(57)【要約】【解決する課題】  ビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）の生残性を増強するために用いられる生残性増強剤、並びにビフィズス菌の生残性を高め、当該細菌を生きた状態で長期に保有し得るプロバイオティクス組成物の提供。【解決手段】ビフィズス菌にＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを共存させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを有効成分とするビフィドバクテリウム属細菌生残性増強剤。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ菌及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム菌である、請求項１記載のビフィドバクテリウム属細菌生残性増強剤。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム属細菌、及び０．３〜２質量％のＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有する組成物。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム属細菌とＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルとが粉体混合されてなる請求項３に記載する組成物。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ菌及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム菌である、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベBCCM LMG23729である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム・ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム ATCC BAA-999である、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビフィドバクテリウム属細菌（以下、単に「ビフィズス菌」とも称する）の生残性を増強するために用いられる剤（生残性増強剤）、並びにビフィズス菌の保存生残性を高め、当該細菌を生きた状態で長期に保有し得るプロバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィズス菌や乳酸菌などのいわゆるプロバイオティクス（微生物）は、水分活性や酸素に比較的弱く、水分活性や酸素含有量の高い環境下では長期間生残性を維持することが難しい。このため、従来からプロバイオティクスの保存安定性を向上させるための方法が複数提案されている（例えば、特許文献１〜１１等参照）。また、この目的でプロバイオティクスをカプセル基材に充填しカプセル表面をコーティングしたり、またプロバイオティクスを含むタブレットが開発されているが、より長期の保存を可能とする技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2012/077038号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2005/058476号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2011/016070号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2005/063200号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2007/022092号パンフレット
【特許文献６】国際公開第2012/005725号パンフレット
【特許文献７】米国特許公開公報第20110217275号
【特許文献８】米国特許公報第8747915号
【特許文献９】国際公開第2004/100896号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第2005/110123号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第1993/018669号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はビフィズス菌の生残性を高めるために用いられるビフィズス菌生残性増強剤を提供する。また本発明は、ビフィズス菌の生残性を高めることで、当該細菌を生きた状態で長期に保有したプロバイオティクス組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ビフィズス菌の生菌、特にビフィドバクテリウム・ブレーベ菌（以下、「Ｂ．ブレーベ菌」ともいう）及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム菌（以下、「Ｂ．ロンガム菌」ともいう）を最終濃度０．３〜２質量％のアスコルビン酸パルミチン酸エステルと乾燥状態で共存させることにより、アスコルビン酸パルミチン酸エステルと共存させない場合と比較して、少なくとも４５℃で１ヶ月保存した後のビフィズス菌の生残性（生存率）を高めることができ、常温で保存した場合でも多くのビフィズス菌を長期間生きた状態で含有するプロバイオティクス組成物を提供することができることを見出した。
【０００６】
本発明はこれらの知見にもとづいて完成したものであり、下記の実施形態を有する。
【０００７】
（Ｉ）生残性増強剤
（Ｉ−１）Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを有効成分とするビフィドバクテリウム属細菌生残性増強剤（ビフィズス菌生残性増強剤）。
（Ｉ−２）Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルの濃度が０．３〜２質量％となるようにビフィドバクテリウム属細菌と共存させて使用される、（Ｉ−１）に記載の生残性増強剤。
（Ｉ−３）Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルがビフィドバクテリウム属細菌と粉体混合された状態で使用される、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する生残性増強剤。
（Ｉ−４）Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルとビフィドバクテリウム属細菌とが共存させた状態の水分活性が０．２未満である、（Ｉ−２）または（Ｉ−３）に記載する生残性増強剤。
（Ｉ−５）ビフィドバクテリウム属細菌がビフィドバクテリウム・ブレーベ菌（Ｂ．ブレーベ菌）、及び／又は、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌（Ｂ．ロンガム菌）である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載する生残性増強剤。
（Ｉ−６）Ｂ．ブレーベ菌がビフィドバクテリウム・ブレーベ BCCM LMG23729であり、及び／又は、Ｂ．ロンガム菌がビフィドバクテリウム・ロンガム ATCC BAA-999である、（１−５）に記載の生残性増強剤。
【０００８】
（II）プロバイオティクス組成物
（II−１）ビフィドバクテリウム属細菌（生菌）、及び０．３〜２質量％のＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有する組成物。
（II−２）ビフィドバクテリウム属細菌とＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルとが粉体混合されてなる（II−１）に記載する組成物。
（II−３）水分活性が０．２未満である（II−１）または（II−２）に記載する組成物。
（II−４）ビフィドバクテリウム属細菌がＢ．ブレーベ菌、及び／又は、Ｂ．ロンガム菌である、（II−１）〜（II−３）のいずれかに記載の組成物。
（II−５）Ｂ．ブレーベ菌がビフィドバクテリウム・ブレーベ BCCM LMG23729であり、及び／又は、Ｂ．ロンガム菌がビフィドバクテリウム・ロンガム ATCC BAA-999である、（II−４）に記載の組成物。
（II−６）食品組成物である、（II−１）〜（II−５）のいずれかに記載する組成物。
（II−７）粉末状の組成物である（II−１）乃至（II−６）のいずれかに記載する組成物。
（II−８）（II−７）に記載する粉末状組成物の造粒物、または当該粉末状組成物若しくはその造粒物の圧縮成形物。
（II−９）カプセル基材中に、（II−７）に記載する粉末組成物または（II−８）に記載する造粒物を含有するカプセル剤。
（II−１０）（II−７）に記載する粉末状組成物、（II−８）に記載する造粒物若しくは圧縮成形物、及び（II−９）に記載するカプセル剤からなる群から選択される少なくとも１種が、遮光性容器または遮光性包装物に充填若しくは封入されてなるプロバイオティクス製品。
【０００９】
（III）プロバイオティクス組成物の製造方法
（III−１）粉末状のビフィズス菌と粉末状のアスコルビン酸パルミチン酸エステルを混合し、アスコルビン酸パルミチン酸エステルの含有量が総量で０．３〜２質量％となるように調整する工程を有する、（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する組成物、（II−８）に記載する造粒物若しくは圧縮成形物、または（II−９）に記載するカプセル剤の製造方法。
（III−２）上記（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する組成物、（II−８）に記載する造粒物若しくは圧縮成形物、（II−９）に記載するカプセル剤の最終の水分活性がいずれも０．２未満になるように調整する工程を有する、（III−Ｉ）に記載する製造方法。
（III−３）上記（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する組成物、（II−８）に記載する造粒物若しくは圧縮成形物、または（II−９）に記載するカプセル剤を遮光性容器または遮光性包装物に充填若しくは封入する工程を有する、（III−Ｉ）に記載するプロバイオティクス製品の製造方法。
【００１０】
(IV) ビフィズス菌の生残性向上方法
（IV−１）ビフィズス菌を、最終濃度が総量で０．３〜２質量％となる量のアスコルビン酸パルミチン酸エステルと乾燥した状態で共存させることを特徴とする、上記菌体の生残性向上方法。
（IV−２）上記乾燥物の水分活性が０．２未満である、（IV−１）に記載する生残性向上方法。
（IV−３）上記乾燥物がビフィズス菌及びアスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有する粉体混合物、その造粒物またはそれらの圧縮成形物である、（IV−１）または（IV−２）に記載する生残性向上方法。
（IV−４）上記ビフィズス菌が、Ｂ．ブレーベ菌及び／又はＢ．ロンガム菌である、（IV−１）〜（IV−３）のいずれかに記載する生残性向上方法。
（IV−５）Ｂ．ブレーベ菌がビフィドバクテリウム・ブレーベ BCCM LMG23729であり、及び／又は、Ｂ．ロンガム菌がビフィドバクテリウム・ロンガム ATCC BAA-999である、（IV−４）に記載の生残性向上方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、常温保存中におけるビフィズス菌の生残性を高めることができ、長期間ビフィズス菌を生きた状態で含有するプロバイオティクス組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（Ｉ）生残性増強剤
本発明の生残性増強剤は、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを有効成分とする製剤であって、ビフィズス菌の生残性を向上する作用効果を有する。このため、もっぱら当該ビフィズス菌の生残性を向上する目的で使用される。当該製剤は、ビフィズス菌を含有する食品に対しては食品添加剤として、ビフィズス菌を含有する医薬品に対しては医薬品添加剤として、またビフィズス菌を含有する医薬部外品に対しては医薬部外品添加剤として用いることができる。
【００１３】
本発明（本件明細書）において「生残性増強」、「生残性向上」及び「生残性を高める」とは、生存可能な状態にあるビフィズス菌（生菌）に作用して死滅（不活性化）による生菌数の減少を抑え、生きた状態で残存する菌体数（生菌数）を維持または向上させることをいう。その意味で、「生残性増強」、「生残性向上」及び「生残性を高める」とは保存中の生菌数の減少を抑制することをも意味する。
【００１４】
こうした「生残性増強」等という特性（作用、効果）は、ビフィズス菌（生菌）を含む被験試料を、乾燥した状態で４５℃で１ヶ月保存した場合に、保存前後のビフィズス菌の生菌数をもとに下式で算出される生残割合（％）が、対照試料の当該生残割合（％）と比較して１０％以上高いことを指標として判断することができる。
【００１５】
【数１】
2017079638.tif 000002
【００１６】
上記においてビフィズス菌としては、プロバイオティクスとして使用されるＢ．ブレーベ菌およびＢ．ロンガム菌を挙げることができる。両ビフィズス菌は、それぞれ単独で使用してもよいし、また両者を組み合わせて使用することもできる。以下、本件明細書において、特に言及しない限り、「ビフィズス菌」という用語は、Ｂ．ブレーベ菌及びＢ．ロンガム菌の両者を区別することなく、また単独または併用の態様の区別なく包括的に意味するものである。これらのビフィズス菌は、市販または公的な菌の寄託機関から商業的に入手することができる。寄託機関から入手できるＢ．ブレーベ菌としてはビフィドバクテリウム・ブレーベLMG23729を、またＢ．ロンガム菌としてはビフィドバクテリウム・ロンガムATCC BAA-999を例示することができる。
【００１７】
また上記において「乾燥した状態」とは、好ましくは水分活性が０．２未満の状態を意味する。水分活性（Aw）は以下の式により求めることができる。
【００１８】
【数２】
2017079638.tif 000003
【００１９】
また「対照試料」とは、細菌生残性増強剤を含まない試料、具体的には被験試料から生残性増強剤を除いた試料を意味する。
【００２０】
このため、具体的には、例えばＢ．ブレーベ菌および／またはＢ．ロンガム菌に生残性増強剤としてＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを配合した被験試料を乾燥状態で４５℃で１ヶ月保存した場合の保存前後での生残割合が７０％であり、一方、Ｂ．ブレーベ菌および／またはＢ．ロンガム菌だけを対照試料として同条件で１ヶ月保存した場合の保存前後での生残割合が５０％である場合、被験試料と対照試料との生残割合の差は２０％であり、１０％を超えているので、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルの配合によりＢ．ブレーベ菌および／またはＢ．ロンガム菌は生残性が向上（増強）しているということができる。またこの場合、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルはＢ．ブレーベ菌および／またはＢ．ロンガム菌に対して生残性増強剤として作用機能しているということができる。
【００２１】
なお、生残割合（％）の算出にあたり、ビフィズス菌の生菌数の求め方は定法に基づくことができるが、具体的には実施例の項で詳説する記載に基づいて実施することができる。
【００２２】
上記のことから、本発明の生残性増強剤は、少なくとも下記の温度環境下、乾燥状態でビフィズス菌（生菌）を保存（保管）する場合の当該ビフィズス菌の生残性を向上させることができるものである。
【００２３】
温度環境としては、１〜４５℃、好ましくは１〜３０℃、より好ましくは１〜２０℃を挙げることができる。この温度条件下で生残性向上効果が期待できる保存時間としては、生残性向上効果が認められる限り、制限されないものの、具体的には、例えば、少なくとも１ヶ月以内、好ましくは１年以内、より好ましくは３年以内、特に好ましくは５年以内である。
【００２４】
なお、保存に際して本発明の生残性増強剤を共存させるビフィズス菌含有物のｐＨ条件は、保存期間中、当該ビフィズス菌含有物は乾燥状態であるため特に制限されないものの、好ましくは、ビフィズス菌含有物をＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル濃度が０．３〜２質量％となるように水に溶解または分散させた場合に、ｐＨ４〜１０となるように調整されていることが好ましい。
【００２５】
本発明の生残性増強剤は、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル単独からなるものであってよいし、またビフィズス菌に対する生残性増強作用（生残性向上作用）が損なわれない限り、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、抗酸化剤、各種ビタミン、風味改良剤、香料、着色料等、またはＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを製剤化するために使用される担体及び添加剤を挙げることができる。具体的には、本発明の生残性増強剤を粉末状（散剤）または顆粒剤として調製する場合、倍散剤、賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤等を配合することができる。この場合、これらの成分は、目的や調製する剤型に応じて０．１〜９９質量％となるような範囲で適宜配合することができる。
【００２６】
本発明の生残性増強剤は、ビフィズス菌を含有する食品、医薬品または医薬部外品に対して、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルの最終濃度が０．３〜２質量％となるような割合で添加使用することができる。食品、医薬品または医薬部外品におけるＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルの最終濃度として、好ましくは０．５〜２質量％を挙げることができる。
【００２７】
また、ビフィズス菌を含有する食品、医薬品または医薬部外品中のビフィズス菌（生菌）の割合として、制限されないものの、これらの製品１ｇ中に含まれる生菌数として１×１０４ＣＦＵ／ｇ以上、好ましくは１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇを例示することができる。
【００２８】
（II）プロバイオティクス組成物
本発明のプロバイオティクス組成物は、ビフィズス菌、並びにアスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有し、上記アスコルビン酸パルミチン酸エステルの含有量が総量で０．３〜２質量％である組成物であることを特徴とする。
【００２９】
ここで本発明が対象とするビフィズス菌としては、前述するようにプロバイオティクスとして使用されるＢ．ブレーベ菌（Bifidobacterium breve）およびＢ．ロンガム菌（Bifidobacterium longum）を挙げることができる。両ビフィズス菌は、それぞれ単独で使用してもよいし、また両者を組み合わせて使用することもできる。これらのビフィズス菌は、いずれも市販または公的な菌の寄託機関から商業的に入手することができる。寄託機関から入手できるＢ．ブレーベ菌としては、「ＬＭＧ２３７２９」（Bifidobacterium breve BCCM LMG23729）という寄託番号でベルギー微生物保存機関（Belgian Co-ordinated Collections of Micoorganisms：ＢＣＣＭ）に寄託されているビフィドバクテリウム・ブレーベ  Ｍ−１６Ｖ（Bifidobacterium breve M-16V）（http://bccm.belspo.be/catalogues/lmg-strain-details?NUM=23729）を例示することができ、またＢ．ロンガム菌としては、「ＢＡＡ−９９９」（Bifidobacterium longum ATCC BAA-999）という寄託番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガム  ＢＢ５３６（Bifidobacterium longum BB536）（http://www.atcc.org/products/all/BAA-999.aspx）を例示することができる。
【００３０】
本発明で用いるアスコルビン酸パルミチン酸エステルはアスコルビン酸の脂肪酸エステルの一種である。その形態は、特に制限されないが、ビフィズス菌と共存させる場合は、乾燥粉末または顆粒形態であることが好ましい。より好ましくは乾燥粉末形態である。
【００３１】
本発明のプロバイオティクス組成物は、制限されないものの、前記ビフィズス菌を適当な培地により生育させ、遠心分離等により分離し、凍結乾燥し、得られた乾燥品を粉砕した後、上記の乾燥粉末または顆粒形態を有するアスコルビン酸パルミチン酸エステルと混合（粉体混合など）して調製することができる。上記ビフィズス菌を凍結乾燥する際には、脱脂粉乳溶液、乳清、または乳タンパク質等の凍結乾燥保護剤を混合してもよい。
【００３２】
本発明のプロバイオティクス組成物におけるアスコルビン酸パルミチン酸エステルの配合量は、最終濃度として０．３〜２質量％である。好ましくは０．５〜２質量％である。
【００３３】
なお、プロバイオティクス組成物の製造に際しては、必要に応じて倍散剤（賦形剤とも称する）を混合してもよい。ここで倍散剤としては、ビフィズス菌の生残性に影響しないものであればよく、制限されないものの、例えばデキストリン、澱粉等の多糖類を挙げることできる。澱粉は上記限りにおいて制限されず、例えばコーンスターチ、馬鈴薯澱粉、米澱粉、小麦澱粉、豆澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉、サゴ澱粉、ワキシーコーンスターチ，及びハイアミロースコーンスターチからなる群から選択される少なくとも１種、好ましくはコーンスターチ及び馬鈴薯澱粉からなる群から選択される少なくとも１種を例示することができる。プロバイオティクス組成物におけるこれら賦形剤の割合としては、制限されないものの、０．１〜９９．７質量％、好ましくは１〜９９．７質量％、より好ましくは２〜８０質量％を挙げることができる。
【００３４】
本発明のプロバイオティクス組成物においては、制限されないものの、組成物１ｇ中にビフィズス菌を通常１×１０４ＣＦＵ／ｇ以上、好ましくは１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇの範囲で含むことができる。
【００３５】
本発明のプロバイオティクス組成物は乾燥状態であればよく、その形態は特に制限されない。乾燥状態とは、（I）で説明した通りであり、好ましくは水分活性が０．２未満の状態を意味する。
【００３６】
本発明のプロバイオティクス組成物の形態として具体的にはビフィズス菌とアスコルビン酸パルミチン酸エステルからなるか、またはこれらを含有する粉体混合物（粉末状物、散剤）、その造粒物、及び粉体混合物または造粒物の圧縮成形物を挙げることができる。造粒物としては顆粒剤を、また圧縮成形物としては錠剤（タブレット、トローチを含む）を挙げることができる。さらに、プロバイオティクス組成物は、ビフィズス菌とアスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有する散剤（粉末状物）または顆粒剤を内部に充填したカプセル剤の形態を有することもできる。なお、これらの製剤形態には、本発明の効果を妨げないことを限度として公知の担体または添加剤を用いて、定法に従って調製することができる。
【００３７】
本発明のプロバイオティクス組成物は、その生残性向上のために、遮光性容器または遮光性包装物に充填若しくは封入されていることが好ましい。遮光性容器としては紫外線から赤外線までの光を遮断できる容器、紫外線から可視光までの光を遮断できる容器、紫外線を遮断できる容器などを例示することができるが、好ましくは茶遮光または緑遮光等のガラス瓶等を挙げることができる。遮光性包装物としてはアルミ箔にＰＥＴやＰＰを複合した包装材、遮光性エバール（登録商標）フィルム等を挙げることができる。
【００３８】
(III) ビフィズス菌の生残性向上方法
本発明のビフィズス菌の生残性向上方法は、ビフィズス菌にＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル、好ましくは前述する本発明の生残性増強剤を、乾燥状態で共存させることで実施することができる。
【００３９】
乾燥状態としては、前述する通り水分活性０．２未満を好適に例示することができる。より好ましくはビフィズス菌を含有する組成物に、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを最終濃度が０．３〜２質量％、好ましくは０．５〜２質量％となる割合で配合し、共存させる方法である。なお、ビフィズス菌を含有する組成物としては、１ｇ中、ビフィズス菌（生菌）を、１×１０４ＣＦＵ／ｇ以上、好ましくは１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇの割合で含むものを挙げることができる。
【００４０】
共存状態は、制限されないものの、前述するように、ビフィズス菌とアスコルビン酸パルミチン酸エステルからなるかまたはこれらを含有する粉体混合物（粉末状物、散剤）、その造粒物、またはそれらの圧縮成形物の状態を挙げることができる。造粒物としては顆粒剤を、圧縮成形物としては錠剤（タブレット、トローチを含む）を挙げることができる。さらに、ビフィズス菌とアスコルビン酸パルミチン酸エステルを含有する散剤（粉末状物）または顆粒剤を内部に充填したカプセル剤を挙げることができる。
【００４１】
ビフィズス菌の生残性を向上するためには、上記するようにビフィズス菌にＬ−アスコルビン酸パルミチン酸エステルを乾燥状態で共存させることに加えて、当該乾燥物（プロバイオティクス組成物）を遮光性容器または遮光性包装物に収納または収容させておくことが好ましい。遮光性容器及び遮光性包装物としては、（II）で前述した通りであり、当該記載はここに援用することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例及び実験例を示して本発明を詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
【００４３】
実験例１  ビフィズス菌末の生残性評価
ビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）をそれぞれ用いて、アスコルビン酸パルミチン酸エステルの存在下で、保存生残性を評価した。
【００４４】
（１）Ｂ．ロンガム菌含有被験試料の調製
ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＢＢ５３６（ATCC BAA-999）を用いた（以下、「BB536」とも称する）。BB536細菌を、蛋白質、アミノ酸、糖源を含有する培地に接種し、３２〜４１℃で５〜２４時間培養を行った後、培養液から遠心分離により菌体（湿菌体）を集菌した。凍結乾燥機（共和真空社製）を用いて１２０時間の凍結乾燥を行い、凍結乾燥終了後の菌体塊を物理的に粉砕し、４．４×１０１１ＣＦＵ／ｇの菌濃度のビフィズス菌末（BB536菌末）を得た。得られたBB536菌末とコーンスターチとを１：４（ｗ／ｗ）の割合で倍散し、これにＬ−アルコルビン酸パルミチン酸エステルの粉末を全体量の２質量％の割合になるように添加した。これをよく混合して、下記組成からなるＢ．ロンガム菌（BB536）含有被験試料を調製した。
【００４５】
また、対照試料として、Ｌ−アルコルビン酸パルミチン酸エステルを配合しないでBB536菌末とコーンスターチとを１：４（ｗ／ｗ）の割合で倍散した試料を調製した。
【００４６】
【表１】
2017079638.tif 000004
【００４７】
（２）Ｂ．ブレーベ菌含有被験試料の調製
ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）Ｍ−１６Ｖ（BCCM LMG 23729）を用いた（以下、「M-16V」とも称する）。上記（１）と同様にして、１．２×１０１２ＣＦＵ／ｇの菌濃度の凍結乾燥ビフィズス菌末（M-16V菌末）を得た。上記（１）と同様に、これをコーンスターチと１：４（ｗ／ｗ）の割合で倍散し、これにＬ−アルコルビン酸パルミチン酸エステルの粉末を全体量の２質量％の割合になるように添加し、これをよく混合して、下記組成からなるＢ．ブレーベ菌（M-16V）含有被験試料を調製した。
【００４８】
また、対照試料として、Ｌ−アルコルビン酸パルミチン酸エステルを配合しないでM-16V菌末とコーンスターチとを１：４（ｗ／ｗ）の割合で倍散した試料を調製した。
【００４９】
【表２】
2017079638.tif 000005
【００５０】
（３）保存試験方法
上記で調製したＢ．ロンガム菌（BB536）含有被験試料及びその対照試料（Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル配合なし）、並びにＢ．ブレーベ菌（M-16V）含有被験試料及びその対照試料（Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル配合なし）をそれぞれアルミ袋に入れて４５℃で１か月間保管し、保存前後の生菌数を測定した。また保存期間中、各試料の水分活性はいずれも０．２未満であった。
【００５１】
（４）保存前後の生菌数の測定
（４−１）懸濁用希釈液の調製：
表３に示す各成分に、それぞれ全量が１０００ｍｌとなるように純水を添加し、混合して生理食塩水、及び懸濁用希釈液を調製した。尚、各懸濁用希釈液は、その後オートクレーブにて１２１℃１５分の条件で滅菌処理を行った。
【００５２】
【表３】
2017079638.tif 000006
【００５３】
（４−２）培養法（混釈法）による生菌数測定：
保存試験前後の各被験試料（Ｂ．ロンガム菌（BB536）含有被験試料、Ｂ．ブレーベ菌（M-16V）含有被験試料）及びそれらの対照試料をそれぞれ５ｇずつ秤量し、そこに懸濁用希釈液を全量が１００ｇとなるように（試料５ｇに対して懸濁用希釈液９５ｇ（２０倍希釈））添加して激しく攪拌し、懸濁液を調製した。
【００５４】
次に、生理食塩水を二次希釈液として用いて、各懸濁液を希釈（１００倍希釈を３回と１０倍希釈を１回の合計１０の７乗倍希釈）した。調製した希釈物を、予め溶解した強化クロストリジア寒天培地（Reinforced clostridial medium Agar）（OXOID社製）とともに混釈法によりプレートに撒き、寒天が固まった後、３７℃の温度条件で３日間嫌気培養を行った。
【００５５】
培養後、培地に生育したコロニー数をカウントし、各試料（Ｂ．ロンガム菌（BB536）含有被験試料、Ｂ．ブレーベ菌（M-16V）含有被験試料）中の生菌数を求めた。保存前の被験試料の生菌数（100％）に対する保存後の生菌数の割合から、保存性（％）を算出した。その結果を表４および表５に示す。 
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
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【００５８】
この結果から、少なくともビフィドバクテリウム属細菌のうちビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）に対して、アスコルビン酸パルミチン酸エステルは、保存時の生残性を強化する作用を有することがわかる。