(57)【要約】【課題】  本発明は、保存安定性に優れたエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片、特に尿中の白血球のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を提供することを目的とする。【解決手段】  酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有するエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片において、さらにシクロデキストリン等のホスト化合物を含有することを特徴とする前記エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。本発明の白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片によれば保存性が高く、想定外の高温環境下にさらされた場合でも試験片の反応性が低下せず、白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性を精確に測定できるため、臨床的にもその意義は大きいと考える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有するエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片において、さらにホスト化合物を含有することを特徴とする前記エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項２】
前記ホスト化合物がシクロデキストリンである請求項１に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項３】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選ばれるいずれか１つ以上のシクロデキストリンである請求項１又は請求項２に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項４】
前記酵素基質が３−（Ｎ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）インドール又は３−（Ｎ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）−5−フェニルピロールである請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項５】
前記ジアゾニウム塩が２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩又は１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホン酸である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項６】
前記アルコールが炭素数６から１２のアルコールである請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項７】
エステラーゼ及び／又はプロテアーゼが白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼである請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
【請求項８】
酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有するエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片において、さらにホスト化合物を含有させることを特徴とする前記エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
【請求項９】
前記ホスト化合物がシクロデキストリンである請求項８に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
【請求項１０】
前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選ばれるいずれか１つ以上のシクロデキストリンである請求項８又は請求項９に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料中、特に尿中の白血球エステラーゼ等のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼを検出する試験片に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料、特に尿中の白血球の検出は腎疾患や尿路感染症の診断に非常に重要であり、従来は尿沈渣を顕微鏡で観察する、尿沈渣鏡検法が広く行われてきた。しかし、この方法は操作が煩雑で時間がかかり、熟練を要するという問題がある。
【０００３】
これに対し、白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの酵素活性を測定することにより白血球を検出する、簡便な白血球検出用試験片が開発されている。
【０００４】
この方法には、酵素基質をエステラーゼ及び／又はプロテアーゼにより加水分解させて直接呈色させる方法や、酵素反応によって生じた化合物とジアゾニウム塩とをカップリングし呈色させる方法がある。
【０００５】
前者の方法としては、スルホフタレインエステル類（特許文献１）やアゾ染料エステル類（特許文献２）を酵素基質とする方法等が提案されており、後者の方法としては、フェノキシアミノ酸エステル（特許文献３）やインドキシルアミノ酸エステル及び／又はインドキシルエステル（特許文献４）を酵素基質とする方法など数多くの酵素基質が提案されている。
【０００６】
しかしながら、これらのエステル化合物を酵素基質とする方法はいずれも長い反応時間を必要とし、十分な検出感度が得られないという問題があった。この問題に対してエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性化剤を添加することで反応性の向上や反応時間の短縮が図られている。
【０００７】
エステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性化剤としては、炭素数１から３０個の非環式アルコール又は炭素数３から２０個の環式アルコール（特許文献５）、炭素数１から１５であるアルコール（特許文献６）、少なくとも１つのハロゲン原子を持つアルコール（特許文献７）等のアルコールが知られている。
【０００８】
エステル化合物を酵素基質としたエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の活性化剤としては、炭素数が１０程度のアルコールが好ましく、１−デカノール等が使用されている（特許文献３、特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５５−００２９９２号公報
【特許文献２】特開昭５５−０２９５９０号公報
【特許文献３】特開昭５７−００８７９８号公報
【特許文献４】特開昭６１−１９９８００号公報
【特許文献５】特開昭５５−１０８３００号公報
【特許文献６】特開昭６０−２５６３９８号公報
【特許文献７】特開平５−１６８４９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
酵素基質、ジアゾニウム塩及び活性化剤としてアルコールを含有させた、白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの酵素活性測定により白血球を検出する試験片では、迅速で高感度な白血球の検出が可能であるが、蒸散しにくい１−デカノール等であっても長期間に渡る保存で徐々に蒸散し、これにより試験片の反応性が低下し、正しい診断ができなくなるという問題があった。
【００１１】
特に、国内外への輸送中に想定外の高温環境下にさらされた場合、活性化剤のアルコールが蒸散し、これにより試験片の反応性が低下し、白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性を精確に測定できなくなる。
【００１２】
従って本発明は、これらの課題に着目してなされたものであって、保存安定性に優れたエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片、特に尿中の白血球のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、保存安定性に優れたエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を開発すべく鋭意研究した結果、酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有する試験片にさらにシクロデキストリン等のホスト化合物を含有させることにより、高温環境下でも長期間安定となることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有するエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片において、さらにホスト化合物を含有することを特徴とする前記エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（２）前記ホスト化合物がシクロデキストリンである（１）に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（３）前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選ばれるいずれか１つ以上のシクロデキストリンである（１）又は（２）に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（４）前記酵素基質が３−（Ｎ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）インドール又は３−（Ｎ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）−5−フェニルピロールである（１）から（３）のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（５）前記ジアゾニウム塩が２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩又は１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホン酸である（１）から（４）のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（６）前記アルコールが炭素数６から１２のアルコールである（１）から（５）のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（７）エステラーゼ及び／又はプロテアーゼが白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼである（１）から（６）のいずれか１項に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片。
（８）酵素基質、ジアゾニウム塩及びアルコールを含有するエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片において、さらにホスト化合物を含有させることを特徴とする前記エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
（９）前記ホスト化合物がシクロデキストリンである（８）に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
（１０）前記シクロデキストリンがメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選ばれるいずれか１つ以上のシクロデキストリンである（８）又は（９）に記載のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の安定化法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びホスト化合物を含有させることによって、保存安定性に優れたエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００１７】
本発明でいう「ホスト化合物」とは、分子、原子あるいはイオンを分子内に取り込み包接化合物を形成する化合物をいう。
【００１８】
本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の特徴は、試験片中に酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びホスト化合物を含有させることにある。
【００１９】
本発明においては、ホスト化合物を含有させることによって、活性化剤のアルコールの蒸散が抑制され、長期間及び／又は高温環境下での高い安定性が得られる。即ち、室温でも数年、特に３０℃で２年間の保存でも試験片の反応性の低下がなく、また、５６℃という高温環境下で１か月間保存しても試験片の反応性の低下がなく、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性、特に白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性の精確な測定ができる。
【００２０】
そして、本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片による測定により得られる結果についても、信頼性の高いものとなることが期待される。
【００２１】
ホスト化合物は活性化剤のアルコールを包接することができるものであれば、公知のものから適宜選択することができる。その具体例としては、シクロデキストリン、ピラアーレン、カリックスアーレンなどが挙げられ、中でもシクロデキストリンが好ましい。
【００２２】
シクロデキストリンは公知のものから適宜選択することができる。その具体例としては、α−シクロデキストリン、２、６−ジ−Ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなどが挙げられる。
【００２３】
このシクロデキストリンの試験片の含浸液中濃度は３〜１３０ｍＭが好ましく、より好ましくは６〜６５ｍＭ、さらに好ましくは６〜３３ｍＭである。シクロデキストリンの該含浸液中濃度が３ｍＭ以下になると、十分な安定性が得られず、１３０ｍMを超えると尿などの水性検体と接触したときの再溶解性が低下する。
【００２４】
酵素基質は、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼに対する基質であれば、公知のものから適宜選択することができる。その具体例としては、例えば３−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）インドール、３−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）−５−フェニルピロール、［Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ］ナフタリン、１−［Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−３−メトキシベンゼンなどが挙げられ、含量、使用濃度等は通常この分野で使用される使用量、濃度範囲等から適宜選択することができる。
【００２５】
ジアゾニウム塩は、酵素基質がエステラーゼ及び／又はプロテアーゼにより加水分解されて生じるアルコール成分とジアゾカップリング反応して呈色するものであれば、公知のものから適宜選択することができる。その具体例としては、例えば２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホン酸、４−ジメチルアミノベンゼンジアゾニウム塩、２，４−ジメトキシベンゼンジアゾニウム塩、４−メトキシベンゼンジアゾニウム塩などが挙げられ、含量、使用濃度等は通常この分野で使用される使用量、濃度範囲等から適宜選択することができる。
【００２６】
アルコールは、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼに対する活性化剤であれば、公知のものから適宜選択することができる。ただし、炭素数の少ないアルコールは蒸散により試験片中の濃度が減少し、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片の反応性が低下する。逆に、蒸散し難い炭素数の多いアルコールは、尿などの水性検体に対する溶解性の低さから、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性化に十分な濃度にすることができない。アルコールの具体例としては、炭素数５から２２、好ましくは炭素数６から１２の飽和又は不飽和の鎖状又は環状アルコールなどが挙げられ、含量、使用濃度等は通常この分野で使用される使用量、濃度範囲等から適宜選択することができる。
【００２７】
本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片は、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリンの他に、緩衝剤、安定化剤、湿潤剤、アルコール以外の活性化剤等を含んでいても良く、それらの含有量、使用濃度等は、通常この分野で使用される使用量、濃度範囲等から適宜選択することができる。
【００２８】
本発明で用いられる緩衝剤としては、ｐＨを６〜１０、好ましくは７〜９に保ち、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼを阻害しないものであれば公知のものから適宜選択することができる。具体例としてはホウ酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、Ｇｏｏｄ’ｓ緩衝剤等が挙げられる。また、これら緩衝剤の測定用試験片の含有量としては、ｐＨを６〜１０、好ましくは７〜９に保持し得る量であれば特に限定されないが、例えば本発明に係る測定用試薬を吸収性担体に保持させるために用いられる緩衝液中の濃度としては、通常０.１〜１．０Ｍが好ましい。
【００２９】
安定化剤としては、例えばリン酸トリモルホリド、高分子カルボン酸等、湿潤剤としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコ−ル、ラウリルピリジニウムクロリド、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ−テル等を挙げることができるが勿論これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片は、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリン、更に必要であれば通常ドライケミストリーの分野で用いられる緩衝剤、安定化剤、湿潤剤、アルコール以外の活性化剤等を、水あるいはアセトン、メタノールやエタノール等の低級アルコール又はジメチルホルムアミド等の極性溶媒、もしくは水とこれら極性溶媒との混合溶媒に適宜組み合わせて溶解し、１種類又は２種類以上の試薬を調製し、吸収性担体に１乃至数回含浸、乾燥して作製される。
【００３１】
吸収性担体としては、濾紙が多用されるが、綿、不繊布、ガラス繊維等も使用可能である。また、試験片は通常、プラスチック等の支持体に貼付される。この支持体としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル等のプラスチック片あるいはシートからなる基体が使用可能である。
【００３２】
本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片は、尿などの液体試料に浸し、直ちに引き上げる。そして一定時間後の呈色を、あらかじめ作成しておいた標準の色調表と肉眼で比較することにより、試料の定性あるいは半定量試験に用いることができる。あるいは測定装置を用いて反射率などを光学的に測定し、検量線にあてはめて濃度を求める定量試験に用いることができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン添加の効果
ＢＦＣ−１８０濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）を第１含浸液に含浸し、６０℃で２０分乾燥し、更に第２含浸液に含浸し６０℃で１５分乾燥した。第２含浸液のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン添加濃度は、８．１ｍＭ、１６．２ｍＭ又は３２．４ｍＭとした。比較例として、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを添加していないものを作製した。第１含浸液及び第２含浸液の組成を以下に示す。
第１含浸液
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）                                    ０．３Ｍ
精製水                                                          溶媒
第２含浸液
３−（Ｎ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニロキシ）−インドール  １．５ｍＭ
２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩            １．０ｍＭ
１−デカノール                                                １．０％
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン              ８．１〜３２．４ｍＭ
メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体                      ５．０％
アセトン                                                        溶媒
乾燥した濾紙を５ｍｍ×４ｍｍに裁断し、５ｍｍ×８０ｍｍのポリ塩化ビニル支持体に両面テープで接着しエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。比較例として、上記実施例中の第２含浸液からヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを除いたものに濾紙を含浸したエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。
【００３５】
ヒト全血より単離した白血球分画を、無添加、２５ｃｅｌｌｓ／μＬ、７５ｃｅｌｌｓ／μＬ及び５００ｃｅｌｌｓ／μＬで陰性検体に添加して液体試料を調製した。作製したエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を、調製した液体試料に浸漬後直ちに引き上げ、６０秒後にＵＳ−２２００（栄研化学株式会社製）を用い、測定波長５４０ｎｍ（参照波長６４０ｎｍ）における反射率を測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2017184734.tif 000002
【００３７】
表１から明らかなように、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリンを含有する本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片では、エステラーゼ及び／又はプロテアーゼの酵素活性に対するシクロデキストリンの添加の影響は見られず、迅速な検出が可能である。すなわち、活性化剤のアルコールの効果はシクロデキストリンにより影響を受けない。
【００３８】
実施例２  高温環境下での保存安定性
本発明による試験片の高温環境下での保存安定性を調べるために、５６℃の環境下で２週間及び４週間試験片を保存し、反応性の変化を検討した。反応性の変化は、実施例１における測定操作と同様の操作により行なった。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2017184734.tif 000003
【００４０】
表２から明らかなように、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリンを含有する本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片では、特に高温の環境下での保存安定性に優れていた。また、室温保存においても長期間安定であった。
【００４１】
実施例３  高温環境下での保存安定性２
第２含浸液中の１−デカノール濃度を２％、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン濃度を６．５ｍＭ、１３．０ｍＭ、１９．５ｍＭ、２５．９ｍＭ又は３２．４ｍＭとした以外は実施例１と同様にエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。比較例として、上記実施例中の第２含浸液からヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを除いたものに濾紙を含浸したエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。
【００４２】
本発明による試験片の高温環境下での長期の保存安定性を調べるために、４℃及び５６℃の環境下で３ヶ月間試験片を保存し、反応性の変化を検討した。反応性の変化は、実施例１における測定操作と同様の操作により行なった。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2017184734.tif 000004
【００４４】
表３から明らかなように、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリンを含有する本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片では、５６℃の環境下に３ヶ月間さらされた場合でも、高い反応性を保持しており、長期間の保存安定性に優れていた。
【００４５】
実施例４  アルコールの種類によるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの効果
第２含浸液中のアルコールを、１−デカノール、１−ヘキサノール又は１−ドデカノールとし、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン濃度を３２．４ｍＭとした以外は実施例２と同様にエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。比較例として、アルコールを１−デカノールとし、上記実施例中の第２含浸液からヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを除いたものに濾紙を含浸したエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片を作製した。
【００４６】
本発明による試験片の高温環境下での長期の保存安定性を調べるために、４℃及び５６℃の環境下で３ヶ月間試験片を保存し、反応性の変化を検討した。反応性の変化は、実施例１における測定操作と同様の操作により行なった。結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
2017184734.tif 000005
【００４８】
表４から明らかなように、酵素基質、ジアゾニウム塩、アルコール及びシクロデキストリンを含有する本発明のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼ検出用試験片では、アルコールとして、１−デカノールに代えて１−ヘキサノール又は１−ドデカノールを用いた場合でも、高い反応性を保持しており、長期間の保存安定性に優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上のように、本発明によれば保存性が高く、輸送中に想定外の高温環境下にさらされた場合でも試験片の反応性が低下せず、白血球中のエステラーゼ及び／又はプロテアーゼの活性を精確に測定できる、エステラーゼ及び／プロテアーゼ検出用試験片の提供が可能となる。