(57)【要約】【課題】筋ジストロフィー、特に重症型の筋ジストロフィーを治療又は診断するための方法及び手段を提供すること。【解決手段】本発明は、サルコリピン阻害剤を有効成分として含む筋ジストロフィー治療剤、及びサンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含む筋ジストロフィー診断薬を提供する。また本発明は、筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法を提供する。【選択図】図４
2017214337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコリピン阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする筋ジストロフィー治療剤。
【請求項２】
サルコリピン阻害剤が、サルコリピンを阻害する化合物、サルコリピンをコードする遺伝子に対するsiRNA、miRNA及びアンチセンス核酸、抗サルコリピン抗体、並びにサルコリピンに対するアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の治療剤。
【請求項３】
サンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含むことを特徴とする筋ジストロフィー診断薬。
【請求項４】
測定手段がDNAプライマー及び／又はDNAプローブである、請求項3に記載の診断薬。
【請求項５】
測定手段が抗体である、請求項3に記載の診断薬。
【請求項６】
サンプルが、筋サンプル、血液サンプル、血清サンプル及び体液サンプルからなる群より選択される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の診断薬。
【請求項７】
筋ジストロフィーの診断が、筋ジストロフィーの保因の判定、筋ジストロフィーの重症度の判定又は筋ジストロフィーの重症化の予測である、請求項3〜6のいずれか1項に記載の診断薬。
【請求項８】
筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法であって、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む方法。
【請求項９】
SERCAの活性を、リアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）アゴニストによる刺激後の筋小胞体へのCa2+再取り込み時間により測定する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の応答性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
をさらに含む、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
RyR1の応答性をRyR1アゴニストによる刺激後の細胞質Ca2+濃度により測定する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
RyR1アゴニストがカフェインである、請求項9又は11に記載の方法。
【請求項１３】
上記筋ジストロフィーの治療薬候補を筋ジストロフィー発症動物又は筋ジストロフィー保因動物に投与し、筋ジストロフィーの病態の変化を観察するステップをさらに含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋ジストロフィー治療剤に関する。また本発明は、筋ジストロフィーの診断薬に関する。さらに本発明は、筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィーは進行性に全身の筋萎縮と筋力低下を引き起こす遺伝性疾患の総称である。筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子変異で発症し、デュシェンヌ（Duchenne）型筋ジストロフィー（DMD）とその軽症型であるベッカー（Becker）型筋ジストロフィー（BMD）がある。DMDの筋細胞膜はジストロフィンが欠失していることにより脆弱で細胞外からのCa2+流入の影響を受けやすく、この細胞質へのCa2+流入は慢性炎症や進行性の再生不良、線維化を惹起する。Ca2+の流入は細胞膜の脆弱性だけでなく、ストレッチ活性化チャネル（stretch-activated channels）、Ca2漏出チャネル、漏出性Ca2+放出チャネルも原因として考えられ、ジストロフィン欠失による細胞内のCa2+ ([Ca2+]i)異常がDMDの発症原因として考えられている。
【０００３】
一方、DMDとBMDのような病態の重症度と[Ca2+]i濃度との関係は不明である。また、ジストロフィン遺伝子のエキソン45-55の欠失によって、骨格筋の病状が軽く、軽症のBMDとなるという報告がある（非特許文献１）が、その具体的な機構は不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nakamura et al., J Clin Meurosci, 15: 757-763, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、筋ジストロフィー、特に重症型の筋ジストロフィーを治療又は診断するための方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、野生型マウス、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）及びDMDモデルマウス（mdxマウス）の[Ca2+]i動態を比較することにより、DMD病態における[Ca2+]iを調節する分子を同定し、この分子を標的とした[Ca2+]i動態制御によるDMDに対する新たな治療法の開発を目指した。その結果、重症型のmdxマウスではサルコリピンレベルが高いのに対し、より軽症なTg/mdxマウスではサルコリピンレベルが野生型に類似していたことから、サルコリピンを標的として筋ジストロフィーを治療することができ、さらに重症型の筋ジストロフィーを診断できるという知見を得た。また、その過程においてリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の機能と筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性の正常化が筋ジストロフィーの病態に重要であることを突き止め、SERCA活性を改善し、RyR1機能を改善する因子が筋ジストロフィーの治療薬候補となりうるという知見も得た。これらの知見から本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下の実施形態を包含する。
[1] サルコリピン阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする筋ジストロフィー治療剤。
[2] サルコリピン阻害剤が、サルコリピンを阻害する化合物、サルコリピンをコードする遺伝子に対するsiRNA、miRNA及びアンチセンス核酸、抗サルコリピン抗体、並びにサルコリピンに対するアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種である、[1]に記載の治療剤。
[2-1] サルコリピン阻害剤が、配列番号2又は3に示される塩基配列を含むsiRNAである、[1]に記載の治療剤。
[3] サンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含むことを特徴とする筋ジストロフィー診断薬。
[4] 測定手段がDNAプライマー及び／又はDNAプローブである、[3]に記載の診断薬。
[5] 測定手段が抗体である、[3]に記載の診断薬。
[6] サンプルが、筋サンプル、血液サンプル、血清サンプル及び体液サンプルからなる群より選択される、[3]〜[5]のいずれかに記載の診断薬。
[7] 筋ジストロフィーの診断が、筋ジストロフィーの保因の判定、筋ジストロフィーの重症度の判定又は筋ジストロフィーの重症化の予測である、[3]〜[6]のいずれかに記載の診断薬。
[8] 筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法であって、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む方法。
[9] SERCAの活性を、リアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）アゴニストによる刺激後の筋小胞体へのCa2+再取り込み時間により測定する、[8]に記載の方法。
[10] 被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の応答性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
をさらに含む、[8]又は[9]に記載の方法。
[11] RyR1の応答性をRyR1アゴニストによる刺激後の細胞質Ca2+濃度により測定する、[10]に記載の方法。
[12] RyR1アゴニストがカフェインである、[9]又は[11]に記載の方法。
[13] 上記筋ジストロフィーの治療薬候補を筋ジストロフィー発症動物又は筋ジストロフィー保因動物に投与し、筋ジストロフィーの病態の変化を観察するステップをさらに含む、[8]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14] サルコリピン阻害剤を対象に投与することを含む、筋ジストロフィーの治療方法。
[15] 対象に由来するサンプルにおいてサルコリピンの発現を測定することを含む、対象における筋ジストロフィーを判定する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る筋ジストロフィー治療剤は、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDを効果的に改善することができるものである。また本発明に係る筋ジストロフィー診断薬により、筋ジストロフィーの重症度を判定し又は重症化を予測することが可能となる。さらに本発明に係るスクリーニング方法により、筋ジストロフィーの治療薬候補を同定することができ、筋ジストロフィー治療法又は発症の予防法の開発に有用である。従って、本発明は、医療、薬学、リハビリテーションなどの分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】RyR1の超ニトロシル化及びSERCA活性の低下は、mdxマウスにおいてCa2+動態の異常を誘導する。（A）カフェイン刺激（20mM）後のWTマウス、Tg/mdxマウス及びmdxマウス由来の筋芽細胞のCa2+応答性の最大振幅を示すグラフである。（B）単一指数を過渡減衰トレースにフィットすることにより測定した、WT、Tg/mdx及びmdx筋管におけるペーシング誘発性Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数（タウ）を示すグラフである。このパラメータがSERCA活性の指標であり、Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数が低いほどSERCA活性は高いといえる。
【図２】（A）WT、Tg/mdx、mdx、Tg/mdx/nNOS KO及びmdx/nNOS KOマウスのTA筋におけるサルコリピンのウエスタンブロット結果を示すグラフである（n > 5匹／群）。（B）WT、Tg/mdx及びmdxマウスの18S rRNAの発現に最適化させた、TA筋におけるサルコリピンのqRT-PCR産物の定量を示すグラフである（n > 5匹／群）。
【図３】サルコリピンノックダウンは、mdxマウスのSERCA活性及び筋機能を改善する。（A）サルコリピンの発現がサルコリピンノックダウンに基づく2種のsiRNAにより阻害されたことを示す写真である。（B）2種のsiRNAによるサルコリピンの阻害によってカフェイン刺激Ca2+放出の振幅が増大したことを示すグラフである。（C）単一指数関数を減衰トレースにフィットすることによりプロットした、サルコリピンの2種のsiRNAに暴露したmdx筋管におけるペーシング誘発性Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数（タウ）を示すグラフである。
【図４】（A）20週齢の野生型マウス、SLN KO/mdxマウス及びmdxマウスの握力（kg/体重（kg））を示すグラフである（n > 10匹／群）。（B）20週齢の野生型マウス、SLN KO/mdxマウス及びmdxマウスのトレッドミル能力を示すグラフである（n > 10匹／群）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者により作出された、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）は、筋細胞膜の安定性、筋病理所見、筋機能に関して、DMDモデルマウス（mdxマウス）と比較して野生型マウスと遜色のないレベルまで回復していた。そこで、野生型マウス、ジストロフィン遺伝子エクソン45-55を欠失したBMDモデルマウス（Tg/mdxマウス）及びDMDモデルマウス（mdxマウス）の[Ca2+]i動態を比較することにより、DMD病態における[Ca2+]iを調節する分子を同定し、この分子を標的とした[Ca2+]i動態制御によるDMDに対する新たな治療法の開発を目指した。
【００１１】
ジストロフィン糖タンパク質複合体に含まれる一酸化窒素合成酵素(nNOS)は通常ジストロフィンのエキソン42-45領域に直接結合し細胞膜に局在するものの、Tg/mdxマウスでは野生型マウスと異なりnNOSが細胞質に局在していた。このことはnNOSの結合領域を一部欠くためと考えられる。一方、mdxマウスは、ジストロフィン欠失に伴い細胞膜に局在できなくなったnNOSやマクロファージ等の浸潤細胞由来のiNOSが産生するNOが筋小胞体(SR)のリアノジン受容体(RyR1)をニトロシル化し、RyR1が漏出性になることで[Ca2+]i濃度が恒常的に高い。そこで、Tg/mdxマウスについて検討すると、mdxマウスと同程度RyR1がニトロシル化されていた。一方、Tg/mdxマウスの[Ca2+]i濃度は野生型マウスより高いものの、mdxマウスと比較すると低値で、両群の中間の値を示した。予想外にも、RyR1のアゴニストであるカフェインを用いてRyR1を刺激するとTg/mdxにおけるその応答性は、mdxより高く、野生型と同程度保たれていた。このようにTg/mdxはRyR1がmdxと同程度ニトロシル化されているものの[Ca2+]i濃度の上昇はmdxほどではなく、RyR1の機能もmdxとは異なり野生型と同レベル維持されていた。以上から、Tg/mdxとmdxとの間で細胞質からSRにCa2+を取り込む役割を担うSERCAの機能が異なることが推測される。実際、本発明者はカフェイン刺激後の細胞質に放出されたCa2+のSRへの再取り込み時間（SERCA活性の指標）を検討したところmdxではその時間が野生型と比較して長く、Tg/mdxでは野生型に近い値を示していた（実施例１、図1のB）。そこで、本発明者はmdxにおいてSERCA機能を抑制する分子としてサルコリピン（SLN）を同定した。SLNはSERCA機能を抑制的に制御することが知られており、その発現はmdxで野生型、Tg/mdxと比べて有意に高い（実施例２、図2）。このことがSERCA機能を低下させていると考えられる。続いて、siRNAを用いてmdx由来筋芽細胞のSLNの発現を抑制するとカフェイン刺激によるRyR1の応答性は回復し、その機能が回復すること（実施例３、図3）、SLN KO/mdxマウスを作出し筋機能を解析すると、mdxより筋機能が回復すること（実施例４、図4）が明らかとなった。
【００１２】
したがって、本発明は、一態様において、サルコリピン阻害剤を含む筋ジストロフィー治療剤に関する。本発明に関連して、「筋ジストロフィーの治療」とは、筋ジストロフィーの改善、例えば、症状の改善、発症若しくは進行の遅延を指す。筋ジストロフィーの症状としては、限定されるものではないが、筋力低下、筋委縮、運動能力の低下、歩行障害、心筋疾患などが含まれる。
【００１３】
本発明に係る筋ジストロフィー治療剤（以下、まとめ「本剤」ともいう）は、有効成分としてサルコリピン阻害剤を含むものである。有効成分であるサルコリピン阻害剤としては、サルコリピンを阻害することができる薬物又は因子であれば任意の薬物又は因子を用いることができる。好ましくは、本発明において使用するサルコリピン阻害剤は、筋細胞内のサルコリピンを阻害することができるものである。本発明において「サルコリピンの阻害」とは、サルコリピンの発現又は活性を阻害する、すなわち低減する、抑制する、排除する又は無効化することを指す。
【００１４】
サルコリピンとは、筋小胞体（SR）のCa2+ポンプ機能を調節するタンパク質である。その遺伝子及びタンパク質の配列情報も知られており、ヒトサルコリピン遺伝子はGenBankにアクセッション番号Gene ID: 6588として登録され、配列番号1に示される配列を有する。
【００１５】
サルコリピン阻害剤としては、限定されるものではないが、サルコリピン遺伝子の発現を阻害する手段、例えばアンチセンス核酸、RNAインターフェアランス（RNAi）を利用する方法（dsRNA、miRNA、siRNAなど）、及びタンパク質としてのサルコリピンの発現又は活性を阻害する手段、例えば化合物、抗体、アプタマーなどが挙げられる。
【００１６】
一実施形態において、サルコリピン阻害剤は、RNAiによってサルコリピン遺伝子の発現を効率的に阻害する二本鎖RNA（dsRNA）分子（例えばsiRNA、miRNAなど）を含む。具体的には、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子又はサルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子を発現可能な発現ベクターを使用することができ、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子は、サルコリピン遺伝子（例えば配列番号1）の10〜100個の連続する塩基、好ましくは10〜50個の連続する塩基、より好ましくは10〜30個の連続する塩基を標的とする塩基配列を含むものである。好ましくは、サルコリピン遺伝子に対するdsRNA分子は、短鎖干渉RNA（siRNA）として短い塩基配列を含むものである。このようなdsRNA分子、例えばsiRNA分子の設計は、当技術分野で公知であり、当業者であればサルコリピン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
【００１７】
別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸を含む。具体的には、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸又はサルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸を発現可能な発現ベクターを使用することができ、サルコリピン遺伝子に対するアンチセンス核酸は、サルコリピン遺伝子（例えば配列番号1）又はその一部の配列に対して相補的な配列を含むものである。このようなアンチセンス核酸の設計は、当技術分野で公知であり、当業者であればサルコリピン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
【００１８】
さらなる実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンを阻害する化合物であり、例えばサルコリピンに結合する化合物、サルコリピンのSERCAに対するアフィニティを低下する化合物などが含まれる。そのような化合物としては、限定されるものではないが、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなどが挙げられる。
【００１９】
また別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンに対する抗体を含む。本明細書において「抗体」という用語は、抗原であるサルコリピンタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメントなど）を意味する。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはヒト化又はキメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）抗体、ドメイン抗体などであってもよい。抗サルコリピン抗体は、当業者であれば慣用的な手法に従って作製することができ、あるいは市販品としても入手可能である。
【００２０】
別の実施形態において、サルコリピン阻害剤は、サルコリピンに対するアプタマーである。アプタマーとは、被検物（本発明ではサルコリピン）と特異的に結合する分子を指す。例えば、アプタマーは、タンパク質アプタマー（抗体など）、ペプチドアプタマー、ペプチド核酸アプタマー、核酸アプタマー（DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド）などである。アプタマーは、例えば試験管内選抜（いわゆるin vitroセレクション又はin vitro進化）により得ることができ、一度得られた後は、当技術分野で公知のペプチド合成法又は核酸合成法を使用して作製することができる。
【００２１】
なお、選択したサルコリピン阻害剤が好適な筋ジストロフィーの治療効果を有するか否かは、当技術分野で公知の方法により確認することができる。例えば、選択したサルコリピン阻害剤を対象（モデル動物など）に投与し、対象における筋ジストロフィーの発症、進行又は症状に影響を及ぼすか否かを判定することによって筋ジストロフィーの治療効果を確認することができる。より具体的には、例えば対象の筋重量、筋断面積、単離骨格筋の張力、筋力（例えば握力）、運動能力（例えばトレッドミル能力）などを測定することによって、筋ジストロフィーの治療効果を確認することができる。
【００２２】
本剤は、有効成分として、1種のサルコリピン阻害剤を含有するものであってもよいし、又は2種以上のサルコリピン阻害剤を組み合わせて含有するものであってもよい。本剤は、サルコリピン阻害剤から選択される少なくとも1種の薬物又は因子を有効成分として含有する限り、上述した筋ジストロフィー治療効果を発揮する。
【００２３】
本剤は、有効成分であるサルコリピン阻害剤の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００２４】
本剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥製剤にしてもよい。また、本剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤、クリーム剤、座剤、パップ剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。
【００２５】
例えばサルコリピン阻害剤として核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を使用する場合には、サルコリピン阻害剤は、ex vivo（例えば、対象に由来する細胞を核酸分子又はそれを発現する発現ベクターと共に培養する）、あるいは、in vivo（例えば、核酸分子又は発現ベクターを対象に投与する）で投与することができる。
【００２６】
核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）は、種々の公知の投与方法により標的部位（筋細胞など）に送達することができる。例えば、dsRNAは、dsRNAを発現可能な発現ベクターを用いて送達しうる。本発明において用いることができる発現ベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスなどのRNAウイルスが挙げられる。
【００２７】
核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を標的組織又は細胞に投与するために用いることができる遺伝子送達系の他の例としては、コロイド分散系、リポソーム誘導系、及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。具体的には、例えば高分子量複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを、送達系として用いることができる。
【００２８】
核酸分子又は発現ベクターは、静脈内注射（持続注入を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、及び皮下注射により、又は他の投与経路により直接投与することができる。
【００２９】
あるいは、核酸分子又は発現ベクターは、対象から採取した細胞又は組織に導入することができ、次にその細胞を対象に投与しうる（ex vivo法）。核酸分子又は発現ベクターの細胞又は組織への導入は、慣用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション又はリポフェクションなどにより実施しうる。核酸分子（例えば、siRNAなどのdsRNA、アンチセンス核酸など）を発現する細胞又は組織の投与もまた、核酸分子又は発現ベクターの直接投与の場合と同様に行いうる。
【００３０】
上述した各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００３１】
本剤に配合するサルコリピン阻害剤は、その有効成分の種類、用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えば総重量を基準として0.01〜90重量％、好ましくは1〜50重量％である。
【００３２】
また、本剤の有効量（投与量又は摂取量）は、該剤に含まれる有効成分の種類、対象の年齢及び体重、症状、投与経路、投与頻度及び回数により異なり、広範囲に変更することができる。例えば、通常成人1日当たりのサルコリピン阻害剤の有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間〜約1年間、好ましくは約1ヶ月〜約12ヶ月にわたり投与することができる。
【００３３】
本剤は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）などの対象に投与する又は摂取させることができる。対象は、特に、筋ジストロフィーを発症した対象、筋ジストロフィーを保因する対象（ジストロフィン遺伝子欠損を有する対象）である。
【００３４】
本剤は、当技術分野で公知の他の筋ジストロフィー治療に有効な方法と組み合わせることができる。例えば、エクソンスキップ治療又はウイルスベクターを用いる遺伝子治療により行われるジストロフィン発現を誘導する治療法などと組み合わせることができる。
【００３５】
本剤は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を1種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本剤が配合された食品又は飼料は、筋ジストロフィー改善のための健康補助製品として有用である。
【００３６】
以上のようにして、サルコリピン阻害剤又は本剤を対象に投与することにより、対象において筋ジストロフィーを治療することができる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、サンプルにおけるサルコリピンの発現を測定するための手段を含む筋ジストロフィー診断薬に関する。本発明では、上述のように、正常及び軽症型筋ジストロフィー（BMD）ではその発現量が低く重症型筋ジストロフィー（DMD）では高く発現されるサルコリピンタンパク質及びそれをコードする遺伝子をマーカーとして利用する。本明細書中、サルコリピン遺伝子及びサルコリピンタンパク質を「本発明のマーカー」と呼ぶ。なお、本発明のマーカーは、本明細書中「マーカー遺伝子」及び「マーカータンパク質」とも記載する。
【００３８】
本発明のマーカータンパク質及びマーカー遺伝子は、当技術分野で公知であり、そのアミノ酸配列及び塩基配列も公知である。但し、本発明のマーカーについて、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDとの関連性については報告されていない。
【００３９】
本発明のマーカーは、当技術分野で公知の他の筋ジストロフィーマーカーと組み合わせてもよい。他のマーカーとしては、例えば血清クレアチニンキナーゼ（CK）値が挙げられる。このようにマーカーを組み合わせることによって、筋ジストロフィーの診断をより高精度に行うことができる。
【００４０】
上述の通り、本発明のマーカーは、筋ジストロフィー、特に重症度の高いDMDにおいて高レベルで発現される。本発明では、対象由来のサンプルにおいて上記のマーカーの発現を測定する。また本発明では、「マーカーの発現」とは、マーカータンパク質又はその派生物又は誘導体の発現であってもよいし、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子（mRNA）の発現であってもよい。「派生物」又は「誘導体」とは、マーカータンパク質から派生する物質又はマーカータンパク質の由来する物質を意味し、例えばシグナルペプチドを含むタンパク質、タンパク質の特定のサブユニット分子、修飾タンパク質、タンパク質断片などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
従って、本発明に係る筋ジストロフィー診断薬（以下、「本診断薬」ともいう）は、対象に由来するサンプル中のサルコリピンの発現を測定するための手段を含むものである。
【００４２】
使用するサンプルは、筋ジストロフィーについて診断しようとする対象に由来するサンプルであれば特に限定されるものではなく、マーカーの発現を測定するための方法又は手段の種類に応じて適宜選択される。例えば生体液サンプル（血液、血清、血漿、尿、髄液、腹水等）、組織又は細胞サンプル（筋組織又は筋細胞、例えば横隔膜の組織又は細胞等）が挙げられ、採取の容易性の点から、筋細胞、血液、血清又は血漿などをサンプルとして用いることが好ましい。血漿を使用する場合には、抗凝固剤としてEDTAを使用することが好ましいが、ヘパリン、クエン酸ナトリウムなど当該分野で公知又は汎用されているものを使用することができる。血液サンプルの場合、採血後は氷冷又は冷蔵保存することが好ましい。また、組織又は細胞サンプルは、採取後に液体窒素、ドライアイスなど当該分野で公知又は汎用されている方法で直ちに凍結し、冷凍保存することが好ましい。筋細胞は、当技術分野で公知の方法により採取することができる。
【００４３】
また対象は、ヒト、及びその他の哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギなど）であり、さらには爬虫類及び鳥類などであってもよい。
【００４４】
マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカーの量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に測定することに関し、その量は、絶対量であってもよいし又は相対量であってもよい。測定は、直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、サンプル中に存在するマーカータンパク質又は遺伝子（mRNA）の分子数と直接相関するシグナルに基づいて、その量又は濃度を測定することに関する。そのようなシグナルは、例えばタンパク質又は遺伝子の特定の物理的又は化学的な特性に基づいている。間接的な測定は、二次成分（すなわちマーカータンパク質又はmRNA以外の成分）、例えば抗体やアプタマーなどのリガンド、標識又は酵素反応生成物から得られるシグナルの測定である。採用するマーカーの発現測定方法に応じて、本診断薬に含まれる測定手段も異なる。
【００４５】
本発明の一実施形態では、マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカータンパク質の量を測定するための手段によって行うことができる。そのような手段は当技術分野で公知であり、例えば免疫アッセイの方法及び試薬などがある。またマーカータンパク質の発現の測定は、マーカータンパク質に特有の物理的又は化学的特性を測定するための手段、例えば正確な分子量又はNMRスペクトル等を測定するための手段によって行うことができる。マーカータンパク質の発現の測定するための手段としては、バイオセンサー、プロテインチップ、免疫アッセイと連結した光学装置、質量分析計、NMR分析計、二次元電気泳動装置又はクロマトグラフィー装置等の分析装置が挙げられる。
【００４６】
例えば、サンプル中のマーカータンパク質の発現の測定は、免疫アッセイ（免疫学的測定法）により行うことができる。すなわちサンプル中のマーカータンパク質と、該タンパク質に特異的に結合する抗体との反応に基づいて、該タンパク質の発現を測定する。免疫アッセイは、当該分野で汎用されている方法であれば液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。検出の容易性の点で、固相系を利用することが好ましい。また免疫アッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法、ウエスタンブロッティング法、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法などであってもよい。
【００４７】
免疫アッセイを採用する場合には、本診断薬は、マーカータンパク質に対する抗体を含む。マーカータンパク質に対する抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよいし、あるいはマーカータンパク質のエピトープに結合することができるFab、Fvフラグメントなどであってもよい。一次抗体と二次抗体を使用する場合には、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。抗体は、当技術分野で公知の方法により調製することができ、また市販品として入手してもよい。
【００４８】
マーカータンパク質と抗体との結合（反応）は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、採用する免疫アッセイの種類及び形式、使用する標識の種類などに応じて、各アッセイについての有効かつ最適な測定方法を決定することができる。例えば、サンプル中のマーカータンパク質と抗体との結合を容易に検出するために、該抗体を標識することにより該結合を直接検出するか、又は標識二次抗体若しくはビオチン−アビジン複合体等を用いることにより間接的に検出する。
【００４９】
免疫アッセイとして固相系を選択する場合には、例えばサンプル中のタンパク質成分を固相（プレート、膜、ビーズ等）に固定化することができ、あるいは、抗体を固相に固定してもよい。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、標識として酵素を用いる場合には、「ELISA」として広く用いられている方法である。このような固相系の方法は、極微量のタンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。またこのような免疫アッセイは、例えば操作が簡便なテストストリップにおいても実施することができる。
【００５０】
免疫アッセイとして液相系を選択する場合には、例えば、標識化抗体とサンプルとを接触させて標識化抗体とマーカータンパク質を結合させ、この結合体を分離し、標識シグナルを検出する。あるいは、マーカータンパク質に対する抗体（一次抗体）とサンプルとを接触させて一次抗体とマーカータンパク質を結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋マーカータンパク質結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。
【００５１】
免疫アッセイにおいて使用する抗体を標識するための標識としては、酵素、放射性同位体、蛍光色素又はアビジン−ビオチン系を使用することができる。酵素としては、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素、例えば、パーオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００５２】
ビオチン−アビジン複合体系を利用する場合には、ビオチン化した抗体とサンプルとを反応させ、得られた複合体に標識を付加したアビジンを反応させる。アビジンは、ビオチンと特異的に結合することができるため、アビジンに付加した標識のシグナルを検出することによって、抗体とマーカータンパク質との結合を測定することができる。アビジンに付加する標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）が好ましい。
【００５３】
標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてパーオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。
【００５４】
あるいは、免疫組織化学染色法（例えば免疫染色法）又は免疫電顕法のように、マーカータンパク質のin situ検出のために、マーカータンパク質に対する抗体を組織学的に用いることも可能である。in situ検出は、対象から組織学的サンプル（例えば筋組織、筋細胞、横隔膜サンプル）を切除し（組織のパラフィン包埋切片など）、それに標識した抗体を接触させることにより実施しうる。
【００５５】
以上の免疫学的方法では、サンプル中のマーカータンパク質とマーカータンパク質に対する抗体との結合量が多いほど、サンプル中にマーカータンパク質が多く発現されていることとなる。
【００５６】
あるいは、マーカータンパク質の発現の測定は、質量分析法（MS）を使用して行うことができる。
【００５７】
また本発明においては、マーカーの発現の測定は、サンプル中のマーカー遺伝子の量を測定するための手段によって行うことができる。そのような手段は当技術分野で公知であり、例えば、マーカー遺伝子のDNAの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマーDNA又はプローブDNAがある。該プライマーDNA又はプローブDNAは、対象由来のサンプル中に発現しているマーカー遺伝子のmRNA又は該mRNAに対応するcDNAと特異的に結合して、サンプル中のマーカー遺伝子の発現を検出することが可能である。
【００５８】
プライマーDNA及びプローブDNAは、マーカー遺伝子のDNAの塩基配列に基づいて、公知のプログラムにより容易に設計することができ、また当業者に公知の方法に従って調製することができる。具体的には、マーカー遺伝子の塩基配列、例えば配列番号1に示される塩基配列及びその相補配列に基づいて設計することができる。プライマーとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。またプローブとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15〜50塩基であり、さらに好ましくは20〜30塩基である。さらに、当業者には周知のように、プライマーDNA又はプローブDNAには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。
【００５９】
対象由来のサンプルにおけるマーカー遺伝子の発現を測定するためには、上記プライマーDNA及び／又はプローブDNAをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。そのような反応を行う場合には、通常は、当技術分野で周知の方法を使用して対象由来のサンプルからmRNA又は該mRNAに対応するcDNAを調製する。以上のように調製したサンプルを用いて、以下に示す増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応を行う。
【００６０】
プライマーDNAを用いてmRNA又はcDNAを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、サンプル中のマーカー遺伝子の発現の測定を行うことができる。増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法（PCR、RT-PCR、リアルタイムPCRなど）を挙げることができる。増幅産物の検出には、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
【００６１】
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、スルホローダミン（SR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【００６２】
標識したdNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
【００６３】
また、プローブDNAを用いてサンプルに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、マーカー遺伝子の発現を測定することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、プローブDNAがサンプル中のマーカー遺伝子のmRNA又はcDNAのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブDNAに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Pなど）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。
【００６４】
標識化プローブDNAを用いた検出は、サンプル又はそれから調製したmRNA若しくはcDNAとプローブDNAとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。具体的には、サンプル又はmRNA若しくはcDNAを適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブDNAを添加することにより、あるいは標識プローブDNAを適当な固相に固定化し、サンプル又はmRNA若しくはcDNAを添加することにより、プローブDNAとサンプル又はmRNA若しくはcDNAとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブDNAを除去した後、サンプル又はmRNA若しくはcDNAとハイブリダイズしているプローブDNAの標識を検出する。標識が検出された場合には、サンプル中にマーカー遺伝子のmRNAが発現していることとなる。標識化プローブDNAを用いた発現の測定方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。
【００６５】
以上のようにして、マーカーの発現を測定する手段を用いてサンプル中のマーカーの発現を測定し、その結果に基づいて筋ジストロフィーを診断することが可能である。本診断薬により診断の対象となるのは筋ジストロフィーであり、特に重症型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）である。本明細書中、「筋ジストロフィーの診断」とは、対象における筋ジストロフィーの保因を判定すること、筋ジストロフィーの重症度を判定すること、筋ジストロフィーの重症化を予測することを意味する。また本発明において「診断」は、既に診断された筋ジストロフィーの継続的なモニタリング、及び既に行った筋ジストロフィーの診断の確認も包含する。
【００６６】
本発明の目的である診断は、診断しようとする対象の全て（すなわち100％）について必ず正しい結果が得られることを意図するものではない。本発明においては、「診断」は、対象を統計学的に有意な確率で診断できることを意図しており、例えば対象の少なくとも60％、少なくとも80％又は少なくとも90％を、本発明によって適切に診断することができる。
【００６７】
診断を行う際、対象由来のサンプル中のマーカーの発現を、基準値と比較する。基準値は、健常者サンプルにおけるマーカーの発現の測定値、筋ジストロフィー（DMD、BMDなど）の保因者又は発症者であると診断がなされた患者サンプルにおけるマーカーの発現の測定値などである。個々の対象に適用する基準値は、対象の種類、年齢などの様々な生理学的パラメータに応じて変化しうる。具体的な判定基準としては、対象のサンプルにおけるマーカーの発現量が健常者のそれと比較して、10％以上、好ましくは30％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは100％以上である場合には、重症度の筋ジストロフィーの可能性があると診断することができる。
【００６８】
さらに筋ジストロフィーの診断は、他の公知の筋ジストロフィーの診断方法と組み合わせて行ってもよい。そのような公知の診断方法としては、血清クレアチンキナーゼ（CK）値の測定、単離骨格筋の張力測定、組織学的な筋最大直径及び中心核線維の頻度の計測、
多重連鎖反応依存性プローブ増幅（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification：MLPA）法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法／シークエンス法による遺伝子変異の同定、あるいは抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学法又はウエスタンブロット法によるジストロフィンタンパク質の定性・定量的解析法が挙げられる。
【００６９】
本診断薬は、マーカーの発現を測定する手段以外にも診断に有用な他の成分を含んでもよく、それにより、マーカーの発現の測定を容易かつ簡便に行うことができ、筋ジストロフィーを診断することができる。
【００７０】
本診断薬の一例は、免疫アッセイ用試薬セットであり、少なくともマーカータンパク質に対する抗体試薬を含む。さらに、希釈や洗浄用緩衝液、標準抗原、各抗体試薬に特異的に結合をする標識抗体試薬、発色・発光・蛍光を生じさせる基質試薬、手順と評価方法を記載した手順書等を含んでもよい。キットに含まれる抗体は、予め標識されたものであってもよいし、又は標識されていなくてもよい。また抗体は、固相支持体（例えば、メンブレン、ビーズ等）に固定されていてもよい。また本発明の診断薬の別の例は、質量分析用試薬セットであり、例えば同位体標識試薬、分画用ミニカラム、緩衝液、手順書等により構成される。本発明の診断薬のさらに別の例は、サンプル中のマーカー遺伝子の発現を測定するための手段（プライマーDNA、プローブDNAなど）を含むものであってもよい。
【００７１】
本発明の診断薬は、該診断薬を使用するための手順及びプロトコールを記載した説明書、筋ジストロフィーの診断において使用する基準値又は基準範囲を示した表などを含んでもよい。
【００７２】
本発明の診断薬に含まれる構成要素は、個別に提供されてもよいし、又は単一の容器内に提供されてもよい。好ましくは、本発明の診断薬は、必要な構成要素の全てを、即時に使用することができるように、例えば調整された濃度の構成要素として含む。
【００７３】
さらに本発明は、別の態様において、筋ジストロフィーの治療薬候補のスクリーニング方法に関する。後述する実施例に示されるように、重症型のDMDでは、野生型及び軽症型のBMDとは異なり、細胞質から筋小胞体（SR）にCa2+を取り込む役割を担うSERCA（筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ）の活性が低く、またリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の機能が低下している。そのため、SERCA活性を改善し、かつRyR1機能を改善する物質又は因子は、筋ジストロフィー、特に重症型のDMDの治療薬候補となる可能性がある。
【００７４】
本発明に係るスクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」ともいう）は、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞における筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ（SERCA）の活性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してSERCAの活性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含む。
【００７５】
ジストロフィンを欠損する筋細胞は、当技術分野で公知の方法に従って入手し調製することができ、あるいは市販の細胞又は公に入手可能な細胞を使用することも可能である。例えば、ヒト線維芽細胞に対してMyoD遺伝子をレトロウイルスによる導入して筋芽細胞に分化させた細胞（例えば、Coriell Institute for medical researchより入手可能）などを利用することができる。あるいは、筋ジストロフィーモデル動物、好ましくは筋ジストロフィーモデル実験動物（マウス、イヌ、ラットなど）から採取された筋細胞であってもよい。例えば、筋ジストロフィーのモデルマウス（mdxマウス：Sicinski, P. et al., Science 244:1578-1580, 1989）、筋ジストロフィーのモデルイヌ（c-xmdイヌ：Komegay, J.N. et al., Muscle Nerve 11:1056-1064, 1988；CXMDJイヌ：Shimatsu Y et al., Exp Anim. 52:93-7. 2003、Shimatsu Y et al., Acta Myol. 24:145-54. 2005）、筋ジストロフィーのモデルネコ（HFMDネコ：Vos, J. H. et al., J. Comp. Pathol. 96:335-41, 1986）などが知られている。
【００７６】
本スクリーニング方法の対象となる被験物質又は因子の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験物質又は因子は、任意の物質、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験物質又は因子は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験物質又は因子は、放射線、紫外線、炭素濃度、温度などの環境因子であってもよい。
【００７７】
また、被験物質又は因子としては単一の被験物質又は因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質又は因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質又は因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００７８】
筋細胞を被験物質又は因子の存在下に配置する場合、その条件は、その物質又は因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、筋細胞を被験物質を添加した培地中で培養することにより、筋細胞を被験物質を含む溶液中に浸漬することにより、筋細胞上に被験物質を積層することにより、又は筋細胞を被験因子の存在下で培養することにより行うことができる。
【００７９】
また、被験物質又は因子の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質又は因子の存在下におく時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験物質又は因子の処置期間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うことができる。
【００８０】
さらに、複数の物質及び／又は因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験物質及び／又は因子を組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
続いて、被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるSERCAの活性を測定する。SERCAの活性は、例えばリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）アゴニストによる刺激後の筋小胞体へのCa2+再取り込み時間により測定することができる。Ca2+再取り込み時間が短いほどSERCAの活性は高いといえる。RyR1アゴニストとしては、限定されるものではないが、カフェインを使用することができる。例えば、被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞をRyR1アゴニストで刺激し、その直後から5分間程度にわたって筋小胞体へのCa2+再取り込み時間を測定する。
【００８２】
筋小胞体へのCa2+再取り込み時間は、当技術分野で公知の方法により、例えばCa2+濃度の変化により測定することができる。具体的な方法としては、例えばカルシウムと結合することにより蛍光を発するFluo-4などを使用して、筋小胞体内の蛍光強度を測定することによりCa2+濃度の変化を測定することができる。
【００８３】
細胞におけるSERCAの活性を測定した後、対照と比較し、SERCAの活性を改善する、すなわち向上させる被験物質又は因子を、筋ジストロフィーの治療薬候補として選択する。対照としては、被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞などを用いることができる。
【００８４】
本スクリーニング方法はさらに、
被験物質又は因子の存在下にて、ジストロフィンを欠損する筋細胞におけるリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）の応答性を測定するステップ、
被験物質又は因子の不在下におけるジストロフィンを欠損する筋細胞と比較してRyR1の応答性が改善した場合に、上記被験物質又は因子を筋ジストロフィーの治療薬候補として同定するステップ
を含んでもよい。このRyR1の応答性は、RyR1アゴニスト（例えばカフェイン）による刺激後の細胞質Ca2+濃度により測定することができる。
【００８５】
また、本発明においては、一次スクリーニングとして、細胞を被験物質又は因子で処置し、該細胞におけるSERCA活性の改善を示した被験物質又は因子を選択し、次に二次スクリーニングとして、選択した被験物質又は因子で動物を処置し、該動物の筋細胞におけるSERCA活性を測定して改善を示した被験物質又は因子を選択してもよい。
【００８６】
さらに、治療薬又は治療法のスクリーニングにおいては、さらに、選択された被験物質又は因子を、筋ジストロフィーモデル動物（筋ジストロフィー発症動物又は筋ジストロフィー保因動物）に投与して、被験物質又は因子がモデル動物における筋ジストロフィーの病態に影響を及ぼすか否かを判定してもよい。被験物質又は因子がモデル動物における筋ジストロフィーの病態に影響を及ぼすか否かの判定は、モデル動物の種類、判定しようとする病態、要因などにより異なるが、当業者であれば、筋ジストロフィーに及ぼす影響を適宜判定することができる。例えば、筋力、血清クレアチンキナーゼ値の測定、単離骨格筋の張力測定、組織学的な筋最大直径及び中心核線維の頻度の計測などを行うことができる。一般的には、モデル動物において被験物質又は因子の有効性が確認された後に、ヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。
【００８７】
上述のようにして、筋ジストロフィーの改善（例えば、症状の改善、発症若しくは進行の遅延）が認められる場合の被験物質又は因子は、筋ジストロフィーの治療薬の候補として選択することができる。
【００８８】
以上から、本スクリーニング方法により、筋ジストロフィーを治療又は予防するための治療薬又は治療法を同定し、さらには治療薬又は治療法の有効性を確認することができる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【００９０】
なお、実施例に示す実験結果について、すべての値は平均±標準誤差（sem）として表す。有意差はStudentのt検定又は一方向ANOVAにより評価した。また、多群間の差異は、Tukey-Kramerの事後解析により及びStudentの独立t検定（unpaired t-test）により評価した。10未満（† P<0.1）、5％未満（*P<0.05）、1％未満（**P<0.01）又は0.1％未満（***P<0.001）の確率を統計学的に有意差ありと判定した。
【００９１】
［実験準備］
（１）Tg/mdxマウスの作出
エキソン45-55欠損ヒトジストロフィンを発現し正常なヒトジストロフィンを発現しないトランスジェニックマウス（Tg/mdxマウス）を以前に記載された方法（Neuromuscular Disorders 24: 791-924, 2014）に従い作出した。簡単に説明すると、pCAGGSプロモーターを用いてエキソン45-55欠損ヒトジストロフィンcDNAを過剰発現するトランスジェニックマウスを作出した。2つのトランスジェニックF0系統（△45-55Tg）を得た。トランスジェニックmdxマウス（△45-55Tg/mdx）雄マウスを得るために、△45-55Tg雄マウスを雌mdxマウス（本出願人により作出され自家繁殖されているもの）と交配した。これらのマウスを15世代を超えてC57BL/6系統と戻し交配した。C57BL/6マウス及びnNOS-nullはNihon CREA及びJackson Laboratoryからそれぞれ購入した。すべての動物は自由に食餌及び水を摂取可能とした。本研究のすべての実験プロトコルについて、国立精神・神経医療研究センターの動物実験倫理問題委員会の承認を得た。
【００９２】
（２）初代筋芽細胞培養物及び単離された単一線維からの培養物
マウス由来単核細胞を以前に記載のようにマウスから調製した（J. Tanihata, et al., J. Gene Med. 10, 702-13 (2008)）。初代筋芽細胞を単独で、コラーゲン被覆皿において20％ウシ胎仔血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン及び2.5ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子（Invitrogen）を含有する増殖培地（GM）F-10で培養した。分化のため、培地を分化培地（DM）（2％ウシ血清及び1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM）に変更し、3日間培養した。GM及びDMは24時間毎に補充した。
【００９３】
単一線維の調製のため、マウス由来のEDL筋を単離し、以前に記載されているように1型コラーゲンを用いた消化により解離させた（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）。
【００９４】
（３）組織調製
マウスを頸椎脱臼により犠牲にした。体重及び筋肉を計量した。TA筋、EDL筋、腓腹筋（GC）、ヒラメ筋（SOL）、DIA筋及び心筋を標準的な解剖方法を用いて採取し、過剰な脂肪、結合組織及び腱を除去した。いくつかの筋肉を組織学的分析のために液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結し、他の筋肉はRNA又はタンパク質単離のために液体窒素中で凍結し、サンプルを−80℃にて保存した。
【００９５】
［実施例１］
Tg/mdxマウスでは、mdxマウスと同程度にリアノジン受容体アイソフォーム1（RyR1）がニトロシル化されていることから（データは示さず）、Tg/mdxマウスにおけるニトロシル化RyR1の機能を調べるため、野生型（WT）マウス、Tg/mdxマウス及びmdxマウス由来の筋芽細胞の初代培養物を用いてカフェイン刺激に対する応答性を分析した。
【００９６】
簡単に説明すると、in vitro実験のため、以前に記載の方法（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）をわずかに変更してFluo-4を用いて[Ca2+]cを記録した。筋管をPSS中で4μM Fluo-4 AM（Dojindo）と共に室温で30分間インキュベートし、色素の均一な細胞内分布を可能にした。37℃で5分インキュベートした後、Fluo-4が負荷された細胞を倒立顕微鏡（Olympus）のステージに載せた。蛍光強度の変化を1秒毎に測定した。カフェインを50mMの濃度でバッファーに溶解し、筋管にアプライした。データは、正規化した蛍光ΔF/F0：ΔF/F0＝(Fmax - F0)/F0（式中、Fmaxは最大蛍光であり、F0は試薬への暴露前の蛍光である）として計算した。
【００９７】
その結果を図1のAに示す。図1のAは、カフェイン刺激（20mM）後のWTマウス、Tg/mdxマウス及びmdxマウス由来の筋芽細胞のCa2+応答性の最大振幅を示している。WTマウス由来の筋芽細胞をカフェインで刺激した場合、大量のCa2+が筋小胞体（SR）から細胞質へ放出されたが、mdx筋芽細胞はわずかに少量のCa2+を放出した。一方、Tg/mdxマウスから調製した筋芽細胞培養物では、予想外にもWT培養物と同様のレベルで大量のCa2+がSRから放出された（図1のA）。Tg/mdx培養物におけるRyR1はmdx培養物と同様のレベルでニトロシル化されていると考えられるが、[Ca2+]i濃度の上昇はmdxほどではなく、Tg/mdxマウスにおけるRyR1の機能はmdxマウスとは対照的に野生型と同程度に維持されていた。
【００９８】
Tg/mdxとmdxとの間で細胞質から筋小胞体（SR）にCa2+を取り込む役割を担うSERCA（筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ）の機能が異なるという仮説をもとに、細胞質からSRへのSERCA媒介Ca2+再取り込みの機能を調べた。具体的には、筋小胞体（SR）からCa2+を放出するRyR1をそのアゴニストであるカフェインを用いて刺激することで、SR内のCa2+をすべて細胞質へ放出させた後の、細胞質からSRへのCa2+の再取り込みの時間を調べた。
【００９９】
その結果を図1のBに示す。図1のBは、単一指数を過渡減衰トレースにフィットすることにより測定した、WT、Tg/mdx及びmdx筋管におけるペーシング誘発性Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数（タウ）を示すグラフであり、このパラメータがSERCA活性の指標であり、Ca2+過渡信号の平均減衰時間定数が低いほどSERCA活性は高いといえる。mdxでは、カフェイン刺激後の細胞質に放出されたCa2+のSRへの再取り込み時間が野生型と比較して長いのに対して、Tg/mdxマウスにおけるCa2+再取り込みの大部分がWTマウスのレベルに回復していた（図1のB）。このことは、mdxマウスとは異なり、Tg/mdxマウスにおけるSERCA機能が維持されたことを示唆している。
【０１００】
骨格筋では、SERCA2Aアイソフォームが主に興奮収縮連関の間のSRへのCa2+再取り込みに寄与していると報告されている（A. E. Rossi, et al., Muscle Nerve. 33, 715-31 (2006)）。また、ジストロフィー筋においてSERCA活性の低下が観察されており（A. Divet, et al., Pflugers Arch. 444, 634-43 (2002)；A. Divet, et al., Acta Physiol. Scand. 184, 173-86 (2005)；M. E. Kargacin, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1290, 4-8 (1996)）、これが細胞質Ca2+レベルの上昇にいたり、筋ジストロフィーにおける欠陥Ca2+処理に寄与している（D. G. Allen, et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 88, 83-91 (2010)）。
【０１０１】
内腔SRのCa2+結合タンパク質であるカルセクエストリン及びサルカルメニンの発現レベルはSRのCa2+含量と相関している。カルセクエストリン及びサルカルメニンのmRNA及びタンパク質レベルは、WTマウス及びTg/mdxマウスと比較してmdxマウスでは低下していた（データは示さず）。これらの結果は、mdxマウスのものと比較してTg/mdxマウスの高いSR Ca2+貯蔵能がSERCA活性の低下により生じ、これがそれぞれの培養物の種々のカフェイン応答性を生じたことを示している。
【０１０２】
以上から、RyR1の超ニトロシル化及びSERCA活性の低下がTg/mdxマウスにおいてCa2+動態の異常を誘導することが示された。
【０１０３】
［実施例２］
サルコリピン（SLN）、ホスホランバン、ミオレグリン（MLN）及びDWORFがSERCA1及び2の調節に役割を果たすことが知られていたため（D. M. Anderson et al., Cell. 160, 595-606 (2015)；B. R. Nelson et al., Science 351, 271-275 (2016)）、これらのアイソフォームの発現レベルをin vivoで調べた。
【０１０４】
ウエスタンブロット分析は、以前に記載されている通りに行った（N. Ito, et al., Nat. Med. 19, 101-6 (2013)）。TA筋からの10μgのタンパク質のサンプルをMini-PROTEAN TGXプレキャストゲル（BIO-RAD）にロードし、ゲル電気泳動を行った。5mA/mm2で1時間の半乾燥ブロッティングによりサンプルをimmobilon PVDF膜（Millipore）に移した。サルコリピンに対するポリクローナルウサギ抗体（Millipore)）と共に膜を4℃で一晩インキュベートした。抗αチューブリン（SIGMA）及び抗GAPDH（Santa Cruz）をローディング対照として使用した。バンドの強度はImage Jソフトウエアを用いて解析した。
【０１０５】
また、mRNAの発現レベルを調べるため、総RNAをTRIzol試薬（Life Technologies）を用いて単離した。RT-PCRのために、第一鎖cDNAをQuantiTect逆転写キット（Qiagen）を用いて合成した。サルコリピンのトランスジーンの発現レベルは、MyiQシングルカラーシステム（Bio-Rad）においてSYBR Premix Ex TaqII（Takara）を用いて定量RT-PCR（qRT-PCR）により評価した。qRT-PCRのためのプライマー配列は以下の通りである：サルコリピンのフォーワードプライマー（5’-GGTCCTTGGTAGCCTGAGTG-3’：配列番号3）及びリバースプライマー（5’-CGGTGATGAGGACAACTGTG-3’：配列番号4）。遺伝子発現レベルは18S rRNAに対して正規化した。
【０１０６】
その結果、Tg/mdxマウスにおけるSERCA1及び2の発現レベルはWTマウス及びmdxマウスに類似であった（データは示さず）。しかし、mdxマウスにおけるサルコリピン（SLN）のタンパク質及びmRNAレベルは、WTマウス及びTg/mdxマウスにおいてそれぞれ20倍及び6倍であった（図2のA及びB）。さらに、TM/nNOS KOマウス及びmdx/nNOS KOマウスのSLN発現レベルはTg/mdxマウス及びmdxマウスと比較して有意に低減した（図2のA）。これらの結果は、nNOSが産生するNOが部分的にSLN発現を調節することを示唆しうる。しかしながら、ホスホランバン、MLN及びDWORFは変化しない発現レベルを示した（データは示さず）。Olsonらの研究グループは、非コードRNAによりコードされるペプチドMLN及びDWORFは、SERCA活性の活性化又は阻害による心筋及び骨格筋生理学の重要な調節因子であることを示している（Anderson et al., (2015)前掲；Nelson et al., (2016)前掲）。しかしながら、ジストロフィー筋においてのみSERCAのSLN媒介阻害が観察された。したがって、SLNはジストロフィー筋の重要な調節因子であると考えられ、DMD/BMDにおけるようなジストロフィー表現型を改善するための手段を提供する。
【０１０７】
以上から、mdxにおいてSERCA機能を抑制する分子としてサルコリピン（SLN）を同定した。SLNはSERCA機能を抑制的に制御することが知られており、その発現はmdxで野生型、Tg/mdxと比べて有意に高い（図2のA）。したがって、サルコリピンの過剰発現は、SERCA機能の低下をもたらすため、重症度の高い筋ジストロフィーの原因となる可能性がある。
【０１０８】
［実施例３］
ニトロシル化RyR1機能がmdxマウスにおけるSERCAの機能的回復によりレスキューされるかどうかを調べるため、siRNAに基づくSLNノックダウンを利用してサルコリピン（SLN）を阻害した。
【０１０９】
最初に、サルコリピンのsiRNAを調製した。マウスサルコリピンcDNA（配列番号5及び6、それぞれエキソン1及び2）の配列をもとに、配列番号6の208〜226番の塩基を標的とするsiRNA#2、及び配列番号6の140〜158番の塩基を標的とするsiRNA#3を設計し、製造業者（SIGMA）の推奨に従って調製した。具体的な配列は以下の通りである：
siRNA#2： 5’-CUUCCAAUGCUCUAUUGUCTT-3’（配列番号7）
5’-GACAAUAGAGCAUUGGAAGTT-3’（配列番号8）
siRNA#3： 5’-CUCGUGAGGUCCUACCAAUTT-3’（配列番号9）
5’-AUUGGUAGGACCUCACGAGTT-3’（配列番号10）
【０１１０】
初代筋芽細胞に、陽性対照、陰性siRNA、及び2種のサルコリピンsiRNAを72時間かけてトランスフェクトした。siRNAに基づくサルコリピンのノックダウンを行ったmdx初代筋芽細胞におけるサルコリピン及びα-チューブリンのウエスタンブロッティングを実施した。その結果、SLN発現レベルは、SLN siRNAによるノックダウンにより80％まで低下した（図3のA）。
【０１１１】
次に、siRNAに基づくSLNノックダウンにより、mdxマウスから調製された初代筋芽細胞培養物においてカフェインに対するRyR1応答性が変化するかを調べた。実施例２と同様の手順で行った。その結果、mdx筋芽細胞では、2種のsiRNAによるサルコリピンの阻害によってカフェイン刺激Ca2+放出の振幅が増大した（図3のB）。このことは、mdx筋芽細胞におけるRyR1機能が陰性対照と比較してSLNノックアウトにより回復したことを示している。
【０１１２】
また、SLNノックダウン後の、SERCA機能、すなわち細胞質からSRへのSERCA媒介Ca2+再取り込みの機能を調べた。実施例２と同様の手順で行った。その結果、mdx筋芽細胞におけるSERCA機能もまた陰性対照と比較してSLNノックダウンにより改善した（図3のC）。
【０１１３】
以上の結果は、サルコリピンの阻害によって、SERCA活性の改善と共にSRのCa2+含量の上昇がmdxマウスにおけるRyR1の機能的回復に至ることを示唆している。
【０１１４】
［実施例４］
サルコリピンの阻害が筋ジストロフィーの表現型に影響を及ぼすか否かをさらに調べるため、サルコリピンノックアウト/ジストロフィン欠失（SLN KO/mdx）マウスを作出した。簡単に説明すると、SLN KOマウス（供与を受けたもの。Nakano H et al., 50: 337-45, 2011に記載）を前述のmdxマウス（本出願人により作出され自家繁殖されているもの）と交配してSLN KO/mdxマウスを作出した。
【０１１５】
作出したSLN KO/mdxマウスの握力及びトレッドミル運動は既報（Y. Aoki et al., Mol. Ther. 18, 1995-2005 (2010)）の通りに行った。このマウスでは、mdxマウスと比較して握力及びトレッドミル能力の有意な改善が観察された（図4のA及びB）。
【０１１６】
この実験結果により、SERCA機能の操作を利用して筋機能を改善できることが明らかとなった。したがって、SLNによるSERCA機能の調節は、DMDのための可能性のある治療法となりうる。
【０１１７】
結論として、サルコリピンを下方調節する又はSERCAに対するアフィニティを低下することにより筋ジストロフィーの治療法を開発することができる。また、サルコリピンの過剰な発現は、重症度の高い筋ジストロフィーのバイオマーカーとなる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号3〜4：人工（合成オリゴヌクレオチド）
配列番号7〜10：人工（siRNA、合成オリゴヌクレオチド）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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