(57)【要約】【課題】新たなオートファジー誘導剤の提供。【解決手段】アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。
【請求項２】
アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とする神経変性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー誘導剤及び神経変性疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、細胞が持っている、細胞内のタンパク質を分解するための仕組みの一つであり、自食作用ともよばれる。オートファジーではまず細胞質の一部が隔離膜によって取り囲まれてオートファゴソームが形成され、次にオートファゴソームの外膜がリソソーム膜と融合しオートリソソームとなり、内容物が分解される。オートファジーはタンパク質だけではなくミトコンドリアなどのオルガネラをも分解できる大規模なシステムで、酵母から高等動植物に至るまで非常によく保存されている。オートファジーでは約１μｍの領域がランダムに包み込まれるため、オートファジーは原則として非選択的な分解システムであると考えられてきたが、最近になって一部の基質は選択的に取り込まれることもわかってきた。
【０００３】
オートファジーは日常的に一定のレベルでおこっており、細胞内構成成分の品質管理機構として重要である。オートファジー能を欠損させたマウスでは反射異常、運動機能障害などをともなう神経変性を呈する（非特許文献１）。またヒトのパーキンソン病や、鉄沈着を伴う神経変性疾患（ＳＥＮＤＡ）においてもオートファジー関連遺伝子の変異が発見されている（非特許文献２、３）。これらの事実を踏まえ、オートファジーによる細胞内浄化を亢進させることで、異常タンパク質蓄積を特徴とする疾患を治療することが動物実験で試みられている（非特許文献４〜８）。ヒトでは、肝細胞内に変異タンパク質が蓄積するα１アンチトリプシン欠損症で、オートファジー活性化効果のあるカルバマゼピンによって症状が軽減したという報告がある（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hara, T. et al. (2006) Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature, 441: 885-889.
【非特許文献２】Narendra, D. et al. (2008) Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol, 183: 795-803.
【非特許文献３】Saitsu, H. et al. De novo mutations in the autophagy gene WDR45 cause static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood. Nat. Genet., 45: 445-449.
【非特許文献４】Ravikumar et al. (2004) Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat. Genet., 36, 585-595.
【非特許文献５】Williams et al. (2008) Novel targets for Huntington's disease in an mTOR-independent autophagy pathway. Nat Chem Biol. 4:295-305.
【非特許文献６】Caccamo A et al. (2010) Molecular interplay between mammalian target of rapamycin (mTOR), amyloid-beta, and Tau: effects on cognitive impairments. J Biol Chem. 285:13107-20.
【非特許文献７】Wang IF et al. (2012) Autophagy activators rescue and alleviate pathogenesis of a mouse model with proteinopathies of the TAR DNA-binding protein 43. Proc Natl Acad Sci U S A. 109:15024-9.
【非特許文献８】Cortes et al. (2012) Rapamycin delays disease onset and prevents PrP plaque deposition in a mouse model of Gerstmann-Straussler-Scheinker disease. J Neurosci. 32:12396-405.
【非特許文献９】Hidvegi T et al. (2010) An autophagy-enhancing drug promotes degradation of mutant alpha1-antitrypsin Z and reduces hepatic fibrosis. Science. 329:229-32.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようにオートファジーの誘導を促進させるというアプローチは、現在有効性の高い薬剤が存在しない神経変性疾患の治療に有効であることが考えられる。
従って、本発明の課題は、新たなオートファジー誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、新たなオートファジー誘導剤を探索すべく既に医薬として用いられている成分を対象としてスクリーニングしてきたところ、特定の１２種の成分に強いオートファジー誘導作用があることから神経変性疾患治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔２〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とするオートファジー誘導剤。
〔２〕アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分を有効成分とする神経変性疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のオートファジー誘導剤及び神経変性疾患治療剤の有効成分は、既に医薬として使用されている成分であるから、安全性は確認されており、かつ強いオートファジー誘導作用を有し、アミロイドβに代表されるペプチド凝集体等を原因とする神経変性疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＧＦＰ−ＬＣ３ドット形成の誘導を示す（溶媒のみ）。
【図２】ＧＦＰ−ＬＣ３ドット形成の誘導を示す（クロペラスチン塩酸塩）。
【図３】ＧＦＰ−ＬＣ３ドット形成の誘導を示す（アデフォビルピボキシル）。
【図４】薬剤処理による凝集体陽性細胞数の減少を示す。ＧＦＰシグナルの蛍光顕微鏡像。明るい小さな輝点がＰｏｌｙＱ凝集体を示す。
【図５】薬剤処理による凝集体陽性細胞数の減少を示す。凝集体陽性率の定量結果。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のオートファジー誘導剤及び神経変性疾患治療剤の有効成分は、アデフォビル  ピボキシル、アジドチミジン、ベンプロペリン、クロペラスチン、エナラプリル、ホモクロルシクリジン、ロメリジン、メチルテストステロン、ノルエチステロン、オキサプロジン、プルリフロキサシン、チペピジン及びこれらの塩から選ばれる成分である。
【００１２】
アデフォビル  ピボキシルは、Ｂ型慢性肝炎の治療に用いられる逆転写阻害剤である。アジドチミジンは、核酸系逆転写酵素阻害剤の一種で、ＨＩＶの治療薬として用いられる成分である。ベンプロペリンは、咳中枢に作用する鎮咳剤である。ベンプロペリンの塩としては、リン酸塩が挙げられる。クロペラスチンは、咳中枢に直接作用し、鎮咳剤として用いられている。クロペラスチンの塩としては、塩酸塩等が挙げられる。
【００１３】
エナラプリルは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤として知られており、高血圧症治療薬として用いられている。エナラプリルの塩としては、マレイン酸塩が挙げられる。
【００１４】
ホモクロルシクリジンは、ヒスタミンＨ1受容体遮断薬であり、皮膚疾患に伴うそう痒、じん麻疹、アレルギー性鼻炎等の治療に用いられている。ホモクロルシクリジンの塩としては、塩酸塩等が挙げられる。ロメリジンは、カルシウム拮抗薬であり、片頭痛治療薬として用いられている。ロメリジンの塩としては、塩酸塩等が挙げられる。
【００１５】
メチルテストステロンは、男性ホルモン薬（アンドロゲン）であり、男子性腺機能不全、造精機能障害による男子不妊症等に用いられる。ノルエチステロンは、別名ノルエチンドロンであり、黄体ホルモン薬であって、無月経、月経周期異常等の治療に用いられている。
【００１６】
オキサプロジンは、非ステロイド抗炎症薬の一つであり、消炎鎮痛薬として用いられている。
【００１７】
プルリフロキサシンは、キノロン系合成抗菌剤として用いられている。チペピジンは、鎮咳去痰薬として用いられており、その塩としてはヒベンズ酸塩が挙げられる。
【００１８】
前記本発明のオートファジー誘導剤の有効成分として用いられる成分は、既に種々の疾患の治療剤として用いられているが、オートファジー誘導作用を有すること、また神経変性疾患に有効であることは全く知られていない。
【００１９】
後記実施例に示すように前記成分は、優れたオートファジー誘導作用を有するため、アミロイドに代表されるタンパク質の異常に基づく神経変性疾患の治療剤として有用である。神経変性疾患とそのタンパク質としては、アルツハイマー病（アミロイドβ、タウ蛋白質）、パーキンソン病（αシヌクレイン）、糖尿病（アミリン）、全身性アミロイド−シス（トランスサイレチン）、ハンチントン病（ハンチンチン）等が挙げられる。本発明のオートファジー誘導剤は、これらの神経変性疾患における異常タンパク質をオートファジー誘導作用により減少させることにより、神経変性疾患を治療することができる。
【００２０】
本発明のオートファジー誘導剤及び神経変性疾患治療剤の投与形態としては、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。このうち、経口剤が特に好ましい。これらの医薬組成物の形態とするには、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。そのような担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００２１】
さらに、本発明の医薬組成物製剤中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。
【００２２】
本発明のオートファジー誘導剤及び神経変性疾患治療剤の投与量は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、前記有効成分量として、成人に対して１日あたり１〜１０００ｍｇであるのが好ましい。またこの投与量は１日に１〜４回、好ましくは２〜４回に分けて投与することもできる。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２４】
実施例１
ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧプローブを用いたオートファジー活性の評価
【００２５】
〔方法〕
ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧを安定発現するＨｅＬａ細胞を用いた。この細胞が発現するＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは先頭（アミノ末端）より、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ３（ＬＣ３）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＬＣ３のカルボキシ末端グリシンの欠損体（ＬＣ３ΔＧ）が連結したものである。ＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは細胞内で合成された後に直ちにＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧに切断分離される。ＧＦＰ−ＬＣ３はオートファジーによって分解されるが、ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧは分解されずに細胞内にとどまる。従って、オートファジーが誘導されるとＧＦＰ／ＲＦＰ比が低下する。この細胞を９６穴プレートに３０，０００個ずつ播種し、翌日薬剤または溶媒のみを含む培地に交換し（１薬剤につき３ｗｅｌｌずつ使用）した。２４時間後、各ｗｅｌｌの細胞を１０分間４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定した。マイクロプレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ）で各ウェルのＧＦＰとＲＦＰの蛍光量を測定しＧＦＰ／ＲＦＰ比を算出した。コントロール（溶媒で処理した細胞）のＧＦＰ／ＲＦＰ比との比率を表１に記す。
【００２６】
【表１】
2017214302.tif 000002
【００２７】
〔結果〕
上記の薬剤で２４時間処理した細胞ではＧＦＰ／ＲＦＰ比が０．８５以下に低下したため、これらの薬剤にオートファジー誘導効果があることが示された。
【００２８】
実施例２
オートファゴソーム形成の可視化による評価
〔方法〕
実施例１と同様にＧＦＰ−ＬＣ３−ＲＦＰ−ＬＣ３ΔＧを安定発現するＨｅＬａ細胞を用いた。この細胞が産生するＧＦＰ−ＬＣ３はオートファゴソームに結合するため、それらは蛍光顕微鏡で輝点として観察される。この細胞を各薬剤で２時間、２４時間処理し、それぞれ４％パラフォルムアルデヒド溶液で１０分間固定した後、蛍光顕微鏡（ＩＸ８１，ＯＬＹＭＰＵＳ）で観察した（図１〜図３）。観察されたＧＦＰ−ＬＣ３の輝点の数を−、±、＋、＋＋、＋＋＋の５段階で評価した（表２）。
【００２９】
【表２】
2017214302.tif 000003
【００３０】
〔結果〕
薬剤で２４時間処理した細胞ではＧＦＰ−ＬＣ３輝点が増加したため、これらの薬剤にオートファジー誘導効果があることが示された。
【００３１】
実施例３
神経変性疾患関連凝集体の除去効果
（方法）
ドキシサイクリン（ＤＯＸ）依存的にＧＦＰ−Ｑ８１を発現するＨｅＬａ細胞を用いた。ＧＦＰ−Ｑ８１は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に８１個のグルタミンが連なった配列（ＰｏｌｙＱ）を付加したものである。ＰｏｌｙＱは細胞内で自己相互作用して凝集体を形成することが知られている。ＰｏｌｙＱ凝集体は複数のヒト神経変性疾患の病態に関連することが知られており、オートファジーの選択的基質となることも報告されている。この細胞をカバーガラス上に播種し、それと同時にＤＯＸを添加して凝集体の誘導を開始した。７２時間後、溶媒（ＤＭＳＯ）またはオートファジー誘導剤（１０μＭ）を含む培地に交換した。更に２４時間後、各細胞を１０分間４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、核を染色した後に、蛍光顕微鏡で観察した。核染色像から画像内の総細胞数を、ＧＦＰ像から凝集体陽性の細胞数を定量し、総細胞数に対する凝集体陽性細胞の割合を計算した。結果を図４、図５及び表３に示す。
【００３２】
【表３】
2017214302.tif 000004
【００３３】
図４、５及び表３より、上記の薬剤はＤＭＳＯ処理時に比して凝集体陽性細胞率が低下したため（表３、図４、５）、これらの薬剤に神経変性疾患関連凝集体の除去効果があることが示唆された。
【図１】
2017214302.tif 000005
【図２】
2017214302.tif 000006
【図３】
2017214302.tif 000007
【図４】
2017214302.tif 000008
【図５】
2017214302.tif 000009