(57)【要約】【課題】真皮層にある線維芽細胞を活性化する作用を有する新規な線維芽細胞賦活剤を提供する。また真皮層にある線維芽細胞を活性化して当該層内の間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）の生成を促しその減少を抑制する、膠原線維や弾性線維の引っ張り力を回復/向上することで、加齢または紫外線照射等によって生じる真皮じわ、肌のたるみ、及び／または肌のハリ低下を予防または改善することが可能な組成物を提供する。【解決手段】セラミド類を有効成分として使用する。さらにセラミド類に加えて皮膚吸収促進剤を組み合わせて使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミド類を有効成分とする線維芽細胞賦活剤。
【請求項２】
セラミド類を有効成分とする、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物。
【請求項３】
さらに皮膚吸収促進剤を含有する、請求項２に記載する組成物。
【請求項４】
上記加齢または紫外線照射による肌劣化症状が、真皮じわ、肌のたるみ及びハリ低下からなる群から選択される少なくとも１つの症状である、請求項２または３に記載する組成物。
【請求項５】
医薬品、医薬部外品、化粧品及び飲食品からなる群から選択されるいずれかである請求項２〜４のいずれかに記載する組成物。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかに記載する組成物を、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を有する被験者に適用し、当該被験者の上記肌劣化症状を改善する美容方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真皮層にある線維芽細胞を活性化する作用を有する線維芽細胞賦活剤、並びに当該作用に優れた医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品に関する。より詳細には、本発明は真皮層にある線維芽細胞に働きかけ、加齢または紫外線照射によって生じる真皮じわ、肌のたるみ、及び／または肌のハリ低下を予防または改善するために有効な線維芽細胞賦活剤、及びそれを有効成分とする医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚（肌）は、外側から順に、表皮、真皮及び皮下組織の三層構造を有している。
【０００３】
表皮は、外側から角層、顆粒層、有棘層及び基底層の４つの層からなる厚さ平均約０.２ｍｍの薄い膜であり、外部からの異物の侵入や体内の水分の蒸散を防ぐバリアとなって内部を保護している。表皮の最表面にある「角層」は、角層細胞と細胞間脂質から構成されている。細胞間脂質は「セラミド」等からなる脂質の層と水分子の層が交互に規則正しく何層も重なり合う層構造（ラメラ構造）を有しており、これが角層細胞と角層細胞の隙間を満たして、外部からの刺激の侵入や体内の水分の過剰な蒸散を防ぎ、表皮のバリア機能と保湿機能という重要な役目を果たしている。表皮の９５％は角化細胞（ケラチノサイト）から構成されている。当該細胞は表皮の最も深部にある基底層で作られ、上へ上へと押し上げられ（基底層→有棘層→顆粒層→角層）、やがては最上層になる角層から垢となって剥がれ落ちる。基底細胞が分裂し、娘細胞が産まれて角層で脱落するまでの時間をターンオーバー時間と呼び、約４５日と言われている。
【０００４】
一方、真皮は、表皮の内側に存在する平均約２ｍｍの厚みを有する皮膚の本体組織であり、表皮とは基底膜によって隔てられている。真皮は、コラーゲンという線維状のタンパク質がその大部分を占めており、その間をヒアルロン酸等のゼリー状の基質が水分を抱えた状態で満たしている。さらにこれにエラスチンやフィブリリンという線維状のタンパク質も加わって、肌に弾力性を与えている。つまり真皮は、その大部分を占めるコラーゲンやエラスチンなどにより、皮膚（肌）を支え、その形や弾力を保つ働きを担っている。そしてこれらの線維状タンパク質や基質を生成する細胞が線維芽細胞である。
【０００５】
ところで従来より肌の乾燥等による肌荒れや小じわ対策が求められている。こうした肌荒れや小じわの発生は肌のバリア機能や保湿機能の低下によるところが大きいこと、また表皮角層の細胞間脂質中に存在するセラミド量の減少が当該肌のバリア機能や保湿機能の低下に深く関与していることから、これらを改善する方法として、減少したセラミドを直接的に補給する方法やセラミド合成促進剤等の使用により、角層細胞間脂質内のセラミド量を増加させる方法が種々提案されている（例えば、非特許文献１等）。
【０００６】
一方、従来より加齢や長期間の紫外線照射によって、肌のたるみ、ハリ低下、及び／又は真皮じわ（真皮層まで達した深いしわ、大しわ）が生じることが知られている。この原因として、加齢や紫外線照射によって真皮に存在するコラーゲンやエラスチンなどの間質成分が古く脆くなり、その量も減少することが挙げられる。
【０００７】
真皮は、表皮とは異なり、新陳代謝がとてもゆっくりであり、そのサイクルは数年を要するため、加齢や紫外線照射による肌のたるみ、ハリ低下、及び／又は真皮じわの対策としては、紫外線照射からの予防は勿論のこと、真皮層に存在する間質成分の劣化や減少を抑制することが必要であり、その方法としては間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）を生成する真皮層にある線維芽細胞を活性化（賦活化）する方法が挙げられる。
【０００８】
線維芽細胞の賦活化方法として従来より知られている方法として、例えば、特許文献１及び２等に記載の方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−１１６４３１号公報
【特許文献２】特開２００４−３３１５７８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Imokawa G.et al:Selective recovery of deranged water-holding properties by stratum corneum lipids.J Invest Dermatol,87,758-761(1986)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、真皮層にある線維芽細胞を活性化する作用を有する新規な線維芽細胞賦活剤を提供することである。また本発明の目的は、真皮層にある線維芽細胞を活性化して当該層内の間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）の少なくとも１種の生成を促してその減少を抑制することで、加齢または紫外線照射等によって生じる真皮じわ、肌のたるみ、及び／または肌のハリ低下を予防または改善することが可能な組成物、具体的には医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、後述する実験例に示すように、セラミドに下記の作用があることを見出し、このことからセラミドには真皮層内にある線維芽細胞を活性化（賦活化）する作用があることを確認した。
（1）ヒト線維芽細胞におけるＡＴＰ産生促進作用
（2）膠原線維の引っ張り力を回復／向上する作用（ヒト線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進作用）
（3）ヒト線維芽細胞において、膠原線維や弾性線維との結合点であるインテグリンの発現を増加する作用（ヒト線維芽細胞におけるインテグリン発現量の増加作用）
（4）ヒト線維芽細胞において、弾性線維構成成分であるフィブリリン-1の発現を増加する作用（ヒト線維芽細胞におけるフィブリリン-1発現量の増加作用）。
【００１３】
線維芽細胞は真皮層内の間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）の生成に関わっている。また、線維芽細胞はインテグリンを介して膠原線維や弾性線維と結合し、膠原線維や弾性線維を引っ張り、皮膚を引き締めている。このため、線維芽細胞を賦活化することで、上記の間質成分の減少を抑制したり、また膠原線維や弾性線維を引っ張った状態にすること等ができ、当該成分の減少及び／又は膠原線維や弾性線維の引っ張り力の低下を原因とする加齢または紫外線照射等による真皮じわ、肌のたるみ、及び／または肌のハリ低下を予防若しくは改善することが可能になる。
【００１４】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を有する。
【００１５】
（Ｉ）真皮線維芽細胞賦活剤
（I-1）セラミド類を有効成分とする線維芽細胞賦活剤。
（I-2）下記（1）〜（4）からなる群から選択される少なくとも１つの作用を有する、（I-1）記載の線維芽細胞賦活剤。
（1）ヒト線維芽細胞におけるＡＴＰ産生促進作用
（2）ヒト線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進作用
（3）ヒト線維芽細胞におけるインテグリン発現量の増加作用
（4）ヒト線維芽細胞におけるフィブリリン-1発現量の増加作用
（I-3）線維芽細胞を賦活化することで真皮層中において膠原線維や弾性線維の引っ張り力の回復/向上作用、間質成分の生成を促進する作用を有する、（I-1）または（I-2）記載の線維芽細胞賦活剤。
【００１６】
（II）加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物
（II-1）セラミド類を有効成分とする、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物。なお、当該組成物は、前述する「（I-1）〜（I-3）のいずれかに記載する線維芽細胞賦活剤を有効成分とする、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物」と言い換えることができる。
【００１７】
（II-2）上記加齢または紫外線照射による肌劣化症状が、真皮じわ、肌のたるみ及びハリ低下からなる群から選択される少なくとも１つの症状である、（II-1）記載の組成物。（II-3）さらに皮膚吸収促進剤を含有する（II-1）または（II-2）に記載する組成物。
（II-4）セラミド類の皮膚浸透を促進するための形態、例えばリポソーム形態、マイクロエマルション形態、またはマイクロニードル形態を有する、（II-1）〜（II-3）のいずれかに記載する組成物。
（II-5）下記（a）〜（ｄ）のいずれかの皮膚浸透法に適用して用いられるものである、（II-1）〜（II-3）のいずれかに記載する組成物：
（a）閉鎖密封法
（b）エレクトロポレーション
（c）ソノフォレーシス
(d)マイクロニードル。
【００１８】
（II-6）医薬品、医薬部外品、化粧品及び飲食品からなる群から選択されるいずれかである（II-1）〜（II-5）のいずれかに記載する組成物。
【００１９】
（III）肌劣化症状を改善する美容方法
（III-1）セラミド類を有効成分とする組成物を、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を有する被験者に適用し、当該被験者の上記肌劣化症状を改善する美容方法（ヒトに対する治療方法を除く）。
（III-2）セラミド類を有効成分とする組成物が、上記（II-1）〜（II-5）のいずれかに記載する組成物である（III-1）に記載する美容方法。
（III-3）セラミド類を有効成分とする組成物が、医薬部外品、化粧品及び飲食品からなる群から選択されるいずれかである（III-1）または（III-2）に記載する美容方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の線維芽細胞賦活剤によれば、真皮層内にある線維芽細胞に作用してそれを活性化することが可能となる。その結果、真皮層に存在する間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）の少なくとも１種の生成を促進したり、また膠原線維及び／又は弾性線維の引っ張り力を回復／向上することで、加齢や紫外線照射によって生じる当該成分の減少や膠原線維や弾性線維の引っ張り力の減少を原因とする肌のたるみ、肌のハリ低下及び／又は真皮じわを予防または改善することが可能となる。従って、本発明の線維芽細胞賦活剤は、加齢または紫外線照射による上記原因の肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物（医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品）の有効成分として有用である。
【００２１】
本発明の組成物によれば、線維芽細胞の賦活作用に基づいて、真皮層に存在する間質成分（膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、ムコ多糖（ヒアルロン酸）等）の少なくとも１種の生成を促進することや膠原線維、弾性線維の引っ張り力の回復/向上ができる。その結果、加齢や紫外線照射によって生じるこれら成分の減少を抑制し、当該成分の減少を原因とする肌のたるみ、肌のハリ低下及び／又は真皮じわを予防または改善することが可能となる。
【００２２】
また有効成分であるセラミド類と皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）等を併用した本発明の組成物によれば、セラミド類の真皮層への浸透性を高めることで、より高い線維芽細胞賦活作用を得ることができ、それに伴って加齢または紫外線照射による肌劣化症状をより有効に予防および／または改善することが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（Ｉ）真皮線維芽細胞賦活剤
本発明の線維芽細胞賦活剤は、セラミド類を有効成分とすることを特徴とする。本発明が対象とするセラミド類には、セラミド（天然セラミド、ヒト型セラミド、植物性セラミド等）の他セラミド類縁体（擬似セラミド等）が含まれる。
【００２４】
ここでセラミド (ceramide) はスフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴシンのアミノ基に長鎖脂肪酸がアミド結合した化合物群の総称である。スフィンゴシンの構造（Ｎ−アシル基の構造など）及び長鎖脂肪酸の構造の違いにより１１種類に細分化（セラミド１〜１１）されている（例えば、Robson KJ, Stewart ME, Michelsen S, Lazo ND,  Downing DT.: 6-Hydroxy-4-sphingenine in human epidermal ceramides. J Lipid Res. 1994 Nov;35(11):2060-8；及び、石田賢哉ら「特集１  機能性原料としてのセラミドとその応用『天然型セラミドの開発と応用  角層細胞間脂質に着目した光学活性セラミド製剤』」FRAGRANCE JOURNAL 2004-11:23-32）。
【００２５】
本発明においては上記のセラミドの構造を有していれば何れのセラミドでも使用でき、動物または植物由来のセラミドの他、有機合成により得られたセラミドを用いてもよい。またこれらには不斉炭素が存在し、光学活性体、ラセミ体（光学不活性体）が存在するが、本発明ではその何れもが使用できる。好ましいのは光学活性体である。なかでも好ましくは、セラミド１、セラミド２、およびセラミド３である。商業的に入手可能なセラミドとしては、例えば、セラミド１（商品名；CERAMIDE I（エボニックジャパン株式会社製））、セラミド２（商品名：CERAMIDE TIC-001(高砂香料工業株式会社製)）セラミド３（商品名：CERAMIDE III（エボニックジャパン株式会社製））等が挙げられる。
【００２６】
セラミド類縁体とは、セラミドと構造及び性質が類似した擬似セラミド及び、それらの成分からの抽出物や誘導体（スフィンゴシン誘導体）も含まれている。当該セラミド類縁体には、特開昭６２−２２８０４８号公報、特開昭６３−２１６８１２号公報、特開昭６３−２２７５１３号公報、特開昭６４−２９３４７号公報、特開昭６４−３１７５２号公報、および特開平８−３１９２６３号公報などに記載されているセラミド類似構造物質が含まれる。具体的には、下記一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物から選択される化合物を挙げることができる。
【００２７】
【化１】
2017178842.tif 000002
［式中、Ｒ１ｂは炭素数１０〜２６の炭化水素基、Ｒ２ｂは炭素数９〜２５の炭化水素基を示し、Ｘは−（ＣＨ２）ｎ−を示す。なお、ｎは２〜６の整数を示す。］
【００２８】
【化２】
2017178842.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一または異なって炭素数１〜４０のヒドロキシル化されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキレン基又は単結合を示し、Ｒ４は水素原子、炭素数１〜１２のアルコキシ基又は２，３−ジヒドロキシプロピルオキシ基を示す。但し、Ｒ３が単結合であるときはＲ４は水素原子である。］
【００２９】
なお、上記式（１）及び（２）中、炭化水素基としてはアルキル基又はアルケニル基を好適に挙げることができる。
【００３０】
セラミド類は、１種単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用することもできる。好ましいセラミド類は、ヒト型（光学活性体）セラミドであり、なかでも前述するように、セラミド１、セラミド２、およびセラミド３からなる群から選択される少なくとも１種を挙げることができる。
【００３１】
本発明の線維芽細胞賦活剤中に含まれるセラミド類の割合としては、線維芽細胞に対して賦活作用を発揮する量であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。通常、０．０００１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは０．０１〜１００重量％、より好ましくは０．６３〜１００重量％を例示することができる。
【００３２】
本発明の線維芽細胞賦活剤は、後述する実験例で示すように、下記（1）〜（4）からなる群から選択される少なくとも１つの作用を有する。
（1）ヒト線維芽細胞におけるＡＴＰ産生促進作用
（2）ヒト線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進作用
（3）ヒト線維芽細胞におけるインテグリン発現量の増加作用
（4）ヒト線維芽細胞におけるフィブリリン-1発現量の増加作用。
【００３３】
前記のとおり、線維芽細胞を賦活化することで、上記の間質成分の減少を抑制する、及び／又は膠原線維や弾性線維を引っ張った状態にすること等ができ、当該成分の減少及び／又は膠原線維や弾性線維の引っ張り力の低下を原因とする加齢または紫外線照射等による真皮じわ、肌のたるみ、及び／または肌のハリ低下を予防若しくは改善することが可能になる。
なお、本発明で「線維芽細胞賦活（活性化）」というときは、正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDF）において、前記（1）乃至（4）のいずれか１以上の作用を高めることができることをいう。
【００３４】
本発明の線維芽細胞賦活剤には、本発明の効果を妨げないことを限度として他の成分を配合することができる。かかる成分は、線維芽細胞賦活剤が医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品からなる群から選択されるいずれの組成物に適用されるかによっても異なるが、例えば、線維芽細胞賦活作用を有する物質（セラミド類以外）、抗酸化剤、防腐・殺菌剤、油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、増粘剤等を挙げることができる。
【００３５】
ここで線維芽細胞賦活作用を有する物質（セラミド類以外）としては、ビルベリー葉エキス、ポリアミン、アロエエキス、カッコンエキス、クロレラエキス、プラセンタエキス、サトウカエデ樹液、ローヤルゼリー、酵母エキス、ムコ多糖体液、ヒオウギ抽出液、ダイズエキス、ホエイ等を挙げることができる。
【００３６】
また抗酸化剤としては、ビタミンＥ、ブチルヒドロキシトルエン、エリソルビン酸、チオジプロピオン酸ジラウリル、無水亜硫酸ナトリウム、チャエキス、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、没食子酸オクチル、アスコルビン酸誘導体等を挙げることができる。
【００３７】
さらに防腐・殺菌剤としては、フェノキシエタノール、ヤシ油アルキルPG-ジモニウムクロリドリン酸Na、ブチルカルバミン酸ヨウ化プロピニル、安息香酸、クレゾール、ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ベンジル等を挙げることができる。
【００３８】
油性成分としては、高級アルコール、植物油、及び植物ステロール（フィトステロール等）が挙げられる。
【００３９】
高級アルコールとしては、炭素数６以上、より好ましくは炭素数６〜３０の脂肪族アルコールが挙げられる。当該油性成分は、常温（２５℃）で固形のものが好ましい。具体的には、セタノール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ラノリンアルコール等が挙げられる。これらの高級アルコールは、１種単独で用いてもよいし、また２種以上を併用してもよい。
【００４０】
植物油としては、マカデミア種子油、ホホバ種子油、カニナバラ果実油、ヤシ油、アボガド油、オリーブ油、杏仁油、ククイナッツ油、グレープシード油、サフラワー油、スイーツアルモンド油、トウモロコシ胚芽油、ヒマワリ油、ヘーセルナッツ油、ホホバワックス、及びローズヒップ油等が挙げられる。これらの植物油は、１種単独で用いてもよいし、また２種以上を併用してもよい。
【００４１】
植物ステロール（フィトステロール）は、植物の細胞膜中に存在し、二重結合を持つシトステロールを始め、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、フコステロールや二重結合を持たないステロール等の混合物である。本発明に使用される植物ステロールは特に限定するものではなく、例えば、大豆、米、小麦、ゴマなどの穀物；大根、キャベツ、リンゴ、レタスなどの果物や野菜；その他ヒマワリ、菜種、ヤシ、棉実、樹木の皮などからの抽出品、精製品などが挙げられる。抽出される植物原料の種類は特に限定するものではないが、好ましくは植物油の脱臭工程により産出されるスカム等より分離して得られる植物ステロール、パルプの製造の際に副産物として得られるステロールを挙げることができる。
【００４２】
界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられる。好ましく非イオン界面活性剤である。具体的にはラウリン酸ポリグリセリル−６、ミリスチン酸ポリグリセリル−６、ステアリン酸ポリグリセリル−６、ラウリン酸ポリグリセリル−１０、ミリスチン酸ポリグリセリル−１０、ステアリン酸ポリグリセリル−１０ミリスチン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、オレイン酸グリセリルが挙げられる。
【００４３】
増粘剤としては、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸／アクリル酸ステアリル）コポリマー、（アクリレーツ／アクリル酸アルキル（Ｃ１０−３０））クロスポリマー、カルボキシメチルセルロースＣａ、キサンタンガム、タマリンドガム等が挙げられる。
【００４４】
本発明の線維芽細胞賦活剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品に適用することができるが、好ましくは外用の医薬品、医薬部外品、及び化粧品等の外用組成物に配合して用いられる。こうした医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品への配合割合としては、これらの製品が経口投与（経口摂取）されるものであるか、または皮膚に塗布または貼付して使用されるものであるか（外用用途）によって異なり、一概に定めることはできないが、経口投与（経口摂取）される組成物に対しては、通常、セラミド類が最終製品に０．０００１〜１００重量％の割合で含まれるように配合することができ、外用組成物に対しては、通常、セラミド類が最終製品に０．０００１〜２０重量％の割合で含まれるように配合することができる。
【００４５】
（II）加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するための組成物
本発明の組成物は、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を予防および／または改善するのに適しており、もっぱらこの目的のために使用される組成物であって、セラミド類を有効成分とすることを特徴とする。
なお、加齢または紫外線照射による肌劣化症状としては、真皮じわ、肌のたるみ及びハリ低下からなる群から選択される少なくとも１つの症状を挙げることができる。ここで肌のたるみ及びハリ低下は、真皮層に存在する膠原線維（コラーゲン）、弾性線維（エラスチン、フィブリリン）、及びムコ多糖（ヒアルロン酸）等（本明細書では、「真皮層内に存在する間質成分」または単に「間質成分」とも称する。）からなる群から選択される少なくとも１種の量の低下、及び／又は膠原線維や弾性線維の引っ張り力の低下に伴って生じる「肌のたるみ及びハリ低下」を意味し、「真皮じわ」は当該間質成分の減少に起因して生じるしわ（大しわ、深いしわ）を意味する。
【００４６】
本発明の組成物中に含まれるセラミド類の割合としては、線維芽細胞に対する賦活作用を有し、その作用に基づいて加齢または紫外線照射による肌劣化症状が予防および／または改善できる量であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。通常、０．０００１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。好ましくは０．０１〜２０重量％、より好ましくは０．６３〜２０重量％を例示することができる。
【００４７】
本発明の組成物には、本発明の効果を妨げないことを限度として他の成分を配合することができる。かかる成分は、本発明の組成物が医薬品、医薬部外品、化粧品、及び飲食品からなる群から選択されるいずれの組成物であるか、またその剤型（固形状、半固形状、液状、乳液状等）によっても異なり、各種の態様に応じて、適宜選択し設定することができる。
【００４８】
例えば、セラミド類以外の線維芽細胞賦活作用を有する物質を組み合わせて配合することもできる。ここで使用できる物質としては、（Ｉ）において説明した線維芽細胞賦活作用を有する物質を同様に挙げることができる。
【００４９】
また本発明の組成物が外用の医薬品、医薬部外品または化粧品である場合、さらに皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）を配合してもよい。皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）としては、セラミド類の経皮浸透性を高め、皮膚への吸収を促進する作用を有するものを使用することができる。かかるものとして、例えば、各種の界面活性剤（アニオン性、カチオン性、ノニオン性界面活性剤）、脂肪酸・脂肪酸エステル（オレイン酸、ミリスチン酸イソプロピル、中鎖脂肪酸トリグリセライド等）、生分解性促進剤（アルキルエステル、アミノカプロン酸）、その他、アミノ酸、テルペン類、ピロリドン類、尿素、リン脂質、各種の溶媒（ポリオール、低級アルコール、高級アルコール、ジメチルフルスルフォキシド等）を制限なく例示することができる。
【００５０】
セラミド類をかかる皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）と併用することで、セラミド類を効率的に真皮層に到達させることができ、当該真皮層においてより有効に線維芽細胞賦活効果を発揮させることができる。制限されないものの、本発明の組成物中、当該皮膚吸収促進剤（皮膚浸透促進剤）は、０．５〜７０重量％の範囲で配合することができる。
【００５１】
本発明の組成物は、その使用目的（医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品）及び投与経路等に応じて、固形剤、半固形剤、液剤、乳液剤等の各種剤形の組成物に調製することが可能である。
【００５２】
外用の医薬品または医薬部外品としての形態としては、例えば、硬膏剤、軟膏剤、クリーム剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、乳液剤、液剤、エアゾール剤を挙げることができる。
【００５３】
化粧品としての形態は特に限定されるものではないが、例えばスキンケア化粧品として化粧水、美容液、パック、マッサージクリーム、乳液、モイスチャークリーム、リップクリーム等；メーキャップ化粧品としてファンデーション、白粉、口紅、ほほ紅、アイシャドウ等とすることができる。上記化粧品には、一般に化粧品に用いられている各種化粧品成分を適宜配合することができる。
【００５４】
本発明の組成物には、所望の効果を損なわない範囲で、通常の外用組成物に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、アミノ酸類、ビタミン類、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、抗炎症剤、抗しわ剤、肌荒れ改善剤、ニキビ用薬剤、アルカリ類、キレート剤の成分を配合することもできる。
【００５５】
また本発明の組成物は皮膚の深部（真皮層）にまでセラミド類が効率的に浸透するような形態を有していてもよい。かかる形態としては、制限されないものの、リポソーム形態、マイクロエマルション形態、またはマイクロニードル形態を例示することができる（例えば、最新・化粧品の機能創製・素材開発・応用技術（技術教育出版社発行）288-293頁、及び日本香粧品学会誌（40周年記念誌）39巻, 2015, 112-115頁等参照）。本発明の組成物を例えばリン脂質でできたナノカプセルに封入して調製してリポソーム形態に調製したり、また各種の界面活性剤を利用することでW/O型、O/W型またはW/O/W型のマイクロエマルション形態にすることで、本発明の組成物を皮膚への浸透（吸収）を高め、セラミド類を真皮層にまで到達しやすくすることができる。また本発明の組成物そのものをマイクロニードル形態に調製しそれを皮膚に貼付するか、または本発明の組成物を例えばシリコン、金属、または生分解性高分子により形成された長さ15μm程度の微細な針を用いて皮膚に適用することで、本発明の組成物に含まれるセラミド類を皮膚の深部（真皮層）にまで効率的に浸透（到達）させることが可能になる（例えば、COSME TECH JAPAN, Vol.1, No.5(2011), 20-24等参照）。
【００５６】
さらにまた本発明の組成物は、皮膚の深部（真皮層）にまでセラミド類が効率的に浸透するような物理的方法を用いて、皮膚に適用することもできる。かかる方法としては、制限されないものの、閉鎖密封法（ODT：Occulusive Dressing Therapy）、エレクトロポレーション、及びソノフォレーシスを例示することができる（例えば、ファルマシア,49巻,5号,(2013),pp.400-404；および「皮膚科学  考え方学び方」金原出版株式会社、平成2年6月10日発行,p.29等）。なお、閉鎖密封法は外用剤の塗布部分をプラスチックやラップなどで覆うことにより（半日〜２日）、角質層をふやけさせ、これにより角質細胞を膨潤、角質細胞間脂質の水分量を増加させることにより角質バリア機能を低下させ、経皮吸収性を増加させる方法である。またこの際、加温すると温熱効果により血流が増加しさらに経皮吸収性を増加させることができる。また、エレクトロポレーションは、高い電圧を短時間に適用し、可逆的な穴を皮膚に形成させることで、皮膚に適用した組成物の経皮吸収を促進する方法である。また、ソノフォレーシスは、超音波振動を利用して皮膚に微細な穴を空けて皮膚に適用した組成物の経皮吸収を促進する方法である。
【００５７】
（III）肌劣化症状を改善する美容方法
また本発明は、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を有する被験者に対して、セラミド類を有効成分とする組成物を適用し、当該被験者の上記肌劣化症状を改善する美容方法に関する。なお、本発明が対象とする方法は、美容方法であり、ヒトに対する治療方法ではない。
【００５８】
加齢または紫外線照射による肌劣化症状としては、真皮じわ、肌のたるみ及びハリ低下からなる群から選択される少なくとも１つの症状を挙げることができる。ここで肌のたるみ及びハリ低下は、真皮層に存在する間質成分の量の低下及び／又は膠原線維や弾性線維の引っ張り力の低下に伴って生じる肌のたるみ及びハリ低下を意味し、真皮じわは当該間質成分の減少に起因して生じるしわ（大しわ、深いしわ）を意味する。
【００５９】
対象とする被験者は、加齢または紫外線照射による肌劣化症状を有する者、好ましくは加齢による肌劣化症状（肌老化症状）を有する者である。通常、男女ともに３０歳を超えると当該該当の被験者になる可能性がある。好ましくは４０歳以上、より好ましくは４５歳以上、さらに好ましくは５０歳以上である。
【００６０】
ここで、セラミド類を有効成分とする組成物としては、上記（II）で説明した本発明の組成物を好適に挙げることができる。これらの組成物には医薬部外品、化粧品及び飲食品が含まれる。
【００６１】
外用の医薬部外品及び化粧品は、その形態によっても異なるが、硬膏、軟膏、クリーム、リニメント、ローション、乳液、液、エアゾール等の形態を有する場合、当該外用医薬部外品及び化粧品を被験者の所望の部位の皮膚に塗布または噴霧することによって使用することができる。また外用医薬部外品及び化粧品がパップ剤の形態を有する場合、当該外用の医薬部外品及び化粧品を被験者の所望の部位の皮膚に貼付することによって使用することができる。皮膚への適用は、１日１回または複数回行ってよく、例えば朝と晩（寝る前）に適用する方法を挙げることができる。
【００６２】
飲食品には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、及び液剤（ドリンク剤）など製剤形態を有するサプリメント、並びに機能性表示食品及び特定保健用食品が含まれる。服用は、１日に１回または複数回行ってよく、例えば朝と晩（寝る前）に服用する方法を挙げることができる。
斯くして加齢または紫外線照射による肌劣化症状（特に肌老化症状）の発生を抑制し（予防）、また改善することが可能になる。
【実施例】
【００６３】
以下、実験例及び実施例に基づいて、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００６４】
実験例１  ヒト真皮線維芽細胞におけるＡＴＰ産生促進作用の評価
（１）被験試料の調製
被験試料として下記のものを準備した。なお、被験試料１及び２は、９６wellマイクロプレートの１well中のセラミド濃度（複数のセラミドを含む場合はそれらの総濃度）が２５μｇ／ｍｌになるように調製した。なお、以下「ＤＭＳＯ」は和光純薬工業株式会社製を使用した。
被験試料１：セラミド２のＤＭＳＯ溶液
被験試料２：セラミド１、２及び３の混合ＤＭＳＯ溶液
コントロール：ＤＭＳＯ溶液（なお、被験試料１及び２のＤＭＳＯと同量に調整）
なお、被験試料２中のセラミド１、２及び３の組成（重量比）は下記の通りである。
セラミド１：セラミド２：セラミド３＝０．０２：８０：１
【００６５】
（２）試験方法
ＤＭＥＭ（Thermo Fischer Scientific Inc製）で予め培養しておいたヒト真皮線維芽細胞を９６wellマイクロプレートに播種（10４個／well）した。これを３７℃で１日間培養した後、被験試料またはコントロールを１μL添加した。次いで３７℃で３日間培養した後に、細胞数とＡＴＰを測定し、下式に基づいて１細胞あたりのＡＴＰ量を産出した。なお、被験試料、コントロールそれぞれの試験数は３であった（ｎ：３）。
【００６６】
【数１】
2017178842.tif 000004
【００６７】
（ａ）細胞数の測定
細胞を含む測定対象のwellに、Cell counting kit-8溶液（タカラバイオ(株)製）を１０μLずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、上清を４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、細胞数を測定した。
【００６８】
（ｂ）ＡＴＰの測定
被験試料（ヒト真皮線維芽細胞）のＡＴＰ量の測定には、ルシフェラーゼ発光法を用いたＡＴＰ測定試薬（「『細胞の』ＡＴＰ測定試薬」、和光純薬工業(株)製）を使用した。具体的にはＡＴＰ測定試薬を各wellに１００μLずつ加えた。次いで、マイクロプレートシェーカーで１分間攪拌した後、１０分間静置し（室温）、マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。
【００６９】
（３）試験結果
試験結果を表１に記載する。なお、値はコントロールの結果（平均値）を１００とした相対値（平均値）である。
【表１】
2017178842.tif 000005
【００７０】
この結果から、セラミドはヒト真皮線維芽細胞におけるＡＴＰ産生を有意に促進することがわかる。ＡＴＰは生物のエネルギー源というべきものであり細胞の各種の働きに介在するものであるので、セラミドの添加によりヒト線維芽細胞１細胞あたりのＡＴＰ産生が促進されたことは、すなわち細胞が賦活化されたものと考えられる。
【００７１】
実験例２  ヒト真皮線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進作用の評価
（１）被験試料の調製
被験試料として、実験例１で調製した被験試料１及び２、並びにコントロールを同様に用いた。なお、被験試料１及び２は、１２wellプレートの１well中のセラミド濃度（複数のセラミドを含む場合はそれらの総濃度）が２５μｇ／ｍｌになるように調製した。
【００７２】
（２）試験方法
（a）氷上に１２wellプレートを置き、各wellにＤＭＥＭ１０倍濃縮溶液（ＤＭＥＭを通常濃度の１０倍となるように調整したもの。以下、同じ。）１００μL、ＦＢＳ１００μL、コラーゲン溶液（３μｇ／ｍL）７００μL、ＮａＨＣＯ３(１mol/L)２０μL、及びヒト真皮線維芽細胞培養液７５μL(125万個/well)を加えた。
（b）次いで各wellに被験試料（被験試料１、２またはコントロール）５μLを添加し、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
（c）ゲルをプレートからはがし、プレート上に置いた状態で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１ｍLを加えた。
（d）各wellに被験試料（被験試料１、２またはコントロール）５μLを添加し、室温で攪拌した。
（e）４日間３７℃の条件で培養した後、ゲルの長さを測定し、下式に基づいて収縮前後（セラミド添加前後）でのコラーゲンゲルの直径の差（cm）を産出した。なお、被験試料、コントロールそれぞれの試験数は３であった（ｎ：３）。
【００７３】
【数２】
2017178842.tif 000006
【００７４】
（３）試験結果
試験結果を表２に記載する。なお、値はコントロールの結果（平均値）を１００とした相対値（平均値）である。
【００７５】
【表２】
2017178842.tif 000007
【００７６】
この結果から、セラミドはヒト真皮線維芽細胞のコラーゲンゲルの収縮を有意に促進することがわかる。これは、セラミドの添加により線維芽細胞が膠原線維をより引っ張り引き締めていることを示しており、当該機能の向上はセラミドが線維芽細胞を賦活化した結果生じたものと考えられる
【００７７】
実験例３  ヒト真皮線維芽細胞におけるインテグリン発現量増加作用の評価
（１）被験試料の調製
被験試料として、実験例１で調製した被験試料２、及びコントロールを同様に用いた。なお、インテグリンとして、インテグリンα２及びインテグリンβ１の発現量を評価した。インテグリンα２の発現量評価には、被験試料２は、１２wellプレートの１well中のセラミドの総濃度が６.２５μｇ／ｍｌになるように調製して使用した。一方、インテグリンβ１の発現量評価には、被験試料２は、１well中のセラミドの総濃度が２５μｇ／ｍｌになるように調製して使用した。
【００７８】
（２）試験方法
（a）氷上に１２wellプレートを置き、各wellにＤＭＥＭ１０倍濃縮溶液１００μL、ＦＢＳ１００μL、コラーゲン溶液（３μｇ／ｍL）７００μL、ＮａＨＣＯ３(１mol/L)２０μL、ヒト真皮線維芽細胞培養液７５μL(125万個/well)を加えた。
（b）次いで各wellに被験試料５μLを添加し、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
（c）ゲルをプレートからはがし、プレート上に置いた状態で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１ｍL加えた。
（d）各wellに被験試料５μLを添加し、室温で攪拌した。
（e）１日培養した後にＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出し、One Step SYBRR PrimerScript RT-PCR kit II（タカラバイオ(株)製）を用いてインテグリンα２とインテグリンβ１のｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、被験試料、コントロールそれぞれの試験数は３であった（ｎ：３）。
【００７９】
（３）試験結果
試験結果を表３に記載する。なお、値はコントロールの結果（平均値）を１００とした相対値（平均値）である。
【００８０】
【表３】
2017178842.tif 000008
【００８１】
この結果から、セラミドはヒト真皮線維芽細胞中のインテグリン（インテグリンα２及びβ１）の発現量を有意に増加させることがわかる。インテグリンは線維芽細胞と膠原線維や弾性線維との結合点であり、その結合点の数は前記線維の引っ張り力と関係する。当該発現量の増加は、セラミドが線維芽細胞を賦活化した結果生じたものと考えられる
【００８２】
実験例４  ヒト真皮線維芽細胞におけるフィブリリン-1発現量増加作用の評価
（１）被験試料の調製
被験試料として、実験例１で調製した被験試料２、及びコントロールを同様に用いた。被験試料２は、１２wellプレートの１well中のセラミドの総濃度が１２.５μｇ／ｍｌになるように調製して使用した。
【００８３】
（２）試験方法
（a）氷上に１２wellプレートを置き、各wellにＤＭＥＭ１０倍濃縮溶液１００μL、ＦＢＳ１００μL、コラーゲン溶液（３μｇ／ｍL）７００μL、ＮａＨＣＯ３(１mol/L)２０μL、ヒト真皮線維芽細胞培養液７５μL(125万個/well)を加えた。
（b）次いで各wellに被験試料５μLを添加し、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
（c）ゲルをプレートからはがし、プレート上に置いた状態で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１ｍLを加えた。
（d）各wellに被験試料５μLを添加し、室温で攪拌した。
（e）１日培養した後にＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出し、One Step SYBRR PrimerScript RT-PCR kit II（タカラバイオ(株)製）を用いてフィブリリン-1のｍＲＮＡの発現量を測定した。
なお、被験試料、コントロールそれぞれの試験数は３であった（ｎ：３）。
【００８４】
（３）試験結果
試験結果を表４に記載する。なお、値はコントロールの結果（平均値）を１００とした相対値（平均値）である。
【表４】
2017178842.tif 000009
【００８５】
この結果から、セラミドはヒト真皮線維芽細胞中のフィブリリン-1の発現量を有意に増加させることがわかる。フィブリリン-1は間質成分の弾性線維を構成するものであり、弾性線維は線維芽細胞により引っ張り引き締められる。当該発現量の増加は、セラミドが線維芽細胞を賦活化した結果生じたものと考えられる。