(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の遺伝子導入や遺伝子改変といった分子生物学的手法を用いずに、多能性幹細胞を簡便に外胚葉へと分化誘導する方法を提供する。【解決手段】胚様体を外胚葉へと分化誘導する方法であって、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養することを含む、方法。前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来し、前記プラズマが低温大気圧プラズマであり、外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚様体を外胚葉へと分化誘導する方法であって、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラズマが低温大気圧プラズマである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養により前記胚葉体のＷｎｔシグナルを抑制し、これにより前記胚様体を外胚葉へと分化誘導する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
外胚葉へと分化誘導された胚様体の製造方法であって、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養することを含む、製造方法。
【請求項８】
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記プラズマが低温大気圧プラズマである、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記培養により前記胚葉体のＷｎｔシグナルを抑制し、これにより前記胚様体を外胚葉へと分化誘導する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
培地をプラズマ照射することを含む胚様体分化誘導用培地の製造方法であって、該培地が胚葉体を外胚葉へと分化誘導するために用いられる、胚様体分化誘導用培地の製造方法。
【請求項１４】
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、請求項１３に記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
【請求項１５】
前記プラズマ照射が低温大気圧プラズマである、請求項１３又は１４に記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
【請求項１６】
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
【請求項１７】
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚様体を外胚葉へと分化誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラズマの医療関連技術への応用研究が進められている。例えばプラズマ照射は、医療材料の表面を改質したり（表面処理技術）、細菌やウィルスを不活化したり（滅菌技術）するのに利用されている。また、プラズマはアレルギー性鼻炎患者の下鼻甲介粘膜焼灼術や、消化器外科手術にも適用されるようになってきた。さらに、プラズマの熱的作用とは異なる作用を医療技術に応用する試みも進められている。例えば低温大気圧プラズマ（気体の温度が室温に近い大気圧プラズマ）は、止血作用、血管新生作用、臓器癒着防止作用、細胞増殖作用等、様々な作用を示すことが報告され、プラズマ照射を傷や疾患の治療に応用することが期待されている。
【０００３】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）といった多能性幹細胞は、生体に存在する様々な細胞に分化する能力（分化多能性）を有した状態で長期にわたり継代培養可能な性質をもつ。したがって、細胞移植が有効な治療方法として期待される白血病、パーキンソン病等の治療への多能性幹細胞の適用が検討されている。
【０００４】
多能性幹細胞を用いた細胞移植療法においては、多能性幹細胞を目的とする細胞又はその前駆細胞に分化誘導した上で移植する必要がある。例えば、パーキンソン病の治療にあたっては、多能性幹細胞を神経細胞又はその前駆細胞（外胚様）へと分化誘導し、これを患者に移植することになる。これまで多能性幹細胞の分化誘導には、主に遺伝子導入や遺伝子改変といった分子生物学的手法が報告されている（例えば、非特許文献１）。しかしこれらの手法は、分化誘導処理が煩雑で熟練した技術を要し、また、分化誘導された細胞を生体に適用した際の安全性も懸念される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００９  Ｖｏｌ．４  Ｉｓｓｕｅ  １２  ｅ８２６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の遺伝子導入や遺伝子改変といった分子生物学的手法を用いずに、多能性幹細胞を簡便に外胚葉へと分化誘導する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、多能性幹細胞に由来する胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）を、プラズマ照射した培地を用いて培養することにより、胚様体の増殖を抑制することなく、胚様体を外胚葉へと特異的に分化誘導できることを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００８】
本発明の上記課題は下記の手段により解決された。
〔１〕
胚様体を外胚葉へと分化誘導する方法であって、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養することを含む、方法。
〔２〕
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記プラズマが低温大気圧プラズマである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
前記培養により前記胚葉体のＷｎｔシグナルを抑制し、これにより前記胚様体を外胚葉へと分化誘導する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
外胚葉へと分化誘導された胚様体の製造方法であって、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養することを含む、製造方法。
〔８〕
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕
前記プラズマが低温大気圧プラズマである、〔７〕又は〔８〕に記載の製造方法。
〔１０〕
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１１〕
前記培養により前記胚葉体のＷｎｔシグナルを抑制し、これにより前記胚様体を外胚葉へと分化誘導する、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１２〕
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１３〕
培地をプラズマ照射することを含む胚様体分化誘導用培地の製造方法であって、該培地が胚葉体を外胚葉へと分化誘導するために用いられる、胚様体分化誘導用培地の製造方法。
〔１４〕
前記胚様体が哺乳類の胚性幹細胞に由来する、〔１３〕に記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
〔１５〕
前記プラズマが低温大気圧プラズマである、〔１３〕又は〔１４〕に記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
〔１６〕
前記プラズマが、ヘリウムガス、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素又は空気のプラズマである、〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載の胚様体分化誘導用培地の製造方法。
〔１７〕
前記の外胚葉への分化誘導が神経細胞への分化誘導である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の、胚様体を外胚葉へと分化誘導する方法によれば、遺伝子の人為的な改変を伴わずに、多能性幹細胞に由来する胚様体を外胚葉へと簡便に分化誘導することができる。また本発明の、外胚葉へと分化誘導された胚様体の製造方法によれば、遺伝子の人為的な改変を伴わずに、外胚葉へと分化誘導された胚様体を簡便に得ることができる。さらに本発明の胚様体分化誘導用培地の製造方法によれば、胚様体を外胚葉へと分化誘導する培地を簡便に得ることができる。すなわち本発明の胚様体分化誘導用培地の製造方法で得られる培地を用いることにより、遺伝子の人為的な改変を伴わずに、胚様体を外胚葉へと簡単に分化誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラズマ照射した培地の製造の一例を示す概略図である。
【図２】プラズマ照射していない培地を用いて胚様体を培養した際の胚様体の形態変化、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養した際の胚様体の形態変化、及びＨ２Ｏ２添加培地を用いて胚様体を培養した際の胚様体の形態変化を示す写真である。
【図３】プラズマ照射した培地を用いて培養した胚様体が、コントロール培地を用いて培養した胚様体に比べて、培養３日目において中胚葉及び内胚葉への分化が抑制されていることを示すリアルタイムＰＣＲ解析の結果である。＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図４】プラズマ照射した培地を用いて培養した胚様体が、コントロール培地を用いて培養した胚様体に比べて、培養１２日目において外胚葉へと分化誘導されていることを示すリアルタイムＰＣＲ解析の結果である。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図５】プラズマ照射した培地を用いて培養した胚様体が、コントロール培地を用いて培養した胚様体に比べて、培養１２日目において神経細胞系へと分化誘導されていることを示すリアルタイムＰＣＲ解析の結果である。＊はＰ＜０．０５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
本発明に用いる胚様体とは、多能性幹細胞を浮遊培養したときに形成されうる初期胚に似た構造をもつ球状の細胞塊である。胚様体は、多細胞生物の初期胚において、卵割によって形成される多数の細胞がしだいに規則的に配列してできる構造を有する。
本発明に用いる胚様体を形成する多能性幹細胞の種類に特に制限はないが、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であることが好ましく、より好ましくはＥＳ細胞である。前記多能性幹細胞は三胚葉性動物に由来する限り特に制限はない。例えば、哺乳類、鳥類等に由来する多能性幹細胞を用いることができ、なかでも哺乳類に由来する多能性幹細胞を好適に用いることができる。前記哺乳類としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
上記多能性幹細胞は、通常の方法で調製することができる。また、寄託機関等に寄託されているセルライン等の分譲により得ることもできる。
【００１２】
本発明に用いる胚様体は常法により多能性幹細胞から誘導することができる。例えば、多能性幹細胞を、細胞吸着能の低い培養皿で、ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）無しの培地で浮遊培養することで胚様体を得ることができる。かかる培地組成の一例として、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５質量％程度、ペニシリンないしストレプトマイシンを１質量％程度、２−メルカプトエタノールを０．１ｍＭ程度、非必須アミノ酸を０．１ｍＭ程度の濃度となるように添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を挙げることができる。但し、胚様体の形成に用いる培地は用いる多能性幹細胞の種類に応じて適宜に選択されるものであり、本発明に用いる培地は上記組成に何ら限定されるものではない。
胚様体を形成させるための温度、ＣＯ２濃度等は通常の条件を採用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で多能性幹細胞から胚様体を形成させることができる。
本発明に用いる胚様体の調製方法は上記に限定されず、胚様体を形成しうる方法であればいかなる方法で調製したものを用いてもよい。
【００１３】
本発明では、胚様体を外胚葉へと分化誘導するために、プラズマ照射した培地を用いて胚様体を培養する。このプラズマ照射した培地としては、上述した多能性幹細胞から胚様体を形成するための培地をプラズマ照射してなる培地を用いることができる。プラズマ照射効果をより高める観点から、ＦＢＳを除いた組成の培地をプラズマ照射し、使用時にＦＢＳを添加して、本発明で規定するプラズマ照射した培地として用いることも好ましい。
本発明において「プラズマ照射した培地」の形態に特に制限はなく、通常は液体培地である。
【００１４】
上記プラズマ照射条件は、胚様体を外胚葉へと分化誘導できれば特に制限はなく、この限りにおいて既存のあらゆるプラズマ照射条件を採用することができる。このプラズマ照射により生じた活性種（反応性成分）が胚様体に作用し、胚様体の外胚葉への特異的な分化が誘導されるものと推定される。胚様体を外胚葉へとより効率的に分化誘導する観点から、低温大気圧プラズマ（低温ＡＰＰ）を照射することが好ましい。低温ＡＰＰはプラズマ照射の一ツールであり、生きた細胞の処理（組織殺菌、止血（血液凝固）、血管新生、傷の治療、腫瘍除去等）等に用いられている。
【００１５】
低温ＡＰＰを照射して「プラズマ照射した培地」を製造する方法の一例を図１に示す。図１に示す形態では、石英セル内を流通させたヘリウム（Ｈｅ）ガスにパルス状高電圧を付与し、大気圧下でプラズマ放電し、プラズマジェットを培地に照射する。このプラズマジェットシステムの詳細は、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ（ＥＳ）  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｐｌａｓｍａｓ  ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．ｖｏｌ．４７，２０１４，４４５４０２に記載され、かかるシステムを本発明におけるプラズマ照射に好適に用いることができる。
低温大気圧プラズマにおいて、照射されるプラズマの温度は１０〜５０℃が好ましく、２０〜３０℃（室温程度）がより好ましい。
また、プラズマ照射時間は、外胚葉分化へと誘導する活性種を十分に生じさせるために、３０秒以上とすることが好ましく、４０秒以上とすることがより好ましく、５０秒以上とすることがさらに好ましい。また、照射時間が長すぎると培地のｐＨが大きく変化するおそれがあるため、プラズマ照射時間は通常は１００秒以下とし、９０秒以下とすることが好ましく、８０秒以下とすることがより好ましく、７０秒以下とすることがさらに好ましい。
上記プラズマの種類は、本発明の効果を奏する限り特に制限はなく、Ｈｅガスの他、例えば、アルゴンガス、ネオンガス、キセノンガス、酸素、窒素、空気等のプラズマを広く用いることができる。
【００１６】
本発明において「プラズマ照射した培地を用いて胚葉体を培養する」には、予めプラズマ照射した培地（プラズマ照射される「培地」は上述した多能性幹細胞から胚様体を形成するための培地である）を調製し、この培地中に多能性幹細胞ないし胚様体を移して培養する形態、及び、胚様体を培養している培地（この「培地」は上述した多能性幹細胞から胚様体を形成するための培地である）を、胚様体ごとプラズマ照射し、そのまま培養を継続する形態が含まれる。胚様体のプラズマ照射によるダメージをより確実に回避する観点から、予めプラズマ照射した培地を調製し、この培地中に多能性幹細胞ないし胚葉体を移して培養する形態が好ましい。
胚様体は胚様体形成０日目（多能性幹細胞を、上述した多能性幹細胞から胚様体を形成するための培地に移して浮遊培養を開始してから０日目を意味する。この「０日目」は、多能性幹細胞を上述した多能性幹細胞から胚様体を形成するための培地に移して浮遊培養を開始した時点から、１０時間（好ましくは５時間、さらに好ましくは２時間）を経過するまでの間を意味する。）から、プラズマ照射した培地で培養することが好ましい。
【００１７】
培地にプラズマを照射すると、反応性酸素種や反応性窒素種等、多くの活性種が生じることが知られている。そしてＨ２Ｏ２は培地のプラズマ照射で生じる主要な活性種の１つである。
しかし、後述する実施例に示されるように、Ｈ２Ｏ２を添加した培地中で胚様体を培養した場合、培養後に内胚葉及び中胚葉への分化が抑制されず、胚様体の外胚葉への特異的な分化を誘導することができない。すなわち、プラズマ照射により生じた多種多様な活性種の複合的な作用によりはじめて、胚様体を外胚葉へと特異的に分化させることが可能になる。
【００１８】
プラズマ照射した培地で培養した胚様体は、後述する実施例に示される通り、培養後数日でＷｎｔシグナルが抑制される。Ｗｎｔシグナルは中胚葉ないし内胚葉への分化を促進することが知られている。すなわち、胚様体をプラズマ照射した培地で培養することにより、胚様体の中胚葉ないし内胚葉への分化を効果的に抑制することができ、結果、外胚葉への分化を特異的に誘導することができる。また、プラズマ照射した培地で胚葉体を培養することにより、後述する実施例に示されるように培養後１０日以上経過した段階では神経細胞マーカーの発現も有意に高められる。すなわち、胚様体をプラズマ照射した培地中で培養することにより、胚様体を神経細胞へと効率的に分化誘導することが可能となる。なお、本発明において「神経細胞」とは、神経細胞及び神経細胞の前駆細胞の双方を含む意味に用いる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００２０】
［プラズマ照射システム］
図１に示すシステムにより２４ウェル型プレート内の培地に対して、Ｈｅガスのプラズマ（低温大気圧プラズマ）を照射した。プラズマ照射の具体的な条件を下記に示す。
＜プラズマ照射条件＞
電源電極（Ｐｏｗｅｒｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅにかけたＰｅａｋ‐ｔｏ−ｐｅａｋ  ｖｏｌｔａｇｅ：１０ｋＶ
パルス周波数：２７ｋＨｚの正弦波
Ｈｅガスの流速：約２リットル／分
Ｈｅガスが流通する石英チューブの内径：１．５ｍｍ
プラズマの中性ガス温度：室温（約２５℃）
２４ウェル型プレートの最上面とプラズマシステムの最下端との距離：５．５ｍｍ
１ウェル中の培地量：１ｍＬ
プラズマ照射時間：６０秒
【００２１】
［細胞培養と胚様体の形成］
多能性幹細胞として、マウスＥＳ細胞を用いた。具体的には、Ｒ１セルライン（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）８４２４−８４２８に記載、自然科学研究機構  生理学研究所  分子神経生理研究部門  より供与）を使用した。このＲ１セルラインは、１０００Ｕ／ｍＬの濃度でＬＩＦ（ケミコン社製）を加えたＥＳＣ培地（１５質量％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１質量％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社製）及び０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加したＤＭＥＭ）中において、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシン  Ｃ（シグマ社製）で不活化したマウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ）上で維持した。
胚様体の形成を誘導するために、上記マウスＥＳ細胞を３．０×１０５細胞ずつ、３．５ｍｍ  Ｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｈｅｓ（住友ベークライト社製）に移し、ＬＩＦを含まない上記のＥＳＣ培地（コントロール）、ＬＩＦを含まない後述するプラズマ照射培地（実施例）、及び、ＬＩＦを含まない後述するＨ２Ｏ２添加培地（比較例）で浮遊培養した。本発明においては、胚様体の形成を誘導するための培地中で多能性幹細胞の浮遊培養の開始した時点を胚様体形成時（多能性幹細胞培養後０日目）とする。したがって、例えば、「胚様体形成から１日後」とは、多能性幹細胞について上記の浮遊培養を開始してから１日後を意味する。
【００２２】
［プラズマ照射培地の調製］
１ｍＬのＥＳＣ培地（ＦＢＳ不含、ＬＩＦ不含）を２４ウェル型プレートの各ウェルに入れた。この２４ウェル型プレートの培地に対し、上記プラズマ照射システムによりプラズマを照射した。プラズマ照射後、培地を直ちにマイクロチューブに移して４℃で保存した。胚様体形成用培地として用いる際には、ＦＢＳを添加してから使用した。
【００２３】
［Ｈ２Ｏ２添加培地の調製］
Ｈ２Ｏ２（関東化学社製）を終濃度４５μＭとなるように、プラズマ照射していないＥＳＣ培地（ＦＢＳ不含、ＬＩＦ不含）に添加し、４℃で保存した。胚様体形成用培地として用いる際には、ＦＢＳを添加してから使用した。
【００２４】
［リアルタイムＰＣＲ分析］
胚様体のトータルＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（インビトロジェン社製）を用いて、使用説明書に従って抽出した。単離したＲＮＡはジエチルピロカーボネート処理した水に溶解し、使用時までは−８０℃で保存した。
ＲＮＡ濃度はＵＶスペクトルフォトメーターを用いて波長２６０ｎｍの吸光度に基づき決定した。
ｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴプライマー（インビトロジェン社製）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてトータルＲＮＡを逆転写して得た。
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ロシュ社製）を用いて行った。
胚様体の遺伝子発現を調べるために、リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーセットについては後述する。
【００２５】
［結果］
＜胚様体の細胞増殖に対するプラズマ照射培地の影響＞
上記マウスＥＳ細胞を、胚様体形成用培地としてプラズマ照射していないＥＳＣ培地（含ＦＢＳ、ＬＩＦ不含、「コントロール培地」という）、上述したプラズマ照射培地（含ＦＢＳ）、及びＨ２Ｏ２添加培地（含ＦＢＳ）で１２日間培養し、その細胞増殖を調べた。なお、１２日間の培養期間中、２日ごと（培養開始から２日後、４日後、６日後、８日後及び１０日後）に培地を新しいものと交換した。
培養後２．５日後、４日後、８日後、及び１２日後における胚様体の形態を顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。図２に示されるように、胚様体の形態（外観）の培地の違いによる変化は認められなかった。
【００２６】
また、培養後２．５日後の胚様体について、Ｓｐｒｙ２（ＦＧＦ４シグナルのターゲット遺伝子）とＦｇｆ４（ＦＧＦリガンド）の発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた結果、コントロール培地で培養した胚様体に比べて、プラズマ照射培地で培養した胚様体において、発現量が有意に上昇していた。また、培養後２．５日後の胚様体において、ＦＧＦ４の刺激により活性化されることが知られているリン酸化Ｅｒｋ１／２のタンパク質の発現量も有意に上昇していた。これらの事実は、プラズマ照射培地で胚様体を培養することにより、ＦＧＦ４シグナルが活性化され、胚様体のエピブラストへの分化が促進されていることを示す。
【００２７】
＜プラズマ照射培地は胚様体の中胚葉及び内胚葉への分化を抑制した＞
多能性幹細胞は胚様体形成用培地で培養を開始してから１〜２．５日程度でエピブラスト（将来、体のすべて組織を構築する未分化な細胞集団）の形態となり、次いでエピブラストにおいてはまず、内胚葉あるいは中胚葉への分化が開始される。エピブラストの外胚葉への分化は、内胚葉あるいは中胚葉への分化開始時期よりも遅れて開始する。上記の胚様体培養後３日目において、中胚葉マーカー又は内胚葉マーカーとして知られる下記遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。
Ｔ                      ：中胚葉マーカー
Ｍｉｘｌ１              ：中胚葉マーカー
Ｆｏｘａ２              ：内胚葉マーカー
Ｇａｔａ６              ：内胚葉マーカー
（使用したプライマーセットの詳細は後述する）
【００２８】
結果を図３に示す。図３に示される通り、プラズマ照射培地で培養した胚様体は、コントロール培地で培養した胚葉体に比べて、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーのいずれの発現も大きく抑制されていることがわかった。一方、Ｈ２Ｏ２添加培地で培養した胚様体では、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーの発現抑制は全く認められず、むしろ発現量が増加する傾向が認められた。これらの結果から、プラズマ照射培地を用いて胚様体を培養することにより、胚様体を外胚葉へと特異的に分化誘導できることがわかった。
【００２９】
胚様体の中胚葉や内胚葉への分化には、Ｗｎｔシグナルが関与しており、Ｗｎｔシグナルが働くことで胚様体の中胚葉や内胚葉への分化が促進されることが知られている。そこで、上記の胚様体培養後３日目において、Ｗｎｔシグナルに関連する遺伝子の発現量についても調べた。具体的には、下記遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。
Ａｘｉｎ２                    ：Ｗｎｔシグナルのターゲット遺伝子
ＣｃｎＤ１                    ：Ｗｎｔシグナルのターゲット遺伝子
Ｗｎｔ３ａ                    ：Ｗｎｔリガンド
Ｌｒｐ５                      ：Ｗｎｔシグナルのレセプター
Ｌｒｐ６                      ：Ｗｎｔシグナルのレセプター
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１（Ｆｚｄ１）：Ｗｎｔシグナルのレセプター
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（Ｆｚｄ５）：Ｗｎｔシグナルのレセプター
（使用したプライマーセットの詳細は後述する）
【００３０】
結果を図３に示す。図３に示されるように、プラズマ照射培地で培養した胚様体は、コントロール培地で培養した胚葉体に比べて、Ｗｎｔシグナルのターゲット遺伝子と、Ｗｎｔレセプターの発現量がいずれも大きく低下していた。一方、Ｗｎｔリガンド（Ｗｎｔ３ａ）の発現量には変化が認められなかった。これらの結果から、プラズマ照射培地を用いることにより、胚様体のＷｎｔレセプターの発現が抑えられ、これにより内胚葉や中胚葉への分化が抑制され、上述したＦＧＦ４シグナルの活性化と相俟って、外胚葉への分化を特異的に誘導できることが示された。なお、Ｈ２Ｏ２添加培地で培養した胚様体では、Ｗｎｔシグナルのターゲット遺伝子やＷｎｔレセプターの発現抑制は認められず、内胚葉や中胚葉への分化が抑制されていないことも示された。
【００３１】
＜プラズマ照射培地は胚様体の外胚葉への分化を誘導した＞
上記の胚様体培養後１２日目において、外胚葉マーカーとして知られる下記遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。
Ｐａｘ６                      ：外胚葉マーカー
（使用したプライマーセットの詳細は後述する）
【００３２】
結果を図４に示す。図４に示されるように、プラズマ照射培地で培養した胚様体は、コントロール培地で培養した胚葉体に比べて、外胚葉マーカーの発現量が大きく高められていることがわかった。
【００３３】
胚様体の外胚葉への分化には、ＦＧＦ４シグナルが関与することが知られている。そこで、上記の胚様体培養後１２日目において、ＦＧＦ４シグナルに係る下記遺伝子の発現量について調べた。具体的には、下記遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。
Ｓｐｒｙ２                      ：ＦＧＦ４シグナルのターゲット遺伝子
Ｆｇｆ４                        ：ＦＧＦリガンド
（使用したプライマーセットの詳細は後述する）
【００３４】
結果を図４に示す。図４の結果から、胚様体培養後１２日目においても、プラズマ照射培地で培養した胚様体は、コントロール培地で培養した胚葉体に比べてＦＧＦ４シグナルが高められていることがわかった。
【００３５】
＜プラズマ照射培地は胚様体の神経細胞系への分化を誘導した＞
上記の胚様体培養後１２日目において、神経細胞マーカーとして知られるＴｕｂｂ３の発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。結果を図５に示す。
図５に示されるように、プラズマ照射培地で培養した胚様体は、コントロール培地で培養した胚葉体に比べてＴｕｂｂ３の発現量が有意に増加しており、神経細胞系への分化が誘導されていることが示された。
【００３６】
以下、上記実施例におけるリアルタイムＰＣＲで用いたプライマーセットを下表に示す。
【００３７】
【表１】
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【図１】
2017093387.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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