(57)【要約】【課題】糖鎖標識体の精製において、糖鎖の種類による回収率のばらつきに改善する。【解決手段】本発明の標識糖の精製物を調製する方法は、アプライ工程と、洗浄工程と、溶出工程とを含む。アプライ工程では、標識糖を含む試料をシリカゲルの固相にアプライする。標識糖は、極性または正電荷を示す標識基を有する。洗浄工程では、洗浄液で固相を洗浄する。溶出工程では、少なくとも酸性溶液で標識糖を溶出する。溶出工程は、酸性溶液よりもｐＨが高い水または水溶液で溶出する第１溶出工程と、酸性溶液で溶出する第２溶出工程と、を含んでよい。【選択図】図１
2017067677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性または正電荷を示す標識基を有する標識糖を含む試料を、シリカゲルの固相にアプライするアプライ工程と、
前記固相を洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
前記固相から、少なくとも酸性溶液で前記標識糖を溶出する溶出工程と、
を含む、標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項２】
前記溶出工程が、
前記酸性溶液よりもｐＨが高い水または水溶液で溶出する第１溶出工程と、
前記酸性溶液で溶出する第２溶出工程と、
を含む、請求項１に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項３】
前記酸性溶液における酸性成分が有機酸である、請求項１または２に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項４】
前記酸性溶液における酸性成分の濃度が、０．０００５体積％以上である、請求項１から３のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項５】
前記有機酸が酢酸である、請求項３または４に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【請求項６】
前記標識糖がピリジルアミノ化糖である、請求項１から５のいずれか１項に記載の標識糖の精製物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖を精製する技術に関する。より具体的には、標識糖を良好な回収率で精製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【０００３】
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
【０００４】
病気を早期発見して生活の質（ＱＯＬ）を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている（非特許文献１，２）。また、糖鎖修飾に異常がみられるとさまざまな疾病が引き起こされることも知られている（非特許文献３）。糖鎖の構造は細胞の癌化やさまざまな疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
【０００５】
糖鎖自体は蛍光性、紫外吸収性をもたないため、糖鎖を分析する際には予め修飾（ラベル化）を施すことが多い。糖鎖をＨＰＬＣあるいはＨＰＬＣ−ＭＳで分析する場合は、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ誘導体化（２ＡＢ化）、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ誘導体化（ＰＡ化）などの蛍光ラベル化が一般的である（非特許文献４）。また、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析する場合にも、ラベル化を施すことにより測定感度の向上を図ることが行われる（非特許文献５、６）。
【０００６】
糖鎖をラベル化する際には、ラベル化効率を高めるため糖鎖に対して過剰量のラベル化試薬を作用させる場合が多い。試料溶液中に過剰のラベル化試薬が存在すると、ＨＰＬＣ測定や質量分析に支障をきたすため、あらかじめ除去する必要がある。このような過剰量のラベル化試薬を簡単に除去可能とするために、ラベル化糖鎖を含む試料溶液をモノリスシリカと接触させることにより、モノリスシリカに糖鎖成分を吸着させる工程と、モノリスシリカを洗浄液で洗浄する工程と、モノリスシリカに溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程と、を含む糖鎖試料調製方法が知られている（特許文献１）。この方法は、２ＡＢ化およびＰＡ化のように一般的な標識糖鎖に適用され、溶出液には、水、または、アセトニトリルおよびアルコールから選ばれる有機溶媒の水溶液が用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５０８３４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ioffe E., Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp.728-732 (1994)
【非特許文献２】Metzler M., Gertz A., Sarker M., Schachter H., Schrader J.W., Marth J.D., EMBO J., 13, pp.2056-2065 (1994)
【非特許文献３】Powell L.D., Paneerselvam K., Vij R., Diaz S., Manzi A., Buist N., Freeze H., Varki A., J. Clin. Invest., 94, pp.1901-1909 (1994)
【非特許文献４】Shilova N.V., Bovin N.V., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29, pp.309-324 (2003)
【非特許文献５】Shinohara Y., Furukawa J.-i., Niikura K., Miura Y., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 76, pp.6989-6997 (2004)
【非特許文献６】Furukawa J.-i., Shinohara Y., Kuramoto H., Miura Y., Shimaoka H., Kurogochi M., Nakano M., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 80, pp.1094-1101 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１の方法は、過剰量のラベル化試薬を簡単に除去可能であるが、糖鎖の種類による回収率のばらつきに改善の余地がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、極性または正電荷を有する標識基を有する糖を固相精製する場合に、固相からの溶出工程で酸性溶液を用いることで上記の本発明の目的を達成することを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下の発明を含む。
【００１１】
（１）
本発明の標識糖の精製物を調製する方法は、アプライ工程と、洗浄工程と、溶出工程とを含む。アプライ工程では、標識糖を含む試料をシリカゲルの固相にアプライする。標識糖は、極性または正電荷を示す標識基を有する。洗浄工程では、洗浄液で固相を洗浄する。溶出工程では、少なくとも酸性溶液で標識糖を溶出する。
【００１２】
これによって、標識糖の固相からの回収率を向上させることができる。なお、アプライ工程と、洗浄工程と、溶出工程とはこの順番で行われる。また、標識糖を含む試料は、中性糖の標識体が少なくとも含まれることが既知の試料であってもよいし、中性糖の標識体が少なくとも含まれる可能性にとどまっている試料であってもよい。
【００１３】
（２）
上記（１）の標識糖の精製物を調製する方法では、溶出工程が、酸性溶液よりもｐＨが高い水または水溶液で溶出する第１溶出工程と、酸性溶液で溶出する第２溶出工程と、を含んでよい。
【００１４】
これによって、試料に含まれる標識糖の由来元となる糖の種類に関わらず、良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。したがって、固相にアプライされる試料が、標識糖として中性糖の標識体のみを含む場合、および中性糖の標識体とともに酸性糖の標識体を含む場合のいずれであっても、良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００１５】
（３）
上記（１）または（２）の標識糖の精製物を調製する方法では、酸性溶液における酸性成分が有機酸であってよい。
【００１６】
これによって、標識糖にとって穏和な条件で精製を行うことが容易となる。
【００１７】
（４）
上記（１）から（３）の標識糖の精製物を調製する方法では、酸性溶液における酸性成分の濃度が、０．０００５体積％以上であってよい。
【００１８】
これによって、より良好な回収率で標識糖の精製物を得ることができる。
【００１９】
（５）
上記（３）または（４）の標識糖の精製物を調製する方法では、有機酸が酢酸であってよい。
【００２０】
このように、本発明の調製方法は汎用性に優れる。さらに酢酸自体が揮発性であるため、精製物を濃縮または乾燥する場合など、溶媒を除去する場合に好都合である。
【００２１】
（６）
上記（１）から（５）の標識糖の精製物を調製する方法では、標識糖がピリジルアミノ化糖であってよい。
【００２２】
このように、本発明の調製方法は汎用性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１から実施例５で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】比較例１および実施例６で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
【図３】比較例２および実施例７で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】参考として、グルコースオリゴマー（中性糖鎖）のＰＡ化体とウシフェツイン（酸性糖鎖）のＰＡ化体との混合物（非分離）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】比較例３および実施例８から実施例１０で精製したＰＡ化糖鎖について、中性糖鎖由来ピークの面積値から求めた中性糖鎖のＰＡ化体の回収率のグラフを示す。
【図６】比較例３および実施例８から実施例１０で精製したＰＡ化糖鎖について、酸性糖鎖由来ピークの面積値から求めた中性糖鎖のＰＡ化体の回収率のグラフを示す。
【図７】図４のＨＰＬＣチャートの主要部分の拡大図を示す。
【図８】実施例１０（ｎ＝３）で得られたＨＰＬＣチャートから求めた、すべてのピークの面積の和に対する各ピークの面積の比のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［１．アプライ工程］
［１−１．標識糖を含む試料］
本発明の方法に供される試料は、溶媒中に、精製すべき標識糖を、分離除去されるべき夾雑物とともに含む。試料は、糖の分析を可能にするために、分析手法に応じて選択された標識試薬を用いて糖の標識反応を行うことで得られた標識反応生成物であってよい。
【００２５】
標識反応に供された糖が糖複合体（たとえば糖タンパク質など）からの糖遊離処理によって得られたものである場合、当該糖は精製されたものであってもよい（この場合、糖遊離処理後に一旦精製処理を行い、標識反応を行う）し、精製されていないものであってもよい（この場合、糖遊離処理と標識反応とをワンポットで行う）。
【００２６】
分離除去されるべき夾雑物としては、未反応の過剰の標識試薬、副生成物、塩などが挙げられる。また、標識糖を得た経緯によっては、当該経緯で添加されうるまたは生じうる上記以外の成分（たとえば、糖鎖遊離酵素、上記の糖複合体の糖以外の構成成分、その他タンパク質、ペプチド、核酸、脂質などの生体分子など）が夾雑物として含まれていてよい。
【００２７】
［１−２．標識基］
標識糖が有する標識基は、糖の標識試薬の誘導体基である。標識基は、極性または正電荷を有する。
標識基は、好ましくは塩基性基を含む。塩基性基は、そのｐＫａより低いｐＨ環境下でイオン率が増大する性質を有する官能基である。たとえば、塩基性窒素原子を含む官能基が挙げられ、具体的には、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、モノ−またはジ−置換アミノ基、モノ−、ジ−またはトリ−置換アミジノ基、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−置換グアニジノ基、モノ−、ジ−またはトリ−置換ヒドラジノ基、ならびにこれらの第４級塩の基が挙げられる。この中でも、アミノ基（第１級アミノ基）、モノ−置換アミノ基（第２アミノ基）、ジ−置換アミノ基（第３級アミノ基）およびそれらの第４級塩の基（第４級アンモニウム基）であることが好ましい。
【００２８】
標識基を与える標識試薬の例としては、たとえば、アミノ基を有する芳香族化合物が挙げられる。この場合の標識試薬は、そのアミノ基が還元アミノ化によって糖の還元末端と反応し、標識基へ誘導化される。アミノ基を有する芳香族化合物は、紫外可視吸収特性または蛍光特性を有するため、ＵＶ検出または蛍光検出での糖の検出感度を向上させる。具体的には、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，  ２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，  ７−ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、３−（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ  ７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、  ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ２−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ；  ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ；２−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃａｒｂａｚａｔｅ、  ４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｏｃ  ａｃｉｄ，  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ２−（６，８−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）ａｃｅｔｏｈｙｄｒａｚｉｄｅ、ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ；１−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｈｙｄｒａｚｉｄｅ；  ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅが挙げられる。この中でも、２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅが、汎用性および分離条件の穏和性の観点から好ましい。また、標識試薬としての機能が維持される限りにおいて、これらの誘導体も挙げられる。
【００２９】
標識基を与える標識試薬の他の例としては、たとえば、オキシルアミノ基またはヒドラジド基などの糖反応性基を有する化合物が挙げられる。オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有する化合物は、たとえば、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基、リジン残基などのアミノ酸残基を含むことができる。アルギニン残基を含む場合、質量分析器による測定時のイオン化を促進するため、質量分析での糖の検出感度が向上する点で好ましい。トリプトファン残基を含む場合、当該残基は蛍光性かつ疎水性であることから、標識された糖鎖の逆相ＨＰＬＣ検出時に、分離性が向上および蛍光検出感度が向上する点で好ましい。フェニルアラニン残基および／またはチロシン残基を含む場合、標識された糖鎖のＵＶ吸収による検出に適する点で好ましい。システイン残基を含む場合、当該残基の−ＳＨ基を標的としてICAT試薬（米国、ABI社）などのラベル化試薬によるラベル化ができる。リジン残基を含む場合、当該残基のアミノ基を標的としてiTRAQ試薬（米国、Applied Biosystems社）、ExacTag試薬（米国、Perkin社）などのラベル化試薬によるラベル化ができる。トリプトファン残基を含む場合、当該残基のインドール基を標的としてNBS試薬（日本国、島津製作所）によるラベル化ができる。
【００３０】
標識基を与える標識試薬のさらなる他の例としては、たとえば、塩基性窒素含有基と糖反応性基とを有する化合物が挙げられる。この場合の標識試薬は、糖反応性基を介して糖を修飾し、さらに塩基性窒素含有基を４級化することによって、正電荷を有する標識基へと誘導化される。これによって、標識糖に正電荷を安定的に存在させることができるため、質量分析での糖の検出感度が向上する点で好ましい。
【００３１】
［１−３．糖］
本発明において、糖とは、単糖および糖鎖の両方を含む。糖（標識化前）の分子量は、たとえば１５０以上６０００以下、好ましくは３００以上３０００以下であってよい。
試料中に含まれる標識糖の由来元となる糖は、その構造、または中性糖鎖であるか否かが未知であってもよいし、既知であってもよいが、本発明は、標識糖が少なくとも中性糖の標識体を含む場合に有用である。中性糖は、硫酸基、カルボキシル基などの酸性基を含まない糖である。
【００３２】
試料中に含まれる標識糖は、さらに酸性糖の標識体を含んでも構わない。この場合、試料には、中性糖鎖の標識体と酸性糖の標識体とが混在する。酸性糖は、硫酸基、カルボキシル基などの酸性基を含む糖である。
【００３３】
［１−４．シリカゲルの固相］
本発明で用いられる固相は、シリカゲルである。シリカゲルは、表面にシラノール基を有する。本発明は、表面のシラノール基のうち一部に修飾基が付されている場合を特段除外するものではないが、非修飾シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）が多いほど好ましい。これによって、精製すべき標識糖を好ましく捕捉することができる。
【００３４】
好ましい量の非修飾シラノール基を有する例として、たとえば、表面全体のシラノール基のうち５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％が非修飾シラノール基であってよい。
【００３５】
固相の形状として特に限定されず、たとえば、ビーズタイプであってもよいし、モノリスタイプであってもよい。
ビーズタイプの場合、粒子径はたとえば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、さらに好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下、たとえば５μｍであってよい。粒子径が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。
【００３６】
モノリスタイプのシリカゲルは、マイクロメートルサイズの三次元網目状細孔（マクロ孔）と、ナノメートルサイズの細孔（メソ孔）とを有する、シリカゲルのバルク体である。マクロ孔の径はたとえば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは１μｍ以上３０μｍ以下、さらに一層好ましくは１μｍ以上２０μｍ以下であってよい。マクロ孔が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。メソ孔の径はたとえば１ｎｍ以上１００ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ以上７０ｎｍ以下であってよい。これによって、精製すべき標識糖を好ましく捕捉することができる。
【００３７】
モノリスタイプのシリカゲルの体積（マクロ孔およびメソ孔の体積を含む）は、たとえば０．０１ｃｍ３以上１ｃｍ３以下、好ましくは０．０１ｃｍ３以上０．１ｃｍ３以下であってよい。この体積であることにより、溶出後の溶離液を、HPLC分析に適した濃度で得ることが容易となる。
【００３８】
シリカゲル固相は、適当な容器に収容されて使用される。容器は、固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、たとえば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブなどが挙げられる。
【００３９】
［１−５．溶媒］
試料中の溶媒は、有機溶媒を主成分として含んでいることが好ましい。溶媒中の有機溶媒の量は、たとえば９０体積％以上、好ましくは９５体積％以上であってよい。これによって、標識糖を良好に溶解させることができる。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド，ヘキサメチルホスホルアミドなどが挙げられるが、この中でも、極性かつ非プロトン性、さらには表面張力が低く粘度も低いという点でアセトニトリルが好ましい。
【００４０】
［１−６．アプライ］
上記の試料は、固相にアプライされる。これによって、固相に標識糖が吸着する。標識糖は、標識基の極性または正電荷を介して、シリカゲル固相のシラノール基に可逆的に捕捉される。
【００４１】
［２．洗浄工程］
［２−１．洗浄液］
試料をアプライした後、洗浄液で固相を洗浄する。洗浄液は、たとえば９０体積％以上１００体積％以下の有機溶媒および０体積％以上１０体積％以下の水、好ましくは９５体積％以上１００体積％以下の有機溶媒および０体積％以上５体積％以下の水を含んでよい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド，ヘキサメチルホスホルアミドなどが挙げられるが、この中でも、非プロトン性であるという点でアセトニトリルが好ましい。
【００４２】
［２−２．洗浄］
洗浄液を通液することによって、標識糖を固相に吸着させたまま、夾雑物を溶出させる。通液の方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心などの方法が挙げられる（後述の溶出工程においても同様）。洗浄においては、組成の異なる洗浄液を用いて段階的に洗浄してもよい。たとえば、１００％アセトニトリルを通液した後に、水を含むアセトニトリルを通液することもできる。
【００４３】
［３．溶出工程］
［３−１．溶出液］
固相を洗浄した後、溶出液を通液して固相から標識糖を溶離液中に溶出させる。溶出液としては、少なくとも酸性溶液を用いる。酸性溶液は、水中に少なくとも酸性成分が含まれていればよい。具体的には、実質的に酸性成分のみを溶質として含む水溶液であってもよいし、酸性成分とその共役塩基とを含んで酸性に調製された緩衝液であってもよい。
【００４４】
酸性成分は、揮発性であることが好ましい。揮発性とは、１atmでの沸点が５０℃以上２６０℃以下、好ましくは１５０℃以下である性質をいう（以下において同様）。これによって、溶離液中の標識糖を濃縮または乾燥が容易となり、酸性成分が残存して分析へ悪影響を及ぼす可能性を防止することができる。
【００４５】
酸性溶液のｐＫａは、たとえば３．５以上５．０以下、好ましくは４．０以上５．０以下の弱酸性であることが好ましい。酸性溶液のｐＫａが上記下限値以上であることは、溶出条件が穏和である点で好ましい。酸性溶液のｐＫａが上記上限値以下であることは、標識糖の精製効率が良好である点で好ましい。たとえば、標識糖として中性糖の標識体と酸性糖の標識体との両方を含んでいた場合であっても、両者とも良好に溶出される。
【００４６】
このような弱酸性を示す酸性成分は、好ましくは有機酸であり、より好ましくはカルボン酸である。ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、シクロヘキサンカルボン酸などが挙げられる。この中でも、溶出条件の穏和性、揮発性および入手容易性を考慮すると、酢酸が最も好ましい。
【００４７】
本発明では、酸性溶液が上述のような弱酸性であることが好ましいが、標識糖の標識基の種類によっては（たとえば極性が比較的小さい場合など）、溶出効率を上げる目的で上記の弱酸性よりも強い酸性であることを除外するものではない。このような場合の酸性成分としては、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸；トリフルオロ酢酸などの含フッ素カルボン酸；有機スルホン酸などが挙げられる。
【００４８】
酸性溶液中の酸性成分の濃度は、たとえば０．０００５体積％以上、好ましくは０．００２体積％であってよい。これによって、標識糖をより回収率良く得ることができる。当該濃度範囲内の上限値は特に限定されないが、本発明で使用する溶出液としての酸性溶液は溶出能に優れるため、溶出液の使用量に対する溶出能をより効率的に得るためたとえば０．２体積％、好ましくは０．１５体積％、より好ましくは０．１体積％で十分である。上記の濃度は、酸性成分が１価酸である場合において好ましい。
【００４９】
酸性溶液の通液量は、たとえば担体の見かけ体積（粒状タイプのシリカゲルである場合は充填状態における粒子間の空隙の体積も含み、モノリスタイプのシリカゲルである場合はマクロ孔およびメソ孔の体積も含む。）のたとえば０．１倍以上、好ましくは０．２倍以上であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば０．１倍以上、好ましくは１倍以上であてよい。たとえば１０μｌ以上、好ましくは１５μｌ以上、さらに好ましくは２０μｌ以上であってよい。これによって、標識糖をより回収率良く得ることができる。
【００５０】
通液量の範囲内の上限値は特に限定されないが、担体の見かけ体積のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。たとえば３０μｌ、好ましくは２５μｌであってよい。これによって、溶出液の使用量に対する溶出能をより効率的に得ることができる。
【００５１】
［３−２．第１溶出工程］
溶出工程では、上記の酸性溶液で溶出させる前に、当該酸性溶液よりもｐＨが大きい水または水溶液を溶出液として通液することができる。標識糖として中性糖の標識体とともに酸性糖の標識体も含まれている場合は、固相には中性糖の標識体と酸性糖の標識体とが両方吸着している。酸性溶液よりもｐＨが大きい水または水溶液を通液することによって、酸性糖の標識体を先に溶出させることができる。
【００５２】
第１溶出工程で溶出液として用いる水または水溶液は、上記の酸性溶液よりもｐＨが大きければ特に限定されない。
【００５３】
たとえば、第１溶出工程で溶出液として用いる水または水溶液のｐＨと、上記の酸性溶液のｐＨとは、１．５以上、好ましくは２．０以上の差があることが好ましい。これによって、中性糖の標識体と酸性糖の標識体とを良好に溶出し分けることができる。当該ｐＨ差の範囲内の上限値は特に限定されないが、たとえば５．０、好ましくは４．０であってよい。これによって、シリカの分解を抑制することが可能となる。
【００５４】
あるいは、第１溶出工程で用いる水または水溶液のｐＨは、５．８以上８．６以下、好ましくは６．０以上７．５以下であってもよい。当該ｐＨが上記下限値以上であることは、中性糖の標識体と酸性糖の標識体とを良好に溶出し分けることができる点で好ましく、上記上限値以下であることは、シリカの分解を抑制することが可能となるという点で好ましい。
【００５５】
溶出液としての水溶液に含まれてよい溶質としては特に限定されないが、たとえば、二酸化炭素、界面活性剤、有機溶媒、塩基性成分、およびｐＨの条件を満たす限りにおいて酸性成分が挙げられる。なお、有機溶媒を含む場合は、水の方が主成分であり、有機溶媒が大部分を占める上述の洗浄液とは明確に区別される。
【００５６】
第１溶出工程は、非加熱条件下で行うことが好ましい。具体的には、４度以上４０度以下の常温環境下で行うことができる。この場合、通液する水溶液が酸性に寄っているほど、酸性糖残基の脱離が良好に抑制される点で好ましい。
【００５７】
第１溶出工程における溶出液の通液量は、たとえば担体の見かけ体積（粒状タイプのシリカゲルである場合は充填状態における粒子間の空隙の体積も含み、モノリスタイプのシリカゲルである場合はマクロ孔およびメソ孔の体積も含む。）のたとえば０．１倍以上、好ましくは０．２倍以上であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば０．１倍以上、好ましくは１倍以上であってよい。たとえば１０μｌ以上、好ましくは１５μｌ以上、さらに好ましくは２０μｌ以上であってよい。これによって、標識糖をより回収率良く得ることができる。
【００５８】
通液量の範囲内の上限値は特に限定されないが、担体の見かけ体積のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。あるいは担体がモノリスシリカタイプのシリカゲルである場合は、マクロ孔およびメソ孔の体積の合計のたとえば１０倍、好ましくは１倍であってよい。たとえば３０μｌ、好ましくは２５μｌであってよい。これによって、溶出液の使用量に対する溶出能をより効率的に得ることができる。
【００５９】
なお、標識糖に酸性糖の標識体が含まれていないことが既知である場合は、第１溶出工程は行わなくてもよい。
【００６０】
［３−３．第２溶出工程］
第１溶出工程を行った場合は、第１溶出工程の後に、すでに述べたとおり酸性溶液を通液する（第２溶出工程）。これによって、中性糖の標識体が溶出される。上述の酸性溶液を溶出液として用いることで、中性糖の標識体を良好な回収率で溶出させることができる。
【００６１】
［３−４．溶離液］
溶出工程で固相から溶出された溶離液は、精製された標識糖を含んでおり、分析工程に供する前に、適宜、濃縮、乾燥、希釈などの処理を行うことができる。第１溶出工程と第２溶出工程を行った場合は、中性糖の標識体と酸性糖の標識体とを分離するなどの目的で、それぞれの工程で得られた溶離液を個別に回収してもよいし、中性糖の標識体と酸性糖の標識体とを混合状態で分析するなどの目的で、それぞれの工程で得られた溶離液を区別せず混合した状態で回収してもよい。
【００６２】
なお、溶出工程で用いた溶出液を構成する物質が水および酸性成分以外の他の成分を含む場合は、酸性成分のみならず、当該他の成分も揮発性であることが好ましい。これによって、溶離液中の標識糖を濃縮または乾燥が容易となり、当該他の成分が残存して分析へ悪影響を及ぼす可能性を防止することができる。
【００６３】
［４．分析］
本発明によって調製された標識糖は、クロマトグラフィ（例えば、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィ）、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳ）、それらの組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）、などの公知の方法により、定性的および／または定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、GlycoMod、Glycosuite、SimGlycan(登録商標)など）を利用することができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１］
（標識糖鎖の精製）
標識糖鎖を精製するため、以下の方法で固相抽出を行った。
固相としてモノリスシリカが保持されたカラムを用いた。このカラムは、スルーポア径（マクロ径）６−１２μｍ、メソ径１０−６０ｎｍのディスク状モノリスシリカフィルターが、容量約１ｍＬのチューブの底部に固定されたものである。このカラムは、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
【００６６】
１０pmolのＰＡ標識糖鎖（タカラバイオ株式会社）をアセトニトリルで希釈し、アセトニトリル含量が９５％（ｖ／ｖ）となるように調製した。この試料溶液の全量を、モノリスシリカスピンカラムにアプライし、卓上遠心機で遠心して通液させることにより標識糖鎖を吸着させた。洗浄液として、アセトニトリル、およびアセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）を用いてカラムを順次洗浄したのち、溶出液として純水中に０．０００５体積％の酢酸を含む酢酸水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、溶離液を回収した。回収した溶離液１μＬをＬＣに供した。
【００６７】
（ＨＰＬＣ測定）
得られた溶離液について、下記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。
【００６８】
【表１】
2017067677.tif 000003
【００６９】
表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整した。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ2−Ｔ1）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1，Ｔ2，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積を基準とした百分率を表わす。
【００７０】
［実施例２］
溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．００２体積％に変更したことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００７１】
［実施例３］
溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．０１体積％に変更したことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００７２】
［実施例４］
溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．０５体積％に変更したことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００７３】
［実施例５］
溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．２体積％に変更したことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００７４】
［溶出効評価−１］
図１に、実施例１から実施例５で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。図１には、比較用として、精製を行っていないＰＡ化糖鎖の原液のＨＰＬＣチャートと、水のＨＰＬＣチャートとを併せて示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は蛍光強度（ｍＶ）である（以下、すべてのＨＰＬＣチャートにおいて同じ）。
【００７５】
図１に示すように、実施例１から実施例５によって、ＰＡ化糖鎖が良好な回収率で溶出されたことを確認した。また、実施例２から実施例５、特に実施例４から実施例５によって、ＰＡ化糖鎖がより一層良好な回収率で溶出されたことを確認した。
【００７６】
［実施例６］
標識糖鎖の標品の代わりに、実際に糖鎖を標識することで得られる過剰試薬が混入した標識糖鎖サンプルを用い、かつ、溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．１体積％に変更したことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００７７】
（糖鎖の標識）
糖鎖の標識は、以下の通りに行なった。
２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ２７６ｍｇを酢酸１００μＬに溶解した（ＰＡ溶液）。ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｂｏｒａｎｅ２００ｍｇを酢酸水溶液（純水５０μＬと酢酸８０μＬを混合）に溶解した（還元剤溶液）。
グルコースオリゴマー１０μｇとＰＡ溶液５０μＬとを混合し、８０℃で６０分間反応させた。その後、還元剤溶液１１０μＬを加え、８０℃で３５分間反応させた。これによって標識反応生成物を得た。
【００７８】
［比較例１］
溶出液を純水に変更したことを除いて、実施例６と同じ操作を行った。
【００７９】
［溶出効評価−２］
図２に、実施例６および比較例１で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
図２に示すように、実施例６によって、ＰＡ化糖鎖の溶出率が大幅に改善されたことを確認した。
【００８０】
［比較例２］
標識対象の糖鎖をヒトＩｇＧ糖鎖に変更し、かつ、溶出液を純水に変更したことを除いて、実施例６と同じ操作を行った。
【００８１】
［実施例７］
標識対象の糖鎖をヒトＩｇＧ糖鎖に変更し、かつ、溶出液としての酢酸水中の酢酸濃度を０．１体積％に変更したことを除いて、実施例６と同じ操作を行った。
【００８２】
［溶出効評価−３］
図３に、比較例２および実施例７で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
図３に示すように、実施例７によって、ＰＡ化糖鎖の溶出率が大幅に改善されたことを確認した。
【００８３】
［比較例３］
標識対象の糖鎖を、グルコースオリゴマー（中性糖鎖）とウシフェツイン（酸性糖鎖）との混合物に変更し、かつ、溶出液を純水５０μＬに変更したことを除いて、実施例６と同じ操作を行った。
【００８４】
［実施例８］
標識対象の糖鎖を、グルコースオリゴマー（中性糖鎖）とウシフェツイン（酸性糖鎖）との混合物に変更し、かつ、モノリスシリカからの溶出において、まず純水１０μＬで溶出した後に１０μＬの０．１体積％の酢酸水で溶出したことを除いて、実施例６と同じ操作を行った。
【００８５】
［実施例９］
溶出において、２０μＬの純水で溶出後、２０μＬの０．１体積％酢酸水で溶出したことを除いて、実施例８と同じ操作を行った。
【００８６】
［実施例１０］
溶出において、２５μＬの純水で溶出後、２５μＬの０．１体積％酢酸水で溶出したことを除いて、実施例８と同じ操作を行った。
【００８７】
［溶出効評価−４］
図４に参考として、グルコースオリゴマー（中性糖鎖）のＰＡ化体とウシフェツイン（酸性糖鎖）のＰＡ化体との混合物（非分離）のＨＰＬＣチャートを示す。
【００８８】
比較例３および実施例８から実施例１０で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートにおいて、図４中に矢印で示すピークのうち保持時間が短い方（中性糖鎖由来）に相当するピークの面積値から中性糖鎖のＰＡ化体の回収率を求め、図５にグラフで示した。縦軸は、回収率を表す。
【００８９】
比較例３および実施例８から実施例１０で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートにおいて、図４中に矢印で示すピークのうち保持時間が長い方（酸性糖鎖由来）に相当するピークの面積値から酸性糖鎖のＰＡ化体の回収率を求め、図５と同様に図６にグラフで示した。
【００９０】
図５に示すように、実施例８から実施例１０によって、中性糖鎖の標識体の回収率が向上することを確認した。さらに図５および図６に示すように、特に実施例９および実施例１０によって、中性糖鎖の標識体の回収率がより一層向上するとともに、酸性糖鎖も良好な回収率で溶出できたことを確認した。
【００９１】
図７に参考として、図４のＨＰＬＣチャートの主要部分の拡大図を示し、各ピークに番号を付した。番号１から番号７を付したピークが中性糖鎖由来、番号８から番号１１を付したピークが酸性糖鎖（シアロ糖鎖）由来のピークである。
【００９２】
実施例１０を、ロットの異なるモノリスシリカを用いて３回行い、それぞれＨＰＬＣチャートを得た。３つのＨＰＬＣチャートそれぞれにおいて、図７の番号１から１１のピークに相当するピークの面積を求め、それらすべてのピーク面積の和に対する各ピークの面積の比を求めた。３つのＨＰＬＣチャートそれぞれから求められた各ピークの面積の比を平均し、図８の（ａ）にグラフで示した。なお、図８では、図４の原液のＨＰＬＣチャートから得られる各ピークの面積比（ｂ）と、比較例３の水溶出のＨＰＬＣチャートから得られる各ピークの面積比（ｃ）も併せて示した。
【００９３】
図８に示したように、本実施例で得られる各ピークの面積比（ａ）は、原液のピーク面積比（ｂ）の±１０％以内におさまっており、特に中性糖鎖の標識体に由来するピークについては水溶出の場合のピーク面積比（ｃ）の倍程度に向上したことが示された。
【００９４】
本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。
【図１】
2017067677.tif 000004
【図２】
2017067677.tif 000005
【図３】
2017067677.tif 000006
【図４】
2017067677.tif 000007
【図５】
2017067677.tif 000008
【図６】
2017067677.tif 000009
【図７】
2017067677.tif 000010
【図８】
2017067677.tif 000011