(57)【要約】【課題】植物体内で発現させたEGFタンパク質の精製品の収率を高めることができる手段を提供すること。【解決手段】上皮細胞増殖因子を含む植物体を破砕する破砕工程；破砕液を遠心分離し、上清を回収する遠心分離工程；回収された上清を、ポリエチレングリコール相及び塩相で構成される水性二相系を用いた水性二相分配法に付し、ポリエチレングリコール相を回収する二相分配工程；及びポリエチレングリコール相をイオン交換クロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィーに付すクロマトグラフィー工程を含み、限外濾過工程を含まないことを特徴とする、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品の製造方法を提供した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖因子を含む植物体を破砕する破砕工程；
破砕液を遠心分離し、上清を回収する遠心分離工程；
回収された上清を、ポリエチレングリコール相及び塩相で構成される水性二相系を用いた水性二相分配法に付し、ポリエチレングリコール相を回収する二相分配工程；及び
ポリエチレングリコール相をイオン交換クロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィーに付すクロマトグラフィー工程
を含み、限外濾過工程を含まないことを特徴とする、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品の製造方法。
【請求項２】
ポリエチレングリコールの分子量が1000〜20000である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフィー工程がイオン交換クロマトグラフィーにより行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
塩相の構築に用いられる塩が、硫酸塩及びリン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
硫酸塩が硫酸アンモニウムである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
リン酸塩がリン酸水素二ナトリウムである、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコール相のポリエチレングリコール濃度が10w/w％〜50w/w％である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
塩相の塩濃度が2w/w％〜30w/w％である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記破砕液に凝集剤を添加して遠心分離を行なう、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
凝集剤がカチオン性ポリマーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法により、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品を製造し、該精製品を化粧品に配合することを含む、上皮細胞増殖因子が配合された化粧品の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法により、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品を製造し、該精製品を医薬品又は医薬部外品に配合することを含む、上皮細胞増殖因子が配合された医薬品又は医薬部外品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖因子は、対応する受容体に結合して、細胞内シグナル伝達系を経て細胞の増殖に必要な代謝系活動を誘発し、細胞の増殖を促す。上皮細胞増殖因子（EGF）は細胞増殖因子のひとつである。EGFの生理活性として、細胞増殖作用の他、胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化器粘膜保護作用、DNA合成促進作用、角膜修復作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用などが知られている。
【０００３】
EGF等の細胞増殖因子は、医薬品及び化粧品等の成分の一つとして利用されている。EGFの効率的な生産方法についても研究が進められており、遺伝子組み換えによるEGFの生産方法が種々報告されている。それらの報告の一例として、大腸菌による生産（非特許文献１）、酵母による生産（非特許文献２〜４）、植物による生産（特許文献１、非特許文献５）等がある。
【０００４】
本願発明者らは、これまでに、植物細胞内で高い効率でEGFを発現できる改変されたEGFコード配列及びシグナルペプチドコード配列を見出し、この配列を利用して、遺伝子組み換え植物を用いない一過性発現系による植物体内でのEGFの実用化可能な生産方法を確立している（特許文献２）。
【０００５】
当該一過性発現技術により発現させたEGFの植物体からの精製は、限外濾過と疎水性相互作用クロマトグラフィーを組み合わせて行なわれている。
【０００６】
より具体的には、第一段階として、タンパク分解酵素阻害剤を含む緩衝液中で、ミキサー等を用いて、収穫した植物地上部を破砕して植物組織からEGFを抽出することから始まる。収穫した地上部すなわち植物組織は、基本的には植物細胞より成り立っている。植物の細胞は、セルロースを主成分とする細胞壁で保護されて、また細胞内部は葉緑体に代表される種々の器官を含んでいる。植物組織からのEGFの抽出は、物理的手段によって細胞壁、葉緑体等の細胞内器官を破壊して植物細胞内の成分を含む抽出物を調製する工程である。この抽出物には、植物組織の破壊物と共に微小な細胞の破片、器官の破壊物等が含まれている。
【０００７】
精製の第二段階として、物理的破壊によって生じた植物組織の破壊物、細胞壁の断片、及び細胞内器官の破壊物を濾過、遠心等の手段により除去して、EGFを含む組成物を調製する。この調製液は、肉眼では澄んだ液体であるが、まだ微小な細胞壁の断片、細胞内器官の断片等を含んでいる。これらの成分を取り除くため、一定の分子量以上の成分を除去する限外濾過を用いる。限外濾過工程では、例えばMiracloth（CALBIOCHEM社）やガラス繊維ろ紙等のフィルターで濾過後、濾液を分画分子量10〜30kDa程度のメンブレンでクロスフロー濾過して粗精製物を得る。その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製を進めて精製品を得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報WO 2011/083500
【特許文献２】国際公開公報WO 2014/097733
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】F. kishimoto et al., Gene, 45, 311 (1986)
【非特許文献２】M. S. Urdea, et al. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 80 7461 (1983)
【非特許文献３】J. M. Clements, et al., Gene 106, 267 (1991)
【非特許文献４】Z. Hambali, Journal of International Studies, 10, 36 (2009)
【非特許文献５】Sonin Wirth, et al., Molecular Breeding 13: 23-35, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献２に記載されている上記の精製方法によれば、生物活性を有するEGFタンパク質組成物を高い純度で得ることができる。しかしながら、これまでの精製方法では、クロマトグラフィー後の最終的な収率が十数％程度と非常に低いことがその後の検討で明らかとなった。植物組織内でのEGF生産効率を高めても、精製品の収率が低いままでは、EGFの生産コストの削減を十分に図ることができない。従って、本発明は、植物体内で発現させたEGFタンパク質の精製品の収率を高めることができる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、植物組織内で発現させたEGFの精製工程について検討を重ね、限外濾過膜による粗精製の工程が収率を低下させる要因になっていると考え、鋭意に研究を進めた結果、限外濾過に代えてポリエチレングリコール相と塩相とで構成される水性二相系を用いた二相分配法を採用し、二相分配による精製液をクロマトグラフィーにより精製することで、活性を有するEGFタンパク質組成物精製品の収率を高めることができること、特にクロマトグラフィー工程においてイオン交換クロマトグラフィーを行なうことで、従来の限外濾過による精製法の２倍以上まで収率を高めることができることを見出し、本願発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、上皮細胞増殖因子を含む植物体を破砕する破砕工程；破砕液を遠心分離し、上清を回収する遠心分離工程；回収された上清を、ポリエチレングリコール相及び塩相で構成される水性二相系を用いた水性二相分配法に付し、ポリエチレングリコール相を回収する二相分配工程；及びポリエチレングリコール相をイオン交換クロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィーに付すクロマトグラフィー工程を含み、限外濾過工程を含まないことを特徴とする、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品の製造方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品を製造し、該精製品を化粧品に配合することを含む、上皮細胞増殖因子が配合された化粧品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により、植物体内で発現させた上皮細胞増殖因子の精製品を製造し、該精製品を医薬品又は医薬部外品に配合することを含む、上皮細胞増殖因子が配合された医薬品又は医薬部外品の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、植物体内で発現させたEGFを高い収率で精製できる手段が提供された。本発明によれば、これまでの精製方法と比較して非常に高い収率で、植物体内で発現させたEGFを抽出・精製することができる。これによりEGF組成物の製造コストをさらに抑えることができ、EGFを配合した化粧品や医薬品、医薬部外品のさらなる低価格化を実現可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】二相分配法により粗精製したEGFをさらに精製するために実施したイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２】イオン交換クロマトグラフィにより分取したフラクション（No. 7, 13, 20, 28〜35, 39）について、SDS-PAGEで分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のEGF精製品の製造方法は、植物体内で発現させたEGFを抽出精製するために用いられる。EGFは、好ましくはヒトEGFである。植物体内でのEGFの発現は、植物ゲノム中にEGFコード配列が組み込まれた組換え植物による発現でもよいし、EGFコード配列が組み込まれた組換え植物ウイルスを植物に感染させることによる、一過性発現系による発現でもよい。一過性発現系によるEGF生産技術としては、本願発明者らが確立した特許文献２記載の手法を挙げることができる。当該手法では、シグナルペプチド及びEGFをコードする塩基配列を植物細胞内で発現させるために最適化した改変配列を利用するが、本願配列表の配列番号１に示す塩基配列が当該改変配列の好ましい一例である。
【００１６】
本発明では、まず、発現させたEGFを含む植物体を、プロテアーゼ阻害剤を含む適当な緩衝液中で破砕する（破砕工程）。ミキサーやホモジナイザー等を用いて、冷却下で破砕すればよい。破砕する植物体としては、地上部のいずれの部位を用いてもよいが、通常は葉が好ましく用いられる。
【００１７】
次いで、破砕液を遠心分離し、上清を回収する（遠心分離工程）。この際、凝集剤を添加して遠心分離を行なうことが好ましい。凝集剤としては、カチオン性ポリマーを好ましく使用することができる。カチオン性ポリマーの使用濃度は、例えば1〜5v/v％程度の終濃度で用いればよい。凝集剤を添加して遠心分離することにより、二相分配工程における粗精製液の呈色や、クロマトグラフィー工程におけるクロマトグラフィー担体への沈着等の悪影響を及ぼす目的タンパク質以外の不純物を、破砕液から効率よく除去することができる。本願発明者らは、カチオン性ポリマーの中でも、特にポリエチレンイミンを凝集剤として用いることで、破砕液中の不純物を極めて効率よく除去できることを見出した。従って、凝集剤としてはポリエチレンイミンを使用することが特に好ましい。
【００１８】
次いで、水性二相分配法により、遠心分離後の上清に含まれるEGFの粗精製を行なう（二相分配工程）。水性二相分配法とは、水性二相分離とも呼ばれる技術であり、従来からタンパク質などの生物由来物質の精製に用いられている、それ自体は公知の技術である（例えば、Folke Tjerneld、(訳)三宅淳、蛋白質  核酸  酵素, Vol.37, No.1, p.37-45, 1992; Marco Rito-Palomares, Journal of Chromatography B, 807 (2004) p.3-11; Per-Ake Albertsson Ed. Partition of Cell particles and Macromolecules 3rd. Edition, Wiley(Inter-science) New York 1986 p.8-39; Methods in Enzymology, Vol.228, Academic Press 1994 p.28-42など参照）。２種類の水溶性ポリマー又は水溶性ポリマーと塩の組み合わせにより水溶液が２相に分離する現象を利用し、水溶液中の各物質を各相への分配係数の差により分離する方法である。従来の液液抽出法としては、水性溶媒又は水性溶媒と有機溶媒とを用いた分離が一般的であるが、多くの生体高分子は有機溶媒との接触によって変性を起こすため使用できなかったのに対し、水溶性ポリマーを利用した2相分配技術では有機溶媒を利用しないため、生体高分子の分離に適している。また、2相分配技術を生体物質の分離に使用すると、以下のような利点があり、本発明においてもこれらの利点を享受することができる。
(1)固相を用いないため、生体物質の吸着とそれに伴う構造破壊・変性などを回避できるだけでなく、生体物質の多くは親水性ポリマーの共存によって安定化されるので常温での操作が可能になる。
(2)  2相間の界面張力の差がわずかであるため、混和により比較的安定な微細液滴の懸濁状態が得られるので、分配平衡の達成が迅速かつ容易である。
(3)  分配係数が系の全体積、2相の体積比そして分離対象の濃度に鈍感であるので、試験管規模の実験結果に基づいてスケールアップを容易に行える。
(4)  目的物質と親和性の高いリガンドを導入し、分離の特異性を向上することができる。
【００１９】
本発明では、二相分配工程において、水性ポリマー相及び塩相で構成される水性二相系を用いる。水性ポリマーとしてはポリエチレングリコール（PEG）を用いる。この水性二相系では、PEG相が上層に、塩相が下層になり、植物体から抽出されたEGFタンパク質は上層のPEG相に分配される。使用可能なPEGの分子量は1000〜20000の範囲であり、中でも分子量1000〜10000、特に分子量3000〜8000のPEGを好ましく用いることができる。なお、分子量が異なる２種以上のPEGを混合してPEG相を構築してもよい。
【００２０】
PEG相のPEG濃度は適宜設定することができるが、通常は50w/w％以下であり、例えば45w/w％以下、40w/w％以下、35w/w％以下、30w/w％以下、28w/w％以下、又は25w/w％以下であり得る。PEG濃度の下限も特に限定されないが、例えば10w/w％以上、12w/w％以上、15w/w％以上、又は20w/w％以上であり得る。2種以上のPEGを組み合わせて用いる場合、上記の濃度は合計の濃度を指す。
【００２１】
塩相の構築には、硫酸塩及びリン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種を好ましく用いることができる。硫酸塩の具体例としては、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム等を挙げることができ、例えば硫酸アンモニウムを好ましく用いることができる。リン酸塩の具体例としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸三カリウム、リン酸一マグネシウム、リン酸二マグネシウム、リン酸三マグネシウム等を挙げることができ、例えばリン酸水素二ナトリウムを好ましく用いることができる。とりわけ、硫酸アンモニウム及びリン酸水素二ナトリウムの少なくともいずれか、特に両者を用いることが好ましい。
【００２２】
塩相の塩濃度は、PEG相のPEG濃度に応じて適宜設定することができる。通常、塩濃度は30w/w％以下であり、例えば25w/w％以下、20w/w％以下、15w/w％以下、10w/w％以下、8w/w％以下、又は6w/w％以下であり得る。塩濃度の下限についても特に限定されないが、例えば2w/w％以上、3w/w％以上、又は4w/w％以上であり得る。なお、ここでいう塩相の塩濃度とは、精製対象物中に含まれる塩類は含まず、塩相の構築のために系内に添加して用いる塩の濃度である。2種以上の塩を組み合わせて用いる場合、上記の濃度は合計の濃度を指す。
【００２３】
二相分配工程では、遠心分離後の上清にPEGと塩を適当量添加し、完全に溶解するまで十分に撹拌を行なった後、遠心分離して上層のPEG相を回収すればよい。通常、４℃〜室温程度の温度で二相分配が行われる。
【００２４】
回収したPEG相は、次いで、クロマトグラフィーによる精製に付す（クロマトグラフィー工程）。水性二相分配技術の問題点として、EGF中間精製物はPEG相の中に溶解しているため、さらに精製を進めるためにはPEGを除去しなければならない。水性二相分配による生物由来物質の精製においては、これまでに限外濾過法やゲル濾過クロマトグラフィー等のいくつかの方法が検討されてきたが（Marco Rito-Palomares, Journal of Chromatography B, 807 (2004) p.3-11）、PEG相の粘度の高さ等により実用化には問題が多く残されていた。本願発明者らは、この問題点を解決するために研究を重ねた結果、PEGを除去する手段としてイオン交換クロマトグラフィーが最も有効な手段であることを見出した。
【００２５】
イオン交換クロマトグラフィーは、生体分子の荷電状態を利用し、反対の電荷を有する担体と可逆的に結合・溶出させて回収する手法である。タンパク質ごとの溶出条件の違いを利用し精製を行うことができる。カラムに充填されている担体は分子構造の一部にイオン基として電離する構造を持つため、反対の電荷を有する物質と結合する。たとえばタンパク質は、多種類のイオン性のアミノ酸を含み、正の電荷と負の電荷の両方を分子表面に持っている。この電荷の総和を有効表面電荷と呼ぶが、アミノ酸の荷電状態が溶液のpHによって正や負へ変化するため、タンパク質分子の有効表面電荷もpHに依存して変化し、タンパク質ごとに表面電荷の正負が釣り合う等電点が存在する。多くの場合、担体に結合したタンパク質はバッファーのイオン強度（塩濃度）を高めるか、あるいはpHを変えて溶出させる。イオン強度を高めると、塩イオン（通常Na+かCl-）と担体に結合した成分が担体表面の電荷と拮抗して結合成分が溶離し始める。イオン強度が高くなるにつれて、そのpHで有効表面電荷の最も少ないタンパク質から溶出していく。pHを変化させると等電点に達したタンパク質は担体との結合力を失い溶出していく。
【００２６】
もっとも、クロマトグラフィー工程はイオン交換クロマトグラフィーに限定されず、吸着クロマトグラフィーによりPEG相を精製することも可能である。タンパク質分子の吸着には主にヒドロキシアパタイト担体が用いられる。
【００２７】
クロマトグラフィー工程では、PEG相の粘度や塩相の高い塩濃度による悪影響を除くため、回収したPEG相を2倍〜20倍程度に希釈することが望ましい。希釈倍率は、使用されるPEGの分子量、塩の種類、濃度によって適宜選択される。クロマトグラフィー担体にEGFを吸着させ、洗浄後、適当な濃度勾配をつけた溶出液で溶出を行ない、適宜280nmの吸光度をモニターしながらEGFを含むフラクションを回収すればよい。
【００２８】
以上の工程により、限外濾過を行なうことなく、植物体内で発現させたEGFを高い収率で回収精製することが可能となる。得られたEGF精製品は、化粧品や医薬品、医薬部外品等の様々な製品に配合して用いることができる。「製品に配合する」とは、該製品の成分の一つとしてEGF精製品を用い、該製品の製造工程のいずれかのステップで他の成分の少なくとも一部と混合することを意味する。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
特許文献２（WO 2014/097733）に記載した方法に従って成熟型ヒトEGFのアミノ酸配列を組み込んだタバコモザイクウイルス（TMV）発現ベクターを作成し、組換えTMV RNAを接種した植物の葉を材料としてEGFの精製を実施した。
【００３１】
＜TMV発現ベクターの作成及びウイルス接種の概要（詳細は特許文献２記載の通り）＞
タバコエクステンシンシグナルペプチド配列と、53残基の成熟型ヒトEGF配列と、小胞体保留シグナルKDELとを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるインサートDNA（配列番号１）は、化学合成により作製した。その一方で、組換えタバコモザイクウイルスを発現可能なプラスミドUB001をPacI及びXhoIで消化し、アガロースゲルで泳動後にゲルから抽出・精製した。インサートDNAとUB001をT4 DNAリガーゼでライゲーションした（３７℃、２０分）。得られたプラスミドDNAをヒートショックにより大腸菌NEB5−α（New England BioLabs社）に導入し、アンピシリン含有培地でスクリーニングしてシングルコロニーを増殖させ、この大腸菌細胞からmini prepキット（キアゲン社）を用いてプラスミドDNAを抽出・精製することにより、UB001のタバコモザイクウイルスMP領域とCP領域との間にインサートDNAが挿入された組換えTMV発現プラスミドを得た。この組換えTMV発現プラスミドDNAを鋳型として、Ambion mMessage mMachine kit（Life Technologies）を用いて転写反応を行なった。
【００３２】
転写反応後の反応液を用いて、バッファー（GENEWARE（登録商標）Inoculation Buffer（GIB））と混合して接種原とした。この接種原を使用して、タバコ（Nicotiana benthamiana）1個体につき2枚の本葉に、葉1枚当たり30μLの接種原を滴下し、手袋をはめた指で軽く擦って葉に傷をつけることにより、組換えTMV RNAをタバコに感染させた。
【００３３】
＜タバコの葉からのEGFの粗精製＞
【００３４】
接種後14日間栽培した後、病徴が出現したタバコ葉243gを収穫した。抽出用緩衝液（50mMトリス緩衝液（pH8.5）、10mM EDTA、1mM PMSF（Phenylmethylsulfonyl fluoride、プロテアーゼ阻害剤として）、0.1％Triton X-100）は、抽出作業まで4℃に冷蔵保存した。
【００３５】
243gの葉に244mLの抽出用緩衝液を加えて、ジューサーで破砕抽出して、ガラス瓶に入れて氷液に保存した。この液にポリエチレンイミン50%溶液を4%（V/V）の割合で添加して20分放置した後、４℃で10,000g、10分間遠心して、その上清液を分離して2相分配法の精製を実施した。
【００３６】
＜二相分配法による精製＞
上記の方法で処理した上清液549mLに(NH4)2SO4 18.14g、Na2HPO4 15.59g、ポリエチレングリコール6000（PEG6000）167.7gを加えて、完全に溶解するまでスターラーで撹拌した後、４℃で10,000g、10分間遠心して上層部を回収した。これを2相分配法による精製液とした。
【００３７】
＜イオン交換クロマトグラフィーによる精製＞
2相分配法で精製した溶液100mLを撹拌装置のある容器に入れ、撹拌しながらRO水で950mLに希釈して水酸化ナトリウム溶液でpH10.2に調製した後、RO水で１Lとした。
【００３８】
この希釈液１Lを20mMグリシン緩衝液（pH10.2）で平衡化したHiPrep Q XLカラム（GEヘルスケア社）に4.3mL/分の速度で流して、その後20mMグリシン緩衝液（pH10.2）で洗浄した。このカラムを20mMグリシン緩衝液（pH10.2）に0〜0.5M（0.5モル/L）塩化ナトリウムの濃度勾配溶液で溶出して、15mLのフラクションを280nmの吸光度をモニターしながら分取した（図１）。
【００３９】
＜SDS-PAGEによる分析＞
イオン交換クロマトグラフィにより分取したフラクション（No. 7, 13, 20, 28〜35, 39）についてSDS-PAGEで分析した。分析は、分子量マーカー、EGF 1μg、各フラクション10μLを電気泳動条件300V、20mA、80分で実施して、染色を行った（図２）。電気泳動後の染色像についてスキャナー分析を行って各フラクションの純度を算出した(表１)。
【００４０】
＜収率＞
R&D社のキットを用いてEIA法により各フラクションのEGF濃度を測定、収率を算出し、特許文献１に記載の精製法と上記した本願精製方法を比較した。その結果を表２に示す。限外ろ過を行なわない二相分配法による本願精製方法によれば、クロマトグラフィー後の最終的な収率が２倍以上に高まり、EGF精製品を収率よく得ることができることが確認された。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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