(57)【要約】【課題】コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法及びコンフォメーション病薬スクリーニング方法を提供する。【解決手段】コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法は、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするためのプリオン感染細胞を製造する方法であって、細胞増殖が抑制された状態且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が飽和状態となるように蓄積させる特異培養条件で、異常プリオン持続感染細胞を細胞培養する工程を含む。また、コンフォメーション病薬スクリーニング方法は、上記製造方法で製造されたプリオン感染細胞を用いるコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、プリオン感染細胞中に蓄積している異常型プリオン蛋白質の量を減少させる試験化合物を候補化合物として選択する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするためのプリオン感染細胞を製造するコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法であって、
細胞増殖が抑制された状態且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が略飽和状態となるように蓄積させる特異培養条件で、異常プリオン持続感染細胞を細胞培養する工程を含むことを特徴とするコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項２】
前記異常型プリオン蛋白質がプロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）であることを特徴とする請求項１に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項３】
前記特異培養条件が、グリセロールを添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項４】
グリセロールを添加する前の細胞培養液が、牛胎児血清（ＦＢＳ）添加の改変型最少必須イーグル培地であることを特徴とする請求項３に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項５】
グリセロールを添加する前の細胞培養液が、終濃度が８〜１２％（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．４〜０．５ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることを特徴とする請求項４に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項６】
グリセロールの添加量が細胞培養液に対して０．２５％（Ｗ／Ｖ）以上、２％（Ｗ／Ｖ）以下であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項７】
前記特異培養条件が、飢餓培養液にブタン酸を添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項８】
前記飢餓培養液が、終濃度が０．１〜０．３（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．０８〜０．１２ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることを特徴とする請求項７に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項９】
ブタン酸の添加量が飢餓培養液に対して４〜６μＭ／Ｌであることを特徴とする請求項７又は８に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記コンフォメーション病がプリオン病であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載されたコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法で製造されたプリオン感染細胞を用いるコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、
前記プリオン感染細胞中に蓄積している異常型プリオン蛋白質の量を減少させる試験化合物を候補化合物として選択することを特徴とするコンフォメーション病薬スクリーニング方法。
【請求項１２】
前記試験化合物を添加した細胞培養液で前記プリオン感染細胞を培養することを特徴とする請求項１１に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング方法。
【請求項１３】
前記細胞培養液が、グリセロールを添加した細胞培養液であることを特徴とする請求項１２に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング方法。
【請求項１４】
前記細胞培養液が、ブタン酸を添加した飢餓培養液であることを特徴とする請求項１２に記載のコンフォメーション病薬スクリーニング方法。
【請求項１５】
前記コンフォメーション病がプリオン病であることを特徴とする請求項１１乃至１４のいずれかに記載のコンフォメーション病薬スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法及びコンフォメーション病薬スクリーニング方法に係り、より詳細には、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするためのプリオン感染細胞を製造するコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法、並びにこのコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法で製造されたプリオン感染細胞を用いるコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするコンフォメーション病薬スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンフォメーション病は、特定の宿主蛋白質についてその立体構造（コンフォメーション）が変化されて難溶性となって細胞や組織に蓄積し病的状態をもたらす疾患群であり、各種疾患例が報告されている〔非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照〕。これには、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症に代表される神経難病が含まれる。コンフォメーション病では、特定の蛋白質が本来のコンフォメーションとは異なるβシート構造と呼ばれる構造成分に富むコンフォメーションをとって難分解性となる。コンフォメーション病のうちこのような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞外の組織に蓄積して難溶性物質（アミロイド）を形成する疾患群はアミロイドーシスと呼ばれる。一方、このような異常なコンフォメーションをとった蛋白質が細胞内に蓄積して「インクルージョン・ボディ（封入体）」と呼ばれる難溶性物質を形成する疾患群もある。前者には各種アミロイドーシスの疾患が含まれ、後者にはポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病、ピック病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型痴呆などが含まれる。また、どちらも見られるものとしてはアルツハイマー病やプリオン病などがある。これらのコンフォメーション病の原因蛋白質は疾患によって異なり、蛋白質の一次構造上の共通点はないものの、コンフォメーションの異常化のメカニズムや異常化蛋白質の沈着を促進するメカニズムには共通の因子が関与していると考えられており、コンフォメーション病全般あるいは複数のコンフォメーション病に共通した治療化合物の開発が可能である〔非特許文献４、非特許文献５参照〕。実際に、これまでにアルツハイマー病、アミロイドーシス全般、プリオン病に共通する薬効を示すことが期待される薬物開発の報告が多数ある〔例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９参照〕。しかし、これらコンフォメーション病については、原因及びその作用機構が徐々に解明されつつあるが、現在まで予防及び治療に決定的に有効な医薬品は見出されていない。また、上述のように、プリオン病の予防及び／又は治療薬のスクリーニングは、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬のスクリーニングであると言える。
【０００３】
ここでプリオン病についてより詳細に説明すると、プリオン病は病原因子プリオンにより中枢神経が侵される致死性疾患であり、ヒトでは急速に進行する認知機能障害とミオクローヌスと呼ばれる全身性の痙攣発作を主な症状とするクロイツフェルト・ヤコブ病や、家族性に発生し失調性歩行や認知機能障害を主な症状とするゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、家族性に発生し失調性歩行や自律神経障害・不眠を主な症状とする致死性家族性不眠症などがある。これまでにフルパーチン［非特許文献１０参照］
、キナクリン［非特許文献１１、１２参照］、ドキシサイクリン［非特許文献１３参照］、ペントサンポリサルフェート［非特許文献１４参照］などが臨床治験で試されたが、症状を改善し疾病の進行を抑制するほどの治療効果は観察されておらず、プリオン病に対する確定した治療薬はない。一方、プリオン病の病原因子は通常のウイルスや細菌に対する滅菌処置には耐性であるため、プリオン病（牛海綿状脳症）に罹患した牛に由来する製品から人にプリオンが感染することや、プリオン病患者に由来する生物製剤やプリオン病患者に用いられた手術器具等から他の人にプリオンが感染することが知られており、これらは大きな社会的・経済的な問題となってきた。また、原因不明で発症する孤発性プリオン病は高齢者に発生する病気であり、高齢社会にあって発生率は右肩上がりに上昇している。このような状況にあり、プリオン病は希少疾患ながら、その予防・治療薬の開発が待望されている。なお、プリオンの本体は異常型プリオン蛋白質（以下、ＰｒＰｓｃ）であり、神経細胞等で正常に発現している正常型プリオン蛋白質（以下、ＰｒＰｃ）の高次構造が変化し、重合化して難溶性となり蛋白質分解処理や通常の滅菌処理に抵抗性となる性質を持っている。ＰｒＰｓｃには、タンパク質分解酵素処理に耐性なもの（以下、ＰｒＰｒｅｓ）が一般に良く知られているが、タンパク質分解酵素処理に感受性なものも含まれている［非特許文献１５参照］。ＰｒＰｓｃとＰｒＰｃを合わせて総プリオン蛋白質（以下、ｔｏｔａｌ  ＰｒＰ）と呼ばれる。
【０００４】
プリオン病治療予防薬の開発には、様々なスクリーニング系が開発されている。インシリコやインビトロの系で多数の化合物をスクリーニングし、候補化合物についてプリオン持続感染細胞で効果を確認した後に、プリオン感染動物で最終的に効果が判定される。このプリオン病の治療予防薬の開発に汎用されているプリオン持続感染細胞（例えば、プリオン持続感染神経芽細胞腫細胞［非特許文献１６、１７参照］）は、死滅することなくプリオンを持続的に産生する不死化増殖細胞である。したがって、これらの細胞を用いたスクリーニングで見つかってきたプリオン産生阻害剤の効果は、細胞増殖による希釈のバイアスにより過大に評価されてきた。すなわち、これまで用いられてきたプリオン持続感染細胞では、少しでもプリオン産生阻害の効果を持つ化合物は見つけやすかったが、既に蓄積しているプリオンを分解促進する効果を持つ化合物の探索には向いていなかった。実際に、既報告のプリオン産生阻害剤のプリオン感染動物を用いた実験での治療効果には限界があり、感染早期に投与を開始すると有意な延命効果が観察されているが、すでにプリオンが蓄積している発病後以降の投与では病気の進行を遅らせることはほぼ不可能である［非特許文献１８、１９参照］。ビボでは分化した分裂静止期の状態にある神経細胞にプリオンが感染して増殖しており、既に増殖している細胞内のプリオンを如何に効率的に分解促進するかが重要である。この目的に適するプリオン病治療薬の評価用細胞として、よりビボに近い状態、すなわち細胞増殖が静止状態に近い状態でプリオンの蓄積が飽和状態にある細胞が必要であるが、このような細胞は神経細胞の初代培養を用いたり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた神経系細胞を用いて、プリオンを感染させて樹立されることが考えられるが、これらの細胞を準備するのは手間や経費の点で効率的・経済的ではないし、熟練した手技が必要である。
【０００５】
本発明は、以上のような、プリオン病の予防及び／又は治療薬スクリーニング方法の問題点を解決することができるプリオン病薬スクリーニング方法をコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法として提供することを目的とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎ  Ｗ  Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９７年、３５０号、１３４−１３８頁
【非特許文献２】石原得博（監修）、池田修一（編集）、「アミロイドーシスの基礎と臨床」２００５年３月金原出版（株）発行、第８頁〜１３頁
【非特許文献３】岩坪威、細胞工学、２００１年、２０巻１１号、１４７４−１４７７頁
【非特許文献４】Ｊａｒｒｅｔｔ  ＪＴ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  ＰＴ  Ｊｒ，Ｃｅｌｌ，１９９３年、７３巻、１０５５−１０５８頁
【非特許文献５】Ｇｅｒｖａｉｓ  Ｆ，  Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ  Ｃ，  Ｋｏｎｇ  Ｘ，  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｉｍｍｕｎ．，Ｅｎｄｏｃ．＆  Ｍｅｔａｂ．Ａｇｅｎｔｓ，２００３年、３巻、３６１−３７０頁
【非特許文献６】Ｗａｔｓｏｎ  ＪＤ，Ｌａｎｄｅｒ  ＤＡ，  Ｓｅｌｋｏｅ  ＪＤ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年、５０巻、３１６１７−３１６２４頁
【非特許文献７】Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ  Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５年、１巻、１４３−１４８頁
【非特許文献８】Ｚｈｕ  Ｈ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋｉｎｄｙ  ＭＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１年、７巻、５１７−５２２頁
【非特許文献９】堂浦克美、ファルマシア、２００２年、７巻、６３５−６３９頁
【非特許文献１０】Ｏｔｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｆｌｕｐｉｒｔｉｎｅ  ｏｎ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＣＪＤ：  Ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｓｔｕｄｙ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００４．６２（５）：ｐ．７１４−８．
【非特許文献１１】Ｃｏｌｌｉｎｇｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＰＲＩＯＮ−１  ｓｔｕｄｙ）：  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２００９．  ８（４）：  ｐ．  ３３４−４４．
【非特許文献１２】Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｍ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ２０１３．  ８１（２３）：  ｐ．  ２０１５−２３．
【非特許文献１３】Ｈａｉｋ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｐｈａｓｅ  ２，  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ２０１４．  １３（２）：  ｐ．  １５０−１５８．
【非特許文献１４】Ｔｓｕｂｏｉ，  Ｙ．，  Ｋ．  Ｄｏｈ−Ｕｒａ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｙａｍａｄａ，  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００９．  ２９（５）：  ｐ．  ６３２−６．
【非特許文献１５】Ｋｉｍ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ＰｒＰＳｃ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ＰｒＰ（Ｃ）．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，  ２０１２．  ８（８）：  ｐ．  ｅ１００２８３５．
【非特許文献１６】Ｒａｃｅ，  Ｒ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ，  ａｎｄ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｓｃｒａｐｉｅ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  １９８８．  ６２（８）：  ｐ．  ２８４５−９．
【非特許文献１７】Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，  １９９２．  ３（８）：  ｐ．  ８５１−６３．
【非特許文献１８】Ｄｏｈ−ｕｒａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００４．  ７８（１０）：  ｐ．  ４９９９−５００６．
【非特許文献１９】Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｃｅｒｅｂｒａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００７．  ８１（２３）：  ｐ．  １２８８９−９８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法及びコンフォメーション病薬スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明によるコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法は、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするためのプリオン感染細胞を製造するコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法であって、細胞増殖が抑制された状態且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が略飽和状態となるように蓄積させる特異培養条件で、異常プリオン持続感染細胞を細胞培養する工程を含むことを特徴とする。
【０００９】
このようなコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法において、前記異常型プリオン蛋白質がプロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）であることが好ましく、また、前記特異培養条件が、グリセロールを添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることが好適であり、さらには、グリセロールを添加する前の細胞培養液が、牛胎児血清（ＦＢＳ）添加の改変型最少必須イーグル培地であることが好ましい。そして、グリセロールを添加する前の細胞培養液が、終濃度が８〜１２％（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．４〜０．５ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることが好ましく、また、グリセロールの添加量が細胞培養液に対して０．２５％（Ｗ／Ｖ）以上、２％（Ｗ／Ｖ）以下であることが好適である。
【００１０】
また、前記特異培養条件が、飢餓培養液にブタン酸を添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることが好ましく、さらには、前記飢餓培養液が、終濃度が０．１〜０．３（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．０８〜０．１２ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることが好適であり、また、前記飢餓培養液が、終濃度が０．１〜０．３（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．０８〜０．１２ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることが好ましく、そして、前記コンフォメーション病がプリオン病であっても良い。
【００１１】
また、上記目的を達成するための本発明によるコンフォメーション病薬スクリーニング方法は、上述のようなコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法で製造されたプリオン感染細胞を用いるコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、前記プリオン感染細胞中に蓄積している異常型プリオン蛋白質の量を減少させる試験化合物を候補化合物として選択することを特徴とする。
【００１２】
このようなコンフォメーション病薬スクリーニング方法において、前記試験化合物を添加した細胞培養液で前記プリオン感染細胞を培養することができ、また、前記細胞培養液が、グリセロールを添加した細胞培養液であることが好ましく、さらには、前記細胞培養液が、ブタン酸を添加した飢餓培養液であることが好適であり、また、前記コンフォメーション病がプリオン病であっても良い。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法及びコンフォメーション病薬スクリーニング方法によれば、細胞増殖を静止状態に近い状態においてプリオンの蓄積が飽和状態であるプリオン感染細胞を効率的かつ経済的に得ることができる。また、このようなプリオン感染細胞を用いてスクリーニングを行うことにより、プリオン病を含むコンフォメーション病発症後の投与でも治療効果を期待できる治療化合物を発見できる。コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞についての２通りの製造方法は、いずれも従来のプリオン持続感染細胞を用いる点で技術的な難度は極めて低く手間や経費も従来と大差ない。また、グリセロールを通常の培養液に添加する方法は、培養液中の血清濃度やグルコース濃度を変更する必要がなく、増殖を抑制したまま１週間を超える長期間の培養を容易に行える利点をもつ。一方の、低血清濃度＋低グルコース濃度の培養液（飢餓培養液）でブタン酸（ブチル酸）を添加する方法は、細胞が飢餓状態でＰｒＰｓｃ量がｔｏｔａｌ  ＰｒＰ量の大半を占め、ＰｒＰｃ量が少なく、かつ分解系が抑制されており、ビボの感染細胞状態に良く似ているという利点を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】グリセロールを添加して培養した際のＮ２ａ細胞のＰｒＰｃ発現量への効果を試験した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真及びグラフである。
【図１ｂ】グリセロールを添加して培養した際のＳｃＮ２ａ細胞のＰｒＰｒｅｓ発現量への効果を試験した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真及びグラフである。
【図１ｃ】グリセロールを添加して培養した際のＳｃＮ２ａ細胞のｔｏｔａｌ  ＰｒＰ発現量への効果を試験した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真及びグラフである。
【図１ｄ】グリセロールを添加して培養した際のＮ１６７細胞のＰｒＰｒｅｓ発現量への効果を試験した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真及びグラフである。
【図２ａ】グリセロールを添加して培養した際のＮ２ａ細胞の培養ウエルあたりの細胞数の時間変化を示すグラフである。
【図２ｂ】グリセロールを添加して培養した際のＳｃＮ２ａ細胞の培養ウエルあたりの細胞数の時間変化を示すグラフである。
【図３ａ】グリセロールを添加して培養した場合のＮ２ａ細胞での細胞死を、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶで解析したフローサイトメーターのデータを示す蛍光スペクトルである。スタウロスポリン添加細胞は、細胞死が誘導された細胞であり陽性対照として示している。
【図３ｂ】グリセロールを添加して培養した場合のＳｃＮ２ａ細胞での細胞死を、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶで解析したフローサイトメーターのデータを示す蛍光スペクトルである。スタウロスポリン添加細胞は、細胞死が誘導された細胞であり陽性対照として示している。
【図３ｃ】グリセロールを添加して培養した場合のＮ２ａ細胞での細胞死を、ＪＣ−１を用いて解析したフローサイトメーターのデータを示す蛍光スペクトルである。スタウロスポリン添加細胞は、細胞死が誘導された細胞であり陽性対照として示している。
【図３ｄ】グリセロールを添加して培養した場合のＳｃＮ２ａ細胞での細胞死を、ＪＣ−１を用いて解析したフローサイトメーターのデータを示す蛍光スペクトルである。スタウロスポリン添加細胞は、細胞死が誘導された細胞であり陽性対照として示している。
【図４ａ】スクロース、マンニトール、ソルビトール（それぞれ４００ｍＯｓＭ）を添加して培養したＮ２ａ細胞、ＳｃＮ２ａ細胞、Ｎ１６７細胞のＰｒＰ発現量を試験した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真及びグラフである。コントロールは何も添加していない。細胞数のデータにはグリセロール（１％、約４００ｍＯｓＭ）のデータも比較のため載せている。
【図４ｂ】スクロース、マンニトール、ソルビトール（それぞれ４００ｍＯｓＭ）を添加して培養したＮ２ａ細胞、ＳｃＮ２ａ細胞、Ｎ１６７細胞の細胞数（ｂ）を示すグラフである。コントロールは何も添加していない。細胞数のデータにはグリセロール（１％、約４００ｍＯｓＭ）のデータも比較のため載せている。
【図５ａ】通常の培養条件でのＳｃＮ２ａ細胞とＮ１６７細胞におけるＰＰＳ，ＰＳＫ，ＱＣ，ｃｏｍｐＢ，およびＰＡＭ６（ＰｒＰｓｃ分解促進陽性対照剤）の効果（ＰｒＰｒｅｓ量）を評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。生理食塩水とＤＭＳＯは溶媒コントロールである。
【図５ｂ】グリセロールを添加して培養した場合のＳｃＮ２ａ細胞とＮ１６７細胞における抗プリオン化合物の効果（ＰｒＰｒｅｓ量）を評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。生理食塩水とＤＭＳＯは溶媒コントロールである。
【図５ｃ】グリセロールを添加して培養した際に、抗プリオン化合物の添加のタイミングを２日間早めた場合のＳｃＮ２ａ細胞におけるそれらの効果（ＰｒＰｒｅｓ量）を評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。生理食塩水とＤＭＳＯは溶媒コントロールである。
【図６ａ】飢餓培養液（血清濃度０．２％、グルコース濃度０．１ｇ／Ｌ）中にレチノイン酸（ＲＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、ヘキサン酸（ＨＡ）を添加して培養した際のＮ１６７細胞のｔｏｔａｌ  ＰｒＰを評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。ＰＰＳでＰｒＰｓｃを除去した治療済み細胞（ＰＰＳ前処置＋）を陰性対照（ＰｒＰｃのみが検出される）として用いた。また、通常の培養液（血清濃度１０％、グルコース濃度０．４５ｇ／Ｌ）で培養した細胞もコントロールとして解析した。
【図６ｂ】飢餓培養液（血清濃度０．２％、グルコース濃度０．１ｇ／Ｌ）中にレチノイン酸（ＲＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、ヘキサン酸（ＨＡ）を添加して培養した際のＮ１６７細胞のＰｒＰｒｅｓを評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。ＰＰＳでＰｒＰｓｃを除去した治療済み細胞（ＰＰＳ前処置＋）を陰性対照（ＰｒＰｃのみが検出される）として用いた。また、通常の培養液（血清濃度１０％、グルコース濃度０．４５ｇ／Ｌ）で培養した細胞もコントロールとして解析した。
【図６ｃ】飢餓培養液（血清濃度０．２％、グルコース濃度０．１ｇ／Ｌ）中にレチノイン酸（ＲＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、ヘキサン酸（ＨＡ）を添加して培養した際のＮ１６７細胞の糖鎖除去処理したｔｏｔａｌ  ＰｒＰシグナルを評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。ＰＰＳでＰｒＰｓｃを除去した治療済み細胞（ＰＰＳ前処置＋）を陰性対照（ＰｒＰｃのみが検出される）として用いた。また、通常の培養液（血清濃度１０％、グルコース濃度０．４５ｇ／Ｌ）で培養した細胞もコントロールとして解析した。
【図７】飢餓培養液中にレチノイン酸（ＲＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、ヘキサン酸（ＨＡ）を添加して培養した際のＮ１６７細胞中のＰｒＰｓｃを含む異常なＰｒＰの蓄積を試験した結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】飢餓培養液（血清濃度０．２％、グルコース濃度０．１ｇ／Ｌ）中にレチノイン酸（ＲＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、ヘキサン酸（ＨＡ）を添加して培養した際のＮ１６７細胞のオートファゴゾーム関連タンパク質ＬＣ３の発現を評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比率はオートファゴソーム形成と相関していることが知られている。ＰＰＳでＰｒＰｓｃを除去した治療済み細胞（ＰＰＳ前処置＋）や、通常の培養液（血清濃度１０％、グルコース濃度０．４５ｇ／Ｌ）で培養した細胞もコントロールとして解析した。
【図９】飢餓培養液＋ブチル酸添加で培養した場合のＳｃＮ２ａ細胞とＮ１６７細胞でのＰＰＳ，ＰＳＫ，ＱＣ，ｃｏｍｐＢ，およびＰＡＭ６（ＰｒＰｓｃ分解促進陽性対照剤）の効果（ＰｒＰｒｅｓ量）を評価した結果を示すウエスタンブロットによる電気泳動像の図面代用写真である。生理食塩水とＤＭＳＯは溶媒コントロールである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明によるコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法及びコンフォメーション病薬スクリーニング方法の実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本実施形態のコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法は、コンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングするためのプリオン感染細胞を製造するコンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法であって、細胞増殖が抑制された状態且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が略飽和状態となるように蓄積させる特異培養条件で、異常プリオン持続感染細胞を細胞培養する工程を含むものである。ここで、異常プリオン持続感染細胞としては、従来より共に広く用いられている、スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎ２ａ：Ｎｅｕｒｏ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞或いは、２２Ｌ株がＮ２ａ細胞に持続感染したＮ１６７細胞が好適に使用できる。また、異常型プリオン蛋白質には、プロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）とプロテアーゼ感受性の異常型プリオン蛋白質が含まれるが、プロテアーゼ抵抗性の異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｒｅｓ）が好ましく、プロテアーゼとしては、トリチラキウム  アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（ＰＫ）が好ましい。
【００１７】
特異培養条件としては、グリセロールを添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることが好ましく、これにより細胞増殖が抑制された状態で且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が略飽和状態となるように蓄積される。グリセロールを添加する前の細胞培養液が、牛胎児血清（ＦＢＳ）添加の改変型最少必須イーグル培地（ＭＥＭ）が好ましい。このような細胞培養液は、終濃度が８〜１２％（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．４〜０．５ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地が好ましく、例えば、グルコース濃度が０．４５ｇ／Ｌの商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社）に、終濃度が８〜１２％（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加した細胞培養液が好適に使用できる。また、グリセロールの添加量は細胞培養液に対して０．２５％（Ｗ／Ｖ）以上、２％（Ｗ／Ｖ）以下とすることができ、０．５％（Ｗ／Ｖ）以上、１．５％（Ｗ／Ｖ）以下が好ましい。
【００１８】
また、特異培養条件は、飢餓培養液にブタン酸（ブチル酸）を添加した細胞培養液を用いて細胞培養するものであることも好適であり、これにより細胞増殖が抑制された状態で且つ細胞内に異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰｓｃ）が略飽和状態となるように蓄積される。ここで、飢餓培養液は、終濃度が０．１〜０．３（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．０８〜０．１２ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地であることが好ましく、終濃度が０．２（Ｖ／Ｖ）となるように牛胎児血清を添加したグルコース濃度が０．１ｇ／Ｌの改変型最少必須イーグル培地が最も好ましい。また、ブタン酸の添加量は、飢餓培養液に対して４〜６μＭ／Ｌとすることが好ましく、５μＭ／Ｌが最も好ましい。
【００１９】
本実施形態のコンフォメーション病薬スクリーニング方法は、上記コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法で製造されたプリオン感染細胞を用いるコンフォメーション病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であり、プリオン感染細胞中に蓄積している異常型プリオン蛋白質の量を減少させる試験化合物を候補化合物として選択するものであり、試験化合物を添加した細胞培養液でプリオン感染細胞を培養することが好ましい。ここで、上記コンフォメーション病薬スクリーニング用細胞の製造方法に説明した特異培養条件で細胞培養することが好ましく、細胞培養液は、グリセロールを添加した細胞培養液、或いはブタン酸を添加した飢餓培養液が好ましい。また、コンフォメーション病はプリオン病であることが好適である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これにより本発明を限定するものではない。
【００２１】
〔実施例１〕
グリセロールは、添加濃度依存的に細胞の正常型プリオン蛋白質ならびに異常型プリオン蛋白質を増加させる効果を持つことを示している。
【００２２】
［方法］
グリセロールは超純水で５０％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ：ｗ／ｖ）のストック液を作製し、細胞培養液中に添加する際にはリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）でｐＨ調整を行い使用した。プリオン非感染細胞であるＮ２ａ細胞、Ｎ２ａ細胞にスクレイピープリオンＲＭＬ株を持続感染させたＳｃＮ２ａ細胞あるいはスクレイピープリオン２２Ｌ株を持続感染させたＮ１６７細胞を、６ウエル培養用ディッシュ（ヌンク社製）にコンフルエント状態（ディッシュに細胞がびっしりと生えた状態）の１０％相当数の細胞を播種し、培養液［終濃度１０％となるように牛胎児血清を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（ギブコ社製）］中で培養した。２４時間後にグリセロールを培養液中に終濃度０％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１．０％となるように添加し、さらに２日間培養した後に培養上清を除き、ＰＢＳで細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、細胞をトリプシン・エチレンジアミン四酢酸液（ギブコ社製）でディシュからはがし、ＰＢＳで細胞懸濁液を作成し、血球計算板（ディジタル  バイオ社製）を用いて細胞数を測定した。次に、解析に用いる細胞数を等量となるように合わせた後に、０．５ｍＬの細胞溶解液［デオキシコール酸ナトリウム（終濃度０．５％）とオクチルフェニルエーテル（商品名：ＮＰ−４０（和光純薬工業）、終濃度０．５％）を添加したＰＢＳ］を用いて細胞を溶解し、軽く遠心分離して高分子核酸を除いた（以下、細胞溶解液と呼ぶ）。
【００２３】
ＰｒＰｒｅｓの検出では、ＳｃＮ２ａ細胞の細胞溶解液やＮ１６７細胞の細胞溶解液をトリチラキウム  アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（以下、ＰＫ）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフロライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて蛋白質分解反応をとめた（以下、この蛋白質分解・停止反応処理をＰＫ処理と呼ぶ）。その後、１８，０００×ｇ、４℃で５分間遠心をして上清を除いた。この沈殿全量に対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー［１％ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェート）、０．０５％ブロモフェノールブルー、４％グリセロール、１％２−メルカプトエタノール、２５ｍＭ  トリス塩酸、ｐＨ６．８］２０μＬを加えて懸濁し、９５℃で５分間の熱変性処理を加えて試料を調製した（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルと呼ぶ）。
【００２４】
ＰｒＰｃの検出には、Ｎ２ａ細胞の細胞溶解液２０μＬに５倍濃厚なＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー５μＬを加えて懸濁し、９５℃で５分間の熱変性処理を加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルをイシカワらの方法［イシカワ  Ｋ．ら、ジャーナル  オブ  ジェネラル  ヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２００４年、８５巻、１７８５−１７９０頁］に準じ、１５％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をナイロンメンブラン（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレイン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体［ＳＰＩ−ＢＩＯ社製、ＳＡＦ８３（５０００倍希釈）］、及び、アルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体［プロメガ社製（２００００倍希釈）］、化学発光検出試薬（アマーシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を使用してプリオン蛋白質の検出を行った。検出したシグナルは、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアーを用いてシグナルの強さを定量化した。
【００２５】
［結果］
図１ａに示すように、非感染Ｎ２ａ細胞ではグリセロールの濃度依存性に細胞あたりのＰｒＰｃ量の増加が確認された。一方、図１ｂに示すようにＳｃＮ２ａ細胞では同様にグリセロールの濃度依存性に細胞あたりのＰｒＰｒｅｓの増加が観察され、また図１ｃに示すように同細胞ではＰｒＰｃとＰｒＰｓｃを合わせたｔｏｔａｌ  ＰｒＰの増加も観察された。また、図１ｄに示すようにＮ１６７細胞でも同様にグリセロールの添加濃度依存性に細胞あたりのＰｒＰｒｅｓの増加が確認された。なお、ＰｒＰには１８０番アミノ酸と１９６番アミノ酸のアスパラギン酸の部分で糖鎖が結合できる部位が２カ所ある。そのためウエスタンブロットで検出した際には糖鎖付加のパターン（無糖鎖型、一糖鎖付加型、二糖鎖付加型）によって３本のバンドとなって検出される。
【００２６】
〔実施例２〕
グリセロールを培養液中に添加すると、細胞当たりのＰｒＰｃ／ＰｒＰｓｃ量の増加以外にグリセロール濃度に依存して細胞数増加が抑えられた。細胞数の増加抑制は、細胞死による細胞数の減少が原因ではなく、細胞増殖抑制が原因であることを示している。
【００２７】
［方法］
グリセロールの細胞増殖に対する影響を解析するために、Ｎ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞において６ウエル培養用ディッシュに播種後１２時間毎に５日間にわたり細胞数を計測した。なお、グリセロールの培養液への添加は播種後に行った。細胞数の計測は、実施例１のとおりである。一方、Ｎ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞で細胞死の解析を行った。細胞死は、２つの方法で解析した。１つ目はフォスファチジルセリンを特異的に認識するフルオレセインイソチオシアネート標識アネキシンＶ（以下、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ）を用いて、フローサイトメーターで解析を行った。初期アポトーシスにより細胞膜の脂質二重膜の平衡が崩れ健常な細胞では二重膜の内側に結合していたフォスファチジルセリンが細胞外に露出するようになり、それをＦＩＴＣ標識アネキシンＶが認識する。２つ目の方法は、５，５’，６，６’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−１，１’，３，３’−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ（以下、ＪＣ−１）を用いてフローサイトメトリーで細胞を解析した。細胞死によりミトコンドリアの電子伝達系が変化し膜電位が消失することが知られているが、ＪＣ−１は生細胞ではミトコンドリアに取り込まれ、赤色の蛍光を呈する。細胞死を引き起こした細胞ではミトコンドリアに取り込まれずに緑色の蛍光を呈する。なお、細胞死の陽性コントロールとして、解析前にスタウロスポリン８０μｇ／ｍｌを細胞培養液に添加して２時間処理を行うことで細胞死を誘導した細胞を使用した。細胞を６ウエル培養用ディッシュに播種し、その２４時間後にグリセロールを添加し、さらに２４時間培養した。それらの細胞をＰＢＳで洗浄後にコラゲナーゼ（終濃度０．１％）を含むＰＢＳで処理を行いディッシュから剥がして、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ［バイオ  ビジョン社製、牛胎児血清（最終濃度０．５％）を添加したＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−ＦＣＳ）で２倍に希釈］を用いて氷上で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄し、フローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で解析した。また、同様にディッシュからはがした細胞をＰＢＳ−ＦＣＳで２倍に希釈したＪＣ−１（ケイマンケミカル社製）と氷上で３０分間反応させ、同様にフローサイトメーターで解析した。
【００２８】
［結果］
図２ａならびに図２ｂに示すように、Ｎ２ａ細胞、ＳｃＮ２ａ細胞のいずれにおいても、グリセロール添加により細胞数の増加抑制が確認された。一方、図３ａならびに図３ｂに示すように、グリセロールの添加の有無にかかわらず、Ｎ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞ではＦＩＴＣ標識アネキシンＶの蛍光は検出されなかったが、スタウロスポリンで細胞死誘導した細胞では強い蛍光が認められた。また、図３ｃならびに図３ｄに示すように、ＪＣ−１を用いた解析でも同様であり、グリセロールの添加の有無にかかわらずＮ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞では緑色の蛍光は見られず、スタウロスポリンで神経細胞死を誘導した細胞でのみ強い緑色蛍光が見られた。これらの結果から、細胞数の増加抑制は、細胞死による細胞数の減少が原因ではなく、細胞増殖抑制が原因である。
【００２９】
〔実施例３〕
グリセロールは高張性化合物であるが、Ｎ２ａ細胞のＰｒＰｃ量の増加やプリオン感染Ｎ２ａ細胞のＰｒＰｒｅｓ量の増加や細胞増殖抑制の効果は、高張性化合物に共通して起こるのではなくグリセロールに特異的であることを示している。
【００３０】
［方法］
グリセロール（分子量９２：Ｃ３Ｈ５（ＯＨ）３）と同様に高い浸透圧を示す薬剤としてスクロース（分子量３４２：Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）マンニトール（分子量１８２：Ｃ６Ｈ１４Ｏ６）、ソルビトール（分子量１８２：Ｃ６Ｈ１４Ｏ６）をそれぞれ４００ｍＯｓＭとなるようにＮ２ａ細胞やＳｃＮ２ａ細胞の培養液に添加して、３日間培養を行い、細胞数を計測するとともに細胞溶解液を回収してウエスタンブロット法でＰｒＰｃやＰｒＰｒｅｓを検出し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアーを用いてシグナルの強さを定量化した。
【００３１】
［結果］
図４ａに示すようにいずれもグリセロールが示すような細胞当たりのＰｒＰｃやＰｒＰｒｅｓの量の増加は見られなかった。一方、図４ｂに示すように、Ｎ２ａ細胞ではマンニトールとソルビトールを添加した細胞、そしてＳｃＮ２ａ細胞ではソルビトールを添加した細胞で細胞数の減少が見られた。したがって、グリセロールによる細胞への作用は浸透圧によるものではない。
【００３２】
〔実施例４〕
従来の培養法によるプリオン持続感染細胞で有効とされた既知の抗プリオン化合物は、グリセロールを添加したプリオン持続感染細胞ではほとんど効果が無いことを示している。
【００３３】
［方法］
従来のプリオン持続感染細胞で有効であると報告された抗プリオン化合物であるペントサンポリサルフェート（以下、ＰＰＳ）［Ｃａｕｇｈｅｙ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．  Ｒａｙｍｏｎｄ，  Ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｐｏｌｙａｎｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｒａｐｉｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＰｒＰ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  １９９３．  ６７（２）：  ｐ．  ６４３−５０．］、プロテインバウンド・ポリサッカライドＫ（以下、ＰＳＫ）［Ｈａｍａｎａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ｐｒｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｋ  ｉｎ  ｐｒｉｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ２０１１．  ４０５（２）：  ｐ．  ２８５−９０．］、キナクリン（以下、ＱＣ）［Ｄｏｈ−Ｕｒａ，  Ｋ．，  Ｔ．  Ｉｗａｋｉ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｃａｕｇｈｅｙ，  Ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｓｃｒａｐｉｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２０００．  ７４（１０）：  ｐ．  ４８９４−７．］、コンパウンドＢ（以下、ｃｏｍｐＢ）［  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｃｅｒｅｂｒａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００７．  ８１（２３）：  ｐ．  １２８８９−９８．］について、ＳｃＮ２ａ細胞とＮ１６７細胞を用いて解析した。なお、ポリアミドアミン・デンドリマー（ジェネレーション６（以下、ＰＡＭ６））［Ｓｕｐａｔｔａｐｏｎｅ，  Ｓ．，  Ｊ．Ｒ．  Ｐｉｒｏ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｒｅｅｓ，  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ：  ｕｎｉｑｕｅ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ２００９．  ８（５）：  ｐ．  ３２３−８．］は細胞中のＰｒＰｓｃの分解を促進する作用を持つことが報告されている化合物であり、陽性対照として用いた。
【００３４】
従来の方法に則り、コンフルエントの１０％相当数の細胞を培養用ディッシュに播種する際に、これらの化合物を培養液中に添加し、３日間培養を行い、その後に細胞溶解液を回収しウエスタンブロット法でＰｒＰｒｅｓを解析した。化合物の添加量は、最終濃度でＰＰＳは１０μｇ／ｍＬ、ＰＳＫは１００μｇ／ｍＬ（以下、高濃度ＰＳＫ）、ＱＣは０．５μＭ、ｃｏｍｐＢは１μＭ、ＰＡＭ６は０．１μＭである。なお、溶媒として生理食塩水あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いたので、陰性対照としてそれらの溶媒のみを添加した。
【００３５】
一方、グリセロール添加プリオン持続感染細胞では、同様に細胞を播種し一日経過後にグリセロールを培養液中に添加（ＳｃＮ２ａ細胞では最終濃度１．２％、Ｎ１６７細胞では最終濃度１．５％）し培養を４日間継続した後に、それぞれの抗プリオン化合物を上記最終濃度で添加し、さらに２日間培養を継続した。その後に細胞溶解液を回収しウエスタンブロット法でＰｒＰｒｅｓを解析した。また、グリセロール添加プリオン持続感染細胞では、抗プリオン化合物の添加のタイミングを２日間早めて、抗プリオン化合物添加後２日間培養した場合についても、ＳｃＮ２ａ細胞で同様に解析した。この場合は、ＰＳＫを５０μｇ／ｍＬで用いた以外は、上記と同じ濃度で抗プリオン化合物を添加した。
【００３６】
［結果］
図５ａに示すように、従来の培養方法で評価した場合には、ＳｃＮ２ａ細胞ではＰＰＳ，高濃度ＰＳＫ，ｃｏｍｐＢでＰｒＰｒｅｓ量の顕著な減少、ＱＣで極めて軽度のＰｒＰｒｅｓ量の減少が見られた。また、Ｎ１６７細胞ではＰＰＳ，高濃度ＰＳＫ，ＰＡＭ６でＰｒＰｒｅｓ量の明らかな減少が見られた。しかし、図５ｂに示すように、グリセロールを添加した培養方法で評価した場合には、ＳｃＮ２ａ細胞では高濃度ＰＳＫ，ＱＣ，ｃｏｍｐＢで極めて軽度のＰｒＰｒｅｓ量の減少が見られたものの、Ｎ１６７細胞ではいずれの化合物においてもＰｒＰｒｅｓ量は減少しなかった。したがって、増殖抑制状態の細胞で飽和状態近くまでＰｒＰｓｃが蓄積している場合には、既知の抗プリオン化合物は有効でないことが、グリセロール添加細胞で証明された。一方で、抗プリオン化合物の添加のタイミングを２日間早めると、ＰＰＳ，ｃｏｍｐＢのＰｒＰｒｅｓ量の減少は極めて軽度に見られたが、陽性対照剤であるＰＡＭ６では顕著なＰｒＰｒｅｓ量の減少が観察された。したがって、グリセロールを添加して培養したプリオン持続感染細胞は、ＰｒＰｓｃの分解作用に優れた化合物を見つけ出すのに適切なスクリーニング用細胞であることが証明された。
【００３７】
〔実施例５〕
飢餓培養液中にブチル酸を添加して培養したプリオン持続感染細胞では、細胞の増殖が抑えられ、ＰｒＰｓｃ量が増加し、逆にＰｒＰｃ量が減少するなど、プリオン病罹患脳で生じている状況［Ｋｉｍ，  Ｅ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  （１８）  Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２０１２．  １９（３）：  ｐ．  ４８８−９３．］及び［Ｌｌｏｒｅｎｓ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰｒＰ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ＰｒＰ（ｃ）  ｉｎ  ＣＳＦ  ｉｎ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ  ＭＭ１  ａｎｄ  ＶＶ２．  Ｐｒｉｏｎ，  ２０１３．  ７（５）：  ｐ．  ３８３−９３．］に近い状態が細胞で見られることを示している。また、本法ではＰｒＰｃ量が少ないため、ＰｒＰｒｅｓを含めた全てのＰｒＰｓｃをＰＫ処理なしに容易に観察できる利点があることを示している。
【００３８】
［方法］
従来培養法［すなわち、１０％牛胎児血清添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（グルコース濃度は０．４５ｇ／Ｌ）培養液中での培養］で培養したＮ１６７細胞を、コンフルエントの５０％相当数の細胞を培養用ディッシュに播種し、１日後に低血清（０．２％牛胎児血清）かつ低グルコースＤＭＥＭ培養液（ギブコ社製、グルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ）（すなわち、この低血清かつ低グルコースの培養液が飢餓培養液）に交換し、分化誘導剤として知られているレチノイン酸（最終濃度、４μＭ）、ブチル酸（最終濃度、５μＭ）、ヘキサン酸（最終濃度、５μＭ）を添加して３日間培養を行った。また、ＰｒＰｓｃ陰性対照群として、従来培養法で培養したＳｃＮ２ａ細胞にＰＰＳ（最終濃度、４μｇ／ｍＬ）を加えて３日間培養を２度繰り返し、ＰｒＰｓｃを検出感度以下にまで除去した治療済み細胞（ＰｒＰｃのみが検出される）を用いた。治療済み細胞も、同様に播種し、１日後に飢餓培養液に交換し分化誘導剤を添加して３日間培養を行った。
【００３９】
その後、細胞溶解液を回収し、細胞溶解液中の蛋白量をＤＣプロティンアッセイ試薬（バイオラッドラボラトリーズ社製）で測定し、等量のタンパク質中のｔｏｔａｌ  ＰｒＰとＰｒＰｒｅｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後に、ウエスタンブロット法で解析した。さらに、サンプルを糖鎖除去処理してｔｏｔａｌ  ＰｒＰを分析して、ＰｒＰｃとＰｒＰｓｃの分子サイズの違いを評価した。なお、糖鎖除去処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルに対してフラボバクテリウム  メニンゴセプチキュム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来ＰＮＧａｓｅ  ＦをＮＥＢ社の取扱説明書通りに添加して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルに含まれる蛋白質上の糖鎖除去反応を行った。３７℃、１時間の反応時間を経たのち、５倍濃縮ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファーを加え、９５℃、５分間の熱変性処理を加えた。その後、糖鎖除去処理サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウエスタンブロット法で解析した。
【００４０】
［結果］
図６ａに示すように、通常培養液で培養した場合や飢餓培養液のみで培養した場合や飢餓培養液＋レチノイン酸で培養した場合や飢餓培養液＋ヘキサン酸で培養した場合に比べて、ＰＰＳ治療済み細胞（ＰＰＳ前処理＋）と未治療細胞（ＰＰＳ前処理−）の比較でわかるように、飢餓培養液＋ブチル酸で培養した場合（破線の囲みで示している）にはｔｏｔａｌ  ＰｒＰで見てもＰｒＰｓｃに相当するシグナルの量が増えており、逆にＰｒＰｃに相当するシグナル量は減少していた。また、図６ｂに示すようにＰｒＰｒｅｓを見ても、飢餓培養液＋ブチル酸で培養した場合には明らかにシグナルが増加していた。さらに、図６ｃに示すように糖鎖除去処理をしてＰｒＰｃとＰｒＰｓｃに相当するシグナルを調べたところ、ＰｒＰｃとＰｒＰｓｃで分子サイズが明らかに異なっており、図６ａで観察された所見があらためてはっきりと確かめられた。したがって、通常法で培養した場合や飢餓培養液のみで培養した場合や飢餓培養液＋他の分化誘導剤で培養した場合に比べて、飢餓培養液＋ブチル酸で培養した場合にはＰｒＰｒｅｓを含めたＰｒＰｓｃの増加がより一層目立ち、ＰＫ処理なしでも顕著に観察できることが明らかとなった。
【００４１】
〔実施例６〕
飢餓培養液中にブチル酸を添加して培養したプリオン持続感染細胞では、ＰｒＰｓｃが細胞内に大量に蓄積していることが免疫細胞化学法でも確認されることを示している。
【００４２】
［方法］
実施例５と同様にＮ１６７細胞をＮｕｎｃ社製Ｌａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅに播種し、１日後に飢餓培養液に交換し分化誘導剤を添加して３日間培養を行った。細胞をＰＢＳで洗浄後、細胞を４％パラホルムアルデヒド液（ＰＢＳに溶解）で室温、２０分間処理した。ＰＢＳで洗浄後に、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳで希釈）で室温、３分間処理を行い、さらに６Ｍ塩酸グアニジンで室温、１０分間処理を行った。ＰＢＳで洗浄後に、１％牛血清アルブミン（ＰＢＳで希釈）で室温、２０分間反応させた。その後、６Ｈ４抗体（１０００倍希釈、プリオニクス社製）と室温、２０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アレクサフルオロ４８８抗体（５００倍希釈、モレキュラープローブ社製）と室温、２０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後にＰｒＰのシグナルを共焦点レーザー顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ３００、オリンパス社製）を用いて観察した。
【００４３】
［結果］
図７に示すように、飢餓培養液のみで培養した場合や飢餓培養液＋レチノイン酸で培養した場合や飢餓培養液＋ヘキサン酸で培養した場合に比べて、飢餓培養液＋ブチル酸で培養した場合には細胞内でＰｒＰｓｃを含む異常なＰｒＰの蓄積量が顕著に増えていた。
【００４４】
〔実施例７〕
ＰｒＰｓｃはオートファジーにより分解されることが報告［Ｇｉｌｃｈ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ＰｒＰ（ｃ）  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｉｏｎ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ＰｒＰ（Ｓｃ）  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２００７．  １２３（４）：  ｐ．  ３７７−８６．］及び［Ｈｅｉｓｅｋｅ，  Ａ．，  Ｙ．  Ａｇｕｉｂ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｍ．  Ｓｃｈａｔｚｌ，  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，  ｐｒｉｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｕｔｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２０１０．  １２（２）：  ｐ．  ８７−９７．］されているが、飢餓培養液＋ブチル酸添加の作用機序として、細胞中でオートファジーによるタンパク質分解が抑制されていることを示している。
【００４５】
［方法］
実施例５と同様にＮ１６７細胞を播種し、１日後に飢餓培養液に交換し分化誘導剤を添加して３日間培養を行った。その後、細胞溶解液を回収し、細胞溶解液中の蛋白量をＤＣプロティンアッセイ試薬で測定し、等量のタンパク質中のオートファゴゾーム形成に関連するＬＣ３蛋白（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後に、ウエスタンブロット法で解析した。１次抗体には抗ＬＣ３抗体（５０００倍希釈、ナノツールズ社製）を用いた。
【００４６】
［結果］
図８に示すように、飢餓培養液のみで培養した場合や飢餓培養液＋レチノイン酸で培養した場合や飢餓培養液＋ヘキサン酸で培養した場合に比べて、飢餓培養液＋ブチル酸で培養した場合（破線の囲みで示している）にはＬＣ３のシグナルの中でＬＣ３−ＩＩのシグナルが減少していた。ＬＣ３−ＩＩはＬＣ３−Ｉにフォスファチジルエタノールアミンが共有結合したもので、ＬＣ３−ＩＩはオートファゴソーム膜の形成に必要であり、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比率がオートファゴソーム形成と正の相関にあることが知られている［Ｋａｄｏｗａｋｉ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．  Ｋａｒｉｍ，  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＬＣ３  ｒａｔｉｏ  ａｓ  ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ２００９．  ４５２：  ｐ．  １９９−２１３．］。したがって、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比率の減少は、オートファゴゾーム形成が抑制され、自食作用による蛋白質分解が抑制されていることを示す。
【００４７】
〔実施例８〕
従来培養法で培養したプリオン持続感染細胞で有効とされた既知の抗プリオン化合物は、飢餓培養液＋ブチル酸添加で培養したプリオン持続感染細胞ではほとんど効果が無いことを示している。
【００４８】
［方法］
実施例４で挙げた従来の培養法でプリオン持続感染細胞で有効であると報告されたＰＰＳ、ＰＳＫ、ＱＣ、ｃｏｍｐＢ，および分解促進陽性対照剤であるＰＡＭ６について、それらの有効性を飢餓培養液＋ブチル酸添加で培養したＳｃＮ２ａ細胞とＮ１６７細胞を用いて解析した。実施例５にあるようにプリオン持続感染細胞を播種し、１日後に飢餓培養液に交換しブチル酸を添加して２日間培養を行った。その後、ブチル酸と抗プリオン化合物を加えた飢餓培養液に培養液を交換し、さらに２日間培養を継続した。抗プリオン化合物の添加量は、最終濃度でＰＰＳは１０μｇ／ｍＬ、ＰＳＫは１００μｇ／ｍＬ（高濃度ＰＳＫ）、ＱＣは０．５μＭ、ｃｏｍｐＢは１μＭ、ＰＡＭ６は０．１μＭである。培養終了後に細胞溶解液を回収し、細胞溶解液中の蛋白量をＤｃプロティンアッセイ試薬で測定し、等量のタンパク質を含む細胞溶解液をＰＫ処理した。得られたＰＫ処理抵抗性のＰｒＰｒｅｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後に、ウエスタンブロット法で解析した。
【００４９】
［結果］
実施例４の従来法で培養した場合の抗プリオン化合物の効果（図５ａ）に比べると、図９に示すように、飢餓培養液にブチル酸を添加した方法で培養した場合には、ＳｃＮ２ａ細胞およびＮ１６７細胞の両者で、陽性対照剤であるＰＡＭ６と同程度の効果が高濃度ＰＳＫに見られたのみであった。したがって、飢餓培養液にブチル酸を添加した培養方法で培養したプリオン持続感染細胞は、ＰｒＰｓｃの分解作用に優れた化合物を見つけ出すのに適切なスクリーニング用細胞であることが証明された。
【図１ａ】
2017201899.tif 000002
【図１ｂ】
2017201899.tif 000003
【図１ｃ】
2017201899.tif 000004
【図１ｄ】
2017201899.tif 000005
【図２ａ】
2017201899.tif 000006
【図２ｂ】
2017201899.tif 000007
【図３ａ】
2017201899.tif 000008
【図３ｂ】
2017201899.tif 000009
【図３ｃ】
2017201899.tif 000010
【図３ｄ】
2017201899.tif 000011
【図４ａ】
2017201899.tif 000012
【図４ｂ】
2017201899.tif 000013
【図５ａ】
2017201899.tif 000014
【図５ｂ】
2017201899.tif 000015
【図５ｃ】
2017201899.tif 000016
【図６ａ】
2017201899.tif 000017
【図６ｂ】
2017201899.tif 000018
【図６ｃ】
2017201899.tif 000019
【図７】
2017201899.tif 000020
【図８】
2017201899.tif 000021
【図９】
2017201899.tif 000022