(57)【要約】      （修正有）【課題】植物の疫病防除のための農薬コストの高い、卵菌類、特に疫病菌及びピシウム菌の感染防御に有効な卵菌類防除剤の提供。【解決手段】例えば、下式で例示される化合物、δ−ルブロマイシン、プルプロマイシン、ヘリキノマイシン、グリセオロジンＡ、グリセオロジンＣ、グリセオロジンＧ、８−メトキシグリセオロジンから選ばれる１又は２種以上の化合物を含む卵菌類防除剤。2017141174.tif 000009（Ｒ１〜Ｒ３は夫々Ｈ又はＯＨ；Ｒ４はＣＯＯＭｅ又はＭｅ）【選択図】図５
2017141174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式１で示される化合物又は次の化学式２で示される化合物のうち少なくとも１種の化合物を含む卵菌類防除剤。但し、式１及び式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれＨ又はＯＨの何れかであり、Ｒ４はＣＯＯＭｅ又はＭｅである。
【化１】
2017141174.tif 000005
【化２】
2017141174.tif 000006
【請求項２】
β−ルブロマイシン、γ−ルブロマイシン、３´−ヒドロキシ−β−ルブロマイシン、δ−ルブロマイシン、プルプロマイシン、ヘリキノマイシン、グリセオロジンＡ、グリセオロジンＣ，グリセオロジンＧ、８−メトキシグリセオロジンからなる群から選ばれる１又は２種以上の化合物を含む卵菌類防除剤。
【請求項３】
β−ルブロマイシン、γ−ルブロマイシン、３´−ヒドロキシ−β−ルブロマイシン、δ−ルブロマイシン、プルプロマイシン、ヘリキノマイシン、グリセオロジンＡ、グリセオロジンＣ、グリセオロジンＧ、８−メトキシグリセオロジンからなる群から選ばれる化合物の生産菌を１又は２種以上含む卵菌類防除剤。
【請求項４】
前記卵菌類は、疫病菌又はピシウム菌である請求項１〜３の何れか１項に記載の卵菌類防除剤。
【請求項５】
次の化学式１で示される化合物又は次の化学式２で示される化合物のうち少なくとも１種の化合物を植物に施用して、卵菌類を防除する方法。但し、式１及び式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれＨ又はＯＨの何れかであり、Ｒ４はＣＯＯＭｅ又はＭｅである。
【化１】
2017141174.tif 000007
【化２】
2017141174.tif 000008
【請求項６】
β−ルブロマイシン、γ−ルブロマイシン、３´−ヒドロキシ−β−ルブロマイシン、δ−ルブロマイシン、プルプロマイシン、ヘリキノマイシン、グリセオロジンＡ、グリセオロジンＣ、グリセオロジンＧ、８−メトキシグリセオロジンからなる群から選ばれる１又は２種以上の化合物を植物に施用して、卵菌類を防除する方法。
【請求項７】
前記卵菌類は、疫病菌又はピシウム菌である請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵菌類防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス，細菌，真菌，卵菌など様々な生物が植物に感染して病気を引き起こす。この植物病を防除するために使われる農薬のうち、原因菌が特定されている植物病に対して世界で使用されている農薬の量を金額ベースで比較すると、卵菌（Phytophthora）による疫病防除のための農薬のコストが最も高い。
【０００３】
卵菌類（Phytophthora属, Pythium属）には３００以上の種が存在する。それらが花卉、野菜、樹木など様々な植物に感染してLate blight disease（疫病）及びピシウム病を引き起こし、甚大な被害をもたらす。ジャガイモやトマトの疫病菌（Phytophthora infestans）による被害に限定しても、被害額は巨額になり、今後も甚大な被害をもたらすと予想される。
【０００４】
これまでに、卵菌に対して防除作用を示す種々の化合物が提案されている（特許文献１や２など）。しかしながら、卵菌はクロミスタ界の不等毛類に属す原生生物の一種であり、形態が似ているカビが属する真菌類とは分類学的に大きく異なる微生物である。そのために卵菌が引き起こす疫病を防除するには、抗生物質・抗真菌剤の一種であるカスガマイシンなどを用いて卵菌の宿主植物への感染をコントロールすることは難しい。また、シアゾファミド、フルアジナム、クロロタニロル、マンネブやマネブ・ジネブ（マンゼブ）、キャプタン、メタラキシルなどの薬剤が卵菌によって引き起こされる病気の防除に使用されてきたが、一定期間同じ薬剤を使い続けると薬剤耐性を獲得した病原菌が出現する。この形質は卵菌の有性世代を通して瞬く間に種間に伝播することが卵菌類による植物病の防除を困難にしている。
【０００５】
また、P. infestansの無性世代で形成される遊走子嚢は、15℃以上の環境では直接菌糸を伸長し、再度遊走子嚢を形成する。この生活環では植物感染力が弱い。しかしながら、15℃以下の場合、P. infestansの遊走子嚢が雨や夜露に濡れると一つの遊走子嚢から平均８個の遊走子が放出される。放出された遊走子が走化的に植物側に泳いでいき、植物上でシストを形成する。シストから再度菌糸を伸長した先に植物感染に重要な役割を担う付着器を形成後、宿主植物に感染する。従って疫病の発症と蔓延は、主に低温に応答した生活環により起きる。これまでに、P. infestansの遊走子嚢分化において分化段階特異的に阻害する化合物の報告例はない。一方、Pythium aphanidermatum（Py. aphanidermatum：以下、便宜上PythiumをPy. と略す。）の遊走子は、球のうを介して放出されること、及び温度に依存していないことが、P. infestansとの違いである。また、Py. aphanidermatumの植物への感染は、主に有性世代で形成される卵胞子を介すこと、及び２５℃付近の比較的温暖な条件で起きる。従って、P. infestansの遊走子嚢分化において分化段階特異的に阻害する化合物が、好適な生活環が異なるPy. aphanidermatumにも作用することは期待できなかった。
【０００６】
β−ルブロマイシンやγ−ルブロマイシンがヒトのテロメラーゼ阻害活性やヒト免疫不全ウイルス−１逆転写酵素阻害活性を有し、抗菌作用や抗腫瘍作用を奏することは公知であるが、P. infestansやPy. aphanidermatumなどの卵菌類に対して防除作用を示すことは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−０１７１１３号公報
【特許文献２】特開２００７−２９７３５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、卵菌類防除剤、具体的には疫病菌やピシウム菌の感染防御に有効な卵菌類防除剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る卵菌類防除剤は、下記の化学式１（化１）で示される化合物又は化学式２（化２）で示される化合物のうち少なくとも１の化合物を含む。但し、化学式１及び化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれＨ又はＯＨの何れかであり、Ｒ４はＣＯＯＭｅ又はＭｅである。また、これらの化合物と共に、あるいはこれらの化合物を含まずに、当該卵菌類防除剤はδ−ルブロマイシン、ヘリキノマイシン、グリセオロジンＡ、８−メトキシグリセオロジンの少なくとも１の化合物を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る卵菌類防除剤は、遊走子嚢発芽後の植物感染、シストからの発芽、及び卵胞子発芽後の植物感染を抑えることで疫病やピシウム病を防除する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は低温下におけるβ−ルブロマイシンの存在下でのシスト発芽抑制効果（遊走子嚢とβ−ルブロマイシンを接触）を示す図である。
【図２】図２は低温下におけるβ−ルブロマイシンの存在下でのシスト発芽抑制効果（シストとβ−ルブロマイシンを接触）を示す図である。
【図３】図３は低温下におけるγ−ルブロマイシンの存在下でのシスト発芽抑制効果（遊走子嚢とγ−ルブロマイシンを接触）を示す図である。
【図４】図４は高温下におけるβ−ルブロマイシンの存在下での遊走子嚢発芽抑制効果（遊走子嚢とβ−ルブロマイシンを接触）を示す図である。
【図５】図５はトマト葉に対する疫病感染防除作用（低温条件でシストが形成された場合の感染）を示す画像である。（ａ）は対照を、（ｂ）は薬剤非存在下における感染状態を、（ｃ）は２μＭのβ−ルブロマイシン存在下による感染状態を、（ｄ）は９μＭのβ−ルブロマイシン存在下による感染状態を示す
【図６】図６はトマト葉に対する疫病感染防除作用（図５の９日経過後）を示す画像である。（ａ）は薬剤非存在下における感染状態を、（ｂ）は２μＭのβ−ルブロマイシン存在下による感染状態を、（ｃ）は９μＭのβ−ルブロマイシン存在下による感染状態を示す。（ａ）（ｂ）（ｃ）の下段はそれぞれ感染部位のプレパラート画像である。
【図７】図７はトマト葉に対する疫病感染防除作用（高温条件において遊走子嚢から菌糸伸長した場合の感染）を示す画像である。（ａ）は対照を、（ｂ）は薬剤非存在下における感染状態を、（ｂ）は２μＭのβ−ルブロマイシン存在下による感染状態を、（ｂ）（ｃ）の下段はそれぞれ感染部位のプレパラート画像である。矢印は感染部位を示す。
【図８】図８はピシウム菌の卵胞子からの菌糸伸長防止作用を示す顕微鏡画像である。（ａ）は薬剤非存在下における卵胞子から菌糸が伸長した状態を、（ｂ）は２μＭのβ−ルブロマイシン存在下で卵胞子からの菌糸伸長が阻害された状態を示す。
【図９】図９は白菜の葉に対するピシウム菌感染防除作用を示す画像である。（ａ）は薬剤非存在下における感染状態を、（ｂ）は２μＭのβ−ルブロマイシン存在下における感染状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る卵菌類防除剤は、次の化学式１に記載の化合物又は次の化学式２で示される化合物の少なくとも１種の化合物を含む（但し、化学式１及び化学式２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれＨ又はＯＨの何れかであり、Ｒ４はＣＯＯＭｅ又はＭｅである。）。
【００１３】
【化１】
2017141174.tif 000003
【００１４】
【化２】
2017141174.tif 000004
【００１５】
具体的には化学式１においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＣＯＯＭｅであるβ−ルブロマイシン、化学式１においてＲ１がＯＨであり、Ｒ２、Ｒ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＣＯＯＭｅである３´−ヒドロキシ−β−ルブロマイシン、化学式２においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＣＯＯＭｅであるγ−ルブロマイシン、化学式２においてＲ１、Ｒ２がそれぞれＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＣＯＯＭｅであるプルプロマイシン、Ｒ１、Ｒ２がぞれぞれＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＭｅであるグリセオロジンＣ、Ｒ１、Ｒ２がそれぞれＯＨであり、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＭｅであるグリセオロジンＧが例示される。また、ここに例示した化学式１や化学式２で示される化合物以外にも、化学式２においてＲ１が糖であり、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯＯＭｅであるヘリキノマイシン、化学式２においてＲ１がＨ、Ｒ４がＭｅであり、Ｒ２、Ｒ３がオキシラン構造となったグリセオロジンＡ、Ｒ１、Ｒ２がそれぞれＯＨであり、Ｒ３がＯＭｅであり、Ｒ４がＭｅである８−メトキシグリセオロジンＣも、それぞれ単独で、あるいは化学式１や化学式２に示された化合物と共に使用され得る。ここに例示された化合物は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属や、アクチノプラネス（Actinoplanes）属等の微生物により生産され得る他、化学合成によっても取得され得る（例えば、Darcy J. Atkinson et al., Nat. Prod. Rep., 2015, 811-40参照）。
【００１６】
本発明に係る卵菌類防除剤は疫病及びピシウム病に有効である。疫病は疫病菌（Phytophthora属の微生物）)によってもたらせられる植物病である。疫病菌は、例えば、Phytophthora infestansであり、P. cactorumであり、P. capsiciであり、P. cinnamomiであり、P. citricolaであり、P. citrophthoraであり、P. cryptogeaであり、P. drechsleriであり、P. medicaginisであり、P. megaspermaであり、P. nicotianae(P. parasitica)であり、P. palmivoraであり、P. porriであり、P. ramorumであり、P. sojaeであり、P. syringaeであり得る。また、ピシウム病は、ピシウム病菌(Pythium属の微生物)によってもたらせられる植物病である。ピシウム病菌は、例えば、Py. aphanidermatumであり、Py. apleroticumであり、Py. dissotocumであり、Py. helicoidesであり、Py. myriotylumであり、Py. paroecandrumであり、Py. ultimumであり、Py. vexansであり得る。この中でも、ジャガイモやトマトを宿主とするP. infestansが好適な対象である。
【００１７】
本発明では上記の化合物がそのまま卵菌類防除剤として使用されるのみならず、上記化合物を含む疫病及び／又はピシウム病の防除用の組成物としても使用され得る。当該組成物は有効量の化合物の他、に農園芸用農薬の製剤化に必要とされる担体（ベントナイト、タルク、炭酸カルシウム、乳糖、ショ糖など）や溶媒（水やエタノールなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）や安定剤、乳化剤、結合剤などの各種補助剤を含み得る。さらに、必要に応じて、植物生長調整剤や疫病菌以外の植物病用薬剤、例えば、ストロビルリン系化合物やカーバメート系化合物、銅系化合物、抗生物質、有機塩素系化合物などの殺菌剤や防黴剤を含み得る。組成物における化合物の含有量は当業者によって任意に設定され得る。その剤形や使用方法などによっても異なるが、概ねその含有量は組成物中０.０００１〜９９.９９９％であり、好ましくは０.００１〜５０％である。
【００１８】
本発明に係る卵菌類防除剤は植物や土壌に対して施用される。施用される方法は一般的な農薬の施用方法と同じであり、感染している植物に散布することのみならず、感染している植物周辺の土壌に散布することでよい。また、感染が予想される植物や栽培地に散布することでもよく、種子と接触させることでもよい。本発明に係る卵菌類防除剤は、P. infestans遊走子から形成されるシストの発芽を抑制することから、シストが形成され得る環境下、具体的には２０℃、好ましくは１５℃以下の環境（生活環）における疫病防除に特に効果が期待される。加えて、シストの発芽が形成されにくいとされる２０℃程度よりも高い温度環境においても疫病防除作用を発揮するだけでなく、Py. aphanidermatum の２５℃における卵胞子発芽および宿主への感染を阻害することから、温暖な環境下でおきる疫病およびピシウム病の防除にも高い効果が期待される。 従って、本発明に係る卵菌類防除剤は、種々の宿主に対して異なる温度環境で引き起こされる卵菌類による植物病の防除に広く用いられ得る。
【００１９】
植物は上記の疫病菌やピシウム病が感染し得る植物であれば特に限定されない。疫病菌であれば例えばジャガイモやトマトなどのナス科の植物であり、キュウリやカボチャなどのウリ科の植物であり、エンドウや大豆などのマメ科植物であり、ネギ類であり、ミカン科やブドウ科などの果樹であり得る。特にP. infestansの感染による被害が大きいとされるジャガイモやトマトが好ましい対象である。また、ピシウム菌であれば、ナス科の植物であり、ウリ科植物であり、白菜や大根などのアブラナ科の植物であり、その他ホウレンソウやミツバなどの葉根菜類の植物である。
【００２０】
卵菌類防除剤の使用量も適宜当業者によって決定され得る。対象となる植物の種類や感染状況などによっても異なるが、例えば植物に直接散布する場合には０.０１ｎＭ〜１Ｍ、好ましくは０.１ｎＭ〜０.１Ｍ程度の溶液が使用され得る。
【００２１】
次に下記実施例に基づき説明するが、本発明は下記実施例に限定されることがないのはいうまでもない。
【実施例１】
【００２２】
〔遊走子嚢分化阻害実験〕
ジャガイモ及びトマトに特異的に感染する分離株であるP. infestans 1306株の遊走子嚢をRye寒天培地に塗布し、18℃で7日から12日間培養してP. infestansが十分に生育したプレートに10℃に保った滅菌水を10mL加え、スプレッダーを用いて遊走子嚢(sporangia)を掻き取った。遊走子嚢を3×103〜5×105個/ml含むように調製した遊走子嚢懸濁液を98μLずつ96wellプレートに分注してサンプルを調製した。なお、Rye培地及びRye寒天培地はそれぞれ次の方法に従って調製した。ライ麦60gを約500mlの蒸留水に約24時間浸漬後、ミキサーで20秒間粉砕したものをオートクレーブ(121℃、30min)により加熱処理した。処理したライ麦を温かいうちにざるで濾過し、濾液にスクロース20gを加えた。適量の蒸留水を加えて全量を1Lにメスアップし、Rye培地を調製した。Rye寒天培地は、1.5％(w/v)の寒天を加えてオートクレーブ(121℃、15min)にて滅菌した後、60℃にて保温後50mg/LのAmpicillinと4ml/LのNystatin(10,000unit/ml)を加え、シャーレに分注して作製した。沈殿物を除いたClarified ryeは、Rye培地を10,000gで10分間遠心した後、得られた上清をClarified rye培地とした。
【００２３】
（低温における発芽抑制）
低温における遊走子嚢分化の観察は次のように行った。まず、10℃で1時間半静置し、80％以上の遊走子嚢が遊走子を放出しているサンプル（遊走子嚢懸濁液）に、終濃度2mMの硝酸カルシウムを添加してシスト形成を促進した。18℃にて30分間静置後に各サンプルの1/40倍量のClarified ryeを添加して発芽を促進し、６時間後の形態変化を顕微鏡下で観察した。サンプルには溶媒(Dimethyl sulfoxide：DMSO)のみ或いは、DMSOに溶解して2μM〜1nMまで段階的に希釈したβ−ルブロマイシン(β-rubromycin：LKT Laboratories社)又はγ−ルブロマイシン(γ-rubromycin：Abcam社)をそれぞれ2μLずつ添加した。シスト発芽率は、総シスト数に占める発芽したシスト数から算出し、各化合物で処理したサンプルにおけるシスト発芽率から各化合物の50％阻害濃度(IC50)を求めた。
【００２４】
また、サンプル（遊走子嚢懸濁液）に、溶媒のみ或いは、DMSOに溶解して2μM〜1nMまで段階的に希釈したβ−ルブロマイシン(β-rubromycin：LKT Laboratories社)をそれぞれ2μLずつ添加した。その後、10℃で1時間半静置し、終濃度2mMの硝酸カルシウムを添加してシスト形成を促進した。18℃にて30分間静置後に各サンプルの1/40倍量のClarified ryeを添加して発芽を促進し、６時間後の形態変化を顕微鏡下で観察した。
【００２５】
（高温における発芽抑制）
高温における遊走子嚢分化は、サンプル（遊走子嚢懸濁液）に濃度2μM〜1nMまで段階的に希釈したβ−ルブロマイシンをそれぞれ2μLずつ添加して25℃にて６時間静置後、形態変化を顕微鏡下で観察した。遊走子嚢からの直接発芽率は、総遊走子嚢にしめる発芽した遊走子嚢数から導出した。
【００２６】
（実験結果）
低温における実験結果を図１〜図３に示した。なお、各グラフには，DMSOのみを添加した条件下でのシスト発芽率を100％とし、各条件下での相対的なシスト発芽率を示した。これらの結果から、β−ルブロマイシン及びγ−ルブロマイシンは、１５℃程度のシスト形成環境では、これらの化合物とシストを接触させること（図２参照）でも、また遊走子嚢と接触させること（図１及び図３参照）でも発芽が抑制され、シストからの分化が抑制されることが観察された。また、これらの化合物はシスト形成を抑制することがなく、シストからの分化（発芽）を特異的に抑制することが示された。
高温における試験結果を図４に示した。なお、グラフには，DMSOのみを添加した条件下での直接発芽率を100％とし、各条件下での相対的なシスト発芽率を示した。２５℃程度の高温環境では、遊走子嚢から遊走子が放出されることなく、遊走子嚢からの発芽を抑制することはなかった。
【実施例２】
【００２７】
〔感染実験〕
（低温における感染実験）
上述の遊走子嚢分化阻害実験と同様にして、サンプル（遊走子嚢懸濁液）を調製した。調製した3×103〜5×103 個/mLの遊走子嚢懸濁液98μLに対し、DMSOに溶解したβ−ルブロマイシンを結果に示した濃度となるように添加し、この混合溶液を1.5％寒天プレート上に置いたトマトの葉一枚当たり3か所に10μLずつ接種した。1時間半10℃で静置し、その後18℃で数日間静置培養して経日的に顕微鏡下で観察した。感染実験を行った後のトマトの葉を1×1cm2にカットしてファルコンチューブに入れ、4mLのSolution A(acetic acid：ethanol=1：3(v/v))を加えて室温にて一晩30rpmで振盪した。Solution Aを捨て、Solution B(acetic acid：ethanol：glycerol=1：5：1(v/v/v))の4mlを加えて、3時間30rpmで振盪した。Solution Bを捨て、staining solution(0.01％ trypan blue in lactophenol solution(lactic acid:phenol：dH2O=1:1:1(v/v/v)))を4ml加え、30rpmで一晩振盪した。staining solutionを取り除き、60％ glycerolですすぎ、30rpmで2時間振盪した。溶液中から葉を取り出し、プレパラートを作成して顕微鏡下で観察した。感染後の葉の経過状況を図５に、感染９日後の顕微鏡下における観察画像を図６に示した。
【００２８】
（高温における感染実験）
低温における感染実験と同様にして、終濃度が2μMとなるようにβ−ルブロマイシン添加した遊走子嚢混合溶液をトマトの葉に摂取し、その後25℃で９日間静置培養した後、低温における感染実験と同様にしてプレパラートを作成して顕微鏡下で観察した。その結果を図７に示した。
【００２９】
（実験結果）
１０℃の低温においてβ−ルブロマイシンを接触させなかった場合には１週間程度で葉全体に菌糸が広がった（図５参照）が、β−ルブロマイシンを接触させた場合には菌糸が観察されず感染が抑制された（同図参照）。また、感染した葉では多数の遊走子嚢が形成され、菌糸も多数観察されたが、β−ルブロマイシンを接触させた場合には、遊走子嚢は観察されず、わずかの菌糸(Hyphae)が観察されたのみであった（図６参照）。また、２５℃の高温においてもβ−ルブロマイシンを接触させた場合には、遊走子嚢は観察されず、わずかの菌糸(Hyphae)が観察されたのみであった（図７参照）。
【００３０】
これらの実験から、β−ルブロマイシンは、１０℃といった低温ではシストからの発芽を抑制し、２５℃といった高温では明確に発芽の抑制をするとは言えないもの、１０℃という低温環境、２５℃という高温環境のいずれにおいても形態変化を伴う卵菌による感染が防除された。
【実施例３】
【００３１】
〔ピシウム菌卵胞子発芽阻害実験〕
（卵胞子懸濁液の調製）
Pythium aphanidermatum T1株を下記方法で調整したV8培地8mlが入ったシャーレに植菌し、20〜25℃、暗所で5日間静置培養した。菌体をミキサーカップに入れた後、50mlの滅菌水で3回洗浄後、50mlの滅菌水を加えて破砕した(10,000rpm、2min)。懸濁液を100μmのメッシュに通し、菌糸を取り除いた。卵胞子が1×103 個/mlとなるように滅菌水で調整し、卵胞子懸濁液を調製した。
V8培地は、V8 juice（Cambell Soup Company）1缶200mlに3gのCaCO3を加えてよく振り混ぜた。3,000rpm、10min.で遠心後、得られた上清100mlを全量が2Lとなるように調製し、5％ V8mediaとした。5% V8寒天培地には、2％の寒天を加えてオートクレーブ(121℃、15min.)にて滅菌し、シャーレに分注した。
【００３２】
（発芽阻害実験）
96wellプレートの各ウェルにPy. aphanidermatum T1株の卵胞子懸濁液を178μlずつ入れ、dimethyl sulfoxide(DMSO)に溶解したβ−ルブロマイシンを終濃度2μMとなるように2μl添加した。V8培地を20μl加え、実験を開始した。30分後、Ca(NO3)2を終濃度2.5mMとなるように加えた。暗所、20〜25℃でインキュベートし、24時間後の様子を顕微鏡下で観察した。その結果を図８に示した。
【００３３】
〔感染実験〕
上記で調製した1×103 個/mlの卵胞子懸濁液198μlに対し、2μlのDMSO、又はDMSOに溶解したβ−ルブロマイシンを終濃度2μMとなるように2μl添加し、混合溶液とした。白菜の葉の主脈にカッターナイフで傷をつけ、各混合溶液を10μlずつ接種した。湿らせたキムタオル（商品名）上に置いた葉を密閉容器に入れ，35℃で4日間静置し、葉の様子を観察した。その結果を図９に示した。
（実験結果）
図８及び図９から理解されるように、β-ルブロマイシンはピシウム菌の卵胞子からの発芽を抑制し、ピシウム菌による感染を防除することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によると、新たな卵菌類防除剤が提供され、疫病やピシウム病の感染や拡散が予防される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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