(57)【要約】【課題】本発明は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を用いつつ、低濃度であっても高い創傷治癒促進効果が得られる創傷治療剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の創傷治療剤は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物の酢酸エチル抽出物を含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物の酢酸エチル抽出物を含有することを特徴とする創傷治療剤。
【請求項２】
前記組成物が鶏冠であることを特徴とする請求項１に記載の創傷治療剤。
【請求項３】
前記分解生成物が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の創傷治療剤。
【請求項４】
前記分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量が、創傷治療剤の全量に対して１０質量％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項５】
分子量が１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることを特徴とする請求項３または４に記載の創傷治療剤。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が、創傷治療剤の全量に対して０．０１質量％以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項７】
総遊離アミノ酸量が創傷治療剤の全量に対する質量比で２質量％以上であり、且つ、総蛋白質量が創傷治療剤の全量に対する質量比で２質量％以上であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項８】
前記遊離アミノ酸が、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチンおよびチロシンから選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７に記載の創傷治療剤。
【請求項９】
前記分解生成物の凍結乾燥物を粉砕して得た粉砕物の酢酸エチル抽出物を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項１０】
前記酢酸エチル抽出物は、前記分解生成物に酢酸エチルと水による分液操作を行うことにより得た酢酸エチル画分であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項１１】
ヒト繊維芽細胞の遊走を促進する作用を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【請求項１２】
ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解して分解生成物を得る酵素処理工程と、前記分解生成物に酢酸エチルと水による分液操作を行って酢酸エチル画分を得る分液工程を含むことを特徴とする創傷治療剤の製造方法。
【請求項１３】
前記組成物が鶏冠であり、前記酵素処理工程の前に、前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程を有することを特徴とする請求項１２に記載の創傷治療剤の製造方法。
【請求項１４】
前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を、凍結乾燥した後、粉砕して粉砕物を得る工程を有し、
前記分液工程で、前記粉砕物に水と酢酸エチルによる分液操作を行って酢酸エチル画分を得ることを特徴とする請求項１２または１３に記載の創傷治療剤の製造方法。
【請求項１５】
前記分液工程の後に、前記分液工程で得た酢酸エチル画分を精製する精製工程を有することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の創傷治療剤の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の創傷治療剤からなることを特徴とする内服剤。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の創傷治療剤からなることを特徴とする外用剤。
【請求項１８】
化粧品であることを特徴とする請求項１７に記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸を含有する創傷治療剤に関する。特に安価に製造することができ、創傷を迅速に治療することができる創傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、保湿効果や保水効果を高める働きがあることが知られており、従来からさまざまな化粧品や医薬品に配合されている。例えば、乾燥肌や荒れ肌に直接適用することにより保湿性を高めて肌のコンディションを調えたり、乾燥期に皮膚表面から水分が失われたりすることを防ぐために予防的に皮膚表面に適用することが通常行われている。また、ヒアルロン酸は、保湿効果から派生する機能や保湿効果以外の有用な特性の発現も期待され、その新たな利用法に関する研究も幾つか見受けられる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を創傷治療剤に用いることが提案されている。この創傷治療剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているために安全性が高く、例えば経口投与や創傷部位への直接投与により創傷を迅速に治療することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１４５８００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物は、創傷治療剤として高い有用性を有する。しかしながら、本発明者らが、この分解生成物の創傷治癒促進効果を、ヒト皮膚繊維芽細胞の創傷部位における遊走距離を指標として評価したところ、その評価で有意な創傷治癒促進効果を得るには、分解生成物を相当に高い濃度で投与する必要があることが判明した。創傷治療剤に分解生成物を高い濃度で配合すると、他の成分との併用や賦形剤との混合が大きく制限されるため、さらなる改良が必要であると考えられた。
そこで本発明者らが、上記の分解生成物について、創傷治癒促進効果を高めるための種々の検討を始め、その中で、分解生成物に各種溶媒を用いて分液操作を行い、得られた各画分の創傷治癒促進効果を評価する検討を行った。その結果、この分解生成物は、分液に用いる溶媒の種類や組み合わせにより各画分の創傷治癒促進効果が大きく異なることを初めて見出した。
【０００６】
このような状況下において本発明者らは、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を用いつつ、低濃度であっても高い創傷治癒促進効果が得られる創傷治療剤およびその製造方法を提供することを課題としてさらに鋭意検討を進めた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物に、酢酸エチルと水による分液操作を行って得た酢酸エチル画分が、極めて高い創傷治癒促進効果を有することを見出した。具体的には、この酢酸エチル画分は、上記の分解生成物で有意な創傷治癒促進効果が認められた濃度の１／１０以下に相当する濃度で、その分解生成物で認められた効果を上回る高い創傷治癒促進効果を奏するとの知見を得た。本発明は、これらの知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。
【０００８】
［１］  ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物の酢酸エチル抽出物を含有することを特徴とする創傷治療剤。
［２］  前記組成物が鶏冠であることを特徴とする［１］に記載の創傷治療剤。
［３］  前記分解生成物が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸を含有することを特徴とする［１］または［２］に記載の創傷治療剤。
［４］  前記分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量が、創傷治療剤の全量に対して１０質量％以上であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
［５］  分子量が１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることを特徴とする［３］または［４］に記載の創傷治療剤。
［６］  Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が、創傷治療剤の全量に対して０．０１質量％以下であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
［７］  総遊離アミノ酸量が創傷治療剤の全量に対する質量比で２質量％以上であり、且つ、総蛋白質量が創傷治療剤の全量に対する質量比で２質量％以上であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
［８］  前記遊離アミノ酸が、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチンおよびチロシンから選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする７に記載の創傷治療剤。
［９］  前記分解生成物の凍結乾燥物を粉砕して得た粉砕物の酢酸エチル抽出物を含むことを特徴とする［１］〜［８］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
［１０］  前記酢酸エチル抽出物は、前記分解生成物に酢酸エチルと水による分液操作を行うことにより得た酢酸エチル画分であることを特徴とする［１］〜［９］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
［１１］  繊維芽細胞の遊走を促進する作用を有することを特徴とする［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の創傷治療剤。
【０００９】
［１２］  ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解して分解生成物を得る酵素処理工程と、前記分解生成物に酢酸エチルと水による分液操作を行って酢酸エチル画分を得る分液工程を含むことを特徴とする創傷治療剤の製造方法。
［１３］  前記組成物が鶏冠であり、前記酵素処理工程の前に、前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程を有することを特徴とする［１２］に記載の創傷治療剤の製造方法。
［１４］  前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を、凍結乾燥した後、粉砕して粉砕物を得る工程を有し、
前記分液工程で、前記粉砕物に酢酸エチルと水による分液操作を行って酢酸エチル画分を得ることを特徴とする［１２］または［１３］に記載の創傷治療剤の製造方法。
［１５］  前記分液工程の後に、前記分液工程で得た酢酸エチル画分を精製する精製工程を有することを特徴とする［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の創傷治療剤の製造方法。
［１６］  ［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の創傷治療剤からなることを特徴とする内服剤。
［１７］  ［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の創傷治療剤からなることを特徴とする外用剤。
［１８］  化粧品であることを特徴とする［１７］に記載の外用剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の創傷治療剤は、比較的低い濃度で高い創傷治癒促進効果を発揮し、創傷を有する生命体に投与されることにより該創傷を迅速に治癒させることができる。本発明の創傷治療剤の製造方法によれば、上記の有用な作用効果を奏する創傷治療剤を低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】創傷治癒促進作用の評価方法を説明するための図であり、（ａ）はウェル内の細胞群をスクラッチしている様子を示す模式図、（ｂ）はスクラッチにより形成された傷と細胞の最長遊走地点を示す模式図である。
【図２】プロテアーゼ分解物の酢酸エチル画分（創傷治療剤１）、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末、プロテアーゼ分解物の水画分および水飽和１−ブタノール画分について、創傷治癒促進作用の評価で測定された細胞遊走距離を示すグラフである。
【図３】実施例で行ったプロテアーゼ分解物の精製工程を示すスキーム図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１３】
［創傷治療剤］
本発明の創傷治療剤は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物の酢酸エチル抽出物を含有する点に特徴がある。
【００１４】
上記組成物に含まれるヒアルロン酸は、化粧品や医薬品の成分として通常用いられているヒアルロン酸であれば特に制限なく使用することができる。ヒアルロン酸は、元来ウシの眼の硝子体から単離されたものであるが、これに限らず、動物の関節液やニワトリの鶏冠などから単離されたものであっても使用することができる。また、自然界から単離されたものでなく、合成や微生物発酵法により得られたものでもよい。
【００１５】
ヒアルロン酸は、アミノ酸とウロン酸からなる複雑な多糖類であるが、その構造の詳細は特に限定されない。例えば、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなるニ糖を繰り返し単位とする多糖を挙げることができる。組成物に含まれるヒアルロン酸の分子量は特に限定されないが、例えば鶏冠に含まれるヒアルロン酸は、分子量が６００万〜１０００万であり、鶏冠から抽出したヒアルロン酸は、抽出過程で分解されるため、平均分子量が数十万〜数百万である。本発明で使用するヒアルロン酸は創傷治癒促進作用を過度に失わない限り、誘導化や熱変性を受けたものであっても構わない。いわゆるヒアルロン酸誘導体として知られている化合物は、本発明で有効に使用することができる。
【００１６】
上記組成物に含まれる蛋白質はその種類を問わないが、鶏冠に含まれる蛋白質が極めて好ましい。鶏冠の種類は特に制限されないが、ニワトリの鶏冠を用いるのが好ましい。ニワトリの鶏冠はヒアルロン酸を含有するため、本発明の創傷治療剤の製造に用いる組成物を提供するに際して、鶏冠にヒアルロン酸を別途添加しなくてもよいというメリットがある。このため、鶏冠を用いれば本発明の創傷治療剤の製造工程が簡略化でき、製造コストも下げることができる。
【００１７】
本発明で用いる組成物は、蛋白質とヒアルロン酸のみを含んでいてもよいし、その他の成分や溶媒、分散媒を含んでいてもよい。溶媒および分散媒としては、蛋白質やヒアルロン酸を溶解できるものであればよく、水や水性緩衝液を好適に用いることができる。また、組成物は、蛋白質とヒアルロン酸を含む天然物そのものであってもよい。組成物となる天然物としては、動物の関節液や鶏冠を挙げることができ、ヒアルロン酸を豊富に含むことからニワトリの鶏冠であることが好ましい。
【００１８】
本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものである。プロテアーゼの種類は特に制限されない。通常の蛋白質分解に用いられるプロテアーゼであればいずれも使用することができる。すなわち、エンドペプチダーゼであっても、エキソぺプチダーゼであっても使用することが可能であり、また活性部位はセリン、システイン、金属、アスパラギン酸等のいずれであってもよい。また、複数のプロテアーゼを混合して使用してもよい。好ましいプロテアーゼとして、例えばプロナーゼを使用することができる。
【００１９】
また、本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものであるため、少なくとも、プロテアーゼにより分解された蛋白質の分解物と、ヒアルロン酸を含有し、未分解の蛋白質（プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていた蛋白質）や組成物由来の他の成分を含有していてもよい。
分解生成物に含まれる蛋白質の分解物としては、未分解の蛋白質よりも低分子量の蛋白質、ペプチド、遊離アミノ酸を挙げることができ、これらが混在していてもよい。
また、分解生成物は、遊離アミノ酸を含有することが好ましい。分解生成物が含有する遊離アミノ酸は、蛋白質の分解物としての遊離アミノ酸であってもよいし、プロテアーゼ添加前の組成物に遊離アミノ酸として元々含まれていたものであってもよい。遊離アミノ酸の種類は、組成物の成分によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠である分解生成物では、比較的含有率が多いアミノ酸としてイソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等を挙げることができ、この他にも、多種類のアミノ酸を含む。
【００２０】
創傷治療剤における総蛋白質量は、創傷治療剤の全量に対する質量比で０．５〜１０質量％であることが好ましく、１〜７質量％であることがより好ましく、２〜５質量％であることがさらに好ましい。また、創傷治療剤における総遊離アミノ酸量は、創傷治療剤の全量に対する質量比で０．５〜１２質量％であることが好ましく、１〜８質量％であることがより好ましく、２〜６質量％であることがさらに好ましい。創傷治療剤における総蛋白質量および遊離アミノ酸量が上記の範囲であることにより、創傷治療剤が効果的に作用すると考えられ、創傷を迅速に治癒させることができる。
本明細書中において「総蛋白質量」とは、Lowry法により求めた総蛋白質含量のことをいい、「総遊離アミノ酸量」とは、Ninhydrin法により求めた遊離アミノ酸の総量のことをいう。
【００２１】
上記の分解生成物に含まれるヒアルロン酸は、プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていたヒアルロン酸がそのまま残存したもの（以下、「未分解のヒアルロン酸」という）であってもよいし、ヒアルロン酸の分解物（以下、「低分子ヒアルロン酸」という）であってもよいし、未分解のヒアルロン酸と低分子ヒアルロン酸とが混在したものであってもよいが、低分子ヒアルロン酸を含有することが好ましい。低分子ヒアルロン酸は生命体の深部に浸透し易く、生命体に対する作用を効果的に得ることができる。分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であってもよいし、上記の組成物とは別の系でヒアルロン酸を加水分解し、得られた低分子ヒアルロン酸を分解生成物に添加したものであってもよいが、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であることが好ましい。組成物中での低分子ヒアルロン酸の生成は、塩酸やヒアルロニダーゼ等の、ヒアルロン酸を加水分解する物質を組成物に添加することにより行うことができる。また、組成物が天然物である場合には、天然物に元々含まれる物質による自己消化を利用して低分子ヒアルロン酸を生成してもよい。ただし、ヒアルロン酸の生体に対する作用を有効に得る点から、ヒアルロン酸は構成単位を保持していること、すなわち、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンまで分解が進行していないことが好ましい。具体的には、創傷治療剤におけるＮ−アセチルグルコサミンの含有量は、創傷治療剤の全量に対して０．０１質量％以下であることが好ましく、０質量％であることが最も好ましい。
本明細書中において「Ｎ−アセチルグルコサミン量」とはMorgan-Elson法により求めたＮ−アセチルグルコサミン含量のことをいう。
【００２２】
分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、分子量が３８０〜５０００であることが好ましい。分子量３８０〜５０００は、ヒアルロン酸の繰り返し単位数で約１〜１４に相当する。創傷治療剤における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量は、創傷治療剤の全量に対して５質量％以上であることが好ましく、７質量％以上であることがより好ましく、１０質量％以上であることがさらに好ましい。また、低分子ヒアルロン酸のうちでは、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸が主成分であることが好ましく、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、７５質量％以上であることがさらに好ましい。これにより、創傷治療剤が効果的に作用すると考えられ、創傷を迅速に治癒させることができる。
低分子ヒアルロン酸の分子量と質量比率は、ポリエチレングリコールを分子量マーカーに用いる高速液体クロマトグラフィにより分析することができる。
【００２３】
分解生成物の性状は、用いる組成物の成分や組成比、プロテアーゼの種類によっても異なるが、通常は液状、さらには粘質性を帯びた液状である。
【００２４】
本発明で用いる酢酸エチル抽出物は、上記の分解生成物から酢酸エチルにより抽出されたものである。抽出方法は、特に限定されず、酢酸エチルと非相溶性溶媒を用いる分液法（液−液抽出法）であってもよいし、酢酸エチルを抽出溶媒として用いる溶媒抽出法（固−液抽出法）であってもよいが、分解生成物は通常液状であるため、分液法の方が汎用的である。ここで、分液法における「非相溶性溶媒」とは、酢酸エチルと接触させても混じり合わず、互いに分離する溶媒のことをいい、具体的には、水、ヘキサン、クロロホルム、エーテル等を挙げることができ、水であることが好ましい。分液法または溶媒抽出法により得られた酢酸エチル抽出物は液状であり、そのまま本発明の創傷治療剤としてもよいし、適宜精製して他の成分と組み合わせる等して本発明の創傷治療剤としてもよい。酢酸エチル抽出物を精製することにより、創傷治癒促進効果がより高い創傷治療剤とすることができる。液状の創傷治療剤は、塗布や点眼のための外用剤、飲料タイプの内服剤等として用いることができる。また、酢酸エチル抽出物を凍結乾燥等により乾燥した後、粉砕した場合は、粉末状の創傷治療剤を提供することが可能である。粉末状の創傷治療剤は、そのまま、もしくは他の成分を含有させて内服剤に用いてもよいし、錠剤やカプセル剤に加工してもよいし、所望の溶媒または分散媒を添加して液状とし、塗布や点眼のための外用剤や飲料タイプの内服剤等として用いてもよい。
【００２５】
本発明の創傷治療剤には、上記分解生成物以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、創傷治療剤に賦形剤を含有させた場合には、酢酸エチル抽出物と賦形剤の配合率を制御して総蛋白質量や総遊離アミノ酸量、低分子ヒアルロン酸量等の成分量を調整することができる。また、保存し易い創傷治療剤の態様として、凍結乾燥させた酢酸エチル抽出物を粉砕して得た粉末を賦形剤で希釈した混合粉末を挙げることができる。賦形剤としては、特に限定されないが、デキストリンが好適である。賦形剤による希釈倍率は、質量比で２〜１０倍であることが好ましく、２〜７倍であることがより好ましく、３〜５倍であることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明の創傷治療剤を投与すれば、繊維芽細胞の創傷部位への遊走が顕著に活発化（促進）し、創傷の治癒を促進することができる。これにより、創傷を迅速に治癒させることができる。また、本発明の創傷治療剤を予備的に投与することにより、創傷が形成されたときに迅速に回復しうる状態にしておくこともできる。ここで、本発明の創傷治療剤は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物そのものではなく、その分解生成物の酢酸エチル抽出物を含有することにより、分解生成物をそのまま含有する創傷治療剤が有意な効果を奏する濃度に比べて、格段に低い濃度で高い創傷治癒促進効果を得ることができる。このため、他の成分や賦形剤を含有させても、十分な創傷治癒促進効果が得ることができ、製剤の改良を図り易いという効果が得られる。また、単位製剤当たりの原料使用量が大きく抑えられ、コストを大幅に削減することができる。
本発明の創傷治療剤の投与形態は特に制限されず、経口投与してもよいし、創傷部位に直接投与してもよい。本発明の創傷治療剤が経口で摂取された場合には、その腸管から吸収された創傷治療剤の成分により、外傷に限らず、生体内の創傷にも治癒促進作用が働き、これらの創傷を迅速に治癒させることができる。また、経口投与によれば、全身に多数の創傷を負った場合、自身で局所適用することが困難な部位に創傷を負った場合、乳幼児や老人など創傷を負ったことを自覚しにくい場合などに効果的である。ここで、本発明の創傷治療剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているため安全性が高く、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
また、本発明の創傷治療剤は、皮膚に適用することも可能である。本発明の創傷治療剤が皮膚に適用された場合には、皮膚から吸収された創傷治療剤の成分が、適用箇所付近の創傷に局所的に作用し、その創傷を迅速に治癒させることができる。
【００２７】
本発明の創傷治療効果は、ヒアルロン酸と蛋白質分解物とを組み合わせ、さらに、その中から酢酸エチルにより抽出した成分（酢酸エチル抽出物）を投与することにより初めて高めることができるものである。このような創傷治療効果は、上記酢酸エチル抽出物の他に、特にアスコルビン酸等のビタミン類や野菜粉末を同時摂取することによりさらに高めることができる。野菜粉末はニンジンに代表される野菜を粉末化したものであるが、エキスのみを使用しても構わない。上記エステル抽出物に対する野菜粉末の固形分重量比は、１：１００から１００：１の範囲内であることが好ましく、１：１０から１０：１の範囲内であることがより好ましく、１：２から２：１の範囲内であることがさらにより好ましい。
【００２８】
本発明の創傷治療剤の投与量は、投与対象者の年齢、体重、創傷の状態、創傷の位置、投与形態などを勘案して適宜決定することができる。例えば本発明の創傷治療剤を内服薬として経口投与する場合、その投与量は８０〜２０００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましく、１日に２〜３回に分けて投与することが適当である。
また、本発明の創傷治療剤を外用薬または化粧品として、皮膚に塗布する場合、その塗布量は０．５ｇ〜５．０ｇ／１０ｃｍ2であることが好ましく、使用回数は１〜４回／日程度が適当である。
【００２９】
［創傷治療剤の製造方法］
次に、本発明の創傷治療剤の製造方法について説明する。
本発明の創傷治療剤の製造方法は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解して分解生成物を得る酵素処理工程と、分解生成物に酢酸エチルと水による分液操作を行って酢酸エチル抽出物を得る分液工程を含むことを特徴とする。
本発明の創傷治療剤の製造方法は、さらに必要に応じて、この他の工程を有していてもよい。例えば、組成物が鶏冠である場合には、酵素処理工程の前に、鶏冠を小片化する小片化工程を有していてもよい。また、酵素処理工程の後に、分解生成物を濾過する濾過工程、濾過した分解生成物を乾燥した後、粉砕する製粉工程を有していてもよい。さらに、分液工程の後に、酢酸エチル画分を精製する精製工程を有していてよい。以下において、本発明の創傷治療剤の製造方法を詳細に説明する。
【００３０】
まず、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物を準備する。組成物としてニワトリの鶏冠を利用する場合には、性別、年令を問わず使用し得る。ただし、採取後なるべく時間を置かずにプロテアーゼ分解に供することが好ましい。また、時間を置いてプロテアーゼ分解するときには、冷凍保存した後に解凍して使用することが好ましい。
【００３１】
鶏冠をプロテアーゼ分解するときには、まず鶏冠を小片化する小片化工程を行ってから、該鶏冠の小片をプロテアーゼ含有溶液に接触させることが好ましい。鶏冠は、好ましくは０．５ｃｍ角以上、より好ましくは０．７ｃｍ角以上、さらに好ましくは０．９ｃｍ角以上の小片にする。過度に細片化してしまったり、ミンチ状にしてしまったりすると、水分が過度に流れ出てしまうため好ましくない。
【００３２】
次に、組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を行う。本発明の製造方法で用いるプロテアーゼの説明については、上記の［創傷治療剤］の欄のプロテアーゼの説明を参照することができる。酵素処理は、組成物やプロテアーゼの種類によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠等の固形物や粉末である場合には、プロテアーゼを溶解した水溶液等の溶液（酵素液）を組成物に添加した後、一定時間放置することで行うことが好ましい。ここで、酵素液のｐＨは５．０〜１０．０であることが好ましく、処理温度は４０〜６０℃であることが好ましく、処理時間は０．５〜３．０時間であることが好ましい。また、酵素処理は、酵素液を添加した組成物を振とうしながら行うことが好ましい。
【００３３】
得られた分解生成物は、ろ過などの方法により鶏冠等の固形分を除去して、液状の分解生成物として用いることができる。また、凍結乾燥等により乾燥してさらに粉砕する製粉工程を行うことにより、粉末状の分解生成物として用いることもできる。
【００３４】
本発明では、以上のようにして得られた分解生成物に、酢酸エチルと水による分液操作を行って酢酸エチル抽出物を得る分液工程を行う。分液に用いる酢酸エチルと水の容量比率は、１：１〜１０：１であることが好ましく、１：１〜５：１であることがより好ましく、１：１〜３：１であることがさらに好ましい。また、分液操作を行う際の環境温度は、０〜７０℃であることが好ましく、１０〜５０℃であることがより好ましく、２０〜３０℃であることがさらに好ましい。分液操作は、１回のみ行ってもよいし、複数回行ってもよいが、複数回行うことが好ましい。分液操作の手順は、特に限定されず、通常の分液操作の手順で行うことができる。好ましい方法として、分解生成物の凍結乾燥物を水で希釈した希釈液を分液ロートに投入し、これに酢酸エチルを加え、分液ロートを振とうする方法を挙げることができる。これにより、水画分が下層、酢酸エチル画分が上層となって分離するので、その上層の酢酸エチル画分を採取する。また、分液操作を複数回行う場合には、分液ロートに残った水画分に、新しい酢酸エチルを加え、分液ロートを振とうした後、酢酸エチル画分を採取するという分液操作を繰り返し行う。これにより水画分に含まれる酢酸エチルに可溶な成分を、より確実に抽出することができる。以上のようにして得られた酢酸エチル画分は、液状の酢酸エチル抽出物として用いることができる。また、凍結乾燥等により乾燥してさらに粉砕することにより、粉末状の酢酸エチル抽出物として用いることもできる。これらの酢酸エチル抽出物は、そのまま本発明の創傷治療剤としてもよいし、適宜精製し、賦形剤等の他の成分と組み合わせる等して本発明の創傷治療剤としてもよい。
【００３５】
本発明の創傷治療剤は、このように、極めて簡単な工程で製造することができる。このため、本発明の創傷治療剤の製造方法を用いることにより、有用性が高い創傷治療剤を低いコストで提供することができる。
また、酢酸エチル抽出物を精製することにより、創傷治癒促進効果がより高い創傷治療剤とすることができる。酢酸エチル抽出物の精製には、カラムクロマトグラフィ等を用いることができる。この精製方法の詳細については、後掲の実施例の＜プロテアーゼ分解物の精製＞の欄を参照することができる。
【００３６】
［創傷治療剤の用途］
上記のように、本発明の創傷治療剤は、高い創傷治癒促進効果を有し、創傷を迅速に治癒させることができる。このため、本発明の創傷治療剤は、ヒト等の動物に投与する内服剤や外用剤として効果的に用いることができる。本発明の創傷治療剤が外用剤である場合、外用医薬であってもよいし、化粧品であってもよい。化粧品である場合、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンスなどの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダー、おしろい、アイシャドーなどのメイクアップ化粧料等の態様で好適に用いることができる。
本発明の創傷治療剤は、その用途に応じて、上記分解生成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
また、創傷治療剤である化粧品には、化粧品に通常用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することもできる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、割合、操作等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００３８】
本実施例で創傷治療剤の製造に用いたプロテアーゼ分解物の成分分析は下記の方法により行った。なお、プロテアーゼ分解物の成分分析は、該プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末をデキストリンで賦形した混合粉末（プロテアーゼ分解物の分析用サンプル）について行った。
（１）水分含有量の測定
水分含有量は、分析用サンプルの１ｇを１０５℃で３時問加熱乾燥し、精密天秤で恒量を求め定量した。
【００３９】
（２）全窒素の定食
全窒素はＡＯＡＣ法に基づくセミミクロケルダール法によって定量した。
【００４０】
（３）遊離アミノ酸の定量およびアミノ酸組成の分析
総遊離アミノ酸量はNinhydrin法によって定量した。定量には標準アミノ酸としてロイシンの検量線を作成し使用した。また、遊離アミノ酸の組成は、生体分析用カラムを装着したアミノ酸自動分析機（日立社製、L-8500型）を用いて分析した。この分析には、分析用サンプルの５０ｍｇを蒸留水に溶解し、ロータリーエバポレーダー（６０℃）で減圧乾固させた後、０．０２Ｎ塩酸５ｍＬで溶出し、ろ紙でろ過したのち、滅菌フィルターでろ過したろ液５０μＬを分析試料として使用した。
【００４１】
（４）タンパク質の定量
総タンバク質量はLawry法によって決定した。標準検量線の作成には牛血清アルブミンを使用した。
【００４２】
（５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの定量
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有量はMorgan-Elson法で定量した。
【００４３】
（６）グルコサミノグリカンの定量
２−ニトロフェニルヒドラジンカップリング法による比色定量法で分析した。標準検量の作成には鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＲＣ）およびstreptococcus zooepidemicus由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＳＺ）を用いた。
【００４４】
（７）低分子ヒアルロン酸の分子量測定
示差屈折計（Shimazu社製、RID-10A型）を装着した高速液体クロマトグラフィー（Shimazu社製）によってヒアルロン酸の分子量を推定した。カラムとしてTSKgel G-2,500PWXL（7.8mmID×30cm）を用い、水を移動相として流速１ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。分子量マーカーには分子量４００、１０００、２０００、６０００の４種のポリエチレングリコール（Aldrich社製）を用いた。また、各低分子ヒアルロン酸の構成重量比は、分析用サンプルとデキストリンのみのサンプルを高速液体クラマトグラフィにより分析し、分析用サンプルで現れたピークのピーク面積からデキストリンのピーク面積を差し引くことにより求めた。
【００４５】
［実施製造例］
採取したてのニワトリの鶏冠１ｋｇを約１ｃｍ角に切断して小片化し、１００℃で蒸きょうを行うことにより加熱殺菌した。この小片状の鶏冠にプロテアーゼを中心とした食物由来の酵素類を添加して４５℃で１．５時間反応させた後、攪拌して均質化した。その後、濾過して粗大な固形成分を除去し、液状の分解生成物（以下、「プロテアーゼ分解物」という）を得た。このプロテアーゼ分解物は、ｐＨ６．５、Ｂｒｉｘ値６．２０、固形分濃度５．９１質量％であった。このプロテアーゼ分解物を凍結乾燥して粉砕し、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末を得た。また、このプロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末に３倍等量（質量比）のデキストリンを添加することにより、成分分析のためのプロテアーゼ分解物の分析用サンプルを得た。
次に、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥物粉末３２．０ｇに超純水を加えてろ過し、そのろ液を、全量が１．５Ｌになるように超純水を加えて希釈した。このろ液の希釈液について、１．５Ｌの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）による分液操作を２回行うことにより、水画分と酢酸エチル画分を得た。このうち酢酸エチル画分を採取して創傷治療剤１とした。
【００４６】
［比較製造例］
上記の実施製造例で得られたプロテアーゼ分解物の水画分に、７５０ｍｌの水飽和１−ブタノールを加えて分液する分液操作を２回行い、水画分と水飽和１−ブタノール画分を得た。
【００４７】
（プロテアーゼ分解物の成分分析）
製造例で調製したプロテアーゼ分解物の分析用サンプルについて、上記の方法により成分分析を行った。測定された一般成分の含有率を表１に示し、遊離アミノ酸の組成を表２に示し、低分子ヒアルロン酸の分子量の分析結果を表３に示す。なお、表１〜３中の「％」は「質量％」を表す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
【表２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
表２に示すように、プロテアーゼ分解物に含まれる遊離アミノ酸の中では、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸の含有量が多く、ついで、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等が多く含まれていた。
また、表３に示すように、プロテアーゼ分解物に含まれる低分子ヒアルロン酸は、推定分子量５０００、１５２０、１１４０、７６０および３８０の５種類からなることがわかった。また、ヒアルロン酸の繰り返し単位１つの分子量を約４００とすると、各低分子ヒアルロン酸の繰り返し単位数は、分子量の大きい順に、１３〜１４、４、３、２および１であり、質量比率は、３３％、４７％、１０％、６％および４％であった。よって、低分子ヒアルロン酸の主要成分は、分子量１５２０程度の４分子成分と分子量５０００程度の１３〜１４分子成分の２成分であることがわかった。なお、分析用サンプルにおける、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有率は、分析用サンプルの全量に対して１３．４質量％であった。
【００５２】
（創傷治癒促進作用の評価）
実施製造例で製造した創傷治療剤１（プロテアーゼ分解物の酢酸エチル画分（EtOAc画分））、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末、比較製造例で得たプロテアーゼ分解物の水画分および水飽和１−ブタノール画分（水飽和1-BuOH画分）について、創傷治癒促進作用を評価した。評価用サンプルは、固形分を図２に示す各濃度に調整したものである。
創傷治癒促進作用の評価は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ細胞）および正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＳＣ２Ｆ０細胞）を用い、以下の方法により評価した。
まず、ＮＢ１ＲＧＢ細胞またはＣＳＣ２Ｆ０細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地に６．０ｘ１０4cells／ｍＬとなるように懸濁し、この懸濁液を、２４穴プレートに１．０ｍＬ／wellで播種した後、５％ＣＯ2を含む空気気相下、３７℃で２４時間培養した。図１（ａ）に示すように、培養後、セルスクラッチャー１１にて、ウェル１２の中央部を上から下へスクラッチし、２ｍｍ幅の傷を付けた。培地を吸引除去し、基本培地で１回洗浄した後、新たに血清不含ＤＭＥＭを９００μＬずつ各ウェルに分注し、さらに、各濃度の評価用サンプルを１００μＬずつ各ウェルに添加した。評価用サンプルを添加してから４８時間後に、培地を除去し、１％グルタルアルデヒドを５００μＬずつ各ウェルに分注し、２０分間静置することで細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒドを除去し、ギムザ染色液を５００μＬずつ各ウェルに分注し、２０分間放置することで染色を行った。その後、ギムザ染色液を除去し、超純水で１回洗浄し、乾燥させた。以上のようにして染色を行った各ウェル内の細胞群において、図１（ｂ）に示すように、一直線上に細胞２が５個以上遊走したところを最長遊走地点とみなし、その最長遊走地点間の長さＡ（創傷部分の幅）をセルスクラッチャーで付けた傷１の幅２ｍｍから差し引いた長さ２−Ａ（ｍｍ）を細胞遊走距離とした。各評価用サンプルを添加した細胞群について、細胞遊走距離を測定した結果を図２に示す。図２中、「Control」は評価用サンプルを添加していないこと以外は同様の方法で創傷治癒促進作用を評価したものである。
図２に示すように、コントロールでの細胞遊走距離が０．７ｍｍ程度であるのに対して、創傷治療剤１（酢酸エチル画分）を添加した系では、創傷治療剤の濃度が１２．５μｇ／ｍＬで約１．６ｍｍの非常に長い細胞遊走距離を達成することができた。また、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末をそのまま添加した系では、濃度が２５０μｇ／ｍＬで細胞遊走距離が１．２ｍｍ程度であり、これと比べて、創傷治療剤１は、その濃度の１／１０以下の濃度で、上記のように長い細胞遊走距離が得られている。また、水飽和１-ブタノール画分または水画分を添加した系も、コントロールに比べれば細胞遊走距離が延長しているものの、酢酸エチル画分を添加した系に比べて、添加濃度が高いにも関わらず細胞遊走距離が短い。このことから、プロテアーゼ分解物に含まれる創傷治癒を促進する成分は、酢酸エチル画分に優位に移行していることが示唆されるとともに、酢酸エチル画分（創傷治療剤）が、プロテアーゼ分解物そのものや、水画分、水飽和１−プロパノール画分に比べて、遥かに優れた創傷治癒促進作用を有することがわかった。
【００５３】
＜プロテアーゼ分解物の精製＞
上記の実施製造例で得た酢酸エチル画分（固形分：１７６．８ｍｇ）および比較製造例で得た水画分（固形分：３７．３ｇ）について、以下のようにしてカラムクロマトグラフィによる精製を行った。その精製スキームを図３に示す。なお、図３に示すカラムのうち、カラム１、３以外のカラムに注入したサンプルは、その直前のカラムから溶出したフラクションのうち、上記の評価方法による創傷治癒促進作用について比較的強い活性が認められたフラクションまたはそれらのフラクションの混合液である。
【００５４】
［酢酸エチル画分の精製］
酢酸エチル画分を下記条件のカラム１に注入し、トルエンとアセトンを、混合比率（トルエン／アセトン）を１０／０、９／１、８／２、６／４の順に変化させて１００ｍＬずつカラム１に流した後、アセトン２００ｍＬをカラムに流し、その後、アセトンとメタノールを９／１の比率（アセトン／メタノール）で混合した混合液２００Ｌをカラム１に流して溶出を行った。
（カラム１の条件）
カラム１    ：Wakogel C-200（直径２．０ｃｍ×長さ１３ｃｍ、４０．８ｃｍ3）
サンプル    ：酢酸エチル画分（固形分：１７７ｍｇ）
フラクションサイズ：フラクション１〜２５；２ＯｍＬ、フラクション２６；５０ｍＬ、フラクション２７〜２８；１００ｍＬ
溶出液      ：トルエン、トルエンとアセトンの混合液、アセトン、アセトンとメタノールの混合液
【００５５】
カラム１から溶出したフラクション８〜９の混合液を下記条件のカラム２に注入し、ヘキサンと酢酸エチルを、混合比率（ヘキサン／酢酸エチル）を１０／０、９／１、８／２、６／４（但し、それぞれ酢酸１滴を加えた）の順に変化させて２５ｍＬずつカラム２に流した後、ヘキサンと酢酸エチルを４／６の比率（ヘキサン／酢酸エチル）で混合した混合液に酢酸１滴を加えたものを５０ｍＬ流して溶出を行った。
（カラム２の条件）
カラム２    ：Wakogel C-300（直径１．０ｃｍ×長さ２８．０ｃｍ、２２．０ｃｍ3）
サンプル    ：カラム１のフラクション８〜９の混合液（８９．０ｍｇ）
フラクションサイズ：２．５ｍＬ
溶出液      ：ヘキサン、ヘキサンと酢酸エチルの混合液に酢酸１滴を加えたもの
カラム２から溶出したフラクション１〜２０の混合液を創傷治療剤２とした。
【００５６】
［水画分の精製］
水画分を下記条件のカラム３に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１００、５／９５、１０／９０、２０／８０、４０／６０の順に変化させて５．０Ｌずつカラム３に流して溶出を行った。
（カラム３の条件）
カラム３  ：DIAION HP20（直径１２．０ｃｍ×長さ４０．５ｃｍ、４５７８ｃｍ3）
サンプル    ：水画分（固形分：３７．３ｇ）
フラクションサイズ：２．５Ｌ
溶出液      ：水、メタノールと水の混合液
【００５７】
カラム３から溶出したフラクション５〜６の混合液を下記条件のカラム４に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１００、２．５／９７．５、５／９５、１０／９０、１５／８５の順に変化させて２Ｌずつカラム４に流して溶出を行った。
（カラム４の条件）
カラム４  ：DIAION HP20（直径７．０ｃｍ×長さ４３ｃｍ、１６５４ｃｍ3）
サンプル    ：カラム３のフラクション５〜６の混合液（固形分：５．１ｇ）
フラクションサイズ：５００ｍＬ
溶出液      ：水、メタノールと水の混合液
【００５８】
カラム４から溶出したフラクション８〜１０の混合液を下記条件のカラム５に注入し、水１．５Ｌを流して溶出を行った。
（カラム５の条件）
カラム５  ：TOYOPEARL HW-40C（直径４．０ｃｍ×長さ３５ｃｍ、４４０ｃｍ3）
サンプル    ：カラム４のフラクション８〜１０の混合液（固形分：５０９．４ｍｇ）
フラクションサイズ：３０ｍＬ
溶出液      ：水（１．５Ｌ）
カラム５から溶出したフラクション１４〜１８を水画分精製物とした。
【００５９】
以上の工程で精製した創傷治療剤２について、上記と同様の方法で創傷治癒促進作用を評価したところ、創傷治療剤１や水画分精製物よりも高い創傷治癒促進作用を示すことを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、創傷の治癒を顕著に促進することができ、高い創傷治療効果を奏する創傷治療剤を低コストで提供することができる。このため、本発明の創傷治療剤を用いれば、創傷を迅速に治癒させることが可能になり、さらに、こうした創傷治療効果が高く、しかも安価な内服剤や外用剤を提供することができる。このため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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