(57)【要約】【課題】本発明は、腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーに関する。【解決手段】  本発明の腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーは、  （ｉ）元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、  （ｉｉ）当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、  （ｉｉｉ）当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、上皮細胞接着分子に対する核酸アプタマーと、を備えている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーであって、
（ｉ）元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
（ｉｉ）当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
（ｉｉｉ）当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、上皮細胞接着分子に対する核酸アプタマーと、
を備えている
前記キャリアー。
【請求項２】
自己組織化単分子膜は、一方の末端基が担持層を構成する元素と結合しており、担持層に結合していない側の末端基の少なくとも一部は、核酸アプタマーと結合している、請求項１に記載のキャリアー。
【請求項３】
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち核酸アプタマーが結合していない末端基の全部又は一部はキャップされている、請求項１又は２に記載のキャリアー。
【請求項４】
担持層は、金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含む、請求項１〜３のいずれか１に記載のキャリアー。
【請求項５】
自己組織化単分子膜は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を含む、請求項１〜４のいずれか１に記載のキャリアー。
【請求項６】
核酸アプタマー及び／又は前記自己組織化単分子膜は、チオール結合により担持層を構成する元素と結合している、請求項１〜５のいずれか１に記載のキャリアー。
【請求項７】
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち核酸アプタマーが結合していない末端基の全部又は一部は、メトキシ基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ヒドロキシル基から選択される基でキャップされている、請求項１〜６のいずれか１に記載のキャリアー。
【請求項８】
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基であって、核酸アプタマーが結合していない末端基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基である、請求項１〜７のいずれか１に記載のキャリアー。
【請求項９】
自己組織化単分子膜が、ポリエチレングリコール膜又はヒドロキシアルカンチオール基である、請求項１−８のいずれか１項のキャリアー。
【請求項１０】
核酸アプタマーが、ＤＮＡである、請求項１−９のいずれか１項のキャリアー。
【請求項１１】
核酸アプタマーが配列番号１からなる、又は、を含むＤＮＡである、請求項１−１０のいずれか１項に記載のキャリアー。
【請求項１２】
腫瘍細胞が血中循環腫瘍細胞である、請求項１−１１のいずれか１項に記載のキャリアー。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれか１項に記載のキャリアーに、腫瘍細胞を含む可能性のある生体試料を接触させることを含む、腫瘍細胞を捕捉するための方法。
【請求項１４】
請求項１−１２のいずれか１項に記載のキャリアーに、生体試料を接触させることを含む、生体試料中の腫瘍細胞の有無を調べる方法。
【請求項１５】
生体試料が、体液又は細胞単離液から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
生体試料が、血液である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアー、当該キャリアーの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場でがんの判定に使われる代表的な手法として、腫瘍マーカーを用いた生検が含まれる。しかしながら、腫瘍は単クローン性の細胞の集合体ではなく、異なるプロファイルを持った細胞で構成されているため、細胞を採取する場所の違いで判定に異なる結果が生じるなど、現在その判断指標としての信憲性に懐疑的な意見が出てきている。
【０００３】
進行したがんでは、腫瘍細胞が原発腫瘍細胞組織から剥離し、血液やリンパ液の流れに乗り、体内の別の臓器に移動することでがんの転移が起こっていると考えられている。このように血流に乗って体内を循環している腫瘍細胞は、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）と呼ばれている。近年、単位血液量（体積）あたりのＣＴＣの個数が、がんの予後や治療奏功に深く関与することが明らかとなってきており、腫瘍マーカーに代わるがんの病態診断マーカーとしてＣＴＣが着目されている。血中に存在するＣＴＣの数が、がんの病態に対して高い相関を示すことが確認されており、がんの予後や治療奏功の有用な判断材料として考えられている。しかしながら、１ｍＬの血液中には１０億個の血液細胞が存在するのに対し、ＣＴＣはわずか数個〜１０個程度しか含まれていないため、ＣＴＣの検出は極めて困難である。
【０００４】
現在のところ、ＣＴＣ数のカウントを原理とする予後診断システムとして米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認しているのは、米国ベリデックス社のＣｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍのみである。多くの固形腫瘍は細胞膜上にＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を高発現していることが知られている（１細胞あたり約４０万個以上）。同システムでは、磁性微粒子上に抗ＥｐＣＡＭ抗体が修飾されており、これを介してＣＴＣが磁気微粒子上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣを抗サイトケラチン抗体ならびにＤＡＰＩで染色し、セルカウンターでＣＴＣ数をカウントする仕組みとなっている。末梢血７．５ｍＬ中の１個のＣＴＣまで再現性よく検出可能であるが、末梢血濃縮に約４０分、その後の測定に２−３時間と比較的長い時間を診断に要する、という課題がある。近年は、術後に開腹状態でＣＴＣ数をカウントし、病巣摘出の奏功の確認を行いたいとのニーズが医療現場からあがってきている。しかしながら、Ｃｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍでは診断までに、合計４時間近く要するためこのニーズに応えることができない。診断時間の短縮が喫緊の課題である。また、抗体を使用し、高価なシステムを利用する必要があるため、診断コストが非常に高く、同システムの普及の妨げになっている。Ｃｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍに変わる新しい診断方法の開発が望まれている。
【０００５】
Ｃｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ  の磁気微粒子を利用した手法以外にも、ＣＴＣを選択的に捕集、捕捉する技術として、ＣＴＣと他の末梢血成分の細胞サイズの差（ＣＴＣ：約３０μｍ、白血球：約８−２０μｍ程度、赤血球：約８μｍ、厚さ約２μｍ、血小板：直径約２−４μｍ）を利用してフィルターで分離捕集する手法、誘電泳動特性の違いを利用し、マイクロ流体デバイスで分離捕集する手法、アビジン修飾プレート（プレートリーダー用）にビオチン修飾核酸アプタマーを固定化したものを用いて捕捉する手法などが提案されている。
【０００６】
しかし、公知のフィルターによる分離捕集法やマイクロ流体デバイスにおいては、標的細胞である腫瘍細胞以外の血球細胞や付着したタンパク質成分などによってフィルターの目詰まりを起こす恐れがあるため、全血に対して前処理を行ったり、希釈したりする必要があるものが多い。また、マイクロ流体デバイスでは、構造上流路が狭いため、一度に流せるサンプル量が限られており、分離捕集に長い時間（数時間）を要することが多い。アビジン修飾プレート上へのアプタマー修飾法を用いても、検出装置、検出方法が限定されてしまう。
【０００７】
腫瘍細胞を簡便かつ効率良く捕捉するためのキャリアー及び方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2014/019025 A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Analytical Chemistry, 2013,85,p.4141-4149
【非特許文献２】PLOS ONE, 2013,8,2,e57613
【非特許文献３】Angew. Chem. Int. Ed. 2014,53,p.13145-13149
【非特許文献４】International Journal of Nanomedicine, 2014,9,p.1083-1096
【非特許文献５】Mol.Cells,37,742-746(2014)
【非特許文献６】Cancer Sci., 102, 991-998(2011)
【非特許文献７】Tumor Biol., 27, 289-301(2006)
【非特許文献８】Cancer Res., 70, 9371-9380(2010)
【非特許文献９】Biochem. Biophys. Res. Commun., 453, 681-685(2014)
【非特許文献１０】PLOS ONE, 9, e90752(2014)
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 8170-8175(2013)
【非特許文献１２】Bull. Korean Chem. Soc., 30, 1827-1831(2009)
【非特許文献１３】Nucleic. Acid Ther., 21, 173-178(2011)
【非特許文献１４】J. Transl. Med., 10, 148-158(2012)
【非特許文献１５】J. Cancer Sci. Ther., 4, 214-222(2012)
【非特許文献１６】Mol. Ther. Nucleic Acids, 1, e21(2012)
【非特許文献１７】Nucleic Acid Ther., 23, 401-407(2013)
【非特許文献１８】Cancer Lett., 330, 84-95(2013)
【非特許文献１９】Mol. Cell. Proteomics, 2230-2230(2007)
【非特許文献２０】Mol. Cancer Ther., 5, 1790-1799(2006)
【非特許文献２１】J. Biol. Chem., 276, 16464-16468(2001)
【非特許文献２２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 15416-15421(2003)
【非特許文献２３】J. Proteome Res., 7, 2133-2139(2008)
【非特許文献２４】Clin. Chem., 53, 1153-1158(2007)
【非特許文献２５】Anal. Chem., 80, 721-728 (2008)
【非特許文献２６】J. Hematol. Oncol., 7, 5(2014)
【非特許文献２７】Leukemia, 23, 235-244(2009)
【非特許文献２８】Biomaterials,29,4177-4186(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアー、当該キャリアーの製造方法等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者ら上記問題の解決のために鋭意研究を重ね、腫瘍細胞の捕捉、検出、除去等の目的のために利用できる、腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーを構築し、本発明を想到した。限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーであって、
（ｉ）元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
（ｉｉ）当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
（ｉｉｉ）当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、上皮細胞接着分子に対する核酸アプタマーと、
を備えている
前記キャリアー。
［態様２］
自己組織化単分子膜は、一方の末端基が担持層を構成する元素と結合しており、担持層に結合していない側の末端基の少なくとも一部は、核酸アプタマーと結合している、態様１に記載のキャリアー。
［態様３］
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち核酸アプタマーが結合していない末端基の全部又は一部はキャップされている、態様１又は２に記載のキャリアー。
［態様４］
担持層は、金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含む、態様１〜３のいずれか１に記載のキャリアー。
［態様５］
自己組織化単分子膜は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を含む、態様１〜４のいずれか１に記載のキャリアー。
［態様６］
核酸アプタマー及び／又は前記自己組織化単分子膜は、チオール結合により担持層を構成する元素と結合している、態様１〜５のいずれか１に記載のキャリアー。
［態様７］
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち核酸アプタマーが結合していない末端基の全部又は一部は、メトキシ基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ヒドロキシル基から選択される基でキャップされている、態様１〜６のいずれか１に記載のキャリアー。
［態様８］
自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基であって、核酸アプタマーが結合していない末端基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基である、態様１〜７のいずれか１に記載のキャリアー。
［態様９］
自己組織化単分子膜が、ポリエチレングリコール膜又はヒドロキシアルカンチオール基である、態様１−８のいずれか１項のキャリアー。
［態様１０］
核酸アプタマーが、ＤＮＡである、態様１−９のいずれか１項のキャリアー。
［態様１１］
核酸アプタマーが配列番号１からなる、又は、を含むＤＮＡである、態様１−１０のいずれか１項に記載のキャリアー。
［態様１２］
腫瘍細胞が血中循環腫瘍細胞である、態様１−１１のいずれか１項に記載のキャリアー。
［態様１３］
態様１−１２のいずれか１項に記載のキャリアーに、腫瘍細胞を含む可能性のある生体試料を接触させることを含む、腫瘍細胞を捕捉するための方法。
［態様１４］
態様１−１２のいずれか１項に記載のキャリアーに、生体試料を接触させることを含む、生体試料中の腫瘍細胞の有無を調べる方法。
［態様１５］
生体試料が、体液又は細胞単離液から選択される、態様１３又は１４に記載の方法。
［態様１６］
生体試料が、血液である、態様１３又は１４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、核酸アプタマー修飾金基板の調製法のスキームを示す。
【図２】図２は、実施例２において本発明の標的細胞捕捉キャリアーで捕捉した標的細胞、正常細胞及び比較例の蛍光観察写真である。
【図３】図３は、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒによるＥｐＣＡＭアプタマーの予測される二次元構造を示した図である。
【図４】図４は、自己組織化単分子膜上に核酸アプタマーが修飾されたキャリアーの製造方法のスキームを示す。
【図５】図５は、担持層の上に核酸アプタマーが直接結合しているキャリアーの製造方法のスキームを示す。
【図６】図６は、実施例３において本発明の標的細胞捕捉キャリアーで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。
【図７】図７は、実施例４において本発明の標的細胞捕捉キャリアーで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。
【図８】図８は、実施例５において本発明の標的細胞捕捉キャリアーで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。
【図９】図９は、実施例６において本発明の標的細胞捕捉キャリアーで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．キャリアー
本発明は、一態様において、腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアーを提供する。
【００１４】
キャリアーの構造
本発明のキャリアーは、
（ｉ）元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
（ｉｉ）当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
（ｉｉｉ）当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、上皮細胞接着分子に対する核酸アプタマーと、
を備えている。
【００１５】
本発明の一態様において、自己組織化単分子膜は、一方の末端基が担持層を構成する元素と結合しており、担持層に結合していない側の末端基の少なくとも一部は、核酸アプタマーと結合している。
【００１６】
担持層は、元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む金属基板、あるいは金属、ガラス、プラスチック又は紙などの支持基板の少なくとも一面に上記元素をメッキ、蒸着、スパッタリングなどの公知の方法を用いて成膜したものでよい。また、ニッケル系合金（たとえばニッケル−コバルト、ニッケル−リンなど）、クロム系合金、スズ系合金などで支持基板をメッキした後に、元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を電鋳により成膜して、担持層を形成してもよい。いずれの成膜方法でも、支持基板は特に限定されず、担持層の少なくとも表面に、元素周期表第１０族元素、第１１族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を有していればよく、特に金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含むことが好ましい。
【００１７】
赤血球（約７μｍ）や白血球（約１５μｍ）などの正常細胞の寸法よりも大きな、例えば、直径２０μｍ程度の孔のあいた担持層を使用しても良い。このような形状の場合、血液（全血）マトリックスのうち、正常細胞は担持層を通り抜け、より大きな腫瘍細胞を選択的に捕捉しやすくなる。
【００１８】
腫瘍細胞をキャリアーに捕捉するための核酸アプタマーについては、後述する。
【００１９】
本発明の方法に使用可能なキャリアーの例を図４及び図５に示す。
【００２０】
図５は核酸アプタマー３３が担持層３１に直接、化学的に結合している態様である。図４は核酸アプタマー３３が自己組織化単分子膜３２に化学的に結合した状態で担持層３１に設けられている態様である。図示した態様において、核酸アプタマー３３、及び／又は、自己組織化単分子膜３２は、チオール結合により担持層３１を構成する元素と結合している。
【００２１】
自己組織化単分子膜３２は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシ基、アミノ基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を含む。これらの官能基で末端が修飾されているポリエチレングリコール膜又はヒドロキシアルカンチオール膜から形成することができる。ヒドロキシアルカンチオールとしては、例えば、ヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオール、ヒドロキシ−ＥＧ３−ウンデカンチオール、６−メルカプト−１−ヘキサノール等を好適に挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２２】
自己組織化単分子膜３２に核酸アプタマー３３が結合している態様では、自己組織化単分子膜３２の末端のカルボキシル基又はヒドロキシル基を活性化するために官能基で修飾した後に、当該官能基を核酸アプタマー３３で置換してもよい。非限定的に、自己組織化単分子膜３２の末端基を修飾する官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、又はマレイミド基であることが好ましい。
【００２３】
自己組織化単分子膜３２の末端がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の場合、アミノ化アプタマー３３のアミノ基と反応させて、これらを自己組織化単分子膜３２に結合させることができる。自己組織化単分子膜３２の末端がアミノ基の場合、例えば化学合成したＮ−ヒドロキシスクシンイミド化核酸アプタマーを、自己組織化単分子膜３２に結合させることができる。
【００２４】
自己組織化単分子膜３２の末端がアミノ基の場合、これをさらにマレイミド化して、自己組織化単分子膜３２の末端を修飾する官能基をマレイミド基としてもよい。具体的には、非限定的に、片方の端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有し、もう一方の端にマレイミド基を有する二価性試薬、例えば、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）（例えば、株式会社  同仁化学研究所より入手可能）を、末端にアミノ基を有する自己組織化単分子膜と反応させると、自己組織化単分子膜３２の末端を修飾する官能基がマレイミド基となる。この場合、化学合成したチオール化核酸アプタマーを、自己組織化単分子膜３２に結合させることができる。
【００２５】
核酸アプタマー３３で置換されなかった官能基が残存することもある。核酸アプタマーが結合しなかった官能基、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は水中で分解し、自己組織化単分子膜３２の末端としてはヒドロキシル基又はカルボキシル基が残る。自己組織化単分子膜３２の末端基がマレイミド基で修飾されている場合には、核酸アプタマーが結合しなかったマレイミド基は自己組織化単分子膜３２の末端基として残る。残ったマレイミド基は、一方の末端にＳＨ基を有し、他方の末端がメトキシ基（−ＯＣＨ３）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル基（−ＣＯＮＨＣＨ３）及びヒドロキシル基（−ＯＨ）を有するキャッピング剤でキャッピングすることが必要となる。
【００２６】
自己組織化単分子膜３２の末端基のうち核酸アプタマー３３が結合していない末端基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である場合、その全部又は一部は、一方の末端にＮＨ２基を有し、他方の末端がメトキシ基（−ＯＣＨ３）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル基（−ＣＯＮＨＣＨ３）及びヒドロキシル基（−ＯＨ）から選択される基を有するキャッピング剤でキャップされていることがより好ましい。
【００２７】
自己組織化単分子膜３２の末端基のうち核酸アプタマー３３が結合していない末端基がアミノ基である場合、その全部又は一部は、一方の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有し、他方の末端がメトキシ基（−ＯＣＨ３）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル基（−ＣＯＮＨＣＨ３）及びヒドロキシル基（−ＯＨ）から選択される基を有するキャッピング剤でキャップされていることがより好ましい。
【００２８】
上記のように、核酸アプタマー３３が結合していない末端基をキャップすることで、標的細胞である腫瘍細胞以外の細胞との非特異的結合を抑制することができ、より確実に腫瘍細胞のみを捕捉することができる。
【００２９】
腫瘍細胞
本発明の捕捉の対象は腫瘍細胞である。腫瘍の種類は特に限定されず、脳悪性腫瘍、胃癌、肺癌、乳癌、咽頭癌、食道癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、基底細胞癌、悪性リンパ腫、白血病、神経膠腫等を含む。腫瘍細胞は、原発性腫瘍細胞、転移性腫瘍細胞、血中循環腫瘍細胞等を含む。好ましくは、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）である。
【００３０】
核酸アプタマー
本発明のキャリアーにおいて、担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して、核酸アプタマーが設けられている。
【００３１】
本明細書において、「核酸アプタマー」の「核酸」の種類は特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡ複合体のいずれであってもよい。好ましくはＤＮＡである。
【００３２】
「アプタマー」（Ａｐｔａｍｅｒ）とは、特定の分子と特異的に結合する分子やペプチドである。通常ランダム配列の巨大ライブラリ中から選び出してくるが、自然界にも存在しておりリボスイッチとして知られている。基礎から薬剤探索などの応用まで幅広く研究されている。リボザイムと複合体化したアプタマーも存在しており、ターゲット分子存在下で自己切断するものが知られている。大きく分けると核酸（ＤＮＡ・ＲＮＡ）アプタマー、ペプチドアプタマーの２種に分類される。
【００３３】
「核酸アプタマー」は進化工学的に得られており、その手法はインビトロ選択法、もしくはＳＥＬＥＸ法として知られている。有機小分子や蛋白質、核酸、細胞、組織、微生物といった様々な標的と特異的に結合するものが存在する。核酸アプタマーは抗体に代わる分子認識が可能な生体物質として、生物工学的応用、薬剤への応用が検討されている。核酸アプタマーは核酸自動合成装置で化学的に、しかも短時間で合成可能であり、免疫原性もほとんどないか全くない点が抗体にはない利点である。核酸アプタマーとしてＲＮＡとＤＮＡの間に本質的な違いは存在しないが、ＤＮＡの方が化学的に安定である。ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーの両者とも、様々な分子に対して高い親和性と特異性を示す。
【００３４】
核酸アプタマーは化学合成が可能であるため、コストを大幅に下げることができる。また、核酸を用いることでＤＮＡ折り紙やナノワイヤー等のように”静的な構造”のみならず、ＤＮＡウォーカーや、リボスイッチ、アプタザイムのような”動的な構造”を自在にプログラミングすることが可能となる（ダイナミックプログラミング）。このプログラムを利用して、腫瘍細胞捕捉のシグナルを増幅することも可能である。
【００３５】
当業者は、目的とする腫瘍細胞の種類に応じて細胞の細胞表面物質に特異的に結合する核酸アプタマーを適宜選択しうる。核酸アプタマーは、非限定的に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に対する核酸アプタマーである。上皮細胞接着分子は、特に血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の細胞表面物質であることが知られており、これに対する核酸アプタマーを利用可能である。例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１３，８５，ｐ．４１４１−４１４９を参照されたい。当該文献には、ＳＹＬ１、ＳＹＬ２、ＳＹＬ３，ＳＹＬ４及びＳＹＬ３Ｃの５種類の核酸アプタマーが記載されている。その中でも、ＳＹＬ３の部分配列であるＳＹＬ３Ｃの配列が、ＥｐＣＡＭに対する特異性が高く望ましい。
【００３６】
ＳＹＬ３Ｃ：
５’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG−３’  （配列番号１）
ＣＴＣの検出には、その他にも以下のような配列が利用可能である。（以下、塩基配列の記載において、特に明記しない限り５’から３’の向きに記載する。）
ＥｐＣＡＭアプタマー（ＥＰ１６６）：AACAGAGGGACAAACGGGGGAAGATTTGACGTCGACGACA（配列番号２）(Mol.Cells,37,742-746(2014))
ＥｐＣＡＭアプタマー（ＥｐＤＴ３）：GCGACUGGUUACCCGGUCG（配列番号３）(Cancer Sci., 102, 991-998(2011))
ＭＵＣ１アプタマー（ＭＵＣ１  Ｓ１．３）：GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG（配列番号４）(Tumor Biol., 27, 289-301(2006))
ＥＧＦＲアプタマー：GGCGCUCCGACCUUAGUCUCUGUGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGGAACCGUGUAGCACAGCAGAGAAUUAAAUGCCCGCCAUGACCAG（配列番号５）(Cancer Res., 70, 9371-9380(2010))
ＥＧＦＲアプタマー（ＴｕＴｕ２２）：TACCAGTGCGATGCTCAGTGCCGTTTCTTCTCTTTCGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATGCTGACGCATTCGGTTGAC（配列番号６）(Biochem. Biophys. Res. Commun., 453, 681-685(2014))
ＥＧＦＲｖＩＩＩアプタマー（Ｕ２）：ATCCAGAGTGACGCAGCATTTTGACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’（配列番号７）(PLOS ONE, 9, e90752(2014))
ＨＥＲ２アプタマー（２−２）：GCACGGTGTGGGG（配列番号８）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 8170-8175(2013))
ＨＥＲ２アプタマー（Ｓ６）：TGGATGGGGAGATCCGTTGAGTAAGCGGGCGTGTCTCTCTGCCGCCTTGCTATGGGG（配列番号９）(Bull. Korean Chem. Soc., 30, 1827-1831(2009))
ＨＥＲ２アプタマー（Ｍｉｎｉ）：AGCCGCGAGGGGAGGGAUAGGGUAGGGCGCGGCU（配列番号１０）(Nucleic. Acid Ther., 21, 173-178(2011))
ＨＥＲ２アプタマー（ＨＳＢ５）：AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATTTTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACTACACACGCACA（配列番号１１）(J. Transl. Med., 10, 148-158(2012))
ＡＢＣＧ２アプタマー（ＡＢＣＧ２／Ａ１２）：ACGCTCGGATGCCACTACAGGCCCACCCTCATGGACGTGCTGGTGAC（配列番号１２）(J. Cancer Sci. Ther., 4, 214-222(2012))
ＣＤ７１アプタマー（ｃ２．ｍｉｎ）：GGGGGAUCAAUCCAAGGGACCCGGAAACGCUCCCUUACACCCC（配列番号１３）(Mol. Ther. Nucleic Acids, 1, e21(2012))
ＣＤ４４アプタマー（Ａｐｔ１）：GGGAUGGAUCCAAGCUUACUGGCAUCUGGAUUUGCGCGUGCCAGAAUAAAGAGUAUAACGUGUGAAUGGGAAGCUUCGAUAGGAAUUCGG（配列番号１４）(Nucleic Acid Ther., 23, 401-407(2013))
ＣＤ１３３アプタマー（ＣＤ１３３−Ａ１５）：CCCUCCUACAUAGGG（配列番号１５）(Cancer Lett., 330, 84-95(2013))
免疫グロブリンμ重鎖アプタマー（ＴＤ０５）：ACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG（配列番号１６）(Mol. Cell. Proteomics, 2230-2230(2007))
ヌクレオリンアプタマー（ＡＳ１４１１）：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG（配列番号１７）(Mol. Cancer Ther., 5, 1790-1799(2006))
ピグペンアプタマー（ＩＩＩ．１）：ATACCAGCTTATTCAATTAGGCGGTGCATTGTGGTGGTAGTATACATGAGGTTTGGTTGAGACTAGTCGCAAGATATAGATAGTAAGTGCAATCT（配列番号１８）(J. Biol. Chem., 276, 16464-16468(2001))
テナシンＣアプタマー（ＧＢＩ−１０）GGCTGTTGTGAGCCTCCTCCCAGAGGGAAGACTTTAGGTTCGGTTCACGTCCCGCTTATTCTTACTCCC（配列番号１９）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 15416-15421(2003))
ＰＴＫ７アプタマー（ｓｇｃ８）：ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA（配列番号２０）(J. Proteome Res., 7, 2133-2139(2008))
Ｔｏｌｅｄｏ細胞アプタマー（Ｓｇｄ５）：ATACCAGCTTATTCAATTATCGTGGGTCACAGCAGCGGTTGTGAGGAAGAAAGGCGGATAACAGATAATAAGATAGTAAGTGCAATCT（配列番号２１）(Clin. Chem., 53, 1153-1158(2007))
ＭＥＡＲ細胞アプタマー（ＴＬＳ１１ａ）：ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG（配列番号２２）(Anal. Chem., 80, 721-728(2008))
ＣＴＣ以外の腫瘍細胞、例えば、急性骨髄性白血病等の検出には、例えば以下に記載の核酸アプタマーを利用可能である。
【００３７】
Ｓｉｇｌｅｃ−５アプタマー（Ｋ１９）：AAGGGGTTGGGTGGGTTTATACAAATTAATTAATATTGTATGGTATATTT（配列番号２３）(J. Hematol. Oncol., 7, 5 (2014))
ＨＬ６０細胞アプタマー（ＫＨ１Ｃ１２）：ATCCAGAGTGACGCAGCATGCCCTAGTTACTACTACTCTTTTTAGCAAACGCCCTCGCTTTGGACACGGTGGCTTAGT（配列番号２４）(Leukemia, 23, 235-244(2009))
ＩＩ．腫瘍細胞を捕捉するための方法
本発明は、一態様において、腫瘍細胞を捕捉するための方法を提供する。本発明の方法は、本発明のキャリアーに腫瘍細胞を含む可能性のある生体試料を接触させることを含む。
【００３８】
「生体試料」とは、目的の腫瘍細胞を含む可能性のある試料であれば、種類は特に限定されない。例えば、生体試料は、体液又は細胞単離液から選択されうる。「体液」とは、一般に、血液（血液全体又は血漿）、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液（関節液、脳脊髄液、漿膜腔液、眼房水等）等を意味する。さらに、消化液（唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液等）、汗、涙等も含まれる。好ましくは、血液（血液全体又は血漿）である。「細胞単離液」とは、生体組織を公知の方法で単離・分散し、液体状にしたものを意味する。組織の種類は特に限定されず、胃、腸、皮膚、肺、乳房、前立腺、精巣、卵巣、子宮、骨髄等、任意の生体組織を適宜対象として使用しうる。細胞の単離・分散のための試薬は、例えば、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、又は、これらの混合物、などの酵素を含む試薬を、生体組織、細胞の種類に応じて適宜使用しうる。例えば、トリプシン、コラゲナーゼ等の複数の酵素をセットとして含むCell Isolation Optimizing System（フナコシ株式会社製）などが含まれる。
【００３９】
生体試料は、非限定的に、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳動物に由来する。
【００４０】
腫瘍細胞の腫瘍の種類は特に限定されず、脳悪性腫瘍、胃癌、肺癌、乳癌、咽頭癌、食道癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、基底細胞癌、悪性リンパ腫、白血病、神経膠腫等を含む。腫瘍細胞は、原発性腫瘍細胞、転移性腫瘍細胞、血中循環腫瘍細胞等を含む。好ましくは、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）である。
【００４１】
本発明のキャリアーに腫瘍細胞を含む可能性のある生体試料を接触させる工程の具体的な手法は特に限定されない。液体の生体試料を本発明のキャリアー上に滴下してもよい。あるいは、液体の生体試料を含む容器中に本発明のキャリアーを入れても良い。
【００４２】
キャリアーを生体試料に接触させた後、非特異的結合を除去するために、キャリアーを洗浄することが好ましい。
【００４３】
腫瘍細胞を捕捉後、本発明の方法における細胞捕捉効率（捕捉数）や細胞選択性の確認を行うことが可能である。また、基板洗浄法も最適化することが可能である。得られた結果をキャリアーの製造方法の検討（アプタマー固定化密度、リンカー長、ＳＡＭ膜の末端ヒドロキシル基のキャッピングなどの最適化）にフィードバックすることができる。
【００４４】
ＩＩＩ．生体試料中の腫瘍細胞の有無を調べる方法
本発明は、一態様において、生体試料中の腫瘍細胞の有無を調べる方法を提供する。本発明の方法は、本発明のキャリアーに、生体試料を接触させることを含む。「生体試料」及び「本発明のキャリアーに腫瘍細胞を含む可能性のある生体試料を接触させる」工程については、「ＩＩ．腫瘍細胞を捕捉するための方法」の項目で前述した通りである。
【００４５】
腫瘍細胞の有無は、キャリアーに捕捉された腫瘍細胞を検出することにより確認することが可能である。検出方法は特に限定されない。腫瘍細胞は、例えば、キャリアーをＤｉＤ等の蛍光色素で染色し、キャリアー表面を蛍光顕微鏡で観察することにより、検出することができる。
【００４６】
あるいは、目的とする腫瘍細胞に特異的な抗体を用いてもよい。例えば、腫瘍細胞が、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）の場合、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に対する抗体を好適に挙げることができる。たとえば、ａｂｃａｍ製カタログＮｏ．ａｂ３２３９２で入手可能なウサギ抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナルＩｇＧ抗体などを挙げることができる。また、腫瘍細胞がＣＴＣでない場合も、腫瘍細胞表層に発現しているタンパク質を介して、特異的に捕捉することができる。たとえば急性骨髄性白血病を発症している白血球を捕捉する場合、ａｂｃａｍ製カタログＮｏ．ａｂ９７４２６を用いればよい。
【００４７】
あるいは、核酸アプタマーに腫瘍細胞が結合することをきっかけとして増幅される核酸プローブのシグナルを検出してもよい。
【００４８】
ＩＶ．本発明の態様
非限定的例として本発明の態様を記載する。
【００４９】
（１）キャリアーの製造
（ｉ）自己組織化単分子膜の末端がヒドロキシル基であるキャリアー（図４（１））
銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施して、担持層３１を調製する。次いで、担持層３１を自己組織化単分子膜形成分子の溶液（ヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液）中に浸漬し、担持層３１上に自己組織化単分子膜３２を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜３２が形成されている担持層３１に、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）を滴下し、自己組織化単分子膜３２の末端に官能基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を導入して、末端基を活性化させる。次いで、末端アミノ化核酸アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜３２の末端の官能基と反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させてキャリアーを作製する。この際、核酸アプタマーと結合しなかった末端の官能基は水中で分解されてヒドロキシル基として残る。
【００５０】
（ｉｉ）自己組織化単分子膜の末端がカルボキシル基であるキャリアー
銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施して、担持層３１を調製する。次いで、担持層３１を自己組織化単分子膜形成分子の溶液（カルボキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液）中に浸漬し、担持層３１上に自己組織化単分子膜３２を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜３２が形成されている担持層３１に、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）を滴下し、自己組織化単分子膜３２の末端に官能基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基）を導入して、末端基を活性化させる。次いで、末端アミノ化核酸アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜３２の末端の官能基と反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させてキャリアーを作製する。この際、核酸アプタマーと結合しなかった末端の官能基は水中で分解されてカルボキシル基として残る。
【００５１】
（ｉｉｉ）自己組織化単分子膜の末端がアミノ基であるキャリアー
銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施して、担持層３１を調製する。次いで、担持層３１を自己組織化単分子膜形成分子の溶液（アミノ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液）中に浸漬し、自己組織化単分子膜３２を形成させる。次いで、末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化核酸アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜３２の末端のアミノ基と核酸アプタマーのＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を反応させ、核酸アプタマーをアミド結合によって連結させてキャリアーを作製する。この際、核酸アプタマーと結合しなかった末端の官能基はそのままアミノ基として残る。
【００５２】
（ｉｖ）自己組織化単分子膜の末端をマレイミド基で修飾して核酸アプタマーを結合させたキャリアー
銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施して、担持層３１を調製する。次いで、担持層３１を自己組織化単分子膜形成分子の溶液（アミノ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液）中に浸漬し、担持層３１上に自己組織化単分子膜３２を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜３２が形成されている担持層３１に、マレイミド基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を両末端に有する二価性試薬溶液（ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド：化１）のアセトニトリル溶液）を滴下し、自己組織化単分子膜３２の末端に官能基（マレイミド基）を導入する。次いで、末端チオール化核酸アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜３２の末端の官能基と核酸アプタマーチオール基を反応させることで、核酸アプタマーを結合させキャリアーを作製する。この際、核酸アプタマーと結合しなかった末端のマレイミド基は、一方の末端にＳＨ基を有し、他方の末端がメトキシ基（−ＯＣＨ３）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル基（−ＣＯＮＨＣＨ３）及びヒドロキシル基（−ＯＨ）を有するキャッピング剤でキャッピングすることが必要となる。
【００５３】
【化１】
2017079635.tif 000002
【００５４】
（ｖ）自己組織化単分子膜の末端を官能基でキャップしたキャリアー（図４（２））
自己組織化単分子膜３２の末端に官能基を導入した後、末端アミノ化核酸アプタマーとキャッピング剤（メトキシ基（−ＯＣＨ３）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル基（−ＣＯＮＨＣＨ３）基、又はヒドロキシル基（−ＯＨ）などを含む）を添加する以外は、上記（１）〜（３）と同様にして、自己組織化単分子膜の末端官能基をキャップしたキャリアーを作製する。
【００５５】
（ｖｉ）担持層３１に核酸アプタマー３３を直接結合させたキャリアー（図５）
銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施して担持層３１を調製する。次に、末端チオール化核酸アプタマー溶液を担持層３１表面に添加し、担持層３１に核酸アプタマー３３を直接、金−チオール結合により結合させる。次いで、核酸アプタマー３３が結合している担持層３１を自己組織化単分子膜形成分子の溶液（ヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール）中に浸漬し、自己組織化単分子膜３２を形成させてキャリアーを作製する。この場合、自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端は、ヒドロキシル基若しくは上記キャッピング剤でキャップされた官能基でよい。
【００５６】
（２）腫瘍細胞の基板への捕捉効率の評価
腫瘍細胞を含むサンプル溶液を修飾基板（キャリアー）上に滴下し、標的とする腫瘍細胞を選択的に捕捉する。血清培地中の腫瘍細胞を用いて、細胞捕捉効率（捕捉数）や細胞選択性の確認を行う。また、基板洗浄法も最適化する。得られた結果を基板調製法の検討（アプタマー固定化密度、リンカー長、ＳＡＭ膜の末端ヒドロキシル基のキャッピングなどの最適化）にフィードバックする。図２に示すように、血清培地中における腫瘍細胞検出を試みた結果、選択的に腫瘍細胞を捕捉することに成功している。インキュベーション時間は、例えば３０分程度でよいが、反射光（ＳＰＲ）、重量（ＱＣＭ）などの分析手法を用い、基板に対する細胞の結合の速度論的な解析を行って、捕捉のためのインキュベーション時間を最適化することが可能である。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５８】
［実施例１］
本実施例は、腫瘍細胞を特異的に捕捉可能なキャリアーの作製方法に関する。元素周期表第１０族元素、第１１族元素又はこれらの組み合わせを含む担持層に対して、上皮細胞接着分子に対する核酸アプタマーで修飾することで、腫瘍細胞の捕捉用キャリアーとして用いることが可能となる。核酸アプタマーを介しない非特異的な細胞の吸着を抑制するため、（１−１）担持層上に自己組織化単分子膜を作製後、その上にアプタマーを修飾する、もしくは（１−２）アプタマーを担持層上に直接修飾後、残りの残余面に自己組織化単分子膜を作製する。以下に、代表例として担持層として金を用いる際のキャリアー製造方法の詳細を述べる。
【００５９】
担持層としては、パターニング工程を施していない（パターンの無い）平面の金基板を用いた。金基板は、金属板または通電性のあるＳｉ基板の一面に、Ｎｉメッキ後、金メッキを施ししたものを用いた。
【００６０】
（１−１）  自己組織化単分子膜上に核酸アプタマーが修飾されたキャリアーの製造（図４）
（ａ）  自己組織化単分子膜の末端がヒドロキシル基のキャリアーの製造方法
金メッキを施した基板をピラニア溶液と１０分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、この基板を１ｍＭヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、１２時間室温で反応させて自己組織化単分子膜を形成させた。次いで、この基板をエタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、１０ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を滴下し、飽和蒸気圧下で５時間静置し、自己組織化単分子膜の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した。次いで、乾燥アセトニトリルで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中にて調製した１０μＭ末端アミノ化アプタマー溶液（３’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー）を滴下して、飽和蒸気圧下で３時間静置し、自己組織化単分子膜の末端のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とアプタマーのアミノ基を反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させた。最後にＰＢＳで洗浄後、窒素を吹きかけて乾燥させた。
【００６１】
核酸アプタマーの配列は、以下の通りである。
【００６２】
ＳＹＬ３Ｃ：
５’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG−３’
（配列番号１）
（ｂ）  自己組織化単分子膜の末端がヒドロキシル基以外のキャリアーの製造方法
自己組織化単分子膜末端のヒドロキシル基を別の官能基（−ＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＯＮＨ２など）に変えることも可能である。導入したい官能基と共に、脂肪族アミンを有する化合物であれば、これを用いて自己組織化単分子膜末端を修飾可能である。本実施例（実施例１−１（ｂ））では、その一例としてメトキシエチルアミンを使用した例を説明する。
【００６３】
自己組織化単分子膜を形成させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入して末端ヒドロキシル基を活性化させるまでの操作は上記（ａ）と同様な操作を行った。上記（ａ）で製造したヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールの自己組織単分子膜の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した後、１０μＭ末端アミノ化アプタマー（３’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー）と０．１μＭメトキシエチルアミンの混合溶液（ＰＢＳ中にて調製）を添加し、３７℃で３時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、窒素を吹きかけて乾燥させ、次に２ｍｇ／ｍＬメトキシエチルアミン溶液（ＰＢＳ中にて調製）を基板上に添加し、３７℃で３時間静置した。最後にＰＢＳで洗浄後、窒素を吹きかけて乾燥させた。
【００６４】
（１−２）  核酸アプタマーが直接修飾されたキャリアーの製造方法（図５）
金メッキを施した基板をピラニア溶液と１０分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、ＰＢＳ溶液中にて調製した１０μＭ末端チオール化アプタマー溶液（３’末端側にヘキサエチレングリコールスペーサーを介し、トリメチレンチオールを導入した構造のアプタマー）を基板表面に添加し、飽和蒸気圧下で２４時間反応させて、担持層に核酸アプタマーを直接、チオール結合させた。次いで、核酸アプタマーが結合している担持層を１ｍＭヒドロキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、２時間室温で反応させて自己組織化単分子膜を形成させた。次いで、エタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた。
【００６５】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で調製した腫瘍細胞に対する核酸アプタマーを修飾したキャリアーを用い、腫瘍細胞を特異的に捕捉した。核酸アプタマーは、多くの固形癌種の細胞膜上に高発現しているＥｐＣＡＭに対するアプタマー（配列番号１）である。
【００６６】
ＳＹＬ３Ｃ：
５’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG−３’  （配列番号１）
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手）及びＫＡＴＯIII（ヒト胃癌由来細胞）（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を標的細胞として、細胞膜をＤｉＯ（緑色標識染色体）で染色し、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を対照となる正常細胞として、細胞膜をＤｉＤ（赤色標識染色体）で染色し、細胞の核をＤＡＰＩ（４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、青色標識染色体）で染色した後、それぞれの懸濁液（２×１０５細胞／ｍＬ）中に、細胞膜上の疎水性が高い部位への非特異的な吸着を抑えるため、マスキング剤としてｔＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、撹拌後、３７℃で３０分インキュベートし、３種類のサンプル生体試料を調製した。
【００６７】
次いで、実施例１（１−１）（ｂ）で製造したキャリアーに３種類の生体試料を滴下し、ＰＢＳで洗浄した後、蛍光を観察した。結果を図２に示す。比較例として、標的細胞捕捉フィルターの代わりに、アプタマーを修飾していない金メッキ銅基板からなるフィルターを用いた以外は同様に行った。
【００６８】
図２左側からＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）及びＫＡＴＯIII（ヒト胃癌由来細胞）の赤色の蛍光は観察されたが、正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）の赤色の蛍光は観察されなかったことから、本発明の標的細胞捕捉装置を用いることで、標的細胞のみを特異的に捕捉できたことが確認できた。また、比較例（図２右側）では、赤色の蛍光が観察できず、標的細胞を捕捉できなかったことが確認できた。
【００６９】
［実施例３］
実施例１（１−１）（ａ）で製造したキャリアーを用いた以外は実施例２と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図６に示す。
【００７０】
図６（ａ）は正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）をＤｉＤの蛍光で観察した画像であり、図６（ｂ）はＨＥＫ２９３ＴをＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図６（ｃ）は（ａ）と（ｂ）をマージした画像である。図６（ａ）〜（ｃ）より、正常細胞はほとんど捕捉されていないことが確認できる。図６（ｄ）は捕捉されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の細胞膜をＤｉＯの蛍光で観察した画像であり、図６（ｅ）は捕捉されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞核をＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図６（ｆ）は（ｄ）と（ｅ）をマージした画像である。図６（ｄ）〜（ｆ）より、標的細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の蛍光が確認できた。図６（ｃ）と（ｆ）を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。
【００７１】
［実施例４］
実施例（１−２）で製造したキャリアーを用いた以外は実施例２と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図７に示す。
【００７２】
図７（ａ）は正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）をＤｉＤの蛍光で観察した画像であり、図７（ｂ）はＨＥＫ２９３ＴをＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図７（ｃ）は（ａ）と（ｂ）をマージした画像である。図７（ａ）〜（ｃ）より、赤色の蛍光は非常に少なく、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図７（ｄ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の細胞膜をＤｉＯ蛍光で観察した画像であり、図７（ｅ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞核をＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図７（ｆ）は（ｄ）と（ｅ）をマージした画像である。図７（ｄ）〜（ｆ）より、標的細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の蛍光が多数確認できた。図７（ｃ）と（ｆ）を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。
【００７３】
［実施例５］
担持層３１として、銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と１０分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、この基板を１ｍＭ６−メルカプト−１−ヘキサノールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、１２時間室温で反応させて自己組織化単分子膜３２を形成させた。次いで、この基板をエタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、１０ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を滴下し、飽和蒸気圧下で５時間静置し、自己組織化単分子膜３２の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した。次いで、乾燥アセトニトリルで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中にて調製した１０μＭ末端アミノ化アプタマー溶液（３’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー）を滴下して、飽和蒸気圧下で３時間静置し、自己組織化単分子膜３２の末端のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とアプタマーのアミノ基を反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させた。最後にＰＢＳで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させ、標的細胞捕捉キャリアーを製造した。
【００７４】
上記製造されたキャリアーを用いた以外は、実施例２と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図８に示す。
【００７５】
図８（ａ）は正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）をＤｉＤの蛍光で観察した画像であり、図８（ｂ）はＨＥＫ２９３ＴをＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり，図８（ｃ）は（ａ）と（ｂ）をマージした画像である。図８（ａ）〜（ｃ）より、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図８（ｄ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の細胞膜をＤｉＯ蛍光で観察した画像であり、図８（ｅ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞核をＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図８（ｆ）は（ｄ）と（ｅ）をマージした画像である。図８（ｄ）〜（ｆ）より、標的細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の多数の蛍光が明瞭に確認できた。図８（ｃ）と（ｆ）を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。
【００７６】
［実施例６］
担持層３１として、銅基板の一面にＮｉメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と１０分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、ＰＢＳ溶液中にて調製した１０μＭ末端チオール化アプタマー溶液（３’末端側にヘキサエチレングリコールスペーサーを介し、トリメチレンチオールを導入した構造のアプタマー）を基板表面に添加し、飽和蒸気圧下で２４時間反応させて、担持層３１にアプタマー３３を直接、チオール結合させた。次いで、アプタマー３３が結合している担持層３１を１ｍＭ６−メルカプト−１−ヘキサノールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、２時間室温で反応させて自己組織化単分子膜３２を形成させた。次いで、エタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させ、標的細胞捕捉キャリアーを製造した。
【００７７】
上記製造されたキャリアーを用いた以外は、実施例２と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図９に示す。
【００７８】
図９（ａ）は正常細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞）をＤｉＤの蛍光で観察した画像であり、図９（ｂ）はＨＥＫ２９３ＴをＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図９（ｃ）は（ａ）と（ｂ）をマージした画像である。図９（ａ）〜（ｃ）より、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図９（ｄ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の細胞膜をＤｉＯ蛍光で観察した画像であり、図９（ｅ）はＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞核をＤＡＰＩの蛍光で観察した画像であり、図９（ｆ）は（ｄ）と（ｅ）をマージした画像である。図９（ｄ）〜（ｆ）より、標的細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌細胞）の多数の蛍光が明瞭に確認できた。図９（ｃ）と（ｆ）を対比することによって、標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。
【００７９】
インキュベーション時間は、本実施例では３０分で行ったが、反射光（ＳＰＲ）、重量（ＱＣＭ）などの分析手法を用い、基板に対する細胞の結合の速度論的な解析を行って、捕捉のためのインキュベーション時間を最適化することが可能である。
【００８０】
血清培地中での実験で得られた最適条件を元に、血液（全血）マトリックス中で腫瘍細胞捕捉実験を行う。実際の患者の血液を想定し、これと同等な腫瘍細胞濃度（１０ｍＬ中に数個の腫瘍細胞）となるように、血液に対して腫瘍細胞を混合し、これを捕捉実験に用いる。必要があれば、遠心分離により、血球成分と血漿成分とを別け、血球成分を用いる。最適化された条件により実際に腫瘍細胞を捕捉することが可能である。
【００８１】
キャリアーとして、赤血球（約７μｍ）や白血球（約１５μｍ）などの正常細胞の寸法よりも大きな直径（２０μｍ程度）の穴のあいたフィルター状の構造物、平面上に複数の微小なピラーを有する構造物、渦巻状の立体構造物などを用いることで、血液（全血）マトリックス中から腫瘍細胞の捕捉を行うことが可能となる。必要があれば、遠心分離により、血球成分と血漿成分とを別け、血球成分を用いる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、チオールを介して担持層と核酸アプタマーとを結合させ、担持層上に形成したポリエチレングリコール誘導体ＳＡＭ膜上に核酸アプタマーを修飾する手法を用いて形成されるキャリアーであり、蛍光や電気化学的ラベル化、反射光（ＳＰＲ）、重量（ＱＣＭ）などのリアルタイムモニタリングなどを検出手法として用いることが可能となる。また、ポリエチレングリコール誘導体ＳＡＭ膜上に核酸アプタマーを修飾すると同時に又は修飾した後に、必要に応じてＳＡＭ膜の末端基をキャップすることで、非特異的吸着を抑制することができる。よって、本発明のキャリアーを用いて血清培地中における腫瘍細胞の検出において誤検出（フォールスポジティブ）をほぼ完全に抑えることができる。本発明のキャリアーはがん患者への外科手術中に病巣摘出の奏功を判断するための検査にも利用することが可能である。超高齢社会の進展による医療費の高騰という課題に対してもがんの早期発見による利点は大きく、社会のニーズに対して時適を得ており、将来性も高い。
【符号の説明】
【００８３】
３１：担持層
３２：自己組織化単分子膜
３３：核酸アプタマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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