(57)【要約】【課題】カルモジュリンおよびカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼ非依存的にキナーゼ活性を有するカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドを提供する。【解決手段】カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側が欠損してなるカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドであって、前記欠損が、少なくともカルモジュリン結合ドメインを含み、かつ前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されていることを特徴とする、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドである。当該ポリペプチドは、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にリン酸化能を発揮し、リン酸化剤として使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側が欠損してなるカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドであって、
前記欠損が、少なくともカルモジュリン結合ドメインを含み、かつ
前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されていることを特徴とする、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド。
【請求項２】
前記カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉが、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉδであることを特徴とする、請求項１記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド。
【請求項３】
前記リン酸化されているアミノ酸が、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼによってリン酸化されるアミノ酸と異なるアミノ酸であることを特徴とする、請求項１または２記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド。
【請求項４】
カルモジュリンおよびカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼ非依存的にキナーゼ活性を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドを含む、リン酸化剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを大腸菌に導入してなる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培地中で培養する工程、
培養液の宿主を破砕処理し、可溶性画分を回収する工程、
を有するカルモジュリンおよびカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼ非依存的にキナーゼ活性を有するカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記培養は、温度１８〜３７℃で６〜２４時間で行うことを特徴とする、請求項９記載のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド、当該ポリペプチドを含むリン酸化剤、および前記カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のタンパク質の約１／３はリン酸化による制御を受けており、リン酸化反応は生体機能の調節に重要である。試験管内で各種タンパク質をリン酸化できれば、リン酸化タンパク質の機能解析が容易になる。また、リン酸化タンパク質の調製が容易になれば、ホスファターゼの活性測定や基質特異性の解析も容易となる。このようなタンパク質をリン酸化する酵素として、生体内には、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素（Ca2+/CaM-dependent protein kinase）がある。高等動物の記憶や学習などの高次神経機能で重要な働きをするタンパク質リン酸化酵素であり、リン酸化により活性化され、その活性は、脱リン酸化酵素により負の制御を受ける。細胞内カルシウム濃度の上昇およびカルモジュリンの直接結合により活性化される、セリン／スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素として、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ（ＣａＭＫＩ：Ca2+/CaM-dependent protein kinase I)や、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素ＩＩ（ＣａＭＫＩＩ：Ca2+/CaM-dependent protein kinase II)等が存在し、前記ＣａＭＫＩとＣａＭＫＩＩは共に、α、β、γ、δと称される４つのアイソフォームを有することが知られている。
【０００３】
ＣａＭＫＩは、Ｎ末端側から順に、触媒ドメイン(catalytic domain)、自己阻害ドメイン(autoinhibitory domain)、カルモジュリン結合ドメイン(Ca2+/CaM-binding domain)を含む。ＣａＭＫＩのリン酸化活性は、カルモジュリン結合とカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼ(Calcium／CaM-dependent protein kinase kinase、以降ＣａＭＫＫと称する。)によるＣａＭＫＩのリン酸化に依存する。刺激に応答して神経細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇するとカルモジュリンがカルシウムとの複合体（以下、カルシウム・カルモジュリン複合体、Ca2+/CaMとも称する。）を形成し、ＣａＭＫＫが活性化される。その後、カルシウム・カルモジュリン（Ca2+/CaM）がＣａＭＫＩのカルモジュリン結合ドメインに結合する。次いで活性化されたＣａＭＫＫによってＣａＭＫＩがリン酸化されリン酸化ＣａＭＫＩとなり、リン酸化活性を発揮する（非特許文献１〜２）。図１６にＣａＭＫＩδの一例として、ゼブラフィッシュのＣａＭＫＩδの一次構造を模式的に示す。Ｎ末端側の第２６〜２８０番のアミノ酸が触媒ドメインであり、第５２アミノ酸にＡＴＰが結合し、第１８２アミノ酸がＣａＭＫＫによるリン酸化を受け、基質タンパク質に対するリン酸化能を有する。なお、ＣａＭＫＩαとＣａＭＫＩδとはＮ末端およびＣ末端構造の一次構造が相違し、ＣａＭＫＩδのＮ末端構造はホスファターゼ抵抗性となっていることが知られている（非特許文献３）。ＣａＭＫＩδは、ホスファターゼ抵抗性を獲得しているため、低Ｃａ２＋状態でも脱リン酸化されることなくリン酸化状態を維持することができる。なお、ＣａＭＫＩδは、ゼブラフィッシュの初期発生時に重要な役割を果たすプロテインキナーゼであり、海馬に多く発現し、神経機能で重要な役割を果たすと考えられている（非特許文献４）。
【０００４】
一方、ＣａＭＫＩＩは、カルモジュリン結合ドメインのＣ末端側に、更に会合領域（association region)を含む点でＣａＭＫＩと相違する。また、リン酸化機構も相違し、ＣａＭＫＫによるリン酸化を必要としない。すなわち、刺激に応答して細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇するとカルシウム・カルモジュリン複合体（Ca2+/CaM）が形成され、ＣａＭＫＩＩのカルモジュリン結合ドメインに結合する。次いで、ＣａＭＫＩＩが自己リン酸化してリン酸化ＣａＭＫＩＩとなり、リン酸化活性を有するようになる（非特許文献５）。
【０００５】
カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素は高次神経機能に深く関わる酵素であり、その活性型酵素の安定的供給は神経科学分野の研究において重要な意味を持つ。基質特異性の広い多機能性タンパク質リン酸化酵素のリン酸化剤としての用途開発が強く望まれ、これをリン酸化試薬として利用する技術が開発されている。例えば、前記した自己リン酸化したＣａＭＫＩＩをキモトリプシンで部分分解して得た、分子量３０ｋＤａのＣａＭＫＩＩフラグメントがある。このポリペプチドフラグメントは、カルモジュリン非依存的なリン酸化活性を導く。更に、大腸菌を介して大量生産に適するようにポリペプチドを改変したものもある（特許文献１）。ＣａＭＫＩＩフラグメントを大腸菌を用いて発現させると発現量が少なく、かつ不溶性画分に発現する。特許文献１では、ＣａＭＫＩＩフラグメントのＮ末端側にアフリカツメガエルＣａＭＫＩｘのＮ末端側１０〜４０個のアミノ酸配列を結合したＣＸ−３０ｋ−ＣａＭＫＩＩγを調製している。ＣＸ−３０ｋ−ＣａＭＫＩＩγは大腸菌での発現量が多く、不溶性画分の発現物をグアニジン塩酸塩等で可溶化すると、時間依存的に顕著に活性が回復するという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４２３５７０８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H. Tokumitsu, H. Enslen, T.R. Soderling, Characterization of a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase cascade: Molecular cloning and expression of calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase, J. Biol. Chem. 270 (1995) 19320-19324.
【非特許文献２】M. Matsushita,  a C. Nairn, Characterization of the mechanism of regulation of Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase I by calmodulin and by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase., J. Biol. Chem. 273 (1998) 21473-21481.
【非特許文献３】Y. Senga, A. Ishida, Y. Shigeri, I. Kameshita, N. Sueyoshi, The phosphatase-resistant isoform of CaMKI, Ca2+/CaM-dependent protein kinase Iδ (CaMKIδ), remains in its “primed” form without Ca2+ stimulation, Biochemistry 54 (2015) 3617-3630.
【非特許文献４】A. Kamata, H. Sakagami, H. Tokumitsu, Y. Owada, K. Fukunaga, H. Kondo, Spatiotemporal expression of four isoforms of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I in brain and its possible roles in hippocampal dendritic growth. eurosci. Res. 57 (2007) 6-976
【非特許文献５】A. Ishida, T. Kitani, H. Fujisawa, Evidence that autophosphorylation at Thr-286/Thr-287 is required for full activation of calmodulin-dependent protein kinase II. Biochim. Biophys. Acta. 1311 (1996) 211-217
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献１記載のＣＸ−３０ｋ−ＣａＭＫＩＩγのｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターｐＥＴに導入して、タンパク質を発現させることができる。しかしながら、発現物は不溶性画分に存在するため不溶性画分を回収した後に可溶化を行う必要があり、操作が煩雑である。また、特許文献１の実施例では、調製物のプロテインキナーゼ活性を０℃と１６℃とでそれぞれ評価しているが、１６℃では５時間をピークに活性が漸減するという。したがって、簡便に製造でき、より耐熱性に優れるポリペプチドが開発できれば、耐熱性タンパク質のリン酸化活性の解明等に便利である。
【０００９】
また、非特許文献１に記載されるＣａＭＫＩもリン酸化活性を有するが、ＣａＭＫＩは、リン酸化の発現にカルモジュリンの結合と、ＣａＭＫＫによるリン酸化を必要とする。タンパク質リン酸化機構の解明には、他の成分に依存せずにリン酸化活性を発揮できることが好ましい。したがって、カルモジュリンやＣａＭＫＫに依存することなくリン酸化能を発揮し得るポリペプチドの開発が望まれる。
【００１０】
更に、リン酸化試薬は、酵素発現機構の解明などの基礎実験に重要であり、大量に供給できることが望ましい。よって、簡便に大量生産できる製造方法の開発が望まれる。
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にキナーゼ活性を発揮できるＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを提供することを目的とする。
【００１２】
また、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【００１３】
更に、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを含む、リン酸化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、ＣａＭＫＩのＣ末端側領域の一部を欠損してなるポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換体を培養したところ、発現物が可溶性画分に分泌されるため精製が容易であること、このように得られたポリペプチドは、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫに非依存的にキナーゼ活性を示すことを見出し、本発明を完成させた。しかも、このＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、凍結融解や熱に対する安定性が高いことも判明した。
【００１５】
すなわち本発明は、ＣａＭＫＩの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側が欠損してなるＣａＭＫＩ由来ポリペプチドであって、
前記欠損が、少なくともカルモジュリン結合ドメインを含み、かつ
前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されていることを特徴とする、ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを提供するものである。
【００１６】
また本発明は、前記ＣａＭＫＩが、ＣａＭＫＩδであることを特徴とする、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを提供するものである。
【００１７】
また本発明は、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にキナーゼ活性を示すことを特徴とする、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを提供するものである。
【００１８】
また本発明は、前記リン酸化されているアミノ酸が、ＣａＭＫＫによってリン酸化されるアミノ酸と異なるアミノ酸であることを特徴とする、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを含む、リン酸化剤を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供するものである。
【００２１】
また本発明は、前記ＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクターを提供するものである。
【００２２】
また本発明は、前記発現ベクターを大腸菌に導入してなる形質転換体を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、前記形質転換体を培地中で培養する工程、
培養液の宿主を破砕処理し、可溶性画分を回収する工程、
を有するカルモジュリンおよびカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素キナーゼ非依存的にキナーゼ活性を有するＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【００２４】
また本発明は、前記培養は、温度１８〜３７℃で６〜２４時間で行うことを特徴とする、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にキナーゼ活性を有するＣａＭＫＩ由来ポリペプチドが提供される。また、当該ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの簡便な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａは、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）の、図１ＢはｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の一次構造を説明する図である。
【図２】実施例１において、培養液の可溶性画分と不溶性画分に含まれるｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を検出した結果を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）とｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）のキレーティングカラムによる精製工程の結果を示す。なお、染色は、ＣＢＢ染色による。
【図４】実施例３の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）、並びにｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）のＣａＭオーバーレイアッセイの結果を示す。なお、図中ＷＴはワイルドタイプを、２９９は（１−２９９）を、２９７は（１−２９７）を、２９４は（１−２９４）を意味する。
【図５】実施例４の結果を示す図であり、Ｃａ２＋／ＣａＭ存在下、非存在下におけるＣａＭＫＩ（ＷＴ）と本発明のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドのリン酸化活性を比較した結果を示す。なお、図中ＷＴはワイルドタイプを、２９９は（１−２９９）を、２９７は（１−２９７）を、２９４は（１−２９４）を意味する。
【図６】実施例５の結果を示す図であり、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫ存在下、非存在下における各ＣａＭＫＩ（ＷＴ）と本発明のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドのリン酸化活性を比較した結果である。なお、図中ＷＴはワイルドタイプを、２９９は（１−２９９）を、２９４は（１−２９４）を意味する。
【図７】実施例５の結果を示す図であり、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫ存在下、非存在下における各ＣａＭＫＩ（ＷＴ）と本発明のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドのリン酸化活性をＭＢＰに取り込まれた［γ−３２Ｐ］のリン酸化を定量した結果である。
【図８】実施例６の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）およびｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）について、ＣＲＥＢ、ＭＬＣ、ヒストン、およびＭＢＰに対するリン酸化能の相違を評価した結果を示す。なお、＊は、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドである。
【図９】実施例７の結果を示す図であり、図９Ａは、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）およびｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）について、ゼブラフィッシュ胚抽出液（１２０ｈｐｆ）を基質にインビトロキナーゼアッセイの結果を示す。なお、＊は、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドである。また、図９Ｂは、フラクション８、９、１０のＣＢＢ染色の結果を示す図である。
【図１０】実施例８の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の凍結融解による安定性の結果を示す。
【図１１】実施例９の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の熱安定性の結果を示す。
【図１２】実施例１０の結果を示す図である。
【図１３】実施例１１の結果を示す図であり、図１３（Ａ）はｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を製造するための本培養条件を変えた場合の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、およびＭＢＰのリン酸化の結果を示し、図１３（Ｂ）は更にλホスファターゼを作用させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図１３（Ｃ）は、本来基質リン酸化能を有しない変異体を用いて調製したＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果およびＭＢＰに対するリン酸化能の結果を示し、図１３（Ｄ）はｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）にλホスファターゼ処理を行った場合のＭＢＰリン酸化能の影響を示す。
【図１４】実施例１２の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）とｒＣａＭＫＩα（１−２９４）とをＣａＭＫＫでリン酸化したリン酸化物を、ＣａＭＫＫによる活性化ループ内のＴｈｒのリン酸化を検出できる抗リン酸化ＣａＭＫＩ抗体およびＣＢＢで検出した結果を示す。なお、図中（１−２９９）はｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を、（１−２９４）はｒＣａＭＫＩα（１−２９４）を意味する。
【図１５】比較例１の結果を示す図であり、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のＮ末端からアミノ酸第３２７までのポリペプチドの、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫ存在、非存在下でのＭＢＰ基質に対するリン酸化能を示す。
【図１６】ゼブラフィッシュのＣａＭＫＩδの一次構造を説明する図である。
【図１７】ＣａＭＫＩαとＣａＭＫＩδの配列比較を説明する図である。
【図１８】ＣａＭＫＩδの動物間の配列比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一は、ＣａＭＫＩの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側が欠損してなるＣａＭＫＩ由来ポリペプチドであって、前記欠損が、少なくともカルモジュリン結合ドメインを含み、かつ前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されていることを特徴とする、ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドである。本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、更に、自己阻害ドメインの一部が欠損するものであってもよい。以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２８】
（１）ＣａＭＫＩ
本発明において、「ＣａＭＫＩ由来」とは、ＣａＭＫＩ由来ポリペプチド、ＣａＭＫＩのアミノ酸配列の一部を含むことを意味する。ＣａＭＫＩは、Ｎ末端から順に触媒ドメイン、自己阻害ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、および調節ドメインを含み、本発明では、種々の動物、植物、微生物由来のＣａＭＫＩを広く使用することができる。例えば、ヒト、ウシ、サル、イヌ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウスなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒルなどの鳥類、タイ、サバ、ゼブラフィッシュなどの魚類、カエル、サンショウウオなどの両生類、ヘビ、トカゲなどの爬虫類その他の動物、酵母、カビなどの微生物、および植物由来のＣａＭＫＩを対象とすることができる。また、例えば動物由来のＣａＭＫＩでは、発生時の何れの段階のものであってもよく、生体であれば何れの組織に含まれるものであってもよい。好ましくは、哺乳類や魚類由来のＣａＭＫＩである。また、ＣａＭＫＩは、α、β、γ、δの４種のアイソフォームが知られているが、何れであってもよい。好ましくはＣａＭＫＩδであり、特に好ましくはホスファターゼ抵抗性を有するＣａＭＫＩδである。低Ｃａ２＋状態でも脱リン酸化されることなくリン酸化状態を維持できるからである。ＣａＭＫＩδのＣ末端側の所定位置で切断したポリペプチド断片をコードするＤＮＡを導入したベクターで形質転換した大腸菌を培養すると、得られるポリペプチドのリン酸化能に優れることが判明した。特に好ましくは、哺乳類や魚類由来のＣａＭＫＩδであり、ゼブラフィッシュ、ラット、マウス、ヒト由来のＣａＭＫＩδである。
【００２９】
（２）ＣａＭＫＩ由来ポリペプチド
本発明における「ＣａＭＫＩ由来ポリペプチド」は、ＣａＭＫＩの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側から、少なくともカルモジュリン結合ドメインを示すポリペプチドを欠損したものであり、かつ前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されていることを特徴とする。以降便宜のため、ゼブラフィッシュ由来のＣａＭＫＩδ（以降、ｚＣａＭＫＩδとも称する。）のワイルドタイプ（以降、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）と称する。）で説明する。
【００３０】
図１６に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）はアミノ酸４３３個からなり、触媒ドメインは、Ｎ末端から第２６〜２８０アミノ酸で構成され、第２８１〜３００が自己阻害ドメイン、第３０１〜３２０がカルモジュリン結合ドメイン、および第３２１〜４３３が調節ドメインとなっている。本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、例えばｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）の自己阻害ドメインのいずれかで切断したＮ末端側ポリペプチドを使用することができる。配列番号１に、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のアミノ酸配列を、配列番号２にｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のＤＮＡ配列を示す。
【００３１】
図１に、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）および、Ｃ末端側の第３００以降のアミノ酸を欠損させた、Ｎ末端から第２９９アミノ酸までのポリペプチド（以降、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）と称する。）の構造を示す。なお、本発明において、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の記載は、ポリペプチド配列を意味する場合のほか、いずれかのアミノ酸がリン酸化されたポリペプチドを意味する場合がある。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、カルモジュリン結合ドメインおよび調節ドメインを欠損するためカルモジュリン結合能がなく、かつ自己阻害ドメインの機能も喪失している。本発明では、ＣａＭＫＩの自己阻害ドメインのいずれかで切断されたＮ末端側ポリペプチドであることが好ましい。より好ましくは、自己阻害ドメインのＮ末端側からアミノ酸２８１〜３０１個、特に好ましくは２８１〜２９９個のいずれかで切断されたＣａＭＫＩのＮ末端側ポリペプチドである。ＣａＭＫＩのリン酸化活性には、カルモジュリン結合とＣａＭＫＫによるリン酸化が必須であるが、本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、カルモジュリン結合ドメインが存在しない場合でも基質タンパク質に対するリン酸化能を発揮することができる。
【００３２】
本発明では、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列としてｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を好ましく使用できるが、これに限定されるものではない。例えば、マウスＣａＭＫＩδのワイルドタイプ（以下、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）と称する。）に由来するＣａＭＫＩ由来ポリペプチドとして、Ｃ末端側の第２９８以降のアミノ酸を欠損させた、Ｎ末端から第２９７アミノ酸までのポリペプチド（以降、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）と称する。なお、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）の記載は、ポリペプチド配列を意味する場合のほか、いずれかのアミノ酸がリン酸化されたポリペプチドを意味する場合がある。）がある。同様にして、ラットＣａＭＫＩαのワイルドタイプ（以降、ｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）と称する。）に由来するＣａＭＫＩ由来ポリペプチドとして、ｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）のＣ末端側の第２９５以降のアミノ酸を欠損させた、Ｎ末端から第２９４アミノ酸までのポリペプチド（以降、ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）と称する。）がある。なお、ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）の記載は、ポリペプチド配列を意味する場合のほか、いずれかのアミノ酸がリン酸化されたポリペプチドを意味する場合がある。図１７にＣａＭＫＩαとＣａＭＫＩδの配列比較を、図１８に、ＣａＭＫＩδの動物間の配列比較を示す。
【００３３】
本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、ポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されている。図１６に示すように、ｚＣａＭＫＩδは、第１８２アミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒ）がＣａＭＫＫによるリン酸化を受け、基質タンパク質に対するリン酸化能を獲得する。本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、ＣａＭＫＫによるリン酸化と同様に第１８２アミノ酸がリン酸化されたものでもよいが、好ましくはＣａＭＫＫによってリン酸化されるアミノ酸とは異なるアミノ酸である。このようなアミノ酸として、セリン、スレオニンなどがある。前記したｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４に対応するアミノ酸配列を有し、かつポリペプチドを構成するアミノ酸の１以上がリン酸化されている本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にリン酸活性を発揮する。
【００３４】
本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、基質タンパク質に対しリン酸化触媒活性を発揮できることを条件に、生物から抽出したＣａＭＫＩのアミノ酸配列の１又は複数のアミノ酸が置換・欠失・付加・挿入されたものであってもよく、いずれかのポリペプチドがリン酸化されたものであってもよい。
【００３５】
更に、本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、抗体のＦc部分、免疫グロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリン、サイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインなどを触媒ドメインのＣ末端側にさらに結合したものであってもよい。
【００３６】
本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドのリン酸化能は、由来の起源となるＣａＭＫＩのワイルドタイプとほぼ同等である。しかも、４０℃で３０分以上加熱してもリン酸活性が高く維持され、耐熱性に優れる。また、凍結融解に対する安定性も高く、少なくとも４回の凍結融解でもリン酸化活性が高く維持される。
【００３７】
（３）リン酸化剤
本発明のリン酸化剤は、前記ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを含む。使用方法は、市販のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットなどと同様に使用することができる。通常、緩衝性物質を含有するグリセロール溶液などの溶液状で提供することができる。例えば、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５ｍＭのＭｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、１００μＭ  ＡＴＰなどの組成からなる溶解液を利用できる。本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、耐熱性および凍結融解に優れ、保存安定性も高い。
【００３８】
（４）ＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法
本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法に限定はない。従って、公知のＣａＭＫＩの自己阻害ドメインの一部を酵素切断し、得られたＮ末端側ポリペプチドをリン酸化して調製することができる。一方、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を形成し、培地中で培養して対象ポリペプチドを発現させると、培養工程でポリペプチドがリン酸化され、リン酸化されたポリペプチドを製造することができる。
【００３９】
宿主としては、大腸菌、枯草菌などの微生物、酵母、ラン藻、放線菌などの従来公知の種々の宿主を使用することができる。培養工程で、発現したポリペプチドをリン酸化し、または発現したポリペプチドによる自己リン酸化を阻害せず、予めリン酸化されたポリペプチドを製造できる宿主である。特に好ましくは、細胞内にＣａＭＫＫを有しない宿主である。ＣａＭＫＫと異なるアミノ酸をリン酸化でき、これによって基質タンパク質に対するリン酸化能に優れるＣａＭＫＩ由来ポリペプチドを製造することができる。発明では、大腸菌を好適に使用することができる。
【００４０】
培養条件は、宿主の培養に好適な公知の方法でよい。例えば大腸菌を使用する場合、温度は１８〜３７℃、より好ましくは２５℃である。また、培養時間は６〜２４時間、より好ましくは１２〜２４時間である。この範囲で温度および培養時間を選択することで、発現したポリペプチドの大半がリン酸化されることが判明した。大腸菌以外の宿主を使用する場合は、予め発現したポリペプチドがリン酸化される温度や培養時間を測定し、好適な培養条件を選択すればよい。
【００４１】
培養後は、培養物をホモジナイズした後に、遠心分離その他によって、可溶性部分と不溶性部分とに分離する。大腸菌を使用する場合、本発明のポリペプチドは、可溶性画分に発現するため可溶性画分を回収し、キレートカラムなどで精製すればよい。なお、宿主によって可溶性画分、不溶性画分のいずれに発現するか不明である場合は、予め少量の培養を行い、何れに発現するかを評価し、回収、精製方法を適宜選択すればよい。本発明のＣａＭＫＩ由来ポリペプチドの製造方法によれば、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された大腸菌を培養するだけで、ポリペプチドがリン酸化した状態で培養物中に含まれる。このため、製造したポリペプチドをその後にリン酸化するなどの複雑な工程を行う必要がない。しかも、可溶性画分に発現するため、大量生産が容易である。
【００４２】
従来から、ＣａＭＫＩのリン酸化の発現には、カルモジュリン結合とＣａＭＫＫによるリン酸化が必須である。しかしながら、大腸菌を培養して製造したＣａＭＫＩ由来ポリペプチドは、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的に基質タンパク質をリン酸化することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）
以下により、発現ベクター（ｐＥＴ−ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９））を構築した。
ＥＳＴ  ｄａｔａｂａｓｅ中からゼブラフィッシュＣａＭＫＩδの全塩基配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＣ１６０６３２）を見出し、この配列をもとに以下の２本のプライマーを合成した。
UrCaMKIδ/Nhe  5'-CTCGAGCACCACCACCACCA-3'（配列番号３）  
LrCaMKIδ/Xho  5'-CATCTGTCGACTGACGGACTCATG-3'（配列番号４）  
【００４５】
予め調製したｐＥＴｚＣａＭＫＩδの全長配列を鋳型にしてＰＣＲ（ＡＢＩ社製  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００を使用）を行った。ＰＣＲにはタカラバイオ社製のPrimeSTAR DNA polymeraseを用い、プログラムは９６℃、２分（９６℃１０秒、６０℃１０秒、７２℃５分）×３０、７２℃７分で増幅した。増幅産物を電気泳動後、ゲルから精製し（フナコシ社製Gene Clean III kitを使用）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン）で５’末端をリン酸化し、Ｔ４リガーゼでセルフライゲーションさせてｐＥＴ−ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を構築した。
【００４６】
発現ベクターｐＥＴ−ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に電気穿孔法にて導入し（Harvard Apparatus社、BTX ECM-600を使用）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１６ｈ培養した。発生したコロニーを３ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌し、３７℃で１６ｈ振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮な５ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌し、３７℃で培養後、対数増殖期に最終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加した後、２５℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離（２０，０００×ｇ、２℃、１分間）することで菌体を回収し、培養液の１／１０量の菌体破砕バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０］を加えて超音波破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、１０分間）することで可溶性画分と不溶性画分に分画した。可溶性画分と不溶性画分の各５μｌをＣＢＢ染色で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて発現を確認した。結果を図２に示す。図２において、Ｓは可溶性画分を、Ｐは不溶性画分を意味し、Ｍｏｃｋは、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を含まないベクターのみでトランスフェクションを行ったものを意味する。なお、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の分子量は４５〜４７ｋＤａである。図２に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は可溶性画分に含まれていた。
【００４７】
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を大量生産するため、発現ベクターｐＥＴ−ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を３ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌し、３７℃で１６ｈ振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮な１００ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植菌した。本培養は３７℃で培養後、対数増殖期に最終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧを添加した後、２５℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離（６，０００×ｇ、４℃、１０分間）することで菌体を回収し、培養液の１／１０量の菌体破砕バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（phenylmethylsulfonyl fluoride）］を加えて超音波破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して可溶性画分を得た。菌体破砕バッファーで平衡化した  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（１ｍｌ）に可溶性画分（Ｉｎｐｕｔ）をアプライし、各１０ｍｌの菌体破砕バッファー（Ｗａｓｈ）、２０ｍＭイミダゾールを含む菌体破砕バッファー、５０ｍＭイミダゾールを含む菌体破砕バッファーを順番に流すことで非特異的に結合しているタンパク質を除去した後、２００ｍＭイミダゾールを含む菌体破砕バッファーを流して目的タンパク質を溶出した。各溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、目的タンパク質の溶出が確認された画分に最終濃度２０ｍＭになるようにＥＤＴＡ（ethylenediamine tetraacetic acid）を添加し、氷上で３０分間静置した。その後、透析チューブに入れ、溶出画分の１００倍容量の透析バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ４０、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール］に対して透析（４℃、２時間×３回）を行い、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を得た。図３にＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）染色によるカラムクロマトの結果を示す。図３において、Ｉｎｐｕｔはアプライ前の可溶性画分、Ｐａｓｓはカラムに結合しなかったタンパク質画分であり、Ｗａｓｈは菌体破砕バッファーでカラム洗浄時の画分、２０ｍＭ、５０ｍＭ、２００ｍＭは溶出液に含まれるイミダゾール濃度であり、２００ｍＭの下部の数値１、２および３はフラクション番号を示す。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、フラクション１〜３に含まれ、その合計収量は２２．１ｍｇであった。なお、図３には、同様に精製したｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）の結果を示す。ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のフラクション２の収量は６．７９ｍｇであった。
【００４８】
(実施例２）
ＥＳＴ  ｄａｔａｂａｓｅ中からマウスＣａＭＫＩδの全塩基配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＣ１４１４１３）、およびラットのｒＣａＭＫＩαの全塩基配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ５９８６８７）を選択し、Ｎ末端からアミノ酸第２９７までのマウスＣａＭＫＩδ由来ポリペプチド（ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７））と、Ｎ末端からアミノ酸第２９４までのｒＣａＭＫＩα由来ポリペプチド（ｒＣａＭＫＩα（１−２９４））とを調製した。
【００４９】
テンプレートとして予め調製したｐＥＴｍＣａＭＫＩδ、ｐＥＴｒＣａＭＫＩαをそれぞれ用いた。実施例１と同様に操作して発現ベクターｐＥＴ−ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）および、発現ベクターｐＥＴ−ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）を構築し、それぞれＢＬ２１（ＤＥ３）に遺伝子導入、および培養してｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）を製造した。
【００５０】
なお、ｐＥＴｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）の調製に使用したプライマーは、以下の通りである。
センスプライマー：5'−CTCGAGCACCACCACCACCA-3'（配列番号５） 、
アンチセンスプライマー：5'−GATCTGGGCACTGACAGATTCGTG-3'（配列番号６） 
また、ｐＥＴｒＣａＭＫＩα（１−２９４）の調製に使用したプライマーは、以下の通りである。
センスプライマー：5'−CTCGAGCACCACCACCACCA-3'（配列番号７） 、
アンチセンスプライマー：5'−GATCTGCTCACTCACTGACTGGTGG-3'（配列番号８） 
【００５１】
（実施例３）
実施例１および２で得たｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）、並びにゼブラフィッシュ、マウスおよびラットから抽出したｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）についてカルモジュリンオーバーレイアッセイを行った。
４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、２ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（２００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）に、１ｍＭのＣａＣｌ２または１ｍＭのＥＧＴＡ（ethylene glycol tetraacetic acid）を加え、１０ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）、ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、またはｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）を添加し、カルモジュリン結合能を評価した。結果を図４に示す。なお、前記反応溶液の５００ｎｇをＣＢＢで染色した結果も併せて記載する。図４に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）は、カルシウム存在下でカルモジュリン結合能を有するが、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）、ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）はカルモジュリン結合能を有しなかった。なお、ＥＧＴＡ添加系ではバンドが存在せず、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）、並びにｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）のいずれもキレート剤の存在下ではカルモジュリンと結合できないことが示された。
【００５２】
（実施例４）
実施例１および２で得たｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）、並びにｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）について、Ｃａ２＋／ＣａＭ存在下、非存在下でのウシ由来のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ:myelin basic protein）に対するリン酸化活性を評価した。
【００５３】
２．５μｇのｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液２０μｌに加え、温度３０℃、３０分反応させた。また、前記リン酸化反応液に、１２５ｎｇのＣａＭＫＫ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および１μＭのカルモジュリンを添加もしくは添加せず、上記と同様にして反応させた。
反応後のｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）（２０ｎｇ）を、１００ｎｇのＭＢＰ、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに添加し、温度３０℃で３０分反応させた。同様にして、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリンを添加もしくは添加せず、上記と同様にして反応させた。得られた各反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。これをｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）についても上記と同様に操作した。また、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）は、ＣａＣｌ２、カルモジュリン、ＣａＭＫＫが存在しない条件で同様に操作した。結果を図５に示す。
【００５４】
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）、ｒＣａＭＫＩα（１−２９４）は、カルシウム・カルモジュリン（Ca2+/CaM）が存在しない条件でもリン酸化活性を発揮した。一方、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）は、カルシウム・カルモジュリン（Ca2+/CaM）が存在しないとＭＢＰは全くリン酸化されなかった。また、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｍＣａＭＫＩδ（ＷＴ）は、カルシウム・カルモジュリン（Ca2+/CaM）存在下でも、Ｃ末端の一部を欠損するｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｍＣａＭＫＩδ（１−２９７）より顕著に、リン酸化活性が弱かった。
【００５５】
（実施例５）
上記実施例で得たｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）、およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）について、カルモジュリンならびにＣａＭＫＫの影響を評価した。
２．５μｇのｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液２０μｌに加え、温度３０℃、３０分反応させた。また、前記リン酸化反応液に、１２５ｎｇのＣａＭＫＫ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および１μＭのカルモジュリンを添加もしくは添加せず、上記と同様にして反応させた。
反応後のｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）（２０ｎｇ）を、１００ｎｇのＭＢＰ、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに添加し、温度３０℃で３０分反応させた。同様にして、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリンを添加もしくは添加せず、上記と同様にして反応させた。得られた各反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。また、液体シンチレーションカウンターに反応液８μｌを供し、ＭＢＰに取り込まれた［γ−３２Ｐ］ＡＴＰのリン酸化を定量した。これをｒＣａＭＫＩα（ＷＴ）についても同様に操作した。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）およびｒＣａＭＫＩα（１−２９４）は、ＣａＭＫＫ、ＣａＣｌ２およびカルモジュリンを添加せず、上記と同様にして反応させた。
【００５６】
オートラジオグラフィーの結果を図６に示し、３２Ｐ-取り込み量によるリン酸活性量を図７に示した。リン酸活性量の測定は３回行い、標準偏差をエラーバーで示した。図６に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）は、Ｃａ２＋／ＣａＭおよびＣａＭＫＫが存在する場合のみＭＢＰをリン酸化した。一方、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、Ｃａ２＋／ＣａＭおよびＣａＭＫＫ非依存的にＭＢＰをリン酸化した。また、図７に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）のリン酸化能は、Ｃａ２＋／ＣａＭおよびＣａＭＫＫ存在下でのｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のリン酸化能とほぼ同等であった。
【００５７】
（実施例６）
実施例１で得たｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）およびｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）について、ＣＲＥＢ（cyclicAMP-responsive element-binding protein）、ＭＬＣ（myosin light chain）、ヒストン（Histones）、およびＭＢＰに対するリン酸化能を評価した。
ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）（４μｇ）を０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリン、２００ｎｇのＣａＭＫＫを含むリン酸化反応液２０μｌに添加し、温度３０℃、３０分反応させてリン酸化した。１００ｎｇのリン酸化したｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリン、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに添加し、更に５００ｎｇの上記ＣＲＥＢ、ＭＬＣ、ヒストン、またはＭＢＰを添加して温度３０℃で３０分反応させ、各種タンパク質をリン酸化した。反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。また、１００ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに添加し、更に５００ｎｇの上記ＣＲＥＢ、ＭＬＣ、ヒストン、またはＭＢＰを添加して温度３０℃で３０分反応させ、各種タンパク質をリン酸化した。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、ＣａＭＫＫ、ＣａＣｌ２およびカルモジュリンを添加せず反応させた。オートラジオグラフィーの結果を図８に示す。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）と、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫ存在下でのＣａＭＫＩδ（ＷＴ）とのパターンは同等であり、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）とｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）は、上記ＣＲＥＢ、ＭＬＣ、ヒストンおよびＭＢＰのいずれもリン酸化した。なお、ＣＲＥＢの分子量は４５〜４７ｋＤａ、ＭＬＣは１５〜２０ｋＤａ、ヒストンは１４〜１５ｋＤａ、ＭＢＰは１８ｋＤａである。これにより、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、ＣＲＥＢ、ＭＬＣ、ヒストン、ＭＢＰに対し、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫによって活性化されたｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）と同等のリン酸化活性を発揮することが判明した。なお、＊は、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドである。ただし、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドに、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）の自己リン酸化バンドが含まれるかは不明である。
【００５８】
（実施例７）
実施例１で得たｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）およびｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）について、内在性基質に対する特異性を評価するため、ＭｉｃｒｏＲｏｔｏｆｏｒにより分画した。基質タンパク質としてゼブラフィッシュ胚抽出液（１２０ｈｐｆ）を用い、このタンパク質抽出物（２．５ｍｇ）を２．５ｍｌのＩＥＦバッファー［５ｍＭジチオスレイトール、４％（ｗ／ｖ）Ｃｈａｐｓ、５％（ｖ／ｖ）グリコール、２％（ｖ／ｖ）Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、ｐＨ３−１０］に溶解した。これを、ＭｉｃｒｏＲｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にアプライし、４℃、１Ｗ定電力で２．５時間電気泳動を行った。電気泳動後、各画分から２００μｌのタンパク質溶液を回収し（１０画分）、１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅを５μｌ加えて３７℃、１０分間インキュベート後、等量の２０％ＴＣＡ（trichloroacetic acid）を加えた。２０，０００×ｇ、１０分間室温にて遠心分離後、沈殿に５００μｌのアセトンを加えて懸濁し、２０，０００×ｇ、２℃、１０分間遠心分離し、上清を慎重に除去して沈殿を得た。この沈殿を風乾して、５０μｌの溶解バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ４０、２ｍＭ  ＤＴＴ］を加え、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Cosmo Bio）にて超音波処理を行ってタンパク質を溶解させ、ロトフォアサンプルを調製した。このロトフォアサンプルを基質に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。
２μｇのｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリン、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および１００ｎｇのＣａＭＫＫを含むリン酸化反応液２０μｌで温度３０℃で３０分反応させてリン酸化した。次いで、前記ロトフォアサンプル（３μｌ）を、２００ｎｇのリン酸化したｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を用い、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリンを含むリン酸化反応液１０μｌで、温度３０℃、３０分反応させ、前記サンプルをリン酸化した。また、２００ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を用い、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌで、温度３０℃、３０分反応させ、前記サンプルをリン酸化した。各反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。結果を図９に示す。図９Ａは、オートラジオグラフィーの結果であり、図９ＢはＣＢＢ染色の結果である。ＣＢＢは前記ロトフォアサンプル３μｌ分をアプライした結果である。ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）とｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）とは、共に塩基性のフラクション（フラクション８、９、１０）の基質を好み、そのリン酸化バンドパターンに大きな違いは観察されなかった。なお、図９Ａにおいて、＊は、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドである。ただし、リン酸化されたＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のバンドに、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）の自己リン酸化バンドが含まれるかは不明である。
【００５９】
（実施例８）
凍結融解が活性に及ぼす影響を評価した。
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ＰＫＡ触媒サブユニット（サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ  触媒サブユニット、ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、以降ＰＫＡｃと称する。）を−８０℃で３０分凍らせ、氷上で融解を４回繰り返した。
０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに２５０ｎｇのＭＢＰおよび２５ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）または下記により予め調製したＰＫＡｃを添加し、温度３０℃で３０分反応させてＭＢＰをリン酸化した。反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。結果を図１０に示す。凍結融解に対する安定性を評価したところ、凍結融解を４回繰り返し行ってもミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する基質リン酸化活性はほとんど変わらなかった。
【００６０】
ＰＫＡｃは、ラット由来のＰＫＡｃ（以下、ｒＰＫＡｃと称する）を用いて以下により調製した。
発現ベクターｐＥＴ−ｒＰＫＡｃを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを３ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌し、３７℃で１６ｈ振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮な１００ｍｌのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）に植菌した。本培養は３７℃で６時間培養した。培養液をｚＣａＭＫＩδと同様に精製し、ＰＫＡｃとした。
【００６１】
（実施例９）
熱に対する安定性を評価するため３０℃または４０℃で０〜１２０分インキュベートしたｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）および実施例８で得たＰＫＡｃを用いてＭＢＰに対するリン酸化活性を比較した。
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）、ＰＫＡｃを３０℃、４０℃で０〜２時間静置した。０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに２５０ｎｇのＭＢＰおよび２５ｎｇのｚＣａＭＫＩδ−２９９またはＰＫＡｃとを添加し、温度３０℃で３０分反応させてＭＢＰをリン酸化した。反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。結果を図１１に示す。
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の活性は３０℃、４０℃でプレインキュベートしてもキナーゼ活性に大きな変化は見られなかった。一方、ＰＫＡｃは４０℃でプレインキュベートすることにより活性が著しく低下した。
【００６２】
（実施例１０）
ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）および実施例８で調製したＰＫＡｃについて、内在性基質に対する特異性をより詳細に評価するため、実施例７と同様にしてＭｉｃｒｏＲｏｔｏｆｏｒにより分画したゼブラフィッシュ脳抽出液を基質にｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。
実施例７で調製したロトフォアサンプル３μｌに、２００ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）もしくはＰＫＡｃ、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌを加え、温度３０℃、３０分反応させた。反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。結果を図１２に示す。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、塩基性のフラクション（フラクション８、９、１０）の基質を好むのに対し、ＰＫＡｃは中性のフラクション（フラクション２、３、４、５、６）の基質を好む傾向があった。
【００６３】
（実施例１１）
実施例１で製造したｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）について、実施例１１−１から実施例１１−４において、培養条件、リン酸化、脱リン酸化等を検討した。
【００６４】
（実施例１１−１）
実施例１において、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を製造するための本培養条件を、２５℃で２４時間に加えて、１８℃６時間、２５℃１２時間で行った。各培養液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後ＣＢＢ染色した。図１３（Ａ）に結果を示す。１８℃６時間の培養物では１本のバンドが観察され、２５℃１２時間の培養物では更に上方に１本のバンドが出現し２本のバンドが観察され、２５℃２４時間の培養物では前記上方のバンドを主成分とする２本のバンドが観察された。培養温度および培養時間依存的にバンドがシフトしていることが観察された。なお、１８℃６時間の培養物で出現したバンドの分子量は、約４７ｋＤａである。
【００６５】
（実施例１１−２）
実施例１１−１で得た上記各培養物３５０μｇに、５０μｇのλホスファターゼ（λＰＰａｓｅ）を添加し、温度３０℃３０分反応させ、各培養液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。また、λホスファターゼ処理しない培養物についても同様に操作した。ＣＢＢ染色した結果を図１３（Ｂ）に示す。各培養物について、λホスファターゼの有無で比較すると、２５℃２４時間の培養物はλホスファターゼによってバンドが下方にシフトし、このシフトは培養温度および培養時間に対応して低減した。図１３（Ａ）の結果と加味すると、大腸菌による培養によって経時的にｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）がリン酸化されることが推定された。
【００６６】
（実施例１１−３）
下記により、基質タンパク質にリン酸基を付加できず、自己リン酸化能もないＣａＭＫＩδ（ＫＤ）を用いて、Ｎ末端からアミノ酸第２９９のポリペプチドＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）を調製した。
実施例１と同様に操作して形質転換体を調製し、培養温度２５℃で２４時間培養した。この培養液には、Ｎ末端からアミノ酸第２９９のポリペプチドＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）が含まれている。この培養液および実施例１のｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）の培養液の各１０μｌを、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。また、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに２５０ｎｇのマウス由来ＭＢＰおよび２５ｎｇのＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）またはｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を添加し、温度３０℃で３０分反応させてＭＢＰをリン酸化した。ＣＢＢ染色とオートラジオグラフィーの結果を図１３（Ｃ）に示す。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）には、２本のバンド（ｉ）と（ｉｉ）とが観察され、上方のバンド（ｉ）が主成分であった。一方、ＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）では１本のバンド（ｉｉ）のみが観察され、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）に観察されるバンドの下方にシフトしたバンドとほぼ同じ分子量と推定される。また、オートラジオグラフィーの結果より、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）はＭＢＰをリン酸化できるが、ＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）はＭＢＰのリン酸化能を有しないものであった。
【００６７】
なお、ＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）の調製は、以下によった。
ＥＳＴ  ｄａｔａｂａｓｅ中からＣａＭＫＩδ−ＷＴの全塩基配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＣ１６０６３２）を選択し、Ｎ末端からアミノ酸第２９９までのＣａＭＫＩδ（ＫＤ）由来ＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）を調製した。
【００６８】
テンプレートとして予め調製したｐＥＴＣａＭＫＩδを用いた。実施例１と同様に操作して発現ベクターｐＥＴ−ＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）を構築し、それぞれＢＬ２１（ＤＥ３）に遺伝子導入、および培養してＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）を製造した。
【００６９】
なお、ｐＥＴＣａＭＫＩδ（１−２９９、ＫＤ）の調製に使用したプライマーは、以下の通りである。なお、下線部が変異個所であり、５４番目のリジンがアラニンに置換されている。
センスプライマー：5'−GCATGCATCCCTAAAAAAGCTCTGAAG−3'（配列番号９） 、
アンチセンスプライマー：5'−CACAGCGTACATCTTTCCCGTGG−3（配列番号１０） '
【００７０】
（実施例１１−４）
実施例１により、大腸菌培養により製造したｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）３５０μｇに、５０μｇのλホスファターゼ（λＰＰａｓｅ）を添加し、温度３０℃で３０分反応させた。次いで、λＰＰａｓｅ処理したサンプルをＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ４０）で平衡化しておいたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(ｉＢＡ)１００μｌに加え、４℃で２時間反応させ、Ｎ末端にストレプタクチンタグが、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加した。７，５００×ｇで１０秒遠心し、上清を除去したのち、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを上記のｂｕｆｆｅｒ  １ｍｌで５回洗浄した。次に溶出ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）を２００μｌ加え１０分間静置し、タンパクを溶出した。７，５００×ｇで１０秒遠心し、上清を回収したのち、Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ４０、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で透析を行った。さらに、０．１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むリン酸化反応液１０μｌに１００ｎｇのウシ由来ＭＢＰおよび２０ｎｇのｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を添加し、温度３０℃で３０分反応させてＭＢＰをリン酸化した。反応液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにより検出した。また、ホスファターゼ処理しないｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を用いて同様に処理した。更に、ウエスタンブロッティングを行い、Ｎ末端にストレプタクチンタグを、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を検出した。結果を図１３（Ｄ）に示す。なお、２９９−Ｓｔｒ／Ｈｉｓは、Ｎ末端にストレプタクチンタグを、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を意味する。図１３（Ｄ）に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）はホスファターゼ処理によってＭＢＰリン酸化能が消失した。これにより、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、大腸菌培養のいずれかの工程で、リン酸化され、これにより基質タンパク質へのリン酸化能を獲得したことが示唆された。
【００７１】
（実施例１２）
実施例１および実施例２で得た２．５μｇのｚＣａＭＫＩδ（１-２９９）とｒＣａＭＫＩα（１−２９４）とを、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭのカルモジュリン、１２５ｎｇのＣａＭＫＫおよび０．１ｍＭのＡＴＰを含むリン酸化反応液中（最終液量１０μｌ）で温度３０℃で３０分反応させて、ｚＣａＭＫＩδ（１-２９９）とｒＣａＭＫＩα（１−２９４）をリン酸化した。次いで、各リン酸化物をＣａＭＫＫによる活性化ループ内のＴｈｒのリン酸化を検出できる抗リン酸化ＣａＭＫＩ抗体（Santa Cruz製、商品名「p-CaMKI Antibody (Thr 177)）にウエスタンブロッティングおよびＣＢＢで検出した。結果を図１４に示す。
【００７２】
図１４に示すように、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）とｒＣａＭＫＩα（１−２９４）は、活性化ループ内のＴｈｒがＣａＭＫＫによってリン酸化されていた。また、ＣａＭＫＫによるリン酸化は、ＣＢＢ染色の結果においてバンドのシフトアップとして検出された。このことは、大腸菌の培養によって調製されたｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）やｒＣａＭＫＩα（１−２９４）の活性化ループ内のＴｈｒは培養工程においてリン酸化を受けていないことを意味する。図１３（Ｄ）の結果に示すように、ホスファターゼ処理によってｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）のＭＢＰに対するリン酸化能が消失していることを勘案すると、ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は大腸菌の培養工程において、ＣａＭＫＫによるリン酸化以外のアミノ酸がリン酸化されていることが示唆された。
【００７３】
（比較例１）
実施例１においてｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）を調製したのに準じ、以下に記載する方法でｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）のＮ末端からアミノ酸第３２７までのポリペプチド(以下、ｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）と称する。)を調製した。実施例５と同様に操作して、Ｃａ２＋／ＣａＭおよびＣａＭＫＫの有無によるＭＢＰに対するリン酸化能を評価した。また、ｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）およびｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）についても同様に操作した。結果を図１５に示す。ｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）は、自己阻害領域およびカルモジュリン結合ドメインを有する。ｚＣａＭＫＩδ（１−２９９）は、Ｃａ２＋／ＣａＭ、ＣａＭＫＫ非存在下でも基質（ＭＢＰ）をリン酸化したが、ｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）はＣａＭＫＫ非存在下では基質（ＭＢＰ）に対するリン酸化活性がなかった。少なくとも、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉの一次構造を示すポリペプチドのＣ末端側のカルモジュリン結合ドメインを欠損することが、基質に対するリン酸化能の発現に必須であることが判明した。
【００７４】
ｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）の調製は以下によった。
ｐＥＴｚＣａＭＫＩδ（ＷＴ）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはタカラバイオ社製のPrimeSTAR DNA polymeraseを用い、プログラムは９６℃、２分（９６℃１０秒、６０℃１０秒、７２℃９０秒）×３０、７２℃７分で増幅した。増幅産物を電気泳動後、ゲルから精製し（フナコシ社製Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩＩ  ｋｉｔを使用）、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。引き続き、ｐＥＴ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ  ｓｉｔｅに組み込んで発現ベクターｐＥＴｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）を構築した。なお、ｐＥＴｚＣａＭＫＩδ（１−３２７）の調製に使用したプライマーは、以下の通りである。センスプライマーの下線部はNheIサイトを示し、アンチセンスプライマーの下線部はXhoIサイトを示す。
センスプライマー：5'-AAAGCTAGCATGGCTCGGGAGAACGGAGA−3'（配列番号１１） 、
アンチセンスプライマー：5'−TTTCTCGAGGCCCAACTGCAGTCTCCTCATG−3'（配列番号１２） 
【００７５】
(結果）
実施例から、本発明のカルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドは、リン酸化酵素Ｉと同様の基質特異性を発揮し、ＣＲＥＢ（cyclic AMP-responsive element-binding protein）やＭＬＣ（myosin light chain）、ヒストン、ゼブラフィッシュ胚抽出液などをリン酸化することができた。一方、カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉと相違して、カルモジュリンおよびＣａＭＫＫ非依存的にリン酸化能を発揮できた。カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチドは、大腸菌発現系で製造でき、しかも可溶性画分に多量に発現するため、精製が容易である。リン酸化活性が高く、かつ耐熱性にも優れ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験系における良好なリン酸化試薬としての利用が期待できる。
【図１】
2017201937.tif 000002
【図２】
2017201937.tif 000003
【図３】
2017201937.tif 000004
【図４】
2017201937.tif 000005
【図５】
2017201937.tif 000006
【図６】
2017201937.tif 000007
【図７】
2017201937.tif 000008
【図８】
2017201937.tif 000009
【図９】
2017201937.tif 000010
【図１０】
2017201937.tif 000011
【図１１】
2017201937.tif 000012
【図１２】
2017201937.tif 000013
【図１３】
2017201937.tif 000014
【図１４】
2017201937.tif 000015
【図１５】
2017201937.tif 000016
【図１６】
2017201937.tif 000017
【図１７】
2017201937.tif 000018
【図１８】
2017201937.tif 000019
【配列表】
2017201937000001.app