(57)【要約】【課題】発光特性の変化に基づき測定（検出や定量など）が可能な機能性タンパク質と抗体Ｆｃ領域結合性ドメインとの融合タンパク質において、簡便な製造過程により高収率で作製可能なものを提供する。【解決手段】抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＦｃ領域結合性ドメインからなる第１の領域と、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するＧＳＴ活性ドメインからなる第２の領域とを含む融合タンパク質を、試料中の抗原、抗体またはＧＳＨの測定に用いる。【選択図】図７
2017201918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＦｃ領域結合性ドメインからなる第１の領域と、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するＧＳＴ活性ドメインからなる第２の領域と、を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｆｃ領域結合性ドメインが、プロテインＡのＺＺドメインである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；および、
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域。
【請求項５】
前記第１の領域が、以下の（ａ）、（ｂ’）、（ｃ’）および（ｄ’）からなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；
（ｂ’）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；
（ｃ’）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；および、
（ｄ’）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域。
【請求項６】
前記第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質：
（ｅ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；
（ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；および、
（ｈ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域。
【請求項７】
前記第２の領域が、以下の（ｅ）、（ｆ’）、（ｇ’）および（ｈ’）からなる群から選択される、請求項６に記載の融合タンパク質：
（ｅ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；
（ｇ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；および、
（ｈ’）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域。
【請求項８】
翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、または配列番号：１７のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
（１）以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（Ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（Ｅ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｆ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｈ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
と、を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（１）前記第１のコード配列が、以下の（Ａ）、（Ｂ’）、（Ｃ）および（Ｄ’）からなる群：
（Ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｂ’）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｄ’）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
から選択され、
（２）前記第２のコード配列が、以下の（Ｅ）、（Ｆ’）、（Ｇ）および（Ｈ’）からなる群：
（Ｅ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｆ’）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｈ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を培養し、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生成させる工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を用いて、試料中の抗原、Ｆｃ領域を含む抗体、または還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を測定する方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体である前記抗体を測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＳＴの存在下で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と反応することにより発光特性の変化を示すＧＳＴ測定用プローブを用い、前記ＧＳＴ測定用プローブの発光特性の変化を指標として、前記試料中の抗原、Ｆｃ領域を含む抗体、またはＧＳＨを測定することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発光特性の変化が、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で前記ＧＳＴ測定用プローブをＧＳＴと接触させる前から後にかけて蛍光強度が増大するというものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＳＴ測定用プローブが、下記一般式（１）：
【化１】
2017201918.tif 000025
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはベンゼン環に結合する１〜３個の同一または異なる置換基を表し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基またはハロゲン原子を表し；Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、フッ素原子または塩素原子を表す、
で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素原子であり、Ｘ１およびＸ２が塩素原子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
所定の抗原と、前記抗原に対する抗体を含みうる試料と、を接触させることと、
前記抗原に結合していない抗体の非存在下で、前記融合タンパク質を前記試料と接触させた後の前記抗原と接触させることと、
ＧＳＴの存在下で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と反応することにより発光特性の変化を示すＧＳＴ測定用プローブと、前記融合タンパク質と接触させた後の前記抗原とを、前記抗体に結合していない前記融合タンパク質の非存在下、かつ、ＧＳＨの存在下で接触させることと、
前記ＧＳＴ測定用プローブを前記抗原と接触させる前後の前記発光特性の変化を指標として、前記試料中の前記抗体を検出または定量することと、
を含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記所定の抗原が、固相に固定化されたものである、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記所定の抗原が、細胞の表面抗原である、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、がん細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面抗原が、前記がん細胞に特異的に発現しているものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法を用いて、前記試料中の前記表面抗原に対する前記抗体を測定することと、
前記測定の結果に基づいて、前記表面抗原に対する抗体を取得することと、
を含む、がんの予防および／または治療剤あるいはこれらの候補抗体のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載の組換えベクター、または請求項１５に記載の形質転換体を含む、試料中の抗原、抗体またはＧＳＨの測定用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（本明細書中、「ＧＳＴ」とも称する）との融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの用途に関する。より具体的には、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＺＺドメインと、ＧＳＴとの融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（本明細書中、「ＧＳＨ」とも称する）との抱合体の生成反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として薬物や内在性活性代謝物のグルタチオン抱合に関与していることが知られている。生体内において、ＧＳＴは、これら抱合体を生成することにより、例えば、親電子性化合物を無毒化したり、排出したりする役割を担っている。また、ＧＳＴはこれ以外にも、ステロイドホルモンの生合成・アミノ酸の分解・プロスタグランジンの生合成など、多岐にわたる機能をもつ。また、ＧＳＴのいくつかのサブタイプはがん細胞において過剰発現しており、阻害剤処理やノックダウンが細胞死を誘導することから、創薬における重要な標的と考えられている。
【０００３】
このため、ＧＳＴの活性を測定して特定疾患の診断に役立てるニーズもある。さらに、生化学の研究分野では、ＧＳＴを利用したキットが多数開発されており、ＧＳＴの活性を正確に測定するという要求は非常に高い。
【０００４】
ここで、従来提案されているＧＳＴ活性の測定方法としては、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがある。吸光法（比色法）によるＧＳＴ活性の測定方法としては、例えば、２，４−ジニトロクロロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて、グルタチオン化生成物の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を検出する方法が知られている。一方、生物発光法によるＧＳＴ活性の測定方法としては、例えば非特許文献１には、ケージドルシフェリンのニトロベンゼンスルホン酸エステルがＧＳＴによる芳香族求核置換反応（脱保護反応）を受けて生成するルシフェリンを、ＡＴＰおよびルシフェラーゼの存在下において発光させて、その発光強度からＧＳＴ活性を測定する方法が開示されている。さらに、蛍光法によるＧＳＴ活性の測定方法として、いくつかの蛍光プローブが開発されている。例えば非特許文献２には、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている。これらの蛍光プローブはＧＳＴ活性によるグルタチオン化と、これに伴う脱ニトロ化反応によって大きな蛍光強度上昇を示す。このように、非特許文献２に開示された蛍光プローブは、ＧＳＴ存在下での反応性が極めて高く、比較的有用な蛍光プローブではあるということができる。
【０００５】
しかしながら、非特許文献２に開示された蛍光プローブ（ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅ）は、ＧＳＴ非依存的なグルタチオンとの反応性が高いことから十分なＳ／Ｎ比が得られず、また、反応後の蛍光量子収率が０．１程度（０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中でのフルオレセインの量子収率を０．８５とした場合）と低いという問題があった。さらに、本発明者による従来の検討によれば、ＤＮＡＦ類を蛍光プローブとして用いると、弱酸性領域のｐＨ条件下では生成物の蛍光強度が大幅に減少するという問題もあることが判明した。この問題を解決するための技術として、本発明者らは、特定部位にフッ素原子または塩素原子が導入されたフルオレセイン誘導体をＧＳＴ測定用の蛍光プローブとして用いることで、上記のようなＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅが抱える問題を解決することができることを報告している（非特許文献３）。
【０００６】
ところで、プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）の細胞壁由来のタンパク質であり、免疫グロブリン（特に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））のＦｃ領域と特異的に結合することが知られている。この性質を利用して、プロテインＡとカルシウム結合発光タンパク質であるイクオリンとの融合タンパク質をイムノアッセイ法に使用することが提案されている（例えば、非特許文献４）。
【０００７】
また、ＺＺドメインは、プロテインＡのＩｇＧ結合領域をもとに開発された合成のＩｇＧ結合領域である（例えば、非特許文献５）。ＺＺドメインとカルシウム結合発光タンパク質であるオベリンとの融合タンパク質（非特許文献６）や、ＺＺドメインとイクオリンとの融合タンパク質（特許文献１）をイムノアッセイに使用することも提案されている。しかしながら、ＺＺドメインをＧＳＴと融合させる技術についてはこれまで何ら報告がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−４８６０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chem Commun (Camb). 2006 (44):4620-4622
【非特許文献２】J Am Chem Soc. 2008 130(44):14533-14543
【非特許文献３】Chem Commun (Camb). 2015 (57):11459-11462
【非特許文献４】Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, (171):169-174
【非特許文献５】Protein Eng. 1987 (1):107-113
【非特許文献６】Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, (219):475-479
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ここで、非特許文献４、非特許文献６および特許文献１に開示された、カルシウム結合発光タンパク質であるイクオリンまたはオベリンをプロテインＡまたはＺＺドメインとの融合タンパク質として構成する技術では、組換え技術等によって得られた融合タンパク質をそのまま抗体の定量等に使用することはできず、融合タンパク質に含まれるアポタンパク質部分（アポイクオリンまたはアポオベリン）を発光基質であるセレンテラジンと接触させることによりホロタンパク質へと変換する処理が必要である。このため、融合タンパク質の製造過程が複雑であり、また、アポタンパク質をホロタンパク質へと変換する際に一部のアポタンパク質がホロタンパク質へと変換されない結果、得られた融合タンパク質をすべて利用できない場合もあった。
【００１１】
そこで本発明は、発光特性の変化に基づき測定（検出や定量など）が可能な機能性タンパク質と抗体Ｆｃ領域結合性ドメインとの融合タンパク質において、簡便な製造過程により高収率で作製可能なものを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、ＧＳＴ活性を有するドメイン（ＧＳＴ活性ドメイン）からなる領域を、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するドメイン（Ｆｃ領域結合性ドメイン）からなる領域に融合させた融合タンパク質により、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の一形態によれば、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＦｃ領域結合性ドメインからなる第１の領域と、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するＧＳＴ活性ドメインからなる第２の領域とを含む融合タンパク質が提供される。
【００１４】
また、本発明の他の形態によれば、上記形態に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドや、当該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、当該組換えベクターが導入された形質転換体、当該形質転換体を培養し、上記形態に係る融合タンパク質を生成させる工程を含む融合タンパク質の製造方法もまた、提供される。
【００１５】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記形態に係る融合タンパク質を用いて、試料中の「Ｆｃ領域を含む抗体」や「抗原」、「ＧＳＨ」を測定する方法のほか、これらの当該方法に用いられるキットが提供される。特に、上記「Ｆｃ領域を含む抗体」を測定する方法は、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法に応用可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、発光特性の変化に基づき測定（検出や定量など）が可能な機能性タンパク質とＺＺドメインとの融合タンパク質であって、簡便な製造過程により高収率で作製可能なものが提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例において構築した各種ＺＺ−ＧＳＴの発現ベクターである各種ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＧＳＴ発現ベクターのベクターマップである。
【図２】図２は、実施例において作製したＺＺ融合型ＧＳＴである（Ａ）ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質、（Ｂ）ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質、（Ｃ）ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質、（Ｄ）ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質のそれぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果を示す泳動写真である。なお、図２（Ａ）〜図２（Ｄ）における各レーンは、それぞれ、１：タンパク質発現誘導前、２：タンパク質発現誘導後、３：Ｈｉｓ−タグカラム非吸着画分、４：精製後のものである。
【図３】図３は、実施例で作製したＺＺ融合型ＧＳＴである（Ａ）ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質、（Ｂ）ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質、（Ｃ）ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質、（Ｄ）ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質のそれぞれについて、酵素反応速度論を検討した結果得られたミカエリスメンテンプロットのグラフである。
【図４】図４は、実施例において、アガロースビーズにプロテインＬを介して固定化された抗トランスフェリン受容体抗体に、本発明に係る各種のＺＺ融合型ＧＳＴをＺＺドメインを介して吸着させた複合体について、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定した結果を示すグラフである。図４（Ａ）は、この実験における蛍光強度の変化を３，４−ＤＮＡＤＣＦ添加後の経過時間に対してプロットしたグラフである。また、図４（Ｂ）は、この実験における反応初速度を示すグラフである。なお、図４（Ｂ）には、ＺＺ融合型ＧＳＴが（ＺＺドメインを介して）アガロースビーズへと吸着するのに必要な抗トランスフェリン受容体抗体（αＴＲ；anti-transferrin receptor antibody）を用いて実験を行った場合（αＴＲが「＋」）とこれを用いずに実験を行った場合（αＴＲが「−」）の結果を併記している。
【図５】図５は、異なる抗体濃度を用いた場合について、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を用いた系で図４に示すのと同様の実験を行った結果を示すグラフである。図５（Ａ）は、この実験における蛍光強度の変化を３，４−ＤＮＡＤＣＦ添加後の経過時間に対してプロットしたグラフである。また、図５（Ｂ）は、本実験において用いた抗体濃度に対するＧＳＴ活性の相関関係を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例において、プレートにプロテインＬを介して固定化された抗トランスフェリン受容体抗体に、本発明に係る各種のＺＺ融合型ＧＳＴをＺＺドメインを介して吸着させた複合体について、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定した結果を示すグラフである。図６（Ａ）は、異なる濃度の抗トランスフェリン受容体抗体をインキュベートした際の蛍光強度上昇の時間変化を示すグラフである。ここで、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を添加していない系列においては、０μＭおよび１０μＭ抗トランスフェリン受容体抗体処理をコントロールとしている。図６（Ｂ）は、抗トランスフェリン受容体抗体の濃度に対して反応初速度をプロットしたグラフである。
【図７】図７は、実施例において、ＭＣＦ７細胞の細胞表面に発現しているトランスフェリン受容体に対するオンセルＥＬＩＳＡにおける抗体の検出・定量に本発明の融合タンパク質を適用し、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定した結果を示すグラフである。図７（Ａ）は、異なる処理の伴う蛍光強度の時間変化を示すグラフである。ここで、□印で示したマーカーは未処理、◆印のマーカーは抗トランスフェリン受容体抗体処理のみ、△印のマーカーはＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３処理のみ、●印のマーカーは抗トランスフェリン受容体抗体およびＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３の両者の処理を行ったものである。また、図７（Ｂ）は、それぞれの処理における単位時間当たりの蛍光強度上昇（図７（Ａ）に示すグラフの傾き）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態を説明する。
【００１９】
１．本発明の融合タンパク質
本発明の一形態は、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＦｃ領域結合性ドメインからなる第１の領域と、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するＧＳＴ活性ドメインからなる第２の領域と、を含む融合タンパク質である。本明細書において、当該融合タンパク質を「本発明の融合タンパク質」とも称する。
【００２０】
（第１の領域）
本発明の融合タンパク質における第１の領域は、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するＦｃ領域結合性ドメインからなる領域である。ここで、第１の領域の具体的な形態について特に制限はなく、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するアミノ酸配列を有するドメインからなるものであればよい。ここで、本発明における「抗体」は、Ｆｃ領域を有するものを意味し、そのクラス（アイソタイプ）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよい。第１の領域を構成するＦｃ領域結合性ドメインが、以下に詳述するプロテインＡやＺＺドメインのように特にＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合するものである場合のように、第１の領域を構成するＦｃ領域結合性ドメインがＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するドメインである実施形態（すなわち、上記抗体がＩｇＧ抗体である実施形態）は、本発明の好ましい一実施形態である。
【００２１】
第１の領域を構成するＦｃ領域結合性ドメインは、例えば、プロテインＡのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインでありうる。ここで、「プロテインＡ」は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）の細胞壁由来のタンパク質であり、免疫グロブリン（特に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ抗体））のＦｃ領域と特異的に結合することが知られている。なお、プロテインＡのアミノ酸配列は、例えば特開平０７−５１０８６号公報に記載されている。
【００２２】
また、第１の領域の他の一例（好ましい実施形態）は、プロテインＡのＺＺドメインである。この「プロテインＡのＺＺドメイン」は、プロテインＡのＩｇＧ結合領域をもとに開発された合成のＩｇＧ結合領域であり、その詳細は例えば非特許文献５（Protein Eng. 1987 (1):107-113）に記載されている。
【００２３】
第１の領域としての「プロテインＡのＺＺドメイン」は、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域が挙げられる。ここで、配列番号：１は、プロテインＡのＺＺドメインのアミノ酸配列を示し、配列番号：２は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（プロテインＡのＺＺドメインのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００２４】
【化１】
2017201918.tif 000003
【００２５】
また、第１の領域としての「プロテインＡのＺＺドメイン」は、例えば（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能を有する領域であってもよい。なお、「配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性または機能」とは、例えば、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を意味する。ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するか否かについては、例えば、ウエスタンブロッティング法や、表面プラズモン共鳴法といった方法などに従って測定することができる。
【００２６】
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987-1997) “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２７】
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能（例えば、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能）を有する領域も挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２８】
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能（例えば、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能）を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後述する。
【００２９】
すなわち、本発明の融合タンパク質の好ましい実施形態において、第１の領域は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；および、
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域。
【００３０】
また、本発明の融合タンパク質のより好ましい実施形態において、第１の領域は、以下の（ａ）、（ｂ’）、（ｃ’）および（ｄ’）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；
（ｂ’）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；
（ｃ’）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域；および、
（ｄ’）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域。
【００３１】
（第２の領域）
本発明の融合タンパク質における第２の領域は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するＧＳＴ活性ドメインからなる領域である。ここで、第２の領域の具体的な形態について特に制限はなく、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性を有するアミノ酸配列を有するドメインからなるものであればよい。ここで、本発明における「ＧＳＴ活性」とは、親電子性化合物と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との抱合体の生成反応を触媒する活性を意味する。
【００３２】
ＧＳＴ活性を有するドメイン（ＧＳＴ活性ドメイン）は、例えば、従来公知のＧＳＴのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインでありうる。ここで、従来、哺乳動物を由来とするＧＳＴとしては、アルファ（α）、カッパ（κ）、ミュー（μ）、オメガ（ω）、パイ（π）、シグマ（σ）、シータ（θ）、ゼータ（ζ）の８種のアイソフォームが知られている。また、哺乳動物以外の生物を由来とするＧＳＴとしては、キイロショウジョウバエ（Drosophila  melanogaster）由来のＤｍＧＳＴｅ１３やＤｍＧＳＴｅ１４のほか、いわゆるＧＳＴタグとして汎用されている、日本住血吸虫（Schistosoma  japonicum）由来のＳｊＧＳＴなどが知られている。本形態に係る融合タンパク質において第２の領域を構成するＧＳＴ活性ドメインは、これらの従来公知のＧＳＴのいずれのもののアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインであってもよい。
【００３３】
ここで、第２の領域の好ましい実施形態は、上述した従来公知のＧＳＴのうち、ヒト由来のｈＧＳＴＡ（アルファ）１、ｈＧＳＴＭ（ミュー）１、ｈＧＳＴＰ（パイ）１およびキイロショウジョウバエ由来のＤｍＧＳＴｅ１３からなる群から選択されるいずれかのＧＳＴのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインからなるものである。これらのなかでも、ＧＳＴ活性に優れるという観点からは、第２の領域は、ｈＧＳＴＭ１、ｈＧＳＴＰ１およびＤｍＧＳＴｅ１３からなる群から選択されるいずれかのＧＳＴのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインからなるものであることが好ましく、ＤｍＧＳＴｅ１３のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメインからなるものであることが最も好ましい。
【００３４】
第２の領域としての「ｈＧＳＴＡ１、ｈＧＳＴＭ１、ｈＧＳＴＰ１およびＤｍＧＳＴｅ１３からなる群から選択されるいずれかのＧＳＴのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメイン」は、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域である。ここで、配列番号：３は、ヒトＧＳＴＡ１（ｈＧＳＴＡ１）のアミノ酸配列（GenBank  Accession  Number：NP_665683.1）を示し、配列番号：４は、配列番号：３で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＡ１（ｈＧＳＴＡ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（終止コドンを含む；GenBank  Accession  Number：NM_145740.4）を示す。配列番号：５は、ヒトＧＳＴＭ１（ｈＧＳＴＭ１）のアミノ酸配列（GenBank  Accession  Number：NP_000552.2）を示し、配列番号：６は、配列番号：５で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＭ１（ｈＧＳＴＭ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（終止コドンを含む；GenBank  Accession  Number：NM_000561.3）を示す。配列番号：７は、ヒトＧＳＴＰ１（ｈＧＳＴＰ１）のアミノ酸配列（GenBank  Accession  Number：NP_000843.1）を示し、配列番号：８は、配列番号：７で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＰ１（ｈＧＳＴＰ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（終止コドンを含む；GenBank  Accession  Number：NM_000852.3）を示す。配列番号：９は、キイロショウジョウバエＧＳＴｅ１３（ＤｍＧＳＴｅ１３）のアミノ酸配列（GenBank  Accession  Number：NP_610457.1）を示し、配列番号：１０は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列（キイロショウジョウバエＧＳＴｅ１３（ＤｍＧＳＴｅ１３）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（終止コドンを含む；GenBank  Accession  Number：NM_136613.3）を示す。
【００３５】
また、第２の領域としての「ｈＧＳＴＡ１、ｈＧＳＴＭ１、ｈＧＳＴＰ１およびＤｍＧＳＴｅ１３からなる群から選択されるいずれかのＧＳＴのアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するドメイン」は、（ｆ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能を有する領域であってもよい。なお、「配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性または機能」とは、例えば、ＧＳＴ活性を意味する。ＧＳＴ活性を有するか否かについては、例えば、後述する実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
【００３６】
【化２】
2017201918.tif 000004
【００３７】
【化３】
2017201918.tif 000005
【００３８】
【化４】
2017201918.tif 000006
【００３９】
【化５】
2017201918.tif 000007
【００４０】
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列に対して約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能（例えば、ＧＳＴ活性）を有する領域も挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。
【００４１】
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性または機能（例えば、ＧＳＴ活性）を有する領域も含まれる。
【００４２】
すなわち、本発明の融合タンパク質の好ましい実施形態において、第２の領域は、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；
（ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；および、
（ｈ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域。
【００４３】
また、本発明の融合タンパク質のより好ましい実施形態において、第２の領域は、以下の（ｅ）、（ｆ’）、（ｇ’）および（ｈ’）からなる群から選択される：
（ｅ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；
（ｇ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域；および、
（ｈ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域。  本発明の融合タンパク質は、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのペプチド配列をさらに含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、本技術分野において用いられているペプチド配列（例えば、ＴＥＥ配列など）を使用することができる。また、精製のためのペプチド配列としては、本技術分野において用いられているペプチド配列（例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）配列など）を使用することができる。なお、このような配列は、融合タンパク質の任意の位置に含まれうる。後述する実施例において作製した融合タンパク質（ＺＺ融合型ＧＳＴ）は、そのＮ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）配列を有しているが、Ｃ末端側に位置していてもよい。
【００４４】
また、本発明の融合タンパク質において、第１の領域と第２の領域とは、直接的に連結している状態でもよいし、間接的に連結している状態でもよい。後者の場合、例えば、第１の領域と第２の領域との間に、リンカー配列を有してもよい。この際、リンカー配列のアミノ酸長は特に制限されず、当業者であれば融合タンパク質の製造時の簡便さや制限部位との兼ね合いなどを考慮してリンカー配列のアミノ酸長およびその具体的な配列を適宜決定することができる。  本発明の融合タンパク質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合タンパク質としては、化学合成により合成した融合タンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合タンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質を化学合成する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、市販のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合タンパク質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合タンパク質を作製することができる。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合タンパク質の発現系での発現などについては、後述する。
【００４５】
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、上述した本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（本明細書中、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）も提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記の細胞・組織からｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することにより本発明のポリヌクレオチドを得てもよい。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドには、（１）以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（Ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；および、
（Ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（Ｅ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｆ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｈ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
と、を含む、ポリヌクレオチドなどが含まれる。なお、本明細書において、「第１のコード配列」とは、第１の領域をコードする塩基配列を含む塩基配列を意味し、「第２のコード配列」とは、第２の領域をコードする塩基配列を含む塩基配列を意味する。
【００４７】
また、本発明のポリヌクレオチドの好ましい実施形態においては、第１のコード配列が、以下の（Ａ）、（Ｂ’）、（Ｃ）および（Ｄ’）からなる群：
（Ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｂ’）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｄ’）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（Ｅ）、（Ｆ’）、（Ｇ）および（Ｈ’）からなる群：
（Ｅ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｆ’）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（Ｇ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
（Ｈ’）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＳＴ活性を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
から選択される。
【００４８】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。
【００４９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とされる相補性の程度が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性（または同一性）を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５１】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、または配列番号：９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．３％以上、９９．５％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、上述した方法を用いて決定することができる。
【００５２】
あるアミノ酸配列に対して、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
【００５３】
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００５４】
また欠失変異体の一種であるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、または配列番号：１７のアミノ酸配列からなるタンパク質（これらのタンパク質は、本発明の誘導タンパク質の具体例である；後述する実施例を参照）をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドなどが挙げられ、その具体例としては、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドが挙げられる。一方、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、または配列番号：１７のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであり、より好ましくは、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなるものである（後述する実施例を参照）。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列（例えば、ＴＥＥ配列など）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、上述したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、本技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ配列）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。
【００５７】
３．本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
【００５８】
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結（挿入）することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、種々の発現用ベクターまたはクローニング用ベクター等が使用でき、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等）などが挙げられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。
【００５９】
また、本発明においては、ｐＣＯＬＤ−Ｉベクター、ｐＣＯＬＤ−ＩＩベクター、ｐＣＯＬＤ−ＩＩＩベクター、ｐＣＯＬＤ−ＩＶベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。後述の実施例などに具体的に示されているように、これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合タンパク質を宿主細胞の細胞質中に可溶性タンパク質として産生させることができる。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｃｓｐＡプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００６１】
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
【００６２】
また、本発明の組換えベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、本技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列（例えば、ＴＥＥ配列など）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。また、精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、本技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ配列など）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。
【００６３】
（２）形質転換体の作製
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などが挙げられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などが挙げられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）などが挙げられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが挙げられる。動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などが挙げられる。
【００６４】
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などが挙げられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などが挙げられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などが挙げられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などが挙げられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などが挙げられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などが挙げられる。このようにして、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００６５】
４．本発明の融合タンパク質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合タンパク質を生成させる工程を含む、本発明の融合タンパク質の製造方法を提供する。本発明の融合タンパク質は、前記形質転換体を本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合タンパク質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
【００６６】
（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。この培養によって、形質転換体が本発明の融合タンパク質を生成し、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合タンパク質が蓄積される。
【００６７】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、当該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ＬａｃプロモーターやｃｓｐＡプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などを、ＴＲＰプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加してもよい。
【００６８】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加える。
【００６９】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７０】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、例えば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７１】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７２】
（本発明の融合タンパク質の分離・精製）
上記培養物から、本発明の融合タンパク質を分離・精製することによって、本発明の融合タンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合タンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００７３】
具体的には、本発明の融合タンパク質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明の融合タンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明の融合タンパク質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により目的タンパク質を含む抽出液を得ることができる。本発明の融合タンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明の融合タンパク質を含む培養上清を得ることができる。
【００７４】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明の融合タンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明の融合タンパク質が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明の融合タンパク質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法を用いることができる。
【００７５】
５．本発明の融合タンパク質などの用途
本発明の融合タンパク質は、上述したように、ＧＳＴ活性と、抗体のＦｃ領域に対する結合能とを有している。したがって、本発明の融合タンパク質は、例えば、イムノアッセイにおける試料中の抗体（特に、ＩｇＧ抗体）または抗原の測定に利用されうる。なお、本明細書において「測定」という用語は、検出、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきであるが、好ましくは検出または定量を意味し、より好ましくは定量を意味する。ここで、本発明の融合タンパク質を抗体の測定に用いる場合、当該抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。この場合、本発明の融合タンパク質を用いた抗体の測定方法の好ましい一実施形態として、例えばハイブリドーマを用いて作製されたモノクローナル抗体を定量することが可能である。なお、ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の作製は、常法に従って行うことができる。例えば、必要に応じて適切なアジュバントと混合した抗原で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、当該動物の脾臓細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法などにより行うことができる。細胞融合後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプレリン、チミジンを含む培地）などの選択培地でハイブリドーマを選別し、上記抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマの能力について、常法（例えば、ＥＩＡ法）に従ってスクリーニングを行う。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このようにして、所望の抗原に対するモノクローナル抗体を作製することができる。そして、作製されたモノクローナル抗体を含む溶液（緩衝液）を試料として用い、本発明に係る抗体の測定方法を実施することで、試料中の上記モノクローナル抗体を定量することができる。
【００７６】
このような抗体または抗原の測定は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明の融合タンパク質を抗体の測定に用いる場合には、本発明の融合タンパク質を（第１の領域を介して）抗体（のＦｃ領域）に結合させ、抗体に結合した当該融合タンパク質の第２の領域に由来するＧＳＴ活性を測定することにより、抗体を測定することができる。また、本発明の融合タンパク質を抗原の測定に用いる場合には、当該抗原に対して特異的に結合することが知られている抗体を当該抗原に結合させた後、本発明の融合タンパク質を（第１の領域を介して）当該抗体（のＦｃ領域）に結合させ、抗体に結合した当該融合タンパク質の第２の領域に由来するＧＳＴ活性を測定することにより、間接的に抗原を測定することができる。
【００７７】
さらに、本発明の融合タンパク質の第２の領域に由来するＧＳＴ活性は、親電子性化合物と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との抱合体の生成反応を触媒するという活性である。したがって、本発明の融合タンパク質を、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の測定に用いることも可能である。
【００７８】
本発明の融合タンパク質のいずれの用途においても、第２の領域に由来するＧＳＴ活性を測定することが必要であるが、ＧＳＴ活性の測定は通常の方法により行うことができる。例えば、ＧＳＴの存在下で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と反応することにより発光特性の変化を示すＧＳＴ測定用プローブを用い、当該ＧＳＴ測定用プローブの発光特性の変化を指標として、第２の領域に由来するＧＳＴ活性を測定する（すなわち、試料中の抗原、Ｆｃ領域を含む抗体、またはＧＳＨを測定する）ことができる。なお、かようなＧＳＴ測定用プローブを利用するＧＳＴ活性の測定方法には、吸光法（比色法）、生物発光法、蛍光法などがあるが、ここではいずれも利用可能である。吸光法（比色法）によるＧＳＴ活性の測定方法としては、例えば、２，４−ジニトロクロロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて、グルタチオン化生成物の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を検出する方法が知られている。また、生物発光法によるＧＳＴ活性の測定方法としては、例えば、ケージドルシフェリンのニトロベンゼンスルホン酸エステルがＧＳＴによる芳香族求核置換反応（脱保護反応）を受けて生成するルシフェリンを、ＡＴＰおよびルシフェラーゼの存在下において発光させて、その発光強度からＧＳＴ活性を測定する方法が知られている（非特許文献１）。なお、上述した吸光法（比色法）や生物発光法と比較して、Ｓ／Ｎ比や感度に優れるという観点から、蛍光法を利用することが好ましい。特に、前記ＧＳＴ測定用プローブの「発光特性の変化」が、「還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で当該ＧＳＴ測定用プローブをＧＳＴと接触させる前から後にかけて蛍光強度が増大する」というものであることがより好ましい。このような蛍光法によるＧＳＴ活性の測定方法としては、４９０ｎｍに極大吸収波長、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長をそれぞれ有するプローブとして、ＤＮＡＦ類やＤＮＡＴ−Ｍｅといった一連の蛍光プローブが開示されている（非特許文献２）。また、非特許文献２に開示された蛍光プローブが抱える問題を解決した蛍光プローブとして、非特許文献３に開示された３，４−ＤＮＡＤＣＦに代表される、下記一般式（１）で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩を用いることが好ましい。下記一般式（１）で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩をＧＳＴ測定用プローブ（蛍光プローブ）として用いると、ｐＨ６．５といった弱酸性領域においても高い蛍光強度を示し、しかも酵素非依存的なＧＳＨとの反応性が低く極めて優れたＳ／Ｎ比を示すという利点がある。
【００７９】
【化６】
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【００８０】
一般式（１）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはベンゼン環に結合する１〜３個の同一または異なる置換基を表す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。また、それぞれのベンゼン環上に２個以上の置換基が存在する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。なお、Ｒ１およびＲ２としてはともに水素原子が好ましい。
【００８１】
一般式（１）において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基またはハロゲン原子を表す。好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素原子またはフッ素原子または塩素原子であり、より好ましくは、いずれも水素原子である。
【００８２】
一般式（１）において、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、フッ素原子または塩素原子を表す。好ましい実施形態において、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方が塩素原子であり、特に好ましくはＸ１およびＸ２がともに塩素原子である。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、一般式（１）で表される化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素原子であり、Ｘ１およびＸ２が塩素原子である化合物またはその塩である（後述する実施例において合成されている３，４−ＤＮＡＤＣＦ）。
【００８４】
本明細書において、「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１〜６個程度、好ましくは炭素数１〜４個程度である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００８５】
本明細書において、「アルコキシ基」は、−Ｏ−アルキル基を意味し、ここで「アルキル基」は上述した定義を有する基である。
【００８６】
本明細書において、「アミノ基」は−ＮＨ２基を意味し、「モノもしくはジ置換アミノ基」は、アミノ基の水素原子の一方または双方が置換基によって置換されてなる基を意味する。前記置換基としては、例えば、アルキル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８７】
本明細書において、「置換シリル基」は、シリル基（−ＳｉＨ３基）の少なくとも１つの水素原子が置換基によって置換されてなる基を意味する。前記置換基としては、例えば、アルキル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
本明細書において、「アシル基」は脂肪族アシル基または芳香族アシル基のいずれであってもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アシル基としてアルキルカルボニル基（アセチル基など）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基など）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基など）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基など）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基など）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基など）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基など）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基など）、又はアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基など）などのアシル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。これらのアシル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。前記置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシル基などが挙げられるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは互いに同一でも異なっていてもよい。
【００８９】
上記一般式（１）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、またはトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩が挙げられる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などが例示されうる。ただし、本発明に係る化合物の塩はこれらに限定されることはない。
【００９０】
一般式（１）で表される化合物またはその塩は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマーなどの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００９１】
一般式（１）で表される化合物またはその塩は、水和物または溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒が挙げられる。
【００９２】
一般式（１）で表される本発明の化合物またはその塩は、親水性の化合物（塩）であることが好ましい。本明細書では、化合物（塩）の親水性の指標として「ｌｏｇＰ値」を用いることができる。ここで、「ｌｏｇＰ値」とは、「オクタノール−水分配係数」や「ｌｏｇＰｏｗ」とも称され、ｎ−オクタノールおよび水からなる二相溶媒系の各相へのある物質の分配濃度の比の値の常用対数として定義され、値が大きいほど親油性が高い（親水性が低い）ことを意味する。なお、本明細書において、ｌｏｇＰ値の値としては、ＪＩＳ Ｚ−７２６０−１０７：２０００に記載のフラスコ振盪法により測定が可能である。また、ｌｏｇＰ値については、実測に代わって、計算化学的手法または経験的方法により見積もることも可能である。
【００９３】
計算方法としては、Ｃｒｉｐｐｅｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２７巻、ｐ２１（１９８７年））、Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２９巻、ｐ１６３（１９８９年））、Ｂｒｏｔｏ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｏｒ．”，１９巻、ｐ７１（１９８４年））、ＣＬｏｇＰ法（参考文献Ｌｅｏ，Ａ．，Ｊｏｗ，Ｐ．Ｙ．Ｃ．，Ｓｉｌｉｐｏ，Ｃ．，Ｈａｎｓｃｈ，Ｃ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１８，８６５  １９７５年）などが好ましく用いられるが、Ｃｒｉｐｐｅｎ’ｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ法（“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．”，２７巻、ｐ２１（１９８７年））がより好ましい。ただし、上述したフラスコ振盪法による測定値と計算化学的手法または経験的方法によって見積もられた値とが有意に異なる場合には、フラスコ振盪法による測定値が優先するものとする。
【００９４】
本発明において一般式（１）で表される化合物のｌｏｇＰ値は、好ましくは５．２以下であり、より好ましくは５．０以下であり、さらに好ましくは４．８以下であり、いっそう好ましくは４．６以下であり、特に好ましくは４．４以下であり、最も好ましくは４．２以下である。一方、一般式（１）の化合物のｌｏｇＰ値の下限値について特に制限はないが、通常は１．５以上程度のｌｏｇＰ値であれば、上述したような効果を十分に得ることができる。なお、後述する実施例において合成されている化合物である３，４−ＤＮＡＤＣＦのｌｏｇＰ値は４．１６である。
【００９５】
一般式（１）で表される本発明の化合物は、例えば、従来公知の文献（Synthesis 2009, 7; 1224-1226およびJ Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543（非特許文献２））に記載の手法を参照しつつ、合成することが可能である。本明細書の実施例の欄には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されており、当業者は本明細書の開示を参照することにより、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００９６】
一般式（１）で表される化合物は、中性領域（例えばｐＨ５〜９の範囲）では実質的に無蛍光である。一方、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の存在下では、当該化合物におけるベンゼン環のパラ位（４位）に結合しているニトロ基（−ＮＯ２基）が脱離するとともにこのパラ位（４位）がグルタチオン化され、強蛍光性の化合物となる。例えば、一般式（１）で表される化合物またはその塩は、中性領域において例えば５０５ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記のようにグルタチオン化された化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えば、蛍光波長５２５ｎｍ）を発する性質を有している。従って、当該化合物をＧＳＴ測定用プローブ（蛍光プローブ）として使用することにより、ＧＳＴの存在を蛍光強度の変化により測定することが可能になる。
【００９７】
ここで、非特許文献４、非特許文献６および特許文献１に開示された、カルシウム結合発光タンパク質であるイクオリンまたはオベリンをプロテインＡまたはＺＺドメインとの融合タンパク質として構成する技術において、イクオリンまたはオベリンは、アポタンパク質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。そして、この複合体の形態のイクオリンまたはオベリンにカルシウムイオンが結合すると、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドおよび二酸化炭素が生成するとともに発光が生じる。この発光の強度を測定することでカルシウムイオンの定量やＺＺドメインに結合した抗体の定量が可能となるというものである。しかしながら、カルシウム結合発光タンパク質がカルシウムイオンと結合した際の発光は瞬間的なものであり、持続的に発光を維持させておきたいアッセイ系などには適用することができず、利用可能な用途が限定されているという問題もあった。これに対し、上述したようなＧＳＴ測定用プローブを用い、当該ＧＳＴ測定用プローブの発光特性の変化を指標として、第２の領域に由来するＧＳＴ活性を測定する（すなわち、試料中の抗原、Ｆｃ領域を含む抗体、またはＧＳＨを測定する）手法（なかでも、特に蛍光法）によれば、長時間にわたって持続的に発光を維持させておくことが可能である。したがって、上述したカルシウム結合発光タンパク質に基づく技術を適用することができないアッセイ系にも適用が可能であるという利点がある。
【００９８】
なお、一般式（１）で表される化合物またはその塩を蛍光プローブとして用いた方法によるＧＳＴ活性の測定は中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で行うことができる。ここで、非特許文献２に開示されている蛍光プローブであるＤＮＡＦ１をｐＨ６．５などの弱酸性条件下で用いてＧＳＴの活性を測定すると、反応生成物の蛍光強度の低下が見られる。これに対し、一般式（１）で表される化合物またはその塩を蛍光プローブとして用いることで、ｐＨ６．５などの酸性条件下での測定であってもかような蛍光強度の低下はほとんど見られない。したがって、一般式（１）で表される化合物またはその塩を蛍光プローブとして用いた方法によるＧＳＴ活性の測定について、好ましい実施形態ではｐＨ６．３〜８．５の範囲で測定が行われ、より好ましくはｐＨ６．４〜６．６の範囲で測定が行われる。
【００９９】
ＧＳＴ測定用蛍光プローブとしては、上記一般式（１）で表される化合物またはその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【０１００】
本発明の融合タンパク質の用途のうち、抗体の測定方法における他の好ましい実施形態は、試料中の「所定の抗原に対する抗体」を測定する方法に関する。すなわち、当該方法の好ましい実施形態は、
所定の抗原と、前記抗原に対する抗体を含みうる試料と、を接触させることと、
前記抗原に結合していない抗体の非存在下で、前記融合タンパク質を前記試料と接触させた後の前記抗原と接触させることと、
ＧＳＴの存在下で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と反応することにより発光特性の変化を示すＧＳＴ測定用プローブを、前記抗体に結合していない前記融合タンパク質の非存在下、かつ、ＧＳＨの存在下で、前記融合タンパク質と接触させた後の前記抗原と接触させることと、
前記ＧＳＴ測定用プローブを前記抗原と接触させる前後の前記発光特性の変化を指標として、前記試料中の前記抗体を検出または定量することと、
を含むものである。
【０１０１】
ここで、上記実施形態において所定の抗原に対する抗体を測定するには、通常、当該所定の抗原として固相に固定化されたものを用いる。この際、固相としてはビーズ担体または基板を用いることが好ましい。なお、ビーズ担体としては、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられ、磁性を利用したハンドリングが容易であることから磁気ビーズが好ましい。また、基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
【０１０２】
上記実施形態において、所定の抗原は、細胞の表面抗原であってもよい。この際、当該細胞としてがん細胞を用いることが好ましい。また、当該細胞ががん細胞である場合、当該表面抗原は、当該がん細胞に特異的に発現しているものであることが好ましい。かような形態によれば、試料中の「がん細胞に特異的に発現している表面抗原に対する抗体」を測定（定量等）することができる。この際、試料としては上記「がん細胞に特異的に発現している表面抗原に対する抗体」を含みうる試料が用いられている。また、「がん細胞に特異的に発現している表面抗原に対する抗体」はがんの予防および／または治療剤として用いられうる。したがって、当該試料中の「所定の抗原に対する抗体」を測定した結果に基づき、がんの予防および／または治療剤あるいはこれらの候補抗体をスクリーニングすることが可能である。すなわち、本発明の融合タンパク質の用途のさらに他の実施形態は、上述した試料中の「所定の抗原に対する抗体」を測定する方法を用いて、当該試料中の当該表面抗原に対する抗体を測定することと、当該測定の結果に基づいて、当該表面抗原に対する抗体を取得することとを含む、がんの予防および／または治療剤あるいはこれらの候補抗体のスクリーニング方法である。なお、測定の結果に基づく判定は、当該抗体の「検出」の有無を指標として行ってもよいし、当該抗体の「定量」の結果を所定の基準（例えば、カットオフ値）に照らして当該判定を行ってもよい。
【０１０３】
６．本発明のキット
本発明によれば、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含む、試料中の抗原、抗体またはＧＳＨの測定用キットも提供される。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、緩衝液、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。
【０１０５】
［合成例］
従来公知の文献（Synthesis 2009, 7; 1224-1226、J Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543（非特許文献２）およびChem Commun (Camb). 2015 (57):11459-11462（非特許文献３））に記載の手法を参照し、下記の合成スキームに従って本発明に係るフルオレセイン誘導体（下記の合成スキームに記載の化合物（５）（「３，４−ＤＮＡＤＣＦ」とも称する））を合成した。
【０１０６】
【化７】
2017201918.tif 000009
【０１０７】
上記合成スキームに記載の化合物（３）〜（５）の機器データは以下の通りである。
【０１０８】
（化合物（３）の機器データ）
【０１０９】
【化８】
2017201918.tif 000010
【０１１０】
（化合物（４）の機器データ）
【０１１１】
【化９】
2017201918.tif 000011
【０１１２】
（化合物（５）の機器データ）
【０１１３】
【化１０】
2017201918.tif 000012
【０１１４】
［ＺＺ融合型ＧＳＴ発現ベクターの構築］
以下の手法により、５種のＺＺ−ＧＳＴ発現ベクターｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＧＳＴを構築した。５種の内訳は、３種がヒト由来のＧＳＴ（ｈＧＳＴＡ１、ｈＧＳＴＭ１またはｈＧＳＴＰ１）を用いたものであり、２種がキイロショウジョウバエ（Drosophila  melanogaster）由来のＧＳＴ（Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４またはＤｍＧＳＴｅ１３）を用いたものであった。
【０１１５】
（ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４の構築）
キイロショウジョウバエ由来ＧＳＴの１種であるＮｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４をコードするｃＤＮＡ配列を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１１６】
【化１１】
2017201918.tif 000013
【０１１７】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ）で切断し、ＩｇＧ抗体結合ドメインであるＺＺドメインをコードするベクターであるｐＥＺＺ１８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャムバイオサイエンス社製）に挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した後、クローン化して、ｐＥＺＺ１８−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４を得た。
【０１１８】
続いて、上記で作製したｐＥＺＺ１８−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４ベクター中のＺＺ−ＧＳＴ領域（ＺＺ配列のＮ末端に存在するリーダー配列は含まない）を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１１９】
【化１２】
2017201918.tif 000014
【０１２０】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ）で切断し、ｐＣＯＬＤ−Ｉベクター（タカラバイオ社製）に挿入して、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４ベクターを得た。なお、このｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４ベクターについては、後述するｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１ベクター、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１ベクター、およびｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３ベクターの構築に用いたこと以外の実験には使用していない。
【０１２１】
（ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１の構築）
ヒト由来ＧＳＴの１種であるｈＧＳＴＡ１をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１２２】
【化１３】
2017201918.tif 000015
【０１２３】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）で切断し、上記で構築したｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４を同様に制限酵素処理したものにライゲーションした。このようにしてｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４の標的配列をＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４からＺＺ−ｈＧＳＴＡ１に置換することにより、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１ベクターを得た。
【０１２４】
図１は、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１ベクターをはじめとする各種ＺＺ−ＧＳＴの発現ベクターである各種ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＧＳＴの発現ベクターマップである。ここで、配列番号：１２は、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１ベクターが発現するＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）である。また、配列番号：１１は、当該ベクターが発現するコードＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号：１１から明らかなように、当該融合タンパク質はＺＺドメインのＮ末端側にヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を含んでいることから、Ｈｉｓ−ｔａｇによるアフィニティ精製が可能となっている（以下の融合タンパク質についても同様である）。
【０１２５】
【化１４】
2017201918.tif 000016
【０１２６】
（ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１の構築）
ヒト由来ＧＳＴの１種であるｈＧＳＴＰ１をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：８）を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１２７】
【化１５】
2017201918.tif 000017
【０１２８】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）で切断し、上記で構築したｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４を同様に制限酵素処理したものにライゲーションした。このようにしてｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４の標的配列をＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４からＺＺ−ｈＧＳＴＰ１に置換することにより、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１ベクターを得た。ここで、配列番号：１６は、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１ベクターが発現するＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）である。また、配列番号：１５は、当該ベクターが発現するコードＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２９】
【化１６】
2017201918.tif 000018
【０１３０】
（ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３の構築）
キイロショウジョウバエ由来ＧＳＴの１種であるＤｍＧＳＴｅ１３をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１０）を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅した。この際、フォワードプライマーはＫｐｎＩ配列を含んでおり、また、標的配列のリバースプライマーの内側にはＸｂａＩ配列が存在していた。
【０１３１】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ）で切断し、上記で構築したｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４を同様に制限酵素処理したものにライゲーションした。このようにしてｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４の標的配列をＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４からＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３に置換することにより、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３ベクターを得た。ここで、配列番号：１８は、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３ベクターが発現するＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）である。また、配列番号：１７は、当該ベクターが発現するコードＤＮＡによってコードされるＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３２】
【化１７】
2017201918.tif 000019
【０１３３】
（ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１の構築）
ヒト由来ＧＳＴの１種であるｈＧＳＴＭ１をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６）を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１３４】
【化１８】
2017201918.tif 000020
【０１３５】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）で切断し、ｐＥＺＺ１８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャムバイオサイエンス社製）に挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した後、クローン化して、ｐＥＺＺ１８−ｈＧＳＴＭ１を得た。
【０１３６】
続いて、上記で作製したｐＥＺＺ１８−ｈＧＳＴＭ１ベクター中のＺＺ−ＧＳＴ領域（ＺＺ配列のＮ末端に存在するリーダー配列は含まない）を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。
【０１３７】
【化１９】
2017201918.tif 000021
【０１３８】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ）で切断し、ｐＣＯＬＤ−Ｉベクター（タカラバイオ社製）に挿入して、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１ベクターを得た。ここで、配列番号：１４は、ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１ベクターが発現するＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）である。また、配列番号：１３は、当該ベクターが発現するコードＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３９】
【化２０】
2017201918.tif 000022
【０１４０】
なお、上記の操作で得られた各種ｐＥＺＺ１８−ＧＳＴおよび各種ｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＧＳＴについては、ＤＮＡシークエンサー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）により塩基配列を決定することにより、挿入ＤＮＡ配列の確認を行った。
【０１４１】
［大腸菌によるＺＺ−ＧＳＴの発現］
上記で作製した各種の組換えベクターｐＣＯＬＤ−Ｉ−ＺＺ−ＧＳＴにより、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。得られた形質転換株を５ｍＬ  ＬＢ培地中（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む）で３７℃にて１６時間振盪培養した。次いで、その培養物を２５０ｍＬ  ＬＢ培地に加え、培養液のＯＤ６００値が０．４〜０．５に達するまで３７℃にて振盪培養した。その後、４℃で３０分間冷却した後、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社製）およびアンピシリンをともに最終濃度１００μＭになるように培養液に添加し、１５℃にて２４時間培養した。培養後、大腸菌液をＢ−ＰＥＲ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモサイエンティフィック社製）に懸濁し、使用時まで−８０℃にて保存した。
【０１４２】
［組換えＺＺ−ＧＳＴの精製］
５０ｍｌ大腸菌液のペレットを２．５ｍＬ  Ｂ−ＰＥＲに懸濁し、室温にて２０分間振盪することで溶解させた。大腸菌溶解液に対して遠心処理（１２，０００ｘｇ、４℃、２０分間）を施して不溶性画分を取り除き、上清を集めた。これに２ｍＬのｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ（ロシュダイアグノスティックス社製）を混合し、４℃にて１．５時間、タンパク質を吸着させた。タンパク質を吸着させたカラムは５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。目的タンパク質は３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３．７５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んだ２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中、４℃にて終夜透析を行った。次いで、透析されたタンパク質溶液を３．７５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３．７５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および２０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含んだ２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）に対して６時間透析した。得られたタンパク質溶液は使用時まで−８０℃にて保存した。なお、タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を標準液として、タンパク質測定法の１つであるブラッドフォード法を用いて測定した。また、タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定し、ＧＳＴ比活性はＣＤＮＢおよび３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いて測定した。
【０１４３】
図２は、（Ａ）ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質、（Ｂ）ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質、（Ｃ）ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質、（Ｄ）ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質のそれぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果を示す泳動写真である。なお、図２（Ａ）〜図２（Ｄ）における各レーンは、それぞれ、１：タンパク質発現誘導前、２：タンパク質発現誘導後、３：Ｈｉｓ−タグカラム非吸着画分、４：精製後のものである。図２（Ａ）〜図２（Ｄ）の各レーンの結果から明らかなように、本手法によれば、目的とする融合タンパク質を高純度で製造することが可能である。また、収量についても、分子種によっては１００ｍｇ／Ｌ以上という高い収量を実現することができた。
【０１４４】
［各種ＺＺ−ＧＳＴの比活性の比較］
上記で作製した４種のＺＺ融合型ＧＳＴ（ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１、ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１、ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１およびＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３）について、比活性（タンパク質１ｍｇ当たりのＧＳＴ活性）を比較した。具体的には、１ｍＭのＣＤＮＢまたは１μＭの３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５、ＣＤＮＢの場合にはエタノール１％（ｖ／ｖ）、３，４−ＤＮＡＤＣＦの場合にはＤＭＳＯ０．１％（ｖ／ｖ）を共溶媒として用いた）に溶解し、１ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下、３０℃にて撹拌しながら反応させた。この際、酵素濃度の変化に対して反応速度が線形性を示す領域の酵素濃度を用いた。そして、マルチウェルプレートリーダー（ＳＨ−９０００、コロナ電気株式会社製）を用い、ＣＤＮＢの場合には吸光度（３４０ｎｍ）の変化、３，４−ＤＮＡＤＣＦの場合には蛍光強度を３０秒ごとに１０００秒間測定した（励起／蛍光波長＝５０５／５２５ｎｍ）。それぞれの酵素濃度から得られた反応速度から、比活性（１分間当たり１ｍｇのＧＳＴが触媒するＣＤＮＢまたは３，４−ＤＮＡＤＣＦのマイクロモル数）を算出した。結果を下記の表１に示す。
【０１４５】
【表１】
2017201918.tif 000023
【０１４６】
表１に示す結果から明らかなように、いずれの融合タンパク質も、本発明の実施に必要とされるレベル以上のＧＳＴ活性を示した。ここで、各種融合タンパク質の比活性を比較すると、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３＞ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１≒ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１＞ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１の序列で比活性に差が見られた。なかでもＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質は、非常に高いレベルの比活性を示した。以上のことから、各種融合タンパク質（なかでも、特にＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３）は、大量発現および簡便なタンパク精製が可能であり、対応した高感度蛍光プローブによってその活性を測定可能なものであるといえる。
【０１４７】
［各種ＺＺ−ＧＳＴの酵素反応速度論の比較］
上記で作製した４種のＺＺ融合型ＧＳＴ（ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１、ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１、ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１およびＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３）について、３，４−ＤＮＡＤＣＦの酵素反応速度論を比較した。具体的には、種々の濃度の３，４−ＤＮＡＤＣＦを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５；ＤＭＳＯ０．１％（ｖ／ｖ）を共溶媒として用いた）に溶解し、１ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下、所定の濃度（ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１：０．９６μｇ／ｍＬ、ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１：３０ｎｇ／ｍＬ、ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１：２５ｎｇ／ｍＬ、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３：１１ｎｇ／ｍＬ）になるように各酵素を加え、室温（２５℃）にて５分間、蛍光強度を測定した。それぞれの濃度における初速度（蛍光強度上昇が線形）を算出し、ミカエリスメンテン式  Ｖ＝Ｖｍａｘ／（［Ｓ］＋ＫＭ）（式中、Ｖｍａｘは最大反応速度であり、［Ｓ］は基質濃度であり、ＫＭはＶｍａｘ／２の速度を与える基質濃度である）を用いて回帰曲線を作成した。得られたミカエリスメンテンプロットを図３に示す。なお、図３の各ミカエリスメンテンプロットのグラフは、（Ａ）ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１、（Ｂ）ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１、（Ｃ）ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１、および（Ｄ）ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３の４種のＺＺ−ＧＳＴにそれぞれ対応している。
【０１４８】
また、図３に示す結果から算出された各ＺＺ融合型ＧＳＴにおける酵素反応速度論的パラメーターを下記の表２に示す。
【０１４９】
【表２】
2017201918.tif 000024
【０１５０】
図３並びに表１〜表２に示す結果から、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３が最も高い比活性を示し、また、１０７Ｍ−１ｓ−１を超える極めて優れた特異活性を示すことが明らかとなった。
【０１５１】
［ＺＺ−ＧＳＴのプロテインＬビーズへの固定］
上記で作製した各種ＺＺ融合型ＧＳＴの抗体の定量への応用可能性を評価すべく、以下の手法により、抗体のe鎖に対して高い親和性を有するプロテインＬが固定化されたアガロースビーズに濃度既知の抗トランスフェリン受容体抗体を固定化し、当該抗体に対して上記で作製した各種ＺＺ融合型ＧＳＴを吸着させ、３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてその活性を測定した。
【０１５２】
具体的には、まず、２０μＬのプロテインＬ−アガロース（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、３０分間室温にてインキュベートした。次いで、任意の濃度の抗トランスフェリン受容体抗体を加え、１時間４℃にてインキュベートした。その後、プロテインＬ−アガロースに対して遠心処理（１０００×ｇ、３分間、４℃）を施し、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ  １ｍＬで３回洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む ＰＢＳ  １ｍＬに懸濁した。そこへ１．６μｇ／ｍＬ  ＺＺ−ＧＳＴを加え、３０分間４℃にてインキュベートした。その後、プロテインＬ−アガロースに対して遠心処理（１０００×ｇ、３分間、４℃）を施し、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した後、反応バッファー（１８０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、６００ｍＭ塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）に懸濁した。このようにして、アガロースビーズにプロテインＬを介して固定化された抗トランスフェリン受容体抗体に、本発明に係るＺＺ融合型ＧＳＴをＺＺドメインを介して吸着させた。
【０１５３】
［アガロースビーズ−プロテインＬ−抗体−ＺＺ−ＧＳＴ複合体を用いたＧＳＴ活性の評価］
上記で各種ＺＺ融合型ＧＳＴを用いて作製したアガロースビーズ−プロテインＬ−抗体−ＺＺ−ＧＳＴ複合体について、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定することにより、各系に存在するＺＺ融合型ＧＳＴを定量した。そして、得られた測定値を各系に存在する抗トランスフェリン受容体抗体の量に換算した。
【０１５４】
具体的に、アッセイは以下のように行った。まず、上記でＺＺ融合型ＧＳＴを固定したビーズ１０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加え、そこに５０μＬの水（０．２ｍＭ  ＧＳＨを含む）を加え、室温にて５分間インキュベートした。そこに１００μＬの反応バッファー（１μＭ  ３，４−ＤＮＡＤＣＦを含む。９０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）を加え、室温（２５℃）にて３６００秒間（６０分間）、蛍光強度の変化を測定した。そして、それぞれの濃度における初速度（蛍光強度上昇が線形）を算出し、単位時間当たりの反応生成物濃度へと換算した。
【０１５５】
なお、本実験は、まず抗体濃度を４０ｎＭに固定した条件下で４種類のＺＺ融合型ＧＳＴについて行った。図４（Ａ）は、この実験における蛍光強度の変化を３，４−ＤＮＡＤＣＦ添加後の経過時間に対してプロットしたグラフである。また、図４（Ｂ）は、この実験における反応初速度を示すグラフである。なお、図４（Ｂ）には、ＺＺ融合型ＧＳＴが（ＺＺドメインを介して）アガロースビーズへと吸着するのに必要な抗トランスフェリン受容体抗体（αＴＲ；anti-transferrin receptor antibody）を用いて実験を行った場合（αＴＲが「＋」）とこれを用いずに実験を行った場合（αＴＲが「−」）の結果を併記している。図４に示す結果から、プロテインＬを固定化したアガロースビーズに吸着させる条件下では、ＺＺ融合型ＧＳＴのＧＳＴ活性は損なわれないこと、４種のＺＺ融合型ＧＳＴのうち、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３が最も高い活性を示すことがわかる。
【０１５６】
また、異なる抗体濃度を用いた場合についても、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を用いた系で本実験を行った。この際、蛍光強度の変化を測定する時間は２４００秒間（４０分間）とした。図５（Ａ）は、この実験における蛍光強度の変化を３，４−ＤＮＡＤＣＦ添加後の経過時間に対してプロットしたグラフである。また、図５（Ｂ）は、本実験において用いた抗体濃度に対するＧＳＴ活性の相関関係を示すグラフである。図５（Ａ）および図５（Ｂ）に示すように、本実験において抗体濃度−蛍光強度上昇速度は比例関係を示し、抗体濃度１．５μｇ／ｍＬまでにおいて両者の間に優れた線形性を示すことが明らかとなった。また、この測定から９６ウェルプレート２００μＬ中における抗体量の検出限界は４．１ｎｇと算出され、抗体検出に十分な感度を有することが明らかとなった。
【０１５７】
［ＺＺ−ＧＳＴのプロテインＬプレートへの固定化］
以下の手法により、抗体のe鎖に対して高い親和性を有するプロテインＬが固定化された９６ウェルマイクロプレートに濃度既知の抗トランスフェリン受容体抗体を固定化し、当該抗体に対して上記で作製した各種ＺＺ融合型ＧＳＴを吸着させ、３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてその活性を測定した。
【０１５８】
具体的には、まず、プロテインＬが固定化された黒色９６ウェルマイクロプレート（Ｇバイオサイエンス社製））を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＩｇＧフリー  和光純薬工業株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、４℃にて３０分間インキュベートした。次いで、任意の濃度の抗トランスフェリン受容体抗体を加え、４℃にて１時間インキュベートした。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ  ３００μＬで３回洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＩｇＧフリー）、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む１００μＬ ＰＢＳを加えた。そこへ４３μｇ／ｍＬ  ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を加え、４℃にて３０分間インキュベートした。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した後、反応バッファー（０．４ｍＭ  ＧＳＨを含む。９０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）に懸濁させた。このようにして、９６ウェルプレートにプロテインＬを介して固定化された抗トランスフェリン受容体抗体に、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を吸着させた。
【０１５９】
［プレート−プロテインＬ−抗体−ＺＺ−ＧＳＴ複合体を用いたＧＳＴ活性の評価］
上記で各種ＺＺ融合型ＧＳＴを用いて作製したプレート−プロテインＬ−抗体−ＺＺ−ＧＳＴ複合体について、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定することにより、各系に存在するＺＺ融合型ＧＳＴを定量した。そして、得られた測定値を各系に存在する抗トランスフェリン受容体抗体の量に換算した。
【０１６０】
具体的に、アッセイは以下のように行った。まず、上記でＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を吸着させたウェル（１００μＬの反応バッファーを含む）に対し、１００μＬの反応バッファー（１μＭ  ３，４−ＤＮＡＤＣＦを含む。９０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）を加え、室温（２５℃）にて１２００秒間（２０分間）、蛍光強度の変化を測定した。そして、それぞれの濃度における初速度（蛍光強度上昇が線形）を算出し、単位時間当たりの反応生成物濃度へと換算した。
【０１６１】
図６（Ａ）は、異なる濃度の抗トランスフェリン受容体抗体をインキュベートした際の蛍光強度上昇の時間変化を示すグラフである。ここで、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を添加していない系列においては、０μＭおよび１０μＭ抗トランスフェリン受容体抗体処理をコントロールとしている。図６（Ｂ）は、抗トランスフェリン受容体抗体の濃度に対して反応初速度をプロットしたグラフである。図６（Ａ）および図６（Ｂ）に示す結果から、本システムによると、抗体の濃度が０．１ｎＭ以上であれば検出・定量が可能であることが示された。
【０１６２】
［培養細胞における抗原の検出・定量］
本実験では、ＭＣＦ７細胞の細胞表面に発現しているトランスフェリン受容体に対するオンセルＥＬＩＳＡ（On cell ELISA）における抗体の検出・定量に本発明の融合タンパク質を適用し、ＧＳＴ測定用蛍光プローブである３，４−ＤＮＡＤＣＦを用いてＧＳＴ活性を測定した。
【０１６３】
まず、ＭＣＦ７細胞を２４,０００細胞／ウェルとなるように透明底面黒色９６ウェルプレート（グライナー社製）に実験の前日に播種した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中、室温にて１５分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク（森永乳業株式会社製）および０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中で室温にて１時間インキュベートした。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中で室温にて５分間振盪し、これを３回繰り返して洗浄した。次に、０．２４μｇ／ウェルとなるように抗トランスフェリン受容体抗体を加えた５％（ｗ／ｖ）スキムミルクおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで室温にて１時間インキュベートした。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで室温にて５分間振盪して洗浄し、これを３回繰り返した。次に、２１．５μｇ／ｍＬ  ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３を加えた５％（ｗ／ｖ）スキムミルクおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで４℃にて１時間インキュベートした。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで室温にて５分間振盪し、洗浄を５回繰り返した後、１００μＬ  反応バッファー（２００μＭ  ＧＳＨを含む。９０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）を加えた。
【０１６４】
アッセイは以下のように行った。まず、上記でＺＺ融合型ＧＳＴを固定化した細胞液１００μＬに対し、１００μＬの反応バッファー（１μＭ  ３，４−ＤＮＡＤＣＦを含む。９０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）を加え、室温（２５℃）にて５０００秒間（約８３分間）、蛍光強度の変化を測定した。そして、それぞれの蛍光強度上昇が線形である時間において傾きを算出し、単位時間当たりの蛍光強度上昇として反応性を比較した。
【０１６５】
図７（Ａ）は、異なる処理の伴う蛍光強度の時間変化を示すグラフである。□印で示したマーカーは未処理、◆印のマーカーは、抗トランスフェリン受容体抗体処理のみ、△印のマーカーはＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３処理のみ、●印のマーカーは抗トランスフェリン受容体抗体およびＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３の両者の処理を行ったものである。また、図７（Ｂ）は、それぞれの処理における単位時間当たりの蛍光強度上昇（図７（Ａ）に示すグラフの傾き）を示すグラフである。図７（Ａ）および図７（Ｂ）に示すように、抗トランスフェリン受容体抗体およびＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３の両者の処理を行なった場合にのみ顕著な蛍光強度上昇の増加が見られることから、本実験における蛍光強度の上昇はＭＣＦ７細胞の細胞表面に発現しているトランスフェリン受容体の量に依存していることが示唆される。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
〔配列番号：１〕
プロテインＡのＺＺドメインのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列（プロテインＡのＺＺドメインのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ）を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトＧＳＴＡ１（ｈＧＳＴＡ１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＡ１（ｈＧＳＴＡ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：５〕
ヒトＧＳＴＭ１（ｈＧＳＴＭ１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＭ１（ｈＧＳＴＭ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトＧＳＴＰ１（ｈＧＳＴＰ１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＳＴＰ１（ｈＧＳＴＰ１）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：９〕
キイロショウジョウバエＧＳＴｅ１３（ＤｍＧＳＴｅ１３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：９で表されるアミノ酸配列（キイロショウジョウバエＧＳＴｅ１３（ＤｍＧＳＴｅ１３）のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＡ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＭ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１に挿入された、ＺＺ−ｈＧＳＴＰ１融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３に挿入された、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−Ｉ−ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３に挿入された、ＺＺ−ＤｍＧＳＴｅ１３融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（ＣＤＳ；終止コドンを含む）を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例においてＮｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＫｐｎＩ配列を含むフォワードプライマーである。
〔配列番号：２０〕
実施例においてＮｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＸｂａＩ配列を含むリバースプライマーである。
〔配列番号：２１〕
実施例においてｐＥＺＺ１８−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４からＺＺ−Ｎｏｂｏ−Ｄｍ／ＧＳＴｅ１４の配列を増幅するのに用いた、ＮｄｅＩ配列を含むフォワードプライマーである。
〔配列番号：２２〕
実施例においてｈＧＳＴＡ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＳａｃＩ配列を含むフォワードプライマーである。
〔配列番号：２３〕
実施例においてｈＧＳＴＡ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＸｂａＩ配列を含むリバースプライマーである。
〔配列番号：２４〕
実施例においてｈＧＳＴＰ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＳａｃＩ配列を含むフォワードプライマーである。
〔配列番号：２５〕
実施例においてｈＧＳＴＰ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＸｂａＩ配列を含むリバースプライマーである。
〔配列番号：２６〕
実施例においてｈＧＳＴＭ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＳａｃＩ配列を含むフォワードプライマーである。
〔配列番号：２７〕
実施例においてｈＧＳＴＭ１のｃＤＮＡ配列を増幅するのに用いた、ＸｂａＩ配列を含むリバースプライマーである。
〔配列番号：２８〕
実施例においてｐＥＺＺ１８−ｈＧＳＴＭ１からＺＺ−ｈＧＳＴＭ１の配列を増幅するのに用いた、ＫｐｎＩ配列を含むフォワードプライマーである。
【図１】
2017201918.tif 000026
【図２】
2017201918.tif 000027
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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