(57)【要約】【課題】      本願発明は、天然物由来の血液凝固阻害剤等を提供することを目的とする。【解決手段】  血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤であって、日本山ニンジンから抽出した抽出物を有効成分として含有する、血液凝固阻害剤である。特に、エタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とすることにより、発明者によって血液凝固作用の濃度依存性が確認された。さらに、特定の構造を有するヒュウガニンＣが止血における凝固カスケードの外因性経路に影響して血液の凝固を阻害することを見出した。本発明により、副作用の少ない血液凝固阻害剤を提供することが容易となる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤であって、
日本山ニンジンから抽出した抽出物を有効成分として含有する、血液凝固阻害剤。
【請求項２】
水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、請求項１記載の血液凝固阻害剤。
【請求項３】
止血における凝固カスケードの外因性経路に影響して血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤であって、
4-ヒドロキシ-3-置換クマリン環の構造を有するクマリン類化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻害剤。
【請求項４】
構造式が（１）式で示されるヒュウガニンＣを有効成分として含有する、請求項３記載の血液凝固阻害剤。
【化１】
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【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の血液凝固阻害剤を有効成分として含有する食品、医薬部外品又は医薬品。
【請求項６】
血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤の生産方法であって、
日本山ニンジンから抽出物を抽出する抽出ステップを含み、
前記抽出ステップにおいて、水、又は、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、血液凝固阻害剤の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固阻害剤及び血液凝固阻害剤の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理学的条件下における血小板接着や血小板凝集などの血小板活性化は、止血の重要な過程である。血小板活性化及びその後の血栓形成は、血管損傷部位における正常止血に極めて重要である。しかし、アテローム発生、心筋梗塞、脳卒中においても重要な役割を果たすことが知られている。
【０００３】
抗血小板療法は、心疾患患者の病的状態や死亡率を改善することが知られている（特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、抗血小板療法は、休止血小板及び活性化血小板を阻害し、正常な止血過程を乱して出血量を増加させる。
【０００５】
加えて、抗血小板療法は、人工物由来であることが一因の抵抗性も伴い、副作用や禁忌が報告されている。
【０００６】
したがって、心疾患の予防や治療における代替物になる天然産物の調査が促されている。
【０００７】
ゆえに、本願発明は、天然物由来の血液凝固阻害剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の観点は、血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤であって、日本山ニンジンから抽出した抽出物を有効成分として含有する、血液凝固阻害剤である。
【０００９】
本発明の第２の観点は、第１の観点の血液凝固阻害剤であって、水、又は、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる。
【００１０】
本発明の第３の観点は、血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤であって、4-ヒドロキシ-3-置換クマリン環の構造を有するクマリン類化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻害剤である。
【００１１】
本発明の第４の観点は、第３の観点の血液凝固阻害剤であって、構造式が（１）式で示されるヒュウガニンＣを有効成分として含有する。
【００１２】
本発明の第５の観点は、第１から第４のいずれかの観点の血液凝固阻害剤を有効成分として含有する食品、医薬部外品又は医薬品である。
【００１３】
本発明の第６の観点は、血液の凝固を阻害する血液凝固阻害剤の生産方法であって、日本山ニンジンから抽出物を抽出する抽出ステップを含み、前記抽出ステップにおいて、水、又は、水よりも極性の低い溶媒を抽出溶媒として用いる、血液凝固阻害剤の生産方法である。
【００１４】
また、本発明を、血液の凝固を阻害する血液凝固阻害方法であって、日本山ニンジンからの抽出物を血しょうに投入する投入ステップを含む、血液凝固阻害方法と捉えてもよい。
【００１５】
【化１】
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【発明の効果】
【００１６】
本発明の各観点によれば、日本山ニンジンから、血液凝固阻害作用の生理活性効果を有する抽出物を抽出して、血液凝固阻害有効成分を含有する製品が提供可能となる。
【００１７】
また、本発明の第２の観点によれば、血液凝固阻害作用を有する抽出物を効率的に抽出することが可能となる。特に、本発明の発明者は、エタノール抽出物又はメタノール抽出物が濃度依存的に血液凝固阻害作用を有することを見出した。この点、実験結果を後述する。
【００１８】
そのため、日本山ニンジンから抽出されたエタノール抽出物又はメタノール抽出物の濃度を調整することにより、副作用の少ない血液凝固阻害剤を得ることが容易となる。
【００１９】
さらに、本発明の第３の観点によれば、本発明者らが特定した構造を有する化合物の凝血作用を利用して効果的な血液凝固阻害剤を生産可能となる。特に、本発明の第４の観点に係るヒュウガニンＣの血液凝固阻害作用を利用した血液凝固阻害剤を生産可能となる。
【００２０】
一般に、クマリン類は抗凝血剤として用いられている。しかし、本発明者らは、日本山ニンジンから単離されたクマリン類化合物の中で、ヒュウガニンＣのみがプロトロンビン時間のみを顕著に増大させることを見出し、止血における凝固カスケードの外因性経路に影響して血液の凝固を阻害することを示した。
【００２１】
ここで、いわゆる日本山ニンジンと言われるセリ科植物には、イヌトウキ（犬当季：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ）とヒュウガトウキ（日向当季：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｔｅｎｕｉｓｅｃｔａ  ｖａｒ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ）という２種類の学名のシシウド属に属する植物がある。日本山人参は、イヌトウキ及びヒュウガトウキとこれらの近似植物の総称と言われることもある。総称と捉えれば、イヌトウキとヒュウガトウキの他にも、トウキ、ホッカイトウキ、セイヨウトウキ、カラトウキ、シシウド、アシタバという同属の学名のものが含まれる。
【００２２】
日本山ニンジンは、日本で伝統的に薬として用いられてきた。一例として、伝統的には心臓血管の病気に効くとされている。しかしながら、日本山ニンジンの作用機序は明らかにされてこなかった。抽出物の生理活性効果があまり明らかにされていなかった。特に、これまで、日本山ニンジンの止血系への影響については知られていない。日本山ニンジンの抽出物が、本発明の各観点のような、生理活性を有することは、発明者らによって明らかにされたものである。また、日本山ニンジンの抽出物の構成成分（単離物質）についても、発明者らによって明らかにされたものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】日本山ニンジンからのエタノール抽出物の血液凝固阻害作用を示す図である。
【図２】ヒュウガニンＣの構造式を示す図である。
【図３】ＡＭＥ及びヒュウガニンＣの抗凝血作用の分析結果を示す図である。
【図４】抗血小板活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
エタノール抽出物の抽出方法
日本山ニンジンの地上部２０ｇを１５０ｍｌのエタノールに浸漬し、常温で時々攪拌しながら一昼夜置いた後にろ過した。ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液（エタノール抽出液）から溶媒を除去し、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で任意の濃度に調製し、血液凝固阻害作用の検討のための下記の実験に用いた。
【００２５】
血液凝固阻害作用の検討
実験に使用される血液は、研究開始前にインフォームド・コンセントに署名した健康な安静状態の献血者（２０歳から２８歳のボランティア５０人）から得られた。被験者としては、血液病の既往歴がなく、少なくとも直近１４日以内に薬を服用しておらず、喫煙者ではなく、実験当日にカフェインを摂取しておらず、少なくとも直近３日以内に漢方薬、にんにく、アルコール又は過度の野菜を摂取していない人物を選んだ。凝固の外因性経路、内因性経路を評価するために、それぞれプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定した。凝固の最終段階にはトロンビン時間（ＴＴ）が評価された。各時間の測定には、自動血液凝固測定装置Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）  ＣＡ−５６０（Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）社）を用いた。
【００２６】
最終濃度がそれぞれ５、１０、２０μｇ／ｍｌ(最大溶解度)になるようにエタノールで溶解されたエタノール抽出物(エタノールの最終濃度は０．１％)存在下で、乏血小板血漿を３７℃で５分間プレインキュベートした。各試料は５回ずつ測定を行い、凝固検査の結果は、平均値±標準偏差として秒数で表した。統計解析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にｔ検定を行い、p値が０．０５以下の場合、統計学的に有意であると判断した。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０（グラフパッドソフトウェア社)を使用した。
【００２７】
なお、ポジティブコントロールとして、ヘパリンを用いた。ヘパリンは抗凝固薬の一つであり、血栓閉塞症、体外循環での血液の凝固防止などに用いられている。最終濃度１０μｇ／ｍｌのヘパリンのプロトロンビン時間は３９．３±１．８秒、最終濃度０．５μｇ／ｍｌのヘパリンの活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間は、それぞれ１０８．２±１．１秒、２１．６±２．１秒であった。
【００２８】
図１は、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、及びトロンビン時間のエタノール抽出物濃度依存性を示す図である。図１を参照して、日本山ニンジンのエタノール抽出物が濃度依存的に、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間の全てを有意に延長させることが明らかになった。この実験結果は、ポジティブコントロールのヘパリンの値と比較しても、日本山ニンジンのエタノール抽出物が、血液凝固阻害作用を有することを示している。
【００２９】
なお、日本山ニンジンの水抽出物にも血液凝固阻害作用がみられた。しかし、エタノール抽出物の方がその効果は顕著にみられた。そのため、日本山ニンジンから抽出されたエタノール抽出物の濃度を調整することにより、副作用の少ない血液凝固阻害剤を得ることが容易となる。
【００３０】
さらに、本発明者らは、日本山ニンジンの抗凝血作用を物質レベルで分析した。以下、日本山ニンジンの成分分析の詳細を述べる。
【００３１】
日本山ニンジンの地上部の乾燥粉末２０ｇを室温（２５℃）でメタノール（１５０ｍｌ×３）を用いて抽出し、日本山ニンジンのメタノール抽出物（ＡＭＥ）を得た。抽出物は、ロータリーエバポレーターで濃縮した。収率は、8.4％であった。
【００３２】
抽出物から、ヒュウガニンC（hyuganin  C）を含むクマリン類も単離し、構造を解析した。構造解析は、1H-NMR、13C-NMR、及び、２次元解析により行った。ここで、解析装置として、Bruker  DRX  600  NMR分光計（Bruker（登録商標）  Daltonics  Inc.,  Billerica,  Ma,  USA）を用いた。ヒュウガニンＣの構造式を図２に示す。
【００３３】
ＡＭＥ及び各化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして貯蔵し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で薄めて用いた。最終的なＤＭＳＯの濃度は、１％未満とした。
【００３４】
血液凝固分析の試薬は、Siemens（登録商標）  Healthcare  Laboratories（Siemens  Medical  Solutions,  Malvern,  USA）から購入した。用いた試薬は、プロトロンビン時間（ＰＴ）分析にはトロンボレル（登録商標）S、ＡＰＴＴにはパトロンチン（登録商標）SL及び0.025Mの塩化カルシウム養液、ＴＴにはトロンビン試薬、さらに、コントロール用正常者由来血漿及びコントロール用病変患者由来血漿を用いた。血小板凝集分析の試薬として、アラキドン酸（ＡＡ）及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を用いた。ＡＡ及びＡＤＰは、Chrono-log  Corporation（Chicago,  IL,  USA）から購入した。
【００３５】
実験に使用される血液は、上記と同様にして得た。サンプル血液は、被験者の肘脈から静脈穿刺によりクエン酸血採取システムを用いて最少閉塞状態で集められた。1.8ｍLの静脈血をクエン酸ナトリウム（3.2%）溶液200μLを抗凝血剤として内包する無菌チューブに移送して、９：１の体積比（０．１２９M）とした。
【００３６】
採取したクエン酸血サンプルに対して、低速（170g、室温で１０分、ブレーキ適用なし）の遠心分離（MPW  350R,  MED.  Instruments,  Warsaw,  Poland）を行い、多血小板血しょう（Platelet  Rich  Plasma;  ＰＲＰ）を得た。残余の成分にさらに2000g、室温で１５分の遠心分離を行い、乏血小板血しょう（Platelet  Poor  Plasma;  ＰＰＰ）を得た。PPPを集めて再度濃縮し、-70℃で保存した。以上のプロセスを全て血液学の英国ガイドライン（British  Committee  for  Standards  in  Hematology;  BCSH）に従って行った。ＰＲＰに対しては抗凝集分析を行い、ＰＰＰに対しては抗凝固分析を行った。
【００３７】
標準クエン酸PPP(50μl)を異なる濃度（最終濃度が1.25,  2.5,  5,  10,  20μg/ml）のAME及び化合物（1.25,  2.5,  5,  10,  20μg/ml））と一緒に37℃で５分かけてプレインキュベートした上でPT、APTT、TT測定を行った。１％のDMSO及びヘパリンを含む食塩水溶液を、それぞれネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして用いた。最終濃度は、PT測定用には10μg/ml、APTT測定及びTT測定用には0.5μMとした。
【００３８】
また、様々な作用薬を透過して混濁したPRPサンプルに分光測定を行い、光透過を利用した血小板凝集能測定を行った。作用薬に起因して血小板凝集が起こる結果、濁度が低下して透過率が増大する。PRPは、上記したように、クエン酸血を濃縮して鮮度のよいものを用いた。PRPに対して血小板算定を行って血小板濃度が250×109/Lであることを確認した直後に実験を行った。濃度の異なるPRPサンプル480μLと凝集試薬を凝集キュベット内に37℃で５分間保温した。続いて、混合液にADP又はAAを5μL投入し、最終濃度をADPについては10μM、AAについては0.5mMとした。得られた凝集物を1,000rpmで撹拌しながらDual-channel  Lumi-aggregometer（Chrono  Log  540-VS  Platelet  Aggregometer  Chronolog  Corporation,  Chicago,  USA）を用いて６分間測定し、透過率の変化をパーセント表記で記録した。各サンプルに対して、サンプル作製から１時間以内に測定を行った。１％のDMSO及びアセチルサリチル酸（最終濃度10μg/ML）を含むPBSをそれぞれネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして用いた。得られた結果を試薬誘発性血小板凝集の阻害率として記録した。この阻害率は、阻害率（％）＝（１−サンプルの血小板凝集／コントロールの血小板凝集）×１００（％）で表される。
【００３９】
統計処理として、規格化のために、全ての変数にコルモゴロフースミルノフ検定を用いた。正規分布した連続変数は、平均値±標準偏差として表した。３度の独立した実験を実施し、各試料は５回ずつ測定を行った。カテゴリー変数は、数値（パーセント）で表記した。独立グループの比較にはマン・ホイットニーのＵ検定を行った。統計解析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にダネットの検定を行った。統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０（グラフパッドソフトウェア社)を使用した。p値が０．０５以下の場合、統計学的に有意であると判断した。
【００４０】
図３は、ＡＭＥ及びヒュウガニンＣの抗凝血作用の分析結果を示す図である。ＡＰＴＴの増大は、内因性経路に影響を及ぼしていることを示す。また、ＰＴの増大は、外因性経路に影響を及ぼしていることを示す。また、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールの値を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
図３（ａ）から、ＡＭＥの投入量が５、１０、２０μg/MLと増加するに伴い、ＰＴ、ＡＰＴＴ及びＴＴが顕著に（Ｐ＜０．００１）増大していることが見てとれる。このことから、ＡＭＥは、外因性経路及び内因性経路の両方に影響を及ぼしていることが分かる。
【００４３】
他方、図３（ｂ）から、ヒュウガニンＣの投入量が１０、２０μg/MLと増加するに伴い、ＡＰＴＴ及びＴＴはほとんど変化しなかったものの、ＰＴが顕著に増大していることが見てとれる。このことから、ヒュウガニンＣは、外因性経路に影響を及ぼしていることが分かる。
【００４４】
日本山ニンジンの地上部から単離されたクマリン類の物質のうち、１０μＭ及び２０μＭの投与量増大に伴ってＰＴ及びＴＴが顕著に増大してＡＰＴＴが増大しなかったのは、ヒュウガニンＣのみであった。このことは、ヒュウガニンＣのみに外因性経路の活性化の効果が見られたことを意味する。
【００４５】
続いて、抗血小板活性の測定結果について述べる。図４は、抗血小板活性の測定結果を示す図である。図４の縦軸は、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びアラキドン酸（ＡＡ）に起因する血小板凝集の阻害率を示す。
【００４６】
図４に示されているように、ＡＭＥは、試験した全ての濃度でＡＤＰに起因する血小板凝集もＡＡに起因する血小板凝集も顕著に阻害した。また、阻害率はＡＭＥの投下量が増えるに伴って増大した。具体的には、ＡＤＰに起因する血小板凝集の阻害率は、１mg／mlのＡＭＥ投入時に46.5±1.1(%)、５mg／mlのＡＭＥ投入時に93.9±2.4(%)、１０mg／mlのＡＭＥ投入時に98.8±1.9(%)であった。また、ＡＡに起因する血小板凝集の阻害率は、１mg／mlのＡＭＥ投入時に32.9±2.6(%)、５mg／mlのＡＭＥ投入時に85.9±1.6(%)、１０mg／mlのＡＭＥ投入時に96.6±4.2(%)であった。
【００４７】
他方、ヒュウガニンＣは、ＡＤＰに起因する血小板凝集を大きく阻害し、ＡＡに起因する血小板凝集については阻害作用があまり見られなかった。具体的には、ＡＤＰに起因する血小板凝集の阻害率は、１mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に10.5±2.6(%)、５mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に30.5±3.1(%)、１０mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に75.6±4.2(%)であった。また、ＡＡに起因する血小板凝集の阻害率は、１mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に15.3±1.8(%)、５mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に17.6±2.5(%)、１０mg／mlのヒュウガニンＣ投入時に18.2±1.6(%)であった。
【００４８】
日本山ニンジンは、日本で伝統的に薬として用いられてきた。一例として、伝統的には心臓血管の病気に効くとされている。しかしながら、日本山ニンジンの作用機序は明らかにされてこなかった。これまで、日本山ニンジンの止血系への影響については知られていない。
【００４９】
止血は、血小板凝集と凝固カスケードの活性化という連続したプロセスを含んでいる。そのため、血小板と凝固活性化のスクリーニングは、抗血栓症試薬の開発に有用と考えられる。
【００５０】
本発明者らは、抗凝固分析により、ＡＭＥが抗凝固パラメータであるＰＴ、ＡＰＴＴ、ＴＴを顕著に増大させうることを見出した。このことは、ＡＭＥが凝固カスケードの外因性経路、内因性経路、共通経路を阻害する機能を有することを示している。
【００５１】
一般に、クマリン類は抗凝血剤として用いられている。しかし、本発明者らは、単離されたクマリン類化合物の中で、ヒュウガニンＣのみがプロトロンビン時間のみを顕著に増大させることを見出し、抗凝固活性を有することを示した。他のクマリン類化合物が不活性であるのは、抗凝固活性に必要な4-ヒドロキシ-3-置換クマリン環の構造を有していないことが原因と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５２】
【特許文献１】特表２００１−５２６７７４号公報
【非特許文献】
【００５３】
【非特許文献１】Taniguchi  M、外４名著，The  115th  Annuaｌ  Meeting  of  the  Pharmaceuticaｌ  Society  of  Japan，Sendai，March  1995，Abstract  of  Papers  II，p.194．
【非特許文献２】松下洋一、外３名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica  furcijuga  Kitagawa）葉および茎の分離・分析，Memoirs  of  the  Facuｌty  of  Engineering，Miyazaki  University，38:87-90，2009-09-30．
【非特許文献３】藤原博士、外６名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica furcijuga）のメラニン色素産生能への影響，Jpn  Phaimacok  Ther(薬理と治療)，voｌ.38，no.12，2010．
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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