(57)【要約】【課題】本発明は、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制する効果をもつ医薬組成物及び食品を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に医薬組成物は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる医薬組成物であって、雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有することを特徴とする。雲南百薬の抽出液を含有することで、ルシフェラーゼ活性を向上させ、ＣＲＥ依存性転写活性を促進し、記憶学習関連遺伝子の発現を亢進するという効果を生じる。そのため、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制することができ、中枢神経疾患の予防及び治療に用いることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる医薬組成物であって、
雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有する、
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記雲南百薬の前記抽出液が、熱水、アルコール類の群から選択される１種の抽出液である、
ことを特徴とする請求項１に記載された医薬組成物。
【請求項３】
中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品であって、
雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有する、
ことを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物および食品に関し、特に中枢神経疾患の予防及び治療に用いられるカミツレを含有する医薬組成物及び食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会に伴う認知症患者数の増加は、深刻な社会問題となっている。今後さらに高年齢者の数が増加することが予測されており、認知症を予防または治療する医薬品（医薬組成物）、食品に対する要求は増加すると考えられる。
記憶障害改善作用と作用機構を明らかにした植物由来成分として、例えば、柑橘類果皮由来のノビレチンが知られている（特許文献１）。
【０００３】
ノビレチンは、アルツハイマー病モデルを含む様々な記憶障害モデル動物において、その記憶障害を改善する。その作用機序として、ｐｒoｔｅｉｎ ｋｉｎａｓe Ａ（ＰＫＡ）／（ＥＲＫ）／ｃＡＭＰ（ＣＲＥ）-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）細胞内シグナル経路を活性化し、ＣＲＥ依存性転写を亢進して記憶学習関連遺伝子の発現を亢進することが知られている（例えば、特許文献２）。
【０００４】
一方、高血圧の改善作用や血中総コレステロール、中性脂肪（トリグリセリド）及び血糖値の上昇抑制作用を有する雲南百薬が着目されている（例えば、特許文献３）。
雲南百薬は、ツルムラサキ科のつる性多年草で、中国雲南省から日本に持ち込まれたとされており、日本の一部の地域では食されている。また、雲南百薬は、蔓状に伸びる茎には地上であっても多数のむかごができるが、葉もむかごも根塊も利用でき、独特のぬるぬる成分が特徴であり、マグネシウムや、銅、カルシウム及び亜鉛の含有量が多い植物として知られているが、その研究、検討はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１１１６６４号公報
【特許文献２】特開２００７−６１０２８号公報
【特許文献３】特開２０１４−１４１４３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在までに、認知症、特にその半数を占めるアルツハイマー病に対する予防や進行抑制効果を持つ決定的な臨床薬は存在していない。そのため、アルツハイマー病に対する予防や進行抑制効果を持つ医薬組成物や食品が求められている。
【０００７】
そこで、本発明は、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制する効果をもつ医薬組成物及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の医薬組成物は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる医薬組成物であって、雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の医薬組成物は、雲南百薬の抽出液が、熱水、アルコール類の群から選択される１種の抽出液であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の食品は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品であって、雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の医薬組成物は、雲南百薬の抽出液を含有することで、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させ、ＣＲＥ依存性転写活性を促進し、記憶学習関連遺伝子の発現を亢進するという効果を生じる。そのため、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制することができ、中枢神経疾患の予防及び治療に用いることができる。
【００１２】
また、本発明の医薬組成物において、雲南百薬を熱水、アルコール類を使用して抽出液を得ることができる。適切な抽出溶媒を選択することで、ルシフェラーゼ活性を向上させることができる。
【００１３】
さらの本発明では、雲南百薬の乾燥物または抽出液を含有し、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品をも提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係る雲南百薬のメタノール抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図２】本実施形態に係る雲南百薬の純水抽出液、アルカリ還元水抽出液、９９％エタノール抽出液、５０％エタノール抽出液（１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図３】本実施形態に係る雲南百薬の酢酸エチル抽出液、ブタノール抽出液、熱水抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果及びＰＤ９８０５９による阻害実験の結果を示している。
【図４】本実施形態に係る雲南百薬のブタノール抽出液におけるフラクション１Ａ〜１Ｋを添加した場合における、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図５】本実施形態に係る雲南百薬のブタノール抽出液におけるフラクション２Ａ〜２Ｉを添加した場合における、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図６】本実施形態に係る雲南百薬の亜臨界抽出したメタノール抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図７】本実施形態に係る雲南百薬の亜臨界抽出液を添加した培地で培養したＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡の画像を示している。        （ａ）：０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）、（ｂ）：３０μＭノビレチン、        （ｃ）：１００μＭノビレチン、（ｄ）：亜臨界抽出液（抽出条件１）
【図８】本実施形態に係る雲南百薬の亜臨界抽出液を添加した培地で培養したＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡の画像を示している。        （ａ）：亜臨界抽出液（抽出条件２）、（ｂ）：亜臨界抽出液（抽出条件３）、        （ｃ）：亜臨界抽出液（抽出条件４）、（ｄ）：亜臨界抽出液（抽出条件５）
【図９】本実施形態に係る雲南百薬の亜臨界抽出液を添加した場合におけるＮＭＤＡ受容体ＮＲ１遺伝子発現の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本実施形態に係る医薬組成物は、雲南百薬の乾燥物または抽出物を含有し、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられるものである。この医薬組成物は、特に、アルツハイマー病やパーキンソン病の予防及び治療に用いることができる。
【００１６】
［試料調整］
雲南百薬は、静岡県富士市産のアカサカズラ（ツルムラサキ科植物）を使用し、メタノールで抽出した。抽出した雲南百薬粉末は、濃度が１００μｇ／ｍＬ（試料１）、５００μｇ／ｍＬ（試料２）、１０００μｇ／ｍＬ（試料３）となるようにジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（以下、ＤＭＳＯと記す。）に溶解させた。
雲南百薬は、中国語学名：藜蔓（落葵薯）、ラテン名：Ａｎｒｅｄｅｒａ ｃоｒｄｉｆоｌｉａ (Ｔｅｎоｒｅ) Ｓｔｅｅｎｉｓ、別名：藤三七（ｔｅｎｇ ｓａｎ ｑｉ）、ラテン名：Ｂоｕｓｓｉｎｇａｕｌｔｉａ ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｍｉｅｒｓｖａｒ．ｐｓｅｕｄоｂａｓｅｌｌоｉｄｅｓ Ｂａｉｌｅｙ）である。
ノビレチンは、柑橘系植物から抽出したものを使用した（純度９９％）。ノビレチンは、濃度が２μｇ／ｍＬ（５μＭ）、６μｇ／ｍＬ（１５μＭ）、１２μｇ／ｍＬ（３０μＭ）となるようにＤＭＳＯに溶解させた。
【００１７】
試料１〜試料３の遺伝子転写活性を評価するためにルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
ルシフェラーゼアッセイは、被検物質の有する転写活性を定量的に解析するために使用されるものである。転写が活性化するためには、遺伝子の上流プロモーターに存在する様々な制御配列が必要である。
本実施例では、ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ細胞内シグナルによって活性化される制御配列であり、かつ記憶学習関連遺伝子の上流プロモーターに存在するＣＲＥ配列と、発光酵素であるルシフェラーゼの遺伝子を連結したプラスミドを使用した。
被験物質がＣＲＥ依存性の転写を活性化した場合、その下流にあるルシフェラーゼ遺伝子が発現し、上昇してルシフェラーゼタンパク質が細胞内で増加する。そうすると、基質を添加することで蛍光を発するため、その吸光度を測定し、転写活性を定量できる。
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来細胞株）を９６穴培養ディッシュに播種濃度４．０×１０４個／穴で播種した。その後、プラスミドをＰＣ１２細胞内に導入し、各試料を滴下した培地で培養した。培地には、１％血清を添加したα改変ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。
ＰＣ１２細胞を所定時間培養した後、試料をそれぞれ１００μＬ加えた培地に交換し、培養ディッシュを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、５時間インキュベートした。その後、反応を停止させ、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。
なお、雲南百薬の培地に対する最終濃度は、以下の通りである。
試料１：１０μｇ／ｍＬ
試料２：５０μｇ／ｍＬ
試料３：１００μｇ／ｍＬ
【００１８】
図１は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
ノビレチンは、濃度が２μｇ／ｍＬがルシフェラーゼ活性を発現する濃度であることが知られている。試料１〜試料３を添加した場合、いずれもノビレチン２μｇ／ｍＬを添加した場合よりもルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。このことから、雲南百薬のメタノール抽出液には、ＰＣ１２細胞におけるルシフェラーゼを活性させる物質が含まれていることが分かった。
また、添加した雲南百薬の濃度が高くなるにつれ、ルシフェラーゼ活性が高くなることが分かった。試料２または試料３を添加した場合では、ノビレチン１２μｇ／ｍＬを添加した場合よりも顕著に高いルシフェラーゼ活性を示した。中でも、試料３を添加した場合では、ノビレチン１２μｇ／ｍＬを添加した場合の２倍のルシフェラーゼ活性を示した。
【００１９】
次に、雲南百薬を純水（熱水）、アルカリ還元水（熱水）、９９％エタノール、５０％エタノールで抽出した抽出液を添加した場合のルシフェラーゼ活性を調べた。
試料１群：純水の熱水抽出液
（抽出液に対する雲南百薬濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対する雲南百薬濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料２群：アルカリ還元水の熱水抽出液
（抽出液に対する雲南百薬濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対する雲南百薬濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料３群：９９％エタノール抽出液
（抽出液に対する雲南百薬濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対する雲南百薬濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料４群：５０％エタノール抽出液
（抽出液に対する雲南百薬濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対する雲南百薬濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
【００２０】
図２は、１５０、５００、２０００、および５０００μｇ／ｍＬの雲南百薬の抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
純水抽出液またはアルカリ還元水抽出液を添加した場合を比較すると、いずれの雲南百薬の濃度においてもアルカリ還元水抽出液を添加した場合の方が、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。このことから、同じ水であってもｐＨが高い水の抽出液にＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させる物質が多く含有されていることが分かった。
また、濃度の異なるエタノール抽出液（９９％、５０％）を比較した場合、いずれの雲南百薬の濃度においても、９９％エタノールで抽出した抽出液を添加した場合の方が、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。この結果から、エタノールで抽出した場合、高い濃度のエタノールで抽出した抽出液にＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させる物質が多く含有されていることが分かった。
また、いずれの試料を添加した場合でも、ノビレチン１２μｇ／ｍＬを添加した場合よりも、ルシフェラーゼ活性が高いことが明らかとなり、雲南百薬のメタノール抽出液は、ルシフェラーゼ活性を向上させる効果を有することが分かった。
【００２１】
雲南百薬の容量依存性を調べた結果、どの抽出液においても、雲南百薬の濃度が高い方が、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。また、ブタノール抽出液、熱水抽出液、酢酸エチル抽出液の順にルシフェラーゼ活性を向上させることが分かった。
この結果より、ルシフェラーゼ活性を向上させる雲南百薬の有効成分は、ブタノール層に多く含まれ、次いで水層、酢酸エチル層に含まれていることが分かった。いずれの層に含まれる有効成分は同じ物質であると考えられ、これらの成分は熱水層に溶解していることから水溶性の物質であると考えられる。ここで、ノビレチンは水溶性ではないことが知られている。そのため、雲南百薬に含まれている有効成分は、ノビレチンとは異なる物質であると考えられる。
【００２２】
次に、ＰＤ９８０５９による阻害効果の検討を行った。
遺伝子の転写活性についての阻害剤であるＰＤ９８０５９を添加することで、遺伝子の転写活性を阻害させる。この遺伝子の転写活性剤が添加されて阻害活性が抑制されるということは、遺伝子の転写活性を維持または増加させることでの遺伝子転写活性を増強させる可能性が示唆される。脳機能において、遺伝子転写活性が活性化させる物質の投与によって、脳機能が維持されると考えられている。
本実験では、ブタノール抽出液、熱水抽出液、酢酸エチル抽出液をそれぞれ添加した培地における、ＰＤ９８０５９による遺伝子の転写活性阻害効果の検討を行った。ＰＤ９８０５９は、５０μＭ、１００μＭに調整し、遺伝子の転写活性阻害効果試験に使用した。
【００２３】
ＰＤ９８０５９による阻害実験の結果（図３）から、酢酸エチル抽出液（５０００μｇ／ｍＬ）、ブタノール抽出液（５０００μｇ／ｍＬ）、熱水抽出液（５０００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加した培地に、ＰＤ９８０５９（５０μＭ）を添加すると、顕著に遺伝子の転写活性の阻害が生じることが分かった。また、ＰＤ９８０５９（１００μＭ）を添加した場合、さらに遺伝子の転写活性を阻害することが分かった。
阻害剤ＰＤ９８０５９を添加することにより、雲南百薬による遺伝子転写活性が阻害されるため、雲南百薬の抽出液の記憶遺伝子転写メカニズムは、ＣＲＥＢの関与したＣＲＥ依存性の記憶遺伝子転写活性作用によるものであると考えられる。これは、ノビレチンと同様な作用によるものである。
以上の結果から、雲南百薬の抽出液は、ＣＲＥ依存性転写を促進し、記憶学習関連遺伝子の発現を亢進するという効果を有することが分かった。
【００２４】
次に、雲南百薬のブタノール抽出液をさらにフラクション１Ａ〜１Ｋに分画し、質量換算で１００ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解させ、その溶液の転写活性をルシフェラーゼアッセイにより測定した。
【００２５】
図４は、分画した各フラクションを添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
フラクション１Ｇが、最も高いルシフェラーゼ活性を有することが分かった。次に、フラクション１Ｈが高く、フラクション１Ｆ、フラクション１Ｄ、フラクション１Ｉの順でルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。
また、生薬換算の濃度に注目すると、フラクション１Ｈが、少ない生薬量で高いルシフェラーゼ活性を有することが分かる。
フラクション１Ｄには、フラクション１Ｆ、フラクション１Ｇ、フラクション１Ｈ、フラクション１Ｉとは別の物質が含有されている可能性があると考えられる。
これらのフラクションには、ルシフェラーゼ活性を向上させる成分が含まれていると考えられ、各分画同士がルシフェラーゼ活性を向上させる、増強作用を検討する必要がある。
【００２６】
次に、少ない生薬量で高いルシフェラーゼ活性を有するフラクション１Ｈをさらに分画した。フラクション１Ｈをフラクション２Ａ〜２Ｉに分画し、質量換算で１００μｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解させ、上記と同様な方法で、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００２７】
図５は、各フラクションを添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
フラクション２Ｅを添加した場合が、最も高いルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。フラクション２Ｂは、フラクション１Ｈと同等のルシフェラーゼ活性を示した。次に、フラクション２Ｆおよびフラクション２Ｂを添加した場合に、高い活性を示した。
高い活性を示したフラクション２Ｆ及びフラクション２Ｅの成分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した。ＴＬＣ画像より、ほぼ同じ成分が含まれていることが分かった。このことから、フラクション２Ｆとフラクション２Ｅは、同じ成分がルシフェラーゼ活性を向上させていると考えられる。また、フラクション１Ｈへの含有量は少量であるが、フラクション２Ｂにも、ルシフェラーゼ活性を向上させる成分が含有されていることが分かった。
【００２８】
次に、亜臨界抽出によって、雲南百薬の成分を抽出した。抽出後、雲南百薬の残渣物をメタノールで抽出した。亜臨界抽出は、１２０℃〜１８０℃の温度範囲で行った。各抽出条件は以下の通りである。
抽出条件１：１２０℃、（飽和水蒸気圧：１９８６．６  ｈＰａ）
抽出条件２：１４０℃、（飽和水蒸気圧：３６１６．６  ｈＰａ）
抽出条件３：１５０℃、（飽和水蒸気圧：４７６４．０  ｈＰａ）
抽出条件４：１６０℃、（飽和水蒸気圧：６１８６．６  ｈＰａ）
抽出条件５：１８０℃、（飽和水蒸気圧：１００３７．０  ｈＰａ）
【００２９】
そして、各抽出液から得られた抽出物をメタノールで抽出し、抽出液に対する雲南百薬の濃度が５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬの試料を調整し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３０】
図６は、各亜臨界抽出した抽出液を添加した場合のルシフェラーゼ測定結果を示している。
抽出条件１〜抽出条件５で抽出した抽出液を添加した場合、ノビレチン溶液を添加したものよりもルシフェラーゼ活性を向上させることが分かった。中でも、抽出条件２および抽出条件３によって抽出した抽出液を添加すると、高いルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。
残渣物の抽出液を添加した場合では、ルシフェラーゼ活性を示すものの、亜臨界抽出した抽出液を添加したものと比較すると、ルシフェラーゼ活性は低いことが分かった。このことから、ルシフェラーゼ活性を向上させる有効成分は、亜臨界抽出した抽出液に多く含まれていることが分かった。
以上のことから、雲南百薬を亜臨界抽出した抽出液（抽出物）には、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させる成分（物質）が含有されていることが明らかとなった。
【００３１】
次に、雲南百薬の亜臨界メタノール抽出液を添加したときのＰＣ１２細胞の形態を位相差顕微鏡により観察した。その位相差顕微鏡像を図７及び図８に示す。
【００３２】
位相差顕微鏡の画像から、０．１％ＤＭＳＯを添加した培地では、ほとんどのＰＣ１２細胞が、丸い形状のまま培養ディッシュに接着している。一方、ノビレチン溶液を添加した培地では、細胞が培養ディッシュに伸展して、扁平状に接着している。
雲南百薬の亜臨界抽出液（抽出条件１〜５）を添加した培地においても、ＰＣ１２細胞は培養ディッシュに接着していることが分かった。さらに、その接着している細胞の形態は、仮足を伸ばし、伸展していることが分かった。
また、抽出条件１〜５の違いによって、接着している形態の相違は見られなかった。
以上のことから、亜臨界抽出した抽出液によって、接着しているＰＣ１２細胞の形態に大きな影響は与えず、細胞は接着および増殖することが明らかとなった。
【００３３】
次に、雲南百薬の亜臨界メタノール抽出液がＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体ＮＲ１遺伝子発現へ作用する効果を調べた。
ＮＭＤＡ受容体は、興奮性神経伝達物質グルタミン酸のイオンチャンネル型受容体であり、記憶や学習に深く関わる受容体であることが知られている。中枢神経疾患の一つであるアルツハイマー型痴呆症の治療薬には、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の部分を作動させるものがある。
本実験では、雲南百薬の亜臨界メタノール抽出液を添加した培地で培養したＰＣ１２細胞のＮＭＤＡ受容体ＮＲ１遺伝子の発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によって調べた。コントロールは、０．２％のＤＭＳＯを使用した。
【００３４】
図９は、ＮＭＤＡ受容体ＮＲ１遺伝子発現の結果を示している。
全ての亜臨界抽出液において、コントロールよりもＮＭＤＡ受容体ＮＲ１遺伝子発現が上昇することが分かった。
中でも、抽出条件１の抽出液は、高いＮＭＤＡ受容体ＮＲ１遺伝子発現を生じ、ノビレチン１００μｇ／ｍＬと同等の効果があることが分かった。
このことから、雲南百薬の亜臨界抽出液には、ＮＭＤＡ受容体を活性させる成分（物質）が含有され、その成分は低温・短時間で亜臨界抽出した抽出液に多く含まれていることが明らかとなった。
【００３５】
現在、雲南百薬は、健康食品の食品素材として使用されている。そのため、雲南百薬の抽出物は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品に適用することもできる。
【００３６】
以上、本実施形態について説明したが、これ以外にも、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で挙げた構成を取捨選択したり、他の構成に適宜変更することが可能である。
例えば、本実施形態では、熱水、メタノール、ブタノール、酢酸エチルの抽出溶媒を使用したが、他の抽出溶媒として、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコールやアセトン等のケトン類や酢酸エチルエステル等のエステル類、やジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム等を使用することもできる。また、これらの抽出溶媒は、水性溶媒と有機溶媒との混合液として使用してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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