(57)【要約】【課題】腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管新生を阻害する薬剤の提供、およびＶＥＧＦ阻害薬抵抗性がんに対する治療薬の提供。【解決手段】抗精神病薬、特に選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）または三環系抗うつ薬から選択される少なくとも１つの抗精神病薬を含む腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、とりわけ、ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんの治療用の該腫瘍幹細部由来血管新生阻害薬ならびに該腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬とＶＥＧＦ経路阻害薬とを組み合わせたがん治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗精神病薬を含む腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬。
【請求項２】
抗精神病薬が選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）または三環系抗うつ薬から選択される少なくとも１つである請求項１記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬。
【請求項３】
抗精神病薬がＳＳＲＩである請求項１または２記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬。
【請求項４】
抗精神病薬が、フルボキサミン、セルトラリン、パロキセチンおよびイミプラミンからなる群より選択される少なくとも１つである請求項２記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬。
【請求項５】
ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんの治療用である請求項１〜４のいずれか１項に記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬とＶＥＧＦ経路阻害薬とを組み合わせたがん治療薬。
【請求項７】
ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんの治療用である請求項６記載のがん治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍幹細胞由来の血管新生阻害薬に関し、とりわけ脳腫瘍幹細胞による血管新生を阻害する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍、特にがんに対する分子標的薬は、現在非常に盛んに研究・開発が行われている。分子標的薬は、従来の古典的な抗がん剤と呼ばれる薬剤と異なり、がん特異的に発現している分子に対して作用し、従来の抗がん剤で問題となる様々な副作用が非常に低い薬剤である。しかしながら、その研究には標的となる分子の同定から種々の低分子薬剤のスクリーニングに至るまで、非常に長期間にわたって、莫大な費用と多くの労力が必要である。また、このような分子標的薬は、非常に大きな費用と労力を経て世に出ても、予期せぬ合併症の原因となり、実験上想定していたような効果をもたらさないこともよく見受けられる。
【０００３】
がんに対する抗血管新生療法の概念は、古く１９７０年代より提唱されており、腫瘍に対して異常に増加している腫瘍血管新生を阻害することで、がんを兵糧攻めにする治療法である。分子標的薬としての血管新生阻害薬としては、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンテダニブ、アフリベルセプト、アキシチニブが承認を取得しており、これら血管新生阻害薬はすべて、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のシグナル伝達経路を標的とするＶＥＧＦ標的治療薬である。その中でも、ベバシズマブやアキシチニブが臨床で使用されている。ベバシズマブは抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、ヒトＶＥＧＦと特異的に結合することにより、ＶＥＧＦと血管内皮細胞上に発現しているＶＥＧＦ受容体との結合やＶＥＧＦの生物活性を阻止して腫瘍組織での血管新生を抑制し、腫瘍の増殖を阻害する。アキシチニブは、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）のリン酸化を阻害し、その下流のシグナル伝達を阻害する。近年では、ベバシズマブが国内外において切除不能進行・再発大腸がんに対する標準治療として確固たる地位を築いているが、他のがんへの普及は遅々として進んでいない。抗血管新生薬を用いた代表的な悪性脳腫瘍（膠芽腫）に対する臨床試験には以下の２つが報告されている。
【０００４】
１つ目は北米を中心にした悪性脳腫瘍（膠芽腫）に対する国際共同研究アバグリオ（AVAglio）にて、標準治療（外科治療＋アルキル化剤＋放射線治療）に抗血管新生薬ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））をさらに使用する併用治療を行った臨床研究である。放射線治療を６０Ｇｙ（２Ｇｙ／日×３０回）で治療中に、テモゾロマイドの連日投与（７５ｍｇ／ｍ2／日）、抗血管新生薬ベバシズマブの投与（２週間間隔で１０ｍｇ／ｋｇ）が行われた。その後、３週間間隔でベバシズマブの投与が１２サイクル継続された。６３７人の患者が治療され、全生存期間中央値は、ベバシズマブ使用群で１５．７ヵ月、不使用群で１６．１ヵ月であり、有意差は認められず、逆にベバシズマブ使用群で副作用が報告されている。
【０００５】
２つ目は、欧州を中心とした悪性脳腫瘍（膠芽腫）に対する国際共同研究ＲＴＯＧ ０８２５において行われた上述アバグリオと同様の臨床試験である。２年生存割合は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））使用群で３３．９％、不使用群で３０．１％と有意差は認められず、逆にベバシズマブ使用群で有害事象が多かったことが報告されている。
【０００６】
さらに、ＶＥＧＦ阻害剤の適用においては、転移性乳がんや原発性乳がんについても生存率の改善が見られていない。
【０００７】
これらのベバシズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤による治療効果が認められていないがんの１つである膠芽腫においては、腫瘍幹細胞が内皮細胞へと分化し、ＶＥＧＦに依存することなく血管新生が可能であることが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
一方、本発明者らは、フルボキサミンまたはその誘導体について、血管脳関門（ＢＢＢ）を通過し得る薬剤として、正常脳におけるがん細胞の浸潤を抑制する効果を見出し、特許文献１において開示している。このフルボキサミンと同様に、現在臨床適用されている、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、三環系抗うつ薬、四環系抗うつ薬などの抗精神病薬は、正常な脳内に作用するものであり、血管脳関門を通過し、高い脳移行性を示す。ＳＳＲＩの１つであるフルボキサミンは、主にうつ病、不安障害、強迫性障害、摂食障害、注意欠陥・多動性障害、月経前症候群などの治療薬として使用されている。日本ではＳＳＲＩの中で最も早くに承認を受けたフルボキサミンマレイン酸塩錠が、「デプロメール（登録商標）」（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ  ファルマ（株））、「ルボックス（登録商標）」（アッヴィ合同会社）として販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１４−１０８９３０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Soda Y, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 108(11):4274-4280, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、既存の血管新生阻害剤は、大腸がんなどの一部のがんで有効であったが、悪性脳腫瘍を始め、多くの悪性腫瘍においては無効であった。特許文献１において、その原因の１つが、腫瘍に存在する腫瘍幹細胞による、ＶＥＧＦ非依存的血管新生であることが示唆されたが、非特許文献１には具体的にＶＥＧＦ阻害剤抵抗性がんに対する治療方法は示されていない。
【００１２】
また、特許文献１においては、フルボキサミンまたはその誘導体について、通常の腫瘍血管新生の阻害についてわずかに示唆があるものの、具体的には細胞浸潤抑制作用が開示されているのみである。
【００１３】
そこで、本発明は、腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管新生を阻害する薬剤を提供すること、ならびにＶＥＧＦ経路阻害剤抵抗性がんに対する治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、通常の腫瘍においては、発育組織より構成される腫瘍血管が８０〜９０％を占め、残り１０〜２０％が腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管であるとされているところ、この腫瘍血管の発育を抑制すると、その血管を補うために腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管が増殖してその割合が増加し、抗ＶＥＧＦ治療に抵抗性を示すことを見出し、各種抗精神病薬を試験することにより、脳腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管を阻害する薬剤を初めて発見し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
［１］抗精神病薬を含む腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、
［２］抗精神病薬が選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）または三環系抗うつ薬から選択される少なくとも１つである上記［１］記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、
［３］抗精神病薬がＳＳＲＩである上記［１］または［２］記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、
［４］抗精神病薬が、フルボキサミン、セルトラリン、パロキセチンおよびイミプラミンからなる群より選択される少なくとも１つである上記［２］記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、
［５］ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんの治療用である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬、
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬とＶＥＧＦ経路阻害薬とを組み合わせたがん治療薬、
［７］ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんの治療用である上記［６］記載のがん治療薬
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＶＥＧＦ阻害薬抵抗性がんに対しても、有効な血管新生阻害薬を提供することができる。また、脳での作用が確認されている抗精神病薬であるためＢＢＢを通過することができ、抗精神病薬として臨床適用がなされている場合には、副作用も明らかであるため、臨床応用までの時間や費用を削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】００５細胞によるチューブ形成アッセイにおける蛍光顕微鏡写真の図である。
【図２】チューブ形成アッセイにおけるフルボキサミンのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図３】フルボキサミンによるチューブ形成阻害を薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図４】チューブ形成アッセイにおけるセルトラリンのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図５】セルトラリンによるチューブ形成阻害を薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図６】チューブ形成アッセイにおけるパロキセチンのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図７】パロキセチンによるチューブ形成阻害を薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図８】チューブ形成アッセイにおけるイミプラミンのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図９】イミプラミンによるチューブ形成阻害を薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図１０】脳腫瘍幹細胞のチューブ形成アッセイにおけるアキシチニブのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図１１】脳腫瘍幹細胞のチューブ形成に対するアキシチニブの影響を、薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図１２】通常脳腫瘍細胞のチューブ形成アッセイにおけるアキシチニブのチューブ形成阻害能を示す蛍光顕微鏡写真の図である。
【図１３】通常脳腫瘍幹細胞のチューブ形成に対するアキシチニブの影響を、薬剤を添加していないコントロールのチューブ形成能（チューブ全長）を１００として示すグラフである。
【図１４】脳腫瘍モデルマウスにおける薬剤の効果を示すＭＲＩ画像の図である。（ａ）は２週間処置後のＴ２増強画像であり、（ｂ）は（ａ）の撮影後にガドリニウム造影剤を投与した後のＴ２−Ｇｄ増強画像である。
【図１５】図１４（ｂ）のＭＲＩ画像より算出した腫瘍体積を示すグラフである。
【図１６】腫瘍幹細胞由来の血管内皮細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現を示すグラフである。（ａ）はフルボキサミン投与後６時間での５種の標的遺伝子の発現量を比較したグラフであり、（ｂ）は、フルボキサミン投与前のＡｎｇ１発現量に対するフルボキサミン投与６時間後および２０時間後のＡｎｇ１発現量を相対的に示すグラフである。
【図１７】各細胞におけるＶＥＧＦＲ２およびＴＩＥ２の発現量を示す電気泳動写真の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬は、有効成分として抗精神病薬を含有することを特徴とする。
【００１９】
「腫瘍幹細胞」とは、腫瘍組織の中に非常に少ない割合で存在する幹細胞であり、その特徴には、自己複製能、腫瘍形成能、治療抵抗性、多分化能、微小環境での生存性などが挙げられる。現在のがん治療では、外科手術、放射線療法、化学療法の３つが主であり、疾患のレベルにより、これらの手法を組み合わせた集学的治療が行われている。その中でも、サイバーナイフなどの定位放射線治療では、医療機器の発達に伴い、ミリ単位で照射野を制御できるようになった。しかし、悪性脳腫瘍を例にみると、最も悪性度の高い膠芽腫では、前述のような放射線治療技術の発達にもかかわらず、平均生存期間約１年、５年生存率５％未満と極めて予後不良である。その理由として、腫瘍が脳内へ浸潤性発育する特性が挙げられる。このような高浸潤能を有する腫瘍は、ＭＲＩ等の画像上描出される腫瘍領域の外側の正常脳に細胞レベルで多くの腫瘍細胞が散在しておりこれらの細胞を治療するには至っていない。これらの治療できない細胞には腫瘍幹細胞も含まれ、上述のその特徴が、がん治療の後の予後を不良なものとしている。この特徴のなかでも、多分化能に着目すると、腫瘍幹細胞は、腫瘍血管を構築する周皮細胞や内皮細胞に分化し、血管新生することが報告されている。
【００２０】
腫瘍幹細胞に由来する血管新生は、現在使用されている抗血管新生薬、すなわちＶＥＧＦ経路を標的とする抗血管新生薬では阻害されず、ＶＥＧＦ経路とは関係のない増殖系において新生する。そして、この腫瘍幹細胞由来の血管新生は、通常の発育組織より発生するＶＥＧＦ経路に依存した血管新生が阻害されると、代替的にその増殖を増加させると考えられる。
【００２１】
抗精神病薬としては、薬物動態や副作用等が明らかとなっており、臨床適用がなされているものが好ましく用いられ、脳腫瘍に用いる場合には、薬剤が脳で作用し、高い脳移行性を示すことが好ましい。このような抗精神病薬としては、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、定型抗精神病薬、非定型抗精神病薬、ベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）、ＢＺＤ受容体拮抗薬、三環系抗うつ薬、四環系抗うつ薬などが挙げられる。その効果の点から、ＳＳＲＩまたは三環系抗うつ薬が好ましい。
【００２２】
具体的には、ＳＳＲＩとしては、パロキセチン、フルオキセチン、フルボキサミン、セルトラリン、（Ｓ）−シタロプラム、シタロプラムなどが挙げられる。
【００２３】
定型抗精神病薬としては、クロルプロマジンなどが挙げられる。
【００２４】
非定型抗精神病薬としては、オランザピン、クエチアピンなどが挙げられる。
【００２５】
ベンゾジアゼピンとしては、クロルジアゼポキシド、ジアゼパムなどが挙げられる。
【００２６】
ＢＺＤ受容体拮抗薬としては、アルプラゾラム、ブロマゼパム、ブロチゾラム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼプ酸、クロチアゼパム、クロキサゾラム、ジアゼパム、エスタゾラム、エチゾラム、ロフラゼプ酸エチル、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルトプラゼパム、ロラゼパム、ロルメタゼパム、メダゼパム、ミダゾラム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、プラゼパム、クアゼパム、トリアゾラム、クロバザム、フルマゼニル、エスゾピクロン、ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロンなどが挙げられる。
【００２７】
三環系抗うつ薬としては、イミプラミン、クロミプラミン、トリミプラミンなどが挙げられる。
【００２８】
四環系抗うつ薬としては、マプロチリン、ミアンセリン、セチプチリン、ミルタザピンなどが挙げられる。
【００２９】
これらの中でも、臨床応用のために必要とされる時間と費用を削減する観点からは、現在既に抗精神病薬として使用されている、クロルプロマジン、オランザピン、クエチアピン、イミプラミン、クロミプラミン、トリミプラミン、パロキセチン、フルオキセチン、フルボキサミン、セルトラリン、（Ｓ）−シタロプラム、シタロプラムなどを好ましく用いることができ、高い効果が確認されている点から、フルボキサミン、セルトラリン、パロキセチンおよびイミプラミンがより好ましく、フルボキサミンが最も好ましい。
【００３０】
また、本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬は、その他の抗がん剤と組み合わせて使用することができる。その組み合わせの方法としては、同時投与、逐次投与、個別投与などいずれの方法を用いてもよい。そのような併用可能な薬剤としては、特に限定されるものではないが、たとえば、がん細胞を殺す効果を有する既知の抗がん剤や、腫瘍の増殖や転移を抑える効果を有する既知の抗がん剤などがあげられる。
【００３１】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬は、ＶＥＧＦ経路阻害薬と組み合わせたがん治療薬とすることが好ましい。これにより、発育組織により構成されるＶＥＧＦ経路に依存する血管新生を抑制したうえで、ＶＥＧＦ経路に依存する血管新生の代わりに脳腫瘍幹細胞由来の血管新生が増加するのを防ぎ、いずれかのみを使用した場合と比較して、格別な相乗効果を奏することができる。その組み合わせの方法としては、同時投与、逐次投与、個別投与などいずれの方法を用いてもよい。このようなＶＥＧＦ経路を標的とする抗血管新生薬としては、ＶＥＧＦ経路を標的とするものであれば特に限定されるものではなく、ＶＥＧＦＲ抗体（ベバシズマブなど）、ＶＥＧＦ受容体阻害薬の第一世代ソラフェニブ、スニチニブ、バゾバニブ、エベロリムスなど、第二世代のアフリベルセブト、バンデタビブ、アキシチニブ、モテサニブ、セジラニブなど、第三世代のドビチニブ、プリバニブなどが挙げられ、これらは単独で用いてもよく、また２種以上を併用することもできる。特にその併用効果が確認されている点から、アキシチニブがより好ましい。
【００３２】
さらには、抗血管新生効果を有するインテグリン阻害薬シリンジタイド（ｃＲＧＤペプタイド）などとの併用についても、より相乗的な効果が期待でき、好ましい。
【００３３】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬は、有効成分である抗精神病薬や、ＶＥＧＦ経路阻害薬自体をそのまま投与しても良いが、一般的には、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物の形態で投与することが好ましい。
【００３４】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬の剤形や投与形態としては、特に限定されるものではないが、たとえば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤などがあげられる。これらの製剤は、常法にしたがって調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時、水またはほかの適当な溶媒に溶解または懸濁する形態であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は、周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用または非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。たとえば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
【００３５】
本発明の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、または医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては、無機または有機物質、あるいは固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分質量に対して１質量％から９０質量％の間で配合することができる。そのような物質の具体例としては、乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水などがあげられる。
【００３６】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、たとえば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤とすることや、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００３７】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００３８】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬の投与量および投与回数はとくに限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与や注射剤投与における成人一日あたりの投与量は、腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬の有効成分質量として、十分な効果を得るという観点からは、０．１ｍｇ以上が好ましく、１ｍｇ以上がより好ましく、１０ｍｇ以上がさらに好ましく、２５ｍｇ以上が特に好ましく、１５０ｍｇ以上が最も好ましい。また、経口投与における成人一日あたりの投与量は、腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬の有効成分質量として、副作用等の影響を考慮すれば、３０００ｍｇ以下が好ましく、３００ｍｇ以下がより好ましく、１５０ｍｇ以下がさらに好ましく、１００ｍｇ以下が特に好ましく、５０ｍｇ以下が最も好ましい。本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬はいずれも、一日１回または数回に分けて、あるいは数日ごとに、また注射剤の場合には、連続投与または間欠投与により投与することができる。
【００３９】
本発明のがん治療薬は、脳腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬を上述の投与量で、そしてＶＥＧＦ経路阻害薬を、アキシチニブの有効成分質量として、十分な効果を得るという観点からは、１日４ｍｇ（１回２ｍｇ、１日２回）以上が好ましく、１日６ｍｇ（１回３ｍｇ、１日２回）以上がより好ましく、１日１０ｍｇ（１回５ｍｇ、１日２回）以上がさらに好ましく、１日１４ｍｇ（１回７ｍｇ、１日２回）以上が特に好ましい。また、経口投与における成人一日当たりの投与量は、腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬の有効成分質量として、副作用等の影響を考慮すれば、１４ｍｇ以下が好ましく、１０ｍｇ以下がより好ましく、６ｍｇ以下がさらに好ましく、４ｍｇ以下が最も好ましい。
【００４０】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、たとえば、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に許容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００４１】
本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬および本発明のがん治療薬の適用対象は、腫瘍幹細胞由来血管新生を阻害することが望まれるあらゆるがん、そしてそのがんの予後である。ＶＥＧＦ経路阻害剤抵抗性がんに対しては、ＶＥＧＦ経路阻害治療後に腫瘍幹細胞由来血管新生が促進されることがわかっているため、本発明の腫瘍幹細胞由来血管新生阻害薬や、本発明のがん治療薬を適用することが好ましい。
【００４２】
ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんとは、ＶＥＧＦ経路阻害薬に対して抵抗性を獲得した状態であり、例えば、ＶＥＧＦ経路阻害治療を行っても、治療効果が見られない状態や、がんの進行を抑制することができなくなった状態、すなわち予後の延長効果が見られない「がん」を意味する。例えば、悪性脳腫瘍（膠芽腫）は、Ａｖａｇｌｉｏスタディにより、ＶＥＧＦ経路阻害薬のアバスチンを投与しても、脳腫瘍患者の予後の延長は見られていないため、悪性脳腫瘍（膠芽腫）は、ＶＥＧＦ経路阻害薬抵抗性がんに分類される。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４４】
まず、以下の参考例、実施例および比較例において用いた細胞およびその培養について説明する。
１．細胞
１−１．脳腫瘍幹細胞００５（以下、００５細胞と称す。）は、Inder M. Verma博士（Laboratory of Genetics, Salk Institute for Biological Studies、米国）より分与された。この細胞は、Marumoto T. et al., Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat. Med. 2009;15(1):110-116に記載されたように、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ遺伝子組み換え技術を使用し、レンチウイルスを用いて２つのがん遺伝子、Ｈ−Ｒａｓ、Ａｋｔと、レポーター遺伝子としてＧＦＰを導入することでマウスに脳腫瘍を形成させ、そこから分離されたものである。
【００４５】
１−２．ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell：ＨＵＶＥＣ)は、セルアプリケーションズ（Cell Applications）、米国より購入した。
【００４６】
２．細胞培養
２−１．００５細胞
００５細胞は、Ｎ2サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、米国）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（和光純薬工業（株））、塩基性ＦＧＦ（ペプロテック、ロッキーヒル、ＮＪ、米国）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（プロスペック、イーストブランズウィック、ＮＪ、米国）、ヘパリン酸ナトリウム（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、米国）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、サーモフィッシャーサイエンティフィック）と、ハムＦ−１２培地（和光純薬工業（株））とを１：１で混合した培地を用いて直径１０ｃｍの超低接着表面培養ディッシュ（Ultra-low attachment culture dishes）（コーニング、ＮＹ、米国）中で３７℃、２１％Ｏ2下で培養した。
【００４７】
２−２．ＨＵＶＥＣ
培養は、培地として２％ＦＢＳ、０．４％ヒドロコルチゾン、０．４％ｈＦＧＦ、０．１％ＶＥＧＦ、０．１％Ｒ３−ＩＧＦ、０．１％アスコルビン酸、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ＧＡ−１０００、０．１％ヘパリンを添加したＥＧＭ（登録商標）−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ、スイス）を用いて、３７℃、２１％Ｏ2下で行った。
【００４８】
参考例１：００５細胞が幹細胞であることの確認
００５細胞について、幹細胞マーカーであるＣＤ１３３の発現を抗体を用いて以下の条件で確認した。
【００４９】
００５細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア、フェアフィールド、ＣＡ、米国）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（和光純薬工業（株））を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、和光純薬工業（株））で懸濁してポリ−Ｌ−リジンでコートされた１２ｍｍカバーガラス（ＡＧＣテクノグラス（株））を２４ウェルプレート（コーニング）に入れ、そこに００５細胞（１×１０4細胞／ウェル）を入れてプレート上で５日間培養を行った。５日後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（和光純薬工業（株））を加え、室温で１０分間細胞を固定した。細胞をＰＢＳで洗浄後、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００含有ＰＢＳを加えて、室温で１５分間静置した。それから、５％（ｖ／ｖ）ロバ血清を希釈したＰＢＳＴを室温で３０分間ブロッキングし、一次抗体は１％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した抗ＣＤ１３３抗体（１：２００、ラビットモノクローナル抗体、プロテインテック、米国）を使用し、４℃で一晩反応させた。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５５５を標識したロバ製ラビット抗体（ライフテクノロジー）溶液（２μｇ／ｍＬ）に室温で１時間浸した。洗浄後、ヘキスト３３２５８（同仁化学研究所）で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ、オリンパス（株））で確認した。
【００５０】
結果は、ＣＤ１３３を発現しており、００５細胞が幹細胞であることが確認された。
【００５１】
参考例２：００５細胞の内皮細胞への分化の確認
００５細胞について、内皮細胞マーカーであるＰＥＣＡＭ−１の発現を抗体を用いて以下の条件で確認した。
【００５２】
００５細胞を２％ＦＢＳ、０．４％ヒドロコルチゾン、０．４％ｈＦＧＦ、０．１％ＶＥＧＦ、０．１％Ｒ３−ＩＧＦ、０．１％アスコルビン酸、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ＧＡ−１０００、０．１％ヘパリンを添加したＥＧＭ（登録商標）−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ、スイス）で懸濁してポリ−Ｌ−リジンでコートされた１２ｍｍカバーガラス（ＡＧＣテクノグラス（株））を２４ウェルプレート（コーニング）に入れ、そこに００５細胞（１×１０4細胞／ウェル）を入れてプレート上で１％Ｏ2で７日間培養を行った。７日後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（和光純薬工業（株））を加え、室温で１０分間細胞を固定した。細胞をＰＢＳで洗浄後、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００含有ＰＢＳを加えて、室温で１５分間静置した。それから、５％（ｖ／ｖ）ロバ血清を希釈したＰＢＳＴを室温で３０分間ブロッキングし、５％（ｖ／ｖ）ロバ血清を希釈したＰＢＳＴを含む抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（１：２００、ラビットポリクローナル抗体、サンタクルズ、米国）溶液（５μｇ／ｍＬ）にカバーガラスを４℃で１６時間浸した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５５５を標識したロバ製ラビット抗体（ライフテクノロジー）溶液（５μｇ／ｍＬ）に室温で１時間浸した。洗浄後、ヘキスト３３２５８（同仁化学研究所）で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ、オリンパス（株））で幹細胞の内皮細胞への分化について観察した。
【００５３】
００５細胞の緑色に染色された領域と、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体により赤色に染色された領域が重なり、この結果より、明らかに内皮細胞への分化が確認された。
【００５４】
参考例３：インビボでの腫瘍における腫瘍幹細胞由来の血管新生と脳血管由来の血管新生の確認
（ａ）脳腫瘍モデルの作製
脳腫瘍モデルマウスは、００５細胞の細胞懸濁液（１×１０4細胞／３μＬ）を、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ、メス、６〜８週齢、１５〜２０ｇ、清水実験材料（株））の脳のブレグマ（Bregma）より前方１ｍｍ、右外側２．５ｍｍ、深さ３ｍｍの位置に直接移植して作製した。
【００５５】
（ｂ）試料の作製および組織染色
５週間後のマウスを、ＰＢＳおよび４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（和光純薬工業（株））で潅流固定後にマウスの脳を摘出し、４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡに浸した。その後３０％（ｗ／ｖ）スクロース（和光純薬工業（株））に２日間浸漬して脱水した。脱水操作後、脳を凍結し、１０μｍの厚さに裁断し、凍結切片を作製した。凍結切片をＰＢＳで洗浄後、０．２５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００含有ＰＢＳに浸し、室温で１５分間静置した。それから、１０％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を希釈したＰＢＳを室温で６０分間ブロッキングし、１％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を希釈したＰＢＳを含む抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（１：２００、ラビットポリクローナル抗体、サンタクルズ、米国）溶液（５μｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５５５を標識したヤギ製ラビット抗体（ライフテクノロジー）溶液（２μｇ／ｍＬ）に室温で１時間浸漬した。洗浄後、ヘキスト３３２５８（同仁化学研究所）で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ、オリンパス（株））でインビボでの幹細胞の内皮細胞への分化について観察した。
【００５６】
（ｃ）結果
腫瘍血管を示す抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による赤色に染色された領域と、脳腫瘍幹細胞００５細胞由来の細胞を示す緑色に染色された領域とが重なって黄色を示す領域が腫瘍血管中に１０〜２５％認められた。
【００５７】
この結果より、明らかに腫瘍において通常の組織由来の血管新生とは異なる腫瘍幹細胞由来の血管新生が確認された。
【００５８】
参考例４：腫瘍幹細胞由来の内皮細胞による血管新生がＶＥＧＦ経路に依存しないことの確認
００５細胞およびＨＵＶＥＣを用い、培地には、２％ＦＢＳ、０．４％ヒドロコルチゾン、０．４％ｈＦＧＦ、０．１％ＶＥＧＦ、０．１％Ｒ３−ＩＧＦ、０．１％アスコルビン酸、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ＧＡ−１０００、０．１％ヘパリンを添加したＥＧＭ−２（登録商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ）を用いて、プロトコールにしたがって培養し、血管内皮細胞へと分化させた。
【００５９】
００５細胞より分化させた血管内皮細胞（１×１０5細胞）と、ＨＵＶＥＣより分化させた血管内皮細胞（１×１０5細胞）をそれぞれ１００℃に熱した１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、和光純薬工業（株））溶液で溶かし、サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００６０】
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（メルク  ミリポア、ドイツ）への転写は、４８ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール（和光純薬工業（株））、３９ｍＭのグリシン（和光純薬工業（株））、１．３ｍＭのＳＤＳ、２０ｖ／ｖ％のメタノール（和光純薬工業（株））からなる溶液中で、セミドライ式転写装置（バイオ−ラッド、米国）を用いて１５Ｖで８０分間行った。転写後はＰＶＤＦ膜を５ｗ／ｖ％スキムミルクを含む１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０（ＭＰバイオメディカルズ（MP biomedicals））、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、ＴＢＳＴ）中にて室温で６０分間振とうした。１次抗体は抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（１：１０００、ウサギモノクローナル抗体、セルシグナリングテクノロジー社、）、抗β−アクチン抗体（１：４０００、マウスモノクローナル抗体、シグマ−アルドリッチ）と室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴで３分間４回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）付加抗マウスＩｇＧ抗体（１：４０００、シグマ−アルドリッチ）、ＨＲＰ付加抗ウサギＩｇＧ抗体（１：４０００、シグマ−アルドリッチ）と室温で６０分間反応させた。ＴＢＳＴで３分間４回洗浄後、ＨＲＰ化学発光基質液ＥＣＬプライム（Prime）（ＧＥヘルスケア）と５分間反応させ、免疫複合体を化学発光検出器（ＶｅｒｓａＤｏｃ  Ｍｏｄｅｌ  ５０００、バイオ−ラッド）で検出した。
【００６１】
その結果、００５細胞より作製した血管内皮細胞ではＶＥＧＦ−Ｒ２の位置にバンドは観察されず、ＨＵＶＥＣより作製した血管内皮細胞ではＶＥＧＦ−Ｒ２の位置に明らかなバンドが観察された。
【００６２】
このウエスタンブロッティングの結果、００５より作製した血管内皮細胞にはＶＥＧＦ−Ｒ２が発現しておらず、ＨＵＶＥＣより作製した血管内皮細胞にはＶＥＧＦ−Ｒ２が発現していることが証明され、００５細胞由来の血管内皮細胞による血管新生は、ＶＥＧＦに依存しないことが示された。
【００６３】
実施例１：チューブ形成アッセイ
９６ウェルプレート（コーニング）にグロースファクターリデュースト（ＧＦＲ）マトリゲル（コーニング）を５０μＬ添加し、３７℃で６０分間ゲル化させた。参考例２の内皮細胞への分化と同じ条件で血管内皮細胞へと分化させた００５細胞を１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルで播種し、３７℃、２１％Ｏ2の条件下で２０〜２４時間培養した。観察はオールインワン蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で行った。培地にはＥＧＭ−２（登録商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ）を使用した。試験薬剤を投与せずチューブ形成されていくのを確認するコントロール試験と、培養と同時に試験薬剤（フルボキサミン、セルトラリン、パロキセチンおよびイミプラミン）を各濃度（１μＭ、５μＭおよび１０μＭ）で投与してチューブ形成の阻害を確認する試験を行った。コントロール試験において、細胞播種後所定の時間（０、６、２０、２４時間）に観察した蛍光顕微鏡写真を図１に示す。各薬剤のチューブ形成阻害評価は、細胞播種後２０時間での観察において、複数視野について、視野内に形成されたチューブの全長を測定し、コントロールの測定値と比較しておこなった。結果を、コントロールでのチューブ全長を１００とする各試験によるチューブ形成阻害としてグラフに示す（図３、５、７、９）。また、各試薬の１０μＭ、２０時間での観察の様子を図２、４、６、８にそれぞれ示す。なお、フルボキサミン、セルトラリンおよびパロキセチンについては、同じコントロールと共に同時に試験を行ったが、イミプラミンについては、別にコントロールと共に試験を行ったため、コントロールの写真が他の例とは異なっているが、結果に影響を与えるものではない。
【００６４】
結果に示されるように、ＳＳＲＩ（フルボキサミン、セルトラリン、パロキセチン）および三環系抗うつ薬（イミプラミン）のいずれの抗精神病薬においても投与群で腫瘍幹細胞由来の血管内皮細胞によるチューブ形成を阻害した。それぞれの薬剤の有効濃度（ＩＣ50）を表１に示す。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
この結果から、これらの抗精神病薬は腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管新生を阻害することが示唆され、同様に、抗精神作用を有するすべての薬剤（例えば、ＳＳＲＩ、定型抗精神病薬、非定型抗精神病薬、ベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）、ＢＺＤ受容体拮抗薬、三環系抗うつ薬、四環系抗うつ薬など）も、腫瘍幹細胞由来の血管新生を阻害するものと示唆される。
【００６７】
比較例１：チューブ形成アッセイ
９６ウェルプレート（コーニング）にグロースファクターリデュースト（ＧＦＲ）マトリゲル（コーニング）を５０μＬ添加し、３７℃で６０分間ゲル化させた。参考例２の内皮細胞への分化と同じ条件で血管内皮細胞へと分化させた００５細胞またはＨＵＶＥＣを１．５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルで播種し、３７℃、２１％Ｏ2の条件下で２０〜２４時間培養した。観察はオールインワン蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で行った。培地にはＥＧＭ−２（登録商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）を使用した。各細胞について、試験薬剤を投与せずチューブ形成されていくのを確認するコントロール試験と、培養と同時に試験薬剤（アキシチニブ）を各濃度（３ｎＭ、３０ｎＭおよび３００ｎＭ）で投与してチューブ形成の阻害を確認する試験を行った。各薬剤のチューブ形成阻害評価は、細胞播種後２０時間での観察において、複数視野について、視野内に形成されたチューブの全長を測定し、コントロールの測定値と比較しておこなった。結果を、コントロールでのチューブ全長を１００とする各試験によるチューブ形成阻害としてグラフに示す（図１１および１３）。また、２０時間での観察の様子をアキシチニブ濃度３００ｎＭについて図１０および１２にそれぞれ示す。
【００６８】
結果に示されるように、アキシチニブは、ＨＵＶＥＣによるチューブ形成に対しては阻害効果を示したが、腫瘍幹細胞である００５細胞によるチューブ形成に対しては有意な効果は示さなかった。
【００６９】
実施例２：フルボキサミンとＶＥＧＦ経路阻害薬との併用
フルボキサミンとＶＥＧＦ経路阻害薬の一つであるＶＥＧＦＲ阻害薬、アキシチニブとの併用による抗腫瘍効果について評価を行った。参考例３の（ａ）に記載したように、ヌードマウスを用いて脳腫瘍モデルを作製した。００５細胞の移植後３週間後より、アキシチニブ２５ｍｇ／ｋｇ（参考投与群ｎ＝３；５％ＤＭＳＯ溶液として０．５ｍｌ）、アキシチニブ２５ｍｇ／ｋｇとフルボキサミン５０ｍｇ／ｋｇとの併用（併用投与群ｎ＝４；５％ＤＭＳＯ溶液として０．５ｍｌ（各液０．２５ｍｌ））、およびコントロールとしての５％ＤＭＳＯ（ｎ＝３；０．５ｍｌ）を１日１回腹腔内投与をした。２週間投与を受けた脳腫瘍モデルマウスにイソフルランで麻酔をかけ、ＭＲＩ装置ＢｉｏＳｐｅｃ（ブルカー、米国）でＴ２増強画像（スライス厚：０．５ｍｍ、スライス数：１５枚、エコータイム：２２ｍｓ、繰り返し時間：８３５ｍｓ）を撮影した（図１４（ａ））。その後ガドリニウム造影剤（バイエル、ドイツ）を腹腔内投与し、Ｔ１増強画像（スライス厚：０．５ｍｍ、スライス数：１５枚、エコータイム：３．１ｍｓ、繰り返し時間：２３５ｍｓ）を撮影した（図１４（ｂ））。Ｔ１、Ｔ２画像両方とも呼吸同期で撮影を行った。ＭＲＩ画像より、腫瘍体積を（長径×短径2）／２の式で計算した。結果を図１５に示す。値は平均値±標準偏差で示し、各群の有意差検定はMicrosoft Office Excel 2013により、ｔ検定を用いて行った。
【００７０】
ＭＲＩの結果、Ｔ２−Ｇｄ画像においてコントロールと参考投与群との両方において右大脳半球にガドリニウムにて造影される占拠性病変が認められた（図１４（ｂ））。しかし、アキシチニブとフルボキサミンの併用投与群においては占拠性病変が認められなかった（図１４（ｂ））。また、算出された腫瘍体積は、コントロールが１５．２±２．７９ｍｍ3、参考投与群が１３．３±５．７４ｍｍ3、併用投与群が３．２３±１．５０ｍｍ3であり、コントロールと併用投与群との間に有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。一方、コントロールと参考投与群との間に有意差は認められなかった（ｐ＝０．１６７）（図１５）。
【００７１】
ＭＲＩ画像の以上の結果からＶＥＧＦ経路阻害薬と抗血管新生薬の併用により有意な抗腫瘍効果が発揮されることが分かる。
【００７２】
参考例５：リアルタイムＰＣＲでのターゲット遺伝子の評価
ＶＥＧＦ非依存性血管増殖に関する計５種類の遺伝子の発現検討を行った。参考例２の内皮細胞への分化と同じ条件で００５細胞を分化させた血管内皮細胞に対してフルボキサミン（１μＭ）投与後６時間でのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにて測定した。具体的には、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ）のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出を行い、余分なＤＮＡを除去するためにＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン、米国）のプロトコールにしたがって処理を行い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIV  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン、米国）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン、米国）のプロトコールに従ってｃＤＮＡを生成した。その後ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ、米国）のプロトコールに従いＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）の装置を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。また、リアルタイムＰＣＲは、標準モード、９６ウェルプレートで、表２の条件により行った。内因性コントロールとしてＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）を用い、標的遺伝子はＡｎｇ１（Ｍｍ００４５６５０３＿ｍ１）、Ｆｇｆ−２（Ｍｍ０１２８５７１５＿ｍ１）、Ｄｌｌ４（Ｍｍ００４４４６１９＿ｍ１）、Ｔｇｆｂ１（Ｍｍ０１１７８８２０＿ｍ１）、Ｐｄｇｆａ（Ｍｍ０１２０５７６０＿ｍ１）とした。また、リアルタイムＰＣＲの結果から得られたＣｔ値を元にΔΔＣｔ法で解析を行った。結果を図１６（ａ）に示す。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
次に同様の００５細胞から誘導した血管内皮細胞を用い、血管内皮細胞および腫瘍血管増殖に関与するアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）のｍＲＮＡを、フルボキサミン投与前、投与後６時間および２０時間でリアルタイムＰＣＲにて測定した。結果を図１６（ｂ）に示す。以上の結果からフルボキサミンを投与することによりＶＥＧＦ非依存的な経路であるアンジオポイエチン／Ｔｉｅ２の経路のアンジオポイエチン−１の発現量が時間依存的に減少したことが確認された。
【００７５】
参考例６：ウェスタンブロッティングによるＴＩＥ−２の検出
参考例５の結果から、本来、脳腫瘍幹細胞由来の腫瘍血管においてＡＮＧの受容体であるＴＩＥ２が発現しているのかを確認するためにウェスタンブロッティングを行った。また、血管増殖因子であるＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ２の発現についても併せて確認を行った。００５細胞（幹細胞）、参考例２の内皮細胞への分化と同じ条件で００５細胞を分化させた脳腫瘍幹細胞由来の脳腫瘍血管内皮細胞（ＴＤＥＣ）については、内皮細胞分化培地に変更してから４日目および７日目の細胞を、そしてポジティブコントロールとしてＨＵＶＥＣをそれぞれ１００℃に熱した１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、和光純薬工業（株））溶液で溶かし、サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００７６】
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（メルク・ミリポア、ドイツ）への転写には４８ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール（和光純薬工業（株））、３９ｍＭのグリシン（和光純薬工業（株））、１．３ｍＭのＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）メタノール（和光純薬工業（株））からなる溶液中で、セミドライ式転写装置（バイオラッド、米国）を用いて１５Ｖで８０分間行った。転写後はＰＶＤＦ膜を５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＭＰバイオメディカルズ社）、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５、ＴＢＳＴ）中にて室温で１時間振とうした。１次抗体として抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（１：１０００、ウサギモノクローナル抗体、セルシグナリングテクノロジー、米国）、抗ＴＩＥ−２抗体（１：１０００、ウサギモノクローナル抗体、プロテインテック）、抗β−アクチン抗体（１：４０００、マウスモノクローナル抗体、シグマ−アルドリッチ）と室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴで５分間５回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）付加抗マウスＩｇＧ抗体（１：４０００、シグマ−アルドリッチ）、ＨＲＰ付加抗ウサギＩｇＧ抗体（１：４０００、シグマ−アルドリッチ）と室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴで５分間５回洗浄後、ＨＲＰ化学発光基質液ＥＣＬプライム（ＧＥヘルスケア）と５分間反応させ、免疫複合体を化学発光検出器（ＶｅｒｓａＤｏｃ  Ｍｏｄｅｌ  ５０００、バイオラッド）で検出した。
【００７７】
脳腫瘍幹細胞由来の脳腫瘍血管内皮細胞（ＴＤＥＣ）と脳血管由来の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、多くの血管新生の中心的な役割を果たしているＶＥＧＦＲ２について始めに検討を行った。参考例４と同様に、ＴＤＥＣでは、ＶＥＧＦＲ２の発現がほとんど確認できず、一方、ＨＵＶＥＣにおいてはＶＥＧＦＲ２の強発現が認められた。次に、ＶＥＧＦ非依存的な経路であるＴＩＥ２の発現について検討を行った。００５を分化させたＴＤＥＣにおいてＴＩＥ２が発現していることが明らかになった。また、ＨＵＶＥＣにおいてもＴＩＥ２の発現が確認された（図１７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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