(57)【要約】【課題】ベクターシステム、遺伝子発現方法、標的遺伝子ノックアウト方法、標的遺伝子ノックダウン方法、標的遺伝子編集方法、及び遺伝子発現キットを提供する。【解決手段】少なくとも一種のベクターを含むベクターシステムであって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子と、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子と、を含むことを特徴とするベクターシステム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のベクターを含むベクターシステムであって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子と、
外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子と、を含むことを特徴とするベクターシステム。
【請求項２】
前記第一の制御因子を含む第一のベクターと、前記第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含む請求項１に記載のベクターシステム。
【請求項３】
前記外来性発現プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される少なくとも一種である請求項１又は２に記載のベクターシステム。
【請求項４】
更に、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二の目的遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項５】
前記第三の制御因子は、更に前記外来性発現プロモーターの制御下にあるｔＴＡをコードする遺伝子を含む請求項４に記載のベクターシステム。
【請求項６】
前記第三の制御因子を含む第三のベクターを含む請求項４又は５に記載のベクターシステム。
【請求項７】
更に、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第三の目的遺伝子と、を含む第四の制御因子を含む請求項４〜６のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項８】
前記第四の制御因子を含む第四のベクターを含む請求項７に記載のベクターシステム。
【請求項９】
前記第二の目的遺伝子は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子であり、前記第三の制御因子は、更に、ガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子を含む請求項４〜８のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項１０】
前記第二の目的遺伝子は、ＴＡＬＥＮ  ｌｅｆｔであり、前記第三の目的遺伝子は、ＴＡＬＥＮ  ｒｉｇｈｔである請求項４〜８のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項１１】
前記第二の目的遺伝子は、ＲＮＡｉ誘導性核酸である請求項４〜８のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項１２】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクターシステム。
【請求項１３】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクターシステムを用いることを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項１４】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を細胞に導入し、
前記第一のベクターの導入量を調節することにより、第一の目的遺伝子が発現する細胞数を調節することを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項１５】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある第一の部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第一のカセットと、前記第一のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、
外来性発現プロモーター、第二の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第二の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第二のカセットと、前記第二のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二の目的遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を第二の部位特異的組み換え酵素発現細胞に導入することを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項１６】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子をノックアウトする方法であって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を、
前記部位特異的組み換え酵素認識配列、標的遺伝子、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む染色体を有する細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子ノックアウト方法。
【請求項１７】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子をノックダウンする方法であって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある第一の部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第一のカセットと、前記第一のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、
外来性発現プロモーター、第二の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第二の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第二のカセットと、前記第二のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、ＲＮＡｉ誘導性核酸と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を第二の部位特異的組み換え酵素発現細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子ノックダウン方法。
【請求項１８】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子を編集する方法であって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、
前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子を含む第三のベクターと、
を細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子編集方法。
【請求項１９】
密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させるためのキットであって、
テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、
外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含むことを特徴とする遺伝子発現キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクターシステム、遺伝子発現方法、標的遺伝子ノックアウト方法、標的遺伝子ノックダウン方法、標的遺伝子編集方法、及び遺伝子発現キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の脳は、複雑な組織であり、密集した神経細胞からなり、相互接続されており、高度な脳の機能を担う複雑な神経回路を形成する。神経回路の発生と機能の詳細な分子細胞学的メカニズムを理解するためには、個々の細胞の接続の影響を排除した１個の細胞の解析とこれらの細胞における分子機構の解析が不可欠である。
このように、細胞密度の高い組織で疎らに細胞内の遺伝子操作をするシステムの必要性、特に細胞密度の高い組織で疎らに細胞を標識するシステムの必要性は高く、世界中で様々な方法が開発されている。
【０００３】
係るシステムとして、ＭＡＤＭ (ｍｏｓａｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ) システムやＳＬＩＣＫ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｅｕｒｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）システムという、２つのトランスジェニック／ノックインマウスをベースとした遺伝子系が報告され、有望なツールとして注目を集めている（例えば、非特許文献１〜２参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Espinosa J.S., Wheeler D.G., Tsien R.W., Luo L.. Uncoupling dendrite growth and patterning: single-cell knockout analysis of NMDA receptor 2B. Neuron. 2009 Apr 30;62(2):205-17.
【非特許文献２】Young P., Qiu L., Wang D., Zhao S., Gross J., Feng G. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 2008 Jun;11(6):721-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１〜２に記載のＭＡＤＭシステムやＳＬＩＣＫシステムといったマウス遺伝学のみに基づいたシステムは、マウスのブリーディングの為の多大なコスト、場所、時間を必要とするため、これらのシステムの活用が妨げられている。
【０００６】
具体的には、非特許文献１に記載のＭＡＤＭシステムを用いるためには、４種類のトランスジェニックマウスを準備する必要があり、所望のマウスを手に入れるまでは、大量の交配を行う必要があり、非常に手間である。
【０００７】
また、非特許文献２に記載のＳＬＩＣＫシステムは、用いるプロモーターの性質から脳の一部でしか使うことができない。汎用性の観点から改良の余地がある。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、密集した細胞群において、個々の細胞特異的な遺伝子操作を容易に行なうことができるベクターシステムの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）非依存的なテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）の漏れに注目し、ｔＴＡ／ＴＲＥの正のフィードバックシステムと部位特異的組み換えシステムを組み合わせることにより、密集した細胞群において、個々の細胞特異的な遺伝子操作を可能とすることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
（１）少なくとも一種のベクターを含むベクターシステムであって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子と、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子と、を含むことを特徴とするベクターシステム。
（２）前記第一の制御因子を含む第一のベクターと、前記第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含む前記（１）に記載のベクターシステム。
（３）前記外来性発現プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される少なくとも一種である前記（１）又は（２）に記載のベクターシステム。
（４）更に、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二の目的遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のベクターシステム。
（５）前記第三の制御因子は、更に前記外来性発現プロモーターの制御下にあるｔＴＡをコードする遺伝子を含む前記（４）に記載のベクターシステム。
（６）前記第三の制御因子を含む第三のベクターを含む前記（４）又は（５）に記載のベクターシステム。
（７）更に、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第三の目的遺伝子と、を含む第四の制御因子を含む前記（４）〜（６）のいずれか一つに記載のベクターシステム
（８）前記第四の制御因子を含む第四のベクターを含む前記（７）に記載のベクターシステム。
（９）前記第二の目的遺伝子は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子であり、前記第三の制御因子は、更に、ガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子を含む前記（４）〜（８）のいずれか一つに記載のベクターシステム。
（１０）前記第二の目的遺伝子は、ＴＡＬＥＮ  ｌｅｆｔであり、前記第三の目的遺伝子は、ＴＡＬＥＮ  ｒｉｇｈｔである前記（４）〜（８）のいずれか一つに記載のベクターシステム。
（１１）前記第二の目的遺伝子は、ＲＮＡｉ誘導性核酸である前記（４）〜（８）のいずれか一項に記載のベクターシステム。
（１２）前記ベクターは、ウイルスベクターである前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載のベクターシステム。
（１３）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、前記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載のベクターシステムを用いることを特徴とする遺伝子発現方法。
（１４）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を細胞に導入し、前記第一のベクターの導入量を調節することにより、第一の目的遺伝子が発現する細胞数を調節することを特徴とする遺伝子発現方法。
（１５）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある第一の部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第一のカセットと、前記第一のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、外来性発現プロモーター、第二の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第二の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第二のカセットと、前記第二のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二の目的遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を第二の部位特異的組み換え酵素発現細胞に導入することを特徴とする遺伝子発現方法。
（１６）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子をノックアウトする方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、  外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を前記部位特異的組み換え酵素認識配列、標的遺伝子、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む染色体を有する細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子ノックアウト方法。
（１７）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子をノックダウンする方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある第一の部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第一のカセットと、前記第一のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、外来性発現プロモーター、第二の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第二の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第二のカセットと、前記第二のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、ＲＮＡｉ誘導性核酸と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を第二の部位特異的組み換え酵素発現細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子ノックダウン方法。
（１８）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子を編集する方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子を含む第三のベクターと、を細胞に導入することを特徴とする標的遺伝子編集方法。
（１９）密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させるためのキットであって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含むことを特徴とする遺伝子発現キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、密集した細胞群において、個々の細胞特異的な遺伝子操作を容易に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（Ａ）本実施形態のベクターシステムに用いられるベクターセットの一例を示す模式図である。（Ｂ）本実施形態のベクターシステムがどのように動くかを示した模式図である。
【図２】（Ａ）Ｆｌｐｅ／ＦＲＴベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ  ＧＦＰ（Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰ）ベクターセットを導入した皮質ニューロンの切片の低倍率の蛍光画像である。（Ｂ）図２（Ａ）上段における四角ｄの高拡大の蛍光画像である。（Ｃ）図２（Ｂ）上段における長方形ｅの高拡大の蛍光画像である。（Ｄ）図２（Ｂ）上段における長方形ｆの高拡大の蛍光画像である。
【図３】（Ａ）Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰで標識された、Ｌ２／３の皮質ニューロンの蛍光画像である。（Ｂ）各月齢のマウスにおける疎ら度を示したグラフである。
【図４】（Ａ）Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰで標識された、Ｌ２／３の皮質ニューロンの蛍光画像である。（Ｂ）導入したＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターの終濃度における疎ら度を示したグラフである。
【図５】（Ａ）Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクターを導入したＥｍｘ１Ｃｒｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ＫＩ）マウスの皮質の蛍光画像である。（Ｂ）Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクター及びＣＡＧ−ＬＳＬ−ＲＦＰで標識したＥｍｘ１Ｃｒｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ＫＩ）マウスの皮質における標識メカニズムを示した図である。
【図６】（Ａ）ＦｌｐｅベースのＳｎＧＦＰ及びＳｎＲＦＰで標識された、皮質ニューロンの蛍光画像である。（Ｂ）ＣｒｅベースのＳｎＧＦＰ及びＳｎｎｌｓＲＦＰで標識された、皮質ニューロンの蛍光画像である。（Ｃ）ＣｒｅベースのＳｎＧＦＰ及びＰＳＤ９５−ＧＦＰで標識された、皮質ニューロンの蛍光画像である。
【図７】（Ａ）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介した遺伝子ノックアウトの模式図である。（Ｂ）ＳｎＲＦＰで標識した海馬ＣＡ１神経細胞における蛍光画像である。
【図８】（Ａ）α２−Ｃｈｎを発現する細胞のＤＡＰＩ染色細胞の対する割合を示すグラフである。（Ｂ）ＲＦＰ陽性細胞におけるα２−Ｃｈｎのシグナル強度、及びＲＦＰ陰性細胞におけるα２−Ｃｈｎのシグナル強度を示すグラフである。
【図９】（Ａ）１個の細胞レベルでのα２−Ｃｈｎの遺伝子編集のためにデザインしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図である。（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ α２−Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮベクターセットを用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬の蛍光画像である。
【図１０】（Ａ）図９（Ｂ）の拡大図を示す。（Ｂ）図９（Ｂ）の拡大図を示す。
【図１１】（Ａ）ＲＦＰ陰性細胞及びＲＦＰ陽性細胞（Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ α２−Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ発現細胞）における、α２−Ｃｈｎｈｉｇｈ、α２−Ｃｈｎｌｏｗ、及びα２−Ｃｈｎｎｅｇａｔｉｖｅの割合を示すグラフである。（Ｂ）マウスα２−Ｃｈｎ遺伝子におけるｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮ及びｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮが標的とする位置を示した模式図である。
【図１２】（Ａ）１個の細胞レベルでのＣｒｅｂ１の遺伝子操作のためにデザインしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図である。（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コントロール（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含まない。）を用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬ＣＡ１領域を示す蛍光画像である。（Ｃ）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−マウスＣｒｅｂ１を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＳｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｃｒｅｂ１）を用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬ＣＡ１領域を示す蛍光画像である。
【図１３】（Ａ）ＧＦＰ標識神経細胞におけるＣＲＥＢ陽性神経細胞とＣＲＥＢ陰性神経細胞の細胞数の割合を示すグラフである。（Ｂ）Ｃｒｅｂ１遺伝子座において見つけられた代表的な変異を示す模式図である。
【図１４】ＧＦＰ陽性神経細胞における標識されたＣｒｅ−ＳｎＲＦＰ及びＦｌｐｅ−ＳｎＲＦＰの割合を示すグラフである。
【図１５】１個の細胞における、興味ある遺伝子（ＧＯＩ）のノックダウンの為のＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図である。
【図１６】（Ａ）ＧＦＰ ＲＮＡｉ発現神経細胞における蛍光画像である。（Ｂ）ＲＦＰ陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合を示すグラフである。（Ｃ）ＬａｃＺＲＮＡｉ発現神経細胞における蛍光画像である。（Ｄ）ＳｎＡｍｃｙａｎ蛍光強度に対するβ−ｇａｌ活性の割合を示すグラフである。
【図１７】（Ａ）ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰベクターセットの模式図である。（Ｂ）〜（Ｄ）海馬ＣＡ１錐体神経細胞における蛍光画像である。（Ｅ）〜（Ｇ）大脳皮質第5層（Ｌ５）錐体神経細胞における蛍光画像である。（Ｈ）〜（Ｉ）海馬ＣＡ１錐体神経細胞における蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪ベクターシステム≫
本発明のベクターシステム（以下、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａともいう。）は、少なくとも一種のベクターを含むベクターシステムであって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子と、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子と、を含む。
【００１４】
本発明のベクターシステムは、第一の制御因子と第二の制御因子を含む一種のベクターを含むものでもよいが、発現効率の観点から、第一の制御因子を含む第一のベクターと、前記第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含むものが好ましい。
ベクターとしては、特に限定されず、プラスミドベクター、ウイルスベクター等、従来公知のものを用いることができる。後述する遺伝子導入法として、好ましく挙げられるｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎは、胎仔の脳に電気パルスを与えることによって遺伝子導入する。遺伝子導入から２日ほどで強い遺伝子発現が得られるため、発達期の脳の解析に最適である。一方、遺伝子発現は長く維持されるので、成体動物の解析に用いることもできるが、遺伝子導入から解析までの時間が長くなるので実験遂行上不便である。また、ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎは、大脳皮質の上層や海馬への遺伝子導入には最適であるが、脳の部位によっては遺伝子導入ができない、あるいは困難な個所もあるという不便がある。一方、後述するＡＡＶウイルスベクターは成体の神経細胞に直接遺伝子導入することによって、すべての脳の領域に用いることができる。一方、遺伝子導入から遺伝子発現まで1週間以上必要となるため、変化の速い発達期の解析には不適切なことが多い。
【００１５】
ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、等が挙げられ、毒性が少ないという観点から、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスベクターが好ましい。
以下、本発明の好ましい実施形態について図を参照しながら説明する。
【００１６】
［第一実施形態］
本実施形態のベクターシステムは、ＴＲＥと、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子（ＳＳＲ）と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列（ＲＴ）、転写終結配列（ｓｔｏｐ）、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列（ＲＴ）を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びｔＴＡをコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を含む。
【００１７】
外来性プロモーターとしては、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される少なくとも一種が好ましく、より強力に下流の遺伝子の発現を駆動する観点から、ＣＡＧプロモーターがより好ましい。このように、用いる外来性プロモーターに何らの制限がないため、本実施形態のベクターシステムは、神経細胞だけでなく、全ての細胞種に適用可能である。
また、転写終結配列としては、ポリＡ付加シグナル配列が挙げられる。
【００１８】
部位特異的組み換え酵素としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐｅ、Ｄｒｅ等が挙げられる。密集した細胞群において、より疎らに、個々の細胞特異的な遺伝子操作を行うという観点からは、Ｆｌｐｅが好ましい。部位特異的組み換え酵素としてＣｒｅに限定して用いる必要がないため、本実施形態のベクターシステムをＣｒｅ発現マウスと組み合わせて用いることができる。また、本実施形態のベクターシステムＣｒｅに依存しないシステムなので、Ｆｌｏｘマウスを使わなくても遺伝子発現制御ができる。
部位特異的組み換え酵素が認識する部位特異的酵素認識配列としては、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ 、ｒｏｘが挙げられる。
【００１９】
第一の目的遺伝子は、特に限定されないが、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、蛍光標識を疎らに行うことができる。これにより、細胞の形態分析等を容易かつ正確に行なえるようになる。
【００２０】
図１（Ａ）は、本実施形態のベクターシステムに用いられるベクターセットの一例を示す模式図である。図１（Ａ）に示されるように、本実施形態のベクターシステムは、一例として、ＴＲＥ−ＳＳＲ−ＷＰＲＥ−ｐＡ（ＴＲＥ−ＳＳＲ）とＣＡＧ−ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴ−ＸＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ−ｐＡ （ＣＡＧ−ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴ−ＸＦＰ−ｔＴＡ）を含む。
ここで、ＴＲＥは、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔを示し、ＳＳＲは、ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを示し、ＷＰＲＥは、ＷＨＰ ｐｏｓｔ−ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔを示し、ＲＴは、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅを示し、ＸＦＰは、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓを示し、ｉｒｅｓは、 ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅを示し、ｔＴＡは、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒを示す。
本実施形態のベクターシステムは、哺乳類の脳における疎らで明るい細胞標識と標識された細胞特異的な遺伝子操作を可能とする。
【００２１】
ＸＦＰ（蛍光タンパク質）としては、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ等の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）；ＥＢＦＰ等の青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｎ, ＢＦＰ ）； ＥＣＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ等のシアン蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＣＦＰ）；ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ等赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＲＦＰ）；ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ等の黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＹＦＰ）、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ等の橙色蛍光タンパク質、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ等の赤外光の蛍光を発する蛍光タンパク質が挙げられる。
【００２２】
図１（Ｂ）は、本実施形態のベクターシステムがどのように動くかを示した模式図である。第一に、ＴＲＥ−ＳＳＲ及びＣＡＧ−ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴ−ＸＦＰ−ｔＴＡを導入された多くの細胞のうち、ごく少数の細胞において、ＴＲＥの漏れが非常に弱い部位特異的組み換え酵素（以下、ＳＳＲともいう。）の発現を駆動する。第二に、この低レベルのＳＳＲが、数コピーのＣＡＧ−ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴ−ＸＦＰ−ｔＴＡベクターにおいて、ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴカセットを切り出し、若干ではあるが、ＸＦＰ（以下、蛍光タンパク質ともいう。）とｔＴＡの転写を開始している。第三に、ＴＲＥとの結合を介して、ｔＴＡは、ＳＳＲの発現を促進する。第四に、多くのコピー数のＣＡＧ−ＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴ−ＸＦＰ−ｔＴＡベクターからＲＴ−ｓｔｏｐ−ＲＴカセットが切り出され、ＸＦＰとｔＴＡの発現が増加する。この正のｔＴＡ／ＴＲＥループの促進が、初期の閾値を超えたＴＲＥの漏れを有する少数の細胞においてのみ、ＳＳＲとＸＦＰの非常に高レベルの発現を誘導する。
【００２３】
［第二実施形態］
本実施形態のベクターシステムは、上述した第一のベクターと、上述した第二のベクターと、外来性発現プロモーター、ＲＴ、ｓｔｏｐ、及びＲＴを５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある第二の目的遺伝子及びｔＴＡをコードする遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を含む。
【００２４】
本実施形態において、第二のベクターと第三のベクターは、外来性発現プロモーターの制御下にある目的遺伝子が異なるのみで、他の構成は同じである。第二の目的遺伝子は、特に限定されない。第一の目的遺伝子及び第二の目的遺伝子をそれぞれ異なる蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、多重蛍光標識を疎らに行うことができる。
例えば、第一のベクターとして、ＴＲＥ−Ｆｌｐｅを用い、第二のベクターとして、ＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＧＦＰ−ｔＴＡを用い、第三のベクターとして、ＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｔＴＡを用いた場合、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、ＧＦＰとＲＦＰの多重標識を疎らに行うことができる。
【００２５】
［第三実施形態］
本実施形態のベクターシステムは、上述した第一のベクターと、上述した第二のベクターと、外来性発現プロモーター、ＲＴ、ｓｔｏｐ、及びＲＴを５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二Ａの目的遺伝子と、を含む第三Ａの制御因子を含む第三Ａのベクターと、を含む。
【００２６】
本実施形態において、第三Ａのベクターは、ｔＴＡを有しない以外は、第二のベクターと同じである。例えば、第一のベクターとして、ＴＲＥ−Ｃｒｅを用い、第二のベクターとして、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＧＦＰ−ｔＴＡを用い、第三Ａのベクターとして、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−第二Ａの目的遺伝子を用いた場合、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、ＧＦＰ標識を疎らに行うことができ、ＧＦＰ発現細胞内でのみ、第二Ａの目的遺伝子の発現を確認することができる。
【００２７】
第二Ａの目的遺伝子としては、特に限定されず、例えば、ゲノム編集に関する因子をコードする遺伝子であってもよい。係る場合、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、蛍光標識を疎らに行うことができ、蛍光標識された細胞内でのみ、ゲノム編集されたことによる表現型の解析をすることができる。
【００２８】
ゲノム編集法としては、例えばＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが使用できる。このうちＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いるのがより好ましい。
【００２９】
ＴＡＬＥＮシステムは、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）を用いるシステムであり、ＴＡＬＥＮはカスタム化されたＤＮＡ結合ドメインと非特異的なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとを融合させたものである。ＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナスのプロテオバクテリアが分泌し、宿主植物の遺伝子転写を変えさせるタンパク質であるｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ（ＴＡＬＥ）由来の保存されたリピートからなっている。
ＴＡＬＥＮシステムにより、遺伝子をノックインするには、ゲノム中の挿入部位に対するＴＡＬＥＮを作製し、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。これらを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用した相同組み換え修復により、目的外来ＤＮＡが導入される。
ＴＡＬＥＮシステムにより、遺伝子をノックアウトするには、ドナーベクターを共導入しなければよい。
【００３０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入した核酸（ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより、遺伝子をノックインするには、ゲノム中の挿入部位を切断するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクター作製を行う。第二Ａの目的遺伝子として、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合、第三Ａの制御因子は、目的部位にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子が必要である。第五の制御因子は、例えば、第三Ａのベクター内に、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と共に組み込まれていてもよいし（図６（Ａ）参照。）、別個のベクターに組み込まれていてもよい。これらベクターをドナーベクターと共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用した相同組み換え修復により、目的外来ＤＮＡが導入される。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより、遺伝子をノックアウトするには、ドナーベクターを共導入しなければよい。
【００３１】
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムは、ＺｎフィンガードメインとＤＮＡ切断ドメインからなる人工制限酵素を用いたゲノム編集である。一つのＺｎフィンガードメインは３塩基を認識するが、３〜５つのＺｎフィンガードメインを連結させることで、特定の９〜１５塩基配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質を設計できる。このＤＮＡ結合タンパク質に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを融合させることで、目的部位を切断する人工ヌクレアーゼＺＦＮを設計する。
ＺＦＮシステムにより、遺伝子をノックインするには、ゲノム中の挿入部位に対するＺＦＮを作製し、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。これらを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨ相同組み換え修復により、目的外来ＤＮＡが導入される。
ＺＦＮシステムにより、遺伝子をノックアウトするには、ドナーベクターを共導入しなければよい。
【００３２】
また、第二Ａの目的遺伝子としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得る核酸を意味する。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡ（又はその部分配列）に相補する塩基配列を含むＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。
ＲＮＡｉ誘導性核酸が標的とするｍＲＮＡは、コーディング領域であっても、ノンコーディング領域であってもよい。また、ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが挙げられる。細胞内に導入され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすベクターとしては、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ／ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現ベクターが挙げられる。
係る場合、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、蛍光標識を疎らに行うことができ、蛍光標識された細胞内でのみ、ＲＮＡ干渉を受けたことによる表現型の解析をすることができる。
【００３３】
［第四実施形態］
本実施形態のベクターシステムは、上述した第一のベクターと、上述した第二のベクターと、上述した第三Ａのベクターと、外来性発現プロモーター、ＲＴ、ｓｔｏｐ、及びＲＴを５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第三の目的遺伝子と、を含む第四の制御因子を含む第四のベクターと、を含む。
【００３４】
本実施形態において、第三Ａのベクターと第四のベクターは、外来性発現プロモーターの制御下にある目的遺伝子が異なるのみで、他の構成は同じである。第三の目的遺伝子は、特に限定されない。第一の目的遺伝子として、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用い、第二Ａの目的遺伝子及び第三の目的遺伝子として、それぞれ異なるタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、密集した細胞群において、１個の細胞レベルにおいて、蛍光標識を疎らに行うことができ、蛍光標識された細胞内でのみ、二種類の異なる遺伝子を発現させたことによる表現型の解析をすることができる。
また、上述したＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔとＴＡＬＥＮ ｒｉｇｈｔのペアとして、標的ＤＮＡの反対鎖にそれぞれ結合する必要がある。例えば、第一のベクターとして、ＴＲＥ−Ｆｌｐｅを用い、第二のベクターとして、ＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｔＴＡを用い、第三Ａのベクターとして、ＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＴＡＬＥＮ ｌｅｆｔを用い、第四のベクターとして、ＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＴＡＬＥＮｒｉｇｈｔを用いた場合、密集した細胞群において、蛍光標識を疎らに行うことができ、蛍光標識された細胞内でのみ、ゲノム編集を受けたことによる表現型の解析をすることができる。
【００３５】
≪組成物又は遺伝子発現キット≫
また、本発明は、ベクターシステムの［第一実施形態］で説明した第一のベクターと第二のベクターを含む組成物又は遺伝子発現キットを提供する。
【００３６】
≪遺伝子発現方法≫
本発明の遺伝子発現方法は、上述したベクターシステムを用いて密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法である。
遺伝子導入方法としては、特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。遺伝子導入対象を培養細胞のみならず、非ヒト動物とする場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎが好ましく、遺伝子導入対象をマウスとする場合には、ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（以下、ＩＵＥともいう。）が好ましい。ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎは、子宮の外からＤＮＡなどを注入し、子宮の外側を電極で挟むことで電気穿孔する方法であり、マウス胎仔の生体内電気穿孔法として一般的である。ＩＵＥをベースとした方法は、実験上の進展が早い。ＩＵＥは、多くの脳領域と全ての神経細胞に応用可能である。故に、ＩＵＥをベースとしたアプローチは、純粋なマウス遺伝学的アプローチに対して多くの利点を有している。ＩＵＥは一般的に遺伝子導入した脳領域において非常に密に標識しすぎるが、本発明の遺伝位発現方法により１個の細胞の遺伝子発現を可能とする。
【００３７】
遺伝子導入対象としては、培養細胞や非ヒト動物等、特に限定されない。非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に制限されないが、哺乳類であることが好ましく、げっ歯類（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）であることがより好ましい。哺乳類に分類される動物としては、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等が挙げられる。げっ歯類に分類される動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。
本発明の遺伝子発現方法は、密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させることができることから、神経細胞の形態解析に好適に用いられる。
【００３８】
また、本発明の遺伝子発現方法は、密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を細胞に導入し、前記第一のベクターの導入量を調節することにより、第一の目的遺伝子が発現する細胞数を調節する方法である。
【００３９】
実施例において後述するように、本発明によれば、導入するベクターの量を調節することにより、密集した細胞群において、目的遺伝子を発現する細胞の疎ら度を調節することができる。
【００４０】
また、本発明の遺伝子発現方法は、密集した細胞群において、個々の細胞特異的に目的遺伝子を発現させる方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある第一の部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第一の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第一のカセットと、前記第一のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第一の目的遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、外来性発現プロモーター、第二の部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記第二の部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む第二のカセットと、前記第二のカセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、第二の目的遺伝子と、を含む第三の制御因子を含む第三のベクターと、を第二の部位特異的組み換え酵素発現細胞に導入する方法である。
【００４１】
例えば、Ｃｒｅ発現Ｔｇマウスに、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰベクター、ＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクター、及びＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＧＦＰ−ＦＲＴ−ＧＦＰ−ｔＴＡを導入することにより、密集した細胞すべてにＲＦＰを発現させる一方で、ＧＦＰを疎らに発現させることができる。
【００４２】
≪標的遺伝子ノックアウト方法≫
本発明の標的遺伝子ノックアウト方法は、密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子をノックアウトする方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、を前記部位特異的組み換え酵素認識配列、標的遺伝子、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含む染色体を有する細胞に導入する方法である。
【００４３】
例えば、ｌｏｘＰで挟まれた標的遺伝子を含む染色体を有するマウスに、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｔＴＡベクター、及びＴＲＥ−Ｃｒｅベクターを導入することにより、ＲＦＰを疎らに発現させた細胞中においてのみ標的遺伝子をノックアウトすることができる。
【００４４】
≪標的遺伝子編集方法≫
本発明の標的遺伝子編集方法は、密集した細胞群において、個々の細胞特異的に標的遺伝子を編集する方法であって、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と、前記ＴＲＥの制御下にある部位特異的組み換え酵素をコードする遺伝子と、を含む第一の制御因子を含む第一のベクターと、外来性発現プロモーター、前記部位特異的組み換え酵素認識配列、転写終結配列、及び前記部位特異的組み換え酵素認識配列を５’側からこの順で含むカセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、蛍光タンパク質をコードする遺伝子及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードする遺伝子と、を含む第二の制御因子を含む第二のベクターと、前記カセットと、前記カセットの下流に位置し、前記外来性発現プロモーターの制御下にある、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡを含む一種以上の遺伝子が作動可能に連結された第五の制御因子を含む第三のベクターと、を細胞に導入する方法である。
【００４５】
例えば、ＴＲＥ−Ｃｒｅベクター、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＧＦＰ−ｔＴＡベクター、及びＵ６−ｓｇＲＮＡ−ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−Ｃａｓ９を細胞に導入することにより、ＧＦＰを疎らに発現させた細胞中においてのみ標的遺伝子を編集することができる。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実施例１］
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａシステムの幅広い活用を可能とするために、発明者らは、体系的かつ包括的にＳｕｐｅｒｎｏｖａによる標識の性質を評価した。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａによる標識の疎ら具合と明度を見積もるため、発明者らは、第２／３層（Ｌ２／３）の皮質ニューロンに、Ｆｌｐｅ／ＦＲＴベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ  ＧＦＰ（Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰ）ベクターセット（ＴＲＥ−ＦｌｐｅとＣＡＧ−ＦＲＴ−ｓｔｏｐ−ＦＲＴ−ＧＦＰ−ｔＴＡ）を胎生期１５．５（Ｅ１５．５）に、ｉｎ  ｕｔｅｒｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（以下、ＩＵＥともいう。）により導入した（図１（Ａ）参照。）。出生後日数２２（Ｐ２２）のマウスの脳から冠状切片を作製し、蛍光観察を行った。図２（Ａ）上段は、低倍率の蛍光画像を示す。遺伝子導入した神経細胞のうち、疎らな小集団がＧＦＰ陽性であった（１．２％±０．２％、ｎ＝５マウスを用いた。）。図２（Ｂ）上段は、図２（Ａ）上段における四角ｄの高拡大の蛍光画像を示す。図２（Ａ）下段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、５０μｍを示す。図２（Ｂ）下段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示す。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）は、図２（Ｂ）上段における長方形ｅ、ｆの高拡大の蛍光画像を示す。図２（Ｃ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１０μｍを示す。図２（Ｄ）上段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、５０μｍを示す。図２（Ｄ）下段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１０μｍを示す。
図２（Ｂ）に示される標識されたＬ２／３錐体神経細胞（樹状突起棘（図２（Ｃ）参照。）、軸索枝（図２（Ｄ）上段参照。）、軸索ボタン（図２（Ｄ）下段参照。）を含む。）の形態を十分視覚化できるほど、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａによる標識は、明るいことが確認された。
また、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰとともに導入されたＣＡＧ−ＲＦＰは、密集した多くの細胞内で発現が確認される一方、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰは、１個の細胞レベルで疎らな発現が確認された。
【００４８】
［実施例２］
発明者らは異なる発生段階及び成体期において、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰとＣＡＧ−ＲＦＰを共に遺伝子導入することにより、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａによる標識の疎らさを定量的に評価した。全ての遺伝子導入細胞を標識するため、ＣＡＧ−ＲＦＰを、ＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターと共に導入した。Ｐ８、Ｐ２２、２か月齢（２Ｍ）、４Ｍのマウスの脳から冠状切片を作製し、蛍光観察を行い、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰ陽性神経細胞とＲＦＰ陽性神経細胞との比率を評価した。図３（Ａ）は、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰで標識された、Ｌ２／３の皮質ニューロンの蛍光画像を示す。導入に用いたＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターの終濃度は、５ｎｇ／μＬだった。蛍光画像の下の数字は、各月齢でのＦｌｐｅ−ＳｎＧＦＰラべリングの疎ら度を示す（Ｐ８、Ｐ２２、２Ｍのマウスにおいては、ｎ＝５で算出した。４Ｍのマウスにおいては、ｎ＝３で算出した。）。疎ら度は、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰ陽性細胞数の遺伝子導入細胞であるＲＦＰ陽性細胞数に対する比として算出された。図３（Ｂ）は、各月齢のマウスにおける疎ら度を示したグラフである。各菱形は、一個体を示す。バーは、平均値を示す。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａラべリングの疎らさと明るさは、初期の出生後段階から成人期にかけて一定であることが確認された。図３のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示す。
【００４９】
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａベクター組成物におけるＴＲＥ−ＳＳＲベクターの濃度を変えることにより、標識の疎らさを調節できる可能性がある。この可能性を確かめるため、異なる濃度のＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクター（５、５０、５００ｎｇ／μＬ）を含むＦｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクター組成物を用意し、各組成物をＥ１５．５にＩＵＥを用いて、Ｌ２／３の皮質ニューロンに導入した。ＣＡＧ−ＲＦＰは、遺伝子導入した神経細胞を標識するために、共導入した。図４（Ａ）は、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰで標識された、Ｌ２／３の皮質ニューロンの蛍光画像を示す。導入したＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターの終濃度は、それぞれ５ｎｇ／μＬ（図４（Ａ）左）、５０ｎｇ／μＬ（図４（Ａ）中央）、５００ｎｇ／μＬ（図４（Ａ）右）であった。Ｐ８のマウスの脳から冠状切片を作製した。図４（Ｂ）は、導入したＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターの終濃度における疎ら度を示したグラフである（各グループのマウスにおいて、ｎ＝５で算出した。）。各菱形は、一個体を示す。バーは、平均値を示す。５ｎｇ／μＬのＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターを用いたとき、非常に少ないＲＦＰ陽性神経細胞がＳｎＧＦＰで標識された（１．４±０．１％、ｎ＝５のマウスを用いた。）。５０ｎｇ／μＬのＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターを用いたとき、およそ半分のＲＦＰ陽性神経細胞がＳｎＧＦＰで標識された（４８．０±５．４％、ｎ＝５のマウスを用いた。）。５００ｎｇ／μＬのＴＲＥ−Ｆｌｐｅベクターを用いたとき、ほぼ全てのＲＦＰ陽性神経細胞がＳｎＧＦＰで標識された（９８．７±２．５％、ｎ＝５のマウスを用いた。）。
これらのデータから、ＴＲＥ−ＳＳＲベクターの濃度を変えることにより、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａにより標識された神経細胞の疎らさを調節可能であることが確認された。図４のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示す。
【００５０】
［実施例３］
今日、多くのＣｒｅ発現マウス系統が報告され、領域特異的又は細胞種特異的なノックアウトマウスを作製することにより、脳の理解に貢献している。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａが、Ｃｒｅ発現脳領域に適用可能かどうかを調べるため、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクターをＥｍｘ１Ｃｒｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ＫＩ）マウスの皮質に導入した。組み換えを示すものとして、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｐＡ（ＣＡＧ−ＬＳＬ−ＲＦＰ）ベクターを、Ｅｍｘ１Ｃｒｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ＫＩ）マウスの皮質に共導入したところ、神経細胞は、密に標識されることが確認された。一方、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクターをＣＡＧ−ＬＳＬ−ＲＦＰと共に導入したところ、少数の皮質ニューロンのみがＧＦＰで標識され、ＳｎＧＦＰ標識神経細胞の樹状突起の形態が鮮明に可視化されたことが確認された（図５（Ａ）参照。）。ＤｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａ ＧＦＰ（Ｄｒｅ−ＳｎＧＦＰ）ベクターセット（ＴＲＥ−Ｄｒｅ及びＣＡＧ−ｒｏｘ−ｓｔｏｐ−ｒｏｘ−ｔＴＡ）においても同様の結果を示した。ＩＵＥは、Ｅ１４．５で行われ、Ｐ８で脳を解体し、冠状切片を作製した。図５（Ｂ）は、Ｆｌｐｅ−ＳｎＧＦＰベクター及びＣＡＧ−ＬＳＬ−ＲＦＰで標識した神経細胞における標識メカニズムを示した図である。Ｆｌｐｅ／ＦＴＲ及びＤｒｅ／ＲｏｘをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａシステムにおいては、Ｃｒｅ発現マウスにおける神経細胞の疎らな標識が可能であることが確認された。図５のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示す。
【００５１】
［実施例４］
疎らな細胞集団における遺伝子の同時多重発現が可能かどうかを確かめるため、ＦｌｐｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａを用いて、ＲＦＰ及びＧＦＰを高い共発現効率で発現させることにより、神経細胞を疎らに標識した。具体的には、ＳｎＧＦＰ及びＳｎＲＦＰを、Ｅ１５．５に、ＩＵＥを用いて皮質ニューロンに共に導入した（ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ、ＣＡＧ−ＦＳＦ−ＧＦＰ−ｔＴＡ、及びＣＡＧ−ＦＳＦ−ＲＦＰ−ｔＴＡ）。Ｐ８で脳を解体し、冠状切片を作製し、蛍光観察を行った（図６（Ａ）参照）。Ｐ８で、ほとんどの標識された神経細胞はＧＦＰ及びＲＦＰの両方を発現することが確認された（ＲＦＰ／ＧＦＰ＝５１／５３細胞、ＧＦＰ／ＲＦＰ＝５１／５１細胞。ｎ＝５のマウスを用いた。）。
ＣｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａシステムを用いて、核移行シグナルを融合させたＲＦＰ（ＳｎｎｌｓＲＦＰ）、及びＧＦＰ（ＳｎＧＦＰ）を、皮質ニューロンに、疎らに共発現させた。Ｐ４で脳を解体し、冠状切片を作製し、蛍光観察を行った（図６（Ｂ）参照。）。
また、ＣｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａシステムを用いて、Ｅ１４．５にＳｎＲＦＰ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ  ＰＳＤ（シナプス後肥厚部タンパク質）９５−ＧＦＰ（ＳｎＰＳＤ９５−ＧＦＰ）をＩＵＥによりＰ１６体性感覚皮質に遺伝子挿入し、接線方向の切片を作製し、蛍光観察を行った。図６（Ｃ）上は、低倍率の蛍光像を示し、図６（Ｃ）下は、図６（Ｃ）上の四角形の高倍率拡大像を示す。樹状突起棘は、ＲＦＰ及びＰＳＤ９５−ＧＦＰで共標識された。図６（Ａ）及び（Ｂ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示し、図６（Ｃ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、２５μｍを示す。
実施例４によれば、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを用いることにより、複数の蛍光タンパク質による１個の細胞の多重染色が可能であることが確認された。
【００５２】
［実施例５］
発明者らは、系統的かつ定量的に、マウスにおけるｌｏｘＰが導入された内在性遺伝子のノックアウトにおける、ＣｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａの効率及び特異性を分析した。ｌｏｘＰが導入されたマウスを用いて、ＣｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａを介して、標識した細胞特異的に遺伝子をノックアウトした。図７（Ａ）は、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介した遺伝子ノックアウトの模式図を示す。
ＳｎＲＦＰで標識した海馬ＣＡ１神経細胞における１個の細胞において、ｌｏｘＰに挟まれたα２−Ｃｈｉｍａｅｒｉｎ（以下、α２−Ｃｈｎともいう。）のノックアウトを行った（図７（Ｂ）参照。）。Ｅ１４．５にＣｒｅ−ＳｎＲＦＰベクターセットを、ＩＵＥによりα２−Ｃｈｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの海馬ＣＡ１領域に導入した。Ｐ１４で脳を解体し、冠状切片を作製し、α２−Ｃｈｎの免疫組織学的解析とＤＡＰＩ染色を行い、蛍光観察を行った。図７（Ｂ）上段は、α２−Ｃｈｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの海馬を示す。拡大した蛍光像を図７（Ｂ）中段に示す。矢印は、Ｃｒｅ−ＳｎＲＦＰ標識ＣＡ１神経細胞を示す。図７（Ｂ）上段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、５００μｍを示し、下段のＳｃａｌｅ ｂａｒは、１００μｍを示す。
次いで、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ依存的α２−Ｃｈｎノックアウト効率を定量化した。図８（Ａ）は、α２−Ｃｈｎを発現する細胞のＤＡＰＩ染色細胞の対する割合を示す。α２−Ｃｈｎの発現は、ほぼ全てのＳｎＲＦＰ陰性ＣＡ１海馬細胞において検出された（９７．７％±０．１％、ｎ＝３マウス）。一方、ＳｎＲＦＰ陽性ＣＡ１海馬細胞における割合は、５．９％±３．０％（ｎ＝３マウス）であった。全ての値を、平均±標準誤差で示した。（＊＊）は、ウエルチのｔ検定により０．００１＜Ｐ＜０．０１を示す。
次いで、ＲＦＰ陽性細胞におけるα２−Ｃｈｎのシグナル強度、及びＲＦＰ陰性細胞におけるα２−Ｃｈｎのシグナル強度を測定した（図８（Ｂ）参照。）（ｎ＝１４細胞。各群において３マウスを用いた。）。バーは平均値を示す。（＊＊＊）は、ウエルチのｔ検定によりＰ＜０．００１を示す。ＳｎＲＦＰで標識したα２−Ｃｈｎ陽性神経細胞においても、α２−Ｃｈｎの発現量は、ＲＦＰ陰性細胞と比較して非常に低かった。
これらのことから、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａによって誘導される遺伝子ノックアウトの特異性及び効率は極めて高く、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａは、ｌｏｘＰが導入されたマウスを用いたコンディショナルな遺伝子ノックアウトに最適であることが確認された。
【００５３】
［実施例６］
効率よく遺伝子の発現抑制を行うため、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＴＡＬＥＮによる野生型マウスにおける標識した細胞特異的な遺伝子編集を行った。図９（Ａ）は、１個の細胞レベルでのα２−Ｃｈｎの遺伝子編集のためにデザインしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図を示す。図９（Ｂ）は、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ α２−Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮベクターセットを用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬の蛍光画像を示す。更にその拡大画像を図１０に示す。図９（Ｂ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、２５０μｍを示す。
Ｐ１４の海馬のＣＡ１において、ほとんどのＲＦＰ陰性神経細胞は、高レベルのα２−Ｃｈｎを発現している（図１０（Ａ）、Ｅｘａｍｐｌｅ  ｉｍａｇｅ  ｓｅｔ１中、Ｃｅｌｌ３参照。）。一方、ほとんどのＲＦＰ陽性神経細胞（Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ α２−Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ発現細胞）において、α２−Ｃｈｎタンパク質の発現は検出されなかった（図１０（Ａ）、Ｅｘａｍｐｌｅ  ｉｍａｇｅ  ｓｅｔ１中、Ｃｅｌｌ１参照。）。しかしながら、極わずかのＲＦＰ陽性神経細胞は、非常に低レベルながらもα２−Ｃｈｎタンパク質の発現を示した（図１０（Ｂ）、Ｅｘａｍｐｌｅ  ｉｍａｇｅ  ｓｅｔ２中、Ｃｅｌｌ２参照。）。図１０（Ａ）及び（Ｂ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、２０μｍを示す。
発明者らは、海馬ＣＡ１領域におけるＤＡＰＩ染色細胞を抗α２−Ｃｈｎ抗体による染色シグナルの強度に応じて、α２−Ｃｈｎｈｉｇｈ、α２−Ｃｈｎｌｏｗ、及びα２−Ｃｈｎｎｅｇａｔｉｖｅの３グループに分類した。図１１（Ａ）は、ＲＦＰ陰性細胞及びＲＦＰ陽性細胞（Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ α２−Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ発現細胞）における、α２−Ｃｈｎｈｉｇｈ、α２−Ｃｈｎｌｏｗ、及びα２−Ｃｈｎｎｅｇａｔｉｖｅの割合を示す。ＳｎＲＦＰ標識細胞の７６．０％±６．０％（ｎ＝３マウス。）が、２−Ｃｈｎｎｅｇａｔｉｖｅ細胞であった。α２−Ｃｈｎｈｉｇｈ細胞は存在せず、残りは、α２−Ｃｈｎｌｏｗ細胞であった。一方、ＲＦＰ陽性細胞において、α２−Ｃｈｎｈｉｇｈ細胞及びα２−Ｃｈｎｌｏｗ細胞は、それぞれ９５．１％±０．５％、３．２％±０．１％（ｎ＝３マウス。）であった。α２−Ｃｈｎを標的とするＴＡＬＥＮ発現細胞において、α２−Ｃｈｎタンパク質レベルは、劇的に減少していた。このことから、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＴＡＬＥＮは、野生型マウスのＣＡ１錐体神経細胞において、α２−Ｃｈｎの発現を首尾よく阻害できることが確認された。
α２−Ｃｈｎを標的とするＴＡＬＥＮを介したゲノム編集を確かめるため、発明者らは、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したα２−ＣｈｎＴＡＬＥＮベクターを、Ｅ１４．５にＩＵＥにより導入したＰ１脳からｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）により蛍光標識した細胞を集めた。次いで、ＦＡＣＳでソーティングした２００細胞のプールから標的遺伝子座をＰＣＲにより増幅し、プラスミドに導入しクローニングを行った。１３のクローン中、１２クローンが変異（３パターン）を有しており、１クローンは野生型の配列であった。実験を繰り返すことにより、合計９個の変異パターンが同定された（図１１（Ｂ）参照。）。
図１１（Ｂ）は、マウスα２−Ｃｈｎ遺伝子におけるｌｅｆｔ  ＴＡＬＥＮ及びｒｉｇｈｔ  ＴＡＬＥＮが標的とする位置を示した模式図である。図１１（Ｂ）中、破線はスペーサー領域を示す（１７ｂｐ）。α２−Ｃｈｎ遺伝子座における変異パターンを下部に示す。
これらのデータから、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＴＡＬＥＮによって誘導される、内在性遺伝子のゲノム編集は、非常に効率が良いことが確認された。
【００５４】
［実施例７］
次いで、発明者らは、他のゲノム編集技術として、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による野生型マウスにおける標識した細胞特異的な遺伝子編集を行った。図１２（Ａ）は、１個の細胞レベルでのＣｒｅｂ１の遺伝子操作のためにデザインしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図を示す。ＩＵＥで用いられるベクターの数を減らすため、発明者らは、１個のベクターから、ｈＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するｐＸ３３０ベクターを用いた。Ｃｒｅ依存性を持たせるため、このベクターにＬＳＬカセットを挿入した（図１２（Ａ）参照。Ｕ６−ＳｇＲＮＡ−ＣＡＧ−ＬＳＬ−Ｃａｓ９）。このベクターをＴＲＥ−ＣｒｅとＣＡＧ−ＬＳＬ−ＧＦＰ−ｔＴＡベクターと共に、Ｅ１４．５にＩＵＥを用いて、海馬ＣＡ１錐体神経細胞に導入した。そして、免疫組織学的解析により、Ｐ８のマウスの海馬におけるＣＲＥＢタンパク質の発現を調べた。Ｐ８で脳を解体し、冠状切片を作製し、ＣＲＥＢの免疫組織学的解析とＤＡＰＩ染色を行い、蛍光観察を行った。図１３（Ａ）は、ＧＦＰ標識神経細胞におけるＣＲＥＢ陽性神経細胞とＣＲＥＢ陰性神経細胞の細胞数の割合を示す。
図１２（Ｂ）は、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コントロール（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含まない。）を用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬ＣＡ１領域を示す。図１２（Ｃ）は、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−マウスＣｒｅｂ１を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＳｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｃｒｅｂ１）を用いて遺伝子導入した野生型マウスの海馬ＣＡ１領域を示す。図中、ＣＲＥＢは、Ｃｒｅｂ１の遺伝子産物を示し、野生型マウスの脳の海馬ＣＡ１領域において広範囲に強く発現している。図１２（Ｂ）に示されるように、ＣＲＥＢの発現は、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コントロールを発現する全てのＧＦＰ陽性細胞において確認された（１１１細胞中、１１１細胞。３マウス使用。図１２（Ｂ）の矢印参照。）。
一方、図１２（Ｃ）上段に示されるように、ＣＲＥＢの発現は、ＳｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｃｒｅｂ１を発現するほとんどのＧＦＰ陽性細胞において特異的に欠損していることが確認された。（８５細胞中、８３細胞。３マウス使用。図１２（Ｃ）上段の矢印参照。）。
また、図１２（Ｃ）下段に示されるように、極わずかな例外も確認された（８５細胞中、２細胞。図１２（Ｃ）下段の矢印参照。）。図１２（Ｂ）及び（Ｃ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、５０μｍを示す。
最後に発明者らは、ＦＡＣＳによりソーティングしたＧＦＰ陽性細胞におけるＣｒｅｂ１の編集を、３００細胞のプールから標的遺伝子座をＰＣＲにより増幅し、プラスミドに導入しクローニングを行った。シーケンス解析により、１２のクローン中、７個の変異パターンが同定された（図１３（Ｂ）参照。）。野生型のクローンは同定されなかった。
図１３（Ｂ）は、Ｃｒｅｂ１遺伝子座において見つけられた代表的な変異を示す。ｓｇＲＮＡの標的位置を太線で示した。ＰＡＭ配列を陰影で示す。対応する変異パターンを示すクローンの数を右に示す。
これらのデータから、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの１個の細胞特異的な遺伝子のノックアウトを非常に効率よく行えることが確認された。
【００５５】
［実施例８］
Ｃｒｅ−ＳｎＲＦＰとＦｌｐｅ−ＳｎＲＦＰの性能を比較するため、Ｅ１５．５に、終濃度５ｎｇ／μＬのＦｌｐｅ−ＳｎＲＦＰ及びＣｒｅ−ＳｎＲＦＰのそれぞれを、ＩＵＥにより皮質ニューロンに遺伝子導入した。遺伝子導入細胞を示すために、ＣＡＧ−ＧＦＰを共発現させた。
その結果、図１４に示すように、Ｐ６にＧＦＰ陽性神経細胞の１４．８％±３．３％（ｎ＝４のマウスを用いた。）がＣｒｅ−ＳｎＲＦＰによって標識された。一方、Ｆｌｐｅ−ＳｎＲＦＰを標識に用いた場合、標識された割合は、１．９％±０．２％（ｎ＝４のマウスを用いた。）であった。全ての値を、平均±標準誤差で示した。バーは平均値を示す。（＊＊）は、ウエルチのｔ検定により０．００１＜Ｐ＜０．０１を示す。神経細胞の標識においては、Ｃｒｅ−ＳｎＲＦＰと比較して、Ｆｌｐｅ−ＳｎＲＦＰは、より良い疎らさを示すことが確認された。
【００５６】
［実施例９］
ｌｏｘＰを導入したマウスを用いなくとも疎に標識した細胞特異的な遺伝子操作を達成するために、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＲＮＡｉによる野生型マウスにおける標識した細胞特異的な遺伝子のノックダウンを行った。
図１５は、１個の細胞における、興味ある遺伝子（ＧＯＩ）のノックダウンの為のＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターセットの模式図を示す。ＧＯＩに対するｓｈＲＮＡを、Ｃｒｅ依存的なｓｈＲＮＡ発現ベクターであるＣＡＧ−ＬＳＬ−ｍｉｒ３０により発現させた。
Ｅ１４．５に、ＣＡＧ−ＬＳＬ−ｍｉｒ３０（ＧＦＰ  ＲＮＡｉのスクランブルの配列；左パネル）又はＣＡＧ−ＬＳＬ−ｍｉｒ３０（ＧＦＰ  ＲＮＡｉ；右パネル）をＳｕｐｅｒｎｏｖａ  ｎｌｓＲＦＰ（Ｓｎ−ｎｌｓＲＦＰ）と共に、ＩＵＥにより、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰ−ＧＦＰレポーターマウスの皮質に導入した。脳をＰ８で回収し、切片を作製してＧＦＰ抗体を用いて染色した（図１６（Ａ）参照。）ＧＦＰ ＲＮＡｉ発現神経細胞におけるＧＦＰシグナルは、ＧＦＰ  ＲＮＡｉのスクランブルの配列を発現する細胞におけるシグナルより遥かに低かった（図１６（Ｂ）参照。）。ＧＦＰのノックダウン効率は、ｎｌｓＲＦＰによって補正した相対的なＧＦＰの蛍光強度によって決定した。（＊＊）は、ウエルチのｔ検定により０．００１＜Ｐ＜０．０１を示す。
また、Ｅ１４．５に、ＣＡＧ−ＬＳＬ−ｍｉｒ３０（ＬａｃＺ  ＲＮＡｉのスクランブルの配列；左パネル）又はＣＡＧ−ＬＳＬ−ｍｉｒ３０（ＬａｃＺ  ＲＮＡｉ；右パネル）をＳｎＡｍｃｙａｎと共に、ＩＵＥにより、Ｒｏｓａ−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｎｌｓＬａｃＺ（ＲＮＺ）レポーターマウスの皮質に導入した。脳をＰ８で採取し、切片を作製して抗β−Ｇａｌ抗体を用いて染色した（図１６（Ｃ）参照。）。
ＬａｃＺのノックダウン効率は、抗β−Ｇａｌ抗体のＡｍｃｙａｎに対する蛍光強度の比として定量した。β−Ｇａｌの発現レベルは、ＬａｃＺ  ＲＮＡｉスクランブル配列を共発現させたＳｎＡｍｃｙａｎで標識した神経細胞と比較して、ＬａｃＺ  ＲＮＡｉを共発現させたＳｎＡｍｃｙａｎで標識した神経細胞において顕著に減少していた（図１６（Ｄ）参照。）。（＊＊＊）は、ウエルチのｔ検定によりＰ＜０．００１を示す。図１６（Ａ）及び（Ｃ）のＳｃａｌｅ ｂａｒは、５０μｍを示す。
これらのことから、標識した細胞特異的に遺伝子のノックダウンが可能であることが確認された。
【００５７】
［実施例１０］
ウイルスを用いた１個の細胞の標識を可能とするため、アデノ随伴ウイルス（以下、ＡＡＶともいう。）をベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムを構築した。ＡＡＶベクターの挿入サイズに制限があるため、蛍光タンパク質発現ベクターのサイズを減らすべく、ｄｏｕｂｌｅ−ｆｌｏｘｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＤＩＯ）の戦略（Ｓｏｈａｌ ＶＳ, Ｚｈａｎｇ Ｆ, Ｙｉｚｈａｒ Ｏ, Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ Ｋ（２００９）．Ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇａｍｍａ ｒｈｙｔｈｍｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｉｒｃｕｉｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ. Ｊｕｎ ４；４５９（７２４７）：６９８−７０２. ）を用いた（図１７（Ａ）参照。）。
図１７（Ａ）に示す、ＡＡＶ−ＴＲＥ−ＣｒｅとＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ＲＦＰ−ｔＴＡの混合物（ＡＡＶ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ  ＲＦＰ（ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰ）ともいう。）をＰ１０〜Ｐ１３マウスの海馬と大脳皮質深層に注入した。ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＧＦＰ−ＷＰＲＥをコントロールとして共に注入した。感染３０日後に皮質切片を作製した。図１７（Ｂ）〜１７（Ｇ）に示すように、海馬ＣＡ１神経細胞（図１７（Ｂ）〜１７（Ｄ））と大脳皮質第5層（Ｌ５）錐体神経細胞（図１７（Ｅ）〜１７（Ｇ））の鮮明な蛍光像を得ることができた。その蛍光像では、疎に標識され、詳細な細胞の形態を鮮明に見ることができる。
この結果から、ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムは、バックグラウンドが小さく、高い蛍光強度で個々の細胞の標識が可能であることが確認された。また、ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムは、ＩＵＥをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムの優れた特長の多くを保持しており、感染１０日後での疎ら度と標識の明るさは同等であり、疎らさはＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅの量を調節するだけで、調節可能で、蛍光強度に顕著な影響を与えないことを確認している。
【００５８】
［実施例１１］
ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムにおいて、疎らに標識された神経細胞においてのみ、Ｃｒｅが染色体のｌｏｘＰ断片の切除を誘導するのに十分なほど、非常に高いレベルで発現している。Ｃｒｅを介した組み換えの効率及び特異性を検討するため、Ｐ１０のＲｏｓａ２６−ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｎｌｓＬａｃＺ（ＲＮＺ）レポーターマウスの海馬ＣＡ１神経細胞に、ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰを注入した。感染４０日後の脳を採取したところ、ＲＦＰで標識したほとんどの神経細胞でＬａｃＺが発現していることが確認された（７６／８０細胞、ｎ＝３マウス）。また、全てのＬａｃＺ陽性細胞は、ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰで標識されていた（７６／７６細胞、ｎ＝３マウス）（図１７（Ｈ）上段参照。）。同様の結果は、皮層でも確認された（図１７（Ｈ）下段参照。）。これらのことから、Ｃｒｅ依存的な染色体の組み換えは、ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰに特異的であることが確認された。
次いで、ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムにおける、α２−Ｃｈｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを用いた内在遺伝子のノックアウトの効率を検討した。Ｐ２のα２−Ｃｈｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの海馬の神経細胞に、ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰを注入した。Ｐ１８で脳を解剖したところ、海馬ＣＡ１における非注入領域では、ＲＦＰ陰性細胞は、α２−Ｃｈｎを発現していた（２０４／２１０細胞、ｎ＝３マウス）。一方、海馬ＣＡ１におけるＡＡＶ−ＳｎＲＦＰ注入領域では、全てのＲＦＰ陽性細胞は、α２−Ｃｈｎを発現していなかった（０／２０細胞、ｎ＝３マウス）（図１７（Ｉ）参照。）。これらのことから、ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａベクターシステムは、ｌｏｘＰが導入されたマウス（ｆｌｏｘマウス）による標識細胞特異的な遺伝子ノックアウトを高い効率で行えることが確認された。
【００５９】
本実施例で用いられた材料を以下に示す。
［プラスミド構築］
＜ＣｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａ＞
ｐＫ０３１.ＴＲＥ−Ｃｒｅ及びｐＫ０２９. ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥについては、Ｍｉｚｕｎｏ Ｈ., Ｌｕｏ Ｗ., Ｔａｒｕｓａｗａ Ｅ., Ｓａｉｔｏ Ｙ.Ｍ., Ｓａｔｏ Ｔ., Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｙ., Ｉｔｏｈａｒａ Ｓ., Ｉｗａｓａｔｏ Ｔ.ＮＭＤＡＲ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｌａｙｅｒ ４ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎaｔｅｓ. Ｎｅｕｒｏｎ. ２０１４ Ａｐｒ １６；８２（２）：３６５−７９.を参照した。
【００６０】
ｐＫ０３８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ＥＧＦＰ及びｉｒｅｓ−ｔＴＡ断片をそれぞれ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）及びｐＫ０２９ベクターから、ＨＭ０５０（配列番号５；ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ）／ＨＭ０５５（配列番号６；ＧＧＡＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＴＣＴＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡ）及びＨＭ０５４（配列番号７；ＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＡＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＴＣＣ）／ＨＭ０３５（配列番号８；ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧ）を用いて、ＰＣＲにより増幅し単離した。得られた２つのＰＣＲ産物を結合させて、ＨＭ０５０／ＨＭ０３５を用いて、再度ＰＣＲにより増幅させて、ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡを作製した。次いで、ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡをｐＫ０２９ベクターのＳａｌＩ/ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＫ０３８ベクターを得た。
【００６１】
ｐＫ０３９.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡｍＣｙａｎ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ｐＡｍＣｙａｎ ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＡｍＣｙａｎ断片をＳａｌＩ/ＳｔｕＩ消化により切り出し、ｐＫ０２９ベクターのＳａｌＩ/ＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＫ０３９ベクターを得た。
【００６２】
ｐＫ０９８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｎｌｓｔａｇＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：核移行シグナル（ｎｌｓ）−ｔａｇＲＦＰをｐＫ０２２ＴａｇＲＦＰ−Ｎ(Ｅｖｒｏｇｅｎ社製)から、ＨＭ０７９（配列番号９；ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧ）／ＨＭ０７５（配列番号１０；ＣＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＴＡＧＧ）を用いて、ＰＣＲにより増幅し、増幅産物をｐＫ０３８ベクターのＳａｌＩ/ＥｃｏＲＶ部位に挿入した。
【００６３】
ｐＫ１０２.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＰＳＤ９５ｅＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ＰＳＤ９５ｅＧＦＰをｐＣＭＶ−ＰＳＤ９５ＧＦＰ（東京大学岡部博士から供与された。）からＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切り出し、クレノウフラグメントによりブラント化し、ＥＧＦＰと交換で、ｐＫ０３８ベクターのブラント化したＳａｌＩ/ＥｃｏＲＶに挿入した。
【００６４】
＜ＦｌｐｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａ＞
ｐＫ０３６.ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ−ＷＰＲＥ：Ｆｌｐｅのコーディング配列をｐＫ０１６.ＣＡＧ−Ｆｌｐｅ−ｉｒｅｓ−Ｐｕｒｏ (ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ社製)から、ＡＹ１０１（配列番号１１；ＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧ）／ＡＹ１０２（配列番号１２；ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣ）を用いて増幅し、増幅産物をｐＫ０２６.ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ ｖｅｃｔｏｒ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＢａｍＨＩ/ＮｏｔＩ部位に挿入した。ｐＫ０２９ベクターから切り出したＷＰＲＥをｐＴＲＥ−ＦｌｐｅベクターのＮｏｔＩ部位に挿入した。
【００６５】
ｐＫ０３７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ｐＫ０２９.のＥｃｏＲＩ/ＳａｌＩ間にあるｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ配列をＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ配列に置き換えた。ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ配列は、ｐＢＳ３０２ ベクター (Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製)から、ＨＭ００９（配列番号１４；ＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡ）／ＨＭ００８（配列番号１３；ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣＡ）を用いて増幅した。
【００６６】
ｐＫ０６８.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ｐＫ０３８ベクターからＳａｌＩとＮｏｔＩでＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡを切り出し、ｐＫ０３７ベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ部位へ挿入し、ｐＫ０６８ベクターを作製した。
【００６７】
＜ＤｒｅをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａ＞
ｐＫ０７３.ＴＲＥ−Ｄｒｅ−ＷＰＲＥ：ｐＫ０５５.ＣＡＧ−Ｄｒｅ−ｉｒｅｓ−ｐｕｒｏ.ｇｃｃベクター（国立遺伝学研究所  森本博士から供与された。）から、ＷＬ００６（配列番号１５；ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧ ＣＴ）／ＷＬ００７（配列番号１６；ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣ ＴＣＴＴ）を用いてＰＣＲでＤｒｅ配列を増幅した。増幅産物をｐＫ０３６.ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ−ＷＰＲＥのＥｃｏＲＩ/ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＫ０７３ベクターを作製した。
【００６８】
ｐＫ１２９.ＣＡＧ−Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ｐＫ０７８.ＪＦＲＣ１７６−１０ＸＵＡＳ−ｒｏｘ−ｄＳＴＯＰ−ｒｏｘ−ｍｙｒ：：ＧＦＰ（Ｇｅｒａｌｄ Ｒｕｂｉｎから供与された。）からＢｇｌＩＩとＸｈｏＩでＲｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘを切り出し、ｐＣＡＧｐｌａｙベクター（Ｎｉｗａ，Ｈ., Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．, ａｎｄ ＭＩｙａｚａｋｉ，Ｊ．（１９９１）. Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｅｃｔｏｒ. Ｇｅｎｅ １０８, １９３−１９９. Ｋａｗａｇｕｃｈｉ, Ｓ.−ｙ., ａｎｄ Ｈｉｒａｎｏ, Ｔ.  （２００６）. Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α３β１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｎｅｕｒｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１, ４１６−４２６.）のＢａｍＨＩ/ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたベクターをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＫ０３７ベクターに挿入し、ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴをＲｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｒｏｘ置き換えた。
【００６９】
ｐＫ２２４.ＣＡＧ−Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ：ｐＫ０７８からＢｇｌＩＩとＸｈｏＩにより、Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘを切り出し、ｐＣＡＧｐｌａｙベクターのＢａｍＨＩ/ＸｈｏＩ部位に挿入した。ｐＫ０６８ベクターからＳａｌＩとＮｏｔＩにより、ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡを切り出し、上記得られたベクターに挿入した。ｐＫ０４６.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ＷＰＲＥからＮｏｔＩで切り出されたＷＰＲＥを、得られたｐＣＡＧ−Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡベクターのＮｏｔＩ部位に挿入した。
【００７０】
＜Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＲＮＡｉ＞
ｐＫ１７７.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０（ＧＦＰ ＲＮＡｉ）及びｐＫ１７８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０ （ＧＦＰ ＲＮＡｉ スクランブルコントロール):ＧＦＰのコーディング領域（４４１−４６１）に対するｓｈＲＮＡ及びそのスクランブルコントロールを、ＨＭ０８２（配列番号１７；ＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧ）／ＨＭ０８３（配列番号１８；ＣＴＡＡＡＧＴＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＧＣＡ）を用いてＰＣＲで増幅した。
ＧＦＰ ｓｈＲＮＡの鋳型オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３'（ＨＭ０８４；配列番号１）である。ＧＦＰ ｓｈＲＮＡスクランブルコントロールの鋳型オリゴヌクレオチドは、５’− ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３'（ＨＭ０８５；配列番号２）である。増幅産物をｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０ベクターのＸｈｏＩ/ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００７１】
ｐＫ２２５.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０  （ＬａｃＺ ＲＮＡｉ）及びｐＫ２２６.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０  （ＬａｃＺ ＲＮＡｉスクランブルコントロール):１個の細胞におけるＬａｃＺのノックダウンの為に、ＬａｃＺのコーディング領域（６５１−６７１）に対するｓｈＲＮＡ及びそのスクランブルコントロールを、ＨＭ０８２／ＨＭ０８３を用いてＰＣＲで増幅した。
ＬａｃＺｓｈＲＮＡの鋳型オリゴヌクレオチドは、５’− ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＣＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３'（ＷＬ０９０；配列番号３）である。ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡスクランブルコントロールの鋳型オリゴヌクレオチドは、５’− ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＡＣＣＧＡＡＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３'（ＷＬ０９１；配列番号４）である。増幅産物をｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０ベクターのＸｈｏＩ/ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００７２】
＜Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＴＡＬＥＮベクター＞
ｐＫ２１７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−α２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ Ｌｅｆｔ 及びｐＫ２１８.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−α２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ Ｒｉｇｈｔ: α２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ Ｋｉｔを用いたｔｗｏ−ｓｔｅｐ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ法により作製した。予想される切断部位は、マウスα２Ｃｈｎエクソン６の２３７番目である。ｐＫ０３７からＳｐｅＩ/ＳａｌＩにより、ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴを切り出し、ｐＫ２０９.ＣＭＶ−Ａ２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ Ｌｅｆｔ 及びｐＫ２１０.ＣＭＶ− Ａ２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ ＲｉｇｈｔのＳｐｅＩ/ＸｈｏＩ部位に挿入した。
【００７３】
＜Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター＞
ｐＫ１６２は、ヒト用にコドンを最適化したＳｐＣａｓ９とキメラのガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｐＸ３３０）であり、Ｆ．Ｚｈａｎｇより供与された。
ｐＫ２３７．ｐＵ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＣＡＧ−ＬＳＬ−ｈｓｐＣａｓ９：ＣＡＧプロモーターの一部とｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰを含む断片を、ｐＫ０２９のＳｎａＢＩとＡｇｅＩから切り出し、ｐＫ１６２（ｐＸ３３０）の同じ部位に挿入した。ｐＫ２３７は、ガイドオリゴを有していないため、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験におけるコントロールとして用いられる。
ｐＫ２３８．ｐＵ６−ｇＲＮＡＣｒｅｂ１−ＣＡＧ−ＬＳＬ−ｈｓｐＣａｓ９：Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇグループによって出版された標的配列クローニングプロトコールに従い、ガイドオリゴＷＬ１０７（配列番号１９；ＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡ）／ＷＬ１０８（配列番号２０；ＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣ）をアニールし、ｐＫ２３７のＢｂｓＩ部位に挿入した。ガイドＲＮＡの標的配列は、Ｆ．  Ｚｈａｎｇグループによって供与されたオンラインツールを用いてデザインした（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）。ＮＣＢＩデータベースからゲノム配列ＮＣ＿００００６７．６（１８０５４．．．１８１６７）をブラストに用いた。
【００７４】
＜他の構築ベクター＞
ｐＫ０４６.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ: ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ配列をｐＢＳ３０２ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）から、ＨＭ０１０（配列番号２１；ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣ）／ＨＭ００７（配列番号２２；ＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡ）を用いて増幅した。ＲＦＰ配列をｐＫ０２３.ＴｕｒｂｏＲＦＰ−Ｎ (Ｅｖｒｏｇｅｎ社製) から、ＨＭ０２６（配列番号２３；ＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣ）／ＨＭ０３０（配列番号２４；ＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴ）を用いて増幅した。ＷＰＲＥ配列をｐＫ０２１.Ｌｅｎｔｉ−Ｓｙｎａｐｓｉｎ−ｈＣｈＲ２  （Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥ ベクターから、ＨＭ０１９（配列番号２５；ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴ）／ＨＭ０２０（配列番号２６；ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧ）を用いて増幅した(Ｚｈａｎｇ, Ｆ., Ｗａｎｇ, Ｌ.−Ｐ., Ｂｒａｕｎｅｒ, Ｍ., Ｌｉｅｗａｌｄ, Ｊ.Ｆ., Ｋａｙ, Ｋ., Ｗａｔｚｋｅ, Ｎ., Ｗｏｏｄ, Ｐ.Ｇ., Ｂａｍｂｅｒｇ, Ｅ., Ｎａｇｅｌ, Ｇ., Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ, Ａ., ｅｔ ａｌ.  （２００７）. Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｆａｓｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ. Ｎａｔｕｒｅ ４４６, ６３３−６３９.) 。得られた三つの増幅産物をｐＣＡＧｐｌａｙベクターのそれぞれＥｃｏＲＩ/ＳａｌＩ、ＳａｌＩ/ＮｏｔＩ、及びＮｏｔＩ 部位に挿入した。
【００７５】
＜ＡＡＶをベースとしたＳｕｐｅｒｎｏｖａ＞
ｐＫ１６８（ｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ＲＦＰ−Ｐ２Ａ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ)：ｔＴＡ配列をｐＫ０２９（ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ−Ａｄｖａｎｃｅｄ  ベクター（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ, Ｂｕｊａｒｄ Ｈ.（１９９２）Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ.Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. Ｊｕｎ １５；８９（１２）：５５４７−５１.））から、ＲＹ７８（配列番号２７；ＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡ）／ＲＹ７９（配列番号２８；ＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡ）を用いて増幅した。
Ｐ２Ａ−ｔＲＦＰ配列をｐＫ０２５（ＴｕｒｂｏＲＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ, Ｍｏｓｃｏｗ, Ｒｕｓｓｉａ））から、ＲＹ６９（配列番号２９； ＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡ）/ＲＹ８０（配列番号３０；ＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧ）を用いて増幅した。
ｐＫ１６８ (pＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ｔＴＡ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ)は、ｔＴＡとＰ２Ａ−ｔＲＦＰを、ｐＫ１６７（ｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ＥＹＦＰ） ｖｅｃｔｏｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ： ２７０５６, Ｃａｍｂｒｉｄge, ＭＡ, ＵＳＡ)の、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ部位とＢａｍＨＩ／ＡｓｃＩ部位に挿入して作製した。
ｐＫ１７０(pＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥ): Ｃｒｅ配列をｐＫ０３１(pＣＡＧ−ｎｌｓＣｒｅ−ＷＰＲＥ)から増幅した。ｐＫ１７０は、ｐＫ１６９(pＡＡＶ−ＴＲＥ−ＭＣＳ−ＷＰＲＥ) ｖｅｃｔｏｒ（Ｄｒ．Ｙｕ  Ｈａｙａｓｈｉから供与）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位にＣｒｅを挿入して製造した。
【００７６】
＜他のＡＡＶベクター＞
ｐＫ１６５（ｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ）は、Ｉｗａｔａ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．（２０１５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ＲａｃＧＡＰ  α２−Ｃｈｉｍａｅｒｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｓ  Ａ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ  ｔｈｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｓｐｉｎｅｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔｈｏｏｄ. Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ３５, １３７２８−１３７４４.を参照した。
ｐＫ２２９（ｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ）：ＥＧＦＰ配列は、ｐＫ０２４（ｐＣＡｓａｌＥＧＦＰ）からＷＬ１０３（配列番号３１； ＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ）／ＷＬ１０４（配列番号３２；ＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧ）を用いて増幅した。ｐＫ２２９を作製するため、ｐＫ１６５（ｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ）中のＲＦＰは、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングすることにより、ＥＧＦＰに置き換えた。
【００７７】
＜動物＞
Ｅｍｘ１Ｃｒｅ ＫＩ−ΔＮｅｏマウス（Ｉｗａｓａｔｏ, Ｔ., Ｄａｔｗａｎｉ, Ａ., Ｗｏｌｆ, Ａ.Ｍ., Ｎｉｓｈｉｙａｍａ, Ｈ., Ｔａｇｕｃｈｉ, Ｙ., Ｔｏｎｅｇａｗａ, Ｓ., Ｋｎｏｐｆｅｌ, Ｔ., Ｅｒｚｕｒｕｍｌｕ, Ｒ.Ｓ., ａｎｄ Ｉｔｏｈａｒａ, Ｓ.  （２０００）. Ｃｏｒｔｅｘ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＮＭＤＡＲ１ ｉｍｐａｉｒｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｒｒｅｌ ｃｏｒｔｅｘ. Ｎａｔｕｒｅ ４０６, ７２６−７３１.；Ｉｗａｓａｔｏ, Ｔ., Ｉｎａｎ, Ｍ., Ｋａｎｋｉ, Ｈ., Ｅｒｚｕｒｕｍｌｕ, Ｒ.Ｓ., Ｉｔｏｈａｒａ, Ｓ., ａｎｄ Ｃｒａｉｒ, Ｍ.Ｃ.（２００８）. Ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ １ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｙｅｒ ＩＶ ｂａｒｒｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２８, ５９３１−５９４３. ； Ｉｗａｓａｔｏ, Ｔ., Ｉｎａｎ, Ｍ., Ｋａｎｋｉ, Ｈ., Ｅｒｚｕｒｕｍｌｕ, Ｒ.Ｓ., Ｉｔｏｈａｒａ, Ｓ., ａｎｄ Ｃｒａｉｒ, Ｍ.Ｃ.  （２００８）. Ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ １ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｙｅｒ ＩＶ ｂａｒｒｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２８, ５９３１−５９４３.）、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰ−ＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒマウス（Ｋａｗａｍｏｔｏ, Ｓ., Ｎｉｗａ, Ｈ., Ｔａｓｈｉｒｏ, Ｆ., Ｓａｎｏ, Ｓ., Ｋｏｎｄｏｈ, Ｇ., Ｔａｋｅｄａ, Ｊ., Ｔａｂａｙａｓｈｉ, Ｋ., ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋi, Ｊ.−ｉ.  （２０００）. Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ｓｔｒａｉｎ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 
ｕｐｏｎ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ. ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７０, ２６３−２６８.）、ＲＮＺレポーターマウス（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ, Ｙ., Ｓａｎｏ, Ｙ., Ｖａｎｎｏｎｉ, Ｅ., Ｇｏｔｏ, Ｈ., Ｉｋｅｄａ, Ｔ., Ｓｕｚｕｋｉ, Ｈ., Ｏｂａ, Ａ., Ｋａｗａｓａｋｉ, Ｈ., Ｋａｎｂａ, Ｓ., Ｌｉｐｐ, Ｈ.−Ｐ., ｅｔ ａｌ.  （２０１３）. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉａｌ ｈａｂｅｎｕｌａ−ｉｎｔｅｒｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ ｐａｔｈｗａｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ. Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７.）、α２−Ｃｈｎ ｆｌｏｘマウス（Ｉｗａｔａ, Ｒ., Ｏｈｉ, Ｋ., Ｋｏｂａｙａｓｈｉ, Ｙ., Ｍａｓｕｄａ, Ａ., Ｉｗａｍａ, Ｍ., Ｙａｓｕｄａ, Ｙ., Ｙａｍａｍｏｒｉ, Ｈ., Ｔａｎａｋａ, Ｍ., Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ, Ｒ., Ｉｔｏｈａｒａ, Ｓ., ｅｔ ａｌ. （２０１４）. ＲａｃＧＡＰ α２−Ｃｈｉｍａｅｒｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｄｊｕｓｔｓ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｄｕｌｔｈｏｏｄ. Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８, １２５７−１２６４.）の遺伝型は、ＰＣＲにて決定した。
ＩＵＥ及びウイルス感染の為の胎児は、一晩、雄と雌を交配させて得られた。膣栓が認められた日の正午を胎生期０．５とした。生まれた日は、出生後日数０としてカウントした。
【００７８】
＜Ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ （ＩＵＥ）＞
ＩＵＥは、以前の報告に基づいて行われた（Ｍｉｚｕｎｏ, Ｈ., Ｈｉｒａｎｏ, Ｔ., ａｎｄ Ｔａｇａｗａ, Ｙ.  （２００７）. Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｗｉｒｉｎｇ： ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｖｉｓｕａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２７, ６７６０−６７７０.）。簡単には、妊娠したマウスに、生理食塩水に溶解したペントバルビタールナトリウム（５０ ｍｇ/ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）を用いて麻酔をかけた。
腹部を７０％エタノールで洗浄した後、約３ｃｍの正中開腹手術を行い、子宮を取り出した。ＤＮＡのマイクロインジェクションの為に、ガラスキャピラリーチューブ（ＧＣ１５０ＴＦ−１０； Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を、マイクロピペットプラー（ＰＣ−１０； Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）を用いて引っ張った。ｍｏｕｔｈ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄピペットシステム（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡ溶液０．５μＬ全量を胎児の右側脳室に注入した。ピンセットタイプの電極で保持することにより（ＣＹ６５０Ｐ１０, Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｄａ, Ｊａｐａｎ）、胎児に、Ｓｑｕａｒｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ （４０ Ｖ； ５０ ｍｓ）をエレクトロポレーター（ＣＵＹ２１ＳＣ； ＮｅｐａＧｅｎｅ）により、子宮を介して、１Ｈｚの割合で５回伝達した。皮質ニューロンに遺伝子導入するための電極の位置は、以前の報告に基づいて行われた（Ｓａｉｔｏ, Ｔ., ａｎｄ Ｎａｋａｔｓｕｊｉ, Ｎ.  （２００１）. Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２４０, ２３７−２４６.）。エレクトロポレーションの後、子宮を腹腔に戻し、腹壁と皮膚を外科的縫合術により縫合した。
ＩＵＥの為のプラスミドをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を用いて精製した。各実験に用いたＤＮＡ溶解液組成物を以下にまとめて示す。
【００７９】
ＣｒｅベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ標識において、ｐＫ０３１.ＴＲＥ−Ｃｒｅ （５ｎｇ／μＬ）及びｐＫ０２９.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ （１μｇ／μＬ) 又はｐＫ０３８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ) 又は ｐＫ０３９.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡｍＣｙａｎ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ) を用いた。
【００８０】
皮質ニューロンのＦｌｐｅベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ標識において、ｐＫ０３６.ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ−ＷＰＲＥ（５ｎｇ／μＬ）及びｐＫ０３７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ （１μｇ／μＬ) 又はｐＫ０６８.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ)を用いた。
【００８１】
海馬ＣＡ１ニューロンのＦｌｐｅベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ標識において、ｐＫ０３６.ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ−ＷＰＲＥ（５０ｎｇ／μＬ）及びｐＫ０３７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ （１μｇ／μＬ)を用いた。
【００８２】
ＤｒｅベースのＳｕｐｅｒｎｏｖａ標識において、ｐＫ０７３.ＴＲＥ−Ｄｒｅ−ＷＰＲＥ （５ｎｇ／μＬ）及びｐＫ１２９.ＣＡＧ−Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ （１μｇ／μＬ) 又はｐＫ０３８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ) 又は ｐＫ２２４.ＣＡＧ−Ｒｏｘ−ＳＴＯＰ−Ｒｏｘ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ) を用いた。
【００８３】
Ｅｍｘ１−Ｃｒｅ ＫＩマウスにおける皮質ニューロンのＦｌｐｅ−ＳｎＧＦＰ及び Ｄｒｅ−ＳｎＧＦＰ標識において、ｐＫ０４６.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ)をコントロールとして共導入した。
【００８４】
共発現実験として、ｐＫ０３１.ＴＲＥ−Ｃｒｅ（１０ｎｇ／μＬ）を、ｐＫ０３８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ （１μｇ／μＬ) 及びｐＫ０９８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｎｌｓｔａｇＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ)又はｐＫ０２９.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ)及び ｐＫ１０２.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＰＳＤ９５ｅＧＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ)と共に用いた。
【００８５】
ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＣＡＴ−ｌｏｘＰ−ＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｔｇマウスを用いた、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａを介した疎らな遺伝子ノックダウン実験において、ｐＴＲＥ−Ｃｒｅ  （１０ ｎｇ／μｌ）、 ｐＫ０９８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｎｌｓｔａｇＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ  （１ μｇ／μｌ）及びｐＫ１７７.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０ （ＧＦＰ ＲＮＡｉ） （１ μｇ／μｌ） 又は ｐＫ１７８.ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０ （ＧＦＰ ＲＮＡｉ スクランブルコントロール）（１μｇ／μｌ）を含有するＤＮＡ溶解液を用いた。
【００８６】
ＲＮＺマウスを用いたＳｕｐｅｒｎｏｖａを介した疎らな遺伝子ノックダウン実験において、ｐＴＲＥ−Ｃｒｅ（１０ｎｇ／μｌ）、ｐＫ０３９： ｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡｍＣｙａｎ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ（１μｇ／μＬ）及びｐＫ２２５：ｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０（ＬａｃＺ ＲＮＡｉ）  （１ μｇ／μｌ）又はｐＫ２２６：ｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｍｉｒ３０（ＬａｃＺ ＲＮＡｉスクランブルコントロール)（１μｇ／μＬ）を含有するＤＮＡ溶解液を用いた。
【００８７】
ＳｕｐｅｒｎｏｖａシステムによるＴＡＬＥＮを介したα２−Ｃｈｎ遺伝子操作の実験において、ｐＫ０３６.ＴＲＥ−Ｆｌｐｅ−ＷＰＲＥ（５０ｎｇ／μｌ）、ｐＫ０３７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−ＲＦＰ−ｉｒｅｓ−ｔＴＡ−ＷＰＲＥ  （１μｇ／μｌ）、ｐＫ２１７.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−α２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ Ｌｅｆｔ （１μｇ／μｌ）、及びｐＫ２１８.ＣＡＧ−ＦＲＴ−ＳＴＯＰ−ＦＲＴ−α２Ｃｈｎ ＴＡＬＥＮ Ｒｉｇｈｔ（１μｇ／μｌ）を含有するＤＮＡ溶解液を用いた。
【００８８】
＜ウイルスの調製＞
ＡＡＶの調製は、ＡＡＶ−ＤＪ／８ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂs, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ, ＵＳＡ)を用いて行った。ｐＡＡＶ発現ベクターをｐＡＡＶ−ＤＪ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ２４００７１）及びｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ２４００７１）と、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ 及びｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入りのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ, １ ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ, ０．０７５％ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔe ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション７２時間後に、細胞をフラスコから優しく掻き採り、２，５００ｒｐｍで３０分遠心分離した。上清を０．４５μｍのメンブレンフィルター(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ, Ｂｅｄｆｏｒｄ, ＭＡ, ＵＳＡ)を用いて濾過し、超遠心チューブに移した。ウイルス沈澱物を１００μＬのｃｏｌｄ  ＰＢＳに懸濁し、−８０℃で保存した。各ウイルスの力価は、プライマーセットＷＬ１２３（配列番号３３；ＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＧ）／ＷＬ１２４（配列番号３４； ＡＧＧＣＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧ）を用いた定量ＰＣＲにより決定した。ウイルスサンプルをＤＮａｓｅＩで、３７℃３０分処理した。ＤＮａｓｅＩは、６５℃１０分インキュベートして不活化した。標準曲線は、ＥｃｏＲＩで消化し、事前に精製したｐＫ１６５プラスミドの１０倍希釈系列(１０〜１０８コピー／μＬ)を用いて作成した。
【００８９】
＜ウイルスの注入＞
Ｐ１０〜Ｐ１３マウスに、１．７〜２．５％のイソフルランを用いて麻酔をかけた。皮膚の注入箇所を開き、ハンドドリル（ＭＩＮＩＭＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、頭がい骨に穴をあけた。左海馬か皮層にウイルスを注入した。ウイルス注入の間に、イソフルランの用量を１．５％にまで減らした。海馬ＣＡ１領域及び深皮層において、標識神経細胞の注入部位は、矢状縫合の約１ｍｍ外側、硬膜表面から−１．５ｍｍ〜−０．８ｍｍに位置した。Ｐ２マウスのウイルス注入において、注入部位は、人字縫合の１．５ｍｍ左、硬膜表面から−１．５ｍｍ〜−１．０ｍｍに位置した。ウイルスのデリバリーは、プログラムされた、３４ゲージの斜角ＮａｎｏＦｉｌ ｎｅｅｄｌｅ （Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ, Ｓａｒａｓｏｔａ, ＦＬ, ＵＳＡ）付きのシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、２２０ｎＬ／分の割合で行われた。注入に用いたウイルスベクターを以下に示す。
【００９０】
ＡＡＶによる通常の標識に、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＲＦＰ−ＷＰＲＥ（５．５ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬ）をＰＢＳで１０〜１０３倍希釈した。希釈した、又は無希釈のＡＡＶ−ＥＦ１α−ＲＦＰ−ＷＰＲＥと、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ（３．５ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬ）と、ＰＢＳを等量ずつ混ぜた。１匹のマウスに、１０００ｎＬのウイルス混合物を注入した。
ＡＡＶ−ＳｎＲＦＰによる標識に、ＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥ（２．３ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）をＰＢＳで１０２〜１０６倍希釈した。希釈した、又は無希釈のＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥと、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ｔＴＡ−ＲＦＰ（１．７ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）と、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ（３．５ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬ）ＰＢＳを等量ずつ混ぜ、注入に用いた。図１７（Ｂ）〜（Ｇ）において、ＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥを１０５倍希釈して用いた。１匹のマウスに、１０００ｎＬのウイルス混合物を注入した。
ＲＮＺマウスへのＡＡＶ−ＳｎＲＦＰの注入において、ＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥ（２．３ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）をＰＢＳで１０５倍希釈し、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ｔＴＡ−ＲＦＰ（１．７ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）と等量ずつ混合した。１匹のマウスに、１０００ｎＬのウイルス混合物を注入した。α２−Ｃｈｎ  ｆｌｏｘｅｄマウスへのＡＡＶ−ＳｎＲＦＰの注入において、ＡＡＶ−ＴＲＥ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥ（２．３ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）をＰＢＳで１０４倍希釈し、ＡＡＶ−ＥＦ１α−ＤＩＯ−ｔＴＡ−ＲＦＰ（１．７ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）と等量ずつ混合した。１匹のマウスに、３００ｎＬのウイルス混合物を注入した。
【００９１】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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