(57)【要約】【課題】本発明の課題は、悪性リンパ腫の処置用の医薬組成物および当該医薬組成物を使用する悪性リンパ腫の処置方法を提供することである。本発明の課題は、また、当該医薬組成物または処置方法の使用のためのコンパニオン診断方法およびそのためのキットを提供することである。【解決手段】悪性リンパ腫を処置するための、ＥＲαアンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。また、悪性リンパ腫の処置を必要としている対象にＥＲαアンタゴニストを投与することを含む、悪性リンパ腫の処置方法を提供する。さらに、対象のリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現レベルを測定することを含む、当該医薬組成物または処置方法の使用のためのコンパニオン診断方法およびそのためのキットを提供する。【選択図】図４
2017214367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性リンパ腫を処置するための、フルベストラントまたはその医薬的に許容し得る塩を含む医薬組成物。
【請求項２】
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞を有する対象における悪性リンパ腫を処置するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
悪性リンパ腫が成熟Ｂ細胞腫瘍である、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
悪性リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
悪性リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
悪性リンパ腫に罹患している対象から得られたリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出することを含む、対象の悪性リンパ腫のフルベストラントによる処置の効果を評価する方法。
【請求項７】
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫のフルベストラントによる処置は有効であると評価する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫をフルベストラントまたはその医薬的に許容し得る塩により処置することを決定する、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象がフルベストラントまたはその医薬的に許容し得る塩による悪性リンパ腫の処置を受けていない、請求項６ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項６ないし請求項９のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、対象から得られたリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬を少なくとも１つ含む、キット。
【請求項１１】
エストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬が、
（ａ）エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）エストロゲン受容体αタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群から選択される、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性リンパ腫の処置用の医薬組成物および当該医薬組成物を使用する悪性リンパ腫の処置方法に関する。本発明はまた、当該医薬組成物または処置方法の使用のためのコンパニオン診断方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性リンパ腫の罹患率は上昇傾向にある（非特許文献１）。従来技術を用いた悪性リンパ腫の標準的治療法は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に対してのＲ−ＣＨＯＰ療法に代表されるように、細胞傷害性抗がん剤と分子標的療法の組み合わせによってなされるが、十分な治療成績は得られていない。たとえば、ＤＬＢＣＬのうち改訂国際予後指標（Ｒ−ＩＰＩ）で高リスクに相当する患者群では、４年の無増悪生存率が５３％、全生存率が５５％である（非特許文献２）。ＤＬＢＣＬ（Ｒ−ＩＰＩ高リスク）のみならず、悪性リンパ腫全般において現行治療法のみでは不十分であり、長期生存率の向上を目的とした新規治療が現在も求められている。
【０００３】
エストロゲンのうち、生理活性の高いエストラジオール（Ｅ２）は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）との相互作用により細胞増殖を促す。近年、造血幹細胞分画に発現するＥＲαがエストロゲン依存性に造血細胞の増殖を制御することがマウスモデルを用いた研究で示された（非特許文献３）。しかしながら、Ｅ２−ＥＲαシグナル伝達経路とヒト造血器腫瘍との関連を明確に示した報告はない。
【０００４】
フルベストラントは、ＥＲα陽性乳癌細胞に対してＥＲαの分解と機能抑制の効果をもつ、ＥＲα選択的ダウンレギュレーターである。既にＥＲα陽性乳癌患者を対象とした大規模臨床試験（フェーズ３）で安全性と有効性が認められている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Katanoda K, et al: Jpn J Clin Oncol. 2015, 45: 390-401
【非特許文献２】Sehn LH, et al: Blood. 2007, 109: 1857-61
【非特許文献３】Nakada D, et al: Nature, 2014; 505: 555-558
【非特許文献４】Di Leo A, et al: J Clin Oncol. 2010 Oct 20;28(30):4594-600
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、悪性リンパ腫の処置用の医薬組成物および当該医薬組成物を使用する悪性リンパ腫の処置方法を提供することを目的とする。本発明はまた、当該医薬組成物または処置方法の使用のためのコンパニオン診断方法およびそのためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、悪性リンパ腫を処置するための、ＥＲαアンタゴニストを含む医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称する）を提供する。
【０００８】
本発明は、また、悪性リンパ腫の処置を必要としている対象にＥＲαアンタゴニストを投与することを含む、悪性リンパ腫の処置方法を提供する。
【０００９】
本発明は、また、悪性リンパ腫に罹患している対象のリンパ系腫瘍細胞におけるＥＲαの発現を検出することを含む、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置の効果を評価する方法（以下、「本発明のコンパニオン診断方法」と称する）およびそのためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、悪性リンパ腫の処置用の医薬組成物および悪性リンパ腫の処置方法が提供される。また、当該医薬組成物または処置方法の使用のためのコンパニオン診断方法およびそのためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＤＬＢＣＬ患者から採取したＥＲα陽性腫瘍細胞の代表的な免疫染色像である。
【図２】図２は、腫瘍細胞におけるＰＡＸ５とＥＲαの蛍光二重染色の結果を示す。
【図３】図３は、ＤＬＢＣＬ由来細胞株におけるＥＲα発現の解析の結果を示す。
【図４】図４は、フルベストラントを投与したＫａｒｐａｓ４２２の細胞増殖を示す。
【図５】図５は、フルベストラントを投与したＫａｒｐａｓ４２２における、各細胞周期の細胞の割合を示す。
【図６】図６は、様々な濃度のフルベストラントを投与したＫａｒｐａｓ４２２の細胞増殖を示す。
【図７】図７は、様々な濃度のフルベストラントを投与したＳＵＤＨＬ９の細胞増殖を示す。
【図８】図８は、様々な濃度のフルベストラントを投与したＯＣＩ−Ｌｙ７の細胞増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１３】
本発明に関して、ＥＲαアンタゴニストは、エストロゲン受容体αの機能を抑制する化合物を意味し、例えば、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェンおよびラロキシフェンが含まれる。本発明のある実施態様では、ＥＲαアンタゴニストは、フルベストラントまたはタモキシフェンである。本発明のある実施態様では、ＥＲαアンタゴニストは、ＥＲα選択的ダウンレギュレーター、特にフルベストラントである。
【００１４】
本発明に関して、「フルベストラント」は、下記の構造式
【化１】
2017214367.tif 000003
で表される、７α−［９−（４,４,５,５,５−ペンタフルオロペンチルスルフィニル）ノニル］エストラ−１,３,５（１０）−トリエン−３,１７β−ジオールを意味する。フルベストラントは、当分野で公知の化合物であり、例えば、特開昭６０−９７９９５、特にその例３５に記載の方法により製造することができる。
【００１５】
本発明に関して、「タモキシフェン」は、下記の構造式
【化２】
2017214367.tif 000004
で表される、２−｛４−［（１Ｚ）−１，２−ジフェニルブト−１−エン−１−イル］フェノキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミンを意味する。タモキシフェンは当分野で公知の化合物であり、公知の方法により製造することができる。
【００１６】
本発明に関して、ＥＲαアンタゴニストは、その医薬的に許容し得る塩、エステル、および、それらの溶媒和物であってもよい。ＥＲαアンタゴニストは、ラセミ混合物であってもよく、立体異性的に純粋であってもよい。
【００１７】
医薬的に許容し得る塩は、ＥＲαアンタゴニストの無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸とのもの、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
【００１８】
また、医薬的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩であり得、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミンまたはメチルピペリジン）から誘導されるアンモニウム塩である。
【００１９】
本発明に関して、「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している化合物を意味する。水和物は、溶媒分子が水である溶媒和物である。
【００２０】
本発明に関して、「エステル」は、インビボで加水分解されるエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例は、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルを含む。
【００２１】
本発明に関して、「悪性リンパ腫」は、リンパ系組織から発生する悪性腫瘍を意味し、特に、成熟Ｂ細胞腫瘍、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、特に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。本発明のある実施態様では、悪性リンパ腫は、リンパ系腫瘍細胞がエストロゲン受容体αを発現するものである。
【００２２】
本発明に関して、「処置する」または「処置」は、疾患に罹患しているか、または、疾患に罹患したことのある対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味し、特に、腫瘍を縮小すること、縮小した腫瘍の再増大を防止すること（維持療法）、および／または、初期治療後の再発を抑制すること（補助療法）を意味する。
【００２３】
本発明に関して、「対象」または「患者」は、哺乳動物、特にヒトである。本発明のある実施態様では、対象は、エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞を有する。
【００２４】
本発明に関して、「医薬組成物」は、ＥＲαアンタゴニストを、不活性、非毒性の医薬的に適する補助剤と共に含む組成物を意味する。医薬組成物は、常套法で、既知方法により、例えば、ＥＲαアンタゴニストを上記補助剤と混合することにより、製造できる。また、公知のフルベストラント製剤、例えば、Di Leo A, et al: J Clin Oncol. 2010 Oct 20;28(30):4594-600、特許第２９１８０４２号、特許第３７１３２３７号、特許第４２９５０８７号に記載のもの、例えば、フェソロデックス（登録商標）筋注（アストラゼネカ社）と同等の組成の製剤を、医薬組成物として使用し得る。
【００２５】
本発明に関して、医薬組成物は、例えば、総重量の約０.０１％ないし約９９.９％、約０.１％ないし約５０％、約０.５％ないし約２５％、約３％ないし約１０％、約４％ないし約９％、約４％ないし約８％、約４％ないし約７％、約４％ないし約６％、例えば約５％のＥＲαアンタゴニストを含み得る。
【００２６】
本発明に関して、ＥＲαアンタゴニストの有効量は、処置する疾患の重症度、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、投与形態、排出速度、併用する他の薬剤などの多くの要因に依存する。ある状況でのＥＲαアンタゴニストの有効量は、日常的な実験によって、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で、容易に決定することができる。本発明に関して、ＥＲαアンタゴニストとしてフルベストラントを使用する場合、その有効量は、単回投与量で、例えば約０.０１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約０.１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または、約５〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ある実施態様では、フルベストラントの単回投与量は約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２７】
それにも拘わらず、必要に応じて、上述の量から逸脱することが必要であり得る。従って、上述の最小量より少なくても十分な場合があり得、一方上述の上限を超えなければならない場合もある。比較的大量に投与する場合、これらを１日に亘る複数の個別用量に分配するのが望ましいことがある。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、１日１回、またはそれ以上、例えば、１日２回、３回または４回投与することができる。本発明の医薬組成物は毎日投与してもよく、２日ないし数ヶ月の投与間隔で投与してもよい。ある実施態様では、本発明の医薬組成物を、最初に投与してから２週後、４週後、その後４週ごとに１回投与する。
【００２９】
本発明に関して、ＥＲαアンタゴニストは、全身的および／または局所的作用を有し得る。この目的で、それらは、適する方法で、例えば、経口で、非経腸で、肺に、鼻腔に、舌下に、直腸に、皮膚に、経皮で、もしくは経膣で、またはインプラントもしくはステントとして、各投与経路に適する投与形で投与できる。
【００３０】
経口投与に適するのは、先行技術に準じて機能し、ＥＲαアンタゴニストを迅速に、かつ／または、改変された方法で送達し、ＥＲαアンタゴニストを結晶形および／または無定形および／または溶解形で含有するものであり、例えば、錠剤（非被覆および被覆錠剤、例えば、胃液耐性であるか、または、不溶であるかもしくは遅延して溶解し、有効成分の放出を制御する被覆を有する錠剤）、口中で迅速に崩壊する錠剤、またはフィルム／オブラート、フィルム／凍結乾燥剤、カプセル剤（例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル剤）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、粉末剤、乳剤、懸濁剤、エアゾル剤または液剤である。
【００３１】
非経腸投与は、吸収段階を回避して（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内に）、または吸収を含めて（例えば、関節内、吸入、筋肉内、皮下、皮内、経皮、経膣または腹腔内）、行うことができる。非経腸投与に適する投与形は、とりわけ、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤または滅菌粉末剤形態の注射および点滴用製剤である。本発明のある実施態様では、フルベストラントを、筋肉内注射により投与する。
【００３２】
他の投与経路に適するのは、例えば、吸入用医薬形態（とりわけ、粉末吸入器、噴霧器エアロゾル）、点鼻薬、液、スプレー；舌投与用の錠剤、フィルム／オブラートまたはカプセル剤、坐剤、膣用カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチ）、ミルク、ペースト、フォーム、散布用粉末剤、インプラントまたはステントである。
【００３３】
ＥＲαアンタゴニストを、不活性、非毒性、医薬的に適する補助剤と混合することにより、それ自体既知の方法で上述の投与形に変換できる。これらの補助剤には、とりわけ、担体（例えば結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば液体ポリエチレングリコール類）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えばアルブミン）、安定化剤（例えば抗酸化剤、例えばアスコルビン酸など）、着色料（例えば無機色素、例えば酸化鉄など）および香味および／または臭気の隠蔽剤が含まれる。
【００３４】
非経口投与に適した投与形として、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤および増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。例えば、フルベストラントの筋肉内注射のための投与形は、水、エタノール、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ヒマシ油等を含み得る。注射用の投与形は、密閉したアンプルやバイアル中に提供されてもよく、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えるだけでよい凍結乾燥物として提供されてもよい。注射溶液および懸濁液を、粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【００３５】
ＥＲαアンタゴニストを、さらなる有効成分と組み合わせることも可能である。さらなる有効成分としては、例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、エトポシド等の抗癌剤、イブルチニブ等のブルトンキナーゼ阻害剤、並びに他のＥＲαアンタゴニストが挙げられる。
【００３６】
さらなる有効成分およびその治療上有効量は、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で決定され得る。さらなる有効成分は、ＥＲαアンタゴニストと同一の医薬製剤中に存在してもよく、ＥＲαアンタゴニストとは別に提供されてもよい。
【００３７】
本発明に関して、成分を「組み合わせる」または「併用する」ことは、全成分を含有する投与形の使用および各成分を別個に含有する投与形の組合せの使用のみならず、それらが悪性リンパ腫の処置に使用される限り、各成分を同時もしくは連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種以上のさらなる有効成分をＥＲαアンタゴニストと組み合わせて使用することも可能である。
【００３８】
本発明の医薬組成物による悪性リンパ腫の処置は、化学療法、放射線療法、免疫療法、造血幹細胞移植および外科手術等の他の療法と並行して、または、それらの前または後に、行ってもよい。
【００３９】
本発明のある態様では、悪性リンパ腫の処置用のＥＲαアンタゴニストが提供される。本発明の別の態様では、悪性リンパ腫の処置用の医薬組成物の製造における、ＥＲαアンタゴニストの使用が提供される。本発明のさらなる態様では、ＥＲαアンタゴニストを対象に投与することを含む、悪性リンパ腫の処置方法が提供される。
【００４０】
本発明の別の態様では、コンパニオン診断方法が提供される。これは、悪性リンパ腫に罹患している対象のリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出することを含む、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置の効果を評価する方法である。ある実施態様では、エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置は有効であると評価する。ある実施態様では、エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出されない場合に、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置は有効ではないと評価する。さらなる実施態様では、エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫をＥＲαアンタゴニストにより処置することを決定する。ある実施態様では、エストロゲン受容体αを発現しているリンパ系腫瘍細胞が検出されない場合に、対象の悪性リンパ腫をＥＲαアンタゴニストにより処置しないことを決定する。
【００４１】
本発明のコンパニオン診断方法は、ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置の前、最中、または後に実施することができる。ある実施態様では、ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置を受けていない対象に、本発明のコンパニオン診断方法を実施し、対象の悪性リンパ腫をＥＲαアンタゴニストにより処置するか否かを決定する。ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置を受けていない対象には、当該処置を受けたことのない対象、および、当該処置を受けたことがあるが、コンパニオン診断方法を実施する時点では受けていない対象が含まれる。別の実施態様では、ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置を受けている対象に、本発明のコンパニオン診断方法を実施し、処置を継続するか否かを決定する。また別の実施態様では、ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置を受けている対象に、本発明のコンパニオン診断方法を実施し、その結果を複数の時点で比較することにより、ＥＲαアンタゴニストによる処置を継続するか否かを決定する。
【００４２】
本発明のコンパニオン診断方法には、悪性リンパ腫に罹患している対象から得られたリンパ系腫瘍細胞を使用し得る。本発明に関して、「リンパ系腫瘍細胞」は、リンパ系組織に由来する腫瘍細胞を意味する。当分野で公知のいかなる方法により、対象からリンパ系腫瘍細胞を採取してもよい。リンパ系腫瘍細胞を含むことが疑われる組織または生検材料をそのまま使用してもよく、そのような組織または生検材料から、リンパ系腫瘍細胞を精製してもよい。リンパ系腫瘍細胞を含むことが疑われる組織または生検材料には、例えば、リンパ節、血液、骨髄、扁桃、脾臓、皮膚、皮下組織、脳、眼球、鼻腔、副鼻腔、心臓、肺、縦隔腫瘍、肝臓、空腸、回腸、結腸、直腸、子宮、卵巣、精巣、腎臓、膀胱が含まれる。
【００４３】
本発明のコンパニオン診断方法では、当分野で公知のいかなる方法を用いてエストロゲン受容体αの発現を検出してもよい。ある実施態様では、エストロゲン受容体α遺伝子の転写産物を検出することにより、発現を検出することができる。エストロゲン受容体α遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するエストロゲン受容体αタンパク質をコードする塩基配列である。本願に関して、エストロゲン受容体α遺伝子には、エストロゲン受容体α遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。
【００４４】
さらに、エストロゲン受容体α遺伝子には、エストロゲン受容体α遺伝子の塩基配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。配列同一性とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００４５】
例えば、エストロゲン受容体αのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを使用して検出することができる。検出は、チップ上またはアレイ上で実施されてもよい。当業者は、エストロゲン受容体α遺伝子の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、エストロゲン受容体α遺伝子の全部または一部、例えば実施例３で使用するプライマー（配列番号２〜５）の配列に基づいてプローブを調製し得るが、これらに限定されない。必要に応じて、当分野で公知の方法を用いて、色素、蛍光、同位体および酵素などの好適な標識によりプローブを標識し、ハイブリダイズした標識を検出することにより、ｍＲＮＡを検出してもよい。
【００４６】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、エストロゲン受容体αに特異的なプライマーを使用して、エストロゲン受容体αの転写産物を検出することもできる。そのようなプライマーも、エストロゲン受容体α遺伝子の配列情報に基づき調製され得る。例えば、実施例３で使用するプライマー（配列番号２〜５）を使用し得るが、これらに限定されない。
【００４７】
別の実施態様では、エストロゲン受容体α遺伝子の翻訳産物を検出することにより、エストロゲン受容体αの発現を検出することができる。例えば、エストロゲン受容体αタンパク質を検出することができる。エストロゲン受容体αタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列である。本願に関して、エストロゲン受容体タンパク質には、エストロゲン受容体タンパク質のアミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。置換、欠失または付加されるアミノ酸残基の数および位置は、エストロゲン受容体の機能が維持される限り、任意である。
【００４８】
タンパク質を検出する方法には、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を使用するイムノアッセイ法（免疫組織化学、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティングなど）が含まれる。抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。さらに、断片がエストロゲン受容体αタンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を使用することができる。抗体を調製する方法は当分野で公知であり、本発明においては、任意の方法を利用してそのような抗体および抗体の任意の断片または改変体を調製し得る。あるいは、販売されている抗体を使用し得る。必要に応じて、当分野で公知の方法を用いて、色素、蛍光、同位体および酵素などの好適な標識により抗体を標識し、結合した標識を検出することにより、タンパク質を検出してもよい。
【００４９】
あるいは、エストロゲン受容体αの生物学的活性を検出することにより、エストロゲン受容体αの発現を検出することができる。例えば、蛍光標識リガンド、放射性標識リガンド等の標識リガンドを用いるリガンド結合アッセイにより、エストロゲン受容体αの生物学的活性を検出し得る。あるいは、エストロゲン受容体の転写因子としての活性をレポーターアッセイ等により検出し得る。
【００５０】
本発明のコンパニオン診断方法に関して、エストロゲン受容体αを発現しないリンパ腫系の培養細胞、例えば、エストロゲン受容体αを発現しないＤＬＢＣＬ系の培養細胞、例えば、ＯＣＩ−Ｌｙ７を対照とし得る。例えば、対象のリンパ系腫瘍細胞において、エストロゲン受容体αを示す指標、例えば、エストロゲン受容体αのｍＲＮＡ、タンパク質または生物学的活性を示す指標が、対照よりも有意に高ければ、リンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現が検出されたと判定し得る。
【００５１】
本発明のある態様は、本発明のコンパニオン診断方法のためのキットを提供する。該キットは、対象のリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬を少なくとも１つ含む。
【００５２】
ある実施態様では、対象のリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬は、以下の群から選択される；
（ａ）エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）エストロゲン受容体αの生物学的活性を検出するための試薬。
【００５３】
エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための試薬には、エストロゲン受容体αｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、エストロゲン受容体αｍＲＮＡに特異的に結合するか、または、エストロゲン受容体αｍＲＮＡを特異的に同定する核酸が含まれる。これらのオリゴヌクレオチドの例は、エストロゲン受容体αｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。当業者は、エストロゲン受容体α遺伝子の配列情報を利用して、そのようなプライマーおよびプローブを調製することができる。例えば、プライマーおよびプローブは、エストロゲン受容体α遺伝子の全部または一部、例えば、実施例３で使用するプライマー（配列番号２〜５）の配列に基づくものであり得るが、これらに限定されない。エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための試薬は、色素、蛍光、同位体および酵素などの好適な標識により標識されていてもよい。また、チップまたはアレイ等の固体マトリックス上に固定化されていてもよい。さらに、エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５４】
エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための試薬には、エストロゲン受容体αタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。さらに、断片がエストロゲン受容体αタンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変体（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、試薬として使用することができる。抗体を調製する方法は当分野で公知であり、本発明においては、任意の方法を利用してそのような抗体および抗体の任意の断片または改変体を調製し得る。エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための試薬は、色素、蛍光、同位体および酵素などの好適な標識により標識されていてもよい。また、プラスチックチューブ、マイクロプレート、ガラスビーズ等の固体マトリックス上に固定化されていてもよい。さらに、エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５５】
エストロゲン受容体αの生物学的活性を検出するための試薬には、エストロゲン受容体αタンパク質のリガンド結合能を測定するための蛍光標識リガンド、放射性標識リガンド等の標識リガンドが含まれる。あるいは、エストロゲン受容体αの転写因子としての活性を測定するためのレポーターアッセイ用の試薬、例えば、エストロゲン受容体α作動性のプロモーター配列を含むレポーターコンストラクトを含むベクター等であり得る。さらに、エストロゲン受容体αの生物学的活性を検出するための複数の試薬が、キットに含まれていてもよい。
【００５６】
キットは、前記試薬を複数含み得る。さらに、キットは、エストロゲン受容体α陽性または陰性の対照試料または対照試薬を含み得る。さらに、キットは、緩衝液、希釈剤、使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを有する容器に含まれ得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。
【００５７】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］
悪性リンパ腫を処置するための、ＥＲαアンタゴニストを含む医薬組成物。
［２］
ＥＲαアンタゴニストがフルベストラントまたはその医薬的に許容し得る塩である、第１項に記載の医薬組成物。
［３］
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞を有する対象における悪性リンパ腫を処置するための、第１項または第２項に記載の医薬組成物。
［４］
悪性リンパ腫が成熟Ｂ細胞腫瘍である、第１項ないし第３項のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］
悪性リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫である、第１項ないし第４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］
悪性リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、第１項ないし第５項のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］
悪性リンパ腫に罹患している対象から得られたリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出することを含む、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置の効果を評価する方法。
［８］
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫のＥＲαアンタゴニストによる処置は有効であると評価する、第７項に記載の方法。
［９］
エストロゲン受容体αを発現するリンパ系腫瘍細胞が検出された場合に、対象の悪性リンパ腫をＥＲαアンタゴニストにより処置することを決定する、第７項または第８項に記載の方法。
［１０］
対象がＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置を受けていない、第７項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］
ＥＲαアンタゴニストがフルベストラントまたはその医薬的に許容し得る塩である、第７項ないし第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］
第７項ないし第１１項のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、対象から得られたリンパ系腫瘍細胞におけるエストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬を少なくとも１つ含む、キット。
［１３］
エストロゲン受容体αの発現を検出するための試薬が、
（ａ）エストロゲン受容体αｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）エストロゲン受容体αタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）エストロゲン受容体αタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群から選択される、第１２項に記載のキット。
【００５８】
本発明に関する上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例１】
【００５９】
実施例１  ＤＬＢＣＬにおけるＥＲα発現解析スクリーニング
２９１人のＤＬＢＣＬ患者のリンパ節、脾臓、扁桃、節外臓器から、生検術、摘出術により採取した腫瘍細胞のホルマリン固定パラフィン包埋切片（ＦＦＰＥ）サンプルを作成し、抗ＥＲα抗体による免疫染色により、ＥＲαの発現についてスクリーニングした。
【００６０】
免疫染色の条件は以下の通りであった。
賦活Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ；１０倍希釈、９５℃、４０分間
ペルオキシダーゼブロック；１０分間
プロテインブロック；１５分間
一次抗体（Envision FLEX-ER（EP1）, DACO）；２倍希釈、３０分間
マウスリンカー；１０分間
ポリマー（DACO REAL EnVision HRP RABBIT/MOUSE）；３０分間
ＤＡＢ；５分間
核染色；２分間
【００６１】
ＤＬＢＣＬの約２５％の症例で、核内が抗ＥＲα抗体で染色される細胞が検出された。これは、ＥＲαが発現されていることを示す。ＥＲα陽性サンプルの代表的な免疫染色像（７６歳男性から得られたサンプル）を図１に示す。この患者では、ＦＩＳＨ法で細胞全体の８３％がＩｇＨ／ＢＣＬ２陽性であり、このことは、腫瘍細胞がＢＣＬ２を発現することを意味する。
【実施例２】
【００６２】
実施例２  蛍光二重染色によるＥＲα発現細胞の同定
実施例１においてＥＲαを発現していると判明した７６歳男性の患者のサンプルで、ＰＡＸ５（Ｂ細胞マーカー）とＥＲαの蛍光二重染色を行った。
【００６３】
免疫染色の条件は以下の通りであった。
賦活Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ；１０倍希釈、９５℃、４０分間
ＴｒｉｔｏｎＸ（０.１％）；１５分間
プロテインブロック；１５分間
一次抗体；６０分間
ＥＲα（Envision FLEX-ER（EP1）, DACO)；２倍希釈
ＰＡＸ５（biocare medical）；５０倍希釈
二次抗体；６０分間
Donkey IgG-FITC（抗マウス）２００倍希釈
Donkey IgG-Alexa555（抗ラビット）２００倍希釈
ＤＡＰＩで封入
【００６４】
結果を図２に示す。この症例で、ＥＲα（下）とＰＡＸ５（中央）が共局在しているのが見られた。これは、ＥＲα陽性細胞はＰＡＸ５陽性細胞であることを示す。これらの結果は、腫瘍性Ｂ細胞がＥＲαを発現していることを示す。他の症例においても、ＥＲα陽性細胞がびまん性に認められるので、これらは腫瘍細胞であると考えられる。
【実施例３】
【００６５】
実施例３  ＤＬＢＣＬ由来細胞株におけるＥＲα発現の解析
ＤＬＢＣＬ由来細胞株であるＫａｒｐａｓ４２２、ＳＵＤＨＬ９、ＯＣＩ−Ｌｙ７およびＦＬ３１８からｃＤＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＥＳＲ１およびＥＳＲ２（各々ＥＲαおよびＥＲβをコードする遺伝子）の発現を調べた。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲ法の条件は以下の通りであった。
変性；９４℃、１０分間
ＰＣＲ増幅；［９４℃；１５秒間、６０℃；３０秒間、６８℃；４０秒間］を４０サイクル
最終の伸長；６８℃、５分間
プライマー：
ＥＳＲ１（ＥＲα）フォワードプライマー：
ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号２）
ＥＳＲ１（ＥＲα）リバースプライマー：
ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡ（配列番号３）
ＥＳＲ２（ＥＲβ）フォワードプライマー：
ＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＣ（配列番号４）
ＥＳＲ２（ＥＲβ）リバースプライマー：
ＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＣＡＴＣ（配列番号５）
【００６７】
結果を図３に示す。Ｋａｒｐａｓ４２２、ＳＵＤＨＬ９およびＦＬ３１８に、ＥＲαの遺伝子であるＥＳＲ１の発現が確認された。また、Ｋａｒｐａｓ４２２およびＯＣＩ−Ｌｙ７にＥＳＲ２の発現が確認された。
【実施例４】
【００６８】
実施例４  Ｋａｒｐａｓ４２２の細胞増殖
Ｋａｒｐａｓ４２２においてＥ２（エストラジオール）およびフルベストラントが細胞増殖に与える影響を検討した。
【００６９】
材料および試薬
ＲＰＭＩ１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地＋フェノールレッド）ＷＡＣＯ
ＦＣＳ、ペニシリン（Ｐｅｎ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）
ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド不含）ＧＩＢＣＯ、活性炭処理済みＦＢＳ
エスラジオール（Ｅ２；シグマアルドリッチ）
フルベストラント（Ｆｕｌ；シグマアルドリッチ）
【００７０】
Ｋａｒｐａｓ４２２をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／ＳＭ（Ｔ２５フラスコ中、全部で１０ｍｌ）で培養し、対数増殖期初期（２×１０５）を実現した。細胞の形態を確認し、細胞の状態が良好であること（円型で明るい、近傍の細胞と房状に増殖）、コンタミネーションがないことを確認した。トリパンブルーを用いて生細胞率を確認した。
【００７１】
以下の工程により、Ｋａｒｐａｓ４２２に対するＥ２／Ｆｕｌ添加実験を実施した。
（１）ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／ＳＭで培養中のＫａｒｐａｓ４２２が、対数増殖期初期ないし中期にあること、および、生細胞率５％以上であることを確認した。
（２）Ｋａｒｐａｓ４２２を３.０×１０５／ｍｌに調整し、細胞液１ｍｌを２４ウェルプレートに播いた。
（３）１μｌのエタノール、または、エタノールに溶解した１μＭ、１００μＭもしくは１ｍＭのＥ２（最終濃度１ｎＭ、１００ｎＭもしくは１μＭ）を、１μｌのエタノール、または、エタノールに溶解した１０ｍＭのＦｕｌ（最終濃度１０μＭ）と共に、ウェルに添加した。
（４）ＣＯ２インキュベーター中で培養し、４８時間後および７２時間後に細胞数および生細胞率を評価した。
【００７２】
結果を図４に示す。フルベストラント（１０μＭ）を添加して培養したＫａｒｐａｓ４２２では、細胞増殖が抑制された。
【実施例５】
【００７３】
実施例５  Ｋａｒｐａｓ４２２の細胞周期解析
Ｋａｒｐａｓ４２２にフルベストラントを投与し、その細胞周期への影響を計測した。
【００７４】
材料および試薬
【表１】
2017214367.tif 000005
【００７５】
通常培地（ＴＩＬ＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中のＫａｒｐａｓ４２２（生細胞率９７％）を、細胞３．３ｘ１０５個／ｍｌの密度で、３．０ｍｌずつ、６ウェルプレートに分注した。各ウェルに、「３μｌの１ｍＭフルベストラント（最終濃度１μＭ）＋２７μｌの１００％ＥｔＯＨ」または「３μｌの１０ｍＭフルベストラント（最終濃度１０μＭ）＋２７μｌの１００％ＥｔＯＨ」または「３０μｌの１０ｍＭフルベストラント（最終濃度１００μＭ）」または「３０μｌの１００％ＥｔＯＨ」を添加した。細胞周期解析の条件設定のため、非処理サンプルも作成した。細胞を３７℃、ＣＯ２５％中、１２時間培養した。
【００７６】
ＢｒｄＵによる細胞のラベリング
３０μｌの１ｎＭ ＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ）をウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２中、２時間培養した。培養液を滅菌１.５ｍｌチューブに移し、遠心分離（２００ｇ、５分間、室温）し、細胞をペレットにした。
【００７７】
細胞の固定と細胞膜浸透化
ペレットを１ｍｌの Stain Buffer で洗浄し、２００ｇ、５分間、室温で遠心分離し、細胞をペレットにした。１００μｌの BD Cytofix/Cytoperm Buffer を添加し、２０分間氷上に静置した。１ｍｌの１ｘ BD Perm/Wash Bufferで細胞を洗浄（遠心分離：２,００ｇ、５分間、室温）し、細胞をペレットにした。１００μｌの BD Cytoperm Plus Buffer をペレットに添加し、１０分間氷上で静置した。１ｍｌの１ｘ BD Perm/Wash Buffer で洗浄し、細胞をペレットにした。１００μｌの BD Cytofix/Cytoperm Buffer をペレットに添加し、１０分間氷上で静置した。１ｍｌの１ｘ BD Perm/Wash Buffer で洗浄し、細胞をペレットにした。
【００７８】
ＢｒｄＵ染色およびＦＡＣＳ解析
１００μｌの３００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（最終ＤＮａｓｅ３０μｇ）をペレットに添加し、３７℃で、１時間インキュベートした。１ｍｌの１ｘ BD Perm/Wash Buffer で洗浄し、細胞をペレットにした。希釈したＡＰＣ−抗ＢｒｄＵ抗体５０μｌを、フルベストラントまたはＥｔＯＨ添加群に加え、室温で２０分間インキュベートした。１ｍｌの１ｘ BD Perm/Wash Buffer で洗浄し、細胞をペレットにした。細胞を２０μｌの７−ＡＡＤで再懸濁した。１ｍｌの Stain Buffer を細胞に加え、ＦＡＣＳ用チューブへ移し、BD Accuri（商標）C6 フローサイトメーターによりＦＡＣＳ解析し、全細胞に対するＧ０〜Ｇ２およびＳ期の細胞の割合を各々算出した。
【００７９】
結果を図５に示す。フルベストラントあるいはエタノールを添加して培養したＫａｒｐａｓ４２２では、添加の１２時間後にＳ期細胞がフルベストラントの濃度依存的に減少することが確認された。
【実施例６】
【００８０】
実施例６  ＥＳＲ１陽性および陰性細胞の細胞増殖
ＥＳＲ１陽性株であるＫａｒｐａｓ４２２およびＳＵＤＨＬ９（ＴＩＬ＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中）、並びに、ＥＳＲ１陰性株であるＯＣＩ−Ｌｙ７（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中）を、エタノール、フルベストラント（１μＭ）、フルベストラント（１０μＭ）、フルベストラント（１００μＭ）の存在下で培養し、細胞数を経時的に測定した。
【００８１】
結果を図６〜８に示す。Ｋａｒｐａｓ４２２およびＳＵＤＨＬ９では、培養開始から４８時間の時点でフルベストラントの濃度依存性に増殖に抑制の傾向が認められた（図６および７）。フルベストラント（１００μＭ）で、ＯＣＩ−Ｌｙ７に増殖抑制が認められた（図８）。このことから、フルベストラント（１００μＭ）はＥＳＲ１遺伝子の発現に関係なく、非特異的な細胞毒性を生じていると考えられた。従って、以下のマイクロアレイ解析には、フルベストラント（１０μＭ）を使用した。
【実施例７】
【００８２】
実施例７  Ｋａｒｐａｓ４２２の遺伝子発現解析
Ｋａｒｐａｓ４２２にフルベストラントを投与し、各種の遺伝子の発現を測定した。
【００８３】
通常培地（ＴＩＬ＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中のＫａｒｐａｓ４２２（生細胞率９４％）を、細胞４．２ｘ１０５個／ｍｌの密度で、３．０ｍｌずつ、６ウェルプレートに分注した。各ウェルに、「３０μｌの１００％ＥｔＯＨ」または「３μｌの１０ｍＭフルベストラント（最終濃度１０μＭ）＋２７μｌの１００％ＥｔＯＨ」を添加した。細胞周期解析の条件設定のため、非処理サンプルも作成した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２中、それぞれ１時間、３時間、６時間、１８時間培養した。
【００８４】
１時間後に５％ＣＯ２インキュベーター内の細胞液を１５ｍｌチューブに回収し、１０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心し、上清を除去後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてピペッティングにより溶解させた。この溶解液（以下ＩＳＯＧＥＮ溶液と呼ぶ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し替えた後に、ボルテックスし、−８０℃で保存した。
【００８５】
３時間後、６時間後、１８時間後も同様に行い、各ＩＳＯＧＥＮ溶液を−８０℃で保存した。ＩＳＯＧＥＮ溶液を室温で解凍し、クロロホルムを用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ＥｔＯＨ添加のＫａｒｐａｓ４２２の遺伝子発現と、１０μＭフルベストラント添加のＫａｒｐａｓ４２２の遺伝子発現を比較する目的で、SurePrint G3 Human GE v3.0 によるマイクロアレイ解析を行った。結果を図９および１０並びに表２に示す。ＫＥＧＧ解析の結果、ＭＫＰ、ＪＮＫ、Ｃｄｃ４２、ｃ−ｆｏｓおよびＪＵＮなどのＭＡＰキナーゼ経路に関する遺伝子発現に有意な変化が認められた（ｐ＜０．０５）。この結果から、フルベストラントはＭＡＰＫ経路を介した細胞周期停止をもたらすと考えられる。
【表２】
2017214367.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、ＥＲαアンタゴニストによる悪性リンパ腫の処置が可能になる。例えば、既に医薬として使用されているか、またはそのための試験が進められているＥＲαアンタゴニストを用いることにより、開発コストを抑制しつつ、安全かつ有効な処置を提供し得る。
【図１】
2017214367.tif 000007
【図２】
2017214367.tif 000008
【図３】
2017214367.tif 000009
【図４】
2017214367.tif 000010
【図５】
2017214367.tif 000011
【図６】
2017214367.tif 000012
【図７】
2017214367.tif 000013
【図８】
2017214367.tif 000014
【配列表】
2017214367000001.app