(57)【要約】【課題】  遺伝子組換えアルカリホスファターゼを動物細胞で高発現することが可能な遺伝子配列を提供する。【解決手段】  配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列からなる、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を用いて、アミノ酸を発現させ、変異型アルカリホスファターゼを製造する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
【請求項２】
変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼ。
【請求項５】
請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸を発現させる工程を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えアルカリホスファターゼを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼは、抗原抗体反応などの検出系にホースラディッシュパーオキシダーゼと並んでよく利用される酵素である。種々の動物から単離されたアルカリホスファターゼの中で、ウシ小腸由来の酵素が比活性が高いことから主に使用されていた。また天然型のアルカリホスファターゼには高活性型（ＣＩＰＩＩ）と中活性型（ＣＩＰＩ）が存在することが知られているが、高活性なアルカリホスファターゼは子牛小腸からしか精製することができず、安定供給は課題の一つであった。
【０００３】
近年遺伝子工学技術を用い、ピキア酵母で高活性遺伝子組換えＡＬＰを生産する方法やＣＨＯ細胞で発現する方法が報告されている（特許文献１）。ピキア酵母で産業上利用できる程度の発現量は得られているが、天然型と比べて糖鎖の構造が同じでないなどの課題がのこる。
【０００４】
ピキア酵母で高活性アルカリホスファターゼを発現した報告例では、アルカリホスファターゼの４８７番目のアスパラギン酸までを発現させている（特許文献１）。また、ＣＨＯ細胞で発現させた報告例では４８０番目のアラニンまでを発現させている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３６５７８９５号公報
【特許文献２】特許第４２９５３８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
天然型のアルカリホスファターゼ遺伝子の３’付近には、ＧＰＩアンカーをコードする配列が含まれている。つまり、天然型のアルカリホスファターゼ遺伝子全長を単純に遺伝子組み換え体として発現させた場合は、細胞膜上の膜たんぱく質として発現する。遺伝子組み換え体として発現させたアルカリホスファターゼを利用することを考えると、細胞から分泌発現させる方が、精製工程のことを考慮すると好ましい形態である。しかし、アルカリホスファターゼのどのアミノ酸をＣ末端にすれば、効率よい発現ができるかなどの情報はなかった。アルカリホスファターゼ遺伝子を短くしすぎると酵素活性が低下あるいは消失してしまい、長すぎるとＧＰＩアンカー領域を含むようになるため、アルカリホスファターゼが細胞膜上に残り、発現量の低下につながることが予想される。さらに、遺伝子組み換えタンパク質を高発現させるためには、できるだけ短いタンパク質として発現させる方がホスト細胞へのストレスが少なく発現量は向上する可能性もある。天然型から精製してきたアルカリホスファターゼを解析するとＣ末端は４８０番目のアミノ酸と報告されているが、遺伝子組み換え体として発現させる場合、天然型と同一部位が最適部位ではない可能性があり、どこが最適部位なのかは不明であった。また、ＣＩＰＩＩの全長遺伝子
はクローニングされておらず、シグナルペプチドの遺伝子配列と４８０番目以降の遺伝子
配列は不明であった。
【０００７】
本発明の目的は、遺伝子組換えアルカリホスファターゼを動物細胞で高発現することが可能な遺伝子配列を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（２）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（３）変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子であって、下記（Ａ）又は（Ｂ）から選択される、遺伝子：
（Ａ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９４番目に記載の遺伝子配列と８０％以上の相同性を有する、変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子。
（４）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸配列からなることを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼ。
（５）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子がコードするアミノ酸を発現させる工程を含むことを特徴とする、変異型アルカリホスファターゼの製造方法。
【０００９】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】
変異型アルカリホスファターゼのアミノ酸配列１番目〜４８０番目までに相当する遺伝子配列は特許文献２に従い合成し、それ以降の遺伝子配列はＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９０、５０３；（１９９３）に記載されているＣＩＰＩのアミノ酸配列４８１番目以降に相当する遺伝子配列に従い合成し、−１９番目〜−１番目に相当するシグナルペプチドの配列もＣＩＰＩのシグナルペプチドのアミノ酸配列に相当する遺伝子配列に従い合成し、全５３３アミノ酸（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に相当する遺伝子（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を合成した。この遺伝子を鋳型として、Ｃ末端からアミノ酸を一個ずつ短くしていったものを発現させ、４７０番目のアミノ酸残基まで短くした変異体を作製した。変異体遺伝子の作製は通常行われている遺伝子組換え技術を利用することができる。
【００１１】
上記各種変異体を遺伝子組み換えタンパク質として発現させるホスト・ベクター系や、その培養方法は特に限定されない。たとえば動物細胞用発現体として発現させるベクターとして、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０に示されるような発現ベクターを使い、ＣＨＯ細胞をホストとして用いることができる。また、ホストとして使用する動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを例示することができるが、それらに限定されるものではない。もちろん、付与される糖鎖の構造が天然型と異なっていたり、糖鎖欠損体であっても良い場合は、大腸菌や酵母、バチルスなどの細菌でも製造することは可能であり、無細胞タンパク質合成系で生産することも可能である。
【００１２】
組換えアルカリホスファターゼを生産するための培養方法も、それぞれのホスト・ベクター系で最適な方法で培養すればよく、培養時間、溶存酸素濃度、ｐＨや各種培地成分をタンパク質の発現量が最適になるように調整することで生産することができる。
【００１３】
また遺伝子組換えアルカリホスファターゼを生産するホスト細胞の作り方も特に限定されず、通常使用されているホスト・ベクターの組み合わせで発現細胞を作製することができる。
【００１４】
［培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼ量の測定］
培養上清中に発現した遺伝子組換えアルカリホスファターゼの定量系を構築した。２種類の抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３、ＡＰＡ０３．２）を用い培養上清中のアルカリホスファターゼの検出を行った。今回は上記に示す２種類のモノクローナル抗体を使用したが、本抗体に限定されるものではなく、他のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いることも可能である。まず、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、スキムミルクでブロッキングした後、遺伝子組み換え体として発現したアルカリホスファターゼを含む培養上清を反応させた。この時に培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼが固相の抗体に捕捉される。その後、ホースラディッシュパーオキシダーゼで標識したＡＰＡ０３．２を反応させ、十分に洗浄後、固相に結合したＨＲＰ量を検出することで、培養上清中に存在していた遺伝子組換えアルカリホスファターゼの量を比較した。
【００１５】
［培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼ活性の測定］
ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、スキムミルクでブロッキングした後、遺伝子組み換え体として発現したアルカリホスファターゼを含む培養上清を反応させた。この時に培養上清中の遺伝子組換えアルカリホスファターゼが固相の抗体に捕捉される。その後十分に洗浄したのちに、アルカリホスファターゼの酵素活性を測定した。
【００１６】
［比活性の比較］
前述した方法で、培養上清中に存在するアルカリホスファターゼの量とアルカリホスファターゼの活性を測定することで、酵素の比活性を比較することができる。ここでは横軸にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を、縦軸にＡＬＰ量を取る（図１）。ＡＬＰの比活性が同じであれば、斜めのライン上にプロットされるが、比活性が向上しているのであれば斜めの線から右側にシフトし、比活性が低下しているのであれば、左にシフトすることとなる。
【００１７】
今回の培養上清を上記方法で評価した。なお、データーのばらつきを考慮して、それぞれ５点ずつ測定しプロットした（図２〜６）。その結果、各種変異体のデーターをプロットしたが、すべて同じ傾きの直線状に並んだことから、今回作製した変異型アルカリホスファターゼは、Ｃ末端の切断位置により比活性は変化しないことが示された。
【００１８】
［発現量の比較］
全５１４アミノ酸を発現したアルカリホスファターゼから、Ｃ末端をＮ末端側に向かって短くしてゆくに従い、培養上清中の活性が増加してゆく傾向にあることが分かった。発現量は、Ｃ末端のアミノ酸番号が５１４番目から４７７番目までは少しずつ増加してゆき、それ以上短くすると急激に発現量が低下することが分かった。培養上清中の活性がなくなる原因として考えられることは、タンパクとして発現しているが活性が無くなった場合と、タンパク質として発現すらしなくなる場合が考えられる。今回培養上清中の酵素活性が消失している培養上清を解析すると、培養上清中にアルカリホスファターゼ自体が存在していないことが明らかとなった。これらのことから、４７７アミノ酸より短くなるとタンパク質として発現できなくなることが分かった。遺伝子組換え体として動物細胞で発現させる場合は、４７７番目以上のアミノ酸が必要である。よって、１〜４７７番目のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、即ち配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目の遺伝子配列が、今回の変異体を作製するためには必須であり、更に配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４９１番目の遺伝子（アミノ酸配列１〜４７８番目に相当）又は５８〜１４９４番目の遺伝子（アミノ酸配列１〜４７９番目に相当）であってもよい。また、上記配列（配列番号２に記載の遺伝子配列の５８〜１４８８番目の遺伝子配列、５８〜１４９１番目の遺伝子配列、又は５８〜１４９４番目の遺伝子配列）と相同性を有する相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明で示した配列を使用することで、高活性アルカリホスファターゼを効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例５で行った比活性の変化を比較する原理図である。
【図２】実施例５で得られた結果のうち、１０クローンの結果を示したグラフである。図中の数字は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示す。
【図３】実施例５で得られた結果のうち、１２クローンの結果を示したグラフである。図中の数字は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示す。
【図４】実施例５で得られた結果のうち、１０クローンの結果を示したグラフである。図中の数字は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示す。
【図５】実施例５で得られた結果のうち、９クローンの結果を示したグラフである。図中の数字は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示す。
【図６】実施例５で得られた結果のうち、１０クローンの結果を示したグラフである。図中の数字は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示す。
【図７】実施例６で、各種変異体の発現量を比較した結果を示す図である。
【図８】実施例７で測定した活性を示す図である。
【図９】実施例８で得られた、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムにより分離されたクロマトグラムを示す図である。
【図１０】実施例８で得られた、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムにより分離されたクロマトグラムを示す図でさる。
【図１１】実施例９で得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【実施例】
【００２１】
［実施例１］  キメラ遺伝子と各種変異体をコードする遺伝子の作製
特許文献２に示されたＣＩＰＩＩの配列とＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９０、５０３；（１９９３）に記載されているＣＩＰＩの配列から、ＣＩＰＩＩとＣＩＰＩのキメラタンパク質（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、配列番号１）を設計し、それをコードする遺伝子（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、配列番号２）を合成した。配列番号１にはシグナルペプチドに相当する１９アミノ酸（配列番号１の−１９〜−１位）を含むため、分泌発現した際は配列番号１の１位のアミノ酸のＬがタンパク質のＮ末端となる。つまり、分泌発現した際の４８０番目のアミノ酸であるＡは、配列番号１では４８０番目のＡとなり、そこまではＣＩＰＩＩの配列であり、それより後の配列はＣＩＰＩの配列であり、全長５１４個のアミノ酸配列とした。なお、配列番号２のＣ末端は終止コドンを含んでいる。この配列を、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０の中で使用されているｐＥＣＥ−ｄｈｆｒベクターに導入した。そのベクターをＡＬＰの全長を発現する発現ベクターとした（ＡＬＰ−５１４）。
【００２２】
その後、ＡＬＰ−５１４を鋳型として用い、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）により、終止コドンの上流のアミノ酸を順次欠失させた変異体を作製した。それぞれの変異体の名前は（ＡＬＰ−数字）で示し、発現したタンパク質のＮ末端のＬを１とした時の、Ｃ末端のアミノ酸番号を記載した。
【００２３】
［実施例２］一過性発現による各種変異体の発現
定法により各種変異体がクローニングされたプラスミドを精製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、取扱説明書に従い遺伝子を導入した。遺伝子を導入してから３日後に培養上清を回収し、以下の実験に使用した。なお実験のばらつきを考慮して、遺伝子導入は一つのプラスミドに対して同じ条件で５点行い、その後それぞれの培養上清を、実施例３と実施例４に示す方法で解析し、図２から６にプロットした。つまり、一つの変異体につき５点のデーターをプロットしている。
【００２４】
［実施例３］ＥＬＩＳＡによる、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ量の比較
ウシ小腸より精製したアルカリホスファターゼを免疫抗原として、定法によりウシ小腸由来アルカリホスファターゼ認識抗体を単離した。それらの中から、ウシ小腸アルカリホスファターゼの異なるエピトープを認識し、サンドイッチアッセイが構築できる２種類の抗体（ＡＰＡ０５．３、ＡＰＡ０３．２）を使用した。固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。その後、実施例２で作製した各種変異体が発現した培養上清を、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで１０倍希釈したものを添加し一時間反応させた。洗浄用緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ標識した抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０３．２）を１，０００倍希釈したものを、１時間反応させた。ＨＲＰ標識は、同仁化学社製のＨＲＰ標識試薬（ＬＫ−１１）を説明書通りに使用した。室温で１時間反応させた後，該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ／ＴＭＢ（セラケア  ライフサイエンシーズ社製）を添加し、説明書通りに反応させ、該ＥＬＩＳＡプレートの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
【００２５】
［実施例４］ＥＬＩＳＡによる、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性の比較
固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。その後、実施例２で作製した各種変異体が発現した培養上清を、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで１０倍希釈したものを添加し一時間反応させた。
【００２６】
洗浄用緩衝液で洗浄後、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルりん酸（４−ＭＵＰ））を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
【００２７】
［実施例５］変異体の比活性の相関性
実施例３で得られた値を縦軸に、実施例４で得られた値を横軸にグラフ上にプロットした。たとえば図２では、１０種類の変異体をそれぞれ５クローンずつ実施例３と４の方法で測定した結果をプロットしたものである。なお、実験日が変わると縦軸と横軸の値が多少変化し、傾きが変化するため図間の直接の比較はできない。そのため、それぞれのグラフ間で共通のクローンを複数測定することで、すべてのクローンでの相関性を考察した。
【００２８】
図２から図６に示すグラフで、ＡＬＰ−５１１、ＡＬＰ−５０９，ＡＬＰ−５０６〜４７０のデーターをプロットしている。各種変異体の５点のプロットは、ほぼ同一の部分にプロットされていることから、実験誤差は少ないことがわかる。さらに、変異体間の関係も、それぞれのグラフで一直線上に並んでおり、相関性が高くプロットされていることから、各種変異体間の比活性の差はないと判断できた。
【００２９】
［実施例６］変異体の発現量の比較
すべての変異体のプラスミドを２６０ｎｍの吸光度を測定することにより定量し、９６ウエルプレートで生育した同数のＣＨＯ細胞に実施例２で示す方法で導入した。その後、実施例４に示す方法で、培養上清中の活性を測定した。その結果をまとめて図７に示した。なお複数のデーターがプロットされているクローンもある。横軸は、変異体のＣ末端のアミノ酸番号を示し、縦軸は得られた蛍光強度を示す。このグラフから、アミノ酸番号５１４番目から４７７番目までは培養上清中のＡＬＰ活性が増加してゆくが、４７６番目まで短くすると急激に活性が低下してしまい、更に短くするとほとんど活性が見られなくなってしまう事が明らかとなった。さらに、図４でも明らかなように、４７０番台前半のクローンは、発現量も低下していることが明らかとなった。つまり活性の低下は、酵素活性部位への影響ではなく、そもそもタンパク質として発現できていないことによることが明確となった。
【００３０】
［実施例７］
実施例４では、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼの活性を、抗アルカリホスファターゼ抗体（ＡＰＡ０５．３）で捕捉して測定した。ここで使用した抗体のエピトープが、変異体を作製する際にアミノ酸を欠失させた領域ではない事の確認を行った。ＡＬＰ−４７０、４７５、４８０、４８５、４９０の変異体遺伝子を、実施例２に示す方法でＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、培養上清を回収した。培養上清を、実施例４に示す方法で活性を測定した結果を図８の右側に示した。このグラフは、抗アルカリホスファターゼ抗体で固相に捕捉したアルカリホスファターゼの活性を示している。
【００３１】
それとは別に、培養上清をＰＢＳで１０倍希釈した溶液１０マイクロリットルを、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−ＭＵＰ）９０マイクロリットルに添加し、３０分間室温でインキュベートしたのちに、蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した結果を図８の左側に示した。このグラフは、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性を示している。
【００３２】
両グラフが同じような傾向を示していることから、抗アルカリホスファターゼの捕捉に使った抗体の認識部位は、変異導入部位にはないことが確認された。
［実施例８］変異体の精製
ＡＬＰ−４７９の発現ベクターを常法によりラットミエローマＹＢ２／０に導入し、安定生産クローンＡＬＰ−４７９（ＹＢ２／０）を得た。その後本細胞を、内径１５０ｍｍの細胞培養用ディッシュの１０％子牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬）  ３０ｍｌに継代し１０日間培養した。培養液を４℃、２５００ｒｐｍ、２０分間遠心して細胞を除き、培養上清を回収した。
【００３３】
培養上清２００ｍｌに硫酸アンモニウムを５５％飽和となるよう添加し、４℃で０．５時間放置、その後４℃、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により、沈殿画分として硫安塩析物を得た。沈殿画分をＰＢＳで溶解し、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍとした後、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ、東ソー株式会社）を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムカラムクロマトグラフィーは、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳを平衡化緩衝液とし、流速１ｍｌ／分の硫安濃度１Ｍから０Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行った。そのときのクロマトグラムを図９に示す。
【００３４】
各溶出フラクションを分取し、パラニトロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）を基質とする０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９．６におけるＡＬＰの活性測定を行った。それにより、ＡＬＰの溶出位置を確認、即ちＡＬＰ活性があった範囲を図９中に下線で示した。
【００３５】
上記活性があった範囲からフラクション１２〜１５を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量３０ＫＤａ、４℃  ５０００ｒｐｍ×１０分）で遠心膜濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５緩衝液で平衡化させた。その後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ、東ソー株式会社）に供給した後、塩化ナトリウム濃度を０Ｍから０．５Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行なった。１分ごとにフラクションを試験管に分取し、各溶出フラクションにつき２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）とＰＮＰＰ法による活性（Ａ４０５）を測定した。結果を図１０に示す。この結果得られた比活性（Ａ４０５／Ａ２８０）の高いフラクションに、高純度のＡＬＰが含まれる。前記比活性の高い、フラクションＮｏ．１７および１８を回収し、該フラクションにアジ化ナトリウムを０．１％、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ、ＺｎＣｌ２を０．０１ｍＭとなるように添加した。タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌのＡＬＰのＡ２８０の吸光度を０．７６としたとき、０．８ｍｇ／ｍｌであった。
［実施例９］精製した変異体の純度と比活性の確認
精製した変異体の純度を確認するために、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのコントロールとして、市販の高活性ウシ小腸アルカリフォスファターゼＡＬＰＩ−１３Ｇ（Ｌｏｔ  １７０６ＡＡ、Ｂｉｏｚｙｍｅ社）も同時に泳動した。この結果から、両者とも純度は９８％以上と見積もれた（図１１）。
【００３６】
両ＡＬＰの比活性をＰＮＰＰ法にて比較したところ、Ａ２８０をベースとした蛋白質量あたりの活性としてＡＬＰＩ−１３Ｇの９６％を示し、十分高い活性を有することが確認された。
【００３７】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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