(57)【要約】      （修正有）【課題】標的物質と共有結合する、タンパク質標識用の（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを、高速で得る方法の提供。【解決手段】以下の工程を含む、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質の選択方法。(a)DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、(b)RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、(c)無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、(d)mRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、(e)cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、及び(f)cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程【選択図】図１
2017035063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(a) DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、
(b) RNAライブラリーのRNAの3’末端側に、リンカーを介して核酸誘導体を連結し、RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、
(c) RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNA部をmRNAとして、無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(d) mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(e) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、及び
(f) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程、
を含む、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質の選択方法。
【請求項２】
前記工程(f)は、前記結合体を有機溶媒及び／又は変性剤で洗浄することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
(g) 選択された結合体のcDNAを増幅する工程
を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(a)〜(g)を繰り返し行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
(h) 増幅されたcDNAの配列を決定する工程
を更に含む、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸誘導体はピューロマイシンである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれかの方法で選択された、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質を含有するペプチド／タンパク質タグ。
【請求項８】
前記標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質は、少なくとも1つのシステイン残基を含む、請求項7に記載のペプチド／タンパク質タグ。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれかの方法で選択された標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質と、該ペプチド又はタンパク質をコードする核酸とが連結された、核酸ディスプレイペプチド／タンパク質。
【請求項１０】
請求項9に記載の核酸ディスプレイペプチド／タンパク質であって異なる核酸配列を有する複数の核酸ディスプレイペプチド／タンパク質からなるライブラリー。
【請求項１１】
以下の工程：
(a) DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、
(b) RNAライブラリーのRNAの3’末端側に、リンカーを介して核酸誘導体を連結し、RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、
(c) RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNAをmRNAとして、無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(d) mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(e) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、
(f) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程、及び
(g) 選択された結合体のcDNAを増幅する工程
を含む、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質をコードする核酸の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意の標的物質と共有結合可能な（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの選択方法、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグ、核酸ディスプレイペプチド、核酸ディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリー、及び標的物質と共有結合可能なペプチド／タンパク質をコードする核酸の取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、進化分子工学が発達し、ディスプレイ技術が実用化されている。例えば、ファージディスプレイでは、ファージの殻タンパク質に外来タンパク質を融合タンパク質として発現させ、標的物質と結合する目的のタンパク質を選択し、目的タンパク質をコードしている遺伝子を解析する。
【０００３】
このようなディスプレイ技術によって得られる標的物質と結合するタンパク質を、標的タンパク質に連結して、目印（タグ）として利用する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグは、細胞内の特定の標的タンパク質を蛍光分子等により標識して可視化することや、細胞内の特定の標的タンパク質の活性や相互作用を制御することに応用が可能なため、生物学・医学的研究等において有用である。
【０００４】
（ポリ）ペプチド／タンパク質タグは、既に市販化されており、例えば、NEB社の「SNAP Tag」、Promega社の「Halo Tag」、Active motif社の「eDHFR Tag」、Invitrogen社の「Cys4 Tag」等が挙げられる。
【０００５】
しかし、前記「SNAP Tag」、「Halo Tag」、「eDHFR Tag」は、タグサイズ（分子量）が大きいため、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグが付加された標的タンパク質と他の生体分子との相互作用や細胞内局在を阻害しやすい。また、前記「Cys4 Tag」は、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグと結合する標的物質中にヒ素原子が含まれる。従って、毒性があり、かつ、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグと標的物質の結合の選択性が比較的低いという問題があった。
【０００６】
また、前記ファージディスプレイのように細胞を利用する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの選択方法の場合、細胞を使用することに由来する欠点があった。例えば、細胞を用いることによる検出空間の狭さや、膜透過性、宿主細胞によるバイアス、宿主細胞の個体数によるライブラリーの制限等の問題である。また、ディスプレイされたペプチドとそれをコードする遺伝子が共有結合を介して連結されてはいないので、変性剤を利用した洗浄による（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの選択に用いることはできない。そこで、細胞を用いない無細胞翻訳系の手法、例えば、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ等が開発された。
【０００７】
例えば、特許文献1には、無細胞タンパク質合成系において、核酸とタンパク質とを結合させ、遺伝子型と表現型が対応づけられた分子を作製する技術が開示されている。
遺伝子型と表現型が対応づけられていれば、標的物質と未知の該表現型のタンパク質とが相互作用することを見出した場合に、該遺伝子型の核酸部分を増幅させることにより、当該未知のタンパク質を同定することができる。
【０００８】
具体的には、mRNAの3’末端側にスペーサーを介してピューロマイシンが連結され、この連結体を無細胞タンパク質合成系で翻訳してタンパク質を合成する。該タンパク質の合成において、mRNAの3’末端側にあるピューロマイシンがリボソームのAサイトに取り込まれ、ペプチジルトランスフェラーゼの作用により、合成されたタンパク質のC末端に取り込まれる。その結果、mRNAとそれに対応する合成されたタンパク質がピューロマイシンを介してつながった、遺伝子型と表現型の対応付け分子を得ることができる。
【０００９】
しかし、ディスプレイされたペプチド（表現型）とそれをコードするDNA（遺伝子型）が共有結合を介して連結されてはいないので、変性剤を利用した洗浄による（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの選択を用いることはできない。また、転写、mRNA精製、ピューロマイシン修飾、ピューロマイシン修飾mRNAの精製、翻訳、mRNAディスプレイペプチドの精製などの多段階の各ステップを個別に行わなければならないため、非常に時間のかかる選択方法であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第3683282号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本技術は、任意の標的物質と共有結合する、タンパク質標識用の（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを、高速で得る方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグのアミノ酸配列を、標的物質と共有結合可能となるように構成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本技術は、以下の工程：
(a) DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、
(b) RNAライブラリーのRNAの3’末端側に、リンカーを介して核酸誘導体を連結し、RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、
(c) RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNA部をmRNAとして、無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(d) mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(e) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、及び
(f) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程、
を含む、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質の選択方法を提供する。
【００１４】
また、本技術は、前記選択方法で選択された、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質を含有するペプチド／タンパク質タグを提供する。
【００１５】
更に、本技術は、前記選択方法で選択された標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質と、該ペプチド又はタンパク質をコードする核酸とが連結された、核酸ディスプレイペプチド／タンパク質を提供する。
【００１６】
また、本技術は、前記核酸ディスプレイペプチド／タンパク質であって異なる核酸配列を有する複数の核酸ディスプレイペプチド／タンパク質からなるライブラリーを提供する。
【００１７】
更に、本技術は、以下の工程：
(a) DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、
(b) RNAライブラリーのRNAの3’末端側に、リンカーを介して核酸誘導体を連結し、RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、
(c) RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNA部をmRNAとして、無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(d) mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(e) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、
(f) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程、及び
(g) 選択された結合体のcDNAを増幅する工程
を含む、標的物質と共有結合可能なペプチド又はタンパク質をコードする核酸の取得方法を提供する。
【００１８】
ここで、例えば、「RNA−リンカー−核酸誘導体」という表現は、「RNA」に「リンカー」が連結し、更に「リンカー」に「核酸誘導体」が連結していることを意味する。特にことわりが無い限り、同様の他の表現も同様に解釈される。
また、例えば、「mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリー」という表現は、「mRNAディスプレイペプチドライブラリー」又は「mRNAディスプレイタンパク質ライブラリー」を意味する。特にことわりが無い限り、同様の他の表現も同様に解釈される。
また、例えば、「（ポリ）ペプチド／タンパク質」という表現は、数個のアミノ酸からなるもの、約十個から数十個程度のアミノ酸からなるもの、約百個から数百個以上のアミノ酸からなるものをも含むことを意味する。
更に、例えば「mRNAディスプレイペプチド」という表現は、mRNAの断片と、その断片から翻訳されたペプチドとが、リンカーや核酸誘導体を介して対応付けられた分子を意味する。特にことわりが無い限り、同様の他の表現も同様に解釈される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、cDNAと（ポリ）ペプチド／タンパク質タグとが共有結合によって不可逆的で安定的に結合した、DNAディスプレイペプチド／タンパク質を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の標的物質と共有結合可能な（ポリ）ペプチド／タンパク質の選択方法の概略を示す図である。
【図２】本発明の実施態様に係るポリペプチドの選択方法の概略を示す図である。
【図３】本発明で用いる無細胞系転写／翻訳カップリングシステムのcDNAディスプレイペプチドライブラリーの調製方法の概略を示す図である。
【図４】調製した全cDNAに対する回収されたcDNA量の割合を選択ラウンドごとに算出したグラフである。
【図５】フルオレセイン修飾pClBz−CRPタグ−DHFR分子の形成を示す図である。
【図６】CRP−DHFRタグ融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図７】DHFR−CRPタグ−フルオレセイン修飾pClBz分子の形成を示す図である。
【図８】DHFR−CRPタグ融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図９】フルオレセイン修飾pClBz−CRPタグ−タンパク質分子の形成を示す図である。
【図１０】CRPタグ−タンパク質融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図１１】蛍光標識分子修飾pClBz−ポリペプチドタグ−DHFR分子の形成を示す図である。
【図１２】CRPタグ−DHFR融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図１３】フルオレセイン修飾pClBz−CRP断片タグ−DHFR分子の形成を示す図である。
【図１４】CRP断片タグ−DHFR融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図１５】調製した全cDNAに対する回収されたcDNA量の割合を選択ラウンドごとに算出したグラフである。
【図１６】CRPタグ−DHFR融合体のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図１７】フルオレセイン修飾ポリペプチドタグ−DHFR分子の形成を示す図である。
【図１８】フルオレセイン修飾ポリペプチドタグ−DHFR分子のSDS-PAGE電気泳動像の図面代用写真である。
【図１９】NLS−GFP−CRPタグ−標識分子修飾pClBz分子の形成を示す図である。
【図２０】蛍光標識ポリペプチドタグ融合タンパク質を発現する細胞の顕微鏡像の図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本技術の標的物質と共有結合可能な（ポリ）ペプチド又はタンパク質の選択方法は、次の工程(a)〜(f)を含み、更に、工程(g)を含めてもよい。
(a) DNAライブラリーを転写してRNAライブラリーを作製する工程、
(b) RNAライブラリーのRNAの3’末端側に、リンカーを介して核酸誘導体を連結し、RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーを作製する工程、
(c) RNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNA部をmRNAとして、無細胞翻訳系でペプチド又はタンパク質合成を行い、mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(d) mRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をDNAに逆転写して、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーを作製する工程、
(e) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる工程、
(f) cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体を選択する工程、及び
(g) 選択された結合体のcDNAを増幅する工程。
【００２２】
前記工程は、工程(a)〜(g)の順で行う。工程(a)〜(c)は連続的に自動進行する。また、工程(e)までは精製を介すること無く、ワンポットで進めることができる。更に、工程(a)〜(g)を繰り返し行うことにより、標的物質と相互作用する目的（ポリ）ペプチド又は目的タンパク質（取得したい（ポリ）ペプチド／タンパク質タグ）を高速で濃縮することができる。
【００２３】
工程(g)で増幅された大量のcDNAは、新たなDNAライブラリーとみなして、次の工程(a)で転写してRNAライブラリーを作製し、工程(b)以降の工程を行えば、迅速に標的物質と相互作用する目的（ポリ）ペプチド又は目的タンパク質（取得したい（ポリ）ペプチド／タンパク質タグ）をコードするDNAを選択することができる。例えば、本技術の最初の工程(a)で用いるイニシャルのDNAライブラリーが約1015種類のポリペプチドを含むものであっても、高速でスクリーニングすることができる。
【００２４】
本技術によれば、突然変異導入を用いた選択方法、個別スクリーニングによる選択方法（〜約105種類のポリペプチドがスクリーニング可能）、ファージディスプレイ法や酵母ディスプレイ法（〜約109種類のポリペプチドがスクリーニング可能）等と比較して、非常に大規模な（約1015種類）ライブラリーから高速に（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを選択することができる。
【００２５】
また、前記工程(a)〜(g)の後に、工程(h)：増幅されたcDNAの配列を決定する工程を行うことができる。この工程により、標的物質と相互作用する目的ペプチド又は目的タンパク質（取得したい（ポリ）ペプチド／タンパク質タグ）を同定することができる。工程(a)〜(g)及び(h)の流れを図1に示す。
【００２６】
前記工程(a)〜(h)で行う、ライブラリーの作製、転写、無細胞系での翻訳、逆転写、増幅等の遺伝子操作技術は、すべて公知の方法で行うことができる。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載された方法に準じて行うことができる。
【００２７】
工程(a)でDNAライブラリーから転写によりRNAライブラリーを作製した後、工程(b)に移る。工程(b)で用いるリンカーは、RNAの3’末端に連結可能な、例えば、天然又は合成の核酸鎖断片、多糖類、ポリエチレングリコール、DNA鎖とポリエチレングリコールのキメラ体等の高分子が挙げられる。リンカーの長さは、例えば約100〜1000Åであるが、本発明の効果を妨げない範囲であれば限定されない。
【００２８】
リンカーの一方の端にはRNAの3’末端を、もう一方の端には核酸誘導体を連結する。核酸誘導体は、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質である。
核酸誘導体は、例えば、ピューロマイシンや、3’−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（PANS−アミノ酸）であってアミノ酸部がグリシンのPANS−Gly、バリンのPANS−Val、アラニンのPANS−Ala等の、全アミノ酸に対応するPANS−全アミノ酸、あるいは3’−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（AANS−アミノ酸）であってアミノ酸部がグリシンのAANS−Gly、バリンのAANS−Val、アラニンのAANS−Ala等の、全アミノ酸に対応するAANS−全アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
次に、工程(b)で作製されたRNA−リンカー−核酸誘導体のライブラリーのRNA部をmRNAとして、無細胞翻訳系で（ポリ）ペプチド又はタンパク質合成を行う（工程(c)）。
RNA−リンカー−核酸誘導体の核酸誘導体部分はリボソームに取り込まれ、ペプチド転移反応の基質として、翻訳された（ポリ）ペプチド又はタンパク質のC末端に取り込まれる。その結果、mRNAの3’末端は、リンカー−核酸誘導体を介して、（ポリ）ペプチド又はタンパク質と連結し、mRNA−リンカー−核酸誘導体−（ポリ）ペプチド／タンパク質の連結体、すなわちmRNAディスプレイペプチド／タンパク質が形成される。
【００３０】
次に、工程(c)で作製されたmRNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのmRNA部をcDNAに逆転写する工程(d)を行う。これにより、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーが形成される。
【００３１】
次に、工程(e)を行う前に、標的物質をあらかじめ固相に固定化しておく。固相には、例えば、磁気ビーズ、アフィニティービーズ等の固相担体として一般的に用いられるものであれば特に限定されない。
固定化の方法は既知の技術を用いればよい。また、標的物質を固定化した後、標的物質以外のものが固相担体に結合しないように固相表面を処理することが好ましい。
そして、工程(e)で、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーに、固定化された標的物質を接触させる。  
【００３２】
cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーと固定化された標的物質を接触させると、標的物質が特異的にペプチド部又はタンパク質部に結合する。標的物質が非特異的にcDNAディスプレイペプチド／タンパク質に結合したものや、弱い結合の（共有結合ではない）もの、固相担体に結合したものは、強い条件下で洗浄すると、除去できる。
【００３３】
強い洗浄条件とは、例えば、DMSO、SDS等の有機溶媒、変性剤等での洗浄であり、cDNAの増幅機能だけにはできるだけ影響を与えないものが好ましい。
具体的には、有機溶媒、変性剤を用いた洗浄、PCR条件にも使われる95℃までの加熱条件下での洗浄などであれば、特に問題はない。  
【００３４】
当該洗浄により、cDNAディスプレイペプチド／タンパク質ライブラリーのペプチド部又はタンパク質部と標的物質とが共有結合した結合体が選択される（工程(f)）。
【００３５】
共有結合で結合した標的物質−cDNAディスプレイペプチド／タンパク質は、強い洗浄条件下で残るので、そのcDNA部分を増幅する（工程(g)）。増幅産物は、そのまま精製することなく、DNAライブラリーとして工程(a)に適用し、次の選択ラウンドに入り、工程(b)〜(g)を行う。この繰り返しによって、標的物質と結合する（ポリ）ペプチドタグ又はタンパク質タグを淘汰する。
【００３６】
標的物質と結合する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを持つcDNAディスプレイペプチド／タンパク質のcDNA部分を工程(g)で増幅後、cDNAの配列を決定する（工程(h)）。これにより、標的物質と相互作用する（ポリ）ペプチド／タンパク質を分析することができる。同定した（ポリ）ペプチド又はタンパク質は、（ポリ）ペプチドタグ又はタンパク質タグとして用いることだけでなく、薬物等との相互作用の研究や医薬の開発等に用いることができる。
【００３７】
＜実施形態1＞
本実施形態では、p-（クロロメチル）ベンズアミド（pClBz）を標的物質の小分子（標的小分子）の例にして説明する。
pClBzは、分子式C9H10ClNOで表され、生細胞の細胞質内に導入することができるサイズの小分子である。
【００３８】
pClBzと反応する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを得るため、DNAライブラリーを作製し、該DNAライブラリーから転写、翻訳を経て、ペプチドタグライブラリーを作製する。該ペプチドタグライブラリーは、N末端のホルミルメチオニンとC末端のGly5-Serスペーサー間に8〜15個のランダムなアミノ酸からなるアミノ酸配列が入るように設計する。
【００３９】
具体的には、DNAライブラリーから転写されたmRNAライブラリーを無細胞翻訳系に適用する。このとき、リンカーにDNA鎖を用い、ピューロマイシンで修飾し、翻訳を行うと、mRNA−DNAリンカー−ピューロマイシン−ペプチドの構成を有する、mRNAディスプレイペプチドが形成される。
【００４０】
次に、mRNAディスプレイペプチドのmRNA部を逆転写すると、cDNAディスプレイペプチドライブラリーが得られる。ここで、該cDNAディスプレイペプチドライブラリーを精製する工程は必要ない。
【００４１】
続いて、磁気ビーズに固定化された前記標的小分子のpClBzと、未精製のcDNAディスプレイペプチドライブラリーとを混合する。標的小分子のpClBzの分子式C9H10ClNOのCl部分は、cDNAディスプレイペプチドのペプチド部に、例えばシステイン残基が含まれていれば、そのチオール基と反応する。これにより、pClBzと反応するペプチドが選択される。この操作では、全てのチオール基をフリーにするため、還元剤のトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の存在下で、pH7.6、37℃、60分の条件で選択を行う。
【００４２】
磁気ビーズに固定化されたpClBzに結合しなかった（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを除去するため、ビーズを洗浄し、選択された（ポリ）ペプチド／タンパク質に対応するcDNAをPCRで増幅し、増幅産物を次の（ポリ）ペプチド／タンパク質を選択するためのライブラリーとして使用する。
ここまでで、第１回目の（ポリ）ペプチド／タンパク質の選択ラウンドが終了する。
本実施態様の標的小分子pClBzを用いた前記一連の工程を図2に示す。
【００４３】
続いて、第2回目の（ポリ）ペプチド／タンパク質の選択ラウンドにおいて、前記増幅産物であるcDNAライブラリーを、無細胞系転写／翻訳カップリングシステムに供する。このとき、前述のように、cDNAディスプレイのためのピューロマイシン−DNAリンカーを添加する。ここで、転写によりmRNAディスプレイペプチドライブラリーが形成され、次の翻訳によりcDNAディスプレイペプチドライブラリーが形成される。
前記無細胞系転写／翻訳カップリングシステムのcDNAディスプレイペプチドライブラリーを調製する方法の概略を図3に示す。
【００４４】
なお、未精製のcDNAディスプレイペプチドライブラリーについて、ビーズに非特異的に結合する（ポリ）ペプチド／タンパク質を除去するため、pClBzが結合していない磁気ビーズを用いて、複数の選択ラウンドにわたってクリアランスすることが好ましい。
【００４５】
更に、pClBzを固定化した磁気ビーズとcDNAディスプレイペプチドとを反応させた後、pClBzに共有結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを選択しつつpClBzと磁気ビーズとが非共有結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを除去するため、変性試薬（尿素及びSDS）と有機溶媒（DMSO）で洗浄する。本技術では、標的小分子と（ポリ）ペプチド／タンパク質タグとが共有結合で強固に結合するので、強い条件下で洗浄できる。
また、pClBz分子と磁気ビーズ部分の両方を認識する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを除去するため、pClBzを固定化する磁気ビーズとして、複数の選択ラウンドにおいて交互に2種類の磁気ビーズを用いることが好ましい。
【００４６】
選択ラウンドによって回収されたcDNAの量について、定量PCRを用いて調製した全cDNA量に対する割合を算出する。その一例を図4のグラフに示す。ラウンド経過に伴い、反応時間を60分から3分へと短くすることや、pClBzを固定化した磁気ビーズの量を少なくすると、選択圧が高まる。
また、例えば、図4のラウンド11〜13で回収されたcDNAを、エラープローンPCR増幅に供しランダム突然変異誘発を行い、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの反応性を増強することができる。
【００４７】
本実施態様における、標的小分子pClBzと反応する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグは、以下の2つが選択される。
ポリペプチドタグCRP1：THWFWCPYWGWLRS（配列番号1）
ポリペプチドタグCRP2：WFWCPYWRTYIWY（配列番号2）
CRP1では、6番目のアミノ酸がシステインであり、CRP2では、4番目のアミノ酸がシステインである。
これらのポリペプチドタグは、共通のモチーフWFWCPYW（配列番号3）を有する。
【００４８】
前記2種類ポリペプチドタグCRP1及びCRP2を、DNAリンカー−ピューロマイシンの非存在下で、無細胞系転写／翻訳カップリングシステムを用いて発現させる。次に、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミドと、37℃で30分間、インキュベーションする。
これを、MALDI-TOF-MS分析すると、当該2種類のポリペプチドタグは、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミドと共有結合することがわかる。
また、前記ポリペプチドタグのC末端にシステイン残基が追加されるようにポリペプチドタグを発現させ、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミドで処理すると、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミド一つと反応したものは検出されるが、二つ以上反応したものは検出されない。
更に、前記ポリペプチドタグのC末端のシステイン残基をセリン残基にして、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミドで処理すると、該ポリペプチドタグは何も反応しない。
つまり、前記２種類のポリペプチドタグは、部位特異的に、システイン残基を介して、p-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミドで標識される。
【００４９】
前記2種類のポリペプチドタグCRP1及びCRP2の標識特異性を調べるには、該ポリペプチドタグとDHFR（dihydrofolate reductase、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）との融合体（DHFR−CRPタグ）をin vitroで発現させ、フルオレセイン修飾pClBzを用いて、37℃で30分間処理する。すると、図5に示す構造の分子（フルオレセイン修飾pClBz−CRP− DHFRタグ）が形成される。
【００５０】
形成物をSDS-PAGE電気泳動すると、図6のように示される（左：クマシーブリリアンドブルー、右：in-gel fluorescence）。レーン1は、DHFRのみで前記ポリペプチドタグは含まないネガティブコントロールである。レーン2は、前記実施形態1で述べたCRP1−DHFRの融合体、レーン3はCRP2−DHFRの融合体である。
この図より、ポリペプチドタグ−DHFRの融合体は、フルオレセイン修飾pClBzで特異的に標識される。これは、ポリペプチドタグに含まれるシステイン残基のチオール基にフルオレセイン修飾pClBzが結合することを示す。
【００５１】
また、DHFRのC末端にCRP1又はCRP2を融合した融合体（DHFR−CRPタグ、図7）を、フルオレセイン修飾pClBzで同様に処理しても、特異的に修飾できる（図8）。
【００５２】
更に、DHFRの代わりに他のタンパク質、例えばTNF（Tumor Necrosis Factor、腫瘍壊死因子）又はPPIA（peptidylprolyl isomerase A、ペプチジルプロピルイソメラーゼA）と前記CRP1又はCRP2との融合体（図9）についても、フルオレセイン修飾pClBzで特異的に標識できる（図10）。
【００５３】
あるいは、フルオレセインの代わりに他の標識物、例えばクマリン、Alexa Fluoro 488（AF488）又はテトラメチルローダミン（TMR）で修飾したpClBzを調製し、同様に処理しても（図11）、CRP1又はCRP2に標識することができる（図12）。
【００５４】
効率よく標識するために好ましい（ポリ）ペプチドタグの長さは、CRP1又はCRP2を切断した様々な長さの（ポリ）ペプチドタグを、DHFRに融合して融合体を発現し、前記と同様の条件下で、フルオレセイン修飾pClBzで標識してみることによって、調べることができる。
例えば、前記CRP1（配列番号1）とCRP2（配列番号2）の共通モチーフであるWFWCPYW（配列番号3）を含むが長さの異なる（ポリ）ペプチドタグを作製する（図13、図14））。
これを、SDS-PAGEで分析すると、CRP1及びCRP2を短くしたものよりも完全長に近いCRP1、CRP2が効率的に標識されることが示される（図14の電気泳動像）。
【００５５】
次に、更に反応性の高い（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの取得について検討する。
（ポリ）ペプチド／タンパク質タグライブラリーのN末端のfMet-Ser-Gly2（配列番号4）と共通のモチーフであるWFWCPYW（配列番号3）との間に5つのランダムアミノ酸を有し、また、共通のモチーフとC末端のGly5−Ser（配列番号5）スペーサーとの間に5つのランダムアミノ酸を有するように、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグライブラリーを作製する。
該（ポリ）ペプチド／タンパク質タグライブラリーについて、前述の選択ラウンドを10回繰り返した後、配列決定を行うと、N末端側の5つのランダムアミノ酸は収束しないが、C末端側の5つのランダムアミノ酸は、主としてCCWVPの配列（配列番号6）に収束する（図15）。
これを、ポリペプチドタグCRP3（WFWCPYWCCWVP、配列番号7）とし、前述と同様にして、CRP3とDHFRとを融合してフルオレセインで標識する際の効率は、前記CRP1と同程度である（図16）。
【００５６】
次に、共有結合による標識の不可逆性について検討する。
例えば、フルオレセイン標識ポリペプチドタグ（CRP）融合DHFRと、Invitrogen社より市販されている赤色二ヒ素(biarsenical) 色素（ReAsH）と結合するテトラシステインペプチドタグ（Cys4、配列番号8）融合DHFR（図17）とを、95℃で5分間、2-メルカプトエタノール（BME）で処理する。
処理物をSDS-PAGEで分析すると、赤色二ヒ素(biarsenical) 色素結合テトラシステインペプチドタグ融合DHFRのフルオレセイン（FlAsH）強度は、2-メルカプトエタノール処理後、減少する。一方、フルオレセイン標識ポリペプチドタグ（CRP）融合DHFRのフルオレセイン強度は処理後であっても一定である（図18）。すなわち、システインを含むポリペプチドタグ（CRP）の標識の不可逆性を示す。このことは、例えば、細胞内タンパク質を標識して洗浄を行う際、強い洗浄条件下でも有利であると考えられる。
【００５７】
生細胞において、細胞内部で（ポリ）ペプチド／タンパク質タグ融合タンパク質が標識されるかを確認するには、核局在配列（NLS）にGFPを連結し、更にGFPのN末端にCRP1〜2をそれぞれ融合したものを設計する（図19）。ここで、核局在配列（NLS）は（DPKKKRKV）3である（配列番号9）。
設計したNLS−GFP−ポリペプチドタグ（CRP1〜2）の融合体を、ヒト胎児由来腎臓（HEK）細胞で発現させる。一方、CRP1〜2の代わりにテトラシステインペプチドタグとの融合体も発現させる。
次に、例えば、0.1μMの膜浸透性TMR（テトラメチルローダミン）修飾pClBz（TMR−pClBz）又はReAsHを、37℃で30分間インキュベートして標識する。
トランスフェクトされた細胞（GFPで識別）では、核はTMRで標識され、一方、トランスフェクトされなかった細胞は、標識されない。CRP1〜2では、コントロールのReAsHで標識されたCys４タグと同様に、標識される。
顕微鏡像をみると、図20の左カラムでは、NLS−GFP−ポリペプチドタグ（CRP1〜2）が緑色に発光して、トランスフェクトされた細胞が存在すること示す。図20の中央カラムでは、TMR−pClBzがペプチドタグCRP1〜2と結合して、又はReASHがテトラシステインペプチドと結合して、赤色に発光していることを示す。図20の右カラムでは、緑色蛍光画像と微分干渉顕微鏡像の合成画像を示す。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
なお、本実施例で用いたプライマー、（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードするDNA、試薬等の詳細は、本実施例の後に述べる。
【００５９】
［1．pClBz（標的物質）と反応する（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの選択］
ランダム（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードするDNAテンプレートを調製するために、SD8M2-NNK8-15-G5.F60オリゴDNA（配列番号10）及びG5S-4an21.R41オリゴDNA（配列番号11）をアニーリングし、KOD-plus-neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO）でプライマー伸長をし、次に、得られた二重鎖DNAを、T7SD8M2.F44プライマー（配列番号12）及びG5S-4an21.R41プライマー（配列番号13）を用いて、Taq DNAポリメラーゼ（Genscript）で増幅した。増幅したDNAは、フェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿で抽出することにより精製した。このようにして調製したランダムDNAテンプレートを、T7 RNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いて、ラン・オフin vitro転写で転写し、ランダムmRNAをイソプロパノール沈殿で精製した。mRNAライブラリーは、8〜15の繰り返しNNK配列を含むランダムmRNAを混合して調製した。mRNAディスプレイペプチドのライブラリーを、release factor-free翻訳システム（PURExpress Δ RF123 Kit、New England Biolabs）で翻訳して調製した。このとき、2.5μMの mRNAライブラリーと2.5μMのピューロマイシンリンカー（BEX）とを含む300μLのスケールで、37℃、25分の条件下で行った。次に、EDTAを、mRNAディスプレイペプチドライブラリーの溶液に添加し、リボソームを解離させた。mRNAディスプレイペプチドライブラリーの逆転写を、選択の操作を行う前に、RNase H-inactivated逆転写酵素（ReverTraAce、TOYOBO）及びG5S-4.R20プライマー（配列番号14）を用いて、42℃で30分間行った。
【００６０】
逆転写反応をEDTAでクエンチング後、HEPES溶液で中和し、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）ですべてのメルカプト基を還元し、磁気ビーズに固定化されたp-（クロロメチル）ベンズアミド（pClBz）（Dynabeads、Life Technologies）を、前記ペプチドライブラリーの溶液に、37℃、60分の条件下で混合した。上清を除去後、磁気ビーズをHBS-T （50 mM HEPES-K pH 7.5、300 mM NaCl、0.05 % tween 20）で3回洗浄し、pClBz固定化ビーズに結合したcDNAをコードする（ポリ）ペプチド／タンパク質を、PCR pre-mixture溶液（10 mM Tris-HCl pH 8.4、50 mM KCl、0.1%(v/v) Triton X-100、2 mM MgCl2、0.25 mMの各dNTP、0.25 μM T7SD8M2.F44（配列番号12）、0.25 μM G5S-4an21.R41（配列番号11）で希釈し、磁気ビーズに結合した選択されたcDNAを95℃、5分間の条件下で溶出した。溶出されたcDNAの量を、T7SD8M2.F44（配列番号12）及びG5S-4an21.R41（配列番号11）をプライマーとして、SYBRを用いた定量的PCR （StepOnePlus、Applied Biosystems）で定量した。また、溶出されたcDNAを、Taq DNAポリメラーゼ（Genscript）を用いてPCR増幅して、次回の選択ラウンドに供した。
【００６１】
二回目のラウンドから、ピューロマイシンリンカー（BEX）と前の工程で得られたcDNAライブラリーを含む未精製のPCR混合物を含むrelease factor-free transcription/translation-coupling システム（PURExpress ΔRF123 Kit、New England Biolabs）で転写と翻訳を行い、mRNAディスプレイペプチドライブラリーを調製した。調製された非共有結合のmRNAディスプレイペプチドライブラリーを、ReverTraAceを用いて42℃、30分の条件下で逆転写し、共有結合したcDNAディスプレイペプチドライブラリーを得た。逆転写反応をEDTAでクエンチング後、HEPES溶液で中和し、すべてのメルカプト基をTCEPで還元し、該cDNAディスプレイペプチドライブラリーを、pClBz無しの磁気ビーズ（Dynabeads、Life Technologies）と、25℃又は37℃、5分の条件下で、ネガティブセレクション用にインキュベートした。該ネガティブセレクションを5回行い、磁気ビーズに結合する（ポリ）ペプチド／タンパク質を除去した。続いて、その上清を、pClBz固定化ビーズ（Dynabeads、Life Technologies又はFG beads、Tamagawa seiki)と、37℃でポジティブセレクション用に混合し、DMSO、SDS含有かつpClBz含有のHBS-Tで、37℃で5回洗浄した。ビーズに結合した選択されたcDNAを、T7SD8M2.F44（配列番号12）及びG5S-4an21.R41（配列番号11）をプライマーとして、SYBRを用いた定量的PCR （StepOnePlus、Applied Biosystems）で定量し、次の選択ラウンドのためにPCR Taq DNAポリメラーゼで増幅した。
【００６２】
［2．無細胞翻訳系によるin vitro発現CRP融合ポリペプチド及びDHFRのpClBz修飾小分子での標識］
CRP融合ポリペプチド及びDHFRを、対応するPCR増幅DNAテンプレートを含むtranscription/translation-coupling システム（PURExpress、New England Biolabs）を用いて、 37℃、60分の条件下でin vitro転写及び翻訳を行って調製した。CRP融合ポリペプチド及びDHFRを10μMのp-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミド又はフルオレセイン-pClBzを用いて、1mMのTCEPの存在下で37℃、30分の条件下で標識した。サンプルをC18-tip （C-TIP、Nikkyo Technos）を用いて脱塩し、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）で飽和した0.5％酢酸及び80％アセトニトリルで溶出し、MALDI-TOF-MS（AXIMA-CFR、SHIMADZU）分析をリニアポジティブモードで行った。SDS-PAGE分析のため、サンプルを10％SDS-PAGEで泳動し、クマシーブリリアントブルー染色とin-gel fluorescence（ImageQuant 400、GE Healthcare）で可視化した。
【００６３】
［3．生細胞におけるTMR-pClBzによるCRP融合タンパク質の標識］
ヒト胎児由来腎臓（HEK）細胞を、コラーゲンタイプIコートチャンバーカバーグラス（IWAKI）を用いて培養し、リポフェクタミン2000（Life Technologies）を用いて核局在性ポリペプチドタグ融合GFP（CRP-GFP-NLS又はCys4-GFP-NLS）でトランスフェクトした。次に、細胞を5％CO2下37℃で、培地中で36時間培養した。過剰なTMR-pClBz又はReAsHを洗浄するため、細胞を培地で3回リンスして、37℃で6時間インキュベートした。細胞をDPBSで洗浄した後、該細胞を生きたまま落射蛍光顕微鏡で観察した（IX71、Olympus）。
【００６４】
〔プライマー、（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードするDNA、試薬等の詳細〕
（1．p-（クロロメチル）安息香酸シアノメチルエステルの化学合成）
p-（クロロメチル）安息香酸シアノメチルエステルを、文献：Kawakami, T., Ishizawa, T. & Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society 135, 12297-12304 (2013)の記載に従って合成した。
【００６５】
（2．p-（クロロメチル）ベンゾイル-tRNAfmet(CAU)の調製）
大腸菌イニシエーターtRNAfMet(CAU)を、前記Kawakamiらの文献に記載されたように、T7 RNAポリメラーゼを用いたラン・オフin vitro転写で調製した。P-（クロロメチル）ベンゾイル-tRNAfmet(CAU)も、前記Kawakamiらの文献の手順に従って調製した。
【００６６】
（3．ペプチドをコードするDNAの調製）
テンプレートDNAを調製するのに使用したプライマーを下記表に示す。ペプチドをコードするDNAは、適宜、プライマー伸長に適切なフォワードプライマー及びリバースプライマーと、PCR増幅に適切なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、Taq DNAポリメラーゼ（Genscript）で調製した。
【００６７】
【表１】
2017035063.tif 000003
【００６８】
【表２】
2017035063.tif 000004
【００６９】
【表３】
2017035063.tif 000005
【００７０】
【表４】
2017035063.tif 000006
【００７１】
【表５】
2017035063.tif 000007
【００７２】
（4．CRP融合（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードするDNAの調製）
前記表1のプライマーを用いて、in vitro翻訳するための、CRP融合（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする直鎖DNAを、PCR増幅に適切なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、KOD-plus-neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO）で調製した。DHFR遺伝子のPCR増幅において、PURExpress DHFRコントロールテンプレート（New England Biolabs）をテンプレートDNAとして用いた。腫瘍壊死因子-α（TNF）及びペプチジル-プロピルシス-トランスイソメラーゼ（PPIA）遺伝子のPCR増幅において、ヒトcDNAクローンをテンプレートDNAとして用いた。トランスフェクション用プラスミドDNAを調製するため、粘着末端に、CRPをコードする相補的オリゴDNAをアニーリングすることによりポリペプチドタグCRPを導入した。アニーリングした挿入物は、適切な制限酵素で処理したプラスミドDNAに導入した。
【００７３】
（5．p-（クロロメチル）ベンズアミド固定化ビーズの調製）
アミン磁気ビーズ（Dynabeads、Life Technologies又はFG beads、Tamagawa seiki）を、273 mMジイソプロピルエチレンアミン（DIEA）のジメチルホルムアミド（DMF）溶液で2回洗浄し、273 mM DIEAのDMF溶液の存在下で60分間、p-（クロロメチル）ベンゾイルクロリドと反応させた。10 mM DIEAのDMF溶液でビーズを3回洗浄し、16.6％DMF含有の10 mM Tris/HCl（pH 6.8）で3回洗浄した。
【００７４】
（6．細胞培養とトランスフェクション）
HEK細胞を、ウシ胎児血清（FBS、GIBCO）10% (v/v)を含むDMEM（Wako）を用いて、5％CO2下、37℃で培養した。リポフェクタミン2000を用いて70％までのコンフルエント細胞にトランスフェクトした。
【００７５】
（7．無細胞翻訳系におけるin vitro発現CRP融合（ポリ）ペプチド／タンパク質及びDHFRのpClBz修飾小分子での標識）
CRP融合（ポリ）ペプチド／タンパク質を、対応するPCR増幅DNAテンプレートを含むtranscription/translation-coupling システム （PURExpress、New England Biolabs）を用いて、 37℃、60分の条件下でin vitro転写及び翻訳を行って調製した。CRP融合ペプチド及びタンパク質を10μMのp-（クロロメチル）-N-（2-ヒドロキシエチル）ベンズアミド、フルオレセイン-pClBz、クマリン-pClBz、AF488-pClBz又はTMR-pClBzを用いて、1mMのTCEPの存在下で37℃、30分の条件下で標識した。サンプルをC18-tip （C-TIP、Nikkyo Technos）を用いて脱塩し、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）で飽和した0.5％酢酸及び80％アセトニトリルで溶出し、MALDI-TOF-MS（AXIMA-CFR、SHIMADZU）分析をリニアポジティブモードで行った。SDS-PAGE分析のため、サンプルを10％SDS-PAGEで変性し、クマシーブリリアントブルー染色とin-gel fluorescence（ImageQuant 400、GE Healthcare）で可視化した。Cys4融合DHFRの標識も、フルオレセイン-pClBzの代わりにFlAsHを用いて、同様にして行った。
【００７６】
（8．DIVERSEシステムに基づくpClBz反応性（ポリ）ペプチド／タンパク質タグの配列最適化）
DNAライブラリーを調製するため、MSG2-NNK5-WFWCPYW-NNK5-G5S.F87 オリゴDNA（配列番号17）及びnewG5S.an21.R41オリゴDNA（配列番号18）をアニーリングし、KOD-plus-neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO）でプライマー伸長し、次に、得られた二重鎖DNAを、T7SD8M2-Sgcc2.F53プライマー（配列番号19）及びnewG5S.an21.R41プライマー（配列番号18）を用いて、Taq DNAポリメラーゼ（Genscript）で増幅した。増幅したDNAをフェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿で抽出した。調製したDNAライブラリーを、T7 RNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いてラン・オフin vitro転写で転写し、mRNAライブラリーをイソプロパノール沈殿で精製した。mRNAディスプレイペプチドのライブラリーを、release factor-free translation システム（PURExpress ΔRF123 Kit、 New England Biolabs）を用いて、2.5 μM mRNAライブラリーと2.5μMピューロマイシンリンカー（BEX）を含む250μLのスケールで、37℃、25分の条件下で翻訳することにより調製した。次に、mRNAディスプレイペプチドライブラリーにEDTAを添加してリボソームを解離させた。mRNAディスプレイペプチドライブラリーの逆転写を、選択ラウンドの前に、RNase H-inactivated逆転写酵素（ReverTraAce、TOYOBO）及びnewG5S.R20プライマー（配列番号２０）を用いて、42℃、30分の条件下で行った。
【００７７】
EDTAで逆転写反応をクエンチング後、HEPESで溶液を中和し、すべてのチオール基をトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）で還元し、磁気ビーズ（Dynabeads、 Life Technologies）に固定化したp-（クロロメチル）ベンズアミド（pClBz）を、該ペプチドライブラリーの溶液に、37℃で10分間混合した。上清を除去した後、ビーズをHBS-T（50 mM HEPES-K pH 7.5、300 mM NaCl、0.05 % tween 20）で３回洗浄し、pClBz固定化ビーズに結合した、ペプチドをコードするcDNAを、PCR pre-mixture溶液（10 mM Tris-HCl pH 8.4、50 mM KCl、0.1% Triton X-100、2 mM MgCl2、各0.25 mM dNTP、 0.25μM T7SD8M2-Sgcc2.F53（配列番号19）、0.25μM G5S-4an21.R41（配列番号11））で希釈し、ビーズ上の選択されたcDNAを、95℃、5分間で溶出した。溶出したcDNAの量を、SYBR greenを用いた定量的PCR（StepOnePlus、Applied Biosystems）で、T7SD8M2-Sgcc2.F53（配列番号19）及びG5S-4an21.R41（配列番号11）をプライマーとして用いて定量した。溶出したcDNAは、Taq DNAポリメラーゼ（Genscript）でPCR増幅して、次の選択ラウンドに供した。
【００７８】
二回目のラウンドから、ピューロマイシンリンカー（BEX）と前の工程で得られたcDNAライブラリーを含む未精製のPCR混合物を含むrelease factor-free transcription/translation-coupling システム（PURExpress ΔRF123 Kit、New England Biolabs）で転写と翻訳を行い、mRNAディスプレイペプチドライブラリーを調製した。調製された非共有結合のmRNAディスプレイペプチドライブラリーを、ReverTraAceを用いて42℃、30分の条件下で逆転写し、共有結合したcDNAディスプレイペプチドライブラリーを得た。逆転写反応をEDTAでクエンチング後、HEPES溶液で中和し、すべてのチオール基をTCEPで還元し、該cDNAディスプレイペプチドライブラリーを、pClBz無しの磁気ビーズ（Dynabeads、Life Technologies）と、25℃又は37℃、5分の条件下で、ネガティブセレクション用にインキュベートした。該ネガティブセレクションを5回行い、磁気ビーズに結合するペプチドを除去した。続いて、その上清を、pClBz固定化ビーズ（Dynabeads、Life Technologies又はFG beads、Tamagawa seiki)と、37℃でポジティブセレクション用に混合し、DMSO、SDSを含有し且つpClBz含有のHBS-Tで、37℃で5回洗浄した。ビーズ上の選択されたcDNAを、T7SD8M2-Sgcc2.F53（配列番号19）及びG5S-4an21.R41（配列番号11）をプライマーとして、SYBRを用いた定量的PCR （StepOnePlus、Applied Biosystems）で定量し、次の選択ラウンドのためにPCR Taq DNAポリメラーゼで増幅した。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明では、非常に多様な大きいライブラリーから特異的にタンパク質を標識するための（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを迅速に同定できるシステム（Directed In Vitro Evolution of Reactive peptide-tags via Sequential Enrichment, 略してDIVERSシステム）を提供する。
本システムでは、ディスプレイされた（ポリ）ペプチド／タンパク質（表現型）とそれをコードするDNA（遺伝子型）が共有結合を介して連結されているので、変性剤などを利用した洗浄により、共有結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質タグのみを選択することができる。また、転写、ピューロマイシン修飾、翻訳の工程が一溶液内で連続的に進行し、かつ、逆転写の工程まで精製なしのワンポットで進めることができるため、非常に短時間で大規模な（約1015種類）ライブラリーから（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを同定することができる。
【００８０】
また本発明によって得られる（ポリ）ペプチド／タンパク質タグはサイズが小さいため、（ポリ）ペプチド／タンパク質タグを融合した標的タンパク質の機能を阻害せず、任意の人工分子で標識も可能である。また、本発明は、複数の異なるタンパク質、複数の異なる標識物質（蛍光色素など）に適用することができる。
更には、本発明による（ポリ）ペプチド／タンパク質タグは、細胞内タンパク質の活性や相互作用を制御するのにも応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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