(57)【要約】【課題】  本発明は、原因菌であるカンジダ菌のコロニーの発色が強く、２０時間程度の培養でも５種類のカンジダ菌を容易に鑑別でき、コロニーの発色が培養時間に影響されず長時間安定している、カンジダ鑑別用発色培地を提供することを目的とする。【解決手段】  酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有することを特徴とするカンジダ鑑別用発色培地。本発明のカンジダ鑑別用発色培地によれば、５種類のカンジダ菌を２０時間程度の培養で同時に鑑別でき、４８時間の培養でもコロニー色が変化せず鑑別性が低下しないため、臨床的にもその意義は大きいと考えられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有することを特徴とするカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項２】
亜テルル酸塩が亜テルル酸カリウムおよび／または亜テルル酸ナトリウムである請求項１記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項３】
亜テルル酸塩の含有量が０．０００５〜０．０１５ｇ／Ｌの範囲である請求項１または請求項２記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項４】
酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート．２Ｎａおよび／または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドである請求項１〜３のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項５】
酵素基質の含有量が０．０１〜０．１ｇ／Ｌの範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項６】
酸化還元試薬がテトラゾリウム塩である請求項１〜５のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項７】
テトラゾリウム塩がテトラゾリウムバイオレットおよび／またはテトラゾリウムブルーである請求項６記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項８】
酸化還元試薬の含有量が０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲である請求項１〜７のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【請求項９】
培地１Ｌあたり、ペプトン１０〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ 、白糖１〜２０ｇ、ブドウ糖１〜１０ｇ、テトラゾリウムバイオレット０．００１〜０．０１ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート．２Ｎａ０．０１〜０．１ｇ、亜テルル酸カリウム０．０００５〜０．０１５ｇおよび寒天３〜２０ｇを含有する請求項１〜８のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンジダ症の原因菌であるカンジダ菌を迅速に鑑別することができ、コロニーの発色が長時間の培養でも変色せず安定しているカンジダ鑑別用発色培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カンジダ症における感染状況、治療状況、再発状況などの診断では、カンジダ菌の棲息形態、組織病変、肉眼的炎症所見等と共に、菌の分離・同定による確認が臨床上重要である。
【０００３】
このような菌の分離・同定菌数による確認については、培養法が汎用されており、既に水野−高田培地やサブロー培地などの種々の培地が市販されている。これらの培地は、いずれも炭素源、窒素源の他、一般細菌の生育を抑制する物質も含みカンジダ菌のみの検出を目的としている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
これらの培地の使用に当たっては、患部から採取した検体を培地中で２〜３日程度培養させた後、肉眼によってコロニーの数や形態を観察することによってカンジダ症の現況を診断する。しかしながら、従来の培地では菌の培養に２日または３日も要するために速やかな診断を下すことができず、迅速に治療が開始できないという問題があった。
【０００５】
このため、少なくともアミノ酸、ペプチド、糖類、細菌繁殖抑制物質を含む水溶液に、夾雑菌の繁殖が抑制されるような酸性域で変色するｐＨ指示薬を、同じく夾雑菌の抑制されるようなｐＨに調整した培地に配合したものを使用することにより、熟練を要さずとも短時間で容易にカンジダ症を診断できるカンジダ症診断用培地が提案されている（特許文献１）。
【０００６】
一方、カンジダ症は、カンジダ・アルビカンスが主要な起因菌として知られているが、これ以外にもカンジダ・グラブラータを起因菌とするものやカンジダ・トロピカリスを起因菌とするものが増加しつつある。
【０００７】
これらのカンジダ菌のうち、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・グラブラータとをテトラゾリウム化合物を添加した培地上のコロニーの色調で容易に判別し、これを利用することによってカンジダ症の起因菌を簡便かつ速やかに究明し、治療対策を早期に確立できるカンジダ簡易鑑別用培地が提案されている（特許文献２、特許文献３）。
【０００８】
しかしながら、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・トロピカリスは、形態学的性状が近似しているだけでなく、生化学的性状も近似しているため、両者は、まったく判別がつかないという問題があった。
【０００９】
このため、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・トロピカリスのそれぞれが産生する酵素の基質である２種の色原体を培地中に添加し、色原体の加水分解後に発色団の基本色とは異なる色を得て両者を区別するカンジダ菌の検出方法が提案されている（特許文献４、特許文献５）。
【００１０】
本発明者も、発色基質として５−ブロム−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと、５−ブロム−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有させることによって、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・トロピカリスとを短時間かつ容易に鑑別できるカンジダ鑑別用発色培地を提案している（特許文献６）。
【００１１】
他方、現在、使用されているカンジダ鑑別用発色培地（商品名：クロモアガーカンジダ、発売元：関東化学（株）、以下、クロモカンジダ培地という）でカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシロシスの５種類のカンジダ菌が推定同定可能と報告されている（非特許文献３）。
【００１２】
しかしながら、このクロモカンジダ培地では、確かに５種類のカンジダ菌が同定可能であるが、本発明者の検討によれば、５種類のカンジダ菌をすべて鑑別するのに４０時間以上の培養が必要であることが確認されている。
【００１３】
本発明者は、発色酵素基質および酸化還元試薬を含有させることによって、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシロシスの５種類のカンジダ菌を２０時間程度の培養で同時に鑑別できるカンジダ鑑別用発色培地を既に提案している（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特公平１−４６１１５号公報
【特許文献２】特開平６−７８７９３号公報
【特許文献３】特開平６−２７７０９４号公報
【特許文献４】特表平９−５００７９０号公報
【特許文献５】特表平９−５００７９１号公報
【特許文献６】特開２００３−３１０２９８号公報
【特許文献７】特開２００５−０８０５７４号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Medical Technology，6，109；1978
【非特許文献２】臨床検査，26，1498；1982
【非特許文献３】臨床と微生物，22，735-739；1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発色酵素基質および酸化還元試薬を含有させた、特許文献７のカンジダ鑑別用発色培地では、確かに２０時間程度の培養で５種類のカンジダ菌が同定可能であるが、培養時間が長くなる（４０時間程度）とコロニー色が変色し、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシロシスの鑑別できなくなるため、なんらかの事情により２０時間程度の培養での判定ができなかった場合には、もう一度培養をやり直さなければならず、迅速に診断ができないという問題があった。
【００１７】
また、カンジダ・グラブラータは着色しないため、夾雑菌と間違えやすく、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・パラプシロシスは色調の差が小さいため、コロニー色だけでの鑑別が難しい場合があった。
【００１８】
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、５種類のカンジダ菌の鑑別性が高く、２０時間程度の培養で鑑別することができ、コロニーの発色が培養時間に影響されず長時間安定している、カンジダ鑑別用発色培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、多種類のカンジダ菌を短時間で容易に鑑別でき、コロニーの発色が長時間安定している培地を開発すべく鋭意研究した結果、酵素基質および酸化還元試薬を含有するカンジダ鑑別用発色培地に、亜テルル酸塩をさらに含有させることにより、５種類のカンジダ菌の鑑別性が向上し、さらに５０時間程度まで発色が安定化することを見出し、本発明を完成した。
【００２０】
本発明は、以下の構成からなる。
（１）酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有することを特徴とするカンジダ鑑別用発色培地。
（２）亜テルル酸塩が亜テルル酸カリウムおよび／または亜テルル酸ナトリウムである（１）記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（３）亜テルル酸塩の含有量が０．０００５〜０．０１５ｇ／Ｌの範囲である（１）または（２）記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（４）酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート．２Ｎａ（以下、ｘ−ｐｈｏｓ．２Ｎａという）および／または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド（以下、ｘ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅという）である（１）〜（３）のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（５）酵素基質の含有量が０．０１〜０．１ｇ／Ｌの範囲である（１）〜（４）のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（６）酸化還元試薬がテトラゾリウム塩である（１）〜（５）のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（７）テトラゾリウム塩がテトラゾリウムバイオレット（以下、ＴＴＶという）および／またはテトラゾリウムブルー（以下、ＴＴＢという）である（６）記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（８）酸化還元試薬の含有量が０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲である（１）〜（７）のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
（９）培地１Ｌあたり、ペプトン１０〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ 、白糖１〜２０ｇ、ブドウ糖１〜１０ｇ、ＴＴＶ０．００１〜０．０１ｇ、ｘ−ｐｈｏｓ．２Ｎａ０．０１〜０．１ｇ、亜テルル酸カリウム０．０００５〜０．０１５ｇおよび寒天３〜２０ｇを含有する（１）〜（８）のいずれか１項に記載のカンジダ鑑別用発色培地。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有させることによって、発色が強く鑑別が容易で、長時間の培養でもコロニーの色が変色しないカンジダ鑑別用発色培地を提供する。また、本発明のカンジダ鑑別用発色培地によれば、５種類のカンジダ菌を２０時間程度の培養で同時に鑑別でき、４８時間の培養でもコロニー色が変化せず鑑別性が低下しないため、臨床的にもその意義は大きいと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明のカンジダ鑑別用発色培地の特徴は、培地中に酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有させることにある。
【００２３】
本発明においては、酵素基質および酸化還元試薬に加えて培地中に亜テルル酸塩を含有させることによってより一層コロニーの発色が明瞭となり、さらに長時間の培養でも発色したコロニーの変色が抑制される。即ち、酵素基質と酸化還元試薬と亜テルル酸塩とが相俟って相乗的効果を生じ、酵素基質と酸化還元試薬とを用いた場合より、更に一層鑑別力を向上させることができ、コロニーの色の変色をを長時間抑制することができる。
【００２４】
酵素基質と酸化還元試薬と亜テルル酸塩が相俟って相乗的効果を生じ、５種類のカンジダ菌が短時間でそれぞれ特有の色を持つコロニーを形成するため容易に鑑別することができ、それぞれのコロニーは５０時間程度でもコロニーの色により鑑別することができる。即ち、培養１８〜２４時間で、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は桃色から濃桃色、カンジダ・グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）は中心灰褐色から中心灰色または中心黒色、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）は青色、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）は水色、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）は淡桃色から桃色にそれぞれ発色し、これらの発色したコロニーの色は培養４０〜４８時間で、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）やカンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）の発色が濃くなることがあるが、これら以外は変化せず、培養４０〜４８時間でも、５種類のカンジダ菌を容易に鑑別することができる。
【００２５】
亜テルル酸塩は公知のものから適宜選択することができる。その具体例としては、亜テルル酸カリウム、亜テルル酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２６】
この亜テルル酸塩の含有量は０．０００５〜０．０１５ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは０．００１〜０．０１２５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．００１〜０．０１ｇ／Ｌの範囲である。亜テルル酸塩の含有量が０．０００５ｇ／Ｌ未満になると、鑑別力が低下し、安定した発色を長時間維持することができなくなる。逆に、０．０１５ｇ／Ｌを超えると、長時間培養でコロニーの変色が起こり鑑別力が低下する。
【００２７】
酵素基質は、カンジダ菌が産生するホスファターゼおよび／またはＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼに対する基質であれば、公知のものの中から適宜選択することができる。その具体例としては、例えばｘ−ｐｈｏｓ．２Ｎａ、ｘ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅなどが挙げられる。
【００２８】
この酵素基質の含有量は０．０１〜０．１ｇ／Ｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０３ 〜０．０８ｇ／Ｌの範囲である。酵素基質の含有量が０．０１ｇ／Ｌ未満になると、コロニーの発色に時間を要すると共に、検出感度も低下する。逆に、０．１ｇ／Ｌを超えると、コロニーの発育が阻害されることがある。
【００２９】
酸化還元試薬はテトラゾリウム塩が好ましく、公知のテトラゾリウム塩の中から適宜選択することができる。テトラゾリウム塩の具体例としては、ＴＴＶ、ＴＴＢなどが挙げられる。
【００３０】
この酸化還元試薬の含有量は０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ の範囲が好ましく、より好ましくは０．００３〜０．００８ｇ／Ｌの範囲である。酸化還元試薬の含有量が０．００１ｇ／Ｌ未満になると、コロニーの発色に長時間を要する。逆に、０．０１ｇ／Ｌを超えると、コロニーの発育が阻害されることがある。
【００３１】
本発明のカンジダ鑑別発色培地は、成分として少なくとも培地１Ｌあたり、ｘ−ｐｈｏｓ．２Ｎａ０．０１〜０．１ｇ、ＴＴＶ０．００１〜０．０１ｇ、亜テルル酸カリウム０．０００５〜０．０１５ｇ、ペプトン１０〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ、白糖１〜２０ｇ、ブドウ糖１〜１０ｇおよび寒天２〜２０ｇを含有することが好ましい。これら成分の他に、カンジダ菌の発育を促進する成分としては、硫酸アンモニウムなどの窒素源、マルトースやスクロースなどの糖類、さらに必要に応じてミネラルやビタミンなど任意のものを含めることができる。
【００３２】
夾雑菌の繁殖を抑制するための抗菌剤としては、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシンなどのアミノグリコキシド系抗生物質、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの広範囲抗生物質、広範囲の抗菌スペクトルを有するペニシリン、セファロスポリンが挙げられるが、中でもクロラムフェニコールが好ましい。
【００３３】
本発明の培地は、液体、半流動、固形のいずれの形態もとりうるが、検出のし易さ等の観点から、固形培地が好ましく、より好ましくは平板固形培地の形態である。固形培地の固化剤としては、寒天、カラギーナン、ローカストビーンガムなど通常使用されているものが挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  亜テルル酸カリウムの添加濃度による発色性についての検討
表１に示した培地成分５１．３ｇを秤量し、１０００ｍＬの精製水に溶解した。溶解後、ｐＨを６．０±０．２に調整し、１２１℃で高圧滅菌した。冷却後、表２に示した所定量でｘ−ｐｈｏｓ．２Ｎａ、ＴＴＶおよび亜テルル酸カリウムを濾過滅菌して加えた後、２０ｍＬずつシャーレに分注して固形化した。亜テルル酸カリウムを添加していないものを比較例とした。
【００３６】
【表１】
2017079733.tif 000002
【００３７】
【表２】
2017079733.tif 000003
【００３８】
上記で作製した培地に、下記の表３および表４記載の（Ａ）〜（Ｊ）の１０株を予め、市販のポテトデキストロース寒天培地でサブカルチャーし、得られた菌株を白金耳で塗抹接種して３５℃で４８時間培養した。培養１８〜２４時間の結果を表３に、培養４０〜４８時間の結果を表４に示した。
【００３９】
【表３】
2017079733.tif 000004
【００４０】
【表４】
2017079733.tif 000005
【００４１】
表３から明らかなように、酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有する本発明のカンジダ鑑別用発色培地では、培養１８〜２４時間で５種類のカンジダ菌のコロニーに色がつき容易に鑑別が可能であった。これに対し、亜テルル酸塩を含有していないカンジダ鑑別用発色培地（比較例）では、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・パラプシロシスとのコロニーの色調の差が小さいため、コロニーの色によるこれらの鑑別は難しく、また、カンジダ・グラブラータは発色しないため、コロニーの色による夾雑菌との鑑別はできなかった。
【００４２】
また、表４からも明らかなように、酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有する本発明のカンジダ鑑別用発色培地では、培養４０〜４８時間で、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・パラプシロシスの発色が濃くなることがあるが、その他の菌のコロニーの色の変色は見られず、５種類のカンジダコロニーが容易に鑑別可能であった。これに対し、亜テルル酸塩を含有していないカンジダ鑑別用発色培地（比較例）では、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシロシスのコロニーの色が変色し、これらの鑑別ができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、酵素基質、酸化還元試薬および亜テルル酸塩を含有させることによって、カンジダのコロニーを短時間で強く発色させることができ、５種類のカンジダ菌を同時に鑑別することができると共に、長時間の培養でもコロニーの色が変色しないため、長時間の培養でも５種類のカンジダ菌を同時に鑑別することができる。