(57)【要約】【課題】パラゴムノキの品種を簡便且つ高精度に判別することができる、パラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キットの提供。【解決手段】本発明は、パラゴムノキ被検体のゲノムＤＮＡの一塩基多型を検出し解析することによって、該パラゴムノキ被検体の品種を判別することを特徴とする、パラゴムノキの品種判別方法を提供する。本発明は、また、増幅用プライマー対と一塩基伸長用プライマーとのプライマーセットを少なくとも１つ、又は、増幅用プライマー対と検出用プローブ対とのプライマープローブセットを少なくとも１つ含むことを特徴とする、パラゴムノキの品種判別用キットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラゴムノキ被検体の一塩基多型を検出し、解析することにより、該パラゴムノキ被検体の品種を判別することを特徴とする、パラゴムノキの品種判別方法。
【請求項２】
前記パラゴムノキ被検体の一塩基多型を、マスアレイ法を用いて検出する、請求項１に記載のパラゴムノキの品種判別方法。
【請求項３】
前記パラゴムノキ被検体の一塩基多型を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて検出する、請求項１に記載のパラゴムノキの品種判別方法。
【請求項４】
前記一塩基多型を、下記部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１つについて検出する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のパラゴムノキの品種判別方法：
配列番号１の２０１番目の塩基；
配列番号２の３０１番目の塩基；
配列番号３の２５１番目の塩基；
配列番号４の２０１番目の塩基；
配列番号５の３０１番目の塩基；
配列番号６の２０１番目の塩基；
配列番号７の１０１番目の塩基；
配列番号８の１０１番目の塩基；
配列番号９の１０１番目の塩基；
配列番号１０の１０１番目の塩基；
配列番号１１の１０１番目の塩基；
配列番号１２の１０１番目の塩基；
配列番号１３の１０１番目の塩基；及び
配列番号１４の１０１番目の塩基。
【請求項５】
前記一塩基多型を、下記（１）〜（６）に示すプライマーセットのうちの少なくとも１つを用いて検出する、請求項２に記載のパラゴムノキの品種判別方法：
（１）配列番号１５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（２）配列番号１８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（３）配列番号２１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（４）配列番号２４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（５）配列番号２７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（６）配列番号３０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット。
【請求項６】
前記一塩基多型を、下記（１）〜（９）に示すプライマープローブセットのうちの少なくとも１つを用いて検出する、請求項３に記載のパラゴムノキの品種判別方法：
（１）配列番号３３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（２）配列番号３７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（３）配列番号４１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（４）配列番号４５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（５）配列番号４９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（６）配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（７）配列番号５７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（８）配列番号６１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（９）配列番号６５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット。
【請求項７】
下記（１）〜（６）に示すプライマーセットのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、パラゴムノキの品種判別用キット：
（１）配列番号１５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（２）配列番号１８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（３）配列番号２１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（４）配列番号２４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（５）配列番号２７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（６）配列番号３０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット。
【請求項８】
下記（１）〜（９）に示すプライマープローブセットのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、パラゴムノキの品種判別用キット：
（１）配列番号３３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（２）配列番号３７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（３）配列番号４１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（４）配列番号４５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（５）配列番号４９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（６）配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（７）配列番号５７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（８）配列番号６１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（９）配列番号６５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）は、天然ゴムの原料として栽培される代表的なゴムノキである。従来、パラゴムノキの品種は、葉・樹皮・樹形などの形態で判別されていたが、実際に品種を判別し、決定するのに長期間要する。その上、このような判別法の習熟・熟練にも時間を要する。また、パラゴムノキの品種によっては外観で判別しにくい品種がある場合、品種判別において誤判定が生じる場合などがあった。
【０００３】
そこで、近年、植物においていくつかの遺伝子工学を応用した品種判別方法が開発されてきた。これらの方法では品種間での塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種判別を行っている。つまり、遺伝子上の客観的な特徴を指標とすることから、正確な品種判別が可能となる。既に多くの商業作物においてＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphisms）法、ＡＦＬＰ（Amplified Fragment Length Polymorphisms）法、マイクロサテライト法（例えば、特許文献１）などの遺伝子工学に基づく品種判別方法が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１６５３８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記品種判別方法には、判別に多量のＤＮＡを必要とする、判別操作が繁雑である、隣接する数塩基についての多型を検出対象とするため、劣化により断片化が高度に進んだＤＮＡでは判別精度が低下する、などの問題点があり得る。従って、パラゴムノキの品種を簡便且つ高精度に判別することができる、パラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キットが必要とされている。
【０００６】
そこで、本発明は、パラゴムノキの品種を簡便且つ高精度に判別することができる、パラゴムノキの品種判別方法及び品種判別用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法は、パラゴムノキ被検体の一塩基多型を検出して解析することにより、該パラゴムノキ被検体の品種を判別することを特徴とする。パラゴムノキ被検体における一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を検出することにより、パラゴムノキの品種を簡便且つ高精度に判別することができる。
【０００８】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法においては、マスアレイ法を用いて前記一塩基多型を検出することが好ましい。この構成により、一塩基多型を質量の違いとして検出することができる。
【０００９】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法において、リアルタイムＰＣＲ法を用いて前記一塩基多型を検出することが好ましい。この構成により、一塩基多型を蛍光波長の違い又は蛍光発光の有無及び強度差として検出することができる。
【００１０】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法においては、一塩基多型を、下記塩基からなる群より選択される少なくとも１つについて検出することが好ましい：
配列番号１の２０１番目の塩基；
配列番号２の３０１番目の塩基；
配列番号３の２５１番目の塩基；
配列番号４の２０１番目の塩基；
配列番号５の３０１番目の塩基；
配列番号６の２０１番目の塩基；
配列番号７の１０１番目の塩基；
配列番号８の１０１番目の塩基；
配列番号９の１０１番目の塩基；
配列番号１０の１０１番目の塩基；
配列番号１１の１０１番目の塩基；
配列番号１２の１０１番目の塩基；
配列番号１３の１０１番目の塩基；及び
配列番号１４の１０１番目の塩基。
この構成により、ＰＢ２６０、ＰＢ３３０、ＰＢ３４０、ＩＡＮ８７３、ＧＴ１、ＲＲＩＣ１００、ＰＲ１０７、ＰＢ２３５、及びＡＶＲＯＳ２０３７などのパラゴムノキの品種を好適に判別することができる。
【００１１】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法において、マスアレイ法を用いる場合、下記（１）〜（６）に示すプライマーセットのうちの少なくとも１つを用いて一塩基多型を検出することが好ましい：
（１）配列番号１５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（２）配列番号１８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（３）配列番号２１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（４）配列番号２４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（５）配列番号２７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（６）配列番号３０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット。
この構成により、マスアレイ法を用いて所定のＳＮＰを特異的に検出することができる。
【００１２】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法において、リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、下記（１）〜（９）に示すプライマープローブセットのうちの少なくとも１つを用いて一塩基多型を検出することが好ましい：
（１）配列番号３３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（２）配列番号３７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（３）配列番号４１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（４）配列番号４５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（５）配列番号４９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（６）配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（７）配列番号５７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（８）配列番号６１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（９）配列番号６５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット。
この構成により、リアルタイムＰＣＲ法にサイクリングプローブ法を組み合わせて用いて所定のＳＮＰを特異的に検出することができる。
【００１３】
本発明のパラゴムノキの品種判別用キットは、下記（１）〜（６）に示すプライマーセットのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする：
（１）配列番号１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（２）配列番号４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（３）配列番号７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（４）配列番号１０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（５）配列番号１３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（６）配列番号１６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット。
この構成により、マスアレイ法を用いる所定のＳＮＰ検出に最適化したプライマーセットを含むパラゴムノキの品種判別用キットを提供することができる。
【００１４】
本発明のパラゴムノキの別の品種判別用キットは、下記（１）〜（９）に示すプライマープローブセットのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする：
（１）配列番号１９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号２２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（２）配列番号２３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（３）配列番号２７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（４）配列番号３１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（５）配列番号３５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（６）配列番号３９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（７）配列番号４３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（８）配列番号４７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（９）配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット。
この構成により、リアルタイムＰＣＲ法にサイクリングプローブ法を組み合わせて用いる所定のＳＮＰ検出に最適化したプライマープローブセットを含むパラゴムノキの品種判別用キットを提供することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、パラゴムノキの品種を簡便且つ高精度に判別することができる、パラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】全９品種を含む２７０体のクローン検体について、マスアレイ法を用いて、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果を示す、クラスターコールプロットである。（ａ）は、プライマーセット（１）を用いて配列番号１の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｂ）は、プライマーセット（２）を用いて配列番号２の３０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｃ）は、プライマーセット（３）を用いて配列番号３の２５１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【図２】全９品種を含む合計２７０体のクローン検体について、マスアレイ法を用いて、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果を示す、クラスターコールプロットである。（ｄ）は、プライマーセット（４）を用いて配列番号４の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｅ）は、プライマーセット（５）を用いて配列番号５の３０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｆ）は、プライマーセット（３）を用いて配列番号６の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【図３】全９品種につき各１体ずつ合計９体のクローン検体について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果を示す、アレル識別プロット（ＡＤプロット）である。（ａ）は、プライマープローブセット（１）を用いて配列番号６の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｂ）は、プライマープローブセット（２）を用いて配列番号７の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｃ）は、プライマープローブセット（３）を用いて配列番号８の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【図４】全９品種につき各１体ずつ合計９体のクローン検体について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果を示す、ＡＤプロットである。（ａ）は、プライマープローブセット（４）を用いて配列番号９の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｂ）は、プライマープローブセット（５）を用いて配列番号１０の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｃ）は、プライマープローブセット（６）を用いて配列番号１１の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【図５】全９品種につき各１体ずつ合計９体のクローン検体について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果を示す、ＡＤプロットである。（ａ）は、プライマープローブセット（７）を用いて配列番号１２の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｂ）は、プライマープローブセット（８）を用いて配列番号１３の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。（ｃ）は、プライマープローブセット（９）を用いて配列番号１４の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【図６】図４で（ａ）（ｂ）（ｃ）として示した各ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロットを白抜き記号及び矢印で表示したものである。
【図７】図５で（ａ）（ｂ）（ｃ）として示した各ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロットを白抜き記号及び矢印で表示したものである。
【図８】図６で（ａ）（ｂ）（ｃ）として示した各ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロットを白抜き記号及び矢印で表示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明をその実施形態に基づき詳細に例示説明する。
【００１８】
［パラゴムノキの品種判別方法］
本発明のパラゴムノキの品種判別方法は、パラゴムノキ被検体の一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」とも呼ぶ）を検出し、解析することにより、該パラゴムノキ被検体の品種を判別することを特徴とする。このように、被検体の一塩基多型を検出し、解析することによって、被検体の表現型を予測することは、一般に、ＳＮＰタイピングと呼ばれる。本発明の品種判別方法では、パラゴムノキ被検体のゲノムＤＮＡにおける一塩基の相違、すなわち、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出対象とするため、劣化により断片化が高度に進んだゲノムＤＮＡを試料として用いても、簡便且つ高精度に品種を判別することができる。また、他の遺伝工学的品種判別方法での検出対象の多型と比較して、ＳＮＰはゲノムＤＮＡにおける出現頻度が高く、複数のＳＮＰの組み合わせを検出対象とすることにより、多数にわたる品種も高精度で識別することができる。かかるＳＮＰは、適切な検出手法を選択することにより、対立遺伝子がヘテロ接合型である遺伝子型と対立遺伝子がホモ接合型である２つの遺伝子型とを区別可能な共優性マーカーとして使用することもできる。
【００１９】
ＳＮＰは、パラゴムノキ被検体から抽出したゲノムＤＮＡを試料として検出する。ゲノムＤＮＡを抽出するためのパラゴムノキ被検体としては、パラゴムノキの植物体のいずれの組織も用いてもよく、生育段階も限定されない。植物体の組織からのゲノムＤＮＡの抽出は、常法により行うことができ、例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等によって行うことができる。また、ゲノムＤＮＡとして粗精製のものを使用することもできる。必要に応じて、抽出したゲノムＤＮＡを、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱等の公知のＤＮＡ精製方法によって精製してもよい。ゲノムＤＮＡの抽出及び／又は精製は、市販のキットなどを用いて行ってもよい。
【００２０】
一塩基多型は、本明細書において開示する所定の一塩基多型部位（以下、「ＳＮＰ部位」とも呼ぶ）の塩基について検出してもよく、又は、既知の一塩基多型同定（「ＳＮＰマッピング）とも呼ばれる）技術のいずれかを用いて同定されるＳＮＰ部位の塩基について検出してもよい。ＳＮＰマッピングによる検出対象ＳＮＰ部位の同定は、例えば、パラゴムノキの種々の品種のクローンから抽出したゲノムＤＮＡの塩基配列をＨｉｓｅｑ２０００などの次世代シーケンサーによって解析し、ｓａｍｔｏｏｌｓなどのソフトウェアを用いてＳＮＰコールを行い、集合演算による配列比較を行うことによって、検出対象のＳＮＰ部位を同定することができる。
【００２１】
ＳＮＰの検出手法としては、特に限定されず、後述するマスアレイ法やリアルタイムＰＣＲ法を含め、ＳＮＰを検出することができる既知の遺伝子工学的検出手法のいずれをも用いることができる。
【００２２】
検出したＳＮＰの塩基型又は遺伝子型は、本明細書で後述の表１として開示する所定のＳＮＰ部位で検出される各品種の塩基型及び遺伝子型などの情報に照らし合わせることによって、解析してもよく、又は、既知のＳＮＰマッピング技術のいずれかを用いて同定された塩基型及び遺伝子型などの情報に照らし合わせることによって、解析してもよい。
【００２３】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法は、単独で使用してもよく、他の品種判別方法と組み合わせて使用してもよい。本発明の品種判別方法を単独で使用する場合には、１個又は複数のＳＮＰを検出対象とし、その検出結果を単独で又は組み合わせることにより、品種を判別することができる。本発明の品種判別方法を他の品種判別方法と組み合わせて使用する場合には、例えば、葉・樹皮・樹形などの形態による品種判別方法を使用して候補を数品種に絞った上で、本発明の品種判別方法を使用して、品種を判別することができる。
【００２４】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法によって判別可能なパラゴムノキの品種は、特に限定されないが、例えば、ＰＢ２６０、ＰＢ３３０、ＰＢ３４０、ＩＡＮ８７３、ＧＴ１、ＲＲＩＣ１００、ＰＲ１０７、ＰＢ２３５、及びＡＶＲＯＳ２０３７などが挙げられる。
【００２５】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法においては、特に限定しないが、マスアレイ法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いてＳＮＰを検出することが好ましい。
【００２６】
＜マスアレイ法を用いる検出＞
マスアレイ法を用いる検出では、ＳＮＰによって生じる質量の差を検出する。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型として、検出対象のＳＮＰを含む約数十〜数百ｂｐの領域をＰＣＲにて増幅した後、増幅産物を鋳型としてＳＮＰ部位直前に伸長用プライマーをハイブリダイズさせ、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）混合物、又はジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）とデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）との混合物を基質として用いてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行うことで、ＳＮＰに応じて質量や長さの異なる断片が生成される。この生成産物を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計などによって質量分析することで、塩基の種類及び遺伝子型を特定することができる。マスアレイ法は、特に限定されないが、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のマスアレイハイスループットＳＮＰ解析システム等を用いて実施することができる。
【００２７】
マスアレイ法では、増幅用プライマー対と一塩基伸長用プライマーとのプライマーセットを用いる。増幅用プライマー対及び一塩基伸長用プライマーは、ゲノムＤＮＡ上の検出対象のＳＮＰ部位に特異的に設計される。
【００２８】
マスアレイ法で用いる増幅用プライマー対は、ゲノムＤＮＡを鋳型として、検出対象のＳＮＰ部位を含む約数十〜数百ｂｐの領域をＰＣＲで増幅することができるように設計されたオリゴヌクレオチド対である、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせであればよい。当業者であれば、かかる増幅対象領域の塩基配列情報に基づき、鋳型サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率及びＴｍ値などを考慮して、かかる増幅用プライマー対を適切に設計することができる。かかる増幅用プライマー対の各プライマーは、増幅反応の安定化や効率化、増幅産物の分解抑制、検出、精製、単離又はクローニングなどの目的で、５’側に、鋳型に相補的でない数塩基〜十数塩基程度のタグ配列を付加したものであってもよい。
【００２９】
マスアレイ法で用いる一塩基伸長用プライマーは、増幅用プライマー対によって得られた増幅産物のセンス鎖又はアンチセンス鎖を鋳型として、検出対象一塩基部位の５’側の上流約２０塩基〜１塩基にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであればよい。当業者であれば、検出対象一塩基の５’側上流の塩基配列情報に基づき、鋳型サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率及びＴｍ値などを考慮して、かかる一塩基伸長用プライマーを適切に設計することができる。
【００３０】
マスアレイ法における伸長反応は、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の取り込みによりＰＣＲ伸長反応が停止することを利用して、検出対象一塩基のみを伸長させることによって行うことができる。ジデオキシヌクレオチド混合物（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＴＴＰ）を基質として用いる場合、ＰＣＲ伸長反応はプライマーの次の塩基（ＳＮＰ部位）で常に停止し、プライマーに１塩基が付加した生成物間の質量差を、質量分析して、ＳＮＰ部位の塩基を決定することができる。このようにして得られた伸長反応の生成物を、必要に応じて精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで質量分析して、質量数により遺伝子型を解析することができる。検出対象のＳＮＰの遺伝子型がホモ接合型である場合は、ＳＮＰ部位の塩基が１種類のみであるため、伸長反応生成物のマススペクトルのピークは１つのみ観察される。検出対象のＳＮＰの遺伝子型がヘテロ接合型である場合は、ＳＮＰ部位の塩基が２種類であるため、伸長反応生成物のマススペクトルのピークは２つ観察される。
【００３１】
あるいは、伸長反応において、ＳＮＰのうちの１種類の塩基に相補的な１種類のジデオキシヌクレオチドと、残り３種類のｄＮＴＰとの混合物を基質として用いることもできる。この場合、ＳＮＰ部位にｄｄＮＴＰと相補的な塩基があるときは１塩基のみ伸長して反応が停止するが、異なる（すなわち、ｄｄＮＴＰと相補的でない）塩基があるときは、次に鋳型鎖にジデオキシヌクレオチドと相補的な塩基が現れるまで伸長反応が継続するため、伸長反応生成物間の質量差を拡大することができる。このようにして得られた伸長反応生成物も、必要に応じて精製し、同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで質量分析して、質量数に基づき、ＳＮＰ部位の塩基の種類及びその組み合わせ、すなわち、遺伝子型を特定することができる。
【００３２】
上述するように被検体の１以上のＳＮＰ部位について得られた塩基の遺伝子型を、同一のＳＮＰ部位について既知の品種で予め得ておいた塩基の遺伝子型のデータ、例えば、下で示す表１〜表３のような検定表に照らし合わせて、被検体の品種を判別することができる。  
あるいは、質量分析の結果を、タイピングソフトウェア、例えば、シーケノム社製ＴｙｐｅｒＡｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅなどで解析することによって、クラスターコールプロットなどとして得ることができる。このようにして被検体の１以上のＳＮＰ部位について得られたプロットを、同一のＳＮＰ部位について既知の品種で予め得ておいたプロットと比較することによっても、被検体の品種を判別することができる。
【００３３】
＜リアルタイムＰＣＲ法を用いる検出＞  
リアルタイムＰＣＲ法を用いる検出では、ＳＮＰと相補的な塩基を有する検出用プローブのハイブリダイゼーションを、蛍光発光などのレポーターシグナルとしてリアルタイムで検出する。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型として、検出対象のＳＮＰを含む約１００〜２５０ｂｐの領域をＰＣＲにて増幅しつつ、ＳＮＰ部位と検出用プローブとをハイブリダイズさせる。検出用プローブは、一方の末端がレポーター（例えば、蛍光色素）で標識され、他方の末端がクエンチャー（消光物質）で標識されている。クエンチャーがレポーターの近傍に存在する場合は、クエンチャーがレポーターの発光を抑制するが、ヌクレアーゼ活性などで検出用プローブが切断又は分解されてクエンチャーとレポーターとが離れると、レポーターの発光が検出可能となる。このレポーターの発光をリアルタイムＰＣＲ装置などによって分析することによって、遺伝子型を特定することができる。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、ＳＮＰを蛍光波長の違い又は蛍光発光の有無及び強度差として検出することができる。検出用プローブとして、複数の多型塩基のいずれか１種類に相補的な塩基を有する１つのプローブを用いてもよく、又は複数の多型塩基の各種類に相補的な塩基を有する複数のプローブを用いてもよい。複数の検出用プローブを用いる場合には、それぞれ発光波長や吸光波長の異なるレポーターを用いて検出された波長の違いを分析することによって（マルチプレックス解析）、塩基の種類及び組み合わせを高感度で特定して、遺伝子型を決定することができる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ法では、増幅用プライマー対と検出用プローブとのプライマープローブセットを用いる。増幅用プライマー対及び検出用プローブは、ゲノムＤＮＡ上の検出対象のＳＮＰに対して特異的に設計される。
【００３５】
リアルタイムＰＣＲ法で用いる増幅用プライマー対は、ゲノムＤＮＡを鋳型として、検出対象のＳＮＰ部位を含む約１００〜２５０ｂｐの領域をＰＣＲで増幅することができるように設計されたオリゴヌクレオチド対である、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせであればよい。当業者であれば、かかる増幅対象領域の塩基配列情報に基づき、鋳型サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率及びＴｍ値などを考慮して、かかる増幅用プライマー対を適切に設計することができる。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲ法で用いる検出用プローブは、検出対象のＳＮＰ部位を含む数塩基〜三十数塩基の領域と特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、一方の末端がクエンチャー（消光物質）で標識され、他方の末端がレポーター（蛍光色素）で標識されている。検出対象のＳＮＰ部位で検出される多型塩基の各々に特異的にハイブリダイズする検出用プローブのセットを検出用プローブ対として用いることもできる。検出用プローブは、検出原理に応じて設計される。検出原理としては、特に限定されないが、例えば、サイクリングプローブ法を使用するもの、ＴａｑＭａｎプローブ法を使用するもの、などが挙げられる。
【００３７】
サイクリングプローブ法による検出原理では、オリゴヌクレオチドがＤＮＡとＲＮＡとからなるキメラプローブ（以下、サイクリングプローブとも呼ぶ）を検出用プローブとして用いる。サイクリングプローブは、ＲＮＡとＤＮＡとからなる数塩基〜十数塩基のキメラオリゴヌクレオチドであり、一方の末端が蛍光物質で、他方の末端がクエンチャーで標識されている。また、検出対象のＳＮＰと相補的な部位又はその１塩基５’側の部位のヌクレオチドのみがＲＮＡであり、残りのヌクレオチドはＤＮＡである。通常のＰＣＲ反応液に、サイクリングプローブとＲＮａｓｅ  Ｈとを添加して、ＰＣＲ反応を行う。サインリングプローブがインタクトな状態では、レポーターとクエンチャーとの距離が近いため、蛍光を発しない。しかし、サインリングプローブが鋳型又はＰＣＲ増幅産物とハイブリッドを形成すると、反応液中に含まれるＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ部位が切断されて、レポーターとクエンチャーとの距離が離れて、蛍光を発する。サイクリングプローブのＲＮＡ部位又はその１塩基５’側にミスマッチが存在するとＲＮａｓｅ Ｈによる切断は起こらないため、非常に配列特異性の高い検出が可能である。また、各々が各ＳＮＰ塩基に特異的な相補塩基を有し且つ異なる種類のレポーター（蛍光色素）で標識された、少なくとも２つ以上のサイクリングプローブからなる一対のサイクリングプローブを設計して検出用プローブとして用いるマルチプレックス解析によって、塩基の種類及び組み合わせを高感度で特定して、遺伝子型を決定することができる。
【００３８】
ＴａｑＭａｎプローブ法による検出原理では、十数塩基〜三十数塩基のＤＮＡからなるオリゴヌクレオチド（以下、ＴａｑＭａｎプローブとも呼ぶ）を検出用プローブとして用いる。ＴａｑＭａｎプローブは、サイクリングプローブ同様に、一方の末端が蛍光物質で、他方の末端がクエンチャーで標識されている。通常のＰＣＲ反応液に、ＴａｑＭａｎプローブを添加して、ＰＣＲ反応を行う。ＴａｑＭａｎプローブがインタクトな状態では、レポーターとクエンチャーとの距離が近いため、蛍光を発しない。しかし、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型又はＰＣＲ増幅産物とハイブリッドを形成すると、反応液中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、ハイブリダイズしていたＴａｑＭａｎプローブが加水分解されて、レポーターとクエンチャーとの距離が離れて、蛍光を発する。ＴａｑＭａｎプローブによる検出も、配列特異性の高い検出が可能である。また、各々が各ＳＮＰ塩基に特異的な相補塩基を有し且つ異なる種類のレポーター（蛍光色素）で標識された、少なくとも２つ以上のＴａｑＭａｎプローブからなる一対のＴａｑＭａｎプローブを設計して検出用プローブとして用いることにより、蛍光分析で発光波長や吸光波長の違いを分析することによって、ＳＮＰ部位の塩基の種類及び  遺伝子型を高感度で検出することができる。
【００３９】
検出用プローブを標識する蛍光色素としては、特に限定されないが、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）などが挙げられる。検出用プローブを標識するクエンチャー（消光物質）としては、特に限定されないが、例えば、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素（ＢＨＱ）、４−((４−(ジメイルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）などが挙げられる。
【００４０】
上述するように被検体の１以上のＳＮＰ部位について決定された遺伝子型を、同一のＳＮＰ部位について既知の品種で予め得ておいた遺伝子型のデータ、例えば、下で示す表１、４及び５のような検定表に照らし合わせて、被検体の品種を判別することができる。  
あるいは、蛍光分析の結果を、タイピングソフトウェア、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦｏｒＳｔｅｐＯｎｅ ａｎｄ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓなどで解析することによって、遺伝子型を表すアレル識別プロット（ＡＤプロット）などとして得ることができる。このようにして被検体の１以上のＳＮＰ部位について得られたプロットを、同一のＳＮＰ部位について既知の品種で予め得ておいたプロットと比較することによっても、被検体の品種を判別することができる。
【００４１】
＜ゲノムＤＮＡ上の検出対象ＳＮＰ部位＞
本発明のパラゴムノキの品種判別方法における検出対象のＳＮＰ部位は、特に限定されないが、下記塩基からなる群より選択される少なくとも１つについて検出することが好ましい：
配列番号１の２０１番目の塩基；
配列番号２の３０１番目の塩基；
配列番号３の２５１番目の塩基；
配列番号４の２０１番目の塩基；
配列番号５の３０１番目の塩基；
配列番号６の２０１番目の塩基；
配列番号７の１０１番目の塩基；
配列番号８の１０１番目の塩基；
配列番号９の１０１番目の塩基；
配列番号１０の１０１番目の塩基；
配列番号１１の１０１番目の塩基；
配列番号１２の１０１番目の塩基；
配列番号１３の１０１番目の塩基；及び
配列番号１４の１０１番目の塩基。
これら塩基のうちの少なくとも１つをマーカーとしてＳＮＰを検出することにより、ＰＢ２６０、ＰＢ３３０、ＰＢ３４０、ＩＡＮ８７３、ＧＴ１、ＲＲＩＣ１００、ＰＲ１０７、ＰＢ２３５、及びＡＶＲＯＳ２０３７などの品種を好適に判別することができる。
【００４２】
例えば、上記品種が被検体である場合に、上記ＳＮＰ部位について検出される一塩基は、下記表１に示す通りである。Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは、それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの各塩基を表す。１つの塩基記号のみ記載されている場合は、検出される塩基は１種類のみであり、対立遺伝子が当該一塩基のホモ接合型であることを示す。２つの塩基記号が斜線を挟んで記載されている場合は、検出される塩基は２種類であり、対立遺伝子が当該二塩基のヘテロ接合型であることを示す。
【００４３】
【表１】
2017184651.tif 000002
【００４４】
＜マスアレイ法に使用可能なプライマーセット＞
本発明において、マスアレイ法を用いるＳＮＰ検出で使用できるプライマーセットは、当業者が、検出対象のＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域の塩基配列情報に基づき、周知慣用技術を用いて適宜設計することができる。かかるプライマーセットの好適な具体例としては、特に限定されないが、例えば、下記（１）〜（６）に示すプライマーセットが挙げられる。
（１）配列番号１５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号１７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（２）配列番号１８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号１９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（３）配列番号２１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（４）配列番号２４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（５）配列番号２７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号２８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号２９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット；
（６）配列番号３０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む一塩基伸長用プライマーとのプライマーセット。
【００４５】
上記（１）〜（６）のプライマーセットの増幅用プライマー対の各プライマーは、検出対象のＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域を増幅することができる限りにおいて、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの１〜数塩基が点変異、欠失又は重複したものや、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’側に１〜数塩基のヌクレオチドを付加したものも、使用することができる。付加されるヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに相補的であってもよく、又はゲノムＤＮＡに相補的でなくタグ配列として機能するものであってもよい。
【００４６】
上記（１）〜（６）のプライマーセットの一塩基伸長用プライマーは、所定のＳＮＰの一塩基伸長反応が可能な限りにおいて、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの１〜数塩基が点変異、欠失又は重複したものや、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの５’側に１〜数塩基のヌクレオチドを付加したものも使用することができる。付加されるヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに相補的であってもよく、又はゲノムＤＮＡに相補的でなくタグ配列として機能するものであってもよい。
【００４７】
尚、各配列番号の塩基配列は、以下の通りである。
配列番号１５：５’−ＡＡＧＡＴＣＡＣＧＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧ−３’
配列番号１６：５’−ＡＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣ−３’
配列番号１７：５’−ＣＧＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＣ−３’
配列番号１８：５’−ＡＣＣＴＴＧＧＧＧＴＣＣＡＡＡＴＴＧＡＧ−３’
配列番号１９：５’−ＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧ−３’
配列番号２０：５’−ＣＣＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣＣＣＣ−３’
配列番号２１：５’−ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＧＧ−３’
配列番号２２：５’−ＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧＣ−３’
配列番号２３：５’−ＡＧＡＣＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧ−３’
配列番号２４：５’−ＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣ−３’
配列番号２５：５’−ＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣ−３’
配列番号２６：５’−ＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧ−３’
配列番号２７：５’−ＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＣＣＧ−３’
配列番号２８：５’−ＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＴＴＧ−３’
配列番号２９：５’−ＧＣＡＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴ−３’
配列番号３０：５’−ＧＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧ−３’
配列番号３１：５’−ＧＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣＧ−３’
配列番号３２：５’−ＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴ−３’
【００４８】
上記（１）〜（６）のプライマーセットを用いることにより、上述する所定のＳＮＰ部位のＳＮＰを好適に検出することができる。上記（１）〜（６）の各プライマーセットが検出対象とするＳＮＰ部位は、下記表２に示す通りである。また、マスアレイ法で上記（１）〜（６）の各プライマーセットを用いた検出結果を、下記表３の検定表に基づき解析することにより、パラゴムノキの品種を判別することができる。
【００４９】
【表２】
2017184651.tif 000003
【００５０】
【表３】
2017184651.tif 000004
【００５１】
＜リアルタイムＰＣＲ法に使用可能なプライマープローブセット＞
本発明において、リアルタイムＰＣＲ法を用いるＳＮＰ検出で使用できるプライマープローブセットは、当業者が、検出対象のＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域の塩基配列情報に基づき、周知慣用技術を用いて適宜設計することができる。かかるプライマープローブセットの好適な具体例としては、特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲ法にサイクリングプローブ法を組み合わせて用いる場合は、例えば、下記（１）〜（９）に示すプライマープローブセットが挙げられる。下記（１）〜（９）に示す検出用プローブ対の各プローブは、検出対象のＳＮＰに相補的な部位又はその１塩基５’側の部位のヌクレオチドがＲＮＡであり、それ以外がＤＮＡからなるサイクリングプローブである。
【００５２】
（１）配列番号３３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号３６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（２）配列番号３７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号３８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号３９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（３）配列番号４１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（４）配列番号４５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号４６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号４７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号４８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（５）配列番号４９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（６）配列番号５３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号５６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（７）配列番号５７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号５８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号５９の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６０の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（８）配列番号６１の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６２の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６３の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６４の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット；
（９）配列番号６５の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと配列番号６６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなる増幅用プライマー対と、配列番号６７の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブと配列番号６８の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブとからなる検出用プローブ対とのプライマープローブセット。
【００５３】
上記（１）〜（９）のプライマープローブセットの増幅用プライマー対の各プライマーは、リアルタイムＰＣＲ法で検出対象のＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域を増幅することができる限りにおいて、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの１〜数塩基が点変異、欠失又は重複したものや、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’側に１〜数塩基のヌクレオチドを付加したものも、使用することができる。付加されるヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに相補的であってもよく、又はゲノムＤＮＡに相補的でなくタグ配列として機能するものであってもよい。
【００５４】
上記（１）〜（９）のプライマープローブセットの検出用プローブ対の各プローブは、リアルタイムＰＣＲ法で検出対象のＳＮＰ部位の塩基の検出に使用できる限りにおいて、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの１〜数塩基が点変異、欠失又は重複したものや、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’側に１〜数塩基のヌクレオチドを付加したものも、使用することができる。付加されるヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに相補的であってもよく、又はゲノムＤＮＡに相補的でなくタグ配列として機能するものであってもよい。
【００５５】
上記（１）〜（９）のプライマープローブセットについて示される各配列番号の塩基配列は、以下の通りである。尚、検出用プローブに含まれるオリゴヌクレオチドの塩基配列（配列番号３５、３６、３９、４０、４３、４４、４７、４８、５１、５２、５５、５６、５９、６０、６３、６４、６７及び６８）においては、右上に＊の印を付した文字（例えば、Ｃ＊）がゲノムＤＮＡのセンス鎖上のＳＮＰ部位に相当する塩基を表し、括弧内の文字がＲＮＡを表す。例えば、配列番号３５のオリゴヌクレオチドを含む検出用プローブは、シトシン（Ｃ）検出用プローブであり、ゲノムＤＮＡ及び／又はその増幅産物のセンス鎖におけるＳＮＰ部位の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に、ゲノムＤＮＡ及び又はその増幅産物のアンチセンス鎖にハイブリダイズする。その結果、検出用プローブがＲＮａｓｅ Ｈにより切断又は分解されて、当該検出用プローブに結合している蛍光物質が発光する。
【００５６】
配列番号３３：５’−ＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＧ−３’
配列番号３４：５’−ＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＡ−３’
配列番号３５：５’−ＣＣＴＧＴＣ＊(Ｇ)ＧＡ−３’
配列番号３６：５’−ＧＣＣＴＧＴ(Ａ＊)ＧＧ−３’
配列番号３７：５’−ＡＧＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＣ−３’
配列番号３８：５’−ＧＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＣＡＧＴＡＡ−３’
配列番号３９：５’−ＧＣ(Ｇ＊)ＡＡＡＡＧＧＡ−３’
配列番号４０：５’−ＣＡ＊(Ａ)ＡＡＡＧＧＡＡＡＡ−３’
配列番号４１：５’−ＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧ−３’
配列番号４２：５’−ＣＴＴＴＡＴＣＧＧＡＡＴＴＴＧＴＡＡＴＧＧＡ−３’
配列番号４３：５’−ＣＡＧＣＴＡＴ＊(Ｇ)ＧＣ−３’
配列番号４４：５’−ＣＴＡＣ＊(Ｇ)ＧＣＧ−３’
配列番号４５：５’−ＣＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴ−３’
配列番号４６：５’−ＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ−３’
配列番号４７：５’−ＴＣＣＴＧＴＡ(Ａ＊)ＡＡＣ−３’
配列番号４８：５’−ＴＣＣＴＧＴＡ(Ｇ＊)ＡＡＣ−３’
配列番号４９：５’−ＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＡＧＴＡ−３’
配列番号５０：５’−ＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡ−３’
配列番号５１：５’−ＡＡＧＣＡＡＡＴＡ(Ａ＊)ＴＡＧ−３’
配列番号５２：５’−ＡＧＣＡＡＡＴＡ(Ｇ＊)ＴＡＧ−３’
配列番号５３：５’−ＧＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴ−３’
配列番号５４：５’−ＣＡＡＣＣＴＣＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣ−３’
配列番号５５：５’−ＣＣＧＣＣ＊(Ａ)ＡＴＴ−３’
配列番号５６：５’−ＴＣＣＧＣＴ＊(Ａ)ＡＴＴ−３’
配列番号５７：５’−ＧＴＡＡＴＣＴＴＧＴＴＣＧＴＡＴＣＣＧＴＣＧＴＡ−３’
配列番号５８：５’−ＧＧＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＡ−３’
配列番号５９：５’−ＣＣＴＣＣ(Ｇ＊)ＴＣＡ−３’
配列番号６０：５’−ＧＣＣＴＣＣ(Ａ＊)ＴＣ−３’
配列番号６１：５’−ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧ−３’
配列番号６２：５’−ＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＴＣＣ−３’
配列番号６３：５’−ＴＡＣ(Ａ＊)ＧＴＴＡＡＧＴＣ−３’
配列番号６４：５’−ＴＡＣＣＡＴＡＣ(Ｇ＊)ＧＴ−３’
配列番号６５：５’−ＣＴＣＡＴＣＧＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧ−３’
配列番号６６：５’−ＡＧＴＡＧＧＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡ−３’
配列番号６７：５’−ＡＧ(Ｇ＊)ＡＧＴＧＧＴＣ−３’
配列番号６８：５’−ＡＡＧ(Ａ＊)ＡＧＴＧＧＴＣ−３’
【００５７】
上記（１）〜（９）のプライマープローブセットを用いることにより、上述する所定のＳＮＰ部位の塩基を好適に検出することができる。上記（１）〜（９）の各セットが検出対象とするＳＮＰ部位は、下記表４に示す通りである。リアルタイムＰＣＲ法で上記（１）〜（１８）の各プライマープローブセットを用いた検出結果を、下記表５の検定表に基づき解析することにより、パラゴムノキの品種を判別することができる。
【００５８】
【表４】
2017184651.tif 000005
【００５９】
【表５】
2017184651.tif 000006
【００６０】
［パラゴムノキの品種判別用キット］
本発明の一実施形態のパラゴムノキの品種判別用キットは、上記（１）〜（６）のプライマーセットのうちの少なくとも１つを含む。上記（１）〜（６）のプライマーセットのうちの少なくとも１つを含むことにより、マスアレイ法を用いるパラゴムノキの品種判別方法において、上記表１で開示する所定のＳＮＰの検出に好適に使用することができる。この品種判別用キットは、上記（１）〜（６）のプライマーセットのうちの少なくとも１つに加えて、当該プライマーセットを用いて検出される遺伝子型をパラゴムノキ品種に帰属させることができる情報（例えば、上記表２又は３に示す情報など）を、例えば検定表として、含んでもよい。更に、マスアレイ法での検出に使用可能な試薬類、容器、実験プロトコルなどを含んでもよい。
【００６１】
本発明の別の実施形態のパラゴムノキの品種判別用キットは、上記（１）〜（９）のプライマープローブセットのうちの少なくとも１つを含む。これにより、リアルタイムＰＣＲ法にサイクリングプローブ法を組み合わせて用いるパラゴムノキの品種判別方法において、上記表１で開示する所定のＳＮＰの検出に好適に使用することができる。この品種判別用キットは、上記（１）〜（９）のプライマープローブセットのうちの少なくとも１つに加えて、当該プライマープローブセットを用いて検出される遺伝子型をパラゴムノキ品種に帰属させることができる情報（例えば、上記表４又は５に示す情報など）を、例えば検定表として、含んでもよい。更に、リアルタイムＰＣＲ法にサイクリングプローブ法を組み合わせて用いる検出に使用可能な試薬類、容器、実験プロトコルなどを含んでもよい。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６３】
［パラゴムノキ試料の調製及びゲノムＤＮＡの抽出・精製］
パラゴムノキの農園より、パラゴムノキの９品種、ＰＢ２６０、ＰＢ３３０、ＰＢ３４０、ＩＡＮ８７３、ＧＴ１、ＲＲＩＣ１００、ＰＲ１０７、ＰＢ２３５、及びＡＶＲＯＳ２０３７の各クローンの葉を採取した。これらの葉から抽出及び精製したゲノムＤＮＡを材料として、上記ＳＮＰの検出を行った。葉からのゲノムＤＮＡの抽出及び精製は、キアゲン社製ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて行った。
【００６４】
［マスアレイ法によるＳＮＰの検出］
クローンから抽出及び精製したゲノムＤＮＡについて、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社のｉＰＬＥＸ（登録商標）Ｇｏｌｄシステムを用いてマスアレイ法によりＳＮＰを検出した。実験手順は、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社のｉＰＬＥＸ  Ｇｏｌｄアプリケーションガイドに従った。具体的な実験手順は、下記の通りである。
【００６５】
＜ＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域の増幅＞
抽出及び精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記（１）〜（６）のプライマーセットの増幅用プライマー対を用いて、検出対象ＳＮＰ部位を含むゲノムＤＮＡ領域を増幅した。サーマルサイクラーとして  タカラバイオ社製ＰＣＲ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを使用した。使用した増幅用プライマー対は、上述の配列番号の塩基配列でコードする各オリゴヌクレオチドの５’側に１０塩基のタグ（５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−３’：配列番号６９）を付加したものであった。９６ウェルサンプルマイクロタイタープレートにＰＣＲ反応液を調製して、ＰＣＲ反応を行った。反応液組成及び反応条件は、ｉＰＬＥＸ  Ｇｏｌｄアプリケーションガイドに従って、下記の通りとした。
【００６６】
【表６】
2017184651.tif 000007
【００６７】
【表７】
2017184651.tif 000008
【００６８】
次いで、反応液中の未反応ｄＮＴＰを中和するため、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理した。具体的には、１ウェル当たりＳＡＰ溶液２μＬ（溶液組成：１０×ＳＡＰバッファ０．１７μＬ、１．７Ｕ／μＬのＳＡＰ酵素を０．３μＬ、ＨＰＬＣグレードの水１．５３μＬ）を添加してボルテックスし、遠心分離機（１０００ｒｐｍ、１分間）でスピンダウンを行った。３７℃で４０分間維持し、次いで８５℃で５分間維持した後、４℃に冷却した。
【００６９】
＜ＳＮＰ伸長反応＞
上記サンプルマイクロタイタープレートに、一塩基伸長用プライマーを含むカクテルを１ウェルあたり１．０６μＬ添加し、ＰＣＲで伸長反応を行った。カクテル組成及び反応条件は、下記の通りであった。
【００７０】
【表８】
2017184651.tif 000009
【００７１】
【表９】
2017184651.tif 000010
【００７２】
＜塩基の特定及び品種判別＞
ｉＰＬＥＸ  Ｇｏｌｄアプリケーションガイドに従って、樹脂をペーストしたディンプルプレートに上記サンプルマイクロタイタープレートをセットして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（シーケノム社製ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ）で質量分析を行った。質量分析の結果をタイピングソフト（シーケノム社製ＴｙｐｅｒＡｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で解析することによって、クラスターコールプロットを得た。
全９品種を含む合計２７０体を超えるクローン検体について、（１）〜（６）の各プライマーセット毎に得られたクラスターコールプロットを、それぞれ図１（ａ）〜（ｃ）及び図２（ｄ）〜（ｆ）として示す。    
【００７３】
図１及び２のクラスターコールプロットにおいて、１つのプロット点（黒丸、黒三角形、黒四角形又は逆黒三角形の記号によって表示）は、１体のクローン検体に相当する。プロットグラフの横軸（Ｌｏｗ  Ｍａｓｓ  Ａｌｌｅｌｅ）及び縦軸（Ｈｉｇｈ  Ｍａｓｓ  Ａｌｌｅｌｅ）は、それぞれ、各クローン検体について得られた総ＰＣＲ産物のうちの低質量数のＰＣＲ産物の割合及び高質量数のＰＣＲ産物の割合を示す。図１（ａ）は、プライマーセット（１）を用いて配列番号１の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。図１（ｂ）は、プライマーセット（２）を用いて配列番号２の３０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。図１（ｃ）は、プライマーセット（３）を用いて配列番号３の２５１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。図２（ｄ）は、プライマーセット（４）を用いて配列番号４の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。図２（ｅ）は、プライマーセット（５）を用いて配列番号５の３０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。図２（ｆ）は、プライマーセット（３）を用いて配列番号６の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果である。
【００７４】
これらクラスターコールプロットで示される遺伝子型について、図１（ａ）、図１（ｃ）及び図２（ｂ）を例に挙げて説明する。図１（ａ）は、プライマーセット（１）を用いて配列番号１の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はグアニン及びアデニンであり、特定される遺伝子型は、グアニンのホモ接合型（Ｇ）、アデニンのホモ接合型（Ａ）、及びアデニンとグアニンとのヘテロ接合型（Ｇ／Ａ）である（表１及び３）。グアニンの分子量は約１５１であり、アデニンの分子量は約１３５であるから、グアニン塩基を有するＰＣＲ産物は高質量数のＰＣＲ産物として、アデニン塩基を有するＰＣＲ産物は低質量数のＰＣＲ産物として検出される。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がグアニンのホモ接合型（Ｇ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であるため、横軸の目盛が０．０で縦軸の目盛が１．０の付近、すなわち、グラフの左上隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がアデニンのホモ接合型（Ａ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であるため、横軸の目盛が１．０で縦軸の目盛が０．０の付近、すなわち、グラフの右下隅付近の黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がグアニンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｇ／Ａ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であるため、横軸の目盛が０．５で縦軸の目盛が０．５の付近、すなわち、グラフの中心付近の黒四角形の点としてプロットされる。黒丸の点（Ｎｏ  Ｃａｌｌ）は、シグナル不良により当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定できなかった検体を表す。“Ｏｔｈｅｒ”は、手動で、すなわち、コンピュータでなく実験者が当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定した検体数を表す。
【００７５】
図１（ｃ）は、プライマーセット（３）を用いて配列番号３の２５１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はシトシン及びチミンであり、特定される遺伝子型は、シトシンのホモ接合型（Ｃ）、チミンのホモ接合型（Ｔ）、及びシトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）である（表１及び３）。シトシンの分子量は約１１１であり、チミンの分子量は約１２６であるから、チミン塩基を有するＰＣＲ産物は高質量数のＰＣＲ産物として、シトシン塩基を有するＰＣＲ産物は低質量数のＰＣＲ産物として検出される。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がチミンのホモ接合型（Ｔ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であるため、横軸の目盛が０．０で縦軸の目盛が１．０の付近、すなわち、グラフの左上隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がシトシンのホモ接合型（Ｃ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であるため、横軸の目盛が１．０で縦軸の目盛が０．０の付近、すなわち、グラフの右下隅付近の黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がシトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であるため、横軸の目盛が０．５で縦軸の目盛が０．５の付近、すなわち、グラフの中心付近の黒四角の記号としてプロットされる。黒丸の点（Ｎｏ  Ｃａｌｌ）は、シグナル不良により当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定できなかった検体を表す。“Ｏｔｈｅｒ”は、手動で、すなわち、コンピュータでなく実験者が当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定した検体数を表す。
【００７６】
図２（ｅ）は、プライマーセット（５）を用いて配列番号５の３０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はシトシン及びアデニンであり、特定される遺伝子型は、シトシンのホモ接合型（Ｃ）、アデニンのホモ接合型（Ａ）、及びシトシンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ａ）である（表１及び３）。シトシンの分子量は約１１１であり、アデニンの分子量は約１３５であるから、アデニン塩基を有するＰＣＲ産物は高質量数のＰＣＲ産物として、シトシン塩基を有するＰＣＲ産物は低質量数のＰＣＲ産物として検出される。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がアデニンのホモ接合型（Ａ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であるため、横軸の目盛が０．０で縦軸の目盛が１．０の付近、すなわち、グラフの左上隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がシトシンのホモ接合型（Ｃ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上１であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０であるため、横軸の目盛が１．０で縦軸の目盛が０．０の付近、すなわち、グラフの右下隅付近の黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の遺伝子型がシトシンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ａ）であるクローン検体では、得られる総ＰＣＲ産物のうち、低質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であり、高質量数のＰＣＲ産物の割合が理論上０．５であるため、横軸の目盛が０．５で縦軸の目盛が０．５の付近、すなわち、グラフの中心付近の黒四角形の点としてプロットされる。黒丸の点（Ｎｏ  Ｃａｌｌ）は、シグナル不良により当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定できなかった検体を表す。“Ｏｔｈｅｒ”は、手動で、すなわち、コンピュータでなく実験者が当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を判定した検体数を表す。
【００７７】
図１（ａ）〜（ｃ）及び図２（ｄ）〜（ｆ）のクラスターコールプロットを表１〜３と照らし合わせて分かるように、プライマーセット（１）〜（６）を用いるマスアレイ法で被検体の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することにより、パラゴムノキの品種判別を行うことができる。  
【００７８】
［リアルタイムＰＣＲ法を用いたＳＮＰの検出］
クローンから抽出及び精製したゲノムＤＮＡについて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルＰＣＲシステムを使用してリアルＰＣＲ法によりＳＮＰを検出した。具体的な実験手順は、下記の通りである。
【００７９】
上記（１）〜（９）のプライマープローブセットを用いた。検出プローブ対のうち、一方のサイクリングプローブはＦＡＭ標識したものであり、他方のサイクリングプローブはＨＥＸ標識したものである。ＰＣＲ試薬として、タカラバイオ社製Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）ＰＣＲ ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘを用いた。リアルタイムＰＣＲの反応液組成及び反応条件は下記の通りであった。  
【００８０】
【表１０】
2017184651.tif 000011
【００８１】
【表１１】
2017184651.tif 000012
【００８２】
＜塩基の特定及び品種判別＞
使用機器の都合上、ＨＥＸ蛍光をＶＩＣ蛍光として検出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルＰＣＲシステムに付属するソフトウェアで検出対象の塩基の特定及び解析を行って、アレル識別プロット（ＡＤプロット）を得た。
全９品種につき各１体ずつ合計９体のクローン検体について、（１）〜（９）の各プライマープローブセットについて得られたＡＤプロットを、それぞれ図３（ａ）〜（ｃ）、図４（ａ）〜（ｃ）及び図５（ａ）〜（ｃ）として示す。
これらＡＤプロットにおいてＧＴ１のクローン検体のプロット点を白抜き記号及び矢印で表示したものを、図６（ａ）〜（ｃ）、図７（ａ）〜（ｃ）及び図８（ａ）〜（ｃ）として示す。
【００８３】
図３〜図８のＡＤプロットにおいて、１つの点（黒丸、黒三角形、逆黒三角形、バツ印、白丸、白三角形、又は逆白三角形の記号によって表示）は、１体のクローン検体に相当する。プロットグラフの横軸及び縦軸は、それぞれ、１体のクローン検体のＰＣＲ産物について測定されたＦＡＭ蛍光及びＶＩＣ（ＨＥＸ）蛍光の強度（相対値）を示し、蛍光によって検出される塩基の記号を付記してある。図３（ａ）は、プライマープローブセット（１）を用いて配列番号６の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図６（ａ）は、図３（ａ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白丸）及び矢印で表示したものである。図３（ｂ）は、プライマープローブセット（２）を用いて配列番号７の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図６（ｂ）は、図３（ｂ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白三角形）及び矢印で表示したものである。図３（ｃ）は、プライマープローブセット（３）を用いて配列番号８の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図６（ｃ）は、図３（ｃ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白三角形）及び矢印で表示したものである。図４（ａ）は、プライマープローブセット（４）を用いて配列番号９の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図７（ａ）は、図４（ａ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白丸）及び矢印で表示したものである。図４（ｂ）は、プライマープローブセット（５）を用いて配列番号１０の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図７（ｂ）は、図４（ｂ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白丸）及び矢印で表示したものである。図４（ｃ）は、プライマープローブセット（６）を用いて配列番号１１の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図７（ｃ）は、図４（ｃ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白三角形）及び矢印で表示したものである。図５（ａ）は、プライマープローブセット（７）を用いて配列番号１２の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図８（ａ）は、図５（ａ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白三角形）及び矢印で表示したものである。図５（ｂ）は、プライマープローブセット（８）を用いて配列番号１３の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図８（ｂ）は、図５（ｂ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（白三角形）及び矢印で表示したものである。図５（ｃ）は、プライマープローブセット（９）を用いて配列番号１４の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であり、図８（ｃ）は、図５（ｃ）ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１のクローンのプロット点を白抜き記号（逆白三角形）及び矢印で表示したものである。
【００８４】
これらＡＤプロットで示される遺伝子型について、図３（ａ）、図３（ｂ）及び図３（ｃ）を例に挙げて説明する。図３（ａ）は、プライマープローブセット（１）を用いて配列番号６の２０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はシトシン及びアデニンであり、特定される遺伝子型は、シトシンのホモ接合型（Ｃ）、アデニンのホモ接合型（Ａ）、及びシトシンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ａ）である（表１及び５）。使用したプローブ対は、配列番号３５のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＦＡＭを結合させたシトシン用検出プローブと、配列番号３６のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＨＥＸを結合させたアデニン検出用プローブである。よって、当該ＳＮＰ部位の塩基の遺伝子型がシトシンのホモ接合型（Ｃ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光のみが検出され、（ＶＩＣ蛍光として検出される）ＨＥＸ蛍光は検出されないため、グラフの左上隅付近の黒丸の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がアデニンのホモ接合型（Ａ）である場合には、理論上、ＨＥＸ蛍光のみが（ＶＩＣ蛍光として）検出され、ＦＡＸ蛍光は検出されないため、グラフの右下隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がシトシンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ａ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方が検出されるため、グラフの左下隅（縦軸及び横軸の始点）と右上隅との対角線付近（図３（ａ）では右上隅付近）の黒三角形の点としてプロットされる。バツ印の点は、反応液において鋳型であるゲノムＤＮＡに代えて滅菌水（ｄＨ２Ｏ）を添加したサンプルであって、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方とも検出されないネガティブコントロールを表す。
【００８５】
図３（ｂ）は、プライマープローブセット（２）を用いて配列番号７の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はグアニン及びアデニンであり、特定される遺伝子型は、グアニンのホモ接合型（Ｇ）、アデニンのホモ接合型（Ａ）及びグアニンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｇ／Ａ）である（表１及び５）。使用したプローブは、配列番号３９のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＨＥＸを結合させたグアニン用検出プローブと、配列番号４０のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＦＡＭを結合させたアデニン検出用プローブである。よって、当該ＳＮＰ部位の塩基の遺伝子型がアデニンのホモ接合型（Ａ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光のみが検出され、（ＶＩＣ蛍光として検出される）ＨＥＸ蛍光は検出されないため、グラフの左上隅付近の黒丸の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がグアニンのホモ接合型（Ｇ）である場合には、理論上、ＨＥＸ蛍光のみが（ＶＩＣ蛍光として）検出され、ＦＡＸ蛍光は検出されないため、グラフの右下隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がグアニンとアデニンとのヘテロ接合型（Ｇ／Ａ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方が検出されるため、グラフの左下隅（縦軸及び横軸の始点）と右上隅との対角線付近の黒三角形の点としてプロットされる。バツ印の点は、反応液において鋳型であるゲノムＤＮＡに変えて滅菌水（ｄＨ２Ｏ）を添加したサンプルであって、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方とも検出されないネガティブコントロールを表す。
【００８６】
図３（ｃ）は、プライマープローブセット（３）を用いて配列番号８の１０１番目のＳＮＰ塩基の遺伝子型を検出した結果であるから、検出される塩基の種類はシトシン及びチミンであり、特定される遺伝子型は、シトシンのホモ接合型（Ｃ）、チミンのホモ接合型（Ｔ）、及びシトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）である（表１及び５）。使用したプローブは、配列番号４３のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＨＥＸを結合させたチミン検出用プローブと、配列番号４４のオリゴヌクレオチドの５’末端にクエンチャー（Ｅｃｌｉｐｓｅ）を３’末端にＦＡＭを結合させたシトシン検出用プローブである。よって、当該ＳＮＰ部位の塩基の遺伝子型がシトシンのホモ接合型（Ｃ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光のみが検出され、（ＶＩＣ蛍光として検出される）ＨＥＸ蛍光は検出されないため、グラフの左上隅付近の黒丸の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がチミンのホモ接合型（Ｔ）である場合には、理論上、ＨＥＸ蛍光のみが（ＶＩＣ蛍光として）検出され、ＦＡＸ蛍光は検出されないため、グラフの右下隅付近の逆黒三角形の点としてプロットされる。当該ＳＮＰ部位の塩基がシトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）である場合には、理論上、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方が検出されるため、グラフの左下隅（縦軸及び横軸の始点）と右上隅との対角線付近の黒三角形の点としてプロットされる。バツ印の点は、反応液において鋳型であるゲノムＤＮＡに変えて滅菌水（ｄＨ２Ｏ）を添加したサンプルであって、ＦＡＭ蛍光とＨＥＸ蛍光の両方とも検出されないネガティブコントロールを表す。
【００８７】
これら図３（ａ）〜（ｃ）として示した各ＡＤプロットにおいて、ＧＴ１クローンを白抜き記号及び矢印で表示したものが、それぞれ、図６（ａ）〜（ｃ）として示されている。ＡＤプロットで示された遺伝子型をみると、ＧＴ１クローンは、プライマープローブセット（１）を用いた結果を示す図６（ａ）で白丸の点、すなわち、シトシンのホモ接合型（Ｃ）として示され、プライマープローブセット（２）を用いた結果を示す図６（ｂ）で白三角形の点、すなわち、アデニンとグアニンとのヘテロ接合型（Ａ／Ｇ）として示され、プライマープローブセット（３）を用いた結果を示す図６（ｃ）で白三角形の点、すなわち、シトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）として示された。一方、ＧＴ１クローンに対して、プライマープローブセット（１）〜（３）を用いて検出される遺伝子型は、表５に示される通り、それぞれ、シトシンのホモ接合型（Ｃ）、アデニンとグアニンとのヘテロ接合型（Ａ／Ｇ）、シトシンとチミンとのヘテロ接合型（Ｃ／Ｔ）である。つまり、ＡＤプロットで示された遺伝子型と表５に示された遺伝子型とが一致していた。同様に、プライマープローブセット（４）〜（６）を用いた場合でも、図７及び８のＡＤプロットで示された遺伝子型と表５に示された遺伝子型とが一致していた。これらの結果から、リアルタイムＰＣＲ法でプライマープローブセット（１）〜（９）を用いて、ＧＴ１被検体を判別できることが分かる。
【００８８】
以上のように、本発明の品種判別方法を使用して、パラゴムノキの１０品種（ＰＢ２６０、ＰＢ３３０、ＰＢ３４０、ＩＡＮ８７３、ＧＴ１、ＲＲＩＣ１００、ＰＲ１０７、ＰＢ２３５、及びＡＶＲＯＳ２０３７）について、品種判別を行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のパラゴムノキの品種判別方法及びパラゴムノキの品種判別用キットは、パラゴムノキの商業品種の適切な管理及び植林に役立ち、ひいては、パラゴムノキ農園の生産性向上に貢献することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号３５：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３６：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３９：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４０：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号２９：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３０：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３３：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３４：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３７：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号３８：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４１：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４２：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４５：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４６：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号４９：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号５０：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号５３：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号５４：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
【図１】
2017184651.tif 000013
【図２】
2017184651.tif 000014
【図３】
2017184651.tif 000015
【図４】
2017184651.tif 000016
【図５】
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【図６】
2017184651.tif 000018
【図７】
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【図８】
2017184651.tif 000020
【配列表】
2017184651000001.app