(57)【要約】【課題】有弁静脈中の弁の再細胞化のための方法を提供すること。【解決手段】上記方法は、同種異系静脈弁を生成するために有用であり、ここで、ドナー有弁静脈は、脱細胞化されており、次いで、全血もしくは骨髄幹細胞を使用して再細胞化される。本明細書で開示される方法によって生成される同種異系弁は、血管疾患を有する患者に埋め込むか、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）するか、または移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）するために有利である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１４年５月２７日に出願された米国仮出願第６２／００３，１２９号に対する優先権およびその利益を主張する。米国仮出願第６２／００３，１２９号の開示は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（開示の分野）
本開示は、有弁静脈中の弁の再細胞化のための方法に関する。本明細書で開示される方法によって生成される弁は、血管疾患を有する患者への埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）か、または移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）のために有利である。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
静脈弁は、静脈を通る血液の逆流を防止する静脈中の膜性のひだである。ヒトが立っている場合、血液は、肢の静脈から重力に対抗して、心臓に達するために上方向に流れなければならない。身体は、皮下の脂肪層に位置した表在静脈、ならびに筋肉中におよび骨に沿って位置した深部静脈を有する。短い静脈は、連結静脈（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｖｅｉｎ）といわれ、表在静脈と深部静脈とを繋ぐ。深部静脈は、血液を心臓に向かって推進するにあたって重要な役割を果たしている。深部静脈における一方向弁は、血液が逆流するのを防止し、深部静脈を取り囲む筋肉が深部静脈を圧迫し、ちょうど歯磨き粉のチューブを圧搾して歯磨き粉を押し出すように、血液を心臓へと押しやるのを助ける。歩を進めるごとに肢の深部静脈を力強く圧迫する強力な腓腹筋は重要である。深部静脈は、肢から心臓へと向かう血液のうちの９０％またはそれより多くを運ぶ。
【０００４】
一方向弁は、縁部が接触する２枚のフラップ（弁尖もしくは弁葉）からなる。これらの弁は、静脈が血液を心臓へ戻すのを助ける。血液は心臓に向かって動くので、血液は、１対の一方向のスイングドアのように弁尖を押し開く（左に示される）。重力が血液を一瞬逆に引っ張る場合に、または血液が静脈の中で後退し始める場合に、上記弁尖は、直ぐに押されて閉じ、逆流を防止する（右に示される）。
【０００５】
表在静脈は、深部静脈と同じタイプの弁を有するが、それらは筋肉よって囲まれていない。従って、表在静脈中の血液は、筋肉の圧搾作用によって心臓に向かって押し出されないので、深部静脈中の血液よりゆっくりと流れる。表在静脈を通って流れる血液の大部分は、深部静脈の中へと、深部静脈と表在静脈との間にある多くの連結静脈を通って送達される。連結静脈の中の弁は、血液を表在静脈から深部静脈へと流すが、その逆はない。
【０００６】
慢性静脈不全（ＣＶＩ）は、肢静脈における静脈壁および／もしくは弁が効率的に機能せず、血液が肢から心臓へと戻るのが困難になるときに起こる状態である。ＣＶＩは、血液をこれらの静脈内に「貯留する」か、もしくは該静脈内に集まる原因となり、この貯留は、鬱血といわれる。静脈は、血液を全ての身体の器官から心臓へと戻す。心臓に到達するために、血液は肢の静脈から上方向に流れる必要がある。腓腹筋および足の筋肉は、静脈を圧搾して血液を上方向に押し出すためには、歩を進めるごとに収縮する必要がある。血液を上に流し続けて下に戻らないようにするために、静脈は一方向弁を含む。慢性静脈不全は、これらの弁が損傷して、血液を後方に漏出してしまうときに起こる。弁損傷は、加齢、長時間の着座もしくは起立、または加齢と運動性の低下との組み合わせの結果として起こり得る。静脈および弁が、血液が心臓へと上に流れるのが困難になっている地点までもろくなっている場合、静脈における血圧は長期間上昇したままであり、ＣＶＩがもたらされる。概算で米国の人々のうちの４０％が、ＣＶＩを有する。
【０００７】
弾性ストッキング（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｏｃｋｉｎｇ）と表在静脈の手術（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）との併用でのＣＶＩの従来の処置は、静脈血行力学を改善するようである；しかし、２４週間後に６５％  潰瘍治癒率を達成するに過ぎず、再発率は１２％／年である。ＣＶＩおよび肢潰瘍化の深部静脈再建手術処置（Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｄｅｅｐ  ｖｅｎｏｕｓ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は侵襲性であるので、使用は制限されている。
【０００８】
血液は、心臓のポンプ作用に由来する動圧が原因で、動脈および静脈の両方を通って動く。閉鎖循環系で、静脈の戻りは、心拍出量に等しくなければならない。動圧の大部分は、動脈循環において消散する。残りのエネルギーは、静脈系で放出される。通常の環境下では、毛細管の静脈端の圧力は、１２〜１８ｍｍＨｇであり、４〜７ｍｍＨｇの動脈圧に向かって着実に下がる。仰臥の場合、重力圧は中和され、血液は、この動圧勾配に沿って流れる。呼吸運動もまた、仰臥位において静脈還流に強く影響を及ぼすが、四肢が依存する（ｔｈｅ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）場合にはほとんど影響はない。
【０００９】
静水圧は、右心房下の血液柱状体（ｂｌｏｏｄ  ｃｏｌｕｍｎ）の重量に由来する。血液密度および重力加速度が静水圧を決定する。静水圧および重力圧は、心房の下ｃｍ単位の垂直距離の一定の乗数（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）（０．７７ｍｍＨｇ／ｃｍ）として表される。上記圧力は、直立している（着座もしくは起立）が、静止している個体において最も高い。しかし、測定された圧力はまた、筋収縮のような外部要因を反映する。他の外部要因はまた、虚脱可能な静脈導管を通る流れを変える。吸気の間に、横隔膜収縮は、腹腔内圧および下肢静脈圧を上昇させる。腹水および肥満は、仰臥の場合にすら、同様の圧力の上昇を生じる。
【００１０】
依存する上肢の圧力は、心房と第１肋骨との間の垂直距離を反映する。直立している被験体の心房より上に保持されている上肢の静脈は、頭頚部の頭蓋外の静脈がそうであるように虚脱する。従って、心房より上の静脈構造における圧力は、ゼロより下には低下しない。浮腫および逆流は、静脈弁が先天的に存在しない場合ですら、上肢においては希である。孤立性中心静脈血栓症は、しばしば、一過性の近位浮腫のみを生じる。
【００１１】
依存する下肢から心臓への血液の静脈還流は、応答能のある静脈弁が補助して、下肢の筋ポンプにより血液を駆出することによって達成される。弁は、静水性の血液柱状体をセグメントへと分け、逆方向の静脈流を防止するように機能する。膝窩下（ｉｎｆｒａｐｏｐｌｉｔｅａｌ）セグメントにおける弁の数がより多いことから、それらの機能的重要性がより大きいことが示唆されるが、静水圧は、大腿静脈もしくは膝窩静脈の機能不全を矯正することによって有意に変化し得る。貫通静脈の弁は、ふくらはぎのポンプ作用の圧力／流れの関係性と一致する概念である深部から表在への流れを防止する。足の貫通静脈は、例外である；２方向性の流れが正常であると考えられる。
【００１２】
慢性静脈不全（ＣＶＩ）および肢潰瘍化を有する患者は、巨大で直接的な年間費用を伴う深刻な医学的かつ社会的問題を構成する。肢静脈潰瘍の有病率は、０．１〜１．０％の間である。弾性ストッキングと表在静脈の手術とを組み合わせてのＣＶＩの従来処置は、静脈血行力学を改善するようである；しかし、２４週間後に６５％  潰瘍治癒率を達成するに過ぎず、再発率は、１２％／年である。
【００１３】
さらに、手術技術は要求が多く、従って、深部静脈再建手術の使用は制限されてきた。
【００１４】
従って、慢性静脈不全（ＣＶＩ）および肢潰瘍化に苦しんでいる処置中の患者にとって、改善された方法が相変わらず必要である。本開示は、これら障害を処置する代替ストラテジーを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（開示の要旨）
本開示は特に、有弁静脈中の弁を脱細胞化および再細胞化するための材料および方法を特徴とする。
【００１６】
本開示は、模擬のインビボ生理条件下で、組織工学で作られたヒト有弁静脈セグメントの弁機能の成功裡の保護を提供する。本開示は、単純な血液サンプル（ここから内皮細胞単層が形成される）での脱細胞化されたヒト静脈セグメントおよび静脈弁の成功裡の再内皮形成をさらに提供する。
【００１７】
本開示は、静脈中の弁の再細胞化のための方法を提供し、上記方法は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む血液を、脱細胞化された静脈の管腔に導入する工程、ならびに上記脱細胞化された静脈の管腔の中で上記細胞を培養し、それによって、上記静脈中の弁を再細胞化する工程を包含する。
【００１８】
本開示は、有弁静脈中の弁の再細胞化のための方法を提供し、ここで上記再細胞化された弁は、機能的弁である。実施形態においては、上記方法は、静脈中の再細胞化された弁が必要な被験体から静脈のセグメントを採取する工程；上記有弁静脈を脱細胞化する工程；上記被験体から血液を採取する工程であって、ここで上記血液は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む工程；上記脱細胞化された有弁静脈を上記採取した血液で灌流する工程；ならびに上記脱細胞化された有弁静脈中で上記細胞を培養し、それによって、上記静脈中の上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程を包含する。
【００１９】
実施形態では、本開示は、上記再細胞化が上記再細胞化された弁の逆流圧の応答能および耐容能を回復させる、静脈中の弁を再細胞化するための方法を包含する。
【００２０】
本開示は、慢性静脈不全（ＣＶＩ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および／もしくは肢潰瘍化の処置を必要とする被験体（再細胞化された有弁静脈のレシピエント）において、静脈の再細胞化された有弁セグメントを上記被験体に導入することによって、慢性静脈不全（ＣＶＩ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および／もしくは肢潰瘍化を処置するための方法を提供し、ここで上記弁は、同種異系静脈の有弁セグメントを脱細胞化する工程；上記被験体から血液を採取する工程であって、ここで上記血液は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む工程；上記脱細胞化された有弁セグメントを上記採取した血液で灌流する工程；上記脱細胞化された有弁静脈の管腔中で上記細胞を培養する工程；それによって、上記静脈の脱細胞化された上記弁を再細胞化する工程；ならびに、上記再細胞化された有弁静脈を、上記被験体への移植工程を包含する方法によって再細胞化し、これにより、上記被験体においてＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置する。
【００２１】
実施形態では、血液は、末梢静脈血もしくは全血である。実施形態では、上記末梢静脈血もしくは上記全血は、上記脱細胞化された静脈に、注射もしくは灌流によって導入される。上記方法は、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流によって、上記細胞を培養することを提供する。上記内皮細胞培地および上記平滑筋細胞培地の灌流は、交互であり得る。実施形態では、上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性、ｖＷＦ陽性、平滑筋アクチン陽性であり、核を有する。実施形態では、上記再細胞化された弁は、０．８Ｎまたはそれより高い第１のピークの力に耐えるという機械的特性を有する。実施形態では、上記再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の閉鎖時間を有する。
【００２２】
本開示は、脱細胞化された静脈の管腔に、以下のうちの１つまたはそれより多くを導入することによって、静脈中の弁の再細胞化の方法を提供する：内皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞の集団。細胞および／もしくは始原細胞の集団は、上記脱細胞化された静脈とともに培養され、それによって、上記静脈中の上記弁を再細胞化する。本開示の再細胞化された弁は、正常な閉鎖時間（すなわち、応答能）を回復し、それが必要な被験体において移植した（ｇｒａｆｔｅｄ）後に、正常な健常な弁に類似して逆流圧に耐える。本開示の特徴は、内皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞の集団を、脱細胞化された静脈の管腔のみに導入することを提供する。
【００２３】
本開示は、静脈中の弁の再細胞化のための方法をさらに提供し、ここで上記再細胞化された弁は、機能的である。再細胞化のための方法は、以下を含む工程を包含する：ヒト静脈の有弁セグメントを採取する工程；上記静脈を脱細胞化する工程；上記再細胞化された弁のレシピエントから血液を採取する工程；上記脱細胞化された静脈を、上記採取した血液で数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、もしくは約１０〜２０時間の間）にわたって灌流する工程；上記静脈を内皮細胞培地で１日より長く灌流する工程；ならびに上記静脈を平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；それによって、上記静脈の上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程。本開示の血液を使用して再細胞化された弁は、正常な閉鎖時間（すなわち、応答能）を回復し、上記弁が必要な被験体において移植した後、正常な健常な弁に類似して逆流圧に耐える。
【００２４】
本開示は、静脈中の弁の再細胞化の方法を提供し、ここで上記再細胞化された弁は機能的である。上記再細胞化方法は、以下の工程を包含する：ドナーから採取された静脈の有弁セグメントを脱細胞化する工程；処置の必要な（すなわち、静脈中の弁の再細胞化が必要な）上記被験体から採取した血液で数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、もしくは約１０〜２０時間の間）にわたって灌流する工程；必要に応じて、上記静脈を、内皮細胞培地で１日より長く灌流する工程；および上記静脈を、平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；それによって、上記静脈の脱細胞化された弁を再細胞化する工程であって、ここで上記再細胞化は、上記弁が必要な被験体において移植した場合に、上記再細胞化された弁の逆流圧の応答能および耐容能を回復する工程。
【００２５】
弁の再細胞化の方法において、末梢静脈血もしくは全血に存在するかもしくはこれらに由来する細胞の集団は、脱細胞化された静脈とともに培養される。本開示は、上記細胞の集団が同種異系であることを提供する。本開示はまた、上記細胞の集団が自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）であることを提供する。上記細胞の集団（同種異系および／もしくは自己由来）は、末梢静脈血もしくは全血から採取されるか、またはこれらの中に存在する。本開示は、同種異系ドナーから採取された末梢静脈血もしくは全血を提供する。上記末梢静脈血もしくは全血は、自己由来である。本開示は、脱細胞化された静脈を、同種異系末梢静脈血もしくは同種異系全血とともに培養することを提供する。本開示は、脱細胞化された静脈を、同種異系全血とともに培養することを提供する。本開示はまた、脱細胞化された静脈を、自己由来末梢静脈血もしくは自己由来全血とともに培養することを提供する。
【００２６】
本開示は、脱細胞化された静脈を提供する。上記静脈は、反復脱細胞化工程、すなわち、上記静脈を１回より多く脱細胞化する工程（「サイクル」と定義される）を包含する方法で脱細胞化される。上記静脈の脱細胞化は、２〜１６サイクルの間を要する。例えば、上記脱細胞化方法は、１４サイクルを要する。
【００２７】
２〜１６回の脱細胞化サイクルを要する方法での脱細胞化後の本開示の有弁静脈は、脱細胞化されていない静脈と比較して、核の数が減少しているか、もしくは核がない（免疫組織化学アッセイにおいて核の染色がより少ないかもしくは陰性である）。２〜１６回の脱細胞化サイクルの後、上記静脈は、ＨＬＡクラス−Ｉ抗原が低下しているかもしくはない（免疫組織化学アッセイにおいてＨＬＡクラス−Ｉ抗原に関して染色がより少ないかもしくは陰性）、および／またはＨＬＡクラス−ＩＩ抗原が低下しているかもしくはない（免疫組織化学アッセイにおいてＨＬＡクラス−ＩＩ抗原に関して染色がより少ないかもしくは陰性）こととして特徴付けられる。２〜１６回の脱細胞化サイクルの後、上記静脈は、脱細胞化されていない静脈と比較して、コラーゲンおよび硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の減少、およびエラスチンの増加を有するとして特徴付けられる上記脱細胞化は、脱細胞化されていない静脈と比較して、脱細胞化された静脈中のＤＮＡを減少させる。
【００２８】
本開示は、脱細胞化された有弁静脈中の弁の再細胞化を提供し、ここで上記再細胞化された弁および静脈は、核を有し、ＣＤ３１陽性である。再細胞化された弁を有する静脈はまた、平滑筋アクチンについて陽性であり、静脈の外膜において紡錘形の平滑筋細胞を有する。上記再細胞化された弁および静脈はまた、内皮マーカーであるｖＷＦについて陽性である。
【００２９】
本開示は、機能的弁を達成する方法によって、脱細胞化された静脈中の弁の再細胞化を提供する。上記機能的弁は、正常な閉鎖時間（すなわち、応答能のある）を有し、正常なレベルの逆流圧に耐える。正常な機能（本明細書で応答能（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｙ）ともいう）を有する弁の正常な閉鎖時間は、０．５秒以下である。正常な機能を有する弁は、１００ｍｍＨｇという正常レベルの逆流圧（そして７〜１２歩歩いている間に、平均約１８ｍｍＨｇ〜約２５ｍｍＨｇへと低下する）に耐える。
【００３０】
本開示は、再細胞化された弁が必要な被験体において移植後に、毛細管の静脈末端において１２〜１８ｍｍＨｇの圧を回復する、再細胞化された弁を提供する。上記再細胞化された弁は、それを必要とする被験体において正常な静水圧および重力圧（これは、心房の下ｃｍ単位の垂直距離の一定の乗数（０．７７ｍｍＨｇ／ｃｍ）として表される）を回復する。上記再細胞化された弁は、移植後に、直立している（着座もしくは起立）が、静止している被験体の正常の最高圧力レベル（これは、１００ｍｍＨｇである）を回復する。本開示はまた、歩行中および呼吸中に起こる応力下での深部静脈系における静脈を通る流れを摸倣するためのインビトロ機能アッセイにおいて、約１００ｍｍＨｇの静脈逆流圧を有する機能的な再細胞化された弁を提供する。
【００３１】
本開示は、応答能のある再細胞化された静脈弁が補助して、下肢筋ポンプにより血液を駆出することによる、依存する下肢から心臓への血液の正常な静脈還流を達成するために、弁の再細胞化を提供する。本開示の再細胞化された弁は、静水性の血液柱状体をセグメントへと分け、静脈流が逆行しないように機能する。静脈の再細胞化は、膝窩下のセグメントにおいてより多くの数の弁を回復する。弁の再細胞化は、大腿静脈もしくは膝窩静脈の機能不全を矯正することによって、静水圧変化から生じる症状を改善する。貫通静脈の弁は、深部から表在への流れを防止し、腓腹筋のポンプの正常圧／流れの関係性を回復する。
【００３２】
足の貫通静脈における再細胞化された弁は、静脈を通る血液の２方向性の流れを回復する。
【００３３】
本開示は、慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状の処置もしくは改善を必要とする被験体において慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状を処置もしくは改善するための方法をさらに提供し、静脈の再細胞化された有弁セグメントを上記被験体への移植工程を包含する。上記弁の再細胞化方法は、１またはそれより多くの工程を包含する。上記方法は、以下の１またはそれより多くの工程を包含する：ヒト同種異系大腿静脈の有弁セグメントを採取する工程；上記大腿静脈の静脈を２〜１６サイクルで脱細胞化する工程；上記被験体から血液を採取する工程；上記脱細胞化された静脈を、抗凝固剤で灌流する工程；上記脱細胞化された静脈を、上記採取した血液で数時間灌流する工程；上記血液を排出し、上記静脈を緩衝液ですすぐ工程；上記静脈を先ず内皮細胞培地で１日より長く灌流し、続いて、上記静脈を平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；ならびにそれによって、上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程；ここで上記再細胞化された弁は、上記被験体に移植すると、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置もしくは改善する。
【００３４】
本開示は、慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状の処置もしくは改善を必要とする被験体において慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状を処置もしくは改善するにあたって使用するための血管の再細胞化された有弁セグメントを提供する。血管の再細胞化されたセグメントは、以下の工程のうちの１またはそれより多くを包含する方法によって得られる：ヒト同種異系大腿静脈の有弁セグメントを採取する工程；上記大腿静脈の静脈を２〜１６サイクルで脱細胞化する工程；上記被験体から血液を採取する工程；上記脱細胞化された静脈を抗凝固剤で灌流する工程；上記脱細胞化された静脈を上記採取された血液で数時間灌流する工程；上記血液を排出し、上記静脈を緩衝液ですすぐ工程；ならびに上記静脈を先ず内皮細胞培地で１日より長く灌流し、次いで、上記静脈を平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；ならびにそれによって、上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程；ここで上記再細胞化された弁は、上記被験体に移植すると、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置もしくは改善し；好ましくは、ここで上記再細胞化された血管のセグメントは、上述の工程のうちの全てを含む方法によって得られる。
【００３５】
本開示は、身体／ドナーから採取もしくは得られた静脈のセグメントである弁、および処置される予定の被験体から採取された血液に対して行われる方法を提供し、ここで上記ドナーおよび上記処置される予定の被験体は、同じ個体ではない。
【００３６】
本開示の弁の脱細胞化工程は、上記有弁静脈を、適切な界面活性剤／有機リン酸化合物（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）およびトリ−ｎ−ブチルホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない）中で、および必要に応じてさらにＤＮＡａｓｅを含んで処置する工程を包含する。
【００３７】
上記脱細胞化された弁は、上記静脈を内皮細胞培地中で２〜６日間の間灌流し、続いて、上記静脈を平滑筋培地中で２〜６日間の間灌流することによって再細胞化される。一局面において、上記脱細胞化された静脈の培養は、インビトロで行われる。
【００３８】
上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁はまた、平滑筋アクチン陽性、ｖＷＦ陽性であり得るか、そして／または紡錘形の平滑筋細胞の存在によって特徴付けられ得る。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力の機械的特性を有する。
【００３９】
本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを再細胞化された有弁静脈で処置するための方法を提供する。本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを処置するにあたって、再細胞化された有弁静脈の使用を提供する。
【００４０】
本開示は、本明細書で記載される再細胞化方法のうちのいずれか１つによって生成される弁を特徴とし、ここで上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁はまた、平滑筋アクチン陽性、ｖＷＦ陽性であり得るか、そして／または紡錘形の平滑筋細胞の存在によって特徴付けられ得る。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力の機械的特性を有する。
【００４１】
本開示はまた、埋め込みもしくは移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）のための本明細書で記載される方法のうちのいずれか１つによって生成される弁の使用を特徴とし、ここで上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁はまた、平滑筋アクチン陽性、ｖＷＦ陽性であり得るか、そして／または紡錘形の平滑筋細胞の存在によって特徴付けられ得る。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力の機械的特性を有する。
【００４２】
本開示は、移植を必要とする被験体における移植により、大腿部の応答能のない弁の症状を処置および／もしくは改善する弁の再細胞化を提供する。一局面において、上記症状の処置および／もしくは改善は、筋ポンプと静脈弁との間の正常な作業関係性を回復することによって達成される。下肢の筋ポンプは、足、ふくらはぎ、および大腿部の筋ポンプを含む。これらの中で、ふくらはぎのポンプは、最も効率的であることから最も重要であり、最大の容量（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）を有し、最高圧（筋収縮の間に２００ｍｍＨｇ）を生じる。正常な肢は、１５００〜３０００ｃｃの範囲に及ぶふくらはぎの容積、１００〜１５０ｃｃの静脈容積を有し、１回の収縮で静脈容積のうちの４０％〜６０％を駆出する。
【００４３】
収縮の間に、腓腹筋およびヒラメ筋は、血液を、その大きな容量がある膝窩静脈および大腿静脈へと駆動する。本開示の再細胞化された弁は、陰圧を生じて、応答能のある貫通静脈を通じて血液を表在系から深部系へと引いて、その後の弛緩の間の逆流（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｆｌｏｗ）（逆流（ｒｅｆｌｕｘ））を防止する。上記再細胞化された弁は、動脈流入が静脈流出と等しくなるまで静脈圧を徐々に下げる。被験体の運動が止まると、再細胞化された弁を有する静脈は、安静時静脈圧へとゆっくりと戻って、毛細血管床をゆっくりと満たす。
【００４４】
大腿静脈は周りを筋肉によって囲まれているものの、静脈還流への大腿筋収縮の貢献は、腓腹筋ポンプと比較すると最小限である。足底静脈叢（ｐｌａｎｔｅｒ  ｖｅｎｏｕｓ
ｐｌｅｘｕｓ）は、歩行している間は圧迫されており、このポンプ作用は、ふくらはぎのポンプを促進すると考えられている。種々の肢のポンプは、応答能のある弁の機能と一緒になって働いて、静脈血を四肢の遠位から近位へと戻す。
【００４５】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料は、本開示の実施もしくは試験において使用され得、適切な方法および材料は、以下に記載される。さらに、材料、方法、および実施例は、例証に過ぎず、限定するとは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が優先する。
【００４６】
本開示の詳細は、添付の図面および以下の記載に示される。本開示の他の特徴、目的および利点は、図面および詳細な記載から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
静脈中の弁の再細胞化のための方法であって、該方法は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む血液を、脱細胞化された静脈の管腔に導入する工程、ならびに該脱細胞化された静脈の管腔の中で該細胞を培養し、それによって該静脈中の該弁を再細胞化する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記血液は、末梢静脈血もしくは全血である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記末梢静脈血もしくは前記全血は、前記脱細胞化された静脈に、注射もしくは灌流によって導入される、項目２に記載の方法。
（項目４）
内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流によって前記細胞を培養する工程をさらに包含する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記内皮細胞培地および前記平滑筋細胞培地の前記灌流は、交互である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性、ｖＷＦ陽性、平滑筋アクチン陽性であり、核を有する、前記項目の１項に記載の方法。
（項目７）
前記再細胞化された弁は、０．８Ｎまたはそれより大きな第１のピークの力に耐えるという機械的特性を有する、前記項目の１項に記載の方法。
（項目８）
前記再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の閉鎖時間を有する、前記項目の１項に記載の方法。
（項目９）
慢性静脈不全（ＣＶＩ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および／もしくは肢潰瘍化の処置を必要とする被験体において慢性静脈不全（ＣＶＩ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および／もしくは肢潰瘍化を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に静脈の再細胞化された有弁セグメントを導入する工程を包含し、ここで該弁は、以下の工程：
ａ）静脈の有弁セグメントを脱細胞化する工程であって、ここで該静脈は、該被験体に対して同種異系である工程；
ｂ）該被験体から血液を採取する工程であって、ここで該血液は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む工程；
ｃ）該脱細胞化された有弁セグメントを、該採取した血液で灌流する工程；
ｄ）該脱細胞化された有弁静脈の管腔において該細胞を培養し；それによって、該静脈の該脱細胞化された弁を再細胞化する工程；ならびに
ｅ）該再細胞化された有弁静脈を該被験体に移植する工程であって；ここで該移植する工程は、該被験体におけるＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置する工程、
を包含する方法によって再細胞化される、
方法。
（項目１０）
前記肢潰瘍は再発性であり、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記血液は、末梢静脈血もしくは全血である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記末梢静脈血もしくは前記全血は、前記脱細胞化された静脈に、注射もしくは灌流によって導入される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞を、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流によって培養する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記内皮細胞培地および前記平滑筋細胞培地の前記灌流は、交互である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性、ｖＷＦ陽性、平滑筋アクチン陽性であり、核を有する、項目９〜１４に記載の方法。
（項目１６）
前記再細胞化された弁は、０．８Ｎまたはそれより大きな第１のピークの力に耐えるという機械的特性を有する、項目９〜１４に記載の方法。
（項目１７）
前記再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の閉鎖時間を有する、項目９〜１４に記載の方法。
（項目１８）
有弁静脈中の弁の再細胞化の方法であって、ここで該再細胞化された弁は、機能的弁であり、該方法は、
ａ）静脈中の該再細胞化された弁が必要な被験体から静脈のセグメントを採取する工程；
ｂ）該有弁静脈を脱細胞化する工程；
ｃ）該被験体から血液を採取する工程であって、ここで該血液は、内皮細胞の始原細胞および平滑筋細胞の始原細胞を含む工程；
ｄ）該脱細胞化された有弁静脈を該採取した血液で灌流する工程；ならびに
ｅ）該脱細胞化された有弁静脈において該細胞を培養し、それによって、該静脈において該脱細胞化された弁を再細胞化する工程、
を包含する、方法。
（項目１９）
前記再細胞化は、前記再細胞化された弁の逆流圧の応答能および耐容能を回復させる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記血液は、末梢静脈血もしくは全血である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記末梢静脈血もしくは前記全血は、前記脱細胞化された静脈に、注射もしくは灌流によって導入される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞を、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流によって培養する工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記内皮細胞培地および前記平滑筋細胞培地の前記灌流は、交互である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性、ｖＷＦ陽性、平滑筋アクチン陽性であり、核を有する、項目１８〜２３に記載の方法。
（項目２５）
前記再細胞化された弁は、０．８Ｎまたはそれより大きな第１のピークの力に耐えるという機械的特性を有する、項目１８〜２４に記載の方法。
（項目２６）
前記再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の閉鎖時間を有する、項目１８〜２４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、静脈の機能試験のための設定およびインビトロモデルの写真を示す。上記システムは、ドップラーシグナルの増強のための超音波造影剤を含む室温の食塩水が循環される。蠕動ポンプ（ａ）は、上記食塩水を、全回路を通してポンプ輸送し、機械式弁（ｂ）は、上記ポンプからの拍出の間に静脈（ｃ）を通る流れを可能にする。超音波プローブ（ｄ）は、静脈（ｅ）の可視化および静脈弁を通る流れの評価のために使用される。弁の部位での逆流圧は、上記静脈より上にあるレザバ（ｆ）の高さによって調節される。機械式弁は、流れる方向の制御を可能にし、弁機能の試験を可能にする。有弁静脈セグメントを回路に取り付け、食塩水を満たした容器の中に入れて、超音波による可視化；弁閉鎖時間評価を容易にする；弁の部位での逆流圧を、上記静脈の上にあるレザバの高さによって調節する。
【００４８】
【図２】図２（Ａ〜Ｄ）は、脱細胞化された弁（静脈セグメントを含む）の全体の形態および顕微鏡写真を示す。（Ａ）正常な静脈の全体の形態および（Ｂ）１４サイクル後の脱細胞化された静脈。１４サイクル後の脱細胞化された静脈のＨＥ染色（Ｃ）は、組織構造が保存されていることおよび青黒い核がないことを示し、（Ｄ）正常な静脈は、核の存在を示す。
【００４９】
【図３】図３（Ａ〜Ｄ）は、脱細胞化された静脈における細胞外マトリクスを示す。（Ａ）正常な静脈のマッソントリクローム（ＭＴ）染色は、核（黒色）、細胞質（赤色／ピンク色）およびコラーゲン（青色）の存在を示す。（Ｂ）脱細胞化された静脈（ＤＶ）において核は見出されなかった。このことは、内皮細胞および平滑筋細胞が存在しないことを示すが、コラーゲンの染色は、コラーゲンがなお存在することを示していた。（Ｃ）１４回の脱細胞化サイクルの後に、それぞれ、コラーゲンおよびＧＡＧの量の有意な減少を示すヒストグラム（ｐ値は０．０３および０．００５）。（Ｄ）脱細胞化後のＤＮＡの量の有意な減少を示すヒストグラム（ｐ値は０．０００１）。３Ａ〜３Ｂでは、スケールバー＝５０μｍ。
【００５０】
【図４】図４（Ａ〜Ｆ）は、再細胞化された弁を含む静脈セグメントの特徴付けを示す。（Ａ）および（Ｂ）それぞれ、低倍率および高倍率での、再細胞化された静脈および弁のヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色した顕微鏡画像。写真は、静脈および弁の両方に関する内皮層において連続した細胞の存在を示す（矢印）。（Ｃ）正常なおよび再細胞化された弁のＨＥおよびマッソントリクローム（ＭＴ）染色から、静脈の全ての写真で核の存在が明らかである。（Ｄ）再細胞化された静脈のＣＤ３１染色からは、連続した内皮層が明らかである。（Ｅ）弁の平滑筋アクチンの染色は、弁における平滑筋細胞の存在を示す。（Ｆ）α平滑筋アクチンの染色は、再細胞化された静脈の培地中の平滑筋細胞を示す。
【００５１】
【図５】図５（Ａ〜Ｅ）は、自己由来末梢全血で、生物工学で作製された（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）静脈グラフトの画像を示す。（Ａ）組織工学で作られた静脈の免疫蛍光染色。倍率は、１００×である。（Ｂ）管腔の中の内皮細胞の存在（緑色）について抗ＣＤ３１抗体で染色された生物工学で作製された弁の免疫蛍光画像。倍率は、２００×である。（Ｃ）抗ＣＤ３１抗体染色の陰性コントロール。倍率は、２００×である。抗平滑筋アクチンでの組織工学で作られた静脈の免疫組織化学染色から、外膜層における平滑筋細胞の明らかな存在が示される（矢印）。（Ｄ）弁を示す全体が再細胞化された静脈の写真。（Ｅ）機能的弁を有する静脈の写真。示される弁はふくれており、これは、新たに採取された、脱細胞化された静脈および再細胞化された静脈においてシリンジで溶液を注射した場合に、液体の保持を示す。
【００５２】
【図６】図６（Ａ〜Ｃ）は、再細胞化された弁の機械的分析を示す。（Ａ）正常なおよび再細胞化された（ＲＣ）静脈弁の変形挙動の代表的模式図。弁は、一連のピークを生じて、水平方向に間隔を空けて徐々に裂けた。（Ｂ）同じ静脈に由来する各対の弁に関する第１のピークの力。正常な静脈弁は、四角のマークであるが、ＲＣ弁は、丸形である。緑色は、機能している静脈を示しているが、赤色のものは、機能していない。青色の線は、機能させるために第１のピークにおいてどの程度の高い力を、静脈が必要とするかに関するカットオフを表す（０．８Ｎ）。（Ｃ）作業している弁のメジアン力のボックスプロットは、正常な弁と再細胞化された弁との間で有意差がないことを示す。
【００５３】
【図７】図７は、組織工学で作られた弁含有静脈を機能検査する相を示す一連の超音波画像を示す。パネル（ａ）〜（ｆ）は、上記静脈セグメントの長軸方向の２−Ｄ超音波投影図を示す。閉じた弁（ａ）、および順方向の流れの間の弁の徐々の開放（ｂ〜ｄ）、逆流（ｅ）および（ｆ）での弁の閉鎖。
【００５４】
【図８】図８は、組織工学で作られた弁含有静脈の機能検査を示す。画像（ａ）〜（ｃ）の底部での黄色のドップラースケールは、弁閉鎖時間（秒単位）を示す。
【００５５】
【図９】図９（Ａ〜Ｂ）は、生体力学検査を実証する一連の写真を示す。（Ａ）インストロン試験器で試験する一方で引き裂き試験および弁の拡張を行うために長軸方向に切った後の静脈の写真。（Ｂ）切った静脈に対して引き裂き試験を行うインストロン試験器の写真。
【００５６】
【図１０】図１０（Ａ〜Ｇ）は、脱細胞化された静脈の免疫組織化学分析を示す。（Ａ）正常な弁のＤＡＰＩ染色は、いくつかの核を示すが、（Ｂ）脱細胞化された静脈は、ＤＡＰＩ染色された核を示さなかった。（Ｃ）脱細胞化された静脈の免疫組織化学染色は、ＨＬＡクラスＩ抗原発現の非存在を示し、（Ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ抗原発現の非存在を示す。（Ｅ）正常な静脈は、ＨＬＡクラスＩについて陽性（茶色）の染色であるが、（Ｆ）ＨＬＡクラスＩＩでは陽性でない。（Ｇ）陰性コントロール。（Ａ）５０×、（Ｂ）１００×の倍率。
【００５７】
【図１１】図１１（Ａ〜Ｄ）は、再細胞化された静脈を示す。（Ａ）正常に見える色が、ピンク色がかった全体の形態（Ａ）および再細胞化された静脈（Ｂ）。ＤＡＰＩ染色は、正常な静脈（Ｃ）および末梢全血で再細胞化された静脈（Ｄ）において核が豊富であることを示す。倍率は、１００×。
【００５８】
【図１２】図１２Ａは、ヒトの肢における深部静脈のスケッチ図である。図１２Ｂは、静脈中で開いているもしくは閉鎖している場合の一方向弁の図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（開示の詳細な説明）
本開示の詳細は、添付の以下の記載に示されている。本明細書で記載されるものに類似もしくは等価な任意の方法および材料が、本開示の実施もしくは試験において使用され得るものの、上記方法および材料は、本明細書で記載される。本開示の他の特徴、目的および利点は、記載からおよび特許請求の範囲から明らかである。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が特段明確に規定しなければ、複数形への言及を含む。
【００６０】
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で使用されるある種の用語がここに集められる。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６１】
（定義）
本明細書で使用される場合、「再細胞化」とは、脱細胞化された静脈に細胞を導入もしくは送達し、それにより上記細胞が増殖および／または最終的に分化して、正常な有弁静脈のものに類似の構造、細胞組織化、および生体活性を有する弁を再生するように上記細胞を培養するプロセスをいう。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「脱細胞化」とは、細胞を弁から除去するプロセスをいう。効率的な脱細胞化は、最終生成物に望ましい組織密度および組織化、幾何的および生物学的特性のような因子、ならびに目標とした臨床適用によって規定される。ＥＣＭ完全性および生体活性を示したままでの弁の脱細胞化は、当業者によって、例えば、処理の間に特定の作用物質および技術を選択することによって、最適化され得る。脱細胞化のための作用物質は、静脈の細胞性、密度、脂質含有量、および厚みを含む多くの要因に依存し得る。大部分の細胞除去剤および方法は、ＥＣＭ組成を変化させ得、ある程度の超微細構造破壊を引き起こし得るとはいえ、これらの望ましくない効果の最小化が望ましい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、有益なもしくは望ましい結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本開示の目的のために、有益なもしくは望ましい臨床結果としては、検出可能であろうが、検出不能であろうが、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１またはそれより多くの症状の軽減もしくは改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の拡がりの防止、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、上記疾患状態の改善もしくは一時的緩和、ならびに回復（部分的であろうが完全であろうが）。「処置」とはまた、処置を受けていない場合に予測される生存と比較して、生存を延ばすことを意味し得る。
【００６４】
「ｒｅｄｕｃｅ（減少する）」もしくはこの文言の他の形態、例えば、「ｒｅｄｕｃｉｎｇ（減少する）」もしくは「ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ（減少）」は、事象もしくは特徴（例えば、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化）の低減を意味する。これが、代表的には、ある標準値もしくは期待値に関連している、言い換えれば、それは相対的であるが、標準値もしくは相対値が参照されることが常に必要なわけではないことは、理解される。
【００６５】
本開示の方法は、疾患もしくは疾患状態を防止することに向けられる限りにおいて、用語「防止する」が、上記疾患状態、例えば、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化が完全に妨害されることを要しないことは理解される。用語「防止する」は、本明細書で開示される再細胞化された弁が、疾患、例えば、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化の症状もしくは進行を低減する手段として、投与される／移植される（ｇｒａｆｔｅｄ）／移植される（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）場合の部分的な効果を包含し得る。上記効果は、個体が治癒しているか、またはＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化のいかなる症状もないと宣言されるという最終的な効果を含め、部分的効果から種々の程度の効果までに拡がり得る。この用語は、上記疾患状態が常に完全に回避されていることを要しない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、疾患もしくは疾患状態を「一時的に緩和する」とは、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床発現が、減らされる（もしくは軽減する）こと、ならびに／またはその進行の時間的経過が上記疾患を処置していない場合と比較して、遅らされるかもしくは延ばされることを意味する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ（阻害する）」、「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（阻害）」、ならびにその種々の名詞および準動詞の変更は、再細胞化された弁の生物学的効果を記載するために本明細書で使用される。それは、１００％阻害を必ずしも要しない。部分的阻害は、この定義内に包含される。関連性のあるコントロール（例えば、化合物が使用されない場合に認められる程度）と比較した場合の任意の阻害の程度は、上記定義内に包含される。
【００６８】
弁の応答能は、本明細書で使用される場合、弁閉鎖時間、もしくは流れが逆になってから流れが止まるまでの時間をいう。正常な機能を有する弁の弁閉鎖時間は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満である。実施形態では、本開示の再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の弁閉鎖時間（もしくは応答能）を有し得る。
【００６９】
静脈逆流とは、本明細書で使用される場合、心臓に向かって血液が流れる方向に対して血液が後ろ向きに流れることをいう。正常な機能を有する弁は、約１００ｍｍＨｇの逆流圧に逆らい得るかもしくは耐え得、７〜１２歩歩く間に、平均約１８ｍｍＨｇ〜約２５ｍｍＨｇへと低下させ得る。正常な機能を有する弁は、閉じたままであり、それによって最大１００ｍｍＨｇまでの圧力に対抗して逆流を防止し、７〜１２歩歩く間に、平均約１８ｍｍＨｇ〜約２５ｍｍＨｇへと低下させる。実施形態では、上記再細胞化された弁は、正常な弁が耐える逆流圧、すなわち、１００ｍｍＨｇのうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％に逆らう能力を実証し得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「被験体」とは、ヒトもしくは動物（動物の場合には、より代表的には、哺乳動物）を意味する。一局面において、上記被験体はヒトである。一局面において、上記被験体は、雄性である。一局面において、上記被験体は、雌性である。本明細書で使用される場合、「それを必要とする被験体」とは、集団全般に対して血管グラフトもしくは移植片を要する、病的なもしくは応答能のない弁をと関連する血管疾患もしくは障害を有する被験体、または、このような血管疾患もしくは障害を発生させるリスクの増大を有する被験体である。
【００７１】
本明細書の開示の理解を促進する目的で、特徴および具体的文言になされる言及は、その同じことを記載するために使用される。本明細書で使用される用語法は、特定の特徴を記載する目的に過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図しない。本開示全体を通じて使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」は、文脈が別段明示的に規定しなければ、複数形への言及を含む。従って、例えば、「ａ  ｖａｌｖｅ（１つの弁）」への言及は、複数のこのような組成物、ならびに単一の組成物を含む。本明細書で使用される全てのパーセンテージおよび比は、別段示されなければ、重量による。
【００７２】
成分の重量％は、そうでないと具体的に示されなければ、上記成分が含まれる製剤もしくは組成物の総重量に基づく。用語「約」とは、製剤の調製において、および疾患もしくは障害の処置において、薬剤の効力を変化させない上記薬剤の濃度もしくは量の任意の最小限の変化をいう。本開示の薬剤（例えば、治療剤／活性薬剤）の濃度範囲に関して用語「約」はまた、有効量もしくは有効範囲である示された量もしくは範囲の任意のバリエーションをいう。
【００７３】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／もしくは「約」もう１つの特定の値までのように本明細書で表現され得る。このような範囲が表される場合、別の局面は、上記１つの特定の値からおよび／もしくは上記他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することによって、上記特定の値が別の局面を形成することが理解される。上記範囲のうちの各々の端点は、他の端点に関連しておよび他の端点とは独立して、両方が有効数であることはさらに理解される。多くの値が本明細書で開示され、各値はまた、「約」その特定の値として、上記値自体に加えて本明細書で開示されることはまた、理解される。本願全体を通じて、データは多くの種々の形式で提供され、このデータは端点および出発点、ならびに上記データ点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた、理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５より大きいかもしくはそれに等しい、１０および１５より小さい、１０および１５より小さいかもしくはそれに等しい、ならびに１０および１５に等しいことが開示されていると考えられ、１０〜１５の間もまた同様であることは、理解される。２つの特定の構成単位間の各構成単位もまた、開示されていることも理解される。例えば、１０および１５が開示されているのであれば、１１、１２、１３、および１４もまた開示されている。
【００７４】
静脈血は、脱酸素化された血液であり、これは、末梢血管から静脈系を通って心臓の右心房へと移動する。脱酸素化された血液は、次いで、右心室によって肺へと肺動脈を通ってポンプ輸送され、肺動脈は、左肺および右肺にそれぞれ向かう左右の２つの枝に分岐する。血液は、肺で酸素化され、肺静脈を通って左心房へと戻る。
【００７５】
出生後脈管形成（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ  ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、循環する内皮始原細胞（ＥＰＣ）による成体における新たな静脈の形成である；そして新脈管形成は、既存の内皮細胞からの新たな静脈の形成である（Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。これら２つのプロセスは、静脈枝の形成に、および創傷治癒、虚血、骨折治癒、腫瘍増殖などのような病原性の状態に貢献する（Ｌａｓｃｈｋｅ  ｅｔａｌ，  ２０１１）。
【００７６】
本開示は、静脈を再細胞化するために使用される細胞の手段は、同種異系であることを包含する。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、器官もしくは組織が由来する種と同じ種の個体（すなわち、血縁がある個体もしくは血縁がない個体）から得られる血液に言及する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、自己由来とは、ドナーおよびレシピエントが同じヒトであることを意味する。例えば、緊急でない手術が予定されている患者は、手術のときまでに貯蔵される血液を彼ら自身のために提供することによる、自己由来ドナーであり得る。自己由来グラフトは、自分自身のために提供されるグラフト（例えば、皮膚のグラフト）である。実施形態では、本開示の再細胞化の方法は、レシピエント（すなわち、処置が必要な被験体（すなわち、「自己由来」））から得られた血液もしくは細胞を導入する工程を包含する。
【００７８】
本明細書中の開示の理解を促進する目的で、特徴および具体的文言になされる言及は、その同じことを記載するために使用される。本明細書で使用される用語法は、特定の特徴を記載する目的に過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図しない。本開示全体を通じて使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」は、文脈が別段明示的に規定しなければ、複数形への言及を含む。従って、例えば、「ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（１つの組成物）」への言及は、複数のこのような組成物、ならびに単一の組成物を含み、「ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ（１つの治療剤）」への言及は、１種またはそれより多くの治療剤および／もしくは医薬品ならびに当業者に公知のその均等物などへの言及である。本明細書で使用される全てのパーセンテージおよび比は、別段示されなければ、重量による。
【００７９】
血液は、心臓のポンプ作用に由来する動圧が原因で、動静脈の両方を通じて移動する。閉鎖循環系において、静脈還流は、心拍出量に等しくなければならない。動圧の大部分は、動脈循環において消散する。残りのエネルギーは、静脈系で放出される。通常の環境下では、毛細管の静脈端の圧力は、１２〜１８ｍｍＨｇであり、４〜７ｍｍＨｇの動脈圧に向かって着実に下がる。仰臥の場合、重力圧は中和され、血液は、この動圧勾配に沿って流れる。呼吸運動もまた、仰臥位において静脈還流に強く影響を及ぼすが、四肢が依存する場合にはほとんど影響はない。
【００８０】
静水圧は、右心房の下にある血液柱状体の重量に由来する。血液の密度および重力加速度は、静水圧を決定する。静水圧および重力圧は、心房の下ｃｍ単位の垂直距離の一定の乗数（０．７７ｍｍＨｇ／ｃｍ）として表される。上記圧力は、直立している（着座もしくは起立）が、静止している個体において最も高い。しかし、測定された圧力はまた、筋収縮のような外部要因を反映する。他の外部要因はまた、虚脱可能な静脈導管を通る流れを変える。吸気の間に、横隔膜収縮は、腹腔内圧および下肢静脈圧を上昇させる。腹水および肥満は、仰臥の場合にすら、同様の圧力の上昇を生じる。
【００８１】
依存する上肢の圧力は、心房と第１肋骨との間の垂直距離を反映する。直立している被験体の心房より上に保持されている上肢の静脈は、頭頚部の頭蓋外の静脈がそうであるように虚脱する。従って、心房より上の静脈構造物における圧力は、ゼロより下には低下しない。浮腫および逆流は、静脈弁が先天的に存在しない場合ですら、上肢においては希である。孤立性中心静脈血栓症は、しばしば、一過性の近位浮腫のみを生じる。
【００８２】
依存する下肢から心臓への血液の静脈還流は、応答能のある静脈弁が補助して、下肢の筋ポンプにより血液を駆出することによって達成される。弁は、静水性の血液柱状体をセグメントへと分け、逆方向の静脈流を防止するように機能する。膝窩下のセグメントにおける弁の数がより多いことから、それらの機能的重要性がより大きいことが示唆されるが、静水圧は、大腿静脈もしくは膝窩静脈の不応答能を矯正することによって有意に変化し得る。貫通静脈の弁は、ふくらはぎのポンプの圧力／流れの関係性と一致する概念である深部から表在への流れを防止する。足の貫通静脈は、例外である；２方向性の流れが正常であると考えられる。
【００８３】
深部静脈再建手術（例えば、弁形成術、自家移植および新弁構築（ｎｅｏｖａｌｖｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ））が、従来の処置が失敗した患者において、潰瘍治癒率を改善し、潰瘍がない期間を提供する選択肢であると判明した。しかし、これら手順の耐久性は、課題を残している。Ｒｏｓａｌｅｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｎｏｕｓ  ｖａｌｖｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  （２００８），  ３６：４６６−７２を参照のこと；Ｒｏｓａｌｅｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｖａｌｖｅ  ｐｌａｓｔｙ  （ＥＶＶＰ）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  （ＰＣＶＩ），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  （２００６），  ３２：５７０−５７６；およびＭａｌｅｔｉ  Ｏ．  ＆  Ｐｅｒｒｉｎ  Ｍ．，  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｆｏｒ  ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｒｅｆｌｕｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｂｓ：  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  （２０１１），  ４１：８３７−４８もまた参照のこと。
【００８４】
本開示は、手術による埋め込みに適した静脈弁が、脱細胞化され、後に、そのグラフトのレシピエントの自己由来の細胞によって再細胞化された、死亡したドナーの静脈から成功裡に生物工学で作製され得るという驚くべき発見に基づく。このアプローチは、血栓症、慢性深部静脈機能不全、静脈閉塞もしくは静脈逆流に起因して、バイパス手術もしくは血管の静脈シャントが必要な患者のために考慮され得る。さらに、この技術は、生涯にわたる免疫抑制の必要性を不要にし、以前の血管移植という解決法より大きな利益および低いリスクをもった有望かつ安全な臨床的アプローチである。
【００８５】
本開示は、静脈を脱細胞化するための方法を提供する。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の完全性を保存しながら内皮細胞の除去を包含する静脈の脱細胞化のための方法が、本明細書で記載される。本明細書で記載されるとおりの脱細胞化のプロセスは、数サイクルで、２種またはそれより多くの異なる細胞破壊溶液の逐次的処理を利用する。本開示の１つの特徴において、脱細胞化は、当該分野で公知の種々の方法によって検出されるように、核が残っていないときに達成され得る。静脈は、ドナー由来であり得る。本開示において、再細胞化のための静脈は、ドナーから得られ；上記ドナーは、死亡している。上記ドナーは、ＨＬＡもしくは組織が適合したドナー由来であり得る。
【００８６】
本開示はまた、脱細胞化された弁の再細胞化のための方法を提供し、上記方法は、細胞の集団を、上記脱細胞化された静脈に導入する工程および上記細胞の集団を、該脱細胞化された静脈上および該静脈中で培養する工程を包含する。本明細書で記載される方法は、上記細胞の集団の増殖、ならびに機能的弁を生成するための機能的内皮細胞および平滑筋細胞への上記細胞の集団の分化のために有用である。
【００８７】
本開示は、下肢の静脈系における弁の再細胞化を提供する。下肢の静脈系は、筋膜の下にありかつ下肢の筋肉の排水をする深部静脈；深在筋膜の上にありかつ皮膚微小循環の排水をする表在静脈；および筋膜を貫通し、表在静脈と深部静脈とを繋ぐ貫通静脈を含む。交通静脈は、同じ区画内の静脈を繋ぐ。上記表在静脈、深部静脈および大部分の貫通静脈は、正常な弁システムにおいて一方向の流れを確実にする二尖弁を含む。本開示は、静脈系の一方向の流れを回復することにおいて、二尖弁の再細胞化および再細胞化された二尖弁の使用を提供する。
【００８８】
本開示は、表在静脈の大伏在静脈、ならびに外側副伏在静脈および内側副伏在静脈（ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｇｒｅａｔ  ｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｖｅｉｎｓ）における弁の再細胞化を提供する。中央の表在系の主な静脈（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｖｅｉｎ）は、大伏在静脈、ならびに外側副伏在静脈および内側副伏在静脈である。本開示は、伏在亜区画（ｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｓｕｂｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）および伏在筋膜（ｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｆａｓｃｉａ）のところの弁が再細胞化されることを提供する。伏在筋膜は、浅在筋膜と深在筋膜の間の部分区画を覆い、表在区画において大伏在静脈を他の静脈から分けている。本開示は、小伏在静脈（ＳＳＶ）における弁が再細胞化されることを提供する。ＳＳＶは、肢の最も重要な後方の表在静脈である。ＳＳＶは、足部の側方から端を発し、最も一般には、膝のひだ（ｋｎｅｅ  ｃｒｅａｓｅ）の直ぐ近くに合流して、膝窩静脈へと排出する。本開示は、伏在静脈間静脈（ｉｎｔｅｒｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｖｅｉｎ）における弁が再細胞化されることを提供する。伏在静脈間静脈（以前はＧｉａｃｏｍｉｎｉ静脈といわれていた）は、小伏在静脈と大伏在静脈とを繋ぐ。
【００８９】
本開示は、表在性大腿静脈（深部静脈）における弁の再細胞化を提供する。表在性大腿静脈（深部静脈）（大腿静脈としても公知）は、膝窩静脈を総大腿静脈へと繋ぐ。本開示は、ふくらはぎの深部静脈（前脛骨静脈、後脛骨静脈、および腓骨静脈）の弁が再細胞化されることを提供する。
【００９０】
本開示は、内皮細胞および／もしくは平滑筋細胞に集団、ならびに／または内皮細胞および／もしくは平滑筋細胞の始原細胞を、脱細胞化された静脈の管腔に導入することによって、静脈中の弁の再細胞化の方法を提供する。細胞および／もしくは始原細胞の集団は、脱細胞化された静脈とともに培養され、それによって、上記静脈中の弁を再細胞化する。本開示の再細胞化された弁は、正常な閉鎖時間（すなわち、応答能）を回復し、正常な健常な弁に近い逆流圧に耐える。
【００９１】
弁再細胞化の方法において、末梢静脈血もしくは全血に存在するかもしくはこれらに由来する細胞の集団は、脱細胞化された静脈とともに培養される。本開示は、細胞の集団が同種異系であることを提供する。本開示は、細胞の集団が自己由来であることを提供する。上記細胞の集団は、末梢静脈血もしくは全血から集められるか、またはこれらに存在する。本開示は、末梢静脈血もしくは全血が、同種異系ドナーに由来することを提供する。本開示は、末梢静脈血もしくは全血が自己由来であることを提供する。本開示は、脱細胞化された静脈が同種異系末梢静脈血もしくは同種異系全血とともに培養されることを提供する。本開示は、脱細胞化された静脈が同種異系全血とともに培養されることを提供する。本開示は、脱細胞化された静脈が自己由来末梢静脈血もしくは自己由来全血とともに培養されることを提供する。
【００９２】
本開示は、脱細胞化された静脈を提供する。静脈は、脱細胞化工程が１回より多く反復される（「サイクル」と定義される）方法で脱細胞化される。本開示は、静脈脱細胞化が２〜１６サイクルの間を要することを提供する。本開示は、静脈脱細胞化方法が１４サイクルを要することを提供する。
【００９３】
静脈は、２〜１６回の脱細胞化サイクルを要する方法での脱細胞化後に、核がなく（免疫組織化学アッセイにおいて核に関する染色陰性）、ＨＬＡクラス−Ｉ抗原が低下しているかもしくは存在せず（免疫組織化学アッセイにおいてＨＬＡクラス−Ｉ抗原の染色が少ないもしくは存在しない）、そしてＨＬＡクラス−ＩＩ抗原が低下しているかもしくは存在しない（免疫組織化学アッセイにおいてＨＬＡクラス−ＩＩ抗原の染色が少ないかもしくは存在しない）。２〜１６回の脱細胞化サイクルの後、静脈は、脱細胞化されていない静脈と比較して、低下したコラーゲンおよび硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、および増加したエラスチンを有するとして特徴付けられる。上記脱細胞化は、脱細胞化されていない静脈と比較して、脱細胞化された静脈においてＤＮＡを減らす。
【００９４】
本開示は、脱細胞化静脈中の弁再細胞化を提供し、ここで上記再細胞化された弁は核を有し、ＣＤ３１陽性である。再細胞化された弁を有する静脈は、静脈の外膜中に紡錘形の平滑筋細胞を有し、内皮マーカーｖＷＦに関して陽性である。
【００９５】
本開示は、機能的弁を達成する方法によって、脱細胞化された静脈中の弁を再細胞化することを提供する。上記機能的弁は、正常な閉鎖時間（すなわち、応答能のある）を有し、逆流圧の正常なレベルに耐える。
【００９６】
本開示は、再細胞化された弁を提供し、上記弁は、移植を必要とする被験体における移植後に、歩いている間に毛細管の静脈末端において１２〜１８ｍｍＨｇの圧力を回復する。動いていない被験体（例えば、着座している）では、本開示の再細胞化された弁は、約１００ｍｍＨｇの下肢静脈圧を達成する（身長に依存する）。本開示は、移植を必要とする被験体における移植後に正常な静水圧および重力圧（これは、心房下ｃｍ単位の垂直距離の一定の乗数（０．７７ｍｍＨｇ／ｃｍ）として表される）を回復する再細胞化された弁を提供する。移植により、上記再細胞化された弁は、直立している（着座もしくは起立）が、静止している、移植を必要とする被験体において、正常な最高レベルの圧力を回復する。
【００９７】
本開示は、再細胞化された弁が、インビトロ流路で約１００ｍｍＨｇの逆流圧の正常レベルを達成することを提供する。
【００９８】
本開示は、応答能のある再細胞化された静脈弁が補助して、下肢筋ポンプにより血液を駆出することによって、依存する下肢から心臓への血液の正常な静脈還流を達成するための弁の再細胞化を提供する。本開示の再細胞化された弁は、静水性の血液柱状体をセグメントへと分け、逆方向の静脈流を防止するように機能する。本開示は、膝窩下のセグメントにおいてより多い弁の数を回復することにおける使用のための再細胞化された弁を提供する。本開示は、大腿静脈もしくは膝窩静脈の不全を矯正することによって、静水圧変化から生じる症状を改善することにおける使用のための再細胞化された弁を提供する。本開示は、再細胞化された貫通静脈弁が深部から表在への流れを防止し、ふくらはぎのポンプの正常な圧力／流れの関係性を回復することを提供する。本開示は、足の貫通静脈における再細胞化された弁が、静脈を通る血液の２方向性の流れを回復することを提供する。
【００９９】
本開示は、必要な被験体における慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状を処置もしくは改善するための方法をさらに提供し、上記方法は、静脈の再細胞化された有弁セグメントを被験体に移植する工程を包含する。上記再細胞化方法は、１またはそれより多くの工程を包含する。上記方法は、以下の１またはそれより多くの工程を包含する：ヒト同種異系大腿静脈の有弁セグメントを採取する工程；上記大腿静脈における静脈を２〜１６サイクルで脱細胞化する工程；上記被験体から血液を採取する工程；上記脱細胞化された静脈を抗凝固剤で灌流する工程；上記脱細胞化された静脈を、上記採取した血液で数時間灌流する工程；上記血液を排出し、上記静脈を緩衝液ですすぐ工程；および上記静脈を先ず内皮細胞培地で１日より長く灌流し、次いで、平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；ならびにそれによって、上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程；ここで上記再細胞化された弁は、上記被験体への移植により、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置もしくは改善する。
【０１００】
本開示の弁脱細胞化工程は、上記有弁静脈を、界面活性剤および有機リン酸化合物中で処理する工程を包含する。上記弁は、Ｔｒｉｔｏｎおよびトリ−ｎ−ブチルホスフェートおよびＤＮＡａｓｅ中で脱細胞化される。
【０１０１】
上記脱細胞化された弁は、上記静脈を内皮細胞培地中で２〜６日間の間灌流し、続いて、上記静脈を平滑筋培地中で２〜６日間の間灌流することによって、再細胞化される。一局面において、上記脱細胞化された静脈の培養は、インビトロで行われる。
【０１０２】
上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力という機械的特性を有する。
【０１０３】
本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを、再細胞化された有弁静脈で処置するための方法を提供する。本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを処置することにおける、再細胞化された有弁静脈の使用を提供する。
【０１０４】
本開示は、本明細書で記載される方法のうちのいずれか１つによって生成される弁を特徴とし、ここで上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁はまた、平滑筋アクチン陽性、ｖＷＦ陽性であり得、そして／または紡錘形の平滑筋細胞の存在によって特徴付けられ得る。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力という機械的特性を有する。
【０１０５】
本開示はまた、埋め込みもしくは移植のための、本明細書で記載される方法のうちのいずれか１つによって生成される弁の使用を特徴とし、ここで上記再細胞化された弁は、ＣＤ３１陽性である。上記再細胞化された弁はまた、平滑筋アクチン陽性、ｖＷＦ陽性であり得、そして／または紡錘形の平滑筋細胞の存在によって特徴付けられ得る。上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力という機械的特性を有する。
【０１０６】
本開示は、移植を必要とする被験体において移植により、大腿部における応答能のない弁の症状を処置および／もしくは改善する、弁の再細胞化を提供する。一局面において、上記症状の処置および／もしくは改善は、筋ポンプと静脈弁との間の正常な作業関係性を回復することによって達成される。下肢の筋ポンプは、足、ふくらはぎ、および大腿部のものを含む。これらの中でも、ふくらはぎのポンプは、これが最も効率的であり、最大の容量を有し、最高圧を生じる（筋収縮の間に２００ｍｍＨｇ）ことから、最も重要である。正常な肢は、１５００〜３０００ｃｃの範囲に及ぶふくらはぎの容積、１００〜１５０ｃｃの静脈容積を有し、１回の収縮で静脈容積のうちの４０％〜６０％を駆出する。
【０１０７】
収縮の間に、腓腹筋およびヒラメ筋は、血液を、その大きな容量がある膝窩静脈および大腿静脈へと駆動する。本開示の再細胞化された弁は、陰圧を生じ、応答能のある貫通静脈を通じて血液を表在系から深部系へと引き入れ、その後の弛緩の間の逆流（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｆｌｏｗ）（逆流（ｒｅｆｌｕｘ））を防止する。上記再細胞化された弁は、動脈流入が静脈流出と等しくなるまで静脈圧を徐々に下げる。本開示は、被験体の運動が止まると、再細胞化された弁を有する静脈が、安静時静脈圧へとゆっくりと戻って、毛細血管床をゆっくりと満たすことを提供する。
【０１０８】
筋肉が大腿静脈の周りを囲んでいるものの、静脈還流への大腿筋収縮の寄与は、ふくらはぎの筋ポンプと比較すると最小限である。歩行の間の足底静脈叢の圧迫に起因するポンプ作用は、ふくらはぎのポンプを促進する。種々の肢のポンプは、応答能のある弁の機能と一緒になって働いて、静脈血を四肢の遠位から近位へと戻す。本開示の再細胞化された弁は、機能的な肢のポンプを回復して、静脈血を四肢の遠位から近位へと戻すことにおいて使用される。
【０１０９】
（脱細胞化の方法）
死体から合計１２の標本を採取し、弁閉鎖時間および逆流圧に対する耐容能を測定することによって機能を試験した。死亡〜採取の間のメジアン時間は、３日間（２〜６日間）であり、死亡〜試験の間のメジアン時間は、６日間（５〜７日間）であった。上記サンプルをスウェーデンへ輸送する前に、正常な閉鎖時間（≦０．５秒）が、１００ｍｍＨｇの圧力で１２の死体標本のうちの８つにおいて記録された。２つの静脈セグメントは、正常な閉鎖時間を示さなかった。さらに、輸送される１０の機能的標本のうちの２つは、脱細胞化を開始する前に既に上記弁が機械的損傷を示し、再細胞化後にも応答能がないままであった。上記静脈標本のメジアン直径は、９．８ｍｍ（７．５〜１４）であり、再細胞化後には９．８ｍｍ（８〜１４．２）であった。
【０１１０】
本開示は、有弁静脈中の弁を脱細胞化するための方法および材料を提供する。本明細書で使用される場合、「脱細胞化」とは、細胞を弁から除去するというプロセスをいう。有効な脱細胞化は、最終生成物に望ましい組織密度および組織化、幾何的および生物学的特性のような因子、ならびに目標とした臨床適用によって規定される。ＥＣＭ完全性および生体活性を保持したままでの弁の脱細胞化は、当業者によって、例えば、処理の間の特定の薬剤および技術を選択することによって、最適化され得る。
【０１１１】
脱細胞化のための最も効率的な薬剤は、静脈の細胞性、密度、脂質含有量、および厚みを含む多くの要因に依存する。大部分の細胞除去薬剤および方法は、ＥＣＭ組成を変化させ得、ある程度の超微細構造破壊を引き起こし得るとはいえ、これらの望ましくない効果の最小化が好ましいことは、理解されるべきである。当業者は、脱細胞化プロセスを本明細書で記載されるように容易に最適化して、ＥＣＭ足場の破壊を最小限にし得る。
【０１１２】
１種またはそれより多くの細胞破壊溶液は、有弁静脈を脱細胞化するために使用され得る。細胞破壊溶液は、一般に、少なくとも１種の界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＰＥＧ、もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ）を含む。上記界面活性剤のうちの１つは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘである。細胞破壊溶液は、上記溶液が上記細胞と浸透圧が不適合であるように水を含み得る。あるいは、細胞破壊溶液は、上記細胞と浸透圧適合性のための緩衝液（例えば、ＰＢＳ）を含み得る。細胞破壊溶液はまた、１種またはそれより多くのコラゲナーゼ、１種またはそれより多くのディスパーゼ（フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＩ切断プロテアーゼ）、１種またはそれより多くのＤＮａｓｅ、またはプロテアーゼ（例えば、トリプシン）が挙げられるが、これらに限定されない酵素を含み得る。いくつかの場合、細胞破壊溶液は、同様にもしくは代わりに、１種またはそれより多くの酵素のインヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、および／もしくはコラゲナーゼインヒビター）を含み得る。
【０１１３】
本開示は、静脈が２種またはそれより多くの異なる細胞破壊溶液で逐次的に処理されることを提供する。例えば、第１の細胞破壊溶液は、１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）（ｘ１００，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を含み、第２の細胞破壊溶液は、１％  トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）（２８７２６．１，ＶＷＲ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を含み、第３の細胞破壊溶液は、０．００４ｍｇ／ｍｌ  デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）（Ｄ７２９１，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を含む。逐次的処理は、処理シーケンスにおいて上記細胞破壊溶液のうちの少なくとも１種での処理を反復することを包含し得る。いくつかの局面において、上記静脈は、脱細胞化の所望のレベルが達成されるまで、同じ順序での１種またはそれより多くの細胞破壊溶液の逐次的処理を含む脱細胞化サイクルによって処理され得る。本開示は、脱細胞化サイクルの数が少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１９回、もしくは少なくとも２０回のサイクルであることを提供する。望ましい脱細胞化に必要とされるサイクルの数は、核、ＨＬＡクラスＩ、もしくはクラスＩＩ抗原の存在、ならびに静脈中の細胞の存在についての他の指標をモニターすることを通じて決定される。脱細胞化された静脈に存在する核がないことは、静脈の脱細胞化のレベルを示す。
【０１１４】
本開示は、各細胞破壊溶液が、さらなる成分（例えば、抗生物質（すなわち、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシン）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム塩二水和物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）（ＥＤＴＡ）、および／またはフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））をさらに含み得ることを提供する。例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉを含む細胞破壊溶液はまた、酵素を活性化するために、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム（Ａ１２８５８，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含み得る。
【０１１５】
灌流法は、上記有弁静脈を細胞破壊溶液で処理して、静脈を脱細胞化するために使用され得る。灌流の方向を交互にする（例えば、順方向および逆方向）と、上記有弁静脈を効率的に脱細胞化する一助となり得る。本明細書で記載されるとおりの脱細胞化は、本質的には、ＥＣＭに対してごく僅かしか損傷を生じないようにして、上記有弁静脈を裏打ちする細胞を内側から除去する。組織のサイズおよび重量、ならびに細胞破壊溶液中の特定の界面活性剤（複数可）および界面活性剤（複数可）の濃度に依存して、有弁静脈は、一般に、細胞破壊培地を用い約２〜約１２時間／ｇ  組織、灌流される。洗浄を含め、器官は、最大で約１２〜約７２時間／ｇ  組織にわたって灌流され得る。灌流は、一般に、拍動流、拍動速度および拍動圧を含め、生理学的条件へと調節される。本明細書で記載されるとおりの灌流脱細胞化は、例えば、米国特許第６，７５３，１８１号および同第６，３７６，２４４号に記載されるとおりの浸漬脱細胞化と比較され得る。
【０１１６】
本開示は、有弁静脈が細胞破壊溶液で満たされ、上記静脈の脱細胞化のために同時に撹拌されることを提供する。種々の細胞破壊溶液が逐次的順序で添加され、その順序が、脱細胞化の望ましいレベルが達成されるまで複数回反復される。例えば、静脈の一方の末端は、開いたまま維持される一方で、開口部の残り（すなわち、剥離物（ａｂｒａｓｉｏｎｓ）および枝）を、漏れを防止するために縫合した。上記静脈は、先ず、抗生物質（０．５％  ペニシリン、０．５％  ストレプトマイシンおよび０．５％  アンホテリシンＢ）を含むＰＢＳ中ですすぐ。次いで、上記静脈は、蒸留水で７２時間すすぐ。各脱細胞化サイクルは、好ましくは、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘとともに３時間、続いて、１％  ＴｎＢＰとともに３時間、および０．００４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉとともに３時間インキュベートすることからなる。最後に、上記静脈を、蒸留水で一晩洗浄して、細胞デブリを除去する。各インキュベーション期間において、上記静脈を細胞破壊溶液で満たし、クランプで閉じる。次いで、上記静脈を、インキュベーション時間（３時間もしくは一晩）にわたって３７℃の撹拌機の上に置いて穏やかに振盪する。各インキュベーション期間の最後に、上記有弁静脈の内容物を除去し、上記静脈をＰＢＳですすぐ。７〜９回のサイクル（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ（登録商標）、ＴｎＢＰ、ＤＮａｓｅＩおよび水洗浄の）＋撹拌の後、上記静脈を４８時間、ＰＢＳで連続して洗浄する（ここで上記ＰＢＳは、６時間毎に交換した）。必要な場合もしくは当業者の裁量で、種々の濃度の界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ（登録商標）もしくはＴｎＢＰ）を利用し得る。必要な場合もしくは当業者の裁量で、種々の濃度の酵素（例えば、ＤＮａｓｅ）が利用され得る。
【０１１７】
本開示は、再細胞化工程の前に、脱細胞化された有弁静脈を滅菌することを提供する。例えば、上記滅菌プロセスは、上記脱細胞化された静脈を、滅菌ＰＢＳ中０．１％  過酢酸の中で１時間インキュベートし、続いて、滅菌した水およびＰＢＳで、各溶液で４時間洗浄する工程を含む。
【０１１８】
本開示は、有弁静脈を適切な界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標））および溶媒／界面活性剤（例えば、２％  トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ））で処理し、必要に応じて、ＤＮＡａｓｅで処理して、上記静脈を脱細胞化することを提供する。有弁静脈は、２〜１６サイクルで、界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標））、および溶媒／界面活性剤（例えば、２％  トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ））で処理し、必要に応じて、ＤＮＡａｓｅで処理することによって再細胞化される。本開示は、有弁静脈が界面活性剤および溶媒／界面活性剤中で、１４サイクルで処理されることを提供する。有弁静脈の脱細胞化の方法は、脱細胞化後の静脈の漏れもサイズの変化も生じない。有弁静脈の脱細胞化は、１４サイクル後に、静脈における核の喪失（図２Ｃを参照のこと）を生じる。脱細胞化の初期サイクルで、静脈は、多量のコラーゲンを有するが、核を有しない（図３ＡおよびＢを参照のこと）。
【０１１９】
本開示は、脱細胞化された静脈がＨＬＡクラス−Ｉもしくは−ＩＩ抗原について陰性として特徴付けられることによる、有弁静脈の脱細胞化の方法を提供する。本開示は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）のコラーゲンおよびＧＡＧの有意な喪失を生じる一方で、上記ＥＣＭにおけるエラスチンのレベルは増加する脱細胞化方法を提供する。本開示の脱細胞化された弁の静脈は、正常な（すなわち、脱細胞化されていない）静脈と比較して、コラーゲンおよびＧＡＧの有意な喪失およびエラスチンの有意な増加を生じる。本開示の脱細胞化プロトコルは、脱細胞化された静脈においてＤＮＡ量の有意な減少（例えば、正常な静脈において２４１．９５±３９．４４ｎｇ／ｍｇ  組織から、脱細胞化された静脈において２２．４４±６．２９  ｎｇ／ｍｇまで）をもたらす。
【０１２０】
同種異系弁を効率的に再細胞化および生成するために、脱細胞化のプロセスの間およびその後に、ＥＣＭの形態および構造が維持される（すなわち、実質的に無傷のままである）ことは重要であり得る。「形態」とは、本明細書で使用される場合、器官もしくはＥＣＭの組織の全体的な形状に言及する一方で、「構造」とは、本明細書で使用される場合、外表面、内表面、およびその間のＥＣＭに言及する。上記ＥＣＭの形態および構造は、脱細胞化プロセスが、ＥＣＭ足場の三次元構造および生体活性を損なわなかったことを検証するために、視覚的におよび／もしくは組織学的に検査され得る。染色（すなわち、Ｈ＆Ｅ、ＭＴもしくはＶＶＧ）による組織学的分析は、脱細胞化された静脈の構造およびＥＣＭ成分（例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニンおよびフィブロネクチン）の保存を可視化するために有用である。当該分野で公知の他の方法およびアッセイは、ＥＣＭ成分（例えば、グリコサミノグリカンおよびコラーゲン）の保存を決定するために有用であり得る。重要なことには、残留する血管新生因子もしくは成長因子が、脱細胞化後にＥＣＭ足場と会合したままである。このような血管新生因子もしくは成長因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＲＦ−２、ＰＬＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−１、フォリスタチン、ＨＧＦ、アンジオポエチン−２、エンドグリン、ＢＭＰ−９、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、エンドセリン−１、レプチン、および当該分野で公知の他の血管新生因子もしくは成長因子。
【０１２１】
（再細胞化の方法）
本開示は、静脈中に再生弁を生成するための材料および方法を提供する。再生弁は、本明細書で記載されるとおりのドナー由来の脱細胞化された静脈と、細胞の集団とを上記静脈の管腔の中で接触させ、上記脱細胞化された静脈の管腔の中で上記細胞の集団を培養する工程によって生成され得る。本開示は、脱細胞化された静脈（ここで上記静脈中の弁はまた、脱細胞化されている）を、全血もしくは末梢血とともに培養することを提供する。本開示は、脱細胞化された静脈が全血もしくは末梢血で灌流されることを提供する。上記全血もしくは上記末梢血は、損なわれたもしくは機能障害の弁に起因する疾患および／もしくは障害を処置もしくは改善する必要がある被験体に由来する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「再細胞化」とは、細胞を脱細胞化された静脈に導入もしくは送達し、上記細胞が増殖および／もしくは最終的に分化して、正常な有弁静脈のものに類似の構造、細胞組織化、および生体活性を有する弁を再生するように上記細胞を培養するというプロセスをいう。
【０１２３】
本開示は、少量（例えば、１０ｍＬ〜３０ｍＬ）の全血もしくは末梢静脈血での静脈中の弁の再細胞化の方法を包含する。実施形態では、上記弁は、培養プレートにおける内皮細胞始原細胞および平滑筋始原細胞のインビトロでの培養、増殖、および分化なしで、再細胞化される。実施形態では、上記脱細胞化された弁は、血液での灌流後に、内皮細胞培地中で２〜６日間の間静脈を灌流し、続いて、平滑筋培地中で数日間（例えば、２〜６日間）静脈を灌流することによって、再細胞化され得る。実施形態では、上記脱細胞化された静脈の培養は、インビトロであってもエキソビボであってもよい。実施形態では、上記脱細胞化された静脈の培養は、バイオリアクター中で行われ得る。
【０１２４】
本開示は、末梢静脈血が採取され、抗凝固剤で被覆した容器（すなわち、ヘパリン被覆バキュテイナーチューブ）に入れられ、可能な限り迅速に（例えば、約２時間以内に）研究室に運ばれる再細胞化方法を提供する。必要とされる血液の体積は、静脈の長さおよび再細胞化が行われるバイオリアクター中で使用されるパイプの長さに依存して変動し得る。
【０１２５】
上記再細胞化プロセスは、５％  ＣＯ２を供給した約３７℃のインキュベーター中で行われる灌流で実施される。再細胞化の前に、上記静脈を、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）で灌流する。上記抗凝固剤で洗浄除去した後、上記静脈を、数時間、所望の速度で（例えば、約４８時間、約２ｍｌ／分で）灌流する。上記灌流は、内皮細胞培地で約２日間またはそれより多くの日数（例えば、約４日間）、次いで、平滑筋細胞培地でさらに約２日間またはそれより多くの日数（例えば、４日間）、継続される。行われる灌流の日数は、任意選択の特徴であり、これは、上記細胞もしくは全血および細胞化効力に依存して調節され得る。
【０１２６】
完全な内皮培地は、約１０％  熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）、約１％  グルタミン（Ｌｏｎｚａ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）、約１％  ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン、およびＥＧＭ２シングルクオートキット（ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕｏｔｅ  ｋｉｔ）（Ｌｏｎｚａ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）（これは、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトＶＥＧＦ、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮成長因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含んだ）を補充したＭＣＤＢ１３１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）基礎培地を使用して調製され得る。上記完全平滑筋培地は、約１０％  熱不活化ヒトＡＢ血清、約１％  ペニシリン−ストレプトマイシン  アンホテリシンおよび約２０ｍｌ  平滑筋成長補充物（ＳＭＧＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を補充した、約５００ｍｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２３１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して調製され得る。当該分野で周知である、内皮細胞および／もしくは平滑筋細胞を成長させるための他の培地もまた、使用され得る。静脈の足場は、合計約１０日間にわたって再細胞化された。
【０１２７】
本開示は、再細胞化のために利用される細胞の集団は、幹細胞もしくは始原細胞、例えば、骨髄由来幹細胞もしくは始原細胞、またはＣＤ１３３を発現する細胞（ＣＤ１３３＋細胞）に由来することが提供される。幹細胞もしくは始原細胞は、当該分野で公知の方法によって、インビトロで増殖され得、そして内皮細胞および／もしくは平滑筋細胞へと分化され得る。例えば、幹細胞もしくは始原細胞は、内皮細胞および／もしくは平滑筋細胞への分化を開始する、ある種の成長因子および補充物の存在下で培養され得る。いくつかの局面において、上記分化した細胞は、最終分化していなくてもよいが、脱細胞化された静脈への導入の前に、少なくとも１つの内皮細胞マーカー（すなわち、ＣＤ３１もしくはｖＷＦ）または少なくとも１種の平滑筋細胞マーカー（すなわち、平滑筋アクチン）を発現し得る。本明細書で記載されるとおりの幹細胞もしくは始原細胞に由来する内皮細胞および平滑筋細胞は、上記脱細胞化された静脈へと、例えば、灌流によって導入される。上記内皮細胞および平滑筋細胞の培養は、望ましい再細胞化が達成されるまで、上記細胞および静脈を、内皮細胞培地もしくは平滑筋細胞培地とともに交互のサイクルでインキュベートする。
【０１２８】
出生後脈管形成は、循環する内皮始原細胞（ＥＰＣ）による成体における新たな静脈の形成である；そして新脈管形成は、既存の内皮細胞からの新たな静脈の形成である（Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。これら２つのプロセスは、静脈枝の形成に、および創傷治癒、虚血、骨折治癒、腫瘍成長などのような病原性の状態に寄与する（Ｌａｓｃｈｋｅ  ｅｔａｌ，  ２０１１）。循環している全血中には内皮細胞および内皮始原細胞が共存しており、上記内皮始原細胞は、血管新生に寄与する（Ａｓａｈａｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。さらに、平滑筋細胞の始原細胞はまた、循環する全血に存在する（Ｓｉｍｐｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【０１２９】
本開示は、再細胞化のために利用される細胞の集団が全血に由来することを提供する。脱細胞化された静脈の再生のための全血の使用は、血管新生始原細胞の亜集団を骨髄もしくは全血から単離および増やす必要性なく、静脈の効率的な再細胞化を生じる。全血は、脱細胞化された静脈に、例えば、灌流によって導入される。
【０１３０】
本開示には、現在入手可能な血管グラフトの選択肢を超える多くの利点がある。本開示は、以下の利点を有する自己由来の操作された静脈を提供する：１）非免疫原性であり、従って、グラフト拒絶および有害な免疫応答の最小限のリスクを有する；２）免疫抑制の必要性を回避し、従って、術後の患者にとっておよび彼らの生涯にわたってリスクが少ない；３）長さの制限がない；４）適合したドナーの静脈もしくは自己由来の静脈と比較した場合、より容易に入手しやすい；５）天然の成分（すなわち、ＥＣＭ、内皮細胞および平滑筋細胞）から構成され、従って、残留する血管新生成長因子および生体力学的完全性を保存していることを含め、大部分の合成および人工静脈より優れた品質を有する；６）静脈の生成は、移植用に自己由来の静脈を採取することと比較して、侵襲性が少ない；７）全血細胞の使用は、被験体に対して迅速かつ最小限に侵襲性の手順を可能にする。
【０１３１】
細胞の集団は、本明細書で使用される場合、脱細胞化された有弁静脈を再細胞化するために使用される任意の細胞であり得る。これら細胞は、全能性細胞、多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）、もしくは多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）であり得、運命決定されていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）もしくは運命決定されたもの（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）であり得る。さらに、本開示において有用な細胞は、未分化の細胞、部分的に分化した細胞、もしくは完全に分化した細胞であり得る。本開示において有用な細胞としてはまた、始原細胞、前駆細胞、および「成体」由来幹細胞が挙げられる。静脈を再細胞化するために使用され得る細胞の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：骨髄由来幹細胞もしくは始原細胞、骨髄単核細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多能性成体始原細胞、全血由来幹細胞もしくは始原細胞（例えば、内皮幹細胞、内皮始原細胞、平滑筋始原細胞）、全血、末梢血、および全血から単離され得る任意の細胞集団。上記始原細胞は、細胞の１つのタイプへと分化するように運命決定された細胞と定義される。例えば、内皮始原細胞は、内皮細胞へと分化するようにプログラムされている細胞を意味する；平滑筋始原細胞は、平滑筋細胞へと分化するようにプログラムされている細胞を意味する。本開示は、運命決定されていない細胞および／もしくは運命決定されている細胞（多能性細胞もしくは全能性細胞）の集団を含む、脱細胞化された有弁静脈を細胞化することにおいて使用するための、全血もしくは末梢血中の始原細胞を提供する。本開示の特徴は、脱細胞化された有弁静脈を全血で細胞化することである。
【０１３２】
本開示は、静脈を再細胞化するために使用される細胞の集団が同種異系であることを提供する。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、器官もしくは組織が由来したもの（すなわち、自身もしくは血縁のあるもしくは血縁のない個体）と同じ種から得られる細胞に言及する。本開示は、細胞もしくは全血が、レシピエントもしくは処置が必要な被験体由来（すなわち、「自己由来」）であることを提供する。
【０１３３】
細胞の集団は、細胞の不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）な集団であり得る。例えば、上記細胞は、全血細胞であり得るか、もしくは全血由来であり得る。これら細胞としては、赤血球、白血球、血小板、内皮細胞、内皮始原細胞、および平滑筋始原細胞が挙げられる。循環する内皮細胞、内皮始原細胞、および平滑筋細胞の始原細胞が、脈管形成および新脈管形成に寄与し得ることは、当該分野で公知である。従って、全血細胞の適用は、静脈の再生のために、脱細胞化された静脈に、増えて内皮細胞および平滑筋細胞へと分化し得る細胞を容易に供給し得る。
【０１３４】
再細胞化のために利用される細胞の集団は、細胞の不均質な集団から単離され得る。本開示は、細胞の集団が骨髄から単離された幹細胞もしくは始原細胞であり得ることを提供する。本開示は、細胞の集団が全血から単離された内皮細胞もしくは内皮始原細胞（すなわち、運命決定された細胞）であり得ることを提供する。不均質な集団から細胞の特定の集団を単離するための方法は、当該分野で公知である。このような方法としては、リンパトラップ（ｌｙｍｐｈｏｔｒａｐ）、密度勾配、分画遠心法、アフィニティクロマトグラフィー、およびＦＡＣＳフローサイトメトリーが挙げられる。目的の細胞の特定の集団を同定することが当該分野で公知のマーカーは、上記細胞を不均質な集団から単離するために使用され得る。例えば、ＣＤ１３３は、骨髄に由来する幹細胞もしくは幹細胞様細胞の表面に発現していることが公知である。ＣＤ１３３＋細胞の選択は、ＭＡＣｓビーズもしくはＣＤ１３３を認識する特異抗体の利用によって達成され得る。内皮始原細胞もしくは平滑筋細胞始原細胞に対して特異的なマーカーはまた、目的の細胞の集団を精製するために利用され得る。
【０１３５】
いくつかの局面において、上記細胞の集団は、脱細胞化された静脈への導入の前に、インビトロで培養され得る。インビトロで培養する目的としては、細胞数を増やすことおよび細胞を目的の特定の細胞系統へと分化させることが挙げられる。本開示は、細胞の集団がインビトロで培養される前に、先ず不均質な集団から単離され得ることを提供する。本開示は、細胞の集団が骨髄由来幹細胞もしくは始原細胞（すなわち、ＣＤ１３３＋細胞）であり得、脱細胞化された静脈への導入の前に、インビトロで分化され得ることを提供する。種々の分化プロトコルは、当該分野で公知であり、例えば、細胞を、内皮細胞もしくは平滑筋細胞への分化を誘導する因子、薬剤、分子もしくは化合物を補充した増殖培地中で増殖させることを包含する。
【０１３６】
静脈を生成するために、脱細胞化された静脈に導入される細胞の数は、静脈のサイズ（すなわち、長さ、直径、もしくは厚み）および再細胞化に使用される細胞のタイプ（すなわち、全血などのより分化した細胞に対して、幹細胞）に依存し得る。細胞の種々のタイプが、それらの細胞が達する集団密度に関して種々の傾向を有し得る。例示によれば、脱細胞化された器官もしくは組織は、少なくとも約１，０００個（例えば、少なくとも１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、もしくは１００，０００，０００個）の細胞で「播種」され得るか；または約１，０００個の細胞／ｍｇ  組織（湿重量，すなわち、脱細胞化前）〜約１０，０００，０００個の細胞／ｍｇ  結合される組織（湿重量）を有し得る。
【０１３７】
上記細胞の集団は、１またはそれより多くの位置への注射によって、脱細胞化された静脈へと導入（「播種」）され得る。さらに、細胞の１種より多くのタイプ（すなわち、内皮細胞もしくは平滑筋細胞）が、脱細胞化された静脈へと導入され得る。例えば、本開示は、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が、脱細胞化された静脈の管腔に導入されることを提供する。代わりに、もしくは注射に加えて、上記細胞の集団は、カニューレ挿入した脱細胞化された静脈へと灌流により導入され得る。例えば、上記細胞の集団は、灌流によって脱細胞化された静脈へと導入され得る。上記細胞の灌流の後、増殖培地および／もしくは分化培地が、上記播種した細胞の成長および／もしくは分化を誘導するために、静脈を通じて灌流され得る。本開示は、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）が、上記細胞の集団の導入の前および／もしくは同時に、投与され得ることを提供する。
【０１３８】
増殖培地および分化培地は、本開示で使用される場合、内皮細胞もしくは平滑筋細胞の増殖ならびに内皮細胞もしくは平滑筋細胞への分化に必要とされる補充物および因子を含む細胞増殖培地を含む。本開示は、内皮細胞のための分化培地は、内皮細胞のための成長／増殖培地と同じであり得ることを提供する。例えば、内皮成長もしくは分化培地に存在するさらなる因子もしくは補充物としては、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトＶＥＧＦ、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮成長因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、平滑筋細胞のための分化培地が平滑筋細胞のための成長／増殖培地と同じであり得ることを提供する。例えば、内皮成長もしくは分化培地に存在するさらなる因子もしくは補充物としては、平滑筋成長補充物、平滑筋分化補充物、ＭｅｓｅｎＰｒｏ、およびトランスフォーミング成長因子β１が挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、成長および分化培地は、基礎培地（すなわち、ＭＣＤＢ１３１、Ｍ２３１、もしくはＤＭＥＭ）、熱不活化血清（例えば、１０％で）、グルタミンおよび抗生物質（すなわち、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）を含む。
【０１３９】
本開示は、播種した静脈を、望ましい再細胞化が達成されるまで、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地で交互にインキュベートもしくは灌流することを提供する。本開示は、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地を複数回および交互に、例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回もしくは少なくとも１５回、灌流を反復することを提供する。本開示は、内皮細胞培地の灌流の持続時間は、平滑筋細胞培地の灌流の持続時間と同じであり得ることを提供する。あるいは、内皮細胞培地の灌流の持続時間は、平滑筋細胞培地の灌流の持続時間とは異なり得る。分化もしくは成長培地のいずれかの灌流の持続時間は、脱細胞化された静脈上に播種した細胞の集団の特徴に依存し得る。上記分化および成長培地の灌流の持続時間は、当業者によって決定され得る。
【０１４０】
再細胞化の間に、上記脱細胞化された静脈は、播種した細胞のうちの少なくともいくらかが、脱細胞化された静脈内および静脈上で増殖および／もしくは分化し得る条件下で維持され得る。それら条件としては、適切な温度および／もしくは圧力、電気的および／もしくは機械的活性、力、Ｏ２および／もしくはＣＯ２の適切な量、湿度の適切な量、ならびに無菌の条件もしくはほぼ無菌の条件が挙げられるが、これらに限定されない。再細胞化の間に、上記脱細胞化された静脈およびこれに結合した細胞は、適切な環境中で維持される。例えば、上記細胞は、栄養補充物（例えば、栄養素および／もしくは炭素源（例えば、グルコース））、外因性ホルモンもしくは成長因子、ならびに／または特定のｐＨを要し得る。
【０１４１】
本開示はまた、本明細書で記載されるように。、適切な条件下で静脈を再細胞化するためのバイオリアクターを提供する。具体的には、上記バイオリアクターは、細胞化される予定の上記静脈に合うように十分な大きさであり、滅菌され得る完全に閉じたチャンバ、ポンプ輸送機構（すなわち、蠕動ポンプ）に繋がれた、細胞および／もしくは培地を供給するためのチューブ、静脈の一方の末端が繋がれる構造体、ならびに２つの入り口および２つの出口を含む。上記静脈およびポンプに関連するチューブの設定は、上記細胞もしくは培地が上記静脈の管腔を通して流れ、上記静脈の外側の周りを流れ、もしくは浸すようにする。
【０１４２】
いくつかの場合、本明細書で記載される方法によって生成された静脈は、患者に移植される予定である。それらの場合、脱細胞化された静脈を再細胞化するために使用される細胞は、上記再生させる細胞が、患者にとって「自己由来」であるように、上記患者から得られ得る。患者由来の細胞は、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、種々のライフステージ（例えば、出生前に、新生児期に、もしくは周産期に、青年期の間、または成体として）にある、血液、骨髄、組織、もしくは器官から得られ得る。あるいは、脱細胞化された器官もしくは組織を再細胞化するために使用される細胞は、上記患者によって同系遺伝子（すなわち、一卵性双生児由来）であり得、上記細胞は、例えば、上記患者の血縁者もしくは上記患者とは血縁がないヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）がマッチした個体に由来する、ＨＬＡがマッチした細胞であり得るか、または細胞は、上記患者にとって同種異系、例えば、非ＨＬＡマッチドナー由来であり得る。
【０１４３】
上記播種された細胞の経過は、再細胞化の間にモニターされ得る。例えば、脱細胞化された静脈もしくは組織上もしくはその中の細胞の数は、再細胞化の間に１またはそれより多くの時点で生検することによって評価され得る。さらに、上記細胞が経験した分化の量は、種々のマーカーが、細胞もしくは細胞の集団に存在するか否かを決定することによってモニターされ得る。種々の細胞タイプおよびそれら細胞タイプに関する種々の分化ステージと関連するマーカーは、当該分野で公知であり、抗体および標準的なイムノアッセイ、免疫蛍光、免疫組織化学もしくは組織学技術を使用して容易に検出され得る。例えば、内皮細胞、または内皮系統において分化した細胞の存在を確認するために、当該分野で公知のいずれかの内皮マーカーが、アッセイされ得る。上記内皮マーカーとしては、ＣＤ３１、ｖＷＦ、ＶＥ−カドヘリンおよびＡｃＬＤＬが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、平滑筋細胞、もしくは平滑筋細胞系統において分化した細胞の存在を確認するために、当該分野で公知のいずれかの平滑筋細胞マーカーがアッセイされ得る。上記平滑筋細胞マーカーとしては、平滑筋アクチンおよびビメンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
本開示は、操作された静脈の引っ張り強度が試験され得ることを提供する。引っ張り強度試験は、当該分野で公知である。例えば、操作された静脈は、環状のセグメントへと横方向に切断され得、半径方向の変形によって試験され得る。上記サンプルを完全に破壊するために使用される合力（total  force）、および50％合力での伸長は、引っ張り強度を決定するために計算され得る。本開示は、脱細胞化された静脈と比較された場合に、増加した引っ張り強度を実証する再細胞化された静脈を提供する。例えば、本開示の操作された静脈は、脱細胞化された静脈と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより大きな合力に耐える能力を実証し得る。本開示の特徴において、上記再細胞化された静脈は、正常な静脈に類似するかもしくはほぼ同じ引っ張り強度を明らかに示す。
【０１４５】
本開示は、死体から採取されたヒト同種異系大腿静脈の有弁セグメントを提供する。上記セグメントは、脱細胞化および再細胞化という技術を使用して、組織工学で作られる。上記脱細胞化され、再細胞化された静脈（ＤＶ／ＲＶ）セグメントは、生化学的に、免疫組織化学的に、および生体力学的に特徴付けられる。弁閉鎖時間（１００ｍｍＨｇでの）および逆流圧への耐性は、インビトロモデルで測定される。ＤＶのＤＮＡ定量から、細胞成分が満足のいく程度除去されていることが確証された。得られたＤＶは、細胞外マトリクスタンパク質のうちのいくらかおよび機械的完全性を保持した。弁の機械的パラメーターは、脱細胞化および再細胞化の後にすら、天然の組織に類似である。上記弁を含む足場の管腔は、バイオリアクター中で、内皮細胞および平滑筋細胞で成功裡に再播種される。
【０１４６】
（再細胞化された弁の特徴付け）
本開示の脱細胞化プロトコルは、上記弁の機能的特性を成功裡に保存する。弁を有する組織工学で作られた静脈は、将来的な前臨床研究および最終的な臨床適用の有効なひな型を提供する。本開示は、移植後に、被験体における再細胞化された弁が、正常なもしくは正常に近い弁として機能し得る再細胞化された機能的弁を提供する。本明細書で開示される方法は、病的な応答能のない深部静脈の置換および静脈逆流の原因の処置を可能にし得る。上記脱細胞化および再細胞化された有弁静脈（ＤＶ／ＲＶ）セグメントは、成功裡の臨床適用のために、上記再細胞化された有弁静脈の機能的能力を確認するために、本明細書で記載されるように、生化学的に、免疫組織化学的に、および生体力学的に特徴付けられる。
【０１４７】
上記再細胞化された弁は、内皮細胞および平滑筋細胞の存在について特徴付けられる。当業者に周知の免疫組織化学および免疫蛍光の技術は、内皮細胞および平滑筋細胞の存在もしくは非存在を検出するために利用される。内皮細胞の存在を可視化するために、ＣＤ３１に対する抗体（１：２００）（Ａｂｃａｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびｖＷＦに対する抗体（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を選択し、上記再細胞化された弁の染色のために使用する。上記再細胞化された静脈におけるＣＤ３１陽性細胞および／もしくはｖＷＦ陽性細胞の存在を、免疫組織化学および免疫蛍光によって検出する（図４Ｄ、４Ｅ、５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。平滑筋細胞を可視化するために、平滑筋アクチンに対する抗体（１：５０）（Ａｂｃａｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、上記再細胞化された弁を染色するために使用する。平滑筋アクチン陽性細胞の存在は、免疫組織化学的分析によって決定される（図４Ｆを参照のこと）。平滑筋細胞はまた、紡錘形の筋細胞の存在について上記再細胞化された有弁静脈を裏打ちする細胞の形態の免疫組織化学分析および免疫蛍光分析によって同定され得る。
【０１４８】
再細胞化された弁および静脈はまた、核の存在によって特徴付けられる。上記再細胞化された有弁静脈は、ＤＡＰＩによって染色され、染色は、核の存在を検出するために免疫蛍光によって可視化される（図１１Ｄを参照のこと）。上記再細胞化された弁および静脈の免疫組織化学染色（例えば、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色またはマッソントリクローム（ＭＴ）染色）はまた、核の検出に適している（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃを参照のこと）。
【０１４９】
弁機能を試験するための種々の方法が当該分野で公知である。上記再細胞化された有弁静脈および上記再細胞化された静脈の漏れは、上記静脈を溶液（すなわち、生理学的に緩衝化された溶液（例えば、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ））で洗い流すことによって試験される。例えば、溶液で満たしたシリンジを、再細胞化された静脈もしくは弁の一方の末端に挿入する。上記溶液は、上記弁もしくは静脈へと、好ましくは一定の速度で流し、上記弁もしくは静脈の表面は、上記再細胞化された弁もしくは静脈の漏れもしくは穴から生じる溶液の任意の蓄積について観察される。本開示の好ましい特徴において、上記再細胞化された有弁静脈は、試験した場合に漏れを示さない。
【０１５０】
本開示は、上記再細胞化された有弁静脈の機能がインビトロで試験することによって、すなわち、生理学的な流れおよびポンプ作用を摸倣する水圧フローシステム（バイオリアクター）によって、評価され得ることをさらに提供する。上記再細胞化された弁の機能性（すなわち、正常機能および逆流圧耐容能）を評価するために本研究において使用されるインビトロ試験設定は、Ｇｅｓｅｌｓｃｈａｐ  ＪＨ，  ｖａｎ  Ｚｕｉｄｅｎ  ＪＭ，  Ｔｏｏｎｄｅｒ  ＩＭ，  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｅｎｓ，  ＣＨＡ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｖａｌｖｅ−ｓｔｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｅｅｐ  ｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａｎ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ．  （２００６），  １３：７６２−７６９によって使用されるものの改変である。このモデルは、所定の圧力で静脈弁機能の評価を可能にする。応力下で深部静脈系における静脈を通る流れを摸倣するために、市販の蠕動ポンプを利用して、一定の順方向の流れを維持するか、または所望の圧力レベルで回路へ間欠的流れを送達した。超音波造影ＳｏｎｏｖｕｅＴＭの追加は、応答能（すなわち、正常な弁閉鎖時間）の決定のために、流れ、弁小葉および弁閉鎖を二重に画像化することを可能にする。例示的なバイオリアクター設定を、図１に図示する。
【０１５１】
上記有弁静脈は、脱細胞化および／もしくは再細胞化の前もしくは後に試験される。上記静脈は、流れの回路の中に垂直に取り付けられ、室温の食塩水で灌流される。上記静脈は、両方の末端が縫合糸でしっかり固定された円錐コネクター（ｃｏｎｉｃ  ｃｏｎｎｅｃｔ）によって流体回路に繋がれる。機械式弁は、蠕動ポンプからの流出の間に、回路を通る流れの方向を調節するために使用される。超音波ドップラー技術は、上記静脈弁の部位での潜在的な逆流を検出するために使用される。
【０１５２】
弁の応答能は、本明細書で使用される場合、弁閉鎖時間、もしくは流れが逆になってから流れが止まるまでの時間をいう。正常な機能を有する弁の弁閉鎖時間は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満である。従って、本開示の好ましい特徴において、本開示の再細胞化された弁は、０．５秒に等しいかまたはそれ未満の弁閉鎖時間（もしくは応答能）を有する。
【０１５３】
静脈逆流は、本明細書で使用される場合、心臓に向かう血流の方向に対して血液が後方に流れることをいう。正常な機能を有する弁は、約１００ｍｍＨｇの逆流圧に逆らうかもしくは耐え、７〜１２歩歩く間に、平均約１８ｍｍＨｇ〜約２５ｍｍＨｇへと低下させることができる。言い換えると、正常な機能を有する弁は、最大で１００ｍｍＨｇまでの圧力に逆らって閉じたままであり、それによって逆流を防止し、７〜１２歩歩く間に、平均約１８ｍｍＨｇ〜約２５ｍｍＨｇへと低下させる。上記再細胞化された弁は、正常な弁が耐える逆流圧（すなわち、１００ｍｍＨｇ）のうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％に耐える能力を実証する。
【０１５４】
再細胞化された弁が正常な弁として機能する能力は、上記弁の生体力学的特性を試験する種々のアッセイを使用してさらに試験され得る。インストロン機械、または引っ張り強度もしくは剪断応力を試験するための他の機械は、再細胞化された弁の機械的特性を測定するために適している。
【０１５５】
本開示は、水平方向に上記弁を裂くことによる、静脈弁の機械的特性の評価を提供する。必要に応じて、上記機械による評価を容易にする一助とするために、縫合糸が使用され得る。具体的には、ポリプロピレンから作製された４−０非吸収性モノフィラメント縫合糸が、インストロン機械への荷重を容易にするために、試験弁にとり付けられる（図９を参照のこと）。所定の予備荷重は、試験の出発点（例えば、０．１Ｎ）として使用される。２０ｍｍ／分の試験速度が、試験弁を水平方向に破断するために使用される。上記試験弁は、経時的に伸ばされ（機械的に）、その力が、伸長距離（すなわち、ｍｍ）の関数として測定される。第１の裂け目まで上記試験静脈が耐える力が、第１のピークとして表される。正常な機能を有する正常な静脈は、約０．８Ｎという第１のピークの力に耐え得る。
【０１５６】
弁を含む静脈を、本明細書で記載される方法を使用して脱細胞化および再細胞化し、正常な静脈と比較して、その生体力学的特性を試験した。上記弁の機械的分析から、再細胞化された有弁静脈のうちの４／６および試験した正常な有弁静脈のうちの１／４が機能的であることが示された（図６を参照のこと）。各静脈において、１対の弁が存在し、弁の各対に関する第１のピークの力を測定した。第１のピークの力を分析したところ、機能した静脈と機能しなかった静脈との間には差異が見出された。得られた結果に基づいて、上記対における弁のうちの一方の不全ですら、上記静脈の機能性に影響を与えるには十分である。好ましくは、本明細書で開示される方法によって得られる再細胞化された弁は、正常な弁が耐える第１のピークの力（すなわち、０．８Ｎ）のうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％に耐え得る。あるいは、上記再細胞化された弁は、０．８Ｎより高い第１のピークの力に耐える。
【０１５７】
本明細書で記載されるように、末梢全血の灌流は、再細胞化される有弁静脈の培地中での明確な内皮細胞単層の形成および平滑筋細胞の存在を生じる。機能および強度は、インビトロでの応答能および逆流圧耐容能試験モデルならびに生体力学的引き裂き試験を使用することによって決定されるように、再細胞化された静脈弁において保存される。単純な末梢血サンプルを上記静脈セグメントを再細胞化するために使用することは、骨髄もしくは末梢血からの成熟細胞／幹細胞の単離および増殖のような、より退屈なアプローチを超える明確な利点がある。これら結果は、自己由来末梢全血を使用して組織工学で作られた静脈の２名の小児科の患者へ成功裡の移植によってさらに裏付けられる。
【０１５８】
（処置もしくは使用の方法）
組織工学で作られた弁を含む静脈セグメントは、深部静脈逆流および静脈高血圧症が再発性の肢潰瘍化をもたらす主な病態生理学的特徴である選択された患者において、治療選択肢であり得る。本開示は、本開示の再細胞化された弁および再細胞化された有弁静脈を、移植を必要とする被験体に導入もしくは移植によって、静脈の障害、例えば、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、慢性静脈不全（ＣＶＩ）（静脈炎後症候群としても公知）、および／もしくは静脈瘤を処置ならびに／または一時的に緩和する方法を包含する。
【０１５９】
本開示は、慢性静脈不全および肢潰瘍化の処置のためのドナー有弁静脈を脱細胞化および再細胞化するための方法を提供する。本明細書で記載される方法によって生成された、再細胞化された弁は、ＣＶＩおよび／もしくは静脈肢潰瘍化に罹患しているかまたはそれに罹患するリスクがある患者に埋め込まれ得るか、移植され得るか、もしくは移植され得る。
【０１６０】
本開示は、慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状の処置もしくは改善を必要とする被験体において慢性静脈不全（ＣＶＩ）および／もしくは肢潰瘍化の症状を処置もしくは改善するための方法をさらに提供し、上記方法は、静脈の再細胞化された有弁セグメントを上記被験体に移植する工程を包含する。上記再細胞化方法は、１またはそれより多くの工程を包含する。処置されるか、改善されるかもしくは一時的に緩和される症状としては、以下が挙げられ得る：肢の鈍痛、重さ、もしくは痙攣、そう痒および刺痛、起立のときの悪化する疼痛、肢を上げているときによくなる疼痛、肢の腫脹、肢および足首の発赤、足首の周りの皮膚の色の変化、表面にある（表在性の）静脈瘤、肢および足首の皮膚の肥厚化および硬化（脂肪皮膚硬化症）、肢および足首の潰瘍、ならびに肢もしくは足首で治癒するまでが遅い創傷。
【０１６１】
上記方法は、ヒト大腿静脈の有弁セグメントを採取する工程；上記大腿静脈における静脈を２〜１６サイクルで脱細胞化する工程；被験体から血液を採取する工程；上記脱細胞化された静脈を抗凝固剤で灌流する工程；上記脱細胞化された静脈を上記採取した血液で数時間灌流する工程；上記血液を排出し、上記静脈を緩衝液ですすぐ工程；および上記静脈を先ず内皮細胞培地で１日より長く灌流し、次いで、平滑筋培地で１日より長く灌流する工程；およびそれによって、上記脱細胞化された弁を再細胞化する工程を包含し；ここで上記再細胞化された弁は、上記被験体に移植すると、ＣＶＩおよび／もしくは肢潰瘍化を処置もしくは改善する。
【０１６２】
本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを、再細胞化された有弁静脈で処置するための方法を包含する。本開示は、深部静脈逆流および／もしくは静脈高血圧症に起因する再発性の肢のがんを処置することにおける再細胞化された有弁静脈の使用を包含する。
【０１６３】
本開示は弁の再細胞化を包含し、移植を必要とする被験体に移植することにより、該被験体の大腿部における応答能のない静脈の症状を処置するかもしくは改善する。実施形態では、上記症状の処置および／もしくは改善は、筋ポンプと上記静脈弁との間の正常な作業関係性を回復することによって達成され得る。下肢の筋ポンプは、足（ｆｏｏｔ）、ふくらはぎ、および大腿部のものを含む。正常なふくらはぎのポンプは、最大のキャパシタンスを有し、最高圧力を生じる（筋収縮の間に２００ｍｍＨｇ）。正常な肢は、１５００〜３０００ｃｃの範囲に及ぶふくらはぎの容積、１００〜１５０ｃｃの静脈容積を有し、１回の収縮で静脈容積のうちの４０％〜６０％を駆出する。
【０１６４】
収縮の間に、腓腹筋およびヒラメ筋は、血液を、その大きな容量がある膝窩静脈および大腿静脈へと駆動する。本開示の再細胞化された弁は、陰圧を生じて、応答能のある貫通静脈を通じて血液を表在系から深部系へと引いて、その後の弛緩の間の逆流（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｆｌｏｗ）（逆流（ｒｅｆｌｕｘ））を防止する。上記再細胞化された弁は、動脈流入が静脈流出と等しくなるまで静脈圧を徐々に下げる。本開示は、被験体の運動が止まると、再細胞化された弁を有する静脈が、安静時静脈圧へとゆっくりと戻して、毛細血管床をゆっくりと満たすことを含む。
【０１６５】
大腿静脈の周りを筋肉が囲んでいるものの、静脈還流への大腿筋収縮の寄与は、腓腹筋ポンプと比較すると最小限である。歩行している間の足底静脈叢の圧迫によるポンプ作用は、ふくらはぎのポンプを促進する。種々の肢のポンプは、応答能のある弁の機能と一緒になって働いて、静脈血を四肢の遠位から近位へと戻す。本開示の再細胞化された弁は、機能的な肢のポンプを回復して、静脈血を四肢の遠位から近位へと戻すのに有用である。
【０１６６】
本開示は、慢性静脈不全および／もしくは肢潰瘍化の処置のための、ドナー有弁静脈を脱細胞化および再細胞化するための方法を包含する。本明細書で記載される方法によって生成された、再細胞化された弁は、ＣＶＩおよび／もしくは静脈肢潰瘍化に罹患しているかもしくは罹患するリスクがある患者に埋め込まれ得るか、移植され得るか、もしくは移植され得る。
【０１６７】
慢性静脈不全は、歩行性静脈高血圧症（運動で静脈圧を低下させることができないと定義される）から生じる静脈疾患のその発現を定義する。通常の環境下で、静脈弁および下肢の筋ポンプは、下肢静脈に血液が蓄積するのを制限する。流出閉塞、筋筋膜の虚弱、関節運動の喪失、もしくは弁の不全に起因する下肢の筋ポンプの不全は、末梢静脈不全と関連づけられる。
【０１６８】
静脈潰瘍化は、静脈弁の（通常は、肢の）不適切な機能に起因する創傷（すなわち、静脈性の肢潰瘍化）である。静脈性潰瘍は、弁が機能低下し、血液の逆流によって静脈中に血液がプールするようになり、静脈および毛細管の圧力が増加するときに生じる。これは、他の関連する合併症（例えば、浮腫、炎症、組織の硬化、皮膚の栄養不良、および静脈性湿疹）をもたらす。静脈性潰瘍は、大きく、浅く、赤血球中の鉄含有色素が組織へ漏れることに起因して変色しており、放出物を有し得る。潰瘍は、最も頻繁には、内果もしくは外果（ｌａｔｅｒ  ｍａｌｌｅｏｌｉ）の周りに位置する。
【０１６９】
本開示は、静脈疾患もしくは障害の症状を処置もしくは改善するために、静脈における再細胞化された弁の使用を提供する。例えば、本開示は、慢性静脈不全もしくは肢潰瘍を処置もしくは改善するための方法における再細胞化された有弁静脈の使用を提供する。本開示の静脈における再細胞化された弁は、正常な下肢静脈圧を回復する。例えば、歩行すれば、下肢静脈圧は、約１００ｍｍＨｇ（身長に依存する）から平均１８ｍｍＨｇから約２５ｍｍＨｇへと７〜１２歩以内に低下する。類似の圧変化が、足首を底屈してもしくは踵を上げて立ち、重さを足の前部に移す（つま先動作）ことで観察される。歩行による静脈圧（ＡＶＰ）は、２１ゲージ針を使用して、足背静脈における１０本のつま先運動（通常は、１秒に１回の速度で）への応答を測定することで決定され得る。起立位（ｓｔａｔｉｎｇ  ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を再開する場合、静水圧は、平均３１秒後に回復される。潰瘍化の発生率は、３０ｍｍＨｇを上回るＡＶＰの増加に対して線形関係を有する。増加したＡＶＰはまた、２０秒未満の９０％  静脈再充満時間と関連づけられる。ＡＶＰとは対照的に、容積変化は、プレスチモグラフィーを使用して非侵襲的に測定され得る（ｃａｎ  ｂｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）。急激な逆流（すなわち、７ｍｌ／秒より大きな静脈充満）およびふくらはぎのポンプ機能障害は、潰瘍化の高い発生率と関連づけられる。静脈中の再細胞化された弁は、移植すると、正常なＡＶＰ、正常な迅速逆流および／もしくは正常なふくらはぎのポンプ機能障害を回復する。好ましくは、静脈中の再細胞化された弁は、移植すると、約１００ｍｍＨｇという逆流圧の正常な耐容能を回復し、および７〜１２歩歩く間に、平均約１８ｍｍＨｇから約２５ｍｍＨｇへと低下させる。
【０１７０】
以下の実施例は、本開示の方法および組成物の例証であって、限定ではない。本開示の他の特徴および利点は、種々の実施例から明らかである。その提供される実施例は、本開示を実施するにあたって有用な、種々の構成要素および方法論を例証する。実施例は、特許請求される主題を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本開示を実施するために有用な他の構成要素および方法論を同定および使用し得る。
【実施例】
【０１７１】
（有弁静脈の採取）
総大腿静脈、大腿深静脈および大腿静脈を含む静脈セグメントを、血管手術技術を使用し、全ての側枝を注意深く結紮することによって成人死体から採取した。弁を同定し、１２のセグメントを、弁の各末端に対して３〜４ｃｍのマージンをもって切断した。上記静脈セグメントを、０．５％  ペニシリン、０．５％  ストレプトマイシン、０．５％  アンホテリシンＢを含むリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で徹底的にすすぎ、４℃で保存した。上記サンプルを、氷上で１週間以内に研究室へと輸送した。
【０１７２】
（脱細胞化および特徴付け）
脱細胞化を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ、１％  トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）および４ｍｇ／Ｌ  ＤＮＡｓｅを使用して行った。上記脱細胞化された静脈セグメントを、無細胞性および種々のＥＣＭタンパク質の定量に関する標準的な手順を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）、ならびにマッソントリクローム（ＭＴ）で染色して、残留するＤＮＡ含有量について評価した。ＨＬＡクラスＩ抗原およびＨＬＡクラスＩＩ抗原を検出するために標準的手順によって免疫組織化学検査を行った。
【０１７３】
（ＤＮＡ定量）
【０１７４】
ＤＮＡを、市販のキットを使用することによって、正常な静脈およびＤＣ静脈から抽出した。２０ｍｇの７つの正常な静脈サンプルおよび９つの脱細胞化された静脈サンプルを、脱細胞化の前および後の種々の静脈から集め、ＤＮＡ抽出を、キット（６９５０６，  Ｑｉａｇｅｎ，  Ｓｗｅｄｅｎ）に含まれるＤＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｂｌｏｏｄ  ＆
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに従って行った。抽出したＤＮＡを、ナノドロップ（ＮＤ−１０００，  Ｓａｖｅｅｎ  Ｗｅｒｎｅｒ，  ＵＳＡ）を使用して、２６０ｎｍ波長で定量した。
【０１７５】
（ＥＣＭ染色および定量）
簡潔には、コラーゲンおよび結合組織を実証するために、ホルマリン固定静脈組織切片を、一晩、室温で、ブアン固定液中で再固定し、続いて、マッソントリクローム染色キット（ｃａｔ  Ｎｏ．  ２５０８８−１，  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を使用した。染色手順の間に使用した色素は、コラーゲン線維を青色に、核を黒に、および細胞質および筋線維を赤色に染色した。
【０１７６】
（酸可溶性／ペプシン可溶性コラーゲンの定量）
上記脱細胞化されたＥＣＭ中の酸可溶性／ペプシン可溶性コラーゲン含有量を、Ｓｉｒｃｏｌ可溶性コラーゲンアッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して測定した。酸可溶性／ペプシン可溶性コラーゲンを抽出するために、上記ＥＣＭ標品を、１％（ｗ／ｖ）
ペプシン（Ｐ７０１２；  Ｓｉｇｍａ）を含む０．５Ｍ  酢酸で、４８時間にわたって４℃で消化した。上記可溶性コラーゲンを、１ｍＬ  Ｓｉｒｃｏｌ色素試薬とともに３０分間室温でインキュベートした。上記コラーゲン−色素複合体を、１０，０００ｇで１０分間遠心分離することによって沈殿させ、その上清を除去した。そのペレットを、１ｍＬ
アルカリ試薬中に溶解し、その相対的吸光度を、９６ウェルプレート中、５５５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ，  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。
【０１７７】
（硫酸化ＧＡＧの定量）
上記脱細胞化されたＥＣＭ中の硫酸化ＧＡＧ含有量を、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化ＧＡＧアッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して測定した。硫酸化ＧＡＧを抽出するために、上記ＥＣＭを、１２５μｇ／ｍＬ  パパイン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  システインヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ）、および２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で、４〜６時間（組織が完全に溶解するまで）、６５℃で消化した。その懸濁液を、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。抽出した硫酸化ＧＡＧ（１００μｌ）を、１ｍＬ  Ｂｌｙｓｃａｎ色素と混合し、３０分間振盪した。１０分間遠心分離することでその沈殿物を集め、次いで、０．５ｍＬ  解離試薬中で溶解した。その吸光度を、９６ウェルプレート中、６５６ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０１７８】
（可溶性エラスチンの定量）
上記脱細胞化されたＥＣＭ中の可溶性エラスチン含有量を、Ｆａｓｔｉｎエラスチンアッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して測定した。可溶性エラスチンを抽出するために、上記ＥＣＭを、１００℃で４〜５時間（組織が完全に溶解するまで）、０．２５Ｍ
シュウ酸（Ｓｉｇｍａ）で加水分解した。不溶性の残渣を、遠心分離によって分離した。その上清を集め、沈殿物には、同じ条件下でのさらなる抽出を行った。抽出した可溶性エラスチンを１ｍＬ  Ｆａｓｔｉｎ色素と混合し、９０分間振盪した。１０分間の遠心分離で沈殿物を集め、次いで、２５０μＬ  解離試薬に溶解した。その吸光度を、９６ウェルプレート中、５１３ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０１７９】
（無菌性のコントロール試験）
再細胞化の間の無菌性を、培養の間に２日おきに集めた灌流した内皮培地および平滑筋培地のうちの１ｍｌを集めることによって評価し、微生物汚染について試験した。約５００μｌの集めた培地を、流動性のチオグリコレートブロスに添加し、トリプトン大豆寒天プレートにまき、３７℃で１４日間インキュベートした。外気に曝した培地を、陽性コントロールとして使用し、培地のみを陰性コントロールとして使用した。真菌、好気性細菌および嫌気性細菌の増殖を可視化し、また、６００ｎｍでの吸光度を分光光度計で測定した。吸光度の差を記した。
【０１８０】
（静脈の再細胞化）
再細胞化の日に、２０〜２５ｍｌ  末梢静脈血を、健康なドナー（年齢群２５〜３５歳）から滅菌ヘパリン被覆バキュテイナーチューブ中に採取し、可能な限り迅速に（２時間以内に）研究室へと輸送した。必要とされる血液の体積は、静脈の長さおよびバイオリアクター中で使用されるパイプの長さによって決定した。
【０１８１】
再細胞化プロセス全体を、滅菌条件下で行い、全ての灌流を、５％  ＣＯ２を供給した３７℃のインキュベーター中で行った。再細胞化の前に、上記静脈を、５０  ＩＵ／ｍｌ
ＰＢＳの濃度のヘパリン（Ｌｅｏｐｈａｒｍａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で２時間灌流した。上記ヘパリンを排出し、全血を４８時間、２ｍｌ／分の速度で直ぐに灌流した。次いで、上記血液を排出し、上記静脈を、血液が完全に除去されるまで１％  ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンを含むＰＢＳですすいだ。上記静脈をその後、４日間内皮培地で、および４日間平滑筋培地で灌流した。完全内皮培地を、１０％  熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）、１％  グルタミン（Ｌｏｎｚａ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシン、およびＥＧＭ２シングルクオートキット（Ｌｏｎｚａ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）（これはアスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトＶＥＧＦ、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮成長因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含んだ）を補充したＭＣＤＢ１３１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）基礎培地を使用して調製した。完全平滑筋培地を、１０％  熱不活化ヒトＡＢ血清、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン  アンホテリシンおよび２０ｍｌ  平滑筋成長補充物（ＳＭＧＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を補充した５００ｍｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２３１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して調製した。静脈足場を、合計１０日間にわたって再細胞化した（手稿を提出）。
【０１８２】
（再細胞化された静脈の特徴付け）
内皮細胞の存在を可視化するために、ＣＤ３１に対する抗体（１：２００）（Ａｂｃａｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびｖＷＦに対する抗体（１：１００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を選択し、免疫組織化学および免疫蛍光によって染色した一方で、平滑筋アクチンに対する抗体（１：５０）（Ａｂｃａｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、免疫組織化学によって染色して、平滑筋細胞を可視化した。
【０１８３】
（生物機械分析）
上記静脈弁の機械的特性を、縫合糸（ポリプロピレンから作製された４−０非吸収性モノフィラメント縫合糸）の助けを借りて、水平方向に弁を裂くことによって評価した。上記静脈を、外科用鋏で切り開き、縫合糸を配置して、インストロン５５６６（Ｉｎｓｔｒｏｎ，  Ｎｏｒｗｏｏｄ  ＵＳＡ）のグリップに取り付けた（図Ｓ１）。０．１Ｎの予備荷重および２０ｍｍ／分の試験速度を使用したところ、これにより、上記弁を水平方向に破砕した。引っ張り試験機の正確性は、ＩＳＯ  ７５００−１：２００４およびＩＳＯ  ９５１３：１９９９に従って徹底的に行われる較正に基づいて、力が０．５％および伸長が０．５％である。第１のピークの力を測定し、メジアン力を各サンプルに関して計算した。合計で６つの再細胞化した静脈（ｎ＝１２弁）および４つの正常な静脈（ｎ＝８弁）を試験した。
【０１８４】
（有弁静脈のインビトロ機能試験）
特注の試験設定を使用して、再細胞化の前および後で、静脈の機能性を評価した（図１）。上記静脈を、インビトロフロー回路の中に垂直にとりつけ、室温の食塩水で灌流した。上記静脈を、円錐コネクターによって流体回路に繋ぎ、両方の末端を縫合糸で固定した。歩行および呼吸の間に起こる応力下での深部静脈系における静脈を通る流れを摸倣するために、市販の蠕動ポンプ（Ｂａｘｔｅｒ，  Ｍｏｄｅｌ  ｎｏ．  ７０００４４，  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  ＵＳＡ）が、上記回路に間欠的流れを送達した。
【０１８５】
機械式弁を使用して、上記ポンプからの流出の間に回路を通る流れの方向を調節し、同じ弁が開いた位置に切り替えられた場合、それは、上記弁が閉じられるまで静脈中で逆流を達成した。静脈における逆流圧を、弁より上の流体の柱状体の高さによって調節した。超音波ドップラー技術を使用して、静脈弁の部位における潜在的な逆流を検出した（９ＭＨｚリニアプローブ，  Ｖｉｖｉｄ  Ｅ９，  ＧＥ）。超音波での可視化を最適化するために、上記静脈セグメントを、食塩水を満たしたプラスチック容器の中に沈めた。造影剤（ＳｏｎｏＶｕｅ，  ＢｒａｃｃｏＴＭ）を、上記食塩水溶液中に投与して、エコー発生性を高め、上記回路における、静脈弁を通る流れおよび流れの方向の記録を可能にした。流れが逆になってから流れが止まるまでの時間を、弁閉鎖時間の尺度として使用した。さらに、弁の直径を、１００ｍｍＨｇの逆流圧において、小葉の部位で測定した。
【０１８６】
（統計）
結果を、メジアンおよび範囲として示す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を行って、弁に対する脱細胞化および再細胞化の効果を比較した。対応のある両側スチューデントＴ検定を、ＥＣＭおよびＤＮＡの定量のために使用した。Ｐ＜０．０５を、有意差があるとみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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