(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な精度で、かつ簡易にタンパク質立体構造を予測することのできる方法を提供する。【解決手段】予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、少なくとも二種の既知タンパク質の立体構造を互いに重複部分が最大となるように重ね合わせることにより、それぞれの立体構造が重複する部分と重複しない部分とを、それぞれ複数ずつ決定し、重複する部分については、そのままその部分に相当する予測対象タンパク質の予測部分構造（核）として採用し、重複しない部分については、その部分に相当する予測対象タンパク質の部分構造を鋳型としてさらに部分的な構造予測を行うことにより予測部分構造（部品）を複数種抽出し、核と複数種の部品との組合せを、生体内温度でシミュレートすることにより、安定した構造群へと変換させることを利用してタンパク質立体構造を予測する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の部分立体構造を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、少なくとも二種の既知タンパク質の立体構造を互いに重複部分が最大となるように重ね合わせることにより、それぞれの立体構造が重複する部分と重複しない部分とを、それぞれ一以上ずつ決定する工程；
（２）工程（１）で決定された、立体構造が重複する各部分を、予測対象タンパク質の第一次予測部分構造として決定する工程；
（３）工程（１）で決定された、立体構造が重複しない各部分のアミノ酸配列について、それぞれ高い相同性を有する、少なくとも一種の既知タンパク質のアミノ酸部分配列を決定し、該既知タンパク質の立体構造のうち、該アミノ酸部分配列に対応する部分構造のそれぞれを、予測対象タンパク質の当該部分についての第一次予測部分構造候補として決定する工程；
（４）工程（１）で決定された第一次予測部分構造と、工程（３）で決定された第一次予測部分構造候補のそれぞれを互いに組み合わせることにより、第一次予測全体構造候補をそれぞれ決定する工程；及び
（５）工程（４）で決定された第一次予測全体構造候補それぞれに対して分子動力学計算を行い、最も各候補間で共通して安定な構造となっている部分構造を抽出し、該部分構造を予測対象タンパク質の第二次予測部分構造として決定する工程。
【請求項２】
工程（５）における前記分子動力学計算によって、生体内における熱力学的挙動をシミュレーションする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（５）における部分構造の抽出を、クラスタリングにより行う、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の部分立体構造を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、in silicoスクリーニング技術としては、大きく分けてLigand-Based Drug Design (LBDD)法と、Structure-Based Drug Design (SBDD)法とが用いられている。
【０００３】
LBDD法においては、薬理効果を有する幾つかの既存薬が必要であり、薬物間相互作用特性を予測して新規候補化合物を生成する。
【０００４】
一方でSBDD法においては、薬物標的となるタンパク質構造が既に明らかとなっている必要があり、そのタンパク質の標的部位を基に新規候補化合物を生成する。
【０００５】
このように、従来の手法では、立体構造が明らかになっていない新規標的タンパク質に対するスクリーニングを行う場合、SBDD法はもちろんのこと、複数個の既存薬が分かっていなければLBDD法も行うことはできなかった。
【０００６】
タンパク質立体構造の予測方法がいくつか提案されているが（非特許文献１及び２）、SBDD法に使用できるほど十分な精度で、かつ簡易に予測できる方法はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D. Petrey, et al., Using Multiple Structure Alignments, Fast model Building, and Energetic Analysis in Fold Reecognition and Homology Modeling. Proteins.53, 430-435 (2003)
【非特許文献２】K. Zhu, et al., Antibody structure determination using a combination of homology modeling, energy-based refinement, and loop prediction. Proteins.82, 1646-1655 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、十分な精度で、かつ簡易にタンパク質立体構造を予測することのできる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、
（ｉ）予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、少なくとも二種の既知タンパク質の立体構造を互いに重複部分が最大となるように重ね合わせることにより、それぞれの立体構造が重複する部分と重複しない部分とを、それぞれ複数ずつ決定し、
（ｉｉ）重複する部分については、そのままその部分に相当する予測対象タンパク質の予測部分構造（核）として採用し、
（ｉｉｉ）重複しない部分については、その部分に相当する予測対象タンパク質の部分構造を鋳型としてさらに部分的な構造予測を行うことにより予測部分構造（部品）を複数種抽出し、
（ｉｖ）核と複数種の部品との組合せを、タンパク質の予測全体構造とし、さらに、
（ｖ）このようにして得られた予測全体構造を、生体内温度で動かす（シミュレートする）ことにより、安定した構造群へと変換させる、
という方法論を採用することにより、高精度かつ簡易に構造予測を行うことができることを見出し、この本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記の実施形態を含む。
項１．
タンパク質の部分立体構造を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、少なくとも二種の既知タンパク質の立体構造を互いに重複部分が最大となるように重ね合わせることにより、それぞれの立体構造が重複する部分と重複しない部分とを、それぞれ一以上ずつ決定する工程；
（２）工程（１）で決定された、立体構造が重複する各部分を、予測対象タンパク質の第一次予測部分構造として決定する工程；
（３）工程（１）で決定された、立体構造が重複しない各部分のアミノ酸配列に対応する予測対象タンパク質の各部分について、それぞれ高い相同性を有する、少なくとも一種の既知タンパク質のアミノ酸部分配列を決定し、該既知タンパク質の立体構造のうち、該アミノ酸部分配列に対応する部分構造のそれぞれを、予測対象タンパク質の当該部分についての第一次予測部分構造候補として決定する工程；
（４）工程（１）で決定された第一次予測部分構造と、工程（３）で決定された第一次予測部分構造候補のそれぞれを互いに組み合わせることにより、第一次予測全体構造候補をそれぞれ決定する工程；及び
（５）工程（４）で決定された第一次予測全体構造候補それぞれに対して分子動力学計算を行い、最も各候補間で共通して安定な構造となっている部分構造を抽出し、該部分構造を予測対象タンパク質の第二次予測部分構造として決定する工程。
項２．
工程（５）における前記分子動力学計算によって、生体内における熱力学的挙動をシミュレーションする、項１に記載の方法。
項３．
工程（５）における部分構造の抽出を、クラスタリングにより行う、項１又は２に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、十分な精度で、かつ簡易にタンパク質立体構造を予測することのできる方法を提供することができる。
【００１２】
また、本発明の方法は、従来のホモロジーモデリング手法とは異なり、予測対象タンパク質のコアドメイン全域に渡り高いアミノ酸配列相同性を示す既知タンパク質を特定できない場合であっても、立体構造を予測しうる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の方法を模式的に示した図である。
【図２】本発明の方法を利用した薬物スクリーニングの模式図である。
【図３】本発明の方法により得られた予測構造と、Ｘ−線結晶解析により得られた立体構造とを対比した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．工程（１）
工程（１）は、予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、少なくとも二種の既知タンパク質の立体構造を互いに重複部分が最大となるように重ね合わせることにより、それぞれの立体構造が重複する部分と重複しない部分とを、それぞれ一以上ずつ決定する工程である。
【００１５】
予測対象タンパク質に対して高いアミノ酸配列相同性を有する、既知タンパク質の立体構造は、公知の手段により探索することができる。特に限定されないが、例えば、BLAST等を用い、Protein Data Bank（PDB）に登録されているタンパク質構造の中から相同性検索により探索することができる。上記探索のためには、他にも、FASTA等も用いることができる。
【００１６】
２．工程（２）
工程（２）は、工程（１）で決定された、立体構造が重複する各部分を、予測対象タンパク質の第一次予測部分構造として決定する工程である。便宜上、このようにして決定された第一次予測部分構造を、「核」と呼ぶことがある。
【００１７】
３．工程（３）
工程（３）は、工程（１）で決定された、立体構造が重複しない各部分のアミノ酸配列に対応する予測対象タンパク質の各部分について、それぞれ高い相同性を有する、少なくとも一種の既知タンパク質のアミノ酸部分配列を決定し、該既知タンパク質の立体構造のうち、該アミノ酸部分配列に対応する部分構造のそれぞれを、予測対象タンパク質の当該部分についての第一次予測部分構造候補として決定する工程である。
【００１８】
便宜上、このようにして決定された第一次予測部分構造を、「部品」と呼ぶことがある。
【００１９】
これらの各部分について、高い相同性を有する既知タンパク質のアミノ酸部分配列を決定するには、公知の手段を利用することができる。特に限定されないが、例えば、BLAST等を用い、PDBに登録されているタンパク質構造の中から相同性検索により探索することができる。上記探索のためには、他にも、FASTA等も用いることができる。
【００２０】
この段階において、各部分に相当する部品を、少なくとも二種以上決定したほうが、後述の通り核と組み合わせて構造予測を行う際に、予測精度を向上することができるため、好ましい。
【００２１】
４．工程（４）
工程（４）は、工程（１）で決定された第一次予測部分構造と、工程（３）で決定された第一次予測部分構造候補のそれぞれを互いに組み合わせることにより、第一次予測全体構造候補をそれぞれ決定する工程である。
【００２２】
第一次予測全体構造候補は、核及び部品の組合せであり、それらの種類が多くなれば、組合せの種類も多くなるため、候補の数が増える。候補の場合が多いほうが、後述の構造予測を行う際に、予測精度を向上することができるため、好ましい。
【００２３】
例えば、核が一つであり、部品の存在する箇所が二箇所ある場合であって、それぞれの箇所において二種類ずつの部品が得られている場合は、核と部品の組合せとしては４通りが得られることになる（図１）。核が一つであり、部品の存在する箇所が三箇所ある場合であって、それぞれの箇所において二種類ずつの部品が得られている場合は、核と部品の組合せとしては６通りが得られることになる。
【００２４】
この段階で得られる、第一次予測全体構造候補については、ラマチャンドラン・プロットで禁制領域に入る領域がたとえ多くても問題としない。そのような領域が多数あったとしても、以後の構造予測により最適な構造を決定することができるためである。
【００２５】
５．工程（５）
工程（５）は、工程（４）で決定された第一次予測全体構造候補それぞれに対して分子動力学計算を行い、最も各候補間で共通して安定な構造となっている部分構造を抽出し、該部分構造を予測対象タンパク質の第二次予測部分構造として決定する工程である。
【００２６】
この工程は、特に限定されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００２７】
まず始めに、構造の安定化を行う。安定化は、特に限定されないが、例えば、Energy Minimization法により行うことができる。ここでは、タンパク質が持つ不自然な構造を生体内の温度揺らぎ（分子振動）を考慮せずに、ある程度緩和させる。内部エネルギーを各原子間距離、原子核度及び二面角によって記述される関数としてあらわし、そのエネルギー値を減少させるように微分方程式を解く。このときには例えば、原子が得る力の大きさに応じて、最急降下法とニュートン法とを組合せることができる。
【００２８】
また、上のようにして第一次予測全体構造候補をエネルギーが小さい方向へと緩和させる際に、特に限定されないが、例えば、各第一次予測全体構造候補の周囲に緩衝水を配置することができる。より具体的には、12 [Å]の緩衝水（TIP3P）を配置することができる。緩衝水の配置により対象内部での水素結合形成によって引き起こされる凝縮等を緩和する事が出来る。
【００２９】
その後、分子動力学計算を利用して、第一次予測全体構造候補を揺らがせる。特に限定されないが、通常、生体内温度に相当する温度において行うことができる。一例として、310 [K] において行うことができる。特に限定されないが、温度上昇は、ゆっくりと行うことが好ましい。例えば、ステップ幅0.0002 [ps]で500,000ステップかけてゆっくりと310 [K]まで昇温させるなどして、ゆっくりと行う。
【００３０】
昇温後、上記の昇温ステップ数に相当する数の構造トラジェクトリを蓄積する。例えば、上記例のように、5,000,000ステップかけて昇温した場合には、5,000,000ステップの構造トラジェクトリを蓄積する。熱揺らぎの過程で十分な時間シミュレートすれば、一般的に不自然な三次元構造部分は消滅させることが可能である。
【００３１】
この構造緩和過程において、全体構造のRMSD（Root Mean Square Deviation）の変異量が十分小さくなるまで分子動力学計算を続ける。十分量なサンプリングがなされているかの判断は、蓄積されたRMSDの偏差がその分割数によらず一定になっているかどうか（Reblocking Analysis）で判定することができる。（J. Chem. Phys. 91, 461, 1989）
上記部分構造の抽出を、クラスタリングにより行うことができる。クラスタリングとしては、特に限定されず、通常用いられる構造クラスタリングの手法を利用することができる。例えば、薬物が結合する空間の周囲5 [Å]に存在する残基だけをできるだけ重ね合せた（RMSDが最小になるようにした）後、RMSDが小さく重なりが大きいものの順に、似たような構造で振り分けることが可能である。
【００３２】
また、本工程においては、必要に応じて、かつ可能な限りにおいて、部分構造ではなく全体構造を同様のプロセスにより決定することとしてもよい。
【００３３】
本発明においては、さらに、上記のようにして得られた部分予測構造、例えば、代表触媒構造を用いて、薬物スクリーニングを行うことができる（図２）。薬物スクリーニングは、薬物候補化合物の結合可否を判定する工程を含む１次スクリーニングと、脱水和作用及び／又は構造変化を考慮した、薬物候補化合物の２次スクリーニングと、さらに薬物候補化合物の類似性クラスタリングとからなっていてもよい。
【００３４】
特に限定されないが、薬物候補化合物の類似性クラスタリングは、Finger Printや、体積等を考慮して行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
実施例１：タンパク質予測構造の作成
Jarid1Bタンパク質のコアドメイン構造を、構造類似性の高いファミリータンパク質である1A、1C及び1Dのいずれも用いずに予測し、Structure-Based Drug Design（SBDD）に必要な立体構造を抽出した。
【００３７】
Jarid1Bのコアドメインのアミノ酸配列は、配列番号１に示される通りである（117塩基）であることが既に報告されている。
【００３８】
ここでBLASTを用いて、 PDBに登録されているタンパク質構造の中から、Jarid1Bのアミノ酸配列との相同性の高いタンパク質群を検索した。その中から比較的高い相同性を持つ複数のタンパク質の三次元構造を重ね合せ、配列、三次元構造共に重なりが高い部分はその三次元構造を採用した。
【００３９】
一方、重なりが低い部分に関しては、その重なりが低い参照配列のみを用いて同様に相同性の高いタンパク質を探索し、三次元構造を抽出した。この三次元構造を「部品」と呼ぶ。この過程によって、コアドメインの中で核となる比較的大きなタンパク質三次元構造と、小さな部品となる三次元部分構造を抽出することが可能となる。
【００４０】
これらの大きなタンパク質三次元構造に対して、小さな部品の組合せにより、複数のタンパク質構造を作成した。この時点ではラマチャンドラン・プロットで禁制領域が多くても問題としないこととした。
【００４１】
次に、タンパク質構造の熱揺らぎシミュレートを、以下の通り行った。
【００４２】
作成した予測構造を、分子動力学法を用いて生体内温度（310 [K]）で揺らがせた。各予測構造に対して、タンパク質周囲に12 [Å]の緩衝水（TIP3P）を配置した。Energy Minimization法により構造を安定化させた後、ステップ幅0.0002 [ps]で500,000ステップかけてゆっくりと310 [K]まで昇温させた。その後、5,000,000ステップの構造トラジェクトリを蓄積した。この熱揺らぎの過程で十分な時間シミュレートすれば、一般的に不自然な三次元構造部分は消滅させることが可能である。
【００４３】
さらに、In Silico創薬のためのタンパク質構造の抽出を、以下の通り行った。
【００４４】
それぞれの初期構造からシミュレートしたそれぞれの構造トラジェクトリを、その触媒部位周辺の残基の三次元配向でクラスタリングすることにより、SBDDに必要な立体構造を抽出した。
【００４５】
試験例１：得られた予測構造の評価
上述した手法により得られた構造トラジェクトリから選ばれた平均的な触媒部位の構造と、X-線結晶解析により抽出された構造（PDB ID: 5A3N）との比較を図３に示した。また、先のトラジェクトリから触媒部位のアミノ酸のみで構造クラスタリングをかけて、SBDDに必須な代表的なタンパク質構造を抽出することに成功した。
【００４６】
本発明により得られた予測構造と、X-線結晶解析により得られた立体構造とを比較すると、非常に類似した構造を抽出することに成功していることが判る。本発明により得られた予測構造においては生体内温度での分子運動が表現されているため、X-線結晶構造と比較して、ややアミノ酸残基間の距離、つまり触媒部位空間が少々広く観測されることと、残基の方向が少々異なる点も存在するが、その残基間の配向は維持されていた。本発明により得られるように、生体内温度での熱揺らぎを考慮した配座から複数の代表構造を抽出するほうが、SBDDにより現実の薬物相互作用を解析するには適していることが推測できる。本発明の構造予測手法は、ファミリータンパク質を用いずとも高精度にタンパク質構造を予測でき、in silico創薬においても非常に有益な手法であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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