(57)【要約】【課題】強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が低下しにくい藻類及び藻類の製造方法を提供すること。【解決手段】hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類。isiA遺伝子が過剰発現する藻類。以下の（１）〜（３）から選択される１以上に該当する藻類。（１）hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異していること。（２）slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失していること。（３）isiA遺伝子が過剰発現すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。
【請求項２】
slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類。
【請求項３】
isiA遺伝子が過剰発現する藻類。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）から選択される１以上に該当する藻類。
（１）hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異していること。
（２）slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失していること。
（３）isiA遺伝子が過剰発現すること。
【請求項５】
hik26遺伝子が変異している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるhik26遺伝子に変異導入する藻類の製造方法。
【請求項６】
hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるhik26遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法。
【請求項７】
slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるslr1916遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法。
【請求項８】
isiA遺伝子が過剰発現する藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるisiA遺伝子を過剰発現させる藻類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は藻類及び藻類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微細藻類を用いて、バイオ燃料、化成品代替原料等の物質を生産することが行われている。微細藻類を屋外で培養する場合、微細藻類は、真夏の太陽光が照射される環境等、光強度が非常に強い環境にさらされる。この場合、微細藻類の増殖速度が低下し、結果として、物質の生産量が減少してしまう。
【０００３】
そこで、微細藻類に突然変異を導入することや、遺伝子組み換えにより、強光耐性株を獲得することが試みられている。そのような試みは非特許文献１に開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology,2002,p.3368-3376
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の強光耐性株は、弱い光が照射される環境において、増殖速度が親株と比較して低下してしまう。本発明は、こうした問題に鑑みてなされたものであり、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が低下しにくい藻類及び藻類の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一態様は、hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異している藻類である。この藻類は、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い。
【０００７】
本開示の一態様は、slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類である。この藻類は、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い。
【０００８】
本開示の一態様は、isiA遺伝子が過剰発現する藻類である。この藻類は、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い。
本開示の一態様は、以下の（１）〜（３）から選択される１以上に該当する藻類である。
【０００９】
（１）hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失又は変異していること。
（２）slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失していること。
（３）isiA遺伝子が過剰発現すること。
【００１０】
この藻類は、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い。
本開示の一態様は、hik26遺伝子が変異している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるhik26遺伝子に変異導入する藻類の製造方法である。この製造方法によれば、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い藻類を製造できる。
【００１１】
本開示の一態様は、hik26遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるhik26遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法である。この製造方法によれば、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い藻類を製造できる。
【００１２】
本開示の一態様は、slr1916遺伝子の少なくとも一部が欠失している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるslr1916遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法である。この製造方法によれば、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い藻類を製造できる。
【００１３】
本開示の一態様は、isiA遺伝子が過剰発現する藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株におけるisiA遺伝子を過剰発現させる藻類の製造方法である。この製造方法によれば、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が高い藻類を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】変異を含むhik26遺伝子の塩基配列を表す説明図である。
【図２】6803Δslr1916株についての強光耐性評価試験結果を表すグラフである。
【図３】6803Δhik26/hik26m株についての強光耐性評価試験結果を表すグラフである。
【図４】6803/OE-isiA株についての強光耐性評価試験結果を表すグラフである。
【図５】Synechocystis sp. PCC 6803株についての強光耐性評価試験結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態を説明する。本開示の藻類は、遺伝子を改変する前の状態において、hik26遺伝子、slr1916遺伝子、及びisiA遺伝子のうち、少なくとも１つを有する。藻類は、微細藻類であってもよいし、それ以外の藻類であってもよい。藻類の株は適宜選択できる。藻類の株の例として、シアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株が挙げられる。
【００１６】
本明細書におけるhik26遺伝子slr1916遺伝子、及びisiA遺伝子の名称は、CyanoBase及びKEGGで公開されたシアノバクテリアのゲノムデータに基づいて記載されている。KEGGは、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesの略称である。CyanoBase及びKEGGは周知のデータベースである。
【００１７】
本明細書において変異しているとは、遺伝子に変異が導入された状態を意味する。変異の導入は、例えば、Kunkel法、Gapped duplex法等により行うことができる。
遺伝子の欠失は、遺伝子工学の技術分野において公知の方法を用い、目的遺伝子を改変することで実現できる。欠失している部分は、目的遺伝子の全てでもよいし、一部でもよい。
【００１８】
本明細書における過剰発現とは、目的遺伝子の改変前に比較して、目的遺伝子の発現量が増加した状態を意味する。
過剰発現を実現させる方法としては、例えば、ゲノム上の目的遺伝子を、野生型に比較して目的遺伝子の発現を強化できる制御領域（以下では強制御領域とする）の制御下に配置する方法、強発現制御領域の制御下に配置された目的遺伝子を、細胞内のゲノム中又はプラスミド中に導入する方法、あるいは、複数の目的遺伝子を細胞内に発現可能に存在させる方法等が挙げられる。
【００１９】
上記の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。制御領域は、例えば、発現を制御する対象である遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域である。
【００２０】
上記の「制御領域の制御下に配置する」とは、制御領域による目的遺伝子の発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子を制御領域の制御下に配置する方法としては、当該制御領域の制御の及ぶ下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
【００２１】
上記の上流とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側に続く領域を意味する。また、下流とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の３’側に続く領域を意味する。
【００２２】
複数の目的遺伝子を細胞内に発現可能に存在させる方法としては、目的遺伝子が発現可能に存在する細胞内のゲノム中又はプラスミド中に、必要に応じて制御領域とともに、さらに目的遺伝子を導入する方法、あるいは、複数個の目的遺伝子を、必要に応じて制御領域とともに、細胞内のゲノム中又はプラスミド中に導入することによって、細胞内で発現する目的遺伝子の数を増加させる方法等が挙げられる。
（実施例１）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、slr1916遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えることで、slr1916遺伝子が欠失したSynechocystis変異株（以下では、6803Δslr1916株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００２３】
まず、Synechocystis sp. PCC 6803株から抽出したゲノムDNA（以下では、第１のゲノムDNAとする）を鋳型とし、プライマーslr1916_Up_F（配列番号１）及びslr1916_Up_R_Cm（配列番号２）を用いて、断片（１Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（１Ａ）は、slr1916遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００２４】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr1916_Down_F_Cm（配列番号３）及びslr1916_Down_R（配列番号４）を用いて、断片（１Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（１Ｂ）は、slr1916遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００２５】
さらに、プラスミドpHSG398を鋳型とし、プライマーCp-F（配列番号５）及びCp-R（配列番号６）を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（１Ｃ）をPCRにより増幅した。なお、配列番号５、６は、プラスミドpHSG398のクロラムフェニコール耐性遺伝子に相補する配列である。クロラムフェニコール耐性部分はトランスポゾンTN9に由来する。
【００２６】
次に、得られた断片（１Ａ）、断片（１Ｃ）及び断片（１Ｂ）を、この順となるように、プライマーslr1916_Up_F（配列番号１）及びslr1916_Down_R（配列番号４）を用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終DNA断片を得た。
【００２７】
この最終DNA断片を用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr1916株である。6803Δslr1916株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。形質転換の確認は、プライマーslr1916_check_F（配列番号７）及びslr1916_check_R（配列番号８）を用いて行った。
（実施例２）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、hik26遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、hik26遺伝子が欠失したSynechocystis変異株（以下では、6803Δhik26株とする）の構築を行った。具体的には、以下の操作を行った。
【００２８】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーhik26_Up_F（配列番号９）及びhik26_Up_R_Km（配列番号１０）を用いて、断片（２Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（２Ａ）はhik26遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００２９】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーhik26_Down_F_Km（配列番号１１）及びhik26_Down_R（配列番号１２）を用いて、断片（２Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（２Ｂ）はhik26遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００３０】
さらに、プラスミドpHSG298を鋳型とし、プライマーpHSG298_Km_p_F（配列番号１３）及びKm_R（配列番号１４）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（２Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００３１】
なお、配列番号１３、１４は、プラスミドpHSG298のカナマイシン耐性遺伝子に相補する配列である。カナマイシン耐性部分は、トランスポゾンTN903に由来する。
次に、得られた断片（２Ａ）、断片（２Ｃ）及び断片（２Ｂ）を、この順となるように、プライマーhik26_Up_F（配列番号９）及びhik26_Down_R（配列番号１２）を用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終DNA断片を得た。
【００３２】
この最終DNA断片を用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、カナマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δhik26株である。6803Δhik26株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。形質転換の確認は、プライマーhik26_Check_F（配列番号１５）及びhik26_Check_R（配列番号１６）を用いて行った。
（実施例３）
実施例２で構築した6803Δhik26株を宿主として、変異を含むhik26遺伝子の発現プラスミドを導入したSynechocystis変異株（以下では、6803Δhik26/hik26m株とする）の構築を、以下のように行った。
【００３３】
なお、このhik26遺伝子の変異は、ゲノム上の2615870塩基目のシトシンがアデニンに置換されたものである。アミノ酸配列では29番目のスレオニンがリジンに置換されている。変異を含むhik26遺伝子の塩基配列を図１に示す。また、この塩基配列を配列番号２５に示す。
【００３４】
まず、強光耐性株Tol(S1)株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、プライマーhik26_M_XhoI_F（配列番号１７）及びhik26_M_BamHI_R（配列番号１８）を用いて、断片（３Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（３Ａ）は変異を含むhik26遺伝子の開始コドンから300 bpの領域である。
【００３５】
得られた断片（３Ａ）を、TAクローニングによりpGEM-T easyベクターに挿入した。このプラスミドを制限酵素XhoI及びBamHIにより消化し、断片を得た。得られた断片をプラスミドpNdhB-psbA2p-EtOH（Yoshikawa, K. et al., J. Biosci. Bioeng., 2015, 119:82-84）におけるndhB遺伝子の下流に挿入した。
【００３６】
上記のように構築したプラスミド用いて、実施例２で構築した6803Δhik26株の形質転換を行い、アンピシリンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δhik26/hik26m株である。6803Δhik26/hik26m株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。形質転換の確認は、プライマーndhB_check_F（配列番号１９）及びndhB_check_R（配列番号２０）を用いて行った。
（実施例４）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、isiA遺伝子が発現強化されたSynechocystis変異株（以下では、6803/OE-isiA株とする）の構築を行った。具体的には、以下の操作を行った。
【００３７】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーisiA_NdeI_F（配列番号２１）及びisiA_BamHI_R（配列番号２２）を用いて、断片（４Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（４Ａ）はisiA遺伝子を含む領域である。得られた断片（４Ａ）を、TAクローニングによりpGEM-T easyベクターに挿入した。
【００３８】
このプラスミドを制限酵素XhoI及びBamHIにより消化し、断片を得た。得られた断片をプラスミドpSlr0168-psbA2p-me-Sm（Yoshikawa, K. et al., J. Biosci. Bioeng., 2015, 119:82-84）のslr0168遺伝子におけるニュートラル部位に挿入した。
【００３９】
上記のように構築したプラスミド用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、ストレプトマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803/OE-isiA株である。6803/OE-isiA株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。形質転換の確認は、プライマーslr0168_check_F（配列番号２３）及びslr0168_check_R（配列番号２４）を用いて行った。
（実施例５）
（１）強光耐性評価試験の方法
実施例１、３、４で構築した6803Δslr1916株、6803Δhik26/hik26m株、及び6803/OE-isiA株について、強光耐性を評価するための試験を行った。比較例として、Synechocystis sp. PCC 6803株についても、同様の試験を行った。
まず、上記の菌株の前培養を行った。前培養では、まず、100 mL容のフラスコに20 mLの改変BG11培地を加え、上記の菌株を植菌した。
改変BG11培地の組成は以下のとおりである。2.7 μM EDTA disodium salt, 18 mM NaNO3, 46 μM H3BO3, 20 mM HEPES (pH 7.5), 1.6 μM Na2MoO4・2H2O, 220 μM K2HPO4, 300 μM MgSO4・7H2O, 260 μM CaCl2, 9.1 μM MnCl2・4H2O, 0.77 μM ZnSO4・7H2O, 0.32 μM CuSO4・5H2O, 0.17 μM Co(NO3)2・6H2O, 16 μM FeCl2・4H2O, 25 μM NH4Cl
その後、LEDプレートを用いて、40 μmol/m2/sの連続光下において、34℃、150 rpmの条件で振盪培養した。LEDプレートの詳細は、LC-LED 450W, TAITEC製というものである。
【００４０】
次に、本培養を行った。本培養では、試験管（φ3 cm×20 cm, AGC Techno Glass, Shizuoka, Japan）に、30 mLの改変BG11培地を加え、培養液のOD730が0.01になるように、前培養液を植菌した。OD730とは、波長730 nmにおける培養液の濁度である。OD730は、培養液中の細胞濃度を表す。
【００４１】
次に、LED点光源（LA-HDF158AS, HAYASHI watch-works, Tokyo, Japan）を用い、連続光を照射している環境下、34℃で培養した。培養は、照射する連続光の強さが4000μmol/m2/sの場合と、7000μmol/m2/sの場合と、9000μmol/m2/sの場合とで、それぞれ行った。培養中は、ポンプを用いて無菌の空気を通気することで、培養液を攪拌した。本培養の開始後、24、48、72時間目における培養液中の細胞濃度を測定した。培養液中の細胞濃度とは、OD730である。
【００４２】
（２）試験結果
6803Δslr1916株についての試験結果を図２に示す。6803Δhik26/hik26m株についての試験結果を図３に示す。6803/OE-isiA株についての試験結果を図４に示す。Synechocystis sp. PCC 6803株についての試験結果を図５に示す。
【００４３】
図２〜図５において、丸のマーカは、光の強さが4000μmol/m2/sの場合の細胞濃度であり、四角のマーカは、光の強さが7000μmol/m2/sの場合の細胞濃度であり、三角のマーカは、光の強さが9000μmol/m2/sの場合の細胞濃度である。
【００４４】
6803Δslr1916株、6803Δhik26/hik26m株、6803/OE-isiA株は、強光耐性を有するとともに、弱い光が照射される環境においても増殖速度が低下しにくかった。それに対し、Synechocystis sp. PCC 6803株は、強光耐性が低かった。
＜他の実施形態＞
以上、本発明を実施するための形態について説明したが、本発明は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
【００４５】
（１）宿主となる藻類は、Synechocystis sp. PCC 6803株以外のものであってもよく、適宜選択することができる。
（２）遺伝子を欠失、変異、過剰発現する方法は、公知の方法の中から適宜選択することができる。
【００４６】
（３）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言のみによって特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本発明の実施形態である。
【００４７】
（４）上述した藻類の他、当該藻類の培養方法、当該藻類を用いて物質を製造する方法、当該藻類を用いて物質を製造するシステム等、種々の形態で本発明を実現することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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