求項１又は２に記載の洗浄方法。
【請求項４】
前記反応容器が、底面及び側壁面を有し、前記反応場が反応容器の底面であり、洗浄液を吐出する箇所が側壁面の一部である、請求項１〜３のいずれかに記載の洗浄方法。
【請求項５】
前記機能性物質は、磁性物質、導電性物質、蛍光物質及び酵素からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の洗浄方法。
【請求項６】
前記機能性物質として、前記微粒子が磁性物質を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の洗浄方法。
【請求項７】
洗浄液の吐出後に、アフィニティ反応に関与しなった前記微粒子を、磁気誘導で反応場から遠ざける工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微粒子が球形であって、当該粒径が１ｎｍ〜１０μｍである、請求項１〜７のいずれかに記載の洗浄方法。
【請求項９】
第１のリガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用いてアフィニティ反応を利用したバイオセンシングのための装置であって、
底面に第２のリガンドが固定化され、アフィニティ反応が終了した反応容器内に、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄液を吐出する機構及び当該洗浄液を吐出する機構の先端部を傾ける機構備え、
当該先端部が、洗浄液の吐出後に反応容器の側壁面の一部に接触させるように制御されている、装置。
【請求項１０】
第１のリガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用いてアフィニティ反応を利用したバイオセンシングのための装置であって、
底面に第２のリガンドが固定化され、アフィニティ反応が終了した反応容器内に、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄液を吐出する機構及び当該反応容器を傾ける機構を備え、
当該洗浄液を吐出する機構の先端部が洗浄液の吐出後に反応容器の側壁面の一部に接触させるように制御されている、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティ反応を利用したバイオセンシングにおける洗浄方法に関する発明であって、より具体的には、Ｂ／Ｆ（Ｂｉｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離工程のための洗浄方法に関する発明である。加えて、本発明は当該洗浄方法を実施するバイオセンシングのための装置に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
高感度バイオセンシング、特に高感度免疫分析を行うには、測定対象物質とアフィニティを示す抗体を反応容器に固定化し、これと測定対象物質を結合させた後、測定対象物質とアフィニティを示す別の抗体とで挟み込んで結合させるサンドイッチタイプの免疫測定法が広く用いられている。２種の抗体のうち一方は、９６穴マイクロプレートのウェルや、ポリマー微粒子、磁性を伴うポリマー微粒子（磁性微粒子）などの固相担体に結合させる。もう一方の抗体には、酵素、蛍光物質や導電性物質を直接標識し、ここから発信されるシグナル、例えば、化学発光、生物発光、蛍光、磁気又は電気化学発光などのシグナルを検出して測定する。
【０００３】
通常、上記の標識された抗体は、測定対象物質に対して過剰量添加される。そのため、検体中の測定対象物質以外の物質や、測定対象物質とアフィニティ反応しなかったフリーの標識抗体は反応後かつ検出前に洗浄により除去される必要がある（Ｂ／Ｆ分離）。
【０００４】
従来のＢ／Ｆ分離における洗浄方法において、反応容器の抗体が固定化された箇所（例えば、ウェルの底面）に直接洗浄液を吐出し、その洗浄液を吸引することが行われてきた。そして、洗浄液を吐出する際に生じる水流は、測定対象物質とこれにアフィニティを示す抗体との親和力へ影響を及ぼすとは考えられていなかったため、洗浄液の吐出方法については検討されていなかった。
【０００５】
近年、更なる高感度バイオセンシング又は迅速なバイオセンシングを達成するため、測定対象物質と結合する抗体などのリガンドを表面に有し、更に、蛍光物質などの機能性分子が内部に封入されるか、表面に担持された微粒子を使用することが知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５４０１７４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３,７５,ｐ６１２４−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
測定対象物質と結合する抗体などのリガンドに対し、発色、発光、蛍光、電流、磁気などのシグナル発信素子としての機能を備えた微粒子はサイズが非常に大きい。例えば、微粒子が球形で直径が２００ｎｍであり、リガンドとしての抗体の直径が２０ｎｍと近似すると、微粒子の表面積は当該抗体に対して約１００倍となる。
このように、リガンドと微粒子の大きさが異なるため、本発明者らは、Ｂ／Ｆ分離における洗浄液から発生する水流により微粒子により大きな力がかかり、アフィニティ反応による結合を切断してしまうのではないかと予想した。
【０００９】
洗浄液による水流で、測定対象物質とリガンドとの結合が外れてしまうと、本来検出すべき微粒子まで洗い流されてしまい、高感度なバイオセンシングが実現することができなくなると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明者らは、より高感度なバイオセンシングを実現することを目的とし、鋭意検討した結果、Ｂ／Ｆ分離工程における洗浄液を反応場（アフィニティ反応が行われた箇所）に直接吐出せずに、当該反応場と関連しない箇所であって、反応場よりも上方の位置に接触するように吐出すると、吐出の際に発する水流の勢いが緩衝され、内壁を伝って反応場に洗浄液が到達し、測定対象物質と微粒子の結合が外れにくくなることを見出した。
【００１１】
具体的に、本発明は、リガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用い、かつ、洗浄液によるＢ／Ｆ分離工程を含む、アフィニティ反応を利用したバイオセンシングにおいて、Ｂ／Ｆ分離工程で、反応容器内のアフィニティ反応の反応場から上方に位置する内壁の一部に洗浄液を接触させるように吐出することを含む、洗浄方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の洗浄方法は、洗浄液によるＢ／Ｆ分離工程を含む、アフィニティ反応を利用したバイオセンシングにおいて、機能性物質を備える微粒子を用いた場合であっても簡便な手段で、誤差の少ない、高精度のバイオセンシングを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で使用する微粒子の一実施態様を示す図である。（ａ）は磁性物質がポリマー層に内包される磁性微粒子を示す。（ｂ）は、その磁性微粒子に蛍光物質を取り込ませた状態の磁性微粒子を示す。（ｃ）は、さらに磁性微粒子の表面に抗体を固定化した状態を示す図である。
【図２】底面（２１）及び側壁面（２２）を備える反応容器を示す図である。反応場である底面には抗体が固定化されている。
【図３】検体を反応容器２に添加して測定対象物質を反応させた後、さらに磁性物質及び蛍光物質を内包し、抗体が固定化された微粒子Ｐを添加し反応させた後の状態を示す図である。
【図４】本発明のＢ／Ｆ分離を行うための洗浄液を添加する具体的な一実施態様を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本発明のバイオセンシングとは、動物やヒトの全血、尿、血漿、血清、唾液などの検体中の測定対象物質を、アフィニティ反応を用いて検出する手法を意味する。特に、本発明のバイオセンシングでは、機能性物質を備えた微粒子を用いる。
【００１５】
本発明における具体的なバイオセンシングとして、
（１）微粒子で標識したリガンドにより測定対象物質を直接認識する直接法、
（２）測定対象物質をリガンド（一次リガンド）により認識し、測定対象物質と結合した一次リガンドを、微粒子に結合した別のリガンド（二次リガンド）で認識させて検出する間接法、
（３）競合法、
（４）測定対象物質を固相化したリガンド（一次リガンド）により捕捉し、さらに微粒子に固定化された別のリガンド（二次リガンド）に認識させて検出するサンドイッチ法
などが挙げられるが、これらに限定されない。また、リガンドとして、アビジン、ストレプトアビジン等を用いて測定対象物質を検出する手法を用いてもよい。
【００１６】
本発明におけるバイオセンシングでの測定対象物質はアフィニティ反応が利用できる物質であればいずれの物質であってもよい。例えば、タンパク質、糖、脂質、核酸、糖タンパク質などが挙げられる。より具体的には、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、アレルゲン、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、脂質、酵素などが挙げられる。
【００１７】
なお、本発明におけるアフィニティ反応とは、抗原抗体反応、核酸（DNAやRNAなど）の相補的結合、核酸とたんぱく質の特異的結合、シグナル伝達系に関わるタンパク質とその受容体タンパク質との結合やProtein A若しくはProtein Gと抗体のFc部位との結合のようなたんぱく質同士の特異的結合、酵素とその基質の特異的結合、ホルモン分子とその受容体の特異的結合、糖鎖とレクチンの特異的結合など、生体分子間（人工的に改変した生体分子との反応も含む）の特異的な反応を含み、さらに、アプタマー等を用いた人工抗体様分子と生体分子の特異的結合、薬剤若しくは薬剤候補物質と生体分子の特異的結合、アビジンとビオチンの特異的結合など、低分子化合物と生体分子（人工的に改変した生体分子との反応も含む）の間の特異的な反応を含む概念である。
【００１８】
本発明のバイオセンシングにおける検体とは、測定対象物質を含みうる試料を指し、液体であることが好ましい。例えば、全血、尿、血漿、血清、唾液、髄液、痰、精液、汗、細胞懸濁液などの体液をはじめとする、生体から採取される液体が挙げられる。
【００１９】
本発明のバイオセンシングでは、リガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を使用する。
本発明におけるリガンドとは、バイオセンシングに利用するアフィニティ反応において、測定対象物質に特異的に相互作用することができる分子全般を意味する。ここでは、リガンドの種類について特に限定されないが、抗体、抗原、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明における微粒子の形状は特に限定されないが、球形、楕円形、円柱、多角柱などの形状が挙げられる。
微粒子が球形の場合、平均粒径は通常、１ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは、８０ｎｍ〜４５０ｎｍ、更に好ましくは、１００ｎｍ〜３００ｎｍである。
球形以外の形状（楕円形、円柱、多角柱）をなす場合であっても、上記平均粒径を有する球形粒子と近似する大きさ（体積、表面積）の分布をなす微粒子を使用することができる。
【００２１】
なお。本発明において、微粒子の平均粒子径は、粒子のブラウン運動の様子を散乱光強度の揺らぎとして観測する動的散乱法を用いて測定することができる。例えば、大塚電子製のゼータ電位・粒子径測定システムＥＬＳＺ−１０００ＺＳが本目的に好適である。
【００２２】
微粒子の材料は特に限定されず、ガラス、セラミック（例えばシリカ）、金属（例えば、金、白金、ステンレス）、樹脂（例えば、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミドなど）、アガロース等を用いることができる。これらの中でも、樹脂が好ましく、ポリスチレンが特に好ましい。
【００２３】
リガンドを微粒子の表面に公知の方法を用いて固定化することができる。通常、微粒子の表面にリガンドと反応可能な官能基を導入し、これとリガンドを反応させる。本技術分野では、表面にリガンドと反応可能な官能基が導入された微粒子は市販されており、入手可能である。
【００２４】
本発明で使用する微粒子は、その表面又は内部に機能性物質を備えている。機能性物質としては、磁性物質、酵素、導電性物質、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。
磁性物質としてはフェライト等：酵素としてはパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等、導電性物質としてはフェロセン、テトラチアフルバレン(TTF)、テトラシアノキノジメタン(TCNQ)、金属錯体等：蛍光物質としてはＦＩＴＣ、ｃｙ３、ｃｙ５等：放射性同位体としては１２５Ｉ等；を挙げることができる。
【００２５】
磁性物質は、微粒子に磁性を付与することができ、磁気誘導することによって、反応容器内のアフィニティ反応が行われる場（反応場）にまで迅速に誘導することができる。
酵素、導電性物質、蛍光物質、放射性物質などは、シグナル発信物質として検出時にその機能を発揮する。なお、導電性物質を用いる場合は、特開２０１３−１１３７３５号公報に詳細に説明されているように、アフィニティ反応を行った後、微粒子から導電性物質を溶出させた導電性物質の導電性（電流値）を測定することで、測定対象物質を定量することができる。
【００２６】
本発明で使用する微粒子では、磁性物質が微粒子に内包されることが好ましい。また、本発明においては、蛍光物質をシグナル発信物質として使用することが好ましく、蛍光物質を微粒子に内包すること更に好ましい。
【００２７】
以下に、本発明の具体的な１つの実施態様を示す。微粒子に機能性物質として磁性物質及び蛍光物質を内包し、かつリガンドとして抗体を用いたサンドイッチ法を用いた場合の洗浄方法について説明する。
【００２８】
図１（ａ）は、ポリマー層（１０２）に内包される磁性物質（１０１）を備える磁性微粒子１である。このような磁性物質を備えた微粒子は、例えば、特開２００６−８８１３１号公報に開示される方法によって作製することができる。なお、市販品で言えば、多摩川精機株式会社製のＦＧビーズを用いることができる。
【００２９】
さらに、図１（ｂ）は磁性物質を備えた磁性微粒子１に蛍光物質（１０３）を内包させた微粒子を表す図である。このような微粒子は、例えば、特許第５１５６９４４号公報や特許第５５７４４９２号公報に開示される方法で作製することができる。
なお、蛍光物質以外のシグナル発信物質としての機能性物質も同様な方法で封入することが可能である。
【００３０】
蛍光物質及び磁性物質が内包された微粒子（図１（ｂ）の微粒子）に、さらにリガンドを固定化する。本発明におけるリガンドとは、バイオセンシングに利用するアフィニティ反応において、測定対象物質に特異的に相互作用することができる分子全般を意味するが、ここでは抗体（１０４）を指す。以上の手順で、磁性物質及び蛍光物質を内包し、かつリガンドとして抗体を表面に固定化した微粒子Ｐを得ることができる（図１（ｃ））。
【００３１】
次に、反応容器２の底面２１に、測定対象物質とは特異的に結合するが上記抗体１０４とは異なる抗体を固定化する（図２の２０１）。ここでの固定化は通常行われている技術を用いる。つまり、この実施態様では、反応容器の底面２１が本発明におけるアフィニティ反応が行われる場所（反応場）となる。
なお、反応容器は特に限定されないが、プラスチック製のマイクロチューブ、マイクロプレートなどを用いることができる。特に、ポリスチレンマイクロプレートを使用することが好ましい。
【００３２】
さらに、反応容器２に検体を添加し、抗体２０１に測定対象物質をアフィニティ反応により捕捉させる。十分な時間反応させた後、磁性物質１０１及び蛍光物質１０３が内包され、抗体が表面に固定化された微粒子Ｐを添加し、微粒子Ｐに固定化された抗体１０４と測定対象物質がアフィニティ反応により結合する。この時の反応容器の状態を図３に示す。
図３では、添加した微粒子Ｐの中で、捕捉された測定対象物質と結合（Ｂｉｎｄ）したものを微粒子Ｐ（Ｂ）、捕捉されず遊離（Ｆｒｅｅ）の状態であるものを微粒子Ｐ（Ｆ）として表している。
【００３３】
図４では、本発明のＢ／Ｆ分離を行うための洗浄液を添加する具体的な一実施態様を示している。
分注器であるピペットの先端部のチップ４から反応容器２の内面の側壁面２２に洗浄液を吐出する。なお、ここではピペットのチップを用いたが、これに限定されず、例えばノズル、プローブの形態であってもよい。なお、洗浄液を吐出するチップ、プローブやノズルの材質は特に限定されないが、プラスチック製が好ましく、プラスチック製チップがより好ましい。
【００３４】
洗浄液を吐出するチップ４は、反応容器２の内面の側壁面２２に対し、チップ４の中心線を示す破線αとで形成する角度Ｒが０°を超え９０°未満の角度、好ましくは５°〜４５°となるように傾ける。なお、別の実施態様として、反応容器２を傾けてもよい。その場合も、反応容器２の内面の側壁面２２とチップ４の中心線を示す破線αが形成する角度Ｒ’が０°を超え９０°未満の角度、好ましくは５°〜４５°となるようにする。
【００３５】
なお、この実施態様において、側壁面２２が本発明における反応容器内の反応場から上方に位置する内側壁となる。
【００３６】
洗浄液を吐出するチップ、プローブ又はノズルは、洗浄液を吐出する際に、反応容器の側壁面２２と接していてもよく、離れていてもよい。
また、洗浄液の吐出速度については、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、反応容器２が２００μＬ容量のプラスチック製チップである場合、１００μＬ／秒以下の速度で洗浄液を吐出することが好ましい。
洗浄液は、バイオセンシングのＲ／Ｆ分離で用いられる一般的な洗浄液を用いることができ、通常、界面活性剤やｐＨ調整剤等を含む洗浄液を使用することができる。
【００３７】
このように、洗浄液は反応溶液の反応場の上方の側壁面に吐出されるため、洗浄液は側壁面を伝って流れ落ち、反応場に到達する。
【００３８】
洗浄液を廃棄する場合は、反応容器２を傾けて廃棄してもよく、ピペットを用いてチップから、又は吸引ノズルから洗浄液を吸引してもよい。洗浄液を吸引する場合は、一定時間（例えば１０秒）静置するか、振とうしてもよい。
さらに、上記実施態様において、反応が行われた反応容器の底面２１から遠ざけるように磁石を設置し、一定時間（例えば１０秒）静置させてもよい。微粒子Ｐ（Ｆ）が磁気誘導されて磁石の設置方向に移動し、分離がより容易になる。ここでの磁石を設置する箇所は、反応容器内の反応が行われなかった箇所であり、洗浄液が吐出された箇所と同じでもよく、異なる任意の箇所でもよい。
また、本発明のバイオセンシングの精度を高めるために上述の振とう及び磁気誘導を組み合わせてもよい。
【００３９】
上述の通り、洗浄液を用いて、Ｂ／Ｆ分離を行った後、微粒子Ｐ（Ｆ）の蛍光物質１０３を、検出・測定する。
【００４０】
上記では、蛍光物質をシグナル発信物質として用いたが、本発明のバイオセンシングでは、これに限らない。反応容器内の測定対象物質の測定を、光学的手段、電気的手段、磁気的手段、放射線検知手段等を用いて行うことができる。光学的手段としては、蛍光測定、発光測定、吸光度測定を挙げることができ、蛍光測定を行うことが好ましい。
【００４１】
さらに、本発明は、上記洗浄方法を実施するバイオセンシングのための装置に関する。
本発明の装置は、一般にバイオセンシングを行う装置に加えて、Ｂ／Ｆ分離を行う洗浄工程において、反応容器を傾ける機構、及び洗浄液を吐出する機構の先端部を傾ける機構のいずれか、もしくは両方を備え、洗浄液が反応容器のアフィニティ反応が行われる反応場ではなく、当該反応に関与しない反応容器の内側の側壁面に洗浄液を吐出するように制御されている。
【００４２】
本発明の装置では、第１のリガンドが表面に固定化され、機能性物質を備える微粒子を用いる。
ここでの「リガンド」とは、上記で定義したリガンドと同義である。「第１のリガンド」とは、反応容器に固定化する第２のリガンドとは異なるリガンドであることを示すものであり、上記の「二次リガンド」に対応する。また、「第２のリガンド」は、上述の「一次リガンド」に対応する。
【００４３】
当該装置は、洗浄液を吐出する機構の先端部を傾ける機構を備える。該先端部の中心線が反応容器の側壁面と交差する点で、反応容器の側壁面と該先端部の中心線で構成する角度が０°を超え９０°未満、好ましくは５°〜４５°になるように調整して該先端部を傾ける。
また、反応容器を傾ける場合は、該先端部の中心線が反応容器の側壁と接する点で、反応容器の側壁面と該先端部の中心線が構成する角度が０°を超え９０°未満、好ましくは５°〜４５°になるように調整して該反応容器を傾ける。
さらに、反応容器及び先端部の双方を傾ける場合は、該先端部の中心線が反応容器の側壁と接する点で、反応容器の側壁面と該先端部の中心線が構成する角度が０°を超え９０°未満、好ましくは５°〜４５°になるように調整して該反応容器及び該先端部を傾ける。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明のバイオセンシングにおける洗浄方法について、実施例により具体的な説明を行うが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【００４５】
まず、抗体（抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体５Ａ６（Ｈｙｔｅｓｔ社製））を表面に固定化し、磁性物質及び蛍光物質を内包する微粒子を次のように調製した。
蛍光物質封入磁性微粒子（ＦＦビーズ、多摩川精機株式会社製）を用意し、これを水中に分散させた溶液を転倒混和で十分に懸濁して均一なＦＦビーズ分散溶液としてから、０．５ｍｇを１．５ｍＬマイクロチューブに採取し、活性化緩衝液（２５ｍＭ、ＭＥＳ  ｐＨ6.0）による洗浄を３回実施した。ＥＤＣ｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩｝（ナカライテスク株式会社製）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように活性化緩衝液に溶解させた溶液を洗浄後ビーズに添加し、超音波で分散させてから室温で３０分間撹拌した（マイクロチューブミキサーを使用）。活性化反応後、遠心分離し、上清を除去したのち、抗体３０μｇを含んだ固定化緩衝液（２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０）２００μＬを添加して超音波で分散させてから４℃で２時間撹拌した。固定化反応後、遠心分離し、上清を除き、洗浄溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で３回洗浄を実施した。洗浄後、上清が除去されたビーズに保存緩衝液を添加し、超音波で分散後、４℃にて保存した。なお、ＦＦビーズの粒子径は、動的散乱法による粒子径測定装置である大塚電子（株）製のELSZ-1000ZSを使用し、１９０±２０ｎｍであることを確認した。
【００４６】
次に、抗体を固相化したプレートを次のように作製した。抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体１Ｈ１２（Ｈｙｔｅｓｔ社製）をＰＢＳ  ｐＨ７．４にて、１μｇ／ｍＬに調整し、５０μＬずつ各マイクロプレート（Ｆ１６  ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ  Ｂｌａｃｋ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ社製）のウェルに添加して４℃で一晩静置した。翌日、溶液を除去し、ブロッキング緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．９、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１％スキムミルク）を２００μＬずつ添加し、室温で２時間静置した。
【００４７】
上記のように作成した抗体固定化ＦＦビーズと抗体固相化プレートを用いて免疫分析を以下のように実施した。
抗体固定化ＦＦビーズをブロッキング緩衝液で１μｇ／ｍＬに調整し、６０μＬずつ用意した。精製ＰＳＡ抗原（Ｈｙｔｅｓｔ社製）をブロッキング緩衝液で０、２００、１０００、５０００ｐｇ／ｍＬの濃度に希釈した各濃度のＰＳＡ希釈溶液２４０μＬを抗体固定化ＦＦビーズ溶液が入ったサンプルチューブに添加して混合した後、室温で１０分間静置した。１０分後、各サンプルを５０μＬずつ、用意した抗体固相化プレートに添加して１時間静置反応させた。反応後の溶液を除去後、反応場に直接接触するように５０μＬ／ｓｅｃの速度で洗浄液を吐出する洗浄方法（１）、もしくは、反応容器に対してチップの先端が３０°となるように傾け（すなわち、図４におけるＲが３０°となるように傾け）、反応容器の反応場から上方の位置に洗浄液を接触させて、抗体が固相化されていない反応容器部分へ５０μＬ／ｓｅｃの速度で吐出する洗浄方法（２）を採用して、合計３回の洗浄操作を実施した。
【００４８】
各回の洗浄液添加後、プレート振とう機で１０秒間振とう操作を行った。洗浄後、洗浄液を完全に除去した状態で蛍光測定装置（ＡＲＶＯＸ４、パーキンエルマー社製）にセット、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１８ｎｍで時間分解蛍光測定を実施した。各濃度のＰＳＡにつき４重測定とし、洗浄方法の違いによる蛍光シグナルの強度やばらつきを確認した。
【００４９】
時間分解蛍光測定の結果を表１に示す。洗浄方法（１）を用いた場合には、洗浄方法（２）を用いた場合と比較して、蛍光シグナルが減少し、同時測定のばらつき（ＣＶ）が増加した。従って、本発明の洗浄方法（２）を採用することにより、抗体固定化ＦＦビーズの水流による流失が防止でき、高シグナル強度かつ、ばらつきの少ない正確な測定が可能になった。
【００５０】
【表１】
2017142073.tif 000003
【符号の説明】
【００５１】
１：磁性微粒子、１０１：磁性物質、１０２：ポリマー層、１０３：蛍光物質、１０４：抗体、２：反応容器、２１：反応容器の底面、２２：側壁面、２０１：抗体
Ｐ（Ｂ）：捕捉された測定対象物質と結合した微粒子
Ｐ（Ｆ）：捕捉された測定対象物質に捕捉されず遊離の状態である微粒子
【図１】
2017142073.tif 000004
【図２】
2017142073.tif 000005
【図３】
2017142073.tif 000006
【図４】
2017142073.tif 000007