(57)【要約】【課題】抗体を利用した白血病改善剤を提供すること。【解決手段】抗エンドグリン抗体を含有する、白血病改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗エンドグリン抗体を含有する、白血病改善剤。
【請求項２】
前記抗エンドグリン抗体が白血病細胞に結合性を有する、請求項１に記載の白血病改善剤。
【請求項３】
前記抗エンドグリン抗体が白血病幹細胞に結合性を有する、請求項１又は２に記載の白血病改善剤。
【請求項４】
前記抗エンドグリン抗体がCD34陰性白血病幹細胞に結合性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の白血病改善剤。
【請求項５】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、及び骨髄腫からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜４のいずれかに記載の白血病改善剤。
【請求項６】
抗がん剤及び放射性同位体からなる群より選択される少なくとも1種と前記抗エンドグリン抗体との複合体を含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の白血病改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病改善剤、白血病細胞標識剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病細胞集団には、正常造血幹細胞（HSC）と同様に階層制が存在し、少数の白血病幹細胞（LSC）が含まれている。LSCはその発見以来、HSCと同様にCD34陽性CD38陰性細胞分画に存在すると考えられてきた（非特許文献１）。
【０００３】
現在、白血病に対して治癒が期待できる治療法は抗がん剤による化学療法、および造血幹細胞移植療法である。しかしながら、LSCが骨髄内に残存することにより再発することが多く、全ての患者で治癒を望むことは困難である。したがって、LSCを標的とする新たな治療方法の開発が必要である。
【０００４】
現在までに、白血病に使用が可能な日米欧で認可されている抗体医薬品には、急性骨髄性白血病に対する抗CD33抗体、B細胞性慢性リンパ性白血病に対する抗CD52抗体、B細胞性急性リンパ性白血病に対する抗CD20抗体、及び成人T細胞性白血病に対する抗CCR4抗体（本邦で開発）の4種類がある。しかしながら、LSCを治療標的としていないため再発率が高いという問題がある。
【０００５】
一方、エンドグリンは多種の固形腫瘍細胞（肺がん、乳がん、前立腺がん、肝がん、膵がん、メラノーマ等）に高発現していることが多数の論文により報告（非特許文献１０〜１５）されている。海外では既に抗Endoglin抗体を用いた固形腫瘍に対する抗体療法の臨床試験が進行しており、有害事象は軽微であるとの報告がある（非特許文献１６）。しかしながら、抗白血病効果に関する報告はこれまでに国内外でみられない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lapidot T, et al.: A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367: 645-648, 1994
【非特許文献２】Wang J, et al.: SCID-repopulating cell activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood 101: 2924-2931, 2003
【非特許文献３】Kikushige Y, et al.: TIM-3 is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells. Cell Stem Cell 7: 708-717, 2010
【非特許文献４】Majeti R, et al.: CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138: 286-299, 2009
【非特許文献５】Jin L, et al.: Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell 5: 31-42, 2009
【非特許文献６】Jin L, et al.: Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med 12: 1167-1174, 2006
【非特許文献７】van Rhenen A, et al.: The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood 110: 2659-2666, 2007
【非特許文献８】Hosen N, et al.: CD96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 11008-11013, 2007
【非特許文献９】Saito Y, et al.: Identification of therapeutic targets for quiescent, chemotherapy-resistant human leukemia stem cells. Sci Transl Med 2: 17ra19, 2010
【非特許文献１０】Tanaka F, et al.: Evaluation of angiogenesis in non-small cell lung cancer: comparison between anti-CD34 antibody and anti-CD105 antibody. Clin Cancer Res 7: 3410-3415, 2001
【非特許文献１１】Kumar S, et al.: Breast carcinoma: Vascular density determined using CD105 antibody correlates with tumor prognosis. Cancer Research 59: 856-861, 1999
【非特許文献１２】Liu Y, et al.: Over expression of endoglin in human prostate cancer suppresses cell detachment, migration and invasion. Oncogene 21: 8272-8281, 2002
【非特許文献１３】Ho J W, et al.: Clinicopathological and prognostic implications of endoglin (CD105) expression in hepatocellular carcinoma and its adjacent non-tumorous liver. World J Gastroenterol 11: 176-181, 2005
【非特許文献１４】Yoshitomi H, et al.: Specific expression of endoglin (CD105) in endothelial cells of intratumoral blood and lymphatic vessels in pancreatic cancer. Pancreas 37: 275-281, 2008
【非特許文献１５】Altomonte M, et al.: Expression and structural features of endoglin (CD105), a transforming growth factor beta1 and beta3 binding protein, in human melanoma. Br J Cancer 74: 1586-1591, 1996
【非特許文献１６】Karzai F H, et al.: A phase I study of TRC105 anti-endoglin (CD105) antibody in metastatic castration-resistant prostate cancer. BJU Int 116: 546-555, 2015
【非特許文献１７】Matsuoka Y, et al.: Prospectively Isolated Human Bone Marrow Cell-Derived MSCs Support Primitive Human CD34-Negative Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells 33: 1554-1565, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は骨髄内直接移植法を開発することにより、ヒト臍帯血中に非常に未分化なCD34陰性HSCが存在することを世界で初めて明らかにしている（非特許文献２）。そして、正常HSCの新たな階層制モデル（図1）に基づき、CD34陰性HSCのleukemic counterpartとしてCD34陰性LSCが存在するとの仮説を立て、ヒト白血病細胞を重症免疫不全マウスへ移植する実験をおこなった。その結果、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病においてCD34陰性LSCの存在を証明した。CD34陰性LSCは従来考えられてきたCD34陽性LSCよりも未分化、つまりCD34陽性LSCを産生する細胞である可能性が高く、根治を目指した治療法の開発にあたってはCD34陰性LSCを殲滅する方法を考案する必要がある。
【０００８】
一方で、近年の基礎研究から、白血病において治療標的として可能性のある膜表面抗原として、TIM3（非特許文献３）、CD47（非特許文献４）、CD123（非特許文献５）、CD44（非特許文献６）、CLL-1（非特許文献７）、CD96（非特許文献８）、CD32（非特許文献９）、CD25（非特許文献９）などに関する報告がある。しかしながら、これらは従来考えられているCD34陽性LSCを治療標的と想定して研究開発がすすめられているものである。CD34陽性LSCよりもCD34陰性LSCを治療標的とする方が、白血病の再発率が低くなる可能性があるが、現在までに開発当初よりCD34陰性LSCを明確な治療標的として特異的な膜表面抗原を同定し、抗体療法を開発するという報告は国内外に存在しない。
【０００９】
本発明は、抗体を利用した白血病改善剤を提供することを課題とする。好ましくは白血病幹細胞、より好ましくはCD34陰性白血病幹細胞を標的とした白血病改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、抗エンドグリン抗体が白血病細胞に結合性を有すること、及び該抗体が白血病改善作用を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  抗エンドグリン抗体を含有する、白血病改善剤．
項２．  前記抗エンドグリン抗体が白血病細胞に結合性を有する、項１に記載の白血病改善剤．
項３．  前記抗エンドグリン抗体が白血病幹細胞に結合性を有する、項１又は２に記載の白血病改善剤．
項４．  前記抗エンドグリン抗体がCD34陰性白血病幹細胞に結合性を有する、項１〜３のいずれかに記載の白血病改善剤．
項５．  前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、及び骨髄腫からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜４のいずれかに記載の白血病改善剤．
項６．  抗がん剤及び放射性同位体からなる群より選択される少なくとも1種と前記抗エンドグリン抗体との複合体を含有する、項１〜５のいずれかに記載の白血病改善剤．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、抗体を利用した白血病改善剤、好ましくは白血病幹細胞を標的とした白血病改善剤、より好ましくはCD34陰性白血病幹細胞を標的とした白血病改善剤を提供することができる。また、本発明の白血病改善剤は、複数種の白血病に対して改善作用を発揮することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】正常造血系と白血病における幹細胞の階層制モデルを示す。
【図２】実施例1の免疫沈降の結果を示す。
【図３】実施例1のアイソタイピングの結果を示す。
【図４】実施例2のフローサイトメトリーの結果（ヒストグラム）を示す。ヒストグラムの最上方に、使用した細胞株名を示す。各ヒストグラム中、横軸がPEシグナル、縦軸が細胞数を示す。左側のピークが抗エンドグリン抗体を作用させない場合を示し、右側のピークが抗エンドグリン抗体を作用させた場合を示す。
【図５】実施例3のフローサイトメトリーの結果（ヒストグラム）を示す。（A）は急性骨髄性白血病細胞（検体番号UPN439）を用いた場合の結果を示し、（B）は急性リンパ性白血病（検体番号UPN303）を用いた場合の結果を示し、（C）は慢性骨髄性白血病（検体番号UPN605）を用いた場合の結果を示す。（A）〜（C）中、最も左のヒストグラムは、白血病細胞をCD34及びCD38を指標として分画した結果を示す。（A）〜（C）中、右側3つのヒストグラムは、全分画又はCD34+分画、及びCD34+CD38-分画それぞれについて、抗エンドグリン抗体結合細胞の陽性率を調べたものである。(A)及び(B)については、CD34-CD38-分画における抗エンドグリン抗体結合細胞の陽性率についても示している。これら3つあるいは4つのヒストグラム中、横軸がPEシグナル、縦軸が細胞数を示す。左側のピークが抗エンドグリン抗体を作用させない場合を示し、右側のピークが抗エンドグリン抗体を作用させた場合を示す。
【図６】実施例4で測定された白血病細胞増加率及び生存率を示す。（A）のグラフは白血病細胞増加率（縦軸）を示し、（B）のグラフは白血病細胞生存率（縦軸）を示す。各グラフの横軸中、数値は抗エンドグリン抗体の培地中濃度を示し、MSC+/-は、支持細胞であるDP-MSC（非特許文献１７）の有無を示す。
【図７】実施例5の試験方法の概要を示す。
【図８】実施例5で撮影された脾臓写真を示す(A)〜(C)に示す。（A）の「健常マウス」は、白血病細胞の移植を行っていない比較対照マウスを示し、（B）の「白血病移植マウス」は、白血病細胞を移植しマウスIgGアイソタイプ抗体を投与した比較対照マウスを示し、（C）の「抗Endoglin抗体投与マウス」は、白血病細胞を移植し抗Endoglin抗体を投与したマウスである。各写真中のスケールの1目盛は1 mmを示す。(D)は(A)〜(C)の各々の群の脾臓重量の平均値を図示したものである。
【図９】実施例5において、マウス体内の白血病細胞を解析した結果を示す。（A）は、骨髄内直接移植法で移植した左脛骨の骨髄における白血病細胞数（縦軸）を示し、（B）は、反対側の脛骨と両側の大腿骨における白血病細胞数（縦軸）を示し、（C）は、脾臓における白血病数（縦軸）を示し、（D）は、末梢血中の白血病細胞の濃度（血液1μl中の数）（縦軸）を示す。各グラフ中、抗体投与群が抗エンドグリン抗体を投与した群を示し、対照群が抗エンドグリン抗体に代えてマウスIgGアイソタイプ抗体を投与した群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１５】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１６】
本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖の可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖の可変領域に存在するCDRのことを意味する。
【００１７】
本明細書中において、「可変領域」とは、上述したCDR1〜CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
【００１８】
各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
【００１９】
FRは、上述した抗原認識配列として特に重要なCDRs1-3を繋ぐリンカー配列としての機能も兼ね備えており、可変領域全体の立体構造形成に寄与する領域である。
【００２０】
1．抗エンドグリン抗体
抗エンドグリン抗体は、エンドグリンに対して結合性を有する抗体であり、この限りにおいて特に制限されない。換言すれば、抗エンドグリン抗体は、エンドグリン内のエピトープを認識する、或いはエンドグリン内の領域に対して結合する。
【００２１】
抗エンドグリン抗体は、エンドグリンに対して特異的結合性を有する抗体であることが好ましい。ここで、「エンドグリンに対して特異的結合性を有する」とは、特に制限されないが、例えば、細胞の全タンパク質を電気泳動して得られたゲルを用いてウェスタンブロットした場合に、検出される全バンドの濃さの総和値に対する、エンドグリンを示すバンドの濃さの値の割合（百分率）が、例えば30％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、99％以上であることを示す。
【００２２】
エンドグリンは、CD105と表記されることもあり、血管内皮細胞に非常に多く発現している二量体の I 型膜貫通蛋白で、TGF-β レセプターシステムのコンポーネントとして発現するタンパク質である。エンドグリンの由来生物種としては、特に制限されず、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類、好ましくはヒトが挙げられる。
【００２３】
種々の生物種由来エンドグリンのアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手することが可能である。
【００２４】
エンドグリンは、細胞内在性のエンドグリンである限りにおいて、特に白血病細胞において発現し得る内在性エンドグリンである限りにおいて置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
【００２５】
抗エンドグリン抗体のエピトープは、特に制限されず、直鎖状エピトープであっても、立体エピトープであってもよい。エピトープが直鎖状エピトープの場合、エピトープは、連続するアミノ酸配列である。また、エピトープが立体エピトープの場合、エピトープは、連続するアミノ酸配列であってもよいし、複数の、互いに連続していないアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
エピトープを構成するアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば40以下、35以下、6〜30、6〜25、6〜20、6〜15、又は6〜10である。
【００２７】
抗エンドグリン抗体は、好ましくは白血病細胞に対する結合性を有する。この場合、抗エンドグリン抗体は、エンドグリンの細胞外領域に結合性を有することになる。エンドグリンの細胞外領域は、各種データベース上で公開されており、例えばNational Center of Biotechnology Information（NCBI）上で公開されている。白血病細胞は、がん化した造血細胞であり、この限りにおいて特に制限されない。抗エンドグリン抗体は、好ましくはより未分化な白血病細胞、具体的には白血病幹細胞（例えば、CD34陽性白血病幹細胞、CD34陰性白血病幹細胞等）に結合性を有し、より好ましくは特に未分化であると考えられているCD34陰性白血病幹細胞に結合性を有する。
【００２８】
抗エンドグリン抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、Kd値、特異性などの観点から、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２９】
抗エンドグリン抗体の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、好ましくは50,000、好ましくは100,000、より好ましくは120,000であり、上限は、例えば1,000,000、好ましくは500,000、より好ましくは200,000である。
【００３０】
抗エンドグリン抗体の構造は、特に制限されない。本発明の抗体は、定常領域を含むものであってもよいし、定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００３１】
抗エンドグリン抗体の構造の具体例としては、イムノグロブリン、Fab、F(ab’)2、ミニボディ（minibody）、scFv‐Fc、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはイムノグロブリンが挙げられる。
【００３２】
イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
【００３３】
Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
【００３４】
F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
【００３５】
ミニボディとは、下記scFVを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
【００３６】
scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
【００３７】
Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していても良い。
【００３８】
scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
【００３９】
ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
【００４０】
抗エンドグリン抗体がイムノグロブリンである場合、そのアイソタイプは特に制限されない。該アイソタイプとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなどが挙げられる。好ましいアイソタイプとしては、例えばIgGが挙げられ、好ましくはIgG1が挙げられ、さらに好ましくはIgG1κが挙げられる。
【００４１】
抗エンドグリン抗体の由来は特に制限されない。本発明の抗体は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
【００４２】
抗エンドグリン抗体は、白血病の治療に有用な他の物質、例えば抗がん剤、放射性同位体等との複合体の状態であってもよい。
【００４３】
抗がん剤としては、特に制限されず、例えばイダルビシンとシタラビンとの組み合わせ、ダウノルビシンとシタラビンとの組み合わせ、ゲムツズマブオゾガマイシン、トレチノイン、トレチノインとシタラビンヤダウノルビシンとの組み合わせ、ビンクリスチンとプレドニゾロンとアントラサイクリン系抗生物質（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン等）との組み合わせ、ネララビン、イマチニブ、ヒドロキシカルバミド、インターフェロン−α等が挙げられる。
【００４４】
放射性同位体としては、特に制限されず、例えば131I、89Sr、99mTc、111In、32P、90Y、153Sm、186Re等が挙げられる。
【００４５】
抗エンドグリン抗体と他の物質との複合体は、抗エンドグリン抗体と他の物質とが、直接又はリンカーなどを介して間接的に結合することによって形成される。結合態様は特に制限されず、例えば共有結合、配位結合、イオン結合などが挙げられる。本発明の抗体と薬物との結合は、その結合態様に応じて、公知の方法に従って又は準じて実施することができる。
【００４６】
共有結合は、例えば、本発明の抗体と薬物の各々が有する官能基又は必要に応じて導入された官能基を反応させることによって行われ得る。当該官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基とカルボキシル基、カルボキシル基とヒドロキシル基、マレイミド基とチオール基、チオール基とチオール基、ヒドラジド基とケトン基、ヒドラジド基とアルデヒド基、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とカルボキシル基、アミノ基とスクアリン酸誘導体、ジエニルアルデヒド基とアミノ基、ハロエステルとチオール基、アジドとアルキン等が挙げられる。
【００４７】
2．抗エンドグリン抗体の製造方法
抗エンドグリン抗体は、例えば、エンドグリンを含み、且つエンドグリンが表面上に露出しているプロテオリポソームや細胞を免疫抗原として用い、或いはエンドグリンそのものを免疫抗原として用い、それ以外は定法に従った又は準じた方法によって製造することができる（製造方法1）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、免疫抗原を、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、免疫抗原をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られたリンパ節細胞、脾臓細胞等と、骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４８】
免疫抗原であるプロテオリポソームは、例えばエンドグリンをコードするポリヌクレオチドを用いて、公知の無細胞タンパク質合成系により、調製することができる。プロテオリポソームを構成する脂質としては、リポソームを構成可能な公知の脂質を各種使用することができる。
【００４９】
抗エンドグリン抗体の少なくともCDRのアミノ酸配列が既に分かっている場合、抗エンドグリン抗体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明の抗体を含む画分を回収する工程を含む方法（製造方法2）によっても製造することができる。
【００５０】
抗エンドグリン抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明の抗体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明の抗体コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、抗エンドグリン抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
【００５１】
抗エンドグリン抗体をコードするポリヌクレオチドの具体例としては、
（I）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（II）本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（III）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
などが挙げられる。
【００５２】
宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞など好ましい。
【００５３】
形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。
【００５４】
回収後は、必要に応じて本発明の抗体を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
【００５５】
3．用途
抗エンドグリン抗体は、白血病改善作用を有するので、種々の用途、例えば白血病改善剤の有効成分として好適に利用することができる。この観点から、本発明は、その一態様において、抗エンドグリン抗体を含有する、白血病改善剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。
【００５６】
対象となる白血病としては、特に制限されず、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄腫等が挙げられる。
【００５７】
白血病の「改善」とは、白血病の症状が改善することを意味する。例えば、脾臓の腫大が症状である場合は、それが縮小することが白血病が「改善」することをであり、またある組織における白血病細胞の増加が症状である場合、該細胞数が減少すること又は増加抑制されることが、白血病が「改善」することである。
【００５８】
本発明の剤中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の剤中の有効成分の含量は、本発明の剤全体を100重量部として0.0001重量部〜100重量部程度をすることができる。
【００５９】
本発明の剤の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下注射、直腸内投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される担体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００６０】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。本発明の剤は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【００６１】
本発明の剤は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の剤は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
【００６２】
本発明の剤の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
【００６３】
本発明の剤の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。本発明の剤の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６５】
実施例1．白血病細胞結合抗体のスクリーニング
免疫源として、白血病のCD34陰性細胞分画を重症免疫不全（NOG）マウスへ移植することにより白血病が再構築されることが確認された急性リンパ球性白血病細胞を用いた。免疫源をアジュバントと混合しBalb/cマウスの足底部に1回/週のペースで3週間免疫した。マウスの鼡径リンパ節よりリンパ球浮遊液を作製し、マウス骨髄腫細胞株（NS-1）と融合させて多数のhybridomaクローンを作製した。これらのhybridoma培養上清中の抗体と免疫に用いた白血病細胞との結合性をFACSによりスクリーニングして、白血病細胞と特異的な結合能を持つモノクローナル抗体を産生するhybridomaクローンを選別した。選別されたクローンのモノクローナリティは、FACSによりシングルセルソーティングに供した後に再培養を行うことにより確保した。さらに、これらのクローンを無血清培地中で大量培養を行うことにより、牛胎仔血清由来の抗体を含まない純度の高い抗体を精製した。
【００６６】
得られた抗体の標的抗原を、免疫沈降と質量分析により調べた。具体的には、得られた抗体と得られた抗体に対する結合能を持つ白血病細胞株を用いて免疫沈降を行い、ポリアクリルアミド電気泳動により抗原由来バンドを作製した。抗原由来バンドを切り出したものをサンプルとして質量分析（LC-MS/MS解析）を行い、各抗体の標的抗原を同定した。また、抗体のアイソタイプをThermo Fisher Scientific社Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit（製品番号37503）を使用して決定した。
【００６７】
その結果、1クローンの抗体（303-23）が標的抗原をエンドグリンとするIgG1κタイプの抗体であることが同定された。免疫沈降の結果を図２に、アイソタイピングの結果を図３に示す。
【００６８】
実施例2．抗エンドグリン抗体の白血病細胞株に対する結合性の評価
実施例1で得られた抗エンドグリン抗体を、終濃度5μg/mlの濃度で各細胞株（急性骨髄性白血病細胞株THP-1、F-36P、急性リンパ球性白血病細胞株NALM-6、又は慢性骨髄性白血病細胞株KU-812）細胞浮遊液に添加し、4℃で30min間静置することにより反応させた。細胞を生理食塩水で洗浄の後、PE結合抗マウスIgG抗体を同様に反応させた。再度細胞を洗浄し、死細胞判定のための試薬7AADを添加した生理食塩水に浮遊させた。得られた細胞をフローサイトメトリーにより解析し、生細胞中の抗エンドグリン抗体結合細胞（PE陽性細胞）の割合（陽性率）を測定した。解析結果を示すヒストグラムを図４に示す。
【００６９】
その結果、各細胞株に対する陽性率はTHP-1：98.19%、F-36P：98.28%、NALM-6 ：99.44%、KU812：84.83%であった。
【００７０】
実施例3．抗エンドグリン抗体の患者由来白血病細胞に対する結合性の評価
細胞株に代えて、患者から採取した白血病細胞（急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、及び慢性骨髄性白血病細胞）を用い、白血病細胞の全分画又はCD34及びCD38を指標とした各分画（具体的には、CD34+分画、CD34+CD38-分画、及びCD34-CD38-分画）における陽性率を測定する以外は、実施例2と同様にして行った。解析結果を示すヒストグラムを図５に示す。また、各細胞及び各分画に対する陽性率を表１〜３にまとめて示す（表１：急性骨髄性白血病細胞、表２：急性リンパ性白血病細胞、表３：慢性骨髄性白血病細胞）。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
表１〜３及び図５に示されるように、抗エンドグリン抗体は、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、及び慢性骨髄性白血病細胞全てに対して結合性を有することが分かった。また、抗エンドグリン抗体は、急性骨髄性白血病に対してはFAB分類のM1〜M7の全ての病型に対する結合性を示した。さらに、抗エンドグリン抗体は、白血病幹細胞が高い比率で存在すると考えられる各細胞分画（CD34+CD38-、CD34-CD38-）に対しても結合性を示した。以上より、抗エンドグリン抗体は、白血病に対して、白血病の種類及び病型を問わずに改善作用を発揮できることが示唆された。
【００７５】
実施例4．抗エンドグリン抗体の抗白血病作用の評価1
本発明者は、すでにヒト骨髄由来Lin-CD45-細胞よりCD34+HSC、及びCD34-HSCに対する高い支持能を持つCD271陽性SSEA-4陽性間葉系幹細胞 (DP-MSC) の樹立に成功している（非特許文献１７）。このDP-MSCと患者由来急性リンパ球性白血病細胞（検体番号UPN303）との共培養を行い、そこへ抗エンドグリン抗体を添加し、添加から7日目に生存細胞数を計測した。計測結果に基づいて、白血病細胞の増加率［＝7日目の生存細胞数／抗体添加直前の生存細胞数］及び生存率［＝（7日目の生存細胞数／7日目の総細胞（死細胞含む）数）×100］を算出した。結果を図６に示す。
【００７６】
図６に示されるように、抗エンドグリン抗体の濃度が高くなるに従い、白血病細胞の増加率及び生存率が有意に減少することが分かった。
【００７７】
実施例5．抗エンドグリン抗体の抗白血病作用の評価2
本実施例の試験方法の概要を図７に示す。重症免疫不全（NSG）マウスに白血病細胞1.0x105個を骨髄内直接移植法により移植し、翌日よりマウスに抗エンドグリン抗体の腹腔内注射による投与を開始した。1回投与量は300μgとして、週一回の投与を10週間継続した。マウスIgGアイソタイプ抗体を比較対照群に同様の方法で投与した。10週経過した時点でマウス体内の白血病細胞を解析した。解析は、（1）脾臓、（2）移植した左脛骨の骨髄、（3）反対側の脛骨と両側の大腿骨の骨髄、及び（4）末梢血に対して、急性リンパ性白血病細胞の表面マーカーであるCD19抗原に対する抗体を使用し、フローサイトメーターを用いて行った。脾臓については撮像、及び重量の測定も行った。
【００７８】
脾臓の写真を図８に示す。図８Ａが白血病細胞の移植を行っていない比較対照マウスの脾臓、図８Ｂが白血病細胞を移植しマウスIgGアイソタイプ抗体を投与した比較対照マウスの脾臓、図８Ｃが白血病細胞を移植し抗Endoglin抗体を投与したマウスの脾臓である。図８Ｄに各々のマウスより得られた脾臓の重量を示す。各々の平均重量は44.5mg、269.3mg、43.8mg（図８Ｄ）であった。図８Ａ〜Ｃに示すように、白血病を移植し且つマウスIgGアイソタイプ抗体を投与した比較対照マウスの脾臓は著しく腫大しているのに対して、抗エンドグリン抗体を投与したマウスの脾臓は、白血病を移植していない比較対照マウスと同程度であり、白血病細胞による脾臓の腫大が著しく抑制されていた。また、図８Ｄに示すように、抗エンドグリン抗体を投与したマウスの脾臓重量はIgGアイソタイプ抗体を投与した比較対照マウスの脾臓重量よりも統計学的有意に低値であった。
【００７９】
また、骨髄内直接移植法で移植した左脛骨の骨髄（図９Ａ）、反対側の脛骨と両側の大腿骨（図９Ｂ）、及び脾臓（図９Ｃ）における、白血病細胞の絶対数、並びに末梢血中の白血病細胞の濃度（血液1μl中の数、図９Ｄ）は、いずれもマウスIgGアイソタイプ抗体を投与した比較対照マウスに比べて、抗エンドグリン抗体を投与したマウスでは明らかに少なかった。白血病細胞数は、特に、末梢血では約300分の1、脾臓では約3000分の1であった。
【００８０】
以上のより、抗エンドグリン抗体がin vivoにおいて抗白血病作用を発揮することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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