(57)【要約】【課題】ＬＣ−ＭＳ法によるＲＮＡの検出方法において、新しい高感度な検出方法を提供すること。【解決手段】ＲＮＡの検出方法は、ＲＮＡをアルカリ条件下でヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸に加水分解する工程と、加水分解により生じたヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析により検出する工程とを含み、塩基種が同一であるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を、液体クロマトグラフにおいて同一の保持時間で溶出して同時に検出することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるＲＮＡの検出方法であって、
ＲＮＡをアルカリ条件下でヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸に加水分解する工程と、
加水分解により生じたヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析により検出する工程とを含み、
塩基種が同一であるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を、液体クロマトグラフにおいて同一の保持時間で溶出して同時に検出することを含む、ＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
試料中のＲＮＡの含有量が、該ＲＮＡを加水分解して得られるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフにおいて異なる保持時間で溶出した場合に、液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析によってヌクレオシド２’−リン酸又はヌクレオシド３’−リン酸が検出限界以下となる量である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフに用いるカラムが、試料と接触する部分がメタルフリーであり、オクタデシルシリル基で修飾されたシリカゲルが固定相として充填されている、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
液体クロマトグラフに用いる移動相が、有機溶媒を含む水溶液である請求項１から３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記有機溶媒がアセトニトリル及びメタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
前記移動相が、前記有機溶媒を３〜１２容量％含むｐＨ７から９のアミン系水溶液である、請求項４又は５記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡチップ法（ＤＮＡマイククロアレイ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。ＤＮＡチップは、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定するための小型装置であり、ガラス、シリコンなどの基材の基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置したものである。ＤＮＡチップを使用することによって、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をＤＮＡチップによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になると思われる。
【０００３】
現在、ＤＮＡチップは、チップ上に数万から数千種類の多数の遺伝子を載せ、一度に大量の遺伝子の発現を調べる研究用として用いられていることが多い。また今後、診断用途でのＤＮＡチップが使用されることが期待されている。診断で使用する場合、検体由来の真のデータを正確に測定することが求められる。そのため、ＤＮＡチップの品質だけでなく、検体の前処理やハイブリダイゼーションに使用する試薬についても品質を保証することが必要である。これら各試薬の品質管理において、主成分の品質だけではなく、ＤＮＡチップとの反応成分であるＲＮＡの混入がないことが求められる。各試薬にＲＮＡの混入があると、得られたＤＮＡチップデータは、検体と混入していたＲＮＡの混合物由来のデータとなり、誤った結果となってしまう。ＲＮＡの混入がないことを証明するためには、直接ＲＮＡを分析し、混入が一定量以下であることを示す。ＲＮＡの分析手法としては、ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法、液体クロマトグラフ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ法）などが適宜用いられる。ＰＣＲ法は検出対象のＲＮＡを増幅するため、高感度であるがバラつきが大きく、信頼性に欠ける。ＥＬＩＳＡ法については、クロスハイブリをおこさない検出プローブの合成に多大な時間を必要とする点に加え、その検出原理より妨害物質の影響を受けやすい。さらに、手技が煩雑なため安定したデータを取得するためには熟練を要する。一方、ＬＣ−ＭＳ法は高選択性と高感度を備えた分析手法であり、核酸の分析にも用いられている。非特許文献１には、ＬＣ−ＭＳ法でＲＮＡが検出できること、また非特許文献２には微量のＤＮＡを検出できたことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Chromatography B, 883-84(2012)76-94
【非特許文献２】Journal of Chromatography A, 1406(2015)210-214
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＬＣ−ＭＳ法は、前述の特徴を有することから、様々な分野において核酸の分析にも適用されている。例えば、非特許文献１には、核酸を対象とする医薬品開発において、非臨床試験や臨床試験から得られる血漿や尿、組織等の生体試料中の核酸の濃度を測定し、核酸の体内動態を把握するための検出手法として開示されている。これら核酸の検出においては、より多くの正確な情報を得るために、より高感度に検出するという課題が常に存在し、種々の開発が行われている。例えば、非特許文献２には、金属フリーの分析カラムを用いたＬＣ−ＭＳ法が、高感度化の一つの手段として開示されている。
【０００６】
本発明も、ＬＣ−ＭＳ法によるＲＮＡの検出方法において、新しい高感度な検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、検出すべきＲＮＡをアルカリ条件下で加水分解を行うと、同一の分子量であるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を生成することに着目し、この２種類の分解産物を、三連四重極型のＬＣ−ＭＳ法（液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析、以降ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）で同一の保持時間で溶出して同時に検出することで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(6)を提供する。
(1)  試料中に含まれるＲＮＡの検出方法であって、
ＲＮＡをアルカリ条件下でヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸に加水分解する工程と、
加水分解により生じたヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析により検出する工程とを含み、
塩基種が同一であるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を、液体クロマトグラフにおいて同一の保持時間で溶出して同時に検出することを含む、ＲＮＡの検出方法。
(2)  試料中のＲＮＡの含有量が、該ＲＮＡを加水分解して得られるヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフにおいて異なる保持時間で溶出した場合に、液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析によってヌクレオシド２’−リン酸又はヌクレオシド３’−リン酸が検出限界以下となる量である、(1)に記載の検出方法。
(3)  液体クロマトグラフに用いるカラムが、試料と接触する部分がメタルフリーであり、オクタデシルシリル基で修飾されたシリカゲルが固定相として充填されている、(1)又は(2)に記載の検出方法。
(4)  液体クロマトグラフに用いる移動相が、有機溶媒を含む水溶液である(1)から(3)のいずれか１項に記載の検出方法。
(5)  前記有機溶媒がアセトニトリル及びメタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種である(4)記載の検出方法。
(6)  前記移動相が、前記有機溶媒を３〜１２容量％含むｐＨ７から９のアミン系水溶液である、(4)又は(5)記載の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法によれば、ＬＣ−ＭＳ法によるＲＮＡの検出方法について、標的ＲＮＡの２つの加水分解産物を、ＬＣ−ＭＳ法で同一の溶出時間で同時に検出することで、高感度な検出が可能となる。そのため、ＲＮＡの検出については、より多くの情報を正確に得ることが可能となる。さらに本発明は、従来技術とは異なる手法を用いた検出方法であり、従来技術と組み合わせて実施することが可能である。例えば、非特許文献２に記載の検出方法と、本発明とを組み合わせて実施可能であるので、金属フリーの分析カラムを用いた検出方法の更なる高感度化も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法を説明するための、本発明による検出結果の一例を模式的に示すである。
【図２】本発明の方法を説明するための、本発明による検出結果の一例を模式的に示すである。
【図３】本発明における「同一の保持時間」の意味を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、試料中に含まれるＲＮＡの検出方法であって、ＲＮＡをアルカリ条件下でヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸に加水分解する工程と、当該ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を液体クロマトグラフ−三連四重極型質量分析により検出する工程とを含み、当該ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を、液体クロマトグラフにおいて同一の保持時間で溶出して同時に検出することを特徴とする。
【００１２】
本発明の検出方法は、試料中に含まれるＲＮＡの検出法であり、複数の物質と混在している場合や、単独で存在しているＲＮＡを検出する方法である。なお、試料中のＲＮＡを定量する場合には、必然的に「検出」を伴うので、試料中のＲＮＡを定量する場合も本発明の「検出方法」に包含される。
【００１３】
本発明における試料は、検出することが望まれるＲＮＡを含んでいるかもしれない試料であれば、何ら限定されるものではなく、各種試薬類、各種生体由来の液、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、各種組織液等の体液、環境試料として土壌水や地下水、そして、飲料水、工業用水、農業用水や、各種機器分析等で使用する化学物質を含む水溶液を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】
ＲＮＡは、前述の試料中に含まれるものであり、ヌクレオチド同士がホスホジエステル結合し、糖とリン酸が繰り返し繋がったものである。その繰り返しの数や、塩基の種類は特に限定されなく、その末端等に蛍光色素や、官能基などが修飾されていてもよい。
【００１５】
本発明の検出方法は、ＲＮＡを加水分解する。加水分解によって、ＲＮＡは構成する塩基種毎にヌクレオチド単位に分解される。本発明では、アルカリ条件下で加水分解される。アルカリ条件下での加水分解によって、ＲＮＡはヌクレオシド２’，３’−環状リン酸を生成し、最終的にはヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸をほぼ等量生成する。つまり、ＲＮＡをヌクレオチド単位に加水分解し、このヌクレオチドを分析することにより、ＲＮＡを加水分解しないで検出する場合と比較して、検出対象のモル数を大幅に増大させることができ、高感度な検出が可能となる。特に、配列未知のＲＮＡの有無を検出する際に有効に用いることができる。酵素を用いた分解では、分析前に酵素を除去する必要があり、その際にヌクレオチドをロスする可能性があるのに対し、アルカリ条件下での加水分解では、そのような分析前の処理が不要であり、高感度検出に適している。
【００１６】
アルカリ条件は、ＲＮＡがヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸に加水分解される条件であれば特に限定されないが、水酸化ナトリウム水溶液やトリスヒドロキシメチルアミノメタンを成分に含む緩衝液等を用い、ｐＨ８以上、好ましくは、ｐＨ９以上、１２以下、かつ、１時間以上の条件が好ましく、１８時間以上がより好ましい。処理時間の上限は特にないが、通常、２４時間以下でよい。また、加水分解を促進するために、３７℃以上に加温してもよく、好ましくは、処理温度は、４５℃〜１００℃である。
【００１７】
本発明の検出方法は、加水分解で得られたヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸をＬＣ―ＭＳ法により検出する。ＬＣ−ＭＳ法は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）で分離できる化合物に適用することができ、一般的には有機化合物（不揮発性物質）、熱に不安定な物質、さらにはペプチドや高分子物質など幅広い物質に適用できる。ＬＣで分離された化合物は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及び大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）によってイオン化され、質量分離器により分離される。マススペクトル、プロダクトイオンスキャンスペクトルやプリカーサーイオンスキャンスペクトルなどを駆使して、未知化合物の構造推定や構造決定などの定性分析や、化合物に特徴的なモニターイオンを選択して、生体試料や環境試料中の化合物の定量分析ができる。質量分離器としては、四重極型、三連四重極型、イオントラップ、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などがある。本発明では、高感度定量測定に適した三連四重極型のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法が好ましく用いられる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、生体試料中の医薬品や代謝物の定量や環境試料中の農薬や環境ホルモンの定量などに汎用されている。ＬＣは、オートサンプラー、送液ポンプ、分析カラム、カラム恒温槽などから構成され、分析対象物質は分析カラムにより夾雑成分と分離され、質量分析計へ導入され、大気圧イオン化法でイオン化される。極性が高い化合物はエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、脂溶性が高い化合物では大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を選択する。１段目の四重極マスフィルターでは、化合物の分子量を反映したプレカーサーイオンだけが通過できるように質量数を選択する。１段目の四重極マスフィルターを通過したプレカーサーイオンは、コリジョンセル内のガス （アルゴンや窒素）との衝突により、プロダクトイオンを生成する。２段目の四重極マスフィルターでは、化合物の構造情報を反映したプロダクトイオンだけが通過できるように質量数を選択する。検出されたイオンは、化合物の構造や量を反映しており、目的の化合物のみを選択的に検出、定量することができる。なお、三連四重極型のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは市販されており、本発明の方法は市販品を用いて実施することができる。
【００１８】
本発明の検出方法は、ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を、液体クロマトグラフにおいて、同一の保持時間で溶出して同時に検出する。各塩基のヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸は、同一の分子量であることから、ＬＣで同一の保持時間で溶出し、ＭＳで同時に検出することができる。２種類の物質を同一の保持時間で溶出して、同時に検出することで、それぞれを異なる保持時間で個別に検出した場合と比較して、検出値を向上させることが可能となり、感度を上げることができる。
【００１９】
図１（Ａ）、（Ｂ）に検出結果の一例を模式的に示す。縦軸が検出値、横軸が保持時間である。（Ａ）は、ほぼ等量のヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を個別に検出した場合のそれぞれの検出ピーク（以降、個別ピーク１という）を示し、検出限界２を上回る２つの個別ピーク１が認められる。
【００２０】
本発明の方法における検出限界は、ベースラインにノイズの３倍を加えた値である。この値を超えた場合、ＲＮＡが検出できたと考える。ベースラインは、得られた検出結果の明らかに検出ピーク以外である検出値の最大値と最小値の平均値とすることができる。
【００２１】
ノイズは、得られた検出結果の明らかに検出ピーク以外である検出値の最大値と最小値の差の１／２とすることができる。図１（Ａ）に、それぞれ、ベースライン６、最大値７、最小値８、最大値７と最小値８との差ｈｎ、ノイズＮ、検出限界２を示した。
【００２２】
一方、（Ｂ）はヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を同一の保持時間で溶出して、同時に検出した結果を示し、２つの個別ピーク１が合算された検出ピーク（以降、合算ピーク３という）を示し、明らかに検出ピークであると認められる。合算ピーク３は、異なる保持時間で溶出した場合に検出される個別ピーク１の検出値が加算されたものに相当する。
【００２３】
本発明の検出方法は、試料中のＲＮＡの含有量が非常に少ない場合に、有効に活用できることがある。この場合、ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を異なる保持時間で個別に検出した場合、ＲＮＡの含有量が少ないため検出限界を上回る個別ピークが検出できないことがある。しかし、本発明の検出方法である同一の保持時間で溶出して、同時に検出することで、二つの個別ピークが加算された合算ピークとなり、検出限界を上回り検出ピークとして認められることがある。図２（Ａ）、（Ｂ）に例を示す。（Ａ）は、異なる保持時間で検出した結果であり、検出限界２を上回る個別ピークが認められない。一方、（Ｂ）は、同一の保持時間で溶出して、同時に検出した結果を示し、合算ピーク３とすることで検出限界２を上回るピークが認められる。このように、本発明の方法によれば、異なる保持時間で溶出し、検出した場合に、検出限界を下回るような試料において、合算ピークとすることで検出限界を上回り、ＲＮＡを検出できることがある。
【００２４】
同一の保持時間とは、ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸のそれぞれの個別ピークの保持時間が一致した場合をいう。図３（Ａ）に例を示す。個別ピークｘ４（点線）の保持時間Ｔｘが、個別ピークｙ５（一点鎖線）の保持時間Ｔｙと一致する場合である。この場合、合算ピーク３の検出値の最大値は、理論的には、個別ピークｘ４の保持時間Ｔｘでの検出値と、個別ピークｙ５の保持時間Ｔｙでの検出値を足し合わせた値となる。また、同一の保持時間とは、ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸のそれぞれの個別ピークについて、一つの個別ピークの保持時間がもう一つの個別ピークのピーク幅に入っている時間もいう。図３（Ｂ）に例を示す。個別ピークｘ４（点線）の保持時間Ｔｘが、個別ピークｙ５（一点鎖線）のピーク幅Ｗｙにギリギリ入っている場合であり、合算ピーク３（実線）の検出値の最大値が個別ピークｘ４の検出値の最大値より僅かながら大きくなっている。また、図３（Ｃ）に個別ピークｘ４（点線）の保持時間Ｔｘが、個別ピークｙ５（一点鎖線）のピーク幅Ｗｙの十分内側に入っている場合を示す。この場合、合算ピーク３（実線）の検出値の最大値は、個別ピークｘ４の検出値の最大値より十分大きくなっている。図３（Ｂ）、（Ｃ）ともに個別ピークの検出値の最大値よりも合算ピークの検出値の最大値の方が大きく、高感度化される。各用語については、図３（Ｄ）に示す。保持時間Ｔｘは、個別ピークｘ４の検出値が最大となる時間、ピーク幅Ｗｘは、個別ピークｘのベースライン６上のピークの幅のことをいう。
【００２５】
本発明の液体クロマトグラムの分析カラムは、一般的にＬＣ−ＭＳ法に用いられる分析カラムが適用される。一般的に再現性が高く、広い適用性を有した逆相カラムを用いることができる。分析カラムの材質は、ＬＣ−ＭＳ法に用いられるものであれば特に限定されず、金属、ガラス、樹脂等を用いることができるが、分析試料と接触する部分、例えば、カラムの内壁については、検出対象のヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸の吸着を抑制するために、金属部分が露出していないメタルフリーのカラムを好ましく用いることができる。メタルフリーの特徴としては、金属でない材質で構成されていること、ポリマーでコーティングされていること、表面の化学修飾でカバーされていることが好ましく用いられる。カラムには一般的に良く用いられるオクタデシルシリル基が修飾されたシリカゲル（以下、ＯＤＳとも表記する。）が充填されるが特に限定されない。具体的な分析カラムとしては、Ｍａｓｔｒｏ  Ｃ１８（株式会社島津ジーエルシー）等がある。
【００２６】
本発明において、液体クロマトグラフィーに用いる移動相は、後述のとおり、有機溶媒と水又は水溶液との混液とすることが好ましい。水溶液には、ｐＨを調整するために塩を溶解することができる。ここで用いる塩としては、揮発性の高いアンモニウム塩、例えば、ぎ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの塩が好ましく用いられる。本発明では、負イオンを検出するため、ｐＨ７から９が好ましい。ｐＨ７未満の場合、イオン化しにくいために、分析精度が低くなることがある。またｐＨが９より大きい場合は、カラムの基材によっては基材の溶出が生じるため、その影響を考慮する必要が出てくる。
【００２７】
従来、ＲＮＡをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で選択的かつ定量的に検出する場合、ＲＮＡに加水分解等の処理を施すことなくそのまま測定される。この場合、ＯＤＳが充填された逆相カラムを使用し、炭酸水素アンモニウム水溶液などの水溶液を移動相として用いることが主流となっており、通常、ＲＮＡの種類別に異なる保持時間で検出される。  本発明では、微量のＲＮＡの有無を検出するために、ＲＮＡをヌクレオチド単位に加水分解し、このヌクレオチドを分析する。このヌクレオチドには、塩基種ごとのヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸が含まれる。これらを、前述の移動相として水溶液を用いる従来の方法で分析すると、分子量が同じであるが、分子構造が異なるため、通常、これらの保持時間も異なって検出される。しかし、本発明の方法では、これらの保持時間を意図的に同一にする点に特徴がある。
【００２８】
加水分解された各ヌクレオチドの保持時間を意図的に同一にすることは、移動相として、水又は上記の塩を含む水溶液に、有機溶媒を配合することにより達成可能である。ここで用いられる有機溶媒としては、水と混じり合う有機溶媒であれば特に限定されないが、好ましい有機溶媒として、アセトニトリル及びメタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。有機溶媒の比率は、ヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸を同一の保持時間で溶出することができれば特に限定されず、用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム等に応じて適宜設定することができるが、多くの場合、安定して分析できる条件として３〜１２容量％が好ましく用いられる。
【００２９】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
ＲＮＡの調製
配列番号１（２２塩基）で表せる塩基配列（ヒトlet-7g遺伝子として知られているmiRNA）を有するＲＮＡ（以下、配列番号１のＲＮＡと記載することがある）を化学合成した。このＲＮＡを純水に１００ｐｍｏｌ／μＬの濃度で溶かしてＲＮＡ溶液とした。
【００３１】
ＲＮＡの加水分解
加水分解に用いるアルカリ性水溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ０．２Ｍ、酢酸カリウム  ０．５Ｍ、酢酸マグネシウム四水和物  ０．１５Ｍ）を調製し、ＲＮＡ溶液４０μＬにアルカリ性水溶液１０μＬを加えて、９４℃で１８時間加温した。
【００３２】
検出装置
本実施例では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いた。ＬＣシステムはＮｅｘｅｒａ  ＭＰシステム（株式会社島津製作所）、三連四重極型質量分析計にはＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ６５００（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）、分析カラムには、Ｍａｓｔｒｏ  Ｃ１８  ３μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ（株式会社島津ジーエルシー）を用いた。データ処理ソフトはＡｎａｌｙｓｔ  Ｖｅｒ．１．６（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を使用した。
【００３３】
測定
加水分解後、１０倍に希釈して、測定を実施した。測定には５μＬ注入した。測定対象は逆相カラムを用いてイソクラティック溶出した。移動相Ａは１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液、移動相Ｂはアセトニトリルとした。移動相ＡとＢの比率は９０：１０（ｖ／ｖ）とした。移動相の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとした。ＭＳ／ＭＳ条件は、負イオン検出ターボイオンスプレー法によって測定を行った。化合物毎に設定するコリジョンエネルギー（ＣＥ）値や他のパラメータについては溶液をインヒュージョンすることによって最適化した。ＭＲＭトランジションはアデニル酸：ｍ／ｚ  ３４６→２１１（または３４６→７９）、グアニル酸：３６２→２１１（または３６２→７９）とした。スプレーニードルには−２ｋＶの高電圧を印加し、イオン源温度は５００℃とした。ネブライザーガス（空気）、ヒーターガス（空気）及びカーテンガス（窒素）の流量は５０、５０及び１０  ｐｓｉ、コリジョンガス（窒素）流量は６  ｕｎｉｔｓ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｓｃａｌｅ）とした。測定時間は１本あたり５分間とした。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３４】
実施例２
移動相ＡとＢの比率を９７：３としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３５】
実施例３
移動相ＡとＢの比率を９６：４としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３６】
実施例４
移動相ＡとＢの比率を８８：１２としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３７】
実施例５
移動相Ｂをメタノールとしたこと以外は、実施例２と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３８】
実施例６
移動相Ｂをメタノールとしたこと以外は、実施例４と同様の操作を行った。その結果を表１に示す。結果を見ると、加水分解産物であるヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を同時に検出できていることが分かる。
【００３９】
比較例１
ＲＮＡの加水分解を行わなかったこと、また、ＭＲＭトランジションをｍ／ｚ  多価イオン→９７（または７９）としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。結果をみると、ヌクレオシド２’−リン酸とヌクレオシド３’−リン酸を検出できなかった。この原因は、低質量領域では、夾雑物由来のイオンによる妨害がバックグラウンドとして観測されてしまうため、微量定量には適していないためと考えられる。
【００４０】
【表１】
2017223469.tif 000003
【符号の説明】
【００４１】
１  分離されたヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸のそれぞれの検出ピーク（個別ピーク）
２  検出限界
３  分離されていないヌクレオシド２’−リン酸及びヌクレオシド３’−リン酸の検出ピーク（合算ピーク）
４  個別ピークｘ
５  個別ピークｙ
６  ベースライン
７  検出ピーク以外の検出値の最大値
８  検出ピーク以外の検出値の最小値
【図１】
2017223469.tif 000004
【図２】
2017223469.tif 000005
【図３】
2017223469.tif 000006
【配列表】
2017223469000001.app