(57)【要約】      （修正有）【課題】胃がんに特異的であり、胃がん組織集積性が高い抗カドヘリン抗体及びそれを用いた診断薬及び治療薬の提供。【解決手段】重鎖が下記（ａ）〜（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）〜（ｆ）である抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。（ａ）特定のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、（ｂ）特定のアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、（ｃ）特定のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、（ｄ）他の特定のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、（ｅ）他の特定のアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、（ｆ）他の特定のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖が下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）である抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。
【請求項２】
放射性金属元素が金属キレート試薬を介して請求項１記載の抗カドヘリン１７抗体又はその改変体に結合してなる、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
【請求項３】
請求項２記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん診断薬。
【請求項４】
胃がん体外イメージング剤である請求項３記載の診断薬。
【請求項５】
請求項２記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃がん細胞に特異的な抗カドヘリン１７抗体及びこれを用いた胃がん診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃がんは、我が国で最も多いがんであり、その死亡率も肺がんに次いで２番目に高い。胃がんの治療法は、原則外科的手術であり、内視鏡での早期がんの切除、腹腔鏡での手術も行われているものの、基本的には広範な切除が行われており、患者への負担は大きい。胃がんの切除術では、がん組織自体の切除に加えて、転移の可能性もありリンパ節も切除する必要がある。
【０００３】
しかしながら、胃がんの切除術においては、術中に胃組織が大きく移動し、脂肪組織中の胃がん組織の発見は容易ではない。さらに、転移可能性のあるリンパ節の発見も困難である場合が多い。従って、手術前及び手術中における胃がん部位及び転移部位の特定は、手術時間の短縮、患者への負担軽減の点から極めて重要である。
【０００４】
胃がん部位の特定手段として、がんのグルコース代謝を利用して18Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を用いたＰＥＴイメージングによりリンパ節転移を診断する検査が広く行われている。
【０００５】
一方、モノクローナル抗体を用いたがん治療は、２１世紀にはいって遺伝子工学によるヒト化や改変抗体などの技術の進歩とあいまって、有効な治療法として受け入れられるようになった。がん表面抗原をターゲットとする抗体は特異性が高く、バイオ医薬品として有効な親和性を有している。抗体を用いた診断技術としては、ハーセプチンにＰＥＴ核種を付与したプローブにより、転移巣のイメージングが有効であることが報告されている（非特許文献１）。イメージングによりがんへの集積がみられれば、治療核種（β線核種あるいはα線核種）による放射線内用療法（ＲＩＴ）の適応も考えられる。これまで、抗体を用いた診断は、セバリンによる悪性リンパ腫のＲＩＴを行う術前診断として、骨髄抑制などの副作用の診断として用いられるものが一般的であり、がんの診断目的で使用されるものは抗ＣＥＡ抗体のＦｍｂ化したものなどがあるが、有効な診断法として一般化されていない。
【０００６】
また、カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、細胞表面に発現するＣａ2+依存的な接着分子である。当該カドヘリンには、Ｅカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｐカドヘリン（ＣＤＨ３）等のクラシックカドヘリンの他にプロトカドヘリン、デスモソームカドヘリン等が知られている。これらのカドヘリンは、ホモフィリックに結合し、アドヘレンス・ジャンクションを形成し、細胞内のカテニンを介して細胞内骨格系（アクチン繊維）に連結することが知られており、このような機序により細胞接着を司っていると考えられる。
【０００７】
またカドヘリンは細胞接着以外に、胚発生、形態形成、シナプス形成、シナプス可塑性、さらには癌の浸潤、転移にも関与しているといわれている。従って、抗カドヘリン抗体は、癌治療に有用であることが報告されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５２２９８２号公報
【特許文献２】特表２００８−５３８９０９号公報
【特許文献３】特表２００９−５２８２５７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Breast Cancer, 28 April 2015, DOI 10. 1007/s 12282-015-0613-z
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、従来の抗カドヘリン抗体の癌治療効果は十分とは言えず、また診断薬としても十分なものとは言えなかった。
従って、本発明の課題は、胃がんに特異的であり、胃がん組織集積性が高い抗カドヘリン抗体並びにそれを用いた診断薬及び治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで本発明者は、数多くの抗カドヘリン抗体を作製し、その胃がん組織集積性、胃がん特異性を検討してきたところ、特定のＣＤＲを有する抗カドヘリン１７抗体が、胃がんに対する特異性が高く、かつ胃がん組織集積性に優れ、当該抗体の放射性金属標識体を用いれば胃がん組織のイメージング及び胃がん治療が可能になることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【００１３】
〔１〕重鎖が下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）である抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。
〔２〕放射性金属元素が金属キレート試薬を介して〔１〕記載の抗カドヘリン１７抗体又はその改変体に結合してなる、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体。
〔３〕〔２〕記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん診断薬。
〔４〕胃がん体外イメージング剤である〔３〕記載の診断薬。
〔５〕〔２〕記載の放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を有効成分とする胃がん治療薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗体は、胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織集積性が高いため、胃がん部位を選択的にイメージングでき、また胃がん治療薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト癌細胞株のカドヘリン１７mRNAの発現を示す。
【図２】新規に取得した抗カドヘリン１７モノクローナル抗体の反応特異性を既存の抗体と比較した結果を示す。
【図３】新規に取得した抗カドヘリン１７モノクローナル抗体についてDOTA化した場合としない場合の反応性を比較し、DOTA化しても反応性に影響がないことを示す。
【図４】新規に取得した抗カドヘリン１７モノクローナル抗体を競合法ELISAでエピトープ分類した結果、５種類のエピトープに分類されたことを示す。
【図５】64Ｃｕ−Ｄ２１１１によるＡＧＳ移植マウスのＰＥＴイメージングを示す。
【図６】各ＲＯＩにおける64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積率を示す。
【図７】ＡＧＳ腫瘍およびＭＫＮ腫瘍における64Ｃｕ−Ｄ２１１１の腫瘍−心縦隔比を示す。
【図８】64Ｃｕ−Ｄ２１０１によるＡＧＳ移転マウスのＰＥＴイメージングを示す。
【図９】各ＲＯＩにおける64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積率を示す。
【図１０】ＡＧＳ腫瘍およびＭＫＮ腫瘍における64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってＮ末端からＣ末端となるように記載される。
Ａｌａ又はＡ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ：イソロイシン
Ｐｒｏ又はＰ：プロリン
Ｐｈｅ又はＦ：フェニルアラニン
Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン
Ｍｅｔ又はＭ：メチオニン
Ｇｌｙ又はＧ：グリシン
Ｓｅｒ又はＳ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ：トレオニン
Ｃｙｓ又はＣ：システイン
Ｇｌｎ又はＱ：グルタミン
Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン
Ｔｙｒ又はＹ：チロシン
Ｌｙｓ又はＫ：リシン
Ａｒｇ又はＲ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン
Ａｓｐ又はＤ：アスパラギン酸
Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸
【００１７】
本発明の抗体は、抗カドヘリン１７抗体であり、好ましくは抗ヒトカドヘリン１７抗体である。当該抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれるが、モノクローナル抗体が好ましい。また天然型抗体、遺伝子組み換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、抗体の改変体としては、ダイアボディ、バイスペシフィックダイアボディ、ミニボディ、ペプチドボディ、シメティボディ等が挙げられる。
【００１８】
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、重鎖が下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）であり、軽鎖が下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）である。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する重鎖ＣＤＲを有する重鎖、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列において２１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖、
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する軽鎖ＣＤＲを有する軽鎖。
【００１９】
前記重鎖及び軽鎖の組み合わせは、配列番号１と２（Ｄ２１０１）、配列番号３と４（Ｄ２１１１）、配列番号５と６(Ｄ２００５)、配列番号７と８（Ｄ２００８）、配列番号９と１０（Ｄ２１０５）、配列番号１１と１２（Ｄ２１０６）、配列番号１３と１４（Ｄ２１０７）、配列番号１５と１６（Ｄ２１１４）、配列番号１７と１８（Ｄ２０２５）、配列番号１９と２０（Ｄ２１６３）である。
このうち、配列番号１と２（Ｄ２１０１）、配列番号３と４（Ｄ２１１１）、配列番号５と６（Ｄ２００５）、配列番号７と８（Ｄ２００８）、配列番号９と１０（Ｄ２１０５）、配列番号１１と１２（Ｄ２１０６）、及び配列番号１３と１４（Ｄ２１０７）がより好ましい。このうち、配列番号１と２の組み合わせ（Ｄ２１０１）、及び配列番号３と４の組み合わせ（Ｄ２１１１）がさらに好ましい。
【００２０】
前記アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加される場合（改変）のアミノ酸の改変の個数は１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。また、改変されたアミノ酸配列の同一性は、前記各アミノ酸配列と９０％以上であるが、９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。
【００２１】
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、胃がん、特にヒト胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織への集積性が高い点で、従来の抗カドヘリン１７抗体、例えば市販の抗カドヘリン１７抗体と明確に相違する。
【００２２】
本発明の抗カドヘリン１７抗体は、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
【００２３】
モノクローナル抗体および抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）。カドヘリン１７遺伝子によりコードされる蛋白質またはフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹腔内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
【００２４】
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質またはそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明のモノクローナル抗体は、単一の抗体産生細胞または、それから得られた抗体をコードするＤＮＡを用いて生産される単一分子種の抗体を示し、前述の方法のいずれで製造されてもかまわない。
【００２６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
【００２７】
モノクローナル抗体発現に使用する宿主細胞系は、哺乳動物起源のものを用いるのが好ましい。発現させたいモノクローナル抗体に最も適する宿主細胞系を選択できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
【００２８】
好ましい宿主細胞系はｄｈｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである。Ｕｒｌａｎｄ，Ｇ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｌｏｃｕｓ：ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖｏｌ．１２，１９８６，ｐ５５５５−５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．２７６，１９７８，ｐ２６９−２７０をそれぞれ参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って行うことができる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるがそれらに限定されない。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
【００２９】
本発明の抗カドヘリン１７抗体の改変体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、ダイボディ、ミニボディ等の改変体もそれ自体公知の手段により製造することができる。
【００３０】
本発明の抗カドヘリン１７抗体又はその改変体は、前述のように胃がん組織に特異的に結合し、かつ胃がん組織集積性が高いので、胃がん診断薬及び胃がん治療薬として有用である。胃がん診断薬とする場合には、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を用いる体外イメージング剤とするのが好ましい。また、胃がん治療薬とする場合は、放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体を用いるのが好ましい。
【００３１】
放射性金属標識抗カドヘリン１７抗体又はその改変体としては、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して前記抗カドヘリン１７抗体又はその改変体に結合してなるものが好ましい。
【００３２】
前記抗カドヘリン１７抗体と結合させる放射性金属としては、癌治療薬として用いる場合には細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であるのが好ましい。
このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（90Ｙ）、レニウム１８６（186Ｒｅ）、レニウム１８８（188Ｒｅ）、銅６７（67Ｃｕ）、鉄５９（59Ｆｅ）、ストロンチウム８９（89Ｓｒ）、金１９８（198Ａｕ）、水銀２０３（203Ｈｇ）、鉛２１２（212Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（165Ｄｙ）、ルテニウム１０３（103Ｒｕ）、ビスマス２１２（212Ｂｉ）、ビスマス２１３（213Ｂｉ）、ホルミウム１６６（166Ｈｏ）、サマリウム１５３（153Ｓｍ）、ルテチウム１７７（177Ｌｕ）などを挙げることができる。
これらの放射性金属の中でも、90Ｙ、153Ｓｍ、177Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
【００３３】
一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（99mＴｃ）、インジウム１１１（111Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（113mＩｎ）、ガリウム６７（67Ｇａ）、ガリウム６８（68Ｇａ）、タリウム２０１（201Ｔｌ）、クロム５１（51Ｃｒ）、コバルト５７（57Ｃｏ）、コバルト５８（58Ｃｏ）、コバルト６０（60Ｃｏ）、ストロンチウム８５（85Ｓｒ）、水銀１９７（197Ｈｇ）、銅６４（64Ｃｕ）が好適に用いられる。
【００３４】
これらの放射性金属元素を抗カドヘリン１７抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して抗カドヘリン抗体に結合している。
【００３５】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００３６】
抗カドヘリン１７抗体への放射性金属元素の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗カドヘリン１７抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
【００３７】
例えば、抗カドヘリン１７抗体のＤＯＴＡ化は、次のようにして行なわれる。抗体を緩衝液に溶解して抗体溶液を得る。一方で、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡを、ＤＭＳＯに溶解する。これらの抗体溶液とイソチオシアノベンジルＤＯＴＡ溶液を混合撹拌し、２５℃で１７時間程度撹拌する。反応後、脱塩カラムで精製する。
【００３８】
本発明の癌治療薬または癌診断薬は、既標識製剤として提供する方法と、標識前駆体を含有するキット製剤として提供する方法があるが、本発明ではいずれの方法でもよい。既標識製剤として提供する場合には、標識済みの抗カドヘリン１７抗体を含有する癌治療薬または癌診断薬をそのまま投与に用いることができる。キット製剤として提供する場合には、所望の放射性金属元素で標識を行ってから投与に用いることができる。
【００３９】
本発明の癌治療薬は、水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。
【００４０】
本発明癌治療薬の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば、成人の１回の投与量は３７〜３７００ＭＢｑであるのが好ましい。
【００４１】
本発明の癌治療薬は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与される。
【００４２】
本発明の癌診断薬は、胃がんのイメージングに使用することができる。本発明の診断薬は胃がんに集積し、シングルフォトン断層撮像装置（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン断層撮像装置（ＰＥＴ）、シンチカメラ等の機器を用いて放射線を検出することにより胃がん部位を撮像することができる。
【００４３】
投与経路は、通常は静脈から血管内に投与されるが動脈を介して投与することもできる。投与量は患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば、成人の１回の投与量は３７〜１１２０ＭＢｑであるのが好ましい。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００４５】
実施例１（完全長ヒトカドヘリン１７（以下ＣＤＨ１７）発現バキュロウイルス（以下ＣＤＨ１７  ＢＶ）の調製）
ヒトＣＤＨ１７の完全長配列（アミノ酸Ｎｏ．１〜８３２）をコードするｃＤＮＡは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００１１４４６６３の塩基配列を用いて化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）。化学合成を行なう際に、ヒトＣＤＨ１７の塩基配列についてはｓｆ９のコドンｕｓａｇｅに一部改変し、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＭｙｃタグをコードする配列を付加して合成した（配列番号２１）。このｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に組み込み、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＦＬＡＧ−ＣＤＨ１７−Ｍｙｃベクターを作製した。次に説明書（Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に従い、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＦＬＡＧ−ＣＤＨ１７−ＭｙｃベクターをＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセルにトランスフォーメーションして、組換えバクミドＤＮＡを作製した。このバクミドＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを作成した。
ＣＤＨ１７遺伝子が導入された組換え発芽型バキュロウイルスの調製は、次のとおり行った。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を２×１０6／ｍＬの細胞密度で５００ｍＬ培養し、上記で作製した組換えウイルスをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｃｔｉｏｎ）＝５で感染させ、７２時間後に培養上清画分を４０，０００×ｇ、４０分遠心して、沈澱画分に発芽型ウイルス（ＣＤＨ１７  ＢＶ）を回収した。ＣＤＨ１７  ＢＶ  におけるＣＤＨ１７蛋白質の発現は、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて下記の記述に従ってウエスタンブロットで確認した。このＣＤＨ１７  ＢＶを免疫原として使用した。
ウエスタンブロットは下記の方法で行なった。ＣＤＨ１７  ＢＶを総蛋白量で１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで調製し、３％ＳＤＳと３％  ２ＭＥを含むＳＤＳ−ポリアクリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用サンプル緩衝液で２倍希釈し、１０％分離ゲルに１０μＬ／ｌａｎｅアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）へ転写し、転写膜への非特異結合をブロックエース（大日本ファーマ社製）でブロッキングした後、４０％ブロックエース／Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下ＴＢＳ）で１μｇ／ｍＬに調製した抗Ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナル抗体を１次抗体として１．５ｍＬ加え、室温で１時間振とう反応させた。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１０ｍＭ  ＴＢＳ）で５分間３回洗浄後、２次抗体としてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１００００倍希釈したものを１．５ｍＬ添加し、室温で１時間振とう反応させた。ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）  を用いて検出した。
【００４６】
実施例２（抗ＣＤＨ１７マウスモノクローナル抗体の作製）
ＣＤＨ１７  ＢＶ  ７０μｇにアジュバントとして０．１μｇの百日咳毒素（フナコシ社製）を混合し、ｇｐ６４トランスジェニックマウス（自家調製，Ｓａｉｔｏｈ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３２２，１０４−１１７，２００７）の腹腔内に投与、免疫した。追加免疫はアジュバントを含まない７０μｇのＣＤＨ１７ＢＶを２週間間隔で１回または２回投与した。最終免疫から３日後に脾細胞を採取し、ポリエチレングリコール（ロッシュ社製）を用いた標準的な方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）に従いマウスミエローマ細胞ＮＳ−１（大日本ファーマ社製）と細胞融合した。融合細胞はＨＡＴ選択培地（０．１ｍＭ  ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，０．１ｍＭ  ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ，ａｎｄ  ０．１６ｍＭ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）で７日間培養した。細胞融合から８日後、ハイブリドーマの培養上清を回収し、ヒト由来の癌細胞株を９６  ウェルプレートに固相化したｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法によってスクリーニングを行なった。
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡは下記（Ａ−１）の記述に従って行なった。癌細胞株は、ＣＤＨ１７蛋白質を発現している株としてＨｕｈ６（肝臓癌）およびＡＧＳ（胃癌）、ＣＤＨ１７を発現していない株としてＨｅｐＧ２（肝臓癌）およびＭＫＮ７４（胃癌）を用いた。各細胞株は、ＬＳＢＭデータベース（図１）を参照してＣＤＨ１７のｍＲＮＡの発現が陽性および陰性のものを選抜し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入した。ＣＤＨ１７蛋白質の発現は、市販の抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）を用い後記段落（００５３）に従ってフローサイトメトリーで確認した。Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにより、ＣＤＨ１７を発現している細胞株に対して陽性、発現していない細胞株に対して陰性のウェルを選別した。計１７５９ウェルのハイブリドーマに対して、１１４の抗体産生陽性ウェルが選別された。
陽性１１４ウェルのうち３２ウェルについてコロニーピッキングを行なった。陽性のコロニーをピッキングすることに成功した２５ウェルについて、限界希釈法でクローニングを行い、２５クローンの抗ＣＤＨ１７抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本クレア社製）に接種し腹水を調製し、５０％硫酸アンモニウム塩析精製を２回行ない、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに透析して抗体蛋白質を調製した。イメージング実験には、さらにＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製を加えたものを使用した。
【００４７】
（Ａ−１）マウスｗｈｏｌｅ抗体のｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ
ヒト癌細胞株Ｈｕｈ６およびＨｅｐＧ２をＲＰＭＩ１６４０  １０％  ＦＢＳ添加培地で、ＡＧＳおよびＭＫＮ７４をＤＭＥＭ  １０％  ＦＢＳ添加培地でそれぞれ培養し、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅコート９６穴プレート（ＢＩＯＣＯＡＴ  ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｃｏａｔｅｄ  ｐｌａｔｅ；Ｆａｌｃｏｎ  ３５６４６１）に０．３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃で１６〜２４時間培養した。培養上清を捨て、生理的食塩水を２５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて細胞を１回洗浄後、固定液（４％パラホルムアルデヒド／Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳ））を５０μＬ加え、室温で１０分間静置して固定化した。固定液を捨て、生理的食塩水を２５０μＬ／ｗｅｌｌ加えて細胞を３回洗浄後、４０％ブロックエース（大日本ファーマ社製）／ＴＢＳを１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温で１時間静置し、ブロッキングを行なった。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した生理的食塩水）を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、１次抗体として抗ＣＤＨ１７抗体溶液（またはハイブリドーマ培養上清）を４０％ブロックエース／ＴＢＳで適宜希釈調製したものを５０μＬずつに添加し、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１０００倍希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を４回洗浄後、生理的食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０無添加）で１回洗浄した。基質液（ＴＭＢ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ＳｃｙＴｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温暗所で３０分静置して呈色反応を行なった後、反応停止液（ＳｃｙＴｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく撹拌後マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｒａｋ  ＩＩ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により４５０ｎｍの吸光度（以下Ａ４５０）を測定した。
【００４８】
実施例３（ＣＤＲの解析）
ハイブリドーマ細胞ペレットを氷上で融解後，ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出した。κ鎖配列を解析する際には、ミエローマ細胞由来のｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅにハイブリダイズする短鎖配列とのインキュベーション、ＲＮａｓｅＨによる処理を行い、さらにＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより精製した。続いて、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲＬＭ  Ｒａｃｅ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によって可変部領域をコードするｃＤＮＡを取得した。取得したｃＤＮＡはｐＧＥＭ（登録商標）−ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりモノクローナルとし、シークエンサーによる配列解析を行った。その結果、各クローンのＣＤＲは次表のアミノ酸配列を有することが判明した。
【００４９】
【表１】
2017024991.tif 000002
【００５０】
実施例４（ｓｃＦｖの作製）
可変領域をコードする遺伝子から、ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＶＬとなるように遺伝子を作製し、さらにこれをｐＧＥＭ−２由来のベクターに載せ替え、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加された遺伝子とした。また、Ｎ末端には、ｐｅｌ−Ｂリーダー配列が付加される場合もある。このベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）等の適切な大腸菌株へ形質転換し、培養し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドによる誘導後、培地上清もしくは大腸菌体に発現しているｓｃＦｖを精製した。
（１）Ｄ２１１１−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を付加したベクターを用い、上記のプロトコルに従ってＢＬ２１（ＤＥ３）による発現後、大腸菌内に生成される封入体を超音波破砕、遠心分離し、さらに２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、アセトン、超純水で洗浄した。これを既報の手法（Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９８））により巻き戻し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーによって単量体として取得した。
（２）Ｄ２１０１−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を付加したベクターを用い、さらに発現量向上のためのアミノ酸変換を行ったものに関して、（１）と同様の手法により取得した。Ｄ２１０１の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＬＳ２２Ｒ変異体が安定発現した。
（３）Ｄ２１０７−ｓｃＦｖの作製
ｐｅｌ−Ｂリーダー配列を有しないベクターを用い、さらに発現量向上のためのアミノ酸変換を行ったものに関して、上記のプロトコルにしたがってＢＬ２１（ＤＥ３）による発現後、大腸菌体を超音波破砕し、取得される可溶性画分を金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製後、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーによって単量体として取得した。Ｄ２１０７の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＨＣ２２Ａ変異体が、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列はＬＳ２２Ｔ変異体が安定発現した。
【００５１】
実施例５（反応特異性の評価）
新規に取得した抗ＣＤＨ１７モノクローナル抗体について、反応特異性をヒト由来の癌細胞株を用いてフローサイトメトリーで評価した。フローサイトメトリーは下記に記述の方法に従って行なった。癌細胞株は、ＣＤＨ１７蛋白質を発現している株としてＨｕｈ６（肝臓癌）およびＡＧＳ（胃癌）、ＣＤＨ１７を発現していない株としてＨｅｐＧ２（肝臓癌）およびＭＫＮ７４（胃癌）を用いた。抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）および抗ヒトＣａｄｈｅｒｉｎ１（以下ＣＤＨ１）モノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）についても同様にフローサイトメトリーで評価し、新規に取得した抗体と比較した。
【００５２】
結果を図２に示した。新規の抗ＣＤＨ１７抗体（Ｄ２１０１、Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７、Ｄ２１１４、Ｄ２０２５及びＤ２１６２）については、いずれも、Ｈｕｈ６およびＡＧＳに対しては良好なピークシフトが観られたが、ＨｅｐＧ２およびＭＫＮ７４に対してはピークシフトは全く観られず、ＣＤＨ１７に対して特異性高く反応することが確認された。一方、市販の抗ＣＤＨ１７抗体については、Ｈｕｈ６およびＡＧＳに対しては新規抗体と同等に良好なシフトが観られたが、ＣＤＨ１７蛋白質の発現が陰性の細胞株ＨｅｐＧ２およびＭＫＮ７４に対しても弱いシフトが観られ、ＣＤＨ１７に対する特異性は新規抗体の方が優れていることが判った。
また新規の抗ＣＤＨ１７抗体は、胃がんの転移をイメージングで診断する目的で使用するので、正常な胃に高発現な他のカドヘリン、ＣＤＨ１には交差反応しないことを確認する必要がある。まず上記の癌細胞株においてＣＤＨ１蛋白質が発現しているかどうかを、市販の抗ＣＤＨ１抗体を用いたフローサイトメトリーにより確認したところ、Ｈｕｈ６、ＨｅｐＧ２、ＭＫＮ７４においてピークシフトが観られ、ＣＤＨ１が発現していることが確認された。特に胃がんの細胞株ＭＫＮ７４では高発現である事が判った。新規の抗ＣＤＨ１７抗体については、これらのうちＣＤＨ１７の発現が陰性のＨｅｐＧ２とＭＫＮ７４に対しては、前述のとおり全くシフトが観られなかったので、ＣＤＨ１とは交差反応しないことが確認された。
以上により、新規に取得した抗ＣＤＨ１７モノクローナル抗体は既存のモノクローナル抗体よりも特異性が優れ、イメージングによる胃がん転移の診断用抗体として適していることが証明された。
【００５３】
フローサイトメトリーは下記の方法で行なった。ヒト癌細胞株（Ｈｕｈ６、ＨｅｐＧ２、ＡＧＳおよびＭＫＮ７４）の細胞２．５×１０5個に対して抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（本特許に記載の新たに取得した抗体）、市販の抗ヒトＣＤＨ１７モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）および抗ヒトＣａｄｈｅｒｉｎ１（以下ＣＤＨ１）モノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を１次抗体として１００μＬ添加し、室温で１時間静置反応させた。１次抗体は、ＰＢＳに２％ウシ血清アルブミンを添加した緩衝液（以下１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）で３μｇ／ｍＬに調製して用いた。１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体を１００μＬ添加し、暗所で室温１時間静置反応させた。２次抗体は、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで２００倍希釈して用いた。細胞を１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後同緩衝液を２００μＬ添加し、フローサイトメーター（ＧＵＡＶＡ  ＥａｓｙＣｙｔｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で分析した。
【００５４】
実施例６（イメージングのための抗体セレクション）
抗ＣＤＨ１７抗体は、放射性同位元素64Ｃｕで標識してイメージング実験に用いられる。64Ｃｕ標識は、まず抗体に金属キレート試薬ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）を結合させ、次に64Ｃｕを配位させるという方法で行なわれる。ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）の−ＳＣＮ基は、抗体蛋白質を構成するアミノ酸残基のうち、リジン残基の側鎖のアミノ基とアミド結合する。抗体をＤＯＴＡ化した場合に、抗原認識にとって重要な部位にＤＯＴＡが結合すると抗原抗体反応に悪影響を及ぼす場合があるため、フローサイトメトリーの評価結果が良好であった５クローン（Ｄ２００１、Ｄ２０１３、Ｄ２１０１、Ｄ２１０３、Ｄ２１１１）についてＤＯＴＡ化を行い、ＤＯＴＡ化した場合としない場合（ｎａｋｅｄ）の抗原に体する結合活性を、ＥＬＩＳＡにて比較した。ＤＯＴＡ化は、前記の方法で行なった。ＥＬＩＳＡについては、上記（Ａ−１）の記述に従ってＡＧＳ細胞固定化プレートを調製し、抗ＣＤＨ１７抗体各種（ＤＯＴＡ化有り／無し）の希釈列を作製し１次抗体として反応させて行なった。
結果を図３に示した。いずれの抗体についてもＤＯＴＡ化有り／無しで同等の反応曲線が得られ、ＤＯＴＡ化により結合活性は影響を受けないことが確認された。以上により、５種類の抗体のうちで反応曲線の立ち上がりの最も早いＤ２１１１およびＤ２１０１をイメージング用抗体として選別した。
【００５５】
実施例７（エピトープ分類）
まず初めに、新規に取得した２５種類の抗ＣＤＨ１７抗体のエピトープが、Ｄ２１１１抗体と同じであるかどうかを調べた。
上記（Ａ−１）の記載に従って調製したＡＧＳ固定化プレートに、新規に取得した抗体２５種類（Ｄ２１１１を含む）の非標識抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した。次に下記（Ａ−２）の記述に従ってビオチン標識Ｄ２１１１抗体を加え、競合法のＥＬＩＳＡを行なった。非標識抗体のエピトープがＤ２１１１（ビオチン標識）と同じかあるいは至近である場合、各々の抗体がいずれもＡＧＳ細胞表面上のＣＤＨ１７抗原の同じエピトープと反応しようとするが、非標識抗体の添加量の方が大過剰であるため、ビオチン標識Ｄ２１１１はＡＧＳ固定化プレートと反応できずＡ４５０のシグナルは出ない。一方非標識抗体のエピトープがＤ２１１１と異なる場合には、非標識抗体、ビオチン標識Ｄ２１１１抗体のいずれもＡＧＳ細胞固定化プレートと反応できるため、Ａ４５０のシグナルが出る。結果、全２５種類中１９種類がＤ２１１１と同じかあるいは至近なエピトープを認識していることが判明した。
残り６種類の抗体（Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７、Ｄ２１０８）についてそれぞれにビオチン標識抗体を調製し、Ｄ２１１１を含む合計７種類の標識抗体に、同７種類の非標識の抗体をそれぞれ終濃度２０μｇ／ｍＬで添加し、競合法のＥＬＩＳＡを行なった。ある標識抗体に対して別種の非標識抗体で競合が観られた場合には、両者は同じエピトープを認識する抗体として分類されるが、競合が観られない場合には別のエピトープを認識する抗体と分類される。
【００５６】
結果を図４に示した。Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２０１６、Ｄ２１０７については同じ抗体同士では競合がかかるが、別種の抗体同士では競合がかからなかったので、それぞれに別のエピトープを認識している抗体であることが判った（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５グループ）。Ｄ２１０５、Ｄ２１０８においては相互に競合がかかったので、両者は同じエピトープを認識していることが判った。またＤ２１０５およびＤ２１０８のビオチン標識抗体に対してはＤ２１１１でも完全に競合がかかった。しかしＤ２１１１のビオチン標識抗体に対しては、Ｄ２１０５およびＤ２１０８ではある程度の競合はかかるが、完全には競合がかからなかったため、「Ｄ２１１１」と「Ｄ２１０５およびＤ２１０８」のエピトープは至近であるが完全に同じではないとして、グループＡ’と判定した。以上により、新たに取得した抗ＣＤＨ１７抗体については、合計５種類（ＡまたはＡ’、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５種類）の異なるエピトープを認識するグループに分類され、多様な抗体が取得できたことが判った。
【００５７】
（Ａ−２）競合法ＥＬＩＳＡ
上記（Ａ−１）の記述に従って、ＡＧＳ細胞固定化プレートを作製し、ブロッキング、洗浄を行なった。１次抗体として、まずビオチン標識されていない抗ＣＤＨ１７抗体（クローンＮｏ．Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７およびＤ２１０８）を、４０％ブロックエース／ＴＢＳを用いて４０μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。次にビオチン標識された抗ＣＤＨ１７抗体（クローンＮｏ．Ｄ２１１１、Ｄ２００５、Ｄ２００８、Ｄ２１０５、Ｄ２１０６、Ｄ２１０７およびＤ２１０８）を、標識抗体毎に設定された濃度（後述）で２５μＬ／ｗｅｌｌ加えてよく撹拌し、室温で１時間振とう反応を行なった。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を３回洗浄後、２次反応試薬としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１０％ブロックエース／ＴＢＳで１０００倍希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して室温で１時間振とう反応させた。洗浄液を２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して細胞を４回洗浄後、生理的食塩水（Ｔｗｅｅｎ２０無添加）で１回洗浄した。上記（Ａ−１）の記載に従って呈色反応を行い、Ａ４５０値を測定した。ビオチン標識抗体の添加濃度については各抗体毎に予め検討を行なった。すなわち、ＡＧＳ細胞固定化プレートに対してビオチン標識抗体の希釈列を反応させた後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを反応させ、Ａ４５０値を測定した。ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅにおいて直線範囲のＡ４５０値を与える濃度を各抗体毎に求め、ビオチン標識抗体添加濃度として設定した。ビオチン標識は、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、使用説明書に従って調製した。
【００５８】
実施例８（ＰＥＴイメージング）
Ａ．材料と方法
抗ＣＤＨ１７  ＩｇＧ  Ｄ２１１１およびＤ２１０１を使用した。抗体は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）または１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）によるキレート化の後、陽電子放出核種64Ｃｕで標識し、それぞれ64Ｃｕ−Ｄ２１１１、64Ｃｕ−Ｄ２１０１としてＰＥＴイメージングに使用した。標識した抗体の結合活性が低下していないことを確認し、ＰＥＴイメージング実験ではマウス１匹あたり７−８ＭＢｑ（７０−８０μｇ）を尾静脈より投与した。
【００５９】
（１）64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＣＤＨ１７陽性腫瘍におけるＰＥＴイメージング実験
64Ｃｕ−Ｄ２１１１の腫瘍細胞表面抗原への結合性を確認するため、ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ細胞株移植ヌードマウスに投与した。64Ｃｕ−Ｄ２１１１の投与直後から最大３日目まで、小動物用ＰＥＴ装置ＩＮＶＥＯＮ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を用いて、ヌードマウス全身の撮像を行った。ネガティブコントロールとして、ＣＤＨ１７陰性ＭＫＮ細胞株移植ヌードマウスに64Ｃｕ−Ｄ２１１１を投与し、同様の撮像を実施した。
（２）64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＣＤＨ１７陽性腫瘍におけるＰＥＴイメージング実験
64Ｃｕ−Ｄ２１０１の腫瘍細胞表面抗原への結合性を確認するため、ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植ヌードマウスに投与した。64Ｃｕ−Ｄ２１０１の投与直後から最大３日目まで、小動物用ＰＥＴ装置ＩＮＶＥＯＮ  （Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を用いて、ヌードマウス全身の撮像を行った。
（３）画像再構成と画像データ解析
収集したＰＥＴデータは、上記Ｓｔｕｄｙ  １、Ｓｔｕｄｙ  ２の一連のデータ収集後、Ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｂａｃｋ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ法または２Ｄ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ法によって３Ｄ画像へと再構成した。画像表示、臓器および腫瘍の関心領域（ＲＯＩ）の設定は、ＰＥＴ用解析ソフトウェアであるＡｓｉｐｒｏ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）またはＰＭＯＤ（ＰＭＯＤ  ｇｒｏｕｐ）を用いて行った。各臓器および腫瘍への本薬剤の集積率は、単位組織重量当たりの投与放射能集積比率％  Ｉｎｊｅｃｔｅｄ  Ｄｏｓｅ／ｇ（％  ＩＤ／ｇ）として算出した。
【００６０】
Ｂ．結果
（１）64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＰＥＴイメージング実験
ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積は投与直後から時間経過と共に増強し、集積率は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ４．０１％  ＩＤ／ｇ、５．６７％  ＩＤ／ｇ、６．１６％  ＩＤ／ｇ、６．５３％  ＩＤ／ｇだった（図５、６）。血中の放射能濃度の代替として、心縦隔の集積率を算出したところ、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１１．１％  ＩＤ／ｇ、７．３％  ＩＤ／ｇ、５．９％  ＩＤ／ｇ、４．４％  ＩＤ／ｇであり、時間経過と共に低下した。肝臓における64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積率も時間経過と共に低下し、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１５．２％  ＩＤ／ｇ、１２．７％  ＩＤ／ｇ、１１．４％  ＩＤ／ｇ、９．８７％  ＩＤ／ｇであった。
【００６１】
ＡＧＳ移植腫瘍へのＲＩの集積が長時間維持、増強されたのに対し、心縦隔および肝臓への集積は比較的速やかに減少した。遊離したと思われる64Ｃｕは投与６時間までに膀胱から速やかに排泄され、それ以外の非標的臓器への非特異的集積は認められなかった。このことから、本抗体のＡＧＳ腫瘍への特異的集積が達成される可能性が示された。
【００６２】
ＣＤＨ１７陽性ＡＧＳ移植腫瘍とＣＤＨ１７陰性ＭＫＮ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１１１の集積を、集積の腫瘍−心縦隔比を指標として比較した（図７）。その結果、ＡＧＳ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ０．３６、０．７８、１．０４、１．５０であった結果に対し、ＭＫＮ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比は投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ０．１７、０．５２、０．６３、０．８９であり、ＡＧＳ移植腫瘍の腫瘍−心縦隔比の方がいずれの時間でも大きかった。このことから、本抗体のＣＤＨ１７陽性腫瘍への特異的集積が達成される可能性が示された。
【００６３】
（２）64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＰＥＴイメージング実験
（１）で２０．７％だった標識率を９８．９％に向上させ、64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＰＥＴイメージング実験を実施した。
ＡＧＳ移植腫瘍への64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積は投与直後から時間経過と共に増強し、集積率は投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１．３１％  ＩＤ／ｇ、８．１４％  ＩＤ／ｇ、１４．３％  ＩＤ／ｇ、２０．６％  ＩＤ／ｇ、２６．６％  ＩＤ／ｇだった（図８）。血中の放射能濃度を測定するため、心縦隔にＲＯＩを設定し集積率を算出したところ、投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１８．０％  ＩＤ／ｇ、１４．３％  ＩＤ／ｇ、８．１４％  ＩＤ／ｇ、６．７６％  ＩＤ／ｇ、５．６％  ＩＤ／ｇであり、時間経過と共に低下した。肝臓における64Ｃｕ−Ｄ２１０１の集積率は時間経過と共に低下し、投与直後、投与後６時間、２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ１０．６％  ＩＤ／ｇ、８．２０％  ＩＤ／ｇ、６．４３％  ＩＤ／ｇ、５．７０％  ＩＤ／ｇ、５．５３％  ＩＤ／ｇだった（図９）。
【００６４】
ＡＧＳ移植腫瘍へのＲＩの集積が長時間維持、増強されたのに対し、心縦隔および肝臓への集積は比較的速やかに減少した。また、非標的臓器への集積も認められなかった（図１０）。このことから、本抗体により高い腫瘍−組織比率（ｔｕｍｏｒ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒａｔｉｏ）が達成できる可能性が示された。
【００６５】
（１）でネガティブコントロールとして実施した64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＭＫＮ移植腫瘍への集積と比較を行った。64Ｃｕ−Ｄ２１１１のＭＫＮ移植腫瘍への集積は最大で６．４３％  ＩＤ／ｇ（４８時間）であり、64Ｃｕ−Ｄ２１０１のＡＧＳ移植腫瘍への集積率とは明らかな差が認められた。このことから、64Ｃｕ−Ｄ２１０１はＡＧＳ移植腫瘍への特異的な集積性を有していると考えられる。
【図１】
2017024991.tif 000003
【図２】
2017024991.tif 000004
【図３】
2017024991.tif 000005
【図４】
2017024991.tif 000006
【図５】
2017024991.tif 000007
【図６】
2017024991.tif 000008
【図７】
2017024991.tif 000009
【図８】
2017024991.tif 000010
【図９】
2017024991.tif 000011
【図１０】
2017024991.tif 000012
【配列表】
2017024991000001.app