(57)【要約】【課題】発酵臭の発生を抑制し、かつα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産性を高くすることが可能な、新規かつ改良されたα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法を提供する。【解決手段】本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法は、禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される基質を供する工程；前記基質にα−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を播種する工程；および前記基質に播種された前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を培養する工程；を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される基質を供する工程；
前記基質にα−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を播種する工程；および
前記基質に播種された前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を培養する工程；
を含むα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項２】
前記基質を供する工程は、
前記穀物を水と混合して混合物を製造する段階;および
前記混合物を滅菌する段階;
を含む請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項３】
前記混合物を製造する段階における前記穀物と前記水とは、前記穀物：前記水＝２０：８０〜５０：５０の質量比で混合される、請求項２に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項４】
前記穀物は、小麦、麦米、押麦、とうもろこし、玄米、米、鳩麦、燕麦からなる群から選択される単一穀物もしくは２種以上の混合穀物または当該単一穀物もしくは当該混合穀物の破砕物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項５】
前記穀物は、小麦粉を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項６】
前記穀物は、小麦粉を含み、
前記基質を供する工程は、
前記小麦粉と水を混合して生地を製造する段階;
製造された前記生地を滅菌する段階;および
滅菌された前記生地を分割し、前記基質を供する段階;
を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項７】
前記基質を供する工程において、前記生地を異なる３つの方向に０．１〜５ｃｍの間隔で切断することにより、前記生地を分割する請求項６に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項８】
前記基質を供する工程において、前記芋を、切断しかつ滅菌する、請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項９】
前記芋は、異なる３つの方向に０．１〜５ｃｍの間隔で切断されている、請求項８に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１０】
前記芋は、サツマイモまたはジャガイモを含む、請求項８または９に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１１】
前記基質は、さらに、ソルビトール、ガラクトース、サトウキビ黒糖および糖蜜からなる群から選択される１種以上の発酵補助剤を含んで構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１２】
前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌および前記基質を含んで構成される培養物中の前記発酵補助剤の濃度は、当該培養物の質量に対し１〜１０質量％である、請求項１１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１３】
前記培養する工程において、培養時間が１２〜７２時間である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１４】
前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌は、Bacillus subtilisおよびBacillus
amyloliquefaciensからなる群から選択される１種以上である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【請求項１５】
前記基質は、菽穀類を含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法に関し、より具体的には禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される基質を固体培地として培養を行う発酵臭が軽微なα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための培養方法（Culturing Methods for the Production of Alpha-Glucosidase Inhibitor with Reduced Fermentation Odor）に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の経済水準の向上および食生活欧米化による、肉類および各種ファーストフードの摂取増加は、肥満をはじめとする代謝症候群を誘発する主要原因となっている。このような代謝症候群を予防しようとする試みが継続して行われており、これに伴い天然抗肥満食品に関する関心が増加してきている。
【０００３】
このような試みの一環として、食品中の有効成分を利用して飲食物中の炭水化物の消化を遅延させる事によって、小腸での単糖類の吸収を阻害し、食後血糖値の上昇抑制および肥満を予防する方法が提案された（特許文献１)。
【０００４】
α−グルコシダーゼ阻害剤(Alpha Glucosidase Inhibitor、以下、「ＡＧＩ」ともいう)は小腸における多糖類の分解を抑制し、炭水化物の消化と吸収を遅延させる。そして、食後の高血糖を抑制して高インスリン血症を抑制する方向に作用する。また、小腸で吸収されない糖類は大腸で腸内微生物によって消費されるため、結果、炭水化物の吸収が抑制され、炭水化物に起因したカロリーの摂取が制限される。このようなα−グルコシダーゼ阻害剤としては、１‐デオキシノジリマイシン（1-deoxynojirimycin)が代表的に知られている(特許文献２)。
【０００５】
桑の葉は、乾燥桑の葉当り０．１〜０．２質量％のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）である１‐デオキシノジリマイシンを含有する。しかしながら、桑の葉をそのまま食品とした場合、桑の葉特有の風味によって食品の風味が損なわれ、また、作用有効量の観点から、十分なα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の効果を期待することができない。この問題を解決するために、桑の葉からα−グルコシダーゼ阻害剤を抽出し、高い濃度のα−グルコシダーゼ阻害剤を含む食品を提供することも考えられるが、抽出およびクロマトグラフィー精製などにより当該食品の価格が高くなってしまう（特許文献３）
【０００６】
微生物由来の食品用α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産方法としては、Bacillus属微生物による生産が、代表的である。このような微生物由来α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の経済的な生産のために様々な試みが行われてきた（特許文献４〜７）これらの試みは、主として液体培養を採用しており、最終的には液体培養物を乾燥して食品などに利用するのを目的としている。しかし液体培養の場合、大量の液体培地を除去することが困難であり、また既存の発酵方法では発酵後の激しい発酵臭のため食品としての活用に制限がある。
【０００７】
一方で、固体培養の場合、例えば、大豆を発酵基質とする清国醤、納豆の場合、これらは加工せずにそのまま食品として利用可能である。しかしながら、α−グルコシダーゼ阻害剤の生産時において、イソブチル酸や、イソ吉草酸などの不快臭を発する低級脂肪酸が生成するため、発酵臭が強く現れる。なお、Bacillus subtilisを利用した納豆のような大豆発酵物の場合、イソブチル酸や、イソ吉草酸などの低級脂肪酸およびアンモニアなどが発酵臭の原因物質と報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
また、納豆の生産においてα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産発酵を行う場合、発酵時間が２４時間以上であるとα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性は上昇するが発酵臭も増加する。さらに、発酵後の乾燥によって発酵臭はさらに強くなるため、食品原料あるいは食品添加物として使用の際に、制限がある。したがって発酵時間の延長によってα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産効率を増大させることは困難である。また、２０時間以内の培養で発酵臭を抑えてα−グルコシダーゼ阻害剤を生産する試みは存在するが、この場合においても乾燥後に強い発酵臭が生じる問題がある。固体培養において、上述したような発酵臭を抑制する目的で多様な試みが提示されている（特許文献８〜１４）。
【０００９】
過去、本発明者は、微生物由来のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を利用した抗糖尿、抗肥満機能性食品を生産する目的で韓国の清国醤からα−グルコシダーゼ阻害剤 (AGI)を多量生産するBacillus subtilis DC-15と命名された菌株を選抜し、韓国と日本において「α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産する菌株およびその製造方法」なる発明の名称で特許（特許文献１５、１６）を取得した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１０３９２８号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３６８０４
【特許文献３】特開昭５３−４４５３０号公報
【特許文献４】韓国特許１０−２００８−０１０７１９３号公報
【特許文献５】韓国特許１０−２００７−００１６２５３号公報
【特許文献６】韓国登録特許１０−０４７７０３９号公報
【特許文献７】米国特許第４３０７１９４号明細書
【特許文献８】特開２０００−２２４９８２号公報
【特許文献９】特開昭６４−８６８５４号公報
【特許文献１０】特開平１−１９１６５５号公報
【特許文献１１】特開平４−１７３０６９号公報
【特許文献１２】特開平６−２６９２８１号公報
【特許文献１３】特開平８−１５４６１６号公報
【特許文献１４】特開平８−２７５７７２号公報
【特許文献１５】韓国登録特許１０−０７０８２８６号公報
【特許文献１６】特許４４６５３３７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】日本食品工業学会誌、日本、日本食品工業学会、１９８４年、３１巻、５８７〜５９５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様々な試みおいては、生納豆の場合にはある程度の発酵臭の低減が可能である。しかしながら、納豆を乾燥して加工する場合には、特有の強い発酵臭が食品素材としての使用に対する大きな障害となる。一方で、乾燥納豆のような大豆発酵物の発酵臭を低減するために発酵臭を発する成分を溶媒抽出により除去する、または有効成分のみ抽出することなどが考えられる。しかしながら、このような除去、抽出も脱臭効率を鑑みると十分でない場合もあり、また、α−グルコシダーゼ阻害剤の生産費用を上昇させるという問題がある。
【００１３】
そこで、本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、発酵臭の発生を抑制し、かつα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産性を高くすることが可能な、新規かつ改良されたα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は上記で現れた問題を解決するために、発酵による微生物由来のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産において発酵臭の発生を軽減しおよびα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産性を向上させるための培養方法を模索し本発明を完成させた。
具体的には、本発明者は上記目的を達成するためにまず大豆以外の穀物を中心に固体発酵基質を鋭意検討した結果、一部の基質で発酵臭が著しく低減され、高いα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性を持つ発酵物が生成することを見出した。また大豆以外の穀物を発酵基質にした場合Bacillus subtilis以外にもBacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus coagulansなどBacillus subtilisの類縁微生物でも発酵臭が著しく低減された発酵物を製造出来る事を明らかにした。
【００１５】
そして、上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される基質を供する工程；前記基質にα−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を播種する工程；および前記基質に播種された前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を培養する工程；を含むα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法が提供される。
【００１６】
また、前記基質を供する工程は、前記穀物を水と混合して混合物を製造する段階;および前記混合物を滅菌する段階;を含んでもよい。
【００１７】
また、前記混合物を製造する段階における前記穀物と前記水とは、前記穀物：前記水＝２０：８０〜５０：５０の質量比で混合されてもよい。
【００１８】
また、前記穀物は、小麦、麦米、押麦、とうもろこし、玄米、米、鳩麦、燕麦からなる群から選択される単一穀物もしくは２種以上の混合穀物または当該単一穀物または当該混合穀物の破砕物であってもよい。
【００１９】
また、前記穀物は、小麦粉を含んでもよい。
また、前記穀物は、小麦粉を含み、前記基質を供する工程は、前記小麦粉と水を混合して生地を製造する段階;製造された前記生地を滅菌する段階;および滅菌された前記生地を分割し、前記基質を供する段階;を含んでもよい。
【００２０】
また、前記基質を供する工程において、前記生地を異なる３つの方向に０．１〜５ｃｍの間隔で切断することにより、前記生地を分割してもよい。
【００２１】
また、前記基質を供する工程において、前記芋を、切断しかつ滅菌してもよい。
また、前記芋は、異なる３つの方向に０．１〜５ｃｍの間隔で切断されていてもよい。
また、前記芋は、少なくともサツマイモまたはジャガイモを含んでもよい。
【００２２】
また、前記基質は、さらに、ソルビトール、ガラクトース、サトウキビ黒糖および糖蜜からなる群から選択される１種以上の発酵補助剤を含んで構成されてもよい。
また、前記発酵補助剤の前記基質中の濃度は、当該基質の質量に対し１〜１０質量％であってもよい。
【００２３】
また、前記培養する工程において、培養時間が１２〜７２時間であってもよい。
また、前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌は、Bacillus subtilisおよびBacillus amyloliquefaciensからなる群から選択される１種以上であってもよい。
また、前記基質は、菽穀類を含まなくてもよい。
【発明の効果】
【００２４】
以上説明したように本発明によれば、発酵臭の発生を抑制し、かつα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産性を高くすることが可能な、新規かつ改良されたα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法を提供することができる。
【００２５】
さらに、本発明の培養方法を利用する場合、長時間培養しても発酵臭が比較的発生しないため、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を多量に含有する発酵物を大量生産することができる。また、本発明の培養方法を利用すると従来の大豆を培地にした時に発生し得るアレルギー問題を克服できる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。
本発明の一実施形態にかかるα−グルコシダーゼ阻害剤生産のための微生物培養方法は、禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される基質を供する工程（基質準備工程）；前記基質にα−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を播種する工程（播種工程）；および前記基質に播種された前記α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を培養する工程（培養工程）；を含む。
【００２７】
（１）基質準備工程
基質準備工程においては、基質を供する。
基質は、禾穀類および擬禾穀類から選択される１種以上の穀物ならびに／または芋を含んで構成される、α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌を培養するための固体培地である。
【００２８】
ここで、禾穀類としては、特に限定されないが、例えば小麦、麦米、押麦、とうもろこし、玄米、米（イネ）、鳩麦、燕麦、キビ、粟、ヒエ等が挙げられる。
また、擬禾穀類としては、特に限定されないが、例えばソバ、アマランサス、キヌア等が挙げられる。
【００２９】
また、芋としては、特に限定されないが、例えば、サツマイモ、キャッサバ等の塊根由来の芋、ジャガイモ、キクイモ、アピオス、タロイモ、サトイモ、コンニャクイモ、ヤムイモ、ナガイモ、ヤマノイモ等の地下茎由来の芋が挙げられる。
【００３０】
また、これらの穀物、芋の一部分を基質の材料として用いてもよい。
例えば、穀物として、穀物の脱穀時に発生する糠を用いることもできる。糠としては、例えば、米糠、麦糠、ふすま等が挙げられる。
【００３１】
また、これらの穀物、芋は、加工されて用いられてもよい。
また、穀物として、破砕された破砕物を用いてもよい。この場合、得られるα−グルコシダーゼ阻害剤の量を増加させることができる。また、穀物の破砕は、穀物の胚乳部分が露出するように行われることが好ましい。
特に、例えば、イネの場合、脱穀して玄米または米（精米）として用いることができる。また、小麦の場合、小麦粒の胚乳部分を挽いて、小麦粉として用いてもよい。
【００３２】
なお、穀物および芋は、基質の調製において、単一の種類で構成することもできるし、複数種を組み合わせて用いることもできる。
例えば、固体培地で使われる穀物は単独であるかまたは２種以上の混合穀物の形態であることができる。例えば、麦米ととうもろこし、麦米と米、きびと鳩麦のように２種の構成成分を適切に選択して固体培地で利用することができる。また小麦、玄米、とうもろこしのように３種の構成成分を混合することもできるし、その以上の多数の穀物を選択して混合することもできる。
【００３３】
また２種以上の混合穀物の場合、各穀物の割合を１：１の割合で等しく混合するかまたはいずれか１つの穀物を他の穀物と異なった割合で混合することができる。例えば、麦米ととうもろこしの割合を１：１の割合でする、または１：２、１：３の割合で調節して固体培地で利用することも可能であり、ここに記載した範囲以外の割合を採用することも可能である。
【００３４】
上述した中でも、基質は、小麦、麦米、押麦、とうもろこし、玄米、米、鳩麦、燕麦からなる群から選択される単一穀物もしくは２種以上の混合穀物または当該単一穀物もしくは当該混合穀物の破砕物を含むことが好ましい。
あるいは、基質は、穀物として小麦粉を含むことが好ましい。
あるいは、基質は、サツマイモまたはジャガイモを含むことが好ましい。
【００３５】
また、基質は、実質的に菽穀類を含まないことが好ましい。具体的には、基質中における菽穀類の含有量が、穀物全体の質量に対して５質量％以下、好ましくは３質量％以下、より好ましくは１質量％以下であることが好ましい。特に好ましくは、基質は菽穀類を完全に含まない。
基質は、予め調製されたものを入手することにより供されるものであってもよいが、適宜、調製されるものであってもよい。基質の調製は、例えば、以下のように、基質の材料の種類に応じて適宜変更することが可能である。
【００３６】
（ｉ）穀物の場合
例えば、穀物を基質の材料として用いる場合、本工程は、穀物を水と混合して混合物を製造する段階および混合物を滅菌する段階を含むことができる。
【００３７】
まず、穀物と水とを混合する。
混合物を製造する段階における穀物と水とは、穀物：水＝２０：８０〜５０：５０の質量比で混合されることができる。より好ましくは、穀物を複数混合した混合穀物を用いる場合、混合穀物と水の割合は約１：２の割合である。
【００３８】
ここで、ソルビトール（sorbitol）、ガラクトース（galactose）、サトウキビ黒糖および糖蜜からなる群から選択される単独または２以上の混合物を発酵補助剤として追加的に基質に添加してもよい。このような発酵補助剤を添加して培養を行うと、結果として得られる発酵物（培養物）のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が著しく増加する。
【００３９】
上記発酵補助剤は、例えば、水に溶かした水溶液として、基質に添加することができる。より具体的には、穀物と混合する水にあらかじめこれらの発酵補助剤を溶解させた水溶液とし、水溶液と穀物とを混合することが好ましい。この場合において、α−グルコシダーゼ阻害剤生産菌および基質を含んで構成される培養物中の発酵補助剤の濃度は、培養物全体の質量に対して１〜１０質量％とすることができる。なお、上記濃度は、培養開始時点における濃度とすることができる。
【００４０】
次に、得られた混合物を滅菌して基質を得る。
用いられる滅菌方法としては、混合物を十分に滅菌することができる方法であれば特に限定されず、例えば、オートクレーブ処理や、低温殺菌法等が挙げられる。
特に、オートクレーブ(autoclave)処理は、加圧蒸気を使う高圧滅菌装置を用いた滅菌処理をいい、材料によって異なるが一般的に２０分間、約１２０℃の加圧蒸気に材料を暴露することにより滅菌を行う処理である。しかしながら、オートクレーブ処理の条件は、上記特定の時間、および温度に限定されず、適宜十分に滅菌することができる条件（温度、時間）とすることができる。
【００４１】
（ｉｉ）小麦粉の場合
穀物が、特に小麦粉を含む場合、基質を供する工程は、小麦粉と水を混合して生地を製造する段階、製造された生地を滅菌する段階、および滅菌された生地を分割し、基質を供する段階を含むことができる。
【００４２】
まず、小麦粉と水とを混合して生地（小麦粉生地）を製造する。
小麦粉と水との混合割合は、特に減されないが、例えば、上述した穀物における混合比率と同様とすることができる。なお、混合物が小麦粉に水が均一に混合された均一な生地となるように、十分な時間混合することが好ましい。
【００４３】
次に、生地を滅菌する。
生地の滅菌は、生地を混合物を十分に滅菌することができる方法であれば特に限定されず、例えば、オートクレーブ処理や、低温殺菌法等が挙げられ、特にオートクレーブ処理が好ましい。
【００４４】
オートクレーブ処理は、生地をトレーに担持させて行うことができる。
ここで、トレーとしては、例えば、オートクレーブが可能な材質のものであれば特に限定されないが、一例として、３０ｃｍｘ２４ｃｍｘ６ｃｍのステンレストレーが挙げられる。ここで、トレーに担持された生地はその厚さを約２ｃｍ程度に調節するのが望ましい。このような厚さの場合、オートクレーブ(autoclave)処理において生地がトレーからあふれ出すことが防止される。
オートクレーブ処理の条件としては、上述した条件と同様とすることができる。
【００４５】
次に、滅菌された生地を分割し、基質を供する。
このように、生地を分割することにより、菌の播種が生地に均等に行われ、発酵できる培地の量が多くなるのみならず、培養中への酸素の供給が円滑に行われ、発酵効率を向上させることができる。
【００４６】
生地の分割は、例えば、上記滅菌された生地を異なる３つの方向、すなわち、第１方向、第２方向、第３方向にそれぞれ個々に０．１〜５ｃｍ間隔で切断することにより行うことができる。上記第１方向、第２方向、第３方向は任意に選択したいかなる方向であってもよい。また、各方向は、それぞれ縦、横、斜め方向とすることもできる。また、切断方向は、直線状であってもよいし、曲線状であってもよい。例えば、切断して得られる生地の代表的な形状としては、正六面体、直方体などの立体形状であることができるが、その他の立体形状となるように切断してもよい。好ましくは生地を各方向につき、０．５〜３ｃｍ間隔で、より好ましくは０．７〜２ｃｍ間隔で、さらに好ましくは、１〜１．５ｃｍの間隔で切断する。
【００４７】
生地の分割は、生地を所定の大きさに分割できれば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、道具、機械を用いて切断することにより行うことができる。
例えば、製造者がカッターなどを利用して手作業で生地を切断することもできる。あるいは、より効率的な大量生産のためにミキサー、粉砕機、破砕機などの機械を利用して生地を切断することができる。上記切断のための機械は複数のカッターを含むこともできる。例えば、複数のカッターが任意の間隔で整列しており、同時に多くの刃で生地を切断するような自動化された装置を利用することもできる。
【００４８】
（ｉｉｉ）芋の場合
基質の材料として芋を用いる場合、芋を切断し、滅菌することにより基質を製造することができる。芋の切断方法、滅菌方法は、上述した小麦粉生地の切断（分割）方法、滅菌方法と同様とすることができる。
【００４９】
なお、芋、とくにサツマイモおよびジャガイモは、その内部に十分な水を含んでおり、微生物の生育に十分な環境が整っているため、基質として供する場合に水を添加する必要がない。しかしながら、場合に応じて、芋に水を適宜添加してもよい。
【００５０】
（２）播種工程
次に、供された基質（固体培地）にα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌を播種する。
α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌としては、特に限定されないが、例えば、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産能力を有する菌として、Bacilus subtilis、Bacilus amyloliquefaciens等が挙げられる。
【００５１】
好ましくは、播種するα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌は、Bacillus subtilis DC-15(韓国登録特許１０−０７０８２８６号公報参照)、Bacillussubtilis ATCC 9372、Bacillus amyloliquefaciens DSM7からなる群から選択される１種以上である。
【００５２】
また、上述した基質の培養において、Bacillus licheniformis ATCC 14580、Bacillus licheniformis ATCC 214218、Bacillus amyloliquefaciens ATCC 234845、Bacillus coagulans ATCC 7050およびBacillus subtilis var. natto Miura、Bacillus subtilis var. natto Takahashi等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産しない菌株を、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌に加えて播種してもよい。これにより、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）以外の目的の化合物を培養を通じて得ることができる。また、このような菌株を添加しても、長時間の間発酵させる過程において、発酵臭の発生は抑制されている。
【００５３】
なお、上記の菌のうち、Bacillus subtilis DC-15（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＤＣ−１５）については、受託機関：Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに２００５年１月１８日付で寄託されており、受託番号：ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰにより特定される。また、他の菌は、公知の菌であり、市場で容易に購入可能である。例えば、Bacillus licheniformis ATCC 14580、Bacillus licheniformis ATCC 214218、Bacillus amyloliquefaciens ATCC 234845、Bacillus coagulans ATCC 7050は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、米国）等の生物資源バンク等より、Bacillus subtilis var. natto Miuraは宮城野納豆製造所より、Bacillus subtilis var. natto Takahashiは高橋祐蔵研究所より入手可能である。
【００５４】
上記菌を、水に当該菌を懸濁させた懸濁液として、生地に播種することができる。ここで、特に限定されないが、上記菌を基質１ｇ当たり胞子または栄養細胞が１０３〜１０５ｃｅｌｌの細胞密度となるように播種することができる。
【００５５】
また、菌の添加は、上述した基質準備工程における基質の切断と同時に行ってもよい。すなわち、基質準備工程と、播種工程とは、その少なくとも一部の処理が重複してもよい。
【００５６】
（３）培養工程
次に、基質（培地）に播種されたα−グルコシターゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌を培養する。
培養条件としては、特に限定されないが、培養温度を３０〜４０℃、培養時間を１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間とすることができる。
【００５７】
なお、培養時において、基質の乾燥を防止するために、基質を包装用具によって覆ってもよい。包装用具としては、特に限定されないが、例えば、可撓性を有さない材料で構成された容器や、樹脂性のシート（例えば、ビニール皮膜）、袋等の可撓性を有する材料で構成された包装用具が挙げられる。中でも、可撓性を有する材料で構成された包装用具を用いることが、基質と包装用具との密着性の観点から好ましい。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳細に説明する。これら実施例は発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは当業者において自明のことである。
【００５９】
１．各培養原料を用いた固体培養
微生物由来α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を大量生産する方法の検討は、基本的に食品で利用可能な原料を利用して固体培養を遂行することにより行った。液体培養の場合専門的な発酵施設および長時間の乾燥過程を必要とするため、微生物由来α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産性が低い。そのため、微生物由来α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産菌が利用することができる経済的な原料を探索する目的に、大豆以外の穀類及び食品原料を対象に発酵後α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が高くて発酵臭が軽微な原料を選抜した。
【００６０】
また、Bacillus subtilis DC-15菌以外のBacillus subtilis ATCC 9392、Bacillus amyloliquefaciens DSM7等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産する菌や、Bacillus subtilis var. natto Miura、Bacillus subtilis var. natto Takahashi、Bacillus licheniformis ATCC 14580等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産しないBacillus subtilisおよび類縁微生物の本方法への適用可能性も検討した。
【００６１】
（１）小麦粉生地１
小麦粉と水とを小麦粉：水が１:２の質量比となるように混合して小麦粉生地を得、その後３０ｃｍｘ２４ｃｍｘ６ｃｍの大きさのステンレストレー(stainless tray)にこの生地を７００ｇずつ入れた。なお、ステンレストレーに盛られる小麦粉生地の量は、オートクレーブ(autoclave)処理時に当該トレーから生地があふれないように適宜調節した。次いで、小麦粉生地について１２０℃、２０分間の条件でオートクレーブを用いて滅菌処理を行った。
【００６２】
その後、Bacillus subtilis DC-15菌の栄養細胞蒸溜水懸濁液を、Bacillus subtilis DC-15菌が生地１ｇ当たり約１０００ｃｅｌｌ含まれるように播種し、カッターで１ｃｍ３となるように切断し、菌を均等に播種した。培地の表面が乾燥しないようにするために、ビニール被膜で小麦粉生地を覆い、３７℃にて７２時間の間培養した。
さらに、別途、小麦粉生地を切断しなかった以外は上記と同様にして小麦粉生地の作製および培養を行った。
【００６３】
（２）各種穀物（単一穀物）
大豆、小麦、小麦（破砕）、ふすま、麦米、麦米（破砕）、押麦、押麦（破砕）、とうもろこし、とうもろこし（破砕）、玄米、米、鳩麦、燕麦、緑豆をそれぞれ試料として、培養を行った。小麦（破砕）、麦米（破砕）、とうもろこし（破砕）など種皮が堅い穀物については、未破砕の穀物を用いた他、発酵効率を高めるために、その各種子が平均して元来の体積の１／２〜１／３となるように粉砕機で破砕して穀物の胚油部分を露出させた。
【００６４】
それぞれの試料に対して質量にして２倍量の水を加えて混合し、混合物について１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブで滅菌処理を行った。オートクレーブ処理した穀物に対し、９０℃程度の温度条件でBacillus subtilis DC-15菌の胞子液を穀物のオートクレーブ処理物（培地）１ｇ当たり１０００ｃｅｌｌとなるように噴霧して播種した。その後、培地をステンレストレーに厚さが２ｃｍ位となるように均等に敷き、培地をビニール被膜で覆った。そして、各培地について、３７℃にて４８時間の間それぞれ培養した。
【００６５】
（３）発酵補助剤を添加した穀物
ソルビトール(Sorbitol)、ガラクトース(Galactose)、サトウキビ黒糖および糖蜜等の発酵補助剤を、それぞれ、培養開始時における培養物中の濃度が当該培養物の質量に対して１〜４質量％となるように水に溶解させた。次に、発酵補助剤を含む溶液を質量にして押麦１に対して２倍量加え、混合物について１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブで滅菌処理を行った。オートクレーブ処理した押麦に対し、９０℃程度の温度条件でBacillus subtilis DC-15菌の胞子液を押麦のオートクレーブ処理物（培地）１ｇ当たり１０００ｃｅｌｌとなるように噴霧して播種した。その後、培地をステンレストレーに厚さが２ｃｍ位となるように均等に敷き、培地をビニール被膜で覆った。そして、各培地について、３７℃にて４８時間の間それぞれ培養した。
【００６６】
（４）混合穀物
麦米ととうもろこしとを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：２で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：３で混合した混合穀物、麦米と米とを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）と米とを質量比１：１で混合した混合穀物を、用意した。
【００６７】
それぞれの混合穀物について、これらに質量にして２倍量の水を加え、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブで滅菌処理を行った。オートクレーブ処理した混合穀物に対し、９０℃程度の温度条件でBacillus subtilis DC-15菌の胞子液を混合穀物のオートクレーブ処理物（培地）１ｇ当たり１０００ｃｅｌｌとなるように噴霧して播種した。その後、培地をステンレストレーに厚さが２ｃｍ位となるように均等に敷き、培地をビニール被膜で覆った。そして、各培地について、３７℃にて４８時間の間それぞれ培養した。
【００６８】
（５）ジャガイモ、サツマイモ
ジャガイモ、サツマイモをそれぞれ、１ｃｍ３程度の大きさに切断した後、追加の水を加えずに、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブで滅菌処理した。オートクレーブ処理したジャガイモ、サツマイモに対し、９０℃程度の温度条件でBacillus subtilis DC-15菌の胞子液をジャガイモ、サツマイモのオートクレーブ処理物（培地）１ｇ当たり１０００ｃｅｌｌとなるように噴霧して播種した。その後、培地をステンレストレーに厚さが２ｃｍ位となるように均等に敷き、培地をビニール被膜で覆った。そして、各培地について、３７℃にて４８時間の間それぞれ培養した。
【００６９】
（６）Bacillus属微生物による発酵
Bacillus subtilis DC-15 菌以外の菌についての本方法の適用性を検討した。まず、麦、米、小麦粉、大豆を原料とし、上記（３）と同様の方法で、培地を作製した。次に、Bacillus subtilis DC-15、Bacillus subtilis ATCC 9392、Bacillus amyloliquefaciens DSM7等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産する菌、ならびにBacillus subtilis var. natto、Bacillus licheniformis  ATCC 14580、Bacillus coagulans ATCC 7050等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産しない菌を、上記（３）と同様の方法でそれぞれの培地に対し播種した後、培養した。
【００７０】
２．評価
以上のようにして得られた各発酵物について、以下のようにα−グルコシダーゼ阻害剤を抽出し、α−グルコシダーゼ阻害剤の活性を測定した。
２．１  α−グルコシダーゼ阻害剤の抽出
培養後の発酵物に蒸留水を加えて、次いでホモジェナイザーにより粉砕を行った。その後、発酵物に存在するプロテアーゼ(protease)及びα−グルコシダーゼ(alpha-glucosidase)など活性測定に影響を与える酵素を不活性化するために、発酵物をオートクレーブを用いて１２１℃で１０分間処理し、その後遠心分離処理を行った。そして、遠心処理後の発酵物の上澄み液（発酵抽出物）をα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の阻害活性測定のための試料とした。
【００７１】
２．２  α−グルコシダーゼ阻害剤の活性測定
ブタ小腸由来のα−グルコシダーゼ１５０μｌ（１．２ユニット）と適宜希釈した発酵抽出物５０μｌの混合液について、ｐＨ７．０、３７℃の条件で、１５分間プレインキュベーション(preincubation)を行った。次に、それぞれの混合液に対し、反応基質である２ｍＭマルトース(maltose)５００μｌを加えて、３７℃で３０分間反応させた。反応後、反応液を１００℃で５分間処理し、反応を停止させた。次いで、反応基質から生成したグルコース(glucose)の量をグルコースキット(glucose kit)で測定した。阻害率は、阻害剤の代わりに緩衝液(buffer)を入れた反応液との吸光度の差から計算した。この時、基質であるマルトース(maltose)が含まれていなかった反応液をブランクとし、ブランクの吸光度測定において得られる吸光度を、反応液の吸光度測定におけるベースラインとした。このようなα−グルコシダーゼを１００％阻害するα−グルコシダーゼ阻害剤の量を１ユニットと定義し、発酵物の湿重量１ｇあたりに含まれるα−グルコシダーゼ阻害剤の量をユニット数で計算した。
【００７２】
（１）小麦粉
表１に、小麦粉と水を１：２の重量比で混合した後、生地をオートクレーブ(autoclave)処理し、その後滅菌した生地を切断しないで、そのまま菌を播種した物と、カッターを利用して手で約１ｃｍ３の大きさに切断した後、菌を播種して培養した結果を示す。
【００７３】
まず、小麦粉を固体培地にした後の発酵臭は小麦粉生地の切断の有無にかかわらず、全て発酵臭が非常に弱いことを確認することができた。また、生地を切断しない場合、発酵が生地の表面だけで進行し、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が比較的低く現われ、また培養を長くしてもα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性の増加は観察されなかった。一方生地を切断した場合、７２時間の培養過程の中でα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性の増加が続き７２時間発酵後には２４時間発酵時より約５倍のアルファーグルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性増加を観察され、発酵効率が向上することが判明した。すなわち、小麦粉生地を利用した発酵で生地を切断する過程は、微生物の円滑な増殖を促し、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）生産性を増大させることができることが見出された。
【００７４】
【表１】
2017046652.tif 000002
【００７５】
（２）各種穀物（単一穀物）
大豆、小麦、小麦（破砕）、ふすま、麦米、麦米（破砕）、押麦、押麦（破砕）、とうもろこし、とうもろこし（破砕）、玄米、米、鳩麦、燕麦、緑豆を固体培地としてBacillus subtilis DC-15菌を播種した後３７℃で４８時間培養してから発酵量と発酵臭をそれぞれ測定した結果を表２に示す。大豆の場合、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性は高いものの、発酵臭が非常に強く現われた。麦米、とうもろこし、玄米などの穀物は全て発酵臭がほとんどなく、１０００〜９０００ユニット／ｇ（湿重量）程度の高い水準のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が測定された。小麦（破砕）、麦米（破砕）、とうもろこし（破砕）など粉砕機で破砕した場合破砕しない試料に比べてより高いα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が観察された。とうもろこし、小麦などのように種皮が堅い場合、これらを破砕することにより発酵効率の増加が期待できる。
【００７６】
【表２】
2017046652.tif 000003
【００７７】
（３）発酵補助剤を添加した穀物
穀物に発酵補助剤を添加して発酵させた際のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産性向上の有無を観察した。その例として、押麦にソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、サトウキビ黒糖、糖蜜を培養開始時における培養物中の濃度が当該培養物の質量に対して１〜４質量％となるように添加して発酵時間の増加によるα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性の変化を観察した。その結果、表３に示すように、培養後４８時間から発酵補助物が添加された麦米でα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性の著しい増加が観察された。４８時間培養では発酵補助剤の添加によって約３倍のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性の増加が見られ、大豆に比べて最大約５倍のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性増加を果たすことができた。大豆以外の固体培地については、添加された発酵補助制の種類および濃度に関わらず、発酵臭がほとんど発生しなかった。
【００７８】
【表３】
2017046652.tif 000004
【００７９】
（４）混合穀物
麦米ととうもろこしとを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：２で混合した混合穀物、麦米（破砕）ととうもろこし（破砕）とを質量比１：３で混合した混合穀物、麦米と米とを質量比１：１で混合した混合穀物、麦米（破砕）と米とを質量比１：１で混合した混合穀物をそれぞれ固体培地にしてBacillus subtilis DC-15菌を播種し、培養した後に測定したα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性と発酵臭とを表４に示した。混合穀物は全て発酵臭がほとんどなく、さらに、４０００〜７０００ユニット／ｇ（湿重量）程度の高い水準のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が測定された。
【００８０】
【表４】
2017046652.tif 000005
【００８１】
（５）サツマイモとジャガイモ
サツマイモとジャガイモをそれぞれ固体培地にしてBacillus subtilis DC-15菌を播種し、培養した後に測定したα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性と発酵臭を表５に示した。サツマイモとジャガイモは全て発酵臭がほとんどなく、さらに８００〜１８００ユニット／ｇ（湿重量）程度のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性が測定された。
【００８２】
【表５】
2017046652.tif 000006
【００８３】
（６）Bacillus属微生物による発酵 
Bacillus subtilis DC-15、Bacillus subtilis ATCC 9392、Bacillus amyloliquefaciens DSM7等のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）を生産する菌、ならびにBacillus licheniformis ATCC 214218、Bacillus coagulans ATCC 7050、Bacillus subtilis var. natto Miura、Bacillus subtilis var. natto TakahashiおよびBacilｌus licheniformis ATCC 14580などの数種のBacillus属の微生物を利用して発酵基質として麦米、小麦粉、大豆などを２４時間〜４８時間発酵させて、α−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）および発酵臭の生成程度を検討した。表６、表７に示されるようにBacillus属微生物は全て大豆を培地にした場合、非常に強い発酵臭が生成されたが、麦米または小麦粉で発酵した場合、非常に弱い発酵臭を呈するのみであった。発酵物のα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）活性は大豆と比べて小麦粉および麦米において高いことが観察され、本培養技術がBacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus coagulansなどのようなBacillus subtilisの類縁微生物でも発酵臭の低減されたα−グルコシダーゼ阻害剤（ＡＧＩ）の生産に適用可能なことが分かる。
【００８４】
【表６】
2017046652.tif 000007
【００８５】
【表７】
2017046652.tif 000008
【００８６】
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【受託番号】
【００８７】
微生物の表示
＜識別の表示＞    Ｂａｃｉｌｌｕｓ    ｓｐ．  ＤＣ−１５
＜受託番号＞      ＫＣＴＣ  １０７６３ＢＰ