(57)【要約】【課題】ＲＮＡウイルスに広く有効であり、既存の抗ＲＮＡウイルス剤とは異なる作用機序による新たな抗ＲＮＡウイルス剤を提供すること。【解決手段】ダイゼイン、ダイゼイン配糖体、グリシテイン、グリシテイン配糖体、大豆加工品、裸麦加工品、及びはと麦加工品から選ばれる少なくとも一種を含有する抗ＲＮＡウイルス剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイゼイン、ダイゼイン配糖体、グリシテイン、グリシテイン配糖体、大豆加工品、裸麦加工品、及びはと麦加工品から選ばれる少なくとも一種を含有する抗ＲＮＡウイルス剤。
【請求項２】
インフルエンザウイルス又はロタウイルスに対する抗ＲＮＡウイルス剤である、請求項１に記載の抗ＲＮＡウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＲＮＡウイルス剤に関する。より詳しくは、大豆加工品、裸麦加工品又ははと麦加工品等を含有する抗ＲＮＡウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは約０．０２〜０．３μｍの大きさを持つ最小の寄生体である。宿主細胞に付着して、ウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡが外被から分離（脱殻）して、宿主細胞内で複製されることで、ウイルスは宿主に感染する。ヒトに感染するウイルスには数百種類が存在すると言われており、例えば呼吸器系の症状を起こすインフルエンザウイルス、胃腸系の症状を起こすロタウイルス、ノロウイルス等がある。
これらのウイルスによる疾患の治療又は予防のために、抗ウイルス剤及びワクチン等が開発されている。抗ウイルス剤のメカニズムとしては、ウイルス複製の様々な段階を抑えるものがあり、例えばウイルス粒子の宿主細胞膜への付着を防止するもの、ウイルス核酸の脱殻に干渉するもの、細胞受容体又はウイルス複製に必要な因子を阻害するもの、ウイルスに特異的な酵素又はタンパク質を阻害するもの、ウイルスの細胞外への放出を抑えるもの等がある。しかし、現在知られている抗ウイルス剤及びワクチン等には、薬剤耐性株が出現すること、予防効果が低いこと、副作用があること等の問題がある。
【０００３】
インフルエンザウイルスでは、ヒトに感染するものとしてＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３つのタイプが存在する。特に、Ａ型は多様な亜型に分類され、頻繁に変異し、そのために大流行することがある。また、高病原性鳥インフルエンザの流行も懸念されている。インフルエンザ治療剤として用いられている抗ウイルス剤は主に、ウイルスの細胞への付着・侵入を阻害するアマンタジン及びリマンタジン、ウイルスの細胞外への放出を阻害するオセルタミビル及びザナミビル等である。しかし、薬剤耐性株が高頻度に出現している。また、ワクチンに関しては、インフルエンザが頻繁に変異を起こすために流行する株の予測が困難であり、有効率が低いとの問題がある。
ロタウイルスは、小児下痢症ウイルスの最も主要なものである。ロタウイルス感染症の制御のために、弱毒化生ワクチン（ロタテック（登録商標），ロタリックス（登録商標）等）が開発されているが、ワクチン株が有効な血清型の遺伝子型が限定的である。このように、ロタウイルス治療に広く有効な抗ウイルス剤及びワクチンがない。
そこで、ＲＮＡウイルスに広く有効であり、既存の抗ＲＮＡウイルス剤とは異なる作用機序による抗ＲＮＡウイルス剤が求められている。
【０００４】
大豆に関しては、特許文献１に、生豆乳がヒトのロタウイルスに対する抗ウイルス作用を有していることが記載されている。しかし、抗ＲＮＡウイルス作用は十分とは言えず、またインフルエンザウイルスに対する効果は知られていない。
はと麦に関しては、非特許文献１に、はと麦の子実である漢方薬のヨクイニンが浮腫、リウマチ、神経痛、疣取りなどに用いられ、また細胞傷害性Ｔ細胞を活性化して抗ウイルス作用がもたらされると記載されている。特許文献２の請求項４には、はと麦の殻、薄皮及び渋皮を発酵処理又は酵素処理したものがヒト乳頭腫ウイルス性疾患の治療剤として有用であることが記載されている。しかし、ヒト乳頭腫ウイルスはＤＮＡウイルスであり、はと麦の加工品がインフルエンザウイルス、ロタウイルス等のＲＮＡウイルスに対して抗ＲＮＡウイルス作用を示すかは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−４７５５０号公報
【特許文献２】特許３５９００４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】特産種苗，第３号，p.20-24（2009.7）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ＲＮＡウイルスに広く有効であり、既存の抗ＲＮＡウイルス剤とは異なる作用機序による新たな抗ＲＮＡウイルス剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、極めて多数の食品抽出物をスクリーニングした結果、意外にも、はと麦茶、大豆加工品、裸麦加工品、及びはと麦加工品が優れたインフルエンザウイルス又はロタウイルスに対する抗ＲＮＡウイルス作用を有することを見出した。さらに、大豆加工品に含まれる活性成分を分析した結果、ダイゼイン及びグリシテインに極めて強い抗ＲＮＡウイルス作用があることを見出して、本発明を完成した。本発明は、かかる知見に基づくものであり、具体的には、本発明は以下の通りである。
［１］  ダイゼイン、ダイゼイン配糖体、グリシテイン、グリシテイン配糖体、大豆加工品、裸麦加工品、及びはと麦加工品から選ばれる少なくとも一種を含有する抗ＲＮＡウイルス剤。
［２］  インフルエンザウイルス又はロタウイルスに対する抗ＲＮＡウイルス剤である、［１］に記載の抗ＲＮＡウイルス剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤は、ＲＮＡウイルスに広く有効であり、既存の抗ＲＮＡウイルス剤とは異なる作用機序による新たな抗ＲＮＡウイルス剤であるため、新たな治療方法として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例１において、はと麦茶の抗インフルエンザウイルス作用を試験した結果を示す図である。
【図２】試験例２において、はと麦茶の抗ロタウイルス作用を試験した結果を示す図である。
【図３】試験例３において、Ａ型インフルエンザのオセタミビル耐性株であるＯｓａｋａ／２０２４／２００９に対する抗ウイルス作用を試験した結果を示す図である。
【図４】試験例３において、Ａ型インフルエンザのオセタミビル耐性株であるＯｓａｋａ／７１／２０１１に対する抗ウイルス作用を試験した結果を示す図である。
【図５】試験例６において、はと麦茶のウイルス増殖阻害段階を示す図である。□はコントロール群を表し、■ははと麦茶添加群を表す。
【図６】試験例８において、マウスインフルエンザによるマウスの体重減少に対する発酵豆乳の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．抗ＲＮＡウイルス剤の成分
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤には、ダイゼイン、ダイゼイン配糖体、グリシテイン、グリシテイン配糖体、大豆加工品、裸麦加工品、及びはと麦加工品から選ばれる少なくとも一種が含まれる。ダイゼイン、ダイゼイン配糖体、グリシテイン及びグリシテイン配糖体は市販されているものを用いることができる。ダイゼイン配糖体としては、ダイゼインの配糖体が挙げられ、例えばダイジン等が挙げられる。グリシテイン配糖体としては、グリシテインの配糖体が挙げられ、例えばグリシチン等が挙げられる。ダイゼイン配糖体及びグリシテイン配糖体は、体内で加水分解されて、それぞれダイゼイン及びグリシテインが容易に生成される。
大豆加工品、裸麦加工品及びはと麦加工品としては、大豆、裸麦もしくははと麦の熱水抽出物、発酵物又は酵素処理物等が挙げられる。
【００１２】
大豆、裸麦又ははと麦の熱水抽出物は、例えば大豆、裸麦又ははと麦を粉砕したものを５０〜１００℃で１０分間〜２日間、熱水もしくは熱した水性有機溶媒で抽出して得たものが挙げられる。抽出条件は好ましくは、６０〜１００℃で２０分間〜１日間が挙げられ、より好ましくは７０〜９０℃で３０分間〜６時間が挙げられ、さらに好ましくは７５〜８５℃で４０分間〜２時間が挙げられる。水性有機溶媒としては、例えば親水性溶媒と水との約１：９９〜約７０：３０の体積比の混合物が挙げられ、好ましくは親水性溶媒と水との約５：９５〜約５０：５０の体積比の混合物が挙げられ、より好ましくは親水性溶媒と水との約１０：９０〜約４０：６０の体積比の混合物が挙げられる。ここで、親水性溶媒としては、例えばメタノール、エタノール等のアルコール、アセトン等のケトン、アセトニトリル等のニトリル等が挙げられ、好ましくはメタノール、エタノール等が挙げられる。好ましい抽出溶媒としては、熱水が挙げられる。
【００１３】
熱水抽出する前に、大豆、裸麦又ははと麦の種子を一旦発芽させてもよく、発芽させることで抗ウイルス作用を増強させることができる。
また、熱水抽出する前に焙煎を行ってもよい。焙煎条件としては、例えば１００〜２５０℃で３０分間〜１日間が挙げられ、好ましくは１４０〜２２０℃で１〜１２時間が挙げられ、より好ましくは１６０〜２００℃で２〜６時間が挙げられる。
以上のようにして得た熱水抽出物は、そのまま水溶液として用いることができるが、溶媒を留去してエキス又は粉末としてもよい。大豆、裸麦又ははと麦の熱水抽出物として、例えばはと麦茶が挙げられる。
【００１４】
大豆、裸麦又ははと麦の発酵物としては、例えば、発酵豆乳、乳酸発酵飲料、味噌、酢、醤油、納豆、諸味、麹等が挙げられる。発酵に用いる菌としては、（１）アスペルギルス・オリザ等のアスペルギルス属に属する麹菌、（２）ラクトバチルス・デルブリッキー、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・デルブルエキイ、ラクトバチルス・ロンガム、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・カゼイ等のラクトバチルス族、ラクトコッカス・ラクティス等のラクトコッカス属、ストレプトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィラス等のストレプトコッカス属に属する乳酸菌、（３）サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルーベリ、サッカロミセス・パラドキサス、サッカロミセス・パストリアヌス等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属、クルーベルミセス・ラクティス、クルーベルミセス・マルキシアヌス等のクルーベルミセス族、ピキア・パストリスピキア族に属する酵母等が挙げられる。
発酵物は、常法に従って調製することができるが、例えば、大豆、裸麦又ははと麦を水に加えて、一定時間浸した後、一定時間煮沸して、水分を留去する。前記の発酵に用いる菌を、水分を留去した組成物に添加し、発酵させて、その後、滅菌処理を施すことで、発酵物を調製することができる。
【００１５】
大豆、裸麦又ははと麦の酵素処理物としては、例えば、ジアスターゼ、タカジアスターゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、β−ダルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等の各種の酵素で処理した物が挙げられる。
酵素処理物は、常法に従って調製することができるが、例えば、大豆、裸麦又ははと麦を粉砕し、水に加えて、前記の酵素を添加し、処理して、その後、遠心分離を施すことで、酵素処理物を調製することができる。
【００１６】
２．抗ＲＮＡウイルス剤の用途
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤は、ＲＮＡウイルスを原因とする症状を緩和するために用いることができる。ＲＮＡウイルスとしては、例えば、オルトミクソウイルス科ＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルス等）、レオウイルス科（ロタウイルス等）、カリシウイルス科ＲＮＡウイルス（ノロウイルス、サポウイルス等）、アレナウイルス科ＲＮＡウイルス（ラッサウイルス等）、コロナウイルス科ＲＮＡウイルス（ＳＡＲＳウイルス等）、トガウイルス科ＲＮＡウイルス（風疹ウイルス等）、ノダウイルス科ＲＮＡウイルス（ウイルス性神経壊死症ウイルス等）、パラミクソウイルス科ＲＮＡウイルス（ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス等）、ピコルナウイルス科ＲＮＡウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス等）、フィロウイルス科ＲＮＡウイルス（マールブルグウイルス、エボラウイルス等）、ブニヤウイルス科ＲＮＡウイルス（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、重症熱性血小板減少症候群ウイルス等）、フラビウイルス科ＲＮＡウイルス（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等）、ラブドウイルス科ＲＮＡウイルス（狂犬病ウイルス等）等が挙げられる。好ましいＲＮＡウイルスとしては、オルトミクソウイルス科ＲＮＡウイルス、レオウイルス科、カリシウイルス科ＲＮＡウイルス等が挙げられ、より好ましくは、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス等が挙げられる。
【００１７】
３．抗ＲＮＡウイルス組成物
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤は、組成物として、例えば、経口的、全身的（例えば、経皮的、鼻腔内、坐剤等）、又は非経口的（例えば、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、点眼等）で投与することができる。組成物の剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、ドライシロップ剤、トローチ剤、ドロップ剤、チュアブル剤、口腔内崩壊剤、発泡剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアゾール剤、液剤、軟膏、クリーム、点眼剤等が挙げられる。
【００１８】
上記の組成物は、本発明の抗ＲＮＡウイルス剤に薬学上許容される担体を添加して調製することができる。薬学上許容される担体としては、組成物の剤型、投与方法等に応じて選択することができ、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、安定剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、風味剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。
賦形剤としては、例えば、結晶セルロース、粉末セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、トレハロース、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール、コムギデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、二酸化ケイ素、硫酸カルシウム等が挙げられる。結合剤としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、カルメロースナトリウム、デキストリン、部分アルファー化デンプン、プルラン、アラビアゴム、グアーゴム、カンテン、ゼラチン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、ポリビニルアルコール、ペクチン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルメロース、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルエチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプピルセルロース、クロスポビドン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、パルミチン酸、タルク、フマル酸ステアリルナトリウム、カルナウバろう、水素化植物油、鉱油等が挙げられる。流動化剤としては、例えば、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤の投与量は、その投与方法、剤型、投与対象の年齢、体重、健康状態によって異なるが、例えば、成人に対して約１ｍｇ〜２ｇ／日が挙げられ、好ましくは約５ｍｇ〜１ｇ／日が挙げられ、さらに好ましくは約１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日が挙げられる。その投与量に従って、例えば１日に１回〜数回、又は数日に１回、上記の組成物をヒト又は動物に投与することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２１】
（１）実験に使用した原料及び材料
はと麦茶は、はと麦茶顆粒（三養）、市販されている３種類のはと麦茶（ゼンヤクノー、お茶の丸幸、伊藤園）を用いた。はと麦茶顆粒（三養）は規定量の蒸留水に溶解させ、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン）で滅菌ろ過を行うことではと麦茶を調製した。３種類のはと麦茶（ゼンヤクノー、お茶の丸幸、伊藤園）は表記されている抽出方法に従って、熱水抽出をし、不要物をろ別し、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン）で滅菌ろ過を行うことで３種類のはと麦茶を調製した。
【００２２】
大豆、裸麦、及びはと麦は、以下のものを用いた。
＜大豆＞  黒千石（兵庫県産：こやま園）、丹波黒（兵庫県産：こやま園）、さやひかり（兵庫県産：こやま園）、とよまさり（北海道産：マルサンアイ）、きぬさやか（宮城県産：マルサンアイ）、ふくゆたか（九州産：マルサンアイ）、みやぎしろめ（宮城県産：マルサンアイ）、えんれい（北陸産：マルサンアイ）。
＜裸麦＞  品種不明（裸麦：滋賀県産：マルサンアイ）、みのりむぎ（六条大麦：岐阜県産：マルサンアイ）、みのりむぎ（六条大麦：滋賀県産：マルサンアイ）、ファイバースノウ（六条大麦：カナダ産：マルサンアイ）、品種不明（六条大麦：福井県産：マルサンアイ）。
＜はと麦＞  あきしずく（島根県産：三養）、はとひかり（島根県産：三養）、品種不明（山形県産：三養）、はとじろう（宮城県産）、ハトユタカ（岩手県産）。
【００２３】
大豆、裸麦及びはと麦の熱水抽出物は、以下のようにして調製した。
大豆、裸麦又ははと麦を粉砕し、１８０℃で４時間、焙煎した。得られたもの２ｇに５０ｍｌの蒸留水を加えて、８０℃で５０分間、熱水抽出した。不溶物をろ別して、０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン）で滅菌ろ過を行うことで、熱水抽出物を得た。なお、実験に使用するまで−２０℃の冷凍庫で保管した。
また、はと麦については、発芽させずに焙煎して熱水抽出したもの、発芽させずにそのまま生で熱水抽出したもの、発芽させて焙煎して熱水抽出したもの、発芽させてそのまま生で熱水抽出したものの４種類の熱水抽出物も、調製した。
発酵豆乳は、以下のようにして調製した。無調整豆乳に植物性乳酸菌（ラクトバチルス・デルブリッキー TUA4408L）を添加し、４３℃で１６時間発酵後、凍結乾燥し、２００ｍｇ／ｍｌの量で蒸留水に溶解した。
ダイゼイン及びグリシテインは、和光純薬工業より購入した。
【００２４】
（２）インフルエンザウイルスの調製
インフルエンザウイルスは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型であるＰＲ／８／３４株、Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５株、Ｓｕｉｔａ／６／２００７株、Ｓｕｉｔａ／１／２００９株、Ｓｕｉｔａ／１１４／２０１１株、Ｏｓａｋａ／２０２４／２００９株、Ｏｓａｋａ／７１／２０１１株、及びＡ（Ｈ３Ｎ２）型であるＳｕｉｔａ／１２０／２０１１株、Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７株、及びＢ型であるＮａｇａｓａｋｉ／１／８７株、Ｓｈａｎｇｈａｉ／２６１／２００２株を用いた。このうち、Ｏｓａｋａ／２０２４／２００９及びＯｓａｋａ／７１／２０１１はオセタミビル耐性株である。
また、マウスインフルエンザとして、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／２９株を用いた。
【００２５】
（３）インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用の試験方法
２４ｗｅｌｌ平底プレート（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）にＭＤＣＫ（Madin-Darby Canine Kidney）細胞を単層培養し、無血清の最小必須培地（ＭＥＭ：シグマ・アルドリッチ）で２回洗浄した。０．０４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：和光純薬工業）含有ＭＥＭ培地を用いて希釈したインフルエンザウイルス溶液０．００１ＭＯＩを３７℃で１時間吸着させた。無血清ＭＥＭ培地で２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌのアセチルトリプシン及び０．４％ＢＳＡを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：シグマ・アルドリッチ）に試験サンプルを５００μｌ／ｗｅｌｌの量で添加した。その後、ＣＯ２インキュベーター内でＨ１Ｎ１株では２４時間、Ｈ３Ｎ２株及びＢ株では４８時間、培養し、上清のみを回収して、インフルエンザウイルスを評価するサンプルとした。
【００２６】
ウイルス力価はフォーカス法で測定した。９６ｗｅｌｌ平底プレート（コーニング・ジャパン）にＭＤＣＫ細胞を単層培養し、無血清ＭＥＭ培地で２回洗浄した。活性試験にて回収した上清を３０μｌ／ｗｅｌｌの量で添加し、３７℃で１時間吸着させ、０．０４％ＢＳＡ含有ＭＥＭ培地を１００μｌ／ｗｅｌｌの量で加えてＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養した。培養後はエタノールで固定し、ＰＡＰ染色法で染色を行い、インフルエンザウイルス量のカウントを行った。
ＰＡＰ染色法は以下のようにして行った。乾燥させたエタノール固定済みのプレートにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１０００倍希釈した１次抗体（マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体のＨ１Ｎ１：Ｃ１７９，Ｈ３Ｎ２：Ｆ４９，Ｂ：７Ｂ１１（阪大微生物研究所））を５０μｌ／ｗｅｌｌの量で添加し、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを用いて１０００倍希釈した２次抗体（ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社））を５０μｌ／ｗｅｌｌの量で添加し、室温にて１０〜２０分間反応させた。水道水で洗浄し、十分乾燥させた上で鏡検にてウイルス量のカウントを行った。
【００２７】
（４）ロタウイルスに対する抗ウイルス作用の試験方法
ロタウイルスは、Ｗａ株（Ｇ１Ｐ［８］）を用いた。試験サンプルを１５ｍｌ遠心チューブ（Violamo：アズワン社）で段階希釈した。１２穴プレートに単層培養したアカゲザル腎細胞（MA-104）に、２．０×１０４ＦＦＵ／ｍｌのロタウイルス（２００μｌ）を接種し、１時間、３７℃でインキュベートした。ウイルス溶液を除去し、１回洗浄し、試験サンプルと終濃度１μｇ／ｍｌのアセチルトリプシン含有無血清ＭＥＭ培地の混合液を添加した。３日間培養し、上清を回収して、ロタウイルスを評価するサンプルとした。
【００２８】
ウイルス力価を奥野らの方法（J Clin. Microbiol. 28: 1308-1313 (1990)；J. Vet. Med. Sci. 75(9): 1209-1212 (2013)）を改変したフォーカス法で測定した。
ウイルスの希釈には、０．２％アルブミン（fraction V：シグマ・アルドリッチ）を含むＭＥＭを用いた。MA-104細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌ（約１０４個／ｗｅｌｌ）を９６穴平底プレート（Iwaki 3860-096：旭硝子）に撒き、単層を形成するまで３７℃のＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度０．５％）でインキュベートした。数日後、MA-104細胞を単層培養した９６穴平底プレートに１０倍段階希釈したウイルス溶液を２０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、１０００×ｇで１時間、室温にて遠心し、吸着させた。ウイルス溶液を除去後、無血清ＭＥＭで１回洗浄した。細胞に終濃度１μｇ／ｍｌアセチルトリプシン含有アビセル（登録商標：FMC Biopolymer）溶液（１．２％アビセル:２×ＭＥＭ＝１：１）１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄後、無水エタノールで１０分間室温にて固定した。その後、細胞をヘアドライヤーで乾燥した。フォーカス染色はマウスモノクローナル抗ロタウイルスＡ VP6抗体（１：５０００）（YO-156）を３７℃で３０分間反応後、PBSで２回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ血清（１：５００）（Millipore）を室温で４０分間反応後、PBSで２回洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は、０．０２％Ｈ２Ｏ２と０．０３ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（和光純薬工業）を添加したPBSで１０分間反応させた。細胞は水道水で洗浄後、乾燥させた。フォーカスは顕微鏡を用いてカウントし、ウイルス力価を算出した。
【００２９】
試験例１
はと麦茶の抗インフルエンザウイルス作用
Ａ（Ｈ１Ｎ１）型ＰＲ／８／３４株を用いて、調製した４種類のはと麦茶をそれぞれ５％、２．５％、１．２５％、０．６２５％、０．３１２５％に希釈して、無添加のコントロールと共に、抗インフルエンザウイルス作用を試験した。
はと麦茶顆粒（三養）から調製したはと麦茶についての試験結果を、図１に示す。また、４種類のはと麦茶のＩＣ５０を以下に示す。
はと麦茶（三養）        ：０．６７％
はと麦茶（ゼンヤクノー）：０．２２％
はと麦茶（お茶の丸幸）  ：０．３０％
はと麦茶（伊藤園）      ：０．９４％
以上の試験結果から、はと麦茶には、抗インフルエンザウイルス作用があることが分かる。
【００３０】
試験例２
はと麦茶の抗ロタウイルス作用
Ｗａ株を用いて、調製した４種類のはと麦茶をそれぞれ２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１２５％に希釈して、無添加のコントロールと共に、抗ロタウイルス作用を試験した。
はと麦茶顆粒（三養）から調製したはと麦茶についての試験結果を、図２に示す。また、４種類のはと麦茶のＩＣ５０を以下に示す。
はと麦茶（三養）        ：０．３８％
はと麦茶（ゼンヤクノー）：０．０９％
はと麦茶（お茶の丸幸）  ：０．０７％
はと麦茶（伊藤園）      ：０．２１％
以上の試験結果から、はと麦茶には、抗ロタウイルス作用があることが分かる。
【００３１】
試験例３
複数のインフルエンザウイルス株に対する抗ウイルス作用
表１に示す複数のインフルエンザウイルス株に対する、はと麦茶顆粒（三養）から調製したはと麦茶の抗ウイルス作用を試験例１と同様に試験した。その結果を表１に記す。
【表１】
2017088567.tif 000003
表１の試験結果から、はと麦茶には、多少の強弱はあるものの、インフルエンザウイルスに対して広く抗ウイルス作用を示すことが分かる。
Ａ型のオセタミビル耐性株である、Ｏｓａｋａ／２０２４／２００９及びＯｓａｋａ／７１／２０１１に対する抗ウイルス作用の試験結果を、図３及び図４に示す。図３及び図４の試験結果から、またオセンタミビル耐性株にも有効であることが分かる。従って、はと麦茶はオセルタミビルとは異なる作用機序で抗ウイルス作用を発揮していると思われる。
【００３２】
試験例４
大豆、裸麦及びはと麦の熱水抽出物の抗インフルエンザウイルス作用
はと麦茶には、通常、はと麦に加えて、大豆、裸麦等も原料に含まれている。そこで、表２に示す大豆、裸麦及びはと麦の熱水抽出物の抗ウイルス作用を試験例１と同様に試験した。その結果を表２に記す。
【表２】
2017088567.tif 000004
以上の試験結果から、大豆、裸麦及びはと麦の熱水抽出物には、インフルエンザウイルスに広く抗ウイルス作用を示すことが分かる。
【００３３】
試験例５
はと麦の熱水抽出物の抗ロタウイルス作用
４種類のはと麦の品種である、はとじろう（宮城県産）、ハトユタカ（岩手県産）、はとひかり（島根県産）及びあきしずく（島根県産）を、焙煎せずに熱水抽出した。得られた熱水抽出物を、試験例２と同様にして抗ロタウイルス作用を試験した。４品種のＩＣ５０を以下に示す。
はとじろう（宮城県産）：０．３６％
ハトユタカ（岩手県産）：０．５５％
はとひかり（島根県産）：０．４７％
あきしずく（島根県産）：０．２９％
以上の試験結果から、はと麦の熱水抽出物には、抗ロタウイルス作用があることが分かる。
また、あきしずく（島根県産）について、発芽させずに焙煎して熱水抽出したもの、発芽させずにそのまま生で熱水抽出したもの、発芽させて焙煎して熱水抽出したもの、発芽させてそのまま生で熱水抽出したものの４種類の熱水抽出物を調製して、抗ロタウイルス作用を試験した。これらの熱水抽出物のＩＣ５０を以下に示す。
発芽させずに焙煎した熱水抽出物  ：０．４１％
発芽させずに焙煎しない熱水抽出物：０．２９％
発芽させて焙煎した熱水抽出物    ：０．１７％
発芽させて焙煎しない熱水抽出物  ：０．１７％
以上の試験結果から、発芽させたほうが、抗ロタウイルス作用が増強されることが分かる。
【００３４】
試験例６
ウイルス増殖阻害段階の検討
ウイルスの感染を阻害するためには、ウイルスの細胞への吸着・侵入、細胞内での複製、細胞外への放出のいずれかを阻害することが有効である。はと麦茶がウイルス増殖のどの段階を阻害しているかについて検討した。試験例１において、ウイルスの接触の１２時間前に、１時間前〜接触まで、接触〜４時間後まで、接触の４時間後〜８時間後まで、接触〜８時間後まで、接触の１時間前〜８時間後まで、はと麦茶（三養）から調製したはと麦茶を５％濃度で培地に添加して、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）型ＰＲ／８／３４に対する抗インフルエンザウイルス作用を試験した。その結果を図５に示す。図５において、□はコントロール群を表し、■ははと麦茶添加群を表す。
この試験結果から、はと麦茶はウイルスの吸着時及び培養時の双方を阻害していることが判明した。特に、吸着時に高い阻害作用を示し、暴露時間を延長したほうが、より高い阻害作用を示すことが確認された。はと麦茶は、ウイルス自体に作用しているのではなく、細胞側に何らかの作用をして抗ウイルス作用を発揮していると思われる。このことから、従来の抗ウイルス剤と異なる作用機序で抗ウイルス作用を発揮していると思われる。
ダイゼインを用いてこの試験を行ったところ、同様の結果が得られた。さらに、はと麦（あきしずく）の熱水抽出物を用いてロタウイルスに対して、この試験を行ったところ、同様の結果が得られた。
【００３５】
試験例７
ダイゼイン及びグリシテインの抗インフルエンザウイルス作用
大豆熱抽出物に含まれる抗インフルエンザウイルス作用を示す成分を調べたところ、ダイゼイン及びグリシテインが見出された。そこで、ダイゼイン及びグリシテインについて、試験例１と同様にして、抗インフルエンザウイルス作用を試験した。ＩＣ５０を以下に示す。
ダイゼイン      ：３０μｇ／ｍｌ
グリシテイン    ：０．５４ｎｇ／ｍｌ
ダイゼイン及びグリシテインは、強い抗インフルエンザウイルス作用を有しており、特にグリシテインの作用は極めて高い。
【００３６】
試験例８
発酵豆乳のマウスインフルエンザに対する抗ウイルス作用
豆乳には、ダイゼインが１．４ｍｇ／１００ｇ含まれ、グリシテインは検出されていないが、発酵豆乳には、ダイゼインおよびグリシテインがそれぞれ４８．４５ｍｇ／１００ｇと１．３ｍｇ／１００ｇと大量に含まれている。
そこで、７週齢の雌マウス（日本エスエルシー）２０匹を２群に分けて、一方はコントロールとして発酵豆乳を与えず、他方の群には、感染前５日間、発酵豆乳１００μｌ／マウス／日を経口投与した。全身麻酔下、マウスインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）型ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／２９株を２５μｌ／マウス（１００ＦＦＵ）を経鼻投与して感染させた。感染後、１４日間、生存率と体重減少率を観察した。
生存率については、コントロール群では、１０日目に２匹が死亡したが、発酵豆乳投与群は生存率が１００％であった。体重減少率の結果を図６に示す。コントロール群は体重の回復が遅れたのに対して、発酵豆乳投与群は１４日後には体重がほぼ初期値まで戻った。この結果から、発酵豆乳はインフルエンザウイルスの増殖を阻害したと思われる。
【００３７】
今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の抗ＲＮＡウイルス剤は、ＲＮＡウイルスに広く有効であり、既存の抗ＲＮＡウイルス剤とは異なる作用機序による新たな抗ＲＮＡウイルス剤であり、新たな治療方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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