(57)【要約】【課題】本発明の目的は、容器の内壁面に細胞が接着することを抑制でき、かつ収容部に保存される細胞の検査を容易に行うことができる細胞凍結保存容器を提供することである。【解決手段】本発明は、細胞を含有する保存液を収容可能な収容部と、前記収容部を構成する内壁面と、を含む細胞凍結保存容器であって、前記内壁面の一部に細胞接着低減性を有する凹凸面と、前記細胞接着低減性を有する凹凸面以外の内壁面の少なくとも一部の領域に対応する壁部に、前記収容部に収容された前記細胞を観察可能な観察部と、を有し、前記観察部の内壁面が平滑面であり、かつ、前記観察部の水中における４５０ｎｍでの光透過度が５５％以上である、細胞凍結保存容器である。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含有する保存液を収容可能な収容部と、前記収容部を構成する内壁面と、を含む細胞凍結保存容器であって、
前記内壁面の一部に細胞接着低減性を有する凹凸面と、
前記細胞接着低減性を有する凹凸面以外の内壁面の少なくとも一部の領域に対応する壁部に、前記収容部に収容された前記細胞を観察可能な観察部と、
を有し、
前記観察部の内壁面が平滑面であり、かつ、前記観察部の水中における４５０ｎｍでの光透過度が５５％以上である、細胞凍結保存容器。
【請求項２】
前記観察部の水中における４５０ｎｍの光透過度が８０％以上である、請求項１に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項３】
前記細胞接着低減性を有する凹凸面は、前記収容部の下方向に位置する内壁面に形成されている、請求項１又は２に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項４】
前記細胞凍結保存容器が自立型の容器であり、前記細胞接着低減性を有する凹凸面が、前記収容部の下方向に位置する底壁部の内壁面に形成されている、請求項３に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項５】
前記収容部の水平方向に位置する側壁部及び前記底壁部を含む容器本体と、該容器本体と連結して前記収容部を密閉する蓋体と、を含み、
前記観察部が前記側壁部の少なくとも一部又は前記蓋体の少なくとも一部に設けられている、請求項４に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項６】
前記観察部の外壁面も平滑面であり、該観察部が平板状である、請求項５に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項７】
前記細胞凍結保存容器が非自立型である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項８】
前記凹凸面が、細胞非接着性を有する複数の微細突起を含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項９】
前記複数の微細突起の配置ピッチは、６０ｎｍ以上かつ収容対象の細胞の平均径以下であり、
前記複数の微細突起の高さは、前記収容対象の細胞の平均径×１／２以上であり、
前記複数の微細突起の頂部の短辺の長さは、前記収容対象の細胞の平均径×１／４０以下である、請求項８に記載の細胞凍結保存容器。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞凍結保存容器を用いて、細胞の接着を抑制して細胞を保存する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を凍結して保存するための細胞凍結保存容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野においては、生体試料から採取された細胞又は培養された細胞が組織の再構築等の様々な用途に用いられている。細胞は、生体試料から採取された後若しくは培養された後医療に用いられるまでの間、保存容器に収容された状態で凍結保存される。
【０００３】
現在、細胞の保存に用いる容器として、一般的に、ポリスチレン（ＰＳ）製容器、ポリプロピレン（ＰＰ）製容器、又はガラス製容器が用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これらの容器を用いて接着性を有する細胞を保存する場合、容器の内壁面に細胞が接着するという問題がある。細胞が接着することを抑制できる容器は、現在存在しておらず、開発が求められている。また、細胞凍結保存容器には、保存後の細胞の状態を検査するために、容器中に細胞含有保存液を収容した状態で細胞を検査できることが求められている。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、容器の内壁面に細胞が接着することを抑制でき、かつ収容部に保存される細胞の検査を容易に行うことができる細胞凍結保存容器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）  細胞を含有する保存液を収容可能な収容部と、前記収容部を構成する内壁面と、を含む細胞凍結保存容器であって、
前記内壁面の一部に細胞接着低減性を有する凹凸面と、
前記細胞接着低減性を有する凹凸面以外の内壁面の少なくとも一部の領域に対応する壁部に、前記収容部に収容された前記細胞を観察可能な観察部と、
を有し、
前記観察部の内壁面が平滑面であり、かつ、前記観察部の水中における４５０ｎｍでの光透過度が５５％以上である、細胞凍結保存容器。
（２）  前記観察部の水中における４５０ｎｍの光透過度が８０％以上である、（１）に記載の細胞凍結保存容器。
（３）  前記細胞接着低減性を有する凹凸面は、前記収容部の下方向に位置する内壁面に形成されている、（１）又は（２）に記載の細胞凍結保存容器。
（４）  前記細胞凍結保存容器が自立型の容器であり、前記細胞接着低減性を有する凹凸面が、前記収容部の下方向に位置する底壁部の内壁面に形成されている、（３）に記載の細胞凍結保存容器。
（５）  前記収容部の水平方向に位置する側壁部及び前記底壁部を含む容器本体と、該容器本体と連結して前記収容部を密閉する蓋体と、を含み、
前記観察部が前記側壁部の少なくとも一部又は前記蓋体の少なくとも一部に設けられている、（４）に記載の細胞凍結保存容器。
（６）  前記観察部の外壁面も平滑面であり、該観察部が平板状である、（５）に記載の細胞凍結保存容器。
（７）  前記細胞凍結保存容器が非自立型である、（１）乃至（３）のいずれか１つに記載の細胞凍結保存容器。
（８）  前記凹凸面が、細胞非接着性を有する複数の微細突起を含む、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載の細胞凍結保存容器。
（９）  前記複数の微細突起の配置ピッチは、６０ｎｍ以上かつ収容対象の細胞の平均径以下であり、
前記複数の微細突起の高さは、前記収容対象の細胞の平均径×１／２以上であり、
前記複数の微細突起の頂部の短辺の長さは、前記収容対象の細胞の平均径×１／４０以下である、（８）に記載の細胞凍結保存容器。
（１０）  （１）乃至（９）のいずれか１つに記載の細胞凍結保存容器を用いて、細胞の接着を抑制して細胞を保存する方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、容器の内壁面に細胞が接着することを抑制でき、かつ収容部に保存される細胞の検査を容易に行うことができる細胞凍結保存容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】自立型の容器の正面視断面図である。
【図２】非自立型の容器の正面図である。
【図３】容器の内表面に形成された微細突起を示す側面視断面図である。
【図４】図３の微細突起の平面図である。
【図５】図３の微細突起の頂面を示す平面図である。
【図６】図３の微細突起上に細胞が配置された状態を示す模式図である。
【図７】参考例としての微細突起上に細胞が配置された状態を示す模式図である。
【図８】本実施形態に係る自立型細胞凍結保存容器の模式的断面図である。
【図９】本実施形態に係る非自立型細胞凍結保存容器の模式的断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、細胞を凍結保存するための細胞凍結保存容器に関する。また、本発明は、細胞及び保存液が充填されている容器に関する。容器に充填されている細胞及び保存液は凍結保存されている状態であってもよいし、凍結保存されていない状態であってもよい。
【００１０】
［容器形状］
本発明に係る細胞凍結保存容器の形状は、細胞及び保存液（以下、細胞を含む保存液を「細胞含有保存液」とも称する）を保持できるものであれば特に限定されない。
【００１１】
一実施形態において、細胞凍結保存容器は自立型の容器である。本明細書において「自立型の容器」とは、容器自身が、特に他の器具などを必要とせずに自立できる構造を有する容器のことを言う。自立型の容器としては、例えば、チューブ形状、バイアル形状、シャーレ形状等の容器が挙げられる。また、袋形状又はバッグ形状を有する容器などの一般的には自立しないと考えられる容器であっても、土台を有することにより自立型の容器となり得る場合もある。自立型の容器は、例えば、図１に示すような、底壁部１１及び底壁部の周縁から立設した側壁部１２を有する容器本体と、蓋体（不図示）とを有する容器１０であるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
一実施形態において、細胞凍結保存容器は非自立型の容器である。本明細書において「非自立型の容器」とは、自立型とは対照的に、容器自身の構造によって自立することができない容器を言う。非自立型の容器としては、例えば、袋形状、バッグ形状等の容器が挙げられる。一般的な非自立型の容器は、例えば、図２に示す、対向する一対のフィルム部２１と、一対のフィルム部の外縁に沿った一対の側辺封止部２２及び底辺封止部２３とを有する容器２０であるが、これに限定されるものではない。図２に示す容器２０では、一対のフィルム部２１で形成される内部空間（収容部）に細胞含有保存液が充填された後、
フィルム部２１の上部が封止される。
【００１３】
容器内の収容部の形状は、特に制限されるものではなく、一般的に容器の形状に応じた形状を有する。例えば、自立型容器の収容部の形状としては、円柱状又は角柱状などが挙げられる。
【００１４】
［細胞接着低減性を有する凹凸面］
本発明に係る細胞凍結保存容器において、容器中の収容部を構成する内壁面の一部に、細胞接着低減性を有する凹凸面が設けられている。
【００１５】
細胞接着低減性を有する凹凸面とは、凹凸形状とすることにより、同じ材料で形成された平滑面に比べて細胞の接着性が低減された凹凸面を意味する。本発明者らは、壁面に凹凸形状を付与することにより、細胞接着を低減できることを見出した。凹凸面は複数の微細突起を含んで構成されることが好ましい。なお、細胞接着低減性を有する凹凸面の具体的な形状に関する説明は後述する。
【００１６】
細胞接着低減性を有する凹凸面は、細胞非接着性を有する凹凸面であることが好ましい。細胞非接着性とは、細胞が接着しない又は細胞が実質的に接着しない性質を意味する。細胞非接着性を有する凹凸面は、凹凸形状により細胞非接着性が付与された凹凸面を意味する。凹凸面における細胞の接着性は、顕微鏡観察などによって当事者であれば容易に確認できる。
【００１７】
細胞含有保存液に含まれる細胞は、重力によって沈降し、収容部の下方に集まる傾向があるため、細胞接着低減性を有する凹凸面は、収容部の下方向に位置する内壁面に形成されることが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「下方向」とは、細胞含有保存液の保存時又は使用時における容器の意図された配置状態を基準にした場合における重力方向を意味する。例えば、容器が自立型である場合、該自立型容器を水平面に配置した状態を基準にし、下方向（さらには上方向、水平方向）を決定する。具体的には、図８に示すような自立型容器の場合、収容部の下方向に位置する内壁面とは、底壁部（１０１ｂ）の内壁面（１０４）のことを意味する。また、容器が非自立型である場合、保存時又は使用時に意図される配置状態は、容器に貼られたシール、バーコードなどにより当業者であれば容易に把握できる。例えば、容器が図９のようなバッグ形状の場合、一般的に商品名が表示されたシールは上面に添付されるため、そのシールが添付された壁部（フィルム）と反対側の壁部（フィルム）が下側になるように配置される。したがって、図９において、下側に向けられて配置された壁部（第二のシート２０２）の内壁面が、収容部の下方に位置する内壁面となる。バッグ形状を有する容器には吊下げられて使用されるものもある。この吊下げ型バッグ容器の場合は、吊下げられた状態を基準にして重力方向を下方向と判断してもよい。
【００１９】
［観察部］
本発明に係る細胞凍結保存容器は、細胞接着低減性を有する凹凸面以外の内壁面の少なくとも一部の領域に対応する壁部に、収容部に収容された細胞を観察可能な観察部を有する。観察部に関し、その内壁面は平滑面であり、かつ、その水中における４５０ｎｍでの光透過度は５５％以上である。
【００２０】
「平滑面」とは、凹凸が無い又は実質的に凹凸が無い面のことを意味し、平面、球面、曲面を含む概念である。「実質的に凹凸が無い」とは、凹部及び／又は凸部が存在していたとしても、凹部の深さ及び凸部の高さが、例えば１μｍ以下であり、好ましくは０．５μｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ以下であることを指す。凹部の深さ及び凸部
の高さは、後述する微細突起の測定法と同様に、原子間力顕微鏡又は走査型電子顕微鏡を用いて測定することができる。
【００２１】
観察部は、その内壁面が平滑面であり、その光透過度が５５％以上であれば、特にその形状、配置位置は制限されるものではない。例えば自立型容器の場合において、観察部は、側壁部の少なくとも一部及び／又は蓋体の少なくとも一部に設けることができる。また、観察部は、側壁部全体を観察部として形成することができ、又は、側壁部の一部に観察部を形成することもできる。観察部は、他の容器部分と同じ材料から形成されてもよく、又は、他の容器部分と異なる材料から形成されてもよい。観察部は、他の容器部分（凹凸面を有する壁部）と同じ材料から形成されることが好ましく、他の容器部分と一体的に形成されることが好ましい。
【００２２】
平滑面では、非平滑面と比較して、光散乱が抑制され、光透過度が高くなる。そのため、充填された細胞含有保存液を平滑面を介して容器外部から容易に観察することが可能となる。
【００２３】
観察部における光透過度が高いほど、充填された細胞含有保存液を容器外部から容易に観察することが可能となる。そのため、光透過度は高いほど好ましい。観察部における光透過度は、５５％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、更に好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは９５％以上である。観察部における光透過度が８０％以上である場合、収容部に収容されている細胞含有保存液を光学顕微鏡を用いて観察できるようになるため特に好ましい。
【００２４】
観察部の外壁面も平滑面であることが好ましい。また、より精密に観察し易くなるという観点から、観察部は平板状であることが好ましい。
【００２５】
本明細書における「光透過度」は、第十六改正日本薬局方の容器・包装材料試験法における透明性試験第一法に従って測定した透過率（波長：４５０ｎｍ）である。
【００２６】
光透過度は、観察部を構成する材料の種類、結晶性等によって変化する。そのため、材料の種類、容器の製造方法等を適宜選択することによって、所望の光透過度を得ることができる。また、プラスチックは、結晶化すると光透過度が低下する傾向があるため、結晶化を防ぐように樹脂成形の際の冷却速度を早くすると、光透過度を向上させることができる。
【００２７】
［容器材料］
容器の材料として、特に制限されるものではなく、例えば、プラスチックであり、凍結保存に用いることを考慮して適宜選択することができる。容器の材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、などが挙げられる。また、容器の材料としては、例えば、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマーなども挙げることができる。また、容器の材料としてガラスも用いることができる。また、その他にも、フッ素系ポリマーを用いることもでき、例えば、エチレン−パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＥＦＥＰ）、パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、エチレン−テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）等が挙げられる。
【００２８】
［細胞含有保存液］
凍結保存する細胞の種類は特に限定されないが、例えば、癌細胞（例えば、肝癌細胞、
グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞）、肝細胞、クッパー細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞、角膜内皮細胞）、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮細胞（例えば、表皮角化細胞）、上皮細胞（例えば、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞）、乳腺細胞、ペリサイト、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、心筋細胞）、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、神経細胞（例えば、末梢神経細胞、視神経細胞）、軟骨細胞、骨細胞、卵細胞、受精卵、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞、再生医療用細胞等の何れであってもよい。また、細胞は、一種を単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
細胞を凍結保存するための保存液としては、特に制限されるものではなく、例えば、公知の細胞保存液を用いることができる。また、保存液としては、例えば、水、又は水とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との混合液を使用できる。
【００３０】
細胞の平均径とは、ＪＩＳ  Ｚ８８２５の規定に準じる測定装置を用いてレーザー回折・散乱法により球相当径として測定された、保存液中に含まれる細胞の平均粒子径を意味する。細胞の平均径は、細胞の種類により異なるが、通常、１０μｍ〜１００μｍの範囲にある。保存液中に含まれる細胞としては、例えば、樹状細胞が挙げられる。
【００３１】
［細胞接着低減性を有する凹凸面の実施形態］
以下、細胞の接着を低減する凹凸面について説明する。細胞接着低減性を有する凹凸面は、複数の微細突起から構成することができる。複数の微細突起を有する凹凸面は、細胞との接着面積が小さくなり、細胞の接着を抑制することができる。
【００３２】
細胞接着低減性を有する凹凸面は、特に細胞非接着性を有することが好ましい。以下、細胞非接着性を有する凹凸面について図面を参照して説明する。図３は微細突起１の側面視断面図である。図４は微細突起１の平面図である。
【００３３】
微細突起は、細胞非接着性の突起である。微細突起が細胞非接着性の機能を示すためには、好ましくは、微細突起の配置ピッチが、６０ｎｍ以上且つ充填する細胞の平均径以下であり、微細突起の高さが、充填する細胞の平均径×１／２以上であり、微細突起の頂部の短辺の長さが、充填する細胞の平均径×１／４０以下である。
【００３４】
細胞の平均径とは、ＪＩＳ  Ｚ８８２５の規定に準じる測定装置を用いてレーザー回折・散乱法により球相当径として測定された、細胞含有保存液に含まれる細胞の平均粒子径を意味する。細胞の平均径は、細胞の種類により異なるが、通常、１０μｍ〜１００μｍの範囲にある。従って、より具体的には、微細突起の配置ピッチは６０ｎｍ以上且つ細胞の平均径（１０μｍ〜１００μｍ）以下であり、微細突起の高さは細胞の平均径（１０μｍ〜１００μｍ）×１／２以上であり、微細突起の頂部の短辺の長さは細胞の平均径（１０μｍ〜１００μｍ）×１／４０以下である。
【００３５】
微細突起の配置ピッチとは、図４における隣り合う２つの微細突起１の中心間の距離Ｌをいう。ここで「中心」とは、図４における微細突起１の形状が点対称である場合、当該形状の対称点を意味し、この場合、当該形状の重心と一致する。一方、図４における微細突起１の形状が点対称では無い場合、当該形状の重心を意味する。
【００３６】
微細突起の高さとは、図３における微細突起１の形状における、微細突起１の底部２と頂部３との間の距離Ｈをいう。
【００３７】
微細突起の頂部の短辺の長さとは、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ａ）に示すように正方形状を有する場合、その一辺の長さをいい、長方形状を有する場合、その短辺の長さをいう。また、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ｂ）に示すように円形状を有する場合、その直径の長さをいい、楕円形状を有する場合、その短径の長さをいう。また、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ｃ）に示すように全体的且つ大局的に見た場合に長手方向（即ち、図５（ｃ）における上下方向）と、短手方向（即ち、図５（ｃ）における左右方向）とを有する場合、その短手方向の長さをそのばらつきの全体的な傾向を反映し得ると期待される複数の箇所にて測定し、測定された短手方向の長さの平均値として特定される。具体的には、例えば、長手方向に沿った仮想線分上に位置する４つの中間点であって、当該仮想線分を５等分する中間点を特定し、特定された４つの中間点のそれぞれについて、各中間点での短手方向の長さを測定する。そして、合計４つの短手方向の長さを平均した値を、微細突起の頂部の短辺の長さとする。また、微細突起１を図３のように側面視した際に、微細突起１の頂部が鋭く尖っている場合、頂部の短辺の長さをゼロとする。
【００３８】
微細突起に関する各種寸法及び形状は、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）又は走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて特定することができる。但し、微細突起の各寸法は、対象となる内表面の全領域を調べてその平均値を算出して特定する必要はなく、実際的には、調査すべき対象（即ち、微細突起の配置ピッチ、高さ、頂面の短辺の長さ等）の全体的な傾向を反映し得ると期待される面積を持つ一区画内において、調査すべき対象のばらつきの程度を考慮して適当と考えられる数を調べてその平均値を算出することによって特定することができる。例えば、３０ｍｍ×３０ｍｍの領域内に含まれる３０箇所を電子顕微鏡により測定して平均を算出することにより、微細突起に関する各寸法（例えば、微細突起の配置ピッチ、高さ、頂面の短辺の長さ等）を特定することができる。
【００３９】
図示された例では、微細突起は規則的なパターンで形成されているが、不規則に形成されていてもよい。
【００４０】
微細突起の形成方法は特に制限されるものではない。微細突起は、例えば、切削加工、サンドブラスト、又は分散メッキにより表面に凹凸形状が形成された金型を用いて射出成形により形成することもできる。また、容器の内表面を切削加工又はエッチングすることにより微細突起を直接形成することもできる。
【００４１】
微細突起をフィルム上に規則的なパターンで形成する方法の一例を説明する。まず、銅、アルミニウム、ステンレス鋼等の金属シートの表面に微細突起のネガ形に対応する凹凸形状をエッチング又は切削加工により形成し、当該金属シートを加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルムを搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたフィルムの表面に金属シート表面の凹凸形状を転写させる。これにより、フィルム上に微細突起が規則的なパターンで形成される。
【００４２】
微細突起をフィルム上に不規則に形成する方法の一例を説明する。まず、フィルムを構成する材料からなるシートの表面に不規則な凹凸形状（梨地形状）をサンドブラストにより形成し、当該シートを回転可能な加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルムを搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたシートの表面の凹凸形状
をフィルムに熱転写させる。即ち、適度に溶かされたシートの表面の凹凸形状の頂部の材料をフィルムに付着させる。これにより、フィルム上に微細突起が不規則に形成される。
【００４３】
微細突起をフィルム上に不規則に形成する方法の別例を説明する。まず、表面に不規則な凹凸形状を有する紙（例えば上質紙）を回転可能な加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルムを搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたフィルムに紙の表面の凹凸形状を転写（賦形）させる。これにより、フィルム上に微細突起が不規則に形成される。ここで、紙の代わりに、分散メッキ若しくはサンドブラストにより表面に不規則な凹凸形状が形成された金属シート、又はサンドブラストにより表面に不規則な凹凸形状が形成された合成樹脂シートを用いてもよい。
【００４４】
図６に示すように、微細突起１の配置ピッチが６０ｎｍ以上且つ細胞４の平均径以下であることで、細胞４が微細突起１の頂部にのみ接触し、微細突起１の側面には接触しにくくなる。これにより、細胞４の足場が小さくなり、細胞４の接着が抑制される。
【００４５】
一方、図７（ａ）に示すように、微細突起１の配置ピッチが細胞４の平均径より大きい場合、細胞４が微細突起１の側面に接触し、側面を足場として細胞４の接着が生じる可能性がある。
【００４６】
また、図７（ｂ）に示すように、微細突起１の配置ピッチが６０ｎｍ未満である場合、微細突起１が細胞にとって平面として認識され、細胞の非接着性が得られない可能性がある。なお、微細突起の間隔が狭すぎると細胞非接着性が得られない可能性があることは文献１にて報告されている（文献１：Elisabetta Ada Cavalcanti-Adam, et al., “Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands”, Biophysical Journal, Volume 92, Issue 8, April 2007, p.2964-2974）。但し、文献１は、微細突起により細胞の非接着性が得られることを確認するに留まっており、細胞含有保存液が充填された容器に応用することまでは記載も示唆もされていない。
【００４７】
また、図７（ｃ）に示すように、微細突起１の高さが、細胞４の平均径×１／２未満の場合、たとえ微細突起１の配置ピッチが細胞４の平均径以下であっても、細胞４が微細突起１の側面に接触し、側面を足場として細胞４の接着が生じる可能性がある。従って、微細突起の高さを細胞の平均径×１／２以上とすることで、細胞に対する非接着性を一層確実に保証している。
【００４８】
また、経験則上、図７（ｄ）に示すように、微細突起１の頂部の短辺の長さが細胞４の平均径×１／４０より大きい場合、細胞４が微細突起１の頂部を足場として利用して接着する可能性がある。文献２には、２５０ｎｍより大きい幅の微細突起には細胞が吸着できるが、２５０ｎｍ以下の幅の微細突起には細胞が吸着できないことが記載されている（文献２：北森武彦、「ナノ構造を利用した細胞パターン制御」、[online]、［平成２７年７月２８日検索］、インターネット(URL:http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/kitamori/research/nanopattern/nanopattern.html)）。２５０ｎｍという値を、最も小さい平均径１０μｍの細胞に換算すると、細胞の平均径×１／４０という値になる。
【００４９】
従って、微細突起の頂部の短辺の長さを細胞の平均径×１／４０以下とすることで、細胞に対する非接着性を一層確実に保証している。ここで、微細突起の頂部の短辺の長さが細胞の平均径×１／４０以下であれば、頂部の平面形状は特に限定されない。例えば、図５（ａ）に示すように正方形であって、その１辺が細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。また、図５（ｂ）に示すように円形であって、その直径が細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。また、図５（ｃ）に示すように円形部分の上端及び下端
にそれぞれ四角形部分が接続された形状であって、短手方向（左右方向）の長さが細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。
【００５０】
（実施形態１）
本発明の一実施形態について図面を参照して以下に説明する。
【００５１】
図８（Ａ）は本実施形態に係る自立型の細胞保存容器１００を示す模式的断面図であり、図８（Ｂ）は自立型容器１００の構成部材としての容器本体１０１を示す模式的断面図であり、図８（Ｃ）は、自立型容器１００の構成部材としての蓋体１０２を示す模式的断面図である。
【００５２】
自立型容器１００は、細胞含有保存液を収容する収容部１０３を有する容器本体（例えば有底筒状本体）１０１と、容器本体１０１と連結することにより収容部１０３を密封可能な蓋部１０２と、を備える。蓋部１０２は、例えば、ねじ込み式によって容器本体１０１と連結できる。容器本体１０１は、収容部１０３の水平方向に位置する側壁部１０１ａ、収容部１０３の下方向に位置する底壁部１０１ｂ、及び土台１０１ｃを有する。側壁部１０１ａは、底壁部１０１ｂの周縁から立設されている。底壁部１０１ｂの内壁面には、細胞接着低減性を有する凹凸面１０４が形成されており、該凹凸面によって保存時又は使用時の細胞接着を抑制することができる。また、側壁部１０１ａの内壁面は平滑面として形成されており、側壁部１０１ａにおける水中での光透過度は５５％以上である。
【００５３】
本実施形態では、側壁部１０１ａが観察部となる。側壁部１０１ａの内壁面が平滑面であり、かつ側壁部１０１ａにおける水中での光透過度が５５％以上であることにより、収容部１０３に収容された細胞含有保存液中の細胞の状態を良好に観察することができる。側壁部１０１ａにおける水中での光透過度は８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
【００５４】
側壁部１０１ａの外壁部も平滑面であることが好ましい。また、側壁部１０１ａが平板状の壁部から構成される場合、光の歪みが少なくなり、観察の精度を向上させることができる。
【００５５】
また、蓋体１０２の収容部１０３に接する内壁面を平滑面とし、かつその光透過度を５５％以上とすることにより、蓋体１０２の内壁面に対応する壁部を観察部としてもよい。
【００５６】
また、図８では側壁部１０１ａの全体を観察部として形成する場合を示しているが、側壁部の少なくとも一部又は蓋体の少なくとも一部に観察部を設ける構成としてもよい。例えば、略円柱形状を有する容器本体の側壁部の一部に、平板状の観察部を設けた形態も想定される。
【００５７】
容器本体１０１において、側壁部１０１ａの構成材料と底壁部１０１ｂの構成材料は同じであってもよく、異なっていてもよい。側壁部の材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素系ポリマー、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリスチレンが好ましく、底壁部の材料としては、ポリエチレン、フッ素系ポリマー、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどが好ましい。
【００５８】
底壁部１０１ｂは、板状に限定されるものではなく、角錐又は円錐形状（側面視V字形状）、試験管様の半球状、すり鉢状、又はスピッツ管のように先細りした形状であってもよい。
【００５９】
（実施形態２）
本発明の一実施形態について図面を参照して以下に説明する。
【００６０】
図９（Ａ）は本実施形態に係る非自立型（具体的にはバッグ形状）の細胞保存容器２００を示す模式的断面図である。
【００６１】
非自立型容器２００は、２枚の樹脂製のシート状部材、すなわち、第一のシート２０１と第二のシート２０２の周縁部同士が溶着されて形成されている。本実施形態では、第二のシート２０２が下側に向けられて保存されることを想定している。第一のシート２０１及び第二のシート２０２に囲まれた空間により細胞が収容される収容部２０３が形成される。そして、第二のシート２０２の内壁面には、複数の微細突起が設けられて細胞接着低減性を有する凹凸面２０４が形成されている。第一のシート２０１の内壁面は平滑面であり、かつ第一のシート２０１の水中における光透過度は５５％以上である。
【００６２】
第一のシート２０１及び第二のシート２０２の構成材料は同じであっても、異なっていてもよい。第一のシート２０１としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素系ポリマー、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ポリスチレンが好ましく、第二のシート２０２としては、ポリエチレン、フッ素系ポリマー、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどが好ましい。
【００６３】
観察部としての第一のシート２０１は、インフレーション法、特に水冷インフレーション法により製造することで光透過度を向上させることが好ましい。第一のシート２０１の水中での光透過度は８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
【符号の説明】
【００６４】
１    微細突起
２    微細突起底部
３    微細突起頂部
４    細胞
１０    容器
１１    底壁部
１２    側壁部
２０    容器
２１    一対のフィルム部
２２    一対の側辺封止部
２３    底辺封止部
１００    自立型の細胞凍結保存容器
１０１    容器本体
１０１ａ  側壁部
１０１ｂ  底壁部
１０１ｃ  土台
１０２    蓋体
１０３    収容部
１０４    細胞接着低減性を有する凹凸面
２００    非自立型の細胞凍結保存容器
２０１    第一のシート
２０２    第二のシート
２０３    収容部
２０４    細胞接着低減性を有する凹凸面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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