(57)【要約】      （修正有）【課題】湿式法により充填剤を充填する場合に高い理論段数が得られる、充填剤を含むスラリーの調製条件と、そのスラリーのカラム容器への充填条件とを備えた液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法を提供する。【解決手段】充填剤を含むスラリーを調製し、スラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を、充填剤の等電点の±３．０以内に調整する工程と、水素イオン濃度を調整したスラリーを前記カラム容器に注入し、カラム容器の入口側から出口側に向かって液体を送液することにより、スラリーを加圧し、カラム容器内に充填剤からなる充填層を形成する工程と、を有することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー用のカラム容器に対して充填剤を充填し、液体クロマトグラフィー用カラムを製造する方法であって、
前記充填剤を含むスラリーを調製し、該スラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を、前記充填剤の等電点の±３．０以内に調整する工程と、
水素イオン濃度を調整した前記スラリーを前記カラム容器に注入し、前記カラム容器の入口側から出口側に向かって液体を送液することにより、前記スラリーを加圧し、前記カラム容器内に前記充填剤からなる充填層を形成する工程と、を有することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項２】
前記スラリーを、前記カラム容器に注入してから、前記液体の送液を開始するまでの時間が１２分以内であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項３】
前記液体の送液を開始してから、前記液体の流量が一定の流量に達するまでの時間が７分以内であることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【請求項４】
前記液体を一定の流量で送液する時間が１０分以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、天然物や発酵生産物、培養生産物、あるいは合成反応物中の目的物質を、共存する複数の物質と分離し、定量等の分析評価の手段、あるいは精製工程の手段として広く用いられている。
【０００３】
液体クロマトグラフィー用カラムは、一般的に、ステンレス鋼材等の金属製、あるいはＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）等の硬質樹脂製の円筒型容器（ハウジング）内に、シリカゲル粒子あるいは樹脂製粒子等の分離機能を担う充填剤が密に封入されて構成されている。
【０００４】
液体クロマトグラフィー用のカラム容器に充填剤を充填する方法としては、例えば、カラム容器内に充填剤を含むスラリーを注入した後、カラム容器を送液ポンプに連結し、スラリーに含まれる溶媒をカラム容器外へ圧送することにより、カラム容器内に充填剤からなる充填層を形成する方法が挙げられる（例えば、非特許文献１、特許文献１、２参照）。この方法により、カラム容器内に比較的緻密な充填層を容易に形成することができる。
【０００５】
一般的に、クロマトグラフィーの分離性能は、理論段数で表わされる。理論段数が高いほど、クロマトグラフィーの分離性能が高いと言える。充填剤の充填状態は分離性能に大きく影響する。そのため、カラム容器に充填剤が高密度かつ均一に充填されている必要がある。従って、スラリー中における充填剤の分散状態は、カラム容器に充填したときの充填剤の充填密度や均一性に影響を及ぼすものと思われる。
【０００６】
これまでに、スラリー中に充填剤を均一に分散・懸濁させることにより、理論段数がより高くなることを立証した研究例が多く報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、それらの考え方に従った条件にて、スラリー中に充填剤を分散させたとしても、必ずしも理論段数が高くなるとは限らず、むしろ理論段数が低くなることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５９−２８６６０号公報
【特許文献２】特開平２−７８９５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】W.W.Yau et al.，”Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography”，John Wiley & Sons，New York，189，1979
【非特許文献２】WAHAB M. Farooq et al.，Journal of Chromatography A，Vol.1270，p.139
【非特許文献３】H.A.Claessens et al.，Journal of High Resolution Chromatography & Chromatography Communications，Vol.5，p.250
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、液体クロマトグラフィー用のカラム容器に対して、湿式法により充填剤を充填する場合に、高い理論段数が得られる、充填剤を含むスラリーの調製条件と、そのスラリーのカラム容器への充填条件とを備えた液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者等は、上記課題を解決するために、充填剤を含むスラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）が、液体クロマトグラフィーの理論段数に影響を及ぼす現象に基づいて検討を行った結果、スラリーのｐＨを充填剤の等電点近傍に調整した場合に、理論段数が最も高い値を示すことを見出した。すなわち、充填剤が凝集し易いとされる条件は、理論段数が高くなると言うことができる。このようなスラリーの調製方法は、充填剤の粒子（以下、「充填剤粒子」と言うこともある。）同士が反発し易いように、スラリーのｐＨを、充填剤粒子表面にゼータ電位が生じる範囲に調整し、充填剤粒子が凝集するのを避けるべきであるという従来の方法とは全く異なる方法である。ゼータ電位により充填剤粒子同士が反発することによって、スラリー中における充填剤粒子の分散状態が向上するものの、カラム容器に充填剤粒子を密に充填することが難しくなる。また、スラリーのｐＨが充填剤の等電点近傍である場合、充填剤粒子が凝集し易いことから、カラム容器へのスラリーの充填条件、特にカラム内におけるスラリーの処理時間の制御が必要となる。
【００１１】
以上のように、本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、充填剤を含むスラリーのｐＨを、充填剤の等電点近傍に調整することにより、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が高くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
［１］液体クロマトグラフィー用のカラム容器に対して充填剤を充填し、液体クロマトグラフィー用カラムを製造する方法であって、前記充填剤を含むスラリーを調製し、該スラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を、前記充填剤の等電点の±３．０以内に調整する工程と、水素イオン濃度を調整した前記スラリーを前記カラム容器に注入し、前記カラム容器の入口側から出口側に向かって液体を送液することにより、前記スラリーを加圧し、前記カラム容器内に前記充填剤からなる充填層を形成する工程と、を有することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１３】
［２］前記スラリーを、前記カラム容器に注入してから、前記液体の送液を開始するまでの時間が１２分以内である［１］に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１４】
［３］前記液体の送液を開始してから、前記液体の流量が一定の流量に達するまでの時間が７分以内である［１］または［２］に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【００１５】
［４］前記液体を一定の流量で送液する時間が１０分以上である［１］〜［３］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、特に水を分散媒に用いた湿式法による液体クロマトグラフィー用のカラム容器への充填剤の充填において、充填操作条件を細かく最適化しなくとも、容易に、分離性能が高い液体クロマトグラフィー用カラムを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１８】
［液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法］
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法は、液体クロマトグラフィー用のカラム容器に対して充填剤を充填し、液体クロマトグラフィー用カラムを製造する方法であって、充填剤を含むスラリーを調製し、そのスラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を、充填剤の等電点の±３．０以内に調整する工程と、水素イオン濃度を調整した前記スラリーを前記カラム容器に注入し、前記カラム容器の入口側から出口側に向かって液体を送液することにより、前記スラリーを加圧し、前記カラム容器内に前記充填剤からなる充填層を形成する工程と、を有する方法である。
【００１９】
「カラム容器」
本発明で用いられるカラム容器は、後述する充填剤が充填されるものである。すなわち、カラム容器は、例えば、円筒形状をなすハウジングから概略構成されている。
ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。
【００２０】
「充填剤」
本発明で用いられる充填剤としては、液体クロマトグラフィーに用いられる材料であれば特に限定されないが、充填剤を含むスラリー（以下、「充填剤スラリー」と言うこともある。）の媒体となる、水あるいは有機溶媒等の液体に分散させても、化学的および物理的に安定で、分解したり、変質したりしないものが用いられる。
【００２１】
充填剤は、基材と、この基材を化学的に修飾する修飾官能基と、を有するものである。
【００２２】
基材としては、樹脂、シリカゲル、アルミナ（酸化アルミニウム）、チタニア（酸化チタン）、セリア（酸化セリウム）、カーボン等が挙げられる。
樹脂としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリグリシジルメタクリレート（グリシジルメタクリレートと架橋性単量体との共重合体）、グリセリンジ（メタ）アクリレートの重合体、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートと架橋性単量体との共重合体）、４−クロロメチルスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体等が挙げられる。
また、基材の組成は、単体に限定されず、例えば、シリカゲルを核として、その周囲を樹脂で被覆した構造（コアシェル構造）のような複合体であってもよい。
【００２３】
これらの中でも、幅広い分離用途および幅広い使用条件に適用可能である点から、強酸あるいは強アルカリに対しても化学的に安定で、かつ種々の修飾官能基で化学的に修飾可能な架橋あるいは非架橋の樹脂材料が好ましく用いられる。
【００２４】
特に、イオン交換基や親水性官能基等の修飾官能基の機能を利用し、水、あるいは水と相溶性のある有機溶剤とを混合した液体を、溶離液（移動相）として用いる分離方法においては、修飾の容易さと多様さの観点から、アルコール性水酸基を有する親水性の樹脂が好ましく用いられる。
【００２５】
アルコール性水酸基を有する樹脂としては、具体的には、カルボン酸ビニルエステルと架橋性単量体からなる架橋共重合体のエステル基を、ケン化またはエステル交換反応によって、アルコール性水酸基に変換したポリビニルアルコール系樹脂が挙げられる。
カルボン酸ビニルエステルとしては、例えば、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル、ピバリン酸ビニル等が挙げられる。これらのカルボン酸ビニルエステルは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、重合およびケン化が容易である点から、酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルが好ましい。
架橋性単量体としては、トリアジン環を有する架橋性単量体が好ましく、トリアジン環を有する架橋性単量体の中でもトリアリルイソシアヌレートが特に好ましい。
【００２６】
基材を化学的に修飾する修飾官能基としては、親水性相互作用あるいはイオン交換相互作用を発現する官能基が挙げられる。このような官能基としては、具体的には、グリシジルアルコールやエピクロルヒドリンの付加後の加水開環処理によって導入される水酸基、ポリエチレングリコールやシクロデキストリン等の親水性化合物の付加によって導入される水酸基、アミン化合物の付加によって導入されるアニオン交換基、カルボキシル基、スルホ基、リン酸基等のカチオン交換基等が挙げられる。
特に、基材の表面を修飾する修飾官能基は、その種類によって充填剤の等電点を変化させる。本発明では、充填剤の等電点に応じて、充填剤スラリーのｐＨを調整することによって、より分離性能に優れるように、カラム容器内に充填剤を充填することができる。
【００２７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法では、イオンクロマトグラフィーおよび親水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＬＩＣ）にて用いられる、アニオン交換基を導入した充填剤が好適に用いられる。
【００２８】
アニオン交換基を導入するために用いられるアミン化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、ジメチルベンゾアミン、１−メチルピペリジン等の３級アミン類、ジメチルアミン、ジエチルアミン、メチルエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、３−メチルアミノ−１，２−プロパンジオール等の２級アミン類、ヘキサメチレンジアミン、ペンタエチルヘキサミン、Ｄ−グルカミン、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−マンニトール、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトール、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−イジトール、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−アラビニトール、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−キシリトール、４−アミノ−１，２，３−ブタントリオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール等の１級アミン類が挙げられる。なお、これらのアミン類は、基材に付加されたグリシジル基に直接反応させて導入してもよいし、エピクロロヒドリン、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジグリシジルエーテル等のグリシジル基を有する化合物を介して基材に導入してもよい。
【００２９】
ただし、アニオン交換基を導入するために用いられるアミン化合物は、アニオン交換能を発現する官能基を有する化合物であればよく、必ずしも上記の化合物に限定されない。
【００３０】
カチオン交換基を導入する方法としては、例えば、上記のアルコール性水酸基を有する樹脂（親水性樹脂）の粒子、または、シリカゲル粒子に、無水マレイン酸とブタジエンとの共重合体（ＰＢＤＭＡＮ）、または、マレイン酸とブタジエンとの共重合体（ＰＢＤＭＡ）の水／アセトン溶液を混合し、次いで、その混合物をラジカル重合開始剤とともに加熱処理した後、溶媒を蒸発除去する方法が挙げられる。また、上記のアルコール性水酸基を有する樹脂（親水性樹脂）の粒子に、エピクロロヒドリン、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジグリシジルエーテル等のグリシジル基を有する化合物を結合した後、そのグリシジル基を有する樹脂（親水性樹脂）の粒子と、亜硫酸ナトリウムとを反応させることにより、スルホン酸基を導入する方法が挙げられる。
【００３１】
充填剤の粒径は、１μｍ〜３０μｍであることが好ましく、２μｍ〜２０μｍであることがより好ましく、２μｍ〜１０μｍであることがさらに好ましい。充填剤の粒径を１μｍ以上とすると、カラム容器内に充填剤を充填する際に、カラム容器の圧力が上昇するのが抑制され、カラム容器内に充填剤を容易に充填することができる。一方、充填剤の粒径を３０μｍ以下とすると、充填剤スラリーのｐＨを、充填剤の等電点近傍に制御した際の効果が発現し易くなり、カラムの理論段数を改善（向上）し、カラムの分離性能を改善（向上）することができる。なお、充填剤の粒径は、シスメックス社製のＦＰＩＡ−３０００を使用した画像イメージング法にて測定した体積平均粒径である。
【００３２】
「充填剤スラリーのｐＨの調整」
充填剤スラリーは、上記の充填剤と、その充填剤を分散させる溶媒と、を含んでなる。
充填剤スラリーの溶媒としては、充填剤スラリーのｐＨを、充填剤の等電点の±３．０以内に制御できるものであれば特に限定されないが、ｐＨの制御が容易である点から、水が好ましい。
【００３３】
また、水に充填剤を均一に分散させるためには、予め水に塩を添加してもよい。
水に添加される塩は、充填剤の種類や、液体クロマトグラフィーによる分離対象に応じて適宜選択される。
水に添加される塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸リチウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸リチウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸リチウム等が挙げられる。これらの塩は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
また、充填剤の分散性を改善するために、水に、水と相溶する（親水性の）有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等）を少量添加してもよい。ただし、有機溶媒の添加量が多過ぎると、有機溶媒と充填剤の親和性に基づく充填剤の分散性が高くなり過ぎて、充填剤の等電点近傍における、充填剤同士の凝集力に起因する理論段数の向上という本発明の本質が損なわれる。
【００３５】
充填剤スラリーにおける充填剤の濃度は、充填剤スラリーの流動性が維持される範囲内であれば特に限定されない。ただし、充填剤スラリーにおける充填剤の濃度が過度に高過ぎると、溶媒に対して充填剤が充分に分散しなくなり、理論段数を高くすることが難しくなる。また、充填剤スラリーの流動性が著しく低下し、カラム容器内に充填剤を充填することが難しくなる。一方、充填剤スラリーにおける充填剤の濃度が低過ぎると、カラム容器内に充填剤を充填するために要する時間が長くなるため好ましくない。そのため、充填剤の種類に応じて、充填剤スラリーにおける充填剤の濃度を適宜調整する必要がある。本発明で特に好ましく用いられる樹脂材料系充填剤の場合、その充填剤を均一に分散させるためには、充填剤スラリーにおける充填剤の濃度は、１質量％〜５０質量％であることが好ましく、１質量％〜５０質量％であることがより好ましい。
【００３６】
本発明において、充填剤の等電点の測定方法としては、ゼータ電位測定装置が用いられる。ゼータ電位測定装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社製のＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ−ＺＳＰ、大塚電子社製のＥＬＳＺ−１０００等が用いられる。
また、充填剤の等電点の測定装置としては、簡便には、電場を印加できるように電極を設置した透明容器中の溶媒（水）に充填剤を希薄に分散させ、電場に応じた充填剤の泳動挙動を顕微鏡で観察する装置が好適に用いられる。このような測定装置としては、例えば、日本ベル社製のマイクロトラック・ベルＺｅｔａＶｉｅｗ等が挙げられる。
【００３７】
充填剤スラリーのｐＨの調整方法としては、充填剤の化学構造を著しく破壊しない限り、一般的に用いられる酸またはアルカリを添加する方法が挙げられる。
酸としては、塩酸、硝酸、硫酸、酒石酸、クエン酸等の水溶液が用いられる。
アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン等の水溶液が用いられる。
【００３８】
本発明において、充填剤スラリーのｐＨの測定方法としては、較正されたｐＨ測定用電極を用いる一般的なｐＨの測定方法が用いられる。
【００３９】
本発明において、充填剤スラリーのｐＨは、充填剤の等電点から±３．０以内に調整される。充填剤スラリーのｐＨが、この範囲を超えると、再現性に優れる分離性能の改善効果が得られない。なお、ここでのｐＨの値は、カラム容器への充填操作を行う温度での値である。
ただし、ｐＨの範囲は、一般的な酸やアルカリを用いて調整可能な範囲である１．０以上１４．０以下である。
【００４０】
なお、充填剤スラリーのｐＨの調整手順としては、予め所定量の溶媒に、所定量の充填剤を充分に分散させた後、その分散液に酸またはアルカリを添加する手順が好ましい。
このような手順を踏むことが好ましい理由は、初めから充填剤スラリーのｐＨを、充填剤の等電点近傍に調整すると、凝集した充填剤の分散に極めて長時間を要したり、充填剤の凝集が解けなかったりするため、結果的に、理論段数の改善（向上）に繋がらないことがあるからである。
【００４１】
「充填剤の充填方法・条件」
湿式法により、カラム容器内に充填剤を充填する方法としては、まず、所定量の前記充填剤スラリーをカラム容器に注入する。注入は、充填剤スラリーを「パッカー」と呼ばれるカラム容器に注入するための専用器具を用いて行うことができる。まず、パッカーに充填剤スラリーをカラム容器に満たす十分量を入れた後、送液ポンプを接続して液体を送ることによりカラム容器内へ充填剤スラリーを注入する。さらに、送液ポンプにより、充填剤スラリーを注入したカラム容器内に液体を所定時間送り続けることにより、充填剤を加圧する方法が用いられる。詳細には、カラム容器のハウジング内に、水素イオン濃度を調整した充填剤スラリーを注入し、カラム容器（ハウジング）の入口側から出口側に向かって加圧用の液体を送液することにより、充填剤を加圧する方法が用いられる。これにより、カラム容器内（ハウジング内）に充填剤からなる充填層を形成する。
【００４２】
カラム容器内に充填剤を充填するための液体としては、充填剤スラリーの溶媒、または、その溶媒から添加物を除いたものが用いられる。このような液体を用いることにより、その液体がカラム容器への充填剤の充填状態に影響を及ぼすことがない。
【００４３】
カラム容器内に液体を送液することにより、カラム容器内に充填剤を充填する方法としては、液体に加える圧力を一定とする方法、液体の流量を一定とする方法、経時的かつ傾斜的に、液体の圧力または流量を変化させる方法等が用いられる。これらの方法は、カラム容器内において、充填剤の沈降堆積を発生させないようにするために、充填剤の種類やカラム容器の長さ等に応じて適宜選択される。
【００４４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法では、あえて、充填剤が凝集しやすい液性の充填剤スラリーを用いる。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法では、水素イオン濃度（ｐＨ）を充填剤の等電点の±３．０以内に調整した充填剤スラリーを用いる。この方法では、カラム容器への充填剤の充填操作が不適切であると、高い理論段数が得られるという効果が充分に発揮されない。
【００４５】
そこで、充填剤スラリーを、カラム容器（ハウジング）に注入してから、上記の液体の送液を開始するまでの時間１２分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましい。
液体の送液を開始するまでの時間を１２分以内とすれば、カラム容器（ハウジング）内に充填剤を充分に充填することができる。なお、カラム容器（ハウジング）内に充填剤を充分に充填するとは、充填剤粒子同士の間に生じる空間をより小さくするように充填剤粒子が配置する状態を作り、充填剤の形状自体は変化することなく、より多くの量が充填されることであり、結果として、理論段数の高いカラムが得られるように、充填剤を充填することである。
【００４６】
また、上記の液体の送液を開始してから、液体の流量が一定の流量に達するまでの時間７分以内であることが好ましく、５分以内であることがより好ましい。
液体の流量が一定の流量に達するまでの時間を７分以内とすれば、カラム容器（ハウジング）内に充填剤を充分に充填することができる。
【００４７】
また、上記の液体を一定の流量で送液する時間が５分以上であることが好ましく、１０分以上であることがより好ましい。
液体を一定の流量で送液する時間を５分以上とすれば、理論段数が高く、分離性能が高いカラムが得られる。
なお、一定流量での送液時間は最大６０分であることが効率の点で好ましい。
【００４８】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法によれば、充填剤スラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を充填剤の等電点の±３．０以内に調整することにより、特に水を分散媒に用いた湿式法による液体クロマトグラフィー用のカラム容器への充填剤の充填において、充填操作条件を細かく最適化しなくとも、容易に、分離性能が高い液体クロマトグラフィー用カラムを提供することができる。また、充填剤スラリーの水素イオン濃度（ｐＨ）を充填剤の等電点の±３．０以内に調整すれば、充填剤スラリーのｐＨが、一般的な酸やアルカリを用いて調整可能な範囲である１．０以上１４．０以下の範囲内にあっても、容易に、分離性能が高い液体クロマトグラフィー用カラムを提供することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
[充填剤Ａの合成]
（ポリビニルアルコールゲル（基材）の合成）
酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１５０ｇ、酢酸ブチル１００ｇ、ｎ−デカン２５ｇおよび２，２−アゾビスイソブチロニトリル５ｇからなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１２ｇおよびリン酸水素二ナトリウム１８ｇを溶解した水１２００ｍＬとを、還流冷却器を備えた５Ｌ三口フラスコに入れ、１０分攪拌した。
次いで、窒素気流下で攪拌しつつ、６０℃にて１６時間重合を行うことにより、平均粒径５μｍの粒状重合体を得た。
次いで、その重合体を濾過し、７０℃のお湯２Ｌを用いて洗浄し、アセトン抽出した後、乾燥した。
次いで、その重合体を４％カセイソーダ水溶液３Ｌとともに、還流冷却器、窒素導入管および攪拌器を備えた５Ｌの三口フラスコに入れ、窒素気流下、１５℃にて２０時間攪拌し、重合体をケン化した。
その後、ケン化した重合体を濾過、水洗し、さらに乾燥した。
ケン化によって得られたポリビニルアルコール重合体（ポリビニルアルコールゲル）における水酸基の密度は２．１ｍｅｑ／ｇであった。
【００５１】
（基材の表面の修飾）
乾燥したポリビニルアルコール重合体１０ｇ、エピクロロヒドリン４５ｇ、ジメチルスルホキシド１００ｍＬおよび３０％苛性ソーダ水溶液５ｍＬを、セパラブルフラスコに入れ、３０℃にて２０時間撹拌し、ポリビニルアルコール重合体に、グリシジル基を導入した。
グリシジル基を導入したポリビニルアルコール重合体を、ジメチルスルホキシド、水およびメタノールで洗浄した後、乾燥した。
【００５２】
グリシジル基を導入したポリビニルアルコール重合体４ｇ、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン１０ｇおよび水４０ｍＬを、セパラブルフラスコに入れ、３０℃にて２０時間撹拌し、ポリビニルアルコール重合体にアミノ基を導入した充填剤Ａを得た。
充填剤Ａを、水での洗浄をはさみながら、０．５Ｎ塩酸および０．５Ｎ苛性ソーダ水溶液で洗浄し、さらに、メタノールで洗浄した後、乾燥した。
このようにして得られた充填剤Ａを、０．５Ｎ塩化カリウム水溶液に分散させ、０．１Ｍ塩酸を用いてアミノ基を滴定することにより、充填剤Ａのアミノ基の密度を測定した。その結果、充填剤Ａのアミノ基の密度は、０．４４ｍｅｑ／ｇであった。また、充填剤Ａの平均粒径は５μｍであった。
【００５３】
（充填剤Ａの等電点の測定）
充填剤Ａ５０ｍｇを、０．００１Ｍ−ＫＣｌ水溶液５０ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて３分間分散処理を施し、充填剤Ａの分散液を調製した。
Ｍａｌｖｅｒｎ社製のゼータ電位測定装置ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏおよび自動滴定制御装置ＭＰＴ−２を用い、次のようにして、充填剤Ａの分散液の等電点を測定した。ｐＨ２．０から開始し、ｐＨ１２．０まで徐々に、分散液に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下しながら、逐次、ゼータ電位測定を行うことにより、充填剤Ａの分散液の等電点を測定した。その結果、ゼータ電位が０ｍＶとなる等電点は、ｐＨ１０．０であった。結果を表１に示す。
【００５４】
［実施例１］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
充填剤Ａ３．０ｇを、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液９ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１０．８に調整した。この充填剤スラリーにおける充填剤Ａの濃度は２０質量％であった。
得られた充填剤スラリーを用いて、表１に示す条件にて、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＳＵＳ製のカラム容器に、充填剤Ａを充填した。
すなわち、カラム容器内に、上記の充填剤スラリーを注入し、カラム容器の入口側から出口側に向かって０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を送液することにより、充填剤スラリーを加圧し、カラム容器内に充填剤Ａからなる充填層を形成し、実施例１の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
充填剤スラリーを、カラム容器内に注入してから、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の送液を開始するまでの時間（静置時間）を０分とした。また、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の送液を開始してから、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の流量が一定の流量に達するまでの時間（立ち上げ時間）を５分とした。また、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を一定の流量で送液する時間（定常送液時間）を２０分とした。
【００５５】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
実施例１の液体クロマトグラフィー用カラムと、示差屈折率検出器とを用いて、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。溶離液としては、アセトニトリルと水を、質量比で８５：１５の割合で含む混合溶液を用いた。溶離液の流量（カラム内を流れる溶離液の速さ）を０．６ｍＬ／分、カラム温度を４０℃とした。
得られたクロマトグラムから、実施例１の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。理論段数の算出方法を、半値幅法（２００６年４月改正の日本薬局方）とした。結果を表１に示す。
【００５６】
［実施例２、３］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
充填剤スラリーのｐＨを７．５および１２．９に調整したこと以外は実施例１と同様にして、実施例２および３の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００５７】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
実施例２および３の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、実施例２および３の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００５８】
［実施例４］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
静置時間を５分としたこと以外は実施例１と同様にして、実施例４の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００５９】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
実施例４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、実施例４の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００６０】
［比較例１］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
充填剤Ａ３．０ｇを、０．３Ｍギ酸水溶液９ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーのｐＨは２．５であった。この充填剤スラリーにおける充填剤Ａの濃度は２０質量％であった。
以下、実施例１と同様にして、比較例１の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００６１】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
比較例１の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例１の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００６２】
［比較例２］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
充填剤Ａ３．０ｇを、７５％アセトニトリル６ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーにおける充填剤Ａの濃度は２０質量％であった。
以下、実施例１と同様にして、比較例２の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００６３】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
比較例２の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例２の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００６４】
［比較例３］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
スラリー液のｐＨを６．７としたこと以外は実施例１と同様にして、比較例３の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００６５】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
比較例３の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例３の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００６６】
［比較例４］
（充填剤Ａを含むカラムの作製）
スラリー液のｐＨを１３．３としたこと以外は実施例１と同様にして、比較例４の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００６７】
（充填剤Ａを含むカラムの特性の評価）
比較例４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１と同様にして、スクロースを分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例４の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2017083250.tif 000002
【００６９】
表１の結果から、実施例１〜実施例４では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が高い一方、比較例１〜比較例４では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が著しく低下していることが確認された。
【００７０】
[充填剤Ｂの合成]
（ポリビニルアルコールゲル（基材）の合成）
充填剤Ａの合成と同様にして、ポリビニルアルコール重合体を得た。
【００７１】
（基材の表面の修飾）
乾燥ポリビニルアルコール重合体１０ｇ、１，４−ブタンジオールグリシジルエーテル１５ｇ、ジメチルスルホキシド２０ｍＬおよび３８％苛性ソーダ水溶液３ｍＬを、セパラブルフラスコに入れ、６０℃にて２時間撹拌し、ポリビニルアルコール重合体に、グリシジル基を導入した。
グリシジル基を導入したポリビニルアルコール重合体を、ジメチルスルホキシドおよび水で洗浄した後、濡れたまま（乾燥しないまま）回収した。
【００７２】
乾燥しないままのグリシジル基を導入したポリビニルアルコール重合体１０ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン０．２ｇおよび水５０ｍＬを、セパラブルフラスコに入れ、４０℃にて２時間撹拌し、ポリビニルアルコール重合体にアンモニウム基を導入した充填剤Ｂを得た。
充填剤Ｂを、水での洗浄をはさみながら、１Ｎ塩酸および１Ｎ苛性ソーダ水溶液で洗浄し、さらに、メタノールで洗浄した後、乾燥した。
このようにして得られた充填剤Ｂを、０．５Ｎ塩化カリウム水溶液に分散させ、０．１Ｍ塩酸を用いてアンモニウム基を滴定することにより、充填剤Ｂのアンモニウム基の密度を測定した。その結果、充填剤Ｂのアンモニウム基の密度は、０．１５ｍｅｑ／ｇであった。また、充填剤Ｂの平均粒径は５μｍであった。
【００７３】
（充填剤Ｂの等電点の測定）
充填剤Ｂ５０ｍｇを、０．００１Ｍ−ＫＣｌ水溶液５０ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて３分間分散処理を施し、充填剤Ｂの分散液を調製した。
以下、充填剤Ａと同様にして、充填剤Ｂの分散液の等電点を測定した。その結果、等電点は、ｐＨ１２．９であった。結果を表２に示す。
【００７４】
［実施例５］
（充填剤Ｂを含むカラムの作製）
充填剤Ｂ１．２ｇを、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液２ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１２．１に調整した。この充填剤スラリーにおける充填剤Ｂの濃度は３０質量％であった。
得られた充填剤スラリーを用いて、表２に示す条件にて、内径２．０ｍｍ、長さ２５０ｍｍのＰＥＥＫ製のカラム容器に、充填剤Ｂを充填した。
すなわち、カラム容器内に、上記の充填剤スラリーを注入し、カラム容器の入口側から出口側に向かって０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を送液することにより、充填剤スラリーを加圧し、カラム容器内に充填剤Ｂからなる充填層を形成し、実施例５の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
充填剤スラリーを、カラム容器内に注入してから、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の送液を開始するまでの時間（静置時間）を０分とした。また、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の送液を開始してから、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液の流量が一定の流量に達するまでの時間（立ち上げ時間）を５分とした。また、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を一定の流量で送液する時間（定常送液時間）を１０分とした。
【００７５】
（充填剤Ｂを含むカラムの特性の評価）
実施例５の液体クロマトグラフィー用カラムと、伝導度検出器とを用いて、硝酸イオン（ＮＯ３−）を分析し、クロマトグラムを得た。溶離液としては、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）と炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を、質量比で４：１の割合で含む混合溶液を用いた。溶離液の流量（カラム内を流れる溶離液の速さ）を０．１８ｍＬ／分、カラム温度を２５℃とした。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、実施例４の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表２に示す。
【００７６】
［実施例６〜１２］
（充填剤Ｂを含むカラムの作製）
充填剤スラリーのｐＨ、静置時間、立ち上げ時間、定常送液時間、定常流量を表１に示した値としたこと以外は、実施例５と同様にして、実施例６〜１２の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００７７】
［比較例５］
（充填剤Ｂを含むカラムの作製）
充填剤Ｂ１．２ｇを、０．３Ｍ酢酸水溶液２ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーのｐＨは３．２であった。この充填剤スラリーにおける充填剤Ｂの濃度は３０質量％であった。
以下、実施例５と同様にして、比較例５の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００７８】
（充填剤Ｂを含むカラムの特性の評価）
比較例５の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例５と同様にして、硝酸イオン（ＮＯ３−）を分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例５の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表２に示す。
【００７９】
［比較例６］
（充填剤Ｂを含むカラムの作製）
スラリー液のｐＨを９．７としたこと以外は実施例５と同様にして、比較例６の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００８０】
（充填剤Ｂを含むカラムの特性の評価）
比較例６の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例５と同様にして、硝酸イオン（ＮＯ３−）を分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例６の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
2017083250.tif 000003
【００８２】
表２の結果から、実施例５〜実施例１２では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が高い一方、比較例５および比較例６では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が著しく低下していることが確認された。
【００８３】
[充填剤Ｃの合成]
（ポリビニルアルコールゲル（基材）の合成）
充填剤Ａの合成と同様にして、ポリビニルアルコール重合体を得た。
【００８４】
（基材の表面の修飾）
２５％ＰＢＤＭＡ（マレイン酸とブタジエンとの共重合体）アセトン溶液５．０４ｇ、乾燥ポリビニルアルコール重合体４ｇおよびアセトン２０ｇを、２００ｍｌのナスフラスコに入れ、超音波を１０分間加えて、ポリビニルアルコール重合体を均一に分散させて、ポリビニルアルコール重合体の分散液を調製した。
得られた分散液を１０分間静置した後、ロータリーエバポレーターを用いて、４０℃、５０ｍｍＨｇで、分散液を回転させながら濃縮し、ポリビニルアルコール重合体の表面に、ＰＢＤＭＡからなる被膜を形成した。
被膜を形成したポリビニルアルコール重合体を、シャーレに移して、２４時間、自然乾燥した。
被膜を形成したポリビニルアルコール重合体を、ジメチルスルホキシドおよび水で洗浄した後、濡れたまま（乾燥しないまま）回収した。
【００８５】
無水マレイン酸３ｇ、ＡＩＢＮ（２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル））０．１ｇおよびトルエン３０ｇを、１００ｍｌのセパラブルフラスコに入れ、トルエンに、無水マレイン酸およびＡＩＢＮを溶解し、無水マレイン酸およびＡＩＢＮを含むトルエン溶液を調製した。
このトルエン溶液に、被膜を形成したポリビニルアルコール重合体を投入し、超音波を１０分間加えて、ポリビニルアルコール重合体を均一に分散させて、ポリビニルアルコール重合体の分散液を調製した。
セパラブルフラスコ内に約３０秒間、窒素を流して、セパラブルフラスコ内を窒素で置換した後、８５℃にて１５時間、加熱、撹拌して、反応させた。
反応物をろ過し、濾物をトルエン、純水で洗浄した。
濾物を、４ｍＭリン酸水溶液中、８５℃にて１時間攪拌することにより、加水分解した。
内容物をろ過し、濾物を、純水、アセトンの順に十分に洗浄し、２４時間、自然乾燥し、表面にカルボキシル基を有する充填剤Ｃを得た。充填剤Ｃの平均粒径は５μｍであった。
【００８６】
（充填剤Ｃ等電点測定）
充填剤Ｃ５０ｍｇを、０．００１Ｍ−ＫＣｌ水溶液５０ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて３分間分散処理を施し、充填剤Ｃの分散液を調製した。
以下、充填剤Ａと同様にして、充填剤Ｃの分散液の等電点を測定した。その結果、等電点は、ｐＨ２．８であった。結果を表３に示す。
【００８７】
［実施例１３］
（充填剤Ｃを含むカラムの作製）
充填剤Ｃ１．４ｇを、１ｍＭ塩化カリウム水溶液７ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーに１Ｎ塩酸を添加して、ｐＨを２．３に調整した。この充填剤スラリーにおける充填剤Ｃの濃度は１６質量％であった。
得られた充填剤スラリーを用いて、表３に示す条件にて、内径４．６ｍｍ、長さ１２５ｍｍのＰＥＥＫ製のカラム容器に、充填剤Ｃを充填した。
すなわち、カラム容器内に、上記の充填剤スラリーを注入し、カラム容器の入口側から出口側に向かって１ｍＭ塩化カリウム水溶液を送液することにより、充填剤スラリーを加圧し、カラム容器内に充填剤Ｃからなる充填層を形成し、実施例１３の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
充填剤スラリーを、カラム容器内に注入してから、１ｍＭ塩化カリウム水溶液の送液を開始するまでの時間（静置時間）を０分とした。また、１ｍＭ塩化カリウム水溶液の送液を開始してから、１ｍＭ塩化カリウム水溶液の流量が一定の流量に達するまでの時間（立ち上げ時間）を５分とした。また、１ｍＭ塩化カリウム水溶液を一定の流量で送液する時間（定常送液時間）を２０分とした。
【００８８】
（充填剤Ｃを含むカラムの特性の評価）
実施例１３の液体クロマトグラフィー用カラムと、伝導度検出器とを用いて、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を分析し、クロマトグラムを得た。溶離液としては、４ｍＭメタンスルホン酸水溶液を用いた。溶離液の流量（カラム内を流れる溶離液の速さ）を１．０ｍＬ／分、カラム温度を４０℃とした。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、実施例１３の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表３に示す。
【００８９】
［実施例１４］
（充填剤Ｃを含むカラムの作製）
静置時間を５分としたこと以外は実施例１３と同様にして、実施例１４の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００９０】
（充填剤Ｃを含むカラムの特性の評価）
実施例１４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１３と同様にして、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、実施例１４の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表３に示す。
【００９１】
［比較例７］
（充填剤Ｃを含むカラムの作製）
充填剤Ｃ１．４ｇを、０．３Ｍ酢酸水溶液７ｍＬを入れた三角フラスコに加えた後、超音波バスにて１分間分散処理を施し、充填剤スラリーを調製した。この充填剤スラリーに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを７．６に調整した。この充填剤スラリーにおける充填剤Ｃの濃度は１６質量％であった。
以下、実施例１３と同様にして、比較例７の液体クロマトグラフィー用カラムを得た。
【００９２】
（充填剤Ｃを含むカラムの特性の評価）
比較例７の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたこと以外は実施例１３と同様にして、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を分析し、クロマトグラムを得た。
得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして、比較例７の液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数を算出した。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
2017083250.tif 000004
【００９４】
表３の結果から、実施例１３および実施例１４では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が高い一方、比較例７では、液体クロマトグラフィー用カラムの理論段数が著しく低下していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、複数の混合成分を分離し定量する分析手法としてすでに広く用いられている液体クロマトグラフィーにおいて、分離性能をさらに改善することに寄与するものである。分離能の改善は、溶離液の高流量化による分析時間の短縮、あるいは、カラムの小径化や短尺化による溶離液の消費量の削減に寄与する。