(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、多価不飽和脂肪酸を合成する活性が向上した多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼを提供すること、また、該多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼを用いた効率的な多価不飽和脂肪酸の製造法を提供することにある。【解決手段】  本発明によれば、多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼのアシルキャリアー蛋白質ドメインの数を増加させることにより、多価不飽和脂肪酸を合成する活性を向上させることができる。また、該多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼを用いることにより、効率的に多価不飽和脂肪酸を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価不飽和脂肪酸（以下、PUFAという。）を合成する活性（以下、PUFA-PKS活性という。）を有する、アシルキャリアー蛋白質（以下、ACPという。）ドメイン、β-ケトアシル-アシルキャリアー蛋白質シンターゼ（以下、KSという。）ドメイン、及びケトレダクターゼ（以下、KRという。）ドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体。
【請求項２】
ACPドメインの数が、元となる蛋白質複合体のACPドメイン数より１〜１０多い請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
【請求項３】
元となる蛋白質複合体のACPドメイン領域に、直列的にACPドメインが連結されている、請求項１又は２に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
【請求項４】
ACPドメイン、KSドメイン、KRドメイン、鎖伸長因子ドメイン、デヒドラターゼドメイン、エノイルレダクターゼドメイン、アシル転移酵素ドメイン、マロニル-CoA:ACPアシル転移酵素ドメイン及びホスホパンテテイン転移酵素から構成される請求項１〜３のいずれか１項に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
【請求項５】
PUFAが、ドコサヘキサエン酸（以下、DHAという。）、エイコサペンタエン酸（以下、EPAという。）、ドコサペンタエン酸（以下、DPAという。）、又はアラキドン酸（以下、ARAという。）である請求項１〜４のいずれか１項に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
【請求項６】
元となる蛋白質複合体が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を含有することを特徴とする請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１］配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［２］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［３］配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［４］配列番号４２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号４２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
【請求項７】
以下の［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質を含有する請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［５］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［６］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［７］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［８］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［９］配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１０］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１１］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１２］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
【請求項８】
元の蛋白質複合体が、以下の［１３］〜［１６］のいずれかに記載の蛋白質複合体である請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１３］請求項６［１］に記載の蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１４］請求項６［２］に記載の蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１５］請求項６［３］に記載の蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１６］請求項６［４］に記載の蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
【請求項９】
以下の［１７］〜［２４］のいずれかである請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１７］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１８］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１９］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２０］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２１］配列番号３０表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２２］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２３］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２４］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
【請求項１０】
以下の［２５］〜［３４］のいずれかに記載のDNA。
［２５］請求項１〜６のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
［２６］請求項７［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
［２７］配列番号３で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号３で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２８］配列番号５で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２９］配列番号１５で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号１５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３０］配列番号１７で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号１７で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３１］配列番号２９で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号２９で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３２］配列番号３１で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号３１で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３３］配列番号４３で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号４３で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３４］配列番号４５で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号４５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
【請求項１１】
以下の［３５］〜［４３］のいずれかに記載のDNA群。
［３５］請求項１０［２５］のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
［３６］請求項７［５］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［２７］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３７］請求項７［６］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［２８］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３８］請求項７［７］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［２９］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３９］請求項７［８］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［３０］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４０］請求項７［９］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［３１］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４１］請求項７［１０］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［３２］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４２］請求項７［１１］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［３３］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４３］請求項７［１２］の蛋白質をコードするDNA、又は請求項１０［３４］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を生産する微生物。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載のDNAを有する微生物。
【請求項１４】
微生物が、さらに、当該微生物が元来保有するアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下、又は喪失した微生物である、請求項１２又は１３に記載の微生物。
【請求項１５】
微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA、又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA、又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA、又はPUFA含有組成物の製造方法。
【請求項１７】
PUFAが、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAである、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸を合成する活性が向上した多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ、該酵素をコードするDNA、該DNAで形質転換した微生物、該微生物を利用した多価不飽和脂肪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドコサヘキサエン酸(以下、DHAという。)、エイコサペンタエン酸(以下、EPAという。)、アラキドン酸(以下、ARAという。)、ドコサペンタエン酸（以下、DPAという。）などの多価不飽和脂肪酸(以下、PUFAという。)は、不飽和結合を複数有する脂肪酸であり、様々な生理機能が知られている。
PUFAの生合成経路としては、好気経路と、多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ（以下、PUFA-PKSという。）による経路の二種類が知られている。好気経路は、脂肪酸合成酵素によって合成されたパルミチン酸などの長鎖脂肪酸に、複数の不飽和化酵素、鎖伸長酵素が作用することで、二重結合の導入、炭素鎖の伸長がなされてPUFAが合成される経路で、古くから多くの生物で知られている合成経路である(非特許文献1)。一方、PUFA-PKSは、アセチルCoAを出発物質としてPUFAを合成する酵素であり、一部の海洋性細菌やラビリンチュラ類真核生物に存在することが示されている(非特許文献2、 非特許文献3)。
【０００３】
PUFA-PKSは、ポリケチドシンターゼと類似の構造からなり、3つ又は4つの蛋白質から構成される蛋白質複合体である。各蛋白質には、PUFAの合成に関わる複数の機能ドメインが存在している。例えば脂肪酸の蛋白質への保持に関わるアシルキャリアー蛋白質(以下、ACPという。)ドメイン、マロニルACPとアシルACPの縮合に関わるβ-ケトアシル-アシルキャリアー蛋白質シンターゼ（以下、KSという。）ドメイン、縮合により生成するケト基を還元するケトレダクターゼ（以下、KRという。）ドメインなどが挙げられる。これらの機能ドメインは、PUFAの合成に必須のものであり、これらの一部を欠く複合酵素では、所望の活性を得ることが出来ないことが知られている(非特許文献4)。
【０００４】
ACPドメインは、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能する、典型的には80個から100個のアミノ酸残基からなる低分子ポリペプチドである。PUFA-PKSには、一般的に4個から多い時には10個ものACPドメインがタンデムに並んだ構造が存在している。この構造は、一般的に１つのACPドメインが反応の場となる他のポリケチドシンターゼや脂肪酸合成酵素とは異なる、PUFA-PKSの特徴である。
【０００５】
これまでに、Shewanella属の細菌やストラメノパイル類の真核生物からPUFA-PKSをコードする遺伝子をクローニングし、異種生物で発現させ、PUFAを生産する検討がなされている(非特許文献2、非特許文献5)。このうち、Shewanella oneidensis MR-1由来のPUFA-PKSは、EpaA、EpaB、EpaC、EpaDの4つの蛋白質からなり、さらに、EpaE遺伝子にコードされたホスホパンテテイン転移酵素がACPドメインを活性化することが知られている(非特許文献6)。このPUFA-PKSは、EPAを生産することが確認されている。
【０００６】
また、ストラメノパイル類の真核生物であるSchizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSは、OrfA、OrfB、OrfCの3つの蛋白質からなる(非特許文献2)。ホスホパンテテイン転移酵素は知られていないものの、シアノバクテリアであるAnabaena（Nostoc） sp. PCC7120由来のHetIが、OrfAのACPドメインを活性化することが知られている(非特許文献5)。
PUFAは生体において様々な重要な役割を果たしているため、PUFA-PKS活性が向上したPUFA-PKSを取得することが出来れば、微生物や油料種子植物などの生物を用いて、PUFAを効率的かつ効果的に生産させることができ、有用である。しかしながら、これまでに知られているPUFA-PKSはその活性が十分ではなく、より高い活性を有する酵素が求められていた。
【０００７】
このような背景のもと、発明者らは、PUFA-PKSのACPドメインの数を増加させることにより、PUFA-PKS活性が大幅に増強することを見出し、本願発明を完成させるに至った。ACPドメインはその数がPUFA-PKS活性の強さに影響することが報告されているが（非特許文献7)、非特許文献7では、ACPドメインが1個又は2個少ない変異型酵素のPUFA-PKS活性が、野生型酵素のそれと比較してわずかな減少であるのに対し、3個以上少ない変異型酵素のPUFA-PKS活性は、顕著に減少することが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ann. Rev. Biochem., Vol. 52, p537, 1983
【非特許文献２】Science, Vol. 293, p290, 2001
【非特許文献３】PLoS One, Vol. 6, e20146, 2011
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., Vol. 73, p665, 2007
【非特許文献５】Plant Physiol. and Biochem., Vol. 47, p472, 2009
【非特許文献６】Biotechnol. Bioprocess Eng., Vol. 11, p510, 2006
【非特許文献７】Methods Enzymol., Vol. 459, p79, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、高活性型のPUFA-PKS、該酵素をコードするDNA、該DNAで形質転換した微生物、該微生物を用いた発酵法によるPUFAの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）多価不飽和脂肪酸（以下、PUFAという。）を合成する活性（以下、PUFA-PKS活性という。）を有する、アシルキャリアー蛋白質（以下、ACPという。）ドメイン、β-ケトアシル-アシルキャリアー蛋白質シンターゼ（以下、KSという。）ドメイン、及びケトレダクターゼ（以下、KRという。）ドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体。
（２）ACPドメインの数が、元となる蛋白質複合体のACPドメイン数より１〜１０多い上記（１）に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
（３）元となる蛋白質複合体のACPドメイン領域に、直列的にACPドメインが連結されている、上記（１）又は（２）に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
（４）ACPドメイン、KSドメイン、KRドメイン、鎖伸長因子ドメイン、デヒドラターゼドメイン、エノイルレダクターゼドメイン、アシル転移酵素ドメイン、マロニル-CoA:ACPアシル転移酵素ドメイン及びホスホパンテテイン転移酵素から構成される上記（１）〜（３）のいずれか１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
（５）PUFAが、ドコサヘキサエン酸（以下、DHAという。）、エイコサペンタエン酸（以下、EPAという。）、ドコサペンタエン酸（以下、DPAという。）、又はアラキドン酸（以下、ARAという。）である上記（１）〜（４）のいずれか１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
（６）元となる蛋白質複合体が、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を含有することを特徴とする上記（１）に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１］配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［２］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号１４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［３］配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号２８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
［４］配列番号４２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、又は配列番号４２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質
（７）以下の［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質を含有する上記（１）に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［５］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［６］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［７］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［８］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［９］配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１０］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１１］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［１２］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
（８）元の蛋白質複合体が、以下の［１３］〜［１６］のいずれかに記載の蛋白質複合体である請求項１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１３］上記（６）［１］に記載の蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１４］上記（６）［２］に記載の蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１５］上記（６）［３］に記載の蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１６］上記（６）［４］に記載の蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
（９）以下の［１７］〜［２４］のいずれかである上記（１）に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体。
［１７］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１８］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１９］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２０］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２１］配列番号３０表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２２］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２３］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２４］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
（１０）以下の［２５］〜［３４］のいずれかに記載のDNA。
［２５］上記（１）〜（６）のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
［２６］上記（７）［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
［２７］配列番号３で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号３で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２８］配列番号５で表わされる塩基配列を含むDNA、又は配列番号５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２９］配列番号１５で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号１５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３０］配列番号１７で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号１７で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３１］配列番号２９で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号２９で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３２］配列番号３１で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号３１で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３３］配列番号４３で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号４３で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３４］配列番号４５で表される塩基配列を含むDNA、又は配列番号４５で表わされる塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
（１１）以下の［３５］〜［４３］のいずれかに記載のDNA群。
［３５］上記（１０）［２５］のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
［３６］上記（７）［５］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［２７］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３７］上記（７）［６］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［２８］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３８］上記（７）［７］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［２９］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３９］上記（７）［８］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［３０］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４０］上記（７）［９］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［３１］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４１］上記（７）［１０］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［３２］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４２］上記（７）［１１］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［３３］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４３］上記（７）［１２］の蛋白質をコードするDNA、又は上記（１０）［３４］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
（１２）上記（１）〜（９）のいずれか１に記載のACPドメイン増加型蛋白質複合体を生産する微生物。
（１３）上記（１０）又は（１１）に記載のDNAを有する微生物。
（１４）微生物が、さらに、当該微生物が元来保有するアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下、又は喪失した微生物である、上記（１２）又は（１３）に記載の微生物。
（１５）微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１２）〜（１４）のいずれか１に記載の微生物。
（１６）上記（１２）〜（１５）のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA、又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA、又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA、又はPUFA含有組成物の製造方法。
（１７）PUFAが、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAである、上記（１６）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高活性型のPUFA-PKS、該酵素をコードするDNA、該DNAで形質転換した微生物、該微生物を用いた発酵法によるPUFAの製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Shizochytorium sp. ATCC2088及びShewanella oneidensis MR-1が有するPUFA-PKSのドメイン構造を表わす。ACP : acyl carrier protein (アシルキャリアープロテイン)ドメイン、AT : acyltransferase (アシルトランスフェラーゼ、アシル転移酵素)ドメイン、CLF : chain length factor (鎖伸長因子)ドメイン、DH : dehydratase (デヒドラターゼ、脱水酵素)ドメイン、ER : enoyl reductase (エノイルレダクターゼ、エノイル還元酵素)ドメイン、KR : ketoreductase (ケトレダクターゼ、ケト還元酵素)ドメイン、 KS : 3-ketoacyl synthase (3-ケトアシル合成酵素)ドメイン、 MAT : malonyl-CoA:ACP acyltransferase (マロニル-CoA:ACPアシル転移酵素)ドメイン
【発明を実施するための形態】
【００１３】
1 本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体
1.1 本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の例-１
本発明は、PUFA-PKS活性を有する、ACPドメイン、KSドメイン、及びKRドメインを含む蛋白質複合体において、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメイン増加型蛋白質複合体（以下、本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体という。）に関する。
【００１４】
PUFA-PKS活性とは、アセチルCoAを出発物質としてPUFAを合成する活性のことをいい、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体は、PUFA-PKSともいう。
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体が合成するPUFAとしては、PUFA １分子が有する炭素原子の数が18〜30個、好ましくは、19〜23個、より好ましくは20〜22個であり、かつ、１分子中に2〜10個、好ましくは3〜8個、より好ましくは4〜6個の二重結合を有するPUFAを、好ましくは、DHA、EPA、DPA及びARAからなる群より選ばれるPUFAを、より好ましくはDHA又はEPAを挙げることができる。
【００１５】
本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体がPUFA-PKS活性を有することは、後述の５に記載の方法により、本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体をコードするDNAで形質転換した微生物を造成し、６に記載の方法により、該微生物を培地に培養し、培養物中にPUFAを生成、蓄積させ、該培養物中に蓄積したPUFAを、ガスクロマトグラフィーで測定することにより、確認することができる。
【００１６】
ACPドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能する、PUFA-PKS活性に必須のドメインをいう。
ＫＳドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、マロニルACPとアシルACPの縮合に関わるドメインをいう。
【００１７】
ＫＲドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、縮合により生成するケト基の還元に関わるドメインをいう。
ドメインとは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
本明細書において「元となる蛋白質複合体」とは、本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体において、ＡＣＰドメインを増加させる前の蛋白質複合体のことをいう。
【００１８】
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体において、元となる蛋白質複合体と比較して増加しているＡＣＰドメインの数としては、１〜１０、好ましくは１〜７、より好ましくは１〜４、最も好ましくは１〜２を挙げることができる。
ACPドメインの数は、元となる蛋白質複合体をコードするDNAに、後述の４に記載の方法でACPドメインをコードするDNAを挿入することによって増加させることができる。ACPドメインをコードするDNAを挿入する部位としては、該蛋白質複合体が元来有する活性を消失させない部位であれば、いずれの部位に挿入してもよいが、例えば、該蛋白質複合体のACPドメイン領域に直列的に連結する部位を挙げることができる。
【００１９】
ＡＣＰドメイン領域とは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質において、複数のＡＣＰドメインが連続して存在する領域のことをいう。
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体において、元となる蛋白質複合体と比べてACPドメインが増加していることは、後述の４に記載の方法により、本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列を取得し、元となる蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列と比較することにより、増加した塩基配列を取得し、当該増加した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列をクエリーとして、元となる蛋白質複合体うちＡＣＰドメインを有する蛋白質のACPドメインに対して相同性検索をした結果、少なくとも95%以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有することにより、確認することができる。
【００２０】
塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)］やFASTA［Methods Enzymol., 183, 63 (1990)］を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２１】
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体は、ＡＣＰドメイン、ＫＳドメイン、ＫＲドメインに加え、さらに、鎖伸長因子ドメイン、デヒドラターゼドメイン、エノイルレダクダーゼドメイン、アシル転移酵素ドメイン、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシル転移酵素ドメイン及びホスホパンテテイン転移酵素を含んでいてもよい。
鎖伸長因子ドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、炭素鎖の伸長に関わるドメインのことをいう。
【００２２】
デヒドラターゼドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ケトン基を還元することによって生じた水酸基の脱水に関わるドメインをのことをいう。
エノイルレダクダーゼドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、生じた二重結合の還元に関わるドメインのことをいう。
【００２３】
アシル転移酵素ドメイン、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシル転移酵素ドメインとは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
ホスホパンテテイン転移酵素とは、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体を構成する酵素であり、ACPドメインの活性化に関わる酵素のことをいう。
【００２４】
本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体及び元となる蛋白質複合体を構成する蛋白質は、当該蛋白質複合体が、PUFA-PKS活性を有する限りにおいて、相互に物理的に結合していてもよく、分離していてもよい。
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体としては、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体であれば野生型及び変異型のPUFA-PKS活性を有する蛋白質のいすれのものでもよいが、PUFA-PKS活性を元来有する微生物が有するPUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体、以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質を含有する蛋白質複合体、及び、以下の［１３］〜［１６］のいずれかに記載の蛋白質複合体を挙げることができる。
［１］配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
［２］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号２８で表されるアミノ酸において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
［４］配列番号４２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する変異蛋白質
［１３］上記［１］に記載の蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１４］上記［２］に記載の蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１５］上記［３］に記載の蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１６］上記［４］に記載の蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2910アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1102〜1204残基、1205〜1313残基、1314〜1424残基、1425〜1535残基、1536〜1651残基、1652〜1762残基、1763〜1866残基、1867〜1977残基、及び1978〜2081残基の領域にＡＣＰドメインを有する。
【００２５】
配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2531アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1223〜1327残基、1328〜1438残基、1439〜1514残基、及び1515〜1616残基の領域にＡＣＰドメインを有する。
配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1556アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1127〜1204残基、1205〜1318残基、1319〜1430残基、及び1431〜1544残基の領域にＡＣＰドメインを有する。
【００２６】
配列番号４２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1732アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列としてN末端側から、1254〜1330残基、1331〜1432残基、1433〜1533残基、1534〜1634残基、及び1635〜1740残基の領域にＡＣＰドメインを有する。
上記［１］〜［４］に記載の蛋白質を有する蛋白質複合体において、該蛋白質以外の、蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、上記［１］〜［４］に記載の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、具体的には、上記［１］に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１３］に記載の、［１］に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記［２］に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１４］に記載の、［２］に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記［３］に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１５］に記載の、［３］に記載の蛋白質以外の蛋白質を、上記［４］に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１６］に記載の、［４］に記載の蛋白質以外の蛋白質を、それぞれ挙げることができる。
【００２７】
上記［１３］〜［１６］に記載の蛋白質複合体において、各蛋白質複合体に含まれる蛋白質のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質以外の蛋白質としては、該蛋白質に代えて、それぞれの該蛋白質が有するアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、該蛋白質が有するアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する変異蛋白質を用いてもよい。
【００２８】
相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造及び機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
変異型蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
【００２９】
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。
【００３０】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群：アスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フェニルアラニン、チロシン
本明細書において「協働する」とは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書では、PUFA-PKS活性に必要な複数の蛋白質を共存させたとき、他の蛋白質と一体となってPUFA-PKS活性を示すことをいう。
【００３１】
PUFA-PKS活性を元来有する微生物としては、シュワネラ属（Shewanella）、コルウェリア属（Colwellia）、デサルファチバチルム属（Desulfatibacillum）、サイクロフレクサス属（Psychroflexus）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、ノストック属（Nostoc）、ミクロシスティス属（Microcystis）、サッカロポリスポラ属（Saccharopolyspora）、ジオバクター属（Geobacter）、プランクトマイセス属（Planctomyces）、デサルフォコッカス属（Desulfococcus）、ソランギウム属（Sorangium）、レニバクテリウム属（Renibacterium）、チチノファガ属（Chitinophaga）、グレオバクター属（Gleobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ソリバクター属（Solibacter）、デサルフォバクテリウム属（Desulfobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium）、ウルケニア属（Ulkenia）、ジャポノチトリウム属（Japonochytrium）、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）、モリテラ属（Moritella）、オーレオスピラ属（Aureispira）からなる群より選ばれる属に属する微生物を、好ましくは、Shewanella pealeana ATCC700345、Shewanella oneidensis MR-1、Colwellia psychrerythraea 34H、Desulfatibacillium alkenivorans AK-01、Psychroflexus torquis ATCC700755、Schizochytrium sp. ATCC 20888、Nostoc punctiforme PCC73102、Nostoc sp. PCC7120、Microcystis aeruginosa NITES-843、Saccharopolyspora erythraea NRRL2338、Geobacter bemidjiensis Bem、Planctomyces limnophilus DSM3776、Desufococcus oleovorans Hxd3、Sorangium cellulosum ‘So ce 56’、Renibacterium salmoninarum ATCC33209、Chitinophaga pinensis DSM2588、Gloeobacter violaceus PCC7421、Azotobacter vinelandii DJ、Rhodococcus erythrophicum HRM2、Clostridium thermocellum ATCC 27405、Schizochytrium minutum、Schizochytrium sp. S31 ATCC20888、Schizochytrium sp. S8 ATCC20889、Schizochytrium sp. LC-RM ATCC18915、Schizochytrium sp. SR21、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Schizochytrium limacinum IF0 32693、Thraustochytrium sp. 23B ATCC20891、Thraustochytrium striatum ATCC24473、Thraustochytrium aureum ATCC34304、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Ulkenia sp. BP-5601、Aureispira marina JCM23201、Moritella marina MP-1及びJaponochytrium sp. L1 ATCC28207からなる群より選ばれる微生物を、最も好ましくは、Shewanella peapeana ATCC700345、Shewanella oneidensis MR-1、Colwellia psychrerythraea 34H、Moritella marina MP-1、Schizochytrium sp. ATCC20888、Aureispira marina JCM23201、Nostoc sp. PCC7120からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる（FEMS Microbiol. Lett. (2009), Vol. 295, p170-176、PLos ONE (2011), Vol. 6(5), art. no. e20146）。
【００３２】
PUFA-PKS活性を元来有する微生物が有する、PUFA-PKS活性を有する蛋白質複合体としては、例えば、配列番号２、８、１０、及び１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体、配列番号１４、２０、２２、２４、 及び２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体、配列番号２８、３４、３６、３８、及び４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体、並びに、配列番号４２、４８、５０、５２、及び５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体等を挙げることができる。
1.2 本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の例-２
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の例としては、以下の［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質を含有するＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体、及び、以下の［１７］〜［２４］のいずれかに記載のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体を、好ましくは、以下の［１７］〜［２４］のいずれかに記載のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体を挙げることができる。
［５］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［６］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［７］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号１６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［８］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［９］配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３０で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号３０で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［１０］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号３２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［１１］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号４４で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［１２］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質、又は、配列番号４６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質
［１７］配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１８］配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［１９］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２０］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２１］配列番号３０表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２２］配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２３］配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
［２４］配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質からなる蛋白質複合体
配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ5個又は6個のACPドメインが存在する。
【００３３】
配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は3019アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1102〜1204残基、1205〜1313残基、1314〜1424残基、1425〜1535残基、1536〜1651残基、1652〜1762残基、1763〜1866残基、1867〜1977残基、1978〜2081残基、及び2082〜2195残基にACPドメインを有する。
配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は3135アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1102〜1204残基、1205〜1313残基、1314〜1424残基、1425〜1535残基、1536〜1651残基、1652〜1762残基、1763〜1866残基、1867〜1977残基、1978〜2081残基、2082〜2195残基、及び2196〜2306残基にACPドメインを有する。
【００３４】
配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ5個又は6個のACPドメインが存在する。
配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2639アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1223〜1327残基、1328〜1430残基、1431〜1541残基、1542〜1617残基、及び1618〜1719残基にACPドメインを有する。
【００３５】
配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2748アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1223〜1327残基、1328〜1430残基、1431〜1541残基、1534〜1644残基、1615〜1720残基、及び1721〜1822残基にACPドメインを有する。
配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ5個又は6個のACPドメインが存在する。
【００３６】
配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1670アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1127〜1204残基、1205〜1318残基、1319〜1430残基、1431〜1544残基、及び1545〜1658残基にACPドメインを有する。
配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は1784アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1127〜1204残基、1205〜1318残基、1319〜1430残基、1431〜1544残基、1545〜1658残基、及び1659〜1772残基にACPドメインを有する。
【００３７】
配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質には、それぞれ6個又は7個のACPドメインが存在する。
配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2754アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1254〜1330残基、1331〜1432残基、1433〜1533残基、1534〜1634残基、1635〜1740残基、及び1741〜1842残基にACPドメインを有する。
【００３８】
配列番号４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質は2856アミノ酸残基からなる蛋白質であり、N末端側から、1254〜1330残基、1331〜1432残基、1433〜1533残基、1534〜1634残基、1635〜1740残基、1741〜1842残基、及び1843〜1944残基にACPドメインを有する。
上記［５］〜［１２］に記載の蛋白質を有する本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体において、該蛋白質以外の、本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、上記［５］〜［１２］に記載の蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、具体的には、上記［５］及び[６]に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１７］及び[１８]に記載の、配列番号４及び６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記［７］及び[８]に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［１９］及び[２０]に記載の、配列番号１６及び１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記［９］及び[１０]に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［２１］及び[２２]に記載の、配列番号３０及び３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、上記［１１］及び[１２]に記載の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質としては、上記［２３］及び[２４]に記載の、配列番号４４及び４６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質以外の蛋白質を、それぞれ挙げることができる。
【００３９】
上記［１７］〜［２４］に記載の蛋白質複合体において、各蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質としては、それぞれの該蛋白質に代えて、それぞれの該蛋白質が有するアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する蛋白質、又は、該蛋白質が有するアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する蛋白質を用いてもよい。
【００４０】
上記［１７］〜［２４］に記載の蛋白質複合体において、各蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質以外の蛋白質としては、それぞれの該蛋白質に代えて、それぞれの該蛋白蛋白質が有するアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する相同蛋白質、又は、該蛋白質が有するアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、該蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する変異蛋白質を用いてもよい。
【００４１】
相同蛋白質及び変異蛋白質に関する記載は上記と同じである。
２．本発明のＤＮＡ
本発明は、本発明のＡＣＰ増加型蛋白質複合体をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡという。）を含む。
本発明のＤＮＡは、複数のＤＮＡから構成されるＤＮＡ群であってもよい。
2.1 本発明のDNAの例-１
本発明のＤＮＡとしては、以下の［２５］〜［３４］のいずれかに記載のＤＮＡを挙げることができる。
［２５］上記（１）〜（６）のいずれかに記載される、元となる蛋白質複合体に含有されるACPドメインと同一のACPドメインを、元となる該蛋白質複合体に含有されるACPドメイン数より多く保有するACPドメインを有する蛋白質をコードするDNA
［２６］上記［５］〜［１２］のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
［２７］配列番号３で表わされる塩基配列を含むDNA、配列番号３で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２８］配列番号５で表わされる塩基配列を含むDNA、配列番号５で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基酸配列からなり、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、及び配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［２９］配列番号１５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号１５で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号１５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３０］配列番号１７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号１７で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号１７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３１］配列番号２９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２９で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号２９で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３２］配列番号３１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３１で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号３１で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号３８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号４０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３３］配列番号４３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４３で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号４３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
［３４］配列番号４５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４５で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA、又は、配列番号４５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、配列番号４８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質及び配列番号５４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNA
上記において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNA又は該DNAの一部がハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNA又は該DNAの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAを挙げることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAを挙げることができる。
【００４２】
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば、モレキュラー・クローニング第4版（2012年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994)、Immunology methods manual, Academic press (Molecular)に記載の他、他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４３】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラべリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等を挙げることができる。
【００４４】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC (750 mMの塩化ナトリウム、75 mMのクエン酸ナトリウム)、50 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、及び20μg/Lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中において42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００４５】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング溶液を添加、又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLAST及びFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、元となる塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、もっとも好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
2.2 本発明のDNAの例-２
本発明のＤＮＡとしては、さらに、以下の［３５］〜［４３］のいずれかに記載のＤＮＡ群を挙げることができる。
［３５］上記［２５］のDNA、及び該DNAにコードされる蛋白質と協働してPUFA-PKS活性を有する蛋白質をコードするDNAを含むDNA群
［３６］上記［５］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［２７］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３７］上記［６］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［２８］のDNA、並びに配列番号７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号９で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号１１で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３８］上記［７］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［２９］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［３９］上記［８］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［３０］のDNA、並びに配列番号１９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２１で表される塩基配列を含むDNA、配列番号２３で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号２５で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４０］上記［９］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［３１］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４１］上記［１０］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［３２］のDNA、並びに配列番号３３で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３５で表される塩基配列を含むDNA、配列番号３７で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号３９で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４２］上記［１１］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［３３］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
［４３］上記［１２］の蛋白質をコードするDNA、又は上記［３４］のDNA、並びに配列番号４７で表される塩基配列を含むDNA、配列番号４９で表される塩基配列を含むDNA、配列番号５１で表される塩基配列を含むDNA、及び配列番号５３で表される塩基配列を含むDNAからなるDNA群
上記［３６］〜［４３］に記載のＤＮＡ群において、各ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡのうち、ＡＣＰドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡ以外のＤＮＡとしては、該ＤＮＡに代えて、該ＤＮＡが有する塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、該ＤＮＡがコードする蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該ＤＮＡがコードする蛋白質と複合体を構成する他の蛋白質と協働してＰＵＦA-PKS活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００４６】
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は上記と同じである。
2.3 本発明のDNAを有する組換え体DNA
本発明のDNAには、上記の本発明のDNAを有する組換え体DNAを含む。
該組換え体DNAは、本発明のDNAが、宿主生物において自律複製可能又は染色体中への組み込みが可能で、該DNAを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体DNAである。
【００４７】
宿主生物については、下記3に後述する。
宿主生物に細菌などの原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体DNAは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の本発明のDNA、及び転写終結配列により構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４８】
リボソーム結合領域であるシャイン‐ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体DNAにおいては、該DNAの発現に転写終結因子は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pColdI（タカラバイオ社製）、pET21a、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロエジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pTrc99A (ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200［Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)］、pLSA1［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、pGEL1［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)］、pBluescriptII SK（+）、pBluescriptII KS（-）（ストラタジーン社製）、pTrS30［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30（Ferm BP-5407）より調整］、pTrS32［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32（Ferm BP-5408）より調整］、pTK31［APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、2007、Vol. 73、No. 20、p6378-6385］、pPAC31（WO98/12343）、pUC19［Gene,33 ,103（1985）］、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pHSG298（タカラバイオ社製）、pUC18（タカラバイオ社製）、等を挙げることができる。
【００４９】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター、T7プロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ptrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
【００５０】
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53［いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175（1984）］等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでよいが、例えば、P54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679（2000）］を用いることができる。
【００５１】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp51（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
3. 本発明の微生物  
本発明は、上記2に記載の、本発明のDNAで親株を形質転換して得られる微生物（以下、本発明の微生物という。）を含む。また、本発明の微生物は、さらに、該親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失していてもよい。
【００５２】
親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元の微生物のことをいいう。
親株はいずれの微生物であってもよいが、例えば、任意の細菌、原生生物、微細藻類、真菌、原生動物を挙げることができる。
特に微細藻類としては、ヤブレツボカビ目の微生物を挙げることができる。ヤブレツボカビ目の微生物としては、スラウストキトリウム属、ラビリンチュロイデス属、ジャポノチトリウム属、シゾキトリウム属、オーランチオキトリウム属からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる。
【００５３】
これらの属内の好ましい種は、限定されるものではないが、シゾキトリウム・ミヌツム（Schizochytrium minutum）、シゾキトリウム・エスピー（S31）（ATCC 20888）、シゾキトリウム・エスピー（S8）（ATCC20889）、シゾキトリウム・エスピー（LC-RM）（ATCC18915）、シゾキトリウム・エスピー（SR21）、シゾキトリウム・アグレガツム（Goldstein及びBelsky）（ATCC28209）、シゾキトリウム・リマシナム（Honda及びYokochi）（IF0 32693）、スラウストキトリム・ストリアツム（Schneider）（ATCC24473）、スラウストキトリウム・オーレウム（Goldstein）（ATCC34304）、ストラウストキトリウム・ローゼウム（Golden）（ATCC28210）、ウルケニア・エスピーBP-5601、ジャポノチトリウム・エスピー（L1）（ATCC28207）、及びオーランチオキトリウム・エスピー（Aurantiochytrium sp.）OH4（FERM BP-11524）を挙げることができる。
【００５４】
特に真菌としては、サッカロマイセス。セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）を含む酵母、もしくはカンジダ（Candida）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）のような他の酵母、又は他の真菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、ノイロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）のような繊維状真菌などを挙げることができる。
【００５５】
特に細菌としては、好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属、及びオーレオスピラ属からなる群より選ばれる属に属する微生物を、最も好ましくは、Escherichia coli XL-1 Blue、Escherichia coli XL-2 ble、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BLR(DE3)（ノバジェン社製）、Escherichia coli BL21 codon plus（ストラタジーン社）、Serratia ficaia、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcesscens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacuens、Brevibacterium immariophilim ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110及びAureispira marina JCM23201からなる群より選ばれる微生物を挙げることができる。
【００５６】
本発明の微生物としては、例えば、上記2.3の組換え体DNAで親株を形質転換して得られる、細胞中のアセチルCoAを出発物質としてPUFAを生産することができる微生物を、具体的には、実施例３に記載のBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA10株、及びBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA11株を、並びに、実施例６に記載のBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA5株、及びBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA6株を挙げることができる。
【００５７】
該組換え体DNAは、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されるか、又は親株のDNAに組み込まれる。
親株がPUFA-PKS活性を有する既知の蛋白質複合体をコードする遺伝子を有する場合には、本発明の微生物には、当該既知の蛋白質複合体を構成する、ACPドメインを有する蛋白質にACPドメインを挿入、付加することによって、ACPドメインの数を増加させた蛋白質を有する蛋白質複合体を有する微生物を造成することができる。ACPドメインを挿入、付加する部位としては、当該蛋白質が元来有する活性を消失させない部位であれば、当該蛋白質のいずれの部位に挿入、付加してもよいが、例えば、当該蛋白質において、元来存在するACPドメインに連続する部位を挙げることができる。
【００５８】
また、本発明の微生物は、さらに、親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失していてもよい。
アシルCoAデヒドロゲナーゼとは、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。
アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性とは、アシルCoAに二重結合を導入する活性をいう。
【００５９】
親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物としては、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型の該蛋白質をコードするDNAの塩基配列に、塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入することにより得られる、以下の（a）又は（ｂ）の微生物を挙げることができる。
(a)親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
(b)親株に比べ、該DNAの転写量又は該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
より好ましくは、該DNAの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。
【００６０】
アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAとしては、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであればいずれでもよいが、エシェリヒア属に属する微生物を親株とした場合には、例えば、以下の［４４］〜［４８］からなる群より選ばれるDNAを挙げることができる。
[４４]配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
[４５]配列番号５６で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[４６]配列番号５５で表される塩基配列からなるDNA
[４７]配列番号５５で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[４８]配列番号５５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
相同蛋白質に関する記載は、上記１．１の記載と同じである。
【００６１】
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、２．１の記載と同じである。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号５５で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００６２】
アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAは、例えば、配列番号５５で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として、後述の４に記載の方法により取得することができる。
アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAの転写量又は該蛋白質の生産量が低下又は喪失した微生物の例としては、アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。具体的には、例えば、実施例３に記載のBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA10株、及びBLR(DE)ΔfadE / pCDF-OrfB’, pCOLA Duet-OrfC, pSTV-HetI, pET21-OrfA11株を、並びに、実施例６に記載のBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA5株、及びBLR(DE3)ΔfadE / pCDF-EpaC, pColADuet-EpaD, pACYCDuet-EpaEB, pET21-EpaA6株を挙げることができる。
【００６３】
本発明の微生物が、親株の細胞中のアセチルCoAを出発基質としてPUFAを生産する能力を獲得したことを確認する方法としては、例えば、下記6の方法で該微生物を培養し、その培養物に蓄積されたPUFAをガスクロマトグラフィーで検出することにより、確認することができる。
また、上記の微生物が、親株に比べ、アシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物であることは、例えば、親株及び該微生物を、適当な脂肪酸を含む培地で培養し、培養液中の脂肪酸濃度を比較することにより確認することができる。
【００６４】
親株に比べ、アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAの転写量又は該蛋白質の生産量が低下又は喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
組換え体DNAで親株を形質転換する方法については、下記5に後述する。
4. 本発明のDNAの取得方法
本発明のＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１３、１９、２１、２３、及び２５で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはシュワネラ（Shewanella）属に属する微生物、より好ましくは、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）MR-1の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、上記微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR［PCR Protocols, Academic Press（1990）］により取得することができる。
【００６５】
シュワネラ・オネイデンシスMR-1株は、アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション（ATCC）からATCCBAA1096として取得することができる。
配列番号１３、１９、２１、２３、及び２５で表わされる塩基配列からなるDNAによりコードされる蛋白質の相同蛋白質をコードするDNAは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１３、１９、２１、２３、及び２５からなる群より選ばれる配列番号で表わされる塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号１４、２０、２２、２４、及び２６からなる群より選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブDNA又はプライマーDNA、及び当該DNAを有する微生物を用いて、上記のDNAを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
【００６６】
配列番号１３、１９、２１、２３、及び２５で表わされる塩基配列からなるDNAによりコードされる蛋白質、並びにそれらの相同蛋白質の変異型蛋白質をコードするDNAは、例えば、配列番号１３、１９、２１、２３、及び２５からなる群より選ばれる配列番号で表わされる塩基配列で表わされるDNAを鋳型としてエラープローンPCR等に供することにより取得することができる。
【００６７】
また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれ5’末端に持つ1組のPCRプライマーを用いたPCR ［Gene, 77, 51（１９８９）］によっても、上記のDNAを取得することができる。すなわち、まず、該DNAの5’端に対応するセンスプライマーと、5’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（5’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該DNAを鋳型にしてPCRを行い、該DNAの5’端から変異導入部位までの断片A（3’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、5’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（3’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該DNAの3’端に対応するアンチセンスプライマーで該DNAを鋳型にしてPCRを行い、5’端に変異が導入された該DNAの変異導入部位から3’端までの断片Bを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにPCRを行うと、増幅断片Aのセンス鎖と増幅断片Bのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてPCRの反応が進行し、変異が導入されたDNAが増幅する。
【００６８】
取得した上記のDNAは、そのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463（1977）］又は3700 DNAアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。上記の宿主細胞としては、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522、Escherichia coli BLR(DE3)等を挙げることができる。
【００６９】
上記ベクターとしては、pHSG298(タカラバイオ社製)、pUC18（タカラバイオ社製）、pBluescriptII KS（+）（ストラタジーン社製）、pDIRECT［Nucleic Acid res., 18, 6069（1990）］、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCRII（インビトロジェン社製）及びpCR-TRAP（ジーンハンター社製）等を挙げることができる。
【００７０】
組換え体DNAの導入方法としては、親株細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110（1972）］、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法［Nucleic Acid Res., 16, 6127（1988）］等を挙げることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
【００７１】
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調整することもできる。
ＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインを有する蛋白質をコードするＤＮＡは、上記で得られた、ＡＣＰドメイン増加型蛋白質複合体の元となる蛋白質複合体のうちＡＣＰドメインをコードする蛋白質をコードするＤＮＡ、その相同蛋白質をコードするDNA、又は上記で取得した変異型蛋白質をコードするDNAに、以下の方法により、ACPドメインをコードするDNAを挿入、付加することによって取得することができる。
【００７２】
挿入対象のDNAの両末端に位置する2つのDNA断片をPCRでそれぞれ増幅する。次に、ACPドメインをコードするDNAをPCRで増幅する。なお、各断片の連結部分の塩基配列が相補的となるよう、各断片を増幅するプライマーを設計する。さらに、これら3断片を等モル比で混合してPCRの鋳型として、当該3断片が連結されたときにその全体を増幅することができるプライマーを用いてPCRで増幅することにより、当該3断片が結合した目的のDNAを取得することができる。また、上記の工程を繰り返すことにより、複数のACPドメインが挿入されたDNAを取得することもできる。
【００７３】
また、ACPドメインの両末端に認識配列を有する制限酵素を用いた方法を用いてもよい。まず、ACPドメインをPCRで増幅し、ベクターにクローニングする。続いて、PCRにより、クローニングしたACPドメインをコードするDNAの片側末端に存在する、ある制限酵素（以下、制限酵素Aという。）の認識配列を、別の制限酵素（以下、制限酵素Bという。）の認識配列に変異させる。ここで、制限酵素Aの切断断片と、制限酵素Bの切断断片は、コードするアミノ酸のアミノ酸配列を変化させることなく連結でき、また、形成されたDNA断片は、制限酵素A及び制限酵素Bのいずれによっても切断されない。この性質を利用し、制限酵素A及び制限酵素Bを用い、ACPドメインをコードするDNAを段階的に挿入することで、複数のACPドメインが増加したDNAを取得することができる。
【００７４】
本発明のDNAは、配列番号１、７、９、及び１１で表わされる塩基配列を有するDNA、その相同蛋白質をコードするDNA、その変異型蛋白質をコードするDNAを、Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNA及びAnabaena（Nostoc）sp. PCC7120のゲノムDNAを用いて、上記と同様の方法により取得して、さらに、ACPドメインを増加させたDNAを、上記と同様に取得することにより、取得することができる。
【００７５】
本発明のDNAは、配列番号２７、３３、３５、３７、及び３９で表わされる塩基配列を有するDNA、その相同蛋白質をコードするDNA、その変異型蛋白質をコードするDNAを、Aureispira marina JCM23201のゲノムDNAを用いて、上記と同様の方法により取得して、さらに、ACPドメインを増加させたDNAを、上記と同様の方法により取得することにより、取得することができる。
【００７６】
また、本発明のDNAは、配列番号４１、４７、４９、５１、及び５３で表わされる塩基配列を有するDNA、その相同蛋白質をコードするDNA、その変異型蛋白質をコードするDNAを、Moritella marina MP-1のゲノムDNAを用いて、上記と同様の方法により取得して、さらに、ACPドメインを増加させたDNAを、上記と同様の方法により取得することにより、取得することができる。
【００７７】
上記で取得した本発明のDNAは、例えば、上記に記載の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明のDNA又は本発明のＤＮＡ群を有する組換え体DNAを作製することができる。
このような組換え体DNAの例としては、実施例において後述するpET21-OrfA10、pCDF-OrfB'、 pCOLADuet-OrfC、及びpSTV-HetIを、pET21-OrfA11、 pCDF-OrfB'、 pCOLADuet-OrfC、及びpSTV-HetIを、pET21-EpaA5、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、 及びpACYCDuet-EpaEBを、並びに、pET21-EpaA6、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、 及びpACYCDuet-EpaEBを挙げることができる。
5. 本発明の微生物の造成方法
本発明の微生物は、以下の方法によって造成することができる。
上記4の方法で取得することができる組換え体DNAで親株を形質転換する。
【００７８】
親株としては、エシェリヒア属に属する微生物を挙げることができる。
該組換え体DNAを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 2110（1972）］、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法［Nucleic Acid Res., 16, 6127（1988）］等の方法を挙げることができる。
【００７９】
該組換え体DNAを親株の染色体DNAに組み込む方法としては、相同組換え法を用いることができる。
相同組換え法は、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え系を利用して、組換え体DNAを導入する方法を挙げることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体DNAを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645（2000）］を挙げることができる。
【００８０】
さらに、組換え体DNAと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラ―ゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Mol. Microbiol., 55, 137（2005）、Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905（2007）］等を用いて、親株の染色体DNA上の目的の領域が組換え体DNAに置換された微生物を取得することができる。
【００８１】
上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、下記6の方法で該微生物を培養し、その培養物に蓄積されたPUFAをガスクロマトグラフィーで検出することにより、確認することができる。
また、本発明の微生物は、さらに、親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失していてもよい。
【００８２】
親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物は、例えば、本発明の微生物を親株とし、該親株のアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、又は喪失させることにより取得することができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等を挙げることができる。
【００８３】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、例えば、アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするDNAと、相同組換え法を用いて置換する方法、又は、アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAに１以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入し、上記の相同組換え法を用いて親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするDNAと置換する方法、を挙げることができる。
【００８４】
アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードするDNAに１以上の塩基の欠失、置換、挿入、又は付加を導入する方法、及び、上記の方法で調製したDNAを、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記の方法と同じである。
上記方法により取得した微生物が、親株に比べアシルCoAデヒドロゲナーゼの活性が低下又は喪失した微生物であることは、上記３の方法により確認することができる。
6. 本発明のPUFA又はPUFA含有組成物の製造方法
本発明は、上記5で造成された微生物を培地に培養し、培養物中にPUFA又はPUFA含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からPUFA又はPUFA含有組成物を採取することを特徴とする、PUFA又はPUFA含有組成物の製造方法（以下、本発明の製造方法という。）を含む。
【００８５】
PUFA、及びPUFA含有組成物に含有されるPUFAは、例えば、DHA、EPA、DPA又はARAを、好ましくはDHA又はEPAを挙げることができる。
PUFA含有組成物は、例えば、PUFA含有油脂又はPUFA含有リン脂質を、好ましくはPUFA含有油脂を挙げることができる。
該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
【００８６】
培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース等の炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地1リットル当たり20〜300gの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費しつくしたのちに、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、PUFA含有組成物の生産量を増大させることができる。
【００８７】
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素を使用することができる。
無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【００８８】
上記の各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりpHを4.0〜9.5の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
培養温度は、一般的には10〜45℃であり、好ましくは20〜37℃である。培養温度は、PUFA含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のpHは、一般的には3.5〜9.5であり、好ましくは4.5〜9.5である。特に好ましいpHは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには、pH 5.0〜8.0である。
【００８９】
培養時間は、例えば2〜7日間とすることができ、通気攪拌培養等で培養を行うことができる。
培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者により公知の常法により行うことができ、例えば、遠心分離法や濾過等により行うことができる。
上記の培養物から分離した微生物を、例えば超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、PUFA含有組成物を得ることができる。
【００９０】
上記の製造法で製造されるPUFA含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法［高橋是太郎, 油化学, 40:931-941(1991)］、又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法［高橋是太郎, 油化学, 40:931-941(1991)］等の方法により、PUFA含有組成物を濃縮して、PUFA含量が高いPUFA含有組成物を得ることができる。
PUFA含有組成物からPUFAを分離して採取することにより、PUFAを製造することができる。例えば、加水分解法によりPUFA含有組成物からPUFAを含有する混合脂肪酸を調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、PUFAを分離して採取することにより、PUFAを製造することができる。
【００９１】
また、PUFA含有組成物からPUFAアルキルエステルを分離して採取することにより、PUFAアルキルエステルを製造することができる。
PUFAアルキルエステルは、PUFAアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、PUFAエチルエステルを挙げることができる。
PUFA含有組成物からPUFAアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりPUFA含有組成物からPUFAアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法等により、PUFAアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
【００９２】
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９３】
本発明のDNAの作製-1  
大腸菌において、T7プロモーターによりSchizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSを発現させるために、以下のプラスミドを構築した。まず、常法により抽出した    Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号５７及び５８で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、Schizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSのOrfA蛋白質（配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするDNA（配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAを得た。得られたDNAを制限酵素NdeI及びEcoRIで処理し、同一の制限酵素処理を行った大腸菌ベクターpET21a (ノバジェン社製)とライゲーションすることにより、pET21-OrfA9を得た。
【００９４】
続いて、Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号５９及び６０で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、Schizochytrium sp. ATCC20888由来のPUFA-PKSのOrfB蛋白質（配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするDNA（配列番号７で表わされる塩基配列からなるDNA）の第4601位から第6180位の塩基までのDNA断片を得た。さらに、大腸菌ベクターpCDF-1b (ノバジェン社製)を鋳型に配列番号６１及び６２で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、pCDF-1bの全長DNA断片を得た。この2つのDNA断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで処理し、ライゲーション反応を行うことでpCDF-OrfBdw1.6を得た。
【００９５】
Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号６３及び６４で表わされるプライマーを用いてOrfB蛋白質をコードするDNAの第4051位から第4634位に相当する領域をPCRにて増幅した。このDNA断片を配列番号６５で表わされる、インビトロジェン社から購入した、コドンを改変したSer-rich領域を含むDNA断片 (OrfBの第4051位から第4634位に相当する) と混合し、配列番号６３及び６６で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRにて結合させた。得られたDNA断片を制限酵素NdeI及びSacIIで処理し、同様に制限酵素NdeI及びSacIIで処理したpCDF-OrfBdw1.6とライゲーションした。得られたプラスミドをpCDF-OrfB’dw2.8とした。
【００９６】
さらに、Schizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号６７及び６８で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、OrfB蛋白質をコードするDNAの第1位から第3353位に相当するDNA断片を得た。得られたDNA断片をNdeI及びMfeIで制限酵素処理し、同じく制限酵素処理したpCDF-OrfB’dw2.8とライゲーションし、pCDF-OrfB’を構築した。
Shizochytrium sp. ATCC20888のゲノムDNAを鋳型に、配列番号６９及び７０で表わされるプライマーを用いて OrfC蛋白質（配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするDNA（配列番号９で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAを、PCRにより増幅した。得られたDNA断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで、pCOLADuet-1 (ノバジェン社製)を制限酵素NdeI及びMfeIで処理し、両者をライゲーションすることによりpColADuet-OrfCを構築した。
【００９７】
pSTV28 (タカラバイオ社製)を鋳型に、配列番号７１及び７２で表わされるプライマーを用いてPCRにより増幅した後、セルフライゲーションし、pSTV28Nを得た。Anabaena（Nostoc）sp. PCC7120由来のHetI蛋白質（配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするDNA (Genbank accession番号：L22883 REGION: 3282..3995) （配列番号１１で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAは、インビトロジェン社より購入した。このDNA断片とpSTV28Nを、それぞれ制限酵素NdeI及びEcoRIで処理し、ライゲーション反応を行いpSTV-HetIを得た。
【実施例２】
【００９８】
本発明のDNAの作製-2
ACPドメインを10個又は11個有するOrfA蛋白質を遺伝子工学的に再構築した。構築したACPドメイン数の異なるOrfA蛋白質をコードするDNAは、T7プロモーターで発現誘導可能なpET21a (ノバジェン社製)へクローニングした。
野生型のOrfA蛋白質は、その内部に、9個のACPドメインがタンデムに並んだ構造を持っている。このACPドメインをN末端側からACP1、 ACP2と命名し、最もC末端側のACPドメインをACP9とする。このうち、ACP2からACP9ドメインをコードするDNAにはそれぞれ制限酵素ZraI認識配列(GAC|GTC)が存在する。このZraI切断断片はPmlI (CAC|GTG) 切断断片とアミノ酸配列を変えることなく連結できる。また、形成されたDNA断片はZraI、PmlIのどちらでも切断されない。この特性を利用し、ACPドメインを再構築した。
【００９９】
まず、配列番号７５及び７６で表わされるプライマーを用いてACP2〜9ドメインをコードするDNAをPCRにて増幅し、それぞれpUC18 (タカラバイオ社製)にクローニングした。クローニングしたACPドメインをコードするDNAの5’末端側のZraI認識配列は、配列番号７５で表わされるプライマーを用いてPmlI認識配列に変異させた。次に、ZraI、PmlIを用いて各ACPドメインをコードするDNAを段階的に連結し、目的数のACPドメインをコードするDNAを有するDNA断片を構築した。ACPドメインをコードするDNAを10個有するDNA断片（配列番号３で表わされる塩基配列からなるDNA）は、ACP9ドメインをコードするDNAの3’側に、ACP2ドメインをコードするDNAを追加して構築した。ACPドメインをコードするDNAを11個有するDNA断片（配列番号５で表わされる塩基配列からなるDNA）は、ACP2及びACP3ドメインをコードするDNAを追加して構築した。これらのDNA断片にてpET-OrfA9の対応する領域を置換し、目的のプラスミドを得た。得られたプラスミドは、ACPドメインをコードするDNAの数に従って、それぞれpET21-OrfA10及びpET21-OrfA11とした。
【実施例３】
【０１００】
本発明の微生物の造成及び本発明の製造方法-１
PUFA-PKSによってDHAを生産する大腸菌を構築するため、まず脂肪酸の分解に関わる遺伝子であるfadEの破壊株の構築を試みた。
fadE遺伝子（配列番号５５で表わされる塩基配列からなるDNA）の破壊は、Quick & Easy E. coli gene Deletion Kit (GENE BRIDGES社製) を用いて行った。キットに添付のKm耐性遺伝子を鋳型に、配列番号７３及び７４で表わされるプライマーを用いてPCRを行い、fadE破壊用DNA断片を得た。キットに付属のプロトコルに従い、大腸菌BLR(DE3)株(ノバジェン社製)を得た。上記破壊株にプラスミド708-FLPe (Cmr) を組み込み、プロトコルに従い、BLR(DE3)ΔfadE株を取得した。
【０１０１】
BLR(DE3)ΔfadE株に、実施例1で造成したpET21-OrfA9、 pCDF-OrfB'、 pCOLA Duet-OrfC及びpSTV-HetIを、又は、実施例2で造成したpET21-OrfA10もしくはpET21-OrfA11、pCDF-OrfB'、pCOLA Duet-OrfC及びpSTV-HetIを導入した。
これらのPUFA-PKSを発現するプラスミドを導入した大腸菌を、Terrific broth（アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/Lを含む）にて1晩培養した。その培養液を新たに調製したTerrific broth（アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/L、1 mM IPTGを含む）に植菌し、PUFA-PKSの発現を誘導、230rpm 20℃にて48時間培養した。培養後、培養液を採取し、Bligh-Dyer法(Bligh, E. G. and Dyer, W. J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917.)にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素メタノールにて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
【０１０２】
その結果、ACPドメインの数が増加するのに伴い、DHA及びDPAの生産性が増大していることがわかった(表１)。
【０１０３】
【表１】
2017184690.tif 000002
【実施例４】
【０１０４】
本発明のDNAの作製-3
大腸菌において、T7プロモーターによりShewanella oneidensis MR-1由来のPUFA-PKSを発現させるために、以下のプラスミドを構築した。
まず、Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、プライマー配列番号７７及７８で表わされるプライマーを用いてEpaA蛋白質（配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするDNA（配列番号１３で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAをPCRにより増幅した。得られたDNA断片及びpET21a (ノバジェン社製)を、EcoRI及びXhoIで制限酵素処理し、ライゲーションすることで、pET21-EpaA’ (Hisタグ融合酵素として発現)を得た。Hisタグを除去するため、T7プロモーター周辺領域（pET21-EpaA’を鋳型に、プライマーとして配列番号７９及び８０を使用）及びEpaA蛋白質をコードするDNAの5’末端領域(pET21-EpaA’を鋳型に、プライマーとして配列番号８１及び８２を使用)をPCRにより増幅した。得られたDNA断片を鋳型に、配列番号７９及び８２で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRを行った。得られたDNA断片及びpET21-EpaA’をApaI/SalIで制限酵素処理後、ライゲーションすることで、pET21-EpaA4を得た。
【０１０５】
Shewanella oneidensis MR-1由来のEpaC蛋白質（配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）を発現させるためにT7プロモーターで発現誘導可能なpCDF-1b (ノバジェン社製)へクローニングした。Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、配列番号８３及び８４で表わされるプライマーを用いてEpaC蛋白質をコードするDNA（配列番号２１で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAをPCRにて増幅した。得られたDNA断片とpCDF-1bを制限酵素PmlI及びXhoIで処理し、ライゲーションすることでpCDF-EpaC’(Hisタグ融合酵素として発現)を得た。Hisタグ領域を除去するため、T7プロモーター周辺領域（pCDF-EpaC’を鋳型に、配列番号７９及び８５で表わされるプライマーを使用）及びEpaC蛋白質をコードするDNAの全長 (pET21-EpaC’を鋳型に、配列番号８６及び８４で表わされるプライマーを使用)をPCRにて増幅した。得られたDNA断片を鋳型に、配列番号７９及び８４で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRを行い、アッセンブルした。得られたDNA断片及びpCDF-EpaC’をApaI/PstIで制限酵素処理後、ライゲーション反応を行うことで、pCDF-EpaCを得た。
【０１０６】
Shewanella oneidensis MR-1由来のEpaD蛋白質（配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）を発現させるためにT7プロモーターで発現誘導可能なpCOLADuet-1 (ノバジェン社製)へクローニングした。Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、配列番号８７及び８８で表わされるプライマーを用いてEpaD蛋白質をコードするDNA（配列番号２３で表わされる塩基配列からなるDNA）を含むDNAをPCRにて増幅した。得られたDNA断片をNdeI及びBamHIで、pColADuet-1をNdeI及びBglIIで制限酵素処理した後、ライゲーションすることでpColA-EpaDを得た。
【０１０７】
Shewanella oneidensis MR-1由来のEpaE蛋白質（配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）及びEpaB蛋白質（配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）を共発現させるためにT7プロモーターで発現誘導可能なpACYCDuet-1 (ノバジェン社製)のマルチクローニングサイト（以下、MCSという。）1へEpaE蛋白質をコードするDNA（配列番号２５で表わされる塩基配列からなるDNA）を、MCS2へEpaB蛋白質をコードするDNA（配列番号１９で表わされる塩基配列からなるDNA）をクローニングした。また、発現を安定化させるため、MCS1とMCS2の間にrrnBターミネーターを導入した
Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、配列番号８９及び９０で表わされるプライマーを用いてEpaE蛋白質をコードするDNAを含むDNAをPCRにより増幅した。得られたDNA断片とpACYCDuet-1ベクターを制限酵素NcoI及びBamHIで処理し、ライゲーションすることでpACYCDuet-EpaEを得た。
【０１０８】
また、Shewanella oneidensis MR-1のゲノムDNAを鋳型に、配列番号９１及び９２で表わされるプライマーを用いてEpaB蛋白質をコードするDNAを含むDNAをPCRにて増幅した。得られたDNA断片を制限酵素NdeI及びBamHIで、pACYCDuet-epaEを制限酵素NdeI及びBglIIで処理し、ライゲーションすることで、pACYCDuet-EpaEB’を得た。EpaE蛋白質をコードするDNAとEpaB蛋白質をコードするDNAの間にrrnBターミネーターを導入するため、pTrc99A (ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)を鋳型に、配列番号９３及び９４で表わされるプライマーを用いてPCRにてrrnBターミネーター領域を増幅した。T7プロモーター領域は、pACYCDuetを鋳型に、配列番号９５及び９６で表わされるプライマーを用いたPCRにて増幅した。得られたDNA断片を鋳型に、配列番号９４及び９６で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRを行い、アッセンブルした。得られたDNA断片とpACYCDuet-EpaEB’を制限酵素NdeI / NotIで処理し、ライゲーション反応を行い、pACYCDuet-EpaEBを構築した。
【実施例５】
【０１０９】
本発明のDNAの作製-4
ACPドメインを5個又は6個有するEpaA蛋白質を遺伝子工学的に再構築した。構築したACPドメイン数の異なるEpaAはT7プロモーターで発現誘導可能なpET21a (ノバジェン社製)へクローニングした。
制限酵素AfeI 認識配列(AGC|GCT) に対応するアミノ酸残基はそれぞれSer及びAlaである。そこで、EpaA蛋白質をコードするDNAにユニークな制限酵素EagI認識配列の上流14 bpに位置するSer1431、Ala1432のコドンをAfeI 認識配列に変異させた。またAfeI切断断片は制限酵素FspI (TGC|GCA) 切断断片と連結した場合、そのアミノ配列は保持され、さらに形成されたDNAはどちらの制限酵素でも切断されない。この特性を利用し、EpaA蛋白質をコードするDNAにACP2ドメインをコードするDNAを挿入し、ACPドメインをコードするDNAの数を増加させた。
【０１１０】
pET21-EpaA4を鋳型に、配列番号９７及び９９で表わされるプライマーを用いてBamHI〜EagI領域を増幅した。この際、Ser1431、Ala1432のコドンをAfeI 認識配列 (AGC|GCT) に変異させた。このDNA断片をpHSG298 (タカラバイオ社製)のBamHI、EcoRIサイトにクローニングした。これをpHSG298-ACP2とした。つぎにpET21-EpaA4を鋳型に、配列番号９８及び９９で表わされるプライマーを用いてACP2ドメインをコードするDNAをPCRにて増幅した。この際、Ser1323、Ala1324のコドンをFspI認識配列(TGC|GCA)、及びSer1431、Ala1432のコドンをAfeI 認識配列に変異させた。このDNA断片をpHSG298-ACP2のAfeI / EcoRIサイトにクローニングし、pHSG298-ACP3を得た。これを繰り返し、pHSG298-ACP4を得た。そして、pET21-EpaA4中のEpaA蛋白質をコードするDNAのBamHI - EagI 領域をこれらDNA断片と置換し、ACPドメインをコードするDNAを５つ有するDNA断片（配列番号１５で表わされる塩基配列からなるDNA）、及びACPドメインをコードするDNAを６つ有するDNA断片（配列番号１７で表わされる塩基配列からなるDNA）を構築した。得られたプラスミドは、ACPドメインをコードするDNAの数に従って、それぞれpET21-EpaA5及びpET21-EpaA6とした。
【実施例６】
【０１１１】
本発明の微生物の造成及び本発明の製造方法-2
実施例3で構築したBLR(DE3)ΔfadE株に、実施例４で造成したpET21-EpaA4、pCDF-EpaC、pColADuet-EpaD、及びpACYCDuet-EpaEBを、又は、実施例５で造成したpET21-Epa5もしくはpET21-Epa6、pCDF-EpaC、 pColADuet-EpaD、及び pACYCDuet-EpaEBを導入した。これらのPUFA-PKSを発現するプラスミドを導入した大腸菌を、Terrific broth（アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/Lを含む）にて1晩培養した。その培養液を新たに調製したTerrific broth（アンピシリン100 mg/L、カナマイシン 20 mg/L、クロラムフェニコール 30 mg/L、ストレプトマイシン 20mg/L、1 mM IPTGを含む）に植菌し、PUFA-PKSの発現を誘導、230rpm 20℃にて48時間培養した。
【０１１２】
培養後、培養液を採取し、Bligh-Dyer法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素メタノールにて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。
その結果、ACPドメインの数が増加するのに伴い、EPA及びDPAの生産性が増大していることがわかった(表２)。
【０１１３】
【表２】
2017184690.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上のように、本発明では、PUFA-PKSの活性をACPドメインの数を単純に増加させるという従来は予想できなかった方法により飛躍的に向上させることに成功した。本酵素を用いることでDHA、EPAといった有用なPUFAを効率的に生産することが可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【配列表】
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