(57)【要約】【課題】  従来法では難しかった前立腺癌と前立腺肥大症とを識別する方法を提供する。【解決手段】  癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の量を測定することで、課題である前立腺癌と前立腺肥大症との識別をすることが可能となった。本発明は例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−等の癌関連構造の糖鎖、及びＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−等の癌関連構造の糖鎖を、同一分子内に有するＭＵＣ１を、２つの抗体を用いたサンドイッチ測定法等により測定し、得られた値から前立腺癌と前立腺肥大症とを識別する方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来の試料中に含まれる癌関連構造の糖鎖を有するムチン−１の量を測定することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症を識別する方法。
【請求項２】
前記ムチン−１が、下記の群より選択される１種以上の癌関連構造の糖鎖を有するものである、請求項１に記載の方法。
Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
ＧａｌＮＡｃα−、
Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び                                    Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【請求項３】
前記ムチン−１が、下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、請求項１又は２に記載の方法。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【請求項４】
癌関連構造の糖鎖がムチン−１のリピート配列（配列番号１）に結合している、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するムチン−１を認識する抗体、及び癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するムチン−１を認識する抗体を用いる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
サンドイッチ法又は免疫沈降／免疫染色法により測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記被検体は血中トータルＰＳＡ値が３.０〜１０.０ｎｇ/ｍｌである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するムチン−１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体、並びに下記の癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するムチン−１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体を含有することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症の識別用キット。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質ムチンの中でも、修飾されている糖鎖の異なるムチン−１（Ｍｕｃｉｎ−１、以下、「ＭＵＣ１」とも称する）を測定することを特徴とする前立腺癌と前立腺肥大症との識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチンの一種であるＭＵＣ１は、腫瘍関連抗原であり、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。この糖タンパク質は、膜糖タンパク質であり、細胞外ドメインには、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（以下「リピート配列」とも称する：ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ（配列番号１））の３０〜９０タンデム型反復から構成される領域が存在する。リピート配列の反復回数は、個体によって異なり、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。リピート配列内にはＯ型糖鎖修飾可能なアミノ酸であるセリン、トレオニンが計５個あり、それぞれのアミノ酸にＯ型糖鎖が付加することは可能であるが、付加しているＯ型糖鎖の種類や、付加しているアミノ酸の部位は、癌の種類によって様々な組み合わせがあり、不均一である。一般的に、癌では糖鎖付加量が減少するためペプチド骨格のコア配列が露出することが知られ、露出したペプチド骨格に対する抗体を用いた免疫診断が確立されている。特に、乳癌の腫瘍マーカーであるＣＡ１５−３は血流中のＭＵＣ１を測定する診断マーカーの一例である。一般に、ムチンを診断マーカーとする欠点として臓器特異性の低さが挙げられる。そのため、ＣＡ１５−３は乳癌の確定診断には適さないマーカーと見なされ、主に治療効果を判定する目的で利用されている。
【０００３】
糖鎖を抗原認識部位の一部とするＭＵＣ１認識抗体としては、ＭＹ．１Ｅ１２やＫＬ６が知られている。さらに、特許文献１では、配列番号１で示されたＭＵＣ１のリピート配列中の９番目のトレオニンに特定の糖鎖が付加した場合に結合する、比較的特異性の高い抗体１Ｂ２が提供され、１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチイムノアッセイが行われている。一方、特許文献２では、配列番号１で示されたＭＵＣ１のリピート配列に特定の糖鎖が結合した場合に結合する比較的特異性の高い抗体１２Ｄ１０が提供され、１２Ｄ１０−１２Ｄ１０サンドイッチアッセイが行われている。しかしながらこれらの抗体を使用した癌の診断も、ＭＵＣ１のコア構造を認識する抗体と同様に臓器特異性が低いという問題があり、糖鎖を抗原認識部位の一部とするＭＵＣ１認識抗体を使用した特定の癌に対する性能の良い診断方法は提供されていない。
【０００４】
前立腺癌は、一般に血中トータルＰＳＡ量を測定することによって特異的に診断することが可能であると考えられている。しかし前立腺肥大症患者においてもトータルＰＳＡ値は上昇し、特にトータルＰＳＡ値が低値（３．０〜１０．０ｎｇ／ｍｌ）の場合において、前立腺癌と前立腺肥大症を識別できないという問題があり、前立腺癌と前立腺肥大症を識別可能な診断方法が必要とされている。
【０００５】
非特許文献１によれば、前立腺癌組織または前立腺癌由来細胞の細胞表面にはシアリルコア１Ｏ型糖鎖構造によって修飾されたＭＵＣ１が発現することが報告されている。しかし、体液中の特定の糖鎖修飾を受けたＭＵＣ１量を指標とした診断技術もしくは、前立腺癌と肥大症を識別する方法は報告されていない。
【０００６】
非特許文献２によれば、前立腺癌組織及び前立腺肥大症組織のいずれにおいても、糖鎖を有するＭＵＣ１が発現していると報告されている。しかし、ここで用いられている抗体は、ＭＵＣ１のペプチド部分を認識する抗体であって、糖鎖を認識するものではない。また、ＭＵＣ１の癌関連糖鎖についての言及はなく、糖鎖を有するＭＵＣ１の量を指標とした癌と肥大症を識別する方法は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０５２８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／１３５８６９号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｒａｉ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．  ６５４−６６１
【非特許文献２】Ｉ．Ｃ．  ＳＣＨＵＴ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）ＢＪＵ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ９１，２７８−２８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＭＵＣ１を用いた前立腺癌患者と前立腺肥大症患者を識別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、以下の通りである。
（１）被検体由来の試料中に含まれる癌関連構造の糖鎖を有するムチン−１の量を測定することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症を識別する方法。
（２）前記ムチン−１が、下記の群より選択される１種以上の癌関連構造の糖鎖を有するものである、前記（１）に記載の方法。
Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
ＧａｌＮＡｃα−、
Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び                                    Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
（３）前記ムチン−１が、下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）及び（Ｂ）を有するものである、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
（４）癌関連構造の糖鎖がムチン−１のリピート配列（配列番号１）に結合している、前記（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するムチン−１を認識する抗体、及び癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するムチン−１を認識する抗体を用いる、前記（３）に記載の方法。
（６）サンドイッチ法又は免疫沈降／免疫染色法により測定することを特徴とする、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記被検体は血中トータルＰＳＡ値が３.０〜１０.０ｎｇ/ｍｌである、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するムチン−１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体、並びに下記の癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するムチン−１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体を含有することを特徴とする、前立腺癌と前立腺肥大症の識別用キット。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、従来法では難しかった前立腺癌と前立腺肥大症とを識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１及び２でサンドイッチＥＬＩＳＡ測定によって測定されたＭＵＣ１量の分布を示す図である。
【図２】前立腺肥大症患者、前立腺癌患者から得られた血清中の、１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定及び１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチＥＬＩＳＡ測定によって測定されるＭＵＣ１量の分布、並びにトータルＰＳＡ値の分布を示す図である。
【図３】前立腺肥大症患者、前立腺癌患者から得られた血清中の、１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定及び１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチＥＬＩＳＡ測定によって測定されるＭＵＣ１量、並びにトータルＰＳＡ値からＲＯＣ解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明の識別方法は、上述の方法により癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１を測定し、得られた値から前立腺癌と前立腺肥大症とを識別することを特徴とするものである。
【００１４】
ここで「癌関連構造」とは、癌組織または癌細胞において高発現している構造（例えば、糖鎖構造）をいう。この構造は、正常組織や正常細胞において発現量が低いことが知られている。このような癌関連構造の糖鎖としては、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、ＧａｌＮＡｃα−、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及びＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−などを挙げることができる。
【００１５】
このとき、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００１６】
さらに、本明細書において、糖鎖の結合様式について、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌの３位とがα−グリコシド結合することを示し、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃは、Ｇａｌの１位とＧａｌＮＡｃの３位とがβ−グリコシド結合することを示し、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌＮＡｃの６位とがα−グリコシド結合することを示し、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌＮＡｃの６位がα−グリコシド結合したＧａｌＮＡｃの３位とＧａｌの１位とがβ−グリコシド結合することを示す。
【００１７】
本発明において「癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１」として、より好ましくは、癌関連構造の糖鎖として（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及びＧａｌＮＡｃα−から選択される１種以上の糖鎖及び、癌関連構造の糖鎖として（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及びＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−から選択される１種以上の糖鎖のそれぞれを同一分子内に有するＭＵＣ１である。
【００１８】
このとき前記糖鎖（Ａ）及び前記糖鎖（Ｂ）は、還元末端側のＧａｌＮＡｃを介してＭＵＣ１のアミノ酸残基に結合している。特に前記糖鎖（Ａ）は、ＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に結合していることが好ましく、具体的にはリピート配列のセリン残基又はトレオニン残基に結合していることが好ましい。中でもリピート配列（配列番号１）の９番目のトレオニンに結合していることがさらに好ましい。また前記糖鎖（Ｂ）もＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に結合していることが好ましい。
【００１９】
癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の測定方法としては特に限定されるものではないが、抗体を用いた免疫学的方法が好ましい。例えば、前記糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び前記糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を組み合わせて用いることができる。但し、その２種類の抗体の少なくとも一方は、ＭＵＣ１のアミノ酸をも認識する抗体を用いる測定方法をあげることができる。これにより前記糖鎖（Ａ）及び前記糖鎖（Ｂ）を同一分子内に有するＭＵＣ１を確実に測定することができる。このような２種類の抗体を用いた測定方法としては、例えば２種類の抗体を用いたサンドイッチ法や、一方の抗体で免疫沈降させ、次いで他方の抗体で免疫染色する免疫沈降／免疫染色法などをあげることができる。
【００２０】
ここで前記「サンドイッチ法」とは、抗原に対して特異的に結合する２つの抗体を抗原に反応させて抗原を追跡する方法である。例えば、使用される抗体の一方を担体に結合した状態にし、試料中の抗原と反応させて抗原を補足し、またもう一方の抗体も抗原に反応させて、抗原抗体複合体を形成する方法である。形成された抗原抗体複合体は、少なくとも１つの抗体を標識するか、または二次抗体を反応させることによって検出される。ＭＵＣ１のように抗原エピトープが多価の分子を検出する場合は、同一の抗体を用いてサンドイッチすることも可能である。抗原に対して２つの抗体を同時に反応させる方法や、順次反応させる方法等があるが、順次反応させる方法の方が好ましい。
【００２１】
また前記「免疫沈降／免疫染色法」の「免疫沈降」法とは、抗体によって目的の抗原を、溶液中から特異的に沈降せしめる方法のことをいう。例えば、抗体をセファロースなどの高分子からなる粒子状の担体と結合して使用することで、容易に抗原を精製及び検出することができる方法である。また前記「免疫沈降／免疫染色法」の「免疫染色法」とは、タンパク質を電気泳動等によって分子量や等電点などのタンパク質の性質に応じて分離した後に、疎水性の高い膜に転写されたタンパク質を抗体によって検出する免疫学的手法のことをいう。本発明ではこれらの免疫沈降法と免疫染色法とを組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明に用いられる抗体は特に限定されるものではないが、例えば特許文献１，２などに記載の方法で作製することができる。中でも、ＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）の９番目のトレオニンに前記糖鎖（Ａ）が結合した構造を認識する抗体が好ましく、このような抗体の一例として、特許文献１に抗体１Ｂ２が記載されている。またＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に前記糖鎖（Ｂ）が結合した構造を認識する抗体が好ましく、このような抗体の一例として特許文献２に抗体１２Ｄ１０が記載されている。
【００２３】
本発明に用いられる被検体由来の試料は特に限定されるものではないが、前立腺癌が疑われる患者の体液（血清、血漿等）が好ましく、特に血中トータルＰＳＡ値が３．０〜１０．０ｎｇ／ｍｌである患者の体液であることが好ましい。日本国内のＰＳＡ検査では、検査対象群の最も若い年齢層である５０〜６４歳において、正常値は３．０ｎｇ／ｍｌ以下とされている。特にトータルＰＳＡ値が３．０〜１０．０ｎｇ／ｍｌの場合は、血中トータルＰＳＡ値だけを指標とした従来法では前立腺癌と前立腺肥大症とを識別できないという問題があったが、本発明によればこれらを識別することができ、さらには、前立腺癌の存在が疑われる患者の前立腺癌の有無を鑑別する方法としても期待される。
【００２４】
本明細書において「ＰＳＡ」とは、前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）をさす。本明細書中「トータルＰＳＡ」とは、主にアンチキモトリプシンと結合した結合型ＰＳＡ及びフリーＰＳＡをさす。「フリーＰＳＡ」とは、複合体を形成していない遊離型ＰＳＡをさす。
【００２５】
また、本発明には前記糖鎖（Ａ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体、並びに前記糖鎖（Ｂ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体を含むキットも含まれる。本キットを用いることで前立腺癌と前立腺肥大症の識別を容易に行うことが可能となる。
【００２６】
本明細書において「前立腺癌と前立腺肥大症を識別する方法」とは、試料中の癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の量に基づいてインビトロで前立腺癌と前立腺肥大症を識別（又は決定）する方法である。例えば、予め算出されたカットオフ値よりも被検体の癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の量の値が大きいとき、被検体が前立腺肥大症ではなく前立腺癌に罹患しているもしくはその可能性がある、と識別（又は決定）することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００２８】
実施例１  サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒト血清検体中のＭＵＣ１の測定
前立腺癌患者および前立腺肥大症患者の血清検体中のＭＵＣ１の測定
【００２９】
ヒト血清検体中のＭＵＣ１量の測定には、健常人男性血清（３２検体）、前立腺癌患者血清（６２検体、ＳＲＬ社）、前立腺肥大症患者血清（５２検体、ＳＲＬ社）を用意した（表１）。日本国内のＰＳＡ検査では、検査対象群の最も若い年齢層である５０〜６４歳において、正常値は３．０ｎｇ／ｍｌ以下とされていることを考慮して、前立腺癌患者血清、前立腺肥大症患者血清はともに、トータルＰＳＡ量が３．０〜１０．０ｎｇ／ｍｌの範囲であるものを使用した。
【００３０】
【表１】
2017009287.tif 000003
【００３１】
測定は以下に示す方法で実施した。
【００３２】
ヒト血清検体中のＭＵＣ１の測定は、以下に記載するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇの抗ＭＵＣ１抗体１Ｂ２（特許文献１参照）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ＭＵＣ１抗体１Ｂ２固相化プレート）。
【００３３】
各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で４倍に希釈した前立腺疾患患者（前立腺癌患者、前立腺肥大症患者）から採取された血清、又は対照被検体として健常人から採取された血清を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、２５ｎｇのビオチン標識抗ＭＵＣ１抗体１２Ｄ１０（特許文献２参照）を含む希釈液を５０μｌ加え、室温で１時間放置した。次に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、希釈液で５０００倍に希釈したｐｏｌｙＨＲＰ８０−ストレプトアビジン溶液を５０μｌ加え、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１０分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図１にその結果を示す。
【００３４】
実施例２
実施例１と同様にして、但し、被検体である血清は１０倍に希釈し、ビオチン標識抗ＭＵＣ１抗体１２Ｄ１０の代わりにＨＲＰ標識抗ＭＵＣ１抗体１Ｂ２を用いて反応を行い、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１０分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図１にその結果を示す。
【００３５】
比較例１
実施例１と同様の検体のトータルＰＳＡを測定した。検体のトータルＰＳＡ値は、採血時に免疫測定装置ＲｏｃｈｅＥ１７０とＰＳＡ測定試薬を用いて測定された値である。図２にその結果を示す。
【００３６】
実施例１の１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定では、前立腺疾患（前立腺癌及び前立腺肥大症）患者血清では健常人血清に比べて大きい値が示された。さらに、前立腺癌と前立腺肥大症患者を比較すると、前立腺癌患者において明らかに高値を示しており、１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチ測定により前立腺癌を前立腺肥大症から識別することが可能であることが明らかとなった。このことは、前立腺癌と前立腺肥大症の患者群で分けた場合の２群間有意差検定の結果も、ｐ値が０．０５未満であり（図１）、有意差があることが示された。
【００３７】
一方、実施例２の１Ｂ２抗体のみを使用した１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチＥＬＩＳＡ測定では、前立腺癌と前立腺肥大症の患者群で有意に差があるものの、実施例１の１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定と比べて明確な差ではないことが分かる。このことは、前立腺癌と前立腺肥大症を識別するには、実施例１の１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定がより優れており、即ち、糖鎖（Ａ）及び（Ｂ）を同一分子内に有するＭＵＣ１を測定することが望ましいといえる。また図２によれば、本発明による１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ測定の結果は、現行品であるトータルＰＳＡの結果よりも、前立腺癌と前立腺肥大症との識別にすぐれていることが明らかである。
【００３８】
これらの事実は、測定の特異性、感度を統計的に解析したＲＯＣ解析結果からも明らかである（図３、表２）。すなわち、１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチ測定では、最適化されたカットオフ値（ＡＢＳ４５０ｎｍ＝０．２９４）での特異性は７８．８％、感度は９０．３％であり、診断性能の１つの指標となるＡＵＣは０．９２５と充分に高い値を示した。一方、１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチ測定では特異性が８８．５％とトータルＰＳＡ測定よりも高い値を示したが、感度はほぼ同じであった。診断性能の１つの指標となるＡＵＣも、トータルＰＳＡ測定よりも良い値を示したが、１Ｂ２−１２Ｄ１０サンドイッチ測定の性能には及ばなかった。
【００３９】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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