(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺癌の治療に有効な、アンドロゲン受容体（ＡＲ）アンタゴニストとしての活性を有する化合物、及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物、該化合物の製造方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物、及び該化合物を含有する医薬組成物、及びストレプトマイセス・エスピーＢＢ４７株による該化合物の製造方法。2017036219.tif 000015【選択図】図７
2017036219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2017036219.tif 000014
【請求項２】
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、前立腺癌治療薬。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、アンドロゲン受容体結合阻害剤。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７として寄託されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株を培養する培養工程と、
前記培養工程において得られた培養物から前記化合物を採取する工程と、
を有する、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、前立腺癌治療薬、アンドロゲン受容体結合阻害剤、及び化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、急増している癌の一つとして、前立腺癌がある。前立腺癌は、男性ホルモン（アンドロゲン）がアンドロゲン受容体（以下、本明細書において「ＡＲ」ということがある。）に結合することで悪性化する。そのため、アンドロゲンとＡＲとの結合を阻害するＡＲアンタゴニストが前立腺癌治療薬として用いられている。
【０００３】
ＡＲアンタゴニストである前立腺癌治療薬としては、例えば、フルタミド（商品名：オダイン（登録商標））、ビカルタミド（商品名：カソデックス（登録商標））、エンザルタミド（商品名：イクスタンジ（登録商標））が知られている（非特許文献１〜３を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｄａｔａｂａｓｅ．ｊａｐｉｃ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｄｆ／ｎｅｗＰＩＮＳ／０００６３１２１．ｐｄｆ
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ２＿ｔ．ｐｄｆ
【非特許文献３】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／ｍｅｄｉｃｕｓ−ｂｉｎ／ｊａｐｉｃ＿ｍｅｄ？ｊａｐｉｃ＿ｃｏｄｅ＝０００６２７１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のフルタミド、ビカルタミド、エンザルタミドのＡＲアンタゴニストに対しては、耐性を示す変異体ＡＲが報告されており、これらは前立腺癌治療薬として有効でない場合がある。
【０００６】
そのため、上記のような耐性を示す変異体ＡＲに対して有効なＡＲアンタゴニストとしての活性を有する化合物があれば、それを変異体ＡＲに対して活性を有する新規な前立腺癌治療薬として利用可能であるため、そのような化合物についてのニーズがある。
【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、前立腺癌の治療に適した新規な化合物、この化合物を有効成分として含有する前立腺癌治療薬、アンドロゲン受容体結合阻害剤、及び化合物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、放線菌の一種であるストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株が、ＡＲの結合に対して阻害活性を有する化合物を産生することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
【００１０】
【化１】
2017036219.tif 000003
【００１１】
（２）  （１）に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、前立腺癌治療薬。
【００１２】
（３）  （１）に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、アンドロゲン受容体結合阻害剤。
【００１３】
（４）  （１）に記載の化合物の製造方法であって、
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７として寄託されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株を培養する培養工程と、
前記培養工程において得られた培養物から前記化合物を採取する工程と、
を有する、製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、前立腺癌の治療に適した新規な化合物、この化合物を有効成分として含有する前立腺癌治療薬、アンドロゲン受容体結合阻害剤、及び化合物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１〜５に係る化合物の精製過程において、その精製のためにＬＣ／ＭＳを用いた際に、化合物をＰＤＡ（フォトダイオードアレイ検出器）により検出したクロマトグラフを示す図である。
【図２】実施例１に係る化合物についての、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを示す図である。
【図３】実施例２に係る化合物についての、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを示す図である。
【図４】実施例３に係る化合物についての、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを示す図である。
【図５】実施例４に係る化合物についての、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを示す図である。
【図６】実施例５に係る化合物についての、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを示す図である。
【図７】（ａ）は、実施例１〜５及び比較例１に係る化合物の濃度と、ＡＲ−ＤＨＴの結合性との関係を示すグラフであり、（ｂ）は、実施例１〜５に係る化合物の濃度と、ＥＲ−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの結合性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００１７】
＜化合物＞
本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００１８】
【化２】
2017036219.tif 000004
【００１９】
上記本発明の化合物は、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の既存のＡＲアンタゴニストに対する耐性を有する変異体ＡＲ（アンドロゲン受容体）に対しても、アンタゴニスト活性を有する。そのため、前立腺癌治療薬や、アンドロゲン受容体結合阻害剤としての使用に適している。
【００２０】
本発明の化合物は、上記一般式（Ｉ）で表される全ての化合物は、該化合物の全ての立体異性体を包含するものである。本発明の化合物は、１種単独の立体異性体であってもよく、２種以上の立体異性体の混合物であってもよい。なお、式（Ｉ）中の波線は、該波線について対応する二重結合が、シス又はトランスのいずれの幾何異性体（シス−トランス異性体）であってもよいことを意味する。
【００２１】
＜前立腺癌治療薬＞
本発明は、上述した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、前立腺癌治療薬を包含する。
【００２２】
本発明の前立腺癌治療薬は、有効成分として上述した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を包含するため、上記のとおり、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の既存のＡＲアンタゴニストに対する耐性を有する変異体ＡＲに対してもアンタゴニスト活性を有し、それによって前立腺癌の治療効果を奏する。
【００２３】
本発明における有効成分である一般式（Ｉ）で表される化合物の薬学的に許容しうる塩は、特に限定されないが、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等）との塩、有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、酪酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、炭酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）との塩、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）との塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）との塩、金属（鉄、亜鉛等）との塩等が挙げられる。これらは、１種単独であってもよく、２種以上を併用してもよい。これらの薬学的に許容しうる塩は、常法に従って調製することができる。
【００２４】
本発明の治療薬の剤形は、特に限定されず、例えば、注射剤（静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、坐剤、軟膏剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供されてよい。
【００２５】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜用い、常法により製造することができる。本発明の治療薬は、上記製剤化を目的として、有効成分以外の成分を有してもよいが、有さなくてもよい。
【００２６】
本発明の治療薬の投与方法は、特に限定されず、経口投与又は非経口投与であってもよく、その剤形に応じて適宜選択できる、
【００２７】
＜アンドロゲン受容体結合阻害剤＞
本発明は、上述した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含有する、アンドロゲン受容体結合阻害剤を包含する。
【００２８】
本発明において、「アンドロゲン受容体結合阻害」とは、アンドロゲン受容体とそのリガンド（ホルモン）であるアンドロゲンとの結合を阻害することを意味する。つまり、「アンドロゲン受容体結合阻害剤」とは、アンドロゲン受容体とアンドロゲンとの結合阻害の用途を意味する。本発明のアンドロゲン受容体結合阻害剤は、有効成分として上述した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を包含するため、ＡＲに対してもアンタゴニスト活性を有し、すなわち、アンドロゲン受容体結合阻害活性を有する。
【００２９】
本発明における結合を阻害する対象となるアンドロゲン受容体は、特に限定されないが、有効成分として上述した一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を包含するため、上記のとおり、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の既存のＡＲアンタゴニストに対する耐性を有する変異体に対しても、アンドロゲン受容体結合阻害活性を有する。そのため、特に、フルタミド、ビカルタミド又はエンザルタミドのアンドロゲン受容体結合阻害活性に対する耐性を有するアンドロゲン受容体の結合阻害剤としての使用に好適である。また、本発明における結合を阻害する対象となるアンドロゲン受容体の由来は、例えば、ヒト由来のアンドロゲン受容体の結合阻害剤としての使用に好適である。
【００３０】
本発明における有効成分である薬学的に許容しうる塩は、上述の本発明の前立腺癌治療薬に用いられるものと同様のものを用いることができる。
【００３１】
本発明の結合阻害剤の剤形は、上述の本発明の前立腺癌治療薬に用いられるものと同様のものを用いることができる。また、本発明の結合阻害剤の剤形は、有効成分以外の成分を有してもよいが、有さなくてもよい。そのような成分は、上述の本発明の前立腺癌治療薬に用いられるものと同様のものを用いることができる。
【００３２】
本発明の結合阻害剤の投与方法は、上述の本発明の前立腺癌治療薬に用いられるものと同様の方法を用いることができる。
【００３３】
＜化合物の製造方法＞
本発明は、上述した一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７として寄託されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株を培養する培養工程と、培養工程において得られた培養物から上記化合物を採取する工程と、を有する、製造方法を包含する。
【００３４】
（培養工程）
本発明における培養工程は、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７として寄託されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株を培養する工程である。該培養工程により、該菌株が増殖するため、この増殖した菌株を培養物として得ることができる。
【００３５】
本発明における培養工程において用いられるストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株の受託は、（１）受領機関名が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターであり、（２）受領日は２０１５年７月１４日付けであり、（３）受領番号は、上記のとおり、ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７である。
【００３６】
ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株は、放線菌の一種であり、通常の放線菌の培養条件により培養することができる。例えば、培地としては、Ｖ−２２培地（成分：Ｇｕｌｕｃｏｓｅ、ＮＺ−ｃａｓｅ等）、Ａ３ＭＰ培地（成分：Ｇｕｌｕｃｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ等）等を用いることができる。培地は、前培養として、Ｖ−２２培地を用い、その後、菌を回収してＡ３ＭＰ培地により培養することが好ましい。また、培養温度については、通常、２５〜３７℃の温度で培養を行うことができる。また、培養期間は、目的とするストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株の量に応じて適宜決定できるが、通常、４〜１０日間の培養を行うことができる。また、培地のｐＨについては、Ｖ−２２培地はｐＨ７、Ａ３ＭＰ培地はｐＨ８に調整し用いることができる。
【００３７】
（採取工程）
本発明における採取工程は、上記培養工程において得られた培養物から一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程である。
【００３８】
培養工程により得られた培養物から、本発明の化合物を採取する方法は、微生物の培養物により産生される代謝産物を採取する際に通常使用される方法を用いることができる。例えば、有機溶媒による抽出、濃縮、乾燥、吸着、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー等の方法から選ばれた１種又は２種以上の方法により目的物質である本発明の化合物を分離・精製することで、採取することができる。
【００３９】
具体的には、以下に例示される方法により、本発明の化合物を採取することができる。まず、培養物を、酢酸エチルにより抽出（有機層を回収）した後、９０％メタノールとヘキサンとを１：１で混合した混合溶媒による抽出（９０％メタノール層を回収）、更に酢酸エチルと水（ｐＨ１０）と１：１で混合した混合溶媒による抽出（有機層を回収）を行い、ＣＨＣｌ３：メタノール：水（ｐＨ９）＝５：６：４の混合溶媒を用いて、遠心分配クロマトグラフィー（例えば、システム・インスツルメンツ社製の「ＣＰＣ２４０」等）による抽出（例えば、正溶出の条件として、移動相：水（ｐＨ９）、固定相：クロロホルム、流速：５ｍＬ／ｍｉｎの条件を用いることができ、反転溶出の条件として、固定相：クロロホルム：流速：５ｍＬ／ｍｉｎの条件を用いることができる。また、分画は、フラクションコレクターにより５ｍＬ／ｆｒ．の条件で行うことができる。）を更に行う。その後、ＬＣ／ＭＳ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ社製の光ダイオードアレイ検出器“２９９６”、質量分析装置“ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ”を用いることができる。また、移動相に５０％アセトニトリル水溶液を、カラムにｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（野村化学社製）を用いることができる）により、目的とする本発明の化合物を含む画分を回収し、本発明の化合物を採取することができる。また、より正確に本発明の化合物を単離された状態で回収するために、ＬＣ／ＭＳによる分離・精製を２回以上行ってもよい。
【００４０】
採取を行う際は、各段階において回収した画分について、ＡＲアンタゴニスト活性を確認することで、回収する画分を選択してもよい。ＡＲアンタゴニスト活性は、従来の公知の方法により行うことができる。例えば、ＡＲアンタゴニスト活性は、放射性同位体で標識したアンドロゲン（例えば、［３Ｈ］−ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）等）を用いて、ＡＲアンタゴニストとの結合性を測定してもよい。あるいは、アンドロゲンにより誘導される遺伝子（例えば、ＤＨＴにより発現されるマーカー遺伝子である前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ））の発現量を直接又は間接的に測定することで、ＡＲアンタゴニスト活性を測定することができる。
【００４１】
本発明の化合物の製造方法の前工程（培養工程、採取工程）において、その一部又は全部の工程を暗条件下（例えば、光を遮断した状態）で行うことが望ましい。これにより、化合物の分解を抑制することができるため、効率的に化合物の製造を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
＜化合物の製造＞
式（Ｉ）で表される化合物（実施例１〜５に係る化合物）を、以下の方法で製造した。
【００４３】
（培養）
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２０８７として寄託されたストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＢＢ４７株について培養を行った。具体的には、以下の手順で行った。
まず、種菌を５００ｍＬのＶ−２２培地に接種し、４日間、３０℃、１６０ｒｐｍで培養を行った。４日間培養後、菌を回収し、１０ＬのＡ３ＭＰ培地により、６日間、３０℃、１６０ｒｐｍで培養を行った。なお、Ｖ−２２培地、Ａ３ＭＰ培地の組成を以下に示す。
【００４４】
・Ｖ−２２培地（ｇ／１００  ｍＬ）
Ｓｏｌｂｌｅ  Ｓｔａｒｃｈ       １．０  ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ                    ０．５  ｇ
ＮＺ−ｃａｓｅ                    ０．３  ｇ
Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ       ０．２  ｇ
Ｔｒｙｐｔｏｎｅ                 ０．５  ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                        ０．１  ｇ
ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ                 ０．０５  ｇ
ＣａＣＯ３                           ０．３  ｇ      
ｐＨ                               ７．０
・Ａ３ＭＰ培地（ｇ／１００  ｍＬ）
Ｇｌｕｃｏｓｅ                    ０．５  ｇ
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ                  ２．０  ｇ
Ｓｏｌｂｌｅ  Ｓｔａｒｃｈ       ２．０  ｇ
Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ           １．５  ｇ
Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ       ０．３  ｇ
ＨＰ−２０                        １．０  ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４                          １．０  ｇ
ｐＨ                               ８．０
【００４５】
（精製）
培養により得られた培養物に対して、１０Ｌの酢酸エチルを用いて抽出を行った。抽出は、具体的には、以下の手順で行った。
まず、１０Ｌの培養液に等量の酢酸エチルを加え、１時間ロータリーシェーカーで振盪した後、５００ｒｐｍで１０分間遠心し、有機層と水層とに分離した。得られた有機層を遮光した状態でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、１．９ｇの抽出物を回収した。
【００４６】
得られた抽出物に対して、９０％メタノール：ヘキサン＝１：１の混合溶媒２Ｌを用いて、更に抽出を行った。分離は、以下の手順で行った。
まず、得られた抽出物を１Ｌの９０％メタノールに溶解させ分液漏斗に入れ、そこに１Ｌのヘキサンを加えよく分配した。９０％メタノール層を回収し、再度１Ｌのヘキサンを加えよく分配した後、９０％メタノール層を回収し、遮光した状態でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮した。
更に、得られた抽出物に対して、酢酸エチル：水（ｐＨ１０）＝１：１の混合溶媒２Ｌを用いて抽出を行った。
まず、得られた抽出物を１Ｌの酢酸エチルに溶解させ分液漏斗に入れ、そこに１Ｌの水（ｐＨ１０）を加えよく分配した。有機相を回収し、再度１Ｌの水（ｐＨ１０）を加えよく分配した後、有機層を回収し、遮光した状態でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、８５４ｍｇの抽出物を回収した。
【００４７】
得られた抽出物を、クロロホルム：メタノール：水（ｐＨ９）＝５：６：４の混合溶媒を用いて、遠心分配クロマトグラフィー（機器名：ＣＰＣ２４０，  メーカー名：システム・インスツルメンツ）による精製を行った。具体的には、以下の手順で行った。
まず、固定相として下層液（クロロホルム）をロータ内に充填させ、移動相に上層液（水（ｐＨ９））を用いて流速５ｍＬ／ｍｉｎで正溶出を行った。続いて、移動相として下層液（クロロホルム）を用いて流速５ｍＬ／ｍｉｎで反転溶出を行った。各溶出において、フラクションコレクターにより５ｍＬ／ｆｒ．で分画を行い、各画分に対してＡＲアンタゴニスト活性を測定し（測定方法は後述する＜アンタゴニスト活性の評価１＞の方法と同様の方法により行った）、活性を有する画分３７２ｍｇを回収した。
【００４８】
回収した画分について、更に、ＬＣ／ＭＳ（機器名：光ダイオードアレイ検出器“２９９６”質量分析装置  “ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ”、メーカー名：Ｗａｔｅｒｓ）により、更に精製を行った。移動相に、５０％アセトニトリル水溶液、カラムにｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（野村化学社製）を用いた。ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ検出器）により検出したクロマトグラフを図１に示す。図１に示されるクロマトグラフのうち、（１）〜（５）のピークの部分の画分を回収した。（４）の画分から、５５．２ｍｇの実施例１に係る化合物を得た。（１）の画分から、１３．８ｍｇの実施例２に係る化合物を得た。（２）の画分から、１７．７ｍｇの実施例３に係る化合物を得た。（３）の画分から、３２．２ｍｇの化合物を得た。（５）の画分から、４３．１ｍｇの化合物を得た。（３）と（５）の画分に対して、移動相として４５％アセトニトリル水溶液、カラムにｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（野村化学社製）を用いて、更に、ＬＣ／ＭＳによる精製を行い、得られたピークの画分をそれぞれ回収し、１３．８ｍｇの実施例４に係る化合物と、４．６ｍｇの実施例５に係る化合物をそれぞれ得た。
【００４９】
＜化合物の構造解析＞
実施例１〜５に係る化合物について、１Ｈ，１３Ｃ，各種二次元ＮＭＲスペクトル（Ｈ−Ｈ−ＣＯＳＹ，ＨＳＱＣ，ＨＭＢＣ，ＮＯＥＳＹ）の解析により決定した。その結果、実施例１〜５に係る化合物が、以下の一般式（Ｉ）で表される、２２員環マクロライド構造を有する幾何異性体であることがわかった。式中の番号は、構造式における炭素原子の位置番号を示す。
【００５０】
【化３】
2017036219.tif 000005
【００５１】
上記式（Ｉ）中、実施例１に係る化合物は、２位の炭素原子と３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、４位の炭素原子と５位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、６位の炭素原子と７位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、８位の炭素原子と９位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１２位の炭素原子と１３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１４位の炭素原子と１５位の炭素原子との間の二重結合がトランスである。
実施例２に係る化合物は、２位の炭素原子と３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、４位の炭素原子と５位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、６位の炭素原子と７位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、８位の炭素原子と９位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、１２位の炭素原子と１３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１４位の炭素原子と１５位の炭素原子との間の二重結合がトランスである。
実施例３に係る化合物は、２位の炭素原子と３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、４位の炭素原子と５位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、６位の炭素原子と７位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、８位の炭素原子と９位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、１２位の炭素原子と１３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１４位の炭素原子と１５位の炭素原子との間の二重結合がトランスである。
実施例４に係る化合物は、２位の炭素原子と３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、４位の炭素原子と５位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、６位の炭素原子と７位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、８位の炭素原子と９位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１２位の炭素原子と１３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１４位の炭素原子と１５位の炭素原子との間の二重結合がトランスである。
実施例５に係る化合物は、２位の炭素原子と３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、４位の炭素原子と５位の炭素原子との間の二重結合がシスであり、６位の炭素原子と７位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、８位の炭素原子と９位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１２位の炭素原子と１３位の炭素原子との間の二重結合がトランスであり、１４位の炭素原子と１５位の炭素原子との間の二重結合がトランスである。
【００５２】
以下に、実施例１〜５に係る化合物についての、ＮＭＲの結果を示す。また、（ａ）１Ｈ−ＮＭＲ、（ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルの分析結果のグラフを図２〜６、表１〜５に示す。
【００５３】
【表１】
2017036219.tif 000006
【００５４】
【表２】
2017036219.tif 000007
【００５５】
【表３】
2017036219.tif 000008
【００５６】
【表４】
2017036219.tif 000009
【００５７】
【表５】
2017036219.tif 000010
【００５８】
なお、実施例１に係る化合物について、立体構造を決定した。具体的には、実施例１に係る化合物の絶対立体配置（Ｃ１１，１６，１９，２１，２２，２３位）は、メタノリシス反応により開環した実施例１に係る化合物の直鎖状メチルエステル体（以下、「直鎖状メチルエステル体」ということがある。）を種々の誘導体へと変換することにより決定した。Ｃ１１、１９位は直鎖状メチルエステル体をＭＰＡエステル体へと誘導することで決定した。続いてＣ２１位は、直鎖状メチルエステル体のＣ１９−Ｃ２１位の１，３−ジオールをアセトナイドへと誘導することで決定した。また、Ｃ２２、２３位は、Ｃ２１〜２３位までの相対立体配置をＪ基準立体配置解析法により明らかにすることで決定した。Ｃ１６位は、直鎖状メチルエステル体をアセチル化した後、酸化分解することで得られたＣ１６位を末端とするカルボン酸をＰＧＭＥアミドへと誘導することにより決定した。以下の一般式（ＩＩ）に、実施例１に係る化合物の立体構造を示す。式中の番号は、構造式における炭素原子の位置番号を示す。
【００５９】
【化４】
2017036219.tif 000011
【００６０】
以下に、実施例１に係る化合物の物理化学的性状を示す。
外観：ｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｐｏｗｄｅｒ
分子式：Ｃ３３Ｈ４４Ｏ６
ＨＲＥＳＩ−ＭＳスペクトル  ｆｏｕｎｄ：５３５．３０５５２，ｃａｌｃｄ．：５３５．３０５９６（ａｓ  Ｃ３３Ｈ４３Ｏ６）
比旋光度  ［α］Ｄ２０＝＋３４．４°
ＵＶ  λｍａｘ  ｎｍ  （ε）  ｉｎ  ＭｅＯＨ  ２３６（３８５８１），３３７（２４０８８）
ＩＲ  νｍａｘ  ｃｍ−１  ３３１３，２９２０，１６７０，１５８８，１４５７，１２３７，  ９９９
【００６１】
＜アンタゴニスト活性の評価１＞
ヒトＡＲ（野生型）を用い、実施例１〜５に係る化合物のＡＲアンタゴニスト活性を評価した。
【００６２】
５０μｇ／ｍＬのリコンビナントＡＲのＣ末端タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ））タグとＡＲのＣ末端タンパク質の融合タンパク質（ＭＢＰ−ＡＲＣ）を大腸菌内で発現させて作製した）と、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４，  ８００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  １ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，  ２ｍＭ  ＤＴＴ）と、２ｎＭ  の［３Ｈ］−ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）と２μＭ、６μＭ、又は２０μＭの実施例１〜５に係る化合物のいずれかとを混合し総量を        １００μＬとした。この混合液を４℃で３時間インキュベートした。その後、バイオゲル（登録商標）ＨＴ（製品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、メーカー名：ＢＩＯ−ＲＡＤ）を添加し、氷上で１５分間インキュベートしながら５分おきにボルテックスにより攪拌した。その後、洗浄用のＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ）を加えてボルテックスにより攪拌した後、５０００ｒｐｍで１．５分遠心して上清を除去した。この洗浄から上澄みの除去までの操作を３回繰り返した。その後、沈殿物をアクアゾルに懸濁して、シンチレーションバイアルに移し、放射活性を液体シンチレーションカウンター（機器名：液体シンチレーションカウンター、メーカー名：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。また、実施例１〜５に係る化合物に代えて、比較例１に係る化合物として、フルタミドを用いて、同様の手順でＡＲアンタゴニスト活性を評価した。
【００６３】
更に、ＡＲ同様の核内受容体スーパーファミリーの一つであるＥＲαに対する結合能を評価することで、ＡＲ特異性を評価した。手順は、上記リコンビナントＡＲのＣ末端タンパク質をリコンビナントＥＲαのＣ末端タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）タグとＥＲαのＣ末端タンパク質の融合タンパク質（ＭＢＰ−ＥＲＣ）を大腸菌内で発現させて作製した）に変更し、［３Ｈ］−ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）を［３Ｈ］−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（エストラジオール）に変更し、４℃でのインキュベート時間を１５分間に変更し、１０μＭ、３０μＭ、又は１００μＭの実施例１〜５に係る化合物を用いた点以外は、上記ＡＲアンタゴニスト活性の評価方法と同様の手順で行った。
【００６４】
ＡＲアンタゴニスト活性及びＥＲαに対する結合能の評価結果を、図７及び以下の表６に示す。図７中、（ａ）は、実施例１〜５及び比較例１に係る化合物の濃度と、ＡＲ−ＤＨＴの結合性との関係を示すグラフであり、（ｂ）は、実施例１〜５及び比較例１に係る化合物の濃度と、ＥＲ−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの結合性との関係を示すグラフである。表６中の数値は、ＡＲ−ＤＨＴの結合、又はＥＲ−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの結合の抑制活性のＩＣ５０の数値である。
【００６５】
【表６】
2017036219.tif 000012
【００６６】
図７に示す結果より、実施例１〜５に係る化合物は、いずれも、フルタミドと同様に、ＡＲ−ＤＨＴの結合を濃度依存的に抑制することがわかった。むしろ、いずれもフルタミドよりＡＲ−ＤＨＴの結合の抑制能が高いことがわかった。一方、ＥＲ−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの結合は、ＡＲ−ＤＨＴの結合を阻害する濃度においては抑制しなかったことがわかった。このことから、実施例１〜５に係る化合物はＡＲに対して特異的に結合することが示唆された。
【００６７】
＜アンタゴニスト活性の評価２＞
実施例２に係る化合物を用い、野生型ＡＲだけでなく、既存のＡＲアンタゴニスト（ハイドロキシフルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド）に対して耐性を示す変異体ＡＲに対するアンタゴニスト活性を評価した。
【００６８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１．５ｍｌ系）で播種した（培地：ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉｕｍ＋ＦＢＳ１０％）。翌日、ｐＴｒｉ−ＡＲ  ｐｌａｓｍｉｄ０．１μｇ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  １．０μｇ、ＬａｃＺ  ｐｌａｓｍｉｄ（製品名：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｌａｃＺ、メーカー名：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０ｎｇ（１ｗｅｌｌ当たり）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（製品名：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，  メーカー名：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２．０μＬを用いてトランスフェクションした。２４時間後、培地を除去し、培地を、ホルモン及びフェノールレッド不含ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉｕｍとｃｈａｒｃｏａｌ／ｄｅｘｔｒａｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  ＦＢＳ２％とからなる培地に変え、ＤＨＴ  １００ｎＭと０．１μＭ、１μＭ、又は１０μＭの実施例２に係る化合物を添加した。２４時間後、それぞれのサンプルについてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙにより発光強度を測定した。更に、β−ｇａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙにより発光強度を測定し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅによる発光強度をβ−ｇａｌａｃｔｏｃｉｄａｓｅによる発光強度で補正した。また、実施例２に係る化合物に代えて、ハイドロキシフルタミド（比較例１に係る化合物）、ビカルタミド（比較例２に係る化合物）、エンザルタミド（比較例３に係る化合物）を用いて、実施例２と同様の手順でＡＲアンタゴニスト活性を評価した。
なお、上記ｐＴｒｉ−ＡＲ  ｐｌａｓｍｉｄは、野生型ヒトＡＲの全長配列がｐＴｒｉ−Ｅｘ  ３  ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒ（製品名：ｐＴｒｉ−Ｅｘ  ３  ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒ、メーカー名：Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入されたｐｌａｓｍｉｄである。また、このｐｌａｓｍｉｄを鋳型として、フルタミド耐性変異Ｔ８７７Ａ、ビカルタミド耐性変異Ｗ７４１Ｃ、又はエンザルタミド耐性変異Ｆ８７６Ｌの変異を導入したｐＴｒｉ−ＡＲ  ｐｌａｓｍｉｄの計４種のｐｌａｓｍｉｄをそれぞれ用いた。また、ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄは、ＰＳＡのプロモーター領域の下流にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子が導入されたプラスミドである。
【００６９】
その評価結果を、以下の表７に示す。表７中の数値は、各ＡＲに対する実施例２及び比較例１〜３に係る化合物のアンタゴニスト活性のＩＣ５０値（μＭ）を示す。
【００７０】
【表７】
2017036219.tif 000013
【００７１】
表７に示すように、既存のＡＲアンタゴニストであるフルタミド（比較例１に係る化合物）、ビカルタミド（比較例２に係る化合物）、エンザルタミド（比較例３に係る化合物）は、野生型ＡＲにおいては、ＤＨＴによる発光強度の上昇を濃度依存的に抑制した。一方、比較例１〜３に係る化合物は、各変異体ＡＲにおいては、野生型ＡＲより、それぞれの対応する耐性を有するＡＲアンタゴニストに対する感受性（ＩＣ５０値）が低下した。このことから、本評価系が正常に機能していることが示された。
【００７２】
また、表７において、野生型及び変異体ＡＲ計４種に対する実施例２に係る化合物が与える影響を評価するために、ＩＣ５０（変異体ＡＲ）／ＩＣ５０（野生型ＡＲ）を求めた。その結果、実施例２に係る化合物についてのＩＣ５０（変異体ＡＲ）／ＩＣ５０（野生型ＡＲ）は、フルタミド耐性が０．８２、ビカルタミド耐性が１．６７、エンザルタミド耐性が１．４５であった。このことから、実施例２に係る化合物が、比較例１〜３の化合物に対する耐性が確認された全てのＡＲに対して、一様にアンタゴニスト活性を示した。
【００７３】
以上の結果から、本発明の化合物は、細胞レベルにおいてＡＲアンタゴニスト活性を示し、更に既存のＡＲアンタゴニストが有する耐性を克服できることが示唆され、有用な前立腺癌治療薬と利用できることが示唆された。
【００７４】
フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミドは、その化学構造中に共通なアニリド骨格を備える。他方、本発明の化合物は、上記で述べたとおり、これらと全く異なる２２員環マクロライド構造を有するため、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミドに対して耐性を有するようなＡＲに対しても、アンタゴニスト活性を有するものと考えられる。
【図１】
2017036219.tif 000016
【図２】
2017036219.tif 000017
【図３】
2017036219.tif 000018
【図４】
2017036219.tif 000019
【図５】
2017036219.tif 000020
【図６】
2017036219.tif 000021
【図７】
2017036219.tif 000022