(57)【要約】【課題】イメージング又は治療に使用される造影剤及びそれに用いられる化合物を提供する。【解決手段】下記式（I）で表される化合物：【化１】2017007976.tif 000009(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。)又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）で表される化合物：
【化１】
2017007976.tif 000007
(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。)
又はその塩。
【請求項２】
下記式(II) 
【化２】
2017007976.tif 000008
（式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。ＭはＧｄ又はＴｂを示す。)
で表される化合物。
【請求項３】
アビジン化標識物質又はアビジン化機能性物質と請求項２に記載の一般式（II）の化合物が、ビオチン−アビジン結合で結合された複合体。
【請求項４】
請求項３に記載の複合体を含む造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、複合体及び造影剤に関する。
【０００２】
本明細書では、以下の略号を用いることがある
NP：ナノ粒子
QD：量子ドット
SPION：超常磁性酸化鉄ナノ粒子
MRI：磁気共鳴画像
NHS：N-ヒドロキシスクシンイミド
DOTA：1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸
【背景技術】
【０００３】
多様な及び多機能なナノ粒子はin vitro及びin vivoでの多重検出のような応用範囲の広がりのために近年注目を集めている(非特許文献1)。
【０００４】
単一のナノメートルスケールのプローブにおける蛍光及び磁性手段の組み合わせは、生体イメージング、光熱療法及び光力学療法、多様な腫瘍の検出及び単離などの多様な用途に有用である。
【０００５】
量子ドット（QD）は広い吸収範囲、大きなモル吸光係数、狭い発光バンド幅、高い光安定性などの特性のためバイオイメージングで注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cheon, J.; Lee, J. H. Synergistically Integrated Nanoparticles as multimodal Probes for Nanobiotechnology. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1630-1640.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、イメージング又は治療に使用される造影剤及びそれに用いられる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の化合物、複合体及び造影剤を提供するものである。
項１．  下記式（I）で表される化合物：
【０００９】
【化１】
2017007976.tif 000002
【００１０】
(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。)
又はその塩。
項２．  下記式(II) 
【００１１】
【化２】
2017007976.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。ＭはＧｄ又はＴｂを示す。)
で表される化合物。
項３．  アビジン化標識物質又はアビジン化機能性物質と項２に記載の一般式（II）の化合物が、ビオチン−アビジン結合で結合された複合体。
項４．  項３に記載の複合体を含む造影剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、蛍光及びMRIに使用可能な造影剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ビオチン化DOTA (化合物3)及びGd(III)(化合物4)とTb(III)(化合物5)のバイオコンジュゲート錯体の調製, 並びにビオチン化Gd(III)-DOTAのストレプトアビジン-官能化 CdSe/ZnS QDへの複合体化又はビオチン化Tb(III)-DOTAのストレプトアビジン-官能化 SPIONへの複合体化により調製されたランタノイド蛍光-磁気NPの図示(化合物6及び化合物7)。
【図２】(A) 錯体の調製中に連続的に加熱した状態で20分間隔で記録された260 nMの化合物5の水溶液の吸収及び(挿入図)蛍光スペクトル。(B,C)化合物6 (B)及び化合物7(C)のTEM 画像。励起光の波長はAにおいて230 nmである。
【図３】(a,a’,b,b’) 655 nm及び(c,c’,d,d’) 705 nmでのEmλmaxを有する(a,a’,c,c’) CdSe/ZnS QD及び(b,b’,d,d’)化合物6の水溶液の (Aa-d) 吸収スペクトル及び(Aa’-d’) PL スペクトル (B)種々の濃度(10 nM, 20 nM及び30 nM)のビオチン-EGF-AlexaFluor633複合体の存在下又は非存在下に記録した20 nM QD605-ストレプトアビジン溶液の蛍光スペクトル。約640 nmの肩のバンドは、アビジン-ビオチン複合体形成及びQDからAlexaFluor633への連続するFRETを示す。励起光の波長は400 nmである。
【図４】(A) 明視野像, (B) 蛍光像及び(C-E)サンプル溶液とH1650細胞ペレットのMRI: (a) 化合物6, (b)化合物6で標識された細胞, (c) 未標識細胞, (d)化合物4, (e) QD705, (f)化合物7, (g) 化合物7で標識された細胞, (h) PBS, (i) SPION及び(j) 化合物5。
【図５】H1650細胞におけるPL画像とEGFR単一分子の強度分布: (A) EGF-化合物6で標識された細胞及び(B,C) EGF-QD複合体で標識された細胞。A及びBにおける核は、Syto13色素で染色され、CではSyto 21色素で染色された。(D)ガラス基板上に結合され、水に浸漬された単一QDの蛍光画像。(E) Dにおける単一QDのPL強度軌跡。QDは532 nmレーザビームで励起され、Syto色素は400 nmレーザビームで励起された。Syto 13, Syto21及びQDの蛍光はバンド-パスフィルター又はロング-パスフィルターで集められた。(F) (a)ガラス基板上に結合された単一QD及び(b-d) EGF-QD 複合体で活性化され、標識後(b)約15分, (c) 約30分及び(d)1時間超記録されたH1650 細胞におけるEGFRのPL強度ヒストグラム。Fの挿入図: EGF-化合物6複合体又はEGF-QD複合体で活性化された細胞におけるEGFRの標識の提示、二量体化及びクラスタリング。スケールバー: (A-C)- 20 μm, (D) 10 μm.
【図６】毒性アッセイ及びin vivoイメージング。(A, B)種々の濃度の(A) 化合物6-EGF複合体及び(B) QD-EGF 複合体で標識されたH1650 細胞用のMTTアッセイのヒストグラム。(C-H) B6マウスの画像: EGF-化合物6複合体の注入前に記録された(C) 明視野光学画像及び(D)蛍光画像, (E-H) EGF-化合物6複合体の20 nM溶液の静脈注射後に記録された蛍光画像及びMRI: (E) 注入直後に得られた蛍光画像, (F) 注入約30分後に得られた蛍光画像, (G) 注入約30分後に得られたT1-強調MRI及び(H) 注入約2時間後に得られた蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一般式（I）で表される化合物、一般式(II)で表される錯体化合物、さらに、アビジン化標識物質又はアビジン化機能性物質と一般式（II）で表される錯体化合物が、アビジン-ビオチン結合を介して結合した複合体を提供するものである。
【００１６】
本発明で使用する化合物を以下の式（Ｉ）及びその錯体である式（II）に示す。
【００１７】
【化１】
2017007976.tif 000004
【００１８】
(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。ＭはＧｄ又はＴｂを示す。)
式（I）の化合物の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００１９】
式（II）の化合物は、ガドリニウムイオン（Gd3+）又はテルビウムイオン（Tb3+）と化合物（I）の錯体である。
【００２０】
Ｚがビオチニル基のとき、Ｚ-OHはビオチンである。
【００２１】
ビオチニル基はアビジン物質と結合することができる。ここで、ビオチン−アビジン結合は、ビオチンとアビジン物質の結合であり、例えばビオチンとアビジンの結合、ビオチンとストレプトアビジンの結合、ビオチンとニュートラアビジンの結合を包含する。
【００２２】
Ｙで表される二価のリンカー基としては、炭素数１以上のアルキレン基、シクロアルキレン基、−ＣＯ−、−（アリーレン）-（炭素数１以上のアルキレン）−基、アリーレン基が挙げられる。
【００２３】
炭素数１以上のアルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、-CH2CH(CH3)-、-CH(CH3)CH2-などの直鎖又は分枝を有するアルキレン基が挙げられる。
【００２４】
シクロアルキレン基としては、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基などの炭素数３〜８のシクロアルキレン基が挙げられる。
【００２５】
アリーレン基は、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の２価の基を意味し、具体例としては、フェニレン、ナフチレン、フルオレニレン、アントリレン、ビフェニリレン、テトラヒドロナフチレン、クロマニレン、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニレン、インダニレン及びフェナントリレンが挙げられる。
【００２６】
−（アリーレン）-（炭素数１以上のアルキレン）−基としては、上記のアリーレン基と炭素数１以上のアルキレン基（好ましくは炭素数１〜４のアルキレン基、より好ましくは炭素数１〜２のアルキレン基）を組み合わせた基が挙げられる。
【００２７】
ｎ１は、０又は１、好ましくは０を示す。
【００２８】
ｎ２は、０又は１、好ましくは０を示す。
【００２９】
ｎ３は、０又は１、好ましくは０を示す。
【００３０】
ｎ４は、０又は１、好ましくは０を示す。
【００３１】
ｎ１が０のとき、（ＣＨ２）ｎ１は単結合を示す。
【００３２】
ｎ２が０のとき、（ＣＨ２）ｎ２は単結合を示す。
【００３３】
ｎ３が０のとき、（ＣＨ２）ｎ３は単結合を示す。
【００３４】
ｎ４が０のとき、（ＣＨ２）ｎ４は単結合を示す。
【００３５】
アビジン化される標識物質としては、量子ドット(QD)、蛍光物質、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）、酵素、金コロイド、ユーロピウム錯体などが挙げられる。
【００３６】
蛍光物質としては、例えば、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などが挙げられる。
【００３７】
酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
【００３８】
ユーロピウム錯体は公知の配位子が配位した錯体が制限なく使用できる。ユーロピウムイオンの配位子としては、例えばβ−ジケトン構造を有する配位子、β−ジスルフォニル構造を有する配位子、カルボニルイミド構造を有する配位子、スルホンイミド構造を有する配位子などが挙げられ、これらの配位子は形成した錯体の発光効率が良好な点で好ましい。
【００３９】
標識物質は、アビジン物質と結合されてアビジン化標識物質となる。ここで標識物質と結合されるアビジン物質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどが挙げられる。アビジン物質と結合した標識物質は、市販品を使用するか、常法に従い製造することができる。アビジン物質と標識物質の結合は直接結合であってもよく、適当なリンカーを介して結合してもよい。
【００４０】
アビジン化機能性物質は、上記アビジン物質と機能性物質が直接あるいは適当なリンカーを介して結合した材料である。機能性物質としては、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、磁性材料、抗体、薬物、ホルモン、サイトカイン、アプタマー、葉酸、RGDペプチド、EGFなどの受容体のリガンド分子などが挙げられる。
【００４１】
前記複合体は、ＭＲＩ検査用造影剤として有用である。例えばガドリニウム錯体、鉄酸化物、マンガン酸化物、コバルト錯体、ニオジウム錯体などの磁性材料、SPIONなどを含む複合体をＭＲＩ検査用造影剤として好ましく使用することができる。これらの磁性材料又はSPIONと標識を含む本発明の複合体は、静脈注射や観察する器官又は組織に注射し、これを造影剤として利用することができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明は二機能性の標識ナノ粒子からなる複合体を提供する。「二機能性」とは、機能性物質（磁性材料、SPION）と標識物質を含むことを意味し、本発明の好ましい複合体は磁性材料、SPIONと標識物質をアビジン-ビオチン結合により連結する。標識物質はイメージングあるいは治療の後に除かれ、体外への排出を促進する。
【００４３】
本発明の一般式(I)の化合物は、以下のスキーム１に従い製造することができる。
スキーム１
【００４４】
【化４】
2017007976.tif 000005
【００４５】
(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、各々０又は１を示す。Ｘ１は、臭素原子又はヨウ素原子を示す。)
【００４６】
一般式（IA）の化合物１モルに対し一般式（A）の化合物を１モル程度使用し、１モルから過剰量の塩基(base)の存在下に溶媒中で室温から溶媒の沸点程度の温度下に１〜２４時間反応させることにより有利に進行する。塩基としては、ＤＢＵ、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられ、溶媒としては、アセトニトリルが挙げられる。
【００４７】
本発明の一般式(II)の化合物は、以下のスキーム２に従い製造することができる。
スキーム２
【００４８】
【化４】
2017007976.tif 000006
【００４９】
(式中、Ｚはビオチニル基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示す。ｎ１〜ｎ４は、同一又は異なって０又は１を示す。Ｘ１は、臭素原子又はヨウ素原子を示す。)
【００５０】
一般式（I）の化合物１モルに対しTb塩（Tb salt）又はGd塩（Gd salt）を１モルから過剰量使用し、水中で室温から５０℃程度の温度下に１〜２４時間反応させることで、一般式（II）の化合物を得ることができる。
【００５１】
Tb塩としては、TbF3、TbCl3、TbBr3、TbI3、Tb(NO3)3、Tb(CH3COO)3などが挙げられる。
【００５２】
Gd塩としては、GdF3、GdCl3、GdBr3、GdI3、Gd(NO3)3、Gd(CH3COO)3などが挙げられる。
【００５３】
アビジン化標識物質とアビジン化機能性物質は、公知であるか、常法に従い標識物質又は機能性物質にアビジンを結合させることにより得ることができる。
【００５４】
一般式（II）の化合物とアビジン化標識物質／アビジン化機能性物質は、水などの溶媒中で混合することでアビジン物質とビオチンが結合して目的とする複合体を得ることができる。アビジン化標識物質／アビジン化機能性物質１モルに対し一般式（II）の化合物を１モルから過剰量使用し、室温程度の温度下に１〜２４時間反応させて、ビオチン−アビジン結合を形成する。過剰な一般式（II）の化合物は、透析などにより除去することができる。
【００５５】
造影剤の投与量は、標的となる組織や細胞の種類、数、疑われている疾患の種類、進行度、患者の年齢、性別、体重等により適宜調整することができ、特に限定されないが、一般に、経口、経皮、注射等によってヒト成人に投与する際には、１回の投与量は、通常、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度である。Ｇｄ／Ｔｂの投与量としては、１回の投与当たり、０．００１ｍｇから１０ｍｇ程度が好ましい。
【００５６】
＊本発明の好ましい実施形態
本発明者は、複雑な化学反応又はホスト材料を使用することなく、新規ビオチン化 DOTA-Gd(III) 錯体のストレプトアビジン-官能化 CdSe/ZnS QDへの直接結合及びビオチン化DOTA-Tb(III) 錯体のストレプトアビジン-官能化 SPIONへの直接結合により調製されたシンプルで小サイズの蛍光-磁気バイモダル NPを提供する。
【００５７】
DOTAの１つのカルボン酸基とビオチンのω-ブロモプロピルエステルの直接縮合により調製されたシンプルなビオチン化-DOTA誘導体を錯体と蛍光-磁気 NPの調製に利用した。次いで、これらのNPを上皮成長因子(EGF)と複合体化し、単一分子, 細胞及びin vivo イメージングにおけるEGF-複合体NPの可能性をヒト肺上皮アデノカルチノーマ(H1650) 細胞又はB6マウスにおいて評価した。
【００５８】
ビオチン化 Gd(III)-DOTA 錯体のストレプトアビジン 官能化 CdSe/ZnS QDへの直接連結及びビオチン化Tb(III)-DOTA 錯体のSPIONへの直接連結により調製される２つのタイプの新規蛍光-磁気NPを用いてin vitro及びin vivoでのMRIと蛍光画像の組み合わせを得ることができる。ビオチン化錯体は、図１に示す単純な化学反応により調製される。最初に、1,3-ジブロモプロパンとビオチンのDBU（1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン）触媒反応により得られるビオチンのω-ブロモプロピルエステル(2)を1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン1,4,7,10-四酢酸(DOTA)の１つのカルボキシル基に複合体化してビオチン化リガンド(3)を得た。次いで、ビオチン化 Gd (III)-DOTA錯体 (4)を化合物3とGdCl3の反応により調製した。同様に, ビオチン化 Tb(III)-DOTA錯体 (5)をTbCl3・6H2Oを用いて調製した。錯体はBrittainとDesreuxにより報告されたものと同様な手順で調製した。本発明者は、種々の時間間隔で反応混合物の吸収及び蛍光スペクトル(図2A)を記録することにより、化合物5の形成を追跡した。また、MALDI-TOF 質量スペクトルを使用して錯体を特徴付けした。Tb (III)における5D4→7F5への遷移に起因して約545 nmの主要バンドを有するTb(III) 錯体特徴的な蛍光バンドは化合物5の検出に有用であった。さらに、本発明者は、化合物3の酸素原子(COOH 基)と窒素原子(サイクレン環)によるTb(III)の水リガンドの置換のため及び関連する吸収-エネルギー移動-発光(AETE)メカニズムにより、反応下の時間に伴う化合物5の蛍光強度(図2Aの挿入図)の増加及び飽和から化合物5の形成を確認した。
【００５９】
他方、化合物３ではなくTb (III)イオンの水溶液の蛍光強度は加熱時に完全なままであった。これらの結果は、化合物4と5の形成を実証する。化合物2-5の調製及び特徴付けは実施例で記載される。蛍光-磁気ナノ粒子である化合物6と7は、化合物4，5とQD及びSPION上のストレプトアビジンのビオチン結合部位への直接連結により調製された(図1)。図2のバンドCは化合物6と7のTEM画像を示す。化合物4のQDへの結合がQDの特性に影響するか否かを評価するために、化合物4の結合の前後でQD655とQD705の定常状態の吸収(図3Aの波形a-d)及び光子放出(PL,図3Aの波形a’-d’) スペクトル及びナノ秒PL減衰プロフィール (図3Aの挿入図)を記録及び解析した。
【００６０】
図3Aに示されるように、QD(QD655又はQD705)の吸光度は化合物4により影響されない。 初期のQDと比較したときの化合物6の光学密度のわずかな相違(<300 nm)は、化合物4のUV光の吸収に原因がある。さらに、化合物4との結合後のQDのPL量子効率の変化[QD655についてΦf = 79%、QD705についてΦf = 51%]とPL 寿命 (QD655についてτPL = 12 ns、QD705についてτPL = 41 ns)は無視できる。ここで、QDのΦf値は製造者により提供され;一方、PL寿命値は、三次の反応速度論に対するPL減衰プロフィールを近似することにより実験的に決定できる。
【００６１】
本発明者らは、QDをコーティングするポリマーとストレプトアビジンにより提供される錯体とQDの間の空間的な分離が化合物6のQDコアの物理特性を保つと考えている。これらの観察は、安定なマルチモーダル NPが準備のできた複合体ランタノイド錯体のQDやSPIONなどのNPへの直接連結により、NPのサイズ及び特性に有意な影響を与えることなくルーチンに構築されることを示唆する。
【００６２】
細胞標識及びin vivo適用用のランタノイドが点在した蛍光-磁気NPを多重配位錯体(化合物4又は5)の連結の前に 1当量のビオチン化EGFリガンドをQD又はSPION表面に結合することにより調製した。ここで、EGFは使用したヒト肺上皮アデノカルチノーマ細胞株(H1650)におけるEGF受容体(EGFR)の過剰発現を考慮して選択した。最初に、ヒト組換えEGFはビオチンスルホ-NHSエステルを用いてビオチン化され、Sephadex G25 カラム上のゲルろ過により精製された。ビオチン化 EGF分子は室温で30分間 QD/SPION上のストレプトアビジンに（1:1 EGF-ビオチン:QD/SPION)で結合され、次いで10:1当量(4:QD及び5:SPION)で化合物4とQDの結合並びに化合物5とSPIONの結合を行った。
【００６３】
ビオチン化 EGF分子のNP上のストレプトアビジンへの結合はFoerster共鳴エネルギー移動(FRET)測定により試験された。ここで、FRET系は、CdSe/ZnS QDをエネルギードナーとし、AlexaFluor633をアクセプターとして構築された。最初に、AlexaFluor633-標識 EGFビオチン化 EGF(50 μL, 6 μM)とAlexaFluor633のNHSエステル(50 mL, 30 μM)とを室温で1時間反応させて調製した。標識EGF分子は2kDaの膜に対して3回繰り返して透析することにより精製し、遊離のAlexaFluor633NHSエステルのような低分子量化合物を除去することにより精製した。ビオチン化 EGF-AlexaFluor633 複合体のストレプトアビジン-QD 複合体(Emλmax= 605 nm)に対する結合は、種々の濃度の混合物の蛍光スペクトルを得ることにより分析した。 混合物中においてEGF-AlexaFluor633の濃度が増加するにつれてQD(エネルギードナー)のPL強度は減少し、これはAlexaFluor633の特徴的な蛍光バンドの出現と増強に関連する（図3B）。これらの結果は、QDからAlexaFluor633へのFRETはビオチン化 EGFのQD上のストレプトアビジンへの結合に起因することを示唆する。
【００６４】
in vitroバイオイメージング用のEGF-複合体化蛍光-磁気NPの可能性はH1650 細胞で試験された。70% コンフルエンスまで培養された細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄され、EGF-QD, EGF-化合物6又はEGF-化合物7複合体の1 nM溶液で1時間氷冷条件下で処理された。このステップ中に、H1650細胞の細胞膜に過剰発現されるEGFR分子に対するEGFリガンドの特異的結合のために、細胞は該複合体で標識された。標識細胞はPBSで十分洗浄され、トリプシンを用いて収穫され、MRIと蛍光イメージング用のペレットにされた。単一細胞のMRIに対する技術的障害のために、本発明者は単一細胞の代わりに細胞ペレットを選択した。バイオマーカー特異的造影剤で標識された細胞ペレットのMRIは、生体分子、腫瘍細胞及びアポトーシスの特徴付けに活かされた。図4A-EはEGF-化合物6又はEGF-7を用いた標識とともに又は標識無しにQD、SPION、化合物4-7及びH1650細胞ペレットの蛍光画像及びMRIを示す。QDのNIR (705 nm)PL(図3A及び4B)及びEGF-化合物6で標識された細胞のT1-及びT2-強調MRI造影の増強はマルチモーダル・バイオイメージング用のGd(III)錯体が点在したNIR QDの可能性を示す。標識されていない細胞(図4Cc)及び化合物4の溶液(図4Cd)及び化合物6の溶液(図4Ca)と比較して、標識細胞の明るいMRIコントラスト(図4Cb)は、EGFRや標識細胞のエンドソームのようなプロトン性オルガネラの磁気緩和の変化に起因する。にもかかわらず、溶液相における化合物4と化合物6のT1-強調コントラストはQD溶液(図4Ce)又はバッファー(図4Dh)のコントラストに匹敵する。標識細胞と比較してサンプルの乏しいコントラストは溶液相での分子又はNPの自由な拡散に原因がある。T1-強調MRIコントラストの増強は、EGF-7で標識された細胞で観察された。SPION-ベースの粒子は理想的なT2-造影剤であるので、サンプル溶液(化合物5, SPION及び化合物7)並びにEGF-7で標識されたH1650 細胞のT2-強調 MRIを記録及び分析した。興味深いことに、標識細胞のMRI(T2)コントラスト(暗化)の大きな増加が観察され[図4Dg(T1)〜図4E(T2)]、これはSPION溶液のT2-強調MRIコントラストの暗化に匹敵する[図4Di(T1)〜図4E(T2)]。 にもかかわらず、UV領域における吸収バンド(図3A)及び化合物5の青緑領域における大きな蛍光バンドが、蛍光-ベースのバイオイメージング用の化合物7の主要な制約である。このように、本発明者はEGF-化合物6に焦点をあててさらに研究し、この研究において非常に優れた明るさや光安定性、Vis-NIR領域におけるブロードな光吸収、大きなストークスシフト及びNIR PL(655nm又は705 nm)のようなQDの特性は、バイオイメージング用のGd(III) 錯体のMRIコントラストと組み合わせられる。蛍光顕微鏡が 生細胞におけるEGF-化合物6 複合体の単一分子検出に使用された。ここで、60mm組織培養プレートにおいて70%コンフルエンスまで培養されたH1650 細胞はEGF-化合物6又はEGF-QD複合体の1 nM 溶液を用いて標識された。標識は、標識ステップ中の複合体のエンドサイトーシスを最小化するために氷冷条件下で行われた。さらに、細胞の核は報告された文献に従い（E. S. Shibu, K. Ono, S. Sugino, A. Nishioka, A. Yasuda, Y. Shigeri, S. Wakida, M. Sawada, V. Biju, ACS Nano 2013, 7, 9851.）Syto21又はSyto13色素で染色された。標識細胞はPBSで十分洗浄され、培地はDMEM培地に変えられ、400 nm(Syto色素用)又は532 nm (QD用)のレーザビームで励起され、倒立光学顕微鏡で観察された。EGF-化合物6複合体を用いて標識された細胞の蛍光画像(図5A)は、複合体の効率的な細胞内送達を示し、これはEGF-QD複合体のエンドサイトーシスに匹敵する(図5B, C)。他方、EGFの非存在下で化合物6又はQDとインキュベートされたコントロール細胞は細胞内の蛍光を示さなかった。複合体の細胞内送達はH1650細胞の細胞膜で過剰発現されているEGFRへの結合により生じ、次いで、EGFR-EGF-化合物6集合体は受容体介在エンドサイトーシスによりのみ込まれる。
【００６５】
EGFのEGFRへの結合とそれに続くEGF-化合物6/EGF-QD複合体の細胞内経路を分析するために、H1650細胞を単一のEGF-QD複合体で標識し、EGF-EGFR錯体の時間-及び強度-依存性単一分子蛍光を記録した。ここで、H1650細胞の細胞膜中のEGFRはEGF-QD複合体の溶液(1 nM)を適用することにより活性化された。図5Cに示されるように、活性化の直後(<15 min)、EGF-EGFR錯体は選択的に細胞膜に存在し、大部分は糸状仮足又は葉状仮足に結合していた。細胞膜における個々の蛍光スポットの点滅とPL強度はガラス基板上に結合された初期のQDに匹敵し(図5D,E)、EGFR単一分子の検出を実証する。図5FはEFG-QD複合体を用いたEGFRの活性化後の種々の時間間隔で検出された蛍光スポットのPL強度ヒストグラムを示す。興味深いことに、1個又は2個のQDに相当する蛍光強度のEGFR分子の均一な分布は、活性化の直後(<15 min)に検出された(図5Fb)。しかしながら、より明るい蛍光スポットはインキュベーション時間とともに現れる。蛍光スポットの強度の一時的な変化は、受容体の二量体化及びクラスタリングに割り当てられ、ガラス基板上に結合されたQDのそれと細胞膜における500超の単一分子受容体の時間-及び強度-依存性の蛍光画像との関連により調べられた。
【００６６】
EGFRの活性化の15分以内に受容体の大部分(>80%)は1又は2のEGF-QD複合体と結合している(図5Fb)。次の15〜30分間、二量体及びより大きなクラスターに相当する発現が増加する。この増加の結果、ヒストグラムはより高い強度の側にシフトした(図5Fc,d)。単一QDと同等の強度を有する蛍光スポットは、EGFRのヘテロダイマー、すなわち1つのみのEGF-QD複合体(図5Ff)により連結されたEGFRプレ-ダイマーに起因する(図5Fe)。2つのQDと同等の強度を有する蛍光スポット数の増加は、2つのEGF-QD複合体(図5Fg)による各プレダイマーの活性化の結果、あるいは図5Ff-hに示されるシグナリングダイマー及びプレダイマーへの2つのヘテロダイマー (図5Ff)の結合及び不均化の結果であることを示唆する(図5Fg及びh)。インキュベーション時間とともに優位を占める高強度蛍光スポットは、ダイマーのクラスタリングを示唆する。より大きなクラスターは最終的に細胞質に輸送され、核周囲のリソソーム形成部位に蓄積する(図5A,B)。これらの結果は、EGF-QD及びEGF-化合物6複合体は、生細胞中のEGFRの単一分子、ダイマー及びクラスター の検出と追跡を可能にする。ナノ材料の特有の光学及び磁気特性にもかかわらず、毒性はその生物学的適用を妨げる未解決の中心的課題である。ナノ材料の毒性は、サイズ、表面、材料に関連し得る。それ故、ナノ材料の毒性に対する全般的な解決はありそうもなく、ケースバイケース分析が必要になる。本発明者は、EGF-化合物6複合体の毒性を複合体で標識されたH1650 細胞におけるミトコンドリアレダクターゼ酵素活性アッセイ (MTT アッセイ)により調べ、未標識細胞及びEGF-QD複合体で標識された細胞の結果と比較した。細胞生存度は、10 nMまでの濃度を有するEGF-化合物6溶液で処理したときに90%超を保持し(図6A)、これは細胞標識及びイメージングで使用する濃度よりも1桁高い(図5A)。図6A及び6Bに示されるように、EGF-化合物6複合体で標識された細胞の生存度は、EGF-QD複合体で標識された細胞と同程度かわずかに高い。これらの結果は、化合物6の生物適合性を確認するだけでなく、QD上の多重Gd(III)錯体はQDの細胞毒性効果を誘発しないことを示唆する。
【００６７】
in vitroでの非細胞毒性の性質にもかかわらず、in vivoで適用されると大抵のナノ材料は細網内皮系と相互作用し、錯体の薬物動態を刺激し、 臨床適用の承認を損なう。換言すると、均一な生体分布及び効率的な腎又は肝胆汁性分泌はナノ材料の生物医学イメージングから薬物送達及び癌治療へのin vivo適用に必須の要件である。本発明者は、B6 マウスにおけるin vivo イメージング用のランタノイド-点在した蛍光-磁気NPの可能性及びin vivoでのNPの結果を評価した。20 nMのEGF-化合物6複合体溶液を静脈内注射によりヌードマウスに投与した。マウスのMRI及び蛍光画像を注射後の種々の時間間隔の前後において得た。注射後30分以内では(図6E, F)、NPは大部分が肝臓に蓄積していた。また、肝臓でのMRIコントラストの増加は、T1-強調画像において検出された(図6G)。肝臓からのPL蛍光は2時間で減少し(図6H)、注射の24時間後にバックグラウンドのレベルになった。これらの結果は、肝臓のような深部組織からのNPの効率的な検出だけでなく、NPのクリアランスの検出を示す。PLの減少及び消失は、腎経路での排出を示し、これはQD及びQD-ベースの蛍光-磁気NPで観察された。本発明者は、NPが肝臓酵素で分解することを排除しない。本発明者は、本発明者はマルチモーダル・イメージング用の新規ランタノイドが点在した NPの調製, 長期薬物動態及びこのようなNPの毒性について焦点を当てて検討した。
【００６８】
本発明者は、QD又はSPIONの表面にGd(III)又はTb(III)の新規の準備のできたバイオ複合体錯体の直接結合によりシンプルな蛍光-磁気NP造影剤の調製を示した。さらに、 EGFホルモンの表面への補充により、これらNPはEGFRが過剰発現しているヒト肺上皮アデノカルチノーマ細胞に効率的に送達された。QD/SPIONと準備のできたバイオ複合体配位錯体Gd(III)/Tb(III)で構成されるバイオイメージング用のランタノイドが点在したNPの可能性は、サンプル溶液のMRI及び蛍光画像、EGFR 単一分子、生細胞及びマウスにより明らかにされた。直接的な調製、T1-及びT2-強調 MRIコントラスト、明るく安定なNIR蛍光及び生物適合性は、NPを生物医学的イメージング及び画像誘導治療に有望な多重配位錯体で装飾されたNPを作製する。 
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００７０】
実施例１
１． 材料
錯体及び蛍光-磁気NPの調製, 精製及び特徴付けに使用する全ての化学物質及び溶媒は、分析グレードであった。ストレプトアビジン-官能化CdSe/ZnS QD サンプル (Emλmax =605/655/705 nm)及びAlexaFluor633-NHSエステルはLife Technologiesから入手し、SPIONはNANOCSから入手した。 ビオチンとDOTAは和光純薬工業(株)から入手した。 ランタノイド塩及びDBUはSigma-Aldrichから入手した。1,3-ジブロモプロパンは東京化成工業(株)から入手した。
【００７１】
２．合成
ビオチン化Gd(III)錯体及びビオチン化Tb(III) 錯体とランタノイド蛍光-磁気NPの調製に関与するステップは、図１に要約される。先ず、ビオチンのω-ブロモプロピルエステル(2)をビオチン (1 g, 4.09 mmol)と1,3-ジブロモプロパン(2.42 g, 12.0 mmol)をDBU(980 μL, 6.55 mmol)を触媒とした反応により調製した。ビオチンをDBUの添加によりアセトニトリル (25 mL)に溶解し、次いで1,3-ジブロモプロパンを添加した。反応混合物を激しく撹拌しながら82℃で12時間加熱した。次に、反応混合物を室温に冷却して白色の沈殿物を生じさせた。n-ヘキサン(4mL未満)を反応混合物に滴下して沈殿物の量を増加させた。白色沈殿を濾紙によるろ過で集め、クロロホルムに溶解し、溶離液としてジクロロメタンを用いるシリカゲル(200-400 mesh)カラムクロマトグラフィーで精製して化合物2を80％の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.46 (m, 2H), 1.70 (m, 4H), 2.18 (m, 2H), 2.35 (t, 2H), 2.74 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.47 (t, 2H), 4.21 (t, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.56 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 5.56 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 29, 32.5, 34, 36, 38, 45, 53, 59, 64.5, 66.5, 101, 167, 178; MALDI-TOF (C13H21N2O3BrS) m/z = 365。
【００７２】
ビオチン化DOTA (3) をDOTA のカルボン酸基の1つと化合物2のω-ブロモ基のDBU触媒縮合反応により調製した。この縮合反応において、DOTA (200 mg, 0.495 mmol), 化合物2 (200 mg, 0.619 mmol)及びDBU (300 μL, 2.01 mmol)の混合物をアセトニトリル (50 mL)に溶解し、82℃で18時間撹拌した(図1)。DBUの使用量は、DOTAの完全な溶解のために300 mLに設定した。18時間後、反応混合物を室温まで冷却し、さらに氷浴で冷却した。トリフルオロ酢酸(300 μL)の10 mLジクロロメタン溶液を添加し、氷冷して粗生成物をオフホワイトの重い液体として分離した。上清をデカントし、粗生成物を5 mLのメタノールに溶解した。次いで15 mLのアセトンを加え、化合物3を白色沈殿として得、これをさらにメタノール:アセトン混合物 (1:4)を用いて繰り返し沈殿させて精製し、化合物3を65%の収率で得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 1.32 (m, 2H), 1.45 (m, 4H), 1.86 (m, 2H), 2.20 (t, 2H), 2.60 (ds, 1H), 2.82 (dd, 1H), 3.38 (bs, 6H), 3.76 (bs, 16H), 3.89 (bs, 2H), 4.07 (t, 2H), 4.13 (t, 2H), 4.22 (q, 1H), 4.40 (q, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ =23.01, 24.77, 27.90, 28.33, 28.54, 33.57, 39.85, 48.89, 49.92, 50.95, 51.09, 52.98, 53.19, 54.13, 55.04, 55.87, 60.45, 60.83, 61.86, 62.24, 115.57, 118.49, 161.55, 161.89, 164.91, 168.98, 170.75, 172.43, 174.22; MALDI-TOF (C29H48N6O11S) m/z = 689。
【００７３】
Gd(III)とTb(III)のバイオコンジュゲート用の錯体をGdCl3又はTbCl3.6H2Oと化合物3の反応により調製した。 DOTA 錯体の調製を文献(H. G. Brittain, J. F. Desreux, Inorg. Chem. 1984, 23, 4459)記載の方法により行った。最初に、化合物3 (4.1 mg, 5.95 μmol) とGdCl3 (36.9 mg, 140 μmol)の水溶液(各1 mL) を調製し、10 mM NaOH溶液を添加して溶液のpHを8に調整した。次に、これら2つの溶液を混合し、60℃で2 時間加熱して化合物4を得た。同様に、各1 mLの水中の化合物3 (1 mg, 1.45 μmol)とTbCl3 (2 mg, 5.36 μmol)を混合して化合物 5 を調製した。これら錯体を吸収、蛍光、MALDI-TOF質量分析で同定した。化合物4: m/z (845.8) 及び化合物5: m/z (846.4)。
【００７４】
３．方法
1Hと13C NMR スペクトルはJEOL 400 MHz spectrometerで得、MALDI/LDI-TOF 質量分析はBRUKER Microflex spectrometerで得た。標識されたH1650細胞の蛍光画像は40x 対物レンズ、Syto色素及びQD用のロングパスフィルターまたはバンドパスフィルター, iXon3 EMCCD (Andor Technology)又はデジタルCCDカメラ(Olympus)を備えた倒立光学顕微鏡(Olympus IX70)で得た。使用した励起光は、Syto色素について400 nm フェムト波(femtowave、詳細は以下に記載)又はQDについて532 nm CW レーザ(Millennia II, Spectra Physics)を使用した。蛍光スポットの強度は、EMCCDカメラを用いて記録された単分子ビデオのPL強度の軌跡を分析することにより得た。単分子測定の詳細は、文献に報告されている（S. Yamashita,  M. Hamada, S. Nakanishi, H. Saito, Y. Nosaka, S. Wakida, V. Biju, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 3892; S. Yamashita,  M. Hamada, S. Nakanishi, H. Saito, Y. Nosaka, S. Wakida, V. Biju, Angew. Chem. 2015, 127, 3964.; E. S. Shibu, A. Sonoda, Z. Tao, Q. Feng, A. Furube, S. Masuo, L. Wang, N. Tamai, M. Ishikawa, V. Biju, ACS Nano 2012, 6, 1601.; M. Hamada, E. S. Shibu, T. Itoh, M. S. Kiran, S. Nakanishi, M. Ishikawa, V. Biju, Nano Reviews 2011, 2, 6366.）。サンプル溶液、細胞ペレット及びマウスの蛍光画像とMRIは小動物イメージングシステム(Maestero, Perkin-Elmer)及びMRI装置(MR Technology, Inc., Japan)を用いて得た。サンプル溶液、細胞ペレット及びマウスの蛍光画像は、Maestro or Image-Pro Plus software (Roper Industries, Inc., USA)を用いて解析した。
【００７５】
定常状態蛍光/PL スペクトルは、蛍光分光光度計(Hitachi FL4500)を用いて記録した。PL減衰プロファイルは、ポリクロメータ(Chromex-250IS)及びストリーク・カメラ(Hamamatsu-C4334)のアッセンブリを用いて記録した。PL寿命測定の詳細は、既報である（S. Yamashita,  M. Hamada, S. Nakanishi, H. Saito, Y. Nosaka, S. Wakida, V. Biju, Angew. Chem. 2015, 127, 3964.）。サンプルは、 光パラメトリック増幅器(Coherent OPA 9400)のSHG 結晶から生じる400 nm パルスを用いて励起され、好適なバンドパスフィルターまたはロングパスフィルターで集めた蛍光シグナルはポリクロメータの入口スリットに焦点を合わせ、ストリークカメラを用いて記録した。
【００７６】
４．毒性アッセイ
NPの毒性はMTTアッセイで評価した (MTT cell proliferation kit, Roche Diagnostics)。約100万個のH1650細胞/プレートを10% FBSを補足したDMEMを含む96-ウェルの組織培養プレート(FALCON)に接種し、 37℃で48時間培養した。細胞を多量のPBSで洗浄した後、培地を異なる濃度(0.1〜10 nM)のEGF-QD又はEGF-化合物6 複合体を添加したDMEM (FBSを含まない)と交換した。1時間のインキュベーション後、細胞を多量のPBSで洗浄し、MTT溶液(10 μL/ウェル, 5 mg/mL)及びDMEM-FBS培地を加えた。37℃で4時間のインキュベーション後、細胞を0.01 M HCl中に10%ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶解バッファー(100 μL/ウェル)で溶解した。MTTから形成されたミトコンドリアレダクターゼの代謝活性の結果である細胞内フォルマザン結晶を37℃で終夜溶解した。非標識細胞とEGF-QD又はEGF-化合物6で標識された細胞の生存度を550 nmでのフォルマザンの吸光度の測定により決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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