(57)【要約】【課題】免疫機能を調整し、生体の恒常性を維持するために有用な免疫機能調整剤及び成人病を予防する抗酸化剤の提供。  【解決手段】下記式（１）で示されるピロール誘導体又はその塩。2017114810.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるピロール誘導体又はその塩。
【化１】
2017114810.tif 000007
【請求項２】
式（１）で示されるピロール誘導体が、下記式（１ａ）で示される（２Ｒ，４Ｒ）体又はこれを含む立体異性体混合物である請求項１記載のピロール誘導体又はその塩。
【化２】
2017114810.tif 000008
【請求項３】
請求項１又は２記載のピロール誘導体又はその塩を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載のピロール誘導体又はその塩を有効成分とする免疫機能調整剤。
【請求項５】
食品である、請求項３記載の抗酸化剤。
【請求項６】
食品である、請求項４記載の免疫機能調整剤。
【請求項７】
アリウム属植物エキスを濃縮及び乾燥させた後、８０〜１２０℃で３０分〜２４時間加熱処理することを特徴とする請求項１記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
【請求項８】
アリウム属植物の乾燥物又はその粉末を、２００〜３００℃で1〜５分加熱処理することを特徴とする請求項１記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
【請求項９】
糖類とS-アリルシステインを非晶質化した後、８０〜１２０℃で３０分〜２時間反応させることを特徴とする請求項１記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
【請求項１０】
糖類がフルクトース又はグルコースである請求項９記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ピロール誘導体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物中には、ピロール環が４つ環状に結合したクロロフィルやピロール環が４つ鎖状に結合したフィコビリンなどが存在する（非特許文献１）。また、沖縄海綿からは、３種の新規ブロモピロールアルカロイドが単離され、いずれの化合物も抗菌活性があることが報告されている（非特許文献２、３）。
【０００３】
一方、ニンニクには特徴的な成分としてγ−グルタミル−Ｓ−アリルシステインが含まれる。該成分はニンニクを切ったり、つぶしたり、すりおろしたり、又は熟成することにより、ニンニク中に含まれるγ−グルタミルトランスペプチダーゼという酵素により、水溶性のＳ−アリルシステイン（以下、ＳＡＣと略す）に変換される。このような酵素反応により生成される水溶性化合物として、ＳＡＣの他にＳ−メチルシステイン、Ｓ−１−プロペニルシステインなどが存在する（非特許文献4）。しかしながら、ニンニクにはピロール誘導体の存在は報告されていない。
【０００４】
イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）は、哺乳類において最も分泌量の多い抗体であり、腸管粘膜固有層においてＩｇＡ産生細胞より分泌される。ＩｇＡは、主として、食品に含まれる異物や侵入した病原菌からの体の保護及び腸内細菌叢のバランスの維持を通じて、身体の恒常性を維持するために機能している（非特許文献５〜７）。また、ＩｇＡ欠損症の患者では、アレルギー性の疾患や自己免疫疾患の発現進度が高いことが知られている（非特許文献８）。また、インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、Ｔ細胞やマクロファージから産生されるサイトカインの一種で、造血や抗体産生細胞の分化を促進する役割を担う一方、過剰産生されることで、慢性炎症や自己免疫疾患の原因となる等、炎症反応を亢進する作用を併せ持っている（非特許文献９，１０）。
【０００５】
したがって、ＩｇＡの産生を促進し、ＩＬ−６の過剰産生を抑制することによって免疫機能の調整を図ることは、身体の恒常性を維持し、アレルギー発症の予防や炎症反応の抑制に有用である。
【０００６】
また、転写因子Ｎｒｆ２は、生体内で親電子性物質、活性酸素、小胞体ストレスや血流によるずり応力によって活性化され、酸化ストレス適応反応を統一的に制御することが知られている。そのため、Ｎｒｆ２を活性化することで、酸化ストレスに起因するガンや糖尿病、高脂血症、肝機能低下などの生活習慣病を予防できると考えられる（非特許文献11）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】生産研究,1巻,号,9-36,1989
【非特許文献２】Nat.Prod.Rep.2011,28,1229-1260
【非特許文献３】Mar.Drugs 2009,7,705-753
【非特許文献４】ニンニクの化学,初版,93-122,2000
【非特許文献５】LM Kato, S Kawamoto, M Maruya, S Fagarasan. Gut TFH and IgA: key players for regulation of bacterial communities and immune homeostasis. Immunol Cell Biol. 2014;92(1):49-56.
【非特許文献６】S Fagarasan, T Honjo. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat Rev Immunol. 2003;3(1):63-72.
【非特許文献７】AJ Macpherson, KD McCoy, FE Johansen, P Brandtzaeg. The immune geography of IgA induction and function. Mucosal Immunol. 2008;1(1):11-22.
【非特許文献８】K Singh, C Chang, ME Gershwin.  Autoimmun Rev.: IgA deficiency and autoimmunity.  2014；13（2）：63-72
【非特許文献９】T Kishimoto , S Akira , T Taga . Interleukin-6 and its receptor: A paradigm for cytokines. Science, 1992.258: 593-597.
【非特許文献１０】T Tanaka, M Narazaki, TKishimoto. IL-6 in Inflammation, Immunity, and Disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014 6(10): 1-16.
【非特許文献１１】生化学，第81巻，第6号，447-455，2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗酸化作用や免疫調整作用を有する新規ピロール誘導体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発者らは、乾燥したニンニク又はその粉末、或いはニンニクエキスの乾燥物を加熱処理した場合に、抗酸化作用や免疫調整作用を有する新規なピロール誘導体が生成されること、また、当該ピロール誘導体は、S-アリルシステインと糖類とを加熱処理することにより、効率よく合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に関するものである。
１）下記式（１）で示されるピロール誘導体又はその塩。
【００１１】
【化１】
2017114810.tif 000002
【００１２】
２）式（１）で示されるピロール誘導体が、下記式（１ａ）で示される（２Ｒ，４Ｒ）体又はこれを含む立体異性体混合物である上記１）に記載のピロール誘導体又はその塩。
【００１３】
【化２】
2017114810.tif 000003
【００１４】
３）上記１）又は２）に記載のピロール誘導体又はその塩を有効成分とする抗酸化剤。
４）上記１）又は２）に記載のピロール誘導体又はその塩を有効成分とする免疫機能調整剤。
５）食品である、上記３）に記載の抗酸化剤。
６）食品である、上記４）に記載の免疫機能調整剤。
７）アリウム属植物エキスを濃縮及び乾燥させた後、８０〜１２０℃で３０分〜２４時間加熱処理することを特徴とする上記１）に記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
８）アリウム属植物の乾燥物又はその粉末を、２００〜３００℃で1〜５分加熱処理することを特徴とする上記１）に記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
９）糖類とS-アリルシステインを非晶質化した後、８０〜１２０℃で３０分〜２時間反応させることを特徴とする上記１）に記載のピロール誘導体又はその塩の製造法。
１０）糖類がフルクトース又はグルコースである上記９）に記載の製造法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のピロール誘導体又はその塩によれば、ＩｇＡの産生促進及びＩＬ−６の産生抑制という免疫機能調整作用によって、外部異物の侵襲あるいは侵襲による障害を緩和し、生体の恒常性を維持することができる。また、炎症反応やアレルギー反応を抑えることができる。更に、転写因子Ｎｒｆ２を活性化することにより、酸化ストレス適応反応を統一的に制御することで、酸化ストレスに起因するガンや糖尿病、高脂血症、肝機能低下などの生活習慣病を予防することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ニンニク乾燥粉末の加熱処理により生成したピロール誘導体の生成量を示すグラフ。
【図２】ピロール誘導体のＩｇＡ産生促進作用を示すグラフ。
【図３】ピロール誘導体のＬＰＳにより誘導されたＩｇＡの産生促進作用を示すグラフ。
【図４】ピロール誘導体のＬＰＳにより誘導されたＩＬ−６の産生抑制作用を示すグラフ。
【図５】ピロール誘導体の抗酸化遺伝子の発現増加作用を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のピロール誘導体は、下記式（１）で示される。
【００１８】
【化３】
2017114810.tif 000004
【００１９】
該化合物（１）は、分子中に２個の不斉炭素を有するため、（２Ｒ，４Ｒ）体＜(2R)-3-(allylthio)-2-((4R)-4-((allylthio)methyl)-6-formyl-3-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-a]pyrazin-2(1H)-yl)propanoic acid （以下、ＰＳＢＳ−Ａと略す）＞と、（２Ｒ，４Ｓ）体＜(2R)-3-(allylthio)-2-((4S)-4-((allylthio)methyl)-6-formyl-3-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-a]pyrazin-2(1H)-yl)propanoic acid（以下、ＰＳＢＳ−Ｂと略す）＞、（２Ｓ，４Ｒ）体＜(2S)-3-(allylthio)-2-((4R)-4-((allylthio)methyl)-6-formyl-3-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-a]pyrazin-2(1H)-yl)propanoic acid＞、及び（２Ｓ，４Ｓ）体＜(2S)-3-(allylthio)-2-((4S)-4-((allylthio)methyl)-6-formyl-3-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-a]pyrazin-2(1H)-yl)propanoic acid＞の４個の立体異性体が存在する。本発明においては、薬理活性の点から下記式（１ａ）で示される（２Ｒ，４Ｒ）体（ＰＳＢＳ−Ａ）若しくはこれを含む立体異性体混合物であるのが好ましい。
【００２０】
【化４】
2017114810.tif 000005
【００２１】
上記式（１）で示されるピロール誘導体には塩が存在するが、酸付加塩又は塩基付加塩の何れでもよい。酸付加塩としては、たとえば、（イ）塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸との塩、（ロ）ギ酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩、（ハ）メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸類との塩を、また、塩基付加塩としては、たとえば、（イ）ナトリウム、カリウム、カルシクム、マグネシウムなどのアルカリ金属との塩、（ロ）カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、（ハ）アンモニウム塩、（ニ）トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩を挙げることができる。
【００２２】
更に、式（１）で示されるピロール誘導体又はその塩は、未溶媒和型のみならず、水和物や溶媒和物としても存在することができ、斯かる水和物又は溶媒和物は製造条件により任意の結晶形として存在することができる。従って、本発明におけるピロール誘導体又はその塩は、全ての立体異性体、水和物、溶媒和物、及び全ての多形結晶形態もしくは非晶形を包含するものである。
【００２３】
本発明のピロール誘導体は、S-アリルシステインと糖類を非晶質化した後、８０〜１２０℃で３０分〜２時間反応させることにより製造することができる。
ここで用いられる糖類としては、フルクトース又はグルコースが挙げられ、S-アリルシステインとしては、S-アリル-Ｌ-システインが挙げられる。
糖類とS-アリルシステインとの混合比は、モル比で１０：１〜１：１であるが、好ましくは５：１〜１：１である。更にフルクトースを使用する場合は４：１であるの好ましく、グルコースを使用する場合は、２：１であるのが好ましい。
加熱反応は、糖類とS-アリルシステインの混合物を非晶質化した後に行うことが反応効率の点から好ましい。非晶質化は、糖類とS-アリルシステインの混合物を、例えばｐＨ４．０〜６．０のリン酸バッファー等に溶解し、凍結乾燥等により乾燥させることにより行うことができる
加熱反応は、８０〜１２０℃で３０分〜２時間行うことが好ましく、９０〜１１０℃で１時間行うのがより好ましい。
反応終了後、酢酸エチル、ジエチルエーテル等の疎水性溶媒にて反応生成物を抽出し、液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離・精製することにより、式（１）で示されるピロール誘導体を取得することができる。
【００２４】
式（１）で示されるピロール誘導体は、常法に従い酸付加塩又は塩基付加塩とすることができる。本反応は、メタノ−ル、エタノ−ル等のようなアルコ−ル類或いは水等の極性溶媒中、式（１）で示されるピロール誘導体を、塩酸、硫酸等の鉱酸、ギ酸、酢酸、クエン酸等の有機カルボン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸等のスルホン酸、或いは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の塩基性化合物、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の含窒素有機塩基の存在下、室温又は適宜加熱することにより行われる。
【００２５】
また、本発明のピロール誘導体又はその塩は、アリウム属植物又はアリウム属植物エキスを所定の条件で加熱処理し、当該処理物から分離精製することにより得ることもできる。
加熱処理は、原料を乾燥させた状態で行うことが必要であり、アリウム属植物を用いる場合、当該植物の乾燥物又はその粉末を、２００〜３００℃で１〜５分加熱することが好ましく、２３０〜２７０℃で２〜４分加熱することがより好ましく、２４０〜２６０℃で２〜４分加熱することが更に好ましい。アリウム属植物エキスを用いる場合は、当該エキスを濃縮及び乾燥した後、８０〜１２０℃で３０分〜２４時間加熱処理することが好ましく、９０〜１１０℃で３〜６時間加熱処理することがより好ましい。
【００２６】
ここで、アリウム属植物エキスは、アリウム属植物を直接圧搾する、アリウム植物を粉砕又はすりおろした後の搾汁を得る、又はアリウム属植物を含水エタノールで抽出することにより調製することができる。
アリウム属植物を含水エタノールで抽出する場合、アリウム属植物を１０〜５０％のエタノール水溶液で、１ヶ月以上抽出に付すが、好ましく２０〜４０％のエタノール水溶液で１〜２０ヶ月抽出に付すことができる。また、抽出は、室温や常温で抽出することができるが、抽出温度を高めれば、抽出期間を短縮できることは言うまでも無い。
ここで、アリウム属植物としては、ニンニク（Allium   sativum  L.）、タマネギ（Allium  cepa  L.）、エレファントガーリック（Allium  ampeloprazum  L.）、ニラ（Allium   tuberosum  Rottl. ex Sprengel）及びネギ（Allium  fistulosum  L.）等が挙げられる。これらの植物は、単独あるいは組み合わせて用いてもよいが、望ましくはニンニクである。また、上記アリウム属植物は生のものをそのまま、あるいは必要に応じて外皮を取り除き、切断又は細断したものを使用することもできる。更に、凍結乾燥や熱風乾燥などにより乾燥したもの、あるいはこれらを粉末化したものを用いることもできる。
【００２７】
斯くして得られた本発明のピロール誘導体は、後記実施例に示すように、Ｓ−アリルシステインに比べて優れたＩｇＡ産生作用を有し、またＬＰＳ刺激下においてＩＬ−６の産生抑制作用を有する。また、本発明のピロール誘導体は、転写因子Ｎｒｆ２のターゲット遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１：heme oxygenase １）遺伝子及びグルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬＭ：glutamate-cysteine ligase, modifier subunit）遺伝子の発現を促進する。
したがって、本発明のピロール誘導体又はその塩は、ＩｇＡ産生促進作用及び／又はＩＬ−６産生抑制作用に基づく免疫機能調整剤となり得、また、ヘムオキシゲナーゼ１産生促進、グルタチオン産生促進、或いはＮｒｆ２活性化作用に基づく抗酸化剤となり得る。
【００２８】
ＩｇＡは、病原性微生物やアレルゲンの侵入を防ぎ、生体の恒常性維持するために機能し、アレルギー発症の予防にも寄与している。また、ＩＬ−６は、Ｂ細胞からの抗体産生誘導、Ｔリンパ球の活性化等の正常な免疫応答や生体防御において中心的な役割を果たす一方で、その過剰発現は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎等の慢性炎症、免疫異常症等の病態形成及び悪化と関連することが報告されている（前記非特許文献１〜６）。よって、ＩｇＡの産生を促進し、ＩＬ−６の過剰産生を抑制することによって免疫機能の調整を図ることは、身体の恒常性を維持し、アレルギー発症の予防や炎症反応の抑制に有用である。
【００２９】
本発明において、「免疫機能調整」とは、主としてＩｇＡ産生促進作用及び／又はＩＬ−６産生抑制作用に基づく免疫機能の調整を意味し、これにより身体の恒常性維持、アレルギー発症の予防、炎症反応の抑制等の効果が発揮される。ここで、ＩｇＡ産生促進には、ＩｇＡ産生細胞を増加すること及び／又は当該細胞からＩｇＡの分泌量を増加することが含まれる。
【００３０】
ＨＯ−１及びＧＣＬＭは、Ｎｒｆ２によって発現制御される抗酸化に係る第二相酵素であることから、本発明のピロール誘導体によるＨＯ−１遺伝子及びＧＣＬＭ遺伝子の発現増加は、Ｎｒｆ２の活性化に起因することが示唆される。したがって、本発明のピロール誘導体又はその塩は、Ｎｒｆ２の活性化、ヘムオキシゲナーゼ１産生促進及び／又はグルタチオン産生促進により、酸化ストレスから細胞を保護する作用を有すると考えられる。
本発明において、「抗酸化」とは、生体内のフリーラジカルや活性酸素（ＲＯＳ）といった酸化ストレス因子から細胞を保護することを意味する。抗酸化によれば、酸化ストレスに起因するガンや糖尿病、高脂血症、肝機能低下などの生活習慣病を予防が可能となる。
【００３１】
本発明の免疫機能調整剤及び抗酸化剤は、それ自体、ヒトに摂取（投与を含む）した場合にＩｇＡ産生促進作用、ＩＬ−６産生抑制作用のような免疫機能調整効果、ヘムオキシゲナーゼ１産生促進作用、グルタチオン産生促進作用或いはＮｒｆ２活性化作用のような抗酸化効果を発揮する医薬又は食品であってもよく、或いはこれらに配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００３２】
また、当該食品には、ＩｇＡ産生促進作用、ＩＬ−６産生抑制作用、免疫機能調整作用、ヘムオキシゲナーゼ１産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、Ｎｒｆ２活性化作用、或いは抗酸化作用をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、病者用食品、特定保健用食品が包含される。
【００３３】
上記医薬又は食品は、粉末や顆粒などの固形物、ペーストやオイル状の半固形物あるいは液状であってもよい。また、必用に応じて保存剤や添加剤を加えることもできる。更に、免疫機能調整効果や抗酸化効果のある他の物質、例えば、糖類、糖アルコール類及び多糖体、レクチンなどの糖タンパク、リポポリサッカライドなどの糖脂質、乳酸菌、ビフィズス菌、酵母あるいは麹菌などの有用細菌類などを含んでいてもよい。
【００３４】
本発明のピロール誘導体又はその塩を含有する医薬の投与形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態をとることができるが、経口に適した形態であることが好ましい。経口投与製剤の具体的な形態として、例えば、固形剤としては錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。斯かる医薬製剤は、本発明のピロール誘導体又はその塩に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法に従って調製することができる。
【００３５】
本発明のピロール誘導体又はその塩を含有する食品の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等、種々の形態をとることができ、更に具体的には、菓子、飲料、調味料、水産加工食品、食肉加工食品、パン、健康食品等の種々の食品の形態であり得る。
斯かる食品は、これらの食品を通常製造する場合に用いられる食品素材と、本発明のピロール誘導体又はその塩を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３６】
上記医薬又は食品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態、同時に摂取する素材や添加剤等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、通常本発明のピロール誘導体又はその塩類として、一日当たり０．１〜２．７ｍｇ／ｋｇ摂取することが好ましく、０．３〜０．９ｍｇ／ｋｇ摂取することがより好ましい。また、所望により、この一日量を２〜４回に分割して摂取することもできる。
【実施例】
【００３７】
製造例１  ニンニク乾燥粉末におけるピロール誘導体の製造
（１）一般的に流通しているニンニク乾燥粉末１８ｇをフライパンで約３分間加熱した（約２５０℃）。その後、適量の４０％アセトニトリルを加えて分散機にて粉砕抽出し、更に４０％アセトニトリルを用いて１００ｍＬにメスアップした。比較対象物として、等量の生ニンニクをスライスしたもの、スライスした生ニンニクを同様に加熱したものを同様の抽出操作に供した。得られた処理物を超高速液体クロマトグラフィー接続の質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）にて分析した。実験に使用した機器及び分析条件は以下の通りである。
【００３８】
分析条件と設備
分析機器：超高速液体クロマトグラフィー  Acquity UPLC i-class core system (Waters)
質量分析器  Xevo T-QS (Waters)
カラム：BEH phenyl (2.0mm × 150 mm, 1.7 μm, Waters)
移動相A：水 (0.1% 蟻酸)
移動相B：99.9% アセトニトリル(0.1% 蟻酸)
移動相のグラジエント条件;
30% B → 60% B → 99% B → 99% B → 30% B → 30% B
0分      4分      4.2分    4.8分    4.9分     5.0分
移動相流速：0.4 mL/min
MS/MS 条件：m/z 395.2 → 99.1
対象の保持時間：PSBS-A  3.79 分、PSBS-B  3.91 分
【００３９】
その結果、ニンニク乾燥粉末を加熱したもののみにおいて、以下に示すＰＳＢＳ−ＡとＰＳＢＳ−Ｂの２化合物の生成が確認された。ＬＣ／ＭＳの結果より算出したＰＳＢＳ−Ａ及びＰＳＢＳ−Ｂの生成量を図１に示す。
ニンニク乾燥粉末を加熱したものでは、ＰＳＢＳ−Ａ  ５．９ｎｍｏｌ／ｇとＰＳＢＳ−Ｂ  ２．８ｎｍｍｏｌ／ｇの生成が確認された。
【００４０】
（２）ＰＡＢＳ-Ａ及びＰＡＢＳ-Ｂの構造決定
ＰＡＢＳ-Ａ及びＰＡＢＳ-Ｂの相対構造はＮＭＲ（1H、13C、1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC）とＬＣＭＳの測定により決定した。それぞれの絶対配置はＣＤスペクトル（円偏光２色性スペクトル）の測定とモデル反応の論理的考察により決定した。以下にそれらのデータを記載する。
【００４１】
（ＰＳＢＳ−ＡのＮＭＲ及びＬＣＭＳデータ）
PSBS-A; 1H NMR: 500 MHz, 13C NMR:125MHz (測定溶媒DMSO-d6) 
1H NMR: δ(ppm)  2.59 [dd, 1H, J = 13.6, 7.6 Hz], 2.88 [dd, 1H, J = 13.6, 6.8 Hz], 2.96 [dd, 1H, J = 14.2, 10.5 Hz], 3.07 [m, 1H], 3.08 [m, 2H], 3.12 [m, 2H], 4.69 [d, 1H, J = 16.9 Hz], 4.93 [d, 1H, J = 16.9 Hz], 4.93 [m, 1H, 4.90 - 4.95], 4.93 [m, 1H, 4.90 - 4.95], 5.01 [m, 1H, 4.99- 5.04], 5.10 [m, 2H, 5.06- 5.14], 5.54 [m, 1H], 5.55 [m, 1H], 5.71 [ddt, 1H, J = 17.1, 10.0, 7.2, 7.2 Hz], 6.29 [d, 1H, J = 4.0 Hz], 7.20 [d, 1H, J = 4.0 Hz], 9.47 [s, 1H] ;
13C NMR: δ(ppm) 28.38 [CH2], 33.50 [CH2], 34.08 [CH2], 34.23 [CH2], 41.76 [CH2], 56.57 [CH], 58.26 [CH], 106.47 [CH], 117.41 [CH2], 117.78 [CH2], 125.42 [CH], 129.87 [C], 133.89 [CH], 134.25 [CH], 134.69 [C], 165.95 [C], 170.08 [C], 178.95 [CH].
UPLC-TOF-ESI- : m/z =393.0949 ([M-H]-)
【００４２】
（ＰＳＢＳ−ＢのＮＭＲ及びＬＣＭデータ）
PSBS-B; 1H NMR: 500 MHz, 13C NMR:125 MHz (測定溶媒DMSO-d6) 
1H NMR: δ(ppm)  2.52 [m, 1H], 2.83 [dd, 1H, J = 13.6, 6.6 Hz], 2.92 [dd, 1H, J = 14.2, 10.7 Hz], 3.09 [m, 2H], 3.11 [m, 1H], 3.17 [m, 2H], 4.55 [d, 1H, J = 16.4 Hz], 4.81 [d, 1H, J = 16.4 Hz], 4.90 [m, 1H, 4.87 - 4.92], 4.98 [m, 1H, 4.96 - 5.00], 5.01 [m, 1H], 5.11 [m, 2H, 5.07- 5.17], 5.54 [m, 1H], 5.58[m, 1H], 5.74 [ddt, 1H, J = 17.0, 10.0, 7.2, 7.2 Hz], 6.31 [d, 1H, J = 4.0 Hz], 7.21 [d, 1H, J = 4.0 Hz], 9.48 [s, 1H]
13C NMR: δ(ppm) 28.67 [CH2], 33.53 [CH2], 34.15 [CH2], 34.19 [CH2], 42.35 [CH2], 56.06 [CH], 58.32 [CH], 106.58 [CH], 117.56 [CH2], 117.73 [CH2], 125.19 [CH], 130.04 [C], 133.93 [CH], 134.14 [CH], 134.26 [C], 165.84 [C], 170.43 [C], 179.05 [CH].
UPLC-TOF-ESI- : m/z =393.0948 ([M-H]-)
【００４３】
以上のデータにより、ＰＡＢＳ-Ａ及びＰＡＢＳ-Ｂは、以下の構造を有するピロール誘導体であると特定した。
【００４４】
【化５】
2017114810.tif 000006
【００４５】
製造例２  ピロール誘導体（ＰＡＢＳ-Ａ及びＰＡＢＳ-Ｂ）の製造
Ｄ−（＋）−グルコース  ２．０６４ｇとＳ−アリル−Ｌ−システイン  ７８０ｍｇを秤量し、リン酸バッファー（１００ｍＭ，ｐＨ６．０）を７７．４９ｍＬ加えて溶解した。その後、溶液を凍結乾燥させることによって非晶質混合物を調製し、１００℃のオーブンで１時間加熱した。加熱終了後、２０％アセトニトリルを用いて加熱混合物を溶かし込み、抽出操作に供した。
【００４６】
反応溶液を分液漏斗に入れ、その容量の約３〜４倍の酢酸エチルと混合させて分液抽出を行った。酢酸エチル層を回収し、水層は再び同様の抽出操作に供した。この操作を合計６回行った後、回収した酢酸エチル層の溶媒を、エバポレーターを用いて除去し、残留物を２０%アセトニトリルに溶解させることで分取用のサンプル溶液を得た。
【００４７】
分取用のサンプル溶液をＨＰＬＣ操作に供することで、目的化合物を得た。得られた化合物はＨＰＬＣによる精製操作を通じて高純度化させた後、ＮＭＲ、ＬＣＭＳ、円偏光二色性スペクトルの測定、及び生物活性の評価に用いた。最終的に得られたＰＳＢＳ−Ａは２．３４ｍｇ、ＰＳＢＳ−Ｂは５．２ｍｇであった。実験に使用した機器や分析条件は以下の通りである。
【００４８】
分析条件と設備
分析機器：JASCO LC-Net II/ADC, MD 2010 plus, PU 2080 plus, AS 2055 plus, 
LG 2080-02S, DG 2080-53
カラム：Luna 5μ Phenyl-Hexyl column(20 mm×250 mm, Phenomenex)
移動相A：水 (0.1% 蟻酸)
移動相B：100% メタノール
移動相のグラジエント条件;
50% B → 50% B → 95% B → 95% B → 50% B → 50% B
0分      3分      21分     26分     28分     30分
移動相流速：18 mL/min
検出波長：290 nm
【００４９】
精製ＨＰＬＣの条件(ＰＳＢＳ-Ａ、Ｂ共通)
分析機器：上記のものと同じ
カラム：ODS-Hypersil column(5μ, 10 mm×250 mm, Thermo)
移動相A：水 (0.1% 蟻酸)
移動相B：100% アセトニトリル
移動相のグラジエント条件;
40% B → 40% B → 80% B → 40% B → 40% B
0分      3分      15分     18分     21分
移動相流速：3.6 mL/min
検出波長：290 nm
【００５０】
試験例
（１）ＩｇＡ産生促進作用
リンパ球を１０％血清含培地にて１×１０6個／ｍＬに調製し、２４穴プレートに１ｍＬずつ播種した。次いで、ＰＳＢＳ−Ａを適宜希釈し最終濃度６．７、２０および６０ μＭとなるように２４穴プレートへ添加し、３７℃で３日間培養した後、上清をとりＥＬＩＳＡにてＩｇＡ量を測定した。その結果、ＰＳＢＳ−Ａが、ＩｇＡの産生を有意に促進した（図２）。
【００５１】
（２）ＬＰＳ誘導性ＩｇＡ産生促進作用
リンパ球を１０％血清含培地にて１×１０6個／ｍＬに調製し、２４穴プレートに１ｍＬずつ播種した。次いで、大腸菌Ｏ５５由来リポ多糖（ＬＰＳ）を１μｇ／ｍＬとなるよう添加したのち、ＰＳＢＳ−Ａを適宜希釈し最終濃度６．７、２０および６０μＭとなるように２４穴プレートへ添加し、３７℃で３日間培養した後、上清をとりＥＬＩＳＡにてＩｇＡ量を測定した。その結果、ＰＳＢＳ−Ａが、ＬＰＳにより誘導されたＩｇＡの産生を有意に促進した（図３）。
【００５２】
（３）ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６産生抑制作用
リンパ球を１０％血清含培地にて１×１０6個／ｍＬに調製し、２４穴プレートに１ｍＬずつ播種した。次いで、大腸菌Ｏ５５由来リポ多糖（ＬＰＳ）を１μｇ／ｍＬとなるよう添加したのち、ＰＳＢＳ−Ａを適宜希釈し最終濃度６．７、２０および６０ μＭとなるように２４穴プレートへ添加し、３７℃で１日間培養した後、上清をとりＥＬＩＳＡにてＩＬ−６量を測定した。その結果、ＰＳＢＳ−Ａが、ＬＰＳにより誘導されたＩＬ−６の産生を有意に抑制した（図４）。
【００５３】
（４）抗酸化遺伝子の発現増加作用
ＬＯＮＺＡ社製ＥＧＭ−２培地を用い、４８穴プレートにてヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｖｅｃ）を培養した。コンフルエントに達した後さらに２日間培養を継続後、ＤＭＥＭ培地（５．５ｍＭグルコース、２％血清）に変え、５０〜１００μＭのＰＳＢＳ−Ａを含む条件にて４時間処理し、トータルＲＮＡを抽出した。ＧＣＬＭ（glutamate-cysteine ligase, modifier subunit）およびＨＯ−１（heme oxygenase １）の発現レベルを特異的に検出するプライマーを用い、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によりトータルＲＮＡ中の発現レベルを測定した。ＧＣＬＭの検出には、配列が5'‐CAGCGAGGAGCTTCATGATTG‐3'(配列番号１）および5'‐TGCATTCCAAGACATCTGGAAA‐3'(配列番号２)であるプライマーをもちいた。ＨＯ−１の検出には、配列が5'‐CAGGCAGAGAATGCTGAG‐3'(配列番号３)および5'‐GCTTCACATAGCGCTGCA‐3'(配列番号４)であるプライマーを用いた。
その結果、ＰＳＢＳ−Ａを加えた条件でＧＣＬＭとＨＯ−１の発現増加が認められた。Ｎｒｆ２ターゲット遺伝子の有意な発現増加が確認できたことから、ＰＳＢＳ−ＡがＮｒｆ２活性化作用を有することが示唆された（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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