(57)【要約】【課題】高い気孔率を有すると同時に、手術時の取り扱いでも容易に崩壊しない程度の圧縮強度を併せ持ち、より迅速な骨再生が可能な骨補填剤を提供する。【解決手段】β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に架橋ゼラチン被覆を有し、2MPa以上の圧縮強度を有する骨補填材。β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体を、ゼラチン溶液に浸漬し、前記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部にゼラチン被覆を形成し、次いで加熱することを含む骨補填材の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に架橋ゼラチン被覆を有し、2MPa以上の圧縮強度を有することを特徴とする骨補填材。
【請求項２】
気孔率が75%以上である請求項1に記載の骨補填材。
【請求項３】
架橋ゼラチン被覆の含有量が、0.1〜5質量%である請求項1又は2に記載の骨補填材。
【請求項４】
ブロック状または顆粒状である請求項1〜3のいずれか1項に記載の骨補填材。
【請求項５】
架橋ゼラチン被覆のエンドトキシン含有量は、50EU/gゼラチン未満である請求項1〜4のいずれか1項に記載の骨補填材。
【請求項６】
圧縮強度が3MPa以上である請求項1〜5のいずれか1項に記載の骨補填材。
【請求項７】
β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体を、ゼラチン溶液に浸漬し、前記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部にゼラチン被覆を形成し、次いで加熱することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の骨補填材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨補填材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨欠損部の補填材として多孔質状のリン酸カルシウム焼結体が用いられている。多孔質体にする理由は、細孔内への細胞や血管の侵入を可能にすることによって、骨再生を促すためである。したがって多孔質骨補填材の気孔率はできるだけ高いことが望ましい。
【０００３】
一方、気孔率を高くすると多孔質骨補填材の圧縮強度は低下する。圧縮強度が過度に低い場合は、手術時の手指による取り扱いによっても崩壊してしまうため、実用に適さない。手術時の手指による取り扱いに耐えうるために必要な圧縮強度は、おおむね１ＭＰａである。現在市販されている多孔質補填材は、リン酸カルシウム、特にβ−リン酸三カルシウムの粒子を焼結したものであるが、リン酸三カルシウムの多孔質焼結体の場合には、圧縮強度を１ＭＰａ以上にするためには、気孔率を７５％よりも高めることができない。たとえば、現在市販されているオリンパステルモバイオマテリアル製の商品名オスフェリオンは、気孔率７５％、気孔径１００〜４００μｍ、圧縮強度０．９ＭＰａ（カタログ値）である。
【０００４】
したがって、多孔質骨補填材本来の機能を損なうことなしに圧縮強度を高める手段を講じることができれば、高い気孔率をもつ骨補填材を作ることができ、より迅速な骨再生が期待できる。たとえば、気孔率９０％以上で、気孔径が２００μｍ以上、圧縮強度が２ＭＰａ以上の骨補填材が実現できれば、従来の骨補填材を用いるよりも迅速に骨再生を促すことができると考えられる。
【０００５】
一般に、多孔質リン酸カルシウム焼結体のような脆性材料の破壊は、構造上最も弱い場所を起点（破壊源）として進行する。通常、破壊源は、焼結体内部に存在する微小亀裂である。破壊源となりうる微小亀裂を高分子等で充填すれば、破壊の開始に必要な応力が高まり、結果として強度が向上する。
【０００６】
このような目的で、これまで使用されてきた高分子としては、生体吸収性のポリ乳酸やポリカプロラクトン（非特許文献１、２）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−２３７１７８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Y. Shigemitsu, et al., "Fabrication of biodegradable β-tricalcium phosphate / poly(L-lactic acid) hybrids and their in vitro biocompatibility", J. Ceramic Society of Japan, 118 (2010) 1181-1187.
【非特許文献２】L. T. Bang et al., "Mechanical behavior and cell response of PCL coated α-TCP foam for cancellous-type bone replacement", Ceramics International, 39 (2013) 5631-5637.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１、２に記載の高分子は生体内で非酵素的に加水分解されて溶解していく際に酸性の物質である乳酸を生成するために、好塩基性の骨芽細胞の接着や増殖に対しては好ましくない。またこれらの高分子は親水性を示さないので、骨芽細胞の接着を妨げる。
【００１０】
本発明の目的は、高い気孔率を有すると同時に、手術時の取り扱いでも容易に崩壊しない程度の圧縮強度を併せ持ち、より迅速な骨再生が可能な骨補填剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、多孔質リン酸カルシウム焼結体のような多孔質体と生体組織や細胞との親和性が高く生体内分解性に優れるゼラチンを組み合わせることで、上記課題を解決することができことを見出して本発明を完成させた。
【００１２】
本発明は、以下のとおりである。
[１]
β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に架橋ゼラチン被覆を有し、2MPa以上の圧縮強度を有することを特徴とする骨補填材。
[２]
気孔率が75%以上である[1]に記載の骨補填材。
[３]
架橋ゼラチン被覆の含有量が、0.1〜5質量%である[1]又は[2]に記載の骨補填材。
[４]
ブロック状または顆粒状である[1]〜[3]のいずれか1項に記載の骨補填材。
[５]
架橋ゼラチン被覆のエンドトキシン含有量は、50EU/gゼラチン未満である[1]〜[4]のいずれか1項に記載の骨補填材。
[６]
圧縮強度が3MPa以上である[1]〜[5]のいずれか1項に記載の骨補填材。
[７]
β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体を、ゼラチン溶液に浸漬し、前記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部にゼラチン被覆を形成し、次いで加熱することを含む、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の骨補填材の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高い気孔率を有すると同時に、手術時の取り扱いでも容易に崩壊しない程度の圧縮強度を併せ持ち、より迅速な骨再生が可能な骨補填剤を提供することができる。更には、本発明によれば、好塩基性の骨芽細胞の接着を妨げない骨補填材を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１で作製した焼結体の電子顕微鏡写真を示す。
【図２】実施例２で作製した組織薄片写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
<骨補填材>
本発明の骨補填材は、β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に架橋ゼラチン被覆を有し、2MPa以上の圧縮強度を有することを特徴とする。
【００１６】
β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体は、公知のものをそのまま利用することができる。β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の製造方法としては、例えば、特開平５−２３７１７８号公報（特許文献１）の記載を参照できる。具体的には、リン酸カルシウム粉末の顆粒を、リン酸カルシウムの発泡スラリーに混ぜて乾燥させた後に焼成する方法などが一般に知られており、本発明では特に指定しない。得られる多孔質焼結体は、気孔率が好ましくは75%以上であり、圧縮強度が好ましくは1MPa以上である。
【００１７】
本発明の骨補填材は、上記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に架橋ゼラチン被覆を有する。ゼラチンは、コラーゲンを変性させて得られるものであり、細胞に対する適合性が高いという性質をもつと同時に、１００℃から１７０℃の温度で加熱することによって分子間の脱水縮合（熱架橋）が進行して強固な固化体となる。架橋ゼラチン被覆は、好ましくは、多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部設けられたゼラチン被覆を熱架橋したものである。熱架橋の条件は後述する。一旦熱架橋した架橋ゼラチンは、生体内に埋入すると再び加水分解し、アミノ酸もしくはオリゴペプチドとなって生体に吸収される性質を持つ。本発明ではこのようなゼラチンの性質を利用して、多孔質骨補填材が本来有する細胞親和性を損なうことなく、その機械強度を向上させる。
【００１８】
ここで使用できるゼラチンとしては、ウシ、ブタまたは魚類由来のI型、II型またはIII型のコラーゲンを変性させて得られるものなどがある。骨補填剤としての利用は、生体骨に埋入することを前提としているため、発熱性物質であるエンドトキシンの低いゼラチンが適している。
【００１９】
上記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部に設けられる架橋ゼラチン被覆は、本発明の骨補填材が、2MPa以上の圧縮強度を有するように設ける。骨補填材の圧縮強度は、主に架橋ゼラチン被覆の量とゼラチンの架橋の程度で決定される。2MPa以上の圧縮強度を有するようにするという観点からは、骨補填材における架橋ゼラチン被覆の含有量は、例えば、0.1〜5質量%であることができる。架橋ゼラチン被覆の含有量は、大きくなると圧縮強度も大きくなるが、骨補填材の気孔率が低下する傾向がある。本発明の骨補填材の気孔率は、好ましくは75%以上である。本発明の骨補填材の気孔率は、主に、架橋ゼラチン被覆を有さない多孔質焼結体の気孔率と架橋ゼラチン被覆の含有量により変化する。本発明の骨補填材の気孔率75%以上であるためには、架橋ゼラチン被覆の含有量は、5質量%以下であることが好ましく、より好ましくは4質量%以下、さらに好ましくは3質量%以下である。一方、2MPa以上の圧縮強度を有するようにするという観点からは、架橋ゼラチン被覆の含有量は、0.1質量%以上、より好ましくは0.5質量%以上、さらに好ましくは1.0質量%以上である。
【００２０】
本発明の骨補填材は、圧縮強度が、3MPa以上であることが、手術時の取り扱いでも容易に崩壊しないという観点からより好ましい。
本発明の骨補填材は、例えば、ブロック状または顆粒状であることができる。但し、これらの形状に限定される意図ではない。
【００２１】
本発明の骨補填材の圧縮強度は、以下の方法で測定される。
補填材を、各辺が約1cm、1cm、2cm程度の角柱形状に切り出して試験片とする。試験片を、長辺が垂直になるように圧縮試験機に設置し、クロスヘッド速度1.0mm/分程度の速度で試験片を加圧する。試験片が破壊に至るまでの間に、クロスヘッドにかかった最大応力値を圧縮強度とする。
【００２２】
本発明の骨補填材は、架橋ゼラチン被覆のエンドトキシン含有量が、例えば、50EU/gゼラチン未満であることが、生体内に導入される材料という観点から好ましい。より好ましくは30EU/gゼラチン未満である。
【００２３】
<製造方法>
本発明の製造方法は、β型リン酸三カルシウムまたは水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体を、ゼラチン溶液に浸漬し、前記多孔質焼結体の外表面及び内表面の少なくとも一部にゼラチン被覆を形成し、次いで加熱することを含む。本発明の製造方法により前記本発明の骨補填材を製造することができる。
【００２４】
本発明の多孔質骨補填材の製造方法を、β型リン酸三カルシウムの場合を例に下記に説明する。この方法は、（１）多孔質β型リン酸三カルシウム焼結体の作製、（２）ゼラチン水溶液への焼結体の浸漬と乾燥、（３）ゼラチンの熱架橋、の３工程を含む。
【００２５】
（１）多孔質焼結体の作製
市販のβ型リン酸三カルシウム（密度３．０７ｇ／ｃｍ３）粉末をボールミル容器に入れ、リン酸三カルシウムの真体積の１．０倍〜３．０倍、好ましくは１．２〜１．５倍の水と、リン酸三カルシウムの質量の０．１〜５％、好ましくは１．０〜２．０％のポリビニルアルコールと、リン酸三カルシウムの質量の０．１〜２．０％、好ましくは０．５〜１．０％のポリアクリル酸塩と粉砕用ボールを加えて４時間以上ボールミルすることにより、リン酸三カルシウムの濃度が５０〜２５体積％のスラリーを得る。
【００２６】
上記スラリーには、焼結時の相転移を防ぐ目的で、０．１〜５．０質量％の酸化マグネシウムまたは水酸化マグネシウムまたは炭酸マグネシウムまたは酢酸マグネシウムまたはこれらの混合物を加えても良い。
【００２７】
得られたスラリーをボールから分離し、スラリー１０ｇあたり０．１〜１．０ｇ、好ましくは０．２〜０．５ｇのポリオキシエチレンアルキルエーテルなどの起泡剤を加えて、調理用泡だて器などを用いて発泡させて発泡スラリーを得る。この発泡スラリーを型枠に入れて、型枠ごと０℃以下の温度に保持して凍結させた後に、凍結乾燥機で乾燥させて多孔質成形体を得る。
【００２８】
多孔質成形体を電気炉に入れ、大気中１１００℃〜１２００℃の温度で焼結して、多孔質焼結体を得る。
【００２９】
（２）ゼラチン水溶液への焼結体の浸漬と乾燥
次に、ゼラチンを純水に０．５〜２質量％になるように溶解し、これに多孔質焼結体を浸して取り出し、０〜１００℃の温度で乾燥させる。β型リン酸三カルシウム多孔質焼結体以外の水酸アパタイトまたはこれらの混合物の多孔質焼結体の場合も同様である。
【００３０】
（３）ゼラチンの熱架橋
ゼラチン水溶液にβ型リン酸三カルシウム多孔質焼結体を浸し、乾燥させた後に、１００℃〜１６０℃、このましくは１２０℃〜１４０℃の温度で常圧もしくは減圧下で保持する。これにより、熱架橋が進行する。熱架橋によってゼラチン分子間の脱水縮合が進行し、それに伴って多孔質焼結体の機械強度が上昇する。
【００３１】
多孔質焼結体に被覆するゼラチンの量を制御するときには、ゼラチン水溶液の濃度を調節するか、ゼラチン水溶液への浸漬、乾燥、熱架橋の工程を数回繰り返すことができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００３３】
［実施例１］
使用した原料は以下の通りである。β型リン酸三カルシウム（太平化学産業製、β−ＴＣＰ−１００）、ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡ、関東化学製ポリビニルアルコール５００）、ポリアクリル酸アンモニウム系分散剤（以下分散剤、花王製、カオーセラ２０００、分散剤濃度５０％）、酸化マグネシウム（高純度化学研究所製）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系起泡剤（以下起泡剤、花王製、エマールＤ−３−Ｄ）、再生医療用ゼラチン（ゼライス株式会社製、ＲＭ−１００）。β型リン酸三カルシウムはメノウ製自動乳鉢で３０分以上粉砕し、粗大凝集粒子を除いておいた。
【００３４】
ポリエチレン製の円筒型容器（内容積３００ｃｍ３）にβ型リン酸三カルシウム粉末３６．４８ｇ（真体積１２．０ｃｍ３）、純水６．０ｍＬ、５％ＰＶＡ水溶液７．０ｍＬ（ＰＶＡ質量０．３５ｇ）、分散剤３．０ｇ、ジルコニア製ボール（直径５．０ｍｍ）を入れ、毎分５０回転の速度で回転させて、スラリーを得た。このスラリー中のβ型リン酸三カルシウムの濃度は約４５体積％となる。その後、焼結時の相転移を防ぐために、スラリーに０．３７ｇの酸化マグネシウムを加え、さらに１時間回転させた。
【００３５】
円筒型容器の内容物から金網を用いてボールを分離したところ、４５ｇのスラリーが得られた。これに９．０ｍＬの起泡剤を加え、調理用の泡だて器で十分に撹拌して発泡スラリーを得た。
【００３６】
発泡スラリーを、直径４．０ｃｍ、高さ５．０ｃｍのポリエチレン製の型枠に入れ、型枠ごと液体窒素蒸気に晒して発泡スラリーを凍結させた。凍結後、凍結乾燥機で乾燥して多孔質成形体を得た。
【００３７】
多孔質成形体を電気炉に入れ、毎分１０℃の昇温速度で加温しながら１２００℃で１２時間焼結した。得られた焼結体を、縦、横、長さそれぞれ約１ｃｍ、１ｃｍ、２ｃｍの直方体に切り出した。上記の操作を繰り返し、５０個以上の直方体試料を作製した。この中から７個の試料を取り分けて、ゼラチンを含まない試料とした。
【００３８】
濃度０．５％、１．０％および２．０％のゼラチン水溶液を調製し、直方体試料を浸した。ゼラチン水溶液はすぐに直方体試料の内部に浸み込むので、すぐに取り出し、紙の上に置いて余分な水溶液を除いたのちに、４℃の冷蔵庫に一晩静置し、さらに室温で真空容器に入れて乾燥させた。その後、１２０℃、１４０℃または１６０℃で真空乾燥してゼラチンを熱架橋した。同一の作製条件の試料を少なくとも７個作製した。
【００３９】
ゼラチンを含まない試料および含んだ試料について、クロスヘッド速度毎分１．０ｍｍで圧縮強度測定を行った。また置換液をエタノールとしたアルキメデス法で試料の気孔率を測定した。ゼラチン含有量は熱重量分析で測定した。
【００４０】
図１に作製した焼結体の電子顕微鏡写真を示す。図１（ａ）はゼラチンを被覆していない焼結しただけのもの（表１に示す試料番号１番）、図１（ｂ）は１．４質量％のゼラチンを被覆したあと、１６０℃で熱架橋したもの（表１に示す試料番号８番）である。ゼラチン被覆の有無に関わらず、気孔径は１００〜３００μｍであり、気孔は互いに連通しており、気孔率は９１．０〜９２．０％であった。
【００４１】
表１に圧縮強度と気孔率に対するゼラチン被覆条件の影響をまとめた。ゼラチンで被覆しない試料（表１中試料１）の圧縮強度は、０．５ＭＰａ以下であったが、約３％のゼラチンを含ませて熱架橋することにより、気孔率が９０％以上で圧縮強度が５ＭＰａ以上の多孔質骨補填材を作製することができた。なお、圧縮強度は熱架橋温度が高くなるにつれて向上し（試料２〜５）、また、１４０℃で熱架橋すれば十分である（試料５と６の比較）ことがわかった。さらに、含ませるゼラチンの量が多くなるほど、圧縮強度が向上することも明らかになった（試料６〜８の比較）。本研究で得られた合成骨材は、市販品（オリンパステルモバイオマテリアル製、商品名オスフェリオン、試料９）よりも気孔率が高く、なおかつ圧縮強度も高いことが示された。
【００４２】
【表１】
2017079838.tif 000002
【００４３】
［実施例２］
実施例１で作製した試料のうち、試料１と試料５から、直径５．０ｍｍ、厚さ３．０ｍｍの円柱状の動物埋入実験用円盤を１０個ずつ切り出し、ガンマ線照射によって滅菌した。
【００４４】
８週齢の雄ウィスター系ラットを２０匹用意し、頭頂部を剃毛して皮膚を切開し、頭蓋冠を露出させた。直径５．２ｍｍの歯科用トレフィンバーを用いて、硬膜を損傷しないように留意しつつ、頭蓋冠に円形の骨欠損を作製した。骨欠損部に埋入用円盤を１個設置し、頭皮を縫合し、感染防止のための抗生物質入り軟膏を塗布し、通常の飼育を行った。
【００４５】
埋入手術の２週間後に、ネンブタール過剰投与によって実験動物を安楽死させ、頭蓋冠を摘出して薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施して光学顕微鏡観察を行った。
【００４６】
図２に組織薄片写真を示す。図２（ａ）は、ゼラチンで被覆しないもの（表１の試料番号１番）、（ｂ）はゼラチンを３．０質量％被覆して１４０℃で熱架橋したもの（表１の試料番号５番）である。図中の（Ａ）は未吸収のリン酸三カルシウム、（Ｂ）は新生骨、（Ｃ）は多孔質焼結体の気孔に相当する場所を示す。ゼラチンで被覆した（ｂ）には、新生骨が認められたが、ゼラチンで被覆しない（ａ）では新生骨が認められなかった。このことから、ゼラチンによるリン酸三カルシウム焼結体の被覆は、新生骨形成を促すことが示されている。また、各群の組織薄片１０枚について、気孔内部に相当する位置での骨芽細胞密度を計数したところ、ゼラチン被覆しない群では０．０１００平方ミリメートル当たり２５．２個（標準偏差０．３）であったのに対し、ゼラチン被覆をした群では０．０１００平方ミリメートル当たり６３．８個（標準偏差０．７）であり、両群には有意の差が見られた。このことは、ゼラチンによる被覆は骨芽細胞の増殖を促していることを示しており、新生骨形成がこれから盛んにおこなわれることを意味している。以上のことから、本発明によって、骨形成を促す骨補填材が作られることが示されている。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、骨の再生医療の分野において有用である。
【図１】
2017079838.tif 000003
【図２】
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