(57)【要約】【課題】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を効率的に行うことが可能なＰＣＲ装置及びＰＣＲ方法を提供すること。【解決手段】容器３０には、反応液６０よりも比重が小さく、反応液６０と混和しない液体５０が充填され、制御部は、容器３０の上方部分の液体５０が第１の温度となり、下方部分の液体５０が第１の温度より低い第２の温度となるように、第１加熱部１５１と第２加熱部１５２とを駆動制御すると共に、液体５０中において球状となった反応液６０が電界によるクーロン力で液体５０の上方部分と下方部分との間で繰り返し上下動するように、電界発生部を駆動制御して下側電極１０と上側電極２０との間に電界を発生させるＰＣＲ装置。【選択図】図６
2017035038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器に収容された反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応装置であって、
鉛直方向に間隔を置いて配置される下側電極及び上側電極と、
電界発生部と、
前記容器が前記下側電極と前記上側電極との間に配置されたときに、
前記容器の前記上側電極に近い側を加熱する第１加熱部と、
前記容器の前記下側電極に近い側を加熱する第２加熱部と、
制御部と、を備え、
前記容器には、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、前記反応液と混和しない液体とが充填され、
前記制御部は、前記容器の上方部分の前記液体が第１の温度となり、前記容器の下方部分の前記液体が前記第１の温度より低い第２の温度となるように、前記第１加熱部と前記第２加熱部とを駆動制御すると共に、前記液体中において球状となった前記反応液が電界によるクーロン力により前記液体の前記上方部分と前記下方部分との間で繰り返し上下動するように、前記電界発生部を駆動制御して前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与えるように前記電界発生部を駆動制御することを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項３】
容器に収容された反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応装置であって、
鉛直方向に間隔を置いて配置される下側電極及び上側電極と、
電界発生部と、
前記容器が前記下側電極と前記上側電極との間に配置されたときに、
前記容器の前記上側電極に近い側を加熱する第１加熱部と、
前記容器の前記下側電極に近い側を加熱する第２加熱部と、
制御部と、を備え、
前記容器には、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、前記反応液と混和しない液体とが充填され、
前記制御部は、前記容器の上方部分の前記液体が第１の温度となり、前記容器の下方部分の前記液体が前記第１の温度より低い第２の温度となるように、前記第１加熱部と前記第２加熱部とを駆動制御すると共に、前記液体中において球状となった前記反応液が電界によるクーロン力で、前記液体の前記上方部分、前記下方部分、前記上方部分と前記下方部分の間の第３の温度となる中間部分の順で繰り返し上下動するように、前記電界発生部を駆動制御して前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項４】
前記制御部は、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与え、前記中間部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位と前記第２電位よりも低い第３電位との間で電位が変化する交流電位を与えるように前記電界発生部を駆動制御することを特徴とする請求項３に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項５】
複数の前記容器を載置可能なステージを備え、
前記下側電極及び前記上側電極は前記複数の容器に対して共通に設けられていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項６】
前記上側電極は前記複数の容器ごとに設けられ、前記容器に挿入可能な柱状電極部を有していることを特徴とする請求項５に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項７】
前記ステージと前記下側電極とが一体となっていることを特徴とする請求項５または６に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項８】
前記下側電極が前記第２加熱部と一体となっていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項９】
前記下側電極及び前記上側電極のうちの少なくとも一方を移動させ、前記下側電極と前記上側電極との間の電極間距離を調整可能な昇降機構を備えることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応装置。
【請求項１０】
反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
容器に、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく前記反応液と混和しない液体とを充填する第１工程と、
前記容器に充填された前記液体の上方部分を前記核酸が熱変性する第１の温度に加熱すると共に、前記容器に充填された前記液体の下方部分を前記第１の温度よりも低く、熱変性した前記核酸を増幅させる第２の温度に加熱する第２工程と、
前記容器に対して鉛直方向に間隔を置いて配置された下側電極と上側電極との間に電界を発生させ、前記液体中において球状となった前記反応液にクーロン力を働かせて、前記反応液を前記液体の前記上方部分と前記下方部分との間で繰り返し上下動させる第３工程と、を備えることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１１】
前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与えることを特徴とする請求項１０に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１２】
前記反応液は、ターゲット核酸と、核酸合成基質と、耐熱性酵素と、プライマーとを含み、
前記第３工程は、前記第１の温度で前記ターゲット核酸を熱変性させて１本鎖核酸に分離する第４工程と、前記第２の温度で前記１本鎖核酸に前記プライマーを結合させる第５工程と、前記第２の温度で前記耐熱性酵素を触媒として前記１本鎖核酸に結合した前記プライマーを起点として前記核酸合成基質を用いて１本鎖部分と相補的な核酸を合成する第６工程と、を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１３】
前記容器中の前記液体は、前記第１の温度に加熱された前記上方部分と、前記第２の温度に加熱された前記下方部分との間に、前記第１の温度より低く前記第２の温度より高い第３の温度となった中間部分を有し、
前記反応液は、ターゲット核酸と、核酸合成基質と、耐熱性酵素と、プライマーとを含み、
前記第３工程は、前記第１の温度で前記ターゲット核酸を熱変性させて１本鎖核酸に分離する第４工程と、前記第２の温度で前記１本鎖核酸に前記プライマーを結合させる第５工程と、前記第３の温度で前記耐熱性酵素を触媒として前記１本鎖核酸に結合した前記プライマーを起点として前記核酸合成基質を用いて１本鎖部分と相補的な核酸を合成する第６工程と、を含み、
前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させ、前記液体中において球状となった前記反応液にクーロン力を働かせて、前記反応液を前記液体の前記上方部分、前記下方部分、前記中間部分の順で繰り返し上下動させることを特徴とする請求項１０または１１に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１４】
前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与え、前記中間部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位と前記第２電位よりも低い第３電位との間で電位が変化する交流電位を与えることを特徴とする請求項１３に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１５】
前記ターゲット核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【請求項１６】
前記ターゲット核酸が、２つの１本鎖ＲＮＡを結合させたものであることを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応装置及びポリメラーゼ連鎖反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量のゲノム（染色体もしくは遺伝子）やＲＮＡ（リボ核酸）から目的のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を選択的に増幅させる方法として、１９８３年に米国（ＵＳＡ）のマリス（Kary  Banks  Mullis）氏が開発したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Polymerase  Chain  Reaction）法が知られている。
ＰＣＲ法は、例えば、増幅対象となる２本鎖ＤＮＡと、ＤＮＡの断片であるプライマーと、ＤＮＡ合成素材と、ＤＮＡ合成酵素とを含む水溶液を所定の反応温度に熱して、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる熱変性工程と、水溶液を上記所定の反応温度から冷却して解離した１本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させるアニーリング工程と、１本鎖ＤＮＡに結合したプライマーにさらにＤＮＡ合成酵素を結合させてプライマーを伸長させる伸長工程と、を有し、この３つの工程を順次繰り返すことで、２本鎖ＤＮＡを指数関数的に増幅する方法である。このようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことができるＰＣＲ装置やＰＣＲ方法が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ＰＣＲを行う容器と、該容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対と、電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことでジュール熱を発生させて反応液の温度を制御する制御手段と、を備えたＰＣＲ装置が開示されている。このＰＣＲ装置によれば、反応液に直流電流を流してジュール熱を発生させ反応液を加熱する方法に比べて、反応液に交流電流が流れるので反応液が電気分解することがなく、且つＰＣＲサイクルのために十分なジュール熱を発生させることができるとしている。
【０００４】
また、例えば、特許文献２には、ＰＣＲを行う容器を装着可能な金属ウェル（対象物）と、ペルチェ効果により対象物を加熱または冷却する温度素子と、温度素子に対する通電を制御する制御部とを備えたＤＮＡ増幅装置が開示されている。また、当該温度素子としてｐ型半導体とｎ型半導体とを組み合わせる例が示されている。このようなＤＮＡ増幅装置によれば、ＰＣＲにおける所定の温度パターンの変化に対して反応液の温度を追従させ、ＰＣＲにおける所要時間を短縮できるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１１５１５９号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８８７４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１のＰＣＲ装置において反応液が流れる流路であるギャップ（チャネル）は、幅が９８０μｍ、深さが６００μｍ、長さが２〜８ｍｍである例が示されている。そうすると、ギャップに充填される反応液の体積はおよそ１〜５μＬ（マイクロリットル）となる。ギャップ（チャネル）には反応液を供給するための注入ウェルと反応液を排出するための排出ウェルとが接続されていることから、実際にはギャップ（チャネル）の容量よりも多い反応液を準備する必要がある。言い換えれば、ＰＣＲを行うための反応液に無駄が生じ易い。
【０００７】
一方で、上記特許文献２のＤＮＡ増幅装置は、ｍｍ（ミリメートル）単位のチューブ（容器）に反応液を計量して納め、当該チューブを金属ウェルに収容してＰＣＲを行うことから、反応液を無駄に消費することは避けられる。そして、従来のＰＣＲにおける３水準の温度パターンの１サイクルに要する時間がおよそ２５０秒かかっていたところを、１５０秒まで短縮できるとしている。しかしながら、上記特許文献２のＤＮＡ増幅装置を用いて、例えば５０サイクルの温度パターンを繰り返すと、ＰＣＲの所要時間は、７５００秒、すなわちおよそ２時間かかることになるので、さらに所要時間を短縮したいという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態または適用例として実現することが可能である。
【０００９】
［適用例］本適用例に係るポリメラーゼ連鎖反応装置は、容器に収容された反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応装置であって、鉛直方向に間隔を置いて配置される下側電極及び上側電極と、電界発生部と、前記容器が前記下側電極と前記上側電極との間に配置されたときに、前記容器の前記上側電極に近い側を加熱する第１加熱部と、前記容器の前記下側電極に近い側を加熱する第２加熱部と、制御部と、を備え、前記容器には、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、前記反応液と混和しない液体とが充填され、前記制御部は、前記容器の上方部分の前記液体が第１の温度となり、前記容器の下方部分の前記液体が前記第１の温度より低い第２の温度となるように、前記第１加熱部と前記第２加熱部とを駆動制御すると共に、前記液体中において球状となった前記反応液が電界によるクーロン力により前記液体の前記上方部分と前記下方部分との間で繰り返し上下動するように、前記電界発生部を駆動制御して前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させることを特徴とする。
【００１０】
本適用例に係るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）装置によれば、下側電極と上側電極との間に電界を発生させて、液体中において球状となった反応液にクーロン力を働かせ、反応液を液体中で上側電極に近い第１加熱部で加熱される上方部分に上昇させ第１の温度とし、該電界の発生を止めることで上昇していた反応液を液体中で下側電極に近い第２加熱部で加熱される下方部分に下降させて第１の温度から第２の温度に素早く変化させることができる。第１の温度をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における核酸を熱変性させて１本鎖核酸とする温度とし、第２の温度を第１の温度よりも低いＰＣＲにおけるアニーリングや伸長の温度とすることで、ＰＣＲの温度パターンに対応して反応液の温度を繰り返し変化させることができる。つまり、反応液を直接的または間接的に加熱してＰＣＲの温度パターンを繰り返す前述した特許文献１や特許文献２の従来のＰＣＲ装置に比べて、ＰＣＲの温度パターンの切り替え時間を短くしてＰＣＲにおける核酸増幅の所要時間を短縮することが可能なＰＣＲ装置を提供できる。また、反応液と混和しない液体中で反応液のＰＣＲが行われることから、前述した特許文献１のＰＣＲ装置に比べて、反応液の無駄を省くことができる。
【００１１】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記制御部は、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与えるように前記電界発生部を駆動制御することが好ましい。
この構成によれば、反応液に対して交流電位によるクーロン力が働くため、反応液が微振動する。つまり、反応液を微小撹拌して、熱変性、アニーリング、伸長のプロセスを促進させることができる。したがって、これらのプロセスに要する時間を短縮できる。
【００１２】
［適用例］本適用例に係る他のポリメラーゼ連鎖反応装置は、容器に収容された反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応装置であって、鉛直方向に間隔を置いて配置される下側電極及び上側電極と、電界発生部と、前記容器が前記下側電極と前記上側電極との間に配置されたときに、前記容器の前記上側電極に近い側を加熱する第１加熱部と、前記容器の前記下側電極に近い側を加熱する第２加熱部と、制御部と、を備え、前記容器には、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく、前記反応液と混和しない液体とが充填され、前記制御部は、前記容器の上方部分の前記液体が第１の温度となり、前記容器の下方部分の前記液体が前記第１の温度より低い第２の温度となるように、前記第１加熱部と前記第２加熱部とを駆動制御すると共に、前記液体中において球状となった前記反応液が電界によるクーロン力で、前記液体の前記上方部分、前記下方部分、前記上方部分と前記下方部分の間の第３の温度となる中間部分の順で繰り返し上下動するように、前記電界発生部を駆動制御して前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させることを特徴とする。
【００１３】
本適用例に係る他のＰＣＲ装置によれば、下側電極と上側電極との間に電界を発生させて、液体中において球状となった反応液にクーロン力を働かせ、反応液を液体中で上側電極に近い第１加熱部で加熱される上方部分に上昇させ第１の温度とし、該電界の発生を止めることで上昇していた反応液を液体中で下側電極に近い第２加熱部で加熱される下方部分に下降させて第１の温度から第２の温度に素早く変化させることができる。また、電界強度を変えることでクーロン力の大きさを調整し、反応液を下方部分から中間部分に上昇させて第２の温度から第３の温度に素早く変化させることができる。第１の温度をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における核酸を熱変性させて１本鎖核酸とする温度とし、第２の温度を第１の温度よりも低いＰＣＲにおけるアニーリングの温度とし、第３の温度をＰＣＲにおける伸長の温度とすることで、ＰＣＲの温度パターンに対応して反応液の温度を繰り返し変化させることができる。つまり、反応液を直接的または間接的に加熱してＰＣＲの温度パターンを繰り返す前述した特許文献１や特許文献２の従来のＰＣＲ装置に比べて、ＰＣＲの温度パターンの切り替え時間を短くしてＰＣＲにおける核酸増幅の所要時間を短縮することが可能なＰＣＲ装置を提供できる。また、反応液と混和しない液体中で反応液のＰＣＲが行われることから、前述した特許文献１のＰＣＲ装置に比べて、反応液の無駄を省くことができる。
【００１４】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記制御部は、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与え、前記中間部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位と前記第２電位よりも低い第３電位との間で電位が変化する交流電位を与えるように前記電界発生部を駆動制御することを特徴とする。
この構成によれば、反応液に対して交流電位によるクーロン力が働くため、反応液が微振動する。つまり、反応液を微小撹拌して、熱変性、アニーリング、伸長のプロセスをそれぞれ促進させることができる。したがって、これらのプロセスに要する時間を短縮できる。
【００１５】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、複数の前記容器を載置可能なステージを備え、前記下側電極及び前記上側電極は前記複数の容器に対して共通に設けられていることが好ましい。
この構成によれば、同種または異種の反応液を同時にたくさんＰＣＲ処理することが可能なＰＣＲ装置を提供することができる。
【００１６】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記上側電極は前記複数の容器ごとに設けられ、前記容器に挿入可能な柱状電極部を有していることが好ましい。
この構成によれば、複数の容器ごとに、下側電極と上側電極の柱状電極部とを適切に配置して、複数の容器ごとに収容された反応液に対して効果的にクーロン力を働かせることができる。
【００１７】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記ステージと前記下側電極とが一体となっていることが好ましい。
【００１８】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記下側電極が前記第２加熱部と一体となっていることが好ましい。
これらの構成によれば、部品点数を削減して簡素な構成のＰＣＲ装置を提供できる。
【００１９】
上記適用例に記載のＰＣＲ装置において、前記下側電極及び前記上側電極のうちの少なくとも一方を移動させ、前記下側電極と前記上側電極との間の電極間距離を調整可能な昇降機構を備えることが好ましい。
この構成によれば、昇降機構によって下側電極と上側電極との電極間距離を調整可能であることから、反応液に対して効果的にクーロン力を働かせることができる。言い換えれば、反応液を動かすクーロン力は、主に下側電極と上側電極とに印加される電位と電極間距離とにより決まることから、印加される電位に応じた適切な電極間距離に調整して無駄な電力消費を削減することができる。
【００２０】
［適用例］本適用例に係るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、反応液に含まれる核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応方法であって、容器に、前記反応液と、前記反応液よりも比重が小さく前記反応液と混和しない液体とを充填する第１工程と、前記容器に充填された前記液体の上方部分を前記核酸が熱変性する第１の温度に加熱すると共に、前記容器に充填された前記液体の下方部分を前記第１の温度よりも低く、熱変性した前記核酸を増幅させる第２の温度に加熱する第２工程と、前記容器に対して鉛直方向に間隔を置いて配置された下側電極と上側電極との間に電界を発生させ、前記液体中において球状となった前記反応液にクーロン力を働かせて、前記反応液を前記液体の前記上方部分と前記下方部分との間で繰り返し上下動させる第３工程と、を備えることを特徴とする。
【００２１】
本適用例に係るＰＣＲ方法によれば、下側電極と上側電極との間に電界を発生させて、液体中において球状となった反応液にクーロン力を働かせ、反応液を液体中で上昇させ上方部分に位置させることで第１の温度とし、該電界の発生を止めることで上方部分に位置していた第１の温度の反応液を液体中で下降させて下方部分に位置させることで第２の温度に素早く変化させることができる。つまり、ＰＣＲの温度パターンに対応して反応液の温度を第１の温度と第２の温度との間で繰り返し変化させることができる。したがって、反応液を直接的または間接的に加熱してＰＣＲの温度パターンを繰り返す前述した特許文献１や特許文献２のＰＣＲ装置を用いた従来のＰＣＲ方法に比べて、ＰＣＲの温度パターンの切り替え時間を短くしてＰＣＲにおける核酸増幅の所要時間を短縮することが可能なＰＣＲ方法を提供できる。また、反応液と混和しない液体中で反応液のＰＣＲが行われることから、上記特許文献１のＰＣＲ装置を用いた従来のＰＣＲ方法に比べて、反応液の無駄を省くことができる。
【００２２】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与えることが好ましい。
この方法によれば、反応液に対して交流電位によるクーロン力が働くため、反応液が微振動する。つまり、反応液を微小撹拌して、第２工程、第３工程における反応を促進させることができる。したがって、これらの工程に要する時間を短縮できる。
【００２３】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記反応液は、ターゲット核酸と、核酸合成基質と、耐熱性酵素と、プライマーとを含み、前記第３工程は、前記第１の温度で前記ターゲット核酸を熱変性させて１本鎖核酸に分離する第４工程と、前記第２の温度で前記１本鎖核酸に前記プライマーを結合させる第５工程と、前記第２の温度で前記耐熱性酵素を触媒として前記１本鎖核酸に結合した前記プライマーを起点として前記核酸合成基質を用いて１本鎖部分と相補的な核酸を合成する第６工程と、を含むことを特徴とする。
この方法によれば、第４工程から第６工程までを効率的に繰り返してターゲット核酸を増幅させることができる。
【００２４】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記容器中の前記液体は、前記第１の温度に加熱された前記上方部分と、前記第２の温度に加熱された前記下方部分との間に、前記第１の温度より低く前記第２の温度より高い第３の温度となった中間部分を有し、前記反応液は、ターゲット核酸と、核酸合成基質と、耐熱性酵素と、プライマーとを含み、前記第３工程は、前記第１の温度で前記ターゲット核酸を熱変性させて１本鎖核酸に分離する第４工程と、前記第２の温度で前記１本鎖核酸に前記プライマーを結合させる第５工程と、前記第３の温度で前記耐熱性酵素を触媒として前記１本鎖核酸に結合した前記プライマーを起点として前記核酸合成基質を用いて１本鎖部分と相補的な核酸を合成する第６工程と、を含み、前記下側電極と前記上側電極との間に電界を発生させ、前記液体中において球状となった前記反応液にクーロン力を働かせて、前記反応液を前記液体の前記上方部分、前記下方部分、前記中間部分の順で繰り返し上下動させることを特徴とする。
この方法によれば、第５工程と第６工程との温度をそれぞれ適切な温度として反応を行わせることができることから、第４工程から第６工程までをより効率的に繰り返してターゲット核酸を増幅させることができる。
【００２５】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記下側電極に第１電位を与え、前記上方部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位よりも高い第２電位との間で電位が変化する交流電位を与え、前記中間部分に前記反応液を位置させるときに、前記上側電極に前記第１電位と前記第２電位よりも低い第３電位との間で電位が変化する交流電位を与えることを特徴とする。
この方法によれば、反応液に対して交流電位によるクーロン力が働くため、反応液が微振動する。つまり、反応液を微小撹拌して、第２工程、第３工程における反応を促進させることができる。したがって、これらの工程に要する時間を短縮できる。
【００２６】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記ターゲット核酸が、ＤＮＡであることを特徴とする。
この方法によれば、ＤＮＡを効率的に増幅可能なＰＣＲ方法を提供できる。
【００２７】
上記適用例に記載のＰＣＲ方法において、前記ターゲット核酸が、２つの１本鎖ＲＮＡを結合させたものであることを特徴とする。
この方法によれば、１本鎖ＲＮＡを効率的に増幅可能なＰＣＲ方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】第１実施形態のＰＣＲ装置の電気的及び機械的な構成例を示す概略図。
【図２】容器を示す概略斜視図。
【図３】加熱部を示す概略平面図。
【図４Ａ】第１実施形態のＰＣＲ装置の動作を示す概略図。
【図４Ｂ】第１実施形態のＰＣＲ装置の動作を示す概略図。
【図５Ａ】上側電極に印加される交流電位の波形を示す図。
【図５Ｂ】反応液の温度変化の一例を示すグラフ。
【図６】ＰＣＲ方法の各工程を示す概略図。
【図７】ＤＮＡの熱変性反応を示す模式図。
【図８】アニーリング反応を示す模式図。
【図９】伸長反応を示す模式図。
【図１０】第２実施形態のＰＣＲ装置を示す概略図。
【図１１】第２実施形態のＰＣＲ装置に用いられる容器を示す概略斜視図。
【図１２】第２実施形態のＰＣＲ装置に用いる加熱部を示す概略平面図。
【図１３】他のＰＣＲ方法の工程を示す概略図。
【図１４Ａ】他のＰＣＲ方法における上側電極に印加される交流電位の波形を示す図。
【図１４Ｂ】他のＰＣＲ方法における反応液の温度変化の一例を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を具体化した実施形態について図面に従って説明する。なお、使用する図面は、説明する部分が認識可能な状態となるように、適宜拡大または縮小して表示している。
【００３０】
（第１実施形態）
＜ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）装置＞
本実施形態のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるＰＣＲ装置の全体構成例について、図１を参照して説明する。図１はＰＣＲ装置の電気的及び機械的な構成例を示す概略図である。本実施形態のＰＣＲ装置は、容器に収容された反応液に対して、ＰＣＲにおける温度パターン（加熱・冷却）を繰り返し実施して、反応液に含まれる核酸を増幅させる装置である。
【００３１】
図１に示すように、本実施形態のＰＣＲ装置１００は、下側電極１０と、上側電極２０と、昇降機構１２０と、移動機構１３０と、電界発生部１４０と、加熱部１５０と、操作部１６０と、制御部１７０とを含んで構成されている。下側電極１０と上側電極２０とを鉛直方向に対向して配置することができ、下側電極１０の表面に反応液が収容される容器３０が載置される。下側電極１０と上側電極２０とが対向して配置される空間が処理室１１０である。処理室１１０は、周囲の空間との間を隔てる壁（図示省略）や開閉可能な蓋（図示省略）などにより構成され、処理室１１０を略閉塞状態と解放状態とにすることができる。ＰＣＲ装置１００は、処理室１１０、昇降機構１２０、移動機構１３０、電界発生部１４０、加熱部１５０、操作部１６０、制御部１７０が設けられる筐体（図示省略）を有している。
【００３２】
処理室１１０を基準とすると、処理室１１０の下方に昇降機構１２０と、電界発生部１４０とが設けられている。処理室１１０の前方に操作部１６０が設けられている。処理室１１０の後方に移動機構１３０と、制御部１７０とが設けられている。以降、図面上において、下側電極１０と上側電極２０とが対向して配置される鉛直方向を上下方向とし、上下方向に直交する前後の方向を前後方向とする。また、図１では図示していないが、上下方向に直交する左右の方向を左右方向として説明する。
【００３３】
下側電極１０は、例えばアルミニウム製の板にアルマイト処理が施されたものであって、上下方向における上側の表面に容器３０を所定の位置で載置可能な載置部を有する。したがって、下側電極１０は容器３０が載置されるステージとして機能するものである。言い換えれば、ステージと下側電極１０とが一体となっている。
【００３４】
上側電極２０は、柱状電極部２１と、電極支持部２２とを有する。電極支持部２２は例えばアルミニウム製の板にアルマイト処理が施されたものである。柱状電極部２１は例えばアルミニウム製の棒にアルマイト処理が施されたものであって、電極支持部２２の上下方向における下側の表面に立設されている。
【００３５】
昇降機構１２０は、下側電極１０を上下動させることができる。これにより、下側電極１０と上側電極２０とが上下方向に対向して配置された状態のときに、下側電極１０と上側電極２０（実質的には柱状電極部２１の先端）との間の電極間距離を調整可能となっている。
【００３６】
移動機構１３０は、前後方向に延びる支持部１３１を前後方向に移動させることができる。支持部１３１の前方側の下側の表面に上側電極２０（電極支持部２２）が取り付けられている。
【００３７】
電界発生部１４０は、下側電極１０と上側電極２０とにそれぞれ電位を与えて、下側電極１０と上側電極２０（実際には柱状電極部２１）との間に電界を発生させる。具体的には、下側電極１０に第１電位として例えば０Ｖを与え、上側電極２０に第２電位として例えば０Ｖと６ｋＶとの間で変位する交流電位を与える。交流電位の詳しい印加方法は、後述するが、交流電位は周期的に印加される。なお、本実施形態では、下側電極１０、上側電極２０、電界発生部１４０をそれぞれ独立した構成としたが、下側電極１０及び上側電極２０は電界発生部１４０に含まれるとしてもよい。
【００３８】
加熱部１５０は、下側電極１０に載置された容器３０の上方部分を加熱可能な第１加熱部１５１と、容器３０の下方部分を加熱可能な第２加熱部１５２とを有する。
【００３９】
操作部１６０は、例えば液晶表示パネルなどの表示部と、表示部に重畳されたタッチパネル方式の入力部とを備え、表示部に表示された各種の操作ボタンを入力部によって選択することができる。
【００４０】
昇降機構１２０、移動機構１３０、電界発生部１４０、加熱部１５０、操作部１６０のそれぞれは、制御部１７０に電気的に接続されている。これにより、制御部１７０は、ＰＣＲ装置１００の各部を駆動制御して上記各種の操作ボタンに対応する操作を行わせる。例えば、制御部１７０は、操作部１６０からの操作に基づいて、昇降機構１２０を駆動制御して下側電極１０を上下方向に昇降させ、対向配置された下側電極１０と上側電極２０との間の電極間距離を調整することができる。また例えば、制御部１７０は、移動機構１３０を駆動制御して支持部１３１を前後方向に移動させ、支持部１３１の前方側に取り付けられた上側電極２０を、下側電極１０と対向する第１の位置と、第１の位置から後退した第２の位置との間で移動させることができる。また例えば、制御部１７０は、電界発生部１４０を駆動制御して、下側電極１０と上側電極２０とにそれぞれ電位を与えて、下側電極１０と上側電極２０との間に電界を周期的に発生させることができる。また例えば、制御部１７０は、加熱部１５０を駆動制御して第１加熱部１５１と第２加熱部１５２とにより容器３０を加熱して、容器３０の上方部分を第１の温度とし、容器３０の下方部分を第１の温度よりも低い第２の温度とすることができる。
【００４１】
制御部１７０は、演算部１７１、記憶部１７２、電源部１７３を含み、記憶部１７２に予め記憶されたＰＣＲプログラムに基づいて、電源部１７３から上述した各部に電源を供給して、各部の駆動制御を自動で実行させることができる。ＰＣＲプログラムは、ＰＣＲにおける各種反応を行わせるための反応条件に係る情報を含んでいる。記憶部１７２には上記ＰＣＲプログラムだけでなく、ＰＣＲ装置１００の各種の制御プログラムを含んでおり、制御部１７０に設けられたインターフェイスを介して外部から記憶部１７２にアクセスしてＰＣＲプログラムの閲覧や修正、追加が可能となっている。なお、外部からのアクセスについては、セキュリティー確保の観点からアクセスコードなどを設定することもできる。また、電源部１７３は制御部１７０に含まれて構成されることに限定されず、独立して設けられて制御部１７０によって電気的に制御される構成としてもよい。
【００４２】
次に、容器３０について図２を参照して説明する。図２は容器を示す概略斜視図である。図２に示すように、容器３０は、透光性の材料を用いて形成された平底の円筒容器である。透光性の材料としては、ガラスやプラスチックなどを用いることができる。容器３０の容量は例えば４００μＬ程度であり、容器３０の内側部分の高さｈを例えば１２ｍｍとすると、容器３０の内径ｄはおよそ６．５ｍｍとなる。図１に示したように、上側電極２０の柱状電極部２１は、容器３０に挿入可能となっている。したがって、柱状電極部２１の太さは容器３０の内径ｄよりも細く、例えば１ｍｍ〜３ｍｍ程度である。柱状電極部２１の長さは例えば１０ｍｍ〜２０ｍｍ程度である。
【００４３】
次に、加熱部１５０について図３を参照して説明する。図３は加熱部を示す概略平面図である。具体的には、図３は加熱部１５０のうち第１加熱部１５１を示すものである。
図３に示すように、加熱部１５０の第１加熱部１５１は、中央に穴１５１ａが空いた平板状の例えばセラミックヒーターである。穴１５１ａの内壁と容器３０の外壁との間にわずかに隙間が生ずる程度の穴１５１ａの大きさとなっており、穴１５１ａに容器３０をスムーズに挿入可能となっている。加熱部１５０の第２加熱部１５２も第１加熱部１５１と同様な構成となっており、同じく容器３０を挿入可能な穴１５２ａを有している。
なお、容器３０の下方部分を加熱可能に配置される第２加熱部１５２は、下側電極１０と一体に構成してもよい。これにより、第２加熱部１５２の穴１５２ａに容器３０を挿入することで下側電極１０に対して容器３０を位置決めして載置可能とし、ステージの機能を発揮できる構成とすることができる。第２加熱部１５２の穴１５２ａに容器３０を挿入した後に、容器３０の上方から第１加熱部１５１をセットする。第２加熱部１５２に対して所定の間隔をおいて第１加熱部１５１がセットされる。第１加熱部１５１と第２加熱部１５２との上下方向における詳しい位置関係については、後述する。
【００４４】
＜ＰＣＲ装置の動作＞
次に、本実施形態のＰＣＲ装置１００の動作について、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂを参照して説明する。図４Ａ及び図４ＢはＰＣＲ装置の動作を示す概略図、図５Ａは上側電極に印加される交流電位の波形を示す図、図５Ｂは反応液の温度変化の一例を示すグラフである。
【００４５】
図４Ａに示すように、容器３０には、液体５０と反応液６０とが収容される。反応液６０は基本的に水溶液であって比重は「１」よりも大きい。これに対して、液体５０は、反応液６０よりも比重が小さく、反応液６０と混和しない物質が選ばれる。容器３０に収容される反応液６０の量（体積）は、液体５０の量（体積）よりも少なく、例えば１０μＬ以下である。したがって、液体５０中において反応液６０は、液体５０との間の界面張力により球状となる。また、反応液６０は液体５０よりも比重が大きいことから容器３０の底部に沈む。
前述したように容器３０は透光性を有する材料からなり、これに収容される液体５０もまた透光性を有する物質である。このような液体５０を構成する物質としては、シリコーン系のオイルが挙げられる。なお、本実施形態において透光性とは、可視光波長領域において８０％以上の透過率を有する状態であることを言う。
【００４６】
液体５０と反応液６０とが収容された容器３０を下側電極１０上に載置する。下側電極１０の表面１０ａには、容器３０を所定の位置で載置するための載置部１１が設けられている。本実施形態では、下側電極１０の表面１０ａに容器３０の底面の大きさに対応した凹部を設け、これを載置部１１としている。凹部の深さは、容器３０の底部の厚みに相当する。なお、載置部１１の構成は、これに限定されるものではなく、容器３０を位置決めする凸部を下側電極１０の表面１０ａに設けてもよい。
【００４７】
下側電極１０上に載置された容器３０に対して、下側電極１０に近い側に第２加熱部１５２が配置される。また、配置された第２加熱部１５２に対して上方に所定の間隔Ｄｈを置いて第１加熱部１５１が配置される。所定の間隔Ｄｈは例えば５ｍｍ〜１０ｍｍである。本実施形態では、容器３０に対して第１加熱部１５１により加熱される領域を第１領域Ｈ１と呼び、同じく容器３０に対して第２加熱部１５２により加熱される領域を第２領域Ｈ２と呼ぶこととする。第１領域Ｈ１が本発明における第１の温度となる上方部分に相当するものであり、第２領域Ｈ２が本発明における第２の温度となる下方部分に相当するものである。液体５０中において球状となった反応液６０が沈んでいるとき、容器３０に対して反応液６０は第２領域Ｈ２に位置していることになる。
【００４８】
制御部１７０は移動機構１３０を駆動制御して柱状電極部２１が容器３０の上方に位置するように上側電極２０を移動させる。続いて、制御部１７０は、昇降機構１２０を駆動制御して下側電極１０を上昇させ、液体５０と反応液６０とが収容された容器３０に対して柱状電極部２１を挿入させる。さらに、図４Ｂに示すように、下側電極１０と上側電極２０（実質的には柱状電極部２１の先端）との間の電極間距離が所望の距離Ｄｅとなるように調整する。以降、所望の距離Ｄｅを電極間距離Ｄｅと呼ぶ。なお、前述したように下側電極１０には載置部１１が設けられていることから、実質的な電極間距離Ｄｅは、載置部１１の深さを考慮して調整される。
【００４９】
また、制御部１７０は電界発生部１４０を駆動制御して、電極間距離Ｄｅで配置された下側電極１０と上側電極２０とに電位を与えて、電界を発生させる。具体的には、例えば、図５Ａに示すように、下側電極１０の電位を０Ｖとして、上側電極２０に例えば０Ｖ〜６ｋＶの間で電位が変化する周波数３０Ｈｚの交流電位をＰＣＲプログラムに基づく周期で印加する。なお、図５Ａでは、交流電位の印加の状態が識別できる程度に交流電位の波形を表示しているので、実際に印加される交流電位の波形とは異なっている。また、交流電位の波形は、図５Ａに示すように矩形状のパルス波形（デジタル的な波形）でもよいし、連続的に電位が変化するサイン波形（アナログ的な波形）でもよい。
【００５０】
上側電極２０に交流電位が印加される例えば時間ｔ0〜時間ｔ1の期間では、下側電極１０と上側電極２０の柱状電極部２１との間に電界が発生して、球状の反応液６０に電界によるクーロン力が働く。したがって、図４Ｂに示すように、球状の反応液６０は、液体５０中で柱状電極部２１側に引き寄せられ上昇する。反応液６０に働くクーロン力と重力とが均衡する位置で反応液６０の上昇が止まる。実際には上側電極２０に交流電位が印加されるので、クーロン力が働いた反応液６０は交流電位の周波数に対応して微振動している。
【００５１】
上側電極２０に交流電位が印加されない例えば時間ｔ1〜時間ｔ2の期間では、下側電極１０と上側電極２０の柱状電極部２１との間の電界が消失して、球状の反応液６０にはクーロン力が働かず重力により液体５０中で下降する。したがって、反応液６０は図４Ａに示すように第２領域Ｈ２に位置することになる。
【００５２】
上側電極２０に印加される交流電位は、０Ｖ〜６ｋＶ、３０Ｈｚであることに限定されない。上側電極２０に交流電位を印加して反応液６０が液体５０中で上昇し第１領域Ｈ１に位置するように、反応液６０の比重や質量、液体５０の比重や粘度などを考慮して、上記交流電位における電圧及び周波数、並びに電極間距離Ｄｅが設定される。例えば、反応液６０の比重をほぼ１．０、体積を１０μｌ（マイクロリットル）以下として、液体５０として比重がおよそ０．８９のシリコーン系のオイルを用いた場合、交流電位は、０Ｖ〜１０ｋＶの範囲、周波数は、０．２Ｈｚ〜５０Ｈｚの範囲が想定される。
【００５３】
第１加熱部１５１によって加熱される第１領域Ｈ１における液体５０の第１の温度を例えば９４℃とし、第２加熱部１５２によって加熱される第２領域Ｈ２における液体５０の第２の温度を例えば６０℃とする。これにより、図５Ｂに示すように、上側電極２０に交流電位を印加して液体５０中で上昇し第１領域Ｈ１に位置する反応液６０の温度は、９４℃に到達して時間ｔ1まで維持される。上側電極２０への交流電位の印加が停止して液体５０中で下降し第２領域Ｈ２に位置する反応液６０の温度は、９４℃から６０℃まで低下して（冷却されて）時間ｔ2まで維持される。
【００５４】
下側電極１０の電位を０Ｖとして、上側電極２０に周期的に交流電位を印加すると、液体５０中において球状の反応液６０は、第２領域Ｈ２と第１領域Ｈ１との間で周期的に上下動する。つまり、反応液６０の温度は、図５Ｂに示すように、９４℃と６０℃との間で周期的に変化することになる。このようなＰＣＲ装置１００の動作は、静置された反応液を直接的または間接的に加熱・冷却して、第１の温度と第２の温度とに変化させる従来のＰＣＲ装置に比べて、反応液６０の温度を素早く変化させることが可能である。
【００５５】
下側電極１０と上側電極２０との間に発生させる電界の強度の調整を考慮すると、球状となった反応液６０が液体５０中で上下動する状態を視認可能であることが好ましい。それゆえ、容器３０及び液体５０は透光性を有していることが好ましい。
【００５６】
＜ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法＞
次に、本実施形態のＰＣＲ方法について、図６〜図９を参照して説明する。図６はＰＣＲ方法の各工程を示す概略図、図７はＤＮＡの熱変性反応を示す模式図、図８はアニーリング反応を示す模式図、図９は伸長反応を示す模式図である。
【００５７】
本実施形態のＰＣＲ方法は、反応液６０に含まれるターゲット核酸としてのＤＮＡを増幅させるものであり、容器３０に液体５０と反応液６０とを充填する充填工程（第１工程）と、加熱工程（第２工程）と、熱変性工程（第４工程）、アニーリング工程（第５工程）、伸長工程（第６工程）、をこの順に繰り返す工程（第３工程）とを備えている。
【００５８】
反応液６０には、ターゲット核酸としてのＤＮＡと、ＤＮＡ合成基質（ｄＮＴＰ；デオキシヌクレオチド三リン酸）と、耐熱性酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）と、プライマー（オリゴヌクレオチド）と、水とが含まれる。なお、反応液６０には、フォワードプライマー及びリバースプライマーと呼ばれる少なくとも２種のプライマーが含まれている。
【００５９】
具体的には、図６に示すように、充填工程では、容器３０に液体５０を充填した後に、容器３０に例えば微量の液体を定量吐出できるマイクロピペット４０からターゲット核酸としてのＤＮＡを含む所定量（例えば５μＬ）の反応液６０を吐出する。吐出された反応液６０の液滴は、比重が液体５０より大きく、液体５０と混和しないので、液体５０中で球状となり、容器３０の底部に沈む。液体５０と反応液６０とが収容された容器３０を、ＰＣＲ装置１００の下側電極１０上にセットする。そして、加熱工程に進む。
【００６０】
加熱工程では、ＰＣＲ装置１００を稼働させて、制御部１７０が第１加熱部１５１と第２加熱部１５２とを駆動制御することにより、容器３０の第１領域Ｈ１における液体５０の温度を第１の温度とすると共に、容器３０の第２領域Ｈ２における液体５０の温度を第２の温度とする。そして、第３工程に進む。
【００６１】
第３工程では、制御部１７０が移動機構１３０を駆動制御して、柱状電極部２１が容器３０の上方に位置するように上側電極２０を移動させる。そして、制御部１７０が昇降機構１２０を駆動制御して、所望の電極間距離Ｄｅとなるように下側電極１０を上昇させる。これにより、柱状電極部２１は容器３０に挿入され、柱状電極部２１の先端が液体５０に浸かり、第１領域Ｈ１のやや上方の位置で止まる。この状態で、制御部１７０は電界発生部１４０を駆動制御して下側電極１０と上側電極２０との間に電界を周期的に発生させる。
【００６２】
上側電極２０に交流電位が印加される期間では、下側電極１０と柱状電極部２１との間に生じた電界によるクーロン力が反応液６０に働いて、球状の反応液６０は柱状電極部２１に引き寄せられて上昇し、第１領域Ｈ１において停止して微振動した状態となる。第１領域Ｈ１における反応液６０の温度は、例えば図５Ｂに示すように９４℃まで上昇して維持される。図７に示すように、反応液６０に含まれる２本鎖ＤＮＡ６１は、反応液６０が９４℃に加熱されることで２つの１本鎖ＤＮＡ６１ａ，６１ｂに分離する。ここまでが第３工程中の熱変性工程（第４工程）である。なお、熱変性工程における液体５０の温度、すなわち反応液６０の温度は、２本鎖ＤＮＡ６１が分離し、且つ反応液６０の沸騰が生じない９５℃以上１００℃未満の温度に設定される。２本鎖ＤＮＡ６１や１本鎖ＤＮＡ６１ａ，６１ｂの端部に示す記号３’、５’は、構成単位であるヌクレオチドにおける糖の炭素の位置を示す。ところで、核酸は糖の３’位の炭素と５’位の炭素がリン酸とリン酸エステル結合して鎖状構造を形成しており、５’位のリン酸エステル結合が切れている末端が５’末端、もう一方の末端が３’末端である。ここで示す３’、５’は、３’末端、５’末端を指すものである。そして、アニーリング工程（第５工程）に進む。
【００６３】
アニーリング工程（第５工程）では、上側電極２０への交流電位の印加を停止する。これにより、下側電極１０と上側電極２０との間に生じていた電界が消失し、反応液６０にクーロン力が働かなくなる。したがって、球状の反応液６０は重力により第１領域Ｈ１から第２領域Ｈ２へ下降する。上側電極２０に交流電位が印加されない期間に、第２領域Ｈ２における反応液６０の温度は、例えば図５Ｂに示すように９４℃から６０℃まで低下して（冷却されて）維持される。図８に示すように、反応液６０において、１本鎖ＤＮＡ６１ａにプライマー６２が結合する。なお、プライマー６２は、１本鎖ＤＮＡ６１ａの相補的な塩基配列を有する部位に結合するものである。そして、伸長工程（第６工程）に進む。
【００６４】
伸長工程（第６工程）では、上側電極２０に交流電位が印加されない状態、つまり、球状の反応液６０が第２の温度（６０℃）となる第２領域Ｈ２に留まった状態で反応が進む。具体的には、図９に示すように、１本鎖ＤＮＡ６１ａに結合したプライマー６２を起点として耐熱性酵素６４を触媒としてＤＮＡ合成基質６３を連続的に結合させ、１本鎖ＤＮＡ６１ａに相補的な２本鎖ＤＮＡ６１を合成する。なお、熱変性工程で分離されたもう１つの１本鎖ＤＮＡ６１ｂにおいても第２の温度（６０℃）でアニーリング反応と伸長反応とが進み、１本鎖ＤＮＡ６１ｂに相補的な２本鎖ＤＮＡ６１が合成される。
【００６５】
上記の熱変性工程〜伸長工程をｎ回繰り返して行うことで、２本鎖ＤＮＡ６１の数は２のｎ乗倍に増幅される。ＰＣＲ法では、このような熱変性工程〜伸長工程を繰り返すことでＤＮＡ合成基質６３が消費され、ＤＮＡ合成基質６３の濃度が低下してゆく。一般的には、熱変性工程〜伸長工程の繰り返しは５０回程度行われる。
【００６６】
ターゲット核酸の増幅が起きたことを確かめる方法として、反応液６０に蛍光プローブを添加する方法が挙げられる。蛍光プローブに含まれる蛍光物質から発する蛍光を計測することで、ターゲット核酸の増幅が起きたことを調べることができる。
【００６７】
上記第１実施形態のＰＣＲ装置１００及びこれを用いたＰＣＲ方法によれば、以下の効果が得られる。
（１）下側電極１０と柱状電極部２１との間に生じさせた電界によるクーロン力を利用して、容器３０に充填された液体５０中で、反応液６０をＰＣＲにおける熱変性反応が進行する第１の温度となる第１領域Ｈ１（上方部分）と、ＰＣＲにおけるアニーリング反応、伸長反応が進行する第１の温度よりも低い第２の温度となる第２領域Ｈ２（下方部分）との間で上下動させる。したがって、静置された反応液６０を直接的または間接的に加熱・冷却する従来のＰＣＲ装置及びこれを用いたＰＣＲ方法に比べて、反応液６０の温度を短時間に変化させることができるため、ＰＣＲにおける所要時間を短縮することが可能なＰＣＲ装置１００およびこれを用いたＰＣＲ方法を提供することができる。
（２）電界によるクーロン力を生じさせるにあたり、下側電極１０に第１電位（０Ｖ）を与え、上側電極２０に第１電位（０Ｖ）よりも高い第２電位（６ｋＶ）との間で電位が変化する交流電位を与える。これにより、反応液６０には交流電位の周波数に相当する微振動が生じ、反応液６０が微小撹拌される。反応液６０が微小撹拌されることで、熱変性反応、アニーリング反応、伸長反応が効率よく進行するので、ＰＣＲにおける所要時間をより短縮することができる。
（３）容器３０に充填される液体５０は、水溶液である反応液６０よりも比重が小さく、且つ反応液６０と混和しない材料が選ばれるので、反応液６０は液体５０中で球状となる。ＰＣＲ装置１００及びこれを用いたＰＣＲ方法は球状となった反応液６０に対してＰＣＲの各反応を行うことから、液体５０を用いない従来のＰＣＲに比べて、少量の反応液６０でもＰＣＲを行うことができる。言い換えれば、反応液６０を構成する試薬の無駄を省くことができる。
【００６８】
（第２実施形態）
次に、第２実施形態のＰＣＲ装置について、図１０〜図１２を参照して説明する。図１０は第２実施形態のＰＣＲ装置を示す概略図、図１１は第２実施形態のＰＣＲ装置に用いられる容器を示す概略斜視図、図１２は第２実施形態のＰＣＲ装置に用いる加熱部を示す概略平面図である。以降、第２実施形態のＰＣＲ装置を説明するにあたり、第１実施形態のＰＣＲ装置１００と基本的に同じ構成には同じ符号を付して詳細な説明は省略する。
【００６９】
図１０に示すように、本実施形態のＰＣＲ装置２００は、第１実施形態のＰＣＲ装置１００と同様に、下側電極１０、上側電極２０、処理室（図示省略）、昇降機構１２０、移動機構１３０、電界発生部（図示省略）、加熱部２５０、操作部（図示省略）、制御部（図示省略）を備えるものである。
下側電極１０は、複数の容器３０を含む容器プレート２３０を載置可能となっている。言い換えれば、下側電極１０は複数の容器３０に対して電気的、機械的に共通に設けられている。上側電極２０もまた複数の容器３０に対して電気的、機械的に共通に設けられ、柱状電極部２１は複数の容器３０ごとに設けられている。
【００７０】
昇降機構１２０は、容器プレート２３０が載置された下側電極１０を上下方向に昇降させ、下側電極１０と複数の柱状電極部２１との間の電極間距離を調整できる。移動機構１３０は上側電極２０が取り付けられた支持部１３１を前後方向に移動させる。
加熱部２５０は、複数の容器３０を共通に加熱可能な第１加熱部２５１と、第２加熱部２５２とを備えている。第１加熱部２５１は容器プレート２３０に対して上側電極２０（柱状電極部２１）に近い側に配置され、第２加熱部２５２は、容器プレート２３０に対して下側電極１０に近い側に配置される。
【００７１】
図１１に示すように、容器プレート２３０は、例えば、左右方向に１２個、前後方向に８個、合計９６個の容器３０がそれぞれ等間隔で配置され、リブ２３１により一体となった構造となっている。このような構造の容器プレート２３０は、例えばポリプロピレンなどのプラスチックを用いて成形されたものが挙げられる。なお、容器プレート２３０における容器３０の数は、９６個に限定されるものではない。
【００７２】
図１２に示すように、加熱部２５０の第１加熱部２５１は、例えば外形が長方形のブロックヒーターであって、複数の容器３０を挿入可能な複数の穴２５１ａを有している。穴２５１ａは左右方向と前後方向とにそれぞれ等間隔で設けられている。図示していないが、第２加熱部２５２も同様である。例えば、下側電極１０を平板状として第２加熱部２５２と一体化すれば、第２加熱部２５２によって複数の容器３０を容易に位置決めして下側電極１０上に載置することができる。また、容器プレート２３０におけるリブ２３１の高さを予め調整して設定し、リブ２３１で第１加熱部２５１を支えるように配置することも可能である。つまり、第１加熱部２５１の上下方向における位置決めを可能な容器プレート２３０としてもよい。
【００７３】
本実施形態のＰＣＲ装置２００及びこれを用いたＰＣＲ方法によれば、同時にたくさんの反応液６０を従来に比べて短い所要時間でＰＣＲ処理することができる。また、複数の容器３０に収容される反応液６０は、同種のターゲット核酸を含んでいてもよいし、異種のターゲット核酸を含んでいてもよい。つまり、ＰＣＲ処理における高い生産性を実現可能なＰＣＲ装置２００及びこれを用いたＰＣＲ方法を提供できる。
【００７４】
（第３実施形態）
＜他のＰＣＲ方法＞
次に、第３実施形態としての他のＰＣＲ方法について、図１３、図１４Ａ及び図１４Ｂを参照して説明する。図１３は他のＰＣＲ方法の工程を示す概略図、図１４Ａは他のＰＣＲ方法における上側電極に印加される交流電位の波形を示す図、図１４Ｂは他のＰＣＲ方法における反応液の温度変化の一例を示すグラフである。
本実施形態の他のＰＣＲ方法は、上述したＰＣＲ装置１００（またはＰＣＲ装置２００）を用いて行うことが可能な方法であって、アニーリング反応における温度と、伸長反応における温度とを異ならせていることが特徴である。
【００７５】
本実施形態の他のＰＣＲ方法は、上記第１実施形態と同様に、容器３０に液体５０と反応液６０とを充填する充填工程（第１工程）と、加熱工程（第２工程）と、熱変性工程（第４工程）、アニーリング工程（第５工程）、伸長工程（第６工程）、をこの順に繰り返す工程（第３工程）とを備えている。充填工程（第１工程）からアニーリング工程（第５）までは上記第１実施形態と同じであるため、以降、伸長工程（第６工程）について説明する。
【００７６】
伸長工程（第６工程）では、図１３に示すように、容器３０の第１領域Ｈ１と第２領域Ｈ２との間の第３領域Ｈ３にアニーリング工程を経た反応液６０が位置するように、制御部１７０は電界発生部１４０を駆動制御して、下側電極１０と上側電極２０の柱状電極部２１との間に電界を発生させる。
容器３０の液体５０における第１領域Ｈ１（上方部分）の温度は、第１の温度となっている。容器３０の液体５０における第２領域Ｈ２（下方部分）の温度は、第１の温度より低い第２の温度となっている。容器３０の液体５０における第３領域Ｈ３の温度は、第１の温度より低く、第２の温度より高い中間的な第３の温度となっている。言い換えれば、第３領域Ｈ３の第３の温度は、第２の温度から第１の温度の間で任意に設定することが可能であり、第３の温度とする第３加熱部を必ずしも設けなくてもよい。第３の温度をより正確に実現するために、第３加熱部を設けてもよい。
【００７７】
アニーリング工程（第５工程）では、前述したように、例えば熱変性工程で得られた１本鎖ＤＮＡ６１ａに第１の温度よりも低い第２の温度でプライマー６２を結合させる。本実施形態の他のＰＣＲ方法における伸長工程（第６工程）では、第３の温度で耐熱性酵素６４を触媒としプライマー６２を起点にしてＤＮＡ合成基質６３を用いて１本鎖ＤＮＡ６１ａに相補的な２本鎖ＤＮＡ６１を合成する。耐熱性酵素６４の種類によっては、第２の温度の活性よりも第３の温度の活性のほうが優れている場合がある。したがって、第２の温度よりも高い第３の温度で伸長反応を行うことが好ましい。
【００７８】
伸長工程（第６工程）では、図１４Ａに示すように、時間ｔ2〜時間ｔ3の間に、例えば下側電極１０を第１電位（０Ｖ）とし、上側電極２０に第１電位（０Ｖ）よりも高く第２電位（６ｋＶ）よりも低い第３電位との間で電位が変位する交流電位（例えば３ｋＶ、周波数３０Ｈｚ）を印加する。これにより、下側電極１０と柱状電極部２１との間に生ずる電界は、６ｋＶ、周波数３０Ｈｚの交流電位を上側電極２０に与えた場合よりも弱くなる。すなわち、反応液６０に働くクーロン力が小さくなり、反応液６０は第２領域Ｈ２と第１領域Ｈ１との間の第３領域Ｈ３に位置することになる。言い換えれば、液体５０の温度が第３の温度となる第３領域Ｈ３（中間部分）に反応液６０が位置するように、制御部１７０は、電界発生部１４０を駆動制御して下側電極１０と上側電極２０（柱状電極部２１）との間に電界を発生させる。つまり、第３の温度の設定（位置）に応じて、上側電極２０に印加される電位や周波数を調整すればよい。
これによって、伸長工程（第６工程）では、例えば図１４Ｂに示すように、時間ｔ2〜時間ｔ3において、反応液６０の温度を、第１の温度（例えば９４℃）と第２の温度（例えば６０℃）との間の第３の温度（例えば７２℃）で維持することができる。
【００７９】
なお、伸長工程（第６工程）において、電極間距離をさらに短くすることも制御方法の１つとして挙げられる。ただし、熱変性工程（第４工程）〜伸長工程（第６工程）を５０回程度繰り返す第３工程を行うことから、頻繁に昇降機構１２０を駆動制御して下側電極１０を上下させることになり、ＰＣＲ装置１００の駆動制御が煩雑になる。その点では、上側電極２０に印加される交流電位を変化させるほうが簡便に駆動制御可能である。
【００８０】
本実施形態のＰＣＲ装置１００を用いた他のＰＣＲ方法によれば、伸長工程（第６工程）において、耐熱性酵素６４が触媒として好適に働く第３の温度で伸長反応を進めることができることから、伸長反応にかかる時間を短縮することができる。すなわち、ＰＣＲにおける所要時間をさらに短くしてターゲット核酸を増幅することができる。
【００８１】
本発明は、上記した実施形態に限られるものではなく、請求の範囲および明細書全体から読み取れる発明の要旨あるいは思想に反しない範囲で適宜変更可能であり、そのような変更を伴うＰＣＲ装置及び該ＰＣＲ装置を用いたＰＣＲ方法もまた本発明の技術的範囲に含まれるものである。上記実施形態以外にも様々な変形例が考えられる。以下、変形例を挙げて説明する。
【００８２】
（変形例１）上記実施形態では、上側電極２０に交流電位を印加して、下側電極１０と上側電極２０との間に電界を発生させたが、これに限定されない。上側電極２０に下側電極１０の電位よりも高い直流電位を印加して、下側電極１０と上側電極２０との間に電界を発生させてもよい。
【００８３】
（変形例２）上記第２実施形態では、複数の容器３０を含む容器プレート２３０に対して、電気的、機械的に共通となるように、下側電極１０及び上側電極２０を構成したが、これに限定されるものではない。例えば、下側電極１０を共通電極とし、複数の容器３０ごとに柱状電極部２１を電気的、機械的に独立して設ける構成としてもよい。これによれば、容器３０に種類が異なる反応液６０が含まれていても、反応液６０の種類に対応して柱状電極部２１に印加される電位や、下側電極１０と柱状電極部２１との電極間距離を調整して、より効率的な条件でＰＣＲを行うことができる。
【００８４】
（変形例３）上記実施形態のＰＣＲ方法において、ターゲット核酸は、２本鎖ＤＮＡに限定されない。例えば、１本鎖ＲＮＡを転写結合させた２本鎖ＲＮＡをターゲット核酸として増幅させる場合にも上記実施形態のＰＣＲ方法を適用することができる。
【００８５】
（変形例４）上記第１実施形態のＰＣＲ方法において、アニーリング工程及び伸長工程では、下側電極１０と上側電極２０（柱状電極部２１）との間に電界を発生させず、液体５０中で反応液６０を沈降させ第２領域Ｈ２に反応液６０が位置した状態でアニーリング反応及び伸長反応を行ったが、これに限定されない。例えば、第２領域Ｈ２の位置を下側電極１０から上方に少し離れた位置として、上側電極２０（柱状電極部２１）に交流電位を印加して電界を発生させ、クーロン力で反応液６０をやや浮かせた状態でアニーリング工程及び伸長工程を行わせてもよい。これによれば、反応液６０を微振動させ積極的に微小撹拌した状態でアニーリング反応及び伸長工程を行うことができる。つまり、アニーリング反応及び伸長反応に係る時間を短縮可能である。
【符号の説明】
【００８６】
１０…下側電極、２０…上側電極、２１…柱状電極部、３０…容器、５０…液体、６０…反応液、６１…ターゲット核酸としての２本鎖ＤＮＡ、６２…プライマー、６３…核酸合成基質としてのＤＮＡ合成基質、６４…耐熱性酵素、１００，２００…ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）装置、１２０…昇降機構、１５１，２５１…第１加熱部、１５２，２５２…第２加熱部、２３０…容器プレート。
【図１】
2017035038.tif 000003
【図２】
2017035038.tif 000004
【図３】
2017035038.tif 000005
【図４Ａ】
2017035038.tif 000006
【図４Ｂ】
2017035038.tif 000007
【図５Ａ】
2017035038.tif 000008
【図５Ｂ】
2017035038.tif 000009
【図６】
2017035038.tif 000010
【図７】
2017035038.tif 000011
【図８】
2017035038.tif 000012
【図９】
2017035038.tif 000013
【図１０】
2017035038.tif 000014
【図１１】
2017035038.tif 000015
【図１２】
2017035038.tif 000016
【図１３】
2017035038.tif 000017
【図１４Ａ】
2017035038.tif 000018
【図１４Ｂ】
2017035038.tif 000019