(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素を検出する新規化合物及びこれを使用した酵素の検出方法を得ること。【解決手段】以下の式（１）又は（２）により表される化合物：ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ（１）、ＨＯＯＣ−Ａｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｙ（２）（式中、Ａｒはアリール基であり、Ｘはアミノ酸残基又はペプチドであり、Ｙは色素標識基である）【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）又は（２）により表される化合物：
ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ    （１）
ＨＯＯＣ−Ａｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｙ    （２）
（式中、Ａｒはアリール基であり、Ｘはアミノ酸残基又はペプチドであり、Ｙは色素標識基である）
【請求項２】
前記アリール基が、炭素数６〜９の単環式芳香族炭化水素基又は炭素数１０〜１３の多環式芳香族炭化水素基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記アリール基が炭素数６〜９の単環式芳香族炭化水素基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
（１）請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物と、サンプルとを混合して混合物を得る工程、
（２）前記混合物をクロマトグラフィーにより分離する工程、及び
（３）前記混合物に、Ｙ及び／又はＸ−Ｙが含まれているか否かを検出する工程、
から成る、酵素の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を検出する新規化合物及びそれを用いた酵素の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を同定することは、微生物学等の学術的な目的に限らず、医療目的においても非常に重要である。例えば、細菌やウイルスによる感染症の治療においては、患者が感染した細菌やウイルスの同定をいかに素早く行うことが出来るか、が的確な治療を行うための鍵となる。患者から採取したサンプルに、細菌やウイルス特有の酵素が含まれているか否かを素早く判断できれば、早期に的確な治療方針を立てることが出来る。
【０００３】
近年、酵素の基質特異性を利用した、酵素の同定方法及び当該方法に使用する化合物の検討が進められている。例えば、特定の酵素によって分解される化合物に、色素等の標識を結合させた複合化合物が検討されている。当該複合化合物と当該化合物を分解できる酵素を含むサンプルとを混合すると、前記複合化合物が酵素によって分解され、前記標識が分離する。当該分解により分離した前記標識が検出されれば、前記サンプルに特定の酵素が含まれていることが確認できる。当該方法は、容易且つ比較的素早く特定酵素の存在の有無を確認することが出来るため、幅広い用途に対する適用が期待されている。特許文献１〜９及び非特許文献１は、これら化合物及び当該化合物を使用した酵素の検出方法に関する技術を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１６６８３０号公報
【特許文献２】特表２００８−５１２１０６号公報
【特許文献３】特開２０１１−２３９７７５号公報
【特許文献４】特開昭６３−２７７９６６号公報
【特許文献５】特表平８−５００２４１号公報
【特許文献６】特表２００１−５２１７６４号公報
【特許文献７】特開平６−１７２３１２号公報
【特許文献８】特開２００５−１８９２３２号公報
【特許文献９】特表２００９−５３２０５２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Detection of Protease Activity with a Fluorescence-labelled Peptide Substrate on a TLC Plate (Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(6), 1285-1287, 2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酵素をより容易に、より素早く検出及び同定する技術が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、酵素を検出するための新規化合物及び当該化合物を使用した酵素の検出方法を見いだし、本発明に至ったものである。
すなわち本発明は、
［１］以下の式（１）又は（２）により表される化合物：
ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ    （１）
ＨＯＯＣ−Ａｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｙ    （２）
（式中、Ａｒはアリール基であり、Ｘはアミノ酸残基又はペプチドであり、Ｙは色素標識基である）、
［２］前記アリール基が、炭素数６〜９の単環式芳香族炭化水素基又は炭素数１０〜１３の多環式芳香族炭化水素基である、［１］に記載の化合物、
［３］前記アリール基が炭素数６〜９の単環式芳香族炭化水素基である、［１］又は［２］に記載の化合物、
［４］（１）［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物と、サンプルとを混合して混合物を得る工程、
（２）前記混合物をクロマトグラフィーにより分離する工程、及び
（３）前記混合物に、Ｙ及び／又はＸ−Ｙが含まれているか否かを検出する工程、
から成る、酵素の検出方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の物質を使用することにより、酵素の検出及び同定を、より容易に且つ素早く行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の薄層クロマトグラフィーの写真
【図２】実施例１、比較例１及び比較例２における化合物の薄層クロマトグラフィーの写真
【図３】色素標識基の構造
【図４】色素化合物の構造
【図５】本発明の化合物の合成経路（例）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の化合物
本発明の化合物は、以下の式（１）又は（２）により表される化合物：
ＨＯＯＣ−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ    （１）
ＨＯＯＣ−Ａｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｙ    （２）
である。
式（１）及び（２）におけるＡｒは、カルボキシル基（ＨＯＯＣ−）を有するアリール基である。前記アリール基は、単環式芳香族炭化水素基又は多環式芳香族炭化水素基である。前記芳香族炭化水素基が単環式芳香族炭化水素基である場合には、前記芳香族炭化水素基の炭素数は、６〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６〜７、さらに好ましくは６である。また、前記芳香族炭化水素が多環式芳香族炭化水素基である場合には、前記芳香族炭化水素基の炭素数は、１０〜１３、好ましくは１０〜１２、より好ましくは１０〜１１、さらに好ましくは１０である。Ａｒの具体例は、例えば、フェニル基、ベンジル基、ベンゾイル基及びナフチル基等が挙げられる。酵素反応混合物から色素標識化合物（本発明の化合物から切断されたY）及び／又はX-Y（色素標識とアミノ酸残基又はペプチドの複合体）をより定量的に検出でき、また本発明の化合物の生理的溶媒に対する溶解性をより高めることが出来るため、Ａｒを単環式芳香族炭化水素基とすることがより好ましい。
【００１１】
式（１）及び（２）に示すように、前記アリール基（Ａｒ）は、カルボキシル基を有している。アリール基がカルボキシル基を有することにより、本発明の化合物の極性を高めてこの化合物の生理的溶媒への溶解度を向上させ、クロマトグラフィーによる検出において低環境負荷な極性溶媒が使用できる。さらに、酵素反応によって本発明の化合物から分離した色素標識基（Ｙ）又はＹとＸ（アミノ酸残基又はペプチド）との複合体と、残りの部分との化学的性質の違いを付与することによって、クロマトグラフィーによる分離の効率を上昇させることが出来る。また、カルボキシル基を有することにより、セルロース等の素材に容易に固定でき、簡易的な酵素検出キットを容易に製造可能となる。アリール基におけるカルボキシル基の結合位置は、例えば、アリール基がフェニル基である場合には、アミド結合を有する炭素原子の位置を基準として、オルト位、メタ位又はパラ位に結合する。
【００１２】
前記式（１）及び（２）におけるXは、アミド結合（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）により前記Ａｒに結合したアミノ酸残基又はペプチドである。前記アミノ酸残基は、例えば、アラニン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、バリン残基、β−アラニン残基、サルコシン残基、オルニチン残基、シトルリン残基、クレアチン残基、γ−アミノ酪酸残基、オパイン残基、トリメチルグリシン残基、テアニン残基、トリコロミン酸残基、カイニン酸残基、ドウモイ酸残基、イボテン酸残基及びアクロメリン酸残基等の天然アミノ酸残基だけで無く、人工的に合成されたアミノ酸のアミノ酸残基も含まれる。また、前記ペプチドは、前記アミノ酸が、２〜３個、好ましくは２個結合したものである。ペプチドを構成するアミノ酸の個数が前記範囲内にあることにより、一つの化合物により複数対象の酵素の検出を可能とする一方で、検出対象となる酵素の範囲が無限に拡大することを防止できる。さらには、ペプチドを形成するアミノ酸の数を限定することで、本発明の化合物をより少ない工程で合成することが可能になる。
【００１３】
なお前記列挙したアミノ酸残基の中には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びリジン等の、α位だけでなく他の箇所にもアミノ基又はカルボキシル基を有するものが存在する。前記のようにXは前記Ａｒとの間でアミド結合を形成し、同時に後述のようにYとの間でもアミド結合を形成する。アミノ酸が前記のように、複数のアミノ基又はカルボキシル基を有する場合に、前記２つのアミド結合はいずれも、アミノ酸のα位におけるアミノ基及びカルボキシル基で形成される。２つのアミド結合をアミノ酸のα位におけるアミノ基及びカルボキシル基で形成させることで、後述する酵素の検出方法で利用可能な化合物となる。
【００１４】
Xとしてのアミノ酸を選択すること又はペプチドを構成するアミノ酸の組み合わせを選択することにより、後述する酵素の検出方法において検出できる酵素の種類が変化する。例えば、Xとして前記アミノ酸のうちからリジンのみを選択した場合、前記式（１）又は（２）で表される化合物を、ペプチダーゼ様活性を有する酵素、例えばトリプシンの検出に使用できる。トリプシンは、リジンを認識し、そのＣ末端側ペプチド結合を切断する特異性を有している。従って、Ｘをリジンとした化合物を作製し、当該化合物をトリプシンと反応させた場合、Ｘ−Ｙ間の結合が切断され、色素標識基Ｙが分離・検出されることとなる。
【００１５】
前記式（１）及び（２）におけるYはアミド結合（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）により前記Xに結合した色素標識基である。ここで、「色素標識基」とは、式（１）若しくは（２）の化合物に結合した状態及び／又は後述する酵素の検出方法において式（１）若しくは（２）の化合物から分離した状態で、自然光の下又は励起光、例えば、紫外線若しくは赤外線等の下で発色する能力を有する置換基を意味する。色素標識基の具体例としては、例えば、５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基（以下、「ダンシル基」）（I）、（６−スルホン酸）ナフタレン−２−イル基（II）、（２，８−ジメチル−７−アミノ）フェナジン−３−イル基（III）、２−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）フェニル基（IV）、２−（３，６−ジアミノキサンチリウム）フェニル基（V）、（３−アミノ−９−（２−カルボキシフェニル））キサンチン−６−イル基（VI）及び（４−メトキシ）ナフタレン−２−イル基（VII）が挙げられる。尚、前記各色素標識基名の後に記載されたローマ数字は、図３における各構造式下に記載された数字に対応している。ダンシル基は、酵素反応後に分離した状態（化合物としてのダンシルの状態）において、極性溶媒を用いてクロマトグラフィーに展開できるため、Yとして選択することがより好ましい。
【００１６】
上記式（１）又は（２）の化合物の具体例として、例えば、以下のような化合物があげられる。
【化１】
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上記化学式において、フェニル基に結合したカルボキシル基は、アミド結合が結合したフェニル基上の炭素を基準として、オルト位、メタ位又はパラ位のいずれかに結合していることを意味する。
上記化合物におけるＡｒは、カルボキシル基を１つ有するフェニル基である。上記化合物におけるＸはリジンである。上記化合物におけるＹはダンシル基である。上記化合物は、アミノ酸としてリジンを含むため、前記のように、ペプチダーゼ様活性を有する酵素、例えばトリプシンの検出に使用できる。
【００１７】
２．化合物の製造方法
使用する原料
前記式（１）及び（２）の化合物を製造する際に使用する原料は以下の通りである。
（ａ）芳香族化合物
前記Ａｒを形成する化合物である。Ａｒは、カルボキシル基を有するアリール基であり、且つXとの間でアミド結合を形成する化合物である。従って、式（１）及び（２）の化合物を製造する際に使用する芳香族化合物は、カルボキシル基を有し、且つアミド結合を形成するためのアミノ基又は前記カルボキシル基とは別のカルボキシル基を有する芳香族化合物である。このような芳香族化合物の例としては、例えば、ｏ−フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、無水フタル酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−メチルアミン安息香酸、３−メチルアミン安息香酸、４−メチルアミン安息香酸、２−カルボキシ安息香酸アミド、３−カルボキシ安息香酸アミド、４−カルボキシ安息香酸アミド、１，４−ナフタレンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸及び２，３−ナフタレンジカルボン酸等が挙げられる。
【００１８】
（ｂ）アミノ酸又はペプチド
アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、シトルリン、クレアチン、γ−アミノ酪酸、オパイン、トリメチルグリシン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸及びアクロメリン酸等の天然アミノ酸だけで無く、人工的に合成されたアミノ酸も含まれる。また、ペプチドは、前記アミノ酸が、２〜３個、好ましくは２個結合したものである。
【００１９】
（ｃ）色素化合物
色素化合物は、アミノ酸との間でアミド結合を形成し、式（１）及び（２）の化合物のＹとなる化合物である。色素化合物は、一般的に使用されている色素標識化合物のうち、アミノ酸との間でアミド結合を形成できるアミノ基及び／又はカルボキシル基を有することを条件として、いかなる化合物も使用可能である。このような色素化合物の例として、例えば、ダンシルヒドラジン（A）、２−アミノナフタレン−６−スルホン酸（B）、２，８−ジメチル−３，７−ジアミノフェナジン（C）、２−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（D）、３，６−ジアミノ−９−(２−カルボキシフェニル)キサンチリウム（E）及び４−メトキシ−２−ナフチルアミン（F）等が挙げられる。尚、左記化合物名の後に記載されているアルファベットは、図４における各構造式の下に記載されたアルファベットに対応している。
色素化合物としては、反応溶媒への溶解度が高く、さらに高純度標品を得られるため副反応を抑制できることから、ダンシルヒドラジンを選択することがより好ましい。
【００２０】
製造方法
式（１）及び（２）の化合物を製造する方法は、前記芳香族化合物とアミノ酸若しくはペプチドとの間でアミド結合を形成し、次いで前記アミノ酸若しくはペプチドと色素化合物との間でアミド結合を形成するか、又は、前記アミノ酸若しくはペプチドと色素化合物との間でアミド結合を形成し、次いで前記芳香族化合物とアミノ酸若しくはペプチドとの間でアミド結合を形成させる方法である。アミド結合の形成には、例えば、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン等の化合物が使用される。
【００２１】
尚、前記アミノ酸又はペプチドが、α位以外にさらにカルボキシル基又はアミノ基を有する場合がある（例：アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びリジン等）。このような場合には、当該α位以外のカルボキシル基又はアミノ基に保護基を導入して、α位以外でアミド結合が形成されることを防ぐことが出来る。前記保護基を導入する化合物は、アミノ基やカルボキシル基を保護するために使用されている一般的な化合物のいずれも使用できる。このような化合物として、例えば、クロロぎ酸9-フルオレニルメチル（以下、ＦＭＯＣ-Cl）や、二炭酸ジ-tert-ブチル（以下、Ｂｏｃ）等があげられる。
【００２２】
具体的な製造方法
式（１）又は（２）の化合物の具体的な製造方法を、化２の化合物を例にとって以下に説明する。
【化２】
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（以下、上記化合物を「α−フタル酸−リジン−ダンシル」とする。）
具体的な反応経路の例が図５に示される。以後、文章中の化合物名の横に括弧付きで記載された数字は、前記反応経路における各化合物の下に記載された番号に対応する。
【００２３】
リジンはα位だけで無く、ε位にもアミノ基を有している。従って、ε位のアミノ基は、あらかじめＦＭＯＣ-Cl又はＢｏｃで保護しておくことが好ましい。また、反応中に余分な副生成物が出来ることを防ぐことを目的として、α位のアミノ基も、あらかじめＦＭＯＣ-Cl又はＢｏｃで保護しておくことが好ましい。α位のアミノ基の保護基と、ε位のアミノ基の保護基は、それぞれ変更することが好ましい。特にＦＭＯＣ-ClとＢｏｃとは、脱保護の条件が異なるため、反応のコントロールが容易となるため、これら保護基を使い分けることがより好ましい。尚、上記反応例においては、α位のアミノ基をＦＭＯＣで、ε位のアミノ基をＢｏｃで保護している。リジンをＦＭＯＣ及びＢｏｃで保護する方法は、通常採用し得るいかなる方法を採用してもよい。尚、ＦＭＯＣ及びＢｏｃであらかじめ保護されたリジン（α−ＦＭＯＣ−ε−Ｂｏｃ−リジン（１））を購入してもよい。
【００２４】
前記α−ＦＭＯＣ−ε−Ｂｏｃ−リジン（１）と、ダンシルヒドラジン（２）とを反応させて、アミド結合を形成する。前記反応においては、例えば、前記試薬の内１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンが使用できる。反応の終了により、α−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（３）が得られる。
【００２５】
前記得られたα−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（３）と、ＦＭＯＣを脱保護するための化合物、例えばジエチルアミン等の二級アミンを添加し、前記化合物からＦＭＯＣを脱保護させる。脱保護によって、リジンのα位におけるアミノ基が反応可能な化合物（４）が得られる。
ＦＭＯＣを脱保護することによって得られた前記化合物（４）と、無水フタル酸とを反応させ、α−フタル酸，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（５）が得られる。前記反応においては、トリエチルアミンを用いる。
前記得られたα−フタル酸，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（５）と、トリフルオロ酢酸とを反応させ、Ｂｏｃの脱保護を行う。Ｂｏｃを脱保護することにより、α−フタル酸−リジン−ダンシルが得られる。
【００２６】
前記各反応は、反応効率の観点から溶液中で反応を行うことが好ましい。反応に使用する溶媒は、前記各化合物を溶解できる溶媒であれば特に制限はなく、例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン及びジメチルホルムアミド等が使用可能である。上記各反応を進行させる際には、前記溶液を攪拌しても良い。反応の種類によっては、アルゴンや窒素等の不活性ガスの存在下で反応を行っても良い。また、反応の種類によっては、発熱等の急激な温度変化や反応の開始・進行に加熱が必要な場合もある。これらの場合には、前記溶液を、加熱、水冷、氷冷等しても良い。
【００２７】
本発明の化合物を用いた酵素の検出方法
前記の通り、本発明の化合物は、酵素の検出に用いることが出来る。検出方法は、
（１）本発明の化合物と、サンプルとを混合して混合物を得る工程（以下、第一工程）、
（２）前記混合物をクロマトグラフィーにより分離する工程（以下、第二工程）、及び
（３）前記混合物に、Ｙ及び／又はＸ−Ｙが含まれているか否かを検出する工程（以下、第三工程）、
から成る。本発明の方法を、工程毎に詳細に説明する。
【００２８】
第一工程
第一工程は、本発明の化合物と、サンプルとを混合する工程である。ここで、本発明における「混合」とは、方法のいかんを問わず、本発明の化合物とサンプルとが混ざり合う状況を作り出す工程を言う。すなわち、本発明の化合物とサンプルとを溶媒中で混ざり合うように攪拌することは勿論のこと、例えば、紙、布及び不織布等の浸透性のある素材に本発明の化合物又はサンプルを固定化し、当該素材を本発明の化合物又はサンプルを溶解させた溶液に浸漬し又は浸透圧を利用して前記溶液を吸い上げて、素材に固定化された化合物又はサンプルと溶液中の化合物又はサンプルとを混ぜ合わせることも、本発明における「混合」に含まれる。
【００２９】
サンプルに対しては、あらかじめ酵素を抽出する際に行われる前処理を施すことが出来る。例えば、採取した細胞を超音波で破砕等することにより、当該細胞内に含まれる酵素が、本発明の化合物と接触出来るようにすることが好ましい。
本発明の化合物の構造及び検出しようとする酵素の種類によって、酵素と本発明の化合物との反応条件が変わり得る。従って、混合物が得られた後、直ちに第二工程に移る場合もあれば、得られた混合物に加熱、攪拌等の処理を行いつつ、一定時間反応させる場合もあり得る。
【００３０】
第二工程
第二工程は、前記混合物をクロマトグラフィーにより分離する工程である。クロマトグラフィーの手法については、一般的に利用されている手法のいずれも使用可能である。具体的なクロマトグラフィーの種類としては、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー及びフラッシュクロマトグラフィー等が挙げられる。前記クロマトグラフィーの中では、検出作業が容易であり、作業スペースが小さくてすむため、薄層クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーを選択することが好ましい。また、薄層クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーにより分離を行う際には、あらかじめ本発明の化合物を薄層又は紙に固定化し、サンプルを含む展開溶媒を吸い上げることで、第一工程における混合と、第二工程における分離を同時に行うことも可能である。
【００３１】
第三工程
第三工程は、前記混合物に、Ｙ及び／又はＸ−Ｙが含まれているか否かを検出する工程である。サンプルに、本発明の化合物を分解する酵素が含まれていた場合、本発明の化合物と酵素とが反応して、Ｙ（アミノ酸又はペプチド）のC末端側及び／又はN末端側が切断される。その結果、色素標識であるY及び／又は色素標識とアミノ酸若しくはペプチドとが結合したX-Yが発生する。言い換えれば、クロマトグラフィーによる分離後、Y及び／又はＸ−Ｙが検出されれば、サンプル中に当該アミノ酸又はペプチドを認識して分解する酵素が含まれていることになる。
検出方法は、上記各クロマトグラフィーで使用し得るいかなる検出方法も利用可能である。薄層クロマトグラフィーやペーペークロマトグラフィーで分離する場合には、サンプルのスポットとは別に、Ｙ及び／又はＸ−Ｙの標準スポットを設けて溶媒で展開させることにより、目視にて容易にサンプル中にＸ及び／又はＸ−Ｙが含まれているか否かを確認できる。目視にて確認する場合、可視光下で確認しても良いし、紫外線ランプや赤外線ランプ等を用いて励起光を照射し色素を発色及び／又は発光させ、視認性を向上させても良い。
【００３２】
本発明の方法により検出できる酵素は、Xであるアミノ酸残基の種類又はXであるペプチドを構成するアミノ酸の組み合わせにより変わり得る。例えば、Xがリジンである場合には、ペプチダーゼ様活性を有する酵素、例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、テルモリシン、ペプシン、エンドペプチダーゼＶ８、パパイン、リジルエンドペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ及びマトリックスメタロプロテアーゼ類が検出対象の例として挙げられる。
【００３３】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明する。なお、実施例が本発明の範囲に影響を与えないことは言うまでも無い。
【実施例】
【００３４】
＜α−フタル酸−リジン−ダンシルの合成＞
α−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン（１ｍｍｏｌ）とダンシルヒドラジン（１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２ｍｌ）にアルゴン雰囲気下で溶解させ、氷浴しながら１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（１．５ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。その後、室温で一晩撹拌した。
ジクロロメタンを減圧留去し、留去後の残渣にジエチルエーテルを加え, 有機層を１０％クエン酸水溶液、次いで蒸留水、次いで４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル溶液に硫酸ナトリウムを加え、溶液中の水分を除去した。水分を除去した後のジエチルエーテル溶液から溶媒を留去し、α−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシルを得た。
【００３５】
α−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍｌ）に空気下で溶解させ、室温でジエチルアミン（１．５ｍｌ）を滴下し、一晩撹拌した。
ジクロロメタンを減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ（和光純薬工業株式会社製Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）（展開溶媒はメタノール：ジクロロメタンが１：１９の混合溶媒）により分離し、ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシルを得た。
【００３６】
ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍｌ）にアルゴン雰囲気下で溶解させ、氷浴しながらトリエチルアミン（０．５ｍｍｏｌ）と無水フタル酸（０．５ｍｍｏｌ）を添加し、３０分撹拌した。その後、室温で一晩撹拌した。
攪拌後の溶液を、１０％クエン酸水溶液、次いで蒸留水で洗浄し、洗浄後のジクロロメタン溶液に硫酸ナトリウムを加え水分を除去した。
水分を除去した後の溶液から溶媒を減圧留去し、α−フタル酸，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシルを得た。
【００３７】
α−フタル酸，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）にアルゴン雰囲気下で溶解させ、氷浴しながらトリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ）を添加し、２時間撹拌した。その後、室温で３時間撹拌した。
攪拌終了後の溶液から溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ（和光純薬工業株式会社製Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）（展開溶媒はメタノール：ジクロロメタンが１：１９の混合溶媒）により分離し、α−フタル酸−リジン−ダンシルを得た。
【００３８】
実施例１
＜α−フタル酸−リジン−ダンシルを用いたトリプシンの検出＞
α−フタル酸−リジン−ダンシルをリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）に溶解させて、１００μＭの溶液を得た。市販のトリプシン粉末試薬（ナカライテスク社製）を、１００μＭになるようにＰＢＳにより溶解させた。
１００μＭのα−フタル酸−リジン−ダンシル溶液（２００μｌ）と１００μＭのトリプシン溶液（１００μｌ）とを混合し、室温で３０分間放置した。
【００３９】
上記混合後の溶液の一部を、薄層クロマトグラフィー媒体（Ｍｅｒｃｋ社製ＴＬＣシリカゲル６０シラナイズドＦ２５４）に滴下した。
これを展開溶媒（メタノール：ジクロロメタンが１：９の混合溶媒）で１０分間展開し、展開後のスポットを波長３６５ｎｍの紫外線ランプを用いて、可視化させた。
１：α−フタル酸−リジン−ダンシル溶液、２：ダンシルヒドラジン及び３；１００μＭのα−フタル酸−リジン−ダンシル溶液（２００μｌ）と１００μＭのトリプシン溶液の混合液をそれぞれスポッティングして薄層クロマトグラフィーを行った結果が、図１の写真である。図１の写真から、トリプシンの活性によってα−フタル酸−リジン−ダンシルが分解され、ダンシルヒドラジンのピークが発生していることが確認できる。
【００４０】
比較例１
＜α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシルを用いたトリプシンの検出＞
α−フタル酸−リジン−ダンシルの代わりにα−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシルを使用し、展開溶媒をメタノール：水＝２：３の混合溶媒を使用する以外は、上記実施例１と同様に行った。
α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシルは、上記得られたα−ＦＭＯＣ，ε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（０．２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解させて溶液を調製し、氷冷しながら前記得られた溶液にトリフルオロ酢酸（１ｍｌ）を添加し、氷冷しながら１時間、次いで室温で２時間攪拌して得られた。
薄層クロマトグラフィーによる分離を試みたが、明確に分離したスポットは確認できなかった。
【００４１】
比較例２
＜リジン−ダンシルを用いたトリプシンの検出＞
α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシルの代わりにリジン−ダンシルを使用する以外は、上記比較例１と同様に行った。
リジン−ダンシルは、上記得られたε−Ｂｏｃ−リジン−ダンシル（０．２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解させて溶液を調製し、氷冷しながら前記得られた溶液にトリフルオロ酢酸（１ｍｌ）を添加し、氷冷しながら１時間、次いで室温で２時間攪拌して得られた。
薄層クロマトグラフィーによる分離を試みたが、明確に分離したスポットは確認できなかった。
【００４２】
図２の写真は、α−フタル酸−リジン−ダンシル（実施例１）、α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシル（比較例１）及びリジン−ダンシル（比較例２）を、同一の薄層上で同時に展開させた後の、薄層クロマトグラフィーの写真である。左から順番に、
１：α−フタル酸−リジン−ダンシル
２：α−フタル酸−リジン−ダンシル＋１００μＭトリプシン
３：α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシル
４：α−ＦＭＯＣ−リジン−ダンシル＋１００μＭトリプシン
５：リジン−ダンシル
６：リジン−ダンシル＋１００μＭトリプシン
のスポットである。展開溶媒は、メタノール：水＝２：３の混合溶媒である。本発明の化合物を使用した１及び２では、トリプシン処理の前後で、明確にスポットが区別出来ることが明らかである。これに対して、比較例である３〜６では、トリプシン処理の前後でスポットに明確な差が無く、トリプシンの検出が出来ていない。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の物質を使用することにより、酵素の検出及び同定を、より容易に且つ素早く行うことが出来る。また、フリーのカルボキシル基を有していることにより、セルロース等の素材に容易に固定できる。従って、簡易的な酵素の検出キットを容易に製造可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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