(57)【要約】      （修正有）【課題】より効率的にバイオマスを糖化することができ、且つ熱安定性に優れたキシラナーゼの提供。【解決手段】（１）下記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質から選ばれるキシラナーゼ。；（ａ）特定のアミノ酸配列において、７７位、２１４位及び３２８位のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質から選ばれるキシラナーゼ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、７７位、２１４位及び３２８位のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有し、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１の何れかのキシラナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組み換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項５】
前記宿主が微生物である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質を含有するバイオマス糖化用酵素製剤。
【請求項７】
バイオマスを、請求項６記載の酵素製剤で糖化処理する工程を含む、糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性を備えたキシラナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを含有するバイオマス材料（以下、「バイオマス」ということがある）中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールや乳酸などへ変換する技術は以前より知られている。さらに近年、環境問題への取り組みの観点から、バイオマスを資源として効率よく利用する技術の開発が注目されている。
【０００３】
バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻くキシランを主に含むヘミセルロース及びリグニンから構成されている。バイオマスにおけるセルロースやヘミセルロースの糖化効率を高めるためには、セルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素の開発が必要となる。また、当該バイオマスからリグニンを除去することが必要である。
【０００４】
バイオマスのセルラーゼによる糖化や、ヘミセルラーゼやリグニナーゼによるバイオマスの酵素分解は、従来から行われている。例えば、セルラーゼにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼやアラビノフラノシダーゼなどのヘミセルラーゼが添加された酵素組成物が開発されている（特許文献１）。また、バガス堆肥に存在する微生物群由来のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、及び当該タンパク質とセルラーゼとをバイオマス資源に反応させることによる糖の製造方法が知られている（特許文献２）。さらに、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）が製造販売しているキシラナーゼ製剤（Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃなど）も知られている。
【０００５】
しかしながら、従来のヘミセルラーゼやキシラナーゼを用いたバイオマスの糖化方法は、糖化効率や単糖の生産性、又は酵素コストの面で未だ満足できるものではなかった。
さらに、従来のキシラナーゼは、至適ｐＨ領域が比較的狭く、また熱安定性の面でも劣っているため、適用用途が制限される場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５１５０８９号公報
【特許文献２】特開２０１２−０２９６７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より効率的にバイオマスを糖化することができ、且つ熱安定性に優れたキシラナーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、広いｐＨ領域において高いキシラナーゼ活性を発揮し得る、Cellulomonas属細菌由来の新規キシラナーゼを見出し、既に特許出願した（特願２０１２−１１９０３４）。そして、更に検討した結果、当該キシラナーゼの所定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱安定性を向上できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に係るものである。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質から選ばれるキシラナーゼ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、７７位、２１４位及び３２８位のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）（１）の何れかのキシラナーゼをコードする遺伝子。
（３）（２）の遺伝子を含有する組み換えベクター。
（４）（３）の組み換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
（５）（１）のタンパク質を含有するバイオマス糖化用酵素製剤。
（６）バイオマスを（５）の酵素製剤で糖化処理する工程を含む、糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のキシラナーゼは、比較的広範囲のｐＨ条件で作用し、且つ５０−６５℃で優れたキシラナーゼ活性を有することから適用範囲が広い。したがって、これを用いれば、過酷な条件においても効率的にバイオマスを糖化することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌを意味する。
【００１２】
本明細書において、「（アミノ酸配列間の）同一性」とは、２つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）したときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１３】
本明細書において「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性をいう。タンパク質のキシラナーゼ活性は、例えば、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。キシラナーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００１４】
本明細書において、「相当する位置のアミノ酸残基」の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各キシラナーゼのアミノ酸配列に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行うことができる。キシラナーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各キシラナーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。アラインメントは、例えば、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，  ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイトから利用することができる。
【００１５】
当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。
【００１７】
本発明のキシラナーゼは、下記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質を包含する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、７７位、２１４位及び３２８位のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１８】
（ａ）で示される「配列番号２で示されるアミノ酸配列」としては、Cellulomonas属細菌由来キシラナーゼ、具体的には、Cellulomonas fimi ＡＴＣＣ４８４由来キシラナーゼのアミノ酸配列が挙げられる（特願２０１２−１１９０３４）。
斯かる配列番号２で示されるアミノ酸配列において、７７位（Ｎ末端から７７番目）、２１４位（Ｎ末端から２１４番目）及び３２８位（Ｎ末端から３２８番目）のアミノ酸はアラニンである。（ａ）で示されるキシラナーゼは、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼを基準キシラナーゼとして、当該キシラナーゼの７７位、２１４位及び３２８位のアラニン残基のいずれか１以上がプロリン残基に置換された変異体（変異キシラナーゼとも称する）である。尚、当該アミノ酸残基の置換は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
斯かる変異キシラナーゼは、基準キシラナーゼと比べて、耐熱性が向上している。
【００１９】
本発明においては、（ａ）で示されるキシラナーゼの他に、（ｂ）及び（ｃ）の如く、（ａ）において示された位置のアミノ酸残基の置換に加えて、そのキシラナーゼ活性を損なわない限り、他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換又は付加）を有するキシラナーゼが包含される。当該任意の位置における変異もまた、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【００２０】
（ｂ）において、「（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」としては、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列のうち、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸を除いた残余のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは、９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
斯かる（ｂ）で示されるキシラナーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるキシラナーゼ活性を有するタンパク質を基準キシラナーゼとして、配列番号２の７７位、２１４位及び３２８位に相当する位置のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が包含される。
【００２１】
（ｃ）において、「（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」としては、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列のうち、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸を除いた残余のアミノ酸配列において、１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個が欠失、置換、付加したアミノ酸配列が挙げられる。ここで、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とはアミノ酸残基が付け加えられていることを意味する。尚、「付加」には、配列中のアミノ酸の間に別のアミノ酸残基が挿入されることも含まれる。
斯かる（ｃ）で示されるキシラナーゼには、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるキシラナーゼ活性を有するタンパク質を基準キシラナーゼとして、配列番号２の７７位、２１４位及び３２８位に相当する位置のいずれか一つ以上のアラニン残基がプロリン残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が包含される。
【００２２】
上記（ｂ）及び（ｃ）のキシラナーゼ活性を有するタンパク質において為される任意の変異は、例えば、対象となるキシラナーゼをコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入（Site-Directed Mutagenesis）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のキシラナーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
【００２３】
本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、上記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質をコードする遺伝子であり、具体的には、下記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子が例示できるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお本発明において「キシラナーゼをコードする遺伝子」とは、キシラナーゼのアミノ酸配列をコードする任意の核酸断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び人工核酸等を含む）を意味する。本発明に係る「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに加えて非翻訳領域（ＵＴＲ）などの他の塩基配列を含んでもよい。
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列において、配列番号１の２２９位〜２３１位、６４０位〜６４２位及び９８２位〜９８４位から選ばれる少なくとも１のアラニンをコードする塩基がプロリンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｅ）（ｄ）の遺伝子の塩基配列において、配列番号１の２２９位〜２３１位、６４０位〜６４２位及び９８２位〜９８４位に相当する塩基以外で同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｆ）（ｄ）の遺伝子の塩基配列において、配列番号１の２２９位〜２３１位、６４０位〜６４２位及び９８２位〜９８４位に相当する塩基以外の位置で、１又は数個、好ましくは１以上１５個以下、より好ましくは１以上６個以下の塩基が、欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。尚、「付加」には、配列中の塩基の間に別の塩基が挿入されることも含まれる。
【００２４】
本発明のキシラナーゼは、例えば以下の方法により取得することができる。すなわち、クローニングされた基準キシラナーゼをコードする遺伝子に対して、当技術分野で公知の各種変異導入技術を用いて本発明の変異を施す。例えば、配列番号1で示されるキシラナーゼをコードする遺伝子に対して、置換対象アミノ酸残基をコードする塩基配列を、置換後アミノ酸残基をコードする塩基配列に変異させる。そして、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより置換対象のアミノ酸残基が所望のアミノ酸残基に置換された変異キシラナーゼを得ることができる。
【００２５】
基準キシラナーゼをコードする遺伝子は、Cellulomonas属細菌、例えばCellulomonas fimi（ATCC 484）等から、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼをコードする遺伝子は、Cellulomonas属細菌の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、当該遺伝子は、本発明のキシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。
【００２６】
基準キシラナーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、基本的には、基準キシラナーゼをコードする遺伝子（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００２７】
部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、基準キシラナーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、且つその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。
【００２８】
プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、基準キシラナーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入されたキシラナーゼをコードする遺伝子を得ることができる。
【００２９】
本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子のより具体的な調製方法としては、まず、回収したプラスミドを鋳型にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列における７７、２１４及び３２８番目のアミノ酸がプロリンに置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲ反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９８℃で１０秒行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃で１５秒行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を６８℃で９分行い、これらを１サイクルとしたものを４０サイクル行うことが挙げられる。
【００３０】
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するＤｐｎＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレー
ト培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたキシラナーゼをコードする遺伝子を取得することができる。
【００３１】
得られた本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を用いたキシラナーゼの生産は、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させ、当該宿主菌株を、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００３２】
ベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターpHY300PLK（タカラバイオ）、pUC19（タカラバイオ）、pUC119（タカラバイオ）、pBR322（タカラバイオ）等を好適に用いることができる。
【００３３】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片、及び複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。また上記のベクターにおいては、上記本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、発現されたタンパクを細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、本発明のプラスミドが適切に導入された微生物を選択するための薬剤耐性遺伝子（アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）がさらに組み込まれていてもよい。上記制御配列等の例としては、S237eglプロモーター及びシグナル配列（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(11):2281-9, 2000）、ならびにBacillus sp. KSM-237株(FERM BP-7875)及びBacillus sp. KSM-64株(FERM BP-2886)由来のセルラーゼの遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。あるいは、当該制御領域としては、配列番号３で示される塩基配列の塩基番号1〜662の塩基配列、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、又はこれらの塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、更により好ましくは98％以上の配列同一性を有し且つ転写開始制御機能、翻訳開始制御機能及び分泌シグナルペプチドとしての機能を有する塩基配列が挙げられる。キシラナーゼ遺伝子と上記制御配列、薬剤耐性遺伝子との連結は、ＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene,77,61,1989）等の方法によって行うことができる。プラスミドベクターへの遺伝子の導入手順は当該分野で周知である。尚、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。
【００３４】
構築された上記ベクターを導入のための微生物としては、Staphylococcus属、Enterococcus属、Listeria属、Bacillus属に属する細菌等が挙げられるが、このうち、Bacillus属細菌、例えば枯草菌又はその変異株（例えば、特開2006-174707記載のプロテアーゼ９重欠損株KA8AX等）が好ましい。導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション等の当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株は、薬剤耐性等を指標に選択することで目的の形質転換体を得ることができる。
【００３５】
斯くして得られた形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクター上にコードされた遺伝子が発現して、本発明のキシラナーゼが生産される。培養に使用する培地は、形質転換体の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。生成された目的のキシラナーゼを該培養物から通常の方法により単離又は精製することにより、本発明のタンパク質を取得することができる。このとき、当該ベクター上でキシラナーゼ遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたキシラナーゼは菌体外に分泌されるため回収がより容易になる。回収されたキシラナーゼは、さらに公知の手段で精製されてもよい。
【００３６】
本発明のキシラナーゼは、後述の実施例に示す通り、比較的広範囲のｐＨ条件で作用し、且つ５０−６５℃で優れたキシラナーゼ活性を有することから、これを含有する組成物は、バイオマス糖化用酵素製剤となり得る。
ここで、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物または粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類、藻類などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性および原料コストの観点から、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独でまたは２種以上を混合して使用してもよい。また上記のバイオマスは乾燥されていてもよい。
【００３７】
当該バイオマス糖化用酵素製剤は、本発明のキシラナーゼの他、糖化効率の向上の観点から、さらにセルラーゼを含むことが好ましい。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオハイドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明に使用されるセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。
本発明において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組み合わせで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、エンドグルカナーゼを含むことが好ましい。
【００３８】
セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ；トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）由来のセルラーゼ；バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ６５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）などの各種バチルス株由来のセルラーゼ；パイロコッカス  ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ；フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、またはフミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼが好ましい。上記セルラーゼを含むセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅTMＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、およびウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられる。このうち、糖化効率の向上の観点、製造コスト低減の観点、入手性の観点などから、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅTMＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）が好ましく、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２がより好ましい。
【００３９】
また、セルラーゼの１種であるβ−グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）由来のβ−グルコシダーゼ（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製β-グルコシダーゼ）、ならびにトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）またはペニシリウム  エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来のβ−グルコシダーゼなどが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、ノボザイム１８８、トリコデルマ  リーゼ由来のβ−グルコシダーゼが好ましく、トリコデルマ  リーゼ由来のβ−グルコシダーゼがより好ましい。
【００４０】
また、セルラーゼの１種であるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、アクレモニウム  セルロリティカス（Acremonium celluloriticus）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）、クロストリジウム  サーモセラム（Clostridium thermocellum）、バチルス（Bacillus）、サーモビフィダ（Thermobifida）、セルロモナス（Cellulomonas）由来の酵素などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ  リーゼ、フミコーラ  インソレンス、バチルス、セルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ  リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。
【００４１】
また、本発明の酵素製剤は、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼを含有していてもよい。ここで、ヘミセルラーゼとは、へミセルロースを加水分解する酵素を指し、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼなどと称される酵素の総称である。本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの具体例としては、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）由来のヘミセルラーゼ；バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）由来のキシナラーゼ；アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）、またはバチルス  アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ；サーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、またはサーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ、バチルス  プミルス（Bacillus pumilus）由来のβ―キシロシダーゼ、セレノモナス  ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来β―キシロシダーゼが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、本発明の酵素製剤は、バチルス  エスピー、アスペルギルス  ニガー、トリコデルマ  ビリデもしくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、またはセレノモナス  ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することが好ましく、バチルス  エスピーもしくはトリコデルマ  ビリデ由来のキシナラーゼ、またはセレノモナス  ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼを含有することがより好ましい。
【００４２】
本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上さらに好ましくは２質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下、さらにより好ましくは３０質量％以下である。また、好ましくは０．５〜７０質量％、より好ましくは１〜５０質量％さらに好ましくは２〜４０質量％、さらにより好ましくは２〜３０質量％である。
また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上であり、且つ好ましくは９９質量％以下、より好ましくは９５質量％以下である。また、好ましくは１０〜９９質量％、より好ましくは３０〜９５質量％、さらに好ましくは５０〜９５質量％である。
また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下である。また好ましくは１〜７０質量％、より好ましくは５〜５０質量％、さらに好ましくは１０〜４０質量％である。
また、本発明の酵素製剤の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量としては、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１質量以上％、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．５以上質量％であり、且つ好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．５〜２０質量％である。
【００４３】
本発明の酵素製剤における、本発明のキシラナーゼと上記セルラーゼのタンパク質量比（本発明のキシラナーゼ／セルラーゼ）は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１以上、より好ましくは０．０５以上であり、且つ好ましくは１００以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは１以下、よりさらに好ましくは０．５以下である。また、好ましくは０．０１〜１００、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．０５〜１、よりさらに好ましくは０．０５〜０．５である。
【００４４】
本発明の酵素製剤における、本発明のキシラナーゼと上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比（本発明のキシラナーゼ／エンドグルカナーゼ）は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．１以上であり、且つ好ましくは１０以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは２以下、よりさらに好ましくは１以下である。また、好ましくは０．０５〜１０、より好ましくは０．１〜５、さらに好ましくは０．１〜２、よりさらに好ましくは０．２〜１である。
【００４５】
本発明の糖の製造方法は、バイオマスを、本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤で糖化する工程を含む。
糖化処理の条件は、本発明のキシラナーゼおよび同時に添加するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されず、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定できるが、バイオマスを含む懸濁液に上記キシラナーゼまたは酵素製剤を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率向上および生産性（生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上であり、且つ好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１５質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下である。また、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。
上記懸濁液に対するキシラナーゼまたは酵素製剤の使用量は、前処理条件、配合される酵素の種類および性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、好ましくは０．０４質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上であり、且つ好ましくは６００質量以下％、より好ましくは１００質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下である。また、好ましくは０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である。
糖化処理時の反応ｐＨとしては、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４以上、より好ましくはｐＨ５以上であり、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ８以下、さらに好ましくはｐＨ７以下である。また、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である。
糖化処理時の反応温度は、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、２０℃以上が好ましく、より好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは３０以上、さらにより好ましくは４０℃以上、なお好ましくは４５℃以上、さらになお好ましくは５０℃以上であり、且つ９０℃以下が好ましく、より好ましくは８５℃以下、さらに好ましくは８０℃以下、さらにより好ましくは７５℃以下、なお好ましくは６５℃以下、さらになお好ましくは６０℃以下である。また、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらにより好ましくは４０〜７５℃、なお好ましくは４５〜６５℃、さらになお好ましくは４５〜６０℃、よりさらになお好ましくは５０〜６０℃である。糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。
【００４６】
尚、本発明の糖の製造方法においては、粉砕効率向上、糖化効率向上、および生産効率向上（生産時間の短縮）の観点から、バイオマスを本発明のキシラナーゼまたは酵素製剤で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。本発明のキシラナーゼはアルカリ領域においても高い酵素活性を有するため、当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。
【００４７】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）〜（ｃ）で示されるタンパク質から選ばれるキシラナーゼ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、７７位、２１４位及び３２８位のいずれか一つ以上のアラニンがプロリンに置換されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外で９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、前記７７位、２１４位及び３２８位のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質。
＜２＞上記＜１＞の何れかのキシラナーゼをコードする遺伝子。
＜３＞上記＜２＞の遺伝子を含有する組み換えベクター。
＜４＞上記＜３＞の組み換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
＜５＞前記宿主が微生物である＜４＞の形質転換体。
＜６＞上記＜１＞のタンパク質を含有するバイオマス糖化用酵素製剤。
【００４８】
＜７＞セルラーゼをさらに含む、上記＜６＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
＜８＞上記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、上記＜７＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
＜９＞上記酵素製剤の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下である、また好ましくは１〜７０質量％、より好ましくは５〜５０質量％、さらに好ましくは１０〜４０質量％である、上記＜８＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
＜１０＞上記＜１＞のタンパク質と上記セルラーゼのタンパク質量比（該タンパク質／該セルラーゼ）が、好ましくは０．０１以上、より好ましくは０．０５以上であり、且つ好ましくは１００以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは１以下、よりさらに好ましくは０．５以下である、また、好ましくは０．０１〜１００、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．０５〜１、よりさらに好ましくは０．０５〜０．５である、上記＜７＞〜＜９＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
＜１１＞上記＜１＞のタンパク質と上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比（該タンパク質／該エンドグルカナーゼ）が、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．１以上であり、且つ好ましくは１０以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは２以下、よりさらに好ましくは１以下である、また、好ましくは０．０５〜１０、より好ましくは０．１〜５、さらに好ましくは０．１〜２、よりさらに好ましくは０．２〜１である、上記＜８＞〜＜９＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
＜１２＞上記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上、好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくはバガスである、上記＜６＞〜＜１１＞のバイオマス糖化用酵素製剤。
【００４９】
＜１３＞バイオマスを、上記＜６＞〜＜１２＞の酵素製剤で糖化処理する工程を含む、糖の製造方法。
＜１４＞上記糖化処理において、上記バイオマスを含む懸濁液に上記＜１＞のタンパク質または上記＜６＞〜＜１２＞の酵素製剤を添加する、上記＜１３＞の方法。
＜１５＞上記懸濁液中の上記バイオマスの含有量が、０．５〜２０質量％、好ましくは３〜１５質量％、好ましくは５〜１０質量％である、上記＜１４＞の方法。
＜１６＞上記懸濁液に対する上記＜１＞のタンパク質または上記＜６＞〜＜１２＞の酵素製剤の使用量が、上記バイオマスの質量に対して、好ましくは０．０４質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上であり、且つ好ましくは６００質量以下％、より好ましくは１００質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下である、また、好ましくは０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である、上記＜１４＞または＜１５＞に記載の方法。
【００５０】
＜１７＞上記糖化処理時の反応ｐＨが、好ましくはｐＨ４以上、より好ましくはｐＨ５以上であり、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ８以下、さらに好ましくはｐＨ７以下である、また、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である、上記＜１３＞〜＜１６＞の方法。
＜１８＞上記糖化処理時の反応温度が、２０℃以上が好ましく、より好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは３０以上、さらにより好ましくは４０℃以上、なお好ましくは４５℃以上、さらになお好ましくは５０℃以上であり、且つ９０℃以下が好ましく、より好ましくは８５℃以下、さらに好ましくは８０℃以下、さらにより好ましくは７５℃以下、なお好ましくは６５℃以下、さらになお好ましくは６０℃以下である、また、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらにより好ましくは４０〜７５℃、なお好ましくは４５〜６５℃、さらになお好ましくは４５〜６０℃、よりさらになお好ましくは５０〜６０℃である、上記＜１３＞〜＜１７＞の方法。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を使用し、PrimeSTAR Max Premix GXL（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々10 pmol、及びPrimeSTAR Max Premix GXLを1μL添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び68℃で9分間の3段階の温度変化を40回繰り返すことにより行った。
【００５２】
実施例1  Cellulomonas由来セルラーゼ遺伝子のクローニング
1-1  ゲノムDNAの抽出
Cellulomonas fimi ATCC 484株をGrowth medium（1.0% Polypeptone、0.2% Yeast extract、0.1% MgSO4・7H2O、pH 7.0）に植菌し、30℃にて1日間培養した。培養して得られた菌体から、UltraCleanTM Microbial DNA Isolation Kit（Mo Bio Laboratories, Inc.製）を用いてゲノムDNAを取得した。
【００５３】
1-2  ベクターの作製
1-1で得られたゲノムDNAを鋳型として、表1に示したフォワードプライマー1（配列番号5）とリバースプライマー1（配列番号6）を用いて、ゲノム上のキシラナーゼ遺伝子領域（配列番号2）約1.4kbp断片(A)を増幅した。また、シャトルベクターpHY300PLK（タカラバイオ）のBamHI制限酵素切断点に、バチルス属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のS237アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）（配列番号3）をコードするDNA断片が挿入された組換えプラスミドpHY-S237を鋳型とし表1に示したフォワードプライマー2（配列番号7）とリバースプライマー2（配列番号8）を用いてS237アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く約5.6kbp断片(B)を増幅した。増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit（Roche製）にて精製した。
【００５４】
【表１】
2017035001.tif 000002
【００５５】
精製されたDNA断片(A)1μLとDNA断片(B)1μL、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）に含まれる5×In-Fusion HD Enzyme Premix2μL、DNaseフリーの水6μLを混合し、50℃で15分反応させた。その後、反応液2μLを用いて、コンピテントセルE.coli HB101（タカラバイオ）20μＬを形質転換した。形質転換体の再生培地には、50ppmアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）、2.0%アガー（和光純薬工業）を含むLB寒天培地を用いた。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体は同様のLB寒天培地を用いて培養後（37℃、1日間）、得られた菌体からプラスミドをHigh Pure Plasmid Isolation kit（Roche）を用いて回収、精製した。
【００５６】
1-3  宿主菌への形質転換
プラスミドの宿主菌への導入はプロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet., 168, 111(1979) ）に従って行った。この際、宿主菌にはBacillus subtilis 168株プロテアーゼ9重欠損株(KA8AX)（特開2006-174707）を用いた。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有DM3再生寒天培地（キシラン from beechwood（Sigma-Aldrich）1.0%(w/v)、バクトカザミノ酸（Difco）0.5%(w/v)、酵母エキス（Difco）0.5%(w/v)、L-トリプトファン（和光純薬工業）0.01%(w/v)、コハク酸二ナトリウム六水和物（和光純薬工業）8.1%(w/v)、リン酸一水素二カリウム（和光純薬工業）0.35%(w/v)、リン酸二水素一カリウム（和光純薬工業）0.15%(w/v)、グルコース（和光純薬工業）0.5%(w/v)、塩化マグネシウム（和光純薬工業）20mM、牛血清アルブミン（和光純薬工業）0.01%(w/v)、トリパンブルー0.01%(w/v) （ACROS ORGANICS）、テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業）0.005%(w/v)、 寒天1.0%(w/v)）を用いた。
【００５７】
実施例2  キシラナーゼ生産
DM3再生寒天培地上に生育した形質転換体15ppmテトラサイクリン含有LB培地5mLを用いてシード培養後（30℃、250rpm、16時間）、シード培養液0.6mLを2×L Mal培地20mL（バクトトリプトン2%(w/v)、酵母エキス1.0%(w/v)、塩化ナトリウム1.0%(w/v)、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業）75ppm、マルトース一水和物（和光純薬工業）7.5%(w/v)、テトラサイクリン塩酸塩15ppm]に添加し、メイン培養を行った（30℃、230rpm、3日間）。培養後、遠心分離（11,000rpm、15分間、4℃）により培養上清を得た。培養上清3mLは脱塩カラムEcono-Pac 10DGカラム（Biorad）を用いて20mM Tris-HCl pH7.5へとバッファー交換を行うことで組換えキシラナーゼ粗酵素液を調製した。
【００５８】
実施例3  変異導入
配列番号１に示す塩基配列からなる野生型キシラナーゼをコードする遺伝子を鋳型として、下記表2に示す（実際に示す）77-Pro induced Cfi Fw（配列番号9）及び77-Pro induced Cfi Rv（配列番号10）のプライマー対、  214-Pro induced Cfi Fw（配列番号11）及び214-Pro induced Cfi Rv（配列番号12）のプライマー対、  328-Pro induced Cfi Fw（配列番号13）及び328-Pro induced Cfi Rv（配列番号14）のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号１に示した野生型キシラナーゼの塩基配列の229〜231番目、640〜642番目、982〜984番目のそれぞれの塩基gcc（アラニン ；A）をccg（プロリン；P）へとそれぞれ置換された変異キシラナーゼ（夫々、A77P、A214P、A328Pと表記する）をコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。得られたPCR反応溶液をDpnＩで処理し、鋳型DNAを消化した後、大腸菌に形質転換して、変異キシラナーゼが発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、DNAシークエンス法によって、変異キシラナーゼをコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
【００５９】
【表２】
2017035001.tif 000003
【００６０】
実施例4  変異キシラナーゼの酵素学的性質の解析
4-1  耐熱性
耐熱性の測定を行った。まず、粗酵素液を50mM酢酸バッファーで適宜希釈し、Veriti サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を用いて62〜67℃(1℃刻み)で20分インキュベートした。同時に合成基質1mM p-nitrophenylxylobioside溶液20μL, 250mM 酢酸バッファー20μL及び水50μLを混合して基質溶液90μLを調整した。基質溶液にインキュベート後の粗酵素溶液10μLを添加し、50℃で10分間反応した。反応後、炭酸カルシウム水溶液を100μL加え、420nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダー VersaMax（モレキュラーデバイスジャパン）で測定した。尚、基質溶液90μLに炭酸カルシウム水溶液を100μL添加後、酵素溶液10μLを加えて、同様の操作を行ったものをブランクとした。そして、p-nitrophenol溶液で作成した検量線を作製し、生成されたp-nitrophenol量を算出した。基質液由来のバックグラウンドの分を差し引いた値をp-nitrophenol生成量とした。
変異キシラナーゼと野生型の比較の結果を表3に示した。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
表3に示したように、本発明のキシラナーゼは野生型よりも高い耐熱性を示していることが確認された。
【００６３】
4-2  最適反応pH
至適pHの測定を行った。合成基質1mM p-nitrophenylxylobioside溶液20μL、250mM リン酸-クエン酸バッファー(pH 4, 5, 6, 7, 8)20μL及び水50μLを混合して基質溶液90μLを調整した。基質溶液に適当な濃度に希釈した粗酵素溶液10μLを添加し、50℃で10分間反応した。反応後、炭酸カルシウム水溶液を100μL加え、420nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダー VersaMax（モレキュラーデバイスジャパン）で測定した。尚、基質溶液90μLに炭酸カルシウム水溶液を100μL添加後、酵素溶液10μLを加えて、同様の操作を行ったものをブランクとした。そして、p-nitrophenol溶液で作成した検量線を作製し、生成されたp-nitrophenol量を算出した。基質液由来のバックグラウンドの分を差し引いた値をp-nitrophenol生成量とした。最大の生成糖量を示したサンプルを100%とした際の各pHでの生成糖量を相対活性として求めた。変異キシラナーゼ及び野生型キシラナーゼによるp-nitrophenylxylobiosideの分解に関する至適pHの結果を表4に示した。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
表4より、本発明のキシラナーゼは、pH6.0において最大活性を示し、pH5.0〜7.0において最大活性の70%以上の活性を維持していた。
【００６６】
4-3  比活性解析
キシラン比活性を測定し、野生型と比較した。2.0%(w/v) キシラン from beechwood 50μL、250mM 酢酸バッファー(pH5.0) 20μL及び水20μLを混合して基質溶液90μLを調整した。適当な濃度に希釈した10μLの変異体の粗酵素溶液を添加し、50℃で10分間反応した。反応後、DNS溶液を100μL添加して反応を停止させ100℃にて5分間反応させた。冷却後、540nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダーで測定した。尚、基質溶液90μLにDNS溶液を100μL添加後、酵素溶液10μLを加えて、同様の操作を行ったものをブランクとした。キシロース溶液で作成した検量線を作製して生成されたキシロオリゴ糖量を算出し、基質液由来のバックグラウンドの糖を差し引いた値を生成糖量とした。その後、生成糖量から希釈酵素溶液のキシラナーゼ活性を計算し、野生型の活性を100%とし、相対活性を測定した。
変異キシラナーゼ及び野生型キシラナーゼによるキシランの分解に関する比活性の結果を表5に示した。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
4-4  最適反応温度
最適反応温度を測定した。合成基質1mM p-nitrophenylxylobioside溶液20μL, 250mM 酢酸バッファー20μL及び水50μLを混合して基質溶液90μLを調整した。基質溶液に適当な濃度に希釈した粗酵素溶液10μLを添加し、Veriti サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を用いて45〜70℃(5℃刻み)で10分間反応させた。反応後、炭酸カルシウム水溶液を100μL加え、420nmの吸光度を吸光マイクロプレートリーダー VersaMax（モレキュラーデバイスジャパン）で測定した。尚、基質溶液90μLに炭酸カルシウム水溶液を100μL添加後、酵素溶液10μLを加えて、同様の操作を行ったものをブランクとした。そして、p-nitrophenol溶液で作成した検量線を作製し、生成されたp-nitrophenol量を算出した。基質液由来のバックグラウンドの分を差し引いた値をp-nitrophenol生成量とした。最大のp-nitrophenylxylobioside生成量を示したサンプルを100%とした際の各温度での生成量を比活性として求めた。
変異キシラナーゼ及び野生型キシラナーゼの至適反応温度の結果を表6に示した。
【００６９】
【表６】
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【００７０】
本発明のキシラナーゼは、50-60℃付近で最もキシラン分解活性が高く、45-65℃の範囲で最大活性の60%以上の活性を示した。
【配列表】
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