(57)【要約】【課題】イムノクロマトにおいてより高感度な診断が可能となる発色粒子の提供。【解決手段】平均粒子径が１０〜８５０ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、かつ、反応活性基を有するモノマーが２〜１０００個の繰り返し単位でグラフト重合したポリマーが結合した着色セルロース微粒子であって、該反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の分散度が８未満であり、かつ、該着色セルロース微粒子の真球度が１０以下である、前記着色セルロース微粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が１０〜８５０ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、かつ、反応活性基を有するモノマーが２〜１０００個の繰り返し単位でグラフト重合したポリマーが結合した着色セルロース微粒子であって、該反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の分散度が８未満であり、かつ、該着色セルロース微粒子の真球度が１０以下である、前記着色セルロース微粒子。
【請求項２】
前記反応活性基の導入量が、前記着色セルロース微粒子１ｇ当たり０．５０〜３０．０ｍｍｏｌである、請求項１に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項３】
前記反応活性基が、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基、及びスルホン酸基からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項４】
前記着色セルロース微粒子の重量の１０〜８０ｗｔ％が着色成分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項５】
前記着色成分が染料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項６】
前記反応活性基にリガンドが共有結合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフトされた着色セルロース微粒子、並びにそれを用いた診断薬キット及びインビトロ診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野や食品分野において、簡便かつ迅速に疾患や病原菌等の有無が判断できる技術が望まれている。これらのニーズに応えるべく様々な技術が開発されており、現在ではインフルエンザなどの病原体感染の有無、妊娠の有無、癌マーカーや心筋マーカーの有無、食品中のアレルギー物質や食中毒の原因となる物質の有無など様々な検査を簡便かつ迅速に行うことが可能となってきている。これらの技術としては、イムノクロマト測定法、蛍光イムノクロマト測定法、酵素免疫測定法、ラテックス凝集測定法、化学発光測定法など多くの測定方法が開発されている。その中でも、目視で判断できるイムノクロマト測定法は、特別な装置や専門的な知識が不要であり、誰でも簡便に迅速な診断が可能であるという特徴から、幅広く使用されている。例えば、イムノクロマト測定法の一種である妊娠検査薬などは、一般薬局で入手可能であることから消費者にとって汎用性の高いものとなっている。
【０００３】
イムノクロマト測定法（以下、イムノクロマトという。）は、抗原抗体反応を利用したものであり、サンドウィッチ法や競合法という方法がある。測定方法としては、検出物をメンブレンに対して水平方向に展開させるラテラルフロー式と、垂直方向に展開させるフロースルー式に大別される。簡便性の観点から、ラテラルフロー式でサンドウィッチ法を用いて、抗原を抗体で捕捉する方法が多く使用されている。測定手順は以下のような方法である。
（１）ニトロセルロース等のメンブレンに、検出対象となる抗原等と反応する抗体を特定部位（テストライン）に固定化する。
（２）発色粒子と呼ばれる標識物質に、検出対象と反応する抗体を担持した検出試薬を作製し、コンジュゲートパット上に塗布後乾燥させ、前記メンブレンとサンプルパットを組み合わせてイムノクロマトキットを作製する。
（３）抗原の有無を検査したい検体又はそれを希釈した検体を混合した展開液をサンプルパット上に滴下し、テストラインの発色の有無を目視（あるいは、簡易的なイムノクロマトリーダー）で観察し、抗原の有無を判断する。
一般に、目視で判定する場合の多くは、検査対象となる抗原（又は抗体、たんぱく質やＤＮＡ）の有無のみを判断する定性分析として使用されている。
【０００４】
イムノクロマトのニーズの一つに分析感度の向上が挙げられる。分析感度とは、検査対象となる抗原の検出限界濃度のことである。検出限界濃度が低い、つまり検体中の抗原濃度がごく微量でも測定できることを高感度という。例えば、インフルエンザ等の感染症を検査する場合、イムノクロマトの分析感度が向上すれば、抗原（ウィルス）量が少ない感染初期でも感染の有無を判定できるので、早期治療に伴う感染拡大の防止が可能となる。
【０００５】
目視での高感度化を達成するために、抗体を担持する発色粒子の開発が進められている。現在、主にイムノクロマトに使用されている発色粒子としては、金コロイドなどの金属粒子や、ポリスチレンなどの高分子ラテックスなどが挙げられる。例えば、以下の特許文献１には、金コロイドを用いたｈＣＧ系のイムノクロマトについて報告されている。ここで、抗体と発色粒子の吸着方法としては、物理吸着型と化学結合型がある。特許文献１では、物理吸着型の金コロイドを使用している。物理吸着型とは、抗体と発色粒子が疎水性相互作用などの物理的な相互作用により吸着しているものである。他方、化学結合型とは、発色粒子に反応活性基であるカルボキシル基などを導入し、抗体中のアミノ基などと共有結合を形成させるものである。一般的に、化学結合型粒子の方が物理吸着型のものより高感度になると言われている。例えば、以下の特許文献２には、金コロイドにスペーサーを介して反応活性基を導入し、化学結合型粒子とすることで、物理吸着型の金コロイドよりｈＣＧ系において、分析感度が１．５〜２倍向上することが述べられている。また、以下の特許文献３には、物理吸着型および化学結合型のラテックスを使用したインフルエンザウィルスの検出方法が述べられている。さらに、以下の特許文献４には、金コロイドやラテックス粒子よりも粒径が大きくかつ、発色強度が高い着色セルロース微粒子を発色粒子として用いることで、ｈＣＧ系において、金コロイドやラテックス粒子より分析感度が向上することが示されている。更に、着色セルロース微粒子にアミノ基やカルボキシル基などの反応活性基を導入し化学結合型とすると、物理吸着型の着色セルロース微粒子より分析感度が向上することも報告されている。
しかしながら、前記いずれの方法においても、蛍光イムノクロマトや化学発光法の感度には到達しておらず、更なる高感度化のための微粒子開発が未だ望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１９７０３８号公報
【特許文献２】特開２００８−１３９２２６号公報
【特許文献３】特開２００７−３１５８８３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１１／０６２１５７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前記した技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、イムノクロマトにおいて、より高感度な診断が可能となる発色粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、反応活性基の導入量が多い着色セルロース微粒子を、イムノクロマトの発色粒子として使用したところ、分析感度が向上することを見出し、本発明に至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
【０００９】
［１］平均粒子径が１０〜８５０ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、かつ、反応活性基を有するモノマーが２〜１０００個の繰り返し単位でグラフト重合したポリマーが結合した着色セルロース微粒子であって、該反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の分散度が８未満であり、かつ、該着色セルロース微粒子の真球度が１０以下である、前記着色セルロース微粒子。
［２］前記反応活性基の導入量が、前記着色セルロース微粒子１ｇ当たり０．５０〜３０．０ｍｍｏｌである、前記［１］に記載の着色セルロース微粒子。
［３］前記反応活性基が、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基、及びスルホン酸基からなる群から選ばれる、前記［１］又は［２］に記載の着色セルロース微粒子。
［４］前記着色セルロース微粒子の重量の１０〜８０ｗｔ％が着色成分である、前記［１］〜［３］いずれかに記載の着色セルロース微粒子。
［５］前記着色成分が染料である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の着色セルロース微粒子。
［６］前記反応活性基にリガンドが共有結合されている、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の着色セルロース微粒子。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の着色セルロース微粒子を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る着色セルロース微粒子をイムノクロマトに使用することで、分析感度を顕著に向上することができる。本発明に係る着色セルロース微粒子は、反応活性基を有するモノマーを微粒子からグラフト重合したことで、反応活性基導入量が非常に多くなっているため、抗体などと効率よく結合可能である。その結果、抗体の結合している向きや抗体の結合量などの調整ができるようになるため、イムノクロマトの分析感度が向上する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施形態について詳細に説明する。
前記したように、特許文献４には、反応活性基が導入された、粒径が大きくかつ発色強度が高い着色セルロース微粒子をイムノクロマトに使用することで、分析感度が向上すること開示されているが、目標とする感度には到達していない。本発明者らは、着色セルロース微粒子に反応活性基を多数導入することで、抗体などが効率よく微粒子と結合するのではないかと考えた。かかる仮説の下、実験を重ね、反応活性基を有するモノマーを着色セルロース微粒子にグラフト重合することで、反応活性基の導入量が多い着色セルロース微粒子の開発に成功した。開発したグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用すると、狙い通り抗体などと微粒子の結合効率などが向上したせいか、分析感度を向上させることに成功した。
【００１２】
本発明の１の実施形態は、平均粒子径が１０〜８５０ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、かつ、反応活性基を有するモノマーが２〜１０００個の繰り返し単位でグラフト重合したポリマーが結合した着色セルロース微粒子であって、該反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の分散度が８未満であり、かつ、該着色セルロース微粒子の真球度が１０以下である、前記着色セルロース微粒子である。
【００１３】
本実施形態における着色セルロース微粒子の「平均粒子径」とは、動的光散乱法で測定した場合の体積平均メジアン径を指し、平均粒子径が１０〜８５０ｎｍの範囲にある。平均粒子径がこの範囲にあると、微粒子の表面積が大きいためにイムノクロマトとして用いる場合にテストラインがより濃くなる、すなわち分析感度が高くなる。平均粒子径が１０ｎｍ未満であると、表面積が小さくなるため、微粒子一個あたりの発色強度が低下し、その結果、分析感度が下がる場合や微粒子の凝集が起こる場合がある。以上の点から粒子径の下限は４０ｎｍが好ましく、より好ましくは８０ｎｍである。微粒子径が８５０ｎｍより大きくなるとメンブレンの孔に詰まってしまう。その結果、診断時間が長くなってしまったり、検査後にメンブレン表面が着色し検査結果の判断に悪影響を及ぼしたり、分析感度が悪くなったりする場合がある。以上の点から粒子径の上限は７００ｎｍが好ましく、より好ましくは６００ｎｍである。尚、ここでいう平均粒子径は、あくまで平均値であり、粒子径分布の一部が上記範囲から外れていても構わない。
【００１４】
粒子径の評価に体積平均を用いる理由は、イムノクロマトにおいてあまりに大きな微粒子はメンブレン中に詰まってしまうが、体積平均であれば、大きい微粒子ほど影響が大きくなるので大きい粒子が僅かに存在するだけでもその影響が反映されるためである。粒子径の評価方法としては体積平均以外にも、数平均、面積平均など様々な表し方がある。当然ながら表し方が異なると粒子径の値も変わってくるが、本実施形態においては体積平均を採用する。
【００１５】
本実施形態における「発色強度」とは、微粒子の色の濃さを定義した値であり、１．０〜１０．０の範囲にある。この値が大きいほど微粒子の色の濃さが濃く、イムノクロマトとして用いる場合に分析感度が高い。もちろん値が大きければ大きいほどよく、色の濃い染料を利用する、染色回数を増やす、スペーサーとして何らかの化合物を介して連結させる、微粒子の非晶領域を増やし染料が入り込みやすくする、微粒子を多孔性にして染料が入り込みやすくする、などの方法を採用することができる。しかしながら、経済性を考慮すると上限は７．０が好ましく、より好ましくは５．０である。また、値が小さいほどイムノクロマトとして用いた場合に分析感度が低下するため、下限は１．５が好ましく、より好ましくは２．０である。
【００１６】
発色強度の測定方法は、濃度既知の発色粒子の純水分散液を調製し、光路長１０ｍｍとして、４００〜８００ｎｍの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、得られた吸光度曲線のピーク値（ＡＢＳ）を測定し、得られた値を発色粒子の重量パーセントで割り返し、発色粒子０．０１重量％辺りの吸光度に換算した値として定義する。例えば、調製した発色粒子の濃度が０．００４５％であり、吸光度曲線のピーク値が１．０であった場合、その発色強度は（１×０．０１）÷０．００４５＝２．２となる。
【００１７】
本実施形態において微粒子の色の濃さの測定に積分球を用いた可視吸光度測定を行う理由として、液体に分散した状態の微粒子の色の濃さを最も正確に測定できるためである。微粒子の色の濃さを測る方法としては、微粒子を乾燥させて得られた固体を測色計などで測定する方法もあるが、このような方法では微粒子の色の濃さを正確に測定できない。例えば、金属コロイドなどは粒子径に応じて色調や最大波長が異なり、乾燥した凝集状態は液体に分散した状態の色の濃さを正確に反映できない。また、液体中に同じ粒子濃度で分散させても凝集が発生すると色の濃さは薄くなる。更に、可視吸光度測定を行う際に積分球を用いる理由は、粒子自体の散乱による影響を除去するためである。通常の可視吸光度測定は透過光を測定する方法であり、入射光に対し着色成分による吸収だけでなく微粒子自体の散乱による影響も反映されてしまう。例えば、イムノクロマトに一般的に使われる金コロイドは、粒子径が４０ｎｍ〜６０ｎｍ、時には１００ｎｍのものが用いられる場合もあるがいずれも粒子径が小さいため散乱光の影響はほとんどない。それに対しラテックス粒子は粒子径が大きく明らかに散乱光の影響が大きい。上記のような理由から、本実施形態では、粒子径や粒子素材が違う場合に粒子自体の色の濃さをより正確に反映するために、積分球を用いた可視吸光度測定を採用する。
【００１８】
本実施形態における「反応活性基」は、特に限定されるものではなく、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アルデヒド基、チオール基などを用いることができる。抗体などとの結合性および、結合させる際の作業性という点から、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基、及びスルホン酸基からなる群から選ばれるものが特に好ましい。また、導入した反応活性基を利用して更に他の置換基を導入することも可能である。例えば、アミノ基を導入したのちに、導入したアミノ基からマレイミド基を導入することなどが可能である。反応活性基が導入されたか否かは、赤外分光法、元素分析、蛍光発光分析などにより確認することができる。
【００１９】
本実施形態における「反応活性基を有するモノマー」は、特に限定されるものでなく、アクリル酸、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、マレイン酸、マレイン酸ナトリウム、β-カルボキシエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ターシャリーブチルアミノエチルメタクリレート、ビニルスルホン酸などが挙げられる。
【００２０】
本実施形態における「反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位」の数は、反応活性基を有するモノマーがいくつ重合したかを示すものである。例えば、モノマーが１０個重合している場合、繰り返し単位の数は１０である。本実施形態においては、かかる繰り返し単位は２〜１０００個である。反応活性基の繰り返し単位が１個であると、微粒子表面に存在する染料層に反応活性基が埋もれてしまい、抗体との反応性が悪くなるおそれがある。そのため、下限は５個が好ましく、より好ましくは１０個である。また、繰り返し単位が１０００個より多いと、グラフト重合により生成したポリマー鎖が長くなるため、ポリマー鎖同士が絡まりあり、微粒子が凝集してしまう場合がある。微粒子が凝集してしまうと、イムノクロマトに使用した際にメンブレン中に微粒子が詰まりやすくなり、展開不良となるおそれがある。そのため、上限は８００個が好ましく、より好ましくは５００個である。反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の測定方法は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いる。特許文献４でも反応活性基を導入しているが、繰り返し単位で表現すると、すべて１個である。反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位が多いと、特許文献４と比較して反応活性基がより多く導入されているため、抗体などとの結合効率が格段に向上し、感度向上が見込める。
【００２１】
また、本実施形態においては、反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位の分散度は、８．０未満である。分散度とは、グラフト重合により生成したポリマー鎖ごとの反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位のばらつきのことであり、分散度が1に近いほどばらつきが小さいということである。そのため、イムノクロマトの再現性の観点から分散度はなるべく1に近いほうが好ましい。分散度が８以上であると、反応活性基を有するモノマー繰り返し単位の数が微粒子中でばらつくため、抗体吸着量の再現性や、イムノクロマトの再現性が著しく低下してしまうおそれがある。そのため、上限は６．０が好ましく、より好ましくは４．０である。
【００２２】
本実施形態における「真球度」とは、微粒子の形状を表した値で、着色セルロース微粒子の短径と長径の比（長径／短径）から算出する。本実施形態においては、真球度は１０以下である。真球度が１０を超える棒状、繊維状または網目状のものは、着色セルロ−ス微粒子としては好ましくはない。この長径／短径が、１０を超えると、イムノクロマトの発色粒子に使用したときに、展開せず、目詰まりを起こし、診断時間が長くなってしまうおそれがあり、また、分析感度も低下してしまうおそれもある。着色セルロース微粒子１００個の長径／短径の平均値の上限は、５．０が好ましい、より好ましくは３．０、更に好ましくは２．０である。この値が小さいほど着色セルロース微粒子の形状は真球形に近くなる。
【００２３】
本実施形態における「真球度の算出方法」としては、電子顕微鏡画像に現される微粒子の投影面積を測定し、その面積と同面積を持つ円の円周長と、電子顕微鏡画像に現される微粒子の実周長の比によって算出できる。この測定方法では各微粒子を平面で見たにすぎないが、少なくとも１００個以上の微粒子を測定した平均値を用いることで観察方向のばらつきを考慮に入れることができ、結果として微粒子を立体的に見た真球の度合いを示すことができる。
【００２４】
本実施形態における「反応活性基の導入量」とは、着色セルロース微粒子１ｇあたりに導入された反応活性基の量のことである。かかる導入量は０．５０〜３０．０ｍｍｏｌ／ｇが好ましい。算出方法としては、酸・塩基の中和滴定や蛍光発光分析を用いる。導入量が０．５０ｍｍｏｌ／ｇ未満では、抗体との結合効率が低下し、分析感度が低下するおそれがある。そのため、下限は０．８０ｍｍｏｌ／ｇが好ましく、より好ましくは、１．０ｍｍｏｌ／ｇである。また、導入量が３０．０ｍｍｏｌ／ｇを超えると微粒子１個あたりの重量が重くなるため、微粒子１個あたりの発色強度が低下する。発色強度が低下すると、イムノクロマトの発色粒子に使用した際に分析感度が低下するおそれがあるため、上限は２０ｍｍｏｌ／ｇが好ましく、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｇである。
【００２５】
本実施形態における「着色セルロース微粒子の着色成分の割合」は、着色セルロース微粒子の全重量対する着色成分の割合を指す。例えば、着色セルロース微粒子１．０ｇが０．２ｇのセルロースと０．８ｇの着色成分から構成される場合、着色成分の割合は８０ｗｔ％である。着色セルロース微粒子の着色成分の割合は１０〜８０ｗｔ％が好ましい。この範囲にあるとイムノクロマトとして用いる場合に分析感度が高い。着色成分の割合が１０ｗｔ％未満の場合は、十分な発色強度を有することができず、イムノクロマトとして用いる場合に分析感度が低くなる。この観点から下限は２０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは３０ｗｔ％である。着色成分の割合が８０ｗｔ％を超えても特に問題はないが、経済的な面から考えると上限は６５ｗｔ％が好ましく、より好ましくは７０ｗｔ％である。
【００２６】
本実施形態における「着色セルロース微粒子の着色成分の割合の算出方法」としては、着色前後の重量変化から算出することができる。また、重量変化からの算出が困難な場合は、着色成分を微粒子から分離する操作を行い着色成分又は微粒子を単離し算出することができる。例えば、セルロース微粒子を反応性染料で染色した場合、酸やアルカリなどでセルロースと染料の共有結合を切断し、遠心分離によりセルロース微粒子を回収することで算出することができる。また、セルラーゼを用いセルロースだけを分解することで算出することもできる。同様に「着色セルロース微粒子のセルロースの割合」も算出することができる。
【００２７】
本実施形態おいて、着色成分に染料を用いる場合、「染料の種類」は特に限定されない。反応染料、直接染料、含金染料、酸性染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料、蛍光染料などの染料を用いることができる。もちろん任意の染料を組み合わせても構わない。中でもセルロースの水酸基と共有結合で結合する反応性染料が、大量に染料を保持できる点や安定性の面から特に好ましい。
【００２８】
本実施形態は、前記反応活性基にリガンドが共有結合されたものであることができる。「リガンド」とは、特定の検査対象物質に選択的かつ特異的に結合する性質をもつ物質である。その種類は特に限定されるものではないが、例えば、抗体、抗原、酵素、遺伝子、ホルモン、核酸、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、前記着色セルロース微粒子を含むイムノクロマト診断キットである。「イムノクロマト診断キット」とは、様々な検体中の検査対象物質の有無を簡便に検出するものである。当該診断キットの種類としては、ラテラルフロー式やフロースルー式がある。発色粒子やサンプルパッドを用いるものであれば特に限定されないが、好ましくはラテラルフロー式である。また、ラテラルフロー式の中でも、ディップスティックタイプとカセットタイプがあるが、それらのタイプは特に限定されない。診断キットの構成は、特に限定されるものではなく、当該分野で一般的に用いられる構成であればいずれでも構わない。発色粒子以外の部材の種類は、当該分野で用いられるものであれば特に限定されず、例えば、サンプルパッド、コンジュゲートパッド（抗体感作発色粒子を含む）、ニトロセルロース等のメンブレン、吸収パッド、及び台紙が挙げられる。また、必要に応じそれら部材を一部省いていてもかまわない。
【００３０】
本実施形態のイムノクロマト診断キットを使用する「診断方法」とは、イムノクロマト診断キットを用いて行われる様々な診断を指す。診断対象は特に限定されるものではなく、人用、動物用、食品用、植物用、その他環境検査など様々な診断対象の検査に用いることができる。一般的な診断の手順では、検査対象から検体試料を採取し、必要であればそれを抽出やろ過などの前処理を行い、サンプルパッドに滴下し、検査開始から所定時間待ち、検査対象物質の有無によって異なる発色より診断結果を判断する。もちろんこの手順に限定されず、同じような手順、原理の診断にも用いることができる。好ましいのは、検体試料を予めろ過しておくことで余分な異物や夾雑物を除去でき、それによりより一層の診断時間の短縮化や、診断精度の向上が期待できる。
【００３１】
本実施形態のイムノクロマト診断キットで診断できる対象は特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ−２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１−ＡＣ、α１−Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ−１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、その他の各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、各種アレルゲン、各種残留農薬、各種有害物。
【００３２】
以下、セルロース微粒子の作製方法、セルロース微粒子の着色方法、着色セルロース微粒子へのグラフト方法、イムノクロマト診断キットの作製方法などを例示するが、本発明はそれらの例示によって何ら限定されるべきではない。
【００３３】
〔セルロース微粒子の作製方法〕
セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。良溶媒としては、公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては、有機溶媒＋水＋アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、予め調製しておいた銅アンモニアセルロ−ス溶液を加えて凝固を行う。さらに硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロ−ス微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは再生に用いた酸の残留により酸性であり、さらに中和で発生したアンモニウム塩などの不純物を含んでいるため、セルロース微粒子と媒体からなるセルロース分散液へと精製する操作が必要となる。精製操作として遠心分離−デカンテーション−分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。得られたセルロース微粒子分散液中のセルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集することもあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いることができる。
【００３４】
〔セルロース微粒子の着色方法〕
得られたセルロース微粒子の水分散体に対し、硫酸ナトリウム、反応性染料を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後にアルカリとして炭酸ナトリウムを加え染色を開始する。所定時間経過後に目的の着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーはアルカリ性であり、さらに硫酸ナトリウム、未反応の染料などを含んでいるため、着色セルロース微粒子と媒体からなる着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、着色セルロース微粒子分散液を得る。得られた着色セルロース微粒子分散液中の着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いることができる。
【００３５】
〔着色セルロース微粒子へのグラフト方法〕
反応活性基を有するモノマーをグラフト重合する場合、「グラフト重合する方法」は特に限定されるものではなく、放射線グラフト重合、可逆的不可開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、ニトロキシドを介したラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、過酸化水素などを用いたセルロース開裂重合、ラジカル分散重合などを用いることができる。中でも、染料などの着色成分の退色や変色の防止、微粒子の粒子径や形状変化の防止などの観点から、温和な条件で反応が進行するラジカル分散重合が好ましい。以下ラジカル分散重合によるグラフト方法を示すが、もちろんこの方法に限定されるべきではない。
【００３６】
〔イムノクロマト診断キットの作製方法〕
所定の濃度に調整したグラフト化着色セルロース微粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、グラフト化着色セルロース微粒子に抗体を結合させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、着色セルロース微粒子のブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。カゼインは、グラフト化着色セルロース微粒子のブロッキングに特に好ましい。抗体結合＆ブロッキング後のグラフト化着色セルロース微粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した微粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した微粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着＆ブロッキングを行った微粒子を所定の濃度含有した分散液を調整する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をガラス繊維製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調製する。また、必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のメンブレン、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有するシートに固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。また、特に記載のない全ての操作は温度２３℃、相対湿度５５％ＲＨの環境下で行った。
【００３８】
〔着色微粒子の平均粒子径測定〕
装置としては日機装社製のナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ−ＥＸ１５０（動的光散乱式）を用いた。測定サンプルとして、着色微粒子が０．０１重量％、純水９９．９９重量％のサンプルを用いた。測定条件としては積算回数を３０回、１測定辺りの測定時間を３０秒とし、体積平均の粒子径分布を用いそのメジアン径を平均粒子径とした。
【００３９】
〔着色微粒子の発色強度測定〕
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０に同社製の積分球ユニットＩＳＶ−７２２を取り付けた装置を用いた。測定するサンプルとして着色微粒子が０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを用い、光路長１０ｍｍの石英セルにサンプルを入れ測定した。得られた吸光度ピークのうち、４００〜８００ｎｍ可視光範囲での最大値（ＡＢＳ）を発色強度とした。
【００４０】
〔反応活性基を有するモノマーの繰り返し単位数の測定〕
装置としては島津製作所社製の高速液体クロマトグラフ装置Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅを用いた。測定するサンプルとしては、着色セルロース微粒子のグラフト化反応の際に添加しているフリー開始剤を使用した。グラフト化反応後の溶液をフリー開始剤の濃度が１０ｍｇ/ｍｌとなるように採取し、０．０５ＭのＮａＨＰＯ４溶液１ｍｌ中に添加した。このように作成したサンプルを１．５ｍｌサンプル瓶にいれ測定した。ポリメチルメタクリレートをスタンダードとして作成した検量線を用いてフリー開始剤の分子量を算出した。以下の式（１）により、算出した分子量（Ａ）からメタクリル酸ナトリウムの分子量（Ｂ）を除して繰り返し単位とした。
繰り返し単位数 ＝ Ａ ／ Ｂ・・・式（１）
例えば、算出した分子量が１０,０００の場合、繰り返し単位は１０,０００÷１０８＝９３となる。また、その他の方法として、２０ｍＬのスクリュー管にグラフト化した着色セルロース微粒子２０ｍｇ及び１０ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を２ｍＬ加え３０℃で２時間撹拌した後に、上記と同様の方法で分子量を測定し繰り返し単位数を算出した。
【００４１】
〔反応活性基の導入量の測定〕
装置としては京都電子社製の電位差自動滴定装置ＡＴ-５１０を用いた。測定するサンプルは、グラフト化着色セルロース微粒子５０ｍｇを５０ｍｌの純水に分散させたものを使用した。反応活性基が、カルボキシル基などの酸性置換基である場合は、まず、０．１Ｍの塩酸溶液をサンプルのｐＨ３となるまで滴下した。その後、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液をｐＨ１１となるまで滴下し、その際の滴定量を記録した（Ａ ｍＬ）。同様に、グラフト化していない微粒子の０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液の滴定量（Ｂ ｍＬ）を記録し、以下の式（２）により導入量を算出した。
導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝１０００×Ｍ×（Ａ−Ｂ）／Ｘ・・・式（２）
｛式中、Ｘ：使用した微粒子量（ｍｇ）、Ｍ：使用した水酸化ナトリウム溶液の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）｝。
アミノ基などのアルカリ性置換基である場合は、まず、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液をｐＨ１１となるまで滴下した後に、０．１Ｍの塩酸溶液をｐＨ３になるまで滴下し、その際の滴下量を記録する。算出方法は酸性置換基の場合と同様である。
導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝１０００×Ｍ×（Ａ−Ｂ）／Ｘ  ・・・式（３）
｛式中、Ａ：グラフト化着色セルロース微粒子の塩酸滴定量（ｍＬ）、Ｂ：グラフト化していない着色セルロース微粒子の塩酸滴定量（ｍＬ）、Ｘ：使用した微粒子量（ｍｇ）、Ｍ：使用した塩酸溶液の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）｝。
例えば、カルボキシル基を導入した微粒子５０ｍｇの０．１Ｍ塩酸の滴下量が２．０００ｍｌ、グラフト化していない微粒子５０ｍｇの滴下量が１．０００ｍｌの場合、式（３）により、導入量は１０００×０．１×（２．０００−１．０００）／５０＝２．０ｍｍｏｌ／ｇとなる。
【００４２】
〔着色微粒子の着色成分の割合の算出〕
所定回数の着色操作を行った後の着色微粒子の重量と、着色前の粒子の重量から計算し算出した。例えば、１．０ｇのセルロース粒子を着色し、２．５ｇの着色セルロース粒子を得た場合の着色成分は２．５ｇ−１．０ｇ＝１．５ｇとして計算した。この場合の着色成分の割合は１．５ｇ÷２．５ｇ×１００＝６０．０ｗｔ％となる。また、その他の方法として、ベックマンコールター社製のＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４という装置を用いた手法でも算出した。測定するサンプルとして着色微粒子が５．００ｗｔ％、純水９５．００ｗｔ％のサンプル１００ｍＬを用い、分散液中の微粒子個数を算出した（Ａ個）。次に着色前微粒子が５．００ｗｔ％、純水９５．００ｗｔ％のサンプル１００ｍＬを用い、分散液中の微粒子個数を算出した（Ｂ個）。次に測定に使用したサンプルをそれぞれ加熱乾燥により乾燥させ、サンプル中の微粒子重量を算出した（着色微粒子重量（ｇ）：ＷＡ、着色前微粒子重量（ｇ）：ＷＢ）。そして、以下の式（４）により、着色成分の割合を算出した。
割合（ｗｔ％）＝（ＷＡ／Ａ−ＷＢ／Ｂ）／（ＷＡ／Ａ）×１００・・・式（４）
例えば、Ａ＝１００００個、Ｂ＝１００００個、ＷＡ＝０．０３０ｇ、ＷＢ＝０．０１０ｇの場合、式（４）により、着色成分の割合は（０．０３０／１００００−０．０１０／１００００）／（０．０３０／１００００）×１００＝６７ｗｔ％となる。
【００４３】
〔着色微粒子のＬ／Ｄ比測定〕
装置としては日本電子株式社製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ-６７００を用いた。着色微粒子が０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを雲母板に滴下し、１０秒経過させることで着色微粒子を雲母板上に吸着させ、キムワイプで余分な液体を吸い取り乾燥させた。得られた雲母板をプラチナでコーティングし、電子顕微鏡測定用のサンプルを調製した。加速電圧１．６ｋＶ、測定倍率５万倍で観測を行い、粒子画像が１００個以上になるように必要枚数の画像を撮影し、それぞれの粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、粒子１００個のＬ／Ｄの平均値（真球度）を算出した。
【００４４】
〔グラフト化着色セルロース微粒子と抗体の結合方法〕
２ｍｌスピッツ管にリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ＰＨ＝６．０）を９０μＬ、グラフト化着色セルロース微粒子１ｗｔ％分散液を１０μＬ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下カルボジイミド、東京化成社製、Ｄ１６０１）の１ｗｔ％ＤＭＦ溶液（東京化成製、Ｄ０７２２）を１０μＬ入れ、３７℃の乾燥機内で２時間静置した。２時間後、グラフト化着色セルロース微粒子に対して１０ｗｔ％となるように抗ｈＣＧ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｌａｒｄｈ社製、♯５０１４）をスピッツ管に添加し、更に３７℃で２時間反応させた。その後、１ｗｔ％カゼイン（和光純薬工業社製、０３０−０１５０５）を含有するブロッキング溶液（１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液、ＰＨ＝８．５）を１２００μＬスピッツ管に添加し、３７℃の乾燥機内で１時間静置した。１時間後、遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ−５００８Ｃ）を用い、１４０００ｇで遠心を３０分間実施し、抗体を結合させたグラフト化着色セルロース微粒子を沈降させたのちに、上澄み液を廃棄した。次いで、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）を１２００μＬスピッツ管に加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ−５０）で１０秒間処理し、抗体を結合させたグラフト化着色セルロース微粒子を分散させた。十分に分散させた後、１４０００ｇの遠心を２０分間行い、上澄み液を廃棄した。抗体を結合させたグラフト化着色セルロース微粒子の濃度が０．０３ｗｔ％となるようにホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）を添加し、超音波分散機により十分に分散させた。以上の方法により、抗体を結合させたグラフト化着色セルロース微粒子（検出試薬）を得た。
【００４５】
〔コンジュゲートパッドへの検出試薬の含浸、乾燥〕
ポリエチレン製コンジュゲートパッド（Ａｈ社製、６６１５）を０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−２０（シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。続いてマイクロピペットを用い、前記検出試薬を２７２μＬ／８ｃｍとなるように均等に塗布し、３７℃で３０分乾燥させた。
【００４６】
〔サンプルパッドの前処理〕
再生セルロース連続長繊維不織布を、大過剰の２．０ｗｔ％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と２．０ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いたのちに５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。
【００４７】
〔捕捉抗体塗布メンブレンの調製〕
ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＨＦ０９００４２５）を幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１ｗｔ％抗ｈＣＧ−βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、６６０１）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）を０．１μｌ／ｍｍの割合で高さ１２ｍｍの部分に塗布した。続いて、３７℃で３０分間乾燥させた。
【００４８】
〔イムノクロマト診断キットの調製〕
バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、調製した捕捉抗体塗布メンブレン、吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０８３）、検出試薬を含有したコンジュゲートパッド、サンプルパッドを張り合わせた。続いて裁断機にて５ｍｍの幅にカットし、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍのイムノクロマト診断キットを得た。
【００４９】
〔イムノクロマト診断キットの検出限界の測定〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダーＣ１００６６−１０を用い測定した。用いる粒子の色に応じて装置の設定を行った。検査対象物質にはヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、「ｈＣＧ」という。）を用いた。ｈＣＧを１ｗｔ％の牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。）を含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ濃度が３．２０ｍＩＵ／ｍｌ、１．６０ｍＩＵ／ｍｌ、０．８０ｍＩＵ／ｍｌ、０．４０ｍＩＵ／ｍｌ、０．２０ｍＩＵ／ｍｌ、０．１０ｍＩＵ／ｍｌ、０．０５ｍＩＵ／ｍｌ、０．０２５ｍＩＵ／ｍｌ、０．０１２５ｍＩＵ／ｍｌ、０．００６２５ｍＩＵ／ｍｌと段階的に薄くしていった陽性検体を調製した。この陽性検体１２０ｕｌを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定した。この測定を各濃度で５回行い、得られた値の平均値が陰性検体を測定した時の値＋２０ｍＡＢＳ以上の場合は陽性判定、以下の場合は検出限界以下と見なした。この陽性判定が得られる下限のｈＣＧ濃度を検出限界とした。
以下の実施例、比較例において上記の方法でイムノクロマト評価を行った。
【００５０】
〔実施例１〕
従来公知の方法で、セルロース濃度０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。さらにテトラヒドロフラン濃度８９．０ｗｔ％、水濃度１１．０ｗｔ％、の凝固液を調製した。
マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続した後に１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー６５００ｇを得た。
得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、脱イオン水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ＰＨ６．０〜７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液１５０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６１ｎｍであった。
【００５１】
次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を１．０ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、反応性染料（Levafix Red CA Gr.、Dystar社製）１ｇを加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に炭酸ナトリウム４ｇを加え、２時間染色を行った。続いて得られた粗着色微粒子を水酸化ナトリウム５％水溶液で洗浄し、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計３サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。
次に、前記のようにして調製した着色セルロース微粒子のグラフト化反応を行った。着色セルロース微粒子とともに、ＧＰＣ測定用にフリー開始剤を反応系に導入した。反応等量はすべて、フリー開始剤を１等量として反応系を設計した。着色セルロース微粒子１．０ｇをグラフトする場合、３００ｍｌのナスフラスコ中で、メタクリル酸ナトリウム（以下、ＭＡＡＮａと示す。シグマアルドリッチ社製、４０８２１２）３０ｍｍｏｌ（ＭＡＡＮａ濃度は０．１Ｍ）、炭酸ナトリウム（関東化学社製、５８０２９−１７）７２ｍｍｏｌ、非イオン性の界面活性剤としてポリソルベート８０（シグマアルドリッチ社製、Ｗ２９１７０６）を１１ｍｍｏｌ、１５０ｍｌの純水と混合し、完全に溶解したことを確認後、セプタムラバーでフラスコを密栓した。次いで、もう一つ３００ｍｌのナスフラスコを用意し、フリー開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム（以下、ＫＰＳと略す。和光純薬工業社製、１６２−０４２３５）９．０ｍｍｏｌ、着色セルロース微粒子１．０ｇを１５０ｍｌの純水と混合し、セプタムラバーで密栓した。溶液が入った二つのナスフラスコをテフロン（登録商標）チューブで連結させ、ＭＡＡＮａが入ったナスフラスコからＮ２ガスを６０分注入し、溶液中に溶存している酸素を除去した。６０分後、ＭＡＡＮａが溶解した溶液を、微粒子が分散している溶液中にキャニュレーションにより注入し、反応を開始させた。この際ナスフラスコは、それぞれ３０℃のウォーターバスに入れて温度調整した。反応は、３０℃２時間で完了とした。このように調製した、グラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５２】
〔実施例２〕
ＭＡＡＮａ濃度を１．０Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５３】
〔実施例３〕
ＭＡＡＮａ濃度を３．０Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５４】
〔実施例４〕
ＭＡＡＮａ濃度を５．０Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５５】
〔実施例５〕
ＭＡＡＮａ濃度を８．０Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５６】
〔実施例６〕
ＭＡＡＮａ濃度を１０．０Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５７】
〔実施例７〕
反応活性基としてリン酸基を有するモノマー（ライトエステルP-1M、共栄社化学株式会社製）に変更し、かつモノマー濃度を１．０Ｍとしたこと以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。またこのグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５８】
〔実施例８〕
反応活性基としてアミノ基を有するモノマー（プロパルギルアミン、東京化成社製）に変更し、かつモノマー濃度を１．０Ｍとしたこと以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００５９】
〔実施例９〕
反応活性基としてスルホン酸基を有するモノマー（アクリルアミドt-ブチルスルホン酸、N-t-ブチルアクリルアミドスルホン酸、東亞合成社製）に変更し、かつモノマー濃度を１．０Ｍとしたこと以外は、実施例１と同様の方法で調製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６０】
〔実施例１０〕
染色サイクルを１回に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６１】
〔実施例１１〕
染色サイクルを８回に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６２】
〔実施例１２〕
凝固液をジメチルスルホキシド濃度５０ｗｔ％、水濃度５０ｗｔ％に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６３】
〔実施例１３〕
凝固液をアセトン濃度２７ｗｔ％、水濃度０．２０ｗｔ％、アンモニア濃度７２．８ｗｔ％に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６４】
〔実施例１４〕
凝固液をテトラヒドロフラン濃度９０ｗｔ％、水濃度１０ｗｔに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６５】
〔実施例１５〕
凝固液を酢酸エチル濃度９４ｗｔ％、水濃度６．０ｗｔに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で作製したグラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６６】
〔実施例１６〕
実施例１と同様の方法で凝固、着色した着色セルロース微粒子を以下の方法でグラフト化した。１００ｍｌのナスフラスコ中で、ＭＡＡＮａ ９３ｍｍｏｌ（ＭＡＡＮａ濃度は２．０Ｍ）及び１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン（シグマアルドリッチ社製、３６６４０４）３．７ｍｍｏｌを２４ｍｌの純水と混合し、完全に溶解したことを確認後、セプタムラバーでフラスコを密栓した。次いで、もう一つ１００ｍｌのナスフラスコを用意し、触媒である臭化銅（Ｉ）（和光純薬工業社製、０３７−１２８８２）１．２ｍｍｏｌ、臭化銅（ＩＩ）（和光純薬工業社製、０３０−１０８９５）０．６９ｍｍｏｌを加えセプタムラバーでフラスコを密栓した。さらに２００ｍｌのナスフラスコ中で、フリー開始剤として２−ブロモイソ酪酸（東京化成社製、Ｂ０６０６）１．２ｍｍｏｌｍｍｏｌ、着色セルロース微粒子１．０ｇを２４ｍｌの純水と混合し、セプタムラバーで密栓した。３つのナスフラスコをテフロン（登録商標）チューブで連結させ、ＭＡＡＮａが入ったナスフラスコからＮ２ガスを６０分注入し、溶液中に溶存している酸素を除去した。６０分後、ＭＡＡＮａが溶解した溶液を、臭化銅が入ったフラスコ中にキャニュレーションにより注入し、臭化銅が完全に溶解するまで３０分間撹拌した。その後、ＭＡＡＮａおよび臭化銅などが溶解した溶液を、微粒子が分散している溶液中にキャニュレーションにより注入し、反応を開始させた。この際ナスフラスコは、それぞれ３０℃のウォーターバスに入れて温度調整した。反応は、３０℃２時間で完了とした。このように調製した、グラフト化着色セルロース微粒子の粒子物性を以下の表１に示す。この反応による染料の変色や退色は認められなかった。また、このグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、その性能を評価した。結果を以下の表２に示す。
【００６７】
〔結果〕
実施例１〜１６においてはいずれも、微粒子に反応活性基を多数導入したため、抗体と微粒子が効率よく結合し、かつ抗体の向きがそろったために、以下の表２に示すように、分析感度が高いイムノクロマト診断キットを得ることができた。
【００６８】
〔比較例１〕
実施例１の染色作業を１サイクルのみ実施し、染色強度が０．５の粒子を作製した。実施例１と同様の方法でグラフト化し、グラフト化着色セルロース微粒子を得た。この粒子を発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を表２に示す。発色強度が弱いために、分析感度が低いものとなった。
【００６９】
〔比較例２〕
粒径が１００ｎｍでかつ反応活性基が導入されていない金コロイド（田中貴金属社製）をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。抗体が粒子に物理吸着で結合しているために、抗体の向きがそろっておらず、その結果抗原を効率的に捕捉できず分析感度が低いものとなった。
【００７０】
〔比較例３〕
粒径が５０ｎｍでかつカルボキシル基が導入された金コロイド（シグマアルドリッチ社製）をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。粒子径が小さいために感度が低くなった。
【００７１】
〔比較例４〕
粒径が４７０ｎｍ、発色強度が０．５でかつカルボキシル基が導入されたラテックス粒子（Bangs社製）をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を表２に示す。発色強度が低いために分析感度が低いものとなった。
【００７２】
〔比較例５〕
粒径が３３０ｎｍ、発色強度が４．０でかつ反応活性基が導入されていない着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。比較例２よりは分析感度は高いが、抗体が粒子に物理吸着で結合しているために、抗体の向きがそろっておらず、その結果抗原を効率的に捕捉できず分析感度が低いものとなった。
【００７３】
〔比較例６〕
特許文献４に記載されている繰り返し単位が一つのカルボキシル基が導入された着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。カルボキシル基導入量が少ないために分析感度が低くなった。
【００７４】
〔比較例７〕
分散度が８．０であるグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。分散度が大きいために粒子間での反応活性基の量のばらつきが大きくイムノクロマト結果の再現性が悪いものとなってしまった。
【００７５】
〔比較例８〕
真球度が１３であるグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。粒形がいびつな楕円形であるために、メンブレン中に詰まってしまい、感度が低下した。
【００７６】
〔比較例９〕
粒径が１２００ｎｍであるグラフト化着色セルロース微粒子をイムノクロマトの発色粒子として使用し、性能を評価した。結果を以下の表２に示す。粒形が大きいためにメンブレン中に詰まってしまい、うまく展開されなかった。
【００７７】
【表１】
2017138271.tif 000002
【００７８】
【表２】
2017138271.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明に係るグラフト化着色セルロース微粒子は、イムノクロマト診断キットの発色粒子として使用した場合、迅速な診断が可能であり、分析感度が高い診断薬として好適に利用可能である。