(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルの破砕後に破砕液中に漏出する核酸やタンパク質等の生体分子が変性することがなく、また、抽出した生体分子の分析に悪影響を及ぼす恐れが無いサンプルの破砕方法及び破砕液を提供する。【解決手段】ナノワイヤを含む破砕液に細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルを懸濁する懸濁工程、サンプルを懸濁した破砕液を撹拌する撹拌工程、を含むことを特徴とするサンプルの破砕方法。前記ナノワイヤが、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤである生体分子の抽出方法。【選択図】図１
2017035002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノワイヤを含む破砕液に細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルを懸濁する懸濁工程、
サンプルを懸濁した破砕液を撹拌する撹拌工程、
を含むことを特徴とするサンプルの破砕方法。
【請求項２】
ナノワイヤを含む破砕液に細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルを懸濁する懸濁工程、
サンプルを懸濁した破砕液を撹拌する撹拌工程、
撹拌した破砕液を遠心分離することで残渣を取り除く残渣除去工程、
を含むことを特徴とする生体分子の抽出方法。
【請求項３】
前記ナノワイヤが、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤであることを特徴とする請求項２に記載の生体分子の抽出方法。
【請求項４】
ナノワイヤを含むことを特徴とする、細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルの破砕液。
【請求項５】
前記ナノワイヤが、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤであることを特徴とする請求項４に記載のサンプルの破砕液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液に関するものである。特に、細胞、ウィルス、菌等（以下「細胞等」と記載することもある。）のサンプルを、ナノワイヤを含む破砕液（以下、単に「破砕液」と記載することもある。）に懸濁して撹拌することで、溶解等の前処理をすることなく細胞等を破砕し、ＤＮＡ及びＲＮＡ（以下「核酸」と記載することもある。）、タンパク質等の生体分子を回収することができる、サンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の進歩により、病院等の医療機関の現場では、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）などの遺伝子診断、病原菌等による感染症の診断やアレルゲンの診断等、遺伝子解析に基づく診断等が広がりつつあり、細胞等から遺伝子である核酸を効率的且つ簡便な操作で抽出する方法が求められている。また、遺伝子診断以外にも、例えば、細胞等からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質が癌マーカータンパク質であるか同定を行うことで癌診断が行われており、核酸と同様、細胞等から効率的かつ簡単な操作でタンパク質を抽出する方法が求められている。
【０００３】
細胞等から核酸やタンパク質等の生体分子を抽出する方法としては、試薬や酵素等を用いて細胞等を破砕して生体分子を抽出する方法が知られている。そして、そのためのキットも複数の会社から市販されており、比較的簡単に細胞等から生体分子を抽出することができる。
【０００４】
しかしながら、上記の細胞等を破砕して生体分子を抽出するキットには、フェノール、クロロホルム、界面活性剤等の試薬が含まれており、これらの試薬が、破砕・抽出後の生体分子を変性したり、分析に悪影響を及ぼす可能性があることが知られている（非特許文献１、２、３参照）。
【０００５】
一方、試薬を用いない細胞等の破砕方法としては、基板上に設けたナノワイヤに細胞等を擦り付けるように移動させることで、細胞等を破砕する方法が知られている（非特許文献３参照）。また、本発明者らは、前記非特許文献３に記載されているナノワイヤは、基板からほぼ鉛直方向に配列して細胞等の流れ方向に向いていないことを見出し、基板上に設けたマイクロ流路内にナノワイヤをランダム又は放射状に成長させることで、ナノワイヤの先端で細胞等を損傷させ、外部電場の印加により核酸を回収する装置及び方法の特許出願を行っている（特許文献１、２参照）。
【０００６】
しかしながら、前記特許文献１、２及び非特許文献３に記載されている方法は、何れも基板に設けたマイクロ流路内にナノワイヤを成長させたものである。したがって、破砕処理できる細胞等の量は、マイクロ流路のサイズ及び単位時間当たりの流量の制限を受けるため、破砕効率が悪いという問題がある。
【０００７】
また、前記特許文献１及び２に記載されている発明は、細胞等を破砕して抽出した核酸をナノワイヤが密集している部分を通過させることで、１分子解析ができるように核酸を伸長するための発明である。そのため、サンプルをマイクロ流路の一端から導入して他端から伸長した核酸を回収する必要があるが、破砕した細胞等の残渣がマイクロ流路の入り口付近のナノワイヤに突き刺さって目詰まりをおこしてしまい、多量の細胞等を連続的に破砕し難いという問題がある。
【０００８】
一方、非特許文献３に記載された発明は、マイクロ流路内で成長したナノワイヤ束間に細胞等を所定以上の流速で流して通過する際に細胞等を破砕する発明であるが、ナノワイヤ束間の間隔が一定である。そのため、例えば、ナノワイヤ束間の間隔を狭くすると、破砕する細胞等が大きな場合は目詰まりが起こり易くなり、逆に、ナノワイヤ束間の間隔を広くすると、破砕する細胞等が小さな場合はナノワイヤ束間を通過してしまい、破砕し難くなる。その為、破砕する細胞等の大きさに応じて、ナノワイヤ束間の間隔が異なるチップを準備する必要があり、非効率であるという問題がある。また、非特許文献３に記載されている発明は、マイクロ流路内にナノワイヤを成長させることから、成長後のナノワイヤの表面を、細胞等の破砕後に目的とする生体成分を抽出するための処理を施すことは難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特願２０１２−２３６４５１号
【特許文献２】特願２０１３−０４４７３９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａ．  Ａｂｏｌｍａａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：  Ｈ７  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４  （１９９８）  １３３−１４１
【非特許文献２】Ｄｉｎｏ  Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｂａｒｂｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  ２００３，  ３，  ２８７−２９１
【非特許文献３】Ｊｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｆａｃｉｌｅ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔ−ｆｒｅｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ”，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，  １２，  ２９１４−２９２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、ナノワイヤを含む破砕液に細胞等のサンプルを懸濁し、次いで、サンプルを懸濁した破砕液を撹拌することで、試薬等を使用することなく、細胞等を効率よく破砕できることを新たに見出した。更に、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤを用いることで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質等の生体分子を高純度で抽出できることを新たに見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明の目的は、ナノワイヤを用いたサンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下に示す、ナノワイヤを用いたサンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液に関する。
【００１４】
（１）ナノワイヤを含む破砕液に細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルを懸濁する懸濁工程、
サンプルを懸濁した破砕液を撹拌する撹拌工程、
を含むことを特徴とするサンプルの破砕方法。
（２）ナノワイヤを含む破砕液に細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルを懸濁する懸濁工程、
サンプルを懸濁した破砕液を撹拌する撹拌工程、
撹拌した破砕液を遠心分離することで残渣を取り除く残渣除去工程、
を含むことを特徴とする生体分子の抽出方法。
（３）前記ナノワイヤが、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤであることを特徴とする上記（２）に記載の生体分子の抽出方法。
（４）ナノワイヤを含むことを特徴とする、細胞、ウィルス、菌から選ばれるサンプルの破砕液。
（５）前記ナノワイヤが、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤであることを特徴とする上記（４）に記載のサンプルの破砕液。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ナノワイヤを含む破砕液でサンプルを破砕することができるので、サンプルの破砕の際に試薬等を用いる必要が無い。したがって、サンプルの破砕後に破砕液中に漏出する核酸やタンパク質等の生体分子が変性することがなく、また、抽出した生体分子の分析に悪影響を及ぼす恐れが無い。
【００１６】
本発明は、ナノワイヤを含む破砕液にサンプルを懸濁して撹拌することでサンプルを破砕する。したがって、従来技術のようにマイクロ流路の容量及び流速の制限を受けることはなく、また、破砕液に含まれるすべてのナノワイヤがサンプルの破砕に寄与するので、一度に大量のサンプルを短時間で破砕処理することができる。
【００１７】
本発明は、破砕液中でナノワイヤは分散した状態で撹拌されることから、破砕後のサンプルの残渣による目詰まりの恐れもない。
【００１８】
本発明の破砕液には、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤを分散することができる。したがって、目的とする生体分子を高純度で回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の破砕液に用いるナノワイヤ４の作製手順の一例を示す図である。
【図２】図２は、図面代用写真で、基板１上に成長したナノワイヤ４のＦＥＳＥＭ写真である。
【図３】図３は、ＰＢＳ溶液中のナノワイヤの濃度と吸光度は相関関係があることを示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２及び比較例３〜５の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例３、比較例６及び７の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例４、比較例８及び９、並びに、化学的に細胞等の破砕を行った比較例４の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例５及び比較例１０〜１２の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例７及び参考例１の分析結果を示すチャートである。
【図９】図９は図面代用写真で、（１）は実施例１０、（２）は実施例１１、（３）は比較例１３の撹拌終了時のＳＥＭ写真である。
【図１０】図１０は、実施例１０及び１１、並びに比較例１３の懸濁液中のＤＮＡ濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、ナノワイヤを用いたサンプルの破砕方法及びナノワイヤを含む破砕液について詳しく説明する。
【００２１】
本発明のナノワイヤを含む破砕液は、ナノワイヤを分散液に分散することで作製することができる。なお、本発明における「ナノワイヤ」とは、分散液に分散して細胞等と撹拌した際に細胞等に損傷を与えて破砕できるものであれば、製造方法、サイズ、材質等に特に制限は無い。
【００２２】
図１は、本発明の破砕液に用いるナノワイヤの作製手順の一例を示す図であり、次の手順でナノワイヤを作製することができる。
（１）基板１を準備する。
（２）基板１上にナノワイヤ作製用の粒子２又は触媒３を塗布する。
（３）基板１上にナノワイヤ４を成長させる。
（４）流水処理、または超音波処理することで、ナノワイヤ４を基板１から剥離する。
（５）剥離したナノワイヤ４を洗浄し、遠心分離を行う。
（６）分離したナノワイヤ４をエッペンドルフチューブ等の容器５に入れ分散液６に分散して破砕液を作製する。
【００２３】
前記基板１の材料は、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ））、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン、ガラス等、ナノワイヤ４が成長できるものであれば特に制限はない。
【００２４】
ナノワイヤ４作製用の粒子２としては、例えば、ＺｎＯが挙げられる。ＺｎＯ微粒子を用いたナノワイヤ４は、前記非特許文献３に記載されている水熱合成方法を用いて作製することができる。具体的には、先ず、ＺｎＯ粒子を基板１上に塗布する。次いで、硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ）、ヘキサメチレンテトラミン（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）を脱イオン水に溶解した前駆体溶液に、加熱した基板１を浸漬させることで、ＺｎＯナノワイヤ４を成長させることができる。
【００２５】
ナノワイヤ４作製用の触媒３としては、例えば、金、プラチナ、アルミ、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム等が挙げられる。触媒３を用いたナノワイヤ４は、前記特許文献１、２に記載されている方法で作製することができる。具体的には、次の手順で作製することができる。
（ａ）触媒３を基板１上に堆積する。
（ｂ）ＳｉＯ2、Ｌｉ2Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ2Ｏ3、ＣａＯ、ＴｉＯ2、Ｍｎ2Ｏ3、Ｆｅ2Ｏ3、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、ＺｎＯ、Ｇａ2Ｏ3、ＳｒＯ、Ｉｎ2Ｏ3、ＳｎＯ2、Ｓｍ2Ｏ3、ＥｕＯ等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、ＶＬＳ（Ｖａｐｏｒ−Ｌｉｑｕｉｄ−Ｓｏｌｉｄ）法等の物理蒸着法でコアナノワイヤを形成する。
（ｃ）破砕・抽出した核酸が静電的相互作用により吸着し難い材料であるＳｉＯ2、ＴｉＯ2等を用い、スパッタリング、ＥＢ蒸着、ＰＶＤ、ＡＬＤ等の一般的な蒸着法により、コアナノワイヤの周囲に被覆層を形成する。
なお、触媒３を用いて作製するナノワイヤ４は、前記特許文献１に記載されているように分岐鎖を有しないナノワイヤ４であってもよいし、前記特許文献２に記載されているように、分岐鎖を有するナノワイヤ４であってもよい。
【００２６】
ナノワイヤ４の直径は、上記のとおり、撹拌することで細胞等に損傷を与えて破砕できるサイズであれば特に制限は無いが、破砕する目的である細胞、ウィルス、菌等の大きさ、及び細胞膜又は壁の強度等に応じて直径を変えてもよい。例えば、原核細胞は１μｍ〜１０μｍ、真核細胞は５μｍ〜１０μｍ、ウィルスは数１０ｎｍ〜数１００ｎｍ、血球細胞は７μｍ〜１５μｍの大きさであることから、ナノワイヤ４の直径は、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、又は２５ｎｍ以上であればよい。また、ナノワイヤ４の直径は、破砕する目的である細胞等よりは小さい必要があり、例えば、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、又は５０ｎｍ以下であればよい。
【００２７】
ナノワイヤ４の直径は、粒子２を用いて形成する場合は、粒子２のサイズを変更する、または、作製したナノワイヤ４に被覆層を形成することで直径を適宜調整することができる。被覆層の形成は、触媒３を用いた場合の被覆層と同じ材料及び被覆方法でよく、蒸着時間を適宜調整すればよい。また、触媒３を用いて成長させる場合も、被覆層を形成する際の蒸着時間を変えることで直径を適宜調整することができる。
【００２８】
本発明においては、遊離しているナノワイヤ４と細胞等を撹拌し、ナノワイヤ４が細胞等に当接した際に、アスペクト比の違いによる長さ方向への慣性力により細胞等を破損すると考えられる。ナノワイヤ４の長さは、撹拌することで細胞等に損傷を与えて破砕できる長さであれば特に制限は無いが、３００ｎｍ以上が好ましい。３００ｎｍより小さいと粒子２とほぼ変わらず、細胞等に当接しても長さが短いので損傷を与え難くなり好ましくない。一方、ナノワイヤ４の長さは、破砕したい細胞等のサイズより長くなると接触の確率が減少し、また、ナノワイヤ４同士が絡まり易くなるので、４μｍ程度までにした方が好ましい。ナノワイヤ４の長さは、粒子２を用いて形成する場合は、前駆体溶液への浸漬時間を変えることで調整することができる。また、触媒３を用いて形成する場合は、コアナノワイヤを形成した後のＶＬＳによる成長時間を変えることで適宜調整することができる。
【００２９】
基板１上に成長したナノワイヤ４は、流水処理で剥離することができるが、必要に応じて、分散液６に基板１を浸漬させ超音波処理することで基板１上からナノワイヤ４を剥離してもよい。超音波は、市販されている一般的な超音波処理装置を用いて数分程度、超音波処理を行えばよい。
【００３０】
本発明の破砕液は、基板１から剥離したナノワイヤ４を分散液６に加え、超音波処理することで凝集したナノワイヤ４を分散させることで作製することができる。破砕液中のナノワイヤ４の濃度は、細胞等の濃度に応じて適宜調整すればよく、濃度は分光光度計の吸光度が所望の数値となるように調整すればよい。
【００３１】
ナノワイヤ４の分散液６は、核酸、タンパク質等の生体分子を変性したり、その後の分析に影響を与えない液体であれば特に問題はなく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液が挙げられる。
【００３２】
なお、本発明においては、回収したナノワイヤ４を、そのまま分散液６に分散してもよいが、ナノワイヤ４を処理してから分散液６に分散してもよい。例えば、本発明の破砕液を用いて核酸を回収する場合は、回収したナノワイヤ４の周りに、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素を固定することで、破砕液と細胞等を撹拌中に破砕液中に漏出するタンパク質を分解できるようにしてもよい。ナノワイヤ４の周りへのタンパク質分解酵素の固定は、タンパク質分解酵素を含む溶液中に回収したナノワイヤ４を懸濁して所定時間放置した後、蒸留水等で洗浄すればよい。
【００３３】
また、本発明の破砕液を用いてタンパク質を回収する場合は、回収したナノワイヤ４の周りに、核酸分解酵素（ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＬ等のリボヌクレアーゼ、ＤＮＡを分解するＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅII等のデオキシリボヌクレアーゼ）を固定することで、破砕液と細胞等を撹拌中に破砕液中に漏出する核酸を分解できるようにしてもよい。ナノワイヤ４の周りへの核酸分解酵素の固定は、核酸分解酵素を含む溶液中に回収したナノワイヤ４を懸濁して所定時間放置した後、蒸留水等で洗浄すればよい。
【００３４】
更に、本発明においては、上記のタンパク質分解酵素及び核酸分解酵素を組合せて用いてもよい。例えば、本発明の破砕液を用いてＤＮＡを高純度で抽出する場合は、ナノワイヤ４にタンパク質分解酵素及びリボヌクレアーゼを固定し、ＲＮＡを高純度で抽出する場合は、ナノワイヤ４にタンパク質分解酵素及びデオキシリボヌクレアーゼを固定すればよい。ナノワイヤ４の周りへの固定は、タンパク質分解酵素及びリボヌクレアーゼの混合溶液、又はタンパク質分解酵素及びデオキシリボヌクレアーゼの混合溶液に回収したナノワイヤ４を懸濁して所定時間放置した後、蒸留水等で洗浄すればよい。
【００３５】
次に、本発明の破砕液を用いたサンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法について説明する。
【００３６】
細胞等のサンプルの破砕は、先ず、遠心分離等により回収した細胞等を破砕液に懸濁して懸濁液を作製する工程を行う。懸濁液は、エッペンドルフチューブ等の生体分子に影響を与えにくい公知の容器５に入れて作製すればよい。なお、懸濁液中のナノワイヤ４の濃度及び細胞等の濃度は、撹拌工程で両者が懸濁液中で十分に撹拌され、ナノワイヤ４の先端が細胞等に接触することで細胞等が損傷・破砕する濃度であれば特に制限はない。
【００３７】
懸濁液を作製する工程の後は、懸濁液を撹拌する工程を行う。撹拌工程は、ナノワイヤ４と細胞等を撹拌することができれば方法に特に制限は無い。例えば、ボルテックスミキサーを用いて容器５を撹拌してもよいし、或いは、マグネチックスターラーの撹拌子を容器５内に入れ撹拌してもよい。撹拌速度及び時間は、ナノワイヤ４の濃度、サンプルの種類及び濃度に応じて適宜調整すればよい。
【００３８】
上記の工程により、細胞等の前処理を行うことなく、また、生体分子に変性等の影響を与える試薬を使用することなく、細胞等を破砕して生体分子を漏出することができる。
【００３９】
撹拌工程の後は、遠心分離等による懸濁液の残渣除去工程を実施することで、懸濁液中のナノワイヤ４、未破砕の細胞等及び細胞壁等の残渣を沈殿・除去し、生体分子を抽出することができる。
【００４０】
また、上記のとおり、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種を固定したナノワイヤ４を用いた場合、撹拌工程中に懸濁液中に漏出した生体分子がナノワイヤ４に固定した酵素により分解されるので、所望の生体分子を高純度で抽出することができる。更に、ナノワイヤ４に酵素を固定化した場合、撹拌工程後にナノワイヤ４を遠心分離等で取り出すことで酵素も同時に懸濁液中から取り出すことができるので、懸濁液中に生体分子を分解する酵素を加える場合と比較して、生体分子を分解する酵素を簡単に除去することができる。
【００４１】
勿論、ナノワイヤ４に、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼから選択される１種又は２種の酵素を固定することに代え、撹拌工程時、又は撹拌工程後に前記酵素を添加してもよい。その場合、酵素により生体分子を分解した後に、定法にしたがって添加した酵素を懸濁液から除去すればよい。
【００４２】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００４３】
〔破砕液の作製〕
＜実施例１＞
ＺｎＯ粒子としてＮＡＮＯＢＹＫ（登録商標）−３８２０（ビックケミー・ジャパン社製；ＺｎＯの直径：２０ｎｍ）を５ｍＬにクロスリンカーとして１０−ＣＤＰＡ（同仁化学）を１．３５ｍｇ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）混合し、室温で３日静置した。その後、１００００倍希釈し、基板１（ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、５０ｍｍ×５０ｍｍ）上に、ピペットを用いて、均一に塗布し、８５℃で１時間定着させた。次に、硝酸亜鉛六水和物（（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ、９８％、シグマ・アドリッチ社製）を０．５６０８ｇ、ヘキサメチレンテトラミン（（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）、９９＋％、シグマ・アドリッチ社製）を１．１６ｇ、脱イオン水２００ｍＬに加えて前駆体溶液を作成した。次に、基板１を前駆体溶液に入れ、８５℃のオーブンに２４時間浸漬させた。図２は、基板１上に成長したナノワイヤ４のＦＥＳＥＭ写真である。次に、基板１をＰＢＳ（５ｍＬ）で流水処理し、その後、当該ＰＢＳ中に基板１を浸漬し、超音波装置（ＵＳ−１、Ａｓｏｎｅ社製）を用いて、３８ｋＨｚ（８０Ｗ）で約１分半、超音波処理を行った。そのＰＢＳ５ｍＬを、１５ｍＬの遠沈管（Ｉｗａｋｉ社製）に入れ、超音波装置（ＵＴ−２５０Ｓ、Ｓｈａｒｐ社製）を用いて３５ｋＨｚ（２００Ｗ）で約２時間、超音波処理を行い、ナノワイヤ４をＰＢＳに高分散させた。次に、エッペンドルフ社製の５４２４Ｒにナノワイヤ４が分散した破砕液を入れ、遠心分離及び／又はＰＢＳの添加により、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社製ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡを用いた際の破砕液の吸光度（４０５ｎｍで測定）が０．６３０となるように調整した。なお、破砕液中のナノワイヤ４の濃度を吸光度により定義しているのは、微小量のナノワイヤ４の重量を正確に測定することは困難であるが、図３に示すように、ＰＢＳ溶液中のナノワイヤ４の濃度と吸光度は相関関係があるためである。作製したナノワイヤ４の直径は約１００ｎｍ、平均長さは２μｍであった。次に、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、７００μＬの破砕液を採取して実施例１の破砕液を作製した。
【００４４】
＜比較例１＞
実施例１のナノワイヤ４に代え、ＺｎＯ粒子（ビックケミー・ジャパン社製；ＺｎＯの直径：２０ｎｍ）を用い、吸光度を実施例１と同様に０．６２９にした以外は、実施例１と同様に破砕液を作製した。
【００４５】
＜比較例２＞
実施例１のナノワイヤ４を添加せず、ＰＢＳ緩衝液のみをエッペンドルフチューブに入れたものを比較例２の破砕液として作製した。
【００４６】
〔ＲＮＡの抽出・定量実験〕
次に、実施例１、比較例１及び２の破砕液を用いて、Ｈｅｌａ細胞からのＲＮＡの抽出・定量実験を行った。
〔細胞、培地の調整〕
Ｈｅｌａ細胞はＥＣＡＣＣ社より購入したものを用いた。Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５５℃にて温浴し、３０分間十分に失活させ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（シグマ・アルドリッチ社）にＦＢＳの容量が１０％となるように加え、さらにＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （ＳＩＧＭＡ社製）が１％とＬ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ（ＳＩＧＭＡ社製）が１％、１００Ｘ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）が１％となるように加えたものをＨｅｌａ細胞用培地とした。
【００４７】
〔培養方法〕
培養フラスコ（Ｉｗａｋｉ社製）に前記培地と細胞を入れてコンフルエントになるまで培養した。次に、あらかじめ、培地、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を３７℃に温めておいた。細胞の状態を顕鏡し確認の後、アスピレーターとパスツールピペットを用い、培養容器内の培地を吸引廃棄した。培養に使用した量の約半量のＰＢＳで１回洗浄後、２５ｃｍ2あたり２ｍＬのトリプシンを添加し、３７℃のＣＯ2インキュベータ内に２分間静置した。細胞の状態を目視にて剥離しているかを確認し、必要に応じて、培養容器内の側面をそっとたたき、張り付いていた細胞を剥離させた。新しい培地を２５ｃｍ2あたり３ｍＬ加え、トリプシンを不活性化させ再懸濁させた。懸濁液を１５ｍＬの遠沈管へ移し替えて１，０００ｒｐｍ、２５℃、３分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清をパスツールピペットで吸引廃棄した。残ったペレット状の細胞に新しい培地を加え、軽くピペッティングにて懸濁させた。この細胞懸濁液を調整し実験に用いた。
【００４８】
〔サンプルの調整〕
細胞懸濁液１０μＬをＣ−Ｃｈｉｐ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ社製）へ注入し、顕微鏡を用い細胞数をカウントした。それぞれ目的の細胞数になるよう新しい培地を用いて希釈を行うことでサンプルの調整を行った。
【００４９】
＜実施例２＞
〔ＲＮＡの抽出〕
上記〔サンプルの調整〕により得られた約８．０×１０5個のＨｅｌａ細胞を、上記実施例１で作製した破砕液７００μＬに懸濁し、ＶＷＲ社製のボルテックスジェニーを用い、２５６０ｒｐｍで撹拌した。０分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分間撹拌した懸濁液を全量、ｍＲＮＡを定量するためにサンプリングした。サンプリングした各懸濁液に対して、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉを用い、添付マニュアルにしたがってＲＮＡの抽出・精製を行った。先ず、１４０μＬのクロロホルム（インフィニティピュア、Ｗａｋｏ社製）を添加し、１５秒手で攪拌後、室温で３分放置した。エッペンドルフ社製の５４２４Ｒを用いて４℃、１３，０００ｒｐｍで１５分、遠心処理を行った後、上層の３５０μＬを１．５ｍＬチューブへ移した。５２５μＬのエタノール（９９．５％、インフィニティピュア、Ｗａｋｏ社製）を加え、数回ピペッティングを行った。次に、７００μＬをスピンカラムへ移し、２５℃、１０，３００ｒｐｍ、１５秒、遠心分離を行った。ろ液を廃棄し、ＲＷＴ  ７００μＬをスピンカラムへ移し、室温、１０，３００ｒｐｍ、１５秒、遠心分離を行い、同様にろ液を廃棄した。次に、５００μＬのＲＰＥを入れ、室温、１０，３００ｒｐｍ、１５秒、遠心分離を行い、ろ液を廃棄した。再度ＲＰＥを入れ、室温、１０，３００ｒｐｍ、１分、遠心分離を行った。スピンカラムを新規コレクションチューブへ移し替え、１３，０００ｒｐｍ、１分、遠心分離を行った。再度、スピンカラムを新規１．５ｍＬチューブへ移し、５０μＬのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水を入れ、１０，３００ｒｐｍ、１分、遠心分離を行った。上記手順により、５０μＬの全ＲＮＡを抽出した。
【００５０】
〔ＲＮＡの定量〕
抽出した各ＲＮＡに対して、ロシュ・アプライド・サイエンス社製のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡ２μＬに、アンカーオリゴプライマーを１μＬ、ＰＣＲグレード水を８．４μＬ加え、６５℃で１０分静置した後、４℃で保存した。そのサンプルにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５Ｘを４μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを０．５μＬ、デオキシヌクレオチドＭｉｘを２μＬ、ＤＴＴを１μＬ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを１．１μＬ加え、５５℃で３０分、８５℃で５分、処理することでｃＤＮＡを作成し、４℃で保存した。ｑＰＣＲはロシュ・アプライド・サイエンス社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用した。キットの使用説明書に従い、ＰＣＲのサイクルは９５℃で１０分加熱した後、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒の３つの工程を４０−４５サイクル行い、９５℃で０秒、５５℃で１５秒処理し、６０℃から９５℃までメルティングカーブを描いた後に、４０℃で３０秒保温し、ＲＮＡの定量を行った。ＲＮＡの定量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現レベルを指標とし、蛍光強度が７０００に達するまでのＰＣＲのサイクル数をカウントすることで行った。サイクル数が少ない程、ＲＴ−ＰＣＲ開始時のＲＮＡの量が多い、つまり、Ｈｅｌａ細胞からより多くのＲＮＡを抽出したことを意味する。
【００５１】
＜比較例３＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例１の破砕液を用いた以外は、実施例２と同様の手順により、ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲのサイクル数をカウントした。
【００５２】
＜比較例４＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例２の破砕液を用いた以外は、実施例２と同様の手順により、ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲのサイクル数をカウントした。
【００５３】
＜比較例５＞
実施例１で作製した破砕液に代え、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉに付属しているＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを７００μＬ添加し、化学的にＨｅｌａ細胞を破砕した以外は、実施例２と同様の手順により、ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲのサイクル数をカウントした。
【００５４】
図４は、実施例２及び比較例３〜５の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。図４から明らかなように、化学的にＨｅｌａ細胞を破砕した比較例５では、撹拌時間に関係なく、ほぼ同じサイクル数となった。一方、ナノワイヤ４を分散した破砕液を用いた実施例２では、撹拌時間が６０分程度までは、比較例３及び４と大差は見られなかったが、撹拌時間を長くするに従い、サイクル数は明らかに小さくなった。以上の結果より、本発明のナノワイヤ４を含む破砕液を用いることで、化学的な破砕液を使用することなく、細胞等を破砕し、ＲＮＡを抽出できることが明らかとなった。また、撹拌時間を長くすることで、細胞等からより多くのＲＮＡを抽出できることが明らかとなった。
【００５５】
〔ＲＮＡの吸着・分解実験〕
次に、懸濁液中に漏出したナノワイヤ４にＲＮＡが吸着するか否か確認を行った。
＜実施例３＞
実施例１で作製した破砕液７００μＬに、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ溶液（濃度：１０００ｎｇ／μＬ）を１０μＬ加え、ＶＷＲ社製のボルテックスジェニーを用い、２５６０ｒｐｍで撹拌した。０分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分間撹拌した懸濁液を全量（７１０μＬ）サンプリングした。サンプリングした各懸濁液に対して、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉを用いて、５０μＬのＲＮＡを抽出した。その後は、実施例２と同様の手順で、蛍光強度が７０００に達するまでのＰＣＲのサイクル数をカウントした。
【００５６】
＜比較例６＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例１の破砕液を用いた以外は、実施例３と同様の手順により、サイクル数をカウントした。
【００５７】
＜比較例７＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例２の破砕液を用いた以外は、実施例３と同様の手順により、サイクル数をカウントした。
【００５８】
図５は、実施例３、比較例６及び７の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。図５から明らかなように、比較例６のＺｎＯナノ粒子を含む破砕液の場合には、撹拌時間の増加に伴い、ｍＲＮＡのサイクル数が増加、つまり、ＲＮＡの量が減少した。このことから、撹拌工程の際に、ｍＲＮＡがＺｎＯ粒子に吸着することが分かった。一方、実施例３のナノワイヤ４を含む破砕液及び比較例７のＰＢＳ緩衝液のみの場合は、サイクル数はほとんど変化無し、つまり、ｍＲＮＡ量の増減は無かった。以上の結果より、ナノワイヤ４を含んだ破砕液を用いた場合、撹拌工程により懸濁液中に漏出したＲＮＡがナノワイヤ４に吸着したり、分解しないことが分かった。
【００５９】
〔クロロホルム添加の影響〕
細胞等から生体分子を化学的破砕方法により抽出する場合、細胞壁や細胞膜を破砕するため、及び、破砕後に生体成分を含む層と分離するために、一般的にクロロホルムを添加する。本発明の破砕液を用いた場合、クロロホルムを添加することなく、細胞等から生体分子を破砕及び抽出できるか否か確認を行った。
【００６０】
＜実施例４＞
実施例２の手順において、１４０μＬのクロロホルムを添加しなかった以外は、実施例２と同様の手順で、０分及び１２０分のサンプルの全ＲＮＡを抽出し、サイクル数をカウントした。
【００６１】
＜比較例８＞
１４０μのクロロホルムを添加しなかった以外は、比較例３と同様の手順で０分及び１２０分のサンプルの全ＲＮＡを抽出し、サイクル数をカウントした。
【００６２】
＜比較例９＞
１４０μのクロロホルムを添加しなかった以外は、比較例４と同様の手順で０分及び１２０分のサンプルの全ＲＮＡを抽出し、サイクル数をカウントした。
【００６３】
図６は、実施例４、比較例８及び９、並びに、化学的に細胞等の破砕を行った比較例４の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。図６から明らかなように、クロロホルムを全く添加しなかった実施例４のナノワイヤ４を含む破砕液を用いた場合であっても、１２０分撹拌後のサイクル数は、比較例４の化学的破砕法のサイクル数に近い値になった。従来の化学的破砕方法では、細胞壁や細胞膜に損傷を与えるためにクロロホルムが必要であったが、その後の分析にクロロホルムは不要であるため、生体分子が含まれる水相画分と相分離して除去する必要があった。一方、本発明の破砕液を用いた場合、ナノワイヤ４で細胞等を破砕した後は、遠心分離によりナノワイヤ４を除去することができるので、相分離を行わなくても効率よく生体分子を抽出することができる。以上の結果より、本発明の破砕液を用いると生体分子に影響を及ぼす可能性のあるクロロホルムを全く使用することなく、細胞等から生体分子を抽出することができることが明らかとなった。
【００６４】
〔ＤＮＡの抽出・定量実験〕
＜実施例５＞
〔ＤＮＡの抽出〕
実施例２のＱｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉに代え、Ｔｈｅｒｍｏ社のＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、また、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに代え、ＧＡＰＤＨの発現レベルを指標として、以下の手順でＤＮＡを精製し、ＰＣＲのサイクル数をカウントした。
先ず、Ｈｅｌａ細胞１×１０6を遠心分離（２５０×ｇ、２５℃、５分）して上清を捨て、ＰＢＳで１回洗浄しペレット状にしたものを、実施例１と同様の手順で作製した破砕液４００μＬに再懸濁し、０分、５分、１０分、３０分、６０分、１２０分間ボルテックス（ＶＷＲ社製のボルテックスジェニーを用い、２５６０ｒｐｍ）をかけた。
次に、２０ｒｐｍ、５６℃（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｃｕ．）で１０分間撹拌した後、ＲＮａｓｅ  Ａを２０μＬ添加し、室温で１０分間静置し、２５０×ｇ、２５℃、５分間遠心分離を行い、上澄み４００μＬを１．５ｍＬチューブに採り、５０％ｅｔｈａｎｏｌ（Ｗａｋｏ社製を希釈）を加えボルテックスで撹拌した。次に、付属のスピンカラムに全量を移し、６，０００×ｇ、２５℃、１分間、遠心分離を行った。その後、新しいコレクションチューブにカラムを付け替え、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉを５００μＬ入れ、８，０００×ｇ、２５℃、１分間、遠心処理を行った。ろ液を廃棄し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩを５００μＬ入れ、２０，０００×ｇ、２５℃、３分間、遠心分離を行った。１．５ｍＬチューブにカラムを付け替え、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ．９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を２００μＬ入れ、２分間室温で静置の後、８，０００×ｇ、２５℃、１分間、遠心分離を行った。得られた液２００μＬをＤＮＡ抽出サンプルとした。
【００６５】
〔ＤＮＡの定量〕
ｑＰＣＲは、ロシュ・アプライド・サイエンス社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用した。キットの使用説明書に従い、ＰＣＲのサイクルは９５℃で１０分加熱した後、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒の３つの工程を７０サイクル行い、９５℃で０秒、５５℃で１５秒処理し、６０℃から９５℃までメルティングカーブを描いた後に、４０℃で３０秒保温し、ＤＮＡの定量を行った。ＤＮＡの定量は、ＧＡＰＤＨの発現レベルを指標とし、蛍光強度が５０００に達するまでのＰＣＲのサイクル数をカウントすることで行った。サイクル数が少ない程、ｑＰＣＲ開始時のＤＮＡの量が多い、つまり、Ｈｅｌａ細胞からより多くのＤＮＡを抽出したことを意味する。
【００６６】
＜比較例１０＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例１の破砕液を４００μＬ用いた以外は、実施例５と同様の手順により、サイクル数をカウントした。
【００６７】
＜比較例１１＞
実施例１で作製した破砕液に代え、比較例２の破砕液を４００μＬ用いた以外は、実施例５と同様の手順により、サイクル数をカウントした。
【００６８】
＜比較例１２＞
実施例１で作製した破砕液に代え、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて化学的にＨｅｌａ細胞を破砕した以外は、実施例５と同様の手順により、サイクル数をカウントした。
【００６９】
図７は、実施例５及び比較例１０〜１２の撹拌時間とサイクル数の関係を示すグラフである。図７から明らかなように、ナノワイヤ４を分散した破砕液を用いた実施例５では、撹拌時間とともにＤＮＡの抽出量が多くなり、１２０分撹拌すると、化学的な破砕液を使用した比較例１０よりも多くのＤＮＡを抽出できた。以上の結果より、本発明のナノワイヤ４を含む破砕液を用いることで、化学的な破砕液を使用することなく、細胞等からＤＮＡを抽出できることが明らかとなった。
【００７０】
次に、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定化したナノワイヤ４を含む破砕液を作製し、撹拌工程時に、懸濁液中のタンパク質を分解できるか否か確認を行った。
【００７１】
＜実施例６＞
〔Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定したナノワイヤ４を含む破砕液の作製〕
実施例１の吸光度を０．６３０にしたナノワイヤ４を含む破砕液を、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製のＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）に混合して１０分間放置した後、エッペンドルフ社製の５４２４Ｒを用いて１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを４００μＬ採り、ＰＢＳ緩衝液を４００μＬ加えることで、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定したナノワイヤ４を含む破砕液を作製した。
【００７２】
＜実施例７＞
〔Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定したナノワイヤ４を用いた破砕実験〕
実施例１で作製した破砕液に代え、実施例６で作製した破砕液を用いた以外は、実施例２と同様の手順で１２０分撹拌した懸濁液のサンプリングを行った。サンプリングした懸濁液は、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製し、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標登録、株式会社エル・エム・エス社製））を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
【００７３】
＜参考例１＞
実施例２の１２０分間撹拌した懸濁液を、実施例７と同様の手順で測定した。
【００７４】
図８は、実施例７及び参考例１の分析結果を示すチャートである。本チャートは、核酸のピークである２６０（ｎｍ）とタンパク質のピークである２８０（ｎｍ）の比である２６０／２８０が、１．８〜２．０はタンパク質が混入していない（ｐｕｒｅ）ことを示している。また、夾雑物のピークである２３０（ｎｍ）と２６０（ｎｍ）の比である２６０／２３０が、１．８より大きいと、夾雑物が少ない（ｐｕｒｅ）ことを示している。図８に示すチャートから明らかなように、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定していない参考例１では、懸濁液中のタンパク質の混合が目立ったが、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを固定した実施例６においては、タンパク質が分解され、核酸の純度が上昇した。以上の結果より、ナノワイヤ４に酵素を固定化することで、細胞等から漏出した生体分子を撹拌工程中に分解することができ、細胞等を破砕後に、例えば、タンパク質除去工程、又は、核酸除去工程を省略することができる。
【００７５】
〔枯草菌の破砕実験〕
次に、サンプルとして枯草菌を用い、ナノワイヤ４の直径を変えた場合の破砕実験を行った。
【００７６】
〔破砕液の作製〕
＜実施例８＞
石英ガラス基板１上（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｓｅ  Ｃｏ．）に、金触媒３をスパッタリングにより厚さ３ｎｍ堆積させた。次いで、ＳｎＯ2を材料に、室温で１０Ｐａ、２０分間パルスレーザーデポジションを行うことでコアナノワイヤを作製した。次いで、ＳｉＯ2を材料に、室温で３〜４分間スパッタリングを行うことでコアナノワイヤの周りに被覆層を形成した。次に、基板１を１ｍＬのエタノール中に浸漬し、２５℃で、超音波装置（ＵＳ−１、Ａｓｏｎｅ社製）を用いて、３８ｋＨｚ（８０Ｗ）で約２時間、超音波処理を行うことで、基板１からナノワイヤ４を剥離した。遠心分離によりエタノールを回収し、次いで、５００μＬのエタノールを用いて２回洗浄し、エタノールを２１，１３０ｇで１時間遠心分離し、ナノワイヤ４を沈殿させた。上澄みを除去した後、エタノールで再懸濁し、２１，１３０ｇで１時間遠心分離し、ナノワイヤ４を沈殿させた。上澄みを除去し、バキュームボックス内で乾燥させた。乾燥後のナノワイヤ４を、ＯＤ（４０５ｎｍ）の測定値が０．１となるように水と混合し、２０分間超音波処理を行うことでナノワイヤ４を懸濁し、破砕液を作製した。作製した破砕液に含まれるナノワイヤ４の直径は３０ｎｍ、平均長は２μｍであった。
【００７７】
＜実施例９＞
被覆層を形成するためのスパッタリングを、１０分とした以外は、実施例８と同様の手順で破砕液を作製した。作製した破砕液に含まれるナノワイヤ４の直径は１１０ｎｍ、平均長は２μｍであった。
【００７８】
〔サンプルの調整〕
枯草菌（ＡＴＣＣ６６３３の芽胞液、栄研化学株式会社）を２ｍＬのＬＢ培地に導入し、３７℃、１２５ｒｐｍの条件で、５時間培養した。培養液を１ｍＬサンプリングし、２５℃、５，０００ｇで１０分遠心処理を行うことで菌を沈降させ、上澄みを取り除いた。次に、１ｍＬの１０ｍＭリン酸バッファーで菌を再懸濁し、上記と同様の条件で遠心処理を行い、菌を再沈降させることで洗浄処理を行った。この洗浄操作は２回行った。洗浄後の菌体を、ＯＤ（５８４ｎｍ）が０．４となるよう、再度１０ｍＭリン酸バッファーに懸濁し、サンプルとした。
【００７９】
＜実施例１０＞
実施例８で作製した破砕液及び上記〔サンプルの調整〕で作製した枯草菌の懸濁液を５μＬずつ混合し、ＶＷＲ社製のボルテックスジェニーを用い２，５６０ｒｐｍで１時間、撹拌した。図９（１）は撹拌終了時のＳＥＭ写真である。撹拌後、５０００ｇで１０分の遠心処理により残渣を除去したのち、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標登録、株式会社エル・エム・エス社製））を用いて２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで、ＤＮＡの定量を行った。
【００８０】
＜実施例１１＞
実施例９で作製した破砕液を用いた以外は、実施例１０と同様の手順により枯草菌を破砕し、ＤＮＡの定量を行った。図９（２）は撹拌終了時のＳＥＭ写真である。
【００８１】
＜比較例１３＞
ナノワイヤ４を含まない以外は、実施例１０と同様の手順により、ＤＮＡの定量を行った。図９（３）は撹拌終了時のＳＥＭ写真である。
【００８２】
図９（１）〜（３）のＳＥＭ写真から明らかなように、ナノワイヤ４の直径が細い方が、枯草菌を破砕し易いことが確認された。
【００８３】
図１０は、実施例１０及び１１、並びに比較例１３で求めた懸濁液中のＤＮＡ濃度を示す。図１０より明らかなように、ナノワイヤ４の直径が細い方が、枯草菌を破砕し易く、その結果、より多くのＤＮＡを抽出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の、ナノワイヤ４を分散した破砕液を用いることで、生体分子に影響を与える化学試薬を用いることなく、細胞等を破砕することができる。したがって、医療機関、大学、企業、研究機関等において、より正確な生体分子の分析を行うための試料調整に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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