(57)【要約】      （修正有）【課題】第１発酵工程であるカビ発酵、及び第２発酵工程である細菌発酵により製造されたイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する方法の提供。【解決手段】ａ）カビで植物性蛋白質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させる工程を含む、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液の製造方法であり、前記発酵液を製造する工程を含む、天然調味素材の製造方法。好ましくは、植物性蛋白質原料が、大豆、トウモロコシ、小麦及び小麦グルテンから選択され、カビが、アスペルギルス属の微生物で、アスペルギルス・ソーヤであり、細菌が、コリネバクテリウム属で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、前記発酵液を製造する方法であり、前記発酵液を製造する工程を含む、天然調味素材の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び
（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させる工程を含む、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液の製造方法。
【請求項２】
前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液が、天然調味素材を製造するための原料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物性タンパク質原料が、大豆、トウモロコシ、米、小麦及び小麦グルテンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カビが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アスペルギルス属の微生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地組成が、食品原料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌発酵用培地組成が、カルシウム−パントテネート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ、ＣＡＰＡ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＭＰ発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、硫酸マグネシウム、リン酸、水酸化カリウム及び穀物発酵液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、原糖（ｒａｗ  ｓｕｇａｒ）、ベタイン、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム及びリン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地の炭素源が、原糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記製造されたＩＭＰ発酵液中のＩＭＰ濃度が、５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記製造されたＩＭＰ発酵液における固形分中のＩＭＰ含量が、３０ｗｔ％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記製造されたグルタミン酸発酵液中のグルタミン酸濃度が、７５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記製造されたグルタミン酸発酵液における固形分中のグルタミン酸含量が、５０ｗｔ％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｃ）前記細菌発酵により得られた前記発酵液を活性炭で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵液を活性炭で処理した後に、処理した培養液を遠心分離又は濾過する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵液を活性炭で処理する前に、発酵液を７０〜９０℃の温度で１５〜６０分間加熱して細胞溶解を誘導する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法により製造されたＩＭＰ発酵液。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法により製造されたグルタミン酸発酵液。
【請求項２３】
（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び
（ｂ）細菌で穀物発酵液を発酵させてＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する工程を含む、天然調味素材の製造方法。
【請求項２４】
（ｃ）工程（ａ）の穀物発酵液と、工程（ｂ）の前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液からなる群より選択される２つ以上の発酵液を混合する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記天然調味素材は、任意の追加成分を添加することなく、前記発酵液のみを用いて製造される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記天然調味素材は、追加的な化学工程を発酵液に加えることなく、前記発酵液を用いて製造される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）の前に、前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を電気透析する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２３に記載の方法により製造された天然調味素材。
【請求項２９】
請求項２８に記載の天然調味素材を含む食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然調味素材の製造のために、原料となるイノシン−５’−一リン酸（ｉｎｏｓｉｎｅ−５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）発酵液を製造する方法に関するもので、より具体的には、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程によりＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する方法、それにより製造されたＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液、前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する工程を含む天然調味素材の製造方法、それにより製造された天然調味素材、及びそれを含む食品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸及びペプチドは、調味素材の成分として用いられており、最近では、大豆、小麦又はトウモロコシなどの植物性タンパク質原料を、カビ、バチルス、乳酸菌又は酵母などの微生物で発酵させ、前記発酵産物を加水分解することにより抽出されるアミノ酸とペプチドを含む天然調味素材が、様々な方法によって開発されている。
【０００３】
一般的に、前記植物性タンパク質原料の加水分解率（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を高めることで遊離される呈味成分（アミノ酸及びペプチド）を改善したり、量の観点から収率を高めることで価格競争率を増進させる技術が開発されている。しかし、植物性タンパク質原料のみを用いる場合、最終的な調味素材中に核酸成分が存在しないため、調味素材中の旨味の強度が弱いという欠点がある。さらに、調味素材は、その商業的価値を高めるために、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）又はグアノシン一リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧＭＰ）などの核酸と共にグルタミン酸を含むことが求められている。
【０００４】
最近では、前述した植物性タンパク質加水分解物の欠点を克服するために、酵母抽出物などの天然の核酸含有素材が一般的に用いられている。しかし、前記酵母抽出物は、特有の発酵臭に起因する異味と異臭が加工食品の持つ固有の風味に悪影響を与えるため、該核酸の含量が制限される（最大の核酸含量：２０％）。さらに、天然の加工食品に使用するための植物性タンパク質素材と酵母抽出物の混合は、グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ、ＭＳＧ）、核酸ＩＧ又は植物性タンパク質加水分解物（Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＶＰ）などの既存の調味素材に比べ、価格競争力が低いという欠点がある。
【０００５】
一方、ＩＭＰは、ＧＭＰと共に食品調味料の添加剤として広く使用されている物質である。特に、ＩＭＰは、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）と一緒に使用する場合、味における相乗効果が大きいことから、核酸系調味料の成分として脚光を浴びている。
【０００６】
調味素材として使用するためのＩＭＰ及びＧＭＰを発酵させる方法としては、酵母のＲＮＡを分解する方法と、イノシン及びグアノシンの製造後に２段階（発酵と化学的手法によるリン酸化）によりＩＭＰとＧＭＰを製造する方法を含む。しかし、最近では、ヨーロッパを含む様々な国で、天然調味料に対する基準が強化され、規制がより厳しくなるにつれ、調味素材を天然成分だけで製造せずに、化学的手法による工程、或いは追加成分を添加して製造することは、天然調味素材として認めなくなった。このような理由から、天然の核酸成分は、細菌で糖を直接発酵させる方法を用いて製造しなければならない。
【０００７】
このような状況下で、本発明者らは、任意の化学工程を行うことなく、追加成分を含まない天然調味素材を製造するために広範な努力をした結果、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程により生産されたＩＭＰ又はグルタミン酸発酵液を使用する場合、後続反応のために発酵液のみを使用しても様々な種類の調味素材を効果的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許公報第１０−１１９１０１０号
【特許文献２】韓国特許公報第１０−２００７−０００５０７号
【特許文献３】韓国特許公報第１０−２０００−００２９１７４号
【特許文献４】韓国特許公報第１０−０３９７３２１号
【特許文献５】韓国特許公報第１０−０２６４７４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の１つの目的は、第１発酵工程であるカビ発酵、及び第２発酵工程である細菌発酵により製造されたイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記方法によって製造されたＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、第１発酵工程であるカビ発酵、及び第２発酵工程である細菌発酵によりＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する工程を含む天然調味素材を製造する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記製造方法により製造された天然調味素材及びそれを含む食品組成物。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するための一態様として、本発明は、（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させる工程を含むイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する方法を提供する。
【００１４】
前記製造されたＩＭＰ及び／又はグルタミン酸発酵液は、天然調味素材を製造するための原料として使用してもよい。言い換えれば、天然調味素材は、ＩＭＰ及び／又はグルタミン酸発酵液を用いて製造してもよい。
【００１５】
図１に本発明による天然調味素材の製造方法を概略的に示す。
【００１６】
グルタミン酸発酵液、ＩＭＰ発酵液及び穀物発酵液は、第１発酵工程であるカビ発酵、及び第２発酵工程である細菌発酵により製造され、最終的に、各調味素材に適した反応又は処理に供することで様々な天然調味素材を製造することができる。
【００１７】
従って、本発明は、天然調味素材を製造するために、天然ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を原料として使用し、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程により製造されることを特徴とする。
【００１８】
前記第１発酵工程であるカビ発酵は、タンパク質原料を用いてペプチド及びアミノ酸を製造する工程である。第１発酵工程であるカビ発酵のみを行う場合、多量のペプチド及びアミノ酸を製造することができるため、調味素材として使用され得るグルタミン酸の生産が可能である。しかし、旨味（ｕｍａｍｉ  ｔａｓｔｅ）を出し得るＩＭＰ又はグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）などの核酸物質は生産できないという欠点がある。さらに、植物性タンパク質原料を使用する場合、単にタンパク質を分解する工程のみを経るため、生産できるペプチド及びアミノ酸がタンパク質自体の濃度又は含量に依存するという問題がある。例えば、豆を使用する場合、生産される発酵液中のグルタミン酸含量が１０％未満であり、小麦グルテンを使用する場合、生産される発酵液中のグルタミン酸含量が１５％未満である。
【００１９】
一方、前記第２発酵工程である細菌発酵は、核酸及びグルタミン酸発酵液を製造する工程である。第２発酵工程である細菌発酵のみを行う場合、核酸及びグルタミン酸を効果的に生産することはできるが、他のアミノ酸及びペプチドの含量が１％未満の濃度で生産されるため、細菌発酵液は、旨味には優れているものの、調味素材として使用できないという欠点がある。言い換えれば、細菌発酵だけで得られた発酵液を調味素材として使用するためには、発酵液を食品に適用できるように発酵液に追加成分を添加しなければならないという欠点がある。
【００２０】
従って、本発明者らは、それぞれのカビ発酵過程及び細菌発酵過程の欠点を克服すると共に、天然調味素材の原料として用いられる発酵液を製造する方法を開発した。さらに、本発明者らは、開発した方法により製造した前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を用いる場合、追加成分を添加することなく製造された発酵液のみを用いて、任意の化学工程を行うことなく天然調味素材を製造することができることを見出した。
【００２１】
前記２段階の発酵過程を用いて、核酸及びグルタミン酸発酵液を製造するためには、炭素源及び窒素源と共に様々な無機塩、アミノ酸及びビタミン類が必要である。特に、既存の技術では、酵母抽出物又は植物性タンパク質加水分解物（ＨＶＰ）が窒素源として使用されたが、この場合、最終発酵液は異味と異臭があり、収率が多少低いという欠点があった。さらに、細菌発酵で使用される様々な物質に依存して全体的な風味だけでなく、最終培養液の調味成分の含量に大きな差が生じる。従って、本発明では、カビ発酵（第１発酵工程）により得られ、窒素源としての役割を果たしながら、多様なアミノ酸及びペプチドを含むことができる穀物発酵液（穀物タンパク質加水分解物）を、第２発酵工程である細菌発酵の基質として用いた。
【００２２】
細菌を用いて核酸又はＭＳＧを製造する既存の工程では、培養液中の核酸及びＭＳＧの濃度、並びに収率を増加させることだけが主に重要視されていた。このような増加は、旨味を向上させるには効果的であるが、場合によっては、最終調味素材の風味に悪影響を与える場合がある。しかし、本発明の前記ＩＭＰ又はグルタミン酸発酵液を用いて混合工程の追加及び反応工程により天然調味素材を製造すると、様々なアミノ酸、糖類、有機酸及び無機イオン等だけでなく、旨味成分であるＩＭＰ及びグルタミン酸の濃度を調整することによって風味を向上させることができる。
【００２３】
以下、本発明の方法におけるＩＭＰ又はグルタミン酸発酵液を製造方法に関する各工程について説明する。
【００２４】
本発明における工程（ａ）の方法は、カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程である。
【００２５】
工程（ａ）では、カビ発酵が植物性タンパク質原料を用いて行われるため、様々なアミノ酸及びペプチドを含み、また、第２発酵工程である細菌発酵において窒素源として使用され得るグルタミンなどの成分を含む、穀物発酵液を得ることができる。具体的には、穀物原料を基質にしてカビを培養することで、タンパク質分解酵素を含有する細胞培養液を製造し、その後、これを植物性タンパク質原料に添加し、次いで加水分解することによって、穀物タンパク質加水分解物を製造することができる。その後、穀物タンパク質加水分解物を濾過し細胞を除去することで、穀物発酵液を製造することができる。前記穀物タンパク質加水分解物は、第２発酵工程である細菌発酵に窒素源を供給するために、全窒素含量が２％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。
【００２６】
前記植物性タンパク質原料として、カビで発酵させることのできるものであれば、本発明において当業界に公知の任意の原料を使用してもよい。前記植物性タンパク質原料の例としては、これらに限定されるものではないが、大豆、トウモロコシ、米、小麦、小麦グルテンなどを含む。一方、小麦グルテンを使用する場合、多量のグルタミンを含有しているため、細菌発酵の収率を向上させることができるという利点がある。従って、好ましくは、前記植物性タンパク質原料として小麦グルテンを使用してもよい。
【００２７】
前記カビとして、植物性タンパク質原料を発酵させて本発明の穀物発酵液を製造できるものであれば、本発明において使用され得る任意のカビを使用してもよい。本発明で使用されるカビは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の微生物を使用するのが好ましく、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）の微生物を使用するのがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の一実施例では、特許文献１（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１−０４６２４９号に対応）に記載されているように、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）を使用して第１発酵工程であるカビ発酵を行った。
【００２９】
本発明における用語「穀物発酵液」とは、カビで植物性タンパク質原料（穀物）を発酵させることによって得られる産物を意味する。前記穀物発酵液は、第２発酵工程である細菌発酵の基質として利用することができ、また、発酵後に濾過及び細胞除去過程により穀物発酵液を得て調味材料を製造する最終工程にも利用することができる。従って、前述のように穀物発酵液は、２つの目的のために用いることができる。
【００３０】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた前記穀物発酵液を細菌で発酵させる工程である。この工程では、天然調味素材の原料として用いられるＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造することができる。具体的には、第１発酵工程であるカビ発酵により得られた前記穀物発酵液は、細菌発酵の基質として用いられ、前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液は、炭素源を補給した培地で穀物発酵液を細菌発酵に供することによって製造され得る。
【００３１】
前記細菌発酵は、当業界に公知の一般的な細菌培養法により行うことができ、好ましくは、フラスコ培養、スケールアップ培養及び本（ｍａｉｎ）培養の３段階から構成され得る。具体的には、スケールアップを達成するために、１次培養培地及び２次培養培地を用いてフラスコ培養及び拡大培養を行い、その後、持続的に追加糖を供給しながら、本培養培地で工程（ａ）の穀物発酵液を基質として用いて細菌発酵を行うことで、ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を得た。
【００３２】
前記細菌発酵用培地には、グルコース、フルクトースなどの炭素源を含んでもよく、特に、グルタミン酸発酵液を製造するための培地には、炭素源として原糖を含んでもよい。前記培地には、様々な無機塩、ビタミン類、アミノ酸などを含んでもよく、ＩＭＰ発酵液若しくはグルタミン酸発酵液を製造しようとする目的の発酵産物に合うように前記培地組成を変えてもよい。
【００３３】
例えば、前記ＩＭＰ発酵液を製造する場合、本培養培地には、グルコース、フルクトース、硫酸マグネシウム、リン酸、水酸化カリウム及び穀物発酵液が含まれてもよく、好ましくは、本培養培地には、培地の総体積に対して、４．４〜５．２ｗｔ％のグルコース、３．７〜４．３ｗｔ％のフルクトース、１．３〜１．７ｗｔ％の硫酸マグネシウム、２．０〜２．４ｗｔ％のリン酸、１．４〜１．８ｗｔ％の水酸化カリウム、及び０．５〜０．９ｗｔ％の穀物発酵液を含んでもよい。さらに、グルタミン酸発酵液を製造する場合、本培養培地には、グルコース、フルクトース、原糖、ベタイン、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム及びリン酸を含んでもよく、好ましくは、培地の総体積に対して、０．５〜０．７ｗｔ％のグルコース、０．９〜１．１ｗｔ％のフルクトース、４．５〜５．５ｗｔ％の原糖、０．００５〜０．０１５ｗｔ％のベタイン、０．３〜０．５ｗｔ％の硫酸マグネシウム、０．８〜１．０ｗｔ％のリン酸カリウム、及び０．２〜０．４ｗｔ％のリン酸を含んでもよい。
【００３４】
さらに、前記培地には、必要に応じて少量の他の成分を含んでもよく、例えば、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、ＣＡＰＡ、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、ＮＣＡ）、ビオチン、塩化カルシウム、チアミン、ビタミンＣなどを含んでもよい。これらの成分を含む各培地の代表的な例を、表５〜８及び表９〜１２に示した。
【００３５】
工程（ａ）におけるカビ発酵の結果として、前記植物性タンパク質原料は、アミノ酸及びペプチドに分解され、カルシウム、マグネシウム及びリン酸などの無機イオンと、ビタミン類などはタンパク質原料から溶出される。前記カビ発酵により生成されるアミノ酸は、グルタミン、システイン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどを含み、工程（ｂ）における細菌発酵の窒素源として利用され得る。特に、高濃度のグルタミンは、プリン生合成に必須の成分であり、高含量のＩＭＰ及びグルタミン酸生成のための主要なプロモーターとして作用し得る。さらに、前記溶出された無機イオン及びビタミン類は、細菌発酵における細菌菌体の成長にも役に立てる。本発明の実施例において、前記カビ発酵により得られた産物を栄養源として使用する場合、細菌菌体の増殖及び成長がより速くなることが確認された（図４）。この結果は、本発明の２段階過程の利点をさらに証明する。
【００３６】
本発明における用語「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」とは、工程（ａ）で得られた穀物発酵液を発酵させて、ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造することのできる任意の細菌を意味する。本発明により天然調味素材を製造するために、ｎｏｎ−ＧＭＯ菌株を使用してもよい。本発明で使用される前記細菌は、発酵によりＩＭＰ及びグルタミン酸を生産できる当業者に公知の任意の細菌を使用してもよい。例えば、ＩＭＰ発酵液を製造する場合は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）又はエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）の微生物を使用してもよく、グルタミン酸発酵液を製造する場合は、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、バシラス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）、カンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．）又はエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）の微生物を使用してもよい。より好ましくは、本発明で使用される前記細菌は、コリネバクテリウム属の微生物を使用してもよく、最も好ましくは、ＩＭＰ発酵液を製造するためには、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）を使用してもよく、グルタミン酸発酵液を製造するためには、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を使用してもよい。さらに、細菌として、先行特許文献に記載されており、ＩＭＰ及びグルタミン酸を製造する能力を有することが知られている、多様な細菌を使用してもよい。例えば、前記ＩＭＰ発酵液は、特許文献２（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５−０９５６２７号に対応）に記載された細菌であるバシラス属又はエシェリヒア属により製造され、前記グルタミン酸発酵液は、特許文献３（米国特許ＵＳ７２４７４５９号に対応）に記載されたエンテロバクター属又はクレブシエラ属を使用して製造され得るが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の一実施例では、ＩＭＰ発酵液を製造するために、特許文献４（ＷＯ国際公開ＷＯ２００２−０５１９８４号に対応）に記載されているように、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を使用しており、グルタミン酸発酵液を製造するために、特許文献５に記載されているように、コリネバクテリウム・グルタミクム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）、ＣＪ９７１０１０（ＫＦＣＣ１１０３９）を使用した。
【００３８】
工程（ｂ）における細菌発酵により得られた前記発酵液には、約１５０ｇ／Ｌの固形分を有する。本発明では、前記細菌発酵により得られたＩＭＰ及び／又はグルタミン酸発酵液が、任意の追加成分を添加することなく、天然調味素材の製造工程に使用されることを特徴とするので、前記発酵液には、所望の成分であるＩＭＰ及びグルタミン酸が多量に含まれていなければならない。
【００３９】
従って、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵により製造されたＩＭＰ発酵液における固形分中に、好ましくは、ＩＭＰ含量を３０％以上有してもよく、より好ましくは、５０％以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。従って、ＩＭＰ発酵液中のＩＭＰ濃度が、好ましくは、５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであってもよく、より好ましくは、７０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌであってもよい。
【００４０】
さらに、第１発酵工程であるカビ発酵により生産される産物にアミノ酸を含むので、ＩＭＰに比べ、高濃度及び高収率でグルタミン酸を得ることができる。製造されたグルタミン酸発酵液における固形分中に、グルタミン酸含量を、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、６０％以上有してもよいが、これらに限定されるものではない。従って、グルタミン酸発酵液中のグルタミン酸濃度が、好ましくは、７５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであってもよく、より好ましくは、９０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌであってもよい。
【００４１】
前述のように、発酵液中にＩＭＰ及びグルタミン酸を高含量で含むため、前記発酵液を乾燥などの過程により粉末化した場合に食品に適宜添加することができる。
【００４２】
本発明の発酵液は、任意の追加成分を添加せず、精製などの追加的な化学工程を経ることなく、天然調味素材の製造過程に利用されることを特徴とするので、発酵液を食品、例えば、加工食品に直接含ませるためには、全ての培地成分が食品原料でなければならない。従って、発酵の間に添加される全ての培地成分は、食品原料であることが好ましい。本発明の一実施例では、培地成分を食品原料として使用するために、β−アラニンをカルシウム−パントテネート（ＣＡ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ；  ＣＡＰＡ）に代替しても、７０ｇ／Ｌ以上のＩＭＰ濃度を有するＩＭＰ発酵液が製造できることを確認した。従って、本発明による細菌発酵用培地は、カルシウム−パントテネートを含むのが好ましい。
【００４３】
一方、濾過工程により天然調味素材を製造する過程で前記発酵液を使用するために、ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造するための本発明の方法は、前記細菌発酵により得られた発酵液を活性炭で処理する工程（ｃ）をさらに含んでもよい。さらに、本発明の方法は、前記発酵液を活性炭で処理する工程の後に、前記発酵液を遠心分離又は濾過する工程を含んでもよい。前記発酵液を活性炭で処理した後、濾過助剤として珪藻土でさらに処理してもよい。さらに、以後に行う濾過工程の収率を高めるために、発酵液に活性炭を処理する前に、発酵液を加熱する前処理過程を通じて細胞溶解を誘導してもよい。前記加熱工程は、７０〜９０℃で行うのが好ましく、加熱時間は、１５分以上であるのが好ましく、１５〜６０分間であるのがより好ましい。
【００４４】
それぞれのＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液は、工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む２段階の発酵過程により製造することができ、前記製造された発酵液は、最終的に３段階の反応を経て、様々な調味素材を製造する過程に使用することができる。前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を基に、発酵液を混合する過程、又は反応若しくは電気透析工程において、異なる原料を使用したり、培地組成を多少変更したり、又は温度、圧力及び時間を含む工程の条件を調節することによって様々な天然調味素材、例えば、中性風味調味素材、及び牛肉、鶏肉、豚肉、コク味などの調味素材を製造することができる。前記製造された天然調味素材の中から、それぞれの食品の目的に適した調味素材を食品に添加して最適の味を出すことができる。
【００４５】
従って、他の態様として、本発明は、（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させてＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する工程を含む天然調味素材を製造する方法を提供する。前記天然調味素材の製造方法は、工程（ａ）の穀物発酵液と、工程（ｂ）のＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液からなる群より選択される２つ以上の発酵液を混合する工程（ｃ）をさらに含んでもよい。
【００４６】
本発明における用語「調味素材（ｆｌａｖｏｒ）」とは、食品の風味を向上させるために添加する物質を意味する。前記調味素材は、味成分によって様々な調味素材に分類することができる。調味素材の具体的例としては、中性風味（ｎｅｕｔｒａｌ）調味素材、牛肉風味調味素材、鶏肉調味素材、豚肉調味素材及びコク味（ｋｏｋｕｍｉ）調味素材を含む。それぞれの調味素材は、本発明の２段階の発酵過程により製造されたＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を用いて製造することができる。例えば、前記用語「中性風味調味素材（ｎｅｕｔｒａｌ  ｆｌａｖｏｒ）」とは、旨味を最大化する一方で他の風味は最小化させることでマイルドで且つクリーンな風味を出す調味素材を意味し、前記用語「牛肉風味調味素材（ｂｅｅｆ  ｆｌａｖｏｒ）」、「鶏肉調味素材」及び「豚肉調味素材」とは、それぞれの牛肉、鶏肉及び豚肉の風味を有する調味素材を意味し、前記用語「コク味調味素材（ｋｏｋｕｍｉ  ｆｌａｖｏｒ）」とは、こってりとした味（ｒｉｃｈ  ｔａｓｔｅ）、濃い味（ｔｈｉｃｋ  ｔａｓｔｅ）、口の中に広がる味（ｍｏｕｔｈ−ｆｉｌｌｉｎｇ  ｔａｓｔｅ）、濃厚な味（ｄｅｎｓｅ  ｔａｓｔｅ）又はねばりのある味（ｓｔｉｃｋｙ  ｔａｓｔｅ）を指すコク味（ｋｏｋｕｍｉ（日本語））を生み出す物質を意味する。
【００４７】
一方、本発明の調味素材は、天然の調味素材であり、発酵液に任意の追加成分を添加することなく、発酵液に任意の化学工程を追加することなく発酵工程により得られた発酵液のみを用いて製造することを特徴とする。従って、本発明の調味素材は、合成調味素材とは対比される概念を持つ天然調味素材である。
【００４８】
前記天然調味素材を製造するための本発明の方法は、カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程及び細菌で前記穀物発酵液を発酵させてＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を得る工程を含む。本発明の天然調味素材は、２段階の発酵過程（カビ発酵と細菌発酵）により各発酵液を製造し、発酵液に任意の処理を追加することなく製造された発酵液を用いることによって製造することができる。各発酵工程は、下記のとおりである。
【００４９】
さらに、前記天然調味素材を製造するための本発明の方法は、前述のように各発酵液を製造した後に、前記穀物発酵液、ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液の中から選択される２つ以上の発酵液を混合する工程をさらに含んでもよい。この工程では、発酵液に追加成分を添加せず、前記発酵液に追加的な化学工程を追加することなく、前記発酵液を混合した後、所望の調味素材の用途に応じた温度、圧力及び時間を含む適切な条件下で反応させることで、様々な天然調味素材を製造することができる。この際、前記発酵液の混合比率、及び混合工程後の反応のための温度、圧力並びに時間が、各調味素材の用途に依存するが、これらの特異的条件に限定されるものではない。本発明は、それぞれの前記発酵液を用いて天然調味素材を製造することを特徴とする。
【００５０】
一方、前記混合工程は、調味素材の用途に応じた各発酵液の電気透析工程をさらに含んでもよい。前記電気透析工程は、調味素材から生じる異味と異臭を除去して、さっぱりしない後味又は苦味を排除すると共に調味素材がよりクリーンで且つマイルドな味を持つことを可能にし、最終的に製造しようとする調味素材の特徴に応じて選択することができる。
【００５１】
本発明の一実施例では、電気透析工程を用いて調味素材を製造し、前記製造された調味素材を、電気透析工程を行わずに製造された試料と官能特性を比較した。その結果、前記製造された調味素材は、金属性風味の強度、苦味、さっぱりしない後味の強度及び色の濃さにおいて全て低下し、それによって、製造された調味素材が、クリーンで且つマイルドな風味を有すると共に前記調味素材に関する全体的な嗜好度が向上したことが示唆された（図５）。
【００５２】
本発明における用語「電気透析（ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ、ＥＤ）」とは、イオン成分を溶液から分離する工程である。理論的に、電界（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ）にかけた電圧によって溶液中のイオン成分が陽イオン交換樹脂膜と陰イオン交換樹脂膜を選択的に通過するという物質伝達の原理に基づく方法である。これは、逆浸透圧及び限外濾過工程と共に最も頻繁に用いられる膜工程である。前記電気透析工程は、化学的工程として解釈されないので、本発明の目的による天然調味素材の製造工程に用いることができる。本発明の目的上、前記発酵液中のイオン、例えば、金属イオン、特に、一価と二価の陽イオン及び陰イオンを電気透析工程により除去することができ、それによって異臭が排除される。
【００５３】
一方、本発明の前記混合工程は、発酵液を濃縮し、前記濃縮産物を乾燥して粉末に製造する工程をさらに含んでもよい。前記発酵液を粉末に製造する工程は、発酵液を混合する前又は後に行ってもよく、好ましくは、前記発酵液を混合する前に行うことができる。前記乾燥は、好ましくは、噴霧乾燥又は真空乾燥によって達成することができる。前記発酵液は、最終的に、食品への添加に適した粉末又はペーストの形態に製造することができる。
【００５４】
さらに他の一態様として、本発明は、本発明の製造方法により製造されたＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を提供する。さらに他の一態様として、本発明は、本発明の製造方法により製造された天然調味素材を提供する。さらに他の一態様として、本発明は、前記天然調味素材を含む食品組成物もまた提供する。
【００５５】
本発明の前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液は、消費者の嗜好度に応じた天然調味素材を製造するための原料として使用され得る。本発明の前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を用いて製造した天然調味素材は、食品の味を最大化するための目的に適した食品に添加してもよく、飼料に適用してもよい。例えば、前記天然中性風味調味素材は、スナックシーズニング（ｓｎａｃｋ  ｓｅａｓｏｎｉｎｇ）、スープストック、市販用調味素材、ドレッシングなどに添加してクリーンな味を出すのに使用してもよく、前記天然牛肉風味調味素材は、ハム、ソーセージーなどに添加して牛肉風味を出すのに使用してもよく、前記天然コク味調味素材は、味噌（ｓｏｙ  ｐａｓｔｅ、ｂｅａｎ  ｐａｓｔｅ）、ヌードルスープ、  カレーなどに添加してコク味を出すのに使用してもよい。
【発明の効果】
【００５６】
本発明の方法により製造された前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液は、天然調味素材を製造するための原料として様々な方法で使用され得る。さらに、前記発酵液を用いて製造された天然調味素材は、天然原料を用いて使用されるため、人体に害がなく、安全に使用できると共に食品に添加するとクリーンで且つマイルドな味を出すことで食品の風味を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液と、これらの発酵液を用いて天然調味素材を製造する全体工程に関する概略図を示す。
【図２】本発明のアデニンを天然食品原料に代替するためにＡＭＰを酸加水分解する過程を示す。
【図３】β−アラニンを天然食品原料に代替するためにＣＡＰＡを導出する代謝経路を示す。
【図４】本発明のカビ発酵により分解された植物性タンパク質が栄養源として添加される場合と、植物性タンパク質が添加されない場合の細菌菌体の増殖程度を示す。
【図５】電気透析工程の前後における官能特性評価の結果を示す。
【図６】本発明による中性風味調味素材と酵母抽出物に関する官能特性の比較結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、実施例を参考にして本発明をより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことは、当業界に通常の知識を有するものにとって自明であろう。
【実施例】
【００５９】
実施例１：植物性タンパク質原料を用いたカビ発酵
第１カビ発酵のために、カビ菌株としてアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の微生物を使用し、大豆、トウモロコシ、米又は小麦などの穀物原料を含む基質を、２０〜３５℃で２４〜７２時間培養することで、高濃度のタンパク質加水分解酵素を含むカビ培養液を製造した。その後、大豆、トウモロコシ、米又は小麦などの植物性タンパク質原料を２５〜３５％の高濃度になるように水と混ぜて滅菌し、高濃度のタンパク質加水分解酵素を含む前記製造されたカビ培養液を無塩状態の滅菌された植物性タンパク質原料に添加し、該植物性タンパク質原料を加水分解した。この際、カビ培養液は、前記滅菌した基質液に対して、１０〜１００％の量を添加し、該基質を４０〜５０℃で４８〜９６時間分解して穀物タンパク質加水分解物を製造した。
【００６０】
具体的には、特許文献１（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１−０４６２４９号に対応）に記載されているように、アスペルギルス・ソーヤ、ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）を使用してフラスコ培養と拡大培養を行った後、脱脂大豆を用いてカビ培養液を製造し、小麦グルテンを基質にして加水分解することによって、穀物タンパク質加水分解物を製造した。より具体的には、１Ｌのフラスコに１次培地２００ｍＬを分注して滅菌し、カビ細胞２００ｍＬを１．７×１０１０カビ細胞／４００ｍＬの密度でフラスコに接種して３０℃、１００ｒｐｍで７時間培養した。その後、２次培地を２５０Ｌの発酵機に添加して滅菌し、１次培養液６００ｍＬを接種し、３０℃、７０ｒｐｍで２４時間培養した。次に、本培養培地を５トンの予備タンクに添加して９０℃で３０分間加熱し、８トンの発酵機に移した後、水１００Ｌ及び消泡剤２Ｌを添加した。その後、２次培養液１４４Ｌを本培養培地に接種した後、３０℃、７００ｒｍｐで４８時間培養することで、カビ培養液を製造した。最後に、基質を加水分解するための原料を５トンの予備タンクに添加して５５℃で１時間加熱し、２０トンの発酵機に移した後、水１００Ｌ及び消泡剤２Ｌを添加した後、滅菌した。その後、前記カビ発酵液５７６０Ｌを基質に接種して４５℃、３０ｒｐｍで９６時間培養することで、穀物タンパク質加水分解物を製造した。前記穀物タンパク質加水分解物の製造に使用された培地組成を、下記表１〜４に示した。
【００６１】
【表１】
2017093418.tif 000003
【００６２】
【表２】
2017093418.tif 000004
【００６３】
【表３】
2017093418.tif 000005
【００６４】
【表４】
2017093418.tif 000006
【００６５】
前述のように製造した穀物タンパク質加水分解物をフィルタープレス（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｅｓｓ）により濾過してカビ細胞を除去することによって、全窒素（ｔｏｔａｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）含量を２％（ｗ／ｖ）以上有し、加水分解率５０％以上の穀物発酵液を製造した。一方、前記穀物発酵液を、２次細菌発酵用培地として準備した。
【００６６】
実施例２：細菌発酵
前記穀物発酵液を用いてＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造するために、実施例１で製造された穀物発酵液にグルコース又はフルクトースなどの炭素源と、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ及びＺｎなどの無機塩、及びビタミン類を添加した後滅菌することで、細菌発酵用培地を製造した。ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造するための培地を製造し、各発酵液に対して、フラスコ培養（１次培地）、拡大培養（２次培地）及び本（ｍａｉｎ）培養のための培地が製造された。
【００６７】
２−１：ＩＭＰ発酵液の製造
特許文献４（ＷＯ国際公開ＷＯ２００２−０５１９８４号に対応）に記載されているように、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を使用して、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造した。
【００６８】
具体的には、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．２に調整した１次培地５０ｍＬを５００ｍＬのフラスコに分注して１２１℃で１５分間滅菌して該細菌菌株を培地に接種した後、３２℃、２００ｒｐｍで２２〜２８時間培養した。その後、ｐＨを７．２に調整しながら、２次培地２．１Ｌを５Ｌのｊａｒに分注して滅菌し、冷却した後、１次培養液３００ｍＬを接種し、２Ｌの空気下、３２℃、９００ｒｍｐで２７〜３０時間培養した。次に、本培養培地８．５Ｌを３０Ｌのｊａｒに分注して滅菌し、冷却した後、ｐＨ７．２に調整しながら、２次培養液１５００ｍＬを接種し、５Ｌの空気下、３２℃、４００ｒｐｍで５〜６日間、グルコースとフルクトースの混合物を含む糖を追加して随時供給しながら培養した。最後の追加糖を供給した後、該培地を７時間以上培養して糖が完全に消失できるようにした。前記ＩＭＰ発酵液の製造に使用される培地組成を、下記表５〜８に示した。
【００６９】
【表５】
2017093418.tif 000007
【００７０】
【表６】
2017093418.tif 000008
【００７１】
【表７】
2017093418.tif 000009
【００７２】
【表８】
2017093418.tif 000010
【００７３】
２−２：グルタミン酸発酵液の製造
特許文献５に記載されているように、コリネバクテリウム・グルタミクム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）、ＣＪ９７１０１０（ＫＦＣＣ１１０３９）を使用して、グルタミン酸濃度を９０ｇ／Ｌ以上有するグルタミン酸発酵液を製造した。
【００７４】
具体的には、２５０ｍＬのフラスコに、１次培地３０ｍＬを分注して滅菌し、該細菌菌株を培地に接種して５〜８時間培養した。その後、５Ｌのｊａｒに２次培地１．４Ｌを分注して滅菌し、冷却した後、１次培養液２０ｍＬを接種して２０〜２８時間培養した。その後、３０Ｌのｊａｒに本培養培地９．２Ｌを分注して滅菌し、冷却した後、２次培養液８００ｍＬを接種して３６〜４５時間、追加糖を随時供給しながら培養した。
【００７５】
最後の追加糖を供給した後、該培地を７時間以上培養して糖が完全に消失できるようにした。前記グルタミン酸発酵液の製造に使用される培地組成は、下記表９〜１２に示した。
【００７６】
【表９】
2017093418.tif 000011
【００７７】
【表１０】
2017093418.tif 000012
【００７８】
【表１１】
2017093418.tif 000013
【００７９】
【表１２】
2017093418.tif 000014
【００８０】
前記ＩＭＰ発酵液の製造用培地を用いてＩＭＰ発酵液を製造し、食品に添加するための調味素材として使用するためには、食品添加物の要求を満たすために、いくつかの培地成分は食品原料に代替しなければならない。従って、細胞成長に必須であるアデニン及びβ−アラニンは、食品原料に代替した。
【００８１】
まず、アデニンは、ＡＭＰを酸加水分解することによってリボース（ｒｉｂｏｓｅ）とのβ−Ｎ−グリコシド結合（β−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）を開裂させ、アデニンを遊離させることにより製造した。前述のように製造されたアデニンを使用して培養する場合、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造できることを確認した（図２）。
【００８２】
その後、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスの代謝経路を確認した結果、β−アラニンを、カルシウム−パントテネート（ＣＡＰＡ）に代替可能であることが予測された。従って、β−アラニンに代わりに、ＣＡＰＡを使用して培養した結果、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造できることを確認した（図３）。
【００８３】
実施例３：カビ発酵による産物を細菌発酵に用いる場合における細菌菌体の成長速度の確認
第１発酵工程であるカビ発酵と第２発酵工程である細菌発酵が連続的に行われる場合の利点を確認するために、前記第１カビ発酵工程により分解される植物性タンパク質が栄養源として添加される場合と、植物性タンパク質が添加されない場合の細菌菌体の成長速度及び増殖程度を確認した。
【００８４】
その結果、図４に示したように、第１カビ発酵工程により分解された植物性タンパク質を栄養源として添加する場合、植物性タンパク質を添加してない場合に比べ、細菌菌体の増殖がより速く、多量であることが確認された（図４）。
【００８５】
実施例４：炭素源の種類によるグルタミン酸発酵液の風味特性変化の確認
グルタミン酸発酵に使用され得る炭素源は、グルコース、フルクトース、糖蜜（ｃａｎｅ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、原糖などを含む。炭素源の種類によってその他の培地成分が多少異なるが、最終発酵液中のグルタミン酸濃度は、炭素源の種類に大して依存しない。しかし、発酵液の風味は、炭素源の種類に依存して大きく変化し、中性風味調味素材を開発するためには、最終発酵液がクリーンな風味を有するのが好ましい。糖蜜は、その中に含まれた様々な無機イオンにより微生物の発酵の観点からすると、優れた培地成分であるが、培地自体の色が非常に濃く、キャラメル反応による香味が最終培養液に残るため、天然調味素材としてのその使用価値が低いという欠点がある。
【００８６】
従って、中性風味調味素材を製造するためのグルタミン酸発酵液の製造において、糖蜜の代わりに原糖を使用することによる最終培養液の風味特性の変化を確認した。この際、糖蜜を原糖に代替しながら、糖蜜に含まれる主要な無機イオン及びビタミン類を培地にさらに添加した。その結果、糖蜜を原糖に代替した場合、異臭が除去され、中性風味調味素材を製造するための好適な風味特性が生み出されることが確認された（表１３）。さらに、原糖を使用して製造したグルタミン酸発酵液の場合も高濃度のグルタミン酸（９６ｇ／Ｌ以上）を含むため、中性風味調味素材を製造するのに適切であることが確認された。
【００８７】
【表１３】
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【００８８】
実施例５：中性風味調味素材の製造
実施例２で製造されたグルタミン酸発酵液とＩＭＰ発酵液を使用して中性風味調味素材を製造した。
【００８９】
具体的には、以後に行われる濾過工程の収率を高めるために、各発酵液を７０〜９０℃で１５分以上加熱して細胞溶解を誘導した。このような前処理過程は、濾過収率を８５％以上に高めることができる。その後、該グルタミン酸発酵液及びＩＭＰ発酵液から発生する異味及び異臭を除去するために、発酵液の量に対して、１〜３％（ｗ／ｖ）の活性炭を添加した後、５０〜７０℃で２〜２４時間活性炭を処理した。活性炭の処理後、発酵液に濾過助剤として１〜３％（ｗ／ｖ）の珪藻土を添加した後、フィルタープレスにより濾過した。
【００９０】
前記活性炭で処理した濾過液を電気透析を通じて、Ｃａ、Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ及びＮＨ４イオンを含む一価と二値イオンを除去することで、アンモニアと金属イオンから発生する異臭を排除し中性風味調味素材を製造した。
【００９１】
前記発酵液が５〜２０Ｌ／ｈｒ・ｍ２の流速で電気透析工程を経る場合、Ｃａ、Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ及びＭｎイオンを含む一価と二値イオンが３０〜６０％減少した。前記電気透析工程を行う前後の発酵液の成分含量を下記表１４に示した。下記に示すように、電気透析工程の後、発酵液中の無機イオン含量が減少したため、前記発酵された調味素材がよりクリーンで且つマイルドな風味を有することが確認された。
【００９２】
最終的に、前述のような培養と濾過工程により得られた濾過液に、精製塩とマルトデキストリン（Ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）を添加し、前記混合液を噴霧乾燥により粉末化することで本発明の天然調味素材を製造した。
【００９３】
【表１４】
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【００９４】
実施例６：電気透析工程による官能特性の評価
前述のように製造された本発明の中性風味調味素材の風味を確かめるために、官能特性評価を行った。
【００９５】
電気透析により無機イオンを除去した各試料と、電気透析工程を行っていない試料を粉末化した後、前記試料の官能特性をパネラーにより評価してもらった。前記パネラーは、官能特性を知覚できるように職業訓練されており、前記パネラーに同じ濃度の試料を提供し、それぞれの試料に対する官能特性と強度を評価してもらった。
【００９６】
その結果、図５に示したように、旨味の強度は、電気透析工程の前後でほとんど差がなかったが、電気透析工程前の発酵液の場合には、官能特性にマイナス要因として作用する金属性風味、苦味、さっぱりしない後味及び色の濃さにおいて全て高く、それによって、前記発酵液に対するクリーンさと全体的な嗜好度が低かった。しかし、電気透析工程を行った発酵液の場合、金属性風味の強度、苦味、さっぱりしない後味の強度及び色の濃さにおいて全て低く、それによって、風味と色への嗜好度は全て高く、クリーン性及び全体的な嗜好度も高かった。従って、電気透析工程を行った場合は、電気透析工程を行う前に比べ、嗜好度が向上したクリーンな風味を有する中性風味調味素材を製造できることが確認された。
【００９７】
実施例７：酵母抽出物との官能特性の比較
本発明の中性風味調味素材の風味効果を検討するために、最近、最も幅広く多様に使用されている天然調味素材の１つである酵母抽出物との官能特性を比較した。
【００９８】
場合によっては、前記酵母抽出物は、加工食品において有益に使用される場合もあるが、ほとんどの場合、特有の発酵臭（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｆｌａｖｏｒという）に起因する異味と異臭により加工食品の持つ風味のバランスが崩れるので、加工食品では、その使用が制限される。
【００９９】
従って、簡単な食品モデルを開発し、各酵母抽出物及び本発明の中性風味調味素材をそこに添加した後、研究員（ｎ＝４５）から構成されるパネラーグループにより官能特性を評価した。
【０１００】
その結果、図６に示したように、酵母抽出物を適用させた群では、酵母風味（ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｒ）の強度が高く、酵母抽出物に対する嗜好度は低かった。そして、前記酵母抽出物を異味と異臭として知覚する傾向が現れた。従って、この結果は、本発明における中性風味調味素材の全ての味に対する嗜好度が、比較的に高いことを示す。
【０１０１】
これらの結果は、本発明の中性風味調味素材から発生する無機イオンによる異味と異臭を効果的に除去し、それによって、食品に適用した場合、良い風味を出す中性風味調味を製造できることを示す。
【０１０２】
さらに、本発明の中性風味調味素材と酵母抽出物の官能特性が、修正された定量的記述分析法（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて９人の訓練されたパネラーにより比較された。具体的には、前記パネラーは、６時間訓練しており、官能特性を３回繰り返して測定した。６種類の試料を同時にパネラーに提供し、パネラーがランダムに摂るようにした。全部で１６の特性を１６点（０〜１５）基準で評価した。前記評価された１６の特性を、６つのアロマ（ａｒｏｍａ）特性、５つの味（ｔａｓｔｅ）特性、３つの風味（ｆｌａｖｏｒ）特性、２つの口中で感じる食感（ｍｏｕｔｈ  ｆｅｅｌｉｎｇ）特性により評価した。試料の試食後は、インスタントライス又は水で口をゆすいだ後、次の試料を試食した。陶器カップに入っている各試料７０ｍＬをパネラーに提供し、統計分析（Ｍｅａｎ、ＭＡＮＯＶＡ、ＰＣＡ）を行った。
【０１０３】
その結果、本発明の天然調味素材の場合、酵母抽出物に比べ、砂糖の甘焦げ香、酸っぱい香り、ソロモンシール茶風味を強く感じるので、天然調味素材は、香ばしくて酸味を有する。さらに、前記中性風味調味素材の場合、培地成分から生成すると思われる茹でたジャガイモ香又は香ばしさは感じられず、発酵臭であると判断される醤油臭さは、酵母発酵に比べ、著しく低かった。さらに、本発明の天然中性風味調味素材は、競合社で製造された他の調味素材に比べ、口中を覆う強度が著しく高かった。これは、少量の使用でも天然中性風味調味素材は口中を覆う感触を容易に示すことができることを表す。具体的には、本発明の天然中性風味調味素材の個別特性からすると、グルタミン酸に関しては、前記旨味強度は非常に高く穀物の焦げ香又は香味（ソロモンシール茶）が強烈であり、ＩＭＰに関しては、前記旨味強度は、酵母抽出物と同程度で砂糖の甘焦げ香が強烈で、中性風味調味素材が持つ酸味を有する。さらに、酵母抽出物は、茹でたジャガイモ香又は香ばしさ、又は醤油臭みがすることを確認することができた。
【０１０４】
実施例８：牛肉風味調味素材の製造
実施例１で製造された穀物発酵液と、実施例２で製造されたグルタミン酸発酵液及びＩＭＰ発酵液を使用して牛肉風味調味素材を製造した。
【０１０５】
具体的には、以後に行われる濾過工程の収率を高めるために、各発酵液を７０〜９０℃で１５分以上加熱して細胞溶解を誘導した。このような前処理過程は、濾過収率を８５％以上に高めることができる。その後、該グルタミン酸発酵液及び該ＩＭＰ発酵液から発生する異味及び異臭を除去するために、発酵液の量に対して、１〜３％（ｗ／ｖ）の活性炭を添加した後、５０〜７０℃で２〜２４時間活性炭で処理した。活性炭の処理後、発酵液に濾過助剤として１〜３％（ｗ／ｖ）の珪藻土を添加した後、フィルタープレスにより濾過した。その後、前記過程によって濾過された発酵液を使用した。
【０１０６】
一方、植物性タンパク質のカビ発酵と細菌発酵により得られた発酵液には、植物性タンパク質に由来し、細菌の代謝経路により生成されたシステイン及びメチオニンなどの硫含有のアミノ酸と有機酸、残糖などが含まれる。
【０１０７】
前記穀物発酵液と前記ＩＭＰ発酵液を、１：４の割合で混合し、８０〜１２０℃、０．８〜１．５ｂａｒで０．５〜２４時間メイラード反応に供した。この際、細菌発酵により生成されたＩＭＰ中の１０％においては、高温によりリン酸基と５炭糖の結合が開裂して５炭糖が生成され、そして、前記生成された５炭糖はメイラード反応の前駆体として利用することができるため、追加糖を添加しなくても、牛肉風味調味素材を形成させることができる。メイラード反応は、アマドリ（ａｍａｄｏｒｉ）転位化合物、２，６−ジメチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン及びジメチルピラジンを生成させ、これらの化合物により牛肉風味調味素材が形成された。
【０１０８】
他の反応ルートにおいて、細菌発酵の終了後、ｐＨを５〜７に調整するために反応の後半にアンモニアの供給を止め、培養液中における成分の高温／高圧反応により３，４−ジデオキシグリコースロース−３−エン（３，４−ｄｉｄｅｏｘｙ  ｇｌｙｃｏｓｕｌｏｓ−３−ｅｎｅ）が生成され、その後、フラン化合物の生成により牛肉風味調味素材が形成された。
【０１０９】
前述の反応により製造された反応液を、噴霧乾燥又は真空乾燥して牛肉風味調味素材に製造した。具体的には、固形分が３５〜５０％になるように精製塩及びデキストリンを反応液に添加し、前記混合物を噴霧乾燥又は真空乾燥して粉末化し、或いは固形分が７０％になるように濃縮してペースト化した。前記牛肉風味調味素材は、動物性原料を含まないにも関わらず、微生物発酵液の反応により牛肉を添加したような効果を期待することができる。
【０１１０】
実施例９：牛肉風味調味素材の適用による官能特性評価
本発明における牛肉風味調味素材の適用が、牛肉風味を有する既存の調味料の使用に比べ、牛肉の風味を向上させるか否かを確認するために官能特性評価を行った。
【０１１１】
９−１：牛肉と大根のスープ
既存の牛肉風味調味料を添加した牛肉と大根のスープを作り、本発明の牛肉風味調味素材を追加して添加した。本発明の牛肉風味調味素材の添加前と後の牛肉の風味に関する官能特性を評価した。官能評価は、調味料を使用する主婦８４名を対象に行った。
【０１１２】
嗜好度と強度などの官能特性は、５点基準で評価された。その結果、下記表１５に示したように、牛肉風味調味素材を適用した群において、全般的な味の嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前の群より、０．２点以上高く、特に、牛肉風味調味素材の適用後の牛肉風味調味素材に対する強度と嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前に比べ、著しく高かった。
【０１１３】
【表１５】
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【０１１４】
９−２：トマトミートソース
トマトと肉を同量含むトマトミートソースに、粉末化した牛肉風味調味素材を添加して、牛肉風味調味素材を添加する前と後のトマトミートソースに対する官能特性を８０名の主婦に評価してもらった。嗜好度と強度などの官能特性は、５点基準で評価された。
【０１１５】
その結果、下記表１６に示したように、牛肉風味調味素材を適用した群において、全体的な味の嗜好度が、牛肉風味調味素材を適用する前の群より、０．２点以上高く、牛肉風味調味素材を適用した後の牛肉香味に対する強度と嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前に比べ、著しく高かった。このような結果は、ミート香味に基づく製品に牛肉風味調味素材を適用する場合でも、製品のミート香味を増加させることができ、製品の全体的な味質を向上させることを示す。
【０１１６】
【表１６】
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【０１１７】
実施例１０：コク味調味素材の製造
実施例１で製造された穀物発酵液と、実施例２で製造されたグルタミン酸発酵液及びＩＭＰ発酵液を使用してコク味調味素材を製造した。
【０１１８】
具体的には、以後に行われる濾過過程の収率を高めるために、各発酵液を７０〜９０℃で１５分以上加熱して細胞溶解を誘導した。このような前処理過程は、濾過収率を８５％以上に高めることができる。その後、該グルタミン酸発酵液及び該ＩＭＰ発酵液から発生する異味及び異臭を除去するために、発酵液の量に対して、１〜３％（ｗ／ｖ）の活性炭を添加した後、５０〜７０℃で２〜２４時間活性炭で処理した。活性炭の処理後、発酵液に濾過助剤として１〜３％（ｗ／ｖ）の珪藻土を添加した後、フィルタープレスにより濾過した。その後、前記過程によって濾過された発酵液を使用した。
【０１１９】
一方、カビで植物性タンパク質原料を発酵させると、タンパク質原料中における低分子量のペプチド及びアミノ酸の含量が増加する。言い換えれば、２，０００Ｄａ以下の分子量を有する低分子量のペプチド含量が、３０％以上であり、好ましくは、１，５００Ｄａ以下の分子量を有する低分子量のペプチド含量が４０〜６０％であってもよい。さらに、前記タンパク質原料は、低分子量のペプチドを有し、平均的にそれぞれ１４個以下のアミノ酸残基からなる。カビ発酵により製造された穀物発酵液が、細菌発酵の栄養源として使用されて最終的に適切に混合される場合、核酸：グルタミン酸：ペプチドを約１：１：１〜１：１：５の比率で含むコク味調味素材を製造することができる。具体的には、前記穀物発酵液、前記ＩＭＰ発酵液及び前記グルタミン酸発酵液を混合して、７０〜１００℃で０．５〜２４時間反応させた。前記反応終了後、固形分が３５〜５０％になるように反応液に精製塩及びデキストリンを添加し、前記混合物を噴霧乾燥又は真空乾燥して粉末化し、或いは固形分が７０％になるように濃縮してペースト化した。前記コク味調味素材は、製品のボディ感を増強させることができると同時に塩味増強効果を期待することができる。
【０１２０】
実施例１１：コク味調味素材の適用による官能特性評価
本発明におけるコク味調味素材を適用すると、口からの質感及び重さと称する製品のボディ感を向上させることができると同時に製品における塩味増強効果を期待することができる。その効果を確かめるために、官能特性評価を行った。
【０１２１】
１１−１：低塩味噌
塩分含有量が低い状態で発酵された味噌の場合、香ばしい香味（ｄｅｌｉｃａｔｅ  ｆｌａｖｏｒ）が少なく、特に、中間ボディ感（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｂｏｄｙ  ｆｅｅｌｉｎｇ）が弱くなると同時に味のバランスが崩れ、このような理由により、全体的に味が低下する。コク味調味素材における味噌のボディ感及び塩味増強効果を確かめるために、従来の味噌、低塩味噌及び低塩味噌に０．３％（ｗ／ｗ）のコク味調味素材を含む味噌をパネラーに提示し、各味噌の全体的な味に対する官能評価をパネラーにより行った。
【０１２２】
嗜好度と強度などの官能特性は、５点基準で評価された。その結果、下記表１７に示したように、前記低塩味噌は、従来の味噌に比べ、全体的な官能特性が低下したが、前記コク味調味素材を添加した味噌では、官能特性が増加することが示された。具体的には、香ばしい香味は、食品の中間ボディ感に影響を及ぼす特性があり、これは、味噌が持つ主要特性である。香ばしい香味の強度と嗜好度は、低塩味噌の場合は低いが、コク味調味素材の添加を含む味噌の場合では増加した。さらに、コク味調味素材の添加を含む味噌の場合、塩味に対する強度と嗜好度が、従来の味噌の場合に比べ、より高かった。これらの結果は、コク味調味素材が味噌のボディ感及び塩味を増加できることを示す。
【０１２３】
【表１７】
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【０１２４】
１１−２：キノコのクリームスープ
コク味調味素材の塩味増強効果を確かめるために、０．１％（ｗ／ｗ）のコク味調味素材の添加を含むキノコのクリームスープをパネラーに提示し、前記キノコのクリームスープの塩味に対する知覚強度をパネラーにより評価してもらった。前記パネラーは、絶対的に塩味を知覚できるように訓練された専門パネラーから構成され、該試料を４０〜５０℃の温度で提供し、該試料は３回繰り返して提供した。塩味の知覚強度の平均値は、ＡＮＯＶＡにより分析した。前記塩味の知覚強度を評価するとき、偏差を排除するために参考尺（ｓｃａｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を適用した。
【０１２５】
その結果、下記表１８に示したように、コク味調味素材（ＫＦ）の添加を含む前記スープの場合、塩味に対する知覚強度が、コク味調味素材を添加しないスープに比べ、１４．５％増加した。これらの結果から、無塩工程により製造された前記コク味調味素材が、製品の塩含量に影響を及ぼさないにも関わらず、コク味調味素材が製品の塩味を増強させる効果を持つことを確認することができた。
【０１２６】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月23日(2017.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び
（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させる工程を含む、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液の製造方法。
【請求項２】
前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液が、天然調味素材を製造するための原料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物性タンパク質原料が、大豆、トウモロコシ、米、小麦及び小麦グルテンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カビが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アスペルギルス属の微生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）またはブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地組成が、食品原料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌発酵用培地組成が、カルシウム−パントテネート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ、ＣＡＰＡ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＭＰ発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、硫酸マグネシウム、リン酸、水酸化カリウム及び穀物発酵液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、原糖（ｒａｗ  ｓｕｇａｒ）、ベタイン、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム及びリン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地の炭素源が、原糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記製造されたＩＭＰ発酵液中のＩＭＰ濃度が、５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記製造されたＩＭＰ発酵液における固形分中のＩＭＰ含量が、３０ｗｔ％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記製造されたグルタミン酸発酵液中のグルタミン酸濃度が、７５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記製造されたグルタミン酸発酵液における固形分中のグルタミン酸含量が、５０ｗｔ％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｃ）前記細菌発酵により得られた前記発酵液を活性炭で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵液を活性炭で処理した後に、処理した培養液を遠心分離又は濾過する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵液を活性炭で処理する前に、発酵液を７０〜９０℃の温度で１５〜６０分間加熱して細胞溶解を誘導する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；及び
（ｂ）細菌で穀物発酵液を発酵させてＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造する工程を含む、天然調味素材の製造方法。
【請求項２２】
（ｃ）工程（ａ）の穀物発酵液と、工程（ｂ）の前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液からなる群より選択される２つ以上の発酵液を混合する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記天然調味素材は、任意の追加成分を添加することなく、前記発酵液のみを用いて製造される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記天然調味素材は、追加的な化学工程を発酵液に加えることなく、前記発酵液を用いて製造される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）の前に、前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を電気透析する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【外国語明細書】
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