(57)【要約】【課題】ＭＥＲＳコロナウイルスを網羅的かつ特異的に検出しつつも、ＳＡＲＳを含むその近縁のコロナウイルスは検出しないことを可能にする抗体を提供すること、および、それによってＭＥＲＳコロナウイルスを正確、迅速かつ簡便に検出する方法を提供すること。【解決手段】ＭＥＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体、該抗体を用いてＭＥＲＳコロナウイルスを検出する方法、および、該抗体を含むキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルスのヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体およびその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜４１３番目にある、前記抗体またはその断片。
【請求項２】
エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜２１２番目または３６４〜４１３番目にある、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５６またはＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５７であるハイブリドーマにより生産される、抗体またはその断片。
【請求項５】
その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
ＭＥＲＳコロナウイルスを試料から検出する方法であって、試料を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と接触させる工程を含む方法。
【請求項７】
試料が、生体由来の細胞および／または分泌物を含む体液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的測定法によりＭＥＲＳコロナウイルスを検出する工程をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、ＭＥＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項１０】
イムノクロマトストリップの形態である、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体、該抗体を用いてＭＥＲＳコロナウイルスを検出する方法および該抗体を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
コロナウイルスはエンベロープを有する直径６０〜２２０ｎｍの一本鎖（＋）ＲＮＡウイルスであり、ヒトに感染すると呼吸器症状を引き起こすことが知られている。コロナウイルスとして高病原性であるＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルスおよびＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス、低病原性であるヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１などが知られ、またコロナウイルスは風邪の原因ウイルスであることも知られている。
【０００３】
ＭＥＲＳコロナウイルスは２０１２年に存在が確認された新型のコロナウイルスである。中東地域や韓国を中心に現在２０カ国以上に流行しており、３０％を超える極めて高い致死率をもたらすことがＷＨＯ（世界保健機関）から発表されている。ヒトへの主な感染源はラクダであると考えられているが、その正確な感染経路は未だ明らかにされていない。現在においてもＭＥＲＳの流行は依然として続いており、ＭＥＲＳコロナウイルスに対する抗ウイルス薬は存在しない。したがって、感染拡大を阻止するため、迅速な検査法によりＭＥＲＳ患者を早期に発見することが極めて重要である。
【０００４】
ＭＥＲＳコロナウイルスの検出方法としてはリアルタイム逆転写ＰＣＲ法などの遺伝子検査が主に使われている。これによってＭＥＲＳコロナウイルスの有無を正確に判断することが可能であるが、一方、遺伝子検査にはＰＣＲ中リアルタイムで蛍光を検出する特殊で高価な装置が必要となり、また結果を得るためには数時間を要することから、感染現場および防疫現場などの設備が十分とはいえない場所における早期発見において実用性に欠ける点が課題となっている。
そこで近年、正確性、迅速性および簡便性を備えた検査方法を開発することを目的として、ＭＥＲＳコロナウイルスに対する抗体の開発が進められている。
【０００５】
例えば、非特許文献１には、ヒトコブラクダから単離したＭＥＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシドを構成するタンパク質（以下、ヌクレオカプシドタンパク質、単にＮＰともいい、特にＭＥＲＳ由来のものをＭＥＲＳ−ＮＰともいう）の親水性領域のうち連続する約２０〜４０アミノ酸からなる５種のオリゴペプチドＰ１〜Ｐ５を合成し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に抱合させた各オリゴペプチドを抗原としてマウスに免疫することによって、ＭＥＲＳ−ＮＰに対するモノクローナル抗体を得たことが報告されている。そして、それら５種のうち２種、すなわちＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列における２２〜４０番目または１６４〜２０２番目のオリゴペプチド（Ｐ１またはＰ３）を抗原として使用して得られた抗体が、イムノクロマト法において、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）およびネココロナウイルス（ＦＣＶ）由来のＮＰは検出せずに、前記のヒトコブラクダ由来のＭＥＲＳ−ＮＰを検出したことが報告されている。
【０００６】
非特許文献２には、臨床的に分離されたＭＥＲＳコロナウイルスの特定の株に由来する全長のＭＥＲＳ−ＮＰを大腸菌で発現および精製したものを抗原としてマウスに免疫することによって、ＭＥＲＳ−ＮＰに対する２４種のモノクローナル抗体を得たことが報告されている。そして、該抗体のうち１２種が酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）において、前記特定のＭＥＲＳ−ＮＰには反応するがヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＯＣ４３由来のＮＰには反応しなかったことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Song D., Ha G., Eltahir Y., et al., Development and validation of a rapid immunochromatographic assay for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus antigen in dromedary camels, J Clin Microb (2015) 53: 178-182.
【非特許文献２】Chen Y., Chan K.-H., Kang Y., et al., A sensitive and specific antigen detection assay for Middle East respiratory syndrome coronavirus, Emerg Microbes Infect (2015) 4: e26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１、２に記載された特定のＭＥＲＳ−ＮＰを検出可能な抗体が、他の種々のＭＥＲＳコロナウイルス株に対しても、あらゆるＭＥＲＳ−ＮＰを検出することが可能であるか否かについては不明であるし、前記抗体のエピトープも具体的には明らかにされていない。さらに、非特許文献では、ヒトにも感染するおそれのある近縁のコロナウイルスに対する前記抗体の特異性についても十分に検討されていない。すなわち、非特許文献に記載の抗体はいずれも、種々のＭＥＲＳコロナウイルス株を網羅的に検出し、かつ近縁のコロナウイルスは検出せず、ＭＥＲＳコロナウイルスのみを特異的に検出することが可能であるか否かについては明らかにされていなかった。
したがって、本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルスを網羅的かつ特異的に検出することが可能な抗体を提供すること、およびそれによってＭＥＲＳコロナウイルスを正確、迅速かつ簡便に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＭＥＲＳコロナウイルスの種々の株に由来するＭＥＲＳ−ＮＰの各アミノ酸配列同士、および、これらのアミノ酸配列とＳＡＲＳや他のコロナウイルスの種々の株に由来するＮＰのアミノ酸配列とを独自に分析した結果、ＭＥＲＳ−ＮＰの各アミノ酸配列間において高度に保存され、かつＳＡＲＳを含む近縁のコロナウイルスのＮＰのアミノ酸配列とは同一性が低い領域を初めて見出した。そして上記課題を鑑み、かかるアミノ酸配列の領域をエピトープとして認識する抗体を作製することによって、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］ＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルスのヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体およびその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜４１３番目にある、前記抗体またはその断片。
［２］エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜２１２番目または３６４〜４１３番目にある、［１］に記載の抗体またはその断片。
［３］抗体が、モノクローナル抗体である、［１］または［２］に記載の抗体またはその断片。
［４］受領番号がＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５６またはＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５７であるハイブリドーマにより生産される、抗体またはその断片。
［５］その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体またはその断片。
【００１１】
［６］ＭＥＲＳコロナウイルスを試料から検出する方法であって、試料を、［１］〜［５］のいずれかに記載の抗体またはその断片と接触させる工程を含む方法。
［７］試料が、生体由来の細胞および／または分泌物を含む体液である、［６］に記載の方法。
［８］ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的測定法によりＭＥＲＳコロナウイルスを検出する工程をさらに含む、［６］または［７］に記載の方法。
［９］［１］〜［５］のいずれかに記載の抗体またはその断片を含む、ＭＥＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
［１０］イムノクロマトストリップの形態である、［９］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗体またはその断片は、ＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列において高度に保存され、近縁のコロナウイルスのＮＰのアミノ酸配列とは相同性が低い領域をエピトープとして認識するため、種々のＭＥＲＳコロナウイルス株を網羅的に検出し、かつＳＡＲＳを含む近縁のコロナウイルスは検出せず、ＭＥＲＳコロナウイルスのみを特異的に検出することができる。
現在、ＭＥＲＳコロナウイルスの検出方法はリアルタイム逆転写ＰＣＲ法などの遺伝子検査しか存在しないが、本発明に係る検出方法によれば、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法などの免疫学的測定法により、ＭＥＲＳコロナウイルスを正確、迅速かつ簡便に検出することができ、したがってＭＥＲＳコロナウイルスの感染拡大を阻止するための検査に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＭＥＲＳ−ＮＰに対するモノクローナル抗体の作製方法の概略を示す。
【図２】図２は、ＭＥＲＳ−ＮＰの二次構造予測および機能ドメイン解析ならびに変異解析の結果を示す。
【図３】図３は、ＭＥＲＳと他のヒトコロナウイルスとのＮタンパク質の相同性解析の結果を示す。
【図４】図４は、抗体のエピトープ解析のために作製された、ＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列において特定の配列が欠失した変異体の構造をそれぞれ示す。
【図５】図５は、ＭＥＲＳ−ＮＰの各欠失変異体を用いて、各抗体が認識するエピトープを解析したウエスタンブロットの結果を示す。
【図６】図６は、ＭＥＲＳ−ＮＰの立体構造における、抗体のエピトープ領域を示す。
【００１４】
【図７】図７は、ＭＥＲＳと他のヒトコロナウイルスの組換えＮタンパク質を用いて、各抗体の特異性を解析したウエスタンブロットの結果を示す。
【図８】図８は、抗原補足ＥＬＩＳＡによる、抗原タンパク質の検出結果を示す。
【図９】図９は、ＭＥＲＳ−ＮＰ検出用イムノクロマトストリップの概要図を示す。
【図１０】図１０は、ＭＥＲＳ−ＮＰ検出用イムノクロマトストリップを用いた抗原タンパク質の検出結果を示す。
【００１５】
【図１１】図１１は、ＭＥＲＳ−ＮＰ検出用フィルター抗原アッセイに用いる器具のイメージを示す。
【図１２】図１２は、ＭＥＲＳ−ＮＰ検出用フィルター抗原アッセイを用いた抗原タンパク質の蛍光による検出結果を示す。
【図１３】図１３は、抗原補足ＥＬＩＳＡによる、ＭＥＲＳコロナウイルスのウイルス様粒子中に含まれる抗原タンパク質の検出結果を示す。
【図１４】図１４は、ＭＥＲＳ−ＮＰ検出用イムノクロマトストリップを用いた、ＭＥＲＳコロナウイルスのウイルス様粒子中に含まれる抗原タンパク質の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、本発明の好適な実施態様に基づき、詳細に説明する。
本発明における「ヌクレオカプシドタンパク質」は「Ｎタンパク質」とも称され、特にＭＥＲＳコロナウイルスのＮタンパク質は、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列またはGenBankアクセッション番号（NC_019843）に開示されたアミノ酸配列などからなり、本明細書中において「ＭＥＲＳ−ＮＰ」とも称される。ＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する。
【００１７】
本発明は、ＭＥＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片を提供するものであり、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜４１３番目におけるエピトープを認識する抗体またはその断片を提供する。本発明者らが当該２０８〜４１３番目に着目した理由は、ＭＥＲＳコロナウイルスの１１３株に由来するＭＥＲＳ−ＮＰの変異解析を行った結果（図２参照）、変異株の割合が５％以下の領域であって、かつ、ＳＡＲＳ等において保存されているセリン・アルギニンリッチ(SR rich)モチーフを除いた領域、すなわちアミノ酸配列の２０８〜４１３番目の領域に対して、抗体がＭＥＲＳへ特異的かつ普遍的に結合することを見出したためである。さらに、本発明者らが、ＭＥＲＳ−ＮＰとＳＡＲＳを含む他の近縁コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質との相同性を解析した結果（図３参照）、ＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列（配列番号１）の２０８〜２１２番目の領域および３６４〜４１３番目の領域において、かかる相同性が極めて低いか、または０％であることを明らかにした。よって、本発明は、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜２１２番目または３６４〜４１３番目の領域におけるエピトープを認識する抗体またはその断片を提供する。
【００１８】
＜抗体＞
本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８〜４１３番目、好ましくは２０８〜２１２番目または３６４〜４１３番目におけるエピトープを認識するモノクローナル抗体が複数種存在する場合、各モノクローナル抗体同士を混合した組成物（いわゆるポリクローナル抗体）であってもよい。
【００１９】
抗体を産生するハイブリドーマは、２０１５年１１月６日に独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５６およびＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５７としてブダペスト条約の下で寄託されている。
【００２０】
本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは以下に述べるとおり、ケラーとミルシュタインの方法（Koehler, G. and Milstein, C. (1975) Nature 256, 495-497）や、その改変法によって得られる。すなわち、好適な方法で調製されたタンパク質を用いて、マウス、ラット、ウサギおよびニワトリなどの動物を免疫した後、該動物から得たＢ細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られたハイブリドーマから目的とする抗体を産生し分泌するハイブリドーマを選別し、単離することができる。以下に、一態様における、本発明に係る上記のハイブリドーマならびにモノクローナル抗体の調製法および同モノクローナル抗体の特性について詳述する。
【００２１】
（１）抗原タンパク質の調製
抗原には、遺伝子工学的手法により合成した組換えタンパク質を用いることができるが、高純度であり、かつ生体内と同等の立体構造を保持した形状であることが望まれる。遺伝子工学的手法によるタンパク質合成は、主として２種類に大別され、大腸菌などの細菌や酵母、昆虫細胞や動物細胞等の生きた細胞を利用する方法と、それらの細胞抽出液等を利用した無細胞系が存在する。一般にウイルス由来のタンパク質は細胞に対して毒性を示すことがあり、生きた細胞を活用した方法では発現が困難な場合が多いため、無細胞系によるタンパク質合成法が望ましい。特に、コムギ胚芽抽出液を用いたタンパク質合成系は真核細胞由来の発現系であり、正確なフォールディングが行われたタンパク質を合成できることに加え、翻訳活性が極めて高いため、目的のタンパク質を大量かつ高純度に回収できることが知られている。したがって、本発明に用いる抗原タンパク質の調製は、コムギ胚芽抽出液を活用した無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。
【００２２】
（２）動物の免疫、ハイブリドーマ細胞の作製
免疫動物として、好適には６週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることができるが、他の系統のマウスも使用することができる。免疫スケジュールおよび抗原濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれる。例えば、マウスの腹腔、フットパッド、尾根部に好適なアジュバンドと共に、下記に詳述するＭＥＲＳ−ＮＰ、すなわちコムギ胚芽抽出液を含む無細胞タンパク質合成系により合成された配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２２〜４１３番目からなるタンパク質１０〜３００μｇ／匹を投与する。以後数日〜数週間おきに、初回免疫に使用したものと同じ抗原を数回投与する。２回目の免疫以後、静脈より採血し、血液中の抗体価について検討する。抗体価の測定はＥＬＩＳＡ法により好適に行なうことができる。
【００２３】
免疫したマウスより脾臓やリンパ節を摘出し、これからＢ細胞懸濁液を調製する。これを適切なマウスミエローマ細胞と適切な融合促進剤を使用して細胞融合させる。ミエローマ細胞はＢ細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を産生しないものが好ましい。
【００２４】
別の容器内で未融合のＢ細胞、未融合のミエローマ細胞および融合したハイブリドーマ細胞の混合物を、未融合のミエローマ細胞を支持しない選択培地で未融合の細胞を死滅させるのに充分な時間培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの、例えばＨＡＴ培地が使用される。未融合のＢ細胞は非腫瘍性細胞なので、この選択培地中では未融合のＢ細胞と未融合のミエローマ細胞は、ある時間後、死滅する。融合した細胞はミエローマ細胞の腫瘍性とＢ細胞の性質とを合わせ持つため、選択培地中で生存する。
【００２５】
（３）ハイブリドーマ細胞のスクリーニングとクローニング
上記の操作によってハイブリドーマが検出された後、その培養上清を採取し、免疫したＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体についてスクリーニングする。このスクリーニングは例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫染色法等により好適に行なうことができる。本スクリーニングで、抗原との反応性や特異性の高いクローンをスクリーニングすることが重要である。目的の抗体を産生するハイブリドーマを適当な方法、例えば、限界希釈法でクローン化する。
（４）モノクローナル抗体の調製
クローン化した細胞から、所望の抗体を得るには２つの方法を用い得る。１つはハイブリドーマを一定時間、適当な培地で培養する方法であり、その培養上清からハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２の方法は、ハイブリドーマを同質遺伝子または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に接種することである。一定時間後、接種されたマウスの血液中および腹水中より、ハイブリドーマの産生する所望のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２６】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法またはアフィニティークロマトグラフィーなどの方法あるいはこれらの方法を組み合わせることなどにより、精製することができる。
【００２７】
本発明の抗体は、完全な免疫グロブリン分子、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む一方で、本発明の抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶ−、ＶＨ−またはＣＤＲ−領域などの、かかる免疫グロブリン分子の部分を含むが、本発明の抗体の断片も、本発明の抗体と同程度にＭＥＲＳ−ＮＰを特異的に認識し結合し得るものである。さらに、抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体のような、修飾および／または変化した抗体を含む。本発明の抗体は、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびに、組み換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体も含む。本発明の抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などの、それらの部分も含む。本発明の抗体は、二機能性抗体のような抗体派生物、および、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖｓまたは抗体融合タンパク質のような抗体構築物も含む。
【００２８】
＜検査方法＞
本発明は、試料を、ＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体またはその断片と接触させる工程を含む、ＭＥＲＳコロナウイルスを試料から検出する方法もまた提供する。
【００２９】
本発明における生体試料としては、ヒトまたは動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；粘液；糞便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞または、それらの抽出液など、ＭＥＲＳ−ＮＰが含まれる可能性のある生体試料であれば対象となり、好ましくは、採取が容易である、口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支および肺などからの細胞および分泌液や、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、うがい液、喀痰、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液などである。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いた方法が多用される。
【００３０】
本発明の検査方法における、ＭＥＲＳ−ＮＰの測定法は、通常の免疫学的測定法であればいずれも採用できる。ここで免疫学的測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、または粒子凝集反応法などを挙げることができる。特に、本発明のＭＥＲＳ−ＮＰの免疫学的測定法には、正確、迅速かつ簡便にＭＥＲＳ−ＮＰを測定することが可能なＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法が好ましい。
【００３１】
イムノクロマト法で測定する場合には、例えば図９、１０および１４に示すように、本発明のＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体および抗マウス免疫イムノグロブリン抗体をそれぞれ別の部位、すなわちテストラインおよびコントロールラインに固定化したイムノクロマトストリップを用いる。該イムノクロマトストリップのサンプルパットには、金コロイド粒子、ラテックス粒子、蛍光粒子、磁気粒子などで標識されたＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体を予め含浸させておく。該サンプルパットに滴下された試料は、毛細管現象により展開され、テストラインに到達すると試料中のＭＥＲＳ−ＮＰのみが反応し、コントロールラインに到達すると金コロイドなどで標識されたＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体のみが反応する。その他の試料中の成分は反応せずに吸水パッドまで移動する。テストラインおよびコントロールラインの色の濃さ、反射強度、吸光度、蛍光強度、または磁気強度などをイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＭＥＲＳ−ＮＰが定量できる。
【００３２】
本発明は、ＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体またはその断片を含む診断薬もまた提供する。本発明は、さらに、かかる抗体またはその断片を試料に接触させる工程を含む診断方法もまた提供する。
【００３３】
＜検査キット＞
本発明は、ＭＥＲＳ−ＮＰに対する抗体またはその断片を含む、ＭＥＲＳコロナウイルスを検出するためのキットを提供する。
【００３４】
本発明の検査キットにおける、ＭＥＲＳ−ＮＰの測定法は、通常の免疫学的測定法であればいずれも採用できる。ここで免疫学的測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、または粒子凝集反応法などを挙げることができる。特に、本発明のＭＥＲＳ−ＮＰの免疫学的測定法には、それぞれ特徴の異なるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法は、感度と定量性に優れ、多検体を同時に処理することが可能である反面、判定までに時間を要する。イムノクロマト法は、感度と定量性は一般的にＥＬＩＳＡ法に劣るものの、迅速簡便に検査できる。フィルター抗原アッセイ法は、感度と定量性はＥＬＩＳＡ法に匹敵し、かつ迅速に検査できるものの、イムノクロマト法と比べると操作が煩雑となる。
【００３５】
本発明の検査キットは、前記の免疫学的測定法に用いられる形態であればいずれも採用できるが、好ましくは、正確、迅速かつ簡便にＭＥＲＳ−ＮＰを測定することが可能なイムノクロマトストリップ（例えば図９を参照）の形態である。
【００３６】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］ＭＥＲＳ−ＮＰに対するモノクローナル抗体の作製
ＭＥＲＳ−ＮＰに対するモノクローナル抗体を、以下の工程により産生した。具体的には、コムギ無細胞タンパク質合成系によりＭＥＲＳ−ＮＰの部分タンパク質を調製し、これを抗原としてマウスに免疫し、免疫したマウスからＢ細胞を摘出してミエローマ細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞からＭＥＲＳ−ＮＰと反応する抗体を産生する細胞を選択し、このハイブリドーマ細胞の培養上清からモノクローナル抗体を精製した。以下に詳細を示す。
【００３８】
（１）抗原タンパク質の調製
抗原タンパク質を調製するため、配列番号２に示されるＭＥＲＳのプロトタイプ株のヌクレオカプシドタンパク質をコードするｃＤＮＡ塩基配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）。なお、遺伝子配列はアミノ酸配列を基に、ヒトでのタンパク質合成用にコドンを最適化させている。これを鋳型として、ＭＥＲＳ−ＮＰアミノ酸配列の内、１２２〜４１３番目の領域をコードするｃＤＮＡ配列の３６４番目から１２４２番目のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。まず、１μＭのフォワードプライマー（配列番号３）５μＬ、１μＭのリバースプライマー（配列番号４）５μＬ、合成遺伝子が挿入された１０ｎｇ／μＬのＤＮＡベクター（ｐＵＣ５７（ジーンウィズ社））１μＬ、PrimeSTAR（登録商標）Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)２５μＬ、超純水１４μＬを混合して全量５０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。次にＰＣＲ反応を表１に示す設定で行った。
【表１】
2017145246.tif 000002
【００３９】
得られたＤＮＡ断片とpEU-E01-His-TEV-MCS-N1ベクター（セルフリーサイエンス社）を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断してアガロースゲル電気泳動により精製した後、ＤＮＡ連結酵素によりＤＮＡ断片をベクターに挿入した。挿入したＤＮＡベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。大腸菌を増殖させた後、菌体からＤＮＡベクターをプラスミド精製キット（プロメガ社またはロシュ社）により調製した。
作製したＤＮＡベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用説明書に従ってＭＥＲＳ−ＮＰのタンパク質を作製し、翻訳反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓ−ｔａｇ付加された組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質を精製した。なお、転写・合成・精製の一連の過程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を用いて行った。
【００４０】
（２）マウスの免疫、ハイブリドーマ細胞の作製
精製した３００μｇの抗原タンパク質をフロイントアジュバントと混合して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回皮下注射して免疫した。免疫したマウスから１か月後にＢ細胞を回収し、ポリエチレングリコール溶液を用いてＳＰ２/０ミエローマ細胞と融合した。融合したハイブリドーマ細胞を選択培地と共に９６穴マイクロプレートに播種した。
【００４１】
（３）ハイブリドーマ細胞のスクリーニングとクローニング
次に、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＭＥＲＳ−ＮＰに対する反応性をＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロット法により調べた。ＥＬＩＳＡ法では、まず、Ｈｉｓ−ｔａｇが付加された組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プレートをブロッキングした後、プレートにハイブリドーマの培養上清を添加して反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス免疫イムノグロブリン抗体を添加して反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、その吸光度を測定した。ウエスタンブロット法では、まずＨｉｓ−ｔａｇが付加された組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％２−メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ハイブリドーマの培養上清を添加して反応させ、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウス免疫イムノグロブリン抗体と反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させて検出した。これらのスクリーニングで特定したハイブリドーマをクローニングすることにより、抗原タンパク質に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞７種（＃５、＃１３、＃２０、＃２５、＃２９、＃４５および＃４６）を得た。
【００４２】
（４）モノクローナル抗体の調製
各ハイブリドーマを無血清・無タンパク質培養液で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清から、プロテインＡカラム（AcroSep Hyper D F，日本ポール社）を用いて各々のハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を精製した。まず、培養上清１２０ｍＬを平衡化・洗浄緩衝液（１．５Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で２倍に希釈して、平衡化・洗浄緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（容積１．０４ｍＬ）に添加して抗体をプロテインＡ担体に捕捉させ、担体に非特異的に吸着された成分を平衡化・洗浄緩衝液１０ｍＬで洗い流した。次にカラムに吸着した抗体を溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）１０ｍＬで溶出させた。回収した溶離液は、アミコンウルトラ（メルクミリポア社）を用いて濃縮した。得られた精製抗体の濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸収法で定量し、タンパク質としての純度はゲル濾過ＨＰＬＣ（TSKGEL-G3000SWXL、東ソー社）を用いて分析した。その結果を表２にまとめる。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
［実施例２］各モノクローナル抗体が認識するエピトープの解析
図４に示すように、ＭＥＲＳ−ＮＰのアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた６つの組換えタンパク質（欠損変異体）を作製し、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた。
各組換えタンパク質を調製するため、まず配列番号１に示したＭＥＲＳ−ＮＰの１２２〜４１３番目のアミノ酸配列をコードするコムギ無細胞系発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-MERS-NP(122-413)（配列番号２２）を実施例１（１）に記載の方法で作製し、これを鋳型として、ＭＥＲＳ−ＮＰアミノ酸配列の内、１２２〜１６８番目、１６５〜２１２番目、２０８〜２５３番目、２５０〜３１２番目、２９９〜３６３番目、および、３５５〜４１３番目のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターを作製した。以下に各ＤＮＡベクターの作製方法を詳細に示す。
【００４５】
コムギ無細胞発現ベクターpEU-E01-His-TEV-MERS-NP(122-413)と、表３に示すプライマーの組み合わせとを用いてＰＣＲを行った。まず、１μＭのフォワードプライマー１μＬ、１μＭのリバースプライマー１μＬ、２５ｐｇ/μＬの鋳型ＤＮＡベクター１μＬ、PrimeSTAR（登録商標）Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)５μＬ、超純水２μＬを混合して全量１０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。次にＰＣＲ反応を表１に示す設定で行った。
【表３】
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【００４６】
ＰＣＲ終了後の反応液２μＬを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。大腸菌を増殖させた後、菌体からＤＮＡベクターをプラスミド精製キット（プロメガ社またはロシュ社）により調製した。
作製したＤＮＡのベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用方法に従って、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により、各組換えタンパク質を合成した。
【００４７】
得られた各タンパク質を用いてウエスタンブロット法で各モノクローナル抗体のエピトープを解析した。結果を図５に示す。＃５、＃２０、＃２５、＃２９および＃４５の５クローンは、作製した６種類のＭＥＲＳ−ＮＰの欠損変異体のうち、３５５〜４１３番目を欠損させた変異体とのみ反応しなかったことから、３６４〜４１３番目の領域を認識することが明らかになった。一方で、＃１３、＃４６の２クローンはＭＥＲＳ−ＮＰの１６５〜２１２番目および２０８〜２５３番目を欠損させた２つの変異体と反応しないことから、その重複領域である２０８〜２１２番目の領域を認識することが示された。
次に、これらの抗体のエピトープがＭＥＲＳ−ＮＰの立体構造中のどの部位であるのかを調べた。まず、ＭＥＲＳ−ＮＰの立体構造をPDBjに登録されているＳＡＲＳ−ＮＰの立体構造（1SSK、2CJR）を鋳型としてModellerを用いてホモロジーモデリング法により二量体として構築した。なお、鋳型の構造が登録されていないアミノ酸領域はI-TASSERならびにQUARKにより構造を予測したものを用いた。そして、構築した立体構造の分子表面における各抗体のエピトープをUCSF Chimeraにより解析した。結果を図６に示す（図中、２０８〜２１２番目の領域を「208-212」として、３６４〜４１３番目の領域を「364-413」として示す）。この結果、抗体のエピトープが、ＭＥＲＳ−ＮＰ中の表面部分であることが推測された。
【００４８】
［実施例３］各モノクローナル抗体の特異性の確認
各モノクローナル抗体が他のヒトコロナウイルス、ＳＡＲＳ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、２２９ＥおよびＮＬ６３のＮＰとは反応せず、ＭＥＲＳ−ＮＰを特異的に認識するかを組換えタンパク質を合成して調べた。
各組換えタンパク質を調製するため、まずＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、２２９ＥおよびＮＬ６３それぞれのヌクレオカプシドタンパク質をコードするｃＤＮＡ塩基配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）。各配列をそれぞれ、配列番号２、１７、１８、１９、２０および２１に示す。なお、遺伝子配列はアミノ酸配列を基に、ヒトでのタンパク質合成用にコドンを最適化させている。
【００４９】
合成した各人工遺伝子が挿入されたベクター（pUC57（ジーンウィズ社））を制限酵素ＫｐｎＩとＸｈｏＩ（NEB社）で切断したものを、アガロースゲル電気泳動により精製した後、ＤＮＡ連結酵素（タカラバイオ社）により各ＤＮＡ断片をpEU-E01-His-TEV-MCS-N2ベクターに挿入した。挿入したＤＮＡベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。大腸菌を増殖させた後、菌体からＤＮＡベクターをプラスミド精製キット（プロメガ社またはロシュ社）により調製した。
各組換えタンパク質は、実施例２に記載の方法と同様の手順で合成した。
得られた各タンパク質を用いて、実施例２に記載したウエスタンブロット法と同様な手順で各モノクローナル抗体の特異性を解析した。結果を図７に示す。＃５、＃１３、＃２０、＃２５、＃２９、＃４５および＃４６はいずれもＭＥＲＳ以外のヒトコロナウイルスのＮＰとは反応せず、ＭＥＲＳ−ＮＰのみを特異的に認識した。
【００５０】
［実施例４］抗原捕捉ＥＬＩＳＡによるＭＥＲＳ−ＮＰの検出
本発明で得られた７種類のモノクローナル抗体の内、抗原認識部位が異なる＃２０および＃４６を用いて抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を実施した。
抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃４６を炭酸緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で２．５μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートに固定化し、２％のスキムミルク溶液でブロッキングした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬからＰＢＳ−Ｔで２倍ずつ段階希釈した組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質をウェルに分注して反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ標識した抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃２０と反応させた。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ社）を加えて発色させ、波長４５０ｎｍ／６３０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図８に示す。組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質を０．６２５ｎｇ／ｍＬまで定量的に検出することができた。
【００５１】
［実施例５］イムノクロマトストリップによるＭＥＲＳ−ＮＰの検出
実施例１で得られた７種類のモノクローナル抗体の内、抗原認識部位が異なる＃２０および＃４６を用いてイムノクロマトストリップを作製した。
まず、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃４６の終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、抗マウス免疫イムノグロブリン抗体の終濃度が０．１２５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。次に図９に示されるように、ニトロセルロースメンブレンのテストライン用に抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃４６、コントロールライン用に抗マウス免疫イムノグロブリン抗体を抗体塗布装置（武蔵エンジニアリング社）により線上に塗布した後に乾燥させた。乾燥後のメンブレンをブロッキングした後、純水で洗浄して乾燥させ、これをイムノクロマト用メンブレンとした。
【００５２】
次に、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃２０の終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。抗体溶液を金コロイド粒子に感作させた後、０．５％のカゼインナトリウム溶液を加えてブロッキングした。その後、金コロイド溶液を洗浄した後に、グラスファイバー製パッドに塗布して減圧乾燥し、コンジュゲートパッドとした。
上記のイムノクロマト用メンブレン、コンジュゲートパッドを図９に示すように貼り合せて切断し、イムノクロマトストリップとした。
イムノクロマトストリップに、２０ｎｇ／ｍＬから２倍ずつ展開液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデット（登録商標）  Ｐ−４０、ｐＨ７．４）で段階希釈した組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質溶液を供して、約１５分後にテストラインにおける呈色を目視で観察した。結果を図１０に示す。簡便な操作で迅速に、組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質を５ｎｇ／ｍＬまで検出することができた。
【００５３】
［実施例６］フィルター抗原アッセイを用いたＭＥＲＳ−ＮＰの発色検出
本発明において得られた７種類のモノクローナル抗体の内、抗原認識部位が異なる＃２９および＃１３を用いてフィルター抗原アッセイ法を実施した。
抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体（＃２９）をメンブレンフィルター（セルロース混合エステル、外形１３ｍｍ、孔径０．４５μｍ、メルクミリポア社）に０．５μｇ相当をスポットした後、メンブレンを自然乾燥させた。抗体を固定したメンブレンをブロックエース溶液（DSファーマバイオメディカル社）に浸漬した後、ＰＢＳ−Ｔで余分なブロッキング液を洗い流した。そして、図１１に示すように市販のフィルターホルダー（メルクミリポア社）に装着した。
【００５４】
次に、試料の１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬの組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質溶液をシリンジ側からフィルターホルダーに通液してフィルター上の抗体に捕捉させ、その後ＰＢＳ−Ｔ溶液を通液して洗浄した。さらに、蛍光標識（IRDye 700DX、LI-COR社）した抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃１３を通液後に、ＰＢＳ−Ｔを続けて通液した。最後にフィルターホルダーからフィルターメンブレンを取り出し、サンドイッチ系が成立してメンブレン上に捕捉された蛍光標識抗体の量を蛍光スキャナー（Odyssey CLx、LI-COR社）で測定した。その結果、図１２に示すように本方法で１ｎｇ／ｍＬの組換えＭＥＲＳ−ＮＰ（１２２−４１３）タンパク質を定量的に検出することができた。
【００５５】
［実施例７］抗原捕捉ＥＬＩＳＡによるＭＥＲＳコロナウイルスのウイルス様粒子の検出
本発明で開発した実施例４に記載の抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより、組換えタンパク質のみならずウイルス粒子中のＭＥＲＳ−ＮＰを検出できるかを確認するため、ウイルス様粒子（virus-like particle；ＶＬＰ）を作製して調べた。なお、ＶＬＰとは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、メンブレン（Ｍ）およびエンベロープ（Ｅ）を有するが、スパイク（Ｓ）および一本鎖（＋）ＲＮＡを有さないため感染および増殖はしない、ウイルスの外部構造と類似した構造を有する粒子を指す。抗体は、天然に存在するウイルスに対する抗原抗体反応と同様にＶＬＰに対して抗原抗体反応を示す。
ＶＬＰを調製するため、まずＭＥＲＳのプロトタイプ株のＮＰ、ＭおよびＥをコードするｃＤＮＡ塩基配列を合成した（ジーンウィズ社）。各配列をそれぞれ、配列番号２、２３および２４に示す。なお、遺伝子配列はアミノ酸配列を基に、ヒトでのタンパク質合成用にコドンを最適化させている。
合成した各人工遺伝子が挿入されたベクター（pUC57（ジーンウィズ社））を制限酵素ＫｐｎＩとＸｈｏＩ（NEB社）で切断したものを、アガロースゲル電気泳動により精製した。その後、ＤＮＡ連結酵素（タカラバイオ社）によりＮＰをコードするＤＮＡ断片をpCAG-Neo（和光純薬社）に、ＭおよびＥをコードするＤＮＡ断片をpcDNA3.1（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）に挿入した。挿入したＤＮＡベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。大腸菌を増殖させた後、菌体からＤＮＡベクターをプラスミド精製キット（プロメガ社またはロシュ社）により調製した。
【００５６】
作製したＤＮＡベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にポリエチレンイミン（ポリサイエンス社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を４０時間培養してＶＬＰを培養液中に放出させた後、培養上清を回収した。その培養上清を１０００×ｇで１０分間遠心した後、上清を孔径０．４５μｍのポリフッ化ビニリデン製フィルター（ミリポア社）でろ過した。ろ過液を遠心チューブに２０％（ｗ／ｖ）ショ糖と重層して１４１，０００×ｇで３時間超遠心した。得られた沈殿物をＰＢＳで懸濁することによりＶＬＰを回収した。調製したＶＬＰは透過型電子顕微鏡解析によりウイルス粒子とほぼ同様な大きさである、約８０〜１２０ｎｍ程度の粒子を形成していることを確認した。
本ＶＬＰを用いて実施例４に記載した抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより検出を試みた。なお、ＶＬＰはＶＬＰ中に含まれるＭＥＲＳ−ＮＰの濃度が約１１ｎｇ／ｍＬ相当となるように調製し、それをＰＢＳ−Ｔで２倍ずつ段階希釈した後、終濃度１％となるようにノニデット（登録商標）Ｐ−４０を添加したものを用いた。結果を図１３に示す。抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃２０および＃４６を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより、ＶＬＰ中のＭＥＲＳ−ＮＰを約０．７ｎｇ／ｍＬ程度まで定量的に検出することができた。
【００５７】
［実施例８］イムノクロマトストリップによるＭＥＲＳコロナウイルスのウイルス様粒子の検出
本発明で開発した実施例５に記載のイムノクロマトストリップにより、組換えタンパク質のみならずＭＥＲＳコロナウイルスのＶＬＰを検出できるか調べた。ＶＬＰは実施例７と同様な手法で作製し、展開液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデット（登録商標）Ｐ−４０、ｐＨ７．４）でＶＬＰ中に含まれるＭＥＲＳ−ＮＰの濃度が約４０ｎｇ／ｍＬ相当となるように調製し、それを展開液で２倍ずつ段階希釈したものを用いた。また、イムノクロマトストリップは実施例５に記載した手法で作製した後、ハウジングケースに装着したものを用いた。結果を図１４に示す。抗ＭＥＲＳ−ＮＰ抗体＃２０および＃４６を用いたイムノクロマトストリップにより、ＶＬＰ中のＭＥＲＳ−ＮＰを約５ｎｇ／ｍＬ程度まで定量的に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、種々のＭＥＲＳコロナウイルス株を網羅的に検出し、かつ近縁のコロナウイルスは検出せず、ＭＥＲＳコロナウイルスのみを特異的に検出することができる。また、本発明により、ＭＥＲＳコロナウイルスを、正確、迅速かつ簡便に検出することができ、それによって、ＭＥＲＳコロナウイルスの感染拡大を阻止するための検査に役立てることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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