(57)【要約】      （修正有）【課題】ＮＰＣ１変異体の安定性及びフォールディング効率の低下を改善する作用を有し、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療のために有用な医薬組成物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で示される化合物、そのエステル又は塩を有効成分として含有するニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤。2017105738.tif 000012（Ａｒ１〜Ａｒ３は各々独立に置換／非置換の芳香族基；Ｘ１はＣＨ２又はＯ；好ましくはＡｒ３が４−アルキル−１，２，４−トリアゾール−５−オン基）【選択図】図２Ｄ
2017105738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2017105738.tif 000009
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２及びＡｒ３は同一又は異なり、置換又は非置換の芳香族基を表し、Ｘ１はＣＨ２又は酸素原子を表す。）
で示される化合物、そのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有するニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
前記式（Ｉ）においてＡｒ３が次式（ａ）：
【化２】
2017105738.tif 000010
（式中、Ｒ１は置換又は非置換のＣ１−６−アルキル基を表す。）
で示される基で４位が置換されたフェニル基である請求項１記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
ニーマンピック病Ｃ型におけるＮＰＣ１変異体の機能異常を改善するためのファーマコロジカルシャペロンをスクリーニングする方法であって、ＮＰＣ１変異体の局在変化を画像解析により算出される特徴量によりファーマコロジカルシャペロン活性を評価する工程を含む方法。
【請求項４】
特徴量として真円に近いほど高い値を示す真円度（Circularity）を用いる請求項３記載の方法。
【請求項５】
特徴量として小さなコンパートメントに分布する割合を示す特徴量（smallObjRatio）及び画像あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度（GFPInt）を組み合わせる請求項４記載の方法。
【請求項６】
次式（Ｉ−１）：
【化３】
2017105738.tif 000011
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２及びＸ１は請求項１記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義であり、Ｒ２はアセトアミド基、カルバモイル基又はシアノ基を表す。）
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＰＣ１変異体に対する安定化作用及びフォールディング効率の改善作用（ファーマコロジカルシャペロン作用）に基づく、ニーマンピック病Ｃ型予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質がその機能を果たすには、適切な三次元構造を形成し、かつ細胞内において適切なコンパートメントに局在する必要がある。この三次元構造の形成過程はフォールディングと呼ばれており、この過程の異常により三次元構造の形成が不完全となると、そのタンパク質の機能の低下あるいは機能の欠損につながる。一般に、膜タンパク質や分泌タンパク質においては、フォールディングは小胞体で起こる。これらのタンパク質はポリペプチド鎖が合成されると同時に小胞体の膜に埋め込まれ、ヘリックスやβシート構造等の二次構造を形成し、更に疎水性領域を内側に向けてコンパクトな構造を取ることで、三次元構造が形成される。その後、そのタンパク質が本来局在すべきコンパートメントへと輸送され、機能を果たす。
【０００３】
細胞内においては、ある割合でフォールディングに失敗するタンパク質が発生するため、小胞体にはそれらをチェック・排除する機構が存在する。この機構は品質管理機構と呼ばれる。品質管理機構のチェックを通過できないタンパク質は、小胞体にとどめられ、最終的に小胞体関連分解という過程により分解される。その結果、本来局在すべきコンパートメントに存在するタンパク質量が減少し、当該タンパク質が担う機能の低下あるいは欠損が起こる。
【０００４】
遺伝性疾患の中には、フォールディングの異常に起因する疾患が多く存在し、未だ有効な治療法が確立されていない疾患が多く存在する。本発明に関わるニーマンピック病Ｃ型もそのような疾患の一つである。ニーマンピック病Ｃ型の主な原因は、膜タンパク質ＮＰＣ１をコードするｎｐｃ１遺伝子の変異であり、この疾患の原因の９５％を占める（非特許文献１）。代表的な変異であるＩ１０６１Ｔ（１０６１番イソロイシンのスレオニンに置換した変異体）において、この変異体はフォールディング効率及び安定性が低下しているため、品質管理機構に「不良品」として認識されることが報告されている（非特許文献２）。ＮＰＣ１は本来であれば小胞体からリソソーム・後期エンドソームに輸送されて、そこでコレステロールの細胞内輸送という機能を担う（非特許文献３）。しかしながら、ＮＰＣ１変異体は小胞体にとどまり（局在の異常）、最終的にプロテアソームにより分解される（安定性の低下）ため、リソソーム・後期エンドソームにおけるＮＰＣ１タンパク質の量が低下し、コレステロールの細胞内輸送機能の低下が起こる。このようなＮＰＣ１の機能欠損の結果、細胞内への脂質の蓄積や神経細胞の脱落といった、ニーマンピック病Ｃ型の病態につながる。
【０００５】
このニーマンピック病Ｃ型のようにフォールディング効率の低下に起因する疾患に対する治療法として、リガンドの「ファーマコロジカルシャペロン作用」の有用性が明らかになってきている（非特許文献４及び５）。この作用は、リガンドが変異タンパク質に直接結合することで起こる、標的タンパク質のフォールディング効率を改善する作用である。フォールディング効率が改善されることにより小胞体局在という局在異常が解消され、更に標的タンパク質の安定化により標的タンパク質の定常状態発現量が増加する。結果として、本来の局在を示す標的タンパク質が増加し、機能の回復が起こる。このようなファーマコロジカルシャペロン作用の治療法としての有用性は、バソプレシン受容体の変異により起こる腎性尿崩症（非特許文献６及び７）や、ＣＦＴＲの変異により起こる嚢胞性線維症（非特許文献８及び９）、リソソーム酵素の変異により起こるファブリー病やゴーシェ病などにおいて示されており（非特許文献１０及び１１、特許文献１）、治療薬としての可能性が期待されている。また、コレステロールの細胞内輸送異常により特徴付けられるニーマンピック病Ｃ型とは別に、スフィンゴミエリナーゼの機能欠損により起こるニーマンピック病Ａ及びＢ型においても、ファーマコロジカルシャペロンの有用性が期待されている（特許文献２）。
【０００６】
ニーマンピック病Ｃ型の治療法としては、ＮＰＣ１機能低下により起こるコレステロールやガングリオシド等の脂質の蓄積を改善する目的で、シクロデキストリンの静脈内投与やミグルスタットの経口投与に効果が認められることが分かってきている。シクロデキストリンはコレステロールに対する包接化合物として作用し、細胞内に溜まったコレステロールの排出を促進する（非特許文献１２）。ミグルスタットはグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤であり、ニーマンピック病Ｃ型で蓄積が認められるガングリオシドの蓄積を抑制する（非特許文献１３）。ミグルスタットは低分子化合物であるため、血液脳関門を通過し中枢神経に届くが、シクロデキストリンは分子量が大きいため、中枢神経症状に対する効果がないという問題がある。
【０００７】
これらの治療法がＮＰＣ１の機能低下ではなく、その結果起こる脂質の蓄積に対する対処法であるのに対し、ファーマコロジカルシャペロンはＮＰＣ１の機能低下を回復させるものであることから、より直接的な治療法となる可能性がある。また、低分子化合物であることから、中枢神経症状にも有効である可能性がある。
【０００８】
なお、ＮＰＣ１の機能低下を改善する目的で、現在研究段階にある治療法として、ヒストン脱アセチル化阻害剤（非特許文献１４）やリアノジン受容体アンタゴニスト（非特許文献１５）など、タンパク質のフォールディング環境を調節するような化合物も近年報告されている（非特許文献１６、特許文献３）。
【０００９】
本発明者らはこれまでに、オキシステロール誘導体がＮＰＣ１変異体に対するファーマコロジカルシャペロンとして作用することを見出し、その治療薬としての可能性を示した（非特許文献１７及び１８）。しかしながらその一方で、代謝安定性を考慮すると非ステロイド性の化合物が好ましい。
【００１０】
従来のＮＰＣ１に対するファーマコロジカルシャペロンの活性評価方法は、本発明者らが開発した下記の二種類の方法があった。すなわち、（１）ＧＦＰ融合タンパク質として培養細胞に発現させたＮＰＣ１変異体の局在変化を目視により評価する方法、あるいは、（２）リソソーム・後期エンドソームマーカーであるＬＡＭＰ１タンパク質との免疫共染色による評価方法であった（非特許文献１７及び１８）。（１）の方法は目視により各細胞毎に局在パターンを分類し、スコア化する方法である。この方法では主観を完全に排除することが難しいこと、スコア化に時間と労力がかかるため多数の画像を処理することが困難であるという問題があった。（２）の方法は免疫共染色を行い、ＮＰＣ１の局在とマーカーの局在パターンから共局在率を算出し、これを活性の指標とするものである。この方法は客観的ではあるものの、免疫共染色に時間がかかり（サンプル調製に約６時間必要）、得られるデータのばらつきが大きく、スクリーニングには適さない方法であった。
【００１１】
また、本発明に用いられるイトラコナゾールは、経口抗真菌剤として既に日本国内で承認されており、ポサコナゾールも海外では承認され、国内でも臨床試験中と、ヒトでの安全性が担保されている。イトラコナゾール及びポサコナゾールについては、種々の誘導体、及びそれらの製造法も報告されているが（特許文献４及び５）、ニーマンピック病Ｃ型については何ら言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０１０−５２３１６０号公報
【特許文献２】特表２００７−５１４６６１号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１１００７号公報
【特許文献４】特開昭５５−１１５７８号公報
【特許文献５】特表平９−５００６５８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ory DS (2000) Niemann-Pick type C: a disorder of cellular cholesterol trafficking. Biochim Biophys Acta 1529: 331-339
【非特許文献２】Gelsthorpe ME, Baumann N, Millard E, Gale SE, Langmade SJ, Schaffer JE & Ory DS (2008) Niemann-Pick type C1 I1061T mutant encodes a functional protein that is selected for endoplasmic reticulum-associated degradation due to protein misfolding. J Biol Chem 283: 8229-8236
【非特許文献３】Kwon HJ, Abi-Mosleh L, Wang ML, Deisenhofer J, Goldstein JL, Brown MS & Infante RE (2009) Structure of N-terminal domain of NPC1 reveals distinct subdomains for binding and transfer of cholesterol. Cell 137: 1213-1224
【非特許文献４】Loo TW & Clarke DM (2007) Chemical and pharmacological chaperones as new therapeutic agents. Expert Rev Mol Med 9: 1-18
【非特許文献５】Morello JP, Petaejae-Repo UE, Bichet DG & Bouvier M (2000) Pharmacological chaperones: a new twist on receptor folding. Trends Pharmacol Sci 21: 466-469
【非特許文献６】Morello JP, Salahpour A, Laperriere A, Bernier V, Arthus MF, Lonergan M, Petaejae-Repo U, Angers S, Morin D, Bichet DG & Bouvier M (2000) Pharmacological chaperones rescue cell-surface expression and function of misfolded V2 vasopressin receptor mutants. J Clin Invest 105: 887-895
【非特許文献７】Bernier V, Morello J-P, Zarruk A, Debrand N, Salahpour A, Lonergan M, Arthus M-F, Laperriere A, Brouard R, Bouvier M & Bichet DG (2006) Pharmacologic chaperones as a potential treatment for X-linked nephrogenic diabetes insipidus. J Am Soc Nephrol 17: 232-243
【非特許文献８】Sampson HM, Robert R, Liao J, Matthes E, Carlile GW, Hanrahan JW & Thomas DY (2011) Identification of a NBD1-Binding Pharmacological Chaperone that Corrects the Trafficking Defect of F508del-CFTR. Chem Biol 18: 231-242
【非特許文献９】Lukacs GL & Verkman AS (2012) CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends Mol Med 18: 81-91
【非特許文献１０】Parenti G (2009) Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med 1: 268-279
【非特許文献１１】Fan J-Q (2003) A contradictory treatment for lysosomal storage disorders: inhibitors enhance mutant enzyme activity. Trends Pharmacol Sci 24: 355-360
【非特許文献１２】Davidson CD, Ali NF, Micsenyi MC, Stephney G, Renault S, Dobrenis K, Ory DS, Vanier MT & Walkley SU (2009) Chronic cyclodextrin treatment of murine Niemann-Pick C disease ameliorates neuronal cholesterol and glycosphingolipid storage and disease progression. PLoS ONE 4: e6951
【非特許文献１３】Patterson MC, Vecchio D, Prady H, Abel L & Wraith JE (2007) Miglustat for treatment of Niemann-Pick C disease: a randomised controlled study. Lancet Neurol 6: 765-772
【非特許文献１４】Helquist P, Maxfield FR, Wiech NL & Wiest O (2013) Treatment of Niemann-pick type C disease by histone deacetylase inhibitors. Neurotherapeutics 10: 688-697
【非特許文献１５】Yu T, Chung C, Shen D, Xu H & Lieberman AP (2012) Ryanodine receptor antagonists adapt NPC1 proteostasis to ameliorate lipid storage in Niemann-Pick type C disease fibroblasts. Hum Mol Genet 21: 3205-3214
【非特許文献１６】Balch WE, Morimoto RI, Dillin A & Kelly JW (2008) Adapting proteostasis for disease intervention. Science 319: 916-919
【非特許文献１７】Ohgane K, Karaki F, Dodo K & Hashimoto Y (2013) Discovery of oxysterol-derived pharmacological chaperones for NPC1: implication for the existence of second sterol-binding site. Chem Biol 20: 391-402
【非特許文献１８】Ohgane K, Karaki F, Noguchi-Yachide T, Dodo K & Hashimoto Y (2014) Structure-activity relationships of oxysterol-derived pharmacological chaperones for Niemann-Pick type C1 protein. Bioorg Med Chem Lett 24: 3480-3485
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ＮＰＣ１変異体の安定性及びフォールディング効率の低下を改善する作用を有し、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療のために有用な医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは前記の課題を解決すべく、ＮＰＣ１変異体のフォールディング効率の低下に起因する局在異常の修正活性を指標とする、画像解析手法に基づくスクリーニング方法を構築し、前記のファーマコロジカルシャペロン作用を有する化合物を鋭意探索した。その結果、ファーマコロジカルシャペロン作用を有することが報告されているオキシステロール誘導体とは異なり、ステロイド骨格を有しない特定の含窒素複素環化合物がＮＰＣ１変異体に対して所望のフォールディング効率向上活性及び安定化作用を有しており、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）：
【化１】
2017105738.tif 000003
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２及びＡｒ３は同一又は異なり、置換又は非置換の芳香族基を表し、Ｘ１はＣＨ２又は酸素原子を表す。）
で示される化合物、そのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有するニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤。
（２）前記式（Ｉ）においてＡｒ３が次式（ａ）：
【化２】
2017105738.tif 000004
（式中、Ｒ１は置換又は非置換のＣ１−６−アルキル基を表す。）
で示される基で４位が置換されたフェニル基である前記（１）に記載の予防及び／又は治療剤。
（３）ニーマンピック病Ｃ型におけるＮＰＣ１変異体の機能異常を改善するためのファーマコロジカルシャペロンをスクリーニングする方法であって、ＮＰＣ１変異体の局在変化を画像解析により算出される特徴量によりファーマコロジカルシャペロン活性を評価する工程を含む方法。
（４）特徴量として真円に近いほど高い値を示す真円度（Circularity）を用いる前記（３）に記載の方法。
（５）特徴量として小さなコンパートメントに分布する割合を示す特徴量（smallObjRatio）及び画像あたりの平均ＧＦＰ蛍光強度（GFPInt）を組み合わせる前記（４）に記載の方法。
（６）次式（Ｉ−１）：
【化３】
2017105738.tif 000005
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２及びＸ１は前記（１）に記載の前記式（Ｉ）中の定義と同義であり、Ｒ２はアセトアミド基、カルバモイル基又はシアノ基を表す。）
で示される化合物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤は、安定性の低下、フォールディング効率の低下、並びに局在の異常を示すＮＰＣ１変異体に対して、安定性を向上し、フォールディング効率を改善し、そして局在異常を修正する作用を有する。更に、本発明における有効成分は、低分子化合物であるため、中枢神経症状にも有効である可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１ＡはＮＰＣ１変異体に対してファーマコロジカルシャペロンとして作用する低分子化合物をスクリーニングする方法について、実施例１に記載のスクリーニング方法の概略、及びファーマコロジカルシャペロン作用によるＮＰＣ１変異体の局在変化の例と、その定量のために用いた特徴量の定義の例を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはＮＰＣ１変異体に対してファーマコロジカルシャペロンとして作用する低分子化合物をスクリーニングする方法について、実施例１において陽性対照群として用いたステロイド性ファーマコロジカルシャペロンの構造と、そのリソソーム・後期エンドソームマーカーＬＡＭＰ１との共局在定量法に基づくＥＣ５０値を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは図１Ａに概略を示したスクリーニング方法により陽性対照群を評価した結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは本発明のスクリーニング方法を用いて既承認薬をスクリーニングした実施例２の結果を示すものであり、画像解析により得られた各特徴量の分布をサンプル及び陽性対照群毎にしめしたグラフである。活性指標となるCircularity（真円に近いほど高い値を示す真円度、Circと略する）、smallObjRatio及びGFPIntが陽性対照化合物mo56HCの濃度依存的に増加する様子が見て取れる。また、Circがデータのばらつきが少なく、最も優れていることも分かる。
【図２Ｂ】図２Ｂは実施例２のスクリーニング結果を、クラスタリング結果とともにCircとCellAreaの二次元に投影したプロットしたグラフである。クラスタリングにより活性ありと判定された化合物は白抜きの四角でプロットし、かつ陽性対照群でないものは太枠白抜きの四角で示して数字を振ってある。
【図２Ｃ】図２Ｃは図２Ｂに示されたデータを陰性対照群、陽性対照群（各濃度）及び被検化合物群に分け、クラスタリング結果とともに示したグラフである。図２Ｂと同様に縦軸は活性の指標Circ、横軸は細胞毒性の指標CellAreaとし、円のサイズはまた別の活性の指標であるsmallObjRatioの値を反映している。更にグレーで塗りつぶした丸は活性有りのクラスターに属する化合物を示す。ここでもヒット化合物には数字を振ってある。
【図２Ｄ】図２Ｄはヒット化合物の構造を示す。薬剤本来の作用(アゾール系抗真菌薬、キナーゼ阻害剤、ステロイドホルモン)に応じて枠を変えている。
【図２Ｅ】図２Ｅは被検化合物群のうち、ヒットした薬剤と本来の作用が同じであるが、活性がなかった薬剤の例を示す。
【図３】図３は本発明のスクリーニング方法により見出されたヒット化合物がＮＰＣ１変異体の局在に及ぼす作用を共焦点顕微鏡により調べた結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは陽性対照及びヒット化合物の濃度依存性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂはイトラコナゾールとその誘導体の活性評価結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃはイトラコナゾールとその誘導体の構造式及び活性評価結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは代表的なヒット化合物のＮＰＣ１変異体に対する安定化作用をフローサイトメトリーにより調べた結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂはイトラコナゾール及び関連化合物の濃度依存性を示す。縦軸は平均蛍光強度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、ＮＰＣ１の局在パターンの変化を画像解析手法により自動的に定量する方法を確立し、下記に示すようにスクリーニングに適用可能なレベルのスループット及びデータの質を実現した。
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を図に基づいて説明する。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法の概要を図１Ａに示す。本発明のスクリーニング方法においては、ＧＦＰ融合ＮＰＣ１のＩ１０６１Ｔ変異体を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を被検化合物で処理し、固定及び核染色後に画像を取得する。取得した画像から、ＧＦＰ融合ＮＰＣ１変異体の局在パターンの変化を画像解析手法により定量する。図１Ａの画像例に示すように、ファーマコロジカルシャペロン処理により、Ｉ１０６１Ｔ変異体の分布は小胞体局在からリソソーム・後期エンドソームに変化する。この局在変化により、Ｉ１０６１Ｔ変異体の細胞内での分布は、細胞内に広く網目状（小胞体）に分布していた状態から、小さなベシクル状の分布（リソソーム・後期エンドソーム）へと変化する。この変化を定量するために、画像解析により形状に関する特徴量であるCircularity (真円に近いほど高い値を示す真円度、場合により「Circ」と略する)と、小さなコンパートメントに分布する割合を示す特徴量(smallObjRatioと称する)を活性の指標として用いた。すなわち、ファーマコロジカルシャペロン処理により高いCirc値とsmallObjRatio値が得られると期待した。また、ファーマコロジカルシャペロンは変異により不安定化したＮＰＣ１タンパク質を安定化し、定常状態発現量を増加させる作用があることから、GFPInt(平均ＧＦＰ蛍光強度)もまた活性の指標として選択した。
【００２２】
特徴量Circは、面積を外周長の二乗で除し、円周率の４倍で更に除したものとして定義される形状に関する特徴量である。つまり、解析対象の形状が真円に近づくほど１に漸近し、線に近づくほど０に漸近する。ＮＰＣ１の局在パターンを撮影した画像をノイズリダクション・バックグラウンド補正した後、二値画像へと変換し、その後、この二値画像中に含まれるＮＰＣ１の局在する領域のそれぞれにおける当該特徴量の平均値を算出することで、Circを求めている。
【００２３】
smallObjRatioは、二値化画像におけるＮＰＣ１が局在する領域の面積のうち、特定の閾値以下の領域が占める割合である。閾値より小さいサイズが増えるほど１に近づく。ＮＰＣ１が小胞体局在する場合、その分布する面積は大きく、smallObjRatioの値が小さくなることが期待される。一方で、リソソーム・後期エンドソーム局在の場合は、面積の小さな領域が増えることとなる。
【００２４】
GFPIntは平均ＧＦＰ蛍光強度をあらわす。ファーマコロジカルシャペロン作用によりGFPIntは上昇することが期待される。また、細胞毒性が現れる場合は低下する傾向があり、更にスクリーニング対象の化合物が自家蛍光を示すかどうか判断する材料ともなる。
【００２５】
また、細胞毒性の指標としては、CellArea (細胞が占めるの面積)、NucNumber (核の数)、NucSize (平均核サイズ)などの特徴量を算出している。図１Ｂに示すような、本発明者らが過去に見出したステロイド性ファーマコロジカルシャペロンmo56HCを陽性対照として用いて、本スクリーニング方法の有効性を検証した。その結果、図１Ｃに示すように少ないばらつきで感度よく活性を検出できることを確認している。
【００２６】
図２Ａにスクリーニング結果を各特徴量毎に、被検化合物群(sample)と陽性対照群(mo56HCの各濃度)を分けてプロットしたものを示す。この図からもわかるように、ファーマコロジカルシャペロン作用の指標としては前記３種のうちCircularityが最も望ましい。特に、Circularity特徴量はわずかな局在パターンの変化を鋭敏にとらえることができており、データのばらつきもsmallObjRatioやGFPIntに比べて明確に小さい。
【００２７】
このCirc値単独でもスクリーニングは可能であるが、他の特徴量を考慮することで擬陽性が減るとともに活性化合物の検出感度が上がる。擬陽性の排除という観点では、smallObjRatioとGFPIntの二つの特徴量と組み合わせることが有効である。特にsmallObjRatioは感度及びデータのばらつきという点ではCircularityに劣るが、擬陽性が少ないという点でCircularityより優れている。また、GFPIntは感度が低くばらつきも大きいため、単独でスクリーニングに用いることはできないが、前記二つの特徴量と組み合わせることで更に擬陽性を減らすことができる。例えば、Circ値単独でヒット化合物を選択した場合、細胞毒性を示す化合物が擬陽性として含まれる。これは、細胞毒性により細胞の形状自体が丸まり、Circ値が上がるためである（後述の図２Ｂにおいて細胞毒性が現れている左下の領域では、Circ値が若干高くなる傾向にある）。また、プロテアソーム阻害剤として知られるボルテゾミブは、ＮＰＣ１変異体のプロテアソームによる分解を阻害するため、ＮＰＣ１変異体が分解されずに細胞内に蓄積し、細胞内に大きな球状の凝集体が形成される。Circ値はボルテゾミブ処理においても有意に上昇する。前者のような細胞毒性に由来する擬陽性は、CellArea (細胞毒性がでると値が小さくなる)やGFPInt (細胞毒性がでると低下する)の値を考慮することで除外が可能である。また、後者のような場合や細胞が丸まった場合は、ＮＰＣ１変異体がサイズの大きな球状に分布するため、smallObjRatioは低下する。よって、smallObjRatioも考慮することで除外が可能である。
【００２８】
前記のようにヒット化合物の選択には、複数の特徴量(特にCirc、smallObjRatio、GFPIntの組み合わせが最もよい)を考慮することが重要である。これら複数の特徴量に対して閾値を設定し、その全てを満たすものとしてヒット化合物を選択することができる。また、このようなヒット化合物の選択は、mo56HCを陽性対照として用いてクラスタリング手法により行うことも可能である。クラスタリング手法は、閾値を手動で設定することなく、各種特徴量の値を考慮して化合物群を類似するグループ毎に分類する方法であり、スクリーニングデータの初期解析(特に探索的なデータ解析)に有効である。陽性対照群と同じグループと判定されるものをヒット化合物として選択できる。
【００２９】
前記のスクリーニング方法を、医薬品として承認されている薬剤のスクリーニングに適用した結果を図２Ｂ及びＣに示す。クラスタリング手法、及び各特徴量(Circ、smallObjRatio、GFPInt)に対する閾値設定による方法を用いてヒット化合物の選択を行った。その結果、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ケトコナゾール、ラパチニブ、パゾパニブ及びプロゲステロンに所望の活性があることを見出した。これらヒット化合物の構造を図２Ｄに示す。６種のヒット化合物のうち、ポサコナゾール、イトラコナゾール及びケトコナゾールの３種はアゾール系抗真菌薬であり、ラパチニブ及びパゾパニブの２種はキナーゼ阻害剤、そしてプロゲステロンはステロイドホルモンである。このうち、プロゲステロンは本発明者らが過去に報告済みであることから（非特許文献１８）、残りの五種に関して以降の詳細な検討を進めた。
【００３０】
なお、図２Ｅに他のアゾール系抗真菌薬及びキナーゼ阻害剤のうち代表的なものの構造を示すが、スクリーニングした被検化合物群に含まれていたアゾール系抗真菌薬のうち残り９種、並びにキナーゼ阻害剤のうち残り６種には活性はみられなかった。この事実は、ＮＰＣ１変異体に対する作用がこれら薬剤の既知の活性(アゾール系抗真菌薬のもつCYP P450酵素阻害作用、あるいはキナーゼの阻害作用)を介したものではなく、これら薬剤が有する新規の作用であることを示している。
【００３１】
より詳細にＮＰＣ１変異体の局在変化を調べた結果を図３に示す。無処理(vehicle)においてはＮＰＣ１変異体が小胞体局在を示すのに対し、陽性対照として用いたmo56HC及びヒット化合物群はいずれもＮＰＣ１変異体のリソソーム・後期エンドソームへの明確な局在変化を起こすことが確認された。
【００３２】
更にこれらの化合物に関して、濃度依存性を確認したところ、特にイトラコナゾール及びポサコナゾールが強い活性を有することが明らかとなった。特にイトラコナゾールはＥＣ５０値が１μＭ以下と、ステロイド性ファーマコロジカルシャペロンに匹敵する良好な活性を示した。ラパチニブはＥＣ５０値が１０μＭ程度、ケトコナゾール及びパゾパニブは活性はみられるもののＥＣ５０値が３０μＭ以上と、前記２化合物に比べて活性が劣ることも分かった。よって、本発明の態様としてはイトラコナゾールが最も望ましい。
【００３３】
イトラコナゾールは肝臓において代謝を受け、主にヒドロキシイトラコナゾールへと代謝される。図４Ｂに示すように、この代謝物に関してもＥＣ５０値が約１μＭと良好な活性を有することを確認している。イトラコナゾールは経口抗真菌剤として臨床で用いられており、経口投与時の血中濃度は通常用いられる２００ｍｇ投与時において１μＭ程度に達する（ヤンセンファーマ株式会社  経口抗真菌剤イトリゾール（登録商標）の医薬品インタビューフォーム  改訂第１２版より）。また、その代謝物のヒドロキシイトラコナゾールも同程度の濃度で血中に存在する。このことは、イトラコナゾールが現在臨床で用いられる用量において、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤として有効である可能性を示唆している。
【００３４】
ファーマコロジカルシャペロンとして作用する化合物は、変異体タンパク質を安定化する作用も有することが知られている（非特許文献１７）。前記の化合物群がこのような安定化作用を有するか、フローサイトメトリーによりＧＦＰ融合ＮＰＣ１変異体のタンパク質量を定量することで確認を行った。その代表的な結果を図５Ａ及びＢに示す。結果、いずれの化合物も濃度依存的な安定化作用を示し、ファーマコロジカルシャペロンとして作用していることが確認された。
【００３５】
これまでにＮＰＣ１に対してファーマコロジカルシャペロンとして作用する化合物としては、本発明者らが見出した化合物が数例のみしか知られていない。ステロイド骨格を有さず、かつＥＣ５０値１μＭ以下という高活性な化合物は、本発明で提供されるイトラコナゾール及びヒドロキシイトラコナゾールが初めてである。
【００３６】
更に、前記式（Ｉ）においてＡｒ３で表される芳香族基が前記式（ａ）で示される基以外の基で置換された化合物もファーマコロジカルシャペロン作用を有することも確認された（図４Ｂ、４Ｃ）。
【００３７】
すなわち、本発明は、前記式（Ｉ）で示される化合物、そのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有するニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
【００３８】
前記式（Ｉ）で示される化合物としては、ファーマコロジカルシャペロン作用の点で、Ａｒ３が前記式（ａ）で示される基で４位が置換されたフェニル基である化合物が好ましい。
【００３９】
前記式（ａ）においてＲ１で表されるＣ１−６−アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基（１−メチルプロピル基）、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基が挙げられる。前記Ｃ１−６−アルキル基は、水酸基、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アミノ基、モノ又はジアルキルアミノ基、Ｃ１−６−アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基）、オキソ基、芳香族基、複素環基等から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。
【００４０】
置換されたＣ１−６−アルキル基としては、好ましくは１−エチル−２−ヒドロキシプロピル基が挙げられる。
【００４１】
前記Ｒ１で表されるＣ１−６−アルキル基の置換基としての芳香族基、及び前記式（Ｉ）においてＡｒ１、Ａｒ２又はＡｒ３で表される芳香族基としては、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等の芳香族炭化水素基；フリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基（例えば１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル基）、ピラゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基等の芳香族複素環基が挙げられる。
【００４２】
前記芳香族基は、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アシル基（例えばホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基等のＣ１−６−脂肪族アシル基；ベンゾイル基、トルオイル基等のアロイル基）、アシルオキシ基（例えばホルミルオキシ基、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基等のＣ１−６−脂肪族アシルオキシ基；ベンゾイルオキシ基、トルオイルオキシ基等のアロイルオキシ基）、水酸基、カルボキシル基、Ｃ１−６−アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基）、アセトアミド基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基、芳香族基（例えばフェニル基、前記式（ａ）で示される複素環基）等から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。
【００４３】
Ａｒ１としては、２，４−ジハロフェニル基（例えば２，４−ジフルオロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基）が好ましい。
【００４４】
Ａｒ２としては、トリアゾリル基（例えば１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル基）が好ましい。
【００４５】
Ａｒ３としては、４位が、前記式（ａ）で示される基、又はその他の極性官能基（例えばアセトアミド基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基）で置換されたフェニル基が好ましく、４位が前記式（ａ）で示される基で置換されたフェニル基が更に好ましい。
【００４６】
前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、前記式（Ｉ−１）で示される化合物は新規化合物である。
【００４７】
前記式（Ｉ）で示される化合物が水酸基を有する場合、当該水酸基はエステルに変換されていてもよい。
【００４８】
前記「エステル」は、（ａ）ポリエーテルエステル、（ｂ）リン酸エステル、（ｃ）ヘテロ環式エステル、（ｄ）アルカノエート及びアルケノエートエステル、（ｅ）アミノアルカノエート及び（ｆ）酸エステル及び（ｇ）硫酸エステルを包含する。
【００４９】
前記「ポリエーテルエステル」としては、例えば次式：
−Ｏ−ＣＯ−［ＣＨ（Ｒ３）］ｓ−［ＯＣＨ（Ｒ３）ＣＨ（Ｒ３）］ｔ−Ｒ４
（式中、Ｒ３同士は同一でも異なっていてもよく、それぞれは水素原子又はＣ１−６−アルキル基を表し、ｓは１〜６の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは１であり；ｔは１〜６の整数、好ましくは１〜３の整数、更に好ましくは２又は３であり、Ｒ４はＲ３又は［ＣＨ（Ｒ３）］ｓ−ＣＯ２−Ｒ３であり、好ましくはＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又はＣＨ２ＣＯ２ＣＨ３である。）
で示されるポリエーテルエステルが挙げられる。
【００５０】
前記「リン酸エステル」としては、例えば次式：
−Ｏ−（ＣＯ）ｚ−［ＣＨ（Ｒ３）］ｎ−（Ｏ）ｍ−ＰＯ−（ＯＷ）２
（式中、Ｒ３は前記と同義であり、ｚは０又は１であり、ｎは０〜６の整数であり、ｍは０又は１であり、Ｗは水素原子、ＣＨ２Ａｒ（式中、Ａｒは前記芳香族基を表す。）又は２−ヒドロキシフェニル基である。）
で示されるリン酸エステルが挙げられる。
【００５１】
前記「ヘテロ環式エステル」としては、例えば次式：
−Ｏ−ＣＯ−［ＣＨ（Ｒ３）］ｎ−Ｒ５
（式中、Ｒ３及びｎは前記と同義であり、Ｒ５は窒素原子を介して結合している５員又は６員の含窒素複素環基、例えば１−ピロリジニル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、１−ピペラジニル基を表す。）
で示されるヘテロ環式エステルが挙げられる。
【００５２】
前記「アルカノエート及びアルケノエートエステル」とは、必要に応じて水酸基又はエーテル部分によって置換された直鎖又は枝分かれ鎖アルカノエート又はアルケノエート基あるいはこのようなアルカノエート又はアルケノエートの混合物を意味する。好ましいアルカノエートエステルは、アセテート〜デカノエート（炭素数２〜１０のアルカン酸とのエステル）、特にアセテート〜ブタノエートを包含する。好ましいアルケノエートエステルは、Ｃ１０〜Ｃ２０アルケノエート（炭素数１０〜２０のアルケン酸とのエステル）である。
【００５３】
前記「アミノアルカノエート」は、天然又は非天然アミノ酸、好ましくは当業者に周知な従来の保護基によって保護されたアミノ基を有するアミノ酸とのエステルを包含する。
【００５４】
前記「酸エステル」としては、例えば次式：
−Ｏ−ＣＯ−［Ｃ（Ｒ３）（Ｒ３）］ｋ−ＣＯＯＨ
（式中、Ｒ３は前記と同義であり、ｋは１〜８の整数である。）
で示される酸エステルが挙げられる。
【００５５】
前記式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。また、前記式（Ｉ）で示される化合物がフェノール性水酸基、カルボキシル基等の酸性置換基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リジン塩、アルギニン塩として用いることもできる。
【００５６】
前記式（Ｉ）で示される化合物の多くは、特許文献４及び５に製造方法が記載されており、当該特許文献に記載の方法に従って製造することができる。前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、前記式（Ｉ−１）で示される化合物は新規化合物であるが、前記特許文献に記載の方法に準じて製造することができる。また、前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、イトラコナゾール及びポサコナゾールは市販されており、これらの市販品をそのまま、又は必要に応じて精製して本発明の有効成分として用いることができる。
【００５７】
前記式（Ｉ）で示される化合物は、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００５８】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。
【００５９】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００６０】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００６１】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
【００６２】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００６３】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００６４】
注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。
【００６５】
その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【００６６】
製剤化したニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療剤は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。
【００６７】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）で示される化合物の重量として、例えば５０〜５００ｍｇを、１日１回又は数回に分けて服用することが適当である。
【００６８】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）で示される化合物の重量として、例えば１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。
【００６９】
また、前記式（Ｉ）で示される化合物は、ニーマンピック病Ｃ型の予防及び／又は治療に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、前記式（Ｉ）で示される化合物と組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えばシクロデキストリン、ミグルスタット、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ステロイド性ファーマコロジカルシャペロン（非特許文献１７及び１８）等が挙げられる。
【００７０】
本発明における有効成分のうち、イトラコナゾールは、経口抗真菌剤として既に日本国内で承認されており、ポサコナゾールも海外では承認され、国内でも臨床試験中と、ヒトでの安全性が担保されている。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例の範囲に限定されるものではない。
【００７２】
［実施例１：ＮＰＣ１変異体に対してファーマコロジカルシャペロン作用を示す薬剤のスクリーニング方法開発］
図１Ａに示したスクリーニング系の手順及び陽性対照群を用いた有用性の実証に関して述べる。評価に用いる細胞としては、Ｉ１０６１Ｔ変異を有するＦＬＡＧ−ＮＰＣ１−ＧＦＰを安定発現するＨＥＫ２９３細胞を用いた。この細胞は本発明者らが過去に報告しているものである（非特許文献１７）。この細胞をポリリジンコーティングした９６ウェルプレートにＤＭＥＭ培地（５％ＦＢＳ、ペニシリンストレプトマイシン混合液含有）中で培養し、図１Ｂに示すような陽性対照群（ステロイド性ファーマコロジカルシャペロン）で２０〜２４時間処理を行った。その後、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２を含む１０％ホルマリン−ＰＢＳ（４％ホルムアルデヒド）により固定・核染色を行った。これをＰＢＳで洗浄後、画像取得のためのサンプルとした。このサンプルをIN Cell Analyzer 2000（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ヘキスト（核）とＧＦＰ（ＮＰＣ１変異体）の二通りの測定条件で、６０倍対物レンズにより各ウェル６視野ずつ撮像した。代表的な画像を図１Ａに示す。
【００７３】
前記で撮像した画像を入力データとし、データ解析環境Ｒ（EBImage, CRImageパッケージ）での画像処理により前記特徴量を視野毎に算出した。入力画像に対して、ガンマ変換により蛍光強度差を圧縮し、バックグラウンド減算処理を行い、ついでadaptive thresholdingを行うことで、ＮＰＣ１局在パターンの抽出を行った。抽出したパターンに対して、Circularity及びsmallObjRatioを算出した。細胞エリアの抽出は、ガンマ変換後により低い値の閾値を用いることで行った。
【００７４】
Circを用いて陽性対照群の濃度依存性を調べた実験結果を図１Ｃに示した。この図では、ｎ＝８で行った平均値とその標準分散（ＳＤ）をプロットしている。標準分散が小さく、スクリーニング系として優れていることが分かる。スクリーニングにおいて陰性対照と陽性対照の分離度の程度を示すＺ’ファクター（１以下の値をとり、優れたスクリーニング系ほど１に近い値となる）は、このデータにおいては０．８を超えており、０．５以上というハイスループットスクリーニングに必要とされるＺ’ファクター基準も超えている（J. Biomol. Screen. 4: 67-73, 1999）。
【００７５】
また、陽性対照群の濃度依存性もこの特徴量により明確に検出できており、このデータから算出されたＥＣ５０値は、免疫共染色に基づくアッセイ法で求めたＥＣ５０ともよい一致を示している（非特許文献１７）。残りの活性を反映する特徴量であるsmallObjRatioやGFPIntにも、濃度依存性は明確に反映されるが、標準分散が大きく、Circの方が望ましいといえる。
【００７６】
一般にスクリーニングにおいては、蛍光強度や吸光度等の値を用いることが多いが、これらの指標はエッジ効果（マルチウェルプレートの中央と端で値が系統的に異なる効果）の影響を受けやすい。実際に本スクリーニングにおいても、GFPIntや細胞の密度や状態に依存するCellAreaやNucNumberなどにおいてはエッジ効果が観察され、データのばらつきの要因の一つになっている。一方で、CircやsmallObjRatioなどの形状に関する特徴量では、エッジ効果の影響をほとんど受けておらず、複数プレート間の誤差も小さく、スクリーニング系の頑強さに寄与している。
【００７７】
［実施例２：前記スクリーニング方法による既存薬剤のスクリーニング］
実施例１に示したスクリーニング系を用いて、既承認薬ライブラリー（Enzo Lifescience, FDA Approved Drug Library V2）のスクリーニングを行った。実施例１同様に陽性対照群は濃度を振ったものを各プレートに配置している。スクリーニングは１０μＭ処理により行い、前記の特徴量を算出した（各処理毎に６枚の画像を取得し、その平均値を使用）。プレート間のばらつきを各特徴量毎に中央値を用いて補正し、データのばらつきを表すＭＡＤ（median absolute deviation）を用いてシグナル−ノイズ比（robust S/N ratio）へと変換した。結果を図２に示す。図２Ａには、スクリーニング結果を各特徴量毎、被検化合物群と陽性対照群に分けてプロットした図を示す。このデータからもCircが活性の指標として優れていることが読み取れる。
【００７８】
図２Ｂ及び図２Ｃは、縦軸を活性の指標の一つであるCirc、横軸を細胞毒性の指標の一つであるCellAreaとしたグラフにデータを投影したものである（ここでは例示のため、複数ある特徴量のうち、直感的に理解しやすいCirc軸とCellArea軸で形成される平面への投影図を示した）。各種特徴量(Circ、smallObjRatio、GFPInt、CellArea等)を考慮してヒット化合物の選択を行うため、データ解析環境Ｒとmclustパッケージを用いて、混合分布モデルによるクラスタリング解析を行った（Chris Fraley, Adrian E. Raftery, T. Brendan Murphy, and Luca Scrucca (2012) mclust Version 4 for R: Normal Mixture Modeling for Model-Based Clustering, Classification, and Density Estimation Technical Report No. 597, Department of Statistics, University of Washington）。被検化合物の中で陽性対照群と同じクラスターに分類されるものをヒット化合物として選択した（図２Ｂの白抜きの四角で示したデータ）。縦軸に示した特徴量Circのみでヒット化合物の判定を行った場合、細胞毒性を示す化合物群（図２Ｂの左側に分布する化合物群、図中の黒塗りの四角で示したデータ）が擬陽性となる傾向があった。また、前述のプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ (図２Bのヒット(2)の隣の点)もCirc値は高い(擬陽性)が、smallObjRatioが小さいため、ヒットではないと判断できる。このように、クラスタリングあるいは複数の特徴量を同時に考慮することは、擬陽性を減らす上で重要である。
【００７９】
クラスタリング結果の解析から、ヒット判定にはCircだけでなくsmallObjRatioとGFPIntを組み合わせることが特に有効であると分かった。なお、この三種の特徴量に対して閾値を設定し、全てを満たす化合物としてヒット化合物を選択しても、同様の化合物群が得られている。探索的なデータ解析の段階でクラスタリングを用いることは、重要な特徴量の選択及びそれらの閾値の設定にも有用であった。
【００８０】
図２Ｃは陽性対照群の各濃度、陰性対照群（vehicle）、及び被検化合物処理群（samples、１０μＭ処理）毎に分けて図示したものであり、黒丸で示したサンプルが活性有りと判定されたものである。陽性対照のmo56HC（ＥＣ５０  ０．２４μＭ）が０．１μＭ以上の濃度では全て活性ありのクラスターに分類されることから、精度・感度よく活性が検出されていることが確認できる。約８００化合物のスクリーニングから、図２Ｂ〜Ｄの（１）〜（６）で示した６種の被検化合物に活性が認められることが明らかとなった（ヒット率０．８％）。
【００８１】
［実施例３：ヒット化合物によるＮＰＣ１変異体の局在変化］
実施例２で得られたヒット化合物による、ＮＰＣ１変異体の局在変化をより詳細に観察するため、共焦点顕微鏡による評価を行った。ポリリジンコーティングしたガラスボトム９６ウェルプレート（Thermo Scientific Nunc, 96 MicroWell Optical Bottom Plate, 164588）にＧＦＰ融合ＮＰＣ１のＩ１０６１Ｔ変異体を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間後に被検化合物で処理した（全ての条件で最終的なＤＭＳＯ濃度は０．１％になるように調整）。更に２４時間培養後、固定・核染色を行い、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Carl Zeiss）にて観察した。陽性対照としては、図１Ｂに示したmo56HCを使用した。図３に示すように、いずれの化合物も陽性対照と同様にＮＰＣ１変異体の小胞体局在をリソソーム・後期エンドソーム局在へと修正することが確認された。
【００８２】
［実施例４：本発明により提供される化合物及びその類縁化合物のファーマコロジカルシャペロン活性の濃度依存性］
実施例１及び２と同様の条件で、ヒット化合物の濃度依存性を検討した。代表的な実験結果を図４Ａに示した。イトラコナゾールのＥＣ５０は０．３４μＭと算出され、mo56HCの０．２４μＭに匹敵する活性が得られている。ポサコナゾールはＥＣ５０が１．３μＭとイトラコナゾールよりやや劣ることが分かった。ラパチニブ（トシル酸塩）のＥＣ５０は約１０μＭ、ケトコナゾール及びパゾパニブは１０μＭにおいてわずかに活性はみられるものの(図３)、ＥＣ５０は３０μＭ以上と活性が弱いことが確認された。
【００８３】
また、イトラコナゾールの主要な代謝物として知られるヒドロキシイトラコナゾール（Toronto Research Chemicals、H943600）に関しても同様に濃度依存性を評価した。その結果、図４Ｂに示すように、若干活性は劣るが（ＥＣ５０  ０．９１μＭ）、活性は保たれることが分かった。なお、スクリーニングにおいて活性なし（ＮＡ）と判定されたミコナゾール（硝酸塩）に関しても、陰性対照としてデータを載せている。
【００８４】
イトラコナゾールの部分構造（左側のアゾールユニットとしてＯＧ３１０２Ｌ、及び右側のＮ，Ｎ’−ジアリールピペラジンユニットとしてＯＧ３１１３Ａ）に関しても活性評価を行った（図４Ｂ及びＣ）。その結果、イトラコナゾールの左側のアゾールユニット（ＯＧ３１０２Ｌ）、及び右側のＮ，Ｎ’−ジアリールピペラジンユニット（ＯＧ３１１３Ａ）では活性がみられない（ＮＡ）ことが分かった。
【００８５】
活性の強いイトラコナゾール、ポサコナゾール、及び活性の弱いケトコナゾール、そして活性のないテルコナゾールの比較から、ジアリールピペラジン構造の重要性が示唆された。そこで、これら部分構造の重要性を調べるため、ケトコナゾールにジアリールピペラジン構造を導入した誘導体（ＯＧ２１０５、ＯＧ２１０９、ＯＧ２１２５及びＯＧ２１３２）あるいはジアリールピペラジン構造を有さない誘導体（ＯＧ２１００及びＯＧ２１０４）の活性を評価した。その結果、ジアリールピペラジンユニットを有さない誘導体（ＯＧ２１００及びＯＧ２１０４）では活性が見られないことが分かった。また、ケトコナゾールにジアリールピペラジン構造を導入した誘導体（ＯＧ２１０５、ＯＧ２１０９、ＯＧ２１２５及びＯＧ２１３２）では、ケトコナゾールに比べて活性が向上することから、ジアリールピペラジン構造の重要性は明確である。これらの誘導体はイトラコナゾールに含まれるトリアゾロンユニットを持たないが、活性を保持している。このことから、トリアゾロンユニットは活性への寄与はあるものの必須ではなく、カルバモイル基やアセトアミド基などの極性官能基で代替可能であることが分かった。
【００８６】
テルコナゾール及びジアリールピペラジンユニットを有さない誘導体（ＯＧ２１００及びＯＧ２１０４）で活性がないことからジアリールピペラジンユニットの必要性は明確であるが、イトラコナゾールにおける１，３−ジオキソラン環又はポサコナゾールにおけるテトラヒドロフラン環の２位に芳香族基と、アラルキル基又はヘテロアラルキル基とが結合したユニットも活性に必要であることが示唆された。
【００８７】
［実施例５：本発明により提供される化合物のＮＰＣ１変異体を安定化する作用］
ＮＰＣ１のＩ１０６１Ｔ変異体は安定性が低下しており、定常状態における発現量が低下している。ファーマコロジカルシャペロン処理により、この変異体が安定化され発現量が増加する。ここでは、局在異常を修正する活性に加えて、スクリーニングで見出されたヒット化合物が安定化作用も有していることを確認した。
【００８８】
１２ウェルプレートにＧＦＰ融合ＮＰＣ１のＩ１０６１Ｔ変異体を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間後に被検化合物処理を行った。２４時間培養後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Gibco、25200-056）により細胞を懸濁した。５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を加えて懸濁し、フローサイトメーター（BD, FACS Canto II）によりＧＦＰ融合ＮＰＣ１変異体の発現量の定量を行った。一条件あたり一万細胞測定した結果を図５Ａに示す。この図ではイトラコナゾールとケトコナゾールについての代表的な結果を示した。いずれの化合物も濃度依存的なＩ１０６１Ｔ変異体の発現量増加が観測された。ポサコナゾール、ヒドロキシイトラコナゾール及びラパチニブに関してもＩ１０６１Ｔ変異体の発現量を増加させることを確認している。
【００８９】
図５Ｂには図５Ａと同様にして得たデータから平均蛍光強度を算出して、濃度依存性を調べた結果を示す。イトラコナゾールのＥＣ５０は０．３３μＭと算出され、局在異常の修正活性から算出した値とよく一致した値が得られている。一方で、局在異常の修正活性を示さないテルコナゾールはこの評価系においても活性は示さないことが確認された。
【００９０】
［実施例６：イトラコナゾール誘導体ＯＧ２１０５の合成］
【化４】
2017105738.tif 000006
【００９１】
100 mgのケトコナゾールを2 mLの濃塩酸と2 mLの水の混合溶液に溶かし、3時間加熱還流を行った。氷冷下で水酸化ナトリウム水溶液を塩基性になるまで加えた（白色沈殿が生じた）。この混合物をクロロホルムにより抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を留去することで、中間体のピペラジン誘導体OG2102（86.8 mg、0.189 mmol）を収率94％で黄色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.46 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.50 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.37-4.31 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 8.5, 6.7 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 8.7, 5.1 Hz, 2H), 3.31 (dd, J = 9.4, 6.7 Hz, 1H), 3.04 (s, total 8H).
13C-NMR (CDCl3) δ: 154.24, 146.58, 138.71, 135.75, 134.53, 132.90, 131.26, 129.44, 128.46, 127.14, 121.08, 118.05 (2C), 115.08 (2C), 107.90, 74.72, 67.61, 67.51, 51.58 (2C, piperazine), 51.19, 46.07 (2C, piperazine).
【００９２】
前記ピペラジン中間体OG2102（498 mg, 1.02 mmol）と４−フルオロベンゾニトリル（359 mg, 2.96 mmol）のDMF溶液（10 mL）を炭酸カリウム（425 mg, 3.88 mmol）で処理し、140℃で6時間加熱した。その後、反応液を室温まで冷やし、ジクロロメタンと水で振り分けを行い、その有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムによる乾燥後、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール = 10:10:0.25から10:10:0.5）することで、OG2105 (103mg, 0.174 mmol, 17％)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.59 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.54-7.51 (m, total 3H), 7.47 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.94-6.90 (m, 4H), 6.78 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.51 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.38-4.31 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 8.3, 6.4 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 8.7, 4.6 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 9.7, 5.1 Hz, 1H), 3.48 (t, J = 5.3 Hz, 4H), 3.27 (dd, J = 9.7, 6.9 Hz, 1H), 3.21 (t, J = 5.1 Hz, 4H).
13C-NMR (CDCl3) δ: 153.26, 152.79, 145.59, 138.80, 135.85, 134.54, 134.08, 133.49, 132.95, 131.34, 129.45, 128.47, 127.20, 121.18, 119.95 (CN), 118.49 (2C), 115.22 (2C), 114.35, (2C), 107.96, 100.49, 74.73, 67.60, 67.52, 51.19, 50.35 (2C, piperazine), 47.34 (2C, piperazine).
【００９３】
［実施例７：イトラコナゾール誘導体ＯＧ２１０９の合成］
【化５】
2017105738.tif 000007
【００９４】
OG2105 (100 mg, 0.169 mmol)をDMSO(1 mL)、メタノール(1 mL)及びジオキサン(1 mL)の混合溶媒に溶解し、氷冷下で炭酸カリウム(11.3 mg, 0.0818 mmol)及び過酸化水素水(0.041 mL, 約0.37 mmol)で処理した。室温にて2時間撹拌後、氷水で希釈し、生じた沈殿を濾取した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール = 50:1から20:1)により精製することで、OG2109(37.3 mg, 0.0613 mmol)を収率36％で白色粉末として得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD, 10:1) δ: 7.71 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.42 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.95-6.88 (m, total 6H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.47 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.34-4.28 (m, 1H), 3.84 (dd, J = 8.3, 6.4 Hz, 1H), 3.71-3.65 (m, 2H), 3.41 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.28 (dd, J = 9.7, 6.4 Hz, 1H), 3.17 (t, J = 5.1 Hz, 4H).
13C-NMR (CDCl3-CD3OD, 10:1) δ: 169.75, 153.44, 152.65, 145.67, 138.51, 135.80, 134.29, 132.83, 131.25, 129.40, 128.93 (2C), 127.78, 127.13, 122.75, 121.23, 118.44 (2C), 115.11 (2C), 114.19 (2C), 107.79, 74.63, 67.57, 67.36, 51.19, 50.43 (2C, piperazine), 47.80 (2C, piperazine).
【００９５】
［実施例８：イトラコナゾール誘導体ＯＧ２１３２の合成］
【化６】
2017105738.tif 000008
【００９６】
OG2102(96.2 mg, 0.197 mmol)、１−フルオロ−４−ニトロベンゼン(0.063 mL, 0.59 mmol)のDMF溶液(4mL)に炭酸カリウム(42.2 mg, 0.306 mmol)を加え、100℃で4時間加熱した。反応溶液を室温まで冷却し、水を加えて酢酸エチルにより抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒の留去後、シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール = 10:10:0.1から10:10:1)により精製することで、OG2125 (96.0 mg, 0.157 mmol)を収率80％で黄色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.16 (d, J = 9.7 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.47 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 9.7 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.51 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.38-4.32 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 8.3, 6.4 Hz, 1H), 3.76-3.69 (m, 2H), 3.58 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.26 (dd, J = 9.7, 7.4 Hz, 1H), 3.23 (t, J = 5.3 Hz, 4H).
13C-NMR (CDCl3) δ: 154.75, 152.90, 145.49, 138.84, 138.66, 135.89, 134.57, 132.99, 131.38, 129.47, 128.51, 127.23, 125.97 (2C), 121.21, 118.56 (2C), 115.27 (2C), 112.84 (2C), 108.00, 74.76, 67.62, 67.55, 51.21, 50.33 (2C, piperazine), 47.21 (2C, piperazine).
【００９７】
OG2125 (86.5 mg, 0.142 mmol)をTHF (5 mL)及びメタノール (2 mL)の混合溶媒に溶解し、窒素雰囲気下にてPd/C (45.0 mg)を添加し、水素雰囲気下、室温で48時間撹拌した。反応液をセライトで濾過した後、濃縮することでOG2129 (84.1 mg)を得た。
【００９８】
OG2129 (83.0 mg, 0.143 mmol)とトリエチルアミン (0.360 mL, 2.60 mL)をジクロロメタン (8 mL)に溶解し、氷冷下でアセチルクロリド (0.093 mL, 1.3 mmol)で処理した。室温で48時間撹拌の後、クロロホルムで希釈して水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール = 10:10:0から10:10:2)により精製し、OG2132 (44.1 mg, 0.0708 mmol)を収率50％で得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.47 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 8.0, 2.5 Hz, 1H), 7.01-6.97 (m, 2H), 6.93 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 4H), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.51 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 4.39-4.32 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.76-3.71 (m, 2H), 3.33-3.30 (m, 1H), 3.29-3.26 (m, 4H), 3.23-3.20 (m, 4H), 2.15 (s, 3H).
【産業上の利用可能性】
【００９９】
現在提供されている（ミグルスタット）あるいは臨床試験中（シクロデキストリン）のニーマンピック病Ｃ型予防及び／又は治療剤とは機序が異なる、新規なニーマンピック病Ｃ型予防及び／又は治療剤が本発明により提供される。本発明における最も好ましい有効成分であるイトラコナゾールは、従来から経口抗真菌剤として広く使用されているものであり、その安全性、薬物動態及び薬物相互作用などに関する蓄積があるという利点がある。他の機序によるニーマンピック病Ｃ型治療剤との組み合わせによっても、更に治療効果を高めることができると考えられる。
【図１Ａ】
2017105738.tif 000013
【図１Ｂ】
2017105738.tif 000014
【図１Ｃ】
2017105738.tif 000015
【図２Ａ】
2017105738.tif 000016
【図２Ｂ】
2017105738.tif 000017
【図２Ｃ】
2017105738.tif 000018
【図２Ｄ】
2017105738.tif 000019
【図２Ｅ】
2017105738.tif 000020
【図３】
2017105738.tif 000021
【図４Ａ】
2017105738.tif 000022
【図４Ｂ】
2017105738.tif 000023
【図４Ｃ】
2017105738.tif 000024
【図５Ａ】
2017105738.tif 000025
【図５Ｂ】
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