(57)【要約】【課題】神経芽腫などの癌細胞を簡便かつ非侵襲に捕捉し、検出するための方法を提供すること。【解決手段】循環癌細胞を捕捉する方法であって、インビトロで、被検者から単離された血液由来の液体試料をマイクロチップに通過させてマイクロチップ内で前記液体試料に含まれる循環癌細胞を捕捉する工程を含み、前記マイクロチップは、内部に流体を通すことのできる流路、当該流路に液体を流入させるための流入口、当該流路を通過した液体を排出するための排出口、および当該流路上に担持された循環癌細胞を捕捉するための抗体を有し、前記工程は、マイクロチップを、排出口側を水中に浸し、流入口側は水面より上方に置いた状態で、流入口から試料をマイクロチップに導入して行うことを特徴とする、方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環癌細胞を捕捉する方法であって、
インビトロで、被検者から単離された血液由来の液体試料をマイクロチップに通過させてマイクロチップ内で前記液体試料に含まれる循環癌細胞を捕捉する工程を含み、
前記マイクロチップは、内部に流体を通すことのできる流路、当該流路に液体を流入させるための流入口、当該流路を通過した液体を排出するための排出口、および当該流路上に担持された循環癌細胞を捕捉するための抗体を有し、
前記工程は、マイクロチップを、排出口側を水中に浸し、流入口側は水面より上方に置いた状態で、流入口から試料をマイクロチップに導入して行うことを特徴とする、方法。
【請求項２】
循環癌細胞が神経芽腫由来の癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が抗CD47抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、捕捉された循環癌細胞を検出する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部に抗体を固定化したマイクロチップを用いて、被検者由来の試料中に存在する循環癌細胞を捕捉又は検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断においては、癌が疑われる初期の段階で直接癌の組織や臓器を解析することが難しく、簡便で非侵襲的に早期の検査を行うための手法が求められている。一方で、癌の組織から血液中に癌細胞が漏れ出ることがあり、このような血液中に循環する癌細胞を検出できれば癌の簡便な診断が可能になる。
循環癌細胞(CTC)を検出するための機器として、循環癌細胞(CTC)チップを利用した診断機器が知られている（特許文献１）。CTCチップは内部に腫瘍細胞特異的抗体を担持したマイクロチップで、血液試料を流路に流すことで循環癌細胞を捕捉し、評価することができる。しかしながら、従来法では、血液試料を流すのに精密なシリンジポンプが必要で、それによる精密かつ厳密な送液(注入、吸引)が必要であること、さらには、検体中の癌細胞や血液細胞が凝集塊を形成しないように持続的にサンプルを振盪保持する機器が必要であること、など問題点があり、実臨床への応用はなされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2013-029391号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、神経芽腫などの癌細胞を簡便かつ非侵襲に捕捉し、検出するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、被検者の末梢血由来の試料を、癌細胞を捕捉するための抗体を担持させたマイクロチップ（以下、CTCチップともいう）に供するに際し、マイクロチップの排出口側を水中に浸し、流入口側を水面より上方に置いた状態で、流入口から試料をマイクロチップに導入して抗体と反応させることにより、より簡便な検査で循環癌細胞が検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、循環癌細胞を捕捉する方法であって、
インビトロで、被検者から単離された血液由来の液体試料をマイクロチップに通過させてマイクロチップ内で前記液体試料に含まれる循環癌細胞を捕捉する工程を含み、
前記マイクロチップは、内部に流体を通すことのできる流路、当該流路に液体を流入させるための流入口、当該流路を通過した液体を排出するための排出口、および当該流路上に担持された循環癌細胞を捕捉するための抗体を有し、
前記工程は、マイクロチップを、排出口側を水中に浸し、流入口側は水面より上方に置いた状態で、流入口から試料をマイクロチップに導入して行うことを特徴とする、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、簡便、安価、短時間に、低侵襲で、神経芽腫などの難治性固形腫瘍患者のCTCを捕捉することが可能となる。すなわち、本発明は以下の利点を有する。
１）検査機器として検査開始までの準備が容易である。
２）チューブを使用する必要がないため不必要な試薬を使用しない。
３）マイクロチップ以外に無駄な流路がないことにより試料を少なくできるため検査時間短縮及び患者の負担軽減につながる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】CTCチップの一態様を示す図。（A）は第一の基板、（B）は第二の基板、（C）は完成図。
【図２】CTCチップの使用態様の例を示す図。
【図３】末梢血単核細胞（PBMC）試料にNB69腫瘍細胞を混合してCTCチップに供したときの結果を示す顕微鏡写真。
【図４】神経芽腫患者由来のPBMCをCTCチップに供したときの結果を示す顕微鏡写真。
【図５】神経芽腫患者由来のPBMCをCTCチップに供した後、PLS3抗体またはDAPIで染色した結果を示す顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明において、捕捉及び検出の対象となる循環癌細胞としては、血液中に循環し得る癌細胞であれば特に制限されないが、ヒトの癌細胞が好ましく、神経芽腫、肺癌、食道癌、胃癌、GIST、大腸癌、膵臓癌、乳癌などの難治性固形腫瘍などが例示される。
【００１０】
循環癌細胞を含む試料としては、被検者の血液由来の試料が使用できるが、末梢血単核細胞（PBMC）が好ましく用いられる。１回の測定に使用される試料の量は特に制限されないが、本発明の方法によれば、数十〜数百μL（具体的には、例えば５０〜３００μL）程度の少量の試料を用いて測定が可能である。
【００１１】
本発明において、使用されるマイクロチップは、その内部に、流体を通すことのできる流路と、該流路上に担持された循環癌細胞を捕捉するための抗体を有し、さらに、流路の第一の端に流路に液体を流入させるための流入口、流路の第二の端に流路を通過した液体を排出するための排出口を有するものであればよい。例えば、特開2013-029391号公報に開示されたようなものを使用することができる。
【００１２】
図１にマイクロチップの一態様を示す。
（C）が完成図であるが、このようなマイクロチップは例えば以下のようにして作製することができる。
まず、片面に流路となる溝１０２が掘られた第一の基板１０１を用意し、その流路部分に抗体を固定化するための担体となる柱状部材１０３を複数配置する。柱状部材１０３の表面には官能基が修飾されており、官能基を介して抗体を固定化させることができる。抗体は予め固定化されていてもよいし、使用直前に抗体溶液を流路に通過させて固定化してもよい。なお、抗体を固定化させるための部材は柱状に限定されず、さらには、抗体は直接流路上に固定化されていてもよい。流路のサイズは循環癌細胞を含む試料を流すのに適したサイズであれば特に制限されないが、例えば、幅１０〜５０ｍｍ、長さ３０〜１００ｍｍ、深さ５０〜２００μｍとすることができる。柱状部材は例えば直径５０〜２００μｍ、高さ５０〜２００μｍのものを流路内に適当な間隔（循環癌細胞を含む試料の流れを阻害しない程度）で複数設置することができる。流路内の液体が充填可能な部分の容積は好ましくは３０〜２００μLである。
【００１３】
次に、それぞれ流入口１０５および排出口１０６となる２つの穴（貫通孔）を有する第二の基板１０４を用意し、これを第一の基板１０１に対し、溝１０２が内側になるように重ねて密着させることで、マイクロチップ１００（CTCチップ）を作製することができる。
マイクロチップの素材は細胞が非特異吸着を起こさない素材でかつ透明で内部が観察でき
る素材が好ましく、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、PETなどのプラスチックやガラスなどの素材が挙げられる。
【００１４】
循環癌細胞を捕捉するための抗体としては、癌細胞に特異的なマーカータンパク質に対する抗体であることが好ましく、対象の循環癌細胞の種類によって適宜選択されるが、上皮細胞マーカーであるEpCAMに対する抗体、表面マーカーであるCD44に対する抗体、CD133に対する抗体、細胞表面受容体EGFRに対する抗体、ERBB2に対する抗体、ERBB3に対する抗体、固形組織マーカーPLS3に対する抗体などが例示されるが、捕捉対象が神経芽腫細胞である時は抗CD47抗体を用いることが好ましい。CD47はintegrin associated proteinとしても知られる膜貫通型タンパク質である。
抗体はポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。抗体は市販の抗体を使用することができるが、ハイブリドーマ法などにより作製して使用してもよい。また、マイクロチップに固定化する抗体は２種類以上でもよい。
【００１５】
マイクロチップへの試料の添加は例えば以下のようにして行うことができる。
図２に示すように、まず、水の入った容器を用意し、水中にマイクロチップの排出口側が浸るように（流入口側は水中に浸さず、水面より上方の大気中に位置させる）マイクロチップを傾けて配置する。水面に対するマイクロチップの設置角度は、例えば25〜60度である。また、容器内の水は生理食塩水や水系の緩衝液でもよい。
【００１６】
そして、流入口から試料をマイクロチップ内の流路に導入する。導入法としては、ピペット等で滴下する方法などが例示されるが、特に制限されない。
マイクロチップの排出口側を水中に入れることで、検体そのものの表面張力(毛細管現象)と、流入口部と排出口部の圧較差で、細胞を含む試料および試薬をほぼ一定の流速で流すことが可能であり、それにより試料中のCTCが安定的に捕捉できる。
【００１７】
試料をマイクロチップ内に導入し、流路を通過させたのちに、細胞等の非特異的な結合を除くために洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄操作は、例えば、リン酸バッファーなどの緩衝液を用い、１回以上行うことが好ましい。
【００１８】
捕捉した細胞の検出は、顕微鏡等を用いて目視で行ってもよいが、細胞染色試薬や癌細胞特異的抗体を用いて行うこともできる。その場合、試薬や抗体反応液を流入口から導入して検出反応を行えばよい。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の内容は以下に限定はされない。
【００２０】
まず、CTCチップは富山県工業技術センターから入手した。サイズ等は以下の通り。
縦76mm
横 26mm
流路（溝）の長さ: 40mm, 幅: 19mm, 深さ: 100μｍ
柱状部材 サイズ: 半径50μm、 高さ100μｍ
官能基の種類:エポキシ基
流入口の径1mm、排出口の径1mm
【００２１】
PBS緩衝液をCTCチップに通液し、CTCチップの流路内を平衡化した。
次に、抗CD47抗体（mouse anti-CD47 monoclonal抗体: Santa Cruz Biotechnology）を濃度20μg/mLとなるように100倍にPBSで希釈し、流路内に導入して、CTCチップ内の柱状部材の表面の官能基と反応させることにより固定化した。室温1時間反応させたのち、抗体
液をPBSで洗浄した。一方、コントロールとしてanti-mouse IgG抗体(Southern biotech)を20μg/mLでCTCチップ内に固定化(4℃ overnightまたは室温3時間)した。
【００２２】
まず、健常者血液より得られたPBMC 250μLを用意し、それにヒト神経芽腫細胞株NB69（RIKEN cell bank）を2000個加えて測定試料とした。
図２のように、水を入れた容器を用意し、CTCチップの排出口側を水中に浸し、流入口側は水面よりも上に位置するように傾けて保持し、その状態で、ピペットで上記測定試料を流入口内に滴下(10μLずつ)することにより、CTCチップの流路内に導入した。
その後、PBSを400μL流して洗浄を行ったのち、顕微鏡で内部の観察を行った。結果を図３に示す。
図３に示すように、抗CD47抗体を固定化した担体（柱状部材）の周りに細胞の付着が見られ、抗CD47抗体による癌細胞の捕捉が可能であることを確認した。また、癌細胞の捕捉率は約30%であった。
【００２３】
次に、神経芽腫患児の血液より得られたPBMC 100μLを用意し、それを測定試料とした。
図２のように、水を入れた容器を用意し、CTCチップの排出口側を水中に浸し、流入口側は水面よりも上に位置するように傾けて保持し、その状態で、ピペットで上記測定試料を流入口内に滴下(10μLずつ)することにより、CTCチップの流路内に導入した。
その後、PBSを400μL流して洗浄を行ったのち、顕微鏡で内部の観察を行った。結果を図４に示す。
図４に示すように、抗CD47抗体を固定化した担体（柱状部材）の周りに細胞の付着が見られ、抗CD47抗体による、患者のPBMC中に含まれる癌細胞（CTC）の捕捉が可能であることを確認した。
【００２４】
さらに、図４で捕捉された細胞に関し、抗PLS3抗体（Santa Cruz Biotechnology）またはDAPIで染色を行い、細胞の特定を行った。染色の手順は以下の通り。
1. PBS 50μL x8回で血液細胞をwash後に、4%PFA 10μL x10回で細胞を固定、室温10分
2. PBS 50μL x4回 wash
3. PLS3抗体 (100倍希釈：抗体2μL + PBS198μL)を作成し全量をチップへ。室温20分
4. PBS 50μL x4回wash
5. anti-goat 594 antibody (Molecular Probe)を500倍希釈（1μL + 499μL)で作成し10μLずつ200μLをCTCチップへ。室温遮光  20分
6. PBS 50μL x4回wash
7. 核染色液DAPI容液を10μLずつ100μLをCTCチップへ
8. 蛍光顕微鏡で観察
【００２５】
結果を図５に示す。その結果、捕捉された細胞は癌細胞マーカーであるPLS3陽性であり、CTCが捕捉できたことが確認できた。
【００２６】
以上より、本発明の方法により、CTCチップの排出口側を水中に置き、表面張力及び圧較差で試料や試薬をCTCチップ内に流す手法により、シリンジポンプなしに短時間（従来法約90分→10分）でのCTC補足が可能となった。また治具も使用しないため準備も容易で過剰な回路（チューブ）が必要ないことから、試薬、抗体、細胞の節約（従来法約1.5 mL→50 μL）も可能となった。
【符号の説明】
【００２７】
１００・・・マイクロチップ（CTCチップ）、１０１・・・第一の基板、１０２・・・流路（溝）、１０３・・・柱状部材、１０４・・・第二の基板、１０５・・・流入口、１０６・・・排出口、１０７・・・容器、１０８・・・水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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