(57)【要約】【課題】細菌を個別に観察する装置は存在したが、多種多様な細菌叢がもつ多様性そのものを観察する装置はなかった。【解決手段】本発明にかかる嫌気性菌の多様性観察装置により、腸内細菌叢の多種多様な状態を腸内環境と同等の環境下にて観察することが可能となった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウエルプレートベースと、  
ウエルプレートベースに配置され、少なくとも一部は嫌気性菌の種類に応じて消費速度が異なる培地を備えた上面開口の複数のウエルと、
前記複数のウエルプレートベースの上部空間を形作りウエルプレートベースを覆って配置されるカバーと、
からなるウエルプレートベース構造体。
【請求項２】
前記上部空間を無酸素状態とした請求項１に記載のウエルプレートベース構造体。
【請求項３】
前記カバーは透明である請求項１又は２に記載のウエルプレートベース構造体。
【請求項４】
前記カバー又は／及びウエルプレートベースには上部空間を無酸素状態とするためのガス注入口が設けられている請求項１から３のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体。
【請求項５】
前記ウエルプレートベースは、透明基板に培地を固定した基板型ウエルプレートベースである請求項１から４のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体。
【請求項６】
前記ウエルプレートベースは、不織布に乾燥培地を固定した不織布型ウエルプレートベースである請求項１から５のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体
【請求項７】
動物の便を採取する便採取ステップと、
採取した便を希釈して検体を作成する検体作成ステップと、
作成された検体をほぼ等量ずつ前記複数のウエルに滴下する滴下ステップと、
滴下の後に前記カバーを配置して上部空間を無酸素状態とする雰囲気作成ステップと、
各ウエルの状態を観察する観察ステップと、
からなる請求項１から６のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体を利用した腸内細菌の観察方法。
【請求項８】
観察ステップは、時間間隔をあけて複数回実施される請求項７に記載の腸内細菌の観察方法。
【請求項９】
観察ステップは、色彩の観察である請求項７又は８に記載の腸内細菌の観察方法。
【請求項１０】
観察ステップは、色の濃さの観察である請求項７から９のいずれか一に記載の腸内細菌の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性菌の多様性観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性細菌の培養及び観察のための装置が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特願２００７−１６７１９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献は、嫌気性細菌の培養及びこれを観察する方法についてであるが、これは、細菌を個別に観察するためのものであり、多種多様な細菌叢がもつ多様性そのものを観察するものとは異なる。腸内には約１００種類もの嫌気性細菌が存在すると言われており、腸内細菌叢（腸内フローラ）の状態は、宿主である人間の健康を左右することが知られている。したがって、腸内細菌叢の状態は人間の健康状態の１つのバロメータとなることから、腸内細菌叢の多種多様な状態を、腸内環境と同等の環境下にて簡易に観察できる装置が望まれていた。ところで腸内環境は腸内滞留物の他に腸内の雰囲気も重要である。腸内細菌は腸内に実現されている気体環境、すなわち腸内雰囲気下で生存しているからである。一方、この腸内雰囲気はその腸内環境を実現している個人差が大きく装置で一律にこれを再現することはできない。したがって腸内環境を観測しようとする個人から採取した便を希釈した検体に含まれる腸内細菌自身によってその個人の腸内環境が再現できる培養環境が求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、第一の発明としては、ウエルプレートベースと、ウエルプレートベースに配置され、少なくとも一部は嫌気性菌の種類に応じて消費速度が異なる培地を備えた上面開口の複数のウエルと、前記複数のウエルプレートベースの上部空間を形作りウエルプレートベースを覆って配置されるカバーと、からなるウエルプレートベース構造体を提供する。
【０００６】
第二の発明としては、前記上部空間を無酸素状態とした第一の発明に記載のウエルプレートベース構造体を提供する。
【０００７】
第三の発明としては、前記カバーは透明である第一又は第二の発明に記載のウエルプレートベース構造体を提供する。
【０００８】
第四の発明としては、前記カバー又は／及びウエルプレートベースには上部空間を無酸素状態とするためのガス注入口が設けられている第一から第三の発明のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体を提供する。
【０００９】
第五の発明としては、前記ウエルプレートベースは、透明基板に培地を固定した基板型ウエルプレートベースである第一から第四の発明のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体を提供する。
【００１０】
第六の発明としては、前記ウエルプレートベースは、不織布に乾燥培地を固定した不織布型ウエルプレートベースである第一から第五の発明のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体を提供する。
【００１１】
第七の発明としては、動物の便を採取する便採取ステップと、採取した便を希釈して検体を作成する検体作成ステップと、作成された検体をほぼ等量ずつ前記複数のウエルに滴下する滴下ステップと、滴下の後に前記カバーを配置して上部空間を無酸素状態とする雰囲気作成ステップと、各ウエルの状態を観察する観察ステップと、からなる第一から第六の発明のいずれか一に記載のウエルプレートベース構造体を利用した腸内細菌の観察方法を提供する。
【００１２】
第八の発明としては、観察ステップは、時間間隔をあけて複数回実施される第七の発明に記載の腸内細菌の観察方法を提供する。
【００１３】
第九の発明としては、観察ステップは、色彩の観察である第七又は第八の発明に記載の腸内細菌の観察方法を提供する。
【００１４】
第十の発明としては、観察ステップは、色の濃さの観察である第七から第九の発明のいずれか一に記載の腸内細菌の観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる嫌気性菌の多様性観察装置により、腸内細菌叢の多種多様な状態を腸内環境と同等の環境下にて観察することが可能となる。
【００１６】
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施形態１のウエルプレートベース構造体の概念図
【図２】実施形態１のウエルプレートベース構造体のＡ−Ａ断面図
【図３】実施形態１の第五の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図４】実施形態１の第五の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図５】実施形態１の第五の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図６】実施形態１の第六の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図７】実施形態１の第六の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図８】実施形態１の第六の発明に関するウエルプレートベース構造体の概念図
【図９】実施形態１のウエルプレートベース構造体に設置された酸素吸着材の概念図
【図１０】実施形態１のウエルプレートベース構造体に設置されたガス排出の概念図
【図１１】実施形態１のウエルプレートベース構造体に設置されたガス注入口の概念図
【図１２】実施形態１の各ウエル内での反応の概念図
【図１３】実施形態１の菌が生成するガス環境の概念図
【図１４】実施形態１の菌群の概念図
【図１５】実施形態１の菌群の反応一覧の例示図
【図１６】実施形態１の観察結果の概念図
【図１７】実施形態２の観察方法のフローチャート
【図１８ａ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図１８ｂ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図１９ａ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図１９ｂ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図２０ａ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図２０ｂ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図２１ａ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【図２１ｂ】実施形態２の観察方法の処理フロー図の一例
【符号の説明】
【００１８】
０１００  ウエルプレートベース構造体
０１０１  ウエルプレートベース
０１０２  ウエル
０１０３  培地
０１０４  カバー
０２０５  上部空間
０９０６  酸素吸着材
１００７  弁
１００８  ガス排出
１１０９  ガス注入口
１１１０  ガス排出口
１２１１  菌の栄養吸収
１２１２  代謝物
１２１３  菌の呼吸
１２１４  代謝ガス
１２１５  色彩の変化
１３１６−１  ガス成分Ａ
１３１６−２  ガス成分Ｂ
１３１６−３  ガス成分Ｃ
１３１６−４  ガス成分Ｄ
１３１７  排出ガスの集合
１５２１  ウエル番号
１５２２  菌群
１５２３  反応度
１５２４−１  反応結果（有り）
１５２４−２  反応結果（無し）
１７０１  便採取ステップ
１７０２  検体作成ステップ
１７０３  滴下ステップ
１７０４  雰囲気作成ステップ
１７０５  観察ステップ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。実施形態１は請求項１から６に、実施形態２は請求項７から１０に関する。なお、本発明はこれら実施形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々の態様で実施しうる。
【００２０】
≪実施形態１≫
【００２１】
＜概要＞
本実施形態は、ウエルプレートベース構造体に関する。
【００２２】
＜機能的構成＞
本実施形態について図１以下を用いて説明する。本実施形態ウエルプレートベース構造体（０１００）は、「ウエルプレートベース」と、「ウエル」と、「カバー」と、を有する。
【００２３】
＜各構成の説明＞
（ウエルプレートベース）
「ウエルプレートベース」（０１０１）は、後述する複数のウエルを設置するための土台となる部分である。ウエルプレートベースの素材は特に限定はないが、プラスチック、シリコン、紙などが考えられる。本ウエルプレートベース構造体は、嫌気性菌を培養し、その状態を観察するためのものである。嫌気性菌のうち偏性嫌気性菌とは、遊離酸素のほとんどないところでのみ発育できる菌をいい、クロストリジウム、メタン細菌、硫酸塩還元細菌が挙げられる。ヒト等の腸内に生息する細菌であるいわゆる腸内細菌もその多くが偏性嫌気性菌である。腸内細菌には、善玉菌や悪玉菌と呼ばれるものがある。具体的には、善玉菌と呼ばれるものにはビフィズス菌に代表されるビフィドバクテリウム属や、乳酸桿菌と呼ばれるラクトバシラス属の細菌など乳酸や酪酸など有機酸を作るものが多い。悪玉菌にはウェルシュ菌に代表されるクロストリジウム属や大腸菌など、悪臭のもととなるいわゆる腐敗物質を産生するものを指すことが多い。本願のウエルプレートベース構造体を用いて、腸内と同様の無酸素状態を作出して、腸内細菌をはじめとする嫌気性菌を培養・観察し、人の腸内の細菌叢の状態を調べて、宿主である対象者の健康状態・精神状態等を把握することが可能となる。
【００２４】
（ウエル）
「ウエル」（０１０２）は、ウエルプレートベースに配置され、少なくとも一部は嫌気性菌の種類に応じて消費速度が異なる培地を備えて、上面開口であるよう構成される。また、このウエルは、ウエルプレートベースに複数備えられるよう構成される。ウエルとは、円形等の断面をもり、底がある筒型の構造体で、後述する培地や、採取した便を希釈してなる検体を入れる。培地は偏性嫌気性菌の種類の数だけ必要なわけでなく、実際に検出が予測されうる菌の種類よりも十分に少ない数の培地の種類でよい。培地は、少なくとも一部のそれぞれの培地はある菌種は繁殖可能であるが、他の菌種では繁殖できないというように構成されているが、特定の菌種がそこに含まれていることを直接的に示す必要はない。全体として観察したときに腸内フローラが健康的な態様性を有するか、否かを判断できれば足りる。培地は酸性度や含まれるミネラル等の成分が異なるように準備されており、それぞれが健康体の人にどのように反応したか、または健康に問題がある人にどのように反応したかを履歴として蓄積したデータベースに基づいて全体判断ができるように構成される。この蓄積されたデータベースでいわゆる経験則を蓄積し、蓄積された経験則に基づいて個別の判断がされる。したがって健康体が示すパターンは一種類とは限らず、また不健康体が示すパターンも一種類とは限らない。
【００２５】
ウエルの個数は、本願は複数の菌群の反応を観察するものであるから、少なくとも６以上であることが好ましい。また、ウエルの素材は、培地及び検体に対し影響を与えないものであることが好ましい。ウエルの容量は、培地及び検体の量に応じて決定することができる。例えば、０．２ｃｃから２ｃｃである。
【００２６】
ウエルに備えられる「培地」（０１０３）は、嫌気性菌を培養できるものであればよい。具体的には、寒天が考えられる、また、嫌気性菌に栄養を与えるように予めブドウ糖を滴下しておいてもよい。さらに、本願は、色彩によって嫌気性菌の有無・量を調べるものであるから、嫌気性菌に反応する発色剤を予め備えておいてもよい。また、各ウエルに添加物を加えておいてもよい。培地としては具体的には、ブレインハートインフュージョンやトリプティックソイブロスなどをベースとした材料を一例としてあげることができる。これらにイーストイクストラクトやメナジオンを適宜添加したり、酸性度を制御したり、場合によっては検体提供者の血液を混入することも考えられる。血液の混入は腸内出血している場合を再現するためである。さらには当日ないしは前日に取った食事に特徴的な成分が含まれている場合にはそれを混入し（例えば大量のコーヒー、アルコール）、薬の服用がある場合にはその薬の成分を培地に混入することも考えられる。
【００２７】
（カバー）
「カバー」（０１０４）は、複数のウエルプレートベースの上部空間を形作りウエルプレートベースを覆って配置されるよう構成される。ここにいう上部空間とは、各ウエルをカバーで隙間なく覆ってしまうのではなく、一定の間隔を設けて各ウエルの開口方向に空間を設けることをいう。本願は、腸内と同様の無酸素状態を作り出した上で、腸内と同様に菌が産生する物質により、他の菌に対する変化を観察するものであるから、各ウエルの上部に共通空間が設けられている。
【００２８】
各ウエルにおける培地の反応を、色彩の変化により観察するものなので、カバーを外して観察することなく、カバーをしたままで観察できるよう、カバーは透明であることが好ましい。さらに反応結果である色彩の違いを厳密に見るために、無色かつ透明なカバーであってもよい。また各ウエルに対してカバーに一体形成されたレンズが設けられていてもよい。さらに特定の周波数の光をカットするための光学フィルターを設けていてもよい。特定の周波数帯の光がノイズ成分となるような場合に便利である。
【００２９】
カバーは、ウエルプレートベース構造体を密閉することができればよい。したがって、専用品でなくても、ウエルプレートベースを覆うようなビニール袋をかぶせるものであってもよい。また、「タッパー」のような密閉することができる容器に、ウエルプレートベースを設置し、カバーとなるタッパーの蓋を閉じて密閉するものであってもよい。なおカバーと各ウエルとの間に目視できる空間がなくても各ウエル上のカバーと各ウエルとの間に実質的に隙間が設けられている場合には同様に各ウエルの上部空間が全ウエルにて共有されていると考えられるので意図的にカバーとウエルとを密閉していない場合には本件発明のカバーを構成する。
【００３０】
図２は、図１でＡ−Ａで示された箇所の断面図である。本図からも分かるように、各ウエル（０２０２）の上部には、上部空間（０２０５）が設けられており、腸内と同様の状態にしている。これにより、腸内細菌が産生するガスにより、他の腸内細菌に対する影響等を調べることができる。嫌気性菌が死滅しないよう酸素（空気）が入らないようにするため、カバーをすることにより、ウエルプレートベース構造体を密閉するものであることが好ましい。密閉は例えばゴムパッキンなどによって行われてよいし、プラスチックのジッパー様のもので密封するように構成してもよい。また上部空間体積はおおよその測定期間（時間）に応じて設計されるが、測定期間（時間）が長くなるほど上部空間体積は相対的に大きく設計する。例えばウエルの体積が０．５ｃｃである場合には、１ウエル当たりの上部空間体積は、０．１ｃｃから２．０ｃｃ程度がよい。
【００３１】
図３は、透明基板に培地を固定した基盤型のウエルプレートベース構造体の概念図である。図４は、Ｂ−Ｂ断面図である。各ウエル（０４０２）における培地（０４０３）がウエルプレートベース（０４０１）から盛り上がって設置されている。これに、図５で示したようなカバー（０５０４）を設置し、密閉する。本願のウエルプレートベース構造体は、各ウエルにおける嫌気性菌がもたらす反応を、色彩の変化により観察するものなので、各ウエル間の色彩の違いをよく認識できるよう、透明であるものが好ましい。また、ウエルプレートベースを透明にすることにより、裏側からも観察することが可能となる。
【００３２】
ウエルプレートベース構造体に用いるウエルプレートベースは、不織布に乾燥培地を固定した不織布型のウエルプレートベースであっても良い。図６は、不織布型のウエルプレートベース構造体の概念図である。乾燥培地の具体例としては、乾燥させた寒天が考えられる。後述するように、各ウエルに採取した便からなる検体を滴下するので、その水分により寒天が水分を含んだ状態となり、嫌気性菌の存続が可能となる。また、不織布型のウエルプレートベースは、印刷機械等を用いて、各ウエルの培地に乾燥培地を付着させることが可能であるため、安価に大量生産することができ、より多くの検体に対する観察を行うことが可能となる。
【００３３】
図７はＣ−Ｃ断面図である。各ウエル（０７０２）における培地（０７０３）がウエルプレートベース（０７０１）から盛り上がって設置されている。これに、図８で示したようなカバー（０８０４）を設置し、密閉する。
【００３４】
ウエルプレートベース構造体の上部空間は、腸内と同様に無酸素状態にする必要がある。嫌気性菌が、酸素に触れることにより徐々に死滅するものであることから、カバー（図９・０９０４）上部に酸素吸着材（０９０６）を設け、酸素を吸着するようにすることが好ましい。酸素吸着材の素材及び量は適宜決定することができる。
【００３５】
酸素吸着材を用いるほか、無酸素状態とするため、カバー（図１０・１００４）上部に弁（１００７）を設け、ガスを排出させ（低圧化させ、１００８）酸素を抜くようにしても良い。
【００３６】
あるいは、カバー又は／及びウエルプレートベースの上部空間を無酸素状態とするためのガス注入口が設けられていても良い。図１１はカバー（１１０４）にガス注入口（１１０９）及びガス排出口（１１１０）を設けたウエルプレートベース構造体の概念図である。各注入口に設けられた弁により、ガスの逆流を防ぐよう設計されている。注入するガスは、検体である菌群に対して影響を与えず、かつ菌群が産生するガスを変質・反応しづらいものであることが好ましく、このような性質を持つガスの例としては、不活化ガスである窒素が考えられる。
【００３７】
図１２は、各ウエルでの反応の概念図である。腸内細菌は、栄養を吸収すると（１２１１）、短鎖脂肪酸等の代謝物（１２１２）を出す。さらに、呼吸により（１２１３）、代謝ガス（１２１４）を産生する。すなわち、宿主が摂取した食餌に含まれる栄養分を主な栄養源として発酵することで増殖し、同時にさまざまな代謝物を産生する。腸内細菌が発酵によって作り出したガスを産生する。これにより、ウエル内の培地の試薬の色調が変化する（１２１５）。
【００３８】
図１３は、各ウエルにおける嫌気性菌が産生する代謝ガスの概念図である。腸内の環境は、さまざまな嫌気性菌が産生する代謝ガスで充満しており（ガス成分Ａ・１３１６−１、ガス成分Ｂ・１３１６−２、ガス成分Ｃ・１３１６−３、ガス成分Ｄ・１３１６−４）さらに、この代謝ガスの集合（１３１７）がさらに嫌気性菌の呼吸に使われて嫌気性菌の分布や生存割合に影響を及ぼしていると考えられる。
【００３９】
嫌気性菌の産生のメカニズムについては下記のとおりである。人体の消化管は自力ではデンプンやグリコーゲン以外の食物繊維である多くの多糖類を消化できないが、大腸内の腸内細菌が嫌気発酵することによって、一部が酪酸やプロピオン酸のような短鎖脂肪酸に変換されてエネルギー源として吸収される。食物繊維は腸内細菌による醗酵分解によってエネルギーを産生する。酪酸菌は、酪酸を生成する嫌気性芽胞形成グラム陽性桿菌である。クロストリジウム属のタイプ種でもある。芽胞の形で環境中に広く存在しているが、特に動物の消化管内常在菌として知られている。
【００４０】
ビタミンＫは食物からの摂取と並んで、幾つかの種類に属する複数腸内細菌によっても供給される。ビオチンも腸内細菌叢により供給される。ピリドキシン（ビタミンＢ６）も腸内細菌により供給される。そのほかに腸内細菌は、パントテン酸（ビタミンＢ５）、葉酸（ビタミンＢ９）、リボフラビン、ナイアシン（ビタミンＢ３）、ビオチン（ビタミンＢ７）、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＫも生成する。
【００４１】
図１４は嫌気性菌である腸内細菌の集合の概念図である。腸内細菌は、１００種以上存在すると言われており、多数の菌群が、他の菌群に影響を与えて腸内環境を生成している。図中(1)で示されたところは、菌群Ａと菌群Ｂによる影響を受けているウエル（１４２０）であることを示す。
【００４２】
図１５は、各ウエル（１５２１、(1)から(8)のウエルがあり、それぞれ培地が異なる。）について、嫌気性菌の菌群（１５２２、仮にＡからＨの８種類があるものとする。）が存在する場合には、反応を示すことになる一覧表であり、一番右の列（１５２３）は、具体的な観察結果における反応度を「有」（１５２４−１）、「無」（１５２４−２）で示している表である。仮に腸内に「Ｃ」という菌群が存在するとすれば、(2)(3)(4)(5)(6)の培地が入ったウエルが反応するはずであるが、本設例では、(4)について反応がなかったので（図１６参照、Ｃの菌群は存在しなかったという結果になる。
【００４３】
＜効果＞
以上の構成を有するウエルプレートベース構造体により、嫌気性菌である腸内細菌叢の多種多様な状態を腸内環境と同等の環境下にて観察することが可能となる。
【００４４】
≪実施形態２≫
【００４５】
＜概要＞
本実施形態は、腸内細菌の観察方法に関する。
【００４６】
＜機能的構成＞
本発明について図１７を用いて説明する。本実施形態の観察方法は、「便採取ステップ」と、「検体作成ステップ」と、「滴下ステップ」と、「雰囲気作成ステップ」と、「観察ステップ」とからなる。
【００４７】
＜各構成の説明＞
（便採取ステップ）
「便採取ステップ」（１７０１）は、動物の便を採取するステップである。
【００４８】
（検体作成取ステップ）
「検体作成ステップ」（１７０２）は、便採取ステップで採取した動物の便を、水等で希釈し、検体を作成するステップである。
希釈倍率は適宜決定できる。
希釈する液体は、水のほか、採取した便中に存在する腸内細菌を変容させたり死滅させないような液体であればよい。
【００４９】
（滴下ステップ）
「滴下ステップ」（１７０３）は、検体作成ステップで作成した検体を、ほぼ等量ずつ前記複数のウエルに滴下するステップである。滴下する量については、ウエルの容量や、既に設置されている培地の量と調整して決定する。
【００５０】
（雰囲気作成ステップ）
「雰囲気作成ステップ」（１７０４）は、ウエルへ検体を滴下した後に、前記カバーを配置して上部空間を無酸素状態とするステップである。腸内細菌は、嫌気性菌であり、一定時間以上酸素に触れることで死滅するので、滴下が終わり次第速やかにカバーを設置し、酸素吸着材等の働きにより、無酸素状態とすることが望ましい。
【００５１】
（観察ステップ）
「観察ステップ」（１７０５）は、各ウエルの状態を観察するステップである。
【００５２】
観察ステップは、時間間隔をあけて複数回実施するようにしてもよい。
【００５３】
観察ステップは、色彩の観察であってもよい。
【００５４】
観察ステップは、色の濃さの観察であってもよい。反応が強い場合、すなわち、菌数が多い場合には、色が濃くなる場合には、濃い色を発しているウエルについては、菌数が多いと判断できる。
【００５５】
さらに具体的に測定方法について説明する。
【００５６】
腸内環境を例えば一種類の嫌気性菌指数で表現する場合の測定方法の具体例を図１８から図２１を用いて説明する。なお、これらの具体例に示す方法のうち一の方法のみを利用してもよく、また複合的に２以上の方法を用いてもよい。
【００５７】
１．回帰特性値平均法（図１８）
【００５８】
回帰特性値平均法とは、図１８に示すとおり、累積消費量の計量結果を「回帰」分析した後（１８０１ａ、１８０１ｂ）、回帰関数に基づく所定の値を「平均」する（１８０３ａ、１８０３ｂ）方法である。なお、図１８（ａ）は通常の回帰特性値平均法の処理フロー図を示し、図１８（ｂ）は平均情報量を利用した回帰特性値平均法の処理フローを示す。
【００５９】
１−１．通常の回帰特性値平均法（図１８（ａ））
【００６０】
まず、各栄養源について、［累積消費量（yi）−経過時間（x）］プロットの回帰分析を行う（０３０１ａ）。ここで、i （= 1, 2, …,ｎ）は栄養源の識別番号であり、使用する栄養源の数ｎが最大値となる（以下、共通である）。従って当該処理により、ｎ個の回帰関数が求められる。
【００６１】
次に、求めた回帰関数に基づいて特性値（αi）を求める（１８０２ａ）。つまり当該処理により栄養源毎に特性値が（αi）算出される。ここで、特性値（αi）とは、特定時刻における回帰関数から求めた累積消費量の推定値や、特定時刻における回帰関数の傾きから求められる消費速度の推定値、培養開始後から特定時刻までの回帰関数の積分値を経過時間で除した、累積消費量推定値の時間平均（以下単純に、累積消費量推定値時間平均と呼ぶ）などが該当する。ここで、特定時刻とは、一定時間経過後の時刻であっても、あるいは、当該回帰関数が変曲点などの幾何学的特徴に達した時刻であっても、また、当該回帰関数が無限大時間経過後に収束する場合にその無限大時間経過後の時刻であってもよい。なお、「一定時間」は、上述したとおりである。
【００６２】
次に、栄養源毎に算出した特性値（αi）をn個の全栄養源について平均し、平均特性値（A）を求める（１８０３ａ）。つまり、当該処理により一の被測定腸内環境において一の平均特性値（A）が求められる。さらに、当該平均特性値（A）を被測定腸内環境の腸内環境指数への変換に用いる（１８０４ａ）。該変換における算出方法は、腸内環境指数の算出結果について、被測定腸内環境の間、及び、基準腸内環境との間で優劣の比較が可能な方法であればよい。例えば嫌気性菌の多様性がはっきりしている基準腸内環境との比較に基づいて特性値の区間を区切って、A, B, C等の段階的な等級に変換してもよい。また、該比較が可能であれば、単純に特性値そのものを用いてもよい。この場合、特性値そのものが腸内環境指数となる。
【００６３】
なお、上記回帰分析処理（１８０１ａ）にて求める回帰関数の種類は特に限定しないが、ロジスティック曲線やその他の成長曲線が該当する。より好ましくはゴンペルツ関数式に基づくシグモイド曲線である。また、一次回帰も含まれるものとする。後で述べる計算例に記載の回帰関数について同じである。なお、線形モデルは精度は低いが計算コストを抑えることができる点で有効である。非線形モデルはより精度が高い点で有効であるが、その分計算コストが高くなる。また、上記平均処理（１８０３ａ）にて行う平均は、累積消費量の測定結果から算出可能なものであれば算術平均、幾何平均、調和平均など特に限定しない。以下に記載の平均について同じである。
【００６４】
そして、上記平均特性値Aとは、上述したとおり、特定時刻における、回帰関数に基づく累積消費量推定値、消費速度推定値、累積消費量推定値時間平均などを、全ての栄養源に渡って平均したものが該当する。
【００６５】
かかる場合、平均特性値Aが累積消費量推定値、消費速度推定値、累積消費量推定値時間平均のいずれの平均の場合であっても、特性値が大きいほどに各種栄養源に対する平均的資化性が大きいことが予測されるため、より腸内細菌の活性が高い嫌気性菌育成に良好な腸内環境であると言える。従って当該平均特性値Aを基準腸内環境のそれと比較し、基準腸内環境の該平均特性値より大きい場合は腸内環境指数の大きい腸内環境、すなわち嫌気性菌育成により適した腸内環境とする。逆に基準腸内環境の平均特性値Aより小さい場合は腸内環境指数の小さい腸内環境、すなわち嫌気性菌育成に適さない腸内環境とする。この場合、例えば、腸内環境指数は、例えば基準腸内環境の平均特性値Aから被測定腸内環境の平均特性値Aを引いた値とする。このとき、嫌気性菌育成に適さない腸内環境の腸内環境指数はマイナスの値となる。なお、基準腸内環境を設定せず、二以上の被測定腸内環境間で比較する場合は、被測定腸内環境間の平均特性値の大小を単純に比較すればよい。すなわち、被測定腸内環境の平均特性値を基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、そのまま当該平均特性値を利用することで、被測定腸内環境の腸内環境指数とし、その測定結果とする。
【００６６】
当該回帰関数が下記式１に示すゴンペルツ曲線の場合の具体例を以下に示す。
［式１］
【００６７】
ｙ＝ｋａ＾ｂ＾（ｘ−ｄ）
ただし、a, b, k, dは回帰計算によって決定されるパラメータ
【００６８】
上記式１の導関数は、下記式２で表され、ｘ＝ｄは変曲点である。
［式２］
【００６９】
ｙ'＝ ｋ（ｌｎａ）×ａ＾ｂ＾（ｘ−ｄ）×（ｌｎｂ）ｂ＾（ｘ−ｄ）
この場合、変曲点における傾き、つまり消費速度推定値（ｅ）（式３）、変曲点における累積消費量推定値（ｆ）（式４）及び無限大時間経過後の時刻における累積消費量推定値（ｋ）が特性値として利用可能である。
［式３］
【００７０】
ｅ＝ｋ（ｌｎａ）×ａ×（ｌｎｂ）
［式４］
【００７１】
ｆ＝ｋａ
【００７２】
かかる場合、各栄養源iについての当該特性値ｅi，ｆi，ｋiの値を特性値αiとして、全栄養源に渡って平均することで、平均特性値Aを算出する。当該平均特性値（A）を基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換して被測定腸内環境の腸内環境指数を算出したり、または、該平均特性値をそのまま腸内環境指数とすることで、その測定結果とする
【００７３】
１−２．平均情報量を利用した回帰特性値平均法（図１８（ｂ））
【００７４】
まず、各栄養源iについて、［累積消費量（yi）−経過時間（x）］プロットの回帰分析を行う（１８０１ｂ）。次に、求めた回帰関数に基づいて特性値（αi）を求め（１８０２ｂ）、当該特性値（αi）を全栄養源について平均し、平均特性値（A）を求める（１８０３ｂ）。なお、ここまでは上記図１８（ａ）に記載のステップと同じである（１８０１ａ、１８０２ａ、１８０３ａ）。
【００７５】
次に、ステップ１８０２ｂにて栄養源毎に算出した特性値（αi）の平均情報量（Ｅ）を算出する（１８０４ｂ）。つまり、平均情報量という概念を用いて栄養源毎の累積消費量の偏りを求める。なお、ステップ１８０３ｂとステップ１８０４ｂの処理はどちらを先に行ってもよい。また、平均情報量（Ｅ）の算出方法は後述する。
【００７６】
次に、ステップ１８０３ｂにて算出した平均特性値（A）に平均情報量（Ｅ）を乗算する（１８０５ｂ）。ここで、累積消費量の栄養源に対する偏りが大きいほど平均情報量（Ｅ）の値は小さく、偏りが小さいほど平均情報量（Ｅ）の値は大きい。また累積消費量の偏りとは、各栄養源に対する資化性の偏りと言えるから、当該平均情報量（Ｅ）は生息する嫌気性菌の多様度が反映された値といえる。従って、生息する嫌気性菌の多様度が大きいほど当該平均情報量（Ｅ）の値は大きく、多様度が小さいほど当該平均情報量（Ｅ）の値は小さい。よって当該乗算値（AＥ）は被測定腸内環境に生息する嫌気性菌の多様度を反映した指標として被測定腸内環境の腸内環境指数測定に利用できる。従って、１−１節で述べた方法と同様に、当該乗算値（AＥ）基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、そのまま当該乗算値を利用することで、被測定腸内環境の腸内環境指数とし、その測定結果とする（１８０６ｂ）。
【００７７】
なお、平均情報量Ｅは、事象iの生起する確率piに関する以下の式によって与えられる。
Ｅ= -Σpi log pi     （ただし、Σはiについて行う。）
今、各栄養源iに対応する特性値αiに対して、その全栄養源にわたる合計に対する割合をpiとすれば、
pi = αi / Σαj     ただし、Σはjについて行う。
となる。平均情報量は、全ての栄養源についてのpが1/n（nは栄養源の数）である場合に、最大値を取り、対数の底をnとおけば、1.0となる。
このとき、
Ｅ = -Σ(αi / Σαj) logn pi =Σαi logn pi / Σαj
となる。一方算術平均Aは、
A= Σαj / n
であるから、Ｅに算術平均を掛けると、
AＥ = - Σαi logn pi / n
となる。すなわち、単純平均に比較して、logn piの項が加わっているだけであるので、一種の重み漬け平均と見なすことが可能である。
【００７８】
２．平均データ回帰法
【００７９】
平均データ回帰法とは、図１９に示すとおり、累積消費量の各時刻における計量結果を時刻別に全栄養源に渡って「平均」した後（１９０１ａ、１９０１ｂ）、時刻を説明変数、各時刻における当該平均値を従属変数として「回帰」分析する（１９０２ａ、１９０４ｂ）方法である。なお、図１９（ａ）は通常の平均データ回帰法の処理フロー図を示し、図１９（ｂ）は平均情報量を利用した平均データ回帰法の処理フローを示す。
【００８０】
２−１．通常の平均データ回帰法（図１９（ａ））
【００８１】
まず、所定時間毎に、各栄養源の累積消費量値（yi,t）を全栄養源について平均する（Yｔ）（１９０１ａ）。つまり、当該処理により栄養源毎に得られた［累積消費量値（yi,t）−経過時間（x）］プロットから平均的な一の［累積消費量値（Yt）−経過時間（x）］プロットが求められる。以下、当該平均的な一の［累積消費量値（Yt）−経過時間（x）］プロットを用いて被測定腸内環境の腸内環境指数を測定する。
【００８２】
次に当該平均的な一の［累積消費量値（Yt）−経過時間（x）］プロットの回帰分析を行う（１９０２ａ）。回帰分析については「１．回帰特性値平均法」に記載したとおりである。
【００８３】
次に回帰関数に基づく特性値（α）を算出する（１９０３ａ）。当該特性値（α）については「１．回帰特性値平均法」に記載したとおりである。当該特性値（α）を、基準腸内環境及びその他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、そのまま特性値を利用することで、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数測定結果とする（１９０４ａ）。
【００８４】
２−２．平均情報量を利用した平均データ回帰法（図１９（ｂ））
【００８５】
まず、所定時間毎に、各栄養源の累積消費量値（yi,t）を全栄養源について平均する（Yｔ）（１９０１ｂ）。次に所定時間毎に、累積消費量値（yi,t）の平均情報量（Ｅｔ）を算出する（１９０２ｂ）。なお、ステップ１９０１ｂとステップ１９０２ｂの処理の順番はどちらを先に行ってもよい。そして、累積消費量平均値（Yｔ）に平均情報量（Ｅｔ）を乗算し、栄養源毎の累積消費量の偏りを反映させた乗算値（YｔＥｔ）を得る（１９０３ｂ）。
【００８６】
次に、当該乗算値（ＡｔＥｔ）を用いて、［YｔＥｔ−経過時間（x）］プロットの回帰分析を行う（１９０４ｂ）。そして回帰関数に基づく特性値（α）を算出する（１９０５ｂ）。当該特性値（α）については「１．回帰特性値平均法」に記載したとおりである。当該特性値（α）を基準腸内環境及びその他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、そのまま特性値を利用することで、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数測定結果とする（１９０６ｂ）。
【００８７】
３．その他の方法
【００８８】
回帰分析を行わず、より簡便な方法の一例を以下に説明する。
【００８９】
３−１．図２０（ａ）及び（ｂ）を用いて説明する。まず、所定時間毎に各栄養源の累積消費量（yi,t）を全栄養源について平均値を算出する（Yｔ）（２００１ａ）。つまり当該処理により、栄養源毎に得られた［累積消費量値（yi,t）−経過時間（x）］プロットから平均的な一の［平均累積消費量値（Yｔ）−経過時間（x）］プロットが求められる。次に当該［平均累積消費量（Yｔ）−経過時間（x）］プロットについて時刻0から一定時刻（Ｔ）までの積分値（S）を算出する（２００１ｂ）。次に、積分値（S）を経過時間（Ｔ）で除算し（２００３ａ）、当該除算値（M）を基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換することで腸内環境指数を算出したり、または、当該除算値（M）をそのまま利用することで、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数測定結果とする（２００４ａ）。なお、累積消費量が等時間間隔で計量されている場合、当該方法は、上記「２−１．通常の平均データ回帰法」において、一次関数［ｙ＝ｂ（ｂは定数）］に回帰する方法と論理的に同等となる。
【００９０】
なお、当該方法においても図２０（ｂ）に示すように平均情報量の概念を利用するように構成されていてもよい。所定時間毎の累積消費量（yi,t）の平均情報量（Ｅｔ）を算出し（２００２ｂ）、これをステップ２００１ｂにて算出した平均累積消費量値（Yｔ）に乗算し、累積消費量の栄養源に対する偏りを反映させた乗算値（YｔＥｔ）を得る（２００３ｂ）。そして、［YｔＥｔ−経過時間（x）］プロットの積分値（S）を算出し（２００４ｂ）、当該積分値（S）を経過時間（Ｔ）で除算し（２００５ｂ）、当該除算値（M）を基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境等と比較可能な形で変換したり、または、当該除算値（M）をそのまま利用することで、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数の測定結果とする（２００６ｂ）。なお、累積消費量が等時間間隔で計量されている場合、当該方法は、上記「２−２．平均情報量を利用した平均データ回帰法」において、一次関数［ｙ＝ｂ（ｂは定数）］に回帰する方法と論理的に同等となる。
【００９１】
３−２．図２１（ａ）及び（ｂ）を用いて説明する。まず、各栄養源の［累積消費量（yi）−経過時間（x）］プロットについて時刻０から一定時刻（Ｔ）までの積分値（si）を算出する（２１０１ａ）。次に当該積分値（si）を経過時間（Ｔ）で除算し（２１０２ａ）、除算値（mi）を全栄養源について平均する（２１０３ａ）。そして当該平均値（M）を基準腸内環境あるいは他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、または、当該平均値（M）をそのまま利用して、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数の測定結果とする（２１０４ａ）。なお、累積消費量が等時間間隔で計量されている場合、当該方法は、上記「１−１．通常の回帰特性値平均法」において、一次関数［ｙ＝ｂ（ｂは定数）］に回帰する方法と論理的に同等となる。
【００９２】
また、当該方法においても図２１（ｂ）に示すように平均情報量の概念を利用するように構成されていてもよい。ステップ２１０１ｂ及びステップ２１０２ｂにて算出した除算値（mi）の平均情報量（Ｅ）を算出し（２１０３ｂ）、これを除算値の平均値（M）に乗算し、累積消費量の偏りを反映させた乗算値（MＥ）を得る（２１０５ｂ）。そして当該乗算値（MＥ）を基準腸内環境または他の被測定腸内環境と比較可能な形で変換したり、あるいは該乗算値（MＥ）をそのまま利用して、腸内環境指数とし、被測定腸内環境の腸内環境指数の測定結果とする（２１０６ｂ）。なお、累積消費量が等時間間隔で計量されている場合、当該方法は、上記「１−２．平均情報量を利用する回帰特性値平均法」において、一次関数［ｙ＝ｂ（ｂは定数）］に回帰する方法と論理的に同等となる。
【００９３】
要約すると、被測定腸内環境の懸濁液を嫌気性菌サンプルとして生成するサンプル生成ステップと、
生成した嫌気性菌サンプルである懸濁液を少なくとも一部は嫌気性菌によって消費速度が異なるn個（nは自然数）の栄養源に滴下する滴下ステップと、
滴下後、嫌気性菌による各栄養源の一定時間内での累積消費量を観察する観察ステップと、
観察された各栄養源の累積消費量に基づいて経過時間と累積消費量との関係を表すn個の回帰関数を求める回帰関数作成ステップと、
n個の各回帰関数に基づいて特定時刻における累積消費量の推定値、特定時刻における回帰関数の傾きから求められる消費速度の推定値、培養開始後から特定時刻までの回帰関数の積分値を経過時間で除した累積消費量推定値の時間平均のいずれか一以上を得る推定値取得ステップと、
推定値測定ステップで得られた累積消費量の推定値、消費速度の推定値、累積消費量推定値の時間平均のいずれか一以上のそれぞれについて、すべての栄養源に渡って平均した平均特性値Ａを被測定腸内環境の腸内環境指数として得る腸内環境指数取得ステップと、
を含む腸内環境の腸内環境指数測定方法を採用することができる。
【００９４】
＜効果＞
本実施形態の嫌気性菌の観察方法により、嫌気性菌の数及び種類を観察することが可能となり、被験者の健康状態等を調べることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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