(57)【要約】【課題】肝線維化を抑制又は阻害する安全で効果的な肝線維化予防・治療剤を提供する。【解決手段】本発明の肝線維化予防・治療剤は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の肝線維化予防・治療剤は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現可能であるベクターを有効成分として含有することを特徴とする。本発明の肝星細胞の活性化抑制方法は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで肝星細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする。本発明の細胞外マトリックスの産生抑制方法は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有効成分として含有することを特徴とする肝線維化予防・治療剤。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡを発現可能であるベクターを有効成分として含有することを特徴とする肝線維化予防・治療剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２９ａ又はその前駆体である請求項１又は２に記載の肝線維化予防・治療剤。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで肝星細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制方法。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする細胞外マトリックスの産生抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝線維化予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維化は持続的な炎症により発症するが、現時点では肝線維化に焦点を当てた治療方法は存在しない。そのため、現在の肝線維化の治療方法としては、原疾患を治療することで炎症を鎮静化させたり（例えば、慢性ウイルス肝炎の場合は、原因となるウイルスを排除する等）、肝庇護剤を投与して炎症を鎮静化させたりすることで、結果的に線維化の自然治癒を期待するものである。
【０００３】
一方、肺線維化では、繊維化促進の代表的な炎症性サイトカインであるトランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β；ＴＧＦ−β）の活性を抑制するために、ピルフェニルドンによる治療が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. N. Iyer., et al., “Effects of Pirfenidone on Transforming Growth Factor-β Gene Expression at the Transcriptional Level in Bleomycin Hamster Model of Lung Fibrosis.”, J. PHARMACOL. EXP. THER., vol.291, no.1, 367-373, 1999.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肺線維化の治療で用いられるピルフェニルドンは、肝毒性を有することが知られており、肝硬変患者には適応が困難である。また、現状、高度な肝線維化については肝移植などでしか対応できない。さらに、日本における肝移植は家族がドナーである生体肝移植が中心で、死体肝移植は少ないため、肝移植の適応となる患者が非常に限定的であることが問題になっている。
そのため、肝線維化に焦点を当てた新規の肝線維化治療方法の確立が望まれている。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、肝線維化を抑制又は阻害する安全で効果的な肝線維化予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）が内因性の遺伝子であるため、安全性が高く、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を応用した核酸医薬として応用可能であることに着目し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］ 配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有効成分として含有することを特徴とする肝線維化予防・治療剤。
［２］ 配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現可能であるベクターを有効成分として含有することを特徴とする肝線維化予防・治療剤。
［３］前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２９ａ又はその前駆体である前記［１］又は［２］に記載の肝線維化予防・治療剤。
［４］配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで肝星細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制方法。
［５］配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで細胞内に導入する工程を備えることを特徴とする細胞外マトリックスの産生抑制方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、肝線維の吸収を促進し、肝線維化の抑制又は阻害することができ、安全且つ効果的に肝線維化を治療することができる。また、肝線維化の度合いは肝発癌率と密接に関係するため、肝線維化を抑制又は阻害することで肝臓での発癌を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】実施例１における慢性肝炎モデルマウスの作製スケジュール及びｍｉＲＮＡ投与スケジュールを示す図である。
【図１Ｂ】実施例１における１週間治療を行った４つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓の、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ；ＨＥ)染色、並びにピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ；ＳＲ）及びファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）を用いた対比染色の結果を示す画像である。
【図１Ｃ】実施例１における２週間治療を行った４つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓の、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ；ＨＥ)染色、並びにピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ；ＳＲ）及びファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）を用いた対比染色の結果を示す画像である。
【図１Ｄ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓での、ＳＲのポジティブ領域の面積を定量化した結果を示すグラフである。
【図１Ｅ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓での、ヒドロキシプリンを定量した結果を示すグラフである。
【図１Ｆ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓での、コラーゲン１α１（Ｃｏｌ１ａ１）のｍＲＮＡを定量した結果を示すグラフである。
【図１Ｇ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群の四塩化炭素投与マウスから得られた肝臓での、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９ａを定量した結果を示すグラフである。
【図２Ａ】実施例１における１週間治療を行った４つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓の、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ；ＨＥ)染色、並びにピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ；ＳＲ）及びファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）を用いた対比染色の結果を示す画像である。
【図２Ｂ】実施例１における２週間治療を行った４つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓の、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ；ＨＥ)染色、並びにピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ；ＳＲ）及びファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）を用いた対比染色の結果を示す画像である。
【図２Ｃ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓での、ＳＲのポジティブ領域の面積を定量化した結果を示すグラフである。
【図２Ｄ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓での、ヒドロキシプリンを定量した結果を示すグラフである。
【図２Ｅ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓での、コラーゲン１α１（Ｃｏｌ１ａ１）のｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量した結果を示すグラフである。
【図２Ｆ】実施例１における１週間又は２週間治療を行った合計８つの群のチオアセトアミド投与マウスから得られた肝臓での、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９ａの相対的発現レベルを定量した結果を示すグラフである。
【図３】ｍｉＲ−２９ａの標的遺伝子をＴａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ及びｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇのオンライン検索アルゴリズムを用いて予測した結果を示す図である。
【図４Ａ】実施例２におけるＬＸ−２細胞へのトランスフォーミング増殖因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦβ１）及びｍｉＲＮＡ投与スケジュールを示す図である。
【図４Ｂ】実施例２におけるＴＧＦβ１処理後にｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞での、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９ａの相対的発現レベルを定量した結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】実施例２におけるＴＧＦβ１処理後にｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞での、Ｃｏｌ１ａ１、ＰＤＧＦＣ及びＭＭＰ２のｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量した結果を示すグラフである。
【図４Ｄ】実施例２におけるＴＧＦβ１処理後にｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞での、Ｃｏｌ１ａ１タンパク質を免疫染色した結果を示す図である。
【図４Ｅ】実施例２におけるＴＧＦβ１処理後にｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞での、細胞増殖キットＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。
【図４Ｆ】実施例２におけるＴＧＦβ１処理後にｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞での、カスパーゼ９の活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例３におけるＬＸ−２細胞へのＴＧＦβ１及びｍｉＲＮＡ投与スケジュールを示す図である。
【図５Ｂ】実施例３におけるｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクション後にＴＧＦβ１処理したＬＸ−２細胞での、Ｃｏｌ１ａ１、ＰＤＧＦＣ及びＭＭＰ２のｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量した結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】実施例３におけるｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクション後にＴＧＦβ１処理したＬＸ−２細胞での、Ｃｏｌ１ａ１タンパク質を免疫染色した結果を示す図である。
【図６Ａ】標的遺伝子に対するｍｉＲ−２９ａによる肝線維化の抑制又は阻害メカニズムを示す図である。
【図６Ｂ】標的遺伝子以外の遺伝子に対するｍｉＲ−２９ａによる肝線維化の抑制又は阻害メカニズムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜＜肝線維化予防・治療剤＞＞
一実施形態として、本発明は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有効成分として含有する、肝線維化予防・治療剤を提供する。
【００１２】
本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）が内因性の遺伝子であるため、安全性が高く、ＲＮＡｉを応用した核酸医薬として応用可能であることに着目した。また、線維化が進んだ肝臓において、ｍｉＲ-１３２、並びにｍｉＲ−２９ファミリー（ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ及びｍｉＲ−２９ｃ）の発現が顕著に下がっていることに着目し、中でもｍｉＲ−２９が肝線維化に深く関与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤によれば、肝線維の吸収を促進し、肝線維化の抑制又は阻害することができ、安全且つ効果的に肝線維化を治療することができる。また、肝線維化を抑制又は阻害することで肝臓での発癌を抑制することができる。
【００１４】
本明細書において、「肝線維化」とは、肝臓においてコラーゲン等の線維物質が増えて細胞が硬く変化することを意味しており、アルコールの摂取、ウイルス等により引き起こされる肝炎、肝硬変等により肝線維化が進むことが知られている。また、肝線維化の度合いは肝発癌率と密接に関係していることが知られている。
【００１５】
＜ｍｉＲＮＡ＞
本実施形態の肝線維化予防・治療剤は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡを有効成分として含有するものである。本実施形態の肝線維化予防・治療剤で用いられるｍｉＲＮＡは、肝線維化に関わる遺伝子、より具体的には、以下の表１に示す遺伝子等を標的として、これらの遺伝子からなるタンパク質の発現を制御するｍｉＲＮＡである。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
通常、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）とは、成熟ｍｉＲＮＡと呼ばれているものを意味する。成熟ｍｉＲＮＡは、ゲノム上にコードされた内在性の２０〜２５塩基程度の非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ、以下、「Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ぶ。）として転写され、次にプロセッシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、さらにプロセッシングを受けて２０〜２５塩基程度の二本鎖成熟ｍｉＲＮＡとなる。二本鎖成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちの一本鎖がＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。
【００１８】
本明細書において、「ｍｉＲＮＡ」は、内在性のｍｉＲＮＡのみならず、内在性のｍｉＲＮＡと同一の塩基配列からなる合成核酸も包含する。
また、本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、その前駆体も包含する。
【００１９】
通常、「ｍｉＲＮＡの前駆体」とは、細胞内のプロセシングや、２本鎖核酸の開裂の結果、細胞内において成熟型ｍｉＲＮＡを生じ得る核酸を意味する。ｍｉＲＮＡの前駆体としては、例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等を挙げることができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ遺伝子の一次転写産物（１本鎖ＲＮＡ）であり、通常数百〜数千塩基程度の長さを有する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが細胞内プロセシングを受けることにより生じるヘアピン構造を有する１本鎖ＲＮＡであり、通常９０〜１１０塩基の長さを有する。ｍｉＲＮＡのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、例えばサンガー研究所が作成しているｍｉＲＢａｓｅデータベース：http://microrna.sanger.ac.uk/等に、その塩基配列が開示されている。
【００２０】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、その安定性を高めるために、例えば、核酸誘導体又は改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸を用いてもよい。核酸誘導体としては、公知のものを適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ポスホラミデートメトキシエチルホスホラミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド、ジメチレン−スルホキシド、ジメチレン−スルホン、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸等が挙げられる。さらに、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等の誘導体も挙げられる。
【００２１】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるＲＮＡを含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により肝線維化に関わる遺伝子の転写を抑制する核酸を包含する。核酸としては、例えば、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ核酸（以下、キメラ核酸と呼ぶ。）又はハイブリッド核酸等が挙げられる。
本明細書において、「キメラ核酸」とは、１本鎖又は２本鎖の核酸において一本の核酸の中にＲＮＡとＤＮＡを含む核酸を意味し、「ハイブリッド核酸」とは、二本鎖において、一方の鎖がＲＮＡ又はキメラ核酸でもう一方の鎖がＤＮＡ又はキメラ核酸である核酸を意味する。
【００２２】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。２本鎖としては、例えば、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド及びキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッド等が挙げられる。
本実施形態におけるｍｉＲＮＡとしては、例えば、１本鎖ＲＮＡ、１本鎖キメラ核酸、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッド等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡの鎖長は、１５塩基以上４０塩基以下が好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がより好ましく、２０塩基以上２５塩基以下がさらに好ましい。
【００２４】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは配列番号１で表される塩基配列（５’−ＵＡＧＣＡＣＣ−３’）をシード配列として有する配列からなる。
【００２５】
通常、「シード配列」とは、成熟ｍｉＲＮＡの５’末端領域に存在する６〜８塩基の塩基配列を意味し、このシード配列がｍｉＲＮＡのターゲットとなるｍＲＮＡを決定することが知られている。
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列を５’末端の１〜７塩基目に有することが好ましい。
【００２６】
本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるＲＮＡの３’末端に、上述の鎖長となるように８塩基以上３３塩基以下の鎖長の核酸が連結されていることが好ましい。
【００２７】
より具体的には、本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるＲＮＡの３’末端に、配列番号２で表される塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％の同一性を有する塩基配列からなる核酸が連結されており、さらに、肝線維化に関わる遺伝子を標的として、これらの遺伝子からなるタンパク質の発現を制御するｍｉＲＮＡ等が挙げられる。中でも、本実施形態におけるｍｉＲＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるＲＮＡの３’末端に、配列番号２で表される塩基配列と１００％の同一性を有する配列からなる核酸が連結されており、さらに、肝線維化に関わる遺伝子を標的として、これらの遺伝子からなるタンパク質の発現を制御するｍｉＲＮＡが好ましい。さらに具体的には、本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号３：５’−ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ−３’）であることが好ましい。
【００２８】
＜発現ベクター＞
本実施形態の肝線維化予防・治療剤は、上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターを有効成分とすることもできる。前記発現ベクターにおいて、上述のｍｉＲＮＡ又はそれをコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ）が、適用対象である哺乳動物（好ましくは、ヒト）の細胞（例えば、肝星細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに連結されている。
【００２９】
使用されるプロモーターは、適用対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。
【００３０】
ｍｉＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用するのが一般的である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。
【００３１】
前記発現ベクターは、上述のｍｉＲＮＡ又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましい。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）や蛍光タンパク質遺伝子（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等）を含有していてもよい。
【００３２】
＜投与条件＞
本実施形態の肝線維化予防・治療剤において、上述のｍｉＲＮＡ又は上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターは、それ単独で、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、投与対象に、有効量で投与することができる。
【００３３】
また、本実施形態の肝線維化予防・治療剤は、他の薬剤と併用して投与してもよく、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスによる肝線維化である場合は核酸アナログ製剤を、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝線維化である場合は抗ウイルス薬を併用することにより、原因となるウイルスの複製を抑制ながら、肝線維化を治療することができる。
【００３４】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤の有効成分である、上述のｍｉＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、化学合成により製造することもできるし、又は、適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。
【００３５】
また、本実施形態の肝線維化予防・治療剤の有効成分として、上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターを用いる場合には、例えば、上述のｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等適当な遺伝子治療用ベクターに挿入することにより構築した発現ベクターを、投与対象に投与することにより、上述のｍｉＲＮＡを投与対象内で発現させることができる。
【００３６】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤若しくは坐剤局所投与のクリーム等の非経口剤を挙げることができる。
【００３７】
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００３８】
非経口投与方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内等）等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本実施形態の肝線維化予防・治療剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本実施形態の肝線維化予防・治療剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき肝臓組織中に外科的に移植することができる。
【００３９】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％ 、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
【００４０】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。本実施形態の肝線維化予防・治療剤の有効成分であるｍｉＲＮＡの投与量としては、例えば、マウス１個体に静注する場合には、約１μｇ〜約１ｍｇが好ましく、約１μｇ〜約５００μｇがより好ましく、約１０μｇ〜約１００μｇがさらに好ましい。また、例えば、ヒト（成人）一人に静注する場合には、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇが好ましく、約１０μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇが好ましく、約５０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇがさらに好ましい。
【００４１】
本実施形態の肝線維化予防・治療剤の投与頻度としては、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の頻度で投与することができる。
【００４２】
＜＜用途＞＞
本実施形態の肝線維化予防・治療剤の有効成分である、ｍｉＲＮＡは以下のような用途に使用することができる。
【００４３】
一実施形態として、本発明は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで肝星細胞内に導入する工程を備える、肝星細胞の活性化抑制方法を提供する。
【００４４】
本実施形態において、上述のｍｉＲＮＡを用いることで、後述の実施例に示すとおり、インビトロにおいて、肝星細胞の活性化を抑制化することができる。
【００４５】
一実施形態として、本発明は、配列番号１で表される塩基配列を含む配列からなるｍｉＲＮＡをインビトロで細胞内に導入する工程を備える、細胞外マトリックスの産生抑制方法を提供する。
【００４６】
本実施形態において、上述のｍｉＲＮＡを用いることで、後述の実施例に示すとおり、インビトロにおいて、細胞外マトリックスの産生を抑制することができる。
【００４７】
通常、「細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）」とは、細胞の外に存在する超分子構造体を意味する。脊椎動物のＥＣＭを構成する成分は、主に、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、カドヘリンやラミニンといった糖タンパク質（一部は細胞接着分子）である。よって、上述のｍｉＲＮＡがＥＣＭの構成成分の一つであるＣｏｌ１ａ１遺伝子の発現を抑制することにより、細胞外マトリックスの産生を抑制することができる。
【００４８】
また、一実施形態として、本発明は、肝線維化の治療のための上述のｍｉＲＮＡ又は上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターを提供する。
また、一実施形態として、本発明は、治療的に有効量の上述のｍｉＲＮＡ又は上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクター、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、一実施形態として、本発明は、前記医薬組成物を含む、肝線維化予防・治療剤を提供する。
また、一実施形態として、本発明は、肝線維化予防・治療剤を製造するための上述のｍｉＲＮＡ又は上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターの使用を提供する。
また、一実施形態として、本発明は、上述のｍｉＲＮＡ又は上述のｍｉＲＮＡを発現し得る発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肝線維化の治療方法を提供する。
【００４９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
［実施例１］
（１）慢性肝炎モデルマウス（四塩化炭素投与マウス及びチオアセトアミド投与マウス）の作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（６週齢）（日本エスシーエル社製）を１週間飼育し、順化した。照明条件は、１２時間明るくし、１２時間暗くするサイクルで制御した。四塩化炭素（ＣＣｌ４）をコーン油と混合し、腹腔内に０．５μＬ／ｇ体重となるように、３日毎に５週にわたって合計１２回投与し、四塩化炭素投与マウスを作製した。また、チオアセトアミド投与マウスは、チオアセトアミド（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；ＴＡＡ）を生理食塩水に溶解し、１回目の投与では１００μｇ／ｇ体重となるように、２〜５回目の投与では２００μｇ／ｇ体重となるように、６〜９回目の投与では３００μｇ／ｇ体重となるように、１０〜１２回目の投与では４００μｇ／ｇ体重となるように、３日毎に投与した。それぞれの慢性肝炎モデルマウスのコントロールマウスとして、コーン油又は生理食塩水のみを５週間与えたものを準備した。５週間後、四塩化炭素投与マウス及びチオアセトアミド投与マウスにおいて、肝線維化が観察された。
【００５１】
（２）ｍｉＲ−２９ａの投与による慢性肝炎の治療評価
（１）で作製されたそれぞれのマウスについて、５週間の肝線維化誘導期間後すぐに、１週間又は２週間にわたって、ｍｉＲ−２９ａを投与した（図１Ａ参照）。５０μｇの二本鎖成熟ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９ａ（ボナック社製）又は、コントロールとしてヒト遺伝子を認識しない２０ｍｅｒの非特異的な遺伝子であるネガティブコントロールＲＮＡ（ＮＣ  ｍｉＲＮＡ）（ボナック社製）を、２００μＬのアテロコラーゲン（アテロジーン社製）と混合し、３日毎に尾静脈から注入した。１週間治療を行ったマウスは、ｍｉＲ−２９ａを２回投与し、２週間治療を行ったマウスは、ｍｉＲ−２９ａを４回投与した。よって、四塩化炭素投与マウス及びチオアセトアミド投与マウスは、それぞれ以下の４つの群のマウスに分けられる。何もせず観察のみ行った群（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、遺伝子導入試薬であるアテロコラーゲンのみを投与した群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、非特異的な遺伝子を投与した群（ＮＣ  ｍｉＲＮＡ）及びｍｉＲ−２９ａを投与した群である（図１Ａ参照）。それぞれ４つの群について、１週間治療した群と、２週間治療した群を作製し、合計８つの群を作製した。
【００５２】
（３）組織学的分析
（２）で作製した８つの群のマウスからそれぞれの肝臓を外科的に取り出した。取り出した肝臓を１０％のホルマリン溶液で固定し、５μｍの２つの連続したパラフィン切片を作製した。１つの切片は、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ；ＨＥ)染色に用いた（図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ及び図２Ｂの上の画像参照）。もう一つの切片は、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ；ＳＲ）溶液（シグマアルドリッチ社製）で染色し、ファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）で対比染色した（図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ及び図２Ｂの下の画像参照）。ＳＲのポジティブ領域はマイクロアナライザー（日本ポラデジタル社製）を用いて定量した（図１Ｄ及び図２Ｃ参照）。ＳＲのポジティブ領域の面積を検証するために、少なくとも一つの門脈を含む５つの画像を選択した。
【００５３】
図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ及び図２Ｂの上のＨＥ染色の結果から、いずれの慢性肝炎モデルマウスにおいても、炎症性細胞が全体的に散見されるが、ｍｉＲ−２９ａを投与したマウスの肝臓では、炎症が増悪していないことが確かめられた。
また、図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ及び図２Ｂの下のシリウスレッド及びファストグリーンによる対比染色の結果と、図１（Ｄ）及び図２（Ｃ）のグラフとから、ｍｉＲ−２９ａを投与したマウスの肝臓では、繊維の面積が減少していることが明らかとなった。
【００５４】
（４）ヒドロキシプリン分析
（３）で取り出した肝臓の一部を用いて、肝臓に含まれるヒドロキシプリンを定量した。ヒドロキシプリンの定量方法は、ヒドロキシプリンアッセイキット（バイオビジョン社製）を用いて、取扱説明書に従い、行った。ヒドロキシプリンはコラーゲンの主成分であり、ヒドロキシプリンを定量することにより、繊維化の度合いを評価することができる。結果を図１Ｅ及び図２Ｄに示す。
【００５５】
図１Ｅ及び図２Ｄから、いずれの慢性肝炎モデルマウスにおいても、ｍｉＲ−２９ａを投与したマウスの肝臓では、ヒドロキシプリンの量が低下しており、繊維化が改善していることが推察される。
【００５６】
（５）肝臓からのＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現解析
（３）で取り出した肝臓の一部を用いて、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（キアゲン社製）を用いて、取扱説明書に従い、抽出した。得られたＲＮＡからｃＤＮＡを、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ロッシュ社製）を用いた合成した。ファストスタートユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したプライマーの配列は、下記の表２に示した通りである。反応は三重測定した。続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（アッセイＩＤ．００２４４７）、及びコントロールとしてＵ１８（アッセイＩＤ．００１２０４）の相対的な発現レベルを定量化した。ｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて合成した。ファストスタートユニバーサルプローブマスター（ロッシュ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。また、Ｃｏ１ａ１のｍＲＮＡの発現解析は、下記表２に示すプライマー及びＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ロッシュ社製）を用いて行った。ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを検出した。反応は三重測定した。結果を図１Ｆ、図１Ｇ、図２Ｅ及び図２Ｆに示す。
【００５７】
【表２】
2017145222.tif 000003
【００５８】
図１Ｆ、図１Ｇ、図２Ｅ及び図２Ｆから、コラーゲン１α１（Ｃｏｌ１ａ１）の遺伝子発現について、いずれの慢性肝炎モデルマウスにおいても、ｍｉＲ−２９ａを投与して１週間治療したマウスの肝臓では発現が低下しており、ｍｉＲ−２９ａを投与して２週間治療したマウスでは統計的な差は見られないものの低下傾向であった。また、肝組織中のｍｉＲ−２９ａの発現は、ｍｉＲ−２９ａを投与したことによって、変化しなかった。
【００５９】
さらに、ｍｉＲ−２９ａによる線維化のメカニズムを明らかにするために、ｍｉＲ−２９ａの標的遺伝子をＴａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ及びｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇのオンライン検索アルゴリズムを用いて予測した。結果を図３に示す。
【００６０】
図３から、ｍｉＲ−２９ａの標的遺伝子として、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １９  （Ａｄａｍ１９）遺伝子、フィブリノーゲン様タンパク質２（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２；Ｆｇｌ２）遺伝子、ＰＤＧＦ遺伝子、コラーゲンＩＶ型α４（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ａｌｐｈａ  ４；Ｃｏｌ４ａ４）遺伝子、Ｍａｐ４ｋ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ４）遺伝子、メチルトランスフェラーゼ３Ｂ（ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ３Ｂ  ；Ｄｎｍｔ３ｂ）遺伝子及びＣｏｌ１ａ１遺伝子が同定された。
いずれの標的遺伝子に対しても、少なくともｍｉＲ−２９ａ中の配列番号１で表される塩基配列（５’−ＵＡＧＣＡＣＣ−３’）がハイブリダイズすることが確かめられた。よって、ｍｉＲ−２９ａにおいて、配列番号１で表される塩基配列がシード配列であると推察される。
【００６１】
［実施例２］
（１）ＬＸ−２細胞の培養
マウントサイナイ病院の肝臓病専門医であるスコット  Ｌ．フリードマンから寄贈されたヒトＨＳＣ細胞株ＬＸ−２を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）及び非必須アミノ酸（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）含有ダルベッコ改変培地（和光社製）を用いて、培養した。続いて、ＬＸ−２細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に播種した。
【００６２】
（２）トランスフォーミング増殖因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦβ１）による処理
２．５ｎｇ／ｍＬ  トランスフォーミング増殖因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦβ１）を細胞に添加し、細胞の炎症を誘導した（図４Ａ参照）。
【００６３】
（３）ＬＸ−２細胞へのマイクロＲＮＡのトランスフェクション
続いて、（２）のＴＧＦβ１処理から１日後の細胞に、４０μＭのｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランス試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてＬＸ−２細胞にトランスフェクションし、さらに、２日間細胞を培養した（図４Ａ参照）。
【００６４】
（４）ＬＸ−２細胞からのＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現解析
続いて、（３）のトランスフェクションから２日後の細胞を回収し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（キアゲン社製）を用いて、取扱説明書に従い、抽出した。実施例１の（５）と同様の方法を用いて、ｍｉＲ−２９ａの相対的発現レベル、Ｃｏｌ１ａ１、ＰＤＧＦＣ及びマトリックスメタロプロテアーゼ２（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ２）のｍＲＮＡの相対的発現レベルを測定した。ＭＭＰ２のｍＲＮＡの発現解析は、下記表３に示すプライマー及びＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ロッシュ社製）を用いて行った。また、結果を図４Ｂ、図４Ｃに示す。
【００６５】
【表３】
2017145222.tif 000004
【００６６】
図４Ｂ、図４Ｃから、ＴＧＦβ１処理して炎症が誘導されたＬＸ−２細胞において、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、Ｃｏｌ１ａ１及びＭＭＰ２のｍＲＮＡの発現が抑制されていることが確かめられた。ＭＭＰ２が繊維を吸収する作用を有するが、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、繊維発現が上昇しないため、繊維吸収機能も抑制されたと考えられる。また、ＰＤＧＦＣのｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲ−２９ａを投与により、統計的な差は見られないものの低下傾向であった。
【００６７】
（５）Ｃｏｌ１ａ１タンパク質量の評価
続いて、（３）のトランスフェクションから２日後の細胞の一部を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）、０．５％デオキシコール酸及び１％  ＮＰ−４０を用いて、ホモゲナイズした。続いて、定量化した上清（２０μｇ／ウェル）に、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエタノール及び０．０１％ブロモフェノールブルーを含む２０％グリセロールを等量添加し、煮沸した。続いて、ＰＡＧＥＬ（登録商標）（５〜２０％）（ＡＴＴＯ社製）を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。サブマリン型ブロッティングにより、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。続いて、得られたメンブレンを５％スキムミルク及びＴｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝食塩水を用いて、インキュベートし、ブロッキングを行った。続いて、１次抗体として抗ＣＯＬＡ１抗体（ｓｃ−８７８４、サンタクルーズ社製）又はコントロールとして抗β−アクチン抗体（ｓｃ−６９８７９、サンタクルーズ社製）を用いて、インキュベートした。続いて、２次抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体又はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ社製）を用いて、インキュベートした。免疫反応性は、化学発光（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって可視化した。結果を図４Ｄに示す。
【００６８】
図４Ｄから、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、Ｃｏｌ１ａ１タンパク質量が低下することが明らかとなった。
【００６９】
（６）細胞生存率分析
１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、ＬＸ−２細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞増殖キットＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ社製）を取扱説明書に従って使用した。具体的には、まず、播種した細胞に２．５ｎｇ／ｍＬ  トランスフォーミング増殖因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦβ１）を細胞に添加した。続いて、ＴＧＦβ１処理から１日後の細胞に、４０μＭのｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランス試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞にトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションから４８時間後の細胞に５０μＬのＸＴＴ試薬を添加し、３７℃で６時間培養した。続いて、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図４Ｅに示す。
【００７０】
図４Ｅから、ＴＧＦβ１処理の有無に関係なく、ｍｉＲ−２９ａが過剰発現したＬＸ−２細胞では、若干細胞生存率の低下することが明らかとなった。
【００７１】
（７）カスパーゼ９（Ｃａｓｐａｓｅ  ９）活性アッセイ
１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、ＬＸ−２細胞を９６ウェルプレートに播種した。続いて、播種した細胞に２．５ｎｇ／ｍＬ  トランスフォーミング増殖因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１：ＴＧＦβ１）を細胞に添加した。続いて、ＴＧＦβ１処理から１日後の細胞に、４０μＭのｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランス試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて細胞にトランスフェクションした。続いて、トランスフェクションから４８時間後の細胞にＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）９アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を取扱説明書に従って使用した。結果を図４Ｆに示す。
【００７２】
図４Ｆから、ｍｉＲ−２９ａが過剰発現したＬＸ−２細胞では、ＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしたＬＸ−２細胞と比較して、Ｃａｓｐａｓｅ  ９の活性が上昇することが明らかとなった。
【００７３】
［実施例３］
（１）ＬＸ−２細胞の培養
実施例２の（１）と同様の方法を用いて、ＬＸ−２細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に播種した。
【００７４】
（２）ＬＸ−２細胞へのマイクロＲＮＡのトランスフェクション
続いて、細胞播種から１日後に、（１）で播種したＬＸ−２細胞へ、実施例２の（３）と同様の方法を用いて、４０μＭのｍｉＲ−２９ａ又はＮＣ  ｍｉＲＮＡをトランスフェクションした（図５Ａ参照）。
【００７５】
（３）ＴＧＦβ１による処理
続いて、（２）のトランスフェクションから６時間後のＬＸ−２細胞に、実施例２（２）と同様の方法を用いて、ＴＧＦβ１を添加し、細胞の炎症を誘導した（図５Ａ参照）。
【００７６】
（４）ＬＸ−２細胞からのＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現解析
続いて、（２）のトランスフェクションから１日後又は２日後の細胞を回収し、実施例２の（４）と同様の方法を用いて、全ＲＮＡを回収し、Ｃｏｌ１ａ１、ＰＤＧＦＣ及びＭＭＰ２のｍＲＮＡの相対的発現レベルを測定した。結果を図５Ｂに示す。
【００７７】
図５Ｂから、予めｍｉＲ−２９ａを投与することにより、Ｃｏｌ１ａ１及びＭＭＰ２のｍＲＮＡの発現が抑制されていることが確かめられた。ＭＭＰ２が繊維を吸収する作用を有するが、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、繊維発現が上昇しないため、繊維吸収機能も抑制されたと考えられる。また、ＰＤＧＦＣのｍＲＮＡの発現については、ｍｉＲ−２９ａを投与による抑制効果が見られなかった。
【００７８】
（５）Ｃｏｌ１ａ１タンパク質量の評価
続いて、（２）のトランスフェクションから２日後の細胞の一部を用いて、実施例２の（５）と同様の方法を用いて、Ｃｏｌ１ａ１タンパク質を免疫染色した。結果を図５Ｃに示す。
【００７９】
図５Ｃから、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、Ｃｏｌ１ａ１タンパク質量が低下することが明らかとなった。
【００８０】
また、図６Ａ及び図６Ｂは、ｍｉＲ−２９ａによる肝線維化の抑制又は阻害メカニズムを示す図である。図６Ａ及び図６Ｂに示された、ＲｈｏＡ、ＭＡＰＫ８、ＲＡＦ１、ＳＲＦ、ＩＬ−１ｂ、ＮＤＲＧ１及びＢＣＬ２とは、以下の表４に示す遺伝子である。また、上記７種類の遺伝子のｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すグラフは、（２）のトランスフェクションから２日後の細胞の一部を用いて、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ８  ×  ６０ｋ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ及び以下の表５に示すプローブを使用して検出した結果である。
【００８１】
【表４】
2017145222.tif 000005
【００８２】
【表５】
2017145222.tif 000006
【００８３】
実施例１〜３より、ｍｉＲ−２９ａはＣｏｌ１ａ１遺伝子及びＰＤＧＦＣ遺伝子それぞれに直接ハイブリダイズし、それら遺伝子の発現を抑制していることが明らかとなった。その結果、細胞外マトリックスであるコラーゲンの産生を抑制する。さらに、図６Ａから、炎症を誘導するＰＤＧＦＣの発現を抑制し、その下流遺伝子であるＲｈｏＡ遺伝子、ＭＡＰＫ８遺伝子、ＲＡＦ遺伝子及びＳＲＦ遺伝子を抑制することにより、細胞移動又は細胞増殖を抑制していると推察される。
【００８４】
また、図６Ｂから、ｍｉＲ−２９ａを投与することにより、標的遺伝子でないが、ＩＬ−１ｂ遺伝子、ＮＤＲＧ１遺伝子及びＢＣＬ遺伝子が低下することが明らかとなった。ＩＬ−１遺伝子を抑制することにより、炎症が抑制され、ＮＤＲＧ１遺伝子を抑制することにより、血管造成が抑制され、さらに、ＢＣＬ２遺伝子を抑制するこりによりアポトーシスが促進されると推察される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、肝線維の吸収を促進し、肝線維化の抑制又は阻害することができ、安全且つ効果的に肝線維化を治療することができる。また、肝線維化の度合いは肝発癌率と密接に関係するため、肝線維化を抑制又は阻害することで肝臓での発癌を抑制することができる。
【図１Ａ】
2017145222.tif 000007
【図１Ｂ】
2017145222.tif 000008
【図１Ｃ】
2017145222.tif 000009
【図１Ｄ】
2017145222.tif 000010
【図１Ｅ】
2017145222.tif 000011
【図１Ｆ】
2017145222.tif 000012
【図１Ｇ】
2017145222.tif 000013
【図２Ａ】
2017145222.tif 000014
【図２Ｂ】
2017145222.tif 000015
【図２Ｃ】
2017145222.tif 000016
【図２Ｄ】
2017145222.tif 000017
【図２Ｅ】
2017145222.tif 000018
【図２Ｆ】
2017145222.tif 000019
【図３】
2017145222.tif 000020
【図４Ａ】
2017145222.tif 000021
【図４Ｂ】
2017145222.tif 000022
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2017145222.tif 000024
【図４Ｅ】
2017145222.tif 000025
【図４Ｆ】
2017145222.tif 000026
【図５Ａ】
2017145222.tif 000027
【図５Ｂ】
2017145222.tif 000028
【図５Ｃ】
2017145222.tif 000029
【図６Ａ】
2017145222.tif 000030
【図６Ｂ】
2017145222.tif 000031
【配列表】
2017145222000001.app