(57)【要約】      （修正有）【課題】新規のトウモロコシデンプンの提供。【解決手段】アミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて測定して、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のアミロース含有分を含み、ＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンのデンプン糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備える、デンプンであって、デンプンは胚乳に少なくとも１つのwxSアレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物に由来する、デンプン。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピー変化よりも少なくとも約３０％高い結晶化のエンタルピー変化をさらに備えるデンプン。走査型電子顕微鏡を用いて観察して、デンプン粒度の分布が、対照デンプンの５ミクロン未満の粒子の割合と比較して、少なくとも約４０％少ない５ミクロン未満の粒子を含む、デンプン粒度の分布をさらに備えるデンプン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて測定して、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のアミロース含有分を含み、
ＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンのデンプン糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備える、デンプンであって、
前記デンプンは胚乳に少なくとも１つのwxSアレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物に由来する、デンプン。
【請求項２】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピー変化よりも少なくとも約３０％高い結晶化のエンタルピー変化をさらに備える、請求項１記載のデンプン。
【請求項３】
走査型電子顕微鏡を用いて観察して、デンプン粒度の分布が、対照デンプンの５ミクロン未満の粒子の割合と比較して、少なくとも約４０％少ない５ミクロン未満の粒子を含む、デンプン粒度の分布をさらに備える、請求項１〜２のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項４】
前記デンプンは、走査型電子顕微鏡を用いて観察して、対照デンプンと比較して、高められた一体性を示す顆粒である、請求項１〜３のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項５】
前記デンプンは少なくとも３回の凍解サイクルに耐えることができる、請求項１〜４のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項６】
前記ワキシーシュガリー２コーン植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物と、wxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物との他家受粉により生成されたものである、請求項１〜５のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項７】
前記ワキシーシュガリー２コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、前記胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項８】
デンプンシンターゼIIa (su2) 遺伝子に対して劣性ホモ接合であり、そして変異顆粒結合デンプンシンターゼI （ＧＢＳＳＩ）遺伝子に対してホモ接合又はヘテロ接合のいずれかである、二重変異コーン植物であって、ここで、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子 (Wx)よりも低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ遺伝子 (wx)よりも高いＧＢＳＳＩ活性を有する、二重変異コーン植物から抽出されるデンプン。
【請求項９】
変異ＧＢＳＳＩ遺伝子はwx-Stonor (wxS) アレルである、請求項８記載のデンプン。
【請求項１０】
前記植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物と、wxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物との他家受粉により生成されたものである、請求項８又は９記載のデンプン。
【請求項１１】
前記コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、前記胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する、請求項８〜１０のいずれか１項記載のデンプン。
【請求項１２】
前記コーン植物の胚乳において産生されるデンプンはwxwxwxsu2su2su2の遺伝子型を有する二重ワキシーシュガリー２劣性変異コーン植物の胚乳において産生されるデンプンと比較して、高い糊化温度を有する、請求項８〜１１のいずれか１項記載のデンプン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１６年４月５日に出願された米国出願第15/090,926号の継続出願であり、その開示の全体を参照によりすべての目的で本明細書中に取り込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は植物及び穀物に由来するトウモロコシデンプン、このようなデンプンの組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
既存のワキシーシュガリー−２二重変異トウモロコシデンプンは、非常に良好な凍解安定性を示す。しかしながら、既存のワキシーシュガリー−２トウモロコシデンプンの粘度はAMIOCA（商標）デンプンなどの商業的なワキシートウモロコシデンプンよりも実質的に低かった。さらに、既存のワキシーシュガリー−２二重変異トウモロコシデンプンの糊化温度はAMIOCA（商標）デンプンよりも実質的に低い。それゆえ、良好な凍解安定性、高められた粘度及び/又はより高い糊化温度を有するトウモロコシデンプンを製造することが当該技術において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明において、既存のワキシーシュガリー−２二重変異トウモロコシに低い活性のＧＢＳＳＩを導入することにより、AMIOCA（商標）デンプンなどの商業上のワキシートウモロコシデンプンよりも高い粘度及び/又は高い糊化温度を有する新規のトウモロコシデンプンを開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は自然に見出されていない新規の機能性を備えたデンプンを提供する。幾つかの実施形態において、該デンプンは、例えば、Megazyme（登録商標）などのアミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のアミロース含有分を含む。幾つかの実施形態において、デンプンはラピッド・ビスコ・アナライザー(RVA, Newport Scientific, Sydney, Australia)を用いて測定して、対照デンプンのデンプン糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備える。幾つかの実施形態において、デンプンは胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを含むワキシーシュガリー−２二重変異コーン植物に由来する。幾つかの実施形態において、ワキシーシュガリー−２二重変異コーン植物は劣性su2 変異アレルを含む。
【０００６】
幾つかの実施形態において、本発明のデンプンは、開示されそして特許請求されるデンプンを生じる遺伝子型のためにトランスジェニックされたものでない（すなわち、非−ＧＭＯ）植物から製造される。
【０００７】
幾つかの実施形態において、デンプンのアミロース含有分は約８ｗｔ％〜約１５ｗｔ％である。
【０００８】
幾つかの実施形態において、水性糊化温度は対照デンプンよりも約５％〜約１５％高い。
【０００９】
幾つかの実施形態において、デンプンは結晶化のエンタルピーの変化をさらに備える。幾つかの実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化は示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピーの変化よりも少なくとも約３０％大きい。幾つかの実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化は、ＤＳＣを用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピーの変化よりも約３０％〜約２００％高い。
【００１０】
幾つかの実施形態において、デンプンは、走査型電子顕微鏡を用いて観察して対照デンプンの５ミクロン未満の粒子の割合と比較して、５ミクロン未満の粒子を少なくとも約４０％少量で含む、デンプン粒度分布をさらに備える。
【００１１】
幾つかの実施形態において、デンプンは走査型電子顕微鏡を用いて観察して、対照のコーン植物に由来するデンプンと比較して、増加した一体性を示す粒子を有する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、デンプンは少なくとも３回の凍解サイクルに耐えることができる。幾つかの実施形態において、デンプンは少なくとも３回〜少なくとも５回の凍解サイクルに耐えることができる。
【００１３】
幾つかの実施形態において、本発明のデンプンを生産する植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物及びwxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物の他家受粉により生成される。幾つかの実施形態において、ワキシーシュガリー２−コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する。
【００１４】
本発明はまた、改良された糊化プロファイルを有するデンプンを製造するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は少なくとも１つのwxSアレルをワキシーコーン植物の胚乳に導入することを含む。
【００１５】
本発明はまた、新規の二重変異植物を提供する。幾つかの実施形態において、植物はコーン植物である。幾つかの実施形態において、植物はデンプンシンターゼIIa (su2)遺伝子に対して劣性ホモ接合である。幾つかの実施形態において、植物は変異顆粒結合性デンプンシンターゼＩ（ＧＢＳＳＩ）遺伝子に対してホモ接合又はヘテロ接合のいずれかである。幾つかの実施形態において、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子(Wx)よりも低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ遺伝子(wx)よりも高いＧＢＳＳＩ活性を有する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子のＧＢＳＳＩ活性の約８％〜約１０％を有する。幾つかの実施形態において、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子はwx-Stonor (wxS) アレルである。幾つかの実施形態において、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子はwx-Gアレル、wx-B5アレル又はwx-Mアレルである。
【００１７】
幾つかの実施形態において、二重変異植物は２つの親植物の他家受粉により生成される。幾つかの実施形態において、第一の植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する。幾つかの実施形態において、第二の植物はwxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する。
【００１８】
幾つかの実施形態において、植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有する。幾つかの実施形態において、植物の胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、植物の胚乳において生成されるデンプンはwxwxwxsu2su2su2の遺伝子型を有する二重ワキシーシュガリー２劣性変異植物の胚乳において生成されるデンプンと比較して高い粘度を有する。
【００２０】
幾つかの実施形態において、植物の胚乳において生成されるデンプンはwxwxwxsu2su2su2の遺伝子型を有する二重ワキシーシュガリー２劣性変異植物の胚乳において生成されるデンプンと比較して高いデンプン糊化温度を有する。
【００２１】
本発明はまた、植物部分、植物細胞及び植物の組織培養物を提供する。幾つかの実施形態において、植物部分は胚乳、葉、花、胚珠、花粉、根茎又は穂先である。幾つかの実施形態において、植物部分は植物の種子である。
【００２２】
本発明はまた、上記の植物から抽出されたデンプンを提供する。
【００２３】
本発明はまた、デンプンの製造方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は本発明の植物の胚乳からデンプンを得ることを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、デンプンの製造方法は本発明の植物を栽培すること、及び、該植物から種子を収穫することを含む。
【００２５】
本発明はまた、種子の製造方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は第一の親植物を第二の親植物と交配させること、及び、得られた種子を収穫することを含む。幾つかの実施形態において、前記第一の親植物及び/又は第二の親植物は本発明の植物である。幾つかの実施形態において、その方法は本発明の植物を自家受粉させること、及び、得られた種子を収穫することを含む。
【００２６】
本発明はまた、植物を栄養繁殖させる方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は植物の部分を回収すること、及び、前記部分から植物を再生させることを含む。
【００２７】
本発明はまた、本発明の植物に由来する植物を生成させる方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は本発明の植物を少なくとも１回自家受粉させて、該植物に由来する孫植物を生成することを含む。幾つかの実施形態において、その方法は本発明の植物を第二の植物と交配させ、植物子孫を生成させることを含む。
【００２８】
本発明はまた、トランスジェニック植物を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態において、その方法は本発明の植物中に対象の導入遺伝子を導入することを含む。対象の導入遺伝子は植物中の１つ以上の所望の表現型を与える。
【００２９】
本発明はまた、所望の表現型を有する植物を製造する方法を提供し、該方法は遺伝子を編集し、本発明の植物における遺伝子配列を生成させることを含む。遺伝子配列は植物において１つ以上の所望の表現型を与える。
【００３０】
本発明はまた、所望の表現型を有する植物を製造する方法を提供し、該方法は本発明の植物において１つ以上の突然変異を誘発させ、遺伝子配列を生成させることを含む。その遺伝子配列は植物において１つ以上の所望の表現型を与える。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は加熱冷却サイクルの間の時間にわたってラピッド・ビスコ・アナライザー(RVA)により測定した、AMIOCA（商標）デンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン及び０ドース、１ドース、２ドース又は３ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプンの糊化プロファイルを描いている。
【００３２】
【図２】図２は、AMIOCA（商標）デンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン及び０ドース、１ドース、２ドース又は３ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプンの糊化プロファイルを描いており、糊化温度、ピークRVU 、保持RVU、最終RVU、ブレークダウンRVU及びセットバックRVUを含む。
【００３３】
【図３】図３は１ドース、２ドース、３ドース又は０ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプン、Waxy Stonor種子のデンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン及びAMIOCA（商標）デンプンの凍解安定性試験を描いている。上記のデンプンは横列に示しており、デンプンゲルの代表的な画像は第一の凍解（サイクル１）後、第三の凍解（サイクル３）後、及び第五の凍解（サイクル５）後で提供している。
【００３４】
【図４】図４はAMIOCA（商標）デンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン及び、０ドース、１ドース、２ドース又は３ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプンの熱特性を描いている。
【００３５】
【図５】図５はAMIOCA（商標）デンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン及び、０ドース、１ドース、２ドース又は３ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプンの粒度分布を描いている。
【００３６】
【図６】図６は１ドース、２ドース、３ドース又は０ドースのwxS遺伝子を含むワキシーシュガリー２二重変異植物のデンプン、wxwxwxSU2su2su2デンプン、AMIOCA（商標）デンプン及びWaxy Stonor種子のデンプンの顆粒モルホロジーを描いている。走査型電子顕微鏡を用いて取った上記のデンプンの各々の例示の画像を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中において、本記載及び特許請求の範囲で使用されるとおりの動詞「含む又は備える（comprise）」及びその活用形は非限定的な意味で使用され、その用語の後続の品目は含むが、詳細に記載されていない品目を排除しないことを意味する。
【００３８】
本発明は組成物及び植物の製造方法を提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「植物」は任意の生体Plantae（すなわち、植物界の任意の属/種）を指す。幾つかの実施形態において、植物はデンプンを生成することができ、該植物としては、限定するわけではないが、トウモロコシ、バレイショ、コムギ、タピオカ、コメ、ジャガイモ及びソルガムが挙げられる。幾つかの実施形態において、植物はコーン植物である。
【００３９】
本発明は植物部分を提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「植物部分」は
植物の任意の部分を指し、限定するわけではないが、胚、胚乳、芽、根、茎、種子、茎、托葉、葉、花弁、花、胚珠、包葉、枝、葉柄、節間、樹皮、柔毛、茎葉、根茎、葉状体、葉身、胚珠、花粉、雄ずいなどが挙げられる。
【００４０】
本発明は、単離（例えば、野生型であり、生体に内在性である）、キメラ、組換え又は合成核酸配列を含む遺伝子を提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「遺伝子」は生体機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。このように、遺伝子としては、限定するわけではないが、その発現に要求されるコード配列及び/又は調節配列が挙げられる。遺伝子は非発現性ＤＮＡセグメントをも包含することができ、該ＤＮＡセグメントは、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する。遺伝子は様々な源から得ることができ、例えば、対象の源からのクローン、又は、既知又は予測配列情報からの合成が挙げられ、そして所望のパラメータを有するように設計された配列を含むことができる。
【００４１】
本発明は野生型参照配列と比較したときに、ヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドを提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「ヌクレオチド変化」は、当該技術分野でよく理解されているように、ヌクレオチド置換、欠失、挿入又はトランスポゾンなどを指す。例えば、突然変異はサイレント置換、付加、欠失又は選択的スプライシングを生じさせる改変を含み、コードされたタンパク質の特性又は活性を変化させ又は変化させず、又は、どのようにタンパク質が製造されるかを変化させ又は変化させない。ヌクレオチド変化はまた、遺伝子中のレトロトランスポゾン要素の挿入及び/又は排除であることもできる。
【００４２】
本発明は野生型参照配列と比較したときに、タンパク質修飾を含むポリペプチドを提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「タンパク質修飾」は、当該技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失、挿入、又はタンパク質活性の変化を指す。
【００４３】
本発明は野生型参照配列に由来するポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「由来する」は起源又は源を指し、そして天然に存在する分子、組換え分子、未精製分子又は精製された分子を挙げることができる。ある起源又は源に由来する核酸又はアミノ酸は本明細書中の他の箇所で規定されるとおりのすべての種類のヌクレオチド変化又はタンパク質修飾を有することができる。
【００４４】
本発明は、本発明の核酸配列及びポリペプチド配列の生物学的活性バリアント又は機能バリアントを提供する。本明細書中に使用されるときに、タンパク質に関する用語「生物学的活性バリアント」又は「機能バリアント」はなおも参照配列の実質的な生物学的活性を維持しながら、参照配列に対して1つ以上のアミノ酸により変更されたアミノ酸配列を指す。バリアントは「保存的な（conservative）」変化を有することができ、ここで、置換アミノ酸は同様の構造又は化学特性を有し、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換である。下記の表は代表的な保存的アミノ酸置換を示す。幾つかの実施形態において、バリアントは1つ以上のアミノ酸置換を有し、ここで、１つ以上又はすべての置換は酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸又はグルタミンである。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
あるいは、バリアントは「非保存的な（nonconservative）」変化を有することができ、例えば、グリシンのトリプトファンによる置換である。類似の小変化としてはまた、アミノ酸欠失又は挿入、又は、その両方を挙げることができる。生物学的又は免疫学的活性を無くすことなく、どのアミノ酸残基が置換され、挿入され又は欠失されうるかを決定する際のガイダンスはDNASTARソフトウエアなどの当該技術分野でよく知られたコンピュータプログラムを用いて発見されうる。ポリヌクレオチドに関しては、バリアントは5'及び/又は3' 端での欠失(すなわちトランケーション)、参照ポリヌクレオチドの1つ以上の内部部位で1つ以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加、及び/又は、参照ポリヌクレオチドの1つ以上の部位で1つ以上のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書中に使用されるときに、「参照」ポリヌクレオチドは本明細書中に開示される方法により製造されるヌクレオチド配列を含む。バリアントヌクレオチドはまた、合成的に誘導されたポリヌクレオチド、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いるなどして発生されたものであるが、遺伝調節要素活性をなおも備えているものも包含する。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチド又は核酸分子又はポリペプチドのバリアントは、配列整合プログラム及び本明細書中の他の箇所で記載されるとおりのパラメータにより決定して、その特定のポリヌクレオチド/ポリペプチドと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上の配列同一性を有するであろう。
【００４７】
バリアントポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡシャフリングなどの変異誘発及び組換え誘発手順から誘導される配列を含む。このようなＤＮＡシャフリングの方策は当該技術分野で知られている。例えば、Stemmer (1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri ら (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore ら(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang ら(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri ら (1998) Nature 391:288-291;ならびに米国特許第5,605,793号及び同第5,837,458号明細書を参照されたい。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅では、対象のいずれかの植物より抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増殖するためにＰＣＲ反応において使用するようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマー及びＰＣＲクローニングを設計するための方法は、一般に、当該技術分野で知られており、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)に開示されている。Innis らeds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis及びGelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York);ならびにInnis及びGelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)も参照されたい。ＰＣＲの既知の方法としては、限定するわけではないが、ペアードプライマー（paired primers）、ネスティッドプライマー（nested primers）、単一特異的プライマー（single specific primers）、縮重プライマー（degenerate primers）、遺伝子特異的プライマー（gene-specific primers）、ベクター特異的プライマー（vector-specific primers）、部分不整合プライマー（partially-mismatched primers）を用いる方法などが挙げられる。
【００４８】
本発明は、トランスジェニック植物を提供する。本明細書中に使用されるときに、用語「トランスジェニック」は様々な形質転換の方法の１つにより外来又は変更遺伝子を受け入れた細胞、脂肪培養物、生体（例えば、植物）及び子孫を指し、ここで、外来又は変更遺伝子は外来又は変更遺伝子を受け入れる生体の種と同一の又は異なる種からのものである。
【００４９】
ワキシー遺伝子：
ワキシー遺伝子は顆粒結合デンプンシンターゼＩ（ＧＢＳＳＩ）遺伝子である。この遺伝子は、生育穀粒の三倍体胚乳及び半数体花粉及び胚嚢におけるアミロース生合成を担うデンプン顆粒結合ＡＤＰ−グルコース−グルコシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.242)をコードする。「Wx」は野生型アレルを指し、そして「wx」はヌル参照変異誘発アレルを指す。用語wxS （別名 wx-Stonor)、wx-G、wx-B5及びwx-Mはワキシー遺伝子においてレトロトランスポゾン挿入を有する中間アレルを指し、Wessler及びVaragona (PNAS, 82:4177-4181, 1985)ならびにVaragonaら (The Plant Cell, 4:811-820, 1992)に記載されるとおりであり、その各々を参照によりその全体を本明細書中に取り入れる。これらの中間アレルは該アレルを有する植物において、野生型植物におけるワキシータンパク質活性よりも低いワキシータンパク質活性をもたらす。トウモロコシワキシー遺伝子はSEQ ID NO: 1の配列を有するタンパク質をコードする。
【００５０】
wx-Stonor:
トウモロコシ植物におけるwx-Stonorアレルはワキシー遺伝子のイントロン５のスプライスドナー部位におけるレトロトランスポゾン挿入によりもたらされる。挿入はスプライス機構（splicing machinery）に影響を及ぼさないが、野生型アレルと比較して低レベルの酵素活性をもたらす（例えば、野生型のわずか約９．５％のＧＢＳＳＩ活性)。結果的に、wx-Stonor アレルを有する植物はwx-Stonorアレルを有しない同一の植物よりも高いアミロースレベルを有する。
【００５１】
シュガリー−２遺伝子:
シュガリー２遺伝子はデンプンシンターゼアイソフォームIIa (SSIIa, EC 2.4.1.21)をコードする。「SU2」は野生型アレルを指し、そして「su2」は劣性の変異誘発アレルを指す。トウモロコシ中のシュガリー−２タンパク質の機能はZhangら(Plant Molecular Biology, 54(6):865-879, 2004)（参照によりその全体を本明細書中に取り込む）に記載されている。トウモロコシ野生型SU2遺伝子はSEQ ID NO: 2の配列を有する野生型タンパク質をコードする。
【００５２】
トウモロコシにおけるワキシー遺伝子及びシュガリー−２遺伝子の詳細は米国特許第4428972号、同第5954883号、同第6828474号、同第 6960703号及び同第7678898号明細書中に記載されており、それらの各々を参照によりその全体を本明細書中に取り込む。
【００５３】
AMIOCA（商標）デンプン:
該用語はNational Starch and Chemical Companyであって、現在はIngredion Incorporatedにより製造されているAMIOCA（商標）コーンデンプンを指す。
【００５４】
wxwxwxSU2su2su2デンプン:
該用語はwxwxwxSU2su2su2の遺伝子型を有するトウモロコシ胚乳から単離されたデンプンを指す。
【００５５】
wxwxwxsu2su2su2デンプン:
該用語は、ワキシーシュガリー２二重劣性突然変異体の胚乳である、wxwxwxsu2su2su2の遺伝子型を有するトウモロコシ胚乳から単離されたデンプンを指す。変異ワキシー遺伝子はその良好な凍解安定性に寄与し、そして変異シュガリー２遺伝子はより短い分子鎖長をもたらす。しかしながら、デンプンは低い一体性のデンプン顆粒を有する。顆粒は容易に破壊し、そしてデンプンは低い粘度を有する。
【００５６】
MELOJEL（登録商標）デンプン:
該用語はNational Starch and Chemical Companyであって、現在はIngredion Incorporatedにより製造されているMELOJEL（登録商標）コーンデンプンを指す。
【００５７】
対照コーン植物:
該用語は比較のための適切な対照植物を指す。幾つかの実施形態において、対照植物は野生型植物であることができる。幾つかの実施形態において、対照植物は本明細書中に記載されるとおりの中間ワキシー遺伝子を有しない植物である。幾つかの実施形態において、対照植物はwxwxwxSU2su2su2デンプン又はwxwxwxsu2su2su2デンプンを製造するコーン植物である。従って、幾つかの実施形態において、対照コーン植物は胚乳においてwx-Sアレルを有しないコーン植物である。
【００５８】
対照デンプン：
該用語は対照デンプンを指す。
wxSwxwxsu2su2su2:
該用語は１ドースのwxSを有するトウモロコシ胚乳を指す。
wxSwxwxsu2su2su2デンプン:
該用語は１ドースのwxSを有するwxSwxwxsu2su2su2遺伝子型を有するトウモロコシ胚乳から単離されたデンプンを指す。
wxSwxSwxsu2su2su2:
該用語は２ドースのwxSを有するトウモロコシ胚乳を指す。
wxSwxSwxsu2su2su2デンプン:
該用語は２ドースのwxSを有する遺伝子型wxSwxSwxsu2su2su2を有するトウモロコシ胚乳から単離されたデンプンを指す。
wxSwxSwxSsu2su2su2:
該用語は３ドースのwxSを有するトウモロコシ胚乳を指す。
wxSwxSwxSsu2su2su2 デンプン:
該用語は３ドースのwxSを有する遺伝子型wxSwxSwxSsu2su2su2を有するトウモロコシ胚乳から単離されたデンプンを指す。
【００５９】
下記の実施例は本発明の様々な態様を例示する。実施例は、もちろん、本発明のほんの特定の実施形態の単なる例示であり、発明の範囲の限定を構成しないことは理解されるべきである。
【００６０】
新規機能性を有するデンプン
１つの態様において、本開示は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子(Wx)よりも低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ遺伝子(wx)よりも高いＧＢＳＳＩ活性を有する中間ＧＢＳＳＩアレルを含む二重変異コーン植物から誘導されるデンプンを提供する。幾つかの実施形態において、中間ＧＢＳＳＩアレルを有する二重変異コーン植物は胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物である。幾つかの実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物及びwxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物の他家受粉により生成される。さらなる実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、そして胚乳はwxSwxwxsu2su2su2, wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する。
【００６１】
幾つかの実施形態において、デンプンはMegazyme（登録商標）アミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて測定して、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のアミロース含有分を備え、そしてＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンの糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備える。
【００６２】
アミロース含有分
デンプンはアミロース及びアミロペクチンを含む。アミロースはα(1→4)グリコシド結合により連結されているα-D-グルコース単位から形成されるらせんポリマーである。アミロペクチンはα(1→4)及びα(1→6)グリコシド結合を含むグルコースの高度に枝分かれしたポリマーである。枝分かれはα(1→6)結合で起こり、それは約２４〜３０個のグルコース単位毎に起こる。幾つかの実施形態において、デンプン中のアミロース含有分は実施例のセクションで示すように、Megazyme（登録商標）により製造されるアミロース/アミロペクチンアッセイキットなどのアミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて測定されうる。
【００６３】
二重変異コーン植物におけるＧＢＳＳＩ遺伝子の中間変異はヌルアレルＧＢＳＳＩ遺伝子を有する対照コーン植物と比較して、誘導されるデンプン中のアミロース含有分を増加させることを観察した。例えば、胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物に由来するデンプンのアミロース含有分は対照コーン植物に対して増加していることが観察された。幾つかの実施形態において、胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを有するコーン植物に由来するデンプンはアミロース含有分が約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％であり、約４ｗｔ％〜約１８ｗｔ％であり、約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％であり、又は、約８ｗｔ％〜約１５ｗｔ％であり、その間にあるすべての値及び副次範囲を包含する。他の実施形態において、アミロース含有分は約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、約９ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約１１ｗｔ％、約１２ｗｔ％、約１３ｗｔ％、約１４ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約１６ｗｔ％、約１７ｗｔ％又は約１８ｗｔ％であり、その間のすべての値を包含する。
【００６４】
理論に拘束されることはないが、アミロース含有分の増加はデンプン中のアミロペクチン含有分を減少させ、それにより、水性媒体と相互作用するのに利用可能なグルコース単位及び水素結合基の総計を減少することが期待される。水素結合のこのような減少は前記デンプンの水性媒体との相互作用の強さの全体としての減少に対応し、そしてデンプンの糊化特性を低減するはずである。しかしながら、糊化プロファイルの予期せぬ改良は本明細書中に開示されるデンプン中でアミロース含有分が増加したときに観察された。理論に拘束されることはないが、この予期せぬ結果は胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)を含むワキシーシュガリー２コーン植物において観察される枝分かれ長さの増加に起因することができる。デンプン上のより長い枝分かれ鎖はより多くのグルコース単位を表し、それはより短い鎖長枝分かれと比較して、水性媒体との水素結合相互作用の数を増加させる。
【００６５】
デンプンの糊化プロファイルはラピッド・ビスコ・アナライザー(RVA)(Newport Scientific, Sydney, Australia)を用いるなどして、既知の方法により測定されうる。例えば、RVAは糊化温度(℃)、ピーク粘度（ＲＶＵ）、保持粘度（ＲＶＵ）、最終粘度（ＲＶＵ）、ブレークダウン粘度（ＲＶＵ）及びセットバック粘度（ＲＶＵ）を測定することができる。幾つかの実施形態において、改良された糊化プロファイルでは、とりわけ、対照デンプンと比較して、より低い有効量のデンプン及び/又はより高い糊化温度で糊化を起こさせることができる。デンプン糊化は水及び熱の存在下にデンプン分子の分子間結合を破壊し、水素結合部位（例えば、ヒドロキシル基）をより多くの水に結合させるプロセスを指す。デンプン糊化プロファイルを測定するために、有効量のデンプンを中性ｐＨで水溶液に添加することができる。例えば、デンプンを水溶液に８ｗ/ｗ％の固形分量で添加することができる。
【００６６】
糊化温度
本明細書中に使用されるときに、糊化温度は実施例のセクションで示されるとおりに測定されることが意図される。デンプンの糊化温度は水中に懸濁したときにデンプン粒子の初期膨潤が起こる温度である。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるデンプンはＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンの糊化温度よりも少なくとも約５％大きい水性糊化温度を有する。幾つかの実施形態において、水性糊化温度は約１％〜約１００％、約１％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約４０％、約５％〜約３０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％又は約５％〜約１４ ％だけ増加され、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。特定の実施形態において、水性糊化温度は二重変異ワキシーシュガリー２コーン植物などの対照植物の水性糊化温度よりも約５％〜約１４％ だけ大きい。
【００６７】
他の実施形態において、水性糊化温度は対照デンプンの糊化温度と比較して、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％又は少なくとも約２０％だけ増加されており、それらの間のすべての値を含む。
【００６８】
なおも他の実施形態において、水性糊化温度は１℃〜約２０℃又は約５℃〜約１０℃だけ増加し、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。他の実施形態において、水性糊化温度は対照デンプンの糊化温度と比較して、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、少なくとも約６℃、少なくとも約７℃、少なくとも約８℃、少なくとも約９℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１１℃、少なくとも約１２℃、少なくとも約１３℃、少なくとも約１４℃又は少なくとも１５℃だけ増加される。
【００６９】
なおも他の実施形態において、本明細書中に記載されるデンプンは水性糊化温度が少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃、少なくとも約９５℃又は少なくとも約１００℃である。特定の実施形態において、胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物に由来するデンプンは水性糊化温度が約５５℃〜約６８℃又は約５９℃〜約６５℃であり、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。なおも他の実施形態において、水性糊化温度は約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃又は約６８℃であり、それらの間のすべての値を含む。
【００７０】
結晶化のエンタルピーの変化
本明細書中に使用されるときに、結晶化のエンタルピーの変化は実施例のセクションで示されるとおりに測定されることが意図される。結晶化は沈殿により溶液から固体結晶を形成するプロセスを指す。幾つかの実施形態において、ワキシーシュガリー２二重変異コーン植物の胚乳に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを導入すると、対照コーン植物からのデンプンと比較して、結晶化のエンタルピーの変化を増加することが観察された。エンタルピー変化は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）などを用いて測定することができる。幾つかの実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化は約１０％〜約３００％、約１０％〜約２００％、約１０％〜約１５０％、約１０％〜約１００％又は約１０％〜約５０％だけ増加され、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。１つのこのような実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化はＤＳＣを用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピーの変化よりも約７０％〜約２００％大きい。
【００７１】
幾つかの実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化は少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％又は少なくとも約２００％だけ増加され、それらの間のすべての値を含む。
【００７２】
幾つかの実施形態において、結晶化のエンタルピーの変化は約１Ｊ/ｇ〜約２０Ｊ/ｇ、約５Ｊ/ｇ〜約１５Ｊ/ｇ、約６Ｊ/ｇ〜約１３Ｊ/ｇであり、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。他の実施形態において、８ｗ/ｗ％の結晶化のエンタルピーの変化は約４Ｊ/ｇ、約５Ｊ/ｇ、約６Ｊ/ｇ、約７Ｊ/ｇ、約８Ｊ/ｇ、約９Ｊ/ｇ、約１０Ｊ/ｇ、約１１Ｊ/ｇ、約１２Ｊ/ｇ、約１３Ｊ/ｇであり、それらの間のすべての値を含む。特定の実施形態において、コーン植物は胚乳に１つのwxSアレルを含み、そして結晶化のエンタルピーの変化はwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物に由来するデンプンよりも少なくとも約１５０％大きい。別の特定の実施形態において、コーン植物は胚乳に２つのwxSアレルを含み、そして結晶化のエンタルピーの変化はwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物に由来するデンプンよりも少なくとも約３０％大きい。なおも別の特定の実施形態において、コーン植物は胚乳に３つのwxSアレルを含み、そして結晶化のエンタルピーの変化はwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物に由来するデンプンよりも少なくとも約７５％大きい。
【００７３】
凍解安定性
凍解安定性は、本明細書中に使用されるときに、実施例のセクションで示されるとおりに測定されることが意図される。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるデンプンは望ましい凍解安定性、例えば、改良された凍解安定性を示す。凍解安定性は水に有効量のデンプンを添加し、スラリーを形成することにより測定することができ、該スラリーを、その後、加熱調理し、そして凍結/冷却のサイクルの後にシネリシスを測定する。幾つかの実施形態において、コーン植物の胚乳中に少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルを導入することで、対照デンプンと比較して、それから得られるデンプンの解凍安定性を低減しなかった。他の実施形態において、コーン植物の胚乳中への少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルの導入はデンプンの凍解安定性を改良した。１つのこのような実施形態において、デンプンは少なくとも３回から少なくとも５回の凍解サイクルに耐えることができる。
【００７４】
粒度分布及び一体性
粒度分布及び一体性は、本明細書中に使用されるときに、実施例のセクションで示されるとおりに測定されることが意図される。
【００７５】
幾つかの実施形態において、少なくとも１つのwx-Stonor (wxS)アレルをコーン植物の胚乳に導入することで、対照デンプンと比較して、デンプン粒子のサイズ分布を変更することが観察された。幾つかのこのような実施形態において、本明細書中に記載されるデンプンの粒度の分布は、走査型電子顕微鏡を用いて観察して、対照デンプンの５ミクロン未満の粒子の割合と比較して、少なくとも約４０％少量で５ミクロン未満の粒子を含む。
【００７６】
粒子一体性は、本明細書中に使用されるときに、水性媒体中に溶解した後に、無傷の粒子として残るデンプンの能力を指す。幾つかの実施形態において、本明細書中に使用されるデンプンは、走査型電子顕微鏡を用いて観察して、対照コーン植物に由来するデンプンと比較して、増加した一体性を示す粒子である。
【００７７】
粘度
粘度は、本明細書中に使用されるときに、実施例のセクションで示されるとおりに測定されることが意図される。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるデンプンは水性ピーク粘度がＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンの水性ピーク粘度よりも少なくとも約１０％高い。幾つかの実施形態において、水性ピーク粘度は約１０％〜約３００％、約１０％〜約２５０％、約１０％〜約２００％、約１０％〜約１５０％、約１０％〜約１００％又は約１０％〜約５０％だけ増加した。ここで、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。幾つかの実施形態において、水性ピーク粘度は少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％又は少なくとも約２００％だけ増加した。ここで、それらの間のすべての値を含む。
【００７８】
幾つかの実施形態において、８ｗ/ｗ％固形分でのデンプンの水性ピーク粘度は約１００ＲＶＵ〜約５００ＲＶＵ、約１００ＲＶＵ〜約４００ＲＶＵ、約１００ＲＶＵ〜約３００ ＲＶＵ、約１００ＲＶＵ〜約２００ＲＶＵ又は約１００ＲＶＵ〜約１５０ＲＶＵであり、それらの間のすべての値及び副次範囲を含む。幾つかの実施形態において、水性ピーク粘度は約１５０ＲＶＵ、約１５５ＲＶＵ、約１６０ＲＶＵ、約１６５ＲＶＵ、約１７０ＲＶＵ、約１７５ＲＶＵ、約１８０ＲＶＵ、約１８５ＲＶＵ、約１９０ＲＶＵ、約１９５ＲＶＵ、約２００ＲＶＵ、約２０５ＲＶＵ、約２１０ＲＶＵ、約２１５ＲＶＵ、約２２０ＲＶＵ、約２２５ＲＶＵ、約２３０ＲＶＵ、約２３５ＲＶＵ、約２４０ＲＶＵ、約２４５ＲＶＵ、約２５０ＲＶＵ、約２５５ＲＶＵ、約２６０ＲＶＵ、約２６５ＲＶＵ、約２７０ＲＶＵ、約２７５ＲＶＵ、約２８０ＲＶＵ、約２８５ＲＶＵ、約２９０ＲＶＵ、約２９５ＲＶＵ、約３００ＲＶＵ、約３０５ＲＶＵ、約３１０ＲＶＵ、約３１５ＲＶＵ、約３２０ＲＶＵ、約３２５ＲＶＵ、約３３０ＲＶＵ、約３３５ＲＶＵ、約３４０ＲＶＵ、約３４５ＲＶＵ、約３５０ＲＶＵ、約３５５ＲＶＵ、約３６０ＲＶＵ、約３６５ＲＶＵ、約３７０ＲＶＵ、約３７５ＲＶＵ、約３８０ＲＶＵ、約３８５ＲＶＵ、約３９０ＲＶＵ、約３９５ ＲＶＵ又は約４００ ＲＶＵであり、それらの間のすべての値を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物は胚乳に１つのwx-Stonor  (wxS)アレルを含み、そしてデンプンはピーク粘度がwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物よりも約１１０％大きい。別の特定の実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物は胚乳に２つのwx-Stonor (wxS)アレルを含み、そしてデンプンはピーク粘度がwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物よりも約３０％大きい。なおも別の特定の実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物は胚乳に３つのwx-Stonor (wxS)アレルを含み、そしてデンプンはピーク粘度がwxwxwxsu2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物よりも約４０％大きい。さらに別の特定の実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物は胚乳に２つのwx-Stonor (wxS)アレルを含み、そしてデンプンはピーク粘度がwxwxwxSU2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物よりも約２０％大きい。なおも別の特定の実施形態において、ワキシーシュガリー２コーン植物は胚乳に２つのwx-Stonor (wxS)アレルを含み、そしてデンプンはピーク粘度がwxwxwxSU2su2su2の胚乳遺伝子型を有する対照植物よりも少なくとも約３０％大きい。
【００８０】
抽出
本発明の植物の穀粒からのデンプンの抽出は当該技術分野でよく知られている湿潤ミリング又は乾燥ミリングプロセスにより標準的な様式で行うことができるが、このような方法に限定されない。１つの典型的な湿潤ミリングプロセスにおいて、植物を強い空気流、シフター及び電磁石により清浄化し、所望しない材料を除去する。その後、少量の二酸化硫黄を含む温かい水中に浸す。浸漬用の水を抜き取り、柔軟化された穀粒をアトリションミルに通し、それを引き裂く。胚芽を除去し、残りの混合物を破砕し、洗浄し、スラリーとし、ふるい掛けする。デンプンを遠心分離技術によりグルテンから分離し、そして残りのスラリー化デンプンを、その後に、ろ過し、洗浄し、懸濁させそして再ろ過する。
【００８１】
植物からのフラワー又はそのバリアントの抽出は乾燥ミリングプロセスにより行うことができる。他の手順を排除することなく、ここに適切な典型的な手順において、本発明の植物から得られるグレンを徹底的に清浄化し、そしてたわしを通し、そしてその後、テンパリングし又は状態調節し、そしてデジャーミネータを通す。デジャーミネータからの原料を乾燥し、その後、冷却し、ひき割りトウモロコシ分離器及びアスピレータを通し、破砕し、そして最後にホール又は分離画分のいずれが所望されるかにより篩にかける。
【００８２】
修飾
一般に使用されている温度よりも低い浸漬水温度を用いるなどした、上記の抽出プロセスのいずれかによる幾つかの修飾は望ましくそしてデンプン実務者に容易に認識されるであろうことが理解されうる。
【００８３】
ここでのデンプンは、所望ならば、ヒドロキシプロピルエーテル、アセテート、ホスフェート、スクシネート、例えば、オクテニルスクシネート、第三級及び第四級アミンエーテルなどのエーテル又はエステルを生成するための誘導化、又は、本明細書中に規定される特性を有するデンプンを生産する他の任意の修飾技術により、当該技術分野で知られた手順により修飾されうる。ここで好ましい置換基はヒドロキシプロピル、ホスフェート又はアセテート基である。
【００８４】
商業的目的で、ここでのデンプンの１つ修飾法は製造操作において頻繁に遭遇する取扱及び処理条件に対して粒子を強化し、そして食品系に望ましいレオロジー特性を付与することができるデンプンを提供するための架橋である。当該技術分野に知られている任意の架橋剤をこの目的で使用することができ、限定するわけではないが、食品系のために、エピクロロヒドリン、直鎖ジカルボン酸無水物、クエン酸アクロレイン、オキシ塩化リン、アジピン酸/酢酸混合酸無水物及びトリメタリン酸エステル塩、及び、非食物系のために、エピクロロヒドリン、直鎖ジカルボン酸無水物、クエン酸アクロレイン、オキシ塩化リン、アジピン酸/酢酸混合酸無水物、トリメタリン酸塩、ホルムアルデヒド、塩化シアヌル、ジイソシアネート及びジビニルスルホンが挙げられる。架橋反応は当業界に知られている技術を用いて行われ、例えば、米国特許第2,328,537号及び第2,801,242号明細書に記載されている。デンプンを修飾するための手順は、チャプター"Starch and Its Modification" by M. W. Rutenberg, pages 22-26 to 22-47, Handbook of Water Soluble Gums and Resins, R. L. Davidson, Editor (McGraw-Hill, Inc., New York, N.Y. 1980)に記載されている。
【００８５】
適切な製品を提供するための必要な架橋剤の量は、例えば、使用される架橋剤のタイプ、架橋剤の濃度、反応条件、架橋デンプンを所望の粘度範囲内にすることの必要性などに応じて変化するであろう。実務者はいかなる量を使用するかは当該技術分野でよく知られているので認識しているであろう。典型的には、この量はデンプンの質量基準で、約０．００１％の低さから、食品使用に許容されると考えられる最大量までの範囲となるであろう。
【００８６】
本デンプンは物理修飾されていてもよく、例えば、WO 95/04082 (1995年2月9日公開)に記載の熱抑制による。
【００８７】
加工
デンプンはα化されてもよい。α化デンプンの調製のための例示の方法は米国特許第4,280,851号明細書(Pitchonら)、米国特許第4,465,702号明細書(Eastmanら)、米国特許第5,037,929号明細書(Rajagopalan)、米国特許第5,131,953号明細書(Kasicaら)及び米国特許第5,149,799号明細書(Rubens)に記載されている。従来のデンプンのα化手順は当業者によく知られており、文献Chapter XXII--"Production and Use of Pregelatinized Starch", Starch: Chemistry and Technology, Vol. III--Industrial Aspects, R. L. Whistler and E. F. Paschall, Editors, Academic Press, New York 1967などに記載されている。
【００８８】
本デンプンはデンプンに生来的であるか又はデンプンの修飾プロセスの間に生じた異臭及び色を除去するために、当該技術分野で知られている任意の方法により精製されることができる。本デンプンを処理するための精製プロセスは1992年2月7日にKasicaらにより出願された米国特許出願第07/832,838号明細書中に開示されている。顆粒又はα化形態のいずれかで使用されることが意図されたデンプンのアルカリ洗浄技術も有用であり、米国特許第5,187,272号(Bertalanら)により代表される特許ファミリーに記載されている。
【００８９】
限定するわけではないが、酸化、酵素転化、特にα-アミラーゼによる酵素転化、酸加水分解、加熱及び/又は酸デキストリン化により調製された流動性又は薄沸点のデンプン、熱及び/又はせん断処理製品を含む、本デンプンから誘導される転化製品もここで有用である。
【００９０】
デンプンを生産する植物
本発明は上記のデンプンを生産する植物を提供する。デンプンを生産する植物としては、限定するわけではないが、トウモロコシ、バレイショ、コムギ、タピオカ、コメ、キャッサバ及びソルガムが挙げられる。
【００９１】
本発明のデンプンはコーン植物、例えば、コーン植物の胚乳から抽出されることができる。本発明のデンプンを生産することができるコーン植物はワキシー/シュガリー２遺伝子型の二重変異植物である。ワキシー遺伝子はコーンの染色体９に位置し、一方、シュガリー２遺伝子は染色体６に位置する(M. G. Nueffer, L. Jones及びM. Zuber, "The Mutants of Maize" (Crop Science Society of America, Madison, WI, 1968), pp. 72及び73を参照されたい)。
【００９２】
本発明の植物はデンプンシンターゼIIa (su2)遺伝子に対して劣性のホモ接合であり、そして変異顆粒結合デンプンシンターゼI (ＧＢＳＳＩ)遺伝子に対してホモ接合又はヘテロ接合のいずれかである。変異ＧＢＳＳＩ遺伝子は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子(Wx)よりも低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ遺伝子(wx)よりも高いＧＢＳＳＩ活性を有する。本明細書中に使用されるときに、このようなワキシー変異遺伝子は中間ワキシー変異体と呼ばれる。幾つかの実施形態において、中間ワキシー変異体は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子発現の３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％ 未満である。幾つかの実施形態において、中間ワキシー変異体は野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子発現の約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％又は約１５％を有する。
【００９３】
野生型ＧＢＳＳＩ遺伝子より低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ遺伝子(wx)よりも高いＧＢＳＳＩ活性を有する中間ＧＢＳＳＩ遺伝子は当該分野で以前に知られたものであってよく、又は、任意の適切な突然変異誘発方法により形成されることができる。
【００９４】
wxS (別名wx-Stonor)、wx-G、wx-B5及びwx-M などの突然変異誘発アレルは中間ＧＢＳＳＩ活性を有する。これらの変異誘発アレルはGBSSI 遺伝子へのレトロトランスポゾン挿入によるものであり、Wessler及びVaragona (PNAS, 82:4177-4181, 1985)及びVaragona ら(The Plant Cell, 4:811-820, 1992)に記載されるとおりである。これらの中間アレルは野生型ワキシータンパク質よりも低い活性を有するワキシータンパク質をもたらす。
【００９５】
中間ＧＢＳＳＩ活性を有する追加の突然変異誘発アレルは適切な方法により製造されうる。例えば、中間ＧＢＳＳＩ活性を有する変異ＧＢＳＳＩ遺伝子を有するコーン植物をスクリーニングするための個体群を生成するために、レトロトランスポゾン突然変異誘発を使用することができる。幾つかの実施形態において、wxS (別名wx-Stonor)、wx-G、wx-B5、及びwx-Mは追加の変異誘発アレルを製造するための出発材料として使用することができる。
【００９６】
中間ＧＢＳＳＩ活性を有する変異誘発アレルを製造するために使用することができる他の突然変異誘発方法としては、限定するわけではないが、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、シグネチャータグ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発及び天然突然変異誘発が挙げられる。
【００９７】
なおも幾つかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｄｓＲＮＡｉ、ＲＮＡ干渉（RNAi）を用いて、中間ＧＢＳＳＩ活性を有する変異誘発アレルを製造することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、細胞中の特定のｍＲＮＡにおいて見出される配列に相補的である又はアンチセンスであるＲＮＡ分子（ＲＮＡ誘導体）を細胞中で発現させ又は導入することを含む。ｍＲＮＡと結合することにより、アンチセンスＲＮＡはコードされた遺伝子産物の翻訳を抑制することができる。特定の植物遺伝子の発現を低減し又は抑制するためのアンチセンス技術の使用は、例えば、欧州特許公開第271988号明細書、Smithら, 334:724-726 (1988); Smithら, Plant Mol. Biol., 14:369-379 (1990))に記載されている。リボザイムは触媒ドメイン及び特定のｍＲＮＡに相補的である配列の両方を有するＲＮＡである。リボザイムはｍＲＮＡと(リボザイムの相補的ドメインを通して)結合し、そしてその後、触媒ドメインを用いてメッセージを開裂（分解）することにより機能する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、サイレンシングされた遺伝子において配列が相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される、動物及び植物中での配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング又は転写遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡｉ技術は、例えば、Elibashirら, Methods Enzymol. 26:199 (2002); McManus & Sharp, Nature Rev. Genetics 3:737 (2002); PCT出願WO 01/75164; Martinezら, Cell 110:563 (2002); Elbashirら, 上記; Lagos-Quintanaら, Curr. Biol. 12:735 (2002); Tuschlら, Nature Biotechnol. 20:446 (2002); Tuschl, Chembiochem. 2:239 (2001); Harborthら, J. Cell Sci. 114:4557 (2001); ら, EMBO J. 20:6877 (2001); Lagos-Quintanaら, Science 294:8538 (2001); Hutvagnerら, 同所、834; Elbashirら, Nature 411:494 (2001)に議論されている。
【００９８】
変異誘発wx及び/又はsu2 アレルが転座、逆位又は染色体工学の他の任意の方法により植物ゲノムの別の位置に移動された変異体から生じるデンプンも本発明の範囲に入る。さらに、既知の標準的な突然変異育種法により生じることができる、人工的突然変異及び上記の遺伝組成の変化から生育される植物から抽出されるデンプンもここに適用可能である。
【００９９】
デンプン生成性植物が中間ＧＢＳＳＩ活性を有するトウモロコシＧＢＳＳＩ遺伝子の変異オルソログ及びトウモロコシＳＳＩＩａ遺伝子の劣性変異オルソログを有するかぎり、コーン植物以外の植物から生産されたデンプンも本発明の範囲に入る。幾つかの実施形態において、植物はコムギ、タピオカ、コメ、キャッサバ、サゴ、バレイショ又はソルガムであることができる。
【０１００】
幾つかの実施形態において、トウモロコシ以外の植物におけるオルソログＧＢＳＳＩ遺伝子は少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上のSEQ ID NO: 1との同一性を有するタンパク質をコードしそしてＧＢＳＳＩ活性を有する。幾つかの実施形態において、オルソログはUniProtエントリー番号O82627 (Antirrhinum majus （ガーデンキンギョソウ(Garden snapdragon)）)、P12615 (Avena sativa (エンバク(Oat)))、Q42968 (Oryza glaberrima （アフリカ稲(African rice)）)、Q43784 (Manihot esculenta （キャッサバ(Cassava)）)、P0C585 (Oryza sativa （コメ(Rice)）)、Q00775 (Solanum tuberosum （バレイショ(Potato))、P27736 (Triticum aestivum （コムギ(Wheat)）)、Q43134 (Sorghum bicolor (ソルガム(Sorghum)))、Q43092 (Pisum sativum （エンドウ(Garden pea)）)、P84766 (Aegilops tauschii subsp. strangulata （ゴートグラス(Goatgrass)）)、Q0DEV5 (Oryza sativa subsp. japonica （コメ(Rice)）)、Q42857 (Ipomoea batatas （サツマイモ(Sweet potato)））、P84633 (Fagopyrum esculentum （普通ソバ(Common buckwheat)）)、P84765 (Secale cereale (ライムギ(Rye)))、Q9MAQ0 (Arabidopsis thaliana)、P09842 (Hordeum vulgare (オオムギ(Barley)))又はA2Y8X2 (Oryza sativa subsp. indica （コメ(Rice)）) の配列を有し、その各々の全体を参照により本明細書に取り込む。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、トウモロコシ以外の植物におけるオルソログSSIIa遺伝子は少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上のSEQ ID NO: 2との同一性を有するタンパク質をコードしそしてＳＳＩＩａ活性を有する。幾つかの実施形態において、オルソログはUniProtエントリー番号V6BPG5 (Triticum urartu (レッドワイルドエインコン(Red wild einkorn)))、V6BPN2 (Triticum monococcum subsp. Monococcum)、C3W8L4 (Hordeum vulgare var. distichum (栽培植物化オオムギ(Domesticated barley)))、E2GHR4 (Oryza sativa subsp. indica (コメ(Rice)))又はE2GHR6 (Oryza sativa subsp. japonica (コメ(Rice)))の配列を有し、その各々の全体を参照により本明細書中に取り込む。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、中間wx変異体及び劣性su2変異体を有する二重変異植物を製造するために、中間wx変異体を有する植物と、劣性su2変異体を有する植物との他家受粉を行うことができる。
【０１０３】
例えば、他家受粉はホモ接合wxS変異体 (wxSwxSSU2SU2)又はヘテロ接合wxS変異体(wxSWxSU2SU2)及びホモ接合ワキシーsu2変異体 (wxwxsu2su2)又はヘテロ接合ワキシーsu2変異体(wxWxsu2su2又はwxwxSU2su2)の間で行われることができる。他家受粉の後に、遺伝型wxSwxSU2su2を有するF1世代の自家受粉を用いて、F2植物を生成することができる。したがって、胚乳に０ドース、１ドース、２ドース又は３ドースのwxS遺伝子のいずれか及び３ドースの劣性su2遺伝子を有する植物は単離されうる (例えば、胚乳は遺伝子型wxwxwxsu2su2su2、wxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwSsu2su2su2を有する)。これは育種法の一例に過ぎず、他の育種スキームを使用することができ、本発明の範囲に入る。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、少なくとも１ドースの中間ワキシーアレル及び劣性シュガリー−２アレルを有する胚乳を有する植物の農場生産はトウモロコシ雌株とトウモロコシ雄株との交配により行われる。典型的な植栽配列は１列の雄列/数列の雌列Aである。雌列は房除去（detassel）されるか、又は、細胞質又は遺伝的手段などの様々な他の手段により雄性不稔とされる。
【０１０５】
本発明において使用されるデンプンは近交系により得ることができ、又は、デンプンは中間ワキシー/劣性su2変異体を含む近交系から誘導される混成から得ることができる。トウモロコシはここでワキシーデンプンの源の代表的な植物であるが、本発明は、中間ワキシー遺伝子及び劣性su2遺伝子を有するかぎり、ワキシーコメ、ワキシーオオムギ及びワキシーソルガムなどの他の植物種にも適用可能である。
【０１０６】
育種法
本発明の植物を製造するために、適切な育種法又は選択法は使用されうる。好適な選択法は、一般に、系統選択、改変系統選択、集団選択、循環選択及び戻し交雑育種が挙げられる。
【０１０７】
放任受粉集団
ライムギ、多種のトウモロコシ及びサトウダイコン、ハムシ科グラス、アルファルファ及びクローバーなどのマメ科植物、カカオ、ココナッツ、オイルパーム及びある種のゴムなどの熱帯樹性作物などの作物の放任受粉集団の改良は、本質的に、高度の（しかし、最大からは遠い）ヘテロ接合性を維持しながら、有利なアレルの固定への遺伝子頻度の変化による。このような集団における均一性は不可能であり、放任受粉品種における型真度（trueness-to-type）は全体としての集団の統計的特徴であり、個々の植物の特徴ではない。このため、放任受粉集団の異質性は近交系、クローン及び混成の同質性（又は事実上同質性）と対照的である。
【０１０８】
集団改良法は自然に２つの群に分類される：通常に集団選択と呼ばれる純粋に表現型選択に基づくもの、及び、後代検定による選択に基づくもの。集団間改良は放任育種集団の概念を用い、１つの集団から別の集団へ遺伝子を流れさせる。１つの集団の植物(栽培品種、株、生態型又は任意の生殖質源)を他の集団の植物と自然に（例えば、風により）又は手もしくは蜂(一般に、Apis mellifera L.又はMegachile rotundata F.)により交配させる。所望の形質を有する植物を両方の源から単離することにより１つ（又は時に両方）の集団を改良するために選択を適用する。
【０１０９】
放任受粉改良の基本的に２つの主な方法が存在する。第一には、選ばれた選択手順により集団がひとまとめに変化される状況が存在する。単離時に集団内で任意交配により漠然と繁殖された改良された集団となる。第二には、合成品種は集団改良と同一の最終結果を達成するが、そのままではそれ自体が繁殖可能でない。親株又はクローンからから再構成されなければならない。放任受粉集団を改良するためのこれらの植物育種手順は当業者によく知られており、他家受粉植物を改良するためにルーチンで使用されている育種手順の総括的なレビューは様々なテキスト及び文献に提供されており、Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979); Hallauer及びMiranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981);及びJensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988)が挙げられる。
【０１１０】
集団選択
集団選択において、所望の個々の植物を選択し、収穫しそして種子を後代検定なしに混成して、次の世代を生じる。選択は母親のみに基づいており、受粉を制御することはできないため、集団選択は選択を伴った任意交配の形になる。本明細書中に記載されるときに、集団選択の目的は集団内の優れた遺伝子の割合を増加させることである。
【０１１１】
合成
合成品種は可能性のある全てのハイブリッド結合において良好な結合能力のために選択されたいくつかの遺伝子型を互いに交配させることによって製造され、放任受粉により品種が後に維持される。一部のサトウダイコン及びマメ（Vicia）又はクローン、グラス、クローバー及びアルファルファなどのように親が（ほぼ近交系）種子繁殖系であっても、なくても、原則的に差異はない。親は一般的な結合能力で選択され、時に、検定交配又はトップ交配、より一般には多交配により選択される。親種子系は意図的に近交系であることができる（例えば、自己交配又は同胞交配による）。しかしながら、親が意図的に近交系であるものとしなくても、系統維持の間の系統内の選択は確実に幾分の同系交配が起こされる。近交系親はもちろん、変化せず、高度にヘテロ結合性を維持する。
【０１１２】
合成品種が親種子生産プロットから農夫に直行することができるか、又は、１又は２サイクルの繁殖を最初に経験しなければならないかは種子生産及び種子の要求のスケールによる。実際上、グラス及びクローバーは一般に、１回又は２回増殖され、このため、初期合成品種から大きく隔たりがある。
【０１１３】
集団選択が時折使用されるが、後代検定は、その操作の単純さ及び目的に対する明らかな妥当性のために、すなわち、合成品種における一般的な結合能力の利用のために、一般に多交配に好ましい。
【０１１４】
合成品種に入る親品種又はクローンの数は広範である。実際上、親系統の数は１０〜数百であり、平均で１００〜２００である。１００以上のクローンから形成される広いベース合成品種は狭いベース合成品種よりも種子繁殖の間に安定であることが期待される。
【０１１５】
系統種
系統種は分離集団からの個々の植物の選択、次いで、自家受粉子孫の繁殖及び種子増加、そして数世代にわたる遺伝子型の注意深い試験により開発される優れた遺伝子型である。これは自然自家受粉種でうまく機能する放任受粉法である。この方法は品種開発において集団選択と組み合わせて使用されうる。系統及び集団選択の組み合わせの変法は自家受粉作物の品種を生成するための最も一般的な方法である。
【０１１６】
混成種
混成種は異なる遺伝子型の親の間の交配から生じる個々の植物である。商業的な混成は現在、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、サトウダイコン、ヒマワリ及びブロッコリを含む多くの作物に広く使用されている。混成種は幾つかの異なるやり方で形成でき、２つの親を直接的に交配させること（単一交配混成）、単一混成種を別の親と交配させること（三方又はトリプル交雑混成）又は２つの異なる混成種を交配させること（四方又はダブル交配混成）が挙げられる。
【０１１７】
系統選択
系統育種は自家受粉作物の改良又は他家受粉作物の近交系のために一般に使用されている。２つの親が有する有利な相補的な形質は交配されて、F1を生じる。F2 集団は１つ又は幾つかのF1を自家受粉すること又は２つのF1を相互交配する (同胞交配)することにより生じる。ニゲノム性半数体繁殖法又は他の倍数減少技術を使用することもできる。最良の個体の選択はF2 集団において、通常に開始され、その後、F3において開始され、最良のファミリー中で最良の個体は選択される。ファミリーの複製試験又はこれらのファミリーの個体が関与する混成結合でしばしばF4 世代となり、低い遺伝性を持った形質の選択の有効性を改良する。近親交配の進行した段階（すなわち、F6 及びF7)で、最良の系統又は表現型的に同様の系統の混合物を、新規の品種の発生の可能性に関して試験する。同様に、ニゲノム性半数体システムを通した新規の品種の開発は、品種の選択、次いで、複製プロットにおける２〜５年の試験を必要とする。
【０１１８】
戻し交雑育種
戻し交雑育種は単純に遺伝され又は高度に遺伝性である形質の遺伝子を反復親である所望のホモ接合性品種又は近交系に導入するために使用されている。導入される形質の源はドナーペアレントと呼ばれる。得られた植物は反復親（例えば、栽培品種）の属性及びドナーペアレントから導入される所望の形質を有することが期待される。当初の交配の後に、ドナーペアレントの表現型を有する個体は選択され、そして反復親に繰り返して交配（戻し交雑）される。得られた植物は反復親（例えば、栽培品種）の属性を有することが期待され、そしてドナーペアレントから導入される所望の形質を有することが期待される。
【０１１９】
集団分離分析(Bulk Segregation Analysis) （ＢＳＡ）
ＢＳＡ、別名、バルクトセグリガント分析（bulked segregant analysis）又はバルクセグリガント分析（bulk segregant analysis）はMichelmoreら(Michelmoreら, 集団分離分析により疾患耐性遺伝子に結合したマーカーの同定（Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis）:集団分離を用いることにより特異的なゲノム領域でマーカーを検知する急速法（a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations）、Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 99:9828-9832)及びQuarrieら(Quarrieら, 1999, Journal of Experimental Botany, 50(337):1299-1306)に記載されている。
【０１２０】
対象の形質のＢＳＡでは、特定の異なる表現型を有する親系は選択され、そして交配されて、ＱＴＬ分析により倍加半数体又は組換近交系集団であるF2を生じる。この集団は、その後、形質の高い又は低い発現を有する個々の植物又は系統を特定するような表現型とされる。１つの表現型（例えば、ウイルスに対して耐性である）を有する個体から１つ、逆の表現型（例えば、ウイルスに感染しやすい）を有する個体からもう１つである、２つのＤＮＡバルクを調製し、そして分子マーカーによりアレル頻度を分析する。もしマーカーが優性であるならば（例えば、ＲＡＰＤ）、わずかな数の個体は各集団に要求される（例えば、各１０植物）。マーカーが共優性であるときには(例えば、ＲＦＬＰ)、より多くの個体は必要とされる。表現型に結合されたマーカーは特定されそして育種又はＱＴＬマッピングのために使用されることができる。
【０１２１】
Targeting Induced Local Lesions in Genomes法 (TILLING（登録商標）)
本出願の育種スキームはTILLING（登録商標）植物品種による交配を含むことができる。TILLING（登録商標）は特異的な遺伝子の突然変異の指向特定を可能にする分子生物学における方法である。TILLING（登録商標）はモデル植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いて２０００年に導入された。TILLING（登録商標）は、以来、ゼブラフィッシュ、コーン、コムギ、コメ、ダイズ、トマト及び千筋ミズナ(Brassica rapa var. nipposinica)などの他の生体における逆遺伝子学的方法として使用されている。
【０１２２】
この方法は化学変異原（例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ））による突然変異誘発の標準的かつ効率的な技術を、標的遺伝子における単一塩基突然変異(点突然変異とも呼ばれる)を特定する感受性ＤＮＡスクリーニング技術と組み合わせる。EcoTILLINGは、通常に集団遺伝分析で、個体の自然突然変異を探すTILLING（登録商標）技術を用いる方法である(Comaiら, 2003 The Plant Journal 37, 778-786; Gilchristら 2006 Mol. Ecol. 15, 1367-1378; Mejlhedeら 2006 Plant Breeding 125, 461-467; Nietoら 2007 BMC Plant Biology 7, 34-42を参照されたい。その各々をすべての目的で、参照により本明細書中に取り込む)。DEcoTILLINGはTILLING（登録商標）及び断片を同定するための安価な方法を使用するEcoTILLINGの変法である(Garvinら, 2007, DEco-TILLING: An inexpensive method for SNP discovery that reduces ascertainment bias. Molecular Ecology Notes 7, 735-746)。
【０１２３】
TILLING（登録商標）法は複アレル（ヘテロ接合体又は複数のホモ接合体及びヘテロ接合体のプールからのものであることができる）がＰＣＲで増幅され、加熱されそしてその後に、ゆっくりと冷却されるときに形成されるヘテロ二本鎖の形成に依存している。「バブル」は２つのＤＮＡストランドのミスマッチで形成され（TILLING（登録商標）における誘発変異又はEcoTILLINGにおける自然変異又はＳＮＰ）、それは、その後、一本鎖ヌクレアーゼにより開裂される。生成物は、その後、幾つかの異なるプラットフォーム上でサイズにより分離される。
【０１２４】
TILLING（登録商標）の方法及び組成物のより詳細な記載は、US 5994075、US 2004/0053236 A1、WO 2005/055704及びWO 2005/048692に見ることができ、その各々をすべての目的で参照により本明細書中に取り込む。
【０１２５】
このように、幾つかの実施形態において、本開示の育種法は１つ以上の同定された突然変異を伴う１つ以上のTILLING（登録商標）植物系を育成することを含む。
【０１２６】
突然変異育種
突然変異育種は植物に新規の形質を導入する別の方法である。自発的に起こり又は人工的に誘発される突然変異は植物育種家にとって有用な多様性源となることができる。人工突然変異誘発の目的は、所望の特性の突然変異の速度を増加させることである。突然変異速度は温度、長期間種子貯蔵、組織培養条件、放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、中性子、ベータ線又は紫外線）、化学的突然変異原（5-ブロモ-ウラシルのような塩基アナログ）、抗生物質、アルキル化剤（例えば、硫黄マスタード、窒素マスタード、エポキシド、エチレンアミン、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン又はラクトンなど）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンを含む、多くの異なる手段又は突然変異剤により増加できる。一旦、所望の形質が突然変異誘発により観察されたら、その形質は、その後、伝統的な育種技術により既存の生殖質に取り込まれることができる。突然変異育種の詳細はW. R. Fehr, 1993, Principles of Cultivar Development, Macmillan Publishing Co.に見ることができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発の使用を伴う育種技術などの新規の育種技術はまた、遺伝的多様性を生じさせ、そして変種に新規の形質を導入するために使用されるであろう。
【０１２７】
幾つかの実施形態において、突然変異育種は単一座位遺伝子変換を含む。単一座位は幾つかの遺伝子及び/又は導入遺伝子を含むことができ、導入遺伝子は例えば、同一の発現ベクターにおいて、除草剤抵抗性のための導入遺伝子をも含む、疾患抵抗性のための導入遺伝子である。除草剤抵抗性のための遺伝子は選択可能なマーカー及び/又は表現型形質として使用されうる。部位特異的組み込み系の単一座位遺伝子変換により、転換座位での複数の遺伝子の組み込みが可能になる。単一座位遺伝子変換はまた、植物ゲノムに１つ以上の部位特異的変化をもたらすことを可能にする。幾つかの実施形態において、単一座位変換はゲノム編集、別名、改変ヌクレアーゼによるゲノム編集（genome editing with engineered nucleases）（ＧＥＥＮ）により行われる。幾つかの実施形態において、ゲノム編集は１つ以上の改変ヌクレアーゼを用いることを含む。幾つかの実施形態において、改変ヌクレアーゼとしては、限定するわけではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc finger nucleases）（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）（ＴＡＬＥＮ）、CRISPR/Cas系及び改変メガヌクレアーゼの再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ（engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases）が挙げられる。幾つかの実施形態において、単一座位遺伝子変換は植物ゲノムの１つ又は幾つかの核酸を変化させる。
【０１２８】
倍加半数体及び染色体倍加
２つの親系統を交配させ、次いで、長い分離子孫選択を行うこと及び/又は複数回の戻し交雑を必要とせずに、ホモ接合植物を得る１つの方法は半数体を形成させ、その後、染色体を倍加して、倍加半数体を形成させることである。半数体植物は自発的に生じることができ、又は、化学処理により、又は、インデューサ系と植物を交配させることにより人工的に誘導されることができる(Seymourら、2012, PNAS vol 109, pg 4227-4232; Zhang ら, 2008 Plant Cell Rep. Dec 27(12) 1851-60)。半数体子孫の生成は配偶子形成の間に染色体の分布に影響を及ぼしうる様々な機構により起こることができる。半数体の染色体組は、時々、自発的に倍加して、ホモ結合性倍加半数体(ＤＨ)を生じる。異なる倍数性を有する細胞を含む植物である混倍数体は時々、生じることがあり、そして倍加半数体組織、器官、新芽、花部分又は植物を自発的に生じる染色体倍加を経験する植物を代表することができる。別の一般的な技術はコルヒチンなどの染色体倍加処理剤により倍加半数体植物の生成を誘発することである(El-Hennawyら, 2011 Vol 56, issue 2 pg 63-72; Doubled Haploid Production in Crop Plants 2003、Maluszynski編、 ISBN 1-4020-1544-5)。倍加半数体植物の生成は、高度に均一な栽培品種を生じさせ、そしてより長い世代の作物の有性同系交配の代替法として特に望ましい。倍加半数体子孫を生じることにより、遺伝形質の可能な遺伝子組み合わせの数はより管理可能になる。このため、効率的な倍加半数体技術は近交系及び栽培品種の開発の時間及びコストを有意に低減することができる。
【０１２９】
原形質融合
植物を育種するための別の方法において、原形質融合を使用して、ドナー植物からレシピエント植物への形質授与性ゲノム材料の導入を行うことができる。原形質融合は２つ以上の原形質体（細胞壁が酵素処理により除去された細胞）の間の体細胞交雑などの誘発又は自発結合であり、それにより、単核、二核又は多核細胞を生じる。事実上、異種交配されることができない植物種を用いてでも得ることができる融合細胞は形質の所望の組み合わせを示す混成植物へ培養される組織である。
【０１３０】
組織培養
本明細書中に使用されるときに、用語「組織培養物」は同一又は異なるタイプの単離された細胞を含む組成物又は植物の部分に組織されたこのような細胞の集合体を指す。組織培養物の例示のタイプは植物又は胚、花粉、花、種子、葉、茎、根、根の先端、葯、雌蕊、分裂組織細胞、腋芽、卵巣、種皮、胚乳、胚軸、子葉などの植物部分において無傷である組織培養物を生成することができる原形質体、カルス、植物塊及び植物細胞である。植物組織培養物を調製しそして維持するための手段は当該技術分野でよく知られている。例えば、器官を含む組織培養物を使用して再生植物を生じさせている。米国特許第5,959,185号、同第 5,973,234号及び同第5,977,445号明細書は特定の技術を記載しており、その開示を参照により本明細書中に取り込む。
【０１３１】
本発明は制限するものと解釈されない下記の実施例及び実施形態によりさらに例示される。本明細書全体にわたって引用されたすべての文献、特許及び公開特許出願の内容、ならびに、図面及び配列表を参照によりその全体を本明細書中に取り込む。
【０１３２】
実施形態
１．
アミロース/アミロペクチンアッセイキットを用いて測定して、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％のアミロース含有分を含み、
ＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンのデンプン糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備える、デンプンであって、
前記デンプンは胚乳に少なくとも１つのwxSアレルを含むワキシーシュガリー２コーン植物に由来する、デンプン。
【０１３３】
２．
前記アミロース含有分は約８ｗｔ％〜約１５ｗｔ％である、実施形態１記載のデンプン。
【０１３４】
３．
前記水性糊化温度は対照デンプンの水性糊化温度よりも約５％〜約１４％高い、実施形態１又は２のいずれか１項記載のデンプン。
【０１３５】
４．
ＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンの結晶化のエンタルピー変化よりも少なくとも約３０％高い結晶化のエンタルピー変化をさらに備える、実施形態１〜３のいずれか１項記載のデンプン。
【０１３６】
５．
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定して、結晶化のエンタルピー変化は対照デンプンの結晶化のエンタルピー変化よりも約７０％〜約２００％高い、実施形態４記載のデンプン。
【０１３７】
６．
走査型電子顕微鏡を用いて観察して、デンプン粒度の分布が、対照デンプンの５ミクロン未満の粒子の割合と比較して、少なくとも約４０％少ない５ミクロン未満の粒子を含む、デンプン粒度の分布をさらに備えた、実施形態１〜４のいずれか１項記載のデンプン。
【０１３８】
７．
前記デンプンは、走査型電子顕微鏡を用いて観察して、対照デンプンと比較して、高められた一体性を示す顆粒である、実施形態１〜６のいずれか１項記載のデンプン。
【０１３９】
８．
前記デンプンは少なくとも３回の凍解サイクルに耐えることができる、実施形態１〜７のいずれか１項記載のデンプン。
【０１４０】
９．
前記デンプンは少なくとも３回〜少なくとも５回の凍解サイクルに耐えることができる、実施形態８記載のデンプン。
【０１４１】
１０．
前記ワキシーシュガリー２コーン植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物と、wxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物との他家受粉により生成されたものである、実施形態１〜９のいずれか１項記載のデンプン。
【０１４２】
１１．
前記ワキシーシュガリー２コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、前記胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する、実施形態１〜１０のいずれか１項記載のデンプン。
【０１４３】
１２．
デンプンの糊化プロファイルにおける少なくとも１つの特徴を改良するための方法であって、
少なくとも１つのwxSアレルをワキシーコーン植物の胚乳に導入することを含み、胚乳に少なくとも１つのwxS アレルを含むワキシーコーン植物に由来している得られるデンプンは、ＲＶＡ分析を用いて測定して、対照デンプンのデンプン糊化温度よりも少なくとも約５％高い水性デンプン糊化温度を備え、それにより、対照デンプンと比較して、デンプンの糊化プロファイルの少なくとも１つの特徴を改良する、方法。
【０１４４】
１３．
デンプンシンターゼIIa (su2) 遺伝子に対して劣性ホモ接合であり、そして変異顆粒結合デンプンシンターゼI （ＧＢＳＳＩ）遺伝子に対してホモ接合又はヘテロ接合のいずれかである、二重変異コーン植物であって、ここで、変異ＧＢＳＳＩ遺伝子は野生型ＧＢＳＳＩ 遺伝子 (Wx)よりも低いＧＢＳＳＩ活性を有するが、劣性の機能欠損ＧＢＳＳＩ 遺伝子 (wx)より高いＧＢＳＳＩ活性を有する、二重変異コーン植物。
【０１４５】
１４．
変異GBSSI遺伝子はwx-Stonor (wxS) アレルである、実施形態１３記載の二重変異コーン植物。
【０１４６】
１５．
前記植物はwxwxsu2su2の遺伝子型を有する第一のコーン植物と、wxSwxSsu2su2の遺伝子型又はwxSwxsu2su2の遺伝子型を有する第二のコーン植物との他家受粉により生成されたものである、実施形態１４記載の二重変異コーン植物。
【０１４７】
１６．
前記コーン植物の胚乳は１ドース、２ドース又は３ドースのwxSアレルを有し、前記胚乳はwxSwxwxsu2su2su2、wxSwxSwxsu2su2su2又はwxSwxSwxSsu2su2su2の遺伝子型を有する、実施形態１５記載の二重変異コーン植物。
【０１４８】
１７．
前記コーン植物の胚乳において産生されるデンプンはwxwxwxsu2su2su2の遺伝子型を有する二重ワキシーシュガリー２劣性変異コーン植物の胚乳において産生されるデンプンと比較して、高い糊化温度を有する、実施形態１３〜１６のいずれか１項記載の二重変異コーン植物。
【０１４９】
１８．
実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異コーン植物の種子。
【０１５０】
１９．
実施形態１３〜１８のいずれか１項記載の二重変異コーン植物の植物部分、植物細胞又は組織培養物。
【０１５１】
２０．
前記植物部分は胚乳、葉、花、胚珠、花粉、根茎及び穂先からなる群より選ばれる、実施形態１９記載の植物部分。
【０１５２】
２１．
実施形態１３〜２０のいずれか１項記載の二重変異コーン植物の胚乳からデンプンを得ることを含む、デンプンの生産方法。
【０１５３】
２２．
実施形態１３〜２１のいずれか１項記載の二重変異コーン植物を栽培し、そして該二重変異コーン植物から種子を収穫することを含む、デンプンの生産方法。
【０１５４】
２３．
第一の親コーン植物を第二の親コーン植物と交配させること、及び、得られたコーン種子を収穫することを含み、前記第一の親コーン植物及び/又は第二の親コーン植物は実施形態１３〜２２のいずれか１項記載の二重変異コーン植物である、コーン種子の生産方法。
【０１５５】
２４．
実施形態１３〜２３のいずれか１項記載の二重変異コーン植物を自己受粉すること、及び、得られたコーン種子を収穫することを含む、コーン種子の生産方法。
【０１５６】
２５．
実施形態１〜１１のいずれか１項記載の植物の部分を回収すること、及び、前記部分から植物を再生させることを含む、実施形態１３〜２４のいずれか１項記載のコーン植物を栄養繁殖させる方法。
【０１５７】
２６．
実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異コーン植物に由来するコーン植物の生産方法であって、実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物を少なくとも１回自家受粉させ、実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物に由来する子孫植物を生じさせることを含む、方法。
【０１５８】
２７．
実施形態１〜１１のいずれか１項記載の二重変異植物に由来するコーン植物の生産方法であって、実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物を第二のコーン植物と交配させ、実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物の子孫植物を生じさせることを含む、方法。
【０１５９】
２８．
導入遺伝子をコーン植物に導入することを含み、該導入遺伝子は実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物の所望の表現型を与える、コーン植物の生産方法。
【０１６０】
２９．
実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物の所望の表現型を与える遺伝子配列を生じるように遺伝子編集することを含む、コーン植物の生産方法。
【０１６１】
３０．
実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異植物の所望の表現型を与える遺伝子配列を生じるように突然変異を導入することを含む、コーン植物の生産方法。
【０１６２】
３１．
実施形態１３〜１７のいずれか１項記載の二重変異コーン植物から抽出されるデンプン。
【０１６３】
３２．
実施形態１５の二重変異コーン植物から抽出されるデンプン。
【０１６４】
３３．
実施形態１６の二重変異コーン植物の胚乳から抽出されるデンプン。
【実施例】
【０１６５】
例１
１、２又は３ドースのwxSアレルを有する顆粒の生成
母親からの２つの極核を父親からの１つの精細胞により受粉するコーン胚乳の三倍体の性質のために、３つの遺伝子型組み合わせが可能である。wxSwxSsu2su2植物を雌として使用して、wxwxsu2su2雄により交配すると、「ドース２」又はwxSwxSwxsu2su2su2顆粒となる。wxSwxSsu2su2を雄として使用して、wxwxsu2su2 雌と交配すると、「ドース１」又はwxSwxwxsu2su2su2 顆粒となる。wxSwxSsu2su2の自家受粉で、「ドース３」又はwxSwxSwxSsu2su2su2顆粒となる。
【０１６６】
【表２】
2017186511.tif 000003
【０１６７】
例２
ラピッド・ビスコ・アミログラフ（ＲＶＡ）を用いたデンプンの粘度
劣性シュガリー２変異植物において０、１、２又は３ドースのwxSアレルを含む植物に由来するトウモロコシデンプンの粘度をラピッド・ビスコ・アミログラフ(Newport Scientific, Eden Prairie, Minn.)を用いて決定した。AMIOCA（商標）デンプン及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンを対照として含んだ。デンプンが単離された胚乳の遺伝子型を下記の表に要約する。アミロース含有分はMegazyme（登録商標）アミロースキットを用いて測定した。デンプンのアミロース含有分はＧＢＳＳＩ活性の増加とともに増加した。 wxwxwxsu2su2su2 デンプンのアミロース含有分(7.4%)、AMIOCA（商標）デンプン(7.1%)及びwxwxwxSU2su2su2 デンプン(6.1%)はWaxy Stonor (12.8%)及びwxwxwxsu2su2su2 デンプンで１〜３ドースのwxS 遺伝子を胚乳に含むもの(8.2〜14.6%)よりも低かった。wxwxwxsu2su2su2 デンプンのアミロース含有分(7.4%, 8.2%, 13.8%及び14.6%)はwxS ドースの増加(それぞれ0, 1, 2及び3ドースのwxS)とともに増加した。結果はwxS遺伝子のwxwxwxsu2su2su2への導入はデンプンのアミロース含有分を若干増加させることを示唆した。
【０１６８】
【表３】
2017186511.tif 000004
【０１６９】
ワキシーコーンデンプンの糊化特性をラピッド・ビスコ・アナライザー(RVA, Newport Scientific, Sydney, Australia) を用いて、「標準２」プロファイル法を用いて分析した。８％デンプン(w/w、乾燥デンプン基準、dsb)を含む懸濁液 （２８．０ｇ）を５０℃で１分間平衡させ、９５℃まで速度６ ℃/分で加熱し、９５℃で５分間保持し、その後、５０℃に速度６ ℃/分で冷却した。パドルの回転速度１６０ｒｐｍであったが、９６０ｒｐｍを最初の１０秒間使用した。結果を図１及び図２に示す。既存のwxwxwxsu2su2su2 デンプンは最も低い糊化温度、ピーク粘度及び最終粘度を有した。wxS遺伝子のwxwxwxsu2su2su2 デンプンへの導入後に、デンプンサンプル(Q3017a [1 wxS], Q8412a [2 wxS]及びQ7738a [3 wxS])は既存のwxwxwxsu2su2su2 デンプン(0 wxS)と比較して増加したピーク粘度を示した。しかしながら、１ドースのwxS 遺伝子を有するwxSwxwxsu2su2su2 デンプンのみがWaxy Stonor、AMIOCA（商標）デンプン及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンよりもずっと高いピーク粘度を示した。
【０１７０】
結果は糊化温度の改良が湿潤ミリングプロセスによりデンプン抽出を可能にするであろうことを示した。
【０１７１】
例３
デンプンの凍解安定性
劣性シュガリー−２変異植物に０、１、２及び３ドースのwxSアレルを含む植物に由来するトウモロコシデンプンを凍解安定性に関して試験した。AMIOCA（商標）デンプン及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンを対照として含んだ。デンプンサンプル８％固形分を水浴中で９５℃にて２０分間加熱調理した。デンプンスラリーをガラス棒で３分間混合し、次いで、調理の間に１７分間静止加熱した。中性ｐＨでのデンプンゲル（８％、w/w）の凍解安定性を、Caronサイクリングフリーザを用いて５回凍解サイクルで分析した。各サイクルにおいて、サンプルを２サイクル/日で６時間凍結し、そして６時間解凍した。サンプルを表面上でシネレシスに関して視覚的に検査し、そして合格したときに、不透明性及びゲル化変化についても検査した。この凍解サイクルを繰り返した。結果を図３に示す。第一の凍結/解凍サイクルの後に、Waxy Stonorデンプンゲルのみが高い不透明性を示し、高度のデンプン老化を示した。デンプンゲルの不透明性は凍結/解凍サイクルの増加とともに増加した。３回目の凍結/解凍サイクルで、AMIOCA（商標）デンプン、wxwxwxSU2su2su2 デンプン及びWaxy Stonorのデンプンゲルは非常に不透明になったが、一方、Q3017a (1 wxS)、Q8412a (2 wxS)、Q7738a (3 wxS)及び既存のwxwxwxsu2su2su2 デンプンのデンプンゲルはなおも不透明ではなかった。５回目の凍結/解凍サイクルの後に、Q3017a (1 wxS)、Q8412a (2 wxS)、Q7738a (3 wxS)及び既存のwxwxwxsu2su2su2 デンプンは若干不透明になった。
【０１７２】
結果はデンプンサンプル中のアミロースの若干の増加が凍解安定性にほとんど影響を及ぼさないことを示唆した。Q3017a (1 wxS)、Q8412a (2 wxS)、Q7738a (3 wxS)デンプンはwxwxwxSU2su2su2 デンプン及びAMIOCA（商標）デンプンよりも良好な凍解安定性を有した。
【０１７３】
例４
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験
劣性シュガリー−２変異植物に０、１、２及び３ドースのwxSアレルを含む植物に由来するトウモロコシデンプンの熱特性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて決定した。AMIOCA（商標）デンプン及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンを対照として含んだ。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は指定された温度で制御された雰囲気内でサンプルにより吸収され又は放出される熱を測定する。ＤＳＣは温度を上昇させながらサンプルの比熱及び潜熱についての情報を提供し、非晶及び結晶構造の変化を示す。データを熱流に関して記録し、そしてジュール/グラム(J/g) (Cassel, 2002)で表記する。デンプンの分析において、ピーク開始、ピーク温度、ピーク終点及び糊化エンタルピー変化情報などのデンプン糊化パラメータを回収した。結果を図４に示す。wxSwxwxsu2su2su2 デンプン(Q3017a)、wxSwxSwxsu2su2su2 デンプン(Q8412a)、wxSwxSwxSsu2su2su2 デンプン(Q7738a)及びwxwxwxsu2su2su2 デンプン(0 wxS)はAMIOCA（商標）デンプン、Waxy Stonor及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンよりも低い糊化温度を示したが、それは１、２及び３ドースのwxSを有するトウモロコシの胚乳から単離されたデンプンのより良好な凍解安定性と一貫している。１ドースのwxS を有するwxSwxwxsu2su2su2 デンプン(Q3017a)は他の混成物 (Q8412a [2 wxS]、Q7738a [3 wxS]及びwxwxwxsu2su2su2 デンプン)よりも若干高い開始糊化温度を有し、Q3017aは他の混成物よりも良好な湿潤ミリング特性を有することを示した。
【０１７４】
例５
デンプン粒子
劣性シュガリー−２変異植物に１、２及び３ドースのwxSアレルを含む植物に由来するワキシートウモロコシデンプンの平均粒度をレーザ光散乱により測定した。AMIOCA（商標）デンプン及びwxwxwxSU2su2su2 デンプンを対照として含んだ。結果を図５に示す。さらに、各サンプルの走査型電子顕微鏡写真を図６に提供し、顆粒モルホロジーを示した。Q3017a (11.4μm)、Q8412a (11.4μm)及びQ7738a (10.9μm)の平均デンプン粒度は既存のwxwxwxsu2su2su2 デンプン(10.4 μm)より大きく、wxS 遺伝子のWaxy VO への導入がデンプン粒度を増加させることを示唆した。結果はSEM画像と一貫しており(図５)、wxS 遺伝子のwxwxwxsu2su2su2デンプンへの導入がデンプン顆粒一体性を増加させることを示した。
【０１７５】
別段の規定がない限り、本明細書中のすべての技術及び科学用語は本発明の属する当業者により一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様又は等価の任意の方法及び材料が本開示の実施又は試験において使用されることができるが、好ましい方法及び材料は本明細書中に記載されている。引用されたすべての刊行物、特許及び特許公開はすべての目的でその全体を参照により本明細書中に取り込まれる。
【０１７６】
本明細書中に議論された刊行物は本出願の出願日の前に開示の目的のみで提供されている。本開示が、先願発明によって、このような刊行物より前の日付に遡及させる資格をなくすと認定するものと解釈されるべきでない。
【０１７７】
本発明はその特定の実施形態との関係で記載されてきたが、さらなる変更を行うことができると理解されるであろう。そして本出願は、一般に、本出願の原理に従った本発明の任意の変更、使用又は適用であって、本発明の技術の属する分野における既知又は慣用的実施の範囲内にあるような本開示からの逸脱を含めて、上記に示しそして下記の添付の特許請求の範囲に示した本質的特徴に適用されうるものをも網羅することが意図される。
【０１７８】
【表４】
2017186511.tif 000005
【表５】
2017186511.tif 000006
【図１】
2017186511.tif 000007
【図２】
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【図３】
2017186511.tif 000009
【図４】
2017186511.tif 000010
【図５】
2017186511.tif 000011
【図６】
2017186511.tif 000012
【配列表】
2017186511000001.app
【外国語明細書】
2017186511000001.pdf