(57)【要約】      （修正有）【課題】グアニン四重鎖を形成する核酸アプタマーを利用したシグナリングアプタマーのスクリーニング方法の提供。【解決手段】ａ）候補化合物の２９５ｎｍにおける融解曲線を測定し、温度上昇に伴って吸光度が減少傾向にあるものを選択すること、（ｂ）工程（ａ）で選択された候補化合物のＣＤスペクトルを測定し、負のモル楕円率極小値と正のモル楕円率極大値から、パラレル型のグアニン四重鎖構造、アンチパラレル型のグアニン四重鎖構造、又はハイブリッド型のグアニン四重鎖構造を有する候補化合物を選択すること、（ｃ）工程（ｂ）で選択された候補化合物の融解温度を算出し、工程（ａ）で得られた溶解曲線からは融解温度を算出することができないか又は融解温度が低い候補化合物を選択する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）候補化合物の２９５ｎｍにおける融解曲線を測定し、温度上昇に伴って吸光度が減少傾向にあるものを選択すること、
（ｂ）工程（ａ）で選択された候補化合物のＣＤスペクトルを測定し、
２３５−２４４ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有し、２５５ｎｍ−２６５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有するパラレル型のグアニン四重鎖構造、
２４５−２５０ｎｍと２９５−３０５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２６０−２７０ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有するアンチパラレル型のグアニン四重鎖構造、又は
２３５−２４４ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有し、２５５ｎｍ−２６５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２４５−２５０ｎｍと２９５−３０５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２６０−２７０ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有するハイブリッド型のグアニン四重鎖構造
を有する候補化合物を選択すること、
（ｃ）工程（ｂ）で選択された候補化合物の融解温度を算出し、工程（ａ）で得られた溶解曲線からは融解温度を算出することができないか又は融解温度が低い候補化合物を選択すること
を含む、シグナリングアプタマーのスクリーニング方法。
【請求項２】
さらに、工程（ｃ）で選択された候補化合物を蛍光分子及び消光分子で修飾し、蛍光分子で修飾された候補化合物を種々の濃度の標的分子と接触させ、蛍光強度を測定すること、及び
標的分子の濃度の変化に依存して蛍光強度が増加又は減少する候補化合物を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的分子が、タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナリングアプタマーのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、特定の分子と特異的に結合する核酸分子やペプチドである。核酸アプタマーは多様な立体構造を有する一本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡであり、アミノ酸のような小分子からタンパク質のような大きな分子まで、様々な分子と結合できるものがこれまでに報告されている。抗体と同程度の結合能を有し、熱安定性が高く保存性に優れている、免疫原性がない、合成や修飾が容易で安価である、毒性が低いなどの特長をもつ。また、アプタマーは以下に示す理由からバイオセンサー素子として適していると考えられる。ターゲットと結合した際に大きな構造変化を起こし、それに伴い修飾した蛍光団等のシグナル強度を変化させることができる。また、抗体のような他の試薬と比べた場合、簡単に合成でき、特定の部位への色素などの導入も容易である。したがって、適切に分子を設計すれば、アプタマーは、ターゲット分子と結合した際のコンフォメーションの変化を化学的シグナルに変換することが可能となる。たとえば、コカインと結合した際に蛍光色素の転移により脱色するコカインアプタマーと蛍光色素の複合体や、細胞膜タンパク質をターゲットとし、本ターゲットを認識することで構造変化を起こして蛍光を発するプローブなどが報告されている（非特許文献１及び２）。
【０００３】
アプタマーがターゲット分子と結合した際に大きな構造変化を起こすという特長を活かすことによって、常時発蛍光型のシグナル分子プローブとは異なり、ターゲットと結合したときのみ、蛍光強度が変化する分子プローブの構築が可能である。このような蛍光検出能を有する核酸アプタマー（シグナリングアプタマー）は、核酸アプタマーの塩基配列上の適切な箇所に一つまたは二つの蛍光分子を修飾したものであり、標的分子との結合に伴う構造変化を蛍光シグナルとして利用する。同プローブ分子を設計する際、従来は、アプタマーの塩基配列から二次構造を予測し、ターゲット分子と結合する部位を同定した後に相補的な配列をアプタマー配列に組み込む、または補助ＤＮＡとして添加するという方法が用いられてきた。しかし、このような従来法によれば、大きな構造変化が期待できるが、結合部位が覆われるため結合能が低下する点、さらに結合部位の同定や相補配列の長さの最適化をアプタマーごとに行うために設計から獲得までに多大な労力と時間を要する点に課題がある。
【０００４】
一方、グアニン含有量の多い一本鎖核酸配列は、非ワトソン・クリック塩基対部であるＧ−カルテット（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）を分子内に有し、グアニン四重鎖（Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成しているものがある。グアニン四重鎖の特徴として、高い融解温度（Ｔｍ）と円二色性（ＣＤ）がある。一般的な一本鎖核酸配列は２６０ｎｍに強い吸収を持っているため、２６０ｎｍの吸収を温度に対してプロットすることでＴｍを算出するが、グアニン四重鎖は２９５ｎｍに特徴的な吸収を持っていることが分かっており、２９５ｎｍの吸収を温度に対してプロットすることでＴｍを算出する（非特許文献３）。また、グアニン四重鎖は構造によって異なるＣＤを示すことが分かっている。パラレル型グアニン四重鎖は２４０ｎｍ付近に負のコットン効果が、そして２６５ｎｍ付近に正のコットン効果があり、アンチパラレル型グアニン四重鎖は、２９５ｎｍ付近に強い正のコットン効果が、２６５ｎｍ付近に弱い負のコットン効果が、そして２４５ｎｍ付近に弱い正のコットン効果がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Stojanovic, Milan N., and Donald W. Landry. "Aptamer-based colorimetric probe for cocaine." Journal of the American Chemical Society 124.33 (2002): 9678-9679
【非特許文献２】Shi, Hui, et al. "Activatable aptamer probe for contrast-enhanced in vivo cancer imaging based on cell membrane protein-triggered conformation alteration."Proceedings of the National Academy of Sciences 108.10 (2011): 3900-3905
【非特許文献３】Mergny, Jean-Louis, Anh-Tuan Phan, and Laurent Lacroix. "Following G-quartet formation by UV-spectroscopy." FEBS letters 435.1 (1998): 74-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規のシグナリングアプタマーのスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇ−カルテット（以下、Ｇカルテットとも、グアニン四重鎖構造ともいう）を分子内に有し、グアニン四重鎖を形成する核酸アプタマーを利用したシグナリングアプタマーのスクリーニング方法を見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下に関する。
［１］下記工程：
（ａ）候補化合物の２９５ｎｍにおける融解曲線を測定し、温度上昇に伴って吸光度が減少傾向にあるものを選択すること、
（ｂ）工程（ａ）で選択された候補化合物のＣＤスペクトルを測定し、
２３５−２４４ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有し、２５５ｎｍ−２６５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有するパラレル型のグアニン四重鎖構造、
２４５−２５０ｎｍと２９５−３０５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２６０−２７０ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有するアンチパラレル型のグアニン四重鎖構造、又は
２３５−２４４ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有し、２５５ｎｍ−２６５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２４５−２５０ｎｍと２９５−３０５ｎｍに正のモル楕円率極大値を有し、２６０−２７０ｎｍに負のモル楕円率の極小値を有するハイブリッド型のグアニン四重鎖構造
を有する候補化合物を選択すること、
（ｃ）工程（ｂ）で選択された候補化合物の融解温度を算出し、工程（ａ）で得られた溶解曲線からは融解温度を算出することができないか又は融解温度が低い候補化合物を選択すること
を含む、シグナリングアプタマーのスクリーニング方法、
［２］さらに、工程（ｃ）で選択された候補化合物を蛍光分子及び消光分子で修飾し、蛍光分子で修飾された候補化合物を種々の濃度の標的分子と接触させ、蛍光強度を測定すること、及び
標的分子の濃度の変化に依存して蛍光強度が増加又は減少する候補化合物を選択することを含む、［１］に記載の方法、
［３］標的分子が、タンパク質である、［１］又は［２］に記載の方法。
【０００８】
本発明において標的分子とは、核酸アプタマーを利用した検出方法などにおいて、検出の標的となる分子のことをいう。標的分子の化学種は特に制限されず、低分子化合物、高分子化合物、および生体由来物質など様々な化学種を含むことができる。また、標的分子は、固相担体の表面に固定することができる。より具体的には、たとえば、糖類、脂質類、オリゴペプチド、タンパク質、及び核酸を挙げることができる。標的分子機能としては、たとえば、抗原、抗体、リガンド、レセプター、相互作用タンパク質などを挙げることができる。
【０００９】
本発明において候補化合物とは、一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡであって、所定の標的分子に対する親和性が高く、特異的に結合し得る分子のことをいう。このような性質を有する核酸分子を核酸アプタマーという。
【００１０】
本発明において融解曲線とは、２６０ｎｍ及び２９５ｎｍにおける核酸アプタマーの吸光度を縦軸に、横軸に温度（４℃〜９５℃）をプロットした曲線である。
【００１１】
本発明において温度上昇に伴って吸光度が減少傾向にあるものとは、２６０ｎｍ及び２９５ｎｍにおける吸光度が減少して変曲点をもつ逆Ｓ字カーブになる融解曲線を示すサンプルである。
【００１２】
本発明においてＣＤスペクトルとは、核酸溶液に円偏光をあてて溶液透過後の旋光度の変化を観測した際に得られる分光学的スペクトルのことである。
【００１３】
本発明において、グアニン四重鎖構造を示すＣＤスペクトルの形状がスクリーニングの指標の一つとなる。グアニン四重鎖構造を示すＣＤスペクトルのうちパラレル型、すなわち、ＤＮＡ一本鎖の５’末端から３’末端へのベクトルが、４つの頂点で全て同じ方向であるものは２３５〜２４４ｎｍに負のモル楕円率の極小値を示し（１）、２５５ｎｍ〜２６５ｎｍに正のモル楕円率極大値を示す（２）。一方、アンチパラレル型、すなわち、ＤＮＡ一本鎖の５’末端から３’末端へのベクトルが、隣り合う２つの頂点で互いに異なる方向であるものは２４５〜２５０ｎｍと２９５〜３０５ｎｍに正のモル楕円率極大値を示し（３）、２６０〜２７０ｎｍに負のモル楕円率の極小値を示す（４）。この中間構造となるハイブリッド型のグアニン四重鎖構造は、上記の（１）〜（４）の特徴を併せ持つＣＤスペクトルを示す。
【００１４】
ＣＤスペクトルのモル楕円率の大きさを評価する場合、パラレル型のＨＩＶのＣＤスペクトルと、アンチパラレル型のｔｅｌｏｍｅｒｅのＣＤスペクトルを指標とし、ＨＩＶとｔｅｌｏｍｅｒｅのＣＤスペクトルのモル楕円率の値の８０％以上の値を持つものを大きなモル楕円率、４０％以下の値を持つものを小さなモル楕円率と定義する。
【００１５】
本発明において融解温度とは、融解温度曲線を一次微分したときに得られるプロットの局大値に対応する温度である。融解温度を算出することができないとは、融解温度曲線において、変曲点を有する曲線が得られないことである。融解温度が低いとは、室温２５℃より低い温度を指す。本発明では、Ｔｍ値が２５℃よりも大きな値を示すものを安定な構造であると定義する。
【００１６】
本発明においてシグナリングアプタマーとは、標的分子との結合に伴い蛍光シグナルの強度が変化するアプタマープローブをさす。
【００１７】
本発明において蛍光分子とは、たとえばカルボキシフルオレセインハイドラート（ＦＡＭ）などのフルオレセイン誘導体をさす。
【００１８】
本発明において消光分子（クエンチャー）とは、蛍光を抑制する物質であり、たとえばブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）などの色素、又は金属粒子などをさす。
【００１９】
蛍光分子や消光分子をアプタマーに導入する方法としては、例えば、蛍光分子や消光分子のアルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基でアプタマーを修飾するか、または該官能基をスペーサー分子を介して修飾するという方法が挙げられる。
【００２０】
本発明において標的分子の濃度の変化に依存して蛍光強度が変化するとは、標的物質を入れる前後である特定波長の蛍光強度が増加又は減少することをさす。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、Ｇ−カルテットを分子内に有し、グアニン四重鎖を形成する核酸アプタマーを利用したシグナリングアプタマーのスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】磁性粒子上に固定化されたＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を用いるＤＮＡアプタマーの連続セレクションである。
【図２】ＶＥＧＦＲ結合アプタマー、ＨＩＶ及びテロメアのＣＤスペクトルである。
【図３−ａ】２６０ｎｍでの４μＭヌクレオチドのＰＢＳ中のＶＥＧＦＲ結合アプタマーの候補配列の融解曲線である。
【図３−ｂ】２９５ｎｍでの４μＭヌクレオチドのＰＢＳ中のＶＥＧＦＲ結合アプタマーの候補配列の融解曲線である。
【図３−ｃ】２６０ｎｍでの４μＭヌクレオチドのＰＢＳＫ中のＶＥＧＦＲ結合アプタマーの候補配列の融解曲線である。
【図３−ｄ】２９５ｎｍでの４μＭヌクレオチドのＰＢＳＫ中のＶＥＧＦＲ結合アプタマーの候補配列の融解曲線である。
【図４】様々な濃度のＶＥＧＦＲと、一定濃度のＡｐｔ０２とを結合させた際のＦＡＭ蛍光強度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
血管内皮増殖因子受容体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）をターゲットとし、ＳＥＬＥＸと次世代シーケンス法を組み合わせた手法でＶＥＧＦＲに結合するアプタマーのセレクションを行った。本セレクションでは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２の両方に結合する核酸アプタマーを獲得するため、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２固定化磁性粒子を用いてセレクションを行った（図１）。
【００２５】
本セレクションにおいて、３ラウンド目までで存在率に増加傾向がみられた配列Ａｐｔ０１，Ａｐｔ０２は、ＶＥＧＦＲ１，ＶＥＧＦＲ２の両方に対して高い結合能を有しており、さらに、ＶＥＧＦＲ−１に対してより強力に結合するＶＥＧＦ−Ａと同様な結合形態を有することが明らかとなった。
【００２６】
セレクションを６ラウンドまで行った結果、存在率が増加傾向にある配列をさらに得ることができた。
【００２７】
融解曲線の測定
以下のＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２に対する結合能が明らかとなっている７つの候補化合物を用いた。
【表１】
2017201949.tif 000002
【００２８】
各オリゴヌクレオチドサンプルをＰＢＳ（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：０４１−２０２１１，ｐＨ７．４にＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを０．２７ｇ加えた。）又はＰＢＳＫ（前記ＰＢＳにＫＣｌを７．１５ｇ／Ｌ加え、Ｋ＋濃度を１００ｍＭとした。）で４μＭ溶液を調製した。この溶液を９０℃で２分３０秒間加熱した後、４℃までゆっくりと冷却することでアニーリングを行った。光路長１ｃｍの８連マイクロブラックセルに各サンプルを１１０μＬずつ入れ、それらを３０μＬの流動パラフィンで覆った。サンプルを４℃までセル内で冷却し、１０分間４℃を維持した後、０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で測定を行った。測定におけるスリット幅は１．０ｎｍとした。９５℃に到達した後、溶液温度が室温まで下がってから溶液を取り出した。融解曲線を、各温度における２６０ｎｍと２９５ｎｍの吸光度をプロットすることにより得た（図３ａ〜ｄ）。
【００２９】
Ａｐｔ０１、Ｎｏ．１１は、２６０ｎｍにおいて融解温度曲線の上昇傾向がみられたが、２９５ｎｍでは大きな変化は観測されなかった。一方で、２９５ｎｍの吸光度のみが減少傾向に観測された配列はＮｏ．１７、１８、２２及び２３であった。さらに、Ａｐｔ０２はＰＢＳ中では融解曲が観測されなかったが、ＰＢＳＫ中では２９５ｎｍにおいてのみ減少傾向にある融解曲線が得られた（図３ａ〜ｄ）。
【００３０】
ＣＤスペクトルの測定
核酸アプタマーをＰＢＳで４μＭに調製し、９０℃で５分間アニーリングしてゆっくりと室温まで冷却した。マイクロブラックセルに１００μＬのサンプルを入れ、円二色性分散計により、開始波長３２０ｎｍ、終了波長２２０ｎｍ、走査速度５００ｎｍ／ｍｉｎ、データ間隔０．５ｎｍ、積算回数２回、レスポンス１ｓｅｃ、バンド幅１ｎｍ、感度１００ｍｄｅｇとして各サンプルの楕円率を窒素雰囲気下室温で測定した。結果を図２に示した。
【００３１】
Ａｐｔ０１のＣＤスペクトルの形状はグアニン四重鎖構造に特有のものではなかった。また、Ｎｏ．１１はパラレル型四重鎖構造に近いＣＤスペクトルが得られたが、モル楕円率の極大値と極小値がＨＩＶのものと比べて非常に小さな値を示した。他のＡｐｔ０２、Ｎｏ．１７、１８、２２及び２３の５配列では、２６０ｎｍ付近に大きな正のモル楕円率、２４０ｎｍに大きな負のモル楕円率が観測されたことから、パラレル型のグアニン四重鎖構造を形成していると考えられる。
【００３２】
Ｔｍ値の算出
得られた融解温度曲線をＯｒｉｇｉｎ  ７．０にＭｕｌｔｉｐｌｅ  ＡＳＣＩＩでインポートした。ＰｌｏｔのＳｃａｔｔｅｒを選択しプロットをし、ＦＦＴ  ＦｉｌｔｅｒのＥｎｔｅｒ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｉｎｔを２０としてＳｍｏｏｔｈｉｎｇをした。ＳｍｏｏｔｈｉｎｇしたデータをＰｌｏｔのＳｃａｔｔｅｒを選択してプロットし、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅにより一次微分し、得られた曲線の変曲点からＴｍを読み取った。
【表２】
2017201949.tif 000003
【００３３】
配列Ｎｏ．１７、１８、２２及び２３は、ＰＢＳ中とＰＢＳＫ中の両溶媒系においても２９５ｎｍの融解曲線からＴｍが算出できたこと、カリウム添加でＴｍ値が上昇したこと、全て４０度以上であることから、比較的安定なＧカルテット構造を形成していることがわかる。さらに、前述のＣＤスペルトルの結果もこれら４配列が安定なＧカルテット構造を有することを支持している。一方、Ａｐｔ０１及びＮｏ．１１は、２６０ｎｍだけで融解曲線、Ｔｍ値が得られたためステムループやジャンクションなどの二本鎖由来の高次構造が形成されている可能性が高い。Ａｐｔ０２は、カリウム濃度を増加させた場合にだけＴｍ値を算出することができた。したがって、この配列もＧカルテット構造を有する配列である。以上の結果から、Ａｐｔ０２、Ｎｏ．１７、１８、２２及び２３の５配列は、グアニン四重鎖構造を形成すると示唆された。ＰＢＳ中における融解温度が２５℃よりも低いことから、Ａｐｔ０２とＮｏ．１７は、熱力学的安定性が低いグアニン四重鎖構造であると考えられ、特にＰＢＳ中においてＡｐｔ０２は構造が不安定で、ほとんどＧカルテット構造を形成していない可能性が高い。
【００３４】
蛍光スペクトルの測定
０．２μＭのＦＡＭ−Ａｐｔ０２−ＢＨＱのＰＢＳ溶液に対して最終濃度０〜６．４μＭ  となるＶＥＧＦＲ−１との混合溶液を調製し、２０μＬをブラックセルに入れ測定した。また、溶液混合後１分後に測定を行った。測定条件は以下のとおりである。
【表３】
2017201949.tif 000004
【００３５】
上述したスクリーニングの結果から、Ａｐｔ０２は四重鎖構造を形成するものの、ＰＢＳ中では不安定であることが明らかとなった。Ａｐｔ０２が構造変化型アプタマーであることを確認するため、Ａｐｔ０２の配列の両端に蛍光分子（ＦＡＭ）と消光分子（ＢＨＱ）を修飾し、構造変化を確認すると同時に同配列のシグナリングアプタマーとしての性能を評価した。標的分子であるＶＥＧＦＲ−１の添加濃度が上昇するにしたがってＦＡＭの蛍光強度が減少した（図４）。予想したとおり、Ａｐｔ０２が構造変化型の四重鎖核酸アプタマーであること、さらに両末端に蛍光分子と消光分子を修飾するだけでシグナリングアプタマー化に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、Ｇ−カルテットを分子内に有し、グアニン四重鎖を形成する核酸アプタマーを利用したシグナリングアプタマーのスクリーニングすることができる。
【図１】
2017201949.tif 000005
【図２】
2017201949.tif 000006
【図３−ａ】
2017201949.tif 000007
【図３−ｂ】
2017201949.tif 000008
【図３−ｃ】
2017201949.tif 000009
【図３−ｄ】
2017201949.tif 000010
【図４】
2017201949.tif 000011
【配列表】
2017201949000001.app