(57)【要約】      （修正有）【課題】１回膜貫通型チロシンキナーゼ受容体、例えば線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に対する、小分子化合物アロステリック阻害剤を同定するスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＦＧＦＲの細胞外ドメインにある、進化的に保存されたＦＧＦＲアロステリック部位を用いた、化学的最適化と組み合わされた高速スループットスクリーニング。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインに由来するアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項２】
前記結合部位がＩｇドメインを有するチロシンキナーゼ受容体に由来する、請求項１に記載のアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項３】
前記結合部位が偏った拮抗作用を誘導する、請求項１または２に記載のアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項４】
前記結合部位がフラストレートされたドメインを含む、請求項１から３のいずれかに記載のアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ受容体が、線維芽細胞増殖因子受容体、血管内皮増殖因子受容体もしくは血小板由来増殖因子受容体、またはこのホモログ、パラログもしくはオソログである、請求項１から４のいずれかに記載のアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項６】
配列番号１：
Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ
または配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を示す配列にある、請求項１から５のいずれかに記載のアロステリック阻害剤結合部位。
【請求項７】
配列番号２
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ
または配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を示す配列にある、請求項４に記載のフラストレートされた結合部位。
【請求項８】
チロシンキナーゼ受容体経路において偏った拮抗作用を誘導するための、請求項１から６に記載のアロステリック阻害剤結合部位の使用。
【請求項９】
小分子化合物阻害剤をスクリーニングするための、請求項１から７に記載のアロステリック阻害剤結合部位の使用。
【請求項１０】
チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインにおけるフラストレートされたドメインのスクリーニングを含む、前記細胞外ドメインにおけるアロステリック阻害剤結合部位の同定方法。
【請求項１１】
チロシンキナーゼ受容体の活性化／阻害に依存する２つの異なる下流経路により誘導される少なくとも２つの異なるレポーターの比較を含む、請求項１から７に記載のチロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインにおけるアロステリック阻害剤部位に結合する小分子化合物アロステリック阻害剤の同定方法。
【請求項１２】
ａ）ＲＴＫのアロステリック結合部位を小分子化合物アロステリック阻害剤候補化合物と接触させる段階、
ｂ）前記チロシンキナーゼ受容体の活性化／阻害に依存する少なくとも２つの下流経路の変化を測定する段階、
ｃ）前記チロシンキナーゼ受容体の活性化／阻害に依存する少なくとも２つの異なる下流経路に対する少なくとも１つのレポーターの状態の変化を比較する段階
を含み、
受容体のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下、少なくとも１つの下流経路が阻害されるのに対し、少なくとももう１つの下流経路が影響を受けない場合に、アロステリック阻害剤が同定される、
ＲＴＫのアロステリック阻害剤の同定方法。
【請求項１３】
前記２つの異なる下流経路が、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路およびＰＬＣγシグナル伝達経路に対応する、請求項１２に記載のＲＴＫのアロステリック阻害剤の同定方法。
【請求項１４】
化合物が小分子である、請求項１から６のいずれかに記載のアロステリック結合部位に結合する前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１回膜貫通型（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎ）チロシンキナーゼ受容体に由来する、アロステリック阻害剤に対する細胞外結合ドメインに関する。より具体的には、本発明は、チロシンキナーゼ受容体、すなわち線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）または血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に由来する細胞外ドメインに関する。さらに、本発明は、他のチロシンキナーゼ受容体の細胞外部分における類似のドメインを同定するためのこのドメインの使用、およびアロステリック阻害剤を同定するスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面受容体は、全ての薬剤の大多数に標的を提示する（Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎら、２００６年）。歴史的に、創薬プログラムは、オルソステリック部位で内因性リガンドと結合を競合するアンタゴニストを開発するための研究が多数派を占めていた。その一方、アロステリック部位、すなわち、オルソステリックリガンド（標的が受容体の場合）または基質（標的が酵素の場合）によって利用されるものとはトポグラフィー的に異なるドメインに結合し、タンパク質の活性を調節する薬剤は、同定するのがより困難であった。しかし、近年は、リガンド依存性イオンチャネルおよびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対して同定されるアロステリック調節因子の数の増加をみている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、２００２年；Ｋｅｎａｋｉｎ、２０１０年。驚くべきことに、増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に関しては、この受容体スーパーファミリーが極めて生物学的に重要であり医学的に意義があるという事実にもかかわらず、ならびにアロステリック剤が、より大きな安全性および／または選択性を含む、伝統的なオルソステリックリガンドに勝る明白な治療上の利点を提供することができるという事実にもかかわらず、アロステリック小分子化合物調節因子はこれまでに同定されていない。これまで、ＲＴＫを標的とするほとんどの治療が、増殖因子リガンドを認識するモノクローナル抗体、または受容体のチロシンキナーゼ活性を直接阻害する小分子化学化合物に焦点を合わせてきた。
【０００３】
なかでも、より有効なおよび／または選択的なＲＴＫ小分子化合物阻害剤から実質的に利益を得られる一つの分野が、抗血管新生薬療法の分野である。ＶＥＧＦ標的化抗血管新生剤は癌患者の生存を延長させるが、全体の奏効は、内因的不応性、獲得耐性を介した逃避（ｅｓｃａｐｅ）および少なくとも前臨床モデルでは転移の刺激により制限される。別の抗血管新生剤との併用療法は、これらの課題を克服するのに役立つ可能性があるとみなされてきた。最初に同定された血管新生因子である線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２は、魅力的な薬剤候補である。実際、ＦＧＦＲシグナル伝達は、癌および炎症性疾患に関与しており（Ｓｈｉｎら、２００６年；Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒら、２００５年；Ｍａｌｅｍｕｄら、２００７年；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、２００５年）、腫瘍血管新生スイッチに寄与し（Ｐｒｅｓｔａら、２００５年；Ｋｕｂｏら、２００２年；Ｓｈｉｎｅら、２００６年；Ｌａｖｉｎｅら、２００６年）、腫瘍の血管新生およびＶＥＧＦ阻害剤治療時の再発を助ける（Ｃａｓａｎｏｖａｓら、２００５年）。それにもかかわらず、ＦＧＦファミリーは、抗血管新生剤開発に関し大きな注目は受けていない。この理由の一部に、１８種類のリガンドおよび４種類のＦＧＦＲのこのスーパーファミリーのメンバー間の重複性がある（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒら、２００５年；ＢｅｅｎｋｅｎおよびＭｏｈａｍｍａｄｉ、２００９年；Ｃｅｎｎｉら、２００５年；Ｂｏｓｓａｒｄら、２００４年；Ｃｏｍｐａｇｎｉら、２０００年）。また、ＦＧＦＲチロシンキナーゼの選択的阻害剤は、臨床使用が承認されていない（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら、１９９９年；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら、２００５年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５，９９３−９９５（２００６）
【非特許文献２】Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１，１９８−２１０（２００２）
【非特許文献３】Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ｒｅｖ，６２，２６５−３０４（２０１０）
【非特許文献４】Ｓｈｉｎら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １７，５７６−５８４（２００６）
【非特許文献５】Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６，１３９−１４９（２００５）
【非特許文献６】Ｍａｌｅｍｕｄら、Ｃｌｉｎｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７５，１０−１９（２００７）
【非特許文献７】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８，９３２−９３６（２００５）
【非特許文献８】Ｐｒｅｓｔａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６，１５９−１７８（２００５）
【非特許文献９】Ｋｕｂｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，８８６８−８８７３（２００２）
【非特許文献１０】Ｌａｖｉｎｅら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０，１６５１−１６６６（２００６）
【非特許文献１１】Ｃａｓａｎｏｖａｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８，２９９−３０９（２００５）
【非特許文献１２】ＢｅｅｎｋｅｎおよびＭｏｈａｍｍａｄｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８，２３５−２５３（２００９）
【非特許文献１３】Ｃｅｎｎｉら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２５，１１０９−１１１３（２００５）
【非特許文献１４】Ｂｏｓｓａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，７５０７−７５１２（２００４）
【非特許文献１５】Ｃｏｍｐａｇｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，７１６３−７１６９（２０００）
【非特許文献１６】Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  １７，１２１−１３５（１９９９）
【非特許文献１７】ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １３，４８３５−４８４１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
驚くべきことに本発明者らは、化学的最適化と組み合わされた高速スループットスクリーニングにより、ＲＴＫ、すなわちＦＧＦＲの最初の経口的に活性な小分子化合物アロステリック阻害剤を同定できることを見出した。この化合物は、ＳＳＲ１２８１２９（略して「ＳＳＲ」）と呼ばれる（図３）。
【０００６】
ＳＳＲ活性に基づく詳細な研究により説明されるように、ＳＳＲは、同じファミリー（現在はＦＧＦＲファミリー）の全てのメンバーを阻害する能力を有する。以下の例で示されるように、ＳＳＲは、ＦＧＦＲ１活性（図４および６）、ＦＧＦＲ２活性（図８）、ＦＧＦＲ３活性（図９）およびＦＧＦＲ４活性（図７）を阻害することができる。故に、このアロステリック阻害剤は、ＴＫＲの異なるメンバーにより共有される受容体の細胞外ド
メインにある、進化的に保存されたＦＧＦＲアロステリック部位に結合する。この保存された部位は、ＦＧＦＲのドメインＩＩＩに位置する（図１１）。結合部位へのＳＳＲの結合は、「偏った拮抗作用（ｂｉａｓｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）」を誘導する。作用は、アロステリック結合部位へのＳＳＲ結合が受容体、特に判定されたフラストレートされた（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ）ドメインの立体構造変化をもたらすという事実により確認される。偏った拮抗作用のため、アロステリック阻害剤を同定する方法は、下記のようにリン酸シグナル伝達経路測定に基づくスクリーニングテストの使用により提供される。今後は、ＳＳＲは、ＲＴＫのアロステリック阻害剤の最初の例である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＦＧＦＲ上のこのような部位の標的化ならびにＶＥＧＦＲ２およびＰＤＧＦＲβのような他のＲＴＫにおける類似の部位の標的化の検証は、重要な実用的意義を有しており、大きな治療効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＡはＨＵＶＥＣでの定量的ＰＣＲ実験がＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４発現のみを示す図である。ＢはＲＴ−ＰＣＲ分析がアイソフォームＦＧＦＲ１βおよびＦＧＦＲ４を同定した図である。ＦＧＦＲ１がＩＩＩｃバリアントのフォーマット下にある図である（Ｃ）。
【図２】ＦＧＦＲ１βｌｌｌｃ−ｈＭｐＩをトランスフェクトされたＢａＦ／３細胞は、挿入されたＦＧＦＲが活性化される場合に増殖することができることを示す図である。ＦＧＦ４（Ａ）のみはＦＧＦＲ１βｌｌｌｃを誘導することができるが、ＦＧＦ１９は誘導することができない（Ｂ）。
【図３】ＳＳＲ化合物表示を示す図である。
【図４−１】内皮細胞増殖に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＡはＦＧＦ２およびＦＧＦ４のみがＨＵＶＥＣ増殖を刺激し、それによりＦＧＦＲ１がこれらの細胞で増殖を駆動することが示される。ＢはＳＳＲがＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ増殖を阻害し、それによりＳＳＲによるＦＧＦＲ１拮抗作用が示される。ＣはＦＧＦＲ１をトランスフェクトされたラットファッドパッド（Ｆａｄ  Ｐａｄ）内皮細胞（ＲＦＰＥＣ）では、ＦＧＦ２は、高用量でさえＳＳＲにより部分的にのみ阻害されるＦＧＦＲ１自己リン酸化を誘導した。Ｄはこの阻害が、ＰＡＥＣトランスフェクトＦＧＦＲ１またはＨＵＶＥＣでのＦＧＦ２結合に対するＳＳＲの競合的効果に起因しない。
【図４−２】内皮細胞増殖に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＡはＦＧＦ２およびＦＧＦ４のみがＨＵＶＥＣ増殖を刺激し、それによりＦＧＦＲ１がこれらの細胞で増殖を駆動することが示される。ＢはＳＳＲがＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ増殖を阻害し、それによりＳＳＲによるＦＧＦＲ１拮抗作用が示される。ＣはＦＧＦＲ１をトランスフェクトされたラットファッドパッド（Ｆａｄ  Ｐａｄ）内皮細胞（ＲＦＰＥＣ）では、ＦＧＦ２は、高用量でさえＳＳＲにより部分的にのみ阻害されるＦＧＦＲ１自己リン酸化を誘導した。Ｄはこの阻害が、ＰＡＥＣトランスフェクトＦＧＦＲ１またはＨＵＶＥＣでのＦＧＦ２結合に対するＳＳＲの競合的効果に起因しない。
【図５】Ａは異方性のパラメータとしての反転速度（ｔｕｍｂｌｉｎｇ  ｓｐｅｅｄ）の測定による、Ｆｃ−タグ（ＦＧＦＲ２∂１２３）なしのＦＧＦＲ２の精製ＥＣＤへの、蛍光ｌｕｍｉｏタグ付ＦＧＦ１の結合（ＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏ）を示す図である。ＳＳＲとＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏの間の直接競合は観察されない。ＢはＳＳＲが、ＦＧＦＲ２多量体化を阻害することができない、またはＣはＦＧＦ２二量体化を阻害することができないことを示す図である。
【図６】内皮細胞走化性遊走に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＡはＦＧＦ２およびＦＧＦ４のみがＨＵＶＥＣ遊走を刺激し、それによりＦＧＦＲ１がこれらの細胞で増殖を駆動することが示される。ＢはＳＳＲが、ＦＧＦＲ１に対する拮抗アフェクト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｆｆｅｃｔ）に対応する、ＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ走化性遊走を阻害する。
【図７】内皮細胞インビトロ血管新生に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＡはＦＧＦ２およびＦＧＦ１９のみがＨＵＶＥＣ血管新生を刺激し、それによりＦＧＦＲ４がこれらの細胞におけるこの分化段階を制御することが示される。ＢはＳＳＲが、ＦＧＦＲ４に対する拮抗アフェクトに対応する、ＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣインビトロ血管新生を阻害する。
【図８】ＰＡＮＣ０２増殖および遊走に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＰＡＮＣ０２細胞は、ＶＥＧＦの有無にかかわらずＦＧＦ７刺激下で増殖（Ａ）または遊走（Ｂ）し、該系のＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ依存を示唆している。ＳＳＲは、ＦＧＦ７誘導ＰＡＮＣ０２増殖およびＦＧＦ７＋ＶＥＧＦ誘導細胞遊走を阻害し、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを阻害する能力を示している。
【図９】Ｂ９骨髄腫細胞増殖に対するＳＳＲ活性に関する試験を示す図である。ＡはＦＧＦ１がＦＧＦＲ３を介してＢ９骨髄腫細胞増殖を誘導し、ＳＳＲがこの刺激を阻害し、それによりＳＳＲがＦＧＦＲ３をブロックできることが示される。Ｂはそれにもかかわらず、ＳＳＲが、自己活性ＦＧＦＲ３変異体（キナーゼドメインが構造的にリン酸化される。）をトランスフェクトされたＢ９細胞の増殖を阻害することはできない。これらの結果は、ＳＳＲの細胞外効果を示している。
【図１０】ＳＳＲが、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦまたはＰＩＧＦなどのさまざまな増殖因子により誘導された細胞遊走を大幅に阻害することができないＨＵＶＥＣ遊走アッセイを示す図である。ＳＳＲは、ＦＧＦＲに特異的であり、およびＦＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ遊走のみをブロックする。
【図１１−１】ＦＧＦＲドメインＩＩＩに結合するＳＳＲを示すＮＭＲ試験を示す図である。ＡはＦＧＦＲ１細胞外ドメインでのＳＳＲ結合の１Ｄ−およびＳＴＤ−ＮＭＲ分析。飽和は対照ＴＮＦＲＩαでは観察されない。ＢはドメインＩＩＩにおける相互作用部位を示唆する、異なるＦＧＦＲ１ドメインに結合するＳＳＲの１Ｄ−ＮＭＲ試験は、ＦＧＦＲ１完全長およびＦＧＦＲ１ドメインＩＩで得られたスペクトルが類似していることを実証する。ＣはＳＳＲが、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３（Ｄ）細胞外ドメインに結合する能力を示す等温滴定熱量（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）。
【図１１−２】ＦＧＦＲドメインＩＩＩに結合するＳＳＲを示すＮＭＲ試験を示す図である。ＡはＦＧＦＲ１細胞外ドメインでのＳＳＲ結合の１Ｄ−およびＳＴＤ−ＮＭＲ分析。飽和は対照ＴＮＦＲＩαでは観察されない。ＢはドメインＩＩＩにおける相互作用部位を示唆する、異なるＦＧＦＲ１ドメインに結合するＳＳＲの１Ｄ−ＮＭＲ試験は、ＦＧＦＲ１完全長およびＦＧＦＲ１ドメインＩＩで得られたスペクトルが類似していることを実証する。ＣはＳＳＲが、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３（Ｄ）細胞外ドメインに結合する能力を示す等温滴定熱量（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）。
【図１２−１】ＳＳＲがＦＧＦ１（Ａ、Ｂ）およびＦＧＦ２（Ｃ）と相互作用できないことを実証するＮＭＲ（Ａ、Ｃ）およびＩＴＣ（Ｂ）試験を示す図である。Ｄはヘパリンミメティクスである八硫酸スクロース（ＳＯＳ）の添加後にＦＧＦＲ１に結合するＳＳＲへの干渉は観察されず、ＳＳＲがＦＧＦＲ１のヘパリン結合部位と相互作用しないことを確認する図である。
【図１２−２】ＳＳＲがＦＧＦ１（Ａ、Ｂ）およびＦＧＦ２（Ｃ）と相互作用できないことを実証するＮＭＲ（Ａ、Ｃ）およびＩＴＣ（Ｂ）試験を示す図である。Ｄはヘパリンミメティクスである八硫酸スクロース（ＳＯＳ）の添加後にＦＧＦＲ１に結合するＳＳＲへの干渉は観察されず、ＳＳＲがＦＧＦＲ１のヘパリン結合部位と相互作用しないことを確認する図である。
【図１３】インシリコモデリングおよび変異誘発が、Ｙ３２８アミノ酸近傍のＳＳＲに対するアロステリック結合部を同定することを示す図である。ＷＴ  ＦＧＦＲ２細胞外ドメイン（Ａ）でのＩＴＣ実験は、ＳＳＲとＦＧＦＲ２の間の相互作用を示す。測定がＹ３２８Ｄ変異体（Ｂ）で実現される場合に失敗するこの結合は、Ｙ３２８Ｄ変異がＦＧＦＲ２をＳＳＲ結合に非感受性にすることを確認する。
【図１４】１００μＭ  ＳＳＲなしまたは１００μＭ  ＳＳＲあり（それぞれ黒い線およびグレーの線）での精製された（Ａ）ＦＧＦＲ２∂２３−ＷＴ、（Ｂ）ＦＧＦＲ２−∂２３−Ｈｉｓ、（Ｃ）ＦＧＦＲ２−∂２３−Ｔｙｒ、（Ｄ）ＦＧＦＲ２−∂２３−Ｈ／Ｔ（Ｈ２９５Ｌ／Ｙ３２８Ｄ二重変異体）のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）測定が、ＷＴまたはＨｉｓ２９５Ｌ変異体の両方で立体構造変化を同定したのに対し、変異Ｙ３２８Ｄはこの変化に対しＦＧＦＲ２を非感受性にすることを示す図である。
【図１５】完全長ＦＧＦＲ２−ＷＴまたは−Ｙ３２８Ｄを有する安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＦＧＦ２で刺激（５分間で０．５ｎｇ／ｍｌ）した後の、活性化Ｅｒｋ１／２のウェスタンブロット分析を示す図である。濃度測定で確定された（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）ＩＣ５０値（平均±標準誤差；３つの独立した実験）は、ＦＧＦＲ２−Ｙ３２８Ｄ変異体受容体（Ｂ）はＦＧＦＲ２−ＷＴ（Ａ）と比較してＳＳＲ阻害に対する感受性が約５倍低いことを示している。
【図１６】ＡはＦＧＦ２で刺激された、ＦＧＦＲ２トランスフェクトＨＥＫ細胞に対する、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ５４０２と比較したＳＳＲ効果のウェスタンブロット分析を示す図である。ＳＵ５４０２がＰＬＣγ、ＦＲＳ２およびＥｒｋ１／２リン酸化を阻害するのに対し、ＳＳＲはＰＬＣγ経路を阻害せず、ＳＳＲによる偏った拮抗作用を示している（Ｂ）。
【図１７−１】ＨＵＶＥＣにおけるＦＧＦ２誘導ＡＫＴリン酸化に対するＳＳＲ効果のウェスタンブロット分析（Ａ）と対応する定量化グラフ（Ｂ）を示す図である。Ｃはこの効果が、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）に対するオンセルＥＬＩＳＡ（ｏｎ−ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ）でも定量化できることを示す図である。Ｄはこの効果が、ＳＳＲがＦＧＦＲに結合するＦＧＦと競合できないことと独立であることを示す図である。
【図１７−２】ＨＵＶＥＣにおけるＦＧＦ２誘導ＡＫＴリン酸化に対するＳＳＲ効果のウェスタンブロット分析（Ａ）と対応する定量化グラフ（Ｂ）を示す図である。Ｃはこの効果が、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）に対するオンセルＥＬＩＳＡ（ｏｎ−ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ）でも定量化できることを示す図である。Ｄはこの効果が、ＳＳＲがＦＧＦＲに結合するＦＧＦと競合できないことと独立であることを示す図である。
【図１８】ソフトウェアプログラムＡＧＡＤＩＲおよび変異分析を用いた、ＶＥＧＦ−Ｒ２受容体における想定されるフラストレートされた帯域の同定を示す図である。（Ａ）構造変化（例えばβシートからαヘリックスへの転移）を起こす傾向がある幾つかの領域が同定された。（Ｂ）２つのリジン（Ｋ６０９およびＫ６４８）が、膜貫通ドメインとの近さおよび変異後のヘリシティ特性に対する最も負の影響により、アスパラギン酸への変異に対して選択された。
【図１９】ソフトウェアプログラムＡＧＡＤＩＲおよび変異分析を用いた、ＰＤＧＦ−Ｒβ受容体における想定されるフラストレートされた帯域の同定を示す図である。アスパラギン酸への変異リジン３８７およびアスパラギン酸への変異ロイシン３８３は、ヘリシティ特性に対する最も負の影響を有するように思われる。
【図２０】Ｅｒｋ１／２およびＰＬＣγを通じたＶＥＧＦ−Ｒ２およびＰＤＧＦ−Ｒβ受容体シグナル伝達経路活性化の略図を示す図である。（Ａ）ＶＥＧＦ刺激後のＶＥＧＦＲ２シグナル伝達および（Ｂ）ＰＤＧＦ刺激後のＰＤＧＦ−Ｒβシグナル伝達。
【図２１】ウェスタンブロットまたはシュアファイアアッセイ（ｓｕｒｅｆｉｒｅ  ａｓｓａｙ）を用いた、ＶＥＧＦ−Ｒ２またはＰＤＧＦ−Ｒβ受容体の野生型または変異型を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞におけるＥｒｋ１／２リン酸化検出を示す図である。（Ａ）ＶＥＧＦ−Ｒ２のマウス野生型およびＫ６０９ＤまたはＫ６４８Ｄで変異されたＶＥＧＦ−Ｒ２は、ＨＥＫ２９３細胞において安定にトランスフェクトされた。飢餓およびマウスＶＥＧＦなし（０）またはマウスＶＥＧＦあり（＋）での刺激後、Ｅｒｋ１／２リン酸化はウェスタンブロットにより検出される。（Ｂ）タンパク質抽出物でのＥｒｋ１／２（左の図式）またはＰＬＣγ（右の図式）リン酸化を検出する確実なアッセイの略図。（Ｃ）１０％ＦＢＳ、１もしくは５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激または対照として刺激なし（０）後のＰＤＧＦＲβトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞における合計Ｅｒｋ１／２またはリン酸化Ｅｒｋ１／２のアルファスクリーンシュアファイア用量。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の種々の態様は、本発明の詳細な記載および以下の例において説明される。
【００１０】
本発明の第１の態様は、チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインに由来するアロステリック結合部位である。本明細書では、アロステリック結合部位とは、受容体のリガンド結合部位へのリガンドの結合の競合的阻害を引き起こすことなく、阻害剤、好ましくは小分子化合物が結合できる部位を意味する。本明細書では、由来するとは、アロステリック結合部位が細胞外ドメインの一部から成るが、完全な細胞外ドメインは含まないことを意味する。好ましくは、アロステリック結合部位は、１０から２００アミノ酸長の間、より好ましくは１０から１００アミノ酸の間、さらにより好ましくは２０から５０アミノ酸の間であり、前記アミノ酸は受容体の細胞外ドメインの部分である。
【００１１】
本明細書では、小分子化合物は、好ましくは１０００Ｄ未満、より好ましくは９００Ｄ未満、より好ましくは８００Ｄ未満、より好ましくは７００Ｄ未満、より好ましくは６００Ｄ未満、さらにより好ましくは５００Ｄ未満の分子重量を有する非ポリマー性質の化合物である。
【００１２】
チロシンキナーゼ受容体および受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、本特許の範囲では、適用等価語である。「チロシンキナーゼ受容体」が受容体を示すのに使用されるのに対し、「受容体チロシンキナーゼ」はより具体的には受容体のキナーゼ活性を示すのに使用される。チロシンキナーゼ受容体は当業者に知られており、ＥＧＦ、インスリン様増殖因子、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｔｒｋ、ＡＸＬ、ＬＴＫ、ＴＩＥ、ＲＯＲ、ＤＤＲ、ＰＫＴ７、ＲＹＫ、ＣＣＫ４、ＥｐｈおよびＭｕＳＫ受容体ファミリーの受容体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記アロステリック結合部位は、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ、ＭｕＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ、ＴＩＥおよびＶＥＧＦＲなどを含む、Ｉｇドメインを有するＴＫＲの細胞外ドメインに由来する。さらにより好ましくは前記アロステリック結合部位は、細胞質ドメインにスプリットキナーゼドメインを有するＴＫＲに由来する。本発明によるＴＫＲの好ましい実施形態は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、またはこのホモログ、オルソログもしくはパラログである。
【００１３】
タンパク質の「ホモログ」は、当該非修飾タンパク質と比べてアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有する、ならびに由来する非修飾タンパク質と類似の生物活性および機能活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を含む。「オルソログおよびパラログ」は、遺伝子の祖先関係を記述するのに使用される進化概念を含む。パラログは、遺伝子祖先遺伝子の複製を通じて生じた同じ種内の遺伝子である。オルソログは、種分化を通じて生じた異なる生物由来の、およびまた共通の祖先遺伝子に由来する遺伝子である。
【００１４】
配列番号１を含むこのようなアロステリック結合は、ＦＧＦＲファミリー、より具体的には、ＦＧＦＲ２に属する。好ましくは、前記アロステリック阻害剤部位は配列番号１を含み、さらにより好ましくは前記アロステリック阻害剤部位は配列番号１から成る。
【００１５】
別の態様では、本発明は、アロステリック結合部位のホモログ、パラログまたはオルソログから成る。好ましくは、これらのホモログ、パラログまたはオルソログのポリペプチド配列は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％以上の相同性を共有する。
【００１６】
一例として、アロステリック結合部位のこのようなパラログは、ＦＧＦＲファミリーに存在する。
【００１７】
特に、本発明によるアロステリック結合部位は、ＦＧＦＲのドメインＩＩＩに位置する。
【００１８】
同様に、ＶＥＧＦＲ２に対するアロステリック結合部位は、リジン６０９およびリジン６４８を含む領域における、受容体のＩｇドメイン６に位置する。
【００１９】
アロステリック結合部位はまた、ＰＤＧＦＲβにも存在し、および膜貫通領域近傍に位置する領域、特にＩｇドメイン３（ロイシン３８３およびリジン３８７を含む領域）に位置する。好ましくは、アロステリック結合部位に対するアロステリック阻害剤の結合により、偏った拮抗作用が誘導される。
【００２０】
本明細書では、「偏った拮抗作用」とは、幾つかの下流経路を有する受容体に関して、アロステリック阻害剤結合部位にアロステリック阻害剤が結合した際に全ての経路が影響を受けるわけではないこと、または全ての経路が同程度に影響を受けるわけではないことを意味する。好ましい実施形態では、少なくとも１つの下流経路が阻害されるのに対し、少なくとももう１つの下流経路は影響を受けない。
【００２１】
好ましくは、本発明によるアロステリック結合部位は、フラストレートされたドメインを含み、好ましくはフラストレートされたドメインから本質的に成り、さらにより好ましくはフラストレートされたドメインから成る。
【００２２】
本明細書では、「フラストレートされたドメイン」とは、１つの構造的立体構造に明確に対するものではないタンパク質ドメインまたはこのフラグメントを意味する。フラストレートされたドメインは当業者に知られており、フラストレートされたドメインの存在は、１つのタンパク質二次構造予測プログラムでの曖昧な答え、または２つの異なるタンパク質二次構造予測プログラム間の予測における矛盾のどちらかにより検出される。優先的に、フラストレートされたドメインの存在は、タンパク質二次構造予測プログラムからの予測、ならびに結晶化およびＸ線回析などのタンパク質構造検出方法により判定されるような実構造における矛盾により検出される。非限定例として、矛盾は、１つの方法によるαヘリックスの表示、および別の方法によるβシートの表示であってもよい。タンパク質は、最小限にフラストレートされる。しかし、幾つかのドメインは、幾つかのフラストレーションを誘導しており（本明細書では「フラストレートされたドメイン」と呼ばれる）、これらのドメインは、タンパク質の立体構造変化を誘導する傾向がある。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記フラストレートされたドメインは配列番号２を含み、好ましくはこれは配列番号２から成る。このフラストレートされたドメインは、ＦＧＦＲファミリー、特にＦＧＦＲ２に属する。
【００２４】
他のフラストレートされたドメインは、上記に示されたように同定することができる。
【００２５】
本発明の別の態様は、アロステリック結合部位が位置するチロシンキナーゼ受容体の結合部位にリガンドが結合した際に、偏った拮抗作用を誘導するための本発明によるアロステリック結合部位の使用である。本発明のさらに別の態様は、前記部位に結合している、ランダムライブラリー由来の小分子化合物阻害剤をスクリーニングするための、本発明によるアロステリック結合部位の使用である。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインにおけるフラストレートされたドメインの存在をスクリーニングすることを含む、前記細胞外ドメインにおけるアロステリック阻害剤結合部位の同定方法である。フラストレートされたドメインをスクリーニングする方法は当業者に知られており、このような方法の例は例８に記載されている。非限定例として、フラストレートされたドメインは、１つのタンパク質二次構造予測プログラムでの曖昧な答えにより、好ましくは２つの異なるタンパク質二次構造予測プログラム間の予測における矛盾により、さらにより好ましくはタンパク質二次構造予測プログラムからの予測、ならびに結晶化およびＸ線回析などのタンパク質構造検出方法により判定されるような実構造における矛盾により検出される。タンパク質二次構造予測のためのプログラムは当業者に知られている。非限定例として、このようなプログラムがＲｏｓｔ（２００３年）により記載されている。好ましくは、前記フラストレートされたドメインは、前記アロステリック結合部位の近傍にある。より好ましくはこれは結合部位の境界から２０アミノ酸以内、さらにより好ましくは１０アミノ酸以内に位置し、さらにより好ましくはこれは前記結合部位に隣接し、さらにより好ましくはこれは結合部位と重複し、最も好ましくはこれは結合部位に含まれる。考えられる阻害剤部位を同定した後、スクリーニングは、該部位に結合する、およびアロステリック阻害機能をテストできる小分子、小ペプチド、ペプチドミメティクス、抗体またはナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）などの化合物を設計して、考えられる阻害剤部位の機能の確認により完了することができる。
【００２７】
本発明の別の態様は、チロシンキナーゼ受容体の活性化に依存する２つの異なる下流経路により誘導される２つの異なるレポーターの比較を含む、本発明による前記チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインにおけるアロステリック阻害剤部位に結合している小分子化合物アロステリック阻害剤の同定方法である。レポーターは、検出可能なシグナルをもたらす化合物の任意の遺伝子、タンパク質であり、非限定例として、抗生物質耐性遺伝子、細胞死をもたらす毒素遺伝子、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子、またはβガラクトシダーゼなどの酵素活性をコードする遺伝子、またはリン酸化もしくは脱リン酸化、アセチル化もしくは脱アセチル化されたまたは立体構造が変化しているタンパク質であってもよい。レポーター遺伝子の場合では、コード配列は、適切なプロモーター、すなわち受容体へのリガンドの結合およびレポーター経路の結果的な誘導により誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。二重経路の場合では、２つの異なるプロモーターが必要とされる。非限定例として、アロステリック阻害剤の存在下または非存在下でタンパク質のリン酸化を比較することは、偏った拮抗作用によるリン酸化の違いを生み、リン酸化のこれらの違いはレポーターとして使用することができる。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＲＴＫのアロステリック阻害剤の同定は、
ａ）ＲＴＫのアロステリック結合部位をアロステリック阻害剤候補化合物と接触させる段階、
ｂ）前記チロシンキナーゼ受容体の活性化／阻害に依存する少なくとも２つの下流経路の変化を測定する段階、
ｃ）前記チロシンキナーゼ受容体の活性化／阻害に依存する少なくとも２つの異なる下流経路の各々に対する少なくとも１つのレポーターの状態の変化を比較する段階
を含み、
受容体のリガンド結合ドメインに結合しているリガンドの存在下、少なくとも１つの下流経路が阻害されるのに対し、少なくとももう１つの下流経路は影響を受けない場合に、アロステリック阻害剤が同定される、スクリーニングテストを実施して行うことができる。レポーターの状態の変化は使用されるレポーターに依存し、非限定例としてレポータータンパク質のリン酸化の変化、または遺伝子の非誘導から誘導への（または逆も同様）スイッチであってもよい。好ましくは、前記状態の変化はホスホイレーション（ｐｈｏｓｐｈｏｙｌａｔｉｏｎ）状態の変化である。
【００２９】
好ましくは、下流経路の変化は、ＥＲＫ１／２  およびＰＬＣγシグナル伝達経路を含む、リン酸シグナル伝達経路の変化の測定により実施される。
【００３０】
別の実施形態では、ＦＧＦ−Ｒのアロステリック調節因子は、下記に記載のようにＳＥＣ−ＬＣ／ＭＳに基づく親和性スクリーニングを用いて同定することができる：
ＳＥＣ−ＬＣ／ＭＳ方法論は、オンライン結合された２次元システム、分離のため高性能液体クロマトグラフィーに結合されたサイズ排除クロマトグラフィーと、これに続く検出のためのエレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析から成る、親和性スクリーニングに使用される分析技法である。
【００３１】
方法は、可溶性ポリペプチド（ペプチド、タンパク質ドメイン、または完全長タンパク質を含む）と相互作用する幾つかの化合物の能力に基づく。目的とするペプチドと小分子化合物のプールを混合した後、ペプチド−リガンド複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによる非結合および結合小分子化合物の分離を可能にする質量シフトを誘導する。次いで、複合体は解離され、バインダーがペプチドから分離され、および正確な質量測定のため高分解能ＬＣ／ＥＳＩ−ＴＯＦを用いて検出される（例えばＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴプレミア質量分析計により）。データデコンボリューションアルゴリズムは、質量検出分析からの結合分子の同定を可能にする。
【００３２】
ＦＧＦＲの小分子化合物アロステリック調節因子を同定するには、この技術を天然のまたは変異された種々のＦＧＦ−Ｒの細胞外ドメインに適用することができる。天然型は、細胞外ドメインに対するバインダー全ての検出を可能にする。あるいはアロステリック調節因子は、ＳＳＲ結合部位に近接するＦＧＦ−Ｒ２ヘリックスの「開口（ｏｐｅｎ）」型を用いてスクリーニングすることができる。前記「開口」型は、アルファヘリックスを安定化し、これによりＳＳＲ結合への感作を可能にする変異Ｔｙｒ３２８Ａｒｇ−Ｉｌｅ３２９Ｌｙｓにより得ることができる。変異ＦＧＦ−Ｒ２は、次いでＷＴ  ＦＧＦ−Ｒ２の代わりにスクリーニングに使用される。類似の戦略を、ＦＧＦ−Ｒ２におけるＴｙｒ３２８およびＩｌｅ３２９に対応するアミノ酸に変異を有するＦＧＦ−Ｒ１、−Ｒ３または−Ｒ４をスクリーニングするのに使用することができる。Ｔｙｒ３２８Ａｓｐでの変異型（ＦＧＦ−Ｒ２）または対応する位置で変異を有する他のＦＧＦ−Ｒを、対照として使用することができる。実際、ＳＳＲは、疎水ポケット近傍のＴｙｒ３２８Ａｓｐで変異されたＦＧＦ−Ｒ２には結合しない。したがってこの変異型は、ＦＧＦ−Ｒ２における標的化ポケットと相互作用しない化合物の部分を廃棄するのに使用することができる。
【００３３】
全てのこれらの場合において、この戦略は、目的とするペプチドの標的ポケットに結合することができる小分子化合物の同定をもたらす。第２の段階では、細胞におけるシグナル伝達に対する効果が評価されなければならない。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）Ａｒｒａｙ「ヒトホスホ−キナーゼアレイキット」により同定されたリン酸シグナル伝達経路に基づき、プロテオームプロファイラーにより検出された影響を受けないキナーゼを阻害することなく、（ＰＹＫ２、ｅＮＯＳ、ｐ５３、ｃ−ｊｕｎ、ＡＫＴ、ＣＲＥＢ、Ｅｒｋ１／２において）リン酸化キナーゼレベルでＨＵＶＥＣに対するＦＧＦ−２効果を阻害する能力に関して、アロステリック調節因子を（細胞タンパク質抽出物でまたは細胞で直接）ＥＬＩＳＡによりチェックすることができる。
【００３４】
類似のアプローチを、他のＲＴＫに対して踏むことができる。受容体の細胞外ドメインにおける１つ以上のフラストレートされたドメインを同定した後、前記フラストレートされたドメインをＳＥＣ−ＬＣ／ＭＳアプローチで使用して、フラストレートされたドメインの領域におけるバインダーを同定することができる。シグナル伝達経路に対するバイン
ダーの効果は、次いで上記のようなホスホマップ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｐ）アプローチ、または経路の任意の他のレポーター系を用いてテストすることができる。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、本発明による「アロステリック阻害剤」とも呼ばれる、および／または本発明による方法により同定された、アロステリック結合部位に結合している小化合物化合物である。
【００３６】
「化合物」とは、単純または複合有機および無機分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、タンパク質、抗体、炭水化物、核酸またはこれらの誘導体を含む、任意の化学的または生物学的化合物を意味する。
【００３７】
（実施例）
例に対する材料および方法
ＳＴＤ−ＮＭＲ結合アッセイ
ヒトＦＧＦＲ１遺伝子（Ｐ１１３６２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ；アミノ酸：３９−３５８）をＰＣＲ増幅し、およびＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ベクターｐＥＴＴＥＶ（Ｎ末端Ｈｉｓ−タグの後にＴＥＶプロテアーゼ切断部位が続く）にクローン化した。タンパク質産生には、得られたプラスミド（ｐＥＴ
ＦＧＦＲ１  Ｄ１Ｄ２Ｄ３）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社）に形質転換した。細胞はＯＤ６００が０．６に達するまで３７℃で増殖させ、組換えタンパク質産生は１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して誘導した。４時間誘導後、細胞を回収し、使用まで−８０℃で貯蔵した。細胞ペレット（１Ｌ培養）を解凍し、リゾチーム（２ｍｇ）、および４０Ｕベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ社）を含有する５０ｍｌ緩衝液１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した。細胞を超音波処理により破壊し、封入体（ＩＢ）を遠心分離（１５，０００ｇ、２０分、４℃）により沈降させ、得られたペレットを緩衝液１で２回洗浄した。ＩＢペレットは２０ｍｌ変性緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に室温で４０分間溶解した。可溶性デブリを遠心分離（３０，０００ｇ、３０分）により除去し、上清を、製造者の推奨に従って緩衝液Ａで事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に添加した。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤは、５００ｍＭイミダゾールを含む変性緩衝液を用いてカラムから溶出した。ＥＣＤを含有する画分をプールし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％アジドへの可溶化タンパク質のフラッシュ希釈（ｆｌａｓｈ−ｄｉｌｕｔｉｎｇ）（希釈係数１：３０）と、この後の２４時間、４℃で穏やかな撹拌によるインキュベーションによりリフォールディングした。リフォールディング混合物を２０分間、３０，０００ｇで遠心分離し、アミコン撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ）でＹＭ１０膜を通じて濃縮し（最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）、２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％アジドに対して透析し、ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰ  ５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適用し、０から２Ｍ  ＮａＣｌへの直線勾配で溶出した。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤの最終精製は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％アジドで平衡化したＨｉ  Ｌｏａｄ２６／６０  ７５ｐＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより達成した。ＦＧＦ１（アミノ酸：１６−１５５）およびＦＧＦ２（アミノ酸９−１５５）およびＴＮＦ−Ｒｉαを発現させ、精製した。ＦＧＦＲ１  ＥＣＤの構造完全性は、ヘパリンカラム（上記参照）に結合する能力およびＦＧＦ１との複合体の形成により実証した。複合体形成は、サイズ排除クロマトグラフィーおよびこの後のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析により分析した。
【００３８】
全てのＳＴＤ−および１Ｄ−ＮＭＲ実験は、ＢＲＵＫＥＲ３チャンネルＤＲＸ６００お
よびＢＲＵＫＥＲ４チャンネルＤＲＸ８００スペクトロメーターで２９８Ｋの標準温度で行い、および内部標準３−トリメチル−２，２，３，３−テトラジュウテロプロピオン酸−ナトリウム塩（ＴＳＰ）を基準にした。典型的には、ＮＭＲ試料は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％アジド（９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ中）中に０．５ｍｌのタンパク質（２０−３００ｍＭ）を含有した。タンパク質リガンド１Ｄ  ＳＴＤ  ＮＭＲ測定のため、スペクトルを、別々のタンパク質メチル共鳴での弱い２秒ＲＦ照射により、１ｍＭリガンドＳＳＲ１２８１２９Ｅ（１００ｍＭ  ＤＭＳＯ原液）および４０ｍＭタンパク質で記録した。水抑制は、標準Ｂｒｕｋｅｒ  ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ３−９−１９シーケンスを用いて行った。ＮＭＲデータは、Ｂｒｕｋｅｒプログラムｘｗｉｎ  ＮＭＲソフトウェアを用いて処理した。
【００３９】
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）
熱量測定実験は全て、以前に記載されているように４５、ＶＰ−ＩＴＣ滴定熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｉｎｃ．社、ノーサンプトン、ＭＡ）により３０℃で実施した。滴定は、１．４０７ｍＬの１０−２０μＭ相互作用タンパク質（すなわちＦＧＦＲ２∂１２３、ＦＧＦＲ２∂２３ならびにこの記載された変異体およびサブドメイン、ＦＧＦＲ３∂１２３、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２ならびにホリスタチン（陰性対照として）を含有する溶液細胞への、４分間隔、回転撹拌器−シリンジを介した１．２５ｍＭ  ＳＳＲの１０μＬアリコートの添加を伴った。３００ｒｐｍの一定撹拌速度を維持し、データをＭｉｃｒｏＣａｌ社により供給された標準非相互作用一部位モデル（ｎが１．０に固定される。）に適合させた。測定は全て、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで実施し、タンパク質を以前に記載されているように（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、２０００年）精製した。変異誘発は「部位特異的変異誘発キット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて実施した。
【００４０】
フーリエ変換赤外線測定
フーリエ変換赤外線測定は、ＡｑｕａＳｐｅｃフローセルを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｔｅｎｓｏｒ  ３７  ＦＴ−ＩＲスペクトロメーターを用いて実施した。試料コンパートメントは２５℃に温度自動調節し、ノイズ比に対し良好なシグナルについて１００スペクトルを平均化した。タンパク質は上記のように精製した。ゲル濾過直後、タンパク質を、ＳＳＲの存在下または非存在下、同じ調製の緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で一晩透析した。透析緩衝液試料を使用してバックグラウンドシグナルを減算した。分析は、Ｂｒｕｋｅｒにより提供されたＯＰＵＳソフトウェアパッケージを用いて実施した。結果の解釈は記載されているように実施した｛Ｂａｒｔｈ、２００２年  ＃６０｝。
【００４１】
ＨＥＫ２９３トランスフェクションならびにＥｒｋ１／２、ＰＬＣγおよびＦＲＳ２リン酸化試験
ＨＥＫ２９３細胞は、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化したｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃａまたはｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃａ−Ｙ３２８Ｄを（ＦｕＧＥＮＥ６、Ｒｏｃｈｅ社を用いて）一時的にまたは安定にトランスフェクトした。安定にトランスフェクト細胞はＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）含有培地で増殖させた。刺激前、細胞を一晩、ＤＭＥＭ（０％血清）で飢餓状態にし、および必要とされる濃度でＳＳＲ１２８１２８Ｅと一緒にプレインキュベートした。細胞をこの後、１μＭでのＳＳＲまたはＳＵ５４０２ありまたはなしにより３７℃、５分間、ＦＧＦ２（０．５−１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度）で刺激した。ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（製造者（Ｒｏｃｈｅ社）により記載されているようにホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する、Ｔｒｉｓ  ３０ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトン−Ｘ、０．５％ｗ
／ｖデオキシコール酸）で溶解した。細胞溶解物を１０分間、１２，０００ｇで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質をＮｏｖｅｘポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）で分離し、この後Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に移した。ＰＢＳで５％非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を以下の抗体：ホスホ−ＥＲＫ１／２（ＣＳＴ：９１０１）、ホスホ−ＦＲＳ２（ＣＳＴ：３８６１）、ホスホ−ＰＬＣγ（ＣＳＴ：２８２１）およびＦＧＦＲ２（Ｆ０３００、Ｓｉｇｍａ社）と一緒に一晩、４℃でインキュベートした。
【００４２】
ＦＧＦＲトランスフェクトＢａＦ／３細胞増殖：
この実験に使用されたＢａＦ／３細胞の構築は、出願ＷＯ２００７／０８０３２５に詳細に記載されている。
【００４３】
定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）およびＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてＨＵＶＥＣから単離し、全ＲＮＡからこの後Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてｃＤＮＡを調製した。プライマーセットおよびＦＡＭ（商標）色素標識ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、ベルギー）を、ヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、およびＴＢＰ用に設計し、ＰＣＲ反応は７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ社、ドイツ）で行った。各試料は、特定の標準対照および非テンプレート対照と一緒に三通りに分析した。増幅は、２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘを用いて行った。各試料における最初のｍＲＮＡコピー数の計算は、サイクル閾値（ＣＴ）方法により行った。ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｍＲＮＡのコピー数は、ＴＢＰ  ｍＲＮＡレベルを用いて正規化した。
【００４４】
ＦＧＦＲ１リン酸化測定
ｈＦＧＦＲ１ＩＩＩｃα−ヘマグルチニンを安定にトランスフェクトされたラット脂肪パッド内皮細胞を、８０−９０％培養密度に増殖させ、２４時間血清飢餓状態にした（０．５％ＦＢＳ）。刺激は、ＳＳＲまたはＤＭＳＯ（対照として）と組み合わせて２ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２で５分間実施した。細胞溶解物を１０分間、１２，０００ｇで遠心分離し、上清を回収した。ＨＡタグ付タンパク質を、アガロース結合抗ＨＡ抗体の存在下、一晩、４℃で細胞培養物のインキュベーションにより免疫沈降させた。免疫複合体は１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄した。タンパク質は、５０μｌの２×ＳＤＳ試料緩衝液と一緒のインキュベーションおよび煮沸を介して溶出した。タンパク質をＮｏｖｅｘポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）で分離し、この後Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に移した。ＰＢＳで５％非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を以下の抗体：ｐＦＧＦＲ（ＣＳＴ：３４７１）およびＦＧＦＲ１（ＣＳＴ：３４７２）と一緒に一晩、４℃でインキュベートした。
【００４５】
異方性測定
ＳＳＲが、結合ポケットへのＦＧＦ１の結合を阻害するかどうかを評価するため、本発明者らはＦｃタグなしのＦＧＦＲ２の全細胞外ドメイン（ＦＧＦＲ２∂１２３）を精製し、およびＳＳＲ（１ｍＭ）なし（青）またはあり（赤）のさまざまな濃度のＦＧＦＲ２∂１２３の存在下、蛍光ｌｕｍｉｏタグ付ＦＧＦ１（ＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏ；１μＭの定濃度）の反転速度（異方性のパラメーターとして）を測定した。ＦＧＦＲ２∂１２３をＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏに添加した場合、リガンド／受容体複合体の反転速度は、該複合体のよ
り大きなサイズのためＦＧＦ−ｌｕｍｉｏ単独の反転速度より遅かった。ＳＳＲの大きなモル過剰（１０００倍）は複合体の反転速度を変化させず、ＳＳＲがＦＧＦＲからＦＧＦを移動させないことを確認した。
【００４６】
ＨＵＶＥＣ増殖
コンフルエントなＨＵＶＥＣ細胞を回収し、０．５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＳＨ３００７０．０３）、２ｍＭグルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１１４０−０３５）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１３６０−０３９）を含む１００μｌ  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）中の５  １０４細胞を、一晩、９６ウェルコラーゲンＩコーティングプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、３５４６５０）にウェルごとに播種する。次いで、培地を除去し、ならびに２×ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ社、２３４−ＦＳＥ−０２５）、ＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ社、２３５−Ｆ４−０２５）またはＦＧＦ−１９（自家製造）および５０μｌの２×ＳＳＲ（２００または６００ｎＭ）を含有する５０μｌの培地に置換する。細胞をＣＯ２チャンバーで３日間、３７℃でインキュベートし、増殖を１００μｌの「Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＧＩｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存能」キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ７５７１）でＡＴＰ含量を定量化して評価する。
【００４７】
ＨＵＶＥＣ走化性遊走
コンフルエントなＨＵＶＥＣ細胞を回収し、およびＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１１４０−０３５）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１３６０−０３９）を含まないＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）に０．８  １０６細胞／ｍｌで再懸濁する。２５０μｌの細胞溶液を、内皮細胞遊走のための２４ウェルＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ血管新生システム（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ社、３５４１４４）の上のチャンバーに４×ＳＳＲで分配し、および７５０μｌの培地を、ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ社、２３４−ＦＳＥ−０２５）、ＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ社、２３５−Ｆ４−０２５）またはＦＧＦ−１９（自家製造）を含む下のチャンバーに６７ｎｇ／ｍｌで分配する。プレートをＣＯ２チャンバーで２２時間、３７℃でインキュベートする。次いで、プレートインサートを除去し、および５００μＬのカルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、Ｃ−３１００）を含有する新たな２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、３５３５０４）に９０分間入れる。次いで遊走細胞が蛍光し、遊走を４８５ｎｍ励起および５３５ｎｍ発光後、ダウンステアズリーディング（ｄｏｗｎｓｔａｉｒｓ  ｒｅａｄｉｎｇ）でルミノメーターにより測定する。
【００４８】
ＨＵＶＥＣインビトロ血管新生
コラーゲン／マトリゲルゲルは、チャンバースライド（Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｅｌｌｗａｒｅコラーゲン、タイプＩ、８ウェル培養サイド（ｃｕｌｔｕｒｅｓｉｄｅ）：Ｂｅｃｔｏｎ  ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社  ３５４６３０）の各ウェルに、コラーゲンＩ（ラット尾コラーゲン、タイプＩ：Ｂｅｃｔｏｎ  ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社  ３５４２３６）中１６０μｌの１／６希釈マトリゲル（増殖因子低減マトリゲル：Ｂｅｃｔｏｎ  ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社  ３５６２３０）を分配して調製する。重合が１時間、３７℃で生じる。次いで、１５．１０３ＨＵＶＥＣを、４００μｌ  ＥＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社  Ｃ３１２１）＋２％ＦＣＳ＋ｈＥＧＦ  １０μｇ／ｍｌにウェルごとに添加する。内皮細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ社、１３３−ＦＢ−０２５）、ＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ社、２３５−Ｆ４−０２５）またはＦＧＦ１９（Ｒ＆Ｄ社、９６９−ＦＧ−０２５）で、ＣＯ２チャンバーで２４時間、３７℃で刺激する。次いで、完全長の偽細管をバイオイメージングシステム（Ｉｍａｇｅｎｉａ  Ｂｉｏｃｏｍ社、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて定量化する。
【００４９】
ＨＵＶＥＣにおけるＡＫＴリン酸化のウェスタンブロット分析
ＨＵＶＥ細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、Ｃ−１２２００）は、２％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＣＣ−４１０１）、ＥＧＭ  ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＣＣ−４１３３）からの１０μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＣＣ−４０１７）、１２５０ｎｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｈ３１４９）および３７５ｎｇ／ｍｌ  ＥＣＧＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５６００６）を含有する２ｍｌのＥＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＣＣ−３１２１）中０．５．１０６細胞で、３５ｍｍコラーゲンＩコーティングディスク（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ、３５４４５６）に播種する。９０％培養密度で、細胞を１．８ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）、０．５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１１１４０−０５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１１３６０−０７０）で一晩飢餓状態にする。翌日、細胞を、１０×ＳＳＲ（３μＭ）ありまたはなしの１０×ＦＧＦ−４（３０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社、２３５−Ｆ４−０２５）を含有する２００μｌの平衡化飢餓培地により１０分間刺激する。次に、細胞を冷ＰＢＳですすぎ、細胞を、２．５ｍＭオルトバナジウム酸およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ８３４０）を含有する７５μｌ  ＲＩＰＡで溶解する。細胞溶解物を１０分間、１２，０００ｇで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を４−２０％Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で分離し、この後ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＩＢ３０１０−０１）に移した。ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０で５％非脂肪乳粉と一緒にインキュベーションした後、膜を、ＴＢＳで１０００×希釈した抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、ＣＳＴ、４０５８）、ｔｗｅｅｎ、１％ＢＳＡと一緒に一晩、４℃でインキュベートした。各スポットのシグナルがＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３４０７６）による化学発光検出後に得られ、スポット密度をＢｉｏｌｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｈｅｍｉｇｅｎｉｕｓ２（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）を用いて定量化する。
【００５０】
オンセルＡＫＴリン酸化ＥＬＩＳＡ
コンフルエントなＨＵＶＥＣ細胞を回収し、０．５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＳＨ３００７０．０３）、２ｍＭグルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１１４０−０３５）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１３６０−０３９）を含む５０μｌ  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）中の５  １０４細胞を、一晩、９６ウェルコラーゲンＩコーティングプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、３５４６５０）にウェルごとに播種する。細胞は、２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ４および６００ｎＭＳＳＲを含有するＦＣＳなしで１００μｌ平衡化飢餓培地で５分間刺激する。次いで、５０μｌのＰＦＡ８％をＰＢＳ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、１８８１４）に室温で１５分間添加し、細胞を２００μｌ  ＰＢＳで２分間、３回洗浄する。非特異的部位は、ＰＢＳ、トリトン０．３％、正常ヤギ血清０．１％（Ｚｙｍｅｄ社、５０−０６２Ｚ）により室温で１時間ブロックし、ブロッキング緩衝液を作製し、およびＰＢＳで１／５００希釈した抗ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体（ＣＳＴ、４０５８）、トリトン０．３％に一晩置換する。一次抗体を次いで除外し、および２００μｌ  ＰＢＳで２分間、３回洗浄した。ＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（ＣＳＴ、７０７４）を使用して、ＰＢＳ、０．３％トリトンで２時間、室温で１／２０００希釈した後、ＡＫＴリン酸化を検出する。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、１００μｌのＨＲＰ基質（Ｕｐｔｉｍａ社、ＵＰ６６４７８１）を暗室で２０分間添加する。酵素反応を１００μｌの停止緩衝液（Ｕｐｔｉｍａ社、ＵＰＳ２９５９０）で停止し、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。
【００５１】
ＦＧＦＲトランスフェクト３００−１９細胞に結合するＦＧＦ２：
ＦＧＦ２は、購入者の推奨に従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  Ｃ５−マレイミド
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１０２５４）で標識した。
【００５２】
このＡＦ４８８−ＦＧＦ２は、ｐＥＦ６−Ｖ５／Ｈｉｓ  Ｔｏｐｏプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ４構築物をトランスフェクトしたマウスプレ−Ｂ  ３００−１９細胞での結合実験において１０ｎｇ／ｍｌで使用した。ＳＳＲ（３００ｎＭ最終）は、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＳＨ３００７０．０３）、２ｍＭグルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１１４０−０３５）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１３６０−０３９）および１５０ｍＭモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ６１４５）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）で、１５０ｒｐｍ撹拌下、４℃で細胞と一緒に２０分間プレインキュベートしていた。次いで、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ最終）を３０分間添加し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて結合を測定する。条件ごとに蛍光培地も分析する。
【００５３】
さまざまな増殖因子による細胞遊走
細胞遊走は、ポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．社）を有する８μｍ孔径トランスウェル透過性支持体を含有する２４ウェルインサートを用いて、改変ボイデンチャンバーアッセイにより評価した。指数関数的に増殖している細胞を０．２％ＦＢＳ含有培地で１６時間飢餓状態にし、および同じ低血清培地に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を上のチャンバーに播種したのに対し、化学誘引物質および／またはＳＳＲは下のチャンバーに入れた。テストした化学誘引物質には、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ−Ｉ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ（ＳＳＲ（１μＭ）の存在下または非存在下、全て１００ｎｇ／ｍｌ）が含まれる。１０％ＦＢＳ含有培地は陽性対照として使用した。３７℃で６時間インキュベーションした後、膜の上側の細胞は綿棒を用いて擦り取ったのに対し、下表面の遊走細胞はＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定し、および蛍光マイクロソープ（ｍｉｃｒｏｓｏｐｅ）を用いた定量化のためＤＡＰＩで核染色した。定量化は、１０×の倍率で５枚のランダム画像を作製しおよび核の数をカウントして実施する。
【００５４】
ＰＡＮＣ０２増殖および遊走：
細胞増殖は、０．２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＳＨ３００７０．０３）、２ｍＭグルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１１４０−０３５）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム  １×（Ｇｉｂｃｏ社、１１３６０−０３９）を含む１００μｌ  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３２４０４−０１４）で１６時間飢餓状態にしおよび９６ウェルマイクロプレートに４，０００細胞／ウェルで播種した、指数関数的に増殖している細胞で分析した。分裂促進因子および／またはＳＳＲに７２時間曝露した後、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）を使用して製造者の指示に従ってアッセイした。細胞遊走は、ポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．社）を有する８μｍ孔径トランスウェル透過性支持体を含有する２４ウェルインサートを用いて、改変ボイデンチャンバーアッセイにより評価した。指数関数的に増殖している細胞を０．２％ＦＢＳ含有培地で１６時間飢餓状態にし、および同じ低血清培地に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を上のチャンバーに播種したのに対し、化学誘引物質および／またはＳＳＲは下のチャンバーに入れた。１０％ＦＢＳ含有培地は陽性対照として使用した。３７℃で６時間インキュベーションした後、膜の上側の細胞は綿棒を用いて擦り取ったのに対し、下表面の遊走細胞は４％ホルムアルデヒドで固定し、および定量化のためＤＡＰＩで核染色した。
【００５５】
Ｂ９骨髄腫細胞増殖：
細胞増殖は、ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３１９８００４８）、０．２％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン含有培地で１６時間飢餓状態にしおよび９６ウェルマイクロプレートに４，０００細胞／ウェルで播種した、指数関数的に増殖している細胞で分析した。分裂促進因子および／またはＳＳＲに７２時間曝露した後、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）を使用して製造者の指示に従ってアッセイした。
【００５６】
アルファスクリーンシュアファイアアッセイ
０日目：ＨＥＫ２９３：ｍＶＥＧＦＲ２ｗｔ細胞またはＨＥＫ２９３：ＰＤＧＦＲβ細胞を１００００細胞／ウェル（９６ウェルプレート細胞結合Ｃｏｓｔａｒ）でプレーティングし、一晩接触させる
１日目：細胞をＤＭＥＭ（０％血清）で最低３時間飢餓状態にする：５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６４またはＰＤＧＦ−ＢＢの混合物をＤＭＥＭ（０％血清）で調製し、５または１５分間刺激する：シュアファイアアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）からの溶解緩衝液で細胞を溶解する：５０μｌの緩衝液で細胞を溶解し、プレートをＲＴで１０分間撹拌し、次いでさらなる使用まで−２０℃で凍結する；タンパク質と溶解緩衝液の混合物を作製し、および製造者の指示に従ってｐＥＲＫ１／２、合計ＥＲＫ１／２ならびにカスタムデザインされたｐＰＬＣγおよび合計ＰＬＣγで分析する。
【実施例１】
【００５７】
アロステリック、マルチＦＧＦＲ阻害剤としてのＳＳＲ１２８１２９Ｅの同定
この試験の目的は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合しおよびＦＧＦＲシグナル伝達を阻害する低分子量化学化合物を開発することであった。小分子化合物が、オルソステリック部位に対する単純な立体障害を介してはるかに大きなポリペプチド（すなわちＦＧＦ）とどのように相互作用できるかを構想することは困難であることから、複数のリガンド結合アッセイフォーマットを利用して、任意の同定された化合物がアロステリック機構を介してオルソステリックに作用しているかどうかを判定した。本発明者らは最初に、ハイスループットシンチレーション近接結合アッセイ（ＳＰＡ）を開発して、Ｆｃ−フラグメントに結合した、３つのＩｇ様ドメインＤ１−３（ＦＧＦＲ１∂１２３／Ｆｃ）から成る、ＦＧＦＲ１−ＥＣＤへの１２５Ｉ−ＦＧＦ２の結合を阻害する化合物を同定した。＞２０，０００化合物のスクリーニングおよび化学的最適化の後、１つの化合物、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ（以後「ＳＳＲ」と略す）が、１２５Ｉ−ＦＧＦ２結合を阻害した。追加のＳＰＡアッセイでは、ＳＳＲは、さまざまなＦＧＦＲへの種々のＦＧＦリガンドの結合をブロックする一方で、関連した構造相同性または全く異なる化学組成を有する＞１００の異なるリガンドと同種受容体との結合を阻害しない、マルチＦＧＦＲ阻害剤として作用した。この知見は、競合的（オルソステリック）機構、または高い負の協同性（ＣｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓおよびＫｅｎａｋｉｎ、２００２年）を特徴とする他のアロステリック相互作用のどちらかを示唆した。
【００５８】
アロステリック相互作用の１つの顕著な特徴は、「プローブ依存性（ｐｒｏｂｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）」、すなわち、調節因子が相互作用しているオルソステリックリガンド−受容体複合体の性質に依存するアロステリック相互作用の大きさおよび方向の変動の現象である（Ｍａｙら、２００７年）。ＳＰＡでの１２５Ｉ−ＦＧＦ２結合に対するＳＳＲの効果が、人工基質にプレーティングされた改変ＦＧＦＲ／Ｆｃ融合タンパク質の立体配置に依存したかどうかを判定するため、本発明者らは次に、異方性のパラメータとしての反転速度を測定して、ＳＳＲが、Ｆｃ−タグなしのＦＧＦＲ２の精製ＥＣＤ（ＦＧＦＲ２∂１２３）への、蛍光ｌｕｍｉｏタグ付ＦＧＦ１（ＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏ）の結合を阻害するかどうかを試験した。ＦＧＦＲ２∂１２３をＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏに添加した場合、リガンド／受容体複合体の反転速度は、該複合体のより大きなサイズのためＦＧＦ−ｌ
ｕｍｉｏ単独の反転速度より遅かった。ＳＳＲがリガンド結合を阻害したなら、反転速度は再び増加するはずである。しかし、＞１，０００倍のモル過剰でさえ、ＳＳＲは複合体の反転速度を変化させなかった。これは、ＳＳＲとＦＧＦ１−ｌｕｍｉｏの間の直接競合の欠如を示唆している（図５Ａ）。最後に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはＦＧＦＲ１を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥ−ＦＧＦＲ１）でのＩ１２５−ＦＧＦ２による結合アッセイもまた、後者がＰＡＥ−ＦＧＦＲ１がインタクトな細胞においてより自然な立体構造で発現される場合、ＳＳＲが（高μＭ濃度でさえ）受容体へのＩ１２５−ＦＧＦ２結合を阻害できないことを明らかにした。しかし、αＦＧＦ２抗体を中和することは効果があった。この後者の実験パラダイムでは、およびＳＰＡとは対照的に、ＳＳＲは、他のＦＧＦＲへの別のＦＧＦリガンド（すなわちＦＧＦＲ２へのＦＧＦ２またはＦＧＦ４；ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ２）の結合も拮抗しなかった。
【００５９】
まとめると、これらの結果から、ＦＧＦリガンドの結合に対するＳＳＲの阻害剤活性は、ＦＧＦＲの立体構造に高度に依存しており、重複する結合ドメインの立体障害に依存する単純な競合的機構とは一致しなかったことが示される。ＦＧＦＲについて本明細書で述べたように、アッセイ条件に応じてオルソステリックリガンドの結合に示差的に影響する小分子化合物アロステリック調節因子の能力は、ＧＰＣＲの分野で以前に報告されている（Ｌｉｔｓｃｈｉｇら、１９９９年；Ｐｒｉｃｅら、２００５年）。恐らく、ＦＧＦＲ１∂１２３／Ｆｃが、ＳＳＲの結合による１２５Ｉ−ＦＧＦ２の親和性に対する負のアロステリック効果の伝達を可能にする立体構造に存在するのに対し、Ｆｃタグ、すなわち天然の環境におけるインタクトな受容体全体の発現の欠如は存在しない。
【実施例２】
【００６０】
ＳＳＲはアロステリックおよびマルチＦＧＦＲ阻害剤である。
ＦＧＦＲ遺伝子発現（図１Ｂ）およびＦＧＦＲ１バリアント（図１Ｃ）を検出する特定のプライマーを用いた定量的ＰＣＲ（図１Ａ）およびＲＴ−ＰＣＲによるＨＵＶＥＣ細胞（Ｃ−１２２００、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）でのＦＧＦＲ発現分析は、ＦＧＦ−Ｒ４およびＦＧＦ−Ｒ１β３ｃの発現のみを実証したことから、本発明者らは、ＨＵＶＥ細胞を最初に用いて異なるＦＧＦＲでのＳＳＲの拮抗活性を試験した。ＦＧＦ１９はＦＧＦＲ４を特異的に刺激することが知られているのに対し、ＦＧＦ４（ＦＧＦ１９ではなく）はＦＧＦＲ１−ｈＭｐｌ融合タンパク質をトランスフェクトしたＢａＦ／３細胞においてＦＧＦ−Ｒ１のみを活性化する（図２Ａ）一方、ＦＧＦ１９は活性化できない（図２Ｂ）。したがって、ＨＵＶＥＣにおいてＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４は、それぞれＦＧＦ４およびＦＧＦ１９で刺激することができる。
【００６１】
ＨＵＶＥＣ増殖は、ＦＧＦ２およびＦＧＦ４で刺激されるが、ＦＧＦ１９では刺激されず（図４Ａ）、ＨＵＶＥＣ増殖がＦＧＦＲ１の制御下にあることを示唆している。ＳＳＲは、ＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ増殖を阻害することができ、ＳＳＲがＦＧＦＲ１β３ｃ受容体を阻害することを示している（図４Ｂ）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはＦＧＦＲ１を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥ−ＦＧＦＲ１）でのＩ１２５−ＦＧＦ２による結合アッセイは、ＳＳＲが（高μＭ濃度でさえ）受容体へのＩ１２５−ＦＧＦ２結合を阻害できないことをさらに明らかにした。しかし、αＦＧＦ２抗体を中和することは効果があった（図４Ｄ）。本発明者らはまた、ＳＳＲが、ＦＧＦＲシグナル伝達における重要な段階であるＦＧＦＲの自己リン酸化を阻害するかどうかも分析した。ラット脂肪パッド内皮細胞で発現されたＦＧＦＲ１の免疫沈降とこの後のリン酸化ＦＧＦＲ１の免疫ブロットは、ＦＧＦ２誘導ＦＧＦＲ１チロシンリン酸化が、ナノモル濃度範囲でＳＳＲにより高度に低減されることを明らかにした（図４Ｃ）。特に、高用量でさえ、ＳＳＲはＦＧＦＲ１チロシンリン酸化を完全には排除せず、低い残基レベルを残した（図４Ｃ）。ＦＧＦＲ２細胞外ドメインに結合するｌｕｍｉｏタグ付ＦＧＦ１に対するＳＳＲ効果が分析されており、ＳＳＲはＦＧＦ１／ＦＧＦＲ２相互作用を阻害しない（図５Ａ）。同様
に、ＳＳＲはＦＧＦＲ２またはＦＧＦ２二量体化を阻害することができる（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【００６２】
ＨＵＶＥＣの遊走も、ＦＧＦ１９ではなくＦＧＦ２−およびＦＧＦ４により刺激した（図６Ａ）。この関連で、ＳＳＲは、ＦＧＦＲ１活性を阻害し、ＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ走化性遊走の低減をもたらすこともできる（図６Ｂ）。
【００６３】
反対に、インビトロ血管新生は、ＦＧＦ２およびＦＧＦ１９により刺激されるのに対し、ＦＧＦ４は不活性であり、ＦＧＦＲ４がこのアッセイではインビトロ血管新生を制御することを示唆している（図７Ａ）。低いナノモル範囲では、ＳＳＲはＦＧＦ２誘導ＨＵＶＥＣ血管新生をブロックし、ＳＳＲがＦＧＦＲ４に制御される細胞プロセスを阻害できることを実証している（図７Ｂ）。
【００６４】
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂバリアントに対するＳＳＲ活性を評価するため、ＰＡＮＣ０２細胞の増殖および遊走が使用された。この理由は、これらの細胞反応が、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂの特異的リガンドである１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ７により刺激され得るためである（図８Ａおよび８Ｂ）。ＶＥＧＦの有無にかかわらず、ＦＧＦ７誘導は１００ｎＭ  ＳＳＲ添加によりブロックされ、ＳＳＲがＦＧＦＲ２受容体および３ｂバリアントを阻害できることを示している（図８Ａおよび８Ｂ）。
【００６５】
ＦＧＦＲ３に対するＳＳＲ効果を試験するため、ＦＧＦＲ３ＷＴまたはＦＧＦＲ３ＴＤ（いずれかのリガンドの非存在下でさえ、Ｋ６５０Ｅ変異により誘導される構造的活性化ＦＧＦＲ３バリアント；Ｔｒｕｅｄｅｌら；ｂｌｏｏｄ  ２００６年）のどちらかを発現するＢ９−骨髄腫細胞の増殖を、ＦＧＦ１（２５ｎｇ／ｍｌ）による刺激によりアッセイした。Ｂ９−ＦＧＦＲ３ＷＴ細胞系が、ＦＧＦ１により誘導され得および０．１μＭのＳＳＲにより阻害され得る（図９）のに対し、Ｂ９−ＦＧＦＲ３ＴＤ細胞系はＳＳＲに非感受性であった（図９）。これは、ＳＳＲがＦＧＦＲ３受容体を阻害できることを示しており、ＳＳＲがＦＧＦＲのキナーゼドメインで作用しないことを確認するものである。
【００６６】
まとめると、これらの結果は、ＳＳＲが全てのＦＧＦＲアイソフォーム（ＦＧＦＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４）およびＦＧＦＲバリアントを阻害できることを示している。
【実施例３】
【００６７】
ＳＳＲは他の増殖因子により誘導される細胞反応を阻害できない。
ＳＳＲがＦＧＦ依存性シグナル伝達効果を示差的に阻害したことから、本発明者らは次に、ＳＳＲがインビトロでのＦＧＦ依存性細胞反応にも影響するかどうかを調査した。ＨＵＶＥＣを用いると、ＳＳＲはＦＧＦ２の走化性効果を阻害した。
【００６８】
ＳＳＲは、いずれもチロシンキナーゼ受容体ファミリーのメンバーを活性化することが知られているＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩＧＦにより誘導された細胞反応に影響しなかった（図１０）。
【実施例４】
【００６９】
ＳＳＲ１２８１２９ＥはＦＧＦＲの細胞外領域のＩｇ様ドメインＤ３におけるアロステリック部位に結合する。
ＳＳＲはマルチＦＧＦＲ阻害剤であったことから、本発明者らは、さまざまな（ヒト）ＦＧＦＲサブタイプのポリペプチドフラグメントを使用した。ＳＳＲの飽和移動差ＮＭＲ（ＳＴＤ−ＮＭＲ）スペクトルは、ＳＳＲがＦＧＦＲ１のＥＣＤ（ＦＧＦＲ１∂１２３）に結合することを明らかにした（図１１Ａ）。これは、一次元（１Ｄ）−ＮＭＲプロファイルの分析により確認され、これがＳＳＲの添加時のＦＧＦＲ１∂１２３シグナルのピー
ク拡大を明らかにした（図１１Ａ）。この結合はＴＮＦ−Ｒ１細胞外タンパク質では観察されないため、この結合は特異的である（図１１Ａ）。本発明者らは次いで、ＦＧＦＲのＥＣＤフラグメントを使用して３つのＩｇドメインの１つに対するＳＳＲの結合部位をマッピングした。ドメインＤ３（ＦＧＦＲ１∂３）のみを含有するフラグメントの１Ｄ−ＮＭＲ測定は、この膜近傍ドメインにおいてＳＳＲの結合部位を同定した（図１１Ｂ）。事実、ＦＧＦＲ１∂３およびＦＧＦＲ１∂１２３は、本発明者らがこれらのタンパク質について同じ親和性を得たことを意味する同一のシグナル（太線）を与えるのに対し、ＦＧＦＲ１∂１２およびＦＧＦＲ１∂２は明確な線（図１１Ｂ）をもたらす。２つのＥＣＤフラグメント、ＦＧＦＲ２∂２３（ドメインＤ２および３から成る）およびＦＧＦＲ３∂２３を用いた等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、ＳＳＲがＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３に結合することを明らかにした（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。
【００７０】
ＦＧＦＲのドメインＤ３へのＳＳＲの結合は特異的であった。この理由は、ＩＴＣまたはＳＴＤ−ＮＭＲにより分析した場合、該化合物がＦＧＦ−リガンド（ＦＧＦ１およびＦＧＦ２；図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ）に結合しなかったためである。さらに、ヘパリンはＦＧＦＲへのＳＳＲの結合を妨げなかった。この理由は、ＳＴＤ−ＮＭＲが、ヘパリン類似体八硫酸スクロース（ＳＯＳ、図１２Ｄ）の存在下または非存在下、ＦＧＦＲへのＳＳＲの同等のシグナルを明らかにしたためである。
【実施例５】
【００７１】
ＳＳＲのアロステリック結合はＦＧＦＲにおける立体構造変化を誘導する。
本発明者らは次いで、先行実験で同定された領域へのＳＳＲの結合により媒介されたＦＧＦＲの立体構造変化の直接的証拠を、本発明者らが得ることができるかどうかを調べた。したがって、本発明者らは、ドメインドメインＤ２−３（ＦＧＦＲ２∂２３）から成る、ＦＧＦＲ２のＥＣＤフラグメントのフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光測定を実施した。どちらかのバリアントへのＳＳＲの添加は、全体的な立体構造変化と一致する、１，６４０ｃｍ−１周辺で最大となる、ＦＴＩＲスペクトルのアミドＩバンドの振幅の増加をもたらした（図１２Ａ）。
【００７２】
本発明者らは次に、ＳＳＲが、Ｄ３におけるオルソステリック部位の部分を形成するアミノ酸残基または別のアロステリック部位に結合するかどうかを調べた。最初に、本発明者らは、ソフトウェアパッケージＭＯＬＥＧＲＯ、ＡｕｔｏｄｏｃｋおよびＹＡＳＡＲＡならびに利用可能な結晶学的データの分子ドッキングアルゴリズムを使用した。両方の方法を用いたＦＧＦＲ２∂３でのＳＳＲのドッキングランは、２つの想定される結合部位（１つはＨｉｓ２９３周辺に集中し、もう１つはＴｙｒ３２８周辺に集中していた。）を同定した。これらの想定される結合部位は、ＦＧＦリガンド結合部位と比べて、受容体の反対面に位置しおよびオルソステリック結合部位から２５Åまでの疎水ポケットを形成する。特に、両方の残基は、オルソステリックＦＧＦ結合ポケットの残基と重複しない。両方の想定されるＳＳＲ結合部位の機能的関連性を評価するため、本発明者らは、分子力場ＦｏＩｄＸソフトウェア（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚら、２００５年）を使用して、アロステリックリガンド結合を低減または排除するが、構造の全体的な立体構造安定性を撹乱しない変異を設計した：（ｉ）芳香族残基を負に帯電されたアスパラギン酸と置換してＳＳＲとの疎水性相互作用を除去するＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄ；（ｉｉ）ＳＳＲの他の想定される結合部位から必須残基を除去するＦＧＦＲ２∂２３−Ｈ２９３Ｌ；および（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄ／Ｈ２９３Ｌ二重変異体（ＦＧＦＲ２∂２３−ＹＨと呼ばれる）。ＩＴＣ結合実験は、ＳＳＲがＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄに結合しないことを示している（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。これらの知見は、ＳＳＲが、オルソステリックリガンド結合部位近傍の疎水ポケットにより形成されたアロステリック部位に結合するモデルで、および残基Ｔｙｒ３２８はＳＳＲとＦＧＦＲ２の間の相互作用を媒介するのに必須と思われるモデルと一致する。本発明者らはまた、前述の変異ＦＧＦＲ２フラグメン
トのＦＴＩＲスペクトルも分析した。これらの単一または二重変異は、ＦＴＩＲスペクトルにおける重大なシフトを誘導しなかった。これは、これらのＦＧＦＲバリアントの全体的な三次元立体配置が同等であることを示している。ＳＳＲは、ＦＧＦＲ２∂２３−Ｈ２９３Ｌおよび天然のＦＧＦＲ２∂２３フラグメントのＦＴＩＲスペクトルの同等のシフトを誘導した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これは、Ｈｉｓ２９３からＬｅｕ２９３への変異が十分に強烈でないこと、またはＨｉｓ２９３がＳＳＲとの相互作用にそれほど意味がないことを示唆している。その一方、ＳＳＲは、変異ＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８ＤまたはＦＧＦＲ２∂２３−ＹＨフラグメントのＦＴＩＲスペクトルの変化を誘導しなかった（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。これは、残基Ｔｙｒ３２８が、ＳＳＲを結合する時のＦＧＦＲ２のアロステリック立体構造変化の媒介に実際に必須であったことを示している。
【実施例６】
【００７３】
アロステリックＳＳＲ結合部位の変異はＦＧＦＲシグナル伝達のＳＳＲ阻害を低減する。
ＦＧＦＲシグナル伝達の調節におけるアロステリック部位の機能的重要性を評価するため、本発明者らは、機能的ＦＧＦＲ２ＷＴまたはＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄバリアントのどちらかを発現する安定なＨＥＫ２９３細胞系を作製し、ＳＳＲがこれらの細胞系でＦＧＦ２によるＥＲＫ１／２の活性化を阻害するかどうかを分析した。免疫ブロッティングは、ＳＳＲによるＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄ細胞でのＦＧＦ２誘導ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害が、ＦＧＦＲ２ＷＴ細胞での阻害能力（ＩＣ５０値：２８±１２ｎＭ）と比べて低減する（ＩＣ５０値：１２１±３０ｎＭ）ことを明らかにした（図１５Ａおよび１５Ｂ）。これは、このアロステリック部位が、インビトロでの精製ＦＧＦＲ２フラグメントへのＳＳＲ結合に関係がないだけでなく、インセルロ（ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ）での生理条件ではＦＧＦＲ２シグナル伝達に対する阻害活性にも関係がないことを示している。Ｙ３２８Ｄ変異が、ＳＳＲの阻害活性を完全には無効にしなかったという事実は、ＦＧＦＲ２が生理学的文脈で発現される場合に、Ｔｙｒ３２８に加えて他の隣接残基もＳＳＲの結合に寄与することを示唆している可能性がある。
【実施例７】
【００７４】
ＳＳＲはＦＧＦＲ依存性ホスホ−シグナル伝達の「偏った」阻害剤である。
ＦＧＦＲ制御リン光体−シグナル伝達に対するＳＳＲ効果を評価するため、ＨＥＫ２９３細胞をＦＧＦＲ２でトランスフェクトし、ＦＧＦＲ依存性ＦＲＳ２およびＰＬＣγカスケードを阻害することが記載された公表ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ５４０２（Ｚｈｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７年）と比較して、ＦＧＦＲ自己リン酸化後の２つの主要経路、ＰＬＣγおよびＦＲＳ２をウェスタンブロットにより試験した。このような細胞では、ＦＧＦは、ＦＲＳ２、Ｅｒｋ１／２およびＰＬＣγリン酸化を誘導する。ＳＵ５４０２が全てのこれらの誘導をブロックするのに対し、ＳＳＲはＦＲＳ２経路を阻害するのみであり（図１６Ａおよび１６Ｂ）、ＳＳＲにより得られた偏った拮抗作用を説明している。より一般的には、リン酸化のこれらの違いは、アロステリック調節因子を評価するためのレポーターとして使用することができる。
【実施例８】
【００７５】
チロシンキナーゼ受容体の細胞外ドメインにおけるフラストレートされたドメインを探索するための方法論
例５からの記載された立体構造変化の考えられる分子機構の１つは、フラストレートされたドメイン（定義については上記参照）の存在を含む。ＡＧＡＤＩＲ（ヘリックス安定性予測アルゴリズム；Ｍｕｎｏｚ，Ｖ．＆Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｌ．  １９９４年）を用いてヒトＦＧＦＲ２のドメインＤ２およびＤ３を分析した時、本発明者らは、βシートからαヘリックスへのシフトを起こす蛍光がある唯一の領域として、Ｔｙｒ３１９からＡｒｇ３３０の範囲の（故に必須残基Ｔｙｒ３２８を含む）残基の配列を同定した。アルファヘリカリティ（ｈｅｌｉｃａｌｉｔｙ）を低減し故にドメインのフラストレーションを低減す
ることがＡＧＡＤＩＲにより予測されたアスパラギン酸によるＴｙｒ３２８の置換（ＦＧＦＲ２∂２３−Ｙ３２８Ｄ）は、このような理論モデルと一致して、ＦＴＩＲ分析により検出されたような観察された立体構造変化を実際に妨げた。他のＴＫＲのうち、ＶＥＧＦＲ１、−２および−３ならびにＰＤＧＦＲβを含む別の増殖因子受容体の類似の配列分析は、比較的高いＡＧＡＤＩＲスコアの領域を含有した。該領域はこの領域からアスパラギン酸に必須残基を変異させることで逆になり得る。本発明者らは、Ｋ６０９ＤおよびＫ６４８Ｄを変異させることが、ＶＥＧＦによる刺激時にＥＲＫ１／２シグナル伝達の低減をもたらした、ＶＥＧＦＲ２の幾つかの予備データを持っている。
【実施例９】
【００７６】
ＳＥＣ−ＬＣ／ＭＳによるＦＧＦ−Ｒアロステリック調節因子の親和性スクリーニングおよび同定された化合物の活性評価
ＳＥＣ−ＬＣ／ＭＳ方法論は、オンライン結合された２次元システム、高性能液体クロマトグラフィーに結合されたサイズ排除クロマトグラフィーと、これに続く検出のためのエレクトロスプレーイオン化−飛行時間型質量分析に依存する、親和性スクリーニングに使用される分析技法である。
【００７７】
可溶性ポリペプチド（ペプチド、タンパク質ドメイン、または完全長タンパク質）と相互作用する幾つかの化合物の能力に基づく。目的とするペプチドと小分子化合物のプールを混合した後、ペプチド−リガンド複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによる非結合と結合小分子化合物との分離を可能にする質量シフトを誘導する。次いで、複合体は解離され、バインダーが正確な質量測定のため高分解能ＬＣ／ＥＳＩ−ＴＯＦを用いて検出される（例えばＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴプレミア質量分析計により）。データデコンボリューションアルゴリズムは、質量検出分析からの結合分子の同定を可能にする。
【００７８】
ＦＧＦ−Ｒアロステリック調節因子を同定するには、この技術を天然のまたは変異された種々のＦＧＦ−Ｒの細胞外ドメインに適用することができる。天然型は、細胞外ドメインバインダー全ての検出を可能にする。アロステリック調節因子のスクリーニングを実現する別の方法は、アルファヘリックスを安定化し、ＳＳＲ１２８１２９結合への感作を可能にする変異Ｔｙｒ３２８Ａｒｇ−Ｉｌｅ３２９Ｌｙｓにより得られた、ＳＳＲ１２８１２９結合部位に近接するＦＧＦ−Ｒ２ヘリックスの「開口」型を用いて行うことができる。この場合、この変異ＦＧＦ−Ｒ２は、ＷＴ  ＦＧＦ−Ｒ２にとって代わることができる。類似の戦略を、ＦＧＦ−Ｒ２におけるＴｙｒ３２８およびＩｌｅ３２９に対応するアミノ酸に変異を有するＦＧＦ−Ｒ１、−Ｒ３または−Ｒ４のスクリーニングを行うのに使用することができる。Ｔｙｒ３２８での変異型（ＦＧＦ−Ｒ２）または他のＦＧＦ−Ｒにおける対応する変異アミノ酸は、カウンタースクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）を行うのに使用することができる。ＳＳＲ１２８１２９は、疎水ポケット近傍のＴｙｒ３２８Ａｓｐで変異されたＦＧＦ−Ｒ２に結合しないため、この変異型は、ＦＧＦ−Ｒ２における標的化ポケットと相互作用しない化合物の部分を廃棄するのに使用することができる。
【００７９】
全ての場合において、この戦略は、目的とするペプチドにおける標的ポケットに結合することができる分子の同定をもたらす。次の段階では、細胞におけるシグナル伝達に対する効果が評価されなければならない。第１に、選択された化合物は、ウェスタンブロット実験でＳＳＲにより観察されたように（図１７Ａおよび１７Ｂ）、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＡＫＴリン酸化などのＦＧＦ誘導誘導経路を阻害しないければならない。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＡＫＴのリン酸化状態は、オンセルＥＬＩＳＡ方法論により測定することができる。このアッセイフォーマットは、ＨＵＶＥＣなどのさまざまな細胞においてＡＫＴリン酸化を直接検出するため自家開発されており、およびＦＧＦ４刺激ＨＵＶＥＣに対するＳＳＲ効果の検出を可能にする（図１７Ｃ）。ＦＧＦＲアロステリック調節因子の典型的
な特徴は、ＦＧＦ結合と競合する能力である。これを評価するため、ＦＧＦＲをトランスフェクトされたマウスプレ−Ｂ  ３００−１９細胞での結合アッセイが作成された。１０ｎｇ／ｍｌでのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ＦＧＦ２は、天然にはいずれのＦＧＦＲも発現しない３００−１９細胞で発現されたＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ４に結合し、３００ｎＭでのＳＳＲは、フローサイトメトリー分析により、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ４へのこの結合を競合することはできない（図１７Ｄ）。
【実施例１０】
【００８０】
ＶＥＧＦ−Ｒ２受容体における想定されるフラストレートされた帯域の同定および想定されるフラストレートされた帯域の変異分析
ＦＧＦ−Ｒ用に開発された戦略が、別の受容体ＴＫ、すなわちＶＥＧＦ−Ｒ２またはＫＤＲに適用される。想定されるアロステリック標的部位を持つことができる領域を同定する最初のアプローチとして、本発明者らは、マウスＶＥＧＦ−Ｒ２受容体由来の利用可能な一次アミノ酸配列（ＥｎｔｒｅｚアクセッションＮＰ＿０３４７４２．２）を用いて、構造変化（例えばβシートからαヘリックスへの転移）を起こす傾向がある領域を同定するソフトウェアプログラムＡＧＡＤＩＲ１を利用した。これは、高い螺旋傾向を有する幾つかの領域をもたらしたが、Ｉｇドメイン構造では主にβシート構造が期待されるはずである。Ａｇａｄｉｒ分析の結果は図１８Ａに示されている。
【００８１】
この後、ＶＥＧＦ−Ｒ２由来の各アミノ酸をアスパラギン酸残基（Ｄ）により連続的にインシリコ変異させた後、本発明者らは、ＡＧＡＤＩＲスコアを再び分析し、ならびに（ｉ）螺旋傾向の変化が最大（最もネガティブ）であるおよび（ｉｉ）膜貫通ドメインに最も近傍に位置するようなＩｇドメインに位置するような変異を選択した。これらから、Ｋ６０９ＤおよびＫ６４８Ｄ（両方の残基ともｍＶＥＧＦ−Ｒ２のドメインｌｇＤ６にある（図１８Ｂ））は螺旋傾向の最大の低下をもたらし、インセルロ分析にさらに使用された（さらなる例１２参照）。
【実施例１１】
【００８２】
ＰＤＧＦ−Ｒβ受容体における想定されるフラストレートされた帯域の同定および想定されるフラストレートされた帯域の変異分析
想定されるアロステリック標的部位を持つことができる領域を同定する最初のアプローチとして、本発明者らは、ヒトＰＤＧＦＲβ受容体由来の利用可能な一次アミノ酸配列（ＥｎｔｒｅｚアクセッションＮＰ＿００２６００．１）を用いて、構造変化（例えばβシートからαヘリックスへの転移）を起こす傾向がある領域を同定するソフトウェアプログラムＡＧＡＤＩＲ１を利用した。これは、高い螺旋傾向を有する幾つかの領域をもたらしたが、Ｉｇドメイン構造では主にβシート構造が発現されるはずである（図１９）。この後、ＰＤＧＦＲβ由来の各アミノ酸をアスパラギン酸残基（Ｄ）により連続的にインシリコ変異させた後、本発明者らは、ＡＧＡＤＩＲスコアを再び分析し、ならびに（ｉ）螺旋傾向の変化が最大（最もネガティブ）であるおよび（ｉｉ）膜貫通ドメインに最も近傍に位置するようなＩｇドメインに位置するような変異を選択した。これらから、Ｌ３８３ＤおよびＫ３８７Ｄ（両方の残基ともｈＰＤＧＦＲβのドメインＩｇＤ３にある）は螺旋傾向の最大の低下をもたらした（図１９）。
【実施例１２】
【００８３】
「偏った」シグナル伝達を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法
ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢの結合は、それぞれの同種受容体の二量体化を誘導し、これが今度は細胞内キナーゼドメインのリン酸化を誘導する。この後（ＦＧＦ−Ｒの偏ったアンタゴニストＳＳＲに一致する目的とする）２つの主要経路が、ＥＲＫ１／２経路（図２１Ａおよび２１Ｃ）およびＰＬＣγ経路（図２０に概略的に示されている）を含め活性化される。各経路の活性化の測定は、考えられる阻害剤の存在下または非存在下、シグ
ナル伝達経路の１つのみの阻害により、「偏った」シグナル伝達を誘導する化合物の同定をもたらす。
【００８４】
ＶＥＧＦ−Ｒ２については、実施例１０で同定された２つの変異体ＶＥＧＦＲ２受容体（ＶＥＧＦＲ２Ｋ６０９ＤおよびＶＥＧＦＲ２Ｋ６４８Ｄ）およびＶＥＧＦ−Ｒ２のウィルト型フォーム（ｗｉｌｔ  ｔｙｐｅ  ｆｏｒｍ）を、ＨＥＫ２９３細胞で安定に発現させた。ＶＥＧＦＲ２ＷＴ受容体は、ＥＲＫ１／２リン酸化の活性化により明らかに反応する。ＶＥＧＦＲ２Ｋ６０９Ｄ変異体が、ＥＲＫ１／２を通じたシグナル伝達能力を低減した（だがカウンタースクリーニングアッセイには十分である）のに対し、ＶＥＧＦＲ２Ｋ６４８Ｄ変異体はこれを喪失した。結果は図２１Ａに要約されている。
【００８５】
ＰＤＧＦ−Ｒβについては、ｈＰＤＧＦＲβ細胞を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、アルファスクリーンシュアファイア手順に従って添加剤なし（「０」）、１０％ウシ胎仔血清（１０％ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地または１ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（１ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地のどちらかで刺激した（図２１Ｂ）。図２１Ｃでは、左のパネルは、刺激時の活性化または合計ＥＲＫ１／２タンパク質を検出する混合物の略図を再び表す。右のパネルは、アルファスクリーンシュアファイア検出方法により測定された細胞のＰＤＧＦ−ＢＢ刺激後に検出された測定を表す。これは、細胞を１０％ＦＢＳまたは５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢのどちらかで刺激する場合、ＰＤＧＦ−ＢＢによる１ｎｇ／ｍｌ刺激の有無にかかわらず、はるかに低いシグナルが存在する間は明らかなシグナルを検出できることを示している。ＰＬＣγの答えは、類似の方法で測定する。
【００８６】
ＦＧＦ−ＲにおけるＳＳＲのように、ＶＥＧＦ−Ｒ２またはＰＤＧＦ−Ｒβにおいて「偏った」シグナル伝達を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法は、Ｅｒｋ１／２およびＰＬＣγの答えに基づく。候補アロステリック阻害剤の存在下および非存在下におけるＥＲＫ１／２およびＰＬＣγ反応の比較は、偏った阻害剤として作用する、すなわち２つのシグナル伝達経路の１つのみを阻害する化合物の同定を可能にする。ＶＥＧＦ−Ｒ２またはＰＤＧＦ−Ｒβの変異構築物は、同定されたアロステリック調節因子の作用の機構を検証するカウンタースクリーニングアッセイに役立つことができる。変異受容体では、化合物は受容体調節能力を喪失せざるを得ない。
【００８７】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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