(57)【要約】【課題】バイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型として１．１ｋｂ以上、特に１．５ｋｂ以上、の長いターゲット領域を増幅することができる核酸増幅用組成物を提供すること。【解決手段】バイサルファイト処理ＤＮＡを鋳型として１．１ｋｂ以上、特に１．５ｋｂ以上のターゲット領域を特異的に増幅させることができるように改変された変異型のＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行うものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイサルファイト処理されたＤＮＡを鋳型として、１．１ｋｂ以上のターゲット領域を特異的に増幅することができることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
ターゲット領域が１．５ｋｂ以上である請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属又はパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である請求項１又は２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第７番目、第３６番目及び第９３番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸に置換されている請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、緩衝剤及び基質を含むことを特徴とするＰＣＲ組成物。
【請求項６】
抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体をさらに含む請求項５に記載のＰＣＲ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、バイサルファイト処理したＤＮＡの核酸増幅に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡの配列変化によらない遺伝子発現を制御・伝達するエピジェネティクス分野が注目を集めている。
【０００３】
エピジェネティクス分野の中でも、特にＤＮＡのメチル化は、近年、遺伝子発現の制御機構として、発生／分化や疾患などの様々な現象に大きく関わってことが知られてきており、エピジェネティクス研究において極めて重要な役割を果たしている。従来のキャピラリーシーケンサーによる解析だけでなく、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を使用した、より長いターゲット領域を解析することが行われつつある。
【０００４】
ＤＮＡのメチル化を判断する方法として、バイサルファイト法が汎用的に使用されている。バイサルファイト処理は重亜硫酸ナトリウムを用いて、シトシンの脱アミノとそれに続くウラシルへの変換反応を行う処理である。メチル化されたシトシンではこの変換反応が起こらないため、バイサル処理された核酸をＰＣＲなどで増幅後、シーケンスを確認することできる。これにより、ＤＮＡがメチル化されているかどうかを判断することができる。
【０００５】
バイサルファイト処理ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、５００ｂｐ以下の短いターゲット領域でＰＣＲが行われている（非特許文献１）。これはバイサルファイト処理の影響でＤＮＡが断片化され、損傷を受けずに変換されたＤＮＡがわずかであり、５００ｂｐ以上の長いターゲット領域が増幅しにくいからである。
【０００６】
バイサルファイト処理したＤＮＡに対するプライマー設計は、シトシンがウラシルに変わることおよびＣｐＧを避けることを考慮しなくてはならないため困難であることが多い。加えて、プライマー設計できる領域が５００ｂｐ以下で狭いと、よりいっそう設計が難しくなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１（２００５年発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、バイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型として１．１ｋｂ以上、特に１．５ｋｂ以上の長いターゲット領域を増幅することができる核酸増幅用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、改変したＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、従来では不可能であったバイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型として１．１ｋｂ以上、特に１．５ｋｂ以上のターゲット領域を増幅することができることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．バイサルファイト処理されたＤＮＡを鋳型として、１．１ｋｂ以上のターゲット領域を特異的に増幅することができることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
項２．ターゲット領域が１．５ｋｂ以上である項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
項３．サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属又はパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である項１又は２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
項４．配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第７番目、第３６番目及び第９３番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸に置換されている項１から３のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ。
項５．項１から４のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、緩衝剤及び基質を含むことを特徴とするＰＣＲ組成物。
項６．抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体をさらに含む項５に記載のＰＣＲ組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、バイサルファイト処理ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでの増幅長の範囲を、従来は増幅することが困難であった長鎖のＤＮＡにも拡張させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを評価した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、バイサルファイト処理ＤＮＡを鋳型として、１．１ｋｂ以上、好ましくは１．５ｋｂ以上のターゲット領域を特異的に増幅させるＤＮＡポリメラーゼおよびこれを用いるＰＣＲ組成物である。
【００１４】
本発明において、「ターゲット領域」とは、プライマーセットによって増幅される目的の核酸配列領域を意味するものである。
【００１５】
本発明におけるバイサルファイト処理されたＤＮＡとは、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供することにより得られる。当該処理により、非メチル化シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化され、さらに加水分解により脱アミノ化され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化により、ウラシルに変換される。これに対して、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理してもウラシルに変換されない。このため、ＣｐＧ含有ＤＮＡの塩基配列中のシトシンがメチル化されているか否かを、重亜硫酸塩処理により、ウラシルに変換されているかどうかで区別する。なお、市販の重亜硫酸塩処理用のキット（例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ製））を使用して、当該キットのマニュアルに準じて、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供することができる。
【００１６】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体であることが好ましい。本発明においてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼをいう。好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
【００１７】
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、前記ＤＮＡポリメラーゼに、３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域の改変、及び／又は、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いても良い。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。
【００１９】
具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第７番目、第３６番目及び第９３番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸に置換されている配列を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２０】
第７番目のチロシン残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインに置換されることが好ましい。第３６番目のプロリン残基は、ヒスチジン、リジン又はアルギニンに置換されることが好ましい。第９３番目のバリン残基は、リジン、ヒスヒジン又はアルギニンに置換されることが好ましい。
【００２１】
上述した改変型ＤＮＡポリメラーゼは、例えば国際公開第２０１４／０５１０３１号パンフレットに開示されている方法により得ることができるが、特に限定はされない。
【００２２】
本発明別の態様として、上記のようなＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ組成物が挙げられる。
【００２３】
本発明におけるＰＣＲ組成物のその他の構成は特に限定されないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００２４】
本発明において、鋳型となる核酸はバイサルファイト処理されたＤＮＡである。
【００２５】
本発明のＰＣＲ組成物において使用する１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとは、増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであり、２種またはそれ以上のプライマーを使用することが好ましい。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、その伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能することができるように選択される。
【００２６】
１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体は、ＰＣＲ反応において基質として使用される。この基質として、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２７】
ＰＣＲ組成物には、さらに緩衝剤を含むことが好ましい。前記緩衝剤として、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝剤の濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。また、前記緩衝液中には、１〜５ｍＭの濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましく、１．５〜２．５ｍＭの濃度で含むことがより好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
【００２８】
さらに、ＰＣＲ組成物中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００２９】
本発明においては、一本鎖結合タンパク質、二本鎖結合タンパク質あるいはミスマッチ結合タンパク質の共存下、核酸増幅反応を行ってもよい。
【００３０】
さらには、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的な増幅の軽減に特に有効である。
【００３１】
＜ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法＞
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），
５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％
Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（
１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μ
ｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液
５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラ
スフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタ
ノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター
（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性
の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、
Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５
ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００３２】
＜バイサルファイト処理されたＤＮＡを用いたＰＣＲの評価方法＞
バイサルファイト処理されたＤＮＡに関して、Ｅｐｉｔｅｃｔ（商標登録）ｆａｓｔ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ製）１μｇをバイサルファイト処理する。鋳型ＤＮＡ１μｇを取扱説明書に準じて調製を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００にて定量を行う。
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、バイサルファイト処理したＤＮＡ５５ｎｇ、および１Ｕの改変型ＫＯＤ（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を含む５０μｌの反応液を調製する。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行う。
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認する。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例により、特に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１：ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の改変型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ（配列番号４の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の改変型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１１）（ｐＫＯＤ  Ｙ７Ａ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号５および６に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
【００３５】
実施例２：改変型ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）の作製
以下の工程により実施例１で得られた菌体の培養を行った。
まず、製造例１で得られたエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養した。次に、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。その後、当該ＴＢ培地に、上記で培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。
【００３６】
上記工程により培養した菌体から以下の工程により精製改変型ＤＮＡポリメラーゼを取得した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍｌの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
【００３７】
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が
高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００３８】
（試薬）
Ａ液：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ  塩化マグネシウ
ム、１５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ液：  １．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ  
Ｃ液：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）  
Ｄ液：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：  １ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００３９】
（方法）  
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加え
て攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷
却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液を
ガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタ
ノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカ
ード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性
の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込
む酵素量とした。
【００４０】
実施例３：ＤＮＡのバイサルファイト処理
以下のようにして、バイサルファイト処理されたＤＮＡの調製を行った。
Ｅｐｉｔｅｃｔ（商標登録）ｆａｓｔ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ製）１μｇをバイサルファイト処理した。鋳型ＤＮＡ１μｇを取扱説明書に準じて調製を行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００にて定量を行い、６７．８ｎｇ／μｌであった。
【００４１】
実施例４：バイサルファイト処理ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ
実施例１においてバイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型として、様々なバッファー組成で改変型ＫＯＤ（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）と既存のバイサルファイト処理ＤＮＡ用ＰＣＲ試薬との増幅量について比較を実施した。比較には１Ｕあたり１μｇの抗ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体と混合した改変型ＫＯＤ（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を使用した。
【００４２】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、バイサルファイト処理したＤＮＡ６７．８ｎｇ、および１Ｕの改変型ＫＯＤを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４３】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、バイサルファイト処理したＤＮＡ６７．８ｎｇ、および１Ｕの改変型ＫＯＤを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、１０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４４】
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＥｐｉＴａｑ  ＨＳ（ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＤＮＡ）（ＴａＫａＲａ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、バイサルファイト処理したＤＮＡ６７．８ｎｇ、および１．２５ＵのＴａＫａＲａ  ＥｐｉＴａｑ  ＨＳを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００４５】
結果を図１に示す。改変型ＫＯＤは他のＤＮＡポリメラーゼでは困難であった１．５ｋｂのターゲットの増幅も増幅することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、バイサルファイト処理ＤＮＡを増幅でき、バイサルファイトシーケンスの前処理に適している。さらに、本発明はこれまでにない長鎖のターゲット領域の増幅を可能にした。そのため、遺伝子診断等の分野において、広く利用することができる。
【図１】
2017093392.tif 000002
【配列表】
2017093392000001.app