(57)【要約】【課題】水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する新規な方法であって、偽陽性の結果をもたらさない方法を提供すること。【課題を解決するための手段】本発明は、水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：（ａ）  グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、水溶性バリウム化合物およびバリウムイオンを含有する液体からなる群から選択される少なくともいずれか１つ、ヘミン、ペルオキシダーゼ発色基質、および過酸化水素水を前記水溶液に添加する工程、および（ｂ）  前記工程（ａ）の後、前記水溶液が青色を呈した場合には、水溶液がカリウムイオンを含有していると判定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、水溶性バリウム化合物およびバリウムイオンを含有する液体からなる群から選択される少なくともいずれか１つ、ヘミン、ペルオキシダーゼ発色基質、および過酸化水素水を前記水溶液に添加する工程、および
（ｂ）  前記工程（ａ）の後、前記水溶液が青色を呈した場合には、水溶液がカリウムイオンを含有していると判定する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記水溶性バリウム化合物が、塩化バリウムおよび硝酸バリウムからなる群から選択される少なくとも１つの化合物である。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
ペルオキシダーゼ発色基質が、3,3’,5,5’-tetramethylbenzidineおよび2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)からなる群から選択される少なくとも１つの基質である。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡが配列番号：０１によって表される。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
請求項１に記載の方法であって、
ペルオキシダーゼ発色基質が、2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１は、水溶液に含有されるカリウムイオンをグアニン四重鎖を用いて検出する方法を開示している。非特許文献１に開示された方法では、カリウムイオンを含有すると思われる水溶液に、グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、ヘミン、3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine、および過酸化水素水が添加される。水溶液がカリウムイオンを含有する場合、水溶液は、青色を呈する。
【０００３】
非特許文献２もまた、水溶液に含有されるカリウムイオンをグアニン四重鎖を用いて検出する方法を開示している。非特許文献２に開示された方法では、水溶液に、グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、ヘミン、2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)、および過酸化水素水が添加される。水溶液がカリウムイオンを含有する場合、水溶液の吸光度は、およそ４２０ナノメートルの波長でピークを有する。3,3’,5,5’-tetramethylbenzidineおよび2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)は、いずれもペルオキシダーゼ発色基質である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Xuan Yang et. al., "Potassium-sensitive G-quadruplex DNA for sensitive visible potassium detection", Analyst, 2010, Vol. 135, pp. 71-75
【非特許文献２】Tao Li et. al., "G-Quadruplex-based DNAzyme as a sensing platform for ultrasensitive colorimetric potassium detection", Chemical Communications, 2009, pp. 580-582
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
後の実験例において実証されるように、非特許文献１または非特許文献２に開示されている従来の方法では、偽陽性の結果がもたらされる。言い換えれば、これらの従来の方法では、カリウムイオンが含まれる水溶液だけでなく、カリウムイオンが含まれない水溶液もまた、青色を呈する。
【０００６】
本発明の目的は、水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する新規な方法であって、偽陽性の結果をもたらさない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、水溶性バリウム化合物およびバリウムイオンを含有する液体からなる群から選択される少なくともいずれか１つ、ヘミン、ペルオキシダーゼ発色基質、および過酸化水素水を前記水溶液に添加する工程、および
（ｂ）  前記工程（ａ）の後、前記水溶液が青色を呈した場合には、水溶液がカリウムイオンを含有していると判定する工程。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、偽陽性の結果をもたらさない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実験例１の結果を示す写真である。
【図２】図２は、対照実験例１の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明が詳細に説明される。
【００１１】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、水溶液がカリウムイオンを含有しているかどうかを判定するために、グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡ、水溶性バリウム化合物またはバリウムイオンを含有する溶液の少なくともいずれか一方、ヘミン、ペルオキシダーゼ発色基質、および過酸化水素水が水溶液に添加される。
【００１２】
（グアニン四重鎖）
グアニン四重鎖は、グアニンに富む核酸配列により形成される。グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡの例が、以下、列挙される。いうまでもないが、ＤＮＡに含まれる全ての塩基はＤ体である。
５’―ＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧ―３’（配列番号：０１）
【００１３】
（バリウムイオン）
本発明は、水溶液がバリウムイオンを含有することによって特徴づけられる。水溶液に水溶性バリウム化合物が添加される。または、バリウムイオンを含有する液体が水溶液に添加される。このようにして、水溶液にバリウムイオンが供給される。水溶性バリウム化合物およびバリウムイオンを含有する溶液の両者が水溶液に添加されても良い。
【００１４】
水溶性バリウム化合物の例は、塩化バリウムまたは硝酸バリウムである。水溶性バリウム化合物が水に溶解されると、水溶性バリウム化合物はバリウムイオンおよびカウンターアニオンに分解する。硫酸バリウムのような難溶性バリウム化合物は本発明では用いられない。
【００１５】
バリウムイオンを含有する水溶液は、例えば、塩化バリウムを純水に溶解することにより調製され得る。
【００１６】
（ヘミン）
ヘミンは、以下の化学構造を有するポルフィリンの一種である。
【００１７】
【化１】
2017101928.tif 000002
【００１８】
（ペルオキシダーゼ発色基質）
ペルオキシダーゼ発色基質の例が、以下、列挙される。
4-Aminoantipyrine Hydrochloride（CAS番号：22198-72-7）
2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)（以下、「ＡＢＴＳ」という、CAS番号：30931-67-0）
4-Aminoantipyrine (CAS番号：83-07-8）
5-Aminosalicylic Acid （CAS番号：89-57-6）
Sodium 3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonate （CAS番号：54970-72-8）
2,4-Dichlorophenol  （CAS番号：120-83-2）
N,N-Dimethylaniline（CAS番号：121-69-7）
N,N-Diethyl-m-toluidine （CAS番号：91-67-8）
3-Methyl-2-benzothiazolinonehydrazone Hydrochloride Hydrate（CAS番号：149022-15-1）
1,2-Phenylenediamine Dihydrochloride （CAS番号：615-28-1）
1,2-Phenylenediamine （CAS番号：95-54-5）
Sodium 3-[Ethyl(m-tolyl)amino]-2-hydroxy-1-propanesulfonate Hydrate（CAS番号：82692-93-1）
Sodium 3-(N-Ethylanilino)propanesulfonate（CAS番号：82611-85-6）
Sodium 3-(N-Ethyl-3-methoxyanilino)-2-hydroxy-1-propanesulfonate （CAS番号：82692-96-4）
N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline Sodium Salt（CAS番号：82692-88-4）
2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid（CAS番号：14348-40-4）、および
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine（以下、「ＴＭＢ」という、CAS番号：54827-17-7）
【００１９】
（過酸化水素水）
ペルオキシダーゼ発色基質を酸化させるために、過酸化水素水が水溶液に添加される。
【００２０】
（工程（ｂ））
工程（ａ）において調製された水溶液は、およそ５分間、静置される。水溶液が青色を呈した場合には、水溶液はカリウムイオンを含有すると判定される。言うまでもないが、水溶液が青色を呈していない場合には、水溶液はカリウムイオンを含有していないと判定される。
【００２１】
非特許文献１および非特許文献２は、水溶液がカリウムイオンを含有している場合には水溶液は青色を呈することを開示している。しかし、水溶液がカリウムイオンを含有していない場合においても、水溶液は薄い青色を呈する。
【００２２】
後述される対照実験例からも明らかなように、非特許文献１または非特許文献２に開示された方法では、水溶液がカリウムイオンを含有していない場合においても、水溶液は青色を呈する。特に、水溶液がナトリウムイオンを含有するがカリウムイオンを含有しない場合においても、水溶液がカリウムイオンを含有する場合と同じように、水溶液は青色を呈する。同様に、水溶液がナトリウムイオンもカリウムイオンも含有しない場合においても、水溶液は薄い青色を呈する。同様に、水溶液がリチウムイオンまたはセシウムイオンを含有する場合においても、水溶液は薄い青色を呈する。
【００２３】
一方、本発明による方法では、水溶液がカリウムイオンを含有していない場合には、水溶液は透明である。水溶液がカリウムイオンを含有している場合だけ、水溶液は青色を呈する。特に、水溶液がナトリウムイオンを含有するがカリウムイオンを含有しない場合においても、水溶液は透明である。同様に、水溶液がナトリウムイオンもカリウムイオンも含有しない場合においても、水溶液は透明である。水溶液がリチウムイオンまたはセシウムイオンを含有する場合においても、水溶液は透明である。
【００２４】
このように、バリウムイオンを用いる本発明においては、水溶液がカリウムイオンを含有する場合のみ、水溶液が青色を呈する。水溶液がカリウムイオンを含有しない場合には、水溶液は透明である。本発明では、偽陽性の結果がもたらされない。言い換えれば、本発明では、カリウムイオンに対する選択性が示される。
【００２５】
（実施例）
以下、実験例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。
【００２６】
（実験例１）
実験例１では、５’―ＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧ―３’（つくばオリゴサービス株式会社より入手、配列番号：０１）により表されるＤＮＡ配列からなる遺伝子が、グアニン四重鎖を形成可能なＤＮＡとして用いられた。
【００２７】
始めに、表１に示される溶液Ａ〜溶液Ｆが調製された。溶液Ａは、Ｂａイオンを含有していた。溶液Ｂは、ＢａイオンおよびＫイオンを含有していた。溶液Ｃは、ＢａイオンおよびＮａイオンを含有していた。溶液Ｄは、ＢａイオンおよびＬｉイオンを含有していた。溶液Ｅは、ＢａイオンおよびＭｇイオンを含有していた。溶液Ｆは、ＢａイオンおよびＣｓイオンを含有していた。ヘミンは東京化成工業株式会社より入手した。
【００２８】
【表１】
2017101928.tif 000003
溶液Ａ〜溶液Ｆの組成（単位：マイクロリットル）
溶液Ａ
溶液Ｂ
溶液Ｃ
溶液Ｄ
溶液Ｅ
溶液Ｆ
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）
１
１００ｍＭ  ＢａＣｌ２
１
１Ｍ  ＫＣｌ
０
１
０
０
０
０
１Ｍ  ＮａＣｌ
０
０
１
０
０
０
１Ｍ  ＬｉＣｌ
０
０
０
１
０
０
１Ｍ  ＭｇＣｌ２
０
０
０
０
１
０
１Ｍ  ＣｓＣｌ２
０
０
０
０
０
１
１００μＭ  ＤＮＡ
１
２００μＭ  ヘミン
０．５
純水
４．５
３．５
全容量
８
【００２９】
次に、溶液Ａ〜溶液Ｆが摂氏８０度で２分間静置された。次いで、溶液Ａ〜Ｆは、摂氏２０度に冷やされた。
【００３０】
摂氏２０度に冷やされた溶液Ａ〜溶液Ｆに、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）の２つの溶液が添加された。
（Ｉ）  Ｈ２Ｏ２（和光純薬工業株式会社より入手、濃度：１０ｍＭ、容量：１マイクロリットル）、および
（ＩＩ）  ＡＢＴＳ（和光純薬工業株式会社より入手、濃度：１０ｍＭ、容量：１マイクロリットル）
【００３１】
溶液Ａ〜溶液Ｆは５分間、静置された。その後、溶液Ａ〜溶液Ｆの写真が撮影された。
【００３２】
図１は、溶液Ａ〜溶液Ｆの写真を示す。
【００３３】
溶液Ａ、溶液Ｃ、溶液Ｄ、溶液Ｅ、および溶液Ｆは、無色であった。一方、溶液Ｂは濃い青色であった。
【００３４】
図１から明らかなように、Ｋイオンのみが特異的に検出された。
【００３５】
（対照実験例１）
対照実験例１では、ＢａＣｌ２が用いられないこと以外は、実験例１と同様の実験が行われた。溶液Ｇ〜溶液Ｌは、それぞれ、溶液Ａ〜溶液Ｆに対応する。溶液Ｇ〜溶液Ｌは、いずれも、バリウムイオンを含有していなかった。
【００３６】
溶液Ｇ〜溶液Ｌの詳細な組成が以下の表２に示される。塩化バリウムが溶液Ｇ〜溶液Ｌには全く含まれていないことに留意せよ。
【００３７】
【表２】
2017101928.tif 000004
溶液Ｇ〜溶液Ｌの組成（単位：マイクロリットル）
溶液Ｇ
溶液Ｈ
溶液Ｉ
溶液Ｊ
溶液Ｋ
溶液Ｌ
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）
１
１００ｍＭ  ＢａＣｌ２
０
１Ｍ  ＫＣｌ
０
１
０
０
０
０
１Ｍ  ＮａＣｌ
０
０
１
０
０
０
１Ｍ  ＬｉＣｌ
０
０
０
１
０
０
１Ｍ  ＭｇＣｌ２
０
０
０
０
１
０
１Ｍ  ＣｓＣｌ２
０
０
０
０
０
１
１００μＭ  ＤＮＡ
１
２００μＭ  ヘミン
０．５
純水
５．５
４．５
全容量
８
【００３８】
図２は、溶液Ｇ〜溶液Ｌの写真を示す。
【００３９】
図２から明らかなように、溶液Ｇ〜溶液Ｌは、いずれも青色であった。この中でも、溶液Ｈおよび溶液Ｉは、濃い青色であった。溶液Ｉは、カリウムイオンではなく、ナトリウムイオンを含有していた。しかし、溶液Ｉの色は、肉眼ではカリウムイオンを含有する溶液Ｂおよび溶液Ｈと区別可能ではなかった。
【００４０】
実験例１および対照実験例１（特に溶液Ｂ、溶液Ｈ、および溶液Ｉ）の結果から明らかなように、水溶液がバリウムイオンを含有しない場合、偽陽性の結果がもたらされる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、水道水などの水に含有されるカリウムイオンを簡易に検出したり、野菜に含有されるカリウムイオンを簡易に検出するために用いられ得る。
【図１】
2017101928.tif 000005
【図２】
2017101928.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月10日(2017.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017101928000001.app
【外国語明細書】
2017101928000001.pdf