(57)【要約】【課題】タンパク質の化学的糖化によって生じるＡＧＥｓの関連反応を抑制する薬剤を提供する。【解決手段】  成分（Ａ）としてケルセチン及びケルセチン配糖体から選択される１種以上、並びに成分（Ｂ）としてスルフォラファン及びスルフォラファン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有し、下記の（１）〜（３）の全てを抑制するＡＧＥｓ関連反応抑制剤。（１）ＡＧＥｓの形成（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）との結合【選択図】図５
2017145236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分（Ａ）としてケルセチン及びケルセチン配糖体から選択される１種以上、並びに成分（Ｂ）としてスルフォラファン及びスルフォラファン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有し、下記の（１）〜（３）の全てを抑制することを特徴とするＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
（１）ＡＧＥｓの形成
（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現
（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）との結合
【請求項２】
成分（Ａ）と成分（Ｂ）との質量比［（Ａ）：（Ｂ）］が、３０：１〜３：１の範囲である請求項１に記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
【請求項３】
ヒトの血中における成分（Ａ）のケルセチン換算濃度が０．１〜４μＭ、かつ、成分（Ｂ）のスルフォラファン換算濃度が０．１〜４μＭとなるように投与される請求項１または２に記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
【請求項４】
成分（Ａ）がケルセチン又はケルセチングルコシド、かつ、成分（Ｂ）がスルフォラファン又はスルフォラファングルコシノレートである請求項１から３のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有することを特徴とするＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有することを特徴とするサプリメント。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有することを特徴とする機能性食品。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有することを特徴とする化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＥｓ関連反応抑制剤、これを含有するＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤、及びその応用品に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴い生体内蛋白は一様に糖化を受け、臓器障害性の強い終末糖化産物（advanced glycation end products、本明細書において、「ＡＧＥｓ」と記載する）と呼ばれる劣化蛋白を形成するに至る。ＡＧＥｓの生成、蓄積は、加齢や酸化ストレス、慢性炎症、高血糖下でも亢進し、老化のプロセスに深く関わることが明らかにされてきた。
ＡＧＥｓ化した蛋白はその機能が劣化するだけではなく、さまざまな細胞表面に存在するＡＧＥｓ受容体ＲＡＧＥ（receptor for ＡＧＥｓ）によって認識され、酸化ストレスや炎症反応を惹起させて心血管合併症や骨粗鬆症、アルツハイマー病、癌など加齢に伴ってリスクが上がってくる老年疾患をひきおこす原因となっている。
本願発明者らは、［１］動物モデルにおいて、ＡＧＥｓに対して特異的に作用するＡＧＥｓアプタマーを投与しＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系を抑えることでこれら疾患の発症・進展を抑制できること（例えば、非特許文献１参照）、［２］血中のＡＧＥｓや可溶型ＲＡＧＥが、各種疾患の活動度を反映するバイオマーカーとなりうること（例えば、非特許文献２〜４参照）を明らかにしてきた。さらに、食事に由来するＡＧＥｓの過剰摂取が老化を押し進め、臓器障害の進行に関わることも報告されてきている（例えば、非特許文献５，６参照）。
以上の事実は、ＡＧＥｓの形成を阻害することや、ＲＡＧＥの発現を阻害すること、ＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系の活性化を抑えることによって、老年疾患に対する一つの治療標的となりうることを示唆している。
【０００３】
ＡＧＥｓに関連する疾患の予防や治療のため、これまでもＡＧＥｓの形成を阻害する作用の探索がされてきた。例えば、特許文献１ではアントラキノンおよびその誘導体、特許文献２ではジカフェオイルキナ酸またはその薬学的に許容される塩、特許文献３ではアセロラ由来のポリフェノールが、ＡＧＥｓの形成を阻害する作用を成分として報告されている。また、本願発明者らも、非特許文献７において、長期間曝露（７日間）かつ高濃度（２５μＭ以上）のスルフォラファンが試験管内においてＡＧＥｓの形成を特異的に阻害することを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３３１４２号公報
【特許文献２】特許第５２７４８１０号公報
【特許文献３】特許第４４５１６２７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Diabetes 62: 3241-3250, 2013.
【非特許文献２】Int J Cardiol 185: 263-268, 2015
【非特許文献３】Rejuvenation Res. 2012 Dec;15(6):564-72.
【非特許文献４】Front Biosci (Elite Ed). 2010 Jun 1;2:1184-95.
【非特許文献５】Proc Natl Acad Sci USA 111: 4940-4945, 2014
【非特許文献６】Curr Pharm Des. 2007;13(27):2832-6.
【非特許文献７】Diabetes Frontier Online 1, e1-001, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記文献のようにこれまでもＡＧＥｓ形成阻害作用、ＲＡＧＥ遺伝子の発現阻害作用、ＡＧＥｓとＲＡＧＥとの結合阻害作用を有する様々な成分が報告されているが、より優れたＡＧＥｓに関連する反応に対する阻害作用を有する成分の探索が行われているのが実状である。
かかる状況下、本発明の目的は、タンパク質の化学的糖化によって生じる、ＡＧＥsに関連する反応を制限することを可能にするＡＧＥｓ関連反応抑制剤およびその応用品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系でＡＧＥｓの形成を阻害する作用のある成分の探索を行い、ケルセチンが従来の成分と同程度以上のＡＧＥｓの形成を阻害する作用を有することを見出した。さらにケルセチンとスルフォラファンを組み合わせて使用することにより、単独で使用するときよりも一層強い作用を示すことを見出した。
また、ＲＡＧＥ遺伝子の発現やＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系の活性化により誘導されるケモカインの発現を抑制する作用を有することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  成分（Ａ）としてケルセチン及びケルセチン配糖体から選択される１種以上、並びに成分（Ｂ）としてスルフォラファン及びスルフォラファン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有し、下記の（１）〜（３）の全てを抑制することを特徴とするＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
（１）ＡＧＥｓの形成
（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現
（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）との結合
＜２＞  成分（Ａ）と成分（Ｂ）との質量比［（Ａ）：（Ｂ）］が、３０：１〜３：１の範囲である、＜１＞に記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
＜３＞  ヒトの血中における成分（Ａ）のケルセチン換算濃度が０．１〜４μＭ、かつ、成分（Ｂ）のスルフォラファン換算濃度が０．１〜４μＭとなるように投与される、＜１＞または＜２＞に記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
＜４＞  成分（Ａ）がケルセチン又はケルセチングルコシド、かつ、成分（Ｂ）がスルフォラファン又はスルフォラファングルコシノレートである、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤。
＜５＞  ＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有するＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤。
＜６＞  ＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有するサプリメント。
＜７＞  ＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有する機能性食品。
＜８＞  ＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有する化粧料組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、（１）ＡＧＥｓの形成、（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現、（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体との結合の全てに対して阻害作用を有するＡＧＥｓ関連反応抑制剤及びその応用品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】蛍光強度によるＡＧＥｓ形成阻害作用の評価結果である。
【図２】ＥＬＩＳＡ法によるＡＧＥｓ形成阻害作用の評価結果である。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲ法（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によるＡＧＥｓ受容体発現抑制の評価結果である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲ法（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によるＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系の活性化阻害作用の評価結果である。
【図５】ＱＣＭ法によるＡＧＥとＲＡＧＥとの結合の抑制作用され評価結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。
【００１２】
１．ＡＧＥｓ関連反応抑制剤
また、本発明は、成分（Ａ）としてケルセチン及びケルセチン配糖体から選択される１種以上、並びに、成分（Ｂ）としてスルフォラファン、スルフォラファン誘導体及びスルフォラファン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有するＡＧＥｓ関連反応抑制剤である。
【００１３】
本発明において、「ＡＧＥｓ関連反応」とは、「ＡＧＥｓあるいは、ＡＧＥｓの受容体であるＲＡＧＥが関連する反応」のことであり、（１）ＡＧＥｓの形成、（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現、（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体との結合を指す。
（１）ＡＧＥｓの形成とは、還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）によりＡＧＥｓを生じることである。（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体との結合とは、ＡＧＥｓがＡＧＥｓ受容体ＲＡＧＥによって認識されることであり、これによりＡＧＥｓ−ＲＡＧＥ系が活性化し、様々な疾患を引き起こす。
【００１４】
本発明におけるＡＧＥｓ関連反応抑制剤の特徴は、前記（１）〜（３）の全てを抑制する作用を有する成分を含む剤をいう。
なお、前記（１）〜（３）を抑制する作用の評価方法は、有効成分によって前記（１）〜（３）が抑制される作用の有無が判断できれば任意である。例えば、「（１）ＡＧＥｓの形成については、蛍光強度による評価方法、ＥＬＩＳＡ法が挙げられ、（２）ＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現については、ＲＴ−ＰＣＲ法、（３）ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体との結合については、ＱＣＭ法が挙げられる。これらの評価方法は、後述の実施例にて具体的に説明する。
【００１５】
なお、ケルセチン（及びその関連物質）やケルセチン（及びその関連物質）とスルフォラファン（及びその関連物質）を組み合わせが、どのような分子機構を介して、ＡＧＥｓ関連反応を抑制するかについては現時点では完全に明らかでないが、ケルセチンは抗酸化能を有し、酸化ストレスの産生がＡＧＥｓの形成を促進させるという事実から、ケルセチンが抗酸化的に作用し、ＡＧＥｓの形成を抑制する可能性がある。また、ＲＡＧＥ遺伝子の発現が抑制されることにより、すでに生体内に存在し細胞障害に寄与しているＡＧＥｓの反応性を軽減しうる。
【００１６】
また、ケルセチン（及びその関連物質）とスルフォラファン（及びその関連物質）を組み合わせることにより、単独で使用するときよりも一層強い作用を示す原因についても現時点では完全に明らかでないが、ケルセチン（及びその関連物質）とスルフォラファン（及びその関連物質）を組み合わせることにより、両者が相乗的に作用し、ＡＧＥｓの形成を抑制すると共に、ＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系をブロックして、ＡＧＥ、ＲＡＧＥ両面からＡＧＥｓ関連疾患の予防治療に有効である可能性がある。
【００１７】
以下、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤についてより詳細説明する。
【００１８】
＜対象となるＡＧＥｓ＞
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤によって、形成が抑制される対象となるＡＧＥｓは特に制限はない。具体例としては、アルブミン、グロブリン等の血清タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックスタンパク質、Ｇタンパク質等の膜タンパク質及び細胞内タンパク質の糖化により形成されるＡＧＥｓ等が挙げられる。
【００１９】
＜成分（Ａ）＞
成分（Ａ）は、ケルセチン及びケルセチン配糖体から選択される１種以上である。なお、後述するようにこれらの化合物は薬理学的に許容される塩として含有されていてもよい。
【００２０】
ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）は、抗酸化活性を有するポリフェノールの一種であり、人工的に合成したものでも、天然物由来のものでも本発明の抑制剤の有効成分として使用できる。天然物を原料とする場合には、原料動植物から、公知の抽出方法によって得られる抽出物をそのまま用いてもよいし、さらに分離精製を行ってもよい。
【００２１】
ケルセチンを含有する天然物として、例えば、タマネギ、柑橘類、ブドウ類、ベリー類、ソバ、リンゴ、緑茶、ブロッコリー、ケール、モロヘイヤ等が挙げられる。これらの原料植物における使用できる部位としては特に制限はなく、例えば、地上部、根部、実等が挙げられる。これらの原料植物は、１種又は２種以上の成分（Ａ）を含有する材料として、未加工のまま、又は乾燥物や抽出物として使用することができる。
【００２２】
また、ケルセチンは配糖体の形態として配合されていてもよい。ケルセチン配糖体は、人工的に合成したものでも、天然物由来のものでもよい。天然物を原料とする場合には、原料動植物から、公知の抽出方法によって得られる抽出物をそのまま用いてもよいし、さらに分離精製を行ってもよい。
【００２３】
ケルセチン配糖体における糖鎖の構造及び該糖鎖を構成する糖の種類には特に限定はなく、具体的には、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸、ルチノース、ソフォロース、ゲンチオビオース、ザンブビオース、ラチロース、ラミナリビオノース、ゲンチオトリオース、ロビノビオース等が挙げられる。また、糖鎖に含まれている水酸基は、他の基により修飾されていてもよい。
【００２４】
上記糖は、有機酸が単独又は複数エステル化結合した糖（有機酸結合糖）でもよい。該有機酸の結合位置には特に限定はない。上記有機酸の種類及び構成には特に限定はない。上記有機酸は芳香族有機酸でもよく、脂肪族有機酸でもよい。
【００２５】
また、ケルセチン及びその配糖体は、薬理学的に許容される塩として含有されていてもよく、その塩の形態としては、特に制限はないが、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、無機塩（酢酸塩、アンモニウム塩など）、有機アミン塩（ジベンジルアミン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩など）、アミノ酸塩（グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩など）などが挙げられる。
【００２６】
＜成分（Ｂ）＞
成分（Ｂ）は、スルフォラファン及びスルフォラファン配糖体から選択される１種以上である。なお、これらの化合物は薬理学的に許容される塩として含有されていてもよい。
【００２７】
スルフォラファン（ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）は、イソチオシアネートの一種であり、人工的に合成したものでも、天然物由来のものでも本発明の抑制剤の有効成分として使用できる。天然物を原料とする場合には、原料動植物から、公知の抽出方法によって得られる抽出物をそのまま用いてもよいし、さらに分離精製を行ってもよい。
【００２８】
スルフォラファンを含有する天然物として、例えば、キャベツ、ブロッコリー、メキャベツ、カリフラワー、ケール等のアブラナ科の植物（スプラウト含む）が挙げられる。これらの原料植物における使用できる部位としては特に制限はなく、例えば、スプラウト、地上部、根部、実等が挙げられる。特にブロッコリースプラウトはスルフォラファンを高濃度に含むため、成分（Ｂ）の原料として好ましい。
これらの原料植物は、１種又は２種以上の成分（Ｂ）を含有する材料として、未加工のまま、又は乾燥物や抽出物として使用することができる。
【００２９】
また、スルフォラファンは配糖体として配合されていてもよい。スルフォラファン配糖体は、人工的に合成したものでも、天然物由来のものでもよい。天然物を原料とする場合には、原料動植物から、公知の抽出方法によって得られる抽出物をそのまま用いてもよいし、さらに分離精製を行ってもよい。
【００３０】
なお、スルフォラファン配糖体における糖鎖の構造及び該糖鎖を構成する糖の種類は、上述のケルセチン配糖体と同様であるため、説明を省略する。
【００３１】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤の成分（Ｂ）として、スルフォラファングルコシノレート（ＳＧＳ）は、熱に強く、水に溶けやすいため好適である。なお、スルフォラファンは、通常、植物細胞内では前駆物質であるＳＧＳの状態で存在し、ＳＧＳが咀嚼などによってミロシナーゼと反応し、加水分解されることでスルフォラファンに変化する。
【００３２】
また、スルフォラファン及びその配糖体は、薬理学的に許容される塩として含有されていてもよい。その塩の形態としては、特に制限はなく、ケルセチン及びその配糖体で例示したものと同様の塩が挙げられる。
【００３３】
＜成分（Ａ）、成分（Ｂ）の含有量、割合＞
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤における成分(Ａ)や成分（Ｂ）の含有量は、対象となる疾患に対する予防、治療又は症状の改善のために必要な活性阻害作用や投与方法等を勘案して、必要量が摂取できるような範囲で適宜決定される。すなわち、成分(Ａ)や成分（Ｂ）の有効量の最適範囲の判定は当業者の技術の範囲内であり、制限的であるものではない。
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤が、前記（１）〜（３）の少なくとも１以上に対して、より優れた抑制作用が得られる点で、成分（Ａ）の質量と成分（Ｂ）の質量との質量比［（Ａ）：（Ｂ）］が、３０：１〜３：１の範囲であることが好適であり、より好適には１５：１〜６：１である。
このような範囲であれば、本発明のＡＧＥｓ形成抑制剤を使用したときに、前記（１）〜（３）の少なくとも１以上に対して、優れた抑制作用が得られる。成分（Ａ）の質量と成分（Ｂ）の一方の割合が多すぎても、少なすぎても成分（Ａ）と成分（Ｂ）の相乗効果による抑制作用が得られない場合がある。
【００３４】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤において成分（Ａ）と成分（Ｂ）の組み合わせは任意であるが、好ましい組み合わせの一例は、成分（Ａ）がケルセチン、かつ、成分（Ｂ）がスルフォラファン又はスルフォラファングルコシノレートの組み合わせである。
【００３５】
＜ＡＧＥｓ関連反応抑制剤の形態＞
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、その有効量を薬学的に許容される担体とともに配合し、固形製剤又は液状製剤として経口又は非経口的に投与することができる。剤形は通常の経口投与または非経口投与に使用されるものならどのような剤形でもよい。
経口投与または非経口投与に利用される剤形としては、具体的には、固形製剤として、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ等が挙げられる。また、液状製剤として内用液剤、外用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射液、輸液等が例示され、これら剤形やその他の剤形が目的に応じて適宜選択される。
【００３６】
固形製剤において、主剤である本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味剤、安定化剤などの補助剤を用いてもよい。主剤と補助剤の比率は目的に応じて適宜選択される。
固形製剤における賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプンなどが挙げられる。結合剤の好適な例としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。崩壊剤の好適な例としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いてもよい。
【００３７】
また、液状製剤として用いる場合、溶媒としては有効成分である上記化合物の分散性を有し、生体安全性があるものが選択される。溶媒の好適な例としては、例えば、注射用水、エタノール、プロピレングリコールなどが挙げられる。
【００３８】
また、液状製剤は、主剤である本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤と共に、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤等の補助成分を含んでいてもよい。
溶解補助剤の好適な例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カヒドロキシメチルセルロース等が挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩等の緩衝液が挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
【００３９】
また、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤には、その活性阻害作用を抑制しない範囲で、公知の任意の成分を含有してもよい。例えば、安定剤や湿潤剤や乳化剤を加えたり、浸透圧調製剤またはｐＨ調製剤として塩を補助薬として、適宜用いることができる。
【００４０】
上記固形製剤や液状製剤の製法は、一般的な医薬品や医薬部外品の製法を適用することができる。
【００４１】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、ＡＧＥｓが関与する疾患の種類や症状の程度によって、剤形、投与量、投与方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤の投与方法は任意であり、経口投与、非経口投与の選択も含めて、対象となる疾患に応じて適宜決定され、制限的であるものではない。
【００４２】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤において、ヒトの血中における成分（Ａ）のケルセチン換算濃度が０．１〜４μＭ（より好適には０．４〜１．６μＭ）、かつ、成分（Ｂ）のスルフォラファン換算濃度が０．１〜４μＭ（より好適には０．４〜１．６μＭ）となるように投与されることが好ましい。投与方法は経口、非経口のいずれでもよい。
ここで、「ケルセチン換算濃度」とは、成分（Ａ）がケルセチンの場合にはケルセチン濃度であり、ケルセチン配糖体の場合には対象となる化合物の分子量のうち、ケルセチンが占める分子量で換算した濃度である。「スルフォラファン換算濃度」についても同様である。
このような範囲であれば、インビトロ試験において有意なＡＧＥｓ形成抑制の相乗効果が認められるため、ヒトの体内においても成分（Ａ）と成分（Ｂ）の相乗効果によるＡＧＥｓ形成抑制作用が期待される。同様に、ＲＡＧＥ遺伝子の発現抑制やＡＧＥｓとＲＡＧＥの結合抑制に対しても、優位な相乗効果が認められるため、ヒトの体内においても成分（Ａ）と成分（Ｂ）の相乗効果による抑制作用が期待される。
なお、健常人が１００ｍｇのケルセチンを摂ると、ケルセチンの血中濃度が０．３〜０．６μＭ程度まで上昇することが知られている。また、健常人が３．９ｍｇのスルフォラファンを摂ると、血中濃度がおよそ７０ｎＭ〜１００ｎＭになることが知られている。
【００４３】
また、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤の有効成分である成分(Ａ)や成分（Ｂ）には生体吸収性が乏しい化合物も含まれる。例えば、ケルセチンは水溶性ではあるが、生体吸収性がそれほど高くない。生体吸収性に乏しい成分(Ａ)や成分（Ｂ）では、前記（１）〜（３）に対する抑制作用に基づく上記薬効が期待できないため、生体吸収性を高めるために生体吸収促進剤を投与することが好ましい。生体吸収促進剤は本発明の薬剤の成分として含有してもよいし、本発明の薬剤と併用して生体吸収促進剤を用いてもよい。
【００４４】
さらに、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、種々の疾患の治療において、前記有効成分の他に、必要に応じて他の医薬として有効な成分を含有させることもできる。
【００４５】
２．ＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤
本発明のＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤（以下、「本発明の薬剤」と記載する。）は、上述の本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有する。
【００４６】
本明細書において、「予防治療用薬剤」とは、対象となる疾患の予防、治療、症状の改善の少なくともひとつに対して有用な薬剤を意味する。また、本明細書において、「予防治療用薬剤」には、医薬品のみならず、医薬部外品も含む。
【００４７】
本発明の薬剤は、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤以外にもその効能を損なわない範囲で他の薬剤や薬理学的に許容される任意の成分を含んでもよい。また、本発明の薬剤は、実質的な有効成分である成分（Ａ）または成分（Ａ），（Ｂ）を含んでいればよく、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤そのものを、本発明の薬剤として使用してもよい。
【００４８】
本発明の薬剤は、ＡＧＥｓが関与する疾患の予防、治療、症状の改善の少なくともひとつに対して有用である。すなわち、「予防」には、当該疾患または症状の発症の抑制および遅延が含まれる。また、「治療」には、当該疾患または症状の病態の改善および寛解、並びに当該疾患または症状の進展の抑制が含まれる。
【００４９】
本発明の薬剤の対象となる、ＡＧＥｓ関連疾患の具体例としては、糖尿病性血管合併症、心筋梗塞、心不全、不整脈や脳血管障害、動脈硬化症関連疾患、勃起障害、不妊、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患、うつ、アルコール依存症による脳障害及び肝障害、歯周病、はげ、サルコペニア、変形性関節症、慢性関節リウマチ、ロコモティブシンドロームや骨粗鬆症等の筋肉骨格系疾患、しわ、たるみ、くすみなど皮膚老化、虚弱、貧血、腎機能障害などの老化現象、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肥満、食物アレルギー、喘息、白内障、脂肪肝、腫瘍の増殖及び転移等が挙げられる。
【００５０】
本発明の薬剤は、ＡＧＥｓ形成抑制剤を含有していればよく、どのような形態の薬剤であっても構わない。本発明の薬剤の形態としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はカプセル剤等の剤型がある。本発明の薬剤の形態は、固体又は液体同士でもよいし、固体と液体でも良いし、特に限定されない。投与方法としては、経口又は非経口であってもよい。本発明の薬剤の好適な態様としては、経口剤や皮膚外用剤が挙げられる。
【００５１】
３．薬剤以外の用途
また、本発明の薬剤の有効成分である成分（Ａ），（Ｂ）は、医薬品、医薬部外品以外の製品に配合してもよい。
そのような用途のうち、好適な具体例としては、サプリメント、機能性食品、化粧料組成物が挙げられる。
【００５２】
（サプリメント）
本発明のサプリメントは、ＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有する。本発明のサプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液、懸濁液等の任意の形態でよい。
本発明のサプリメントは、ＡＧＥｓ関連反応抑制剤以外に、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、アミノ酸，ペプチド；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＢ、葉酸等のビタミン類；ミネラル類；糖類；無機塩類；クエン酸またはその塩；茶エキス；油脂；プロポリス、ローヤルゼリー、タウリン等の滋養強壮成分；ショウガエキス、高麗人参エキス等の生薬エキス；ハーブ類：コラーゲン等が挙げられる。
【００５３】
（機能性食品）
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、日常的に経口摂取しやいように、各種の食品、飲料と混ぜて機能性食品とすることで、長期的に摂取することも容易である。
ここでいう「機能性食品」とは、一般食品に加えて、健康の維持の目的で摂取する食品および／又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品や栄養機能食品や、健康食品、栄養補助食品、栄養保険食品等を含む概念である。この中でも保健機能食品である特定保健用食品や栄養機能食品が好ましい機能性食品の態様である。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料等を添加していてもよい。
【００５４】
本発明の機能性食品の対象となる、食品、飲料は特に限定されるものではない。例えば、食品として、ソーセージ、ハム、魚介加工品、ゼリー、キャンディー、チューインガムなどの食品類が挙げられる。また、飲料としては、各種の茶類、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンクなどが挙げられる。
【００５５】
（食品添加剤）
また、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、それ自体またはこれに他の成分を添加して食品添加剤として使用することも可能である。他の成分は、飲食品添加剤として使用可能であるならば特に制限はない。食品添加剤の添加対象となる飲料、食品についても任意であり、特に制限はない。
【００５６】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。そのため、動物用のＡＧＥｓ関連反応抑制剤として使用してもよく、また、ペットフード等の動物用のサプリメントや機能性食品へ添加することもできる。
【００５７】
（化粧料組成物）
本発明の化粧料組成物は、上記本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有することを特徴とする。本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、前記（１）〜（３）に対し優れた抑制作用を有し、かつ、各種化粧料基材及び化粧料添加物に対して任意に配合できる。
【００５８】
本発明の化粧料組成物は、慣用の化粧料基材を適宜配合し、所望の剤型とすることができる。その形態は特に制限はないが、化粧水、乳液、ジェル、クリーム、パック、ヘアトニック、ヘアクリームファンデーション、水性軟膏、スプレー等の形態が挙げられる。また、本発明において、化粧料組成物は、入浴剤、ボディーソープ、シャンプー等の入浴用組成物も含む概念である。
【００５９】
また、本発明の化粧料組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で通常化粧料や皮膚外用医薬、入浴用製品で使用される任意の成分を添加することができる。かかる任意成分の具体例としては、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、ミツロウ等が挙げられる。これら任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。
【００６０】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤を、化粧料組成物に配合する割合は任意であるが、成分（Ａ）や成分（Ｂ）の含有量として、化粧料組成物が前記（１）〜（３）に対し抑制作用を十分に発揮する範囲で適宜選択される。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
ケルセチンのＡＧＥｓ阻害作用の評価として、蛍光強度を用いた評価（評価１）及びＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法を用いた評価（評価２）を行った。
【００６３】
＜評価１＞：蛍光強度を用いた評価
蛍光強度を用いたケルセチンによるＡＧＥｓ阻害作用の評価は、既報「J Biol Chem 272: 8723-8730, 1997.」」に準じる方法で行った。
まず、２５ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミン（シグマーアルドリッチ）を０．１Ｍのグリセルアルデハイド（ナカライ）と各種濃度のケルセチン（シグマーアルドリッチ）存在、非存在下に、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液中で０から７日間３７℃でインキュベーションした。なお、０日とは、２５ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミンのみの条件を意味する。０、１、３、５、７日目にサンプルを５０μＬ採取し、プレートリーダー（PerkinElmer社製）を用い、励起波長３５５ｎｍで４６０ｎｍの蛍光強度を測定した（Ｎ＝３）。
【００６４】
評価１の結果を図１に示す。なお、データは、平均±標準誤差で示した。データ間の統計比較は、Student’s t-testにより、p＜0.05の場合、有意差ありと判定した。
図１に示すごとく、０．４μＭケルセチン存在下で１日間、３日間、７日間、０．８μＭケルセチン存在下で１日間、３日間、１．６μＭケルセチン存在下で１日間、３日間、７日間、グリセルアルデハイドとウシ血清アルブミンをインキュベーションすると、ＡＧＥｓに特徴的な蛍光活性が有意に低下することが見いだされた。すなわち、この結果からケルセチンによりＡＧＥｓ形成が抑制されていることが分かる。
【００６５】
＜評価２＞：ＥＬＩＳＡ法を用いた評価
ＥＬＩＳＡ法を用いたケルセチン及び/又はスルフォラファンによるＡＧＥｓ阻害作用の評価は、既報「Diabetes Care 35: 2618-2625, 2012.」に準じる方法で行った。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液中で２５ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミンと２ｍＭのグリセルアルデハイドを０．４μＭケルセチンや０．４μＭスルフォラファン（シグマーアルドリッチ）存在下、又は非存在下に５日間３７℃でインキュベーションした。その後、各サンプルをPD-10クロマトグラフィーカラム（GE Healthcare、東京）で精製、分離し、リン酸バッファーで透析後、ＡＧＥｓ化したアルブミン量をＡＧＥｓに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した（Ｎ＝５）。なお、標準曲線における ＡＧＥｓ化したアルブミンの５０％阻害濃度を１Ｕとした。
【００６６】
評価２の結果を図２に示す。なお、データは、平均±標準誤差で示した。データ間の統計比較は、Student’s t-testにより、p＜0.05の場合、有意差ありと判定した。
図２に示される通り、０．４μＭケルセチンによりＡＧＥｓの形成が有意に抑えられていることがわかる。すなわち、０．４μＭケルセチンを共存させることにより、蛍光強度から半定量的に推定されるＡＧＥｓ形成だけでなく（評価１）、ＥＬＩＳＡ法で特異的に測定されるグリセルアルデハイドに由来するＡＧＥｓの生成を有意に抑制できることが確認された。
【００６７】
さらに、図２に示されるように同じように低濃度（０．４μＭ）のスルフォラファンにはＡＧＥｓの形成を有意に抑える働きはなかったが、０．４μＭケルセチンと０．４μＭスルフォラファンとを共存させることで、ケルセチンによるＡＧＥｓ阻害作用が強まることが確認された。
【００６８】
＜評価３＞：ＲＴ−ＰＣＲ法（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法による評価
ＲＴ−ＰＣＲ法による評価は以下の手順で行った。
０．４μＭのケルセチン及び０．４μＭスルフォラファン（シグマーアルドリッチ）存在下、又は非存在下で、血管内皮細胞を１００μｇ／ｍＬ（ヒトの血液中に存在するのと同程度）のＡＧＥ化したウシ血清アルブミンで４時間処理し、NucleoSpin（登録商標） RNA XS（タカラバイオ、東京）を用いて内皮細胞からｍＲＮＡを抽出した。その後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応でＲＡＧＥ（Ａ）とＭＣＰ−１(Ｂ)の遺伝子発現に及ぼす影響について検討した。ＡＧＥ化していない血清アルブミンで同様に４時間処理した内皮細胞におけるＲＡＧＥ（Ａ）とＭＣＰ−１(Ｂ)の遺伝子発現をそれぞれ１として、各条件下におけるＲＡＧＥ（Ａ）とＭＣＰ−１(Ｂ)の遺伝子発現の程度を数量化した。
【００６９】
評価３の結果を図３、４に示す。なお、データは、平均±標準誤差で示した。データ間の統計比較は、Student’s t-testにより、p＜０．０５の場合、有意差ありと判定した。
図３、４に示す通り、０．４μＭケルセチンや０．４μＭスルフォラファン非共存下では、内皮細胞に存在するＲＡＧＥ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ）と呼ばれるＡＧＥｓ受容体の遺伝子（ｍＲＮＡ）量が有意に増え、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ系が活性化し、ＭＣＰ−１（単球走化性因子；ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）と呼ばれるケモカインの発現が誘導されて内皮細胞が障害された。一方、０．４μＭのケルセチンと０．４μＭのスルフォラファンの共存下では、ＲＡＧＥの遺伝子（ｍＲＮＡ）量および、ＭＣＰ−１の発現が統計学的に有意に、かつ、強く抑えられることが確認された。
【００７０】
＜評価４＞：水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ法）による評価
ケルセチン配糖体及びスルフォラファンの混合物に、ＡＧＥｓとＡＧＥｓ受容体（ＲＡＧＥ）との結合を抑制する作用があることを確認するためのＱＣＭ法による評価を、以下の手順で行った。
評価は、既報「Diabetes. 2013 Sep;62(9):3241-50」に準じて、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ法、イニシアム社製）でおこなった。なお、ＱＣＭ法は、一定の振動数で振動している水晶振動子表面に物質が結合するとその質量分だけ振動数が下がり、脱離すると振動数が上がるという原理を利用した測定方法である。なお、本評価では、ＲＡＧＥを固定化した板状の水晶にＡＧＥｓが結合した際に生じる振動数の減少が、被験物質の添加により抑制されるか否かを評価し、振動数の減少が抑制される程度が、被験物質によるＡＧＥｓとＲＡＧＥとの結合に対する阻害作用の大きさの指標となる。
まず、セラミックセンサーチップ（イニシアム社製）に１０μg/ｍＬＲＡＧＥ溶液を１００μＬ滴下し、室温で２時間静置し、ＲＡＧＥを固定化した。次いで、リン酸緩衝液に、ケルセチン配糖体であるケルセチングルコシド（玉ねぎの皮由来抽出物）０．４μＭ及びスルフォラファン０．４μＭを溶解させた溶液（８ｍＬ）に、ＲＡＧＥを固定化したセンサーチップを浸漬し、振動数変化が安定化した後、８μＬのＡＧＥｓ溶液（０．２ｍｇ/ｍＬ）を滴下し、振動数変化量を測定した。同様の操作を計３回行い、１セットの評価とした。また、コントロールとして、ケルセチングルコシド及びスルフォラファン非存在下での同様の評価を行った。
【００７１】
２．評価結果
評価の結果を図５に示す。なお、データは、基準周波数を０とし、基準周波数からの減少分を平均（３回）±標準誤差で示した。データ間の統計比較は、Student’s t-testにより、p＜0.05の場合、有意差ありと判定した。
図５に示すごとく、コントロールではＡＧＥ濃度の増加に伴い、振動数が減少し、ＡＧＥｓとＲＡＧＥの結合が生じていることが確認された。一方、０．４μＭケルセチングルコシド及び０．４μＭスルフォラファンの共存下では、非存在下（コントロール）に対して、振動数の減少が小さく、ＡＧＥｓのＲＡＧＥへの結合が抑制されていることが確認された（ＡＧＥｓ０．４μｇ/ｍL、０．６μｇ/ｍLでコントロールに比べ、有意差あり（p<0.05））。
【００７２】
以上の事実から、ケルセチン（及びその関連物質）とスルフォラファン（及びその関連物質）の２つが同時に存在すると、ＡＧＥｓの形成がより効果的に抑えられ、ＡＧＥｓ受容体の遺伝子の発現およびＡＧＥｓ-ＲＡＧＥ系の活性化によるケモカインの発現を効果的に抑えられ、さらにはＡＧＥのＲＡＧＥへの結合が抑制されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤は、ＡＧＥｓ関連反応に対して優れた抑制作用を有すると共に、人体に対する毒性や刺激性が少ない。そのため、本発明のＡＧＥｓ関連反応抑制剤及びＡＧＥｓ関連反応抑制剤を含有するＡＧＥｓ関連疾患の予防治療用薬剤、並びにサプリメント、機能性食品及び化粧料組成物等への応用が可能であり、日常的に使用することが期待できる。
【図１】
2017145236.tif 000003
【図２】
2017145236.tif 000004
【図３】
2017145236.tif 000005
【図４】
2017145236.tif 000006
【図５】
2017145236.tif 000007