(57)【要約】【課題】より高速でかつ核酸増幅が確実に行われるＰＣＲの関連技術を提供する。【解決手段】ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第一目標温度Ｔ１１（℃）以上に昇温させた後に、前記Ｔ１１以下に降温させる過昇温工程を含み、前記Ｔ１１が９０〜１０５℃であり、前記過昇温工程における最高到達温度Ｔ１０（℃）がＴ１１より５〜３０℃高く、前記Ｔ１０から前記Ｔ１１への降温に要する時間が１〜１０秒であり、前記過昇温工程を含む所定の温度昇降サイクルを複数回繰り返し、前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である増幅方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、
標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第一目標温度Ｔ１１（℃）以上に昇温させた後に、前記Ｔ１１以下に降温させる過昇温工程を含み、
前記Ｔ１１が９０〜１０５℃であり、
前記過昇温工程における最高到達温度Ｔ１０（℃）がＴ１１より５〜３０℃高く、
前記Ｔ１０から前記Ｔ１１への降温に要する時間が１〜１０秒であり、
前記過昇温工程を含む所定の温度昇降サイクルを複数回繰り返し、
前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法。
【請求項２】
前記Ｔ１１が前記標的核酸の変性温度である、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、
標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第二目標温度Ｔ２１（℃）以下に降温させた後に昇温させる過冷却工程と、
前記過冷却工程に続いて、前記表面温度を所定の温度範囲内に所定時間維持する温度維持工程とを含み、
前記Ｔ２１が４０〜７５℃であり、
前記過冷却工程における最低到達温度Ｔ２０（℃）がＴ２１より５〜２０℃低く、
前記所定の温度範囲がＴ２１±１℃であり、
前記所定時間が２秒以上であり、
前記過冷却工程と前記温度維持工程と含む所定の温度昇降サイクルを複数回繰り返し、
前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法。
【請求項４】
前記所定の温度範囲がＴ２１±０．５℃である、請求項３に記載の増幅方法。
【請求項５】
前記Ｔ２１が前記プライマーの融解温度Ｔｍである、請求項３又は４に記載の増幅方法。
【請求項６】
前記所定時間が２０秒以下である、請求項３〜５のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項７】
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、
標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第一目標温度Ｔ１１（℃）以上に昇温させた後に、前記Ｔ１１以下に降温させる過昇温工程と、
前記表面温度を、所定の第二目標温度Ｔ２１（℃）以下に降温させた後に昇温させる過冷却工程と、
前記過冷却工程に続いて、前記表面温度を所定の温度範囲内に所定時間維持する温度維持工程とを含み、
前記Ｔ１１が９０〜１０５℃であり、
前記過昇温工程における最高到達温度Ｔ１０（℃）がＴ１１より５〜３０℃高く、
Ｔ１０からＴ１１への降温に要する時間が１〜１０秒であり、
前記Ｔ２１が４０〜７５℃であり、
前記過冷却工程における最低到達温度Ｔ２０（℃）がＴ２１より５〜２０℃低く、
前記所定の温度範囲がＴ２１±１℃であり、
前記所定時間が２秒以上であり、
前記過昇温工程と前記過降温工程と前記温度維持工程とをこの順番で行うことを含む温度昇降サイクルを複数回繰り返し、
前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法。
【請求項８】
前記Ｔ１１が前記標的核酸の変性温度である、請求項７に記載の増幅方法。
【請求項９】
前記所定の温度範囲がＴ２１±０．５℃である、請求項７又は８に記載の増幅方法。
【請求項１０】
前記Ｔ２１が前記プライマーの融解温度Ｔｍである、請求項７〜９のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項１１】
前記所定時間が２０秒以下である、請求項７〜１０のいずれかに記載の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法に関する。本発明の核酸の増幅方法は、１サイクルの所要時間が短く、かつ標的核酸の増幅を確実に行うことができるものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の高速化を実現する上で、１サイクルに要する時間をいかにして短縮するかが大きな検討課題となる。一般に、ポリメラーゼ連鎖反応は、（１）標的核酸の変性（変性工程）、（２）プライマーの結合（アニーリング工程）、（３）ポリメラーゼによる伸長反応（伸長工程）、を繰り返すことにより行われる。
【０００３】
特許文献１，２には、変性状態からアニーリング状態へ温度変化を所定の冷却速度で行い、ＰＣＲにかかる時間を短縮することが記載されている。また特許文献１には、所謂ブロック・サーマルサイクラーを用い、冷却ステップにおいて所望される溶液温度よりも低いブロック温度を設定して冷却を行うことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−３９５６２号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２４４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、本発明者らは、ＰＣＲにおいて単純に温度変化を速めるだけでは、各工程での反応の確実性を損なうことがあることを見出した。例えば、標的核酸の変性やプライマーの結合（アニーリング）が十分に行われなかったり、逆に酵素が失活してしまうことで、増幅が十分に行われないおそれがある。変性工程を例にとると、通常の温度制御を行うと、標的核酸の変性温度（目標温度）を挟んで温度が上下に波打ち、振幅を繰り返してしまうことがある。この場合、目標温度以上の温度に維持される合計時間が短くなって、標的核酸に与える熱量が不足し、結果的に変性工程に長時間を要することとなる。
そこで本発明は、より高速でかつ核酸増幅が確実に行われるＰＣＲの関連技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１つの様相は、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第一目標温度Ｔ１１（℃）以上に昇温させた後に、前記Ｔ１１以下に降温させる過昇温工程を含み、前記Ｔ１１が９０〜１０５℃であり、前記過昇温工程における最高到達温度Ｔ１０（℃）がＴ１１より５〜３０℃高く、前記Ｔ１０から前記Ｔ１１への降温に要する時間が１〜１０秒であり、前記過昇温工程を含む所定の温度昇降サイクルを複数回繰り返し、前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法である。
【０００７】
本様相の方法は上記構成の過昇温工程を含むので、標的核酸の変性がより確実に行われる。そのため、ＰＣＲによる核酸増幅をより確実かつ短時間に行うことができる。
【０００８】
ここで、「最高到達温度」とは、表面温度がＴ１１を超えてから初めてＴ１１以下となるまでの過程において、表面温度が最も高くなった時点の温度を指す。つまり、当該過程における、時間に対する表面温度の変化を表す曲線（以下、「温度変化プロファイル」とも記載する）の極大値を指す。
【０００９】
好ましくは、前記Ｔ１１が前記標的核酸の変性温度である。
【００１０】
本発明の他の様相は、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第二目標温度Ｔ２１（℃）以下に降温させた後に昇温させる過冷却工程と、前記過冷却工程に続いて、前記表面温度を所定の温度範囲内に所定時間維持する温度維持工程とを含み、前記Ｔ２１が４０〜７５℃であり、前記過冷却工程における最低到達温度Ｔ２０（℃）がＴ２１より５〜２０℃低く、前記所定の温度範囲がＴ２１±１℃であり、前記所定時間が２秒以上であり、前記過冷却工程と前記温度維持工程と含む所定の温度昇降サイクルを複数回繰り返し、前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法である。
【００１１】
本様相の方法は、上記構成の過冷却工程と温度維持工程を含むので、変性した標的核酸へのプライマーの結合と、ポリメラーゼによる伸長反応がより確実に行われる。そのため、ＰＣＲによる核酸増幅をより確実かつ短時間に行うことができる。
【００１２】
ここで、「最低到達温度」とは、表面温度がＴ２１を下回ってから上昇に転じるまでの過程において、表面温度が最も低くなった時点での温度を指す。つまり、当該過程における温度変化プロファイルの極小値を指す。
【００１３】
好ましくは、前記所定の温度範囲がＴ２１±０．５℃である。
【００１４】
かかる構成により、標的核酸へのプライマーの結合とポリメラーゼによる伸長反応が、さらに確実に行われる。
【００１５】
好ましくは、前記Ｔ２１が前記プライマーの融解温度Ｔｍである。
【００１６】
ここで、融解温度が異なる複数種のプライマーを用いる場合は、融解温度が最も高いプライマーの融解温度ＴｍＨと、融解温度が最も低いプライマーの融解温度ＴｍＬとの差であるΔＴｍ（＝ＴｍＨ−ＴｍＬ）が１℃以下であることが好ましい。さらに、この場合、所定の温度範囲がＴｍＬ−０．５℃以上、ＴｍＨ＋０．５℃以下であることが好ましい。
【００１７】
好ましくは、前記所定時間が２０秒以下である。
【００１８】
本発明の他の様相は、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅方法であって、標的核酸及びプライマーを含む試料が収容された容器の表面温度を、所定の第一目標温度Ｔ１１（℃）以上に昇温させた後に、前記Ｔ１１以下に降温させる過昇温工程と、前記表面温度を、所定の第二目標温度Ｔ２１（℃）以下に降温させた後に昇温させる過冷却工程と、前記過冷却工程に続いて、前記表面温度を所定の温度範囲内に所定時間維持する温度維持工程とを含み、前記Ｔ１１が９０〜１０５℃であり、前記過昇温工程における最高到達温度Ｔ１０（℃）がＴ１１より５〜３０℃高く、Ｔ１０からＴ１１への降温に要する時間が１〜１０秒であり、前記Ｔ２１が４０〜７５℃であり、前記過冷却工程における最低到達温度Ｔ２０（℃）がＴ２１より５〜２０℃低く、前記所定の温度範囲がＴ２１±１℃であり、前記所定時間が２秒以上であり、前記過昇温工程と前記過降温工程と前記温度維持工程とをこの順番で行うことを含む温度昇降サイクルを複数回繰り返し、前記温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である、増幅方法である。
【００１９】
本様相の方法は、上記構成の過昇温工程と、過冷却工程と、温度維持工程を含む。かかる構成により、ＰＣＲによる核酸増幅をさらに確実かつ短時間に行うことができる。最高到達温度および最低到達温度の意義は、上記と同様である。
【００２０】
好ましくは、前記Ｔ１１が前記標的核酸の変性温度である。
【００２１】
好ましくは、前記所定の温度範囲がＴ２１±０．５℃である。
【００２２】
好ましくは、前記Ｔ２１が前記プライマーの融解温度Ｔｍである。プライマーの融解温度Ｔｍの意義は、上記と同様である。
【００２３】
好ましくは、前記所定時間が２０秒以下である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の核酸の増幅方法によれば、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅を短時間で行うことができる。さらに、標的核酸の変性とプライマーの結合が確実に行われるので、核酸増幅をより正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態における試料容器の表面温度の温度変化プロファイルを示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお特に断らない限り、本明細書における温度の単位は全て摂氏である。
【００２７】
本発明の一実施形態に係る核酸の増幅方法では、試料が収容された容器の表面温度Ｔｓを、図１に示す温度変化プロファイルにしたがって昇降させる。そして、この温度昇降パターンを１サイクルとし、当該サイクル（温度昇降サイクル）を複数回繰り返す。
【００２８】
図１に示す温度変化プロファイルの概要について説明する。
図１の温度変化プロファイルは、開始点ｔ０から終了点ｔ２３に至る一連の温度昇降パターンで表現されている。ただし、実際にはこの温度昇降パターンを複数回繰り返すので、開始点とそれに対応する終了点をどこに設定するかは任意であり、固定されるものではない。
【００２９】
まず、開始点ｔ０から表面温度Ｔｓの温度上昇が開始する。Ｔｓの温度上昇が続き、目標温度Ｔ１１を超えて、やがてＴｓが最高到達温度Ｔ１０に到達する（Ｔ１０到達点：ｔ１０）。表面温度ＴｓがＴ１０に到達すると、降温に転じ、第一目標温度Ｔ１１に向かう。
【００３０】
表面温度Ｔｓが第一目標温度Ｔ１１に到達した後、さらにＴｓを降温させる（降温開始点：ｔ１１）。このとき、降温速度をより速くしてもよい。また、ＴｓをＴ１１に暫く維持した後に降温させてもよい。
【００３１】
表面温度Ｔｓの温度下降が続き、第二目標温度Ｔ２１を超えて、やがてＴｓが最低到達温度Ｔ２０に到達する（Ｔ２０到達点：ｔ２０）。表面温度ＴｓがＴ２０に到達した後、昇温に転じる。
【００３２】
表面温度Ｔｓが昇温に転じた後、ＴｓをＴ２１±１℃の範囲内で所定時間維持する（維持開始点：ｔ２２〜終了点：ｔ２３）。このｔ０からｔ２３に至る一連の温度昇降パターンが１サイクルとなる。さらに、本実施形態では、このサイクル（温度昇降サイクル）１回当たりの所要時間が３５秒以下である。
【００３３】
本実施形態の核酸の増幅方法は、過昇温工程、過冷却工程、及び温度維持工程の３つの工程を含む。
【００３４】
過昇温工程では、標的核酸の変性が行われる。過昇温工程は、容器の表面温度Ｔｓを所定の第一目標温度Ｔ１１以上に昇温させた後、Ｔ１１以下の温度に降温させる工程である。具体的には、表面温度Ｔｓを最高到達温度Ｔ１０まで到達させ、その後、Ｔ１１以下の温度に降温させるまでの工程である。過昇温工程では、第一目標温度Ｔ１１より高い最高到達温度Ｔ１０まで表面温度Ｔｓを到達させた後、第一目標温度Ｔ１１以上の温度を所定時間維持することとなる。
ここで、第一目標温度Ｔ１１は９０〜１０５℃であり、好ましくは９５〜１０１℃、より好ましくは９７〜９９℃である。なお、Ｔ１１が９０℃未満であると、標的核酸の変性が不十分となるおそれがある。一方、Ｔ１１が１０５℃を超えると、ポリメラーゼの失活が起こるおそれがある。
Ｔ１１として、標的核酸の変性温度を採用することができる。
【００３５】
最高到達温度Ｔ１０は、第一目標温度Ｔ１１よりも５〜３０℃高い温度である。例えば、Ｔ１０は１００〜１２０℃であり、より好ましくは１０２〜１２０℃、さらに好ましくは１０５〜１２０℃である。なお、Ｔ１０とＴ１１の差が５℃未満であると、標的核酸の変性が不十分となるおそれがある。一方、Ｔ１０とＴ１１の差が３０℃を超えると、ポリメラーゼの失活が起こるおそれがある。
【００３６】
本実施形態において、最高到達温度Ｔ１０から第一目標温度Ｔ１１以下への降温に要する時間（以下、「ｔ１０−１１」とも記載する）は、１〜１０秒である。換言すれば、ｔ１０（Ｔ１０到達点）からｔ１１（降温開始点）に至るまでの時間が１〜１０秒である。当該時間ｔ１０−１１は１〜１０秒であるが、例えば１〜７秒や１〜５秒でもよい。なお、当該時間が１０秒を超えると、ポリメラーゼの失活が起こるおそれがある。
【００３７】
過冷却工程は、過昇温工程の後に行われる。過冷却工程では、変性した標的核酸へのプライマーの結合が行われる。
過冷却工程は、表面温度Ｔｓを第二目標温度Ｔ２１（℃）以下に降温させた後に昇温させる工程である。具体的には、表面温度Ｔｓを第二目標温度Ｔ２１より低い最低到達温度Ｔ２０まで到達させ、その後、昇温させる工程である。
ここで、Ｔ２１は４０〜７５℃であり、より好ましくは６０〜７０℃である。
最低到達温度Ｔ２０（℃）は第二目標温度Ｔ２１より５〜２０℃低い温度であり、より好ましくはＴ２１より５〜１８℃低く、さらに好ましくはＴ２１より８〜１２℃低い温度である。
【００３８】
第二目標温度Ｔ２１としては、プライマーの融解温度Ｔｍを採用することができる。融解温度が最も高いプライマーの融解温度ＴｍＨと、融解温度が最も低いプライマーの融解温度ＴｍＬとの差が１℃以内となるようにプライマーを設計することが好ましい。融解温度が同じである複数種のプライマーを用いる場合は、そのプライマーの融解温度が前記融解温度Ｔｍとなる。
【００３９】
過冷却工程に続いて、温度維持工程が行われる。温度維持工程は、表面温度Ｔｓを所定の温度範囲内に所定時間維持する工程である。具体的には、表面温度ＴｓがＴ２１±１℃の範囲内に到達した後、Ｔｓを当該範囲内で２秒以上維持する工程である。
温度維持工程における当該維持温度はＴ２１±１℃の範囲内であり、より好ましくはＴ２１±０．５℃の範囲内である。
表面温度ＴｓをＴ２１±１℃の範囲内で維持する時間（以下、「ｔ２２−２３」とも記載する）は、ｔ２２（維持開始点）からｔ２３（終了点）に至る時間であり、２秒以上である。当該維持時間（ｔ２２−２３）が２秒以上であれば、伸長反応をより十分に行うことができる。当該維持時間（ｔ２２−２３）は、好ましくは２〜２０秒であり、より好ましくは２〜１５秒、さらに好ましくは２〜１０秒である。
【００４０】
本実施形態では、上記した温度昇降サイクルを１サイクルとして、当該サイクルを複数回繰り返す。例えば、３０〜４０回繰り返す。
また本実施形態では、温度昇降サイクル１回あたりの所要時間が３５秒以下である。より好ましくは５〜３５秒であり、さらに好ましくは１０〜３５秒である。
【００４１】
上記した実施形態の核酸の増幅方法は、過昇温工程、過冷却工程、温度維持工程の３つの工程を含むが、これらの一部のみを含む実施形態も可能である。
【００４２】
例えば別の実施形態として、上記３工程のうち過昇温工程のみを採用してもよい。すなわち、標的核酸の変性工程として上記した過昇温工程を用い、その後のアニーリング工程と伸長工程については通常採用されている条件（例えば、４０〜６０℃程度で数分間維持）で行うことができる。
【００４３】
さらに他の実施形態として、上記３工程のうち過冷却工程と温度維持工程のみを採用してもよい。すなわち、標的核酸の変性工程については通常採用されている条件（例えば、９４〜９６℃程度で数分間維持）で行い、その後のアニーリング工程と伸長工程について、上記の過冷却工程と温度維持工程を用いてもよい。
【００４４】
標的核酸及びプライマーを含む試料を収容する容器としては、ＰＣＲ用の反応容器として一般的に用いられているものを用いることができる。例えば、ポリプロピレン製の耐熱チューブ、ウェルを有するプレート、チップ、等を用いることができる。好ましくは、微細な流路や反応室が設けられたマイクロチップが、前記容器として用いられる。例えば、流路の直径がμｍオーダーであり、反応室の容量がμＬオーダーであるマイクロチップが、前記容器として好ましく用いられる。
【００４５】
容器の表面温度を昇温、降温、維持するための手段としては、例えば、所望温度に調整した加温体や冷却体を容器表面に接触させることが挙げられる。加温体または冷却体としては、ペルチェ素子、ヒートブロック等が挙げられる。
なお、加温体や冷却体を容器表面に接触させる態様では、加温体や冷却体の表面温度と容器の表面温度とは基本的に等しい。
【００４６】
上記した温度変化プロファイルは、公知の加熱手段、冷却手段、温度制御方法等を組み合わせることにより実現することができる。温度制御としては、例えば、オンオフ制御、比例制御、ＰＩＤ制御等を採用することにより、上記温度変化プロファイルを実現することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４８】
図１のＴ１０（℃）、Ｔ１１（℃）、ｔ１０−１１（秒）、Ｔ２０（℃）、Ｔ２１（℃）、及びｔ２２−２３（秒）の各パラメータを、表１（実施例１〜２、比較例１〜３）と表２（実施例３、比較例４〜９）に示すように設定し、下記試料を用いてＰＣＲを行った。
【００４９】
＜標的核酸＞
・クラミジア由来ＤＮＡ（ＡＴＣＣ）
＜プライマー＞
・プライマーＦ：配列番号１に示すオリゴＤＮＡ（Ｔｍ＝６５℃、北海道システムサイエンス社）
・プライマーＲ：配列番号２に示すオリゴＤＮＡ（Ｔｍ＝６５℃、北海道システムサイエンス社）
【００５０】
＜試料の組成＞
・標的核酸：６×１０-3ｎｇ／μＬ
・プライマーＦ：０．５ｍＭ
・プライマーＲ：０．５ｍＭ
・ＤＮＡポリメラーゼ：TAKARA HS FIRST DITECT（タカラバイオ社）１０μＬ
・滅菌水：３．６μＬ
・ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）：１／１００００希釈
・試料の全体積：２０μＬ（ｍｍ3）
【００５１】
＜増幅産物の検出＞
・ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた蛍光検出（増幅の評価）
・１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動による増幅産物の目視確認（特異性の評価）
【００５２】
＜方法＞
上記組成の試料を、シクロオレフィンポリマーで作製したチップに入れ、試薬の入り口をテープで塞いだ。リアルタイムＰＣＲ装置にて各条件のＰＣＲを行い、蛍光測定を行った。その後、アガロースゲル電気泳動にて目的産物の確認を行った。各試料につき、増幅、時間、特異性の３項目について、良好（○）、やや不良（△）、不良（×）の３段階で評価した。増幅の評価は、核酸増幅の有無を指標とした。時間の評価は、１サイクルの所要時間が３５秒以内であるか否かを指標とした。特異性の評価は、核酸増幅が観察された場合において、標的核酸以外の増幅の有無を指標とした。
【００５３】
＜結果＞
結果を表１、表２に示す。
まず、実施例１，２と比較例１〜３においては、過冷却工程と温度維持工程に係るＴ２１、Ｔ２０、及びｔ２２−２３を固定し、過昇温工程に係るＴ１１、Ｔ１０、及びｔ１０−１１について種々の値に設定した（表１）。
実施例１と実施例２では、増幅、時間、特異性の３項目とも、良好な結果が得られた。
一方、Ｔ１０がＴ１１より３℃高いのみである比較例１では、増幅がうまく行われなかった（評価×）。これは標的核酸の変性が不十分であったためと考えられた。
Ｔ１０がＴ１１より３２℃高い比較例２、及びｔ１０−１１が１５秒である比較例３では、増幅がうまく行われなかった（評価×）。これは、ＤＮＡポリメラーゼが熱により失活したためと考えられた。
【００５４】
実施例３と比較例１〜９では、過昇温工程に係るＴ１１、Ｔ１０、及びｔ１０−１１を固定し、過冷却工程と温度維持工程に係るＴ２１、Ｔ２０、及びｔ２２−２３について種々の値に設定した（表２）。
実施例３では、増幅、時間、特異性の３項目とも、良好な結果が得られた（評価○）。
一方、Ｔ２０がＴ２１と同じ温度で、かつｔ２２−２３が１秒である比較例４では、増幅がうまく行われなかった（評価×）。これはプライマーの結合と伸長時間が不十分であったためと考えられた。
Ｔ２０がＴ２１より２４℃低い比較例５では、増幅が行われたものの、非特異的増幅が観察され、特異性が悪かった（増幅：△、特異性：×）。
ｔ２２−２３が２５秒である比較例６では、増幅と特異性に問題はなかったが、１サイクルの所要時間が３５秒を超えた（評価×）。
Ｔ２０がＴ２１よりも高く、かつｔ２２−２３が１秒である比較例７では、増幅がうまく行われなかった（評価×）。これはプライマーの結合と伸長時間が不十分であったためと考えられた。
Ｔ２０がＴ２１と同じ温度である比較例８では、増幅が行われたものの、非特異的増幅が観察され、特異性が悪かった（増幅：△、特異性：×）。
Ｔ２０がＴ２１よりも高く、かつｔ２２−２３が２５秒である比較例９では、増幅がうまく行われず、１サイクルの所要時間が３５秒を超えた（評価×）。
【００５５】
以上より、上記構成の過昇温工程、過冷却工程、及び温度維持工程を含む温度昇降サイクルを繰り返すことにより、高速でかつ核酸増幅が確実に行われるＰＣＲを実現することができた。
【００５６】
【表１】
2017093319.tif 000003
【００５７】
【表２】
2017093319.tif 000004
【図１】
2017093319.tif 000005
【配列表】
2017093319000001.app