(57)【要約】【課題】長期間摂取しても副作用を伴うことなく、安全に使用することができ、特に便通改善などの用途に有用な、腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物及び方法を提供する。【解決手段】ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するためキチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を用いる。更に、ラフィノース及びラクチュロースを用いることが好ましい。本発明は、特に便通の改善に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物であって、キチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
更に、ラフィノース及びラクチュロースを含有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
更に、ゲル化剤及び酸味料を含有し、ゼリー状である請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
便通の改善のために用いられる請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
キチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖をヒト及び／又は動物に投与して、前記ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善することを特徴とする方法（医療行為を除く）。
【請求項８】
更に、ラフィノース及びラクチュロースを投与する請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記キチンオリゴ糖、前記ガラクトオリゴ糖、前記ラフィノース、及び前記ラクチュロースを、それらを含有し、更に、ゲル化剤及び酸味料を含有するゼリーの形態で投与する請求項７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト及び／又は動物の便通の改善する請求項７〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、便通改善などの用途に有用な、腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の健康志向の高まりから、乳酸菌やビフィズス菌を生きたまま腸に届けることを謳ったヨーグルトやサプリメントなどのプロバイオティクス製品や、腸内に存在しているいわゆる善玉菌の増殖や機能を選択的に高めることを謳った食物繊維やオリゴ糖などを含むプレバイオティクス製品など、腸内環境を整えることができる製品への消費者の要望は高い。特に高齢になると日頃の食事から腸内環境を整えることが難しくなり、腸内細菌叢のバランスを崩しやすくなるので、健康長寿社会に向けて腸内環境を整えることができる優れた製品の開発が一層望まれている。
【０００３】
一方、例えば、下記特許文献１には、腸内環境整備または抗酸化能整備、あるいはその両方を行う成分により、一般食品、保健機能食品または健康補助食品の有効成分の生体内利用効率を向上させる機能増強組成物が記載されている。そして、その腸内環境整備を行う成分として、ガラクトシルラクトース、ラクチュロース、α結合ガラクトオリゴ糖、キチンオリゴ糖、ラフィノース、ビートオリゴ糖などのオリゴ糖が挙げられている（特許文献１の段落００１６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３４１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１には、腸内環境整備を行う成分として挙げられた上記の各種オリゴ糖について、特定のオリゴ糖の組み合わせが腸内細菌叢のバランスを改善する作用効果に優れていることは示されていなかった。
【０００６】
本発明の目的は、長期間摂取しても副作用を伴うことなく、安全に使用することができ、特に便通改善などの用途に有用な、腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、特定のオリゴ糖の組み合わせが腸内細菌叢のバランスを改善する作用効果に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物及び方法を提供する。
［１］ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物であって、キチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を含有することを特徴とする組成物。
［２］更に、ラフィノース及びラクチュロースを含有する上記［１］記載の組成物。
［３］前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる上記［１］又は［２］記載の組成物。
［４］前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］更に、ゲル化剤及び酸味料を含有し、ゼリー状である上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の組成物。
［６］便通の改善のために用いられる上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の組成物。
［７］キチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖をヒト及び／又は動物に投与して、前記ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善することを特徴とする方法（医療行為を除く）。
［８］更に、ラフィノース及びラクチュロースを投与する上記［７］記載の方法。
［９］前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる上記［７］又は［８］記載の方法。
［１０］前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である上記［７］〜［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］前記キチンオリゴ糖、前記ガラクトオリゴ糖、前記ラフィノース、及び前記ラクチュロースを、それらを含有し、更に、ゲル化剤及び酸味料を含有するゼリーの形態で投与する上記［７］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］前記ヒト及び／又は動物の便通の改善する上記［７］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組成物もしくはその方法によれば、ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するためキチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を用いるので、長期間摂取しても副作用を伴うことなく、安全に使用することができる。特に、便通改善の用途に有用である。また、ラフィノース及びラクチュロースを更に組み合わせて用いて、より効果を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に使用されるキチンオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミンが直鎖状にβ−１，４結合したオリゴ糖類である。その由来、製法等について特に制限はなく、例えばエビやカニ等の甲殻類の殻に含まれるキチンを酸や酵素を用いて部分加水分解することにより得ることができる。その加水分解の処理の後には、更にイオン交換樹脂を用いて、脱アセチル化物を除去したり、活性炭等の吸着剤を充填したカラムクロマトグラフィーにより重合度別に分画するなどの精製を行ってもよい。
【００１１】
また、キチンオリゴ糖は、キチンを脱アセチル化して得られたキトサンを酸や酵素を用いて部分加水分解することによりキトサンオリゴ糖を得、それをアセチル化することによっても得ることができる。この場合、種々の重合度の混合物であるキトサンオリゴ糖、及び重合度別に精製されたキトサンオリゴ糖のいずれをアセチル化してもよい。
【００１２】
なお、キチンオリゴ糖は、重合度の増加と共に溶解度が低下するが、部分的に脱アセチル化してその溶解性を改良することもできる。この場合、脱アセチル化の手段としては酵素法、アルカリ法などが挙げられ、特に制限はない。また味質の観点からは、脱アセチル化度は７０％以下に抑えることが望ましい。
【００１３】
本発明に使用されるキチンオリゴ糖は、単一の糖鎖長のものでもよく、各糖鎖長の混成物のものでもよく、各糖鎖長の混成物のものから更に所定の糖鎖長のものを分離精製して用いてもよい。糖鎖長は２〜１０であることが好ましく、より好ましくは４〜７である。また、複数の糖鎖長のキチンオリゴ糖の混成物を用いる場合は、糖鎖長２〜１０のものが好ましくは１０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上含むことが好ましい。
【００１４】
このように生産されたキチンオリゴ糖は、食品に準じてヒト及び／又は動物が安全に摂取することができるものである。典型的には単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％のものなどを用いることができる。また、「ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）等の市販のものを用いてもよい。
【００１５】
本発明において使用されるガラクトオリゴ糖は、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（Ｇａｌ：ガラクトース残基、Ｇｌｃ：グルコース残基、ｎ：１〜４の整数）で表されるオリゴ糖類である。その由来、製法等について特に制限はなく、例えば乳糖にバチルス・サーキュランス等微生物由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させてそのガラクトシル基転移反応によって生産性よく得ることができる。ガラクトオリゴ糖は単一の糖鎖長のものでもよく、各糖鎖長の混成物のものでもよく、各糖鎖長の混成物のものから更に所定の糖鎖長のものを分離精製して用いてもよい。このように生産されたガラクトオリゴ糖は、食品に準じてヒト及び／又は動物が安全に摂取することができるものである。典型的には単糖類及び乳糖の合計の含有量が固形分当たり２０〜５０質量％であって、ガラクトオリゴ糖の含有量が固形分当たり５０〜８０質量％のものなどを用いることができる。また、「オリゴメイト５５Ｎ」（商品名、ヤクルト薬品工業株式会社製）、「オリゴメイト５５ＮＰ」（商品名、ヤクルト薬品工業株式会社製）等の市販のものを用いてもよい。
【００１６】
本発明において使用されるラフィノースは、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、及びＤ−フラクトースからなる３糖類のオリゴ糖である。その由来、製法等について特に制限はなく、例えばビート（甜菜）から温水抽出、非糖分の吸着除去、カラムクロマトグラフィーによる分離精製、濃縮、結晶化等の手段により天然のオリゴ糖として得ることができる。このように天然物から得られたラフィノースは、食品に準じてヒト及び／又は動物が安全に摂取することができるものである。典型的にはラフィノース以外の糖類の含有量が固形分当たり０〜９０質量％であって、ラフィノースの含有量が固形分当たり１０〜１００質量％のものなどを用いることができる。また、「明治ビートオリゴＦＰ」（商品名、株式会社明治フードマテリア製）、「スイートオリゴ」（商品名、日本甜茶製糖株式会社製）等の市販のものを用いてもよい。
【００１７】
本発明において使用されるラクチュロースは、Ｄ−ガラクトース及びＤ−フラクトースからなる２糖類のオリゴ糖である。その由来、製法等について特に制限はなく、例えば乳糖をアルカリ異性化して、必要に応じて未成分の乳糖成分の分離除去、カラムクロマトグラフィーによる分離精製、濃縮、結晶化等の手段により得ることができる。ラクチュロースは、加熱処理された牛乳や乳製品中に含まれ古くからの食経験もあり、食品に準じてヒト及び／又は動物が安全に摂取することができるものである。典型的には乳糖のほかラクチュロース以外の糖類の含有量が固形分当たり０〜４０質量％であって、ラクチュロースの含有量が固形分当たり３０〜１００質量％のものなどを用いることができる。また、「ミルクオリゴ糖ＭＬＳ−５０」（商品名、森永乳業株式会社製）、「ミルクオリゴ糖ＭＬＳ−３５」（商品名、森永乳業株式会社製）、「ミルクオリゴ糖ＭＬＰ−９５」（商品名、森永乳業株式会社製）、「ミルクオリゴ糖ＭＬＣ−９７」（商品名、森永乳業株式会社製）等の市販のものを用いてもよい。
【００１８】
本発明においては、ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するために、少なくともキチンオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を用いる。また、更に、任意にラフィノース及びラクチュロースを用いてもよい。
【００１９】
その実施形態としては、上記オリゴ糖からなる有効成分がヒト及び／又は動物の腸内に作用するように用いられればよく、特に制限はないが、例えば上記オリゴ糖からなる有効成分を含有する組成物の形態や、上記オリゴ糖からなる有効成分を投与する方法の形態をとり得る。この場合、ヒトを対象とした組成物又は方法であってもよく、家畜やペット等の動物を対象とした組成物又は方法であってもよい。
【００２０】
より具体的には、その組成物において、キチンオリゴ糖を固形分当たり０．０１〜５０質量％含有することが好ましく、固形分当たり０．１〜２０質量％含有することがより好ましい。また、ガラクトオリゴ糖を固形分当たり１０〜９９質量％含有することが好ましく、固形分当たり５０〜９９質量％含有することがより好ましい。また、任意にラフィノースを更に含有せしめてもよく、その場合には、ラフィノースを固形分当たり０．０１〜５０質量％含有することが好ましく、固形分当たり０．１〜２０質量％含有することがより好ましい。また、任意にラクチュロースを更に含有せしめてもよく、その場合には、ラクチュロースを固形分当たり０．０１〜５０質量％含有することが好ましく、固形分当たり０．１〜２０質量％含有することがより好ましい。
【００２１】
また、その方法において、キチンオリゴ糖を１日当たり０．００５〜１ｇ投与することが好ましく、１日当たり０．０１〜０．５ｇ投与することがより好ましい。また、ガラクトオリゴ糖を１日当たり０．１〜２０ｇ投与することが好ましく、１日当たり１〜１０ｇ投与することがより好ましい。また、任意にラフィノースを更に投与してもよく、その場合には、ラフィノースを１日当たり０．００５〜１ｇ投与することが好ましく、１日当たり０．０１〜０．５ｇ投与することがより好ましい。また、任意にラクチュロースを更に投与してもよく、その場合には、ラクチュロースを１日当たり０．００５〜１ｇ投与することが好ましく、１日当たり０．０１〜０．５ｇ投与することがより好ましい。
【００２２】
上記組成物は、経口的に摂取するように用いられることが好ましい。そのため必要に応じて、経口摂取用として許容される基材や担体を用いて、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゼリー状剤等の経口摂取用組成物の形態とすることができる。その場合、剤形形態によっても異なるが、上記オリゴ糖からなる有効成分の合計として組成物の全体中に固形分当たり１〜１００質量％含有していることが好ましく、固形分当たり１０〜１００質量％含有していることがより好ましく、固形分当たり２０〜１００質量％含有していることが最も好ましい。また、その摂取量は、上記オリゴ糖からなる有効成分の合計として１日当たり０．１〜２０ｇ程度であることが好ましく、１〜１０ｇ程度であることがより好ましい。摂取量が０．１ｇ未満では改善の効果が期待できず、２０ｇを超えると下痢などの症状が出る可能性があるため好ましくない。
【００２３】
上記組成物の使用形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用健康食品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメントなど各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。また、各種の飲食品と組み合わせて使用されることも可能である。特に、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、食物繊維、糖アルコール、乳酸菌、ビフィズス菌、酵母、麹菌、又はこれらを含有もしくは配合した飲食品などと組み合わせて使用されることが可能である。これによれば、本発明の作用効果をより有効に発揮させることができる。
【００２４】
一方、上記組成物の好ましい使用形態の１つは、ゼリーの形態である。より具体的には、上記オリゴ糖からなる有効成分に加え、ゲル化剤及び酸味料を含有してなる、例えばゼリー状組成物あるいはゼリー食品の形態である。これによれば、食感や風味が良好なゼリーの形態とすることで、日常的な摂取が容易となる。
【００２５】
ゲル化剤としては、特に制限はなく、例えば増粘多糖類などが挙げられ、より具体的には、マンナン、カラギーナン、ジェランガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、タマリンド種子ガム、寒天、コンニャクイモ抽出物、ゼラチンなどが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、あるいは２種類以上を併用して用いてもよい。このうち、カラギーナン、キサンタンガム、寒天、コンニャクイモ抽出物からなる群から選ばれた１種又は２種以上を用いることが好ましく、カラギーナンと寒天を併用することがより好ましい。
【００２６】
酸味料は、特に制限はなく、例えば、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、アスコルビン酸、酒石酸、及びそれらの塩などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、あるいは２種類以上を併用して用いてもよい。
【００２７】
上記ゼリーは、例えば、ゲル化剤を含むゼリー原料を水に添加し、そのゲル化剤を加熱溶解してゼリー原料液を調製し、更に酸味料を添加してｐＨを調整した後、溶融状態で包装容器に充填し、ヒートシールにより容器の開口部を密封したうえ、容器内で冷却してゲル化させる等により製造することができる。このとき、上記オリゴ糖からなる有効成分を添加するタイミングは特に問わないが、ゲル化剤を溶解する際に一緒に添加すれば効率よく製造することができるので好ましい。
【００２８】
上記ゼリーには、上記以外の成分として、果汁、ビタミン類、ミネラル類、食物繊維、多糖類、上記オリゴ糖からなる有効成分以外のオリゴ糖類、タンパク質、ペプチド類、アミノ酸類、有機酸類、香料、着色料、呈味料等を適宜配合することができる。これらの添加順序や添加方法には特に制限はない。
【００２９】
上記ゼリーのｐＨは、ｐＨ３．０〜６．５であることが好ましく、ｐＨ３．８〜４．０であることがより好ましい。ｐＨがその範囲を超えると、微生物の繁殖等、食品衛生上の危険が増すため、好ましくない場合がある。
【００３０】
上記ゼリーは、スティック状包装容器に充填されてなるものであることがより好ましい。これによれば、スティック状包装容器の封を開け、内容物のゼリーをスティック状包装容器から押し出ながら口に入れて摂取するなど、使用感が良好なゼリーの形態とすることができる。これにより、日常的な摂取がより容易となる。
【００３１】
スティック状包装容器としては、食品用包装材として使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、三方シール包装やピロー包装等の包装形態が挙げられる。三方シール包装とは、包装材を二つ折りして合わせた三方をシールして袋にする際に、折った縁がシールされていない包装形態である。また、ピロー包装とは、筒状の包装材を上下方向また水平方向に繰り出す過程で内容物を筒状の包装材内に挿入してその区切り部分をシールして袋にする包装形態である。これらは、液体、粉体、粘体、粒体の食品等の包装に広く用いられている。シールには、包装材の加熱溶着によるヒートシールの形態を用いることができる。包装材の材質としては、アルミ、ナイロン素材やプラスチック類のポリエチレンやポリプロピレン等が挙げられる。また、携帯及び喫食の容易性等の観点から、その大きさは縦１０〜１６ｃｍ、横１〜５ｃｍ、内容量１０〜５５ｇ程度であることが好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
＜試験例１＞
表１に示すオリゴ糖の各配合について、ヒト糞便中の細菌叢に与える影響を調べた。具体的には、培地に各オリゴ糖を添加して糞便を嫌気液体培養し、その培養後の糞便中の細菌叢について１６ＳｒＲＮＡ配列データを利用した菌叢解析を行った。
【００３４】
【表１】
2017178929.tif 000002
【００３５】
なお、キチンオリゴ糖含有食品素材としては「ＮＡ−ＣＯＳ−Ｙ」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）、ガラクトオリゴ糖含有食品素材としては「オリゴメイト５５Ｎ」（商品名、ヤクルト薬品工業株式会社製）、ラフィノース含有食品素材としては「明治ビートオリゴＦＰ」（商品名、株式会社明治フードマテリア製）、ラクチュロース含有食品素材としては「ミルクオリゴ糖ＭＬＳ−５０」（商品名、森永乳業株式会社製）、をそれぞれ用いた。また、後述の製造例等においても同様にこれらの食品素材を使用した。
【００３６】
糞便の嫌気液体培養及び菌叢解析は以下のようにして行った。
【００３７】
（糞便の嫌気液体培養）
ヒト糞便を排便後直ちに嫌気条件下に氷冷し、２４時間以内のものを糞便試料として使用した。
【００３８】
嫌気性培地としては、ＥＧ培地（光岡知足，腸内細菌の世界，叢文社，１９９０）からブドウ糖、可溶性デンプン、消泡剤、寒天を抜き、血液の代わりにヘミンを添加した液体培地（以下、「ＥＧ液体培地」という。）（下記表３参照）を使用した。
【００３９】
上記表１に示した各オリゴ糖含有食品素材を少量の蒸留水に溶解し、３０ｍＬずつ分注したＥＧ液体培地に各オリゴ糖の配合量が表２に示す量になるように添加し、１０５℃、２０分間滅菌した。
【００４０】
【表２】
2017178929.tif 000003
【００４１】
滅菌後、流水で急冷しアスコルビン酸・システイン液（光岡知足，乳酸菌の細菌学，臨床検査，１１，１１６３，１９７４）（下記表３参照）０．３ｍＬを添加した。
【００４２】
一方、糞便試料１ｇを嫌気性希釈液（光岡知足，乳酸菌の細菌学，臨床検査，１１，１１６３，１９７４）（下記表３参照）９ｍＬに懸濁し、この糞便液を上記オリゴ糖入りＥＧ液体培地（およそ３０ｍＬ）に１ｍＬずつ接種し、嫌気ジャーで３７℃、６日間培養した。
【００４３】
【表３】
2017178929.tif 000004
【００４４】
（菌叢解析）
培養後、３２００ｒｐｍ、３０分間の遠心により沈殿物を回収した。その糞便サンプルからＤＮＡ抽出キット「NucleoSpin Soil」（MACHERY-NAGEL社）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ精製キット「AMPure XP」（ベックマン コールター社）を使用して精製処理を実施した。
【００４５】
上記ＤＮＡのおよそ１０ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、微生物ゲノムの１６ＳｒＲＮＡ（ｖ３−ｖ４領域）配列を増幅するための共通配列が付与された増幅プライマー（配列番号１，２）を用いて次の条件でＰＣＲ増幅を行なった。
【００４６】
・１ｓｔＰＣＲ増幅条件
（９４℃，６０秒）→「（９８℃，１０秒）→（５０℃，１５秒）→（６８℃，１５秒）」×２８サイクル→（４℃，保持）→終了
【００４７】
増幅産物は、ＤＮＡ精製キット「AMPureXP」（ベックマン・コールター社）を使用して精製処理を実施した。
【００４８】
上記１６ＳｒＲＮＡ増幅産物を鋳型とし各検体に固有のインデックス配列付きプライマーを用いて次の条件でＰＣＲ増幅を行なった。
【００４９】
・２ｎｄＰＣＲ増幅条件
（９４℃，６０秒）→「（９８℃，１０秒）→（５０℃，１５秒）→（６８℃，１５秒）」×８サイクル→（４℃，保持）→終了
【００５０】
増幅産物は、ＤＮＡ精製キット「AMPure XP」（ベックマン コールター社）を使用して精製処理を実施した。
【００５１】
・シークエンス解析
オリゴ糖の配合ごとに４検体分の上記検体インデックス付１６ＳｒＲＮＡ増幅産物を混合したうえ、高速シークエンス解析装置「MiSeqシステム」（Illumina社）によるシークエンス解析に供して、それぞれの検体について、およそ９０万〜２３０万リード（２５０塩基長）分の配列データを取得した。
【００５２】
・データ解析
上記配列データを菌叢解析パイプライン（解析エンジン：QIIME (Caporaso J. G., et al., Nat. Methods(2010) 7:335)）に供し、各検体の細菌叢を解析した。
【００５３】
結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
2017178929.tif 000005
【００５５】
その結果、ガラクトオリゴ糖のみの配合１に比べ、キチンオリゴ糖を併用した配合２のほうが、乳酸菌とビフィズス菌の菌叢割合が増加した。ガラクトオリゴ糖にラフィノースを併用した配合３や、ガラクトオリゴ糖にラクチュロースを併用した配合４では、ガラクトオリゴ糖のみの配合１に比べ、乳酸菌の菌叢割合が増加したが、ビフィズス菌の菌叢割合が逆に低下した。なお、表４中に示した、フィーカリ菌(Faecalibacterium)はヒト腸内の最大の常在菌叢を形成する細菌群であり、コプリ菌(Prevotella copri)は関節リウマチ患者で豊富に検出される細菌である。
【００５６】
＜製造例１＞
表５に示す配合で、１包あたりの内容量２０ｇのスティック包装入りオリゴ糖含有ゼリーを調製した。
【００５７】
【表５】
2017178929.tif 000006
【００５８】
＜試験例２＞
製造例１で調製したスティック包装入りオリゴ糖含有ゼリーを、日頃から便秘や便秘気味であると訴える人に供して、３０日間自由に使用してもらい、３０日後に便秘の改善の状況についてアンケートを実施した。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
2017178929.tif 000007
【００６０】
その結果、全体の６８．１％の人が「改善した」あるいは「やや改善した」と評価した。
【００６１】
＜試験例３＞
製造例１で調製したオリゴ糖含有ゼリーを、４０代１人、５０代１人、６０代２人、７０代１人の計５人の人に、１日１包３０日間摂取してもらい、摂取前後の糞便を採取して、その糞便中の細菌叢について１６ＳｒＲＮＡ配列データを利用した菌叢解析を行った。
【００６２】
菌叢解析は、糞便サンプルからＤＮＡ抽出キットとして「NucleoSpin Microbial DNA」（MACHERY-NAGEL社）を使用し、１ｓｔＰＣＲ増幅の鋳型ＤＮＡ量として、ＤＮＡ濃度が１ｎｇ／μＬに満たない場合には１０μＬの使用液量でＰＣＲ増幅を行った以外、その他は試験例１と同様にして行なった。
【００６３】
また、取得した配列データについてRarefaction解析の手法を用いて多様性の評価を行った。Rarefaction解析は、サンプル中に存在する菌の多様性を調べる解析手法であり、リード数を段階的に増加させたときのOTUs（Operational Taxonomic Units）の数をプロットし、サンプル中に存在する菌の多様性を調べる解析手法である。解析インデックスとしてはShannon 指数を採用した。
【００６４】
菌叢解析の結果を表７に、多様性評価の結果を表８に、それぞれ示す。
【００６５】
【表７】
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【００６６】
【表８】
2017178929.tif 000009
【００６７】
その結果、ガラクトオリゴ糖、キチンオリゴ糖、ラフィノース、ラクチュロースを配合したゼリーを摂取した５人とも、いずれも摂取前に比べて、ビフィズス菌（Bifidobacterium）の菌叢割合が糞便中に増加した。また、５０代の人以外において細菌叢の多様性が大きくなった。
【００６８】
＜試験例４＞
試験例３で被験者となった４０代１人と６０代Ａ１人の人には、試験例３の試験終了後にも、日常の生活において製造例１で調製したオリゴ糖含有ゼリーを断続的に摂取してもらい、試験例３の試験終了からおよそ１年後に、更に本試験を行った。
【００６９】
試験では、これらの被験者に、上記試験例で使用したガラクトオリゴ糖含有食品素材６．１ｇ（オリゴ糖として２．５ｇ）とキチンオリゴ糖含有食品素材０．１ｇ（オリゴ糖として０．０５ｇ）とを１日１回３０日間併用摂取してもらい、その摂取後の糞便を採取して、その糞便中の細菌叢について１６ＳｒＲＮＡ配列データを利用した菌叢解析を行った。菌叢解析は試験例３と同様にして行った。
【００７０】
また、上記のガラクトオリゴ糖とキチンオリゴ糖との併用摂取につづけて、ガラクトオリゴ糖含有食品素材６．１ｇ（オリゴ糖として２．５ｇ）のみを１日１回３０日間単独摂取してもらい、その摂取後の糞便を採取して、同様に菌叢解析を行った。
【００７１】
結果を表９に示す。
【００７２】
【表９】
2017178929.tif 000010
【００７３】
その結果、ガラクトオリゴ糖とキチンオリゴ糖の併用摂取によって、４０代１人と６０代Ａ１人の人のいずれにおいても、試験例３の試験終了時より以上に、ビフィズス菌（Bifidobacterium）の菌叢割合が糞便中に増加した。これは、これらの被験者には、試験例３の試験終了後にも、日常の生活において製造例１で調製したオリゴ糖含有ゼリーを断続的に摂取してもらっていたことが大きく寄与しているものと考えられた。しかしながら、ガラクトオリゴ糖の単独摂取に代えると、その１日１回３０日間の単独摂取によって、４０代１人と６０代Ａ１人の人のいずれにおいても、ビフィズス菌の菌叢割合が低下した。これは、キチンオリゴ糖とガラクトオリゴ糖とは、それらが協同的にに腸内細菌叢のバランスを改善する作用効果を発揮することからであると考えられた。
【００７４】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：１６ＳｒＲＮＡ（ｖ３−ｖ４領域）のＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマー；341Fprimer（5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’）
配列番号２：１６ＳｒＲＮＡ（ｖ３−ｖ４領域）のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー；806Rprimer（5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月15日(2017.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善するための組成物であって、キチンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラフィノース、及びラクチュロースを含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
更に、ゲル化剤及び酸味料を含有し、ゼリー状である請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
便通の改善のために用いられる請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
キチンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラフィノース、及びラクチュロースをヒト及び／又は動物に投与して、前記ヒト及び／又は動物の腸内細菌叢のバランスを改善することを特徴とする方法（医療行為を除く）。
【請求項７】
前記キチンオリゴ糖が天然キチンの分解物の形態で含まれる請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記キチンオリゴ糖が、天然キチンの分解物の形態で含まれており、単糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン）の含有量が固形分当たり３０〜５０質量％、２糖類（Ｎ−アセチルキトビオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、３糖類（Ｎ−アセチルキトトリオース）の含有量が固形分当たり１０〜３０質量％、４糖類（Ｎ−アセチルキトテトラオース）の含有量が固形分当たり５〜２５質量％、５糖類（Ｎ−アセチルキトペンタオース）の含有量が固形分当たり１〜２６質量％、６糖類（Ｎ−アセチルキトヘキサオース）の含有量が固形分当たり０．１〜１０質量％であって、全キチンオリゴ糖の含有量が固形分当たり３０〜１００質量％である請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記キチンオリゴ糖、前記ガラクトオリゴ糖、前記ラフィノース、及び前記ラクチュロースを、それらを含有し、更に、ゲル化剤及び酸味料を含有するゼリーの形態で投与する請求項６〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト及び／又は動物の便通の改善する請求項６〜９のいずれか１つに記載の方法。