(57)【要約】【課題】糖酸および酸性糖鎖結合性レクチンおよびその精製法を提供する。【解決手段】天然のコケ植物コマチゴケ由来の３種類レクチンは、３つの工程からなる方法で精製できる。糖化合物に対し本レクチンは、全糖酸および酸性糖鎖に親和性を示すが、中性糖およびアミノ糖に親和性を示さない。特にアルダル酸に親和性を示すレクチンは、本レクチンに限られており、かつこれらの特異性がヒドロキシ酸構造を認識するという特徴は、本レクチンが新規の糖酸結合性レクチンであると示唆されるとともに、本課題を解決するための要件を満たしている。さらに本レクチンは高い耐熱性を有する。本発明は上記特性を有するレクチンおよびその製造法を提供し、全糖酸を対象とした酸性糖鎖およびそれら糖鎖の変化による疾患原因の解明および、糖酸や有機酸などのヒドロキシ酸化合物に対する新規検出法や測定法などに繋げられるものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をヘパリンアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチン。
【請求項２】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をゲルろ過に供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約27 kDaおよび単量体約105 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチン。
【請求項３】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはヘパリンアフィニティクロマトグラフィーのいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはヘパリンアフィニティクロマトグラフィーのいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法。
【請求項４】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法。
【請求項５】
請求項１および請求項２を有する出発物質であるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患に関わる酸性糖鎖の変化を網羅的に調べるための前段階となる、全糖酸に結合可能なレクチンの精製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖酸は単糖にカルボキシル基がついた糖化合物の総称である。糖酸は大きく４つのグループ：aldaric acids、aldonic acids、ulosonic acids、uronic acidsに分けられる。Aldaric acidsの一つであるglucaric acidはβ-グルコニダーゼ活性を阻害することから、癌のリスクを抑える効果が知られる。また、無毒な食品添加物や医薬品として多く利用され、植物などの食物から取り込んでも有害物質とともに尿から排泄される。Aldonic acidsの一つであるgluconic acidは蜂蜜などに多く含まれ、ビフィズス菌の増殖を促進し、虫歯の初期原因とされるミュータント菌に対し抗菌効果を示す。Ulosonic acidsの代表的な化合物であるシアル酸(N-acetylneuraminic acidまたはNANA)は、個体発生、癌の浸潤・転移、ウィルス感染、炎症反応、免疫応答、病原菌に対する生体防御などに関係する。Uronic acidsでは、glucuronic acid、galacturonic acid、iduronic acidが知られ、グライコサミノグリカン(GAGs)の主要成分として存在する。動物性GAGsの一つであるヘパリンは血栓塞栓症や播種性血管内凝固症候群に対する抗凝血剤として使われる。
【０００３】
レクチンは単糖やオリゴ糖の構造を特異的に認識・結合するタンパク質の総称である。レクチンは全生物に存在し、シグナル伝達、細胞接着、細胞増殖の制御、生体防御などの役割を担っている。外来生物がもつ糖鎖とレクチンとの親和性に着目した先行研究では、免疫変調作用、抗細菌活性、抗ウィルス活性、癌細胞に対するアポトーシス、マイトジュン活性等が示された。糖鎖に対するレクチンの特異性は人の血液型、微生物の検出、正常細胞と悪性細胞の認識、特定の細胞が細胞表面にもつ糖鎖の探索等に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５０２０３７号公報
【特許文献２】特開２０１０−９１３０８号公報
【非特許文献１】Leibovici et al. 1986. Anticancer Res. ６: 1411−1415.
【非特許文献２】Avichezer et al. 1987. In: Lapis K, Ackhardt S, eds. Lectures and Symposia 14th Int. Cancer Cong, Budapest, Vol. II. pp. 79−85, Karger, Basel.
【非特許文献３】Zipris & Gilboa-Garber 1987. Develop. Comp. Immunol. 11: 501−511.
【非特許文献４】Nitta et al. 1987. Cancer Res. 47: 4877−4883.
【非特許文献５】Matsui et al. 1994. J. Biochem. 116: 1127−1133.
【非特許文献６】正木  弘実  日皮会誌 1972. 82: 233−238.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
糖酸結合性レクチンは、これまでに全ての生物群から発見されている(表１参照)。動物では子宮、胎盤、生殖腺、卵、体液等から単離され、その内、Aplysia depilans(アメフラシの一種)由来レクチンAGLはヒト末梢血リンパ球の有糸分裂を刺激し、AKRリンパ腫や肺癌細胞を凝集させる(非特許文献１−３)。ウシガエル(Rana catesbeiana)の卵由来レクチンSBL-Cはリボヌクレアーゼ活性を示し腹水ガン細胞(S-180、AH109A)を凝集する(非特許文献４)。マナマコ(Apostichopus japonicus)由来レクチンSPL-１は体腔細胞を凝集する(非特許文献５)。植物由来の糖酸結合性レクチンはその他の生物群のものに比べ、ほとんど知られていない。セイヨウニワトコ(Sambucus nigra)由来レクチンSNA-Iおよびイヌエンジュ(Maackia amurensis)由来レクチンMAA、MALは単糖のシアル酸に結合しないが、それぞれα２,６結合型シアル酸-ガラクトースとα２,３結合型シアル酸-ガラクトースと親和性をもつ。フヨウ(Hibiscus mutabilis)由来レクチンはガラクトン酸に特異的に結合する。
【０００６】
疾患の原因と考えられている糖鎖変化に着目した応用例では、肝細胞癌のα-フェトプロテイン抗原に付加するフコースの有無に関する診断薬としてレンズマメ(Lens culinaris)レクチンLCAが用いられる(特許文献１)。また、前立腺特異抗原(PSA)で露出する糖鎖中のシアル酸の結合形式に関する診断に、MAA、MALやSNA-Iが用いられる(特許文献２)。ただ、中性糖鎖における疾患原因に関する知見に比べ、全糖酸を対象とした酸性糖鎖については十分ではない。
【０００７】
これを解決するために、以下の特異性を有するレクチンが必要とされる: １）糖酸または酸性糖鎖と親和性がある、２）中性糖やアミノ糖含有糖鎖と親和性がない、３）糖酸の共通構造であるカルボキシル基を認識できる。既存の糖酸結合性レクチンは主に２グループに大分される: a) 中性糖やアミノ糖含有糖鎖にも親和性をもつグループ。b) 中性糖やアミノ糖含有糖鎖に対して親和性を示さず、特定の糖酸(例えば、シアル酸特異的またはシアル酸とウロン酸に親和性)や酸性糖鎖に特異的に結合するグループ。a) については、ヒト(Homo sapiens)由来レクチン: HHL、カイコ(Bombyx mori)由来レクチン: Bombyx agglutinin、Semibalanus balanoides(フジツボの一種): BRA-１、BRA-２、BRA-３、AGL、アメフラシ(Aplysia kurodai)由来レクチン: Aplysia kurodai agglutinin、ナミイソカイメン(Halichondria panicea)由来レクチン: Halichondria panicea lectin、SPL-１、MLA-１、SNA-I、アミヒラタケ(Polyporus squamosus)由来レクチン: PSAおよびBacillus subtilis (枯草菌の一種)由来レクチン: B. subtilis B-7025 lectinが該当する(表１参照)。これらは中性糖やアミノ糖による副反応を避けるために、好ましくない。また、b) については、ラット(Rattus norvegicus)由来レクチン: SAA、SBL-C、Heterometrus granulomanus(サソリの仲間)由来レクチン: Scorpin、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)由来レクチン: Limulus polyphemus agglutinin、フヨウ(Hibiscus mutabilis)由来レクチン: Hibiscus mutabilis lectin、ヤマブシタケ(Hericium erinaceum)由来レクチン: HEL、Paecilomyces japonica(ペシロミセス属の一種)由来レクチン: PJA、Aspergillus fumigates(コウジカビの一種)由来レクチン: A. fumigates hemagglutinin、Tritrichomonas mobilensis (トリコモナス属の一種)由来レクチン: TML、ウシ胎仔トリコモナス(Tritrichomonas foetus)由来レクチン: TFL、および大腸菌(Escherichia coli)由来レクチン: CS2が該当する(表１参照)。非特許文献では、これらはシアル酸特異的レクチンや酸性糖鎖結合性レクチンと記されるが、詳細な結合メカニズムは明らかにされていない。つまり、特定の糖酸に特異的に親和性を示す(条件１)に当てはまる既存レクチンは見出されているが、aldaric acidsやaldonic acidsにも親和性を示すための、糖酸に共通構造であるカルボキシル基を認識できる(条件３)と確認されたレクチンが見出されていない。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
本発明は全糖酸および酸性糖鎖に結合可能なレクチンおよびその精製法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は５つの発明を含む。第１の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をヘパリンアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチンに関する。
【００１１】
第２の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をゲルろ過に供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約27 kDaおよび単量体約105 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチンに関する。
【００１２】
第３の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはヘパリンアフィニティクロマトグラフィーのいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはヘパリンアフィニティクロマトグラフィーのいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法に関する。
【００１３】
第４の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法に関する。
【００１４】
第５の発明は、前記第１または第２の発明における植物由来糖酸結合性レクチンを有する出発物質であるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、少なくとも二つの精製工程を経ることで得られる全糖酸および酸性糖鎖に結合可能なレクチンおよびその精製法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の糖酸結合性レクチンの精製方法の実施を示す工程図。
【図２】精製用試料をSephadex G-50 mediumカラムに供試した結果を示すグラフ。凝集活性(レクチン活性)を示した画分はボイドボリュームで溶出され、太いバーで示した画分を回収した。■は吸光度280 nmの測定結果、▲は凝集活性の測定結果。
【図３】粗精製画分１をハイドロキシアパタイトに供試した結果を示すグラフ。凝集活性を示した画分は、非吸着画分 (粗精製画分２)、20-100 mM PB溶出画分(粗精製画分３)、500 mM PB溶出画分(粗精製画分４)それぞれで溶出され、太いバーで示した画分を切り離して回収した。
【図４】粗精製画分２をヘパリンカラムに供試した結果を示すグラフ。高い凝集活性を示した画分は０-0.5 M NaClグラジエントで溶出され、これを回収した。
【図５】粗精製画分３をTOYOPEARL HW-50Fカラムに供試した結果を示すグラフ。凝集活性を示した画分はボイドボリュームで溶出され、これを回収した。
【図６】粗精製画分４をHW-50Fカラムに供試した結果を示すグラフ。凝集活性を示した画分はボイドボリュームで溶出され、これを回収した。
【図７】精製画分１に関する各精製結果をSDS-PAGEに供した結果。Lanes １、８: 分子量マーカー(broad range)、lane ２: 抽出液、lane ３: 精製用試料、lane ４: 粗精製画分１、lane ５: 粗精製画分２、lane ６: 精製画分１ (還元下)、lane ７: 精製画分１ (非還元下)。矢頭は精製画分１のバンド。
【図８】精製画分２に関する各精製結果をSDS-PAGEに供した結果。Lanes １、８: 分子量マーカー、lane ２: 抽出液、lane ３: 精製用試料、lane ４: 粗精製画分１、lane ５: 粗精製画分３、lane ６: 精製画分２(還元下)、lane ７: 精製画分２ (非還元下)。矢頭は精製画分２のバンド。
【図９】精製画分３に関する各精製結果をSDS-PAGEに供した結果。Lanes １、８: 分子量マーカー、lane ２: 抽出液、lane ３: 精製用試料、lane ４: 粗精製画分１、lane ５: 粗精製画分４、lane ６: 精製画分３ (還元下)、lane ７: 精製画分３ (非還元下)。矢頭は精製画分３のバンド。
【図１０】糖酸結合性レクチンの温度安定性。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のレクチンの原料であるコマチゴケは、西日本を含む北東アジアを主な分布域とする普遍種であり、低地帯の土壌や倒木上に生育する。日本産コマチゴケ属には、コマチゴケ、キレハコマチゴケ(H. hookeri)、アイノコマチゴケ(H. minutum)が存在するが、これらの中で十分な量を確保可能な種であるコマチゴケを材料に選定した。
本レクチンは、磨り潰した植物試料に緩衝液を加えて、抽出液を得た後、濃縮した試料を液体クロマトグラフィー(ゲルろ過、ハイドロキシアパタイト、アフィニティー)により分離精製することで得られる。
【００１８】
レクチンの精製方法について、対象外の植物や土などの夾雑物を取り除いた植物試料を磨り潰し、適宜の緩衝液を加えて、タンパク質を抽出する。これを遠心分離して、上清と沈殿に分ける。さらに抽出液(上清)を適宜濃縮し、精製用試料(濃縮画分)を得る。
【００１９】
本レクチンそれぞれの精製・分離方法は３つの工程からなる。第一工程は精製用試料をゲルろ過カラムに供試する。塩を含む緩衝液で平衡化した同カラムに画分を添加し、同緩衝液で分離を行う。回収した各画分に対し、分光光度計でタンパク質の定量および動物赤血球を用いて凝集活性を測定した。この工程では本レクチンはボイドボリュームに出て、凝集活性を示す画分を粗精製画分１とする。
【００２０】
第二工程では、粗精製画分１をハイドロキシアパタイトカラムに供試する。適宜の緩衝液で平衡化したカラムに画分を添加し、緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液の濃度を二段階に分けて上げ、吸着したタンパク質を溶出する。この工程では、凝集活性は非吸着画分(粗精製画分２)、第一濃度で溶出する画分(粗精製画分３)、第二濃度で溶出する画分(粗精製画分４)それぞれで示される。各画分に含まれるレクチンの精製はそれぞれ以下の条件で行う。
【００２１】
粗精製画分２はヘパリンカラムに供試し、アフィニティークロマトグラフィーを行う。適宜の緩衝液で平衡化したカラムに画分を添加し、同緩衝液で洗浄後、塩濃度を二段階に分けて上げ、吸着したタンパク質を溶出する。この工程では、レクチンは第一濃度で溶出される。これを精製画分１として保存する。
【００２２】
粗精製画分３はゲルろ過カラムに供試する。塩を含む緩衝液で平衡化したカラムに画分を添加し、同緩衝液で分離を行った。この工程では、レクチンはボイドボリュームに出る。これを精製画分２として保存する。
【００２３】
粗精製画分４はゲルろ過カラムに供試する。塩を含む緩衝液で平衡化したカラムに画分を添加し、同緩衝液で分離を行った。この工程では、レクチンはボイドボリュームに出る。これを精製画分３として保存する。
本レクチンの物性について、保存した各精製画分の分子量をSDS-PAGEで測定した結果、精製画分１−３の順に、それぞれが還元・非還元下ともに約116 kDa、27 kDa、105 kDaから成る単一バンドであることを確認した。この結果から、コマチゴケから３つのレクチンを精製できたことを確認し、各レクチンはそれぞれの分子量の由来するHML116、HML27、HML105と命名した。なお、本レクチンの分子量に一致する既存の糖酸結合性レクチンは確認されなかった。
【００２４】
次に、各レクチンの糖化合物に対する親和性および特異性を明らかにした。レクチンの凝集活性に対する阻害剤には、糖化合物(中性糖、アミノ糖、酸性糖、糖タンパク質、GAGs)、酸性アミノ酸を用いた。その結果、本レクチンの凝集活性は、中性糖、アミノ糖、酸性アミノ酸などに阻害されず、酸性糖(糖酸)、酸性糖鎖を含む糖タンパク質およびGAGsと親和性をもつことが示された。このことから、本レクチンそれぞれが糖酸結合性レクチンであると判断した。
【００２５】
本レクチン間での特異性に関する共通点および相違点から、本レクチンが糖化合物中のカルボキシル基を認識し、環状の糖におけるその官能基の結合方向(垂直と水平)と、カルボキシル基および隣接するヒドロキシル基から成る（α-またはβ-）ヒドロキシ酸が本レクチンの認識の違いに関係すると推定された。
推定された各レクチンの特異性の裏付けとして、ヒドロキシ酸構造を有する有機酸化合物に対する親和性を調べた結果、本レクチンの凝集活性は供試した全ての化合物によって阻害された。この結果から、本レクチンはヒドロキシ酸構造を有する化合物(糖酸、酸性糖鎖および有機酸)を認識できると考えられた。本来、レクチンは糖化合物を特異的に認識・結合するタンパク質と定義されており、本レクチンの特異性は特筆すべき特徴であり、同特性を有するタンパク質が見出された文献はない。
【００２６】
本レクチンの耐熱性について、本レクチンを熱処理後、凝集活性を測定したところ、本レクチンの凝集活性は、室温からオートクレーブ滅菌処理(121℃)まで変化しなかった。この結果から、本レクチンは高い耐熱性をもつことが示された。オートクレーブ滅菌まで耐えられるタンパク質は、リボヌクレアーゼ(RNase)や好熱菌がもつタンパク質など、ごく一部に限られる。
【００２７】
以上、本レクチンの物性(分子量、特異性、熱耐性)結果から、本レクチンが新規タンパク質であると特定できる。本レクチンのソースは、糖酸結合性をキーとした類似の特性を有する既知レクチンを起点とした生物種由来ではなく、天然のコケ植物である。故に、本発明は、既存の糖酸結合性レクチンが係わる特許文献および非特許文献いずれにも関連しない。
この特異性は、単純にあらゆるカルボキシル基含有化合物を認識するよりも、ヒドロキシ酸含有化合物(糖酸を含む)を認識する点でより選択的と言える。従って、本発明で得た全てのレクチンは、本課題を解決するための３要件を満たしている。
【実施例】
【００２８】
本発明の精製方法および物性試験の実施例・比較例について、図表を参照して説明する。以下、本発明に関する実施例を詳細に述べるが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。コマチゴケからレクチンを抽出・精製する一連の方法を提供するとともに、その際に得られた各レクチンの収量についても述べる。
【００２９】
(糖酸結合性レクチンの精製方法)
対象外の植物や土などの夾雑物を取り除くために、採集した植物試料を水で洗浄し、冷凍(-80℃下で)保存した。凍結した試料(生重量100 g)を乳鉢上で磨り潰し、１/５倍量(volume/weight)にあたる20 mlの100 mM トリス-塩酸緩衝液(TB、pH 7.5)を加えて、４℃下で一晩撹拌し、タンパク質を抽出した。これを遠心分離(15,000 rpm、30 min、４℃)し、上清(抽出液)と沈殿(抽出残渣)に分けた。沈殿は２次抽出のために冷蔵保存した。抽出液107 mlに対し、75%飽和になるように硫安アンモニウム(硫安)を55.21 g加え、30 min撹拌後、４℃下で一晩静置した。これを遠心分離し、上清と沈殿物に分けた。上清は処分し、沈殿物を少量の20 mM TB (pH 7.5)で懸濁させ、同緩衝液を外液とする透析(６h毎に計６回交換、以下同条件)で、硫安を除いた。内液を回収後、遠心分離し、上清を75%飽和硫安沈殿画分(精製用試料、25 ml)とした。
【００３０】
本レクチンの精製・分離方法は３つの工程からなる（図１参照）。精製の第一工程は、精製用試料をSephadex G-50 medium (GE Healthcare Life Sciences社製)に供試して、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。0.3 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)で平衡化したG-50カラム(Column Volume、CV = 150 ml)に、精製用試料を４分割にして添加し、同緩衝液で分離を(計４回)行った。分割した理由は、カラムサイズと精製用試料中のタンパク質量を考慮した上で、一度の分離操作での許容範囲が100 mg未満であることが望ましいと判断したからである。また、精製用試料添加の際は、緩衝液による試料の希釈を抑えつつ、かつ樹脂(G-50)が乾燥しない程度までカラム中の同緩衝液を除くことで、効率化を図った。流速は１ ml/min以下とした。各精製実験における回収した各画分に対し、吸収光280 nmによるタンパク質の定量結果を◆で示し(単位: mg/ml)、およびウサギ赤血球(日本バイオテスト研究所)を用いた凝集活性の結果を▲で示した。ウサギの赤血球は、保存血を0.15 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)溶液で洗浄したものである。図２に示したように、第１工程では凝集活性を示した画分はボイドボリュームで溶出されたことから、本レクチンは担体の孔に入らず溶出されたと判断した。上部太いバーで示した画分は５ mMリン酸緩衝液(PB、pH 7.0）を外液に透析した。透析した画分を粗精製画分１とした。
【００３１】
第二工程では、粗精製画分１を遠心分離(9,000 rpm、30 min、４℃、以降同条件)後、上清(32 ml)をハイドロキシアパタイトカラム(日本ケミカル株式会社、生化学工業株式会社製)に供試した。５ mM PBで平衡化したカラム(CV = 20 ml)に画分を添加し、20 mM PBで非特異的タンパク質を洗浄した。それから20-100 mM PBのグラジエント法(５CV、100 ml)による溶出、100 mM PBで十分にカラムを洗浄後、さらに500 mM PBで溶出した。流速は0.5 ml/min以下とした。この工程では、凝集活性は非吸着画分(粗精製画分２)、20-100 mM PBで溶出された画分(粗精製画分３)、500 mM PBで溶出された画分(粗精製画分４)それぞれで示された(図３参照)。各粗精製画分に含まれるレクチンの精製はそれぞれ以下の条件で行った。
【００３２】
粗精製画分２は20 mM TB (pH 7.5）を外液に透析した。回収した内液を遠心分離後、上清(42 ml)をHeparin Sepharose CL-6Bカラム(GE Healthcare Life Sciences社製)に供試し、アフィニティークロマトグラフィーを行った。20 mM TBで平衡化したカラム(CV =６ ml)に画分を添加し、同緩衝液で洗浄後、０-0.5 M NaClを含む緩衝液によるグラジエント法(５CV、30 ml)で溶出、さらに２ M NaClを含む緩衝液で溶出した。流速は0.3 ml/min以下とした。この工程では、凝集活性は０-0.5 M NaClで溶出された画分で示された(図４参照)。上部太いバーで示した画分は超純水を外液に透析し、凍結乾燥法で濃縮した。乾燥粉末を20 mM TB(pH 7.5)で懸濁し、遠心分離で沈殿を除いた。これを精製画分１とした。
【００３３】
粗精製画分３は、超純水を外液に透析を行い、凍結乾燥法で濃縮した。少量の20 mM TB(pH 7.5)で懸濁し、遠心分離で沈殿を除いた後、上清(0.3 ml)をTOYOPEARL HW-50F(TOSOH社製)に供試して、ゲルろ過クロマトを行った。0.3 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)で平衡化したカラム(CV = 50 ml)に画分を添加し、同緩衝液で分離を行った。G-50の場合と同じ要領で試料添加量、分離効率および流速を設定した。この工程で、レクチンはボイドボリュームに出てきた(図５参照)。上部太いバーで示した画分を精製画分１と同様の処理を行った。
【００３４】
粗精製画分４は、超純水を外液に透析を行い、凍結乾燥法で濃縮した。少量の20 mM TBで懸濁し、遠心分離で沈殿を除いた後、上清(0.5 ml)をHW-50Fに供試して、ゲルろ過クロマトを行った。0.3 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)で平衡化したカラムに画分を添加し、同緩衝液で分離を行った。この工程で、レクチンはボイドボリュームに出てきた(図６参照)。上部太いバーで示した画分を精製画分１と同様の処理を行った。
【００３５】
各精製画分をSDS-PAGEに供した結果を図７−９に示した。図７では、精製画分１に関する精製結果を示した。精製画分１(Lanes６，７)は還元・非還元下ともに約116 kDaから成る単一バンドを確認した(共に添加量10 μg)。図８では、精製画分２に関する精製結果を示した。精製画分２(Lanes６，７)は還元・非還元下ともに約27 kDaから成る単一バンドを示した(共に添加量５ μg)。図９では、精製画分３に関する精製結果を示した。精製画分３(Lanes６，７)は両条件下約105 kDaから成る単一バンド(共に添加量10 μg)を確認した。この結果から、３つのレクチンが精製されたことを確認し、それぞれの分子量に由来して、HML116、HML27、HML105とそれぞれ命名した。
本レクチンを精製した一連の工程で得られた実験結果を表２にまとめた。
【００３６】
【表２】
2017088554.tif 000004
【００３７】
表２に示した一連の精製工程の結果について、G-50以降の各結果は、粗精製画分１を４分割したうちの１回のゲルろ過実験の結果を元に、以降の各工程で得られた結果を示した。各画分の最終的なタンパク質量は、BCA(Bicinchoninic acid)法で定量した。Specific activityおよびPurification foldの値は、工程を踏む毎に上がっていることも確認された。最終的に、生鮮試料100 gから得られた各レクチンの収量について、HML116は約100 μg、HML27は約100 μg、HML105は約250 μgであった。ただし、２次・３次の抽出でも同手法で同程度のレクチンを精製できた。また、本実施例で用いた試料と異なる年度に、複数の地域で採集した同植物に対し、同一実験条件でも精製できることを確かめた。
【００３８】
実施例２ (赤血球凝集活性試験)
レクチンの凝集活性を測定するために、ウサギの赤血球を用いた赤血球凝集試験を行った。試験はV字プレートで行った。各ウェルに0.15 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)を25 μlずつ入れ、レクチン試料25 μlを使って、連続２倍希釈してレクチン溶液を調整した。各ウェルにウサギの赤血球を25 μlずつ入れ、撹拌後、室温で１時間静置し、凝集を目視で確認した。レクチンの凝集活性は力価で示し、凝集がみられる最大希釈倍率で表した。
【００３９】
実施例３ (糖阻害試験)
精製された各レクチンの特性として、糖化合物に対する親和性を調べた。それはウサギの赤血球を用いた赤血球凝集阻害試験で確認した。試験はV字プレートで行った。各阻害化合物の調整について、0.15 M NaClを含む20 mM TB (pH 7.5)を用いて、各ウェル(液量25 μl)に含まれる濃度が、低分子化合物の場合、200 mM (１ウェル目)、100 mM (２ウェル目)、50 mM (３ウェル目)、25 mM (４ウェル目)となるように、連続２倍希釈で糖溶液を調整した。力価を４-８に調整したレクチン溶液を各ウェルに25 μlずつ添加し、撹拌後、室温で70分静置した。さらに各ウェルにウサギの赤血球を25 μlずつ入れ、撹拌後、70分静置し、凝集を目視で確認した。その際、実施例２の赤血球凝集活性の測定、凝集活性のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に行った。
【００４０】
凝集阻害に用いた化合物は以下の通りである。単糖: D-glucose、D-galactose、D-mannose、D-fucose、D-xylose、L-rhamnose、N-acetylneuraminic acid (NANA)、D-glucuronic acid (GlcA)、α-D-galacturonic acid (GalA)、D-glucaric acid potassium、D-gluconic acid potassium、アミノ糖: N-acetyl-D-glucosamine、N-acetyl-D-galactosamine、二糖: D-lactose、糖タンパク質: porcine thyroglobulin、bovine submaxillary mucin (BSM)、上記２つのアシアロ糖タンパク質、グライコサミノグリカン: chondroitin sulfate (CS、CS4S、CS6S)、dermatan sulfate、heparin、heparan sulfate、hyaluronic acid、pectin、酸性アミノ酸: L-sodium aspartate、L-sodium glutamate。単糖、二糖、アミノ酸の各濃度は100 mM、糖酸は200 mM、糖タンパク質およびグライコサミノグリカンは2000 μg/mlで調製した。NANA、GlcA、GalAおよびglucaric acid溶液のpHは、調製時に炭酸水素ナトリウムで中和した。本発明で得られた各レクチンの阻害化合物に対する親和性の結果を表３に示した。
【００４１】
【表３】
2017088554.tif 000005
【００４２】
表３の各数値は、力価を４−８に調整したレクチンに対して、凝集阻害が確認された最少濃度を表している。値が小さいほど高い親和性を示している。本レクチンの凝集活性は共通してNANA、glucaric acid、BSM、heparinに阻害され、さらにHML27ではGalAとGlcA、HML105ではGalAとgluconic acidで阻害された。反対に、中性糖(glucose、galactose、rhamnose等)、アミノ糖、BSM以外の糖タンパク質、heparin以外のグライコサミノグリカン、酸性アミノ酸によって、本レクチンの活性は阻害されなかった。なお、単糖150 mM以上での阻害は、過剰量を理由に阻害なしとした。この結果を踏まえ、各レクチンが糖酸結合性レクチンであると判断した。
【００４３】
各レクチン特異性に関し、これらの共通点は糖酸および酸性糖鎖に親和性を示した点である。これは、本レクチンが糖化合物中のカルボキシル基を認識していることを示唆している。反対に、相違点は糖酸に対する親和性が異なる点である。これは、環状の糖におけるカルボキシル基の結合方向(垂直と水平)と、カルボキシル基および隣接するヒドロキシル基から成る（α-またはβ-）ヒドロキシ酸が本レクチンの認識に強く関係すると推定された。
【００４４】
実施例４ (本レクチンの特異性の検証)
推定された各レクチンの特異性の裏付けとして、ヒドロキシ酸を含む有機酸化合物(trisodium citrate、sodium tartrate、共に200 mM)を用いた赤血球凝集阻害試験を行った結果、本レクチンの凝集活性が両化合物で阻害された(表３参照)。この結果から、本レクチンはヒドロキシ酸構造を有する糖化合物（糖酸や酸性糖鎖）や有機酸（citric acid、tartaric acidなど）を認識できると考えられた。
【００４５】
実施例５ (耐熱性に関する比較)
本レクチンの温度安定性を調べた。30-120℃の範囲で、10℃ 間隔に設定した温度下で各試料(30 μl/tube)を20 min処理し、2 min氷冷した。これら凝集活性を測定し、室温(25℃)での活性と比較した。30℃から110℃までの熱処理はヒートブロックを用い、120℃処理はオートクレーブ滅菌(121℃、２気圧、20 min)にて行った。活性の測定は実施例２に従った。試験の結果、本レクチンの凝集活性は、いずれも室温から120℃まで変化せず一定であった(図10参照)。なお、120℃熱処理・測定後に、凝集活性を示したウェルに任意の阻害剤を少量加えると、そのウェルの凝集活性は阻害された。同条件下での比較対象として用いた任意のレクチン試料では、50℃から活性が減少し、70℃で完全に失活した。この結果から、変性温度が60℃の典型的なタンパク質に比べ、本レクチンは高い耐熱性をもつことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
ヒトの生命活動や疾患の原因に、シアル酸含有糖鎖やその糖鎖の変化が深く関わっているが、中性糖鎖における疾患原因に関する知見に比べ、全糖酸を対象とした酸性糖鎖については十分ではない。また、これまでにヒドロキシ酸構造をもつ糖化合物を認識するレクチンを用いた先例はない。本発明によって、その構造をもつ全糖酸が対象可能になり、酸性糖鎖の変化による影響が明らかになることで、その糖鎖の生物学的役割や変化による疾患の原因解明等が期待される。
乳酸、クエン酸、キナ酸などのヒロドキシ酸化合物は、解糖系、クエン酸回路、シキミ酸経路などの重要な代謝物である。そのため、食品や医薬など幅広い分野でヒドロキシ酸化合物が利用されている。従来、食品中のクエン酸やリンゴ酸などの化合物の分析法は、目的の化合物を酵素処理し、得られた反応物を検出することで定量している。例えば、クエン酸の定量法は、クエン酸をクエン酸リアーゼでオキサロ酢酸と酢酸に変換し、さらにリンゴ酸脱水素酵素および乳酸脱水素酵素の存在下、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)により還元される。この際の酸化されるNADH量がクエン酸量に化学量論的に比例するため、酸化物NAD+を検量することでクエン酸を定量している。本レクチンの特異性は、糖酸や酸性糖鎖に限らず、解糖系、クエン酸回路、シキミ酸経路などに含まれるヒドロキシ酸化合物(代謝物)にも及ぶ。かつ、一般的にレクチンと対象物は直接結合するので、測定に多くの試薬を要し、間接的な検出に留まる従来の方法と比べ、本発明による３つのレクチンを用いることは、より簡便に対象物を検出できる手法の確立に繋がると予想される。
また、医薬分野では、ヒドロキシ酸の一つであるヒドロキシクエン酸は、ガン細胞で高い発現を示すATPクエン酸リアーゼの活性(EC ４.１.３.８)を阻害する。この酵素が阻害されると、ミトコンドリアからでたクエン酸がアセチルCoAに変換できなくなり、ガン細胞の発生や悪性化に必要な脂肪酸の合成が抑制され、結果的にガン細胞の増殖抑制に繋がる。さらにアルファリポ酸と組み合わせることで、ガン細胞に細胞死を起こしやすくなる。本発明による３つのレクチンは、それらヒドロキシ酸化合物の有効性、ガン細胞に対する作用機序、化合物そのものの蓄積や代謝による細胞毒性などを検証する上で役立つことが考えられる。
タンパク質の温度安定性に関し、オートクレーブ滅菌に耐えられるタンパク質は、リボヌクレアーゼ(RNase)や好熱菌がもつタンパク質など、ごく一部に限られる。そのため、高い耐熱性を示した本レクチンの利用性(効果)は、１) 高い耐熱性の分子機構に関する不足した知見を補い、２) 高い耐熱性を必要とする抗体や酵素などのタンパク質の設計基準に寄与し、３) 一般タンパク質の異常による高安定性タンパク質が引き起こす疾患(アルツハイマー、プリオン病など)の原因解明につなげられる。
【図１】
2017088554.tif 000006
【図２】
2017088554.tif 000007
【図３】
2017088554.tif 000008
【図４】
2017088554.tif 000009
【図５】
2017088554.tif 000010
【図６】
2017088554.tif 000011
【図７】
2017088554.tif 000012
【図８】
2017088554.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2017088554.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月25日(2015.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチン。
【請求項２】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をゲルろ過に供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約27 kDaおよび単量体約105 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチン。
【請求項３】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーのいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーのいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法。
【請求項４】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはゲルろ過のいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの
精製方法。
【請求項５】
請求項１および請求項２を有する出発物質であるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は５つの発明を含む。第１の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなる植物由来糖酸結合性レクチンに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
第３の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーのいずれか一方に供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーのいずれか他方に供する第三工程とを備える植物由来糖酸結合性レクチンの精製方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【表３】
2017088554.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月20日(2016.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDa、約105 kDa、または約27 kDaの分子量の少なくともいずれかひとつからなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチン。
【請求項２】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチンの精製方法。
【請求項３】
試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をゲルろ過に供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約27 kDaおよび単量体約105 kDaの分子量の少なくともいずれかひとつからなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチンの精製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は３つの発明を含む。第１の発明は、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDa、約105 kDa、または約27 kDaの分子量の少なくともいずれかひとつからなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチンに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
第２の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をアフィニティクロマトグラフィーに供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約116 kDaの分子量からなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチンの精製方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
第３の発明は、試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供する第一工程と、前記第一工程で得られた画分をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供する第二工程と、前記第二工程で得られた画分をゲルろ過に供する工程とを経て精製され、糖酸結合性および高耐熱性を有し、かつ、単量体約27 kDaおよび単量体約105 kDaの分子量の少なくともいずれかひとつからなるコマチゴケ(Haplomitrium mnioides)由来糖酸結合性レクチンの精製方法に関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】