(57)【要約】【課題】ミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤を提供すること。【解決手段】式（１）で表される化合物及びそれらの塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含むものを、ミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤とする。    【化１】2017105729.tif 000041【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2017105729.tif 000032
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）で表される化合物及びそれらの塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするミトコンドリア病の治療剤。
【請求項２】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする請求項１に記載の治療剤。
【化２】
2017105729.tif 000033
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
【請求項３】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする請求項１に記載の治療剤。
【化３】
2017105729.tif 000034
【請求項４】
ミトコンドリア病が、Ｌｅｂｅｒ病、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、又はＬｅｉｇｈ脳症であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
式（１）
【化４】
2017105729.tif 000035
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）で表される化合物及びそれらの塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするエリスロポエチン発現増強剤。
【請求項６】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする請求項５に記載のエリスロポエチン発現増強剤。
【化５】
2017105729.tif 000036
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
【請求項７】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする請求項５に記載のエリスロポエチン発現増強剤。
【化６】
2017105729.tif 000037
【請求項８】
式（１）表される化合物又はその塩。
【化７】
2017105729.tif 000038
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）
【請求項９】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする請求項８に記載の化合物又はその塩。
【化８】
2017105729.tif 000039
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
【請求項１０】
式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする請求項８に記載の化合物又はその塩。
【化９】
2017105729.tif 000040
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、真核生物細胞の細胞小器官の１つであり、主な機能は電子伝達系によるＡＴＰの生産である。生物の体内で消費するエネルギーのほとんどは、ミトコンドリアからＡＴＰとして供給される。ここ最近、ミトコンドリアは、エネルギー産生系という本来の機能とは別に、多様な機能に関与することが報告されている。例えば、ミトコンドリアを介するアポトーシス経路、ミトコンドリアの分解系、さらに、ミトコンドリアの異常を原因とする多数の疾患の解明が、医学の分野では盛んに進められるようになった。
【０００３】
ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能低下や障害に起因する疾患の総称である。これまでは、ミトコンドリア病は、ＭＥＬＡＳ（メラス：脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群）、ＭＥＲＲＦ（マーフ：赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）等のミトコンドリア脳筋症のように、ミトコンドリア遺伝子（ｍｔＤＮＡ）の遺伝的変異による先天性の疾患と考えられてきたが、最近では、環境因子や薬剤によるミトコンドリア機能障害や、神経変性疾患によるミトコンドリア異常等の後天的なミトコンドリア病も報告されている。
【０００４】
ミトコンドリア病の治療剤の開発は進められており、例えば、脳保護剤として販売されている３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有効成分とする製剤（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ社製）は、ミトコンドリア脳筋症患者において梗塞の拡大を停止する効果や、浮腫を抑制する効果を有することが報告されている（特許文献１）。また、本発明者らは、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソ−ブタン酸が、ミトコンドリア病の治療効果やエリスロポエチン発現増強効果を有することを報告している（特許文献２）。しかしながら、未だミトコンドリア病に対して有効な治療法は確立されておらず、対症療法に頼っているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−８９４５６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０８０６４０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、インドール骨格にハロゲン原子や疏水性基を導入したものは、ミトコンドリア病の治療効果やエリスロポエチン発現量の増強効果を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕式（１）
【０００９】
【化１】
2017105729.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）で表される化合物及びそれらの塩からなる群（以下、「本件化合物群」ということがある）から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするミトコンドリア病の治療剤。
〔２〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする上記〔１〕に記載の治療剤。
【００１０】
【化２】
2017105729.tif 000003
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
〔３〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする上記〔１〕に記載の治療剤。
【００１１】
【化３】
2017105729.tif 000004
〔４〕ミトコンドリア病が、Ｌｅｂｅｒ病、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、又はＬｅｉｇｈ脳症であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の治療剤。
〔５〕式（１）
【００１２】
【化４】
2017105729.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）で表される化合物及びそれらの塩から選択される１種又は２種以上の化合物を含有することを特徴とするエリスロポエチン発現増強剤。
〔６〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする上記〔５〕に記載のエリスロポエチン発現増強剤。
【００１３】
【化５】
2017105729.tif 000006
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
〔７〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする上記〔５〕に記載のエリスロポエチン発現増強剤。
【００１４】
【化６】
2017105729.tif 000007
〔８〕式（１）表される化合物又はその塩。
【００１５】
【化７】
2017105729.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。）
〔９〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの式（２）〜（６）であることを特徴とする上記〔８〕に記載の化合物又はその塩。
【００１６】
【化８】
2017105729.tif 000009
（式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
〔１０〕式（１）で表される化合物が、以下のいずれかの化合物であることを特徴とする上記〔８〕に記載の化合物又はその塩。
【００１７】
【化９】
2017105729.tif 000010
【００１８】
また本発明の実施の他の形態として、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を、ミトコンドリア病の治療又は予防を必要とする対象（患者）に投与することにより、ミトコンドリア病を治療又は予防する方法や、ミトコンドリア病の治療又は予防剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、ミトコンドリア病の治療又は予防における使用のための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、ミトコンドリア病の治療又は予防剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用を挙げることができる。
【００１９】
また本発明の実施の他の形態として、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を、エリスロポエチン発現低下やエリスロポエチン反応性低下に起因する貧血の治療又は予防を必要とする対象（患者）に投与することにより、エリスロポエチン発現低下やエリスロポエチン反応性低下に起因する貧血を治療又は予防する方法や、エリスロポエチン発現増強剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、エリスロポエチン発現低下やエリスロポエチン反応性低下に起因する貧血の治療又は予防剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、エリスロポエチンの産生低下や反応性低下に起因する貧血の治療又は予防における使用のための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、エリスロポエチン発現増強剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用や、エリスロポエチン発現低下やエリスロポエチン反応性低下に起因する貧血の治療又は予防剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用を挙げることができる。
【００２０】
また本発明の実施の他の形態として、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を、虚血性疾患の治療又は予防を必要とする対象（患者）に投与することにより、虚血性疾患を治療又は予防する方法や、虚血性疾患の治療又は予防剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、虚血性疾患の治療又は予防における使用のための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、虚血性疾患の治療又は予防剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のミトコンドリア病の治療剤によると、Ｌｅｂｅｒ病、ＫＳＳ等のミトコンドリア病患者の酸化ストレスによる細胞死を抑制し、ミトコンドリア病を治療することができる。また、本発明のエリスロポエチン発現増強剤によると、腎臓、肝臓などの生体組織で産生されるエリスロポエチン量の抑制を解除することや、かかる生体組織で産生されるエリスロポエチン量を増強することができ、エリスロポエチンの産生低下や反応性低下に起因する貧血を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、グルタチオン合成阻害剤ＢＳＯ（L-Buthionine sulphoximine）で処理したＬｅｂｅｒ病（ＬＨＯＮ）患者由来の皮膚線維芽細胞の細胞生存率を解析した結果を示す図である。図１Ａ中の「＊」は、ＢＳＯ非存在下（ＢＳＯ（−））の結果に対して統計学的な有意差（ｐ＜０．０５［t-test、両側検定］）があることを示す。図１Ｂは、ＢＳＯで処理したＬｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞を、各種濃度（０．１、０．３、１、３、及び１０μＭ）の化合物（４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸［以下、「本件化合物＃６」ということがある］；図中の「Ａ６」）、及び特許文献２における化合物＃４（４−（４−フルオロフェニル）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソ−ブタン酸［以下、便宜上「比較例化合物＃４」ということがある］；図中の「＃４」）存在下で培養し、細胞生存率を解析した結果を示す図である。図１Ｃは、ＢＳＯで処理したＬｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞を、各種濃度の本件化合物＃６及び比較例化合物＃４存在下で培養し、細胞障害レベルを解析した結果を示す図である。
【図２】エリスロポエチン産生ヒト肝臓癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂを、３種類の化合物（４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（６−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸［以下、便宜上「本件化合物＃１」ということがある］、２−（４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸［以下、「本件化合物＃５」ということがある］、及び本件化合物＃６；それぞれ図中の「Ａ１」、「Ａ５」、及び「Ａ６」）と、ＴＮＦα（Tumor Necrosis Factor-α）存在下で培養し、エリスロポエチン発現量を解析した結果を示す図である。縦軸のエリスロポエチン発現量は、化合物非存在下（ＤＭＳＯ）の結果を１としたときの相対値として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のミトコンドリア病の治療剤は、ミトコンドリア病患者の酸化ストレスによる細胞死を抑制する作用を有する。このため、本発明のミトコンドリア病の治療剤は、ミトコンドリア病の酸化ストレス抑制剤や、ミトコンドリア病の予防剤に有利に適用することができる。治療対象であるミトコンドリア病としては、細胞核ＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡにおける遺伝子変異等により、ＡＴＰ産生、アポトーシスの調節、カルシウムイオンや鉄の細胞内濃度の調節等のミトコンドリア機能が低下することが原因の症状であればよく、具体的にはＣＰＥＯ（慢性進行性外眼麻痺症候群）、ＭＥＬＡＳ（メラス：脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群）、ＭＥＲＲＦ（マーフ：赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群）、Ｌｅｉｇｈ脳症（リー脳症：亜急性壊死性脳脊髄症）、Ｌｅｂｅｒ病（レーバー病:レーバー遺伝性視神経症［ＬＨＯＮ］）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、バース症候群、Ｐｅａｒｓｏｎ病（ピアソン病）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）を挙げることができ、これらの中でもＬｅｉｇｈ脳症、Ｌｅｂｅｒ病、カーズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）が好ましい。なお、本発明におけるミトコンドリア病には、ミトコンドリア病の酸化ストレスに起因する、或いは伴う疾患が便宜上含まれる。かかる疾患としては、例えば、神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病など）、肝疾患（脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎［ＮＡＳＨ］、肝硬変など）、腎症（糖尿病性腎症、放射線腎症、造影剤腎症、薬剤耐性腎症など）、臓器線維化（腎線維化、肝臓線維化、脳線維化、肺線維症など）、糖尿病を挙げることができる。
【００２４】
本発明のエリスロポエチン発現増強剤は、腎臓や肝臓などのエリスロポエチンを分泌する組織において、エリスロポエチンの発現（産生）を増強する作用を有する。エリスロポエチン発現の増強作用としては、炎症性サイトカインによるエリスロポエチン発現抑制を解除する作用や、エリスロポエチン発現を促進する作用が好ましく、ここでエリスロポエチン発現が促進するとは、少なくとも通常の酸素（１８〜２２％Ｏ２）条件下において、エリスロポエチン遺伝子のｍＲＮＡの転写やエリスロポエチンタンパク質の発現が促進（増加）することをいう。また、炎症性サイトカインによりエリスロポエチン発現が抑制されるとは、通常低酸素（０〜１０％Ｏ２）条件下ではエリスロポエチン産生が促進されるが、炎症性サイトカインの作用によりかかる促進効果が抑制されることをいう。本発明のエリスロポエチン発現増強剤の効果により、上記促進効果が抑制されることを解除し、エリスロポエチン遺伝子のｍＲＮＡの転写やエリスロポエチンタンパク質の発現を増強（増加）することができる。
【００２５】
上記炎症性サイトカインとしては、エリスロポエチン発現抑制作用を有するものであれば特に制限されず、具体的にはinterleukin-1（ＩＬ１）、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２、ＩＬ１８、tumor necrosis factor-α（ＴＮＦα）、Interferon-γ（ＩＦＮγ）を挙げることでき、これらの中でもＴＮＦαが好ましい。
【００２６】
上記エリスロポエチン発現抑制の解除やエリスロポエチン発現の促進における作用機序としては、ＧＡＴＡ２、３等のＧＡＴＡ因子の発現抑制、ＧＡＴＡ因子のエリスロポエチン遺伝子に存在するＧＡＴＡ配列への結合阻害等によりエリスロポエチン産生の抑制が解除され、エリスロポエチン発現が増強される作用機序や、ＨＩＦ−αの分解阻害、ＨＩＦ産生促進等によりエリスロポエチン遺伝子プロモーターの転写活性が促進され、エリスロポエチン発現が増強される作用機序を挙げることができる。
【００２７】
本発明のエリスロポエチン発現増強剤は、エリスロポエチンの産生低下や反応性低下に起因する貧血の治療又は予防剤に有利に適用することができる。かかる貧血としては、例えば、膠原病（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等）、慢性感染症（結核、感染性心内膜炎、肝膿瘍等）、アレルギー性疾患（アトピー性皮膚炎、乾癬等）、自己免疫疾患（リウマチ、多発性硬化症等）、腫瘍（卵巣腫瘍、黒色腫等）、慢性腎不全、甲状腺機能低下症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、上記ミトコンドリア病等の疾患に伴う貧血を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明のエリスロポエチン発現増強剤は、エリスロポエチンが虚血性疾患の治療効果を有することが知られていることから（例えば、国際公開第２００７／１４２２８８号パンフレットや、かかる文献の段落［０００５］参照）、虚血性疾患の治療又は予防剤に有利に適用することもできる。かかる虚血性疾患としては、虚血性心疾患（虚血性心疾患、心筋梗塞等）、虚血性脳疾患（ミトコンドリア脳症、脳血栓症、脳梗寒等）、虚血性脊髄疾患（脊髄梗塞等）、虚血性腎疾患（腎炎、腎不全等）、虚血性肝疾患（劇症肝炎等）、虚血性肺疾患（急性肺損傷、成人呼吸窮迫症候群［ＡＲＤＳ］等）、虚血性膵臓疾患（膵炎等）などを挙げることができる。
【００２９】
本発明のエリスロポエチン発現増強剤やミトコンドリア病の治療剤としては、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、本件化合物群に含まれる化合物の詳細な説明は以下に示す。
【００３０】
（化合物）
本発明の化合物は、以下の式（１）で表される化合物である。
【００３１】
【化１０】
2017105729.tif 000011
【００３２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基を表す。Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が、すべて水素原子を表す場合は除く。
【００３３】
式（１）におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を挙げることができる。
【００３４】
式（１）におけるＣ１〜Ｃ６のアルキル基とは、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖状または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。
【００３５】
式（１）におけるＣ２〜Ｃ６のアルケニル基とは、置換基を有していてもよい炭素数２〜６の直鎖状または分岐状のアルケニル基を意味し、具体的には、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１，３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基等を挙げることができる。
【００３６】
式（１）におけるＣ２〜Ｃ６のアルキニル基とは、置換基を有していてもよい炭素数２〜６の直鎖状または分岐状のアルキニル基を意味し、具体的には、エチニル基、１−プロピニル基、１−ブチニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基等を挙げることができる。
【００３７】
上記「置換基を有していてもよい」の置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基を挙げることができる。上記炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基は、式（１）における炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基と同じである。また、上記Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基を挙げることができる。
【００３８】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基が好ましく、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等のＣ１〜Ｃ３のアルキル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基がより好ましい。
【００３９】
上記Ｒ５は、水素原子又はＣ１〜Ｃ３のアルキル基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。
【００４０】
上記Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等のＣ１〜Ｃ３のアルキル基、ベンジル基がより好ましい。
【００４１】
前記式（１）で表される化合物の中でも、好ましくは、以下の式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）で表される化合物又はその塩である。
【００４２】
【化１１】
2017105729.tif 000012
【００４３】
上記式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。
【００４４】
式（１）で表される化合物は、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
【００４５】
【化１２】
2017105729.tif 000013
【００４６】
【化１３】
2017105729.tif 000014
【００４７】
【化１４】
2017105729.tif 000015
【００４８】
【化１５】
2017105729.tif 000016
【００４９】
【化１６】
2017105729.tif 000017
【００５０】
上記化合物の中でも、好ましくは、以下の化合物である。
【００５１】
【化１７】
2017105729.tif 000018
【００５２】
本件化合物群に含まれる化合物を、ミトコンドリア病の治療剤として用いる場合、本件化合物群に含まれる化合物としては、本件化合物＃６を好適に例示することができ、本件化合物群に含まれる化合物を、エリスロポエチン発現増強剤として用いる場合、本件化合物群に含まれる化合物としては、本件化合物＃１、＃５、及び＃６を好適に例示することができる。
【００５３】
（化合物の合成）
本発明における式（１）で表される化合物は、公知の有機化学反応を用いる有機合成手法によって得ることができる。例えば、以下に示すように（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸と式（７）で表されるインドール誘導体とをマイケル反応させることにより、式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００５４】
【化１８】
2017105729.tif 000019
【００５５】
（上記式（７）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５と同じ定義である。）
【００５６】
上記（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸は、以下に示すように１，３−ジフルオロベンゼンと無水マレイン酸とのフリーデル−クラフツ反応により合成することができる。かかるフリーデル−クラフツ反応は、ルイス酸、リン酸、ポリリン酸等を触媒として作用させることで行い、触媒として好適には塩化アルミニウムが好適に用いられる。
【００５７】
【化１９】
2017105729.tif 000020
【００５８】
上記式（７）で表されるインドール誘導体は、市販品を用いることができる。市販のインドール誘導体としては、４−フルオロインドール、４−クロロインドール、４−ブロモインドール、６−フルオロインドール、６−クロロインドール、６−ブロモインドール、５−メチルインドール等を挙げることができる。
【００５９】
また、上記式（７）で表されるインドール誘導体は、公知の有機化学反応を用いる有機合成手法によって得ることもできる。例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５がハロゲン原子である場合、市販のインドールに、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド等のハロゲン化剤を作用させることにより上記式（７）で表されるインドール誘導体を得ることができる。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ６で表される有機オキシ基である場合、上述のように市販のインドールをハロゲン化した後、アルキルリチウム等の有機リチウム試薬との反応、鈴木−宮浦カップリング反応等によって、上記式（７）で表されるインドール誘導体を得ることができる。さらに、Ｒ５がＣ１〜Ｃ６のアルキル基である場合、ブロモメタン、ブロモエタン等のＣ１〜Ｃ６のハロゲン化アルキルと市販のインドールを反応させることにより、上記式（７）で表されるインドール誘導体を得ることができる。
【００６０】
上記のすべての有機反応は、それぞれ溶媒中で行うことができるが、溶媒は反応温度や反応物等によって適宜選択される。また、上記有機反応の反応温度は、用いる溶媒の沸点等の条件によって適宜選択される。上記有機反応で溶媒を用いる場合、得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、残渣をそのまま次の反応に使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製を挙げることができる。
【００６１】
本発明のミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤は、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分がさらに添加されたものを例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【００６２】
本発明のミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。
【００６３】
本発明のミトコンドリア病の治療剤やエリスロポエチン発現増強剤の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定される。通常、１μｇ〜２００ｍｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、好ましくは２μｇ〜２０００μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、より好ましくは３〜２００μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、さらに好ましくは４〜２０μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、一日あたり単回又は複数回（例えば、２〜４回）に分けて投与されるが、症状の改善の状況に応じて投与量を調節してよい。
【００６４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
１．化合物の合成
【００６６】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（６−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（本件化合物＃１）の合成
【００６７】
【化２０】
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【００６８】
６−フルオロインドール（４８５ｍｇ，３．５９ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（５０８ｍｇ，２．３９ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で７時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝２：１）で精製した、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（６−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（４３３ｍｇ，収率５２％）を無色結晶で得た。
【００６９】
融点 210-214℃；
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ 10.31 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.47 (dd, J=8.8, 5.2, 1H), 7.34 (d, J=2.0, 2H), 7.12-7.20 (m, 3H), 6.92 (td, J=9.6, 2.4, 1H), 4.54 (dd, J=10.4, 4.0, 1H), 4.01 (ddd, J=18.8, 10.8, 3.2, 1H), 3.38 (td, J=18.8, 3.2, 1H); 
13C-NMR (100MHz, CDCl3) δ 195.18, 174.85, 166.28 JC-F(dd, 254, 13 Hz), 163.42 JC-F (dd, 254, 13 Hz), 161.74, 159.4, 137.54 JC-F (d, 13 Hz), 133.47 JC-F (dd, 11, 3 Hz), 123.35 JC-F(d, 4Hz), 123.02 JC-F (dd, 13, 4 Hz), 120.97 JC-F (d, 11 Hz), 113.51, 112.94 JC-F (dd, 10, 2 Hz) , 108.27 JC-F (d, 24 Hz), 105.59 JC-F (t, 27 Hz), 98.27 JC-F (d, 26 Hz), 46.68 JC-F (d, 7Hz) ,38.47;
FAB-MS m/z = 348 [M+H]+
【００７０】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃２」ということがある）の合成
【００７１】
【化２１】
2017105729.tif 000022
【００７２】
５−フルオロインドール（９２５ｍｇ，６．８５ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（９６９ｍｇ，４．５７ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で１１時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、クロロホルムと酢酸エチルから再結晶を行い、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（１１２２ｍｇ，収率７１％）を無色結晶で得た。
【００７３】
融点 207-208℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.34 (s, 1H), 8.02 (m, 1H), 7.47 (dd, J=10.4, 2.8, 1H), 7.39-7.43 (m, 2H), 7.13-7.21 (m, 2H), 6.93 (td, J=9.2 , 2.8, 1H), 4.52 (dd, J=10.4, 3.6, 1H), 4.03 (ddd, 18.4, 10.8, 3.6, 1H), 3.40 (td, 18.4, 3.6, 1H); 
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.17, 174.86, 166.52 JC-F(dd, 254, 13 Hz), 163.58 JC-F (dd, 254, 13 Hz), 159.52, 157.21, 134.25, 133.46 JC-F (dd, 11, 4 Hz), 127.66 JC-F (d, 11 Hz), 123.01 JC-F (dd, 10, 4 Hz), 113.42 JC-F (d, 5 Hz), 113.28 JC-F(d, 10 Hz), 113.51 JC-F (dd, 21, 4 Hz), 110.56 JC-F (d, 27 Hz), 105.61 JC-F (t, 27 Hz), 104.65 JC-F (d, 24 Hz), 46.68 JC-F (d, 8Hz), 38.48；
FAB-MS m/z = 348 [M+H]+
【００７４】
２−（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃３」ということがある）の合成
【００７５】
【化２２】
2017105729.tif 000023
【００７６】
７−クロロインドール（１０９４ｍｇ，５．１６ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（９３５ｍｇ，４．４１ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で１０時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で２回洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、２−（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（１０１７ｍｇ，収率５４％）を無色結晶で得た。
【００７７】
融点 225-227℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.55 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.75 (d, J=8.4, 1H), 7.45 (d, J=2.8, 1H), 7.06-7.14 (m, 4H), 7.08 (t. J=7.6, 1H), 4.57 (dd, J=10.4 , 3.6, 1H), 4.03 (ddd, 18.4, 10.8, 3.6, 1H), 3.41 (td, 18.4, 3.6, 1H);
13C-NMR(100MHz, acetone-d6) δ 195.06, 74.67, 166.53, JC-F(dd, 252, 12 Hz), 163.63 JC-F (dd, 252, 12 Hz), 134.45, 133.46 JC-F(dd, 11, 5 Hz), 129.25, 124.97, 122.98 JC-F (dd, 13, 4 Hz), 121.91, 120.84, 119.03, 117.22, 114.73, 112.99 JC-F (dd, 21, 3 Hz), 105.61 JC-F(t, 27 Hz), 46.71 JC-F (d, 8 Hz) , 38.50；
FAB-MS m/z = 364 [M+H]+
【００７８】
２−（５−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃４」ということがある）の合成
【００７９】
【化２３】
2017105729.tif 000024
【００８０】
５−クロロインドール（１０００ｍｇ，６．６１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（９３５ｍｇ，４．４１ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で７時間、加熱還流した。反応液に、蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で２回洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、２−（５−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（１０８４ｍｇ，収率６３％）を淡黄色結晶で得た。
【００８１】
融点 236-239℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.45 (s, 1H), 8.02 (q, J=8.3, 1H), 7.80 (d, J=1.6, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.11-7.22 (m, 3H), 4.54 (dd, J=10.4, 3.8, 1H), 4.01 (ddd, J=18.7, 10.7, 3.2, 1H), 3.41 (td, J=18.7, 3.2, 1H)；
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.10, 174.76, 166.52 JC-F(dd, 253, 12Hz), 163.62 JC-F (dd, 253, 12 Hz), 136.06, 133.44 JC-F(dd, 12, 4 Hz), 128.47, 125.62, 122.96 JC-F (dd, 13, 4 Hz), 122.48, 119.33, 113.77, 113.12, 112.96 JC-F (dd, 22, 3 Hz), 105.61 JC-F(t, 27 Hz), 46.72 JC-F (d, 8 Hz), 38.35；
FAB-MS m/z = 364 [M+H]+
【００８２】
２−（４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（本件化合物＃５）の合成
【００８３】
【化２４】
2017105729.tif 000025
【００８４】
４−クロロインドール（９０３ｍｇ，５．９８ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（８４２ｍｇ，３．９７ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で７時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製した後、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、２−（４−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（６０２ｍｇ，収率５１％）を無色結晶で得た。
【００８５】
融点 203-204℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.24 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.77 (d, J=8.4, 1H), 7.42 (d, J=8.0, 1H), 7.21〜7.03 (m, 4H), 4.57 (dd, J=10.8, 3.6, 1H), 4.03 (ddd 18.8, 10.8, 3.2, 1H), 3.38 (td, 18.8, 3.2, 1H);
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.28, 174.97, 166.55 JC-F(dd, 254, 12 Hz), 163.62 JC-F (dd, 254, 12 Hz), 137.646, 137.49, 133.46 JC-F (dd, 11, 4 Hz), 127.37, 123.70, 123.54, 123.05 JC-F(dd, 13, 4 Hz), 122.39, 119.88, 119.79, 112.95 JC-F (dd, 22, 4 Hz), 105.58 JC-F (t, 26 Hz), 46.95 JC-F (d, 8 Hz), 38.47；
FAB-MS m/z = 364 [M+H]+
【００８６】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（本件化合物＃６）の合成
【００８７】
【化２５】
2017105729.tif 000026
【００８８】
５−メチルインドール（１７１ｍｇ，１．３１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（１８５ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で７時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（２００ｍｇ，収率６７％）を無色結晶で得た。
【００８９】
融点200-202℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.20-7.31 (m, 2H), 7.13-7.20 (m, 1H), 7.96 (d, J=6.8, 1H), 4.53 (dd, J=10.6, 3.6, 1H), 4.01 (ddd 18.8, 10.6, 3.2, 1H), 3.36 (td, 18.8, 3.2, 1H), 2.40 (s, 3H);
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.33, 175.08, 166.54 JC-F(dd, 254, 12 Hz), 163.49 JC-F (dd, 254, 12 Hz), 136.01, 133.45 JC-F(dd, 11, 4 Hz), 128.59, 127.63, 124.02, 123.72, 123.05 JC-F (dd, 13, 4 Hz), 119.43, 112.94 JC-F (dd, 22, 4 Hz), 112.74, 112.03, 105.59 JC-F(t, 26 Hz), 47.01 JC-F (d, 7 Hz), 38.45, 21.64;
FAB-MS m/z = 344 [M+H]+
【００９０】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃７」ということがある）の合成
【００９１】
【化２６】
2017105729.tif 000027
【００９２】
１−メチルインドール（２５１２ｍｇ，１９．１７ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（２７１０ｍｇ，１２．７８ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で１時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で２回洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（３８９８ｍｇ，収率８９％）を無色結晶で得た。
【００９３】
融点 192-193℃
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 8.00 (m, 1H), 7.75 (d, J=7.6, 1H) , 7.37 (d, J=8.4, 1H), 7.12-7.22 (m, 4H), 7.07 (t, J=7.6, 1H), 4.54 (dd, J=10.8, 3.6, 1H), 4.00 (ddd, 18.8, 10.4, 3.6, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.36 (td, 18.8, 3.6, 1H);
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.22, 174.94, 166.52 JC-F(dd, 253, 13 Hz), 163.57 JC-F (dd, 253, 13 Hz), 138.08, 133.46 JC-F(dd, 11, 4 Hz), 128.00, 127.79, 123.03 JC-F (dd, 13, 4 Hz), 122.36, 120.07, 119.72, 112.94 JC-F (d, 22, 4 Hz), 112.33, 110.32, 105.60 JC-F(t, 27 Hz), 47.01 JC-F (d, 8 Hz), 38.36, 32.72;
FAB-MS m/z = 344 [M+H]+
【００９４】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（７−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸の（以下、便宜上「本件化合物＃８」ということがある）の合成
【００９５】
【化２７】
2017105729.tif 000028
【００９６】
７−メトキシインドール（１０８３ｍｇ，７．３６ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（１０４１ｍｇ，４．９０ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で１４時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、続いて、クロロホルムから再結晶を行って、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（７−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（１１７９ｍｇ，収率６７％）を無色結晶で得た。
【００９７】
融点 181-183℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.26 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.35 (d, J=8.0, 1H), 7.28 (d, J=2.8, 1H), 7.12-7.20 (m, 2H), 6.98 (t, J=7.8, 1H), 6.67 (d, J=7.8, 1H), 4.54 (dd, J=10.8, 3.6, 1H), 4.03 (ddd 18.8, 10.6, 3.3, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.36 (td, 18.6, 3.2, 1H);
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 1195.28, 174.98, 166.54 JC-F(dd, 252, 12 Hz), 163.48 JC-F (dd, 252, 12 Hz), 147.35, 133.44 JC-F(dd, 11, 4 Hz), 128.81, 127.83, 123.22, 123.05 JC-F (dd, 13, 4 Hz) , 120.43, 113.76, 112.94 JC-F (dd, 22, 4 Hz), 112.7, 105.59 JC-F(t, 27 Hz), 102.52, 55.52, 46.97 JC-F (d, 8 Hz) , 38.59；
FAB-MS m/z = 360 [M+H]+
【００９８】
４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃９」ということがある）の合成
【００９９】
【化２８】
2017105729.tif 000029
【０１００】
５−メトキシインドール（１１６６ｍｇ，７．９３ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で１０時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で２回洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、ベンゼンとアセトンから再結晶を行い、続いて、クロロホルムから再結晶を行って、４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−オキソブタン酸（１４７８ｍｇ，収率７５％）を無色結晶で得た。
【０１０１】
融点 205-206℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.09 (s, 1H), 8.02 (m, 1H), 7.27-7.31 (m, 3H), 7.13-7.20 (m, 2H), 6.79 (dd, J=8.8, 2.4, 1H), 4.52 (dd, J=10.8, 3.6, 1H), 4.00 (ddd, 18.8, 10.4, 3.4, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.38 (td, 18.6, 3.4, 1H；
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.35, 175.03, 166.53, JC-F(dd, 253, 12 Hz), 163.61 JC-F (dd, 253, 12 Hz), 154.84, 133.45 JC-F(dd, 11, 4 Hz), 132.72, 127.78, 124.22, 123.04 JC-F (dd, 12, 4 Hz), 112.95 JC-F (dd, 22, 4 Hz), 112.96, 112.68, 105.61 JC-F (t, 26 Hz), 101.58, 55.79, 46.9 JC-F (d, 8 Hz), 38.67；
FAB-MS m/z = 360 [M+H]+
【０１０２】
２−（６−ベンジルオキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（以下、便宜上「本件化合物＃１０」ということがある）の合成
【０１０３】
【化２９】
2017105729.tif 000030
【０１０４】
６−ベンジルオキシインドール（１２５５ｍｇ，５．６２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れた後、（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸（７９５ｍｇ，３．７４ｍｍｏｌ）を加え、ベンゼン（２０ｍＬ）で溶解し、８０℃で９時間、加熱還流した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えたのち、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（３０ｍＬ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。濃縮して得られた生成物を桐山ロートでろ過し、クロロホルムから再結晶を行って、２−（６−ベンジルオキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソブタン酸（５３１ｍｇ，収率３３％）を淡黄色結晶で得た。
【０１０５】
融点 177-178℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 10.0 4(s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.65 (d, J=8.8, 1H), 7.48 (d, J-7.6, 2H), 7.38 (t, J=7.2, 2H), 7.31 (m, 1H), 7.13-7.20 (m, 3H), 7.03 (d, J=2.0, 1H), 6.83 (dd, J=8.4 , 2.0, 1H), 4.51 (dd, J=10.4 , 3.6, 1H), 4.01 (ddd, 18.1, 10.4, 3.3, 1H), 3.36 (td, 18.1, 3.3, 1H);
13C-NMR (100MHz, acetone-d6) δ 195.29, 175.00, 166.54 JC-F(dd, 254, 12 Hz), 163.52 JC-F (dd, 254, 12 Hz), 156.33, 138.85, 138.45, 133.45, JC-F (dd, 11, 4 Hz), 129.17, 128.37, 128.23, 123.01 JC-F(dd, 13, 4 Hz), 122.49, 121.97, 120.54, 113.24, 113.06 JC-F (dd, 21, 4 Hz), 110.73, 105.59 JC-F (t, 27 Hz), 96.89, 70.70, 46.94 JC-F(d, 8 Hz), 38.57；
FAB-MS m/z = 436 [M+H]+
【０１０６】
［参考例１］
（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸
【０１０７】
【化３０】
2017105729.tif 000031
【０１０８】
本件化合物＃１〜１０の合成で用いた（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸は、以下のとおり合成した。すなわち、１，３−ジフルオロベンゼン（１３００ｍｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）を１００ｍＬ丸底フラスコに入れた後、無水マレイン酸（８９４ｍｇ，９．１２ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン（４０ｍＬ）で溶解し、スターラーで撹拌した。撹拌しながら、無水塩化アルミニウム（２２７９ｍｇ，１７．０９ｍｍｏｌ）を少しずつ投入して室温で６時間撹拌した。反応液を丸底フラスコの中の反応物を氷水（１００ｍＬ）に入れて反応を停止させた後、水層を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を食塩水（１００ｍＬ）で２回抽出操作をした後、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮して固形物を得た。この固形物を温浴中でベンゼンと少量のアセトンで再結晶させて精製したところ、淡黄色結晶の（Ｅ）−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−オキソ−２−ブテン酸を収率４８％で得た。
【０１０９】
融点 136.0〜139.0℃；
1H-NMR(400MHz, acetone-d6) δ 7.98 (m, 1H), 7.72 (dd, J=15.6 , 3.6, 1H), 7.20-7.28 (m, 2H), 6.75 (d, J=15.6, 2H);
13C-NMR(100MHz, acetone-d6) δ 187.13, 166.86 JC-F(dd, 254, 12 Hz), 166.35, 163.33 JC-F (dd, 254, 12 Hz), 139.95 JC-F(d, 7 Hz), 133.98 JC-F (dd, 66, 59 Hz), 132.91, 123.22 JC-F(d, 9 Hz), 113.33 JC-F (dd, 22 , 3 Hz), 105.76, JC-F (t, 22 Hz)
【０１１０】
特許文献２における化合物＃４（比較例化合物＃４）は、ミトコンドリア病の治療効果や、エリスロポエチン産生の促進効果を有することが示されている。そこで、かかる化合物の類似体である本発明の化合物についても同様に、ミトコンドリア病の治療効果や、エリスロポエチン産生の促進効果を有するかどうか検討した。
【０１１１】
以下の実施例２において、Ｌｅｂｅｒ病（ＬＨＯＮ）患者に皮膚生検を行って皮膚線維芽細胞を得た後、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（GIBCO社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（GIBCO社製）、１％ＦＢＳ（GIBCO社製）を含むＤＭＥＭ低グルコース（GIBCO社製）培養液（以下、「ＤＭＥＭ低グルコース通常培養液」という）中で５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で初代培養を行い、線維芽細胞を単離した。また、以下の実施例３において、エリスロポエチン産生ヒト肝臓癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］より入手）は、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（GIBCO社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（GIBCO社製）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製）培養液（以下、「ＲＰＭＩ１６４０通常培養液」という）中で５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で培養した。
【実施例２】
【０１１２】
２．本発明の化合物がミトコンドリア病の治療効果を有することの確認
［方法］
実施例１で合成した本件化合物＃６を用い、以下の手順〔１〕〜〔４〕にしたがってＬｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞の酸化ストレスによる細胞死抑制効果を検討した。
〔１〕２４ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり３×１０４個のＬｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞を撒いた後、２４時間培養した。
〔２〕グルタチオン合成阻害剤ＢＳＯ（L-Buthionine sulphoximine）（Sigma-Aldrich社製）を、１００μＭとなるように培養液中に混和し、２４時間培養した。
〔３〕本件化合物＃６及び比較例化合物＃４を、各種濃度（０．１、０．３、１、３、及び１０μＭ）となるように培養液中に混和し、４８時間培養した（ｎ＝４）。なお、対照として化合物非存在下（ＤＭＳＯを０．０１％となるように添加）で培養した。
〔４〕細胞生存率を、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を用いたＭＴＴアッセイにより測定した。すなわち、各ウェルにCell Count Reagent SFを１００μＬずつ添加し、２時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで３秒間撹拌した後、吸光度４５０ｎｍ（リファレンス７５０ｎｍ)を測定した。また、細胞障害レベルは、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（同仁化学研究所社製）を用いて細胞外に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより検出した。すなわち、各ウェルに調製したWorking Solutionを１００μＬずつ添加し、３０分間インキュベーションし、Stop Solutionを５０μＬずつ添加し、マイクロプレートリーダーで３秒間撹拌した後、吸光度４９０ｎｍ（リファレンス７５０ｎｍ)を測定した。
【０１１３】
［結果］
まず、ＢＳＯ存在下でＬｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞を培養すると、細胞生存率が低下することを確認した（図１Ａ参照）。次に、かかる条件で本件化合物＃６を添加すると、少なくとも１μＭの濃度で細胞生存率低下が抑制され（図１Ｂの左図参照）、細胞障害レベルが低下することが示された（図１Ｃの左図参照）。一方、比較例化合物＃４は、細胞生存率低下を抑制させ、細胞障害レベルを低下させるためには、少なくとも１０μＭの濃度を必要とすることが示された（図１Ｂ及びＣの右図参照）。この結果は、本件化合物＃６は比較例化合物＃４よりも低濃度で、Ｌｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞の酸化ストレスによる細胞死を抑制することができることを示している。また、同様の解析法を用いて、本件化合物＃１〜５、及び７〜１０についても、Ｌｅｂｅｒ病患者由来線維芽細胞の酸化ストレスによる細胞死抑制効果を有することを確認した。さらに、ＫＳＳ患者由来線維芽細胞を用いた同様の解析法により、本件化合物＃１〜１０は、ＫＳＳ患者由来線維芽細胞の酸化ストレスによる細胞死抑制効果を有することも確認した。
以上の結果は、本発明の化合物は、Ｌｅｂｅｒ病、ＫＳＳ等のミトコンドリア病患者の酸化ストレスによる細胞死を抑制し、ミトコンドリア病の治療効果を有することを示している。
【実施例３】
【０１１４】
３．本発明の化合物がエリスロポエチン産生促進効果を有することの確認
［方法］
１２ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１×１０５個のエリスロポエチン産生ヒト肝臓癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］より入手）を撒いた後、２４時間正常酸素（２０％Ｏ２）下で培養し、実施例１で合成した３種類の化合物（本件化合物＃１、５及び６）と、リコンビナントヒトＴＮＦα（Roche社製）とを、それぞれ３μＭ及び２２０μｇ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０通常培養液に混和し、さらに２４時間正常酸素（２０％Ｏ２）下で培養した後、培養液中に産生されたエリスロポエチンの濃度（ｍＩＵ／ｍＬ）をヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystems社製）を用いて測定した（図２の「Ａ１」、「Ａ５」、及び「Ａ６」）。なお、ネガティブコントロールとして化合物非存在（ＤＭＳＯ添加［１％］）下で培養したＨｅｐ３Ｂ細胞（図２の「ＤＭＳＯ」）を用いた。
【０１１５】
［結果］
Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるエリスロポエチン産生はＴＮＦα存在下で抑制されるが、３種類の化合物（本件化合物＃１、５及び６）存在下で培養すると、エリスロポエチンの発現量は増加することが明らかとなった（図２参照）。この結果は、本発明の化合物は、ＴＮＦα等の炎症性サイトカインによるエリスロポエチン産生抑制を解除し、エリスロポエチン産生を促進する効果を有することを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、ミトコンドリア病の治療や、エリスロポエチンの産生低下又は反応性低下に起因する貧血の治療に資するものである。
【図１】
2017105729.tif 000042
【図２】
2017105729.tif 000043