(57)【要約】【課題】Chtop関連疾患治療剤をスクリーニングする。【解決手段】供試物質と、Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位及び/又はChtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させ、上記供試物質がChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
供試物質と、少なくともChtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位及び/又はChtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、
上記供試物質が上記mRNAにおけるChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又は上記mRNAにおけるChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを備える、
Chtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
上記核酸領域の転写の際にスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAの量が、上記供試物質の非存在下と比較して上記供試物質の存在において大である場合、上記供試物質が上記mRNAにおけるChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又は上記mRNAにおけるChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進すると判断することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記Int2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3138番目の領域（Int2-2-2）及び/又は2668〜2873番目の領域（Int2-1）であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記Int2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3061番目の領域（Int2-2-2a）であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における1〜113番目のドメインを介して上記Int2におけるChtop結合部位と結合することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における114〜203番目のドメインを介して上記スプライシング制御因子（hnRNP）と結合することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順で有することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン３よりも下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン２よりも上流及び上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
上記Chtop関連疾患は、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌形赤血球症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
上記Ex2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2591〜2672番目の領域であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における114〜203番目のドメインを介して上記Ex2におけるChtop結合部位と結合することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
Chtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該エキソン２を有し、且つChtop遺伝子のイントロン２（Int2）を有しないことを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Chtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
供試物質と、Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるスプライシング制御因子（hnRNP）結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、
上記供試物質が上記mRNAにおけるhnRNP結合部位とhnRNPタンパク質との結合を阻害する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを備える、
Chtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
上記核酸領域の転写の際にスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAの量が、上記供試物質の非存在下と比較して上記供試物質の存在において大である場合、上記供試物質が上記mRNAにおけるhnRNP結合部位とhnRNPタンパク質との結合を阻害すると判断することを特徴とする請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
上記hnRNP結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列における2668〜2873番目の領域及び/又は2893〜3169番目の領域を含むことを特徴とする請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順で有することを特徴とする請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン３よりも下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする請求項１８記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン２よりも上流及び上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする請求項１８記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
上記Chtop関連疾患は、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌形赤血球症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患であることを特徴とする請求項１５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリオブラストーマ等のChtop（Chromatin target of PRMT1）関連疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Chtop（Chromatin target of PRMT1）は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ1（PRMT1）のクロマチンターゲットであり、脊椎動物の間期細胞における核スペックルに主として局在し、条件的ヘテロクロマチンと結合している。Chtopは、その代替名SRAG [アルギニンとグリシンに富む小さなタンパク質（RG）]とFriend of PRMT1によって示されるように、PRMT1によってメチル化されるRGリッチドメインを有している（非特許文献１）。
【０００３】
近年、5-hydroxymethylcytosine (5hmC)が神経膠芽腫（グリオブラストーマ）細胞のDNAに多く存在し、また、当該腫瘍細胞で発現量が増加しているChtopがChtop-methylosome複合体となって5hmCと結合することが報告された（非特許文献２）。そして、非特許文献２によれば、5hmCがChtop-methylosome複合体をDNAへと導くことで、細胞をがん化させる遺伝子を活性化していることが明らかとなった。
【０００４】
グリオブラストーマはグリア細胞（星状膠細胞）由来のグリオーマの中で極端に増殖能が高い腫瘍細胞で最も悪性度が高いとされている。そのために腫瘍の増大による進行が早く、短期間に悪化する。浸潤が早く手術による摘出も難しく、平均生存期間は1年程度で、5年生存率は10％程度と低く、放射線治療、化学療法でも効果が期待できないと言われている。現在は、手術で腫瘍を摘出しその後放射線照射とデモゾロマイドなどの抗がん剤を併用する治療が一般的と言われているが、再発率も高く有効な治療法は今のところ無い。
【０００５】
また、2013年にグリオブラストーマに対する新しい治療法として、抗VEGF抗体による血管新生を抑制する療法や、その他にも、グリオブラストーマの増殖を抑えるEGFR、mTOR阻害剤などの投与療法、樹状細胞・ペプチドなどを用いた免疫療法、腫瘍幹細胞のPML（Promyelocytic Leukemia）タンパク質を標的とした分子標的療法など、様々な研究が精力的に行われている。しかしながら、グリオブラストーマの発症機序は不明であり、その腫瘍細胞の増殖を特異的に抑制することはできない。
【０００６】
一方、Chtopは、エストロゲン受容体標的遺伝子の活性化や（非特許文献３）、胎児ヘモグロビンから成人ヘモグロビンへの移行に関わる胎児γグロビンのダウンレギュレーションに関与していることが解っている（非特許文献４）。したがって、Chtopはγグロビン遺伝子の発現を調節する能力を介して、βサラセミアと鎌状赤血球症治療のための潜在的な標的になりうると考えられている（非特許文献４及び５（CaoとGalanello、2010））。さらに、Chtopについては、細胞内におけるその他の活性や挙動が報告されている（非特許文献６）。
【０００７】
サラセミアは、グロビンタンパク質の変異によって作られた異常なヘモグロビンが脾臓で壊され溶血を起こして貧血になる病気である。ヘモグロビンはαグロビンとβグロビンの2分子ずつからなるが、どちらか一方の変異で正常なヘモグロビンができなくなる。鎌形赤血球貧血もまた、この変異によって起る病気に含まれる。これらは遺伝病なので根本的治療法はなく、対処療法として輸血を行うか、鉄キレート剤が使われる。重症の場合は骨髄移植が必要となる場合もある。遺伝子治療法として正常な遺伝子を導入する方法が検討されている段階であるが、まだ有効な方法は報告されていない。
【０００８】
以上のように、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌状赤血球症等、Chtopが関連する各種の疾患について、Chtopが治療薬の標的と成り得ることが示唆されるものの、細胞内におけるChtop量の調節メカニズムは未解明のままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zullo AJ, Michaud M, Zhang W, Grusby MJ. (2009) Identification of the small protein rich in arginine and glycine (SRAG): a newly identified nucleolar protein that can regulate cell proliferation. J Biol Chem 284: 12504-12511
【非特許文献２】Takai H, Masuda K, Sato T, Sakaguchi Y, Suzuki T, Suzuki T, Koyama-Nasu R, Nasu-Nishimura Y, Katou Y, Ogawa H, Morishita Y, Kozuka-Hata H, Oyama M, Todo T, Ino Y, Mukasa A, Saito N, Toyoshima C, Shirahige K, Akiyama T (2014) 5-Hydroxymethylcytosine Plays a Critical Role in Glioblastomagenesis by Recruiting the CHTOP-Methylosome Complex. Cell Rep 9: 48-60
【非特許文献３】van Dijk TB, Gillemans N, Stein C, Fanis P, Demmers J, van de Corput M, Essers J, Grosveld F, Bauer UM, Philipsen S (2010a) Friend of Prmt1, a novel chromatin target of protein arginine methyltransferases. Mol Cell Biol 30: 260-272
【非特許文献４】van Dijk TB, Gillemans N, Pourfarzad F, van Lom K, von Lindern M, Grosveld F, Philipsen S (2010b) Fetal globin expression is regulated by Friend of Prmt1. Blood 116: 4349-4352
【非特許文献５】Cao, A., and Galanello, R. (2010) Beta-thalassemia. Genet. Med., 12, 61-76
【非特許文献６】Chang, C.T., Hautbergue, G.M., Walsh, M.J., Viphakone, N., van Dijk, T.B., Philipsen, S., and Wilson, S.A. (2013). Chtop is a component of the dynamic TREx mRNA export complex. EMBO J. 32, 473-486.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述した実情に鑑み、細胞内におけるChtopのタンパク質量を調節することで、グリオブラストーマ等のChtop関連疾患を治療しうる物質（以下、治療剤）のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究した結果、Chtopの発現調節メカニズムを明らかにし、この新たな知見に基づいて細胞内におけるChtopタンパク質量を調節できる物質をChtop関連疾患治療剤としてスクリーニングできる方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は以下を包含する。
（１）供試物質と、少なくともChtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位及び/又はChtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、
上記供試物質が上記mRNAにおけるChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又は上記mRNAにおけるChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを備える、
Chtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
（２）上記核酸領域の転写の際にスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAの量が、上記供試物質の非存在下と比較して上記供試物質の存在において大である場合、上記供試物質が上記mRNAにおけるChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又は上記mRNAにおけるChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進すると判断することを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（３）上記Int2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3138番目の領域（Int2-2-2）及び/又は2668〜2873番目の領域（Int2-1）であることを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（４）上記Int2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3061番目の領域（Int2-2-2a）であることを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（５）上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における1〜113番目のドメインを介して上記Int2におけるChtop結合部位と結合することを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（６）上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における114〜203番目のドメインを介して上記スプライシング制御因子（hnRNP）と結合することを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（７）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順で有することを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（８）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン３よりも下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする（７）記載のスクリーニング方法。
（９）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン２よりも上流及び上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする（７）記載のスクリーニング方法。
（１０）上記Chtop関連疾患は、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌形赤血球症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患であることを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（１１）上記Ex2におけるChtop結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2591〜2672番目の領域であることを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（１２）上記Chtopタンパク質は、配列番号２に示すChtopタンパク質のアミノ酸配列における114〜203番目のドメインを介して上記Ex2におけるChtop結合部位と結合することを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（１３）Chtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該エキソン２を有し、且つChtop遺伝子のイントロン２（Int2）を有しないことを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法。
（１４）Chtop遺伝子のエキソン２（Ex2）におけるChtop結合部位を含む上記核酸領域は、下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする（１３）記載のスクリーニング方法。
（１５）供試物質と、Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるスプライシング制御因子（hnRNP）結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、
上記供試物質が上記mRNAにおけるhnRNP結合部位とhnRNPタンパク質との結合を阻害する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを備える、
Chtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
（１６）上記核酸領域の転写の際にスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAの量が、上記供試物質の非存在下と比較して上記供試物質の存在において大である場合、上記供試物質が上記mRNAにおけるhnRNP結合部位とhnRNPタンパク質との結合を阻害すると判断することを特徴とする（１５）記載のスクリーニング方法。
（１７）上記hnRNP結合部位は、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列における2668〜2873番目の領域及び/又は2893〜3169番目の領域を含むことを特徴とする（１５）記載のスクリーニング方法。
（１８）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、少なくとも、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順で有することを特徴とする（１５）記載のスクリーニング方法。
（１９）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン３よりも下流にレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする（１８）記載のスクリーニング方法。
（２０）Chtop遺伝子のイントロン２（Int2）におけるhnRNP結合部位を含む上記核酸領域は、上記エキソン２よりも上流及び上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を有し、
上記供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とすることを特徴とする（１８）記載のスクリーニング方法。
（２１）上記Chtop関連疾患は、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌形赤血球症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患であることを特徴とする（１５）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るスクリーニング方法は、Chtopタンパク質自身が関与するChtop遺伝子発現調節機構又はhnRNPが関与するChtop遺伝子発現調節機構に基づいて、Chtopの発現量を低下させる物質を同定することができる。したがって、本発明によれば、グリオブラストーマ等のChtop関連疾患に対する治療剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】Dox処理によるFLAG-Chtopの発現及び内因性Chtopの発現を検討した結果を示す（ウエスタンブロット）特性図である。
【図１Ｂ】Dox処理によるFLAG-Chtopの発現及び内因性Chtopの発現を検討した結果を示す特性図である。
【図１Ｃ】内因性ChtopのmRNAとFLAG-ChtopのmRNAの構造を示す模式図である。
【図１Ｄ】Dox処理による内在性Chtop mRNA及び全Chtop（内在性Chtop+FLAG-Chtop）mRNAをRT-qPCRにより測定した結果を示す特性図である。
【図２Ａ】ChtopプレmRNAを示す模式図である。
【図２Ｂ】Dox処理によるFLAG-Chtop発現時のChtop mRNAのRT-sqPCRの結果を示す（アガロース電気泳動図）特性図である。
【図２Ｃ】Int2を含むChtopミニ遺伝子を用いた、スプライシングアッセイの模式図である。
【図２Ｄ】スプライシングアッセイの結果（RT-PCR及びウエスタンブロット）を示す特性図である。
【図２Ｅ】特異的siRNAまたは非特異的/スクランブルRNA（scRNA）でChtopをノックダウンしたときのEx1-（Int2）-GFPミニ遺伝子によるスプライシングアッセイを行った結果（RT-sqPCR及びウエスタンブロット）を示す特性図である。
【図３Ａ】CHX処理時のChtop mRNAをRT-PCRした結果を示す電気泳動写真である。
【図３Ｂ】UPF1をノックダウンしたときのChtop mRNAのRT-PCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図４Ａ】Chtop欠失変異体ΔN1、ΔRG、およびΔC1の構成を示す模式図である。
【図４Ｂ】Chtop欠失変異体を発現する細胞をDox処理したときの、内因性ChtopとFLAG-Chtopの発現を検討した結果（ウエスタンブロッティング）を示す特性図である。
【図４Ｃ】Chtop欠失変異体を発現する細胞をDox処理したときの、内因性Chtop mRNAレベルをRT-qPCRで調べた結果を示す特性図である。
【図４Ｄ】Chtop欠失変異体を発現する細胞をDox処理したときの、Chtop mRNAをRT-sqPCRで調べた結果を示す特性図である。
【図５Ａ】FLAG-Chtopに結合したChtop mRNAをEx1-Ex4に特定のプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果を示す特性図である。
【図５Ｂ】RNA複合体結合アッセイの結果であり、BT-RNAを含むFLAG-Chtop複合体を検出した結果を示す特性図である。
【図５Ｃ】RNA複合体結合アッセイの結果であり、BT-RNAを含むFLAG-Chtop複合体を検出した結果を示す特性図である。
【図５Ｄ】BT-Int2-2-2を含むFLAG-Chtop欠失変異体複合体を検出するための、RNA複合体結合アッセイの結果を示す特性図である。
【図５Ｅ】BT-Int2-2-1またはBT-Int2-2-2 RNAとの組換えTF-N1（またはコントロールTF）を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す特性図である。
【図６Ａ】Int2wtと変異体の構成を示す模式図である。
【図６Ｂ】FLAG-Chtop発現時の、Ex1-（Int2）-GFPミニ遺伝子を用いたスプライシングアッセイの結果を示す特性図である。
【図６Ｃ】FLAG-Chtop発現時の、Ex1-（Int2）-GFPミニ遺伝子を用いたスプライシングアッセイの結果を示す特性図である。
【図６Ｄ】BT-Int2-2-2aまたはBT-Int2-2-2bとFLAG-Chtop複合体の、RNA複合体結合アッセイの結果を示す特性図である。
【図７Ａ】hnRNPsのノックダウン時におけるChtopプレmRNAをE1からE4の領域（Ex1-Ex4）をカバーするプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果を示す特性図である。
【図７Ｂ】293T細胞においてhnRNP Hをノックダウンした後、CHX処理したときのRT-PCR分析の結果を示す特性図である。
【図７Ｃ】FLAG-Chtop細胞をDox処理し、次いで、（IP）で免疫沈降させhnRNP Hを検出した結果を示す特性図である。
【図７Ｄ】FLAG-Chtopを抗FLAGで免疫沈降させ、FLAG-Chtop複合体をRNase Aで処理した後、hnRNP Hを検出した結果を示す特性図である。
【図７Ｅ】FLAG-Chtopまたはその欠失変異体について抗FLAGを使用して、各核抽出物から免疫沈降し、hnRNP Hを検出した結果を示す特性図である。
【図７Ｆ】Int2pGT1とInt2pGT2ミニ遺伝子をInt2wtから構築する設計図と、Ex1からGFPの間を増幅する特定のプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果を示す特性図である。
【図７Ｇ】FLAG-hnRNP Hを抗FLAGで免疫沈降させ、ノーザンブロットでBT-RNAを検出した結果を示す特性図である。
【図８Ａ】インビボ・スプライシングアッセイに使用したミニ遺伝子の構成を示す特性図である。
【図８Ｂ】インビボ・スプライシングアッセイの結果を示す特性図である。
【図９】TR、WT、ΔC1、ΔRG、ΔN1又はNLSΔN1変異体を発現したT-REx293細胞由来の核抽出液と混合し、anti-FLAG magnetic beadsでプルダウンし、ビオチン化-EX2のRNAをノーザンブロットで検出した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法において、Chtop関連疾患とは、Chtop（Chromatin target of PRMT1）タンパク質量が、正常細胞あるいは胎児期（分化段階の異なる）細胞と比較して高いといった特徴を示す疾患である。このような疾患には、特に限定されないが、グリオブラストーマ、サラセミア及び鎌形赤血球症を挙げることができる。
【００１７】
なお、ここで、Chtop関連疾患治療剤とは、上述した具体的な疾患に対する治療効果が期待できる物質という意味を含み、薬理試験や臨床試験等により治療効果が確認された物質のみを意味するものではない。したがって、本発明において「Chtop関連疾患治療剤」という用語は、Chtop関連疾患に対する治療効果を有する薬剤の候補物質と言い換えることができる。すなわち、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法とは、Chtop関連疾患に対する治療効果を有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法と言い換えることもできる。
【００１８】
[スクリーニング方法１]
特に、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法は、Chtopタンパク質が、自身をコードするChtop遺伝子の発現量を調節する機能を有するといった新規知見に基づいている。Chtopタンパク質は、細胞内においてChtop遺伝子から転写されたプレmRNAにおける2番目のイントロン（イントロン２と呼称する）及び2番目のエキソン（エキソン２と呼称する）に結合することができる。なお、後述の実施例に示すように、Chtopタンパク質は、イントロン２における複数の部位（本明細書において「Int2におけるChtop結合部位」と称する）に結合しうること、エキソン２における特定の部位（本明細書において「Ex2におけるChtop結合部位」と称する）に結合しうることを明らかにしている。プレmRNAにおいて、Int2におけるChtop結合部位或いはEx2におけるChtop結合部位にChtopが結合した状態では、スプライシング阻害を来し、イントロン２が残留したmRNA（以下、「残留mRNA」と称する場合もある）が残ることとなる。イントロン２が残留したmRNAは、ナンセンス変異を含むため、通常、ナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD）により分解される。
【００１９】
なお、以下の説明において、単に「Chtop結合部位」と記載する場合、Int2におけるChtop結合部位及びEx2におけるChtop結合部位の両方を含む意味である。
【００２０】
また、Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質は、スプライシング制御因子（hnRNP）と結合することができ、当該hnRNPによる正常なスプライシングを阻害する。したがって、Chtop遺伝子のプレmRNAとChtopタンパク質との結合を維持することができれば、細胞内におけるChtopタンパク質量は減少することとなる。逆に、Chtop遺伝子のプレmRNAに結合したChtopタンパク質が容易に乖離すれば、細胞内におけるChtopタンパク質量が増加することとなる。
【００２１】
このような新規知見から、Chtopタンパク質とChtop遺伝子のプレmRNAとの結合（すなわち、Chtopタンパク質とInt2におけるChtop結合部位及び/又はEx2におけるChtop結合部位との結合）を維持すれば、細胞内のChtopタンパク質量は減少する、或いは増大することなく所定のレベルを維持できることがわかる。すなわち、Chtopタンパク質とChtop遺伝子のプレmRNAとの結合を維持する物質については、上述したChtop関連疾患に対する治療効果を期待することができる。
【００２２】
また、このような新規知見から、Chtop遺伝子のプレmRNAと結合したChtopタンパク質（すなわち、Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質）とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を維持すれば、細胞内のChtopタンパク質量は減少する、或いは増大することなく所定のレベルを維持できることがわかる。すなわち、Chtop遺伝子のプレmRNAに結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を維持する物質については、上述したChtop関連疾患に対する治療効果を期待することができる。
【００２３】
すなわち、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法は、供試物質と、少なくとも上述したChtop結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、上記供試物質が上記Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又は上記Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを含む方法である。
【００２４】
具体的に、上記核酸領域に含まれるChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を直接的又は間接的に観察する系を利用することで、供試物質について、上記Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する機能を有するか否かを判定することができる。また、上記核酸領域に含まれるChtop結合部位に対して結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を直接的又は間接的に観察する系を利用することで、供試物質について、Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する機能を有するか否かを判定することができる。
【００２５】
なかでも、Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合を直接的に観察する系としては、例えばゲルシフトアッセイやRNaseフットプリント法等を挙げることができる。また、Chtop結合部位に対して結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を直接的に観察する系としては、同様に、例えばゲルシフトアッセイやRNase フットプリント法等を挙げることができる。
【００２６】
また、Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合を間接的に観察する系又はChtop結合部位に対して結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を間接的に観察する系とは、Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合が維持されることで生じる、残留mRNAに由来する翻訳産物を観察することを意味する。すなわち、残留mRNAに由来する翻訳産物を観察することで、Chtop結合部位に対するChtopタンパク質の結合や、Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を間接的に観察することができる。なお、翻訳産物を観察するには、特に限定されないが、ウエスタンブロッティング法や、翻訳産物を蛍光タンパク質等の融合タンパク質として発現させて蛍光を観察する方法などを適用することができる。
【００２７】
以上のようにして、Chtop結合部位を含む核酸領域のスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAや残留mRNAの翻訳産物を観察し、供試物質の非存在下と比較して供試物質の存在において残留mRNA量や残留mRNAの翻訳産物量が大である場合、当該供試物質がChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又はChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進すると判断することができる。
【００２８】
ここでInt2におけるChtop結合部位とは、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3138番目の領域（以下、Int2-2-2と称する場合もある）及び2668〜2873番目の領域（以下、Int2-1と称する場合もある）のいずれか一方又は両方を意味する。特に、Int2におけるChtop結合部位としては、Int2-2-2の領域に含まれる、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2997〜3061番目の領域（以下、Int2-2-2aと称する場合もある）とすることが好ましい。なお、Int2におけるChtop結合部位としては、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において3070〜3138番目の領域（以下、Int2-2-2bと称する場合もある）とすることもできる。
【００２９】
また、Int2におけるChtop結合部位を含む核酸領域とは、Chtop遺伝子から選ばれる領域であって上記Int2におけるChtop結合領域を含み、Chtopタンパク質との結合を検出可能な領域である。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるイントロン２のみを含む領域；Chtop遺伝子におけるイントロン２上流のエキソン２と、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域；及び、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３下流のエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域を挙げることができる。なかでも、核酸領域としては、Chtopタンパク質が当該Int2におけるChtop結合部位に結合した状態でスプライシング阻害を生じうる領域とすることが好ましい。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるイントロン２上流のエキソン２と、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができ、或いは、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３の下流にエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができる。このような構成の核酸領域を使用すれば、スプライシング阻害により、エキソン２-イントロン２-エキソン３（-エキソン４）という構成の残留mRNAが存在することとなる。
【００３０】
なお、核酸領域としては、上述した構成に限定されず、エキソン２の上流にエキソン１を含む構成でも良いし、エキソン４の下流に他のエキソン（エキソン５及び６）を含む構成であっても良いし、上述したエキソン２に加えて所定の位置に他のイントロン（イントロン１、イントロン３〜５）を含む構成であっても良い。
【００３１】
また、ここでEx2におけるChtop結合部位とは、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2591〜2672番目の領域から選ばれるChtopタンパク質との結合に関与する領域を意味する。特に、Ex2におけるChtop結合部位としては、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列における2591〜2672番目の全領域とすることができる。
【００３２】
また、Ex2におけるChtop結合部位を含む核酸領域とは、Chtop遺伝子から選ばれる領域であって上記Ex2におけるChtop結合領域を含み、Chtopタンパク質との結合を検出可能な領域である。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるエキソン２のみを含む領域；Chtop遺伝子におけるエキソン２と、当該エキソン２下流のイントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域；及び、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３下流のエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域を挙げることができる。なかでも、核酸領域としては、Chtopタンパク質が当該Ex2におけるChtop結合部位に結合した状態でスプライシング阻害を生じうる領域とすることが好ましい。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるエキソン２と、当該エキソン２下流のイントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができ、或いは、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３下流のエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができる。このような構成の核酸領域を使用すれば、スプライシング阻害により、エキソン２-イントロン２-エキソン３（-エキソン４）という構成の残留mRNAが存在することとなる。
【００３３】
なお、核酸領域としては、上述した構成に限定されず、エキソン２の上流にエキソン１を含む構成でも良いし、エキソン４の下流に他のエキソン（エキソン５及び６）を含む構成であっても良いし、上述したエキソン２に加えて所定の位置に他のイントロン（イントロン１、イントロン３〜５）を含む構成であっても良い。
【００３４】
なお、配列番号１に示すChtop遺伝子において、１〜362番目がエキソン１であり、363〜2590番目がイントロン１であり、2591〜2672番目がエキソン２であり、2673〜4313番目がイントロン２であり、4314〜4467番目がエキソン３であり、4468〜8264番目がイントロン３であり、8265〜8448番目がエキソン４であり、8449〜9245番目がイントロン４であり、9246〜9383番目がエキソン５であり、9384〜11082番目がイントロン５であり、11083〜12325番目がエキソン６である。
【００３５】
特に、Chtop結合部位を含む核酸領域は、蛍光タンパク質等をコードするレポーター遺伝子を融合することが好ましい。レポーター遺伝子の発現に基づいて、スプライシング阻害により生じる残留mRNA由来の発現産物を容易に検出することができる。
【００３６】
例えば、Chtop結合部位を含む核酸領域において、イントロン２の下流に位置するエキソン３よりも更に下流にレポーター遺伝子を融合することが好ましい。イントロン２を残留したmRNAは、イントロン２内に終止コドンを有するため、終止コドンより下流のエキソン３やその下流に位置するレポーター遺伝子は翻訳されない。よって、供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、供試物質の存在下において残留mRNAに由来する翻訳産物が多いと判断できる。すなわち、この場合、供試物質がChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又はChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進すると判断できる。
【００３７】
また、Chtop結合部位を含む核酸領域において、イントロン２の上流に位置するエキソン２の更に上流及びイントロン２の下流に位置するエキソン３の更に下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を融合することがより好ましい。供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質の存在下において残留mRNAに由来する翻訳産物が多いと判断できる。すなわち、この場合、供試物質がChtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する、及び/又はChtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進すると判断できる。
【００３８】
ここで、Chtopタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。Chtopタンパク質は、N末端側のドメイン（N1ドメイン）を介してInt2におけるChtop結合部位と結合する。また、Chtopタンパク質は、アルギニンとグリシンに富むドメイン（RGドメイン）を介してEx2におけるChtop結合部位と結合する。N1ドメインは、配列番号２に示すアミノ酸配列において1〜113番目に相当している。また、Chtopタンパク質は、RGドメインを介してスプライシング制御因子（hnRNP）と結合する。RGドメインは、配列番号２に示すアミノ酸配列において114〜203番目に相当している。なお、配列番号２に示すアミノ酸配列において、204〜268番目をC1ドメインと称している。
【００３９】
ここで、供試物質とは、何ら限定されず、如何なる物質であってもよい。供試物質としては、Chtop関連疾患に対する治療効果が予測された物質であっても良いし、Chtop関連疾患との関連性が全く未知である物質であっても良い。供試物質としては、単独の物質であってもよいし、複数の構成成分からなる混合物であってもよい。供試物質としては、例えば微生物若しくは培養液からの抽出物のように未同定の物質を含むような構成であってもよいし、既知の組成物を所定の組成比で含むような構成であってもよい。また、被検物質としては、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物及び無機化合物のいずれでもよい。
【００４０】
また、具体的に、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法では、上述した、Chtop結合部位を含む核酸領域を導入した細胞を準備し、供試物質を含む溶液に当該細胞を浸漬する、或いは供試物質を含む培養液で当該細胞を培養することで、供試物質と当該核酸領域を転写したmRNAとを接触させる。そして、例えば、上述したように、ゲルシフトアッセイやレポーター遺伝子の発現に起因する蛍光を測定することで、スプライシング阻害による残留mRNAや残留mRNA由来の翻訳産物を観察する。その結果から、供試物質が上記Chtop結合部位とChtopタンパク質との結合を促進する機能を有するか、上記Chtop結合部位に結合したChtopタンパク質とスプライシング制御因子（hnRNP）との結合を促進する機能を有するかを判断することができる。
【００４１】
[スクリーニング方法２]
また、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法は、スプライシング制御因子（hnRNP）がChtop遺伝子のmRNAと結合することで、Chtop遺伝子の発現量を調節する機能を有するといった新規知見に基づいている。hnRNPは、細胞内においてChtop遺伝子から転写されたプレmRNAにおける2番目のイントロン（イントロン２と呼称する）に結合することができる。なお、後述の実施例に示すように、hnRNPは、イントロン２における複数の部位（本明細書において「hnRNP結合部位」と称する）に結合しうることを明らかにしている。プレmRNAにおいて、hnRNP結合部位にhnRNPが結合した状態ではスプライシングが正常に進行するが、hnRNPとhnRNP結合部位との結合が阻害されると正常なスプライシングが阻害される結果、イントロン２が残留したmRNAが残ることとなる。イントロン２が残留したmRNAは、ナンセンス変異を含むため、通常、ナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD）により分解される。
【００４２】
したがって、Chtop遺伝子のプレmRNAとhnRNPとの結合を阻害することができれば、細胞内におけるChtopタンパク質量は減少することとなる。逆に、Chtop遺伝子のプレmRNAに結合したhnRNPが容易に乖離しなくなれば（当該プレmRNAとhnRNPとの結合を促進すれば）、細胞内におけるChtopタンパク質量が増加することとなる。
【００４３】
このような新規知見から、hnRNPとChtop遺伝子のプレmRNAとの結合（すなわち、hnRNPとhnRNP結合部位との結合）を阻害すれば、細胞内のChtopタンパク質量は減少する、或いは増大することなく所定のレベルを維持できることがわかる。すなわち、hnRNPとChtop遺伝子のプレmRNAとの結合を阻害する物質については、[スクリーニング方法１]で説明したChtop関連疾患に対する治療効果を期待することができる。
【００４４】
すなわち、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法は、供試物質と、少なくとも上述したhnRNP結合部位を含む核酸領域を転写したmRNAとを接触させる工程と、上記供試物質が上記hnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害する場合に、当該供試物質をChtop関連疾患治療剤の候補物質とする工程とを含む方法である。
【００４５】
具体的に、上記核酸領域に含まれるhnRNP結合部位とhnRNPとの結合を直接的又は間接的に観察する系を利用することで、供試物質について、上記hnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害する機能を有するか否かを判定することができる。
【００４６】
なかでも、hnRNP結合部位とhnRNPとの結合を直接的に観察する系としては、例えばゲルシフトアッセイやRNaseフットプリント法等を挙げることができる。
【００４７】
また、hnRNP結合部位とhnRNPとの結合を間接的に観察する系とは、hnRNP結合部位とhnRNPとの結合が阻害されることで生じる、イントロン２が残留したmRNAに由来する翻訳産物を観察することを意味する。すなわち、残留mRNAに由来する翻訳産物を観察することで、hnRNP結合部位に対するhnRNPの結合を間接的に観察することができる。なお、翻訳産物を観察するには、特に限定されないが、ウエスタンブロッティング法や、翻訳産物を蛍光タンパク質等の融合タンパク質として発現させて蛍光を観察する方法などを適用することができる。
【００４８】
以上のようにして、hnRNP結合部位を含む核酸領域のスプライシング阻害によりイントロン２を残留したmRNAや残留mRNAの翻訳産物を観察し、供試物質の非存在下と比較して供試物質の存在において残留mRNA量や残留mRNAの翻訳産物量が大である場合、当該供試物質がhnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害すると判断することができる。
【００４９】
ここでhnRNP結合部位とは、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列において2668〜2873番目の領域（以下、Int2-1と称する場合もある）及び2893〜3169番目の領域（以下、Int2-2と称する場合もある）のいずれか一方又は両方を意味する。特に、hnRNP結合部位としては、後述する実施例に示すように、配列番号１に示すChtop遺伝子の塩基配列における2733〜2736番目のGGGGを挙げることができる。したがって、hnRNP結合部位としては、この2733〜2736番目のGGGGを含むInt2-1とすることが好ましい。
【００５０】
また、hnRNP結合部位を含む核酸領域とは、Chtop遺伝子から選ばれる領域であって上記hnRNP結合領域を含み、hnRNPとの結合を検出可能な領域である。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるイントロン２のみを含む領域；Chtop遺伝子におけるイントロン２上流のエキソン２と、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域；及び、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３下流のエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域を挙げることができる。なかでも、核酸領域としては、hnRNPがhnRNP結合部位に結合した状態でスプライシング阻害を生じうる領域とすることが好ましい。例えば、このような核酸領域としては、少なくとも、Chtop遺伝子におけるイントロン２上流のエキソン２と、当該イントロン２と、当該イントロン２下流のエキソン３とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができ、或いは、エキソン２と、イントロン２と、エキソン３と、エキソン３の下流にエキソン４とをこの順（5’末端から3’末端の順）に含む領域とすることができる。このような構成の核酸領域を使用すれば、スプライシング阻害により、エキソン２-イントロン２-エキソン３（-エキソン４）という構成の残留mRNAが存在することとなる。
【００５１】
なお、核酸領域としては、上述した構成に限定されず、エキソン２の上流にエキソン１を含む構成でも良いし、エキソン４の下流に他のエキソン（エキソン５及び６）を含む構成であっても良いし、上述したエキソン２に加えて所定の位置に他のイントロン（イントロン１、イントロン３〜５）を含む構成であっても良い。
【００５２】
特に、hnRNP結合部位を含む核酸領域は、蛍光タンパク質等をコードするレポーター遺伝子を融合することが好ましい。レポーター遺伝子の発現に基づいて、スプライシング阻害により生じる残留mRNA由来の発現産物を容易に検出することができる。
【００５３】
例えば、hnRNP結合部位を含む核酸領域において、イントロン２の下流に位置するエキソン３よりも更に下流にレポーター遺伝子を融合することが好ましい。イントロン２を残留したmRNAは、イントロン２内に終止コドンを有するため、終止コドンより下流のエキソン３やその下流に位置するレポーター遺伝子は翻訳されない。よって、供試物質の存在下において当該レポーター遺伝子の発現量が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して小である場合、供試物質の存在下において残留mRNAに由来する翻訳産物が多いと判断できる。すなわち、この場合、供試物質がhnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害すると判断できる。
【００５４】
また、hnRNP結合部位を含む核酸領域において、イントロン２の上流に位置するエキソン２の更に上流及びイントロン２の下流に位置するエキソン３の更に下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子を融合することがより好ましい。供試物質の存在下において、上記エキソン２よりも上流に位置するレポーター遺伝子の発現量（E1）と上記エキソン３よりも下流にそれぞれ異なるレポーター遺伝子の発現量（E2）との比（E1/E2）が、上記供試物質の非存在下における発現量と比較して大である場合、当該供試物質の存在下において残留mRNAに由来する翻訳産物が多いと判断できる。すなわち、この場合、供試物質がhnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害すると判断できる。
【００５５】
なお、供試物質とは、何ら限定されず、[スクリーニング方法１]の欄で説明した如何なる物質であってもよい。
【００５６】
また、具体的に、本発明に係るChtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法では、上述した、hnRNP結合部位を含む核酸領域を導入した細胞を準備し、供試物質を含む溶液に当該細胞を浸漬する、或いは供試物質を含む培養液で当該細胞を培養することで、供試物質と当該核酸領域を転写したmRNAとを接触させる。そして、例えば、上述したように、ゲルシフトアッセイやレポーター遺伝子の発現に起因する蛍光を測定することで、スプライシング阻害による残留mRNAや残留mRNA由来の翻訳産物を観察する。その結果から、供試物質が上記hnRNP結合部位とhnRNPとの結合を阻害する機能を有するかを判断することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
〔実施例１〕
本実施例では、Flp-In T-RExシステムを使用して、サイトメガロウイルスプロモーターおよびテトラサイクリンオペレーターの制御下にChtop遺伝子を導入し、Chtopをタグ付き誘導FLAG（FLAG-Chtop）の単一コピーとして発現できるHEK293細胞株（T-REx 293セル）を作製した。FLAG-Chtopの発現は、24時間まで増加し、それ以降は横ばいとなっているが、内因性Chtopは非誘導細胞と比較して48時間後には50％以下まで減少していることがわかった（図1A及び1B）。逆転写（RT）後の定量的PCRによって測定されるように、この内因性Chtopの減少は、内在性mRNAレベルの減少と相関していた（図1C及び1D）。内因性Chtop mRNAレベルは、FLAG-Chtopを発現しないT-REx 293細胞において変化しなかったのに対し、FLAG-Chtopを発現誘導した細胞では、非誘導細胞と比較して48時間では大幅に減少した（図1D）。これとは対照的に、外因性Chtop mRNAを含む総Chtop mRNAは非誘導細胞（図1D）と比較して、48時間誘導後までに15倍増加した。これらの結果から、FLAG-Chtopの外因性発現の際に、内因性Chtopのレベルの低下がmRNAレベルで引き起こされることが明らかとなった。
【００５９】
なお、図1Aは、FLAG-Chtopのドキシサイクリン（Dox）の誘導発現を示しており、FLAG-Chtopおよび内因性（Endo）Chtopを明らかにするために、全細胞抽出物について抗Chtop（KT64）を用いたウエスタンブロッティングに供した結果を示している。Lamin Bは、ローディングコントロールとして使用した。図1Bは、バンドの強度を定量化し、Dox非誘導時の内在性Chtop（0時間）の発現レベルに対する、Dox誘導時の内在性ChtopとFLAG-Chtopの割合を示している（Lamin Bレベルで標準化した）。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。図１CはEndo ChtopとFLAG-Chtop mRNAの模式図である。図１C中の矢印は、RT-qPCRにより増幅されたmRNAのコード配列（CDS）及び3 '非翻訳領域（UTR）を示している。図1Dは、内在性Chtop mRNAおよび全Chtop（内在性Chtop + FLAG-Chtop）mRNAをRT-qPCRにより測定した結果である。Chtop mRNAの各値は、GAPDH mRNAで標準化した、相対Chtop mRNAレベルは、Dox未処理時の値で標準化した値である。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。P-値は、unpaired t-testを用いて計算した。
【００６０】
〔実施例２〕
本実施例では、T-REx 293細胞におけるFLAG-Chtopの発現の際に、選択的スプライシングを受けたChtopプレmRNAのレベルに変化があるかどうかを調べた。Chtop遺伝子におけるエキソン1（Ex1）からEx6まで（Ex1-Ex6）を覆う領域を増幅するプライマーセットを用いて、細胞抽出物中に存在するChtop mRNAのRT-PCRを実施し、大凡2000、3500および7000塩基対のDNAバンドを検出した（図2B、アスタリスク）。大凡2000塩基対のDNAは、イントロンがなく全てのエキソンを含むEx1-Ex6（2160）のサイズに対応していた。また、3500塩基対のDNA断片は、その大きさを考慮するとEx1-Ex6に加えて、イントロン２（Int2）（2163+1641=3804）又はイントロン５（INT5）（2163+1699=3862）が含まれていると考えられた。そこで、DNA断片の塩基配列を決定したところ、2000塩基対のDNA断片がイントロンを含まないEx1-Ex6の塩基配列を持ち、3500塩基対のDNA断片がInt2を持っていることを確認した。なお、この3500塩基対のDNA断片をEx1-（Int2）-Ex6と表記する。この塩基配列決定によって、Ex1-（Int2）-Ex6内のEx2の3'末端の直後に終止コドンが存在していることが判明した。
【００６１】
増加した3つのDNAバンドの合計に対するEx1-（Int2）-E6の存在比率を比べると、FLAG-ChtopのDox誘導48時間ではEx1-（Int2）-E6の量が増加し、Ex1-Ex6は減少していた（図2B）。なお、データは示さないが、FLAG-Chtop誘導によって、Ex1-（Int2）-Ex4の割合が増加すること、特定のプライマーセットを用いて増幅する（Ex1-Ex4）断片及び（Ex4-Ex6）断片の割合が減少していた。これらのデータは、FLAG-Chtopの増加がChtopプレmRNAのスプライシングの際にInt2の残留を引き起こすことを示唆していた。
【００６２】
そこで、Int2残留を調べるために、Ex1-（Int2）-Ex4の上流にGFPコードDNAを含む [Ex1-（Int2）-GFPミニ遺伝子（Int2wt）]を構築した（図2C）。このミニ遺伝子を使用することにより、Ex1からGFPにまたがるプライマーセットを用いて、RT後の半定量的PCR（sqPCR）によってInt2保持を調べることができる（図2C）。検出された全ての転写物の総量に対するInt2を残留した転写物Ex1-（Int2）-GFPの割合は、FLAG-Chtopを発現しない細胞と比較してFLAG-Chtopを発現した細胞ではFLAG-Chtopレベルの増加と共に増加した。また、抗GFPで検出された翻訳産物の量は、FLAG-Chtopを発現しない細胞と比較してFLAG-Chtop発現した細胞ではEx1-（Int2）-GFPの増加に伴って減少した（図2C及び2D）。これは、Ex2の3'末端の直後に終止コドンが存在するといった配列解析の結果と一致している。
【００６３】
さらに、Ex6内の領域に相補的な短い干渉RNA（siRNA）を使用したChtopノックダウン細胞でのEx1-（Int2）-GFPミニ遺伝子由来のプレmRNA中のInt2保持を分析した。Chtopノックダウン細胞は、スクランブル/非特異的なRNA（scRNA）を発現する細胞を測定したものと比較してInt2-保持転写物の割合を半分に減少させた（図2E）。これらのデータは、ChtopがChtopプレmRNAのスプライシングの際に、スプライシング阻害を来し、Int2残留を促進することを示唆している。
【００６４】
なお、図2Aは、ChtopプレmRNAの模式図であり、エキソン（Ex、ボックス）とChtop mRNAのイントロン（Int、線）を示している。各グレーボックス(Ex1、Ex6)は非コード領域である。シーケンスの長さは、各エキソンおよびイントロンの下に示している。プライマー（矢印）とPCR増幅領域（破線）を示している。図2Bは、FLAG-Chtop発現時のChtop mRNAのRT-sqPCRの結果である。T-REx 293細胞、FLAG-Chtop細胞におけるDox非誘導（-）または24時間誘導（+）時の、内因性Chtop mRNAはChtopのmRNA（Ex1-Ex6）をRT-sqPCRによって定量化した。ACTB mRNAは、ローディングコントロールとして使用した。アスタリスク（*、**、***）は、推定Chtop mRNAを表す。全DNA断片に対する3500-bpのChtopのDNA（**で示される）の比率を、各レーンの下に示した。図２CはInt2を含むChtopミニ遺伝子を用いた、スプライシングアッセイの模式図を示している。図２Dは、スプライシングアッセイの結果を示している。Ex1-GFP及びEx1-（Int2）-GFPのmRNAのレベルはRT-sqPCR（上）によって決定した。 Ex1-GFP及びEx1-（Int2）-GFPに対応するPCR断片を、図の右側に示している。下のパネルはEx1-（Int2）-GFPミニ遺伝子ならびにFLAG-Chtopから派生したGFP融合タンパク質のウエスタンブロット（WB）を示している。 βアクチンをローディングコントロールとして使用した。図2Eは、特異的siRNAまたは非特異的/スクランブルRNA（scRNA）でChtopをノックダウンした場合に、Ex1-（Int2）-GFPミニ遺伝子によるスプライシングアッセイを行った結果であり。Ex1-GFPとEx1-（Int2）-GFPのmRNAのレベルは、RT-sqPCRで測定している。Chtopタンパク質レベルは、WBによって検出している。ACTB、βアクチンは、それぞれRT-PCR及びWBのためのローディングコントロールとして使用した。グラフはEx1-（Int2）-GFPのmRNAの割合を示している。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。P値は、unpaired t検定を用いて計算した。
【００６５】
〔実施例３〕
本実施例では、Int2を残留したmRNAがナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD）により分解されることを確認した。すなわちInt2を残留したmRNAは、Ex2の3'末端の後に終止コドンを有するためNMDにより分解されるか検証した。本例では、実施例１で作製したFLAG-Chtopを発現するT-REx 293細胞に対するNMD阻害剤：シクロヘキシミド（CHX）の効果を評価した。その結果、CHXはFLAG-Chtop発現細胞及び対照細胞の両方でInt2を残留したChtop mRNAのレベルを増加させた（図3A）。また、Int2の残留に対するUPF1（NMD機構の必須成分）のsiRNA媒介ノックダウンの効果を評価したところ、UPF1のノックダウンがInt2の残留を増加させることが明らかになった（図3B）。これらのデータから、スプライシング阻害によりInt2を残留したChtop mRNAはNMDを介して分解されることを示している。
【００６６】
なお、図3Aは、CHX処理時のChtop mRNAを測定した結果であり、48時間FLAG-Chtop細胞の誘導した後、細胞を2時間CHXで処理した。Chtop mRNAはChtop mRNAのEx6（Ex1の-Ex6）にEx1のための特定のプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した。Ex1-Ex6とEx1-（Int2）-Ex6は、図の右側に示している。ACTBをローディング対照として使用した。図3Bは、UPF1ノックダウン場合のChtop mRNAのRT-PCRの結果を示している。293T細胞におけるsiRNAによるUPF1ノックダウンをWB（上）に示した。βアクチンをローディング対照として使用した。UPF1ノックダウン細胞におけるChtop mRNAはChtop mRNAのEx1の-Ex6（下部）に特異的なプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した。ACTBをローディング対照として使用した。
【００６７】
〔実施例４〕
本実施例では、ChtopプレmRNAのスプライシングの際にInt2残留を引き起こすメカニズムを調べるために、Int2残留に関与するChtop分子内の領域を決定した。そのために、それぞれがN末端FLAGタグを含む、Chtop（ΔC1、ΔRG、またはΔN1）の欠失変異体を発現するDox誘導性T-REx 293細胞株を作製した（図4A）。なお、ΔN1は、N1ドメイン（配列番号２における1〜113番目）を欠失した変異体である。ΔRGは、RGドメイン（配列番号２における114〜203番目）を欠失した変異体である。ΔC1は、C1ドメイン（配列番号２における204〜268番目）を欠失した変異体である。タンパク質レベルは、Chtopタンパク質における1〜110残基に対する抗体（抗体KT59）と、C末端208〜264残基に対する抗体（抗体KT64）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した（図4B）。本例で作製した３つの欠失変異体のなかでは、ΔC1のみが、内因性Chtop mRNAのレベルを減少させることが、RT-qPCRの結果からあきからとなった（図4C）。またΔC1は、RT-sqPCRによって決定されるように、[図4DにEx1-（Int2）-Ex4として示されている] Int2残留転写産物の量を増加させた。
【００６８】
なお、ΔRG変異体は、核内で主に存在していたが、野生型FLAG-Chtop（図4D）とは対照的に、Int2残留転写産物の量を増加させなかった。このことは、RGドメインはInt2の残留に必要であることを示唆している。しかし、RGドメインを含むΔN1の発現は、Int2の残留をもたらさなかった。これは、データは示さないが、ΔN1が主として細胞質に存在したという事実によって支持される。これらの実験からは、Int2の残留におけるN1の直接の関与を排除しなかった。
【００６９】
なお、図4Aは、Chtop欠失変異体ΔN1、ΔRG、およびΔC1の模式図を示している。図中、 FLはFLAGを示している。図4Bは、変異体を発現する細胞を、Doxで48時間誘導し、そして内因性ChtopとFLAG融合Chtopをの下部に示された抗体（KT59、KT64、FLAG）を用いてウエスタンブロッティングによって分析した結果を示している。各Chtop欠失変異体は、「FLAG」（閉じた矢印）で示している。βアクチンをローディング対照として使用した。図4Cは、Chtopの変異体を発現したDox誘導細胞における内因性Chtop mRNAレベルをRT-qPCRで調べた結果を示している。変異体を発現する細胞のそれぞれは、48時間のDoxで処理し、そして内因性Chtop mRNAは3'UTRに特異的なプライマーセットを用いてRT-qPCRにより分析した。各Chtop mRNAはGAPDH mRNAで標準化し、それぞれのmRNAレベルは、Dox（0時間）で処理されていない細胞に対する値で標準化した。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。それぞれのP値は、unpaired t検定を用いて計算した。図4Dは、Dox誘導Chtop欠失変異細胞中のChtop mRNAをRT-sqPCRで調べた結果を示している。Ex1-Ex4に特定のプライマーセットを用い、RT-sqPCRを行った。欠失変異体を発現する細胞の各々は、Doxで48時間処理し、そしてChtop mRNAを分析した。Ex1-（Int2）-Ex4とChtop mRNAのEx1の-Ex4は、図の右側に示している。ACTBをローディング対照として使用した。
【００７０】
〔実施例５〕
本実施例では、Chtopによって標的とされるInt2内の領域を決定するために、FLAG-Chtopを釣り餌とした親和性プルダウン分析により、プレmRNAとChtopの結合を調べた。FLAG-ChtopでプルダウンされるRNAのRT-PCR解析は、FLAG-ChtopはEx1-（Int2）-Ex4（大凡2000塩基対）と強く結合していることを示した（図5A）。100種の脊椎動物（UCSCゲノムブラウザ、http://genome.ucsc.edu/）の間でChtopプレmRNAのInt2配列内の高度に保存された領域を検索した（データは示さず）。その結果、3つ高度に保存された領域の塩基配列を特定し、その配列にビオチンを付加したRNA（BT-RNAのInt2-1、Int2-2、及びInt2-3）をそれぞれ化学合成した。それぞれの領域は、Chtop遺伝子の塩基配列（配列番号１）における2668〜2873番目、2893〜3169番目及び3971〜4314番目の領域に対応している。各BT-RNAは、FLAG-Chtopを発現したT-REx 293細胞の抽出物と混合し、抗FLAG M2磁気ビーズでプルダウンし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を抱合したストレプトアビジンで検出した。このインビトロ結合分析の結果から、Chtopは、BT-Int2-2 RNAに強く結合し、BT-Int2-1に非常に弱く結合していることが示された（図5B）。Chtopが結合に関与する領域をさらに狭めるために、BT-Int2-2 RNAに関して、さらに２つの追加BT-RNA：BT-Int2-2-1（2893〜2994番目）とBT-Int2-2-2（2997〜3138番目）を化学合成し、同様にin vitroでのプルダウン分析を行った。これによって、BT-Int2-2-2がFLAG-Chtopに結合することが示された（図5C）。
【００７１】
次に、Int2-2-2への結合に関与するChtopドメインを決定するために、BT-Int2-2-2 RNA及びChtop変異体（ΔC1、ΔRGまたはΔN1）を発現したT-REx 293細胞の抽出物を使用して、インビトロ結合アッセイを行った（図5D）。その結果、ΔC1及びΔRGにではなく、ドメインN1がInt2-2-2に結合していることが示された（図5D）。この結果を確認するために、N1のみからなるトリガー因子を融合した組換えタンパク質（TF-N1）を調製した。この組換えTF-N1を、BT-Int2-2-1又はBT-Int2-2-2と混合し、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって分析した。その結果、TF-N1は、BT-Int2-2-1ではなくBT-Int2-2-2でシフトを引き起こした。単独TF（コントロール）は、泳動シフト（図5E）を引き起こさなかった。これらの結果から、Chtopは、ドメインN1を介して、ChtopプレmRNAにおけるInt2-2-2領域に強く結合することが明らかとなった。
【００７２】
なお、図5Aは、FLAG-Chtop細胞をDoxで4時間誘導した後、核抽出物を抗FLAGで免疫沈降（IP）に供し、FLAG-Chtopに結合したChtop mRNAをChtop mRNAのEx1-Ex4に特定のプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果である。FLAG-Chtopは、ウェスタンブロッティング（WB）により検出した。図5B及びCは、RNA複合体結合アッセイの結果であり、BT-RNAを含むFLAG-Chtop複合体を検出した結果である。FLAG-Chtopは、FLAG-Chtop誘導細胞、またはT-REx 293細胞の核抽出物にBT-RNAを添加し、抗FLAG抗体で免疫沈降した。抗FLAG免疫沈降から抽出されたBT-RNAは、ノーザンブロッティングにより検出され、FLAG-Chtopをウェスタンブロッティング（WB）により検出した。IgG軽鎖をローディング対照として使用した。図5Dは、BT-Int2-2-2を含むFLAG-Chtop欠失変異体複合体を検出するための、RNA複合体結合アッセイの結果である。誘導された細胞（野生型; WT、ΔC1、ΔRG、またはΔN1）または対照T-REx 293細胞（TR）の核抽出物にBT-Int2-2-2を添加し、抗FLAGで免疫沈降した。免疫沈降物から抽出されたBT-Int2-2-2はノーザンブロッティングにより検出され、FLAGタグ付きタンパク質はウェスタンブロッティング（WB）により検出した。矢印はFLAGタグ化タンパク質を示し、アスタリスク（*）は、IgG lightチェーンを示している。図5Eは、ゲルシフトアッセイ（EMSA）の結果を示しており、BT-Int2-2-1またはBT-Int2-2-2 RNAとの組換えTF-N1（またはコントロールTF）を用いて行った結果である。
【００７３】
〔実施例６〕
本実施例では、Int2-2-1領域（Int2Δ2-2-1）またはInt2-2-2領域（Int2Δ2-2-2）（図6A）を欠くInt2含有ミニ遺伝子を構築し、Int2残留を評価した。Int2Δ2-2-2ミニ遺伝子の発現は、Int2wtまたはInt2Δ2-2-1ミニ遺伝子と比較すると、Int2を残留したものとスプライスされたものの比において、Int2残留したものの割合を約60％まで減少させた（図6B）。FLAG-Chtopも発現させた場合、Int2Δ2-2-2ミニ遺伝子の発現は、再びInt2wtまたはInt2Δ2-2-1ミニ遺伝子（図6B）で観察されたものと比較して、この比で60％の減少を示した。Int2Δ2-2-2を発現させた際に注目すべきことは、これがChtopにInt2-1領域を介して弱くしか結合しないが（図5B）、FLAG-Chtopの発現量が増加すると、Int2を残留したものが増加するとの結果が得られたことである（図6B）。この結果は、Int2-1領域は、その弱い結合を介してInt2の残留に関与していることを示している。
【００７４】
また、本実施例では、Int2-2-2領域の二次構造を予測するために、RNAfoldウェブサーバー（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）を使用した。この分析により、Int2-2-2は、2つの安定なステムループを形成できることを明らかにした。領域Int2-2-2の配列は、脊椎動物間で高度に保存されているので、これら2つのステムループがChtopへの結合とChtopによるInt2残留のために重要であると仮定した。そこで、さらにInt2残留のために必要な領域を狭めるために、Int2-2-2領域のステムループのそれぞれ1つを欠いた2つの追加の変異体Int2含有ミニ遺伝子、Int2Δ2-2-2aとInt2Δ2-2-2bを構築した（図6A）。Int2Δ2-2-2aは、Int2wtのそれと比較した場合、Int2を残留したものとスプライスされたものとの比において、75％減少し、Int2Δ2-2-2bは40％その比率を減少させた（図6C）。この結果は、Int2-2-2aがよりInt2の保持に寄与することを示すが、2つのステムループの両方がInt2の保持に関与することを示している。この結論と一致して、インビトロ結合アッセイはまた、BT-Int2-2-2bへの結合は弱いものの、BT-Int2-2-2aとBT-Int2-2-2b両方がFLAG-Chtopに結合することを示している（図6D）。これらの結果は、ChtopプレmRNAの領域Int2-2-2に保存された反復配列を含む2つのステムループがChtop媒介性Int2の残留に関与していることを示している。
【００７５】
なお、図6Aは、E1-（Int2）-GFP Chtop Int2（Int2野生型、Int2wt）と変異体の模式図である。図６B及びCは、FLAG-Chtop発現の有無時の、Ex1-（Int2）-GFPミニ遺伝子を用いたスプライシングアッセイの結果である。図中、各ブロットは、Ex1の-GFPとEx1-（Int2）-GFPのmRNA（PCR断片が右に示されている）のためのRT-sqPCR結果を示している。各グラフは、Ex1-（Int2）-GFPのmRNAの割合を示している。FLAG-Chtopはウエスタンブロッティングにより検出した。ACTB mRNA、βアクチンは、それぞれRT-PCRおよびウエスタンブロッティングのローディングコントロールとして使用した。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。P値は、unpaired t検定を用いて計算した。図6Dは、BT-Int2-2-2aまたはBT-Int2-2-2bとFLAG-Chtop複合体の、RNA複合体結合アッセイの結果を示している。BT-RNAを添加したFLAG-Chtop誘導細胞（FLAG-Chtop）または対照細胞（T-REx 293）の核抽出物から免疫沈降（IP）させた。抗FLAGを用いて免疫沈降物から抽出されたBT-RNAは、ノーザンブロッティングにより検出され、FLAG-Chtopはウエスタンブロッティングにより検出した。
【００７６】
〔実施例７〕
本実施例では、Int2の残留における2つのhnRNPsの関与の可能性を検討した。RNAiを介して、hnRNP FまたはhnRNP Hをノックダウンし、RT-sqPCRによってInt2を残留したChtopのmRNAを検出した（図7A）。hnRNP Fノックダウンは、Int2を残留したものの比を変えなかったが、hnRNP Hのノックダウンは、scRNA（対照）で処理した細胞と比較してInt2を残留したInt2-スプライス型に対する比において約2倍増加させた（図7A）。そして、これまでの結果と一致して、hnRNP Hのノックダウンは、細胞中の内因性Chtopのレベルを減少させた（データを示さず）。また、hnRNP Hノックダウン細胞では、CHXは、Int2を残留したChtopのmRNAを増加させたので、このこともhnRNP HはInt2の残留に関与していることを示唆している（図7B）。また、hnRNP HのノックダウンとInt2wtミニ遺伝子発現を組合せた実験でも、同様の結果を得た（データを示さず）。これらのデータは、のhnRNP Hは、Int2排除を促進するため、Int2の残留に負の影響を与えることを示している。
【００７７】
Int2の残留にhnRNP Hがどのように負の影響を与えるかを調べるために、内因性のhnRNP Hに対する抗体を用いたプルダウンを行った。FLAG-Chtopを発現させるとhnRNP HはInt2を残留したChtop mRNAとの結合を増加させた（図7C）。一方、hnRNP HはスプライスされたChtop mRNAに結合せず、またChtopを発現しても、hnRNP HはスプライスされたChtopのmRNAに何ら影響しなかった（図7C）。これらのデータは、hnRNP HはInt2を残留したChtop mRNAのInt2領域と相互作用し、ChtopがプレmRNA中のhnRNP HとInt2との間の相互作用を増加させることを示唆している。
【００７８】
次に、RNaseの存在下、非存在下でのhnRNP HとChtopの相互作用を調べた。そのために、FLAG-Chtopを釣り餌としたプルダウン実験を行い、ChtopはRNAを介さずにhnRNP Hと結合していることが明らかとなった（図7D）。陽性対照として、RNase活性は、U4のsnRNAの消失によって確認した。また、ドメイン変異体ΔC1、ΔRG、及びΔN1を用いてプルダウン分析を行ったところ、ΔC1のみがhnRNP Hに結合することが明らかになった（図7E）。N1を含むΔRGは核内に存在するにもかかわらず（野生型FLAG-ChtopとΔC1行ったように）、hnRNP Hと相互作用しなかった（データを示さず）。これらの結果から、ChtopのRGドメインがhnRNP Hへの結合に関与することが示された。
【００７９】
hnRNP Hファミリータンパク質は、コンセンサスRNA配列GGGAと、5'側及び3'側のスプライス部位に一般的であるGGGトリプレットとを認識する。そこで、種間で保存されたInt2のイントロン領域内で少なくとも3つの連続した Gを含む配列を検索したところ、6ヶ所にそのような配列を見いだした。Int2-1-1内のGGGG（2733〜2736番目）、Int2-1-2内のGGGC（2828〜2830番目）、Int2-2-1内のGGGA（2897〜2990番目）とGGGG（2955〜2858番目）、Int2-2-2内のGGGC（3097〜3100番目）、及びInt2-3内のGGGA（4218〜4221番目）の6ヶ所である。そこで、これらの領域に対してhnRNP Hが結合してInt2の排除を促進するならば、これらの領域を欠損した場合にはInt2残留を増加させると推論した。そして、ミニ遺伝子の発現がInt2Δ2-2-1（GGGA（2897〜2990番目）とGGGG（2955〜2858番目）を欠損）とInt2Δ2-2-2（GGGC（3097〜3100）の欠損）は、Int2wtと比較の上で、FLAG-Chtopの非存在下または存在下でInt2の残留を増加しなかったことを考え、Int2-1-1のGGGGで3箇所に変異を挿入したInt2pGT1ミニ遺伝子、Int2-1-2内のGGGCGGTTG（2828〜2835番目）の6箇所で変異を導入したInt2pGT2ミニ遺伝子を構築した。そして、Int2の残留に対するこれらの変異体の効果を調べた（図7F）。その結果、Int2pGT2は何ら効果が見られなかったが、Int2pGT1は、Int2wtに比べInt2の残留の増加を引き起こした（図7F）。これらの結果から、Int2-1-1内のGGGG（2733〜2736番目）が、Int2排除を促進する役割を持ち、hnRNP HはInt2-1-1でこのGGGGサイトへの結合を介してInt2排除を促進することが示めされた。
【００８０】
さらに、本例では、ChtopのmRNAにおけるInt2のうちどの領域に対してhnRNP Hタンパク質が結合するか検証した。具体的に、BT-RNA（BT-Int2-1、BT-Int2-2又はBT-Int2-3）をFLAG-hnRNP Hを誘導発現したT-REx293 細胞の核抽出液に混合し、anti-FLAG抗体で免疫沈降し、ノーザンブロットでBT-RNAを検出した。FLAG-hnRNP HはFLAG抗体で検出した。結果を図7Gに示した。図7Gに示すように、hnRNP Hは主にInt2-1（2668〜2873番目の領域）に結合することを示した。また、hnRNP Hは少ない程度はあるが、Int2-2（2893〜3169番目の領域）にもに結合するすることを示した。
【００８１】
なお、図7Aは、hnRNPsのノックダウン時（siRNAで）のChtopプレmRNAをE1からE4の領域（Ex1-Ex4）をカバーするプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果である。Ex1-（Int2）-Ex4およびEx1の-Ex4のmRNAは、図の右側に示されている。ACTB mRNAは、RT-PCRのためのローディングコントロールとして使用した。hnRNP FとhnRNP HはWBで検出した。グラフはEx1-（Int2）-Ex4の割合を示している。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表している。P値は、unpaired t検定を用いて計算した。図7Bは、293T細胞を、siRNA（Si）またはコントロール（CN）siRNAでhnRNP Hをノックダウンした後、CHXで2時間、処理したときのRT-PCR分析の結果である。Chtop mRNAはChtop mRNAのEx1の-Ex4に特異的なプライマーを用いてRT-PCRによって分析した。ACTBをローディング対照として使用した。hnRNP Hおよびβアクチンは、WBで検出した。図7Cは、FLAG-Chtop細胞を、24時間、Doxで誘導し、次いで、抗hnRNP H抗体で免疫沈降させhnRNP HをWBで検出した結果を示している。hnRNP H免疫沈降物内のChtop mRNAはChtop mRNAのEx1の-Ex4に特異的なプライマーを用いてRT-PCRによって分析した。図７Dは、FLAG-Chtopを抗FLAGで免疫沈降させ、FLAG-Chtop複合体をRNase Aで処理し、そしてのhnRNP HをWBで検出した結果を示している。FLAG-Chtop複合体から抽出されたU4 snRNAのは、ノーザンブロット法により検出した。図7Eは、FLAG-Chtopまたはその欠失変異体について抗FLAGを使用して、各核抽出物から免疫沈降し、hnRNP HをWBで検出した結果を示している。図7Fは、Int2pGT1とInt2pGT2ミニ遺伝子をInt2wtから構築する設計図を示しており、Ex1からGFPの間を増幅する特定のプライマーセットを用いてRT-PCRによって分析した結果を示している。ACTB mRNAをローディング対照として使用した。グラフはEx-（Int2）-GFPの割合を示している。データは、4つの独立した実験の平均±SEMを表している。P値は、unpaired t検定を用いて計算した。
【００８２】
〔実施例８〕
本実施例では、実施例１〜７に示した知見に基づいて、Chtop関連疾患治療剤のスクリーニング方法に利用可能な評価システムを構築した。すなわち、本例では、エキソン２（Ex2）の上流に赤色蛍光タンパク質（DsRed）をコードするレポーター遺伝子を備え、またエキソン4(Ex4)の下流に緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするレポーター遺伝子を備えるミニ遺伝子を構築した。
【００８３】
先ず、pDsRed-Express2-C1（Clontech）をNheI/XhoIで酵素処理し、1％アガロースゲルで電気泳動し、DsRed-Express2 DNA断片を精製した。pEGFP-N1をNheI/XhoIで酵素処理し、精製したDsRed-Express2 DNA断片を挿入し、DsRed-Express2-pEGFP-N1をクローニングした。次に、実施例２で作製したEx1-Ex2-Int2-Ex3-Ex4-GFPをテンプレートとし、プライマーセット(5’-TATACTCGAGCTGCTGCACAGTCAGCGCCGAAAGTTGTG-3’（配列番号３）/5’-TATAGAATTCGTGCCTGGATGTTACTCTTACCC-3’（配列番号４）)を用いて、XhoI-CT-Ex2-Int2-Ex3-Ex4-C-EcoRI DNA断片をPCRで増幅した。PCRにはKOD neo plus（TOYOBO）を用いた。PCRで合成したDNA断片をXhoI/EcoRIで酵素処理し、１％アガロースゲルで電気泳動後、DNA断片を精製した。
【００８４】
DsRed-Express2-pEGFP-N1をXhoI/EcoRIで酵素処理し、１％アガロースゲルで電気泳動後、精製したDsRed-Express2-pEGFP-N1に、XhoI-CT-Ex2-Int2-Ex3-Ex4-C-EcoRI DNA断片を挿入し、DsRed-Express2-Ex2-Int2-Ex3-Ex4-pEGFP-N1をクローニングした。クローニングしたプラスミドはDNAシークエンスにより配列を確認した。 
【００８５】
以上のように作製した発現プラスミドを細胞にトランスフェクトし、タンパク質発現を行った場合、通常では細胞内で発現したプレmRNAのInt2がスプライシングにより除去されるため、DsRed（Exp2）とEGFPの2種類の蛍光タンパク質を含むタンパク質が発現する。このため、蛍光測定により赤色蛍光、緑色蛍光が同程度で検出できる。一方で、供試物質でInt2のスプライシングが阻害された場合、Int2を含むmRNAがタンパク質として翻訳され、Ex2までで翻訳が停止するため、GFPを持たず、DsRed(Exp2)のみを持つ蛍光タンパク質が発現する。このため、細胞の蛍光測定から、赤色蛍光の上昇と、緑色蛍光の低下が検出できる。これらのことから、この発現プラスミドを発現した細胞を赤色及び緑色蛍光測定することで、細胞内のInt2のスプライシング傾向が検出でき、化合物ライブラリー等を用いたInt2スプライシング阻害剤のスクリーニングを行うことが可能となる。
【００８６】
より具体的にスプライシングアッセイは、以下のように実施することができる。すなわち、60 mmのペトリディッシュで培養した1x106細胞の293T細胞に1μgのDsRed-Express2-Ex2-Int2-Ex3-Ex4-pEGFP-N1及び1μgのpcDNA3.1又はHA-hnRNP H1-pcDNA3.1、又はFLAG-Chtop-pcDNA5FRT/TOをトランスフェクトし、24時間後にDsRed/GFP蛍光測定を行った。トランスフェクトには、8μlのLipofectamine2000 (Invitrogen)を用いた。Splicing inhibitorとしてisoginkgetinを用い、100 μMで8時間処理した後、DsRed/GFP蛍光測定を行った。DsRed/GFP 蛍光測定にはGloMax (Promega)を用い、DsRed Express2の測定にはGreen filter(励起波長/蛍光波長：525/580-640nm)を、GFPの測定にはBlue filter (励起波長/蛍光波長：490/510-570nm)を用いた。
【００８７】
〔実験手順１〕
以下、上記実施例１〜７にて行った各種実験の手順及び材料を記述する。表１−１〜１−４は、本研究で使用したプライマーの配列を示している。
【００８８】
【表１−１】
2017079736.tif 000002
【００８９】
【表１−２】
2017079736.tif 000003
【００９０】
【表１−３】
2017079736.tif 000004
【００９１】
【表１−４】
2017079736.tif 000005
【００９２】
<RNAの単離およびRT-PCR>
細胞から全RNAを、Trizol試薬（Invitrogen）を用いて単離し、37℃で1時間のBaseline-ZERO DNase（エピセンターバイオテクノロジーズ）で処理し、そしてTrizol試薬を用いて精製した。RT-qPCRのために、cDNAは、PrimeScript RT試薬キット（タカラバイオ）を用いて、ランダムヘキサマーおよびオリゴd（T）で逆転写し合成したRT-qPCRはSYBRプレミックスとThermal cycler Dice real time system（タカラバイオ）を利用し行った。相対的な遺伝子発現比較は、ΔΔCT法により測定し、値は、GAPDH mRNAについて得られた値に対して標準化した。RT-sqPCRのために、cDNAをPrimeScript II RT試薬を用いて、オリゴd（T）で生成し、そしてPCRは、その後、KODプラスネオまたは実施例IIのTaq DNAポリメラーゼを用いて行った。増幅されたDNAを、1％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてDNAをImageQuant LAS4000（富士フィルム）で検出し、ソフトMultiGauge（富士フィル・BR> ）によって定量した。
【００９３】
<スプライシングアッセイのためのミニ遺伝子の構築>
Ex1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子を構築するために、誘導FLAG-Chtopを発現する細胞からの全RNAを、Trizol試薬を用いて単離した。ヒトCHTOP（NG_030030.1）のEx1の（56から362）-Ex2（2591から2672）-Int2（2673から4313）-Ex3（4314から4467）-Ex4（8265から8303）を含むDNA断片は、KOD-Plus neo DNAポリメラーゼを用いて増幅し、pEGFP-N1（Clontech社）のXhoI/EcoRI部位にクローニングした。Int2Δ2-2-1、Int2Δ2-2-2、Int2Δ2-2-2aとInt2Δ2-2-2bを構築するために、DNA断片をEx1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子を鋳型として KOD-Plus neo DNAポリメラーゼを用いて増幅した。増幅したDNAをClaIで消化し、DNA T4リガーゼでSelf-ligationした。Int2pSL、Int2pGT1とInt2pGT2を構築するために、DNA断片をEx1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子鋳型としてKODプラスネオDNAポリメラーゼを用いて増幅した。PCR産物は、鋳型DNAを分解するDpnIで処理し、増幅したDNAをクローニングした。スプライシングアッセイのためのミニ遺伝子を構築するために使用されるDNAプライマー配列は表１に示した。ヘマグルチニン（HA）-tag融合DsRed2の-N1ベクターを構築するために、プライマー（5'-AGCTTGCCACCATGTACCCATATGACGTCCCGGACTACGCCCGG-3'（配列番号５）と5'-GATCCCGGGCGTAGTCCGGGACGTCATATGGGTACATGGTGGCA-3'（配列番号６））をアニーリングさせ二本鎖DNAオリゴヌクレオチドを作成しpDsRed2-N1（Clontech社）のBamHI/ HindIII部位にクローニングした。すべての構築物は、DNA配列決定により確認した。
【００９４】
<スプライシングアッセイのためのトランスフェクション>
Ex1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子（スプライシングアッセイ用ミニ遺伝子）、FLAG-Chtop pcDNA5FRT /TOおよびHA-DsRed2の293T細胞（35 mmのコラーゲンコートペトリ皿上で培養）へのトランスフェクションにはリポフェクタミン 2000（Life Technologies）を用いて行った。トランスフェクションの24時間後、細胞を回収し、抽出物をWB法またはRT-sqPCRに供した。
【００９５】
<BT-RNAの合成>
Int2-1、Int2-2、Int2-3、Int2-2-1とInt2-2-2 RNAのin vitro転写のための鋳型DNAは、KOD-Plus neo DNAポリメラーゼのための鋳型としてEx1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子を用いて増幅した。Ex1-（Int2）-Ex4-GFPミニ遺伝子はInt2-1、Int2-2、Int2-3、Int2-2-1、およびInt2-2-2に、Int2Δ2-2-2pSLミニ遺伝子はInt2-2-2pSLのために使用した。表１のプライマーセットを示した。増幅されたDNAを1％アガロースゲル電気泳動により分離し、QIAquickゲル抽出キットを用いてゲル片から精製した。インビトロ転写CUGA 7インビトロ転写キット（NIPPON GENE）を使用して鋳型DNAの0.2ピコモルを用いて行った。転写物は、RNeasyミニキット（Qiagen）（Int2-1、Int2-2、Int2-3）またはイソプロパノール沈殿で回収し（Int2-2-1、Int2-2-2、In2-2-2a、Int2-2-2b、Int2-2-2pSL）、および逆相液体クロマトグラフィーを用いて精製した。BTは5 'EndTag核酸エンドラベリングシステムとビオチン（ロングアーム）マレイミド（ベクター研究所）を用いてRNAの5'末端に加えた。合成したBT-RNAをエタノール沈殿により回収した。
【００９６】
<RNA-複合体結合アッセイ>
FLAG-Chtopを発現する1.0×107細胞の核抽出物を本アッセイに使用した。BT-RNA（1ピコモル）を抽出物に添加し、抗FLAGビーズを用いた免疫沈降に供した。FLAGタグ化タンパク質複合体から単離されたRNAは、変性尿素PAGEとノーザンブロットに供した。BT-RNAを安定化ストレプトアビジンHRPコンジュゲート（サーモサイエンティフィック、89880D）で検出した。化学発光をImageQuant LAS4000を用いて検出した。
【００９７】
<TF-N1の発現>
HA-N1-pcDNA3.1を構築するために、HA-N1をコードするDNA断片をFLAG-Chtop pcDNA5FRT/TOを鋳型としてとKOD plus neo DNAポリメラーゼを用いて増幅した。増幅されたDNAは、HA-N1-pcDNA3.1を生成するpcDNA3.1のKpnI/XhoI部位に挿入した。N1-pCold TF DNAを構築するために、HA-N1-pcDNA3.1をKpnI/XhaIで消化したHA-N1をコードするDNA断片を得、pCold TF DNA（タカラバイオ）のKpnI/XhaI部位に挿入した。TF-N1は、0.1mMのイソプロピルβ-D-1-thiogalactosylparanosideの存在下、15℃で24時間の誘導により大腸菌Rosetta2（DE3）で発現させた。細胞xTractorバッファー（Clontech社製）を用いて抽出し、TF-N1は、TALON磁気ビーズ（Life Technologies）を用いてプルダウンした。TF-N1を含む溶出液を4℃で6時間、Tris緩衝化生理食塩水で透析して、精製されたTF-N1は、BCAタンパク質アッセイ（サーモサイエンティフィック）を用いて定量した。
【００９８】
<hnRNP H複合体の免疫沈降>
ヤギポリクローナル抗のhnRNP H（3μgの）または抗GST（コントロール実験）を0.1％（w/v）ツイーン20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBST）中で15μlのプロテインG結合ダイナビーズ （Invitrogen社）と室温で30分間インキュベーションし、結合させた。抗体結合ダイナビーズをPBSTで3回洗浄し、免疫沈降に使用した。ビーズは、1mlの免疫沈降洗浄緩衝液で5回洗浄し、タンパク質およびRNAを抗体結合ダイナビーズから回収し、4℃で4時間、293T細胞からの核抽出物を1 mgと共にインキュベートした。
【００９９】
<ノーザンブロット法>
RNAの変性尿素-PAGEおよびその後のノーザンブロッティングを行った。BT-オリゴヌクレオチド（5'-GACTATATTGCAAGTCGTCACGGC-3 '（配列番号７））プローブは、U4 snRNAを検出した。
【０１００】
<RNAi>
RNAi（siRNA/scRNA; Invitrogen社）やミッションのRNAi（siRNA/対照RNA; Sigma社）トランスフェクションは、リポフェクタミンRNAiMAX lipofectamine（Life Technologies）を用いて行った。35 mmのペトリディッシュに、293T細胞（5×105細胞）に5μlのリポフェクタミンRNAiMAX lipofectamineと100ピコモルのRNAをトランスフェクトした。表１に各RNA配列を示した。
【０１０１】
<EMSA>
各結合反応は、1 pmolのBT-RNAと関連した組み換えタンパク質(100ng)を混合することにより、室温で20分間行った。各反応は、50 mM Tirs-HCl（pH7.4）150 mM NaClを含有する中で実施し、6％非変性ポリアクリルアミドゲル上で120分間、100Vで電気泳動した（0.5×トリス、ホウ酸/EDTA緩衝液（44.5 mMトリス-ホウ酸、1mMのEDTA））。分離されたRNA-タンパク質複合体をハイボンドN+メンブレンにブロットし、乾燥させ、UV（120ミリジュール/cm2）照射（FS-1500（フナコシ社製））で架橋した。BT-RNAを安定化ストレプトアビジンHRPコンジュゲートを用いて検出し、そしてImageQuant LAS4000で可視化した。
【０１０２】
<抗体および試薬>
抗体は以下の供給源から得た。シグマから：マウスモノクローナル抗FLAG（M2）、ウサギポリクローナル抗FLAG（F7425）、マウスモノクローナル抗SC35（S4045）、Cy3結合抗マウスIgG（C2181）、およびHRP結合抗ヤギIgG（A5420）。サンタクルーズバイオテクノロジーから：マウスモノクローナル抗βアクチン（SC-69879）、ヤギポリクローナル抗ラミンB（SC-6216）、ウサギポリクローナル抗RENT1（UPF1）（SC-48802）、HRP結合抗ラットのIgG（SC-2032）、およびヤギポリクローナル抗のhnRNP H（SC-10042）。セルシグナリングテクノロジーから：HRP結合抗マウスIgG（＃7076）、およびHRP結合抗ウサギIgG（＃7074）。マウスモノクローナル抗GAPDHはAmbion社（AM4300）から入手し、マウスモノクローナル抗のhnRNP FはImmuQuest（IQ207）から入手し、ヤギポリクローナル抗GSTはファルマシア（27-4577-01）から入手し、FITC結合抗ウサギIgGでしたアメリカQualex社（A602FS）から入手し、ウサギポリクローナル抗GFPはGenetex（GTX113617）から入手した。ラットモノクローナル抗Chtop（KT64とKT59）はヴァンダイクらから入手した。FLAGタグ融合タンパク質の免疫沈降のために、抗FLAG M2磁気ビーズを使用した。BT-オリゴヌクレオチドの検出のために、安定化ストレプトアビジンHRPコンジュゲートを使用した。すべての一般的な試薬は和光純薬（和光）、関東化学、またはナカライテスクから購入した。
【０１０３】
<細胞培養>
T-REx 293細胞、293T細胞、及びMCF7細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Sigma-Aldrich社）（10％の熱不活性化ウシ胎児血清（Biowest LLC）およびストレプトマイシン（和光を0.1 mg/ml）、ペニシリンG（100 U/ml））中で37℃、5％CO2下で培養した。細胞は、100 ng/mlのdoxで処理し、タグ融合タンパク質を発現誘導した。細胞は、CHX（50 ng/ml）で様々な期間処理した。メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するために24時間、750μlの5'-デオキシ-5'-メチルチオアデノシン（シグマ、D5011）で処理した。
【０１０４】
<エピトープタグ融合発現プラスミドの構築>
Chtop 欠失変異体ΔC1とΔN1を構築するために、cDNAをKOD plus neoDNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて（鋳型としてFLAG-FOP-pcDNA5FRT/TOを使用）増幅した後、FLAGタグ付きpcDNA5FRT/TO（FLAG-Chtop-pcDNA5FRTのBamHI/XhoIでChtopを切り出すことにより生成した）のBamHI/XhoI部位に挿入した。ΔRGを構築するために、cDNAを上記のように増幅し、ClaIで消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ）を用いて、自己連結させた。すべての構築物は、DNA配列決定により確認した。表１にFLAGタグ化発現プラスミドを構築するために使用したプライマーの配列を示した。
【０１０５】
<タグ融合タンパク質の薬物誘発性発現のための細胞株の構築>
Doxに応じて、FLAG-Chtop、ΔC1、ΔRGまたはΔN1を誘導発現可能な細胞株はFlp-T-REx発現システム（Invitrogen）を用いて樹立した。
【０１０６】
<免疫蛍光染色>
誘導FLAGタグ融合タンパク質を発現するT-Rex 293細胞を、コラーゲン被覆培養スライド上で増殖させ、24時間100ng/mlのDoxで処理した。PBSで洗浄後、細胞を室温で10分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSTで2回洗浄した。細胞を0.1％トリトンX-100（w/v）を含有したPBS中、室温で5分間インキュベートし透過処理した。PBSTで洗浄して、細胞を3％（w/v）スキンミルク/PBSで1時間ブロッキングした。次いで、一次抗体とともに2時間インキュベートした。10分間PBSTで3回洗浄後、細胞を室温で1時間、二次抗体と共にインキュベートした。細胞を、10分間、PBSTで3回洗浄し、次いで4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含むベクタシールド（ベクター研究所）でマウントした。得られた細胞をAXIOVERT 200 M顕微鏡（カールツァイス）で観察した。
【０１０７】
<ウエスタンブロット法>
タンパク質は、SDS-PAGEに供し、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore、ビレリカ、MA）に移した。膜を室温で1時間、0.1％（w/v）のトゥイーン20を含有するトリス緩衝生理食塩水（TBS）（TBST）中の5％脱脂乾燥スキムミルクでブロッキングした後、特異的な一次抗体で一晩インキュベートした。10分間、TBSTで3回洗浄後、膜を1時間、HRP結合二次抗体と共にインキュベートし、次いで、10分間、TBSTで3回洗浄した。シグナルは、HRPの基質としてルミノール/エンハンサー溶液および過酸化物溶液（サーモサイエンティフィック）で検出し、ImageQuant LAS4000を用いて定量した。バンド強度はMultiGaugeソフトウェアを用いて定量した。
【０１０８】
<RT-sqPCRにより増幅したDNAのDNAシークエンシング>
DNA断片は、KOD-Plus neoDNAポリメラーゼで増幅した後、アデニンをTaq DNAポリメラーゼを用いて70℃、10分間処理し添加した。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動により分離し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いてゲル片から精製した。各DNA断片をpGEM-T easy（Promega）にクローニングし、そして各DNA断片の配列は、3500ジェネティックアナライザー（Applied Biosystems）を用いて測定した。
【０１０９】
<細胞分画法>
誘導FLAGタグ付きタンパク質を発現したT-REx 293細胞を回収し、緩衝液（16.7 mMトリス塩酸pH7.4、50mM NaCl、5mM MgCl2、0.1％(w/v)トリトンX-100、2μl/ml、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）ペプスタチンA、2μl/mlのロイペプチン、2μl/ml アプロチニン）で氷上で5分間溶解した。4℃で5分間、1000×gで遠心分離後、上清を細胞質抽出物として回収した。上記緩衝液で一回遠心分離ペレットを洗浄した後、ペレットをSDS-PAGE試料緩衝液で取り、Bioruptor UCD-250（コスモバイオ）を用いて、出力最大設定で30秒間回超音波処理した。4℃で10分間20,000×gで遠心分離後、上清を核抽出物として使用した。全細胞抽出物を調製するために、回収した細胞をSDS-PAGE試料緩衝液で溶解し、上記のように超音波処理した。同様に遠心分離後、上清を全細胞抽出物として使用した。各抽出物の等量をウエスタンブロッティングに供した。
【０１１０】
<FLAGタグ付きタンパク質複合体の免疫沈降>
免疫沈降に核抽出物を調製するために、細胞分画によって得られた核ペレットは、緩衝液中（50 mMトリス-塩酸pH7.4中、400 mMの塩化ナトリウム、1 mMのPMSF、2 μg/mlアプロチニン、2μg/mlペプスタチンA、2μ/mlロイペプチン、0.5％（W/V）IGEPAL CA-630）で、4℃で10分間溶解した、4℃で20,000×gで20分間遠心分離し、上清を免疫沈降のための核抽出物として回収した。この抽出物を4℃で4時間、15μlの抗FLAG（登録商標）M2ビーズとインキュベートした。ビーズによって捕捉FLAGタグ融合タンパク質複合体を1 mlの洗浄緩衝液（50 mMのTris-HCl pH7.4中、150 mMのNaCl、1 mMのPMSF、0.5％IGEPAL CA-630）で5回洗浄し、150μlのタンパク質-RNA抽出溶液（10 mM Tris-HCl pH8.0、7M尿素、350 mM塩化ナトリウム、1％SDS、2％2-メルカプトエタノール）でタンパク質及び、RNAを溶出した。フェノール-クロロホルム抽出によって複合体のタンパク質およびRNA成分を分離した後、フェノール相からのタンパク質を700μlのイソプロパノールの添加により沈殿させ、水相からRNAを、225μlのイソプロパノール、15μlの3 M酢酸ナトリウムpH5.2で沈殿させた。沈殿したタンパク質およびRNAをそれぞれ、75％エタノールで洗浄後、空気乾燥させ、そして使用するまで-80℃で保存した。
【０１１１】
〔実施例９〕
本実施例では、インビボ・スプライシングアッセイにより、Int2の残留に直接的に関与する領域を検討した。
【０１１２】
本例では、図８Aに示したように、Ex1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子とその変異体を使用した。なお、図８Aには、これらEx1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子とその変異体に関する遺伝子構成を示し、Chtop遺伝子（NG_030030.1）における塩基配列の位置を数値で示した。また、アッセイに使用したプライマーの位置を矢印で記した。
【０１１３】
なお、結果を図示していないが、Int2の保持に関与しているChtopのmRNA中の領域を決定するために、Ex1（56〜362）を欠いたミニ遺伝子（ΔEx1）、Int2-1/2-2（2697〜3138）を欠いたミニ遺伝子（ΔInt2-1/2-2）、Int2mid（3139〜3970）を欠いたミニ遺伝子（ΔInt2mid）及びInt2-3（3971〜4243）を欠いたミニ遺伝子（ΔInt2-3）を構築した。これらミニ遺伝子についてインビボ・スプライシングアッセイを行ったところ、全てのミニ遺伝子において、Chtopの発現増加が認められ、スプライシング阻害によるInt2保持が認められた。本実施例では、図８Aに示したように、Ex1-（INT2）-Ex4-GFPミニ遺伝子のうち2つの領域を欠損させたミニ遺伝子を構築した。ここで、ΔEx１-2/ΔInt2-1/2-2はChtop遺伝子におけるEx1-Ex2領域をINS2遺伝子のEx2と交換し、且つ、Int2-1及びInt2-2を欠失した構成のミニ遺伝子である。ΔEx1-2はChtop遺伝子におけるEx1-Ex2領域をINS2遺伝子のEx2と交換した構成のミニ遺伝子である。ΔEx1/ΔInt2-1/2-2はChtop遺伝子のEx1とInt2-1及びInt2-2をともに欠失した構成のミニ遺伝子である。ΔEx2/ΔInt2-1/2-2はChtop遺伝子におけるEx2をINS2遺伝子のEx2と交換し、且つ、Int2-1及びInt2-2を欠失した構成のミニ遺伝子である。
【０１１４】
インビボ・スプライシングアッセイの結果を図８Bに示した。図８Bにおいて、FLAG-Chtopの共発現有り無しをそれぞれ+及び-で表記した。各電気泳動写真の下方に示した数値は、独立した３回の実験の平均（Ave.）±平均誤差（SEM）を示している。なお、P値はunpaired t-testで算出した。
【０１１５】
図８Bに示すように、ΔEx1-2とΔEx1/ΔInt2-1/2-2では、Chtopの増加に従ってInt2を保持したChtop mRNAが増加したのに対して、ΔEx1-2/ΔInt2-1/2-2とΔEx2/ΔInt2-1/2-2とΔEx1-2/Int2pSLでは、Chtopが発現増加してもInt2を保持したChtop mRNAが増加しなかった。これらの結果から、Chtop遺伝子におけるEx2とInt2-1及び2-2とは、Chtop mRNAのInt2の保持に直接関与しており、したがってChtopの自己発現調節に関与することを示唆している。
【０１１６】
<インビボ・スプライシングアッセイ>
インビボ・スプライシングアッセイは、293T細胞に、FLAG-Chtop pcDNA5FRT/TO、GFPミニ遺伝子、HA-DsRed2をLipofectamine 2000(Life Technologies)を用いて24時間トランスフェクトし、細胞を回収し、RT-PCR分析により行った。
【０１１７】
<インビボ・スプライシングアッセイのためのミニ遺伝子の構築>
Ex1-（INT2）-Ex4-GFPミニ遺伝子、Ex1の（ヒトCHTOP（NG_030030.1）の56〜362）-Ex2（2591〜2672）-Int2（2673〜4313）-Ex3（4314〜4467）-Ex4（8265〜8304）をコードするDNA断片を構築するために、FLAG-Chtop発現したT-Rex293細胞から調製したDNAライブラリーをテンプレートとして、プライマーセット（XhoI-FOP(56-637)-C-EcoRI-For/XhoI-FOP(56-637)-C-EcoRI-Rev）を用いてKOD-Plus neo DNAポリメラーゼで増幅し、pEGFP-N1（Clontech社製）のXhoI/EcoRI部位に挿入した。ΔInt2-1/2-2（2697〜3138）、ΔInt2mid（3139〜3970）、ΔInt2-3（3971〜4243）、ΔInt2-2-2（2997〜3138）、ΔInt2-2-2a（2997〜3061）、ΔInt2-2-2b（3070〜3138）を構築するために、表２に記載されている対応するプライマーセットを使用して、Ex1-（INT2）-Ex4-GFPミニ遺伝子から増幅したDNAを（ΔInt2-1/2-2、ΔInt2-2-2、ΔInt2-2-2a、ΔInt2-2-2b用）をClaI、（ΔInt2mid、ΔInt2-3用）をMluIで消化し、DNA T4リガーゼ（タカラ、日本）でセルフライゲーションして構築した。ΔEx1ミニ遺伝子を作成するにあたり、CHTOPのEx2-Int2-Ex3-Ex4 (2591〜8304)をコードするcDNAをプライマーセット（XhoI-Ex2(363-)-for/XhoI-FOP(56-637)-C-EcoRI-Rev）を用い増幅した。テンプレートとしてEx1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子を用いた。XhoIとEcoRIで酵素消化しpEGFP-N1のXhoIとEcoRIサイトに挿入した。
【０１１８】
Int2pSLミニ遺伝子を作成するにあたり、プライマーセット（Int2pSL-For/Int2pSL-Rev）を用いて、Ex1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子をテンプレートとしてDNAを増幅し、DpnIで酵素処理し、クローニングした。ΔEx1-2/ΔInt2-1/2-2(56〜362/2591〜3138)ミニ遺伝子を作成するにあたり、INS2遺伝子のEx2-Int2(589〜1032 in pL53In vector)の領域をプライマーセット（XhoI-Ins2-E2-for/Ins2-In2-MluI-rev）を用いて、CD44 v5ミニ遺伝子(pETv5)をテンプレートとして増幅し、XhoI/MluIで酵素処理した。もう一方のDNA断片として、CHTOP遺伝子のInt2mid-Ex4(3139〜8304)に該当する領域をプライマーセット（MluI-3139-for/XhoI-FOP(56-637)-C-EcoRI-Rev）を用い、Ex1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子をテンプレートとして増幅し、MluI/EcoRIで酵素処理した。2つのDNA断片をpEGFP-N1のXhoI/EcoRI サイトに挿入して作成した。
【０１１９】
ΔEx1-2(56〜362/2591〜2696)ミニ遺伝子を作成するにあたり、INS2遺伝子のEx2-Int2 (589〜1032 in pL53In vector)に該当すすDNAをプライマーセット（XhoI-Ins2-E2-for/Ins2-In2-MluI-rev）を用い、pETv5をテンプレートとして増幅した。これをXhoI/MluIで酵素処理し、Ex1-Ex2を欠いたEx1-(Int2)-Ex4-GFP遺伝子のXhoI/MluIサイトに挿入した。Ex1-Ex2を欠いた Ex1-(Int2)-Ex4-GFP遺伝子はプライマーセット（-362-Rev/MluI-2697-for）を用いて増幅し、XhoI/MluIで酵素処理し作成した。
【０１２０】
ΔEx1/ΔInt2-1/2-2(56〜362/2697〜3138)ミニ遺伝子を作成するにあたり、CHTOPのEx2及びInt2mid-Ex4を含む領域をプライマーセット（ClaI-3139-For/-2696-ClaI-Rev）を利用して、ΔEx1をテンプレートとして増幅し、ClaIで酵素処理しセルフライゲーションした。
【０１２１】
ΔEx2/ΔInt2-1/2-2ミニ遺伝子を作成するにあたり、CHTOPのEx1(56〜362)の領域をプライマーセット（HindIII-Ex1(56-)/-362-Rev）を用い、Ex1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子をテンプレートとして増幅し、HindIIIで酵素処理しpETv5のCD44 exon v5領域をKpnIで消化し除いたもの(chEx1-pL53InΔmcs)のHindIII/PvuIIサイトに挿入した。ChtopのEx1とINS2のEx2-Int2を含む領域はプライマーセット（XhoI-FOP(56-637)-C-EcoRI-For/Ins2-In2-MluI-rev）を用い、chEx1-pL53InΔmcs をテンプレートとして増幅し、XhoI/MluIで酵素処理し、ΔEx1/ΔInt2-1/2-2ミニ遺伝子からEx2をXhoI/MluI消化で除去したものに挿入した。
【０１２２】
ΔEx1-2/Int2pSLミニ遺伝子を作成するため、プライマーセット（Int2pSL-For/Int2pSL-Rev）を用いて、ΔEx1-2ミニ遺伝子をテンプレートとして増幅し、DpnI消化し、クローニングした。 
【０１２３】
HAタグ融合DsRed2の-N1ベクターは、二本鎖DNA（5'-AGCTTGCCACCATGTACCCATATGACGTCCCGGACTACGCCCGG-3'（配列番号７４）及び5'-GATCCCGGGCGTAGTCCGGGACGTCATATGGGTACATGGTGGCA-3'（配列番号７５））を結合させpDsRed2-N1（Clontech社）のHindIII/BamHI部位に挿入した。各PCRは、KOD-PlusneoDNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いて行った。表２は、本研究で使用したDNAプライマー配列を示している。すべての構築物をDNA配列決定によって確認した。
【表２】
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【０１２４】
〔実施例１０〕
本実施例では、ChtopのmRNAにおけるEx2領域に対してChtopタンパク質の如何なるドメインが結合するか検証した。
【０１２５】
具体的には、RNA-タンパク質結合アッセイにより、ビオチン化-EX2のRNAをT-REx293細胞(control; TR)由来、又はドキシサイクリンで野生株（WT）、ΔC1、ΔRG、ΔN1又はNLSΔN1変異体を発現したT-REx293細胞由来の核抽出液と混合し、anti-FLAG magnetic beadsでプルダウンし、ビオチン化-EX2のRNAをノーザンブロットで検出した。ノーザンプロットの結果を図９に示す。なお、図９には、ウエスタンブロットで検出した、FLAG融合タンパク質を矢じりで示し、anti-FLAG抗体のIgG軽鎖をアステリスクで示した。
【０１２６】
図９に示すように、Chtopタンパク質はRGドメインがChtopのmRNAにおけるEx2領域に結合することが明らかとなった。実施例１〜７及び実施例９の結果と併せると、Chtopは、N1ドメインを介してInt2領域に結合し、また、これとは独立して、RGドメインを介してEx2ドメインに結合することが明らかとなった。
【０１２７】
<ビオチン化Ex2の合成>  
Ex2のin vitro transcriptionのDNAテンプレートの合成には、KOD-Plus-Neo DNA polymerase を用い、Ex1-(Int2)-Ex4-GFPミニ遺伝子をテンプレートとして使用した。プライマーセットT7-Ex2-for/T7-Ex2-revを使用した。増幅したDNAは1% agaroseで分離し、QIAquick Gel Extraction kitで精製した。In vitro transcriptionは0.2 pmolのDNAテンプレートを用い、CUGA 7 in vitro transcription kit (NIPPON GENE)を使用して行った。転写物は、イソプロパノール沈殿で濃縮し、reverse-phase liquid chromatographyで精製した。5’ EndTag Nucleic Acid End Labeling System and Biotin (Long Arm) Maleimide (Vector Labs)を用いて、転写物の5’末端にBiotin (BT)を付加した。
【図１Ａ】
2017079736.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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