(57)【要約】      （修正有）【課題】製造時のストレス等で変性した抗体の量を迅速・簡便に測定可能な方法を提供すること。【解決手段】（１）変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体とを接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程とを含む方法。【選択図】図１
2017187476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）及び（２）に示す工程を含む、変性した抗体の量を測定する方法
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、
被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程。
【請求項２】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、抗体の安定性を評価する方法
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、
被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、
（３）工程（２）において測定した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の安定性を評価する工程。
【請求項３】
工程（１）が、前記オリゴペプチド結合担体と前記試料とを先ず接触させ、次いで前記標識抗体と接触させることにより、前記複合体を形成させる工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴペプチド結合担体が、さらにコラーゲンペプチドによりブロッキングされてなる担体である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記担体が疎水性の高いプレートである、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記担体が磁性ビーズである、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が結合している標識抗体とを含む、変性した抗体の量を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性した抗体の量を測定する方法に関する。また当該方法を用いた抗体の安定性を評価する方法に関する。さらに変性した抗体の量を測定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品用途で用いる抗体は、通常当該抗体を発現可能な細胞を培養後、得られた培養液を遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行ない、製造する。その際、得られた抗体の中には、製造時のストレス等により変性を受けることで生じる、当該抗体の凝集体が含まれている可能性がある。抗体凝集体は免疫原性を有するおそれがある（非特許文献１）ため、特に医薬品用途で用いる場合、当該凝集体を精度よく検出する必要がある。
【０００３】
抗体凝集体を検出する方法として、サイズ排除クロマトグラフィーやフィールドフローフラクショネーションを用いた方法が知られている。しかしながら、これらの方法はタンパク質のサイズに基づき抗体凝集体を検出する方法であり、構造・性状に基づいた方法ではない。また抗体の高次構造の精密な解析手法として、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲを用いた方法が知られているが、これらの方法は非常に手間のかかる方法であり、製造時の純度管理等、迅速・簡便な測定が求められる用途には不向きである。
【０００４】
近年、ストレス等により変性を受けた抗体を、その分子量を問わず、特異的に認識する分子が報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３及び非特許文献２）。しかしながら、これら文献に記載の前記分子を用いた変性抗体測定法は表面プラズモン共鳴を利用した方法であり、当該方法を実施するにはＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア製）等の高価な専用装置を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１４／１０３２０３号
【特許文献２】国際公開２０１４／１１５２２９号
【特許文献３】国際公開２００８／０５４０３０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１００，３５４−３８７，２０１１
【非特許文献２】Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９，３３９４−３４０４，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、製造時のストレス等で変性した抗体を迅速・簡便に測定可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が結合している標識抗体とを用いることにより、迅速かつ簡便に、被検抗体を含む試料中の変性した抗体を定量的に検出できることを見出した。また、かかる変性した抗体の量を測定する方法において、前記担体への非特異的吸着を抑制する上でコラーゲンペプチドが有用であることを見出した。さらに、前記担体として疎水性の高いプレート又は磁性ビーズが好適に用いられることも明らかにした。また、かかる方法によれば、変性をもたらすストレスの種類に関わらず、変性した抗体の量を測定することができ、特に既存のタンパク質物性解析装置では検出することのできなかった、加熱処理、凍結融解処理、又は撹拌処理によって変性した抗体を精度高く定量的に検出できることも見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、以下の（１）及び（２）に示す工程を含む、変性した抗体を測定する方法である。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、抗体の安定性を評価する方法である。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、
（３）工程（２）において測定した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の安定性を評価する工程。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、工程（１）が、前記オリゴペプチド結合担体と前記試料とを先ず接触させ、次いで前記標識抗体と接触させることにより、前記複合体を形成させる工程である、前記第一又は第二の態様に記載の方法である。  また本発明の第四の態様は、前記オリゴペプチド結合担体が、さらにコラーゲンペプチドによりブロッキングされてなる担体である、前記第一〜三のうちのいずれか一の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第五の態様は、前記担体が疎水性の高いプレートである、前記第一〜四のうちのいずれか一の態様に記載の方法である。
【００１３】
また本発明の第六の態様は、前記担体が磁性ビーズである、前記第一〜四のうちのいずれか一の態様に記載の方法である。
【００１４】
さらに本発明の第七の態様は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、抗体を認識する抗体に標識物質が結合している標識抗体とを含む、変性した抗体の量を測定するためのキットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の変性した抗体の量を測定する方法は、（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体とを接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程とを含む方法であり、製造時のストレス（例えば、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌）等により変性を受けた抗体を迅速・簡便に測定することができる。また本発明の方法によれば、Ｂｉａｃｏｒｅ等の高価な専用装置を必要とせず、比較的安価に変性した抗体の量を測定することもできる。さらに前記測定結果に基づき、抗体の安定性を評価することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の結果を示した図である。白三角は未変性ヒト抗体溶液の結果であり、黒丸が変性ヒト抗体溶液の結果である。
【図２Ａ】実施例２の結果において、１％（ｗ／ｖ）コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。またグラフにおいて、黒は配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（２Ａ１）をウェルに固定化したときの、白は２Ａ１をウェルに固定化しなかったときの、それぞれ結果を示す（グラフの表記については、以下図２Ｂ〜Ｄにおいても同じ）。
【図２Ｂ】実施例２の結果において、２％（ｗ／ｖ）スキムミルクをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図２Ｃ】実施例２の結果において、１００ｍＭエタノールアミンをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図２Ｄ】実施例２の結果において、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図３Ａ】実施例３の結果を示した図である。黒ひし形がＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを、白四角がＭｅｄｉＳｏｒｐプレートを、白三角がＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、黒丸がＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレートを、それぞれ用いたときの結果を示す。
【図３Ｂ】実施例４の結果を示した図である。黒ひし形がＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを、白四角がＭｅｄｉＳｏｒｐプレートを、白三角がＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、黒丸がＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレートを、それぞれ用いたときの結果を示す。
【図４Ａ】実施例５の結果のうち、酸処理又はアルカリ処理したヒト抗体を対象とし、本発明の方法にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図４Ｂ】実施例５の結果のうち、酸処理又はアルカリ処理したヒト抗体を対象とし、市販の装置にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図５Ａ】実施例５の結果のうち、加熱処理、凍結融解処理又は撹拌処理したヒト抗体を対象とし、本発明の方法にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図５Ｂ】実施例５の結果のうち、加熱処理、凍結融解処理又は撹拌処理したヒト抗体を対象とし、市販の装置にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図６Ａ】実施例６の結果を示した図であり、硫酸アンモニウムを含む緩衝液でヒト抗体を溶出したときの結果を示した図である。
【図６Ｂ】実施例６の結果を示した図であり、は塩化カリウムを含む緩衝液でヒト抗体を溶出したときの結果を示した図である。
【図７】実施例７の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
＜変性した抗体の量を測定する方法＞
本発明の変性した抗体の量を測定する方法は、以下の（１）及び（２）に示す工程を含む方法である。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程。
【００１９】
本発明において、変性した抗体とは、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌等によるストレスで抗体の全構造又は一部構造が変化したものをいう。なお変性した抗体は、Ｆｃ領域を有する限り、その種類について特に限定はなく、例えば、免疫グロブリンのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）及びそれらのアイソタイプのサブクラスが挙げられ、より具体的に、ヒトの免疫グロブリンとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭの９種類のクラスが挙げられる。また、変性した抗体の由来について特に限定はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等に由来する抗体が挙げられ、特にヒトに由来する抗体が好ましい。さらに、変性した抗体は、このような単一の動物種に由来する抗体に限らず、異なる動物種に由来する抗体の断片が結合されてなる抗体であってもよい。例えば、キメラ抗体（ヒト抗体のＦｃ領域と、他の動物に由来する抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体）に由来する配列（可変領域、ＣＤＲ等）を含むキメラ抗体等）、ヒト化抗体であってもよい。また、本発明にかかる抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２０】
本発明の方法に供する試料としては、変性、未変性の如何を問わず、前記被検抗体を含むものであれば特に制限はなく、通常、抗体を含む溶液であり、特にヒト抗体を含むものが好ましい。また、溶液としても、変性した抗体と下記オリゴペプチドとの結合を阻害しない限り、特に制限はない。
【００２１】
本発明において、変性した抗体を認識するオリゴペプチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含んでいればよく、配列番号：１に記載のアミノ酸配列のみからなるオリゴペプチドを用いてもよいし、前記オリゴペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に後述の担体と結合させるためのリンカーペプチドといった数アミノ酸残基から数十アミノ残基からなるオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドを用いてもよい。本発明にかかるオリゴペプチドの長さとしては、変性した抗体を認識する限り、特に制限はないが、通常５０〜２５アミノ酸であり、好ましくは４０〜２５アミノ酸であり、より好ましくは３０〜２５アミノ酸であり、特に好ましくは２５アミノ酸（配列番号；１に記載のアミノ酸配列のみ）である。また、オリゴペプチドは、通常天然アミノ酸がペプチド結合により連結されて構成されるものであるが、本発明において非天然型のアミノ酸を含むものであってもよく、また修飾が施されているものであってもよい。
【００２２】
本発明において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを固定化させる担体に特に限定はなく、例えば、プレート（複数の凹部が形成されたプレート（ウェルプレート、マイクロプレート等）も含む）、ビーズ、ゲル等が挙げられる。また、担体の材料としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリ塩化ビニル等のビニル系重合体、ポリメチル（メタ）アクリレート等のアクリル系樹脂、ポリエチレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、ポリカーボネート樹脂）、金属（金、銀、アルミ、ステンレス等）、酸化物（ガラス、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等）、寒天等が挙げられる。
【００２３】
本発明における担体としては、より具体的に、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法で用いられるウェルプレートや、ガラスビーズ、磁性ビーズ、金属粒子、シリカビーズ、ジルコニアビーズ、セルロースゲル、アガロースゲル、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標、親水性ビニル系重合体にヘキシル基、ブチル基、フェニル基又はオリゴエチレングリコール基を導入したポリマー等、東ソー株式会社製）等のポリマーゲルが挙げられる。
【００２４】
なお、担体としてウェルプレート等のプレートを用いる場合、疎水性の高いプレートを用いると非特異吸着がより抑えられる（変性した抗体に対する結合能が低いという）点で好ましい。ここで、「疎水性が高い」とは、通常水接触角度が６０度以上であり、好ましくは７０度以上、より好ましくは８０度以上、さらに好ましくは８５度以上、特に好ましくは９０度以上である（なお、水接触角度とは、大気中、室温における水滴に対する静的接触角度のことを意味する）。また、本発明におけるプレートの好ましい一例として、ポリソープ（登録商標）処理が施されたポリスチレン製プレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）が挙げられる（特開２０１４−２２４７１０号公報によれば、ＰｏｌｙＳｏｒｐプレートの水接触角は８８．１度である）。
【００２５】
また、本発明の方法をより簡単かつ迅速に実施すべく、ＡＩＡ−６００ＩＩやＡＩＡ−ＣＬ２４００（いずれも東ソー株式会社製）等の自動酵素免疫測定装置を用いる場合、担体として磁性ビーズが好適に用いられる。
【００２６】
本発明で用いるオリゴペプチドを結合した担体（オリゴペプチド結合担体）は、前記オリゴペプチドを前述した担体に化学的又は物理的に固定化することで得られる。本発明にかかるオリゴペプチドの前記担体への固定化方法としては特に制限はなく、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用、架橋剤等を利用する方法が挙げられる。本発明にかかるオリゴペプチドの固定化時の濃度は、担体の材質、形状、固定化の方法等に合わせて適宜調整すればよく、例えば、５〜５０μｇ／ｍＬの濃度が挙げられ、好ましくは１０〜４０μｇ／ｍＬである。
【００２７】
また、オリゴペプチド固定化後の担体に対しブロッキング剤によるブロッキング操作を行なうと、非特異吸着が抑えられ、測定時のバックグラウンドも抑えられるため、好ましい。特に、後述の実施例２に示す通り、コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いると、測定時のバックグラウンドがより抑えられる点で好ましい。コラーゲン以外にも、糖タンパク質を含有するブロッキング剤（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（商標）  （ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）等）がブロッキング剤として使用できる。
【００２８】
コラーゲンペプチドは、コラーゲンを加水分解して得られるものであれば、その由来（例えば、ブタ、ウシ、魚）に特に制限はない。なお加水分解の程度にも特に制限はなく、常法に従い、例えばコラーゲンをパパイン、ペプシン又はトリプシンといったタンパク質加水分解酵素の共存下、例えば５０℃で１８０分間加熱等すればよい。また、その重量平均分子量についても特に制限はないが、通常２０００〜１００００、好ましくは３０００〜５０００である。さらに、コラーゲンペプチドの使用量としては、溶液状態において好ましくは０．５〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％である。また、コラーゲンペプチドを溶解させるための液としても特に制限はなく、各種緩衝液（例えば、ｐＨ８〜１０の緩衝液（炭酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等））を利用し、ブロッキング剤として調製することができる。
【００２９】
本発明において、被検抗体を認識する抗体としては、当該抗体を認識し得る抗体であればよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。また、抗体の形態についても特に制限はなく、被検抗体を認識する抗体は、その機能的断片であってもよい。しかしながら、被検抗体を認識する抗体が変性していたとしても、該変性した認識抗体は前記オリゴペプチド結合担体に結合し難く、かつ、被検抗体中の変性した抗体のみが前記オリゴペプチド結合担体に結合し易くなるという観点から、被検抗体を認識する抗体は、Ｆｃ領域を含まない抗体の機能的断片が好ましい。かかるＦｃ領域を含まない抗体の機能的断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディーが挙げられる。また、被検抗体を認識する抗体と変性した抗体を含む被検抗体とは、異なる種由来であることが好ましく、例えば、変性した抗体を含む被検抗体がヒト由来の抗体である場合には、被検抗体を認識する抗体は、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体）が挙げられる。
【００３０】
本発明で用いる被検抗体を認識する抗体に結合する標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質が挙げられる。
【００３１】
また、被検抗体を認識する抗体と標識物質との結合は、後述の当該物質の検出における簡便さから、通常リンカー（例えば、ＮＨＳエステル、マレイミド）等を介した架橋反応により行われるが、標識物質を結合させた二次抗体を用いて行うこともできる。ここで、二次抗体とは、被検抗体を認識する抗体に特異的な結合性を示す抗体である。そして、この特異的な結合性を利用することにより、当該二次抗体を介し、被検抗体を認識する抗体に標識物質を間接的に結合させることができる。また、この標識物質が結合された二次抗体を用いる場合には、オリゴペプチド結合担体及び変性した抗体と複合体を形成した後に、当該二次抗体を介して抗体を認識する抗体に標識物質を結合させてもよい。
【００３２】
本発明において、オリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料と標識抗体とを接触させる際の条件としては、上述のオリゴペプチドと当該試料中の変性した抗体とが結合できる条件であり、また被検抗体と標識抗体とが結合できる条件であればよく、通常、０〜４５℃の温度下での接触であり、好ましくは０〜４０℃の温度下での接触であり、より好ましくは４〜３７℃の温度下であり、さらに好ましくは２５℃〜３７℃の温度下での接触である。また、接触させる時間としても特に制限はなく、オリゴペプチド結合担体の種類、試料中の抗体及び標識抗体の濃度、標識物質の種類等により、適宜調整され得るが、通常５分〜６時間であり、好ましくは１０分〜２時間、より好ましくは２０分〜１時間である。
【００３３】
また、この接触後、オリゴペプチドに結合できなかった抗体、被検抗体に結合できなかった標識抗体等を除去するため、本発明の方法においては洗浄工程を設けてもよい。その洗浄に用いられる洗浄液としては、オリゴペプチドと変性した抗体との結合及び被検抗体と標識抗体との結合を阻害せず、担体等に非特異的に吸着した抗体を洗浄できるものであればよく、例えば、緩衝液（ｐＨ６〜８）、より具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。また、これらの緩衝液においては、塩類、界面活性化剤、タンパク質、糖、双性イオン化合物等を適宜含有していてもよい。また、市販の免疫反応用試薬キットに含まれる洗浄液（例えば、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ洗浄液、東ソー株式会社製）も好適に用いられる。
【００３４】
なお、本発明にかかる工程（１）に関し、上述のとおり、オリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料と標識抗体とを一遍に接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成させる態様について説明したが、本発明にかかる工程（１）は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、オリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料とを先ず接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体とを含む複合体を形成し、次いで標識抗体を更に接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成してもよい。また、本発明にかかる工程（１）においては、被検抗体を含む試料と標識抗体とを先ず接触させることにより、変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成し、次いでオリゴペプチド結合担体を更に接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とを含む複合体を形成してもよい。なお、前記各物質の接触条件としては上述のとおりである。また、前記各物質の接触後においても、オリゴペプチドに結合できなかった抗体、被検抗体に結合できなかった標識抗体等を除去するため、上述の洗浄工程を適宜設けてもよい。また、このような実施形態において、変性した抗体の検出感度がより向上し易いという観点から、本発明にかかる工程（１）は、オリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料とを先ず接触させ、次いで標識抗体と接触させる工程であることが好ましい。
【００３５】
次に、本発明の方法の工程（２）においては、上述の工程（１）における接触を経て形成された複合体中の標識物質を検出することにより、試料中の変性した抗体の量を測定する。
【００３６】
本発明において標識物質の検出とは、標識物質に由来した信号の検出を意味し、その検出は、当該技術分野の公知の方法にしたがって行うことができる。例えば、標識物質として蛍光物質を用いる場合には、それが発する蛍光をプレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。また、標識物質として酵素を用いる場合には、当該酵素の作用によって分解して発色、発光等する基質を添加することにより、その発色、発光等をプレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。また、標識物質として放射性物質を用いる場合には、当該物質の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により検出及び定量することができる。
【００３７】
本発明においては、後述の実施例に示す通り、このようにして検出される標識物質に由来した信号の強度（吸光度、蛍光強度等）と、試料中の変性した抗体の量とは、高い相関性を示す。そのため、濃度既知の変性した抗体を含む標準試料を用いて本発明の方法を実施し、被検抗体を含む試料を用いて得られる測定値との間の相関データを取得し、当該相関データに基づき当該被検試料に存在する変性した抗体の量を測定（定量）することができる。なお相関データとは、例えば検量線である。
【００３８】
＜抗体の安定性を評価する方法＞
上述の通り、本発明の変性抗体測定法では、試料中の変性した抗体の量に基づき、前記標識物質に由来した信号（発光、蛍光等）が変化する。したがって、当該信号に基づき、抗体の安定性を評価することもできる。
【００３９】
すなわち、本発明の抗体の安定性を評価する方法は、以下の（１）から（３）に示す工程を含む方法である。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とが反応した複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、
（３）工程（２）において測定した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の安定性を評価する工程。
【００４０】
工程（１）〜（２）については、上述の通りである。また、工程（３）において、試料中の被検抗体の安定性の評価としては、特に制限はないが、例えば、工程（２）において変性した抗体が有意に検出されなければ、試料中の抗体の安定性は極めて高いと評価できる。また、被検抗体を含む試料を用いて得られる測定値を、それと同濃度の変性した抗体のみを含む試料を用いて本発明の方法を実施して得られた測定値と比較して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下（例えば、４％、３％、２％、１％。０％）であれば、試料中の抗体は安定性が高いと評価できる。また、後述の実施例に示す通り、ストレス（酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌等）を与える前と比較して、ストレスを与えた後の測定値が有意に変わらなければ、試料中の抗体の各ストレスの対する安定性は極めて高いと評価できる。
【００４１】
＜変性した抗体の量を測定するためのキット＞
本発明の変性した抗体の量を測定するためのキットは、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み、変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と抗体を認識する抗体に標識物質が結合している標識抗体とを含む、キットである。
【００４２】
オリゴペプチド結合担体及び標識抗体については、上述の通りである。また、本発明のキットは、これら以外に、上述の、被検抗体を溶解又は希釈させるための液、ブロッキング剤、洗浄液、酵素の作用によって分解して発色、発光等する基質、その発色等を停止するための停止液、濃度既知の変性した抗体を含む標準試料等を含むものであってもよい。さらに、本発明のキットには、本発明の方法を実施する際の、前記オリゴペプチド結合担体等の使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１）  本発明の方法を用いた変性ヒト抗体測定（その１）
（１）本実施例においては、本発明にかかるヒト抗体として抗ＣＤ２０抗体を用いた。そして、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０抗体溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを１００ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．０）で一晩透析することで、変性したヒト抗体を含む溶液（以下、「変性ヒト抗体溶液」とも称する）を調製した。
（２）（１）で調製した変性ヒト抗体溶液と、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、２Ａ１と表記）との反応性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。なお、２Ａ１は、有機合成化学の手法により調製した。
（２−１）４％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを９６穴マイクロプレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に３００μｌ／ｗｅｌｌで塗布し、３７℃で２時間放置後、２Ａ１を２μｇ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間放置することで、前記ポリペプチドを前記ウェルへ固定化した。
（２−２）１％（ｗ／ｖ）コラーゲンペプチド（魚鱗又は魚皮由来のコラーゲン又はゼラチンの加水分解産物、重量平均分子量：３０００〜５０００のコラーゲンペプチド、製品名：イクオスＨＤＬ、新田ゼラチン株式会社製）を含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を３００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間放置することで、ブロッキング処理を行なった。
（２−３）洗浄緩衝液Ａ（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（１）で調製した変性ヒト抗体溶液を各ウェルに添加し、２５℃で１時間反応させた。
（２−４）反応終了後、洗浄緩衝液Ａで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０ｎｇ／ｍＬに希釈したアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソンイムノリサーチ製、カタログ番号：１０９−０５６−０９７）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（２−５）２５℃で１時間反応させ、洗浄緩衝液Ａで洗浄後、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、２５℃で３０分反応させた。
（２−６）ＡＰＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を止めた後、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ製）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。
（３）比較対象として（１）の操作を行なわない未変性のヒト抗体溶液について、（２）と同様な方法のＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００４５】
種々の濃度の変性／未変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度（５９５ｎｍ）測定結果を図１に示す。溶液中に含まれる変性ヒト抗体の濃度が上昇すると、吸光度も上昇していることから、本発明の方法により、溶液中に含まれる変性ヒト抗体の濃度に基づく測定ができることがわかる。また未変性ヒト抗体溶液を測定した結果、濃度に関係なくほぼ一定の吸光度を示したことから、本発明の方法は変性ヒト抗体を特異的に測定できることがわかる。
【００４６】
（実施例２）  ブロッキング剤の検討
実施例１（２−１）のプレートとして、２Ａ１を固定化したプレート又は２Ａ１を固定化しないプレートを、実施例１（２−２）のブロッキング処理で用いるブロッキング剤として、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク（製品名：Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、１００ｍＭエタノールアミン（製品名：２−エタノールアミン、和光純薬工業株式会社製）又は０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、製品名：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を、それぞれ用いた他は、実施例１と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定した。
【００４７】
結果を図２Ａ〜図２Ｄに示す。これら図面において、黒棒は２Ａ１をウェルに固定化したときの、白棒は２Ａ１をウェルに固定化しなかったときの、それぞれの結果を示す。コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いたときは、プレートへの２Ａ１の固定化により吸光度が有意に上昇し、かつ変性ヒト抗体の濃度により吸光度が変化した（図２Ａ）。一方、スキムミルク、エタノールアミン、ＢＳＡをブロッキング剤として用いたときは、２Ａ１の固定化による吸光度の有意な上昇は確認できなかった（図２Ｂ〜図２Ｄ）。このことから、２Ａ１を結合した担体を調製する際、用いるブロッキング剤としては、コラーゲンペプチドが好ましいことがわかる。
【００４８】
（実施例３）  固相の検討（その１）
実施例１（２−１）のプレートとして、２Ａ１を固定化しない、ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート、ＭｅｄｉＳｏｒｐプレート、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、及びＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレート（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いた他は、実施例１と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定し、プレートへの抗体の非特異吸着について分析した。得られた結果を図３Ａに示す。なお各プレートの疎水性は、ＰｏｌｙＳｏｒｐ、ＭｅｄｉＳｏｒｐ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、ＭｕｌｔｉＳｏｒｐの順に高い。
【００４９】
（実施例４）固相の検討（その２）
実施例１（２−２）のブロッキング処理を行わなかったほかは、実施例４と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定し、プレートへの抗体の非特異吸着について分析した。得られた結果を図３Ｂに示す。
【００５０】
図３Ｂに示した結果から明らかな通り、プレートの疎水性が高いほど（ＰｏｌｙＳｏｒｐ、ＭｅｄｉＳｏｒｐ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、ＭｕｌｔｉＳｏｒｐの順に）、変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度の上昇が抑えられていることがわかる。このことから、２Ａ１を結合する担体としてプレートを用いる場合、非特異吸着の低い、疎水性の高いプレートが好ましいことがわかる。また、図３Ａに示した結果から明らかな通り、コラーゲンペプチドでブロッキング処理することで、ブロッキング処理を行わないとき（図３Ｂ）と比較し、変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度の上昇がさらに抑えられていることがわかる。特に疎水性の高いプレートであるＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを用いたときは、変性ヒト抗体濃度が高い溶液（１０μｇ／ｍＬ）を添加しても吸光度の上昇を十分に抑制されていることも明らかになった。
【００５１】
（実施例５）  本発明の方法を用いた変性ヒト抗体測定（その２）
（１）実施例１（１）の変性ヒト抗体溶液の調製を下記（ａ）から（ｅ）のいずれかの条件で処理した他は、実施例１と同様な方法で変性ヒト抗体溶液を測定した。
（ａ）酸処理／アルカリ処理
１０ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液をグリシン緩衝液（ｐＨ２、ｐＨ３）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４、ｐＨ５）、リン酸緩衝液（ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）又は炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で希釈して調整した０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを３７℃で一晩放置することで処理した。
（ｂ）加熱処理
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを４℃、２５℃、３７℃又は５０℃で３７℃で一晩放置することで処理した。
（ｃ）凍結融解処理
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを凍結（−３０℃又は液体窒素（−１９６℃））し３７℃で融解させる操作を１０回行なうことで処理した。
（ｄ）撹拌処理、スターラー
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液６００μＬをスターラーを用い２５℃で一晩撹拌することで処理した。
（ｅ）撹拌処理、振とう器
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液３００μＬを振とう器を用い２５℃で一晩振とうすることで処理した。
（２）比較対象として、（１）で調製した変性ヒト抗体溶液を市販のタンパク質物性解析装置（Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ製）に供し、変性開始温度を測定した。
【００５２】
結果を図４Ａ〜５Ｂに示す。なお本発明の方法での測定結果（図４Ａ及び図５Ａ）は、吸光度が低い（すなわち変性ヒト抗体量が低い）ほどタンパク質（抗体）の安定性が高いことを示す。一方、市販の装置（Ｏｐｔｉｍ２）での測定結果（図４Ｂ及び図５Ｂ）は、変性開始温度が高いほどタンパク質（抗体）の安定性が高いことを示す。
【００５３】
ヒト抗体を酸処理又はアルカリ処理した場合（図４Ａ及び４Ｂ）、本発明の方法と市販の装置を用いた方法、ともに前記処理によりヒト抗体の安定性が低下している。このことから、本発明の方法と市販の装置を用いた方法との間に相関性があることがわかる。一方、ヒト抗体を加熱処理、凍結融解処理、又は撹拌処理した場合、市販の装置を用いた方法では変性開始温度の変化がほとんどなかった（図５Ｂ）が、本発明の方法では５０℃での加熱、凍結融解、及びスターラーでの撹拌により変性ヒト抗体量が有意に上昇（すなわちヒト抗体の安定性が低下）した（図５Ａ）。このことから、本発明の方法は、市販の装置による変性開始温度測定法と比較し、変性ヒト抗体量（すなわちヒト抗体の安定性低下）をより精度高く測定することができることが明らかになった。
【００５４】
（実施例６）  本発明の方法を用いた変性ヒト抗体測定（その３）
本発明の方法を、ヒト抗体精製工程におけるヒト抗体の品質評価に適用した。
（１）ヒトガンマグロブリン（商品名：ガンマ‐グロブリン筋注、化血研製）溶液をプロテインＡカラム（ＡＦ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−６５０Ｆ、東ソー株式会社製）に供した後、下記溶出液ＡからＥのいずれかを用いて前記ヒト抗体を溶出させた。
溶出液Ａ：酢酸緩衝液（ｐＨ３．３から４．０）
溶出液Ｂ：１５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３．３から３．９）
溶出液Ｃ：３００ｍＭの硫酸アンモニウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３．３から３．９）
溶液液Ｄ：１５０ｍＭの塩化カリウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３．１から３．９）
溶出液Ｅ：３００ｍＭの塩化カリウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３．１から３．９）
（２）２Ａ１（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を結合した磁性ビーズ（フェライトを練り込んだエチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）による粒子）を、（１）のヒト抗体溶出液に添加し、３７℃で２０分間撹拌した。なお、磁性ビーズへの２Ａ１の固定化方法は下記に示す。
（２−１）４％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを磁性ビーズへ添加し、３７℃で２時間撹拌後、２Ａ１を添加し、３７℃で２時間放置することで、磁性ビーズへ固定化した。
（２−２）１％（ｗ／ｖ）コラーゲンペプチド（イクオスＨＤＬ、新田ゼラチン株式会社製）を含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を３００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間撹拌することで、ブロッキング処理を行なった。
（３）洗浄緩衝液Ｂ（商品名：Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ洗浄液、東ソー株式会社製）で洗浄することで遊離成分を除去後、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソンイムノリサーチ製、カタログ番号：１０９−０５６−０９７）を含む溶液を添加し、３７℃で２０分間撹拌した。
（４）洗浄緩衝液Ｂで洗浄することで余剰の標識ヒト抗体を除去後、基質である４−メチルウンベリフェリルりん酸を添加し、酵素反応により生じる蛍光物質（４−メチルウンベリフェロン）の生成速度（レート値）を全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−６００ＩＩ（東ソー株式会社製）で測定することで、磁性ビーズに結合した変性ヒト抗体量を測定した。
【００５５】
結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａは溶出液Ａ、Ｂ又はＣで溶出したときの結果であり、図６Ｂは溶出液Ａ、Ｄ又はＥで溶出した時の結果である。緩衝液中に含まれる成分（硫酸アンモニウム及び塩化カリウム）の濃度並びに緩衝液のｐＨの変化により、蛍光強度（すなわち変性ヒト抗体濃度）が変化している。具体的には、緩衝液中に含まれる成分は塩化カリウムよりも硫酸アンモニウムの方が、ｐＨは酸性側が、それぞれヒト抗体に対するストレスが大きい（変性しやすい条件）であることがわかる。
【００５６】
（実施例７）  本発明の方法を用いた変性ヒト抗体測定（その４）
（１）本実施例では、本発明にかかるヒト抗体としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（すべＳｉｇｍａ社製）を用いた。そして、それぞれの１ｍｇ／ｍＬの抗体溶液と１００ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．０）を等量ずつ混合し、３７℃で１６時間反応することで変性ヒト抗体溶液を調製した。
（２）調製した変性ヒト抗体溶液を実施例１（２）と同様な方法で測定した。
【００５７】
結果を図７に示す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の変性ヒト抗体溶液すべてが濃度依存的に検出していることから、本発明の方法は、ＩｇＧのサブクラスに依存せずに検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上説明したように、本発明によれば、ストレス（例えば、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌）等により変性を受けた抗体の量を迅速・簡便に測定することできる。また本発明の方法によれば、Ｂｉａｃｏｒｅ等の高価な専用装置を必要とせず、比較的に安価に変性した抗体の量を測定することもできる。さらに前記測定結果に基づき、抗体の安定性を評価することもできる。したがって、本発明は、抗体を含む医薬品の品質管理等において有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017187476.tif 000009
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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