(57)【要約】【課題】  酵素の活性若しくは反応性を向上させた、又は反応中の活性低下を抑制した高活性酵素を提供すること。【解決手段】  酵素をグルタルアルデヒドと接触させることにより高活性酵素を得る。酵素は微生物により産生されたものが好ましく、微生物は、ロドコッカス属に属する微生物、ゴルドナ属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、シュードノカルディア属に属する微生物又はジオバチルス属に属する微生物が好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素をグルタルアルデヒドと接触させる工程を含む、高活性酵素の製造方法。
【請求項２】
酵素が微生物により産生されたものである、請求項１に記載の高活性酵素の製造方法。
【請求項３】
酵素が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ及びアミダーゼから選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の高活性酵素の製造方法。
【請求項４】
酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部接触させる、請求項１〜３のいずれかに記載の高活性酵素の製造方法。
【請求項５】
高活性酵素及びグルタルアルデヒドを含む、酵素組成物。
【請求項６】
高活性酵素が微生物により産生された酵素に由来する、請求項５に記載の酵素組成物。
【請求項７】
高活性酵素が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ及びアミダーゼから選ばれる少なくとも１種に由来するものである、請求項５又は６に記載の酵素組成物。
【請求項８】
高活性酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部含む、請求項５〜７のいずれかに記載の酵素組成物。
【請求項９】
酵素をグルタルアルデヒドと接触させて高活性酵素を製造する工程、及び
得られた高活性酵素の存在下にニトリル化合物からアミド化合物を製造する工程
を含む、アミド化合物の製造方法。
【請求項１０】
酵素が微生物により産生されたものである、請求項９に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項１１】
酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部接触させる、請求項９又は１０に記載のアミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高活性酵素の製造方法、高活性酵素を用いた化合物の製造方法及び酵素組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産生する酵素（微生物由来の酵素）は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和能又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能である。
【０００３】
更に、光学特異的水和能又は光学特異的加水分解能を有する酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、光学活性アミノ酸、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能である。
【０００４】
微生物由来の酵素を触媒とする化学変換反応において、微生物体内で産生された酵素を微生物体内から取り出して使用する場合は、一般的には、微生物を破砕した後、遠心分離、膜分離、薬剤の添加等により破砕残渣や核酸を除去したものが使用されている。
【０００５】
微生物由来の酵素を微生物体内から取り出す方法としては、微生物を破砕した後の破砕液を遠心分離することにより破砕残渣を除去した後、加熱、ｐＨ制御を行う方法(特許文献１)が提案されている。
一方で、酵素の反応を効率良く行う方法としては、酵素活性を向上させる方法(特許文献２)、温度による活性低下を抑制し、化合物耐性を向上させる方法(特許文献３)、グルタルアルデヒドで処理した微生物菌体を不飽和脂肪酸存在下で反応させる方法(特許文献４)等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００７７２５号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２９５８１５号公報
【特許文献３】特開２０１０−１７２２９５号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、酵素は高温下で活性が低下したり、反応原料又は生成する化合物の毒性により活性が低下したりすることから、化合物の工業的生産に酵素を使用する場合には、酵素の性能を更に改善する必要がある。
【０００８】
そこで、本発明は、活性を向上させた酵素を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、酵素にグルタルアルデヒドを接触させることにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．酵素をグルタルアルデヒドと接触させる工程を含む、高活性酵素の製造方法。
項２．酵素が微生物により産生されたものである、項１に記載の高活性酵素の製造方法。
項３．酵素が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ及びアミダーゼから選ばれる少なくとも１種である、項１又は２に記載の高活性酵素の製造方法。
項４．酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部接触させる、項１〜３のいずれかに記載の高活性酵素の製造方法。
項５．高活性酵素及びグルタルアルデヒドを含む、酵素組成物。
項６．高活性酵素が微生物により産生された酵素に由来する、項５に記載の酵素組成物。
項７．高活性酵素が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ及びアミダーゼから選ばれる少なくとも１種に由来するものである、項５又は６に記載の酵素組成物。
項８．高活性酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部含む、項５〜７のいずれかに記載の酵素組成物。
項９．酵素をグルタルアルデヒドと接触させて高活性酵素を製造する工程、及び得られた高活性酵素の存在下にニトリル化合物からアミド化合物を製造する工程を含む、アミド化合物の製造方法。
項１０．酵素が微生物により産生されたものである、項９に記載のアミド化合物の製造方法。
項１１．酵素１００質量部に対してグルタルアルデヒドを０．１〜１６０質量部接触させる、項９又は１０に記載のアミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡便な方法で、活性が高い又は活性低下が抑制された高活性酵素を得ることができる。また、本発明によれば、このような酵素を用いて、効率良く化合物、特にアミド化合物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１３】
（１）高活性酵素の製造
（１−１）酵素
本明細書において、「酵素」はグルタルアルデヒド（ＧＡ）と接触させていない酵素を意味する。
【００１４】
一方、「高活性酵素」とは、
（イ）酵素をＧＡと接触させることにより、ＧＡと接触させていない酵素と比べて活性が高くなった酵素、
（ロ）酵素をＧＡと接触させることにより、ＧＡと接触させていない酵素と比べて反応性が高くなった酵素、又は、
（ハ）酵素をＧＡと接触させることにより、ＧＡと接触させない酵素と比べて、反応原料（基質）や生成物の毒性、反応環境中の温度等の外部環境の影響による活性低下が抑制された酵素
を意味し、前述の「酵素」とは区別される。
【００１５】
ここで、活性とは、単位量当たりの（高活性）酵素が単位時間当たりに生産した生成物の量、又は単位量当たりの（高活性）酵素が単位時間当たりに基質を消費した（減少させた）量として示すことができる。
【００１６】
また、反応性は、上記活性として示すこともできるし、単に、単位量当たりの（高活性）酵素が所定時間に生産した生成物の量、又は単位量当たりの（高活性）酵素が所定時間に基質を消費した（減少させた）量として示すこともできる。
【００１７】
本発明において使用する酵素は、市販されている酵素であっても、化学的に合成した酵素であっても、微生物において産生される酵素であってもよい。これらの中でも、簡便に所望の種類の酵素を量産できることから、微生物において産生される酵素を使用するのが好ましい。
【００１８】
酵素の種類は限定されず、得られる生成物の種類、反応の種類等に応じて適宜選択することができる。本発明で用いられる酵素の種類としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、セルラーゼ、ペプチダーゼ、グルカナーゼ、リパーゼ、アミダーゼ等の加水分解反応を触媒する酵素、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ等の酸化還元反応を触媒する酵素、エピメラーゼ、ムターゼ等の分子内反応を触媒する酵素等が挙げられる。本発明においては、上記酵素から選択される１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００１９】
これらの中でも、工業的に汎用されているニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ等が好ましい。ニトリルヒドラターゼは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素であり、現在、工業的に使用されているので、より好ましい。
【００２０】
また、酵素としては、天然に存在する（遺伝子が改変されていない微生物により産生される）酵素（野生型の酵素）であっても良いし、遺伝子工学的手法等によって遺伝子を改変した微生物が産生する酵素（変異型の酵素）であっても良い。例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物から得られる酵素（ニトリルヒドラターゼ）を用いることもでき、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を他の微生物に導入することによって発現させた酵素（ニトリルヒドラターゼ）を用いることもできる。
【００２１】
（１−２）微生物
本発明において使用する微生物としては、目的とする酵素を産生する微生物を用いる。微生物は、自然界より単離された微生物であっても良いし、遺伝子組換え微生物であっても良い。すなわち、目的とする酵素を産生する微生物をそのまま使用することもできるし、目的とする酵素を産生しない微生物に遺伝子組み換え等を行うことにより、目的とする酵素を産生するようにした微生物も使用することができる。
【００２２】
本発明で使用する微生物の種類は限定されず、目的とする酵素を産生する微生物を使用すればよい。本発明で使用する微生物としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物が挙げられる。
【００２３】
例えば、目的とする酵素がニトリルヒドラターゼの場合、使用する微生物としては、ロドコッカス属、ゴルドナ属、シュードモナス属、シュードノカルディア属、ジオバチルス属等に属する微生物が好ましい。
【００２４】
また、本発明においては、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物も使用することができる。これらの組換え微生物の中でも、工業的には、ロドコッカス属、ゴルドナ属、シュードノカルディア属等に属する微生物が産生するニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した、組換え大腸菌又は組換えロドコッカス属細菌が好ましい。
【００２５】
例えば、ロドコッカス属に属する微生物としては、特公平６−５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１）、国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５４４５６号に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４株等が挙げられる。
【００２６】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株は、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。
【００２７】
また、ロドコッカス・ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４株は、２００３年３月５日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に受託番号ＮＣＩＭＢ４１１６４として寄託されている。
【００２８】
シュードノカルディア属の具体例としては、特開平０９−２７５９７８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５）等が挙げられる。当該株は、「ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５」として同センターに寄託されている。
【００２９】
（１−３）酵素の抽出
本発明において、酵素を抽出するためには、微生物を破砕して微生物体内に存在する酵素を微生物体外に取り出し、微生物の核や細胞壁等の不溶成分を除去することが好ましい。
【００３０】
破砕の方法としては限定されず、微生物の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、高圧式ホモジナイザー等の機械的ホモジナイズ法；凍結融解法；熱分解法；減圧法；薬剤添加による化学溶菌法が挙げられる。
【００３１】
これらの中でも、工業的に大量に且つ安定的に微生物の破砕液を得ることができることから、高圧式ホモジナイザーを使用することが好ましい。また、上述した方法は単独で使用することもできるし、併用して使用することもできる。破砕を行う際の条件も特には限定されず、破砕方法や微生物の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
機械的ホモジナイズ法で微生物を破砕する際には、微生物を分散媒に懸濁させた状態で破砕すればよい。破砕する際の微生物の濃度は特に限定されず、微生物の種類、当該微生物が産生する酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、微生物を分散媒に懸濁させる濃度としては、乾燥菌体濃度として０．１〜３０質量％、より好ましくは０．２〜２０質量％の範囲とすればよい。乾燥菌体濃度として０．１質量％以上とすることにより、効率良く微生物を破砕することができる。乾燥菌体濃度として３０質量％以下とすることにより、破砕効率の悪化を防ぐことができる。
ここで、乾燥菌体濃度（乾燥菌体質量（％））とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表される。より詳細には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣割合（％））から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥残渣の該液層に対する質量比（百分率：乾燥残差／実質的に菌体を含まない液層（％））を差引くことにより便宜的に求めることができる。
【００３３】
本発明において分散媒とは、破砕対象となる微生物の懸濁に使用する溶液を意味する。分散媒の種類は限定されず、微生物の種類、抽出する酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、微生物の培養に使用した液体培地をそのまま使用することもできるし、培養に使用した液体培地を緩衝液に置換したものを使用してもよいし、上記培地に緩衝液を添加したものを使用してもよい。
【００３４】
緩衝液の種類も限定されず、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を使用することができる。
【００３５】
上記のように微生物を破砕した後、酵素と、細胞壁、核等を含む不溶解成分とを分離すればよい。その方法は特に限定されず、微生物の種類、酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、単に遠心分離により上澄み液中に酵素を得ることもできるし、膜分離によりろ液中に酵素を得ることもできるし、凝集剤等の薬剤を添加した後、遠心分離により上澄み液中に酵素を得ることもできる。このようにして、微生物を破砕し、不溶解成分を取り除くことにより、本発明で使用する酵素を含む酵素液を得ることができる。
【００３６】
本発明において、得られたタンパク質濃度の測定方法は特に限定されず、市販のタンパク質分析用試薬を用いて、公知の方法により測定することができる。
【００３７】
また、得られた酵素を安定化するために、上記分散媒中に添加剤を加えることもできる。添加剤の種類も限定されず、酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。添加剤としては、例えば、有機酸を使用することができる。有機酸の種類としては、酵素活性を阻害しないものであれば特には限定されず、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸等のカルボン酸類が挙げられ、その中でもアクリル酸が好ましい。
【００３８】
（１−４）グルタルアルデヒド（ＧＡ）
本発明においては、酵素をグルタルアルデヒドと接触させることにより、高活性酵素を得る。
【００３９】
ＧＡは市販されているものを使用することができる。本発明でＧＡを使用する場合は、ＧＡは固体状のものを使用することもできるし、溶液状のものを使用することができる。取り扱いが容易なため、ＧＡは水溶液として使用することが好ましい。水溶液の濃度は特に限定されず、酵素の量に応じて適宜希釈又は濃縮して使用すればよい。
【００４０】
本発明において使用するＧＡの量は特には限定されず、酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ＧＡは、酵素１００質量部に対して、０．１〜１６０質量部、好ましくは１〜１４０質量部、より好ましくは２〜１００質量部使用することができる。
【００４１】
ＧＡを酵素１００質量部に対し０．１質量部以上使用することにより、効率良く高活性酵素を得ることができる。ＧＡを酵素１００質量部に対し１６０質量部以下とすることにより、酵素どうしの過剰な架橋により酵素が不溶化し活性が低下するのを防ぐことができる。
【００４２】
ここで、酵素として微生物により産生された酵素を用いる場合、微生物体内から抽出したタンパク質成分の中から酵素のみを取り出すのは困難であるため、ここでは、「酵素」を「タンパク質」と読み替えることもできるものとする。すなわち、ＧＡの使用量を、タンパク質１００質量部に対して、０．１〜１６０質量部、好ましくは１〜１４０質量部、より好ましくは２〜１００質量部とすることができる。
【００４３】
（１−５）酵素とＧＡの接触
酵素をＧＡと接触させる方法も特には限定されず、酵素がＧＡと十分に接触できればよい。例えば、酵素又は酵素を含む溶液（酵素溶液）にＧＡ又はＧＡ溶液を添加しても良いし、ＧＡ又はＧＡ溶液に酵素又は酵素溶液を添加しても良い。
【００４４】
酵素とＧＡとの接触は、撹拌下に酵素とＧＡとを混合しても良いし、これらを混合した後に撹拌してもよい。撹拌速度、撹拌時間、温度を初めとする撹拌の方法や条件は特には限定されず、得られる高活性酵素の活性向上が大きく低下しない限り、特には限定されない。
【００４５】
本発明において、酵素とＧＡを接触させる時間は特には限定されず、接触させる際の温度や酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、接触時間は１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上とすることができる。
【００４６】
また、酵素とＧＡを接触させる温度についても特には限定されないが、酵素が失活しない又は高活性化が妨げられない温度範囲とするのが良い。
【００４７】
高温に加熱する場合は短時間の接触、高温でない場合は長時間の接触とすることができる。例えば、３０〜４０℃の温度範囲で接触させる場合、１時間〜２０日間、好ましくは５時間〜１５日間、より好ましくは１〜１０日間とすることができる。４１〜５０℃の温度範囲で接触させる場合は、０．５時間〜１０日間、好ましくは１時間〜７日間、より好ましくは２時間〜４日間とすることができる。５１〜６５℃の温度範囲で接触させる場合は、０．１〜５時間、好ましくは０．２〜４時間、より好ましくは０．３〜３時間とすることができる。
【００４８】
一方で、加熱しない場合は、１０〜２９℃の温度範囲で酵素とＧＡを接触させる場合は、０．５時間〜２５日間、好ましくは１時間〜２０日間、より好ましくは２時間〜１５日間とすることができる。０〜９℃の温度範囲で酵素とＧＡを接触させる場合は、０．５時間〜３０日間、好ましくは１時間〜２５日間、より好ましくは２時間〜２０日間とすることができる。
【００４９】
（１−６）高活性酵素
本発明の方法によって高活性酵素の製造を行った場合、ＧＡとの接触を行わなかった酵素に比して、高い活性を有する。例えば、酵素としてニトリルヒドラターゼを用いる場合、本発明の方法で得られた高活性酵素の活性は、酵素（ＧＡとの接触を行わなかった場合）に対して、１００％を超え、より好ましくは１１０％を超え、さらに好ましくは１２０％を超え、さらにより好ましくは１３０％を超える。
【００５０】
また、本発明の方法によって高活性酵素の製造を行った場合、ＧＡとの接触を行わなかった酵素に比して、高い反応性を有する。例えば、酵素としてニトリルヒドラターゼを用いる場合、本発明の方法で得られた高活性酵素の活性は、酵素（ＧＡとの接触を行わなかった場合）に対して、反応性が３倍以上向上し、好ましくは４倍以上向上し、より好ましくは５倍以上向上する。
【００５１】
また、本発明の方法によって高活性酵素の製造を行った場合、ＧＡとの接触を行わなかった酵素に比して、外部環境（基質や生成物による毒性、温度等）による活性の低下が抑制された高活性酵素が得られる。  
【００５２】
活性の測定方法も特には限定されず、（高活性）酵素の種類に応じた方法を用いることができる。例えば、ニトリルヒドラターゼ活性は、ＧＡの添加前と添加して混合した後の基質（例えば、アクリロニトリル等のニトリル化合物）に対する生成物（例えば、アクリルアミド等のアミド化合物）の生成反応速度、または生成物への変換量を比較することにより測定することが可能である。
【００５３】
（２）酵素組成物
本発明において、上記のようにＧＡと接触させた高活性酵素は、そのまま（ＧＡを除去せずに）ＧＡを含む酵素組成物として、化合物の製造に使用することもできるし、使用するまで保存しておくこともできる。また、必要に応じて、酵素組成物からＧＡを除去して化合物の製造に使用することも可能である。
【００５４】
（３）化合物の製造
本発明では、得られた高活性酵素の存在下に（高活性酵素を触媒として用いて）化合物を製造することができる。反応条件等は、製造する化合物の種類や用いる高活性酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
例えば、高活性酵素としてニトリルヒドラターゼに由来するものを使用してアミド化合物を製造する場合、ニトリル化合物を基質（反応原料）として用い、対応するアミド化合物を得ることができる。ニトリル化合物としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリル等の脂肪族飽和ニトリル；アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の脂肪族不飽和ニトリル；ベンブニトリル、フタロジニトリル等の芳香族ニトリル；及びニコチノニトリル等の複素環式ニトリル等のニトリル化合物が挙げられる。
【００５６】
これらの中でも、好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、インブチロニトリル等のＣ２〜Ｃ４のニトリル化合物であり、より好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アセトニトリルが好適である。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。
【００５８】
また、本明細書における実施例及び比較例中の「％」は、「質量％」を意味する。
【００５９】
〔タンパク質濃度の測定〕
微生物体内から抽出したタンパク質の濃度は、ＤＣプロテインアッセイ試薬（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）を使用し、比色分析により測定した。標準物質として牛血清アルブミンを使用し、その検量線から微生物体内から抽出したタンパク質濃度を算出した。
【００６０】
〔ニトリルヒドラターゼ活性の測定〕
酵素としては、菌体を破砕し、遠心分離した後、残渣を分離・除去した上澄み液（酵素溶液）を使用した。各実施例及び比較例における（高活性）酵素溶液中のタンパク質濃度は、分散媒を用いて等しくした。
【００６１】
ニトリルヒドラターゼ活性は、アクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルを（高活性）酵素溶液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、リン酸添加により反応を停止させ（反応時間は１０分間）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１４Ｂ、島津製作所）でアクリルアミドの濃度を分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ  ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
【００６２】
ニトリルヒドラターゼ活性は、（高活性）酵素溶液１ｍＬが１分間に生産するアクリルアミドの量（μｍｏｌ）として測定した。
【００６３】
〔アミド変換量の測定〕
アミド変換量は、ニトリルヒドラターゼの基質であるアクリロニトリルの減少量から算出した。リン酸緩衝液、アクリルアミド及びアクリロニトリルを混合し、攪拌下に酵素溶液を添加することで反応を開始した。（高活性）酵素溶液を添加してから６時間後、反応液を採取し（反応時間は６時間）、ニトリルヒドラターゼ活性測定と同じ条件でガスクロマトグラフィーにて分析し、アクリロニトリルの濃度を算出した。
【００６４】
＜実施例１及び比較例１＞(（高活性）酵素活性の測定)
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８７年９月１８日に寄託されている）を、グルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト６水和物０．０１％を含む培地（ｐＨ７．０）により３０℃で６２時間好気的に培養した。
【００６５】
これを遠心分離機を用いて集菌し、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄して、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）を分散媒とする菌体懸濁液（乾燥菌体濃度６．７％）を得た。
【００６６】
次に、上記の菌体懸濁液を５００ｍＬ採取し、高圧式ホモジナイザーである菌体破砕装置ＰＡＮＤＡ２Ｋ（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）にて菌体を破砕し、破砕液を調製した。破砕圧力は１００ＭＰａ、破砕時間は２５分、破砕時の温度は４℃であった。
【００６７】
調製した破砕液を、４℃、１５０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離を行って上澄み液を得た。この上澄み液を酵素溶液として使用した。この酵素溶液中のタンパク質濃度を測定した結果、１６．４ｇ／Ｌであった。
【００６８】
この酵素溶液を２ｇ計り取り、グルタルアルデヒド（ＧＡ）（和光純薬工業社製）の１０％水溶液を上澄み液中のタンパク質量に対し、ＧＡ純分として６％（タンパク質１００質量部に対し、ＧＡは６質量部）となるように、ＧＡ水溶液を酵素溶液中にマグネチックスターラーによる攪拌下に添加した。
【００６９】
このＧＡ含有酵素溶液を６３℃の水浴中に1時間浸漬した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、ニトリルヒドラターゼ活性の相対値は、グルタルアルデヒドを添加しなかった場合（コントロール：比較例１）を１００としたときに、１３１であった。
【００７０】
＜実施例２及び３＞
ＧＡの使用量を、表１に記載された量（実施例２では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは１８質量部、実施例３では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは３０質量部。）を用いた以外は、実施例１と同様に実験を行った。得られたニトリルヒドラターゼ活性の相対値の結果を併せて表１に示す。
【００７１】
＜実施例４〜７、比較例２＞
ＧＡの使用量を下記表１に記載した量とし（実施例４では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは３質量部、実施例５では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは９質量部、実施例６では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは１８質量部、実施例７では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは２６質量部。）、６３℃の水浴中に1時間浸漬する代わりに３５℃の恒温器に７日間保存した以外は、実施例１と同様に実験を行った。
【００７２】
その結果、ニトリルヒドラターゼ活性の相対値は、グルタルアルデヒドを添加しなかった場合（コントロール：比較例２）を１００としたときに、表１に示される値が得られた。表１から、ＧＡと接触させた酵素は活性が向上することが分かった。
【００７３】
【表１】
2017184686.tif 000002
【００７４】
＜実施例８＞(高濃度アクリルアミド中におけるアミド変換量の測定)
実施例１と同様にして得られた酵素溶液を２ｇ計り取り、グルタルアルデヒドの１０％水溶液を上澄み液中のタンパク質量に対し、ＧＡ純分として９％（タンパク質１００質量部に対し、ＧＡは９質量部）となるように、ＧＡ水溶液を酵素溶液中にマグネチックスターラーによる攪拌下に添加した。１時間撹拌した後、冷蔵庫で保存（４℃の環境下で７日）することにより、高活性酵素を得た。
【００７５】
内容積１００ｍLの蓋付ポリケース(新商器材社製)にリン酸緩衝液３．４ｇ、５０．５％アクリルアミド９３．１ｇ、アクリロニトリル３．０ｇを加え、３０℃に制御しながら攪拌した。
【００７６】
これに、高活性酵素を含む酵素溶液０．１ｇを添加し、反応を開始した。６時間後、反応液を採取し（反応時間は６時間）、ガスクロマトグラフィーによりアクリロニトリルの濃度を測定した。反応開始前のアクリロニトリル濃度から反応後のアクリロニトリル濃度を差し引くことによりアクリロニトリルからアクリルアミドへの変換量（アミド変換量）を求めた。
【００７７】
ＧＡと接触させなかった酵素溶液を用いて得られたアミド変換量（比較例３）を「１」として相対値を求めたところ、６であった。得られたアクリルアミドへの変換量の相対値を表２に示す。
【００７８】
＜実施例９〜１２＞
ＧＡの使用量を下記表２に示す量にした以外は（実施例９では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは１８質量部、実施例１０では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは２６質量部、実施例１１では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは３５質量部、実施例１２では、タンパク質１００質量部に対しＧＡは４４質量部。）、実施例８と同様に実験を行い、得られたアクリルアミドへの変換量の相対値を併せて表２に示した。
【００７９】
表２から、ＧＡと接触させた酵素は、反応性が向上することが分かった。
【表２】
2017184686.tif 000003