(57)【要約】      （修正有）【課題】長期間の使用または保管後における検出感度の低下を従来よりも抑制することが可能なセンサを提供する。【解決手段】分析対象物を電気化学的に定量するためのセンサであって、作用極２１および対極２２、少なくとも基質と反応する酵素、および、メディエータを含む試薬層３を備え、作用極２１および対極２２の表面の少なくとも一部が、試薬層３にさらに水溶性物質を含むコーティング層によって被覆されていることを特徴とするセンサ。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を電気化学的に定量するためのセンサであって、
電極を備え、
前記電極の表面の少なくとも一部が、水溶性物質を含むコーティング層によって被覆されていることを特徴とする、センサ。
【請求項２】
前記分析対象物は基質以外の対象物を含み、
前記基質以外の対象物を定量するための電極の表面の少なくとも一部が、前記コーティング層によって被覆されている、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記水溶性物質は、親水性高分子および両親媒性高分子の少なくともいずれかである、請求項１または２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記親水性高分子は、セルロース系高分子である、請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記親水性高分子は、二重結合した酸素原子を有さない、請求項３または４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記親水性高分子は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のセンサ。
【請求項７】
前記両親媒性高分子は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および、ポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３に記載のセンサ。
【請求項８】
前記電極は、その表面にスパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法、ＭＢＥ法、融液輸送法、融液温度降下法、ゾル−ゲル法、めっき法または塗布法によって形成された電極膜を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学法を用いたセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値センサなどのグルコースセンサのように、電気化学法を利用した各種のセンサ（バイオセンサ）が知られている。
【０００３】
例えば、バイオセンサのキャビティ（スペーサに形成された溝によって形成される空間）に、検体（血液など）を導入すると、検体に含まれる成分（基質）が、酵素を介してメディエータを還元する。ここで、電極に所定の電圧を印加すると、電気化学反応により、還元されたメディエータが逆に酸化される。このとき発生する酸化電流を測定することで、着目する成分の量を検出できる。
【０００４】
このようなバイオセンサは、一般に、少なくとも作用極と対極を含む２つ以上の電極を備えており、電極上に、キャビティを形成するためのスペーサを貼り合わせたのち、キャビティの一部に酵素、メディエータなどを含む試薬層を形成し、カバーを貼り合わせてなる構造を有している。
【０００５】
ここで、従来から本発明の技術分野では、長期間の使用または保管後のバイオセンサにおいて、電極の検知感度が低下するという問題が指摘されていた。なお、常温下でも保管時間にしたがって、電極で検出される電流値が経時的に低下する場合があるが、特に３０℃を越える高温環境下では、その電流低下が顕著となることが分かっている。
【０００６】
特許文献１には、この電流低下の一因について、電極（電極膜）がスパッタリング法で形成された金属膜である場合、スパッタガス、基材または装置内壁からのアウトガスなどのガス成分が製造工程で金属膜に取り込まれ、その保存過程では、金属膜からガス成分が離脱することで、金属膜中に間隙（ポア）が生じ、間隙が金属成分で埋まることで金属膜の物性が変化する（表面抵抗値が下がる）と考えられる旨が記載されている。
【０００７】
このため、特許文献１では、電極膜の長期安定性を向上させるために、ガス成分が電極膜に取り込まれ難い成膜条件を選択することで、電極膜に内在するガス成分を減らし、電極の経時変化を抑制することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１３２１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、本発明者らが特許文献１と同様の実験を試みたところ、上記のような条件の適正化を行っても、完全に電極膜からガス成分を排除することはできず、依然として電極膜にポアが発生するため、保管時間に伴う電極の特性変化（電流低下）を完全に抑制することはできなかった。なお、特に３０℃を超える高温環境下では電流低下が顕著になることが分かった。
【００１０】
したがって、特許文献１に開示されるセンサでは、長期間の使用または保管後に、電極の検知感度の低下を抑制する効果は必ずしも十分ではなかった。なお、特に３０℃を超えるような高温条件下では、電極の検知感度の低下を十分に抑制することが出来ないという問題があった。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、長期間の使用または保管後における検出感度の低下を従来よりも抑制することが可能なセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［１］
分析対象物を電気化学的に定量するためのセンサであって、
電極を備え、
前記電極の表面の少なくとも一部が、水溶性物質を含むコーティング層によって被覆されていることを特徴とする、センサ。
［２］
前記分析対象物は基質以外の対象物を含み、
前記基質以外の対象物を定量するための電極の表面の少なくとも一部が、前記コーティング層によって被覆されている、［１］に記載のセンサ。
［３］
前記水溶性物質は、親水性高分子および両親媒性高分子の少なくともいずれかである、［１］または［２］に記載のセンサ。
［４］
前記親水性高分子は、セルロース系高分子である、［３］に記載のセンサ。
［５］
前記親水性高分子は、二重結合した酸素原子を有さない、［３］または［４］に記載のセンサ。
［６］
前記親水性高分子は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つである、［５］に記載のセンサ。
［７］
前記両親媒性高分子は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および、ポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つである、［３］に記載のセンサ。
［８］
前記電極は、その表面にスパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法、ＭＢＥ法、融液輸送法、融液温度降下法、ゾル−ゲル法、めっき法または塗布法によって形成された電極膜を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載のセンサ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、長期間の使用または保管後における検出感度の低下を従来よりも抑制することが可能なセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１における保存期間とヘマトクリット測定電流との関係を示すグラフである。
【図２】実施例２における保存期間とヘマトクリット測定電流との関係を示すグラフである。
【図３】実施例３における保存期間とヘマトクリット測定電流との関係を示すグラフである。
【図４】比較例１における保存期間とヘマトクリット測定電流との関係を示すグラフである。
【図５】実施形態１のバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。
【図６】実施形態１のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための斜視図である。
【図７】実施形態１のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図８】実施形態１のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図９】実施形態１のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図１０】実施形態１のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図１１】実施形態２のバイオセンサの構成を説明するための上面模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。なお、図面において、同一の参照符号は、同一部分または相当部分を表す。また、長さ、幅、厚さ、深さなどの寸法関係は図面の明瞭化と簡略化のために適宜変更されており、実際の寸法関係を表すものではない。各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。
【００１６】
［実施形態１］
図５を参照して、本実施形態のセンサは、試料液中に含まれる基質を定量するためのバイオセンサであって、絶縁性基板１と、電極と、試薬層３と、スペーサ４と、カバー５とを備える。
【００１７】
電極は、絶縁性基板１の一方の面に設けられた作用極２１および対極２２を含む。
試薬層３は、電極の絶縁性基板１と反対側の表面の一部に形成され、少なくとも基質と反応する酵素、および、メディエータを含んでいる。試薬層３はさらに水溶性物質を含んでおり、これにより、試薬層３は電極のコーティング層を兼ねている。
【００１８】
スペーサ４は、試料液を試薬層３に誘導するキャビティ４１を形成するための切欠部４２を有し、切欠部４２（キャビティ４１）の内部に試薬層３が位置するように電極上に配置される。
【００１９】
カバー５は、少なくとも切欠部４２を覆うように、スペーサ４の絶縁性基板１と反対側の面に設けられる。また、カバー５は、キャビティ４１に連通する空気孔５ａを有している。
【００２０】
本実施形態のセンサ（バイオセンサ）は、電極の表面の少なくとも一部が、水溶性物質を含むコーティング層（試薬層）によって被覆されていることを特徴としている。なお、電極の表面のうち、少なくともキャビティ４１内に露出している部分がコーティング層（試薬層）で被覆されていることが好ましい。
【００２１】
電極の表面がコーティング層によって被覆（保護）されることにより、周辺環境への暴露に伴う電極表面の酸化や不純物の付着が抑制されるため、電極膜の物性が安定化し、センサの長期安定性および耐熱性が向上する。したがって、本実施形態のセンサにおいては、長期間の使用または保管後における検出感度の低下を従来よりも抑制することができる。
【００２２】
なお、このような本実施形態のセンサによる長期安定性の向上効果は、常温においても発揮されるが、特に、３０℃以上の高温環境下においても、電極の物性変化が抑制され、検出する電流値の低下を抑制できるため、長期安定性（耐熱性）の向上効果が顕著である。したがって、患者の本来の血糖値を測ることが可能な、高精度で信頼性の高い血糖値センサを提供できる。
【００２３】
また、例えば、電極が、その表面にスパッタリング法等によって形成された電極膜を含む場合、電極（電極膜）の表面をコーティング層で被覆する際に、コーティング層中の水溶性物質が電極膜のポアの中に入り、ポアに内在していた微量のガス成分が排出される。このため、特許文献１に記載されるような保管過程でのガス成分の金属膜からの離脱による電極膜の物性変化を抑制することができる。このような作用により、さらに電極膜の物性が安定化し、センサの長期安定性および耐熱性が向上するため、長期間の使用または保管後におけるセンサの検出感度の低下を従来よりも抑制することができる。
【００２４】
コーティング層を構成する物質は、水溶性物質（好ましくは高分子化合物）であり、本発明の効果を奏するものであれば特に限定されないが、親水性高分子および両親媒性高分子の少なくともいずれかであることが好ましい。
【００２５】
親水性高分子は、セルロース系高分子であることが好ましい。また、親水性高分子は、二重結合した酸素原子（＝Ｏ）を有さないことが好ましく、二重結合した酸素原子を有さないセルロース系高分子であることがより好ましい。
【００２６】
本発明者らの検討結果から、特に、二重結合した酸素原子を有さない親水性高分子、または、両親媒性高分子は、電極膜を保護する機能が高いことが分かった。これは、化学的に活性の高い官能基である二重結合した酸素原子を有する水溶性物質を用いた場合、二重結合した酸素原子を含む官能基（例えば、カルボニル基）が電極を構成する金属原子に対して求核攻撃し、電子供与することで、電極の物性が変化するためであると考えられる。
【００２７】
二重結合した酸素原子を有さないセルロース系高分子としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースなどが挙げられる。
【００２８】
二重結合した酸素原子を有さないセルロース系高分子は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００２９】
なお、二重結合した酸素原子を有する親水性高分子を用いてもよく、二重結合した酸素原子を有するセルロース系高分子としては、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。
【００３０】
両親媒性高分子は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および、ポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００３１】
本実施形態において、基質（分析対象物）としては、例えば、グルコース（血糖）、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【００３２】
絶縁性基板１の材料としては、特に限定されないが、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどのプラスチック材料、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、または、生分解性材料などが挙げられる。これらの材料は、スペーサ４、カバー５の材料としても用いられる。
【００３３】
絶縁性基板１上に設ける電極は、少なくとも作用極２１と対極２２を含む。電極は、作用極２１および対極２２以外に、電極電位の測定時に電位の基準となる参照電極や、キャビティ４１に試料が供給されたことを検知するための検知電極を含んでいてもよい。
【００３４】
これらの電極（作用電極、対極、参照極、検知用電極など）の材料としては、白金、金、パラジウムなどの貴金属、カーボン、銅、アルミニウム、ニッケル、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（酸化亜鉛）などが挙げられる。
【００３５】
酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらの酵素を検出したい測定対象物質（グルコース、アルコール、乳酸、コレステロール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸など）に応じて選択することで種々のバイオセンサを作製することができる。
【００３６】
例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを作製でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを作製でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを作製でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを作製できる。
【００３７】
メディエータとは、作用極２１と対極２２との間の電子伝達を仲介する化合物（電子伝達体）であり、それ自体が酸化還元反応を行う物質であることが好ましい。メディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。
【００３８】
試薬層３は、上記のコーティングのための水溶性物質以外の親水性高分子を含んでいてもよい。このような親水性高分子は、試薬層３を電極の表面へ容易に固定化する効果、または、試料液中の夾雑物（血液中の血球など）をろ過する効果を有している。なお、上記の水溶性物質だけで、これらの効果を奏する場合は、特に上記水溶性物質以外の親水性高分子を配合する必要はない。
【００３９】
また、試薬層３は、検体導入を促進するための親水化剤などを含んでいてもよい。親水化剤としては、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどの界面活性剤、レシチンなどのリン脂質が挙げられる。
【００４０】
カバー５の材料は、絶縁性材料であることが好ましく、例えば、ＰＥＴフィルムなどプラスチック、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、生分解性材料を用いることができる。なお、カバー５は、スペーサ４によって形成されるキャビティ４１と連通する空気孔５ａを有していることが好ましい。毛細管現象により試料が空気孔５ａに向かって吸引されて、キャビティ４１内への試料の導入が容易になるからである。
【００４１】
（バイオセンサの製造方法）
本実施形態のバイオセンサの製造方法の一例について、図５〜図１０を参照して説明する。図５は、本実施形態のバイオセンサの構成を示す分解斜視図である。図６〜図１０は、本実施形態のバイオセンサの製造工程の一例を説明するための図であって、それぞれ異なる工程を示している。本実施形態では、複数のバイオセンサを同時に作製することができる。
【００４２】
まず、図６を参照して、電極（基質を定量するための作用極２１および対極２２）を、複数の絶縁性基板１の各々の上に形成する。具体的には、絶縁性基板１の一方の面に、導電層をスパッタリング法等により形成し、形成された導電層にレーザー加工、フォトリソグラフィー等によりパターン形成することで、電極（電極膜）を形成する。なお、作用極２１および対極２２以外に、上述の参照電極、検知電極などを形成してもよい。また、電極および絶縁性基板１の表面にプラズマ処理を施しておいてもよい。
【００４３】
電極膜は、例えば、スパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ（化学蒸着）法、ＭＢＥ（分子線エピタキシー）法、融液輸送法、融液温度降下法、ゾル−ゲル法、めっき法、塗布法、スクリーン印刷等を用い形成することができる。
【００４４】
電極は、好ましくは、スパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法、または、ＭＢＥ法によって形成される。これらの方法では、スパッタリング法と同様に、ガス成分が製造工程で金属膜に取り込まれ、保存過程で金属膜からガス成分が離脱することで、金属膜中に間隙（ポア）が生じる可能性がある。
【００４５】
したがって、本実施形態においては、電極膜の表面をコーティング層で被覆する際に、コーティング層中の水溶性物質が電極膜のポアの中に入り、ポアに内在していた微量のガス成分が排出される。保管過程でのガス成分の金属膜からの離脱による電極膜の物性変化を抑制することができる。このような作用により、さらに電極膜の物性が安定化し、センサの検出感度の低下を従来よりも抑制することができる。
【００４６】
別の態様において、電極は、好ましくは、融液輸送法、融液温度降下法、ゾル−ゲル法、めっき法または塗布法によって形成される。これらの液相成長法で形成された電極膜についても、製造工程で電極膜中に大気中の窒素、酸素等のガス成分が含有され得るため、上記のスパッタリング法等によって形成された電極膜に対する効果と同様の効果が奏される。
【００４７】
電極膜の厚みは、特に限定されないが、例えば、５〜５００ｎｍである。このような厚みの範囲において、特に上記のプロセスで形成された電極膜における特性変化が生じやすいため、本発明の効果が顕著である。
【００４８】
次に、図７を参照して、電極（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極が形成されていない領域の電極側の表面の一部に、切欠部４２を有するスペーサ４を貼り合わせる。
【００４９】
次に、図８を参照して、電極（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側（切欠部４２の内部）に試薬液を滴下し、試薬液を乾燥させることによって試薬層３を形成する。なお、例えば、コーティング層を構成する水溶性物質を含む液、酵素液、メディエータ液を順に滴下した後にそれらを乾燥して試薬層３を形成してもよく、少なくとも酵素、メディエータおよび水溶性物質を含む液（混合液）を滴下した後にそれらを乾燥して試薬層３を形成してもよい。
【００５０】
次に、図９を参照して、空気孔５ａを有するカバー５が、スペーサ４上に、少なくとも切欠部４２を覆うように積層されることで、試薬層３に試料液を誘導するためのキャビティ４１が形成される。なお、空気孔５ａはキャビティ４１の開口の反対側においてキャビティ４１の内部と連通するように設けられている。
【００５１】
次に、以上の工程によって形成されたバイオセンサの集合基板を分割することで、キャビティ４１を有するバイオセンサが得られる（図１０、図５）。
【００５２】
（バイオセンサの使用方法）
本発明のバイオセンサ（バイオチップ）は、測定器に装着されて使用されるものである。すなわち、測定器に装着されたバイオセンサのキャビティ４１に試料（血液など）を供給し、試料中の測定対象物質（グルコースなど）と酵素およびメディエータとが反応することで還元物質が生成する。そして、バイオセンサの作用極２１および対極２２と電気的に接続された測定器により、作用極２１と対極２２との間に電圧を印加し、この還元物質を酸化することにより得られる酸化電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が行われる。
【００５３】
以下、本発明のバイオセンサの使用方法の一例について説明する。まず、キャビティ４１の先端部分（入口４１ｃ）に血液を接触させ、血液を、毛細管現象を利用してキャビティ４１内部に導入する。そして、作用極２１と対極２２間に電圧を印加し、一定のタイミングで電流値を測定する。印加電圧は、例えば０．３Ｖとする。キャビティ４１内に血液が導入されると、血中の分析対象物が酵素を介してメディエータを還元する。作用極２１と対極２２の間に電圧を印加した際に流れる電流は、メディエータの還元体濃度、すなわち分析対象物濃度と相関がある。
【００５４】
次に、電圧印加から一定時間経過後の電流値を測定する。例えば、３〜５秒後の電流値を測定する。この電流値を用いて、あらかじめ求めておいた検量線から分析対象物の濃度を決定することができる。
【００５５】
なお、本実施形態においては、試料液中に含まれる基質（分析対象物）を酵素反応を利用して定量するバイオセンサの一例について説明したが、本発明のセンサは、電気化学法を用いたセンサであれば、このようなバイオセンサに限定されない。バイオセンサ以外のセンサとしては、例えば、血中の血球数（ヘマトクリット値）のみを電気化学法を用いて直接測定するセンサが挙げられる。
【００５６】
［実施形態２］
図１１を参照して、本実施形態のバイオセンサは、グルコース測定用電極（作用極２１および対極２２）に加えて、試料液（血液等）中に含まれる血球量（ヘマトクリット）を測定するための電極（作用極２３および対極２４）を備えている。そして、このヘマトクリット測定用電極の表面の少なくとも一部（電極の表面のうち、少なくともキャビティ４１内に露出している部分）が、水溶性物質を含むコーティング層によって被覆されている。本実施形態のバイオセンサは、この点で実施形態１とは異なるが、それ以外の点は実施形態１と同様である。
【００５７】
本実施形態のバイオセンサのように、基質（グルコースなど）以外の対象物の測定（たとえば、血球量（ヘマトクリット）の測定、測定機へのセンサチップ挿入の検知、センサチップへの検体導入の検知、周辺環境温度の測定など）に用いられる電極（作用極、対極など）の表面を水溶性物質を含むコーティング層で被覆すると、それらの電極の長期安定性・耐熱性が向上し、基質濃度測定以外の測定の精度を向上させることができる。
【００５８】
上記のような基質以外の対象物の測定は、基質の定量値を補正する等の基質の定量値の測定精度を高めることを目的として実施される場合が多く、基質以外の対象物の測定精度が向上することにより、基質の測定精度も向上させることができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
［実施例１］
基本的には、上記実施形態２で説明した図１１に示されるような構成を有するバイオセンサを作製した。電極の材料としては金を用い、スパッタリング法によって金からなる金属膜を形成し、これをパターン形成することにより、グルコース測定用電極（電極膜）とヘマトクリット測定用電極（電極膜）とを作製した。
【００６１】
また、ヘマトクリット測定用電極の表面にＣＭＣ液を滴下し、そのＣＭＣ液を乾燥することでＣＭＣからなるコーティング層を形成した。なお、ＣＭＣとしては、カルボキシメチルセルロースナトリウム（商品名：ＣＡＲＢＯＸＹＭＥＴＨＹＬＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＳＯＤＩＵＭ、シグマアルドリッチ社製）を使用した。
【００６２】
なお、グルコース測定用電極上には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）液、酵素液、メディエータ液を順に滴下した後に、それらを乾燥することで形成した。酵素液としてはグルコースデヒドロゲナーゼとメチルセルロースの混合液、メディエータ液としてはフェリシアン化カリウムとヒドロキシプロピルメチルセルロースの混合液を用いた。絶縁性基板１およびスペーサの材質はポリエチレンテレフタレートである。
【００６３】
［実施例２および３］
実施例１で用いたＣＭＣ液の代わりに、実施例２ではメチルセルロース液、実施例３ではポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、実施例２および３のバイオセンサを作製した。なお、実施例２では、メチルセルロースとして、メトローズＳＭ４００（商品名メトローズＳＭ４００、信越化学工業株式会社製）を使用し、実施例３では、ＰＶＰとして、ポリビニルピロリドン（商品名ポリビニルピロリドン、和光純薬工業(株)製）を使用した。
【００６４】
［比較例１］
試薬層の実施例１で用いたＣＭＣ液を滴下しなかった点以外は、実施例１と同様にして、実施例２および３のバイオセンサを作製した。
【００６５】
［試験例１］
ヘマトクリット値の測定対象となる試料液として、健常者の血糖値である１００ｍｇ／ｄＬで得られる電流値と同等となるように、メディエータとして用いるフェリシアン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムの混合溶液を作製し、実験の簡便性からヘマトクリット値はゼロとしたものを用意した。
【００６６】
この試料液を、上記の実施例１〜３および比較例１で作製されたバイオセンサのキャビティ内に供給し、ヘマトクリット測定用電極の作用極と対極の間に１．８Ｖの電圧を印加して、ヘマトクリット測定用電極に流れる電流値（ヘマトクリット測定電流）を測定した。なお、測定は、３０℃または５０℃で保存した各々１０個のバイオセンサについて、保存開始の直前（初期）、１ヵ月後、２ヵ月後、３ヵ月後、４ヵ月後、５ヵ月後および６ヵ月後に実施し、各測定時における１０個の測定値の平均値を測定結果とした。
【００６７】
実施例１〜３および比較例１で作製されたバイオセンサの各々を用いたときの測定結果を、それぞれ図１〜図４に示す（図１が実施例１、図２が実施例２、図３が実施例３、図４が比較例１に対応する。）。
【００６８】
図４に示される比較例１（コーティング層なしのセンサ）の結果では、３０℃でも電流値の経時的低下が顕著であり、高温（５０℃）での保管では、短期間で電流値が低下した。これより、たとえ化学的に安定な金電極を用いても、検出する電流値の低下を十分には抑制できないといえる。
【００６９】
次に、図１に示される実施例１（ＣＭＣからなるコーティング層）の結果から、実施例１では、比較例１と比べて電流値の低下速度が遅くなっており、電流値の経時的低下が抑制されていることが分かる。
【００７０】
実施例１においては、ヘマトクリット測定用電極がコーティング層で被覆されているため、電極の表面に汚れが付着したり、空気に曝されることにより電極の表面が酸化されるといった電極の劣化現象が抑制されたと考えられる。
【００７１】
また、コーティング層の形成工程で、スパッタリング法で形成された電極膜のポアに水溶性物質が入り込み、ポアに内在していたガス成分（スパッタガス等）が排出されることで、センサの保管過程においては、ガス成分が金属膜から徐々に離脱するといった現象が抑制されたため、電極膜の物性変化を抑制することができたと考えられる。
【００７２】
なお、コーティング層が水溶性物質で形成されているため、測定時に水溶性物質が試料液に溶解され、電極による電流値の検出を妨げずに、電流値の測定が可能であったと考えられる。
【００７３】
ただし、実施例１では、電流値の低下速度は遅くなったものの、電流値は経時的に低下した。これは、ＣＭＣが求核攻撃を行い得るカルボキシル基（カルボニル基）の酸素−炭素間の二重結合（二重結合した酸素原子）を有しており、かつ、カルボキシル基がイオン化されるため、この二重結合した酸素原子が電極に求核攻撃をし、作用することで、電極の表面状態が変化したことが原因であると考えられる。
【００７４】
次に、図２に示される実施例２（メチルセルロースからなるコーティング層）の結果、および、図３に示される実施例３（ＰＶＰからなるコーティング層）の結果では、３０℃保管および５０℃保管のいずれの場合でも、６カ月経過後も電流値の減少は見られなかった。
【００７５】
このように、実施例２が実施例１に対して優れた長期安定性および耐熱性を有しているのは、コーティング層の材料として、二重結合した酸素原子を有さない親水性高分子であるメチルセルロースを用いることで、上記のような二重結合した酸素原子による電極の表面状態の変化が生じなくなったためであると考えられる。したがって、実施例２においては、実施例１と同様の電極の劣化現象の抑制効果や、スパッタリング法で形成された電極膜の物性変化を抑制する効果が阻害されることなく、センサの長期安定性および耐熱性が向上したと考えられる。
【００７６】
また、実施例３が実施例１に対して優れた長期安定性および耐熱性を有しているのは、コーティング層の材料として両親媒性高分子であるＰＶＰを用いることで、ＰＶＰは二重結合した酸素原子を有しているものの、両親媒性の高分子であり、単量体における疎水基の割合が大きく、二重結合した酸素原子を疎水基が覆うことによって二重結合した酸素原子の求核性が減少し、上記のような二重結合した酸素原子による電極の表面状態の変化が生じなくなったためであると考えられる。したがって、実施例３においては、実施例１と同様の電極の劣化現象の抑制効果や、スパッタリング法で形成された電極膜の物性変化を抑制する効果が阻害されることなく、センサの長期安定性および耐熱性が向上したと考えられる。
【符号の説明】
【００７７】
１  絶縁性基板、２１  作用極、２２  対極、３  試薬層、４  スペーサ、４１  キャビティ、４１ｃ  入口、４２  切欠部、５  カバー、５ａ  空気孔、６  試料液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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