(57)【要約】      （修正有）【課題】尿タンパクの上昇，糸球体硬化，腎組織円柱形成，体重減少，慢性炎症，これらの症状のいずれか又は複数を改善する慢性腎臓病の治療方法の提供。【解決手段】α１−酸性糖タンパク質の血中濃度を上昇させる。具体例としては、α１−酸性糖タンパク質を有効成分とする薬剤の投与する。【選択図】図３
2017186315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α１−酸性糖タンパク質の血中濃度を上昇させることにより，慢性腎臓病の治療を行うことを特徴とする薬剤
【請求項２】
前記薬剤の有効成分が，α１−酸性糖タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤
【請求項３】
慢性腎臓病において，尿タンパクの上昇，糸球体硬化，腎組織円柱形成，体重減少，慢性炎症，これらの症状のいずれか又は複数の治療を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤
【請求項４】
請求項１ないし３に記載の薬剤を用いて，慢性腎臓病の治療を行うことを特徴とする慢性腎臓病治療方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，慢性腎臓病の薬剤に関する。より詳細にいうと本発明は，α１−酸性糖タンパク質の血中濃度を上昇させることにより，慢性腎臓病の治療を行う薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病の増加や高齢化社会を背景として，慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease。以下「CKD」と略する。）の患者数は年々増加しており，国内で成人人口の13%，1300万人以上にも達している。また，CKDと関連して，後述する透析患者数についても，約30万人に及んでいる。
【０００３】
CKDは，一般的に，腎機能の障害が慢性的に持続する疾患のすべてを含むものとして定義される。CKDの症状の目安としては，糸球体濾過量（Glomerular Filtration Rate。以下，「GFR」と略する。）の低下が健常人の60％以下（GFRが60mL/分/1.73m2未満），あるいはタンパク尿や組織所見における腎障害などの腎異常，これらのいずれか又は両方が，3か月以上，継続していることが目安とされる。
【０００４】
CKDは，末期腎不全ならびに心血管疾患（例えば，脳卒中や冠動脈疾患）のリスクが高い。また，末期腎不全となると，腎線維化が起こり，慢性腎臓病の病態の増悪に重大な影響を与えてしまうこととなり，血液透析や腎移植が必要となってしまう。さらに，CKDは，根治的治療が未だ確立しておらず，また，心血管系疾患の治療ないし予防的処置の必要性も高い。
これらのことから，CKDは，QOLの悪化や医療費の高騰につながりやすい疾患であり，CKDの根治的治療法，ないしはCKDを予防するための治療法の開発が望まれている。
現在，腎疾患に対する薬物治療としては降圧薬やステロイドなどが使用されているが，これらの腎疾患治療薬は予防的側面が強く，病態進行を改善または回復させる薬剤は未だ存在しない。
【０００５】
一方，α１−酸性糖タンパク質（α1-acid glycoprotein，別名Orosomucoid。以下，「AGP」と略する。）は，血漿中に存在する，高度にグリコシル化された41-43kDAの分子量を有するタンパク質である。AGPの生理的役割については不明な点も多いが，外傷，外科手術，熱傷，心筋梗塞，腫瘍疾患，炎症性疾患，感染症時など，急性炎症時に血漿中濃度が上昇することから，急性炎症においてAGPが作用すると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H Komori, H Watanabe et al, J Biol Chem. 2012 Aug 31;287(36):30688-700
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年，発明者らは，AGPの抗炎症作用を，新たに見出してきた（非特許文献１）。
すなわち，AGPが，「内因性の炎症・免疫制御因子」として，弱いTLR4活性化作用により，M2型マクロファージのマーカーであるCD163の発現量を上昇させることを発明者らが初めて見出したものである。
この時，TNF-α，IL-6，IL-10及びCD163の発現解析結果より，AGPは過度の炎症を引き起こすことなくCD163を誘導することを発明者らは明らかにした。また，AGPは，非常に弱いTLR4アゴニスト活性を発揮する一方，強力なTLR4アゴニストであるLPS存在下では，アンタゴニスト的に機能する，ユニークな作用で抗炎症効果を示すことについても，発明者らが明らかとしたものである。
発明者らは，これら一連の作用機序を示すAGPに着目し，AGPが慢性腎臓病様の症状を示す腎疾患モデルにおいて，どのような役割を果たすかに着目し，研究に着手したものである。
【０００８】
上記事情を背景として，本発明では，AGPが慢性腎臓病様の症状を示す腎疾患モデルにおいて，どのような役割を果たすかを明らかにするとともに，得られた知見を，慢性腎臓病の治療等へ適用することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは，鋭意研究の結果，AGPが腎保護効果を発揮すること，ならびにそのメカニズムとして，慢性的な症状進行を防ぎうることを明らかとし，AGPの血中濃度上昇をメカニズムとする慢性腎臓病治療薬の発明を完成させたものである。
【００１０】
すなわち，AGPは，ネフローゼ及び糸球体硬化を惹起する腎疾患モデルであるアドリアマイシン腎症モデルマウスにおいて，尿タンパクの上昇および腎組織障害を，強く抑制した。加えて，そのメカニズムについて検討を行ったところ，マクロファージに起因する炎症反応の鎮静化を一因として，これらの効果が発揮されていることを発明者らは確認したものである。
マクロファージは，慢性炎症に強く関与する細胞であり，このことから，AGPは，慢性炎症の鎮静化を一因として，尿タンパクの上昇および腎組織障害を抑制するものであり，慢性腎臓病における腎障害の進行を抑制しうることを明らかとしたものである。
【００１１】
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，α１−酸性糖タンパク質の血中濃度を上昇させることにより，慢性腎臓病の治療を行うことを特徴とする薬剤である。
本発明の第二の構成は，前記薬剤の有効成分が，α１−酸性糖タンパク質であることを特徴とする第一の構成に記載の薬剤である。
本発明の第三の構成は，慢性腎臓病において，尿タンパクの上昇，糸球体硬化，腎組織円柱形成，体重減少，慢性炎症，これらの症状のいずれか又は複数の治療を行うことを特徴とする第一又は第二の構成に記載の薬剤である。
本発明の第四の構成は，第一ないし第三の構成に記載の薬剤を用いて，慢性腎臓病の治療を行うことを特徴とする慢性腎臓病治療方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により，AGPが慢性腎臓病様の症状を示す腎疾患モデルにおいて，どのような役割を果たすかを明らかになるとともに，AGPを慢性腎臓病の治療へ適用することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ANマウスにおいて，AGP投与の有無による体重変化の様子を比較した図
【図２】ANマウスにおいて，AGP投与の有無による尿たんぱくの量を比較した図
【図３】ANマウスにおいて，AGP投与の有無による腎組織のPAS染色の様子を比較した図
【図４】正常マウスならびにANマウスの腎組織において，F4/80のmRNA量を比較した図
【図５】正常マウスならびにANマウスの腎組織において，TNF-αのmRNA量を比較した図
【図６】正常マウスならびにANマウスにおいて，AGP投与の有無による血漿中AGP量を比較検討した結果を示した図
【図７】正常マウスならびにANマウスの腎組織において，AGP投与の有無によるPAS染色ならびにAGP染色の様子を比較した図
【図８】正常マウスならびにANマウスの腎組織において，AGP投与の有無によるF4/80染色の様子を比較した図
【図９】正常マウスならびにANマウスの腎組織において，AGP投与の有無による各種炎症性サイトカインのmRNA量を比較した図
【図１０】PMAで分化させたTHP-1細胞（ヒト単球細胞）において，各種炎症性サイトカインのmRNA量の発現に及ぼすAGPの影響を比較した図
【図１１】PMAで分化させたTHP-1細胞（ヒト単球細胞）においてAGP有無が，その後のLPS刺激による各種炎症性サイトカインのmRNA量の発現に及ぼす影響を比較した図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ここでは，本発明の慢性腎臓病治療薬（以下，「CKD治療薬」と略する）について，説明を行う。
【００１５】
本発明におけるCKD治療薬は，AGPの血中濃度を上昇させ，CKDの治療を行うことをメカニズムとする薬剤である。
【００１６】
「AGPの血中濃度の上昇」とは，AGPの血中濃度を，直接的もしくは間接的に上昇させる意味として定義される。
すなわち，AGP自体は，主として肝臓にて産生されヒト血漿中に存在するタンパク質である。このことからAGPの血中濃度を上昇させる手法として，(i)  薬剤の有効成分によりヒト体内におけるAGP自体の産生を促進する（間接的手法），(ii)  AGPないしはこれの誘導体をヒトに投与する（直接的手法），が挙げられる。これら直接的手法もしくは間接的手法のいずれかもしくは両方の作用を果たす薬剤により，「AGPの血中濃度の上昇」を達成しうるものである。
【００１７】
AGPの血中濃度の上昇を直接的に行う化合物として，AGPを有効成分とすることが好ましい。AGPは，ヒト血漿中に存在するタンパク質であるとともに，古くから研究が行われていることから，治療効果と合わせて高い安全性が期待できるという効果を有する。
この場合，AGPは，そのままの化学構造を保持した形で有効成分としてもよいし，本発明の趣旨に鑑み，生体内における代謝等を受けて化合物の構造を変化させAGPとして作用する，もしくは，血中半減期を長くするための化学的修飾を行うなどの，いわゆるDDS化されたAGPを含むものとしてもよい。また，用いるAGPについては，科学的に合成・製造したものを用いてもよいし，ヒト血漿から精製したものを用いてもよい。
【００１８】
本発明の薬剤の剤形について，特に限定する必要はなく，種々の剤形を用いることができる。典型的には，注射用製剤が挙げられるが，これに限定する必要はなく，錠剤やカプセル剤，散剤，経皮吸収型製剤など種々の形態を採用することができる。
【００１９】
本発明において，「CKDの治療」とは，必ずしもCKDの根治を意味するものではなく，その症状の改善や進行の抑制，予防を行うことを含む概念として定義される。
典型的には，CKD患者に投与を行うことにより，尿たんぱくの減少や，糸球体硬化，腎組織円柱形成，体重減少，慢性炎症等のCKDに生じる症状を抑制することなどがCKDの治療として挙げられる。また，CKDに移行する可能性の高い糖尿病性腎症などの基礎疾患を有する患者に，予防的に投与を行い，CKDへの移行を防いだり，遅延させたりするなどもCKDの治療に該当するものである。
【実施例】
【００２０】
以下，実験例を示して，本発明について詳述する。
【００２１】
＜＜実験例１，アドリアマインシン腎症マウスにおけるAGPの効果の検討＞＞
ネフローゼならびに糸球体硬化の症状を示すアドリアマイシン腎症マウス（以下，「ANマウス」と略する）において，AGPがどのような効果を発揮するかを明らかにすることを目的として，検討を行った。
【００２２】
＜実験方法＞
１．ANマウスについては，下記のとおり，作製を行った。
(1)  マウスとして，6週齢のBALB/cN Seaマウス（オス）を用いた。購入したマウスは，体重でランダム化し，群分けを行った。
(2)  投与を行うアドリアマイシン（以下，「ADR」と略する）薬液について，日本化薬から購入したADR（ドキソルビシン塩酸塩注射用10mg NK）を生理食塩液に溶解させ，ADR薬液を調整した。
(3)  調整したADR薬液を，ADRが13mg/kgの投与量となるよう，マウス尾微静脈から投与を行った。
２．AGPの効果を検討するため，ANマウスにAGPの投与を行った。
(1)  AGPは，ヒト血漿より，単離・精製したものを用いた。
(2)  AGP投与群（実施例１，n=3）において，1日目はADR投与30分後に，AGPが1個体あたりの投与量が5mgとなるよう腹腔内投与を行い，その後，４日間，同投与量で腹腔内投与を行った。
(3)  また，AGPと同様に，生理食塩液のみを腹腔内に投与したものを比較対象（比較例１，n=2）とした。
３．ADR投与開始から３週間，毎日，各個体の体重測定を行うとともに，週に一度代謝ケージにて蓄尿の採取ならびに採血を行った。採取した尿については，尿中のタンパク量の比較を行った。
４．ADR投与３週間後に，生理食塩水で心灌流し，実施例・比較例それぞれの腎臓を取り出した。取り出した腎組織についてPFAで固定を行い，パラフィン切片を作製した後，PAS染色により病理学的評価を行った。
【００２３】
＜実験結果＞
１．図１に，体重変化の結果を示す。
(1)  ADR投与から5日までは，実施例１，比較例１ともに同様の体重減少を示した。
(2)  6日目以降からは，実施例１，比較例１，ともに体重が増加していったが，比較例１よりも実施例１の方が明らかに体重増加の速度が速く，また，その程度も大きいものであった。実施例１においては，21日後には，ほぼADR投与前の体重に戻っていた。
２．図２に，尿タンパク量の結果を示す。いずれの週においても，実施例１の方が，比較例１よりも尿タンパク量が少なく，その差は顕著であった。
３．図３に，腎組織の病理学的評価の結果を示す。
(1)  比較例においては，糸球体障害の指標である円柱形成が多くみられ，また，その程度も，大きいものであった。
(2)  一方，実施例においては，円柱形成はほとんど見られなかった。
４．これらの結果より，AGPが，ANマウスにおける尿たんぱくの上昇を抑制すること，ならびに腎組織障害を抑制することが示された。
【００２４】
＜＜実験例２，AGP作用メカニズムの検討＞＞
ANマウスにおいて，AGPによる腎保護効果が示されたことから，このメカニズムを明らかにすることを目的として検討を行った。
【００２５】
＜実験方法＞
１．実験例１にて取り出した腎組織からRNAを抽出し，Prime ScriptTM RT Master Mix(Takara)を使用しcDNA を作成した。
２．qRT-PCRにて，マクロファージマーカであるF4/80，炎症性サイトカインであるTNF-α，それぞれを定量した。
３．実験例１と同様，ANマウスに，ADRとともにAGPを投与した群を実施例２，生理食塩液を投与した群を比較例２とし，これらと合わせて正常マウスについても同様の操作を行った。
【００２６】
＜実験結果＞
１．図４，図５に結果を示す。これらの結果は，正常マウスにおける値を１とした場合の，実施例２，比較例２のそれぞれの相対値を示している。
(1)  F4/80の発現量においては，比較例２の値が約2.9に対し，実施例２は約1.9と，低い値を示した。
(2)  TNF-αの発現量においては，比較例２の値が約3.2に対し，実施例２は約1.5と，低い値を示した。
２．これらより，炎症反応抑制の一因として，マクロファージの発現の抑制が関与していることが示された。
【００２７】
＜＜実験例３，AGP作用メカニズムの検討２＞＞
AGP腹腔内投与後の血漿中AGP濃度の上昇の程度と，糸球体への移行性を明らかにすることを目的として検討を行った。
【００２８】
＜実験方法＞
１．実験例１と同様の手法で作製ならびにAGPを腹腔内投与したANマウスについて，血液を採取し，血漿中のAGP分析を行った。
２．また，実験例１と同様の手法で腎組織を採取・病理学的評価を行った。
【００２９】
＜実験結果＞
１．血漿中AGPを電気泳動後Western blotにより分析した結果を図６に示す。正常マウス（Control）や生理食塩液群（Saline）と比較してAGP群（AGP）は，AGP腹腔内投与により，AGP濃度が有意に増加しており，コントロールと比較しておよそ14倍，Salineと比較しておよそ7倍であった。
２．病理学的評価の結果を図７に示す。
(1)  PAS染色の結果，生理食塩液群では糸球体障害の指標である円柱形成が多くみられ，また，その程度も，大きいものであった。一方，AGP群では，円柱形性の抑制が見られた。
(2)  AGP染色において，正常マウスにおいてAGPの染色が強く見られた。また，生理食塩液群ではAGPの染色は弱く，AGP群では，AGPの染色が強く見られた。
【００３０】
３．これらの結果から，下記のことが分かった。
(1)  AGPは，正常時においても，腎糸球体に局在する。
(2)  腎障害時においてAGPは減少するものの，AGPを投与することにより，腎糸球体のAGPを増加させるとともに，腎障害を減少させることが可能となる。
【００３１】
＜＜実験例４，AGP作用メカニズムの検討３＞＞
AGPによる腎保護効果のメカニズムを明らかにすることを目的として検討を行った。
【００３２】
＜実験方法＞
１．実験例２と同様の手法で，各炎症性サイトカインの定量を行った。
２．また，F4/80による免疫染色を行った。
【００３３】
＜実験結果＞
１．免疫染色の結果を図８に示す。生理食塩液群では，正常マウスと比較して強い染色を示した。一方，AGP群では，生理食塩液群と比較して低い染色であった。
２．各炎症性サイトカインの定量結果を，図９に示す。
(1)  iNOSについて，生理食塩液群では正常マウスと比較してはるかに高い値を示した。一方，AGP群では，正常マウスほどではないものの，生理食塩液群と比較して有意に低い値であった。
(2)  IL-1βについて，生理食塩液群では正常マウスと比較して高い値を示した。一方，AGP群では，生理食塩液群と比較して有意に低い値であった。
(3)  TGF-βについて，生理食塩液群では正常マウスと比較して高い値を示した。一方，AGP群ではこれと比較して有意に低い値であった。
【００３４】
３．これらの結果から，AGPが，マクロファージの浸潤および炎症性因子の発現を抑制することが分かった。
【００３５】
＜＜実験５．AGP作用メカニズムの検討４＞＞
AGPによる腎保護効果についてのメカニズムを明らかにすることを目的として検討を行った。
【００３６】
＜実験方法＞
１．細胞株としてTHP-1細胞（ヒト単球細胞）を用い，PMA刺激を行ったうえで，各実験条件にて，培養を行った。
２．培養後，実験例２と同様の手法で，各サイトカインのmRNAの定量を行った。
【００３７】
＜実験結果＞
１．PMA 分化THP-1 細胞に，正常時濃度（0.5mg/mL）から病態時濃度（1.0〜2.5mg/mL）のAGPを添加，48時間後に炎症関連遺伝子の発現変動を観察，mRNAの発現量を調べた結果を図１０に示す。
(1)  iNOSについて，AGPの添加濃度依存的にiNOS発現減少が観察された。
(2)  また，IL-10とCD163については，添加濃度依存的に増加していた。
２．AGP（1mg/mL）存在下，24時間培養を行った後，細胞をウォッシュしたうえで培地を入れ換え，LPS刺激を行ってから，mRNAの定量を行った結果を図１１に示す。
(1)  iNOSについて，AGP 存在下では発現が減少していた。
(2)  一方，CD163とIL-10 の遺伝子発現は増大していた。
【００３８】
以上より，AGPは濃度依存的に炎症性サイトカインiNOSを放出する炎症性マクロファージを減少させる。また，IL-10の産生を促進し，炎症性サイトカインの産生を抑制する。さらに，濃度依存的に抗炎症性サイトカインCD163を放出する抗炎症性マクロファージを増加させる。
すなわち，濃度依存的にマクロファージを抗炎症性マクロファージ型に変化させることにより，慢性炎症の治療効果を発揮することが示唆された。
【図１】
2017186315.tif 000003
【図２】
2017186315.tif 000004
【図３】
2017186315.tif 000005
【図４】
2017186315.tif 000006
【図５】
2017186315.tif 000007
【図６】
2017186315.tif 000008
【図７】
2017186315.tif 000009
【図８】
2017186315.tif 000010
【図９】
2017186315.tif 000011
【図１０】
2017186315.tif 000012
【図１１】
2017186315.tif 000013