(57)【要約】【課題】５００ｍＭ以上の濃度のイミダゾールを用いても、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと結合可能なタグペプチドを提供すること。【解決手段】（ａ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１）、（ｂ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号２）、（ｃ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号４）、（ｅ）Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）、（ｆ）Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号６）の（ａ）〜（ｆ）のいずれか記載のタグペプチドを作製する。【選択図】図３
2017088536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか記載のタグペプチド。
（ａ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ｂ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号２）
（ｃ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）
（ｄ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号４）
（ｅ）Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）
（ｆ）Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号６）
【請求項２】
請求項１記載のタグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする請求項２記載のタグペプチド融合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターを含有するポリペプチドの固定化キット。
【請求項７】
ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体を含む請求項６記載のポリペプチドの固定化キット。
【請求項８】
ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、請求項２記載のタグペプチド融合ポリペプチドとを混合することを特徴とするポリペプチドの固定化方法。
【請求項９】
金属イオンがニッケルであることを特徴とする請求項８記載の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと結合可能なタグペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を分離又は精製する場合等において、アミノ酸と金属イオンとの配位結合を利用する方法（非特許文献１参照）が広く行われている。たとえば、タンパク質の末端に６残基のヒスチジンを付加したヒスチジンタグ融合タンパク質を作製し、かかるヒスチジンタグ融合タンパク質をニッケルカラムに通してヒスチジンタグ融合タンパク質をニッケルカラムに固定化する。次に、５〜１０ｍＭの低濃度イミダゾールをカラムに通して洗浄し、さらに約２００ｍＭの高濃度イミダゾールをニッケルカラムに通してヒスチジンタグ融合タンパク質をニッケルカラムから溶出して分離することができる。
【０００３】
しかしながら、上記方法によれば、ヒスチジンを多く含むタンパク質もニッケルカラムに結合してしまうことから、２００ｍＭのイミダゾールをニッケルカラムに通した際に、ヒスチジンタグ融合タンパク質だけでなく、ヒスチジンを多く含むタンパク質も溶出されてしまうという問題があった。そこで、目的とするタンパク質のみを固定化するために、２００ｍＭよりも高濃度、好ましくは５００ｍＭ以上の濃度のイミダゾールを加えても配位結合が維持されるタグペプチドの開発が求められていた。
【０００４】
一方、タグペプチドとしては６残基のヒスチジンタグ以外にも、たとえば、式：（Ｈｉｓ）ｘ−（Ａ）ｙ−（Ｈｉｓ）ｚ［式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０である］で示されるキレート化ペプチド（特許文献１参照）や、式Ｒ1−（Ｈｉｓ）2-6−Ｒ2（式中Ｒ1は、水素、１個のアミノ酸または数個のアミノ酸を示し、Ｒ2は、Ｑ、Ｑ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＱ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−を示し、及びＱはペプチド結合、１個のアミノ酸又は数個の、最大３０個のアミノ酸の配列を示す）（特許文献２参照）や、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列（特許文献３参照）が開示されている。しかしながら、５００ｍＭ以上の濃度のイミダゾールを用いてもニッケルカラムとの結合を維持できるタグペプチドについてはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１５７６００号公報
【特許文献２】特開昭６３−２５１０９５号公報
【特許文献３】特開２００８−２４１５６０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Porath, J. et al. Nature 258, 598 - 599 (1975)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、５００ｍＭ以上の濃度のイミダゾールを用いても、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと結合可能なタグペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、６残基のヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ）からなるヒスチジンタグよりもニッケルに対して結合力の強いタグを開発するため、３残基のヒスチジン（３Ｈｉｓ）と３残基のヒスチジン（３Ｈｉｓ）との間、すなわち３Ｈｉｓ−Ｘ−３ＨｉｓのＸ部分に他のアミノ酸を挿入してニッケルビーズと結合させ、従来のヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ）の結合力と比較した。その結果、Ｘとしてシステインを用いると結合力が高いことを見出した。さらにヒスチジンとシステインとの組み合わせからなるタグを作製したところ、５残基のヒスチジンと１残基のシステインからなるペプチドはニッケルビーズとの結合力が高いことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に示すとおりのものである。
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか記載のタグペプチド。
（ａ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ｂ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号２）
（ｃ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）
（ｄ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号４）
（ｅ）Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）
（ｆ）Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号６）
［２］上記［１］記載のタグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド。
［３］ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする上記［２］記載のタグペプチド融合ポリペプチド。
［４］上記［１］記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［５］上記［４］のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［６］上記［５］記載の発現ベクターを含有するポリペプチドの固定化キット。
［７］ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体を含む上記［６］記載のポリペプチドの固定化キット。
［８］ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記［２］記載のタグペプチド融合ポリペプチドとを混合することを特徴とするポリペプチドの固定化方法。
［９］金属イオンがニッケルであることを特徴とする上記［８］記載の固定化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタグペプチドを用いれば、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体にポリペプチドなどを結合させることが可能となる。特に、５００ｍＭ以上のイミダゾール存在下でも結合が維持されるので、本発明のタグペプチドを利用すれば、上記担体に目的とするポリペプチドなどを高純度で結合させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１においてテンプレートとして用いたＹＥｐＧＡＰ−Ｃｈｅｒｒｙベクターのマップを示す図である。
【図２】実施例１においてテンプレートとして用いたｐＳＣ７５５ベクターのマップを示す図である。
【図３】実施例１において、工程５）、８）、１０）、１３）の処理後のチューブの写真を示す図である。
【図４】実施例２において、タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルビーズとの結合を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明におけるタグペプチドとしては、（ａ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１）、（ｂ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号２）、（ｃ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号４）、（ｅ）Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）、（ｆ）Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号６）の（ａ）〜（ｆ）のいずれか記載のタグペプチドであれば特に制限されず、ここで、本発明における「タグ」とは、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと親和性を有するアフィニティタグを意味する。
【００１３】
本発明において、Ｃｙｓはシステイン、Ｈｉｓはヒスチジンを意味する。
【００１４】
本発明のタグペプチドとしては、上記配列番号１〜６に示す（ａ）〜（ｆ）のタグペプチドを含んでいるかぎり特に制限されないが、かかるタグペプチドのＮ末端又はＣ末端には、さらにＨｉｓが少なくとも１残基、好ましくは１残基結合していてもよい。
【００１５】
本発明のタグペプチド融合ポリペプチドとしては、タグペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれか、又は両方には、ポリペプチドを融合させたものであればよく、かかるタグペプチド融合ポリペプチドにおいて、融合させるポリペプチドとタグペプチドとの間に任意のアミノ酸が結合していても、融合させるポリペプチドとタグペプチドとが直接融合していてもよい。なお、任意のアミノ酸としては１〜３０００残基を挙げることができる。
【００１６】
上記ポリペプチドとしては、３以上のアミノ酸がペプチド結合を形成して重合した物質であればよく、タンパク質、ペプチドホルモン、エピトープなどを挙げることができる。タンパク質としては特に制限されないが、酵素、蛍光タンパク質、構造タンパク質、金属結合タンパク質、補因子タンパク質、抗体、糖タンパク質等を挙げることができる。
【００１７】
さらに、タグペプチド融合ポリペプチドには標識配列を含んでもよい。標識配列の位置はタグペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれか、又は両方のいずれでもよく、標識配列としては、ＦＬＡＧ配列、ＨＡ配列、ＭＹＣ配列、ＧＦＰ配列、ＭＢＰ配列、ＧＳＴ配列、ＳＮＡＰ配列、ＡＣＰ配列、ＣＬＩＰ配列、ＴＡＰ配列、Ｖ５配列などを挙げることができる。
【００１８】
また、タグペプチド融合ポリペプチドにおいて、タグペプチドとポリペプチドの間にプロテアーゼを認識するアミノ酸配列を含んでもよい。プロテアーゼを認識するアミノ酸配列としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）を認識するアミノ酸配列を挙げることができる。かかるプロテアーゼを認識するアミノ酸配列を備えていれば、必要に応じてプロテアーゼを用いてタグペプチドとポリペプチドとの融合を切断することが可能となる。
【００１９】
なお、融合させるポリペプチドとしては、配列番号１〜６に示す（ａ）〜（ｆ）の配列を有していない染色体上のポリペプチドであってもよい。
【００２０】
上記タグペプチド融合ポリペプチドは、遺伝子工学的手法や、液相法や固相法によるペプチド合成法などの公知の手法によって作製することが可能である。
【００２１】
本発明のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上記配列番号１〜６に示す（ａ）〜（ｆ）のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば特に制限されず、かかるポリヌクレオチドは遺伝子工学的手法を用いた公知の手法によって作製することが可能である。上記配列番号１〜６に示す（ａ）〜（ｆ）のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、たとえば配列番号７〜１２に示すポリヌクレオチドを挙げることができるが、これらのヌクレオチドにおけるヒスチジン又はシステインの対応する他のコドンに置換した配列を用いてもよい。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとしては、上記本発明のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターであれば特に制限されず、発現ベクターとしては、宿主に応じて適宜選択することができ、ｐＥＴベクター、ｐＢＴベクター、ｐＧＥＸベクター、ｐＫＫベクター、ｐＳＥベクター、ｐＱＥベクターなどの細菌用発現ベクターや、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧベクター、ｐＥＧＦＰベクター、ｐｃＤＭベクターなどの哺乳動物用発現ベクターや、ＹＥｐベクターなどの酵母用発現ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃｌベクター、ＢａｋＰＡＫベクターなどの昆虫用発現ベクターや、タバコモザイクウイルスベクターなどの植物用発現ベクターを挙げることができる。
【００２３】
本発明のポリペプチドの固定化方法としては、本発明のタグペプチド融合ポリペプチドと、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体とを混合する方法であれば特に制限されず、金属イオンとしては、ニッケルであることが好ましい。上記金属イオンと本発明のタグペプチドが配位結合することにより、タグペプチドに融合したポリペプチドを上記担体に固定化することが可能となる。なお、本発明のタグペプチド融合ポリペプチドと、上記金属イオンを固定化した担体とは混合後直ちに配位結合するが、混合した後に１分以上、１時間以上、又は６時間以上静置してもよい。
【００２４】
担体としては、水に対して不溶なものであれば特に制限されず、シリカゲル、多孔性ガラス、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、磁気ビーズを挙げることができる。
【００２５】
上記担体と上記金属イオンとの間にはスペーサーを設けてもよく、スペーサーとしては炭素数が６〜１０の炭化水素からなるスペーサーを挙げることができ、結合させるタグペプチド融合ポリペプチドと担体とを、スペーサーを介して結合させることが可能となる。
【００２６】
本発明のタグペプチドはニッケル、銅、亜鉛、又はコバルトのいずれかから選択される金属イオンとの親和性が高い。そのため、本発明のタグペプチド融合ポリペプチドを含む溶液と上記担体とを混合してタグペプチドに融合したポリペプチドを上記担体に固定化した後、５００ｍＭ又は１ｍＭイミダゾール溶液などの溶出溶液によって洗浄することで、上記担体に対して低い親和性を有するポリペプチドなどの物質を除去でき、その結果、タグペプチド融合ポリペプチドを高純度で固定化することが可能となる。
【００２７】
また、上述のように本発明のタグペプチド融合ポリペプチドにプロテアーゼを認識するアミノ酸配列を含んでいた場合には、目的とするポリペプチドを高純度で得ることが可能となる。具体的には、まず上述のように本発明のタグペプチド融合ポリペプチドを担体に固定化し、５００ｍＭ又は１ｍＭイミダゾール溶液などの溶出溶液を用いて担体に固定化した金属イオンと低い親和性を有するポリペプチドなどの物質を除去する。その後プロテアーゼで処理することによって本発明のタグペプチドとポリペプチドとの結合を切断し、溶出することによって高純度のポリペプチドを得ることが可能となる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの固定化キットとしては、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含有していれば特に制限されないが、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体を含むことが好ましい。さらに、緩衝液、金属イオンとの親和性が弱い物質を溶出するための溶出溶液、好ましくは５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、５００ｍＭ、又は１Ｍのイミダゾール溶液を含んでもよい。
【００２９】
本発明のタグペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれか、又は両方には、核酸、ホルモン、ビタミン類、サイトカイン、糖、ステロイドなどの化合物を融合させてもよく、また、タグペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一つをチオール修飾させてもよい。また、融合させる上記化合物とタグペプチドとの間に上記プロテアーゼを認識するアミノ酸配列など、任意のアミノ酸が結合していても、融合させる上記化合物とタグペプチドとが直接融合していてもよい。かかるタグペプチド融合化合物やチオール修飾タグペプチドを用いれば、融合させる上記化合物やチオール修飾タグペプチドと親和性を有する物質のスクリーニングや検出を行うことが可能となる。たとえば上記のタグペプチド融合ポリペプチドと同様の方法でタグペプチド融合化合物やチオール修飾タグペプチドを上記担体に固定化し、融合させた上記化合物又はチオール修飾タグペプチドと親和性を有すると思われる候補物質を含む溶液と混合し、融合させた上記化合物又はチオール修飾タグペプチドと親和性を有する物質を得ることが可能となる。
【００３０】
さらに、本発明のタグペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれか、又は両方には、Ｃｙ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、ローダミン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲ又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎなどの蛍光低分子化合物を融合させてもよく、かかるタグペプチド融合蛍光低分子化合物を用いれば、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを蛍光観察によって検出することがが可能となる。
【実施例１】
【００３１】
（タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルビーズとの結合）
赤色タンパク質であるｙＥｍＲＦＰのＣ末端に、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（ＸはＨｉｓ以外のアミノ酸）を結合させたタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株を作製し、タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルカラムとの結合能を以下の方法によって調べた。
【００３２】
ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクター（図１）及びＲＡＫ１２５６７株が有するｐＳＣ７５５ベクター（図２）をテンプレートとして、表１に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、対照コントロール以外用、及び対照コントロール用のベクター側のＰＣＲ産物を調製した。同様に、上記ＲＡＫ１２５６７株が有するｐＳＣ７５５ベクターをテンプレートとして、表２に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、インサート側のＰＣＲ産物を調製した。次に、ベクター側のＰＣＲ産物とインサート側のＰＣＲ産物を混合し、サッカロマイセス・セレビシエの野生株ＢＹ４７４１を形質転換し、それぞれのタグペプチド配列融合ｙＥｍＲＦＰ、すなわち、ｙＥｍＲＦＰのＣ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｘはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニールアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシン）が直接融合したタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株を作製した。対照コントロールとして、ｙＥｍＲＦＰのＣ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが直接融合したタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株を作製し、ＲＡＫ１２９８７と命名した。なお、ｙＥｍＲＦＰのＣ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが融合したタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株はＲＡＫ１７８１０株と命名した。
【００３３】
【表１】
2017088536.tif 000003
【００３４】
【表２】
2017088536.tif 000004
【００３５】
次に、上記で作製したそれぞれのタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株が生産するタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルビーズとの結合を以下の工程１）〜１３）によって調べた。また、以下の工程５）、８）、１０）、１３）の処理後のチューブの写真を図３に示す。
【００３６】
１）２４ウェルプレートに１ウェルにつきＡＹＤ−Ｕ培地１．５ｍＬを用意し、上記それぞれのタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株を植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍで一晩培養した。上記ＡＹＤ−Ｕ培地は、国際公開第２０１４／０３０７７４号パンフレットにおいて記載したＡＹＤ培地においてウラシルを欠損させた培地である。
２）１ｍＬを１．５ｍＬチューブに移し、遠心により集菌後、５００μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを加えて懸濁後、遠心して集菌した。
３）ペレットに３００μＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを加え、懸濁し、５０℃で３０分静置することで菌体内のタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰを菌体外（上清）に溶出した。
４）タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰを含む上清とニッケルビーズ（His-Select Nickel Affinity Gel P6611：シグマ・アルドリッチ社製）液とを反応させた（９０μＬのタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ含有上清＋１０μＬ  ニッケルビーズ／０．２ｍＬ用チューブ）。なお、ニッケルビーズ液は、ニッケルビーズをチューブに入れて、沈殿させ、等量の１Ｍ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ４．０）を加えて混合して調整した。
５）室温で一晩静置した（図３ａ）。
６）上清を捨て、５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、遠心して上清を除去した。
７）ペレットに１０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
８）ペレットに５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心した。（図３ｂ）。
９）上清を捨て、ペレットに１００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
１０）ペレットに１５０ｍＭイミダゾー含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心した（図３ｃ）。
１１）上清を捨て、ペレットに２００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
１２）ペレットに２５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
１３）ペレットに５００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心した（図３ｄ）。
【００３７】
（結果）
図３（ａ）に示すように、いずれのタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰを用いた場合でも、ニッケルビーズと結合することが確認できた。また、図３（ｂ）〜（ｄ）に示すように、Ｘがシステイン、すなわちｙＥｍＲＦＰのＣ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが結合した融合ポリペプチドは、１５０ｍＭのイミダゾール溶液だけでなく５００ｍＭのイミダゾール溶液を用いた場合においてもニッケルとの結合を維持していることが明らかとなった。一方、Ｘがシステイン以外の場合には、１５０ｍＭのイミダゾール溶液によってタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルとの結合が切れていることが明らかとなった。
【実施例２】
【００３８】
（タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルビーズとの結合）
上記ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙ（図１）及びｐＳＣ７５５ベクター（図２）をテンプレートとして、表３に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＲＡＫ１２９８７用、及びＲＡＫ１２９８７以外用のベクター側のＰＣＲ産物を調製した。同様に、上記ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙ（図１）をテンプレートとして、表４に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、インサート側のＰＣＲ産物を調製した。次に、ベクター側のＰＣＲ産物とインサート側のＰＣＲ産物を混合し、サッカロマイセス・セレビシエの野生株ＢＹ４７４１を形質転換し、それぞれのタグペプチド配列融合ｙＥｍＲＦＰ、すなわち、ｙＥｍＲＦＰのＣ末端に（ａ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１）、（ｂ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号２）、（ｃ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）、（ｄ）Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号４）、（ｅ）Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号５）、（ｆ）Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号６）が融合したタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株ＲＡＫ１７９５７、ＲＡＫ１７９５５、ＲＡＫ１７９５１、ＲＡＫ１７９４８、ＲＡＫ１７９４３、ＲＡＫ１７９４２を作製した。
【００３９】
【表３】
2017088536.tif 000005
【００４０】
【表４】
2017088536.tif 000006
【００４１】
次に、上記で作製したそれぞれのタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰ生産株、及び実施例１で作製したＲＡＫ１２９８７、ＲＡＫ１７８１０が生産するタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰとニッケルビーズとの結合を以下の工程１）〜８）によって調べた。また、以下の工程４）、８）の処理後のチューブの写真を図４に示す。
【００４２】
１）それぞれのｙＥｍＲＰＦ発現酵母を５０ｍｌのＡＹＤ−Ｕ培地中、３０℃、１５０ｒｐｍで１日間振盪培養した。
２）培養した培地２０ｍｌを遠心により集菌し、ペレットに５ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを加えて懸濁後、遠心して集菌した。
３）ペレットに１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅを加えて懸濁し、５０℃で１時間インキュベートすることでタグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰを菌体外（上清）に溶出した。
４）タグペプチド融合ｙＥｍＲＦＰを含む上清とニッケルビーズ液とを実施例１と同様に反応させ、室温で一晩静置した（図４（ａ））。
５）混合液を撹拌し、遠心した。その後、上清を除去し、５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、遠心して上清を除去した。
６）ペレットに１５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
７）ペレットに５００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、１０分間撹拌混和し、遠心して上清を除去した。
８）ペレットに１Ｍイミダゾール含有ＰＢＳを２００μＬ加え、室温で一晩静置した（図４（ｂ））。
【００４３】
図４（ａ）に示すように、いずれのペプチドを融合させた場合でも、ニッケルビーズと結合することが確認できた。また、図４（ｂ）に示すように、１Ｍのイミダゾール含有ＰＢＳを加えて１日ほど静置した後であってもレーン２〜８においてはニッケルビーズとＥｍＲＦＰとの結合が維持され、ニッケルビーズの沈殿が赤色を維持していた。一方、従来から用いられた６つヒスチジン残基からなるヒスチジンタグを用いた場合であるレーン１においては、ニッケルビーズの沈殿において赤色がほとんど消失していた。したがって、本発明のタグペプチドが結合したタグペプチド融合タンパク質は、１Ｍのイミダゾール存在下でもニッケルビーズと結合していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のタグペプチドは、ポリペプチドの精製や検出、特定の化合物と親和性を有する物質のスクリーニング分野に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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