(57)【要約】【課題】糖尿病の検査方法を提供することを課題とする。【解決手段】被験者から採取された試料に含まれる腸内細菌叢全体の細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を対象として、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって末端標識制限酵素断片を得ること、及び、前記Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比に基づいて、１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定すること、を含む糖尿病の検査方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された試料に含まれる腸内細菌叢全体の細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を対象として、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって末端標識制限酵素断片を得ること、及び、
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比に基づいて、１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定すること、
を含む糖尿病の検査方法。
【請求項２】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、ＢｓｌＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｓｐＩ及びＡｌｕＩからなる群から選択される少なくとも１つの制限酵素を使用して末端標識制限酵素断片を得ることを含む、請求項１に記載の糖尿病の検査方法。
【請求項３】
前記試料が糞便である、請求項１又は請求項２に記載の糖尿病の検査方法。
【請求項４】
前記判定が、データマイニング法によって生成された決定木に従って被験者を分類することを含み、ここで前記データマイニング法は、１型糖尿病であるか、２型糖尿病であるか、又は１型糖尿病でも２型糖尿病でもないかを目的変数とし、かつ、前記末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比を説明変数として行われる、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の糖尿病の検査方法。
【請求項５】
前記データマイニング法がＣ＆ＲＴ法である、請求項４に記載の糖尿病の検査方法。
【請求項６】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号１に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＢｓｌＩにより切断することを含むものであって、前記判定が、以下に示される末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１３）のうち少なくとも一つを含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項７】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、請求項６に記載の条件（１）〜（１３）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１３）に示す通り定められている、請求項６に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項８】
以下の（４）、（７）又は（９）のうち少なくとも１つを含む、請求項７に記載の糖尿病の検査方法。
（４）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項９】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号１に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＨａｅＩＩＩにより切断することを含むものであって、前記判定が、以下に示される末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１１）のうち少なくとも一つを含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（８）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（９）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１０】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、請求項９に記載の条件（１）〜（１１）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１０）に示す通り定められている、請求項９に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（８）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（９）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１１】
以下の（２）、（６）又は（８）のうち少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の糖尿病の検査方法。
（２）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１２】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号３に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＭｓｐＩにより切断することを含むものであって、前記判定が、以下に示される末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１２）のうち少なくとも一つを含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（１０）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１３】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、請求項１２に記載の条件（１）〜（１２）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１２）に示す通り定められている、請求項１２に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（１０）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１４】
以下の（１）、（６）、（７）又は（１１）のうち少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（１１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
【請求項１５】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号３に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＡｌｕＩにより切断することを含むものであって、前記判定が、以下に示される末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１０）のうち少なくとも一つを含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
（９）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
（１０）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
【請求項１６】
前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、請求項１５に記載の条件（１）〜（１０）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１０）に示す通り定められている、請求項１５に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が０．４０５以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１以上である場合に、健常人であると判定する。
（９）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４以上である場合に、健常人であると判定する。
（１０）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７以上である場合に、健常人であると判定する。
【請求項１７】
以下の（３）、（５）又は（８）のうち少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の糖尿病の検査方法。
（３）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１以上である場合に、健常人であると判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は罹患率の高いｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅである。糖尿病であると診断するためには、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上である場合を除き、７５ｇ経口糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）及びヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）を検査する必要がある。ＨｂＡ１Ｃは末梢血を用いた検査が可能であり患者への負担は比較的少ないが、貧血等により検査値が影響を受けるという問題点がある。一方、７５ｇＯＧＴＴは検査に２時間を要し、簡便な検査ではなく再現性も十分に高いとはいえない。また、７５ｇＯＧＴＴは検査に２時間を要するために、二次検査を指示されても医療機関を受診しない者も多く、早期の治療介入を阻んでいる。
糖尿病のスクリーニングのための検査としては、空腹時血糖値及び／又はＨｂＡ１Ｃが検査されることが多い。しかし、空腹時血糖値が基準値を超えない場合であっても、７５ｇＯＧＴＴでは基準値を超え糖尿病であると診断される場合もあり、空腹時血糖値はスクリーニングのための検査としては充分とはいえない。また、ＨｂＡ１Ｃと空腹時血糖値とを組み合わせても糖尿病を検出できない場合もある。   
【０００３】
１型糖尿病と２型糖尿病との鑑別診断は、臨床経過及び病態、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（抗ＧＡＤ抗体）等の膵自己抗体の有無を総合的に判断して行われている。抗ＧＡＤ抗体は１型糖尿病の診断マーカーとして重要であるが、１型糖尿病患者において必ずしも陽性を示すとは限らず、また、抗ＧＡＤ抗体が基準値以下である１型糖尿病患者も存在する。そのため、１型糖尿病と２型糖尿病との鑑別に苦慮する場合が少なくない。
【０００４】
近年、腸内細菌叢が様々な疾患により変化することが明らかになり、具体的な菌種や菌属と疾患との関連についての研究が進められている。糖尿病との関連においては、糖尿病モデル動物の糖尿病の発症と関連する可能性がある腸内細菌が同定されている（特許文献１）。しかし、ヒトの腸内細菌叢にはおよそ１５００種の腸内細菌が存在するといわれているが、これらのうち、菌種が同定されているのは約３００種に過ぎない。未同定の菌種については、そのゲノムを解読しても菌種を同定することは現時点ではできない。未同定の菌種が糖尿病と関わっているか否かについても報告されておらず、数多く存在する未同定の菌種と糖尿病との関連は不明である。
糖尿病と腸内細菌叢との関連について探索し、新たな検査方法が提供されれば、既存の検査方法に代わる検査、若しくは、既存の検査方法を補う検査になり得ると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再公表特許公報第２０１３−１４６３１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖尿病は罹患率が高い重要な疾患であるにも関わらず、糖尿病の診断のためには７５ｇＯＧＴＴなどの時間がかかる検査を要する場合がある。そのため、簡便かつ侵襲性が低い新たな検査が望まれている。本発明は、１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定する、簡便かつ侵襲性が低い新たな糖尿病の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞  被験者から採取された試料に含まれる腸内細菌叢全体の細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を対象として、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって末端標識制限酵素断片を得ること、及び、前記Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比に基づいて、１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定すること、を含む糖尿病の検査方法。
＜２＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、ＢｓｌＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｓｐＩ及びＡｌｕＩからなる群から選択される少なくとも１つの制限酵素を使用して末端標識制限酵素断片を得ることを含む、＜１＞に記載の糖尿病の検査方法。
＜３＞  前記試料が糞便である、＜１＞又は＜２＞に記載の糖尿病の検査方法。
＜４＞  前記判定が、データマイニング法によって生成された決定木に従って被験者を分類することを含み、ここで前記データマイニング法は、１型糖尿病であるか、２型糖尿病であるか、又は１型糖尿病でも２型糖尿病でもないかを目的変数とし、かつ、前記末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比を説明変数として行われる、＜１＞〜＜３＞のいずれか一つに記載の糖尿病の検査方法。
＜５＞  前記データマイニング法がＣ＆ＲＴ法である、＜４＞に記載の糖尿病の検査方法。
【０００８】
＜６＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号１に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＢｓｌＩにより切断することを含むものであって、前記判定が、以下に示される末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１３）のうち少なくとも一つを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜７＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、＜６＞に記載の条件（１）〜（１３）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１３）に示す通り定められている、＜６＞に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１３）塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜８＞  ＜６＞又は＜７＞に記載の糖尿病の検査方法であって、＜６＞又は＜７＞に記載の条件（１）〜（１３）をいずれか２つ以上含む、糖尿病の検査方法。
【０００９】
＜９＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号１に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＨａｅＩＩＩにより切断することを含むものであって、前記判定が以下に示される、末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１１）のうち少なくとも一つを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（８）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（９）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜１０＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、請求項９に記載の条件（１）〜（１１）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１０）に示す通り定められている、＜９＞に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（８）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（９）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１０）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜１１＞  ＜９＞又は＜１０＞に記載の糖尿病の検査方法であって、＜９＞又は＜１０＞に記載の条件（１）〜（１１）をいずれか２つ以上含む、糖尿病の検査方法。
【００１０】
＜１２＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号３に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＭｓｐＩにより切断することを含むものであって、前記判定が以下に示される、末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１２）のうち少なくとも一つを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（１０）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜１３＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が配列番号２に示されるリバースプライマーを使用するものであって、＜１２＞に記載の条件（１）〜（１２）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１２）に示す通り定められている、＜１２＞に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２以上である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（９）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（１０）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１１）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
（１２）塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定する。
＜１４＞  ＜１２＞又は＜１３＞に記載の糖尿病の検査方法であって、＜１２＞又は＜１３＞に記載の条件（１）〜（１２）をいずれか２つ以上含む、糖尿病の検査方法。
【００１１】
＜１５＞  前記Ｔ−ＲＦＬＰ法が、配列番号３に示されるフォワードプライマーを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物をＡｌｕＩにより切断することを含むものであって、前記判定が以下に示される、末端標識制限酵素断片の総量に対する特定の塩基長を有する末端標識制限酵素断片の存在比の条件（１）〜（１０）のうち少なくとも一つを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
（９）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
（１０）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が所定のしきい値以上である場合に、健常人であると判定する。
＜１６＞  ＜１５＞に記載の条件（１）〜（１０）の所定のしきい値が、それぞれ以下の（１）〜（１０）に示す通り定められている、＜１５＞に記載の糖尿病の検査方法。
（１）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（２）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（３）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（４）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７未満である場合に、１型糖尿病であると判定する。
（５）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（６）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が０．４０５以上である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（７）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９未満である場合に、２型糖尿病であると判定する。
（８）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１以上である場合に、健常人であると判定する。
（９）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４以上である場合に、健常人であると判定する。
（１０）塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７以上である場合に、健常人であると判定する。
＜１７＞  ＜１５＞又は＜１６＞に記載の糖尿病の検査方法であって、＜１５＞又は＜１６＞に記載の条件（１）〜（１０）をいずれか２つ以上含む、糖尿病の検査方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便かつ侵襲性が低い、新たな１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定する糖尿病の検査方法を提供することができる。この検査方法により受診者の負担を軽減することができ、受診率の向上も見込まれる。
また、本発明によれば、未同定の細菌を含む腸内細菌叢全体の解析により、新たな機序の糖尿病の検査方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｔ−ＲＦＬＰ法の結果の一例を示す。
【図２】ＢｓｌＩを用いた本発明の一実施形態にかかる糖尿病の検査方法における、決定木の例を示す。
【図３】ＨａｅＩＩＩを用いた本発明の一実施形態にかかる糖尿病の検査方法における、決定木の例を示す。
【図４】ＭｓｐＩを用いた本発明の一実施形態にかかる糖尿病の検査方法における、決定木の例を示す。
【図５】ＡｌｕＩを用いた本発明の一実施形態にかかる糖尿病の検査方法における、決定木の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明の検査方法は、被験者から採取された試料に含まれる腸内細菌叢全体の細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を対象として、Ｔ−ＲＦＬＰ法を実施すること、及び、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の断片長及び存在比に基づいて、１型糖尿病の有無及び／又は２型糖尿病の有無を判定すること、を含む検査方法である。
【００１５】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において組成物中のある成分の量について言及する場合、組成物中に当該成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に別途定義しない限り、当該量は、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において、「腸内細菌叢全体の細菌」は、被験者の腸内細菌叢に含まれる個々の細菌ではなく、腸内細菌叢に含まれる細菌の集団を意味する。
【００１６】
＜腸内細菌叢全体の細菌の採取＞
糞便に含まれる細菌は腸内細菌叢全体の細菌の種類及び量を反映しているため、腸内細菌叢の解析には一般的に糞便が用いられる。したがって、被験者の糞便の一部を採取することにより、腸内細菌叢全体の細菌を採取することができる。糞便に代えて被験者の腸の内容物を採取して試料としてもよい。
採取した糞便等の試料は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液などに懸濁してＴ−ＲＦＬＰ法の実施まで保管してもよい。
【００１７】
＜核酸の抽出＞
細菌からの核酸の抽出は、ビーズ・フェノール法、塩化ベンジル法などの従来知られた方法により行うことができる。例えば、核酸抽出を阻害する細菌の細胞壁にダメージを与えた後に、エタノールやイソプロパノール等のアルコールを用いて核酸を沈殿させればよい。細菌の細胞壁にダメージを与える方法の例としては、酵素により細胞壁を溶解する方法、激しく振動させて菌体を破砕する方法、ホモジナイザーを用いて菌体を破砕する方法、が挙げられる。激しく振動させて菌体を破砕する方法において、激しく振動させる際にガラスビーズ、ジルコニアビーズ等を用いればより効率良く菌体を破砕することができる。採取した糞便は、核酸を抽出する前に水や緩衝液等に懸濁し遠心分離することにより洗浄してもよい。
細菌からの核酸の抽出は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ（登録商標、キアゲン社）が挙げられる。また、公知の文献に記載の方法により行ってもよい（Appl Environ Microbiol 69 : 1251-1262, 2003など）。
抽出した核酸は、さらに７０％エタノールを用いた沈殿を行うなどの方法によって、洗浄及び／又は精製してもよい。また、核酸抽出の過程や核酸抽出の前後において、熱処理などの核酸増幅の阻害を防止するための処理を行ってもよい。
【００１８】
＜末端標識制限酵素断片長多型（Ｔ−ＲＦＬＰ）法＞
１６ＳリボゾームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子を対象としたＴ−ＲＦＬＰ法は、一般に以下の（１）〜（３）を含む。しかし、他の工程を含むことに何ら制限はない。（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の全細菌に共通な配列を対象として、標識したプライマーを使用して核酸増幅を行う。（２）増幅産物の末端を制限酵素で切断する。（３）キャピラリー電気泳動装置などを用いて電気泳動して末端標識断片の断片長及び存在比を測定する。
Ｔ−ＲＦＬＰ法は公知の方法であり、Kobayashi T.et al., Biosci Microbiota Food Health. 2013 ;32 (4) :pp129-37やNagashima K. et al., Appl Environ Microbiol. 2003,  69, 1251-1262.などを参照して行うこともできる。
【００１９】
（１）核酸の増幅
核酸の増幅方法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。
【００２０】
以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本発明は、この例に制限されない。
【００２１】
まず、鋳型核酸とフォワードプライマー及びリバースプライマーとを含むＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。  
【００２２】
核酸の増幅に用いるプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）は、細菌種によらず細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅できるプライマーセットが好ましい。当業者は、公知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列を基に適切なプライマーセットを設計することができる。細菌種によらず共通の塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域に結合するプライマーは、当分野ではユニバーサルプライマーとして公知である。したがって、当業者はこれらのユニバーサルプライマーの中から適切なフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択し、核酸増幅を行いＴ−ＲＬＦＰ法に用いることができる。
【００２３】
このようなプライマーセットとしては、以下に示す表１に示すものが特に好ましい。表１中、「名称」は当分野で通常用いられているユニバーサルプライマーの名称である。例えば、制限酵素としてＢｓｌＩ又はＨａｅＩＩＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行う場合には、５１６ｆ（配列番号１）と１５１０ｒ（配列番号２）とを組み合わせて用いることが好ましく、制限酵素としてＭｓｐＩ又はＡｌｕＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行う場合には、２７ｆ（配列番号３）と１５１０ｒとを組み合わせて用いることが好ましい。２７ｆに代えて３５ｆ（配列番号４）を用いることも好ましい。３５ｆを用いた場合には、Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られる制限酵素末端断片の断片長は、２７ｆを用いた場合よりも１０ｂｐ短くなる。
フォワードプライマー２７ｆ、３５ｆ又は５１６ｆのそれぞれに組み合わせるリバースプライマーとしては、２７ｆ、３５ｆ又は５１６ｆのそれぞれより下流側（３’側）の位置の相補鎖側に結合するリバースプライマーであればいずれでもよい。例えば、９２６ｒ（５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ−３’）（配列番号５）、 １４０６ｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ−３’）（配列番号６）などが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２４】
【表１】
2017201894.tif 000003
【００２５】
核酸の増幅に用いるフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方は標識されたものを用いる。なお、フォワードプライマーが標識されていることが好ましい。標識物質の種類は特に制限されず、公知の標識を使用すればよい。例えば、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及び６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５（６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの蛍光色素が挙げられる。
【００２６】
プライマーを標識する方法はこの分野で周知である。具体的には、標識物質をプライマーに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させればよい。蛍光標識された塩基が、プライマーの５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することが、蛍光標識の効率及び核酸増幅効率の観点から好ましく、５’末端に存在することが特に好ましい。蛍光標識物質はオリゴヌクレオチドに直接結合させてもよいし、リンカー等を介して間接的に結合させてもよい。
蛍光標識物質のオリゴヌクレオチドへの結合は、Ｍｅｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＯｌｉＧｒｏ（登録商標）等の市販のラベリングキットを用いて行うこともできる。
【００２７】
ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
【００２８】
核酸の増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
【００２９】
ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。
溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。
【００３０】
ＰＣＲは、通常、（ｉ）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、（ｉｉ）プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、４５℃〜６０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜１２０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、１０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。
例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。
【００３１】
（２）制限酵素による切断
Ｔ−ＲＦＬＰ法に使用する制限酵素は、増幅した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を切断できるものであれば、特に限定されない。当業者は、使用したプライマーの配列から、１６SｒＲＮＡの遺伝子配列が既知の細菌の増幅産物の配列を予測することができる。さらに、増幅産物の配列から、増幅産物に含まれる制限酵素認識部位を知ることができる。
Ｔ−ＲＦＬＰ法に使用する制限酵素としては、例えば、ＢｓｌＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｓｐＩ、ＡｌｕＩ、ＨｈａＩ、ＭｂｏｌＩ、ＭａｅＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＲｓａＩなどが挙げられる。ＢｓｌＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｓｐＩ及びＡｌｕＩが特に好ましい。
制限酵素処理は公知の方法によって行うことができる。適当なユニット数の制限酵素及び緩衝液を含む反応液と、増幅した核酸とを混合し、使用する制限酵素に適した温度及び時間でインキュベーションすればよい。
【００３２】
（３）末端標識断片の断片長及び存在比の測定
Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の断片長及び存在比を測定する。  末端標識断片の断片長は当業者に公知の方法によって測定することができる。例えば、制限酵素により切断した試料を、塩基長スタンダードと共にキャピラリー電気泳動し、泳動距離を基に塩基長スタンダードから作成した標準曲線から求めてもよい。末端標識断片の存在比は当業者に公知の方法によって測定することができる。例えば、末端標識断片の標識のシグナル強度から把握してもよい。末端標識断片の断片長及び存在比は、例えば、ＤＮＡシークエンサーのキャピラリー電気泳動装置を用いて末端標識断片の標識を検出することにより測定してもよい。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０ｘ１を用いてキャピラリー電気泳動を行い、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ｖｅｒ．４．０を用いて結果を解析し、末端標識断片の断片長、各断片長のピーク面積、蛍光強度を得ることができる。
【００３３】
４つの試料を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０ｘ１を用いてキャピラリー電気泳動を行った結果を、得られた末端標識断片の断片長と蛍光強度の関係として示した例を図１に示す。
ある末端標識断片の存在比は、図１のようなキャピラリー電気泳動によって得られた結果から、末端標識断片の断片長とその標識シグナルの強度を用いて、目的とする末端標識断片に相当するピークの面積及び全てのピークの面積の合計から、以下の式を用いて算出することができる。
目的とする末端標識断片の存在比（％）＝目的とする末端標識断片に相当するピーク面積／総ピーク面積×１００
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ｖｅｒ．４．０は、ピーク面積の計算に好適に用いられる。
【００３４】
＜データマイニング法による決定木の生成＞
本発明の一実施形態において、データマイニング法によって生成された決定木に従って被験者を分類する決定木を生成する場合には、データマイニング法のアルゴリズムは特に制限されない。アルゴリズムとしては、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅｓ（Ｃ＆ＲＴ）法、Ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＣＨＡＩＤ）法、Ｑｕｉｃｋ，  Ｕｎｂｉａｓｅｄ，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｒｅｅ（ＱＵＥＳＴ）法、Ｃ５．０法が広く用いられており、好ましい方法として例示される。
Ｃ＆ＲＴ法は特に好ましいアルゴリズムである。Ｃ＆ＲＴ法による決定木の生成について以下に記載する。
Ｃ＆ＲＴ法は、目的変数に対してできるだけ等質なデータサブセットを作成すべく、対象を２つに分別することにより決定木を構築する方法である。目的変数を診断情報（１型糖尿病患者、２型糖尿病患者、健常人（１型糖尿病でも２型糖尿病でもない者））とし、説明変数を制限酵素断片の断片長及び存在比とする。
具体的には、データの不純度（Ｇｉｎｉ係数）を算出し、元のデータ（親ノードのデータ）を２つのサブセット（子ノードのデータ）に分割するとき、子ノードの不純度が親ノードの不純度に対してどの程度改善されたかを示す改善度を分別作業の評価基準として構築していく。
そして、改善度が最大となるような分別点（分別変数及びその値）を再帰的に探索する過程を、停止規則を満たすまで反復する（日本国特許第５６４５７６１号）。
【００３５】
不純度ｇ（ｔ）および改善度ｆ（ｔ）は、以下のように算出される。
【００３６】
【数１】
2017201894.tif 000004
【００３７】
【数２】
2017201894.tif 000005
【００３８】
ただし、数式１および数式２において、
【００３９】
【数３】
2017201894.tif 000006
【００４０】
【数４】
2017201894.tif 000007
【００４１】
【数５】
2017201894.tif 000008
である。
【００４２】
ここで、π（ｊ）は、カテゴリｊの事前確率、Ｎｊ（ｔ）は、ノードｔにおけるカテゴリｊのケース数、Ｎｊは、ルートノードにおけるカテゴリｊのケース数である。また、ＰＬは、ノードｔにおいて１つ目の子ノードに送られるケースの割合であり、ＰＲは、ノードｔにおいて２つ目の子ノードに送られるケースの割合である。
Ｃ＆ＲＴ法においては、改善度ｆ（ｔ）が最大となるように分別する。すなわち、不純度が最も大きく減少するように分別する。
なお、Ｃ＆ＲＴ法による決定木の生成には、分岐の条件として上述したようにＧｉｎｉ係数を使用する他に、Ｔｗｏｉｎｇ、最小２乗偏差（ＬＳＤ）等を使用する方法を用いてもよい。
【００４３】
生成された決定木中の各ノードにおいて、下流側に子ノードを持たない、決定木の末端に位置する葉ノードは不純度が０であり、１型糖尿病患者、２型糖尿病患者又は健常人（１型糖尿病でも２型糖尿病でもない者）のいずれかのみが含まれるノードである（ただし、再帰的計算を中止した結果として末端に位置するノードは除く）。決定木の最も上流に位置する根ノードから１型糖尿病患者、２型糖尿病患者又は健常人のいずれかのみが含まれる葉ノードに至る経路を辿ることによって、当該葉ノードの臨床情報（１型糖尿病患者、２型糖尿病患者又は健常人）について判定することができる。ある被験者について根ノードから葉ノードへの経路を辿るためには、当該被験者のＴ−ＲＦＬＰ法の結果が、決定木において根ノードから当該葉ノードに至る分岐点に設定された条件を全て満たすことを確認すればよい。ある被験者について根ノードから葉ノードへの経路を辿る場合、根ノードから当該葉ノードに至る分岐点に設定された条件を全て満たせば、条件を適用する順序はいずれでもよい。
図２に示すＢｓｌＩを用いたＴ−ＲＦＬＰ法の結果から生成した決定木を例として具体的に説明する。ノード４は１型糖尿病患者のみが含まれる葉ノードであり、根ノードには全ての被験者が含まれる。根ノードに含まれる被験者は、腸内細菌叢全体に含まれる細菌をＢｓｌＩを用いて切断して得られた制限酵素断片の断片長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であるとき子ノードであるノード１に分類される。次に、ノード１に含まれる被験者は、断片長１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１未満である場合に１型糖尿病患者のみが含まれる葉ノード４に分類される。この結果から、ある被験者において、ＢｓｌＩを用いて切断された制限酵素断片の断片長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、かつ、断片長１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１未満である場合には、１型糖尿病であると判定することができることがわかる。
【００４４】
生成された決定木において、親ノードから子ノードへの分岐の条件は、末端標識制限酵素断片の断片長の断片長及び存在比の組み合わせである。このうち、末端標識制限酵素断片の断片長の存在比をしきい値と呼ぶ。決定木を生成する際に得られた各ノードにおいて子ノードへの分岐の条件となるしきい値の数値は、他の被験者についても所定のしきい値として適用することができる。決定木を生成して得た所定のしきい値を用いて、決定木を生成する際に対象とされた被験者以外の被験者について、１型糖尿病であるか、２型糖尿病であるか、又は、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないことを判定することができる。
また、末端標識制限酵素断片の断片長もまた、決定木を生成する際に対象とされた被験者以外の被験者について適用することができる。
【００４５】
根ノードから葉ノードへの経路は、１つを単独で用いてもよいし、他の経路と組み合わせて用いてもよい。例えば、１つの決定木において全ての葉ノードを用いる場合には、全ての被験者について１型糖尿病の有無及び２型糖尿病の有無を判定することができる。
【００４６】
決定木の生成には、説明変数として使用する末端標識制限酵素断片の断片長の存在比は、１種類の制限酵素を用いたＴ−ＲＦＬＰ法から得られたもののみを用いてもよいし、２種類の制限酵素を用いて別々に行ったＴ−ＲＦＬＰ法から得られた末端標識制限酵素断片の断片長の存在比を合わせて用いてもよい。
【００４７】
１種類の制限酵素によるＴ−ＲＦＬＰ法による末端標識制限酵素断片の断片長の存在比を用いて生成した決定木の特定の葉ノードと、別の種類の制限酵素によるＴ−ＲＦＬＰ法による末端標識制限酵素断片の断片長の存在比を用いて生成した決定木の特定の葉ノードによる判定とを組み合わせて用いてもよい。一方の判定はもう一方の判定を相補うことができる。また、判定に適用する葉ノードの数は特に制限されず、複数の根ルートから葉ノードに至る経路を用いてもよい。組み合わせに用いる複数の葉ノードは、１型糖尿病患者が含まれる葉ノード、２型糖尿病葉ノード、健常人が含まれる葉ノード、又はこれらの一部若しくは全てを含んでもよい。
【００４８】
[解析例]
以下、本発明を解析例により具体的に説明するが、本発明はこれらの解析例に限定されるものではない。
【００４９】
[解析例１]
＜被験者＞
発症５年以内の１型糖尿病患者１１名、２型糖尿病患者１１名、及び、１型糖尿病及び２型糖尿病ではないと診断された健常人３１名を被験者とした。
【００５０】
＜腸内細菌叢全体の細菌の採取及びＤＮＡ抽出＞
被験者の便を５００ｍｇ採取し９容量の滅菌蒸留水中に懸濁した。１０分間静置後、得られた懸濁液０．１ｍＬを０．９ｍＬの滅菌蒸留水に加え、１８０００×ｇで５分間遠心した。ペレットを１ｍＬの滅菌蒸留水で洗浄し、さらに遠心した後に、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を含む溶液２５０μＬに懸濁した。得られた懸濁液を０．６ｇのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）が入った試験管に移し、ビーズ粉砕機を用いて便を粉砕した。得られた懸濁液１００μＬにベンジルクロライド１５０μＬと１０％ドデシル硫酸ナトリウム５０μＬを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。続いて、３Ｍ酢酸ナトリウムを１５０μＬ加え、１５分間氷冷した後に、１８０００×ｇで１０分間遠心した。上層を回収し、等量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールでペレットを洗浄し、次いでＤＮＡペレットを乾燥し、１ｍＬ当たり５０μｇのＲＮａｓｅを含有するトリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μＬに溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いてＤＮＡを精製し、得られたＤＮＡを定法に従って定量した。
【００５１】
＜ＰＣＲ法＞
抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。１×ＰＣＲ緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰのヌクレオチド−３リン酸、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各０．１μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、及び、便から抽出したＤＮＡ１０ｎｇ、０．５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（株式会社キアゲン）を含むＰＣＲ反応液を調製した。フォワードプライマーとしてＦＡＭ（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）で標識したユニバーサルプライマー５１６ｆ（５’−ＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ−３’）、リバースプライマーとしてユニバーサルプライマー１５１０ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を使用した。ＰＣＲ反応液は１テスト当たり２０μＬ使用した。
ＰＣＲ法は、９５℃で１５分間処理した後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、及び、７２℃で１分間を１サイクルとして、３０サイクル繰り返し、続いて７２℃で１０分間の最終的な伸長反応を行った。
【００５２】
＜ＰＣＲ産物の精製及び制限酵素ＢｓｌＩ処理＞
２０μＬのＰＣＲ産物を、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＦＢフィルタープレート（メルク株式会社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に、１０μＬ当たり０．５ＵのＢｓｌＩ（商品名：Ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  ＢｓｌＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）を加え、３７℃で１０分間、制限酵素処理を行った。
【００５３】
＜Ｔ−ＲＦＬＰ法＞
制限酵素で切断処理を行ったＰＣＲ産物２μＬを、４倍希釈したＧｅｎｅＳｃａｎ２５００サイズスタンダード（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）０．５μＬ及び脱イオンホルムアミド１２μＬに混合し、９６℃で２分間変性処理を行い直ちに氷冷してキャピラリー電気泳動の試料とした。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１３０ｘ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）を用いて、インジュクション時間４０秒、泳動時間４０分でキャピラリー電気泳動を行い、ＨＥＸにより標識された制限酵素断片の末端の断片長及びピーク面積をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１３０ｘ１のＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ｖｅｒ．４．０ソフトウェアを用いて算出した。得られた結果の例を図１に示す。
【００５４】
＜データマイニング＞
Ｔ−ＲＦＬＰ法によって得られた末端標識制限酵素断片の断片長及びその存在比と、被験者の臨床情報（１型糖尿病、２型糖尿病又は１型糖尿病でも２型糖尿病でもない健常人）とを対応付け、Ｃ＆ＲＴ法によりデータマイニングを行って決定木を生成した。存在比は前述の通り算出することができる。
【００５５】
＜解析例１の結果＞
得られた決定木を図２に示す。１型糖尿病患者は、ノード４、ノード８、ノード１０、ノード１９及びノード２４に含まれた。２型糖尿病患者は、ノード１８及びノード２２に含まれた。健常人は、ノード１３、ノード１５、ノード２０、ノード１２及びノード１３に含まれた。
【００５６】
ノード４には１型糖尿病患者のみが含まれる。これは、制限酵素としてＢｓｌＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行い、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、断片長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１未満である場合に１型糖尿病であると判定できることを示す。以下同様に、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９未満である場合に（ノード８）、１型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０未満である場合に（ノード１０）、１型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１以上である場合に（ノード１９）、１型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８未満である場合に（ノード２４）、１型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２未満である場合に（ノード１６）、２型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００未満である場合に（ノード１８）、２型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１未満である場合に（ノード２２）、２型糖尿病であると判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１以上である場合に（ノード１３）、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６以上であり、塩基長が９６８ｂｐである断片の存在比が０．５６０以上であり、塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が３６．９９２以上である場合に（ノード１５）、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４未満であり、塩基長が３１７ｂｐである断片の存在比が１７．４０１未満である場合に（ノード２０）、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１以上であり、塩基長が１６８ｂｐである断片の存在比が３．０８１以上であり、塩基長が５０５ｂｐである断片の存在比が１．８５９以上であり、塩基長が３３２ｂｐである断片の存在比が６．２３１未満であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．１８１以上である場合に（ノード２１）、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す。塩基長が３６６ｂｐである断片の存在比が２．２８１未満であり、塩基長が７５４ｂｐである断片の存在比が１．２２６未満であり、塩基長が７４９ｂｐである断片の存在比が４．６４４以上であり、塩基長が６５０ｂｐである断片の存在比が０．３００以上であり、塩基長が１０６ｂｐである断片の存在比が０．７７８以上である場合に（ノード２３）、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す。
【００５７】
全ての１型糖尿病患者はノード４、ノード８、ノード１０、ノード１９、又は、ノード２４のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての１型糖尿病患者を１型糖尿病患者であると判定することが可能であった。全ての２型糖尿病患者はノード１８又はノード２２に含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての２型糖尿病患者を２型糖尿病患者であると判定することが可能であった。また、全ての健常人はノード１３、ノード１５、ノード２１、又は、ノード２３のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての健常人を健常人であると判定することが可能であった。
また、ノード１９に含まれる１型糖尿病患者は１１名中６名であり、図２に示す決定木において、根ノードからノード１９に至る経路のみによって感度５５％、特異度１００％の判定をすることができた。ノード１８に含まれる２型糖尿病患者は１１名中９名であり、図２に示す決定木において、根ノードからノード１８に至る経路のみによって感度８２％、特異度１００％の判定をすることができた。また、ノード１３に含まれる健常人は３１名中１９名であり、図２に示す決定木において、根ノードからノード１３に至る経路のみによって感度６１％、特異度１００％の判定をすることができた。
【００５８】
[解析例２〜４]
制限酵素として、ＨａｅＩＩＩ（商品名：Ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  ＨａｅＩＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）（解析例２）、ＭｓｐＩ（商品名：Ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  ＭｓｐＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）（解析例３）、又は、ＡｌｕＩ（商品名：Ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  ＡｌｕＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）（解析例４）を用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行った。制限酵素としてＨａｅＩＩＩを用いた場合には、解析例１と同じフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用した。制限酵素としてＭｓｐＩ又はＡｌｕＩを用いた場合には、フォワードプライマーとしてＦＡＭ（で標識したユニバーサルプライマー２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）、リバースプライマーとしてユニバーサルプライマー１５１０ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を使用した。
各制限酵素による増幅産物の処理条件は、解析例１と同様の条件で行った。
【００５９】
＜解析例２の結果＞
得られた決定木を図３に示す。１型糖尿病患者は、ノード１０、ノード１６及びノード１９に含まれた。２型糖尿病患者は、ノード８、ノード１５及びノード１８に含まれた。健常人は、ノード６、ノード７、ノード９、ノード１７及びノード２０に含まれた。
【００６０】
ノード１０には１型糖尿病患者のみが含まれる。これは、制限酵素としてＨａｅＩＩＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行い、塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す。以下同様に、塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１６）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８以上である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１９）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６未満である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード８）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０未満であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が２．６３６以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１５）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８未満である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１８）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード６）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１以上であり、塩基長が７９ｂｐである断片の存在比が０．８５６以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード７）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２以上であり、塩基長が３１５ｂｐである断片の存在比が７．９４１未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が０．１１４以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード９）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２５８以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード１７）。塩基長が８５ｂｐである断片の存在比が０．３９２未満であり、塩基長が１７７ｂｐである断片の存在比が４．０６７以上であり、塩基長が２３６ｂｐである断片の存在比が４．１４０以上であり、塩基長が２６５ｂｐである断片の存在比が３８．２７６未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．３２８未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード２０）。
【００６１】
全ての１型糖尿病患者は、ノード１０、ノード１６、又は、ノード１９のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての１型糖尿病患者を１型糖尿病患者であると判定することが可能であった。全ての２型糖尿病患者は、ノード８、ノード１５又はノード１８のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての２型糖尿病患者を２型糖尿病患者であると判定することが可能であった。また、全ての健常人はノード６、ノード７、ノード９、ノード１７、又は、ノード２０のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての健常人を健常人であると判定することが可能であった。
また、ノード１６に含まれる１型糖尿病患者は１１名中７名であり、図３に示す決定木において、根ノードからノード１６に至る経路のみによって感度６４％、特異度１００％の判定をすることができた。ノード１８に含まれる２型糖尿病患者は１１名中８名であり、図３に示す決定木において、根ノードからノード１８に至る経路のみによって感度７３％、特異度１００％の判定をすることができた。また、ノード７に含まれる健常人は３１名中２２名であり、図３に示す決定木において、根ノードからノード７に至る経路のみによって感度７１％、特異度１００％の判定をすることができた。
【００６２】
＜解析例３の結果＞
得られた決定木を図４に示す。１型糖尿病患者は、ノード９、ノード１４、ノード１６、ノード１８及びノード２０に含まれた。２型糖尿病患者は、ノード４、ノード１５、ノード１９及びノード２１に含まれた。健常人は、ノード６、ノード１７及びノード２２に含まれた。
【００６３】
ノード９には１型糖尿病患者のみが含まれる。これは、制限酵素としてＭｓｐＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行い、塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２以上である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す。以下同様に、塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１４）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１６）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１８）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード２０）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９未満である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード４）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０以上であり、塩基長が１２０ｂｐである断片の存在比が０．３１２未満であり、塩基長が８１ｂｐである断片の存在比が７．００９以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１５）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０未満であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．２６３以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１９）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード２１）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０未満であり、塩基長が４５７ｂｐである断片の存在比が１．６２０未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード６）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７以上であり、塩基長が３９０ｂｐである断片の存在比が０．７５０以上であり、塩基長が２００ｂｐである断片の存在比が０．５４２以上である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード１７）。塩基長が２９３ｂｐである断片の存在比が９．７４０以上であり、塩基長が１５０ｂｐである断片の存在比が３．８７９以上であり、塩基長が１９４ｂｐである断片の存在比が２．６１７未満であり、塩基長が８８ｂｐである断片の存在比が１．１７９以上であり、塩基長が４５ｂｐである断片の存在比が１．６８９未満である場合に、１型糖尿病でも２型糖尿病でもないと判定できることを示す（ノード２２）。
【００６４】
全ての１型糖尿病患者は、ノード９、ノード１４、ノード１６、ノード１８、又は、ノード２０のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての１型糖尿病患者を１型糖尿病患者であると判定することが可能であった。１１人のうち１０人の２型糖尿病患者は、ノード４、ノード１５、ノード１９、又は、ノード２１のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、２型糖尿病患者を２型糖尿病患者であると判定することが可能であった。また、全ての健常人はノード６、ノード１１、又は、ノード２２のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての健常人を健常人であると判定することが可能であった。
また、ノード９に含まれる１型糖尿病患者は１１名中５名であり、図４に示す決定木において、根ノードからノード９に至る経路のみによって感度４５％、特異度１００％の判定を行うことができた。ノード１５に含まれる２型糖尿病患者は１１名中５名であり、図４に示す決定木において、根ノードからノード１５に至る経路のみによって感度４５％、特異度１００％の判定をすることができた。また、ノード１７に含まれる健常人は３１名中２７名であり、図４に示す決定木において、根ノードからノード１７に至る経路のみによって感度８７％、特異度９６％の判定をすることができた。
【００６５】
＜解析例４の結果＞
得られた決定木を図５に示す。１型糖尿病患者は、ノード６、ノード１２、ノード１６及びノード１８に含まれた。２型糖尿病患者は、ノード５、ノード７及びノード１４に含まれた。健常人は、ノード１１、ノード１５及びノード１７に含まれた。
【００６６】
ノード６には１型糖尿病患者のみが含まれる。これは、制限酵素としてＡｌｕＩを用いてＴ−ＲＦＬＰ法を行い、塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す。以下同様に、塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１２）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１６）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８値以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７未満である場合に、１型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１８）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８未満であり、塩基長が５８ｂｐである断片の存在比が１．０６２以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード５）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が０．４０５以上である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード７）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９未満である場合に、２型糖尿病であると判定できることを示す（ノード１４）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１以上であり、塩基長が７６ｂｐである断片の存在比が４．１２１以上である場合に、健常人であると判定できることを示す（ノード１１）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２未満であり、塩基長が８３ｂｐである断片の存在比が９．７４４以上である場合に、健常人であると判定できることを示す（ノード１５）。塩基長が４４ｂｐである断片の存在比が９．０２８以上であり、塩基長が２１６ｂｐである断片の存在比が０．８６１未満であり、塩基長が４８７ｂｐである断片の存在比が０．７６２以上であり、塩基長が２０３ｂｐである断片の存在比が０．７４９以上であり、塩基長が８３０ｂｐである断片の存在比が０．３１７以上である場合に、健常人であると判定できることを示す（ノード１７）。
【００６７】
１型糖尿病患者１１人のうち１０人は、ノード６、ノード１２、ノード１６、又は、ノード１８のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、１型糖尿病患者を１型糖尿病患者であると判定することが可能であった。２型糖尿病患者１１人のうち９人は、ノード５、ノード７、又は、ノード１４のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、２型糖尿病患者を２型糖尿病患者であると判定することが可能であった。また、全ての健常人はノード１１、ノード１５、又は、ノード１７のいずれかに含まれ、決定木の根ノードからこれらのノードに至る経路を辿れば、全ての健常人を健常人であると判定することが可能であった。
また、ノード１６に含まれる１型糖尿病患者は１１名中５名であり、図５に示す決定木において、根ノードからノード１６に至る経路のみによって感度４５％、特異度１００％の判定を行うことができた。ノード５に含まれる２型糖尿病患者は１１名中５名であり、図５に示す決定木において、根ノードからノード５に至る経路のみによって感度４５％、特異度１００％の判定をすることができた。また、ノード１１に含まれる健常人は３１人中１９人であり、根ノードからノード１１に至る経路のみによって感度６１％、特異度１００％の判定をすることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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