(57)【要約】      （修正有）【課題】生体における安全性が高く、かつ長期の体内での耐久性及び形状維持性を有する、膀胱尿管逆流症などの長期残留組織膨隆材による治療を必要とする疾患に有用な長期残留組織膨隆材の提供。【解決手段】グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）架橋体であって、ＧＡＧ分子のカルボキシル基にアミド結合により結合したＳＰＡＡＣ型反応性基を導入し、更にＳＰＡＡＣ反応を行って得る下記架橋：−ＣＯＮＨ−Ｒ１−Ｘ−Ｒ２−ＮＨＣＯ−、又は−ＣＯＮＨ−Ｒ３−Ｘ−Ｒ４−Ｘ’−Ｒ５−ＮＨＣＯ−を有するＧＡＧ架橋体。［式中、Ｒ１〜Ｒ５は、同一又は異なって、アルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基を表し、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；Ｘ及びＸ’は、同一又は異なって、特定の１，２，３−トリアゾール環を有する二価の基を表わす。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のＧＡＧ分子のカルボキシル基と第二のＧＡＧ分子のカルボキシル基との間に下記基：
−ＣＯＮＨ−Ｒ１−Ｘ−Ｒ２−ＮＨＣＯ−、又は
−ＣＯＮＨ−Ｒ３−Ｘ−Ｒ４−Ｘ’−Ｒ５−ＮＨＣＯ−
［式中、
両端の−ＣＯＮＨ及びＮＨＣＯ−はＧＡＧ分子のカルボキシル基を介したアミド結合を意味し、
Ｒ１〜Ｒ５は、同一又は異なって、アルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基を表し、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｘ及びＸ’は、同一又は異なって、式：
【化２８】
2016172783.tif 000029
で示される構造を表し、Ａ、Ｂ結合の向きはどちらでも良く；
ここで、Ａ及びＢは、結合部位を示し；
Ｙ１〜Ｙ６は、同一又は異なって、−ＣＲ６Ｒ６’−、−Ｃ（−Ｒ６）＝、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を表し、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、及び−Ｓ−が隣接することはなく；
Ｒ６及びＲ６’は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基若しくはカルボキシル基を表すか、又は一緒になってオキソ基を形成し、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｒ７は、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を表し、当該アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；又は、
Ｙ１〜Ｙ６のうち隣接する２つの基においては、Ｒ６及びＲ６’は、結合している環原子と一緒になって飽和又は不飽和の３〜６員環を形成することができ、上記結合Ｂは、当該３〜６員環に結合することもできる］
をアミド結合を介して結合したＧＡＧ架橋体（第一のＧＡＧ分子と第二のＧＡＧ分子は同一分子でもよい）。
【請求項２】
ＧＡＧが、式：
【化２９】
2016172783.tif 000030
［式中、
Ｒ８及びＲ９は、水素原子又はヒドロキシル基を表し；ただし、Ｒ８がヒドロキシル基の場合、Ｒ９は水素原子であり、Ｒ８が水素原子の場合、Ｒ９はヒドロキシル基であり；
Ｒ１０は、Ｒ１１又は請求項１に記載の架橋を表し；
Ｒ１１は、ＯＮａ又はＯＨである］、
で示される構造単位の繰り返し構造を基本骨格として有し、Ｒ8がヒドロキシル基である場合には、当該構造単位中のヒドロキシル基の少なくとも１つは、−ＯＳＯ３Ｎａ又は−ＯＳＯ３Ｈである、請求項１に記載のＧＡＧ架橋体。
【請求項３】
下記（１）ＧＡＧ誘導体Ａ、及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂ又は（３）化合物Ｃを含む組成物：
（１）ＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合及び２価のスペーサー基を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体Ａ；
（２）（１）の反応性基と相補的な反応性基が、アミド結合及び２価のスペーサー基を介してカルボキシル基に導入されたＧＡＧ誘導体Ｂ；
（３）（１）の反応性基と相補的な反応性基を少なくとも２つ有する下記構造から定義される化合物Ｃ；
【化３０】
2016172783.tif 000031
［式中、
Ｙは、同一又は異なって、（１）の反応性基と相補的な反応性基であり；
Ｚは、ｎ価のスペーサー基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数である］。
【請求項４】
ｎ価のスペーサー基が、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基から誘導されるｎ価の基であって、当該スペーサー基中の−ＣＨ2−が、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよい、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
化合物Ｃにおけるｎが２である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＳＰＡＡＣ型反応性基及び当該反応性基と相補的な反応性基のいずれか一方がアジド基であり、もう一方が、式：
【化３１】
2016172783.tif 000032
［式中、
ここで、Ｂは、結合部位を示し；
Ｙ１〜Ｙ６は、同一又は異なって、−ＣＲ６Ｒ６’−、−Ｃ（−Ｒ６）＝、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を表し、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、及び−Ｓ−が隣接することはなく；
Ｒ６及びＲ６’は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基若しくはカルボキシル基を表すか、又は一緒になってオキソ基を形成し、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｒ７は、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を表し、当該アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；又は、
Ｙ１〜Ｙ６のうち隣接する２つの基においては、Ｒ６及びＲ６’は、結合している環原子と一緒になって飽和又は不飽和の３〜６員環を形成することができ、上記結合Ｂは、当該３〜６員環に結合することもできる］
で示される環状基である、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
ＳＰＡＡＣ型反応性基又は当該反応性基と相補的な反応性基が、
【化３２】
2016172783.tif 000033
より選択されるシクロオクチン誘導体アミンのアミノ基とＧＡＧのカルボキシル基とのアミド結合によりＧＡＧに導入されている、請求項３〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ＧＡＧが、ヒアルロン酸若しくはその塩又はコンドロイチン硫酸若しくはその塩である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
アジド基の、ＧＡＧ誘導体の二糖繰り返し単位のモル当量に対する置換基導入率が０．１〜８０％である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
アジド基の、ＧＡＧ誘導体の二糖繰り返し単位のモル当量に対する置換基導入率が０．５〜２０％である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
シクロオクチニル基の、ＧＡＧ誘導体の二糖繰り返し単位のモル当量に対する置換基導入率が０．１〜８０％である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
シクロオクチニル基の、ＧＡＧ誘導体の二糖繰り返し単位のモル当量に対する置換基導入率が０．５〜２０％である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＧＡＧの分子量が５〜２，０００ｋＤａである、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＧＡＧの分子量が１０〜５００ｋＤａである、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項３〜１４のいずれか１項に記載の組成物を含む、組織膨隆材。
【請求項１６】
組成物が投与時に液状である、請求項１５に記載の組織膨隆材。
【請求項１７】
泌尿器科領域での膀胱尿管逆流症、腹圧性尿失禁又は便失禁処置治療材である、請求項１５に記載の組織膨隆材。
【請求項１８】
前立腺全摘術後の組織再建のための膨隆材である、請求項１５に記載の組織膨隆材。
【請求項１９】
外科、整形外科又は形成外科領域での組織再建のための組織膨隆材である、請求項１５に記載の組織膨隆材。
【請求項２０】
生体内で架橋させることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の組織膨隆材。
【請求項２１】
注入後の、Ｅ型回転粘度計、標準コーン（１°３４’ｘＲ２４）、２５℃、５ｒｐｍでの粘度値が１Ｐａ・ｓに到達するまでの時間が、１２時間以下である、請求項２０に記載の組織膨隆材。
【請求項２２】
下記：
【化３３】
2016172783.tif 000034
より選択されるシクロオクチン誘導体アミンのアミノ基とＧＡＧのカルボキシル基とがアミド結合したＧＡＧ誘導体。
【請求項２３】
下記：
【化３４】
2016172783.tif 000035
より選択されるシクロオクチン誘導体アミン。
【請求項２４】
下記（１）ＧＡＧ誘導体Ａ、及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂ又は（３）化合物Ｃを含む、組織膨隆材用キット：
（１）ＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合及び２価のスペーサー基を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体Ａ；
（２）（１）の反応性基と相補的な反応性基が、アミド結合及び２価のスペーサー基を介してカルボキシル基に導入されたＧＡＧ誘導体Ｂ；
（３）（１）の反応性基と相補的な反応性基を少なくとも２つ有する下記構造から定義される化合物Ｃ；
【化３５】
2016172783.tif 000036
［式中、
Ｙは、同一又は異なって、（１）の反応性基と相補的な反応性基であり；
Ｚは、ｎ価のスペーサー基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数である］。
【請求項２５】
ｎ価のスペーサー基が、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基から誘導されるｎ価の基であって、当該スペーサー基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよい、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、その原料組成物、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ糖とウロン酸から構成されるグリコサミノグリカンすなわちＧＡＧは、生体適合性に優れるため、医用材料として広く用いられており、これを架橋させることによって得られるＧＡＧハイドロゲルもまた、医用材料として広く用いられている。このうち、ヒアルロン酸を構成するＤ−グルクロン酸のカルボキシル基に架橋性基を結合させたヒアルロン酸を、クリック型反応による架橋に付すことが特許文献１に記載されている。しかし、アジド基とアルキン基を反応させて１，２，３−トリアゾール環を形成させるクリック型反応は、銅触媒を要するため、その毒性により、生体系への利用は大きく制限されている。そこで、銅触媒を必要とせず、環構造が有する歪みにより、速やかかつ高選択的に反応するシクロアルキニレンなどの架橋性基を反応性基として用い、その歪みで架橋反応が速やかに進行するＳＰＡＡＣ（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition）型反応によりヒアルロン酸などの多糖類のハイドロゲルを得ることが、特許文献２に記載されている。しかし、特許文献２のハイドロゲルは、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチル−グルコサミンのアルコール基にアルキレン鎖を解して架橋性基を結合しているため、生体内でのゲル形成後の残存期間が１週間程度と短く、その用途が限られていた。
【０００３】
一方、膀胱尿管逆流症（ＶＵＲ）とは腎臓から尿管、そして膀胱へと流れていく尿が、排尿時に膀胱から尿管、腎臓へと逆もどりする状態をいい、尿管と膀胱のつなぎ目の「バルブ」機能が先天的に不十分なために生じると考えられている。その治療法としては、抗菌薬の投与；膀胱外再建法などの開腹手術のほか；膀胱と尿管の接続部分に、担体ゲルであるヒアルロン酸ナトリウムにデキストラノマービーズを混合させた高粘性ゲルを注入し、その滞留部位の周囲を結合組織にとり囲ませることによって長期の膨隆効果を生じさせる内視鏡治療が行われている（非特許文献１）。しかし、当該高粘性ゲルによる内視鏡治療は、適用できる患者が限定されており、開腹手術に比べて成功率が低く、再発の可能性も高いという問題があった。
【０００４】
また、腹圧性尿失禁（ＳＵＩ）とは、尿道抵抗の低下により、腹圧時の膀胱内圧上昇が尿道抵抗を上回り、膀胱収縮を伴わずに尿が漏れる状態をいい、腹圧がかかる時、例えば咳・くしゃみをする、重いものを持つ、走る・階段を上る時などに、尿意を伴わずに尿が漏れることが特徴的な症状である。一般診療における診断では、症状の評価及び身体的検査が重要であるが、必ずしも自覚症状と病態が一致しないこともあり、専門診療において種々の他覚的検査が必要であるが、重症度評価、治療法選択、治療効果判定においてＱＯＬの評価の重要性が世界的に指摘されつつある一方で、世界共通の重症度分類はいまだ確立されていない状況にもある（非特許文献２）。この腹圧性尿失禁（ＳＵＩ）の治療には、下部尿路リハビリテーション、薬物治療、膣内装具などの保存的治療と、外科的治療に分けられる。一般には、軽症から中等症においては下部尿路リハビリテーション、中等症から重症においては外科的治療が適応される。薬物治療は、その有効性評価がいまだ不十分であることなどの理由から補助的な治療と位置づけられる。軽症から中等症における下部尿路リハビリテーションの代表的なものは骨盤底筋訓練法であり、腹圧性尿失禁においては、軽症例では３０％〜４０％程度の消失が報告されているが、指導にはある程度のノウハウが必要なこと、専門的に指導できるコメディカルスタッフが少ないことなどの理由から普及に至っていない。
【０００５】
腹圧性尿失禁の外科的治療は、大きく恥骨後式手術などの膀胱頚部挙上術、膀胱頚部スリング手術、尿道周囲コラーゲン注入療法に分けられる。外科的治療に関しては、種々の術式の治療成績の比較は、尿失禁改善に関する定義のばらつきが大きく、長期成績を検討した論文が少ない、手術方法が一定でなく術者による変更が多い、無作為比較研究が極めて少ないなどの理由で容易ではないが、１９９７年米国非尿器科学会作成の女性腹圧性尿失禁の外科的治療に関するガイドラインにおいて行われたメタアナリシスによる長期成績の検討、及び無作為比較試験から、４年以上の長期成績では、恥骨後式膀胱頚部挙上術８４％、経膣式膀胱頚部挙上術６７％、前膣壁形成術６１％、スリング手術８３％と示されており、恥骨後式膀胱頚部挙上術とスリング手術が、他の術式に比べ有効であるとされている（非特許文献３）。しかしながら、尿道周囲コラーゲン注入療法よりも低侵襲で簡便な外科的治療法は見出されていない。
【０００６】
この尿道周囲コラーゲン注入療法は、膀胱頸部・近位尿道粘膜下にコラーゲンを注入し、膀胱頸部・近位尿道の密着を図るもので、頚尿道的内視鏡下あるいは傍外尿道口からの針穿刺による注入が行われている。外科的治療の中で最も低侵襲で簡便な方法であるが、再発率が高く、安定した効果を得るためには２回以上の注入を要することが多いとされている（非特許文献２）。実際に、コラーゲンを材料とする尿道周囲注入療法に用いる製品（Coaptite（登録商標）Injectable Implantなど）が存在したが、長期的な治療効果の観点などから市場から撤退しているのが現状である。さらに、この長期的な治療効果をより得るために種々の材料を用いた製品が開発上市されてきた。例えば、カルシウムハイドロキシアパタイトを材料とする製品が見出されたが、コラーゲンの場合と同様の効果であって時間の経過とともに消えていく傾向にあった。カーボンビーズを材料とする製品は、コラーゲンよりも早期の吸収は無かったが、注入に用いる針のゲージがより太いことから、コラーゲンよりも注入が難しい懸念があり、またこの使い勝手の悪さに加え、カーボンビーズ粒子を残してサスペンジョンゲルが最初に注入される傾向にあることが知られている。シリコーンは、美容整形分野の組織膨隆材としては歴史が深いが、腹圧性尿失禁に用いる治療材としては米国では比較的新しく承認されたもので、長期的な効果を示すに至っていない。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）は、肉芽種を形成するプラスチック素材であって組織移行性のリスクから米国未承認であり、エチレンビニルアルコールは、尿道の浸食を含む重篤な合併症が確認されていることから、もはや推奨されていない（非特許文献４）。
以上の通り、泌尿器科の臨床用途において例示したが、組織膨隆材として、使い勝手に優れた物質の性状を有し、低侵襲な方法の一つとして注入が可能で、さらに安全性が高く、かつ長期の耐久性、形状維持性を有する物質は、いまだ創りだされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０−５０２８２４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／１６５４６２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】デフラックス添付文書
【非特許文献２】ＥＢＭに基づく尿失禁診療ガイドライン
【非特許文献３】Female Stress Urinary Incontinence Clinical Guidelines Panel Summary Report on Surgical Management of Female Stress Urinary Incontinence, The Journal of Urology, Volume 158, Issue 3, September 1997, Pages 875-880
【非特許文献４】Injectable Bulking Agents for Incontinence, Author: Raymond Rackley, Chief Editor: Edward David Kim, May 2, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体における安全性が高く、かつ長期に体内に残留し、膀胱尿管逆流症などの長期残留組織膨隆材による治療を必要とする疾患に有用な長期残留組織膨隆材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヒアルロン酸に代表されるＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体をＳＰＡＡＣ反応に付すことによって得られるＧＡＧ架橋体が、生体内で優れた安全性を有するとともに、生体内に長期にわたって安定に残留することを見出し、さらに膀胱尿管逆流症などの長期残留組織膨隆材による治療を必要とする疾患の治療用材料として有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、第一のＧＡＧ分子のカルボキシル基と第二のＧＡＧ分子のカルボキシル基との間に下記基：
−ＣＯＮＨ−Ｒ１−Ｘ−Ｒ２−ＮＨＣＯ−、又は
−ＣＯＮＨ−Ｒ３−Ｘ−Ｒ４−Ｘ’−Ｒ５−ＮＨＣＯ−
［式中、
両端の−ＣＯＮＨ及びＮＨＣＯ−はＧＡＧ分子のカルボキシル基を介したアミド結合を意味し、
Ｒ１〜Ｒ５は、同一又は異なって、アルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基を表し、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｘ及びＸ’は、同一又は異なって、式：
【化１】
2016172783.tif 000002
で示される構造を表し、Ａ、Ｂ結合の向きはどちらでも良く；
ここで、Ａ及びＢは、結合部位を示し；
Ｙ１〜Ｙ６は、同一又は異なって、−ＣＲ６Ｒ６’−、−Ｃ（−Ｒ６）＝、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を表し、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、及び−Ｓ−が隣接することはなく；
Ｒ６及びＲ６’は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基若しくはカルボキシル基を表すか、又は一緒になってオキソ基を形成し、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｒ７は、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を表し、当該アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；又は、
Ｙ１〜Ｙ６のうち隣接する２つの基においては、Ｒ６及びＲ６’は、結合している環原子と一緒になって飽和又は不飽和の３〜６員環を形成することができ、上記結合Ｂは、当該３〜６員環に結合することもできる］
をアミド結合を介して結合したＧＡＧ架橋体（第一のＧＡＧ分子と第二のＧＡＧ分子は同一分子でもよい）に関する。
【００１２】
本発明は更に、下記（１）ＧＡＧ誘導体Ａ、及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂ又は（３）化合物Ｃを含む組成物：
（１）ＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合及び２価のスペーサー基を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体Ａ；
（２）（１）の反応性基と相補的な反応性基が、アミド結合及び２価のスペーサー基を介してカルボキシル基に導入されたＧＡＧ誘導体Ｂ；
（３）（１）の反応性基と相補的な反応性基を少なくとも２つ有する下記構造から定義される化合物Ｃ；
【化２】
2016172783.tif 000003
［式中、
Ｙは、同一又は異なって、（１）の反応性基と相補的な反応性基であり；
Ｚは、ｎ価のスペーサー基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数である］
に関する。
【００１３】
本発明は更にまた、上記組成物を含む組織膨隆材；上記ＧＡＧ誘導体Ａ、及び上記ＧＡＧ誘導体Ｂ又は上記化合物Ｃを含む組織膨隆材用キットにも関する。
本発明は更にまた、上記ＧＡＧ誘導体Ａ又は上記ＧＡＧ誘導体Ｂである、下記：
【化３】
2016172783.tif 000004
より選択されるシクロオクチン誘導体アミンのアミノ基とＧＡＧのカルボキシル基とがアミド結合したＧＡＧ誘導体；ならびに上記ＧＡＧ誘導体を得るための中間体化合物である、
下記：
【化４】
2016172783.tif 000005
より選択されるシクロオクチン誘導体アミンにも関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の組成物をＳＰＡＡＣ型反応に付すことによって得られる本発明のＧＡＧ架橋体は、膀胱尿管逆流症などの長期残留組織膨隆材による治療を必要とする疾患の治療用材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例２１による、混合後の粘度値の経時変化を示す図である。
【図２】実施例２２による、混合後の粘度値の経時変化を示す図である。
【図３】実施例２３による、ゲル固体の歪みと応力の関係を示す図である。
【図４】実施例２４の、形状維持性能試験の結果を示す図である。
【図５】実施例２５の、形状維持性能試験の結果を示す図である。
【図６】２．２％ＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）注入４週後の組織像を示す図である。
【図７】２．２％ＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）注入２４週後の組織像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、アルキル基とは、１〜１４個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいい、アルキレン基とは、１〜１４個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいう。
【００１７】
アルケニル基とは、少なくとも１個の二重結合を有する、２〜１４個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいい、アルケニレン基とは、少なくとも１個の二重結合を有する、２〜１４個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいう。
【００１８】
アルキニル基とは、少なくとも１個の三重結合を有する、２〜１４個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいい、アルキニレン基とは、少なくとも１個の三重結合を有する、２〜１４個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基をいう。
【００１９】
アルコキシ基とは、上述のアルキル基が結合した酸素原子が形成する１価の基をいう。
【００２０】
アリーレン基とは、環構成原子として６〜２０個の炭素原子を有する、２価の単環式又は多環式の芳香族炭化水素基をいう。具体的には、フェニレン（１，２−、１，３−若しくは１，４−フェニレン）、ナフチレンなどを挙げることができる。
【００２１】
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
ＧＡＧ架橋体
上述したように本発明は、第一のＧＡＧ分子のカルボキシル基と第二のＧＡＧ分子のカルボキシル基との間に下記基：
−ＣＯＮＨ−Ｒ１−Ｘ−Ｒ２−ＮＨＣＯ−、又は
−ＣＯＮＨ−Ｒ３−Ｘ−Ｒ４−Ｘ’−Ｒ５−ＮＨＣＯ−
をアミド結合を介して結合したＧＡＧ架橋体であり、式中の各記号も上述のとおりであり、第一のＧＡＧ分子と第二のＧＡＧ分子は同一分子でもよい。
【００２３】
ＧＡＧ
本発明においては、ＧＡＧ、すなわちグリコサミノグリカンは、アミノ糖（グルコサミン、ガラクトサミン）及びウロン酸又はガラクトースからなる二糖の繰り返し構造単位を有する、そのヒドロキシル基が硫酸化されていてもよい、分子量５〜２,０００kDaの酸性多糖である。このようなＧＡＧの例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸が挙げられる。本発明においては、これらの中でもヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びコンドロイチンが好ましく；ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸が更に好ましく；コンドロイチン硫酸が特に好ましい。また、これらのＧＡＧは、薬剤学的に許容しうるその塩であってもよい。このような塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩及びカルシウム塩が挙げられるが、これらの中でナトリウム塩が好ましい。
【００２４】
ＧＡＧの由来は特に限定されず、動物若しくは微生物由来であっても、又は化学合成したものであってもよい。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを使用する場合、鶏冠由来のものを例示することができ、コンドロイチン硫酸を使用する場合、サメ軟骨由来のものを例示することができる。ＧＡＧの分子量は特に限定されないが、その重量平均分子量は、好ましくは５〜２，０００kDa、更に好ましくは１０〜５００kDaである。ＧＡＧとしてヒアルロン酸又は薬剤学的に許容しうるその塩を使用する場合、その重量平均分子量は、好ましくは５〜２，０００kDa、更に好ましくは１０〜５００kDaである。ＧＡＧとしてコンドロイチン硫酸又は薬剤学的に許容しうるその塩を使用する場合、その重量平均分子量は、５〜２００kDa、更に好ましくは１０〜１００kDaである。
【００２５】
本発明のＧＡＧの一態様としては、式：
【化５】
2016172783.tif 000006
［式中、
Ｒ８及びＲ９は、水素原子又はヒドロキシル基を表し；ただし、Ｒ８がヒドロキシル基の場合、Ｒ９は水素原子であり、Ｒ８が水素原子の場合、Ｒ９はヒドロキシル基であり；
Ｒ１０は、Ｒ１１又は先に記載の架橋を表し；
Ｒ１１は、ＯＮａ又はＯＨである］、
で示される構造単位の繰り返し構造を基本骨格として有し、Ｒ8がヒドロキシル基である場合には、当該構造単位中のヒドロキシル基の少なくとも１つは、−ＯＳＯ３Ｎａ又は−ＯＳＯ３ＨであるＧＡＧを好ましく挙げることができる。
【００２６】
架橋
本発明のＧＡＧ架橋体は、第一のＧＡＧ分子のカルボキシル基と第二のＧＡＧ分子のカルボキシル基との間に下記基：
−ＣＯＮＨ−Ｒ１−Ｘ−Ｒ２−ＮＨＣＯ−、又は
−ＣＯＮＨ−Ｒ３−Ｘ−Ｒ４−Ｘ’−Ｒ５−ＮＨＣＯ−
をアミド結合を介して結合しており、第一のＧＡＧ分子と第二のＧＡＧ分子は同一分子でもよい。
【００２７】
ここで、Ｒ１〜Ｒ５は、同一又は異なって、アルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基を表し、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよい。好ましいアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基は、それぞれ１〜１４個、より好ましくは１〜８個の炭素原子から構成される、上記で定義された２価の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基である。
【００２８】
また、Ｘ及びＸ’は、同一又は異なって、式：
【化６】
2016172783.tif 000007
で示される構造を表し、Ａ、Ｂ結合の向きはどちらでも良く；
ここで、Ａ及びＢは、結合部位を示し；
Ｙ１〜Ｙ６は、同一又は異なって、−ＣＲ６Ｒ６’−、−Ｃ（−Ｒ６）＝、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を表し、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、及び−Ｓ−が隣接することはなく；
Ｒ６及びＲ６’は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基若しくはカルボキシル基を表すか、又は一緒になってオキソ基を形成し、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｒ７は、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を表し、当該アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；又は、
Ｙ１〜Ｙ６のうち隣接する２つの基においては、Ｒ６及びＲ６’は、結合している環原子と一緒になって飽和又は不飽和の３〜６員環を形成することができ、上記結合Ｂは、当該３〜６員環に結合することもできる。かかる３〜６員環としては、員数３〜６のシクロアルキル環、フェニル環、又は５〜６員のヘテロアリール環などを挙げることができる。
【００２９】
好ましいＸ及びＸ’としては、下記の基を挙げることができる。
【化７】
2016172783.tif 000008
【００３０】
より好ましいＸ及びＸ’としては、具体的には下記の基を挙げることができる。
【化８】
2016172783.tif 000009
【００３１】
本発明のＧＡＧ架橋体においてより好ましい架橋としては、例えば下記を挙げることができ、ここでｍは、３〜８の整数である（実施例で実際に使用したスペーサー）。
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｘ−ＣＨ2−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ2−Ｏ−Ｘ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−
【００３２】
上記の架橋においては、Ｘは、好ましくは、下記の基である。
【化９】
2016172783.tif 000010
【００３３】
なお、上述したＸ及びＸ’の各種好ましい態様においては、トリアゾリル環部分は、共役しているため、トリアゾリル環部分が有する３個の窒素原子のいずれもが、結合手を有することができる。
【００３４】
導入率
本発明のＧＡＧ架橋体においては、ＧＡＧ構成単位の全てのカルボキシル基が上記の架橋を有している必要はない。ＧＡＧの二糖繰り返し単位のモル当量に対する結合した架橋のモル当量の割合（本明細書では以降「導入率」と呼ばれる）は、ＧＡＧの種類、組織膨隆材として使用するに際しての必要な粘度、必要な応力、投与部位などに応じて適宜決定することができる。例えば、ＧＡＧとしてヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸を使用する場合、ＧＡＧの二糖繰り返し単位のモル当量に対して、導入率は、好ましくは０．１〜８０％、そして更に好ましくは０．５〜２０％である。
【００３５】
組成物
本発明はまた、下記（１）ＧＡＧ誘導体Ａ、及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂ又は（３）化合物Ｃを含む組成物：
（１）ＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合及び２価のスペーサー基を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体Ａ；
（２）（１）の反応性基と相補的な反応性基が、アミド結合及び２価のスペーサー基を介してカルボキシル基に導入されたＧＡＧ誘導体Ｂ；
（３）（１）の反応性基と相補的な反応性基を少なくとも２つ有する下記構造から定義される化合物Ｃ；
【化１０】
2016172783.tif 000011
［式中、
Ｙは、同一又は異なって、（１）の反応性基と相補的な反応性基であり；
Ｚは、ｎ価のスペーサー基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数である］に関する。すなわち、本発明の上記組成物は、（１）ＧＡＧ誘導体Ａ及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂの組み合わせ；又は（１）ＧＡＧ誘導体Ａ及び（３）化合物Ｃの組み合わせ；を含む。
【００３６】
ＧＡＧの種類
本発明の組成物を構成するＧＡＧ誘導体Ａ及びＢにおいては、ＧＡＧとしては、上述のＧＡＧ架橋体について述べたＧＡＧと同じＧＡＧを用いることができ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンを好ましく用いることができ、ヒアルロン酸若しくはその塩及びコンドロイチン硫酸若しくはその塩をより好ましく用いることができ、コンドロイチン硫酸を特に好ましく用いることができる。
【００３７】
２価のスペーサー基及びｎ価のスペーサー
本発明の組成物を構成するＧＡＧ誘導体Ａ及びＢにおいては、ＧＡＧのカルボキシル基が形成するアミド結合とＳＰＡＡＣ型反応性基が、２価のスペーサー基を介して結合している。かかる２価のスペーサー基は、ＳＰＡＡＣ型反応性基と、当該反応性基と相補的な反応性基との反応を阻害するものでない限り、任意の鎖状基を使用することができる。このような２価のスペーサー基としては、上述のＧＡＧ架橋体において使用される基Ｒ1〜Ｒ5、すなわちアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基を用いることができ、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよい。
【００３８】
本発明の組成物を構成する化合物Ｃが有するｎ価のスペーサーも２価のスペーサーと同様であり、アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基から誘導されるｎ価の基を用いることができ、当該基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよい。ここでアリーレンとしては、１，２−、１，３−若しくは１，４−フェニレンなどのフェニレン基を用いることができ、なかでも１，４−フェニレン基を好ましく用いることができる。ここで、ｎは、２又はそれ以上の整数であるが、好ましくは２である。
【００３９】
ＳＰＡＡＣ型反応性基
本発明の組成物においては、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＢ、化合物Ｃは、ＳＰＡＡＣ型反応性基、又は当該反応性基と相補的な反応性基を有する。ＳＰＡＡＣ型反応とは、アジド基とアルキン基を反応させて、望ましくない副生成物を生じさせず、急速かつ簡単に、効率的に１，２，３−トリアゾール環を形成させるクリック型反応において、アルキン基として、銅触媒を必要とせず、環構造が有する歪みのため、速やかかつ高選択的に架橋反応が進行するシクロアルキニレニル基を用いる反応をいう。本発明の組成物において採用しうるＧＡＧ誘導体Ａ及びＢ、化合物Ｃは、任意のＳＰＡＡＣ型反応性基、又は当該反応性基と相補的な反応性基を有することができるが、具体的には、炭素数７〜９、好ましくは炭素数７又は８、より好ましくは炭素数８のシクロアルキニレニル基から誘導される基と、アジド基の組み合わせを用いることができる。当該シクロアルキニレニル基としては、式：
【化１１】
2016172783.tif 000012
［式中、
ここで、Ｂは、結合部位を示し；
Ｙ１〜Ｙ６は、同一又は異なって、−ＣＲ６Ｒ６’−、−Ｃ（−Ｒ６）＝、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、又は−Ｓ−を表し、−ＮＲ７−、＝Ｎ−、−Ｏ−、及び−Ｓ−が隣接することはなく；
Ｒ６及びＲ６’は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基若しくはカルボキシル基を表すか、又は一緒になってオキソ基を形成し、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；
Ｒ７は、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を表し、当該アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基中の−ＣＨ2−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく；又は、
Ｙ１〜Ｙ６のうち隣接する２つの基においては、Ｒ６及びＲ６’は、結合している環原子と一緒になって飽和又は不飽和の３〜６員環を形成することができ、上記結合Ｂは、当該３〜６員環に結合することもできる］
で示される環状基を挙げることができる。かかる３〜６員環としては、員数３〜６のシクロアルキル環、フェニル環、又は５〜６員のヘテロアリール環などを挙げることができる。
【００４０】
かかるＳＰＡＡＣ型反応性基、又は当該反応性基と相補的な反応性基の具体例としては、下記の骨格を有する反応性基とアジド基の組み合わせを好ましく挙げることができる。
【化１２】
2016172783.tif 000013
【００４１】
更により好ましくは、下記の基とアジド基の組み合わせをより好ましく挙げることができる。
【化１３】
2016172783.tif 000014
【００４２】
ＧＡＧへの反応性基の導入率
本発明の組成物を構成するＧＡＧ誘導体Ａ及びＢにおいては、ＳＰＡＡＣ型反応性基と、当該反応性基と相補的な反応性基は、ＧＡＧ構成単位の全てのカルボキシル基に結合している必要はない。ＧＡＧの二糖繰り返し単位のモル当量に対する結合した架橋のモル当量の割合、すなわち導入率は、ＧＡＧの種類、必要な粘度、必要な応力、投与部位などに応じて適宜決定することができる。例えば、ＧＡＧとしてヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸を使用する場合、ＧＡＧの二糖繰り返し単位のモル当量に対して、導入率は、好ましくは０．１〜８０％、そして更に好ましくは０．５〜２０％である。
【００４３】
ＧＡＧ誘導体Ａ及びＢ並びに化合物Ｃ
ＧＡＧ誘導体Ａ及びＢのうち、ＳＰＡＡＣ型反応性基としてシクロアルキニレニル基を有するＧＡＧ誘導体としては、好ましくは下記：
【化１４】
2016172783.tif 000015
より選択されるシクロオクチン誘導体アミンのアミノ基とＧＡＧのカルボキシル基とがアミド結合したＧＡＧ誘導体を挙げることができる。
【００４４】
また、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＢのうち、ＳＰＡＡＣ型反応性基としてアジド基を有するＧＡＧ誘導体としては、好ましくは下記：
Ｎ3−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｎ3−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｎ3−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｎ3−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｎ3−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｎ3−ＣＨ2−［ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2］2-10−ＣＨ2−ＮＨ2；
より選択されるアジドアミンのアミノ基をＧＡＧのカルボキシル基と縮合反応させることにより得られるＧＡＧ誘導体を挙げることができる。
【００４５】
また、化合物Ｃとしては、好ましくは下記の化合物を挙げることができる。
【化１５】
2016172783.tif 000016
【００４６】
ＧＡＧ誘導体Ａ、Ｂ及び化合物Ｃの組成比
本発明の組成物においては、ＧＡＧ誘導体Ａ、Ｂ及び化合物Ｃが有するＳＰＡＡＣ型反応性基、及び当該反応性基と相補的な反応性基は、１：１〜１：４のモル比、好ましくは、１：１のモル比で存在する。
【００４７】
ＧＡＧ誘導体Ａ、Ｂ及び化合物Ｃの製造方法
本発明の組成物に含まれるＧＡＧ誘導体Ａ及びＢは、ＳＰＡＡＣ型反応性基、又は当該反応性基と相補的な反応性基、及びアミノ基がスペーサー基を介して結合した化合物のアミノ基を、ＧＡＧのカルボキシル基と縮合させることによって得ることができる。
【００４８】
例えば、代表的なＳＰＡＡＣ型反応性基であるシクロアルキニリル基及びアミノ基がスペーサー基を介して結合した化合物は、下記に示すように合成することができる。
【００４９】
メチル−６−ブロモ−６−デオキシ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α，Ｄ−グルコピラノシド３は、Organic Letter, 2008, Vol.10, No.14,3097-99に記載の方法により合成する。３を原料とした亜鉛還元／還元的アミノ化反応の後、イミノ基をｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護することで４とする。続いて、オレフィンメタセシス反応によりアザシクロオクテン５とした後、二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）を用いた酸化によりケトン体６とし、６をパラジウム炭素触媒下、水素添加することで７が得られる。７に対してセミカルバジド塩酸塩を付加させた後、二酸化セレンで処理する事で、セレナジアゾール８が得られる。続いて８のＢｏｃ基を酸性条件下で除去することでイミン塩酸塩９へと変換し、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化グリシンと縮合する事で、１０とする。最後に、加熱還流下、トリフェニルフォスフィンで処理することで、Ｆｍｏｃ基を除去しつつアザシクロオクチンへと変換し、塩酸処理することで、ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１が合成される。
【化１６】
2016172783.tif 000017
【００５０】
ＳＰＡＡＣ型反応性基であるシクロアルキニリル基及びアミノ基がスペーサー基を介して結合したその他の化合物もまた、Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 635-638、Bioconjugate Chem. 2010, 21, 2076-2085などに記載された方法、及びそれに準じた方法により容易に合成することができる。
【００５１】
また、ＳＰＡＡＣ型反応性基であるアジド基及びアミノ基がスペーサー基を介して結合した化合物は、市販されているか、又は市販されている化合物から容易に合成することができる。例えば、上述のアジドアミンは、Chem.Commun., 2005, 5390-5392；Chem.Commun., 2006, 2012-2014；J. Org. Chem. 2006,71(17),6697-6700；Tetrahderon Lett., 2001, 2709-2711；J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 12434-12435；Tetrahderon Lett., 2001, 2709-2711に記載の方法、又はそれに準じた方法で容易に合成することができる。
【００５２】
化合物Ｃもまた、市販されているか、又は市販されている化合物から容易に合成することができる。
【００５３】
こうして得られる反応性基を結合させたスペーサー化合物とＧＡＧを、エタノール/水混合溶液中、室温下、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）などの縮合剤を用いた縮合反応に付すことにより、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＢを得ることができる。
【００５４】
更にこうして得られたＧＡＧ誘導体ＡとＢ、又はＧＡＧ誘導体Ａと化合物Ｃを、水中や、水と任意に混合できる有機溶媒と水との混合液中、さらに任意の塩を含む溶液中、５〜６０℃の温度下で、ＳＰＡＡＣ型反応に付すことにより、本発明のＧＡＧ架橋体も得ることができる。
【００５５】
本発明の組成物の用途
本発明の組成物は、必要に応じて生理食塩水、リン酸緩衝液などの溶媒中、ＳＰＡＡＣ型反応に付すことにより、本発明のＧＡＧ架橋体を形成することができる。当該ＧＡＧ架橋体は、生体内で優れた安全性を有するとともに、生体内に長期にわたって安定に残留することができるので、長期残留組織膨隆材による治療を必要とする各種疾患の治療用材料として用いることができる。
かかる用途について具体的に説明すると、本発明の組成物は、例えば、注入後に生体内に長期に残留することができるので、何らかの原因によって失われた、あるいは取り除いた生体組織の機能的な再建を意図する外科又は整形外科領域の用途、失われた組織を審美的に補修する形成外科領域の用途など、各種用途に用いることができる。より具体的には、例えば胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、便失禁（ＦＩ）などを挙げることができる。さらにより具体的な他の用途についてみると、前立腺全摘術は、下腹部に７〜２０ｃｍくらいの皮膚切開を入れ、前立腺と精嚢を摘出し、膀胱と尿道を吻合する手術である。そして手術後は膀胱にカテーテルを挿入し、１週間程度で尿道造影検査後にカテーテルを抜く。この場合、術後合併症として約７０％の患者において排尿障害を伴うことが知られている。これが、前立腺が存在した組織間隙が無くなることによる排尿障害である場合には、本発明の組成物を、尿道を支持する媒体として使用することができる。さらに腹腔鏡下手術において前立腺の全摘術が可能となってきている状況からも、低侵襲手術における摘出手術後の術後合併症を防ぐための組織再建に用いることもできる。
このように、本発明の組成物は、各種領域において、長期残留組織膨隆材として使用することができる。なかでも本発明の組成物は、泌尿器科領域での膀胱尿管逆流症、腹圧性尿失禁、又は便失禁などの組織膨隆材による治療を必要とする疾患の処置；前立腺全摘術後の組織再建；外科、整形外科又は形成外科領域での組織再建；において、長期残留組織膨隆材として使用することができる。
【００５６】
使用に際しては、本発明の組成物の構成成分であるＧＡＧ誘導体Ａ及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃを、そのまま例えば粉状物として、または溶媒に溶解して溶液として生体内に投与することができるが、好ましくは必要に応じて生理食塩水、リン酸緩衝液などの溶媒に溶解して混合して液状の組成物とし、生体内に、注射などの手段によって投与することができる。溶媒に溶解する場合の濃度は、長期残留組織膨隆材としての用途に求められる粘度に応じて適宜決定することができる。すなわち、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃを混合することによりＳＰＡＡＣ反応によりＧＡＧ架橋体の形成が開始され、混合物の粘度が上昇し始めるが、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃの濃度が高い場合には、混合物の粘度も速やかに上昇する。そこで、本発明の組成物を、例えば、膀胱尿管逆流症などの疾患において用いる腹部皮下形状維持材料として用いる場合、粘度値が１Ｐａ・ｓに到達するまでの時間が１２時間以下（測定条件：Ｅ型回転粘度計、標準コーン（１°３４’ｘＲ２４）、２５℃、５ｒｐｍ）であるように、ＧＡＧ誘導体Ａ及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃの濃度を決定することができる。
【００５７】
投与に際しては、ＧＡＧ誘導体Ａ、及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃを、それぞれ粉状物のまま、又は溶解して液状組成物として別々に投与することにより、あるいは投与直前にＧＡＧ誘導体Ａ及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃを混合し、粉状物のまま、又は溶解して液状組成物として投与することにより、生体内でＳＰＡＡＣ反応により架橋させて長期残留組織膨隆材を形成させてもよい。
【００５８】
また、投与量は、膀胱尿管逆流症などの疾患において長期残留組織膨隆材として必要とされる量を投与すればよい。
【００５９】
本発明のキット
本発明の組織膨隆材用キットは、下記の（１）ＧＡＧ誘導体Ａ、及び（２）ＧＡＧ誘導体Ｂ又は（３）化合物Ｃを含む。
（１）ＧＡＧのカルボキシル基にアミド結合及び２価のスペーサー基を介してＳＰＡＡＣ型反応性基を導入したＧＡＧ誘導体Ａ；
（２）（１）の反応性基と相補的な反応性基が、アミド結合及び２価のスペーサー基を介してカルボキシル基に導入されたＧＡＧ誘導体Ｂ；
（３）（１）の反応性基と相補的な反応性基を少なくとも２つ有する下記構造から定義される化合物Ｃ；
【化１７】
2016172783.tif 000018
［式中、
Ｙは、同一又は異なって、（１）の反応性基と相補的な反応性基であり；
Ｚは、ｎ価のスペーサー基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数である］。
本発明の上記キットとしては、例えば、ＧＡＧ誘導体Ａの溶液、及びＧＡＧ誘導体Ｂの溶液又は化合物Ｃの溶液から構成され、それぞれが別々の容器に充填されている形態、あるいはＧＡＧ誘導体Ａの粉末、及びＧＡＧ誘導体Ｂの粉末又は化合物Ｃの粉末、並びに注射用水から構成されており、それぞれが別々の容器に充填されている形態が例示される。使用に際しては、それぞれ粉状物のまま、又は液状組成物として別々に投与することにより、あるいは投与直前にＧＡＧ誘導体Ａ、及びＧＡＧ誘導体Ｂ又は化合物Ｃを混合し、粉状物のまま、又は液状組成物として投与することができる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。また、次の略語は以下に示す意味を表す。
ＨＡ  ヒアルロン酸
ＣＳ  コンドロイチン硫酸
ＤＩＭＡＣ  ジメトキシアザシクロオクチン
ＤＢＣＯ  ジベンジルシクロオクチン 
ＣｕＡＡＣ  銅触媒アジド−アルキン環化付加
ＳＰＡＡＣ  環ひずみにより促進させるアジド−シクロアルキン環化付加
【００６１】
［実施例１］：ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩の調製
下記式：
【化１８】
2016172783.tif 000019
で示されるＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩を、以下の手順に従って調製した。
【００６２】
（工程１）化合物４の合成
【化１９】
2016172783.tif 000020
化合物３は、Organic Letter, 2008, Vol.10, No.14, 3097-99に記載の方法により合成した。
【００６３】
化合物３  ２４．６ｇ（１．００ｅｑ．、８６．１mmol）を、１−プロパノール／水＝１９／１（１５mL）に溶解させた。室温下、Ｚｎ粉末２２５ｇ（４０．０ｅｑ．、３．４５mol）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３００mL）に溶解させたシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）１９．０ｇ（３．５０ｅｑ．、３０２mmol）、アリルアミン１６２mL（２５．０ｅｑ．、２．１７mol）を順次添加し、１１５℃のオイルバス中で１．５時間攪拌しつつ、加熱還流した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて、原料の消失を確認後、冷却した反応液をセライト濾過した。残渣をメタノール（ＭｅＯＨ）で洗浄後、ろ液を減圧濃縮して得られた混合物に対して、メタノール／塩化メチレン／１Ｎ  ＨＣｌ水溶液＝６／２／１（１３５０mL）を添加し、室温下で１時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し有機溶媒を留去した後、２０％水酸化ナトリウム水溶液（１２３mL）と水（３３０mL）を添加し、クロロホルムにて分液抽出を５回行い、集めた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濾過した結果、中間体であるイミン体を得た。
【００６４】
得られたイミン体を１，４−ジオキサン（５００mL）に溶解させ、室温下、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）２０．７ｇ（１．１０ｅｑ．、９４．６mmol）を加えて、１時間攪拌した。ＴＬＣで中間体の消失を確認後、反応液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製し、化合物４を２１．２ｇ（６７．３mmol）、淡黄色透明粘性液体として得た（収率７８％）。
【００６５】
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）：Ｒｆ値＝０．４８（化合物４）
1H-NMR(500MHz, CDCl3,δ) 1.47（9H, s, Boc), 2.17-2.74(1H, m), 3.14(1H, brs), 3.24(1H, dd. 15Hz, 8Hz), 3.44-3.54(7H, m), 3.64(1H, brs), 3.84(1H, brs), 4.02(1H, m), 4.31(1H, brs), 5.12(2H, m), 5.22(1H, d, 5Hz), 5.37(1H, dt, 18Hz, 2Hz), 5.78(1H, m), 5.94(1H, m)
ESI-MS: Calcd for C16H29NO5[M+H]+, 316.2; found 316.6
【００６６】
（工程２）化合物５の合成
【化２０】
2016172783.tif 000021
化合物４  ９．００ｇ（１．００ｅｑ．、２８．５mmol）を、無水ジクロロメタンに溶解させた。４５℃のオイルバス中で、Grubbs第二世代触媒(Bis[4-[Bis(tert-butyl)phosphino]-N, N-Dimethylbenzenamide]dichloropalladium)１．３４ｇ（０．０５５０ｅｑ．、１．５７mmol）を添加し、５０℃のオイルバス中で３５分間、加熱還流させた。ＴＬＣで原料の消失を確認後、反応液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製し、化合物５  ６．６６ｇ（２３．２mmol）を、無色透明粘性液体として得た。（収率８１％）
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）：Ｒｆ値＝０．４２（化合物５）
1H-NMR(500MHz, CDCl3,δ) 1.46-1.51(9H, m, Boc), 2.83-2.95(2H, m), 3.23-3.31(1H, m), 3.42-3.77(9H, m), 4.41-4.44(1.5/2H, m), 4.59(0.5/2H, d, 18Hz), 5.46-5.48(1H, m), 5.56-5.59(1H, m)
ESI-MS: Calcd for C14H25NO5 [M+H]+, 288.2; found 288.6
【００６７】
（工程３）化合物６の合成
【化２１】
2016172783.tif 000022
化合物５  ６．９０ｇ（１．００ｅｑ．、２４．０mmol）に、室温、アルゴンガス雰囲気下、モレキュラーシーブス４Å（粉末状）１０ｇと無水ジクロロメタン（５００mL）を添加し、懸濁溶液とした。４０℃のオイルバス中で、二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）１３．６ｇ（１．５０ｅｑ．、３６．０mmol）を添加し、５時間攪拌した。その後さらに室温で終夜攪拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認後、反応液をろ過し、残渣をクロロホルム（６００mL）で洗浄した。ろ液を減圧濃縮した後、クロロホルム６００mLを添加し、水（３００mL）で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製し、化合物６  ５．６７ｇ（１９．９mmol）を黄色透明粘性液体として得た。（収率８３％）
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）：Ｒｆ値＝０．３８（化合物６）
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.43-1.46(9H, m, Boc), 3.38-3.55(8H, m), 3.67-3.94(3H, m), 4.02-4.06(1H, m), 5.84-5.95(2H, m)
ESI-MS: Calcd for C14H23NO5[M+H]+, 286.2; found 286.6
【００６８】
（工程４）化合物７の合成
【化２２】
2016172783.tif 000023
化合物６  ５．６４ｇ（１．００ｅｑ．、１９．８mmol）をエタノール（５００mL）に溶解させ、５％パラジウム／炭素１．１３ｇを添加し、反応系内を水素ガスで置換した後、室温下、終夜攪拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認後、反応液をセライトろ過し、残渣をメタノール（７００mL）で洗浄した。ろ液を減圧濃縮し、真空乾燥することで、化合物７  ５．６１ｇ（１９．５mmol）を、淡黄色透明粘性液体として得た。（収率９９％）
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）：Ｒｆ値＝０．２９（化合物７）
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45-1.47(9H, m, Boc), 1.99-2.18(2H, m), 2.34-2.5(2H, m), 2.71-2.76(0.6/1H, m), 2.81-2.89(1H, m), 2.95(0.4/1H, dt, 14Hz, 5Hz), 3.33-3.34(3H, m), 3.55-3.57(3H, m), 3.59-3.64(0.4/1H, m), 3.69-3.89(3H, m), 3.95-3.96(0.6/1H, m)
ESI-MS: Calcd for C14H25NO5 [M+H]+, 288.2; found 288.6
【００６９】
（工程５）化合物８の合成
【化２３】
2016172783.tif 000024
化合物７  ３．９８ｇ（１．００ｅｑ．、１３．９mmol）を、エタノール／水＝１／１中１００mMのアニリン溶液１１０mL（０．７８９ｅｑ．、１１．０mmol）に溶解させ、セミカルバジド塩酸塩１５．５ｇ（１０．０ｅｑ．、１３９mmol）、酢酸１１．２mL（１４．０ｅｑ．、１９５mmol）を添加し、室温下、８．５時間攪拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認後、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液１９２mLで、反応液のｐＨを約６に調整した。反応液中のエタノールを減圧留去し、酢酸エチル（４００mL）を添加し、水（１００mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥することで、セレナジアゾールの中間体を粗製物として得た。
【００７０】
得られた中間体を１，４−ジオキサン（５０mL）に溶解させ、二酸化セレン７．１１ｇ（４．６０ｅｑ．、６．４１mmol）を１，４−ジオキサン／水＝１／１（３０mL）に溶解させた溶液を、室温下、４．５時間かけてゆっくり滴下投入した。その後、室温下、４日間反応させた後、反応液を減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（４００mL）を添加し、水（１００mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）で精製する事により、化合物８  ４．４９ｇ（１１．９mmol）を、茶色透明粘性液体として得た（収率８６％）。
【００７１】
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）：Ｒｆ値＝０．５３（化合物８）
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.46-1.49(9H, m, Boc), 2.37(0.4/1H, dd, 14Hz, 10Hz), 2.43(0.6/1H, dd, 15Hz, 10Hz), 2.88-2.98(1H, m), 3.31-3.41(5H, m), 3.57(3H, s), 3.77(0.6/1H, dd, 15Hz, 5Hz), 3.89(0.4/1H, dd, 14Hz, 5Hz), 4.08-4.16(1H, m), 4.24(0.6/1H, ddd, 14Hz, 5Hz, 4Hz), 4.36-4.39(0.4/1H, m), 5.83-5.41(1H, m)
ESI-MS: Calcd for C14H23N3O4Se [M+H]+, 378.1; found 378.6
【００７２】
（工程６）化合物９の合成
【化２４】
2016172783.tif 000025
化合物８  ２．９９ｇ（１．００ｅｑ．、７．９５mmol）に、氷浴下、４Ｎ塩化水素／１，４−ジオキサン（１２mL）を添加し、室温で１．５時間攪拌した。反応液は、赤白色の懸濁溶液となった。ＴＬＣで原料の消失を確認後、反応液にヘキサン（８０mL）を添加し、上清を除去する操作を４回行い、さらにジエチルエーテル（８０mL）を添加し、上清を除去する操作を３回繰り返し、沈殿を洗浄した。得られた沈殿を真空乾燥することで、目的物９  ２．５９ｇ（８．２８mmol）を赤白色粉体として得た（収率：定量的）。
1H-NMR(500MHz,D2O,δ) 3.34(3H, s, OMe), 3.39-3.45(1H, m), 3.48-3.57(5H, m), 3.67-3.73(2H, m), 3.91-3.97(1H, m), 4.23(1H, t, 6Hz), 5.58(1H, d, 6Hz)
ESI-MS: Calcd for C9H15N3O2Se [M+H]+, 278.0; found 278.2
【００７３】
（工程７）化合物１０の合成
【化２５】
2016172783.tif 000026
Ｆｍｏｃ−グリシン５７１mg（１．２０ｅｑ．、１．９２mmol）を、メタノール／水＝９／１（４mL）に溶解させ、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３８４μＬ、１．２０ｅｑ．、１．９２mmol）を添加した。この溶液に、室温下、化合物９  ５００mg（１．００ｅｑ．、１．６０mmol）のメタノール／水＝９／１（６mL）溶液を添加し、さらにメタノール／水＝１／１（５００μＬ）を追加した。４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）５３２mg（１．２０ｅｑ．、９．４０mmol）及び５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ７付近になるまで添加し、室温下、３時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、残液に酢酸エチル（３００mL）を添加し、１Ｎ塩酸（１００mL）で２回、さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝３／２〜２／１）で精製し、化合物１０  ６８７mg（１．２４mmol）を、淡黄白色アモルファスとして得た（収率７７％）。
ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝３／１）：Ｒｆ値＝０．３７（化合物１０）
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 2.57(0.4/1H, dd, 14Hz, 5Hz), 3.24-3.60(10H, m), 3.68-3.70(0.6/1H, m), 3.82-4.14(3H, m), 4.22-4.50(4H, m), 5.40-5.48(1H, m, NH), 5.67(0.6/1H, brs, NH)5.84(0.4/1H, brs, NH), 7.29-7.33(2H, m), 7.38-7.42(2H, m), 7.16(2H, t, 7Hz), 7.76(2H, dd, 8Hz, 4Hz)
ESI-MS: Calcd for C26H28N4O5Se [M+H]+, 557.1; found 557.1
【００７４】
（工程８）ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１の合成
【化２６】
2016172783.tif 000027
化合物１０  ２．２０ｇ（１．００ｅｑ．、３．９６mmol）を無水トルエン（４４mL）に溶解させ、トリフェニルフォスフィン１．８７ｇ（１．８０ｅｑ．、７．１４mmol）を室温下、添加した。１３０℃のオイルバスで、２０時間加熱還流させた後、反応液を減圧濃縮した。残液を酢酸エチル（６０mL）で希釈し、水（３０mL）で５回抽出した。水層を減圧濃縮し、真空乾燥する事で、ＤＩＭＡＣ−アミンを黄色粘性液体として得た。
【００７５】
得られたアミン体をジエチルエーテル（２５mL）に溶解させ、溶液を激しく攪拌し、４Ｎ塩化水素／１，４−ジオキサン（１mL）を添加することで、沈殿を析出させた。上清を除去し、ジエチルエーテル（４０mL）での洗浄を３回行い、沈殿を真空乾燥する事で、ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩５７４mg（２．１９mmol）を、淡赤白色粉末として得た（収率５５％）。
1H-NMR(500MHz,D2O,δ) 2.24-2.39(1H, m), 2.60-2.81(1H, m), 3.16(1H, dd, 15Hz, 9Hz), 3.37-3.44(4H, m), 3.55-3.60(3H, m, OMe), 3.69-3.83(1H, m), 3.93-4.06(2H, m), 4.09-4.20(2H, m), 4.27-4.38(1H, m)
ESI-MS: Calcd for C11H18N2O3 [M+H]+, 227.1; found 227.1
【００７６】
［実施例２］：ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩のヒアルロン酸への導入
ヒアルロン酸（ＨＡ：１，１００ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、鶏冠由来、生化学工業株式会社）３００mgを注射用水（ＷＦＩ）３０mL及びエタノール（ＥｔＯＨ）３０mLに溶解させ、実施例１、工程８で調製したＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１を１９．７mg（０．１００ｅｑ．、７５．０μmol）加えた。さらに、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ、株式会社トクヤマ社）３５．１mg（０．１６９ｅｑ．、１２７μmol）を加えて終夜攪拌した。その後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液４．５０mLを加えて４時間攪拌した後、５０％酢酸水溶液１２９μＬ、塩化ナトリウム１．５０ｇ／注射用水４．９２mLを順次加え、エタノールを添加し沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を２回、ジエチルエーテルでの洗浄を１回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸２２０mgを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中）にて、導入率を算出したところ、１０％であった。
なお、導入率は、原料ＧＡＧ骨格由来ピークの積分値と導入された化合物由来ピークの積分比により、算出した。
【００７７】
［実施例３］
原料ヒアルロン酸の分子量を８００ｋＤａとした以外は、実施例２と同様の方法でＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸２５２mgを得た。導入率は、１２％であった。
【００７８】
［実施例４］
原料ヒアルロン酸の分子量を６００ｋＤａとした以外は、実施例２と同様の方法でＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸２４１mgを得た。導入率は、７％であった。
【００７９】
［実施例５］
原料ヒアルロン酸の分子量を１７０ｋＤａとした以外は、実施例２と同様の方法でＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸２３７mｇを得た。導入率は、１０％であった。
【００８０】
［実施例６］：ＤＢＣＯ−アミン塩酸塩のヒアルロン酸への導入
以下の構造式：
【化２７】
2016172783.tif 000028
で示されるＤＢＣＯ−Ｃ２−アミン（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ 社）を、以下の手順に従って、ヒアルロン酸にアミド結合を形成させることにより導入した。
【００８１】
ヒアルロン酸（２５０ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、鶏冠由来、生化学工業株式会社）５００mgを注射用水（ＷＦＩ）５０mL、及びエタノール（ＥｔＯＨ）５０mLに溶解させ、ＤＢＣＯ−Ｃ２−アミン１７．２mg（０．０５０ｅｑ．、６２．５μmol）、１Ｎ塩酸６２．５μＬ（０．０５０ｅｑ．、６２．５μmol）を加えた。さらに、ＤＭＴ−ＭＭ  ２９．２mg（０．０８５ｅｑ．、１０６μmol）を加えて終夜攪拌した。その後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液７．５mLを加えて４時間攪拌した後、５０％酢酸水溶液で中和し、塩化ナトリウム２．５ｇ／注射用水８．２mLを順次加え、エタノールを添加し沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を２回、ジエチルエーテル洗浄を１回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするＤＢＣＯ導入ヒアルロン酸４９８mgを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中）にて、導入率を算出したところ、５％であった。
【００８２】
［実施例７］
ＤＢＣＯ−Ｃ２−アミンの添加量を３４．４mg（０．１００ｅｑ．、１２５μmol）、１Ｎ塩酸の添加量を１２５μＬ（０．１００ｅｑ．、１２５μmol）、ＤＭＴ−ＭＭの添加量を５８．４mg（０．１６９ｅｑ．、２１１μmol）とした以外は、実施例６と同様の方法で、目的とするＤＢＣＯ導入ヒアルロン酸５２１mgを得た。導入率は、１０％であった。
【００８３】
［実施例８］：アジド−アミン塩酸塩のヒアルロン酸への導入
ＨＡ（１，１００ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、鶏冠由来、生化学工業株式会社）５００mgを注射用水（ＷＦＩ）５０mL、及びエタノール（ＥｔＯＨ）５０mLに溶解させ、２−アジドエタンアミン塩酸塩６１．０mg（０．４００ｅｑ．、４９８μmol）を加えた。さらに、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）２３４mg（０．６７８ｅｑ．、８４５μmol）を加えて終夜攪拌した。その後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液７．５mLを加えて４時間攪拌した後、５０％酢酸水溶液２１５μＬ、塩化ナトリウム２．５ｇ／注射用水８．２mLを順次加え、エタノールを添加し沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を３回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするアジド導入ヒアルロン酸５４７mgを得た。導入率は、アジド基をＳＰＡＡＣでクマリン標識した誘導体をＧＰＣ−ＨＰＬＣで解析する事により算出した。導入率は、２２％であった。
【００８４】
［実施例９］
２−アジドエタンアミン塩酸塩の添加量を４５．８mg（０．３００ｅｑ．、３７４μmol）とした以外は、実施例８と同様の方法で、アジド導入ヒアルロン酸５３１mgを得た。導入率は、２１％であった。
【００８５】
［実施例１０］
２−アジドエタンアミン塩酸塩の添加量を３０．５mg（０．２００ｅｑ．、２４９μmol）とした以外は、実施例８と同様の方法で、アジド導入ヒアルロン酸５３５mgを得た。導入率は、１６％であった。
【００８６】
［実施例１１］
原料ヒアルロン酸を１７０ｋＤａ、２−アジドエタンアミン塩酸塩の添加量を１５．３mg（０．１００ｅｑ．、１２５μmol）とした以外は、実施例８と同様の方法で、アジド導入ヒアルロン酸を４９０mgを得た。導入率は１０％であった。
【００８７】
［実施例１２］
アミンを１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン塩酸塩１２．７mg（０．１００ｅｑ．、５０．０μmol）とした以外は、実施例１１と同様の方法でアジド基導入ヒアルロン酸２３１mgを得た。導入率は、４％であった。
【００８８】
［実施例１３］
アミンをＯ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール塩酸塩２３．７mg（０．１００ｅｑ．、５０．０μmol）とした以外は、実施例１１と同様の方法でアジド基導入ヒアルロン酸２３１mgを得た。導入率は、４％であった。
【００８９】
［実施例１４］：ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（ＣＳ：３６ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、サメ軟骨由来、生化学工業株式会社）５００mgを注射用水（ＷＦＩ）５mL、及びエタノール（ＥｔＯＨ）５mLに溶解させ、実施例１の工程８で調製したＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１を１０３mg（０．４００ｅｑ．、３９１μmol）加えた。さらに、ＤＭＴ−ＭＭ  １８４mg（０．６７８ｅｑ．、６６６μmol）を加えて終夜攪拌した。その後、１０％炭酸ナトリウム水溶液５mLを加えて４時間攪拌した後、５０％酢酸水溶液１mL、塩化ナトリウム０．５ｇを順次加え、エタノールと８５％エタノール／注射用水を用いて、沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を２回、ジエチルエーテルでの洗浄を１回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするＤＩＭＡＣ導入コンドロイチン硫酸３８８mgを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中）にて、導入率を算出したところ、４２％であった。
【００９０】
［実施例１５］
ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１の添加量を７７．１mg（０．３００ｅｑ．、２７９μmol）、ＤＭＴ−ＭＭの添加量を１３８mg（０．５０９ｅｑ．、５００μmol）とした以外は、実施例１４と同様の方法で、目的とするＤＩＭＡＣ導入コンドロイチン硫酸４８７mgを得た。導入率は、３３％であった。
【００９１】
［実施例１６］
ＤＩＭＡＣ−アミン塩酸塩１１の添加量を５１．４mg（０．２００ｅｑ．、１９６μmol）、ＤＭＴ−ＭＭの添加量を９１．８mg（０．３３９ｅｑ．、３３１μmol）とした以外は、実施例１４と同様の方法で、目的とするＤＩＭＡＣ導入コンドロイチン硫酸４８７mgを得た。導入率は、２１％であった。
【００９２】
［実施例１７］：ＤＢＣＯ−Ｃ２−アミン塩酸塩のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（３６ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、サメ軟骨由来、生化学工業株式会社）３ｇを注射用水３０mL、及びエタノール３０mLに溶解させ、ＤＢＣＯ−Ｃ２−アミン１６１mg（０．１００ｅｑ．、５８３μmol）、１Ｎ塩酸５８３μＬ（０．１００ｅｑ．、５８３μmol）を加えた。さらに、ＤＭＴ−ＭＭ２７６mg（０．１６９ｅｑ．、９９６μmol）を加えて終夜攪拌した。その後、１０％炭酸ナトリウム水溶液３０gを加えて２時間攪拌した後、５０％酢酸水溶液６mL、塩化ナトリウム３．０ｇを順次加え、エタノールと８５％エタノール／注射用水を用いて、沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を２回、ジエチルエーテルでの洗浄を１回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸３．１４gを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中）にて、導入率を算出したところ、１１％であった。
【００９３】
［実施例１８］
ＤＢＣＯ−Ｃ２−アミンの添加量を８１．４mg（０．１００ｅｑ．、２９５μmol）、１Ｎ塩酸添加量を２９５μＬ（０．０５００ｅｑ．、２９５μmol）、ＤＭＴ−ＭＭ添加量を１３７mg（０．０８４８ｅｑ．、４９６μmol）とした以外は、実施例１７と同様の方法で、目的とするＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸２．９５gを得た。導入率は、６％であった。
【００９４】
［実施例１９］：アジド−アミン塩酸塩のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（３６ｋＤａ、カルボキシル基１．００ｅａ、サメ軟骨由来、生化学工業株式会社）３．００gを注射用水３０mL、及びエタノール３０mLに溶解させ、２−（２−アジドエトキシ）エタンアミン塩酸塩７３．１mg（０．１００ｅｑ．、５９６μmol）を加えた。さらに、ＤＭＴ−ＭＭ  ２７５mg（０．１６９ｅｑ．、９９４μmol）を加えて終夜攪拌した。塩化ナトリウム３．００gを加え、エタノールを用いて、沈殿を形成させた。上清を除去し、９０％エタノール／注射用水での洗浄を２回、エタノールでの洗浄を３回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥し、目的とするアジド導入コンドロイチン硫酸２．６６gを得た。導入率は、アジド基をＣｕＡＡＣでクマリン標識した誘導体をＧＰＣ−ＨＰＬＣで解析する事により算出した。導入率は、１１％であった。
【００９５】
［実施例２０］
２−（２−アジドエトキシ）エタンアミン塩酸塩の添加量を３６．０mg（０．０５００ｅｑ．、２９４μmol）、ＤＭＴ−ＭＭの添加量を１３９mg（０．０８４８ｅｑ．、５０１μmol）とした以外は、実施例１９と同様の方法で、目的とするアジド導入コンドロイチン硫酸２．７４gを得た。導入率は、５％であった。
【００９６】
［実施例２１］：混合後の増粘特性（ＣＳ＋ＣＳ）
以下の実験手順により、アジド導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１９由来）溶液ＡとＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１７由来）溶液Ｂの混合後の増粘特性を調査した。
（１）２０mMリン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ２ＨＰＯ４＋ＮａＨ２ＰＯ４＋ＮａＣｌ）（ｐＨ６．５）中、それぞれ下記濃度の溶液Ａと溶液Ｂを調製した。
１．１０wt％、１．７５wt％、２．２０wt％、３，５０wt％、４．４０wt％
（２）Voltex（Scientific Industries社製）により溶液Ａ及びＢを１：１(v/v)で均一に混合した。
（３）Ｅ型回転粘度計ＴＶ−Ｌ（コーン：ＣＯＲＤ−１、１°３４’ｘＲ２４）（東機産業社製）、２５℃、５rpmでの粘度値（Ｐａ・ｓ）の経時変化を追跡した。
結果を図１に示す。濃度に依存した、粘度値上昇効率の向上が確認された。
【００９７】
［実施例２２］
アジド導入コンドロイチン硫酸の導入率を５％(実施例２０由来)、ＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸の導入率を６％(実施例１８由来)として、濃度を１．７５wt％、２．２０wt％、３．５０wt％、４．４０wt％、７．００wt％とした以外は、実施例２１と同様の方法で、混合後の増粘特性を調査した。
結果を図２に示す。実施例２２と同様に、濃度に依存した、粘度値上昇効率の向上が確認された。
【００９８】
［実施例２３］：混合後の濃度と物理的性質の関係（ＣＳ＋ＣＳ）
以下の実験手順により、アジド導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１９由来）溶液ＡとＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１７由来）溶液Ｂの混合(１：１(v/v))により得られるゲル固体の物性測定を実施した。
（１）２０mM  リン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ２ＨＰＯ４＋ＮａＨ２ＰＯ４＋ＮａＣｌ）（ｐＨ６．５）中、それぞれ下記濃度の溶液Ａと溶液Ｂを調製した。
１．１０wt％、１．７５wt％、２．２０wt％、３，５０wt％、４．４０wt％、７．００wt％
（２）Voltex（Scientific Industries社製）により溶液Ａ、Ｂを１：１(v/v)で均一に混合した。
（３）２５mL遠沈管に混合液を１．８ｇ注入し、室温で終夜静置した。
（４）テクスチャーアナライザー（TA.XT plus）（Stable Micro Systems社製）、Ｐ／０．５ＨＳプローブ、5ｋｇロードセルにより、歪みと応力の関係を調査した。
ラット筋肉又はラット脂肪との比較と共に、結果を図３に示す。実施例２１と相関して、濃度が高いほど、歪みに対する高い応力が観察された。応力は、ラット筋肉と比較しても顕著に高い値といえる。この応力は、形状維持性能に関連した重要な指標といえる。
【００９９】
［実施例２４］：ラット腹部皮下形状維持性能評価試験（in vivo）ＨＡ、ＣＳ
以下の方法により、ラット腹部皮下での形状維持性能を評価した。
（１）雄性Ｗｉｓｔａｒラット（６週齢）に対して、イソフルラン麻酔下、被験物質を４００μＬ／siteにて腹部皮下に注入した。
（２）ハイトゲージを用い経時的に膨隆部の高さを測定し、形状維持能の指標とした。
＜形状維持性能試験１：注入４週＞
被験物質は以下の通りである。各物質とも、均一に混合した後、ラット腹部皮下に注入して、膨隆部の高さの変化を観察した。
（１）１．７５wt％アジド導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１９由来）生理食塩水溶液と１．７５wt％のＤＢＣＯ導入コンドロイチン硫酸（導入率１１％、実施例１７由来）生理食塩水溶液の１：１（v/v）均一混合物［１．７５％ＣＳ（Ｎ３＋ＤＢＣＯ）］。
（２）２．２０wt％アジド導入ヒアルロン酸(１７０kDa)（導入率１０％、実施１１由来）生理食塩水溶液と、２．２０wt％  ＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸(１７０kDa)（導入率１０％、実施例５由来）生理食塩水溶液の１：１（v/v）均一混合物［２．２０wt％ＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）］
（３）１．００wt％ヒアルロン酸水溶液
結果を図４に示す。（３）の１．００wt％ヒアルロン酸水溶液と比較して、（１）（２）の被験物質は、投与２８日後であっても顕著に高い形状維持性能を示した。
【０１００】
［実施例２５］
＜形状維持性能試験２：注入２４週＞
実施例２５と同様の方法により、ラット腹部皮下での形状維持性能を評価した。被験物質は以下の通りである。各物質とも、１：１（v/v）で均一に混合した後注入した。
（１）２．２０wt％アジド導入ヒアルロン酸(１７０kDa)（導入率１０％、実施１１由来）生理食塩水溶液と、２．２０wt％  ＤＩＭＡＣ導入ヒアルロン酸（導入率１０％、実施例５由来）生理食塩水溶液の１：１（v/v）均一混合物［２．２０wt％ＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）］
（２）１．００wt％ヒアルロン酸水溶液
結果を図５に示す。（２）の１．００wt％ヒアルロン酸水溶液と比較して、（１）の被験物質は、２４週という長期間でも顕著に高い形状維持性能を示した。
【０１０１】
［実施例２６］：ラット腹部皮下形状維持性能評価試験（in vivo）での生体適合性評価結果
実施例２５の形状維持性能試験２に記載のラット腹部皮下形状維持性能評価において、注入２日後、４週後、２４週後に、２．２wt％ＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）注入部の皮膚を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で浸漬固定後、パラフィン包埋し、ＨＥ染色標本を作製した。その後、光学顕微鏡により病理組織学的に検査した。
その結果、注入２日後では、生理食塩水の注入でも見られるような、ごく軽度の急性炎症反応が認められるのみであった。注入４週後及び注入２４週後では、注入物は線維で被包化され、炎症性の反応など、異物反応及び組織反応はいずれも認められなかった（図６及び図７）。以上から、２．２％wtＨＡ（Ｎ３＋ＤＩＭＡＣ）は、急性期でも慢性期でも生体適合性は良好であると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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