(57)【要約】【課題】骨再生又は骨増生（ｂｏｎｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に有効な手段を提供すること。【解決手段】第８リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む多孔質複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む多孔質複合体。 
【請求項２】
水分含量が５重量％以下である、請求項１に記載の多孔質複合体。 
【請求項３】
骨再生用又は骨増生用である、請求項１又は２に記載の多孔質複合体。 
【請求項４】
更にコラーゲンを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の多孔質複合体。 
【請求項５】
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の多孔質複合体。 
【請求項６】
第８リン酸カルシウムを含む第１多孔質複合体に副甲状腺ホルモンを添加することを含む、第８リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む第２多孔質複合体の製造方法。 
【請求項７】
第２多孔質複合体を凍結乾燥することを更に含む、請求項６に記載の製造方法。 
【請求項８】
第１多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、請求項６又は７に記載の製造方法。 
【請求項９】
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
リン酸カルシウム含有多孔質複合体及びＰＴＨの組み合わせ、及びその利用等が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアパタイト、β−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）、及び第８リン酸カルシウム（Ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下、「ＯＣＰ」という）等のリン酸カルシウムが骨再生材料として使用されている（例えば、特許文献１〜５）。また、ＯＣＰに保形性を付与するために、コラーゲンでできた多孔質体にＯＣＰを含有させることが提案されている（特許文献５）。また、非特許文献１には、ＯＣＰ単独よりもＯＣＰを含有するコラーゲン多孔質体の方が骨再生作用に優れることが報告されている。
【０００３】
非特許文献２には、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）の皮下投与によって局所の骨形成が有意に促進されたことが報告されている。非特許文献２には、β−ＴＣＰによる骨形成は限定的であり、β−ＴＣＰと組み合わせることによってＰＴＨによる骨形成作用も阻害されることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２７３８４７号公報
【特許文献２】特開２００３−２６０１２４号公報
【特許文献３】特開２００９−１３２６０１号公報
【特許文献４】特開２００５−２７９０７８号公報
【特許文献５】特開２００６−１６７４４５号公報
【特許文献６】特開平５−０７０１１３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ７９：  ２１０−２１７．  ２００６
【非特許文献２】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，  ３７：  ４１９−４２６，  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
骨再生又は骨増生（ｂｏｎｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に有効な新たな手段を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
リン酸カルシウムを含む多孔質複合体とＰＴＨを併用することにより、より効果的な骨再生又は骨増生が可能であることが確認された。斯かる知見に基づき、下記に代表される発明が提供される。
Ａ：骨再生又は骨増生の方法
Ａ１．
骨再生又は骨増生が必要な部位にリン酸カルシウムを含む多孔質複合体を移植すること、及び
骨再生又は骨増生が必要な患者に副甲状腺ホルモンを投与すること
を含む、骨再生又は骨増生するための方法。
Ａ２．
該多孔質複合体が移植され、次いで副甲状腺ホルモンが投与される、Ａ１に記載の方法。
Ａ３．
骨再生又は骨増生が必要な部位に副甲状腺ホルモンが局所投与される、Ａ１又はＡ２に記載の方法。
Ａ４．
該多孔質複合体が移植された部位に副甲状腺ホルモンが局所投与される、Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の方法。
Ａ５．
副甲状腺ホルモンが皮下投与される、Ａ１又はＡ２に記載の方法。
Ａ６．
副甲状腺ホルモンが患者に投与され、次いで該多孔質複合体が移植される、Ａ１及びＡ３〜Ａ５のいずれかに記載の方法。
Ａ７．
骨再生又は骨増生が必要な部位に副甲状腺ホルモンが局所投与される、Ａ６に記載の方法。
Ａ８．
副甲状腺ホルモンが皮下投与される、Ａ６に記載の方法。
Ａ９．
骨再生又は骨増生が必要な部位が、骨再生が必要な部位である、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の方法。
Ａ１０．
骨再生が必要な部位が骨欠損部位である、Ａ９に記載の方法。
Ａ１１．
骨再生又は骨増生が必要な部位が、骨増生が必要な部位である、Ａ１〜Ａ８のいずれかに記載の方法。
Ａ１２．
骨増生が必要な部位が、上顎洞底挙上術（ｓｉｎｕｓ  ｌｉｆｔ）、骨移植（ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ）、及び歯槽堤拡大術（ｒｉｄｇｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）から成る群より選択される少なくとも１種を必要とする部位である、Ａ１１に記載の方法。
Ａ１３．
該多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、Ａ１〜Ａ１２のいずれかに記載の方法。
Ａ１４．
該リン酸カルシウムが、第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）、β型リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、及び非晶性リン酸カルシウム（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から成る群より選択される少なくとも１種である、Ａ１〜Ａ１３のいずれかに記載の方法。
Ａ１５．
該副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ａ１〜Ａ１４のいずれかに記載の方法。
【０００８】
Ｂ：骨再生又は骨増生の方法
Ｂ１．
リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む多孔質複合体を骨再生又は骨増生が必要な部位に移植することを含む、骨再生又は骨増生するための方法。
Ｂ２．
骨再生又は骨増生が必要な部位が、骨再生が必要な部位である、Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．
骨再生が費用な部位が骨欠損部位である、Ｂ２に記載の方法。
Ｂ４．
骨再生又は骨増生が必要な部位が、骨増生が必要な部位である、Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５．
骨増生が必要な部位が、上顎洞底挙上術、骨移植、及び歯槽堤拡大術から成る群より選択される少なくとも１種を必要とする部位である、Ｂ４に記載の方法。
Ｂ６．
該多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、Ｂ１〜Ｂ５のいずれかに記載の方法。
Ｂ７．
該リン酸カルシウムが、第８リン酸カルシウム、β型リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、及び非晶性リン酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種である、Ｂ１〜Ｂ６のいずれかに記載の方法。
Ｂ８．
該副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｂ１〜Ｂ７のいずれかに記載の方法。
【０００９】
Ｃ：副甲状腺ホルモンを含む複合体
Ｃ１．
リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む、骨再生又は骨増生のための多孔質複合体。
Ｃ２．
更にコラーゲンを含む、Ｃ１に記載の多孔質複合体。
Ｃ３．
該リン酸カルシウムが、第８リン酸カルシウム、β型リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、及び非晶性リン酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種である、Ｃ１又はＣ２に記載の多孔質複合体。
Ｃ４．
該副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｃ１〜Ｃ３のいずれかに記載の多孔質複合体。
【００１０】
Ｄ：多孔質複合体の製造方法
Ｄ１．リン酸カルシウムを含む多孔質複合体に副甲状腺ホルモンを添加することを含む、骨再生又は骨増生のための多孔質複合体を製造する方法。
Ｄ２．
該リン酸カルシウムが、第８リン酸カルシウム、β型リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、及び非晶性リン酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種である、Ｄ１に記載の方法。
Ｄ３．
該多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、Ｄ２に記載の方法。
Ｄ４．
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｄ１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１１】
Ｅ．キット
Ｅ１．
リン酸カルシウムを含む多孔質複合体、及び副甲状腺ホルモンを含む、骨再生又は骨増生のためのキット。
Ｅ２．
該リン酸カルシウムが、第８リン酸カルシウム、β型リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、及び非晶性リン酸カルシウムから成る群より選択される少なくとも１種である、Ｅ１に記載のキット。
Ｅ３．
該多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、Ｅ１又はＥ２に記載のキット。
Ｅ４．
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載のキット。
【００１２】
Ｆ：多孔質複合体
Ｆ１．
第８リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む多孔質複合体。
Ｆ２．
水分含量が５重量％以下である、Ｆ１に記載の多孔質複合体。
Ｆ３．
骨再生用又は骨増生用である、Ｆ１又は２に記載の多孔質複合体。
Ｆ４．
更にコラーゲンを含む、Ｆ１〜３のいずれかに記載の多孔質複合体。
Ｆ５．
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｆ１〜４のいずれかに記載の多孔質複合体。
【００１３】
Ｇ：多孔質複合体の製造方法
Ｇ１．
第８リン酸カルシウムを含む第１多孔質複合体に副甲状腺ホルモンを添加することを含む、第８リン酸カルシウム及び副甲状腺ホルモンを含む第２多孔質複合体の製造方法。
Ｇ２．
第２多孔質複合体を凍結乾燥することを更に含む、Ｇ１に記載の製造方法。
Ｇ３．
第１多孔質複合体が更にコラーゲンを含む、Ｇ１又はＧ２に記載の製造方法。
Ｇ４．
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、Ｇ１〜Ｇ３のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
効果的な骨再生及び／又は骨増生手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体での骨欠損部位の処置に対する皮下投与したＰＴＨの影響を調べた結果を上から撮影したＸ線写真である。
【図２】図２は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体での骨欠損部位の処置に対する皮下投与したＰＴＨの影響を調べた結果（断面）を示すＸ線写真である。
【図３】図３は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体での骨欠損部位の処置に対する皮下投与したＰＴＨの影響を染色した病理組織標本で調べた結果を示す。上方は皮膚側であり、下方は脳硬膜側である。（▼）は欠損辺縁を示す。図３は、低倍率（×１．２５）画像である。
【図４】図４は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体での骨欠損部位の処置に対する皮下投与したＰＴＨの影響を染色した病理組織標本で調べた結果を示す。上方は皮膚側であり、下方は脳硬膜側である。図４は、高倍率（×２０）画像である。
【図５】図５は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体での骨欠損部位の処置に対する皮下投与したＰＴＨの影響を新生骨の割合  （ｎ−Ｂｏｎｅ％）で調べた結果を示す。
【図６】図６は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体で処置した骨欠損部位に滴下したＰＴＨの影響を調べた結果を上から撮影したＸ線写真である。
【図７】図７は、ＯＣＰ含有多孔質複合体又はβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体で処置した骨欠損部位に滴下したＰＴＨの影響を調べた結果（断面）を示すＸ線写真である。
【図８】図８は、ＯＣＰ含有多孔質複合体で処置した骨欠損部位に滴下したＰＴＨの影響を染色した病理組織標本で調べた結果を示す。上方は皮膚側であり、下方は脳硬膜側である。上段は低倍率（Ｘ１．２５）画像であり、下段は高倍率（Ｘ２０）画像である。
【図９】図９は、ＯＣＰ含有多孔質複合体で処置した骨欠損部位に滴下したＰＴＨの影響を組織形態計測した結果を示す。
【図１０】図１０は、ＯＣＰ単独又はＯＣＰとＦＧＦ−２との組み合わせで骨欠損部位を処置した結果を示す。
【図１１】図１１は、術後１２週後に撮影した摘出標本の軟Ｘ線写真である。Ａ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  １．０μｇを含む凍結乾燥複合体）、Ｂ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．１μｇを含む凍結乾燥複合体）、Ｃ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ、Ｄ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  １．０μｇを含む凍結乾燥複合体）、Ｅ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．１μｇを含む凍結乾燥複合体）、Ｆ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ
【図１２】図１２は、術後４週後及び１２週後に断層撮影したＣＴ写真である。Ａ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０、Ｂ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１、Ｃ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ、Ｄ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０、Ｅ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１、Ｆ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ
【図１３】図１３は、術後１２週後に摘出し、染色した病理組織標本である。Ａ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０、Ｂ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１、Ｃ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ、Ｄ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０、Ｅ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１、Ｆ群：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ
【図１４】図１４は、術後４週後及び１２週後に断層撮影したＣＴ写真である。Ａ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．０１（ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．０１μｇを含む凍結乾燥複合体）、Ｂ群：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．００１（ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．００１μｇを含む凍結乾燥複合体）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態において、骨再生又は骨増生（ｂｏｎｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の方法は、骨再生又は骨増生が必要な部位にリン酸カルシウムを含む多孔質複合体を移植する工程（Ｉ）、及び骨再生又は骨増生が必要な被検体に副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を投与する工程（ＩＩ）を含むことが好ましい。工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は、いずれを先に行っても同時に行ってもよい。一実施形態において、骨再生又は骨増生の方法は、工程（Ｉ）の後に工程（ＩＩ）を行うことが好ましい。例えば、骨再生又は骨増生が必要な部位に多孔質複合体を埋入した後に、ＰＴＨを投与することができる。他の実施形態において、骨再生又は骨増生の方法は、工程（ＩＩ）の後に工程（Ｉ）を行うことが好ましい。例えば、骨再生又は骨増生が必要な部位にＰＴＨを投与（例えば、滴下）し、その後多孔質複合体を該部位に埋入することができる。他の好適な一実施形態において、ＰＴＨは予め多孔質複合体に含有されている。
【００１７】
ＰＴＨは、一般的に、パラトルモン、副甲状腺ホルモン、又は上皮小体ホルモンとも呼ばれる、副甲状腺（上皮小体）から分泌される８４アミノ酸から構成されるヒト由来のポリペプチドホルモンである。本書において、ＰＴＨとは、このような野生型のＰＴＨだけでなく、野生型のＰＴＨと同様の生理作用を保持した誘導体及びその薬学的に許容される塩も含まれる。そのような誘導体としては、例えば、野生型ＰＴＨのＮ末端の３４アミノ酸領域に相当するテリパラチド（ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）を挙げることができる。テリパラチドは、フォルテオ（Ｆｏｒｔｅｏ）又はテリボン（Ｔｅｒｉｂｏｎｅ）という名称で骨粗鬆症の治療薬として販売されており、配列番号１のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、ＰＴＨはテリパラチドであることが好ましい。ここで、テリパラチドにはその薬学的に許容される塩も含まれる。
【００１８】
多孔質複合体は、リン酸カルシウムを含むことが好ましい。リン酸カルシウムは、骨再生又は骨増生作用を有するものが好ましい。リン酸カルシウムとしては、例えば、第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）、β型リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、非晶性リン酸カルシウム（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）無水リン酸水素カルシウム（ＤＣＰＡ）、及びリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）等を挙げることができる。一実施形態において、リン酸カルシウムは、ＯＣＰ、β−ＴＣＰ、及びＨＡＰから成る群より選択される一種以上であることが好ましく、ＯＣＰであることがより好ましい。これらのリン酸カルシウムは、任意の方法で調製することができ、市販品を購入して使用することもできる。
【００１９】
ＯＣＰは、種々公知の方法によって調製することができる。例えば、滴下法（ＬｅＧｅｒｏｓ  ＲＺ，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ３７：１９４−１９７，１９８５）、又は特許文献６に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、リン酸二水素ナトリウム水溶液と酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することによる混合法によって調製することもできる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。粒径は１０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００〜５００μｍに調製することが好ましく、さらに好ましくは３００〜５００μｍに調製することが好ましい。粒径は、ふるい分け法によりふるいの目開きのサイズによって分級することができる。
【００２０】
β−ＴＣＰは、種々公知の方法によって調製することができる。例えば、下記の方法が例示される。まず、水酸化カルシウム粉体とリン酸水素カルシウム粉体とを、リンに対するカルシウムのモル比（Ｃａ／Ｐ）が１．４５〜１．７２となるように配合して原料体を調製する。得られた原料体を混合粉砕処理して、ソフトメカノケミカル複合化反応によりリン酸カルシウム前駆体を調製し、得られた前駆体を６００℃以上の温度で熱処理することによりβ−ＴＣＰを得ることができる。他の方法として、リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウムを含む混合スラリーをポットミルで２４時間粉砕・反応させた後、スラリーを乾燥後、７５０℃で１時間焼成することによりβ−ＴＣＰ粉末を得ることができる。
【００２１】
ＨＡＰは、種々公知の方法によって調製することができる。例えば、水熱合成法、乾式合成法、又は湿式合成法により調製することができる。水熱合成法は次の通りである。無水リン酸水素カルシウム［ＣａＨＰＯ４］の水懸濁液をリン酸［Ｈ３ＰＯ４］でｐＨ４に調整する。次いで、これを水熱反応合成装置にて３５０℃，８８００Ｉｂ／ｉｎ２気圧の条件下で４８時間反応させることにより、ＨＡＰを得ることができる。乾式合成法は次の通りである。難溶性リン酸カルシウムであるピロリン酸カルシウム（Ｃａ２Ｐ２Ｏ７）、あるいはリン酸三カルシウム［Ｃａ３（ＰＯ４）２］と炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を，水蒸気雰囲気中で９００〜１３００℃，１〜２４時間反応させることにより、ＨＡＰを得ることができる。湿式合成法は次の通りである。可溶性リン酸塩あるいはリン酸の水溶液と，可溶性カルシウム塩の水溶液を７０〜１００℃でアルカリ性を保ちながら，２４〜４８時間反応させることによりＨＡＰを得ることができる。湿式合成法の別の方法としては、水に不溶性のリン酸カルシウム塩を水中に懸濁させ、懸濁液に水に不溶性の炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を添加し、懸濁液を撹拌下に過熱して反応させて、ＨＡＰを得ることができる。さらに湿式合成法の別の方法としては、炭酸カルシウム粉末とリン酸水素カルシウム又はその二水和物の粉末とを、カルシウム原子のリン酸に対する原子比が１．５〜１．６７の範囲になるように調整し、湿式粉砕機により磨砕混合しながらＨＡＰを得ることができる。
【００２２】
多孔質複合体の素材は、骨再生又は骨増生に適している限り任意であり、特に制限されない。例えば、多孔質複合体は、多孔質状に形成されたリン酸カルシウムであってもよい。一実施形態において、多孔質複合体がリン酸カルシウムで形成される場合、リン酸カルシウムは、β−ＴＣＰ又はＨＡＰであることが好ましい。一実施形態において、多孔質複合体は、コラーゲンとリン酸カルシウムで形成されていることが好ましい。
【００２３】
多孔質複合体を構成するコラーゲンは、骨再生又は骨増生用の材料として適している限り、由来及び性状などは特に限定されず、任意のコラーゲンを使用することができる。一実施形態において、コラーゲンは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、又はプロナーゼ等）で可溶化し、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンであることが好ましい。このようなコラーゲンはアレルゲン性が低い。また、コラーゲンは、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型のコラーゲンであることが好ましい。一実施形態において、コラーゲンは、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの混合物であることが好ましい。コラーゲンの原料は、例えば、豚又は牛などの皮膚、骨、若しくは腱等、並びに魚のうろこなどを用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高い。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。
【００２４】
多孔質複合体がコラーゲンで形成される場合、リン酸カルシウムとコラーゲンの配合比は、所望する保形性、操作性、及び生体親和性等を考慮して適宜調整することができる。例えば、コラーゲン１重量部に対するリン酸カルシウムの配合比は、０．５〜３５重量部、好ましくは１〜２０重量部、より好ましくは２〜１０重量部である。コラーゲン１重量部に対してリン酸カルシウムが０．５重量部未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、３５重量部を超えると保形性が低下するおそれがある。ここで、リン酸カルシウムはＯＣＰであることが好ましい。
【００２５】
一実施形態において、多孔質複合体は３〜９０μｍの細孔径を有することが好ましい。細孔径が９０μｍを超える場合、多孔質複合体の強度が低下する傾向がある。一方、細孔径が３μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。多孔質複合体の細孔径は、より好ましくは５〜４０μｍであり、更に好ましくは７〜３６μｍである。
【００２６】
多孔質複合体の細孔径は水銀ポロシメーター（Ｍｅｒｃｕｒｙ  ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）による細孔分布測定を用いて測定される。具体的には以下の方法により測定される。
（細孔径測定）
前処理として、サンプル（多孔質複合体）を１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、下記の測定装置を用いた水銀圧入法により、下記の条件で細孔径（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）０．００１８〜２００μｍの細孔分布を求める。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力：０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０−５Ｎで換算）
【００２７】
上記水銀圧入法で得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔径（直径）の値が本書における細孔径（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）の値である。
【００２８】
一実施形態において、多孔質複合体は、上記水銀圧入法により測定された細孔分布において、２００μｍ以下の細孔全体に占める７１〜２００μｍの大きさの細孔の割合が８％以下であることが好ましく、３〜８％であることがより好ましい。細孔割合は水銀ポロシメーターにより測定された累積細孔容積および全細孔容積を用いて下式で表される。
細孔割合（％）＝  累積細孔容積／全細孔容積×１００
【００２９】
多孔質複合体の細孔率（空隙率）は８０〜９８％であることが好ましく、より好ましくは８５〜９５％であり、更に好ましくは８５〜９０％である。細孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式により求められる。
細孔率（％）＝全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×１００
【００３０】
多孔質複合体の形状は、それを充填する患部の形状及び大きさ等を考慮して任意に設定することができる。例えば、多孔質複合体は、直方体（ブロック体）、立方体、円筒体、タブレット状、又は顆粒であることが好ましい。一実施形態において、直方体である多孔質複合体の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上であることが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍであることが好ましい。円筒状である場合の大きさは、直径が５〜５０ｍｍであることが好ましく、高さは１〜５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。顆粒状の多孔質複合体の直径は、ふるい分け試験法により求められる。
【００３１】
多孔質複合体を移植する方法（ｍａｎｎｅｒ）は、任意であり特に制限されない。例えば、多孔質複合体の移植は、適当なサイズの多孔質複合体を骨再生又は骨増生が必要な部位に補填することより行われ得る。骨再生又は骨増生が必要な部位（例えば、骨欠損部）に十分な血液もしくは体液が存在する場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。当該部位に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。
【００３２】
ＰＴＨを投与する方法（ｍａｎｎｅｒ）は、任意であり特に制限されない。例えば、ＰＴＨは、任意の方法で局所投与又は全身投与される。一実施形態において、ＰＴＨは、骨再生又は骨増生が必要な部位（例えば、骨欠損部）に局所投与されることが好ましい。局所投与は、例えば、ＰＴＨを含む溶液を該部位に滴下することによって行うことができる。多孔質複合体を移植した後にＰＴＨを局所投与する場合、例えば、多孔質複合体を骨再生又は骨増生が必要な部位に埋入し、該多孔質複合体上（又はその中）にＰＴＨを投与することができる。該部位へのＰＴＨの局所投与は、例えば、骨再生又は骨増生手術中に該部位を外科的に露出させ、そこにＰＴＨを含む溶液を滴下することにより行うことができる。また、該部位へのＰＴＨの局所投与は、注射針を該部位まで挿入し、ＰＴＨを含む溶液を注入することによって行うこともできる。一実施形態において、ＰＴＨは、注射によって全身投与される。例えば、ＰＴＨは、皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与される。一実施形態において、ＰＴＨは、皮下注射によって全身投与されることが好ましい。
【００３３】
投与するＰＴＨの量は、任意であり特に制限されない。例えば、ＰＴＨの量は、骨欠損の程度、被検体の体重、及び年齢等に応じて適宜設定することができる。ＰＴＨを含む液体を骨再生又は骨増生が必要な部位に滴下する場合、当該液体におけるＰＴＨの濃度は、例えば、０．０１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌに調整することができる。また、当該部位に滴下するＰＴＨ含有溶液の量は、例えば、０．０１ｍｌ〜５００ｍｌを選択することができる。ＰＴＨ含有溶液は、例えば、市販されるＰＴＨ（例えば、テリパラチド）を生理食塩水に添加することによって調製することができる。ＰＴＨを注射によって全身投与する場合、その投与量は、例えば、０．０１μｇ／ｋｇ／日〜５０μｇ／ｋｇ／日に設定することができる。ＰＴＨの投与は、単回投与でも複数回投与でも良い。一実施形態において、ＰＴＨを全身投与する場合、ＰＴＡを一定期間に複数回投与することが好ましい。例えば、投与頻度は、例えば、１回／日、１回／週、２回〜６回／週、又は１回〜３回／月とすることができる。投与期間は、例えば、１週間、１カ月、２〜１１ヶ月、１年、１年半、又は２〜５年とすることができる。
【００３４】
骨再生が必要な部位は、例えば、骨欠損部位を含む。骨欠損は種々に要因により生じ得る。要因としては、例えば、骨欠損は、骨折、外傷後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、骨の外科的手術、先天性骨欠損、感染後の骨欠損（ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）、骨の化学療法処置（ｂｏｎｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、同種移植片の埋め込み（ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、骨の放射線療法処置（ｂｏｎｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関連する骨欠損疾患（ｂｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、及び歯周病等を挙げることができる。骨の外科的手術としては、例えば、脊椎固定術、四肢の関節固定術などを含む関節固定、および外傷後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴後の関節の手術（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｊｏｉｎｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、整形後の骨の手術（ｐｏｓｔ−ｐｌａｓｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、及び歯科手術（ｄｅｎｔａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）等を挙げることができる。一実施形態における骨欠損部位としては、例えば、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、及び抜歯窩等を挙げることができる。
【００３５】
骨増生が必要な部位は、特に制限されず、例えば、ｓｉｎｕｓ  ｌｉｆｔ，  ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ，  及びｒｉｄｇｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎから成る群より選択される一種以上の処置を必要とする部位である。一実施形態において、骨増生が必要な部位は、骨粗鬆症、変形性脊椎症、慢性関節リウマチ、悪性腫瘍、外傷等に伴う骨塩量の減少病態を示す部位であり得る。他の実施形態において、骨増生が必要な部位は、構音障害咀嚼傷害、及び／又は審美障害を伴う口腔外科的病態が挙げられる。
【００３６】
被検体は、特に制限されないが、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、及びラット等の動物を挙げることができる。一実施形態において、好ましい被検体はヒトである。
【００３７】
一実施形態において、上記多孔質複合体は、リン酸カルシウム及びＰＴＨを含むことが好ましい。換言すれば、一実施形態において、ＰＴＨは、多孔質複合体に取り込まれた状態で投与されることが好ましい。ＰＴＨを含む多孔質複合体は任意の手法で作製することができる。例えば、ＰＴＨを含まない多孔質複合体を準備し、それにＰＴＨ含有溶液を滴下するか、ＰＴＨを含まない多孔質複合体をＰＴＨ含有溶液に浸漬することによって、ＰＴＨ含有多孔質複合体を得ることができる。このようなＰＴＨ含有多孔質複合体は、多孔質複合体を移植する直前に準備してもよく、予め作成し保存して使用まで保存しておいても良い。一実施形態において、リン酸カルシウム及びＰＴＨを含む多孔質複合体のリン酸カルシウムは、ＯＣＰであることが好ましい。
【００３８】
一実施形態において、リン酸カルシウム及びＰＴＨを含む多孔質複合体は、水分含量が５重量％以下、４重量％以下、３．５重量％以下、又は３重量％以下であることが好ましい。ここで、水分含量が５重量％以下であるとは、１ｇのＰＴＨを含む多孔質複合体を２．０ｋＰａ以下の減圧下、１０５℃で３時間乾燥した際の減量が５０ｍｇ以下であること（即ち、乾燥原料試験法で測定した値）を意味する。このように水分含量が低いＰＴＨ含有多孔質複合体は、取り扱い性及び保存安定性の観点から好ましい。
【００３９】
水分含量が５重量％以下であるリン酸カルシウム及びＰＴＨを含む多孔質複合体は任意の手法で得ることができる。例えば、リン酸カルシウム含有多孔質複合体にＰＴＨ含有溶液を含浸させ、それを乾燥することによって、水分含量が低い多孔質複合体を得ることができる。乾燥法は種々公知の方法を用いることができ、例えば、定温乾燥、赤外線乾燥、送風乾燥、温風乾燥、減圧乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、スピン乾燥、及び／又は凍結乾燥が用いられる。一実施形態において、乾燥法は凍結乾燥であることが好ましい。凍結乾燥の条件は特に制限されず、サンプルの大きさや形状等に応じて適宜設定することができる。例えば、−２０〜―９０℃で多孔質複合体を凍結し、その後凍結乾燥機により２５〜−４０℃にて１２〜７２時間乾燥させることができる。凍結乾燥時の温度は定温保持のほかに、段階的に昇降させることができる。また、凍結乾燥後に電子線を照射して多孔質複合体を滅菌することが好ましい。
【００４０】
多孔質複合体が含有するＰＴＨの量は任意であり、特に制限されない。例えば、多孔質複合体は、０．１ｎｇ／ｇ〜２５ｍｇ／ｇのＰＴＨを含有することができ、好ましくは１ｎｇ／ｇ〜１ｍｇ／ｇであり、より好ましくは５ｎｇ／ｇ〜１００μｇ／ｇである。
【００４１】
一実施形態において、上記多孔質複合体及びＰＴＨを含む骨再生又は骨増生のためのキットが提供される。キットは、上記の任意の多孔質複合体を含み得る。また、キットは、多孔質複合体及びＰＴＨの他に任意の成分、試薬、及び説明書等を含み得る。
【００４２】
多孔質複合体は、任意の方法で製造することができる。例えば、多孔質複合体は、下記の（ａ）〜（ｃ）の方法で製造できる。下記の方法ではリン酸カルシウムとしてＯＣＰを用いて説明するが、他のリン酸カルシウムを用いる場合も同様にして多孔質複合体を得ることができる。リン酸カルシウムとしてβ−ＴＣＰを用いる場合は、（ａ）又は（ｂ）の方法が好ましい。
【００４３】
（ａ）ＯＣＰとコラーゲンとを混合して複合化する方法
濃度及びｐＨ等がゲル化し得る範囲に調整されたコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、十分に混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製する。次いで、この混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。得られた複合体は、熱脱水架橋処理を施し、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌することが好ましい。
【００４４】
（ｂ）ＯＣＰ懸濁液を混合して複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨ５．５〜７．５に調整する。そこにコラーゲンがゲル化する前にＯＣＰを添加して、コラーゲンとＯＣＰの懸濁液を調製する。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持した状態で型に流し込み、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合体を得ることができる。その後、上記（ａ）と同様に凍結乾燥および滅菌処理を施すことが好ましい。
【００４５】
（ｃ）ＯＣＰをコラーゲンに析出させて複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨを５．５〜７．５に調整する。そこに、コラーゲンがゲル化する前に、カルシウム溶液およびリン酸溶液を添加してコラーゲン上にＯＣＰを析出させる。その後、析出したＯＣＰをｐＨを中性から弱アルカリ性に保持し、型に流し込んで、形状を付与する。適当な温度（例えば３７℃）でゲル化した後、水洗浄を繰り返して緩衝液などの塩を除去して複合体を得ることができる。その後、上記（ａ）と同様に凍結乾燥および滅菌処理を施すことが好ましい。
【００４６】
なお、ＯＣＰの析出は、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−の濃度、並びにｐＨなどにより決まる過飽和度（イオン積／溶解度積）に基づく。よって、ＯＣＰに関して過飽和となる条件でＣａ２＋溶液およびＰＯ４３−溶液を、ｐＨを調節したコラーゲン溶液に注加してＯＣＰを析出させることができる。ＯＣＰは、コラーゲン間隙に自発的に析出するか、又はコラーゲン線維の表面を核として析出する。
【００４７】
一実施形態において、多孔質複合体を得る方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。「ゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結し」とは、例えば、ゲル、ゾルまたは液体が収容された容器を密閉した後に該容器を液体冷媒に浸漬して、ゲル、ゾルまたは液体を凍結させる態様も含む。
【００４８】
液体冷媒は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、及び液体窒素等が挙げられる。該液体冷媒の温度は、好ましくは−２０℃以下であり、より好ましくは−４０℃以下であり、さらに好ましくは−８０℃以下である。ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬することによって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の細孔径を小さくすることができると考えられる。
【００４９】
一実施形態において、多孔質複合体は、熱処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。
【００５０】
熱処理の温度は、好ましくは５０〜２００℃、より好ましくは６０〜１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０〜３０００Ｐａ、より好ましくは０〜３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは０．１〜１０日、より好ましくは０．５〜５日である。
【００５１】
ＨＡＰを用いた多孔質複合体は、例えば、次の方法により得ることができる。まずリン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液又は懸濁液を調製する。コラーゲン／リン酸塩水溶液は、コラーゲンと、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム又はリン酸二水素カリウムのリン酸塩を用いて調製する。カルシウム塩水溶液又は懸濁液は炭酸カルシウム、酢酸カルシウム又は水酸化カルシウム等を用いて調製する。添加すべきカルシウム塩水溶液又は懸濁液の量とほぼ同量の水を予め反応容器に入れ、４０℃程度に加熱しておく。そこに、コラーゲン／リン酸塩水溶液とカルシウム塩水溶液又は懸濁液とを室温で同時に滴下することにより、繊維状ＨＡＰ／コラーゲン複合体を生成する。滴下終了後、スラリー状となった水とＨＡＰ／コラーゲン複合体との混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥は、−１０℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。その後架橋処理を行い、ＨＡＰとコラーゲンを含む多孔質複合体を得ることができる。
【００５２】
一実施形態において、多孔質複合体は、上述する各成分以外の任意の成分を含み得る。そのような配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体等）を挙げることができる。
【００５３】
上述の多孔質複合体は、骨再生材料として用いることができる。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、並びに、開頭、及び開胸術後の骨欠損修復などに有用である。例えば、歯科口腔外科領域においては、歯周病、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、抜歯窩等により生じた骨欠損に対し、多孔質複合体からなる骨再生材料を補填することにより、数週間から数ヶ月には優れた骨再生効果が確認できる。整形外科領域においては、例えば骨腫瘍切除後の骨欠損、骨折等外傷により生じた骨欠損に対し、本骨再生材料を骨欠損部に補填し、骨再生を促進することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５５】
製造例１：ＯＣＰの調製
ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡ  Ｚ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、１液を２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。
【００５６】
上記の混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。それを蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。このろ過及び洗浄の工程をさらに３回繰り返した。洗浄した沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００〜５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行い、ＯＣＰを得た。
【００５７】
製造例２：ＯＣＰ／Ｃｏｌ多孔質複合体の調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。このとき、コラーゲン懸濁液のイオン強度は約０．０１であった。コラーゲン懸濁液に製造例１で得たＯＣＰ（粒径３００〜５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加え、室温で撹拌してＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。
【００５８】
ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄した後、内容物を薬さじで約２分間混合し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径９．０ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。
【００５９】
密閉した状態のプラスチック容器をその容積に対して大過剰の−８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。得られたものをメスで厚さ１．０ｍｍ（試験例１で使用）又は１．５ｍｍ（試験例２、試験例４及び製造例７で使用）のディスク状にカットした。これらを電子線を照射し、滅菌し、ＯＣＰ／Ｃｏｌ多孔質複合体（ＯＣＰ／Ｃｏｌ）を得た。
【００６０】
製造例３：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ多孔質複合体の調製
β−ＴＣＰ（オスフェリオン：オリンパステルモバイオマテリアル社）を３００〜５００μｍ径に整粒したものをＯＣＰに代えて使用した以外は、製造例２と同様にして、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ多孔質複合体（β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ）を得た。
【００６１】
製造例４：滴下用テリパラチドの調製
５６．５μｇのテリボン皮下注用（旭化成ファーマ社製）に生理食塩水１．１３ｍｌを加え、５０μｇ／ｍｌのテリパラチド（ＰＴＨ）溶解液を得た。これをＰＣＲチューブ（０．５ｍｌ）に２０μｌ採取し、生理食塩水８０μｌを加え１．０μｇ／０．１ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ）のテリパラチド溶解液を得た。また、この溶液を生理食塩水で更に１０倍希釈し、０．１μｇ／０．１ｍｌ（１．０μｇ／ｍｌ）のテリパラチド溶解液を得た。これらを使用まで−２０℃の冷凍庫で保存した。
【００６２】
製造例５：皮下注用テリパラチドの調製
５６．５μｇのテリボン皮下注用（旭化成ファーマ社製）に生理食塩水１．１３ｍｌを加え、５０μｇ／ｍｌのテリパラチド溶解液を得た。これをＰＣＲチューブ（０．５ｍｌ）に７０μｌ採取し、生理食塩水２８０μｌを加え３．５μｇ／０．３５ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ）のテリパラチド溶解液を得た。これを使用まで−２０℃の冷凍庫に保存した。
【００６３】
製造例６：ＯＣＰ／ＦＧＦ‐２複合体（ＯＣＰ／ＦＧＦ−２）作製
凍結乾燥した遺伝子組み換えヒト線維芽細胞成長因子２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２：  以下ＦＧＦ−２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を０．０１Ｍ  リン酸緩衝液  （０．１％以上のｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含む）に溶解した。乾熱滅菌したＯＣＰ顆粒（３００−５００  μｍ径）１５  ｍｇに対して、ＦＧＦ−２を３つの異なる濃度（１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ）で添加し、−２０℃で２０分間浸漬後、凍結乾燥し、ＯＣＰ／ＦＧＦ−２顆粒を作製した。対照試料としてＦＧＦ−２を添加しないＯＣＰ顆粒を用いた。
【００６４】
製造例７：ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ多孔質複合体の調製
５６．５μｇのテリボン皮下注用（旭化成ファーマ社製）に注射用水１．０ｍＬを加え、５６．５μｇ／ｍＬのテリパラチド（ＰＴＨ）溶解液を得た。４８穴プレートに製造例２で作製したＯＣＰ／Ｃｏｌを１つずつ並べ、１穴につき１７．７μＬのＰＴＨ溶解液を添加した。これらを−７８℃のディープフリーザーにて凍結した後に凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、２４時間）した。最後に電子線を照射することで滅菌し、ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  １．０μｇを含む複合体（ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（乾燥））を得た。また、５６．５μｇ／ｍＬのＰＴＨ溶解液を注射用水で１０倍に希釈した溶液を用いて、前述と同様の操作をすることで、ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．１μｇを含む複合体（ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（乾燥））を得た。また、ＰＴＨ溶解液の希釈倍率を変更することにより、ＯＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨを０．０１μｇ又は０．００１μｇ含む「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．０１（乾燥）」及び「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．００１（乾燥）」を調製した。
【００６５】
製造例８：β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ多孔質複合体の調製
β−ＴＣＰ／ＣｏｌをＯＣＰ／Ｃｏｌに代えて使用した以外は、製造例７と同様にして、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  １．０μｇを含む複合体（β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（乾燥））およびβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ  １枚当たりにＰＴＨ  ０．１μｇを含む複合体（β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（乾燥））を得た。
【００６６】
試験例１：ＯＣＰ又はβ−ＴＣＰ＋テリパラチド（皮下注）
雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（１２週齢）を腹腔内麻酔し、頭蓋冠部に皮膚切開、及び骨膜切開を加え、頭蓋冠を明示し、自然治癒の望めない約９ｍｍ径の規格化した全層の骨欠損を作製した。そこに、製造例２で作製したディスク状のＯＣＰ／Ｃｏｌを１枚又は製造例３で作製したディスク状のβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌを１枚を埋入した。対照として骨欠損のみを作製し、試料を埋入しないラット（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ群）を用意した。試料埋入後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。ＯＣＰ／Ｃｏｌ群、β‐ＴＣＰ／Ｃｏｌ群、及び未処置群をそれぞれテリパラチド皮下注射群（皮下注射群）とテリパラチド皮下注射を行わない群（非注射群）に分け、計６群に振り分けた。テリパラチド皮下注射群のラットには、手術直後及びその後毎日１０μｇ／ｋｇの割合で製造例５で調製したテリパラチドを皮下注射した。皮下注射は、解凍したテリパラチド溶液を１ｍｌシリンジ（２７Ｇ注射針）に吸い上げ、背部皮膚をヒビテン希釈液にて消毒後、相当量のテリパラチド溶液を背部皮下に注射して行った。術後の観察期間は各群８週とし、各期間５匹のラットを用いた。
【００６７】
術後４週、及び８週後に実験動物用Ｘ線ＣＴ装置（Ｌａｔｈｅｔａ  ＬＣＴ−２００；日立アロカメディカル社製）を低Ｘ線管電圧で用い、生存状態で断層撮影を行い、骨欠損部における新生骨形成状況を精査した。同様に術後８週後のＣＴ撮影後、ペントバルビタ?ル過量麻酔にて屠殺し頭蓋冠および周囲組織を採取し、０．１Ｍリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ  ７．４）に浸漬固定した。摘出標本は軟Ｘ線写真装置（ＣＭＢＷ−２；ソフテックス社製）を用いて撮影（２０ＫＶ，５ｍＡ）後、１０％  ＥＤＴＡで脱灰しパラフィン標本作成後、前頭断で６μｍ厚の組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色で組織学的に検索を行った。さらに各標本の欠損中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、作成された欠損内における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）を組織定量学的に検討した。各群のｎ−Ｂｏｎｅ％の平均値、標準偏差を用いて分散分析等を行い、有意差検定を行った。有意水準は５％に設定した。
【００６８】
結果を図１〜５に示す。図１〜４において、ＰＴＨ（＋）とはテリパラチドを皮下投与したことを示し、ＰＴＨ（−）とは、テリパラチドを非投与群であることを示す。図１は、摘出した骨欠損部のＸ線写真である。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群では欠損全域に塊状の不透過像を認め、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群に比べ欠損内は広範囲に不透過像で占められていた。β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群も同様にβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群に比べ欠損内は広範囲に不透過像で占められていた。一方、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（＋）群およびＵｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下（−）群は欠損内の不透過像は同程度に乏しかった。
【００６９】
図２は、頭蓋冠および周囲組織の生存状態で撮影したＸ線写真である。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群はＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群に比べ欠損内の広い領域が既存骨と同程度の不透過像によって占められている。β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋群もβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群に比べ、欠損内の広い範囲で既存骨と同程度の不透過像で占められている。既存骨より不透過度の高いβ−ＴＣＰは欠損内に散在して認められ、不透過像に囲まれているものや、孤立しているものが見られる。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下（＋）群およびＵｎｔｒｅａｔｅｄ群／皮下ＰＴＨ（−）は欠損辺縁（▼）から伸びる不透過像を認めるが、既存骨に比べてそれらの厚さは薄い。
【００７０】
図３及び図４は、染色した病理組織標本である。病理組織標本は上方が皮膚側、下方が脳硬膜側である。低倍率（Ｘ１．２５）画像である図３ではＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群の欠損内は赤色に染色された新生骨によって大部分が満たされ、厚みも保たれている。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群の欠損内は新生骨と移植体が混在している。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（＋）群、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（−）群では欠損内は欠損辺縁（▼）から伸び出した薄い骨組織とそれを取り巻く結合組織からなっている。高倍率（Ｘ１０）である図４ではＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群およびＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群は埋入されたＯＣＰ／Ｃｏｌと一体化した新生骨はモザイク状を呈し、旺盛な骨改造を示すとともにそれらへの血管侵入も認められる。また、埋入されたＯＣＰ顆粒は小さくなってきている。β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群およびβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群はβ−ＴＣＰ顆粒の周囲を新生骨が囲み、一部は新生骨に包含されている。但し、残存しているβ−ＴＣＰ顆粒の大きさはＯＣＰ顆粒に比べて大きいように思われる。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（＋）群およびＵｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（−）群は欠損辺縁部から薄い新生骨が伸び出してきている。
【００７１】
上記各標本の欠損中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、欠損内における新生骨の割合  （ｎ−Ｂｏｎｅ％）を組織定量学的に求めた（図５）。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群４９．３  ±  ８．４、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群３８．８  ±  １４．７、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群３９．０±１７．６、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群４１．０±１１．９、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（＋）群３１．１  ±  １０．２、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（−）群３１．６±１１．９となり、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群はＯＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群に比べて高値を示した。一方、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（＋）群、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（＋）群はそれぞれβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／皮下ＰＴＨ（−）群、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ／皮下ＰＴＨ（−）群と同程度の新生骨の割合を示した。
【００７２】
以上の通り、図１〜５の結果から、テリパラチド単独では新生骨形成は見られなかったものの、テリパラチドとＯＣＰ又はβ−ＴＣＰを組み合わせることにより、ＯＣＰ又はβ−ＴＣＰ単独で処置した場合と比較して新生骨形成が有意に促進されることが確認された。特に、テリパラチドとＯＣＰを組み合わせた場合のＯＣＰ単独との差は顕著であった。
【００７３】
試験例２：ＯＣＰ又はβ−ＴＣＰ＋テリパラチド（滴下）
雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（１２週齢）を腹腔内麻酔後、頭蓋冠部に皮膚切開、骨膜切開を加え、頭蓋冠を明示し、自然治癒の望めない約９ｍｍ径の規格化した全層の骨欠損を作製した。そこに、製造例２で作製したディスク状のＯＣＰ／Ｃｏｌを１枚又は製造例３で作製したディスク状のβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌを１枚を埋入した。その際、ＯＣＰ／Ｃｏｌには製造例４で調製したテリパラチド溶液（１．０μｇ／０．１ｍｌ又は０．１μｇ／０．１ｍｌ）を試料１枚あたり０．１ｍｌ滴下し、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌには同テリパラチド溶液（１．０μｇ／０．１ｍｌ）を試料１枚あたり０．１ｍｌ滴下した。対照としてＯＣＰ／Ｃｏｌ又はβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌにテリパラチド溶液を滴下しない群を用意した。試料埋入後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。術後の観察期間は各群１２週とし、各期間６匹のラットを用いた。術後４週及び１２週後に試験例１と同様の解析を行った。
【００７４】
結果を図６〜９に示す。図６〜９において、ＰＴＨ  １．０μｇ及びＰＴＨ  ０．１μｇとはそれぞれテリパラチド溶液を試料１枚あたり１．０μｇ及び０．１μｇ滴下したことを示し（滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群及び滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群）、ＰＴＨ（０）とはテリパラチド溶液を滴下しなかったことを示す（ＰＴＨ（−）群）。図６は、摘出した骨欠損部のＸ線写真である。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群、及びＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）では欠損全域が板状の不透過像で占められている。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群は欠損の大部分が塊状の不透過像で占められ、一部透過像も混在していた。これらの結果から、ＰＴＨを滴下することにより、ＯＣＰによる新生骨形成が有意に促進されることが確認された。β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群、及びβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群でも欠損全域が板状の不透過像で占められていることが確認された。
【００７５】
図７は、頭蓋冠および周囲組織の生存状態で撮影したＸ線写真である。上段は、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群、及びＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群の結果である。下段は、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群、β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群、及びβ−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群の結果である。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群、及びＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群では、埋入後４週から欠損の大部分に不透過像を認め、それらは経時的に不透過度を増大させ、欠損が修復されていることが確認された。一方、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群（ＰＴＨ非投与群）では埋入後４週から欠損全域が小さな散在性の不透過像の集合体で占められ、それらは経時的に不透過度を増大させるとともに融合し、欠損内に占める不透過像を増大させていった。これは、ＰＴＨ投与群と比較して、ＰＴＨ非投与群では欠損内の不透過性の亢進が遅いことを意味する。
【００７６】
図８は、染色した病理組織標本（埋入後１２週）である。病理組織標本は上方が皮膚側であり、下方が脳硬膜側である。低倍率（Ｘ１．２５）画像（上段）のＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群及びＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群では、欠損内は赤色に染色された新生骨によってほとんどが満たされ、新生骨の厚みは既存骨と同程度に保たれ、欠損辺縁と新生骨との継ぎ目は区別できない。高倍率（Ｘ２０）画像（下段）のＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群は欠損部のほとんどは旺盛な骨改造を示す新生骨で占められ、一部は皮質骨化していた。また埋入されたＯＣＰ顆粒はほとんど目立たなくなっている。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群では欠損部のほとんどは旺盛な骨改造を示し、埋入されたＯＣＰ／Ｃｏｌと一体化した新生骨で占められ、一部は皮質骨化していた。また埋入されたＯＣＰ顆粒はかなり小さくなっている。ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群はＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ群と比べ、新生骨量は少ない。埋入されたＯＣＰ／Ｃｏｌと一体化した新生骨はモザイク状を呈しており、埋入されたＯＣＰ顆粒は小さくなっている。
【００７７】
図９は、組織形態計測結果（新生骨の割合）を示す。欠損内に占める新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）はＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（１．０μｇ）群：５３．６  ±  ４．３、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（０．１μｇ）群：５２．２  ±  ７．４、ＯＣＰ／Ｃｏｌ／滴下ＰＴＨ（−）群：４０．１  ±  ８．４となり、ＰＴＨとＯＣＰを併用することにより、ＯＣＰ単独と比較して新生骨の割合が有意に高くなることが確認された（ｐ  ＝  ０．００８）。
【００７８】
以上のとおり、図６〜９に示される結果から、ＰＴＨとＯＣＰを併用することにより、ＯＣＰによる新生骨形成が有意に促進されることが確認された。試験例１の皮下注群（１０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ：８週）では各個体（体重２５０〜３５０ｇ程度）それぞれに１５０μｇ超のＰＴＨを投与したが、それらに比べて数百〜数千分の一の投与量でそれらを上回る骨再生効果を実現可能であることが確認された。
【００７９】
試験例３：ＯＣＰ＋ＦＧＦ−２
雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（１２週齢）を腹腔内麻酔後、ラット頭蓋冠部に皮膚切開及び骨膜切開を加え、頭蓋冠を明示し、自然治癒の望めない約９ｍｍ径の規格化した全層の骨欠損を作製した。そこに製造例６で得たＯＣＰ／ＦＧＦ−２顆粒（１５ｍｇ）又はＯＣＰ顆粒（１５ｍｇ）を埋入した。試料埋入後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。各群４〜５匹のラットで構成し、術後４週で評価した。また、ＯＣＰ／ＦＧＦ−２  １００ｎｇ投与群及びＯＣＰ投与群（各群５匹）については、術後８週で骨再生能を検討した。
【００８０】
観察期間経過後、ペントバルビタ?ル過量麻酔にて屠殺し頭蓋冠及び周囲組織を採取し、０．１Ｍリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）に浸漬固定した。摘出標本は軟Ｘ線写真装置（ＣＭＢＷ−２；ソフテックス社製）を用いて撮影（２０ＫＶ，  ５ｍＡ）後、１０％ＥＤＴＡで脱灰しパラフィン標本作成後、前頭断で６μｍ厚の組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色で組織学的に検索を行った。さらに各標本の欠損中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、作成された欠損内における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）を組織定量学的に検討した。各群のｎ−Ｂｏｎｅ％の平均値、標準偏差を用いて分散分析等を行い、有意差検定を行った。有意水準は５％に設定した。
【００８１】
得られた軟Ｘ線写真（図１０）では欠損内に埋入されたＯＣＰ／ＦＧＦ−２又はＯＣＰに対応した顆粒状の不透過像を認め、組織学的にはＯＣＰ／ＦＧＦ−２投与群及びＯＣＰ投与群ともに欠損辺縁および埋入されたＯＣＰ／ＦＧＦ−２又はＯＣＰを核とした骨形成を認めた。組織定量学的には術後４週における欠損内における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％：平均値  ±標準偏差）はＯＣＰ／ＦＧＦ−２  １０ｎｇ投与群で１４．５±６．９％  、ＯＣＰ／ＦＧＦ−２  １００ｎｇ投与群で１６．７±１９．３％、ＯＣＰ／ＦＧＦ−２  １μｇ投与群で９．７±３．９％となり、各群間における有意差を認めなかった。また術後８週における欠損内における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％：平均値±標準偏差）はＯＣＰ／ＦＧＦ−２  １００ｎｇ投与群で１２．８±５．８％、ＯＣＰ投与群で１０．４±１０．４％となり、両群間における有意差を認めなかった。このような結果から、ＯＣＰとＦＧＦ−２を組み合わせてもＯＣＰによる新生骨形成の促進作用は得られないことが確認された。
【００８２】
試験例４：ＯＣＰ又はβ−ＴＣＰ＋テリパラチド（凍結乾燥多孔質複合体）
雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（１２週齢）を用い、以下の６群（各群５匹）に分けた。
【００８３】
【表１】
2017186297.tif 000002
【００８４】
「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（乾燥）」及び「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（乾燥）」は製造例７で作製したものである。「β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  １．０（乾燥）」及び「β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．１（乾燥）」は製造例８で作製したものである。「ＯＣＰ／Ｃｏｌ」は、製造例２で作製したものである。「β−ＴＣＰ／Ｃｏｌ」は製造例３で作製したものである。
【００８５】
腹腔内麻酔後、ラット頭蓋冠部に皮膚切開、骨膜切開を加え、頭蓋冠を明示し、自然治癒の望めない約９ｍｍ径の規格化した全層の骨欠損を作製し、表１に示すいずれかの埋入物を同欠損部に埋入した。その後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。術後の観察期間は各群１２週とした。
【００８６】
術後４週および１２週後に実験動物用Ｘ線ＣＴ装置（Ｌａｔｈｅｔａ  ＬＣＴ−２００；日立アロカメディカル社製）を低Ｘ線管電圧で用い、生存状態で断層撮影を行い、骨欠損部における新生骨形成状況を精査した。同様に術後１２週後にＣＴ撮影を行い、ペントバルビタ?ル過量麻酔にて屠殺し頭蓋冠および周囲組織を採取し、０．１Ｍリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）に浸漬固定した。摘出標本は軟Ｘ線写真装置（ＣＭＢＷ−２；ソフテックス社製）を用いて撮影（２０ＫＶ，５ｍＡ）後、１０％ＥＤＴＡで脱灰しパラフィン標本作成後、前頭断で６μｍ厚の組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色で組織学的に検索を行った。さらに各標本の欠損中央相当部（複数個）の組織切片を用いて、作成された欠損内における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）を組織定量学的に検討した。各群のｎ−Ｂｏｎｅ％の平均値、標準偏差を用いて統計学的解析を行い、有意差検定を行った。有意水準は５％に設定した。
【００８７】
術後１２週後に撮影した摘出標本の軟Ｘ線写真を図１１に示す。Ａ群及びＢ群では欠損全域が比較的均一で板状の不透過像で占められていた。Ｃ群は欠損の大部分が塊状の不透過像で占められ、一部透過像も混在していた。Ｄ群では欠損内に顆粒状の不透過像と塊状の不透過像が混在し、一部透過像も混在していた。Ｅ群では顆粒状の不透過像が優位であり、Ｆ群では顆粒状の不透過像と塊状の不透過像が混在していた。これらの結果は、ＰＴＨ及びＯＣＰ含有多孔質複合体が、ＰＴＨ非含有ＯＣＰ含有多孔質複合体、ＰＴＨ及びβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体、並びにＰＴＨ非含有β−ＴＣＰ含有多孔質複合体に比べて、より骨再生を促進することを示唆する。
【００８８】
術後４週後及び１２週後に断層撮影したＣＴ写真を図１２に示す。Ａ群及びＢ群では術後４週から欠損の大部分に母床骨と連続した比較的均一で板状の不透過像を認め、それらは術後１２週ではさらに不透過度を増し、欠損の大部分を覆った。Ｃ群では埋入４週から欠損全域が小さな散在性の不透過像の集合体で占められ、それらは埋入１２週では不透過度を増大させるとともに融合し、欠損内に占める不透過像を増大させた。Ｄ群では、術後４週で顆粒状の不透過像が優位であったが、術後１２週では母床骨と連続した板状の不透過像も混在するようになった。しかし、それらの不透過像は未だ欠損中央部には遠い所に留まっていた。Ｅ群では術後４週及び１２週においても顆粒状の不透過像が優位であった。Ｆ群では術後４週では顆粒状の不透過像と塊状の不透過像が混在しており、それらは術後１２週では不透過度を増してしていた。これらの結果も、ＰＴＨ及びＯＣＰ含有多孔質複合体が、ＰＴＨ非含有ＯＣＰ含有多孔質複合体、ＰＴＨ及びβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体、並びにＰＴＨ非含有β−ＴＣＰ含有多孔質複合体に比べて、骨再生促進作用に優れていることを示唆する。
【００８９】
染色した病理組織標本を図１３に示す。上方が皮膚側であり、下方が脳硬膜側である。Ａ群及びＢ群では、欠損内は赤色に染色された新生骨によってほとんどが満たされ、新生骨の厚みは既存骨と同程度に保たれ、欠損辺縁と新生骨との継ぎ目は区別できない。また、一部は皮質骨化し、新生骨内には血管の侵入や骨髄形成も認められた。Ｃ群も欠損内の多くの部分が新生骨で満たされている。Ａ〜Ｃ群全てにおいて脳硬膜側の骨再生がより旺盛であった。Ｄ群及びＦ群では欠損内は多くの新生骨によって占められているが、骨断端からの新生骨形成が目立ち、欠損中央部での新生骨形成は乏しかった。Ｅ群では欠損内の多くはβ−ＴＣＰ顆粒と線維性結合組織で占められ、目立った新生骨形成は見られなかった。Ｄ〜Ｆの全ての群において脳硬膜側の骨再生がより旺盛であった。
【００９０】
各群の新生骨の割合下記の表２に示す。表２に示されるとおり、Ａ群及びＢ群は、他の全ての群と比較して有意に新生骨の割合が高いことが確認された。
【００９１】
【表２】
2017186297.tif 000003
【００９２】
試験例５：ＯＣＰ＋テリパラチド（凍結乾燥多孔質複合体）
試験例４に準じて、雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（１２週齢）を以下の２群に分けた。
【００９３】
【表３】
2017186297.tif 000004
【００９４】
「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．０１（乾燥）」及び「ＯＣＰ／Ｃｏｌ／ＰＴＨ  ０．００１（乾燥）」は製造例７で作製したものである。
【００９５】
腹腔内麻酔後、ラット頭蓋冠部に皮膚切開、骨膜切開を加え、頭蓋冠を明示し、自然治癒の望めない約９ｍｍ径の規格化した全層の骨欠損を作製し、表１に示すいずれかの埋入物を同欠損部に埋入した。その後、骨膜および皮膚縫合を行い手術を終了した。術後の観察期間は各群１２週とした。
【００９６】
術後４週および１２週後に実験動物用Ｘ線ＣＴ装置（Ｌａｔｈｅｔａ  ＬＣＴ−２００；日立アロカメディカル社製）を低Ｘ線管電圧で用い、生存状態で断層撮影を行い、骨欠損部における新生骨形成状況を精査した。同様に術後１２週後にＣＴ撮影を行った。
【００９７】
術後４週後及び１２週後に断層撮影したＣＴ写真を図１４に示す。Ａ群及びＢ群では術後４週から欠損の大部分に母床骨と連続した比較的均一で板状の不透過像を認め、それらは術後１２週ではさらに不透過度を増し、欠損の大部分を覆った。これらの結果は、ＰＴＨ及びＯＣＰ含有多孔質複合体がＰＴＨの添加量が低濃度でも図７及び図１２に示すＰＴＨ非含有ＯＣＰ含有多孔質複合体に比べて、有意な骨再生が実現でき、それらが骨再生促進作用に優れていることを示唆する。
【００９８】
以上の結果から、ＰＴＨ及びＯＣＰ含有多孔質複合体が、ＰＴＨ非含有ＯＣＰ含有多孔質複合体、ＰＴＨ及びβ−ＴＣＰ含有多孔質複合体、並びにＰＴＨ非含有β−ＴＣＰ含有多孔質複合体に比べて、有意な骨再生が実現できることが確認された。
【図１】
2017186297.tif 000005
【図２】
2017186297.tif 000006
【図３】
2017186297.tif 000007
【図４】
2017186297.tif 000008
【図５】
2017186297.tif 000009
【図６】
2017186297.tif 000010
【図７】
2017186297.tif 000011
【図８】
2017186297.tif 000012
【図９】
2017186297.tif 000013
【図１０】
2017186297.tif 000014
【図１１】
2017186297.tif 000015
【図１２】
2017186297.tif 000016
【図１３】
2017186297.tif 000017
【図１４】
2017186297.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月24日(2016.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウム及びテリパラチドを含む多孔質複合体。 
【請求項２】
第８リン酸カルシウム、副甲状腺ホルモン、及びコラーゲンを含み、水分含量が５重量％以下である、多孔質複合体。
【請求項３】
水分含量が５重量％以下である、請求項１に記載の多孔質複合体。 
【請求項４】
更にコラーゲンを含む、請求項１又は３に記載の多孔質複合体。 
【請求項５】
副甲状腺ホルモンがテリパラチドである、請求項２に記載の多孔質複合体。
【請求項６】
骨再生用又は骨増生用である、請求項１〜５のいずれかに記載の多孔質複合体。