(57)【要約】      （修正有）【課題】種々の病気が凝固に関連しており、かつ凝固系の大規模な活性化に起因する播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は敗血症ショックに影響を与え、また、凝固障害は、部分的に心血管疾患の原因になるとも考えられているので、凝固を阻害するための有効な生物活性を有する治療方法の提供。【解決手段】抗凝固に用いる医薬組成物であって、親形態としての式（Ｉ）で表される化合物、又はその異性体、或いはその塩、エステル、若しくは溶媒和物を含む医薬組成物。薬学的に許容される担体を更に含み、前記担体が燐酸緩衝生理食塩水であることが、好ましい、医薬組成物。2017186302.tif 000020【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固に用いる医薬組成物であって、親形態としての式（Ｉ）:
【化１】
2017186302.tif 000012
またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記異性体が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【化２】
2017186302.tif 000013
【化３】
2017186302.tif 000014
【化４】
2017186302.tif 000015
またはそれらの塩、エステルもしくは溶媒和物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
薬学的に許容され得る担体をさらに含み、該薬学的に許容され得る担体がリン酸緩衝生理食塩水である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
非経口的に投与される請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
腹腔内注入または血管内注入により投与される請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
液体剤形または固体剤形で経口的に投与される請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記対象が哺乳類であり、該哺乳類がマウスまたはヒトである請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗凝固に用いる医薬組成物であって、親形態としての式（Ｉ）:
【化５】
2017186302.tif 000016
またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含み、該抗凝固に用いる前記医薬組成物の用量が、対象の体重の約５×１０-5ｍＬ／ｋｇ以上の量である医薬組成物。
【請求項９】
前記異性体が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【化６】
2017186302.tif 000017
【化７】
2017186302.tif 000018
【化８】
2017186302.tif 000019
またはそれらの塩、エステルもしくは溶媒和物である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗凝固に用いる前記医薬組成物の用量が、前記対象の体重の０．０５ｍＬ／ｋｇの量である請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗凝固に用いる前記医薬組成物の用量が、前記対象の体重の５×１０-5ｍＬ／ｋｇの量である請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容され得る担体をさらに含み、該薬学的に許容され得る担体がリン酸緩衝生理食塩水である請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
非経口的に投与される請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
液体剤形または固体剤形で経口的に投与される請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記対象が哺乳動物であり、該哺乳動物がマウスまたはヒトである請求項８〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月３日に出願され、「抗凝固方法」と題された係属中の米国特許出願第１５／０１４３７３号に基づいていると共に、その優先権を主張し、その開示全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は抗凝固に用いる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
凝固（Coagulation）（凝固（clotting）としても知られる）は、血液が液体からゲルに変わるプロセスである。それは潜在的に、止血、損傷した血管からの失血の停止、続く修復、につながる。凝固のメカニズムは、フィブリンの沈着および成熟と共に、血小板の活性化、付着および凝集を含む。凝固は、生物全体で高度に保存されている。すべての哺乳動物において、凝固には、細胞（血小板）およびタンパク質（凝固因子）成分の両方が関与する。ヒトにおけるその系は、最も大規模に研究され、かつ最もよく理解されているものである。
【０００４】
凝固障害は、出血（bleeding）（大出血（hemorrhage）もしくは紫斑）または閉塞性の凝固（obstructive clotting）（血栓症）につながり得る病状である。例えば、血栓症には静脈血栓症および動脈血栓症が含まれる。詳細には、静脈血栓症は、深部静脈血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、前頸静脈血栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、脳静脈洞血栓症、海綿静脈洞血栓症などであり、動脈血栓症は脳卒中および心筋梗塞などである。
【０００５】
現在、臨床で最も一般的に用いられている抗凝血剤にはヘパリンおよびクマリンが含まれる。ヘパリンは、凝固因子XIIａ、XIａ、IXａ、Xａ、およびIIａを順に阻害するアンチトロンビンIIIを活性化する。クマリンは、経口の抗凝固剤であり、これはビタミンＫを激減させる。
【０００６】
また、敗血症ショックは生命を脅かす細菌感染症の合併症である。重症敗血症および敗血症ショックは、感染患者の院内死亡を引き起こす主な原因の１つである。いわゆる敗血症とは、全身炎症状態（全身性炎症反応症候群、またはＳＩＲＳと称される）、および明らかな感染の存在のことである。敗血症ショックはしばしば、凝固系の大規模な活性化に起因する播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）によって悪化する。しかし、人体自体も敗血症ショックに対する治療を行う。多くの生体分子、例えば活性化プロテインＣなどが、抗凝固経路に関与している。
【０００７】
敗血症ショックの主な症状には、発熱、悪寒、速い呼吸速度、および精神錯乱／昏睡などが含まれ、それらには体温上昇または体温低下（３８．３℃を超える、または３６℃未満）、１分間に９０回を超える心拍数、１分間に２０回を超える呼吸数、および１２０００／ｃｕ．ｍｍを超える、または４０００／ｃｕ．ｍｍ未満の白血球の数、も含まれる。
【０００８】
敗血症のさらにひどい状態は、低血圧、低灌流、および多臓器不全につながる可能性があり、それらには尿流量の低下（腎不全）、異常肝機能、および黄疸が含まれ得る。不十分な血流によるこの致命的な臓器不全の状態が、敗血症ショックと呼ばれるものである。
【０００９】
細菌感染のケースにおいて、宿主の免疫細胞の活性化はサイトカインおよび非サイトカインメディエーターの放出により起こり、それらのうち最も悪名高いのは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）である。これらの因子は、全身性炎症反応症の広範な活性化に関与する。結果として、プロスタグランジン、トロンボキサンＡ２および硝酸などの血管拡張性および内毒素性を有するメディエーターが全身に放出される。これは血管拡張および内皮損傷を引き起こし、ひいては低血圧および毛細血管漏出につながる。さらに、サイトカインが凝固経路を活性化することで、毛細血管の微小血栓および終末器官の虚血が生じる。
【００１０】
ステロイド、組換えＡＰＣ（活性化プロテインＣ）、および多くの化学化合物を含む、敗血症ショックに対するいくつかの治療に関して研究が行われている。
【００１１】
プロテインＣは、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ酵素のように機能する、主要な抗凝固成分である。プロテインＳは、抗凝固因子ＶおよびVIIIの不活性化においてプロテインＣの補因子として機能する。プロテインＣは、プロテインＣおよびトロンビンの細胞表面タンパク質トロンボモジュリンへの結合から始まるシークエンスにおいて活性化される。活性化プロテインＣは、補因子としてのプロテインＳおよびリン脂質と共に、抗凝固因子ＶおよびVIIIを分解し、よって凝固を阻害する。
【００１２】
Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｇ  Ｒら、２００１によれば、組換えヒト活性化プロテインＣは抗血栓性、抗炎症性および線維素溶解促進性を有する。過去の報告によると、ＡＰＣは動物およびヒトを敗血症ショックから守り得ることが知られている。しかし、ＡＰＣの効果はなお発見されている。Ｎａｃｉｒａ  Ｓは、ＬＰＳにより誘発された血圧低下の防止、ラットにおける血管の過敏性および心筋能力の両者の改善、といったＡＰＣの保護効果を証明した。この効果は、ＮＦ−κＢ、ｉＮＯＳおよびＭＭＰ−９のアップレギュレーションの低下に関連していた（非特許文献１）。それは有効ではあったが、大規模無作為化臨床試験では重症敗血症患者において６．１％の死亡率の絶対的低下（３０．８％から２４．７％）のみが証明されたに過ぎず、副作用を伴う効果も存在する（非特許文献２）。さらに、主要な研究が敗血症の治療に効果がないことを示した後、２０１１年１０月２５日、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．はＸｉｇｒｉｓ（ＡＰＣの商品名）を市場から回収した（「有効性欠如のためＸｉｇｒｉｓ（ドロトレコギンアルファ（活性化））は回収される予定」、プレスリリース、ロンドン、ＵＫ：欧州医薬品庁、２０１１年１０月２５日、２０１１年１０月２６日オリジナルからアーカイブに保管、２０１１年１０月２６日検索）。
【００１３】
また、特許文献１は、ピリミド−ピリミジン誘導体によるエンドトキシンショックの治療法を開示している。Ｅ．ｃｏｌｉエンドトキシンは、中枢神経系における自動血圧調節回路（automatic blood pressure regulatory circuit）を活性化することによってその血圧降下作用を発揮し得るため、ピリミド−ピリミジン誘導体の投与は、髄質の心血管の制御系（medullary cardiovascular regulatory system）に作用する血圧上昇効果を有するであろう。
【００１４】
特許文献２は、敗血症ショックの治療に用いる化学式Ｃ2Ｈ2Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＨ2のアミン化合物およびその化学構造を開示し、式中Ｒ１およびＲ２は水素、炭化水素、カルボキシル基、アミン基または１〜８個の炭素を含むアルキル基から選ばれ、Ｒ３は水素、炭化水素、カルボキシル基、フェニル基およびその置換、アクリルアミン、３〜８個の炭素を含むアルキルアミン、アルキルアミノ−カルボン酸またはそれらの有効量の塩、エステルもしくは溶媒和物から選ばれる。当該アミン化合物が経口または非経口的に被験体に投与された。
【００１５】
特許文献３は、イソアミルアミン（ＩＡ）により敗血症ショックまたはエンドトキセミアを治療する方法を開示している。しかし、そのメカニズムは未知のままである。
【００１６】
上述したように、種々の病気が凝固に関連しており、かつ凝固系の大規模な活性化に起因する播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は敗血症ショックに影響を与える。また、凝固障害は、部分的に心血管疾患の原因になるとも考えられている。
【００１７】
故に、凝固を阻害するための有効な生物活性を有する治療方法が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４３８８３１８号明細書
【特許文献２】米国特許第６０１１０６６号明細書
【特許文献３】米国特許第８５５７８７３号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｎａｃｉｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００９  Ｊａｎｕａｒｙ；３７（ｌ）：２４６−５５
【非特許文献２】Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｇ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１，  ８；３４４（１０）：６９９−７０９
【発明の概要】
【００２０】
本発明の実施形態は、抗凝固に用いる医薬組成物を提供する。該医療組成物は、親形態としての式（Ｉ）:
【化１】
2017186302.tif 000002
またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、抗凝固に用いる医薬組成物を提供する。該医療組成物は、親形態としての式（Ｉ）:
【化２】
2017186302.tif 000003
またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含み、抗凝固に用いる該医薬組成物の用量は、対象の体重の約５×１０-5ｍＬ／ｋｇまたはこれ以上の量である。
【００２２】
添付の図面を参照にしながら、以下の実施形態において詳細な説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
添付の図面を参照にしながら以下の詳細な説明および実施例を読むことによって、本発明をより十分に理解することができる。
【００２４】
【図１Ａ】本発明の医薬組成物の化学式を示す。
【図１Ｂ】本発明の医薬組成物の異性体の化学式を示す。
【図１Ｃ】本発明の医薬組成物の異性体の化学式を示す。
【図１Ｄ】本発明の医薬組成物の異性体の化学式を示す。
【図２Ａ】本発明のいくつかの実施形態による、イソアミルアミン（ＩＡ）で処理した（１０００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬ）マウスの異なる処理時間における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を示す。
【図２Ｂ】本発明のいくつかの実施形態による、異なる用量のイソアミルアミン（ＩＡ）で３時間処理したマウスの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を示す。
【図３Ａ】本発明のいくつかの実施形態による、イソアミルアミン（ＩＡ）で処理した（１０００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬ）マウスの異なる処理時間におけるプロトロンビン時間（ＰＴ）を示す。
【図３Ｂ】本発明のいくつかの実施形態による、異なる用量のイソアミルアミン（ＩＡ）で３時間処理したマウスのプロトロンビン時間（ＰＴ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下の記載は、本発明を実施するのに最良であると考えられる形態である。この記載は、本発明の基本原理を説明する目的でなされたものであり、限定の意味に解してはならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により決定されるべきである。
【００２６】
適度なアルコールの摂取は、心血管イベントのすべての原因による死亡率を、内皮の保護によって低下させる。特に、赤ワインの飲用は、有益な止血の効果に寄与する。３−メチル−１−ブタンアミンまたはイソペンチルアミンの同義語であるＩＡは、無色液体の有機化学化合物であり、かつ赤ワインおよびブドウジュースの成分の１つでもある。J of agriculture & food chemistry, 2011, 59:8742-53によると、ポートワイン中のＩＡの含有量は約０．４ｐｐｍであり、ブドウジュース中のＩＡの含有量は約１．２ｐｐｍである。よって、ＩＡは食べられる。本出願は、心血管イベントの原因である、マウスの凝固へのＩＡの効果を明らかにする。
【００２７】
本発明の一つの実施形態は、抗凝固に用いる医薬組成物を提供する。該医療組成物は、親形態としての式（Ｉ）またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含む。
【化３】
2017186302.tif 000004
【００２８】
本発明の他の実施形態では、抗凝固に用いる医薬組成物は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のような医薬組成物の式（Ｉ）の異性体、またはそれらの塩、エステルまたは溶媒和物を含み得る。
【化４】
2017186302.tif 000005
【化５】
2017186302.tif 000006
【化６】
2017186302.tif 000007
【００２９】
本発明の一実施形態において、抗凝固への医薬組成物の使用には、必要とする対象に、親形態としての式（Ｉ）またはその異性体、またはその塩、エステル、もしくは溶媒和物を含む治療上有効量の医薬組成物を投与することが含まれ得る。本発明の別の実施形態では、抗凝固への医薬組成物の使用には、必要とする対象に、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のような医薬組成物の式（Ｉ）の異性体、またはその塩、エステルもしくは溶媒和物を含む治療上有効量の医薬組成物を投与することが含まれ得る。
【００３０】
本発明において、医薬組成物の治療上有効な量は、個体における血液凝固を低減、阻害、または防止するのに十分な量を表し、血液凝固が、エンドトキシン、菌血症などにより誘発され得るものである。一実施形態において、医薬組成物の治療上有効な量は、体重の５×１０-5ｍＬ／ｋｇまたはこれ以上の量であってよい。一実施形態において、医薬組成物の治療上有効な量は、処理時間および作用経路（affected pathway）（内因性または外因性）に応じ、体重の５×１０-5から０．０５ｍＬ／ｋｇの量、例えば体重の５×１０-4ｍＬ／ｋｇまたは５×１０-3ｍＬ／ｋｇとすることができる。
【００３１】
一実施形態において、医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水または滅菌水（sterile water）のような薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてよい。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、医薬組成物は非経口的に投与することができ、例えば、対象に、滅菌液体剤形（sterile liquid dosage form）で、腹腔内または血管内注入することができる。また、医薬組成物は経口的に、例えば、シロップおよび懸濁液のような滅菌液体剤形、またはカプセル、錠剤および粉末のような固体剤形で投与してもよい。
【００３３】
一実施形態において、対象は哺乳動物であり得る。別の実施形態では、対象はマウスであり得る。別の実施形態では、対象はヒトであり得る。
【００３４】
以下に記載される実施例では、異なる用量および処理時間における凝固へのＩＡの効果を明らかにする。以下の実施例は、本発明の最良の形態を説明するために本明細書に提示されるものであり、それらは本発明の限定を意図するものではないという点に留意すべきである。
【実施例】
【００３５】
材料および方法
イソアミルアミン（ＩＡ）
イソペンチルアミン（イソアミルアミン；Ｍ−８２０７１６）２５０ｍＬをメルク、ドイツから購入した。それを生理食塩水で各種濃度に希釈して、腹腔内注入に用いた。
【００３６】
ａＰＴＴおよびＰＴ試薬
ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）およびＰＴ（プロトロンビン時間）試薬は、デイド・ベーリング社（Dade Behring company）、シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティクス・プロダクト・ゲーエムベーハー、マールブルク、ドイツより購入した。
【００３７】
動物
体重約２０ｇの５から６週齢オスＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウスをナショナル・ラボラトリー・アニマル・センター、台北、台湾から購入した。
【００３８】
処理
血液における凝固系は内因性経路および外因性経路から構成される。内因性経路は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）によってアッセイされ、外因性経路はプロトロンビン時間（ＰＴ）によってアッセイされる。各種用量のＩＡの腹腔内注入後、血漿を異なる時間で採取し、ａＰＴＴおよびＰＴのアッセイを行った。ａＰＴＴおよびＰＴはＳｔａｇｏ  ＳＴ４凝固アナライザー（ＳＴ  ａｒｔ  ４、ディアグノスティカ・スタゴ（Diagnostica Stago）、フランス）でアッセイした。
【００３９】
マウス血漿の調製
マウスに炭酸ガス麻酔をし、心臓穿刺により採血し、３．２％クエン酸ナトリウムと血液とを１：９の比率で混合した。その血液を２０００ｇ／ｒｐｍで１０分間遠心分離し、マウス血漿を得、それを速やかにアッセイした。
【００４０】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のアッセイ
キットに備わっていた緩衝溶液を希釈剤として用い、ａＰＴＴ試薬の４倍希釈液中でａＰＴＴをアッセイした。ａＰＴＴアッセイでは、血漿０．１ｍＬをＳｔａｇｏ  ＳＴ４凝固アナライザー中の４つのキュベットのバレッタ（barrette）内にて１分間、３７℃で保温してから、４倍希釈したａＰＴＴ試薬０．１ｍＬおよび１つのスチールボールを加え１８０秒待った。最後に、２５ｍＭ  ＣａＣｌ2溶液０．１ｍＬを加えてａＰＴＴの検出を行った。
【００４１】
プロトロンビン時間（ＰＴ）のアッセイ
ＰＴ試薬１部、２５ｍＭ  ＣａＣｌ2溶液１部、および滅菌水２部を含む４部からなるＰＴ試薬の４倍希釈液中でＰＴをアッセイした。ＰＴアッセイでは、血漿０．１ｍＬを、それぞれ１つのスチールボールを備えている４つのバレッタキュベット（cuvette）の各々に入れ、Ｓｔａｇｏ  ＳＴ４凝固アナライザー中にて１分間、３７℃で保温した。次いで、希釈ＰＴ試薬０．２ｍＬを加えてＰＴの検出を行った。
【００４２】
実施例１：経時的研究（ａＰＴＴ）
ＩＡ処理マウスの凝固系の内因性経路における抗凝固効果を調べるため、異なる処理時間にてａＰＴＴを測定した。マウス（ｎ＝６）に対し、１０００ｐｐｍ（０．０５ｍＬ／ｋｇ）のＩＡ  １ｍＬを腹腔内注入し、ＩＡ注入の１時間後、２時間後、３時間後および２４時間後に採血した。１０匹のマウスにビヒクルを注入し（ｎ＝１０）、対照群とした。次いで、各群のａＰＴＴを測定した。その結果を表１−１および図２Ａに示す。図２Ａは表１−１の図である。
【００４３】
【表１−１】
2017186302.tif 000008
【００４４】
表１−１および図２Ａに示されるように、ａＰＴＴはＩＡ注入の１時間後には延長され、さらに処理時間が長くなるつれ次第に延長された。ＩＡで１時間処理した後に得られたデータは統計的意味を有する。ＰＴ（以下に示される）と比較して、ａＰＴＴはＩＡ注入に対してより敏感であった。ａＰＴＴの傾向のｐ値は＜０．００１であった。結果から、ＩＡ処理マウスにおける凝固時間は経時的に増加することが明らかとなり、このことは、ＩＡにより生じる内因性経路における抗凝固の傾向を示している。
【００４５】
実施例２：用量効果（ａＰＴＴ）
ＩＡ処理マウスの凝固系の内因性経路における抗凝固効果を調べるため、異なるＩＡの用量においてもａＰＴＴを測定した。異なる群のマウス（ｎ＝６）に、１ｍＬの各種用量（１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ）のＩＡをそれぞれ腹腔内注入した。３時間後に血漿を分離した。１０匹のマウスにビヒクルを注入し、対照群とした。各群のａＰＴＴを測定した。その結果を表１−２および図２Ｂに示す。図２Ｂは表１−２の図である。
【００４６】
【表１−２】
2017186302.tif 000009
【００４７】
表１−２および図２Ｂに示されるように、ａＰＴＴは、マウスを１、１０、１００、１０００ｐｐｍのＩＡで処理したときに、延長された。１ｐｐｍ（５×１０-5ｍＬ／ｋｇ）またはそれ以上のＩＡで処理したときに、データは統計的意味を有する。傾向のｐ値（p value for trend）は０．００５であった。結果から、ＩＡは、ＩＡ処理マウスにおける凝固時間を有効に延長することが明らかとなり、このことは、１ｐｐｍと低いＩＡにより生じる内因性経路における抗凝固効果を示している。
【００４８】
実施例３：経時的研究（ＰＴ）
また、ＩＡ処理マウスの凝固系の外因性経路における抗凝固効果を調べるため、異なる処理時間にてＰＴを測定した。異なる群のマウス（ｎ＝６）にそれぞれ、１０００ｐｐｍ（０．０５ｍＬ／ｋｇ）のＩＡ  １ｍＬを腹腔内注入し、ＩＡ注入の１時間後、２時間後、３時間後および２４時間後に採血した。１０匹のマウスにビヒクルを注入し（ｎ＝１０）、対照群とした。次いで、各群のＰＴを測定した。その結果を表２−１および図３Ａに示す。図３Ａは表２−１の図である。
【００４９】
【表２−１】
2017186302.tif 000010
【００５０】
表２−１および図３Ａに示されるように、ＰＴは２時間の時点で延長され、さらに処理時間が長くなるつれ次第に延長された。ＩＡで２時間処理した後に得られたデータは統計的意味を有する。ＰＴの傾向のｐ値は＜０．００１であった。結果から、ＩＡ処理マウスの凝固時間は経時的に増加することがわかり、このことは、ＩＡにより生じる外因性経路における抗凝固の傾向を示している。
【００５１】
実施例４：用量効果（ＰＴ）
ＩＡ処理マウスの凝固系の外因性経路における抗凝固効果を調べるため、異なるＩＡの用量においてもＰＴを測定した。異なる群のマウス（ｎ＝６）に、１ｍＬの各種用量（１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ）のＩＡをそれぞれ腹腔内注入した。３時間後に血漿を分離した。１０匹のマウスにビヒクルを注入し、対照群とした。各群のＰＴを測定した。その結果を表２−２および図３Ｂに示す。図３Ｂは表２−２の図である。
【００５２】
【表２−２】
2017186302.tif 000011
【００５３】
表２−２および図３Ｂに示されるように、ＰＴは、マウスを１０００ｐｐｍのＩＡで処理したときに、顕著に延長された。１０００ｐｐｍのＩＡで処理したときに、データは統計的意味を有する。ＰＴの傾向のｐ値は０．３０７であった。結果から、ＩＡが高用量であるときに、ＩＡ処理マウスにおける凝固時間が増加することが明らかとなり、このことは、高用量のＩＡにより生じる外因性経路における抗凝固効果を示している。
【００５４】
本出願は、内因性経路（ａＰＴＴ）および外因性経路（ＰＴ）を含むマウスの凝固系をＩＡが抑制することを明らかとしている。１０００ｐｐｍのＩＡ（０．０５ｍＬ／ｋｇ）１ｍＬにより、腹腔内注入の２時間後ＰＴが抑制された。しかし、用量研究では、腹腔内注入の３時間後、ＰＴを抑制するのに１０００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬを要した。ａＰＴＴはＩＡによる抑制に、より敏感である。ＩＡを１ｍＬ、１０００ｐｐｍで注入すると、１時間でａＰＴＴを抑えることができた。用量研究では、１ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬほどで、ＩＡ腹腔内注入の３時間後にａＰＴＴを抑制することができた。上記データは、ＩＡが処理マウスのａＰＴＴを有効に延長するが、１０００ｐｐｍのようにＩＡが高用量である場合にのみＰＴを延長することを示しており、このことは、ＩＡが、外因性経路に比べ、凝固の内因性経路に対してより有意な効果を有することを示唆する。換言すると、内因性経路はＩＡによる抑制により敏感である。
【００５５】
我々の実験データはさらに、１ｍＬの１０００ｐｐｍのＩＡ（０．０５ｍＬ／ｋｇ）がマウスに投与された場合に正常な生理的状態が維持され得ることも示している、という点に留意すべきである。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（２０ｇ）は、１ｍＬの２００００ｐｐｍ（０．１ｍＬ／ｋｇ）の腹腔内注入に耐えられる。また、出願人は、３００００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬをラット投与したときでさえ、正常な生理的状態が同様に維持され得ることを見出した。言い換えれば、高用量でも、ＩＡは哺乳動物の健康に害を及ぼさない。
【００５６】
本発明の結果は、ＩＡの処理時間が長くなるにつれ、外因性経路のＰＴおよび内因性経路のａＰＴＴの両方が延長されることを示している。また、１０００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬの腹腔内注入の２時間後にＰＴが統計的意味を有して増加し、かつ１０００ｐｐｍのＩＡ  １ｍＬの腹腔内注入の１時間後にａＰＴＴが統計的意味を有して増加したこともわかった。
【００５７】
これら結果から、式（Ｉ）の医薬組成物、つまりＩＡは、マウスおよびラットのような哺乳動物において抗凝固効果を有することが明らかとなった。よって、必要とする対象へのＩＡの投与による抗凝固方法は、将来の医学研究および応用、例えば、血栓症および塞栓症の予防における抗凝固のためのＩＡ投与の利用、において非常に高い価値を有する。
【００５８】
本発明を実施例により、かつ好ましい実施形態の観点から記載したが、本発明は開示された実施形態に限定されないということが理解されなければならない。それとは逆に、本発明は（当業者には明らかであろう）各種の変更および類似の構成をカバーするよう意図されている。よって、添付の特許請求の範囲は、かかる各種変更および類似の構成がすべて包含されるよう、最も広い解釈が与えられなければならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【外国語明細書】
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