(57)【要約】【課題】ＰＣＲのための核酸抽出において、核酸の抽出効率を向上できる核酸抽出キット及び核酸抽出カートリッジを提供する。【解決手段】本発明の核酸抽出キットは、核酸を含有する生物材料に、血清と、従来のカオトロピック剤を含む核酸抽出液を混合し、この混合液にシリカ表面を有する担体を接触させ、核酸が結合したシリカ表面を有する担体を洗浄し、核酸が結合したシリカ表面を有する担体から核酸を溶出させて、回収する。【選択図】図３
2017184626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸結合性のシリカ表面を有する担体と、
カオトロピック剤と血清とを含む核酸抽出液と、
を含むことを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項２】
前記血清の濃度は、０．００１ｖ／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下であることを特徴とする
請求項１に記載の核酸抽出キット。
【請求項３】
核酸は、ＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出キット。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の核酸抽出キットを含み、
長手方向を有し、
オイルからなる第１プラグと、
オイルと相分離し、核酸が結合したシリカ表面を有する担体を洗浄する第１洗浄液から
なる第２プラグと、
オイルからなる第３プラグと、
オイルと相分離し、前記核酸が結合したシリカ表面を有する担体から前記核酸を溶出す
る溶出液からなる第４プラグと、
オイルからなる第５プラグと、を順に内部に備えたチューブを有することを特徴とする
核酸抽出カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出キットおよび核酸抽出カートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス等の核酸を抽出し、その核酸を特異的に増幅して検出するポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）がある。このＰＣＲ
法は、遺伝子検査に広く使われている。しかし、ＰＣＲ法を日常的に臨床で使用する際に
は、検体に含まれる成分の影響で、反応が阻害されるため、検体からＰＣＲ阻害物質を排
除して核酸を抽出精製・回収する処理が必要となる。
そこで、カオトロピック塩の存在下で、核酸をシリカ表面を有する担体へ結合させ、核
酸を回収する原理を用いて、検体（生体材料など）から核酸を抽出精製・回収する方法が
報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１４６７８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、医療現場のインフルエンザに代表される感染症の診断において、罹患後
、より初期段階（ウィルス量が少ない段階）で感染を確認するためには、さらに微量なウ
ィルスの核酸を精度よく抽出・回収できることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上述の課題の少なくとも一つを解決するためになされたものであり、以下の
態様又は適用例として実現することができる。
【０００６】
［適用例１］本適用例に係る核酸抽出キットは、核酸結合性のシリカ表面を有する担体
と、カオトロピック剤と血清とを含む核酸抽出液と、を含むことを特徴とする。
【０００７】
本適用例によれば、核酸抽出液に血清を添加したことにより、核酸抽出・回収の効率が
改善されるため、ＰＣＲに導入される核酸が増加することになる。これによって、検体に
含まれる核酸の検出感度を向上させる核酸抽出キットを提供することができる。
【０００８】
［適用例２］上記適用例に記載の核酸抽出キットは、前記血清の濃度は、０．００１ｖ
／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下であることが好ましい。
【０００９】
本適用例によれば、血清の濃度を０．００１ｖ／ｖ％以上にすることにより、核酸の精
製・回収効率を飛躍的に高めることができる。一方、血清の濃度が５０ｖ／ｖ％を超える
と、相対的にカオトロピック剤の濃度が低下し、核酸の精製・回収効率が低下する。従っ
て、血清の添加濃度が０．００１ｖ／ｖ％以上であり、５０ｖ／ｖ％以下で、生物試料に
含まれる核酸の検出感度が良好な核酸抽出キットを提供することができる。
【００１０】
［適用例３］上記適用例に記載の核酸抽出キットは、核酸が、ＲＮＡであることが好ま
しい。
【００１１】
本適用例によれば、核酸抽出液に血清を添加したことにより、ＲＮＡの抽出・回収の効
率が改善されるため、ＰＣＲに導入されるＲＮＡが増加することになる。これによって、
生物試料に含まれるＲＮＡの検出感度を向上させる核酸抽出キットを提供することができ
る。
【００１２】
［適用例４］本適用例に係る核酸抽出カートリッジは、上記適用例に記載の核酸抽出キ
ットを含み、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグと、オイルと相分離し、核酸が
結合したシリカ表面を有する担体を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグと、オイルか
らなる第３プラグと、オイルと相分離し、前記核酸が結合したシリカ表面を有する担体か
ら前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグと、オイルからなる第５プラグと、を、
順に内部に備えたチューブを有していることを特徴とする。
【００１３】
本適用例によれば、血清を添加した核酸抽出キットを含む核酸抽出カートリッジは、核
酸抽出・回収の効率が改善されるため、ＰＣＲに導入される核酸が増加することになり、
これによって、生物試料に含まれる核酸の検出感度が向上させる核酸抽出カートリッジを
提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】核酸抽出のプロセスフローチャート図。
【図２Ａ】実施形態２に係る核酸抽出カートリッジを模式的に示す図。
【図２Ｂ】図２Ａの連結前の容器とチューブ部を模式的に示す図。
【図３】実施形態２の核酸抽出カートリッジの一変形例を模式的に示す図。
【図４】実施例１の結果を示す図であって、本発明に係る核酸抽出キットによりインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図。
【図５Ａ】実施例２の結果を示す図であって、本発明に係る核酸抽出キットにより添加する血清濃度を変化させて、精製済みＲＮＡから抽出したインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図。
【図５Ｂ】実施例２において、血清濃度が０．１ｖ／ｖ％以下の場合を拡大して示した図。
【図６】実施例３の結果を示す図であって、本発明に係る核酸抽出キットにより培養したインフルエンザＡウィルスから抽出したインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図。
【図７】実施例４の結果を示す図であって、本発明に係る核酸抽出キットにより培養したＭＳ２ファージから抽出したインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図。
【図８】実施例５の結果を示す図であって、本発明に係る核酸抽出カートリッジによりヒト鼻腔拭い液由来検体から抽出したインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本
発明の例を説明するものである。本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではな
く、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下
で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
【００１６】
（実施形態１）
以下、実施形態１に係る核酸抽出キットについて説明する。
図１は、実施形態１に係る核酸抽出キットを使用した核酸抽出のフローチャート図であ
る。
核酸抽出は、溶解・吸着工程Ｓ１０、洗浄工程Ｓ２０、溶出工程Ｓ３０の順に行う。
【００１７】
実施形態１に係る核酸抽出キットは、核酸結合性のシリカ表面を有する担体と、カオト
ロピック剤、血清を含む核酸抽出液と、を含む。核酸抽出液に血清を添加することにより
、核酸の精製・回収効率が改善するメカニズムは明らかになっていないが、溶解・吸着工
程Ｓ１０でシリカ表面を有する担体への核酸吸着が促進される、その後の洗浄工程Ｓ２０
で該担体からの核酸脱離が抑制される、溶出工程Ｓ３０で該担体から溶出液への核酸溶出
が促進される、の３つのいずれか、または複数が同時に起きていると考えている。
【００１８】
核酸を抽出する試料は、核酸を含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細胞
塊などの生体試料、ウイルス、合成核酸、一旦単離した核酸に不純物や夾雑物が混入した
試料などであってもよい。
【００１９】
カオトロピック剤は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰
イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸がシリカ表面
を有する担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニ
ジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸
ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオ
シアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度
は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、２．
５Ｍ以上で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、３Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００２０】
血清は、核酸抽出キットにより回収する核酸を増加させる作用を有している。核酸抽出
液に含まれる血清の濃度を０．００１ｖ／ｖ％以上にすることにより、核酸の精製・回収
効率を飛躍的に高めることができる。一方、血清の濃度が５０ｖ／ｖ％ を超えると、相
対的にカオトロピック剤の濃度が低下し、核酸の精製・回収効率が低下する。従って、血
清の添加濃度が０．００１ｖ／ｖ％以上であり、５０ｖ／ｖ％以下で、生物試料に含まれ
る核酸の検出感度が良好な核酸抽出キットを提供することができる。
【００２１】
なお、血清の添加は、特に、ＲＮＡの精製・回収効率の改善に有効である。
【００２２】
図１に示した溶解・吸着工程Ｓ１０にて使用する    核酸抽出液は、カオトロピック剤
と血清とを含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタン
パク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一
般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活
性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等
の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の
範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、核酸抽出液には、２−メルカプトエタ
ノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有していても良い。溶媒は、緩衝液で
あっても良いが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体
的には、２．５〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍ
ＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有していても良い。
【００２３】
シリカ表面を有する担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可
逆的な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限
定されない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土
、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁
性金属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核
酸との可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。
【００２４】
また、これらのシリカ表面を有する担体の形態としては、粒子、フィルター、バッグ、
ディッシュ、反応容器等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸
着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定され
ないが、０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に
好ましくは１〜１０μｍである。
【００２５】
具体的には、以下の様にして核酸を抽出することができる。
まず、溶解・吸着工程Ｓ１０として、適量の核酸抽出液に、核酸を抽出する試料及びシ
リカ表面を有する担体を混合し、ホモジェナイザーやボルテックスミキサー、超音波、加
熱などによって試料を破砕し、核酸を担体に吸着させる。シリカ表面を有する担体、及び
核酸抽出液は、上述の核酸抽出キットを使用することができる。
【００２６】
次に、洗浄工程Ｓ２０として、非特異的にシリカ表面を有する担体に吸着した夾雑物を
除去するため、核酸が吸着したシリカ表面を有する担体を、適量の洗浄液で洗浄すること
が好ましい。洗浄回数は特に限定されないが、１回〜数回洗浄すればよい。
【００２７】
洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物
質を含有しても良いが、溶出工程前の洗浄液は、水または低塩濃度水溶液であることが好
ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度
は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ま
しい。また、低塩濃度水溶液の塩濃度の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが
好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔ
ｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液
にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸、クエン酸など
の塩が好ましく用いられる。
【００２８】
ここでいう洗浄とは、核酸の結合したシリカ表面を有する担体を洗浄液と接触させ、再
び分離することにより、担体から、核酸以外の非特異的に結合した物質を除去する操作で
ある。具体的な分離方法は、使用する担体の形態により異なるが、シリカ表面を有する担
体が粒子形態である場合には、遠心分離、ろ過分離及びカラム操作等を用いることができ
る。担体が磁性体を含む場合は、磁石等を用いて、簡便に担体を洗浄することができる。
【００２９】
そして、溶出工程Ｓ３０として、核酸が吸着したシリカ表面を有する担体に、適量の溶
出液を加え、ボルテックスミキサーなどによって混合し、核酸を担体から溶出させる。こ
の際、溶出液を加熱することにより、核酸溶出を促進しても良い。加熱温度は特に限定さ
れないが、４０℃より高ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい
。さらに、８０℃以上が好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、水の沸点より
１００℃以下であることが好ましい。加熱方法として、予め加熱した溶出液に核酸が結合
するシリカ表面を有する担体を加えても良く、溶出液に当該担体を加えた後で加熱しても
良い。
【００３０】
溶出液には、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチ
ド）が含まれていても良いが、特に限定されない。溶媒は、水であることが好ましく、エ
タノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含ま
ないものがより好ましい。また、逆転写酵素用緩衝液となるように、塩を含有していても
良い。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリ
ス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定され
ず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉ
ｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕ
ｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ 
Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ
Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用で
きるが、耐熱性の酵素が好ましい。この場合、溶出液を、そのまま逆転写反応に用いるこ
とができる。この際、溶出に用いたチューブをそのまま用いてもよく、新しいチューブに
移しても良いが、反応効率の点で、溶出に用いたチューブをそのまま用いるのが好ましい
。また、逆転写反応には、溶出液の一部または全部を用いてもよく、一部を用いる場合は
、逆転写酵素用に調製したバッファーで希釈するのが好ましい。逆転写酵素用に調製した
バッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いても良いが、塩濃度が適正に調製されてい
ることが好ましく、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマーは、それぞれ添
加されていてもいなくても構わない。このとき、シリカ表面を有する担体は、除去しても
しなくても構わないが、除去することが好ましい。
【００３１】
逆転写反応は、逆転写酵素に適した条件で行えば良い。そして、逆転写反応の後、増幅
したｃＤＮＡは、ＰＣＲを含むポリメラーゼ反応など、様々な用途に用いることができる
。溶出工程の間に逆転写反応を行うことによって、逆転写反応のための時間を設けること
なく、全体の反応時間短縮の効果を得ることもできる。その場合、核酸の溶出と逆転写反
応を同時に進行させるため、反応温度は、６０℃以上７０℃以下であることが好ましく、
６０℃以上６５℃以下であることがより好ましく、６０℃であることが最も好ましい。
【００３２】
さらに、溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴ
ヌクレオチド）を含んでいても良く、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリ
ーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいても良い。溶媒は、水であることが
好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質
を事実上含まないものがより好ましい。また、ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように
、塩を含有していても良い。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に
限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。ＤＮ
Ａポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば
、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改
良型など、非常に多数の市販品がある。この場合は、逆転写反応後の反応液を、直接ＤＮ
Ａポリメラーゼ反応に用いることができる。この際、逆転写反応に用いたチューブをその
まま用いてもよく、新しいチューブに移しても良いが、反応効率の点で、逆転写反応に用
いたチューブをそのまま用いるのが好ましい。また、ＤＮＡポリメラーゼ反応には、反応
液の一部または全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調製
したバッファーで希釈するのが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼ用に調製したバッファーは
、溶出液と同じ成分の溶液を用いても良いが、塩濃度が適正に調製されていることが好ま
しく、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーは、それぞ
れ添加されていてもいなくても構わない。
【００３３】
さらに、溶出液は、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラ
チンを含有しても良い。
【００３４】
ＤＮＡポリメラーゼ反応は、用いるＤＮＡポリメラーゼに適した条件で行えば良い。そ
して、ＤＮＡポリメラーゼ反応の後、増幅したｃＤＮＡは、ライブラリー作製など様々な
用途に用いることができる。
【００３５】
本発明の核酸抽出キットは、２〜７Ｍのグアニジン塩、血清、０〜５％の非イオン性界
面活性剤を含有する核酸抽出液と、エタノールや低塩濃度水溶液からなる洗浄液と、水ま
たは低塩濃度水溶液からなる溶出液と、を含む。本キットによって、核酸抽出液に血清を
添加するだけで、本発明にかかる精度のよい核酸抽出・回収を行うことができる。
【００３６】
（実施形態２）
以下、実施形態２に係る核酸抽出カートリッジ２０００について説明する。
【００３７】
図２Ａは、本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００の一例を示す模式図である。
核酸抽出は、図１に示した、溶解・吸着工程、洗浄工程、溶出工程の順に、図２Ａに示
した核酸抽出カートリッジ２０００の流路内で行う。用いた試薬は、実施形態１に示した
構成と同様である。
【００３８】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００は、オイルからなる第１プラグ１０、オイ
ルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２０、オイルからなる第３プラグ３０、オ
イルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０、及びオイルからなる第５プラグ５０、
が当該順で内部に配置されたチューブとしてのチューブ部２００と、チューブ部２００の
第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続可能な容器１２０と、を含む構成である。
【００３９】
容器１２０は、内部に検体を分散させる液体や、核酸を捕集する担体等を収容すること
ができる。
【００４０】
容器１２０は、検体を分散させる液体や、核酸を捕集する担体等として、核酸抽出液及
びシリカ表面を有する担体として磁性粒子を収容していてもよい。このようにすれば、検
体を容器１２０に導入した際、検体に含まれる核酸を磁性粒子に吸着させる工程を、容器
１２０において行うことができる。これにより、他の容器を用意する必要がなく、さらに
迅速にＰＣＲの前処理を行うことができる。磁性粒子については後に詳述する。
【００４１】
また、容器１２０を、可とう性を有する材質とすれば、容器１２０をチューブ部２００
に接続した状態で、容器１２０を変形させることにより、チューブ部２００の内部を加圧
することができる。このようにすれば、核酸が溶出された第４プラグ４０の溶出液をチュ
ーブ部２００の第５プラグ５０側の端から吐出させる際に、チューブ部２００の第１プラ
グ１０側から圧力を容易に印加することができる。これにより、例えばＰＣＲのための反
応容器等に容易に溶出液を分注することができる。
【００４２】
チューブ部２００は、内部に空洞を有し、当該空洞内に液体を長手方向に流通させるこ
とのできる筒状の部分である。チューブ部２００は、長手方向を有するが、屈曲してもよ
い。チューブ部２００の内部の空洞は、液体がチューブ部２００内でプラグ形状を維持で
きれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ部２００の内部の空洞の
大きさや長手方向に垂直な断面の形状は、チューブ部２００の長手方向に沿って変化して
もよい。液体がチューブ部２００内でプラグ形状を維持できるかどうかについては、チュ
ーブ部２００の材質、液体の種類等の条件に依存するので、チューブ部２００の長手方向
に垂直な断面の形状は、液体がチューブ部２００内でプラグ形状を維持できる範囲内で適
宜に設計される。
【００４３】
チューブ部２００の外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチュー
ブ部２００の肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されない。
チューブ部２００の内部の空洞の長手方向に垂直な断面が円形である場合、チューブ部２
００の内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５
ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブ部２００の内径がこの範囲であると、
チューブ部２００の材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい
のでより好ましい。
【００４４】
チューブ部２００の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、高分子、金属など
とすることができる。しかし、チューブ部２００の材質にガラスや高分子などの可視光に
おいて透明性を有する材質を選択すると、チューブ部２００の外部から内部（空洞内）を
観察することができるのでより好ましい。また、チューブ部２００の材質に、磁力を透過
する物質や非磁性体を選択すると、チューブ部２００に磁性粒子（シリカ表面を有する担
体）を通過させる場合などに、チューブ部２００の外部から磁力を与えることによってこ
れを行うことが容易化されるため好ましい。
【００４５】
チューブ部２００の内部には、オイルからなる第１プラグ１０、オイルと混和しない第
１洗浄液からなる第２プラグ２０、第１洗浄液と混和しないオイルからなる第３プラグ３
０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０、及び溶出液と混和しないオイル
からなる第５プラグ５０が、当該順で配置される。オイルとしては、例えば、ジメチルシ
リコーンオイル等のシリコーン系オイル、パラフィン系オイル及びミネラルオイル並びに
それらの混合物から選択される一種を挙げることができる。
【００４６】
第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のチューブ部２００の長手方向
における長さは、プラグが形成可能な範囲であれば、いずれも特に限定されない。第１プ
ラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のチューブ部２００の長手方向における
具体的な長さとしては、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、シリカ表面を有する担体の粒子
等の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以
上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。これらのうち第３プラグ３０のチューブ部２００の長
手方向における長さを長くすると、第４プラグ４０をチューブ部２００の第５プラグ５０
側の端から吐出する態様を採る場合に、第２プラグ２０を吐出しにくくすることができる
。この場合、第３プラグ３０の具体的な長さとしては、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下とする
ことができる。
【００４７】
第２プラグ２０は、チューブ部２００内の第１プラグ１０と第３プラグ３０との間の位
置に配置される。第２プラグ２０は、第１洗浄液からなる。第１洗浄液は、第１プラグ１
０を構成するオイル及び第３プラグ３０を構成するオイルのいずれとも混和しない液体で
ある。第１洗浄液としては、水、又は緩衝液等が挙げられる。緩衝液の組成は、特に限定
されないが、ＴＲＩＳバッファー、クエン酸バッファー、ＨＣｌ、などを例示することが
できる。
【００４８】
第２プラグ２０の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させたシリカ表面を有する担体
粒子等の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５
μＬである場合には、第２プラグ２０の体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０
μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさ
らに好ましい。第２プラグ２０の体積が、この範囲であれば、粒子等の体積が、０．５μ
Ｌである場合に粒子等の洗浄を十分に行うことができる。なお、粒子等の洗浄には、第２
プラグ２０の体積は、より大きいことが好ましいが、チューブ部２００の長さや太さ、こ
れに依存する第２プラグ２０のチューブ部２００の長手方向における長さ等を考慮して、
適宜に設定することができる。
【００４９】
第４プラグ４０は、チューブ部２００内の第３プラグ３０と第５プラグ５０との間の位
置に配置される。第４プラグ４０は、溶出液からなる。
【００５０】
溶出液とは、粒子等に吸着した核酸を、粒子から脱離させて液中に溶離させる液体のこ
とを指す。溶出液としては、例えば、滅菌水、蒸留水、イオン交換水等の精製された水、
又はそのような水に対して、酵素、ｄＮＴＰ、プローブ、プライマー及びバッファーの少
なくとも一種を溶解させた水溶液を挙げることができる。溶出液は、第３プラグ３０を構
成するオイル及び第５プラグ５０を構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。
【００５１】
溶出液を水又は水溶液とすれば、核酸が吸着されたシリカ表面を有する担体粒子等が溶
出液に浸漬されることで、粒子等に吸着した核酸を遊離（溶出）させることができる。ま
た、溶出液に酵素、ｄＮＴＰ、プローブ、プライマー及びバッファーの少なくとも一種を
溶解させた水溶液を選択すると、粒子等に吸着した核酸を遊離（溶出）させるとともに、
ＰＣＲの反応液に必要な成分の一部又は全部を溶出液に含有させることができるので、溶
出液を用いてＰＣＲの反応液を調製する際の時間と手間をさらに省くことができる。第４
プラグ４０の溶出液に酵素、ｄＮＴＰ、プローブ、プライマー及びバッファーの少なくと
も一種を溶解させる場合の濃度は特に限定されず、調製するＰＣＲの反応液に合わせて設
定できる。
【００５２】
第４プラグ４０の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させたシリカ表面を有する担体
粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．
５μＬである場合には、第４プラグ４０の体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、
０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさ
らに好ましい。第４プラグ４０の体積が、この範囲であれば、当該粒子等の体積が、０．
５μＬである場合に粒子等からの核酸の溶出を十分に行うことができる。なお、粒子等か
らの核酸の溶出には、第４プラグ４０の体積は、チューブ部２００の長さや太さ、及びＰ
ＣＲの熱サイクルの迅速性を考慮して、反応液の熱容量が大きくなりすぎないように考慮
して適宜に設定することができる。
【００５３】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００は、チューブ部２００に、第１プラグ１０
、第２プラグ２０、第３プラグ３０、第４プラグ４０、及び第５プラグ５０、を有するが
、他の機能を付加する構成を含んでもよい。本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００
は、以下に説明する構成の組み合わせや、各構成の変形形態を含んでもよい。
【００５４】
次に、図２Ｂについて記述する。図２Ｂは、図２Ａに示した核酸抽出カートリッジ２０
００を、容器１２０とチューブ部２００に分割した状態を示す模式図である。
チューブ部２００の両端は、脱着自在の栓１１０によって封止されてもよい。チューブ
部２００の両端が栓１１０によって封止されている場合、例えば、核酸抽出カートリッジ
２０００の保管、移送がより容易になる。さらに、チューブ部２００の使用時に、栓１１
０がチューブ部２００の第５プラグ５０側の端を封止した状態とすれば、チューブ部２０
０の内部で粒子等を移動させる際に、各プラグのチューブ部２００内での移動を抑制する
ことができるので、洗浄、抽出をさらに容易化することができる。その上、当該栓１１０
は、脱着自在であるため、チューブ部２００の第５プラグ５０側の端を開放することがで
き、核酸が溶出された第４プラグ４０の溶出液をチューブ部２００の第５プラグ５０側の
端から吐出させることが容易である。
【００５５】
容器１２０は、内部に液体を収容することができる。容器１２０は、液体や固体を出し
入れできる開口１２１を有する。また、図２Ａの例では、容器１２０の開口１２１が、チ
ューブ部２００の第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続される態様となっている
。
【００５６】
図２Ｂの例では、チューブ部２００の両端が、脱着自在の栓１１０によって封止されて
いる。また、核酸抽出キットは、容器１２０の開口１２１を脱着自在に封止する蓋１２２
を含んでもよく、容器１２０の開口１２１が脱着自在の蓋１２２によって封止されてもよ
い。さらに、核酸抽出キットでは、核酸抽出液の成分の一部又は全部が容器１２０に収容
されていてもよい。
【００５７】
また、核酸抽出カートリッジ２０００では、容器１２０は、図２Ａと同様に、核酸抽出
液及びシリカ表面を有する担体として磁性粒子を収容していてもよい。このようにすれば
、検体を容器１２０に導入した際、検体に含まれる核酸を磁性粒子に吸着させる工程を、
容器１２０において行うことができる。これにより、他の容器を用意する必要がなく、さ
らに迅速にＰＣＲの前処理を行うことができる。またこの場合、容器１２０の開口１２１
は、必要に応じて脱着自在の蓋１２２によって封止されてもよい。磁性粒子については後
に詳述する。
【００５８】
また、容器１２０を、既に述べたように、可とう性を有する材質とすれば、容器１２０
をチューブ部２００に接続した状態で、容器１２０を変形させることにより、チューブ部
２００の内部を加圧することができる。このようにすれば、核酸が溶出された第４プラグ
４０の溶出液をチューブ部２００の第５プラグ５０側の端から吐出させる際に、チューブ
部２００の第１プラグ１０側から圧力を容易に印加することができる。これにより、例え
ばＰＣＲのための反応容器等に容易に溶出液を分注することができる。
【００５９】
図２Ａと図２Ｂに示した核酸抽出カートリッジ２０００には、チューブ部２００及び容
器１２０の他に、例えば、栓、蓋、取扱説明書、試薬、ケース等の他の構成が含まれても
よい。またここではチューブ部２００内に５つのプラグが配置されている例を示したが、
チューブ部２００内には、第６プラグ、第７プラグ等や、必要に応じてその他のプラグが
配置されてもよい。
【００６０】
以後は、図２Ｂに示した核酸抽出カートリッジ２０００を用いて詳述する。本実施形態
の核酸抽出カートリッジ２０００は、チューブ部２００の第１プラグ１０側の端に内部を
連通させて接続可能な容器１２０を有するため、容器１２０内において、シリカ表面を有
する担体粒子等と検体とを収容すれば、粒子等に核酸を吸着させることができ、容器１２
０をチューブ部２００の第１プラグ１０側の端に接続すれば、当該粒子等をチューブ部２
００の第１プラグ側から容易にチューブ部２００内に導入することができる。また、本実
施形態の核酸抽出カートリッジ２０００は、容器１２０を有するため、容器１２０を振と
うすることができ、容器１２０内の液体を十分に撹拌することができる。これにより迅速
に当該粒子等に核酸を吸着させることができる。
【００６１】
また、チューブ部２００に容器１２０を接続することにより、核酸が吸着されたシリカ
表面を有する担体粒子等をチューブ部２００の第１プラグ１０側の端から導入して、第４
プラグ４０まで移動させることが容易である。これにより、核酸の抽出をきわめて短時間
で容易に行うことができる。核酸抽出カートリッジ２０００は、核酸が吸着された当該粒
子等をチューブ部２００内において移動させることによって、高い純度で核酸を含有する
溶出液を得ることができる。そのため、核酸抽出カートリッジ２０００によれば、ＰＣＲ
のための前処理に要する時間と手間を大幅に削減することができる。
【００６２】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００による核酸抽出は、磁性微粒子Ｍ及び核酸
抽出液が収容された可とう性を有する容器１２０に、核酸を含有する検体を導入する導入
工程と、容器１２０を揺動して核酸を磁性微粒子Ｍに吸着させる吸着工程と、オイルから
なる第１プラグ１０、オイルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２０、オイルか
らなる第３プラグ３０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０及びオイルか
らなる第５プラグ５０、が当該順で内部に配置されたチューブ部２００の第１プラグ１０
側の端に、容器１２０内部とチューブ部２００内部を連通させて容器１２０を接続する接
続工程と、磁力を印加して容器１２０内部からチューブ部２００内部を通過させて第５プ
ラグ５０の位置まで、磁性微粒子Ｍを移動させる移動工程と、第４プラグ４０の溶出液に
対して磁性微粒子Ｍから核酸を溶出させる溶出工程と、を含む。
【００６３】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００では、核酸抽出液を用いて核酸を吸着させ
ることのできるシリカ表面を有する担体であって、チューブ部２００内を移動させること
のできる粒子であれば、各種（例えばシリカ粒子、ポリマー粒子、磁性粒子等）の粒子を
用いることができるが、以下に説明する核酸抽出カートリッジの一実施形態では、磁性体
を含有するシリカ表面を有する粒子担体であって、粒子表面に核酸を吸着できる磁性微粒
子Ｍを使用する。なお、磁性微粒子Ｍ以外の粒子等をチューブ内で移動させる場合は、例
えば、重力や電位差を利用してこれを行うことができる。
【００６４】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００では、容器１２０及びチューブ部２００に
磁力を透過する材質を選び、容器１２０及びチューブ部２００の外部から磁力を印加する
ことによって磁性微粒子Ｍを容器１２０及びチューブ部２００の内部で移動させる。
【００６５】
検体には標的となる核酸が含まれている。以下、これを単に標的核酸ということがある
。標的核酸は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ（ＤＮＡ：Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ 
Ａｃｉｄ、及び／又はＲＮＡ：Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）である。標的核酸は
、本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００によって検体から抽出され、溶出液に溶出
された後、例えばＰＣＲの鋳型として利用される。検体としては、血液、鼻腔粘液、口腔
粘膜、その他各種の生体試料などが挙げられる。
【００６６】
［吸着工程］
核酸のシリカ表面を有する担体への吸着は、容器１２０を揺動させて行われる。この工
程は、容器１２０の開口１２１を封止する蓋１２２があれば、これを用いて容器１２０を
封止して行うとより効率的に行うことができる。ここでは、シリカ表面を有する担体とし
て、シリカ表面を有する磁性微粒子Ｍを使用することができる。この工程により、標的核
酸は、カオトロピック剤の作用により、磁性微粒子Ｍの表面に吸着される。この工程では
、磁性微粒子Ｍの表面には、標的核酸の他に標的核酸以外の核酸や蛋白質が吸着してもよ
い。
【００６７】
容器１２０を揺動させる方法としては、ボルテックスシェイカーなどの装置を用いても
よいし、作業者の手で振り混ぜてもよい。また、磁性微粒子Ｍの磁性を利用して、外部か
ら磁場を与えながら容器１２０を揺動してもよい。容器１２０を揺動させる時間は、適宜
設定されうるが、例えば容器１２０のおよその形状が、直径が２０ｍｍ、高さが３０ｍｍ
程度の円筒状である場合には、容器１２０を１０秒間手で振って揺動する程度で十分に撹
拌され、核酸が磁性微粒子Ｍの表面に吸着する。
【００６８】
次に、図２Ａに示すように、チューブ部２００の第１プラグ１０側の端に容器１２０を
接続する。チューブ部２００内の各プラグは、第１プラグ１０側の栓１１０を外しても、
第５プラグ５０側の栓１１０がなされているため、チューブ部２００内を移動しにくくな
っている。この工程は、チューブ部２００の第１プラグ１０側の端に栓１１０が取り付け
られている場合には該栓１１０を外して行う。そして、容器１２０及びチューブ部２００
は、内容物が漏出しないように接続され、容器１２０内部とチューブ部２００の内部との
間で内容物が流通可能なように連通される。
【００６９】
［移動工程］
上記工程を経ると、容器１２０内の核酸が吸着した磁性微粒子Ｍがチューブ部２００に
流通できる状態となっている。核酸が吸着した磁性微粒子Ｍをチューブ部２００に導く手
法としては、重力や遠心力を利用する方法を用いてもよく、特に制限されないが、本実施
形態では容器１２０及びチューブ部２００の外部から磁力を印加して行う。磁力は、例え
ば、磁石、電磁石等により印加することができるが、発熱等を生じない点で、磁石を用い
て印加することがより好ましい。また、磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動か
して行ってもよいし、機械装置等を利用して行ってもよい。磁性微粒子Ｍは、磁力によっ
て引き寄せられる性質を有しているため、この性質を利用して、容器１２０及びチューブ
部２００と、磁石の相対的な配置を変化させて、容器１２０内からチューブ部２００に移
動させる。これにより、第１プラグ１０から順に、各プラグを通って、第４プラグ４０ま
で磁性微粒子Ｍが移動される。磁性微粒子Ｍが各プラグを通過するときの各プラグにおけ
る滞在時間は特に限定されないし、同一プラグ内でチューブ部２００の長手方向に沿って
往復するようにして移動させてもよい。
【００７０】
［溶出工程］
磁性微粒子Ｍが第４プラグ４０に到達すると、溶出液の作用により、磁性微粒子Ｍに吸
着された核酸が、第４プラグ４０の溶出液に溶出する。本工程を経ると、検体から溶出液
に対して核酸が溶出し、検体から核酸が抽出された状態となる。
【００７１】
本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００によれば、核酸の抽出をきわめて短時間で
容易に行うことができる。本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００は、核酸が吸着さ
れた磁性微粒子Ｍをチューブ部２００内において移動させることによって、高い純度で核
酸を含有する溶出液を得ることができる。本実施形態の核酸抽出カートリッジ２０００に
よれば、ＰＣＲのための核酸抽出・回収に要する時間と手間を大幅に削減することができ
る。
【００７２】
（変形例）
次に、実施形態２の核酸抽出カートリッジ２０００の一変形例を、図３を参照して説明
する。
図３は、実施形態２の核酸抽出カートリッジ２０００の一変形例を模式的に示す図であ
る。
本変形例の核酸抽出カートリッジ２０００ａは、チューブ部２００の内部に配置された
磁性微粒子Ｍに対して磁力を印加する永久磁石４１０を含む。チューブ部２００内部には
、オイルからなる第１プラグ１０、オイルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２
０、オイルからなる第３プラグ３０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０
、及びオイルからなる第５プラグ５０、が当該順で配置され、第５プラグ５０側に栓１１
０をして封止して、チューブ部２００内部で粒子等を移動させる際に、各プラグのチュー
ブ部２００内部での移動を抑制している。
【００７３】
実施形態２における移動工程に相当する磁性粒子を移動させる工程では、磁性微粒子Ｍ
に対して磁力を外部から印加することによって、磁性微粒子Ｍを第１プラグ１０から各プ
ラグを通過させて第４プラグ４０まで移動させると説明した。しかし、磁性微粒子Ｍが第
２プラグ２０に移動されたときに、外部から印加される磁力を変化させて、第２プラグ２
０内で磁性微粒子Ｍを振動させたり、拡散凝集を繰り返したりして行ってもよい。このよ
うにすれば、第２プラグ２０の第１洗浄液による磁性微粒子Ｍの洗浄効果を高めることが
できる。
【００７４】
具体的には、図３のＡ、Ｂに示すように、磁力を印加する手段として、一対の永久磁石
４１０を用いる場合には、永久磁石４１０によって容器１２０から磁性微粒子Ｍを移動さ
せ、第１プラグ１０を通過させて、第２プラグ２０まで磁性微粒子Ｍが到達したときに、
一方の永久磁石４１０をチューブ部２００から遠ざけ、他方の永久磁石４１０を、チュー
ブ部２００に対して対向する側から近づけると、磁性微粒子Ｍを第２プラグ２０内でチュ
ーブ部２００の長手方向と交差する方向に振動させることができる（図中Ａ，Ｂの態様の
繰り返し）。このようにすれば、第２プラグ２０の第１洗浄液による磁性微粒子Ｍの洗浄
効果を高めることができる。このような磁性微粒子Ｍの洗浄は、第２プラグ２０を分割し
た場合や、チューブ部２００内に第６プラグが配置される場合に、複数の第２プラグ２０
や、第６プラグにおいて適用してもよい。
【００７５】
また、図３のＣに示すように、永久磁石４１０を単にチューブ部２００から遠ざけるこ
とにより、第２プラグ２０内で磁性微粒子Ｍを拡散させることができる。磁性微粒子Ｍは
、表面が親水性であるため、例えば第２プラグ２０において、磁力を弱めて拡散されたと
しても、第１プラグ１０や第３プラグ３０のオイルには進入しにくいので、このような態
様としてもよい。
【００７６】
具体的には、永久磁石４１０によって容器１２０から磁性微粒子Ｍを移動させ、第１プ
ラグ１０を通過させて第２プラグ２０に磁性微粒子Ｍが到達したときに、永久磁石４１０
をチューブ部２００から遠ざけ、第２プラグ２０内において磁性微粒子Ｍを拡散させる。
そして、磁性微粒子Ｍを再び永久磁石４１０の磁力によって移動させ、第３プラグ３０を
通過させて、第４プラグ４０に導くことができる。
【００７７】
このような外部から印加される磁力を変化させて、磁性微粒子Ｍを振動させたり、拡散
凝集を繰り返したりする態様は、容器１２０内の吸着液に磁性微粒子Ｍが存在する状態や
、第４プラグ４０（溶出液）に磁性微粒子Ｍが存在する状態において適用してもよい。
【００７８】
実施形態２における溶出工程に相当する核酸を溶出させる工程では、第４プラグ４０を
加熱して行ってもよい。第４プラグ４０を加熱する方法としては、例えば、チューブ部２
００の第４プラグ４０に対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる方法や
、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができる。
【００７９】
第４プラグ４０を加熱する場合には、第４プラグ４０以外のプラグも加熱されてもよい
が、核酸が吸着された磁性微粒子Ｍが、洗浄液のプラグに存在する状態では、当該プラグ
は加熱されないことが好ましい。第４プラグ４０を加熱する場合の到達温度としては、溶
出の効率の観点から、６５℃以上１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以上１
００℃以下、さらに好ましくは９０℃以上１００℃以下である。
【００８０】
核酸を溶出させる工程において、第４プラグ４０を加熱すると、磁性微粒子Ｍに吸着さ
れた核酸を、溶出液に対して、より効率的に溶出させることができる。また、第１洗浄液
又は第２洗浄液と、溶出液の組成が同一又は類似していても、洗浄液に対して溶出せずに
磁性微粒子Ｍに残って吸着している核酸を溶出液に対して溶出させることができる。すな
わち、核酸が吸着した磁性微粒子Ｍを第１洗浄液又は第２洗浄液によって洗浄した後でも
、溶出液に対して核酸をさらに溶出させることができる。これにより、洗浄液の組成と、
溶出液の組成が同一又は類似していても、十分な洗浄と、溶出液への十分な濃度での溶出
とを両立ことができる。
【００８１】
以下に実施例を説明し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によ
って何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
本実施例では、実施形態１に記載した核酸抽出キットを用いて、培養されたインフルエ
ンザＡウィルスから精製されたＲＮＡを分散させた水溶液からのＲＮＡ抽出を行った。こ
こで、核酸抽出に与える血清添加の効果を確認するため、比較対象（コントロール）とし
て、血清の代わりに、核酸分解酵素除去処理を行った水を添加した。
【００８３】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％
グアニジンチオシアン酸塩、１．０ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリス
塩酸緩衝液ｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノール、１ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ
ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ以下、「ＦＢＳ」と記す。））を入れ、そこに、精製されたＲ
ＮＡを含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性微粒子Ｍ（直径１〜３μｍのシリカ表
面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）を入れ、ボルテックスミキサーで１０分間、十
分に撹拌した。磁石で磁性ビーズを引き付け、核酸抽出液を除去した。次に、洗浄液１（
３０ｗｔ％グアニジン塩酸塩、６０ｖ／ｖ％エタノール）を入れ、ボルテックスミキサー
で５秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍと引き付け、洗浄液１を除去した。洗浄液１によ
る洗浄を２回行った後、洗浄液２（０．１ｗｔ％トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５、０．２ｗ
ｔ％塩化ナトリウム、７０ｖ／ｖ％エタノール）で、同様に２回洗浄を行った。洗浄液２
による洗浄を２回行った後、洗浄液３（０．１ｗｔ％クエン酸ｐＨ４．０、０．０５ｗｔ
％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００）で、同様に２回洗浄を行った。洗浄液を除去後、磁性微粒子
Ｍに溶出液として核酸分解酵素除去処理を行った水を２７．５μＬ入れ、ボルテックスミ
キサーで、５秒間軽く撹拌した後、９５℃のヒーターに入れて２分間加熱した。最後に、
磁性微粒子Ｍを磁石で引き付け、溶出液を回収し、ＲＮＡ溶液とした。
【００８４】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なおＲＴ−ＰＣＲはＣＤ
Ｃ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１）に従って実施した。具体的には、
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。図４にその結果を示す。図４は、実施例１の結果を示す図であって、本発
明に係る核酸抽出キットによりインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲ
を行った結果を示した図である。
逆転写  ５０℃  ３０分
Ｔａｑ活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−５５℃  ３０秒  ５０サイクル
【００８５】
核酸抽出液にＦＢＳを添加した結果とコントロールの結果を比較すると、ＦＢＳを添加
した方がＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度の立ち上がりが早くなった。このことは、核酸抽出液に
血清を添加した方が、ＲＮＡの回収効率が向上することを示す。
【実施例２】
【００８６】
本実施例では、実施形態１に記載した核酸抽出キットを用いて、培養されたインフルエ
ンザＡウィルスから精製されたＲＮＡを分散させた水溶液からのＲＮＡ抽出を行った。こ
こで、ＦＢＳの濃度が核酸抽出に与える液用を確認するため、添加するＦＢＳの濃度を変
化（０ｖ／ｖ％〜５．０ｖ／ｖ％）させた。
【００８７】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％
グアニジンチオシアン酸塩、１．０ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリス
ｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノール、０ｖ／ｖ％〜５．０ｖ／ｖ％の間で変化させたＦ
ＢＳ）を入れ、そこに、精製されたＲＮＡを含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性
微粒子Ｍ（直径１〜３μｍのシリカ表面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）を入れ、
ボルテックスミキサーで１０分間、十分に撹拌した。磁石で磁性ビーズを引き付け、核酸
抽出液を除去した。次に、洗浄液１（３０ｗｔ％グアニジン塩酸塩、６０ｖ／ｖ％エタノ
ール）を入れ、ボルテックスミキサーで５秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍと引き付け
、洗浄液１を除去した。洗浄液１による洗浄を２回行った後、洗浄液２（０．１ｗｔ％ト
リスｐＨ７．５、０．２ｗｔ％塩化ナトリウム、７０ｖ／ｖ％エタノール）で、同様に２
回洗浄を行った。洗浄液２による洗浄を２回行った後、洗浄液３（０．１ｗｔ％クエン酸
ｐＨ４．０、０．０５ｗｔ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で、同様に２回洗浄を行った。
洗浄液を除去後、磁性微粒子Ｍに溶出液として核酸分解酵素除去処理を行った水を２７．
５μＬ入れ、ボルテックスミキサーで、５秒間軽く撹拌した後、９５℃のヒーターに入れ
て２分間加熱した。最後に、磁性微粒子Ｍを磁石で引き付け、溶出液を回収し、ＲＮＡ溶
液とした。
【００８８】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なおＲＴ−ＰＣＲはＣＤ
Ｃ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１）に従って実施した。具体的には、
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。図５Ａおよび図５Ｂにその結果を示す。図５Ａは、実施例２の結果を示す
図であって、本発明に係る核酸抽出キットにより添加する血清濃度を変化させて、精製済
みＲＮＡから抽出したインフルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った
結果を示した図である。また、図５Ｂは、実施例２において、血清濃度が０．１ｖ／ｖ％
以下の場合を拡大して示した図である。
逆転写  ５０℃  ３０分
Ｔａｑ活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−５５℃  ３０秒  ５０サイクル
【００８９】
核酸抽出液にＦＢＳを添加した結果とコントロールの結果を比較すると、ＦＢＳを添加
した方がＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度の立ち上がりが早くなる、すなわちＣｔ値が小さくなる
ことわかる。このことは、核酸抽出液にＦＢＳを添加した方が、ＲＮＡの回収効率が向上
することを示す。さらに、図５Ｂより、ＦＢＳ濃度を０．００１ｖ／ｖ％以上にすること
により、核酸抽出液にＦＢＳを添加しない場合に比べ、蛍光強度が立ち上がる点が著しく
早くなっており、ＦＢＳ濃度を０．００１ｖ／ｖ％以上にすると良好な効果を示すことが
わかる。また、図５Ｂからは、ＦＢＳを添加する効果が０．０５ｖ／ｖ％でほぼ飽和する
ことも読み取れる。
【実施例３】
【００９０】
本実施例では、実施形態１に記載した核酸抽出キットを用いて、培養したインフルエン
ザＡウィルスからのＲＮＡ抽出を行った。ここで、核酸抽出に与えるＦＢＳ添加の効果を
確認するため、比較対象（コントロール）として、ＦＢＳの代わりに、核酸分解酵素除去
処理を行った水を添加した。
【００９１】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％
グアニジンチオシアン酸塩、１．０ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリス
ｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノール、１ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を入れ、そこに、培養した
インフルエンザＡウィルスを含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性微粒子Ｍ（直径
１〜３μｍのシリカ表面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）を入れ、ボルテックスミ
キサーで１０分間、十分に撹拌した。磁石で磁性ビーズを引き付け、核酸抽出液を除去し
た。次に、洗浄液１（３０ｗｔ％グアニジン塩酸塩、６０ｖ／ｖ％エタノール）を入れ、
ボルテックスミキサーで５秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍと引き付け、洗浄液１を除
去した。洗浄液１による洗浄を２回行った後、洗浄液２（０．１ｗｔ％トリスｐＨ７．５
、０．２ｗｔ％塩化ナトリウム、７０ｖ／ｖ％エタノール）で、同様に２回洗浄を行った
。洗浄液２による洗浄を２回行った後、洗浄液３（０．１ｗｔ％クエン酸ｐＨ４．０、０
．０５ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００）で、同様に２回洗浄を行った。洗浄液を除去後、
磁性微粒子Ｍに溶出液として核酸分解酵素除去処理を行った水を２７．５μＬ入れ、ボル
テックスミキサーで、５秒間軽く撹拌した後、９５℃のヒーターに入れて２分間加熱した
。最後に、磁性微粒子Ｍを磁石で引き付け、溶出液を回収し、ＲＮＡ溶液とした。
【００９２】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なおＲＴ−ＰＣＲはＣＤ
Ｃ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１）に従って実施した。具体的には、
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。図６にその結果を示す。図６は、実施例３の結果を示す図であって、本発
明に係る核酸抽出キットにより培養したインフルエンザＡウィルスから抽出したインフル
エンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図である。
逆転写  ５０℃  ３０分
Ｔａｑ活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−５５℃  ３０秒  ５０サイクル
【００９３】
核酸抽出液にＦＢＳを添加した結果とコントロールの結果を比較すると、ＦＢＳを添加
した方がＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度の立ち上がりが早くなった。このことは、核酸抽出液に
ＦＢＳを添加した方が、ＲＮＡの回収効率が向上することを示す。
【実施例４】
【００９４】
本実施例では、実施形態１に記載した核酸抽出キットを用いて、培養したＭＳ２ファー
ジ（ＲＮＡを持つ）からのＲＮＡ抽出を行った。ここで、核酸抽出に与えるＦＢＳ添加の
効果を確認するため、比較対象（コントロール）として、ＦＢＳの代わりに、核酸分解酵
素除去処理を行った水を添加した。
【００９５】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％
グアニジンチオシアン酸塩、１．０ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリス
ｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノール、１ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を入れ、そこに、培養したＭ
Ｓ２ファージを含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性微粒子Ｍ（直径１〜３μｍの
シリカ表面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）を入れ、ボルテックスミキサーで１０
分間、十分に撹拌した。磁石で磁性ビーズを引き付け、核酸抽出液を除去した。次に、洗
浄液１（３０ｗｔ％グアニジン塩酸塩、６０ｖ／ｖ％エタノール）を入れ、ボルテックス
ミキサーで５秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍと引き付け、洗浄液１を除去した。洗浄
液１による洗浄を２回行った後、洗浄液２（０．１ｗｔ％トリスｐＨ７．５、０．２ｗｔ
％塩化ナトリウム、７０ｖ／ｖ％エタノール）で、同様に２回洗浄を行った。洗浄液２に
よる洗浄を２回行った後、洗浄液３（０．１ｗｔ％クエン酸ｐＨ４．０、０．０５ｗｔ％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、同様に２回洗浄を行った。洗浄液を除去後、磁性ビーズに
溶出液として核酸分解酵素除去処理を行った水を２７．５μＬ入れ、ボルテックスミキサ
ーで、５秒間軽く撹拌した後、９５℃のヒーターに入れて２分間加熱した。最後に、磁性
ビーズを磁石で引き付け、溶出液を回収し、ＲＮＡ溶液とした。
【００９６】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。図７にその結果を示す。図７は、実施例４の結果を示す図であって、本発
明に係る核酸抽出キットにより培養したＭＳ２ファージから抽出したインフルエンザＡの
ＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図である。
逆転写  ５０℃  ３０分
Ｔａｑ活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−６０℃  ３０秒  ５０サイクル
【００９７】
核酸抽出液にＦＢＳを添加した結果とコントロールの結果を比較すると、ＦＢＳを添加
した方がＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度の立ち上がりが早くなった。このことは、核酸抽出液に
ＦＢＳを添加した方が、ＲＮＡの回収効率が向上することを示す。
【実施例５】
【００９８】
本実施例では、ヒト鼻腔拭い液由来検体からのＲＮＡ抽出を、実施形態２に記載した核
酸抽出カートリッジ２０００を用いた方法で行った。これを、実施形態１に記載した核酸
抽出キット（変形）での、ヒト鼻腔拭い液由来検体からのＲＮＡ抽出と比較した。
【００９９】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％
グアニジンチオシアン酸塩、１．０ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリス
ｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノール、１ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を入れ、そこに、ヒト鼻腔拭
い液由来検体を含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性微粒子Ｍ（直径１〜３μｍの
シリカ表面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）を入れ、ボルテックスミキサーで１０
分間、十分に撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍを引き付け、核酸抽出液を除去した。次に、
洗浄液２（０．１ｗｔ％トリスｐＨ７．５、０．２ｗｔ％塩化ナトリウム、７０ｖ／ｖ％
エタノール）を入れ、ボルテックスミキサーで５秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子Ｍと引
き付け、洗浄液２を除去した。洗浄液２による洗浄を２回行った後、洗浄液３（０．１ｗ
ｔ％クエン酸ｐＨ４．０、０．０５ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００）で、同様に２回洗浄
を行った。洗浄液を除去後、磁性ビーズに溶出液として核酸分解酵素除去処理を行った水
を２７．５μＬ入れ、ボルテックスミキサーで、５秒間軽く撹拌した後、９５℃のヒータ
ーに入れて２分間加熱した。最後に、磁性微粒子Ｍを磁石で引き付け、溶出液を回収し、
ＲＮＡ溶液とした。
【０１００】
図２Ａに示すように、チューブ部２００の第１プラグ１０側の端に容器１２０を接続す
る。容器１２０及びチューブ部２００は、内容物が漏出しないように接続され、容器１２
０内部とチューブ部２００の内部との間で内容物が流通可能なように連通される。
【０１０１】
上記工程を経ると、容器１２０内の核酸が吸着した磁性微粒子Ｍ（直径１〜３μｍのシ
リカ表面を有する担体、濃度４００ｍｇ／ｍＬ）がチューブ部２００に流通できる状態と
なっている。核酸が吸着した磁性微粒子Ｍをチューブ部２００に導く手法としては、実施
形態２では容器１２０及びチューブ部２００の外部から磁力を印加して行った。磁力は、
永久磁石４１０を用いて印加した。磁性微粒子Ｍは、磁力によって引き寄せられる性質を
有しているため、この性質を利用して、容器１２０及びチューブ部２００と、磁石の相対
的な配置を変化させて、容器１２０内からチューブ部２００に移動させる。これにより、
第１プラグ１０から順に、各プラグを通って、第４プラグ４０まで磁性微粒子Ｍが移動さ
せた。本実施例では、第１プラグ１０にはオイル、第２プラグ２０には第２洗浄液、続い
て、オイルと第３洗浄液のプラグを形成し、第３プラグ３０にはオイル、第４プラグ４０
には溶出液、第５プラグ５０にはオイルを入れて、核酸抽出カートリッジ２０００を構成
した。
【０１０２】
磁性微粒子Ｍが、第４プラグ４０に到達すると、溶出液と加熱の作用により、磁性微粒
子Ｍに吸着された核酸を、第４プラグ４０の溶出液に溶出させた。本工程を経て、検体か
ら溶出液に対して核酸が溶出し、検体から核酸が抽出された状態とした。
【０１０３】
実際は下記のように核酸抽出カートリッジ２０００に試薬を詰め、核酸抽出を行った。
容器１２０：７００μＬの核酸抽出液（３０ｗｔ％グアニジンチオシアン酸塩、１．０
ｗｔ％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、０．３ｗｔ％トリスｐＨ７．２、５０ｖ／ｖ％エタノー
ル、１ｖ／ｖ％ＦＢＳ）を入れ、そこに、ヒト鼻腔拭い液由来検体を含んだ１４０μＬの
溶液及び２５μＬの磁性微粒子Ｍ（直径１〜３μｍのシリカ表面を有する担体、濃度４０
０ｍｇ／ｍＬ）を入れて３０秒間撹拌した。
永久磁石４１０にて、チューブ部２００の下記構成プラグを通過させた。
第１プラグ１０：    シリコーンオイル（ＫＦ−９６Ｌ−２ＣＳ、信越化学工業）
第２プラグ２０：洗浄液２（０．１ｗｔ％トリス  ｐＨ７．５、０．２ｗｔ％塩化ナト
リウム、７０ｖ／ｖ％エタノール）、２８０μＬ
第１’プラグ：シリコーンオイル（ＫＦ−９６Ｌ−２ＣＳ、信越化学工業）
第２’プラグ：洗浄液３（０．１ｗｔ％クエン酸  ｐＨ４．０、０．０５ｗｔ％Ｔｒｉ
ｏｎ Ｘ−１００）、２２μＬ
第３プラグ３０：    シリコーンオイル（ＫＦ−９６Ｌ−２ＣＳ、信越化学工業）
第４プラグ４０：溶出液（核酸分解酵素除去処理を行った水）、１．６μＬ、９５℃ヒ
ーター３０秒加熱揺動
核酸を含む溶出液に、溶出液と同じ核酸分解酵素除去処理を行った水０．４μＬを添加
し、２μＬとした。また、この前処理は、約３分で実施することができた。
【０１０４】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なおＲＴ−ＰＣＲはＣＤ
Ｃ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１）に従って実施した。具体的には、
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。図８にその結果を示す。図８は、実施例５の結果を示す図であって、本発
明に係る核酸抽出カートリッジ２０００によりヒト鼻腔拭い液由来検体から抽出したイン
フルエンザＡのＲＮＡを精製・回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示した図である。
逆転写  ５０℃  ３０分
Ｔａｑ活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−５５℃  ３０秒  ５０サイクル
【０１０５】
ヒト鼻腔拭い液由来検体からのＲＮＡ抽出を、実施形態２に記載した核酸抽出カートリ
ッジ２０００と核酸抽出装置を用いた方法で行った結果と、実施形態１（変形）に記載し
た方法で行った結果と、を比較すると、ＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度は同等の立ち上がりとな
った。このことは、ＦＢＳの添加がＲＮＡの抽出手段によらず、核酸抽出カートリッジ２
０００と核酸抽出装置にも適用できることを示す。
【符号の説明】
【０１０６】
１０…第１プラグ、２０…第２プラグ、３０…第３プラグ、４０…第４プラグ、５０…
第５プラグ、１１０…栓、１２０…容器、１２１…開口、１２２…蓋、２００…チューブ
部、４１０…永久磁石、２０００…核酸抽出カートリッジ、Ｍ…磁性微粒子。
【図１】
2017184626.tif 000003
【図２Ａ】
2017184626.tif 000004
【図２Ｂ】
2017184626.tif 000005
【図３】
2017184626.tif 000006
【図４】
2017184626.tif 000007
【図５Ａ】
2017184626.tif 000008
【図５Ｂ】
2017184626.tif 000009
【図６】
2017184626.tif 000010
【図７】
2017184626.tif 000011
【図８】
2017184626.tif 000012