(57)【要約】【課題】放射免疫療法を利用して腹腔内転移した腫瘍を効果的に治療するための技術を提供する。【解決手段】本発明は、腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含む、腹腔内腫瘍を治療するための放射性医薬組成物を提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含む、腹腔内腫瘍を治療するための放射性医薬組成物。
【請求項２】
前記放射能標識抗体は、放射性銅で標識されたモノクローナル抗体である、請求項１に記載の放射性医薬組成物。
【請求項３】
前記放射能標識抗体は、二官能性キレート剤を用いて、前記放射性銅で前記モノクローナル抗体を標識したものである、請求項２に記載の放射性医薬組成物。
【請求項４】
前記二官能性キレート剤が、3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trience-3,6,9-triacetic acid（ＰＣＴＡ）である、請求項３に記載の放射性医薬組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体又は抗ヒトＥＧＦＲ関連物質２（ＨＥＲ２）抗体である、請求項２乃至４いずれか一項に記載の放射性医薬組成物。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体は、セツキシマブ又はトラスツズマブである、請求項５に記載の放射性医薬組成物。
【請求項７】
腹腔内投与されるための、請求項１乃至６いずれか一項に記載の放射性医薬組成物。
【請求項８】
腹腔内投与した後、前記放射能標識抗体から放出される放射線を体外より検出しながら腹腔内腫瘍を切除するために用いられる、請求項７に記載の放射性医薬組成物。
【請求項９】
一以上の放射能標識抗体を用いて、患者の腹腔内より採取した腫瘍細胞に対する、前記放射能標識抗体の結合性を評価するステップと、
前記腫瘍細胞に対する前記放射能標識抗体の結合性に基づいて、前記放射能標識抗体の少なくとも一つを腹腔内腫瘍の治療薬の有効成分として選択するステップと、
を含む、放射能標識抗体のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性医薬組成物、及び、その有効成分である放射能標識抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜転移は、胃がんや大腸がん、卵巣がんなどの腹腔内臓器に発生したがんが、それら臓器の表面を覆っている膜を突き破って腹腔内にこぼれ落ち、直接に広がるという独特の転移をする。腹膜播種は、腹膜転移により腹腔内広範囲にがん転移巣が広がった状態で、大腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん等の多種のがんにおける進行した状態で発見される。こうした腹腔内に散在した腫瘍は、外科手術では病巣を取り切れない他、術後化学療法を行っても予後が極めて不良である。そのため、現状を改善する新規治療戦略の開発が求められている。
【０００３】
非特許文献１に記載されるように、放射能標識抗体は、広く播種した病巣にも特異的に結合し、選択的に内部放射線照射を与えて制御することが期待されている。このような放射能標識抗体を用いた標的療法（放射免疫療法）を目指して、１３１Ｉ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ等用いる放射性核種の選択や、モノクローナル抗体のキメラ化・ヒト型化など、標的に効率的に免疫抱合体（腫瘍関連抗原を認識するモノクローナル抗体を放射線同位元素で標識したもの）を集積させるための諸課題に国内外の研究者が取り組み、臨床においても研究が行われたが、悪性リンパ腫においては優れた治療効果が得られたものの、固形癌について有効性が確立された放射免疫療法はほとんどない。
【０００４】
放射性銅（Ｃｕ−６４、半減期１２．７時間）は、β＋およびβ−と放出するため、ＰＥＴ（Positron emission tomography）イメージングのみならず、治療にも注目される放射性核種である。セツキシマブは、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに特異結合する、Ｉｇ１に属する組換えヒト・マウスキメラ化モノクローナル抗体であるが、非特許文献２、３では、セツキシマブをＣｕ−６４で標識し、ＰＥＴイメージングや体内分布により腫瘍集積を評価した例が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】近畿大医誌第３３巻第３号１９３〜１９８頁
【非特許文献２】J. Nucl. Med., 2011, 52 (supplement 1):1607
【非特許文献３】Mol. Pharmaceutics, 2014, 11, 3980-3987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献２，３には、Ｃｕ−６４で標識したセツキシマブを用いて、皮下移植腫瘍に対する生体内分布や腫瘍への放射能集積量を調べた例は開示される一方、腹腔内転移巣に対して、生体内分布や腫瘍への放射能集積量、腫瘍を実際に治療した例は開示されていない。
【０００７】
また、放射免疫療法は、必ずしも患者のがんに放射能標識抗体が結合するとは限らず、奏功しない場合があった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、放射免疫療法を利用して腹腔内転移した腫瘍を効果的に治療するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含む、腹腔内腫瘍を治療するための放射性医薬組成物である。
【００１０】
本発明の他の態様は、一以上の放射能標識抗体を用いて、患者の腹腔内より採取した腫瘍細胞に対する、前記放射能標識抗体の結合性を評価するステップと、前記腫瘍細胞に対する前記放射能標識抗体の結合性に基づいて、前記放射能標識抗体の少なくとも一つを腹腔内に散在する腫瘍の治療薬の有効成分として選択するステップと、を含む、放射能標識抗体のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、放射免疫療法を利用して腹腔内転移した腫瘍を効果的に治療することができる。具体的には、治療前に、本発明のスクリーニング方法により、腹腔内転移した腫瘍細胞に特異的に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を選択し、これを有効成分として含有する放射性医薬組成物を用いて腹腔内腫瘍を治療する。これにより、個々の患者に適した放射免疫療法を行うことができ、より高い治療効果を得ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】正常マウスに尾静脈投与した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（64Cu-PCTA-Cetuximab）の体内分布を示す図である。
【図２】正常マウスに腹腔内投与した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（64Cu-PCTA-Cetuximab）の体内分布を示す図である。
【図３】腹膜播種モデルに尾静脈投与又は腹腔内投与した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（64Cu-PCTA-Cetuximab）の腹腔内腫瘍における集積を示す図である。
【図４】６４Ｃｕ標識セツキシマブ（64Cu-PCTA-Cetuximab）及び６４Ｃｕ標識トラスツズマブ（64Cu-PCTA-Trastuzumab）を用いた抗体結合性評価の結果を示す図である。
【図５】腹膜播種モデルマウスの治療効果をＨＣＴ１１６−ＲＦＰ蛍光イメージングにより観察した結果を示す図である。
【図６】内照射治療又は既存の分子標的治療を受けた腹膜播種モデルマウスの生存率をカプランマイヤー生存曲線で示す図である。
【図７】ＰＥＴ（Positron emission tomography）を用いたイメージガイド手術の様子を示す図である。
【図８】ＰＥＴを用いた腹膜播種モデルマウスのイメージガイド手術の様子を示す図である。（ａ）は、腹膜播種モデルマウスを示す図である。（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であり、右矢印が肝臓、左矢印が腫瘍を示す。（ｃ）は、臓器に隠れて腫瘍は肉眼で見えないことを示す図である。（ｄ）は、リアルタイムＰＥＴ画像を見ながら手術を行う様子を示す図である。（ｅ）は、１３ｍｍ大の腫瘍を摘出した様子を示す図である。（ｆ）は、腫瘍摘出後のＰＥＴ画像であり、左矢印が、摘出部位には放射能集積がないことを示し、右矢印は、腫瘍摘出後に確認された腫瘍を示す。
【図９】蛍光顕微鏡を用いた腹膜播種モデルマウスのイメージガイド手術の様子を示す図である。（ａ）は、ＰＥＴ装置付属の蛍光顕微鏡で観察した様子の一部を示す図である。（ｂ）は臓器裏に隠れた腫瘍が蛍光では観察できないことを示す図である。（ｃ）はＰＥＴ装置付属の蛍光顕微鏡で観察した様子の一部を示す図である。（ｄ）は摘出された腫瘍から蛍光が観察されたことを示す図である。
【図１０】ＰＥＴを用いた腹膜播種モデルマウスのイメージガイド手術の様子を示す図である。（ａ）は腹膜播種モデルマウスを示す図である。（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であり、右矢印が肝臓、左矢印が腫瘍を示す。（ｃ）は、リアルタイムＰＥＴ画像を見ながら手術を行う様子を示す図である。矢印は、摘出した腫瘍を示す。（ｄ）は、リアルタイムＰＥＴより、残存腫瘍を発見した例を示す図である。左下の矢印が残存腫瘍を示す。（ｅ）は、残存腫瘍を摘出した様子を示す図である。右端の矢印が摘出した腫瘍であり、その他の矢印が残存腫瘍である。（ｆ）は、残存腫瘍摘出後のＰＥＴ画像である。右下の矢印が摘出腫瘍であり、摘出腫瘍の上の２つの矢印がそれぞれ残存腫瘍を示す。
【図１１】ＰＥＴを用いた腹膜播種モデルマウスのイメージガイド手術の様子を示す図である。（ａ）は腹膜播種モデルマウスを示す図である。（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であり、矢印が腫瘍を示す。（ｃ）は、（ｂ）の拡大図であり、矢印が腫瘍を示す。（ｄ）は、リアルタイムＰＥＴ画像を見ながら手術を行う様子を示す図である。（ｅ）は、３ｍｍ大の腫瘍を摘出した様子を示す図であり、矢印が摘出腫瘍を示す。（ｆ）は、腫瘍摘出後に腫瘍が確認したが、残存部位には放射能集積がないことを示すＰＥＴ画像である。
【図１２】正常マウスにおけるＰＥＴ画像を示す図である。（ａ）がＰＥＴ解析画像である。左が腹膜播種モデルマウスの画像であり、右が正常マウスの画像である。各画像の右矢印が肝臓を示す。腹膜播種モデルマウス画像の左矢印が腫瘍を示す。（ｂ）がリアルタイムＰＥＴ画像である。左が腹膜播種モデルマウスの画像であり、右が正常マウスの画像である。各画像の右矢印が肝臓を示す。腹膜播種モデルマウス画像の左矢印が腫瘍を示す。
【図１３】６４Ｃｕ標識セツキシマブを使った内照射治療効果をＨＣＴ１１６−ＲＦＰ蛍光イメージングにより観察した結果を示す図である。（ａ）は、ＰＥＴを用いたイメージガイド手術群を示し、（ｂ）は、ＰＥＴを用いたイメージガイド手術＋放射免疫治療群を示し、（ｃ）は、偽手術群を示す。
【図１４】６４Ｃｕ標識セツキシマブを使った内照射治療を受けた腹膜播種モデルマウスの生存率をカプランマイヤー生存曲線で示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［放射能標識抗体］
本発明において「放射能標識抗体」とは、放射性核種を標識したモノクローナル抗体である。
【００１４】
この明細書において「放射性核種」とは、放射線内用療法に用いられるものであれば制限されず、アルファ線、ベータ線及びオージェ電子からなる群から選択される少なくとも一種を放出するものであればよく、例えば、放射性銅（６４Ｃｕ）、放射性ストロンチウム（８９Ｓｒ）、放射性イットリウム（９０Ｙ）、放射性ヨウ素（１３１Ｉ）、放射性エルビウム（１６９Ｅｒ）、放射性レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）が挙げられるが、放射性銅（６４Ｃｕ）がより好ましい。６４Ｃｕが放出するオージェ電子は、腫瘍細胞に対し、高い線エネルギー付与をすることができるため、治療耐性が高いがん細胞にも効果的である。また、６４Ｃｕは飛程が約１−２ｍｍと比較的短いため、副作用を軽減できる。また、６４Ｃｕは大量安定生産が可能であり、実用面でも優れている。
【００１５】
本発明において「モノクローナル抗体」とは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれも含まれ、例えば、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体、抗ヒトＥＧＦＲ関連物質２（ＨＥＲ２）抗体、抗インテグリン抗体が挙げられる。ＥＧＦＲ抗体としては、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブが例示される。また、ＨＥＲ２抗体としては、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）が挙げられる。本発明では、好ましくは、モノクローナル抗体として、セツキシマブ又はトラスツズマブが用いられる。
【００１６】
本発明の放射能標識抗体は、一般的な抗体標識法を用いてモノクローナル抗体を放射性核種で標識することで合成することができるが、例えば、イソシアネート基又はＮ-ヒドロキシスクシンイミジル基が導入されたキレート剤を、モノクローナル抗体のリシン残基の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基に作用させた後、放射性金属元素と錯形成させることで、合成することができる。錯形成しない放射性核種を用いる場合は、放射性核種が導入されたイソシアネート化合物の又はＮ-ヒドロキシスクシンイミド化合物をモノクローナル抗体の上記アミノ基に作用させてもよい。放射性核種は、既知の方法で得ることができる。
【００１７】
本発明の放射能標識抗体の一例として、二官能性キレート剤を用いて、放射性銅でモノクローナル抗体を標識したものが挙げられる。二官能性キレート剤としては、1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid（ＤＯＴＡ）、1,4,7-triazacyclononane-triacetic acid（ＮＯＴＡ）、1,4,7-tris(carboxymethylaza)cyclododecane-10-azaacetyl amide（ＤＯ３Ａ）、3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trience-3,6,9-triacetic acid（ＰＣＴＡ）が例示される。これら二官能性キレート剤にイソシアネート基又はＮ-ヒドロキシスクシンイミジル基を導入し、これに、モノクローナル抗体のリシン残基の側鎖アミノ基又はＮ末端アミノ基に作用させることで、モノクローナル抗体にキレート部位を導入する。その後、キレート部位に放射性銅（６４Ｃｕ）を錯形成させることで、６４Ｃｕ標識抗体を得ることができる。
【００１８】
なお、６４Ｃｕ標識抗体は、上述の例に限定されず、例えば、J. Label Compd. Radiopharma, 2014, 57, 224-230に挙げられた種々のキレート剤、及び、方法を用いて合成することができる。
【００１９】
［放射能標識抗体のスクリーニング方法］
本発明の一の態様である、放射能標識抗体のスクリーニング方法は、少なくとも評価ステップ（ａ）及び選択ステップ（ｂ）の２ステップを含むものである。
【００２０】
評価ステップ（ａ）は、腫瘍細胞に対する放射能標識抗体の結合性を評価するステップである。この腫瘍細胞は、対象患者の腹腔内から採取したものであり、例えば、外科手術により摘出した検体の全部もしくは一部、腹水もしくは針生検から採取したものが挙げられる。好ましくは、腹膜に転移した腫瘍細胞であり、より好ましくは、腹腔内に存在する臓器に由来する腫瘍が腹膜に転移したものであり、大腸癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、肝臓癌に由来するものを例示することができる。
【００２１】
放射能標識抗体としては、前述のものを少なくとも一以上使用し、それぞれ、PBSなどの緩衝液、その他体液に近似した環境下で腫瘍細胞と一定時間反応させる。その後、遠心分離など行って残渣の放射能標識抗体を取り除いた後、腫瘍細胞を回収し、腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体から放出される放射能を測定する。そして、腫瘍細胞に対し使用した放射能標識抗体の放射能の全量を１００％とし、これに対する腫瘍細胞から測定された放射能、すなわち腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体の放射能の比率（＝腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体の放射能量／使用した放射能標識抗体の放射能量）を算出する。腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体の放射能の比率が高いほど、対象腫瘍細胞に対する放射能標識抗体の特異性が高いと評価できる。放射能の測定は、６４Ｃｕ標識抗体を用いた場合は、例えば、γカウンタ―を使用することができる。
【００２２】
選択ステップ（ｂ）は、対象患者の腹腔内から採取した腫瘍細胞に特異的な放射能標識抗体を選択するステップである。このステップでは、評価ステップ（ａ）で評価された腫瘍細胞に対する放射能標識抗体の結合性に基づいて、対象患者の治療に最適な放射能標識抗体を選択すればよい。例えば、腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体の放射能の比率が所定値以上であった放射能標識抗体を選択してもよいし、複数の放射能標識抗体の中から、腫瘍細胞に結合した放射能標識抗体の放射能の比率が相対的に高いものを一種又は二種以上選択してもよい。
【００２３】
選択ステップ（ｂ）で選択した放射能標識抗体を有効成分として含む放射性医薬組成物を投与することで、対象患者に適した放射免疫治療を行うことができる。
【００２４】
［放射性医薬組成物］
本発明の一態様である放射性医薬組成物は、腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含むものである。本発明において「腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体」とは、対象患者の腹腔内で転移した腫瘍細胞に対する抗体結合性が高いものをいい、かかる抗体結合性は、前述したスクリーニング方法を用いて評価することができる。また、本発明における「腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体」は、前述したスクリーニング方法を用いて選択することができる。
【００２５】
本発明の一態様である放射性医薬組成物は、腹腔内転移した腫瘍の治療に用いられるものであり、大腸、胃、膵臓、卵巣、肝臓など腹腔内に存在する臓器に由来する腫瘍が、別の腹腔内臓器に転移した場合の治療に用いることができる。好ましくは、腹膜転移により腹腔内に散在した腫瘍の治療に用いられることができ、より好ましくは、腹膜播種の治療に用いられる。
【００２６】
本発明の一態様である放射性医薬組成物は、「腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体」を有効成分としてそのまま含んでいてもよいし、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、若しくは賦形剤とともに製剤化されていてもよい。剤形は、経口投与又は非経口投与のいずれかに適したものであればよいが、例えば注射剤などの非経口投与の剤形が好ましい。この放射性医薬組成物は、好ましくは腹腔内投与されるため、腹腔内投与に適した剤形がより好ましい。腹腔内投与することにより、静脈投与と比較して短時間で、有効性成分の放射能標識抗体を腹腔内腫瘍に集積させることができる。したがって、腫瘍病巣に高線量を集中させることが可能になる。
【００２７】
本発明の一態様である放射性医薬組成物の投与量は、投与対象となる患者の種別、年齢、性別、体重、症状、投与法などによって異なり特に限定されないが、一般の内照射治療用の放射性医薬品において通常採用されている範囲を採用することができる。また、本発明の放射性医薬組成物は、単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。
【００２８】
また、本発明の放射性医薬組成物は、腹腔内投与した後、放射能標識抗体から放出される放射線を体外より検出しながら、腹腔内腫瘍を切除するために用いられてもよい。これにより、物理的形状で確認し難い微細な腫瘍も削除でき、術後は、内照射治療を行うことができる。例えば、６４Ｃｕ標識抗体を使用することで、ＰＥＴ（positron emission tomography）を用いたイメージガイド手術と同時に内照射治療を行うことが可能である。イメージガイド手術で使用するＰＥＴ装置としては、例えば、ＷＯ２０１２−１６４６６４に記載される、体軸方向に２分割した検出器リングを離して配置し、物理的に開放された視野領域（オープンスペース）を有するオープンＰＥＴ装置を用いることが好ましい。６４Ｃｕ標識抗体は、臓器深部に存在する腫瘍の検出も可能で、既存の蛍光プローブを用いた術中迅速診断では検出できない深部腫瘍を発見できる利点を有する。また、ＰＥＴで画像化しきれない非常に小さい腫瘍は、同時に放射免疫療法を行うことで、治療することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
セツキシマブは、メルクセローノ株式会社から入手した「アービタックス（登録商標）注射液１００ｍｇ」を用いた。
トラスツズマブは、中外製薬株式会社から入手した「ハーセプチン（登録商標）注射用１５０」を用いた。
3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trience-3,6,9-triacetic acid（ＰＣＴＡ）は、Macrocyclics, Inc.から入手した。
６４Ｃｕは、McCarthyらの方法（Nuclear medicine and biology,vol.24,1997,pp.35-43）及びObataらの方法（Nuclear medicine and biology,vol.30,2003,pp.535-539）に準じて製造・精製した。
ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰは、Yoshii et al 2016 International Journal of Oncology, vol.48, pp.1477-1484 4に従い作製した。
マウスは、日本エスエルシー株式会社から入手したBALB/c Slc−nu/nu（雌性）、６週齢のものを使用した。
【００３０】
（実施例１）６４Ｃｕ標識セツキシマブ（64Cu-PCTA-Cetuximab）の合成
標識は、以下の様な条件で行った。まず、セツキシマブ溶液（「アービタックス（登録商標）注射液１００ｍｇ」そのまま）をホウ酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）にbuffer置換し、２ｍｇ／ｍＬに濃度調節を行った。その後、ＰＣＴＡを５等量になるよう混合し、３７°Ｃで一昼夜反応させた。その後、得られたセツキシマブ−ＰＣＴＡ溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸アンモウム緩衝液（ｐＨ５．５）にｂｕｆｆｅｒ置換し、２ｍｇ／ｍＬに濃度を調節した。得られた溶液に、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸アンモウム緩衝液（ｐＨ５．５）で溶解した６４Ｃｕを加え、４０℃で６０分間反応させ、セツキシマブ−ＰＣＴＡ結合体に６４Ｃｕを標識した。必要があれば、標識後の６４Ｃｕ標識放射性抗体をゲルろ過カラムで精製し、その後、以下に条件を示すラジオＴＬＣにより純度検定試験を行い、放射化学的純度９５％以上の６４Ｃｕ標識放射性抗体を得た。
＜ラジオＴＬＣによる純度検定試験＞
ＴＬＣプレート：シリカゲルプレート（製品名：Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０、メルク株
式会社製）
展開相：８０％メタノール
検出：フルオロイメージアナライザー（形式：ＦＬＡ−７０００，富士フイルム株式会社製）
【００３１】
（実施例２）６４Ｃｕ標識トラスツズマブ（64Cu-PCTA-Trastuzumab）の合成
標識は、以下の様な条件で行った。まず、「ハーセプチン（登録商標）注射用１５０」のトラスツズマブ含有バイアルにハーセプチン濃度が６ｍｇ／Ｌになるように生理食塩液を加えてトラスツズマブ溶液を調製した。このトラスツズマブ溶液をホウ酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）にbuffer置換し、２ｍｇ／ｍＬに濃度調節を行った。その後、ＰＣＴＡを５等量になるよう混合し、３７℃で一昼夜反応させた。その後、得られたトラスツズマブ−ＰＣＴＡ溶液を０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）にｂｕｆｆｅｒ置換し、２ｍｇ／ｍＬに濃度を調節した。得られた溶液に、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で溶解した６４Ｃｕを加え、４０℃で６０分間反応させ、トラスツズマブ−ＰＣＴＡ結合体に６４Ｃｕを標識した。必要があれば、標識後の６４Ｃｕ標識放射性抗体をゲルろ過カラムで精製し、その後、実施例１に示す条件と同じラジオＴＬＣにより純度検定試験を行い、放射化学的純度９５％以上の６４Ｃｕ標識放射性抗体を得た。
【００３２】
（実施例３）体内動態
正常マウスに対し、実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（３．７ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）を尾静脈又は腹腔内に投与した。投与後、３時間、６時間、１８時間、２４時間、４８時間後にマウスを犠牲死させ、各臓器を摘出した。摘出した臓器の重量を計測した他、放射能をγカウンターで測定し、放射能濃度（％ＩＤ／ｇ）を決定した。
【００３３】
正常マウスにおける体内動態における集積を図１、図２にそれぞれ示す。図１は、尾静脈投与した結果であり、図２は、腹腔内投与した結果である。各臓器への集積は、静脈投与・腹腔内投与ともにおおむね低いことが示された。腹腔内投与においては、腹水の放射能濃度は、６時間までは高かったが、それ以降は血中レベルまで低下していた。
【００３４】
（実施例４）腹腔内腫瘍における集積
ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ）を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞（３×１０６細胞）を５００μＬ  ＰＢＳに溶解し、マウス腹腔内に移植し、１週間経たものを使用した。作製したモデルマウス４匹に対し、実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（３．７ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）を尾静脈又は腹腔内にそれぞれ投与した。３時間、６時間、１８時間、２４時間、４８時間後に、マウスを犠牲死させ、蛍光実体顕微鏡で確認しながら腫瘍（２−３ｍｍ前後）を取り出し、ＯＣＴコンパウンドを用い、凍結切片（８μｍ）を作成した。同様に、１００％ＩＤ／ｇ、５０％ＩＤ／ｇ、２５％ＩＤ／ｇ、１２．５％ＩＤ／ｇ、６．２５％ＩＤ／ｇ、３．１３％ＩＤ／ｇとなるように作成した標準サンプル（２０％ゼラチン中）でも切片（標準切片）を作成した。腫瘍切片、標準切片ともに、イメージングプレートを使用し、オートラジオグラフィーイメージを得た。標準切片のシグナル強度から、検量線を作成し、腫瘍切片における放射能濃度（％ＩＤ／ｇ）を計算した。なお、本法で腫瘍臓器（肝臓・腎臓・筋肉）についても放射能濃度を測定したが、γカウンターで決定した放射能濃度とほぼ一致していた。
【００３５】
結果を図３に示す。６４Ｃｕ標識セツキシマブは、静脈投与・腹腔内投与ともに、腫瘍に良好な集積を示すことが明らかとなった。特に、６４Ｃｕ標識セツキシマブを腹腔内投与することで、尾静脈投与と比較して、早期から腫瘍に対し高い集積を集められることが示された。
【００３６】
実施例３、４の結果から、以下の放射免疫治療並びに術中迅速診断に関する検討は、マウス腹腔内に存在する腫瘍に対して、６４Ｃｕ標識抗体を腹腔内投与することで行った。また、術中迅速診断に関しては、腹水の放射能濃度が低減する投与後２４時間後の時点で行った。
【００３７】
（実施例５）抗体結合性事前診断〔放射能標識抗体のスクリーニング〕
ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）細胞のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ）を用い、６４Ｃｕ標識セツキシマブ並びに６４Ｃｕ標識トラスツズマブの結合性を評価した。ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）に実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブ、及び、実施例２に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識トラスツズマブを各々１４．８ｋＢｑずつ加え、１時間氷上で反応させた後、遠心後細胞を回収した。直ちに、ＰＢＳで細胞を洗浄し、得られた細胞を１ｍＬのＰＢＳに溶解し、γカウンターを用いて放射能を測定し、細胞に結合した放射能の割合を算出した。
【００３８】
結果を図４に示す。図４に示すとおり、ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞では、６４Ｃｕ標識セツキシマブの結合性が高い一方で、６４Ｃｕ標識トラスツズマブの結合性が低いことが明らかとなった。
【００３９】
（実施例６）個別化放射免疫治療
ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞を移植した腹膜播種モデルを使用し、６４Ｃｕ標識セツキシマブ及び６４Ｃｕ標識トラスツズマブを用いた放射免疫治療実験を行った。
ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）細胞のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ）を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞（０．５×１０６細胞）を５００μＬ  ＰＢＳに溶解し、マウス腹腔内に移植し、１週間経たものを使用した。作製したモデルマウスに対し、実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブ、又は、実施例２に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識トラスツズマブを腹腔内投与（２２．２ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）し、投与日を治療開始０日目として治療を行い、治療効果を生理食塩水を同様に投与したコントロール群と比較した。また、放射性標識していない抗体を用いた既存の分子標的治療の効果と比較する目的で、セツキシマブ投与群（１ｍｇ／ｋｇ，実験期間中週２回投与）、並びにトラスツズマブ投与群（１ｍｇ／ｋｇ，実験期間中週２回投与）の検討も行った。治療経過は、ＲＦＰシグナルを蛍光イメージング装置（ＩＶＩＳ）で計測したほか、体重測定・マウス全身状態の観察を経時的に行った。腹部の膨張、治療開始０日目の体重に対し２０％を超える体重減少、全身虚弱をエンドポイントの指標とした。
【００４０】
結果を図５、６に示す。図５は、腹膜播種モデルの治療効果をＨＣＴ１１６−ＲＦＰ蛍光イメージングにより観察した結果を示す図である。また、図６は、内照射治療又は既存の分子標的治療を受けた腹膜播種モデルの生存率をカプランマイヤー生存曲線で示す図である。本検討は、各群ｎ＝６で、生存率は、実験に使用した全匹数に対する生存匹数の割合を百分率で示したものとした。
図５に示すとおり、６４Ｃｕ標識セツキシマブによる内照射治療では、コントロール群と比較し、腫瘍の増殖が抑制されていることが明らかとなった。６４Ｃｕ標識トラスツズマブによる内照射治療、並びに、セツキシマブ及びトラスツズマブによる分子標的治療では、コントロール群と比較し、有意差は見られなかった。
また、図６に示すとおり、６４Ｃｕ標識セツキシマブ投与群では、生存が有意に延長されていた（Ｐ＜０．０５）。一方、６４Ｃｕ標識トラスツズマブ投与群及びその他の群は、コントロール群と比較し、有意差は見られなかった。
これにより、抗体結合性事前診断により結合性が高かった６４Ｃｕ標識セツキシマブが腹膜播種モデルにおいて高い治療効果を有することが示された。また、その効果は既存の分子標的治療よりも高かった。
【００４１】
（実施例７）術中迅速診断（リアルタイムＰＥＴ手術）
ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ）を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞（１×１０７細胞）を５０μＬ  ＰＢＳに溶解し、５０μＬのマトリゲルと混合したうえで、マウス腹腔内に移植することで作成した。マウスＡ，Ｂについては下腹部脊椎付近に、マウスＣについては腹腔中心部に移植した。１週間後、実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブを腹腔内投与し（７．４ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）、２４時間後ＰＥＴガイド下手術を行い、術中迅速診断が可能か評価した（図７）。ＰＥＴガイド下手術には、ＯｐｅｎＰＥＴ（登録商標）（Yamaya et al. IEEE 2013, Tashima IEEE 2012他，ＷＯ２０１２−１６４６６４他）を使用した。
【００４２】
図８〜９がマウスＡのＰＥＴガイド下手術の様子を示す図であり、図１０がマウスＢのＰＥＴガイド下手術の様子を示す図であり、図１１がマウスＣのＰＥＴガイド下手術の様子を示す図である。
【００４３】
図８（ａ）はマウスＡを示す図である。図８（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であるが、左矢印で示すとおり、ＰＥＴにより腹腔深部に腫瘍が発見された。同腫瘍は、図８（ｃ）で示すとおり、皮膚を切開し開腹した状態においては、臓器に隠れて肉眼で確認できなかった。図８（ｄ）は、リアルタイムＰＥＴ画像を見ながら手術を行う様子を示す図であるが、図８（ｄ）で示すとおり、ＰＥＴガイド下手術を行うことにより、リアルタイムに観察しながら、腫瘍の切除を行い、図８（ｅ）で示すように、１３ｍｍ大の腫瘍を摘出した。図８（ｆ）は、腫瘍摘出後のＰＥＴ画像であるが、左矢印で示すように、摘出後、腫瘍の残存部位には高い集積は確認されなかった。
【００４４】
また、マウスＡについては、ＰＥＴ装置に付属の蛍光イメージング顕微鏡でも観察を行った。図９（ａ）、（ｃ）はマウスＡを用いたＰＥＴガイド下手術の様子をＰＥＴ装置付属の蛍光顕微鏡で観察した様子を示す図である。図９（ｂ）で示すように、皮膚を切開し開腹した状態においては、同腫瘍は臓器裏に隠れて蛍光では観察できなかったが、図９（ｄ）で示すように、摘出組織からは蛍光が観察され、腫瘍であることが確認された。
【００４５】
図１０（ａ）はマウスＢを示す図である。図１０（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であるが、左矢印で示すように、ＰＥＴ画像により腹腔深部に腫瘍が発見された。図１０（ｃ）で示すように、ＰＥＴガイド下手術を行うことにより、リアルタイムに観察しながら、腫瘍の切除を行い、１ｃｍ程度の腫瘍を摘出した。摘出後、図１０（ｄ）の左下の矢印で示すように、ＰＥＴ画像により腫瘍の取り残しが確認されたため、図１０（ｅ）で示すように、ＰＥＴ画像により、リアルタイムに観察しながら、再度腫瘍を切除し、１ｃｍ程度の腫瘍を２個摘出した。図１０（ｅ）中、右端の矢印が先に摘出した腫瘍であり、その他の矢印が摘出した残存腫瘍である。図１０（ｆ）は、残存腫瘍摘出後のＰＥＴ画像であるが、腫瘍の残存部位には高い集積は確認されなくなった。なお、マウスＡ、Ｂと同様に処理したマウスにおける腫瘍（約１ｃｍ大）への放射能集積は、１７．５６±５．１８％ＩＤ／ｇ（ｎ＝１６）であった。
【００４６】
図１１（ａ）は、マウスＣにおいてマウス腹腔内に腫瘍を移植した様子を示す図である。図１１（ｂ）は、術者から見えるリアルタイムＰＥＴ画像であり、図１１（ｃ）は、（ｂ）の拡大図であるが、図１１（ｂ）、（ｃ）の矢印で示す通り、右脇腹に比較的小さい腫瘍をＰＥＴ画像により発見した。図１１（ｄ）で示すように、ＰＥＴガイド下手術により、リアルタイムに観察しながら、腫瘍の切除を行い、図１１(ｅ)の矢印で示すとおり、３ｍｍ大の腫瘍を摘出した。摘出後、腫瘍の残存部位には高い集積は確認されなかった（図１１（ｆ））。
【００４７】
これらの検討から、抗体結合性事前診断に基づき選択された６４Ｃｕ標識セツキシマブを用い術中迅速診断を行うことで、肉眼では発見できない深部の腫瘍、残存腫瘍、比較的小さい数ミリ程度の腫瘍を摘出できることが示された。
【００４８】
（実施例８）正常マウスによる検討
正常マウスに、実施例１に示す方法に従って合成した６４Ｃｕ標識セツキシマブ（７．４ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）を正常マウスに腹腔内投与し、２４時間後にＰＥＴ撮像により画像を取得した。
【００４９】
結果を図１２に示す。図１２（ａ）がＰＥＴ解析画像であり、図１２（ｂ）がリアルタイムＰＥＴ画像である。図１２（ａ）、（ｂ）の各図において、左が実施例７の腹膜播種モデルマウスＡの画像であり、右が正常マウスの画像である。各画像の右矢印が肝臓を示す。腹膜播種モデルの左矢印が腫瘍を示す。図１２に示すとおり、腹部に生理的集積はほとんど見られず、バックグラウンドは低いことが確認された。
【００５０】
（実施例９）放射免疫治療と術中迅速診断法の応用（リアルタイムＰＥＴ手術と放射免疫治療の併用）
ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞を移植し病気が進行した進行性腹膜播種モデルを使用し、６４Ｃｕ標識セツキシマブを用いたリアルタイムＰＥＴ手術と放射免疫治療の組み合わせ使用による効果を検討した。
本検討では、ヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）細胞のＲＦＰ過剰発現株（ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ）を用い、進行性腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、ＨＣＴ１１６−ＲＦＰ細胞（０．５×１０６細胞）を５００μＬ  ＰＢＳに溶解し、マウス腹腔内に移植し、４週間経たものを使用した。作製したモデルマウスを、（i）６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群（診断容量の６４Ｃｕ標識セツキシマブを投与し、２４ｈ後にＰＥＴガイド下で開腹・腫瘍摘出を行い、閉腹を行う）、（ii）６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術＋放射免疫治療群（治療容量の６４Ｃｕ標識セツキシマブを投与し、４８時間後にＰＥＴガイド下で開腹・腫瘍摘出を行い、閉腹を行う）、（iii）偽手術群（６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群・６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術＋放射免疫治療群と同様に手術を行うがＰＥＴガイドは行わない、６４Ｃｕ標識セツキシマブは投与しない）に分け検討を行った。（i）は、診断容量の６４Ｃｕ標識セツキシマブ（７．４ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）を、（ii）治療容量の６４Ｃｕ標識セツキシマブ（２２．２ＭＢｑ／２０μｇ／１００μＬ）をそれぞれ腹腔内投与した。また、（iii）では生理食塩水を同様に投与した。各群の投与日を治療開始０日目とした。治療経過は、ＲＦＰシグナルを蛍光イメージング装置（ＩＶＩＳ）で計測したほか、体重測定・マウス全身状態の観察を経時的に行った。腹部の膨張、治療開始０日目に比較して２０％を超える体重減少、全身虚弱をエンドポイントの指標とした。
【００５１】
結果を図１３、１４に示す。図１３（ａ）は、６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群（i）を示し、図１３（ｂ）は、６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術＋放射免疫治療群（ii）を示し、図１３（ｃ）は、偽手術群（iii）を示す。図１３に示すとおり、蛍光イメージング観察より、６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術＋放射免疫治療群（ii）、及び、６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群（i）は、偽手術群（iii）と比較し、腫瘍の増殖が抑制されていた。図１４は、（i）〜（iii）の各群の生存率をカプランマイヤー生存曲線で示す図である。本検討は、各群ｎ＝８で、生存率は、実験に使用した全匹数に対する生存匹数の割合を百分率で示したものとした。６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術＋放射免疫治療群（ii）は、偽手術群（iii）及び６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群（i）と比較し、生存が有意に延長されていた（Ｐ＜０．０５）。６４Ｃｕ−ＰＥＴガイド下手術群は、偽手術群と比較し、生存が延長する傾向が見られたが、有意差は見られなかった。
これらの検討から、６４Ｃｕ標識セツキシマブを用いた放射免疫治療と術中迅速診断法の組み合わせは、進行性腹膜播種に有用であることが示された。
【００５２】
以上の結果から、本発明によれば、放射免疫療法を利用して腹腔内に散在する腫瘍を効果的に治療できることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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