(57)【要約】【課題】本発明は、ガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化する機能を有する新規なガン抑制薬を提供すること。【解決手段】２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩からなることを特徴とするガン抑制薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩からなることを特徴とするガン抑制薬。
【請求項２】
抑制される対象のガンが、膵臓、肺、脳、卵巣、大腸、肝臓を原発巣とするガンであることを特徴とする請求項１に記載のガン抑制薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の再発防止剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の発生予防剤。
【請求項６】
２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩を含有することを特徴とするガン幹細胞の分化促進剤。
【請求項７】
２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩を含有する培地においてガン幹細胞を培養することを特徴とするガン幹細胞の分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の化学療法に使用されるガン抑制薬、及び当該ガン抑制薬を含有する薬剤に関する。より詳細には、新規なガン抑制薬及びそれを含有する抗腫瘍剤、腫瘍の再発防止剤及び腫瘍の発生予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の化学療法は、化学療法剤と呼ばれる抗腫瘍剤を用いて行われる。しかしながら、従来の化学療法剤はＤＮＡのアルキル化等によって細胞分裂を阻害する等の作用機序に基づくものであり、一般的に腫瘍細胞だけではなく正常細胞をも破壊してしまう副作用を有し、その副作用が従来から問題視されていた。また、従来の化学療法剤では腫瘍組織拡大に寄与するガン幹細胞が標的とされないため、一時的には腫瘍の増大抑制ないし縮小をもたらす場合でも、長期的には腫瘍組織の再拡大、すなわち再発を防止ができない点も問題視されていた。また、上述の副作用や標的とする腫瘍細胞の問題から、腫瘍発生予防の目的で使用することができなかった。
【０００３】
これに対して、例えば、特許文献１には、従来の化学療法剤とは異なる作用機序を有するガン治療剤が記載されている。特許文献１に記載される治療剤は、腫瘍組織の拡大に寄与するガン幹細胞を標的とするガン治療剤であり、腫瘍におけるガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化することによって腫瘍組織の拡大を抑制して治療効果を発現している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２２１７５２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｄｅｍａ，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；１５：３３８−３４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化する機能を有する新規なガン抑制薬を提供することを課題とするものである。また別の面では、本発明は、抗腫瘍剤、腫瘍の再発防止剤及び腫瘍の発生予防剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、試行錯誤を重ねて鋭意研究を行ったところ、驚くべきことに、２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩が、各種の腫瘍組織（細胞）に有効に作用することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）  ２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩からなることを特徴とするガン抑制薬。
（２）  抑制される対象のガンが、膵臓、肺、脳、卵巣、大腸、肝臓を原発巣とするガンであることを特徴とする（１）に記載のガン抑制薬。
（３）  （１）又は（２）に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
（４）  （１）又は（２）に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の再発防止剤。
（５）  （１）又は（２）に記載のガン抑制薬を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍の発生予防剤。
（６）  ２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩を含有することを特徴とするガン幹細胞の分化促進剤。
（７）  ２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリル又は薬学的に許容されるその塩を含有する培地においてガン幹細胞を培養することを特徴とするガン幹細胞の分化方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば主にガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化させることにより、腫瘍組織の拡大防止や、長期的には腫瘍組織の消滅が期待される。また、本発明に係る化合物で処置されたガン細胞による二次腫瘍の形成が抑制されるため、腫瘍組織の再発や転移等の抑制が期待される。更に、本発明に係る化合物は既に人体に対する安全性が確認されたものであり、健常人において最小限の副作用の元で腫瘍組織の形成を予防する効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】血清培養した各種ヒトガン細胞に対してBentamapimodが示す細胞毒性の様子を示す図である。
【図２】ヒトガン細胞株（ＧＳ−Ｙ０１、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）に対してBentamapimodが示す細胞毒性の様子を示す図である。
【図３】体外でのBentamapimodによる処置により、ガン幹細胞における幹細胞マーカーが発現しなくなることを示す図である。
【図４】Bentamapimodによる処置の有無によるスフィアフォーメーション能の違いを示す図である。
【図５】（Ａ，Ｂ）体外でBentamapimodによる処置を行ったガン細胞の腫瘍形成能を示す図である。（Ｃ，Ｄ）マウス体内でBentamapimodによる処置を行ったガン細胞の腫瘍形成能を示す図、及び、当該処置によりガン幹細胞における幹細胞マーカーが発現しなくなることを示す図である。
【図６】マウスに対してBentamapimod（４０mg/kg）を全身投与した際の体重の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
各種腫瘍を構成するガン細胞は、正常な体細胞と比較して、いずれも等しく細胞分裂の回数に制限がなく高い増殖力を有すると共に、周辺組織への浸潤や、体内の他の部位へ転移するといった特徴を有していると考えられていた。一方、最近の研究により、一つの腫瘍を構成する多数のガン細胞には多様性があり、ガン細胞のうちごく一部を占める小集団が「ガン幹細胞」として機能し、自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能を有することにより、腫瘍形成能を発揮することが明らかになりつつある。そして、ガン幹細胞が分化して生じる非ガン幹細胞は腫瘍形成能をもたないと共に、もはやガン幹細胞に戻ることはできないとする不可逆性の考え方がガン幹細胞の基本概念となっている（非特許文献１）。このことはすなわち、ガン幹細胞が腫瘍組織拡大の源であり、再発を防いでガンを根本的に治療するためにはガン幹細胞を標的とする治療が有効であることを意味している。
【００１２】
本発明においてガン幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、高い腫瘍形成能を有する未分化な細胞であり、未分化な状態で自己複製をする（細胞分裂によりガン幹細胞を生み出す）能力と、より分化度が高く腫瘍形成能をもたない非ガン幹細胞へと変化（分化）する能力に特徴づけられるガン細胞である。ガン幹細胞の存在や頻度を検出するための方法として、実験動物に腫瘍細胞を移植して腫瘍形成能を観察する移植実験方法が当業者に広く行われている。
【００１３】
また、ガン幹細胞は、胚性幹細胞をはじめとする種々の幹細胞の維持に関与するタンパク質であり、分子マーカーの一種として使用されるｂｍｉ１（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｍｏ−ＭＬＶ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ）や、胚性幹細胞をはじめとする種々の幹細胞の維持に関与する転写因子であり、同様に分子マーカーの一種として使用されるＳｏｘ２を発現することによっても特徴づけられる。
【００１４】
一方、本発明における非ガン幹細胞とは、腫瘍組織を形成する細胞であるガン幹細胞以外のガン細胞を意味する。非ガン幹細胞は腫瘍形成能をもたず、ガン幹細胞と比較してガン幹細胞が特異的に発現する分子マーカーの発現が低いことで特徴づけられる。
【００１５】
ガン幹細胞から、非ガン幹細胞への分化は、ガン幹細胞が特異的に発現する分子マーカーと、非ガン幹細胞特異的に発現する分子マーカーとの発現量を通常用いられる方法により測定すること等によって確認することができる。具体的には、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４４：７６１−７６５に記載の方法等により、分子マーカーのフローサイトメトリー、免疫細胞化学、ウエスタンブロット解析等をすることにより測定することができる。なお、本明細書において、区別の必要がある際には「ガン幹細胞」、「非ガン幹細胞」と記載する一方で、両者を区別しない場合や両者が混在するものについては一般的に「ガン細胞」等と記載する。
【００１６】
一方、本発明で典型的に使用される２−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−［２−［［４−（モルホリン−４−イル）メチル］フェニル］メトキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリルは、（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）［２−［［４−［（モルホリン−４−イル）メチル］ベンジル］オキシ］ピリミジン−４−イル］アセトニトリルとも記載され、既にBentamapimod（AS 602801、CAS番号：848344-36-5）の名称で上市されている公知の化合物である。
【００１７】
また、上記化合物（以下、「Bentamapimod」という。）は、子宮内膜症の治療を目的として、３２０mg/day（１日１６０mg×２）の量を８〜２０週間、患者に経口投与する臨床治験において、その安全性及び有効性についてポジティブな情報が存在する化合物である。
【００１８】
本発明者が、従来の化学療法剤とは異なる作用機序を有するガン抑制薬、特にガン幹細胞を標的とするガン抑制薬を種々の方法で探索したところ、上記Bentamapimodが人体への悪影響が十分に抑制可能と考えられる投与量の範囲で、ガン幹細胞の非ガン幹細胞（通常のガン細胞）化や死滅を生じる効果を発現し、抗腫瘍剤など腫瘍組織（ガン細胞）に対する抑制薬として機能することを見出し、本発明に至ったものである。
【００１９】
つまり、以下の実施例の結果から示されるように、本発明に係るインビトロにおける検討において、正常ヒト線維芽細胞の生存に影響を及ぼさない濃度でBentamapimodを含む培養環境において、各種腫瘍組織に由来するガン細胞が大きな割合で死滅することが観察され、Bentamapimodがガン細胞に対して選択的な細胞毒性を有することが示された。また、当該処置後に生存していた細胞においては、自己複製能及び腫瘍開始能が大きく低下し、ガン幹細胞が特有に示すマーカーが観察されなくなることが示された。
【００２０】
一方、マウスを使用したインビボにおける検討においても、原発腫瘍の移植により形成された皮下腫瘍を有するマウスに対して外見的な副作用が観察されない量のBentamapimodを継続投与した場合に、投与を行ったマウスの腫瘍組織から分離したガン細胞においてガン幹細胞マーカーが観察されず、また当該腫瘍組織から分離したガン細胞を皮下移植したマウスにおいて二次腫瘍の形成が抑制されることが観察された。
【００２１】
以上の結果は、インビトロ及びインビボにおいて、生体及び生体組織に悪影響が見られない範囲の濃度のBentamapimod等を投与することで、原発腫瘍に含まれるガン幹細胞が非ガン幹細胞化すること、及び、ガン幹細胞を含むガン細胞を死滅させることが可能であることを示している。
【００２２】
本発明で見出されたBentamapimod等が示すガン抑制薬としての機能について、これを発現する作用機序は必ずしも明らかでない。一方、近年の研究により、細胞内に存在するシグナル経路の一種であるＪＮＫが細胞のガン化に関与している可能性が指摘されており、ＪＮＫ阻害作用を有する物質を用いたガン抑制薬の探索が行われている。例えば、本発明者らは、ＪＮＫ阻害作用を有するSP600125（CAS番号：129-56-6）がグリオブラストーマや膵臓ガン等に対して、一定の作用を示すことを報告している（Okada M, Shibuya K, Sato A, Seino S, Watanabe E, Suzuki S, Seino M and Kitanaka C. Specific role of JNK in the maintenance of the tumor-initiating capacity of A549 human non-small cell lung cancer cells. Oncol Rep. 2013; 30(4):1957-1964、Suzuki S, Okada M, Shibuya K, Seino M, Sato A, Takeda H, Seino S, Yoshioka T and Kitanaka C. JNK suppression of chemotherapeutic agents-induced ROS confers chemoresistance on pancreatic cancer stem cells. Oncotarget. 2015; 6(1):458-470）。
【００２３】
一方、ＪＮＫが細胞の生存に不可欠なシグナル経路の一つであることや、実際にインビボにおいて様々な肝臓及び腎臓疾患モデルに対する有効性及び安全性が示されたＪＮＫ阻害剤であるＣＣ−４０１やＣＣ−９３０については、骨髄性白血病の治療において最適な生物学的用量を決定するための臨床治験が完了しない等の事実を考慮すれば、ＪＮＫを阻害することのみによってはヒトにおいて有効なガン抑制薬としての作用が期待できないとも考えられている。また、本発明者らのデータや文献情報は、各種のＪＮＫ阻害剤がＪＮＫアイソフォームに対して異なる阻害作用を生じることを示していることから（Bubici C and Papa S. JNK signalling in cancer: in need of new, smarter therapeutic targets. Br J Pharmacol. 2014; 171(1):24-37、Bogoyevitch MA and Arthur PG. Inhibitors of c-Jun N-terminal kinases: JuNK no more? Biochim Biophys Acta. 2008; 1784(1):76-93、Bogoyevitch MA, Ngoei KR, Zhao TT, Yeap YY and Ng DC. c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling: recent advances and challenges. Biochim Biophys Acta. 2010; 1804(3):463-475）、ＪＮＫ阻害作用にも様々な機序が存在し、単にＪＮＫ阻害作用を有することのみ等によっては、抗腫瘍剤等としての適否が決定できないものと考えられる。
【００２４】
上記BentamapimodもＪＮＫ阻害剤としての側面を有し、Bentamapimodが腫瘍組織に対して示す作用がＪＮＫ阻害にも関連する可能性が考えられるが、他のＪＮＫ阻害剤のガン細胞や人体に対する作用を考慮すれば、Bentamapimodが示す上記抗腫瘍剤等のガン抑制薬としての有効性をそのＪＮＫ阻害作用のみに起因させることは困難である。特に、Bentamapimodが示すガン細胞の死滅効果をＪＮＫ阻害作用と関連付ける研究は存在しないと思われ、本発明が奏する効果をBentamapimodが示すＪＮＫ阻害作用のみで説明することは困難である。
【００２５】
以上のように、Bentamapimod等が本発明により明らかになったような効果を奏する作用機序は明らかではないものの、以下の実施例で示すように、前臨床動物実験の結果として、腫瘍を有するマウスの全体的な健康状態に悪影響を与えない用量（４０mg/kg/day）及びスケジュール（１０日間の１日１回の腹腔投与）での、Bentamapimodの全身投与によって、インビトロのデータと全く同じように樹立異種移植腫瘍中に存在するガン幹細胞を標的として、その非ガン幹細胞化等が可能であることが明らかになった。
【００２６】
４０mg/kg/dayでマウスに投与する場合に等しいBentamapimodのヒトへの用量は、ヒト及びマウスのＫｍに基づき計算した場合、およそ３．３mg/kg/dayである。このため、実施例の結果は、Bentamapimod等が既に臨床的にクリヤーしている投薬スケジュールで前臨床異種移植モデルにおいて有効であったことを意味しており、これはBentamapimod等がガン幹細胞を標的化する抑制薬の候補物質であることを意味する。
【００２７】
以下の実施例から明らかなように、Bentamapimod等は各種の腫瘍組織に含まれるガン幹細胞の非ガン幹細胞化等を誘導し、その結果として腫瘍組織の拡大防止や消失等のガン抑制薬として作用することから、Bentamapimod等を含有する抗腫瘍剤の有効性が期待される。また、Bentamapimod等により処置されたガン細胞は二次腫瘍の形成能が抑制されるため、ガン抑制薬としてのBentamapimod等を含有することで腫瘍組織の再発や転移等を抑制する腫瘍の再発防止剤としての有効性が期待される。更に、Bentamapimodは既に人体に対する安全性が確認されたものであり、遺伝的な要素等によって腫瘍組織の形成が疑われる健常人において最小限の副作用の元で存在が疑われるガン幹細胞を非ガン幹細胞化して、腫瘍組織の発生を予め予防する腫瘍発生予防剤としての使用が期待される。
【００２８】
なお、本発明においては、本発明に係るガン抑制薬を有効成分として含有する剤であって、腫瘍組織の存在が認められる患者に対して、当該腫瘍組織の拡大防止や消失の効果を目的として投与するものを抗腫瘍剤と称するものとする。また、当該剤を存在した腫瘍組織を外科的手段等により除去した患者に対して、腫瘍の再発や転移の防止を目的として投与するものを再発防止剤と称するものとする。また、腫瘍組織の存在が確認されない状態において、体内での存在が疑われるガン幹細胞等の抑制を目的として健常人に対して投与するものを腫瘍形成予防剤と称するものとする。
【００２９】
また、以下に示す本発明の実施例から明らかなように、腫瘍組織から摘出されたガン幹細胞やガン幹細胞を含む組織をインビトロで培養する際にBentamapimod等を含有する培地を用いることで、ガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化させることが可能であり、Bentamapimod等を使用してガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化させる分化方法に係る発明、及び、ガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化させる分化促進剤に係る発明が把握される。当該発明によれば、各種腫瘍組織に係る評価において特に非ガン幹細胞に着目した評価が容易に精度良く行うことが可能となる。
【００３０】
本発明においてガン抑制薬等として使用される化合物は、上記Bentamapimodの他、Bentamapimodの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、共結晶、複合体、プロドラッグ、前駆体、代謝物、及び／又は誘導体であってもよい。本明細書においては、これらを総合してBentamapimod等と称することがある。
【００３１】
薬学的に許容される塩としては、本発明の目的を達成することができ薬学的に許容される塩であれば特段限定されるものではないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基や、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係るガン抑制薬の使用対象となる腫瘍は、本発明の目的を達成することができる限り特段限定されるものではないが、以下の実施例でその有効性が確認された膵臓、肺、脳、卵巣を原発巣とする腫瘍の他、当該腫瘍群と同様にＪＮＫが発ガンに関与することが指摘されている大腸、肝臓を原発巣とする腫瘍に対して特にその有効性が期待される。また、本発明に係るガン抑制薬は正常細胞に悪影響のない範囲の投与で腫瘍組織内のガン幹細胞を非ガン幹細胞化することから、膵臓ガン、肺ガン、脳腫瘍のような腫瘍組織の完全除去が難しいような腫瘍や正常組織との境界が不明瞭な腫瘍の場合に、腫瘍組織の全部又は一部を温存しながら本発明に係るガン抑制薬やそれを含む剤の投与により拡大を防止する等の処置が有効である。
【００３３】
本発明に係るガン抑制薬は、ヒトを始めとする哺乳動物に対して有効である。また、本発明に係るガン抑制薬を抗腫瘍剤として用いる場合の具体的な投与量等は、投与形態、患者の年齢や体重、腫瘍の部位や重篤度等の条件に応じて、当業者が適宜設定することができる。具体的な投与量としては、これらの態様のみに限定されるわけではないが、例えば、成人に対する全身投与の量として３２０ｍｇ／日程度以下の量を一日一回〜数回に分けて、或いは持続注入等の方法を用いて投与することで、生体や正常組織に対する影響を防止しつつ有効性を発揮することが可能である。また、病巣に直接注射ないし薬剤放出ペレットを留置することにより局所投与する場合には、当該部位におけるBentamapimod等の濃度を１０μＭ程度、好ましくは７．５μＭ程度以下とすることで、当該部位の正常組織に対する影響を防止しながら有効性を発揮させることが可能である。
【００３４】
また、本発明に係るガン抑制薬を腫瘍の再発防止剤や腫瘍発生予防剤として用いる場合には、例えば、成人に対する全身投与の量として３２０ｍｇ／日程度以下の量を、継続して１０〜２０日間程度投与することで、生体内に存在するガン幹細胞を非ガン幹細胞化することが可能である。また、当該投与をガン幹細胞の再発生が疑われる期間（例えば、半年から１年程度）毎に行うことで、継続してガン幹細胞の生体内における存在を防止することが可能である。また、特に本発明に係るガン抑制薬を腫瘍の再発防止剤として使用する場合には、腫瘍が存在した部位に直接注射ないし薬剤放出ペレットを留置することによる薬剤の局所投与を行うことも有効である。
【００３５】
本発明に係るガン抑制薬の投与方法は特に限定されず、ガン抑制薬を含有する薬剤の経口投与であってもよいし、非経口投与であってもよい。経口投与の剤形としては、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、エリキシル剤、サシェ剤等が挙げられる。非経口投与の方法としては、皮下注射、静脈内注射、筋肉注射、腹腔内注射、座薬の使用等が挙げられる。非経口投与の剤形としては、液剤、懸濁剤等が挙げられる。本発明に係る化合物は、腫瘍細胞に対する選択性が高いために全身投与による副作用が抑制されるが、病巣に直接注射ないし薬剤放出ペレットの留置による局所投与によって腫瘍部位における薬剤濃度を高めることも好ましい。
【００３６】
一方、以下の実施例から明らかなように、本発明に係るガン抑制薬がガン幹細胞の非ガン幹細胞化に非常に効果的である一方で、インビトロで血清培養した非ガン幹細に対する阻害効果は限定的であると考えられる。このため、特に存在が確認された腫瘍組織の拡大防止や消失を目的として本発明に係るガン抑制薬を用いる場合には、腫瘍組織の大部分が非ガン幹細胞から構成されることから、非ガン幹細胞であるバルク腫瘍細胞を標的とする化学療法薬とを組み合わせることが合理的である。
【００３７】
本発明に係るガン抑制薬と組み合わせて使用される剤は、患者の状態等に応じて実際に処置を行う医師等の判断により適宜選択されればよいことから、特段限定されるものではないが、例えば、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、フルダラビン、シタラビン、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン及びビンブラスチン；並びにタキサン、例えばパクリタクセル及びドセタキセル）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、メルファラン、イフォスファミド、カルムスチン、アザシチジン、デシタビン、ブスルファン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、テモゾロミド並びにニトロソウレア、例えばカルムスチン、ロムスチン、ビスクロロエチルニトロソウレア及びヒドロキシウレア）、白金剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン（ＪＭ−２１６）及びＣＩ−９７３）、アントラサイクリン類（例えば、ドキソルビシン及びダウノルビシン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、ブレオマイシン、イダルビシン、アドリアマイシン、ダウノマイシン（ダウノルビシン、ルビドマイシン又はセルビジンとしても知られる）、及びミトキサントロン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド及びカンプトテシン）、プリンアンタゴニスト又はピリミジンアンタゴニスト（例えば、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン、クロファラビン、及びゲムシタビン）、細胞成熟剤（例えば、三酸化ヒ素及びトレチノイン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（例えば、ポドフィロトキシン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、及びテニポシド）、細胞生存を阻止する酵素（例えば、アスパラギナーゼ及びペグアスパルガーゼ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット）、他の細胞毒性物質（例えば、リン酸エストラムスチン、デキサメタゾン、プレドニムスチン、及びプロカルバジン）、ホルモン類（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、及びメゲストロール）、モノクローナル抗体（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、リツキシマブ、及びイットリウム−９０−イブリツモマブチウキセタン）、免疫調節剤（例えば、サリドマイド及びレナリドミド）、Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＰ２３４６４、ＡＺＤ０５３０、ＣＧＰ７６０３０、ＰＤ１８０９７０、ＳＫＩ−６０６、イマチニブ、ＢＭＳ３５４８２５（ダサチニブ）、ＡＭＮ１０７（ニロチニブ）、及びＶＸ−６８０）、ホルモンアゴニスト又はアンタゴニスト、部分アゴニスト又は部分アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、生物学的反応修飾物質（例えば、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子）などが挙げられる。
【００３８】
なお、２つ以上の活性成分を併用する際には、それらは、同時使用、個別使用又は逐次使用のいずれの態様で投与されてもよい。例えば、併用する２つ又はそれ以上の活性成分を全て含む医薬組成物としてもよいし、１つ又はそれ以上の活性成分を含む組成物と、１つ又はそれ以上の活性成分を含む組成物とを別々に調製し、組み合わせ剤として使用してもよい。
【００３９】
本明細書の実施例に示されるように、腫瘍細胞を用いたインビトロにおける試験において、更には、マウスを用いたインビボの試験において、本発明に係る化合物は、良好な抗腫瘍作用又は腫瘍の再発防止作用を奏することが確認された。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の実施態様は、これら実施例に記載される態様のみに限定されるわけではない。
【００４１】
＜抗体及び試薬＞
Bentamapimod（ＡＳ６０２８０１）は、ChemScene（Monmouth Junction, NJ, USA）から購入し、ＤＭＳＯに溶解して１０mMストック溶液を調製し、評価に使用した。以下の評価で使用したＳｏｘ２（カタログ番号：３５７９）、Ｎａｎｏｇ（カタログ番号：４９０３）、Ｂｍｉ１（カタログ番号：６９６４）、ＧＦＡＰ（カタログ番号：３６７０）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−Ｊｕｎ（カタログ番号：９２６１）、ｃ−Ｊｕｎ（カタログ番号：９２６５）及びＧＡＰＤＨ（カタログ番号：５１７４）に対する抗体は、Cell Signaling Technology Inc.（Beverly, MA, USA）から購入した。抗ＣＤ１３３（Ｗ６Ｂ３Ｃ１）は、Miltenyi Biotech（Bergisch Gladbach, Germany）から購入した。ＧＳ−Ｙ０１細胞におけるＳｏｘ２（ＭＡＢ２０１８）及びＢｍｉ１（０５−６３７）の発現を検出するために使用した抗体は、R&D Systems Inc.（Minneapolis, MN, USA）及びMillipore（Billerica, MA, USA）からそれぞれ購入した。
【００４２】
＜細胞培養＞
以下の実施例で使用したヒト膵臓ガン細胞株ＰＡＮＣ−１は、Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku Universityから入手した。ヒト卵巣ガン細胞株Ａ２７８０は、T. Tsuruo博士(Institute of Molecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo, Japan)並びにR.F. Ozols博士及びT.C. Hamilton博士(the National Institutes of Health, USA)から頂戴した。ヒト非小細胞肺ガン細胞株Ａ５４９は、Riken BioResource Centerから得た。これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Sigma)を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。グリオーマ幹細胞であるＧＳ−Ｙ０１は、山形大学医学部倫理委員会の承認を得て、発明者が悪性脳腫瘍の患者から摘出して樹立した。正常ヒトＩＭＲ９０胎児肺線維芽細胞は、ＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。更に、培養培地に、１００U/mLペニシリン及び１００μg/mLストレプトマイシンを補充した。
【００４３】
本実施例で使用したヒトガン細胞株（ＰＡＮＣ−１  ＣＳＬＣ、Ａ２７８０  ＣＳＬＣ及びＡ５４９  ＣＳＬＣ）の樹立は、Okada M, Shibuya K, Sato A, Seino S, Suzuki S, Seino M and Kitanaka C. Targeting the K-Ras-JNK axis eliminates cancer stem-like cells and prevents pancreatic tumor formation. Oncotarget. 2014; 5(13):5100-5112、Okada M, Shibuya K, Sato A, Seino S, Watanabe E, Suzuki S, Seino M and Kitanaka C. Specific role of JNK in the maintenance of the tumor-initiating capacity of A549 human non-small cell lung cancer cells. Oncol Rep. 2013; 30(4):1957-1964、Seino M, Okada M, Shibuya K, Seino S, Suzuki S, Ohta T, Kurachi H and Kitanaka C, Requirement of JNK signaling for self-renewal and tumor-initiating capacity of ovarian cancer stem cells. Anticancer Res. 2014; 34(9):4723-4731、Sato A, Sunayama J, Okada M, Watanabe E, Seino S, Shibuya K, Suzuki K, Narita Y, Shibui S, Kayama T and Kitanaka C. Glioma-initiating cell elimination by metformin activation of FOXO3 via AMPK. Stem Cells Transl Med. 2012; 1(11):811-824に記載されている方法で行った。また、ＧＳ−Ｙ０１の樹立は、Sato A, Sunayama J, Matsuda K, Seino S, Suzuki K, Watanabe E, Tachibana K, Tomiyama A, Kayama T, Kitanaka C. MEK-ERK Signaling Dictates DNA-Repair Gene MGMT Expression and Temozolomide Resistance of Stem-Like Glioblastoma Cell via the MDM2-p53 Axis. Stem Cells 2011; 29:1942-1951に記載されている方法で行った。
【００４４】
これらの細胞株は、上記文献で報告された単層幹細胞培養条件下で維持した。簡潔に言うと、各細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートしたディッシュ（IWAKI, Tokyo, Japan）において、幹細胞培養培地（１％  Ｂ２７［Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA］、２０ng/mL  ＥＧＦ及びＦＧＦ２［Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, USA］、Ｄ−（＋）−グルコース［終濃度２６．２mM］、Ｌ−グルタミン［終濃度４．５mM］、１００U/mLペニシリン及び１００μg/mLストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）で培養した。原則として、幹細胞培養培地は３日毎に取り替え、ＥＧＦ及びＦＧＦ２を毎日培養培地に加えた。ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣがそれぞれＰＡＮＣ−１、Ａ２７８０及びＡ５４９に由来する細胞であることの確認は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座（Bio-Synthesis Inc., Lewisville, TX, USA）のジェノタイピングによって確認し、その後、ヒト細胞株についてのＡＴＣＣ ＳＴＲデータベース（http://www.atcc.org/STR_Database.aspx）と比較した。
また、全てのＩＭＲ９０に関する実験は、低継代数（＜８）の細胞を用いて行った。
【００４５】
＜統計学的分析＞
得られた結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として示し、差を２標本のスチューデントｔ検定を用いて比較した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であると考え、図面中のアスタリスクを用いて示した。
【００４６】
［実施例１］細胞毒性アッセイ（１）
Bentamapimodが各種ガン細胞に対して示す細胞毒性を確認するために、インビトロにおいてBentamapimodを各種細胞に作用させた際の生存細胞及び死滅細胞の数を、２種の生体染色色素（トリパンブルー、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））を用いて評価した。
なお、各種細胞に作用させるBentamapimodの濃度を決定するための予備実験として、正常ヒトＩＭＲ９０胎児肺線維芽細胞を、各種濃度のBentamapimodを含む１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Sigma)を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３日間、３７℃で培養した後、トリパンブルーで生存細胞数を評価した結果（図１のＡ，ＩＭＲ９０）、７．５μM以下の濃度においてはBentamapimodを含まない場合（コントロール）と比較して生存細胞数に変化が見られなかった。このことから、Bentamapimodの濃度を７．５μMとして、各ガン細胞についての細胞毒性の検討を行った。
本実施例における細胞毒性の評価は、Bentamapimodの濃度を７．５μMとした１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Sigma)を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、上記血清で培養した３種のヒトガン細胞株（ＰＡＮＣ−１：膵臓ガン、Ａ５９４：肺ガン、Ａ２７８０：卵巣ガン）を３日間、３７℃で培養して行った。また、コントロールとして、Bentamapimodを含まない以外は同様とした培養液中で各ヒトガン細胞株を培養した。
トリパンブルーを用いた評価は、各種の細胞を室温（ＲＴ）で１分間、０．２％トリパンブルーで染色し、生存細胞及び死滅細胞の数を、血球計を用いて決定した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた評価は、各種の細胞をＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０分間、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；１μg/mL）及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１０μg/ml)とともにインサイチュインキュベートして、死滅細胞及び細胞核をそれぞれ染色した。続いて、ＰＩポジティブな細胞の数及びＨｏｅｃｈｓｔポジティブな細胞の数を、蛍光顕微鏡（CKX41; Olympus, Tokyo, Japan）下で計数し、Ｈｏｅｃｈｓｔポジティブな細胞（全細胞）に対するＰＩポジティブな細胞（死滅細胞）の割合を決定した。
図１には、血清培養した各種ヒトガン細胞に対してBentamapimodが示す細胞毒性の様子を示す。図１（Ａ）はトリパンブルーを用いて生存細胞数と細胞が死滅した割合を評価した結果、図１（Ｂ）はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いてＰＩポジティブな細胞（死滅細胞）について評価した結果である。なお、各グラフ中の値は、３回の独立した実験からの平均＋ＳＤを示している（＊Ｐ＜０．０５）。
図１（Ａ）に示すように、評価に用いた７．５μM のBentamapimodは、ＩＭＲ９０に対しては有意な細胞死滅を誘導しない一方で、ＰＡＮＣ−１、Ａ２７８０及びＡ５４９ではコントロールに対して有意な細胞死滅の誘導が確認された。
また図１（Ｂ）に示すように、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた評価によっても同様の傾向が確認され、７．５μM のBentamapimodがＩＭＲ９０に有意な細胞死滅を誘導しない一方で、ＰＡＮＣ−１、Ａ２７８０及びＡ５４９では有意な細胞死滅の誘導が確認された。なお、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた評価によれば、細胞回収手順の間の死滅細胞の損失を回避することができるため、トリパンブルーによる評価で細胞死を過小評価した可能性を排除可能である。
以上のように、７．５μMのBentamapimodを用いた処置によって、正常細胞であるＩＭＲ９０には有意な細胞死滅が観察されない一方で、各種のガン細胞では生存細胞数が減少し、Bentamapimodがガン細胞に対して選択的細胞毒性を有することが示された。
【００４７】
［実施例２］細胞毒性アッセイ（２）
Bentamapimod等のガン幹細胞に対する影響を検証するため、上記各ガン細胞から樹立したヒトガン胞株（ＧＳ−Ｙ０１、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）を用いて、Bentamapimodの存在下で培養を行った。
上記ＰＡＮＣ−１等の通常血清存在下で維持される細胞株の大部分は「非」がん幹細胞からなっていると考えられる一方、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ等はＰＡＮＣ−１等の細胞中のがん幹細胞を選択的に増殖したもので、その多くががん幹細胞の性質を有していると考えられる。ＰＡＮＣ−１等とＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ等は遺伝子的には同一である一方、遺伝子の発現パターンには一定の違いがあるため、薬剤に対する感受性も異なる可能性があるため、それぞれの細胞を用いての検討が有用である。
評価は、血清で培養したヒトガン細胞株に代えて、樹立したヒトガン細胞株（ＧＳ−Ｙ０１、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
図２には、ヒトガン細胞株（ＧＳ−Ｙ０１、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）に対してBentamapimodが示す細胞毒性の様子を示す。図２（Ａ）はトリパンブルーを用いて生存細胞数と細胞が死滅した割合を評価した結果、図２（Ｂ）はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いてＰＩポジティブな細胞（死滅細胞）について評価した結果である。なお、各グラフ中の値は、３回の独立した実験からの平均＋ＳＤを示している（＊Ｐ＜０．０５）。
図２に示すように、血清で培養したヒトガン細胞株の際と同様に、Bentamapimodを用いた処理により、ガン幹細胞を高い割合で含むヒトガン細胞株（ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）においても有意に細胞死滅が誘導されることが確認された。また、患者由来のグリオーマ幹細胞であるＧＳ−Ｙ０１についても同様の効果が観察され、細胞株由来のガン幹細胞に対してだけではなく、患者の腫瘍組織から直接樹立したガン幹細胞に対してもBentamapimodが細胞毒性を示すことが明らかになった。
【００４８】
［実施例３］フローサイトメトリー分析
ガン幹細胞に対するBentamapimodによる処置の効果を確認するため、実施例２での処置後に生存した細胞に対して、以下の手順でＣＤ１３３を用いたフローサイトメトリー分析を行い、Bentamapimodによる処置を行わない細胞（コントロール）との比較を行った。
フローサイトメトリー分析は、樹立したヒトガン細胞株（ＧＳ−Ｙ０１、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣ及びＡ５４９ ＣＳＬＣ）を、７．５μM のBentamapimodを含有する幹細胞培養培地（１％ Ｂ２７［Gibco-BRL, Carlsbad, CA, USA］、２０ng/mL ＥＧＦ及びＦＧＦ２［Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, USA］、Ｄ−（＋）−グルコース［終濃度２６．２mM］、Ｌ−グルタミン［終濃度４．５mM］、１００U/mLペニシリン及び１００μg/mLストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。以下、各実施例において同様。）で６日間培養した細胞と、Bentamapimodを含まない幹細胞培養培地で同じく６日間培養した細胞（コントロール）を回収してそれぞれ通常の手段で解離した後に、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再び洗浄した。その後、各細胞を１時間、ＦＣＭバッファー（ＰＢＳ中、０．５％［ｗ／ｖ］ウシ血清アルブミン、０．１％［ｗ／ｖ］ＮａＮ３）中でブロックし、続いて、ＰＢＳで３回リンスし、更に、４℃で一晩、ＦＣＭバッファー中の抗ＣＤ１３３抗体とともにインキュベートし、次いで、室温で１時間、Alexa Fluor（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。その後、単一の細胞に解離した細胞を取り出して、そのゲーティングをアイソタイプコントロールにおける前方散乱光を用いて設定した。その際、アイソタイプコントロールサンプルを用いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）チャネルにおけるゲートを設定した。アイソタイプコントロールにより設定したゲートを超えてＣＤ１３３に対するシグナルを示す細胞を、ＣＤ１３３ポジティブと見なした。全てのフローサイトメトリー分析の実験は、FACSCantoTM IIフローサイトメーター（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）で行った。ＣＤ１３３は、膵がん、卵巣がん、肺がん、グリオーマを含む多くの細胞で、幹細胞が選択的に発現している幹細胞マーカーである。
図３（Ａ）には、Bentamapimodによる処置による、ガン幹細胞における幹細胞マーカーの発現の変化を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。図３（Ａ）に示すとおり、評価を行った全てのガン細胞株でＣＤ１３３ポジティブな細胞の集団が有意に減少し、Bentamapimodによる処置によってガン幹細胞の非ガン幹細胞化を生じることが示された。
【００４９】
［実施例４］イムノブロット分析
ガン幹細胞に対するBentamapimodによる処置の効果を確認するため、実施例２での処置後に生存した細胞に対して、以下の手順でＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｍｉ１、ｃ−Ｍｙｃ等の幹細胞マーカー、ローディングコントロールとなるＧＡＰＤＨ、グリア分化マーカーであるＧＦＡＰを用いてイムノブロット分析を行い、Bentamapimodによる処置を行わない細胞（コントロール）との比較を行った。
イムノブロット分析は、実施例３と同様に、Bentamapimodにより処置した細胞と、コントロールの細胞を用いて行った。各細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ７．４］、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  デオキシコール酸ナトリウム、１％ ＮＰ−４０、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１．５mM Ｎａ３ＶＯ４、１０mM ＮａＦ、１０mM ピロリン酸ナトリウム、１０mM β−グリセロリン酸ナトリウム、及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII［Sigma］）中で溶解させた。その後、４℃、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞溶解物としての上清を回収し、細胞溶解物のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA）により決定した。等量のタンパク質を含む細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、フッ化ポリビニリデンメンブレンに移した。メンブレンを、各抗体の製造業者により推奨されたプロトコールにしたがい、一次抗体でプローブし、次いで、適切なＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体でプローブした。免疫反応性の結合を、Immobilon Western化学発光HRP基質(Millipore)を用いて可視化した。
図３（Ｂ）には、Bentamapimodによる処置による、ガン幹細胞における幹細胞マーカーの発現の変化を示すイムノブロット分析の結果を示す。図３（Ｂ）に示すようにＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｍｉ１及びｃ−Ｍｙｃ等の幹細胞マーカーの発現が、いずれもBentamapimodによる処置を行った細胞で減少することが示された。特に、グリオーマ幹細胞等のガン幹細胞の維持に中心的な役割を担っていることが報告されている多能性因子であるｃ−Ｍｙｃの発現が、Bentamapimodによる処置の後に顕著に減少することが興味深い。
【００５０】
［実施例５］スフィアフォーメーションアッセイ
Bentamapimodによる処置を行ったガン幹細胞の自己複製能を確認するため、実施例２での処置後に生存した細胞についてスフィアフォーメーションアッセイを行い、Bentamapimodによる処置を行わない細胞（コントロール）との比較を行った。
スフィアフォーメーションアッセイは、以下の操作で行った。実施例３と同様にBentamapimodにより処置した細胞とコントロールの細胞について、各細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浮遊させてBentamapimod等を除去して通常の手段で単一細胞へと解離させ、幹細胞培養培地で段階希釈して非コート９６ウェルプレートに播いて、Bentamapimodの非存在下で各ウェルが単一の細胞を含むようにした。単一細胞を含むウェルを播種の翌日に位相差顕微鏡下でマークし、１週間後に、マークされたウェルの全数に対するスフィアを含むマークされたウェルの割合を決定した。
図４には、Bentamapimodによる処置の有無によるスフィアフォーメーション能の違いを示す図を示す。図４のグラフ中の値は、Bentamapimodによる処置を行った群と、Bentamapimodによる処置を行わない群（コントロール）におけるスフィアを形成したウェルの割合である。各値は３回の独立した実験からの平均＋ＳＤを示している（＊Ｐ＜０．０５）。また、図４の写真は、代表的なウェルの様子を示している。スフィアーの形成は幹細胞の増殖によって担われるため、実施例３，４で示されたように、Bentamapimodによる処置によってガン幹細胞の非ガン幹細胞化が誘導されることにより、スフィアフォーメーション能が抑制されることが期待される。
図４に示すとおり、評価を行った各ガン幹細胞においては、コントロールと比較してBentamapimodによる処置を行った場合に、スフィアフォーメーション能が有意に低下しており、実施例３，４で示された結果と良く一致した。
以上のとおり、インビトロにおいて、Bentamapimodはガン細胞に対して選択的細胞毒性を有して有意な割合で細胞死を誘導すると共に、生存したガン幹細胞についても非ガン幹細胞化を誘導して自己複製能を障害して、スフィアフォーメーション能を低下させることが示された。
【００５１】
［実施例６］マウスを用いたBentamapimodによる処置の評価（１）
以下の実施例では、上記インビトロにおいて得られた結果を検証するために、マウスを用いたインビボでの検証を行った。
本実施例では、上記で樹立したＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣとＡ２７８０ ＣＳＬＣの２種のヒトガン細胞株を用いて、それぞれについてBentamapimodによる処置を行ったものと、行わなかったもの（コントロール）を準備してマウスに移植し、その後にマウスの全般的な健康状態及び皮下腫瘍の存在についてモニターし、Bentamapimodによる処置後の腫瘍開始能について検証を行った。
Bentamapimodによる処置は、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣについては７．５μＭ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣについては４μＭのBentamapimodを含む幹細胞培養培地で６日間培養し、その後に生存した細胞を移植に用いた。コントロールは、Bentamapimodを含まない以外は同様の培地で６日間培養した細胞を移植に用いた。マウスへの移植は、各群について３匹の６〜９週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan）をアバチン（０．３７５g/kg腹腔内投与)で麻酔後、滅菌ＰＢＳ ２００μLに懸濁した各細胞を、側腹部に皮下移植して行った。移植した細胞の数は、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣについては２×１０５個、Ａ２７８０ ＣＳＬＣについては５×１０５個とした。皮下移植により腫瘍組織が形成されたものについては、カリパスを用いて腫瘍の直径を測定（腫瘍の２つの直行する軸について測定）することによって、１／２×（大直径）×（小直径）２を計算して腫瘍の体積とした。
図５（Ａ），（Ｂ）には、上記で移植を行ったマウスに形成された腫瘍組織の腫瘍体積（平均値）の経時変化を示す。図５（Ａ），（Ｂ）に示すように、上記で樹立したＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣとＡ２７８０ ＣＳＬＣのヒトガン細胞株は、いずれも移植によって腫瘍組織が形成されて拡大したのに対して、Bentamapimodによる処置を行ったＡ２７８０ ＣＳＬＣでは腫瘍組織の形成が観察されなかった。また、Bentamapimodによる処置を行ったＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣについては、初期に腫瘍を形成したが、最終的に全て自発的に消失した。
以上の結果は、Bentamapimodによる処置後に生存したＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣ、Ａ２７８０ ＣＳＬＣについても腫瘍創始能が阻害されており、ヌードマウスに生着はするものの、進行性の腫瘍の成長を支持する無限自己複製能が奪われていることの強い証拠であると考えられる。
【００５２】
［実施例７］マウスを用いたBentamapimodによる処置の評価（２）
本実施例では、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣを移植することにより皮下腫瘍を形成されたマウスに対してBentamapimodを投与することで、マウス体内でBentamapimodによるガン細胞の処置を行い、その後のガン細胞の評価を行った。
予備的な実験により、マウスに対するBentamapimodの投与量を決定した。Bentamapimodの投与は、Bentamapimodのストック溶液（ＤＭＳＯ中１０mM）をＰＢＳで希釈して、各注射につき２００μLの溶液を調製して行った。図６には、週齢の等しいマウスに４０mg/kgのBentamapimodを毎日投与した際の体重の経時変化を、Bentamapimodを投与しないマウスの体重の経時変化と比較して示す。図６に示すとおり、４０mg/kgのBentamapimodを毎日投与しても体重変化に違いを生じないことから、当該量のBentamapimodの投与によっては顕著な副作用がないものとして、以下の試験ではマウスに対して４０mg/kg/dayのBentamapimodの投与を行った。
実施例６のコントロールと同様の処置により、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣに起因する皮下腫瘍（一次腫瘍）を有するマウスを複数準備した。移植３週間後、平均腫瘍体積がおよそ５００mm3に達した時点で、２つの処置群（１群あたり４匹のマウス）にランダムに分け、その後１０日間、Bentamapimodが４０mg/kg/dayとなるようにストック溶液（ＤＭＳＯ中１０mM）をＰＢＳで希釈して、各注射につき２００μLとした溶液、又はBentamapimodを含まない以外は同様のコントロールビヒクル２００μLを腹腔内注射した。この際、全てのマウスに、体重あたり等容量のＤＭＳＯ（３．６mL/kg/body）が投与されるようにした。その後、最後の薬物処置の次の日に各群の皮下腫瘍を切り出し以下の評価を行った。
切り出した皮下腫瘍に含まれるガン細胞について、腫瘍創始能を検証する目的で解離したガン細胞の段階希釈物を新たなマウスに移植して、その後に形成される腫瘍体積を観察した。ガン細胞の再移植は、Bentamapimodを腹腔内注射した群とコントロール群から切り出した皮下腫瘍について、冷却した滅菌ＰＢＳ中で洗浄した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に移し、はさみで刻み、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Sigma）中、３７℃で３０分間インキュベートし、ＤＭＥＭ／Ｆ１２でリンスした後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁し、７０μmのストレーナーを通して濾過した単一細胞の懸濁液を、細胞の数及び生存性について決定した後、皮下移植した。移植する細胞数を１×１０６個／匹、５×１０５個／匹、２×１０５個／匹として、実施例６と同様の方法で各条件について３匹ずつ移植を行い、二次腫瘍の発生及び成長についてモニターした。
図５（Ｃ）には、Bentamapimodを投与したマウスに由来する群とBentamapimodを投与しなかったマウスに由来する群（コントロール）について、移植細胞数毎に形成された二次腫瘍の腫瘍体積（平均値＋ＳＤ）の経時変化を示す。図５（Ｃ）に示すように、Bentamapimodを投与したマウスに由来する細胞を移植したマウスにおいては、１×１０６個の細胞を移植した２匹のマウスでのみ観察された。これに対して、コントロールで処置した腫瘍由来の細胞を移植したマウスにおいては、２匹のマウス（１匹は５×１０５個を移植したマウス、もう１匹は２×１０５個を移植したマウス）以外の全てで二次腫瘍の形成が観察され、Bentamapimodを投与したマウスに由来する群との間で腫瘍形成能に有意の差が見られた。
以上の結果から、ＰＡＮＣ−１ ＣＳＬＣに由来する皮下腫瘍を有するマウスにBentamapimodを投与することで、マウス体内で腫瘍組織にBentamapimodが作用して腫瘍組織に含まれるガン幹細胞の非ガン幹細胞化を生じていることが推察された。
上記の結果を裏付けるために、Bentamapimodを投与したマウスに由来するガン細胞とBentamapimodを投与しなかったマウスに由来するガン細胞（コントロール）について、実施例４と同様の方法によりイムノブロット分析による幹細胞関連タンパク質の発現について分析した。
図５（Ｄ）には、Bentamapimodを投与したマウスに由来するガン細胞とBentamapimodを投与しなかったマウスに由来するガン細胞について、ガン幹細胞における幹細胞マーカーの発現の変化を示すイムノブロット分析の結果を示す。
図５（Ｄ）に示すようにＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｍｉ１及びｃ−Ｍｙｃ等の幹細胞マーカーの発現が、いずれもBentamapimodを投与したマウスに由来するガン細胞で減少することが示され、インビトロでの結果と一致した。これらの結果は、Bentamapimodは、腫瘍を有するマウスに全身投与した場合、腫瘍内の腫瘍拡大等に係るガン幹細胞を非ガン幹細胞化ないし死滅することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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