(57)【要約】【課題】  本発明は、生体高分子のＸ線結晶構造解析を可能にする結晶を迅速かつ簡便に製造する方法を提供することを目的とするものである。【解決手段】  本発明は、頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体の結晶を製造する方法に関する。本発明によれば、生体高分子等のゲスト分子を包摂したヘモシアニン会合体を得ることができる。特に結晶形態の包摂体はＸ線結晶構造解析の試料として利用可能であり、これによりゲスト分子単独の結晶を調製するための結晶化条件を検討する作業が不要となる。【選択図】図１
2017214339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを共存させる工程を含む、ヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を製造する方法。
【請求項２】
包摂体が結晶である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ａ１）、
工程（ａ１）において形成されたヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を前記溶液から回収する工程（ａ２）、及び
ヘモシアニンの会合体を結晶化させる条件下で前記包摂体を結晶化させる工程（ａ３）
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヘモシアニンの会合体の結晶とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ｂ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを含む溶液をヘモシアニンの会合体を結晶化させる条件下に置いてヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を結晶化させる工程（ｃ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
頭足類由来のヘモシアニンがスルメイカ由来ヘモシアニンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ゲスト分子の分子量が３〜５００ｋＤａである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
頭足類由来のヘモシアニンの会合体からなる包摂体作成用ホスト分子。
【請求項９】
頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析に利用可能なヘモシアニン会合体を用いた包摂体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸、多糖類等の生体高分子の立体構造を解析する方法の一つに、Ｘ線結晶構造解析法がある。この方法においては、生体高分子の結晶を調製することが最も難しい課題と理解されている。一般的には、蒸気拡散法、バッチ法、液液拡散法、透析法、又はシーディング法等を基本とし、溶液の組成、分析対象物の濃度、結晶化促進物質や結晶の安定化剤等の選択、溶媒の蒸発速度その他の結晶を析出させるための条件（結晶化条件）を、生体高分子毎に検討して設定することが必要とされる。
【０００３】
生体高分子の結晶を調製するための従来のアプローチでは、結晶化条件の検討は事実上不可避に近いため、結晶化条件の検討を効率的に行うための手段に関心が寄せられてきた（例えば、特許文献１）。また、結晶化条件の検討の効率化とは別のアプローチとして、生体高分子が溶解している溶液に対しパルスレーザーを照射する等の、物理化学的な刺激で結晶化を促す方法（特許文献２）等も提唱されている。
【０００４】
近年、結晶スポンジ法と呼ばれる新たなＸ線結晶構造解析法が開発された（非特許文献１）。この方法では、結晶スポンジと呼ばれる結晶性ホスト分子をゲスト分子の溶液に接触させることでホスト結晶細孔内にゲスト分子を包摂させ、この結晶を用いてＸ線回折測定を行う。この方法は解析対象化合物の結晶化を必要とせず、構造解析の研究分野において飛躍的進歩をもたらすものである。しかしながら、生体高分子は、その分子の大きさ、表面の多様性及び運動性の高さから、結晶スポンジ法を適用することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１３３６９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０１８７４４号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｏｋｕｍａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４９５，４６１−４６６（２０１３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生体高分子のＸ線結晶構造解析を可能にする結晶を迅速かつ簡便に製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、巨大タンパク質であるヘモシアニンの会合体は生体高分子等を包摂することができ、ホスト分子としての機能を有すること、及びヘモシアニンの会合体の包摂体の結晶を利用することで前記課題を解決することができることを見出し、下記の各発明を完成させた。
【０００９】
（１）頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを共存させる工程を含む、ヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を製造する方法。
（２）包摂体が結晶である、（１）に記載の方法。
（３）ヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ａ１）、
工程（ａ１）において形成されたヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を前記溶液から回収する工程（ａ２）、及び
ヘモシアニンの会合体を結晶化させる条件下で前記包摂体を結晶化させる工程（ａ３）
を含む、（２）に記載の方法。
（４）ヘモシアニンの会合体の結晶とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ｂ）を含む、（２）に記載の方法。
（５）ヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを含む溶液をヘモシアニンの会合体を結晶化させる条件下に置いてヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を結晶化させる工程（ｃ）を含む、（２）に記載の方法。
（６）ヘモシアニンがスルメイカ由来ヘモシアニンである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ゲスト分子の分子量が３〜５００ｋＤａである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）頭足類由来のヘモシアニンの会合体からなる包摂体作成用ホスト分子。
（９）頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体高分子等のゲスト分子を包摂したヘモシアニンの会合体を得ることができる。特に結晶形態の包摂体はＸ線結晶構造解析の試料として利用可能であり、これによりゲスト分子単独の結晶を調製するための結晶化条件を検討する作業が不要となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヘモシアニンの会合体の立体構造をバックボーンモデルで表した図である。パネルＡはヘモシアニンの会合体を横方向から見た図、パネルＢは縦方向から見た図である。
【図２】ヘモシアニンの会合体の結晶を光学顕微鏡を用いて撮影した写真である。
【図３】ヘモシアニンの会合体の結晶の構造を模式的に表した図である。
【図４】ヘモシアニンの会合体と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との包摂体を含む溶液のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるタンパク質濃度（２８０ｎｍ吸光度）とＧＦＰの吸収（４８０ｎｍ吸光度）を示すクロマトチャートである。
【図５】ヘモシアニンの会合体とＧＦＰとの包摂体の結晶を光学顕微鏡を用いて撮影した写真（パネルＡ）、及び同結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（パネルＢ）である。
【図６】ヘモシアニンの会合体及び各種生体高分子の大きさの比較を同一スケールで表した図である。図中、ＡＰＣはアロフィコシアニン、ＣＰはＣ−フィコシアニン、ＰＥはフィコエリスリンである。
【図７】ヘモシアニンの会合体とＤＮＡとの包摂体の結晶を光学顕微鏡を用いて撮影した写真（レーンＡ）、及び同結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（レーンＢ）である。
【図８】ヘモシアニンの会合体と各種タンパク質との包摂体の結晶を光学顕微鏡を用いて撮影した写真（レーンＡ）、及び同結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（レーンＢ）である。
【図９】ヘモシアニンの会合体とＧＦＰ、ＡＰＣ又はＰＥとを含む溶液をヘモシアニンの会合体を結晶化させる条件に置いて調製した結晶を、光学顕微鏡を用いて撮影した写真（レーンＡ）、及び同結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（レーンＢ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第一の態様は、頭足類由来のヘモシアニンの会合体とゲスト分子とを共存させる工程を含む、ヘモシアニンの会合体とゲスト分子との包摂体を製造する方法に関し、特に包摂体が結晶である前記方法に関する。
【００１３】
ヘモシアニンは、エビ・カニ等の節足動物、貝やイカ・タコ等の軟体動物のリンパ液に見られる、酸素を運搬する機能を有するタンパク質であり、分子量約４００キロダルトン（ｋＤａ）のサブユニットが１０個集まった分子量約４００万Ｄａの会合体（１０量体、以下ヘモシアニン会合体と表す）を形成することが知られている。以下、頭足類由来のヘモシアニンについて、スルメイカ由来のヘモシアニンを代表例として、さらに詳細に説明する。
【００１４】
ヘモシアニン会合体は１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２００ｍＭ  ＣａＣｌ２，２５〜３０％ＰＥＧ４００（結晶化バッファー）という条件下で再現性よく結晶化し（例えばＭａｔｓｕｎｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９０，３７９−３８２（２０１５））、その立体構造はＸ線結晶構造解析法によって既に解明されている（Ｇａｉ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，２２０４−２２１２（２０１５））。
【００１５】
ヘモシアニン会合体の立体構造を図１に示す。ヘモシアニン会合体は、１０個のヘモシアニン分子が環状につながった円筒状の形態を有する。便宜上、円筒の口が向いている方向を縦方向、これと直交する方向を横方向と表すこととする。ヘモシアニン会合体の円筒の開口部分の内径は約２２０Åであり、円筒の中ほどに５つのヘモシアニン分子が円筒の内側に突出した部分があり、これら突出した部分における内径は約１１０Åである。また、円筒の高さは１６０Å程である。すなわち、ヘモシアニン会合体は、１０個のヘモシアニン分子で取り囲まれてなる、内径が約１１０〜２２０Å、高さ約１６０Åの円筒状の巨大な空隙を有している。
【００１６】
ヘモシアニン会合体の立体構造の特徴は上記の通りであるが、ヘモシアニン会合体の結晶は、ヘモシアニン会合体が縦方向に重なってできる管が多数束ねられた構造を有している。ヘモシアニン会合体の結晶の写真を図２に、その模式図を図３に示す。ヘモシアニン会合体の結晶は、上記の構造を有することで、上記の円筒状の空隙に加えて、管と管の間にも空隙が形成される。
【００１７】
本発明は、上で説明したヘモシアニン会合体を利用する発明であり、ヘモシアニン会合体が有する空隙にゲスト分子が包摂された包摂体、すなわちヘモシアニン会合体をホスト分子とし、その空隙にゲスト分子を包摂させた包摂体を製造する方法と表すことができる。
【００１８】
本発明では、イカ・タコ等の頭足類から採取されるリンパ液そのものを、また該リンパ液から適当な方法で精製したものをヘモシアニン会合体として利用することができる。また、ヘモシアニンをコードする遺伝子はスルメイカ、コウイカ等から既にクローニングされており（例えばＧａｉ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，２２０４−２２１２（２０１５）等）、これらの遺伝子を利用することでヘモシアニンを組換えタンパク質として作製し、適当な緩衝液中で会合体を形成させ、使用してもよい。
【００１９】
本発明にいう包摂体とは、ヘモシアニン会合体が有する空隙にゲスト分子が取り込まれた状態の物質を指す。包摂体において、ヘモシアニン会合体とゲスト分子の間には、例えば水素結合、静電結合、疎水結合等の分子間結合が介在してもよく、又は適当な架橋剤を用いることで共有結合を形成させてもよい。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ビスマレイミド等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の方法においてヘモシアニン会合体に包摂されるゲスト分子に限定はないが、好ましくはタンパク質、核酸又はこれらの糖修飾物その他の誘導体といった生体高分子から選択される。本発明の方法が適用される好適な生体高分子は、分子量が３〜５００ｋＤａ、好ましくは２０〜３００ｋＤａの水溶性タンパク質である。なお、本発明においては、一般的な技術用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、特に断らない限り区別されることなく同義の用語として理解される。
【００２１】
本発明の第一の態様の好ましい例は、ヘモシアニン会合体とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ａ１）、工程（ａ１）において形成されたヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体を前記溶液から回収する工程（ａ２）、及びヘモシアニン会合体を結晶化させる条件下で前記包摂体を結晶化させる工程（ａ３）を含む、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体の結晶を製造する方法である。この例示的態様の概略は、溶液中でヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体を形成させ、その後これをヘモシアニン会合体を結晶化させる条件下で結晶化させるものであると理解することができる。
【００２２】
工程（ａ１）におけるヘモシアニン会合体とゲスト分子とを含む溶液は、両物質を変性させずに溶解させて保持することができる溶液であればよい。使用可能な溶媒は水、特にイオン交換水等の純水又は超純水である。また溶液はヘモシアニン及びゲスト分子に対する安定化剤、ｐＨ緩衝剤その他の成分を必要に応じて含んでいてもよい。そのような溶液の組成ないしｐＨ等の物理化学的条件は、ヘモシアニンとゲスト分子それぞれについて知られている望ましい条件を参考にして、当業者の技術常識の範囲内で適宜設定すればよい。
【００２３】
溶液中のヘモシアニンの濃度は、５〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１２〜１８ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１４〜１６ｍｇ／ｍＬの範囲内で適宜定めることができる。上記濃度範囲５〜３０ｍｇ／ｍＬは、ヘモシアニン会合体を１つの分子と仮定したときに、１．３〜７．８μＭのヘモシアニン会合体に相当する。
【００２４】
一方、溶液中のゲスト分子の濃度は、その飽和溶解度を上限として、溶液中のヘモシアニン会合体の個数に対して等倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上の分子数となるように設定することが望ましい。
【００２５】
インキュベートは、上記溶液を４℃〜室温、好ましくは４〜１０℃に、１〜７２時間、好ましくは１２〜１８時間、静置するか又は軽く振盪することで行うことができる。溶液の調製からインキュベート終了までの間に、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体が形成される。
【００２６】
工程（ａ２）は、上記インキュベートによって形成されるヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体を溶液から回収する工程である。典型的には、ゲスト分子を包摂していないヘモシアニン会合体及びゲスト分子を包摂したヘモシアニン会合体（包摂体）に相当する分子量約４００万Ｄａの分子とゲスト分子に相当する分子量３〜５００ｋＤａの分子とを分画することができる適当なゲル濾過クロマトグラフィーを利用して、包摂体を含む分子量画分を回収する工程である。ただし、回収手段はゲル濾過カラムクロマトグラフィーに限定されず、ヘモシアニン会合体を含む溶液から包摂されなかったゲスト分子を取り除くことができる任意の手段を採用して、包摂体を回収してもよい。
【００２７】
工程（ａ３）は、ヘモシアニン会合体を結晶化させる条件下で前記包摂体を結晶化させる工程であり、好ましくは、ヘモシアニン会合体を結晶化させる公知の条件、例えば前出のＭａｔｓｕｎｏらの文献に記載されている条件及び方法で、前記包摂体を結晶化させる工程である。
【００２８】
工程（ａ３）においては、工程（ａ２）で回収した包摂体をヘモシアニン会合体の結晶化に適した溶液と混合して結晶化する。そのような溶液としては、２００ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２５〜３０％  ＰＥＧ４００を含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）等を挙げることができる。この溶液に対して、ヘモシアニン会合体の結晶化が可能な任意の結晶化方法を適用することができる。そのような結晶化方法の例としては、ハンギング・ドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）法又はシッティング・ドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ）法等の蒸気拡散法、バッチ法、液液拡散法、透析法、又はシーディング法等を挙げることができる。本発明において好ましい結晶化方法は、蒸気拡散法、特に好ましくはシッティング・ドロップ法である。
【００２９】
本発明の第１の態様の別の好ましい例は、ヘモシアニン会合体の結晶とゲスト分子とを含む溶液をインキュベートする工程（ｂ）を含む、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体の結晶を製造する方法である。この例示的態様の概略は、ヘモシアニン会合体の結晶を、その空隙にゲスト分子を入り込ませることで包摂体の結晶に変換するものと理解することができる。
【００３０】
ヘモシアニン会合体の結晶は、ヘモシアニン会合体を結晶化させる公知の条件、例えば前出のＭａｔｓｕｎｏらの文献に記載されている条件及び方法で調製したものを使用すればよい。
【００３１】
工程（ｂ）は、例えばゲスト分子を溶解した溶液にヘモシアニン会合体の結晶を浸してインキュベートする工程、あるいはヘモシアニン会合体を結晶化させた溶液にゲスト分子を直接添加して溶解する又はゲスト分子を溶解した溶液を添加する等してインキュベートする工程であればよい。
【００３２】
工程（ｂ）におけるヘモシアニン会合体の結晶とゲスト分子とを含む溶液は、ヘモシアニン会合体の結晶を溶解させず、かつゲスト分子を変性させずに溶解させて保持することができる溶液であればよい。使用可能な溶媒は水、特にイオン交換水等の純水又は超純水である。また溶液はヘモシアニン及びゲスト分子に対する安定化剤、ｐＨ緩衝剤その他の成分を必要に応じて含んでいてもよい。そのような溶液の組成ないしｐＨ等の物理化学的条件は、ヘモシアニンとゲスト分子それぞれについて知られている望ましい条件を参考にして、当業者の技術常識の範囲内で適宜設定すればよい。また、溶液中のゲスト分子の濃度は、その飽和溶解度を上回らない範囲で高く設定することが好ましい。
【００３３】
溶液中の結晶は、１〜１００個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の範囲内で適宜定めることができる。また、溶液中のゲスト分子の濃度は、その飽和溶解度を上限として、０．１μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは５０μＭ以上の分子数となるように設定することが望ましい。
【００３４】
工程（ｂ）におけるインキュベートは、溶液を４℃〜室温、好ましくは１５〜２０℃に、１〜２４０時間、好ましくは１６８〜２４０時間、静置するか又は軽く振盪することで行うことができる。
【００３５】
また、工程（ｂ）の前に、ヘモシアニン会合体の結晶に適当な架橋剤を作用させてヘモシアニン分子の間に架橋を形成させる工程（ｂ’）を含んでいてもよい。ヘモシアニン分子の間に架橋が形成されることで、インキュベート中にヘモシアニン会合体の結晶構造が崩壊することを防止することができる。好ましい架橋剤としては、グルタルアルデヒド，ホルムアルデヒド等を挙げることができる。
【００３６】
この例示的態様において分子量の小さいゲスト分子を用いた場合、ゲスト分子は、ヘモシアニン会合体の空隙に包摂される他に、あるいは空隙に包摂される代わりに、管と管の間の空隙にその全体が又はその一部分が入り込み、ヘモシアニン会合体の結晶に取り込まれることもあり得る。このような態様の包摂体も、本発明にいう包摂体に包含され、その結晶は本発明にいう包摂体の結晶として利用可能である。
【００３７】
本発明の第１の態様のさらなる別の好ましい例は、ヘモシアニン会合体とゲスト分子とを含む溶液をヘモシアニン会合体を結晶化させる条件下に置いてヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体を結晶化させる工程（ｃ）を含む、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体の結晶を製造する方法である。この例示的態様の概略は、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体とその結晶の調製とを一つの作業で行うものであると理解することができる。
【００３８】
工程（ｃ）におけるヘモシアニン会合体とゲスト分子とを含む溶液は、両物質を変性させずに溶解させて保持することができる溶液であって、かつヘモシアニン会合体の結晶化に適した溶液であることが好ましい。使用可能な溶媒は水、特にイオン交換水等の純水又は超純水である。また溶液はヘモシアニン及びゲスト分子に対する安定化剤、ｐＨ緩衝剤その他の成分を必要に応じて含んでいてもよい。そのような溶液の組成ないしｐＨ等の物理化学的条件は、ヘモシアニンを結晶化させる際の条件を参考にして、当業者の技術常識の範囲内で適宜設定すればよい。
【００３９】
溶液中のヘモシアニンの濃度は、１０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは７０〜８５ｍｇ／ｍＬの範囲内で適宜定めることができる。上記濃度範囲１０〜１５０ｍｇ／ｍＬは、ヘモシアニン会合体を１つの分子と仮定したときに、２．６〜３９μＭのヘモシアニン会合体に相当する。
【００４０】
一方、溶液中のゲスト分子の濃度は、その飽和溶解度を上限として、溶液中のヘモシアニン会合体の個数に対して等倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２５倍以上の分子数となるように設定することが望ましい。
【００４１】
上記３つの例示的態様の各々により製造されたヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体の結晶は、適当な緩衝液で洗浄することで包摂体を形成していないヘモシアニン会合体及びゲスト分子を取り除いた後に、Ｘ線結晶構造解析法の適用対象として利用することができる。
【００４２】
従来、ゲスト分子のＸ線回折データを直接取得するには、試行錯誤を経てゲスト分子の結晶を調製する必要があるのに対して、本発明の方法によれば、ヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体を試行錯誤を要することなく結晶化させることができる。Ｘ線結晶構造解析法によって前記包摂体の結晶のＸ線回折データを取得すれば、これと既に公知のヘモシアニン会合体のＸ線回折データとの差分を取ることによって、ゲスト分子の立体構造を特定することが可能なデータを得ることができる。
【００４３】
また、本発明の第一の態様により製造される包摂体において、ゲスト化合物はヘモシアニン会合体の空隙に取り込まれて集積し、外部環境から保護される。したがって、第一の態様の方法は、ゲスト化合物の吸着、安定化をもたらし、例えば化合物の吸着、特殊環境下での化学反応の制御のために、またドラックデリバリーシステムとして、医薬、化学、農業等の分野において広く利用することができる。
【００４４】
本発明の第二の態様は、頭足類由来のヘモシアニン会合体からなる包摂体作成用ホスト分子に関する。包摂体作成用ホスト分子としてのヘモシアニン会合体の調製及びその使用方法については、前記第一の態様において説明されている通りである。
【００４５】
本発明の第三の態様は、頭足類由来のヘモシアニン会合体とゲスト分子との包摂体に関する。かかる包摂体は前記第一の態様において説明されている通りに製造し、使用することができる。
【００４６】
以下に示す実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例】
【００４７】
＜実験試料＞
ヘモシアニン会合体として、活スルメイカから注射針および注射器を用いて採取したスルメイカ血リンパ液をそのまま使用した。
【００４８】
ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識された５ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡ（ＦＡＭ−５ｍｅｒＤＮＡ）、ＦＡＭ標識された１０ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡ（ＦＡＭ−１０ｍｅｒＤＮＡ）、ＦＡＭ標識された２０ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡ（ＦＡＭ−２０ｍｅｒＤＮＡ）は、シグマアルドリッチジャパン社に依頼して合成したものを使用した。
【００４９】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ｐＥＴ２２ｂベクターを用いて形質転換した大腸菌発現ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養して、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する組換え体として大量発現させ、Ｎｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアジャパン）を用いて精製したものを使用した。
【００５０】
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＣ−フィコシアニン（ＣＰ）はシグマアルドリッチジャパン社より購入したものを、またフィコエリスリン（ＰＥ）はｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入したものを、それぞれ限外濾過膜（アミコンウルトラ−４  ３０Ｋ、ミリポア社）を用いてバッファー置換したものを使用した。
【００５１】
ＦＡＭ標識されたフェリチン（ＦＡＭ−ＦＥ）はＦｕｊｉｔａら（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６，１６９０２−１６９０８（２０１４））に記載されている方法に従って調製したものを使用した。
【００５２】
＜実施例１＞包摂体形成後の結晶化による包摂体結晶の作製
２００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５（以下、ゲストバッファーと表す）２ｍＬ、スルメイカ血リンパ液５００μＬ及び１０ｍＭビスマレイミド２５μＬを混合し、４℃で１８時間静置した。その後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に混合液をアプライして未反応のビスマレイミドを除去し、ヘモシアニン会合体の溶液を得た。
【００５３】
１．７５ｍＬのヘモシアニン会合体溶液に終濃度３．６６ｍｇ／ｍＬになるようにＧＦＰを添加し、４℃で１８時間静置して、ヘモシアニン会合体とＧＦＰとの包摂体を調製した。
【００５４】
ゲストバッファーで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００に前記包摂体を含む溶液をアプライし、ヘモシアニン会合体とＧＦＰとの包摂体を含む溶出画分（１０ｍＬ）を回収した。溶出画分の２８０ｎｍ吸収とＧＦＰに由来する４８０ｎｍ吸収とを表したクロマトチャートを図４に示す。
【００５５】
限外濾過膜（アミコンウルトラ−４  １００Ｋ、ミリポア社）を用いて、前記包摂体を含む溶出画分をＯＤ２８０＝１２８まで濃縮した。濃縮後の包摂体溶液０．２μＬに対して、Ｍａｔｓｕｎｏら（Ｍａｔｓｕｎｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９０，３７９−３８２（２０１５））に記載の条件に従ってシッティングドロップ蒸気拡散法を行い、包摂体の結晶を得た。
【００５６】
得られた包摂体の結晶を結晶化バッファーを用いて３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０（カールツァイス））を用いてＧＦＰの蛍光を観察した。図５に、光学顕微鏡で結晶を撮影した写真（パネルＡ）と、同じ結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（パネルＢ）を示す。光学顕微鏡で観察される結晶のほぼ全体でＧＦＰの蛍光が確認された。
【００５７】
＜実施例２＞ヘモシアニン会合体結晶化後の包摂による包摂体結晶の作製
スルメイカ血リンパ液１μＬを等量の結晶化バッファーに添加した溶液に対して、Ｍａｔｓｕｎｏら（Ｍａｔｓｕｎｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９０，３７９−３８２（２０１５））に記載の条件に従ってシッティングドロップ蒸気拡散法を行った。
【００５８】
結晶が成長したドロップに、ドロップと等量の２％ホルムアルデヒドを含む結晶化バッファーを加えて１時間静置した後、結晶化バッファーで３回洗浄して、架橋されたヘモシアニン会合体の結晶を得た。
【００５９】
表１に示されるそれぞれのゲスト分子を溶解したゲストバッファーに、架橋されたヘモシアニン会合体の結晶を浸漬し、１週間以上静置した。ヘモシアニン会合体と各ゲスト分子の分子の大きさを同スケールで表した図を図６に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
各結晶を回収し、ゲストバッファーで３回以上洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０（カールツァイス））を用いて、ゲスト分子の蛍光を観察した。
【００６２】
ヘモシアニン会合体とＤＮＡとの包摂体の各結晶を光学顕微鏡で撮影した写真（レーンＡ）と、それぞれ同じ結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（レーンＢ）を図７に示す。またヘモシアニン会合体と各種タンパク質との包摂体の各結晶を光学顕微鏡で撮影した写真（レーンＡ）と、それぞれ同じ結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（レーンＢ）を図８に示す。結晶のほぼ全体から各生体高分子が発する発光が確認された。
【００６３】
＜実施例３＞１ステップでの包摂及び結晶化（共結晶）
スルメイカ血リンパ液０．８〜０．５μＬとゲストバッファーに溶解したＧＦＰ０．２〜０．５μＬとを、ＧＦＰの最終濃度が２．７〜６．９ｍｇ／ｍＬとなるように混合して、ヘモシアニン会合体とＧＦＰとを含む溶液を調製した。同様に、スルメイカ血リンパとゲストバッファーに溶解したＡＰＣ又はＰＥとを、ＡＰＣ又はＰＥの最終濃度がそれぞれＯＤ２８０＝０．９又は１．４となるように混合して、ヘモシアニン会合体とＡＰＣ又はＰＥとを含む溶液を調製した。
【００６４】
各混合液溶液に対して、Ｍａｔｓｕｎｏら（Ｍａｔｓｕｎｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９０，３７９−３８２（２０１５））に記載の条件に従ってシッティングドロップ蒸気拡散法を行った。得られた結晶を結晶化バッファーにて３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０（カールツァイス））を用いてゲスト分子の蛍光を観察した。
【００６５】
図９に、ヘモシアニン会合体とＧＦＰ、ＡＰＣ又はＰＥとの包摂体の結晶を光学顕微鏡で撮影した写真（パネルＡ）と、同じ結晶を共焦点レーザー顕微鏡で撮影した写真（パネルＢ）を示す。光学顕微鏡で観察される結晶のほぼ全体から各蛍光タンパク質が発する発光が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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