(57)【要約】【課題】悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているリボソームタンパク質であるRPL29を標的とする新規分子標的薬を提供することを課題とする。RPL29を標的とする分子標的薬に関し、RPL29に対してより効果的に作用する抗腫瘍剤を提供することを課題とする。【解決手段】RPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬であって、RPL29タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列から選択され、少なくとも５個のアミノ酸残基を含む部分を標的とすることを特徴とする分子標的薬による。【選択図】図３
2017141163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬であって、RPL29タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列から選択され、少なくとも５個のアミノ酸残基を含む部分を標的とすることを特徴とする分子標的薬。
【請求項２】
分子標的薬の標的部位が、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列の部分、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列の部分を標的とし、当該標的となる部位が、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列から選択される部分である、請求項１に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
【請求項３】
分子標的薬が抗体であり、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸残基をエピトープとして認識することを特徴とする抗RPL29抗体からなる請求項１又は２に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
【請求項４】
分子標的薬がペプチドワクチンであり、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むRPL29に対するペプチドワクチンからなる請求項１又は２に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の分子標的薬を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤。
【請求項６】
悪性腫瘍が、膵癌、乳癌、肺腺癌、大腸癌、肝細胞癌、胃癌、甲状腺癌、卵巣癌、唾液腺腺様嚢胞癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、粘液性脂肪肉腫、膠芽腫、胞巣状横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、乏突起膠細胞腫、副腎皮質癌、多発性骨髄腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、髄芽腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、肺線癌、肺扁平上皮癌、II型子宮内膜癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、末梢Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ユーイング肉腫及び前駆Ｔ細胞リンパ芽球性白血病から選択される一種又は複数種の癌である、請求項５に記載の抗悪性腫瘍剤。
【請求項７】
悪性腫瘍が、膵癌、乳癌、肺腺癌及び大腸癌から選択される一種又は複数種の癌である、請求項６に記載の抗悪性腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているリボソームタンパク質であるRPL29を標的とする新規分子標的薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の悪性腫瘍に対する分子標的薬としては、肝癌や腎癌に使用されるソラフェニブ、大腸癌に使用されるセツキシマブやベバシズマブ、肺癌に使用されるエルロチニブやゲフィチニブ、乳癌に使用されるトラスツズマブなど多くの薬剤が開発されており、実地臨床で使用されている。各薬剤の標的物質としては、例えば癌キナーゼ、血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、HER2タンパク質等が挙げられる。しかし、悪性腫瘍に対する分子標的薬は、皮膚障害や消化管穿孔、間質性肺炎、肝不全など重篤な副作用による死亡例も報告されている。よって、より安全性の高い分子標的薬の登場が望まれている。一方、健常者においても毎日数千個の悪性腫瘍（癌）細胞ができるといわれているが、必ずしも全員が発病するわけではない。自己免疫性肝炎(AIH)における肝発癌率は0.7% /年程度 (Aliment Pharmacol Ther 2006;24:1197)と報告されており、C型慢性肝炎の3% /年(Ann Intern Med 1999;131:174)に比べて明らかに低率である。
【０００３】
リボソームタンパク質であるRPL29 (Ribosomal protein L29)は、大腸癌（非特許文献１）、肝細胞癌（非特許文献２）、胃癌（非特許文献３）、甲状腺癌（非特許文献４）、乳癌（非特許文献５）等様々な悪性腫瘍細胞で発現が亢進していることが報告されている。RPL29は細胞内部に発現していると同時に細胞表面に発現している膜タンパクでもあり、RPL29の発現を低下させるとアポトーシスに陥る細胞が増加したり（非特許文献６）、細胞の分化が誘導される（非特許文献１）ことが報告されている。
【０００４】
悪性腫瘍に対する分子標的薬に関し、RPL29を標的とする分子標的薬について検討した報告がある。健常者においても毎日数千個の癌細胞ができるといわれているにもかかわらず、必ずしも全員が癌を発病するわけではないことや、自己免疫性肝炎(AIH)における肝発癌率は0.7 %／年程度と報告されており、C型慢性肝炎の3 %／年に比べて明らかに低率であることが報告されている。そして、自己免疫性疾患の患者血清中に、悪性腫瘍細胞の増殖を抑制しうる免疫グロブリン（IgG）が存在することを確認し、RPL29を標的とする抗RPL29抗体であることが開示されている（特許文献１）。さらに特許文献１では抗RPL29抗体価を指標とする悪性腫瘍の検査方法についても開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J Cell Physiol., 2006; 207(2):287-92
【非特許文献２】Life Sci. 2007 Jan 23;80(7):690-8. Epub 2006 Dec 6
【非特許文献３】BMC Cancer, 2010; 10: 240
【非特許文献４】Cancer Res., 1998; 58: 4745
【非特許文献５】Cancer Res., 1997; 57: 5148
【非特許文献６】Carcinogenesis, 2004; 25 (6): 873-879
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開WO2013/111770号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているリボソームタンパク質であるRPL29を標的とする新規分子標的薬を提供することを課題とする。RPL29を標的とする分子標的薬に関し、RPL29に対してより効果的に作用する抗腫瘍剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記課題を解決するために、より効果的に抗腫瘍効果が得られるRPL29タンパク質の分子標的薬について鋭意検討を重ねた結果、RPL29タンパク質のいずれかの部位を特異的に標的とすることで、より効果的に抗腫瘍効果が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．RPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬であって、RPL29タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列から選択され、少なくとも５個のアミノ酸残基を含む部分を標的とすることを特徴とする分子標的薬。
２．分子標的薬の標的部位が、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列の部分、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列の部分を標的とし、当該標的となる部位が、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列から選択される部分である、前項１に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
３．分子標的薬が抗体であり、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列における連続した少なくとも５アミノ酸残基をエピトープとして認識することを特徴とする抗RPL29抗体からなる前項１又は２に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
４．分子標的薬がペプチドワクチンであり、以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むRPL29に対するペプチドワクチンからなる前項１又は２に記載の分子標的薬。
qapkrtqaptkase（配列番号２１）
pklgkrarariakg（配列番号２４）
mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
rlcrpkakakakak（配列番号２５）
５．前項１〜４のいずれか１に記載の分子標的薬を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤。
６．悪性腫瘍が、膵癌、乳癌、肺腺癌、大腸癌、肝細胞癌、胃癌、甲状腺癌、卵巣癌、唾液腺腺様嚢胞癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、粘液性脂肪肉腫、膠芽腫、胞巣状横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、乏突起膠細胞腫、副腎皮質癌、多発性骨髄腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、髄芽腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、肺線癌、肺扁平上皮癌、II型子宮内膜癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、末梢Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ユーイング肉腫及び前駆Ｔ細胞リンパ芽球性白血病から選択される一種又は複数種の癌である、前項５に記載の抗悪性腫瘍剤。
７．悪性腫瘍が、膵癌、乳癌、肺腺癌及び大腸癌から選択される一種又は複数種の癌である、前項６に記載の抗悪性腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のRPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬によれば、悪性腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているRPL29を標的とする本発明の分子標的薬は、悪性腫瘍細胞ができたとしても、本来生体内に備わっている抗RPL29抗体であって発病に至らない生体防御機構に係る抗体と同様の作用を有すると考えられる。係る物質を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤は、安全性が高い薬剤であり、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】RPL29（NCBI Reference Sequence: NP_000983.1）のアミノ酸配列からなるタンパク質に関し、自己免疫性肝炎(AIH)３例、膵癌(PK)２例、肺癌(LK)１例より得た血液中に含まれる抗RPL29抗体について、８種類のペプチドについて間接ELISA法にてエピトープマッピングを行った結果を示す図である。（参考例１）
【図２】参考例１と同手法にて、さらに１２種類のペプチドについて間接ELISA法にてエピトープマッピングを行った結果を示す図である。（参考例２）
【図３】エピトープマッピングにより、抗原性が高いと認められるペプチド５種を各々抗原として作製した５種類のIgG抗体について、各種培養癌細胞の増殖に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。（実施例１）
【図４】膵癌細胞Panc-1に及ぼすIgG146-159抗体の細胞増殖抑制効果を示す図である。（実施例２）
【図５】膵癌細胞Panc-1にIgG146-159抗体を加えて培養したときに細胞内シグナルの変化について確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図６】肺腺癌細胞株PC9に及ぼすIgG102-115抗体の細胞増殖抑制効果を示す図である。（実施例４）
【図７】肺腺癌細胞株PC9におけるIgG102-115抗体を加えて培養したときに細胞内シグナルの変化について確認した結果を示す図である。（実施例５）
【図８】乳癌細胞株MCF7に及ぼすIgG102-115抗体の細胞増殖抑制効果を示す図である。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているリボソームタンパク質であるRPL29を標的とする分子標的薬に関する。本発明の分子標的薬は、RPL29に対してより効果的に作用し、抗腫瘍作用を有する。
【００１３】
本明細書のRPL29を構成するアミノ酸配列は、60S ribosomal protein L29 [Homo sapiens]として、NCBI Reference Sequence: NP_000983.1（配列番号１）で特定されるアミノ酸配列であり、本明細書で分子標的薬の標的となりうるアミノ酸配列は、配列番号１で特定されるアミノ酸配列又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００１４】
NCBI Reference Sequence: NP_000983.1: maksknhtth nqsrkwhrng ikkprsqrye slkgvdpkfl rnmrfakkhn kkglkkmqan nakamsarae aikalvkpke vkpkipkgvs rkldrlayia hpklgkrara riakglrlcr pkakakakak dqtkaqaaap asvpaqapkr tqaptkase（配列番号１）
【００１５】
アミノ酸残基の置換の場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換させることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸、塩基含有側鎖を有するアミノ離、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸を挙げることができる。
【００１６】
本発明では、RPL29に対してより効果的に作用し、抗腫瘍作用を有する分子標的薬の標的として、RPL29のうち特に優れた領域を選別する。本発明は当該領域を標的とする抗体又はペプチドワクチンを提供することも課題とする。本発明におけるRPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬は、RPL29タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列から選択され、少なくとも５個のアミノ酸残基を含む部分を標的とする。
【００１７】
より具体的には、本発明の分子標的薬は以下の配列番号２１、２４、２２、２３及び２５に示すいずれかのアミノ酸配列から選択される部分を標的とする。各々について配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における部位も示した。
146-159番目：qapkrtqaptkase（配列番号２１）
102-115番目：pklgkrarariakg（配列番号２４）
43-56番目：mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
75-88番目：lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
117-130番目：rlcrpkakakakak（配列番号２５）
【００１８】
本発明は、上記配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドにおける連続した少なくとも５アミノ酸残基をエピトープとして認識する、RPL29を標的とする抗RPL29抗体にも及ぶ。そして本発明は、上記の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列、配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドからなる、RPL29を標的とするペプチドワクチンにも及ぶ。
【００１９】
さらに、本発明におけるRPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤にも及ぶ。本明細書において、抗RPL29抗体を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤には、記配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドにおける連続した少なくとも５アミノ酸残基をエピトープとして認識するRPL29を標的とする抗RPL29抗体を少なくとも１種含むものであればよい。有効成分として含む抗体の種類は１種であってもよいし、複数種であってもよい。また、抗体の型としてはFabなどの抗原抗体反応をしうる部分ペプチドであってもよいが、好ましくはインタクト型の抗体である。同様に、本明細書において、ペプチドワクチンを含む抗悪性腫瘍剤は、記配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドワクチン、又は配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドワクチンからなる、RPL29を標的とするペプチドワクチンを少なくとも１種含むものであればよい。
【００２０】
本明細書において、分子標的薬を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤における悪性腫瘍とは、膵癌、乳癌、肺腺癌、大腸癌、肝細胞癌、胃癌、甲状腺癌、卵巣癌、唾液腺腺様嚢胞癌、前立腺癌、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、粘液性脂肪肉腫、膠芽腫、胞巣状横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、乏突起膠細胞腫、副腎皮質癌、多発性骨髄腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、髄芽腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、肺線癌、肺扁平上皮癌、II型子宮内膜癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、末梢Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ユーイング肉腫及び前駆Ｔ細胞リンパ芽球性白血病から選択される一種又は複数種の癌であり、特に好ましくは膵癌、乳癌、肺腺癌及び大腸癌から選択される一種又は複数種の癌である。
【００２１】
RPL29を標的とする場合であっても、癌の種類によっては標的となる部位が必ずしも共通するとは限らない。例えば、抗悪性腫瘍の場合は、標的部位としてはqapkrtqaptkase（配列番号２１）において最も抗腫瘍効果が認められ、次にpklgkrarariakg（配列番号２４）、mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）、lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）、rlcrpkakakakak（配列番号２５）の順で効果があると考えられる。膵癌の場合では、qapkrtqaptkase（配列番号２１）において最も抗腫瘍効果が認められ、次にlvkpkevkpkipkg（配列番号２３）、rlcrpkakakakak（配列番号２５）、mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）、pklgkrarariakg（配列番号２４）の順で効果があると考えられる。非小細胞肺癌の場合には、pklgkrarariakg（配列番号２４）において最も抗腫瘍効果が認められ、次にqapkrtqaptkase（配列番号２１）、lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）、mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）、rlcrpkakakakak（配列番号２５）の順で効果があると考えられる。乳癌の場合には、pklgkrarariakg（配列番号２４）において最も抗腫瘍効果が認められ、次にmrfakkhnkkglkk（配列番号２２）、qapkrtqaptkase（配列番号２１）、lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）、rlcrpkakakakak（配列番号２５）の順で効果があると考えられる。
【００２２】
本発明は、本発明の分子標的薬の製造方法にも及ぶ。本発明の分子標的薬がペプチドワクチンの場合は、上記の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを調製することにより製造することができる。ペプチドは、自体公知、又は今後開発される製造方法により製造することができる。また、本発明の分子標的薬が抗RPL29抗体の場合は、上記の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として抗体（ペプチド抗体）を作製することができる。
【００２３】
本発明のペプチドワクチンは、得られた上記アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことが可能である。また本発明のペプチドは、公知の遺伝子工学的手法により合成することも可能である。遺伝子工学的な合成手法の一例としては、以下の方法が挙げられる。すなわち、目的のペプチドをコードするDNAを適当な宿主細胞に導入し、形質転換細胞を作製する。この形質転換細胞から産生されるペプチドを回収することにより、本発明のペプチドを得ることが可能である。また本発明のペプチドは、一度融合タンパク質として作製し、それを適切なプロテアーゼで分解することにより得ることも可能である。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと他のペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。
【００２４】
本発明の抗体は、上記の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列、又は以下の配列番号２１〜２５に示すいずれかのアミノ酸配列のうち１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、導入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原とし、自体公知の方法、又は今後開発される製造方法を適用することができる。上記ペプチドを免疫原とし、自体公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製することができる。抗体の作製方法は、当業者に公知の手法を用いることができる。
【００２５】
本明細書において、RPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬を有効成分として含む抗悪性腫瘍剤には抗RPL29抗体を増強しうる物質を含んでいてもよい。抗RPL29抗体を増強しうる物質としては、抗RPL29抗体に対する免疫賦活化剤等が挙げられる。生体内の抗RPL29抗体に対する免疫賦活化剤としては、例えば生体内の抗体産生細胞の活性化剤、例えばIL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、GM-CSF、TNF-α、細菌及びその菌体成分、植物や真菌の多糖体、核酸、脂溶性ビタミン、ミネラルオイルなどが挙げられる。生体内の抗体産生細胞としては、例えばＢ細胞や形質細胞が挙げられる。
【００２６】
上記のRPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬を有効成分として含む本発明の抗悪性腫瘍剤には、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。上記の抗悪性腫瘍剤に用いられる薬理学的に許容しうる担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができる。
【００２７】
本発明の抗悪性腫瘍剤の投与形態としては、局所的に投与しても全身的に投与してもよい。非経口投与用の製剤は、滅菌した水性の、又は非水性の溶液、懸濁液及び乳濁液を含んでいてもよい。非水性希釈剤の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油及び有機エステル組成物、例えば、エチルオレエートであり、これらは注射用に適している。水性担体には、水、アルコール性水性溶液、乳濁液、懸濁液、食塩水及び緩衝化媒体が含まれていてもよい。非経口的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、リンゲル乳酸及び結合油が含まれていてもよい。静脈内担体には、例えば、液体用補充物、栄養及び電解質（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれていてもよい。本発明の抗悪性腫瘍剤はさらに、保存剤及び他の添加剤、例えば，抗微生物化合物、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどを含むことができる。
【実施例】
【００２８】
本発明の理解を深めるために、参考例、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは、いうまでもない。参考例では、本発明を完成するに至った研究経緯を示す。以下の臨床検体を用いた本研究は、岡山大学内の倫理委員会により承認されている。
【００２９】
（参考例１）RPL29エピトープ解析（１回目）
本参考例では、下記の配列番号１で特定される60S ribosomal protein L29 [Homo sapiens]（NCBI Reference Sequence: NP_000983.1）のアミノ酸配列からなるタンパク質に関し、自己免疫性肝炎(AIH)３例、膵癌(PK)２例、肺癌(LK)１例より得た血液中に含まれる抗RPL29抗体について、間接ELISA法にてエピトープマッピングを行った。
配列番号２〜９に示すアミノ酸からなるペプチドを、各々ペプチド合成器（ABIMED Multiple Peptide Synthesizer AMS 422）を用いて、Fmoc法により合成した。各々について配列番号１に示すアミノ酸配列における部位も示した。
1-30番目：maksknhtth nqsrkwhrng ikkprsqrye（配列番号２）
21-50番目：ikkprsqrye slkgvdpkfl rnmrfakkhn（配列番号３）
41-70番目：rnmrfakkhn kkglkkmqan nakamsarae（配列番号４）
61-90番目：nakamsarae aikalvkpke vkpkipkgvs（配列番号５）
81-110番目：vkpkipkgvs rkldrlayia hpklgkrara（配列番号６）
101-130番目：hpklgkrara riakglrlcr pkakakakak（配列番号７）
121-150番目：pkakakakak dqtkaqaaap asvpaqapkr（配列番号８）
141-159番目：asvpaqapkr tqaptkase（配列番号９）
【００３０】
・間接ELISA法
１）10μg/mlの各ペプチド抗原を96 wellマイクロプレートの各wellに100μl加えて1 時間静置し抗原を固相化した。
２）1% ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）を300μl/well加えて15分間のブロッキング処理後、各血清又は血漿を100倍に希釈した溶液100μl/well添加し、1 時間反応させた。
３）洗浄後、1μg/mlのHRP標識抗ヒトIgG抗体を100μl/well添加し、1 時間反応させた。４）さらに洗浄後、2,2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonateを100μl/well添加し、十分反応させた。
５）ELISAリーダー (Model 680 Microplate Reader: Bio-Rad Laboratories Ltd., Tokyo, Japan) で、波長405nmでの吸光度を測定した。陰性コントロールは血清のかわりにウシ血清の希釈液とした。吸光度測定後に陰性コントロールの吸光度を引いた値を抗体価とした。
【００３１】
上記方法によりエピトープマッピングを行い、エピトープ候補を探索したところ、配列番号４〜８に示すアミノ酸配列からなるペプチド抗原に対して、抗原抗体反応が確認された（図１）。
【００３２】
（参考例２）RPL29エピトープ解析（２回目）
本参考例では、配列番号１０〜２１に示すアミノ酸配列からなるペプチドを用いたほかは、参考例１と同手法にてエピトープマッピングを行った。各々について配列番号１に示すアミノ酸配列における部位も示した。
41-55番目：rnmrfakkhn kkglk（配列番号１０）
51-65番目：kkglkkmqan nakam（配列番号１１）
61-75番目：nakamsarae aikal（配列番号１２）
71-85番目：aikalvkpke vkpki（配列番号１３）
81-95番目：vkpkipkgvs rkldr（配列番号１４）
91-105番目：rkldrlayia hpklg（配列番号１５）
101-115番目：hpklgkrara riakg（配列番号１６）
111-125番目：riakglrlcr pkaka（配列番号１７）
121-135番目：pkakakakak dqtka（配列番号１８）
131-145番目：dqtkaqaaap asvpa（配列番号１９）
141-155番目：asvpaqapkr tqapt（配列番号２０）
146-159番目：qapkr tqaptkase（配列番号２１）
【００３３】
上記方法によりエピトープマッピングを行い、エピトープ候補を探索したところ、配列番号１０〜１１及び１４〜１８、２１に示すアミノ酸配列からなるペプチド抗原がエピトープ候補と考えられた（図２）。
上記結果解析より、配列番号２１〜２５に示すアミノ酸配列からなるペプチド部分がエピトープ候補（標的部位）と考えられた。各々について配列番号１に示すアミノ酸配列における部位も示した。
146-159番目：qapkrtqaptkase（配列番号２１）
43-56番目：mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）
75-88番目：lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）
102-115番目：pklgkrarariakg（配列番号２４）
117-130番目：rlcrpkakakakak（配列番号２５）
【００３４】
（実施例１）人工的に作製した抗RPL29抗体（ペプチド抗体）の抗腫瘍効果
生後3か月のウサギに、配列番号２１〜２５で特定される各ペプチドのC端にC-KLHで修飾したペプチドを3回免疫（0週、2週、5週）した。最後の免疫から7日目に血清を採取した。抗体の作製は、GenScript社にSC1492 Custom Polyclonal Antibody Service until 3rd immunizationsにより依頼した。ペプチド特異的なポリクローナル抗体は、上記で採取した血清からAlltech Alltima C18 HPLC Column（AT88307 Alltech No.:88307）を使用して精製し、ペプチド抗体を得た。ウサギIgG（Sigma-Aldrich：I5006-10MG）をコントロール抗体として使用した。
【００３５】
各ペプチド抗体について、各種腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を調べた。各ペプチド抗体は、セントリカット超ミニ（KURABO）を用いてマニュアルに従い細胞培養に使用する培養液へ溶解させた。各培養細胞を5.0×104 cell/ml に調整後、細胞培養用96 wellプレートに100μl/wellで播種し、37℃で5% CO2下にて培養した。
各培養細胞についての培養液は下記の通りである。
肝癌細胞株Huh7、膵癌細胞株Panc-1：DMEM (Invitrogen Co.) に加熱処理FBS(10%)、1% 非必須アミノ酸 (Sigma-Aldrich Co.)、1% ピルビン酸Na(Sigma-Aldrich Co., MO)、2mM L-グルタミン酸塩 (Sigma-Aldrich Co.) 、1% ペニシリン／ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich Co.) 。
大腸癌細胞株HCT15、乳癌細胞株MCF-7、肺腺癌細胞株PC-9、前立腺癌細胞株PC-3：RPMI-1640 培地 (Sigma-Aldrich Co.) 、 に加熱処理FBS(10%) 、1% ペニシリン／ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich Co.) 。
【００３６】
培養開始24時間後に、各ペプチドを抗原として作製した抗体(1)〜(5)を50μg/ml各wellに加えた。コントロールには、培溶液のみを同量加えた。抗体投与直前又は抗体投与24時間後と48時間後、必要に応じて72時間後に、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT：5 mg/ml リン酸緩衝液）溶液10μlを各wellに加えた。MTT添加4 時間後に培養液を除去し、DMSO 100μlを各wellに加えた。ELISAリーダー (Model 680 Microplate Reader: Bio-Rad Laboratories Ltd.）で、570 nmの吸光度を測定した。
(1) mrfakkhnkkglkk（配列番号２２）：IgG43-56
(2) lvkpkevkpkipkg（配列番号２３）：IgG75-88
(3) pklgkrarariakg（配列番号２４）：IgG102-115
(4) rlcrpkakakakak（配列番号２５）：IgG117-130
(5) qapkrtqaptkase（配列番号２１）：IgG146-159
【００３７】
各種癌細胞株の増殖に及ぼす抗体の効果を図３に示した。図３に示す各抗体(1)〜(5)は上記のとおりである。その結果、培養細胞株の種類に応じて抗体の細胞抑制効果に違いが認められたが、いずれかの抗体で細胞増殖抑制効果が認められた。
【００３８】
（実施例２）膵癌に及ぼすIgG146-159抗体の効果
実施例１の結果、膵癌細胞に対しては(5)のペプチドを抗原として作製した抗体（IgG146-159）が最も抗腫瘍効果が認められた。そこで、IgG146-159抗体について各種濃度の抗体を加えて培養したときの膵癌細胞の増殖に及ぼす効果を確認した。コントロール抗体はウサギコントロール抗体とした。その結果、コントロール抗体では細胞増殖抑制効果はほとんど認められなかったが、IgG146-159抗体では濃度依存的に細胞増殖抑制効果が確認された（図４）。培養開始24時間後に25μg/mlを1回添加した場合の結果を図４（Ａ）に示し、24時間後及び48時間後の2日連続で添加した場合の結果を図４（Ｂ）に示した。その結果、培養開始24時間後に25μg/mlを1回添加するよりも24時間後と48時間後の2日連続で添加した方が培養開始72時間後における細胞増殖抑制効果が強く認められた。更に、 25μg/mlで2日連続添加するよりも50μg/mlで2日連続添加した方が細胞増殖抑制効果が強く認められた。以上より、連日投与の有効性も確認された。
【００３９】
（実施例３）膵癌に及ぼすIgG146-159抗体の効果
膵癌細胞Panc-1にIgG146-159抗体を加えて培養したときに細胞内シグナルの変化について確認した。
【００４０】
膵癌細胞Panc-1を5.0×104 cell/ml に調整後、細胞培養用 6wellプレートに2 ml/wellで播種した。なお、実施例１と同様の培養液を用い、37℃で5% CO2下に培養した。培養開始24時間後に、培養液に溶解させた抗体を加えた。コントロールには、溶解液のみを同量加えた。抗体投与24時間後に培養液を除去し、Pierce IP Lysis緩衝液(Thermo Fisher Scientific Inc.) 400μlを各wellに加えた。15分間攪拌した後、ビーズ破砕機（TAITEC）で細胞を破砕した。その後、13,000gで10分間遠沈し、上澄を回収した。得られた上澄に等量の2×サンプルバッファー（20% Glycerol, 4% SDS, 125mM Tris-HCl / pH6.8, 10% メルカプトエタノール, 0.004% ブロモフェノールブルー(BPB)）を等量添加し、5分間煮沸し、タンパク質を抽出した。
【００４１】
上述の方法で抽出したタンパク質を、常法に従ってSDS-PAGEにより電気泳動を行った。電気泳動したタンパク質を常法に従ってPVDFメンブレンにブロッティングした。PVDF Blocking Reagent for Can Get Signal (TOYOBO)で1 時間のブロッキング処理後、β-actin、Phospho-MDM2 (Ser166)、Phospho-p53 (Ser15)、p53、Bax、p21、Phospho-β-Catenin (Thr41/Ser45)、β-Catenin、Cyclin D1、Survivin、Met、C-myc、p27、Phospho-p70 S6K (Thr389)、Phospho-4E-BP1 (Thr37/46)、Phospho-MEK1/2 (Ser217/221)の各一次抗体 (Cell signaling Techonology, Inc.)で1 時間処理した。メンブレンを洗浄後、HRP標識抗IgG抗体（RPN2124: GE Healthcare）を二次抗体として1 時間反応させた。メンブレンを洗浄後、ECL Western Blotting Detection System (RPN2132: GE Healthcare)で発色させ、ルミノメーターで検出した。
その結果、IgG146-159抗体を含む培養液で培養した場合に、細胞内シグナルのうちp53とβカテニンのリン酸化亢進、Baxとp21、p27の発現亢進、cyclin D1とSurvivinの発現低下、4E-BP1のリン酸化低下を認め、アポトーシスの亢進、β-catenin経路の抑制、mTOR経路の抑制が示唆された（図５）。
【００４２】
（実施例４）肺腺癌細胞株PC9に及ぼすIgG102-115抗体の効果
実施例１の結果、肺腺癌細胞に対しては(3)のペプチドを抗原として作製した抗体（IgG102-115）が最も抗腫瘍効果が認められた。そこで、IgG102-115抗体について各種濃度の抗体を加えて培養したときの肺腺癌細胞の増殖に及ぼす効果を確認した。IgG102-115抗体では濃度依存的に細胞増殖抑制効果が確認された（図６）。
【００４３】
（実施例５）肺腺癌細胞株PC9におけるIgG102-115抗体による細胞内シグナル変化
IgG102-115抗体にIgG102-115抗体を加えて培養したときに細胞内シグナルの変化について確認した。
【００４４】
IgG102-115抗体を5.0×104 cell/ml に調整後、細胞培養用 6wellプレートに2 ml/wellで播種した。なお、実施例１と同様の培養液を用い、37℃で5% CO2下に培養した。培養開始24時間後に、培養液に溶解させた抗体を加えた。実施例３に記載の方法と同手法でSDS-PAGEにより電気泳動を行い、同様にブロッティングした。実施例３と同手法により処理を行い、ルミノメーターで検出した。なお、Phospho-EGFR (Tyr1068)、Phospho-p53 (Ser15)、p53、Bax、p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)、Stat3、Phospho-Stat3 (Tyr705)、c-Jun、Phospho-c-Jun (Ser63)、c-Fos、Phospho-c-Fos (Ser32)、p27、Phospho-CDC2 (Tyr15)、β-actin（以上、Cell signaling Techonology, Inc.）とRPL29（Abnova Corporation）に対する一次抗体を使用した。
その結果、IgG102-115抗体を含む培養液で培養した場合に、細胞内シグナルのうちp53とc-Jun、c-Fosのリン酸化亢進、Baxとc-Fos、p27の発現亢進、EGF受容体とp38 MAPK、Stat3、CDC2のリン酸化低下を認め、アポトーシスの亢進と細胞周期の抑制が示唆された（図７）。
【００４５】
（実施例６）乳癌細胞MCF7に及ぼすIgG102-115抗体の効果
実施例１の結果、乳癌細胞MCF7に対しては(3)のペプチドを抗原として作製した抗体（IgG102-115）が最も抗腫瘍効果が認められた。そこで、IgG102-115抗体について各種濃度の抗体を加えて培養したときの乳癌細胞の増殖に及ぼす効果を確認した。IgG102-115抗体では濃度依存的に細胞増殖抑制効果が確認された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上詳述したように、本発明で特定されるRPL29に対する抗体又はペプチドワクチンからなる分子標的薬によれば、悪性腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。本発明の悪性腫瘍細胞において発現の亢進しているRPL29を標的とする物質は、悪性腫瘍細胞ができたとしても、本来生体内に備わっている抗RPL29抗体であって発病に至らない生体防御機構に係る抗体（特許文献１）と同様の作用を有すると考えられる。係る物質を有効成分として含む本発明の抗悪性腫瘍剤は、安全性が高い薬剤であり、有用である。
【図１】
2017141163.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017141163.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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