(57)【要約】【課題】本発明は、幅広い温度制御を可能とし、細胞に損傷を与えない条件下での培養細胞の分離回収が可能で、室温での実験操作がより容易となる、ＨＰＣ誘導体が固定化された温度応答性培養基材を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の温度応答性細胞培養基材は、基材表面の少なくとも一部に、特定のカーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体が膜状に固定化され、膜厚が１〜１００ｎｍであることを特徴とする。【選択図】図１
2017079648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2017079648.tif 000009
［式中、Ｒ１は、−Ｈ、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍＨ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍ−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２のいずれかである。またｎは１００以上、２０００以下の整数であり、ｍは１以上、５以下の整数である。Ｒ２は同一又は異なり、総炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基である。］
で表される繰り返し単位を有するカーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体が、基材表面の少なくとも一部に膜状に固定化され、かつ、該セルロース誘導体が下記（Ｉ）及び（ＩＩ）：
（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０
（ＩＩ）ＤＳ：０．１〜２．０
［ここで、ＭＳは、無水グルコースユニットあたりの−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−基のモル置換度であり、ＤＳは、無水グルコースユニットあたりの−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２基のモル置換度である。］
を満たし、該セルロース誘導体の膜厚が１〜１００ｎｍである、温度応答性細胞培養基材。
【請求項２】
基材表面にアミノ基を導入する工程；及び
前記セルロース誘導体を、該セルロース誘導体の末端アルデヒド基と該アミノ基との反応により基材表面に固体化させる工程；
を含む、請求項１に記載の温度応答性細胞培養基材の製造方法。
【請求項３】
前記セルロース誘導体の固定化工程において、反応時間が１０〜２０時間であり、反応温度が４０〜５０℃である、請求項２に記載の温度応答性細胞培養基材の製造方法。
【請求項４】
下記式（１）：
【化２】
2017079648.tif 000010
［式中、Ｒ１は、−Ｈ、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍＨ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍ−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２のいずれかである。またｎは１００以上、２０００以下の整数であり、ｍは１以上、５以下の整数である。Ｒ２は同一又は異なり、総炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基である。］
で表される繰り返し単位を有し、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）：
（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０
（ＩＩ）ＤＳ：０．１〜２．０
［ここで、ＭＳは、無水グルコースユニットあたりの−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−基のモル置換度であり、ＤＳは、無水グルコースユニットあたりの−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２基のモル置換度である。］
を満たす、温度応答性細胞培養基材用カーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞培養基材及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、プラスチック（例：ポリスチレン）やガラスの容器が使用されてきた。これらの容器は、細胞培養を有効に行えるようにするために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等を固定化させた表面処理が施されている。従って、これら細胞培養容器を培養基材として用いる場合には、培養・増殖した細胞が表面処理された容器表面に接着しており、細胞を単離・剥離するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素 や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要がある。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が 煩雑であるほか、操作中に雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する場合がある。また、酵素や化学薬品の影響で、細胞自身が損傷を受けてしまう問題がある。
【０００３】
近年、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（以下「ＰＮＩＰＡＡｍ」とも称す）のホモポリマー又はコポリマーを極薄くコーティングした温度応答性細胞培養基材が知られている（非特許文献１及び特許文献１〜２）。このＰＮＩＰＡＡｍは３２℃未満では水溶性であるが、３２℃以上では急激な脱水和を生じ、疎水性相互作用により高分子鎖が凝集して相分離を起こす化合物である。このようなＰＮＩＰＡＡｍを基材表面に導入すると、表面の親疎水性を温度によって大きく変えることができる。
【０００４】
一方、生分解性を有し、容易に機能化もできる新しい多糖類ポリマーも研究されている。その中でもヒドロキシプロピルセルロース（以下「ＨＰＣ」とも称する）は、天然に広く存在するセルロース（パルプ）を原料とし、これを水酸化ナトリウムで処理した後、酸化プロピレンと反応させて得られる非イオンセルロースエーテルである。日本では、日本薬局方第二部に収載され、錠剤・顆粒剤の滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤、結合剤、シロップの懸濁・安定化剤、パップ剤の増粘剤、軟膏、ゼリー基剤等として使用されている。米国において、ＨＰＣは食品添加物、間接食品添加物及び医薬品の原料等として使用されており、食品添加物としては乳化剤、フィルム形成剤、保護コロイド、安定剤、分散剤、粘稠化剤及び結合剤としてＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）のもとで使用が認められている。また、欧州連合（ＥＵ）では、食品添加物及び医薬品添加剤として使用が認められており、食品添加物としては一部の食品を除いて一般食品にＧＭＰのもとで使用することができ、また、成分規格が定められている。
【０００５】
市販のＨＰＣにおいて、ヒドロキシプロピル基によるモル置換度が２〜４のものは、水及び低級アルコール等に溶解する。モル置換度が０．１６〜０．４の低置換度ＨＰＣは、水及び有機溶剤に対して不溶性である。また、ＨＰＣの水溶液は、所定温度以下では水和し、所定温度以上では脱水和することにより体積変化を引き起こす下限臨界溶液温度（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（以下「ＬＣＳＴ」とも称す）を有することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５２２７２２３号公報
【特許文献２】特許第５０８０８４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】岡野らＬａｎｇｍｕｉｒ，２０，５５０６〜５５１１（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＰＮＩＰＡＡｍを用いた温度応答性基材は、トリプシン等の酵素を用いずに培養細胞を回収できるが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のモノマーであるＮ−アルキルアクリルアミドは強い臭気を発するうえ、神経毒性を有しているため取扱いが難しい。また、ＬＣＳＴが３２℃と固定されており、幅広い温度制御は難しく、応用範囲が限定されている。また、細胞継体培養期間中で、そのＬＣＳＴ（３２℃）よりも低い室温にて培地交換や顕微鏡観察を行う際、細胞の自発的な剥離が発生するため、実験操作に注意を要する。
【０００９】
一方、ＨＰＣのＬＣＳＴは分子量に応じて４０〜５５℃と高いため、ＨＰＣを温度応答性ポリマーとして細胞培養基材に用いることには適していない。
そこで、本発明は、幅広い温度制御を可能とし、細胞に損傷を与えない条件下での培養細胞の分離回収が可能で、室温での実験操作がより容易となる、ＨＰＣ誘導体を固定化した新規の温度応答性細胞培養基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、好適なＬＣＳＴを有するＨＰＣ誘導体を、膜厚１〜１００ｎｍで基材に固定化した温度応答性培養基材が、良好な細胞培養特性を有し、トリプシン等の酵素や化学薬品を用いずに細胞を剥離・回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
［１］下記式（１）：
【化１】
2017079648.tif 000003
［式中、Ｒ１は、−Ｈ、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍＨ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍ−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２のいずれかである。またｎは１００以上、２０００以下の整数であり、ｍは１以上、５以下の整数である。Ｒ２は同一又は異なり、総炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基である。］
で表される繰り返し単位を有するカーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体が、基材表面の少なくとも一部に膜状に固定化され、かつ、該セルロース誘導体が下記（Ｉ）及び（ＩＩ）：
（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０
（ＩＩ）ＤＳ：０．１〜２．０
［ここで、ＭＳは、無水グルコースユニットあたりの−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−基のモル置換度であり、ＤＳは、無水グルコースユニットあたりの−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２基のモル置換度である。］
を満たし、該セルロース誘導体の膜厚が１〜１００ｎｍである、温度応答性細胞培養基材。
［２］基材表面にアミノ基を導入する工程；及び
前記セルロース誘導体を、該セルロース誘導体の末端アルデヒド基と該アミノ基との反応により基材表面に固体化させる工程；
を含む、［１］に記載の温度応答性細胞培養基材の製造方法。
［３］前記セルロース誘導体の固定化工程において、反応時間が１０〜２０時間であり、反応温度が４０〜５０℃である、［２］に記載の温度応答性細胞培養基材の製造方法。
［４］下記式（１）：
【化２】
2017079648.tif 000004
［式中、Ｒ１は、−Ｈ、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍＨ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍ−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２のいずれかである。またｎは１００以上、２０００以下の整数であり、ｍは１以上、５以下の整数である。Ｒ２は同一又は異なり、総炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基である。］
で表される繰り返し単位を有し、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）：
（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０
（ＩＩ）ＤＳ：０．１〜２．０
［ここで、ＭＳは、無水グルコースユニットあたりの−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−基のモル置換度であり、ＤＳは、無水グルコースユニットあたりの−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２基のモル置換度である。］
を満たす、温度応答性細胞培養基材用カーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体。
【発明の効果】
【００１２】
本発明において提供される温度応答性細胞培養基材は、その表面が細胞培養に好適な状態を有している。また、製造方法が簡便であり、高価な装置が不要で量産を容易に行うことができる。更に、培養細胞の剥離工程において酵素や化学薬品による細胞の破損や、薬品の混入を生じることなく、迅速に細胞を剥離回収することができる。また、室温において、細胞の剥離を生じることなく実験操作を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のＬＣＳＴ測定における図である。
【図２】実施例１〜３及びＨＰＣ誘導体による固定化をしていない基材（以下「コントロール基材」と称す）に関する、基材表面の温度応答性を示した図である。詳細には、基材の表面温度を、横軸で示される１８℃、３７℃、１８℃、３７℃、１８℃の順で昇温・降温を繰り返し、接触角を測定した図である（以下、図３及び図４も同様である）。
【図３】実施例７〜８及び比較例３ならびにコントロール基材に関する、基材表面の温度応答性を示した図である。
【図４】実施例７，９〜１０及びコントロール基材に関する、基材表面の温度応答性を示した図である。
【図５】実施例４にて作製した基材のＨＰＣ誘導体の膜厚を示したＴＥＭ画像である。
【図６】実施例５にて作製した基材のＨＰＣ誘導体の膜厚を示したＴＥＭ画像である。
【図７】実施例６にて作製した基材のＨＰＣ誘導体の膜厚を示したＴＥＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［ＨＰＣ誘導体］
本発明の温度応答性細胞培養基材は、ＨＰＣの構成単位である無水グルコース単位当たり３個存在する水酸基がカーボネート置換基で置換され、前記置換基の置換度が特定の関係を満足するＨＰＣ誘導体を用いる。具体的には、該ＨＰＣ誘導体は、前記式（１）で表される繰り返し単位を有し、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）：
（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０
（ＩＩ）ＤＳ：０．１〜２．０
［ここで、ＭＳは、無水グルコースユニットあたりの−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−基のモル置換度であり、ＤＳは、無水グルコースユニットあたりの置換基−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２基のモル置換度である。］を満たすカーボネート化ヒドロキシプロピルセルロース誘導体である。
【００１５】
本発明のＨＰＣ誘導体において、ｎは２以上２０００以下の整数であるが、好ましくは１００以上、２０００以下であり、より好ましくは２００以上、１０００以下である。
本発明のＨＰＣ誘導体において、ｍは１以上、５以下の整数であるが、好ましくは２以上、４以下である。
本発明のＨＰＣ誘導体において、Ｒ１は、−Ｈ、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍＨ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２、｛−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−｝ｍ−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２のいずれかであるが、これら置換基の種類と、式（１）中の３箇所のＲ１の置換位置とには特段の関係はなく、それぞれ同一でも異なっていてもよい。ただし、（Ｉ）ＭＳ：１．０〜５．０の条件から明らかなように、Ｒ１のすべてが−Ｈであることはない。
【００１６】
前記条件（Ｉ）において、ＭＳは無水グルコースユニット当たりに反応した酸化プロピレンのモル数を表す。本発明のＨＰＣ誘導体のＭＳは、水あるいは低級アルコールへの溶解性の点から、通常１〜５であり、好ましくは２〜４である。ＭＳの測定方法は、１Ｈあるいは１３Ｃ  ＮＭＲにより算出する。
本発明のＨＰＣ誘導体は、ＨＰＣの水酸基の少なくとも一部が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２で表される基で置換された構造を有する。ここで、Ｒ２は、総炭素数５以下のアルキル基又はアルコキシアルキル基である。総炭素数６以上の場合、水への溶解性が低下するため、好ましくない 。
【００１７】
Ｒ２で示される炭素数５以下のアルキル基は、直鎖状、分岐状、又は環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、シクロペンチル基等が例示できる。
Ｒ２で示される総炭素数５以下のアルコキシアルキル基は、直鎖状、分岐状又は環状のいずれであってもよく、メトキシエチル基、メトキシプロピル基、メトキシブチル基、エトキシエチル基、エトキシプロピル基等が例示できる。
Ｒ２としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、イソブチル基、ｎ−ブチル基、メトキシエチル基、メトキシブチル基を用いることができ、ＨＰＣ水溶液のＬＣＳＴを０〜５０℃の範囲で必要に応じて変化させることができる 。
【００１８】
本発明のＨＰＣ誘導体において、ＨＰＣの水酸基は、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２で表される基により置換されており、その無水グルコースユニットあたりのモル置換度をＤＳという。ＤＳは通常０．１〜２．０であり、好ましくは０．２〜１．０である。ＤＳが２を超える場合は、水への溶解性が低下するため、好ましくない。ＤＳが０．１未満の場合は、本発明の細胞培養基材の温度応答性が不十分となる 。
ＨＰＣは、無水グルコースユニット中に３つの水酸基が存在するが、各無水グルコースユニット間で−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２で表される基で置換される水酸基の数及び位置は異なっていてもよい。
【００１９】
本発明のＨＰＣ誘導体の製造方法については特に制限はないが、製造の容易さ、特に溶媒の入手の容易さや取り扱いの容易さから、ＨＰＣとハロゲン化蟻酸エステルとを、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、ジアルキルエーテル、ジアルキルカーボネート、及び酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種を溶媒として用いて反応させることが好ましい。かかる溶媒の選択により、従来の方法に比べ、精製工程が簡易なものとなり、本発明のＨＰＣ誘導体の製造が容易となるからである。この反応は、活性水素を有しないアルカリ性化合物の存在下で行うことが好ましい。
【００２０】
ハロゲン化蟻酸エステルのハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられるが、塩素原子が好ましい。
ハロゲン化蟻酸エステルは、公知の方法により合成し、又は市販品として入手することができる。クロロギ酸エステルとしては、例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸プロピル、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸ブチル、クロロギ酸イソブチル、クロロギ酸へキシルが挙げられる。
【００２１】
ハロゲン化蟻酸エステルの使用量は、原料ＨＰＣの無水グルコースユニット１モルに対し、１〜５モルが好ましく、１〜３モルがより好ましい。１モルより少ないと、十分なカーボネート化が行われず、５モルより多いと、未反応物や副生成物などの不純物が増加し、好ましくない。
原料ＨＰＣは、公知の方法により合成して入手することができる。例えば、セルロースとプロピレンオキシド等のエポキシ化合物とを反応させることにより製造することができる。また、市販品として入手することも可能である。
【００２２】
反応温度と時間は、使用するＨＰＣ、ハロゲン化蟻酸エステル及び溶媒の量等により適宜決定すればよいが、反応温度としては０〜５０℃が好ましく、反応時間としては１時間〜７２時間が好ましい。
得られた反応混合物より、本発明のＨＰＣ誘導体は、常法に従って精製、単離することができる。例えば、簡便な方法としては、透析膜を用いてＨＰＣ誘導体を単離することができる。次に、凍結乾燥機により水を除去しＨＰＣ誘導体の精製することができる。
【００２３】
本発明において好適に使用できる温度応答性を有するＨＰＣ誘導体は、細胞培養温度下（通常３７℃程度）においては、疎水性を有し、ＨＰＣ誘導体の高分子鎖が収縮性を示し、培養した細胞の剥離時の温度下においては、ＨＰＣ誘導体が親水化し、その高分子鎖が膨潤し伸縮性を示すと考えられる。なお、温度応答性であるＨＰＣ誘導体のＬＣＳＴは、培養後の細胞の剥離の容易さの観点から、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の接着面が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞の剥離時においては、ＨＰＣ誘導体の膜が親水化することによって、膜の表層が膨潤すると考えられ、培養された細胞が細胞培養基材から分離されることで、細胞の剥離をより一層容易にすることができる。
【００２４】
本発明において好適に使用できる温度応答性ＨＰＣ誘導体は、具体的にはＬＣＳＴが０〜５０℃、好ましくは２０〜５０℃であるポリマーが好ましい。ＬＣＳＴが５０℃を超えると培地の揮発が起こり細胞の死滅の可能性があるので好ましくない。また、ＬＣＳＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、又は細胞が死滅してしまうため好ましくない。
本発明のＨＰＣ誘導体の分子量は、重量平均分子量で１００００〜１００００００が好ましい。分子量が１００００未満では、ＨＰＣ誘導体の膜が不安定になり、１００００００を超えると溶解性が悪くなるので好ましくない。
【００２５】
［基材］
ＨＰＣ誘導体が固定化される基材は、その表面が、前記ＨＰＣ誘導体と反応により共有結合し得る材料を含むものである限り特に限定されず。表面が前記ＨＰＣ誘導体と反応して共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面又は中間層に本発明の目的を防げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を実施してもよい。例えば、オゾン処理、プラズマ照射処理、プラズマ重合処理、スパッタリング等の処理技術を用いて表面に官能基の導入することができる。
【００２６】
基材を構成する材料であって、それ自体が上記ＨＰＣ誘導体と共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド（ナイロン）、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有シリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーからなるものであってもよい。
【００２７】
上記ＨＰＣ誘導体と共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理又はプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーからなるものであってもよい。
【００２８】
基材の形状としては、プレート、トレー、ディッシュ形状や、フィルム形状等が挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面にＨＰＣ誘導体層を形成した後、細胞培養に適した形状に加工することができる。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組合せて使用することもできる。
【００２９】
［固定化用組成物］
本発明の温度応答性細胞培養基材の製造方法では、ＨＰＣ誘導体の末端アルデヒド基と基材表面に導入されたアミノ基とを反応させるため、ＨＰＣ誘導体と有機溶媒とを含む固定化用組成物を用いる。この固定化用組成物と基材表面との反応により、基材表面の全面に均一なＨＰＣ誘導体の固定化層を形成することができる。
固定化用組成物にはＨＰＣ誘導体が単独又は複数種含まれる。ＨＰＣ誘導体の分子量は、特に限定されず、重量平均分子量で１００００より大きいものが好ましく、重量平均分子量で４００００以上のものがより好ましい。上限は特に限定されず、重量平均分子量で５０００００以上であってもよい。
【００３０】
有機溶媒としてはＨＰＣ誘導体を溶解しうるものであれば特に限定されないが、常圧下において沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ（若しくはｉ）−プロパノール、２（若しくはｎ）−ブタノール、及びバッファー、水等が挙げられ、それらの１種以上使用してよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノールなども１種以上使用してよい。
固定化用組成物中のＨＰＣ誘導体の含有量は０．０１重量％〜２０重量％であることが好ましい。
【００３１】
［固定化工程］
前記固定化組成物を前記基材の表面に塗布してその表面上に固定化層を形成する方法は、特に制限されず、例えば、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応、また、塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。そのうち、プラズマ処理あるいはプラズマ重合等の手法により基材表面に導入されたアミノ基、カルボキシル基、水酸基等と、本発明のＨＰＣ誘導体との反応により、固定化することもできる。また、末端アルデヒド基を有するＨＰＣ誘導体を０．０１重量％〜２０重量％で溶媒に溶解させた溶液と、アミノ基が導入された基材表面とを反応させて形成されるシッフ塩基による共有結合によりＨＰＣ誘導体を固定化させることができる。反応 温度と時間は、基材の表面官能基の種類により適切に決定してもよいが、反応温度は、使用する溶媒の沸点より低く、特に３０〜６０℃の反応温度が好ましく、より好ましくは４０〜５０℃である。反応時間は、通常１時間〜７２時間であり、好ましくは１０〜２０時間である。また、その際のＨＰＣ誘導体の溶液は、静置させてもよいが、動的に振盪させることで、膜の均一性を向上させることができる。有機溶媒は、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒が好適である。
【００３２】
［洗浄工程］
前記の固定化工程を経て形成されたＨＰＣ誘導体層には、基材表面に固定されたＨＰＣ誘導体分子だけでなく、固定化されていない遊離のＨＰＣ誘導体分子が存在している。よって、これらの遊離ＨＰＣ誘導体を除去するために洗浄を行う洗浄工程を更に含むことが好ましい。洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には、浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては、典型的には各種水系、アルコール系が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養基材に応じて適宜選択すればよい。
【００３３】
［乾燥工程］
前記洗浄工程に残留する洗浄液を除去する乾燥工程を含む。
乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風乾燥法、真空乾燥法などが挙げられる。
【００３４】
［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材は、温度応答を制御できるＨＰＣ誘導体を用いることを特徴とする。
本発明の細胞培養基材は、その基材表面に固定化された温度応答性のＨＰＣ誘導体層の厚さが、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であることが良く、好ましくは２〜５０ｎｍの範囲であることが良く、更に好ましくは５〜４０ｎｍの範囲であることが良い。厚さが１ｎｍ未満の場合は、細胞の剥離性が低下し、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に１００ｎｍを超えると、細胞の接着性が低下し、細胞培養が困難となる。このようなＨＰＣ誘導体層の厚さは、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）測定、被覆部若しくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に、接触角測定やＸ線光電子分光法による表面分析を単独或いは併用して求めることができる。
【００３５】
［細胞剥離方法］
本発明の細胞培養基材を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮さ細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、更には骨髄細胞、ＥＳ細胞等を剥離できる。
【００３６】
本発明において好適に使用できる温度応答性を有するＨＰＣ誘導体は、細胞培養温度下（通常３７℃程度）においては疎水性を示し、細胞の剥離時の温度下においては培養基材の表面が親水性を示すことが特徴である。基材表面が親水性となった場合、ＨＰＣ誘導体の膜が膨潤し伸縮性を有することで細胞が剥離しやすくなると考えられる。この細胞培養基材から細胞を剥離する方法として、培養基材をＨＰＣ誘導体が有する所定のＬＣＳＴ以下の温度にして、軽く振動を与えるか、細胞を吸い込まないように注意しながら細胞上方からピペッティング操作を繰り返すことで、細胞を容易に剥離することができる。これらの剥離方法は、剥離用の酵素や化学薬品等の必要が無く、また、細胞の生存に影響を与えない温度下で剥離することが可能である。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３８】
（１）ＨＰＣ誘導体の合成及びＬＣＳＴの測定
本実施例で使用したＨＰＣは、日本曹達製ＨＰＣ−Ｌであり、平均分子量１４０，０００、ＭＳ２．７５を有する。クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸へキシル、超脱水テトラヒドロフラン、及びピリジンは和光純薬工業（株）製を使用した。
蟻酸エステル導入量は、１３Ｃ  ＮＭＲ定量モード（ＮＮＥ）により算出する。具体的には、セルロース部分は１０１ｐｐｍに検出されるアノメリック位の炭素のピーク面積を基準にして炭酸エステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）由来のピークとエステル基の末端メチルのピークを基準にして算出した。
感温性高分子水溶液の相分離温度であるＬＣＳＴの測定は、生成物ＨＰＣエチルカーボネートの水溶液の相分離現象をブルックフィールドＢ型粘度計（アナログ粘度計Ｔ）により調べた。詳細には、ＨＰＣ生成物の水溶液（５質量％）をＬＶ−１スピンドルに入れ、回転速度（１００ｒｐｍ）、測定温度（１０〜４０℃）を制御しながらデータを収集した。加熱速度は、１．０℃／分であった。
【００３９】
［合成例１］
１０００ｍＬの三口フラスコに、バキュームスターラー、塩化カルシウム管付きコンデンサー及び窒素導入管を取り付け、フラスコ内を窒素置換した。乾燥した窒素雰囲気下でテトラヒドロフラン５００ｍＬ、ＨＰＣ（日本曹達製ＨＰＣ−Ｌ）３０．０ｇ、及びピリジン９．０ｇを加えた。この溶液を氷冷バスで１０℃程度にまで冷却し、一様に攪拌しながらゆっくりとクロロ蟻酸エチル１２．４ｇを滴下した。全量を滴下した後、ゆっくりと２０℃まで温度を上げ、１時間そのまま攪拌を続けた。攪拌後、７０℃熱水で３回洗浄を行い、１２時間４０℃真空乾燥して目的の化合物であるＨＰＣエチルカーボネート２４．０ｇを得た（収率：８０％）。フーリエ変換型赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社  Ｎｉｃｏｌｅｔ６７００）及び高分解能核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、日本電子  ＥＣＡ−５００）により解析を行い、目的物の生成を確認した。さらに、ＮＭＲにより解析した結果、原料ＨＰＣの水酸基はＨＰＣの無水グルコースユニットの０．３３モルがエチルカーボネート残基（−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＥｔで表される基）で置換されていた。
１３Ｃ  ＮＭＲ  （５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：１５３ｐｐｍ（蟻酸エステルのＣ＝Ｏ炭素ピーク）、１０１ｐｐｍ（アノメリック位炭素）、１４ｐｐｍ（エチル基の末端）メチルピーク）。
ＩＲ（ＫＢｒ）：１７４０ｃｍ−１（蟻酸エステルのＣ＝Ｏピーク）、１２６５ｃｍ−１（蟻酸エステルのＣ−Ｏピーク）。
上記合成により得られたＨＰＣ誘導体のＬＣＳＴの測定結果を図１に示す。２１℃付近で粘度が激しく下がり始め相分離現象が確認されたことから、ＬＣＳＴは２１℃であることを確認した。また、ＬＣＳＴ温度が４７℃である原料ＨＰＣと比べ、ＬＣＳＴは低温側にシフトしていた。
【００４０】
［合成例２］
クロロ蟻酸エチル１２．４ｇの代わりにクロロ蟻酸エチル１０．３ｇを使用した以外は、合成例１と同様にして、ＨＰＣエチルカーボネート２２．０ｇを得た。エチルカーボネート残基によるモル置換度は０．２８であった。ＬＣＳＴは２７℃であった。
【００４１】
［合成例３］
クロロ蟻酸エチル１２．４ｇの代わりにクロロ蟻酸エチル６．２ｇを使用した以外は、合成例１と同様にして、ＨＰＣエチルカーボネート１８．０ｇを得た。エチルカーボネート残基によるモル置換度は０．２５であった。ＬＣＳＴは３４℃であった。
【００４２】
［合成例４］
クロロギ酸エチルの代わりにクロロギ酸メチル１０．８ｇを使用した以外は、合成例１と同様にして、ＨＰＣメチルカーボネート９．２ｇを得た。メチルカーボネート残基によるモル置換度は０．２３であった。ＬＣＳＴは２６℃であった。
１３Ｃ  ＮＭＲ  （５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：１５３ｐｐｍ（蟻酸エステルのＣ＝Ｏ炭素ピーク）、１０１ｐｐｍ（アノメリック位炭素）、１６ｐｐｍ（メチルピーク）。
【００４３】
［合成比較例１］
クロロ蟻酸エチル１２．４ｇの代わりにクロロ蟻酸エチル６２．０ｇを使用した以外は、合成例１と同様にして、ＨＰＣエチルカーボネート２８．５ｇを得た。エチルカーボネート残基によるモル置換度は２．５であった。ＬＣＳＴは、得られたＨＰＣが不溶解性であったため、測定できなかった。
【００４４】
［合成比較例２］
クロロ蟻酸エチルの代わりにクロロ蟻酸へキシル１８．８ｇを使用した以外は、合成例１と同様にして、ＨＰＣへキシルカーボネート２７．３ｇを得た。へキシルカーボネート残基（−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＨｅｘで表される基）によるモル置換度は、０．５４であった。ＬＣＳＴは、得られたＨＰＣが不溶解性であったため、測定できなかった。
【００４５】
［合成比較例３］
疎水性基を導入していない原料のＨＰＣ（日本曹達製ＨＰＣ−Ｌ，分子量１４０，０００）についてＬＣＳＴを測定したところ、４５〜４７℃であり、細胞培養温度の３７℃よりも高かった。
合成例１〜４及び合成比較例１〜３結果を、表１にまとめる。
【００４６】
【表１】
2017079648.tif 000005
【００４７】
表１より、カーボネート化の程度を制御し、ＨＰＣ誘導体の疎水基及びその置換度を適切に選択すれば、そのＬＣＳＴを幅広く制御できることがわかる。
【００４８】
（２）細胞培養基材の作製・細胞の剥離評価
振盪固定化による細胞培養基材の作製
コーニング社製のアミノ基が被覆された６ウェルプレート（商品名：ＰｕｒｅｃｏａｔＴＭアミン）を用いて、上記合成例で得られたＨＰＣ誘導体を溶解させた５重量％のメタノール溶液５ｍｌずつを上記市販の６ウェルプレートに分注し、溶媒が揮発しないように、プレートの蓋を耐熱性テープでシリングした。振盪固定化用装置としては、加温型ロッキングミキサー（アズワン社製、ＨＲＭ１  ＨＯＴ  ＲＯＣＫＩＮＧ  ＭＩＸＥＲ）を用いた。詳細には、振盪台の傾斜角度：７度、回転速度：５６ｒｐｍに設定した。また、ウェル内の溶液温度を４５℃になるように設定した。その後、上記の６ウェルプレートをロッキングミキサーの振盪台に放置し、所定の固定化反応時間に設定した。反応終了後、ウェルプレート内のＨＰＣ誘導体の溶液を捨て、その後、試薬特級グレードのメタノール５ｍｌずつ所定回数で洗浄を行った。洗浄後のウェルプレートをオーブン（ＥＹＥＬＡ社製、ＶＯＳ−４５０ＳＤ）に入れ、４０℃にて２時間で真空乾燥を行った。
【００４９】
静置固定化による細胞培養基材の作製
コーニング社アミノ基が被覆された６ウェルプレート（商品名：ＰｕｒｅｃｏａｔＴＭアミン）に対して。実施例２のＨＰＣ誘導体を用いて、その５重量％のメタノール溶液５ｍｌずつを６ウェルプレートに分注する。固定化はオーブン（ＥＹＥＬＡ社製、ＶＯＳ−４５０ＳＤ）を用いて、ウェル内液温度が所定の温度になるように加熱温度を設定する。その後、上記の６ウェルプレートをオーブン内に静置し、所定の固定化反応時間に設定した。固定化終了後、ウェルプレート内のＨＰＣ誘導体溶液を捨て、試薬特級グレードのメタノールを５ｍｌずつ５回で洗浄を行った。
【００５０】
接触角計による培養基材の温度応答性評価
上記合成例で得られたＨＰＣ誘導体を用いて作製した培養基材に対し、接触角計を用いて培養基材表面の親疎水変化（温度応答性）を評価した。詳細には、接触角計測定装置（協和界面科学社製、ＤＭ−３０１）と、ベベル無しのシリンジ針（２２Ｇ）を用いた。画像解析ソフトは、ＦＡＭＡＳ（協和界面科学社製、θ／２法）を用いた。また、温調ステージとして、クールプレート（アズワン社製、ＳＣＰ−８５）及びＫタイプ熱電対を用い測定を行った。温調ステージの温度は、ＨＰＣ誘導体のＬＣＳＴの約３℃以下、又はＨＰＣ誘導体のＬＣＳＴの約３℃以上に設定し、それぞれの温度にて接触角を測定した。同様な測定を複数回繰り返し行い、基材表面の温度応答性を確認した。
【００５１】
ＨＰＣ誘導体の膜厚の測定
透過型電子顕微鏡ＴＥＣＮＡＩ  Ｇ２（ＦＥＩ社製、加速電圧１２０ＫＶ）を用いて、上記方法により基材表面に固定化されたＨＰＣ誘導体の各膜厚を測定した。具体的には、観察用の試料をプレートから切り出し、その上面を０．２ｎｍ白金コートした。白金コートした試料をプラスチック包埋板に固定後、可視光硬化性包埋樹脂（アルニックスＤ−８００）で短時間室温にて硬化し包埋した。その後、ＵＬＴＲＡＣＵＴ−Ｓ（ライカ製）で５０−７０ｎｍに薄切し、Ｃｕ製グリッドに載せて、０．５重量％四酸化ルテニウムの蒸気により室温１５分で染色を行い、ＨＰＣ誘導体の膜厚を観察した。
【００５２】
細胞の培養・剥離評価
マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、独立法人理化学研究所セルバンク（ＲＣＢ−２７６７））を用いて、ＨＰＣ誘導体により作製した培養基材の細胞培養及び細胞剥離試験を行った。詳細には、培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）において、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＦＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０重量％で培地に添加し使用した。細胞培養の詳細は、１日目細胞播種（播種密度：７．５ｘ１０３細胞／ｃｍ２）を行い、２日目に培地を交換し３日目に細胞剥離を実施した。細胞剥離を実施するためには、培地２．４ｍｌ／ウェルを添加した細胞培養プレートを、４〜８℃の冷蔵庫に１０分間インキュベートする。１０分後、上記の培地（１ｍｌ／回）を用いて室温にて細胞を吸い込まないよう注意しながら細胞上方からピペティングを５回行い、接着細胞を剥離させた。プレートに残留された細胞を倒立顕微鏡で観察し、アラマーブルー（商品名：ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ、コスモ・バイオ社製）を用いて吸光度を求めて細胞剥離率を測定した。吸光度は、セルにアラマーブルーを加え、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で３時間インキュベートした後、５７０ｎｍ及び５８５ｎｍの波長を有する光により測定される。細胞剥離率は、以下の数式により求められる：細胞剥離率（％）＝１００−（剥離後のセルの吸光度／剥離を行っていない対照セル）×１００）。
【００５３】
室温における細胞接着性評価
剥離試験の前に、室温（約２５℃）にて５分間プレートを放置した後、プレート中の細胞の接着状態を目視にて観察した 。
【００５４】
［実施例１］
合成例３により得られたＨＰＣ誘導体を用いて、振盪固定化により細胞培養基材を作製した。固定化のための反応時間は３時間であり、メタノールによる洗浄を５回行った。得られた基材を用いて、上記の通り細胞培養を行い、細胞剥離率を測定したところ４６．９％であった。室温における細胞接着性は、剥離している細胞が無く、良好であった。基材表面の温度応答性は、図２に示される通り良好であった。
【００５５】
［実施例２］
振盪固定化による作製において、反応時間を５時間にした以外は、実施例１と同様に行った。細胞剥離率は６３．９％であった。室温における細胞接着性は良好であった。基材表面の温度応答性は、図２に示される通り良好であった。
【００５６】
［実施例３］
振盪固定化による作製において、反応時間を１５時間にした以外は、実施例１と同様に行った。室温における細胞接着性は良好であった。細胞剥離率は１００．０％であった。基材表面の温度応答性は、図２に示される通り良好であった。
【００５７】
［実施例４］
振盪固定化による作製において、洗浄回数３回にした以外は、実施例１と同様に行った。細胞剥離率は９６．９％であった。室温における細胞接着性は良好であった。ＨＰＣ誘導体の膜厚は、図５に示される通り約１４ｎｍであった。
【００５８】
［実施例５］
振盪固定化による作製において、反応時間を１５時間にした以外は、実施例１と同様に行った。細胞剥離率は１００．０％であった。室温における細胞接着性は良好であった。ＨＰＣ誘導体の膜厚は、図６に示される通り約１３ｎｍであった。
【００５９】
［実施例６］
振盪固定化による作製において、反応時間を１５時間、洗浄回数１０回にした以外は、実施例１と同様に行った。細胞剥離率は９８．９％であった。室温における細胞接着性は良好であった。ＨＰＣ誘導体の膜厚は、図７に示される通り約１４ｎｍであった。
【００６０】
［比較例１］
基材に、ＰＮＩＰＡＡｍが固定化されているアップセル（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード）を用いた以外は、細胞の培養・剥離評価を実施例１と同様に行った。細胞剥離率は十分なものであったが、室温において細胞の剥離が観察された 。
実施例１〜６の結果を、表２及び表３にまとめる。
【００６１】
【表２】
2017079648.tif 000006
【００６２】
表２より、振盪固定化の反応時間により作製した培養基材の細胞剥離率が変わり、反応時間を１５時間にした場合（実施例３）、最も高い細胞剥離率が得られたことが分かる。
【００６３】
【表３】
2017079648.tif 000007
【００６４】
表３より、振盪固定化の反応時間１５時間後にメタノールで洗浄工程にて作製した培養プレートは、洗浄回数に寄らず温度応答性を示すことが分かる。
【００６５】
［実施例７］
合成例２により得られたＨＰＣ誘導体を用いて、静置固定化による細胞培養基材の作製を行った。固定化のための反応温度は４５℃、反応時間は１５時間、メタノールによる洗浄は５回行った。得られた基材を用いて、上記の通り細胞培養を行い、細胞剥離率を測定したところ、６９．２％であった。室温における細胞接着性は、剥離している細胞が無く、良好であった。基材表面の温度応答性は、図３に示される通り良好であった。
【００６６】
［実施例８］
固定化反応温度を６０℃にした以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は５２．１％であった。室温における細胞接着性は良好であった。基材表面の温度応答性は、図３に示される通り良好であった。
【００６７】
［実施例９］
合成例１のＨＰＣ誘導体を用いた以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は５０．０％であった。室温における細胞接着性は良好であった。基材表面の温度応答性は、図４に示される通り良好であった。
【００６８】
［実施例１０］
合成例３のＨＰＣ誘導体を用いた以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は７６．４％であった。室温における細胞接着性は良好であった。基材表面の温度応答性は、図４に示される通り良好であった。
【００６９】
［実施例１１］
実施例３のＨＰＣ誘導体を用い、固定化反応時間を３時間にした以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は５０．６％であった。室温における細胞接着性は良好であった。
【００７０】
［実施例１２］
実施例３のＨＰＣ誘導体を用い、固定化反応時間を２４時間にした以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は６４．４％であった。室温における細胞接着性は良好であった。
【００７１】
［比較例２］
反応温度を室温（約２５℃）で行い、洗浄をしなかった以外は、実施例７に記載の固定化方法と同様に行った。ＨＰＣ誘導体の膜が厚くなったため（約８μｍ）、温度を変化させる際にＨＰＣ誘導体の膜が不安定となり、細胞培養評価を行うことができなかった。
【００７２】
［比較例３］
反応温度を３７℃にした以外は、実施例７と同様に行った。細胞剥離率は１３．５％であった。基材表面の温度応答性は、図３に示される通り、表面温度応答性を示さなかったことから、ＨＰＣ誘導体が固定されていないことが示唆された。
実施例７〜１２及び比較例２〜３の結果を、表４にまとめる。
【００７３】
【表４】
2017079648.tif 000008
【００７４】
表４より、静置固定化方法は、振盪固定化方法（表２、３）と比べて、細胞剥離率が低く、細胞が剥離され難いことが分かる。一方、固定化温度を室温にした場合（比較例２）は、ＨＰＣ誘導体の膜が安定して固定化されなかった。固定化温度を３７℃にした場合（比較例３）は、反応温度を４５℃又は６０℃にした場合と比べ、細胞剥離率が低かった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のＨＰＣ誘導体は、細胞培養関連の周辺材料やティッシュエンジニアリング用材料に利用可能である。また、本発明のＨＰＣ誘導体の形成体（例えば、ハイドロゲル）を用いれば、従来の昇温時ゲル化タイプハイドロゲルに様々な生理活性機能（例えば、生体適合性、細胞接着性、細胞増殖能促進、細胞分化能促進などの機能）を付加することが可能となる。これらの生理活性機能を利用する用途、例えば、細胞（組織）培養基材、創傷被覆材、生体接着剤、ＤＤＳ用基材、塞栓剤、関節易滑剤などとして利用できる。
【図１】
2017079648.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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