(57)【要約】【課題】  癌に用いた場合には高い治療効果を発揮すると共に副作用が少ないエクソソーム製剤、および、感染予防・治療に有効なエクソソーム製剤を提供する。【解決手段】  細胞に、外来「デンジャー・シグナル」として抗原性のあるタンパク、ペプチド、あるいはそのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を導入後、培養を行い、培養上澄みから回収、単離して得たエクソソームを用いた、腫瘍の治療、あるいは微生物の感染予防・治療のための製剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した細胞由来のエクソソームを含む製剤
【請求項２】
抗原性の高いタンパクが微生物抗原である請求項１の製剤
【請求項３】
微生物抗原が結核菌抗原である請求項２の製剤
【請求項４】
微生物抗原が結核菌抗原ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ−６）である請求項２の製剤
【請求項５】
微生物抗原が結核菌抗原Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）である請求項２の製剤
【請求項６】
微生物抗原がアデノウィルス抗原Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤＰ）である請求項２の製剤
【請求項７】
抗腫瘍効果を目的とする請求項１の製剤
【請求項８】
抗腫瘍効果を目的とする請求項２の製剤
【請求項９】
抗腫瘍効果を目的とする請求項３の製剤
【請求項１０】
抗腫瘍効果を目的とする請求項４の製剤
【請求項１１】
抗腫瘍効果を目的とする請求項５の製剤
【請求項１２】
抗腫瘍効果を目的とする請求項６の製剤
【請求項１３】
感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項１の製剤
【請求項１４】
当該微生物による感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項２の製剤
【請求項１５】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項３の製剤
【請求項１６】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項４の製剤
【請求項１７】
結核感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項５の製剤
【請求項１８】
アデノウィルス感染予防・感染症治療効果を目的とする請求項６の製剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、遺伝子導入した細胞から得られるエクソソームからなる癌などの免疫治療薬および微生物感染予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】  癌などの疾患を対象とした免疫治療としては、様々な腫瘍関連抗原（以下ＴＡＡｓ）をコードしたＤＮＡワクチンが試みられ、限定的ではあるがその効果が報告されている（非特許文献１）。しかしＴＡＡｓは、もともと遺伝子的に同一の正常細胞がガン化した細胞の抗原であり、正常細胞にも量の差はあれ多少は発現しているのが普通である。そのためＴＡＡｓは一般に免疫原性が低く、ＴＡＡｓタンパクそのもの、あるいはそれをコードしたＤＮＡを投与しても、十分な免疫応答が誘導できないことが常に問題となり、抗イディオタイプ・ワクチンによるＢ細胞腫の治療など一部の例を除いては、十分な効果は認められていない（非特許文献１）。【０００３】  一方近年、エクソソームを用いた新しいガンの診断、治療法が注目を集めている。特に、２００７年にエクソソームが分泌細胞由来のｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡを内包することが報告されて以来、エクソソームをガンの診断や核酸医薬のキャリアーとして癌治療に用いる研究が急速に発展した。腫瘍細胞から放出されたエクソソームは腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）を持つことが知られており、エクソソームを用いた抗腫瘍免疫応答の導入が試行された。しかし、ＴＡＡｓは一般に免疫原性が低いため、サイトカインである顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの併用がないと、エクソソームそのものを投与しても免疫応答を誘導する効果は認められなかった（非特許文献２）。そこで、サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）で修飾した腫瘍細胞由来エクソソームが作られ、これらには免疫抑制を抑える効果があることがイン・ビトロの実験で示された（非特許文献３）が、生体中での治癒効果までは確認されていない。また、腫瘍細胞由来エクソソームに代わって、ＴＡＡｓでパルスした樹状細胞（ＤＣ）に由来するエクソソームを用いた免疫誘導が試みられた。しかし、これらのＤＣ由来エクソソームは、成熟ＤＣに対しては免疫導入効果を示すが、未成熟ＤＣには効果は認められなかった（非特許文献４）。【０００４】  他方、ガンばかりでなく、感染症も毎年多くの人の命を奪い続けている重要な疾患である。三大感染症と呼ばれるエイズ、結核、マラリアだけで毎年３００万人以上が亡くなっており、いまだに多くの中・低所得国で主要な死因の一つである。エクソソームを用いた感染予防の研究も近年盛んになった。結核菌に感染したマクロファージから分泌されたエクソソームを用いる研究（非特許文献５）や、トキソプラズマの抗原で刺激したＤＣからのエクソソームを用いた感染予防の研究（非特許文献６）が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１０（２０１０），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５９６４３２，１３  ｐａｇｅｓ
【非特許文献２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１６  ４，７８２−７９０
【非特許文献３】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｍａｙ；２５（５）：６９５−７００
【非特許文献４】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７２，２１２６−２１３６
【非特許文献５】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００８  Ｊｕｎ  １８；３（６）：ｅ２４６１
【非特許文献６】ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ｊｕｌｙ  ２００４，４１２７−４１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  原発性の腫瘍細胞の腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は、上述のように抗原性が弱く、また正常細胞にもしばしば発現しているため、腫瘍細胞から放出されたエクソソームや、ＴＡＡｓでパルスした樹状細胞（ＤＣ）に由来するエクソソームだけでは抗腫瘍免疫を惹起するのに不十分であり、十分な治癒効果は得られない。免疫システムを稼動させるための外来「デンジャー・シグナル」の存在が無いと、抗原性の弱いＴＡＡｓに対する免疫を惹起させるのは難しい。【０００７】  また、上で述べたように、エクソソームを用いた感染予防の研究が行われている。しかし、細菌感染や、単離したトキソプラズマ抗原による抗原提示細胞の刺激は、煩雑な手法や、特殊な設備、技術を必要とするため、広く一般的に応用できる、容易で汎用的な手法の開拓が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  すなわち、本発明は、抗原性の高いタンパク遺伝子を培養腫瘍細胞に導入し、そこから得られたエクソソームを抗腫瘍免疫製剤として利用する方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】  原発性の腫瘍細胞の腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は、上述のように抗原性が弱く、また正常細胞にもしばしば発現しているため、サイトカインの併用だけでは抗腫瘍免疫を惹起するのに不十分であると考えた。そこで、本発明者らは、樹状細胞を成熟させるためには「デンジャー・シグナル」の存在が必要であると考え、上記欠点を解決すべく鋭意研究を行った結果、「抗原遺伝子導入細胞由来のデンジャー・シグナル担持エクソソーム製剤」を考案した。すなわち、抗原性の高いタンパクの遺伝子を導入した培養細胞から得たエクソソームを用いて効果的に免疫を惹起、誘導する製剤である。【００１０】  親細胞として腫瘍細胞を用いた場合には、分泌されるエクソソームは「デンジャー・シグナル」と、ＴＡＡｓの両者を兼ね備えた強力なガンワクチンとなる。実際に、デンジャーシグナルとして結核菌抗原タンパクの遺伝子をコードしたＤＮＡの複合体を用いて、腫瘍細胞に「デンジャー・シグナル」遺伝子を導入後、培養を続けてエクソソームを分泌させ、回収、単離したエクソソームを同じ腫瘍細胞を移植したマウスの腫瘍内に投与してみた。すると驚くべきことに、遺伝子導入していない（デンジャーシグナルを持たない）腫瘍細胞由来のエクソソームと比べて著しく高い治療効果が見られ、「抗原遺伝子導入細胞由来のデンジャー・シグナル担持エクソソーム製剤」の優れた抗腫瘍効果が確認された。と、同時に、エクソソームを用いた抗腫瘍免疫治療における「デンジャー・シグナル」の重要性が確認された。【００１１】  本発明のエクソソームは、血中安定性が高く、腫瘍組織内への蓄積性が高く、また、毒性が低く副作用が少ないため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。同様の実験を、デンジャー・シグナル担持エクソソームの静脈内投与で行ってみたところ、同等の高い抗腫瘍効果が確認された。エクソソームは腫瘍細胞や抗原提示細胞への高い取り込み効率を持つことが期待される。そのために、全身投与に於いても高い治療効果を発揮したと考えられ、また、転移癌の治療にも有効であることが示された。【００１２】  さらに驚くべきことに、抗原遺伝子導入した腫瘍細胞由来のエクソソームは、同種の腫瘍を担持したマウスに対してだけでなく、他種の腫瘍を持つマウスに対しても高い腫瘍増殖抑制効果を示した。また、その効果は、親細胞と異系列のマウスに対しても示された。腫瘍細胞や樹状細胞は貪食作用が盛んであり、エクソソームを取り込みやすいこと、さらに取り込んだエクソソームの持つ抗原、あるいはエピトープは自己の主要組織適合遺伝子複合体への再結合が可能であるため、と思われる。すなわち、抗原遺伝子導入した腫瘍細胞由来のエクソソームは、他家であっても、また、他種の腫瘍に対しても効果的に用いることができることが示された。【００１３】  また、病原体の抗原遺伝子を導入した細胞から分泌されたエクソソームは、「デンジャー・シグナル」としてこれらの病原体の抗原またはそのエピトープを含む。そのため、これらの抗原に対する強い細胞性免疫を誘導することが見出された。これは、本発明のエクソソームが微生物の感染予防、治癒にも非常に有効であることを示すものであ��。
本発明のエクソソームは、腫瘍組織内への蓄積性が高く、毒性が低いため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。また、調製・取り扱いが簡便で、保存性にも優れている。さらに、本発明の一態様においては、他の抗腫瘍免疫治療製剤と併用することで治癒効果を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】  微生物遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームをＢ１６細胞を移植したマウスに単回投与することによる抗腫瘍効果を示す。
【図２】  微生物遺伝子を導入したＣＨＯ細胞から得られたエクソソームをＢ１６細胞を移植したマウスに単回投与することによる抗腫瘍効果を示す。
【図３】  微生物遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームをマウスに単回投与することによる腫瘍細胞に対する細胞性免疫惹起の効果を示す。
【図４】  微生物遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソームをマウスに単回投与することによる当該微生物に対する細胞性免疫惹起の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】  本発明で行う細胞に導入するデンジャー・シグナル遺伝子としては、抗腫瘍効果を期待するのであれば、対象とする患者、罹患動物において抗原性を有するものであればあらゆる種類のタンパク、ペプチド、またはこれらのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を使用することができる。デンジャー・シグナルとしての効果は、その抗原性の高さに由来するため、高い効果を期待するのであれば、抗原性の高いタンパク、ペプチド、またはこれらのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子を用いるのがよい。例えば、ウィルス、バクテリア、原虫、異種生物の抗原性タンパク遺伝子などが使用できる。
感染予防効果を期待するのであれば、対象となる疾患の病原体の抗原タンパク、ペプチド、またはそのエピトープを含むタンパク、ペプチドの遺伝子が良い。
【００１６】  本発明でデンジャー・シグナル遺伝子を導入し、エクソソームを分泌させる細胞にとしては、培養可能な細胞であれば、自家、他家を問わず、腫瘍細胞、繊維芽細胞、ＤＣ、マクロファージなど、あらゆる動物細胞を使用することができる。
【００１７】  本発明で行う細胞への遺伝子導入法には、ウィルスを用いる方法、リン酸カルシウム、ポリカチオン、カチオン性脂質またはその集合体を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などを使用することができる。実施例では、特許文献７記載と同じＤＮＡ複合体を用いた。その複合体の特徴を以下に述べる。ただし、この特徴の記載は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【００１８】  培養細胞に人工のベクター（ポリカチオン、カチオン性脂質など）を用いて遺伝子導入しても、その遺伝子発現期間は短く、通常３〜４日後には発現が消えてしまう。また、発現を高めようと、多くのＤＮＡ複合体を細胞に加えると、その毒性のために細胞は弱り、一両日中に死んでしまう。効率よくデンジャー・シグナルを担持したエクソソームを調製するためには、細胞が導入した遺伝子を発現しながら長期間エクソソームを分泌する条件が必要である。我々は、以前生体内で高発現する遺伝子導入システムを得るために、通常のＤＮＡ／ポリカチオン（またはカチオン性脂質）複合体ではなく、これにさらにポリアニオンを加えたＤＮＡ三元複合体システムを開発し、様々な効果を上げてきた（特許文献１）。このＤＮＡ三元複合体システムは遺伝子発現が比較的長期間持続すること（非特許文献７）、また、細胞毒性が低いこと（非特許文献８）から、エクソソームの効率良い調製に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６０００２
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献７】Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０３，１７９−１８４，２０１４
【非特許文献８】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１５，７，１６５−１７４
【００２１】  様々な手法で遺伝子導入した細胞を数日間培養し、その上澄みから超遠心分離法、エクソソーム単離試薬など、通常の方法によって、目的のデンジャー・シグナルを担持したエクソソームを容易に得ることができる
【００２２】  得られたデンジャー・シグナルを担持したエクソソームは、注射用シリンジ、点滴用具などを用いて、生体に腫瘍内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与などにより容易に投与することができる。
【００２３】  本発明を、実施例により更に具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】結核菌の抗原タンパクであるＥａｒｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ−６（ＥＳＡＴ−６）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（ＥＳ−Ｂ１６−Ｅｘ）および遺伝子導入していないＢ１６メラノーマ細胞からのコントロールの空エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ−Ｂ１６−Ｅｘ）の単離
ＥＳＡＴ−６プラスミド、およびＰＥＩ″Ｍａｘ″は、非特許文献８に記載と同じものを用いた。ＨＡは、生化学工業株式会社の「トリトサカ由来」のヒアルロン酸を用いた。ＰＢＳはＲｏｍａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製のＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ（Ｔａｂｌｅｔ）を蒸留したイオン交換水に溶解したものを用いた。以降の実施例でも同様である。【００２５】操作手順
▲１▼  遺伝子を導入する３日前に、２４穴マルチプレートに１ウェルあたり１．０×１０４個のＢ１６メラノーマ細胞をまき、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地を用いて３晩インキュベートした。
▲２▼  培養した培地を取り除き、１０％エクソソーム・フリーＦＢＳ、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＥＭＥＭ培地５００μｌをウェルに入れた。
▲３▼  ＥＳＡＴ−６プラスミド１．５μｇを含む水溶液４．８４μｌを１．７８μｌのＣＳ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡ／ＣＳ比（電荷モル比）が８となるように混合した後、０．８８μｌのＰＥＩ″Ｍａｘ″水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡ／ＰＥＩ″Ｍａｘ″比（電荷モル比）が１２となるように混合し、２０分後に２倍濃縮ＰＢＳを７．５μｌ加えた。。
▲４▼  ▲３▼で調製したＤＮＡ複合体懸濁液１５μＬをウェルに加えた（ＥＳＡＴ−６プラスミド１．５μｇ／ウェル）。
▲５▼  ３７℃、５％ＣＯ２−９５％  ａｉｒ下で５時間インキュベートした。
▲６▼  培地を新しい１０％エクソソーム・フリーＦＢＳと２５Ｕのペニシリンと２５μｇのストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ  １ｍｌと取り換え、３７℃で７２時間インキュベートした。
▲７▼  ７２時間のインキュベート後、ウェル中の上澄みを回収した。
▲８▼  遠心分離（３０００ｘ  ｇ、１５分）した後、上清を採取し、体積にして半分量のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）．）を加え、一晩４℃で静置した。
▲９▼  遠心分離（１００００ｘ  ｇ、１時間）した後、沈殿したエクソソームを０．１６ｍｌのＰＢＳに懸濁した。エクソソーム懸濁液は、４℃で保管、一週間以内に使用した。
▲１０▼  同様の実験を遺伝子導入していないＢ１６細胞に対しても行い、コントロールの空エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ−Ｂ１６−Ｅｘ）懸濁液を作成した。【００２６】結果
遺伝子導入したもの、していないものともに、Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  （ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）と混合し、一晩後遠心分離することによって、白色のエクソソームの沈殿が得られた。再懸濁した液中のエクソソームをＥｘｏ−ｇｒｅｅｎ  または  Ｅｘｏ−ｒｅｄ  （ともにＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ））で染色し、ＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ  （ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ））で単離し、蛍光顕微鏡で観察したところ、直径数十ｎｍの輝点が浮遊しているのが同じ位置に観察され、確かにエクソソーム懸濁液が得られたことが確認された。
【実施例２】
【００２７】結核菌の抗原タンパクであるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＰｒｏｔｅｉｎＡｎｔｉｇｅｎ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｅ）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（Ａｇ−Ｂ１６−Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、Ｂ１６メラノーマ細胞にＡｇ８５Ｂの遺伝子を導入した後、その培養上澄からＡｇ８５Ｂ遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞由来のエクソソーム（Ａｇ−Ｂ１６−Ｅｘ）を単離した。
【実施例３】
【００２８】アデノウィルスの抗原タンパクであるＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤＰ）の遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞からのエクソソーム（ＡＤ−Ｂ１６−Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、Ｂ１６メラノーマ細胞にＡＤＰの遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＡＤＰ遺伝子を導入したＢ１６メラノーマ細胞由来のエクソソーム（ＡＤ−Ｂ１６−Ｅｘ）を単離した。
【実施例４】
【００２９】結核菌の抗原タンパクであるｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ６  ｋＤａ（ＥＳＡＴ−６）の遺伝子を導入したＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞からのエクソソーム（ＥＳ−ＣＨＯ−Ｅｘ）の単離
実施例１と同様の手法で、ＣＨＯ細胞にＥＳＡＴ−６の遺伝子を導入した後、その培養上澄みからＥＳＡＴ−６遺伝子を導入したＣＨＯ細胞由来のエクソソーム（ＥＳ−ＣＨＯ−Ｅｘ）、および遺伝子導入していないＣＨＯ細胞からのエクソソーム（Ｅｍｐｔｙ−ＣＨＯ−Ｅｘ）を単離した。
【実施例５】
【００３０】  デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームの抗腫瘍効果（１）
▲１▼  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の皮下にＢ１６細胞を移植し、坦癌モデルマウスを作成した。
▲２▼  腫瘍の直径が５ｍｍを越えたところで、実施例１〜３で得られた各エクソソーム懸濁液（２００μＬ）を腫瘍内に一回投与し、その後の腫瘍のサイズの変化を調べた。【００３１】  結果
結果を図１に示す。ここで、図中の値は３例以上の平均値を表している。微生物遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ−Ｂ１６−Ｅｘはほとんど抗腫瘍効果を示さなかったのに対し、微生物遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソーム、ＡＤ−Ｂ１６−Ｅｘ、Ａｇ−Ｂ１６−Ｅｘ、ＥＳ−Ｂ１６−Ｅｘは明らかな抗腫瘍効果を示した。
【実施例６】
【００３２】デンジャーシグナル遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームの抗腫瘍効果（２）
▲１▼  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の皮下にＢ１６細胞を移植し、坦癌モデルマウスを作成した。
▲２▼  腫瘍の直径が５ｍｍを越えたところで、実施例４で得られた各エクソソーム懸濁液（２００μＬ）を腫瘍内に一回投与し、その後の腫瘍のサイズの変化を調べた。【００３３】［結果］
結果を図２に示す。ここで、図中の値は３例以上の平均値を表している。微生物遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ−ＣＨＯ−Ｅｘはほとんど抗腫瘍効果を示さなかったのに対し、ＥＳＡＴ−６遺伝子を導入したＣＨＯ細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ−ＣＨＯ−Ｅｘは明らかな抗腫瘍効果を示し、異種の腫瘍に対しても効果があること、また他家のエクソソームも抗腫瘍効果を導くことが確認された。
【実施例７】
【００３４】ＥＳＡＴ−６の遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームの細胞性免疫導入効果（１）
▲１▼  実施例１で得られたエクソソーム懸濁液をＣ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の両後足の足底に７５μＬずつ一回投与した。
▲２▼  ９日目に両後足の膝裏のリンパ節を採取し、つぶしてメッシュを通した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
▲３▼  得られたリンパ球懸濁液をマイトマイシン処理したＢ１６メラノーマ細胞とともに９６穴培養プレートに加え、３７℃で２日間インキュベート後、分泌されたＩＦＮ−ＹをＭｏｕｓｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））で定量した。【００３５】  ［結果］
結果を図３に示す。ここで、図中の値は３例以上の平均値を表している。ＥＳＡＴ−６遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ−Ｂ１６−Ｅｘを投与したマウスのリンパ球は、ＥＳＡＴ−６遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ−Ｂ１６−Ｅｘを投与したマウスのリンパ球に比べて、Ｂ１６細胞と２日間インキュベートすることで明らかに多くのＩＦＮ−Ｙを分泌した。このことから、微生物遺伝子を導入した腫瘍細胞から得られたエクソソームは腫瘍細胞に対する細胞性免疫を惹起する効果を持つことが確認された。
【実施例８】
【００３６】ＥＳＡＴ−６の遺伝子を導入した細胞から分泌したエクソソームの細胞性免疫導入効果（２）
▲１▼  実施例１で得られたエクソソーム懸濁液をＣ５７ＢＬ／６マウス（オス、５週齢）の両後足の足底に７５μＬずつ一回投与した。
▲２▼  ９日目に両後足の膝裏のリンパ節を採取し、つぶしてメッシュを通した後、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
▲３▼  得られたリンパ球懸濁液を１μｇのＥＳＡＴ−６を含むＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ  ｂｌｏｏｄの検査管に加え、３７℃で一晩インキュベート後、分泌されたＩＦＮ−ＹをＭｏｕｓｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））で定量した。【００３７】  ［結果］
結果を図４に示す。ここで、図中の値は３例以上の平均値を表している。ＥＳＡＴ−６遺伝子を導入したＢ１６細胞から得られたエクソソーム、ＥＳ−Ｂ１６−Ｅｘを投与したマウスのリンパ球は、ＥＳＡＴ−６遺伝子を導入していないＢ１６細胞から得られたエクソソーム、Ｅｍｐｔｙ−Ｂ１６−Ｅｘを投与したマウスのリンパ球に比べて、ＥＳＡＴ−６タンパクと一晩インキュベートすることで明らかに多くのＩＦＮ−Ｙを分泌した。このことから、微生物遺伝子を導入した細胞から得られたエクソソームは、当該微生物に対する細胞性免疫を惹起する効果を持つことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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