(57)【要約】【課題】糖鎖転移反応を用いてＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を容易に製造可能な製造方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）のエンドＭ変異体の存在下、マンノース−６−リン酸基（Ｍａｎ６Ｐ）が非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有する糖鎖供与体と、下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、の間の糖鎖転移反応により、Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を製造するＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法：（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンドＭ変異体。一般式（１）中、Ｙ１は糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基を表す。2017184736.tif 000017【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）のエンドＭ変異体の存在下、マンノース−６−リン酸基が非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有する糖鎖供与体と、下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、の間の糖鎖転移反応により、マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質を製造するマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンドＭ変異体
（ｂ）前記（ａ）の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記（ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ前記糖鎖転移反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体。
【化１】
2017184736.tif 000014
（一般式（１）中、Ｙ１は糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（１）中、Ｙ１は、リソソーム酵素に由来する構造を含むアシルアミノ基である請求項１に記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【請求項３】
前記糖鎖供与体が、下記一般式（２）で表される請求項１又は請求項２に記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【化２】
2017184736.tif 000015
（一般式（２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の少なくとも一つは、非還元末端にマンノース−６−リン酸基を有する糖質由来の基である。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１がＧｌｃＮＡｃである場合には、前記ＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ２は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。）
【請求項４】
前記糖鎖供与体が、下記一般式（３）で表される請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【化３】
2017184736.tif 000016
(一般式（３）中、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、水素原子、Ｍａｎ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎを表す。Ｍａｎはマンノシル基を表す。Ｍａｎ６Ｐは、６位にリン酸基が結合したマンノシル基を表す。また、Ｘ７−６は、Ｍａｎの６位に結合したＸ７を示し、Ｘ８−３は、Ｍａｎの３位に結合したＸ８を示し、Ｘ９−２は、Ｍａｎの２位に結合したＸ９を示す。Ｘ７、Ｘ８及びＸ９の少なくとも一つは、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ及びＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであることを示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表し、α１−２はＭａｎの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合を表す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｙ３は一価の置換基を表す。）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法によって得られるマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質に、さらに蛍光基を導入して得られる蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質を、細胞に付与することによって、前記蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法、及び蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内で機能する糖蛋白質遺伝子の欠損症では、細胞内での該糖蛋白質の機能が不全となり、重篤な疾患を引き起こすことが知られている。例えば、リソソーム病は、細胞内小器官であるリソソームに存在する加水分解酵素（リソソーム酵素）等の遺伝的欠損により発症する難病であり、現在の治療法としては、調製した酵素（組み換え酵素）を静脈内投与して治療する酵素補充療法が知られている。酵素補充療法とは、糖蛋白質が有するＮ結合型糖鎖の非還元末端のマンノース−６−リン酸基（以下、Ｍａｎ６Ｐと称する）と、細胞表面及びリソソームに存在するＭａｎ６Ｐレセプターとの結合に伴うエンドサイトーシスによる細胞内への取り込み現象を利用した療法であり、リソソーム病患者の標的となる細胞に、Ｍａｎ６Ｐを有するリソソーム酵素を細胞外から与えることにより、治療効果を発揮させる治療法である。
ここで、標的とする細胞内、あるいは細胞内小器官に、高効率に目的の糖蛋白質を導入したい場合には、Ｎ結合型糖鎖の非還元末端にＭａｎ６Ｐが付加された該糖蛋白質を用いることが重要であり、これにより治療効果の高い酵素補充療法が可能となると考えられる。
【０００３】
Ｍａｎ６Ｐを有する糖蛋白質の調製方法としては、以前より、個々の糖蛋白質の遺伝子を導入した細胞によって調製する方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２３６４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、糖蛋白質の遺伝子を導入した細胞によって調製する方法では、リン酸基の糖蛋白質への付加が必ずしもおこるわけではなく、糖蛋白質によっては、Ｍａｎ６Ｐの含有量を高められないという問題がある。また宿主となる細胞等の脱リン酸化酵素の影響等により、得られる糖蛋白質には、Ｍａｎ６Ｐが全く結合していないものが多く混入するという問題もある。
【０００６】
一方、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖を変換する酵素−化学的な方法としては、特開平７−５９５８７号公報に記載されるように、毛カビ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（エンドＭ）により、糖鎖供与体であるＮ結合型糖鎖の非還元末端側の大きなオリゴ糖鎖部位を、糖鎖受容体に一度に糖鎖転移する方法が報告されている。また、エンドＭのアミノ酸を改変した変異体（グライコシンターゼ）は、目的とするＮ結合型糖鎖由来の構造を含む糖鎖供与体の糖鎖を糖鎖受容体に効率よく糖鎖転移できることが、梅川らの文献［J. Biol. Chem., Vol. 285(1), 511-521, (2010)］によって報告されている。
【０００７】
従って、グライコシンターゼが、Ｍａｎ６Ｐを有するＮ結合型糖鎖を糖鎖供与体として、糖鎖受容体に糖鎖転移することが可能であれば、結果的に、Ｍａｎ６Ｐの含有量が高い所望の糖蛋白質が得られることが期待できる。
【０００８】
しかし、前記文献に用いられている糖鎖供与体には、その調製のために強い酸性条件を必要とするオキサゾリン化された化合物を用いているため、Ｍａｎ６Ｐを有するオキサゾリン化された糖鎖供与体を調製する場合には、酸性条件に弱いリン酸基を脱離しないようにオキサゾリン化する必要があるという難点を有する。また、オキサゾリン環は不安定であるため、オキサゾリン化した後にリン酸基を導入することは難しい。
【０００９】
また、オキサゾリン化した糖鎖供与体の糖鎖転移反応においては、糖鎖転移が、糖鎖受容体のＧｌｃＮＡｃ以外の残基、例えばアミノ酸残基にもおこるという懸念がある。
【００１０】
このように、Ｍａｎ６Ｐを容易に調製する方法として、グライコシンターゼを利用し、かつオキサゾリン化していない糖鎖供与体を用いる新たな製造方法が望まれていた。
【００１１】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、糖鎖転移反応を用いてＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を容易に製造可能な製造方法、及び蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
課題を解決するための具体的手段には、以下の形態が含まれる。
＜１＞  下記（ａ）又は（ｂ）のエンドＭ変異体の存在下、マンノース−６−リン酸基が非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有する糖鎖供与体と、下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、の間の糖鎖転移反応により、マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質を製造するマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンドＭ変異体
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記（ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ前記糖鎖転移反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体。
【００１３】
【化１】
2017184736.tif 000002
【００１４】
（一般式（１）中、Ｙ１は糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。）
【００１５】
＜２＞前記一般式（１）中、Ｙ１は、リソソーム酵素に由来する構造を含むアシルアミノ基である＜１＞に記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【００１６】
＜３＞前記糖鎖供与体が、下記一般式（２）で表される＜１＞又は＜２＞に記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【００１７】
【化２】
2017184736.tif 000003
【００１８】
（一般式（２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の少なくとも一つは、非還元末端にマンノース−６−リン酸基を有する糖質由来の基である。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１がＧｌｃＮＡｃである場合には、前記ＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ２は一価の置換基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｍａｎはマンノシル基を表し、α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。）
【００１９】
＜４＞前記糖鎖供与体が、下記一般式（３）で表される＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の製造方法。
【００２０】
【化３】
2017184736.tif 000004
【００２１】
(一般式（３）中、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、水素原子、Ｍａｎ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎを表す。Ｍａｎはマンノシル基を表す。Ｍａｎ６Ｐは、６位にリン酸基が結合したマンノシル基を表す。また、Ｘ７−６は、Ｍａｎの６位に結合したＸ７を示し、Ｘ８−３は、Ｍａｎの３位に結合したＸ８を示し、Ｘ９−２は、Ｍａｎの２位に結合したＸ９を示す。Ｘ７、Ｘ８及びＸ９の少なくとも一つは、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ及びＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであることを示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表し、α１−２はＭａｎの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合を表す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｙ３は一価の置換基を表す。）
【００２２】
＜５＞前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法によって得られるマンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質に、さらに蛍光基を導入して得られる蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質を、細胞に付与することによって、前記蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、糖鎖転移反応を用いてＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を容易に製造可能な製造方法、及び蛍光基結合型マンノース−６−リン酸基含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒトαイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子を導入したトランスジェニックカイコが生産する中部絹糸腺から得られた抽出液のＩＤＵＡ活性を示す図である。
【図２】ＩＤＵＡ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコが生産する中部絹糸腺から得られた抽出液に対して、抗ＩＤＵＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図３】ＩＤＵＡ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコの中部絹糸腺から得られた抽出液を各クロマトグラフィー操作によって精製した溶液に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図４】本発明における糖鎖供与体である化合物１２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】図４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの拡大図である。
【図６】化合物１２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたマススペクトルを示す図である。
【図７Ａ】（Ａ）は、糖鎖供与体（化合物１２）の糖鎖受容体（エンド酵素処理後のＩＤＵＡ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ））への糖鎖転移後の試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。レーン１は、ＩＤＵＡ遺伝子を導入したチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞から得られたＩＤＵＡを含む試料であり、レーン２はエンド酵素処理前のＩＤＵＡを含む試料であり、レーン３は糖鎖受容体（エンド酵素処理後のＩＤＵＡ（ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ））を含む試料であり、レーン４は、糖鎖供与体（化合物１２）の糖鎖受容体（ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ）への糖鎖転移後の試料である。
【図７Ｂ】（Ｂ）は、（Ａ）と同じ試料について、Ｍａｎ６Ｐ特異的に結合するレクチン（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ）によるレクチンブロットを行った結果を示す図である。
【図８Ａ】（Ａ）は、ムコ多糖症１型（ＭＰＳ−１）患者皮膚繊維芽細胞等にＭ６Ｐ含有ＩＤＵＡを添加して２４時間インキュベートした後の細胞内のＩＤＵＡ活性における活性回復比を示す図である。
【図８Ｂ】（Ｂ）は、ムコ多糖症１型（ＭＰＳ−１）患者皮膚繊維芽細胞等にＭ６Ｐ含有ＩＤＵＡを添加してインキュベートした後に得られた細胞内溶液（酵素源）の、４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＵＧ）に対するβ−ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）（対照酵素）活性を測定した図である。
【図９】Ｍａｎ６Ｐ含有化合物（Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯ）への蛍光基の修飾方法を示す概略を示す図である。
【図１０】蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有化合物（Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す図である。
【図１１】蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有化合物（Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯ）を添加し２４時間インキュベートした後のムコ多糖症１型（ＭＰＳ−１）患者皮膚繊維芽細胞を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１２】蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有ＩＤＵＡ（Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯ）を添加し２４時間インキュベートした後のムコ多糖症１型（ＭＰＳ−１）患者皮膚繊維芽細胞を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１３Ａ】（Ａ）は、糖鎖供与体（化合物１２）の糖鎖受容体（エンド酵素処理後のＣＴＳＡ（ＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ））への糖鎖転移後の試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。レーン１は、ＣＴＳＡ遺伝子を導入したチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞から得られたＣＴＳＡを含む試料であり、レーン２は糖鎖受容体（エンド酵素処理後のＣＴＳＡ（ＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ））を含む試料であり、レーン３は、糖鎖供与体（化合物１２）の糖鎖受容体（ＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ）への糖鎖転移後の試料である。
【図１３Ｂ】（Ｂ）は、（Ａ）と同じ試料について、Ｍａｎ６Ｐ特異的に結合するレクチン（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ）によるレクチンブロットを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて示された用語について説明する。
数値範囲を表す「〜」はその上限及び下限の数値を含む範囲を表す。
【００２６】
「エンドＭ」とは「エンド酵素」の一種を示し、「エンド酵素」とは、「エンド−β−Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ」と同じ意味であり、下記一般式（４）の矢印の先を伸ばした位置、すなわちＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を意味する。「エンド酵素変異体」とは、エンド酵素のアミノ酸の１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換したものである。糖鎖転移する対象となる物質とは、糖鎖転移反応における糖鎖供与体及び糖鎖受容体のことを指す。
【００２７】
【化４】
2017184736.tif 000005
【００２８】
一般式（４）中、ＸはＮ結合型糖鎖中の、還元末端のキトビオシル残基（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）の非還元末端側のＧｌｃＮＡｃの４位に結合するオリゴ糖を示し、Ｒはポリペプチドを示す。矢印はエンド酵素又はエンド酵素変異体が加水分解する位置を表す。
【００２９】
「糖鎖転移」とは、糖鎖供与体の糖鎖構造の部分、例えば前記一般式（４）であれば、矢印の先を伸ばした位置（β１−４グリコシド結合部分）から左側の部分を、糖鎖受容体に結合（転移）させることをいう。本発明における糖鎖受容体とは、前記一般式（１）で表されるようなＧｌｃＮＡｃを非還元末端に有する糖含有物質を指す。
「糖鎖転移活性」とは、エンドＭ又はエンドＭ変異体が、糖鎖供与体を糖鎖受容体に転移させ、新たな生成物を生成する（糖鎖転移する）能力をいう。
【００３０】
「糖鎖転移収量」とは、糖鎖転移反応後に生ずる生成物であって、糖鎖受容体に、糖鎖供与体において、上記一般式（４）の矢印の先を伸ばした位置から左側の部分が転移されて生成した糖蛋白質の量をいう。当該生成物を、糖鎖転移後生成物と称することがある。
【００３１】
ここで、「エンドＭ変異体」とは、エンドＭのアミノ酸配列（配列番号１参照）のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているエンド酵素変異体を示す。「エンドＭ」とは、毛カビであるムコールヒエマリス由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）、「エンドＤ」とはストレプトコッカス  ニューモニエ由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ６２０４２．１）を意味する。
【００３２】
「相同性」とは、蛋白質のアミノ酸配列の変異体において、最大の相同性（パーセント）を達成するために、必要ならば間隙を導入して、配列を整列させた後に同一である残基のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは本技術分野においてよく知られており、本明細書中ではＣｌｕｓｔｒａｌＷ２  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を使用している。
またアミノ酸残基の表記方法としては、３文字表記及び１文字表記のどちらかで表記する。
【００３３】
また、蛋白質におけるアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基を示す表記について、例えばエンドＭのアミノ酸配列においては、１７５番目のアスパラギン残基は、Ｎ１７５と示される。また、アミノ酸残基を置換、すなわち他のアミノ酸に置換されたアミノ酸残基の表記について、例えばエンドＭの１７５番目のアスパラギン残基をグルタミン残基（もしくはアラニン）に置換した残基は、Ｎ１７５Ｑ（もしくはＮ１７５Ａ）と示され、これを含むエンドＭを、エンドＭのＮ１７５Ｑ変異体、もしくは単にＮ１７５Ｑ変異体のように称することがある。
【００３４】
また、エンドＭ変異体のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異体を、「本発明のエンドＭ変異体」と称することがある。また、本発明のエンドＭ変異体のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記エンドＭ変異体のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し糖鎖転移活性を有しているエンドＭ変異体を、上記のＮ１７５Ｑ変異体もしくはＮ１７５Ａ変異体等と区別する観点から、特に「本発明のエンドＭ変異体ホモログ」と称することがある。
【００３５】
エンドＭ変異体による糖鎖転移活性は、反応後の溶液中に生成したＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レクチンブロット及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで測定することによって確認することができる。
【００３６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとしては、例えば、次の方法が挙げられる。
すなわち、反応後の溶液に一定量のアセトンを加え、溶解した部分を乾燥後、一定量のＤＨＢＡ溶液（２０ｍｇ／ｍＬの２、５−ジヒドロキシ安息香酸を５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液）に溶解させる。その後、溶解させた溶液の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析用のｐｌａｔｅにスポットし乾燥させ、ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタ  システム（ブルーカー・ダルトニクス社製）によって、下記の条件にて測定することで、反応後の生成物の質量を確認できる。
<条件>
・測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ又はｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ及びｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ又はＬｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅ
・測定電圧：１．５Ｋｖ〜２．５Ｋｖ
・測定分子量の範囲：０〜１００００（ｍ／ｚ）
・積算回数：５００〜１００００
【００３７】
また、レクチンブロットとしては、例えば、Ｍａｎ６Ｐに対するレクチンを用いることができ、該レクチンとしては、Ａｋｅｂｏｓｈｉらの文献[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 73, 4805-4812, (2007)]に記載のＣＩ−Ｍａｎ６ＰＲ（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓと称することがある）が挙げられる。
【００３８】
また、糖鎖転移後生成物については、例えば、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レクチンブロット及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで測定することによって同定することができ、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロット等で得られた糖鎖転移後生成物のバンドの濃さ等の比較から、糖鎖転移後生成物の収量（糖鎖転移収量）の大きさについて定性的に確認することができる。また、この結果から、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性についての大きさについても定性的に確認することができる。
【００３９】
本明細書等では、炭水化物の部分は、オリゴ糖の記述に通常用いられる命名法を参照して記載される。これらの命名法は、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄらの文献［Ann.Rev.Biochem., Vol.50, 555, (1981)］に見出される。この方法に従って、マンノースはＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンはＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースはＧａｌ、フコースはＦｕｃ及びグルコースはＧｌｃ、という略式表記によって表記される。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対するＮｅｕＡｃ、及び５−グリコリルノイラミン酸に対するＮｅｕＧｃという略式表記によって表記される。また、Ｎ−アセチルグルコサミニル基はＧｌｃＮＡｃ残基、マンノシル基はＭａｎ残基と称することもある。
【００４０】
単糖とは、上記の糖、例えばＭａｎやＧｌｃＮＡｃそのもののみを意味する。
糖を形成する炭素の位置は、還元末端を１位、その隣の炭素原子を２位のように表し、それらの炭素原子それぞれに結合する水酸基又は酸素原子を１位の水酸基又は１位の酸素原子のように表し、グリコシド結合を表す場合には、単に「ＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのグリコシド結合」のように示す。なお、これらの２以上の単糖が結合したものをオリゴ糖といい、その誘導体はオリゴ糖誘導体と称する。すなわち、Ｎ結合型糖鎖はオリゴ糖である。
【００４１】
「グリコシド結合」とは、糖鎖中の糖ユニットの１位の水酸基と他の糖の水酸基が脱水縮合することで、互いが酸素原子を介して結合する結合をいい、例えばα１−６グリコシド結合とは、糖の１位（の炭素）と他の糖の６位（６位の酸素原子）がα型で結合したグリコシド結合であることをいう。なお、糖の１位の水酸基はα型とβ型が存在する。
上記に従い、例えば前記一般式（４）について示すと、そのキトビオシル部位（−ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−）の非還元末端側のグルコサミニル基（ＧｌｃＮＡｃ）は、そのＧｌｃＮＡｃの１位の酸素原子を含まず、かつ４位の酸素原子を含むことを示す。還元末端側のＹに結合するＧｌｃＮＡｃは、１位の酸素原子を含まず、４位の酸素原子を含むことを示す。
なお、ＭａｎやＧｌｃＮＡｃにおいて、グリコシド結合していない２位、３位、４位及び６位の炭素は、水酸基が結合していることを示す。
また、糖鎖を説明する表現として、単糖を３つ含む糖鎖は３糖、５つ含む場合は５糖、のように称することもある。
【００４２】
「コア糖鎖」とは、Ｎ結合型糖鎖の中で、下記Ｃ−１で表される糖鎖部分をいい、「トリマンノシル」とは、コア糖鎖の中の３つのマンノース部分をいう。また、Ｃ−１の左側の破線部分に示すように、トリマンノシル部分のうち、非還元末端側のα１−６で結合するＭａｎをＭａｎ２、非還元末端側のα１−３で結合するＭａｎをＭａｎ３及び還元末端側のＭａｎをＭａｎ１と称する。
【００４３】
【化５】
2017184736.tif 000006
【００４４】
また、一般式（４）の矢印の先を伸ばした位置の左側に示すようなオリゴ糖を、トリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖と称することがある。
【００４５】
本明細書中、「蛋白質」は、ペプチドを含むことを意味する。すなわち、糖蛋白質は糖ペプチドを含む。また、糖ペプチドと称する場合には、該糖ペプチドのアミノ酸残基数が５０以下の糖蛋白質のことをさす。本明細書中、「蛋白質」には、特に断わらない限り、糖蛋白質も前記糖蛋白質でない蛋白質も含む。
また「糖蛋白質」は、それらのペプチドやポリペプチド部分に、Ｎ結合型糖鎖が少なくとも１つ以上存在していることを示し、特に説明されない限り、複数のＮ結合型糖鎖の種類は１種のものも、２種以上のものも含む。
【００４６】
また、「リソソーム酵素」とは、真核細胞内のリソソーム内で酵素として機能する糖蛋白質のことをいう。
【００４７】
本発明においては、化学−酵素的なＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の調製において、安定な天然型の基質を用いることができ、かつ従来技術では達成できなかったＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を製造することができる。
エンドＭの糖鎖転移反応において、糖鎖供与体としてキトビオシル骨格を有するＮ結合型糖鎖誘導体を用いる場合には、エンドＭの非還元末端側の糖鎖構造によって、糖鎖転移における反応性が大きく変わることが知られていた。特に、リン酸基のような大きな極性残基を有するＮ結合型糖鎖は、エンドＭ変異体による糖鎖転移反応の糖鎖供与体には適さないと予想されるところ、本発明においては、予想外にも高い糖鎖転移収量を達成できることが示された。
上記の高い糖鎖転移収量を達成できる理由は定かではないが、発明者は以下のように考えている。すなわち、エンドＭ変異体は、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有するＮ結合型糖鎖を認識しにくいながらも糖鎖供与体として認識し、前記一般式（１）で表される糖鎖受容体が水よりも優先的に該糖鎖供与体と結合することによって、糖鎖転移反応が進行するものと考えられ、糖鎖転移後生成物が一旦形成された場合には、再度エンドＭ変異体が糖鎖転移後生成物を認識しにくいために、結果として、糖鎖転移後生成物の収量が増加するものと推察される。
【００４８】
また、上記の糖鎖転移反応に用いるオキサゾリン骨格を有しない糖鎖供与体は、リン酸基を酸性条件に晒さない方法で合成することが可能であるという利点を有する上に、緩衝溶液中でも安定に存在できる。加えて、本発明におけるキトビオシル骨格を有する糖鎖供与体は、オキサゾリン化された糖鎖供与体のように、糖鎖受容体のＧｌｃＮＡｃ以外の基と結合する可能性は著しく低い。
このため、本発明における糖鎖転移反応は、従来のオキサゾリン化された糖鎖供与体では容易に製造することができなかったＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造を容易にする反応であり、さらに、工業的な大量調製への応用も視野に入れることができる。
【００４９】
以下、本発明のＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法を説明する。
【００５０】
≪Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法≫
本発明のＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）のエンドＭ変異体の存在下、Ｍａｎ６Ｐが非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有する糖鎖供与体と、上記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、の間の糖鎖転移反応により、Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を製造するＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法である。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンドＭ変異体
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記（ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ前記糖鎖転移反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体。
【００５１】
（Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質）
本発明において製造されるＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質としては、天然に見いだされているものも、合成によるものも含む。また、天然に存在する糖蛋白質におけるＮ−結合型糖鎖が結合するアスパラギンのＣ末端側には、該アスパラギンから２つ目のアミノ酸残基が必ずスレオニン残基かセリン残基であることが知られているが、本発明においても同様である。
【００５２】
本発明の製造方法で製造されるＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質のうちの糖蛋白質は、特に制限されない。例えば、動物細胞由来であれば、細胞内外又は細胞表面に分泌しかつＮ−結合型糖鎖を有する糖蛋白質などが挙げられ、例として、各種酵素、各種ホルモン、細胞接着因子、各種受容体及び各種サイトカインなどが挙げられる。
この中でも、動物細胞内で機能するという観点から、各種酵素が好ましく、各種酵素としては、細胞内で機能する酵素が挙げられ、中でもリソソーム酵素が好ましい。リソソーム酵素としては、βヘキソサミニダーゼ（βＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ）、αＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βガラクトシダーゼ、αガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、αイズロニダーゼ、αイズロン酸２スルファターゼ、βグルクロニダーゼ、βグルコセレブロシダーゼ、βガラクトセレブロシダーゼ、αＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ、αフコシダーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、エンドβガラクトシダーゼ、エンドβＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βマンノシダーゼ、αマンノシダーゼ、アリルスルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、αノイラミニダーゼ１、αノイラミニダーゼ４、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホジエステルαＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、シアリン、へパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡαＮ−アセチルグルコサミニド  アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、プロサポシン、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、サポシンＤ、ＧＭ２活性化タンパク質、ＮＰＣ１タンパク質、及びリポタンパクリパーゼ等が挙げられる。
また、上記の糖蛋白質の由来は、本発明の効果を損なうものでない限り特に限定されないが、動物細胞内に導入させて機能させるという観点から、動物細胞由来が好ましく、さらに、ヒトへの酵素補充療法の効果を高めるという観点から、ヒト由来であることがより好ましい。
【００５３】
＜エンドＭ変異体＞
本発明におけるエンドＭ変異体は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有するエンドＭ変異体又は（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記（ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ糖鎖転移反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体（エンドＭ変異体ホモログ）である。ここで、糖鎖転移反応とは、Ｍａｎ６Ｐが非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有する糖鎖供与体と、上記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、の間の糖鎖転移反応のことをいう。
【００５４】
本発明のエンドＭ変異体は、エンドＭのアミノ酸に変異を導入した変異体である。配列番号１で示されるエンド酵素は、ムコールヒエマリス由来のエンドβ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）である。
本発明では、エンドＭ変異体としては、Ｎ１７５ＱもしくはＮ１７５Ａであることで、糖鎖転移反応後の生成物の加水分解を十分に抑えることができる。また、糖鎖転移収量の観点からは、Ｎ１７５Ｑ変異体であることが好ましい。
【００５５】
本発明のエンドＭ変異体は、通常の遺伝子工学的な手法によって調製することができ、様々な宿主の種類や、対応する適切な蛋白質発現ベクターを用いて調製することができる。宿主としては、大腸菌、ブレビバシラス菌、シアノバクテリウム、乳酸菌、酵母、昆虫細胞及び動物細胞などが挙げられる。この中でも調製のしやすさ、及び発現量の観点から、大腸菌を宿主とする方法や、酵母を宿主とする方法によって調製することが好ましい。具体的な製造方法としては、大腸菌であれば梅川らの文献［J. Biol. Chem., Vol.285(1), 511-521, (2010)］に詳しく記載され、酵母であれば特開平１１−３３２５６８号公報に詳しく記載されている。
【００５６】
本発明のエンドＭ変異体及びエンドＭ変異体ホモログは、糖鎖転移反応において、他のペプチドもしくは蛋白質とそれらのＣ末端側もしくはＮ末端側で融合させた融合型エンドＭ変異体（もしくは融合型エンドＭ変異体ホモログ）としても用いることができる。融合させることができるペプチドもしくは蛋白質としては、糖鎖転移反応を阻害するものでなければ特に限定されないが、例えば、ヘキサヒスチジンペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＨＨＨＨＨＨ）、フラッグペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＤＹＫＤＤＤＤＫ）、インフルエンザＨＡポリペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、アビジン、キチン結合蛋白質、ｃ−ｍｙｃ、チオレドキシン、ジスルフィド異性化酵素（ＤｓｂＡ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、及び緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などが挙げられる。この中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの調製のしやすさという観点から、ヘキサヒスチジンペプチド及びフラッグペプチドが特に好ましい。
【００５７】
なお、上記の融合型エンドＭ変異体もしくは融合型エンドＭ変異体ホモログにおいては、融合させるペプチド又は蛋白質のポリペプチド部分と、エンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログのポリペプチド部分との間には数残基から５０残基のリンカー領域としてのペプチド部分を含む。なお、リンカー領域を構成するアミノ酸残基の種類としては特に限定されない。リンカー領域には、プロテアーゼによって加水分解されるアミノ酸配列部分（プロテアーゼサイト）を含めてもよい。プロテアーゼサイトとしては特に限定されないが、例えば、ファクターＸａサイト、トロンビンサイト、エンテロキナーゼサイト、プレシジョンプロテアーゼサイトが挙げられる。
【００５８】
天然から見いだされている糖質加水分解酵素は、公知の情報（http://www.cazy.org/）で示されるように、アミノ酸配列の相同性等から、百数十のグリコシルヒドラーゼファミリー（ＧＨファミリー）に分類されている。エンドＭは、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼであり、他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質としては、ヒトから細菌類までに広く分布すること知られている。エンドＭのアミノ酸配列（配列番号１）を基に、一般に使用できるホモロジー検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を行うと、エンドＭと他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質とは、アミノ末端側から５００番目のアミノ酸付近までの触媒領域を含む領域内で、高い相同性を有することがわかる。
このため、本発明のエンド酵素変異体ホモログは、エンドＭの触媒領域を含む５００残基程度のアミノ酸配列の長さを有していれば、エンドＭとしての糖鎖転移活性を有すると推定できる。
本発明のエンドＭ変異体ホモログは、Ｎ１７５Ｑ変異体もしくはＮ１７５Ａ変異体と８０％以上の相同性を有し、かつ糖鎖転移活性を有するものであれば、１７５番目のアミノ酸残基以外のどのアミノ残基を他のアミノ酸に置換、欠失又は付加により調製されたものでもよい。
【００５９】
以上の観点から、本発明においては、本発明のエンドＭ変異体のアミノ酸配列の１７５番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により生じるエンドＭ変異体ホモログのアミノ酸配列の前記エンドＭ変異体のアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上であれば糖鎖転移活性を十分に維持できる。また、９０％以上であれば、糖鎖転移収量が向上しやすいことから好ましく、より好ましくは９５％以上であり、特に好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００６０】
本発明において、反応溶液中のエンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌであることが好ましい。０．１Ｕ／ｍｌ以上であることで、糖鎖転移収量を高めることができ、１Ｕ／ｍｌ以下であることで、糖鎖転移反応後の生成物の加水分解反応をより抑制することができる。こここで、１ユニット（Ｕ）とは、シアログライコペプチド（以下ＳＧＰと称する）１μモルを、１分間で、βパラニトロフェニルＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−ｐＮＰ）に転移する酵素量を示す。さらに、濃度としては、０．１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌであることがより好ましく、０．２Ｕ／ｍｌ〜０．５Ｕ／ｍｌであることが特に好ましい。
【００６１】
また、反応に用いるエンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの精製度においては、反応時間の短縮化、糖鎖転移収量の観点から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果等から、精製度が５０％以上であることが好ましく、さらに７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。精製度が５０％以上であることで、反応時間を短縮化することができ、かつ糖鎖転移収量を高めやすい。
【００６２】
（糖鎖供与体）
糖鎖供与体としては、Ｍａｎ６Ｐが非還元末端に結合したＮ結合型糖鎖に由来する構造を有していればよく、一般式（１）で表される糖鎖受容体に糖鎖転移できるものであれば特に限定されない。Ｎ結合型糖鎖に由来する構造とは、Ｎ結合型糖鎖そのもの、及びＮ結合型糖鎖の誘導体も含むことを意味する。
【００６３】
また、糖鎖転移収量をより高める観点からは、下記一般式（２）で表される糖鎖供与体であることが好ましい。
【００６４】
【化６】
2017184736.tif 000007
【００６５】
一般式（２）中、Ｘ１〜Ｘ６は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表し、Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも一つは、非還元末端にＭａｎ６Ｐを有する糖質由来の基である。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１がＧｌｃＮＡｃである場合は、前記ＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙ２は一価の置換基を表す。
【００６６】
一般式（２）中、Ｘ１〜Ｘ６が水素原子又は糖質由来の基であって、Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも一つは、非還元末端にＭａｎ６Ｐを有する糖質由来の基であればよく、糖質由来の基としては、本発明の効果を損なうものでない限り特に限定されない。なお、Ｍａｎ６Ｐを有する糖質由来の基には、Ｍａｎ６Ｐそのものを含む。
【００６７】
上記一般式（２）中、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有する糖質由来の基以外の基としては、水素原子以外に例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、異種抗原：Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ポリラクトサミン：［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ケラタン硫酸［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、［Ｇａｌ（６ＳＯ３）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、硫酸化ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、末端硫酸修飾（３ＳＯ３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ルイス糖鎖：Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−２、血液型抗原：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＨＮＫ１抗原：（３ＳＯ３）ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＧｌｃＡβ１−２及びＧｌｃＮＡｃＡβ１−２が挙げられる。
【００６８】
また、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有する糖質由来の基としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）等のオリゴ糖残基の非還元末端に、Ｍａｎ６Ｐがα１−２等で結合したものが挙げられる。
【００６９】
また、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有する糖質由来の基以外の基は、水素原子以外にハイマンノース型糖鎖由来の構造のいずれかを有していてもよく、Ｘ１〜Ｘ６は、例えば、Ｍａｎα１−６、Ｍａｎα１−３、Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３、Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−６、Ｍａｎα１−２、Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２等が挙げられる。
また、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有する糖質由来の基としては、例えば、Ｍａｎ６Ｐα１−６、Ｍａｎ６Ｐα１−３、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎα１−３、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎα１−６、Ｍａｎ６Ｐα１−２、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎα１−２等が挙げられる。
【００７０】
Ｘ１〜Ｘ６が上記の場合には、Ｚ１は水素原子でもＧｌｃＮＡｃβ１−４であってもよい。
【００７１】
前記一般式（２）において、Ｙ２としては酸素原子、窒素原子、炭素原子又は硫黄原子がＧｌｃＮＡｃの１位の炭素に直接結合する構造を含む置換基が挙げられる。
Ｙ２としては、糖鎖転移活性を低下させるものでなければ、特に限定されない。例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミノ基、アシルアミノ基、イミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基、又はハロゲン基が挙げられ、これらの基の中で、アルコキシ基、アシルアミノ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基及びアリールスルホニルオキシ基が挙げられる。これらの置換基は、さらに置換基を有していてもよい。
【００７２】
以上の中でも、調製のしやすさから、Ｙ２はヒドロキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜３０のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルケニルオキシ基及び置換基を有していてもよいアシルアミノ基が好ましい。
【００７３】
さらに、糖鎖供与体としての調製のしやすさ及び糖鎖転移収量の観点から、Ｙ２は炭素数１〜１０の置換基を有していてもよいアルコキシ基、炭素数２〜１０の置換基を有していてもよいアルケニルオキシ基、炭素数６〜２４の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアシルアミノ基が好ましく、さらに炭素数１〜８の置換基を有していてもよいアルコキシ基、炭素数２〜６の置換基を有していてもよいアルケニルオキシ基、炭素数６〜１２の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアシルアミノ基が特に好ましい。
具体的には、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基などが挙げられる。
【００７４】
また、置換基を有していてもよいアシルアミノ基としては、ペプチド又は蛋白質のアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアシルアミノ基であることが好ましく、反応溶液中への溶解度及び糖鎖転移収量の観点からはペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアシルアミノ基がより好ましい。
【００７５】
また、上記の置換されていてもよい置換基は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数６〜１２のアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、ピリジル基から選択される少なくとも１つであり、置換基が２以上ある場合には、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００７６】
上記一般式（２）で表される糖鎖供与体の調製方法としては特に限定されないが、調製方法の容易さから、例えば、Ｎ結合型糖鎖を調製し、さらにＭａｎ６Ｐを化学的に導入する方法が挙げられる。
Ｎ結合型糖鎖としては、ハイマンノース型糖鎖と複合型糖鎖が挙げられるが、ハイマンノース型糖鎖の調製方法としては、化学合成による方法であっても、天然物から調製する方法であってもよい。化学合成による方法としては、例えば、松尾らの文献［Tetrahedron, Vol. 62, 8262-8277, (2006)］に記載されるように、マンノシル残基を順次グリコシル化して調製する方法や、特開２００７−２９７４２９号公報に記載されるように、化学合成的な手法とマンノシダーゼを組み合わせた方法が挙げられる。また、天然物から調製する方法としては、例えば、特許第３７７６９５２号及び特開平１０−２５１３０４号公報に記載されるように、卵白アルブミンから抽出する方法が挙げられる。
上記のハイマンノース型糖鎖の調製方法の中でも、非還元末端にＭａｎ６Ｐを導入する観点から、合成による調製方法が好ましい。
【００７７】
複合型糖鎖の調製方法としては、化学合成による方法であっても、天然物から調製する方法であってもよい。化学合成による方法としては、例えば、Ｗａｎｇらの文献［J.Am.Chem.Soc., Vol.134(29), 12308, (2012)］に記載の方法によって調製することができる。天然物から調製する方法としては、例えば、卵黄から抽出する方法（例えば国際公開第９６２２５５号及び特開２０１１−２３１２９３号公報）を挙げることができる。
上記の複合型糖鎖の調製方法の中でも、非還元末端にＭａｎ６Ｐを導入する観点から、合成によって得られるものであることが好ましい。
【００７８】
また、上記で得られるＮ結合型糖鎖の非還元末端にＭａｎ６Ｐを導入する方法としては、化学的な導入方法を挙げることができる。化学的な導入方法としては、Ｎ結合型糖鎖の非還元末端にＭａｎ６Ｐが導入できれば、どのような合成経路であってもよく、目的とする糖鎖供与体の構造によって適宜選択される。また、リン酸基のマンノースへの導入方法は特に限定されないが、例えば、Ｎ結合型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の６位水酸基にリン酸化試薬を反応させることによって導入することができる。リン酸化試薬としては、例えば、ピロリン酸テトラベンジル、環状亜リン酸アミド、ホスファイト、リン酸トリエステル、アミダイトが挙げられる。リン酸基を導入する場合には、Ｎ結合型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の６位水酸基のみにリン酸基を導入する観点から、前記水酸基以外は保護基によって保護化されていることが好ましい。なお、保護化とは、水酸基が、上記のリン酸化試薬とは反応性を有しない基に変換されていることをいう。
【００７９】
また、糖鎖転移収量及び糖鎖転移後生成物の細胞内への導入効率からは、下記一般式（３）で表される糖鎖供与体であることが好ましい。
【００８０】
【化７】
2017184736.tif 000008
【００８１】
一般式（３）中、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、水素原子、Ｍａｎ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎを表す。Ｍａｎはマンノシル基を表す。Ｍａｎ６Ｐは、６位にリン酸基が結合したマンノシル基を表す。また、Ｘ７−６は、Ｍａｎの６位に結合したＸ７を示し、Ｘ８−３は、Ｍａｎの３位に結合したＸ８を示し、Ｘ９−２は、Ｍａｎの２位に結合したＸ９を示す。Ｘ７、Ｘ８及びＸ９の少なくとも一つは、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ及びＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであることを示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表し、α１−２はＭａｎの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合又はＭａｎ６Ｐの１位とＭａｎの２位とのαグリコシド結合を表す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｙ３は一価の置換基を表す。
【００８２】
一般式（３）中、Ｘ７、Ｘ８及びＸ９の少なくとも一つが、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであれば、他は水素原子、Ｍａｎ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであってよい。また、一般式（３）中、Ｍａｎ６Ｐを非還元末端に有するものは、Ｘ７〜Ｘ９のうちのいずれであってもよく、糖鎖転移させる目的のペプチド又は糖蛋白質の種類によって適宜調整されることが好ましい。しかし、糖鎖転移後生成物の細胞内への導入効率からは、Ｘ７がＭａｎ６Ｐ、Ｍａｎ６Ｐα１−２Ｍａｎ又はＭａｎ６Ｐα１−６Ｍａｎのいずれかであることがより好ましい。また、Ｘ７〜Ｘ９のうちのＭａｎ６Ｐの数は、２以上がより好ましく、３であることが特に好ましい。
【００８３】
一般式（３）で表される糖鎖供与体のうち、すでに天然の糖蛋白質中に見出されているハイマンノース型糖鎖であるという観点からは、以下の一般式（３−１）〜一般式（３−１０）で表されるものが好ましく、中でも、一般式３−３がより好ましい。
【００８４】
【化８】
2017184736.tif 000009
【００８５】
【化９】
2017184736.tif 000010
【００８６】
上記一般式（３−１）〜一般式（３−１０）中、Ｙ３は一価の置換基を表す。Ｍａｎ６Ｐは、６位にリン酸基が結合したマンノシル基を表す。
Ｙ３は一般式（２）のＹ２と同義であり、好ましい範囲も同じである。
【００８７】
上記一般式（３）で表される化合物は、例えば、公知の化学的なグリコシル化法と、上記のリン酸基などの導入法などを適宜組み合わせることにより調製できる。
【００８８】
（糖鎖受容体）
糖鎖受容体は、以下の一般式（１）で表されるＧｌｃＮＡｃ含有糖蛋白質である。糖鎖受容体としては、前記一般式（１）で表されるものであれば、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を阻害するものでない限り、特に限定されない。
【００８９】
【化１０】
2017184736.tif 000011
【００９０】
一般式（１）中、Ｙ１は糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。
【００９１】
Ｙ１において、糖蛋白質としては、例えば、各種酵素、各種ホルモン、細胞接着因子、各種受容体及び各種サイトカインなどが挙げられる。中でも、細胞内で機能させる観点から各種酵素が好ましく、さらに、リソソーム膜上Ｍａｎ６Ｐレセプターを利用してリソソーム内で機能させる観点からは、リソソーム酵素が好ましい。リソソーム酵素としては、βヘキソサミニダーゼ（βＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ）、αＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βガラクトシダーゼ、αガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、αイズロニダーゼ、αイズロン酸２スルファターゼ、βグルクロニダーゼ、βグルコセレブロシダーゼ、βガラクトセレブロシダーゼ、αＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ、αフコシダーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、エンドβガラクトシダーゼ、エンドβＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、βマンノシダーゼ、αマンノシダーゼ、アリルスルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、αノイラミニダーゼ１、αノイラミニダーゼ４、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホジエステルαＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、シアリン、へパランＮ−スルファターゼ、アセチル−ＣｏＡαＮ−アセチルグルコサミニド アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、プロサポシン、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、サポシンＤ、ＧＭ２活性化タンパク質、ＮＰＣ１タンパク質、及びリポタンパクリパーゼ等が挙げられる。
また、上記の糖蛋白質の由来は、本発明の効果を損なうものでない限り特に限定されないが、動物細胞内に導入させて機能させるという観点から、動物細胞由来が好ましく、さらに、ヒトへの酵素補充療法の効果を高めるという観点から、ヒト由来であることがより好ましい。
【００９２】
一般式（１）で表される糖鎖受容体のうち、Ｙ１がアミノ酸残基数で３０残基以下の糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基であるものは、例えば、Ｈｕａｎｇら［Chembiochem., Vol.12(6), 932-941, (2011)］に示されるように、化学的な方法や特許文献（特開平１０−４５７８８号公報）に示されるようなペプチド伸長工程を含む化学的な合成法によって調製できる。さらに、試薬メーカーによって得られる糖ペプチド又はＮ結合型糖鎖の誘導体を、本発明のエンドＭ変異体もしくは市販のエンド酵素によって加水分解することで容易に調製できる。
また、Ｙ１が糖蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基であるものは、市販の試薬や食品を購入して得られる糖蛋白質、遺伝子工学的な手法によって調製した糖蛋白質、あるいは食品や天然物を一般的な抽出分離法によって得られた糖蛋白質に対し、本発明のエンドＭ変異体もしくは市販のエンド酵素で加水分解することで容易に調製できる。
【００９３】
前記市販のエンド酵素としては、エンドＨ（ニューイングランドバイオラボ社製)、エンドＳ(シグマ−アルドリッチ社製)、エンドＤ(コスモバイオ社製)、エンドＭ（東京化成工業社製）、エンドＦ１〜Ｆ３(シグマ−アルドリッチ社製）などが挙げられる。また、市販されていない酵素としては、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼ、又はＧＨファミリー１８に属し、かつＮ−結合型糖鎖を加水分解する酵素であることが示されているものを挙げることができる。
【００９４】
上記の遺伝子工学的な手法による糖蛋白質の調製においては、目的の糖蛋白質をコードする遺伝子を、宿主となる細胞や個体に導入（トランスジェニック）して、所望とする糖蛋白質を調製することができる。宿主としては特に限定されないが、糖蛋白質を容易に調製する観点からは、酵母、昆虫細胞及び各種動物由来の細胞、並びに、個体である昆虫、両生類及び哺乳類等の動物が挙げられる。これらの宿主の中でも、糖鎖受容体の調製における経済性の観点から、昆虫細胞又は個体である昆虫がより好ましく、さらにカイコ細胞又はカイコが特に好ましく、個体であるカイコが最も好ましい。
カイコについては、例えば、伊藤らの文献［日本糖質学会年会要旨集（２０１１）、３０ｔｈ、５４頁］に示されるように、外来遺伝子を導入されたカイコ（トランスジェニックカイコ）は、その中部絹糸腺中に大量に外来蛋白質を発現することが知られている。また、発現された該蛋白質が有する糖鎖は、ヒト型様部分構造を含み、昆虫特異的な糖鎖構造が付加されないという利点がある。
また、トランスジェニックカイコから調製される糖蛋白質は、例えば特開２０１５−２０８２６０号公報に示されるように、Ｎ結合型糖蛋白質糖鎖が主にハイマンノース型糖鎖であるため、多くのエンド酵素の基質となりやすく、糖鎖受容体の調製に有利である。
このため、大量にかつ安価に飼育が可能なカイコは、上記の糖蛋白質の調製にとって経済的に有利であるといえる。
【００９５】
（反応）
反応は、糖鎖転移反応を意味し、糖鎖転移反応は、エンドＭ変異体、糖鎖供与体及び糖鎖受容体を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖転移活性の点から、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びリン酸緩衝液が好ましい。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖転移活性の点から、１０ｍＭ〜２５０ｍＭが好ましく、２０ｍＭ〜１５０ｍＭがより好ましく、特に好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭである。１０ｍＭ以上とすることで緩衝能力を高め、２５０ｍＭ以下とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を高め、糖鎖転移収量を高めることができる。
【００９６】
また、反応における溶液のｐＨは、糖鎖転移収量を高める観点から、５．５〜８．５が好ましく、６．０〜８．０がより好ましく、６．５〜７．５が特に好ましい。
【００９７】
反応における温度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の観点、糖鎖転移収量を高める観点及び糖鎖受容体やエンドＭ変異体等の安定性の観点から、４℃〜４０℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがより好ましく、２５℃〜３５℃であることが特に好ましい。４℃以上とすることで、エンドＭ変異体等の糖鎖転移活性を高めることができ、４０℃以下とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの安定性を高めることができる。
【００９８】
糖鎖転移反応においては、反応溶液中のエンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の濃度は、０．００５μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬであることが好ましい。０．００５μｇ／μＬ以上であることで、糖鎖転移活性を向上させ、０．５μｇ／μＬ以下であることで、エンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の糖鎖転移後生成物の再加水分解を抑制し、糖鎖転移収量を向上させることができる。
【００９９】
糖鎖転移反応において、糖鎖受容体の反応溶液中の濃度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移反応を阻害するものでなければ特に限定されるものでなく、所望とする糖鎖転移収量や糖鎖受容体の反応溶液中への溶解度等を考慮して適宜調整される。しかし、前記一般式（１）で表される糖鎖受容体が蛋白質を含むものでは、１．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましい。この範囲であることで、より高い糖鎖転移収量を得ることができる。中でも、２．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【０１００】
糖鎖転移反応においては、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数／糖鎖受容体のモル数）は、用いる糖鎖供与体もしくは糖鎖受容体の種類や、反応後における、それらの回収等を考慮して、適宜設定することができる。しかし、糖鎖転移収量の観点からは、モル比率は１０〜３０００で行うことが好ましく、１００〜２０００で行うことがより好ましく、２００〜１５００で行うことが特に好ましく、さらに３００〜１０００で行うことが最も好ましい。モル比率が１０以上で、より十分な糖鎖転移収量を得ることができ、３０００以下で行うことで、より高い糖鎖転移収量を得ることができる。
【０１０１】
糖鎖転移反応における反応時間は、反応温度及びエンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの溶液中の濃度等によって、適宜設定されるが、３時間〜１００時間であることが好ましい。３時間以上であることで、糖鎖転移収量をより高めることができ、１００時間以下であることで、糖鎖転移後の生成物の加水分解の影響をより抑制し、糖鎖転移収量を高めることができる。上記の反応時間の中でも、１０時間〜５０時間であることがより好ましい。
また、反応方法としては、反応の糖鎖転移収量をさらに高める観点から、一定時間の反応後に、再度、反応溶液中に糖鎖供与体とエンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログを添加して、一定時間反応させることが好ましい。
【０１０２】
本発明のＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法では、個体、動物組織及び細胞等を使用しないので、外部からの夾雑物又はウィルスなどは混入する可能性は極めて低い。このため、上記の製造方法で製造されたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質は、安全かつ機能を維持した医薬用組成物や薬品の構成成分として提供できる。また、医薬用組成物は、本発明によって製造されたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。
また、本発明のＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の製造方法では、多くの種類の糖鎖供与体を用いて、対応する多くの種類のＭａｎ６Ｐ含有糖鎖を高い割合で有する蛋白質が得られるため、得られたものは糖蛋白質標品としても有用である。
【０１０３】
≪蛍光基結合型Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法≫
本発明の蛍光基結合型Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法は、上記の製造方法によって得られたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質に、さらに蛍光基を導入して得られる蛍光基結合型Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を、細胞に付与することによって、該糖蛋白質の細胞内分布を検出する方法である。蛍光基結合型とは、Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質に共有結合又はイオン結合で蛍光基が結合していることを意味する。
すなわち、上記の製造方法によって得られたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質に、さらに蛍光基を導入し、これを目的の細胞に付与することにより、前記Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の細胞内での局在性などの分布を検出することができる。前記方法では、蛍光基結合型Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質等が、Ｍａｎ６Ｐレセプターによって容易に細胞内に侵入するので、侵入後の蛍光Ｍａｎ６Ｐ糖蛋白質等の細胞内での挙動を、蛍光基が発する蛍光によって追跡することができる。
【０１０４】
蛍光基の導入方法としては、例えば、Ａｓａｎｕｍａらの文献［Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 53(24) 6085-6089, (2014)］及び五稜化薬株式会社のホームページに記載の文献（http://goryochemical.com/products/acidifluor/acidifluor-orange.html)を参考にして、適宜所望とする蛍光基を、上記の製造方法によって得られたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質に導入することによって調製できる。また、蛍光基を導入する試薬は市販されており、例えば、五稜化薬株式会社製のＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ ＯＲＡＮＧＥ−ＮＨＳを利用することができる。
【０１０５】
前記検出方法においては、例えば、目的とする細胞や組織等に、前記蛍光Ｍａｎ６Ｐ糖蛋白質を添加させ、一定の雰囲気、温度、及び時間にてインキュベートした後に、蛍光顕微鏡等で観察することによって、前記蛍光Ｍａｎ６Ｐ糖蛋白質の細胞内での局在性や分布を知ることができる。前記蛍光Ｍａｎ６Ｐ糖蛋白質の細胞への添加量雰囲気、温度及び時間は、細胞の種類、前記蛍光Ｍａｎ６Ｐ糖蛋白質における蛋白質としての機能や性質等によって適宜調整される。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。
以下、ヒトαイズロニダーゼはＩＤＵＡと称する。また特に断らない限り、ＩＤＵＡは酵素としての活性を有するものであるものをさす。
「ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ」とは、ＩＤＵＡのＮ結合型糖鎖を、エンド酵素によって加水分解した後に得られる蛋白質であり、ＩＤＵＡを構成するポリペプチドに１つのＧｌｃＮＡｃが、少なくとも１か所結合していることを示す。
「Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ」とは、Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質をさし、特に断らない限り、後述するトランスジェニックカイコ（ＴＧカイコとも称する）から得た後に３段階のクロマトグラフィーにより精製されたものをさす。
また、ヒトＩＤＵＡは、通常、６個のＮ結合型糖鎖を有し、以下ＴＧカイコによって調製されるＩＤＵＡは、１個〜６個のＮ結合型糖鎖の混合物である。
【０１０７】
〔実施例１〕
＜糖鎖受容体（ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ）の調製＞
【０１０８】
（ＩＤＵＡ遺伝子を導入したＴＧカイコの作製）
Ｔａｋａｈａｓｈｉらの文献[Proc Natl Acad Sci USA.,Vol.104,8941-8946, (2007)]及びＫｏｂａｙａｓｈｉらの文献[Arch Insect Biochem Physiol.,Vol.76(4),195-210, (2011)]を参考にして、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターに、カイコ中部絹糸腺（組織）に特異的な転写プロモーター（セリンシン１プロモーター）下流に転写因子ＧＡＬ４、及びその認識配列ＵＡＳの下流に、ヒトαイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）遺伝子、さらに遺伝子導入個体の選別用のキヌレニン酸化酵素遺伝子を挿入し、カイコ卵にインジェクションした。本方法により、遺伝子導入カイコ幼虫の中部絹糸腺特異的にＩＤＵＡを高発現するトランスジェニックカイコを作製した。
【０１０９】
（カイコによるαイズロニダーゼの発現及び精製）
まず、上記で得られたＴＧカイコからＩＤＵＡを得ることを確認するための各種測定方法について説明し、次に、ＴＧカイコからのＩＤＵＡの抽出及び分離精製方法について説明する。
<各種測定方法>
〜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色〜
ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、スラブ電気泳動装置（バイオクラフト社製）を使用し、１０％ポリアクリルアミド均一ゲルを用いて電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル内タンパク質の検出は、ＣＢＢ染色液［１０％ＣＢＢ−Ｒ３５０（ＧＥ社製）、２７％メタノール、９％酢酸、０．１％ＣｕＳＯ４］中で振盪し、１ｈ以上染色を行った後、脱色液（１０％酢酸）を用い６時間以上脱色することにより行った。
【０１１０】
〜ウェスタンブロッティング〜
サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（バイオラッド社製）を使用しＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写を、１５Ｖの定電圧で１時間行った。転写用の緩衝液は４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノールの混合溶液を用いた。転社したＰＶＤＦ膜を、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク）／ＴＢＳ中で、室温で１．５時間振盪してブロッキングした。
１ｓｔプローブとしてＩＤＵＡ抗体（Ａｎｔｉ−ＩＤＵＡ、ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、（Ｒ＆Ｄ社製））を使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中でＰＶＤＦ膜を振盪した（４℃、Ｏ／Ｎ）。その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。２ｎｄプローブとして抗ヒツジ抗体（Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｖｅｃｔｏｒ社製））を使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中、ＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中で室温で５分間洗浄した。３ｒｄプローブとしてＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中でＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。ＰＶＤＦ膜はＷｅｓｔｅｒｎ  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｕｌｔｒａ／Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）により化学発光させ、画像解析装置［ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉＥＰＵＶ（富士フイルム社製）］を用いてシグナル（バンド）検出を行った。
【０１１１】
〜人工蛍光基質を用いる酵素活性測定法〜
ヒトαイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）活性は４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）−α−Ｌ−イドピラノシド（Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）（以下、４ＭＵ−Ｉｄｏと称することがある）を基質としてクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中にて３７℃で３０分間インキュベートした後、遊離した４ＭＵの蛍光強度（Ｅｘ：３５５ｎｍ、Ｅｍ：４６０ｎｍ）を指標にして測定した。なお、４ＭＵ−Ｉｄｏを基質とする酵素活性は、ＩＤＵＡ活性と称することがある。
【０１１２】
<中部絹糸腺の採取方法>
カイコからの中部絹糸腺の採取は、公知の一般的な方法によって行った。５令〜熟蚕期のＴＧカイコの腹側（第４節〜第５節付近）の外皮を（手術用手袋を装着した人手で）割き、割かれた部分から押し出されてくる絹糸腺を引き出した。生理食塩水中で、採取した絹糸腺組織全体から、前部、後部絹糸腺及び付着した脂肪体組織を除去し、中部絹糸腺のみを分取して回収した。生理食塩水での洗浄を２回行った後に５０頭分ずつをコニカルチューブに詰め、−２０〜−３０℃で凍結保存した。
【０１１３】
<中部絹糸腺からのＩＤＵＡ精製>
ＩＤＵＡは、３段階のクロマトグラフィー操作（アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー）と、上記のＩＤＵＡ活性測定方法を併せて行うことによって精製することで得られた。
まず、上記のＴＧカイコから採取した中部絹糸腺を解凍後、細断し、０．５ＭのＮａＣｌを含有した２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ４．５）中で超音波破砕し、抽出液Ａを調製した。
得られた抽出液Ａについて、４ＭＵ−Ｉｄｏに対する酵素活性（ＩＤＵＡ活性）を測定した結果を図１に示す。なお、図１中、未導入とは、ＩＤＵＡ遺伝子を導入していないカイコから、上記の方法と同様に得られた中部絹糸腺の抽出液ＢについてＩＤＵＡ活性を測定したものである。
結果から、ＩＤＵＡ遺伝子を導入したＴＧカイコから得られた抽出液Ａは、抽出液Ｂに比べて顕著に高いＩＤＵＡ活性を示した。
また、得られた抽出液に対してヒトＩＤＵＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、図２中のレーン１及び２に示すように、ＩＤＵＡ遺伝子未導入のカイコから抽出された蛋白質含有溶液では何らのバンドも得られなかったのに対し、レーン３及び４に示すように、ＩＤＵＡ遺伝子を導入したＴＧカイコから抽出された蛋白質含有溶液では８０ｋＤａ付近に強いバンドが見出された。
以上の結果から、ヒトＩＤＵＡ遺伝子を導入したＴＧカイコから、ＩＤＵＡ活性を有するＩＤＵＡを含む抽出液Ａが得られた。
【０１１４】
上記にて得られた抽出液Ａを、遠心分離［２０、０００ｘｇ、４℃、２０分（ベックマンコールター社製、ＡｖａｎｔｉＪ−Ｅ、ロータ：ＪＲＡ１６．２５０）］によって遠心後、上清を回収した。得られた上清にまず終濃度が１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２及びＭｎＣｌ２を添加し、予め結合用緩衝液［２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ２及び１ｍＭのＭｎＣｌ２含有（ｐＨ４．５）］で平衡化したＣｏｎＡ樹脂（ＣｏｎＡセファロース４Ｂ、ＧＥ社製）を含む遠心管内で、蓋で密閉後、ローテータ（Ｔａｉｔｅｃ社製のＲＴ−５０）で緩やかに撹拌し、抽出液Ａ内の糖タンパク質のＣｏｎＡ樹脂への吸着を行った（４℃、Ｏ／Ｎ）。遠心後の上清を除去し、ＣｏｎＡ樹脂の洗浄用緩衝液［２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍＭのＭｎＣｌ２含有（ｐＨ４．５）］を用いてＣｏｎＡ樹脂の洗浄を行った。その後、溶出用緩衝液［２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、及び０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ｐＨ４．５）］により溶出を行った。得られた溶出画分（以下、ＣｏｎＡ溶出画分と称する）を、アミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、陽イオン交換カラム結合用緩衝液［１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ含有（ｐＨ６．０）］を用いて緩衝液交換を行った。その後、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）を用いて、前記溶出画分中の不溶物を除去した後、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ−１０（ＧＥ社製）に装備されている陽イオン交換クロマトグラフィー用のカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ社製））にアプライし、ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭから５００ｍＭまで連続的に増大させる条件によって精製操作を行った。ＩＤＵＡ活性を示す溶出画分（以下、ＳＰ溶出画分と称する）をアミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮後、ブチル−セファロースカラム結合用緩衝液［５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ含有（ｐＨ４．５）］との緩衝液交換を行った。その後、０．２２μｍフィルターで濾過を行い、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ−１０に装備されている疎水性相互作用クロマトグラフィー用のカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ、ＧＥ社製）にアプライし、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで連続的に低下させる条件によって精製操作を行い、分画された各画分のＩＤＵＡ活性を測定し、活性を有する画分（以下、Ｂｕｔｙｌ溶出画分と称する）を集めた。上記の各精製方法によって得られた画分の比活性の結果を、表１に示す。また、抽出液、ＣｏｎＡ溶出画分及びＳＰ溶出画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図３に示す。表１及び図３中、Ｅｘｔｒａｃｔは、上記抽出液Ａを示し、ＣｏｎＡ  ｅｌｕａｔｅは、上記のＣｏｎＡ溶出画分を示し、ＳＰ  ｅｌｕａｔｅは、上記のＳＰ溶出画分を示し、Ｂｕｔｙｌ  ｅｌｕａｔｅは、上記のＢｕｔｙｌ溶出画分を表す。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは各レーンに同量（１０μｇ）のタンパク量をアプライして行った。
【０１１５】
【表１】
2017184736.tif 000012
【０１１６】
結果から、上記の精製方法によって得られたＢｕｔｙｌ溶出画分の４ＭＵ−Ｉｄｏに対する比活性は、抽出液Ａ（Ｅｘｔｒａｃｔ）の４ＭＵ−Ｉｄｏに対する比活性の３０倍以上に向上していることから、前記ＴＧカイコから、高度に精製されたＩＤＵＡを得ることができた。
また、図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＳＰ溶出画分及びＢｕｔｙｌ溶出画分の８０ｋＤａ付近のバンド以外のバンドの染色濃度が、抽出液のものに比べて顕著に薄くなっていることから、得られたＳＰ溶出画分及びＢｕｔｙｌ溶出画分に存在するＩＤＵＡが高度に精製されていることが示された。なお、以下、前記Ｂｕｔｙｌ溶出画分に存在するＩＤＵＡをＴＧ−ＩＤＵＡと称する。
上記の精製操作によって得られたＩＤＵＡを含む画分は、以下に示す糖鎖受容体の調製に用いた。
【０１１７】
〈エンド酵素によるＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ（糖鎖受容体）の調製〉
糖鎖受容体は、以下のように、上記にて得られたＴＧ−ＩＤＵＡを、エンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）によってマンノース残基数が５以下のＮ結合型糖鎖を加水分解することにより調製した。
４ｍｇのＴＧ−ＩＤＵＡ  と１０００ＵのＥｎｄｏ−Ｄを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（５００ｍＭのＮａＣｌ含有）８００μＬに溶解し，３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後はＣｈｉｔｉｎ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）によってＥｎｄｏ−Ｄを吸着除去した。具体的には５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（５００ｍＭのＮａＣｌ含有）で平衡化したＣｈｉｔｉｎ  ｒｅｓｉｎ  １００μＬに対して上記インキュベート後溶液を加えて、４℃で２時間穏やかに撹拌した。その後サンプルをムロマックカラム（ムロマチテクノス社製）に加え，素通り画分を回収した。この画分はアミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて濃縮し、さらに５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）への緩衝液交換を行った。得られた画分をＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ（糖鎖受容体）とした。
【０１１８】
＜糖鎖供与体の調製＞
（試薬及び測定方法）
用いた試薬は特に記載がない場合、東京化成工業株式会社のものを使用した。ＮＭＲは日本電子株式会社製ＥＣＡ−４００を使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定はブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタ  システムを使用した。薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣと称する）はメルク社製６０Ｆ  ２５４を用い、１０％硫酸エタノールにて発色させた。
【０１１９】
<各種測定方法>
〜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ〜
反応液をそのままもしくは精製後のサンプルを溶媒(例えば塩化メチレン、酢酸エチル、メタノール、トルエン、アセトン、水)に溶解した溶液及びＤＨＢＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸を５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液）の０．５〜２μＬずつを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析用のｐｌａｔｅにスポットし乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を、ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタ  システム（ブルーカー・ダルトニクス社製）を用い、下記の測定条件で行った。
・測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ又はｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ及びｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ又はＬｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅ
・測定電圧：１．５Ｋｖ〜２．５Ｋｖ
・測定分子量の範囲：０〜１００００（ｍ／ｚ）
・積算回数：５００〜１００００
以下、具体的な糖鎖供与体の調製方法を示す。
【０１２０】
（化合物１２（糖鎖供与体）の合成）
糖鎖供与体として化合物１２を、下記に示す経路で合成した。
【０１２１】
【化１１】
2017184736.tif 000013
【０１２２】
上記経路で示すように、公知のグリコシル化法にて６糖の誘導体（化合物６）を合成した。その後、還元末端のパラメトキシフェニル基を脱離基であるフルオロ基に変換し、後述するようなグリコシル化の条件でグリコシル化を行って、７糖の誘導体である化合物９を合成した後、リン酸基を導入する位置の２つの保護基を脱保護し、続いてリン酸基を導入した後、保護基を脱保護することで、末端にＭａｎ６Ｐを有する７糖のパラメトキシフェニル誘導体（糖鎖供与体）を得た。
【０１２３】
〜化合物６の合成〜
東京化成工業株式会社製のＭａｎ［２Ｂｚ、３Ａｌｌ、４６Ｂｚｄ］β（１−４）ＧｌｃＮＰｈｔｈ［３６Ｂｎ］−β−ＭＰ（製品コード：Ｍ２４４２）より誘導した化合物１（２．９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）と文献［Tetrahedron Lett., Vol.51, 4323-4327, (2010)］に従い合成した化合物２（４．７ｇ、４．６ｍｏｌ）をトルエン１５０ｍｌに溶解しモレキュラーシーブス４Å１５ｇを加え室温で１時間撹拌した。反応液を−３０℃に冷却し、Ｎ−ヨードスクシンイミド１．６ｇ（７．０ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸６１μＬ（０．７ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液にトリエチルアミン２１０μＬ（１．５ｍｍｏｌ）を加え反応を停止し、セライトで濾過した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１１：１）で精製し、化合物３（４．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を収率７６％で得た。
次にナスフラスコにトリフルオロメタンスルホン酸銀０．９１ｇ（３．５ｍｍｏｌ）、ハフノセンジクロリド０．６７ｇ（１．８ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Å４．２ｇを入れ、化合物３のベンジリデンアセタール保護基を脱保護することにより得られた化合物４（１．３ｇ、０．７ｍｍｏｌ）のトルエン２１ｍＬ溶液を加え１．５時間撹拌した。反応液を−３０℃に冷却後、文献［Tetrahedron Lett., Vol.40, 8049−8053, (1999)］に従い合成したＯ−（６−Ｏ−アセチル−２、３、４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）−２、３、４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノースより調製した化合物５（０．８２ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）のトルエン２１ｍＬ溶液を、前記反応液に加え１時間撹拌した。この溶液をセライト濾過後に、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝８：１→５：１）で精製し、１．７ｇの生成物を得た。生成物について、ＮＭＲ測定を行い下記の結果を得た
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：５．５４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、４．６７（ｂｒｓ、１Ｈ、Ｈ−１ｂ）、４．３３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２ａ）、４．１８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３ａ）、４．０６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４ａ）、３．４２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５ａ）、１．９３（ｓ、３Ｈ、Ａｃ）、１．８８（ｓ、３Ｈ、Ａｃ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ：１７０．９２、１７０．７３、１５５．３４、１５０．８７、１３７．９０−１３９．１０（ａｒｏｍ．）、１２６．８６−１２８．５１（ａｒｏｍ．）、１１８．７２、１１４．３０、１０１．９９、１０１．４９、９９．２８、９８．４３、９８．００、９７．６２、８３．１５、７９．８４、７９．６７、７９．４０、７９．０６、７８．６０、７５．３６、７５．１７、７５．１０、７４．９７、７４．８２、７４．７１、７４．５７、７４．４１、７４．１２、７３．４７、７３．３５、７２．７０、７２．５４、７２．２０、７２．０１、７１．３６、７１．０５、７０．５８、６９．９７、６８．１２、６６．６８、６５．６１、６３．５７、６３．４８、５５．５７、２０．８４．
以上の測定結果によって、糖鎖供与体である化合物６（０．６１ｍｍｏｌ）を収率８７％で得られたことが示された。
【０１２４】
〜化合物９の合成〜
化合物６（１．０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２０ｍＬ、トルエン１５ｍＬ、水１０ｍＬに溶解した。０℃に冷却し、硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）２．０ｇ（３．６ｍｍｏｌ）を加え２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、還元末端が脱保護された１−ＯＨ体０．８１ｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を収率８４％で得た。得られた１−ＯＨ体０．８１ｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８．１ｍＬに溶解させた後に−２０℃に冷却し、（ジエチルアミノ）サルファートリフルオリド０．１６ｍＬ（１．２ｍｍｏｌ）を加え１．５時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液にメタノール（０．１ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）を加え反応を停止し、塩化メチレンで希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、化合物７（０．７２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を得た。
次にナスフラスコにトリフルオロメタンスルホン酸銀０．２１ｇ（０．８２ｍｍｏｌ）、ハフノセンジクロリド０．２８ｇ（１．６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Å２．２ｇを加え［参考文献；文献１(Tetrahedron Lett., Vol.30, 4853-4856, (1989))及び文献２(Carbohydr Lett., Vol.295, 25-39, (1996))］、さらに東京化成工業株式会社製の化合物８（製品コード：Ｍ１６１５）（０．２４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をトルエン１１ｍＬ溶液に加え、アルゴン雰囲気下２時間撹拌した。反応液を−３０℃に冷却後、化合物７（０．７２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のトルエン（１１ｍＬ）溶液を加え１３時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、この溶液をセライト濾過し、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物９（０．７０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を化合物６に対し収率７２％で得た。
【０１２５】
〜化合物１０の合成〜
化合物９（０．５２ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノール１０ｍＬに溶解し、エチレンジアミン０．５４ｍＬ（８．１ｍｍｏｌ）加え１１０℃で６時間撹拌後、室温で１０時間撹拌し、さらに１４０℃に昇温して１０時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸をおこなった。得られた残渣にピリジン（５ｍＬ）を加え溶解させ、無水酢酸（０．２４ｍＬ、２．５８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン５．０ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）加え、室温で４時間撹拌し、さらに５０℃で３時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸後、酢酸エチルで希釈した。有機層を２Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール＝１００：１→８０：１）で精製し、アセチル化された化合物０．３５ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を収率７１％で得た。得られた前記化合物０．３４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１．７ｍＬとメタノール１．７ｍＬの混合溶媒に溶解させ、ナトリウムメトキシド（２．５μＬ、０．０１２ｍｍｏｌ）を加え２．５時間撹拌した。その後さらにナトリウムメトキシド（５．０μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）加え１７時間撹拌した。ＤＯＷＥＸ（５０ＷＸ８（２００−４００Ｈ＋））を加え中和し、濾過後に、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝７０：１）で精製し、化合物１０（０．２４ｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を収率７３％で得た。
【０１２６】
〜化合物１１の合成〜
文献［Bull.Chem.Soc.Jpn., Vol.81, No.7, 796-819, (2008)］に従いリン酸化を行った。化合物１０（０．１０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３ｍＬに溶解しアルゴン雰囲気下ピロリン酸テトラベンジル０．１８ｇ（０．３４ｍｍｏｌ）を加え−６０℃に冷却した。その後、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（約２６％テトラヒドロフラン溶液、約１．３ｍｏｌ／Ｌ）の６７μＬ（０．０８８ｍｍｏｌ）を加え１．５時間撹拌した。さらに、２時間、３．５時間後にそれぞれリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（約２６％テトラヒドロフラン溶液、約１．３ｍｏｌ／Ｌ）の６７μＬ（０．０８８ｍｍｏｌ）を加え０．５時間攪拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液に酢酸エチル及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。酢酸エチルで希釈後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで粗精製した。次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝８：１→７：１）で精製し、化合物１１（９０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を収率７６％で得た。
【０１２７】
〜化合物１２の合成〜
化合物１１（０．０８５ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５ｍＬ、エタノール６ｍＬ、水６ｍＬの混合溶液に溶解し、パラジウム炭素（０．３４ｇ）加え水素気流下で２２時間撹拌した。ＴＬＣにて反応を確認後、反応液をセライト濾過し、減圧濃縮した。得られた残渣をＤＯＷＥＸ（Ｎａ＋）にてナトリウム塩に変換後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製し、０．０３５ｇの生成物を得た。生成物について、ＮＭＲ測定を行い下記の結果を得た。ＮＭＲ測定により得られた測定値を下記に示す。また、得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に示し、その拡大したスペクトルを図５にそれぞれ示す。また、生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られた測定値を下記に示し、得られたマススペクトルを図６に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：６．９４−７．０３（ｍ、４Ｈ）、５．３９（ｂｒｓ、１Ｈ）、５．０１−５．０３（ｍ、２Ｈ）、４．９０（ｍ、２Ｈ）、４．８１（ｂｒｓ、１Ｈ）、４．６２（ｄ、１Ｈ、Ｈ−１、Ｊ１，２＝７．７８Ｈｚ）、３．６２−４．２２（ｍ、４４Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ、Ａｃ）、２．０２（ｓ、３Ｈ、Ａｃ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、１００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：１７５．５３、１７５．４４、１５５．５３、１５１．７３、１１８．９４、１１５．７６、１０３．１５、１０２．０８、１０１．６１、１０１．１５、１００．５１、１００．１９、８０．４３、７９．７５、７５．４３、７５．０９、７２．８５、７２．６４、７１．３９、７１．３５、７１．０１、７０．８７、７０．６３、６７．２０、６６．６８、６０．６４、５６．４８、５５．６３、２２．９２、２２．８１．
３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、１６２ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）：３．０３（ｂｒｓ、２Ｐ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ−Ｈ］−１４９９．４０；ｆｏｕｎｄ、１４９９．９６．
以上の測定結果によって、糖鎖供与体である化合物１２を収率８６％で得られたことが示された。
【０１２８】
<エンドＭ変異体>
本実施例で用いられるエンドＭ変異体は、Ｎ１７５Ｑ変異体（東京化成工業社製、グライコシンターゼリコンビナント）を用いた。
【０１２９】
（エンドＭ変異体による糖鎖転移）
〈Ｍａｎ６ＰＲ（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ）の調製方法〉
Ｍａｎ６Ｐを検出するためのレクチン（ＣＩ−Ｍａｎ６ＰＲ）は、以下のように調製した。
すなわち、Ａｋｅｂｏｓｈｉらの文献[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 73, 4805-4812, (2007)]を参考にして作製したＣＩ−Ｍａｎ６ＰＲ（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ）発現用プラスミドベクターを、メタノール資化性酵母株（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１）５株にエレクトロポレーション法により導入した。２％メタノールを含むＢＭＧＹ培地で５日培養した後、培養後の酵母を含む培養液全量を遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃、１ｈ、ＫＵＢＯＴＡ６８００（ロータ：ＲＡ−１５００））し、培養上清を回収した。培養上清は０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いてフィルトレーションし、限外ろ過［Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ５Ｋ（ミリポア社製）］により濃縮した。
濃縮された培養上清を、Ｈｉｓタグ精製用樹脂（Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ社製）に結合させた後、前記樹脂に付属されているプロトコールに従って、洗浄用緩衝液［２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ含有（ｐＨ８．０）］で洗浄し、溶出用緩衝液［２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ含有、５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）］を用いて溶出させることで、ＣＩ−Ｍａｎ６ＰＲ（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ）を含む溶液を得た。得られた溶液を適宜希釈して、後述する糖鎖転移反応後溶液中の生成物中のＭａｎ６Ｐの検出に用いた。
【０１３０】
<エンドＭ変異体による糖鎖転移反応>
糖鎖受容体として、上記のＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ、糖鎖供与体として、上記の化合物１２を、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）１０μＬに溶解し、下記の条件にて糖鎖転移反応を行った。
<条件>
・糖鎖供与体：化合物１２・・・２００ｎｍｏｌ
・糖鎖受容体：ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ・・・２００ｐｍｏｌ
・エンドＭ変異体：Ｎ１７５Ｑ・・・２ｍＵ
・糖鎖受容体（Ａ）に対する糖鎖供与体（Ｄ）のモル比（Ｄ／Ａ）：１０００
・反応温度：３０℃
・反応時間：２４時間
【０１３１】
<レクチンブロット>
サンプル（糖鎖転移反応後の溶液等）について、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（バイオラッド社製）を使用しＰＶＤＦ膜へのタンパク質の転写を、１５Ｖの定電圧で１時間行った。転写用の緩衝液は４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノールの混合溶液を用いた。転社したＰＶＤＦ膜を、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ（ナカライテスク）／ＴＢＳ中で、室温で１．５時間振盪してブロッキングした。
１ｓｔプローブとして上記のＤｏｍ９−Ｈｉｓを使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中でＰＶＤＦ膜を振盪した（４℃、Ｏ／Ｎ）。その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。２ｎｄプローブとして抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｔａｇ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中、ＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中で室温で５分間洗浄した。３ｒｄプローブとしてＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を使用し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ／ＴＢＳ中でＰＶＤＦ膜を室温で１時間振盪した。その後ＴＢＳＴ中、ＰＶＤＦ膜について、室温で５分間の洗浄を５回繰り返した後、さらにＴＢＳ中、室温で５分間洗浄した。ＰＶＤＦ膜はＷｅｓｔｅｒｎ  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｕｌｔｒａ／Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）により化学発光させ、画像解析装置［ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉＥＰＵＶ（富士フイルム社製）］を用いて、露光時間１秒でかつ高感度の取込み条件でシグナル（バンド）検出を行った。
【０１３２】
上記の反応後の溶液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図７Ａに示し、さらにレクチンブロットを行った結果を図７Ｂに示す。なお図７Ａ及び図７Ｂ中のレーン１は、ＩＤＵＡ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞（Ｋ１株、理化学研究所セルバンク）の培養後に精製して得られたＩＤＵＡ（以下、ＣＨＯ−ＩＤＵＡと称する）を含む試料の結果であり、レーン２は、ＴＧ−ＩＤＵＡを含む試料の結果であり、レーン３は、ＴＧ−ＩＤＵＡをエンドＤで処理した後の試料の結果であり、レーン４は糖鎖転移反応後の結果である。
図７Ａから、レーン３に示すように、レーン３のバンドがレーン２のバンドよりも低分子量側にバンドが現れていることから、上記のエンドＤの処理によって、ＴＧ−ＩＤＵＡからＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡが得られていることが示された。次に、レーン４に示すように、糖鎖転移反応を行った後は、レーン３の８０ｋＤａ付近のＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡのバンドが消滅し、代わりに、高分子量側にバンドが現れた。従って、糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡに糖鎖転移が起こり、１個〜６個のＮ結合型糖鎖に２個〜１２個のＭａｎ６Ｐが結合した糖鎖転移後生成物が得られたことが示された。
また、図７Ｂの結果から、図７Ｂのレーン２〜４中、レーン４のバンドに相当するバンドのみに強い発光シグナルが得られることから、糖鎖転移後生成物がＭａｎ６Ｐを有することが示唆されたことから、糖鎖供与体中のＭａｎ６Ｐを含む糖鎖が、糖鎖受容体に糖鎖転移したことが示された。以上の結果から、糖鎖転移後生成物のほぼすべてが、少なくとも１つのＭ６Ｐ含有糖鎖を有していることが示唆された。
このように、上記のＭａｎ６Ｐを有する糖鎖供与体を用いた糖鎖転移反応は、Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の調製に有効であることが示された。
【０１３３】
<Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質（Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ）の調製>
実施例１の糖鎖転移反応後の溶液を、アミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）を用いて限外ろ過を行い，未反応の糖鎖供与体を除去した。またリン酸生理緩衝溶液（以下、ＰＢＳと称する）への緩衝液交換を行い、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ（１０．５μｇ）を得た。得られたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを、以下のムコ多糖症１型患者繊維芽細胞（ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞）等に対する補充効果の検討に用いた。
また、以下、ＴＧ−ＩＤＵＡ、ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡ及びＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを総称して、補充酵素と称することがある。
【０１３４】
（ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞への補充効果）
補充効果は、以下のように、各補充酵素を、各種細胞に添加した後に得られる前記細胞内の酵素（酵素源）についての活性を比較することによって検討した。
【０１３５】
<各種細胞>
ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞は、徳島大学病院小倫理委員会の承認と患者様へのインフォームド・コンセントを経て、口腔粘膜組織から、Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１０培地（＋１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）存在下で誘導し、接着培養及び継代操作により樹立することで得た。健常人の繊維芽細胞である”ｎｏｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏ”（Ｈｓ６８）は、ＡＴＣＣ製品（製品番号：ＣＲＬ−１６３５）を購入して入手し、同様に接着培養及び継代した。
【０１３６】
<各酵素源>
各酵素源は以下のように調製した。
コラーゲンコート２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ２４ｗｅｌｌ、ＩＷＡＫＩ社製）に培養された５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルのＭＰＳ１患者由来細胞又は健常人の繊維芽細胞（ＨＳ６８）を有する培養液１ｍＬに、それぞれ上記の、ＴＧ−ＩＤＵＡ（エンド酵素未処理のＩＤＵＡ）を２０００ｎｍｏｌ／ｈ（２．５μｇ）、ＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡを２０００ｎｍｏｌ／ｈ（２．８５μｇ）及びＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ２０００ｎｍｏｌ／ｈ（４．６μｇ）のいずれかを添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄後、さらに０．２ｍＬの０．５％トリプシンＥＤＴＡ溶液を添加し、５分間インキュベートすることによって細胞をウェルから剥がした。培養液１ｍＬを加え、トリプシンの反応を停止させた後、４℃、２００ｘｇで５分間遠心分離することで細胞を回収した。得られた細胞に対し５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）（５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、１μＭのペプスタチンＡ、２０μＭのロイペプチン及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む）１００μＬを加え、超音波発生装置（ＭＵＳ−１０、東京理化器械株式会社製）によって細胞を破砕した。その後４℃、１７，９００ｘｇで１５分間遠心分離し、得られた上清を酵素源として次の酵素活性測定に供した。また健常者の繊維芽細胞についても同様の抽出処理を行い、得られた酵素源を次の酵素活性測定に供した。
なお、ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞に、補充酵素のいずれも加えずにインキュベートした後、上記の調製方法によって得られた酵素源をＭＰＳ−Ｅと称し、健常人の繊維芽細胞（ＨＳ６８）に、補充酵素のいずれも加えずにインキュベートした後、上記の調製方法によって得られた酵素源をＮＦ−Ｅと称する。また、ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞に、ＴＧ−ＩＤＵＡを添加してインキュベートした後、上記の調製方法によって得られた酵素源をＭＰＳ−Ｃ−Ｅと称し、ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞にＧｌｃＮＡｃ−ＩＤＵＡを添加してインキュベートした後、上記の調製方法によって得られた酵素源をＭＰＳ−ＧＩ−Ｅと称し、ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞に、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを添加してインキュベートした後、上記の調製方法によって得られた酵素源をＭＰＳ−ＭＩ−Ｅと称する。
【０１３７】
<酵素活性測定>
ＩＤＵＡ活性については、４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）−α−Ｌ−イドピラノシド（Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）（以下、４ＭＵ−Ｉｄｏと称することがある）を基質としてクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中にて３７℃で３０分間インキュベートした後、遊離した４ＭＵの蛍光強度（Ｅｘ：３５５ｎｍ、Ｅｍ：４６０ｎｍ）を指標にして測定した。なお、４ＭＵ−Ｉｄｏを基質とする酵素活性は、ＩＤＵＡ活性と称することがある。
また、β−ヘキソサミニダーゼ活性であるＭＵＧ分解活性は、４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＳＩＧＭＡ社製）を基質としてクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中にて３７℃、３０分間インキュベート後、遊離した４ＭＵの蛍光強度（Ｅｘ：３５５ｎｍ、Ｅｍ：４６０ｎｍ）を指標にして測定した。
【０１３８】
<評価>
ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞への補充効果は、以下のように評価した。すなわち、各酵素源（ＭＰＳ−Ｅ、ＮＦ−Ｅ、ＭＰＳ−Ｃ−Ｅ、ＭＰＳ−ＧＩ−Ｅ及びＭＰＳ−ＭＩ−Ｅ）のそれぞれのＩＤＵＡ活性の活性回復比を、各酵素源のＭＵＧ分解活性を対照酵素活性として、以下の式１によって算出することにより求めた。
各活性回復比＝(各酵素源のＩＤＵＡ活性／各酵素源のＭＵＧ分解活性)／ＭＰＳ−ＥのＩＤＵＡ活性・・・式１
【０１３９】
図８Ａは、上記の各補充酵素をＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞等に添加して２４時間インキュベートした後の細胞内のＩＤＵＡ活性における活性回復比を示し、図８Ｂは、上記の各酵素源のＭＵＧ分解活性を示す。また、図８Ａの各カラム上の数字は、活性回復比の値を示し、図８Ｂの各カラム上の数字は、ＭＵＧ分解活性の値を示す。
結果から、ＭＰＳ−Ｅ以外の、他の酵素源の活性回復比は、ＭＰＳ−Ｅの２３倍〜５２倍という非常に高い値を示した。また、ＭＰＳ−ＭＩ−Ｅの活性回復比は、他の酵素源の活性回復比に比較して最も活性回復比が高いことが示された。従って、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを、ＩＤＵＡ活性を有しない細胞（ＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞）に添加した場合には、該細胞内のＩＤＵＡ活性を著しく向上させることが示された。このように、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを細胞に添加することで、細胞内にＩＤＵＡ活性を有する酵素が補充され、該活性をより向上させることが示された。
【０１４０】
（蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有化合物の細胞内分布の検出）
以下のように、蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有化合物（Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯ）、及び蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡを調製し、それらを用いて、細胞内でのＭａｎ６Ｐ含有化合物及びＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡの局在性及び分布を調べた。
【０１４１】
<蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ含有化合物の合成>
非還元末端にＭａｎ６Ｐを含有する化合物は、Ａｓａｎｕｍａらの文献［Angew.Chem.Int.Ed.Engl., Vol.53(24), 6085-6089, (2014)］及び五稜化薬株式会社のホームページに記載の文献（http://goryochemical.com/products/acidifluor/acidifluor-orange.html）を参考にして合成した。すなわち、上記で得られた化合物７と、文献［Tetrahedron Lett., Vol.61, 4313-4321, (2005)］に従い合成した３−（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙａｍｉｎｏ）−１−ｐｒｏｐｙｌ  ３，６−ｄｉ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−２−ｄｅｏｘｙ−２−ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅとを用い、化合物１２の合成法と同様の方法により、図９に示すように、３位にアミノ基を有するｎ−プロポキシ基を有する化合物ＡＦを合成した。さらに、酸性ｐＨで活性化する蛍光分子（ＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ  ＯＲＡＮＧＥ−ＮＨＳ、五稜化薬株式会社製）と結合させることで、化合物ＡＦ１を作製した。得られた化合物ＡＦ１と化合物ＡＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを図１０に示す。結果から、原料化合物である化合物ＡＦから、蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ付加型化合物（Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯ）が得られたことが示された。なお、ＡＦＯとは蛍光化合物（ＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ  ＯＲＡＮＧＥ）をさす。
【０１４２】
次に６糖のオリゴ糖の誘導体であるＭａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯがＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞表面のＭａｎ６Ｐレセプターとの結合を介して、細胞内に取り込まれるかどうかを評価した。Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯを最終濃度５０ｎＭで、３５ｍｍコラーゲンコートディッシュ（３５ｍｍ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｄｉｓｈ、ＩＷＡＫＩ社製）中に培養されたＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞を含む培養液に添加し、２４時間後に、Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯの蛍光を蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で観察した。結果を図１１に示す。
結果から、ＡＦＯ試薬自体は、細胞内に取り込まれなかったのに対し、Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯは細胞名に取り込まれ、蛍光が観察された。一方、Ｍ６Ｐレセプターの取り込みにおける競合阻害剤である５ｍＭのマンノース６リン酸（Ｍ６Ｐ）存在下では細胞内蛍光は観察されなかったことから、Ｍａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯは、細胞表面のＭ６Ｐレセプターを介して取り込まれ、酸性ｐＨを有する細胞内小器官である後期エンドソーム／リソソームまで輸送されていることを示した。したがってＭａｎ６Ｐ−Ｍａｎ５−ＡＦＯは、Ｍａｎ６Ｐに結合した分子を、細胞内小器官（リソソーム）へと送達するためのタグとして機能することが示された。
【０１４３】
<蛍光基修飾されたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡの合成>
上記によって得られたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ３０μｇを、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）３００μＬに溶解後、ＤＭＳＯに溶解したＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ  ＯＲＡＮＧＥ−ＮＨＳ（五稜化薬株式会社製）６０μｇを（ＤＭＳＯ量６μＬ）を加え、チューブ内で混合し、遮光しながら室温で２時間撹拌した。アミコンウルトラフィルターユニット（分画分子量３０ｋＤａ）（ミリポア社製）にて限外ろ過し、未反応のＡｃｉｄｉＦｌｕｏｒ  ＯＲＡＮＧＥ−ＮＨＳを除去することで、蛍光基修飾された（蛍光基結合型）Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ（Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯ）を得た。得られたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯは、使用直前まで−８０℃で保存した。
【０１４４】
<Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯの細胞内分布の検出>
上記で得られたＭａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯを、最終濃度７０ｎＭで、８ウェルチャンバースライド（８−ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ、Ｎｕｎｃ社製）に培養されたＭＰＳ１患者由来繊維芽細胞の培養液に添加し、２４時間後にＰＢＳで細胞を洗浄し、その後にＡＦＯの蛍光を蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で観察した。結果を図１２に示す。
結果から、細胞内に取り込まれ、酸性ｐＨオルガネラ（後期エンドソーム／リソソーム）での蛍光が観察された。一方、Ｍ６Ｐレセプターの取り込みにおける競合阻害剤である５ｍＭのマンノース６リン酸（Ｍ６Ｐ）存在下では細胞内蛍光は著しく減少していた。また、この場合に、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯは、細胞内に取り込まれず、酸性ｐＨオルガネラでの蛍光は観察されなかった。したがって、Ｍａｎ６Ｐ−ＩＤＵＡ−ＡＦＯは、繊維芽細胞表面のＭ６Ｐレセプターを介して取り込まれ、酸性を有する細胞内小器官である後期エンドソーム／リソソームまで輸送されていることが示された。
このように、蛍光基が導入されたＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を用いることによって、目的とするＭａｎ６Ｐ含有糖蛋白質の細胞内での局在や分布を容易に検出できることから、当該Ｍａｎ６Ｐ含有糖蛋白質を用いる検出方法の有効性が示された。
【０１４５】
〔実施例２〕
＜Ｍａｎ６Ｐ含有ＣＴＳＡの調製＞
【０１４６】
（ＣＴＳＡ遺伝子恒常発現ＣＨＯ細胞株の培養上清からのＣＴＳＡの精製）
組換えヒトＣＴＳＡ（組換えヒトカテプシンＡ；ＣＴＳＡ）遺伝子を恒常的に発現しているＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ＣＴＳＡ株）からＣＴＳＡタンパク質を３段階の精製法（アフィニティークロマトグラフィー→疎水性相互作用クロマトグラフィー→アフィニティークロマトグラフィー）で精製した。
【０１４７】
はじめに、ＣＨＯ／ＣＴＳＡ株の培養上清についてＣｏｎＡセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、ＣＴＳＡタンパク質を精製した。具体的には、培養上清を集め、終濃度が１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２及びＭｎＣｌ２を培養上清に加えた。次にＣｏｎＡセファロースを結合用緩衝液［２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２（ｐＨ５．５）］で平衡化し，これに培養上清をアプライしてＣｏｎＡへの吸着を行った。素通り画分を除去した後，ＣｏｎＡ洗浄用緩衝液［２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２ （ｐＨ５．５）］を用いてＣｏｎＡセファロースの洗浄を行った。その後，溶出用緩衝液［２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５Ｍ メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ｐＨ５．５）］により溶出を行った。
【０１４８】
次に得られたＣｏｎＡカラム溶出画分をアミコンウルトラフィルターユニット３０ｋＤａカットで濃縮し、Ｂｕｔｙｌ結合用緩衝液［５０ｍＭ ＭＥＳ, １Ｍ 硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５）］に緩衝液を交換した。その後，０．２２μｍフィルターでフィルトレーションを行い，ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製)を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにて精製した。精製にはＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＵＰＣ−１０を使用し，カラムへのＣＴＳＡタンパク質吸着後に硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで連続的に変化させながら溶出した。得られたＢｕｔｙｌカラム溶出画分は、アミコンウルトラフィルターユニット３０ｋＤａカット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて、Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）結合用緩衝液［１００ｍＭ トリス−酢酸緩衝液 （ｐＨ７．５）］に緩衝液を交換した。
【０１４９】
その後，Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）アガロース（Ｗａｋｏ社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）アガロースを結合用緩衝液［１００ｍＭ トリス−酢酸緩衝液 （ｐＨ７．５）］で平衡化し，これにサンプルをアプライしてＰｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）アガロースへの吸着を行った。素通り画分を除去した後，Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）洗浄用緩衝液［１００ｍＭ トリス−酢酸緩衝液 （ｐＨ７．５）］を用いてＰｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）アガロースの洗浄を行った。その後，溶出用緩衝液［２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）］によりＣＴＳＡの溶出を行った。
【０１５０】
（エンド酵素によるＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ（糖鎖受容体）の調製）
糖鎖受容体は、上記により得られたＣＴＳＡについて、エンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｈｆ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、マンノース数が５以上のＮ結合型糖鎖のキトビオース構造を加水分解することにより調製した。６０μｇのＣＴＳＡと１２０ＵのＥｎｄｏ−Ｈｆとを５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）の緩衝液２００μＬに溶解し，４℃で４８ｈインキュベートした。反応後、ＭＢＰトラップカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、Ｅｎｄｏ−Ｈｆを吸着除去した。具体的には反応溶液について、アミコンウルトラフィルターユニット１０ｋＤａカット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌに緩衝液を交換した。その後，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）でフィルトレーションを行い，２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＭＢＰトラップカラム１ｍＬに対して反応溶液を加えて、Ｅｎｄｏ−ＨｆをＭＢＰトラップカラムに吸着させた。素通り画分を回収し、さらに２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ  ２ｍＬを、ＭＢＰトラップカラムに加えて素通り画分を洗い出した。素通り画分はアミコンウルトラフィルターユニット１０ｋＤａカット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液を交換した。得られた画分をＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ（糖鎖受容体）とした。
【０１５１】
（エンドＭ変異体による糖鎖転移反応）
糖鎖受容体として、前記のＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ、糖鎖供与体として、前記の化合物１２、糖鎖転移酵素として、エンドＭ変異体（グライコシンターゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍ−Ｎ１７５Ｑ）、東京化成工業社製；製品コードＧ０３６５）を、６０μＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解して下記の条件にて糖鎖転移反応を行った。
〈条件〉
・糖鎖供与体：化合物１２・・・２００ｎｍｏｌ
・糖鎖受容体：ＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡ・・・２００ｐｍｏｌ
・糖鎖転移酵素：グライコシンターゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍ−Ｎ１７５Ｑ）・・・２ｍＵ
・糖鎖受容体（Ａ）に対する糖鎖供与体（Ｄ）のモル比（Ｄ／Ａ）：１０００
・反応温度：３０℃
・反応時間：２４ｈ
【０１５２】
上記の反応後の溶液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルのＣＢＢ染色を行った結果を図１３Ａに示し、さらにレクチン（Ｄｏｍ９−Ｈｉｓ（Ａｋｅｂｏｓｈｉ  Ｈ．らの文献、Glycobiology(2009)19(9):1002-1009を参照））を１次プローブとしてレクチンブロットを行った結果を図１３Ｂに示す。なお図１３Ａ及びＢ中のレーン１はＣＴＳＡを含む試料の結果であり、レーン２は、ＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡを含む試料の結果であり、レーン３は、糖鎖転移反応後の結果である。
図１３Ａの結果から、レーン２のバンドがレーン１のバンドよりも低分子量側に現れていることから、上記のＥｎｄｏ−Ｈｆの処理によって、ＣＴＳＡからＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡが得られていることが示された。次にレーン３に示すように、エンドＭ変異体（Ｅｎｄｏ−Ｍ（Ｎ１７５Ｑ）を用いて糖転移反応を行った後は、レーン３のバンドがレーン２のバンドよりも高分子量側に現れた。したがって、糖鎖受容体であるＧｌｃＮＡｃ−ＣＴＳＡに糖転移反応が起こり、末端Ｍａｎ６Ｐ含有Ｎ型糖鎖が１〜２本結合した糖鎖転移後生成物が得られたことが示された。
また、図１３Ｂの結果から、図１３Ｂのレーン２において消失した発光シグナルが、レーン３において新たに得られることから、糖鎖供与体中のＭａｎ６Ｐを含む糖鎖が、糖鎖受容体に糖鎖転移したことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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