(57)【要約】      （修正有）【課題】分子識別素子に配向性を持たせた分子識別素子固定化電極及び該固定化電極の製造方法、並びに、該電極を含むセンサ及び該センサの製造方法を提供する。【解決手段】ペプチドが連結している分子識別素子１を、金属結合性蛋白質とし、連結方法は合成による連結でも良く、遺伝子工学的手法でも良い。例えば、金属結合性蛋白質２をコードする塩基配列が組込まれた組換え微生物によって、金属結合性蛋白質２を組換え生産させる。得られた金属結合性蛋白質２は、金属結合性ペプチド２が連結しているため、ペプチドを介して分子識別素子１を化学結合により電極３に固定化できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質からなる分子識別素子が固定化された電極の製造方法であって、
前記分子識別素子に連結した親水性の金属結合性ペプチドを介して、前記分子識別素子が電極上に化学結合により固定化される工程を含む、
分子識別素子固定化電極の製造方法。
【請求項２】
前記蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に前記金属結合性ペプチドを連結した、請求項１記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
【請求項３】
前記金属結合性ペプチドが金及び白金族金属結合性である、請求項１又は２記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
【請求項４】
前記金属結合性ペプチドが塩基性ペプチドである、請求項１〜３の何れかに記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
【請求項５】
前記分子識別素子が、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である、請求項１〜４の何れかに記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
【請求項６】
蛋白質からなる分子識別素子が固定化された電極であって、
前記分子識別素子に連結した親水性の金属結合性ペプチドを介して、分子識別素子が電極上に化学結合により固定化された、
分子識別素子固定化電極。
【請求項７】
前記蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に前記金属結合性ペプチドを連結した、請求項６記載の分子識別素子固定化電極。
【請求項８】
前記金属結合性ペプチドが金及び白金族金属結合性である、請求項６又は７記載の分子識別素子固定化電極。
【請求項９】
前記金属結合性ペプチドが塩基性ペプチドである、請求項６〜８の何れかに記載の分子識別素子固定化電極。
【請求項１０】
前記分子識別素子が、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である、請求項６〜９の何れかに記載の分子識別素子固定化電極。
【請求項１１】
絶縁性基板及び請求項６〜１０の何れかに記載の電極を備える、試料液中の測定対象物を測定するためのバイオセンサ。
【請求項１２】
グルコース測定用である、請求項１１記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
請求項６〜１０の何れかに記載の電極を備える、バイオ電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子識別素子固定化電極及び該電極を含むセンサ並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電極の表面に抗体、酵素又は微生物等の分子識別素子を固定化した電極が、バイオセンサやバイオ電池に使用されている。
【０００３】
固定化には架橋剤を用いた方法等が知られているが、分子識別素子の配向性を制御することが難しいという問題があった（特許文献１）。
【０００４】
配向性を制御する固定化方法も知られているが、電極構成基材が炭素基材に限定される、又は酵素が特定の構造を有する必要があり、汎用性が低いという問題があった（特許文献２又は３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−６１５４号公報
【特許文献２】特開２００５−８３８７３号公報
【特許文献３】特許第５２１９２６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
電極への分子識別素子の固定化において、配向性を制御できる固定化方法であって、かつ汎用性のある固定化方法が求められていた。本発明は、前記に鑑みてなされたものであり、分子識別素子に配向性を持たせた分子識別素子固定化電極及び該固定化電極の製造方法、並びに、該電極を含むセンサ及び該センサの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、金属結合性ペプチドを連結した分子識別素子を用いることで、配向性を持たせた固定化が可能になることを見出した。更に、様々な分子識別素子及び電極に応用可能な該固定化方法により分子識別素子固定化電極の製造方法を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１３］の態様に関する。
［１］蛋白質からなる分子識別素子が固定化された電極の製造方法であって、前記分子識別素子に連結した親水性の金属結合性ペプチドを介して、前記分子識別素子が電極上に化学結合により固定化される工程を含む、分子識別素子固定化電極の製造方法。
［２］前記蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に前記金属結合性ペプチドを連結した、［１］記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
［３］前記金属結合性ペプチドが金及び白金族金属結合性である、［１］又は［２］記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
［４］前記金属結合性ペプチドが塩基性ペプチドである、［１］〜［３］の何れかに記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
［５］前記分子識別素子が、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である、［１］〜［４］の何れかに記載の分子識別素子固定化電極の製造方法。
［６］蛋白質からなる分子識別素子が固定化された電極であって、前記分子識別素子に連結した親水性の金属結合性ペプチドを介して、分子識別素子が電極上に化学結合により固定化された、分子識別素子固定化電極。
［７］前記蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に前記金属結合性ペプチドを連結した、［６］記載の分子識別素子固定化電極。
［８］前記金属結合性ペプチドが金及び白金族金属結合性である、［６］又は［７］記載の分子識別素子固定化電極。
［９］前記金属結合性ペプチドが塩基性ペプチドである、［６］〜［８］の何れかに記載の分子識別素子固定化電極。
［１０］前記分子識別素子が、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である、［６］〜［９］の何れかに記載の分子識別素子固定化電極。
［１１］絶縁性基板及び［６］〜［１０］の何れかに記載の電極を備える、試料液中の測定対象物を測定するためのバイオセンサ。
［１２］グルコース測定用である、［１１］記載のバイオセンサ。
［１３］［６］〜［１０］の何れかに記載の電極を備える、バイオ電池。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、分子識別素子に配向性を持たせた分子識別素子固定化電極が簡便に製造でき、かつ、本発明の方法は、汎用性の高い方法である。更に、本発明により、電極上で分子識別素子形状が安定し、構造変化による不活性化を抑えることができる。よって、電極上の分子識別素子量を抑えられ、コストを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】分子識別素子固定化電極の模式図である。左から、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端、並びにＮ末端及びＣ末端に金属結合性ペプチドを連結した分子識別素子の固定化を表している。
【図２】金属結合性エステラーゼＥｓｔ−Ｎ１〜１７及びＥｓｔ−Ｃ１〜１７の模式図である。
【図３】金属結合性エステラーゼの固定化に関する評価結果である。
【図４】金属結合性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの配向性制御能評価結果である。
【図５】金属結合性グルコース脱水素酵素ＧＬＤ−Ｎ１、ＧＬＤ−Ｃ１’及びＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’の模式図である。
【図６】金属結合性グルコース脱水素酵素ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’の固定化に関する評価結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の分子識別素子は、蛋白質からなり、糖蛋白質でもよい。該分子識別素子は酵素又は抗体が好ましく、加水分解酵素、転移酵素又は酸化還元酵素が例示できる。例えば、加水分解酵素はエステラーゼ、転移酵素はｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼが例示できる。酸化還元酵素は、酸化酵素及び脱水素酵素を包含する。例えば、グルコース、乳酸、コレステロール又はアルコールをそれぞれ基質として、酸化反応を触媒する酵素が例示できる。グルコース酸化酵素、グルコース脱水素酵素、乳酸酸化酵素、乳酸脱水素酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、アルコール酸化酵素又はアルコール脱水素酵素が好ましい。
【００１２】
本発明の分子識別素子は、金属結合性ペプチドを連結している。該ペプチドが連結する部位は、該分子識別素子の蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端が好ましい。該分子識別素子と該ペプチドとの間にリンカーペプチドがあっても良い。該ペプチドが連結している分子識別素子を、金属結合性蛋白質とする。連結方法は、合成による連結でも良く、遺伝子工学的手法でも良い。例えば、金属結合性蛋白質をコードする塩基配列が組込まれた組換え微生物によって、金属結合性蛋白質を組換え生産させる。得られた金属結合性蛋白質は、金属結合性ペプチドが連結しているため、該ペプチドを介して分子識別素子を化学結合により電極に固定化できる。
【００１３】
本発明の金属結合性ペプチドは、金属表面に化学的に結合できるペプチドであれば良い。好ましくは、金及び白金族金属結合性ペプチドであり、例えば、白金族金属は白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム又はイリジウムが例示でき、パラジウム結合性ペプチドが最も好ましい。該ペプチドは、親水性ペプチドであることが好ましい。更に、塩基性ペプチドであることが好ましい。また、３〜２０アミノ酸であることが好ましく、４〜１４アミノ酸であることがより好ましく、６〜１２アミノ酸であることが更に好ましい。本発明の金属結合性ペプチドの選定については、特にファージディスプレイを使った進化分子工学的手法で効率的に所望のペプチドを選定できる。表１記載の金属結合性ペプチドＰ１〜Ｐ１７又はその逆配列を有する金属結合性ペプチドが例示できる。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
本発明の電極は、金属結合性ペプチドが結合できる導電物質を基材とする電極であれば良い。導電物質は、金又は白金族金属が好ましい。例えば、白金族金属は白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム又はイリジウムが例示でき、パラジウムが最も好ましい。前記金属を導電物質として含む電極が好ましい。
【００１６】
本発明の分子識別素子固定化電極は、金属結合性ペプチドを連結している分子識別素子を、前記金属結合性ペプチドを介して電極上に化学結合により固定化する工程を含むことにより、製造できる。
【００１７】
本発明のバイオセンサは、絶縁性基板及び本発明の電極を含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着等の方法を利用して電極系を形成する工程、及び分子識別素子を固定化する工程を含むことにより製造できる。電極は対極及び作用極を備えることが好ましく、参照極を備えても良い。電流値、イオン、発色強度又は振動数変化等を検知する方式のバイオセンサを構築可能である。更に、メディエータ、緩衝剤又は安定化剤を含んでも良い。
【００１８】
メディエータは、ヘム等の蛋白質性電子メディエータや、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等を例示できる。緩衝剤は、目的の反応環境に調整できる緩衝剤であれば良い。安定化剤としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、分子識別素子と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。
【００１９】
本発明のバイオセンサを用いることによって、試料液中の測定対象物を測定する、測定方法を提供できる。試料液に該バイオセンサを接触させる工程を備えることで、試料液中の測定対象物を測定できる。固定化する分子識別素子は、所望の測定対象物によって、適宜選択すれば良い。例えば、グルコースを測定する場合は、グルコース酸化酵素又はグルコース脱水素酵素を電極に固定化すれば、グルコース測定方法を提供できる。試料液は特に限定されないが、生体試料が例示でき、具体例として血液、涙、尿又は細胞間質液等が例示できる。血糖測定には、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする真核細胞由来のグルコース脱水素酵素が好ましい。
【００２０】
本発明のバイオ電池は、本発明の電極を含む電池であれば良い。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記のメディエータ及び酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。
【実施例】
【００２１】
［実施例１］
（エステラーゼ（Ｅｓｔ）の固定化）
金属結合性ペプチドを連結した、３４種類の金属結合性Ｅｓｔを作成した。ＥｓｔのＮ末端に金属結合性ペプチドＰ１〜Ｐ１７を連結したＥｓｔ−Ｎ１〜１７、及びＥｓｔのＣ末端にＰ１〜Ｐ１７を連結したＥｓｔ−Ｃ１〜１７である。図１に模式図を示す。
【００２２】
３４種類の各金属結合性Ｅｓｔについて、パラジウム板への固定化を行った。２４穴プレートに、片面がパラジウムメッキされた１ｃｍ×１ｃｍのプラスチック板（Ｐｄ板）を、メッキ面を上にして、両面テープで固定した。該プレートに、１０μｇ／ｍｌＥｓｔ−Ｎ１溶液を、８００μＬ添加し、３７℃で１時間静置することで、Ｐｄ板上にＥｓｔ−Ｎ１を結合させた。次に、該Ｐｄ板を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに、３７℃で５分間浸す洗浄工程を３回行った。更に、ＰＢＳに３７℃で５分間浸し、未結合のＥｓｔ−Ｎ１を除去した。
【００２３】
該Ｐｄ板上のＥｓｔ活性を測定するため、該Ｐｄ板を、予め３７℃保温した４．９５ｍＬＰＢＳ入り５ｍＬ容チューブに移した。該チューブに、１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル酢酸を５０μＬ添加し、酵素反応を開始した。５分毎に１００μＬサンプリングして９６穴プレートに入れ、プレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｅｓｔ−Ｎ２〜１７及びＥｓｔ−Ｃ〜１７についても前記と同様に測定した。尚、コントロールとして、金属結合性ペプチドを連結していないＥｓｔを用いて、前記と同様に測定した。結果を図３に示した。横軸に、金属結合性ペプチドＰ１〜Ｐ１７をＮ末端又はＣ末端に連結したものを、Ｐ１〜Ｐ１７で表し、前記コントロールをＣで表した。縦軸に、Ｐｄ板上のエステラーゼ残存活性について、コントロールを１として相対値で表した。
【００２４】
その結果、Ｅｓｔ−Ｎ１〜１７又はＥｓｔ−Ｃ１〜１７は、金属結合性ペプチドを連結していないＥｓｔと比較して、Ｐｄ板上のＥｓｔ残存活性が約１．５〜４．０倍だった。よって、エステラーゼは、何れも、連結した金属結合性ペプチドによってＰｄ板上に固定化されたため、Ｐｄ板上で高い残存活性を呈することが可能になったと思われる。
【００２５】
［実施例２］
（ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳＳ）の固定化）
金属結合性ペプチドを連結した１２種類の金属結合性ＯＡＳＳを作製した。ＯＡＳＳのＮ末端に金属結合性ペプチドＰ１、２、３、４、９又は１３を連結したＯＡＳＳ−Ｎ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９又はＯＡＳＳ−Ｎ１３、及びＯＡＳＳのＣ末端にＰ１、２、３、４、９又は１３を連結したＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３である。
【００２６】
１２種類の各金属結合性ＯＡＳＳについて、電極への固定化を行い、ＮＡＰｉＣＯＳシステム（日本電波工業社製）を用いて配向性制御能を評価した。最初に、ＱＣＭセンサ（日本電波工業社製）について、水晶振動子の金電極表面をパラジウム蒸着処理することで、パラジウム成膜処理ＱＣＭセンサを作製した。該センサのパラジウム上に、１００μｇ／ｍＬ  ＯＡＳＳ−Ｎ１溶液を添加し、室温にて１時間静置することで、パラジウム表面にＯＡＳＳ−Ｎ１を結合させた。次に、該センサを、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して未結合のＯＡＳＳ−Ｎ１を除去し、ＯＡＳＳ−Ｎ１固定化センサチップを作製した。該センサをＮＡＰｉＣＯＳシステムにセットし、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ溶液でブロッキング処理した。１０μｇ／ｍＬのセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）溶液を流し、次に１００μｇ／ｍＬのＳＡＴ溶液を流して、該センサ上のＯＡＳＳ−Ｎ１と相互作用させ、各々の振動数変化を測定した。ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３についても同様の操作を行い、振動数変化を測定した。結果を図４に示した。
【００２７】
蛋白質のＣ末端側に金属結合性ペプチドを連結すると、Ｃ末端側で金属に結合し、一方、Ｎ末端側に金属結合性ペプチドを連結すると、Ｎ末端側で金属に結合する。ＯＡＳＳはＣ末端付近に活性部位があるため、理論上、Ｃ末端側で金属に結合すると、ＳＡＴが作用し難いため測定値が小さく、Ｎ末端側で金属に結合すると、活性部位にＳＡＴが作用し易いため測定値が大きくなると考えられる。よって、ＯＡＳＳ−Ｎ１とＯＡＳＳ−Ｃ１の前記測定値を比べて、ＯＡＳＳ−Ｎ１の方が振動数変化が大きければ、金属結合性ペプチドにより配向性制御がなされていると判断できる。
【００２８】
図４より、ＯＡＳＳ−Ｎ１とＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２とＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３とＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４とＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９とＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｎ１３とＯＡＳＳ−Ｃ１３は、全てＮ末端に金属結合性ペプチドを連結した方が振動数変化が大きかった。すなわち、ＯＡＳＳは、何れも、連結した金属結合性ペプチドによって電極上に固定化され、更に、配向性制御もなされていることが明らかとなった。
【００２９】
［実施例４］
（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の固定化）
金属結合性ペプチドを連結した、３種類の金属結合性ＧＬＤを作成した。１つ目はＧＬＤのＮ末端に金属結合性ペプチドＰ１を連結したＧＬＤ−Ｎ１である。２つ目はＧＬＤのＣ末端に金属結合性ペプチドＰ１の逆配列Ｐ１’を連結したＧＬＤ−Ｃ１’である。３つ目はＧＬＤのＮ末端にＰ１を、Ｃ末端にＰ１’を連結したＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’である。図５に模式図を示す。
【００３０】
前記ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’について、パラジウム板への固定化を行った。１２穴プレートに、片面がパラジウムメッキされた１ｃｍ×１ｃｍのプラスチック板（Ｐｄ板）を、メッキ面を上にして、両面テープで固定した。該プレートに、７μｇ／ｍｌＧＬＤ−Ｎ１溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間静置することで、Ｐｄ板上にＧＬＤ−Ｎ１を結合させた。次に、該Ｐｄ板を、５ｍＬの０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに、室温で５分間浸す洗浄工程を３回行った。更に、ＰＢＳに室温で５分間浸し、未結合のＧＬＤ−Ｎ１を除去した。
【００３１】
該Ｐｄ板上のグルコース脱水素酵素活性を測定するため、該Ｐｄ板を、１２穴プレートに移した。該１２穴プレートに、予め２５℃保温したＧＬＤ活性測定試薬を添加することで酵素反応を開始した。経時的にサンプリングして、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。尚、ＧＬＤ活性測定試薬は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水０．６１ｍＬ、３ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬの混合液である。ＧＬＤ−Ｃ１’及びＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’についても前記と同様に測定した。尚、コントロールとして、金属結合性ペプチドを連結していないＧＬＤを用いて、前記と同様に測定した。何れも２回測定し、平均値を算出した。結果を図６に示した。縦軸に、Ｐｄ板上のＧＬＤ残存活性について、コントロールの平均値を１として相対値で表した。
【００３２】
その結果、平均値で比較すると、ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’は、金属結合性ペプチドを連結していないＧＬＤと比較して、Ｐｄ板上のＧＬＤ残存活性が約３．８倍だった。よって、グルコース脱水素酵素は、何れも、連結した金属結合性ペプチドによってＰｄ板上に固定化されたため、Ｐｄ板上で高い残存活性を呈することが可能になったと思われる。
【符号の説明】
【００３３】
１・・・分子識別素子、２・・・金属結合性ペプチド、３・・・電極、４・・・金属結合性蛋白質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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