(57)【要約】【課題】ＭＭＤを診断するための客観的で正確な低侵襲性試験の提供。【解決手段】モヤモヤ病（ＭＭＤ）を有する対象を特定するための方法であって、（ａ）対象から入手した第一の全血試料をビヒクル中に溶解された刺激物質に暴露すること；（ｂ）対象から入手した第二の全血試料を前記ビヒクル単独に暴露すること；（ｃ）白血球を前記第一および第二の全血試料から単離すること；（ｄ）所定のｍＲＮＡの発現を前記白血球から検出すること；（ｅ）前記第二の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現に対する、前記第一の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現の比である、前記一つまたは複数のｍＲＮＡの増加倍率を決定すること；及び（ｆ）前記ｍＲＮＡにおいて前記増加倍率が増加倍率の閾値を超えている場合に、前記対象がＭＭＤを有していると特定することを含む、前記方法。【選択図】図１
2017184739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モヤモヤ病（ＭＭＤ）を有する対象を特定するための方法であって、
（ａ）対象から入手した第一の全血試料をビヒクル中に溶解された刺激物質に暴露すること；
（ｂ）対象から入手した第二の全血試料を前記ビヒクル単独に暴露すること；
（ｃ）白血球を前記第一および第二の全血試料から単離すること；
（ｄ）ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＥＲ４、ＭＭＰ‐３、ＭＭＰ‐９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１β、ＭＣＰ‐１、およびＳＤＦ‐１αからなる群から選択される一つまたは複数のｍＲＮＡの発現を前記白血球から検出すること；
（ｅ）前記第二の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現に対する、前記第一の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現の比である、前記一つまたは複数のｍＲＮＡの増加倍率を決定すること；及び
（ｆ）前記ｍＲＮＡにおいて前記増加倍率が増加倍率の閾値を超えている場合に、前記対象がＭＭＤを有していると特定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第一および第二の全血試料が、アスピリンを最後に使用してから少なくとも２４時間経過した後の前記対象から入手するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記刺激物質がＩＬ‐１βであり、前記一つまたは複数のｍＲＮＡの発現の前記検出がＰＴＧＥＳおよびＰＴＧＥＲ４の発現を検出することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＴＧＥＳにおける前記閾値が２．５である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記特定が、前記ＰＴＧＥＳの増加倍率が２．５を超えており、前記ＰＴＧＥＲ４の増加倍率が１．２５を超えている場合に、前記対象がＭＭＤを有していると特定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記暴露が前記全血試料を３７℃で４時間インキュベートすることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記白血球の単離が、前記全血試料の一部を９６ウェルプレートのウェル内でフィルター材に通過させることを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、
（ｉ）前記白血球からｍＲＮＡを単離すること、
（ｉｉ）前記単離ｍＲＮＡを逆転写酵素と接触させることで相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製すること、及び
（ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡと、前記一つまたは複数のｍＲＮＡのうちの１つに対し特異的なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼとを接触させて増幅ＤＮＡを作製すること、
を含む方法によって、前記一つまたは複数のｍＲＮＡに対応する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を検出することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記センスプライマーが配列番号１〜１６からなる群から選択され、前記アンチセンスプライマーが配列番号１７〜３２からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体液を用いてモヤモヤ病（ＭＭＤ）を検出および／または治療するための方法に関する。いくつかの実施形態は、インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）で刺激された全血におけるｍＲＮＡプロファイルを評価する生体外検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
モヤモヤ病（ＭＭＤ）は進行性の閉塞性脳血管疾患である。閉鎖を補うために閉鎖血管周囲に発達する側副血管は、Ｘ線血管造影において、「ひと吹きの煙」（日本語で「もやもや」）のように見える。側副血管は脆く、出血、動脈瘤、および血栓症を起こし易い。ＭＭＤ患者は脳卒中のリスクが高い。ＭＭＤの診断は主に画像解析によって行われ、現在は血液検査が利用できない。
【０００３】
モヤモヤ病（ＭＭＤ）は小児および成人の両方に発症する進行性の脳血管疾患である。診断は主に、従来の血管造影法および磁気共鳴画像法を含む画像解析によって行われる。ＲＮＦ２１３遺伝子におけるｒｓ１１２７３５４３１変異体（ｐ．Ｒ４８１０Ｋ）の遺伝子型同定は診断を補助することが知られているが（非特許文献１）、前記遺伝子の浸透度は不完全であり、非東アジア人集団には適用することができない。ＭＭＤに特有な血清サイトカインプロファイルが報告されているが、診断に使用可能であるかどうかは明らかでない。ＭＭＤ患者において、インターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）刺激に応答した平滑筋細胞からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）放出が上方制御されていたことが以前に報告された（非特許文献２）。過剰なＰＧＥ２は血管透過性を増加させ、血管緊張を低減させ得るため、ＭＭＤにおける内膜肥厚の発達を誘導および促進し得る、増殖因子およびサイトカインを含む血液成分への血管の暴露が促進されると推測される。モヤモヤ血管はＰＧＥ２およびＩＬ‐１βによる血管内皮細胞増殖因子の誘導と関連し得る。発現上昇したＩＬ‐１β誘導性ＰＧＥ２は、ＭＭＤの病状を監視するのに使用することができるが、通例の診断法とするには、平滑筋細胞培養物の入手は侵襲的な外科的処置を必要とし、細胞培養は手間がかかり、多大な時間を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Morito D, Nishikawa K, Hoseki J, Kitamura A, Kotani Y, Kiso K, Kinjo M, Fujiyoshi Y, Nagata K.Moyamoya disease-associated protein mysterin/RNF213 is a novel AAA+ ATPase, which dynamically changes its oligomeric state.Sci Rep. 2014;4:4442
【非特許文献２】Yamamoto M, Aoyagi M, Fukai N, Y. Increase in Prostaglandin E2 Production by Interleukin-1β in Arterial Smooth Muscle Cells Derived From Patients With Moyamoya Disease. Circulation. 1999;85:912
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＭＭＤを診断するための客観的で正確な低侵襲性試験を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。
〔１〕
モヤモヤ病（ＭＭＤ）を有する対象を特定するための方法であって、
（ａ）対象から入手した第一の全血試料をビヒクル中に溶解された刺激物質に暴露すること；
（ｂ）対象から入手した第二の全血試料を前記ビヒクル単独に暴露すること；
（ｃ）白血球を前記第一および第二の全血試料から単離すること；
（ｄ）ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＥＲ４、ＭＭＰ‐３、ＭＭＰ‐９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１β、ＭＣＰ‐１、およびＳＤＦ‐１αからなる群から選択される一つまたは複数のｍＲＮＡの発現を前記白血球から検出すること；
（ｅ）前記第二の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現に対する、前記第一の全血試料由来の白血球中の一つまたは複数のｍＲＮＡの発現の比である、前記一つまたは複数のｍＲＮＡの増加倍率を決定すること；及び
（ｆ）前記ｍＲＮＡにおいて前記増加倍率が増加倍率の閾値を超えている場合に、前記対象がＭＭＤを有していると特定すること
を含む、前記方法。
〔２〕
前記第一および第二の全血試料が、アスピリンを最後に使用してから少なくとも２４時間経過した後の前記対象から入手するものである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記刺激物質がＩＬ‐１βであり、前記一つまたは複数のｍＲＮＡの発現の前記検出がＰＴＧＥＳおよびＰＴＧＥＲ４の発現を検出することを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記ＰＴＧＥＳにおける前記閾値が２．５である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
前記特定が、前記ＰＴＧＥＳの増加倍率が２．５を超えており、前記ＰＴＧＥＲ４の増加倍率が１．２５を超えている場合に、前記対象がＭＭＤを有していると特定することを含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記暴露が前記全血試料を３７℃で４時間インキュベートすることを含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
前記白血球の単離が、前記全血試料の一部を９６ウェルプレートのウェル内でフィルター材に通過させることを含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記検出が、
（ｉ）前記白血球からｍＲＮＡを単離すること、
（ｉｉ）前記単離ｍＲＮＡを逆転写酵素と接触させることで相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製すること、及び
（ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡと、前記一つまたは複数のｍＲＮＡのうちの１つに対し特異的なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼとを接触させて増幅ＤＮＡを作製すること、
を含む方法によって、前記一つまたは複数のｍＲＮＡに対応する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を検出することを含む、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
前記センスプライマーが配列番号１〜１６からなる群から選択され、前記アンチセンスプライマーが配列番号１７〜３２からなる群から選択される、〔８〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＭＭＤを診断するための客観的で正確な低侵襲性試験を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＩＬ‐１βに応答したプロスタグランジンＥシンターゼｍＲＮＡの増加倍率（ＦＩ）は、対照個体よりもモヤモヤ病患者においてより高いことを示す。Ａ〜Ｈ：ヘパリン添加全血（ＷＢ）をインターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）、リポ多糖（ＬＰＳ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。ＬＰＳまたはＩＬ‐１βと共に４時間インキュベートした後のβ‐アクチン（Ａ、Ｂ）、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６；Ｃ、Ｄ）並びにプロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＴＧＥＳ；Ｅ、Ｆ）およびＰＴＧＥ受容体４（ＰＴＧＥＲ４；Ｇ、Ｈ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の増加倍率（ＦＩ）を、ＰＢＳを参照して決定した。これらの値をモヤモヤ病患者（ＭＭＤ）と対照個体との間で、ウエルチ補正を使用する対応のないｔ検定を用いて比較した。有意差は、ＩＬ‐１β刺激によるＰＴＧＥＳおよびＰＴＧＥＲ４  ｍＲＮＡのＦＩにおいてのみ観察された。水平バーは平均値を示す。
【図２】ＩＬ‐１βによるＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡの年齢および性別に特異的なＦＩを示す。Ａ：ＩＬ‐１β刺激応答性のＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩが患者年齢に応じて示される。全ての対照対象は点線で示されるように２．５未満のＦＩを有する。Ｂ：ＩＬ‐１β刺激応答性のＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩが男女間で比較される。対照では差異は無いが、ＭＭＤ患者においては女性が男性よりも高いＦＩを示した。
【図３】いかなる薬物治療も行わない試験集団間のＰＴＧＥＳおよびＰＴＧＥＲ４のＩＬ‐１β誘導性ｍＲＮＡのＦＩを示す。試験集団をいかなる薬物治療も行っていない集団に限定した場合、ＭＭＤ患者は、ＰＴＧＥＳについては２．５超の、ＰＴＧＥＲ４については１．２５超のカットオフＦＩ値を介して区別することができる。
【図４】ＭＭＤ患者および対照対象の定常状態ｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＰＧＥ２放出の上方制御が平滑筋細胞に特有でない可能性があり、末梢単核細胞においても観察される可能性があることが、本開示により考慮される。血管平滑筋細胞による過剰なＰＧＥ２産生はＭＭＤにおける内膜肥厚の発達を説明し得るが、この知見にはＭＭＤの低侵襲診断検査には限定的な用途しかない。活性化マクロファージがＩＬ‐１βの供給源になり得るとして、本開示により、いくつかの実施形態において、ＭＭＤを診断するための手段としての血液由来白血球の使用が考慮される。血液由来白血球は、全血由来の単核細胞がマイクロストリップにおいて適切な薬剤で刺激され、４時間以内に薬剤誘導性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が定量化される、生体外負荷試験において使用されている。全血の使用および短いインキュベーション期間は、生体外と見なされ得る。本開示が提示する実施形態は、全血から単離された白血球のｍＲＮＡプロファイルの同様の解析方法を使用する。しかし、全血試料を用いてＩＬ‐１β応答性のＰＧＥ２の発現上昇をモニターし、ＭＭＤに特異的なバイオマーカーを特定することが可能な方法が、本開示により特定される。ＰＧＥ２はタンパク質ではなく脂質化合物であるため、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＴＧＥＳ）およびＰＴＧＥ受容体４（ＰＴＧＥＲ４）のｍＲＮＡが定量化された。
【００１０】
ＭＭＤ診断の現行法は、脳血管撮影法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および／または磁気共鳴血管造影法（ＭＲＡ）等の画像診断法に依存している。このようなイメージング手順は実行するのに高浸潤性および／または高コストであり得る。さらに、いくつかの状態はＭＭＤに非常に似たイメージング外見をもたらし得る。例えば、ＭＭＤは、動脈硬化症、脳腫瘍、および自己免疫疾患等の他の病態生理学的状態と似たように見え得る。
【００１１】
本明細書で開示される方法および系はＭＭＤの生体外検査に関する。本開示は、いくつかの実施形態では、ＭＭＤを検出するための、および／または、ＭＭＤを有する対象を治
療（もしくは進行中の治療をモニター）するための、生体液（例えば全血（ＷＢ））の使用に関する。いくつかの実施形態において、生物試料（例えば、全血）は、患者から入手され、サイトカイン（例えば、ＩＬ‐１β）で、または内毒素（例えば、ＬＰＳ）で刺激される。実施形態に応じて、様々な免疫性／炎症性ｍＲＮＡ、血液細胞由来ｍＲＮＡ、ケモカインｍＲＮＡ、および種々のｍＲＮＡが評価される（例えば、一部の例では適切な対照と比較して、発現レベルが評価される）。いくつかの実施形態では、患者から全血試料を解析用に入手する前に、患者の薬物使用（例えば、アスピリン、シロスタゾール）が制限され得る。
【００１２】
従って、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、サイトカインで刺激された生体液のｍＲＮＡ発現プロファイルを解析することにより、ＭＭＤを検出、診断、スクリーニングまたはモニタリングするための有望なバイオマーカーを特定することに関する。生体液としては、限定はされないが、全血、血漿、血清、唾液、母乳、尿等が挙げられる。全血としては、抗凝固剤を添加した全血が好ましく、例えば、ヘパリン添加全血、ＥＤＴＡ添加全血、クエン酸添加全血、シュウ酸添加全血、フッ化ナトリウム添加全血、ＡＣＤ（Acid Citrate Dextrose Solution）添加全血などが挙げられる。生体液の刺激に使用される刺激物質としては、限定はされないが、ＩＬ‐１β、ＬＰＳ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、ザイモサン等が挙げられる。種々のマーカーの発現が、刺激された生体液から評価される。例えば、マーカーとしては、限定はされないが、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＥＲ４等の白血球由来遺伝子；α１‐アンチトリプシン（ＡＡＴ）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ‐３）、ＭＭＰ‐９、組織メタロプロテアーゼ阻害物質‐１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２等の酵素遺伝子；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ‐β）等の増殖因子遺伝子；血管細胞接着分子‐１（ＶＣＡＭ‐１）、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１）、Ｅ‐セレクチン等の接着分子遺伝子；細胞内レチノイン酸結合タンパク質‐１（ＣＲＡＢＰ‐１）、単球走化性タンパク質‐１（ＭＣＰ‐１）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、ストロマ細胞由来因子‐１（ＳＤＦ‐１）等の等の炎症性および／または凝固因子遺伝子が挙げられる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、コンピュータ化された方法を用いて、前記段階のうちの一つまたは複数が完了される。いくつかの実施形態では、コンピュータ化された方法は、単離されたＲＮＡおよび／または作製されたｃＤＮＡ、ポリメラーゼおよび遺伝子特異的プライマーを含む反応混合物を熱サイクルに暴露することを含む。いくつかの実施形態では、熱サイクルは、温度時間、および反応混合物が暴露されるサイクル数を制御するように構成されたコンピュータによって作られる。他の実施形態では、コンピュータは反応混合物に対する時間のみまたは温度のみを制御し、個々が１つまたは複数の追加の変数を制御する。いくつかの実施形態では、対象がＭＭＤに罹患しているかどうかを特定するために、検出段階からデータを受信し、バイオマーカーに必要とされる熱サイクル数を検知して、所定の増幅閾値を達成するプログラムを実行するよう構成されたコンピュータが使用される。さらに別の実施形態では、試験および検出過程の全体が自動化される。
【００１４】
例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、完全に自動化された方法、例えば、コンピュータプロセッサおよび関連する自動機械によって制御される方法によって単離される。一実施形態では、全血試料等の生物試料は、採取され、試料処理ユニット内に配置された受入容器内に添加される。使用者により、試料のＩＤ、試料の量、および／または特定の患者特徴に関する情報が、データ入力受信機に入力される。いくつかの実施形態では、使用者はグラフィカルユーザーインターフェースを用いてデータを入力する。他の実施形態では、データ入力は自動化される（例えば、バーコード、ＱＲコード、または他の図式識別子による入力）。次に、使用者によりＲＮＡ単離プロトコルが実行され得、そのため
に、コンピュータは、白血球等の生物学的成分を単離した後に白血球を処理してＲＮＡを放出させるために、アルゴリズムにアクセスし、関連機能を実行して試料を処理するよう構成される。さらなる実施形態では、コンピュータにより実行されるプログラムが、単離ＲＮＡの量を定量化および／または純度を評価し得る。そのような実施形態では、量および／または純度は最小閾値を超えているべきであり、ＲＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するために、自動化された様式でさらに処理され得る。次に、ｃＤＮＡが、例えば、オリゴｄＴ分子にポリＡ  ＲＮＡ尾部を結合させた後にＲＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる等の確立された方法を用いて、作製され得る。他の実施形態では、量および／または純度が最小閾値を超えていない場合、コンピュータにより実行されるプログラムは、追加の生物試料を供給するよう使用者を促し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＭＭＤを診断する方法が提供され、前記方法は、（Ｉ）対象から全血試料を入手し、（ＩＩ）全血試料をＩＬ‐１βと共にインキュベートし、（ＩＩＩ）全血試料から白血球を単離し、（ＩＶ）ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＥＲ４、ＭＭＰ‐３、ＭＭＰ‐９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１β、ＭＣＰ‐１、およびＳＤＦ‐１αから成るマーカー群からの少なくとも１つのＭＭＤのマーカーの発現を、（ｉ）ＲＮＡを単離白血球から放出させ、（ｉｉ）放出されたＲＮＡを逆転写酵素と接触させることで相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、（ｉｉｉ）増幅されたＤＮＡを作製するために、前記ｃＤＮＡをＭＭＤの各マーカーに特異的なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼと接触させることを含む方法によって検出し；（Ｖ）対象のＭＭＤの状態を、（ａ）ＩＬ‐１β誘導性ＰＴＧＥＳが、ＭＭＤを有さない対照対象のレベルからの増加が２．５倍超であるレベルで検出された場合に、ＭＭＤを有するであろうと特定する、または、（ｂ）ＩＬ‐１β誘導性ＰＴＧＥＳが、ＭＭＤを有さない対照対象のレベルからの増加が２．５倍未満であるレベルで検出された場合に、ＭＭＤを有さないであろうと特定することを含む。いくつかの実施形態では、対象のＭＭＤの状態の特定は、対象を、（ａ）ＩＬ‐１β誘導性ＰＴＧＥＲ４が、ＭＭＤを有さない対照対象のレベルからの増加が１．２５倍超であるレベルで検出された場合に、ＭＭＤを有するであろうと特定する、または、（ｂ）ＩＬ‐１β誘導性ＰＴＧＥＲ４が、ＭＭＤを有さない対照対象のレベルからの増加が１．２５倍未満であるレベルで検出された場合に、ＭＭＤを有さないであろうと特定することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、患者の全血試料由来の白血球から単離されたＲＮＡを鋳型として用いて、例えば逆転写酵素の使用を通じて、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が作製される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅される。他の実施形態では、核酸およびＲＮＡの増幅はまた、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）すなわち核酸のプライマー依存的な連続増幅、またはリガーゼ連鎖反応等の、あらゆる適切な増幅技術によって達成され得る。他の方法を用いて核酸を定量化してもよく、例えば、ノーザンブロット解析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＮＡ配列決定、ＲＴ‐ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅法、分岐ＤＮＡ増幅、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ＣｈＩＰシーケンス、およびＤＮＡまたはＲＮＡマイクロアレイ解析等が挙げられる。
【００１７】
全血試料から白血球を捕捉し、後の解析用の試料を調製するためのプロセスの一実施形態の一般的方法を以下に記載する。簡潔に記載すると、全血試料が対象から入手される。いくつかの実施形態では、全血試料は、アスピリンを最後に使用してから、少なくとも、例えば２４時間、好ましくは３日間、より好ましくは１週間、さらに好ましくは１ヵ月、よりさらに好ましくは６ヵ月経過した後の対象から入手される。全血試料が白血球捕捉デバイス（以下により詳細に記載）に充填され、遠心分離される（他の実施形態では他の力が適用され得る）。遠心分離により全血が白血球捕捉膜を通過し、白血球が膜上に保持さ
れ、血液の残り（ここでは、白血球枯渇）は遠心管の底部（実施形態によって受入容器とも称される）に移る。その後、捕捉デバイスの内部部分が分離され、フィルター含有部分が複数ウェルマイクロプレート（例えば、９６ウェルプレート）と連絡して配置される。捕捉された白血球からＲＮＡを放出させるために、溶解緩衝液が各々のベシクル捕捉部分（例えば、各部分はマイクロプレートの個々のウェル内に存在する）に添加される。その後、ＲＮＡは、後の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の作製およびＭＭＤ関連マーカーについてのマーカー発現解析を可能にするために、例えば固定化されたオリゴｄＴを含むプレートに移される。いくつかの実施形態で使用されるＰＣＲ反応についてのさらなる詳細は、参照によってその全体が本明細書に援用される、米国特許出願第８，１０１，３４４号にも見出される。ＰＣＲ反応の完了後、一つまたは複数のマーカーのｍＲＮＡ（ＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡの検出量で表される）が定量化される。ある実施形態では、定量化は、ＭＭＤマーカーをコードするｍＲＮＡの量を基準値と比較することにより算出される。いくつかの実施形態では、基準値は健常な非疾患患者において見られるｍＲＮＡの量となる。いくつかの実施形態では、マーカーのｍＲＮＡ発現における増加倍率（ＦＩ）は、刺激物質（例えば、ＩＬ‐１β）で刺激された全血中のマーカーのｍＲＮＡ発現を、ビヒクル対照と共にインキュベートされた全血中のマーカーの発現と比較することにより、定量化される。いくつかの実施形態では、ＭＭＤ状態評価中の試験対象のマーカーのＦＩは、ＭＭＤを有さないことが知られている対象から成る対照集団におけるマーカーのＦＩと比較される。他の実施形態では、基準値はハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。そのようなある特定の実施形態では、β‐アクチン、または他の適切なハウスキーピング遺伝子が基準値として使用される。当該技術分野において周知の多数の他のハウスキーピング遺伝子も、基準値として使用され得る。他の実施形態では、最終的な比較が、非疾患（対照）試料由来の同一マーカーと比較した、疾患を有する患者由来のマーカーの発現レベルとなるように、ハウスキーピング遺伝子は補正因子として使用される。いくつかの実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は、上記したもの等の、組織特異的な遺伝子またはマーカーである。さらに他の実施形態では、マーカーの定量化が絶対数で表されるように、基準値はゼロである。いくつかの実施形態では、疾患を有する患者由来の一つまたは複数のマーカーの発現を、疾患を有さない人由来の一つまたは複数の他のマーカーと比較した比が作成される。
【実施例】
【００１８】
いくつかの実施形態において、アッセイ手順は３つの主な段階から成る：（ｉ）白血球刺激、単離およびフィルタープレート上での溶解；（ｉｉ）ｍＲＮＡ単離、リバースプライマーハイブリダイゼーション、およびオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートにおけるｃＤＮＡ合成；及び（ｃ）リアルタイム定量ＰＣＲ。
【００１９】
実施例１
全血刺激
治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認および適切なインフォームドコンセントの後、ＭＭＤ患者および対照対象からヘパリン添加全血試料を得た。ヘパリン添加全血を、ビヒクル中に溶解したＩＬ‐１βを含有する、またはビヒクル中に溶解したＬＰＳを含有する、またはビヒクル単独（対照）を含有する８ウェルストリップマイクロチューブ内でインキュベートした。ヘパリン添加全血試料をマイクロチューブに添加するに先立ち、１．２μＬの５０×濃度のＩＬ‐１β（１０μｇ／ｍｌ、３ウェル）、またはＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ、２ウェル）、またはＰＢＳ（３ウェル）をマイクロチューブに添加することにより、８ウェルストリップマイクロチューブに血液を受け入れる準備をした。１．２μＬのＰＢＳまたは濃縮ＩＬ‐１βまたはＬＰＳを含有するマイクロチューブは、使用まで−２０℃で保存した。６０μｌのヘパリン添加全血試料を、１．２μＬの薬剤またはビヒクル対照を含有する各マイクロチューブに３連で添加した。薬剤はＩＬ‐１β（１０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）であった。ビヒクル対照はＰＢＳであった。全血試料
を、マイクロチューブ内で、薬剤またはビヒクル対照と共に３７℃で４時間インキュベートした。各々の薬剤または対照処理の後、血液試料を−８０℃で凍結保存した。
【００２０】
白血球単離
カスタムフィルタープレートを用いて全血試料から白血球を単離した。カスタムフィルタープレートは、ウェル内フィルター、および液体をウェルの底部から出させるウェル底部の穴を有する、９６ウェルカスタムプレートである。フィルタープレートを収集プレート上に配置し、１５０μＬの５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を添加して、フィルター膜を濡らした。フィルタープレートを１２０ｇ、４℃で２分間遠心してＴｒｉｓを除去した。５０μＬの解凍血液試料を９６ウェルカスタムフィルタープレートに添加して、白血球をトラップした。３００μＬのＰＢＳをウェルに添加し、フィルタープレートを２０００ｇ、４℃で５分間遠心することによりウェルを１回洗浄して、食塩水を除去した。遺伝子特異的リバースプライマーの混合物を含有する６０μＬのストック溶解緩衝液をフィルタープレートに添加し、ｍＲＮＡを精製した。溶解緩衝液は、５ｇ／ＬのＮ‐ラウロイルザルコシン、４×標準クエン酸添加生理食塩水、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＬ／ＬのＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ‐６３０（ＮＰ‐４０の代わり）、１．７９ｍｏｌ／Ｌのチオシアン酸グアニジンを含有しており、１０ｍＬ／Ｌの２‐メルカプトエタノール、０．５ｇ／ＬのプロテアーゼＫ、０．１ｇ／Ｌのサケ精子ＤＮＡを追加し、０．１ｇ／Ｌの大腸菌（Escherichia coli）ｔＲＮＡ特異的リバースプライマー（表１）を溶解緩衝液に添加した（５ｎｍｏｌ／Ｌ）。プレートを溶解緩衝液およびプライマーと共に３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート上に配置し、２０００ｇ、４℃で５分間遠心した。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを、１００μＬの単純溶解緩衝液で３回、次に、１５０μＬの洗浄緩衝液（０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）で３回、４℃で洗浄した。１×逆転写緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｎＬ／μＬのＴｗｅｅｎ２０）、１．２５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、および８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素を含有する３０μＬの緩衝液を添加し、３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを各ウェル内で直接合成した。それぞれの３０μＬ反応物から、４μＬのｃＤＮＡを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、５μＬのＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ混合物および１μＬのオリゴヌクレオチド混合物（各５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（表１）、並びに１〜２μＭのＴａｑＭａｎプローブ）を添加した。各遺伝子を増幅し、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲによって個々に測定した。ＰＣＲは、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６０℃で１分間を４５サイクルで実行した。サイクル閾値（cycle threshold）（Ｃｔ）をソフトウェア（ＳＤＳ、アプライドバイオシステムズ社）によって自動で決定した。結果の確証をたてるために、融解曲線を従来通りに分析し、単一ピークを確認した。
【００２１】
【表１】
2017184739.tif 000003
【００２２】
ｍＲＮＡ発現の増加倍率
ＬＰＳまたはＩＬ‐１βに応答したＰＴＧＥＳおよびＰＴＧＥＲ４並びにβ‐アクチン（陰性対照）およびＩＬ‐６（陽性対照）の増加倍率（ＦＩ）を、ＭＭＤと対照との間で比較した（図１）。ＩＬ‐１β刺激に応答したｍＲＮＡ発現の増加倍率（ＦＩ）は以下の式を用いて算出した：
【００２３】
ＦＩ＝２＾（（ＩＬ‐１βのＣｔ）−（ＰＢＳのＣｔ））
【００２４】
ＬＰＳ刺激に応答したｍＲＮＡ発現の増加倍率（ＦＩ）は以下の式を用いて算出した：
【００２５】
ＦＩ＝２＾（（ＬＰＳのＣｔ）−（ＰＢＳのＣｔ））
【００２６】
統計解析
１３人のＭＭＤ患者および８人の対照対象から得られたヘパリン添加全血試料を、上記のように、処理し、ｍＲＮＡ発現レベルについて解析した。ＭＭＤ患者と対照対象との間のｍＲＮＡ発現における差異を、カテゴリ変数についてはフィッシャーの正確検定を用いて、連続変数については対応のないｔ検定を用いて、解析した（プリズムソフトウェア（Prism Software）および統計ソフトウェアＲ）。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。
【００２７】
ＬＰＳおよびＩＬ‐１βのどちらも、ＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現を増加させなかった（図１Ａ、図１Ｂ）。ＬＰＳはＩＬ‐６（図１Ｃ）およびＰＴＧＥＳ（図１Ｅ）の両方のｍＲＮＡレベルを増加させた。このことは、実験時に血液が機能的であったことを示している。しかし、ＬＰＳ誘導性ＩＬ‐６のｍＲＮＡレベルはＭＭＤ患者と対照対象との間で同様であった（図１Ｃ）。一方、ＩＬ‐１β誘導性のＩＬ‐６（図１Ｄ）またはＰＴＧＥＳ（
図１Ｆ）のｍＲＮＡのＦＩは、対照よりもＭＭＤ患者においてより高かった。ＩＬ‐６  ｍＲＮＡにおける差異は統計的に有意ではなかったが、ＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡにおける差異は統計的に有意であった（図１Ｆ、ｐ＝０．０３２）。ＩＬ‐１β誘導性ＰＴＧＥＲ４のＦＩも、対照よりもＭＭＤ患者において有意により高かった（図１Ｈ、ｐ＝０．０１３）。ＬＰＳ誘導性ＰＴＧＥＲ４のＦＩは対照と比較してＭＭＤにおいて上昇していたが、この差異は統計的に有意ではなかった。ＩＬ‐１β刺激によるＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩに対し２．５のカットオフ値を用いたところ、１３中８人の患者がＰＴＧＥＳ誘導について陽性であったが、一方で、対照個体はいずれもこの判定基準を満たさず（フィッシャーの正確検定によりｐ＝０．００６８）、このことは、これがＭＭＤの有望なバイオマーカーであることを示している。
【００２８】
性別特異的および年齢特異的なＩＬ‐１β刺激に対するＰＴＧＥＳ応答を図２に示す。ＰＴＧＥＳ応答は、対照においては性別依存的でも年齢依存的でもなかったが、一方で、患者においては男性よりも女性においてより高かった（ｐ＝０．０４３）。患者の臨床的特徴を、２．５倍超のＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡの増加を示した患者と、２．５倍未満を示した患者との間で比較した（表２）。低ＰＴＧＥＳ応答を有した後者の群において、アスピリンの使用が有意により頻繁に見られた（ｐ＝０．０３１）。低ＰＴＧＥＳ応答を有した全ての患者がアスピリンまたはシロスタゾールを摂取しており、一方、高ＰＴＧＥＳ応答を有した患者は８人中１人しかアスピリンまたはシロスタゾールを摂取していなかった。高ＰＴＧＥＳ応答を有した患者の８人中３人において脳卒中の再発が見られたが、一方で、低ＰＴＧＥＳ応答を有した患者はいずれも再発を起こさなかった。これらの発見は、ＰＴＧＥＳ応答がＭＭＤの治療状態および病状を反映し得ることを示している。
【００２９】
【表２】
2017184739.tif 000004
【００３０】
アスピリン等の薬物がこれらのｍＲＮＡ（ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＥＲ４）のＦＩに影響を与え得ることから、あらゆる薬物を摂取した患者を除外した後に、データを解析した。５人のＭＭＤ患者および３人の対照が解析に含まれた。図３に示すように、全てのＭＭＤ患
者がＰＴＧＥＲ４において１．２５超のＦＩ、およびＰＴＧＥＳにおいて２．５超のＦＩを示し、一方、対照はいずれも判定基準を満たさなかった。ＭＭＤ患者および対照対象の定常状態のｍＲＮＡ発現レベルを図４に示す。
【００３１】
本明細書で開示される方法は、ＭＭＤを診断、予後判定、およびモニタリングするための生体外検査を提供する。ＩＬ‐１β応答性のＰＧＥ２産生は、ＭＭＤ患者において、頭蓋血管平滑筋細胞でだけではなく、末梢血細胞においても、上方制御されていると思われる。これは、末梢血における血管内皮前駆細胞または平滑筋前駆細胞がＭＭＤの発症に関与することを示唆する最新の知見と一致している。ＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩは対照よりも患者において有意により高かった。ＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩに対し２．５のカットオフ値を用いたところ、１３人中８人の患者がこのバイオマーカーについて陽性であり、その他の５人の患者は陰性であった。興味深いことに、このバイオマーカーについて陰性であった患者の全てが抗炎症／抗血小板医薬を摂取しており：４人の患者がアスピリンを摂取しており、１人がシロスタゾールを摂取していた。一方、このバイオマーカーについて陽性であった患者は８人中１人のみがアスピリンを摂取していた。アスピリンおよびシロスタゾールは共にＰＧＥ２産生を抑制することが知られていることから、これらの抗炎症剤はＩＬ‐１β誘導性のＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡ応答を抑制し得る。従って、ＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡのＦＩは、薬剤応答をモニターする可能性を有し、ＭＭＤに対する治療薬のスクリーニングに使用され得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、アスピリンを最後に使用してから、例えば１週間経過した後の患者から血液試料を入手することを含み得る。他の薬剤もＰＴＧＥＳ応答に影響を与え得るという可能性を考慮して、本明細書では、あらゆる薬物を摂取した個体を排除することにより、層別解析を行った。その結果、２．５のカットオフ値を用いて、ＭＭＤ患者および対照個体を完全に区別することができた。ＰＴＧＥＲ４  ｍＲＮＡを解析したところ、１．２５のカットオフ値で患者を区別することが分かり、このことは、これらのバイオマーカーがＭＭＤの診断に使用できることを示唆している。
【００３２】
本開示において、性別は症例および対照の間で一致していなかったが、対照における男性と女性との間ではＰＴＧＥＳ  ｍＲＮＡ応答に有意差はなかった。従って、性別が本明細書で開示された結論に影響を及ぼす可能性は低い。一方、女性患者は男性患者よりも高いＰＴＧＥＳ応答を示す。この機構は明らかではないが、この所見はＭＭＤにおいて女性が優勢であることを説明し得る。この試験は試験集団の数が少なく、後向き研究（retrospective study）の性質を有するため、より大きな集団を用いた前向き研究（prospective
study）が、これらのバイオマーカーが確かにＭＭＤ患者を区別し得るかどうか、および、このようなバイオマーカーまたは他のバイオマーカーが患者における再発または患者の予後を予測し得るかどうかを調べるために有効なものとなり得る。バイオマーカーが抗炎症剤の効果をモニターし得るかどうかは、さらなる研究によって明らかとなるであろう。
【００３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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