(57)【要約】【課題】新規な５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤を提供すること。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１を含有する５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１を含有する５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
５−フルオロウラシル誘発性腸疾患が、下痢又は炎症である請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１含有医薬と５−フルオロウラシル含有医薬との組み合わせ。
【請求項４】
５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療用医薬製造のためのビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１の使用。
【請求項５】
ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有する場合を除く請求項１又は２に記載の剤。
【請求項６】
ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有する場合を除く請求項３に記載の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん化学療法剤の投与が下痢や体重減少を伴い、小腸絨毛の短縮や腺窩の破壊により特徴付けられる腸炎を引き起こすことが報告されている。５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵともいう）は抗癌剤の一つであるが、本薬剤による化学療法中の患者の５０〜８０％に重篤な下痢を伴う腸炎（mucositis）が観察される。このような腸炎発生は、５−ＦＵの容量制限や使用中止などを招く。
【０００３】
一方、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）フェーカリエス（Streptococcus(Enterococcus) faecalis）を主成分とする乳酸菌生菌製剤が抗がん剤と併用されていることが知られている（非特許文献１）。しかし、上記菌とは属が異なる、即ち性質が異なるビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１（以下、単にＢＢＧ９−１と略称することがある）と５−フルオロウラシルとの併用については、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】伏谷秀治ら、「抗菌薬、抗癌剤による薬物療法における乳酸菌生菌製剤の併用状況」、Jpn. J. Pharm. Health Care Sci., 35 (5), 360-367 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、ある特定の乳酸菌が上記５−ＦＵ誘発性腸疾患を予防及び／又は治療することを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
〔１〕ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１を含有する５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤。
〔２〕５−フルオロウラシル誘発性腸疾患が、下痢又は炎症である前記〔１〕に記載の剤。
〔３〕ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１含有医薬と５−フルオロウラシル含有医薬との組み合わせ。
〔４〕５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療用医薬製造のためのビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１の使用。
〔５〕ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有する場合を除く前記〔１〕又は〔２〕に記載の剤。
〔６〕ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有する場合を除く前記〔３〕に記載の組み合わせ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、新規な５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤を提供することができる。本発明の５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤は、５−ＦＵ投与により生じる、下痢、体重減少、小腸短縮、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase；ＭＰＯ）活性の上昇、組織学的変化（絨毛の先端から小腸腺窩の接合部までの長さの短縮、小腸腺窩の傷害（１ｍｍあたりの生存小腸腺窩の減少及び小腸腺窩あたりの生存腺窩細胞の減少）等）、腫瘍壊死因子−α（Tumor Necrosis Factor-α；ＴＮＦ−α）発現の増大、インターロイキン−１β（Interleukin-1β；ＩＬ−１β）発現の増大等を抑制することができる。また、本発明の剤は、５−ＦＵを高用量（例えば１日量フルオロウラシルとして１５ｍｇ/ｋｇ）使用する場合においても５−ＦＵ誘発性腸疾患を予防又は抑制することができる点において、特に顕著な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は噴霧乾燥装置の概略を示す図である。
【図２】図２は試験スケジュールを示す説明図である。
【図３】図３は５−ＦＵ投与による体重減少に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図４】図４は５−ＦＵ投与による下痢に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図５】図５は５−ＦＵ投与による小腸短縮に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図６】図６は５−ＦＵ投与によるＭＰＯ活性の上昇に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図７】図７は５−ＦＵ投与による組織学的変化に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図８】図８は５−ＦＵ投与による組織学的変化に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図９】図９は５−ＦＵ投与による組織学的変化に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図１０】図１０は５−ＦＵ投与による組織学的変化に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図１１】図１１は５−ＦＵ投与によるＴＮＦ−α発現の増大に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【図１２】図１２は５−ＦＵ投与によるＩＬ−１β発現の増大に対するＢＢＧ９−１の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１を含有する５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療剤（以下、本発明の剤ともいう）を提供する。本発明の剤は、ＢＢＧ９−１を含有していればよく、さらに他の成分を含有していてもよい。
ＢＢＧ９−１は、医療用医薬品のビオフェルミン錠剤（商品名、ビオフェルミン製薬社製）等の成分として含まれており、該錠剤等から通常行われる方法で精製することによって入手可能である。また、市販されているものを適宜使用することもできる。ＢＢＧ９−１はまた、公知の条件で培養することによっても得ることができる。例えば、通常、グルコ−ス、酵母エキス、ペプトン等を含む液体培地で上記菌体を通常約２５〜４５℃程度で約４〜７２時間程度、好気又は嫌気培養し、培養液から菌体を集菌し、洗浄し、湿菌体を得る。
【００１１】
本発明において用いるＢＢＧ９−１は、生菌が好ましいが、死菌でもよく、生菌又は死菌の処理物を用いてもよい。菌の処理物とは、ＢＢＧ９−１に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などにより得られる破砕液、該菌体の培養液又は培養上清、それらを濾過又は遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素又は機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理又は塩析処理などして得られるタンパク質複合体（タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など）又はペプチド複合体（ペプチド、糖ペプチド等）なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液又は培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも本発明における該処理物に含まれる。ＢＢＧ９−１の死菌体も本発明における該処理物に含まれる。上記死菌体は、例えば、酵素処理、約１００℃程度の熱をかける加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより得ることができる。これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明において、そのような技術に従ってよい。
【００１２】
本発明において使用されるＢＢＧ９−１は、乾燥物（菌体乾燥物）であってもよく、菌体乾燥物としては、シングルミクロンの菌体乾燥物が好ましい。菌体乾燥物とは、通常は乾燥された個々の菌体又は乾燥された菌体の集合物をいう。また、シングルミクロンとは、小数第１位を四捨五入して１〜１０μｍをいう。本発明に使用されるＢＢＧ９−１として、シングルミクロンの菌体乾燥物を使用すると、製剤中の生菌率が上がり、その結果、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療効果が高くなる。シングルミクロンのＢＢＧ９−１の製造方法も従来公知であり、本発明の実施においても、公知の方法に従ってよい。
【００１３】
菌体乾燥物の好ましい製造方法について説明する。上記菌体を溶媒に分散して菌体液とする。溶媒は、当業界で用いられる公知の溶媒を用いてよいが、水が好ましい。また、所望によりエタノールを加えてよい。エタノールを加えることによって、最初にエタノールが気化し、ついで水が気化するから、段階的な乾燥が可能となる。さらに、菌体液は、懸濁液であってもよい。溶媒は上記で示したものと同じでよい。また、懸濁させる際、懸濁剤、例えばアルギン酸ナトリウム等を使用してもよい。
【００１４】
上記菌体液を、菌体乾燥物を製造するために噴霧乾燥装置による乾燥操作に付する。噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できる微粒化装置を備えた噴霧乾燥装置が好ましい。非常に粒径の小さな噴霧液滴にすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなり、乾燥温風との接触が効率よく行われるため、生産性が向上する。
ここでシングルミクロンの液滴とは、好ましくは噴霧液滴の粒径が小数第１位を四捨五入して１〜１０μｍであるものをいう。
【００１５】
噴霧乾燥装置には、微粒化装置が、例えばロータリーアトマイザー（回転円盤）、加圧ノズル、又は圧縮気体の力を利用した２流体ノズルや４流体ノズルである噴霧乾燥装置が挙げられる。
噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できるものであれば、上記形式のいずれの噴霧乾燥装置であってもよいが、４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置を使用するのが好ましい。
【００１６】
４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置では、例えば４流体ノズルの構造としては、好ましくは気体流路と液体流路とを１系統として、これを２系統ノズルエッジにおいて対称に設けたもので、ノズルエッジに流体流動面となる斜面を構成している。
また、ノズルエッジの先端の衝突焦点に向かって、両サイドから圧縮気体と液体を一点に集合させる外部混合方式の装置がよい。この方式であれば、ノズル詰まりがなく長時間噴霧することが可能となる。
【００１７】
４流路ノズルを有する噴霧乾燥装置について図１を用いてさらに詳しく説明する。４流路ノズルのノズルエッジにおいて、液体流路３及び４から湧き出るように出た菌体液が、気体流路１又は２から出た高速気体流により流体流動面５で薄く引き伸ばされ、引き伸ばされた液体はノズルエッジ先端の衝突焦点６で発生する衝撃波で微粒化させることにより、シングルミクロンの噴霧液滴７を形成する。
【００１８】
圧縮気体としては、例えば、空気、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガス等を用いることができる。とくに、酸化されやすいもの等を噴霧乾燥させる場合は、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガスを用いるのが好ましい。
圧縮気体の圧力としては、通常約１〜１５ｋｇ重／ｃｍ２、好ましくは約３〜８ｋｇ重／ｃｍ２である。
ノズルにおける気体量は、ノズルエッジ１ｍｍあたり、通常約１〜１００Ｌ／分、好ましくは約１０〜２０Ｌ／分である。
【００１９】
通常、その後、乾燥室において、その噴霧液滴に乾燥温風を接触させることで水分を蒸発させ菌体乾燥物を得る。
乾燥室の入り口温度は、通常約２〜４００℃、好ましくは約５〜２５０℃、より好ましくは約５〜１５０℃である。入り口温度が約２００〜４００℃の高温であっても、水分の蒸発による気化熱により乾燥室内の温度はそれほど高くならず、また、乾燥室内の滞留時間を短くすることにより、生菌の死滅や損傷をある程度抑えることができる。
出口温度は、通常約０〜１２０℃、好ましくは約５〜９０℃、より好ましくは約５〜７０℃である。
【００２０】
上記のように菌体乾燥物の粒径を小さくすることにより、生菌率が上がり、生菌率の多い製剤を提供できるという利点がある。
すなわち、シングルミクロンの菌体乾燥物を得るためにはシングルミクロンの噴霧液滴を噴霧するのが好ましい。噴霧液滴の粒径を小さくすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなるので、乾燥温風との接触が効率よく行われ、乾燥温風の熱による菌体の死滅又は損傷を極力抑えることができる。その結果として、生菌率が上がり生菌数の多い菌体乾燥物が得られる。
【００２１】
なお、ＢＢＧ９−１は、一般に嫌気性で乾燥状態では空気又は酸素に対して弱く、また、高温と湿気に弱いため、組成物の製剤化に際してはできるだけ、不活性ガスの存在下又は真空、低温下で、処理することが好ましい。
【００２２】
本発明において、ＢＢＧ９−１の投与量は、生菌を用いる場合には、生菌の菌数にして通常約１０３〜１０１２個／大人／回、好ましくは１０５〜１０１０個／大人／回、より好ましくは１０６〜１０１０個／大人／回である。本発明において、ＢＢＧ９−１の投与回数は、１０３〜１０１２個／大人／回の場合において、１日当たり１〜数回が好ましい。ここで、製剤中の生菌数の測定は、例えば日本薬局方外医薬品規格に記載されたＢＢＧ９−１の定量方法により容易に測定できる。
【００２３】
本発明の好ましい態様として、経口剤又は非経口剤が挙げられる。経口剤としては、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤；水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等の液剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）等が挙げられる。これらの製剤は、当該分野で通常行われている手法により、薬学上許容される添加剤を用いて製剤化することができる。薬学上許容される添加剤としては、賦形剤、担体、結合剤、希釈剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、矯味剤、香料等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等を賦形剤又は担体として使用できる。製剤中に含まれるＢＢＧ９−１の合計量は、通常、最終製剤中に約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができ、約０．０５〜約５０質量％含むことが好ましく、約０．１〜約２５質量％含むことがより好ましい。
【００２４】
経口用の固形剤（錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）は好ましく、有効成分を例えば賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等の添加剤と混合し、常法に従って製剤化することができる。必要に応じて、コーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。
微量の有効成分（ＢＢＧ９−１）を大量の他の粉末と混合し均一な混合物を得るためには、いわゆる段階的混合法を採るのがよい。例えば、有効成分をその１００〜２００容量倍の粉末と混合して均一な粉末を得、これを残りの粉末と混合すると均一な粉末を得ることができる。
含水物からの乾燥には、上記した噴霧乾燥以外に、Ｌ−乾燥、凍結乾燥などの手段をとることができる。いずれにせよ、例えばＢＢＧ９−１の乾燥菌体を得るには、適当な安定剤、例えばグルタミン酸モノナトリウム塩、アドニトールなどを加えた中性の緩衝液に菌を懸濁させておき、上記した自体公知の方法で乾燥することもできる。
【００２５】
経口用の液剤（水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等）は、有効成分を一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノール又はそれらの混液等）に溶解、懸濁又は乳化して製剤化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００２６】
非経口剤としては例えば、皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤は、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、エアゾール剤等に適用できるが、外用に適する剤型であればこれらに限定されるものではない。皮膚外用剤には、必要に応じて、水、低級アルコール、溶解補助剤、界面活性剤、乳化安定化剤、ゲル化剤、粘着剤、その他、所望する剤型を得るために通常使用される基剤成分を配合でき、使用目的に応じて血管拡張剤、副腎皮質ホルモン、保湿剤、殺菌剤、清涼化剤、ビタミン類、香料、色素等を本発明の効果を損なわない範囲で適宜に配合することも可能である。
【００２７】
非経口剤としては例えば、注射剤が挙げられる。注射剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、及び用時溶剤に溶解又は懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、有効成分を溶剤に溶解、懸濁又は乳化して製剤化される。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等及びそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また注射剤は、無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、これを使用前に無菌化又は無菌の注射用蒸留水又は他の溶剤に溶解して製造することもできる。
【００２８】
本発明の剤は、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療に有用である。「治療」は、「軽減」、「改善」等の概念を包含する。さらに本発明における５−ＦＵは、そのプロドラッグも包含する。本発明の剤は、５−ＦＵ投与により生じる、体重減少、下痢、炎症、小腸短縮、ＭＰＯ活性の上昇、組織学的変化（絨毛の先端から小腸腺窩の接合部までの長さの短縮、小腸腺窩の傷害（１ｍｍあたりの生存小腸腺窩の減少及び小腸腺窩あたりの生存腺窩細胞の減少）等）、ＴＮＦ−α発現の増大、ＩＬ−１β発現の増大等を抑制することができる。
本発明の剤は、例えば、５−ＦＵ投与が必要なヒトや他の動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。５−ＦＵ投与が必要なヒトや他の動物として、例えば胃癌、肝癌、結腸癌、子宮体癌、膵癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、食道癌、肺癌、頭頚部腫瘍等の疾病に罹患した、又は、罹患する可能性があるヒトや他の動物等が挙げられる。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様として、医薬部外品、化粧品、医薬品、健康食品（特定保健用食品、サプリメント、栄養補助食品、機能性食品等を含む）、食品添加剤等が挙げられる。本発明のこれらの製品の包装部材に、５−ＦＵ誘発性疾患の予防又は治療に供される旨の表示があるのが好ましい。
【００３０】
本発明の剤は、医薬部外品又は化粧品の場合、好ましくは例えば、皮膚外用剤（化粧水、乳液、ファンデーション、美容液等を含む）、シャンプー、コンディショナー、トリートメント、ヘアケア剤、スタイリング剤の形態とすることができる。本発明の剤が経口剤又は非経口剤の場合、上記本発明の好ましい態様として記載された経口剤又は非経口剤を参照することができる。医薬部外品又は化粧品の原料として、例えばＢＢＧ９−１の培養液を使用することができる。５−ＦＵ投与を必要とする動物（患者を含む）は、既に市販されているＢＢＧ９−１を含む医薬部外品、化粧品、医薬品、食品、健康食品等から本発明の有効成分を摂取可能である。
【００３１】
本発明の剤は、医薬品の場合、上記本発明のＢＢＧ９−１を有効成分とし、薬学的に許容される添加剤を適宜配合して製剤化することができる。本発明の剤が経口剤又は非経口剤の場合、上記本発明の好ましい態様として記載された経口剤又は非経口剤を参照して実施することができる。医薬品の原料として、例えばＢＢＧ９−１の培養液を使用することができる。
【００３２】
本発明の剤は、健康食品の場合、本願出願前に既に存在するＢＢＧ９−１を含んでいる又は含んでいない飲食品そのものではなく、本発明はこれらに５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療するためのＢＢＧ９−１が添加又は増量されている、健康食品（特定保健用食品、サプリメント、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等を含む）を含むものである。健康食品の形態は特に限定されないが、例えば、自然流動食、半消化態栄養食若しくは成分栄養食、又はドリンク剤等の加工形態とすることもできる。健康食品の形態として、例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子及びパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓等を挙げることができる。また、本発明の健康食品は、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療をコンセプトとする旨が表示されている特定保健用食品、サプリメント、栄養補助食品、機能性食品等を含む。また、本発明の健康食品は、乳糖、デンプン、結晶セルロース、リン酸ナトリウム等の医薬用賦形剤を含んでいてもよい。さらに詳細な形態としては、上記本発明の好ましい態様として記載された経口剤を参照することができる。
【００３３】
本発明の剤が食品添加剤の場合、好ましくは例えば加工乳、発酵乳等の乳製品（ヨーグルトを含む）に本発明の剤を添加して使用することで、５−ＦＵ投与を必要とする患者は、そのＢＢＧ９−１を含む乳製品等から本発明の有効成分を摂取可能である。
【００３４】
本発明の剤の有効成分であるＢＢＧ９−１は、単独で優れた５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療効果を示すが、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療のために使用される他の有効成分と組み合わせて使用することにより、相殺的ではない、つまり、相加的又は相乗的な効果の向上が期待できる。５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療のために使用される他の有効成分としては、好ましくは例えばＢＢＧ９−１以外の有用菌が挙げられる。ＢＢＧ９−１以外の有用菌は特に限定されず、例えば、ＢＢＧ９−１以外の乳酸菌、糖化菌、酪酸菌等が挙げられる。なお、本発明の剤は、ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有しなくてもよく、この場合でも優れた５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療効果を示す。
【００３５】
ＢＢＧ９−１以外の乳酸菌は、例えば、Bifidobacterium bifidum、B. longum、 B. breve、B. adolescentis、B. infantis、B.pseudolongum、B.thermophilum等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属のビフィズス菌（但し、ＢＢＧ９−１を除く）；例えば、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. plantarum、L. delbrueckii subsp bulgaricus、L. delbrueckii subsp lactis、L. fermentum、L. helveticus、L. johnsonii、L. paracasei subsp. paracasei、L. reuteri、L. rhamnosus、L. salivarius、L. brevis等のラクトバシラス（Lactobacillus）属の乳酸桿菌；例えば、Leuconostoc mesenteroides等のリューコノストック属、Streptococcus(Enterococcus) faecalis、Streptococcus(Enterococcus) faecium、 Streptococcus(Enterococcus) hirae、Streptococcus thermophilus等のストレプトコッカス（Streptococcus）属（現在の分類学上、エンテロコッカス (Enterococcus)属に分類される）、Lactococcus lactis、L. cremoris等のラクトコッカス（Lactococcus）属、Tetragenococcus halophilus等のテトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、Pediococcus acidilactici、P. pentosaceus等のペディオコッカス（Pediococcus）属、Oenococcus oeni等のオエノコッカス（Oenococcus）属等の乳酸球菌等が挙げられる。
これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯ等の機関や財団法人  日本ビフィズス菌センターなどから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
なお、本明細書中においては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属とは、ストレプトコッカス（Streptococcus）属及びエンテロコッカス(Enterococcus)属を包含する。
【００３６】
糖化菌、酪酸菌等として、例えば、Bacillus subtilis 129 BIO H(α)等のBacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌； Bacillus  toyoi、B．licheniformis、Clostridium  butyricum等の酪酸菌等が挙げられる。
これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯなどの機関から容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
【００３７】
本発明は、（Ａ）ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１含有医薬と（Ｂ）５−フルオロウラシル含有医薬との組み合わせ（以下、本発明の組合せともいう）を包含する。本発明の組合せは、ラクトバチルス・アシッドフィルス又はラクトバチルス・カゼイを含有する場合を除いてもよい。
本発明において、「組み合わせ」とは、「混合物」の態様及び「併用して用いられる（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせ」の態様を包含する。本発明において、上記（Ａ）と（Ｂ）とを併用する場合、（Ａ）と（Ｂ）とがそれぞれ別個に同一又は異なる投与経路から同時投与する投与形態、及びそれぞれ別個に同一又は異なる投与経路による間隔をずらした投与のいずれの投与形態も含むものである。
【００３８】
本発明の組合せにおいて、上記（Ａ）と（Ｂ）とを併用する場合、（Ａ）と（Ｂ）とを使用するタイミングは特に限定されず、（Ｂ）の前投与、同時投与又は後投与のいずれに（Ａ）を用いてよく、またいずれかを組み合わせてもよいが、対象への前処理の負担がない点から、（Ａ）と（Ｂ）の同時投与が好ましい。ここで、「前投与」とは、（Ｂ）を未投与状態の対象へ（Ａ）を一定時間投与することを意味する。また、「同時投与」とは、（Ｂ）の投与開始時から投与停止時まで継続して、又は（Ｂ）の投与開始時から投与停止時までの間に一定時間、対象へ（Ａ）を投与することを意味する。「後投与」とは、（Ｂ）の投与停止後から、対象へ（Ａ）を一定時間投与することを意味する。なお、（Ａ）と（Ｂ）の投与間隔は、特に限定されないが、例えば、３０分以下であってもよい。
【００３９】
本発明の組合せにおいて、（Ａ）／（Ｂ）の質量比は適宜設定されるが、例として、１／０．０１〜１／１００であってもよい。（Ａ）／（Ｂ）の質量比として好ましくは例えば１／０．５〜１／１５である。
【００４０】
本発明は、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療用医薬製造のための本発明の剤の使用を包含する。
本発明は、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療のための本発明の剤の使用を包含する。
本発明は、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療のために使用する本発明の剤を包含する。
本発明は、本発明の剤の有効量を、５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療をすることが必要な動物に投与することを特徴とする５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療方法を包含する。
本発明の剤又は組み合わせは、上記した乳酸菌、糖化菌又は酪酸菌自体又はこれらを含む組成物を範囲に含む。
本発明は、ＢＢＧ９−１を５−ＦＵ誘発性腸疾患の予防及び／又は治療が必要なヒトに経口的に摂取させる非治療的な５−ＦＵ誘発性腸疾患改善方法を包含する。なお、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体又は動物の体への処置行為を含まない概念である。
【００４１】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【００４２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により実施可能である。
【００４３】
試験方法
１．使用動物
６週齢の雄性ＩＣＲマウス（２０〜２４ｇ，ＳＬＣ）を、通常飼育環境（１２時間の明暗サイクル、室温２２±１℃、湿度約５５％）を７日間維持して飼育した。
【００４４】
２．使用薬物
薬物として、５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、以下５−ＦＵと示す）及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  Ｇ９−１(ビオフェルミン製薬、以下ＢＢＧ９−１と示す)を使用した。
５−ＦＵを生理食塩水に溶解させ、１日１回、６日間、７５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹腔内投与した。
ＢＢＧ９−１を、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）に溶解後十分撹拌し、３７℃で加温した。調製した菌懸濁液は、１日１回、９日間、１０７、１０８又は１０９ｃｆｕ／０．３ｍｌ／ｍｏｕｓｅの用量で経口投与した。対照群にはＰＢＳのみを同容量で経口投与した（図２）。
【００４５】
３．５−ＦＵ誘起腸炎モデルの作製
５−ＦＵ誘起腸炎のモデルは、７週齢の雄性ＩＣＲマウスに５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回６日間投与することで作製した。また、ＢＢＧ９−１（０．３ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）を１日１回９日間経口投与した（図２）。疾患の重症度は、体重減少と下痢の程度を観察することで評価した（スコア０:正常便  スコア１:軟便  スコア２:流動便  スコア３:水様不形成便）。
【００４６】
４．小腸粘膜ミエロペルオキシダーゼ活性の測定
小腸粘膜におけるＭＰＯ活性は、Ｋｒａｗｉｓｚ  ＪＥらの方法を改変して測定した。即ち、５−ＦＵの最終投与２４時間後に炭酸ガスにより安楽死させ、小腸を摘出した。冷却した生理食塩水で洗浄、抽出用緩衝液（ｐＨ６．０，５０ｍＭリン酸＋０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ：和光純薬））を組織重量５０ｍｇ当たり１ｍＬの割合で加えてガラスホモジナイザー（井内）により均質化し、さらに凍結及び融解を３回繰り返した後、冷却化にて２０００ｇで１０分間遠心分離した。９６穴プレートに遠心上清５μＬ及びリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、１０ｍＭリン酸）９５μＬを加えてよく混和し、さらに過酸化水素・ｏ−ジアニシジン反応液（０．４４μＭ  過酸化水素（三徳化学）：２０ｍＭ  ｏ−ジアニシジン＝１：２００（容量比））５０μＬを加えた後、波長４５０ｎｍにおける吸光度変化をマイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡ  ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。各検体のタンパク質含量はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。標準曲線は５μｇ／ｍＬペルオキシターゼ標準液（Ｓｉｇｍａ）５μＬに各濃度の過酸化水素・ｏ−ジアニシジン反応液（０．８８μＭ過酸化水素：２０ｍＭ  ｏ−ジアニシジン＝１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００（容量比））５０μＬを加えた際の吸光度変化を測定することにより作成し、次式によりＭＰＯ活性を算出した。
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  （μｍｏｌｅ  Ｈ２Ｏ２／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）＝（ＯＤ／ｍｉｎ）／（ＯＣ／１μｍｏｌｅ  Ｈ２Ｏ２ ×ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
【００４７】
５．組織学的検討
５−ＦＵ最終投与から２４時間後、深麻酔下において動物を安楽死させ摘出した小腸を、１０％中性ホルマリン溶液中で固定した。病変部の組織サンプルをパラフィンで包埋し、厚さ４ｕｍの切片としてヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ：Ｈ＆Ｅ）染色を行った。絨毛の長さ（絨毛の先端から小腸腺窩の接合部まで）と小腸腺窩の傷害（１ｍｍあたりの生存小腸腺窩の減少及び小腸腺窩あたりの生存腺窩細胞の減少）を、光学顕微鏡（ＢＸ−５０、Ｏｌｙｍｐａｓ）を用いて測定した。
【００４８】
６．炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現の検討
ｍＲＮＡ発現をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）法により検討した。５−ＦＵ最終投与から２４時間後に動物を深麻酔下で安楽死させ、小腸を摘出した。冷却した生理食塩水で洗浄し、使用時まで−２０℃でＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中で保存した。ＲＮＡを、Ｓｅｐａｓｏｌ  ＲＮＡ−ＩＩ  Ｓｕｐｐｅｒ  Ｇ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を用いて抽出した。逆転写をＲｅｖａＴｒａ  Ａｃｅ−ａｌｐｈａ  ｗｉｔｈ  ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて行った。得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  （Ｔａｋａｒａ）及び特異プライマーを用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応させ、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）によるβ−ａｃｔｉｎ（プライマーセットＩＤ：ＭＡ０５０３６８）、ＴＮＦ−α（プライマーセットＩＤ：ＭＡ０９７０７０）及びＩＬ−１β（プライマーセットＩＤ：ＭＡ０２５９３９）の定量を行った。それぞれのｍＲＮＡ発現量は、ノーマル群（５−ＦＵ非処置）マウスのβ−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量を基準とした。
【００４９】
結果
１．５−ＦＵ投与による体重減少及び下痢に対するＢＢＧ９−１の効果
５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）の６日間連続投与は３日後から顕著な体重減少、２日後から下痢を惹起した。ＢＢＧ９−１（１０７−１０９ｃｆｕ／０．３ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）の９日間連続投与は５−ＦＵによる体重減少及び下痢を用量依存的に抑制し、特にＢＢＧ９−１  １０９ｃｆｕの用量で体重減少を有意に抑制した（図３及び４）。なお、ｃｆｕは、Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（コロニー形成単位）である。
【００５０】
２．５−ＦＵ投与による小腸短縮に対するＢＢＧ９−１の効果
５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）の６日間連続投与は、顕著な小腸短縮を惹起した。ＢＢＧ９−１（１０７−１０９ｃｆｕ／０．３ｍｌ／ｍｏｕｓｅ）の９日間連続投与は、用量依存的に小腸短縮を抑制し、その効果は特にＢＢＧ９−１  １０９ｃｆｕの用量で小腸短縮を有意に抑制した（図５）。
【００５１】
３．５−ＦＵ投与による小腸粘膜ＭＰＯ活性に対するＢＢＧ９−１の効果
５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）の６日間連続投与は、正常粘膜におけるＭＰＯ活性と比較して有意に増大した。このＭＰＯ活性の増大はＢＢＧ９−１の９日間連続投与により有意に抑制されており、特にＢＢＧ９−１  １０８，１０９ｃｆｕの用量でＭＰＯ活性を有意に抑制した（図６）。
【００５２】
４．５−ＦＵ投与による組織学的変化に対するＢＢＧ９−１の効果
５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）の６日間連続投与は、顕著な小腸絨毛の短縮と腺窩の傷害（腺窩及びその構成細胞数の減少）を惹起した。ＢＢＧ９−１の９日間連続投与は用量依存的に腸炎を抑制し、その効果はＢＢＧ９−１  １０９ｃｆｕの用量で有意に腸炎を抑制した（図７、８、９及び１０）。
【００５３】
５．５−ＦＵ投与による小腸粘膜の各種サイトカイン発現増大に対するＢＢＧ９−１の効果
５−ＦＵ（７５ｍｇ／ｋｇ）の６日間連続投与は、小腸粘膜における炎症を惹起するＴＮＦ−α及びＩＬ−１β発現の増大を惹起した。ＢＢＧ９−１の９日間連続投与は、これらサイトカイン発現の増大を抑制した（図１１及び１２）。
【００５４】
結論
ＢＢＧ９−１が５−ＦＵ投与による体重減少、下痢及び腸炎の発生を有意に抑制したことから、ＢＢＧ９−１は、がん化学療法時の消化管に対する副作用の軽減に有効であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の剤は５−フルオロウラシル誘発性腸疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【符号の説明】
【００５６】
１、２  圧縮気体が供給される気体流路
３、４  被乾燥体を含む液体が供給される液体流路
５      流体流動面
６      衝突焦点
７      噴霧液滴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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