(57)【要約】【課題】細胞のコラーゲン産生を促進する物質又は組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸とが相補的に結合している二本鎖核酸からなるコラーゲン産生促進剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸とが相補的に結合している二本鎖核酸からなる、コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
前記二本鎖核酸は、以下の式（Ｉ）で示される構造を有し、
【化１】
2017178886.tif 000006
式（Ｉ）中の各々の
【化２】
2017178886.tif 000007
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵの各々は、独立して、リボヌクレオチドであり、
ａ及びｔの各々は、独立して、デオキシリボヌクレオチドであり、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ及びｔの各々は、隣接するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ又はｔに共有結合で連結している、請求項１記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のコラーゲン産生促進剤を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進用の組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載のコラーゲン産生促進剤、又は、請求項３記載の組成物を細胞に導入して作製された、コラーゲン産生細胞。
【請求項５】
請求項１又は２記載のコラーゲン産生促進剤、又は、請求項３記載の組成物を細胞に導入する導入ステップと、
前記コラーゲン産生促進剤又は前記組成物が導入された導入細胞を培養する培養ステップと、
を備える、コラーゲン産生細胞の作製方法。
【請求項６】
前記培養ステップにおいて、前記導入細胞からコラーゲンを産生している細胞をスクリーニングし、コラーゲン産生能が高い導入細胞をクローニングして系統化する系統化ステップを備える、コラーゲン産生細胞の作製方法。
【請求項７】
前記細胞は、ヒト肺癌由来細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト肝癌由来細胞又はヒト近位尿細管上皮細胞である、請求項５又は６に記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚の真皮、靭帯、腱、骨及び軟骨等を構成する線維状の蛋白質で、動物の全蛋白質のほぼ２５％を占める。コラーゲンは、線維芽細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞等の結合組織細胞から分泌されたのち、細胞間マトリックスを形成し、細胞や臓器の形態維持に役立つ。また、軟骨や骨では、基質蛋白質の構成成分として重要な役割を果たす（非特許文献１）。
【０００３】
生体のコラーゲン産生は、加齢に伴い低下することが知られている（非特許文献２）。コラーゲン産生の低下は、皮膚のしわやたるみの増加、創傷治癒の遅延及び骨密度の低下を引き起こす（非特許文献３〜６）。このような加齢性変化を予防・改善する治療薬として、コラーゲン産生促進剤の開発がすすめられており、これまでに種々の物質がコラーゲン産生促進作用を有することが報告されている。具体的には、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β（以下、ＴＧＦ−β）、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（以下、ＣＴＧＦ）又はマイクロＲＮＡ２１等によるコラーゲン産生促進作用が知られている（非特許文献７及び８）。
【０００４】
また、コラーゲン産生促進剤は、新薬の開発の場にも用いられている。例えば、過剰なコラーゲンの産生を特徴とする線維症の治療薬のスクリーニング方法には、コラーゲン産生促進剤を用いてコラーゲン産生を増大させた細胞が用いられる（非特許文献９）。
【０００５】
一方、本発明に係る二本鎖核酸は、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡとしての作用を有することが既に明らかとなっている（特許文献１及び２並びに非特許文献１０）。ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡは、コラーゲンの産生を抑制することが報告されている（特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７２０８２号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１７０９５７号
【特許文献３】特開第２０１５／１２９１８８号公報
【特許文献４】特開第２０１２／２０９９５号公報
【特許文献５】特開第２０１３／１２６９７５号公報
【特許文献６】特開第２０１０／５９１２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】中山ら、日本獣医病理学会、動物病理学総論第３版、文永堂出版株式会社、２０１３年、ｐ７９−８０
【非特許文献２】Ｖａｒａｎｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６年、第１６８巻、ｐ１８６１−１８６８
【非特許文献３】Ｋａｈｎら、Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１０年、第２６巻、ｐ３５０−３５５
【非特許文献４】Ｃａｓｔｅｌｏら、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、１９９４年、第１８巻、ｐ１９９−２０６
【非特許文献５】Ｇｅｒｓｔｅｉｎら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｃｌｉｎｉｃ、１９９３年、第１１巻、ｐ７４９−７５７
【非特許文献６】Ｎｙｍａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１２年、第１０巻、ｐ１６９−１７７
【非特許文献７】Ｌｅａｓｋら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４年、第１８巻、ｐ８１６−８２７
【非特許文献８】Ｌｉｕら、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２０１４年、第３０巻、ｐ１６８９−１６９９
【非特許文献９】Ｘｕら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第２９３巻、ｐ６３１−６４０
【非特許文献１０】Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ（Ｉｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄ）  ｓｉＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔ、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、コラーゲン産生促進剤としてこれまで報告されている物質では、十分なコラーゲン産生促進効果はいまだ得られていない。
【０００９】
そこで、本発明は、細胞のコラーゲン産生を促進する物質又は組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸が相補的に結合している二本鎖核酸が、コラーゲン産生促進剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸とが相補的に結合している二本鎖核酸からなる、コラーゲン産生促進剤を提供する。
【００１２】
上記の二本鎖核酸は、下記の式（Ｉ）で示される構造を有し、
【化１】
2017178886.tif 000002
式（Ｉ）中の各々の
【化２】
2017178886.tif 000003
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵの各々は、独立して、リボヌクレオチドであり、
ａ及びｔの各々は、独立して、デオキシリボヌクレオチドであり、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ及びｔの各々は、隣接するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ又はｔに共有結合で連結していることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進用の組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤、又は、上記の組成物を細胞に導入して作製された、コラーゲン産生細胞を提供する。
【００１５】
また、本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤、又は、上記の組成物を細胞に導入する導入ステップと、上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物が導入された導入細胞を培養する培養ステップと、を備える、コラーゲン産生細胞の作製方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、上記の培養ステップにおいて、上記の導入細胞からコラーゲンを産生している細胞をスクリーニングし、コラーゲン産生能が高い導入細胞をクローニングして系統化する系統化ステップを備える、コラーゲン産生細胞の作製方法を提供する。
【００１７】
上記の細胞は、ヒト肺癌由来細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト肝癌由来細胞又はヒト近位尿細管上皮細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、細胞にコラーゲン産生を誘導し、コラーゲン産生が惹起したコラーゲン産生細胞を作製することができる。また、本発明のコラーゲン産生細胞を使用すれば、コラーゲン産生を阻害する物質をスクリーニングすることができ、コラーゲン産生が亢進した病気の治療薬の探索に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。
【図２】図２ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図２ａは、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図２ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図２ｂは、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図３】Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内ＨＳＰ４７ｍＲＮＡの発現抑制作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。
【図４】図４ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の発現抑制作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図４ａは、細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の蛍光強度を示す。図４ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の発現抑制作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図４ｂは、細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図５】図５ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β無刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図５ａは、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図５ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β無刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図５ｂは、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図６】図６ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β無刺激条件下での細胞外コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図６ａは、細胞外コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図６ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β無刺激条件下での細胞外コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図６ｂは、細胞外コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図７】図７ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図７ａは、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図７ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図７ｂは、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図８】図８ａ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間）。図８ａは、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図８ｂ：Ａ５４９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間）。図８ｂは、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【図９】ＬＬ２９細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。
【図１０】ＨｅｐＧ２細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。
【図１１】図１１ａ：ＨＫ−２細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図１１ａは、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示す。図１１ｂ：ＨＫ−２細胞における、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下での細胞内コラーゲン蛋白質の発現促進作用を示す図である（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）。図１１ｂは、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸とが相補的に結合している二本鎖核酸からなることを特徴とする。上記の二本鎖核酸は、配列表の配列番号１で示される塩基配列からなる第１の核酸と、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる第２の核酸とからなる二本鎖核酸であることが好ましい。
【００２２】
上記の二本鎖核酸の第１の核酸及び第２の核酸は、各核酸の隣接するヌクレオチドが共有結合で連結された、２つの別々のポリヌクレオチド鎖である。また、上記の二本鎖核酸の第１の核酸及び第２の核酸は、相補的な塩基間で水素結合により塩基対を形成（塩基対合）し、二本鎖構造を形成している。
【００２３】
上記第１の核酸に含まれる塩基配列を配列表の配列番号１に、上記第２の核酸に含まれる塩基配列を配列表の配列番号２に示す。そして、上記第１の核酸に含まれる塩基配列の５’末端から１９番目までの部分配列（リボヌクレオチド）を配列表の配列番号３に、上記第２の核酸に含まれる塩基配列の５’末端から１９番目までの部分配列（リボヌクレオチド）を配列表の配列番号４に示す。
【００２４】
配列表の配列番号１で示される塩基配列の５’末端から１９番目までの塩基（ＣＵＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡ（配列番号３））及び配列表の配列番号２で示される塩基配列の５’末端から１９番目までの塩基（ＵＵＣＣＵＵＣＵＣＧＵＣＧＵＣＧＵＡＧ（配列番号４））は、ＲＮＡを構成する塩基である。すなわち、配列表の配列番号１で示される塩基配列の５’末端から１９番目までのヌクレオチド及び配列表の配列番号２で示される塩基配列の５’末端から１９番目のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。一方、配列表の配列番号１で示される塩基配列の３’末端の２塩基（ｔｔ）及び配列表の配列番号２で示される塩基配列の３’末端の２塩基（ｔａ）はＤＮＡを構成する塩基である。すなわち、配列表の配列番号１で示される塩基配列の３’末端の２ヌクレオチド及び配列表の配列番号２で示される塩基配列の３’末端の２ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。配列表の配列番号１で示される塩基配列を含む第１の核酸及び配列表の配列番号２で示される塩基配列を含む第２の核酸は、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列とを含むヌクレオチド鎖である。なお、本明細書においては、ＲＮＡを構成する塩基配列（リボヌクレオチド）を大文字の英字（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）で示し、ＤＮＡを構成する塩基配列（デオキシリボヌクレオチド）を小文字の英字（ａ、ｃ、ｇ、ｔ）で示す。また、塩基配列は５’末端から３’末端の順に示す。
【００２５】
上記の二本鎖核酸の第１の核酸及び第２の核酸の各々の長さは、コラーゲン産生促進作用を有する限りにおいて特に制限はないが、例えば、塩基長としては、２１〜４９塩基であり、２１〜３０塩基であることが好ましく、２１〜２５塩基であることがより好ましく、２１〜２３塩基であることがさらに好ましく、２１塩基であることが最も好ましい。第１の核酸及び第２の核酸の各々の長さは、異なる塩基長であってもよく、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってよい。
【００２６】
上記の二本鎖核酸の第１の核酸及び第２の核酸の末端構造としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。例えば、平滑末端を有する構造であってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有する構造であってもよく、３’端が突き出した構造が好ましい。上記の二本鎖核酸の第１の核酸及び第２の核酸の３’末端に、１〜４個の塩基（ヌクレオチド）のオーバーハングを有することが好ましく、２〜３個の塩基（ヌクレオチド）のオーバーハングを有することがより好ましく、２個の塩基（ヌクレオチド）からなるオーバーハングを有することが最も好ましい。オーバーハングの塩基の種類は、特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基（リボヌクレオチド）又はＤＮＡを構成する塩基（デオキシリボヌクレオチド）のいずれを含んでいてもよい。上記の二本鎖核酸の第１の核酸の好ましい３’オーバーハング配列としては、配列表の配列番号１で示される塩基配列の３’末端の２塩基のｔｔ（ＤＮＡを構成する塩基；デオキシリボヌクレオチド）であり、上記の二本鎖核酸の第２の核酸の好ましい３’オーバーハング配列としては、配列表の配列番号２で示される塩基配列の３’末端の２塩基のｔａ（ＤＮＡを構成する塩基；デオキシリボヌクレオチド）である。
【００２７】
上記の二本鎖核酸は、以下の式（Ｉ）で示される構造を有し、
【化３】
2017178886.tif 000004
式（Ｉ）中の各々の
【化４】
2017178886.tif 000005
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵの各々は、独立して、リボヌクレオチドであり、
ａ及びｔの各々は、独立して、デオキシリボヌクレオチドであり、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ及びｔの各々は、隣接するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ａ又はｔに共有結合で連結していることが好ましい。
【００２８】
上記の式（Ｉ）の上段の核酸（第１の核酸）は、配列表の配列番号１で示される塩基配列からなり、上記の式（Ｉ）の下段の核酸（第２の核酸）は、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる。上記の式（Ｉ）において、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵはリボヌクレオチド（ＲＮＡを構成する塩基）であり、ａ及びｔはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡを構成する塩基）である。また、「Ａ」及び「ａ」はアデニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｕ」はウラシル、並びに、「Ｔ」及び「ｔ」はチミンである。第１の核酸のリボヌクレオチド（５’末端から１９番目までの塩基配列）は、第２の核酸のリボヌクレオチド（５’末端から１９番目までの塩基配列）との間で塩基対合しており、１９塩基対を形成している。各核酸の３’末端の２塩基（ＤＮＡを構成する塩基）は、塩基対合は形成しておらず、オーバーハングしている。
【００２９】
上記の二本鎖核酸は、化学合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いて作製することができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖核酸を合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、第１の核酸及び第２の核酸の塩基配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成された第１の核酸や第２の核酸をそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、上記の二本鎖核酸は、市販品としても入手可能である。例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィックのＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉＲＮＡを用いることができる。
【００３０】
上記の二本鎖核酸は、コラーゲン産生促進作用を有する限りにおいては、二本鎖核酸の全体又はその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位・糖部位）及び／又はヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸とは異なった構造を有するものを意味する。
【００３１】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋構造型核酸（ＥＮＡ）、及びモルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五炭糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース等；六炭糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは、塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；及び他の複素環塩基等が挙げられる。上記の二本鎖核酸は、１以上の修飾されたヌクレオシドを有することが好ましく、１以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を有することが好ましい。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、架橋構造型核酸（ＢＮＡ；Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の一種で、ＢＮＡは、１０種類以上が知られており、このうちロックド核酸（ＬＮＡ）は、糖の２’位と４’位とを−Ｏ−ＣＨ２−で架橋しコンフォメーションをＮ型に固定した人工核酸であり、２’，４’−ＢＮＡ（２’，４’−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とも呼ばれるものである。
【００３２】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００３３】
コラーゲンは、皮膚の真皮、靭帯、腱、骨及び軟骨等を構成する線維状の蛋白質である。多種類のコラーゲン分子が発見されており、これらは互いに遺伝子が異なる。生体内では、Ｉ型コラーゲンが最も多く、主に皮膚の真皮、靭帯、腱、骨に存在する。Ｉ型コラーゲンは、２つのα１鎖と１つのα２鎖とからなり、このα１鎖をコードする遺伝子として、ＣＯＬ１Ａ１が知られている。
【００３４】
「コラーゲン産生促進剤」とは、細胞のコラーゲン産生能を促進する又は／及び細胞のコラーゲン分解能を抑制することにより、細胞のコラーゲン産生を促進する薬剤を意味する。「細胞のコラーゲン産生を促進する」とは、上記のコラーゲン産生促進剤を処置しない場合と比べて、コラーゲン産生を増大させることを意味する。「細胞のコラーゲン産生能を促進する」とは、コラーゲン産生機序（コラーゲン遺伝子の発現からコラーゲン蛋白質の細胞外分泌までの機序）を正に調節してコラーゲン産生を促進することを意味する。「細胞のコラーゲン分解能を抑制する」とは、コラーゲン分解機序（コラーゲンの分解に関連する遺伝子の発現から細胞内又は細胞外におけるコラーゲン蛋白質の分解までの機序）を負に調節してコラーゲン産生を促進すること、及び、コラーゲン（遺伝子、蛋白質）の細胞内又は細胞外での安定性を向上させ、コラーゲン産生を促進することを意味する。上記のコラーゲン産生促進剤は、優れたコラーゲン産生促進作用を有する。上記のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン蛋白質及び／又はコラーゲンｍＲＮＡの発現量を増大させる薬剤を包含する。より詳細には、細胞内のコラーゲン蛋白質、細胞内のコラーゲンｍＲＮＡ及び／又は細胞外のコラーゲン蛋白質の発現量を増大させる薬剤を包含する。上記のコラーゲン産生促進剤は、細胞内のコラーゲン蛋白質及び細胞内のコラーゲンｍＲＮＡの発現量を増大させる薬剤であることが好ましい。また、上記のコラーゲン産生促進剤は、特に、Ｉ型コラーゲン産生促進作用を有するため、Ｉ型コラーゲン産生促進剤であることが特に好ましい。
【００３５】
本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進用の組成物を包含する。
【００３６】
上記のコラーゲン産生促進剤は、上記の二本鎖核酸そのものからなるものであってもよいし、上記の二本鎖核酸を有効成分とし、薬学上又は衛生上許容される担体や添加物等の他の成分を更に含んでなるものであってもよい。すなわち、上記のコラーゲン産生促進剤は、組成物であってよい。かかる担体又は添加物の種類及び配合量は、上記の二本鎖核酸がコラーゲン産生促進作用を有する限りにおいて、適宜設定することができる。
【００３７】
上記のコラーゲン産生促進剤は、他のコラーゲン産生促進剤と併用して用いてもよい。併用して用いることができる他のコラーゲン産生促進剤としては、例えば、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ又はマイクロＲＮＡ２１等が挙げられるが、ＴＧＦ−βが好ましい。
【００３８】
また、本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物を細胞に導入して作製された、コラーゲン産生細胞を包含する。
【００３９】
上記の細胞は、コラーゲン産生能を生来有している、又は、獲得する可能性のある細胞であればいずれであってもよい。上記の細胞としては、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝星細胞、尿細管上皮細胞、肺癌由来細胞及び肝癌由来細胞等が挙げられる。また、上記の細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞（例えば、霊長類細胞及びげっ歯類細胞）である。すなわち、上記の細胞は、動物細胞由来、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル又はチャイニーズハムスター等由来であるが、好ましくはヒト由来である。上記の細胞は、動物の生体内から採取して作製した初代培養細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、又は株化細胞等であるが、継代維持が簡便な株化細胞が好ましい。上記の細胞としては、ヒト肺癌由来細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト肝癌由来細胞又はヒト近位尿細管上皮細胞が好ましい。ヒト肺癌由来細胞としてはＡ５４９細胞がより好ましく、ヒト肺線維芽細胞としてはＬＬ２９細胞がより好ましく、ヒト肝癌由来細胞としてはＨｅｐＧ２細胞がより好ましく、ヒト近位尿細管上皮細胞としてはＨＫ−２細胞がより好ましい。
【００４０】
また、本発明は、上記のコラーゲン産生促進剤、又は、上記の組成物を細胞に導入する導入ステップと、上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物が導入された導入細胞を培養する培養ステップと、を備える、コラーゲン産生細胞の作製方法を包含する。
【００４１】
上記の細胞は、コラーゲン産生能を生来有している、又は、獲得する可能性のある細胞であればいずれであってもよい。上記の細胞としては、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝星細胞、尿細管上皮細胞、肺癌由来細胞及び肝癌由来細胞等が挙げられる。また、上記の細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞（例えば、霊長類細胞及びげっ歯類細胞）である。すなわち、上記の細胞は、動物細胞由来、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル又はチャイニーズハムスター等由来であるが、好ましくはヒト由来である。上記の細胞は、動物の生体内から採取して作製した初代培養細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、又は株化細胞等であるが、継代維持が簡便な株化細胞が好ましい。上記の細胞としては、ヒト肺癌由来細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト肝癌由来細胞又はヒト近位尿細管上皮細胞が好ましい。ヒト肺癌由来細胞としてはＡ５４９細胞がより好ましく、ヒト肺線維芽細胞としてはＬＬ２９細胞がより好ましく、ヒト肝癌由来細胞としてはＨｅｐＧ２細胞がより好ましく、ヒト近位尿細管上皮細胞としてはＨＫ−２細胞がより好ましい。
【００４２】
また、本発明は、上記の培養ステップにおいて、上記の導入細胞からコラーゲンを産生している細胞をスクリーニングし、コラーゲン産生能が高い導入細胞をクローニングして系統化する系統化ステップを備える、コラーゲン産生細胞の作製方法を包含する。
【００４３】
上記の作製方法で得られたコラーゲン産生細胞は、コラーゲン産生が増大した細胞ということもできる。
【００４４】
「コラーゲン産生が増大した細胞」とは、コラーゲン蛋白質及び／又はコラーゲンｍＲＮＡの発現量が増大した細胞を包含する。より詳細には、細胞内のコラーゲン蛋白質、細胞内のコラーゲンｍＲＮＡ及び／又は細胞外のコラーゲン蛋白質の発現量が増大した細胞を包含する。上記のコラーゲン産生が増大した細胞は、細胞内のコラーゲン蛋白質及び細胞内のコラーゲンｍＲＮＡの発現量が増大した細胞であることが好ましい。また、上記のコラーゲン産生が増大した細胞は、Ｉ型コラーゲン産生が増大した細胞であることが特に好ましい。
【００４５】
「コラーゲン産生促進剤又は組成物を細胞に導入する」とは、上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物の有効成分である上記の二本鎖核酸を細胞に導入（すなわち、トランスフェクション）することを意味する。上記の二本鎖核酸を細胞に導入する方法しては、上記の二本鎖核酸を細胞に導入できる方法であればいずれでもよく、例えば、細胞への導入方法としては、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法などが挙げられ、リポフェクション法が好ましい。
【００４６】
上記のコラーゲン産生細胞の作製方法において、コラーゲン産生促進剤の使用濃度は、コラーゲン産生を増大させる効果を奏する量であれば、特に制限はないが、１〜５０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましく、１〜１０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲がより好ましく、１０ｎｍｏｌ／Ｌであることが特に好ましい。
【００４７】
上記のコラーゲン産生細胞の作製方法において、コラーゲン産生促進剤の存在下に細胞を培養する期間は、コラーゲン産生を増大させる効果を奏する期間であれば特に制限はないが、３〜７２時間の範囲が好ましく、２４〜４８時間の範囲がより好ましく、４８時間が特に好ましい。
【００４８】
上記のコラーゲン産生細胞の作製方法において、上記のコラーゲン産生促進剤と共に、他のコラーゲン産生促進剤を併用して用いてもよい。他のコラーゲン産生促進剤としては、特に限定されないが、例えば、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ又はマイクロＲＮＡ２１等を使用することができ、ＴＧＦ−βを使用することが好ましい。また、上記のコラーゲン産生促進剤と他のコラーゲン産生促進剤とを併用する場合、他のコラーゲン産生促進剤は、上記のコラーゲン産生促進剤を細胞に処置する（すなわち、細胞内に導入する）前、同時、又は後に処置してもよい。
【００４９】
また、本発明は、上記の方法で作製した、コラーゲン産生細胞を用いる、コラーゲン産生を阻害する物質のスクリーニング方法を包含する。該スクリーニング方法は、上記の方法で作製した、コラーゲン産生細胞を、被験物質の存在下及び非存在下に培養し、両条件下におけるコラーゲン産生量を比較する工程を含む。
【００５０】
「コラーゲン産生を阻害する物質」とは、細胞のコラーゲン産生能を抑制する又は／及び細胞のコラーゲン分解能を促進することにより、細胞のコラーゲン産生を阻害する物質を意味する。「細胞のコラーゲン産生を阻害する」とは、上記のコラーゲン産生を阻害する物質を処置しない場合と比べて、コラーゲン産生を減少させることを意味する。「細胞のコラーゲン産生能を抑制する」とは、コラーゲン産生機序（コラーゲン遺伝子の発現からコラーゲン蛋白質の細胞外分泌までの機序）を負に調節してコラーゲン産生を阻害することを意味する。細胞のコラーゲン分解能を促進するとは、コラーゲン分解機序（コラーゲンの分解に関連する遺伝子の発現から細胞内又は細胞外におけるコラーゲン蛋白質の分解までの機序）を正に調節してコラーゲン産生を阻害すること、及び、コラーゲン（遺伝子、蛋白質）の細胞内又は細胞外での安定性を低下させコラーゲン産生を阻害することを意味する。
【００５１】
上記のスクリーニング方法に用いる被験物質は、生体内物質、遺伝子組換え物質、天然物又は化学合成化合物等の別を問わず、また、これらに限定されるものでもない。また、上記の被験物質は、溶媒に溶解又は懸濁して添加することができる。上記の溶媒は、適当な薬学的に許容可能な担体であればよい。
【００５２】
コラーゲン産生を阻害する物質を選択する際に、被験物質を接触させない対照細胞を比較対照として用いることもできる。「被験物質を接触させない」とは、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、コラーゲン産生に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００５３】
上記の被験物質と上記のコラーゲン産生が増大した細胞との接触は、例えば、細胞培養用培地や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。被験物質の添加期間、回数、及び濃度は、被験物質の効力により適宜設定すればよい。添加される被験物質の濃度は、例えば、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１００００μｍｏｌ／Ｌの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分〜約７２時間が挙げられる。また、被験物質は、上記コラーゲン促進剤を細胞に処置する（すなわち、細胞内に導入する）前、同時、又は後に処置してもよい。
【００５４】
コラーゲン産生量の測定としては、細胞内のコラーゲン蛋白質、細胞内のコラーゲンｍＲＮＡ及び／又は細胞外のコラーゲン蛋白質を測定すればよいが、細胞内のコラーゲン蛋白質及び／又は細胞内のコラーゲンｍＲＮＡの発現量を測定することが好ましい。コラーゲン産生量の測定としては、感度・特異性の面では、細胞内のコラーゲンｍＲＮＡの発現量を測定することが好ましいが、簡便性の面では、細胞内のコラーゲン蛋白質の発現量を測定することが好ましい。
【００５５】
コラーゲン産生量を測定する方法は、コラーゲンｍＲＮＡ又はコラーゲン蛋白質の発現量を定性的又は定量的に検出できる方法であればいずれの方法でもよい。
【００５６】
コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定は、細胞の採取直後に行ってもよいし、ＲＮＡが分解・変性等されない条件下で適切に保存後（例えば、凍結保存後）、後日実施することでもかまわない。
【００５７】
細胞におけるコラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法等、公知の方法で測定することができるが、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが好ましい。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施する方法をいうが、ＰＣＲとしてはリアルタイムＰＣＲが好ましい。また、コラーゲンのＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、ＰＣＲを実施する場合は、該ＤＮＡ塩基配列に基づいてプライマーを適宜設定することができる。このプライマーとしては、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列を増幅するものが好ましい。コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定は、例えば、Ｉ型コラーゲンのα１鎖をコードする遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１のｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することができる。
【００５９】
ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法としては、例えば、サザンブロット法、ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を用いるＤＮＡマイクロアレイ法、又は、細胞からＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡをポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせるノーザンブロット法若しくはＲＮａｓｅプロテクションアッセイが挙げられるが、コラーゲンのＤＮＡ塩基配列に特異的な配列をポリヌクレオチドプローブとして設計する必要がある。ここで、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ解析により確認することができる。
【００６０】
また、コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定において標準化のために用いる内在性コントロール遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ又はＧ３ＰＤＨと略される。）、１８ＳｒＲＮＡ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６１】
コラーゲン蛋白質の発現量の測定は、細胞又は培養上清の採取直後に行ってもよいし、蛋白質が分解・変性等されない条件下で、細胞又は培養上清を適切に保存後（例えば、凍結保存後）、後日実施することでもかまわない。
【００６２】
細胞内のコラーゲン蛋白質の発現量を測定するためには、その前処理として、採取した細胞から蛋白質を抽出する処理を行うことが好ましい。蛋白質を抽出する方法は、例えば、タンパク質抽出バッファーを用いた方法で行うことができる。蛋白質の抽出は、細胞の採取直後に行ってもよいし、蛋白質が分解・変性等されない条件下で適切に保存後（例えば、凍結保存後）、後日抽出することでもかまわない。蛋白質抽出液は、次の作業まで、蛋白質が分解・変性等されない条件下で適切に保存（例えば、凍結保存）してもよい。また、細胞外のコラーゲン蛋白質の発現量を測定するために採取した培養上清は、蛋白質が分解・変性等されない条件下で適切に保存（例えば、凍結保存）してもよい。
【００６３】
コラーゲン蛋白質の発現量の測定は、抗体を用いた免疫細胞染色、ウエスタンブロット、ドットブロット、免疫沈降法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、プロテインアレイ、又はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等、公知の方法で測定することができる。コラーゲン蛋白質の発現量の測定には特異的抗体が必要であるが、特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。例えば、Ｉ型コラーゲン蛋白質の発現量を測定する場合、抗ｃｏｌｌａｇｅｎＩ抗体を用いた免疫細胞染色、ウエスタンブロット、ドットブロット、免疫沈降法、ＲＩＡ、プロテインアレイ、ＥＬＩＳＡ等を用いて測定することができる。好ましくは、コラーゲン蛋白質の発現量の測定は、抗ｃｏｌｌａｇｅｎＩ抗体を用いた免疫細胞染色による測定である。
【００６４】
また、免疫細胞染色で得られた結果を定量化する方法は、特に限定されないが、顕微鏡下でコラーゲン産生が増大した細胞を目視で計測する方法や、顕微鏡カメラや細胞画像取得装置等により撮影した画像を解析ソフトにより解析する方法等、公知の方法で定量化することができる。細胞画像取得装置により撮影した画像を解析ソフトにより解析する方法が好ましい。
【００６５】
細胞画像取得装置は、特に限定されないが、ＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔ、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｍａｇｅ  Ｘｐｒｅｓｓ、Ｏｐｅｒａ、Ｏｐｅｒｅｔｔａ等を用いることができる。
【００６６】
画像解析ソフトは、特に限定されないが、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｓｃａｎ、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ、Ｍｅｔａ  Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｒｍｏｎｙ、Ｉｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ等を用いることができる。
【００６７】
より具体的には、上記のスクリーニング方法は、以下の工程（１）〜（４）を備えることが好ましい。
（１）上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物を細胞に導入して培養することによって、コラーゲン産生が増大した細胞を作製する工程と、
（２）被験物質を接触させた、上記のコラーゲン産生が増大した細胞のコラーゲン産生量を測定する実験群測定工程と、
（３）被験物質を接触させない、上記のコラーゲン産生が増大した細胞のコラーゲン産生量を測定する対照群測定工程と、
（４）上記の実験群測定工程の結果が、上記の対照群測定工程の測定結果と比較して、コラーゲン産生量が少ない場合に、上記の被験物質は、コラーゲン産生を阻害する物質であると判定する工程。
【００６８】
上記の工程（１）における「上記のコラーゲン産生促進剤又は上記の組成物を細胞に導入して培養する」作業と、上記の工程（２）及び（３）における「被験物質を接触させる／させない」作業の順序は、どちらが先であってもよく、または同時であってもよい。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
【００７０】
（実施例１）  Ａ５４９細胞における上記の二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下でのコラーゲン産生促進作用（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）
１．実験方法：
（使用核酸）
本発明に係る二本鎖核酸としては、サーモフィッシャーサイエンティフィックからＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ（Ｉｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄ）  ｓｉＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ；４３９２４２０、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ；ｓ２４８６、Ｇｅｎｅ  Ｎａｍｅ；ｓｅｒｐｉｎ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｃｌａｄｅ  Ｈ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７）、ｍｅｍｂｅｒ１、（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））（以下、ｓ２４８６核酸）を購入して用いた。該核酸は、上記の式（Ｉ）で示される二本鎖核酸である。ｓ２４８６核酸は、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡとしての作用を有することが知られている核酸である（特許文献１及び２並びに非特許文献１０）。
【００７１】
また、コントロールとしての二本鎖核酸は、サーモフィッシャーサイエンティフィックからＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃２  ｓｉＲＮＡ（Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ；４３９０８４６）（以下、コントロール核酸）を購入して用いた。
【００７２】
（細胞培養及び核酸の細胞内への導入）
９６ウェルプレート（コーニング、３５９５）に、ヒト肺癌由来細胞株の１種であるＡ５４９細胞（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、１０％ウシ胎児血清含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で、５％ＣＯ２環境下、３７℃、約２４時間培養した。１０ｎｍｏｌ／Ｌのｓ２４８６核酸又はコントロール核酸と、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１３７７８０３０）との混合液（１：１）を細胞に添加し、約４８時間培養した。なお、核酸を導入しない細胞も設けた。
【００７３】
（ＴＧＦ−β刺激）
培養上清を除去後、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った。ＴＧＦ−β無刺激の細胞には新たな無血清培地を１００μＬ添加し、ＴＧＦ−β刺激の細胞には５又は１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β含有無血清培地を１００μＬ添加し、約４８時間培養した。ｓ２４８６核酸又はコントロール核酸を導入した細胞には、ＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、「ｓ２４８６核酸群」、「コントロール核酸群」と記載する）。核酸を導入しない細胞には、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、「ＴＧＦ−β無刺激群」、「ＴＧＦ−β刺激群」と記載する）。
【００７４】
（細胞内コラーゲンｍＲＮＡ及び細胞内ＨＳＰ４７ｍＲＮＡの発現量の測定（リアルタイムＰＣＲ法））
培養上清を除去後、遠心分離によりウェルから細胞を回収して、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン、７４１０４）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。このトータルＲＮＡから、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、リアルタイムＰＣＲ法にて、ＣＯＬ１Ａ１（Ｉ型コラーゲンのα１鎖をコードする遺伝子）、ＨＳＰ４７及びコントロール遺伝子（１８Ｓ）の発現量を測定した。プローブ及びプライマーは、ＣＯＬ１Ａ１特異的Ｔａｑｍａｎ（登録指標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）、ＨＳＰ４７特異的Ｔａｑｍａｎ（登録指標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＩＤ：Ｈｓ０１０６０３９７＿ｇ１）又は１８Ｓ特異的Ｔａｑｍａｎ（登録指標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｈｓ０３００３６３１＿ｇ１）を用いた。リアルタイムＰＣＲ法にて得られたデータから、リアルタイムＰＣＲ付属のＳＤＳｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ１．２．１を用いて検量線法により相対定量を実施した。その際、Ｂａｓｅｌｉｎｅ及びｔｈｒｅｓｈｏｌｄはオート機能により設定した（ｎ＝１）。
【００７５】
（細胞内コラーゲン蛋白質及び細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色））
培養上清を除去後、４％ＰＦＡ（室温、１０〜２０分）で細胞を固定した後に、以下の通り、細胞内コラーゲン蛋白質及び細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の免疫細胞染色を行った。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ（室温５分）、１％  ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ（室温２０分）で前処理を行った後、一次抗体（１．コラーゲン蛋白質測定用：ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ａｂｃａｍ、ａｂ３４７１０、５００倍希釈又はｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−１０３、２００倍希釈、２．ＨＳＰ４７蛋白質測定用：ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＨＳＰ４７  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ａｂｃａｍ、ａｂ７７６０９、２００倍希釈）を室温で１時間、二次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ―ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８；ａｂｃａｍ、ａｂ１５００７７、１０００倍希釈）を室温で３０分間反応させ、ＤＡＰＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所、３４０−０７９７１、１０００倍希釈）で核を染色し（室温１分）、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にて画像を取り込み、画像の観察を行った。さらに取り込んだ画像を用いて、１ウェルあたり約２００個の細胞を解析し、細胞内コラーゲン蛋白質及び細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の細胞質内の蛍光強度（ＲＦＵ）を算出した（ｎ＝３〜６）。得られたデータは、統計解析システムＳＡＳ  ｖｅｒ．９．３（ＳＡＳインスティチュ−トジャパン株式会社）を用いて、次の通り統計学的処理を行った。ｓ２４８６核酸群とコントロール核酸群との間で、２群間の分散についてＦ検定を行い、有意な差を示した場合はＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定を、有意な差がみられなかった場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【００７６】
２．結果：
細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定結果を図１に、細胞内ＨＳＰ４７ｍＲＮＡの発現量の測定結果を図３に示す。図１及び図３の縦軸は、それぞれ、細胞内コラーゲンｍＲＮＡの相対発現量、細胞内ＨＳＰ４７ｍＲＮＡの相対発現量を示し、横軸は、左からＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）及びｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）を示す。
【００７７】
細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図２に、細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図４に示す。図２（ａ）及び図４（ａ）のグラフの縦軸は、それぞれ、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度、細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の蛍光強度を示し、横軸は、左からＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）及びｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）を示す。各群について、平均値±標準偏差（ｎ＝６）をグラフに示す。図２（ｂ）は、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示し、図４（ｂ）は、細胞内ＨＳＰ４７蛋白質の染色画像の一例を示す。左上は、ＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、右上は、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、左下は、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）、右下は、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）である。
【００７８】
ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）と比較して、細胞内コラーゲンの発現量の増加がみられた（コラーゲンｍＲＮＡ：９２．９倍、コラーゲン蛋白質：７．５倍）（図１及び２）。したがって、ｓ２４８６核酸は、コラーゲン産生を促進させることが示された。
【００７９】
一方、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）と比較して、細胞内ＨＳＰ４７のｍＲＮＡ及び蛋白質の発現量の９０％以上の抑制がみられた（図３及び４）。この結果から、確かに、ｓ２４８６核酸は、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡとして作用することが示された。
【００８０】
以上の結果から、ｓ２４８６核酸は、ＨＳＰ４７  ｓｉＲＮＡとして作用するにもかかわらず、コラーゲン産生を促進することが示された。
【００８１】
このように、本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生促進作用を有することが示された。
【００８２】
（実施例２）  Ａ５４９細胞における上記の二本鎖核酸によるＴＧＦ−β無刺激条件下でのコラーゲン産生促進作用（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）
１．実験方法：
（使用核酸）
実施例１と同様にｓ２４８６核酸を用いた。
【００８３】
（細胞培養及び核酸の細胞内への導入）
９６ウェルプレート（コーニング、３５９５）に、１０ｎｍｏｌ／Ｌのｓ２４８６核酸又はコントロール核酸と、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１３７７８０３０）との混合液（１：１）を添加した後に、Ａ５４９細胞（４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、１０％ウシ胎児血清含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で、５％ＣＯ２環境下、３７℃、約４８時間培養した。ｓ２４８６核酸又はコントロール核酸を導入した細胞を、それぞれ、「ｓ２４８６核酸群」、「コントロール核酸群」と記載する。なお、核酸を導入しない細胞も設けた（「無処置群」と記載する）。
【００８４】
（無血清培地への交換）
培養上清を除去後、新たな無血清培地を１００μＬ添加し、約４８時間培養した。
【００８５】
（細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色））
実施例１と同様の方法により、細胞内コラーゲン蛋白質の免疫細胞染色、画像解析及び蛍光強度（ＲＦＵ）算出を行った。得られたデータは、統計解析システムＳＡＳ  ｖｅｒ．９．３（ＳＡＳインスティチュ−トジャパン株式会社）を用いて、次の通り統計学的処理を行った。ｓ２４８６核酸群とコントロール核酸群との間で、２群間の分散についてＦ検定を行い、有意な差を示した場合はＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定を、有意な差がみられなかった場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【００８６】
（細胞外コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色））
培養上清を除去後、４％ＰＦＡ（室温、１０〜２０分）で細胞を固定した後に、以下の通り、細胞外コラーゲン蛋白質の免疫細胞染色を行った。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−１０３、２００倍希釈）を室温で１時間、二次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ―ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８；ａｂｃａｍ、ａｂ１５００７７、１０００倍希釈）を室温で３０分間反応させ、ＤＡＰＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所、３４０−０７９７１、１０００倍希釈）で核を染色し（室温１分）、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にて画像を取り込み、画像の観察を行った。さらに取り込んだ画像を用いて、１ウェルあたり約２００個の細胞を解析し、細胞外コラーゲン蛋白質の蛍光強度（ＲＦＵ）を算出した（ｎ＝４）。得られたデータは統計解析システムＳＡＳ  ｖｅｒ．９．３（ＳＡＳインスティチュ−トジャパン株式会社）を用いて、次の通り統計学的処理を行った。ｓ２４８６核酸群とコントロール核酸群との間で、２群間の分散についてＦ検定を行い、有意な差を示した場合はＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定を、有意な差がみられなかった場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【００８７】
２．結果：
細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図５に示す。図５（ａ）のグラフの縦軸は、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示し、横軸は、左から無処置群（核酸導入なし；図中の「無処置」）、コントロール核酸群（図中の「コントロール核酸」）、及び、ｓ２４８６核酸群（図中の「ｓ２４８６核酸」）を示す。各群について、平均値±標準偏差（ｎ＝３）をグラフに示す。図５（ｂ）は、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。左上は、無処置群（核酸導入なし；図中の「無処置」）、右上は、コントロール核酸群（図中の「コントロール核酸」）、左下は、ｓ２４８６核酸群（図中の「ｓ２４８６核酸」）である。
【００８８】
細胞外コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図６に示す。図６（ａ）のグラフの縦軸は、細胞外コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示し、横軸は、左から無処置群（核酸導入なし；図中の「無処置」）、コントロール核酸群（図中の「コントロール核酸」）、及び、ｓ２４８６核酸群（図中の「ｓ２４８６核酸」）を示す。各群について、平均値±標準偏差（ｎ＝４）をグラフに示す。図６（ｂ）は、細胞外コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。左上は、無処置群（核酸導入なし；図中の「無処置」）、右上は、コントロール核酸群（図中の「コントロール核酸」）、左下は、ｓ２４８６核酸群（図中の「ｓ２４８６核酸」）である。
【００８９】
ｓ２４８６核酸群（図中の「ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「コントロール核酸」）と比較して、細胞内及び細胞外コラーゲン蛋白質の発現量の増加がみられた（細胞内コラーゲン蛋白質：５．５倍、細胞外コラーゲン蛋白質：３．３倍）。したがって、ＴＧＦ−β無刺激条件下においても、ｓ２４８６核酸は、コラーゲン産生を促進させることが示された。また、ｓ２４８６核酸は、細胞内コラーゲンのみでなく、細胞外コラーゲンの産生も促進させることが示された。
【００９０】
この結果から、本発明のコラーゲン産生促進剤は、ＴＧＦ−βの存在の有無にかかわらず、コラーゲン産生促進作用を有することが示された。
【００９１】
（実施例３）  Ａ５４９細胞における上記の二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下でのコラーゲン産生促進作用（１．二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間、２．二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間）
１．実験方法：
（使用核酸）
実施例１と同様にｓ２４８６核酸を用いた。
【００９２】
（細胞培養及び核酸の細胞内への導入）
１．二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間
９６ウェルプレート（コーニング、３５９５）に、１ｎｍｏｌ／Ｌのｓ２４８６核酸又はコントロール核酸と、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１３７７８０３０）との混合液（１：１）を添加した後に、Ａ５４９細胞（４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、１０％ウシ胎児血清含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で、５％ＣＯ２環境下、３７℃、約４８時間培養した。なお、核酸を導入しない細胞も設けた。
２．二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間
９６ウェルプレート（コーニング、３５９５）に、１０ｎｍｏｌ／Ｌのｓ２４８６核酸又はコントロール核酸と、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１３７７８０３０）との混合液（１：１）を添加した後に、Ａ５４９細胞（４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、１０％ウシ胎児血清含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で、５％ＣＯ２環境下、３７℃、約２４時間培養した。なお、核酸を導入しない細胞も設けた。その後、培養上清を除去し、新たな無血清培地を１００μＬ添加し、約２４時間培養した。
【００９３】
（ＴＧＦ−β刺激）
培養上清を除去後、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った。ＴＧＦ−β無刺激の細胞には新たな無血清培地を１００μＬ添加し、ＴＧＦ−β刺激の細胞には５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β含有無血清培地を１００μＬ添加し、約４８時間培養した。ｓ２４８６核酸又はコントロール核酸を導入した細胞には、ＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、ｓ２４８６核酸群、コントロール核酸群と記載する）。核酸を導入しない細胞には、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、「ＴＧＦ−β無刺激群」、「ＴＧＦ−β刺激群」と記載する）。
【００９４】
（細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色））
実施例１と同様の方法で、細胞内コラーゲン蛋白質の免疫細胞染色、画像解析及び蛍光強度（ＲＦＵ）算出を行った。得られたデータは統計解析システムＳＡＳ  ｖｅｒ．９．３（ＳＡＳインスティチュ−トジャパン株式会社）を用いて、次の通り統計学的処理を行った。ｓ２４８６核酸群とコントロール核酸群との間で、２群間の分散についてＦ検定を行い、有意な差を示した場合はＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定を、有意な差がみられなかった場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【００９５】
２．結果：
細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図７及び図８に示す。図７は、１．二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間の結果を示し、図８は、２．二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間の結果を示す。
【００９６】
図７及び図８の（ａ）のグラフの縦軸は、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示し、横軸は、左からＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）、及び、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）を示す。各群について、平均値±標準偏差（ｎ＝３）をグラフに示す。図７（ｂ）及び図８（ｂ）は、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。左上は、ＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、右上は、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、左下は、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）、右下は、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）である。
【００９７】
二本鎖核酸の処置濃度：１ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間という条件において、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）と比較して、細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の増加がみられた（コラーゲン蛋白質：２．２倍）。また、二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：２４時間という条件においても、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）と比較して、細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の増加がみられた（コラーゲン蛋白質：２．６倍）。
【００９８】
したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤は、処置濃度及び処置時間を変更しても、コラーゲン産生促進作用を有することが示された。
【００９９】
（実施例４）  ＬＬ２９細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨＫ−２細胞における上記の二本鎖核酸によるＴＧＦ−β刺激条件下でのコラーゲン産生促進作用（二本鎖核酸の処置濃度：１０ｎｍｏｌ／Ｌ、処置時間：４８時間）
１．実験方法：
（使用核酸）
実施例１と同様にｓ２４８６核酸を用いた。
【０１００】
（細胞培養及び核酸の細胞内への導入）
９６ウェルプレート（コーニング、３５９５）に、ヒト肺線維芽細胞株であるＬＬ２９細胞（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、又は、ヒト近位尿細管上皮細胞株であるＨＫ−２細胞（３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、１０％ウシ胎児血清含有培地（ＬＬ２９細胞：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＨｅｐＧ２細胞：１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び１％ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ）、ＨＫ−２細胞：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２Ｋ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック））で、５％ＣＯ２環境下、３７℃、約２４時間培養した。１０ｎｍｏｌ／Ｌのｓ２４８６核酸又はコントロール核酸と、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１３７７８０３０）との混合液（１：１）を細胞に添加し、約４８時間培養した。なお、核酸を導入しない細胞も設けた。
【０１０１】
（ＴＧＦ−β刺激）
培養上清を除去後、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った。ＴＧＦ−β無刺激の細胞には新たな無血清培地を１００μＬ添加し、ＴＧＦ−β刺激の細胞には５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β含有無血清培地を１００μＬ添加し、約４８時間培養した。ｓ２４８６核酸又はコントロール核酸を導入した細胞には、ＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、ｓ２４８６核酸群、コントロール核酸群と記載する）。核酸を導入しない細胞には、ＴＧＦ−β無刺激又はＴＧＦ−β刺激を行った（それぞれ、「ＴＧＦ−β無刺激群」、「ＴＧＦ−β刺激群」と記載する）。
【０１０２】
（細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定（リアルタイムＰＣＲ法））
ＬＬ２９細胞及びＨｅｐＧ２細胞では、実施例１と同様の方法により、細胞内コラーゲンｍＲＮＡ（ＣＯＬ１Ａ１）の発現量の測定を行った。
【０１０３】
（細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色））
ＨＫ−２細胞では、実施例１と同様の方法で、細胞内コラーゲン蛋白質の免疫細胞染色、画像解析及び蛍光強度（ＲＦＵ）算出を行った。得られたデータは、統計解析システムＳＡＳ  ｖｅｒ．９．３（ＳＡＳインスティチュ−トジャパン株式会社）を用いて、次の通り統計学的処理を行った。ｓ２４８６核酸群とコントロール核酸群との間で、２群間の分散についてＦ検定を行い、有意な差を示した場合はＡｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定を、有意な差がみられなかった場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を行った。有意水準は５％とした。
【０１０４】
２．結果：
ＬＬ２９細胞における細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定結果を図９に、ＨｅｐＧ２細胞における細胞内コラーゲンｍＲＮＡの発現量の測定結果を図１０に示す。図９及び図１０の縦軸は、細胞内コラーゲンｍＲＮＡの相対発現量を示し、横軸は、左からＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）及びｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）を示す。
【０１０５】
ＨＫ−２細胞における、細胞内コラーゲン蛋白質の発現量の測定（免疫細胞染色）の結果を図１１に示す。図１１（ａ）のグラフの縦軸は、細胞内コラーゲン蛋白質の蛍光強度を示し、横軸は、左からＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）、及び、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）を示す。各群について、平均値±標準偏差（ｎ＝３）をグラフに示す。図１１（ｂ）は、細胞内コラーゲン蛋白質の染色画像の一例を示す。左上は、ＴＧＦ−β無刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（−）」）、右上は、ＴＧＦ−β刺激群（核酸導入なし；図中の「ＴＧＦ−β（＋）」）、左下は、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）、右下は、ｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）である。
【０１０６】
ＬＬ２９細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨＫ−２細胞のｓ２４８６核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋ｓ２４８６核酸」）では、コントロール核酸群（図中の「ＴＧＦ−β（＋）＋コントロール核酸」）と比較して、細胞内コラーゲンｍＲＮＡ又は蛋白質の発現量の増加がみられた（ＬＬ２９細胞のコラーゲンｍＲＮＡ：４．８倍、ＨｅｐＧ２細胞のコラーゲンｍＲＮＡ：９．１倍、ＨＫ−２細胞のコラーゲン蛋白質：２．４倍）。したがって、ＬＬ２９細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨＫ−２細胞においても、ｓ２４８６核酸は、コラーゲン産生を促進させることが示された。
【０１０７】
したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤は、さまざまな細胞に対してコラーゲン産生促進作用を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、コラーゲン産生が増大した細胞を作製することができる。また、上記細胞を用いて、コラーゲン産生を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号１：第１の核酸に含まれる塩基配列
配列番号２：第２の核酸に含まれる塩基配列
配列番号３：第１の核酸に含まれる５’末端から１９番目までの部分配列（リボヌクレオチド）
配列番号４：第２の核酸に含まれる５’末端から１９番目までの部分配列（リボヌクレオチド）
【図１】
2017178886.tif 000008
【図２】
2017178886.tif 000009
【図３】
2017178886.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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