(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中のｈＧＨ，ウシ血清アルブミン、免疫グロブリンＧ等のタンパク質と結合し、次いで結合したタンパク質を解離させることにより、タンパク質を分離することができる、タンパク質結合ポリマー微粒子の提供。【解決手段】アクリルアミド誘導体、及び、メタアクリルアミド誘導体の夫々に由来する構造単位を有し、その合計量が５０ｍｏｌ％以上である共重合体を含む、微粒子形状のタンパク質結合剤。【選択図】図１
2017101004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物及び式（２）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を含有し、その合計量が５０ｍｏｌ％以上である共重合体を含むことを特徴とする、微粒子形状のタンパク質結合剤。
【化１】
2017101004.tif 000007
【化２】
2017101004.tif 000008
（上記式（１）において、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ２は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、上記式（２）において、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ４は弱塩基性官能基である。）
【請求項２】
共重合体が、更に下記式（３）で表される化合物に由来する構造単位を含有する、請求項１に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
【化３】
2017101004.tif 000009
（上記式（３）において、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ６は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基である。）
【請求項３】
前記式（２）で表される化合物がＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミドである、請求項１または２に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
【請求項４】
前記式（３）で表される化合物がｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミドである、請求項２又は３に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
【請求項５】
平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の微粒子である、請求項１〜４いずれかに記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の微粒子形状のタンパク質結合剤と試料とを接触させることにより、試料中のタンパク質を微粒子形状のタンパク質結合剤に結合させ、次いで微粒子形状のタンパク質結合剤に結合したタンパク質を解離させることを特徴とする、タンパク質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子形状のタンパク質結合剤及びそれを用いた分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＮＩＰＡｍとする）に由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなるポリマー微粒子は、刺激応答性粒子として広く研究されてきた（非特許文献１、２）。最近、ＮＩＰＡｍとＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド（以下、ＤＭＡＰＭとする）のそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなるポリマー微粒子が、温度変化により二酸化炭素を吸収・放散することが報告された（特許文献１、非特許文献３）。また、ＮＩＰＡｍ、ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（以下、ＴＢＡｍとする）及びアクリル酸のそれぞれに由来する構造単位を主成分とし、かつ１ｗｔ％のＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド（以下、Ａｍとする）を含有する共重合体からなるポリマー微粒子が特定のタンパク質に結合することが報告された（特許文献２）。しかしながら、ＤＭＡＰＭに代表される弱塩基性モノマー及びＮＩＰＡｍのそれぞれに由来する構造単位を主成分として含有する共重合体からなるポリマー微粒子がタンパク質に結合できることに関してこれまでに何の知見も開示もない。
【０００３】
成長ホルモンは下垂体前葉から分泌される代表的なホルモンで、成長促進活性を示すタンパク質である。また、その他の作用として、糖代謝、脂質代謝、蛋白同化、細胞の増殖や分化に深く関与することが明らかとされている。ヒト成長ホルモン（以下、ｈＧＨとする）は、成長ホルモン分泌不全性低身長症、慢性腎不全などの疾患の治療薬として使用されており、ｈＧＨを安価に製造できる方法が今後益々重要になると考えられる。これまでにｈＧＨの精製法については多数の報告例があり、種々の分離モード、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーの組合せによるものがある（非特許文献４、５）。また、ブルー色素やヒト成長ホルモン結合タンパク質をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによるものがある（特許文献３、４）。
【０００４】
しかしながら、複数のカラムクロマトグラフィーの組み合わせによる精製法は、精製工数が多いことから最終回収率が非常に低くなる可能性や精製コストが高くなる可能性が考えられ、効率的な精製法とはいえない。ブルー色素は群特異的アフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして市販されており、様々なタンパク質が結合することが明らかとなっている。そのため、ブルー色素をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーでは、結合・洗浄・溶出条件を工夫することで、ようやくｈＧＨに特異的な精製が達成されうる。一方、ヒト成長ホルモン結合タンパク質はｈＧＨを特異的に結合させることができるためｈＧＨ精製用リガンドとして優れているが、一般的にタンパク質は安定性・保存性が悪く、その製造は煩雑であり、コストが高くなる可能性が考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１３／２７６６８号パンフレット
【特許文献２】特開２０１４−１６１８３３号公報
【特許文献３】特開平１０−２６５４９９号公報
【特許文献４】特許第５３２８３９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．，８，４８１−４８５（１９８７）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３７３，４９−５２（１９９５）
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４，１８１７７−１８１８０（２０１２）
【非特許文献４】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０４，１４５−１５０（１９８６）
【非特許文献５】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ８（２）：ｅ５６１６８（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、タンパク質に結合するポリマー微粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、以下のとおりである。
［１］下記式（１）で表される化合物及び式（２）で表される化合物のそれぞれに由来する構造単位を含有し、その合計量が５０ｍｏｌ％以上である共重合体を含むことを特徴とする、微粒子形状のタンパク質結合剤。
【０００９】
【化１】
2017101004.tif 000003
【００１０】
【化２】
2017101004.tif 000004
【００１１】
（上記式（１）において、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ２は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、上記式（２）において、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ４は弱塩基性官能基である。）
［２］共重合体が、更に下記式（３）で表される化合物に由来する構造単位を含有する、［１］に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
【００１２】
【化３】
2017101004.tif 000005
【００１３】
（上記式（３）において、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基であり、Ｒ６は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基である。）
［３］前記式（２）で表される化合物がＤＭＡＰＭある、［１］または［２］に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
［４］前記式（３）で表される化合物がＴＢＡｍである、［２］又は［３］に記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
［５］平均粒径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の微粒子である、［１］〜［４］いずれかに記載の微粒子形状のタンパク質結合剤。
［６］上述の［１］〜［５］いずれかに記載の微粒子形状のタンパク質結合剤と試料とを接触させることにより、試料中のタンパク質を微粒子形状のタンパク質結合剤に結合させ、次いで微粒子形状のタンパク質結合剤に結合したタンパク質を解離させることを特徴とする、タンパク質の分離方法。
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤において、一般式（１），（２），（３）で表される化合物のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５の炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基があげられる。Ｒ４は弱塩基性官能基であり、例えば、炭素数１〜３の分岐していてもよいアルキル基で１つ又は２つ置換されていてもよいアミノ基等があげられる。Ｒ６は炭素数４〜８の分岐していてもよいアルキル基であり、例えば、ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基等があげられる。
【００１６】
式（１）で表される化合物としては、好ましくはＮＩＰＡｍ、Ｎ−プロピルアクリルアミド等があげられ、式（２）で表される化合物としては、好ましくはＤＭＡＰＭ、Ａｍ等があげられ、式（３）で表される化合物としては、好ましくはＴＢＡｍ、Ｎ−ｔｅｒｔ−ペンチルアクリルアミド等があげられる。
【００１７】
共重合体中の式（２）で表される化合物に由来する構造単位の量には、特に限定はなく、吸着するタンパク質の種類により異なるものであるが、ｈＧＨ結合剤として用いる場合には、好ましくは２０〜４５ｍｏｌ％、更に好ましくは２５〜３５ｍｏｌ％である。
【００１８】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤としては、共重合体が、更に式（３）で表される化合物に由来する構造単位を含有するものであってもよい。その量は特に限定されるものではないが、微粒子形状のｈＧＨ結合剤として用いる場合には、共重合体中の含有量は好ましくは１５〜４５ｍｏｌ％、更に好ましくは３０〜４５ｍｏｌ％である。
【００１９】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤は、特に粒径２０〜５００ｎｍの微粒子が好ましい。
【００２０】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤に結合するタンパク質としては特に限定はないが、例えばｈＧＨ、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）、免疫グロブリンＧ等があげられる。
【００２１】
本発明の微粒子に含まれる共重合体の合成方法は特に限定されないが、例えば、モノマーの混合物を架橋剤の存在下で重合開始剤により重合させればよい。特にポリマー微粒子が得られる合成条件がよい。モノマーとしては、重合反応の反応物となりうる化合物であれば特に限定されないが、ｈＧＨに結合するポリマー微粒子を例に挙げれば、ＮＩＰＡｍ、ＤＭＡＰＭ、ＴＢＡｍを用いるのが好ましい。
【００２２】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤のタンパク質に対する結合・解離の評価方法としては、表面プラズモン共鳴分析法、水晶振動子マイクロバランス法、蛍光偏光法、ＥＬＩＳＡ等の各種手法により行なえばよい。
【００２３】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤は、試料と接触させることにより、試料中のタンパク質を微粒子形状のタンパク質結合剤に結合させ、次いで微粒子形状のタンパク質結合剤に結合したタンパク質を解離させることにより、タンパク質を分離することができる。このとき、塩濃度により、本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤とタンパク質との結合・解離を制御することができる。例えばｈＧＨでは、本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤と結合した後、塩濃度を上げることにより、ｈＧＨを微粒子形状のタンパク質結合剤から解離させることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤を構成する共重合体は、弱塩基性モノマーに由来する構造単位を含有し、さらに疎水性モノマーに由来する構造単位の割合を調整するという単純かつ簡便な操作を行なって合成することができ、本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤のタンパク質に対する親和性及び特異性を制御することができるという特徴を有する。
【００２５】
また、塩濃度により該微粒子形状のタンパク質結合剤とタンパク質との結合・解離を制御することができるという特徴を有する。これらの特徴から、本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤を用いてタンパク質を分離することができる。
【００２６】
本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤は、安価なモノマーを原料として合成することができ、低コストかつ簡便に製造することが可能である。また、タンパク質に対する親和性及び特異性を制御して製造することが容易である。本発明の微粒子形状のタンパク質結合剤を利用することにより、タンパク質、特にヒト成長ホルモンの精製が効率化、低コスト化されることが期待される。これは、ヒト成長ホルモンを医薬品として安定供給する上で重要である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例４の結果を示したグラフである。
【図２】実施例５の結果を示した図である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］ポリマー微粒子の合成
ポリマー微粒子は、非特許文献３に記載の擬沈殿重合法に従い合成した。
【００３０】
ポリマー微粒子の原料モノマーとして、ＮＩＰＡｍ、ＤＭＡＰＭ、ＴＢＡｍ、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（以下、Ｂｉｓとする）を用いた。ＤＭＡＰＭはアルミナカラムを通し重合禁止剤を除去した物を用いた。原料モノマーとして、ＮＩＰＡｍ、ＤＭＡＰＭ、ＴＢＡｍ、Ｂｉｓを下記表１の割合および量で、溶液中のモノマー総濃度が３１２ｍＭになるように、３０ｍｌの水に溶解した。その際、ＴＢＡｍは、表に記載した量のメタノールにあらかじめ溶解してから溶液に投入した。また、２１．９ｍｇのセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（以下、ＣＴＡＢとする）を添加し溶解した。溶液をナスフラスコに入れ、セプタムで密栓し、７０℃の油浴に入れて攪拌しながら３０分窒素バブリングで脱気した。次いで、２１ｍｇの２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（以下、ＡＡＰＤとする）を１ｍｌの水に溶解した溶液を添加し、油浴温度を７０℃に維持したまま窒素雰囲気下３時間攪拌重合した。ポリマー微粒子１０についてはＡＡＰＤの代わりに、アゾビスイソブチロニトリル（以下、ＡＩＢＮとする）を用いた。重合反応終了後、透析膜に溶液を入れ、水で４日間透析を行い、ポリマー微粒子水溶液を得た。溶液内のポリマー微粒子の濃度は、透析後の水溶液を所定量凍結乾燥し、乾燥後に残ったポリマー微粒子の重量より求めた。なお、ポリマー微粒子の平均粒径は、動的光散乱法で測定したところ、２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であった。
【００３１】
【表１】
2017101004.tif 000006
【００３２】
［実施例２］ポリマー微粒子とｈＧＨの結合性の評価
ポリマー微粒子とｈＧＨの結合性の評価を市販の表面プラズモン共鳴測定装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）にて実施した。まず、何も固定化していないＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に実施例１で得られた１０種類のポリマー微粒子をそれぞれ添加した。このとき、ランニングバッファーとして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。１０種類のポリマー微粒子のうち、ＤＭＡＰＭの共重合比が０ｍｏｌ％で合成されたポリマー微粒子１、４、７、１０はＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に吸着しなかったが、５ｍｏｌ％または３０ｍｏｌ％で合成されたポリマー微粒子２、３、５、６、８、９はＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に吸着した。
【００３３】
ポリマー微粒子１、４、７、１０とｈＧＨとの結合性の評価は次のようにして実施した。まず、ｈＧＨ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）をＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に固定化した。該Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５にポリマー微粒子１、４、７、１０をそれぞれ添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルを測定した。このとき、ランニングバッファーとして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。その結果、表面プラズモン共鳴シグナルは観察されなかった。すなわち、ポリマー微粒子１、４、７、１０はいずれもｈＧＨと結合しないことが確認された。
【００３４】
ポリマー微粒子２、３、５、６、８、９とｈＧＨとの結合性の評価は次のようにして実施した。まず、ポリマー微粒子２、３、５、６、８、９をそれぞれＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に添加し、吸着させた。該Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５それぞれにｈＧＨを添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルを測定した。このとき、ランニングバッファーとして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。その結果、ポリマー微粒子２、５、８をそれぞれ吸着させたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５では、ｈＧＨの添加による表面プラズモン共鳴シグナルは観察されなかった。すなわち、ポリマー微粒子２、５、８はいずれもｈＧＨと結合しないことが確認された。一方、ポリマー微粒子３、６、９をそれぞれ吸着させたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５では、ｈＧＨの添加による表面プラズモン共鳴シグナルの増大が観察された。すなわち、ポリマー微粒子３、６、９はいずれもｈＧＨと結合することが確認された。
【００３５】
［実施例３］ポリマー微粒子とｈＧＨとのカイネティクス解析
ポリマー微粒子とｈＧＨとのカイネティクス解析をＢＩＡＣＯＲＥ２０００にて実施した。このとき、ランニングバッファーとして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。まず、ポリマー微粒子３、６、９をそれぞれＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に添加し、吸着させた。該Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５それぞれにｈＧＨ（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ）を添加し、ｈＧＨの各濃度における平衡時の表面プラズモン共鳴シグナルを得て、スキャッチャードプロットから解離定数を算出した。解離定数はそれぞれポリマー微粒子３が２１３ｎＭ、ポリマー微粒子６が１３０ｎＭ、ポリマー微粒子９が２７ｎＭであった。ポリマー微粒子３、６、９の共重合比における相違点はＴＢＡｍの共重合比であり、ＴＢＡｍの共重合比を増加させて合成したポリマー微粒子ほど解離定数が小さく、ｈＧＨとの親和性が強いことが明らかとなった。すなわち、ＴＢＡｍの共重合比を調整してポリマー微粒子を合成することにより、ポリマー微粒子のｈＧＨに対する親和性を制御できることが確認された。
【００３６】
［実施例４］ポリマー微粒子のｈＧＨとＢＳＡに対する結合性の比較
ポリマー微粒子のｈＧＨとＢＳＡに対する結合性の比較をＢＩＡＣＯＲＥ２０００にて実施した。このとき、ランニングバッファーとして１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用した。まず、ポリマー微粒子３、６、９をそれぞれＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に添加し、吸着させた。該Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５それぞれにｈＧＨまたはＢＳＡ（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ）を添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルを測定した。結果を図１に示す。ポリマー微粒子３、６では、ｈＧＨを添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルよりも、ＢＳＡを添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルのほうが大きかった。一方、ポリマー微粒子９では、ＢＳＡを添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルよりも、ｈＧＨを添加したときの表面プラズモン共鳴シグナルのほうが大きかった。すなわち、ポリマー微粒子３、６はｈＧＨよりもＢＳＡに結合しやすく、ｈＧＨに対する特異性が小さいが、ポリマー微粒子９はＢＳＡよりもｈＧＨに結合しやすく、ｈＧＨに対する特異性が大きいことが明らかとなった。ポリマー微粒子３、６、９の共重合比における相違点はＴＢＡｍの共重合比であり、ＴＢＡｍの共重合比を調整してポリマー微粒子を合成することにより、ポリマー微粒子のｈＧＨに対する特異性を制御できることが確認された。
【００３７】
［実施例５］ポリマー微粒子とｈＧＨの結合・解離
ポリマー微粒子とｈＧＨの結合・解離は以下の方法で評価した。まず、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液に、ポリマー微粒子９とｈＧＨを添加し、室温で１０分間インキュベートした。この溶液を遠心式フィルター（ミリポア社、アミコンウルトラ  １００Ｋ）に移し、溶液が完全にフィルターを通過するまで１５０００ｇで遠心した。このときのフィルター通過液をサンプルＡとした。フィルター上に残ったポリマー微粒子９に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を添加し、溶液が完全にフィルターを通過するまで１５０００ｇで遠心した。このときのフィルター通過液をサンプルＢとした。フィルター上に残ったポリマー微粒子９に５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を添加し、溶液が完全にフィルターを通過するまで１５０００ｇで遠心した。このときのフィルター通過液をサンプルＣとした。フィルター上に残ったポリマー微粒子９に１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を添加し、溶液が完全にフィルターを通過するまで１５０００ｇで遠心した。このときのフィルター通過液をサンプルＤとした。サンプルＡ−Ｄに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。結果を図２に示す。サンプルＡではｈＧＨのバンドは確認できなかった。すなわち、ポリマー微粒子９とｈＧＨは結合していることが明らかとなった。また、サンプルＢとＣにおいてもｈＧＨのバンドは確認できなかったが、サンプルＤではｈＧＨのバンドが確認できた。サンプルＢ、Ｃ、Ｄの違いは塩濃度であり、ポリマー微粒子とｈＧＨの結合・解離を塩濃度により制御できることが明らかとなった。
【図１】
2017101004.tif 000010
【図２】
2017101004.tif 000011