(57)【要約】【課題】シアニジンやＣ３Ｇよりも糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することが可能なアントシアニンを見出し、見出したアントシアニンを含有する治療剤または予防剤、及び食品組成物を提供する。【解決手段】シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤である。あるいは、この化合物を含有する、糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の食品組成物である。シアニジン−３，５−ジグルコシドは、アントシアニンの一種であり、シアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示す。本剤あるいは本食品組成物が摂取されると、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性が抑えられやすいため、低血糖を引き起こすことを避けつつ効果的に糖尿病または血糖値上昇を予防、治療し得る。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、
糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤。
【請求項２】
前記化合物を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有する請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項３】
シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤。
【請求項４】
シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、
糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の食品組成物。
【請求項５】
シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、
ＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物。
【請求項６】
シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、
ＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害用のアロニア果汁。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アントシアニンを含有する、糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤、及び食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アントシアニンは、アントシアニジン配糖体であり、例えば、葡萄、ブルーベリー、ラズベリー、及びアロニア等の液果類の果実に含有されている生理活性物質である。また、非特許文献１では、アロニア果汁を摂取した糖尿病患者の血糖値が降下したと報告されている。しかし、その血糖降下の作用機構は、不明であった。
【０００３】
これに対して、非特許文献２では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験により、アントシアニジンの一種であるシアニジンや、シアニジン−３−グルコシド（以下「Ｃ３Ｇ」という。）等のアントシアニンが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下「ＤＰＰ−ＩＶ」という。）活性を阻害したと報告されている。このため、シアニジンやＣ３Ｇは、糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する上で有用な生理活性物質であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｇｄａ  Ｂａｄｅｓｃｕ，他３名，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｎｄ  Ａｒｏｎｉａ  ｍｅｌａｎｏｃａｒｐａ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５３巻（４），２０１５年４月，ｐ．５３３−５３９
【０００５】
【非特許文献２】Ｊｕｎｆｅｎｇ  Ｆａｎ，他４名，Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｃｉｔｒｕｓ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３年，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４７９５０５
【０００６】
【非特許文献３】Ｉｗａｏ  Ｏｈｋｕｂｏ，他４名，Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｓｅｍｉｎａｌ  Ｐｌａｓｍａ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４年，第１１６巻，ｐ．１１８２−１１８６
【０００７】
【非特許文献４】Ｊ．Ｓ．Ｂａｒｎｅｓ，他１名，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙａｎｉｄｉｎｇ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ−３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ：Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｉｏｎ  ｔｒａｐ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０１１年，第３０８巻，ｐ．７１−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、非特許文献２によれば、シアニジンによるＤＰＰ−ＩＶ阻害活性は強くはなく、Ｃ３ＧによるＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の強さは中程度であるとされている。このため、シアニジンやＣ３Ｇを摂取しても、糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する効果は現れにくいと考えられる。
【０００９】
そこで、本発明の課題は、シアニジンやＣ３Ｇよりも糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することが可能なアントシアニンを見出し、見出したアントシアニンを含有する治療剤または予防剤、及び食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記した課題を解決しようと鋭意検討を重ねた結果、アントシアニンの一種であるシアニジン−３，５−ジグルコシドがアロニアの果実や果汁に含有されていることを発見した。また、シアニジン−３，５−ジグルコシドがシアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示すことを発見した。さらに、アロニア果汁がα−グルコシダーゼ阻害活性をも発揮することを発見した。これらの発見により、本発明者は、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含有する薬剤や食品組成物を摂取することで、糖尿病や血糖値上昇を効果的に予防、治療し得ることを見出した。
【００１１】
すなわち、前述した課題を解決するため、本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。
【００１２】
本予防剤または本治療剤は、前記化合物を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有し得る。
【００１３】
あるいは、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。
【００１４】
また、本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。
【００１５】
あるいは、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。
【００１６】
さらに、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害用のアロニア果汁は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る予防剤または治療剤を摂取すると、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物により、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性が抑えられる。また、この化合物のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性は、シアニジンやＣ３ＧのＤＰＰ−ＩＶ阻害活性よりも強い。この強い阻害活性により、本予防剤または本治療剤を摂取した者は、低血糖を引き起こすことを避けつつ、効果的に糖尿病または血糖値上昇を予防または治療することができる。なお、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、食品組成物、及びアロニア果汁も、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含有しているため、本予防剤または本治療剤と同様の作用効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１（アロニア果汁）のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフである。ｎ＝４、＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差あり。
【図２】実施例１（アロニア果汁）をＳｐｅｌｃｏカラムクロマトグラフィーにより分画して得られた参考例１，及び実施例２のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフである。ｎ＝４、＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【図３】実施例２をＨＰＬＣにより逆相カラムクロマトグラフィーにかけて分離したときに、紫外可視分光検出器により記録されたクロマトグラムである。このクロマトグラムの縦軸は、溶出液に波長２１５ｎｍの紫外線や波長５２５ｎｍの可視光を照射したときの検出器出力（ｍＶ）を示す。
【図４】実施例２をＨＰＬＣにより逆相カラムクロマトグラフィーにかけて得られた実施例３，及び参考例２〜４のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフである。ｎ＝４、＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【図５】実施例３をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけて、カラムを通過した溶出液に含まれる成分の濃度の溶出時間ごとの分布を示すグラフである。
【図６】図５のグラフにおいて最大のピークを示した部分の溶出液をＭＳ／ＭＳにかけて得られたマススペクトルである。
【図７】シアニジン−３，５−ジグルコシド、シアニジン、及びＣ３Ｇのいずれか０．５μｍｏｌ／Ｌの存在下でのＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフである。ｎ＝４、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり。
【図８】ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質（シアニジン、シアニジン−３−グルコシド、又はシアニジン−３，５−ジグルコシド）の濃度と、ＤＰＰ−ＩＶ活性との関係を示すグラフである。
【図９】水を自由摂取させた対照群のマウスと、アロニア果汁を自由摂取させたアロニア群のマウスとで、摂取の開始日から２８日間での（ａ）体重の変化を示すグラフ、及び（ｂ）血糖値の変化を示すグラフである。ｎ＝５、＊はｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり。
【図１０】水を自由摂取させた対照群のマウスと、アロニア果汁を自由摂取させたアロニア群のマウスとで、摂取の開始日から２８日目での（ａ）精巣上体の白色脂肪組織の重量を示すグラフ、（ｂ）腸間膜の白色脂肪組織の重量を示すグラフ、（ｃ）腹膜後方の白色脂肪組織の重量を示すグラフ、及び（ｄ）皮下の白色脂肪組織の重量を示すグラフである。ｎ＝５、＊はｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【図１１】水を自由摂取させた対照群のマウスと、アロニア果汁を自由摂取させたアロニア群のマウスとで、摂取の開始日から２８日目での（ａ）血清のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフ、（ｂ）肝臓のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフ、及び（ｃ）ＫＫ−Ａｙマウスでの小腸のＤＰＰ−ＩＶ活性を示すグラフである。ｎ＝５、＊はｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【図１２】（ａ）は、実施例１（アロニア果汁）のα−グルコシダーゼ活性を示すグラフである。さらに、水を自由摂取させた対照群のＫＫ−Ａｙマウスと、アロニア果汁を自由摂取させたアロニア群のＫＫ−Ａｙマウスとで、摂取の開始日から２８日目での（ｂ）小腸上部のα−グルコシダーゼ活性、及び小腸下部のα−グルコシダーゼ活性を示すグラフ、（ｃ）小腸上部でのＧＩＰのｍＲＮＡ量を示すグラフ、及び（ｄ）小腸下部でのＧＬＰ−１のｍＲＮＡ量を示すグラフである。ｎ＝５、＊はｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【図１３】水を自由摂取させた対照群のマウスと、アロニア果汁を自由摂取させたアロニア群のマウスとで、摂取の開始日から２８日目での血清インスリン濃度を示すグラフである。ｎ＝５、＊＊はｐ＜０．０１で有意差あり、ｎ．ｓ．は有意差なし。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤］
本発明に係る糖尿病または血糖値上昇の予防剤または治療剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。なお、本明細書において剤とは、内服薬の薬剤を意味している。このため、例えば、採取後に全く加工されていない植物体（果実）、後述する食品組成物、及び果汁１００％のジュースは、本明細書における剤に該当しない。
【００２０】
シアニジン−３，５−ジグルコシドは、分子内に２つの糖残基を有するアントシアニンの一種であり、その分子構造としては、シアニジンの３位と５位の各々に１分子ずつグルコースがグリコシド結合している構造である。なお、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、シアニジン−３，５−Ｏ−ジグルコシド、あるいはシアニンともいわれている。
【００２１】
シアニジン−３，５−ジグルコシドの塩としては、薬理学的に許容され得る塩であり、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が挙げられる。この塩は、凝集しにくい観点から、好ましくはナトリウム塩および／またはカリウム塩である。
【００２２】
本予防剤または本治療剤は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果を示すため、好ましくはＤＰＰ−ＩＶ阻害用として使用される。換言すれば、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。
【００２３】
本予防剤、本治療剤、及び本阻害剤（以下、この３種類の剤をまとめて「本剤」という。）は、内服薬として公知の剤形をとり得る。つまり、本剤の剤形としては、例えば、錠剤、チュアブル錠、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等が挙げられる。
【００２４】
本剤を摂取すると、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性が阻害されるため、低血糖を引き起こすことを避け、さらに２型糖尿病患者では高血糖にも関わらず夜間にグルカゴンが過剰分泌されることが抑えられる。また、他種の糖尿病治療剤（例えば、スルホニル尿素剤、チアゾリジン誘導体等）とは異なる作用機構により２型糖尿病を予防、治療することができる。このため、本剤は、病状に応じて、他種の糖尿病治療剤の代わりに、あるいは他種の糖尿病治療剤と併用して、経口摂取されることが望ましい。この観点から、本剤は、好ましくは、病状に応じて２型糖尿病患者に摂取させて使用される。
【００２５】
本剤は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性を大幅に抑えることにより糖尿病や血糖値上昇をさらに効果的に予防、治療する観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が、好ましくは３０ｍｇ／１００ｇ以上、さらに好ましくは２００ｍｇ／１００ｇ以上である。なお、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、その分子量が約６１１．５であるため、上記した３０ｍｇ／１００ｇが４９１μｍｏｌ／Ｌに相当し、上記した２００ｍｇ／１００ｇが３．２７ｍｍｏｌ／Ｌに相当する。
【００２６】
シアニジン−３，５−ジグルコシドは渋味を呈するため、本剤は、この渋味をなるべく抑えて摂取しやすくする観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が、好ましくは２０ｇ／１００ｇ以下、さらに好ましくは２．０ｇ／１００ｇ以下である。
【００２７】
本剤は、例えば、有効成分（シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物）を含有する中間原料を含んで成る。この中間原料は、有効成分を含有する植物体を加工して得られる。このような植物体としては、例えば、ブラックベリー果実、アロニア果実、ハスカップ果実、ヤグルマギク花弁、青色のバラ花弁、クロマメ葉、シソ葉等が挙げられる。
【００２８】
上記した植物体は、シアニジン−３，５−ジグルコシドを高濃度で含有するため本剤を製造しやすい観点から、好ましくは、アロニア果実および／またはブラックベリー果実である。この場合、液果類の果実の風味が付与されて本剤を摂取しやすくなる観点からも好ましい。
【００２９】
前述した有効成分を含有する中間原料としては、例えば、前述した植物体の搾汁粕、前述した植物体の破砕物または搾汁（果汁）から抽出された有効成分を含有する粗抽出物、この粗抽出物がカラムクロマトグラフィー等により分画されて得られる有効成分の濃度を高められた植物体抽出物、この植物体抽出物から溶媒を除かれて有効成分の濃度をさらに高められた濃縮物が挙げられる。
【００３０】
例えば、本剤の原料としてアロニア果実を使用した場合には、アロニア果実から果汁を搾った後に残された搾汁粕や、この搾汁粕および／またはアロニア果汁から抽出されたシアニジン−３，５−ジグルコシドを含むアントシアニンを高濃度で含有する抽出液や、この抽出液をカラムクロマトグラフィーにより分画して得られたシアニジン−３，５−ジグルコシドを高濃度で含有する画分から成る植物抽出物や、この植物抽出物から溶媒を除去して得られる濃縮物は、本剤における有効成分を含有する中間原料として好適に使用することができる。なお、搾汁粕を使用する場合には、産業廃棄物である搾汁粕を有効利用し、搾汁粕の廃棄量を低減できるため、果汁製造のランニングコストを低減させつつ、環境負荷も低減させることができて望ましい。
【００３１】
本剤は、例えば、前述した中間原料と、公知の医薬品添加物と、が混合されて成り、必要に応じて圧縮成形されたものである。この医薬品添加物は、製剤化を容易にする、品質の安定化を図る、有用性を高める等の目的で、発明の効果を妨げない限りの種類と分量で使用される、薬理作用を示さず薬理学的に許容され得る添加物である。一般的に、この医薬品添加物は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等といわれている。医薬品添加物として具体的には、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００３２】
アロニア果実には、小腸上部に存在するα−グルコシダーゼの活性の阻害物質が含有されている。このα−グルコシダーゼ阻害物質は、アロニア果実に含有されるアントシアニンであると考えられる。このため、本剤は、２型糖尿病患者を効果的に治療する観点から、さらにより好ましくは、アロニア果実由来の前述した中間原料と、公知の医薬品添加物と、が混合されて成る。この場合の中間原料には、シアニジン−３，５−ジグルコシドを含めた複数種のアントシアニンが含有されている。この場合の本剤は、換言すれば、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物と、アロニア果実由来のアントシアニン（アロニア果実から抽出されたアントシアニン）と、を含有するＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤である。
【００３３】
上記したＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤を毎日摂取し続けると、小腸上部でグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（以下「ＧＩＰ」という。）の発現量（分泌量）が減り、小腸下部でグルカゴン様ペプチド−１（以下「ＧＬＰ−１」という。）の発現量（分泌量）が増し、血糖値や白色脂肪組織の重量が小さく抑えられやすい。このため、インスリン抵抗性や高インスリン血症の症状が緩和されると考えられる。また、α−グルコシダーゼ阻害物質（アロニア果実由来のアントシアニン）により小腸下部でＧＬＰ−１の発現量が増し、さらに、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質（シアニジン−３，５−ジグルコシド）によりＧＬＰ−１が分解されにくいため、ＧＬＰ−１の血中濃度が増したまま保たれる相乗効果が発揮されやすいと考えられる。結果として、血糖値が正常に保たれやすいため、効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することができる。
【００３４】
［食品組成物］
本発明に係る食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有し、糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用である。
【００３５】
本明細書において食品組成物とは、加工食品、調味料、食品添加物、及びサプリメントからなる群より選ばれた１種以上の食品組成物を意味している。前述した本剤や、採取後に全く加工されていない植物体（例えば、ブラックベリー果実、アロニア果実）は、本明細書における食品組成物に該当しない。
【００３６】
例えば、本剤の説明で前述した中間原料は、食品衛生上の問題を生じなければ、そのまま上記した食品添加物として使用可能である。また、上記した加工食品としては、例えば、漬物、乾物、練り製品、粉類、缶詰、冷凍食品、レトルト食品、インスタント食品、乳製品、菓子類、嗜好品、飲料等が挙げられる。ここでの飲料としては、例えば、果汁１００％のジュース、清涼飲料水、アルコール飲料等が挙げられる。上記した加工食品としては、例えば、上記した食品添加物が公知の加工食品原料と混合されて成る加工食品が挙げられる。上記した飲料としては、例えば、アロニア果汁、ブラックベリー果汁、これらの果汁および／または上記した食品添加物が公知の飲料原料と混合されて成る飲料等が挙げられる。
【００３７】
本食品組成物は、摂取され続けることで前述した本剤と同様の作用効果を奏する。このため、本食品組成物は、好ましくは糖尿病または血糖値上昇の予防用または治療用の健康食品の組成物として使用される。なお、ここでの健康食品としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品、高齢者用食品等が挙げられる。
【００３８】
本食品組成物は、小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性の阻害に起因する糖尿病または血糖値上昇の治療効果を発揮しやすい観点から、さらに好ましくは、２型糖尿病患者を対象とした糖尿病治療用の食品組成物である。換言すれば、本発明に係るＤＰＰ−ＩＶ阻害用の食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する。
【００３９】
本食品組成物は、有効成分を抽出したり濃縮する操作をしなくても有効成分をある程度の高濃度で含有している観点や、摂取すると小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性の阻害効果が発揮されやすい観点から、好ましくは、アロニア果実の加工食品および／またはブラックベリー果実の加工食品である。この場合の加工食品は、アロニア果実由来および／またはブラックベリー果実由来の風味が付与されているため、摂取しやすい観点からも好ましい。なお、この場合の加工食品としては、例えば、アロニア果実および／またはブラックベリー果実のジャム、果実飲料（果汁１００％のジュース等）、砂糖漬け、乾燥果実、冷凍果実等が挙げられる。
【００４０】
本食品組成物は、手軽に毎日摂取し続けやすい観点や、２種類の酵素の活性を阻害することにより糖尿病や血糖値上昇の予防効果や治療効果が発揮されやすい観点から、さらに好ましくは、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を有効成分として含有する、ＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害用のアロニア果汁である。アロニア果汁を毎日摂取し続けると、前述した「ＤＰＰ−ＩＶ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害剤」と同様の作用機構により、効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療することができる。
【００４１】
本食品組成物は、有効成分を高濃度で含有することにより小腸に存在するＤＰＰ−ＩＶの活性を大幅に阻害して更に効果的に糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を、好ましくは３０ｍｇ／１００ｇ以上、さらに好ましくは２００ｍｇ／１００ｇ以上含有する。この場合の本食品組成物としては、例えば、サプリメントが挙げられる。この場合のサプリメントは、本剤の説明で前述した中間原料と、公知のサプリメント用の添加物と、が混合されて、必要に応じて圧縮成形されて成る。この場合のサプリメントの形態や公知のサプリメント用の添加物は、本剤の説明で前述した剤形や医薬品添加物と同様である。
【００４２】
本食品組成物は、シアニジン−３，５−ジグルコシドに起因する渋味を抑えて摂取しやすくする観点から、シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を、好ましくは２０ｇ／１００ｇ以下、さらに好ましくは２．０ｇ／１００ｇ以下含有する。
【００４３】
［中間原料である植物抽出物の調製方法］
本剤および食品組成物の説明で前述した植物抽出物について、その調製方法の一例として、原料を準備する工程と、原料から抽出液を調製する工程と、抽出液から粗精製物を得る工程と、粗精製物を分離する工程と、を含む調製方法が挙げられる。以下、この調製方法について詳述する。
【００４４】
原料を準備する工程では、有効成分（シアニジン−３，５−ジグルコシド、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物）を含有する原料を準備する。ここでの原料は、例えば、本剤の説明で前述した植物体、その搾汁や搾汁粕等である。
【００４５】
原料から抽出液を調製する工程では、準備した原料から、有効成分を含有する抽出液を調製する。このためには、まず、液体窒素により原料を凍結させる。次に、凍結物をミキサーで粉砕する。得られた粉砕物を、室温（１〜３０℃）において、塩酸又はトリフルオロ酢酸を含む水溶液に浸けて、有効成分が抽出された粗抽出液を得る。この粗抽出液をろ過し、凍結乾燥機によりろ液を凍結乾燥する。それから、凍結乾燥により得られたオイル状の有効成分を１．０ｍｏｌ％酢酸エタノール溶液に溶解させ、この溶液にエーテルを加えると、溶液が上清と沈殿物に分離する。ここで沈殿物を除いて採取した上清を、有効成分を含有する抽出液とする。
【００４６】
抽出液から粗精製物を得る工程では、上記した抽出液を吸着クロマトグラフィーにかける。吸着クロマトグラフィーのカラムとしては、例えば、吸着剤としてアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（ダウ・ケミカル社製、米国）を充填したカラムや、Ｓｕｐｅｌ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２  ＳＰＥ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＳＵＰＥＬＣＯ社製、米国）のカラムが挙げられる。吸着クロマトグラフィーのカラムを例えばｐＨ７．０のリン酸緩衝液で事前に平衡にしておき、このカラムに抽出液を加えて、そのままカラムを通過した溶液は除去する。次いで、カラムをエタノールで広範囲にわたって洗浄し、それから２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させて、得られた溶出液を粗精製物とする。
【００４７】
粗精製物を分離する工程では、上記した粗精製物を逆相カラムクロマトグラフィーにかける。例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という。）の装置を用いて、アセトニトリル又は０．１ｍｏｌ％ギ酸を溶出液として、ｐＨ０〜３．５に調製したＣ１８カラム等の逆相分配型カラムに粗精製物を加える。さらに、このカラムにトリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してアセトニトリル０〜１００ｍｏｌ％、又はトリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してギ酸０〜１０ｍｏｌ％の勾配で溶出させて、粗精製物を分離させる。
【００４８】
さらに、粗精製物を分離する工程では、ＨＰＬＣに付属の紫外可視分光検出器を用いて、例えば図３に示すようにクロマトグラムにおいて波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示す溶出時間を確認する。波長２１５ｎｍの紫外線は多くの種類の分子結合を励起させるため、図３に示すように、この紫外線に対してピークを示した溶出時間の溶出液には、構造不明ながら何らかの成分が含まれている。また、波長５２５ｎｍの可視光はシアニジン構造に特有の波長であるため、この可視光に対してピークを示した溶出時間の溶出液には、シアニジン−３，５−ジグルコシドのように分子内にシアニジン構造を有するアントシアニン等の化合物が含有されていると推測できる。ピークと溶出時間を確認の上、当該溶出時間の溶出液を分取する。
【００４９】
分取する際、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光の両方に対してピークを示す溶出時間が複数箇所に分かれる場合には、個々のピークに対応する溶出時間ごとに溶出液を分取する。例えば、図３のクロマトグラムが示された場合には、参考例２の溶出液と実施例３の溶出液をそれぞれ分取する。
【００５０】
粗精製物を分離する工程で分取した画分のいずれかに、有効成分が高濃度で含有されている。例えば、本製造法において原料がアロニアの果実や果汁である場合には、回収した画分のうちでカラムからの溶出時間が二番目に短い画分（例えば、図３での実施例３の溶出液）に目的の有効成分が高濃度で含まれており、この画分は有効成分を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有する植物抽出物とすることができる。
【００５１】
なお、後述する定量法により、植物抽出物におけるシアニジン−３，５−ジグルコシドの濃度を測定することができる。測定の結果、上記した植物抽出物で有効成分の含有量が３０ｍｇ／１００ｇ未満であった場合には、凍結乾燥機を用いて、この植物抽出物を凍結乾燥すると、溶媒が気化するため濃縮されて、有効成分を３０ｍｇ／１００ｇ以上含有する植物抽出物の濃縮物を得ることができる。
【００５２】
また、粗精製物を分離する工程で複数の画分を回収し、回収した画分のいずれに目的の有効成分が含まれるか不明である場合、これらの画分の溶液それぞれについて、例えば、後述する「ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定」と同様の方法によりＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害の強さを測定する。ここで、他の画分よりも強い阻害活性が示された画分に、有効成分が高濃度で含有されていると推定される。必要であれば、後述する「ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質の同定」と同様の方法により、粗精製物を分離する工程で回収した複数の画分のそれぞれについて質量分析（ＭＳ）を行い、シアニジン−３，５−ジグルコシドがいずれの画分に含まれるか確認することが望ましい。
【００５３】
［シアニジン−３，５−ジグルコシドの定量法］
シアニジン−３，５−ジグルコシドの定量法は、前述した「植物抽出物の調製方法」と概ね同じである。ただし、定量の条件を統一するため、この定量法では、前述した原料から抽出液を調製する工程において、原料の粉砕物を１５〜２５℃において、塩酸を含む水溶液に浸けて粗抽出物を得る。
【００５４】
また、この定量法では、定量の条件を統一するため、前述した抽出液から粗精製物を得る工程で、吸着クロマトグラフィーのカラムとしてＳｕｐｅｌ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２  ＳＰＥ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムを用い、このカラムをｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液で事前に平衡にしてベッドボリューム６ｍｌとし、抽出液を流速５ｍｌ／ｈで加え、カラムをエタノールで洗浄後に２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させて粗精製物を得る。
【００５５】
前述した定量法では、定量の条件を統一するため、前述した粗精製物を分離する工程で、アセトニトリルを溶出液として、ｐＨ２．８〜３．２に調製した直径４．６ｍｍ×高さ１５０ｍｍのＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス社製、米国）に、粗精製物を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで加え、トリフルオロ酢酸０．１ｍｏｌ％に対してアセトニトリル０〜１００ｍｏｌ％の勾配で溶出させて、粗精製物の溶質を分離させる。
【００５６】
前述した定量法では、分光光度計を用いて、植物抽出物の溶液を波長５２５〜５３０ｎｍの可視光でスキャンして極大波長における吸光度を測定することで、植物抽出物が含有する目的の化合物の濃度を算出する。なお、吸光度を測定する際には、植物抽出物の溶液をそのまま、あるいは色が濃すぎれば当該溶液をアセトニトリルで希釈してから測定する。シアニジン−３，５−ジグルコシド及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の抽出に用いた溶液による希釈率を考慮した上で、シアニジン−３，５−ジグルコシドの標準品の吸光度と比較して、この化合物の含有量を算出する。
【実施例】
【００５７】
［ＤＰＰ−ＩＶの精製］
本発明者は、非特許文献３の記載に従って、以下に詳述する方法により、豚の精漿からＤＰＰ−ＩＶを精製することとした。豚の精漿を愛知県畜産総合センターから譲り受け、使用するまで−３０℃で保管した。また、ＤＰＰ−ＩＶに対する蛍光ペプチド基質であるグルシル−Ｌ−プロリン−４−メチルクマリル−７−アミド（以下、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ」という。）や、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（以下「ＤＰＰ−ＩＩ」という。）に対する蛍光ペプチド基質であるＬ−リジル−Ｌ−アラニン−４−メチルクマリル−７−アミド（以下「Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡ」という。）を、株式会社ペプチド研究所から購入した。なお、ＤＰＰ−ＩＶの精製方法は、特に記載のない限り４℃で行った。また、ＤＰＰ−ＩＶの精製方法で用いたその他の試薬は、全て分析グレードである。
【００５８】
精製の程度を確認するために、後述する精製の第２〜５段階で、ＤＰＰ−ＩＶ活性とＤＰＰ−ＩＩ活性を測定することとした。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、ｐＨ８．０で５０ｍｍｏｌのトリス塩酸緩衝液中でＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを用いて測定し、ＤＰＰ−ＩＩの活性はｐＨ６．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液５０ｍｍｏｌ中でＬｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡを用いて測定した。これらの酵素活性の測定するために、１０ｍｍｏｌ／Ｌの蛍光ペプチド基質１０μｌ、ｐＨ８．０で０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液１００μｌ、後述する画分のいずれかの溶液１０〜２０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製し、３７℃で３０分間保ち酵素反応をさせた後、混合液に０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。３７℃で遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（以下「ＡＭＣ」という。）が発する蛍光（励起３８０ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）を検出し、蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性とＤＰＰ−ＩＩ活性を算出した。活性の算出にあたり、１分間あたりに基質１μｍｏｌを加水分解する酵素量を、１ユニットの活性として定義した。
【００５９】
以下、ＤＰＰ−ＩＶを精製するための各段階を詳述する。精製の第１段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、一晩かけて豚の精漿を透析した。得られた透析物を遠心分離機にかけて、１０，０００×ｇの遠心力を４５分間作用させて、上清と沈殿物に分離させた。
【００６０】
精製の第２段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により、直径２．５ｃｍ×長さ２０ｃｍのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（ＧＥヘルスケア社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述した第１段階で得られた上清を流速５０ｍｌ／ｈで加えた。カラムを前述したトリス塩酸緩衝液により広範囲にわたって洗浄し、それから、同じ緩衝液５００ｍｌと、ｐＨ８．０で０．５ｍｍｏｌ／Ｌの食塩を含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液５００ｍｌと、で形成された食塩の直線的な濃度勾配により溶出させた複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性及びＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分を特定した。特定した画分のタンパク質を、固体状の硫酸アンモニウム塩（８５％飽和）により濃縮させた。濃縮させて得られた混合物を、１時間かき混ぜた後に遠心分離機にかけて、１０，０００×ｇの遠心力を４５分間作用させて、上清と沈殿物に分離させた。沈殿物を最少量のｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝食塩水中で再懸濁して、この緩衝液により沈殿物を一晩透析した。
【００６１】
精製の第３段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝食塩水を用いて、直径３．５ｃｍ×長さ１００ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（ＧＥヘルスケア社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述の第２段階で沈殿物を透析した溶液を流速３０ｍｌ／ｈで加えて、複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性及びＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分を特定した。この第３段階により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分と、ＤＰＰ−ＩＩ活性を示す画分とが、明確に分離されて別の画分になった（詳しくは、非特許文献３を参照）。ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を、ｐＨ７．５で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により一晩透析した。
【００６２】
精製の第４段階として、ｐＨ７．５で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、直径１．５ｃｍ×長さ２０ｃｍのＭａｔｒｅｘ  Ｒｅｄ  Ａゲルカラム（Ａｍｉｃｏｎ社製、米国）を、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述の第３段階で透析して得られた透析物を流速２０ｍｌ／ｈで加えて、複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を特定した。特定した画分を集めて混合し、混合して得られた溶液が食塩濃度３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように食塩を加えた。
【００６３】
精製の第５段階として、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液を用いて、直径１．５ｃｍ×８ｃｍのフェニル−セルロファイン（ＪＮＣ株式会社製）のカラムを、事前に平衡にしておいた。このカラムに、前述した第４段階でＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を混合して得られた溶液を、流速１５ｍｌ／ｈで加えた。カラムに吸着されなかったタンパク質を、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液で洗い流し、それから、この緩衝液７５ｍｌと、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液とで、減少する塩勾配により溶出して複数の画分を得た。これらの画分のうちから、前述した蛍光比色定量法により、ＤＰＰ−ＩＶ活性を示す画分を特定した。特定した画分を集めて混合した溶液を、ｐＨ８．０で２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液により一晩透析した。これにより、精製されたＤＰＰ−ＩＶ溶液が得られた。
【００６４】
前述した第５段階で得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液は、前述した第１段階で透析された精漿と比べて、１５％の収率であり約５，７００倍の濃度に精製されていた。また、得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液は基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを急速に加水分解し、Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＭＣＡを弱く加水分解した。なお、得られたＤＰＰ−ＩＶの最初の１８残基のアミノ酸配列は、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−であり、ヒトやラットの肝臓に存在するＤＰＰ−ＩＶやマウスの胸腺に存在するＤＰＰ−ＩＶにおける膜貫通部位の後部の配列に高度に一致する（詳細は、非特許文献３を参照）。
【００６５】
［植物抽出物の試作、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価方法］
以下に詳述する方法により植物抽出物（中間原料）を試作し、そのＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を評価することとした。なお、試作は、特に記載のない限り１５〜２５℃で行った。また、試作、及びＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定では、特に記載のない限り、和光純薬工業株式会社から購入した分析グレードの試薬を用いた。
【００６６】
試作においてはブルガリア産のアロニア果実を原料とし、この原料を搾って得られたアロニア果汁（商品名：ｆｒｕｉｔ−ｊｕｉｃｅ  Ａｒｏｎｉａ、有限会社中垣技術士事務所）を準備した。このアロニア果汁そのものを実施例１とした。
【００６７】
実施例１（アロニア果汁）の組成等を表１に示す。
【表１】
2017214344.tif 000003
【００６８】
また、実施例１（アロニア果汁）に含有されている糖質の組成を表２に示す。
【表２】
2017214344.tif 000004
【００６９】
原料から抽出液を調製する工程として、液体窒素を用いて実施例１（アロニア果汁）を凍結させ、凍結物をミキサーで粉砕し、この粉砕物を塩酸水溶液に浸けて、粗抽出液を得た。この粗抽出液をろ過し、凍結乾燥機によりろ液を凍結乾燥し、凍結乾燥により得られたオイル状のアントシアニンを１．０ｍｏｌ％酢酸エタノール溶液を溶解させ、この溶液にエーテルを加えて、沈殿物から分離した上清を採取して抽出液とした。
【００７０】
試作において抽出液から粗精製物を得る工程では、ｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液を用いて、Ｓｕｐｅｌ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２  ＳＰＥ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムを、ベッドボリューム６ｍｌとして、事前に平衡にしておいた。このカラムに抽出液を流速５ｍｌ／ｈで加え、そのままカラムを通過した溶液を回収して参考例１に係る溶液とした。参考例１を回収後のカラムをエタノールで広範囲にわたって洗浄し、それから２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含むｐＨ７．０で５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出させた粗精製物を得て、この粗精製物の溶液を実施例２とした。
【００７１】
試作において粗精製物を分離する工程として、ＨＰＬＣにより、実施例２に係る溶液を逆相カラムクロマトグラフィーにかけることとした。直径４．６ｍｍ×高さ１５０ｍｍのＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８カラムに、実施例２に係る溶液を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで加え、トリフルオロ酢酸０．１重量％に対してアセトニトリル０〜１００重量％の勾配で溶出させて、実施例２に含まれる溶質を分離させた。
【００７２】
また、ＨＰＬＣの装置に付属の紫外可視分光検出器により、溶出時間ごとに溶出液で波長２１５ｎｍの紫外線や波長５２５ｎｍの可視光の吸収の度合いを検出した。図３に示されたピークに基づいて、逆相カラムクロマトグラフィーにかけられた後の溶出液から、次の４つの画分を分取した。まず、最も短い溶出時間において、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示した溶出液を、参考例２とした。また、二番目に短い溶出時間において、波長２１５ｎｍの紫外線と波長５２５ｎｍの可視光との両方に対してピークを示した溶出液を、実施例３とした。三番目に短い溶出時間において波長２１５ｎｍの紫外線に対してのみピークを示した溶出液を、参考例３とした。四番目に短い溶出時間において波長２１５ｎｍの紫外線に対してのみピークを示した溶出液を、参考例４とした。
【００７３】
次いで、実施例１〜３、及び参考例１〜４について各々のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を評価することとした。対照群（水）としては、１０ｍｍｏｌ／Ｌの蛍光ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ１０μｌ、ｐＨ９．０で０．５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液１００μｌ、前述した精製方法により得られたＤＰＰ−ＩＶ溶液５μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含む混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。また、実施例１〜３、及び参考例１〜４については、対照群（水）と同じく蛍光ペプチド基質、トリス塩酸緩衝液、及びＤＰＰ−ＩＶ溶液を含有し、さらに実施例１〜３及び参考例１〜４に係る溶液のいずれか１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。
【００７４】
上記した混合液を３７℃で３０分間保って酵素反応をさせた後、混合液に０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。３７℃で遊離したＡＭＣが発する蛍光（励起３８０ｎｍ，蛍光４４０ｎｍ）を検出して、蛍光比色定量法によりＤＰＰ−ＩＶ活性を算出した。ＤＰＰ−ＩＶ活性のデータは、ｎ＝４で、平均値±標準誤差で表わした。データの統計分析は、対応のないスチューデントｔ−検定に従って分散分析（一元配置分析）を用いて行った。多数の試料との比較のために、テューキー・クレーマー検定を用いた。
【００７５】
［実施例１〜３、及び参考例１〜４のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価結果］
図１に示すように、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していない対照群（水）に比べて、実施例１（アロニア果汁）では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が約２７％低かった。アロニア果汁がＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。
【００７６】
図２に示すように、試作における抽出液から粗精製物を得る工程で、Ｓｕｐｅｌ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２  ＳＰＥ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅのカラムをそのまま通過した参考例１では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。一方、このカラムをエタノールで洗浄して２．０ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液の段階的な勾配により溶出された実施例２では、対照群（水）に比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約２８％低かった。実施例２がアロニア果汁由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。
【００７７】
図４に示すように、試作における粗精製物を分離する工程で、実施例２を逆相カラムクロマトグラフィーにより分離して得られた画分のうちで、参考例２〜４ではＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。一方、実施例３では、対照群（水）と比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約８１％低かった。実施例３が、アロニア果汁由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を含有していることが示唆された。また、実施例３は、実施例１（アロニア果汁）よりもＤＰＰ−ＩＶ阻害物質を高濃度で含有していると考えられる。
【００７８】
［アロニア果汁に含有されているＤＰＰ−ＩＶ阻害物質の同定］
液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、実施例３に係る溶液を分離して成分の質量分析をすることとした。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｍ−ｃｌａｓｓシステム（ウォーターズ社製、米国）を用いて、直径７５μｍ×長さ１５０ｍｍのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｍ−ｃｌａｓｓ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム（ウォーターズ社製）に、実施例３に係る溶液を流速５μｌ／ｍｉｎで加えて、ＨＰＬＣにより実施例３に含まれる成分を分離した。その結果、図５に示すように、溶出時間７分１８秒前後における溶出液で最大のピークが示された。次いで、このピークを示した溶出液に含まれる成分について、エレクトロスプレーイオン化源を備えるＸｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ（ウォーターズ社製）を用いて、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行った。解析用ソフトウェアとしてＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ４．１（ウォーターズ社製）を用いて、測定器を制御してデータを収集した。なお、ＭＳ／ＭＳにあたり、毛細管の温度は１２０℃であり、毛細管の電圧は３ｋＶであった。陽イオンモードで、分子量１００〜１，０００で質量スペクトルを記録した。
【００７９】
実施例３についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った結果、図６に示すように、６３５．７４ｍ／ｚで主なピークが示され、２８９．３８ｍ／ｚ及び４５１．５６ｍ／ｚで断片のピークが示された。ここで、非特許文献４に記載のデータに基づき、２８９．３８ｍ／ｚでのピークはシアニジン、４５１．５６ｍ／ｚでのピークはＣ３Ｇ、６３５．７４ｍ／ｚでのピークはシアニジン−３，５−ジグルコシドを示すことが明らかとなった（詳しくは、非特許文献４を参照）。
【００８０】
次いで、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質としてシアニジン（株式会社常盤植物化学研究所製）、シアニジン−３−グルコシド（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製、フランス）、及びシアニジン−３，５−ジグルコシド（シグマ  アルドリッチ社製、米国）の試薬を準備した。これら試薬の各々について、前述した実施例１〜３や参考例１〜４と同様の条件でＤＰＰ−ＩＶ活性を測定して、阻害活性を評価することとした。図７に示すように、０．５μｍｏｌ／Ｌのシアニジン又はシアニジン−３−グルコシドを含有する混合液では、ＤＰＰ−ＩＶ活性が阻害されなかった。これに対して、０．５μｍｏｌ／Ｌのシアニジン−３，５−ジグルコシドを含有する混合液では、対照群（水）に比べてＤＰＰ−ＩＶ活性が約２５％低かった。
【００８１】
また、上記したＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の評価と同様にして、本発明者が他の実験系において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害物質（シアニジン、シアニジン−３−グルコシド、又はシアニジン−３，５−ジグルコシド）の濃度と、豚の精漿由来のＤＰＰ−ＩＶの活性と、の関係を算出したところ、図８に示す結果となった。図８においても、シアニジン−３，５−ジグルコシドは、シアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示している。
【００８２】
上記した一連の実験結果に基づき、本発明者は、シアニジン−３，５−ジグルコシドが、シアニジンやＣ３Ｇよりも強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示すことを発見した。また、非特許文献１で報告されたアロニア果汁を摂取したことによる血糖降下の作用や、図１に示す実施例１（アロニア果汁）が示したＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害は、その大半がアロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドに起因していると推定される。
【００８３】
［アロニア果汁の効果を評価するための動物実験方法］
動物実験により、アロニア果汁の効果を評価することとした。このためには、前述した実施例１（アロニア果汁）と、前述した豚の精漿由来の精製されたＤＰＰ−ＩＶ溶液を準備した。また、この動物実験は、アメリカ国立衛生研究所の「動物実験の管理と使用に関する指針」に従って実施した。特に記載のない限り、和光純薬工業株式会社から購入した分析グレードの試薬を用いた。
【００８４】
さらに、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃ雄性マウス（以下「Ｃ５７ＢＬマウス」という。）と、ＫＫ−Ａｙ雄性マウス（以下「ＫＫ−Ａｙマウス」という。）を、各々４週齢で日本エスエルシー株式会社から入手した。なお、Ｃ５７ＢＬマウスは、多くの動物実験で対照群として使用されているモデル生物である。ＫＫ−Ａｙマウスは、２型糖尿病発症のモデル生物であり、早期（７〜８週齢）かつ重度の肥満や高血糖を発現する。
【００８５】
上記した全てのマウスには、飼育期間中に普通食（Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ  Ａｕｔｏ／ＹＳ、ＬａｂＤｉｅｔ社製、米国）を自由摂取させた。入手から２週経過時（６週齢の時点）に、Ｃ５７ＢＬマウスとＫＫ−Ａｙマウスのそれぞれを、各々５匹から成る２群（対照群とアロニア群）に分けた。この分けた時点を開始日として２８日間、つまり６〜１０週齢にかけて、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）には水を自由摂取させ、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）とアロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）にはアロニア果汁を自由摂取させた。
【００８６】
開始日から２８日経過するまで、３日または４日ごとに全てのマウスの体重と血糖値を測定した。なお、血糖値の測定には、グルコースＮｅｏアルファと、グルテストＮｅｏセンサー（共に、パナソニックヘルスケア株式会社製）を使用した。
【００８７】
開始日から２８日目に、全てのマウスの静脈から採血し、得られた血液を遠心分離して血清を得た。さらに、全てのマウスをイソフルランで麻酔した上で解剖して、精巣上体の白色脂肪組織、腸間膜の白色脂肪組織、腹膜後方の白色脂肪組織、皮下の白色脂肪組織、肝臓、及び小腸を摘出した。摘出した各々の白色脂肪組織の重量を量った。摘出した小腸を切断して、主に十二指腸と空腸を含んで成る小腸上部と、主に回腸を含んで成る小腸下部に分離した。小腸上部と小腸下部の各々について、内容物を除去し、生理食塩水中で振り洗いした。肝臓、小腸上部、及び小腸下部の各々について、組織片にＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製、オランダ）を浸透させてからホモジナイズして、各々の破砕物を得た。
【００８８】
血清、肝臓、小腸上部、小腸下部の各々について、ＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果を評価することとした。このためには、１０ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡを１０μｌ、０．５ｍｏｌ／ＬでｐＨ９．０のトリス塩酸１００μｌ、ＤＰＰ−ＩＶ溶液５μｌ、血清または前述した破砕物のいずれか１０〜２０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計１．０ｍｌ）を調製した。この混合液を３７℃で３０分間保ち酵素反応させた後、さらに０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸２ｍｌを加えて酵素反応を終了させた。酵素反応により遊離したＡＭＣを、蛍光分析（励起３８０ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）により測定した。
【００８９】
また、実施例１（アロニア果汁）等について、α−グルコシダーゼ阻害活性を評価することとした。このためには、まず、α−グルコシダーゼの基質として、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（シグマアルドリッチ社製、以下「ＰＮＰ−グルコシド」という。）とジメチルスルホキシドとの混合溶液を調製した。
【００９０】
その上で、対照群（水）として、２０ｍｍｏｌ／Ｌの基質１０μｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬでｐＨ７．０のリン酸ナトリウム１００μｌ、α−グルコシダーゼ（パナソニックヘルスケア株式会社製）１０μｌ、１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。また、実施例１（アロニア果汁）のα−グルコシダーゼ阻害活性を評価するため、対照群（水）と同じく基質、リン酸ナトリウム、α−グルコシダーゼを含有し、さらに実施例１（アロニア果汁）１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。これらの混合液を３７℃で３０分間保ち酵素反応させ、３０分経過時に直ちに、残存しているＰＮＰ−グルコシドの量を９６穴マイクロプレートの分光光度計により波長４０５ｎｍで測った。
【００９１】
さらに、血清、肝臓、小腸上部、小腸下部の各々について、α−グルコシダーゼ活性の阻害効果を評価することとした。このためには、上記した対照群（水）と同じく基質、リン酸ナトリウム、α−グルコシダーゼを含有し、さらに、血清または前述した破砕液のいずれか１０μｌ、及び１８ｍΩのミリＱ水を含有する混合液（合計３００μｌ）を調製した。その後、上記した対照群（水）と同様に酵素反応させて３０分経過時に残存しているＰＮＰ−グルコシドの量を測った。
【００９２】
血清と、マウスインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製）を用いて、開始日から２８日目のマウスにおける血清インスリン濃度を測定した。
【００９３】
小腸上部でのＧＩＰのｍＲＮＡ量と、小腸下部でのＧＬＰ−１のｍＲＮＡ量を測定することとした。このためには、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、オランダ）を用いて、小腸上部の破砕液と小腸下部の破砕液の各々からトータルＲＮＡを抽出した。さらに、このトータルＲＮＡを５００ｎｇ、表３に示す遺伝子のプライマー、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）、及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムＰＣＲシステム（バイオ・ラッド社製、米国）により、定量ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
定量ＲＴ−ＰＣＲにおいて、９５℃で３分、９５℃で１０秒、及び６０℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返して、トータルＲＮＡにおける各々の遺伝子（ＧＩＰ、又はプログルカゴン）のｍＲＮＡ量を定量した。なお、ＧＬＰ−１はプログルカゴンが切断されて生成されるため、プログルカゴンのｍＲＮＡ量をＧＬＰ−１のｍＲＮＡ量として考えることとした。また、インターナルコントロールとしたβ−アクチンのｍＲＮＡが増幅されたため、定量ＲＴ−ＰＣＲでの連鎖反応は阻害されなかったと判断した。
【００９６】
この動物実験で得られたデータについて、対応がないスチューデントｔ−検定にしたがい、一元配置分散分析により統計分析を行なった。多数の試料を比較するため、テューキー・クレーマー検定を行なった。
【００９７】
［アロニア果汁の効果を評価するための動物実験について結果と考察］
図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、加齢に伴う体重と血糖値の増加が著しく抑えられていた。開始日から２８日目に、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）は、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、体重で約１２％軽く、血糖値で約４５％低かった。このＫＫ−Ａｙマウスでの実験結果により、２型糖尿病患者がアロニア果汁を摂取し続けると、過体重や高血糖が緩和されることにより糖尿病が治療され得ると考えられる。
【００９８】
また、図９（ａ）及び（ｂ）において、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、体重や血糖値に有意差こそ認められなかったものの、低い値が示されやすかった。このため、糖尿病を患っていない者であっても、アロニア果汁を摂取し続けると、過体重や高血糖が緩和されることにより糖尿病や血糖値上昇が予防され得ると考えられる。
【００９９】
図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、開始日から２８日目に、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、各々の白色脂肪組織の重量が有意に低かった。各々の白色脂肪組織の重量を比べると、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、精巣上体で２７％軽く、腸間膜で２６％軽く、腹膜後方で３８％軽く、皮下で４８％軽かった。なお、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、各々の白色脂肪組織の重量に有意差は認められなかったが、精巣上体、腹膜後方、及び皮下については低い値が示されやすかった。図１０（ａ）〜（ｄ）での実験結果より、アロニア果汁を摂取し続けることによる過体重の抑制効果は、白色脂肪組織の重量増加を抑えることによるものと考えられる。
【０１００】
図１１（ａ）に示すように、ＫＫ−Ａｙマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスと比べて、血清でのＤＰＰ−ＩＶ活性が有意に低く抑えられていた。また、図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）と対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）とでは血清や肝臓でのＤＰＰ−ＩＶ活性に有意差が認められなかったことに対して、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）は対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて血清や肝臓でのＤＰＰ−ＩＶ活性が有意に増していた。アロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドによるＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害効果は、血清や肝臓に存在するＤＰＰ−ＩＶに対しては発揮されにくいものと考えられる。
【０１０１】
これに対して、図１１（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、ＤＰＰ−ＩＶ活性が小腸上部で約３５％小さく、小腸下部で約４６％小さく抑えられていた。アロニア果汁に含有されているシアニジン−３，５−ジグルコシドは、小腸上部や小腸下部に存在するＤＰＰ−ＩＶに対して、その活性の阻害効果を顕著に発揮したものと考えられる。
【０１０２】
図１２（ａ）に示すように、実施例１（アロニア果汁）を含有する混合液では、アロニア果汁の代わりに水を含有する対照群（水）の混合液と比べて、α−グルコシダーゼ活性が４９％小さく抑えられていた。このため、アロニア果汁には、α−グルコシダーゼ活性の阻害物質が含有されていると考えられる。
【０１０３】
図１２（ｂ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸上部でα−グルコシダーゼ活性が４２％小さく抑えられていた。なお、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）の小腸下部では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、α−グルコシダーゼ活性に有意差は認められなかったが、低い値が示された。このため、アロニア果汁を摂取し続けることによるα−グルコシダーゼ活性の阻害効果は、アロニア果汁に含有されているα−グルコシダーゼ阻害物質が、小腸上部に存在するα−グルコシダーゼの活性を阻害することによるものと考えられる。
【０１０４】
図１２（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸上部におけるＧＩＰのｍＲＮＡ量が有意に少なかった。なお、ＧＩＰは小腸上部に存在するＫ細胞で発現し、その発現量は糖濃度により調節されている。このことから、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）の小腸上部において、α−グルコシダーゼ活性の阻害により糖の吸収が抑えられ、Ｋ細胞で糖濃度の上昇が抑えられたため、ＧＩＰのｍＲＮＡ量が減少したと考えられる。また、ＧＩＰのｍＲＮＡ量が減少すると、ＧＩＰの分泌量や血中濃度の減少により脂肪細胞の表面に存在するＧＩＰ受容体に結合するＧＩＰの量が減少するため、脂肪細胞での脂肪の蓄積が抑えられて、図１０（ａ）〜（ｄ）で示したように白色脂肪組織の重量増加が抑えられたと考えられる。
【０１０５】
さらに、図１２（ｃ）に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、小腸下部におけるＧＬＰ−１（プログルカゴン）のｍＲＮＡ量が有意に多かった。小腸上部でα−グルコシダーゼ活性が阻害されてグルコースの吸収量が減ったため、小腸下部でグルコースの吸収量が増したことに起因して、小腸下部に存在するＬ細胞でＧＬＰ−１の発現量が顕著に増加したものと考えられる。また、アロニア果汁を摂取し続けると、α−グルコシダーゼ活性の阻害によりＧＬＰ−１の分泌量が増し、さらにＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害によりＧＬＰ−１の血中濃度が減少しにくいため、糖尿病または血糖値上昇を予防、治療する効果が発揮されやすいと考えられる。
【０１０６】
図１３に示すように、アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、血清インスリン量が有意に少なく抑えられていた。なお、アロニア群（Ｃ５７ＢＬマウス）では、対照群（Ｃ５７ＢＬマウス）と比べて、血清インスリン量について有意差は認められなかったが少なく抑えられていた。
【０１０７】
アロニア群（ＫＫ−Ａｙマウス）では、図９（ｂ）に示すように血糖値の増加が抑えられ、図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように白色脂肪組織の重量増加が抑えられ、かつ、図１３に示すように血清インスリン濃度が少なく抑えられていたため、対照群（ＫＫ−Ａｙマウス）と比べて、インスリン抵抗性や高インスリン血症の症状が緩和されていると考えられる。また、ＫＫ−Ａｙマウスでは、Ｃ５７ＢＬマウスよりも顕著な効果が発揮されたため、アロニア果汁を摂取し続けることにより糖尿病や血糖値上昇を予防、治療する効果は、２型糖尿病患者で顕著に発揮されやすいものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
シアニジン−３，５−ジグルコシドに限らず、分子内に２分子の糖残基を有するアントシアニンを含有する薬剤または食品組成物を摂取し続ける場合には、シアニジンやＣ３Ｇを含有する薬剤または食品組成物を摂取する場合よりも、ＤＰＰ−ＩＶ活性が著しく阻害されることにより糖尿病または血糖値上昇を予防、治療しやすい場合があるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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