(57)【要約】【課題】検体中の脂質を高精度に質量分析する方法の提供。【解決手段】脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること、及び、イオン化した脂質を質量分析により検出することを含む、脂質の質量分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること；及び、
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法。
【請求項２】
前記脂質が、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記質量分析方法が、液体クロマトグラフィー−質量分析方法であり、かつ前記脂質を含む検体が、液体クロマトグラフィー分離の生成物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記炭酸水素アンモニウムが、前記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記炭酸水素アンモニウムが、前記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化を促進するための方法であって、該検体に炭酸水素アンモニウムを添加することを含む、方法。
【請求項７】
前記脂質が遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記炭酸水素アンモニウムが、前記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記炭酸水素アンモニウムが、前記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
炭酸水素アンモニウムを含有する、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１２】
前記脂質が遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１記載の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１３】
正イオンモードでのイオン化において［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成を促進する、請求項１１又は１２記載の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１４】
負イオンモードでのイオン化において［Ｍ−Ｈ］-の生成を促進する、請求項１１又は１２記載の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１５】
前記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１６】
前記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、請求項１５記載の脂質のイオン化促進剤。
【請求項１７】
前記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、請求項１５記載の脂質のイオン化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質を質量分析する方法、及びそのためのイオン化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
角質層は表皮の最表面に位置し、皮膚のバリア機能や保湿機能に寄与している。ヒト角質層の細胞間脂質は、主にセラミド、コレステロール、遊離脂肪酸、硫酸コレステロールなどから構成されている。ヒト角質層のセラミドは、従来、皮膚のバリア機能や保湿機能に関与する主因子として報告されている。セラミド以外の細胞間脂質についても、皮膚機能との関連が報告されている。
【０００３】
生体試料の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）においては、主にエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）又は大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）が用いられている。質量分析法では、目的分子をイオン化し、生じたイオンを、真空中でｍ／ｚ（質量数／電荷）に応じて分離及び検出する。生成されるイオンとしてはプロトン付加分子（［Ｍ＋Ｈ］+）や脱プロトン分子（［Ｍ−Ｈ］-）などが挙げられる。当該イオン化処理で生成するイオンの種類は、イオン化の条件や、検体又は移動相中に含まれる溶媒や添加剤の影響を受ける。例えば、正イオンモードでは、検体又は移動相中にアンモニウム塩やアンモニアが存在するとアンモニウムイオン付加分子（［Ｍ＋ＮＨ4］+）が、ナトリウム塩が存在するとナトリウムイオン付加分子（［Ｍ＋Ｎａ］+）が生成される場合がある。また負イオンモードでは、検体又は移動相中に酢酸や酢酸アンモニウムが存在すると酢酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＣＨ3ＣＯＯ］-）が、ギ酸やギ酸アンモニウムが存在するとギ酸イオン付加分子（［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-）が、塩化物イオンが存在すると塩化物イオン付加分子（［Ｍ＋Ｃｌ］-）が生成される場合がある。
【０００４】
目的分子のイオン化の過程で多種のイオン種が生成されると、各イオンの信号強度が分散し、検出感度の低下に繋がる場合がある。また、目的分子が多種類存在する際には、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚが重なることにより、目的分子の検出が困難になる場合がある。さらに、質量分析では各イオンの同位体も同時に検出されるため、ｍ／ｚの差が近接する場合にも、目的分子の検出が困難になることがある。
【０００５】
炭酸水素アンモニウム（又は炭酸アンモニウム）は、従来、液体クロマトグラフィーにおいて、試料中の目的分子を分離するための緩衝剤として移動相に添加されていた。非特許文献１には、炭酸アンモニウム水溶液／アセトニトリルの混合溶媒を用いたＬＣにより、胆汁酸からコール酸誘導体を分離したことが記載されている。非特許文献２には、メタノール／炭酸水素アンモニウムバッファーの混合溶媒からなる移動相でグルコサミンをＬＣ分離した後、ＥＳＩ−ＭＳ分析したことが記載されている。一方、非特許文献３には、植物油中のトリアシルグリセリドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析において、ＭＡＬＤＩマトリックスであるジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）への添加剤として炭酸水素アンモニウムを用いたことが記載されている。しかしながら、これまで、炭酸水素アンモニウムをＥＳＩ−ＭＳやＡＰＣＩ−ＭＳにおけるイオン化促進のために用いたという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lipids, 1978, 13(12):908-909
【非特許文献２】Journal of Chromatography A, 2010, 1217:3275-3281
【非特許文献３】Rapid Commun Mass Spectrom 2007, 21:1951-1957
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、質量分析用検体のＥＳＩ、ＡＰＣＩ、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化におけるイオン化処理において、該検体中の脂質が特定のイオン種にイオン化することを促進するイオン化促進剤、ならびに、該イオン化促進剤を用いた、脂質を高精度に質量分析する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々検討した結果、脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下でＥＳＩ、ＡＰＣＩ、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化などのイオン化処理に供することにより、生成される脂質分子のイオン種を特定の種類に限定することができることを見出した。したがって、炭酸水素アンモニウムをイオン化促進剤として用いることにより、脂質の質量分析の精度を向上させることができる。
【０００９】
したがって、本発明は、
脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること；及び、
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化を促進するための方法であって、該検体に炭酸水素アンモニウムを添加することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、炭酸水素アンモニウムを含有する、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のイオン化促進剤は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化による質量分析用検体のイオン化処理において生成される脂質分子のイオン種を、特定の種類に限定することができる。したがって、本発明のイオン化促進剤を用いることで、質量分析における目的分子からの複数種イオンの生成が抑制され、目的とする脂質の検出の感度が向上する。また、目的分子が多種類存在する際に、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚの重複が解消され、各目的分子の検出が容易になる。したがって、本発明によれば、高精度な脂質の質量分析を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１でのトリグリセリドとセラミドＮＤＳの抽出イオンクロマトグラム。
【図２】実施例１及び比較例１におけるトリグリセリド（正イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例１、Ｂ：実施例１。
【図３】実施例１及び比較例１におけるセラミドＮＤＳ（正イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例１、Ｂ：実施例１。
【図４】実施例１及び比較例１におけるセラミドＮＤＳ（負イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例１、Ｂ：実施例１。
【図５】実施例２でのトリグリセリド、セラミドＮＤＳ及び遊離脂肪酸の抽出イオンクロマトグラム。
【図６】実施例２及び比較例２におけるトリグリセリド（正イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例２、Ｂ：実施例２。
【図７】実施例２及び比較例２におけるセラミドＮＤＳ（正イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例２、Ｂ：実施例２。
【図８】実施例２及び比較例２におけるセラミドＮＤＳ（負イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例２、Ｂ：実施例２。
【図９】実施例２及び比較例２における遊離脂肪酸（負イオンモード）の質量分析スペクトル。Ａ：比較例２、Ｂ：実施例２。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、脂質の質量分析方法を提供する。該本発明の方法で分析される脂質の例としては、動物又は植物由来の脂質、食品由来の脂質、化粧品等の油脂含有組成物由来の脂質などが挙げられ、好ましくは皮膚角質層及び毛に含まれる脂質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法で分析される脂質のより詳細な例としては、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、モノアシルグリセリド（ＭＡＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＡＧ）、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）、セラミド等の脂肪酸含有化合物、ならびにコレステロール、硫酸コレステロール等のコレステロール及びその誘導体が挙げられ、好ましい例としては、ＦＦＡ、ＴＡＧ及びセラミド等の脂肪酸含有化合物が挙げられる。本発明の質量分析方法において、上記に挙げた脂質は、いずれか１種が分析されてもよいが、２種以上、好ましくは全てが網羅的に分析されてもよい。好ましくは、本発明の質量分析方法において分析される脂質は、ＦＦＡ、ＴＡＧ及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１５】
本発明の質量分析方法の検体は、上記脂質を含む検体である。好ましくは、該検体は、液体クロマトグラフィー分離で得られた生成物である。したがって、好ましくは本発明の質量分析方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）法である。
【００１６】
本発明の方法がＬＣ−ＭＳ法の場合、動物、植物、食品、化粧品等の油脂含有組成物、などの試料から脂質を含む抽出液を調製し、これをＬＣに供することができる。該試料の好ましい例としては、皮膚角質層や毛が挙げられる。好ましくは、上記試料は溶媒抽出に供され、脂質を含む抽出液へと調製される。溶媒抽出のための溶媒には、標的脂質の溶解性が高い溶媒を用いる。好ましい溶媒の例としては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、クロロホルムなどが挙げられる。さらに、脂質解析が夾雑成分の影響を受ける可能性がある場合、夾雑物を除去するための前処理を試料に施してもよい。あるいは、上記試料から脂質を含む溶媒抽出液を調製する方法として、生体試料から脂質成分を分離精製するための公知の手法、例えば、Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ法（Ｅ．Ｇ．Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．Ｄｙｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．３７，９１１−９１７，１９５９）又はＦｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ，Ｍ．Ｌｅｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｈ．Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２６，４９７−５０９，１９５７）を適用することができる。
【００１７】
次いで、上記手順で調製した脂質を含む抽出液をクロマトグラフィー分離する。クロマトグラフィーは、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）であっても、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）であってもよい。本発明の方法においては、標的脂質ごとにＮＰＬＣとＲＰＬＣを使い分けてもよいが、全ての試料をまとめてＮＰＬＣ又はＲＰＬＣのいずれかにかけてもよい。本発明の方法において好ましいＬＣは、ＲＰＬＣである。
【００１８】
ＮＰＬＣ用の充填剤としては、シリカゲルやシリカゲルに極性官能基を結合した充填剤が挙げられる。ＲＰＬＣ用の充填剤としては、シリカゲルやポリマーゲル基材に炭化水素鎖を結合した充填剤が挙げられる。好ましくは、シリカゲル基材にオクタデシル基を結合した充填剤（ＯＤＳ又はＣ１８充填剤とも称する）が挙げられる。
【００１９】
クロマトグラフィーの移動相は、標的脂質を適度に保持して分子種別に分離することが可能であり、かつ不揮発性の酸や塩を高濃度に含まないものが好ましい。例えば、移動相ａはメタノール/水の混合液、移動相ｂは２−プロパノールとし、移動相ａとｂで１００：０〜０：１００（体積比）のグラジエントをかけることができる。
【００２０】
斯くして得られたクロマトグラフィー分離の生成物は、質量分析のための検体として使用される。すなわち、該クロマトグラフィー分離の生成物はイオン化に供され、その中に含まれる脂質がイオン化される。イオン化の手段としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、及びＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化が挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「ＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源」（または単に「マルチイオン源」）とは、ＥＳＩとＡＰＣＩを同時に行う複合イオン化法を実行できるか、又はＥＳＩとＡＰＣＩそれぞれの単独イオン化法をデッドタイム無く切換えて実行可能であり、それによって、１回の質量分析でＥＳＩとＡＰＣＩにより生成されたイオンを同時に検出することができるように検体をイオン化することができるイオン源を意味している。このようなマルチイオン源は、マルチモードイオンソース、デュアルイオンソース、ＥＳＣｉマルチモードイオン源、デュオスプレーイオンソース、ハイブリッドイオン源などと称され、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、島津製作所、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、株式会社日立ハイテクノロジーズなどから販売又は公開されている（例えば、米国特許第６６４６２５７号、国際公開公報第２００３／１０２５３７号、国際公開公報第２００７／０３２０８８号、国際公開公報第２０１４／０８４０１５号）。マルチイオン源によるイオン化により、検体中の脂質を、その極性や構造特異性にかかわらずイオン化することができる。
【００２２】
本発明において、上記脂質のイオン化は、炭酸水素アンモニウムの存在下で行われる。本発明において、炭酸水素アンモニウムは、検体中の標的脂質のイオン化効率の向上のために使用される、イオン化促進剤である。さらに本発明において、炭酸水素アンモニウムは、検体中の標的脂質のイオン化で生成される標的脂質イオンの種類を、特定のイオン種に限定させる作用を有する。すなわち、本発明において、炭酸水素アンモニウムは、標的脂質の種類に依存して、特定のイオン種の生成を促進するイオン化促進剤である。
【００２３】
より詳細には、本発明で用いられる炭酸水素アンモニウムは、脂質分子種依存的に、正イオンモードでのイオン化においては［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成を促進し、負イオンモードでのイオン化においては［Ｍ−Ｈ］-の生成を促進する（ここで、Ｍは、質量分析での検出対象である脂質分子種の中性分子を表す）。例えば、炭酸水素アンモニウムは、正イオンモードにおいて、ＴＡＧを［Ｍ＋ＮＨ4］+の形態にイオン化されるよう促し、一方、セラミドを［Ｍ＋Ｈ］+の形態にイオン化されるよう促す。また例えば、炭酸水素アンモニウムは、負イオンモードにおいて、セラミド及びＦＦＡを［Ｍ−Ｈ］-の形態にイオン化されるよう促す。
【００２４】
本発明の方法において、炭酸水素アンモニウムは、イオン化に供するための検体、例えばクロマトグラフィー分離後の生成物に添加することができる。クロマトグラフィー分離生成物への炭酸水素アンモニウムの添加濃度は、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００２５】
あるいは、本発明の方法においては、クロマトグラフィー分離の過程で炭酸水素アンモニウムを添加し、炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物を調製してもよい。クロマトグラフィー分離の過程で炭酸水素アンモニウムを添加する場合、クロマトグラフィーの移動相に添加することが好ましい。例えば、炭酸水素アンモニウム含有メタノール溶液／水の１／１溶液を移動相に用いたクロマトグラフィー分離を行うことによって、炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物を得ることができる。該移動相への炭酸水素アンモニウムの添加濃度は、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００２６】
本発明の方法において、上記炭酸水素アンモニウムの作用を阻害しないためには、クロマトグラフィーの移動相には、従来使用されている緩衝剤、例えばギ酸、酢酸、及びそれらの塩（例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム）などを添加しないことが望ましい。また本発明の方法においては、炭酸水素アンモニウム以外のイオン化促進剤を使用しないことが望ましい。
【００２７】
好ましくは、本発明の方法においては、炭酸水素アンモニウムと検体との混液が調製されてイオン化に供される。
【００２８】
上記の手順にて炭酸水素アンモニウム存在下でイオン化された標的脂質は、質量分析（ＭＳ）にかけられ、質量数／電荷（ｍ／ｚ）ごとに分離されて検出される。本発明で使用されるＭＳとしては、ＥＳＩ−ＭＳ、ＡＰＣＩ−ＭＳ、及びＥＳＩとＡＰＣＩの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化を用いて質量分析を行う方法が挙げられる。
【００２９】
イオン化した脂質の質量分析には、四重極型質量分析装置（Ｑ−ＭＳ）、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ−ＭＳ）、フーリエ変換型質量分析装置（ＦＴ−ＭＳ）等のシングル型の質量分析装置、Ｑ−ＴＯＦ、ＩＴ−ＴＯＦ等のハイブリッド型質量分析装置、又はトリプル四重極型等のタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ等）などの公知の質量分析装置を用いることができる。質量分析におけるイオン化された脂質の検出は、正イオンモード及び負イオンモードのいずれで行ってもよく、標的脂質分子種に応じて正又は負のイオンモードを選択すればよい。例えば、コレステロールならびにＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧは、正イオンモードで検出することが好ましく、遊離脂肪酸及び硫酸コレステロールは、負イオンモードで検出することが好ましい。セラミドは、正負いずれのイオンモードでも検出することができるが、夾雑物の影響を回避するためには負イオンモードで検出することが好ましい。検出された分子種は、ｍ／ｚに基づいて同定することができる。
【００３０】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３１】
〔１〕脂質を含む検体を、炭酸水素アンモニウム存在下で、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化に供すること；及び、
イオン化した脂質を質量分析により検出すること、
を含む、脂質の質量分析方法。
【００３２】
〔２〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕記載の方法。
【００３３】
〔３〕好ましくは、上記質量分析方法が液体クロマトグラフィー−質量分析方法であり、かつ上記脂質を含む検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００３４】
〔４〕好ましくは、上記脂質を含む検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔３〕記載の方法：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
【００３５】
〔５〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
【００３６】
〔６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加され、該炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物が調製される、〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【００３７】
〔７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔３〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【００３８】
〔８〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記脂質を含む検体との混液がイオン化に供される、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
【００３９】
〔９〕好ましくは、上記質量分析において、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出する、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
【００４０】
〔１０〕エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化を促進するための方法であって、該検体に炭酸水素アンモニウムを添加することを含む、方法。
【００４１】
〔１１〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１０〕記載の方法。
【００４２】
〔１２〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
【００４３】
〔１３〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔１２〕記載の方法：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
【００４４】
〔１４〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。
【００４５】
〔１５〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加され、該炭酸水素アンモニウムを含有するクロマトグラフィー分離生成物が調製される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４６】
〔１６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４７】
〔１７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液を調製することを含む、〔１０〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の方法。
【００４８】
〔１８〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔１０〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
【００４９】
〔１９〕炭酸水素アンモニウムを含有する、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進剤。
【００５０】
〔２０〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１９〕記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５１】
〔２１〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔１９〕又は〔２０〕記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５２】
〔２２〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔２１〕記載の脂質のイオン化促進剤：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
【００５３】
〔２３〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔２１〕又は〔２２〕記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５４】
〔２４〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、〔２１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５５】
〔２５〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔２１〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５６】
〔２６〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液である、〔１９〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５７】
〔２７〕好ましくは、正イオンモードでのイオン化において［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成を促進する、〔１９〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５８】
〔２８〕好ましくは、正イオンモードでのイオン化において、トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+へのイオン化を促すか、あるいはセラミドの［Ｍ＋Ｈ］+へのイオン化を促す、〔２７〕記載の脂質のイオン化促進剤。
【００５９】
〔２９〕好ましくは、負イオンモードでのイオン化において［Ｍ−Ｈ］-の生成を促進する、〔１９〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００６０】
〔３０〕好ましくは、負イオンモードでのイオン化において、セラミド又は遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-へのイオン化を促す、〔２９〕記載の脂質のイオン化促進剤。
【００６１】
〔３１〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔１９〕〜〔３０〕のいずれか１項記載の脂質のイオン化促進剤。
【００６２】
〔３２〕エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、又はそれらの両方を誘起するマルチイオン源によるイオン化における質量分析用検体中の脂質のイオン化促進のための炭酸水素アンモニウムの使用。
【００６３】
〔３３〕上記脂質が、
好ましくは、脂肪酸含有化合物、コレステロール及びコレステロール誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、遊離脂肪酸、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、セラミド、コレステロール及び硫酸コレステロールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセリド及びセラミドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔３２〕記載の使用。
【００６４】
〔３４〕好ましくは、上記検体が液体クロマトグラフィー分離の生成物である、〔３２〕又は〔３３〕記載の使用。
【００６５】
〔３５〕好ましくは、上記検体が、以下を液体クロマトグラフィー分離して得られた生成物である、〔３４〕記載の使用：
好ましくは、動物、植物、食品又は化粧品から調製した脂質を含む抽出液、
より好ましくは、皮膚角質層又は毛から調製した脂質を含む抽出液。
【００６６】
〔３６〕好ましくは、上記液体クロマトグラフィーが、順相液体クロマトグラフィー又は逆相液体クロマトグラフィーである、〔３４〕又は〔３５〕記載の使用。
【００６７】
〔３７〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが上記液体クロマトグラフィーの移動相に添加される、〔３４〕〜〔３６〕のいずれか１項記載の使用。
【００６８】
〔３８〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが上記液体クロマトグラフィー分離の生成物に添加される、〔３４〕〜〔３６〕のいずれか１項記載の使用。
【００６９】
〔３９〕好ましくは、上記炭酸水素アンモニウムが、該炭酸水素アンモニウムと上記検体との混液として使用される、〔３２〕〜〔３８〕のいずれか１項記載の使用。
【００７０】
〔４０〕好ましくは、上記イオン化促進が、正イオンモードでのイオン化における［Ｍ＋Ｈ］+又は［Ｍ＋ＮＨ4］+の生成の促進である、〔３２〕〜〔３９〕のいずれか１項記載の使用。
【００７１】
〔４１〕好ましくは、上記イオン化促進が、正イオンモードでのイオン化におけるトリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+へのイオン化の促進であるか、あるいはセラミドの［Ｍ＋Ｈ］+へのイオン化の促進である、〔４０〕記載の使用。
【００７２】
〔４２〕好ましくは、上記イオン化促進が、負イオンモードでのイオン化における［Ｍ−Ｈ］-の生成の促進である、〔３２〕〜〔３９〕のいずれか１項記載の使用。
【００７３】
〔４３〕好ましくは、上記イオン化促進が、負イオンモードでのイオン化におけるセラミド又は遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-へのイオン化の促進である、〔４２〕記載の使用。
【００７４】
〔４４〕好ましくは、上記質量分析が、
トリアシルグリセリドの［Ｍ＋ＮＨ4］+イオンを検出するための質量分析であるか、
遊離脂肪酸の［Ｍ−Ｈ］-イオンを検出するための質量分析であるか、又は
セラミドの［Ｍ−Ｈ］-イオン又は［Ｍ＋Ｈ］+を検出するための質量分析である、
〔３２〕〜〔４３〕のいずれか１項記載の使用。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００７６】
（試料）
ＴＡＧ−Ｃ４８：３及びＦＦＡ−Ｃ２４：０を各１０μｍｏｌ／Ｌ、及びＮ−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミド（以下、セラミドＮＤＳ）Ｃ４６を１μｍｏｌ／Ｌ含む、メタノール／２−プロパノール／クロロホルム＝４５／４５／１０溶液を調製した。この試料を下記実施例１又は２の条件でＬＣ−ＭＳ分析した。
【００７７】
（実施例１）
ＬＣ−Ｑ−ＭＳ分析
（装置）
６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
（クロマトグラフィー分離）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ  ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（化学物質評価研究機構）（４０℃）
移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌイオン化促進剤含有メタノール／水＝１／１溶液
移動相：Ｂ）２−プロパノール
グラジエント：Ａ１００％（０ｍｉｎ）→Ｂ５０％（５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（３５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（４５ｍｉｎ）
移動相流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
平衡化時間：１０ｍｉｎ
イオン化促進剤：炭酸水素アンモニウム
（質量分析）
イオン化法：ＥＳＩ（Ｇ１９５８−６５５３８）
測定：Ｓｃａｎ
極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ＆Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
質量範囲：２００−１２００
フラグメンター電圧：２００Ｖ
キャピラリー電圧：３５００Ｖ
ネブライザー圧力：２０ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：３５０℃
乾燥ガス流量：１０Ｌ／ｍｉｎ
【００７８】
（比較例１）
実施例１と同様の条件で、ただしイオン化促進剤として酢酸アンモニウムを用いて、試料をＬＣ−ＭＳ分析した。
【００７９】
（実施例２）
ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
（装置）
ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
（クロマトグラフィー分離）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ  ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（化学物質評価研究機構）（４０℃）
移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌイオン化促進剤含有メタノール／水＝１／１溶液
移動相：Ｂ）２−プロパノール
グラジエント：Ａ１００％（０ｍｉｎ）→Ｂ５０％（５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（３５ｍｉｎ）→Ｂ１００％（４５ｍｉｎ）
移動相流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
平衡化時間：１０ｍｉｎ
イオン化促進剤：炭酸水素アンモニウム
（質量分析）
イオン化法：ＥＳＩ
測定：Ｓｃａｎ
極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ＆Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
質量範囲：２００−１２００
コーン電圧：２０Ｖ
Ａｐｅｒｔｕｒｅ電圧：１０Ｖ
キャピラリー電圧：２０００Ｖ
脱溶媒ガス＝６００Ｌ／Ｈｒ（３５０℃）
コーンガス＝５０Ｌ／Ｈｒ
イオン源ヒーター＝１２０℃
【００８０】
（比較例２）
実施例２と同様の条件で、ただしイオン化促進剤として酢酸アンモニウムを用いて、試料をＬＣ−ＭＳ分析した。
【００８１】
実施例１における試料のクロマトグラフィー分離で検出されたトリグリセリドとセラミドＮＤＳの抽出イオンクロマトグラムを図１に示す。図２〜４は、実施例１及び比較例１における質量分析結果を表す。図２は、トリグリセリド（正イオンモード）、図３はセラミドＮＤＳ（正イオンモード）、図４はセラミドＮＤＳ（負イオンモード）のスペクトルデータを表す。各図とも、Ａは比較例１（イオン化促進剤に酢酸アンモニウムを使用）、Ｂは実施例１（イオン化促進剤に炭酸水素アンモニウムを使用）を表し、各スペクトルの横には検出されたイオン種とｍ／ｚ値が、括弧内にはスペクトル強度が記載されている。
【００８２】
また、実施例２における試料のクロマトグラフィー分離で検出されたトリグリセリド、セラミドＮＤＳ及び遊離脂肪酸の抽出イオンクロマトグラムを図５に示す。図６〜９は、実施例２及び比較例２における質量分析結果を表す。図６は、トリグリセリド（正イオンモード）、図７はセラミドＮＤＳ（正イオンモード）、図８はセラミドＮＤＳ（負イオンモード）、図９は遊離脂肪酸（負イオンモード）のスペクトルデータを表す。各図とも、Ａは比較例２（イオン化促進剤に酢酸アンモニウムを使用）、Ｂは実施例２（イオン化促進剤に炭酸水素アンモニウムを使用）を表し、各スペクトルの横には検出されたイオン種とｍ／ｚ値が、括弧内にはスペクトル強度が記載されている。
【００８３】
実施例１及び２では、比較例１及び２と比較して、検出対象の各脂質分子種が特定の１種類のイオン種に限定してイオン化されており、かつそのスペクトル強度も増加していた。さらに、エレクトロスプレーイオン化及び大気圧化学イオン化の両方を誘起するマルチイオン源を用いた試験〔カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、移動相：Ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ  炭酸水素アンモニウム含有メタノール／水＝１／１溶液、移動相：Ｂ）２−プロパノール、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、Ｍｕｌｔｉ  ｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ（６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇ１９７８Ｂ）：ＥＳＩ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ：ＡＰＣＩ／Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ〕においても、特定の１種類のイオン種に限定したイオン化、およびそのスペクトル強度の増加が観察された。したがって、イオン化促進剤として炭酸水素アンモニウムを使用することで、質量分析における目的分子からの複数種のイオンの生成が抑制され、目的とする脂質の検出の感度が向上する。また、目的分子が多種類存在する際に、各目的分子において生成されたイオンのｍ／ｚの重複が解消され、各目的分子の検出が容易になる。
【図１】
2017067510.tif 000002
【図２】
2017067510.tif 000003
【図３】
2017067510.tif 000004
【図４】
2017067510.tif 000005
【図５】
2017067510.tif 000006
【図６】
2017067510.tif 000007
【図７】
2017067510.tif 000008
【図８】
2017067510.tif 000009
【図９】
2017067510.tif 000010