(57)【要約】【課題】本発明の目的は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内に存在しうる、任意の副次的切断部位より著しく迅速に加水分解されるエンテロキナーゼ部位を含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを提供することである。【解決手段】前記目的は、式:Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1[式中、  Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、  X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、  X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、  X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、  Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドによって達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを、任意選択で単離する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質から成熟タンパク質を放出させるためのタンパク質発現及びタンパク質化学の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の発現技法は、例えば、それらの生物学的活性のために使用されうる、大量の望ましいタンパク質の作製を可能とする。このようなタンパク質は、微生物宿主細胞内で、組換え融合タンパク質として発現させることが多い。目的のタンパク質は、発現レベルを上昇させ、分泌を容易とし、可溶性を増大させ、タンパク質のフォールディングを促進して、タンパク質を、意図しないタンパク質分解から保護するか、又は目的のタンパク質の精製を容易にするために、融合パートナータンパク質又は小型のアミノ酸伸長部分に結合させることが多い。目的のタンパク質を得るために、融合パートナータンパク質は、タンパク質分解により、融合タンパク質から除去する必要がある。
【０００３】
このようなプロセシングのために使用される、1つのプロテアーゼは、エンテロキナーゼ(E.C.3.4.21.9)である。このプロテアーゼの生物学的に天然の機能は、チモーゲン内のDDDDKプロセシング部位(配列番号2;本明細書の以下では、D4Kとする)における切断により、トリプシノーゲンを、トリプシンへと転換することである[Biochim. Biophys Acta 20、(1956)、443〜434頁]。
【０００４】
同様に、融合パートナータンパク質のエンテロキナーゼに触媒される除去を可能とするために、D4Kプロセシング部位を、融合パートナータンパク質と、目的のタンパク質との間に挿入する。融合タンパク質のエンテロキナーゼ触媒性プロセシングの特異性及び効率は、今や、例えば、目的のタンパク質内の、D4K部位及び潜在的な内部分解部位の相対加水分解速度に依存する。エンテロキナーゼは、D4K部位に対してだけでなく、また、他の極めて多数の配列に対しても活性を有する[例えば、Anal. Biochem. 106、(1980)、199〜206頁を参照されたい]。
【０００５】
基質特異性が限定されたエンテロキナーゼの欠点を是正するのに、多数の手法が使用されている。
【０００６】
US6906176は、エンテロキナーゼにより、D4K部位と比べてより効率的に切断される、多数のペプチド配列について記載している。
【０００７】
PNAS 103、(2006)、7583〜7588頁は、エンテロキナーゼにより、D4K部位と比べてより迅速に切断される、多数のペプチド配列について記載している。
【０００８】
Protein Expr. Purif. 41、(2005)、332〜340頁は、ペプチド配列LKGDR(配列番号3)を、エンテロキナーゼによる切断のために、D4K部位より有効な配列として含むタンパク質について記載している。
【０００９】
Protein Expr. Purif. 59、(2008)、314〜319頁は、切断反応を尿素の存在下実行することによる、エンテロキナーゼ切断の特異性の増強について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】US6906176
【特許文献２】WO2013/092855A1
【特許文献３】WO2008/043847
【特許文献４】WO87/06941
【特許文献５】WO90/11296
【特許文献６】WO91/11457
【特許文献７】EP0699686-A2
【特許文献８】EP0708179-A2
【特許文献９】WO99/43708
【特許文献１０】WO2013/0928
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Biochim. Biophys Acta 20、(1956)、443〜434頁
【非特許文献２】Anal. Biochem. 106、(1980)、199〜206頁
【非特許文献３】PNAS 103、(2006)、7583〜7588頁
【非特許文献４】Protein Expr. Purif. 41、(2005)、332〜340頁
【非特許文献５】Protein Expr. Purif. 59、(2008)、314〜319頁
【非特許文献６】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献７】DeBoerら、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、80: 21〜25頁
【非特許文献８】Studier及びMoffatt、J.Mol.Biol.189、113頁、(1986)
【非特許文献９】Dalbogeら、1987、Biotechnology 5、161〜164頁
【非特許文献１０】「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American、1980、242: 74〜94頁
【非特許文献１１】Simonen及びPalva、1993、Microbiological Reviews 57: 109〜137頁
【非特許文献１２】Nielsenら、1997、Protein Eng.10、1〜6頁
【非特許文献１３】Emanuelsenら、2007、Nature Protocols 2、953〜971頁
【非特許文献１４】Cordingleyら、J.Virol.、1989、63、5037〜5045頁
【非特許文献１５】Birchら、Protein Expr Purif.、1995、6、609〜618頁
【非特許文献１６】Chichら、Anal.Biochem、1995、224、245〜249頁
【非特許文献１７】Xinら、Protein Expr.Purif.、2002、24、530〜538頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
成熟タンパク質内の内部部位を切断せずに、且つ成熟タンパク質上にアミノ酸伸長部分を残さずに融合パートナータンパク質を除去するための、より特異的なエンテロキナーゼ切断反応が必要とされている。このエンテロキナーゼ切断反応は、成熟タンパク質を製造するための産業工程において実行するのに特に好適であることが好ましい。また、成熟タンパク質への意図されない化学的変化及び物理的変化が生じないように穏やかな工程条件でも、多くの異なるタンパク質にとって使用可能なより特異的なエンテロキナーゼ切断反応も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内に存在しうる、任意の副次的切断部位より著しく迅速に加水分解されるエンテロキナーゼ部位を含む、前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを提供することである。また本発明の目的は、化学的に安定なエンテロキナーゼ切断部位を含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを提供することでもある。
【００１４】
本発明の第1の態様によれば、標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを、任意選択で単離する工程と
を含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の第2の態様によれば、式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであって、
i)Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含むか、又はii)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなり、Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含み、例えばZ2が非存在であるか、Z2が、アミノ酸残基であるか、若しくはZ2が、2個〜40個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが提供される。
【００１６】
一実施形態では、X4は、Dである。一実施形態では、X4は、Eである。別の実施形態では、X5-X4は、DEである。別の実施形態では、X5-X4は、DDである。
【００１７】
別の実施形態では、Z1は、GLP-1ペプチドである。
【００１８】
本発明の第3の態様によれば、式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列が提供される。
【００１９】
本発明の第4の態様によれば、式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列であって、上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動的に連結されたDNA配列を含む発現ベクターが提供される。
【００２０】
本発明の第5の態様によれば、式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列であって、上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動的に連結されたDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一実施形態では、本発明は、式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドは、式(I)からなる。
【００２２】
本明細書で使用される「エンテロキナーゼ」という用語は、消化過程に関与する触媒性カスケードの一部として、トリプシノーゲンを、トリプシンへと切断することにより、活性化を触媒する、膵臓のヒドロラーゼを意味することが意図される。「エンテロキナーゼ」は、任意の供給源から単離された天然の酵素のほか、組換え発現により産生された酵素も含む。エンテロキナーゼの、1つの非限定的な例は、ジスルフィド連結された約115kDaの重鎖と、約35kDaの小型の軽鎖とを含む、自然発生の二量体である。エンテロキナーゼの、別の非限定的な例は、触媒性ドメインを含む、軽鎖単独である。軽鎖単独のほか、その機能的な変異体も、エンテロキナーゼ酵素として良好に機能することが記載されている(WO2013/092855A1を参照されたい)。
【００２３】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」という用語は、非自然発生のポリペプチドを構成するように併せて融合させた、2つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドを意味することが意図される。融合させるポリペプチドのサイズは、変化させることができ、融合ポリペプチドの目的に依存する。融合ポリペプチドは、発現を増大させる理由で、可溶性の発現産物の維持を容易とし、融合ポリペプチド又はその一部の、細胞外培地への排出を容易とし、ポリペプチドを、プロテアーゼ又はペプチダーゼなどにより、意図しない形でプロセシングされることから保護するように、タンパク質の組換え発現時に頻繁に使用される。このような融合ポリペプチド内では、少なくとも2つの構成ポリペプチドのうちの1つは、「標的ポリペプチド」又は「成熟タンパク質」(すなわち、組換え発現法により製造されるポリペプチドである)と称することが多い。
【００２４】
本明細書で使用される「エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド」という用語は、エンテロキナーゼ切断部位の各末端において、適切な条件下で、2つのポリペプチドを連結するエンテロキナーゼ切断部位において、エンテロキナーゼにより切断されうる、非自然発生のポリペプチドを構成するように併せて融合させた、2つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドを意味することが意図される。したがって、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドは、非自然発生のポリペプチドである。また、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドによって構成される2つのポリペプチドの各々も、エンテロキナーゼにより認識及び切断される副次的部位を含有しうることを理解されたい。しかし、このような副次的切断部位は、エンテロキナーゼが、本発明に従う、意図された切断部位を切断する速度より低い速度で、エンテロキナーゼによる切断を経ると予想される。一実施形態では、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内の、全ての副次的エンテロキナーゼ切断部位は、対応するD4K部位の切断の速度より低い速度で、エンテロキナーゼにより切断される。
【００２５】
本発明の文脈では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、ポリペプチドを指示するように、互換的に使用することができる。使用される特定の用語は、分子のサイズについての限定を有さない(特定の文脈において直接言明されない限り)ことを理解されたい。
【００２６】
アミノ酸残基は、IUPACによる命名法に従う一文字式の略記法に従い指示され、例えば、Dは、アスパラギン酸(Asp)を意味し、Gは、グリシン(Gly)を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「遺伝子によりコードされるアミノ酸」は、以下のアミノ酸:G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、Tのほか、これらの任意の生物学的修飾からなる群を意味することが意図される。一実施形態では、本発明における使用に適するアミノ酸は、遺伝子によりコードされるアミノ酸のアイソスターを含む。このような生物学的修飾の非限定的な例は、例えば、アミド化、グリコシル化、及びジスルフィド結合の形成である。
【００２８】
本明細書で使用される「類似体」は、タンパク質に由来する1個又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、及び/又は付加を介して、別のタンパク質から導出されたタンパク質を意味することが意図される。GLP-1(7〜37)(配列番号4)の類似体の非限定的な例は、残基34をアルギニン残基で置換した、K34R-GLP-1(7〜37)(配列番号5)、及び残基34をアルギニン残基で置換し、アミノ酸残基7〜8を欠失させた(GLP-1ペプチドのアミノ酸残基の一般的な番号付けを使用して)、K34R-GLP-1(9〜37)(配列番号6)である。一実施形態では、GLP-1(7〜37)(配列番号4)は、HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGである。
【００２９】
本明細書で使用される「機能的な変異体」は、元のタンパク質と実質的に同じ主要な機能を保持する、ある特定のタンパク質の化学的変異体を意味することが意図される。よって、機能的な変異体は、典型的にはタンパク質の修飾変化形であって、元のタンパク質の実質的に同じ主要な機能を保存しながら、何らかの望ましい特性を得るように修飾されるタンパク質に必要な最小限の修飾を導入した修飾変化形である。機能的な変異体の非限定的な例は、例えば、伸長タンパク質、切断タンパク質、融合タンパク質、及び類似体である。ウシエンテロキナーゼ軽鎖の、機能的な変異体の非限定的な例は、例えば、C112Aウシエンテロキナーゼ軽鎖である。GLP-1(7〜37)の機能的な変異体の非限定的な例は、K34R-GLP-1(7〜37)である。
【００３０】
一実施形態では、タンパク質の機能的な変異体は、前記タンパク質と比較して、1〜2カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸付加を含む。別の実施形態では、機能的な変異体は、前記タンパク質と比較して、1〜5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸付加を含む。別の実施形態では、機能的な変異体は、対応する自然発生のタンパク質又は自然発生のタンパク質の部分配列と比べて、1〜15カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸付加を含む。
【００３１】
一実施形態では、Z2は、可溶化ドメインを含む。本明細書で使用される「可溶化ドメイン」は、融合タンパク質の一部であり、前記融合タンパク質の可溶性を、ある特定の条件下で、融合パートナータンパク質自体より大きくするタンパク質を意味することが意図される。式(I)内のZ2として使用されうる可溶化ドメインの非限定的な例は、DsbC(チオール:ジスルフィド交換タンパク質)、WO2008/043847において記載されている、RL9(リボソームタンパク質L9)、MPB(マルトース結合性タンパク質)、NusA(転写終結タンパク質/抗転写終結タンパク質)、及びTrx(チオレドキシン)である。
【００３２】
本明細書で使用される「非自然発生のポリペプチド」は、人為的介入を伴わずに天然で発生することが公知でないか、又は人為的介入を伴わずに天然で発生しない、ポリペプチドを意味することが意図される。非自然発生のポリペプチドの非限定的な例は、例えば、異なる供給源に由来する2つのタンパク質を、1つのポリペプチドとして併せて融合させた、融合ポリペプチドである。
【００３３】
本明細書で使用される「GLP-1ペプチド」という用語は、GLP-1(7〜37)、GLP-1(7〜36)アミドのほか、従来の組換えDNA技法並びに従来の合成法によっても生成することが可能な、これらの類似体を指示することが意図される。このようなGLP-1ペプチドは、ヒトGLP-1とも称されうる、天然のグルカゴン様ペプチド1、例えば、WO87/06941において開示されている、GLP-1(7〜37)及びその機能的な変異体を含む、このようなペプチド断片;WO90/11296において開示されている、GLP-1(7〜36)及びその機能的な誘導体を含む、このようなペプチド断片;WO91/11457において開示されている、活性のGLP-1ペプチド7〜34、7〜35、7〜36、及び7〜37のこのような類似体;EP0699686-A2において開示されている、GLP-1のこのようなN末端切断断片;並びにEP0708179-A2において開示されている、N末端イミダゾール基を含む、このようなGLP-1類似体及びGLP-1誘導体を含むがこれらに限定されない。GLP-1ペプチドの非限定的な例は、GLP-1(7〜37)、K34R-GLP-1(7〜37)、及びエキセンディン-4(1〜39)(配列番号7)である。一実施形態では、エキセンディン-4(1〜39)(配列番号7)は、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGである。
【００３４】
本明細書で使用される「グルカゴンペプチド」は、グルカゴン受容体に対する親和性を有する、プレプログルカゴンファミリーに由来するポリペプチドを意味することが意図される。グルカゴンペプチドの非限定的な例は、グルカゴン(1〜29)(配列番号8)及びこれらの類似体である。一実施形態では、グルカゴン(1〜29)(配列番号8)は、HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGである。
【００３５】
本明細書で使用される「インスリン前駆体」は、インスリンのA鎖及びB鎖と、任意選択で、介在するCペプチドとを含むポリペプチドを意味することが意図される。インスリンは、ヒトインスリン、又は類似体若しくは切断変化形など、その機能的な変異体でありうることを理解されたい。インスリン前駆体の非限定的な例は、例えば、A(1〜21)-AAK-B(1〜29)-ヒトインスリン(配列番号9)である。A(1〜21)-AAK-B(1〜29)-ヒトインスリン(配列番号9)は、GIVEQCCTSICSLYQLENYCNAAKFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKGである。
【００３６】
本明細書で使用される「エキセンディン」という用語は、エキセンディンのほか、その類似体及び断片、例えば、エキセンディン-3及びエキセンディン-4を含む、その機能的な変異体も指示することが意図される。エキセンディンのほか、その類似体及び断片も、例えば、その内容が、参照によりその全体において組み入れられる、WO99/43708において記載されている。
【００３７】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内のエンテロキナーゼ部位はまた、化学的安定性の点でも頑健な部位であることが好ましい。エンテロキナーゼ部位内のアミノ酸残基のある特定の部分配列は、化学的安定性が小さい可能性があるので、エンテロキナーゼ部位の配列(X6-X5-X4-GDR)は、意図される条件下で化学的に安定な配列であることが一般に好ましい。
【００３８】
一実施形態では、式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内では、X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、又はTから選択される。別の実施形態では、X4は、E、Q、L、D、G、又はAから選択される。X4は、Eでありうる。X4は、Q又はLでありうる。X4は、Dでありうる。X4は、D、G、又はAでありうる。別の実施形態では、X5は、D又はEである。更に別の実施形態では、X5は、Dである。一実施形態では、X5は、S又はIではない。一実施形態では、X5-X4は、DD、DE、DL、DQ、EE、及びEQからなる群から選択される。別の実施形態では、X5-X4は、DE又はDDである。X5-X4は、DL、DQ、又はDGでありうる。X5-X4は、DA、DS、又はEEでありうる。X5-X4は、EQ、EL、又はEDでありうる。X5-X4は、EG、EA、又はESでありうる。X5-X4は、QE、HE、NE、又はMEでありうる。X6の存在及び識別は、厳密ではない。一実施形態では、X6は、I、G、L、T、R、又はSである。別の実施形態では、X6は、非存在である。X6は、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y、又はQでありうる。X6は、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、又はWでありうる。X6は、I又はGでありうる。
【００３９】
一実施形態では、Z2は、非存在である。別の実施形態では、Z2は、0個〜10個のアミノ酸残基を有するか、又は約8個〜約200個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである。小型のZ2ポリペプチドは、Z2が、宿主細胞内のエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現を容易にするポリペプチドである場合、又はZ2が、発現させるポリペプチドを、N末端においてタンパク質分解によりプロセシングされることから保護する場合に使用されることが多い。一実施形態では、Z2は、EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、及びEELDARLEALKからなる群から選択される。Z2は、配列EEK、EEAEK、又はHKを含みうる。Z2は、配列EEAHK、E(EA)2HK又はE(EA)3HKを含みうる。Z2は、配列EEGHK、EHPK、又はEEGEPKを含みうる。Z2は、配列EEAHELK、EEAHEVK、又はEEAHEMKを含みうる。Z2は、配列EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、又はEELDARLEALKを含みうる。別の実施形態では、Z2は、DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、及びDVKPGQPMYからなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、Z2は、DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE、及びDVEPGQPLYからなる群から選択される配列を含む。Z2は、配列DVKPGQPLY、DVKPGQELY、又はDVKPGEPLYを含みうる。Z2は、配列DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、又はDVKEGQPLYを含みうる。Z2は、配列DVKPGQPLA、DVKPGQPLE、又はDVEPGQPLYを含みうる。別の実施形態では、Z2は、QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW、及びEAEAWHからなる群から選択される配列を含む。Z2は、配列QPMYKR、GQPMYK、又はPGQPMYを含みうる。Z2は、配列KPGQPM、LKPGQP、又はQLKPGQを含みうる。Z2は、配列LQLKPG、WLQLKP、又はHWLQLKを含みうる。Z2は、配列WHWLQL、AWHWLQ、又はEAWHWLを含みうる。Z2は、配列AEAWHW又はEAEAWHを含みうる。Z2は、宿主細胞内の前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現を容易にするポリペプチドでありうる。一実施形態では、Z2は、3個〜40個、4個〜30個、又は5個〜20個のアミノ酸残基など、2個〜50個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである。Z2は、2個〜8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドでありうる。Z2は、少なくとも8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドでありうる。Z2は、40個以下のアミノ酸残基を含む場合もあり、これらからなる場合もある。Z2は、約10個〜約25個のアミノ酸残基を有するポリペプチドでありうる。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列Z2-X8-X7を含むペプチドであって、Z2が、本明細書で規定される通りであり、X8が、非存在であるか、又はエンテロキナーゼ切断部位を含むペプチドであり、X7が、少なくとも1個のアミノ酸を含むポリペプチドである、ペプチドに関する。一実施形態では、Z2は、Z2-X8-X7の、組換え発現を増大させ、可溶性の発現産物であるZ2-X8-X7の維持を容易とし、Z2-X8-X7又はその一部の、細胞外培地への排出を容易とし、X7又はその一部を、プロテアーゼ若しくはペプチダーゼにより意図しない形でプロセシングされることから保護し、且つ/又はZ2-X8-X7の、捕捉(例えば、HPLCなど、クロマトグラフィーによる精製を介する)のための特性を改善する。X8は、非存在でありうる。X8は、少なくとも3個のアミノ酸、少なくとも4個のアミノ酸、又は少なくとも5個のアミノ酸など、少なくとも2個のアミノ酸を含みうる。X8は、3個〜20個のアミノ酸、4個〜15個のアミノ酸、又は少なくとも5個〜10個のアミノ酸など、1個〜30個のアミノ酸を含みうる。X7は、少なくとも5個のアミノ酸、少なくとも10個のアミノ酸、又は少なくとも15個のアミノ酸を含みうる。X7は、10個〜70個のアミノ酸又は20個〜50個のアミノ酸など、1個〜100個のアミノ酸を含みうる。X7は、本明細書で規定されるZ1でありうる。例えば、Z1は、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体でありうる。一実施形態では、Z2-X8-X7は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドである。X8は、アミノ酸配列X6-X5-X4-G-D-R[式中、X6、X5、及びX4は、本明細書で規定される通りである]を含みうる。X8は、アミノ酸配列DDGDR又はDEGDRを含みうる。
【００４１】
式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド内では、Z1は、組換え発現により製造される標的ポリペプチドであることが多い。一実施形態では、Z1は、薬学的に活性なポリペプチド、又は薬学的に活性なポリペプチドの前駆体である。ある実施形態では、Z1は、約15個〜約100個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである。更に別の実施形態では、Z1は、少なくとも約15個〜約50個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである。別の実施形態では、Z1は、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体であり、例えばK34R-GLP-1(7〜37)又はK34R-GLP-1(9〜37)である。一実施形態では、K34R-GLP-1(7〜37)は、HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGである。一実施形態では、K34R-GLP-1(9〜37)は、EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRGである。Z1は、N末端配列であるHAEGT又はEGTFTを含みうる。Z1は、N末端配列であるHAEGTFTSDVSSYLE、EGTFTSDVSSYLE、又は少なくとも5個のアミノ酸を含む、これらの断片を含みうる。別の実施形態では、Z1は、グルカゴンペプチド又はその機能的な変異体である。Z1は、N末端配列であるHGTFTを含む、グルカゴンペプチド又はその機能的な変異体でありうる。Z1は、(des7-8、31H、34Q、37K);(des7-8、34R、37K、38E);(des7-8、34R、37K);(des7-8、9G、34R、37K);(des7-8、23R、34R、37K);(31H、34Q、37K);(9Q、34R、37K);(30E、34R、37K);(34R、37K、38G);(34R、36G、37K);及び(34R、37K、38E)からなる群から選択される、GLP-1(7〜37)の類似体でありうる。Z1は、(i)des7-8、18K、34R;(ii)des7-8、18K、34Q;(iii)des7-8、18K、22E、34R;(iv)des7-8、18K、22E、34Q;(v)des7-8、12L、18K、34Q;(vi)des7、18K、22E、34Q;(vii)18K、34R;(iix)18K、34Q;(ix)18K、22E、34R;(x)18K、22E、34Q;(xi)18K、26R、31K、34R;(xii)18K、26H、31K、34R;(xiii)18K、26H、27K、34Q;(xiv)18K、22K、26R、34Q;(xv)18K、25V、26R、31K、34R;(xvi)18K、22E、26R、31K、34R;(xvii)18K、22E、26H、27K、34R;(iixx)18K、22E、26H、27K、34Q;(ixx)18K、22E、26H、27K、31H、34R;(xx)18K、22E、26H、27K、31H、34Q;(xxi)18K、22E、25V、26R、31K、34R;(xxii)18K、22E、25V、26R、31K、34Q;(xxiii)18K、22E、25V、26R、31K、34G;(xxiv)18K、22E、25V、26R、27K、34R;(xxv)18K、22E、25V、26R、27K、34Q;(xxvi)18K、22E、25V、26R、27K、31H、34R;(xxvii)18K、22E、25V、26R、27K、31H、34Q;(iixxx)18K、22E、23E、25V、26R、27K、34R;(ixxx)18K、22E、23E、25V、26R、27K、34Q;(xxx)18K、22E、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxi)18K、22E、25V、26R、31H、des35-37;(xxxii)18K、22E、25V、26R、30K、34G、des35-37;(xxxiii)18K、22E、25V、26R、30K、31H、34G、des35-37;(xxxiv)18K、22E、25V、26R、27L、30K、34G、des35-37);(xxxv)18K、22E、26R、31K、34G、des35-37;(xxxvi)18K、22E、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxxvii)des7、18K、22E、26R、34R、37K;(iixxxx)des7、18K、22E、26R、27K、31H、34G、des35-37;(ixxxx)7Imp、18K、22E、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxx)des7-8、18K、22E、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxxi)8S、18K、22E、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxxii)des7-8、18K、26V、27K、34R;(xxxxiii)des7-8、18K、26H、30K、34R、des36-37;(xxxxiv)des7-8、18K、25V、26R、31K、34R;(xxxxv)des7-8、18K、22E、34R、des36-37;(xxxxvi)des7-8、18K、22E、26R、34R、37K;(xxxxvii)des7-8、18K、22E、26R、31K、34R;(iixxxxx)des7-8、18K、22E、26R、31K、34G、des35-37;(ixxxxx)des7-8、18K、22E、26R、30K、34R、des36-37;(xxxxx)des7-8、18K、22E、26R、30K、34R;(xxxxxi)des7-8、18K、22E、26R、27K、31H、34R、des36-37;(xxxxxii)des7-8、18K、22E、25V、26R、31K、des34-37;(xxxxxiii)des7-8、18K、22E、25V、26R、31K、34R;(xxxxxiv)des7-8、18K、22E、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxxxv)des7-8、18K、22E、25V、26R、30E、31K、34G、des35-37;(xxxxxvi)des7-8、18K、22E、25V、26R、27L、des35-37;(xxxxxvii)des7-8、18K、22E��25V、26R、27K、34Q;(iixxxxxx)des7-8、18K、22E、25V、26R、27K、31H、34G、des35-37;(ixxxxxx)des7-8、18K、22E、25V、26R、27H、31K、34G、des35-37;(xxxxxx)des7-8、18K、22E、25V、26H、31K、34G、des35-37;(xxxxxxi)des7-8、18K、22E、23R、25V、26R、31K、34G、des35-37;(xxxxxxii)18K、22E、25V、26R、27L、30K、34G、des35-37;(xxxxxxiii)des7、18K、22E、26R、27K、34Q;(xxxxxxiv)34H;及び(xxxxxxv)des7-8、18K、34Hからなる群から選択される、GLP-1(7〜37)の類似体でありうる。Z1は、(i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)des7-8、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)des7-8、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)des7-8、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)des7-8、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)des7-8、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)des7-8、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)des7-8、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)des7-8、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;及び(xxvii)des7-8、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gからなる群から選択される、GLP-1(7〜37)の類似体でありうる。Z1は、GLP-1(7〜37)、又は(iii)(22E)及び(iv)22E、30Eからなる群から選択される、GLP-1(9〜37)の類似体でありうる。Z1は、i)(22E、26R、27K、34R、38G、39G、40G、41S、42K);ii)(22E、26R、31K、34R、38G、39G、40G、41S、42K);iii)(22E、26R、34R、38K、39G、40G、41S、42K);iv(22E、23K、26R、34R、38G、39G、40G、41S、42K);v)(22E、26R、34R、36K、38G、39G、40G、41S、42K);及びvi)(18K、22E、26R、34R、38G、39G、40G、41S、42K)からなる群から選択される、GLP-1(9〜37)の類似体でありうる。更に別の実施形態では、Z1は、A(1〜21)-AAK-B(1〜29)-ヒトインスリンなど、インスリン前駆体又はその機能的な変異体である。別の実施形態では、Z1は、エキセンディン、PYY、レプチン、及びこれらの機能的な変異体からなる群から選択される。
【００４２】
一実施形態では、Z1及びZ2は、異なる起源に由来する、すなわち、異なる種及び/又は合成の起源に由来する。
【００４３】
融合ポリペプチドの製造
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドは、組換え核酸技法により作製することができる。一般に、Z2、X6-X5-X4-GDR、及びZ1をコードする核酸配列は、合成により得る(小型のポリペプチドについて)か、又は所望のポリペプチドをコードするように修飾されたクローニングされたDNAとして得る。Z2をコードする核酸配列は、野生型のDNAをクローニングすることにより得ることができることが多いが、Z2が限定されたサイズのポリペプチドである場合はまた、合成により得ることもできる。エンテロキナーゼ部位をコードする核酸配列であって、5個〜6個のアミノ酸残基だけのポリペプチドである、X6-X5-X4-GDRは通例、合成により得られると予想される。特に、Z2が、むしろ小型のポリペプチドである状況では、X6-X5-X4-GDRはなお、Z2をコードする同じ核酸配列によりコードされうる。Z2、X6-X5-X4-GDR、及びZ1の異なる部分をコードする核酸配列は、式(I)の、少なくともエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードする1つの核酸配列を構成するように、インフレームで融合させる。このような融合ポリペプチドは、タグなど、例えばHisタグ、又は可溶化ドメイン(DsbC、RL9、MBP、NusA又はTrxなど)など、N末端又はC末端の伸長部分(Z1及びZ2としての、又はZ1内及びZ2内の)を伴うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド、又はN末端又はC末端の伸長部分を伴わないエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであり得る。次いで、この修飾核酸配列を発現ベクターへと挿入し、これを順に発現宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトする。
【００４４】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードする核酸構築物は適宜、ゲノム起源、cDNA起源、又は合成起源であってもよい。エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードする核酸構築物は、起源の異なる核酸配列を含むことが多い。アミノ酸配列の変化は、周知の技法により、遺伝子コードの改変によって達成される。
【００４５】
更なる態様では、本発明は、本発明のエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列を提供する。
【００４６】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列は通例、組換えDNA手順に簡便にかけうる任意のベクターでありうる、組換えベクターへと挿入するが、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多いと予想される。したがって、ベクターは、自律複製型ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製に依存しない染色体外の実体、例えば、プラスミドとして存在するベクターでありうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞へと導入されると、宿主細胞ゲノムへと組み込まれ、それが組み込まれた染色体と併せて複製されるベクターでもありうる。
【００４７】
ベクターは、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列を、DNAの転写に要求される更なるセグメントに作動可能に連結した発現ベクターであることが好ましい。「作動可能に連結した」という用語は、それらが、それらの意図された目的のために、呼応して機能する、例えば、転写が、プロモーターにおいて始まり、ターミネーターで終結するまで、ポリペプチドをコードするDNA配列を通って進むように、セグメントが、配置されていることを指し示す。
【００４８】
したがって、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させるときの使用のための発現ベクターは、クローニングされた遺伝子又はcDNAの転写を開始し、方向付けることが可能なプロモーターを含むと予想される。プロモーターは、えり抜きの宿主細胞内で転写活性を示し、宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる、任意のDNA配列でありうる。
【００４９】
加えて、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させるための発現ベクターはまた、宿主細胞により認識されて、転写を終結させる配列である、ターミネーター配列も含むと予想される。ターミネーター配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列の3'末端に作動可能に連結する。本発明では、えり抜きの宿主細胞内で機能的な任意のターミネーターを使用することができる。
【００５０】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現は、宿主細胞の細胞質ゾル中の細胞内発現を目的とすることもでき、増殖培地中への細胞外発現のための分泌経路へと方向付けることもできる。代替的に、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現は、細胞内小器官を標的とすることもできる。
【００５１】
細胞内発現は、デフォルトの経路であり、プロモーターを含むDNA配列、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列に続き、ターミネーターを伴う発現ベクターを要求する。
【００５２】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路へと方向付けるために、分泌シグナル配列(また、シグナルペプチド又はプレ配列としても公知の)は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドのN末端伸長部分として必要とされる。シグナルペプチドをコードするDNA配列を、適正なリーディングフレーム内で、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列の5'末端へと接続する。シグナルペプチドは、通常タンパク質と会合するペプチドであることができ、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来であることもできる。
【００５３】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、及び/又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲーションし、それらを、複製に必要な情報を含有する適切なベクターへと挿入するのに使用される手順は、当業者に周知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989を参照されたい)。
【００５４】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列を導入する宿主細胞は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、細胞内又は細胞外で発現させることが可能な、任意の細胞でありうる。翻訳後修飾が必要な場合、適切な宿主細胞は、哺乳動物細胞など、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び高等真核生物細胞を含む。
【００５５】
細菌による発現:大腸菌(E.coli)内の発現では、細菌宿主細胞内の核酸構築物の転写を方向付けるのに適するプロモーターの例は、全てが大腸菌に由来する、lacオペロン、trpオペロン、及びこれらのハイブリッド体である、trc及びtacから得られるプロモーターである(DeBoerら、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21〜25頁)。大腸菌内の使用のための、他のなおより強力なプロモーターは、T7ファージ及びT5ファージに由来する、バクテリオファージプロモーターである。T7プロモーターは、大腸菌宿主内のT7ポリメラーゼの存在を要求する[Studier及びMoffatt、J.Mol.Biol.189、113頁、(1986)]。これらのプロモーターは全て、IPTG、ラクトース、又はトリプトファンによる誘導を介して、細菌増殖周期内の戦略地点において転写を開始させるように調節される。大腸菌はまた、持続的発現のための、強力なプロモーター、例えば、Dalbogeら、1987、Biotechnology 5、161〜164頁において、hGHを発現させるのに使用されている、合成プロモーターも有する。
【００５６】
バチルス(Bacillus)属内の発現のために、枯草菌(Bacillus subtilis)のレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)のマルトース生成型アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子(penP)、枯草菌のxylA遺伝子及びxylB遺伝子に由来するプロモーターは、適切な例である。更なるプロモーターは、「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American、1980、242: 74〜94頁;及びSambrookら、1989、上掲において記載されている。
【００５７】
大腸菌では、細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、全てが大腸菌に由来する遺伝子である、DegP、OmpA、OmpF、OmpT、PhoA、及びエンテロトキシンSTIIから得られるシグナルペプチドである。バチルス属では、シグナルペプチド領域は、バチルス属NCIB 11837のマルトース生成型アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルスのアルファ-アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスのスブチリシン、バチルス・リケニフォルミスのベータ-ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルスの中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、及び枯草菌のprsAから得られる。更なるシグナルペプチドは、Simonen及びPalva、1993、Microbiological Reviews 57: 109〜137頁により記載されている。大腸菌及びバチルス属のいずれについても、シグナルペプチドは、SignalPアルゴリズム(Nielsenら、1997ら、Protein Eng.10、1〜6、Emanuelsenら、2007、Nature Protocols 2、953〜971頁)において概説されている規則に従い、デノボで創出することができる。シグナル配列は、所与の文脈に適応させ、SignalPスコアについて点検することができる。
【００５８】
転写のための強力なターミネーターの例は、Thiofusion Expression System内などのアスパルターゼaspA、pETベクター内のT7遺伝子10ターミネーター(Studierら)、及びリボソームRNA遺伝子である、rrnA、rrnDのターミネーターである。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、式(I)に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。一実施形態では、発現ベクターを含む宿主細胞は、酵母、細菌、又は真菌である。別の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス(Saccharomyces)属種、ピキア(Pichia)属種、ハンセヌラ(Hansenula)属種、及びクルイベロミセス(Kluyveromyces)属種からなる群から選択される。宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)でありうる。更なる実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)及びバチルス属種からなる群から選択される。
【００６０】
好ましい発現宿主の例は、バクテリオファージによる溶原化を介してT7ポリメラーゼを保有する、大腸菌K12 W3110株、微量の大腸菌B株、大腸菌MC1061株を伴う大腸菌K12株、及び大腸菌B BL21 DE3株である。発現のためのプラスミドで形質転換される場合、これらの宿主は、抗生剤により選択することができる。抗生剤非含有選択では、好ましい宿主は、例えば、大腸菌B株に特異的であり、病原性挙動と関連することが多い、2つのD,L-アラニンラセマーゼ遺伝子である、alr、dadXを欠失させ、II群莢膜遺伝子クラスター(kpsM-kpsF)を欠失させた、大腸菌B BL21 DE3 3xKO株である。II群遺伝子クラスターの欠失により、大腸菌B BL21 DE3 3xKO株も、大腸菌K12と同じ安全性に類別される。選択は、AmpR遺伝子の代わりに、発現プラスミド内に挿入されたalr遺伝子により、D-アラニンが要求されなくなることに基づく。
【００６１】
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、宿主生物内で発現させたら、従来の技法により、回収し、要求される純度へと精製することができる。このような従来の回収法及び精製法の非限定的な例は、遠心分離、可溶化、濾過、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)、RP-HPLC、ゲル濾過、及び凍結乾燥である。
【００６２】
HRV14 3Cの組換え発現及び精製の例は、例えば、Cordingleyら、J.Virol.、1989、63、5037〜5045頁、Birchら、Protein Expr Purif.、1995、6、609〜618頁、及びWO2008/043847において見出すことができる。
【００６３】
乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)からの、XaaProDAPの、微生物による発現及び精製の例は、例えば、Chichら、Anal.Biochem、1995、224、245〜249頁;及びXinら、Protein Expr.Purif.、2002、24、530〜538頁において見出すことができる。
【００６４】
更なる態様では、本発明は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを切断するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と
を含む方法を提供する。
【００６５】
更なる態様では、本発明は、標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)本発明に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法を提供する。
【００６６】
この方法に有用なエンテロキナーゼは、ウシエンテロキナーゼ、ヒトエンテロキナーゼ、又はこれらの機能的な変異体など、任意の哺乳動物エンテロキナーゼである。エンテロキナーゼはまた、エンテロペプチダーゼとも称されうる。エンテロキナーゼの軽鎖は、触媒性ドメインを含み、重鎖の非存在下で活性であるので、他の有用なエンテロキナーゼは、ウシ軽鎖又はこれらの機能的な変異体である。このようなウシ軽鎖変異体は、例えば、WO2013/092855A1、例えば、(C112A)変異体及び(C112A、L134K、I135K)変異体において開示されている。
【００６７】
上記の方法に従うエンテロキナーゼ切断は、多数の切断条件下で実施することができる。一実施形態では、工程b)の接触させる工程が有機溶媒を含む水溶液中で実行される方法が、実行される。この有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-プロパノール、アセトン、グリセロール、又はこれらの混合物から選択することができる。一実施形態では、前記有機溶媒は、約10%w/w〜約25%w/wの濃度のエタノールである。一実施形態では、前記有機溶媒は、約10%w/w〜約25%w/wの濃度の、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-プロパノール、アセトン、グリセロール、又はこれらの混合物である。
【００６８】
本発明の実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態により、更に記載される。
1.式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
2.式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであって、
i)Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含むか、ii)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなり、Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含むか、又はiii)Z2が、可溶化ドメインを含む、
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
3.X5が、G、P、A、V、L、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、及びTである、実施形態1又は2に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
4.X4が、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、又はTである、実施形態1〜3のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
5.X4が、E、Q、L、D、G、又はAである、実施形態1〜4のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
6.X4が、Eである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
7.X4が、Qである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
8.X4が、Lである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
9.X4が、Dである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
10.X4が、Gである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
11.X4が、Aである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
12.X5が、D又はEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
13.X5が、Dである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
14.X5が、Eである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
15.X5-X4が、DEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
16.X5-X4が、DDである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
17.X5-X4が、DLである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
18.X5-X4が、DQである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
19.X5-X4が、DGである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
20.X5-X4が、DAである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
21.X5-X4が、DSである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
22.X5-X4が、EEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
23.X5-X4が、EQである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
24.X5-X4が、ELである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
25.X5-X4が、EDである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
26.X5-X4が、EGである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
27.X5-X4が、EAである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
28.X5-X4が、ESである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
29.X5-X4が、QEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
30.X5-X4が、HEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
31.X5-X4が、NEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
32.X5-X4が、MEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
33.X6が、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y、又はQである、実施形態1〜32のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
34.X6が、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、又はWである、実施形態33に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
35.X6が、I、G、L、T、R、又はSである、実施形態34に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
36.X6が、Iである、実施形態35に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
37.X6が、Gである、実施形態35に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
38.X6が、非存在である、実施形態1〜32のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
39.Z2が、宿主細胞内の前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現を容易にするポリペプチドである、実施形態1〜38のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
40.前記宿主細胞が、大腸菌である、実施形態39に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
41.前記宿主細胞が、酵母である、実施形態39に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
42.前記宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、実施形態39〜40に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
43.Z2が、非存在である、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
44.Z2が、0個〜10個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜43のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
45.Z2が、2個〜8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
46.Z2が、少なくとも8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
47.Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含む、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
48.Z2が、アミノ酸残基であるか、又はZ2が、2個〜40個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
49.Z2が、約8個〜約200個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
50.Z2が、約10個〜約25個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
51.Z2が、EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、及びEELDARLEALKからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
52.Z2が、DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、及びDVKPGQPMYからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
53.Z2が、DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE、及びDVEPGQPLYからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
54.Z2が、QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW、及びEAEAWHからなる群から選択される配列を含む、実施形態1〜42に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
55.Z2が、可溶化ドメインを含む、実施形態1〜54のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
56.Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含む、実施形態1〜55のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
57.Z1が、薬学的に活性なポリペプチド、酵素、又はこれらの前駆体である、実施形態1〜56のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
58.Z1が、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
59.Z1が、K34R-GLP-1(7〜37)又はK34R-GLP-1(9〜37)である、実施形態58に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
60.Z1が、グルカゴンペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
61.Z1が、インスリン前駆体又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
62.Z1が、エキセンディン、PYY、レプチン、及びこれらの機能的な変異体からなる群から選択される、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
63.Z1が、約15個〜約100個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜62のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
64.Z1が、約15個〜約50個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜63のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
65.非自然発生のポリペプチドである、実施形態1〜64のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
66.Z1とZ2とが、異なる起源、すなわち、異なる種に由来するか、又は合成である、実施形態1〜65のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
67.前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなる、実施形態1〜66のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
68.実施形態1〜67のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列。
69.上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動的に連結された、実施形態68に従うDNA配列を含む発現ベクター。
70.実施形態69に従う発現ベクターを含む宿主細胞。
71.酵母、細菌、又は真菌である、実施形態70に従う宿主細胞。
72.サッカロミセス属種、ピキア属種、ハンセヌラ属種、及びクルイベロミセス属種からなる群から選択される、実施形態70〜71のいずれかに従う宿主細胞。
73. サッカロミセス・セレビシエである、実施形態70〜72のいずれかに従う宿主細胞。
74.大腸菌及びバチルス属種からなる群から選択される、実施形態70〜71のいずれかに従う宿主細胞。
75.エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを切断するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I)  配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と
を含む方法。
76.標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)実施形態1〜67のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。
77.工程b)で使用される前記エンテロキナーゼが、ウシエンテロキナーゼ、ウシエンテロキナーゼ軽鎖、又はこれらの機能的な変異体から選択される、実施形態75又は76に従う方法。
78.前記エンテロキナーゼが、ウシエンテロキナーゼ軽鎖変異体(C112A)、(C112A、L134K、I135K)、又はこれらの機能的な変異体である、実施形態75〜78のいずれかに従う方法。
79.工程b)の前記接触させる工程が、有機溶媒を含む水溶液中で実行される、実施形態75〜77のいずれかに従う方法。
80.前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-プロパノール、アセトン、グリセロール、又はこれらの混合物から選択される、実施形態78に従う方法。
81.前記有機溶媒が、約10%w/w〜約25%w/wの濃度のエタノールである、実施形態79に従う方法。
82.前記工程c)が、任意選択である、実施形態76〜80のいずれかに従う方法。
83.アミノ酸配列Z2-X8-X7を含むペプチドであって、Z2が、実施形態1〜82のいずれかで規定されている通りであり、X8が、非存在であるか、又はエンテロキナーゼ切断部位を含むペプチドであり、X7が、少なくとも1個のアミノ酸を含むポリペプチドである、ペプチド。
84.X8が、非存在である、実施形態83に従うペプチド。
85.X8が、少なくとも3個のアミノ酸、少なくとも4個のアミノ酸、又は少なくとも5個のアミノ酸など、少なくとも2個のアミノ酸を含む、実施形態83に従うペプチド。
86.X8が、3個〜20個のアミノ酸、4個〜15個のアミノ酸、又は少なくとも5個〜10個のアミノ酸など、1個〜30個のアミノ酸を含む、実施形態83に従うペプチド。
87.X7が、少なくとも5個のアミノ酸、少なくとも10個のアミノ酸、又は少なくとも15個のアミノ酸を含む、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
88.X7が、10個〜70個のアミノ酸、又は20個〜50個のアミノ酸など、1個〜100個のアミノ酸を含む、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
89.X7が、実施形態1〜88のいずれかで規定されたZ1である、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
90.Z1が、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態89に従うペプチド。
91.Z2-X8-X7が、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドである、実施形態83〜90のいずれかに従うペプチド。
92.X8が、アミノ酸配列X6-X5-X4-G-D-Rを含み、X6、X5、及びX4が、実施形態1〜91のいずれかで規定されている通りである、実施形態83〜91のいずれかに従うペプチド。
93.X8が、アミノ酸配列DDGDR又はDEGDRを含む、実施形態83〜91のいずれかに従うペプチド。
【００６９】
本明細書で引用される、刊行物、特許出願、及び特許を含む、全ての参考文献は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられ、各参考文献が、参照により組み入れられるように、個別に、且つ、具体的に指し示され、その全体において本明細書に示された場合と同じ程度に本明細書に組み入れられる(法規により許容される最大程度まで)。本明細書では、全ての見出し及び小見出しは、簡便さだけのために使用されるものであり、本発明をいかなる形でも限定するものとみなされるべきではない。本明細書で提示される、任意の例及び全ての例、又は例示的表現(例えば、「など」)の使用は、本発明をよりよく例示することだけを意図するものであり、そうでないことが主張されない限りにおいて、本発明の範囲に対して限定を付与するものではない。本明細書内のいかなる表現も、特許請求されていない要素を、本発明の実施に不可欠なものとして指し示すものとみなされるべきではない。本明細書の特許文献の引用及び組入れは、簡便さのためだけになされるものであり、このような特許文献の妥当性、特許性、及び/又は権利行使可能性についてのいかなる所見を反映するものでもない。本発明は、本明細書に付属の特許請求の範囲において列挙される、対象物の全ての改変及び同等物を、関連法規により許容されるものとして含む。
【実施例】
【００７０】
略語の一覧
EK:エンテロキナーゼ又はエンテロキナーゼ軽鎖
D4K:DDDDK
NMP:N-メチル-2-ピロリドン
Abz:2-アミノベンゾイル
Dnp:2,4-ジニトロフェニル
【００７１】
材料及び方法
一般的な調製法
方法:SPPS_I(固相ペプチド合成)
C末端Lys(Abz)アミドフルオロフォア及びN末端Lys(Dnp)消光剤を有する、分子内消光型蛍光発光性ペプチド基質を、固相ペプチド合成により合成した。
【００７２】
これらのペプチド基質は、以下の一般構造:
Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*  式(II)
[式中、
X6-X5-X4は、式(I)における意味と同じ意味を有し(各々は、アミノ酸であるが、X6は任意選択である)、
Z2*は、Lys(Dnp)であり、
Z1*は、Z1-Lys(Abz)アミドであり(式中、Z1は、式(I)で規定される通りである)]
を有する。
【００７３】
SPPS_Iは、Intavis Bioanalytical Instruments AG社(Koeln、Germany)製のMultipep RSi合成器上で、例えばRinkamide-Chematrix(0.5 mmol/g)のような樹脂の投入量と比べて2.5倍過剰量のFmoc-アミノ酸(300mMのOxyma Pure(登録商標)を含むNMP中に300mM)を使用して、3μmolのスケールで、並行して実施した。Fmoc脱保護は、NMP中に20%のピペリジンを使用して実施した。カップリングは、NMP中に1:1:1:1のアミノ酸/Oxyma Pure(登録商標)/DIC/コリジンを使用して実施した。全てのアミノ酸を、「二重カップリング又は三重カップリングした」とは、1回目のカップリング(60分間)の後、樹脂を排出し、より多くの試薬(アミノ酸、Oxyma Pure(登録商標)、DIC、及びコリジン)を添加し、混合物を再度反応させたことを意味する。
【００７４】
方法:EKの精製
精製エンテロキナーゼ酵素の調製物は、WO2013/092855A1において記載されている手順に従い調製した。
【００７５】
検出及び特徴付けの一般的な方法
方法:EK-反応速度_1
EK-反応速度_1は、式(II)に従う、分子内消光型蛍光発光性ペプチド:Lys(Dnp)-ペプチド-Lys(Abz)アミドの加水分解の初期速度を測定することにより実施した。一般に、1〜50μMの範囲の基質濃度で、ペプチドのバックグラウンド蛍光を測定した後で、加水分解の初期速度、すなわち、30分間で5%未満の加水分解の読取りを可能とする濃度で精製エンテロキナーゼ酵素を添加することにより、加水分解の初期速度を測定した。典型的には、1〜10nMの酵素濃度を使用できる。最長で1時間にわたる加水分解の後、更なる酵素を添加して、総加水分解時における蛍光レベルの測定を可能とした。加水分解速度は一般に、50mMのMOPS緩衝液、1mMのEDTA、pH 7.5中、25℃で、励起のための320nm及び発光のための420nmを使用する、Perkin Elmer Enspire蛍光プレートリーダーを使用して測定した。
【００７６】
方法:EK-反応速度_2
EK-反応速度_2は、N末端伸長部分を含む全長GLP-1の加水分解の初期速度を計算することにより実施した。基質濃度は、150〜300μMの範囲とした。加水分解反応は、9.5nMの最終濃度をもたらす量のエンテロキナーゼを添加することにより開始させた。試料は、6.2分後、18.7分後、43.7分後、86.3分後、151.3分後、及び243.8分後に採取し、5%の酢酸中への1+9希釈によりクエンチした。Waters iClass UPLC上で適切な方法を使用して、残りの基質及び解析的逆相カラム上に形成された産物を分離し、ピーク面積を積分することにより、これらを個別に定量化した。以下の形の式:
【００７７】
【数１】
2017184764.tif 000002
【００７８】
[式中、tは、時間であり、cS0は、初期基質濃度であり、cEは、酵素濃度であり、cPtは、時間tにおける産物濃度であり、cStは、時間tにおける基質濃度であり、kcat及びKmは、加水分解パラメータであり、Kiは、産物阻害定数である]
を、生データへと当てはめた。0.1μMの定数Kiを、全ての反応のために使用した。初期加水分解速度は、全てのペプチドの、1mg/mlの初期基質濃度について決定されたパラメータに基づき計算した。全ての反応は、50mMのトリス緩衝液、1mMのEDTA、pH 8.5中で実施した。
【００７９】
エンテロキナーゼ酵素
本明細書の実施例のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００８０】
(実施例1〜39)
GLP-1(7〜37)のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例1〜39の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 1(表1)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例1〜39のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００８１】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００８２】
例えば、実施例1では、基質は、エンテロキナーゼ切断部位AEGDR(配列番号12)を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドのためのモデル基質である、以下の構造:Lys(Dnp)-AEGDR-HAEGT-Lys(Abz)アミド(配列番号11)を有する。
【００８３】
【表１】
2017184764.tif 000003
【００８４】
(実施例40〜59)
GLP-1(9〜37)変異体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例40〜59の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、EGTFT(配列番号13)、すなわち、GLP-1(9〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 2(表2)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例40〜59のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００８５】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００８６】
【表２】
2017184764.tif 000004
【００８７】
(実施例60〜79)
エキセンディン-4のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例60〜79の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HGEGT(配列番号14)、すなわち、エキセンディン-4に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 3(表3)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例60〜79のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００８８】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００８９】
【表３】
2017184764.tif 000005
【００９０】
(実施例80〜83)
グルカゴン類似体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例80〜83の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HGTFT(配列番号15)、すなわち、グルカゴン類似体に由来するN末端ペンタペプチドであり、X5-X4は、Table 4(表4)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、EK精製により精製し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例80〜83のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００９１】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００９２】
【表４】
2017184764.tif 000006
【００９３】
(実施例84〜87)
グルカゴン類似体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例84〜87の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、QGTFT(配列番号16)、すなわち、グルカゴン類似体に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 5(表5)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度1_法により決定した。実施例84〜87のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００９４】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００９５】
【表５】
2017184764.tif 000007
【００９６】
(実施例88〜91)
ヒトグルカゴンのN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例88〜91の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HSQGT(配列番号17)、すなわち、ヒトグルカゴンに由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 6(表6)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例88〜91のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【００９７】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【００９８】
【表６】
2017184764.tif 000008
【００９９】
(実施例92〜110)
GLP-1(7〜37)のN末端及び異なるX6を含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例92〜110の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X5-X4は、DEであり、X6は、Table 7(表7)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例92〜110のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【０１００】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、X6-X5-X4=ADE(100%)を有する基質に対して標準化する。
【０１０１】
【表７】
2017184764.tif 000009
【０１０２】
(実施例111〜117)
GLP-1(7〜37)のN末端を含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例111〜117の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4-GDRに対応するエンテロキナーゼ部位は、Table 8(表8)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。
【０１０３】
Table 8(表8)で指定されるEK部位は、X5-X4-GDR配列に対応するペンタペプチドを指示する。よって、実施例111では、基質は、構造Lys(Dnp)-IMGDRHAEGT-Lys(Abz)アミド(配列番号18)を有し、実施例112では、基質は、構造Lys(Dnp)-INDDRHAEGT-Lys(Abz)アミド(配列番号19)を有する。したがって、実施例112では、エンテロキナーゼ部位は、GDR配列を含まず、DDR配列を含む。実施例111〜117のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【０１０４】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【０１０５】
【表８】
2017184764.tif 000010
【０１０６】
(実施例118〜137)
全[Arg34]GLP-1(9〜37)配列を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度、及びN末端伸長部分、及びDDDDKを含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド
実施例118〜135の全てについて、基質は、Z2*-X6-X5-X4-GDR-Z1*[式中、Z2及びZ1は、Table 9(表9)で規定される通りである、すなわち、Z2は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドのN末端伸長部分であり、Z1は、{Arg34}GLP-1(9〜37)であり、X6は、非存在であり、X5-X4-GDRに対応するエンテロキナーゼ部位は、基準例を除き、Table 9(表9)で指定される通りであった]であり、Table 9(表9)(例えば、実施例118)で指定される通り、基質は、Z2*-X6-DDDDK-Z1*であった。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_2法により決定した。
【０１０７】
Table 9(表9)で指定されるEK部位は、X5-X4-GDR配列に対応するペンタペプチドを指示する。よって、実施例119では、基質は、構造DVKPGQPLYDEGDR-[Arg34]GLP-1(9〜37)を有する。
【０１０８】
実施例118〜135のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
【０１０９】
エンテロキナーゼ切断の初期速度は、D4K部位[式(II)中のX5-X4-GDRを置き換える]を有する基質に対して標準化する。
【０１１０】
【表９】
2017184764.tif 000011
【０１１１】
本発明のある特定の特徴について例示してきたが、今や、当業者には、本明細書で記載される、多くの改変、置換、変化、及び同等物が想起されると予想される。したがって、付属の特許請求の範囲は、全てのこのような改変及び変化を、本発明の真の精神の範囲内に収まるものとして対象とするように意図されることを理解されたい。
【配列表】
2017184764000001.app
【外国語明細書】
2017184764000001.pdf