(57)【要約】【課題】本発明は、ペプチドの熱安定性を向上させる変異を計算機上で効率的かつより高精度でスクリーニングする方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るペプチドの熱安定性を向上させる変異のスクリーニング方法は、ペプチドのフォールド状態およびアンフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーを計算し、その差を算出し、天然型ペプチドと変異ペプチドとの間でその差を比較することで熱安定性を評価するに当たり、フォールド状態でのみ時間を要する分子動力学法で求め、且つそのシミュレーション時間を１００ピコ秒以下にすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱安定性を向上させる変異をスクリーニングするための方法であって、
フォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
アンフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法により求める工程、
フォールド状態とアンフォールド状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
フォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
アンフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法により求める工程、
フォールド状態とアンフォールド状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの熱安定性に与える影響を評価する工程を含むことを特徴とする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記シミュレーション時間を１０ピコ秒以上５０ピコ秒以下とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記対照ペプチドのアミノ酸残基数が５００以下である請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの熱安定性を向上させる変異を計算機上で効率的かつより高精度でスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は一般的に溶液中で一定の三次構造を形成するが、タンパク質を構成している個々の原子は完全に静止しておらず絶えず動いている。この動きは、タンパク質の物性や機能に密接に関連する為、その動きをウエットな実験やドライな解析で評価する研究は盛んになされている。ウエットな実験とは実験動物や細胞などを用いた実験であるのに対して、ドライな解析とは、実験動物や細胞などを用いることなく、主にコンピュータを用いるものである。ドライな解析として、タンパク質などの生体分子の個々の原子の動きをコンピュータ上でシミュレーションする手法は「分子動力学」と呼ばれる（特許文献１，非特許文献１）。
【０００３】
分子動力学を用いたタンパク質の熱安定性評価は標準的な手法と言えるが、マイクロ秒スケールの長時間シミュレーションをしないと正確な評価は難しいとされる（非特許文献２）。しかし、コンピュータ・スペックの目覚ましい発展はあるものの、個々の研究現場において、多数のタンパク質の計算が必要となる変異スクリーニングをマイクロ秒スケールの分子動力学シミュレーションで行うことは非現実的である。もちろん、ペプチドの変異をデザインするごとにそのペプチドを実際に合成してアッセイすることは、時間や労力が過剰にかかるため考えられない。
【０００４】
したがって、あるタンパク質の変異スクリーニングをコンピュータ上で行う際には、分子の時間発展に伴うシミュレーションは行わず、いわゆる「分子力学」を用いた手法が中心である（非特許文献３）。コンピュータによる変異スクリーニングに用いられるソフトウェアは、ＢＬＡＳＴやサポートベクターマシン（ＳＶＭ）などのバイオインフォマティクス手法を、分子力学法などと組み合わせて変異の影響を予測する手法を採用しているケースが多い（非特許文献３，４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５１４５０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ，ＭｃＣａｍｍｏｎ  ＪＡ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２００２年，９巻，６４６−６５２頁
【非特許文献２】Ｋｌｅｐｅｉｓ  ＪＬ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２００９年，１９巻，１２０−１２７頁
【非特許文献３】Ｋｈａｎ  ＦＩ．，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２０１６年，８５巻，４８−６２頁
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈ  ＣＡ．，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ  Ｔ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１年，６巻，ｅ２０４５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、分子を構成する原子間に働く力、例えば、化学結合力、静電気力、引力などを合計し、熱安定性を評価する分子力学法（ＭＭ法）がある。しかし、原子は静止しているわけではなく、常に運動しており、ＭＭ法ではかかる運動が考慮されていないため精度は比較的低いといえる。
【０００８】
一方、分子動力学法（ＭＤ法）は、ＭＭ法からさらに、上記原子間力を受けた原子がどのように運動するかをニュートンの運動方程式に基づいて計算し、原子の配置がどのように変わったかを明らかにする。かかるプロセスを繰り返して熱安定性を評価するため、ＭＤ法はより正確であるといえる。しかし、分子を構成する原子のすべてでかかる計算を繰り返すため、ＭＤ法には多大な時間がかかる。特にペプチドの熱安定性を向上させる変異を見出すには、多数の変異体を評価する必要があるため、ＭＤ法は不向きである。
【０００９】
そこで本発明は、ペプチドの熱安定性を向上させる変異を計算機上で効率的かつより高精度でスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を進めた。その結果、ペプチドのフォールド状態およびアンフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーを測定するに当たり、フォールド状態でのみ時間を要する分子動力学法で求め、且つそのシミュレーション時間を１００ピコ秒以下にしても、ポテンシャルエネルギー差の値はペプチドの熱安定性の実測値と高い相関を示すことを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
以下、本発明を示す。
【００１２】
［１］  熱安定性を向上させる変異をスクリーニングするための方法であって、
フォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
アンフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法により求める工程、
フォールド状態とアンフォールド状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
フォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める工程、
アンフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法により求める工程、
フォールド状態とアンフォールド状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差を算出する工程、
対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの熱安定性に与える影響を評価する工程を含むことを特徴とする工程を含むことを特徴とする方法。
【００１３】
［２］  上記シミュレーション時間を１０ピコ秒以上５０ピコ秒以下とする上記［１］に記載の方法。
【００１４】
［３］  上記対照ペプチドのアミノ酸残基数が５００以下である上記［１］または［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
ペプチドの熱安定性を向上させる変異をスクリーニングするに当たり、変異をデザインする毎にペプチドを実際に合成してアッセイしていては労力、時間、コストなどがかかり過ぎるので、現実的ではない。そこで、変異ペプチドの熱安定性を計算機で評価することが考えられる。
【００１６】
しかし、計算機を用いる熱安定性の評価方法のうち分子動力学法は、原子の動きの計算を繰り返すものであることから、一つのペプチドの熱安定性を評価するだけでも多大な時間を要する。一方、分子力学法は、評価時間は短いものの、静止した分子を評価するものであって原子の動きは考慮されないので、評価の正確性に問題がある。
【００１７】
それに対して本発明方法は、評価時間が比較的短い上に、評価結果が実測値と高い相関を示すことから、膨大な数の変異ペプチドデザインの中から高い熱安定性を示すものをスクリーニングする場合に非常に有用であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ペプチドのフォールド状態およびアンフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーの差ΔＥを縦軸に、ペプチドの変性中点温度Ｔｍを横軸にプロットしたグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明方法は、ペプチドの熱安定性を向上させる変異を効率的かつより高精度でスクリーニングするための方法である。以下、本発明方法を工程毎に説明する。
【００２０】
工程１：フォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、フォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める。
【００２１】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。例えば、ペプチドにはペプチドドメインも含まれる。「ペプチドドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。本発明においては、ペプチドとタンパク質は基本的に同義であるが、一般的には立体構造を取る程度のアミノ酸数からなるペプチドはタンパク質と呼ぶ。
【００２２】
本発明が適応されるペプチドの大きさに特に制限はないが、スクリーニングする変異数、計算ソフトの仕様、計算機のスペック、および、予定する計算所要時間によって、実用上の上限は決まる。ペプチドのアミノ酸残基数の上限としては、好ましくは５００残基であり、より好ましくは３００残基であり、さらにより好ましくは１００残基である。アミノ酸残基数の下限は、立体構造を取る限りにおいて特に制限はないが、好ましくは１０残基であり、より好ましくは３０残基であり、さらにより好ましくは５０残基である。
【００２３】
本工程でフォールド状態のポテンシャルエネルギーを計算する「対照ペプチド」は、後記の変異ペプチドの熱安定性を評価する基準となるものであれば特に制限されない。例えば、天然型のペプチドを挙げることができる。ただし、この天然型ペプチドは、厳密な意味で天然由来のものである必要は無く、立体構造を形成したり或いは機能を発揮する最小単位のものであれば、糖鎖やその他のペプチド部分を欠失させたものであってもよい。また、対照ペプチドは、ある程度の熱安定性を示す変異ペプチドであってもよい。
【００２４】
「フォールド状態」とは天然状態の意味であり、結晶状態であるか溶液状態であるかを問わず、ペプチドを変性させない状態での最安定化構造にある状態をいう。
【００２５】
本工程では、フォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子動力学法（ＭＤ法）により計算する。ペプチドを構成する原子は、例えば溶液中で静止しているわけではなく、少しずつ位置を変えている。このような原子の動きを計算機の中で再現するために使用されるのが分子動力学計算法である。
【００２６】
分子動力学計算法では、先ず、Ｘ線結晶構造などの三次元構造情報を基に、原子の最初の配置を決める。計算に用いるペプチドのフォールド状態における立体構造は、Ｘ線結晶構造、ＮＭＲ、電子顕微鏡イメージング等の公知の実験手法によって得られ、そのような情報が無くても、一次配列の類似性に基づく立体構造ホモロジーモデリングによって構築することも可能である。立体構造モデリングは、例えば、専用ソフトであるＭｏｄｅｌｌｅｒ（https://salilab.org/modeller/）や、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｈｙｐｅｒｃｈｅｍ（http://www.molfunction.com/jp/software1.htm）などを利用して実施することができる。いずれの手法においても、残基の側鎖は、立体構造上で適切な立体配置と立体配座を取るよう、側鎖ロータマーの最適化を行うことが好ましい。
【００２７】
以上の通り原子の最初の配置を決めた後に、１個の原子に他の原子から及ぶ力を計算する。かかる力としては、結合の伸縮エネルギー、結合角の変角エネルギー、ねじれ（トーション）エネルギー、ファンデルワールス相互作用エネルギー、双極子相互作用エネルギー、静電相互作用エネルギー、水素結合エネルギーなどを挙げることができる。分子を構成する全ての原子に働く力の総和が「ポテンシャルエネルギー」である。ここまでの計算方法は、一般的に分子力学法（ＭＭ法）と呼ばれている。
【００２８】
次に、その力を受けた原子がどのように運動するかをニュートンの運動方程式に基づいて計算する。これにより、最初の配置から短い刻み時間の後に、原子の配置がどう変わったかが分かる。変化後の配置を新たな出発点として、同様の計算を再び行う。非常に短い時間の刻みでこれを繰り返すと、原子が徐々に動く様子が再現できる。このように、（ｉ）原子の配置の決定、（ｉｉ）原子に働く力の計算、（ｉｉｉ）原子の動きの計算、という（ｉ）〜（ｉｉｉ）を計算機で繰り返し、時間の経過に伴って変化する物理量や立体構造を任意に抽出し、それらを統計処理したり画像表示するなどして、化合物の物性や構造を解析する方法が分子動力学法（ＭＤ法）である。分子動力学法では、解析の対象として、一定時間において変化したポテンシャルエネルギーの平均を求めることができる。本発明では、このポテンシャルエネルギーを利用する。
【００２９】
本発明における分子動力学法の「シミュレーション時間」とは、上記計算の繰り返しによって原子の動きを追ったトータルの時間を指す。上記の短い刻みの時間を、本発明では「ステップ時間」と定義する。ステップ時間は、通常は０．１〜１０フェムト（１０-15）秒であり、好ましくは０．５〜２フェムト秒である。本発明では、特段の断りが無い限り、ステップ時間は１フェムト秒（１ｆｓ）とする。上記の計算繰り返しの回数を、本発明では「ループ回数」と定義する。本発明におけるループ回数は、ステップ時間を１フェムト秒としたときに、その下限は、５，０００が好ましく、１０，０００がより好ましい。一方、その上限は、１００，０００が好ましく、５０，０００がより好ましい。本明細書における「シミュレーション時間」とは、「ステップ時間」と「ループ回数」の積で表される時間を指す。すなわち、本発明におけるシミュレーション時間は、５ピコ秒（５ｐｓ）以上、１００ピコ秒以下が好ましい。本工程でのシミュレーション時間が５ピコ秒以上であれば、シミュレーションの系がより確実に平衡に達し得るので、実測値と十分な相関のある熱安定性を最終的に導き出すことができる。一方、当該シミュレーション時間が１００ピコ秒以下であれば、十分に高精度な熱安定性を最終的に導き出せる範囲で、効率的なスクリーニングが可能になる。当該シミュレーション時間としては、１０ピコ秒以上がより好ましく、５０ピコ秒以下がより好ましい。
【００３０】
なお、一般的な分子動力学法のシミュレーション時間は数ナノ秒から数十ナノ秒であり、１つの原子当たりのシミュレーション時間が短くても、ペプチドは多数の原子で構成されており、また、原子同士は互いに相互作用し、ある原子の運動に影響を与える原子の位置が変わればその原子に加わる力も変化するため、ペプチドのポテンシャルエネルギーや最安定化構造を分子動力学法で求めるには多大な時間がかかる。分子動力学法によりペプチドのポテンシャルエネルギーを求めるには実際にどの程度の時間を要するのかについては、使用する計算機のスペックなどにも依存するが、例えば、後記の実施例１（３）では５０ピコ秒のシミュレーション時間で約２時間かかったのに対して、シミュレーション時間を１ナノ秒にするだけでも、約２０時間かかることになる。
【００３１】
ペプチドなどの分子中に存在する各原子が、どのような力を受けているのかを関数として数式化したものが分子力場である。分子力場に基づく分子力学計算や分子動力学計算では、原子間に働く力を、原子間の結合を表すパラメータ（結合距離や結合角など）を変数とし、原子の種類や結合様式によって決まるポテンシャル関数で数値として表す。分子の「ポテンシャルエネルギー」は、分子中に働くこれらの全てのポテンシャル関数の総和で表現される。ペプチドのポテンシャルエネルギーは、結合の伸縮エネルギー、結合角の変角エネルギー、ねじれ（トーション）エネルギー、ファンデルワールス相互作用エネルギー、双極子相互作用エネルギー、静電相互作用エネルギー、および水素結合エネルギーなどの総和で表されるが、これらに限定されない。また、どのエネルギー項を計算に取り入れるかの選択も、特に限定はされない。また、計算の効率を考慮して、原子間の距離が一定以上であれば計算しない、一般的にカットオフ法と呼ばれる手法を導入してもよい。
【００３２】
ポテンシャルエネルギーは、ある一定のシミュレーション時間内における、各ステップで算出されるポテンシャルエネルギーの平均として計算することが好ましいが、これには限定されない。例えば、最大値や最小値を評価に用いても構わない。平均を求める際のサンプリングの時間は、特に限定されないが、ポテンシャルエネルギーの値が平衡に達して安定になる、シミュレーション後半の１０ピコ秒程度が好ましい。例えば、シミュレーション時間が５０ピコ秒の場合には、４０ピコ秒以上、５０ピコ秒以下をポテンシャルエネルギーの平均を求めるサンプリング時間とすることができる。
【００３３】
本発明においては、ペプチドの熱安定性を、ポテンシャルエネルギーを指標として評価する。ポテンシャルエネルギーは、同じ原子数で同じ原子構成の分子であっても、その値が大きい程、歪みなどに起因する余分なエネルギーを持つことになり、エネルギー的に不安定とされる。したがって、熱安定性を比較する２つの分子に関し、比較条件を何らかの条件や考えに基づいて揃えた場合は、ポテンシャルエネルギーが低い、すなわち値が小さい方が熱安定性は高いと評価される。このように、ポテンシャルエネルギーの数値そのものは、何らかの実験値を示す訳では無いので、ポテンシャルエネルギーを指標とした適当なスコア関数を用いてもよい。
【００３４】
ペプチドの分子力学法および分子動力学法による計算用プログラムとしては、ＡＭＢＥＲ（http://ambermd.org/）、ＣＨＡＲＭＭ（http://www.charmm.org/charmm/）、ＮＡＭＤ（http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）、ＧＲＯＭＡＣＳ（http://www.gromacs.org/）、および、ＭｙＰｒｅｓｔｏ（http://presto.protein.osaka-u.ac.jp/myPresto4/）などが挙げられる。計算に関しては、通常の一定温度下でのカノニカル・アンサンブル（ＮＶＴアンサンブル）計算が好ましいが、特にこれには限定されない。
【００３５】
計算は、２８０Ｋ以上、３２０Ｋ以下程度の設定温度下で行うのが一般的であるが、対象とするペプチドや見たい現象によっては、３２０Ｋ超の高温で計算しても問題は無い。通常のＷｅｔ実験では実施が困難な温度でのシミュレーションが可能なことが計算機での計算の利点であり、計算時の設定温度は特に限定されない。アンフォールド状態の分子力学計算に関して、ポテンシャルエネルギーの算出には、一般的にエネルギー極小化計算を用いるのが好ましいが、特にこれには限定されない。
【００３６】
計算においては、溶媒効果を考慮することが好ましい。例えば、溶媒分子を計算対象であるペプチドと同様に個々の測定対象分子として取り扱う系で計算してもよいし、溶媒分子を連続体として近似して計算してもよい。連続体近似を行うモデルとしては、例えば、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ／Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａモデル（ＧＢ／ＳＡモデル）がよく利用される。なお、溶媒効果を考慮した場合には、ペプチドのフォールド状態とアンフォールド状態のポテンシャルエネルギーの差は、ペプチドの水溶液中の変性ギブス自由エネルギー差を反映しており、両者は近似しているともいえる（非特許文献３）。
【００３７】
工程２：アンフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、アンフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法により求める。
【００３８】
「アンフォールド状態」とは変性状態ともいい、ペプチドに何らかの外力を付加した結果、高次構造が変化した状態をいう。アンフォールド状態の立体構造は、変性によって一定の立体構造を取らないことが一般的である。
【００３９】
分子動力学法では、シミュレーション温度を十分に高温にすることで、フォールド状態の構造が崩れた変性構造をサンプリングして、ポテンシャルエネルギーを求めることが可能である。ただし、アンフォールド状態の分子動力学計算では、立体構造は分子の一部が二次構造を取るなど、意図せぬ偏りが生じることがあり、特に１００ピコ秒以下の短いシミュレーション時間では、その傾向が顕著に出る。よって、野生型と変異体のアンフォールド状態の立体構造をある共通の一定構造として、分子力学法でポテンシャルエネルギーを評価することが好ましい。また、分子力学法によるポテンシャルエネルギーの計算は、分子動力学法による場合よりも顕著に速く且つ容易であるため、時間やコストを削減できるという効果もある。したがって、本発明では、ペプチドのフォールド状態のポテンシャルエネルギーは分子動力学法により求め、アンフォールド状態のポテンシャルエネルギーは分子力学法により求めることが好ましい。
【００４０】
本発明においては、アンフォールド状態におけるペプチドの立体構造は特に制限されない。アンフォールド状態は、基本的には、ペプチド分子内のアミノ酸残基同士の相互作用について、共有結合を介した相互作用以外の相互作用がほとんど無い状態なので、例えば、ペプチドの主鎖が線状に伸びた形状の伸張状態が好ましい。より具体的には、アンフォールド状態にあるペプチドの立体構造は、伸張構造として、ＣＡ間距離３．８Å、らせん半径０．５Å、回転角３０°という主鎖構造が例として挙げられるが、特にこれには限定されない。
【００４１】
本工程においては、分子力学法および分子動力学法によりポテンシャルエネルギーを求める前の「原子の最初の配置」を、計算機において、事前に定めたアンフォールド状態におけるペプチドの立体構造中の各原子の位置に定めることと、ポテンシャルエネルギーを分子力学法でのみ計算すること以外は、上記の工程１と同様にして実施する。ただし、ペプチドのアンフォールド状態の立体構造は、例えば、モデル再構成ツールであるＰＵＬＣＨＲＡ（http://www.pirx.com/pulchra/index.shtml）を利用すると作成可能である。
【００４２】
工程３：ポテンシャルエネルギーの差の算出工程
本工程では、上記工程１で求めたフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギー（以下、「ＥNature」と表記する場合がある）と、上記工程２で求めたアンフォールド状態にある対照ペプチドのポテンシャルエネルギー（以下、「ＥDenatured」と表記する場合がある）との差（以下、「ΔＥ」と表記する場合がある）を算出する。
【００４３】
一般的には、ＥDenaturedの値は、エネルギー極小化を行って構造の歪みを除いた後のエネルギー後であることからＥNatureの値よりも小さくなるので、ΔＥはＥNatureの値からＥDenaturedの値を減ずることにより算出することが好ましい。
【００４４】
工程４：フォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、フォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間が１００ピコ秒以下の分子動力学法により求める。
【００４５】
ペプチドの「変異」は、野生型ペプチドなど上記の対照ペプチドのアミノ酸配列に対し、少なくとも１つ以上のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失が導入することをいい、「変異ペプチド」とは、かかる変異が導入されたペプチドをいう。
【００４６】
本工程は、対照ペプチドの代わりに変異ペプチドを用いる以外は上記工程１と同様に実施する。例えば変異ペプチドの立体構造も、対照ペプチドと同様に立体構造ホモロジーモデリングによって構築することが可能である。ただし、変異ペプチドの立体構造は、対照ペプチドの立体構造に対して、特にアミノ酸残基を置換のみする場合には、変異するアミノ酸残基の側鎖が変更されるだけなので、側鎖原子の構築だけに特化したプログラムであるＳＣＷＲＬ（http://dunbrack.fccc.edu/scwrl4/SCWRL4.php）を利用すると、変異ペプチドの立体構造の決定を自動化することもできる。
【００４７】
工程５：アンフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーの計算工程
本工程では、アンフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギーを分子力学法より求める。
【００４８】
本工程は、対照ペプチドの代わりに変異ペプチドを用いる以外は上記工程２と同様に実施する。特に、変異ペプチドのアンフォールド状態の立体構造は、ペプチドが変異している以外、上記工程２における対照ペプチドのアンフォールド状態の立体構造と同一または極力同一にする必要がある。
【００４９】
工程６：ポテンシャルエネルギーの差の算出工程
本工程では、上記工程４で求めたフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギー（ＥNature）と、上記工程５で求めたアンフォールド状態にある変異ペプチドのポテンシャルエネルギー（ＥDenatured）との差（ΔＥ）を算出する。本工程は、変異ペプチドのフォールド状態とアンフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーの差を求める以外、上記工程３と同様に実施する。
【００５０】
工程７：変異の評価工程
本工程では、対照ペプチドと変異ペプチドとの間の上記ポテンシャルエネルギー差を比較することにより、変異がペプチドの熱安定性に与える影響を評価する。具体的には、フォールド状態とアンフォールド状態のペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差が小さい程、ペプチドの熱変性中点温度（Ｔｍ）が高く、熱安定性が高いといえる。また、上記工程３で算出した「フォールド状態とアンフォールド状態の対照ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差」から、上記工程６で算出した「フォールド状態とアンフォールド状態の変異ペプチドの間のポテンシャルエネルギーの差」を減じて両者の差（ΔΔＥ）を算出した上で、対照ペプチドと複数の変異ペプチドとのΔΔＥ値を比較することにより、熱安定性をより向上させる変異を特定することが可能になる。
【００５１】
本発明において「変異スクリーニング」とは、変異による分子の熱安定性の変化を網羅的に評価し、分子の熱安定性を向上させる変異を選出することを意味する。基本的には、変異を導入したペプチド（変異ペプチド）と変異を導入していないペプチド（対照ペプチド）の、同じ条件で計算した際のポテンシャルエネルギーの差が、変異が熱安定性に与える影響を評価する上での代表的な基準の一つとなる。正確には、変異による分子の原子数や構成の違いを補正する必要はある。ポテンシャルエネルギーをより正確に熱安定性に反映するには、あるペプチドのフォールド状態とアンフォールド状態のポテンシャルエネルギー差を求めることが好ましい。フォールド状態とアンフォールド状態のポテンシャルエネルギー差は、同じアミノ酸配列からなる異なる立体構造のポテンシャルエネルギーの差に該当する為、変異による分子の原子数や構成の違いを補正（キャンセレーション）する役割も果たす。この場合は、ポテンシャルエネルギー差（ΔＥ）の差（ΔΔＥ）が、変異の有無による熱安定性の違いを評価する上での指標となる。例えば、上記ΔΔＥの値が、対照ペプチドに比べて変異ペプチドより小さい場合には、変異ペプチドの熱安定性は対照ペプチドより高いといえる。このように、対照ペプチドと変異ペプチドとの間でΔΔＥの値を比較することにより、熱安定性を向上できる変異をスクリーニングすることが可能になる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
以下では、変位を導入しない野生型ペプチドは、「ペプチド名−Ｗｉｌｄ」の形で表記し、変異としてアミノ酸残基置換した変異ペプチドについては、「ペプチド名−導入した変異」の形で表記する。例えば、野生型ペプチドの第３位におけるチロシンをフェニルアラニンに置換した変異を導入した変異ペプチドは、「ペプチド名−Ｙ３Ｆ」と表記する。複数の置換を同時に導入した変異ペプチドの変異は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｙ３ＦおよびＬ７Ｉを導入した変異体は、「ペプチド名−Ｙ３Ｆ／Ｌ７Ｉ」と表記する。
【００５４】
実施例１
（１）既知データ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来プロテインＧ（以下、「ＳｐＧ」と略記する）に含まれる複数のドメインの内、５６残基からなる免疫グロブリン結合性のＢドメインを対象として、各種変異体の熱変性中点温度（Ｔｍ）をＷｅｔ実験にて評価した２報の文献（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．，１９９７，６，１７０１−１７０７；  Ｍａｌａｋａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，５，４７０−４７５）の記載データを表１に記載した。なお、Ｂ−Ｙ３Ｆ／Ｌ７Ｉ／Ｔ１６Ｉ／Ｔ１８Ｉ／Ｖ３９ＩとＢ−Ｙ３Ｆ／Ｌ７Ｉ／Ｔ１６Ｉ／Ｔ１８Ｉ／Ｔ２５Ｅ／Ｖ３９Ｉに関しては、文献ではＴｍ値＞９９℃となっていたが、ΔＧの値も考慮し、便宜的にそれぞれ９９℃と１００℃とした。
【００５５】
【表１】
2017201463.tif 000002
【００５６】
以下では、これらの変異体に関し、ポテンシャルエネルギーを指標にして各変異が熱安定性に与える影響をＤｒｙ解析し、その評価結果と表１のＷｅｔ実験結果との一致度を検証した。
【００５７】
（２）計算に利用する立体構造の準備
本実施例の野生型ペプチドに該当するＳｐＧのＢドメインのアミノ酸一次配列は以下の通りであり、以後はこれをＢ−Ｗｉｌｄと呼ぶ。なお、天然型のＢ−Ｗｉｌｄの立体構造は、同一配列のＸ線結晶構造がＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do，ＰＤＢコード：１ＰＧＡ）に登録されているので、これを利用した。
【００５８】
Ｂ−Ｗｉｌｄ：  ＭＴＹＫＬＩＬＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ
評価する１０種の変異ペプチドについては、側鎖原子構築プログラムＳＣＷＲＬを用いて、Ｂ−Ｗｉｌｄの立体構造をベースに、変異する残基の側鎖ロータマーを探索・置換したモデリング構造を構築した。
【００５９】
アンフォールド状態のＢ−Ｗｉｌｄの立体構造は、ＣＡ間距離３．８Å、らせん半径０．５Å、回転角３０°のらせんを形成するようにＣＡ原子を一直線に並べた座標を作り、これをベースにＰＵＬＣＨＲＡを用いて主鎖原子座標を構築した。その後、ＳＣＷＲＬを用いて側鎖構造をモデリングした。
【００６０】
（３）フォールド状態の分子動力学（ＭＤ）計算によるポテンシャルエネルギー算出
ＭＤ計算の工程に進む前に、（２）で準備したフォールド状態の構造を用いて、分子力学（ＭＭ）計算によるエネルギー極小化を行った。エネルギー極小化計算は、共役勾配法（ｃｏｓｇｅｎｅでのオプション名はＣＯＮＪ）を用い、最初のステップでの原子移動距離ＲＭＳＤ＝０．０１［Ａ］、最大計算ステップ数１００００、収束判定条件ＲＭＳＦ＝０．１［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ］として行った。
【００６１】
上記ＭＭ計算の出力座標を初期構造として、シミュレーション時間５０［ｐｓ］のカノニカルＭＤ計算を行った。ＭＤ計算のエンジンとしては、ｍｙＰｒｅｓｔｏのパッケージのｃｏｓｇｅｎｅ（ｃｏｓｇｅｎｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２０８  ｓｉｎｇｌｅ版）を用いた。基本的な計算条件として、ステップ時間１ｆｓ、ループ回数５０，０００とし、温度を３００Ｋで一定とするＮＶＴアンサンブル計算とした。また、Ｃｏｓｇｅｎが実装している、結合伸縮を考慮しないＳＨＡＫＥアルゴリズム、溶媒効果を考慮するＧＢ／ＳＡを計算に利用した。エネルギーや座標等のトラジェクトリ出力は全てデフォルトの設定とし、４０〜５０ｐｓのスナップショットのポテンシャルエネルギーの平均をフォールド状態のポテンシャルエネルギー（ＥNature）とした。
【００６２】
上記ＭＤ計算では、ＣＰＵがＸｅｏｎ  Ｘ５５７０（クロック周波数：２．９３ＧＨｚ，４コア）、メモリが１２ＧＢのスペックの計算機を使っており、今回の５６残基からなるペプチド１種のシミュレーション時間５０ピコ秒のＭＤ計算に要した時間は、１ＣＰＵあたり約２時間であった。仮にシミュレーション時間１ナノ秒のＭＤ計算を行うと、単純に２０倍の４０時間が必要となる。したがって、通常のラボで用いられるワークステーションで、数多くの変異体のＭＤ計算をナノ秒オーダーで計算することは、この程度のアミノ酸数のペプチドでも現実的とは言えず、シミュレーション時間を１オーダー以上低減できたことは、実用面でも非常に意味があると言える。
【００６３】
（４）アンフォールド状態の分子力学（ＭＭ）計算によるポテンシャルエネルギー算出
Ｃｏｓｇｅｎｅを利用して、（２）で作成したアンフォールド状態の構造を初期構造としたＭＭ計算によるエネルギー極小化を行った。計算条件は（３）と同様であり、共役勾配法（ｃｏｓｇｅｎｅでのオプション名はＣＯＮＪ）を用い、最初のステップでの原子移動距離ＲＭＳＤ＝０．０１［Ａ］、最大計算ステップ数１００００、収束判定条件ＲＭＳＦ＝０．１［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ］として行い、その最終構造の出力ポテンシャルエネルギーを、アンフォールド状態のポテンシャルエネルギー（ＥDenatured）とした。
【００６４】
（５）ポテンシャルエネルギー差の算出と実験結果との一致度検証
野生型および各種変異体のポテンシャルエネルギー差（ΔＥ）は、単純にフォールド状態のポテンシャルエネルギー値（ＥNature）からアンフォールド状態のポテンシャルエネルギー値（ＥDenatured）をそのまま減ずる形で算出した。それらを表２にまとめた。この数値が低い程、計算では熱安定性が高いと予測されたことになる。なお、ＥNatureの方がＥDenaturedより値が大きいのは、ＥDenaturedはエネルギー極小化を行って構造の歪みを除いた後のエネルギー値だからである。ポテンシャルエネルギー差は、計算評価の指標となる一種のスコア関数であり、その絶対値は特別な意味は無い。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
図１として、計算によって求めたΔＥを縦軸に、Ｗｅｔ実験によって求めた変性中点温度Ｔｍを横軸にプロットしたグラフを示す。図１には、全てのデータの線形近似曲線も併せて示した。変性中点温度の数値が大きい方が熱安定性は高いので、ΔＥとＴｍは逆相関の関係にある。相関係数は−０．７５であり、高い負の相関、すなわち、実験結果の傾向に合致する計算結果が得られた。
【００６７】
以上の結果の通り、ペプチドのフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーを、シミュレーション時間を１００ピコ秒以下とする分子動力学法（ＭＤ法）で計算し、アンフォールド状態におけるポテンシャルエネルギーを分子力学法（ＭＭ法）で計算し、両数値の差を算出することにより、その熱安定性を実測値と比較しても正確に、かつ効率的に求めることができることが実証された。
【図１】
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