(57)【要約】【課題】サルコペニアのモデルマウスを提供する。【解決手段】骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを発現させたＴＧマウスを作製し、骨格筋特異的に小胞体ストレスが亢進していることを確認した。更に、本発明のＴＧマウスにＡＰ２０１８７を投与することにより、小胞体ストレスを骨格筋特異的に更に亢進できることを見出した。また、本発明のＴＧマウスがサルコペニアの病態を再現することを見出した。この結果、サルコペニアのモデルマウスとして本発明のＴＧマウスが使用できることを明らかにした。また、本発明のＴＧマウスを使用することにより、サルコペニアの治療剤のスクリーニングが可能になった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）のモデルマウスであって、
ａ）ヒト骨格筋α−アクチンプロモーターの下流に、
ｂ）Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫをコードするｃＤＮＡと、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリＡシグナル（ｂＧＨｐＡ）が直列に結合しているｃＤＮＡを用いて、
ｃ）骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが発現するようになっている
ことを特徴とする、トランスジェニック（ＴＧ）マウス。
【請求項２】
上記マウスが、Ｃ５７／ＢＬ６由来であることを特徴とする、請求項１に記載のＴＧマウス。
【請求項３】
Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現量が、骨格筋において内在性のＰＥＲＫ発現量の４００倍以上であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＴＧマウス。
【請求項４】
Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現量が、骨格筋において内在性のＰＥＲＫ発現量の５００倍以上であることを特徴とする、請求項１又は２のＴＧマウス。
【請求項５】
ＡＰ依存的に小胞体ストレスなどを惹起せずに、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）依存的に骨格筋のみでＰＥＲＫ経路のみを活性化できることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のＴＧマウス。
【請求項６】
上記請求項１〜５のいずれかに記載のＴＧマウスを用いる、サルコペニアのモデルマウス。
【請求項７】
上記請求項１〜５のいずれかのＴＧマウスにＡＰを投与して得られる、請求項６のサルコペニアの重症化モデルマウス。
【請求項８】
上記請求項６又は７のサルコペニアのモデルマウスを用いて、評価サンプルを投与し、骨格筋重量の低下や筋力の低下の抑制効果を評価することである、サルコペニアの治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＡＰ投与量が、腹腔内に０．５〜５ｍｇ／ｋｇを投与することである、請求項８に記載のサルコペニアの治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、サルコペニアの治療剤評価方法に関するものであり、特に骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを発現するトランスジェニックマウスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）は、高齢者の転倒と寝たきりにつながる病態として、その成因解明や予防又は治療剤の開発が注目されている疾患である。サルコペニアの主な要因として，加齢に伴う身体活動の低下があり、更に加齢に伴って変化する栄養状態の変化，内分泌系の変化（ホルモン，サイトカイン，液性因子）など、さまざまな要因が関与していると考えられている。これらの影響により、筋タンパク合成と分解のアンバランスによる筋タンパクの減少が誘導され筋萎縮が生じる。そして、同時に筋代謝能の低下、ミトコンドリア機能低下、低レベルの持続性炎症なども生じて、筋量・筋力低下を引き起こすと考えられている。
サルコペニア発症の分子メカニズムは図１に示すものである。加齢やインスリン抵抗性を背景に、インスリンやＩＧＦ−１のシグナル不全、低レベルの持続性炎症、ミトコンドリア機能低下などが生じる。その結果、筋タンパク合成の低下や筋タンパク分解の亢進、また筋再生を担う筋サテライト細胞数や機能が低下することにより、サルコペニアが発症すると考えられている（非特許文献１）。【０００３】  上記筋タンパクの恒常性の破綻についてはある程度研究が進んでいるが、不明なことが多く、筋の再生能に関してはその調節メカニズムも明らかとはなっていない。これらのことが明らかとなれば、サルコペニアの治療方法として、運動やアミノ酸摂取といった代表的な治療方法以外に、サルコペニアに対する予防剤又は治療剤の開発が可能になる。そのためには、ヒトサルコペニアの表現型を有し、かつ汎用性の高い動物モデルの確立が重要課題であると考えられる。
従って、上記動物モデルが確立されると、それを用いてスクリーニング系を構築し、サルコペニアに対する予防または治療剤の開発が可能になる。従って、新たなサルコペニアの動物モデルの作成とそれを用いたスクリーニング方法が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本老年医学会雑誌５０巻６号７６６−７６９（２０１３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、サルコペニアのモデルマウスの作製とそれを用いた治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  骨格筋は、生体の最大のエネルギー消費器官であり、唯一の運動器官である。骨格筋の収縮や弛緩は、筋線維内の筋小胞体からのカルシウムイオンの流出入が起点となるため、小胞体の機能変化は骨格筋機能と密接に関連している。例えばサルコペニアの動物モデルとしてマウスの後脚懸垂モデル（後脚骨格筋の不活動モデル）が知られている。本発明者らは、マウスの後脚懸垂モデルで１２日間の後脚懸垂を行ったところ、図２に示されるように、不活動で骨格筋のＰＥＲＫ経路が活性化し、ｅｌＦ２αのリン酸化が進むことを明らかにした。
本発明者らは、骨格筋におけるストレス応答については、ほとんど解明されていないことから、ＰＥＲＫ−ｅｌ２αリン酸化シグナル経路に着目して検討をおこなった。何故なら、図３に示されるように、小胞体ストレスには３種の経路（ＩＲＥ１，ＡＴＦ６，ＰＥＲＫ）がある。高等動物の小胞体ストレス応答は、まず最初にＰＥＲＫ経路（翻訳抑制）が始動し、次にＡＴＦ６経路（シャペロンによる構造修正）、更にＩＲＥ１経路（構造修正と分解処理）が始動する。しかし、それでも改善できない場合にはアポトーシスを誘導して細胞丸ごと処理し、個体としての生存を図るといった多段階の応答機構が時間依存的に次々と作動することになっている。
このように、小胞体ストレス応答の最初のスタート経路がＰＥＲＫ経路であるため、小胞体ストレスのＰＥＲＫ経路を選択的に活性化できるモデルマウスの構築が期待されていた。しかし、図３に示されるように、小胞体ストレスが惹起される場合には、３つの経路が全て活性化されることが生じる。
サルコペニアの治療剤のスクリーニングを行うために、小胞体ストレス応答の最初のスタート経路のＰＥＲＫ経路を選択的に活性化する必要がある。そこで、本発明者らは、図４に示されるＰＥＲＫ経路を薬剤（ＡＰ２０１８７）依存的に活性化できるＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ融合タンパクを使用し、これが骨格筋特異的に発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウスの作製を検討した。【０００８】  本発明者らは、臓器特異的なタンパク発現を促進するため、プロモーターとして図５上段に示されるヒト骨格筋α−アクチンプロモーターを使用した。更に、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫのｃＤＮＡの３’末端にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ遺伝子を付加することを行い、翻訳されるｍＲＮＡの安定性を高めてタンパクへの翻訳効率を高めることを行った。
上記のように構築されたｃＤＮＡを用いて、マウスの受精卵に注入すると、ＴＧマウスを作製することができる。作製されたＴＧマウスの各臓器を採取して、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫのタンパク産生をイムノブロット（ＩＭＭＵＮＯＢＬＯＴＳ）で評価すると、図５下段に示されるように骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫのタンパクが発現していることを確認できた。更にこのＴＧマウスにＡＰ２０１８７（ＡＰ）を投与すると、図６に示されるようにｅｌＦ２αのリン酸化が亢進することが明らかとなった。
このように、図５上段に示されたｃＤＮＡを使用することにより、図６に示されるようにＡＰの投与量に応じて骨格筋特異的にＰＥＲＫ経路を活性化できるＴＧマウスを作製できた。【０００９】  ＴＧマウスは、元々存在するＰＥＲＫ以外に、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが遺伝子導入されているのでｅｌＦ２αのリン酸化が亢進する。即ち、ＴＧマウスは図１０に示されるように小胞体ストレスマーカーのＴｒｉｂ３が顕著に発現しており、小胞体ストレスが惹起されていることを示している。小胞体ストレスが惹起された結果、図７〜図９に示されるように、ＴＧマウスは、骨格筋の重量が低下し（図７）、骨格筋の筋線維が萎縮して（図８）、筋力が低下している（図９）。このようにＴＧマウスでは骨格筋が減少することから、図１３に示されるように体重増加が抑制される。以上のように、本発明のＴＧマウスは、サルコペニアのモデルマウスとして利用できることが確認できた。
更に、本発明のＴＧマウスに対して、ＰＥＲＫ経路の活性化薬剤（ＡＰ２０１８７）を投与すれば、重症化したサルコペニアのモデルマウスを作製できることになる。本発明の重症化のモデルマウス（ＴｇＡＰ）では、小胞体ストレスマーカー（Ｔｒｉｂ３等）が顕著に発現増大しており、図１１に示すようにアポトーシスを促進するＣｈｏｐの発現も向上している。また、図１２に示すように、この重症化モデルマウスではＰＥＲＫ経路に係る多くの小胞体ストレス関与の因子が発現増大していることが示されている。この結果、本発明の重症化モデルマウスでは、図１４に示されるように体重や筋肉重量が急速に低下して行くことが見出されている。
本発明の上記サルコペニアのモデルマウスを用いることで、より的確にサルコペニアの治療薬をスクリーニングすることができる。また、本発明のモデルマウスでは多くの小胞体ストレスマーカーが発現向上していることから、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングで、サルコペニアに対する作用機序を解明することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングでヒットした合成化合物に関する筋肉委縮抑制効果や作用機序の解明を遺伝子発現のプロファイル解析によって達成できる。更には、上記合成化合物のターゲットとなるタンパクやリセプターなどの対象についても、ＴＧマウス由来の全タンパクのサンプルからプル−ダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）法を用いて明らかにできる。
本件発明者らは、以上の知見に基づいて、本発明を完成した。【００１０】  即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）のモデルマウスであって、
ａ）ヒト骨格筋α−アクチンプロモーターの下流に、
ｂ）Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫをコードするｃＤＮＡと、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリＡシグナル（ｂＧＨｐＡ）が直列に結合しているｃＤＮＡを用いて、
ｃ）骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが発現するようになっている
ことを特徴とする、トランスジェニック（ＴＧ）マウス。
（２）上記マウスが、Ｃ５７／ＢＬ６由来であることを特徴とする、上記（１）のＴＧマウス。
（３）Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現量が、骨格筋において内在性のＰＥＲＫ発現量の４００倍以上であることを特徴とする、上記（１）又は（２）のＴＧマウス。
（４）Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現量が、骨格筋において内在性のＰＥＲＫ発現量の５００倍以上であることを特徴とする、上記（１）又は（２）のＴＧマウス。
（５）ＡＰ依存的に小胞体ストレスなどを惹起せずに、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）依存的に骨格筋のみでＰＥＲＫ経路のみを活性化できることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかのＴＧマウス。【００１１】（６）上記（１）〜（５）のいずれかのＴＧマウスを用いる、サルコペニアのモデルマウス。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかのＴＧマウスにＡＰを投与して得られる、上記（６）のサルコペニアの重症化モデルマウス。
（８）上記（６）又は（７）のサルコペニアのモデルマウスを用いて、評価サンプルを投与し、骨格筋重量の低下や筋力の低下の抑制効果を評価することである、サルコペニアの治療剤のスクリーニング方法。
（９）ＡＰ投与量が、腹腔内に０．５〜５ｍｇ／ｋｇを投与することである、上記（８）に記載のサルコペニアの治療剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】  本発明のＴＧマウスは、サルコペニアのモデルマウスであり、骨格筋でのＰＥＲＫ経路のみが活性化されている。更にＰＥＲＫ経路を活性化する薬剤ＡＰ２０１８７を投与することにより、サルコペニアの重症化モデルマウスを作製できる。本発明のＴＧマウスでは、重症化モデルマウスも含めて、サルコペニアの病態と同様に、骨格筋の重量が低下し、骨格筋の筋繊維が萎縮して、ＴＧマウスの筋力が低下することが示されている。
それ故、本発明のＴＧマウスは、サルコペニアのモデルマウスとして有用であり、これを用いて、薬物のｉｎ  ｖｉｖｏでの高次評価試験が可能となった。その結果、サルコペニアの治療剤開発が具体的に推進できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】小胞体ストレスによるサルコペニアの発症メカニズムを表した図である。非特許文献１（日本老年医学会雑誌５０巻６号７６６−７６９（２０１３年））から転用したものである。
【図２】サルコペニアの動物モデルの一つであるマウスの後脚懸垂モデルにおいて、不活動な後脚の筋肉において、日数が経てば次第にｅｌＦ２αのリン酸化が亢進することを表した図である。即ち、運動をしない場合には、当該骨格筋においてＰＥＲＫ経路が活性していた。
【図３】小胞体ストレス応答には３種の経路があることを示した図である。
【図４】ＰＥＲＫ経路だけを活性化させるＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫシステムの概要を表した図である。Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ遺伝子が導入されたＴＧマウスにＡＰ２０１８７を投与すると、２量化が促進してｅＩＦ２αのリン酸化が促進されることを模式的に表している。小胞体内では、２量体化領域とＰＥＲＫキナーゼ領域の融合した蛋白が産生され、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）の投与により２量体化が促進される。その結果、ｅＩＦ２αのリン酸化が亢進する。
【図５】上の図は、ＴＧマウスの作製にヒト骨格筋のα−アクチンプロモーターとＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ、ｂＧＨ−ｐＡ（ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ遺伝子）がタンデムに接続しているｃＤＮＡを使用することを表した図である。下の図は作製されたＴＧマウスにおいて発現されるＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの組織分布を表した図であり、骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを発現していることを示している。
【図６】野生型（ＷＴ）マウスとＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを比較的に低発現するＴＧマウス、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを比較的に高発現するＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスにおいて、リン酸化されたｅｌＦ２α、全ｅｌＦ２α、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの存在量をイムノブロット法で評価した図である。左図は、ＴＧマウスとＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスの腓腹筋に存在する、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ、リン酸化されたｅｌＦ２α、全ｅｌＦ２αの量をイムノブロット法で評価した図である。右図は、ＡＰを投与した時のＷＴマウスとＴＧマウスの腓腹筋に存在する、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ、リン酸化されたｅｌＦ２α、全ｅｌＦ２αの量をイムノブロット法で評価した図である。
【図７】通常食で飼育したＷＴマウスとＴＧマウスの腓腹筋とヒラメ筋の筋肉量を表した図である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝１２−１３，＊＊ｐ＜０．０１）。ＴＧマウスでは骨格筋の重量が低下することが示された。
【図８】通常食で飼育したＷＴマウスとＴＧマウスの前脛骨筋をヘマトキシリン・エオシン染色した図（写真）である。
【図９】通常食で飼育したＷＴマウスとＴＧマウスの握力を評価した図である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝１３，＊ｐ＜０．０５）。
【図１０】ＷＴマウスとＴＧマウスのひらめ筋における、小胞体ストレスの３つの径路で標的となる遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ解析の結果を表した図である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝５，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。この結果に示されるように、ＴＧマウスでは、小胞体ストレスマーカー（ＰＥＲＫ経路の標的遺伝子）であるＴｒｉｂ３のみが発現亢進していた。即ち、ＴＧマウスでは、小胞体ストレスのＰＥＲＫ経路が特異的に活性化していることが示された。
【図１１】上記図１０と同様にして、ＰＥＲＫ経路の活性化剤（ＡＰ２０１８７）を投与した重症化モデルマウス（ＴｇＡＰ）とＷＴマウスの対比を行った図である。重症化モデルマウスでは、小胞体ストレスマーカー（Ｔｒｉｂ３、Ｇａｄｄ３４、Ｃｈｏｐ）が顕著に発現亢進していることが示された。
【図１２】上記図１１で示された小胞体ストレスマーカー以外の主要な骨格筋機能制御に関与する遺伝子の発現変動を示した図である。
【図１３】通常食で飼育したＷＴマウスとＴＧマウス、ＴＧ（ｈｉｇｈ）の体重変化を評価した図である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，ｎ＝１０−１３，＊＊ｐ＜０．０１，ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【図１４】体重と筋肉重量に関して、重症化モデルマウス（ＴｇＡＰ）とＷＴマウスの対比を行った図である。重症化モデルマウス（ＴｇＡＰ）では、顕著に体重と筋肉重量が減少することが示されている。
【図１５】ＡＰ２０１８７（ＡＰ）の化学構造式を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】  本発明の第一の態様は、骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを発現したトランスジェニックマウスとその作製方法に関するものである。
本発明の「ヒト骨格筋α−アクチンプロモーター」とは、ヒト骨格筋線維に特異的に発現するプロモーター遺伝子のことである（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６２（１１）：１２１３−１２１６，２０００）。このプロモーター遺伝子を含む発現ベクターは、プロモーターの下流にあるタンパク遺伝子の発現を骨格筋線維に特異的に行うことができる。
本発明の「Ｆｖ２Ｅ」とは、２つの修飾されたＦＫ５０６結合領域（ｔｗｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＦＫ５０６  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｖ２Ｅ）のことである。
本発明の「ＰＥＲＫ」とは、小胞体膜上のＩ型膜貫通蛋白で、Ｎ末端の小胞体内腔領域は小胞体（ＥＲ）ストレスセンサーであり、Ｃ末端はｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２α）をリン酸化するセリン／スレオニンキナーゼ活性を持っている。即ち、ＰＥＲＫとはｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ＥＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｒ  ＰＫＲ−ｌｉｋｅ  ＥＲ  ｋｉｎａｓｅの略称である。なお、このＰＥＲＫのストレスセンサー領域はＢｉＰが結合していることで不活性化されている。ＥＲストレスが生じると、ＥＲ内に蓄積した不完全なタンパク（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がＢｉＰをＰＥＲＫから引き離し、ＰＥＲＫの多量体化及び自己リン酸化を起こす。リン酸化されたＰＥＲＫはｅＩＦ２αの５１位のセリンをリン酸化する。リン酸化されたｅＩＦ２α（ｅＩＦ２α−Ｐ）は４３Ｓの翻訳開始複合体の形成を阻害し、翻訳開始を阻害する（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）。これにより、多くの蛋白はＥＲストレス下では産生が低下する。なお、転写因子のＡＴＦ４などは逆に産生が上昇し、特定の遺伝子の転写を上昇させることが知られている。それらの１つのＧＡＤＤ３４はｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １と複合体（ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１）を形成し、ｅＩＦ２αを再び脱リン酸化して、蛋白翻訳を元に戻し、ＥＲストレス反応は終結することになる。
本発明の「Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ」とは、上記Ｆｖ２ＥとＰＥＲＫが融合したタンパクのことを言う。この融合タンパクは、文献（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２３（１）１６９−１７９）の記載に従って作製できる。
【００１５】  本発明の「トランスジェニック（ＴＧ）マウス」とは、骨格筋で選択的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ融合タンパクが発現するマウスを言う。このＴＧマウスは、常法によってマウスの受精卵に、図５で示されるα−アクチンプロモーター・Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ・ｂＧＨｐＡで構成されたｃＤＮＡを注入し、その受精卵を母体に戻して作製したものである。得られたＴＧマウスは、骨格筋のみでＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが発現していた。また、得られたＴＧマウスには、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現量が相違する２種のＴＧマウスが存在し、低発現量のマウスをＴＧマウスと名付け、高発現量のものをＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスと名付けた。Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの高発現量のＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスは、図１５のＡＰを投与して小胞体ストレスのＰＥＲＫ経路を活性化させなくても、ＰＥＲＫの発現量が多いことから、小胞体ストレスを惹起し易くなっている。それ故、ＡＰの投与がなくても、図１１に示されるように自発的にサルコペニアの状態を惹起することが示されている。
本発明の「サルコペニアのモデルマウス」とは、図７〜９に示されるように、骨格筋の重量が低下し、骨格筋の筋繊維が委縮して、筋力が低下したサルコペニアと同じ症状を示すマウスのことであり、本発明のＴＧマウス、ＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスが該当する。更に、これらのマウスにＡＰを投与して、より強力にＰＥＲＫ経路の小胞体ストレスを惹起させた重症化モデルマウスも含むものである。
本発明の「サルコペニアの重症化モデルマウス」とは、上記ＴＧマウスにＡＰを投与して、ＰＥＲＫ経路の小胞体ストレスを強く惹起させたモデルマウスのことである。図１４に示されるように、体重減少や筋肉量の低下が短期間で生じている。また、図１４のＣに示されるように、顕著な筋肉量の減少が起きていることから、サルコペニアの改善又は治療できる薬剤をスクリーニングするために、適切なサルコペニアの重症化モデルである。
【００１６】  本発明の第二の態様は、本発明のＴＧマウスを使用するサルコペニアの治療剤のスクリーニング方法のことである。
本発明の「骨格筋でのＰＥＲＫ経路を活性化させる」とは、ＡＰをＴＧマウスに投与し、ＰＥＲＫ経路を更に活性化することを言う。ＴＧマウスに対するＡＰの投与量は、効果が発現できる量であれば特に限定するものではないが、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの投与量が好ましい。また、投与方法は、目的に応じて経口や非経口の方法を適宜使用することができるが、好ましくは腹腔内投与、静脈注射等を挙げることができる。
本発明の「骨格筋重量の低下や筋力の低下の抑制効果を評価する」ことは、体重や腓腹筋とヒラメ筋の筋肉量を評価すること、更には、懸垂させた際のマウスの握力試験結果等から評価、判断することを言う。
本発明の「ＰＥＲＫ経路が活性化して骨格筋重量の低下や筋力の低下を誘導できる」とは、骨格筋に導入されたＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫのｃＤＮＡのコピー数が多く、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの融合タンパクが高発現であることを言う。それ故、ＰＥＲＫ経路が常に活性化されており、ＡＰを投与しなくても、サルコペニアの症状を発症することが起きる。このように、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの融合タンパクが高発現であるＴＧマウスをＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスと言う。
なお、本発明のＴＧマウスのＰＥＲＫ経路の活性化は、マウスＣ５７ＢＬ／６１と比較して、４１０倍となっており、ＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスのＰＥＲＫ経路の活性化は、マウスＣ５７ＢＬ／６１と比較して５５０倍となっている。従って、ＡＰを投与せずともサルコペニアのモデルマウスとして使用できるが、ＡＰを投与によって他のモデルでは得られない急激なサルコペニア病態を再現することができる。
【実施例】
【００１７】  以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】骨格筋α−アクチンプロモーターとＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ、ｂＧＨｐＡのｃＤＮＡが搭載されたベクター
（１）試剤：
ａ）Ｆｖ２Ｅ−Ｐｅｒｋの２．４ｋｂのｃＤＮＡ断片を有するレトロウイルスベクター（ｐＢｅｂｅ／Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）は、文献（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２３（１）１６９−１７９）の記載に従って作製できる。本願発明では、上記のｃＤＮＡを含むベクターを上記著者のダビット  ロン（Ｄａｖｉｄ  Ｒｏｎ）より供与された。
ｂ）ヒト骨格筋α−アクチンプロモーターの２．２ｋｂのｃＤＮＡ断片を有するベクターは、文献（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６８（１）７１９−７２５（１９９３年））の記載に従って作製できる。本願発明では、上記ｃＤＮＡを含むＥＨ１１４ベクターを上記著者のエドナ  ハードマン（Ｅｄｏｎａ  Ｃ．Ｈａｒｄｅｍａｎ）より供与された。
ｃ）ウシ成長ホルモン遺伝子のポリＡシグナル（ｂＧＨｐＡ）は、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の記載に従って作製できる。本願発明では、ｂＧＨｐＡは上記ＥＨ１１４ベクターから作製した。【００１９】（２）ベクターの構築
５’端と３’端にＮｏｔ１制限酵素サイトを付加したＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫをＰＣＲで構築し、Ｎｏｔ１制限酵素で処理して得たＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫのｃＤＮＡ断片を、同じくＮｏｔ１制限酵素で処理したＥＨ１１４ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法で挿入してクローン化した。クローンしたベクターの遺伝子挿入箇所はＤＮＡシーケンサーで配列を確認した。
【実施例２】
【００２０】骨格の平滑筋でＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫタンパクが特異的に発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウスの作成
（１）作製方法
実施例１に記載のｐｈＳＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ．１ベクターを使用し、文献（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｉｓｍ．２００８  ７（６）：５２０−３２）の記載に準じて作製できる。即ち、実施例１に記載のベクターをＣｌａ１とＳｐｈ１の制限酵素で処理して得られたα−アクチンプロモーター・Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ・ｂＧＨｐＡで構成されたｃＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡ断片を、マウスＣ５７ＢＬ／６１の受精卵に注入し、常法によりＴＧマウスの作製を行った。
（２）結果
２種のＴＧマウスが得られた。注入したｃＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入された量や挿入された場所に依存して、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫの発現の程度が異なっている。Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが低発現量のものをＴＧマウスと呼び、高発現量のものをＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスと呼ぶ。
なお、図５に示すように、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫは、ＴＧマウスの骨格筋においてのみ発現している。更に、図６に示すように、これら２種のＴＧマウスにリガンドのＡＰを投与する時、ＰＥＲＫの基質であるｅｌＦ２αは、このリガンドの投与量に比例してリン酸化が起きることが示された。
以上のことから、作製された２種のＴＧマウスは、骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが発現しているＴＧマウスであることが確認できた。更にＡＰを投与することにより、小胞体ストレス（ＰＥＲＫ経路）が亢進することが示された。【００２１】（３）ＴＧマウスの機能確認
これら２種のＴＧマウスでは、骨格筋α−アクチンプロモーターがＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを過剰発現させるので、ｅｌＦ２αのリン酸化が野生型（ＷＴ）マウスより亢進している。そしてＡＰの存在により、更にｅｌＦ２αのリン酸化の亢進を誘導することが可能であり、その程度はＴＧマウスよりもＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスがいずれも強い。ＴＧマウスはＷＴマウスのタンパク合成と同等あるいは少なくとも著明な差は認めず、骨格筋に強い障害を与えることなく筋萎縮を誘導するサルコペニアモデルであることが示された。
なお、これらの２種のＴＧマウスでは、図１０に示されるように、ｅｌＦ２αのリン酸化の増大に基づいて、ＰＥＲＫ経路の標的遺伝子の一つ（Ｔｒｉｂ３）を誘導する。しかし、ＩＲＥ１とＡＴＦ６経路の標的遺伝子（Ｘｂｐ１，Ｇｒｐ７８，Ｈｅｒｐｕｄ，Ｅｄｅｍ１）を誘導しない。即ち、これらの２種のＴＧマウスでは、ＰＥＲＫ経路の活性化が選択的に生じていることが示された。
これら２種のＴＧマウスにおけるｅｌＦ２αのリン酸化のレベルが、通常の範囲内（筋肉内の生理学的なストレス条件の範囲内）のものであるか否かを確認するため、ＡＰの投与を行わず、ＴＧマウスの成長速度（体重増加）を評価した。図１１に示されるように、通常食を摂取させた場合の体重は、ＴＧマウスではＷＴマウスより若干減量していたが、ＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスでは、かなり減量したものとなっていた。
次に、ＴＧマウスのＰＥＲＫの活性化が骨格筋の量と性質に影響を及ぼすか否かを評価した。ＴＧマウスは、ＷＴマウスと比較して、常に小さなふくらはぎとヒラメ筋の筋肉線維を持っている。従って、ＴＧマウスの握る力は、ＷＴマウスよりも弱くなっている。ＴＧ（ｈｉｇｈ）マウスは、ＴＧマウスより大きな筋委縮と弱い握力を示していた。
【実施例３】
【００２２】本発明の２種のＴＧマウスを用いたサルコペニアの重症化モデルマウスの作製
（１）試剤
実施例２で作製された２種のＴＧマウスとＷＴマウスそれぞれ３〜７匹使用した。
ＡＰ２０１８７（ＡＰ）を１００％エタノールに溶解し、６２．５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製し、そのエタノール溶液を４重量％、ＰＥＧ−４００を１０重量％、ツイーン２０を２重量％含有するＡＰ水溶液を作製した。
プラセボの水溶液として、エタノールを４重量％、ＰＥＧ−４００を１０重量％、ツイーン２０を２重量％含有する水溶液を作製した。
（２）方法
上記ＴＧマウスに、ＡＰ２０１８７水溶液を１０日間、毎日腹腔内投与し、サルコペニアのモデルマウスを作製した。ＡＰの投与量は、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ・日、２ｍｇ／ｋｇ・日、５ｍｇ／ｋｇ・日となるように設定した。同様に、ＷＴマウスにプラセボ水溶液を投与し、コントロール（ＷＴ  ｖｅｈｉｃｌｅ）とした。
（３）結果
図１１と１２に示されるように、ＡＰ水溶液を投与したＴＧマウスでは、小胞体ストレスマーカーであるＴｒｉｂ３が、ＷＴマウスと対比して顕著に発現亢進していた。図１０の場合と対比すると、ＡＰ水溶液の投与により、極めて効率的に小胞体ストレスが惹起されていることが示された。また、このサルコペニアの重症化モデルマウスでは、図１１と１２に示されるように、小胞体ストレスに関係する蛋白等の遺伝子発現が亢進していることが見出された。従って、本発明の重症化モデルマウスを使用してサルコペニア治療剤のスクリーニングを行った場合、どの箇所の遺伝子発現を抑制するのかが明瞭に示されるので、評価化合物のサルコペニアに対する作用機序を遺伝子発現のプロファイル解析によって解明することができる。
また、図１４に示されるように、重症化モデルマウスでは、体重減少と筋肉量の低下が顕著に起きていることが示された。このことから、重症化モデルマウスを用いることにより、評価化合物の筋肉委縮抑制効果が容易に評価できる。
【実施例４】
【００２３】サルコペニア治療剤のスクリーニング方法
（１）試剤
実施例２で作製されたＴＧマウスを使用する。
評価化合物を含有した飼料を作製する。
（２）方法
上記実施例３に基づき、上記ＴＧマウスに、ＡＰ水溶液を腹腔内投与し、サルコペニアの重症化モデルマウスを作製した。
同時に、薬剤を含有する飼料で飼育を行い、コントロール群と薬剤投与群を対比して体重低下、骨格筋重量の低下や筋力の低下の抑制効果を確認する。
（３）結果
上記の評価の結果、有意差を持って体重低下等を抑制できた評価化合物をヒット化合物として、次の高次評価検討に進めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００２１】  サルコペニアの治療剤を評価する適切なｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法はほとんどなかったが、本発明の骨格筋特異的にＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを発現させたＴＧマウスにより、小胞体ストレス関与のサルコペニアモデルマウスを作製することができた。更に、本発明のＴＧマウスにＡＰ２０１８７を投与することにより、骨格筋に顕著な小胞体ストレスを惹起させたサルコペニアの重症化モデルマウスを作製できた。この結果、本発明のＴＧマウスを用いることにより、小胞体ストレス経由のサルコペニアの治療剤が的確にｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングでき、又ヒットした治療剤についても、その作用機序の解明が容易になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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