(57)【要約】      （修正有）【課題】イヌのリンパ腫に対する新しい診断及び病勢モニターマーカーとしてCD70分子を同定し、それを用いた治療法及び診断法の提供。【解決手段】イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片を用いて、抗イヌCD70モノクローナル抗体を有効成分として含むイヌのリンパ腫治療剤をイヌに投与するイヌのリンパ腫の治療法、及びイヌ末梢血のリンパ球に発現するCD70を測定し、リンパ球にCD70が発現している場合に、リンパ腫に罹患していると判断するイヌリンパ腫の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イヌCD70への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イヌCD70への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAがコードする重鎖可変領域及び配列番号３で表される塩基配列からなるDNAがコードする軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列がコードするイヌCD70への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号３で表される塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列がコードするイヌCD70への結合活性を有する軽鎖可変領域を含むイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項５】
重鎖定常領域及び軽鎖定常領域がイヌIgG抗体の定常領域である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項６】
機能的断片がFab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(dsFv) 、二量体化V領域（diabody）、一本鎖Fv（scFv）及びCDRからなる群から選択されるペプチド断片である請求項１〜５のいずれか１項に記載のイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域であるポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域であるポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項９に記載のポリヌクレオチドと請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌCD70モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片を用いて、イヌ末梢血のリンパ球に発現するCD70を測定し、リンパ球にCD70が発現している場合に、リンパ腫に罹患していると判断するイヌリンパ腫の診断方法。
【請求項１５】
フローサイトメーターを用いて行う、請求項１４記載の診断方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片を含む、イヌリンパ腫の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌリンパ腫の治療及び診断のために用いる抗イヌCD70抗体及びその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌの寿命の延長に伴い、ヒトと同様、がんの発生が増加している。従来から用いられている3大療法（外科手術、放射線療法、化学療法）では限界があり、それに代わる又は同時に用いることができる新たな治療法が必要である。
【０００３】
ヒトにおいては、抗体医薬として、腫瘍細胞表面に発現する分子に対する抗体を担ガン患者へ投与することによる腫瘍の治療が近年行われており、新規治療法として注目されている。
【０００４】
例えば腫瘍壊死因子（TNF)スーパーファミリーの一員であるCD70に対する抗体をヒトの癌等の治療に用いることが報告されている（特許文献１を参照）。
【０００５】
しかしイヌに比較的多い血液系腫瘍であるリンパ腫について抗体医薬の候補となる分子の同定はほとんどなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2009-509510号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、イヌのリンパ腫に対する新しい診断及び病勢モニターマーカーとしてCD70分子を同定し、それを用いた治療法及び診断法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
イヌに比較的多い血液系腫瘍であるリンパ腫について抗体医薬の候補となる分子の同定はほとんどなされていなかった。本発明者らは、イヌのリンパ腫に特異的に発現する分子の同定を行い、腫瘍壊死因子（TNF)スーパーファミリーの一員であるCD70が特異的に発現していることを見出した。
【０００９】
本発明者らは、CD70に対するモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体を用いることにより、イヌのリンパ球におけるCD70の発現を測定することにより、イヌがリンパ腫に罹患しているか否かを診断できることを見出した。
【００１０】
さらに、抗CD70抗体をイヌのリンパ腫の治療に用い得ることを見出し本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イヌCD70への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イヌCD70への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[３]  配列番号１で表される塩基配列からなるDNAがコードする重鎖可変領域及び配列番号３で表される塩基配列からなるDNAがコードする軽鎖可変領域を含む、イヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[４]  配列番号１で表される塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列がコードするイヌCD70への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号３で表される塩基配列と90％以上の配列同一性を有する塩基配列がコードするイヌCD70への結合活性を有する軽鎖可変領域を含むイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[５]  重鎖定常領域及び軽鎖定常領域がイヌIgG抗体の定常領域である、[１]〜[４]のいずれかのイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[６]  機能的断片がFab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(dsFv) 、二量体化V領域（diabody）、一本鎖Fv（scFv）及びCDRからなる群から選択されるペプチド断片である[１]〜[５]のいずれかのイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片。
[７]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域であるポリペプチド。
[８]  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域であるポリペプチド。
[９]  配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[１０]  配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[１１]  [９]のポリヌクレオチド、[１０]のポリヌクレオチド、又は[９]のポリヌクレオチドと[１０]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[１２]  [１１]に記載のベクターを含む細胞。
[１３]  配列番号１で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするDNAを抗体の重鎖定常領域をコードするDNAと連結し、配列番号３で表されるDNA配列からなる、抗イヌCD70モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAを抗体の軽鎖定常領域をコードするDNAと連結し、得られたDNAコンストラクトを発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞又は宿主動物を形質転換し、該宿主細胞又は宿主動物により抗体を産生させることを含む、抗イヌCD70モノクローナル抗体の製造方法。
[１４]  [１]〜[６]のいずれかのイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片を用いて、イヌ末梢血のリンパ球に発現するCD70を測定し、リンパ球にCD70が発現している場合に、リンパ腫に罹患していると判断するイヌリンパ腫の診断方法。
[１５]  フローサイトメーターを用いて行う、[１４]の診断方法。
[１６]  [１]〜[６]のいずれかのイヌCD70に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体又はイヌCD70に結合するその機能的断片を含む、イヌリンパ腫の検出試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗イヌCD70抗体により、イヌのリンパ腫を診断することができる。また、本発明の抗イヌCD70抗体は、イヌのリンパ腫の治療のためにも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】イヌリンパ腫におけるCD70の発現解析の結果を示す図である。
【図２】イヌCD70及びCD27をコードする遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図３】抗イヌCD70モノクローナル抗体とNRK/cCD70との結合性を示す図である。
【図４Ａ】cCD27-hIgとNRK/cCD70との結合性を示す図である。
【図４Ｂ】抗イヌCD70モノクローナル抗体がイヌCD70とイヌCD27の結合阻害効果を有しないことを示す図である。
【図５Ａ】イヌリンパ腫腫瘍細胞株9例におけるCD70の発現解析の結果を示す図である。
【図５Ｂ】イヌリンパ腫症例2例(B細胞型)、慢性リンパ性白血病症例1例より採取した腫瘍細胞におけるCD70の発現解析の結果を示す図である。
【図６】イヌの末梢血リンパ球におけるCD70の発現解析の結果を示す図である。
【図７】イヌの各種臓器におけるCD70の発現解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はイヌCD70に特異的に結合するモノクローナル抗体4F2-12の重鎖可変領域及び軽鎖（κ鎖）可変領域を含むイヌCD70に特異的に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体である。
【００１５】
さらに、本発明は前記4F2-12抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖（κ鎖）可変領域であるポリペプチド並びにそれらの可変領域をコードするポリヌクレオチドも包含する。
【００１６】
本発明の抗体は、抗体の機能的断片又はその修飾物も包含する。例えば、抗体の機能的断片は、抗体の断片であって抗原に特異的に結合し得る断片である。機能的断片としては、Fab、F（ab'）2、Fv、1個のFabと完全なFcを有するFab/c、Ｈ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）又はCDR等が挙げられる。ポリヌクレオチドは、DNAもRNAも包含する。
【００１７】
4F2-12抗体の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列は配列番号１で表される塩基配列からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる。また、4F2-12抗体の軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列は配列番号３で表される塩基配列からなり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる。
【００１８】
重鎖可変領域は配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性、すなわちイヌCD70への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。軽鎖可変領域は配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において１若しくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖可変領域の活性、すなわちイヌCD70への結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変流域も含む。
【００１９】
このような配列番号２又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２又は４のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
【００２０】
このような配列番号２又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
【００２１】
また、上記の配列番号１又は３で表される配列からなる塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有している塩基配列からなるDNAであって、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちイヌCD70への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
【００２２】
また、上記の配列番号１又は３で表される配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちイヌCD70への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50％ フォルムアミド、４×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×デンハルツ（Denhardt, s）溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるDNAである。
【００２３】
本発明のイヌCD70に特異的に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、イヌCD70を免疫原として用いて、マウスやラットの細胞を用いて、公知の方法により抗イヌCD70抗体産生ハイブリドーマを取得し、該ハイブリドーマから重鎖可変領域をコードするDNA又は軽鎖可変領域をコードするDNAを単離し、該DNAを発現させることにより得ることができる。
【００２４】
また、前記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むイヌCD70に特異的に結合する抗イヌCD70モノクローナル抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインCH1、CH2及びCH3から構成されている。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であってもよいが、最も好適には、IgG1又はIgG4定常領域である。軽鎖定常領域は、１個のドメインCLで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
【００２５】
抗体をコードするDNAは、重鎖可変領域をコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAを連結し、さらに軽鎖可変領域をコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAを連結することにより重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAとして得られる。可変領域の由来生物種と定常領域の由来生物種は異なっていてもよく、本発明の抗イヌCD70抗体は、可変領域の由来生物種と定常領域の由来生物種が異なるキメラ抗体も含む。例えば、配列番号１で表されるDNAにコードされる重鎖可変領域及び配列番号３で表されるDNAにコードされる軽鎖可変領域はラット由来であるが、これをイヌ由来の抗体の定常領域をコードするDNAと連結させてラット由来の可変領域とイヌ由来の定常領域を含むキメラ抗体を作製することができる。
【００２６】
本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、重鎖可変領域をコードするDNA又は軽鎖可変領域をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより細胞に産生させることができる。
【００２７】
本発明の抗イヌCD70モノクローナル抗体は、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させることができる。この際、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを同じ発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよいし、重鎖をコードするDNAと軽鎖をコードするDNAを別々のベクターに挿入し、２つのベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよい。この際、特定のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードするDNAを予め挿入したベクターに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするDNAを挿入してもよい。また、該ベクターは宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするDNAを含んでいてもよい。この場合、シグナルペプチドをコードするDNAと抗体をコードするDNAをインフレームで連結するようにする。抗体が産生された後にシグナルペプチドを除去し、抗体を成熟タンパク質として得ることができる。
【００２８】
この際、重鎖可変領域をコードするDNA、軽鎖可変領域をコードするDNA、重鎖可変領域をコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAを連結したDNA、軽鎖可変領域をコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAを連結したDNAをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。
【００２９】
プロモータ及びエンハンサーとしては、サイトメガロウイルス（CMV)、シミアンウイルス40(SV40）、アデノウイルス由来のプロモータ及びエンハンサーを用いることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、公知のものを用いることができる。例えば、Flexi（登録商標）ベクター（プロメガ社）、pUC19、pTV118 N (宝酒造社製)、pUEX2（アマシャム社製）、pGEX-4T、pKK233-2(ファルマシア社製)、pMAM-neo（クロンテック社製）等が挙げられる。
【００３１】
発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキストラントランスフェクション法等がある。
【００３２】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。動物細胞としては、ヒト胎児腎細胞株であるHEK293細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（CHO）細胞、カイコ等の鱗翅目昆虫細胞であるSf 21細胞、Sf 9細胞やTN5細胞、サルCOS細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられ、酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が挙げられる。また、本発明の可変領域又は抗体は、カイコ虫体等の動物体を用いて産生することもできる。カイコ虫体を用いての産生は公知の方法により行うことができる。
【００３３】
発現、産生された抗体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。また、抗イヌCD70抗体をアフィニティータグ付きの状態で製造した後、アフィニティータグを利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。アフィニティータグ配列としては、例えば、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列が挙げられる。この場合、ニッケルをリガンドとしたニッケルキレートカラムクロマトグラフィーを利用することにより合成タンパク質を精製することができる。また、ポリヒスチジンに対する抗体をリガンドとして固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによっても精製することができる。その他、ヒスチジンを含む配列からなるHATタグ、HNタグ等も用いることができる。さらに、他のアフィニティータグとして、V5タグ、Xpressタグ、AU1タグ、T7タグ、VSV-Gタグ、DDDDKタグ、Sタグ、CruzTag09、CruzTag22、CruzTag41、Glu-Gluタグ、Ha.11タグ、KT3タグ等がある。本発明は、これらのタグが結合した抗イヌCD70抗体も包含する。
【００３４】
本発明のイヌCD70モノクローナル抗体は、イヌのリンパ腫の検出、診断及びイヌのリンパ腫の治療の両方に用いることができるが、治療剤として用いる場合は、イヌの体内に投与した場合に免疫反応を惹起しないものが望ましい。このような抗体として、抗体の定常領域としてイヌの定常領域を含むキメラ抗体、定常領域と超可変領域を除く全ての可変領域をイヌの配列に置き換えたイヌ化抗体等が挙げられる。
【００３５】
本発明の抗イヌCD70モノクローナル抗体は、イヌのリンパ腫の診断に用いることができる。すなわち、本発明の抗イヌCD70モノクローナル抗体を用いてイヌのリンパ球表面に発現しているCD70を免疫学的に検出することによりイヌがリンパ腫に罹患しているか否かを診断することができる。イヌ被験体のリンパ球にCD70が発現している場合に、該イヌ被験体はリンパ腫に罹患していると判断することができる。リンパ球におけるイヌCD70の検出は、イヌ被験体の末梢血中のリンパ球表面のCD70抗原の発現の有無を検出すればよい。
【００３６】
リンパ球表面のCD70抗原の発現は、例えば、抗CD70抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、FACS又はフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。フローサイトメーターとしては例えばFACSAria(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。
【００３７】
これらの表面抗原が陰性とは、上記のようにFACSを用いて分析した場合に、陽性細胞としてソーティングされないこと、あるいはRT-PCRにより発現を調べた場合に、発現が認められないことをいい、これらの手法により検出できない程度発現していたとしても、本発明においては陰性とする。また、上記マーカーが陽性であることが公知の細胞と同時に測定を行い、これらの陽性細胞と比較して、ほとんど検出されないか、あるいは有意に発現量が低い場合に陰性としてもよい。
【００３８】
この際、あらかじめ健常イヌ個体から採取したリンパ球のCD70の発現レベルを測定しておき、測定値からカットオフ値を定め、イヌ被験体のリンパ球のCD70の発現レベルをカットオフ値と比較して診断することもできる。
【００３９】
本発明は、イヌ血液中のリンパ球のイヌCD70の検出を可能にするキットの提供をも目的とするが、該キットは少なくとも抗イヌCD70モノクローナル抗体を含む。
【００４０】
本発明の検出方法が対象とする、イヌリンパ腫には、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、ろ胞性リンパ腫等が含まれる。
本発明の抗CD70モノクローナル抗体をイヌリンパ腫の治療に用いることも可能である。
【００４１】
本発明の抗体を含む製剤の投与形態は限定されず、経口、非経口、経粘膜（例えば舌下又は口腔投与）、局所、経皮、直腸、吸入（例えば鼻又は肺奥吸入）等により投与することができる。非経口投与として、静脈内、皮下、筋肉内注射等が挙げられる。局所又は経皮製剤は粉末、エマルジョン、懸濁液、スプレー、クリーム、軟膏、ローション及びペースト等の形態で用いられ、又は薬用膏薬、パッチ又は膜の形で用いられる。治療に用いるに必要な本発明の抗体の量は、治療する病状の性質、被験体の年齢と状態で変わり、最終的には担当獣医が決めることができる。例えば、抗体を１日あたり0.05〜２mgの抗体を投与すればよい。所定の投与量は１回の投与で与えてもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与の適当な間隔で与えてもよい。
【００４２】
本発明は、抗イヌCD70モノクローナル抗体を有効成分として含む、イヌのリンパ腫治療剤も包含し、さらに、抗イヌCD70モノクローナル抗体をイヌに投与することを含むイヌのリンパ腫の治療法も包含する。さらにイヌCD70を分子標的とした治療剤も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
イヌのリンパ腫の治療において、CD70発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように腫瘍細胞と抗CD70抗体を接触させればよい。
【実施例】
【００４４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４５】
実施例１  イヌリンパ腫におけるCD70の発現解析
山口大学動物医療センターに来院したイヌのT細胞型リンパ腫3症例より腫瘍細胞を採取し、用いるまで-80℃で保存した。一方コントロールとして、健常ビーグル3頭よりそれぞれ末梢血液を採取し、末梢血単核球を分離後、抗イヌCD3抗体（AbD Serotec社）を用いた磁気ビーズ法によりT細胞を分離し、正常Tリンパ球とした。それぞれのサンプルよりTRI Reagent(Molecular Research Center社)を用いてトータルRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイをMiltenyi社に依頼し、腫瘍細胞と正常細胞において発現量に差のある遺伝子群を同定した。その中で同定された遺伝子イヌCD70についてreal time PCR（Superscript IIIおよびQunatiTect SYBR Green PCR Kit）を用いてさらに遺伝子発現を検討した。
【００４６】
cDNAマイクロアレイの結果、発現上昇が認められた遺伝子中の中から選択したCD70のイヌのリンパ腫における発現量をRealtime PCRによって検討した。10種類のイヌのリンパ腫腫瘍細胞株（GL-1, CL-1, Ema, UL-1, Nody-1, CLBL-1. CLGL90, 17-71, CLL1390, 3132）及び38例のイヌのリンパ腫由来症例においては、健常イヌ由来無刺激リンパ球、刺激Tリンパ球及び刺激Bリンパ球と比較してCD70の発現上昇が認められるサンプルが存在した。一方で、健常イヌ由来無刺激リンパ球、刺激Tリンパ球及び刺激Bリンパ球とリンパ腫腫瘍細胞株及びリンパ腫由来症例のCD70遺伝子発現量の比較を行ったところ、有意差を認めなかった（図１）。
【００４７】
実施例２  イヌCD70のCD70分子の遺伝子クローニング及び塩基配列の決定
健常イヌより採取した肺及びConA活性化リンパ球より抽出したRNAを用いてsuperscript III cDNA合成キットを用いて作製したcDNAを鋳型に、YTM946（ggagggctgacgtttcatc（配列番号５））及びYTM947（aagagaaaaacacattctcccaat（配列番号６））、YTM1277（agctcccctgagtgagaacc（配列番号７））及びYTM1278（tgggatagaggctgaggttt（配列番号８））をプライマーとして用いて、KOD Plus neo によってイヌCD70分子及びイヌCD27分子の遺伝子クローニングを行ない、塩基配列を決定した（図２）。
【００４８】
実施例３  イヌCD70分子をラット腎臓細胞株NRKに過剰発現させた細胞株（NRK/cCD70）の作製及び抗イヌCD70モノクローナル抗体の作製
イヌのCD70分子をpMx-IPベクター（東京大学医科学研究所北村俊雄博士より分与）に組み込み、PLAT-gp細胞（東京大学医科学研究所北村俊雄博士より分与）にpCVSVGとともに遺伝子導入したあと産生されたレトロウイルスを用いて、ラット腎臓細胞株NRKに感染させることにより、イヌCD70過剰発現細胞(NRK/cCD70)を得た。NRK/cCD70をSDラットに免疫することにより、イヌCD70に対するラットモノクローナル抗体(4F2-12)を作製した。これら抗体をprotein Aカラムで精製後、ラットIgG2a, kappa鎖であることを確認した。またNRK/cCD70細胞と各種濃度に希釈した4F12-E6抗体をインキュベートし、さらに二次抗体を反応させ、その後フローサイトメトリー（Becton Dickinson社、BD Accuri）により蛍光強度を測定することにより、濃度依存的にNRK/cCD70に結合することを確認した（図３）。
【００４９】
実施例４  イヌCD70リガンド(CD27)とヒトIg Fc領域との融合蛋白 cCD27-hIgの作製
CD70のリガンドであるイヌCD27の細胞外領域をPCRによって増幅し、pFUSE-hIgF2-Fc (Invivogen社)ベクターに組み込み、それをHEK293T細胞にトランスフェクとし、培養上清を回収した。さらに、それら培養上清より、Protein Aビーズを用いて、ヒトIgG2のFc領域の融合蛋白cCD27-hIgを作製した。これら融合蛋白を用いて、実施例3と同様にして、NRK/cCD70との結合を確認した。その結果、cCD27-hIgは濃度依存的にNRK/cCD70に結合することが確認できた（図４Ａ）。
【００５０】
実施例５  抗イヌCD70モノクローナル抗体(4F2-12)の性質の検定
さらに実施例３で得られた抗イヌCD70抗体 (4F2-12)がcCD27-hIgとNRK/cCD70の結合を阻害できるかを、実施例3と同様にして検討した。すなわちNRK/cCD70に4F2-12を1-10μg/mlで反応させ、そのあとcCD27-hIgを100μg/mlで反応させたところ、4F2-12の濃度にかかわらず、cCD27-hIgはNRK/cCD70に結合可能であることが明らかとなった。この結果より、4F2-12抗体は、イヌCD70とイヌCD27の結合阻害効果は認められなかった（図４Ｂ）。
【００５１】
実施例６  抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の塩基配列の決定
実施例３において得られた各抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の塩基配列を決定した。塩基配列は以下の方法で決定した。
【００５２】
抗イヌCD70モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからSV total RNA isolation (promega)を用いてtotal RNAを抽出し、これを鋳型としてSMARTerlM RACE cDNA Ampllittion Kit(TaKaRa)とラット抗体(IgG)定常領域に特異的なプライマーを用いて逆転写反応を実施した。
【００５３】
得られたcDNAを鋳型としてPrimeSTAR GXL DNA polymerase(TaKaRa)とラットIgG定常領域に特異的なプライマーを使用してRACE PCRを実施した。得られたPCR産物をpGEM easy T-vector(Promega)にクローニングした後、ランダムにピックアップしたクローンについて遺伝子配列の解析を実施した。
【００５４】
逆転写には、以下に記すH-RT1およびL-RT1をプライマーとして使用した。
PCRにはH-PCR-N1、H-PCR-N2およびL-PCRをプライマーとして使用した。
表１にプライマーの配列を示す。
【００５５】
【表１】
2017141172.tif 000002
【００５６】
抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ、配列番号１及び３に示し、それぞれの推定アミノ酸配列を配列番号２及び４に示す。
【００５７】
実施例７  抗CD70抗体を用いてフローサイトメトリーによりイヌのリンパ腫症例より採取した腫瘍細胞におけるCD70の発現解析
イヌリンパ腫腫瘍細胞株9例（T細胞型 Ema, Nody-1, CLC, UL-1, CLGL90, CLK; B細胞型 CLBL-1, GL-1, 17-71）、イヌリンパ腫症例2例(B細胞型)、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）症例1例より採取した腫瘍細胞を用いてフローサイトメトリー（Becton Dickinson社、BD Accuri）によりイヌCD70の発現を検討したところ、腫瘍細胞株では5例において（図５Ａ）、症例では3例全てにおいて（図５Ｂ）イヌCD70の発現が検出された。
【００５８】
実施例８  抗CD70抗体を用いてフローサイトメトリーによりイヌの末梢血リンパ球におけるCD70の発現解析
健常ビーグル4頭の末梢血より分離したリンパ球、さらにそれをConA刺激（5μg/ml）又はLPS (5μg/ml)及びCD40リガンドで2日間刺激した細胞を用いてフローサイトメトリー（Becton Dickinson社、BD Accuri）によりイヌCD70の発現を検討したところ、いずれの細胞においてもイヌCD70の発現は検出されなかった（図６）。
【００５９】
実施例９  抗CD70抗体を用いて、健常イヌの各種臓器におけるCD70の発現解析
イヌリンパ腫症例より29例より採取した腫瘍組織を用いて免疫染色を行ったところ、12例においてイヌCD70の発現が検出された。図７に典型的な免疫染色像を示す。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の抗イヌCD70抗体をイヌリンパ腫の診断及び治療に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号５〜１３  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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