(57)【要約】【課題】  可溶性の酸化剤を添加することなく不溶性の化合物を用いてチオールのジスルフィド結合を形成させ、前記不溶性の化合物の再利用を可能にするジスルフィド結合形成方法や該ジスルフィド結合形成方法に用いるカラムやリアクターを提供する。【解決手段】  チオールのジスルフィド結合形成にカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を用いる。ジスルフィド結合形成には、ＣＮＴとチオールを溶液中で混合させる方法のほか、ＣＮＴを固定した部材を具備したカラムやリアクターにチオールを流す方法を用いる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオールのジスルフィド結合を形成させる方法において、チオールとカーボンナノチューブを共存させることを特徴とするチオールのジスルフィド結合形成方法。
【請求項２】
チオールとカーボンナノチューブを混合した溶液を用いることを特徴とする請求項１に記載のジスルフィド結合形成方法。
【請求項３】
前記カーボンナノチューブは、担体に固定化されたものであり、かつ、カラムに具備されていることを特徴とする請求項１に記載のジスルフィド結合形成方法。
【請求項４】
前記カーボンナノチューブは固体表面に固定化されたものであり、かつ、リアクターに具備されていることを特徴とする請求項１に記載のジスルフィド結合形成方法。
【請求項５】
請求項３に記載のジスルフィッド結合形成方法に用いるカラムであって、チオールの供給手段と、カーボンナノチューブが固定された担体を具備することを特徴とするカラム。
【請求項６】
請求項４に記載のジスルフィッド結合形成方法に用いるリアクターであって、チオールの供給手段と、カーボンナノチューブが固定された担体を具備することを特徴とするリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブ（以下、単に「ＣＮＴ」とする）を用いてチオールのジスルフィド結合を形成させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオールはタンパク質やペプチドなどを含めたチオール基を有する化合物の総称であり、チオール基同士の酸化反応によって形成されるジスルフィド結合はタンパク質やペプチドの立体構造の安定化に寄与している。ジスルフィド結合の形成技術はタンパク質のリフォールディング（特許文献１、特許文献２）など、生物学的製剤などの生産技術に利用可能である。
【０００３】
従来のチオールのジスルフィド結合形成法としては、低分子化合物や酵素などを用いた酸化反応が主流である。これらの酸化剤をチオールと混合することでジスルフィド結合を形成させる手法のほか（特許文献３）、カラムなどのインラインのシステムなどを用いてジスルフィド結合を形成させる手法が考案されている（特許文献４、５、６）。その他に、マイクロ波を用いる方法も開発されている（特許文献７）。
【０００４】
従来のジスルフィド結合を形成させる化合物（酸化剤など）の多くは可溶性であるため回収・再利用が難しい。したがって、これらの化合物ではジスルフィド結合形成反応を連続的に進めることや再利用することが困難であり、生産性とコスト削減には限界がある。また、マイクロ波照射によるジスルフィド結合形成方法では溶液の温度上昇によるタンパク質やペプチドの変性や化学変化の可能性を捨てきれない。
【０００５】
このような現状から、固体の部材などへ固定化可能で、かつチオール基のジスルフィド結合を促進させることが可能な不溶性の化合物が望まれている。また、再利用を可能にするために、これらの化合物の状態はジスルフィド結合形成反応後に始状態に戻る（触媒反応やそれに類する反応を有する）ことが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５１６８６０４号公報
【特許文献２】特表平１１−５０７０３７号公報
【特許文献３】特開２０１２−１１６８１２号公報
【特許文献４】特許第５１３７０３８号公報
【特許文献５】特開２００３−１０２４９４号公報
【特許文献６】特許第５０８３８４０号公報
【特許文献７】特開２０１０−２１５５３７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Langmuir 31, (2015) 8923-8929
【非特許文献２】Synth. Met. 103, (1999) 2555-2558
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 126, (2004) 15490-15494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述のとおり、チオールのジスルフィド結合形成反応を繰り返して利用するためには、ジスルフィド結合形成能を有する不溶性の化合物とそれを用いたジスルフィド結合形成法が求められている。
【０００９】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、可溶性の酸化剤を添加することなく不溶性の化合物を用いてチオールのジスルフィド結合を形成させ、前記不溶性の化合物の再利用を可能にするジスルフィド結合形成方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、チオールのジスルフィド結合形成反応を連続的に進めるために、ジスルフィド結合形成能を有する不溶性の化合物を用いたジスルフィド結合反応用のカラムやリアクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、（Ａ）ＣＮＴがチオールのジスルフィド結合形成を促進させる、（Ｂ）ジスルフィド結合形成には、ＣＮＴとチオールを溶液中で混合させる方法のほか、ＣＮＴをカラムクロマトグラフィの担体に固定してカラムにチオールを流す方法等が利用可能であるなどの知見を得た。
【００１１】
本発明はかかる新規な知見に基づいてなされたものであって、この出願によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞チオールのジスルフィド結合を形成させる方法において、チオールとカーボンナノチューブを共存させることを特徴とするチオールのジスルフィド結合形成方法。
＜２＞チオールとカーボンナノチューブを混合した溶液を用いることを特徴とする＜１＞に記載のジスルフィド結合形成方法。
＜３＞前記カーボンナノチューブは、担体に固定化されたものであり、かつ、カラムに具備されていることを特徴とする＜１＞に記載のジスルフィド結合形成方法。
＜４＞前記カーボンナノチューブは固体表面に固定化されたものであり、かつ、リアクターに具備されていることを特徴とする＜１＞に記載のジスルフィド結合形成方法。
＜５＞＜３＞に記載のジスルフィッド結合形成方法に用いるカラムであって、チオールの供給手段と、カーボンナノチューブが固定された担体を具備することを特徴とするカラム。
＜６＞＜４＞に記載のジスルフィッド結合形成方法に用いるリアクターであって、チオールの供給手段と、カーボンナノチューブが固定された担体を具備することを特徴とするリアクター。
本発明は、次のような実施態様を含むことができる。
＜７＞チオールを含み、ｐＨが３〜５の溶液を用いることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のジスルフィド結合形成方法。
＜８＞カーボンナノチューブがＨｉＰｃｏ法、ＡＰＪ法、及び／又は、ｅＤＩＰＳ法のものである＜１＞〜＜４＞、＜７＞のいずれか１項に記載のジスルフィド結合形成方法。
＜９＞前記担体が、シリカゲル、デキストラン系ゲル、アガロースゲル、デンプンゲル、アクリルアミドゲル、又は、これらゲルの２種以上の混合物である＜５＞に記載のカラム。
＜１０＞前記担体が、シリカゲル、デキストラン系ゲル、アガロースゲル、デンプンゲル、アクリルアミドゲル、又は、これらゲルの２種以上の混合物である＜６＞に記載のリアクター。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、不溶性の化合物としてのＣＮＴはチオールのジスルフィド結合形成反応を可能とし、かつ、再利用が可能であるため、ジスルフィド結合形成反応の低コスト化が可能になる。また、ＣＮＴをカラムの担体へ固定することで、インラインに寄るジスルフィド結合形成反応が可能になり、作業の迅速化が可能である。本発明は、タンパク質のリフォールディングだけでなく、タンパク質やペプチドの分析のほか、チオールのジスルフィド結合形成を必要とするあらゆる作業工程に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１−６で用いた各種ＣＮＴとカーボンナノホーン（ＣＮＨ）の吸収スペクトル。（ａ）はＨｉＰｃｏ法ＣＮＴ、（ｂ）はＡＰＪ法ＣＮＴ、（ｃ）はｅＤＩＰＳＣＮＴ、（ｄ）はＣＮＨ。
【図２】実施例１（各種ＣＮＴまたはカーボンナノホーン（ＣＮＨ）とシステインの混合）におけるシステインの吸収スペクトル（黒色）をＣＮＴ等を含まない吸収スペクトル（灰色）と対比して示す図。（ａ）はＨｉＰｃｏ法ＣＮＴ、（ｂ）はＡＰＪ法ＣＮＴ、（ｃ）はｅＤＩＰＳＣＮＴ、（ｄ）はＣＮＨ。
【図３】実施例２（各種ＣＮＴまたはカーボンナノホーン（ＣＮＨ）とジチオスレイトール（ＤＴＴ）の混合）におけるＤＴＴの吸収スペクトル（黒色）をＣＮＴ等を含まない吸収スペクトル（灰色）と対比して示す図。（ａ）はＨｉＰｃｏ法ＣＮＴ、（ｂ）はＡＰＪ法ＣＮＴ、（ｃ）はｅＤＩＰＳＣＮＴ、（ｄ）はＣＮＨ。
【図４】実施例４（ＨｉＰｃｏ法ＣＮＴを固定化したカラムを用いたｐＨ４．５でのジスルフィド結合形成反応）における、（ａ）システインと（ｂ）ジチオスレイトールの吸収スペクトル（黒色）の変化をＣＮＴを含まない吸収スペクトル（灰色）と対比して示す図。２００ｎｍ付近の吸収ピークで規格化した。
【図５】実施例５（ＨｉＰｃｏ法ＣＮＴを固定化したカラムを用いた（ａ）ｐＨ４と（ｂ）ｐＨ５でのジスルフィド結合形成反応）における、システインの吸収スペクトル（黒色）の変化をＣＮＴを含まない吸収スペクトル（灰色）と対比して示す図。２００ｎｍ付近の吸収ピークで規格化した。
【図６】実施例６〔（ａ）システインと（ｂ）ジチオスレイトールの添加量（０，５，５０，５００μＭ）の相違によるＣＮＴの還元反応〕における、ＣＮＴの吸収スペクトルの変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、チオール溶液とＣＮＴを共存させることにより、チオールのジスルフィド結合を形成させることを特徴とするものである。共存とはＣＮＴがチオール溶液中で均一または不均一に分散した状態であっても良いし、ＣＮＴが固体表面に固定化されたＣＮＴがチオール溶液に接触する状態であっても良いことを意味する。
以下、順に説明する。
【００１５】
［ＣＮＴについて］
ＣＮＴはその電気的特性や機械的強度など優れた性質を持ち、究極の新素材として研究開発が精力的に行われている。このＣＮＴは、レーザー蒸発法、アーク放電法、及び化学気相成長法（ＣＶＤ法）などの種々の方法で合成されている。
【００１６】
本発明におけるＣＮＴは、製造方法や形状（直径や長さ）あるいは構造（単層、二層など）などについて問題とされることなく、いずれも本発明の対象とすることができる。
【００１７】
本発明におけるチオールはシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオンなどの低分子化合物のほか、タンパク質やペプチドなどの高分子であり、チオール基を有する全ての化合物を本発明の対象とすることができる。
【００１８】
［チオールとＣＮＴの混合によるジスルフィド結合形成方法について］
合成されたＣＮＴは通常、金属型ＣＮＴと半導体型ＣＮＴの両方を含む数十から数百本の束（バンドル）になっている。チオールとＣＮＴを混合する際に、超音波照射することで、反応効率が高まる。ただし、束になった状態であっても、ジスルフィド結合形成反応が完全に失われるわけではない。
【００１９】
上記の反応後に生成物を回収するためには、遠心分離を利用できる。ＣＮＴは遠心分離によって沈降するため、上澄み液から反応後の生成物を回収できる。
【００２０】
ジスルフィド結合反応の溶媒としては、水が好ましいが、水に限定されるものではない。
【００２１】
ジスルフィド結合反応の反応性を高めるために、ＣＮＴの分散剤を利用することができる。そのほかに、塩などの溶質を利用することもできる。
【００２２】
ＣＮＴの分散剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のいずれもが使用できる。これらの界面活性剤は混合して使用することができ、また、他の界面活性剤と併用することもできる。
【００２３】
上記の反応後に生成物を回収するためには、遠心分離のほか、有機溶媒によるＣＮＴの沈降を利用することができ、その後、上澄み液から反応後の生成物を回収できる。
【００２４】
使用するＣＮＴの濃度は、ジスルフィッド結合を効果的に進める点で１μｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌが好ましいが、これに限定されるものではない。
チオールを含む溶液は、ジスルフィッド結合を効果的に進める点でｐＨが３〜５が好ましいが、この範囲に限定されるものではない。ｐＨの調整には、例えば、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、アンモニア等が使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
［部材表面に固定化したＣＮＴによるジスルフィド結合形成方法について］
ＣＮＴを部材表面に固定化し、その表面にチオールを流すことによってジスルフィド結合形成反応を進めることも可能である。例えば、ＣＮＴを固定化したカラムクロマトグラフィによるジスルフィド結合形成方法が可能である。
【００２６】
カラムの担体へのＣＮＴの吸着の前にＣＮＴを十分に分散させることが好ましい。分散方法としては超音波照射が最も好ましい。
【００２７】
分散剤としては上記の界面活性剤のほか、ＤＮＡなどのポリマーやＮ−メチルピロリドンなどの有機溶媒を利用できる。
【００２８】
超音波処理後に分散性の高いＣＮＴのみを回収するためには遠心分離を利用することができるが、必須ではない。
【００２９】
カラム担体へＣＮＴを吸着させるためには担体とＣＮＴ分散液を混合・撹拌する。吸着を促進させるために、溶質添加、温度調節、ｐＨ調節などを行うことも可能である。
【００３０】
ＣＮＴの固定化に使用する担体は、シリカゲルやデキストラン系ゲル、アガロースゲル、デンプンゲル、アクリルアミドゲルなどである。また、これらに化学修飾を施したゲルでもよく、他の化合物との混合物からなるゲルであってもよい。特にアミノ基を導入したゲルはＣＮＴの固定化に好ましい（非特許文献１）。そのほか複数のゲルを混合したカラムも利用できる。
【００３１】
ＣＮＴを固定した固体表面におけるチオールのジスルフィド結合反応は、カラムに充填させたゲル表面に限定されるものではなく、バッチ法にも適用できる。また、ゲル表面に限定されるものではなく、任意の固体表面で利用可能である。
ただし、カラムを用いた場合、カラムへの送液は、オープンカラムを用いて溶媒の重力落下で送液する方法の他、密閉したカラムにポンプで溶液を送液する方法などが適用できる。ポンプを用いた方法では、流速をあげて大量処理を行うことも可能である。クロマトグラフィーシステムを用いた自動化も可能である。
【００３２】
［スペクトル測定］
チオールのジスルフィド結合反応はジスルフィド結合に対応する紫外吸収スペクトルの測定を利用できる。例えばシステインのジスルフィド結合は２５０ｎｍ付近に吸光を示し、ジチオスレイトールのジスルフィド結合は２８０ｎｍ付近に吸光を示す。一般にタンパク質やペプチドの場合にもシステイン残基間のジスルフィド結合を吸収スペクトルから判断することが可能である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明がこれに制限されるものではない。
【００３４】
＜実施例１＞
本実施例は、システイン溶液と各種ＣＮＴまたはカーボンナノホーン（グラフェンを円錐形に丸めた構造の物質）を混合し、超音波照射・遠心分離した後の上澄み液に含まれる生成物の吸収スペクトルを測定した例である。
［ＣＮＴまたはカーボンナノホーンとシステインの混合によるジスルフィド結合形成］
ＣＮＴは、（ａ）ＨｉＰｃｏ法（直径０.９〜１.２ｎｍ、Ｎａｎｏｉｎｔｅｇｒｉｓ社製）、（ｂ）ＡＰＪ法（直径１.４ｎｍ±０.１ｎｍ、名城ナノカーボン社製）、（ｃ）ｅＤＩＰＳ法（直径２.０ｎｍ±０.８ｎｍ、名城ナノカーボン社製）を使用した。（ｄ）カーボンナノホーンは２−５ｎｍ（ＮＥＣ社製）を使用した。
各試料の吸収スペクトルを図１（ａ）〜（ｄ）に示した。カーボンナノチューブはファンホーブ特異性と呼ばれる特有のピークを示し、平均直径が細くなるにつれて短波長側に、平均直径が太くなるにつれて長波長側にシフトしていく。これらのピーク位置からＣＮＴの太さを概算できる（非特許文献２）。
【００３５】
１ｍｇ／ｍｌのＣＮＴまたはＣＮＨ、２ｍＭのシステイン、０.１％の酢酸アンモニウム緩衝液を含む溶液（ｐＨ４.５）に対してチップ型超音波破砕機（ソニファイアー、ブランソン社製、出力５−６Ｗ）を用いて１時間の超音波照射を行ない、その後１０,０００ｘｇで１０分間の遠心分離を行い、上澄み液を１ｍｌの紫外吸収スペクトルを測定した。ただし、カーボンナノホーンの場合には、２１０,０００ｘｇで１０分間遠心分離した後、０.２μｍのシリンジフィルターでろ過後に紫外吸収スペクトルを測定した。
【００３６】
システインを用いた場合の反応後の吸収スペクトルを図２（ａ）〜（ｄ）に示す。図にはＣＮＴを含まない場合のスペクトルも重ねた。システインがジスルフィド結合した際に現れる２５０ｎｍ付近の吸光度がＣＮＴ存在下で認められた。ＣＮＴの非存在下においても若干の吸収が観察されたが、これは超音波照射と溶存酸素による酸化であると考えられる。カーボンナノホーンでは吸収スペクトルの変化が殆ど観察されないことから、ＣＮＴがシステインのジスルフィド結合形成を促進することが明らかになった。
【００３７】
＜実施例２＞
本実施例では、上記実施例１と同様の実験を異なるチオールであるジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて行った。
ジチオスレイトールはジスルフィド結合を形成することで２８０ｎｍ付近に吸光を示す。システインの場合と同様に、ＣＮＴ存在下でジスルフィド結合が形成されることが図３（ａ）〜（ｄ）のスペクトル測定から明らかになった。
【００３８】
＜実施例３＞
本実施例では、上記実施例１と同様の実験を異なるチオールであるグルタチオンを用いて行った結果、ＣＮＴ存在下でジスルフィド結合が形成されることがスペクトル測定から明らかになった（図示せず）。
【００３９】
＜実施例４＞
本実施例では、アミノ基で修飾したシリカゲル（ケムコプラス社製）にＨｉＰｃｏ法のＣＮＴを吸着させることで得られたカラム充填剤を高速液体クロマトグラフィー用のカラムに充填させて、インラインでのジスルフィド結合反応を実証した。
【００４０】
ＣＮＴのシリカゲルへの吸着には、Ｎ−メチルピロリドンで分散させたＣＮＴとシリカゲルを混合する方法を利用した。クロマトグラフィーの条件は、０.１％酢酸緩衝液(ｐＨ４とｐＨ４.５)、流速０.２ｍｌ／ｍｉｎ、温度２５℃、０.５ｍＭチオール、注入量２０μｌである。対照にはＣＮＴを固定化しないカラムを利用した。
【００４１】
ｐＨ４.５の条件で（ａ）システインおよび（ｂ）ジチオスレイトールをカラムへ通した際のスペクトルをＣＮＴの有無で比較したものを図４（ａ）、（ｂ）に示す。ＣＮＴを固定化したカラムではジスルフィド結合に特有の吸光が測定された。本結果はＣＮＴによるチオールのジスルフィド結合の形成反応は固体表面に固定化したＣＮＴを用いても可能であることを示している。ＣＮＴを含まないカラムから溶出した溶液のスペクトルはジスルフィド結合由来の吸光は殆ど観察されなかった。この結果は、上記の超音波による混合法とは異なり、溶存酸素による酸化が抑制されたことを示しており、カラムを用いることによるジスルフィド結合形成反応の高い制御性を示している。
【００４２】
＜実施例５＞
一般にジスルフィド結合反応の反応性はｐＨに依存することが知られている。カラムを用いたジスルフィド結合形成においてもこのような特性は維持される。図５（ａ）、（ｂ）には上記実施例４と同様の実験をシステインに対して（ａ）ｐＨ４および（ｂ）ｐＨ５で行った際の結果を示した。システインの場合、ｐＨ５ではＣＮＴの効果が殆ど観察されず、ＣＮＴがない条件と類似の結果を示した。この結果はｐＨが上昇することによって溶存酸素による酸化が優先的に生じたことを示している。（なお、当実施例では溶存酸素による酸化がｐＨ５で観測されたが、一般にチオールの空気酸化は解離定数に依存するため、空気酸化が促進されるｐＨはチオール化合物の種類や溶液条件に依存する。）以上から、ＣＮＴは酸素による酸化が抑制された条件であってもチオールのジスルフィド結合反応を促進する効果を有することが明らかになった。なお、ｐＨの調整には酢酸とアンモニアを利用した。
【００４３】
＜実施例６＞
上記の実験では、チオールがＣＮＴによって酸化されてジスルフィド結合を形成することが示された。一方、本実施例は、ＣＮＴがチオールによって還元されることを示すために、チオール存在下でのＣＮＴの吸収スペクトルを測定した。一般に水溶液中で酸化したＣＮＴを還元させると半導体特有の吸収帯（とりわけＳ１１と呼ばれる吸収帯）の吸光度が高くなる（非特許文献３）。
０，５，５０，５００μＭの（ａ）システインまたは（ｂ）ジチオスレイトール存在下でのＨｉＰｃｏ法のＣＮＴの吸収スペクトルを図６（ａ）、（ｂ）に示した。ＨｉＰｃｏ法のＣＮＴのＳ１１はおおまかに９４０ｎｍ−１４００ｎｍ付近で観察される。結果として、ジチオスレイトールよりもシステインの方がＣＮＴを還元させる効果が高く、より低濃度でＣＮＴの吸光度を増加させる効果を有していた。本結果はＣＮＴによるチオールのジスルフィド結合形成反応がＣＮＴの還元とチオールの酸化が組み合わされた酸化還元反応であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、タンパク質のリフォールディングだけでなく、タンパク質やペプチドの分析のほか、チオールのジスルフィド結合形成を必要とするあらゆる作業工程に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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