(57)【要約】【課題】ノズルと着滴対象部との距離を短く保った状態でノズル周辺の粒子状態を検知することが可能な液滴形成装置を提供すること。【解決手段】本液滴形成装置は、沈降性粒子を懸濁した粒子懸濁液を保持する液体保持部と、ノズルが形成され、前記液体保持部に保持された前記粒子懸濁液を振動により前記ノズルから液滴として吐出する膜状部材と、前記液体保持部の側より、前記粒子懸濁液における前記ノズルの周辺の前記沈降性粒子の粒子状態を検知する粒子状態検知手段と、を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
沈降性粒子を懸濁した粒子懸濁液を保持する液体保持部と、
ノズルが形成され、前記液体保持部に保持された前記粒子懸濁液を振動により前記ノズルから液滴として吐出する膜状部材と、
前記液体保持部の側より、前記粒子懸濁液における前記ノズルの周辺の前記沈降性粒子の粒子状態を検知する粒子状態検知手段と、を有する液滴形成装置。
【請求項２】
前記粒子状態検知手段は、光源と、受光手段と、を有し、
前記光源によって照明された前記ノズルの周辺の前記沈降性粒子からの散乱光又は蛍光を検知する請求項１に記載の液滴形成装置。
【請求項３】
前記粒子状態検知手段は、前記受光手段が受光する光量に基づいて、前記ノズルの周辺の前記沈降性粒子の有無、前記沈降性粒子の個数、前記沈降性粒子の濃度のうち少なくとも１つを検知する請求項２に記載の液滴形成装置。
【請求項４】
前記粒子状態検知手段は、結像光学素子を有し、
前記結像光学素子によって、前記受光手段と前記ノズルとが共役となるように配置されている請求項２又は３に記載の液滴形成装置。
【請求項５】
前記受光手段は１画素の受光素子であり、
前記受光素子の直前にピンホールが設けられ、
前記結像光学素子によって、前記ピンホールに設けられた穴と前記ノズルとが共役となるように配置されている請求項４に記載の液滴形成装置。
【請求項６】
前記粒子懸濁液は細胞を懸濁した溶液である請求項１乃至５の何れか一項に記載の液滴形成装置。
【請求項７】
前記粒子状態検知手段の検知結果に基づいて、前記液滴の形成を行う請求項１乃至６の何れか一項に記載の液滴形成装置。
【請求項８】
前記粒子状態検知手段の検知結果に基づいて、前記液体保持部に保持された前記粒子懸濁液を撹拌する請求項１乃至７の何れか一項に記載の液滴形成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴形成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞をインクジェットで吐出し組織体を形成する技術の開発が行われている。インクジェットの方式としては、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を引っ張る静電方式等が挙げられる。この中でも、圧電加圧方式は、他の方式と比べて熱や電場によるダメージを細胞に与え難いため、細胞溶液の液滴形成に用いるのに好適である。
【０００３】
細胞を代表とする粒子状の物質を含む液滴を吐出する際に、吐出する液滴中にどの程度の粒子が含まれているかを検知することが重要である。このため、吐出する液滴中に含まれる粒子の個数を検知する様々な方法が提案されている。
【０００４】
一例を挙げると、圧電素子（アクチェータ）によって液室（キャビティ）を加圧してノズルから液滴を形成するインクジェット装置に関し、キャビティとノズルの間において側方より液に含まれる粒状体の個数及び形態を検知する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。これによって、吐出する液滴中に粒子が含まれるかどうかを識別することができる。
【０００５】
他の例を挙げると、インクジェット素子等からなる分注素子から吐出される液滴を側方より観察し、液滴の状態や軌跡を確認する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、微小な液滴を吐出する装置において、吐出部、すなわちノズルと、液を受ける着滴対象部の距離が離れていることは、その間に液滴が減速し所望の方向に正確に吐出することができなくなるため、好ましくない。よって、インクジェット等の微小な液滴を吐出する装置において、ノズルと着滴対象部の距離は数ｍｍ以下、より好ましくは１ｍｍ以下とすることが一般的である。
【０００７】
しかしながら、上記の技術は、何れも吐出方向に対して側方より液滴を観察するものである。このとき、側方にはレンズやカメラを含む大きな検出部が備えられるため、着滴対象部が検出部と干渉し、ノズルと着滴対象部との距離を短く保つことが困難となる問題があった。
【０００８】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、ノズルと着滴対象部との距離を短く保った状態でノズル周辺の粒子状態を検知することが可能な液滴形成装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本液滴形成装置は、沈降性粒子を懸濁した粒子懸濁液を保持する液体保持部と、ノズルが形成され、前記液体保持部に保持された前記粒子懸濁液を振動により前記ノズルから液滴として吐出する膜状部材と、前記液体保持部の側より、前記粒子懸濁液における前記ノズルの周辺の前記沈降性粒子の粒子状態を検知する粒子状態検知手段と、を有することを要件とする。
【発明の効果】
【００１０】
開示の技術によれば、ノズルと着滴対象部との距離を短く保った状態でノズル周辺の粒子状態を検知することが可能な液滴形成装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１の実施の形態に係る液滴形成装置を例示する模式図である。
【図２】圧電素子の上下電極に印加される電圧を例示する図である。
【図３】液滴が形成される過程を例示する図である。
【図４】粒子状態検知手段によって観察されるノズル周辺の粒子状態を例示する図である。
【図５】第１の実施の形態に係る液滴形成装置の動作を示すフローチャートの一例である。
【図６】第１の実施の形態に係る液滴形成装置の動作を示すフローチャートの他の例である。
【図７】第１の実施の形態の変形例１に係る液滴形成装置を例示する模式図である。
【図８】第１の実施の形態の変形例２に係る液滴形成装置を例示する模式図である。
【図９】第１の実施の形態の変形例３に係る液滴形成装置を例示する模式図である。
【図１０】第１の実施の形態の変形例４に係る液滴形成装置を例示する模式図である。
【図１１】２つの光源を時系列で順次点灯するタイミングを例示する図である。
【図１２】第１の実施の形態の変形例５に係る液滴形成装置を例示する模式図である
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して発明を実施するための形態について説明する。各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。
【００１３】
〈第１の実施の形態〉
［液滴形成装置の構造］
まず、第１の実施の形態に係る液滴形成装置について説明する。図１は、第１の実施の形態に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図１を参照するに、液滴形成装置１０は、液室１１と、メンブレン１２と、圧電素子１３と、粒子状態検知手段１４とを有する。図１では、液室１１に沈降性粒子３５０を含有する粒子懸濁液３００が保持されている状態を模式的に示している。
【００１４】
なお、本実施の形態では、便宜上、液室１１側を上側、圧電素子１３側を下側とする。又、各部位の液室１１側の面を上面、圧電素子１３側の面を下面とする。又、平面視とは対象物をメンブレン１２の上面の法線方向から視ることを指し、平面形状とは対象物をメンブレン１２の上面の法線方向から視た形状を指すものとする。
【００１５】
液滴形成装置１０において、液室１１は、沈降性粒子３５０を懸濁した（沈降性粒子３５０が分散された）粒子懸濁液３００を保持する液体保持部であり、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。液室１１は、液室１１内を大気に開放する大気開放部１１１を上部に有しており、粒子懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１１から排出可能に構成されている。
【００１６】
メンブレン１２は、液室１１の下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１に保持された粒子懸濁液３００はメンブレン１２の振動によりノズル１２１から液滴として吐出される。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【００１７】
メンブレン１２の材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２の材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【００１８】
特に、沈降性粒子３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【００１９】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば日油株式会社製、Lipidure）によってコーティングすることが可能である。
【００２０】
ノズル１２１は、メンブレン１２の略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、沈降性粒子３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、沈降性粒子３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。具体的には、動物細胞、特にヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ〜１００μｍ以上とすることが好ましい。
【００２１】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、本実施の形態に係る液滴形成装置１０においては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【００２２】
圧電素子１３は、メンブレン１２の下面側に形成されている。圧電素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の圧電素子１３を形成することが好ましい。
【００２３】
圧電素子１３は、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造であり、圧電素子１３の上下電極に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【００２４】
但し、メンブレン１２を振動させる加振手段は圧電素子１３に限られない。例えば、メンブレン１２上にメンブレン１２とは線膨張係数が異なる材料を貼り付け、加熱することによって線膨張係数の差を利用してメンブレン１２を振動させることが可能である。この際、線膨張係数の異なる材料にヒータを形成し、通電によってヒータを加熱してメンブレン１２を振動させる構成とすることが好ましい。
【００２５】
粒子状態検知手段１４は、液室１１の上方に配置され、液室１１の側より、粒子懸濁液３００におけるノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０の粒子状態を光学的な手法によって検知する。
【００２６】
ここで、ノズル１２１周辺とは、ノズル１２１全体及びノズル１２１と接するメンブレン１２上面の少なくとも一部の領域を指す。但し、メンブレン１２上面の領域の広狭は問わない。すなわち、光学系の設計により、ノズル１２１全体及びノズル１２１と接するメンブレン１２上面の極めて狭い範囲の粒子状態を取得することも可能であるし、ノズル１２１全体及びノズル１２１と接するメンブレン１２上面の略全領域の粒子状態を取得することも可能である。
【００２７】
粒子状態を検知するノズル１２１周辺の範囲は、実験的に決められた領域となっていることが好ましい。例えば、本発明の典型的な実施例として、メンブレン１２の厚み２０μｍ、ノズル１２１の径８０μｍから、液滴サイズ２００ｐｌの液滴を吐出する構成が挙げられる。
【００２８】
このとき、ノズル１２１の部分に保持されている液の容量は１００ｐｌであり、吐出する液滴サイズにはノズル１２１周辺からの液も含まれる。この場合、粒子が含まれる可能性がある範囲として、ノズル１２１の中心から１００μｍの範囲を『ノズル１２１周辺』とすることが望ましい。この範囲は、インクジェットヘッドの構成や吐出する液滴サイズに対して最適に求められることが最も望ましく、実験的に算出することが好ましい。
【００２９】
又、粒子状態とは、少なくとも粒子の有無、粒子の個数、粒子の濃度を含む。又、粒子状態を検知するとは、後述の図４に示すように、粒子状態の違いを光学的に観察すること（光学情報を取得すること）である。つまり、粒子状態検知手段１４は、粒子の有無、粒子の個数、粒子の濃度の少なくとも１つを検知（観察）する手段であり、２つ以上を同時に検知してもよい。
【００３０】
粒子状態検知手段１４は、結像レンズ１４１と、２次元撮像素子１４２とを有している。図１中の点線は、粒子状態検知手段１４における光路を模式的に示したものである。２次元撮像素子１４２としては、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等を用いることができる。なお、２次元撮像素子１４２は、本発明に係る受光手段の代表的な一例である。粒子状態検知手段１４の具体的な検知方法については、後述する。
【００３１】
沈降性粒子３５０としては、金属微粒子や無機微粒子、或いは細胞、特にヒト由来の細胞等が想定される。本実施の形態では、粒子状態検知手段１４により光学的な手法によって粒子の状態を検知するため、対象とする粒子サイズとしては１μｍ以上であることが望ましい。
【００３２】
粒子懸濁液３００として特に細胞を懸濁した細胞溶液を用いた際には、細胞の基材への接着、細胞分裂、細胞死、細胞間の凝集等、粒子に様々な状態の変化が起こり得る。そのため、液室内における粒子状態をモニタリングすることは重要であり、本装置の用途として最適である。本明細書においては、粒子として主にヒト細胞を用いたときを中心に述べるが、必ずしも用途としては細胞に限られるものでは無い。
【００３３】
粒子懸濁液３００として、細胞特にヒト細胞が分散された細胞懸濁液を用いる際に、細胞懸濁液の主たる成分としては細胞と親和性の高い水を用いる。更に溶液中には細胞と浸透圧を調整するための塩、ｐＨを調整するためのｐＨ調整剤が含まれていることが望ましい。より具体的には、細胞懸濁液としては、ｐＨを調整したＴｒｉｓバッファ水溶液や、Ｃａ、Ｋ、Ｎａ等の金属塩を培養液と同等に加えたＰＢＳ溶液を用いることができる。
【００３４】
或いは、細胞懸濁液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」のｐ５８１に記載されているような基礎培地を用いることができる。
【００３５】
更に、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えてもよい。又、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
【００３６】
液滴形成装置１０は、駆動装置５００と接続可能に構成されている。駆動装置５００は、制御部５１０と、駆動部５２０とを有する。制御部５１０は、例えば、粒子状態検知手段１４の検知結果を入手し、検知結果に基づいて圧電素子１３を駆動する駆動波形を選択することができる。駆動部５２０は、制御部５１０が選択した駆動波形を圧電素子１３を駆動できる信号に変換して圧電素子１３を駆動することができる。
【００３７】
制御部５１０は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御部５１０の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。但し、制御部５１０の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御部５１０は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【００３８】
このように、駆動装置５００は、粒子状態検知手段１４の検知結果に基づいて、メンブレン１２を振動させて液滴を形成する吐出波形と、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２を振動させる撹拌波形とを圧電素子１３に選択的に（例えば、交互に）付与することができる。例えば、駆動装置５００は、粒子状態検知手段１４の検知結果に基づいて粒子が分散状態にあると判断した場合には吐出動作を行い、粒子が凝集状態にあると判断した場合には撹拌動作を行う。
【００３９】
つまり、駆動装置５００は、吐出波形を圧電素子１３に加え、メンブレン１２の振動状態を制御することにより、液室１１に保持された粒子懸濁液３００をノズル１２１から液滴として吐出させることができる。又、駆動装置５００は、撹拌波形を圧電素子１３に加え、メンブレン１２の振動状態を制御することにより、液室１１に保持された粒子懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴は吐出されない。
【００４０】
但し、液滴形成装置１０を駆動装置５００と接続可能に構成することは一例であり、これには限定されない。例えば、粒子状態検知手段１４の検知結果を表示装置（液晶ディスプレイ等）に表示し、液滴形成装置１０の使用者が表示装置を目視して吐出に適切な粒子状態か否かを判断するようにしてもよい。この場合、使用者が手動で吐出波形と撹拌波形の切り替えができるような装置構成とすることができる。
【００４１】
［液滴形成装置の液滴形成過程］
次に、第１の実施の形態に係る液滴形成装置によって、液滴が形成される過程について説明する。図２は、圧電素子の上下電極に印加される電圧を例示する図であり、図２（ａ）は液滴を形成するための駆動波形である吐出波形を、図２（ｂ）は吐出を行わず粒子を撹拌するための駆動波形である撹拌波形を示している。図３は、液滴が形成される過程を例示する図であり、液滴形成装置１０の一部を示している。
【００４２】
まず、吐出動作について説明する。液滴形成装置１０の圧電素子１３の上下電極に図２（ａ）に示すパルス状の電圧が印加された場合、図３に示すように液滴が形成される。まず、図２（ａ）のＡのタイミングでは、図３（ａ）に示すように、メンブレン１２が急激に変形することによって、液室１１に保持された粒子懸濁液３００とメンブレン１２との間に高い圧力が発生する。そして、この圧力によってノズル１２１から液滴３１０が外に押し出される。
【００４３】
次に、図２（ａ）のＢのタイミングでは、図３（ｂ）に示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル１２１からの液押し出しが続き液滴３１０が成長する。最後に、図２（ａ）のＣのタイミングでは、図３（ｃ）に示すように、メンブレン１２が元の状態に戻る際に、粒子懸濁液３００とメンブレン１２との界面近傍の液圧力が低下し、沈降性粒子３５０を含有する液滴３１０が形成される。
【００４４】
次に、撹拌動作について説明する。圧電素子１３に印加される電圧として、図２（ｂ）に示すような、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力する。この電圧印加によりメンブレン１２が上下に振動し、液室１１に保持された粒子懸濁液３００に流れが発生する。これにより、凝集していた沈降性粒子３５０の再分散を促進することができる。
【００４５】
なお、液滴形成装置１０において、液室１１内の粒子懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。しかし、液滴形成装置１０では、液室１１の上部に大気開放部１１１が設けられているため、粒子懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１１を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【００４６】
すなわち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２の振動によって上方に移動するが、液室１１には大気開放部１１１が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１１から排出可能となる。
【００４７】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２を振動させ、積極的に気泡を液室１１の上方に移動させてもよい。
【００４８】
このように、第１の実施の形態に係る液滴形成装置１０は、液室１１内を大気に開放する大気開放部１１１を有するため、液室１１内に気泡が混入しても大気開放部１１１を通じて気泡を外気に排出できる。そのため、通常の加圧液室を有するインクジェットヘッドとは異なり、液室１１に気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【００４９】
［粒子状態検知手段］
次に、第１の実施の形態に係る液滴形成装置の粒子状態検知手段について説明する。液滴形成装置１０は、ノズル１２１が形成されたメンブレン１２の振動によって液室１１中の粒子懸濁液３００を液滴状に吐出することができる。液滴形成装置１０では、一般的なインクジェットと異なりキャビティを形成していないため、液室１１の上方からノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０の粒子状態を簡単に観察・検知することが可能である。
【００５０】
これにより、従来技術のように側方から液状態や粒子状態を観察する装置と比較して、着滴対象部と液滴形成装置との配置自由度を高くすることが可能となる。言い換えれば、ノズル１２１と着滴対象部との距離を短く保った状態で、ノズル１２１周辺の粒子状態を検知することが可能となる。
【００５１】
粒子状態検知手段について、以下に、より詳しく説明する。図４は、粒子状態検知手段によって観察されるノズル周辺の粒子状態を例示する図である。図４（ａ）では、沈降性粒子３５０が均等に分散しており、液滴を形成するのに適した状態となっている。これに対して、図４（ｂ）では、沈降性粒子３５０の一部が凝集体を形成しており、液滴を形成するのに不適な状態となっている。
【００５２】
なお、図４（ｂ）とは別の液滴を形成するのに不適な状態として、大量の沈降性粒子３５０が存在する場合も考えられる。このときもメンブレン１２に焦点を合わせることによって沈降性粒子３５０を検知することが可能である。このように、液滴形成装置１０では、粒子状態検知手段１４を備えることにより、粒子状態の違いを観察することが可能であり、使用者が目視で、或いは画像処理によって自動で、吐出に適切な粒子状態か否かを判断することができる。
【００５３】
図５は、第１の実施の形態に係る液滴形成装置の動作を示すフローチャートの一例である。まず、ステップＳ１０１では、粒子状態検知手段１４は、ノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０からの散乱光を受光し、受光した散乱光から得られた２次元画像を駆動装置５００に送る。
【００５４】
次に、ステップＳ１０２では、駆動装置５００の制御部５１０は、沈降性粒子３５０から入手した２次元画像に基づいて、沈降性粒子３５０の粒子状態が分散状態であるか否かを判断する。制御部５１０は、例えば、粒子状態検知手段１４から取得した図４に示す２次元画像に対して、閾値処理によって粒子の領域を抽出して粒子サイズを計測し、粒子サイズが規定値を超えているかどうかを検出することにより、沈降性粒子３５０の粒子状態が分散状態であるか凝集状態であるかを判断できる。
【００５５】
或いは、分布集中度を算出するための一般的な手法を適用することも可能である。例えば、得られた２次元画像を適切な大きさの区画に分け、夫々の区画に含まれる粒子数をカウントし、その粒子数の分散を平均値で割った分散指数を求めることによって、沈降性粒子３５０の粒子状態が分散状態であるか凝集状態であるかを判断することも可能である。
【００５６】
制御部５１０が、沈降性粒子３５０の粒子状態が分散状態であると判断した場合（ＹＥＳの場合）には、ステップＳ１０３に移行する。ステップＳ１０３において、制御部５１０は、吐出波形を駆動部５２０に出力する。駆動部５２０は、制御部５１０からの吐出波形に基づいて、圧電素子１３を駆動し、吐出動作が行われる。吐出動作の終了後、ステップＳ１０４において、次の動作（吐出位置の移動等）が行われる。
【００５７】
一方、ステップＳ１０２において、制御部５１０が、沈降性粒子３５０の粒子状態が分散状態でない（凝集状態である）と判断した場合（ＮＯの場合）には、ステップＳ１０５に移行する。ステップＳ１０５において、制御部５１０は、撹拌波形を駆動部５２０に出力する。駆動部５２０は、制御部５１０からの撹拌波形に基づいて、圧電素子１３を駆動し、撹拌動作が行われる。撹拌動作の終了後、ステップＳ１０１に移行し、上記と同様の処理が繰り返される。
【００５８】
このように、液滴形成装置１０では、粒子状態検知手段１４によってノズル１２１周辺の粒子状態（例えば、粒子の個数）を検知できる。そのため、その情報を利用して、沈降性粒子３５０が分散状態にあるか凝集状態にあるかを判断し、圧電素子１３に印加する電圧波形を吐出波形と撹拌波形とに切り替えることが可能である。これにより、沈降性粒子３５０が凝集状態や沈降状態にあるまま液滴を吐出することを防ぎ、液滴中に含まれる沈降性粒子３５０の数や吐出状態を安定化させることができる。
【００５９】
液滴形成装置１０を用いて、図６に示すように、１液滴に１個の沈降性粒子３５０を封入して吐出することも可能である。図６は、第１の実施の形態に係る液滴形成装置の動作を示すフローチャートの他の例である。まず、ステップＳ１０１では、粒子状態検知手段１４は、ノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０の粒子状態を検知し、検知結果である２次元画像を駆動装置５００に送る。
【００６０】
次に、ステップＳ２０２では、駆動装置５００の制御部５１０は、沈降性粒子３５０から入手した２次元画像に基づいて、ノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０の数が１個であるか否かを判断する。制御部５１０は、例えば、粒子状態検知手段１４から取得した図４に示す２次元画像からノズル１２１周辺のみの画像を切り出し、ノズル１２１周辺の沈降性粒子３５０のみの数をカウントする。この際、例えば、沈降性粒子３５０のエッジコントラストが所定閾値以上のもののみを抽出し、カウントする手法を採ることができる。
【００６１】
制御部５１０が、沈降性粒子３５０の数が１個であると判断した場合（ＹＥＳの場合）には、ステップＳ１０３に移行する。ステップＳ１０３において、制御部５１０は、吐出波形を駆動部５２０に出力する。駆動部５２０は、制御部５１０からの吐出波形に基づいて、圧電素子１３を駆動し、吐出動作が行われる。吐出動作の終了後、ステップＳ１０４において、次の動作（吐出位置の移動等）が行われる。
【００６２】
一方、ステップＳ２０２において、制御部５１０が、沈降性粒子３５０の数が１個でないと判断した場合（ＮＯの場合）には、ステップＳ１０５に移行する。ステップＳ１０５において、制御部５１０は、撹拌波形を駆動部５２０に出力する。駆動部５２０は、制御部５１０からの撹拌波形に基づいて、圧電素子１３を駆動し、撹拌動作が行われる。撹拌動作の終了後、ステップＳ１０１に移行し、上記と同様の処理が繰り返される。
【００６３】
このように、液滴形成装置１０では、液室１１がキャビティを形成していないため、液室１１の側に粒子状態検知手段１４を配置できる。そのため、ノズル１２１と着滴対象部との距離を短く保った状態でノズル１２１周辺の粒子状態を検知することができる。
【００６４】
又、１液滴に１個の沈降性粒子３５０を封入して吐出することも可能であるため、例えば、沈降性粒子３５０が細胞である場合、多数のウェル中に１細胞ずつ吐出し、各細胞の遺伝子や遺伝子発現状態を解析することができる。
【００６５】
すなわち、通常、粒子懸濁液から吐出された液滴中に含まれる粒子の個数はポアソン分布に従って分布する。一方で、所定の位置に所定数の粒子をより制御性高く吐出することができれば、従来にはない精密な液滴形成装置を実現できる。
【００６６】
特に、ヒト細胞を用いた研究において、従来の多数細胞を対象とした遺伝子解析、或いは遺伝子発現解析に対して、細胞１個ずつの個性を把握するための１細胞遺伝子解析・遺伝子発現解析の実現が望まれている。このためには、１細胞ずつ所定の位置に分注する簡便な装置が必要である。
【００６７】
液滴形成装置１０では、粒子状態検知手段１４によってノズル１２１周辺の粒子状態を検知できるため、その結果に基づいてメンブレン１２を振動させることが可能である。例えば、粒子の個数が適当なときには吐出動作を行い、粒子の個数が不適切なときには撹拌動作を行うことによって、所定数又は所定範囲の粒子を安定的に吐出することが可能となる。これにより、粒子の個数の分布としてポアソン分布よりもシャープな分布、特に液滴中に１粒子ずつ封入して吐出することが可能となる。
【００６８】
又、従来のキャビティを加圧して液滴を形成するインクジェットヘッドでは、キャビティに気泡が混入すると、キャビティへの加圧を気泡が吸収してしまうため、キャビティ加圧ができなくなり直ちに不吐出となる。これに対して液滴形成装置１０では、ノズル１２１周辺のみをメンブレン１２の変形によって加圧するため気泡が混入したとしても、その影響を受けにくい。
【００６９】
ノズル１２１周辺に気泡が混入した場合や、メンブレン１２上に多数の気泡が混入した際には吐出状態に影響を及ぼすが、メンブレン１２上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２の振動によって上方に移動するため、短期間で吐出状態が回復する。これにより、液滴形成装置１０では、表面張力の高い細胞懸濁液であっても安定的に液滴形成を行うことが可能である。
【００７０】
〈第１の実施の形態の変形例１〉
第１の実施の形態の変形例１では、沈降性粒子からの蛍光像を取得可能な液滴形成装置の例を示す。なお、第１の実施の形態の変形例１において、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【００７１】
図７は、第１の実施の形態の変形例１に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図７を参照するに、液滴形成装置１０Ａは、粒子状態検知手段１４が粒子状態検知手段２４に置換された点が、液滴形成装置１０（図１参照）と相違する。
【００７２】
粒子状態検知手段２４は、光源２４１と、レンズ２４２と、励起フィルタ２４３と、ダイクロイックミラー２４４と、結像レンズ２４５と、蛍光フィルタ２４６と、結像レンズ２４７と、２次元撮像素子１４２を有する。
【００７３】
液滴形成装置１０Ａにおいて、光源２４１からの光はレンズ２４２を通り、沈降性粒子３５０を光励起するのに適した波長の光（励起光）のみを透過する励起フィルタ２４３を経てダイクロイックミラー２４４に入射する。そして、励起光は、ダイクロイックミラー２４４により光路を変換され、結像レンズ２４５により集光されて粒子懸濁液３００を照明する。
【００７４】
なお、粒子懸濁液３００には、沈降性粒子３５０として、光源２４１からの励起光により蛍光を発する蛍光粒子を分散させておく。蛍光粒子は、光源２４１からの励起光によって蛍光を発し、蛍光粒子からの蛍光は結像レンズ２４５によって集められ、ダイクロイックミラー２４４に入射する。そして、ダイクロイックミラー２４４を透過し、蛍光フィルタ２４６によって蛍光以外の光がカットされた後、結像レンズ２４７により２次元撮像素子１４２に結像する。
【００７５】
蛍光粒子としては、例えば、予め蛍光色素によって染色された無機微粒子、有機ポリマー粒子等を用いることができる。又、蛍光染色された細胞や、蛍光タンパク質を発現可能な細胞等を用いることができる。
【００７６】
このように、第１の実施の形態の変形例１では、沈降性粒子３５０として蛍光粒子を用いる。これにより、第１の実施の形態の効果の加えて更に以下の効果を奏する。すなわち、液滴形成装置１０Ａでは、状態を知りたい特定の粒子を蛍光粒子とすることにより、その特定粒子に関して高感度に粒子状態を検知可能であり、混入物等の影響を排除することができる。
【００７７】
更に、応用として２つ以上の蛍光波長及び励起波長を用いることも可能である。この場合、励起フィルタ２４３及び蛍光フィルタ２４６として複数波長透過するものを用い、２次元撮像素子１４２として複数波長取得可能なセンサ、例えばフルカラーＣＣＤを用いることができる。
【００７８】
これにより、例えば、複数種類の細胞が混在した状態において、特定の細胞を１細胞のみ吐出するように動作させることが可能となる。又、細胞への染色方法によっては、生細胞と死細胞の蛍光波長を変えることも可能であり、生細胞を吐出して死細胞を吐出しないことができる。
【００７９】
光源２４１としては、蛍光観察において一般的に用いられる水銀ランプ、ＬＥＤ（発光ダイオード）等を用いることができる。光源２４１としてＬＥＤを用いた際には、励起フィルタ２４３を省略することができる。又、複数色のＬＥＤを用いることで複数の励起波長とすることも可能であり、この場合にはＬＥＤを２次元撮像素子１４２の撮像タイミングと同期して順次点灯することで、複数の励起波長に対する像を取得することができる。
【００８０】
〈第１の実施の形態の変形例２〉
第１の実施の形態の変形例２では、着滴対象部の着滴側と逆側に光源等を配置した液滴形成装置の例を示す。なお、第１の実施の形態の変形例２において、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【００８１】
図８は、第１の実施の形態の変形例２に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図８を参照するに、液滴形成装置１０Ｂは、粒子状態検知手段２４が粒子状態検知手段３４に置換された点が、液滴形成装置１０Ａ（図７参照）と相違する。沈降性粒子３５０は、第１の実施の形態の変形例１と同様に蛍光粒子である。
【００８２】
粒子状態検知手段３４は、光源２４１と、レンズ２４２と、結像レンズ２４５と、蛍光フィルタ２４６と、結像レンズ２４７と、受光素子３４１とを有する。受光素子３４１は、１画素の受光素子であり、例えば、フォトダイオードやアバランシェフォトダイオード、光電子増倍管等を用いることができる。なお、受光素子３４１は、本発明に係る受光手段の代表的な一例である。
【００８３】
第１の実施の形態や変形例１では２次元撮像素子１４２を用いていた。しかしながら、２次元撮像素子は一般的にフレームレートが１００フレーム／秒以下であり、液滴の形成可能な速度に対して遅く、又、２次元の画像処理を行うのに時間がかかるという問題がある。より高速に液滴を吐出するためには、粒子状態検知手段３４として更に単純な処理で済むものを用いることが好ましい。そこで、本実施の形態では、２次元撮像素子に代えてフォトダイオード等である受光素子３４１を用い、粒子状態検知手段３４は受光素子３４１が受光する光量に基づいて、ノズル１２１周辺における沈降性粒子３５０の粒子状態を検知する。
【００８４】
液滴形成装置１０Ｂでは、着滴対象部６００の着滴側と逆側に光源２４１及びレンズ２４２が設置されている。そのため、液滴形成装置１０Ｂでは、着滴対象部６００としては、光透過性を有する材料を用いる必要がある。
【００８５】
液滴形成装置１０Ｂにおいて、光源２４１からの光はレンズ２４２及び着滴対象部６００を通して、メンブレン１２を照明する。メンブレン１２は一般的に光透過性を有しない素材によって形成されるため、メンブレン１２によって殆どの光は遮られ、ノズル１２１を通過した僅かな光のみが粒子懸濁液３００を照明する。
【００８６】
ノズル１２１周辺に存在する沈降性粒子３５０（蛍光粒子）は、光源２４１からの励起光によって蛍光を発し、蛍光粒子からの蛍光は結像レンズ２４５によって集められ、蛍光フィルタ２４６によって蛍光以外の光がカットされる。その後、結像レンズ２４７により受光素子３４１に結像する。
【００８７】
制御部５１０において、受光素子３４１で得られた信号強度に、蛍光粒子が存在しない場合と１つだけ存在する場合とを分離する第１閾値と、蛍光粒子が１つだけ存在する場合と２つ存在する場合とを分離する第２閾値とを予め設定しておく。これにより、適切な２つの閾値を設定することで、制御部５１０は、受光素子３４１で得られた信号強度が第１閾値と第２閾値の間の値を示している場合に、ノズル１２１周辺に蛍光粒子が１つだけ存在すると判断することができる。
【００８８】
このように、第１の実施の形態の変形例２では、２次元撮像素子１４２に代えてフォトダイオード等の受光素子３４１を用いる。これにより、第１の実施の形態の変形例１の効果の加えて更に以下の効果を奏する。すなわち、液滴形成装置１０Ｂでは、より短い時間で粒子状態を検知することができる。
【００８９】
又、液滴形成装置１０Ｂにおいて、結像光学素子である結像レンズ２４７によって、受光素子３４１とノズル１２１とが共役となるように配置されていると好適である。これにより、受光素子３４１には主としてノズル１２１周辺の極狭い領域に位置する粒子からの蛍光のみが受光されるようになり、ノズル１２１周辺の極狭い領域の粒子状態を厳密に検知することが可能となる。
【００９０】
〈第１の実施の形態の変形例３〉
第１の実施の形態の変形例３では、受光素子の入射側にピンホールを配置した液滴形成装置の例を示す。なお、第１の実施の形態の変形例３において、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【００９１】
図９は、第１の実施の形態の変形例３に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図９を参照するに、液滴形成装置１０Ｃは、粒子状態検知手段３４が粒子状態検知手段４４に置換された点、及び光源２４１及びレンズ２４２が着滴対象部の着滴側と同じ側に配置されている点が、液滴形成装置１０Ｂ（図８参照）と相違する。沈降性粒子３５０は、第１の実施の形態の変形例２と同様に蛍光粒子である。
【００９２】
粒子状態検知手段４４は、光源２４１と、レンズ２４２と、結像レンズ２４５と、蛍光フィルタ２４６と、結像レンズ２４７と、ピンホール４４１と、受光素子３４１とを有する。
【００９３】
液滴形成装置１０Ｃにおいて、光源２４１からの光（励起光）はレンズ２４２を通り、ダイクロイックミラー２４４に入射する。そして、励起光は、ダイクロイックミラー２４４により光路を変換され、結像レンズ２４５により集光されて粒子懸濁液３００を照明する。
【００９４】
蛍光粒子は、光源２４１からの励起光によって蛍光を発し、蛍光粒子からの蛍光は結像レンズ２４５によって集められ、ダイクロイックミラー２４４に入射する。そして、ダイクロイックミラー２４４を透過し、蛍光フィルタ２４６によって蛍光以外の光がカットされた後、結像レンズ２４７により受光素子３４１に結像する。
【００９５】
受光素子３４１の入射側の直前には、ピンホール４４１が設けられている。結像光学素子である結像レンズ２４７によって、ピンホール４４１に設けられた穴とノズル１２１とが共役となるように配置されていると好適である。これにより、受光素子３４１には主としてノズル１２１周辺の極狭い領域に位置する粒子からの蛍光のみがピンホール４４１に設けられた穴を介して受光されるようになり、ノズル１２１周辺の極狭い領域の粒子状態を厳密に検知することが可能となる。
【００９６】
このように、第１の実施の形態の変形例３では、受光素子３４１の入射側の直前にピンホール４４１を配置する。これにより、第１の実施の形態の変形例２の効果の加えて更に以下の効果を奏する。すなわち、受光素子３４１の直前に、ノズル１２１と共役となるようにピンホール４４１を配置し、ピンホール４４１の径を最適な値とすることによって、液滴形成時に吐出される範囲に略等しいノズル１２１周辺の極狭い領域の粒子状態を検知することが可能となる。
【００９７】
又、液滴形成装置１０Ｃでは、光源２４１等を着滴対象部の着滴側と同じ側に配置することにより、着滴対象部として光透過性を有しない材料を用いることができる。又、光源２４１等を着滴対象部の着滴側と反対側に配置すると、光源２４１等が大型化する傾向にあるが、液滴形成装置１０Ｃでは光源２４１等が大型化することを避けることができる。
【００９８】
〈第１の実施の形態の変形例４〉
第１の実施の形態の変形例４では、波長の異なる複数の光源を配置した液滴形成装置の例を示す。なお、第１の実施の形態の変形例４において、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【００９９】
図１０は、第１の実施の形態の変形例４に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図１０を参照するに、液滴形成装置１０Ｄは、粒子状態検知手段４４が粒子状態検知手段５４に置換された点が、液滴形成装置１０Ｃ（図９参照）と相違する。沈降性粒子３５０は、第１の実施の形態の変形例２と同様に蛍光粒子である。
【０１００】
液滴形成装置１０Ｄは、互いに波長の異なる光源２４１１及び２４１２を有している。例えば、光源２４１１及び２４１２として波長の異なるＬＥＤを用い、時分割で照明を行うことで、複数の細胞種類を区別してカウントすることが可能である。
【０１０１】
例えば、光源２４１１は特定の粒子Ａを励起することが可能であり、光源２４１２は粒子Ａとは異なる粒子Ｂを励起することが可能であるとする。このとき、図１１に示すように、光源２４１１と光源２４１２とを時系列で順次点灯することによって、粒子Ａと粒子Ｂの個数を測定することが可能である。
【０１０２】
例えば、第１の実施の形態の変形例２と同様に、第１閾値及び第２閾値を予め設定しておく。これにより、光源２４１１を点灯したときに信号強度が第１閾値と第２閾値の間の値を示している場合に、ノズル１２１周辺に粒子Ａが１つだけ存在する状態を検知することができる。又、光源２４１２を点灯したときに信号強度が第１閾値と第２閾値の間の値を示している場合に、ノズル１２１周辺に粒子Ｂが１つだけ存在する状態を検知することができる。
【０１０３】
なお、波長の異なる３つ以上の光源を用いることにより、３種類以上の粒子の個数を測定することができる。又、波長の異なる複数の光源を用いる代わりに、ピンホール４４１の後に、異なる波長フィルタを備えた複数の受光素子を備える構成としても、複数種類の粒子の個数を検知することができる。
【０１０４】
このように、第１の実施の形態の変形例４では、複数の光源を時分割で照明する。これにより、第１の実施の形態の変形例３の効果の加えて更に以下の効果を奏する。すなわち、液滴形成装置１０Ｄでは、複数種類の粒子の個数を検知することができる。
【０１０５】
〈第１の実施の形態の変形例５〉
第１の実施の形態の変形例５では、液滴形成装置１０をウェル中に１細胞ずつ分注するシステムに用いる例を示す。なお、第１の実施の形態の変形例５において、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１０６】
図１２は、第１の実施の形態の変形例５に係る液滴形成装置を例示する模式図である。図１２を参照するに、液滴形成装置１０は、ステージ７２０に沿って移動自在に構成されている。
【０１０７】
着滴対象部である基材７００には多数のウェル７１０（穴）が形成されており、液滴形成装置１０から夫々のウェル７１０中に順次細胞を含む粒子懸濁液を吐出することができる。
【０１０８】
液滴形成装置１０は、例えば図６に示したフローチャートに従って、吐出動作と撹拌動作を適宜組み合わせることによって、ウェル７１０中に１細胞を含む溶液を吐出する。吐出後は、液滴形成装置１０がステージ７２０に沿って次のウェル７１０が形成されている位置に移動し、再度図６に示したフローチャートの処理を実行する。以上の動作を繰り返すことにより、多数のウェル７１０中に細胞を１つずつ分注することが可能になる。
【０１０９】
ステージ７２０に沿って液滴形成装置１０を所定の位置に移動させる機能は、例えば、駆動装置５００の制御部５１０にプログラムとして組み込むことができる。なお、液滴形成装置１０に代えて、液滴形成装置１０Ａ〜１０Ｄの何れかを用いてもよい。
【０１１０】
以上、好ましい実施の形態等について詳説したが、上述した実施の形態等に制限されることはなく、特許請求の範囲に記載された範囲を逸脱することなく、上述した実施の形態等に種々の変形及び置換を加えることができる。
【０１１１】
例えば、変形していないときのメンブレン１２の平面内にＸＹ方向をとり、メンブレン１２の法線方向をＺ方向とした際に、液滴形成装置１０をＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向に独立に移動できる機構を設けてもよい。これにより、ＸＹ平面内での細胞のパターニングや、Ｚ方向への細胞の積層を容易に行うことができる。
【符号の説明】
【０１１２】
１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ  液滴形成装置
１１  液室
１２  メンブレン
１３  圧電素子
１４、２４、３４、４４、５４  粒子状態検知手段
１１１  大気開放部
１２１  ノズル
１４１  結像レンズ
１４２  ２次元撮像素子
２４１、２４１１、２４１２  光源
２４２  レンズ
２４３  励起フィルタ
２４４  ダイクロイックミラー
２４５  結像レンズ
２４６  蛍光フィルタ
２４７  結像レンズ
３００  粒子懸濁液
３１０  液滴
３４１  受光素子
３５０  沈降性粒子
４４１  ピンホール
５００  駆動装置
５１０  制御部
５２０  駆動部
７００  基材
７１０  ウェル
７２０  ステージ
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１３】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０９９２８７号
【特許文献２】特許第４０１３８６９号
【図１】
2017083439.tif 000003
【図２】
2017083439.tif 000004
【図３】
2017083439.tif 000005
【図４】
2017083439.tif 000006
【図５】
2017083439.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2017083439.tif 000012
【図１１】
2017083439.tif 000013
【図１２】
2017083439.tif 000014