(57)【要約】【課題】毛の成長を抑制し、除毛又は脱毛に有用な毛成長抑制剤の提供。【解決手段】イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛成長抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛成長抑制剤。
【請求項２】
イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする除毛又は脱毛剤。
【請求項３】
イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制剤。
【請求項４】
ＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５遺伝子及び／又はＫＲＴ３６遺伝子の転写を阻害し、ＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現を抑制する請求項３記載のＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛成長抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
頭髪や体毛は、生物学的には頭部、胸部、手足等の重要な器官を防護するものである。しかしながら、近年、特に手足等における体毛は、美的外観上無い方が好ましいとする傾向が高まっている。
【０００３】
体毛を除去する方法としては、毛抜き、シェーバー、脱毛器等を用いる機械的除去方法、脱毛剤や除毛剤を用いた化学的作用による除去方法が挙げられる。化学的作用による脱毛方法としては、生薬抽出物や特定の化合物を用いて発毛や育毛過程を抑制することが挙げられ、例えば、ザクロ抽出物が、線維芽細胞増殖因子−７、血管内皮細胞増殖因子、インシュリン様成長因子−１等のｍＲＮＡの発現を抑制し、抑毛効果を発揮することが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、これらの体毛除去方法は、皮膚に対して物理的又は化学的刺激を伴う場合があり、また抑毛作用という点では未だ不十分であるため、一定期間経過後には再び体毛除去処理を行わなければならない。したがって、安全でより手間のかからない体毛除去方法の開発が望まれている。
【０００５】
ニシキギ科ニシキギ属の植物であるイースタンワーフー（Euonymus atropurpureus）は、その樹皮に緩下作用があり古くから下剤として使用されている他、強壮、催胆、利尿等の薬理作用を有することが知られている。また、ガガイモ科トウワタ属の植物であるオオトウワタ（Asclepias syriaca）は、その根茎が利尿剤、下剤、鎮痛剤、発汗剤として使用されている。
【０００６】
しかしながら、これらの植物やそれに含有される成分に毛成長制御作用があることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−０１３４４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、毛の成長を抑制し、除毛又は脱毛に有用な毛成長抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、毛成長を抑制する素材を探索した結果、イースタンワーフー及びオオトウワタの抽出物に毛成長抑制作用があることを見出した。また併せて、これらがケラチンの発現制御に関わる転写因子であるＦＯＸＮ１によるケラチン遺伝子（ＫＲＴ８５及びＫＲＴ３６）の転写を阻害し、当該ケラチンの発現を抑制することを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に係るものである。
１）イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛成長抑制剤。
２）イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする除毛又は脱毛剤。
３）イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、植物由来で生体に対して安全であり、且つ毛成長抑制効果の高い毛成長抑制剤、脱毛又は除毛剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】イースタンワーフー抽出物の毛成長抑制効果。Ｖｅｈｉｃｌｅ：対照群、イースタンワーフー：イースタンワーフー抽出物添加群。
【図２】オオトウワタ抽出物の毛成長抑制効果。Ｖｅｈｉｃｌｅ：対照群、オオトウワタ：オオトウワタ抽出物添加群。
【図３】ＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５遺伝子の転写の活性化。ＭＯＣＫ：ＭＯＣＫ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を過剰発現した場合、ＦＯＸＮ１：ＦＯＸＮ１／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を過剰発現した場合。
【図４】ＦＯＸＮ１によるＫＲＴ３６遺伝子の転写の活性化。ＭＯＣＫ：ＭＯＣＫ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を過剰発現した場合、ＦＯＸＮ１：ＦＯＸＮ１／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を過剰発現した場合。
【図５】本発明植物抽出物のＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５遺伝子の転写阻害効果。
【図６】本発明植物抽出物のＫＲＴ８５ ｍＲＮＡ発現抑制効果。Ｖｅｈｉｃｌｅ：対照群、イースタンワーフー：イースタンワーフー抽出物添加群。
【図７】本発明植物抽出物のＫＲＴ３６ ｍＲＮＡ発現抑制効果。Ｖｅｈｉｃｌｅ：対照群、オオトウワタ：オオトウワタ抽出物添加群。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「イースタンワーフー（英名：Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｗａｈｏｏ）」とは、ニシキギ科ニシキギ属のＥｕｏｎｙｍｕｓ  ａｔｒｏｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（学名）を指し、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｂｕｒｎｉｎｇｂｕｓｈとしても知られている。
「オオトウワタ」とは、ガガイモ科トウワタ属のＡｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ（学名）を指し、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍｉｌｋｗｅｅｄ、Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ  ｆｌｏｗｅｒ、Ｓｉｌｋｗｅｅｄ、Ｓｉｌｋｙ  Ｓｗａｌｌｏｗｗｏｒｔ、又はＶｉｒｇｉｎｉａ  Ｓｉｌｋｗｅｅｄとしても知られている。
【００１４】
イースタンワーフー及びオオトウワタ（以下、「本発明の植物」とも称する）は、その任意の部位、例えば、全草、葉（葉身、葉柄等）、果実（成熟、未熟等）、樹皮、枝、種子、花（花弁、子房等）、茎、地上部、根茎、根、塊根、又はそれらの組み合わせが使用され得る。このうちイースタンワーフーについては樹皮又は枝を、オオトウワタについては根を用いるのが好ましい。
斯かる植物は、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
また、本発明において、上記の植物又はその抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１５】
斯かる植物の抽出物としては、公知の抽出方法により抽出して得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、固液抽出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。例えば、浸漬は、０℃〜溶媒沸点（好ましくは１５〜４０℃）で１時間〜４週間、浸漬・浸出することが挙げられ、固液抽出は、０℃〜溶媒沸点（好ましくは１５〜４０℃）下、３０〜１０００ｒｐｍで３０分〜２週間の攪拌もしくは振盪することが挙げられる。また、抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化性雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。また、還流抽出の場合には、ソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行うことができる。
【００１６】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、薬理活性および汎用性の点で、水、アルコール類およびそれらの混液が挙げられる。
【００１７】
上記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられる。このうち、薬理活性および操作性の点で、１価アルコール類および２価アルコール類が好ましい。また好ましくは、上記アルコール類は、炭素数１〜１０のアルコール、より好ましくは炭素数１〜４のアルコールであり得る。
【００１８】
上記アルコール類の好ましい例としては、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられる。
【００１９】
上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上であり、且つ好ましくは９９．９容量％以下、より好ましくは９９．５容量％以下、さらに好ましくは９５容量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０〜９９．９容量％、より好ましくは２０〜９９．５容量％、さらに好ましくは３０〜９５容量％である。
【００２０】
上記アルコール類のうち、汎用性の観点から、エタノールがより好ましい。したがって、上記植物の抽出物を調製するためのより好適な溶媒としては、水、エタノール、エタノール水溶液が挙げられる。
【００２１】
上記エタノール水溶液におけるエタノール濃度は、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上であり、且つ好ましくは９９．９容量％以下、より好ましくは９９．５容量％以下、さらに好ましくは９５容量％以下である。また、上記エタノール水溶液におけるエタノール濃度は、好ましくは２０〜９９．９容量％、より好ましくは２０〜９９．５容量％、さらに好ましくは３０〜９５容量％である。
【００２２】
抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されない。抽出における溶媒の使用量としては、植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１０００ｍＬが好ましい。また、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上であり、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは２週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。抽出条件の例としては、１５〜４０℃で１日〜５週間、好ましくは１〜２週間、６０〜９０℃で１〜５時間等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００２３】
本発明の植物抽出物は、例えば化粧品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができ、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２４】
斯くして得られた植物抽出物は、そのまま用いることもできるが、希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２５】
後記実施例に示すように、イースタンワーフー及びオオトウワタの各植物抽出物は、器官培養毛の伸長を抑制する作用を有する。また、イースタンワーフー及びオオトウワタの各植物抽出物は、器官培養毛において、ヘアシャフトを構成するケラチンとして知られているＫＲＴ８５及びＫＲＴ３６のｍＲＮＡの発現を抑制する。ＫＲＴ８５遺伝子に変異があるヒトは、全身性の欠毛症状や脱毛症状を示すことが報告され＜1)M Naeem et al.,J Med Genet. 2006 Mar; 43(3): 274-279.、2)Yutaka Shimomura et al., Journal of Investigative Dermatology (2010) 130, 892-895）＞、また、髪において、ＫＲＴ３６は、ＫＲＴ８５と発現部位が一部重なることが報告されており＜Lutz Langbein et al., Journal of Investigative Dermatology (2010) 130, 55-73＞、ＫＲＴ３６はＫＲＴ８５と同様に毛髪に重要であることが示唆される。したがって、ＫＲＴ８５及びＫＲＴ３６の発現が抑制されれば、毛の成長が抑制されると考えられる。
【００２６】
更に、イースタンワーフー及びオオトウワタの各植物抽出物は、ＫＲＴ８５遺伝子及びＫＲＴ３６遺伝子に対するＦＯＸＮ１の転写活性を阻害する。ＦＯＸＮ１は、ｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ  ファミリーに属する転写因子の一つで、ヌードマウスの原因遺伝子であることが知られており（Mecklenburg L. et al. Exp Dermatol. 14(11):797-810. (2005)）、また、ＦＯＸＮ１にナンセンス変異を持つヒトは、先天性の脱毛症状を示すことが知られている（Frank J. et al. Nature. 398(6727):473-4. (1999)）。ＦＯＸＮ１は、ＫＲＴ８５遺伝子の転写を活性化することが知られていたが（Schlake T et al. Dev Dyn. 217(4):368-76. (2000)）、本発明者らは、ＦＯＸＮ１を過剰発現することより、ＫＲＴ８５遺伝子の他、ＫＲＴ３６遺伝子についてもその転写が活性化されることを明らかにした（参考例１参照）。すなわち、ＦＯＸＮ１は、毛の成長に重要であると考えられるケラチン分子の発現制御に深く関与すると考えられ、ＦＯＸＮ１による当該ケラチン遺伝子の転写活性を阻害することより毛の成長を抑制できると考えられる。
【００２７】
したがって、本発明の植物又はその抽出物は、毛成長抑制が所望される動物、好ましくはヒトに投与することにより、毛成長を抑制し、当該作用により皮膚から毛を除去することができる。すなわち、本発明の植物又はその抽出物は、毛成長抑制剤、除毛又は脱毛剤となり、毛成長抑制作用によって毛の本数や太さを減らして除毛や脱毛の処理を容易にしたり、又は処理後の毛の成長を遅らせて除毛や脱毛の処理の持続性を高め、必要な除毛や脱毛処理の頻度を減少させたりすることができる。また、本発明の植物又はその抽出物は、ＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制剤となり得る。
また、本発明の植物又はその抽出物は、毛成長抑制剤、除毛又は脱毛剤、又はＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制剤を製造するために使用することができる。
また、本発明の植物又はその抽出物は、毛成長抑制、除毛又は脱毛、又はＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制のために使用することができる。
ここで、本発明の植物又はその抽出物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよいが、非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。本発明において、非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での脱毛、除毛もしくは毛成長抑制のための本発明の植物の使用、例えばエステティシャン、美容師、理容師、トリマー等による使用等が挙げられる。
【００２８】
本発明において、「毛成長抑制」とは、毛又は毛包の伸長を抑制する作用、あるいは毛径を縮小させる作用を意味する。また、成長を抑制される「毛」としては、頭髪、ひげ、手足や体幹部の毛等の頭髪以外の体毛が挙げられるが、好ましくは頭髪以外の体毛である。
【００２９】
また、本発明のＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制には、遺伝子レベルでの発現抑制及びタンパク質レベルでの発現抑制が包含される。遺伝子レベルでの発現抑制にはｍＲＮＡの発現抑制、好ましくはｍＲＮＡへの転写抑制が挙げられ、タンパク質レベルでの発現抑制には翻訳における抑制が含まれるが、好ましくはＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６のｍＲＮＡの発現抑制であり、より好ましくは、ＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６遺伝子の転写阻害によるＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６のｍＲＮＡの発現抑制が挙げられる。
尚、ＫＲＴ８５とは、ＮＣＢＩのデータベース（ＯＭＩＭ）[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim]にＭＩＭ  ＩＤ：＊６０２７６７として登録されているタンパク質を指し、ＫＲＴ３６とは、ＭＩＭ  ＩＤ：＊６０４５４０として登録されているタンパク質を指す。また、ＦＯＸＮ１とは、ＭＩＭ  ＩＤ：＊６００８３８として登録されているタンパク質を指す。
【００３０】
本発明の毛成長抑制剤、除毛又は脱毛剤、又はＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制剤は、毛成長抑制、除毛又は脱毛、ＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制を目的とした、化粧品、医薬品、医薬部外品であり得、又は毛成長抑制、除毛又は脱毛、又はＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６の発現抑制を目的とした、化粧品、医薬品、医薬部外品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００３１】
本発明の植物又はその抽出物を含む、化粧品、医薬品、医薬部外品等の各種製剤の形態は、経口又は非経口投与の形態のいずれでも良いが、非経口投与の形態であるのが好ましく、皮膚外用剤であるのがより好ましい。具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態で用いるのが好ましい。
【００３２】
当該皮膚外用剤は、毛成長抑制のみを目的とするものに限らず、保湿、美白、スキンケア、制汗、デオドラント、洗浄等の他の用途と毛成長抑制の用途を併せ持つ製剤であってもよい。
【００３３】
上記製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の植物又はその抽出物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の植物又はその抽出物の他、それぞれ化粧品、医薬部外品、医薬品等の製剤の種類に応じて、適宜、他の植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。また、毛成長抑制効果を更に高めるべく、他の抑毛成分を適宜配合することもできる。
【００３４】
当該製剤組成物中の本発明の植物又はその抽出物の含有量は、当該抽出物の乾燥重量に換算して、一般的に好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．００００１〜１０質量％、より好ましくは０．０００１〜５質量％である。
【００３５】
上記医薬品、医薬部外品、化粧料の投与量は、対象の毛成長の抑制を達成できる量であり得る。好ましくは、有効量とは、投与群の毛包伸長を、未投与群の９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下に低下させることができる量であり得る。また好ましくは、有効量とは、投与群の毛径を、未投与群の９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下に低下させることができる量であり得る。
【００３６】
当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の植物又はその抽出物（乾燥物換算）として、例えば好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇである。また、好ましくは０．０１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは１〜１０ｍｇである。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、毛成長抑制、除毛又は脱毛を目的とするヒトが好ましい。
【００３７】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする毛成長抑制剤。
＜２＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする除毛又は脱毛剤。
＜３＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制剤。
【００３８】
＜４＞毛成長抑制剤を製造するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜５＞除毛又は脱毛剤を製造するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜６＞ＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制剤を製造するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
【００３９】
＜７＞毛成長抑制に使用するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物。
＜８＞除毛又は脱毛に使用するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物。
＜９＞ＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制に使用するための、イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物。
【００４０】
＜１０＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を適用することを含む毛成長抑制方法。
＜１１＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を適用することを含む除毛又は脱毛方法。
＜１２＞イースタンワーフー及びオオトウワタから選ばれる植物又はその抽出物を適用することを含むＫＲＴ８５及び／又はＫＲＴ３６発現抑制方法。
【００４１】
＜１３＞上記＜７＞〜＜９＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での脱毛、除毛もしくは毛成長抑制のための非治療的な使用である。
＜１４＞上記＜１０＞〜＜１２＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での脱毛、除毛もしくは毛成長抑制のための非治療的な方法である。
＜１５＞上記＜１＞〜＜１４＞において、イースタンワーフーは好ましくはイースタンワーフーの樹皮であり、オオトウワタは好ましくはオオトウワタの根である。
＜１６＞上記＜１＞〜＜１４＞において、抽出物は、好ましくはエタノール水溶液抽出物である。
＜１７＞上記＜１６＞において、エタノール水溶液中のエタノール濃度は、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上であり、より好ましくは４０容量％以上であり、より好ましくは５０容量％以上であり、且つ好ましくは９９．９容量％以下、より好ましくは９９．５容量％以下、さらに好ましくは９５容量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０〜９９．９容量％、より好ましくは２０〜９９．５容量％、さらに好ましくは３０〜９５容量％、さらに好ましくは４０〜９５容量％、さらに好ましくは５０〜９５容量％である。
＜１８＞上記＜１＞〜＜２＞、＜４＞〜＜５＞、＜７＞〜＜８＞、＜１０＞〜＜１１＞において、毛は頭髪以外の体毛である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
製造例１
（１）イースタンワーフー抽出物の調製
イースタンワーフー（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ａｔｒｏｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）の乾燥樹皮２０ｇに５０％エタノール水溶液２００ｍＬを加え、室温で７日間浸漬した。これをろ過し、イースタンワーフー抽出物を得た。その蒸発残分は１．９８％であった。この抽出物を５０％エタノールにて希釈し、１％（ｗ／ｖ）の溶液とした。
【００４３】
（２）オオトウワタ抽出物の調製
オオトウワタ（Ａｓｃｌｅｐｉａｓ  ｓｙｒｉａｃａ）の乾燥根２０ｇに５０％エタノール水溶液２００ｍＬを加え、室温で７日間浸漬した。これをろ過し、オオトウワタ抽出物を得た。このオオトウワタ抽出物を濃縮したところ、その固形分は４．７５ｇであった。この抽出物を５０％エタノールにて希釈し、１％（ｗ／ｖ）の溶液とした。
【００４４】
実施例１  ヒト単離毛包を用いた毛成長抑制効果の評価
ヒト頭皮サンプルは０．１％ヒビテン液に１分間浸漬して消毒後、ＰＢＳにて洗浄した。その後、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、実体顕微鏡下にてピンセットとメスを用いて毛包を単離した。単離した毛包は、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地に２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０ｎｇ／ｍｌ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  （ＳＩＧＭＡ）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃｓ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）となるように添加した培地中（２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、３００μｌ）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００４５】
培養開始時と４８時間後に顕微鏡下で写真を撮影、同条件で撮影されたスケールを元に画像解析にて毛包の長さを算出した。解析結果より、４８時間で０．２ｍｍ以上伸長した毛包を、試験物質が添加された培地に移した。試験物質としては、製造例１で調製したイースタンワーフー抽出物又はオオトウワタ抽出物を０．１ｖｏｌ％（最終濃度０．００１質量％）となるように培地に添加した。対照として、同量の５０％エタノール溶液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を培地に添加した。
器官培養毛は、経時的に写真撮影及び画像解析にて毛包の長さを算出し、試験物質が添加された培地に移してからの増加量を毛伸長量とした。
得られた数値は平均値±標準偏差で示し、各タイミングにおけるＶｅｈｉｃｌｅと試験物質添加群の数値データに関して、ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで有意差検定を行った。
【００４６】
結果を図１及び図２に示す。
対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では、培養時間に従って毛包の伸長（毛成長）が観察された一方、イースタンワーフー抽出物添加群及びオオトウワタ抽出物添加群では、毛包の伸長が有意に抑制された。よって、イースタンワーフー抽出物及びオオトウワタ抽出物は毛成長抑制効果を持つことが示された。
【００４７】
参考例１  ＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５遺伝子及びＫＲＴ３６遺伝子の転写活性化
（１）ヒト腎細胞（ＨＥＫ２９３Ａ細胞）はＡＴＣＣより購入し、ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０％  Ｈｅａｔ-ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＢＳ）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに８×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう２ｍｌずつ播種した。
２４時間後に、ヒトＦＯＸＮ１のｃＤＮＡが発現用ベクターに挿入されたヒトＦＯＸＮ１発現プラスミド（ＦＯＸＮ１／ｐｃＤＮＡ３．１（＋））及びコントロールプラスミド（ＭＯＣＫ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋））をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは付属の使用説明書に従って実施した。
２４時間後に、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製は付属の使用説明書に従って実施した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは分光光度計にて濃度を測定した。
濃度をそろえたｔｏｔａｌ  ＲＮＡとＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を用い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、逆転写反応を行った。逆転写反応は付属の使用説明書に従って行った。逆転写反応後のサンプルは、使用まで−２０℃で保存した。
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現の定量は、ＰＯＷＥＲ  ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、７５００  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。反応液は全量で５０μｌとし、９５℃で１５秒の変性反応、６０℃で１分のアニーリング及び伸長反応の条件で増幅した。
ＫＲＴ８５ ｍＲＮＡ発現量又はＫＲＴ３６ ｍＲＮＡ発現量は、コントロール遺伝子ＲＰＬＰ０ ｍＲＮＡ発現量により補正した。
ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
【００４８】
【表１】
2017088546.tif 000002
【００４９】
得られた数値は平均値±標準偏差で示し、ＭＯＣＫとＦＯＸＮ１の数値データに関して、ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで有意差検定を行った。
【００５０】
（２）結果
結果を図３及び図４に示す。
ＦＯＸＮ１過剰発現により、ＫＲＴ８５ ｍＲＮＡ発現量及びＫＲＴ３６ ｍＲＮＡ発現量が有意に増加することが確認された。よって、ＦＯＸＮ１がＫＲＴ８５遺伝子及びＫＲＴ３６遺伝子の転写を活性化することが示された。
【００５１】
実施例２  ＦＯＸＮ１の転写阻害効果
（１）ヒトＫＲＴ８５プロモーター活性の測定
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２．５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう１００μｌずつ播種した。
２４時間後に、ヒトＫＲＴ８５プロモーター（配列番号７：２１２６ｂｐ［転写開始点から−２０２２〜＋１０４］）の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたＫＲＴ８５Ｐ／ｐＧＬ４．１０  ［ｌｕｃ２］プラスミド、ＦＯＸＮ１発現プラスミド（ＦＯＸＮ１／ｐｃＤＮＡ３．１（＋））、及びトランスフェクション効率の補正を目的としてＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたプラスミド（ｐＧＬ４．７３、Ｐｒｏｍｅｇａ）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは付属の使用説明書に従って実施した。
２４時間後に、製造例１で調製したイースタンワーフー抽出物又はオオトウワタ抽出物を０．１ｖｏｌ％（最終濃度０．００１質量％）となるように培地に添加した。対照として、同量の５０％エタノール溶液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を培地に添加した。
２４時間後に、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ルシフェラーゼレポーターアッセイは付属の使用説明書に従って実施した。
全てのＫＲＴ８５プロモーター活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、ＫＲＴ８５プロモーター活性阻害率を以下の式にて求め、ＫＲＴ８５プロモーター活性を試験物質が何％阻害したかを算出した。
【００５２】
ＫＲＴ８５プロモーター活性阻害率（％）
＝｛（溶媒対照添加群のＫＲＴ８５プロモーター活性−試験物質添加群のＫＲＴ８５プロモーター活性）／溶媒対照添加群のＫＲＴ８５プロモーター活性｝×１００
【００５３】
（２）結果
結果を図５に示す。
イースタンワーフー抽出物添加及びオオトウワタ抽出物添加により、ＫＲＴ８５プロモーター活性がそれぞれ約３１％、約４４％阻害された。よって、イースタンワーフー抽出物及びオオトウワタ抽出物は、転写因子であるＦＯＸＮ１によるＫＲＴ８５遺伝子の転写を阻害することが示された。
【００５４】
実施例３  ＫＲＴ８５及びＫＲＴ３６の発現抑制効果
（１）ヒト頭皮サンプルは０．１％ヒビテン液に１分間浸漬して消毒後、ＰＢＳにて洗浄した。その後、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、実体顕微鏡下にてピンセットとメスを用いて毛包を単離した。単離した毛包は、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地に２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０ｎｇ／ｍＬ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  （ＳＩＧＭＡ）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃｓ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）となるように添加した培地中  （２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、３００μＬ）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
培養開始時と４８時間後に顕微鏡下で写真を撮影、同条件で撮影されたスケールを元に画像解析にて毛包の長さを算出した。解析結果より、４８時間で０．２ｍｍ以上伸長した毛包を、試験物質が添加された培地に移した。試験物質としては、製造例１で調製したイースタンワーフー抽出物又はオオトウワタ抽出物を０．１ｖｏｌ％（最終濃度０．００１質量％）となるように培地に添加した。対照として、同量の５０％エタノール溶液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を培地に添加した。
４８時間後、毛包をＲＮＡ  ｌａｔｅｒ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に浸し、４℃で２４時間処理した。処理後の毛包は、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に浸し、使用まで−８０℃で保存した。
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製は付属の使用説明書に従って実施した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとＯｌｉｇｏ  （ｄＴ）２０を用い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、逆転写反応を行った。逆転写反応は付属の使用説明書に従って行った。逆転写反応後のサンプルは、使用まで−２０℃で保存した。
参考例１と同様に、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより、ｍＲＮＡの発現量を求めた。
尚、ＫＲＴ８５ ｍＲＮＡ発現量又はＫＲＴ３６ ｍＲＮＡ発現量は、コントロール遺伝子ＲＰＬＰ０ ｍＲＮＡ発現量により補正した。
得られた数値は平均値±標準偏差で示し、Ｖｅｈｉｃｌｅと試験物質添加群の数値データに関して、  ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで有意差検定を行った。
【００５５】
（２）結果
結果を図６及び図７に示す。
イースタンワーフー抽出物添加及びオオトウワタ抽出物添加により、ＫＲＴ８５ ｍＲＮＡ発現量及びＫＲＴ３６ ｍＲＮＡ発現量が有意に減少することが確認された。よって、イースタンワーフー抽出物及びオオトウワタ抽出物はＫＲＴ８５及びＫＲＴ３６の発現抑制効果を持つことが示された。
【図１】
2017088546.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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