(57)【要約】【課題】  酒粕を原料として得られるペプチドの新たな用途を提供する。【解決手段】  (a)酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(c)Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ-Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを含有する脂質代謝改善剤。【選択図】図４
2017155026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ-Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを含有する脂質代謝改善剤。
【請求項２】
脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制又は低減剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である請求項１に記載の脂質代謝改善剤。
【請求項３】
(a)酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有する脂質代謝改善剤。
【請求項４】
脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制若しくは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である請求項３に記載の脂質代謝改善剤。
【請求項５】
(a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである請求項３又は４に記載の脂質代謝改善剤。
【請求項６】
(a)  酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有するＴＮＦ-α抑制剤。
【請求項７】
(a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである請求項６に記載のＴＮＦ-α抑制剤。
【請求項８】
酒粕に、酸性プロテアーゼを２４〜４８時間作用させるか、又はアルカリ性プロテアーゼを５〜２４時間作用させる工程を含む、脂質代謝改善活性を有するペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酒粕から生成するペプチドを含む脂質代謝改善剤、コレステロール低下剤、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ抑制剤、及びＳＲＥＢＰ抑制剤、並びに脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒粕は、蒸米に麹及び酵母を作用させて得られるものであり、麹菌や酵母の生産する酵素により米の糖類が分解されて高分子化合物として蛋白質やペプチドが高比率で含まれている。これらの蛋白質やペプチドをプロテアーゼ処理して得られる低分子量のペプチドは種々の有用な生理活性を有することが期待される。また、酒粕の糖類はある程度分解されているため、酒粕をプロテアーゼ処理して得られる処理物中のペプチドは単離、精製が容易である。
例えば、特許文献１は、酒粕を原料とした新規なアンギオテンシン変換酵素阻害剤を開示している。また、特許文献２は、米蛋白の蛋白質分解酵素分解物として酒粕を用いたアンギオテンシン変換酵素阻害用経口摂取物を開示している。また、特許文献３は、酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物が抗酸化活性及び肝機能障害抑制活性を有することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３０５４４６２号
【特許文献２】特許第３４１４７６１号
【特許文献３】特開第５４７４３６９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酒粕を原料として得られるペプチドの新たな用途を提供すること、及び酒粕を原料として得られる有用なペプチドの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、以下の知見を得た。
（i）  酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物（酒粕のプロテアーゼ処理物）は、肝細胞において、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）-ＣｏＡレダクターゼ、及び転写因子ステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン（ＳＲＥＢＰ；Sterol Regulatory Element-Binding Protein）（ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＲＥＢＰ２）の各遺伝子の発現を抑制する。
（ii）  酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物を、動物に経口投与すると、その動物の肝臓でのＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、転写因子ＳＲＥＢＰ（ＳＲＥＢＰ２）遺伝子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体遺伝子の発現が抑制される。また、この動物の血清総コレステロール、肝臓トリグリセリドが低減し、肝臓の脂肪滴が小さくかつ少なくなる。また、脂肪組織でも脂肪滴が少なくなる。
（iii）  酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物を、動物に経口投与すると、その動物の肝臓での腫瘍壊死因子ＴＮＦ-α遺伝子の発現が抑制される。
（iv）  Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）は、肝細胞において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現を抑制する。
（v）  Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制する。Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制する。
（vi）  これらの脂質代謝改善作用を有するジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドは、酒粕を酸性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテアーゼで処理することにより、効率よく生成する。
【０００６】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の脂質代謝改善剤、コレステロール低下剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、及びＳＲＥＢＰ抑制剤、並びに脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造方法を提供する。
項１．  Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ-Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを含有する脂質代謝改善剤。
項２．  脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制又は低減剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である項１に記載の脂質代謝改善剤。
項３．  (a)酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有する脂質代謝改善剤。
項４．  脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制若しくは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である項３に記載の脂質代謝改善剤。
項５．  (a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである項３又は４に記載の脂質代謝改善剤。
項６．  (a)  酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有するＴＮＦ-α抑制剤。
項７．  (a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである項６に記載のＴＮＦ-α抑制剤。
項８．  酒粕に、酸性プロテアーゼを２４〜４８時間作用させるか、又はアルカリ性プロテアーゼを５〜２４時間作用させる工程を含む、脂質代謝改善活性を有するペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、及び転写因子ＳＲＥＢＰ（ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＳＲＥＢＰ２）遺伝子の発現を抑制する。
体内のコレステロールは、アセチルＣｏＡを出発物質として約３０段階の酵素反応により生成するところ、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼは、コレステロール生合成経路の律速酵素である。従って、本発明のペプチド混合物は、この酵素の生成を抑制することにより、体内のコレステロール量を低減させる。
また、転写因子ＳＲＥＢＰのうちＳＲＥＢＰ１ｃは、主に、脂肪酸合成経路の諸酵素遺伝子の発現を促進する（「脂質代謝制御の中心的役割を演じる転写因子ＳＲＥＢＰの分子基盤」、佐藤隆一郎、Nutrition Review June,2008）。従って、本発明のペプチド混合物は、ＳＲＥＢＰ１ｃの生成抑制を介して、体内のトリグリセリド量を低減する。
また、転写因子ＳＲＥＢＰのうちＳＲＥＢＰ２は、コレステロール生合成経路の諸酵素の遺伝子や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体の遺伝子の転写を促進することにより、包括的に体内のコレステロールの量及び質を制御している（「脂質代謝制御の中心的役割を演じる転写因子ＳＲＥＢＰの分子基盤」、佐藤隆一郎、Nutrition Review June,2008）。従って、本発明のペプチド混合物は、ＳＲＥＢＰ２の発現を抑制することにより、体内のコレステロール量を低減し、また、細胞内に取り込まれるＬＤＬコレステロール（悪玉コレステロール）の量を低減してコレステロールの質を改善する。
酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、上記作用により、脂質代謝を包括的に改善する。
【０００８】
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、肝臓において、腫瘍壊死因子ＴＮＦ-α遺伝子の発現を抑制する。従って、ＴＮＦ-αの過剰産生による疾患、例えば、関節リウマチや乾癬などの予防、改善、又は治療に好適に使用できる。
【０００９】
本発明の酒粕ペプチド混合物は、経口摂取により体内に取り込まれて上記作用を発現するため、保健機能食品や医薬として好適に利用できる。
【００１０】
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチドであるＡｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現を抑制し、それにより、体内のコレステロール量を低減させる。
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチドであるＡｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、ＧＩ（Ｇｌｙ−Ｉｌｅ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制し、それにより、脂質代謝を包括的に改善する。
また、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制し、それにより、体内のトリグリセリド量を低減する。
これらのペプチドも、経口摂取により体内に取り込まれて上記作用を発現するため、機能性食品や医薬として、好適に利用できる。
【００１１】
本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、酒粕の分解により得られるものであるため、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。よって、本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、副作用や過剰摂取を気にすることなく安心して長期間服用できる。また、本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、清酒製造の副産物である酒粕から製造できる点でも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペプチドＲ及びペプチドＳがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制したことを示すウェスタンブロッティングの結果である。
【図２】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの血清総コレステロール量を低減させたことを示す図である。
【図３】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓トリグリセリド量を低減させたことを示す図である。
【図４】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓でＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現を抑制したことを示す図である。
【図５】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓でＳＥＢＰ２遺伝子の発現を抑制したことを示す図である。
【図６】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓でＴＮＦ−α遺伝子の発現を抑制したことを示す図である。
【図７】ペプチドＲが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓でＬＤＬコレステロールレセプター遺伝子の発現を抑制したことを示す図である。
【図８】ペプチドＲが、肝臓組織の脂肪滴の数を抑制したことを示す図である。
【図９】ペプチドＲが、肝臓組織の脂肪滴の肥大を抑制したことを示す図である。
【図１０】ペプチドＲが、精巣上体脂肪組織の脂肪滴の数を抑制したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明の各剤の有効成分であるペプチド混合物及びペプチドと、その製造方法について説明し、次いで、それを含有する本発明の剤について説明する。
（１）ペプチド混合物
原料
本発明で使用するペプチド混合物は、酒粕を原料として製造することができる。酒粕は、夾雑物である糖質が少なく蛋白質が多く含まれる点や、酒類製造の副産物であり入手し易い点で、望ましい製造原料である。酒粕は、蒸米、米麹から醸造した場合の酒粕でも、液化した米、米麹を用いる液化仕込みによって醸造した場合の液化粕でもどちらでもよい。特に、液化粕は、蛋白質含量が多く夾雑物も少ないため有効成分が濃縮されている点で、好ましい。
【００１４】
糖質の除去
酒粕にプロテアーゼを作用させる前に、酒粕中の糖質をできるだけ除去しておくことで、ペプチド混合物の生成効率が良くなる。従って、本発明では、糖質除去を行うことが好ましい。例えば、酒粕にセルラーゼを作用させて糖質を除去することができる。セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼには、セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼと、セルロースの還元末端から切断してセルビオースを生成するセロビオヒドロラーゼとが含まれる。いずれを使用してもよいが、両者を併用することにより、効率よくセルロースを分解することができる。
また、セルラーゼの由来は特に限定されないが、本発明方法の原料に対して機能し易い点で、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌（特に、アスペルギルス ニガー）由来のセルラーゼが好ましい。
【００１５】
セルラーゼの使用量は、酒粕に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内にセルロースが十分に分解されて液体画分に可溶化される。また、反応温度と反応時間は使用する原料とセルラーゼの種類によって異なるが、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約２〜２０時間が好ましい。また、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約３．５〜６が好ましい。上記範囲であれば、セルラーゼが失活することなく、かつその機能を十分に発揮できる。セルラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を、例えば約８０〜９０℃で、約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。
【００１６】
また、夾雑物である糖質を除去するために、セルラーゼに加えて、アミラーゼを使用することができる。アミラーゼとはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼは、１種を単独で、または２種以上を組み合わせて使用できる。中でも、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼが好ましく、β−アミラーゼがより好ましく、小麦由来のβ−アミラーゼがさらにより好ましい。
【００１７】
アミラーゼの使用量は、酒粕に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に糖質が十分に可溶化される。反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。アミラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を、例えば約８０〜９０℃で、約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。反応時のｐＨは酵素が機能し易い約５〜６が好ましい。
【００１８】
液体画分の除去
糖質除去反応を行った反応液から液体画分を除去すればよい。この工程により低分子化された糖質をはじめ、主に水溶性成分が除去される。固液分離の方法としては、圧搾、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、ある程度の水分が除去できればよい。この工程により酒粕中の蛋白質を多く含む固形分が得られる。
【００１９】
プロテアーゼ処理
このようにして得られた固形分にプロテアーゼを作用させればよい。この工程では、酒粕中の蛋白質から有効成分となるペプチドを生成させるためにプロテアーゼを使用する。
本発明では、プロテアーゼとして、中性プロテアーゼ、及び酸性プロテアーゼを、それぞれ単独で使用、又は併用することができる。各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼが好ましい。バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼの例として、それには限定されないが、バチルス属細菌由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、中でも、バチルス サーモリシン由来の耐熱性中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼ（大和化成社製、現在は、天野エンザイム社が販売）が挙げられる。
本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。
中性プロテアーゼは１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。酸性プロテアーゼも１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
【００２０】
各プロテアーゼの使用量は、酒粕に対して、それぞれ、約０．０５〜２重量％が好ましく、約０．１〜１重量％がより好ましい。
また、酒粕から糖質除去と液体画分の除去を行う場合は、糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜０．８重量％が好ましく、約０．３〜０．６重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に酒粕中の蛋白質を、脂質代謝改善活性を有するペプチド（以下、「活性ペプチド」ということがある）にまで分解できる。
【００２１】
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、バチルス属細菌（中でも、バチルス サーモリシン）由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６５℃が好ましく、反応時間は約５〜２４時間が好ましい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出された活性ペプチドがさらに分解されて、活性が低下することが回避される。または、活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
【００２２】
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましく、バチルス属細菌（中でも、バチルス サーモリシン）由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼの場合、約６〜７が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼは、それぞれ単独で作用させてもよく、併用しても良い。併用する場合は、いずれを先に反応させてもよいが、より活性の強いペプチド混合物を得ることができる点で、中性プロテアーゼを先に反応させるのが好ましい。また、両プロテアーゼが機能するｐＨが重複する場合は、同時に反応させてもよい。
【００２３】
プロテアーゼ処理により得られた混合物から固形分を除去してもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分は、そのまま食品に添加することができ、また医薬の有効成分として用いることができる。
さらに、この液体画分を濃縮したり、乾燥させて粉末化したりすることも出来る。これにより、より長期間保存が可能で、加工しやすいペプチド混合物を得ることができる。
【００２４】
本発明は、上記説明した工程を含むペプチド混合物（特に、脂質代謝改善作用を有するペプチド混合物）、又は脂質代謝改善剤の製造方法を包含する。
【００２５】
ペプチド組成
このようにして得られるペプチド混合物を本発明の剤の有効成分として用いることができる。このペプチド混合物は、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒの１種以上を含有する。
中でも、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒのそれぞれを０．００１重量％以上含有し、例えば、これらのそれぞれを１重量％以下、０．５重量％以下、又は０．２重量％以下含有するペプチド混合物が好ましい。
また、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒのそれぞれを０．００１重量％以上含有し、例えば、これらのそれぞれを１重量％以下、０．５重量％以下、０．２重量％以下、又は０．１重量％以下含有するペプチド混合物も好ましい。
【００２６】
（２）ペプチド
ペプチド
また、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）の１種以上も、本発明の剤の有効成分として用いることができる。これらのペプチドは、脂質代謝改善活性を有する。
【００２７】
製造方法
これらのペプチドは、合成することができる。また、酒粕のプロテアーゼ処理によっても得ることができる。
酒粕のプロテアーゼ処理により上記の活性ペプチドを得る方法について詳述すると、原料となる酒粕や、糖質除去とその後の液体画分除去を行うのが好ましいことは、ペプチド混合物の製造方法と同様である。
プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼの何れを用いてもよいが、酸性プロテアーゼ、又はアルカリ性プロテアーゼが好ましい。酸性、中性、又はアルカリ性プロテアーゼは、１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、アスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼ、バチルス属細菌由来のアルカリ性プロテアーゼが好ましい。本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。
【００２８】
各プロテアーゼの使用量は、酒粕に対して、それぞれ、約０．０５〜２重量％が好ましく、約０．１〜１重量％がより好ましい。また、酒粕から糖質除去と液体画分の除去を行う場合は、糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜０．８重量％が好ましく、約０．３〜０．６重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に酒粕中の蛋白質を、脂質代謝改善活性を有するペプチドにまで分解できる。
【００２９】
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましい。また、反応時間は５時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらにより好ましく、３８時間以上が特に好ましい。また、７２時間以下が好ましく、６０時間以下がより好ましく、４８時間以下がさらにより好ましく、４５時間以下が特に好ましい。
また、アルカリ性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましい。また、反応時間は３時間以上が好ましく、４時間以上がより好ましく、５時間以上がさらにより好ましい。また、４８時間以下が好ましく、２４時間以下がより好ましく、８時間以下がさらにより好ましく、６時間以下が特に好ましい。
各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出された活性ペプチドがさらに分解されて、活性が低下することが回避される。または、活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
【００３０】
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましく、アルカリ性プロテアーゼの場合、約８〜１０が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
【００３１】
プロテアーゼ処理により得られた混合物から固形分を除去してもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分から、各種クロマトグラフィーにより目的ペプチドを単離すればよい。
【００３２】
本発明は、上記説明した工程を含むペプチド（特に、脂質代謝改善作用を有するペプチド）、又は脂質代謝改善剤の製造方法を包含する。
【００３３】
（３）ペプチド混合物・ペプチドの用途
本発明の第１の脂質代謝改善剤は、上記説明した本発明のペプチド混合物を含み、特に、有効成分として含むことができる。
第１の脂質代謝改善剤は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、転写因子ＳＲＥＢＰ（中でも、ＳＲＥＢＰ１ｃ、及び／又はＳＲＥＢＰ２）、及び／又は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体を抑制ないしは低減することにより、脂質代謝を改善する。特に、これらの酵素、転写因子、受容体蛋白質の遺伝子発現を抑制することで、その生成を抑制ないしは低減する。従って、本発明の第１の脂質代謝改善剤は、コレステロール（特に、悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール）抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を包含する。
【００３４】
本発明の第２の脂質代謝改善剤は、上記説明した本発明のペプチドの１種以上を含み、特に、有効成分として含むことができる。
第２の脂質代謝改善剤も、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、転写因子ＳＲＥＢＰ（中でも、ＳＲＥＢＰ１ｃ、及び／又はＳＲＥＢＰ２）、及び／又は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体を、特に遺伝子発現を抑制することにより、抑制ないしは低減し、その結果、脂質代謝を改善する。従って、本発明の第２の脂質代謝改善剤は、コレステロール（特に、悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール）抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を包含する。
特に、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（ＧＳＨ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ抑制剤として好適に使用できる。
また、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）は、ＳＲＥＢＰ抑制剤として好適に使用できる。
【００３５】
また、本発明のＴＮＦ-α抑制剤は、本発明のペプチド混合物を含み、特に、有効成分として含むことができる。本発明のペプチド混合物は、特に、ＴＮＦ-αの遺伝子発現を抑制することにより、ＴＮＦ-αの生成を抑制、ないしはその量を低減する。従って、本発明のペプチド混合物は、ＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患、例えば、関節リウマチ、乾癬などの予防、改善、又は治療剤として使用できる。
【００３６】
（４）製剤
医薬組成物
本発明のペプチド混合物又はペプチドを医薬組成物の有効成分として使用する場合、ペプチドは、そのまま又はジペプチドやアミノ酸にまで分解されて容易に吸収されることから、これらの医薬品は各種の経口投与形態を有する製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。
【００３７】
固形製剤は、有効成分であるペプチド混合物又はペプチドに、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、本発明のペプチド混合物又はペプチドを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
【００３８】
脂質代謝改善剤（コレステロール抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を含む。）中の上記ペプチド又はペプチド混合物の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤又は組成物の全体に対して、約０．００１〜１００重量％が好ましく、約１〜９５重量％がより好ましく、約１０〜９０重量％がさらにより好ましく、約３０〜８５重量％がさらにより好ましい。
【００３９】
また、ＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤中の上記ペプチド又はペプチド混合物の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤又は組成物の全体に対して、約０．００１〜１００重量％が好ましく、約１〜９５重量％がより好ましく、約１０〜９０重量％がさらにより好ましく、約３０〜８５重量％がさらにより好ましい。
【００４０】
食品組成物
本発明のペプチド混合物又はペプチドを食品組成物の有効成分として使用する場合、この食品組成物は、上記ペプチド混合物又はペプチドを、乾燥重量に換算して、食品組成物全体に対して、例えば約０．００１〜１００重量％、好ましくは約１〜９５重量％、より好ましくは約１０〜９０重量％、さらにより好ましくは約３０〜８５重量％含んでいればよい。
この食品組成物は、栄養補助食品（サプリメント）、健康補助食品、栄養調整食品といった一般食品として用いるのに適している。また、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）として好適に使用できる。この食品組成物は、本発明のペプチド混合物又はペプチドを上記範囲で含むことにより、無理なく摂取できる食品量中に、十分な活性を示すペプチド混合物又はペプチドが含まれることになる。
【００４１】
この食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に調製することができる。中でも、ペプチド粉末の劣化を防止できる点で、カプセル剤が好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
【００４２】
（５）使用方法
本発明の脂質代謝改善剤（コレステロール抑制ないしは低減剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を含む。）、ＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤の１日使用量は、対象者の症状又は状態、体重、性別などによって異なるが、有効成分であるペプチド混合物又はペプチドの乾燥重量に換算した１日使用量が、例えば約０．１〜２０ｇ、好ましくは約０．５〜１０ｇ、より好ましくは約１〜５ｇになるようにすればよい。この量を、例えば、１日に約１〜１、２、３、４、又は５回に分けて使用すればよい。また、投与期間は、対象者の症状又は状態によって異なるが、例えば、約１４日以上、中でも約２８日以上、中でも約５６日以上とすることができる。本発明のペプチド混合物又はペプチドは、長期にわたり摂取しても副作用はないが、本発明の各剤の投与期間は、例えば、１年以下、中でも約３６０日以下、中でも約１８０日以下、中でも約１００日以下とすることができる。
また、本発明の各剤は、通常、経口投与される。
【００４３】
（６）対象となる疾患又は状態
脂質代謝異常症（脂質異常症）は、コレステロール（特に、ＬＤＬコレステロール）の過多と、中性脂肪であるトリグリセリドの過多に大別される。このような脂質異常は、高脂血症、肥満（特に、脂肪肝などの内臓脂肪型の肥満）などを特徴とするメタボリックシンドロームを招き、それが、高脂血症、高血圧、糖尿病、動脈硬化などの生活習慣病を引き起こす。
本発明のペプチド混合物又はペプチドは、体内のコレステロール、特に、疾患の原因となる悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール、及び中性脂肪の量を低減させるため、本発明の脂質代謝改善剤は、脂質代謝異常症（脂質異常症）、高脂血症、肥満（特に、脂肪肝などの内臓脂肪型の肥満）、メタボリックシンドローム、高脂血症、高血圧、糖尿病、動脈硬化などの患者、又はこのような症状を有する未病状態のヒトが好適な対象となる。従って、本発明の脂質代謝改善剤は、これらの疾患における脂質代謝改善剤として使用することができる。また、本発明のペプチド混合物又はペプチドは、これらの疾患の予防、改善、又は治療剤の有効成分として使用できる。
また、本発明のＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤は、関節リウマチ、乾癬の患者、又はこのような症状を有する未病状態のヒトが好適な対象となる。従って、本発明のペプチド混合物又はペプチドは、関節リウマチ、乾癬の予防、改善、又は治療剤の有効成分として使用できる。
【００４４】
[実施例]
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ペプチド混合物の製造
（1-1）ペプチドＲ
酒粕６０ｋｇ（湿重量、固形分５８．４％）に水１２０Ｌを添加し十分に攪拌した。この混合物を５０℃に保温した状態でセルラーゼ（トリコデルマ属由来、セルロシンＴ２；エイチビィアイ社製）３０ｇとβ−アミラーゼ（麦芽由来、ビオザイムＭ；天野エンザイム社製）３０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）；ＯＮＳ自動圧濾圧搾機500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、蛋白高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、固形分５６．８％）を得た。
【００４５】
次いで、得られた蛋白高含有酒粕４１．９ｋｇに水１８０Ｌを加え、ＫＯＨでｐＨ６．８に調製し、よく攪拌した。５０℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ（バチルス属細菌由来、プロテアーゼＮアマノＧ；天野エンザイム社製）２１０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。さらに、ＨＣｌでｐＨ４．２に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス属菌由来、スミチームＡＰ；新日本化学工業社製）２５０ｇを添加して６０℃で２２時間さらに分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）、ＯＮＳ自動圧濾圧搾機  500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合液２００Ｌを得た。
得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター（日本ビュッヒ株式会社製  RE121  Rotavapor：湯浴温度50℃、100rpm）とアスピレーター（ヤマト科学製  Neocool Aspirator BP-51：冷却温度5℃）を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機（EYELA 東京理化器械株式会社製  FDU-2100）を用いてマイナス８０℃、真空度０．４Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
得られたペプチド混合物をペプチドＲと命名した。
【００４６】
（1-2）ペプチドＳ
液化液による清酒醸造法により米から清酒を醸造したときの酒粕（水分３６％）１０ｇを０．２ｌの水に懸濁し、大和化成製（現在は、天野エンザイム社が販売）蛋白分解酵素（サモアーゼ）を０．２ｇ加え、３７℃で反応させた。その後沸騰水浴中で１０分間加熱した後５０００回転１０分間の遠心分離により溶解物を得、凍結乾燥によりペプチド画分を得た。
得られたペプチド混合物をペプチドＳと命名した。
【００４７】
（２）ペプチド混合物中のペプチドの定量
上記ペプチドＲ及びペプチドＳ中に含まれるペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
（2-1）ペプチド標準試料の測定
(i)ペプチド標準溶液の調製
分取した各ペプチド、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（シグマ社製）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（シグマ社製）、Ａｓｎ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（シグマ社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（東レリサーチセンター社製）、Ａｒｇ−Ｐｈｅ（シグマ社製）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（国産化学社製）、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（ペプチド合成装置により自社製造）、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（国産化学社製）、及びＴｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ペプチド合成装置により自社製造）１０ｍｇをそれぞれ量り取り、水または0.1N塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、１ｍｌに定容し、各々のペプチド標準溶液を作成した。
【００４８】
(ii)内部標準物質溶液の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍｌで完全に溶解させ、内部標準原液とした。
(iii)標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、ペプチドと内部標準物質が各0.0１ｍｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう各々のペプチド標準溶液を調製した。下記のＬＣ／ＭＳ分析条件により、ペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム： Imtakt UK-C18 4.6×75mm
移動相：A液：0.05% HCOOH/水、B液：アセトニトリル（0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分）
注入量：10 μＬ
流速：1.0ｍｌ/分
カラム温度：35℃
検出条件：UV  190-300 nm
MS  エレクトロスプレーイオン（ESI）法  positive ＳＩＲモード ＋25V
【００４９】
【表１】
2017155026.tif 000003
【００５０】
（2-2）ペプチドの定量
ペプチドＲ及びペプチドＳの各１０ｍｇを純水1ｍｌに溶解し、ペプチド水溶液とした。
ペプチド水溶液と内部標準原液と混合し、酒粕ペプチドと内部標準物質が各0.002ｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様に各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従ってペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量（ｍｇ/g）＝
［標準溶液のペプチド濃度（mｇ/ml）×（試料溶液のペプチドピーク面積/試料のＩＳピーク面積）/（標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のＩＳピーク面積）/試料のペプチド濃度（ｇ/ml）］
【００５１】
（2-3）結果
ペプチドＲ及びペプチドＳ中の各ペプチドの含有量（重量％）を以下の表２に示す。
【表２】
2017155026.tif 000004
【００５２】
（３）ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ産生抑制（Ｎｏ．１）
（3-1）方法
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現量を測定した。
【００５３】
細胞を回収してホモジナイズし、ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan)を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収したのちReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan)で逆転写反応を行いｃＤＮＡを生成した。その後、So Fast Eva Green(Bio-Rad)を使用し、7500/7500Fast Real-Time System (Applied Biosystem, Japan)にてＲｅａｌ-Ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析により、ｃＤＮＡの定量を行った。用いたプライマーは以下の通りである。
HMG-CoA レダクターゼ (ヒト)
F-5’-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3’  （配列番号１）
R-5’-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3’（配列番号２）
【００５４】
被験物質として、ペプチドＲ、ペプチドＳ、及び下記表３、表４に示すペプチドを用いた。コントロールはペプチドを使用しなかったものである。
【００５５】
（3-2）結果
各ペプチド存在下でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現量を、コントロールのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現量に対する百分率で表した結果を、以下の表３、表４に示す。
【表３】
2017155026.tif 000005
【００５６】
【表４】
2017155026.tif 000006
【００５７】
ペプチドＲ、ペプチドＳ、Ａｒｇ-Ｌｅｕ、Ｖａｌ-Ｇｌｎに、強いＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。また、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ（グルタチオン）にも、やや強いＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。また、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐにも、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。
【００５８】
（４）ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ産生抑制（Ｎｏ．２）
（4-1）方法
ペプチドＲ、ペプチドＳがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制することを、蛋白質レベルでも確認した。具体的には、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ蛋白質をウエスタンブロッティング法で観察した。得られた細胞を破砕溶解して、細胞溶解緩衝液を用いて単離したタンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供して分離した。電気泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、これを５％スキムミルクを含むＴＢＳＴブロッキング剤で1時間処理した後、抗ＨＭＧ−ＣoＡ還元酵素−ウサギポリクローナル抗体（抗-ＨＭＧＣＲ ａｂｃａｍ社製）を1：10000で室温で1時間反応させた。次いで得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで軽く5分間洗浄し、HRP結合-抗ウサギIgG（Santacruz Biotechnology）で60分間インキュベーションした。タンパク質のバンドを、化学発光試薬：Amersham ECL (ECL Western Blotting Detection System;GE Healthcare社製）を用いて検出した。
（4-2）結果
ウェスタンブロッティングの結果を図１に示す。ペプチドＲ、ペプチドＳの存在により、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ量は大きく低減した。
【００５９】
（５）転写因子ＳＲＥＢＰ産生抑制
（5-1）方法
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＳＲＥＢＰ遺伝子の発現量を測定した。
【００６０】
細胞を回収してホモジナイズし、ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan)を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan)で逆転写反応を行いｃＤＮＡを生成した。その後、Go Taqを用いてＰＣＲ解析を行った。
用いたプライマーは以下の通りである。
【００６１】
SREBP1c（ヒト）
F-5’-GTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAG-３’（配列番号３）
R-5’-AGGTACCCGAGGGCATCCGAGAAT-３’（配列番号４）
SREBP2（ヒト）
F-5’-TGGGAGAGTTCCCTGACTTGT-３’（配列番号５）
R-5’-TGAATGACCGTTGCACTGAAG-３’（配列番号６）
【００６２】
（5-2）被験物質
被験物質として、ペプチドＲ、及び下記表５、表６に示すペプチドを用いた。コントロールはペプチドを使用しなかったものである。
【００６３】
（5-3）結果
各ペプチド存在下でのＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の各発現量を、コントロールの遺伝子発現量に対する百分率で表した結果を、以下の表５、表６に示す。
【表５】
2017155026.tif 000007
【００６４】
【表６】
2017155026.tif 000008
【００６５】
ペプチドＲ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏは、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を強く抑制した。Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ-Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅも、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制した。また、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙは、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制した。
【００６６】
（６）高脂肪食マウスの脂質代謝に及ぼす影響
（6-1）方法
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊ）の実験マウス６週齢を２２± ２℃、昼夜１２時間サイクル（約午前8:00〜午後8:00)の環境下で飼育した。全てのマウスを４週間の肥育期間を設けて肥育した後、通常食/水(R/DW:Regular/distilled water)、高脂肪食/水(HF/DW:High Fat/distilled water)、高脂肪食/ペプチド(HF/P:High Fat/Peptide)の摂餌方法ごとに３グループに分け、各摂餌法で４週間飼育した。期間中のペプチド投与は１７５ｍｇのペプチドＲを含むペプチド水をゾンデにより経口投与を行った。対照として通常食/水、高脂肪食/水のグループには蒸留水を同量与えた。高脂肪食はＨｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２(CLEA Japan, Inc.)を使用した。飼育期間の最終日に１６時間の絶食時間を設けた後に、解剖し、血液、肝臓、精巣上体周囲部脂肪組織を採取した。血液は３,０００ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離をかけ血清を分離し、肝臓は重量を計測し、−８０℃で冷凍保存した。
【００６７】
＜血清総コレステロール＞
BioMajesty (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)を用いて、血清中の総コレステロールを測定した。
【００６８】
＜肝臓トリグリセリド＞
マウスの肝臓(40-60 mg)をホモジナイズしたのちクロロホルム/メタノール(2:1)混合液を加え、１５分のボルテックスを行ったのち一晩常温で放置した。その抽出液から固形成分を取り除き０．５ｍＬの蒸留水を加え３０分静置したのち、８０００ｇ、４℃、１０分の条件下で遠心分離を行った。分離後の下層(有機層)を採取しさらに０．６ｍＬのクロロホルム/メタノール/蒸留水(2:1:3)混合液を加え30分間ボルテックスし、さらに３０分静置した後、８０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離した。その下層(有機層)を採取し、窒素置換気において液体成分を蒸発させ、残った固形成分を１ｍＬのイソプロパノール/Triton X-100(19/1)混合液で溶解してサンプルを調製し、  BioMajesty (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)を用いて、肝臓中のトリグリセリドを測定した。
【００６９】
＜遺伝子発現量＞
下記プライマーを用いた他は、「（5-2）ＳＲＥＢＰ遺伝子発現量の測定」と同様にして、肝臓中のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＳＲＥＢＰ２、ＴＮＦ−α、及び低密度リポコレステロール（ＬＤＬ）レセプターの遺伝子発現量を測定した。
HMG-CoAレダクターゼ (マウス)
F-5’-GTTCTTTCCGTGCTGTGTTCTGGA-3’    （配列番号７）
R-5’-CTGATATCTTTAGTGCAGAGTGTGGCAC-3’（配列番号８）
SREBP2 (マウス)
F-5’-AGAGAGGCGGACAACACACAATATC-3’（配列番号９）
R-5’-CCTTCCTCAGAACGCCAGAC-3’     （配列番号１０）
TNF-α（マウス）
F-5’-GATCTCAAAGACAACCAACTAGTG-3’（配列番号１１）
R-5’-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3’（配列番号１２）
LDLコレステロールレセプター (マウス)
F-5’-ACTCAGGCAGCAGGAACGAG-3’（配列番号１３）
R-5’-GTCATTTTCAAGTCTACCT-3’ （配列番号１４）
【００７０】
＜病理組織学的解析＞
精巣上体周囲部脂肪組織と肝臓を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋を行った。包埋処理を行った組織は滑走式ミクロトーム(Yamato Kohki Industrial Co., Ltd., Saitama, Japan)を用いて厚さ4μmの切片に薄切した。薄切した切片にヘマトキシリン・エオジン染色を行った。また、肝臓はOTC compound (Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan)に包埋し-80°Cで凍結させ凍結切片も作成した。その後、クリオスタット(Leica CM1900)(Leica Microsystems K.K., Tokyo, Japan)を用いて4μmの切片に切り出し、オイルレッドO染色を行った。各種染色後の切片は光学顕微鏡を用いて観察し撮影した(×200)。
【００７１】
（6-2）結果
結果を図２〜図７に示す。
ペプチドＲは、高脂肪食を与えたマウスにおいて、血清総コレステロール、肝臓トリグリセリドを明らかに低下させ、また、高脂肪食を与えたマウスの肝臓で、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＳＲＥＢＰ２、ＴＮＦ−α、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールレセプターの各遺伝子発現量を明らかに抑制した。
また、肝臓組織の染色像を図８〜１０に示す。ペプチドＲは、高脂肪食を与えたマウスの肝臓組織の脂肪滴の大きさと数を明らかに低減させ、また、高脂肪食を与えたマウスの脂肪組織の脂肪滴の数を明らかに低減させた。
【００７２】
（７）酒粕素材中のペプチドの定量
（7-1）方法
「（２）ペプチド混合物中のペプチドの定量」の項目と同じ方法で、酒粕ペプチド、液化粕、及び酒粕蛋白質画分中に含まれるペプチドを定量した。
ここで用いた酒粕ペプチドは、ペプチドＲである。また、液化粕は、原料米を液化酵素により液化処理しアルコール発酵させることにより製造される清酒製造において得たものである。また、酒粕蛋白質画分は、液化粕を０．５％ ＮａＯＨあるいは２５ｍＭ ＫＯＨで洗浄後、クエン酸を添加しｐＨを４〜５に調整後、液体を取り除いて再度水で洗浄後、乾燥し得たものである。
【００７３】
（7-2）結果
結果を表７に示す。表７中の濃度は、固形分中のペプチド濃度（重量％）である。
【表７】
2017155026.tif 000009
脂質代謝改善作用を有するペプチドは、酒粕及び酒粕の蛋白質画分には含まれておらず、酒粕の蛋白質画分をプロテアーゼ処理することにより生成することが分かる。
【００７４】
（８）脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造条件の検討
（8-1）方法
液化粕９０ｇに、水３６０ｍＬ、アスペルギルス ニガー由来のセルラーゼであるセルロシン（ＨＩＢ社、ＡＣ４０）４５ｍｇを混合し、バッフル付き３００ｍＬ容三角フラスコ３個に分注し、５０℃、１２０ｒｐｍで、２時間分解した。分解液を各プロテアーゼに適したｐＨに調整した後、バッフル付き１２５ｍＬ容三角フラスコに、各分解液４０ｍＬとプロテアーゼ１０ｍｇを入れ、５０℃、１５０ｒｐｍで分解した。分解開始６時間、２４時間、４５時間後にサンプリングし、遠心分離して得た上清をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5mL 3Kを用いて遠心ろ過した。ろ液中のＲＬ及びＶＱ濃度を定量した。
プロテアーゼとして、酸性プロテアーゼのオリエンターゼＡＹ、及びアルカリ性プロテアーゼのオリエンターゼ２２ＢＦを用い、反応液のｐＨは、それぞれ、４及び８．８とした。
【００７５】
（8-2）結果
結果を表８に示す。表８中の濃度は、固形分中のペプチド濃度（重量％）である。
【表８】
2017155026.tif 000010
Ａｒｇ−Ｌｅｕは、オリエンターゼ２２ＢＦで６時間の分解反応により、最も効率よく生成した。Ｖａｌ−Ｇｌｎは、オリエンターゼＡＹで４５時間の分解反応により、最も効率よく生成した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明で使用するペプチドは、脂質代謝を効果的に改善するので、医薬、保健機能食品などとして好適に使用できる。
【図１】
2017155026.tif 000011
【図２】
2017155026.tif 000012
【図３】
2017155026.tif 000013
【図４】
2017155026.tif 000014
【図５】
2017155026.tif 000015
【図６】
2017155026.tif 000016
【図７】
2017155026.tif 000017
【図８】
2017155026.tif 000018
【図９】
2017155026.tif 000019
【図１０】
2017155026.tif 000020
【配列表】
2017155026000001.app