(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな肝癌モデル動物及び肝癌治療薬の提供。【解決手段】ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の機能が低下又は消失した遺伝子改変動物。遺伝子改変動物は例えば、ノックアウトマウスでありｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスにおける肝癌では、脂肪の蓄積が見られず、ＮＡＳＨのような脂肪性肝炎を介さない新たな肝癌モデル動物として有用であり、薬剤のスクリーニング等に利用でき、亦、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡ或いはその前駆体ＲＮＡ、それらをコードするＤＮＡ、又はミミックを含む肝癌を治療又は予防するための医薬組成物。被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定し、標準値と比較し、前記発量が有意に低下していることを同定検出し、肝癌の治療又は予防に適した患者であることを同定する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする、非ヒト遺伝子改変動物。
【請求項２】
ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子配列に変異を有することを特徴とする、請求項１記載の遺伝子改変動物。
【請求項３】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡが発現されない、またはその発現量が低下していることを特徴とする、請求項１記載の遺伝子改変動物。
【請求項４】
マウスまたはラットである、請求項１〜３のいずれか一項記載の遺伝子改変動物。
【請求項５】
肝がんモデル動物である、請求項１〜４のいずれか一項記載の遺伝子改変動物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の遺伝子改変動物の肝がんモデル動物としての使用。
【請求項７】
肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する非ヒト肝がんモデル動物を用意する工程；
ｉｉ）該モデル動物に薬剤を投与する工程；
ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；および
ｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程
を含む、方法。
【請求項８】
肝がんモデル動物がマウスまたはラットである、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡ、またはミミックを含む、肝がんを治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡが配列番号１の配列を含む、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項９または１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
肝がんを治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象にｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡ、またはミミックを投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡが配列番号１の配列を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定する方法であって、
ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定する工程；
ｉｉ）該配列を配列番号１の配列と比較する工程；および
ｉｉｉ）被検者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定する方法であって、
ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定する工程；
ｉｉ）被検者におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を標準値と比較する工程；および
ｉｉｉ）ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している被検者を同定する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を用いた肝がんの治療または予防に適した患者を同定するための方法であって、
ｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定して、患者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程；または
ｉｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定して、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している患者を同定する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変動物に関する。より具体的には、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする遺伝子改変動物に関し、そのような遺伝子改変動物の肝がんモデル動物としての使用にも関する。また、本発明は、肝がんを治療または予防するための医薬組成物にも関し、より具体的には、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ミミック、またはそれらをコードするＤＮＡを含む、肝がんを治療または予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝がんは、世界で年間約７０万人が罹患する第３番目のがん死亡原因である。その多くは、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスに起因するが、近年、肥満やアルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＳＨ）など、肝炎ウイルスが原因でない肝がんが増加傾向にある（非特許文献１）。しかしながら、ウイルス非依存的な肝がんの発症メカニズムは不明な点が多い。
【０００３】
実験動物を用いて肝がんを再現する方法は、肝がん治療法開発のために有効な手段の一つである。現在までに複数の原発性肝がんモデル動物が知られているが、大きく分けて薬剤等の投与によるモデルと遺伝子改変によるモデルがある（非特許文献２）。Ｎ−ニトロソジエチルアミン（ＤＥＮ）などの薬剤を用いた方法は、簡便であるという利点があるが、実際の肝がんにおいてそのような薬剤に暴露されていることは考えにくく、実際の肝がんを再現しているとは言い難い。遺伝子改変マウスによる肝がんモデルとしては、肝臓特異的ＰＴＥＮノックアウトマウスが挙げられる（非特許文献３）。このマウスはＮＡＳＨを引き起こし、７８週までに６６％が肝細胞がんを発症する優れたモデルであるが、ＰＴＥＮの変異が見られない肝がんも存在し、またＮＡＳＨを介さない原発性肝がんも存在するため、その他のＰＴＥＮを介さない肝がんマウスモデルも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Oda et al., Clin J Gastroenterol. 2015 Feb;8(1):1-9
【非特許文献２】Bakiri et al., Mol Oncol. 2013 Apr;7(2):206-23
【非特許文献３】Horie et al., J Clin Invest. 2004 Jun;113(12):1774-83
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、肝がん治療法開発のために有効な手段となる実験動物を提供することを目的の一つとする。また、本発明の別の目的としては、肝がんを治療または予防するための医薬を提供すること、そのような医薬を用いて肝がんを治療または予防するための方法を提供することも含まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスが加齢により肝がんを自然発症することを見出した。ｍｉＲ−１４６ｂはｍｉＲ−１４６ａと相同性の高いマイクロＲＮＡであり、ｍｉＲ−１４６ａについては炎症を抑制する機能があることが知られているが、ｍｉＲ−１４６ｂの機能はこれまで明らかにされていない。ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスにおける肝がんでは、脂肪の蓄積が見られず、ＮＡＳＨのような脂肪性肝炎を介さない新たな肝がんモデル動物として有用であると考えられる。また、ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスの解析結果は、ｍｉＲ−１４６ｂが肝がん発症制御に重要な役割を担っており、ｍｉＲ−１４６ｂが肝がん治療及び予防に有効であることを示している。そこで、ｍｉＲ−１４６ｂを遺伝子導入試薬と混合して、これを例えば静脈から投与し、肝臓に取り込ませることにより、肝がんの治療及び予防のための医薬として利用することが可能であることが当業者には理解される。本発明は、これらの知見を基礎とするものであり、具体的には、以下の事項に関する。
【０００７】
［１］非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする、非ヒト遺伝子改変動物。
［２］ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子配列に変異を有することを特徴とする、［１］記載の遺伝子改変動物。
［３］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡが発現されない、またはその発現量が低下していることを特徴とする、［１］記載の遺伝子改変動物。
［４］マウスまたはラットである、［１］〜［３］のいずれか一項記載の遺伝子改変動物。
［５］肝がんモデル動物である、［１］〜［４］のいずれか一項記載の遺伝子改変動物。
［６］［１］〜［４］のいずれか一項記載の遺伝子改変動物の肝がんモデル動物としての使用。
［７］［１］〜［４］のいずれか一項記載の遺伝子改変動物に由来する、単離された組織または細胞。
［８］肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する肝がん非ヒトモデル動物を用意する工程；ｉｉ）該モデル動物に薬剤を投与する工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含む、方法。
［９］肝がんモデル動物がマウスまたはラットである、［８］記載のスクリーニング方法。
［１０］肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する肝がん非ヒトモデル動物に由来する単離された組織または細胞を用意する工程；ｉｉ）該組織または細胞に薬剤を接触させる工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含む、方法。
［１１］肝がんモデル動物がマウスまたはラットである、［１０］記載のスクリーニング方法。
［１２］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡ、またはミミックを含む、肝がんを治療または予防するための医薬組成物。
［１３］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡが配列番号１（ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕａｇｇｃｕ）の配列を含む、［１２］記載の医薬組成物。
［１４］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、［１２］または［１３］記載の医薬組成物。
［１５］肝がんを治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象にｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ミミック、またはそれらをコードするＤＮＡを投与する工程を含む、方法。
［１６］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡが配列番号１（ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕａｇｇｃｕ）の配列を含む、［１５］記載の方法。
［１７］ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、［１５］または［１６］記載の医薬方法。
［１８］肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する単離されたヒト肝細胞を用意する工程；ｉｉ）該ヒト肝細胞に薬剤を接触させる工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含む、方法。
［１９］肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定する方法であって、ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定する工程；ｉｉ）該配列を配列番号１の配列と比較する工程；およびｉｉｉ）被検者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程を含む、方法。
［２０］肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定する方法であって、ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定する工程；ｉｉ）被検者におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を標準値と比較する工程；およびｉｉｉ）ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している被検者を同定する工程を含む、方法。
［２１］上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の医薬組成物を用いた肝がんの治療または予防に適した患者を同定するための方法であって、ｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定して、患者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程；またはｉｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定して、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している患者を同定する工程を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＴＡＬＥＮを用いたｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスの作製方法を示す図面である。ＴＡＬＥＮ  ＲＮＡを受精卵の細胞質にインジェクションすることにより、ｍｉＲ−１４６ｂ配列の一部が欠損したマウスが得られた。
【図２】ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスの腫瘍形成について示す図面である。１６〜２０ヶ月齢のｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスにおいて肝がん及びリンパ腫の形成が確認された。
【図３】ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウス肝がんのＨ＆Ｅ染色像を示す図面である。２２ヶ月齢野生型マウス（上）と腫瘍形成が見られた２０ヶ月齢ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウス（下）の肝臓をパラフィン包埋した切片のＨ＆Ｅ染色像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に組み込まれていると解釈すべきである。
【００１０】
ｍｉＲ−１４６ｂ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、２０〜２４ヌクレオチドの短い非コード性ＲＮＡであり、ｍＲＮＡの安定性と翻訳の両方に影響を与えることによって、多細胞生物における遺伝子発現の転写後調節に関与している。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、キャップ構造を有するポリアデニル化された初期転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部として転写される。この転写産物は、タンパク質をコードすることも、コードしないこともある。この初期転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、約７０ヌクレオチドのステムループ構造をとる前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生成する。これはさらに、細胞質のＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡとそのアンチセンス側のｍｉＲＮＡ＊を生じる。そして、成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対合を通じて標的ｍＲＮＡを認識し、一般的には、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害もしくは不安定化をもたらす。
【００１１】
ｍｉＲ−１４６ｂは、炎症によって発現が惹起され、ＴＲＡＦ６やＩＲＡＫ１を抑制することで炎症を収束させる働きを持つｍｉＲ−１４６ａのホモログｍｉｃｒｏＲＮＡである。ｍｉＲ−１４６ｂは、標的ｍＲＮＡの認識に重要なシード配列がｍｉＲ−１４６ａと同一であり、全長配列も２塩基のみ異なる。これまでのがん細胞を用いた実験報告により、ｍｉＲ−１４６ｂは乳がんやグリオーマなどのがんの抑制に関与することが示唆されているが（Liu et al., Oncotarget. 2015, 6(30):29129-42; Garcia et al., EMBO Mol Med. 2011, 3(5):279-90.）、個体レベルでの機能についての報告はない。
【００１２】
ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから成熟ｍｉＲＮＡとなる際に約２２塩基ほどの二本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−５ｐ／ｍｉＲＮＡ−３ｐデュプレックス）を経るが、そのうちの片方の鎖がＲＩＳＣと呼ばれる複合体に取り込まれてｍｉＲＮＡとして働き、もう一方の鎖は分解される。ｍｉＲ−１４６ｂの場合、ｍｉＲＮＡとして働くのはｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐであり、本明細書におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡとの記載はｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ  ＲＮＡと同義である。
【００１３】
成熟ｍｉＲ−１４６ｂ（配列番号１：５’−ＵＧＡＧＡＡＣＵＧＡＡＵＵＣＣＡＵＡＧＧＣＵ−３’）およびｐｒｅ−ｍｉＲ−１４６ｂ（配列番号２：５’−ＣＣＵＧＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＣＵＧＡＡＵＵＣＣＡＵＡＧＧＣＵＧＵＧＡＧＣＵＣＵＡＧＣＡＡＵＧＣＣＣＵＧＵＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＣＵＧＧＵＧＣＣＣＧＧ−３’）の配列は公知であり、ｍｉＲＢａｓｅなどの各種データベースから入手可能である（例えば、成熟ｍｉＲ−１４６ｂのｍｉＲＢａｓｅアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００２８０９、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４６ｂのｍｉＲＢａｓｅアクセッション番号：ＭＩ０００３１２９）。これらの配列をもとに核酸を合成する方法は、当業者には公知である。なお、成熟ｍｉＲ−１４６ｂおよびｐｒｅ−ｍｉＲ−１４６ｂは、Thermo Fisher SCIENTIFICからmirVana mimic、Ambion Pre-miR miRNA Precursorとして販売されているものを購入して利用することもできる。
【００１４】
ＲＮＡを合成する際には、天然の核酸に加えて、２’Ｏ−メチル修飾などの修飾を加えた核酸を使用してもよい。そのような核酸の合成方法は、当業者には公知である。また、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１４６ｂ配列を含むゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、各種発現ベクターまたは各種ウイルスベクター等に導入して、細胞内でＲＮＡを転写により合成してもよい。
【００１５】
遺伝子改変動物
本発明の一つの側面は、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする、非ヒト遺伝子改変動物に関する。ここで、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有するとは、例えば、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子配列中に変異（例えば、塩基の置換、欠失、挿入）を有するために、あるいはｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡが発現されない、またはその発現量が低下しているために、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の機能が低下している、または消失していることなどを含む。非ヒト遺伝子改変動物におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の機能の低下は、例えば、正常な活性の５０％以下であれば、疾患のモデル動物として有用となると考えられ、必ずしもｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の機能が完全に消失している必要はない。例えば、本発明の非ヒト遺伝子改変動物におけるｍｉＲ−１４６ｂの遺伝子抑制活性は、正常な動物に比べて、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満に低下している。なお、ｍｉＲ−１４６ｂの遺伝子抑制活性は、例えば、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を指標にして評価することができる。
【００１６】
ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子配列中に変異を有する非ヒト遺伝子改変動物は、当業者に既知の任意の方法を用いて作製することができる。ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子のノックアウト（ＫＯ）マウスは、その一例であるが、そのようなマウスは、相同組換えを用いる方法、人工ヌクレアーゼＴＡＬＥＮを用いる方法、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを用いる方法などの、当業者に既知の任意の方法を用いて作製することができる。ＴＡＬＥＮあるいはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを用いる場合は、まずｍｉＲ−１４６ｂを標的とするＴＡＬＥＮベクターあるいはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡベクターを作製する。ＴＡＬＥＮベクターの設計は、TALEN Targeter（tale-nt.cac.cornell.edu/）などのウェブツールを用いて設計し、Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting（Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82）に記載の方法などにより作製する。ＣＲＩＳＰＲを用いる場合は、CRISPR Design Tool（http://crispr.mit.edu）などによりガイドＲＮＡを設計し、RNA-guided human genome engineering via Cas9（Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6）に記載の方法などに従い、ガイドＲＮＡベクターを作製する。ＴＡＬＥＮベクター、またはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡベクターおよびＣａｓ９ベクターは、制限酵素により直鎖化あるいはＰＣＲにより目的部分とＴ７プロモーターを増幅し精製する。これを鋳型として用いてＲＮＡを転写した後、精製する。精製したＲＮＡをマウス受精卵の細胞質にマイクロインジェクションし、産まれたマウスの遺伝子をシークエンシングして変異マウスを同定する。変異が見つかったマウスを掛けあわせてノックアウトマウスを取得する。また、当業者に既知の方法を用いて、ノックインマウスを作製して、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子配列を他の配列に置き換えてもよい。
【００１７】
また、ｍｉＲ−１４６ｂの機能は、その発現またはプロセッシングに影響を与えることにより、低下または消失させることもできる。一般に、ｍｉＲＮＡは、まず、ゲノムＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼＩＩによってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（primary miRNA、初期転写産物）が転写され、それが核内に存在するＲＮａｓｅＩＩＩ様のＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって切断されて約７０塩基長のステムループ構造をもつｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（precursor miRNA、成熟ｍｉＲＮＡの前駆体）を生じ、それが核外に輸送された後、細胞質中でＤｉｃｅｒと呼ばれる酵素のスプライシングによって、２０から２５塩基長の２本鎖ｍｉＲＮＡとなる過程を経て生じる。つまり、ｍｉＲ−１４６ｂの機能は、これらの過程のいずれか、例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの転写の段階、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからｐｒｅ−ｍｉＲＮＡへのプロセッシングの段階、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから成熟ｍｉＲＮＡへのプロセッシングの段階のいずれかに影響を与えることによっても、低下または消失させることができる。そのために、例えば上記のノックアウトまたはノックイン技術を利用することができる。さらに、例えば、ｍｉＲ−１４６ｂ自体またはその前駆体の一部に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物を作製して、その機能を抑制または消失させてもよい。
【００１８】
本発明における非ヒト遺伝子改変動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなど、遺伝子改変の可能な任意の動物種を使用することができる。特に、作製および維持が容易であるマウスを用いることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の一つの側面は、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする、非ヒト遺伝子改変動物に由来する、単離された組織または細胞に関する。これらの組織、細胞としては、肝臓、リンパ節、脾臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、腎臓、副腎、血管、心臓、消化管、脳などに由来する組織、細胞が好適に例示される。
【００２０】
肝がんモデル動物
本発明の一つの側面は、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有することを特徴とする非ヒト遺伝子改変動物の肝がんモデル動物としての使用に関する。本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子のノックアウトマウスが、加齢により肝がんを自然発症することを見出した。ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスにおける肝がんでは、脂肪の蓄積が見られず、ＮＡＳＨのような脂肪性肝炎を介さない新たな肝がんモデル動物として有用となりうる。
【００２１】
このような非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する非ヒト遺伝子改変動物に対して、薬剤による処置を行うことにより、さらに肝がんを誘発してもよい。そのような薬剤処理としては、例えば、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（ＤＥＮ）、フェノバルビタール、四塩化炭素、ジメチルベンツアントラセン（ＤＭＢＡ）などを用いる方法がある。あるいは、高脂肪食や薬剤を与える、または高脂肪食と薬剤投与を併用することで肝炎を誘導し、肝がんを誘発してもよい。また、他の肝がんモデル動物との掛け合わせを行うことにより、さらに肝がんを誘発してもよい。利用されうる他の肝がんモデル動物としては、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子やＭｄｒ２遺伝子に変異を有する動物が挙げられる。
【００２２】
肝がんモデル動物が、肝がんを発症したか否かの評価は、例えば、解剖、組織生検、評価マーカーの検出などにより行うことができる。本発明に係る肝がんモデル動物は、マウスの場合、通常の条件で飼育すると、生後約１６〜２０ヶ月で肝がんの発生が確認されるが、肝がんの発症時期は、上記のように、高脂肪食や薬剤などを与えることによって調整されうる。また、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子以外の遺伝子の変異をさらに導入することによっても、肝がんの発症時期は調整されうる。
【００２３】
スクリーニング方法
本発明の一つの側面は、肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する肝がん非ヒトモデル動物を用意する工程；ｉｉ）該モデル動物に薬剤を投与する工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含む、方法に関する。
【００２４】
非ヒト遺伝子改変動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなど、遺伝子改変の可能な任意の動物種を使用することができるが、特に、作製および維持が容易であるマウスを用いることが好ましい。
【００２５】
スクリーニングを行う際、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する非ヒト遺伝子改変動物に対して、薬剤による処置を行うことにより、さらに肝がんを誘発してもよい。そのような薬剤処理としては、例えば、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（ＤＥＮ）を用いる方法がある。あるいは、高脂肪食や薬剤を与えることで肝炎を誘導し、肝がんを誘発してもよい。また、他の肝がんモデル動物との掛け合わせを行うことにより、さらに肝がんを誘発してもよい。利用されうる他の肝がんモデル動物としては、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子やＭｄｒ２遺伝子に変異を有する動物が挙げられる。
【００２６】
試験薬剤が、肝がんを治療または予防しうるか否かの評価は、例えば、解剖、組織生検、評価マーカーの検出などにより行うことができる。
【００２７】
また、本発明の一つの側面は、肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法であって、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する肝がん非ヒトモデル動物に由来する単離された組織または細胞を用意する工程；ｉｉ）該組織または細胞に薬剤を接触させる工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含む方法にも関する。
【００２８】
これらの組織、細胞としては、肝臓、リンパ節、脾臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、腎臓、副腎、血管、心臓、消化管、脳などに由来する組織、細胞が好適に例示される。試験薬剤が、薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かの評価は、例えば、細胞増殖の抑制などを指標にして評価することができる。
【００２９】
さらに、本発明の一つの側面は、非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有する、単離されたヒト肝細胞、およびそれを用いた肝がんを治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。そのようなスクリーニング方法は、例えば、ｉ）非機能的なｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子を有するヒト肝細胞を用意する工程；ｉｉ）該ヒト肝細胞に薬剤を接触させる工程；ｉｉｉ）薬剤が肝がんの発症または進行に影響するか否かを判定する工程；およびｉｖ）肝がんを治療または予防するための薬剤を同定する工程を含むことができる。培養ヒト肝細胞において、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の機能を阻害もしくは消失させる際には、当業者に既知の任意の方法を利用することができる。
【００３０】
医薬組成物
本発明の一つの側面は、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡ、またはｍｉＲ−１４６ｂミミックを含む、肝がん（特に原発性肝がん）を治療または予防するための医薬組成物に関する。ここで、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡは、配列番号１（ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕａｇｇｃｕ）の配列を含んでいる。ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡは、配列番号１から成るＲＮＡを好適に使用できるが、その両方または片方の末端に付加的な塩基を有していても良い。また、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡは、適当な修飾核酸および／または変異（例えば、１つまたは複数の塩基の置換、欠失、挿入）を含んでいてもよく、そのミミック（化学修飾された短い二本鎖ＲＮＡであり、内在性ｍｉＲＮＡを模倣し、ｍｉＲＮＡの活性を増幅することを可能とする）を使用してもよい。
【００３１】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体としては、天然のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを好適に使用できるが、これらの前駆体は、適当な修飾および／または変異を含んでいても良い。また、Thermo Fisher SCIENTIFIC社から販売されているmirVana mimicやAmbion Pre-miR miRNA Precursorを用いても良い。
【００３２】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクター中に組み込んで使用することができるが、細胞中でｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡの転写を可能とするものであれば、任意の形態であってよい。
【００３３】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ｍｉＲ−１４６ｂミミック、またはそれらをコードするＤＮＡは、化学的、生化学的または生物学的に合成することができる。そのような合成方法は、当業者には広く知られている。
【００３４】
本発明に係る医薬組成物は、錠剤、粉末、液体、半固体などの任意の形態をとることができ、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、それらをコードするＤＮＡ、またはｍｉＲ−１４６ｂミミックに加えて、適当な賦形剤、添加剤を含みうる。また、本発明に係る医薬組成物には、他の抗がん剤が配合されていてもよい。各成分の配合量は、医薬として許容される範囲で適宜決定することができる。また、組成物の投与量は、使用する核酸の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。投与経路についても、使用する核酸の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。
【００３５】
肝がんを治療または予防するための方法
本発明の一つの側面は、肝がん（特に原発性肝がん）を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象にｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ｍｉＲ−１４６ｂミミック、またはそれらをコードするＤＮＡを投与する工程を含む方法に関する。ここで、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡは、配列番号１（ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕａｇｇｃｕ）の配列を含んでいる。ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡは、配列番号１から成るＲＮＡを好適に使用できるが、その両方または片方の末端に付加的な塩基を有していても良い。また、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡは、適当な修飾核酸および／または変異（例えば、１つまたは複数の塩基の置換、欠失、挿入）を含んでいてもよい。
【００３６】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの前駆体としては、天然のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを好適に使用できるが、これらの前駆体は、適当な修飾および／または変異を含んでいても良い。
【００３７】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクター中に組み込んで使用することができるが、細胞中でｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡの転写を可能とするものであれば、任意の形態であってよい。
【００３８】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ｍｉＲ−１４６ｂミミック、またはそれらをコードするＤＮＡは、化学的、生化学的または生物学的に合成することができる。そのような合成方法は、当業者には広く知られている。
【００３９】
ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、それらをコードするＤＮＡ、またはｍｉＲ−１４６ｂミミックは、適当な賦形剤、添加剤を含む錠剤、粉末、液体、半固体などの任意の形態の医薬組成物として投与されることができる。また、他の抗がん剤と組み合わせて投与されてもよい。各成分の配合量は、医薬として許容される範囲で適宜決定することができる。また、薬剤の投与量は、使用する核酸の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。投与経路についても、使用する核酸の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができるが、核酸医薬の場合、静脈への注射により肝臓に効率よく送達できることが知られている。
【００４０】
投与の対象としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが含まれる。
【００４１】
肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者の同定方法
本発明の一つの側面は、肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定するための方法に関する。このような方法は、例えば、ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定する工程；ｉｉ）該配列を配列番号１の配列と比較する工程；およびｉｉｉ）被検者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程を含みうる。被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定する方法としては、当業者に公知の任意の方法、例えば、自動シークエンサーを用いる方法などを利用することができる。決定した配列を配列番号１の配列と比較する工程および変異の有無を決定する工程は、例えば、コンピューターにより自動化して行うことができる。
【００４２】
上記の肝がんに罹患しやすい、または罹患している被検者を同定するための方法は、ｉ）被検者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定する工程；ｉｉ）被検者におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を標準値と比較する工程；およびｉｉｉ）ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している被検者を同定する工程を含むものでもよい。ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定する方法は、当業者に公知の任意の方法、例えば、Taqman(R) microRNA Assays（Thermo社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法による定量解析などを利用することができる。発現量を比較する標準値としては、正常な被検者に由来する試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を用いることができる。ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下しているか否かの判断は、例えば、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が標準値に比べて５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満に低下していることを基準にして判断することができる。
【００４３】
ｍｉＲ−１４６ｂを用いた肝がんの治療または予防に適した患者の同定方法
本発明の一つの側面は、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡ、ｍｉＲ−１４６ｂミミック、またはそれらをコードするＤＮＡなどを含む医薬組成物を用いた肝がんの治療または予防に適した患者を同定するための方法に関する。このような方法は、例えば、ｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列を決定して、患者のｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子における変異の有無を決定する工程；またはｉｉ）患者から得た試料中におけるｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定して、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量が有意に低下している患者を同定する工程を含むことができる。ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子の配列の決定および変異の有無の評価は、上記のとおり、自動化して行う事ができる。また、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量を測定する方法は、Taqman(R) microRNA Assays（Thermo社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法による定量解析などを利用して行うことができる。
【００４４】
このような方法を用いることにより、ｍｉＲ−１４６ｂに基づく医薬品が患者にもたらす効果を投与前に予測することが可能となる。また、ｍｉＲ−１４６ｂ  ＲＮＡの発現量の測定値は、患者に投与する薬剤の量を決定する上でも有用となりうる。
【００４５】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ｍｉＲ−１４６ｂノックマウスの作製
ｍｉＲ−１４６ｂノックマウスは、以下の手順に従って作製した（図１）。まず、ｍｉＲ−１４６ｂを標的とするＴＡＬＥＮベクターを作製した。ｍｉＲ−１４６ｂを標的とするＴＡＬＥＮベクターは、マウスｍｉＲ−１４６ｂ配列近傍のＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧ配列（配列番号３）とＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡ配列（配列番号４）の２つの領域を標的とするものをCellectis社の受託サービスを利用して作製した。各ＴＡＬＥＮベクターは、制限酵素ＰａｃＩにより直鎖化し精製した。これを鋳型としてmMESSAGE mMACHINE(R) T7 Transcription Kit（Thermo社）を用いてＲＮＡを転写し、MEGA clear（Thermo社）を用いて精製した。精製したＲＮＡをマウス受精卵の細胞質にマイクロインジェクションし、産まれたマウスのシークエンシングにより変異マウスを同定した。変異が見つかったマウスを掛けあわせてノックアウト遺伝子がホモ接合のノックアウトマウスを取得した。
【００４７】
実施例２：ｍｉＲ−１４６ｂノックマウスの表現型解析
ｍｉＲ−１４６ｂノックマウスの表現型を解析した結果は以下のとおりである。実施例１のようにして作製したｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスは、正常に発生し、２ヶ月齢のマウスに野生型との違いは見られなかった。１６〜２０ヶ月齢のｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスを安楽死させ、肝臓、脾臓などの組織を観察したところ、一部のノックアウトマウスにおいて腫瘍が確認された（図２）。Ｈ＆Ｅ染色による病理学的解析の結果、その殆どはリンパ腫であったが、肝臓における腫瘍は原発性の肝がんであることが明らかになった（図３）。
【００４８】
実施例３：他の因子による肝がん発生のさらなる誘導
実施例１のようにして作製したマウスに対して、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（ＤＥＮ）、フェノバルビタール、四塩化炭素、ジメチルベンツアントラセン（ＤＭＢＡ）を用いた処置を行うことにより、あるいは、高脂肪食負荷による非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルおよび／または高脂肪食とジメチルベンツアントラセン（ＤＭＢＡ）を併用した処置を行うことにより、肝がん発生のさらなる誘導を行う。
【００４９】
実施例４：想定されるｍｉＲＮＡによる肝がん治療の動物実験プロトコル
肝がんモデルによる肝がん誘導を行ったマウスの尾静脈に、ｍｉＲ−１４６ｂミミック（ｍｉＲＮＡ分子を模倣した２本鎖ＲＮＡ）または対照ミミックを、任意でInvivofectamine(R)3.0（invitrogen製）などのｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション試薬と混合して注射し、肝がん形成への影響を調査する。ｍｉＲＮＡのトランスフェクション方法の確立にはＣｙ３で蛍光ラベルしたｍｉＲＮＡを用いて行う。これにより肝臓への導入効率が容易に評価できる。導入したｍｉＲＮＡの保持される期間についても同様に評価し、尾静脈への注射の頻度を決定する。使用するｍｉＲＮＡは市販のミミックなどの他、２’−Ｏメチルなどの各種修飾を行い、合成したｍｉＲＮＡでもよい。肝がん形成の評価は安楽死させたマウスの肝がん形成の有無、腫瘍の大きさなどを観察して行う。
【００５０】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
上記のとおり、発明者らは、ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子改変動物（より具体的にはマウス）が加齢により肝がんを自然発症することを見出した。ｍｉＲ−１４６ｂ遺伝子改変動物における肝がんでは、脂肪の蓄積が見られず、ＮＡＳＨのような脂肪性肝炎を介さない新たな肝がんモデル動物として有用であると考えられる。また、ｍｉＲ−１４６ｂノックアウトマウスの解析結果は、ｍｉＲ−１４６ｂが肝がん発症制御に重要な役割を担っており、ｍｉＲ−１４６ｂが肝がん治療及び予防に有効であることを示している。そこで、ｍｉＲ−１４６ｂを遺伝子導入試薬と混合して、これを例えばヒトの静脈から投与し、肝臓に取り込ませることにより、肝がんの治療及び予防のための医薬として利用することが可能であることが当業者には理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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