(57)【要約】      （修正有）【課題】キシロースに対する反応性が低下した変異グルコース脱水素酵素（GDH）の提供。【解決手段】以下のペプチド配列（i）〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のGDHαサブユニットにおいて、ペプチド配列（iii）の１０位、ペプチド配列（iv）の４位、及びペプチド配列（v）の４位の１つ以上が他のアミノ酸に置換されたαサブユニットを含む変異GDH。（i）Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly（ii）Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys（iii）Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly（iv）Lys Lys Ile/Leu His Leu Ser Asn（v）Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のペプチド配列（i）〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のグルコース脱水素酵素αサブユニットのアミノ酸配列において、ペプチド配列（iii）の１０位のグリ
シン、ペプチド配列（iv）の４位のヒスチジン、及びペプチド配列（v）の４位のアスパ
ラギンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異グルコース脱水素酵素αサブユニットを含む変異グルコース脱水素酵素であって、グルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性が低下した、変異グルコース脱水素酵素。
（i）Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly （配列番号２１）
（ii）Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys （配列番号２２）
（iii）Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly （配列番号２３）
（iv）Lys Lys Ile/Leu His Leu Ser Asn （配列番号２４）
（v）Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile （配列番号２５）
【請求項２】
さらに、ペプチド配列（ii）の８位のMet、ペプチド配列（iii）の１２位のGly、ペプチ
ド配列（iv）の６位のSer、ペプチド配列（v）の２位のAla、ペプチド配列（v）の３位のPro/Asn、ペプチド配列（v）の５位のAsn及びペプチド配列（v）の７位のIleから選択さ
れる少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項３】
さらにガラクトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、請求項１または２に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項４】
前記変異グルコース脱水素酵素αサブユニットは、配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項５】
前記変異グルコース脱水素酵素αサブユニットは、配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項６】
前記変異グルコース脱水素酵素αサブユニットは、配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７または配列番号８において、1または数個のアミノ酸が置換、
欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項７】
配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を含む変異グルコース脱水素酵素であって、前記アミノ酸配列においては、配列番号３の４７４位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、配列番号３の３２２位のグリシンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換され、配列番号３の３６３位のヒスチジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンまたはセリンに置換され、かつ配列番号３の４７５位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換されており、キシロースに対する反応性が低下したことを特徴とする、変異グルコース脱水素酵素。
【請求項８】
さらに電子伝達サブユニットを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項９】
電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする請求項８に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換えベクターで形質転換された微生物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素を含む、グルコースアッセイキット。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素を含む、グルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性の向上した変異グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）に関する。詳細には、本発明は変異型αサブユニットを含むＧＤＨに関する。本発明のＧＤＨはグルコースセンサ及びグルコースアッセイキット等に好適に使用することができ、生化学分野、臨床分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在、野生型のシトクロムＣ含有ＧＤＨ（ＣｙＧＤＨ）やピロロキノリンキノンを補酵素とするＰＱＱＧＤＨが自己血糖測定センサに用いられている。しかし、野生型のＣｙＧＤＨやＰＱＱＧＤＨはグルコースのみならずキシロースにも反応することから、正確な血糖値の測定ができないという欠点があった。
【０００３】
特許文献１には、二糖類に対する反応性の低い、αサブユニットの３２６位、３６５位及び４７２位に変異を有する変異ＧＤＨが開示されているが、反応性の低下が示されているのはマルトースに対してのみであり、キシロースやガラクトースに対する反応性が低下した変異ＧＤＨについては知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-090563号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、キシロース、好ましくはキシロース及びガラクトースに対する反応性が低下し、グルコースに対する基質特異性の向上したＧＤＨを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、下記ペプチド配列（i）
〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列において、ペプチド配列（iii）の１０位のグリシン、ペプチド配列（iv）の４位のヒス
チジン、及びペプチド配列（v）の４位のアスパラギンの１つ以上を他のアミノ酸に置換
することにより、キシロースやガラクトースに対する反応性が低下し、グルコースに対する基質特異性が向上することを見出し、この知見に基づいてグルコースセンサ等に有用な変異ＧＤＨを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下のペプチド配列（i）〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のＧＤＨαサブユニットのアミノ酸配列において、ペプチド配列（iii）の１０位のグリシン、ペ
プチド配列（iv）の４位のヒスチジン、及びペプチド配列（v）の４位のアスパラギンの
１つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異ＧＤＨαサブユニットを含む変異ＧＤＨであって、ＧＤＨ活性を有し、キシロースに対する反応性が低下した、変異ＧＤＨ。
（i）Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly （配列番号２１）
（ii）Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys （配列番号２２）
（iii）Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly （配列番号２３）
（iv）Lys Lys Ile/Leu His Leu Ser Asn （配列番号２４）
（v）Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile （配列番号２５）
（２）さらに、ペプチド配列（ii）の８位のMet、ペプチド配列（iii）の１２位のGly、
ペプチド配列（iv）の６位のSer、ペプチド配列（v）の２位のAla、ペプチド配列（v）の３位のPro/Asn、ペプチド配列（v）の５位のAsn及びペプチド配列（v）の７位のIleから
選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、（１）に記載の変異ＧＤＨ。
（３）さらにガラクトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、（１）または（２）に記載の変異ＧＤＨ。
（４）前記変異ＧＤＨαサブユニットは、配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の変異ＧＤＨ。
（５）前記変異ＧＤＨαサブユニットは、前記タンパク質は、配列番号３（SM4），配列
番号４（YP_002234347），配列番号５（ZP_02370914），配列番号６（ZP_02007109），配列番号７（YP_002260434）または配列番号８（YP_001890482）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の変異ＧＤＨ。
（６）前記変異ＧＤＨαサブユニットは、配列番号３（SM4），配列番号４（YP_002234347），配列番号５（ZP_02370914），配列番号６（ZP_02007109），配列番号７（YP_002260434）または配列番号８（YP_001890482）において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の変異ＧＤＨ。
（７）配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を含む変異ＧＤＨであって、前記アミノ酸配列においては、配列番号３の４７４位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、配列番号３の３２２位のグリシンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換され、配列番号３の３６３位のヒスチジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンまたはセリンに置換され、かつ配列番号３の４７５位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換されており、キシロースに対する反応性が低下したことを特徴とする、変異ＧＤＨ。
（８）さらに電子伝達サブユニットを含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の変異ＧＤＨ。
（９）電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする（８）に記載の変異ＧＤＨ。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の変異ＧＤＨをコードするＤＮＡ。
（１１）（１０）に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
（１２）（１１）に記載の組み換えベクターで形質転換された微生物。
（１３）（１）〜（９）のいずれかに記載の変異ＧＤＨを含む、グルコースアッセイキット。
（１４）（１）〜（９）のいずれかに記載の変異ＧＤＨを含む、グルコースセンサ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、グルコースに対する特異性の向上したＧＤＨが提供され、グルコースセンサ等の用途に好適に使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１。
【図１−２】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−３】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−４】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−５】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−６】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−７】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−８】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−９】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図１−１０】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その１（続き）。
【図２−１】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２。
【図２−２】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−３】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−４】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−５】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−６】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−７】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−８】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−９】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図２−１０】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その２（続き）。
【図３−１】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３。
【図３−２】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−３】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−４】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−５】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−６】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−７】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−８】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−９】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【図３−１０】ＧＤＨの配列アライメントを示す図〜その３（続き）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異ＧＤＨは、以下のペプチド配列（i）〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のＧＤＨαサブユニットのアミノ酸配列において、ペプチド配列（iii）の１
０位のグリシン、ペプチド配列（iv）の４位のヒスチジン、及びペプチド配列（v）の４
位のアスパラギンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する変異ＧＤＨαサブユニットを含み、ＧＤＨ活性を有し、キシロースに対する反応性が低下したことを特徴とする。
（i）Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly 配列番号２１
（ii）Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys 配列番号２２
（iii）Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly 配列番号２３
（iv）Lys Lys Ile/Leu His Leu Ser Asn 配列番号２４
（v）Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile 配列番号２５
【００１１】
上記ペプチド配列（i）〜（v）は、図１〜３に示すように、種々のＧＤＨ αサブユニ
ットタンパク質間で保存され、ＧＤＨ活性に重要な領域である。
【００１２】
図１の各配列は以下の通り。
Sequence 3  配列番号３（CyGDH）
WP_006396898.1   choline dehydrogenase [Burkholderia multivorans]
WP_035974223.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia complex]
EGD03130.1   glucose-methanol-choline oxidoreductase [Burkholderia sp. TJI49]
WP_040131619.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_040140036.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_034204694.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_044843287.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. USM B20]
WP_023476482.1   glucose dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_027780833.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_011658979.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ambifaria]
WP_050012791.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_011547562.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_034202233.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_011349244.1   choline dehydrogenase [Burkholderia lata]
WP_034180249.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pyrrocinia]
WP_006752014.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ambifaria]
WP_047903069.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pyrrocinia]
YP_002234347  putative oxidoreductase [Burkholderia cenocepacia J2315] （配列番
号７）
WP_039320756.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. A9]
WP_011882360.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_021162033.1   MULTISPECIES: glucose dehydrogenase [Burkholderia]
WP_014724779.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_012366205.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ambifaria]
WP_046548034.1   choline dehydrogenase [Burkholderia contaminans]
WP_039351161.1   choline dehydrogenase [Burkholderia contaminans]
WP_027791851.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia complex]
WP_047849808.1   choline dehydrogenase [Burkholderia contaminans]
WP_043184375.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_014899066.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_048252127.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cepacia]
WP_031400524.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_010089726.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ubonensis]
WP_011354898.1   choline dehydrogenase [Burkholderia lata]
WP_034187894.1   choline dehydrogenase [Burkholderia cenocepacia]
WP_017329146.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pyrrocinia]
WP_045565070.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ubonensis]
WP_010804580.1   glucose-methanol-choline oxidoreductase [Pandoraea sp. SD6-2]
WP_042588018.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. MSHR3999]
WP_038746878.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_010118596.1   choline dehydrogenase [Burkholderia oklahomensis]
WP_010108853.1   choline dehydrogenase [Burkholderia oklahomensis]
ZP_02370914  hypothetical protein BthaT_07876 [Burkholderia thailandensis TXDOH]（配列番号８）
WP_045602806.1   choline dehydrogenase [Burkholderia thailandensis]
WP_004528231.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_009897186.1   choline dehydrogenase [Burkholderia thailandensis]
WP_038763142.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_038781432.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_038778573.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_038779482.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_004198666.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [pseudomallei group]
WP_041195444.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_044490678.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_041189202.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
WP_038789867.1 MULTISPECIES: choline dehydrogenase [pseudomallei group]
WP_041198446.1 choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
KGT02773.1 FAD dependent oxidoreductase family protein [Burkholderia pseudomallei]
WP_015602981.1 FAD-binding protein [Burkholderia thailandensis]
WP_006027349.1 MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_027778581.1 choline dehydrogenase [Burkholderia caledonica]
【００１３】
図２の各配列は以下の通り。
Sequence 3  配列番号３（CyGDH）
WP_038789867.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [pseudomallei group]
WP_041198446.1   choline dehydrogenase [Burkholderia pseudomallei]
KGT02773.1   FAD dependent oxidoreductase family protein [Burkholderia pseudomallei]
WP_015602981.1   FAD-binding protein [Burkholderia thailandensis]
WP_006027349.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_027778581.1   choline dehydrogenase [Burkholderia caledonica]
WP_020067867.1   choline dehydrogenase [Burkholderia bryophila]
WP_027798558.1   choline dehydrogenase [Burkholderia dilworthii]
WP_017774216.1   choline dehydrogenase [Burkholderia kururiensis]
WP_035557405.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. 9120]
WP_028194543.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Burkholderia]
WP_048931828.1   choline dehydrogenase [Ralstonia sp. MD27]
WP_039597686.1   choline dehydrogenase [Ralstonia sp. A12]
WP_021195199.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Ralstonia]
WP_027677929.1   choline dehydrogenase [Ralstonia sp. UNC404CL21Col]
WP_004629448.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Ralstonia]
WP_024976326.1   choline dehydrogenase [Ralstonia pickettii]
WP_045204558.1   choline dehydrogenase [Burkholderiaceae bacterium 26]
ZP_02007109  FAD dependent oxidoreductase [Ralstonia pickettii 12D]（配列番号９
）
WP_045786289.1   choline dehydrogenase [Ralstonia mannitolilytica]
WP_009238767.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Bacteria]
CBJ51936.1   putative transmembrane dehydrogenase (Large subunit) oxidoreductase[Ralstonia solanacearum PSI07]
WP_020749404.1   dehydrogenase (Large subunit) oxidoreductase [Ralstonia solanacearum]
WP_011000725.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_028852718.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_016727135.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_019717688.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_020831435.1   2-Keto-D-gluconate dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
YP_002260434  transmembrane dehydrogenase (large subunit) protein [Ralstonia solanacearum IPO1609]（配列番号１０）
WP_003279244.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_039568928.1   choline dehydrogenase [Ralstonia solanacearum]
WP_050138572.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_049608172.1   choline dehydrogenase [Yersinia pekkanenii]
WP_050140675.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050101384.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050151802.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050107996.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050146890.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050135114.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050122940.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_050113306.1   choline dehydrogenase [Yersinia kristensenii]
WP_019081810.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CQH40496.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_050076365.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Yersinia]
CFQ84255.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
CFB68626.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_019083704.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_004391242.1   choline dehydrogenase [Yersinia kristensenii]
WP_050130822.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_048616917.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Yersinia]
WP_050157528.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CNB97617.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
CRE83670.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_038635282.1   MULTISPECIES: choline dehydrogenase [Yersinia]
CQQ92408.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_049679386.1   choline dehydrogenase [Yersinia mollaretii]
WP_049648565.1   choline dehydrogenase [Yersinia mollaretii]
WP_050159872.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_050144494.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CFR10819.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia frederiksenii]
WP_050299034.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
WP_049610421.1   choline dehydrogenase [Yersinia mollaretii]
WP_004877956.1   choline dehydrogenase [Yersinia mollaretii]
WP_046050437.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CFR23261.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia kristensenii]
【００１４】
図３の各配列は以下の通り。
Sequence 3  配列番号３（CyGDH）
WP_013650283.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CQJ52766.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_050539080.1   choline dehydrogenase [Yersinia mollaretii]
WP_049562931.1   choline dehydrogenase [Yersinia kristensenii]
CCV62586.1   hypothetical protein YE3094_31131 [Yersinia enterocolitica (type O:2) str. YE3094/96]
WP_005172530.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_011815792.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_050290584.1   choline dehydrogenase [Yersinia kristensenii]
WP_004707861.1   choline dehydrogenase [Yersinia frederiksenii]
CQJ18911.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_049600682.1   choline dehydrogenase [Yersinia bercovieri]
WP_049603209.1   choline dehydrogenase [Yersinia aldovae]
CFQ30984.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_004702484.1   choline dehydrogenase [Yersinia aldovae]
WP_049688140.1   choline dehydrogenase [Yersinia aldovae]
WP_042548059.1   choline dehydrogenase [Yersinia aldovae]
CRX73404.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_014609437.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
CFQ15314.1   2-keto-D-gluconate dehydrogenase membrane-bound flavoprotein [Yersinia enterocolitica]
WP_050128783.1   choline dehydrogenase [Yersinia enterocolitica]
WP_018433926.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. JPY251]
WP_018424152.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. WSM4176]
WP_008921043.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. H160]
WP_013092964.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sp. CCGE1002]
WP_027195331.1   choline dehydrogenase [Burkholderia sprentiae]
WP_028223852.1   choline dehydrogenase [Burkholderia ferrariae]
WP_027796285.1   choline dehydrogenase [Burkholderia acidipaludis]
WP_028196142.1   choline dehydrogenase [Burkholderia fungorum]
YP_001890482  glucose-methanol-choline oxidoreductase [Burkholderia phytofirmans]
【００１５】
したがって、本発明において、キシロースに対する反応性を低下させる変異が導入される前のＧＤＨ αサブユニットの配列は、これらペプチド配列（i）〜（v）の配列を有し
、全長アミノ酸が５２０〜５５０（好ましくは５２５〜５４４）であってＧＤＨ活性が維持されている限り、特に制限されない。
本発明において、キシロースに対する反応性を低下させる変異が導入される前のＧＤＨ
αサブユニットの配列は、好ましくは配列番号３と６０％以上の同一性を有する。
【００１６】
配列番号３はブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株が保持するＧＤＨ  αサブユニットのアミノ酸配列である。ＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番
地１ 中央第６）に、受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。ペプチド配列（i）〜（v）は配列番号３においては、それぞれ、アミノ酸番号１２−２０、２１２−２２２、３１３−３２４、３６０−３６６、４７１−４７７の領域に該当する。
【００１７】
配列番号３と６０％以上同一性を有するＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列としては
、ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株のputative oxidoreductase（配列番号
７）、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株のhypothetical protein BthaT#07876（配列番号８）、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株のFAD dependent oxidoreductase（配列番号９）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株のtransmembrane dehydrogenase（配列番号１０）およびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ
株のglucose-methanol-choline oxidoreductase（配列番号１１）のそれぞれのαサブユ
ニットが例示される。
なお、配列番号７〜１１に示したアミノ酸配列については、いずれもアメリカの国立生物
工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）のデータ
ベースに登録されている。それぞれの登録番号は、配列番号７がYP_002234347、配列番号８がZP_02370914、配列番号９がYP_002980762、配列番号１０がYP_002260434、配列番号
１１がYP_001890482である。
ブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株は、LMG 16656、ATCC BAA-245、CCM 4899
、CCUG 48434、NCTC 13227として寄託されている。ブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株は、LMG 22487、CCUG 49060として寄託されている。
【００１８】
また、配列番号３と６０％以上同一性を有するＧＤＨ  αサブユニットとして、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株と同属である、ブルクホリデリア・セパシア株、例えばＪＣＭ２８００、ＪＣＭ２８０１、ＪＣＭ５５０６、ＪＣＭ５５０７、ＩＦＯ１４５９５由来のそれぞれのＧＤＨのαサブユニット（配列番号１２〜１６）も挙げることができる。なお、ＪＣＭ２８００、ＪＣＭ２８０１、ＪＣＭ５５０６、およびＪＣＭ５５０７は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM
）に保存されている。ＩＦＯ１４５９５は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に保存されている。
【００１９】
なお、配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号７〜１１に対して、それぞれ、９６％、９３％、８２％、８２％、６３％のアミノ酸配列同一性を有する。
図１〜３において、これらを含めた１４９のGDH αサブユニットの配列について、配列番号３に対して配列アライメントを行った。図１〜３に示されている種々のＧＤＨ  αサブユニットの配列のうち、最も配列番号３と同一性が低いのはYP_001890482であり、これが配列番号３に対して６３％同一である。このように、多くのＧＤＨ αサブユニットが知
られており、いずれも配列番号３と６０％以上の同一性を有し、上記領域は保存されている。したがって、ペプチド配列（i）〜（v）をこの順で含む５２０〜５５０アミノ酸のＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列、好ましくはペプチド配列（i）〜（v）をこの順で
含み、配列番号３と６０％以上（好ましくは６３％以上）の同一性を有する５２０〜５５０アミノ酸のアミノ酸配列において、ペプチド配列（iii）の１０位のグリシン、ペプチ
ド配列（iv）の４位のヒスチジン、及びペプチド配列（v）の４位のアスパラギンの１つ
以上を他のアミノ酸に置換することにより、本発明の変異GDH αサブユニットを含む変異GDHが得られる。
【００２０】
ペプチド配列（iii）の１０位のグリシンを置換するアミノ酸はグリシン以外であればど
のアミノ酸でもよいが、グルタミン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、バリン、ロイシン、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アルギニンが好ましく、グルタミンが特に好ましい。
ペプチド配列（iv）の４位のヒスチジンを置換するアミノ酸はヒスチジン以外であればどのアミノ酸でもよいが、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、セリンが好ましく、グルタミンが特に好ましい。
ペプチド配列（v）の４位のアスパラギンを置換するアミノ酸はアスパラギン以外であれ
ばどのアミノ酸でもよいが、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、グルタミン、メチオニン、チロシン、システイン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸が好ましく、セリンが特に好ましい。
【００２１】
本発明の変異GDH αサブユニットは、これら３つの変異のうちいずれかを有していればよいが、２つ以上有することが好ましく、３つ有することが特に好ましい。
好ましいのは、ペプチド配列（iii）の１０位のグリシンの置換とペプチド配列（v）の４位のアスパラギンの置換の組み合わせであり、より好ましいのはペプチド配列（iii）
の１０位のグリシンの置換とペプチド配列（v）の４位のアスパラギンの置換とペプチド
配列（iv）の４位のヒスチジンの置換の組み合わせである。
【００２２】
ペプチド配列（iii）の１０位のグリシンは、配列番号３では３２２位のグリシン、配
列番号７では３２２位のグリシン、配列番号８では３２０位のグリシン、配列番号９では３２３位のグリシン、配列番号１０では３２３位のグリシン、配列番号１１では３１８位のグリシン、に該当する。
ペプチド配列（iv）の４位のヒスチジンは、配列番号３では３６３位のヒスチジン、配列番号７では３６３位のヒスチジン、配列番号８では３６１位のヒスチジン、配列番号９では３６４位のヒスチジン、配列番号１０では３６４位のヒスチジン、配列番号１１では３５９位のヒスチジン、に該当する。
ペプチド配列（v）の４位のアスパラギンは、配列番号３では４７４位のアスパラギン
、配列番号７では４７４位のアスパラギン、配列番号８では４７２位のアスパラギン、配列番号９では４７５位のアスパラギン、配列番号１０では４７５位のアスパラギン、配列番号１１では４６８位のアスパラギン、に該当する。
【００２３】
なお、上記アミノ酸置換変異の位置は、配列番号３、７、８、９、１０、１１における位置であるが、配列番号３、７、８、９、１０、１１のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するＧＤＨ αサブユニットのホモログ又はバリアントにおいては、元のアミノ酸
配列とのアラインメントにおいて、前記アミノ酸置換の位置に相当する位置を示す。例えば、Ｎ末端のメチオニン残基は翻訳後に脱落する可能性があるので、１〜３２１位の領域において１個のアミノ酸残基の欠失を有するＧＤＨ αサブユニットの保存的バリアント
においては、３２２位とは、前記バリアントの３２１位を示す。
【００２４】
本発明の変異型αサブユニットの例として、前記特定の変異以外は、配列番号３、７〜１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、変異型αサブユニットは、ＧＤＨ活性を有し、キシロースに対する反応性が低下したものである限り、配列番号３、７〜１１のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。また、上記置換は保存的な置換が好ましく、「保存的置換」とは、酸性アミノ酸同士の置換、中性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換など、性質が類似したアミノ酸同士の置換をいう。
なお、本発明の変異型αサブユニットは、配列番号３、７〜１１のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質がより好ましい。
【００２５】
本発明の変異型αサブユニットは、上記の変異に加えて、ペプチド配列（ii）の８位のメチオニン、ペプチド配列（iii）の１２位のグリシン、ペプチド配列（iv）の６位のセ
リン、ペプチド配列（v）の２位のアラニン、ペプチド配列（v）の３位のプロリンまたはアスパラギン、ペプチド配列（v）の５位のアスパラギンおよびペプチド配列（v）の７位のイソロイシンから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていてもよい。
これらのアミノ酸は、配列番号３においては、以下の位置に該当する。
ペプチド配列（ii）の８位のメチオニン・・・配列番号３の２１９位の
メチオニン
ペプチド配列（iii）の１２位のグリシン・・・配列番号３の３２４位のグリシン
ペプチド配列（iv）の６位のセリン・・・配列番号３の３６５位のセリン
ペプチド配列（v）の２位のアラニン・・・配列番号３の４７２位のアラニン
ペプチド配列（v）の３位のプロリンまたはアスパラギン・・・配列番号３の４７３位の
プロリン
ペプチド配列（v）の５位のアスパラギン・・・配列番号３の４７５位のアスパラギン
ペプチド配列（v）の７位のイソロイシン・・・配列番号３の４７７位のイソロイシン
その他にも、配列番号３の５９位のメチオニン、配列番号３の６１位のフェニルアラニン、配列番号３の３２６位のセリン、配列番号３の３４１位のグルタミン酸、配列番号３の３６７位のロイシン、配列番号３の３６９位のアルギニン、配列番号３の４００位のチロシン、配列番号３の４０２位のグルタミン、配列番号３の４０４位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の一つ以上が置換されてもよい。
【００２６】
以下に、好ましい変異体の例を示す。
G322Q-H363Q-N474S-N475S
G322Q-H363Q-S365A-N474S-N475S
G322Q-H363Q-S365G-N474S-N475S
G322Q-H363S-S365N-N474S-N475S
G322Q-H324Q-N474S-N475S
G322Q-H324S-N474S-N475S
G322Q-D404E-N474S-N475S
G322Q-A472M-N474S-N475S
これらの変異点は配列番号３における位置を示しており、例えば、G322Q-H363Q-N474S-N475Sは配列番号３において、３２２位のグリシンがグルタミンに、３６３位のヒスチジ
ンがグルタミンに、４７４位のアスパラギンがセリンに、４７５位のアスパラギンがセリンに、それぞれ置換された変異体であるが、配列番号３においてこれら以外のアミノ酸に変異が導入されてもよいし、配列番号７〜１１等の他のGDHの配列において同じ位置に変
異が導入されたものも当然に本発明の変異GDHに含まれる。
【００２７】
例えば、以下に示すような変異体は本発明の変異体に含まれる。
【００２８】
配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を含む変異ＧＤＨであって、配列番号３の４７４位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、配列番号３の３２２位のグリシンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換され、かつ配列番号３の４７５位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換されており、キシロースに対する反応性が低下したことを特徴とする、変異ＧＤＨ。
【００２９】
配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質を含む変異ＧＤＨであって、配列番号３の４７４位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換され、配列番号３の３２２位のグリシンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換され、配列番号３の３６３位のヒスチジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンまたはセリンに置換され、かつ配列番号３の４７５位のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換されており、キシロースに対する反応性が低下したことを特徴とする、変異ＧＤＨ。
【００３０】
本発明の変異ＧＤＨは、上記特定の変異を有することによって、キシロースに対する反応性が低下している。例えば、キシロースに対する反応性が野生型ＧＤＨに比べて５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
なお、グルコースに対する反応性と比較してキシロースに対する反応性が相対的に低下した場合も「キシロースに対する反応性が低下した」に含まれる。例えば、以下のような基質特異性（Xyl/Glc）が野生型ＧＤＨと比較して低下した場合が該当する。例えば、基
質特異性（Xyl/Glc）が野生型ＧＤＨに比べて、５０％以下、好ましくは２０％以下、よ
り好ましくは１０％以下である。基質特異性＝（キシロースに対する比活性／グルコース
に対する比活性）×１００）
【００３１】
本発明の変異ＧＤＨは、上記特定の変異を有することによって、好ましくは、キシロースに対する反応性だけでなく、ガラクトースに対する反応性も野生型ＧＤＨに比べて低下している。例えば、ガラクトースに対する反応性も野生型ＧＤＨに比べて、例えば、５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
なお、グルコースに対する反応性と比較してガラクトースに対する反応性が相対的に低下した場合も「ガラクトースに対する反応性が低下した」に含まれる。例えば、以下のような基質特異性（Gal/Glc）が野生型ＧＤＨと比較して低下した場合が該当する。例えば
、基質特異性（Gal /Glc）が野生型ＧＤＨに比べて、５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
基質特異性＝（ガラクトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）×１００）
【００３２】
本発明の変異ＧＤＨは、αサブユニットのみであってもよいし、αサブユニットとβサブユニットとの複合体、αサブユニットとγサブユニットとの複合体、又はαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットからなる複合体であってもよい。
【００３３】
ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ αサブユニット遺伝子、及びβサブユニ
ット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（米国特許出願公開第２００４／００２３３３０号）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号３）、及びβサブユニット（配列番号４）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしている。また、配列番号５に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号６に示す（欧州特許出願公開第１４９８４８４号）。配列番号６において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドである。
【００３４】
本発明の変異ＧＤＨがβサブユニットを含む場合、βサブユニットとしてはβサブユニットとして機能する限り特に制限されず、公知のものを含め種々の生物に由来するβサブユニットが使用できるが、具体的には、例えば、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株由来の配列番号６のアミノ酸番号２３〜４２５のアミノ酸配列を有するタンパク質が使用できる。しかし、ＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、ＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、ＫＳ１株以外のβサブユニットのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、ＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を損なわずに電子伝達サブユニット、すなわち、チトクロームＣとして機能することをいう。
【００３５】
本発明の変異ＧＤＨがγサブユニットを含む場合、γサブユニットとしてはγサブユニットとして機能する限り特に制限されず、公知のものを含め種々の生物に由来するγサブユニットが使用できるが、具体的には、例えば、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株由来の配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質が使用できる。しかし、γサブユニットとして機能し得る限り、配列番号２からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、γサブユニットとして機能し得る限り、ＫＳ１株以外のγサブユニットのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたア
ミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、γサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を高める機能をいう。
【００３６】
本発明の変異ＧＤＨのαサブユニットをコードする遺伝子としては、変異ＧＤＨ αサブ
ユニットのアミノ酸配列に対応した塩基配列を有するものであればよいが、具体例としては、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列において上記アミノ酸置換に対応するコドン置換を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３７】
βサブユニット遺伝子の具体例としては、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３８】
γサブユニット遺伝子の具体例としては、配列番号１の塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またγサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基番号２５８〜７６１からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００３９】
前記ストリンジェントな条件としては、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で洗浄する条件が挙げられる。
【００４０】
αサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子及びγサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。ＰＣＲ用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。なお、ＫＳ１株以外のブルクホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株、ブルクホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株、ラルストニア・ピッケティ１２Ｄ株、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株およびブルクホルデリア・フィトフィルマンスＰｓＪＮ株も用いることができる。
【００４１】
所望の変異を有するＧＤＨ αサブユニットは、ＧＤＨ αサブユニットをコードするＤＮＡ（αサブユニット遺伝子）に、部位特異的変異法によって、所望のアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異を導入し、得られる変異ＤＮＡを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。また、変異ＧＤＨ αサブユニットをコードする
ＤＮＡを、βサブユニットをコードするＤＮＡ（βサブユニット遺伝子）、又はβサブユニット遺伝子とγサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）とともに発現させることによって、変異ＣｙＧＤＨ複合体を取得することができる。尚、ＧＤＨαサブユニットをコードするＤＮＡへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片を用いてもよい。
【００４２】
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロ
ニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９、２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって取得することができる。
【００４３】
ＧＤＨの各サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターとしては、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクター、具体的にはｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＰL、ｔｅｔ、ＰｈｏＡ等が挙げられる。また、プ
ロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子を挿入することによって、これらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３等が挙げられる。
【００４４】
また、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子は、発現可能な形態で宿主微生物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
組換えベクターで微生物を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４５】
宿主微生物としては、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
【００４６】
変異型αサブユニットを含むGDHの糖類に対する基質特異性は、例えば、実施例に記載
された方法によって各種糖類に対する反応性を調べ、野生型αサブユニットを含むＧＤＨの反応性と比較することよって、決定することができる。
【００４７】
本発明の変異αサブユニットを含むGDH又はこれを発現する微生物は、グルコースセンサ
の酵素電極の構成要素として用いることができる。グルコースセンサとしては、作用極として、本発明の変異αサブユニットを含むGDHが金電極、白金電極、カーボン電極等の電
極表面上に固定化された酵素電極を用いるグルコースセンサが挙げられる。センサは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）の３電極を含む。あるいは、慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含むことが好ましい。センサは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサとしては、血糖値を連続で計測できるセンサであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の酵素を固定した二電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサであってもよい。このような酵素センサの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ．Ｆ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉ
ｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ ａｎｄ Ｇｅｒｏｇｅ Ｓ． Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８７に記載されている。
【００４８】
本発明のグルコースセンサを用いるグルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。センサの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の変異ＧＤＨを固定化した酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準
濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４９】
本発明の変異αサブユニットを含むGDHは、グルコースアッセイキットの構成要素として
用いることもできる。グルコースアッセイキットには、本発明の変異αサブユニットを含むGDH以外に、発色又は発光試薬、希釈用緩衝液、標準物質、使用説明書などが含まれて
よい。
【００５０】
例えば、ブルクホルデリア・セパシアの野生型ＧＤＨを用いたグルコースセンサ及びグルコースアッセイキットは、米国特許公開第２００４／００２３３３０Ａ１に記載されている。本発明の変異ＧＤＨも、同様にして使用することができる。
【実施例】
【００５１】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕ブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨを発現するプラスミドの構築ブルクホルデリア・セパシアのＧＤＨを発現するプラスミドとして、ＧＤＨのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
【００５３】
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、ＷＯ０２／０３６７７９（ＥＰ１３３１２７２Ａ１に対応）に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ γサブユニッ
ト構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むＤＮＡ断片が、ベクターｐＴｒｃ９９Ａのクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のＧＤＨγα遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、ＧＤＨのαサブユニットＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加されたＤＮＡ断片を含むプラスミド全体を増幅した。
【００５４】
〔フォワードプライマー〕
５’−ＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１７）
〔リバースプライマー〕
５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１８）
【００５５】
増幅した断片の両端を平滑末端化した後、５’末端をリン酸化し、ライゲーションによって環状化した。得られた組換えベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約２．１ｋｂの挿入断片が確認された。本プラスミド中のＧＤＨの各構造遺伝子は、ｔｒｃプロモーターによって制御される。本プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００５６】
〔実施例２〕ＧＤＨ αサブユニット遺伝子への変異導入
実施例１で得られたｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αに含まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子を
用い、同遺伝子がコードするαサブユニットの各アミノ酸に変異が導入されるように、部位特異的変異導入を行った。具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて、実施例１に記載のプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αに含
まれるＧＤＨ αサブユニット遺伝子において、３２２位のグリシン、３６３位のヒスチ
ジン、及び４７４位のアスパラギン等のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるようにコドン改変を行った。
【００５７】
表１に、構築した各変異体を示す。尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、N474Gは、４７４
位のアスパラギンからグリシンへの置換を示す。
【００５８】
〔実施例３〕変異ＧＤＨの基質特異性の解析
実施例２で得られた変異ＧＤＨ発現プラスミドを用いて、変異ＧＤＨを製造し、基質特異性を検討した。
【００５９】
（１）培養
変異ＧＤＨ発現プラスミドを導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１株を、各々３ｍｌのＬＢ培地（カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ含有）で、Ｌ字管を用いて３７℃で４時間培養後、温度を２５℃にしてさらに２０時間培養した。
【００６０】
（２）粗酵素サンプルの調製
前記で培養した培養液から菌体を集め、これを４００μｌのバグバスター（メルクミリポア製）に懸濁して室温で２０分間高速振盪することで破砕した。この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、２０分、４℃）して残渣を除去し、得られた上清（水溶性画分）を粗酵素サンプルとした。
【００６１】
（３）ＧＤＨ活性の測定
酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）の退色を６００ｎｍでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液（１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５）＋６．０ｍＭ ＰＭＳ（メチルフェナジンメトサルフェート）＋０．１２ｍＭ ＤＣＩＰ濃度は全て終濃度）に基質（グルコース、キシロー
ス又はガラクトース）を加えることで反応を開始し、６００ｎｍの吸光度変化を測定した。基質の終濃度は４０ｍＭとした、結果を、表１に示す。尚、野生型ＧＤＨとして、SM4
γαを用いた。
【００６２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【００６３】
この結果、３２２位のグリシン、３６３位のヒスチジン、４７４位のアスパラギンの一つ
以上を置換した時に、グルコースに対する反応性を維持しつつ、キシロースとの反応性が低下すること、およびこれらの変異体の多くはガラクトースに対する反応性も同時に低下させることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の変異ＧＤＨは、グルコースに対する基質特異性が向上しており、グルコースセンサ等を用いたグルコースの測定に好適に使用することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【配列表】
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