(57)【要約】【課題】本発明の解決すべき課題は、天然物に由来するＤＰＰ−４阻害剤を提供することにある。【解決手段】  本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤は、ルゴシンＢを有効成分とすることを特徴とする。 【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（化１）を有するルゴシンＢを有効成分とすることを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤。
【化１】
2017036243.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、特にローズバッツ由来の活性成分からなる阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤（以下、ＤＰＰ−４阻害剤）は、ポリペプチド及びタンパク質のＮ−末端からＸ−Ｐｒｏ又はＸ−Ａｌａジペプチド（Ｘは任意のアミノ酸残基である）を除去するセリンアミノジペプチダーゼであり、極めて広範囲に及ぶ動物組織（たとえば腸、肝臓、肺、腎臓及び胎盤）の上皮及び内皮細胞上で発現され、また体液中にも見出されている。ＤＰＰ−４はまた、循環されているＴリンパ球細胞上でも発現されており、細胞表面抗原ＣＤ−２６と同義であることが示されている。ＤＰＰ−４は、後述するように多くの疾患状態に関連していることが報告されている。
近年、ＤＰＰ−４がグルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ−１という）の代謝に働いていることが明らかにされた。ＧＬＰ−１は、小腸内のプログルカゴンの翻訳後の処理により誘導される、２９のアミノ酸を持つペプチドである。ＧＬＰ−１は、インスリン分泌の促進、グルカゴン分泌の阻害、摂食抑制作用、満腹感の増進、及び胃排泄速度の低下などの多くの作用を生体内で有する。
ＤＰＰ−４は、ＧＬＰ−１のアミノ末端のジペプチドを加水分解することによって不活化する。そのため、ＧＬＰ−１の生体内での半減期は数分ほどであることが明らかにされている。また、その不活化体がＧＬＰ−１受容体のアンタゴニストとして作用することが知られている。
したがって、ＤＰＰ−４を阻害することは、ＧＬＰ−１の作用を高め、インスリン分泌を促進して糖代謝を改善し、ひいては、高血糖症、糖尿病（２型糖尿病など）、糖尿病関連疾患（たとえば肥満、高脂血症、高コレステロール血症、脂質代謝異常、高血圧症、脂肪肝、メタボリックシンドローム、浮腫、心不全、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風）、糖尿病合併症（たとえば、網膜症、腎症、神経障害、白内障、足壊疽、感染症、ケトーシス）、及びインスリン抵抗性等の治療及び予防に有用であると期待されている。実際、ＤＰＰ−４欠損ラットでは、対象動物と比較して有意な血中ＧＬＰ−１の増加や良好な耐糖能が認められ、さらに高脂肪食付加による肥満及びインスリン抵抗性の進展抑制が認められている（非特許文献１，２）。
加えて、ＤＰＰ−４阻害活性を有する物質を糖尿病自然発症モデルラットに投与することにより、インスリン感受性の改善や血糖症の低下が認められている（非特許文献３）。
また、ＤＰＰ−４は、神経ペプチドであるニューロペプチドＹの代謝、免疫担当細胞であるＴ細胞の活性化、癌細胞の内皮への接着、ＨＩＶウイルスのリンパ球への侵入に関与していることが知られている（非特許文献４）。したがって、ＤＰＰ−４を阻害することは、これらに関連する免疫疾患などの治療及び予防にも有用であると考えられる。
加えて、良性の前立腺肥大、乾癬、慢性関節リウマチ、及び扁平苔癬患者の皮膚の繊維芽細胞においてＤＰＰ−４の高発現が見出されており、ＤＰＰ−４の阻害は、両性の前立腺肥大をはじめとするこれらの疾患の治療及び予防にも有用であると考えられる。
天然物由来では、チーズの水溶性画分やパプリカ、ローズレッドペタル、キャッツクローの有機溶媒又は有機溶媒水溶液による抽出物がＤＰＰ−４阻害活性を有することが知られている（特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−０３９４２４号公報
【特許文献２】特開２００７−２７７１６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jun 8;284(2):501-6
【非特許文献２】Life Sci. 2002 May 31;71(2):227-38
【非特許文献３】Diabetes. 2002 Apr;51 943-50
【非特許文献４】Crit Rev Clin Lab Sci. 2003 Jun;40(3):209-94
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は前記従来技術に鑑みなされたものであり、その解決すべき課題は、天然物に由来するＤＰＰ−４阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために本発明者らは、ローズバッツ抽出物にＤＰＰ−４阻害効果があることを見出し、さらにその関与成分の同定を行った。
この結果、ルゴシンＢに顕著なＤＰＰ−４阻害効果があることを見出した。
すなわち、本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤は、下記構造式（化１）を有するルゴシンＢを有効成分とすることを特徴とする。
【化１】
2017036243.tif 000002
【発明の効果】
【０００７】
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤によれば、天然物中にも存在するルゴシンＢを有効成分とするので、優れたＤＰＰ−４阻害活性は無論、高い安全性が確保される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤探索過程の説明図である。
【図２】ローズバッツ抽出液分離過程で示されるＦｒ．３のＨＰＬＣ分離結果の説明図である。
【図３】ローズバッツ抽出液分離過程で示されるＦｒ．５のＨＰＬＣの分離結果の説明図である。
【図４】本発明にかかる阻害剤（ルゴシンＢ）の１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を示すチャートである。
【図５】本発明にかかる阻害剤（ルゴシンＢ）のＭＳスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について説明する。
まず、本発明において用いた評価方法について説明する。
［ＤＰＰ−４阻害活性の測定］
ＤＰＰ−４阻害活性は、ＤＰＰ−４インヒビター・スクリーニング・アッセイ・キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｍｐａｎｙ製、Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００２１０）を用いて実施した。
（試薬の調製）
＜アッセイバッファー＞
上記キットに添付されたＤＰＰアッセイバッファー濃縮物（×１０）（Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００２１１）  ３ｍｌを、ＨＰＬＣ−グレードの水２７ｍｌで希釈し、「アッセイバッファー」（100mM NaCl及び1mM EDTAを含む20mM Tris-HCl, pH8.0）を調製した。
＜組み換えヒトＤＰＰ−４希釈＞
上記キットに添付された組み換えヒトＤＰＰ−４（Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００２１２）１２０μＬに、上記で調製したアッセイバッファー４８０μＬを加え、ボルテックスミキサーにより撹拌して、「組み換えヒトＤＰＰ−４希釈物」を調製した。
＜ＤＰＰ基質溶液＞
上記キットに添付された、５ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ結合アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）（Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００２１３）  １２０μＬを、上記で調製したアッセイバッファー２．８８ｍＬで希釈し、ボルテックスミキサーにより撹拌して、「ＤＰＰ基質溶液」を調製した。
＜測定方法＞
９６ウェル・マイクロプレート（１００μＬ用）に、３０μＬのアッセイバッファー、１０μＬの組み換えヒトＤＰＰ−４希釈物、及び１０μＬの供試サンプルを加えた。各供試サンプルごとに３つのウェルを使用した。５０μＬのＤＰＰ基質溶液を加えた後、マイクロプレート表面をプレートカバーで覆い、３７℃で３０分間、インキュベートした。プレートカバーを外し、各サンプルのＤＰＰ−４阻害活性を、励起波長３６０nm、測定は超４６０nmにて測定した。３つのウェルからの値の平均値を各サンプルのＤＰＰ−４阻害活性とした。
上記において、供試サンプル１０μＬの代わりに、アッセイバッファー１０μＬを使用したこと以外は同様に処理し、ＤＰＰ−４初期活性を測定し、「１００％のＤＰＰ−４活性」とした。
さらに、上記１００％のＤＰＰ−４活性の測定において、組み換えヒトＤＰＰ−４希釈物１０μＬの代わりに、アッセイバッファー１０μＬを使用したこと以外は同様に処理して「バックグラウンド」とした。
上記各測定値から「バックグラウンド」を引いたものを、「各サンプルのＤＰＰ−４阻害活性知」及び「１００％のＤＰＰ−４活性知」とした。これらの値を用いて、下記計算式により、各サンプルについてのＤＰＰ−４阻害率を求めた。
【数１】
2017036243.tif 000003
２．ローズバッツ試料からのＤＰＰ−４阻害剤の探索
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤の由来は、ローズバッツ（バラの蕾）である。
すなわち、バラ（薔薇）はバラ科バラ属の総称であり、特に園芸種を総称する。バラ属は灌木、低木あるいは木本性のつる植物で、葉や茎にとげがあるものが多い。葉は１回奇数羽状複葉。花は５枚の花弁と多数の雄蕊を持つ（ただし、園芸種では大部分が八重咲である）。北半球の温帯域に広く自生しているが、チベット周辺、中国雲南省からミャンマーにかけてが主産地で、ここから中近東、ヨーロッパへ、また極東から北アメリカへと伝搬したと考えられている。
以下の実施形態では、パキスタン産Rosa gallicaの蕾を用いた。
＜抽出＞
ローズバッツの蕾より、含水アルコールにて抽出し、濃縮後にデキストリンを加えて乾燥し、エキス（パウダー）を得た。
このローズバッツエキスパウダー５０ｇを脱塩水５００ｍｌに溶解したサンプル溶液（この濃度を１ｎとする）は、ＤＰＰ−ＩＶ inhibitor screening kit (Cayman Chemical)による阻害活性測定の結果、0.1n:93%、0.01n:43%の阻害率を示した。
このサンプル溶液を図１に示すように分画しＤＰＰ−４阻害活性を指標として評価を行った。
同図に示す分離過程で、溶媒分配において、酢酸エチル可溶画分とｎ−ブタノール可溶画分に同程度の活性が認められたが、重量比では酢酸エチル可溶画分の活性が高かったため、こちらを採用した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィー、Cosmosil 75C18-OPNによる逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した結果、Fr.1,3,4,5に活性が認められた。
なお、Fr.1は逆相クロマトグラフィーによる吸着がうまくいかずに溶出してしまった部分であり、またFr.4にはFr.3,5と共通するピークがほとんどであったため、Fr.3,5についてHPLCによる分画を行った。
結果を図２，３に示す。
図２に示すFr.3のＨＰＬＣによる分離結果では、ピーク(1)，(3)はTellimagrandin Ｉ、ピーク(2)，(4)はRugosin B、ピーク(5)はHeterophillin Aであった。
また、図３に示すFr.5のＨＰＬＣによる分離結果では、ピーク(1)はRugosin B ethylester、ピーク(2)はEugeniin、ピーク(3)はRugosin A、ピーク(4)はDecarboxylated Rugosin Aであった。
なお、ルゴシンＢ（ピーク(2)，(4)）の同定データを以下に示す。
＜ルゴシンＢ同定データ＞
前記ルゴシンＢ（Fr.3 ピーク(2)，(4)）の1H-NMRデータを図４に、またMS-スペクトルを図５に示す。1H-NMRデータは、Chem. Pharm. Bull. 38(12)3308-3313と対照し、ルゴシンＢに相当することを確認した。また、ＭＳ−スペクトル中、ESI-MS(negative)m/z=953(M-H)  （分子量９５４）がルゴシンＢである。
次の表１に、各化合物のＤＰＰ−４阻害活性を示す。
表１
2017036243.tif 000004
なお、ルゴシンＢの100Mm阻害活性は61であり、IC50 = 24.0μMであった。さらに、ローズバッツエキスパウダー1g中のルゴシンB含有量は、UPLC-Tof-MSによる定量分析の結果、ローズバッツエキスパウダー１ｇ中、38.2mg(40.0μmol)であった。
定量条件
ＵＰＬＣ条件
使用機器：Waters AQUITY UPLC SYSTEM
カラム：Inertsustain C18(φ2.1×100mm)
移動相：0.1%トリフロオロ酢酸(TFA)，5%アセトニトリル水溶液から0.1%TFA，95%アセトニトリル水溶液へ20分間でグラジェント
流速：0.2mL/min
検出：UV280nm
温度：室温
Ｔｏｆ−ＭＳ条件
使用機器：LCT Premier
検出：ネガティブモード  [M-H]イオンを検出
定量ソフト：Waters MassLynx
サンプル溶液（各4μLをインジェクション）
ルゴシンＢ：５，１０，１５，２０，２５μM(検量線用)
ローズバッツエキスパウダー：1mg/mL
なお、ルゴシンＢは、クローブなど他の植物にも含有されており、これらに由来するルゴシンＢを本発明のＤＰＰ−４阻害剤として用いることもできる。
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤は、医薬品として高血糖症、糖尿病（２型糖尿病など）、糖尿病関連疾患（たとえば肥満、高脂血症、高コレステロール血症、脂質代謝異常、高血圧症、脂肪肝、メタボリックシンドローム、浮腫、心不全、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風）、糖尿病合併症（たとえば、網膜症、腎症、神経障害、白内障、足壊疽、感染症、ケトーシス）、及びインスリン抵抗性等の治療及び予防に有用である
また、同阻害剤は、ＤＰＰ−４阻害によって、ニューロペプチドＹの代謝に関連する疾患、Ｔ細胞活性化に関連する疾患、癌細胞の内皮への接着、ＨＩＶウイルス感染、良性の前立腺肥大、乾癬、慢性関節リウマチ、及び扁平苔癬の治療及び予防にも有用であると考えられる。
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。その材系は、投与経路に応じて適宜選択することができ、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内服液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻薬、点耳薬、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などを挙げることができる。これらは、症状に応じてそれぞれ単独で又は組み合わせて用いることができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの、この分野において通常用いられる補助剤が使用される。
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤の投与量は、使用目的、使用形態に応じて適宜決定され、特に限定されるものではないが、通常５〜１００ｍｇ／日を数度に分けて投与することが好ましい。
本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤は、医薬部外品としても用いることができる。医薬部外品として用いる場合、必要に応じて医薬部外品などの技術分野で用いられている種々の補助剤（前記）とともに用いられる。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形してもよい。これらの組成物に含まれる阻害剤の量は特に限定されず、使用目的、使用形態に適宜選択することができる。
また、本発明にかかるＤＰＰ−４阻害剤を飲食品用組成物として摂取することも可能であり、健康食品、健康飲料、特定保健用食品、機能性食品、栄養補助食品あるいは他の動物に対する資料などに添加することができる。
本発明のＤＰＰ−４阻害剤を飲食物に用いる場合、必要に応じて甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤を配合することができる。また、固形状、粉末状、顆粒状、溶液状、懸濁液状、シロップ状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等の所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる本発明の活性成分の量は、特に限定されず、使用目的、使用形態に応じて適宜選択することすることができる。
以下に、本発明にかかるジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤の製剤例を示す。
錠剤
ルゴシンＢ        ５ｍｇ
デンプン      ２００ｍｇ
上記組成で錠剤化し、２錠／回  １日３回  食前投与用錠剤を得た。
カプセル
ルゴシンＢ      １０ｍｇ
乳糖          ２００ｍｇ
上記組成をカプセルに封入し、１カプセル／回  １日３回  食前投与用カプセルを得た。
なお、上記製剤において、ルゴシンＢを例えばローズバッツ抽出物（ルゴシンＢとして同程度量）に置き換えて製剤化することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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