(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子発現モジュレーションシステムの制御下にある条件的に発現する１つまたは複数のタンパク質を活性化リガンドの存在下で生成する方法、ならびに動物における治療目的での使用法の提供。【解決手段】哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または増強する方法であって、（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に投与する段階と、（ｂ）ＥＰＯをコードするウイルスポリヌクレオチドからのＥＰＯ発現を誘導するアクチベーターリガンドを投与する段階とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または増強する方法で
あって、
（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に投与
する段階と、
（ｂ）ＥＰＯをコードするウイルスポリヌクレオチドからのＥＰＯ発現を誘導するアクチ
ベーターリガンドを投与する段階と
を含み、
アデノ随伴ウイルスが、筋肉内投与され、
アデノ随伴ウイルスが、遺伝子スイッチをさらに含み、遺伝子スイッチが、プロモータ
ーに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列を含み、少なくとも１つの転写因
子配列によってコードされる少なくとも１つの転写因子がリガンド依存性転写因子であり
、
アデノ随伴ウイルスが、ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された第
二のプロモーターをさらに含み、第二のプロモーターが、アクチベーターリガンドの投与
後に、少なくとも１つのリガンド依存性転写因子により活性化される、方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＰＯの発現が、アクチベーターリガンドの投与される用量（単数または複数）を制御
することにより誘導、調節または増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アクチベーターリガンドが、正常生理範囲内のＥＰＯ発現レベルの誘導または維持に十
分な用量（単数または複数）で投与（adminster）される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドが、配列番号６または配列番号８に対し少なくと
も８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同
一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヘマトクリットまたは血液中の赤血球細胞の容積パーセンテージが、哺乳動物において
増加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリヌクレオ
チドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結され
た少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化される
プロモーターに機能的に連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレ
イン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン
様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチ
ン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から
選択される、ベクター。
【請求項８】
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項７に記載のベクタ
ー。
【請求項９】
ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポック
スウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタ
イン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカ
リモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９に記載のベクター
。
【請求項１１】
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、
請求項７に記載のベクター。
【請求項１２】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを
含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配
列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能する複合体を形成する、請求項７に記載のベクター。
【請求項１３】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコ
ードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因
子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項７
に記載のベクター。
【請求項１４】
前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列がＥＭＣＶ配列内リボソーム進
入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されている、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９にコードされるアミノ酸に対し
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１
００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１６】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１０に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１７】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１１に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１８】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１
３のアミノ酸配列、配列番号１４の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列または配
列番号１５の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配
列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１９】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１７または配列番号１８に対し少
なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１０
０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項２０】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１９に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項２１】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２０に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項２２】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２１に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項２３】
１つまたは複数のタンパク質を発現する細胞集団を作製する方法であって、１つまたは
複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより細胞を改変する段階を含み、
ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが
、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモ
ーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含
み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブ
ラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（
ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンお
よび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される、方
法。
【請求項２４】
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項２３に記載の方法
。
【請求項２５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポック
スウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタ
イン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカ
リモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを
含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配
列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能する複合体を形成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコ
ードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因
子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項２
３に記載の方法。
【請求項３０】
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）により接続される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより改変された細胞
集団であって、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリ
ヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に
連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレ
イン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン
様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチ
ン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から
選択される１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、細胞集
団。
【請求項３２】
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項３１に記載の細胞
集団。
【請求項３３】
ベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の細胞集団。
【請求項３４】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポック
スウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタ
イン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカ
リモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３３に記載の細胞集
団。
【請求項３５】
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求
項３１に記載の細胞集団。
【請求項３６】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを
含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配
列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能する複合体を形成する、請求項３１に記載の細胞集団。
【請求項３７】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコ
ードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因
子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項３
１に記載の細胞集団。
【請求項３８】
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）により接続される、請求項３７に記載の集団。
【請求項３９】
哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する細胞集団を投与する段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法。
【請求項４０】
哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法。
【請求項４１】
タンパク質のうち少なくとも１つが、Ｃ１エステラーゼ阻害剤であり、疾患が、血管浮
腫、遺伝性血管浮腫、敗血症、凝固性亢進、肺性機能障害、低酸素血症、出血性膵炎（pa
ncreaitis）、心筋梗塞、肺移植、外傷、熱傷または血管漏出からなる群から選択される
、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質のうち少なくとも１つが、カリクレイン阻害剤であり、疾患が、血管浮腫、
遺伝性血管浮腫、アテローム血栓症、冠動脈疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、ク
ローン病、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、ブラジキニン介在性炎症および接触系の疾患
、状態または障害からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質のうち少なくとも１つが、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤であり、疾患が、
血管浮腫、遺伝性血管浮腫、ブラジキニン介在性炎症、糸球体硬化症、アルツハイマー病
、大脳浮腫、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、疼痛、炎症、外傷、火傷、ショック、アレ
ルギーおよび心血管疾患からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法
。
【請求項４４】
タンパク質のうち少なくとも１つが、プロスタグランジン合成酵素であり、疾患が、肺
高血圧症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、特発性肺動脈性肺高血圧症、家族性肺動脈性
肺高血圧症、続発性肺動脈性肺高血圧症、肺静脈閉塞症、肺毛細血管の血管腫症、新生児
の遷延性肺高血圧症からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４５】
タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）であり、
疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載
の方法。
【請求項４６】
タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）であり、
疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載
の方法。
【請求項４７】
タンパク質のうち少なくとも１つが、アディポネクチンであり、疾患が、糖尿病または
他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質のうち少なくとも１つが、レプチンであり、疾患が、糖尿病または他の代謝
性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質のうち少なくとも１つが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴ
Ｒ）であり、疾患が、嚢胞性線維症である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物における多発性硬化症を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびイ
ンターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）からなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９に対し少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配
列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１６に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびインター
フェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）の両方を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項５０に記載の方法
。
【請求項５５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポック
スウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタ
イン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカ
リモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求
項５０に記載の方法。
【請求項５８】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを
含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配
列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能する複合体を形成する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコ
ードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因
子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項５
０に記載の方法。
【請求項６０】
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）により接続される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
哺乳動物における炎症性腸疾患またはクローン病を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、インターロイキン−１０（ＩＬ−１
０）である、方法。
【請求項６２】
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２２に対し少なくとも８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸
配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
インターロイキン−１０が、ヒトＩＬ−１０タンパク質である、請求項６１に記載の方
法。
【請求項６４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポック
スウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタ
イン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカ
リモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求
項６１に記載の方法。
【請求項６７】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを
含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配
列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能する複合体を形成する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下におけ
る第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコ
ードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因
子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項６
１に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列がＥＭＣＶ配列内リボソーム進
入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されている、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一
項に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項７１】
全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内、脳内、くも膜下腔内、皮内ま
たは皮下投与される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一
項に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む薬物。
【請求項７３】
全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内、脳内、くも膜下腔内、皮内ま
たは皮下投与される、請求項７２に記載の薬物。
【請求項７４】
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一
項に記載の細胞集団を含むキット。
【請求項７５】
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一
項に記載の細胞集団および遺伝子スイッチを活性化するリガンド。
【請求項７６】
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項７５に記載のベクターまたは細胞集団お
よびリガンド。
【請求項７７】
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５
９３２である、請求項７６に記載のベクターまたは細胞集団およびジアシルヒドラジンリ
ガンド。
【請求項７８】
リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、請求項７
５に記載のベクターまたは細胞集団およびリガンド。
【請求項７９】
リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、ジアシルヒドラジンである、請求項７〜
２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３〜３０および３９〜６９のいずれか一
項に記載の方法、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項８０】
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５
９３２である、請求項７９に記載のベクター、方法または細胞集団。
【請求項８１】
リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオ
キサジアゾリンである、請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３〜
３０および３９〜６９のいずれか一項に記載の方法、請求項３１〜３８のいずれか一項に
記載の集団。
【請求項８２】
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一
項に記載の細胞集団およびリガンドを含むキット。
【請求項８３】
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５
９３２である、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、請求項８
２に記載のキットおよびリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由で電子提出した配列表の参照
本願と共に提出した、電子提出した配列表（ファイル名：SequenceListing.ascii.txt
；サイズ：１５３，６２９バイト；作成日：２０１２年３月２日）の全内容が参照により
本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、防御免疫応答および腫瘍形成の抑制を非限
定的に含む、いくつかの生物学的過程への寄与に関係するＩ型サイトカインファミリーの
メンバーである（Abdi et al., 2006；Adorini, 1999；Adorini, 2001；Adorini et al.,
2002；Adorini et al., 1996；Akhtar et al., 2004；Akiyama et al., 2000；Al-Mohan
na et al., 2002；Aliberti et al., 1996；Allavena et al., 1994；Alli and Khar, 20
04；Alzona et al., 1996；Amemiya et al., 2006；Araujo et al., 2001；Arulanandam 
et al., 1999；Athie et al., 2000；Athie-Morales et al., 2004；Bertagnolli et al.
, 1992；Bhardwaj et al., 1996；Biedermann et al., 2006；Brunda and Gately, 1994
；Buchanan et al., 1995；Romani et al., 1997；Rothe et al., 1996；Satoskar et al
., 2000；Schopf et al., 1999；Thomas et al., 2000；Tsung et al., 1997；Wolf et a
l., 1994；Yuminamochi et al., 2007）。ＩＬ−１２がヒト疾患（例えば、癌）を抑える
ための有望な標的である可能性を示唆する証拠は増えている。
【０００３】
ＩＬ−１２が１型抗腫瘍ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するその
強力な補助活性に基づき、癌治療薬として依然として有望であるという事実（Trinchieri
, 2003）にもかかわらず、患者において報告されている組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ
−１２）の毒性（Atkins et al., 1997）は、臨床適用のためのＧＭＰ等級のｒｈＩＬ−
１２の供給源が限られていることと併せて、ＩＬ−１２に基づく治療アプローチの成功を
妨げてきた。このため、遺伝子治療アプローチがより安全で、筋道の立った治療選択肢で
あると考えることは妥当であるように思われる。実際に、組換えウイルス（Sangro et al
., 2004；Triozzi et al., 2005）もしくは組換えプラスミドに基づくＩＬ−１２  ｃＤ
ＮＡ（Heinzerling et al., 2005）の、またはＩＬ−１２遺伝子が改変された自己線維芽
細胞（Kang et al., 2001）の腫瘍内または腫瘍周囲送達を採り入れた第１相臨床試験で
は、安全性および十分な忍容性が明らかにされている。
【０００４】
しかし、これらの遺伝子療法を受けている黒色腫または様々な癌の患者における客観的
な臨床的奏効は稀で、一定せず、一過性であり、かつ多くは治療部位に限局していた（He
inzerling et al., 2005；Kang et al., 2001；Sangro et al., 2004；Triozzi et al., 
2005）。疾患の消散が部分的または完全であった症例では、腫瘍浸潤性リンパ球の頻度の
増大（Heinzerling et al., 2005；Sangro et al., 2004）および腫瘍特異的循環ＣＤ８
＋Ｔ細胞のレベルの上昇（Heinzerling et al., 2005）が認められており、これはこれら
の患者における抗原特異的Ｔ細胞のクロスプライミングの向上と合致する。
【０００５】
特異的Ｔ細胞のクロスプライミングは、ＩＬ−１２の自然の、しかし調節下にある供給
源として働く樹状細胞（ＤＣ）によって最もうまく達成されるため（Berard et al., 200
0）、ＤＣに基づくＩＬ−１２遺伝子治療の前臨床試験での有効性が相対的に優れていた
という最近の報告は大変興味深い（Satoh et al., 2002；Tatsumi et al., 2003；Yamana
ka et al., 2002）。例えば、マウスモデルにおける、ＩＬ−１２ｐ７０を産生するよう
に（組換えアデノウイルス感染により）遺伝子操作されたＤＣの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射
は、広域反応性の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞レパートリーのクロスプライミングの劇的な
向上をもたらし、それに呼応して腫瘍拒絶が生じたことが示されている（Tatsumi et al.
, 2003）。ＣＭＶに基づくプロモーターの下でｍＩＬ−１２をコードする組換えアデノウ
イルス（ｒＡｄ．ｃＩＬ１２、（Tatsumi et al., 2003））が以前に用いられたことを考
慮すれば、遺伝子操作されたＤＣによるＩＬ−１２の産生は恒常的であり、それ故に、初
期の腫瘍病変内および後期の腫瘍流入領域リンパ節内でのこのサイトカインの免疫学的影
響を治療成績に関して分けて分析することはできなかった。このため、導入遺伝子の発現
レベルおよび導入遺伝子の活性化のタイミングの両方を調節することを目的として、ＩＬ
−１２の条件的発現のために遺伝子操作されたＤＣには需要が存在する。本発明は、その
ような細胞の使用に関する有望な治療成績を提供する。
【０００６】
対象核酸配列によってコードされたタンパク質を含有するベクター組成物による遺伝子
の発現に付随する問題を考慮すると、依然として、直接注射に用いられる、あるいは細胞
に基づく治療法における使用のための導入ベクター組成物を改善する必要がある。
【０００７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、骨髄における赤血球系前駆細胞の増殖、分化および生
存を制御することにより、赤血球細胞産生の調節における中心的な役割を果たす。ＥＰＯ
タンパク質が欠如すると貧血になる。組換えヒトＥＰＯ（ｈｕＥＰＯ）による治療は、慢
性疾患に関連する貧血管理の改善において効率的かつ安全である。タンパク質療法は成功
したにもかかわらず、様々な有害作用が報告された。例えば、患者は、ＥＰＯ抵抗性とな
ることがあり、また、生物製剤（biologic）に対し反応性が低下することもある。さらに
、化学療法による貧血を患う患者での臨床治験における観察は、ｒＨｕＥＰＯタンパク質
が致死率を増加させることを示した。よって、当技術分野において、現在利用できる送達
アプローチの不利益を回避する、貧血を治療するためのＥＰＯ送達アプローチの必要が依
然としてある。
【０００８】
多発性硬化症は、脳および脊髄の軸索周りの脂肪性髄鞘が損傷し、脱髄および瘢痕なら
びに広範囲の徴候および症状をもたらす炎症性疾患である。疾患過程に関与する機序につ
いて多くのことが知られているが、原因は未だ不明である。多発性硬化症の公知の治癒法
はない。治療は、発作後の機能回復、新たな発作の予防および身体障害の予防を試みる。
多発性硬化症薬物療法は、有害作用を有する、あるいは耐容性が低いことがあり、多くの
患者は、支持する科学的研究がないにもかかわらず代替治療を求める。
【０００９】
血管浮腫は、真皮、皮下組織、粘膜および粘膜下組織の急速な腫脹（浮腫）である。血
管浮腫は、後天性または遺伝性のいずれかとして分類される。後天性血管浮腫は通常、ア
レルギーに起因し、他のアレルギー性症状および蕁麻疹と共に起こる。これは、特定の薬
物療法、特にＡＣＥ阻害剤に対する副作用としても生じうる。遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）
は、３形態が存在し、そのすべては、常染色体優性型で遺伝する遺伝的変異に起因する。
これらは、根底にある遺伝的異常により識別される。ＨＡＥのすべての形態が補体系の異
常活性化を導き、すべての形態が、消化管等、身体の他の部位における腫脹の原因となり
うる。ＨＡＥは、喉頭に関与する場合、生命にかかわる窒息の原因となりうる。
【００１０】
肺高血圧症は、肺動脈（心臓から肺へと繋がる血管）内の圧力が正常レベルよりも高く
上昇する肺の障害である。肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、肺動脈圧および肺血管抵抗
の増加により特徴付けられる疾患である。Harrison's Principles of Internal Medicine
、第15版、1506〜1507頁（McGraw-Hill、2001年）。治療せずにおくと、ＰＡＨは、「多
くの場合予後不良となり、結果的に右室不全となり死亡する」。Ulrich, S., et al., Sw
iss Med. Wkly 137:73-82, 73（2007）。
【００１１】
クローン病は、胃腸（ＧＩ）管の慢性炎症性障害であり、これは、エピソードの再発お
よび寛解により定義され、狭窄、瘻孔または膿瘍の合併症へと経時的に進行する。米国に
おいて、クローン病は、およそ百万人が発症し、年間推定の疾患に起因しうる直接経費は
、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）の場合は６３億ドルと推定され、クローン病の場合では、その
値のうち３６億ドルの費用に寄与すると推定される。アザチオプリンおよび６−メルカプ
トプリンは、一次治療が失敗した患者、特に、全身性副腎皮質ステロイドに依存性または
それに対し応答しない患者に頻繁に処方される。アザチオプリンにより治療された患者の
およそ４０％は、１年後に寛解を維持する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を標的とするインフ
リキシマブおよび他のモノクローナル抗体は、クローン病患者における寛解の誘導および
維持における有効性を示したが、多くの指針およびコンセンサス論文（consensus articl
e）においては、インフリキシマブは、管腔疾患の場合、患者を外科医に引き渡す前の最
後の医療手段（last medical resort）であると考えられている。したがって、ＩＢＤお
よびクローン病を治療するための治療方法の改善の必要がまだある。
【００１２】
ＩＬ−１０は、活性化されたＴｈ２細胞、Ｂ細胞、ケラチノサイト、単球およびマクロ
ファージによって産生されるサイトカインである。ＩＬ−１０は、活性化マクロファージ
によって、およびヘルパーＴ細胞によって産生される、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３
、ＴＮＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの合成を阻害する。ＩＬ−１
０は、活性化されたヒトＢ細胞の成長および分化を促進し、Ｔｈ１応答を阻害して移植拒
絶反応およびＴ細胞媒介性自己免疫疾患を予防する上で有用である。
【００１３】
ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）は、炎症誘発性サイトカインの産生を強く下方
制御し、腸管炎症の調節に関与する免疫調節性サイトカインである。ｒｈＩＬ−１０（組
換えヒトＩＬ−１０）の臨床開発は、狭い治療域と、ＧＩ組織に限定的なバイオアベイラ
ビリティをもたらす薬物動態プロファイルを実証した。しかし、ＩＬ−１０が、インビボ
細胞発現により局所的に増加しても、全身性有害作用が生じない可能性がある。
【００１４】
ＣＦ（嚢胞性線維症）は、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）の遺伝
子における欠損に起因する常染色体劣性障害であり、ＣＦＴＲタンパク質は、粘液、汗、
唾液、涙および消化酵素を産生する細胞の膜を貫く塩化物イオンチャネルとして機能する
ため、この欠損は、粘膜表面における上皮細胞を貫く塩化物イオン輸送の異常をもたらす
。塩化物イオンの輸送は、組織における水移動の制御を助け、これは薄く、自由に流動す
る粘液（その正常な含量は、気道、消化器系、生殖器系ならびに他の臓器および組織の裏
打ちの保護に必要である）の産生に必要である。ＣＦＴＲタンパク質は、ナトリウムイオ
ンと呼ばれる正電荷を持つ粒子を、細胞膜を貫いて輸送するチャネル等、他のチャネルの
機能も調節する。これらのチャネルは、肺および膵臓等、臓器の正常機能に必要である。
よって、ＣＦは、外分泌腺機能に影響を及ぼし、肺、膵臓および他の臓器における粘液の
鬱滞の原因となる。この粘液閉塞は、膵酵素不全症および消化の問題に加えて、肺の感染
症および炎症をもたらしうる。
【００１５】
およそ３０，０００人の米国人がＣＦであり、そのためＣＦは米国における最も一般的
な寿命短縮遺伝性疾患の１種であり、各ＣＦ患者は３７年の平均余命を有する。ＣＦにお
ける治療法の最も一貫した側面は、クオリティオブライフを維持し、濃い粘液および感染
症に起因する肺損傷を治療するものであった。嚢胞性線維症患者において、ＣＦＴＲ遺伝
子における１，０００種を超える変異が同定された。これらの変異の大部分は、ＣＦＴＲ
タンパク質における単一アミノ酸を変化させ、あるいはＣＦＴＲ遺伝子から少量のＤＮＡ
を欠失させる。デルタＦ５０８と呼ばれる最も一般的な変異は、ＣＦＴＲタンパク質の５
０８位におけるアミノ酸１個の欠失である。その結果生じる異常チャネルは、生成直後に
崩壊し、細胞膜に到達して塩化物イオンを輸送することはない。ＣＦＴＲ遺伝子における
疾患の原因となる変異は、塩化物イオンチャネルの産生、構造または安定性を変化させる
。これらの変化はすべて、チャネルが適切に機能するのを妨げ、これにより塩化物イオン
の輸送および細胞内外への水の移動を損なう。その結果、肺、膵臓および他の臓器の通路
を裏打ちする細胞は、異常に濃く粘着性の粘液を産生する。異常粘液は、気道および腺を
閉塞し、嚢胞性線維症に特徴的な徴候および症状をもたらす。近年、ＫＡＬＹＤＥＣＯ（
商標）が、ＣＦの根底にある原因（ＣＦＴＲ遺伝子におけるＧ５５１Ｄ変異）を標的化す
る第一の治療としてＦＤＡにより認可された。しかし、ＫＡＬＹＤＥＣＯ（商標）は、最
も一般的なＣＦＴＲ変異を有する患者の治療において有効ではない。したがって、依然と
して、ＣＦ治療の改善の必要がある。
【００１６】
多くの場合単に糖尿病と称される真性糖尿病は、人間の身体が十分なインスリンを産生
しないこと、あるいは細胞が産生されたインスリンに応答しないことのいずれかが原因で
高血糖となる代謝性疾患の一群である。この高血糖は、多尿症（頻尿症）、多飲症（口渇
増加）および過食症（空腹増加）の古典的な症状を生じる。メタボリックシンドロームは
、同時に発生すると心血管疾患および糖尿病の発症リスクを増加させる内科的障害の組合
せである。米国における５人に１人がこれに罹患し、罹患率は年齢と共に増加する。一部
の研究は、米国における罹患率が、人口の推定２５％であることを示した。したがって、
真性糖尿病治療を改善する必要が依然としてある。
【００１７】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、インスリン分泌のグルコース依存性刺激を
誘導しつつ、グルカゴン分泌を抑制する強力な血糖降下ホルモンである。ＧＬＰ−１は、
ＧＬＵＴ２およびグルコキナーゼの発現増加が関与している可能性のある機序により、膵
β細胞のグルコース感受性を回復すると考えられる。ＧＬＰ−１は、膵β細胞アポトーシ
スを阻害し、インスリン分泌β細胞の増殖および分化を刺激することも知られている。そ
の上、ＧＬＰ−１は、胃液の分泌および胃の運動性を阻害する。これは、炭水化物吸収を
遅延および長期化し、満腹効果に寄与する。
【００１８】
グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）は、腸管内分泌Ｌ細胞および中枢神経系におけ
る様々なニューロンにより産生される。腸管ＧＬＰ−２は、栄養の経口摂取により、ＧＬ
Ｐ−１と共に同時分泌（co-secret）される。外部から投与されると、ＧＬＰ−２は、腸
管成長、腸管機能の増強、骨破壊の低下および神経保護等、多数の効果を生じる。
【００１９】
アディポネクチンは、グルコース調節および脂肪酸異化反応等、多数の代謝過程をモジ
ュレートするタンパク質ホルモンである。アディポネクチンは、専ら脂肪組織から（妊娠
中の胎盤からも）血流へと分泌され、血漿において多くのホルモンと比べて非常に豊富で
ある。ホルモンのレベルは、成人において体脂肪パーセンテージと逆相関する。
【００２０】
ヒトレプチンは、主に白色脂肪組織の脂肪細胞において生産され、循環レプチンのレベ
ルは、身体における脂肪の総量に正比例する。レプチンは、脳視床下部における受容体に
おいて作用して、（１）神経ペプチドＹ（腸および視床下部における細胞により分泌され
る強力な摂食刺激物質）の効果を相殺し、（２）アナンダマイド（ＴＨＣと同じ受容体と
結合する別の強力な摂食刺激物質）の効果を相殺し、（３）食欲抑制物質であるα−ＭＳ
Ｈの合成を促進することにより食欲を抑制する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、１つまたは複数のプロモーターの制御下にある、１つまたは複数の治療タン
パク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する１つまたは複数のタンパク質をコ
ードする組換えベクターを提供する。一実施形態において、１つまたは複数のプロモータ
ーは条件的である。別の一実施形態において、１つまたは複数のプロモーターは構成的で
ある。別の一実施形態において、ベクターは、ジアシルヒドラジン（例えば、ＲＧ−１１
５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２）などの可溶性低分子リガンド
の供給によって条件的に活性化させることのできるプロモーターで駆動される１つまたは
複数のタンパク質をコードするアデノウイルスベクターである。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または
増強する方法であって、
（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に筋肉
内投与する段階と、
（ｂ）アクチベーターリガンドを投与する段階と
を含み、
アデノ随伴ウイルスが、遺伝子スイッチをさらに含み、遺伝子スイッチが、プロモータ
ーに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列を含み、
少なくとも１つの転写因子配列によってコードされる少なくとも１つの転写因子が、リ
ガンド依存性転写因子であり、
アデノ随伴ウイルスが、ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された第
二のプロモーターをさらに含み、第二のプロモーターが、アクチベーターリガンドの投与
後に少なくとも１つのリガンド依存性転写因子により活性化される、
方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって
、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機
能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子によ
り活性化されるプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数のタンパク質をコード
するポリヌクレオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害
剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素
、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ア
ディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）か
らなる群から選択される、ベクターを提供する。
【００２４】
本発明はまた、１つまたは複数のタンパク質を発現する細胞集団を作製する方法であっ
て、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより細胞を改変す
る段階を含み、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリ
ヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に
連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性
化されるプロモーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌク
レオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレ
イン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン
様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチ
ン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から
選択される、方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより
改変された細胞集団であって、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチ
ドを含み、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモー
ターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）Ｃ１エステラーゼ阻
害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵
素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、
アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）
からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む細胞集団を提供する。
【００２６】
本発明はまた、遺伝子スイッチをコードする組換えポリヌクレオチドを含むインビトロ
で遺伝子操作された細胞であって、（１）プロモーターに機能的に連結された、リガンド
依存性転写因子をコードする少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転
写因子により活性化されるプロモーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドであり、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻
害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵
素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、
アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）
からなる群から選択されるポリヌクレオチドとを含む、細胞を提供する。
【００２７】
本発明はまた、哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するようインビトロで遺伝子操作され
た細胞集団を投与する段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、
ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチド
が、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含み、ベクターが細胞内に含有されていない、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、哺乳動物における多発性硬化症を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含み、ベクターが、細胞内に含有されていない、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびイ
ンターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）からなる群から選択される、方法を提供する。
【００３０】
哺乳動物における炎症性腸疾患またはクローン病を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、インターロイキン−１０（ＩＬ−１
０）である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける対側性メラノーマ（Ｂ１６Ｆ０）腫瘍における、アクチベーターリガンドによるＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２の有効性を表す線グラフである。図１Ａは、動物の右側腹部における処置された腫瘍の体積を表す。図１Ｂは、動物の左側腹部における未処置腫瘍の体積を表す。腫瘍サイズは、平均値±ＳＥとして示す。
【図２】Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２およびアクチベーターリガンドに応答した、両側腹部にメラノーマ腫瘍を有するマウスの体重変化を表す線グラフである。
【図３】ＬＬＣおよび４Ｔ１細胞系における、ｍＩＬ１２およびｍＩＦＮαのインビトロで調節された発現を表す棒グラフである。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＬＬＣおよび４Ｔ１細胞系におけるｍＩＬ１２およびｍＩＦＮαの効果を表す線グラフである。
【図５】マウスにおけるＩＬ１２およびＩＦＮαの全身性および腫瘍内効果を表す棒グラフである。
【図６】ＩＬ１２およびＩＦＮαの同時発現が、４Ｔ１およびＬＬＣ癌細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を増強することを表す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図７Ａ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれベクター００３４Ａ、００３４Ｂ、００３４ＣＢおよび００３４Ｄのベクターマップである。００３４Ａは、標準スイッチ系エレメントを有する。００３４Ｂは、改変された調節されたプロモーターを有する。
【図７Ｂ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれベクター００３４Ａ、００３４Ｂ、００３４ＣＢおよび００３４Ｄのベクターマップである。００３４Ａは、標準スイッチ系エレメントを有する。００３４Ｂは、改変された調節されたプロモーターを有する。
【図７Ｃ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれベクター００３４Ａ、００３４Ｂ、００３４ＣＢおよび００３４Ｄのベクターマップである。００３４Ａは、標準スイッチ系エレメントを有する。００３４Ｂは、改変された調節されたプロモーターを有する。
【図７Ｄ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれベクター００３４Ａ、００３４Ｂ、００３４ＣＢおよび００３４Ｄのベクターマップである。００３４Ａは、標準スイッチ系エレメントを有する。００３４Ｂは、改変された調節されたプロモーターを有する。
【図８】ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯの筋肉内（ＩＭ）投与後のＣ３Ｈ／Ｈマウスの生理応答を表す線グラフである。
【図９】Ｃ３Ｈ／ＨマウスのヘマトクリットにおけるＨｕＥＰＯの調節された発現の効果を示す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図１０】Ｂａｌｂ／ｃマウスのヘマトクリットにおけるＨｕＥＰＯの調節された発現の効果を示す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図１１】ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯの単一ＩＭ注射後のヘマトクリットにおけるＨｕＥＰＯの調節された発現の効果を示す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯのＩＭ送達後のヘマトクリットの絶対的変化を示す線グラフである。
【図１３】アクチベーターリガンド用量に応じた、ヘマトクリットにおけるＨｕＥＰＯの調節された発現の効果を示す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図１４】ヘマトクリットにおける、３／４腎摘出したＣ３Ｈ／Ｈマウス結果におけるＨｕＥＰＯの発現の効果を示す、線グラフと棒グラフを組み合わせたグラフである。
【図１５】ヘマトクリットにおける、Ｂａｌｂ／ｃマウスへのＲＴＳ−ＨｕＥＰＯのＩＭ送達発現の効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列の説明
配列番号１は、ショウジョウバエ（Drosophila）で認められるエクジソン応答エレメン
トのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号２は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）で認められるエ
クジソン応答エレメントの核酸配列である。
【００３４】
配列番号３は、キイロショウジョウバエで認められるエクジソン応答エレメントの核酸
配列である。
【００３５】
配列番号４は、ヒトＩＬ−１２コード配列を含むアデノウイルスベクターのＤＮＡ配列
である：Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（ＳＰ１−ＲｈｅｏＩＬ−１２）。
【００３６】
配列番号５は、ベクター（Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２）の核酸配列である。
【００３７】
配列番号６は、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号７は、コリストネウラ・フミフェラナ（Choristoneura fumiferana）エクジソ
ン受容体リガンド結合ドメインのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号８は、シグナルペプチド配列、ヒトエリスロポエチン配列および終止コドンの
核酸配列である。
【００４０】
配列番号９は、ヒトミエリン塩基性タンパク質の核酸配列である。
【００４１】
配列番号１０は、ヒトＣ１エステラーゼ阻害剤のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１１は、エカランチドのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１２は、ヒトプロスタグランジンシンテターゼ２のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１３は、ヒトプロスタグランジンシンテターゼ１のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１４は、ヒトプロスタグランジンシンテターゼ２の核酸配列である。
【００４６】
配列番号１５は、ヒトプロスタグランジンシンテターゼ１の核酸配列である。
【００４７】
配列番号１６は、ヒトインターフェロン−ベータのアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１７は、ヒトＧＬＰ−１のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１８は、ヒトＧＬＰ−２のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１９は、ヒトアディポネクチンのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２０は、ヒトレプチンのアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２１は、ヒトＣＦＴＲのアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２２は、ヒトＩＬ−１０のアミノ酸配列である。
【００５４】
発明の詳細な説明
定義
別に定義する場合を除き、本明細書において用いられるすべての技術用語、表記および
他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解
されている意味を有するものとする。場合によっては、明確さおよび／または参照の便宜
を図るために、意味が一般的に理解されている用語を本明細書において定義しているが、
このような定義を本明細書に含めたことは、当技術分野において一般に理解されているも
のとの実質的な違いを意味するとは必ずしもみなされるべきではない。分子生物学の用語
および／または方法および／またはプロトコールの一般的に理解されている定義は、Rieg
er et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-
Verlag: New York, 1991；Lewin, Genes V, Oxford University Press:NewYork, 1994；S
ambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)およびAusube
l et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994)に見出すことができる。適
宜、市販のキットおよび／または試薬の使用を伴う手順は、別に記載のある場合を除き、
一般に、製造元の手引きおよび／またはプロトコールおよび／またはパラメーターに従っ
て実施する。
【００５５】
本発明は、１つまたは複数のプロモーターの制御下における、タンパク質（複数可）を
コードする組換えベクターを提供する。一実施形態において、１つまたは複数のプロモー
ターは、条件的である。別の一実施形態において、１つまたは複数のプロモーターは、構
成的である。別の一実施形態において、ベクターは、ジアシルヒドラジン（例えば、ＲＧ
−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２）等、可溶性小分子リガ
ンドの供給によって条件的に活性化されうるプロモーターから駆動されるタンパク質（複
数可）をコードするアデノウイルスベクターである。このベクターは、細胞におけるタン
パク質（複数可）の発現の制御を可能にする。
【００５６】
一実施形態において、免疫モジュレーターの機能を有する１つまたは複数のタンパク質
をコードするポリヌクレオチドは遺伝子スイッチのプロモーターの制御下にあり、ＩＬ−
１２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは構成的プロモーターの制
御下にある。別の一実施形態において、１つまたは複数の治療タンパク質（例えば、免疫
モジュレーター）の機能を有する１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドおよびＩＬ−１２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは両方と
も、遺伝子スイッチの１つのマルチシストロン性プロモーターの制御下にある。別の一実
施形態において、１つまたは複数の治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機
能を有する１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは遺伝子スイッチ
のプロモーターの制御下にあり、ＩＬ−１２の機能を有するタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは、遺伝子スイッチプロモーターとは異なる条件的プロモーターの制御下に
ある。さらなる実施形態において、１つまたは複数の治療タンパク質（例えば、免疫モジ
ュレーター）の機能を有する１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
に関する遺伝子調節システム、およびＩＬ−１２の機能を有するポリヌクレオチドに関す
る遺伝子調節システムはオルソゴナル（orthogonal）である。さらなる実施形態において
、各タンパク質をコードする各ポリヌクレオチドに関する遺伝子調節システムはオルソゴ
ナルである。
【００５７】
一実施形態において、本発明はまた、黒色腫腫瘍、神経膠腫腫瘍、腎癌および前立腺癌
、さらには表１に列記された癌など、ただしこれらには限定されない癌の治療も提供する
。ＩＬ−１２遺伝子治療は、動物モデル試験において組換えｃＤＮＡベクターとして適用
した場合に抗腫瘍効果を示している（Faure et al., 1998；Sangro et al., 2005）が、
遺伝子を改変したＤＣの状況で適用した場合にはさらに効果的であった（Satoh et al., 
2002；Svane et al., 1999；Tatsumi et al., 2003；Yamanaka et al., 2002）。しかし
、現在までに、プラスミドまたはウイルスベクターを採り入れたＩＬ−１２遺伝子治療の
ヒト第Ｉ相試験は、癌の環境では持続性のある客観的な臨床的奏効を達成することができ
ていない（Heinzerling et al., 2005；Kang et al., 2001；Sangro et al., 2004；Trio
zzi et al., 2005）。本明細書に記載された遺伝子治療は、有望な治療手段を提供する。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する１つまたは複数
のタンパク質を条件的に発現するようインビトロで遺伝子操作された本発明の免疫細胞、
ＴＳＣの集団またはベクター（またはそれらの組合せ）を、腫瘍周囲の領域における腫瘍
微小環境へと腫瘍内投与、あるいは全身投与する段階と、
（ｂ）前記哺乳動物に治療上有効量の活性化リガンドを投与して、これにより治療タン
パク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、前記
腫瘍を治療する段階と、
を含む、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法を提供する。
【００５９】
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するため
の方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する
１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するよう改変された細胞集団を投与する段階
と、
（ｂ）前記哺乳動物に、治療上有効量の活性化リガンドを投与して、これにより治療タン
パク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、前記
疾患または障害を治療する段階と
を含む、方法を提供する。
【００６０】
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するため
の方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する
１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するよう改変された細胞の２種以上の集団を
投与する段階であり、改変された細胞の各集団が、１つまたは複数の治療タンパク質（例
えば、免疫モジュレーター）の異なるセットを発現する段階と、
（ｂ）前記哺乳動物に、治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを投与して、こ
れにより治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有するタンパク質の発
現を誘導し、前記疾患または障害を治療する段階と
を含む、方法を提供する。
【００６１】
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するため
の方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する
１つまたは複数のタンパク質およびＩＬ−１２の機能を有するタンパク質を条件的に発現
するよう改変された細胞集団を投与する段階であり、治療タンパク質（例えば、免疫モジ
ュレーター）またはＩＬ−１２の機能を有するタンパク質のうち少なくとも１つが、リガ
ンドによって活性化される条件的なプロモーターの制御下にある段階と、
（ｂ）前記哺乳動物に、治療上有効量の活性化リガンドを投与して、これにより治療タン
パク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有するタンパク質および／またはＩＬ−
１２の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、前記疾患または障害を治療する段階と
を含む、方法を提供する。
【００６２】
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するため
の方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する
１つまたは複数のタンパク質およびＩＬ−１２の機能を有するタンパク質を条件的に発現
するよう改変された細胞の２つ以上の集団を投与する段階であり、改変された細胞の各集
団が、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有する１つまたは複数の
タンパク質の異なるセットを発現し、治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）ま
たはＩＬ−１２の機能を有するタンパク質のうち少なくとも１つが、リガンドによって活
性化される条件的なプロモーターの制御下にある段階と、
（ｂ）前記哺乳動物に、治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを投与して、こ
れにより治療タンパク質（例えば、免疫モジュレーター）の機能を有するタンパク質およ
び／またはＩＬ−１２の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、前記疾患または障害を
治療する段階と
を含む方法を提供する。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
、タンパク質（複数可）を条件的に発現させるためのベクターであって、遺伝子スイッチ
をコードする前記ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プ
ロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）前記リガンド
依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、１つまたは複数のタン
パク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ベクターを提供する。
【００６４】
一実施形態において、本発明のベクターは、タンパク質を条件的に発現する。別の一実
施形態において、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するベクター、例えば、ア
デノウイルスベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。シグナ
ルペプチドは、コドン最適化されていてよい。他の実施形態において、ベクターは、５’
非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’調節領域またはその両方をさらに含み、タンパク質発現およ
び／または全収率を改善する。
【００６５】
本発明はさらに、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターによ
って細胞を改変すること（例えば、トランスフェクトすること、エレクトロポレーション
を行うこと、その他）により、１つまたは複数のタンパク質を発現する細胞の集団を生成
する方法であって、そのベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み
、前記ポリヌクレオチドが、（１）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性
転写因子をコードする少なくとも１つの転写因子配列、および（２）前記リガンド依存性
転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質
をコードするポリヌクレオチド、を含む方法を提供する。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する
ベクターおよび１つまたは複数の調節配列を生成する段階であって、前記１つまたは複数
の調節配列が、タンパク質の発現を改善する段階を含む、タンパク質の発現を増加させる
方法を提供する。
【００６７】
本発明は、タンパク質（複数可）を条件的に発現する組換えベクターにより改変された
（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション等により）、タンパク質（複
数可）を発現する細胞集団であって、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌク
レオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする
、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）前記リガ
ンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された１つまたは複数のタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、細胞集団をさらに提供する。
【００６８】
別の一実施形態において、本発明は、本発明の細胞の２つまたはそれ以上の集団を含む
組成物であって、組成物中のそれぞれの細胞の集団が、組成物中の他の細胞集団において
発現される１つまたは複数のタンパク質とは異なる１つまたは複数のタンパク質を発現す
る、組成物を提供する。一実施形態において、組成物は２つの細胞集団を含む。別の一実
施形態において、組成物は２つを上回る細胞集団を含む。別の一実施形態において、組成
物は３つの細胞集団を含む。別の一実施形態において、組成物は４つの細胞集団を含む。
【００６９】
別の一実施形態において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを
含むベクターを含む、インビトロで遺伝子操作された細胞であって、前記ポリヌクレオチ
ドが、（１）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする
少なくとも１つの転写因子配列、および（２）前記リガンド依存性転写因子によって活性
化されるプロモーターに連結された、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含む
細胞を提供する。
【００７０】
別の一実施形態において、本発明は、インビトロで遺伝子操作された細胞の２つまたは
それ以上の集団を含む組成物であって、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の
集団のそれぞれが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、
前記ポリヌクレオチドが、（１）プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも１つの転写因子配列、および（２）前記リガンド依存性転
写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、タンパク質をコードするポリヌ
クレオチド、を含み、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞のそれぞれの集団が
、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の他の集団において発現される１つまた
は複数のタンパク質とは異なる１つまたは複数のタンパク質を発現する、組成物を提供す
る。
【００７１】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、真性糖尿病、代謝性疾患、
代謝性障害およびメタボリックシンドロームの治療に用いられる。一実施形態において、
ベクターは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、アディポネクチンもしくはレプチンまたはＧＬＰ
−１、ＧＬＰ−２、アディポネクチンもしくはレプチンの断片をコードするポリヌクレオ
チド配列を含む。別の一実施形態において、ベクターは、ヒトＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、
アディポネクチンもしくはレプチンまたはヒトＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、アディポネクチ
ンもしくはレプチンの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）お
よび／またはクローン病の治療に用いられる。一実施形態において、ベクターは、ＩＬ−
１０またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において
、ベクターは、ヒトＩＬ−１０またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む
。
【００７３】
一実施形態において、本発明は、欠損または変異体ＣＦＴＲタンパク質を交換または補
充するための嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のインビボ産生を可能
にする、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターを含むベクター（単数または複数
）を網羅する。よって、一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、ＣＦ（嚢
胞性線維症）の治療に用いられる。一実施形態において、ベクターは、正常（非変異体（
non-mutatant））ＣＦＴＲまたはその機能（生理活性のある／イオン輸送可能な）断片を
コードするポリヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、ベクターは、正常ヒ
トＣＦＴＲ（非変異体（non-mutatant）ＣＦＴＲ）またはその機能（生理活性のある／イ
オン輸送可能な）断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
本発明は、また、本明細書に記載されている細胞の集団を含む医薬組成物、または細胞
集団を欠く、発現ベクターの直接注射に適した、すなわち、直接的に注射される組成物を
提供する。
【００７５】
本発明はまた、プロスタグランジン合成酵素を条件的に発現するためのベクターであっ
て、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチ
ドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された
少なくとも１つの転写因子配列と、（２）プロスタグランジン合成酵素をコードするポリ
ヌクレオチドとを含むベクターを提供する。本発明はまた、ベクターを投与する段階を含
む、肺高血圧症を治療するための方法を提供する。
【００７６】
ＩＬ−１２は、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞に対する増殖因子として作用し、Ｎ
Ｋ／リンホカインにより活性化されたキラー細胞の溶解活性を高め、かつ休止末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮ−γの産生を刺激することのできるサイトカインである。
ＩＬ−１２のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号ＮＭ
＿０００８８２（ヒトＩＬ１２Ａ）；ＮＭ＿００２１８７（ヒトＩＬ１２Ｂ）；ＮＭ＿０
０８３５１（マウスＩＬ１２ａ）；ＮＭ＿００８３５２（マウスＩＬ１２ｂ）；ＮＭ＿２
１３５８８（ニワトリＩＬ１２Ａ）；ＮＭ＿２１３５７１（ニワトリＩＬ１２Ｂ）；ＮＭ
＿０５３３９０（ラットＩＬ１２ａ）；およびＮＭ＿０２２６１１（ラットＩＬ１２ｂ）
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
【００７７】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号ＮＰ＿０００８７３（ヒトＩＬ１２Ａ）；ＮＰ＿００２１７８（ヒトＩＬ
１２Ｂ）；ＮＰ＿０３２３７７（マウスＩＬ１２ａ）；ＮＰ＿０３２３７８（マウスＩＬ
１２ｂ）；ＮＰ＿９９８７５３（ニワトリＩＬ１２Ａ）；ＮＰ＿９９８７３６（ニワトリ
ＩＬ１２Ｂ）；ＮＰ＿４４５８４２（ラットＩＬ１２ａ）；およびＮＰ＿０７２１３３（
ラットＩＬ１２ｂ）として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
【００７８】
一実施形態において、ＩＬ−１２遺伝子は、野生型マウスＩＬ−１２配列である。別の
一実施形態において、配列は、野生型マウスＩＬ−１２に対し少なくとも８５％同一、例
えば、野生型マウスＩＬ−１２に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である
。さらなる一実施形態において、ＩＬ−１２遺伝子配列は、マウスＩＬ−１２ポリペプチ
ドをコードする。別の一実施形態において、遺伝子は、野生型マウスＩＬ−１２に対し少
なくとも８５％同一、例えば、野生型マウスＩＬ−１２に対し少なくとも９０％、９５％
または９９％同一であるポリペプチドをコードする。
【００７９】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、中枢神経系における神経の髄鞘形成過程にお
いて重要であると考えられるタンパク質である。古典的ＭＢＰ遺伝子によりコードされる
タンパク質は、神経系におけるオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の髄鞘の主要構
成成分である。ＭＢＰ関連の転写産物は、骨髄および免疫系にも存在する。ＭＢＰのアミ
ノ酸およびポリヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１０２５０８１およびＮＰ＿０
０１０２０２５２（ヒト）ならびにＮＭ＿００１０２５２４５およびＮＰ＿００１０２０
４１６（マウス）として入手できる。
【００８０】
一実施形態において、ＭＢＰは、野生型ヒトＭＢＰ配列である。別の一実施形態におい
て、配列は、野生型ヒトＭＢＰに対し少なくとも８５％同一、例えば、野生型ヒトＭＢＰ
に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００８１】
Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１−阻害剤、Ｃ１−ｉｎｈ）は、セルピンスーパーファミ
リーに属するプロテアーゼ阻害剤である。その主要機能は、補体系を阻害して、自発的活
性化を防止することである。Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、０．２５ｇ／Ｌ前後のレベルで
血液中を循環する急性期タンパク質であり、そのレベルは、炎症の際におよそ２倍上昇す
る。Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、補体の古典的経路のＣ１複合体におけるＣ１ｒおよびＣ
１ｓプロテアーゼと不可逆的に結合し、不活性化する。レクチン経路のＭＢＬ複合体にお
けるＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２プロテアーゼも不活性化される。Ｃ１エステラーゼ
阻害剤は、Ｃ１およびＭＢＬによる、より後期の（later）補体成分Ｃ４およびＣ２のタ
ンパク分解性開裂を妨げる。Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、線維素溶解性、凝固およびキニ
ン経路のプロテアーゼも阻害する。Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、血漿カリクレインの阻害
剤である。ヒトＣ１エステラーゼ阻害剤のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＤＵ８７
６２５．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＧＵ７２７６２３．１）に見出される。
【００８２】
一実施形態において、Ｃ１エステラーゼ阻害剤は、野生型ヒトＣ１エステラーゼ阻害剤
配列である。別の一実施形態において、配列は、野生型ヒトＭＢＰに対し少なくとも８５
％同一、例えば、野生型ヒトＣ１エステラーゼ阻害剤に対し少なくとも９０％、９５％ま
たは９９％同一である。
【００８３】
エカランチド（商標名Ｋａｌｂｉｔｏｒ、治験名（investigational name）ＤＸ−８８
）は、タンパク質カリクレインの阻害剤であり、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の治療および
心臓胸郭部の手術における失血の防止において有用である。エカランチドのアミノ酸配列
は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００７／０
２１３２７５号明細書に見出すことができる。
【００８４】
一実施形態において、エカランチドは、野生型ヒトエカランチド配列である。別の一実
施形態において、配列は、野生型ヒトＭＢＰに対し少なくとも８５％同一、例えば、野生
型ヒトエカランチドに対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００８５】
一実施形態において、ＧＬＰ−１は、野生型ヒトＧＬＰ−１配列である。別の一実施形
態において、配列は、野生型ヒトＧＬＰ−１に対し少なくとも８５％同一、例えば、野生
型ヒトＧＬＰ−１に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００８６】
一実施形態において、ＧＬＰ−２は、野生型ヒトＧＬＰ−２配列である。別の一実施形
態において、配列は、野生型ヒトＧＬＰ−２に対し少なくとも８５％同一、例えば、野生
型ヒトＧＬＰ−２に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００８７】
一実施形態において、アディポネクチンは、野生型ヒトアディポネクチン配列である。
別の一実施形態において、配列は、野生型ヒトアディポネクチンに対し少なくとも８５％
同一、例えば、野生型ヒトアディポネクチンに対し少なくとも９０％、９５％または９９
％同一である。
【００８８】
一実施形態において、レプチンは、野生型ヒトレプチン配列である。別の一実施形態に
おいて、配列は、野生型ヒトレプチンに対し少なくとも８５％同一、例えば、野生型ヒト
レプチンに対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００８９】
一実施形態において、ＩＬ−１０は、野生型ヒトＩＬ−１０配列である。別の一実施形
態において、配列は、野生型ヒトＩＬ−１０に対し少なくとも８５％同一、例えば、野生
型ヒトＩＬ−１０に対し少なくとも９０％、９５％または９９％同一である。
【００９０】
本発明において「単離された」という用語は、その元の環境（それが天然に存在する環
境）から取り出された生物材料（細胞、核酸またはタンパク質）のことを指す。例えば、
植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、そ
れが天然に存在する隣接核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」とみ
なされる。
【００９１】
生物材料に対して適用される「精製された」という用語は、その材料が、他の化合物の
存在を排除して、絶対的純粋さを呈する形で存在することを要求するものではない。そう
ではなくて、この用語は相対的な定義である。
【００９２】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「ポリヌ
クレオチド」は互換的に用いられ、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかにある
、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子
」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デ
オキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合形態
、またはその任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステ
ルなどのことを指す。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡの二本鎖ヘ
リックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語は、分子
の一次構造および二次構造のみのことを指し、それを何らかの特定の三次形態に限定する
ことはない。したがって、この用語は、いくつか例を挙げると、直鎖状または環状ＤＮＡ
分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡおよび染色体において認められ
る二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する際に、本明細書
では配列を、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）に沿って
５’から３’への向きの配列のみを表示するという通常の慣習に従って記載することがあ
る。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子のことである。Ｄ
ＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡ
が非限定的に含まれる。
【００９３】
ポリヌクレオチド配列に対して適用される「断片」という用語は、参照核酸に比して長
さが短く、その共通の部分にわたって、参照核酸と同一なヌクレオチド配列を含むヌクレ
オチド配列のことを指す。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、それを構
成要素とする、より大きいポリヌクレオチドの中に含まれていてもよい。そのような断片
は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５
７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３
５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００、１５００、２０００
、３０００、４０００、５０００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの範囲にわた
る長さのオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【００９４】
本明細書で用いる場合、「単離された核酸断片」とは、合成性、非天然性または改変さ
れたヌクレオチド塩基を任意で含む、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡの重
合体のことを指す。ＤＮＡの重合体の形態にある単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントで構成されてもよい。
【００９５】
「遺伝子」とは、転写のみによって（例えば、生物活性のあるＲＮＡ種）、または転写
および翻訳によって（例えば、ポリペプチド）産生される機能性分子を含む、機能性分子
をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのことを指す。「遺伝子」という用語
は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を範囲に含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前
の調節配列（５’非コード配列）および後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定
のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片のことも指す。「ネイティ
ブ性遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子のことを指す
。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒には見られない調節配列および／またはコード配
列を含む、ネイティブ性遺伝子ではない任意の遺伝子のことを指す。したがって、キメラ
遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが天
然に見出されるものとは異なる様式で並んでいる調節配列およびコード配列を含みうる。
キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコード配列および／または異なる源に由来する調節
配列を含みうる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中でその天然の位置にあるネイテ
ィブ性遺伝子のことを指す。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物中に
通常は見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子のことを指す。外来性
遺伝子には、非ネイティブ性生物に挿入されたネイティブ性遺伝子、またはキメラ遺伝子
が含まれうる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子
のことである。例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）遺伝子はＩＬ−１２タン
パク質をコードする。ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合によって連結されて完全に機能性
のＩＬ−１２ｐ７０を生じる、３５ｋＤサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤサブユニ
ット（ｐ４０）のヘテロ二量体である。ＩＬ−１２遺伝子はｐ３５サブユニットおよびｐ
４０サブユニットの両方をコードする。
【００９６】
「異種ＤＮＡ」とは、細胞内に、または細胞の染色体部位内に天然には位置しないＤＮ
Ａのことを指す。異種ＤＮＡは細胞にとって外来性である遺伝子を含みうる。
【００９７】
「ゲノム」という用語は、染色体、ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスの
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００９８】
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度に関して適切な
条件下で、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子とアニーリングしう
る場合に、そのもう一方の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件は周知であり、Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor(1989)、特にその中の第１１章および表１１．１に例示されている。温度および
イオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定づける。
【００９９】
ストリンジェンシー条件は、遠い関係にある生物由来の相同配列のように中程度の類似
性のある断片から、近い関係にある生物由来のそっくり同じ機能性酵素を産生する遺伝子
のように極めて類似性の高い断片に至るまでをスクリーニングしうるように調節すること
が可能である。相同核酸の予備的スクリーニングのためには、Ｔｍ５５°に対応する低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、
０．２５％乳、およびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．
５％ＳＤＳを用いることができる。中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション
条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣに対応する
。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％
ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣに対応する。
【０１００】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが可能である。「
相補的」という用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述す
るために用いられる。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であ
り、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明はまた、本明細書に
おいて開示または使用される完全な配列に対して、さらにはそれらの実質的に類似した核
酸配列に対して相補的な単離された核酸断片も含む。
【０１０１】
本発明の一実施形態においては、ポリヌクレオチドを、Ｔｍ５５℃でのハイブリダイゼ
ーション段階を含み、上述の条件を用いるハイブリダイゼーション条件を用いることによ
って検出する。他の実施形態において、Ｔｍは６０℃、６３℃または６５℃である。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション後の洗浄もストリンジェンシー条件を決定づける。条件の１つ
のセットでは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温、１５分間で開始し、続いて２×Ｓ
ＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、４５℃、３０分間で繰り返し、続いて０．２×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳ中、５０℃、３０分間を２回繰り返す、一連の洗浄を用いる。ストリンジェント
な条件の１つのセットでは、より高い温度を用い、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で
の最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に高める以外は、洗浄は上記のものと同じ
とする。より高度にストリンジェントな条件の別のセットでは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ中、６５℃で最後の２回の洗浄を用いる。
【０１０３】
さらに、当業者は、本発明の範囲に含まれる実質的に類似した配列が、本明細書におい
て例示した配列とストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、
その上で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
で洗浄）下でハイブリダイズする能力によっても規定されることを認識しているであろう
。本発明の実質的に類似した核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書に報告された核酸断
片のＤＮＡ配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％または９５％同一である核酸断片
である。
【０１０４】
核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において
周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配
列間の類似性および相同性の度合いが大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリ
ッドのためのＴｍの値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高
いＴｍに対応）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低くなる。
長さが１００ヌクレオチドを上回るハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が
導き出されている（Sambrook et al.、前記、9.50-0.51を参照）。より短い核酸、すなわ
ちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要にな
り、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定づける（Sambrook et al.、前記、11.
7-11.8を参照）。
【０１０５】
本発明の一実施形態においては、ポリヌクレオチドを、５００ｍＭ未満の塩中および少
なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション段階、ならびに２×ＳＳＰＥ中、少なくとも
６３℃の温度での洗浄段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによって検出
する。別の一実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーショ
ン段階に関して２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。さらなる実施形態に
おいて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方の段
階に関して２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。
【０１０６】
別の一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレ
オチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくとも約１５
ヌクレオチド；例えば、少なくとも約２０ヌクレオチド；例えば、少なくとも３０ヌクレ
オチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄液の塩濃度を、プローブの長さ
などの要因に応じて適宜調節しうることを理解するであろう。
【０１０７】
「プローブ」という用語は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対合して二本鎖分子を形成
することのできる一本鎖核酸分子のことを指す。
【０１０８】
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃ
ＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズ可能な短鎖核酸のこ
とを指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンなど
の標識を共有結合させたヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチド
は、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチ
ド（その一方または両方が標識されていてもよい）は、核酸の全長もしくは断片をクロー
ニングするため、ＤＮＡシークエンシングのため、または核酸の存在を検出するためのＰ
ＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ分子と
三重らせんを形成させるために用いることもできる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成
により、好ましくは核酸合成装置にて調製する。このため、オリゴヌクレオチドを、チオ
エステル結合などの天然に存在しないホスホエステル類似体結合によって調製することが
できる。
【０１０９】
「プライマー」とは、標的核酸配列とハイブリダイズして、適した条件下でＤＮＡ合成
のための開始点としての役を果たしうる二本鎖核酸領域を作り出すオリゴヌクレオチドの
ことを指す。そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において、またはＤＮＡシ
ークエンシングのために用いることができる。
【０１１０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略記され、特定の核酸配列を酵素的に増幅する
ためのインビトロ法のことを指す。ＰＣＲは一連の温度サイクルの繰り返しを伴い、各サ
イクルは次の３つの段階を含む：標的分子の鎖を分離させるためのテンプレート核酸の変
性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーとテンプレート核酸とのアニーリング、
およびアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長。ＰＣＲは、標的分子の
存在を検出するための手段、および定量的または半定量的な条件下で、核酸の出発プール
内のその標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【０１１１】
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＲＴ−ＰＣＲと略記され、１つまたは複数のＲＮ
Ａ分子から１つまたは複数の標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に生成し、続いて上記の１つまた
は複数の標的ｃＤＮＡ分子内の１つまたは複数の特定の核酸配列を酵素的に増幅するため
のインビトロ法のことを指す。ＲＴ−ＰＣＲはまた、標的分子の存在を検出するための手
段、および定量的または半定量的な条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対
量を決定するための手段も提供する。
【０１１２】
ＤＮＡ「コード配列」または「コード領域」とは、ポリペプチドをコードし、適した調
節配列の制御下に置かれると体外、インビトロまたはインビボで細胞内でポリペプチドに
転写および翻訳されうる二本鎖ＤＮＡ配列のことを指す。「適した調節配列」とは、コー
ド配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、
随伴するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及
ぼすヌクレオチド配列のことを指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、
イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位
およびステム−ループ構造が含まれうる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端にあ
る開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンによって決定される。
コード配列には、原核生物配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、さらには
合成ＤＮＡ配列が非限定的に含まれうる。コード配列が真核生物細胞における発現を意図
したものである場合には、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配
列に対して３’側に位置することになる。
【０１１３】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略記され、ＡＴＧまたはＡＵＧなどの
翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつポリペプチド配列に
翻訳される可能性のある、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである、ある長さの
核酸配列のことを指す。
【０１１４】
「頭−頭（head-to-head）」という用語は、本明細書において、２つのポリヌクレオチ
ド配列の互いに対する向きを記述するために用いられる。２つのポリヌクレオチドは、一
方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の
５’末端に隣接していれば頭−頭の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチ
ドの転写の方向は他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れる方に進行する。「頭−頭
」という用語は、（５’）−（５’）と略記してもよく、また、記号（←→）または（３
’←５’５’→３’）によって表示してもよい。
【０１１５】
「尾−尾」という用語は、本明細書において、２つのポリヌクレオチド配列の互いに対
する向きを記述するために用いられる。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオ
チドのコード鎖の３’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し
ていれば尾−尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドに向かうように進行する。「尾−尾」という用語は、（３’）−
（３’）と略記してもよく、また、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によっ
て表示してもよい。
【０１１６】
「頭−尾」という用語は、本明細書において、２つのポリヌクレオチド配列の互いに対
する向きを記述するために用いられる。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオ
チドのコード鎖の５’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し
ていれば頭−尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドと同じ方向に進行する。「頭−尾」という用語は、（５’）−（
３’）と略記してもよく、また、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって
表示してもよい。
【０１１７】
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド
配列のことを指す。特に、下流ヌクレオチド配列は一般に、転写開始点の後に続く配列に
関係している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
【０１１８】
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド
配列のことを指す。特に、上流ヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写開始点
の５’側に位置する配列に関係している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始
部位の上流に位置する。
【０１１９】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は互換的に用いられ、二本
鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列の内部に結合してそれを切断する酵素のことを指す
。
【０１２０】
「相同組換え」とは、別のＤＮＡ分子への外来ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体への
ベクターの挿入のことを指す。好ましくは、ベクターは、特異的な染色体部位を相同組換
えのための標的とする。特異的な相同組換えのために、ベクターは、ベクターの染色体と
の相補的結合およびその中への組み入れが可能になるように、染色体の配列に対する十分
に長い相同性領域を含むと考えられる。相同性領域がより長く、配列類似性の度合いがよ
り大きいほど、相同組換えの効率を高めることができる。
【０１２１】
当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを
増やすことができる。ひとたび適した宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現
ベクターを増やして、大量に調製することができる。本明細書において記載される通り、
用いうる発現ベクターには、少数であるが例を挙げると、以下のベクターまたはその誘導
体が非限定的に含まれる：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動
物のウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファー
ジベクター（例えば、λ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【０１２２】
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または導入のための任意
の媒体のことを指す。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを結びつけて、結びつけたセグ
メントの複製を生じさせることのできるレプリコンであってもよい。「レプリコン」とは
、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複
製することのできる、任意の遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色
体、ウイルス）のことを指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまた
はインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス性および非ウイルス性媒体の両方を含
む。当技術分野において公知の数多くのベクターを、核酸を操作して、応答エレメントお
よびプロモーターを遺伝子に組み入れるなどのために用いることができる。考えられるベ
クターには、例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくは
ｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどを
含む、プラスミドまたは改変ウイルスが含まれる。本発明において有用なベクターの別の
例は、ＷＯ２００７／０３８２７６号および米国特許第２００４／１８５５５６号に記載
された、ＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔ
ｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，  ＶＡ）である。例えば、応答エレ
メントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の、適したベクター中への挿入は、適切
なＤＮＡ断片を、相補的付着末端を有する選択したベクター中にライゲートすることによ
って達成することができる。または、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾してもよく、また
はヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲートすることによって任意の部位
を作製してもよい。そのようなベクターは、マーカーが細胞ゲノム中に組み入れられた細
胞の選択をもたらす選択マーカー遺伝子を含むように遺伝子操作することができる。その
ようなマーカーは、マーカーを組み入れ、それによってコードされるタンパク質を発現す
る宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【０１２３】
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、さらには生きている動物対
象において多岐にわたる遺伝子送達用途に用いられている。用いうるウイルスベクターに
は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター
、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベク
ター、エプスタイン−バーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイル
スベクターおよびカリモウイルスベクターが非限定的に含まれる。非ウイルス性ベクター
には、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複
合体および生体高分子が含まれる。核酸に加えて、ベクターが、１つもしくは複数の調節
領域、ならびに／または核酸移入の結果（どの組織への導入か、発現の持続時間など）を
選択、測定およびモニターする上で有用な選択マーカーを含んでもよい。
【０１２４】
「プラスミド」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の形態にある、多くの場合は遺伝子を保有している染色体外因子のことを指す。
そのような因子は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子産物のためのプロモ
ーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列とともに細胞に導入することのでき
る独特な構築物として連結されるか組み換えられている、任意の源に由来する、一本鎖ま
たは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖状、環状または超らせん状の、自律複製配列、
ゲノム組込み配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列であってよい。
【０１２５】
「クローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドのように、別の
核酸セグメントを結びつけて、結びつけたセグメントの複製を生じさせることのできる、
連続して複製するある単位長の核酸、好ましくはＤＮＡであって、かつ複製起点を含む、
「レプリコン」のことを指す。クローニングベクターは、１つの細胞種において複製が可
能であって、別のものにおいて発現が可能であってもよい（「シャトルベクター」）。ク
ローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために用いうる１つもしくは複数の
配列、および／または関心対象の配列を挿入するための１つもしくは複数のマルチクロー
ニングサイトを含んでもよい。
【０１２６】
「発現ベクター」という用語は、挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計さ
れたベクター、プラスミドまたは媒体のことを指す。クローニングされた遺伝子、すなわ
ち挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの
制御エレメントの制御下に置かれる。開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細
胞において核酸の発現を駆動するのに有用であり、非常に多く、当業者には知られている
。これらの遺伝子の発現を駆動することのできる事実上あらゆるプロモーターを発現ベク
ター中に用いることができ、これにはウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プ
ロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異
的プロモーター、病原性または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性
プロモーター、光調節性プロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡ
Ｌ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、Ｌ
ＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリ性ホスファターゼプロモーター（サッカロミセス属（
Saccharomyces）における発現のために有用）；ＡＯＸ１プロモーター（ピキア属（Pichi
a）における発現のために有用）；β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ
、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Escherichia coli
）における発現のために有用）；光調節性、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリ
フラワーモザイクウイルス３５Ｓ、最小ＣＭＶ３５Ｓ、キャッサバ葉脈モザイクウイルス
（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース−１，５−二リン酸カ
ルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿
状ウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸
レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパ
ク質およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現のために有用）；ＳＶ４
０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復
配列（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａのプロモータ
ーまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期
プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター
、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１）プロモーター、ホスホ
グリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、ア
ルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写
制御領域、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリ
ンなど）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰな
ど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子型などの）治療用遺伝子
のプロモーター、病原性または疾患関連プロモーター、ならびに、組織特異性を呈し、か
つトランスジェニック動物で利用されているプロモーター、例えば、膵臓腺房細胞におい
て活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓β細胞において活性のあるインスリン
遺伝子制御領域、リンパ細胞において活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、
乳房、リンパ系および肥満細胞において活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域；肝臓に
おいて活性のあるアルブミン遺伝子、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓にお
いて活性のあるα−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓において活性のあるα１−ア
ンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞において活性のあるβ−グロビン遺伝子制御
領域、脳内の乏突起神経膠細胞において活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御
領域、骨格筋において活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部にお
いて活性のあるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモ
ーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α−
アクチンのプロモーターなどを非限定的に含む、当技術分野において公知の動物および哺
乳動物プロモーターが非限定的に含まれる。加えて、これらの発現配列を、エンハンサー
または調節配列などの付加によって修飾してもよい。
【０１２７】
ベクターは、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレク
トロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキスト
ラン法、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用
、またはＤＮＡベクター輸送体などによって、所望の宿主細胞に導入することができる（
例えば、Wu et al., J. Biol Chem. 267:963 (1992)；Wu et al., J. Biol. Chem. 263:1
4621 (1988)；およびHartmut et al.、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照）
。
【０１２８】
本発明のベクターは、筋肉内投与等が挙げられるがこれに限定されない任意の投与経路
により対象に投与することもできる。
【０１２９】
また、本発明によるポリヌクレオチドを、リポフェクションによってインビボで導入す
ることもできる。過去１０年の間に、インビトロでの核酸のカプセル封入およびトランス
フェクションのためのリポソームの使用が増えている。リポソーム媒介トランスフェクシ
ョンに伴う困難および危険を抑えるように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカ
ーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製す
ることができる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987)；Mack
ey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)；およびUlmer et al., Scienc
e 259:1745 (1993)）。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル封入を助長
し、また、負に荷電した細胞膜との融合も助長しうる（Felgner et al., Science 337:38
7 (1989)）。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、ＷＯ９５／１８
８６３号、ＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載され
ている。インビボで外因性遺伝子を特定の臓器に導入するためのリポフェクションの使用
には、いくつかの実用的な利点がある。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティング
は、恩恵のある１つの領域である。トランスフェクションを特定の細胞種に向かわせるこ
とが、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞不均質性のある組織において特に好ましい
と考えられることは明らかである。脂質をターゲティングの目的で他の分子に化学的にカ
ップリングさせてもよい（Mackey et al. 1988、前記）。標的指向性ペプチド、例えばホ
ルモンもしくは神経伝達物質など、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド性分
子を、リポソームに化学的にカップリングさせることが可能と考えられる。
【０１３０】
カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク
質由来のペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオン性重合体（例え
ば、ＷＯ９５／２１９３１号）などの他の分子も、インビボでの核酸のトランスフェクシ
ョンを助長するために有用である。
【０１３１】
ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入することも可能である（米国特
許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号を参
照）。受容体を介したＤＮＡ送達アプローチを用いることもできる（Curiel et al., Hum
. Gene Ther. 3:147 (1992)；およびWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)）。
【０１３２】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性または異種性のＲＮＡまた
はＤＮＡの取り込みのことを指す。外因性または異種性のＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の内
側に導入された場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクト
」されている。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場
合、細胞は外因性または異種性のＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。
形質転換用のＲＮＡまたはＤＮＡは染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合されて）、細
胞のゲノムを構成することができる。
【０１３３】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片
の移入のことを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック
」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【０１３４】
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅または発現
が求められる細胞宿主における複製のための１つまたは複数の起点、マーカーまたは選択
マーカーを含んでもよい。
【０１３５】
「選択マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐
性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択するこ
とのできる識別用因子、通常は抗生物質耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子のことを指
し、この効果を利用して、関心対象の核酸の遺伝を追跡し、かつ／または関心対象の核酸
を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定する。当技術分野において公知であり
、用いられる選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなど
に対する耐性を与える遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち
、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる
。
【０１３６】
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定すること
ができる識別用因子をコードする核酸のことを指し、この効果を利用して、関心対象の核
酸の遺伝を追跡し、関心対象の核酸を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定し
、かつ／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定する。当技術分野において公知であ
り、用いられるレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガ
ラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが含まれる。選択マ
ーカー遺伝子をレポーター遺伝子とみなすこともできる。
【０１３７】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に用いられ、コード配列または
機能性ＲＮＡの発現を制御することのできるＤＮＡ配列のことを指す。一般に、コード配
列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ性遺
伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエ
レメントで構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当
業者であれば、異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または発生
の異なる段階において、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の
発現を導くことを理解するであろう。遺伝子をほとんどの細胞種においてほとんどの時点
で発現させるプロモーターは、一般的には「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を
特定の細胞種において発現させるプロモーターは、一般的には「細胞特異的プロモーター
」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の
段階で発現させるプロモーターは、一般的には「発生特異的プロモーター」または「細胞
分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用物質、生体分子、化
学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導され、遺伝子を発現さ
せるプロモーターは、一般的には「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」
と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に明確には規定され
ないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることも認識され
ている。
【０１３８】
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、本明細書に開示されたプ
ロモーターを含む。一実施形態において、プロモーターは、本明細書において表１に列記
されたプロモーターである。
【０１３９】
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、組織特異的プロモーター
を含む。一実施形態において、組織特異的プロモーターは、本明細書に開示された組織特
異的プロモーターである。別の一実施形態において、組織特異的プロモーターは、本明細
書において表２に列記された組織特異的プロモーターである。
【０１４０】
プロモーター配列は、典型的には、その３’末端では転写開始部位を境界とし、上流（
５’方向）に、バックグラウンドを超える検出可能なレベルでの転写を開始させるのに必
要な最少数の塩基またはエレメントを含むように伸びる。プロモーター配列の内部には、
転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって規定することが好
都合である）のほか、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセ
ンサス配列）も存在する。
【０１４１】
「治療用スイッチプロモーター」（「ＴＳＰ」）とは、遺伝子スイッチ構成要素の発現
を制御するプロモーターのことを指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入
れられる米国特許出願公開第２００９／００９８０５５号明細書を参照されたい。遺伝子
スイッチおよびそれらの様々な成分は、本明細書における他の箇所に詳細に記載されてい
る。ある実施形態において、ＴＳＰは構成的であり、すなわち、継続的に活性がある。構
成的ＴＳＰは、構成的−遍在性（すなわち、いかなる組織または細胞においても、別の因
子もレギュレーターも必要とせずに、全般的に機能する）、または構成的−組織もしくは
細胞特異的（すなわち、特定の組織型または細胞種において、別の因子もレギュレーター
も必要とせずに、全般的に機能する）のいずれであってもよい。ある実施形態において、
本発明のＴＳＰは、疾患、障害または病状に付随する条件下で活性化される。２つまたは
それ以上のＴＳＰがかかわる本発明のある実施形態において、プロモーターは構成的プロ
モーターおよび活性化しうるプロモーターの組合せであってよい。本明細書で用いる場合
、「疾患、障害または病状に付随する条件下で活性化されるプロモーター」には、疾患特
異的プロモーター、特定の生理的、発生的、分化的または病的条件に応答するプロモータ
ー、特異的な生体分子に応答するプロモーター、および疾患、障害または病状に付随する
特定の組織型または細胞種、例えば、腫瘍組織または悪性細胞に特異的なプロモーターが
非限定的に含まれる。ＴＳＰは、天然に存在するプロモーターの配列、天然に存在するプ
ロモーターに由来する改変配列、または合成配列（例えば、プロモーターの応答性を変更
するための、最小プロモーター配列中への応答エレメントの挿入）を含みうる。
【０１４２】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、続いてそれがト
ランス−ＲＮＡスプライシングされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列
によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞内で転写制御配列および翻訳制
御配列の「制御下」にある。
【０１４３】
「転写制御配列および翻訳制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の発現をもた
らす、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列のことを指す
。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【０１４４】
「応答エレメント」という用語は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を通じ
て媒介される、プロモーターに対する応答性を付与する１つまたは複数のシス作用性ＤＮ
Ａエレメントのことを指す。このＤＮＡエレメントは、その配列がパリンドローム性（完
全または不完全）であるか、または様々な数のヌクレオチドによって隔てられた配列モチ
ーフもしくはハーフサイト（halfsite）で構成されるかのいずれかであってよい。ハーフ
サイトは類似または同一であってよく、直列反復配列もしくは逆方向反復配列のいずれか
として、または単一のハーフサイトもしくは縦列に隣接するハーフサイトの多量体として
配列されうる。応答エレメントは、この応答エレメントが組み入れられる細胞または生物
の性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含んでもよい。転写因子
のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのＤＮＡ
配列と結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始させるかまた
は抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントのＤＮＡ配列の例には、ＲＲＧＧ／
ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（配列番号１）（Cherbas et. al., Genes Dev. 5:120 (1
991)を参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（配列番号２）、式中、Ｎ（ｎ）は１
つまたは複数のスペーサーヌクレオチドでありうる（D'Avino et al., Mol. Cell. Endoc
rinol. 113:1 (1995)を参照）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（配列番号３）
（Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)を参照）が含まれる。
【０１４５】
「機能的に連結された」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるよう
な、１つの核酸断片上の核酸配列の連係のことを指す。例えば、プロモーターは、コード
配列の発現に影響を及ぼしうる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあ
る）場合、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結している。コード配列は、セン
スまたはアンチセンスの向きに、調節配列と機能的に連結させることができる。
【０１４６】
「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、核酸またはポリヌクレオチドに由来す
るセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積のことを
指す。発現が、ｍＲＮＡのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳のことを指すこともあ
る。
【０１４７】
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の
制限部位に、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することの
できるＤＮＡのセグメントのことを指す。ＤＮＡのセグメントは、関心対象のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳の
ための正しいリーディングフレームでのカセットの挿入を確実とするように設計される。
「形質転換カセット」とは、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を助長するエレメントを有す
る特定のベクターのことを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット
および形質転換カセットは、宿主細胞における関心対象のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドの発現強化を可能とするエレメントも含みうる。これらのエレメントには、
プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列
、ポリアデニル化配列が非限定的に含まれうる。
【０１４８】
本発明において、「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと連係している応答
エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが組み入れられた遺伝子の発現を１つ
または複数のリガンドの存在下でモジュレートするリガンド依存性転写因子に基づく系と
の組合せのことを指す。「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」という用語は
、プロモーターと連係している応答エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが
組み入れられた遺伝子の発現を１つまたは複数のリガンドの存在下でモジュレートするリ
ガンド依存性転写因子に基づく系をコードするポリヌクレオチドとの組合せのことを指す
。
【０１４９】
本発明の治療用スイッチプロモーターは、特定の疾患、障害または病状を治療するため
、改善するため、または予防するために有用な任意のプロモーターであってよい。その例
には、特定の疾患、障害または病状の際にのみ発現増大を呈する遺伝子のプロモーター、
および特定の細胞条件（例えば、増殖、アポトーシス、ｐＨの変化、酸化状態、酸素レベ
ル）下で発現増大を呈する遺伝子のプロモーターが非限定的に含まれる。遺伝子スイッチ
が複数の転写因子配列を含むいくつかの実施形態においては、疾患特異的または病状特異
的プロモーターと、治療用産物が発現される組織を限定する組織型特異的または細胞種特
異的プロモーターとを組み合わせることにより、治療方法の特異性を高めることができる
。したがって、組織特異的または細胞種特異的プロモーターは、治療用スイッチプロモー
ターの定義の範囲に含まれる。
【０１５０】
疾患特異的プロモーターの例として、癌を治療するために有用なプロモーターには、貧
血を治療するためのプロモーターを含む、癌遺伝子のプロモーターが含まれる。癌遺伝子
のクラスの例には、増殖因子、増殖因子受容体、プロテインキナーゼ、プログラム細胞死
レギュレーターおよび転写因子が非限定的に含まれる。癌遺伝子の具体的な例には、ｓｉ
ｓ、ｅｒｂ  Ｂ、ｅｒｂ  Ｂ−２、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｙｃおよびｂｃｌ−２およびＴＥ
ＲＴが非限定的に含まれる。他の癌関連遺伝子の例には、新生物細胞において過剰発現さ
れる腫瘍関連抗原遺伝子および他の遺伝子（例えば、ＭＡＧＥ−１、癌胎児性抗原、チロ
シナーゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、
ＭＵＣ−４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｔ／Ｔｎ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＧＭ２、Ｔｎ
、ｓＴｎおよびトンプソン・フリーデンライヒ（Thompson-Friedenreich）抗原（ＴＦ）
）が含まれる。
【０１５１】
当技術分野において公知であり、本発明における治療用スイッチプロモーターとして有
用なプロモーター配列および他の調節エレメント（例えば、エンハンサー）の例は、表１
および２に列記された参考文献中に、各プロモーターと関連のある疾患／障害（表１）ま
たは組織特異性（表２）とともに開示されている。これらの表に引用されている米国特許
および米国特許出願公開に開示されているプロモーター配列ならびにこれらに開示されて
いる配列は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１５２】
表１に列挙するタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、治療用プロモ
ーターではないプロモーターを備える本発明のベクターを用いて発現することもできる。
【０１５３】
【表１−１】
2017141245.tif 000002
【表１−２】
2017141245.tif 000003
【０１５４】
【表２−１】
2017141245.tif 000004
【表２−２】
2017141245.tif 000005
【０１５５】
特定の疾患または障害の際に発現レベルの変化を呈し、それ故に本発明において有用な
プロモーターをもたらす可能性のある他の遺伝子には、表３に（関連のある疾患／障害と
ともに）列記された遺伝子が非限定的に含まれる。
【０１５６】
【表３−１】
2017141245.tif 000006
【表３−２】
2017141245.tif 000007
【表３−３】
2017141245.tif 000008
【表３−４】
2017141245.tif 000009
【表３−５】
2017141245.tif 000010
【表３−６】
2017141245.tif 000011
【表３−７】
2017141245.tif 000012
【０１５７】
疾患、障害または病状の際に発現パターンがモジュレートされる遺伝子がひとたび同定
されれば、その遺伝子のプロモーターは本発明の遺伝子スイッチに用いうる可能性がある
。プロモーター領域を含む、多くの遺伝子の配列が当技術分野において公知であり、公開
データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能である。このため、ひとたび適切な遺
伝子が同定されれば、そのプロモーター配列を容易に同定して入手することができる。本
発明の別の態様は、そのプロモーターを単離して遺伝子スイッチ中に配置することのでき
る、適した遺伝子を同定することを対象とする。したがって、プロモーターを単離して、
その後の状況または環境において用いることができる限り、遺伝子の実体は、本発明の具
体的な実施形態において特に重要ではないと考えられる。本発明はこのため、まだ同定さ
れていない遺伝子に由来するプロモーターの使用も含む。ひとたび適した遺伝子が同定さ
れれば、プロモーター機能のために必要な遺伝子配列を決定することは、当技術分野の定
型的な技能または実験に属する事柄である。実際に、関心対象の遺伝子のプロモーター領
域の決定の助けになる、いくつかの商業的プロトコールが存在する。例を挙げると、Ｄｉ
ｎｇらは最近、ヒトＳｐｒｏｕｔｙ４遺伝子の５’隣接配列を漸進的に欠失させることに
より、新規Ｓｐｒｏｕｔｙ４遺伝子のプロモーター配列を解明した（Am. J. Physiol. Lu
ng Cell. Mol. Physiol. 287:L52 (2004)、これは参照により組み入れられる）。手短に
述べると、ひとたび転写開始部位が決定されたところで、一般的なＰＣＲプライマーを用
いてＰＣＲ断片を生成させて、５’隣接セグメントのセグメントを一方向様式でクローニ
ングした。生成されたセグメントをルシフェラーゼレポーターベクター中にクローニング
して、ルシフェラーゼ活性を測定することで、ヒトＳｐｒｏｕｔｙ４遺伝子のプロモータ
ー領域が決定された。
【０１５８】
遺伝子プロモーターの取得および検証のためのプロトコールの別の例は、以下の段階を
含む：（１）組織型が同様／同一である罹患性および非罹患性の細胞／組織試料を取得す
る段階；（２）試料から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する段階；（３）罹患性および非
罹患性ＲＮＡの示差的マイクロアレイ分析を行う段階；（４）疾患特異的転写物の候補を
同定する段階；（５）疾患特異的転写物と関連のあるゲノム配列を同定する段階；（６）
疾患特異的転写物の転写開始部位と予想される部位の上流および下流にあるＤＮＡ配列を
取得または合成する段階；（７）段階６による種々の長さのＤＮＡを用いてプロモーター
レポーターベクターを設計および作製する段階；ならびに（８）罹患性および非罹患性の
細胞／組織、さらには無関係な細胞／組織において、プロモーターレポーターベクターを
試験する段階。
【０１５９】
遺伝子スイッチ中に挿入されるプロモーターの源は天然性でも合成性でもよく、プロモ
ーターの源が本明細書に記載される本発明の範囲を限定すべきではない。換言すれば、プ
ロモーターを細胞から直接クローニングしてもよく、またはプロモーターが異なる源から
以前にクローニングされていてもよく、またはプロモーターを合成してもよい。
【０１６０】
別の一実施形態において、表１〜３において参照される遺伝子産物のいずれかをコード
するポリヌクレオチドは、治療用途および診断目的のために、本発明のベクターおよび方
法において用いることができる。
【０１６１】
遺伝子スイッチシステム
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任意
の遺伝子スイッチシステムでありうる。一実施形態において、遺伝子スイッチは、遺伝子
発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の遺
伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子複合体の例には、それぞれのリガンド
（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン
、ならびにその類似体および模倣物）によって活性化される核内受容体スーパーファミリ
ーのメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが非限定的に含ま
れる。本発明の１つの態様において、遺伝子スイッチはＥｃＲに基づく遺伝子スイッチで
ある。そのようなシステムの例には、米国特許第６，２５８，６０３号、第７，０４５，
３１５号、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号、第２００７／０１６１０８
６号、およびＷＯ０１／７０８１６号に記載されたシステムが非限定的に含まれる。キメ
ラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号、米国特許出願公
開第２００２／０１１０８６１号、第２００４／００３３６００号、第２００４／００９
６９４２号、第２００５／０２６６４５７号、および第２００６／０１００４１６号、な
らびにＷＯ０１／７０８１６号、第０２／０６６６１２号、第０２／０６６６１３号、第
０２／０６６６１４号、第０２／０６６６１５号、第０２／２９０７５号、および第２０
０５／１０８６１７号に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により組み入
れられる。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの一例は、ＲｈｅｏＳｗｉ
ｔｃｈ（登録商標）ＭａｍｍａｌｉａｎＩｎｄｕｃｉｂｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓ
ｔｅｍ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）である。本発明
の別の態様において、遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と、ラ
パマイシンまたはその非免疫抑制性類似体を通じて調節されるＦＫＢＰラパマイシン関連
タンパク質（ＦＲＡＰ）とのヘテロ二量体化に基づく。そのようなシステムの例には、Ａ
ＲＧＥＮＴ（登録商標）ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＩ
ＡＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ならびに米国特許
第６，０１５，７０９号、第６，１１７，６８０号、第６，４７９，６５３号、第６，１
８７，７５７号および第６，６４９，５９５号に記載されたシステムが非限定的に含まれ
る。
【０１６２】
一実施形態において、遺伝子スイッチは、治療用スイッチプロモーターの制御下にある
リガンド依存性転写因子複合体をコードする単一の転写因子配列を含む。転写因子配列は
、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体であるリガンド依存性
転写因子複合体をコードしてよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によっ
て、または複数の異なる転写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の
天然配列が改変されたもののことである。一実施形態において、転写因子はグループＨ核
内受容体リガンド結合ドメインを含む。一実施形態において、グループＨ核内受容体リガ
ンド結合ドメインは、エクジソン受容体、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体
１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、レチノイドＸ受容体
相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイド
ホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α
（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（Ｒ
ＩＰ−１４）またはファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）からのものである。別の一実施
形態において、グループＨ核内受容体ＬＢＤはエクジソン受容体からのものである。
【０１６３】
Ａ．エクジソンに基づく遺伝子スイッチ
ＥｃＲおよび他のグループＨ核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであ
り、これはそのすべてのメンバーが、任意でヘテロ二量体化パートナー（ＨＰ）と融合し
てコアクチベーションタンパク質（ＣＡＰ）を形成するアミノ末端トランス活性化ドメイ
ン（ＡＤ、「ＴＡ」または「ＴＤ」とも互換的に呼ばれる）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ
Ｄ）、およびヒンジ領域を介してＤＢＤと融合してリガンド依存性転写因子（ＬＴＦ）を
形成するＬＢＤの存在によって一般に特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ
結合ドメイン」という用語は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するよ
うに機能する限り、最長でＤＮＡ結合タンパク質の全長までの、ＤＮＡ結合タンパク質の
最小のポリペプチド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、以下の４
つまたは５つのドメインの存在によっても特徴付けられる：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および
いくつかのメンバーではＦ（米国特許第４，９８１，７８４号およびEvans, Science 240
:889 (1988)を参照）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」
はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ド
メインに対応する。このファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤの
カルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
【０１６４】
以下のポリペプチド配列は、エクジソン受容体（エクジステロイド受容体）（２０−ヒ
ドロキシ−エクジソン受容体）（２０Ｅ受容体）（ＥｃＲＨ）（核内受容体サブファミリ
ー１グループＨメンバー１）のポリペプチド配列として報告されており、Ｇｅｎｂａｎｋ
ではアクセッション番号Ｐ３４０２１を有する。
【０１６５】
キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）由来のエクジソン受容体（８７８ａａ）
（配列番号５）
1 mkrrwsnngg fmrlpeesss evtsssnglv lpsgvnmsps sldshdycdq dlwlcgnesg
61 sfggsnghgl sqqqqsvitl amhgcsstlp aqttiiping nangnggstn gqyvpgatnl
121 galangmlng gfngmqqqiq nghglinstt pstpttplhl qqnlggaggg giggmgilhh
181 angtpnglig vvgggggvgl gvggggvggl gmqhtprsds vnsissgrdd lspssslngy
241 sanescdakk skkgpaprvq eelclvcgdr asgyhynalt cegckgffrr svtksavycc
301 kfgracemdm ymrrkcqecr lkkclavgmr pecvvpenqc amkrrekkaq kekdkmttsp
361 ssqhggngsl asgggqdfvk keildlmtce ppqhatipll pdeilakcqa rnipsltynq
421 laviykliwy qdgyeqpsee dlrrimsqpd enesqtdvsf rhiteitilt vqlivefakg
481 lpaftkipqe dqitllkacs sevmmlrmar rydhssdsif fannrsytrd sykmagmadn
541 iedllhfcrq mfsmkvdnve yalltaivif sdrpglekaq lveaiqsyyi dtlriyilnr
601 hcgdsmslvf yakllsilte lrtlgnqnae mcfslklknr klpkfleeiw dvhaippsvq
661 shlqitqeen erleraermr asvggaitag idcdsastsa aaaaaqhqpq pqpqpqpssl
721 tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta
781 pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv
841 smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta
【０１６６】
一実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、無脊椎動物エクジソ
ン受容体リガンド結合ドメイン、節足動物エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、鱗翅
目（Lepidopteran）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、双翅類（Dipteran）エクジ
ソン受容体リガンド結合ドメイン、直翅類（Orthopteran）エクジソン受容体リガンド結
合ドメイン、同翅類（Homopteran）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、半翅類（He
mipteran）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、トウヒノシントメハマキ（spruce b
udworm）、コリストネウラ・フミフェラナＥｃＲエクジソン受容体リガンド結合ドメイン
、甲虫、チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）エクジソン受容体リガンド
結合ドメイン、タバコスズメガ（Manduca sexta）エクジソン受容体リガンド結合ドメイ
ン、ヘリオシス・ビレセンス（Heliothies virescens）エクジソン受容体リガンド結合ド
メイン、小昆虫、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）エクジソン受容体リガ
ンド結合ドメイン、カイコガ、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）エクジソン受容体リ
ガンド結合ドメイン、スクインティングブッシュブラウン（squinting bush brown）、ビ
サイクルス・アニナナ（Bicyclus anynana）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、バ
ックアイ（buckeye）アメリカタテハモドキ（Junonia coenia）エクジソン受容体リガン
ド結合ドメイン、ミバエ（fruit fly）、キイロショウジョウバエエクジソン受容体リガ
ンド結合ドメイン、蚊、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）エクジソン受容体リガンド結
合ドメイン、ホホアカクロバエ（blowfly）、ルシリア・カプリナ（Lucilia capitata）
エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、ホホアカクロバエ、ルシリア・クプリナ（Luci
lia cuprina）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、ホホアカクロバエ、カリホラ・
ビシナ（Calliphora vicinia）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、チチュウカイミ
バエ、セラティティス・キャピタータ（Ceratitis capitata）エクジソン受容体リガンド
結合ドメイン、バッタ、トノサマバッタ（Locusta migratoria）エクジソン受容体リガン
ド結合ドメイン、アブラムシ、モモアカアブラムシ（Myzus persicae）エクジソン受容体
リガンド結合ドメイン、シオマネキ（fiddler crab）、セルカ・プギレーター（Celuca p
ugilator）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、マダニ、アンブリオマ・アメリカナ
ム（Amblyomma americanum）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、コナジラミ類（wh
itefly）シルバーリーフコナジラミ（Bamecia argentifoli）エクジソン受容体リガンド
結合ドメインおよびヨコバイ、ツマグロヨコバイ（Nephotetix cincticeps）エクジソン
受容体リガンド結合ドメインからなる群から選択される。
【０１６７】
別の一実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、コリストネウラ
・フミフェラナ（Christoneura fumiferana）エクジソン受容体リガンド結合ドメインで
あり、そのアミノ酸配列は、配列番号１に表記されている。
【０１６８】
別の一実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは、コリストネウラ
・フミフェラナエクジソン受容体リガンド結合ドメインのインビトロにおけるコリストネ
ウラ・フミフェラナエクジソン受容体リガンド結合活性の少なくとも８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を保持する、コリストネ
ウラ・フミフェラナエクジソン受容体リガンド結合ドメインの類似体である。インビトロ
におけるエクジソン受容体リガンド結合アッセイは、当業者によく知られている。例えば
、国際公開第０２／０６６６１２号パンフレットを参照されたい。
【０１６９】
別の一実施形態において、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン類似体は、国際公開
第０２／０６６６１２号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／０１００４１６号
明細書、国際公開第０５／１０８６１７号および第２００５／０２６６４５７号パンフレ
ットに開示されているエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。別の一実施形態に
おいて、エクジソン受容体リガンド結合ドメイン類似体は、配列番号７のＶ１０７Ｉ／Ｙ
１２７Ｅ置換変異体である。
【０１７０】
ＤＢＤは、応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボ
ックスおよびＤ−ボックスが間にある２つのシステインジンクフィンガーの存在によって
特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパ
ク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。ＥｃＲは、核内受容体ファミ
リーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う、あまり詳細には解明されていな
い領域も有する。核内受容体のドメインはモジュール的な性質であるため、ＬＢＤ、ＤＢ
ＤおよびＡＤを入れ替えてもよい。
【０１７１】
別の一実施形態において、転写因子は、ＡＤ、その発現をモジュレートしようとする治
療用タンパク質または治療用ポリヌクレオチドと連係している応答エレメントを認識する
ＤＢＤ；およびグループＨ核内受容体ＬＢＤを含む。ある実施形態において、グループＨ
核内受容体ＬＢＤは置換突然変異を含む。
【０１７２】
ＤＮＡ結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ結合ドメインまたはその類似体、組合
せもしくは修飾等、公知の応答エレメントを有するいずれかのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ
Ｄ）となりうる。一実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ、Ｌｅ
ｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、グループＨ核内受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／甲
状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、Ｅ
ｃＲ  ＤＢＤ、ＧＡＬ４  ＤＢＤおよびＬｅｘＡ  ＤＢＤからなる群から選択される。
【０１７３】
トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と省略）は、いかなるグループＨ核
内受容体メンバーＡＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体ＡＤ、合成もしくはキメ
ラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性もしくは酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ＡＤ、ＧＡＬ
４  ＡＤ、ＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ
）、ｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）またはそれらの類似体、組合せもしく
は修飾であってもよい。
【０１７４】
別の一実施形態において、遺伝子スイッチは、第１の治療用スイッチプロモーター（Ｔ
ＳＰ−１）の制御下にある第１の転写因子配列、例えばＣＡＰ、および第２の治療用スイ
ッチプロモーター（ＴＳＰ−２）の制御下にある第２の転写因子配列、例えばＬＴＦを含
み、前記第１の転写因子配列によってコードされるタンパク質と前記第２の転写因子配列
によってコードされるタンパク質とが相互作用してタンパク質複合体（ＬＤＴＦＣ）を形
成するが、すなわちこれは「二重スイッチ」または「ツーハイブリッド」に基づく遺伝子
スイッチである。第１および第２のＴＳＰは同じでも異なってもよい。この実施形態にお
いては、遺伝子スイッチ中に治療用分子の発現のために必要な２つの異なるＴＳＰが存在
するため、治療方法の特異性が高まる（ＷＯ２０１１／１１９７７３の図２参照）。ＷＯ
２０１１／１１９７７３の図２はまた、適切なＴＳＰを単に挿入することのみにより、任
意の疾患、障害または病状を治療するために治療用遺伝子スイッチを改変しうることも示
している。
【０１７５】
さらなる実施形態において、第１および第２の転写因子配列、例えばＣＡＰまたはＬＴ
Ｆは、単一の治療用スイッチプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１１９７７３の図１
中のＴＳＰ−１）の制御下にある。このプロモーターの活性化は、単一のオープンリーデ
ィングフレームの下でＣＡＰおよびＬＴＦの両方を生成させると考えられる。これは、Ｉ
ＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）などの転写リンカーの使用によって達成することが
できる。この実施形態においては、リガンド依存性転写因子複合体の両方の部分がＴＳＰ
−１の活性化に応じて合成される。ＴＳＰ−１は構成的プロモーターであってもよく、ま
たは疾患、障害もしくは病状と関連のある条件下のみにおいて活性化されてもよい。
【０１７６】
さらなる実施形態において、一方の転写因子配列、例えばＬＴＦは、疾患、障害または
病状と関連のある条件下のみにおいて活性化される治療用スイッチプロモーターの制御下
にあり（例えば、ＷＯ２０１１／１１９７７３における図４中のＴＳＰ−２またはＴＳＰ
−３）、もう一方の転写因子配列、例えばＣＡＰは、構成的治療用スイッチプロモーター
（例えば、ＷＯ２０１１／１１９７７３における図４中のＴＳＰ−１）の制御下にある。
この実施形態において、リガンド依存性転写因子複合体の１つの部分は構成的に存在し、
一方、第２の部分は疾患、障害または病状と関連のある条件下でのみ合成されると考えら
れる。
【０１７７】
別の一実施形態において、一方の転写因子配列、例えばＣＡＰは、第１のＴＳＰ（例え
ば、ＷＯ２０１１／１１９７７３における図３中のＴＳＰ−１）の制御下にあり、２つま
たはそれ以上の異なる第２の転写因子配列は、例えばＬＴＦ−１およびＬＴＦ−２は異な
るＴＳＰ（例えば、ＷＯ２０１１／１１９７７３における図３中のＴＳＰ−２およびＴＳ
Ｐ−３）の制御下にある。この実施形態において、ＬＴＦのそれぞれは、異なる因子調節
性プロモーター配列を認識する異なるＤＢＤを有してよい（例えば、ＤＢＤ−Ａは因子調
節性プロモーター−１（ＦＲＰ−１）と連係している応答エレメントと結合し、ＤＢＤ−
Ｂは因子調節性プロモーター−２（ＦＲＰ−２）と連係している応答エレメントと結合す
る。因子調節性プロモーターのそれぞれが異なる治療用遺伝子と機能的に連結されていて
もよい。この様式では、複数の治療を同時に提供することができる。
【０１７８】
一実施形態において、第１の転写因子配列は、ＡＤ、その発現をモジュレートしようと
する治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびグループＨ
核内受容体ＬＢＤを含むポリペプチドをコードし、第２の転写因子配列は、脊椎動物レチ
ノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクル（ultraspiracle）
タンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲおよびＵＳＰから選択
される少なくとも２つの異なる核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含む
キメラ核内受容体から選択される核内受容体ＬＢＤを含む転写因子をコードする（ＷＯ０
１／７０８１６Ａ２号およびＵＳ２００４／００９６９４２Ａ１号を参照）。「パートナ
ー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然変異、置換突然変異ま
たは別の修飾をさらに含んでもよい。
【０１７９】
別の一実施形態において、遺伝子スイッチは、核内受容体ＬＢＤおよびその発現をモジ
ュレートしようとする治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するＤＢＤを
含む第１のポリペプチドをコードする第１の転写因子配列、ならびにＡＤおよび核内受容
体ＬＢＤを含む第２のポリペプチドをコードする第２の転写因子配列を含み、ここで核内
受容体ＬＢＤの１つはグループＨ核内受容体ＬＢＤである。一実施形態において、第１の
ポリペプチドはＡＤを実質的に含まず、第２のポリペプチドはＤＢＤを実質的に含まない
。本発明において、「実質的に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性
を提供するのに十分な当該ドメインの配列を含まないことを意味する。
【０１８０】
本発明の別の態様において、第１の転写因子配列はヘテロ二量体化パートナーおよびＡ
Ｄを含むタンパク質（「ＣＡＰ」）をコードし、第２の転写因子配列はＤＢＤおよびＬＢ
Ｄを含むタンパク質（「ＬＴＦ」）をコードする。
【０１８１】
一方の核内受容体ＬＢＤだけがグループＨ  ＬＢＤである場合、もう一方の核内受容体
ＬＢＤは、グループＨ  ＬＢＤと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであ
ってよい。例えば、グループＨ核内受容体ＬＢＤがＥｃＲ  ＬＢＤである場合、もう一方
の核内受容体ＬＢＤ「パートナー」は、ＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、ウ
ルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲおよ
びＵＳＰから選択される少なくとも２つの異なる核内受容体ＬＢＤポリペプチド断片を含
むキメラ核内受容体からのものであってよい（ＷＯ０１／７０８１６Ａ２号、国際特許出
願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５号、米国特許第２００４／００９６９４２Ａ１号およ
び米国特許第７，５３１，３２６号を参照）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ド
メインは、短縮突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、または別の修飾をさらに含んで
もよい。
【０１８２】
一実施形態において、脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤは、ヒト（ヒト、Homo sapiens）、マウ
ス（ハツカネズミ、Mus musculus）、ラット（ドブネズミ、Rattus norvegicus）、ニワ
トリ（チャボ、Gallus gallus）、ブタ（ブタ、Sus scrofa domestica）、カエル（アフ
リカツメガエル、Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ、Danio rerio）
、ホヤ（ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（ミツデリ
ッポウクラゲ、Tripedalia cysophora）のＲＸＲからのものである。
【０１８３】
一実施形態において、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（ト
ノサマバッタ、Locusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」
）、マダニ（アムブリオンマ−アメリカヌム、Amblyomma americanum）ＲＸＲホモログ１
（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ（アムブリオンマ−アメリカヌム）ＲＸＲホモログ２（
「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ（セルカ−プギレーター、Celuca pugilator）ＲＸＲ
ホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、カブトムシ（チャイロコメノゴミムシダマシ、Tenebrio m
olitor）ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（ヨーロッパミツバチ、Apis mel
lifera）ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ（モモアカアブラムシ、Myzus 
persicae）ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅目（non-Dipteran）／非鱗
翅目（non-Lepidopteran）ＲＸＲホモログからのものである。
【０１８４】
一実施形態において、キメラＲＸＲ  ＬＢＤは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、
無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホ
モログポリペプチド断片から選択される、少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本
発明に用いるためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種の
ＲＸＲポリペプチド断片を含んでよく、または種が同一である場合、２つまたはそれ以上
の複数のポリペプチド断片はその種のＲＸＲポリペプチド断片の２つまたはそれ以上の異
なるアイソフォームからのものであってよい。このようなキメラＲＸＲ  ＬＢＤは、例え
ば、国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレットに開示されている。
【０１８５】
一実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動
物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含む。
【０１８６】
別の一実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊
椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホ
モログポリペプチド断片を含む。
【０１８７】
リガンドは、核内受容体のＬＢＤと組み合わされると、続いてそれが治療用産物配列と
連係しているＦＲＰの応答エレメントと結合することで、治療用産物配列の発現の外部か
らの時間的調節をもたらす。結合の機序、または本発明の様々な構成要素が互いに結合す
る順序、すなわち、例えばリガンドからＬＢＤに、ＤＢＤから応答エレメントに、ＡＤか
らプロモーターに、といったことは特に重要ではない。
【０１８８】
１つの具体的な例において、グループＨ核内受容体のＬＢＤおよびその核内受容体ＬＢ
Ｄパートナーに対するリガンドの結合は、治療用産物配列の発現を可能にする。この機序
は、グループＨ核内受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーに対するリガンド結合、お
よびその結果生じる活性ホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナ
ー＋パートナー）の形成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメイン
の１つまたは複数を変更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハ
イブリッド遺伝子およびその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞ま
たは生物において、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメ
ントの認識に関して最適化されるように、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびＡＤという３つのドメイ
ンのうち１つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。
加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Sadowski et al., N
ature 335:563 (1988)を参照）もしくは大腸菌（Escherichia coli）由来のＬｅｘＡタン
パク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ド
メインに対する応答エレメント、またはそのような特異的相互作用のために設計、修飾お
よび選択されたタンパク質との標的指向性相互作用に対して特異的な合成応答エレメント
（例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照）で修飾ま
たは置換して、ハイブリッド受容体に適応させることもできる。ツーハイブリッドシステ
ムの別の利点は、それらが、所望の最終結果に即した遺伝子発現を駆動するために用いら
れるプロモーターの選択を可能にすることである。そのような二重制御は、発現のタイミ
ングならびに発現が起こる細胞の両方を制御しうるため、遺伝子治療の領域において、特
に細胞傷害性タンパク質が産生される場合に、特に重要であると考えられる。適したプロ
モーターに連結された遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明
のシステムの存在によって制御される。プロモーターは、構成的であっても誘導的に調節
されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみで発現される）であっ
てもその生物のある特定の発生段階に対して特異的であってもよい。
【０１８９】
第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存
在下で応答エレメントのＤＮＡ配列と結合して、この応答エレメントの調節下で、下流遺
伝子の転写を開始させるかまたは抑制する。
【０１９０】
機能性ＬＤＴＦＣ、例えばＥｃＲ複合体は、イムノフィリンなどの別のタンパク質を含
んでもよい。転写因子（ＤＨＲ３８またはβＦＴＺ−１など）として知られるタンパク質
の核内受容体ファミリーの別のメンバーは、ＥｃＲ、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲのリガ
ンド依存性または非依存性パートナーであってもよい。さらに、一般にコアクチベーター
（アダプターまたはメディエーターとも呼ばれる）として知られるタンパク質などの他の
補因子が必要とされることもある。これらのタンパク質はＤＮＡと配列特異的には結合せ
ず、基本的な転写にも関与しない。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより
、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することにより、アクチベーターの
ＤＮＡ結合の刺激を含む、様々な機序を通じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そ
のようなコアクチベーターの例には、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１
、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴ
Ｒ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰ、さらには乱交雑性コアクチベーターＣ応答エレメン
トＢ結合タンパク質ＣＢＰ／ｐ３００が含まれる（総説については、Glass et al., Curr
. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)を参照）。また、コリプレッサー（リプレッサー、サ
イレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られる）として一般に知られ
ているタンパク質補因子が、リガンドの非存在下における転写活性化を効果的に阻害する
ために必要とされることもある。これらのコリプレッサーは、リガンドが結合していない
ＥｃＲと相互作用して、応答エレメントでの活性をサイレンシングさせることができる。
現時点での証拠は、リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、その結果
、コリプレッサーの放出および上記のコアクチベーターの動員が起こり、それにより、そ
れらのサイレンシング活性が消失することを示唆している。コリプレッサーの例には、Ｎ
−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが含まれる（総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol
. 10:1167 (1996)を参照）。これらの補因子は細胞もしくは生物内にある内因性のもので
あってもよく、または調節性もしくは非調節性のいずれかの様式で発現される導入遺伝子
として外因的に添加してもよい。
【０１９１】
Ｂ．ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチ
本発明はさらに、ＦＫ５０６結合タンパク質をリガンド依存性転写因子複合体として、お
よびラパマイシンをリガンドとして利用する遺伝子スイッチシステムを提供する。一実施
形態において、遺伝子スイッチをコードする構築物は、
（ａ）ラパマイシンまたはその類似体と結合し、少なくとも１つのＦＫ５０６結合タンパ
ク質（ＦＫＢＰ）ドメインおよびそれに対して異種性である少なくとも１つのタンパク質
ドメイン異種を含み、ＦＫＢＰドメインが以下から選択されるペプチド配列を含む、第１
のキメラタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド：
（１）天然に存在するＦＫＢＰ
（２）最大で１０個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するＦＫＢＰの変異体、および
（３）（１）または（２）のＦＫＢＰをコードするＤＮＡ配列と選択的にハイブリダイズ
するＤＮＡ配列によってコードされるＦＫＢＰ；
（ｂ）（ａ）ラパマイシンまたはラパマイシン類似体および（ｂ）第１のキメラタンパク
質の両方と複合体を形成し、少なくとも１つのＦＫＢＰ：ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ド
メインおよびそれに対して異種性である少なくとも１つのタンパク質ドメインを含み、Ｆ
ＲＢドメインが以下から選択するペプチド配列を含む、第２のキメラタンパク質をコード
する第２のポリヌクレオチド：
（４）天然に存在するＦＲＢドメイン、
（５）最大で１０個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するＦＲＢドメインの変異体、および
（６）（４）または（５）のＦＲＢをコードするＤＮＡ配列と選択的にハイブリダイズす
るＤＮＡ配列によってコードされるＦＲＢドメイン、
を含む。
【０１９２】
この遺伝子スイッチシステムにおいて、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌク
レオチドのそれぞれは、本明細書中の他の箇所で記載された１つまたは複数の治療用スイ
ッチプロモーターの制御下にある。さらに、ある実施形態において、第１および第２のキ
メラタンパク質中のＦＫＢＰおよび／またはＦＲＢドメインに対して異種性である少なく
とも１つのタンパク質ドメインは、１つまたは複数の「作用」または「エフェクター」ド
メインであってよい。エフェクタードメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイ
ン、細胞局在化ドメインおよびシグナル伝達ドメイン（すなわち、クラスター化または多
量体化されると細胞成長、増殖、分化、アポトーシス、遺伝子転写などを誘発することの
できるドメイン）を含む、多岐にわたるタンパク質ドメインから選択されうる。
【０１９３】
ある実施形態において、１つの融合タンパク質は少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン
（例えば、ＧＡＬ４またはＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメイン）を含み、別の融合タンパク質
は少なくとも１つの転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６またはｐ６５転写活性化ドメ
イン）を含む。リガンドを介した融合タンパク質の会合は転写因子複合体の形成に相当し
、融合タンパク質の一方の上のＤＮＡ結合ドメインによって認識される（すなわち、それ
と結合することのできる）ＤＮＡ配列に連結された標的遺伝子の転写の開始を導く。遺伝
子発現システムならびにリガンドに関する情報は、米国特許第６，１８７，７５７Ｂ１号
、第６，６４９，５９５Ｂ１号、第６，５０９，１５２Ｂ１号、第６，４７９，６５３Ｂ
１号および第６，１１７，６８０Ｂ１号に開示されている。
【０１９４】
他の実施形態において、本発明は、リガンドの非存在下において自己凝集する２つの融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子スイッチシステムであって、（
ａ）第１の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合する条件的凝集ドメインおよび転
写活性化ドメインを含み、かつ（ｂ）第２の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合
する条件的凝集ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含み、かつ（ｃ）リガンドの非存在
下において、細胞が、前記ＤＮＡ結合ドメインが結合する調節性ＤＮＡと機能的に連結さ
れた遺伝子を発現する、遺伝子スイッチシステムを提供する。遺伝子スイッチシステムを
含む改変細胞を、遺伝子のリプレッションのために十分な量のリガンドの存在下で増やす
。リガンドの除去は、細胞死を引き起こす、コードされたタンパク質の発現を誘導する。
この２つの融合タンパク質をコードする核酸は、少なくとも１つの条件的プロモーターの
制御下にある。条件的凝集ドメインを利用する遺伝子発現システムは、米国特許出願公開
第２００２／００４８７９２号に開示されている。
【０１９５】
Ｃ．原核生物リプレッサー／オペレーターに基づく遺伝子スイッチシステム
一実施形態において、本発明は、（ａ）原核生物テトラサイクリン（「ｔｅｔ」）リプレ
ッサーおよび真核生物転写アクチベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベー
ター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）治療用タンパ
ク質または治療用ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む遺伝子スイ
ッチシステムであって、前記第２のポリヌクレオチドが最小プロモーターおよび少なくと
も１つのｔｅｔオペレーター配列と機能的に連結されている、遺伝子スイッチシステムを
提供する。トランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド
は、本明細書中の他の箇所で記載された治療用スイッチプロモーターを含みうる。この致
死性タンパク質の発現はテトラサイクリンの非存在下でアップレギュレートされる（例え
ば、Gossen et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci.89：5547-5551；Gossen et al.（199
3）TIBS 18：471-475；Furth et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：9302-9306；
およびShockett et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. 92：6522-6526を参照）。Ｔｅ
ｔＯ発現システムは、米国特許第５，４６４，７５８Ｂ１号に開示されている。
【０１９６】
別の一実施形態において、遺伝子スイッチシステムは、細菌である大腸菌（Escherichi
a coli）由来のラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサー−オペレーターシステムを含む。
本発明の遺伝子スイッチシステムはまた、（ａ）原核生物ｌａｃＩリプレッサーおよび真
核生物転写アクチベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベーター融合タンパ
ク質をコードする第１のポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）治療用タンパク質または治療
用ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含んでもよく、ここで前記第２の
ポリヌクレオチドは治療用スイッチプロモーターに機能的に連結されている。このＬａｃ
システムにおいて、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトシドなどの合成類似体の非存在下では不活性化される。
【０１９７】
そのほかの遺伝子スイッチシステムには、以下に記載されたものが含まれる：ＵＳ７，
０９１，０３８号；ＷＯ２００４０７８９２４号；ＥＰ１２６６０１５号；ＵＳ２００１
００４４１５１号；ＵＳ２００２０１１０８６１号；ＵＳ２００２０１１９５２１号；Ｕ
Ｓ２００４００３３６００号；ＵＳ２００４０１９７８６１号；ＵＳ２００４０２３５０
９７号；ＵＳ２００６００２０１４６号；ＵＳ２００４００４９４３７号；ＵＳ２００４
００９６９４２号；ＵＳ２００５０２２８０１６号；ＵＳ２００５０２６６４５７号；Ｕ
Ｓ２００６０１００４１６号；ＷＯ２００１／７０８１６号；ＷＯ２００２／２９０７５
号；ＷＯ２００２／０６６６１２号；ＷＯ２００２／０６６６１３号；ＷＯ２００２／０
６６６１４号；ＷＯ２００２／０６６６１５号；ＷＯ２００５／１０８６１７号；ＵＳ６
，２５８，６０３号；ＵＳ２００５０２０９２８３号；ＵＳ２００５０２２８０１６号；
ＵＳ２００６００２０１４６号；ＥＰ０９６５６４４号；ＵＳ７，３０４，１６２号；Ｕ
Ｓ７，３０４，１６１号；ＭＸ２３４７４２号；ＫＲ１０−０５６３１４３号；ＡＵ７６
５３０６号；ＡＵ２００２−２４８５００号；およびＡＵ２００２−３０６５５０号。
【０１９８】
Ｄ．遺伝子スイッチシステムの組合せ
本発明は、１つまたは複数のリガンドの有効量によって活性化される複数の異なるリガン
ド依存性転写因子複合体を含む２つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムを含み、そ
の２つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムが、１つまたは複数のリガンドと結合す
ると１つまたは複数の治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの発現を選択的
に誘導する第１の遺伝子スイッチおよび第２の遺伝子スイッチを含む、核酸組成物、改変
された細胞およびバイオリアクターを提供する。任意の数の遺伝子スイッチシステムおよ
び／またはその任意の組合せが本発明の範囲内にある。
【０１９９】
一実施形態において、本発明は、以下のものを含む核酸組成物を提供する：
ａ．以下のものを含む第１の遺伝子スイッチシステム：
ｉ．以下のものを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む第１の遺伝子発現カセット：
１．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン；お
よび
２．ヘテロ二量体パートナードメイン；
ｉｉ．以下のものを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第２の遺伝子発現カセット：
１．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するＤＮＡ結合ドメイン；および
２．リガンド結合ドメイン；ならびに
ｉｉｉ．以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第３の遺伝子発現カセット：
１．第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因
子調節性プロモーター；および
２．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、
ならびに
ｂ．以下のものを含む、第２の遺伝子発現システム：
ｉ．以下のものを含む、第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第１の遺伝子発現カセット：
１．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン；お
よび
２．ヘテロ二量体パートナードメイン、
ｉｉ．以下のものを含む、第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む第２の遺伝子発現カセット：
１．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するＤＮＡ結合ドメイン；および
２．リガンド結合ドメイン；ならびに
ｉｉｉ．以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第３の遺伝子発現カセット：
１．第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因
子調節性プロモーター；および、
２．治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
【０２００】
この複数の誘導性遺伝子発現システムは、複数の異なる疾患、障害もしくは病状と関連
のある条件下における所与の治療用ポリヌクレオチドもしくは治療用ポリペプチドの発現
、または、同じ疾患障害もしくは病状と関連のある同じ条件下または複数の異なる疾患、
障害もしくは病状と関連のある複数の異なる条件下のいずれかにおいて複数の治療用ポリ
ペプチドもしくは治療用ポリヌクレオチドの発現をもたらす。
【０２０１】
ある実施形態において、２つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムの組合せは、（
１）二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子発現システム、および（２）単一
スイッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチであってよい。他の実施形態にお
いて、組合せは、（１）単一スイッチ性または二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づ
く遺伝子スイッチ、および（２）ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチであってよい。ま
たは、遺伝子スイッチシステムの組合せは、２つの同一な、上記に開示されたラパマイシ
ンに基づく遺伝子スイッチシステムであってもよい。遺伝子スイッチシステムのあらゆる
可能な組合せが、本発明の範囲内にある。二重スイッチエクジソンシステムの例は、例え
ば、国際公開第２００２／２９０７５号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２
／０１１０８６１号明細書に見出すことができる。
【０２０２】
リガンド
本明細書で用いる場合、ＬＤＴＦＣに基づく遺伝子スイッチ、例えば、ＥｃＤ複合体に基
づく遺伝子スイッチに対して適用される「リガンド」という用語は、遺伝子スイッチを活
性化してその中にコードされるポリペプチドの発現を刺激する能力を有する低分子および
可溶性分子を記述している。本発明のリガンド依存性転写因子複合体のリガンドは、リガ
ンド結合ドメイン、ヘテロ二量体パートナードメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびトラン
ス活性化ドメインのうち１つまたは複数を含むタンパク質複合体と結合する。リガンド依
存性転写因子複合体を活性化するためのリガンドの選択は、利用する遺伝子スイッチの型
に応じて決まる。
【０２０３】
リガンドの例には、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリ
ステロンＡなどのエクジステロイド、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似
体、米国特許第６，０１３，８３６号；第５，１１７，０５７号；第５，５３０，０２８
号；および第５，３７８，７２６号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８
３号および第２００６／００２０１４６号に開示されたものなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒ
ドラジン；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号に記載されているオキサジア
ゾリン；欧州特許出願第４６１，８０９号に開示されたものなどのジベンゾイルアルキル
シアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたものなどのＮ−アルキ
ル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第２３４，９９４号に開示されたも
のなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６
１号に記載されたものなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；
米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号に記載されたものなどのアミドケトン；
および３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド
、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロー
ル、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１
３１７、５−α−６−α−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７
−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファメソール、胆汁酸、１，１−ビホスホン
酸エステル、幼若ホルモンＩＩＩなどを含む、他の類似の材料が非限定的に含まれる。本
発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、ＲＧ−１１５８１９（３，５
−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−
メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３
，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル
−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジ
メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メ
トキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が含まれる。米国特許第２００９／０１６３５９２
号として公開された米国特許出願第１２／１５５，１１１号およびＰＣＴ／ＵＳ２００８
／００６７５７号を参照されたく、これは両方ともその全体が参照により本明細書に組み
入れられる。
【０２０４】
例えば、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチのリガンドは、任意の適したリガン
ドから選択することができる。天然に存在するエクジソンまたはエクジソン類似体（例え
ば、２０−ヒドロキシエクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、ポナステロンＢ、
ポナステロンＣ、２６−ヨードポナステロンＡ、イコノステロンまたは２６−メシルイコ
ノステロン）および非ステロイド性誘導物資の両方を、本発明の遺伝子スイッチのリガン
ドとして用いることができる。米国特許第６，３７９，９４５Ｂ１号は、ステロイドおよ
びある種の非ステロイド性誘導物資の両方に応答する遺伝子スイッチとして作用しうる、
ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）から単離された昆虫ステロイド受容体（
「ＨＥｃＲ」）を記載している。非ステロイド性誘導物資は、ステロイドおよび非ステロ
イド性誘導物資の両方に対して応答するこのシステムおよび多くの他のシステムにおいて
、例えば以下のもの：製造コストがより低いこと、代謝的安定性、昆虫にも植物にも哺乳
動物にも存在しないこと、および環境的受容性を含むいくつかの理由から、ステロイドを
上回る明確な利点を有する。米国特許第６，３７９，９４５Ｂ１号は、１，２−ジベンゾ
イル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジンおよびテブフェノジド（Ｎ−（４−エチルベン
ゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジ
ン）という２種のジベンゾイルヒドラジンの、エクジソンに基づく遺伝子スイッチのリガ
ンドとしての有用性を記載している。同じく本発明にリガンドとして含まれるものに、米
国特許第５，１１７，０５７Ｂ１号に開示されたものなどの他のジベンゾイルヒドラジン
がある。キイロショウジョウバエ由来のエクジソン受容体に対する化学リガンドとしての
テブフェノジドの使用は、米国特許第６，１４７，２８２号にも開示されている。エクジ
ソンリガンドのそのほかの非限定的な例には、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒド
ロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、１，２−ジアシ
ルヒドラジン、Ｎ’−置換−Ｎ，Ｎ’−二置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノ
ヒドラジン、Ｎ−置換−Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−置換−Ｎ−
アシル−Ｎ−アルキル、カルボニルヒドラジンまたはＮ−アロイル−Ｎ’−アルキル−Ｎ
’−アロイルヒドラジンがある（米国特許第６，７２３，５３１号を参照）。
【０２０５】
一実施形態において、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムのリガンドは、ジア
シルヒドラジンリガンドまたはキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッ
チシステムに用いられるリガンドは、式Ｉ
【０２０６】
【化１】
2017141245.tif 000013
の化合物、
式中、Ａはアルコキシ、アリールアルキルオキシもしくはアリールオキシであり；
Ｂは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；かつ
Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ置換されてもよいアリー
ル、もしくは置換されてもよいヘテロアリールである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
【０２０７】
別の一実施形態において、リガンドは、式ＩＩ
【０２０８】
【化２】
2017141245.tif 000014
の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Ａはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、
置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
Ｂは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；かつ
Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリ
ール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
ただし、Ｒ１はＲ２と等しくはなく；
ここで、Ｒ１およびＲ２を有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がＳである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
【０２０９】
ある実施形態において、リガンドは、式ＩＩＩ
【０２１０】
【化３】
2017141245.tif 000015
の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Ａはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、
置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
Ｂは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；かつ
Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリ
ール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり；
ただしＲ１はＲ２と等しくはなく；
ここでＲ１およびＲ２を有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がＲである；
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
【０２１１】
一実施形態において、リガンドは、鏡像異性体過剰率が少なくとも９５％である（Ｒ）
−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エ
チル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、またはその薬学的に許容される塩、水
和物、結晶形態もしくは非晶質形態であってよい。
【０２１２】
式Ｉのジアシルヒドラジンリガンドおよび式ＩＩまたはＩＩＩのキラルジアシルヒドラ
ジンリガンドは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムに用いた場合、本発明の治
療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの外部からの時間的調節をもたらす。２
００８年５月２９日に提出され、米国特許第２００９／０１６３５９２号として公開され
た米国特許出願第１２／１５５，１１１号を参照されたく、これは参照により本明細書に
全面的に組み入れられる。
【０２１３】
本発明に用いられるリガンドは、塩を形成してもよい。「塩」という用語は、本明細書
で用いる場合、無機性および／または有機性の酸および塩基によって形成される酸性およ
び／または塩基性塩を表す。加えて、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物が塩基性モイエテ
ィおよび酸性モイエティの両方を含む場合には、両性イオン（「分子内塩」）が形成され
ることがあり、これは本明細書で用いる「塩」という用語に含まれる。薬学的に許容され
る（すなわち、無毒性で生理的に許容される）塩が用いられるが、他の塩も、例えば、調
製中に用いられる可能性のある単離または精製の段階において有用である。式Ｉ、ＩＩま
たはＩＩＩの化合物の塩は、例えば、塩が内部に沈殿するもののような媒質中、または水
性媒質中で、化合物を、ある量の、例えば等量の酸または塩基と反応させ、その後に凍結
乾燥を行うことによって形成させることができる。
【０２１４】
塩基性モイエティを含むリガンドは、種々の有機酸および無機酸との塩を形成すること
ができる。例示的な酸付加塩には、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えばトリフルオ
ロ酢酸と形成されるものなど）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アス
パラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ク
エン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、
ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸
塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン塩酸、塩酸塩（塩酸と形成
される）、臭化水素酸塩（臭化水素と形成される）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエ
タンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸と形成される）、メタンスルホン
酸塩（メタンスルホン酸と形成される）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、
硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸
塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩
（硫酸と形成されるものなど）、スルホン酸塩（本明細書中で言及したものなど）、酒石
酸塩、チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが
含まれる。
【０２１５】
酸性モイエティを含むリガンドは、種々の有機塩基および無機塩基と塩を形成すること
ができる。例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム
塩、リチウム塩およびカリウム塩など、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩および
マグネシウム塩など、有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、例えば、ベンザチン、ジ
シクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジ
アミンと形成される）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ
−ブチルアミン、およびアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が含まれる。
【０２１６】
ＦＫ５０６結合ドメインを利用する誘導性遺伝子発現システムのリガンドの非限定的な
例には、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡまたはラパマイシンがある。ＦＫ５０６、ラパマ
イシンおよびそれらの類似体は、米国特許第６，６４９，５９５Ｂ２号および第６，１８
７，７５７号に開示されている。米国特許第７，２７６，４９８号および第７，２７３，
８７４号も参照されたい。
【０２１７】
本明細書に記載されたリガンドは、単独で、または薬学的に許容される担体を含む薬学
的組成物の一部として投与することができる。一実施形態において、薬学的組成物は、液
剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物の形態にある。
【０２１８】
一実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、モノクローナル抗体をコ
ードする。
【０２１９】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、ワクチンとしての核酸の発
現に用いることができる。本発明は、また、本発明のベクターまたは発現系を含むワクチ
ン組成物を提供する。別の一実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントを含む
。
【０２２０】
「エリスロポエチンまたはそのアゴニスト」は、エリスロポエチンポリペプチド、エリ
スロポエチンと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは
９９％配列同一性を有するポリペプチド（polypepitde）またはエリスロポエチンのイン
ビトロにおけるエリスロポエチン受容体結合活性の少なくとも約８０％、８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％を保持するエリスロポエチ
ンの断片（fragement）である。
【０２２１】
本発明の方法において、いかなるエリスロポエチンポリヌクレオチド配列を用いてもよ
い。一実施形態において、エリスロポエチンポリヌクレオチド配列は、ヒトエリスロポエ
チンをコードし、そのアミノ酸配列は、受託番号ＡＡＦ２３１３４（配列番号６）に表記
されている。エリスロポエチンをコードするアミノ酸配列は、公開データベースから受託
番号ＡＡＨ９３６２８（ヒト）；ＡＡ１１９２６６（マウス）；およびＢＡＡ０１５９３
（ラット）として入手することもでき、その配列は、参照により本明細書に組み入れられ
る。エリスロポエチンをコードするポリヌクレオチド配列は、公開データベースから受託
番号ＢＣ０９３６２８（ヒト）；ＢＣ１１９２６５（マウス）；およびＤ１０７６３（ラ
ット）として入手することができ、その配列は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２２】
別の一実施形態において、エリスロポエチンポリヌクレオチド配列は、ヒトエリスロポ
エチンのインビトロにおけるエリスロポエチン受容体結合活性の少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を保持するヒトエ
リスロポエチンの類似体をコードする。インビトロにおけるエリスロポエチン受容体結合
アッセイは、当業者によく知られている。例えば、Harris, K.W. et al., J. Biol. Chem
. 25: 15205-9(1992); Wrighton, N.C. et al., Science 273: 458-463(1996);およびJar
sch, M. et al., Pharmacology 81: 63-69(2008)を参照されたい。
【０２２３】
エリスロポエチン（erthropoietins）の非限定的な例として、ダルベポエチン（darbep
oietin）アルファ、エポエチンアルファ、エポエチンアルファ、エポエチンベータおよび
エポエチンカッパーが挙げられる。
【０２２４】
エリスロポエチン（ertythropoietin）アゴニストの非限定的な例として、米国特許第
７，７６７，６４３号、第７，７８６，１６３号、第７，６７４，９１３号、第７，５５
３，８６１号、第７，４１０，９４１号、第７，３４５，０１９号、第７，３０９，６８
７号、第６，５３１，１２１号、第５，８５８，６７０号、第５，６５０，４８９号およ
び第５，５１０，２４０号明細書に開示されているアゴニストが挙げられる。エリスロポ
エチン（ertythropoietin）アゴニストの他の非限定的な例として、米国特許出願公開第
２０１１／００２７８９０号、第２０１０／０３０５００２号、第２０１０／２９７１１
７号、第２０１０／０２９７１０６号、第２０１０／０１９０６９２号、第２０１０／０
１４５００６号、第２０１０／１３６０１５号、第２０１０／０１２０６６１号、第２０
１０／０９３６０８号、第２０１０／００２８３３１号、第２０１０／０１６２１８号、
第２０１０／０００９９６１号、第２００９／０２３３８４４号、第２００９／００２２
７３４号、第２００９／０００４２０２号、第２００８／０２１３２７７号、第２００８
／００１４１９３号、第２００７／０２９８０３１号、第２００７／０２９３４２１号、
第２００７／００６０５４７号、第２００６／０２７０７１号、第２００６／０００９５
１８号、第２００３／０１３４７９８号、第２００３／０１０４９８８号および第２００
２／００８６１６号明細書に開示されているアゴニストが挙げられる。エリスロポエチン
（ertythropoietin）アゴニストの他の非限定的な例として、MacDougal, I.C. et al., N
. Engl. J. Med. 361: 1848-55(2009); Pankratova, S. et al., Brain 133(Pt. 8): 228
1-94(2010);およびZarychanski, R. et al., Canadian Medical Association Journal 17
7: 725-34(2007)に開示されているアゴニストが挙げられる。
【０２２５】
遺伝子スイッチに関して、「エクジソン受容体に基づく」という用語は、天然に存在す
るかまたは合成性のエクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能性部分を含
み、エクジソン受容体リガンド結合ドメインと結合するリガンドに応答して遺伝子発現を
調節する遺伝子スイッチのことを指す。エクジソン応答システムの例は、米国特許第７，
０９１，０３８号および第６，２５８，６０３号に記載されている。一実施形態において
、システムはＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ
（ＲＴＳ）であり、これは図１に示されているように、構成的プロモーターの下で発現さ
れる、突然変異を誘発させたエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＥＦドメインをＧａｌ４Ｄ
ＮＡ結合ドメインと融合させたもの、およびキメラＲＸＲのＥＦドメインをＶＰ１６転写
活性化ドメインと融合させたものという２つの融合タンパク質を含む。
【０２２６】
「モジュレートする（modulate）」および「モジュレートする（modulates）」という
用語は、核酸または遺伝子の発現を誘導する、減少させる、または阻害して、その結果、
タンパク質またはポリペプチドの産生のそれぞれ誘導、減少または阻害がもたらされるこ
とを指す。
【０２２７】
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞において遺伝子の発現を駆
動するのに適した少なくとも１つのプロモーターをさらに含んでもよい。
【０２２８】
本発明の実施形態において用いうるエンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エン
ハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが非限定的に含まれる。
【０２２９】
終結制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列も、好ましい宿主
に対してネイティブ性である様々な遺伝子に由来しうる。任意で、終結部位が必要でない
こともあるが、含まれれば最も好ましい。本発明の一実施形態において、終結制御領域は
、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ
４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウ
イルスターミネーター配列などで構成されるか、またはそれらに由来してよい。
【０２３０】
「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」という用語は、コード配列
の下流（３’）に位置するＤＮＡ配列のことを指し、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識
配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる調節シ
グナルをコードする他の配列を含んでよい。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前
駆体の３’末端へのポリアデニル酸鎖の付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる
。
【０２３１】
「調節領域」とは、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを指す。調節領域
は、特定の核酸の発現を天然において担う配列（相同領域）を含んでもよく、または異な
るタンパク質もしくはさらには合成タンパク質の発現を担う異なる起源の配列（異種領域
）を含んでもよい。特に、これらの配列は、遺伝子の転写を特異的または非特異的な様式
で、および誘導性または非誘導性の様式で刺激または抑圧する、原核生物、真核生物もし
くはウイルス遺伝子の配列または導き出された配列でありうる。調節領域は、複製起点、
ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、およびポリペプチ
ドを標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を含む。
【０２３２】
「異種性の源」からの調節領域とは、発現される核酸に天然では付随していない調節領
域のことを指す。異種性調節領域に含まれるものには、異なる種からの調節領域、異なる
遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在せずに当業者によっ
て設計された調節配列が含まれる。
【０２３３】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写の結果
として生じる産物のことを指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである
場合には、それは一次転写物と呼ばれるが、またはこれが一次転写物の転写後プロセシン
グに由来するＲＮＡ配列であってもよく、それは成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを伴わず、細胞によってタンパク質に翻訳され
うるＲＮＡのことを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それに由
来する二本鎖ＤＮＡのことを指す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、そのため細
胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写物のことを指す。「アンチセンスＲＮＡ
」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補的であって、標的
遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物のことを指す。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特
定の遺伝子転写物の任意の一部、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、また
はコード配列におけるものでありうる。「機能性ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リ
ボザイムＲＮＡ、または翻訳されないものの細胞過程に影響を及ぼす他のＲＮＡのことを
指す。
【０２３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、共有結
合したアミノ酸残基で構成される高分子化合物のことを指す。
【０２３５】
「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」または「単離されたタンパク質
」とは、その天然状態において通常はそれに付随する化合物（例えば、他のタンパク質ま
たはポリペプチド、核酸、糖質、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク
質のことを指す。「単離された」は、他の化合物との人工的もしくは合成的な混合物も、
生物活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定剤の添加または薬学的に許容され
る製剤への調合が原因となって存在する可能性のある不純物の存在も排除しないものとす
る。
【０２３６】
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」とは、野生型または天然の
ポリペプチドに比して、少なくとも１つの野生型または天然のアミノ酸の異なるアミノ酸
による置換を含む、突然変異体ポリペプチドを意味することが理解されるであろう。置換
突然変異体ポリペプチドは、１つの野生型または天然のアミノ酸置換のみを含んでもよく
、これは「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドと呼ばれることもあ
る。または、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然のポリペプチドに比して
、２つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の２つまたはそれ以上のアミノ酸に
よる置換を含んでもよい。本発明によれば、置換突然変異を含むグループＨ核内受容体リ
ガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然のグループＨ核内受容体リガンド
結合ドメインポリペプチドに比して、少なくとも１つの野生型または天然のアミノ酸の異
なるアミノ酸による置換を含む。置換変異体グループＨ核内受容体リガンド結合ドメイン
ポリペプチドの非限定的な例は、国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレットおよ
び米国特許出願公開第２００６／０１００４１６号明細書に見出すことができる。
【０２３７】
置換突然変異体ポリペプチドが２つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の置
換を含む場合、この置換は、置換のために欠失した野生型もしくは天然のアミノ酸と同じ
数、すなわち、２つの非野生型もしくは非天然のアミノ酸による２つの野生型もしくは天
然のアミノ酸の置き換えを含んでもよく、または置換のために欠失した野生型アミノ酸と
同じでない数、すなわち、１つの非野生型アミノ酸による２つの野生型アミノ酸の置き換
え（置換＋欠失突然変異）、もしくは３つの非野生型アミノ酸による２つの野生型アミノ
酸の置き換え（置換＋挿入突然変異）を含んでもよい。
【０２３８】
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内部の置き換えられたアミノ酸残基および数
、ならびに新たな置換されたアミノ酸残基を示すための略記命名法を用いて記述すること
ができる。例えば、ポリペプチドの２０番目（20th）のアミノ酸残基が置換されている置
換突然変異体は「ｘ２０ｚ」と略記することができ、ここで「ｘ」は置き換えられるアミ
ノ酸であり、「２０」はポリペプチド内部のアミノ酸残基の位置または数であり、「ｚ」
は新たな置換されたアミノ酸である。したがって、互換的に「Ｅ２０Ａ」または「Ｇｌｕ
２０Ａｌａ」と略記される置換突然変異体は、その変異体が、ポリペプチドの２０位にグ
ルタミン酸（当技術分野において一般的には「Ｅ」または「Ｇｌｕ」と略記される）の代
わりにアラニン残基（当技術分野において一般的には「Ａ」または「Ａｌａ」と略記され
る）を含むことを指し示している。
【０２３９】
置換突然変異体は、インビトロ部位指定突然変異誘発法（Hutchinson et al., J. Biol
. Chem. 253:6551 (1978)；Zoller et al., DNA 3:479 (1984)；Oliphant et al., Gene 
44:177 (1986)；Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986)）、Ｔ
ＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、制限エンドヌクレアアーゼ消
化／断片欠失および置換、ＰＣＲ媒介性／オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などを
非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術によって作製しうる
。ＰＣＲに基づく手法が、部位指定突然変異誘発のためには好ましい（Higuchi, 1989, "
Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for D
NA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70を参照）。
【０２４０】
ポリペプチドに対して適用される「断片」という用語は、そのアミノ酸配列が参照ポリ
ペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドの全部分にわたって同一のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドのことを指す。そのような断片は、必要に応じて、それら
がその一部である、より大きなポリペプチドの中に含まれてもよい。本発明によるポリペ
プチドのそのような断片は、長さは少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０
、４５、５０、１００、２００、２４０もしくは３００またはそれ以上のアミノ酸であっ
てよい。
【０２４１】
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」とは、ポリペプチドまたはタンパク質に由
来し、かつそのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を保って
いる任意の類似体、断片、誘導体または突然変異体のことを指す。ポリペプチドまたはタ
ンパク質の複数の異なる変異体が天然に存在することもある。これらの変異体は、タンパ
ク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いによって特徴付けられるアレル変
種であってもよく、または差異のあるスプライシング、もしくは翻訳後修飾がかかわって
もよい。当業者であれば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを
有する変異体を作製することができる。これらの変異体には、いくつか例を挙げると、（
ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸で置換されている
変異体、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されて
いる変異体、（ｃ）１つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）ポリ
ペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合されている変
異体が含まれうる。これらの変異体を入手するための手法は、遺伝的（抑制、欠失、突然
変異など）、化学的および酵素的な手法を含め、当業者に公知である。一実施形態におい
て、変異体ポリペプチドは少なくとも約１４個のアミノ酸を含む。
【０２４２】
「相同性」という用語は、２つのポリヌクレオチドモイエティまたは２つのポリペプチ
ドモイエティの間の一致度（percent of identity）のことを指す。１つのモイエティか
らの配列と別のものからの配列との間の対応性は、当技術分野において公知の技術によっ
て決定することができる。例えば、相同性は、配列情報のアラインメントを行って、容易
に入手しうるコンピュータプログラムを用いることによる、２つのポリペプチド分子間の
配列情報の直接比較によって決定することができる。または、相同性を、相同領域の間で
安定な二重鎖を形成する条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、
その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によっ
て決定することもできる。
【０２４３】
本明細書で用いる場合、「相同な」という用語は、そのすべての文法的形態および綴り
変形物において、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）か
らのタンパク質および異なる種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含
む、「共通の進化的起源」を有するタンパク質の間の関係のことを指す（Reeck et al., 
Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、
それらの高度の配列類似性に反映されるような配列相同性を有する。しかし、一般的用法
および本出願において、「相同な」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾された場
合には、配列類似性を意味し、共通の進化的起源を意味しないこともある。
【０２４４】
すなわち、「配列類似性」という用語は、そのすべての文法的形態において、タンパク
質の核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の度合いのことを指し、それ
らは共通の進化的起源を有してもよく、または有しなくてもよい（Reeck et al., Cell 5
0:667 (1987)を参照）。一実施形態において、２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少な
くとも約５０％（例えば、少なくとも約７５％、９０％、または９５％）が、ＤＮＡ配列
の規定の長さにわたって一致する場合に、「実質的に相同」または「実質的に類似」であ
る。実質的に相同な配列は、配列を、配列データバンクで入手しうる標準的なソフトウェ
アを用いて、または例えば、その特定の系に対して定められたストリンジェントな条件な
どにおけるサザンハイブリダイゼーション実験において比較することによって、同定する
ことができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当業者の技能の範囲
内にある（例えば、Sambrook et al., 1989、前記を参照）。
【０２４５】
本明細書で用いる場合、「実質的に類似」とは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の
変化が、結果として、１つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらすが、そのＤＮＡ配列に
よってコードされるタンパク質の機能的特性には影響を及ぼさないような核酸断片のこと
を指す。「実質的に類似」はまた、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、アンチ
センス技術または共抑制技術によって遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響
を及ぼさないような核酸断片のことも指す。「実質的に類似」はまた、結果として生じる
転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の
欠失または挿入といった本発明の核酸断片の修飾のことも指す。したがって、本発明は具
体的な例示的配列を上回るものを範囲に含むことが分かる。提案されている修飾はそれぞ
れ、当業者の定型的な技能の範囲内に十分に含まれ、コードされる産物の生物活性の保持
の判定についても同様である。
【０２４６】
２つのアミノ酸配列は、約４０％を上回るアミノ酸が同一であるか、または６０％を上
回るアミノ酸が類似している（機能的に同一である）場合に、「実施的に相同」または「
実質的に類似」である。好ましくは、類似した配列または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，  Ｍａｄｉｓｏｎ
，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定
される。
【０２４７】
「対応する」という用語は、本明細書において、類似性または相同性を測定する対象に
なる分子と正確な位置が同一であるかまたは異なるかにかかわらず、類似した配列または
相同な配列を指して用いられる。核酸配列またはアミノ酸配列のアラインメントはスペー
スを含んでもよい。したがって、「対応する」という用語は、配列類似性のことを指し、
アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けのことは指していない。
【０２４８】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手作
業による評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool；Altsc
hul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993)）；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能）
などのアルゴリズムを用いるコンピュータでの自動化された配列比較および同定によるか
のいずれかにより、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペ
プチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、ポリペプチド配
列または核酸配列が公知のタンパク質または遺伝子に対して相同であると推定的に同定す
るためには、１０個もしくはそれ以上の連続したアミノ酸または３０個もしくはそれ以上
のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０
個の連続したヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、配列依
存的な遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌
コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）
の方法に用いることもできる。加えて、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣ
Ｒにおける増幅プライマーとして、そのプライマーを含む特定の核酸断片を入手する目的
で用いることもできる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列
を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。
【０２４９】
「一致度」という用語は、当技術分野において公知であるように、配列を比較すること
によって決定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列間または２つもしくはそ
れ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことを指す。当技術分野において、「同一性」
はまた、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いのことも指し、
これは場合によってはそのような配列鎖の間の合致によって決定される。「同一性」およ
び「類似性」は、Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford Univers
ity Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith
, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data
, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994
)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (
1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stoc
kton Press, New York (1991)に記載されたものを非限定的に含む、公知の方法によって
容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、被験配列の間で
最良の合致が得られるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、公
開コンピュータプログラムで体系的に整備されている。配列アラインメントおよび一致度
の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  
ｓｕｉｔｅのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，  ＷＩ）などの配列分析ソフトウェアを用いて行うこともできる。配列の多重アライ
ンメントは、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（Higgins et al., CABIOS. 5:151 (1989)
）をデフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥ
ＮＡＬＴＹ＝１０）で用いて行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いる対アラインメ
ントのデフォルトパラメーターを選択してもよい：ＫＴＵＰＬＥ１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬ
ＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【０２５０】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のた
めに有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムのことを指す
。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでもよく、または独自に開発したものでもよ
い。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ
、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）、およびＤＮＡＳ
ＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，  Ｉｎｃ．  １２２８  Ｓ．  Ｐａｒｋ  Ｓｔ．  Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，  ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）が非限定的に含まれる。本出願の文脈において、配
列分析ソフトウェアを分析に用いる場合には、別に指定しない限り、分析の結果は参照し
たプログラムの「デフォルト値」に基づくことが明らかであろう。本明細書で用いる場合
、「デフォルト値」とは、最初に初期化したときにソフトウェアに最初にロードされた値
またはパラメーターの任意のセットを意味するものとする。
【０２５１】
ＤＮＡの配列に関して「化学的に合成された」とは、構成要素のヌクレオチドがインビ
トロで組み立てられたことを指す。ＤＮＡの手作業での化学合成を十分に確立された手順
を用いて行ってもよく、またはいくつかの市販の装置の１つを用いて自動化学合成を行う
こともできる。このようにして、遺伝子を、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレ
オチド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現となるように調整することができる。当
業者は、コドン使用が宿主によって優先されるコドン側に偏る場合に遺伝子発現が成功す
る確率を評価可能である。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合には
、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０２５２】
本明細書で用いる場合、２つまたはそれ以上の個別に動作可能な遺伝子調節システムは
、ａ）選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそれぞれのモジュ
レーションが、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化をも
たらし、かつｂ）その変化が、実際のモジュレーションが同時であるかまたは逐次的であ
るかに関係なく、細胞、組織または生物において同時に動作可能な他のすべてのシステム
の発現の変化と統計学的に有意に異なる場合、「オルソゴナル」であるという。好ましく
は、それぞれの個別に動作可能な遺伝子調節システムのモジュレーションは、細胞、組織
または生物における他のすべての動作可能なシステムよりも少なくとも２倍大きい、例え
ば、少なくとも５倍、１０倍、１００倍、または５００倍大きい遺伝子発現の変化を生じ
させる。理想的には、選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそ
れぞれのモジュレーションは、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定
可能な変化をもたらし、その細胞、組織または生物において動作可能な他のすべてのシス
テムの発現の測定可能な変化はもたらさない。そのような場合、これらの多重誘導性遺伝
子調節システムは「完全にオルソゴナル」であるという。有用なオルソゴナルリガンドお
よびオルソゴナルな受容体に基づく遺伝子発現システムは、ＵＳ２００２／０１１０８６
１Ａ１号に記載されている。
【０２５３】
「外因性遺伝子」という用語は、その対象にとって外来性である遺伝子、すなわち、形
質転換過程を通じて対象に導入される遺伝子、内因性突然変異遺伝子の非突然変異型のも
の、または内因性非突然変異遺伝子の突然変異型のものを意味する。形質転換の方法は本
発明にとって特に重要ではなく、当業者に公知の、対象に適した任意の方法であってよい
。外因性遺伝子は、ＤＮＡ、または逆転写酵素などによってＤＮＡ中間体を経由して機能
しうるＲＮＡの形態で対象に導入される、天然遺伝子または合成遺伝子のいずれでもあり
うる。そのような遺伝子は、標的細胞に導入すること、対象に直接導入すること、または
対象への形質転換細胞の移入によって間接的に導入することができる。
【０２５４】
「治療用産物」という用語は、そのような産物が発現される宿主細胞に対して有益な機
能を付与する治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドのことを指す。治療用ポ
リペプチドには、長さ３アミノ酸ほどの短いペプチド、単鎖または複数鎖タンパク質、お
よび融合タンパク質が非限定的に含まれうる。治療用ポリヌクレオチドには、アンチセン
スオリゴヌクレオチド、短鎖干渉性ＲＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡ外部ガイド配列が非
限定的に含まれうる。治療用産物には、天然配列、合成配列、または天然および合成配列
の組合せが含まれうる。
【０２５５】
「リガンド依存性転写因子複合体」または「ＬＤＴＦＣ」という用語は、１つまたは複
数のタンパク質サブユニットを含む転写因子のことを指し、この複合体は、本明細書で定
義するような「因子調節型プロモーター」によって駆動される遺伝子発現を調節すること
ができる。モデルとなるＬＤＴＦＣは「エクジソン受容体複合体」であり、これは一般に
、エクジソン受容体（「ＥｃＲ」）およびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質
という核内受容体ファミリーの少なくとも２つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパ
ク質複合体のことを指す（Yao et al., Nature 366:476 (1993)；Yao et al., Cell 71:6
3 (1992)を参照）。ＥｃＲ複合体などの機能性ＬＤＴＦＣがイムノフィリンなどの別のタ
ンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の
別のメンバー（ＤＨＲ３８、βＦＴＺ−１または他の昆虫ホモログなど）が、ＥｃＲおよ
び／またはＵＳＰのリガンド依存性または非依存性パートナーであってもよい。ＥｃＲ複
合体などのＬＤＴＦＣが、ＥｃＲタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動
物ホモログ、レチノイン酸Ｘ受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質、またはＵＳＰおよびＲＸ
Ｒのキメラ体とのヘテロ二量体であってもよい。「ＬＤＴＦＣ」および「ＥｃＲ複合体」
という用語は、ＥｃＲタンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体、さらには同じ機能を
果たす単一のポリペプチドまたは三量体、四量体および他の多量体も範囲に含む。
【０２５６】
ＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦＣは、ＥｃＲを含むが複合体の他のタンパク質も除外され
ない複合体のタンパク質の１つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガ
ンドによって活性化されうる。ＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦＣは、すべてのメンバーがア
ミノ末端トランス活性化ドメイン（本明細書において互換的に用いられる「ＡＤ」、「Ｔ
Ｄ」または「ＴＡ」）、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）およびリガンド結合ドメイン
（「ＬＢＤ」）を含む１つまたは複数のポリペプチドサブユニットの存在によって特徴付
けられる、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ＡＤは「
ヘテロ二量体化パートナー」または「ＨＰ」との融合体として存在してもよい。本発明の
ＡＤおよびＨＰを含む融合タンパク質を、本明細書では「共活性化タンパク質」または「
ＣＡＰ」と称する。ＤＢＤおよびＬＢＤを融合タンパク質として発現させることもでき、
本明細書ではこれを「リガンド誘導性転写因子」（「ＬＴＦ」）と称する。これらの融合
パートナーは、リンカー、例えばヒンジ領域によって隔てられていてよい。ＬＴＦファミ
リーの一部のメンバーが、ＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有
してもよい。ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミ
ノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスが間にある２つのシステインジンクフィ
ンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、ま
たは異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。
【０２５７】
外因性遺伝子、応答エレメント、および例えばＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦＣを構成す
るＤＮＡ配列は、古細菌、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Baci
llus subtilis）もしくは他の腸内細菌など、または真核細胞、例えば植物細胞もしくは
動物細胞などに組み入れることができる。しかし、遺伝子によって発現されるタンパク質
の多くは細菌内では不正確に処理されるため、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または
多細胞生物の形態であってよい。また、外因性遺伝子、応答エレメントおよび受容体複合
体のヌクレオチド配列を、ＲＮＡ分子として、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの
機能性ウイルスＲＮＡの形態で組み入れることもできる。真核細胞の中でも脊椎動物細胞
が好ましいが、これはそれらがＥｃＲに対する本発明のリガンドへの応答を付与する分子
を天然では持たないためである。その結果として、それらは本発明のリガンドに対して「
実質的に非感受性」である。したがって、本発明において有用なリガンドは、形質転換細
胞または生物体全体に対して、無視しうる程度の生理学的または他の影響しか及ぼさない
と考えられる。このため、細胞はリガンド自体の存在によって実質的な影響を受けずに、
成長して所望の産物を発現することができる。
【０２５８】
「エクジソン受容体複合体」という用語は一般に、エクジソン受容体（「ＥｃＲ」）お
よびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質という核内受容体ファミリーの少なく
とも２つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパク質複合体のことを指す（Yao et al.
, Nature 366:476 (1993)；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照）。機能性ＥｃＲ複合
体がイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる核内
受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー（ＤＨＲ３８、βＦＴＺ−１または他の昆
虫ホモログなど）が、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰのリガンド依存性または非依存性パー
トナーであってもよい。ＥｃＲ複合体が、ＥｃＲタンパク質と、ウルトラスピラクルタン
パク質の脊椎動物ホモログ、レチノイン酸Ｘ受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質、またはＵ
ＳＰおよびＲＸＲのキメラ体とのヘテロ二量体であってもよい。ＥｃＲ複合体という用語
は、ＥｃＲタンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体も範囲に含む。
【０２５９】
ＥｃＲ複合体は、ＥｃＲを含むが複合体の他のタンパク質も除外されない複合体のタン
パク質の１つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性
化されうる。本明細書で用いる場合、「リガンド」という用語は、ＥｃＲに基づく遺伝子
スイッチに適用される場合、遺伝子スイッチを活性化してその中にコードされるポリペプ
チドの発現を刺激する能力を有する可溶性の低分子を記述する。リガンドの例には、エク
ジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのエクジス
テロイド、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、米国特許第６，０１３
，８３６号；第５，１１７，０５７号；第５，５３０，０２８号；および第５，３７８，
７２６号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号および第２００６／０
０２０１４６号に開示されているものなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国特許出
願公開第２００４／０１７１６５１号に記載されているオキサジアゾリン；欧州特許出願
第４６１，８０９号に開示されているものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン
；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されているものなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’
−ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第２３４，９９４号に開示されているものなどの
Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号に記
載されているものなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国
特許出願公開第２００４／００４９０３７号に記載されているものなどのアミドケトン；
および３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド
、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロー
ル、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１
３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（Ｅ
ＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファメソール、胆汁酸、１，１
−ビホスホン酸エステル、幼若ホルモンＩＩＩなどを含む他の類似の材料が非限定的に含
まれる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、ＲＧ−１１５８１
９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ
’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（
（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（
２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチ
ル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が含まれる。本発明の実施において有用
なそのほかのジアシルヒドラジンについては、２００８年５月２９日に提出された米国特
許出願第１２／１５５，１１１号、および２００８年５月２９日に提出されたＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２００８／００６７５７号を参照されたい。
【０２６０】
ＥｃＲ複合体は、ヒンジ領域によって隔てられた、すべてのメンバーがアミノ末端トラ
ンス活性化ドメイン（「ＴＡ」）、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）およびリガンド結
合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる核内受容体スーパーファミリー
のメンバーであるタンパク質を含む。ファミリーの一部のメンバーが、ＬＢＤのカルボキ
シ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。ＤＢＤは、エクジソン応答エレ
メントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボッ
クスが間にある２つのシステインジンクフィンガーの存在によって特徴付けられる。これ
らのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパク質の異なるドメイン
のキメラ体のいずれであってもよい。
【０２６１】
外因性遺伝子、応答エレメント、およびＥｃＲ複合体を構成するＤＮＡ配列は、古細菌
、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）もしく
は他の腸内細菌など、または真核細胞、例えば植物細胞もしくは動物細胞などに組み入れ
ることができる。しかし、遺伝子によって発現されるタンパク質の多くは細菌内では不正
確に処理されるため、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形態であっ
てよい。また、外因性遺伝子、応答エレメントおよび受容体複合体のヌクレオチド配列を
、ＲＮＡ分子として、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能性ウイルスＲＮＡの
形態で組み入れることもできる。真核細胞の中でも脊椎動物細胞が好ましいが、これはそ
れらがＥｃＲに対する本発明のリガンドへの応答を付与する分子を天然では持たないため
である。その結果として、それらは本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」であ
る。したがって、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞または生物体全体に対
して、無視しうる程度の生理学的または他の影響しか及ぼさないと考えられる。このため
、細胞はリガンド自体の存在によって実質的な影響を受けずに、成長して所望の産物を発
現することができる。
【０２６２】
ＥｃＲリガンドは、外因性遺伝子と連結した応答エレメントと引き続いて結合するＥｃ
Ｒ複合体とともに用いると、外因性遺伝子の発現を外部から時間的に調節する手段を提供
する。様々な構成要素が互いに結合する順序、すなわちリガンドが受容体複合体に、受容
体複合体が応答エレメントに、といったことは特に重要ではない。典型的には、外因性遺
伝子の発現のモジュレーションは、ＥｃＲ複合体の特異的な制御ＤＮＡエレメントまたは
調節性ＤＮＡエレメントとの結合に応答したものである。ＥｃＲタンパク質は、核内受容
体ファミリーの他のメンバーと同様に、少なくとも３つのドメイン、すなわちトランス活
性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを有する。この受容体は
、核内受容体ファミリーのあるサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う詳細には
解明されていない領域も有する。ＥｃＲタンパク質のリガンド結合ドメインに対するリガ
ンドの結合は、ＵＳＰまたはＲＸＲタンパク質とヘテロ二量体化した後、ヘテロ二量体タ
ンパク質のＤＮＡ結合ドメインが応答エレメントに活性型で結合するのを可能にし、その
ようにして外因性遺伝子の発現または抑制をもたらす。この機序は、リガンドがＥｃＲま
たはＵＳＰのいずれかと結合し、その結果として活性ホモ二量体複合体（例えば、ＥｃＲ
＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）が形成されるという可能性を否定するものではない。一
実施形態において、受容体ドメインの１つまたは複数を変更して、キメラ遺伝子スイッチ
を作製することもできる。典型的には、キメラ受容体が、選択した宿主細胞または生物に
おいてトランス活性化特性、リガンドの相補的結合および特異的な応答エレメントの認識
に関して最適化されるように、３つのドメインの１つまたは複数を他のドメインの源とは
異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のＧＡＬ
−４タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照）または大腸菌（E. c
oli）由来のＬｅｘＡタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照）などの他
のＤＮＡ結合タンパク質ドメインに対する応答エレメントで修飾または置換して、キメラ
ＥｃＲ複合体に順応させることもできる。キメラシステムの別の利点は、それが、所望の
最終結果に応じて、外因性遺伝子を駆動するために用いるプロモーターの選択を可能にす
ることである。そのような二重制御は、遺伝子療法の領域において、特に細胞傷害性タン
パク質が産生される場合には、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の両方を制御
しうるため、特に重要である可能性がある。適切なプロモーターに機能的に連結された外
因性遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在
によって制御される。プロモーターは構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または
組織特異的（すなわち、特定の型の細胞のみにおいて発現される）もしくは生物のある特
定の発生段階に対して特異的であってもよい。
【０２６３】
ある実施形態において、方法の項に記載された治療用スイッチプロモーターは構成的で
ある。ある実施形態において、治療用スイッチプロモーターは疾患、障害または病状と関
連のある条件下において活性化され、例えば、プロモーターは、疾患に応答して、特定の
生理的、発生的、分化的もしくは病的条件に応答して、および／または１つもしくは複数
の特異的な生体分子に応答して活性化される；かつ／または、プロモーターは、特定の組
織型または細胞種において活性化される。ある実施形態において、疾患、障害または病状
は、治療用ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する反応性がある。例えば、ある非
限定的な実施形態において、治療用ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、疾患、障害
または病状を治療する、予防する、改善する、症状を軽減する、進行を予防する、または
治癒させるために有用であるが、これらの事項のいずれか１つまたはすべてを達成する必
要はない。ある実施形態においては、第１および第２のポリヌクレオチドを、疾患、障害
または病状と関連のある条件下におけるリガンド依存性転写因子複合体の発現が可能にな
るように導入する。一実施形態において、治療方法は、治療用ポリペプチドまたは治療用
ポリヌクレオチドが発現し、前記疾患、障害または病状を治療する、改善する、または予
防するのに十分なレベルで対象の全体にわたって散布されるように行われる。本明細書で
用いる場合、「散布される」とは、対象における効果または活性を十分に有するように、
ポリペプチドが改変細胞から発現されて放出されることを意味する。散布は全身性、局所
性またはその中間の任意のものでよい。例えば、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌ
クレオチドが、血流またはリンパ系を経由して全身性に散布されてもよいであろう。また
は、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドを、治療しようとする組織もしく
は臓器中に局所的に散布させてもよいであろう。
【０２６４】
転写因子およびレポータータンパク質などの種々のポリペプチドをコードする数多くの
ゲノム核酸配列およびｃＤＮＡ核酸配列が、当技術分野において周知である。当業者は、
事実上すべての公知の遺伝子に関する核酸配列情報にアクセスして、その核酸分子を公的
な寄託機関、その配列を公開した施設から直接入手すること、または定型的な方法を用い
てその分子を調製することのいずれかを行うことができる。例えば、下記の配列アクセッ
ション番号ｉｎｆｌａの記載を参照されたい。
【０２６５】
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任
意の遺伝子スイッチシステムであってよい。一実施形態において、遺伝子スイッチは、遺
伝子発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明
の遺伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子の例には、その各々のリガンド（
例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、
ならびにその類似体および模倣物）によって活性化される核内受容体スーパーファミリー
のメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが非限定的に含まれ
る。本発明の１つの態様において、遺伝子スイッチはＥｃＲに基づく遺伝子スイッチであ
る。そのようなシステムの例には、米国特許第６，２５８，６０３号、第７，０４５，３
１５号、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号、第２００７／０１６１０８６
号、およびＷＯ０１／７０８１６号に記載されたシステムが非限定的に含まれる。キメラ
エクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号、米国特許出願公開
第２００２／０１１０８６１号、第２００４／００３３６００号、第２００４／００９６
９４２号、第２００５／０２６６４５７号、および第２００６／０１００４１６号、なら
びにＷＯ０１／７０８１６号、第０２／０６６６１２号、第０２／０６６６１３号、第０
２／０６６６１４号、第０２／０６６６１５号、第０２／２９０７５号、および第２００
５／１０８６１７号に記載されている。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システ
ムの一例は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌ
ｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，
Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）である。
【０２６６】
一実施形態において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
の制御下にある、リガンド依存性転写因子をコードする単一の転写因子配列を含む。転写
因子配列は、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体をコードし
てよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によって、または複数の異なる転
写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の天然配列が改変されたもの
のことである。一実施形態において、転写因子はグループＨ核内受容体リガンド結合ドメ
イン（ＬＢＤ）を含む。一実施形態において、グループＨ核内受容体ＬＢＤは、ＥｃＲ、
ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１
、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン
受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体
相互作用タンパク質１４またはファルネソール受容体からのものである。別の一実施形態
において、グループＨ核内受容体ＬＢＤはエクジソン受容体からのものである。
【０２６７】
一実施形態において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
の制御下にある、リガンド依存性転写因子をコードする単一の転写因子配列を含む。転写
因子配列は、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体をコードし
てよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によって、または複数の異なる転
写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の天然配列が改変されたもの
のことである。一実施形態において、転写因子はグループＨ核内受容体リガンド結合ドメ
イン（ＬＢＤ）を含む。一実施形態において、グループＨ核内受容体ＬＢＤは、ＥｃＲ、
ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１
、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン
受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体
相互作用タンパク質１４またはファルネソール受容体からのものである。別の一実施形態
において、グループＨ核内受容体ＬＢＤはエクジソン受容体からのものである。
【０２６８】
ＥｃＲおよび他のグループＨ核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーで
あり、これはそのすべてのメンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン（ＴＤ）、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから隔てられたＬＢＤの
存在によって一般に特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」と
いう用語は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り
、最長でＤＮＡ結合タンパク質の全長までの、ＤＮＡ結合タンパク質の最小のポリペプチ
ド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、以下の４つまたは５つのド
メインの存在によっても特徴付けられる：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびいくつかのメンバ
ーではＦ（米国特許第４，９８１，７８４号およびEvans, Science 240:889 (1988)を参
照）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメ
インに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する
。このファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ末端側
に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
【０２６９】
ＤＢＤは、応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボ
ックスおよびＤ−ボックスが間にある２つのシステインジンクフィンガーの存在によって
特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパ
ク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。ＥｃＲは、核内受容体ファミ
リーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う詳細には解明されていない領域も
有する。核内受容体のドメインはモジュール的な性質があるため、ＬＢＤ、ＤＢＤおよび
ＴＤを入れ替えてもよい。
【０２７０】
別の一実施形態において、転写因子は、ＴＤ、発現をモジュレートしようとする外来性
遺伝子と連係している応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびグループＨ核内受容体Ｌ
ＢＤを含む。ある実施形態において、グループＨ核内受容体ＬＢＤは置換突然変異を含む
。
【０２７１】
別の一実施形態において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第１のプ
ロモーターの制御下にある第１の転写因子配列、および第２のプロモーターの制御下にあ
る第２の転写因子配列を含み、該第１の転写因子配列によってコードされるタンパク質と
該第２の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存
性転写因子として機能するタンパク質複合体、すなわち「二重スイッチ」または「ツーハ
イブリッド」に基づく遺伝子スイッチを形成する。第１および第２のプロモーターは同じ
でも異なってもよい。
【０２７２】
ある実施形態において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、１つのプロ
モーターの制御下にある第１の転写因子配列および第２の転写因子配列を含み、該第１の
転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第２の転写因子配列によってコードさ
れるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複
合体、すなわち「単一遺伝子スイッチ」を形成する。第１の転写因子配列および第２の転
写因子配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されていてもよい。
ＩＲＥＳはＥＭＣＶＩＲＥＳであってもよい。
【０２７３】
一実施形態において、第１の転写因子配列は、ＴＤ、その発現をモジュレートしようと
する外来性遺伝子と連係している応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびグループＨ核
内受容体ＬＢＤを含むポリペプチドをコードし、第２の転写因子配列は、脊椎動物ＲＸＲ
ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、ウルトラスピラクルタンパク質ＬＢＤ、および２
つのポリペプチド断片を含むキメラＬＢＤから選択される核内受容体ＬＢＤを含む転写因
子をコードし、ここで第１のポリペプチド断片は脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物Ｒ
ＸＲ  ＬＢＤまたはウルトラスピラクルタンパク質ＬＢＤからのものであり、第２のポリ
ペプチド断片は異なる脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤまたはウルト
ラスピラクルタンパク質ＬＢＤからのものである。
【０２７４】
別の一実施形態において、遺伝子スイッチは、核内受容体ＬＢＤおよびその発現をモジ
ュレートしようとする外因性遺伝子と連係している応答エレメントを認識するＤＢＤを含
む第１のポリペプチドをコードする第１の転写因子配列、ならびにＴＤおよび核内受容体
ＬＢＤを含む第２のポリペプチドをコードする第２の転写因子配列を含み、ここで核内受
容体ＬＢＤの１つはグループＨ核内受容体ＬＢＤである。一実施形態において、第１のポ
リペプチドはＴＤを実質的に含まず、第２のポリペプチドはＤＢＤを実質的に含まない。
本発明において、「実質的に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を
提供するのに十分な当該ドメインの配列を含まないことを意味する。
【０２７５】
本発明の別の態様において、第１の転写因子配列はヘテロ二量体パートナーおよびＴＤ
を含むタンパク質をコードし、第２の転写因子配列はＤＢＤおよびＬＢＤを含むタンパク
質をコードする。
【０２７６】
一方の核内受容体ＬＢＤだけがグループＨ  ＬＢＤである場合、もう一方の核内受容体
ＬＢＤは、グループＨ  ＬＢＤと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであ
ってよい。例えば、グループＨ核内受容体ＬＢＤがＥｃＲ  ＬＢＤである場合、もう一方
の核内受容体ＬＢＤ「パートナー」は、ＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、ウ
ルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲおよ
びＵＳＰから選択される少なくとも２つの異なる核内受容体ＬＢＤポリペプチド断片を含
むキメラ核内受容体からのものであってよい（ＷＯ０１／７０８１６Ａ２号、国際特許出
願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５号および米国特許第２００４／００９６９４２Ａ１号
を参照）。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然
変異、置換突然変異、または別の修飾をさらに含んでもよい。
【０２７７】
一実施形態において、脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤは、ヒト（ヒト、Homo sapiens）、マウ
ス（ハツカネズミ、Mus musculus）、ラット（ドブネズミ、Rattus norvegicus）、ニワ
トリ（チャボ、Gallus gallus）、ブタ（ブタ、Sus scrofa domestica）、カエル（アフ
リカツメガエル、Xenopus laevis）、ゼブラフィッシュ（ゼブラダニオ、Danio rerio）
、ホヤ（ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis）、またはクラゲ（ミツデリ
ッポウクラゲ、Tripedalia cysophora）ＲＸＲからのものである。
【０２７８】
一実施形態において、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ（ト
ノサマバッタLocusta migratoria）ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）
、マダニ（アムブリオンマ−アメリカヌムAmblyomma americanum）ＲＸＲホモログ１（「
ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ（アムブリオンマ−アメリカヌム）ＲＸＲホモログ２（「Ａ
ｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ（セルカ−プギレーターCeluca pugilator）ＲＸＲホモロ
グ（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫（チャイロコメノゴミムシダマシTenebrio molitor）ＲＸＲ
ホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（ヨーロッパミツバチApis mellifera）ＲＸＲホ
モログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ（モモアカアブラムシMyzus persicae）ＲＸＲホ
モログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅目（non-Dipteran）／非鱗翅目（non-Lepidopt
eran）ＲＸＲホモログからのものである。
【０２７９】
一実施形態において、キメラＲＸＲ  ＬＢＤは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、
無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホ
モログポリペプチド断片から選択される、少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本
発明に用いるためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種の
ＲＸＲポリペプチド断片を含んでよく、または種が同一である場合、２つまたはそれ以上
の複数のポリペプチド断片はその種のＲＸＲポリペプチド断片の２つまたはそれ以上の異
なるアイソフォームからのものであってよい。
【０２８０】
一実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動
物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含む。
【０２８１】
別の一実施形態において、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊
椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片および１つの非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホ
モログポリペプチド断片を含む。
【０２８２】
リガンドは、核内受容体のＬＢＤと組み合わされると、続いて外来遺伝子と連結してい
る応答エレメントと結合し、外来遺伝子発現の外部からの時間的調節をもたらす。結合の
機序、または本発明の様々な構成要素が互いに結合する順序、すなわち、例えばリガンド
がＬＢＤに、ＤＢＤが応答エレメントに、ＴＤがプロモーターに、といったことは特に重
要ではない。
【０２８３】
１つの具体的な例において、グループＨ核内受容体のＬＢＤおよびその核内受容体ＬＢ
Ｄパートナーに対するリガンドの結合は、外来性遺伝子の発現を可能にする。この機序は
、グループＨ核内受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーに対するリガンド結合、およ
びその結果生じる活性ホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナー
＋パートナー）の形成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメインの
１つまたは複数を変更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハイ
ブリッド遺伝子およびその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞また
は生物において、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメン
トの認識に関して最適化されるように、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびＴＤという３つのドメイン
のうち１つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加
えて、応答エレメント自体を、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Sadowski et al., Nat
ure 335:563 (1988)を参照）もしくは大腸菌（Escherichia coli）由来のＬｅｘＡタンパ
ク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメ
インに対する応答エレメント、またはそのような特異的相互作用のために設計、修飾およ
び選択されたタンパク質との標的指向性相互作用に対して特異的な合成応答エレメント（
例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照）で修飾また
は置換して、ハイブリッド受容体に適応させることもできる。
【０２８４】
機能性ＥｃＲ複合体がイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子
として知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー（ＤＨＲ３８またはβ
ＦＴＺ−１など）が、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲのリガンド依存性または非
依存性パートナーであってもよい。さらに、一般にコアクチベーター（アダプターまたは
メディエーターとも呼ばれる）として知られるタンパク質などの他の補因子も必要とされ
ることもある。これらのタンパク質はＤＮＡと配列特異的には結合せず、基本的な転写に
も関与しない。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより、またはアクチベー
ター−開始複合体相互作用を媒介することにより、アクチベーターのＤＮＡ結合の刺激を
含む、様々な機序を通じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そのようなコアクチベ
ーターの例には、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲ
Ｃ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡ
Ｃ３／ｐＣＩＰ、さらには乱交雑性コアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合タンパク質
ＣＢＰ／ｐ３００が含まれる（総説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol.
9:222 (1997)を参照）。また、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサーまたはサ
イレンシングメディエーターとしても知られる）として一般に知られているタンパク質補
因子が、リガンドの非存在下における転写活性化を効果的に阻害するために必要とされる
こともある。これらのコリプレッサーは、リガンドが結合していないＥｃＲと相互作用し
て、応答エレメントでの活性をサイレンシングさせることができる。現時点での証拠は、
リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、その結果、コリプレッサーの
放出および上記のコアクチベーターの動員が起こり、それにより、それらのサイレンシン
グ活性が消失することを示唆している。コリプレッサーの例には、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭ
ＲＴが含まれる（総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を
参照）。これらの補因子は細胞もしくは生物内にある内因性のものであってもよく、また
は調節性もしくは非調節性のいずれかの様式で発現される導入遺伝子として外因的に添加
してもよい。
【０２８５】
外因性遺伝子は、遺伝子スイッチによってコードされるリガンド依存性転写因子のＤＢ
Ｄによって認識される少なくとも１つの応答エレメントを含むプロモーターに機能的に連
結されている。一実施形態において、プロモーターは、応答エレメントの１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含む。所望の応答エレメントを
含むプロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または当技術分野に
おいて周知の手法、例えば、最小プロモーターに機能的に連結された１つまたは複数の応
答エレメントを用いて作り出された人工プロモーターであってもよい。
【０２８６】
タンパク質をコードする遺伝子は、コドン最適化することができる。一実施形態におい
て、タンパク質のコード領域は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。当
業者であれば理解できるように、遺伝暗号の重複性のため、様々な核酸コード領域が同一
ポリペプチドをコードしている。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを
含むヌクレオチド配列における偏向は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にす
る。各コドンは３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４種の特定の
塩基に限定されているため、６４通りの可能なヌクレオチドの組合せが存在するが、その
うちの６１通りがアミノ酸をコードする（残りの３通りのコドンは、翻訳終結シグナルを
コードする）。本明細書において、いずれのコドンがいずれのアミノ酸をコードするかを
示す「遺伝暗号」の写しを表４に記す。その結果、多くのアミノ酸が、２種以上のコドン
で表されている。例えば、アミノ酸のアラニンおよびプロリンは、４種のトリプレットに
よってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６種にコードされており、一方、トリプ
トファンおよびメチオニンは、ただ１種のトリプレットによってコードされている。この
ような縮重によって、ＤＮＡ塩基組成は、該ＤＮＡによってコードされたポリペプチドの
アミノ酸配列を変えることなく広範に変動しうる。
【０２８７】
【表４】
2017141245.tif 000016
【０２８８】
本発明に係るポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、用いられているコ
ドンにかかわらず、本発明の範囲内に含まれることを理解されたし。
【０２８９】
多くの生物が、伸長しているポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードす
る特定のコドン使用に対する偏向を提示する。コドンの優先性またはコドンバイアス、生
物間のコドン使用の差は、遺伝暗号の縮重によってもたらされ、多くの生物において十分
に考証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
の翻訳効率と相関し、また、この効率は、とりわけ、翻訳されているコドンの性質および
特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の有効性に依存すると考えられている。細胞における
選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に用いられている
コドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所定の生物におけ
る最適な遺伝子発現のために目的に合わせて作製することができる。
【０２９０】
ポリヌクレオチドは、所定の種の遺伝子における使用に好ましいコドンをＤＮＡ配列に
組み入れることによって調製される。
【０２９１】
多種多様な動物、植物および微生物種に利用できる数多くの遺伝子配列を考慮すると、
コドン使用の相対的な頻度を計算することができる。コドン使用表は、例えば、http://w
ww.kazusa.or.jp/codon/（２００６年５月３０日アクセス）にて閲覧できる「コドン使用
データベース」から容易に入手でき、これらの表は、多くの様式において適応することが
できる。Nakamura, Y., et al., "Codon usage tabulated from the international DNA 
sequence databases: status for the year 2000"  Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を
参照されたし。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５１．０から計算されたヒトのコド
ン使用表の写しを下の表５に記す（http://www.kazusa.or.jp/codon/より、上記参照）。
これらの表はｍＲＮＡ命名法を用いているため、これらの表は、ＤＮＡに存在するチミン
（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに存在するウラシル（Ｕ）を使用している。表は、全６４コド
ンではなく各アミノ酸の頻度を計算できるように適応させた。
【０２９２】
【表５−１】
2017141245.tif 000017
【表５−２】
2017141245.tif 000018
【０２９３】
上の表または類似の表を利用することによって、当業者は、頻度を任意の所定のポリペ
プチド配列に適用し、ポリペプチドをコードするが所定の種に最適なコドンを用いるコド
ン最適化されたコード領域の核酸断片を作製することができる。
【０２９４】
当業者にとって公知の標準かつルーチンの分子生物学的操作を用いた、上述の方法のい
ずれかによって設計されたコドン最適化されたコード領域の合成に、多くのオプションを
利用できる。
【０２９５】
一実施形態において、本発明のベクターにおけるタンパク質をコードするコード領域は
、コドン最適化されている。別の一実施形態において、コード領域は、ヒトにおける発現
のためにコドン最適化されている。特定の一実施形態において、配列は、コドン最適化さ
れた核酸配列である。
【０２９６】
インビボまたはｅｘ  ｖｉｖｏでポリヌクレオチドを細胞に導入するために、ベクター
を用いることができる。ベクターは、例えば、プラスミドベクターまたは一本鎖もしくは
二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクターとなることができる。このようなベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための公知の技法によって、それを必要とする
対象、例えば、哺乳動物の細胞に導入することができる。ウイルスベクターは複製能を有
してもよく、または複製能を欠損していてもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、
補完性のある宿主細胞のみで起こると考えられる。本明細書で用いる場合、「宿主細胞」
または「宿主」という用語は、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを有している
本発明の細胞を意味して用いられる。
【０２９７】
したがって、最低限でも、ベクターは本発明のポリヌクレオチドを含まなければならな
い。ベクターの他の構成要素には、選択マーカー、クロマチン修飾ドメイン、ベクター上
に同じく存在しうる他のポリペプチド（例えば、致死性ポリペプチド）の発現を駆動する
別のプロモーター、ゲノム組込み部位、組換え部位、および分子挿入中心点（molecular 
insertion pivot）が非限定的に含まれうる。ベクターは、ベクターを所望の治療方法の
具体的な目標に合わせて調整しうるように、ポリヌクレオチドの内部または内部以外のい
ずれかに、任意の数のこれらの追加的なエレメントを含んでよい。
【０２９８】
本発明の一実施形態において、細胞に導入されるベクターは、発現された場合に、本発
明の遺伝子スイッチ構築物が宿主細胞のゲノムに組み込まれたことを指し示す「選択マー
カー遺伝子」をさらに含む。このように、選択用遺伝子はゲノム組込みに関する陽性マー
カーとなりうる。本発明の方法にとって特に重要ではないが、選択マーカー遺伝子の存在
は、ベクター構築物が細胞のゲノム中に組み込まれた生細胞の集団を実施者が選択するこ
とを可能にする。したがって、本発明のある実施形態は、ベクターが首尾良く組み込まれ
た細胞を選択することを含む。本明細書で用いる場合、「選択する」という用語またはそ
の変形物は、細胞とともに用いる場合、特定の遺伝的構成または表現型を有する細胞を選
ぶための標準的な周知の方法を意味するものとする。典型的な方法には、細胞をＧ４１８
、ネオマイシンおよびアンピシリンなどの抗生物質の存在下で培養することが非限定的に
含まれる。選択マーカー遺伝子の他の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイ
シンまたはミコフェノール酸に対する耐性を付与する遺伝子が非限定的に含まれる。他の
選択方法には、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼまたはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを選択用物質として用いるこ
とを可能にする選択マーカー遺伝子が非限定的に含まれる。１つまたは複数の抗生物質耐
性遺伝子を含むベクター構築物を含む細胞は、したがって、培養下で抗生物質に耐えるこ
とができると考えられる。同様に、１つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含むベクター
構築物を含まない細胞は、培養下で抗生物質に耐えることができないと考えられる。
【０２９９】
本明細書で用いる場合、「クロマチン修飾ドメイン」（ＣＭＤ）は、クロマチン構造の
維持および／または改変に関連する種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列の
ことを指し、これにはＤＮＡインスレーターなどがあるが、それらには限定されない。Ci
avatta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006)を参照。ＣＭＤの例
には、ニワトリβ−グロブリンインスレーターおよびニワトリ高感受性部位４（ｃＨＳ４
）が非限定的に含まれる。１つまたは複数の遺伝子プログラム（すなわち、プロモーター
、コード配列、および３’調節領域）の間に複数の異なるＣＭＤ配列を用いることにより
、例えば、これらの差異のあるＣＭＤＤＮＡ配列を、様々な微生物またはインビトロのリ
コンビニアリング技術と組み合わせて、既存の複遺伝子および単一遺伝子シャトルベクタ
ーの間で遺伝子プログラムを「交換」するための「ミニ相同性アーム」として用いること
が容易になる。クロマチン修飾ドメインの他の例は、当技術分野において公知であるか、
または容易に同定することができる。
【０３００】
本発明のベクターにおけるポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、タンパク質の分
泌を導く分泌またはシグナルペプチドをコードする追加的なコード領域に関連しうる。シ
グナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、シグナルペプチド
または分泌リーダー配列を有し、この配列は、伸長するタンパク質鎖の粗面小胞体を通っ
た輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される。脊椎動物細胞によって分泌される
ポリペプチドは、一般に、該ポリペプチドのＮ末端と融合したシグナルペプチドを有し、
このシグナルペプチドは、完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌または
「成熟」型のポリペプチドを生成する。
【０３０１】
一実施形態において、本発明のベクターは、ポリヌクレオチドが、（１）プロモーター
に機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも１つの転写因子
配列と、（２）前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的
に連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、１
つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコ
ードする核酸配列をさらに含む、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の一実施形態において、シグナルペプチドは、タンパク質の天然のシグナルペプチド遺
伝子を含むベクターと比較して、ベクターによってコードされたタンパク質の分泌を増加
させる。特に、本発明において用いられるシグナルペプチドは、コドン最適化することが
できる。
【０３０２】
本発明のベクターは、様々な調節領域、例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’
ＵＴＲまたはその両方を含むことができる。本発明は、また、分泌、タンパク質翻訳、翻
訳後、ｍＲＮＡ転写または転写後過程の改善を誘導するための様々な調節領域の使用を対
象とする。本明細書において、遺伝子の「５’非翻訳領域」または「５’ＵＴＲ」は、一
次ＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ前駆体）へと転写される、コード配列の上流に位置する遺伝
子の当該部分として理解されたし。一次転写産物は、ＤＮＡの転写によって生成される、
イントロンおよびエクソンを含有する初期ＲＮＡ産物である。多くの一次転写産物は、Ｒ
ＮＡプロセシングを行って、生理活性を有するＲＮＡ種を生成する必要がある。成熟ｍＲ
ＮＡへのプロセシングは、末端のトリミング、イントロンの除去、キャップ形成および／
または個々のｒＲＮＡ分子のその前駆ＲＮＡからの切り出しを含みうる。このように、ｍ
ＲＮＡの５’ＵＴＲは、タンパク質へと翻訳されず、コード配列の上流に位置するｍＲＮ
Ａの当該部分である。ゲノム配列において、５’ＵＴＲは、通常、転写開始部位と開始コ
ドンとの間の領域として定義される。脊椎動物ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）
は、数十塩基から数百塩基の長さとなりうる（Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16）
。本明細書における５’ＵＴＲは、天然起源のものであっても、天然では近接していない
１つまたは複数の核酸配列を含有するよう改変されていてもよく（キメラ配列）、および
／または置換、挿入および欠失ならびにそれらの組合せを包含していてもよい。一実施形
態において、５’ＵＴＲ配列は、野生型ＴＮＦ−α配列または５Ｕ２配列に由来する。別
の一実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、５Ｕ２の５’ＵＴＲである。一部の実施形態
において、５’ＵＴＲは、タンパク質発現、例えば、ｍＲＮＡ転写、転写前または転写後
の改善を誘導する。
【０３０３】
本発明において用いられる３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、コード配列の下流（３’）に
位置するＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化［ｐｏｌｙ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮ
Ａプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼしうる調節シグナルをコードする他の配列
を含みうる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデ
ニル酸付加経路に及ぼす影響によって特徴付けられる。合成最適化配列や、ＢＧＨ（ウシ
成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイ
ンバーウイルス）ならびにヒトパピローマウイルスおよびＢＰＶ（ウシパピローマウイル
ス）等のパピローマウイルスのポリアデニル化配列等、任意の適切なポリアデニル化配列
を用いることができる。特定の一実施形態において、３’調節領域は、ＳＶ４０ｅ（ヒト
肉腫ウイルス−４０）ポリアデニル化配列である。別の特定の一実施形態において、３’
調節領域は、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化配列である。
【０３０４】
特定の実施形態において、シグナルペプチドおよび／または調節領域の単独または組合
せは、シグナルペプチドおよび／または調節領域を含有しない対照と比較して、タンパク
質分泌、転写または翻訳を、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９
倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍または５００倍改善しう
る。タンパク質、例えば、ＴＮＦ−αの分泌レベルは、野生型遺伝子を有するベクターに
よってコードされたタンパク質発現に対して正規化することができる。本発明の別の特定
の一実施形態において、シグナルペプチドおよび／または調節領域の単独または組合せは
、タンパク質の生産性を、約５％〜約１０％、約１１％〜約２０％、約２１％〜約３０％
、約３１％〜約４０％、約４１％〜約５０％、約５１％〜約６０％、約６１％〜約７０％
、約７１％〜約８０％、約８１％〜約９０％、約９１％〜約１００％、約１０１％〜約１
４９％、約１５０％〜約１９９％、約２００％〜約２９９％、約３００％〜約４９９％ま
たは約５００％〜約１０００％増加させる。特定の一実施形態において、本発明は、５Ｕ
２の５’ＵＴＲと、ＩＬ−２シグナルペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列
と、タンパク質をコードするコドン最適化されたコード領域と、ＳＶ４０ｅまたはヒト成
長ホルモンのポリアデニル化シグナルとを含む、タンパク質を条件的に発現するベクター
を含む。
【０３０５】
本発明とともに用いるための特定のベクターは、タンパク質またはポリヌクレオチドを
コードする発現ベクターである。一般に、そのようなベクターは、発現させようとするポ
リヌクレオチドと機能的に連結された、宿主における発現のために有効なシス作用性制御
領域を含む。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給されるか、補完的ベクター
によって供給されるか、または宿主への導入後にベクター自体によって供給される。
【０３０６】
非常に様々な発現ベクターを、タンパク質またはポリヌクレオチドを発現させるために
用いることができる。そのようなベクターには、染色体ベクター、エピソームベクターお
よびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵
母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、
バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベク
ター、ならびにそれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミド
といったプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するものなどが
含まれる。これらすべてを、本発明のこの態様に従った発現のために用いることができる
。一般に、宿主においてポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持する、増やす、または
発現させるのに適した任意のベクターを、これに関連した発現のために用いることができ
る。
【０３０７】
本発明において用いられる適切なウイルスベクターとして、アデノウイルスに基づくベ
クター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクター、
パルボウイルスに基づくベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベク
ターおよびＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクターが挙げられるが、これらに限定される
ものではない。これらのウイルスベクターは、例えば、Sambrook et al., Molecular Clo
ning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Har
bor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Gr
eene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)に記載さ
れている標準組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。
【０３０８】
一実施形態において、本発明のウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
アデノウイルス（Ａｄ）は、ＤＮＡをインビボで様々な異なる標的細胞型へと効率的に導
入する３６ｋｂ二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスベクターは、高力価で作製
することができ、ＤＮＡを複製および非複製細胞へと効率的に導入することができる。ア
デノウイルスベクターゲノムは、任意の種、株、サブタイプまたは種、株もしくはサブタ
イプの混合物またはキメラアデノウイルスをベクターＤＮＡの供給源として用いて生成す
ることができる。アデノウイルスの供給源として利用できるアデノウイルスストックは、
現在、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（Ａ
ＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手できるアデノウイルス血清型１〜５１から、あ
るいはその他の供給源から入手できるその他のアデノウイルス血清型から増幅することが
できる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および
３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４および
３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例え
ば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３
６〜３９および４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４
０および４１）またはその他のアデノウイルス血清型のものとなることができる。ヒトア
デノウイルス血清型５（Ａｄ５）ゲノムが、完全に配列決定されていることを考慮すると
、本明細書における本発明のアデノウイルスベクターは、Ａｄ５血清型に関して記載され
ている。アデノウイルスベクターは、一部の有意な部分（必ずしも実質的にではないが）
において、アデノウイルスのゲノムに由来するまたはそれに基づく、細胞で増殖できるい
ずれのアデノウイルスベクターであってもよい。アデノウイルスベクターは、任意の適切
な野生型アデノウイルスのゲノムに基づくことができる。特定の実施形態において、アデ
ノウイルスベクターは、特に血清型２または５の、野生型アデノウイルスＣ群のゲノムに
由来する。アデノウイルスベクターは、本技術分野において公知のものであり、例えば、
米国特許第５，５５９，０９９号、第５，７１２，１３６号、第５，７３１，１９０号、
第５，８３７，５１１号、第５，８４６，７８２号、第５，８５１，８０６号、第５，９
６２，３１１号、第５，９６５，５４１号、第５，９８１，２２５号、第５，９９４，１
０６号、第６，０２０，１９１号および第６，１１３，９１３号明細書、国際特許出願の
国際公開第９５／３４６７１号パンフレット、国際公開第９７／２１８２６号パンフレッ
トおよび国際公開第００／００６２８号パンフレットならびにVirology, B. N. Fields e
t al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New   York (1996)におけるそれぞれThomas 
Shenk, "Adenoviridae and their Replication,"およびM. S. Horwitz, "Adenoviruses,"
Chapters 67 and 68に記載されている。
【０３０９】
他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製欠損である。本明細書におけ
る用語「複製欠損」は、アデノウイルスベクターが、少なくとも１つの複製必須遺伝子機
能を欠くゲノムを含むことを意味する。本明細書において、遺伝子、遺伝子機能または遺
伝子もしくはゲノム領域における欠損は、その核酸配列が全体的または部分的に欠失され
ている、遺伝子の機能を損なうまたは消すのに十分なウイルスゲノム遺伝子材料の欠失と
して定義されている。複製必須遺伝子機能は、複製欠損アデノウイルスベクターの複製（
すなわち、繁殖）に必要とされる遺伝子機能である。複製必須遺伝子機能は、例えば、ア
デノウイルス初期遺伝子領域（early region）（例えば、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域）、
後期遺伝子領域（late region）（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージング
に関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）およびウイルス関連のＲＮＡ（例えば、Ｖ
Ａ−ＲＮＡ  Ｉおよび／またはＶＡ−ＲＮＡ  ＩＩ）によってコードされる。さらにまた
他の実施形態において、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１
つまたは複数の領域（例えば、複数（multiply）複製欠損アデノウイルスベクターのため
のアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域）の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能にア
デノウイルスゲノム欠損を含む。アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域は、Ｅ１
、Ｅ２およびＥ４領域からなる群から選択される。複製欠損アデノウイルスベクターは、
Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損（Ｅ１欠損アデノウイルス
ベクターと表示）、特に、アデノウイルスＥ１Ａ領域およびアデノウイルスＥ１Ｂ領域そ
れぞれの複製必須遺伝子機能における欠損を含むことができる。Ｅ１領域におけるこのよ
うな欠損に加えて、組換えアデノウイルスも、国際特許出願の国際公開第００／００６２
８号パンフレットに記されている通り、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に変異を有する
ことができる。特定の一実施形態において、ベクターは、Ｅ１領域および非必須Ｅ３領域
の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）の少なくとも１つの複製必須遺伝
子機能が欠損している（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表示）。
【０３１０】
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが、ア
デノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおけるウイルス複製に必要とされる１
つまたは複数の遺伝子機能を欠損していることを意味する「複数欠損」である。例えば、
上述のＥ１欠損またはＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも
１つの複製必須遺伝子機能をさらに欠損することができる（Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイル
スベクターと表示）。Ｅ４領域全体が欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主
免疫応答を誘発することができる。
【０３１１】
あるいは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全体または一部およびＥ２領域の全
体または一部における複製必須遺伝子機能を欠く（Ｅ１／Ｅ２欠損アデノウイルスベクタ
ーと表示）。Ｅ１領域の全体または一部、Ｅ２領域の全体または一部およびＥ３領域の全
体または一部における複製必須遺伝子機能を欠くアデノウイルスベクターもまた、本明細
書において企図されている。本発明のアデノウイルスベクターが、Ｅ２Ａ領域の複製必須
遺伝子機能を欠損している場合、該ベクターは、約２３０塩基対未満の長さのＥ２Ａ領域
の完全欠失を含まない。一般に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製に必要とさ
れるポリペプチドであるＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする。ＤＢＰは、ウイ
ルス血清型に応じた４７３〜５２９アミノ酸で構成される。ＤＢＰは、Ｎｔドメインが延
長した、球状Ｃｔからなる扁長楕円体として存在する非対称タンパク質であると考えられ
る。研究により、Ｃｔドメインは、ＤＢＰの核酸との結合能力、亜鉛との結合能力および
ＤＮＡ鎖伸長レベルにおけるＤＮＡ合成機能に関与することが示された。しかし、Ｎｔド
メインは、後期遺伝子発現の転写および転写後レベルの両方において機能すると考えられ
ており、該タンパク質の効率的な核局在の原因であり、また、それ自身の発現の増強に関
与しうる。Ｎｔドメインのアミノ酸２〜３８間における欠失は、該領域が、ＤＢＰ機能に
重要であることを示した（Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰの
Ｃｔ領域をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス複製に影響しないが、ＤＢＰ
のＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス複
製を損なう。一実施形態において、複数複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイ
ルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含有する。特に、例えば、保持されるＥ２Ａ領域の
所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって定義されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ
領域の部分、具体的には、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のＡｄ５（
２３８１６）〜Ａｄ５（２４０３２）の部分である。
【０３１２】
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期遺伝子領域のみ、アデノウイ
ルスゲノムの後期遺伝子領域のみならびにアデノウイルスゲノムの初期および後期遺伝子
領域両方の複製必須遺伝子機能を欠損することができる。アデノウイルスベクターは、ま
た、基本的に全アデノウイルスゲノムが除去されていてよく、この場合、ウイルス末端逆
位配列（ＩＴＲ）および１つまたは複数のプロモーターか、ウイルスＩＴＲおよびパッケ
ージングシグナルの少なくともどちらかは、インタクトのままである（すなわち、アデノ
ウイルスアンプリコン）。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きいほど、ゲノム
内に挿入できる外来核酸配列部分が大きくなる。例えば、アデノウイルスゲノムが、３６
ｋｂであることを考慮すると、ウイルスＩＴＲおよび１つまたは複数のプロモーターをイ
ンタクトのままにすることにより、アデノウイルスの外来インサート収容力は、およそ３
５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲおよびパッケージングシグナルのみを含有する複数欠損
アデノウイルスベクターは、およそ３７〜３８ｋｂの外来核酸配列を効果的に挿入できる
。当然ながら、欠損アデノウイルス領域のいずれかまたは全体においてスペーサーエレメ
ントを包含すると、大型インサートのためのアデノウイルスベクターの収容力を減少させ
るであろう。複数欠損アデノウイルスベクター等、適切な複製欠損アデノウイルスベクタ
ーは、米国特許第５，８５１，８０６号および第５，９９４，１０６号明細書ならびに国
際特許出願の国際公開第９５／３４６７１号パンフレットおよび国際公開第９７／２１８
２６号パンフレットに開示されている。一実施形態において、本発明の方法における使用
のためのベクターは、国際特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０５３６号明細書に
記載されているベクターである。
【０３１３】
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変化させうるこ
とを理解されたい。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生じる
炎症反応を低下させうる。さらに、アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、国際
特許出願の国際公開第９８／４０５０９号パンフレットに記載されている通り、野生型コ
ートタンパク質に対し作製された中和抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの
能力または無能力を減少させるよう改変することができる。
【０３１４】
アデノウイルスベクターは、特に、Ｅ１およびＥ４領域の複製必須遺伝子機能における
複数複製欠損である場合、スペーサーエレメントを包含して、単数（singly）複製欠損ア
デノウイルスベクター、特に、Ｅ１領域における欠損を含むアデノウイルスベクターによ
って達成される増殖と同様に補完的株化細胞におけるウイルス増殖を達成することができ
る。スペーサーエレメントは、所望の長さの任意の配列（単数または複数）を含有するこ
とができる。スペーサーエレメント配列は、アデノウイルスゲノムに関してコードまたは
非コードおよび天然または非天然となることができるが、欠損領域に対する複製必須機能
を回復していない。スペーサーがないと、複数複製欠損アデノウイルスベクターの線維タ
ンパク質の産生および／またはウイルス増殖は、単数複製欠損アデノウイルスベクターと
比較して低下する。しかし、欠損アデノウイルス領域のうち少なくとも１つ、好ましくは
Ｅ４領域におけるスペーサーの包含は、この線維タンパク質生産およびウイルス増殖の減
少を相殺しうる。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第５，
８５１，８０６号明細書に記載されている。
【０３１５】
アデノウイルスベクターの構築は、本技術分野において十分に理解されている。アデノ
ウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号明細書ならびに国際特許
出願の国際公開第９８／５６９３７号パンフレット、国際公開第９９／１５６８６号パン
フレットおよび国際公開第９９／５４４４１号パンフレットに説明されている方法を用い
て構築および／または精製することができる。アデノウイルス遺伝子導入ベクターの作製
は、本技術分野において公知のものであり、例えば、Sambrook et al．（上記参照）、Wa
tson et al．（上記参照）、Ausubel et al．（上記参照）および本明細書において言及
されている他の参考文献のいずれかに記載されている技法等、標準分子生物学的技法の使
用に関与する。
【０３１６】
複製欠損アデノウイルスベクターは、通常、高力価のウイルスベクターストックを生じ
るため、適切なレベルで、複製欠損アデノウイルスベクターに存在しないがウイルス繁殖
に必要とされる遺伝子機能を提供する補完的株化細胞において産生される。一実施形態に
おいて、株化細胞は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも１つおよび／また
はすべての複製必須遺伝子機能を補完する。補完的株化細胞は、全アデノウイルス機能等
、初期遺伝子領域、後期遺伝子領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連のＲＮ
Ａ領域またはそれらの組合せ（例えば、末端逆位配列（ＩＴＲ）およびパッケージングシ
グナルのみ、またはＩＴＲおよびアデノウイルスプロモーターのみ等、最小アデノウイル
ス配列を含む、アデノウイルスアンプリコンの繁殖を可能にする領域）によってコードさ
れた少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損を補完することができる。別の一実施形
態において、補完的株化細胞は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複
製必須遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製必須遺伝子機能）の欠損、特に、Ｅ１Ａおよ
びＥ１Ｂ領域それぞれの複製必須遺伝子機能の欠損を補完する。その上、補完的株化細胞
は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端
タンパク質に関して）および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の
欠損を補完することができる。望ましくは、Ｅ４領域の欠損を補完する細胞は、Ｅ４−Ｏ
ＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、望
ましくは、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦを
含まない。株化細胞は、好ましくは、アデノウイルスベクターと非重複様式で補完遺伝子
を含有するという点においてさらに特徴付けられ、このことは、細胞ＤＮＡとベクターゲ
ノムの組換えの可能性を最小化、特に排除する。したがって、複製能を有するアデノウイ
ルス（ＲＣＡ）の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合最小化され、した
がって、これは、特定の治療目的、特に遺伝子治療目的に適している。ベクターストック
におけるＲＣＡの欠如は、非補完的細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を回避す
る。補完的株化細胞の構築は、Sambrook et al.（上記参照）およびAusubel et al.（上
記参照）によって記載された技法等、標準分子生物学的および細胞培養技法に関与する。
遺伝子導入ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を産生するための補完的株化細
胞として、２９３細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977)に
記載）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願の国際公開第９７／００３２６号パン
フレットならびに米国特許第５，９９４，１２８号および第６，０３３，９０８号明細書
に記載）および２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願の国際公開第９５／３４６
７１号パンフレットおよびBrough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997)に記載）が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸配列のアデノウイルスゲノム（例
えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域）への挿入は、公知の方法、例えば、アデノウイ
ルスゲノムの所定のポジションにおけるユニークな制限部位の導入によって容易となりう
る。
【０３１７】
レトロウイルスは、多種多様な宿主細胞に感染することができるＲＮＡウイルスである
。レトロウイルスゲノムは、感染するとその宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、宿主細胞
ＤＮＡと共に複製され、これによりウイルスＲＮＡおよびレトロウイルスゲノムに組み込
まれた任意の核酸配列を定常的に産生する。このように、レトロウイルスを用いると治療
因子（複数可）の長期発現を達成することができる。病原性レトロウイルスが存在するが
、遺伝子治療における使用に企図されるレトロウイルスは比較的非病原性である。病原性
レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞リンパ増殖
性ウイルス（ＨＴＬＶ）を利用する場合、宿主に対する毒性を排除するためのウイルスゲ
ノムの変質を慎重に行う必要がある。レトロウイルスベクターは、さらに、ウイルス複製
欠損を付与するよう操作することができる。このように、レトロウイルスベクターは、イ
ンビボにおける安定的な遺伝子導入に特に有用であると考えられる。ＨＩＶに基づくベク
ター等、レンチウイルスベクターは、遺伝子送達に用いられるレトロウイルスベクターの
具体例である。レトロウイルスとは異なり、ＨＩＶに基づくベクターは、自身のパッセン
ジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、したがって、遷延型の疾患の
治療に役立つ。
【０３１８】
ＨＳＶに基づくウイルスベクターは、核酸を多数の細胞型に導入するための遺伝子導入
ベクターとしての使用に適している。成熟ＨＳＶビリオンは、外被に包まれた正二十面体
カプシドからなり、ウイルスゲノムは、１５２ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。
多くの複製欠損ＨＳＶベクターは、１つまたは複数の中間型初期遺伝子を除去するための
欠失を含有して、複製を妨げる。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現をもたらしう
る潜伏期に入るその能力と、最大２５ｋｂの外来ＤＮＡインサートを収容できるその大型
のウイルスＤＮＡゲノムである。当然ながら、外来タンパク質の長期産生を促進するＨＳ
Ｖの能力は、短期治療計画の観点からは潜在的に不利である。しかし、当業者であれば、
特定の状況のための適切なベクターの決定に必要な理解を有する。ＨＳＶに基づくベクタ
ーは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、第５，８４
９，５７２号および第５，８０４，４１３号明細書ならびに国際特許出願の国際公開第９
１／０２７８８号パンフレット、国際公開第９６／０４３９４号パンフレット、国際公開
第９８／１５６３７号パンフレットおよび国際公開第９９／０６５８３号パンフレットに
記載されている。
【０３１９】
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療プロトコールにおける使用に関して特に興味深いウイル
スベクターである。ＡＡＶは、ヒト疾患の原因となることが知られていないＤＮＡウイル
スである。ＡＡＶゲノムは、ウイルスのＤＮＡ複製およびパッケージングの認識シグナル
を含有する、末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接する２種の遺伝子、ｒｅｐおよびｃａｐで構
成される。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイ
ルスまたは単純ヘルペスウイルス）との同時感染またはヘルパー遺伝子の発現を必要とす
る。ＡＡＶは、利用されているヘルパーウイルスに応じて、ヒト、サルおよびげっ歯類細
胞等、幅広い宿主細胞において繁殖することができる。核酸配列の投与に用いられるＡＡ
Ｖベクターは、通常、ＩＴＲのみが残るようにおよそ９６％の親ゲノムが欠失している。
このことは、ウイルス遺伝子の発現のため、免疫性または毒性の副作用を排除する。必要
に応じて、ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶベクターと同時投与して、ＡＡＶベクタ
ーの宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にすることができる。組み込まれたＡＡＶゲノムを
含む宿主細胞は、細胞増殖または形態における変化を示さない（例えば、米国特許第４，
７９７，３６８号明細書を参照）。このように、ＡＡＶベクターからの治療因子の延長さ
れた発現は、遷延性および慢性疾患の治療に有用となりうる。
【０３２０】
発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、例えば、ｍＲＮＡの転写を導くプロモータ
ーを含む、適切な発現制御配列と機能的に連結されている。そのほかのプロモーターの代
表例には、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導性プロモーターが非限定的に
含まれる。構成的真核生物プロモーターの例には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプ
ロモーター（Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen.1:273 (1982)）；ヘルペスウイルスのＴ
Ｋプロモーター（McKnight, Cell 31:355 (1982)）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benois
t et al., Nature 290:304 (1981)）；およびワクシニアウイルスプロモーターが非限定
的に含まれる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現を作動させるために用いうると
考えられるプロモーターのそのほかの例には、アルブミンプロモーター（肝細胞）、プロ
インスリンプロモーター（膵臓β細胞）などといった、組織特異的プロモーターおよび特
定のタンパク質に対する他の内因性プロモーターが非限定的に含まれる。一般に、発現構
築物は、転写、開始および終結のための部位、ならびに転写される領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を含むと考えられる。構築物によって発現される成熟転写物のコード部
分は、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳を開始させるＡＵＧを、その末端に適切に配
置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含みうる。
【０３２１】
加えて、構築物は発現を調節するとともに発生させる制御領域を含みうる。一般に、そ
のような領域は、いくつか例を挙げるとリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの
ように、転写を制御することによって動作すると考えられる。
【０３２２】
真核生物ベクターの例には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから販売されているｐＷ−ＬＮＥＯ
、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから販売されているｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐ
ＳＶＬ；ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈから販売されているｐＣＭＶＤｓＲｅｄ２−ｅｘｐｒ
ｅｓｓ、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ、およびｐＣＭＶ−Ｅ
ＧＦＰが非限定的に含まれる。他にも多くのベクターが周知であり、市販されている。
【０３２３】
遺伝子プログラムのエレメントの迅速な挿入および除去のための分子挿入中心点を含む
、特に有用なベクターは、米国特許出願公開第２００４／０１８５５５６号、米国特許出
願第１１／２３３，２４６号、ならびに国際公開公報ＷＯ２００５／０４０３３６号およ
びＷＯ２００５／１１６２３１号に記載されている。そのようなベクターの一例は、ＷＯ
２００７／０３８２７６号に記載されたＵｌｔｒａＶｅｃｔｏｒ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，  Ｖ
Ａ）である。本明細書で用いる場合、「遺伝子プログラム」は、プロモーター（Ｐ）、発
現配列（Ｅ）および３’調節配列（３）を含む遺伝子エレメントの組合せのことであり、
このため「ＰＥ３」は１つの遺伝子プログラムである。遺伝子プログラム内部のエレメン
トは、遺伝子プログラムのエレメントのそれぞれを挟み込んだ分子中心点の間で容易に交
換することができる。分子中心点とは、本明細書で用いる場合、直鎖状に並んだ少なくと
も２つの非可変性の稀なまたは一般的でない制限部位を含むポリヌクレオチドと定義され
る。一実施形態において、分子中心点は、直鎖状に並んだ少なくとも３つの非可変性の稀
なまたは一般的でない制限部位を含む。典型的には、任意の１つの分子中心点は、同じ遺
伝子プログラム内の任意の他の分子中心点の稀なまたは一般的でない制限部位を含まない
と考えられる。所与の制限酵素が作用する６ヌクレオチドを上回るコグネイト配列は「稀
な」制限部位と呼ばれる。しかし、統計学的に予測されるよりも低い頻度で出現する６ｂ
ｐの制限部位があり、これらの部位およびそれらを切断するエンドヌクレアーゼは「一般
的でない」制限部位と呼ばれる。稀なまたは一般的でない制限酵素の例には、ＡｓｉＳＩ
、ＰａｃＩ、ＳｂｆＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、ＭｌｕＩ、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＳｗａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢＳｉＷＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＡｆｌＩＩＩ、Ｐｖｕ
Ｉ、ＮｇｏＭＩＶ、ＡｓｅＩ、ＦｌｐＩ、ＰｍｅＩ、ＳｄａＩ、ＳｇｆＩ、ＳｒｆＩ、Ｎ
ｒｕＩ、ＡｃｌＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＡｇｅＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＢｓｔＢＩ
、ＨｐａＩ、ＡａｔＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ、ＡｖｉＩＩ、ＡｖｒＩＩ、
ＭｆｅＩ、ＡｆｅＩ、ＦｓｐＩ、ＫｐｎＩ、ＳｃａＩ、ＢｓｐＥＩ、ＮｄｅＩ、ＢｆｒＩ
、ＸｈｏＩ、ＰｍｌＩ、ＡｐａＬＩ、ＫａｓＩ、ＸｍａＩ、ＢｓｒＢＩ、ＮｓｉＩ、Ｓａ
ｃＩＩ、ＳａｃＩ、ＢｌｐＩ、ＰｓｐｏＭＩ、ＰｃｉＩ、ＳｔｕＩ、ＳｐｈＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＸｂａＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＢｓｒＧＩおよびＳｓｅ８７８１Ｉが非限定的に含まれる。
【０３２４】
ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）酵素と呼ばれる第２のクラスの制
限酵素の制限部位を含んでもよい。ＨＥ酵素は大きな非対称性制限部位（１２〜４０塩基
対）を有し、その制限部位は天然では低頻度である。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩとして知られ
るＨＥは１８ｂｐの制限部位（５’ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ３’）を有し
、これはランダムな配列の７×１０１０塩基対毎に１回しか出現しないと予想される。こ
の出現率は、哺乳動物ゲノムの２０倍のサイズのゲノム中でわずか１部位に等しい。ＨＥ
部位のこの希少性は、ＨＥ部位がクローニングベクタープラスミド中の適切な位置に含ま
れる場合に、遺伝子操作者が、遺伝子プログラムの完全性を損なうことなしに遺伝子プロ
グラムを切り出せる見込みを大きく高める。
【０３２５】
宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は公知の手順
であり、ベクターの構築および宿主への導入、ならびに宿主におけるその発現のために必
要な手法は、当技術分野において定型的な技能である。
【０３２６】
細胞へのポリヌクレオチドの導入は、ベクターの一時的トランスフェクション、安定的
なトランスフェクションであってもよく、または遺伝子座特異的な挿入であってもよい。
宿主細胞へのベクターの一時的および安定的なトランスフェクションは、リン酸カルシウ
ムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方
法によって生じさせることができる。そのような方法は、Davis et al., Basic Methods 
in Molecular Biology (1986)；Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185:527-37；Sa
mbrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.などの、多くの標準的な実験マニュアルに記載
されている。これらの安定的な形質転換方法は、細胞のゲノム中へのベクターのランダム
な挿入をもたらす。さらに、ベクターのコピー数および配向も、一般的に言ってランダム
である。
【０３２７】
本発明の一実施形態においては、ベクターをゲノム中の生物学的中立部位（ｂｉｏ−ｎ
ｅｕｔｒａｌｓｉｔｅ）に挿入する。生物学的中立部位とは、ポリヌクレオチドの挿入が
、細胞の正常な機能に、仮にあるにしても極めてわずかしか干渉しない、ゲノム中の部位
である。生物学的中立部位を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いて分析しても
よい。多くの生物学的中立部位が当技術分野において公知であり、これには例えば、ＲＯ
ＳＡ等価遺伝子座（ROSA-equivalent locus）がある。他の生物学的中立部位を、当技術
分野において周知の定型的な手法を用いて同定することもできる。ゲノム挿入部位の特性
決定は、当技術分野において公知の方法を用いて行われる。ベクターを細胞に導入する際
にポリヌクレオチドの場所、コピー数および／または配向を制御するために、遺伝子座特
異的な挿入の方法を用いてもよい。遺伝子座特異的な挿入の方法は当技術分野において周
知であり、これには相同組換えおよびリコンビナーゼ媒介ゲノム挿入が非限定的に含まれ
る。当然ながら、遺伝子座特異的な挿入方法を本発明の方法に用いる場合には、ベクター
は、この遺伝子座特異的な挿入、例えば限定されるわけではないが相同組換えなどを助け
るエレメントを含んでもよい。例えば、ベクターが、１、２、３、４個またはそれ以上の
ゲノム組込み部位（ＧＩＳ）を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「ゲノム組込み部
位」は、そのヌクレオチド配列が、ゲノム中へのベクターの挿入を可能にする細胞内のゲ
ノムの部分と同一またはほぼ同一である、ベクター配列の部分と定義される。特に、ベク
ターは、少なくともそのポリヌクレオチドを挟み込む２つのゲノム挿入部位を含みうる。
当然ながら、ＧＩＳが追加的なエレメントを、またはさらにはベクター上に存在するすべ
てのエレメントを挟み込んでもよい。
【０３２８】
別の一実施形態において、遺伝子座特異的な挿入を、リコンビナーゼ部位特異的な遺伝
子挿入によって行うこともできる。手短に述べると、限定されるわけではないがＰｈｉＣ
３１インテグラーゼなどの細菌リコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内部の「偽」組換え部
位に対して作用しうる。これらの偽組換え部位はリコンビナーゼを用いる遺伝子座特異的
な挿入の標的となりうる。リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入は、Thyagarajan et a
l., Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001)に記載されている。リコンビナーゼ部位特異的な遺
伝子挿入に用いうるリコンビナーゼおよびその各々の部位の他の例には、Ｒ４およびＴＰ
９０１−１などのセリンリコンビナーゼならびにＷＯ２００６／０８３２５３号に記載さ
れたリコンビナーゼが非限定的に含まれる。
【０３２９】
さらなる実施形態において、ベクターが、化学療法耐性遺伝子、例えば、多剤耐性遺伝
子ｍｄｒ１、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキ
ルトランスフェラーゼを含んでもよい。化学療法耐性遺伝子は、構成的（例えば、ＣＭＶ
）または誘導性（例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標））プロモーターの制御下に
あってよい。この実施形態において、対象内部の改変細胞を維持しながら対象の疾患を治
療することが望まれる場合には、医師は罹患細胞を破壊するために化学療法薬を適用する
ことができ、その際、改変細胞は適した化学療法耐性遺伝子の発現のために薬剤から防御
されると考えられることから、疾患または障害の治療、改善または予防のために使用を継
続することができる。化学療法耐性遺伝子を誘導性プロモーターの下に配置することによ
り、化学療法耐性遺伝子の不必要な発現を避けることができ、それでも、継続治療が必要
とされる場合には依然として利用可能であると考えられる。改変細胞自体が罹患した場合
でも、それらは依然として、以下に記載する致死性ポリペプチドの発現を誘導することに
よって破壊することができると考えられる。
【０３３０】
本発明の方法は、遺伝子スイッチおよび外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドを
対象の細胞に導入することによって行われる。当技術分野において公知である、ポリヌク
レオチドを細胞に導入するための、上記のもののような任意の公知の方法を用いることが
できる。
【０３３１】
ポリヌクレオチドを細胞にエクスビボで導入する場合には、生検、擦過および外科的組
織摘出を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の手法によって、対象から細胞
を入手することができる。単離した細胞は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに十分
な時間、例えば、２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６、４８時間またはそれ
以上にわたって培養することができる。初代細胞を短期間培養するための方法は当技術分
野において周知である。例えば、細胞をプレート（例えば、マイクロウェルプレート）中
で、付着させるか浮遊させて培養することができる。
【０３３２】
エクスビボでの治療法のためには、細胞を対象から単離して、ポリヌクレオチドを細胞
に導入するのに適した条件下で培養する。ポリヌクレオチドが細胞にひとたび導入されれ
ば、細胞をリガンド依存性転写因子が発現されるのに十分な期間、例えば、０．５、１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８、もしくは２４時間またはそれ以上
にわたってインキュベートする。ポリヌクレオチドを細胞に導入した後のある時点（意味
のあるレベルのリガンド依存性転写因子が発現される前または後のいずれか）で、細胞を
対象に再導入する。再導入は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、静脈内注
入または組織もしくは腔への直接注射によって行うことができる。一実施形態においては
、細胞を対象に再導入する前に、細胞におけるポリヌクレオチドの存在を判定する。別の
一実施形態においては、ポリヌクレオチドを含む細胞を選択し（例えば、ポリヌクレオチ
ド中の選択マーカーの存在に基づいて）、ポリヌクレオチドを含む細胞のみを対象に再導
入する。細胞を対象に再導入した後に、リガンドを対象に投与して、治療用ポリペプチド
または治療用ポリヌクレオチドの発現を誘導する。１つの代替的な実施形態においては、
治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが細胞の再導入前に発現されるように
、細胞を対象に再導入するよりも前にリガンドを細胞に添加してもよい。リガンドは、全
身性（例えば、経口、静脈内）または局所性（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、細胞を
再導入する組織もしくは臓器中への直接注射）のいずれかで、任意の適した方法によって
投与してよい。リガンド投与の最適なタイミングは、定型的な範囲にとどまる手法を用い
て、細胞および疾患または障害のそれぞれの種類に対して決定することができる。
【０３３３】
本発明のインビボでの治療法は、対象の細胞へのポリヌクレオチド、例えばアデノウイ
ルスベクターの直接的なインビボ導入を伴う。ポリヌクレオチドは対象に全身性または局
所性（例えば、疾患または障害の部位）に導入することができる。ポリヌクレオチドが対
象にひとたび導入されれば、リガンドを投与して、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリ
ヌクレオチドの発現を誘導することができる。リガンドは、全身性（例えば、経口、静脈
内）または局所性（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が起こっている
組織もしくは臓器中への直接注射）のいずれかで、任意の適した方法によって投与してよ
い。リガンド投与の最適なタイミングは、定型的な範囲にとどまる手法を用いて、細胞お
よび疾患または障害のそれぞれの種類に対して決定することができる。
【０３３４】
インビボでの使用のためには、本明細書に記載したリガンドを、例えば、溶液、懸濁液
、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物といった、薬学的に許容され
る担体中に取り入れることができる。薬学的組成物は、リガンドを重量比で０．０１％か
ら９９％の範囲で含むことができる。組成物は単回投与剤形または多回投与剤形のいずれ
であってもよい。任意の特定の薬学的組成物におけるリガンドの量は、有効用量、すなわ
ち、所望の遺伝子発現または抑制を誘発させるために必要な用量に依存すると考えられる
。
【０３３５】
本明細書で用いる場合、「ｒＡＤ．ＲｈｅｏＩＬ１２」という用語は、活性化リガンド
の存在下でＩＬ−１２タンパク質を産生させることのできる、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登
録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）の遺伝子スイッチの制御下に
あるＩＬ−１２遺伝子を保有するアデノウイルスポリヌクレオチドベクターのことを指す
。本明細書で用いる場合、「ｒＡｄ．ｃＩＬ１２」という用語は、構成的プロモーターの
制御下にあるＩＬ−１２遺伝子を含むアデノウイルスポリヌクレオチド制御ベクターのこ
とを指す。
【０３３６】
本明細書で用いる場合、「ＩＬ−１２ｐ７０」という用語は、ｐ４０およびｐ３５と一
般的に呼ばれる２つのサブユニットを天然に有するＩＬ−１２タンパク質のことを指す。
ＩＬ−１２ｐ７０という用語は、ＩＬ−１２（ｐ４０およびｐ３５）の２つのサブユニッ
トを含む融合タンパク質を範囲に含み、ここで融合タンパク質はサブユニットの間にリン
カーアミノ酸を含んでもよい。
【０３３７】
薬学的製剤の適した投与経路には、経口、直腸、局所（皮膚、口腔内および舌下を含む
）、膣、避腸的（皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）、
および経鼻胃管によるものが含まれる。当業者であれば、投与経路は治療される病状に依
存すると考えられ、レシピエントの状態などの要因によって変化しうることを理解するで
あろう。
【０３３８】
本明細書で用いる場合、「活性化すること」または「活性化する」という用語は、関心
対象の遺伝子の発現をもたらす、遺伝子スイッチの細胞活性の何らかの測定可能な増加の
ことを指す。
【０３３９】
本明細書で用いる場合、疾患を「治療すること」または疾患の「治療」という用語は、
あるプロトコールを遂行することを指し、それは疾患の徴候または症状を改善するための
取り組みにおいて、１つまたは複数の薬物またはインビトロで遺伝子操作された細胞を、
哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与することを含みうる。したがって、「治療すること
」または「治療」は、必ずしも徴候または症状の完全な改善が必要であると解釈されるべ
きではなく、治癒を必要とはせず、特に、対象に対してわずかな効果しかないプロトコー
ルも含む。
【０３４０】
本明細書において、用語「インビトロで遺伝子操作された細胞」または「インビトロで
遺伝子操作された細胞集団」または「遺伝子操作された細胞の集団」または「タンパク質
を発現する細胞」は、活性化リガンドによって活性化されうる遺伝子スイッチの制御下に
おいてタンパク質を条件的に発現する細胞を意味する。
【０３４１】
本明細書で用いる場合、「改変細胞」という用語は、トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラ
ン法、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクション（リソソーム融合）を非限定的に含
む過程によって改変された細胞のことを指す。
【０３４２】
本明細書で用いる場合、「ＭＯＩ」または「感染多重度」という用語は、特定の実験に
おいて単一細胞を感染させるアデノウイルス粒子（例えば、組換えアデノウイルスまたは
対照アデノウイルス）の平均数のことを指す。
【０３４３】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、疾患の治療に用いることが
できる。
【０３４４】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、腎疾患の治療に用いること
ができる。一実施形態において、腎疾患は、腎不全である。別の一実施形態において、腎
疾患は、慢性腎不全である。
【０３４５】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、貧血の治療に用いることが
できる。一実施形態において、貧血は、腎疾患、例えば、腎不全または慢性腎不全に関連
する貧血である。別の一実施形態において、貧血は、例えば、１つまたは複数の化学療法
剤による癌療法に関連する。別の一実施形態において、貧血は、高齢に関連する。別の一
実施形態において、貧血は、肺機能不良に関連する。別の一実施形態において、貧血は、
骨髄形成異常（myelodisplasia）に関連する。別の一実施形態において、貧血は、放射線
療法に関連する。別の一実施形態において、貧血は、重病に関連する。
【０３４６】
一実施形態において、貧血は、心疾患に関連しない。別の一実施形態において、エリス
ロポエチンによる治療に対し応答性の疾患、障害または状態は、心疾患ではない。「心疾
患」の非限定的な種類は、うっ血性心不全、低酸素、虚血性心臓病、高血圧性心臓病、冠
動脈疾患、末梢血管疾患および虚血性心臓性イベント、例えば、心筋梗塞、心臓発作、心
不全、不整脈、心筋断裂、心膜炎、心原性ショック、血栓症、塞栓症、粥状動脈硬化およ
び動脈狭窄である。
【０３４７】
別の一実施形態において、エリスロポエチンまたはそのアゴニストをコードするポリヌ
クレオチドを含むポリヌクレオチドは、ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合体のエタネルセプトもコ
ードすることはない。別の一実施形態において、エリスロポエチンまたはそのアゴニスト
をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、エタネルセプトをコードする
ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも投与された対象に投与されない。
【０３４８】
一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、多発性硬化症の治療に用いられ
る。一実施形態において、ベクターは、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド
配列またはその断片を含む。別の一実施形態において、ベクターは、インターフェロン−
ベータをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含む。別の一実施形態におい
て、ベクターは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）をコードするポリヌクレオチド配
列またはその断片を含む。一実施形態において、ベクターは、インターフェロン、例えば
、インターフェロン−ベータをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片およびミ
エリン塩基性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含む。
【０３４９】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、血管浮腫の治療に用いられ
る。別の一実施形態において、血管浮腫は、遺伝性血管浮腫である。一実施形態において
、ベクターは、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（例えば、ヒトＣ１エステラーゼ阻害剤）、カリ
クレイン阻害剤およびブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストからなる群から選択される
分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０３５０】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、Ｃ１エステラーゼの阻害が
治療上有益な効果をもたらす疾患、状態または障害の治療に用いられる。本実施形態にお
いて、ベクターは、例えば、敗血症、凝固性亢進、肺性機能障害、低酸素血症、出血性膵
炎（pancreaitis）、心筋梗塞、肺移植、外傷、熱傷および血管漏出からなる群から選択
される疾患、状態または障害を治療するための、Ｃ１エステラーゼ阻害剤をコードするポ
リヌクレオチド配列を含む。
【０３５１】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、カリクレインの阻害が治療
上有益な効果をもたらす疾患、状態または障害の治療に用いられる。このような疾患、状
態または障害の例として、接触系（contact system）の疾患、状態または障害が挙げられ
るがこれらに限定されない。例えば、Shariat-Madar et al., Innate Immunity, vol. 10
, no. 1, 3-13(2004)およびFrick, et al., EMBO J.,(2006) 25, 5569 −5578(2006)を参
照されたい。本実施形態において、ベクターは、例えば、アテローム血栓症、冠動脈疾患
、アルツハイマー病（Alzheimer's Disesase）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病）、
血管漏出、急性呼吸促迫症候群およびブラジキニン介在性炎症からなる群から選択される
疾患、状態または障害を治療するためのカリクレイン（kallirein）阻害剤をコードする
ポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ベクターは、カリクレイン阻害剤を
コードするポリヌクレオチド配列を含む。カリクレイン阻害剤の例として、エカランチド
ならびにその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１０／
００３４８０５号、第２００９／０２６４３５０号、第２００９／０２３４００９号、第
２００８／０２２１０３１号、第２００７／０２１３２７５号、第２００６／０２６４６
０３号および第２００５／００８９５１５号明細書に表記されているカリクレイン阻害剤
が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５２】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、肺高血圧症の治療に用いら
れる。一実施形態において、肺高血圧症は、肺動脈性肺高血圧症である。別の一実施形態
において、肺動脈性肺高血圧症は、特発性肺動脈性肺高血圧症である。別の一実施形態に
おいて、肺動脈性肺高血圧症は、家族性肺動脈性肺高血圧症である。別の一実施形態にお
いて、肺動脈性肺高血圧症は、他の疾患または状態に関連する肺動脈性肺高血圧症である
。別の一実施形態において、肺動脈性肺高血圧症は、他の状態に続発する肺動脈性肺高血
圧症である。別の一実施形態において、肺動脈性肺高血圧症は、続発性肺動脈性肺高血圧
症である。別の一実施形態において、肺動脈性肺高血圧症は、顕著な静脈性または毛細血
管性合併症（involvement）、例えば、肺静脈閉塞症および肺毛細血管の血管腫症に関連
する。別の一実施形態において、肺動脈性肺高血圧症は、新生児の遷延性肺高血圧症であ
る。一実施形態において、ベクターは、筋肉内投与される。
【０３５３】
一実施形態において、用語「プロスタグランジン合成酵素」は、プロスタグランジン合
成酵素、プロスタグランジンシンテターゼ、プロスタグランジンシンテターゼ１、プロス
タグランジンシンテターゼ２、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテターゼ、プ
ロスタグランジンＥシンテターゼ、プロスタグランジンＨ２シンテターゼ、プロスタグラ
ンジンＧ／Ｈシンテターゼ１、プロスタグランジンＧ／Ｈシンテターゼ２、ＰＧシンテタ
ーゼ、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−３から
なる群から選択されるポリペプチドである。
【０３５４】
ヒトプロスタグランジン（Prosteglandin）Ｇ／Ｈ合成酵素１ヌクレオチド配列の受託
番号は、ＮＣ＿０００００９であり、ヒトプロスタグランジン（Prostoglandin）Ｇ／Ｈ
合成酵素１アミノ酸配列の受託番号は、受託番号ＮＰ＿０００９５３である。例えば、La
nder et al., Nature 429: 369-374(2004)を参照されたい。
【０３５５】
ヒトプロスタグランジン（Prosteglandin）Ｇ／Ｈ合成酵素２ヌクレオチド配列の受託
番号は、ＮＣ＿０００００１であり、ヒトプロスタグランジン（Prostoglandin）Ｇ／Ｈ
合成酵素２アミノ酸配列の受託番号は、受託番号ＮＰ＿０００９５４．１である。例えば
、Lander et al., Nature 431: 931-945(2004)を参照されたい。
【０３５６】
ヒトインターフェロン−ベータの受託番号は、ＮＰ＿００２１６７．１である。
【０３５７】
ヒトＧＬＰ−１の受託番号は、ＲＰ＿１２７３８である。
【０３５８】
ヒトＧＬＰ−２の受託番号は、ＲＰ＿１０７６９である。
【０３５９】
ヒトアディポネクチンの受託番号は、ＡＢＺ１０９４２．１である。
【０３６０】
ヒトレプチンの受託番号は、ＡＡＨ６９３２３．１である。
【０３６１】
ヒトＣＦＴＲの受託番号は、ＡＢＤ７２２１３．１である。
【０３６２】
ヒトＩＬ−１０の受託番号は、ＮＰ＿０００５６３である。
【０３６３】
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、ブラジキニンＢ２受容体の
阻害が治療上有益な効果をもたらす疾患、状態または障害の治療に用いられる。本実施形
態において、ベクターは、例えば、糸球体硬化症、アルツハイマー病、大脳浮腫、血管漏
出、急性呼吸促迫症候群、疼痛、炎症、外傷、火傷、ショック、アレルギーおよび心血管
疾患からなる群から選択される疾患、状態または障害を治療するための、ブラジキニンＢ
２受容体阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ブラジキニンＢ２受容体阻害
剤の例として、ヘロキネスタチン（helokinestatin）および抗ブラジキニンＢ２受容体抗
体が挙げられるがこれらに限定されない。ヘロキネスタチン（helokinestatin）のアミノ
酸配列は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇである（その全体が参照により本明細書に組み入れられるKwok, H.F. et al., P
eptides 29I 65-72(2008)）。抗ブラジキニンＢ２受容体抗体の非限定的な例は、Alla, S
.A. et al., J. Biol. Chem. 271: 1748-1755(1996)に表記されている。
【０３６４】
一実施形態において、開示されている疾患のうち１つまたは複数を患う哺乳動物に投与
されるベクターは、アデノウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む。一態様において、遺伝子スイッチ
は、ＥｃＲに基づく遺伝子スイッチである。別の一実施形態において、遺伝子スイッチを
コードするポリヌクレオチドは、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配
列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、前記第一の転
写因子配列および前記第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用し
て、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する。一態様におい
て、リガンドは、ジアシルヒドラジンである。別の一態様において、リガンドは、ＲＧ−
１１５８１９、ＲＧ−１１５９３２およびＲＧ−１１５８３０から選択される。さらに別
の一態様において、リガンドは、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリン
である。
【０３６５】
一実施形態において、核酸アデノウイルスベクターは、遺伝子スイッチを含有した状態
で提供され、ＶＰ１６−ＲＸＲおよびＧａｌ４−ＥｃＲのコード配列は、ＥＭＣＶ配列内
リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により離間され、ヒトユビキチンＣプロモーターの
制御下においてアデノウイルスシャトルベクターに挿入される。例えば、ＩＲＥＳ配列に
より離間され、合成誘導性プロモーターの制御下において配置されたＩＬ１２のｐ４０お
よびｐ３５サブユニットのコード配列は、ユビキチンＣプロモーターの上流に挿入される
。別の一例において、合成誘導性プロモーターの制御下において配置されたＴＮＦ−アル
ファのコード配列は、ユビキチンＣプロモーターの上流に挿入される。
【０３６６】
濃度を増加させるためのベクター精製は、密度勾配精製（例えば、塩化セシウム（Ｃｓ
Ｃｌ））またはクロマトグラフィー技法（例えば、カラムまたはバッチクロマトグラフィ
ー）等、任意の適切な方法により達成することができる。例えば、本発明のベクターは、
２または３回のＣｓＣｌ密度勾配精製段階に付すことができる。ベクター、例えば、複製
欠損アデノウイルスベクターは、望ましくは、アデノウイルスに感染した細胞を溶解する
段階と、ライセートをクロマトグラフィー樹脂にアプライする段階と、クロマトグラフィ
ー樹脂からアデノウイルスを溶出する段階と、アデノウイルスを含有する画分を収集する
段階とを含む方法を用いて、複製欠損アデノウイルスベクターに感染した細胞から精製さ
れる。
【０３６７】
１つの特定の実施形態においては、その結果得られた一次ウイルス株をＨＥＫ２９３細
胞またはＣＨＯ細胞の再感染によって増幅し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法によって精製する
。
【０３６８】
タンパク質に基づくタグは、効果的な標的化のための高度に特異的な翻訳後修飾の必要
を低下またはなくす。有用なタンパク質に基づくタグとして、ＩＧＦ２Ｒ標的（ＩＧＦ２
（ＧＩＬＴ）／ＩＧＦ２遺伝子操作）、トランスフェリン受容体標的（トランスフェリン
、ＴｆＲ標的ペプチド）およびＴａｔタンパク質（細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカ
ン（ＨＳＰＧ）が、Ｔａｔの内部移行を媒介する）が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。
【０３６９】
タグとして用いることのできるリソソームを標的とする他のタンパク質として、ビタミ
ンＤ結合タンパク質、葉酸結合タンパク質、ラクトトランスフェリン、性ホルモン結合グ
ロブリン、トランスサイレチン、プロサポシン、レチノール結合タンパク質、Ａｐｏリポ
タンパク質Ｂ、Ａｐｏリポタンパク質Ｅ、プロラクチン、受容体関連タンパク質（一実施
形態において、ＨＮＥＬ配列を欠く）、天然のトランスフェリンおよび変異体トランスフ
ェリン（例えば、Ｋ２２５Ｅ／Ｒ６５１Ａ変異体またはＫ２２５Ｅ／Ｋ５５３Ａ変異体）
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３７０】
一態様において、本発明は、タンパク質を発現するインビトロで遺伝子操作された細胞
の集団またはベクター、例えば、アデノウイルスベクターを含む、ヒトまたは非ヒトへの
投与に適した医薬組成物であって、製剤が、腫瘍内投与による投与に適した医薬組成物を
提供する。別の一実施形態において、組成物、例えば、医薬組成物は、タンパク質を条件
的に発現するベクターを含む。一部の実施形態において、組成物は、約１×１０５以上の
粒子単位（ｐｕ）の遺伝子導入ベクターを含む。「粒子単位」は、単一のベクター粒子で
ある。特定の実施形態において、組成物は、約１×１０６粒子単位の遺伝子導入ベクター
（例えば、約１×１０７以上の粒子単位、約１×１０８以上の粒子単位または約１×１０
９以上の粒子単位）を含む。他の実施形態において、組成物は、約１×１０１０以上のｐ
ｕ、１×１０１１以上のｐｕ、１×１０１２以上のｐｕ、１×１０１３以上のｐｕ、１×
１０１４以上のｐｕまたは１×１０１５以上のｐｕの遺伝子導入ベクター、特に、複製欠
損アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを含む。組成物における遺伝子導入ベク
ターの粒子単位数は、さらに本明細書に記載されている通り、遺伝子導入ベクターの標準
溶液（すなわち、公知の遺伝子導入ベクター濃度の溶液）の吸光度と組成物の吸光度を比
較することによる等、任意の適切な公知方法を用いて決定することができる。
【０３７１】
一実施形態において、活性化リガンドは、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０お
よびＲＧ−１１５９３２からなる群から選択される。
【０３７２】
本発明はさらに、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２
などの活性化リガンドを含む薬学的組成物であって、腹腔内、経口または皮下投与による
投与に適している組成物も提供する。
【０３７３】
一実施形態において、活性化リガンドは、経口投与される。別の一実施形態において、
活性化リガンドは、非経口的に投与される。別の一実施形態において。活性化リガンドは
、腹腔内、皮下または筋肉内投与される。
【０３７４】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。担体は、遺伝
子操作された樹状細胞、遺伝子導入ベクターまたは活性化リガンドに適切な任意の担体と
なることができる。組成物に適切な担体は、米国特許第６，２２５，２８９号明細書に記
載されている。担体は、通常、液体であるが、固体または液体および固体成分の組合せで
あってもよい。担体は、望ましくは、薬学的に許容される（例えば、生理的または薬理学
的に許容される）担体（例えば、賦形剤または希釈剤）である。薬学的に許容される担体
は、公知のものであり、容易に入手できる。担体の選択は、少なくとも一部には、組成物
中の特定の成分および組成物の投与に用いられる特定の方法によって決定されることにな
る。組成物は、その他の適切な成分、特に、組成物および／またはその最終用途の安定性
を増強するための成分をさらに含むことができる。したがって、本発明の組成物には多種
多様の適切な製剤が存在する。
【０３７５】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水またはオレンジジュース等、希釈剤に
溶解された有効量の有効成分等、液体の溶液、（ｂ）それぞれ、所定量の有効成分を固体
または顆粒として含有するカプセル、小袋または錠剤、（ｃ）適切な液体に懸濁した懸濁
液および（ｄ）適切なエマルジョンを含む。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コ
ーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コ
ロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウム、ステアリン酸その他の賦形剤、着色料、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、調味料
および薬理学的に適合性の賦形剤のうち１つまたは複数を含むことができる。トローチ剤
形態は、香味料、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント中に有効成分を含む
ことができ、また、不活性基剤（ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビア
ゴム等）中に有効成分を含む芳香錠ならびに有効成分と共にこのような賦形剤を含有する
エマルジョン、ジェルその他は、本技術分野において公知のものである。
【０３７６】
吸入による投与に適した製剤は、エアロゾル製剤を含む。エアロゾル製剤は、ジクロロ
ジフルオロメタン、プロパン、窒素その他等、加圧された許容される噴霧剤中に置くこと
ができる。これは、ネブライザーまたはアトマイザーから送達するための非加圧調製物と
して製剤することもできる。
【０３７７】
非経口投与に適した製剤は、製剤に目的レシピエントの血液との等張性を付与する抗酸
化剤、バッファー、静菌薬および溶質を含有しうる水性および非水性の等張性無菌注射溶
液ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性無
菌懸濁液を含む。製剤は、アンプルおよびバイアル等、単位用量または複数用量の密封容
器に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体賦形剤、例えば、水の添加のみを
必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時用の注射溶液
および懸濁液は、前述の種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０３７８】
経肛門投与に適した製剤は、乳化基剤または水溶性基剤等、様々な基剤と有効成分を混
合することにより、坐剤として調製することができる。経膣投与に適した製剤は、有効成
分と共に、本技術分野において適切であることが公知の担体を含有するペッサリー、タン
ポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡またはスプレー処方として存在することができる
。
【０３７９】
その上、組成物は、追加的な治療または生物活性薬剤を含むことができる。例えば、特
定の徴候の治療において有用な治療因子が存在していてもよい。イブプロフェンまたはス
テロイド等、炎症を制御する因子は、遺伝子導入ベクターのインビボ投与に伴う肥大およ
び炎症ならびに生理的窮迫を低下させるための組成物の一部となることができる。免疫系
サプレッサーは、遺伝子導入ベクターそのものに対するまたは障害に伴う任意の免疫応答
を低下するための組成物方法により投与することができる。あるいは、免疫賦活薬は、疾
患に対する身体の自然防御を上方制御するため、組成物中に含まれうる。さらに、免疫エ
フェクター細胞を腫瘍部位へと誘引するため、サイトカインを組成物と共に投与すること
ができる。
【０３８０】
本明細書に記載された特定の実施形態において、本発明は、腫瘍を治療するための方法
であって：
ａ．インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはＴＳＣの集団を哺乳動物に腫瘍内投与
する段階；および
ｂ．前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階、
を、この順序で含む方法を提供する。
【０３８１】
一実施形態において、活性化リガンドは、インビトロで遺伝子操作された細胞またはベ
クター、例えば、アデノウイルスベクターを含む組成物と実質的に同時に、例えば、細胞
またはベクター組成物の投与前後の１時間以内に投与される。別の一実施形態においては
、活性化リガンドを、インビトロで細胞またはベクターの投与時または投与後の約２４時
間未満のうちに投与する。さらに別の一実施形態においては、活性化リガンドを、インビ
トロで遺伝子操作された細胞またはベクターの投与時または投与後の約４８時間未満のう
ちに投与する。別の一実施形態において、リガンドはＲＧ−１１５９３２である。別の一
実施形態においては、リガンドを約１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する。別の一実
施形態においては、リガンドを約３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する。別の一実施形態
においては、リガンドを７〜２８日の期間にわたって毎日投与する。別の一実施形態にお
いては、リガンドを１４日の期間にわたって毎日投与する。別の一実施形態においては、
約１×１０６〜１×１０８個の細胞を投与する。別の一実施形態においては、約１×１０
７個の細胞を投与する。
【０３８２】
「対象」という用語は、哺乳動物を意味する。哺乳動物は、ヒト、げっ歯類、サルおよ
びその他の動物を包含するが、ヒトまたはマウスがより好ましい。他の哺乳動物には、イ
ヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの獣医学的動物が含まれる。
【０３８３】
本明細書において、用語「タンパク質発現」は、転写、転写後、翻訳および／または翻
訳後を限定せずに包含する。
【０３８４】
本発明において、タンパク質のｍＲＮＡまたはタンパク質発現を増加させる方法であっ
て、タンパク質を条件的に発現するベクターを生成する段階であり、前記ベクターが、前
記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に接続された１つまたは複数の調節配列
をさらに含む段階と、活性化リガンドを加えて、これによりタンパク質の発現を誘導する
段階であり、前記１つまたは複数の調節配列および／またはシグナルペプチドが、前記タ
ンパク質の発現を改善する段階とを含む、方法も包含される。５’非翻訳領域（５’ＵＴ
Ｒ）、３’ＵＴＲまたはその両方を含むがこれらに限定されない本発明の様々な調節領域
が記載されている。一実施形態において、５’ＵＴＲは、５Ｕ２である。５Ｕ２は、５’
末端に隣接したエクソン２スプライスドナーおよび３’末端に隣接したエクソン３スプラ
イスアクセプターに、ウシカゼイン５’ＵＴＲの一部が続く、イヌＳＥＲＣＡ２イントロ
ン２と変異型推定コンセンサスｐｏｌｙ−Ａ部位との融合体である。別の一実施形態にお
いて、３’調節領域は、ＳＶ４０またはｈＧＨのポリアデニル化シグナルである。
【０３８５】
本発明はさらに、関心対象の遺伝子が条件的に発現されるインビトロで遺伝子操作され
た細胞の、ヒトの疾患の有効かつ効率的な治療のための革新的アプローチとしての治療的
適用の裏づけともなる。
【０３８６】
本実施形態において、ベクターは、細胞にパッケージングされることなく対象に投与さ
れる。
【０３８７】
一実施形態において、細胞は、ベクターと共に腫瘍内投与されない。
【０３８８】
別の一実施形態において、細胞内に含有されていない本発明のベクターは、投与される
細胞と同時、その前またはその後に投与される。
【０３８９】
一実施形態において、投薬量は、ベクター投与１サイクル当たり少なくとも約１．０×
１０９ウイルス粒子である。別の一実施形態において、投薬量は、ベクター投与１サイク
ル当たり少なくとも約１．０×１０１０ウイルス粒子である。別の一実施形態において、
投薬量は、ベクター投与１サイクル当たり約１．０×１０９〜約１．０×１０１３ウイル
ス粒子である。別の一実施形態において、投薬量は、ベクター投与１サイクル当たり約１
．０×１０１０〜約１．０×１０１３ウイルス粒子である。別の一実施形態において、投
薬量は、ベクター投与１サイクル当たり約１．０×１０１０、約１．０×１０１１、約１
．０×１０１２または約１．０×１０１３ウイルス粒子である。
【０３９０】
活性化リガンドの投薬量は、約５〜１００ｍｇ／日、例えば、約５、１０、１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、９５または１００ｍｇ／日である。一実施形態において、活性化リガンドは、少な
くとも１日１回投与される。別の一実施形態において、活性化リガンドは、１日１回で約
１４日間投与される。
【０３９１】
一実施形態において、少なくとも２通りのベクター投薬量（例えば、約１×１０１１お
よび１×１０１２）が、少なくとも３通りの異なる投薬量レベルの活性化リガンド（例え
ば、約５ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日）と組み合わせて用いられる。
【０３９２】
当業者であれば、様々な程度の活性化リガンド活性化に対するベクターの有効血漿レベ
ルの範囲を得るため、投薬量を最適化できるであろう。
【０３９３】
一実施形態において、対象に投与される活性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投
与サイクル内の活性化リガンドの投与期間にわたって変化する。別の一実施形態において
、対象に投与される活性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投与サイクル内の活性化
リガンドの投与期間にわたって減少する。別の一実施形態において、対象に投与される活
性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投与サイクル内の活性化リガンドの投与期間に
わたって増加（増大）する。
【０３９４】
一実施形態において、対象は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０サイクルの
ベクター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、３〜７サイクルのベ
クター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、４〜６サイクルのベク
ター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、５または６サイクルのベ
クター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、６サイクルのベクター
投与により治療される。
【０３９５】
一実施形態において、ベクター投与の各サイクルは、１、２、３、４、５、６、７、８
、９または１０週間間隔で実施される。別の一実施形態において、ベクター投与の各サイ
クルは、４週間間隔で実施される。
【０３９６】
一実施形態において、ベクターの投薬量は、ベクター投与の続くサイクルのそれぞれに
おいて変化する。別の一実施形態において、ベクターの投薬量は、ベクター投与の続くサ
イクルのそれぞれにおいて減少する。別の一実施形態において、ベクターの投薬量は、ベ
クター投与の続くサイクルのそれぞれにおいて増加する。
【０３９７】
一実施形態において、本発明は、また、薬学的に許容される担体と、細胞内に含有され
ていない本発明のベクターとを含む医薬組成物を提供する。適切な担体として、生理食塩
水、蒸留水、塩化ナトリウム溶液、塩化ナトリウムおよび無機塩の混合物またはその類似
の混合物、マンニトール、ラクトース、デキストランおよびグルコース等の材料の溶液、
グリシンおよびアルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液およびグルコース
溶液の混合物、製剤に等張性を付与する抗酸化剤、キレート化剤、バッファー、静菌薬お
よび溶質を含有しうる水性および非水性の等張性無菌注射溶液ならびに懸濁剤、溶解剤、
増粘剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられるが、
これらに限定されるものではない。製剤は、アンプルおよびバイアル等、単位用量または
複数用量の密封容器に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体担体、例えば、
水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。
【０３９８】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に含有される。一実施形
態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、線虫細胞、昆
虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、無脊椎動
物宿主細胞、脊椎動物宿主細胞、酵母細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハム
スター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤ
ギ細胞、雌ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパ
ンジー細胞またはヒト細胞からなる群から選択される。
【０３９９】
一実施形態において、宿主細胞は、心臓細胞または筋細胞ではない。
【０４００】
宿主細胞形質転換は、当技術分野においてよく知られており、エレクトロポレーション
、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介
性トランスフェクション、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換、微粒
子銃等が挙げられるがこれらに限定されない、様々な方法により達成することができる。
所望の遺伝子産物の発現は、適切な条件下における形質転換宿主細胞の培養および形質転
換された遺伝子の発現誘導に関与する。原核および真核細胞における培養条件および遺伝
子発現プロトコールは、当技術分野においてよく知られている。細胞を収集し、遺伝子産
物に特異的なプロトコールに従って遺伝子産物を単離することができる。
【０４０１】
本明細書において引用された任意の参照文献の任意の教示または示唆と本明細書との間
に矛盾がある場合は、本発明においては後者が優先するものとする。
【０４０２】
本明細書において引用された特許、特許出願および刊行物はすべて、それらの全体が参
照により全面的に組み入れられる。
【０４０３】
前述した実施形態および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと
、ならびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての実施形態および例示を
、本明細書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図してい
ることが理解されるべきである。
【０４０４】
２００８年１０月８日に提出された、「遺伝子操作された樹状細胞および癌の治療のた
めの使用」と題する米国特許出願第１２／２４７，７３８号は、その全体が参照により本
明細書に組み入れられる。２００８年９月２９日に提出された、「生物治療用分子の発現
のための治療用遺伝子−スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにそれらの使用
」と題する米国特許出願第１２／２４１，０１８号も、その全体が参照により本明細書に
組み入れられる。
【０４０５】
本発明の実施形態は、次の記載も包含する（「Ｅ」は、「実施形態」を示す）。
【０４０６】
Ｅ１．  哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または増強する
方法であって、
（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に投与
する段階と、
（ｂ）ＥＰＯをコードするウイルスポリヌクレオチドからＥＰＯ発現を誘導するアクチベ
ーターリガンドを投与する段階と
を含み、
アデノ随伴ウイルスが、筋肉内投与され、
アデノ随伴ウイルスが、遺伝子スイッチをさらに含み、遺伝子スイッチが、プロモータ
ーに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列を含み、少なくとも１つの転写因
子配列によってコードされる少なくとも１つの転写因子が、リガンド依存性転写因子であ
り、
アデノ随伴ウイルスが、ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された第
二のプロモーターをさらに含み、第二のプロモーターが、アクチベーターリガンドの投与
後に、少なくとも１つのリガンド依存性転写因子により活性化される、方法。
【０４０７】
Ｅ２．  哺乳動物がヒトである、実施形態Ｅ１に記載の方法。
【０４０８】
Ｅ３．  ＥＰＯの発現が、アクチベーターリガンドの投与される用量（単数または複数）
を制御することにより誘導、調節または増強される、実施形態Ｅ１またはＥ２に記載の方
法。
【０４０９】
Ｅ４．  アクチベーターリガンドが、正常生理範囲内のＥＰＯ発現レベルの誘導または維
持に十分な用量（単数または複数）で投与（adminster）される、実施形態Ｅ１〜Ｅ３の
いずれか一実施形態に記載の方法。
【０４１０】
Ｅ５．  ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドが、配列番号６または配列番号８（ヒトＥ
ＰＯ）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか一実施形
態に記載の方法。
【０４１１】
Ｅ６．  哺乳動物においてヘマトクリットまたは血液中の赤血球細胞の容積パーセンテー
ジが増加する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４１２】
Ｅ７．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリヌ
クレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連
結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化
されるプロモーターに機能的に連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カ
リクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グル
カゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポ
ネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる
群から選択される、ベクター。
【０４１３】
Ｅ８．  タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、実施形態Ｅ７に記
載のベクター。
【０４１４】
Ｅ９．  ベクターがウイルスベクターである、実施形態Ｅ７またはＥ８に記載のベクター
。
【０４１５】
Ｅ１０．  ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス
およびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態Ｅ９に記
載のベクター。
【０４１６】
Ｅ１１．  遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチであ
る、実施形態Ｅ７〜Ｅ１０のいずれか一実施形態に記載のベクター。
【０４１７】
Ｅ１２．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子
配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転
写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因
子として機能する複合体を形成する、実施形態Ｅ７〜Ｅ１１のいずれか一実施形態に記載
のベクター。
【０４１８】
Ｅ１３．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列に
よってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二
の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、
実施形態Ｅ７〜Ｅ１１のいずれか一実施形態に記載のベクター。
【０４１９】
Ｅ１４．  第一の転写因子配列および第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム
進入部位（ＩＲＥＳ）により接続される、実施形態Ｅ７〜Ｅ１３のいずれか一実施形態に
記載のベクター。
【０４２０】
Ｅ１５．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９（ヒトミエリン塩基性
タンパク質）にコードされるアミノ酸に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態
Ｅ７〜Ｅ１４のいずれか一実施形態に記載のベクター。
【０４２１】
Ｅ１６．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１０（ヒトＣ１エステラ
ーゼ阻害剤）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１５のいずれか
一実施形態に記載のベクター。
【０４２２】
Ｅ１７．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１１（エカランチド）に
対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％また
は１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１６のいずれか一実施形態に記
載のベクター。
【０４２３】
Ｅ１８．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１４または配列番号１５（プロスタグランジン合成酵素）に対し少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミ
ノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１７のいずれか一実施形態に記載のベクター。
【０４２４】
Ｅ１９．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１７（ＧＬＰ−１）また
は配列番号１８（ＧＬＰ−２）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜
Ｅ１７のいずれか一実施形態に記載のベクター。
【０４２５】
Ｅ２０．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１９（アディポネクチン
）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１７のいずれか一実施形態
に記載のベクター。
【０４２６】
Ｅ２１．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２０（レプチン）に対し
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１
００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１７のいずれか一実施形態に記載の
ベクター。
【０４２７】
Ｅ２２．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２１（ＣＦＴＲ）に対し
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１
００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ７〜Ｅ１７のいずれか一実施形態に記載の
ベクター。
【０４２８】
Ｅ２３．  １つまたは複数のタンパク質を発現する細胞集団を作製する方法であって、１
つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより細胞を改変する段階
を含み、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレ
オチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結さ
れた少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化され
るプロモーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻
害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプ
チド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レ
プチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択さ
れる、方法。
【０４２９】
Ｅ２４．  タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、実施形態Ｅ２３
に記載の方法。
【０４３０】
Ｅ２５．  ベクターがウイルスベクターである、実施形態Ｅ２３またはＥ２４に記載の方
法。
【０４３１】
Ｅ２６．  ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス
およびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態Ｅ２５に
記載の方法。
【０４３２】
Ｅ２７．  遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチであ
る、実施形態Ｅ２３〜Ｅ２６のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４３３】
Ｅ２８．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子
配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転
写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因
子として機能する複合体を形成する、実施形態Ｅ２３〜Ｅ２７のいずれか一実施形態に記
載の方法。
【０４３４】
Ｅ２９．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列に
よってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二
の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、
実施形態Ｅ２３〜Ｅ２７のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４３５】
Ｅ３０．  第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）により接続される、実施形態Ｅ２９に記載の方法。
【０４３６】
Ｅ３１．  １つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより改変さ
れた細胞集団であって、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含
み、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに
機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）Ｃ１エステラーゼ阻害剤、
カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グ
ルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディ
ポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からな
る群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む
、細胞集団。
【０４３７】
Ｅ３２．  タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、実施形態Ｅ３１
に記載の細胞集団。
【０４３８】
Ｅ３３．  ベクターがウイルスベクターである、実施形態Ｅ３１またはＥ３２に記載の細
胞集団。
【０４３９】
Ｅ３４．  ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス
およびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態Ｅ３３に
記載の細胞集団。
【０４４０】
Ｅ３５．  遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチであ
る、実施形態Ｅ３１〜Ｅ３４のいずれか一実施形態に記載の細胞集団。
【０４４１】
Ｅ３６．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子
配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転
写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因
子として機能する複合体を形成する、実施形態Ｅ３１〜Ｅ３５のいずれか一実施形態に記
載の細胞集団。
【０４４２】
Ｅ３７．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列に
よってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二
の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、
実施形態Ｅ３１〜Ｅ３５のいずれか一実施形態に記載の細胞集団。
【０４４３】
Ｅ３８．  第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）により接続される、実施形態Ｅ３７に記載の集団。
【０４４４】
Ｅ３９．  哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する細胞集団を投与する段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法。
【０４４５】
Ｅ４０．  哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤
、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド
１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチ
ンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される
、方法。
【０４４６】
Ｅ４１．  タンパク質のうち少なくとも１つが、Ｃ１エステラーゼ阻害剤であり、疾患が
、血管浮腫、遺伝性血管浮腫、敗血症、凝固性亢進、肺性機能障害、低酸素血症、出血性
膵炎（pancreaitis）、心筋梗塞、肺移植、外傷、熱傷または血管漏出からなる群から選
択される、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に記載の方法。
【０４４７】
Ｅ４２．  タンパク質のうち少なくとも１つが、カリクレイン阻害剤であり、疾患が、血
管浮腫、遺伝性血管浮腫、アテローム血栓症、冠動脈疾患、アルツハイマー病、炎症性腸
疾患、クローン病、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、ブラジキニン介在性炎症および接触
系の疾患、状態または障害からなる群から選択される、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に記
載の方法。
【０４４８】
Ｅ４３．  タンパク質のうち少なくとも１つが、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤であり、
疾患が、血管浮腫、遺伝性血管浮腫、ブラジキニン介在性炎症、糸球体硬化症、アルツハ
イマー病、大脳浮腫、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、疼痛、炎症、外傷、火傷、ショッ
ク、アレルギーおよび心血管疾患からなる群から選択される、実施形態Ｅ３９またはＥ４
０に記載の方法。
【０４４９】
Ｅ４４．  タンパク質のうち少なくとも１つが、プロスタグランジン合成酵素であり、疾
患が、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、特発性肺動脈性肺高血圧症、家族性
肺動脈性肺高血圧症、続発性肺動脈性肺高血圧症、肺静脈閉塞症、肺毛細血管の血管腫症
、新生児の遷延性肺高血圧症からなる群から選択される、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に
記載の方法。
【０４５０】
Ｅ４５．  タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）
であり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、実施形態Ｅ３９また
はＥ４０に記載の方法。
【０４５１】
Ｅ４６．  タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）
であり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、実施形態Ｅ３９また
はＥ４０に記載の方法。
【０４５２】
Ｅ４７．  タンパク質のうち少なくとも１つが、アディポネクチンであり、疾患が、糖尿
病または他の代謝性疾患もしくは障害である、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に記載の方法
。
【０４５３】
Ｅ４８．  タンパク質のうち少なくとも１つが、レプチンであり、疾患が、糖尿病または
他の代謝性疾患もしくは障害である、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に記載の方法。
【０４５４】
Ｅ４９．  タンパク質のうち少なくとも１つが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子
（ＣＦＴＲ）であり、疾患が、嚢胞性線維症である、実施形態Ｅ３９またはＥ４０に記載
の方法。
【０４５５】
Ｅ５０．  哺乳動物における多発性硬化症を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびイ
ンターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）からなる群から選択される、方法。
【０４５６】
Ｅ５１．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９（ヒトミエリン塩基性
タンパク質）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ５０に記載の方法。
【０４５７】
Ｅ５２．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１７（インターフェロン
−ベータ）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ５０に記載の方法。
【０４５８】
Ｅ５３．  １つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および
インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）の両方を含む、実施形態Ｅ５０に記載の方法。
【０４５９】
Ｅ５４．  タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、実施形態Ｅ５０
〜Ｅ５３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４６０】
Ｅ５５．  ベクターがウイルスベクターである、実施形態Ｅ５０〜Ｅ５４のいずれか一実
施形態に記載の方法。
【０４６１】
Ｅ５６．  ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス
およびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態Ｅ５５に
記載の方法。
【０４６２】
Ｅ５７．  遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチであ
る、実施形態Ｅ５０〜Ｅ５６のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４６３】
Ｅ５８．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子
配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転
写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因
子として機能する複合体を形成する、実施形態Ｅ５０〜Ｅ５７のいずれか一実施形態に記
載の方法。
【０４６４】
Ｅ５９．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列に
よってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二
の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、
実施形態Ｅ５０〜Ｅ５７のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４６５】
Ｅ６０．  第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）により接続される、実施形態Ｅ５９に記載の方法。
【０４６６】
Ｅ６１．  哺乳動物における炎症性腸疾患またはクローン病を治療するための方法であっ
て、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与
する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポ
リヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少な
くとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された
１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これによ
り１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質のうち１つがインターロイキン−１０（ＩＬ−１０
）である、方法。
【０４６７】
Ｅ６２．  １つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２２（インターロイキン
−１０）に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｅ６１に記載の方法。
【０４６８】
Ｅ６３．  インターロイキン−１０が、ヒトＩＬ−１０タンパク質である、実施形態Ｅ６
１またはＥ６２に記載の方法。
【０４６９】
Ｅ６４．  ベクターがウイルスベクターである、実施形態Ｅ６１〜Ｅ６３のいずれか一実
施形態に記載の方法。
【０４７０】
Ｅ６５．  ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス
およびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態Ｅ６４に
記載の方法。
【０４７１】
Ｅ６６．  遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチであ
る、実施形態Ｅ６１〜Ｅ６５のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４７２】
Ｅ６７．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子
配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転
写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因
子として機能する複合体を形成する、実施形態Ｅ６１〜Ｅ６６のいずれか一実施形態に記
載の方法。
【０４７３】
Ｅ６８．  遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御
下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列に
よってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二
の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、
実施形態Ｅ６１〜Ｅ６６のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４７４】
Ｅ６９．  第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）により接続される、実施形態Ｅ６８に記載の方法。
【０４７５】
Ｅ７０．  実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクターまたはＥ３１〜
Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む組成
物。
【０４７６】
Ｅ７１．  全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内（intravertebrally）
、脳内、くも膜下腔内、皮内または皮下投与される、実施形態Ｅ７０に記載の組成物。
【０４７７】
Ｅ７２．  実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクターまたはＥ３１〜
Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む薬物
。
【０４７８】
Ｅ７３．  全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内、脳内、くも膜下腔内
、皮内または皮下投与される、実施形態Ｅ７２に記載の薬物。
【０４７９】
Ｅ７４．  実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクターまたは実施形態
Ｅ３１〜Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団を含むキット。
【０４８０】
Ｅ７５．  実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクターまたは実施形態
Ｅ３１〜Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団および遺伝子スイッチを活性化す
るリガンド。
【０４８１】
Ｅ７６．  リガンドがジアシルヒドラジンである、実施形態Ｅ７５に記載のベクターまた
は細胞集団とリガンド。
【０４８２】
Ｅ７７．  ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ
−１１５９３２である、実施形態Ｅ７６に記載のベクターまたは細胞集団とジアシルヒド
ラジンリガンド。
【０４８３】
Ｅ７８．  リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、
実施形態Ｅ７５に記載のベクターまたは細胞集団とリガンド。
【０４８４】
Ｅ７９．  リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、ジアシルヒドラジンである、実
施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクター、実施形態Ｅ２３〜Ｅ３０お
よび実施形態Ｅ３９〜Ｅ６９のいずれか一実施形態に記載の方法、実施形態Ｅ３１〜Ｅ３
８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団。
【０４８５】
Ｅ８０．  ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ
−１１５９３２である、実施形態Ｅ７９に記載のベクター、方法または細胞集団。
【０４８６】
Ｅ８１．  リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、アミドケトン（amidoketone）
またはオキサジアゾリンである、実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベ
クター、実施形態Ｅ２３〜Ｅ３０およびＥ３９〜Ｅ６９のいずれか一実施形態に記載の方
法、実施形態Ｅ３１〜Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の集団。
【０４８７】
Ｅ８２．  実施形態Ｅ７〜Ｅ２２のいずれか一実施形態に記載のベクターまたは実施形態
Ｅ３１〜Ｅ３８のいずれか一実施形態に記載の細胞集団およびリガンドを含むキット。
【０４８８】
Ｅ８３．  リガンドがジアシルヒドラジンである、実施形態Ｅ８２に記載のキット。
【０４８９】
Ｅ８４．  ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ
−１１５９３２である、実施形態Ｅ８３に記載のキット。
【０４９０】
Ｅ８５．  リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、
実施形態Ｅ８２に記載のキットおよびリガンド。
【実施例】
【０４９１】
〔実施例１〕
Ｂ１６Ｆ０メラノーマモデルにおける局所的および対側性腫瘍に対するＡｄ−ＲＴＳ−ｍ
ＩＬ１２の局所注射の効果
本出願人らは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２による局所的腫瘍の処置（局所的腫瘍成長の
退行をもたらす）が、遠位腫瘍においても抗腫瘍活性を生じるか調査した。この目標に向
けて、本出願人らは、免疫担当性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両側腹部領域にメラノーマ
腫瘍を発生させ、右側腹部における腫瘍を、アクチベーターリガンドの存在下、Ａｄ−Ｒ
ＴＳ−ｍＩＬ１２で処置した。
【０４９２】
６〜８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウスをＨａｒｌａｎ（米国）から購入した。動物の
ケアおよび実験手順はＩｎｔｒｅｘｏｎの施設内実験動物委員会（Intrexon's Instituti
onal Animal Care and Use Committee）ガイドラインに従い実施した。
【０４９３】
ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）からマウスメラノーマ（Ｂ１６Ｆ０）細胞を購入
した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）においてＢ１
６Ｆ０細胞を増殖させた。ＤＭＥＭに、熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％ｖ／ｖ、２
ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、ジョージア
州ローレンスビル）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌストレプ
トマイシンを補充した。細胞は５％ＣＯ２中３７℃において増殖させた。すべての細胞系
を通常通り試験し、マイコプラズマ（mycoplasma）がないことを確認した。
【０４９４】
合計４５匹のＣ５７ＢＬ／６動物の右および左後側腹部に、マウスメラノーマ、Ｂ１６
Ｆ０（ＡＴＣＣ）、１ｅ５細胞／５０ｕｌを皮下接種した。１２日後、肉眼で腫瘍が見え
るようになったら、下表に示す通り動物１０匹の４群に動物をランダム化した。処置なし
（群１）、アクチベーター単独（群２）、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２単独（１×１０１０
ｖｐ用量、群３）およびＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２（１×１０１０ｖｐ用量）と、固形飼
料中に存在するアクチベーターリガンド（１０００ｍｇ／ｋｇ固形飼料、群４）。
【０４９５】
アクチベーターリガンドを与えるコホートには、実験終了までにアクチベーターリガン
ドＲＧ−１１５９３２を配合したげっ歯類固形飼料を自由に（ad libitum）与えた。アク
チベーターを与えないコホートには、標準的な食餌を与え続けた。
【０４９６】
腫瘍細胞接種後１２日目および１９日目にベクターを腫瘍内投与した。各マウスの腫瘍
サイズおよび体重を実験終了まで週に３回モニターした。その累積腫瘍サイズが１０００
ｍｍ３を超えたとき、または３日間を超えて体重減少＞１５％を示したときに、動物を屠
殺した。実験が完了したら、残る全動物を安楽死させた。
【０４９７】
式、Ｌ×Ｗ２／２を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍サイズは、平均値±ＳＥとして示
す。統計解析は、両側ｔ検定を用いて行った。群の間の差がｐ＜０．０５である場合、有
意であると考慮される。
【０４９８】
【表６】
2017141245.tif 000019
【０４９９】
右側腹部における腫瘍が平均体積４４ｍｍ３に達したときに、処置を開始した。限局的
送達のため、１ｅ１０ｖｐのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２による腫瘍内注射を右の腫瘍に７
日間空けて２回行った。これらの動物に、アクチベーターリガンド固形飼料（１０００ｍ
ｇ／ｋｇ）を与えた。対照動物に、処置なし、あるいはアクチベーターリガンド（１００
０ｍｇ／ｋｇ）単独、あるいはアクチベーターなしのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２のいずれ
かを与えた。ベクター投与２４時間前に、表示のコホートに、アクチベーターリガンド（
１０００ｍｇ／ｋｇ）を与えた。これらの動物は、腫瘍進行または退行のいずれかの徴候
に関して週に３度モニターした。図１Ａに示す通り、アクチベーターリガンド処置ありま
たは処置なしの対照動物は、細胞接種後２１日目にそれぞれ９２４±８０ｍｍ３および８
８４±１４２ｍｍ３の平均腫瘍体積を有していた。
【０５００】
対照的に、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２＋アクチベーターリガンドで処置した腫瘍は、８
６±１３８ｍｍ３の腫瘍体積を有しており、このため、処置なしの動物と比較して統計学
的に有意な（ｐ＜０．０００１）ほぼ９１％腫瘍成長阻害を示す。アクチベーターリガン
ドなしのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２は、腫瘍体積５６５±３０５ｍｍ３を有しており、対
照動物と比べて有意ではなかった（ｐ＜０．０７）。これらのデータは、アクチベーター
リガンドなしのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２が、腫瘍成長にほとんど影響を与えなかったが
、アクチベーターリガンド存在下のＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２は、顕著な抗腫瘍活性を有
していたことを実証した。
【０５０１】
重要なことに、処置なしの対照群における注射なし対側性腫瘍（１０１９±２３３ｍｍ
３）と比較して、右側腹部腫瘍にＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２プラスリガンドを与えた動物
は、注射なし左側腹部腫瘍（１８９±２３１ｍｍ３）の統計学的に有意な（ｐ＜０．００
５）８１％の腫瘍成長阻害を示した（図１Ｂ）。しかし、リガンド処置腫瘍なしのＡｄ−
ＲＴＳ−ｍＩＬ１２に関し、対側の未処置腫瘍における有意な低下は見られなかった。Ａ
ｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２単独またはアクチベーターリガンド単独のいずれかで処置した対
照群における腫瘍と共に、対側の注射なし腫瘍は、腫瘍移植２１日後に、より急速に成長
し続けた。これらのデータは、原発腫瘍においてＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２プラスリガン
ドによる処置後に生じた腫瘍細胞に対する全身性免疫応答が、遠位未処置腫瘍において観
察された抗腫瘍効果の原因となりうることを示唆する。
【０５０２】
本実験において、毒性の関数として体重を測定した。実験が完了するまで週に３回動物
を秤量した。いずれかの有害および処置関連副作用の顕性の徴候に関してマウスを頻繁に
観察した。許容される毒性は、実験における１５％未満の平均体重減少として定義される
。本実験における全処置は、優れた耐容性を示した。最大平均体重減少は、許容される限
度内（＜１５％）（図２）であり、処置関連死は見られなかった。しかし、本出願人らは
、全群において孤発性の死亡を見出した。
【０５０３】
免疫系が、腫瘍特異的抗原を認識し、悪性細胞を根絶できることは十分に確立されてい
る（Brunda, M.J. et al., J. Exp. Med. 178: 1223‐1230(1993); Brunda, M.J. et al.
, Cancer Chemother. Pharmacol. 38(Suppl): S16‐S21(1996);およびGolab J. et al., 
Int. J. Mol. Med. 3(5):537-44(1999)）。しかし、癌治療における治療目的に免疫系を
役立てる能力は、依然として定義が難しい。この戦略は、全身毒性を誘導することなく腫
瘍成長を低下させるため（Komita, H. et al, Cancer Gene Ther. 16: 883-91(2009)）、
また、免疫系を活性化させて遠位および転移性の癌を死滅させるための、調節されたＩＬ
−１２発現を行う複製欠損ウイルスベクター、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２の腫瘍内注射の
使用に関与する。
【０５０４】
本実験において、アクチベーターリガンドの存在下におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２
による、確立された腫瘍への腫瘍内注射は、Ｂ１６Ｆ０モデルにおける腫瘍成長を阻害し
た。そこで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける両側性の確立された皮下Ｂ１６Ｆ０腫瘍モデ
ルを用いて、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２による片側への腫瘍内注射が、注射した腫瘍およ
び対側の注射していない腫瘍の両方の成長の有意な低下をもたらしたことを実証した。こ
の抗腫瘍効果は、アクチベーターリガンド単独またはアクチベーターリガンドなしＡｄ−
ＲＴＳ−ｍＩＬ１２で処置した動物と比較して有意であった。これらの結果は、腫瘍微小
環境へのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ１２の直接送達が、治療上の利益をもたらし、転移性癌細
胞に対し保護的抗腫瘍免疫を生じることを示唆する。
【０５０５】
〔実施例２〕
ＩＬ−１２およびＩＦＮアルファ併用療法
現在の癌免疫療法は、臨床においてある程度の成果しか提供せず、抗腫瘍免疫応答の有
効性をさらに増強するための革新的な戦略が必要とされる。本実験は、マウスＩＬ−１２
またはＩＦＮａの発現調節のため、誘導性プロモーターシステムである新規Ｒｈｅｏｓｗ
ｉｔｃｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＲＴＳ（登録商標））
によるアデノウイルス（Ａｄ）の腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与を利用して、抗腫瘍活性を評価
した。小分子アクチベーターリガンド（ＡＬ）、ＩＮＸＮ−１００１の経口投与は、Ａｄ
−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２におけるＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＦＮａにおけるＩ
ＦＮａの発現を調節する。単独で、あるいは組み合わせてｉ．ｔ．投与されたＡｄ−ＲＴ
Ｓ−ｍＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＦＮａからのＩＬ−１２およびＩＦＮａの発
現調節および治療上の利益を、同一遺伝子ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）および同一遺伝子乳
癌細胞（４Ｔ１）モデルにおいて試験した。
【０５０６】
ＬＬＣモデルにおいて、経口ＡＬ単独（飼料中に１０００ｐｐｍで投与、ほぼ２２５ｍ
ｇ／ｋｇ／ｄａｙの一日量を表す）またはＡＬの非存在下におけるｉ．ｔ．サイトカイン
遺伝子治療法による毎日の処置は、対照、未処置腫瘍と比較して、腫瘍成長の有意な阻害
を生じなかった。対照的に、１０１０ｖｐ  Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２またはＡｄ−Ｒ
ＴＳ−ｍＩＦＮａによるｉ．ｔ．注射および毎日の経口ＡＬは、２５日目までに有意な腫
瘍成長阻害をもたらした（それぞれ７２および７１％；ｐ＜０．０５）。特に、Ａｄ−Ｒ
ＴＳ−ｍＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＦＮａと経口ＡＬによるＬＬＣ腫瘍処置の
組合せは、体重変化がないと評価されたことから顕性の毒性がなく、いずれかの処置単独
と比較して有意な抗腫瘍効果を生じた（９７％成長阻害；ｐ＜０．０５）。４Ｔ１モデル
において、１０１０ｖｐのＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２によるｉ．ｔ．処置プラスＡＬま
たはＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＦＮａプラスＡＬは、対照未処置腫瘍と比較して、３４日目まで
に腫瘍成長の５８および５３％阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。特に、Ａｄ−ＲＴＳ
−ｍＩＬ−１２プラスＡＬおよびＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＦＮａプラスＡＬ両方による同時処
置は、８０％成長阻害による抗腫瘍活性の増強をもたらした。これらのデータは、ＡＬと
同時に行われる、ＡｄベクターにおけるＲＴＳ調節されたＩＬ−１２およびＩＦＮａを用
いた組合せ処置戦略が、高悪性度マウス腫瘍に対し有効治療活性を誘導することを示す。
将来的な研究は、ＩＬ−１２およびＩＦＮαの両方が上述の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効
果を発揮する機序を調査するであろう。
【０５０７】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、数種の感染症および悪性疾患の治療に用い
られる強力な多面的サイトカインである。ＩＬ−１２抗腫瘍活性は、直接的な腫瘍細胞の
細胞毒性、抗血管新生特性ならびにナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８
＋Ｔ細胞の活性化等、免疫調節活性の増強に媒介される。これらの抗腫瘍効果にもかかわ
らず、ヒトにおける組換えＩＬ−１２の全身注入は、重篤な全身毒性をもたらし、これに
よりその臨床上の用途が著しく限定される。
【０５０８】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮａ）は、強力な抗ウイルスおよび抗腫瘍効果を有す
るサイトカインである。ＩＦＮａの投与は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖を
刺激し、腫瘍細胞の細胞毒性、抗血管新生作用（anti-angiogensis）ならびに主要組織適
合抗原（ＭＨＣ）、腫瘍抗原および接着分子の発現増加をもたらす。ＩＬ−１２と同様に
、高レベルのＩＦＮａも、インフルエンザ様症候群、重篤な悪心、疲労および抑うつ状態
等、重篤な副作用を呈する。
【０５０９】
したがって、これらのサイトカインの発現レベルを制御する必要が明らかにある。ＲＴ
Ｓ（商標）（Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、経口
により生物が利用できる小分子薬であるアクチベーターリガンドである、ＩＮＸＮ−１０
０１を用いた遺伝子発現の制御を可能にする新規調節システムを表す。サイトカイン発現
を制御するためにＲＴＳ技術を利用して、本出願人らは、Ａｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２形質
導入した樹状細胞を用いて、より最近では、Ａｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２の直接的な腫瘍内
（ＩＴ）注射のいずれかを用いて、数種の前臨床動物モデルにおける腫瘍成長低下を以前
に実証した。これは、ステージＩＩＩ／ＩＶ悪性メラノーマ患者の腫瘍病変への直接的な
Ａｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２の第１相臨床治験の開始を導いた。
【０５１０】
コンビナトリアル治療法は、前臨床モデルのみならず臨床における有望な可能性を示し
ている。したがって、本実験において、本出願人らは、２種の異なる同一遺伝子腫瘍モデ
ル、ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）および４Ｔ１乳癌における、ＩＴ同時投与されたＡｄ−Ｒ
ＴＳ−ＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ＩＦＮａの相乗効果に取り組む。
【０５１１】
ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）は、３種の
基礎成分：（１）誘導性プロモーター；（２）リガンド誘導性転写因子および同時活性化
パートナー；（３）ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈアクチベーターリガンド（ＡＬ）を含有する。
【０５１２】
リガンドの非存在下で、スイッチタンパク質複合体は、「オフ（off）」シグナルをも
たらす。対照的に、リガンドの存在下では、複合体は、立体構造を変化させ、標的遺伝子
発現のための用量依存的「オン（on）」シグナルをもたらす。インビボにおいて、経口投
与されたＡＬは、２４時間以内に遺伝子発現のスイッチを入れ、ＡＬを中断すると、遺伝
子発現は、約２４時間以内にベースラインレベルに戻る。
【０５１３】
ＬＬＣおよび４Ｔ１細胞に、１００ＭＯＩのＡｄ−ＲＴＳ−マウスＩＬ１２またはＡｄ
−ＲＴＳ−マウスＩＦＮａを一過的に形質導入した。遺伝子発現を誘導するため、７５ｎ
Ｍ濃度のアクチベーターリガンドＩＮＸＮ−１００１を培養培地に添加した、あるいは対
照として０．１％ＤＭＳＯで処置した。４８時間目に上清を収集し、ＥＬＩＳＡによりサ
イトカインレベルを評価した。ｎ＝３、平均値±ｓ．ｄ．。結果を図３に示す。
【０５１４】
ＬＬＣおよび４Ｔ１細胞に、１００ＭＯＩのＡｄ−ＲＴＳ−マウスＩＬ１２またはＡｄ
−ＲＴＳ−マウスＩＦＮａを一過的に形質導入した。遺伝子発現を誘導するため、７５ｎ
Ｍ濃度のアクチベーターリガンドＩＮＸＮ−１００１を培養培地に添加した、あるいは対
照として０．１％ＤＭＳＯで処置した。４８時間目に上清を収集し、ＥＬＩＳＡによりサ
イトカインレベルを評価した。ｎ＝３、平均値±ｓ．ｄ．。結果を図に示す。特定の日に
おけるアデノウイルスの腫瘍内投与を、図４における矢印で示す。対照は、アクチベータ
ーリガンド（ＩＮＸＮ−１００１）処置ありまたはなしの、ＰＢＳおよびＡｄ−ＲＴＳ−
Ｌｕｃ注射マウスを包含したが、これらは、腫瘍サイズにおける効果が生じなかったため
グループ化された。腫瘍阻害のパーセンテージは、グラフにおいて報告され、対照および
単一サイトカイン治療群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１）。ｎ＝５、平均値±ｓ．
ｅ．ｍ．。
【０５１５】
別個の実験において、本出願人らは、マウスに１×１０５の４Ｔ１癌細胞をｓ．ｃ．経
路で注射した。腫瘍が触知できるサイズに達したら、マウスをランダム化して、腫瘍内投
与Ａｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２および／またはＡｄ−ＲＴＳ−ＩＦＮａ（１０１０ｖｐ／マ
ウス／ベクター）単独または組合せによる処置群に分けた。腫瘍内注射後４８時間目に血
清および腫瘍を収集した。対照は、ＩＮＸＮ−１００１アクチベーターリガンドありまた
はなしのＰＢＳおよびＡｄ−ＲＴＳ−Ｌｕｃ注射したマウスを包含し、これらは、腫瘍サ
イズにおける効果が生じなかったためグループ化された。ＩＮＸＮ−１００１をＬａｂｒ
ａｓｏｌに処方し、経口経管栄養により毎日送達した。血清および腫瘍ホモジネートを用
いて循環および腫瘍内におけるサイトカインレベルを評価し、ＥＬＩＳＡにより検出した
。ｎ＝４、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．。結果を図５に示す。
【０５１６】
ＬＬＣおよび４Ｔ１（今週中の結果）細胞に、各ベクター５００ＭＯＩ濃度のＡｄ−Ｒ
ＴＳ−ＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ＩＦＮａ単独または組合せを形質導入した。形質
導入した細胞を、７５ｎｍ  ＩＮＸＮ−１００１または０．１％ＤＭＳＯの存在下で４８
時間培養した。サイトカイン解析のために細胞培養上清を収集した。ＭＨＣクラスＩ発現
のフローサイトメトリー解析のために細胞も収集した。ｎ＝２〜３、平均値±ｓ．ｄ．。
結果を図６に示す。
【０５１７】
データは、腫瘍成長を阻害するＩＬ１２およびＩＦＮａサイトカインの相乗効果を実証
する。ＩＬ−１２は、腫瘍成長を低下させることが以前に示されたが、ＬＬＣおよび４Ｔ
１モデルにおける腫瘍成長低下により測定された通り、Ａｄ−ＲＴＳ−ＩＦＮａとの組合
せは、有効性を有意に増強させた。特に、サイトカイン発現後に毒性は観察されず、Ｒｈ
ｅｏｓｗｉｔｃｈシステムによるＩＬ１２およびＩＦＮａの発現調節を実証した。機構的
に、ＩＦＮａは、腫瘍細胞におけるＭＨＣ−Ｉ発現を誘発し、これにより細胞死の増大化
をもたらす。追加的なＭＯＡ実験は、現在進行中である。
【０５１８】
全体的に見て、安全で制御された誘導性様式で送達されたサイトカイン組合せは、ヒト
集団に罹患し易い高悪性度腫瘍を治療するための新規戦略を表す。
【０５１９】
〔実施例３〕
方法
次の実施例４〜８における実験は、次の通りに行った。
【０５２０】
動物
メスＣ３Ｈ／ＨおよびＢａｌｂ／ｃマウス、６〜８週齢をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの施設内実験動
物委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）に従って動物を維持および
処置した。動物に、水と、Ｈａｒｌａｎから購入したアルファルファ不含固形飼料、１８
％タンパク質含有を与えた。
【０５２１】
麻酔下の動物において全手順を行った。四頭筋周囲の部位を、ＤＮＡ注射の１時間前に
５０Ｕ（５０μｌ最終容量における）のＨｙｌａｎｅｘ（ｒＨｕＰＨ２０、Ｈａｌｏｚｙ
ｍｅ）で前注射した。小さな切開を作り、四頭筋を露出して、２９ゲージ（guage）針を
装着したツベルクリンシリンジを用いて、最終容量１００ｕｌにおける２５０ｕｇの前臨
床グレードＲＴＳ−ｈＥＰＯプラスミドを注射した。切開を手早く縫合した。２針電極（
５ｍｍ）を活用して各針をＤＮＡ注射部位の両側に置いて筋肉内に挿入し、ＤＮＡをエレ
クトロポレーションした。５０Ｖ／ｃｍにおける８パルス（２０ｍｓ、１Ｈｚ）を送達し
て、遺伝子移入を増強させた。
【０５２２】
リガンド
ＲＧ−１１５９３２リガンドを、動物の食餌に処方して、１０００ｍｇ／ｋｇの濃度で
与えた。ＯＧのため、リガンドをＬａｂｒａｓｏｌに１０ｍｇ／ｍｌで処方した。
【０５２３】
ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯ（００３４Ａ、００３４Ｂ）の筋肉内投与
動物を麻酔し、その四頭筋を可視化して、注射部位を滅菌した。０．５ｍｌインスリン
シリンジおよび２９．５ゲージ針を用いてマウスにベクターを注射した。各動物に、１０
０ｕｌ容量における合計１０１１ウイルスゲノムを注射した。手順の後、動物をケージ内
に置き、正常歩行運動を観察した。
【０５２４】
タンパク質解析
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、＃０１６３０）を用いて、ヒトエリスロポエチンの存在に関して血漿試料をアッセイ
した。
【０５２５】
ヘマトクリット測定
マウスを後眼窩洞から出血させ、Ｈｅｓｋａ  ＣＢＣ血液学分析機器により試料を測定
した。
【０５２６】
〔実施例４〕
ＡＡＶ−ＲＴＳ−ＨｕＥｐｏの単一筋肉内投与後のマウスにおけるヒトエリスロポエチン
有効性の評価
「ＡＡＶ−ＲＴＳ−ＨｕＥＰＯ」は、アデノ随伴（adeno-assocated）ウイルスベクタ
ー−ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ−ヒトＥ
ＰＯを意味する。シグナルペプチド配列、ヒトエリスロポエチン配列および終止コドンの
核酸配列は、配列番号８に表記されている。
【０５２７】
本実験の目標は、マウスへのＨｕＥＰＯ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性筋肉内（ＩＭ）送達
が、測定可能なｈｕＥＰＯ発現およびヘマトクリット（ＨＣＴ）の同時発生的な増加を達
成するか決定することである。２種のマウス系統、Ｃ３Ｈ／ＨおよびＢＡＬＢ／ｃを用い
て、２種のＡＡＶ−ｈｕＥＰＯベクター、００３４Ａおよび００３４Ｂ（図７Ａおよび図
７Ｂ）を試験した。両方のＡＡＶベクターにおけるｈｕＥＰＯ発現カセットは、誘導性プ
ロモーターの制御下にある。血漿におけるＨｕＥｐｏレベルおよびＨＣＴを毎週測定した
。
【０５２８】
実験開始時に、ベースラインヘマトクリットレベルのためにマウスを出血させ、続いて
動物当たり１０１１ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯウイルスゲノムをＩＭ投与した。ＡＡＶ投与の日
から、動物にアクチベーターリガンド含有固形飼料（１８−１０００）を与えた。対照動
物には、いずれかのベクター投与および正常固形飼料（アクチベーターリガンドなし）を
与えた、あるいはアクチベーターリガンドありまたはなしの賦形剤単独のＩＭ投与（生理
食塩水）を与えた。全群において７日毎にＨＣＴを測定した。アクチベーターリガンドの
存在下でＨｕＥＰＯベクターを与えたどちらの群も、ヘマトクリット上昇を呈した。
【０５２９】
図８に示す通り、対照と比較して、００３４Ａは４０％ＨＣＴ増加を呈し、００３４Ｂ
は２５％ＨＣＴ増加を呈した。実験２９日目に、リガンド誘導因子を除去し、全群に正常
固形飼料を与えた。重要なことに、ヘマトクリットレベルは、アクチベーターリガンドの
除去後２週間までに正常範囲へと減少した。５０日目にリガンド含有固形飼料を再導入し
たところ、再度ＨＣＴ増加をもたらし、６４日目に再度除去し、ＨＣＴの減少をもたらし
た。
【０５３０】
これらのデータは、生理変化を媒介するＡＡＶ−ｈｕＥＰＯベクターの単一ＩＭ投与後
のＨｕＥＰＯ発現の調節を実証する。アクチベーターリガンドの存在下で、ＨＣＴの増加
を伴いつつ、高レベルのＨｕＥＰＯが発現した。アクチベーターリガンドを除去すると、
ＨＣＴは正常範囲内に低下する。ＨｕＥＰＯ発現およびその後のＨＣＴ増加は、アクチベ
ーターリガンドの導入により少なくとも２回誘導されうる。
【０５３１】
〔実施例５〕
Ｃ３Ｈ／ＨおよびＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＨｕＥＰＯの発現調節（Regualted）
処置したＣ３Ｈ／Ｈマウスの血漿におけるＨｕＥＰＯの存在をＥＬＩＳＡにより評価し
た。両方のＡＡＶ−ｈｕＥＰＯベクターによるＨｕＥＰＯ発現を検出した。図９に示す通
り、ＨｕＥＰＯ発現レベルは、正常ヒト生理レベル（正常ヒトＥＰＯレベルは、４〜２４
ｍＵ／ｍｌである）よりも４倍高かった。血漿ＨｕＥＰＯレベルは、００３４Ｂベクター
を与えた動物と比較して、００３４Ａで処置した動物において１０倍高かった。対照動物
においてＨｕＥＰＯ発現は検出されなかった。ＨｕＥＰＯ発現レベルは、７日目と１４日
目の間にピークになり、１４〜２８日目に定常状態を維持した。
【０５３２】
重要なことに、ＨｕＥＰＯ発現は、ＨＣＴ増加に平行し、ｈｕＥＰＯ発現の誘導と測定
可能なＨＣＴ変化との間に予想される遅延時間を呈した（ＥＰＯに応答して赤血球細胞が
増殖するのに必要な時間）。２９日目にリガンドを除去した。３５、４２および５０日目
に、血漿においてＨｕＥＰＯは検出されなかった（ベクター処置および対照）。５０日目
に、関連動物を、アクチベーターリガンドを含有する固形飼料に戻した。ＨｕＥＰＯ発現
は、第一の誘導サイクルにおいて観察されたレベルと同様のレベルで再度検出可能となっ
た。６４日目にリガンドを除去した。ＨｕＥＰＯ発現は、７１日目に検出可能ではなく、
００３４Ａベクターにより８５日目に検出可能ではなかった。００３４Ｂベクターにより
８５日目に、低レベルのＨｕＥＰＯ発現が検出された。
【０５３３】
正常Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、図９に示す実験と同一の実験を並行して行った（図
１０）。
【０５３４】
〔実施例６〕
ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯの単一ＩＭ注射後のＨｕＥＰＯの発現調節
０日目において、１０１１ｖｐのＡＡＶ−ＨｕＥＰＯ（００３４Ｂ）のＩＭ注射により
動物に投薬した。実験の最初の２１日間に、経口経管栄養（ＯＧ）によりリガンドを毎日
送達した。処置されたマウスの血漿におけるＨｕＥＰＯの存在をＥＬＩＳＡにより評価し
たところ、ＨｕＥＰＯ発現はＨＣＴ変化に平行した。図１１に示す通り、ＨＣＴレベルお
よびＨｕＥＰＯ発現は、２１日目にピークとなった。２１日目にリガンド送達を停止し、
ｈｕＥＰＯ発現およびＨＣＴは、アクチベーターリガンドが存在しないと急激な減少を呈
した。３５日目の試料のＨｕＥＰＯ  ＥＬＩＳＡデータは、図１１を準備したときはまだ
利用できなかった。
【０５３５】
時点毎に平均化した各動物および群に対して、ＨＣＴをベースライン（０時間目、前出
血）と比較した。図４８Ａおよび図４８Ｂに示す通り、Ｃ３Ｈ／Ｈマウスにおける００３
４Ａによる１４日目およびＢａｌｂ／ｃマウスにおける２８日目のＨＣＴは最大１．７倍
増加した。ＨＣＴレベルは、Ｃ３Ｈ／Ｈにおける００３４Ｂによる投与後に最大１．４倍
増加し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて最大１．６倍増加した。ＨＣＴは、リガンド誘導因
子除去後に正常範囲内へと減少した。
【０５３６】
〔実施例７〕
アクチベーターリガンド用量によるＨｕＥＰＯの発現調節
ベースラインＨＣＴレベルのために動物を出血させ、続いて動物当たり１０１１ＡＡＶ
−ＨｕＥＰＯウイルスゲノムをＩＭ投与した（００３４Ａ）。ＡＡＶ投与日から、動物に
アクチベーターリガンド濃度１０００ｍｇ／ｋｇ（１８−１０００）、２５０ｍｇ／ｋｇ
（１８−２５０）、１００ｍｇ／ｋｇ（１８−１００）、５０ｍｇ／ｋｇ（１８−５０）
または０ｍｇ／ｋｇ（１８−０）を含むアクチベーターリガンド含有固形飼料を与えた。
対照動物に、ベクター投与および正常固形飼料（アクチベーターリガンドなし、１８−０
）のいずれかを与えた、あるいはアクチベーターリガンドあり（１８−１０００）または
なし（１８−０）で賦形剤単独のＩＭ投与（生理食塩水）を与えた。全群において７日毎
にＨＣＴおよびＨｕＥＰＯ発現レベルを測定した。
【０５３７】
図１３に示す通り、ベースライン、前出血試料においてＨｕＥＰＯは検出されなかった
。７〜２１日目にＨｕＥＰＯ発現が検出された。最低濃度のアクチベーターリガンド（１
８−５０）において、７日目にアッセイの感度限界（８ｍＵ／ｍｌ）を超えるＨｕＥＰＯ
発現は検出されなかったが、より高いアクチベーターリガンド用量を与えた動物よりも低
いレベルではあったが、１４および２１日目に検出可能であった。ＨｕＥＰＯは、２種の
最高濃度のアクチベーターリガンド（１８−１０００および１８−２５０）を与えたコホ
ートにおいて、同様のピーク発現レベルに達した。中等度の濃度のアクチベーターリガン
ド（１８−１００）による動物の血漿におけるＨｕＥＰＯレベルは、７日目においてより
低いＨｕＥＰＯ発現を呈し、これは、１４および２１日目において、１８−１０００およ
び１８−２５０動物と同様のレベルに達した。ＨＣＴ変化は、ＨｕＥＰＯ発現レベルに平
行した。２１日目におけるリガンド除去後に、ＨＣＴレベルは正常範囲に減少した。
【０５３８】
これらのデータは、ＡＡＶベクターの単一筋肉内投与後のＨｕＥＰＯ発現調節を実証す
る。重要なことに、ＨｕＥＰＯ発現レベルは、アクチベーターリガンド用量により調節さ
れた。これらのデータは、ＨｕＥＰＯ発現が、アクチベーターリガンド濃度の用量設定に
より正常生理範囲内に維持されうること、臨床応用を有することを示唆する。
【０５３９】
〔実施例８〕
ＡＡＶ−ＨｕＥＰＯの単一ＩＭ注射後のＨｕＥＰＯの発現調節
合計２５匹の３／４腎摘出したＣ３Ｈ／ＨマウスをＴａｃｏｎｉｃから入手した。ベー
スラインＨｕＥＰＯレベルおよびＨＣＴのために動物を出血させた。実験期間中、表示の
コホートに、固形飼料におけるＲＧ−１１５９３２アクチベーターリガンド（１８−１０
００、１０００ｍｇ／ｋｇ固形飼料）を与えた。０日目に、Ｈｙａｓｅ（Ｈａｌｏｚｙｍ
ｅ製５０Ｕ  ｒＨＵＰＨ２０）による前処置の１時間後に、開放筋肉ＩＭ注射と、エレク
トロポレーション（ＥＰ）により、ＲＴＳ−ＨｕＥＰＯプラスミドＤＮＡ（００３４Ｄ）
を投与した。動物コホートは、１）ＨｕＥＰＯ  ＤＮＡ＋ＥＰ＋Ｈｙａｓｅ＋リガンド、
２）ＨｕＥＰＯ  ＤＮＡ＋ＥＰ＋Ｈｙａｓｅ、リガンドなし、３）ＨｕＥＰＯ  ＤＮＡ＋
ＥＰ、Ｈｙａｓｅなし＋リガンド、４）生理食塩水＋ＥＰ＋Ｈｙａｓｅ＋リガンド、およ
び５）組換えヒトＥＰＯタンパク質のＩＰ注射で１週間に２回処置した動物を包含した。
【０５４０】
図１４に示す通り、８日目の血漿において高いＨｕＥＰＯ発現が検出され、２２日目に
より低い正常範囲へと減少した。ＨＣＴ変化は、血漿におけるＨｕＥＰＯレベルと平行し
た。ＨＣＴ変化は、３０日目におけるベクターの再投与後に血漿において検出されなかっ
た。
【０５４１】
ＨｕＥＰＯプラスミドＤＮＡ（００３４Ｃ、ＲＴＳ−ｈＥｐｏ−ＩＲＥＳ−ｆＬｕｃ）
をＢａｌｂ／ｃマウスに送達し（四頭筋、動物当たり２００ｕｇのＤＮＡ）、続いてエレ
クトロポレーションを行った。ＤＮＡ送達およびエレクトロポレーションの１時間前に、
動物をヒアルロニダーゼ（Ｈａｌｏｚｙｍｅ製５０Ｕ  ｒＨＵＰＨ２０）または生理食塩
水単独でも処置した。本実験の期間中、全動物に固形飼料を経由してアクチベーターリガ
ンドを与えた。
【０５４２】
ＤＮＡ送達前ならびに送達後４日目および７日目に、マウスにおけるＨＣＴを測定した
。図１５に示す通り、７日目におけるＨＣＴの４０％増加が、ｈｕＥＰＯプラスミドプラ
スヒアルロニダーゼ前処置を与えた動物において検出されたが、ヒアルロニダーゼ前処置
なしのｈｕＥＰＯを与えた動物は、７日目におけるＨＣＴの２５％増加を呈した。
【０５４３】
前述の実施形態および例証は、いかなる点においても本発明の範囲の限定を目的としな
いこと、また、本明細書に提示されている特許請求の範囲は、本明細書において明確に提
示されているか否かにかかわらず、あらゆる実施形態および例証の網羅を目的とすること
を理解されたい。
（参考文献）
Abdalla, 2007
【図１】
2017141245.tif 000020
【図２】
2017141245.tif 000021
【図３】
2017141245.tif 000022
【図４】
2017141245.tif 000023
【図５】
2017141245.tif 000024
【図６】
2017141245.tif 000025
【図７Ａ】
2017141245.tif 000026
【図７Ｂ】
2017141245.tif 000027
【図７Ｃ】
2017141245.tif 000028
【図７Ｄ】
2017141245.tif 000029
【図８】
2017141245.tif 000030
【図９】
2017141245.tif 000031
【図１０】
2017141245.tif 000032
【図１１】
2017141245.tif 000033
【図１２】
2017141245.tif 000034
【図１３】
2017141245.tif 000035
【図１４】
2017141245.tif 000036
【図１５】
2017141245.tif 000037
【配列表】
2017141245000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月7日(2017.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または増強する方法であって、
（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に投与する段階と、
（ｂ）ＥＰＯをコードするウイルスポリヌクレオチドからのＥＰＯ発現を誘導するアクチベーターリガンドを投与する段階と
を含み、
アデノ随伴ウイルスが、筋肉内投与され、
アデノ随伴ウイルスが、遺伝子スイッチをさらに含み、遺伝子スイッチが、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列を含み、少なくとも１つの転写因子配列によってコードされる少なくとも１つの転写因子がリガンド依存性転写因子であり、
アデノ随伴ウイルスが、ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された第二のプロモーターをさらに含み、第二のプロモーターが、アクチベーターリガンドの投与後に、少なくとも１つのリガンド依存性転写因子により活性化される、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４３】
前述の実施形態および例証は、いかなる点においても本発明の範囲の限定を目的としないこと、また、本明細書に提示されている特許請求の範囲は、本明細書において明確に提示されているか否かにかかわらず、あらゆる実施形態および例証の網羅を目的とすることを理解されたい。
（参考文献）
Abdalla, 2007
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
哺乳動物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を誘導、調節または増強する方法であって、
（ａ）ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスを哺乳動物に投与する段階と、
（ｂ）ＥＰＯをコードするウイルスポリヌクレオチドからのＥＰＯ発現を誘導するアクチベーターリガンドを投与する段階と
を含み、
アデノ随伴ウイルスが、筋肉内投与され、
アデノ随伴ウイルスが、遺伝子スイッチをさらに含み、遺伝子スイッチが、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列を含み、少なくとも１つの転写因子配列によってコードされる少なくとも１つの転写因子がリガンド依存性転写因子であり、
アデノ随伴ウイルスが、ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された第二のプロモーターをさらに含み、第二のプロモーターが、アクチベーターリガンドの投与後に、少なくとも１つのリガンド依存性転写因子により活性化される、方法。
［２］
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
［３］
ＥＰＯの発現が、アクチベーターリガンドの投与される用量（単数または複数）を制御することにより誘導、調節または増強される、請求項１に記載の方法。
［４］
アクチベーターリガンドが、正常生理範囲内のＥＰＯ発現レベルの誘導または維持に十分な用量（単数または複数）で投与（adminster）される、請求項３に記載の方法。
［５］
ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドが、配列番号６または配列番号８に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
［６］
ヘマトクリットまたは血液中の赤血球細胞の容積パーセンテージが、哺乳動物において増加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［７］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される、ベクター。
［８］
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項７に記載のベクター。
［９］
ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
［１０］
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９に記載のベクター。
［１１］
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求項７に記載のベクター。
［１２］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項７に記載のベクター。
［１３］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項７に記載のベクター。
［１４］
前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列がＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されている、請求項１３に記載のベクター。
［１５］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９にコードされるアミノ酸に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［１６］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［１７］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［１８］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列または配列番号１５の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［１９］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１７または配列番号１８に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［２０］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１９に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［２１］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［２２］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
［２３］
１つまたは複数のタンパク質を発現する細胞集団を作製する方法であって、１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより細胞を改変する段階を含み、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに連結された、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される、方法。
［２４］
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項２３に記載の方法。
［２５］
ベクターがウイルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
［２６］
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
［２７］
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求項２３に記載の方法。
［２８］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項２３に記載の方法。
［２９］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項２３に記載の方法。
［３０］
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により接続される、請求項２９に記載の方法。
［３１］
１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターにより改変された細胞集団であって、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、（２）Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、細胞集団。
［３２］
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項３１に記載の細胞集団。
［３３］
ベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の細胞集団。
［３４］
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３３に記載の細胞集団。
［３５］
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求項３１に記載の細胞集団。
［３６］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項３１に記載の細胞集団。
［３７］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項３１に記載の細胞集団。
［３８］
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により接続される、請求項３７に記載の集団。
［３９］
哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する細胞集団を投与する段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これにより１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される、方法。
［４０］
哺乳動物における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これにより１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、カリクレイン阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤、プロスタグランジン合成酵素、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、アディポネクチン、レプチンおよび嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）からなる群から選択される、方法。
［４１］
タンパク質のうち少なくとも１つが、Ｃ１エステラーゼ阻害剤であり、疾患が、血管浮腫、遺伝性血管浮腫、敗血症、凝固性亢進、肺性機能障害、低酸素血症、出血性膵炎（pancreaitis）、心筋梗塞、肺移植、外傷、熱傷または血管漏出からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
［４２］
タンパク質のうち少なくとも１つが、カリクレイン阻害剤であり、疾患が、血管浮腫、遺伝性血管浮腫、アテローム血栓症、冠動脈疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、ブラジキニン介在性炎症および接触系の疾患、状態または障害からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
［４３］
タンパク質のうち少なくとも１つが、ブラジキニンＢ２受容体阻害剤であり、疾患が、血管浮腫、遺伝性血管浮腫、ブラジキニン介在性炎症、糸球体硬化症、アルツハイマー病、大脳浮腫、血管漏出、急性呼吸促迫症候群、疼痛、炎症、外傷、火傷、ショック、アレルギーおよび心血管疾患からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
［４４］
タンパク質のうち少なくとも１つが、プロスタグランジン合成酵素であり、疾患が、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、特発性肺動脈性肺高血圧症、家族性肺動脈性肺高血圧症、続発性肺動脈性肺高血圧症、肺静脈閉塞症、肺毛細血管の血管腫症、新生児の遷延性肺高血圧症からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
［４５］
タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）であり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
［４６］
タンパク質のうち少なくとも１つが、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）であり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
［４７］
タンパク質のうち少なくとも１つが、アディポネクチンであり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
［４８］
タンパク質のうち少なくとも１つが、レプチンであり、疾患が、糖尿病または他の代謝性疾患もしくは障害である、請求項３９または４０に記載の方法。
［４９］
タンパク質のうち少なくとも１つが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、疾患が、嚢胞性線維症である、請求項３９または４０に記載の方法。
［５０］
哺乳動物における多発性硬化症を治療するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これにより１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）からなる群から選択される、方法。
［５１］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号９に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の方法。
［５２］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号１６に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の方法。
［５３］
１つまたは複数のタンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−Ｂ）の両方を含む、請求項５０に記載の方法。
［５４］
タンパク質のうち１つまたは複数が、ヒトタンパク質である、請求項５０に記載の方法。
［５５］
ベクターがウイルスベクターである、請求項５０に記載の方法。
［５６］
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
［５７］
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求項５０に記載の方法。
［５８］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項５０に記載の方法。
［５９］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項５０に記載の方法。
［６０］
第一の転写因子配列と第二の転写因子配列が、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により接続される、請求項５９に記載の方法。
［６１］
哺乳動物における炎症性腸疾患またはクローン病を治療するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与する段階であり、ベクターが、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、
（１）リガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つの転写因子配列と、
（２）リガンド依存性転写因子により活性化されるプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含む、段階と、
（ｂ）治療上有効量の１つまたは複数の活性化リガンドを哺乳動物に投与して、これにより１つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階と
を含み、１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）である、方法。
［６２］
１つまたは複数のタンパク質のうち１つが、配列番号２２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。
［６３］
インターロイキン−１０が、ヒトＩＬ−１０タンパク質である、請求項６１に記載の方法。
［６４］
ベクターがウイルスベクターである、請求項６１に記載の方法。
［６５］
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ジェミニウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルスおよびカリモウイルスのウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
［６６］
遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）に基づく遺伝子スイッチである、請求項６１に記載の方法。
［６７］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下における第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下における第二の転写因子配列とを含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項６１に記載の方法。
［６８］
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドが、１つのプロモーターの制御下における第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、第一の転写因子配列によってコードされる第一の転写因子および第二の転写因子配列によってコードされる第二の転写因子が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能する複合体を形成する、請求項６１に記載の方法。
［６９］
前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列がＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されている、請求項６１に記載の方法。
［７０］
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
［７１］
全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内、脳内、くも膜下腔内、皮内または皮下投与される、請求項７０に記載の組成物。
［７２］
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む薬物。
［７３］
全身、静脈内、腫瘍内、経口、腹腔内、筋肉内、椎骨内、脳内、くも膜下腔内、皮内または皮下投与される、請求項７２に記載の薬物。
［７４］
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団を含むキット。
［７５］
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団および遺伝子スイッチを活性化するリガンド。
［７６］
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項７５に記載のベクターまたは細胞集団およびリガンド。
［７７］
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２である、請求項７６に記載のベクターまたは細胞集団およびジアシルヒドラジンリガンド。
［７８］
リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、請求項７５に記載のベクターまたは細胞集団およびリガンド。
［７９］
リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、ジアシルヒドラジンである、請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３〜３０および３９〜６９のいずれか一項に記載の方法、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団。
［８０］
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２である、請求項７９に記載のベクター、方法または細胞集団。
［８１］
リガンド依存性転写を活性化するリガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３〜３０および３９〜６９のいずれか一項に記載の方法、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の集団。
［８２］
請求項７〜２２のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の細胞集団およびリガンドを含むキット。
［８３］
リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項８２に記載のキット。
［８４］
ジアシルヒドラジンが、ＲＧ−１１５８１９、ＲＧ−１１５８３０またはＲＧ−１１５９３２である、請求項８３に記載のキット。
［８５］
リガンドが、アミドケトン（amidoketone）またはオキサジアゾリンである、請求項８２に記載のキットおよびリガンド。
【外国語明細書】
2017141245000001.pdf