(57)【要約】      （修正有）【課題】コリンエステラーゼに対して酵素阻害能が低く、低感度の有機リン系農薬（チオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬）についても、アンペロメトリック測定が可能な残留農薬測定方法の提供。【解決手段】試料中の残留農薬の濃度を検出する残留農薬測定方法であって、前記試料から抽出液を作成する前処理工程（ステップ１〜９）と、前記抽出液と一種又は複数種の酵素を含む酵素溶液とを所定時間接触させて農薬を酵素阻害反応させる酵素阻害工程（ステップ１１）と、該酵素阻害工程で得られた溶液をアンペロメトリックセンサを用いて酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程（ステップ１２）とを有し、前処理工程（ステップ１〜９）と酵素阻害工程（ステップ１１）との間には、前記抽出液に残留する有機リン系農薬の酸化を行う酸化工程（ステップ１０）を設けた残留農薬測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の残留農薬の濃度を検出する残留農薬測定方法であって、
前記試料から抽出液を作成する前処理工程と、前記抽出液と一種又は複数種の酵素を含む酵素溶液とを所定時間接触させて農薬を酵素阻害反応させる酵素阻害工程と、該酵素阻害工程で得られた溶液をアンペロメトリックセンサを用いて酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程とを有し、
前記前処理工程と前記酵素阻害工程との間には、前記抽出液に残留する有機リン系農薬の酸化を行う酸化工程を設けたことを特徴とする残留農薬測定方法。
【請求項２】
前記酸化工程は、前記抽出液に次亜塩素酸を添加して酸化反応を行い、次いで、チオ硫酸を添加して酸化反応を停止させ、前記抽出液に残留する分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させてなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【請求項３】
前記測定工程は、測定直前に溶液中にコリンオキシダーゼを添加して、酵素活性による過酸化水素の発生を誘因させてなる請求項１又は２記載の残留農薬測定方法。
【請求項４】
前記測定工程は、測定直前に溶液中に希釈液を添加して、溶液の濃度調製を行ってなる請求項１から３のいずれかに記載の残留農薬測定方法。
【請求項５】
前記測定工程における溶液の濃度調製は、前記溶液と希釈液との液量比を１：４〜１：１９にしてなる請求項４記載の残留農薬測定方法。
【請求項６】
前記酵素阻害工程は、前記抽出液と前記酵素溶液との液量比を１：０．０４〜１：０．１としてなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、残留農薬測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数農薬が混在する検体を測定妨害の少ない電気化学デバイスであるアンペロメトリックセンサ（電気化学検出法）を利用して各農薬濃度を測定する方法は公知である。例えば、特許文献１は農薬の酵素阻害による信号を過酸化水素として検出する方法である。
【０００３】
この農薬濃度を測定する方法を詳細に説明すると、まず、コリンエステラーゼと農薬を含む検体とを接触させ、これをコリンオキシターゼ、コリンエステラーゼ基質（アセチルコリン及びベンゾイルコリン等）を含む電解液に滴下し、一定時間、過酸化水素を生成する反応を行った後、反応を停止させる。その後、過酸化水素に対して高感度、高選択的な応答性を示すセンサ（電極、参照電極及び対極から構成される）を電解セル内に挿入し、定法に従ったアンペロメトリック測定を行い、この時得られる定常状態還元電流値もしくは還元電流値の変化割合を農薬による阻害の程度を示す信号として記録し、農薬を含まない検体についても同様に測定を行い、これによって得られる信号を記録し、そして、農薬による酵素阻害の程度を、農薬非共存下での活性に対する共存下での活性の比として表すと、逆数が農薬濃度に対し直線的に応答することから、農薬濃度を知ることができるのである。
【０００４】
上記構成により、判定すべき全ての農薬とそれぞれの残留基準値とを比較し、残留基準値をオーバーしているか否かにより残留農薬汚染による危険性を評価できるものとなる。
【０００５】
また、測定時の妨害要因を防ぎ、農薬検出感度を高めることができる残留農薬測定方法として、特許文献２記載のものがある。このものは、抽出液を作成する前処理工程と、該抽出液と酵素溶液とを接触させる（酵素阻害反応）酵素接触工程と、希釈液を加えて希釈するとともに、基質を添加する濃度調整工程と、得られた溶液をアンペロメトリック測定により測定を行う測定工程とを備えたものであり、これにより、希釈率が高められ、測定時の妨害要因（酵素への妨害、センサへの妨害影響）が酵素接触時の濃度ではなく、測定時の希釈された濃度で決定することとなり、０．０１ppm以下の農薬濃度を検出することを可能とするという作用・効果がある。
【０００６】
しかしながら、上記特許文献２記載の技術であっても、コリンエステラーゼに対して酵素阻害能が低く、低感度である有機リン系農薬（例えば、チオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬）については、アンペロメトリック測定により測定することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３４７３０２２号公報
【特許文献２】特許第５４６４４７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記問題点にかんがみ、コリンエステラーゼに対して酵素阻害能が低く、低感度の有機リン系農薬（チオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬）についても、アンペロメトリック測定により測定が可能な残留農薬測定方法を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため請求項１記載の発明は、試料中の残留農薬の濃度を検出する残留農薬測定方法であって、前記試料から抽出液を作成する前処理工程と、前記抽出液と一種又は複数種の酵素を含む酵素溶液とを所定時間接触させて農薬を酵素阻害反応させる酵素阻害工程と、該酵素阻害工程で得られた溶液をアンペロメトリックセンサを用いて酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程とを有し、前記前処理工程と前記酵素阻害工程との間には、前記抽出液に残留する有機リン系農薬の酸化を行う酸化工程を設ける、という技術的手段を講じた。
【００１０】
また、請求項２記載の発明は、前記酸化工程が、前記抽出液に次亜塩素酸を添加して酸化反応を行い、次いで、チオ硫酸を添加して酸化反応を停止させて、前記抽出液に残留する分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させることを特徴とする。
【００１１】
さらに、請求項３記載の発明は、前記測定工程が、測定直前に溶液中にコリンオキシダーゼを添加して、酵素活性による過酸化水素の発生を誘因させることを特徴とする。
【００１２】
請求項４記載の発明は、前記測定工程が、測定直前に溶液中に希釈液を添加して、溶液の濃度調製を行うことを特徴とする。
【００１３】
請求項５記載の発明は、前記測定工程における溶液の濃度調製が、前記溶液と希釈液との液量比を１：４〜１：１９としたことを特徴とする。
【００１４】
請求項６記載の発明は、前記酵素阻害工程が、前記抽出液と前記酵素溶液との液量比を１：０．０４〜１：０．１としたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
請求項１記載の発明によれば、試料中の残留農薬の濃度を検出する残留農薬測定方法であって、前記試料から抽出液を作成する前処理工程と、前記抽出液と一種又は複数種の酵素を含む酵素溶液とを所定時間接触させて農薬を酵素阻害反応させる酵素阻害工程と、該酵素阻害工程で得られた溶液をアンペロメトリックセンサを用いて酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程とを有し、前記前処理工程と前記酵素阻害工程との間には、前記抽出液に残留する有機リン系農薬の酸化を行う酸化工程を設けたので、該酸化工程により、コリンエステラーゼに対し阻害能が低く測定が困難であった有機リン系農薬を、コリンエステラーゼに対し阻害能が高い有機リン系農薬に変化させて測定を行うので、従来低感度により測定できなかった有機リン系農薬の農薬濃度を、間接的に精度よく検出することができる。
【００１６】
また、請求項２記載の発明によれば、前記酸化工程は、前記抽出液に次亜塩素酸を添加して酸化反応を行い、次いで、チオ硫酸を添加して酸化反応を停止させて、前記抽出液に残留する分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させるので、従来測定できなかったチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬の農薬濃度を、間接的に精度よく検出することができる。
【００１７】
さらに、請求項３記載の発明によれば、前記測定工程が、測定直前に溶液中にコリンオキシダーゼを添加して、酵素活性による過酸化水素の発生を誘因させるので、酵素阻害工程でコリンオキシダーゼを添加するものと比較すると、測定時の妨害要因（コリンオキシダーゼ酵素への妨害）を軽減させ、測定精度を向上させることができる。
【００１８】
請求項４記載の発明によれば、前記測定工程が、測定直前に溶液中に希釈液を添加して、溶液の濃度調製を行うので、さらに高精度に測定時の妨害要因（酵素への妨害、センサへの妨害影響）を軽減させ、測定感度を向上させることができる。
【００１９】
請求項５記載の発明によれば、前記測定工程における溶液の濃度調製が、前記溶液と希釈液との液量比を１：４〜１：１９としたので、測定時の妨害要因（酵素への妨害、センサへの妨害影響）を軽減させる効果が高くなる。
【００２０】
請求項６記載の発明によれば、前記酵素阻害工程が、前記抽出液と前記酵素溶液との液量比を１：０．０４〜１：０．１としたので、酵素阻害工程における妨害要因（酵素への妨害、センサへの妨害影響）の発生を軽減させ、酵素阻害反応を高める効果が高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の残留農薬測定方法を実施するための第１実施例のフローチャートである。
【図２】チオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬をオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させる際の模式図である。
【図３】酵素阻害工程において２種類の酵素を添加する際の模式図である。
【図４】酸化工程で生成した妨害成分がコリンオキシダーゼを失活させることを示す模式図である。
【図５】本発明の残留農薬測定方法を実施するための第４実施例のフローチャートである。
【図６】第４実施例における酵素阻害工程を示す模式図である。
【図７】第４実施例における測定工程を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。  図１は、本発明の残留農薬測定方法を実施するためのフローチャートである。本発明の残留農薬測定方法は、試料を粉砕した後、溶媒で溶出するとともに、減圧濃縮を行って抽出液を作成する前処理工程（図１のステップ１〜ステップ９）と、前記抽出液を酸化処理し、抽出液中に分散している分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させる酸化処理工程（ステップ１０）と、この抽出液を一種又は複数種の酵素と酵素阻害反応を生じさせる酵素阻害工程（ステップ１１）と、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程（ステップ１２）と、を備えたものである。
【００２３】
前記前処理工程は、試料から農薬を効率良く抽出するため、溶媒で溶出し、最終的に減圧濃縮により農薬を水溶液に溶かし込んだ抽出液を得るものである。該前処理工程で得られた抽出液に、農薬が含まれていると仮定すれば、カーバメート系農薬としては、例えば、アラニカルブ、オキサミル、カルボスルファン、チオジカルブ、ベンフラカルブ、メソミル、BPMC、NACなどが挙げられ、有機リン系農薬としては、例えば、アセフェート、ジメトエート、ダイアジノン、マラソン、DDVP、DMTP、MEP、MPPなどが挙げられる。
【００２４】
上記農薬のうち、ダイアジノン、フェニトロチオンに代表される分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬は、塩素処理により酸化させると、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に（ダイアジノンオキソン、フェニトロチオンオキソン）容易に変化する。すなわち、前記酸化処理工程は、チオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬の分子Ｐ＝Ｓ基を、オキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させ、コリンエステラーゼ（酵素）に対して酵素阻害能の高いオキソ型に変換し、従来測定できなかったチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬の農薬濃度を、間接的に検出することを目的とする。さらに、前記酵素阻害工程は、抽出液に含まれた各種農薬の酵素阻害の感度を知るために必要な工程である。このとき、一種類又は複数種類の酵素と同時又は時間差をもって酵素接触させると、測定時の妨害要因（酵素への妨害、センサへの妨害影響）を軽減させたり、測定感度を向上させたりすることができる。
【００２５】
前記酵素阻害工程の後は、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する測定工程となる。この測定工程は、複数農薬が混在する検体を電気化学デバイスであるアンペロメトリックセンサ（例えば、作用極に酵素ペルオキシダーゼを被膜しているもの）を利用して各農薬濃度を測定することができる。そのほか、過酸化水素定量可能な検出器（例えば、固定化酵素カラム）、吸光度検出器などを用いることもできる。
【００２６】
測定工程においては、下記の３パターンを選択することができる。第１パターンとしては、酵素阻害工程の後、そのまま酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出することが挙げられる。この場合、測定時の妨害要因の影響を考慮しなければならない。第２パターンとしては、酵素阻害工程に続いて基質待機溶液などを注入して濃度調製を行った後、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出することが挙げられる。この場合、測定時の妨害要因の影響が緩和されることが期待される。第３パターンとしては、基質待機溶液などを注入して濃度調製を行うとともに、過酸化水素発生の誘因となるコリンオキシダーゼを添加して、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出することが挙げられる。この場合、酵素阻害工程における妨害作用を受けることなく、精度の高い電流値の検出が可能となる。
【００２７】
前述したように、抽出液を酸化する酸化処理工程を設けているため、抽出液中に分散している分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化させると、これまでは感度不足で判定不可能な、ダイアジノン、フェニトロチオンに代表されるチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を検出することが可能になる。以下、実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００２８】
＜前処理工程（図１のステップ１〜ステップ９）について＞
前処理工程は、試料を粉砕した後、溶媒で溶出するとともに、減圧濃縮を行って抽出液を作成するものである。
【００２９】
まず、米（玄米）、野菜又は果物等の農作物からなる被検試料（ステップ１）を、計量カップなどに採取してサンプルミキサーで粉砕を行う（ステップ２）。そして、粉砕した被検試料を電子はかりにより25ｇ秤量し（ステップ３）、三角フラスコにアセトニトリル50mLとともに投入して、振とう機で１５〜２０分間振とうを行う。（ステップ４）。次に、この溶液の吸引ろ過を行う（ステップ５）。吸引ろ過には、アセトニトリル25mLをはかりとり、これを漏斗上のろ紙に３〜４滴滴下してろ紙と目皿とを密着させ、ろ過吸引機を作動させながらステップ４で得られた溶液をろ紙上に順次注いでろ過を行う。25mLのはかりとった残りのアセトニトリルは振とうに使った三角フラスコに入れ、軽く振った後、ろ紙上に注いで三角フラスコ内の残留物のろ過を行う。漏斗からろ液が滴下しなくなったら、ろ過工程が終了する。
【００３０】
次に、液々分配（ステップ６）を行う。液々分液には、上部投入口に栓を持ち、漏斗の足の付け根に二方コックを持った分液漏斗が使用される。この分液漏斗にステップ５で得られたろ液と、ヘキサン50mLとを、投入して栓をした後、振とうする。そして、しばらく放置すると、上層がアセトニトリル層に、下層が水層にそれぞれ分離するので、下層の水層を廃棄し、上層のアセトニトリル層のみをナスフラスコに回収する。
【００３１】
液々分配で得られた上層のアセトニトリル層には、農薬が含まれているので、これを減圧乾固（ステップ7）する。減圧乾固には、ウォーターバス及びロータリーエバポレータを使用するが、アセトニトリル層の農薬が昇華、蒸発などにより留去する虞（おそれ）があるため、キーパー溶液（5（W／V）％-ジエチレングリコールを含むエタノール溶液）0.1mLをナスフラスコに添加しておく。そして、溶媒が十分に揮発したら、減圧乾固を終了する。
【００３２】
減圧乾固の終了後、ナスフラスコに酢酸エチル5mLを添加して乾固物の残渣を溶解させ、この溶液を精製カラム（PSA（陰イオン交換樹脂）0.5ｇカラム）に滴下し、精製を行う（ステップ９）。精製カラムからの流出液は洗浄済みナスフラスコに回収する。そして、再度、減圧乾固終了後のナスフラスコに酢酸エチル20mLを入れ、軽く振って、減圧乾固終了後のナスラスコ内の残渣を溶解させ、この溶液を精製カラムに滴下する。
【００３３】
次に、精製カラムからの流出液について減圧濃縮を行う（ステップ９）。この減圧濃縮は、流出液中に含まれる酢酸エチルが次工程の酵素接触反応の際に悪影響を及ぼすため、溶媒である酢酸エチルを十分に揮発させることを目的とする。すなわち、流出液が入っているナスフラスコにヘキサン75mLと溶解液(0.1M 塩化カリウムを含む 20mM MES緩衝液(pH6.0))5mLを入れ、ウォーターバス30℃、圧力150hPaのもと、有機溶媒のみを留去させる。そして、ナスフラスコの内側に曇りが付着すれば、減圧濃縮処理が終了する。減圧濃縮が終了したナスフラスコに溶解液を7.5mL加える。残った溶解液を遠沈管などの容器に移し替えておく。この溶液を抽出液という。
【００３４】
以下、本発明の要部となる酸化工程（ステップ１０）、酵素阻害工程（ステップ１１）及び測定工程（ステップ１２）についてそれぞれ説明する。
【００３５】
＜酸化工程（ステップ１０）について＞
回転子を入れた5mL容量の容器に抽出液2.5mLを入れる。そして、この容器に活性化溶液Ａ（0.425%の次亜塩素酸ナトリウム溶液）を0.0125mL入れ、１５分間反応させる。１５分間経過したら（活性化反応後に）、反応停止剤Ａ（チオ硫酸ナトリウム溶液）を0.0125mL 入れ、さらに５分間反応させる。5分間経過したら希釈液（0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））2.5mLを入れる。分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬は、主にコリンエステラーゼ（酵素）に対して酵素阻害能が低いことが知られている。このチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、塩素処理により酸化すると、容易に分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化する。このオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬は、コリンエステラーゼ（酵素）に対して酵素阻害能が高いので、農薬濃度の検出の高感度化が可能となる（図１のステップ１０、図２参照）。
【００３６】
＜酵素阻害工程（ステップ１１）について＞
次の酵素阻害工程では、上記容器に、酵素Ｆ溶液（2.5U/mL アセチルコリンエステラーゼ及び1％牛血清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.6））と、酵素Ｂ溶液（90U/mL コリンオキシダーゼを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.6））とを、25μLずつ入れる。酵素Ｆ溶液はカーバメート系農薬や有機リン系農薬など農薬成分と酵素阻害反応を行わせる役割がある。また、酵素Ｂは、酵素Ｆによる酵素阻害反応に伴い、次工程の測定において過酸化水素センサ（作用極に酵素ペルオキシダーゼを被膜しているもの）から過酸化水素を発生させる生じさせる役割がある。このために、酵素Ｆ溶液と酵素Ｂ溶液とを同時に添加した。
【００３７】
次いで、被検試料と比較するための基準液も同時に作成する。すなわち、基準液は、待機液（0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））5mLに前記酵素Ｆ溶液と、酵素Ｂ溶液とを、25μL ずつ入れたものである。そして、前記抽出液に酵素Ｆ溶液及び酵素Ｂ溶液を入れたものと、待機液に酵素F溶液及び酵素B溶液を入れたものとを、それぞれ45分から４時間の間、酵素接触を行うのである（ステップ１１、図３）。
【００３８】
＜測定工程（ステップ１２）について＞
測定の際には、基質溶液（10mMヨウ化アセチルコリン）0.05mLを、測定する溶液に注入して濃度調製を行う。その後、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する（図１のステップ１２）。
【００３９】
実施例１の測定結果を下記表１に示す。
【００４０】
【表１】
2016187318.tif 000003
【００４１】
実施例1では、測定可能な農薬成分が少ない。測定可能農薬数の拡大のため実施例2を行った。実施例2は、ステップ８までは実施例1と同様であるが、ステップ９以降の工程を以下のように変更した。
【実施例２】
【００４２】
精製カラムからの流出液について減圧濃縮を行う（ステップ９）。この減圧濃縮は、流出液中に含まれる酢酸エチルが次工程の酵素接触反応の際に悪影響を及ぼすため、溶媒である酢酸エチルを十分に揮発させること、また実施例1に比べ加える溶解液量を少量として抽出物の濃縮を目的とする。すなわち、流出液が入っているナスフラスコにヘキサン75mLと溶解液(0.1M 塩化カリウムを含む 20mM MES緩衝液(pH6.0))0.625mLを入れ、ウォーターバス30℃、圧力150hPaのもと、有機溶媒のみを留去させる。そして、ナスフラスコの内側に曇りが付着すれば、減圧濃縮処理が終了する。減圧濃縮が終了したナスフラスコに溶解液を0.625mL加える。残った溶解液を遠沈管などの容器に移し替えておく。この溶液を抽出液という。
【００４３】
＜酸化工程（ステップ１０）について＞
回転子を入れた5mL容量の容器に抽出液0.25mLを入れる。そして、この容器に活性化溶液Ａ（0.425%の次亜塩素酸ナトリウム溶液）を0.05mL入れ、１５分間反応させる。１５分間経過したら（活性化反応後に）、反応停止剤Ａ（チオ硫酸ナトリウム溶液）を0.05mL入れ、さらに５分間反応させる。5分間経過したら希釈液（0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））2.5mLを入れる。分子内にＰ＝Ｓ基を有するチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬はＰ＝Ｓ基が分解され易く、主にコリンエステラーゼ（酵素）に対して酵素阻害能が低いことが知られている。このチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を、塩素処理により分解して酸化すると、容易に分子内にＰ＝Ｏ基を有するオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬に変化する。このオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬は、コリンエステラーゼ（酵素）に対して酵素阻害能が高いので、農薬濃度の検出の高感度化が可能となる（図１のステップ１０、図２参照）。
【００４４】
＜酵素阻害工程（ステップ１１）について＞
次の酵素阻害工程では、上記容器に、酵素Ｆ溶液（2.5U/mL アセチルコリンエステラーゼ及び1％牛血清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.6））と、酵素Ｂ溶液（90U/mL コリンオキシダーゼを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.6））とを、25μLずつ入れる。酵素Ｆ溶液はカーバメート系農薬や有機リン系農薬など農薬成分と酵素阻害反応を行わせる役割がある。また、酵素Ｂは、酵素Ｆによる酵素阻害反応に伴い、次工程の測定において過酸化水素センサ（作用極に酵素ペルオキシダーゼを被膜しているもの）から過酸化水素を発生させる生じさせる役割がある。このために、酵素Ｆ溶液と酵素Ｂ溶液とを同時に添加した。
【００４５】
次いで、被検試料と比較するための基準液も同時に作成する。すなわち、基準液は、待機液（0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））0.6mLに前記酵素Ｆ溶液と、酵素Ｂ溶液とを、25μL ずつ入れたものである。そして、前記抽出液に酵素Ｆ溶液及び酵素Ｂ溶液を入れたものと、待機液に酵素F溶液及び酵素B溶液を入れたものとを、それぞれ45分から４時間の間、酵素接触を行うのである（ステップ１１、図３）。
【００４６】
＜測定工程（ステップ１２）について＞
測定の際には、基質待機溶液（0.11mMヨウ化アセチルコリン、0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））4.5mLを、測定する溶液に注入して濃度調製を行う。その後、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出する（図１のステップ１２）。
【００４７】
実施例２の結果は、農薬未混入が確認できている被検試料においても電流値の増加が見られず、測定自体がままならず、測定系が確立できなかった。
【００４８】
実施例2では、ステップ１０の酸化工程において、実施例1に比べ抽出物中の成分も濃縮されており、これと塩素による反応で妨害成分が高濃度に生じたと思われ、この妨害成分がステップ１１の酵素阻害工程で悪影響を及ぼしていることが推察された（図３の矢印Ａ参照）。
【００４９】
さらに、分析を行うと、妨害成分は酵素阻害工程で使用する酵素Ｂ（コリンオキシダーゼ）に対し大きく影響を及ぼし、コリンオキシダーゼが失活してしまうことが判明した（図４の矢印Ｂ参照）。そこで本発明者らは、ステップ１０の酸化工程を除外し、コリンエステラーゼに高感度なオキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬及びカーバメート系農薬のみを測定対象農薬とする試験をした。
【実施例３】
【００５０】
実施例３として、図１のステップ１０の酸化工程を除外し、実施例２とほぼ同様の残留農薬測定試験を行った。実施例３の測定結果を下記表２に示す。
【表２】
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【００５１】
表２の実施例２では、表１の実施例１と比較して、測定可能な農薬として、オキソ型（Ｐ＝Ｏ型）有機リン系農薬及びカーバメート系農薬の数が増加した。しかし、「チオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬の検出数を増加させる」という本来の目的を達成し得ていない。
【００５２】
そこで本発明者らは、ステップ１０の酸化工程を除外するのではなく、ステップ１１の酵素阻害工程とステップ１２の測定工程とにおいて、酵素Ｆ溶液と酵素Ｂ溶液をそれぞれ別々に添加することで、酸化工程で生じる妨害成分による測定妨害を軽減することを知見した。以下、実施例４により詳細に説明する。
【実施例４】
【００５３】
図５は、酵素阻害工程と測定工程とにおいて酵素Ｆ溶液と酵素Ｂ溶液をそれぞれ別々に添加する実施例を示すフローチャートである。ステップ１からステップ１０までの工程は実施例２とほぼ同様である。
【００５４】
＜酵素阻害工程（ステップ１１）について＞
ステップ１１の酵素阻害工程では、上記容器に希釈液（0.1M 塩化カリウムを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH7.6)）を0.25mL入れるとともに、酵素として酵素F溶液を25μL入れる。そして、被検試料と比較するための基準液も同時に作成する。すなわち、基準液は、待機液（0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））0.6mLに前記酵素F溶液を、25μL入れたものである。そして、前記抽出液に酵素F溶液を入れたものと、待機液に酵素F溶液を入れたものとを、それぞれ４５分から４時間の間、酵素接触を行う（図５のステップ１１、図６参照）。
【００５５】
＜測定工程（ステップ１２）について＞
測定の際には、基質待機溶液（0.11mMヨウ化アセチルコリン、0.5U/mLコリンオキシダーゼ及び0.1M塩化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.6））4.5mLを、測定する溶液に注入し、濃度調製と酵素阻害反応を行う。その後、酵素活性による過酸化水素の生成速度を電流値として検出することになる（図５のステップ１２）。
【００５６】
上記測定工程では、電流値の検出の直前にコリンオキシダーゼを基質溶液とともに添加するものである。ステップ１１の酵素阻害工程において、コリンオキシダーゼを添加しないために抽出液からの妨害を受けることなく電流値の検出が可能となる。このため、測定可能な農薬成分数を多数増やすことに成功した（図７参照）。実施例４の測定結果を下記表３に示す。
【表３】
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【００５７】
表３の実施例４では、表２の実施例３と比較して、チオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬の数が増加した。これにより、「チオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬の検出数を増加させる」という本来の目的が達成された。
【００５８】
ステップ１１の酵素阻害工程において、特に、抽出液と酵素F溶液との液量比が限定されることはない。すなわち、ステップ１２の測定工程における測定時の活性（酵素濃度）により酵素の液量比を決定するとよい。そして、測定する直前で、出来る限り希釈して濃度調製を行ってから測定するとよい。これにより、抽出液中の測定妨害（酵素への妨害、センサへの妨害影響）を軽減させる作用を行わせるため、抽出液と酵素F溶液とを、液量比１：０．０４〜１：０．１程度に設定するのが好ましい。
【００５９】
ステップ１２の測定工程内の濃度調製工程において、特に、抽出液と希釈液との液量比が限定されることはない。例えば、本発明者らは、以下を考慮して液量比の決定を行った。すなわち、
（１）．測定時の基質の終濃度が0.1mM程度になるように希釈液は調整する。
（２）．測定時の抽出液と希釈液との液量比は、大きければ大きい程その比に応じ測定妨害の影響が小さくなる（10倍希釈して、測定妨害信号は等倍時の1割）。
（３）．農薬の阻害については、測定時の抽出液と希釈液との液量比が大きくなれば若干の阻害低下はみられるが、測定妨害の影響軽減のように比がそのまま阻害信号に現れるほどの低下ではなかった（10倍希釈しても、農薬阻害信号は等倍時の9割）。
（４）．ピペットの精度、測定容器の容量（5mL）、測定時に希釈液を注入する分注シリンジの都合により抽出液と希釈液との液量比は1：9とした。
（５）．より好ましい条件としては、抽出液と希釈液との液量比は1：4〜1：19程度がよい。
【００６０】
以上から、コリンエステラーゼに対して酵素阻害能が低く、低感度のチオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬についても、農薬濃度を検出することを可能となった。例えば、これまで感度不足で判定不可能であった、ダイアジノン、フェニトロチオンに代表されるチオノ型（Ｐ＝Ｓ型）有機リン系農薬を検出することを可能にした。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の残留農薬測定方法は、市場への出荷を待つ農産物（例えば、米（玄米、精白米）、野菜又は果物）に含有される農薬について、スクリーニングを行おうとする場合に有用性があり、特に、コリンエステラーゼに対して酵素阻害能が低く、低感度のチオノ（Ｐ＝Ｓ）型有機リン系農薬についても迅速かつ高感度で測定することができる。
【符号の説明】
【００６２】
Ａ…酵素阻害工程で妨害成分が悪影響示す矢印
Ｂ…妨害成分がコリンオキシダーゼを失活させる矢印
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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