(57)【要約】【課題】スキャナやリレーレンズを大型化させることなく、大きな標本を高分解能で観察する。【解決手段】光源からのレーザ光Ｌを走査させるガルバノミラー２ａを有するスキャナ２と、該スキャナ２により走査されたレーザ光Ｌをリレーするリレー光学系３と、該リレー光学系３によりリレーされたレーザ光Ｌを標本Ａに集光する対物レンズ４と、該対物レンズ４とスキャナ２との間の光路上に配置され、回折により対物レンズ４に入射させるレーザ光Ｌの光束径を拡大させる回折光学素子８とを備える顕微鏡装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からのレーザ光を走査させるガルバノミラーを有するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光をリレーするリレー光学系と、
該リレー光学系によりリレーされたレーザ光を標本に集光する対物レンズと、
該対物レンズと前記スキャナとの間の光路上に配置され、回折により対物レンズに入射させるレーザ光の光束径を拡大させる回折光学素子とを備える顕微鏡装置。
【請求項２】
前記リレー光学系が光軸方向に間隔を空けて配置された一対のレンズを備え、
前記回折光学素子が、前記対物レンズ側の前記レンズの前側焦点位置近傍に配置されている請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
倍率の異なる複数の前記対物レンズが交換可能に設けられ、
前記回折光学素子が、前記光路に挿脱可能に設けられている請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記回折光学素子が、前記光源からのレーザ光の波長に対応して複数備えられ、
これらの回折光学素子を択一的に光路上に配置する素子選択機構を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、光源からのパルスレーザ光をスキャナによって走査し、リレーレンズによってリレーし、対物レンズによって標本に集光させることにより、多光子励起効果により発生した蛍光を観察する顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
この特許文献１の顕微鏡装置において、大きな標本を高分解能で観察するためには、実視野の広い低倍率の対物レンズを装着するとともに、対物レンズの焦点位置におけるレーザ光の開口数（照明ＮＡ）を増大させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−８５８２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ガルバノミラーを用いたスキャナを備える顕微鏡装置においては、照野と照明ＮＡとを独立に設計することは困難であり、照野は、リレーレンズによるガルバノミラーから対物レンズの瞳位置へのリレー倍率に反比例するのに対し、照明ＮＡは比例するという関係にある。したがって、照野確保を優先すると対物レンズの瞳径を満たすように光束径を拡大することはできず、照明ＮＡを十分に増大させることはできず、分解能が制限されてしまうという不都合がある。
一方、照明ＮＡの十分な増大を優先するとガルバノミラーの振り角が足りず照野を十分に確保できないという不都合がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、スキャナやリレーレンズを大型化させることなく、大きな標本を高分解能で観察することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目標を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からのレーザ光を走査させるガルバノミラーを有するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光をリレーするリレー光学系と、該リレー光学系によりリレーされたレーザ光を標本に集光する対物レンズと、該対物レンズと前記スキャナとの間の光路上に配置され、回折により対物レンズに入射させるレーザ光の光束径を拡大させる回折光学素子とを備える顕微鏡装置を提供する。
【０００８】
本態様によれば、光源からのレーザ光がスキャナのガルバノミラーによって走査された後、リレー光学系によってリレーされ対物レンズによって標本に集光されることにより、標本において蛍光を発生させ、発生した蛍光が対物レンズによって集光されて検出されることにより、標本の蛍光観察を行うことができる。この場合において、レーザ光はスキャナと対物レンズとの間の光路上において回折光学素子によって回折により光束径を拡大させられるので、リレー光学系のリレー倍率を調整することなく、対物レンズの瞳を満たす光束径で対物レンズに入射させることができる。
【０００９】
すなわち、照野を確保し得るリレー倍率に設定しておき、リレー倍率とは無関係に回折光学素子によって光束径を拡大させることにより、照野を確保しながら空間分解能を向上することができる。これにより、大きな標本を高分解能で観察することができる。また、リレー倍率を調整しないので、スキャナ、リレー光学系および対物レンズを変更せずに済み、スキャナやリレー光学系の大型化を防止することができる。
【００１０】
上記態様においては、前記リレー光学系が光軸方向に間隔を空けて配置された一対のレンズを備え、前記回折光学素子が、前記対物レンズ側の前記レンズの前側焦点位置に配置されていてもよい。
このようにすることで、リレー光学系を構成する一対のレンズの内、対物レンズ側のレンズの前側焦点位置において集光してスポットを形成したレーザ光の拡散角度を回折光学素子によって拡大させ、リレー光学系から出力される略平行光束の光束径を容易に拡大させることができる。
【００１１】
また、上記態様においては、倍率の異なる複数の前記対物レンズが交換可能に設けられ、前記回折光学素子が、前記光路に挿脱可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、瞳径の小さい対物レンズに対しては、回折光学素子を光路上から離脱させて光束径を小さくすることによってケラれを防止し、瞳径の大きい対物レンズに対しては、回折光学素子を光路上に挿入して光束径を拡大させ、分解能を向上することができる。なお、単一の回折光学素子の挿脱に代えて、回折角度の異なる複数の回折光学素子を挿脱して、さらに細かく対物レンズの瞳径に合わせた調整を行うことができる。
【００１２】
また、上記態様においては、前記回折光学素子が、前記光源からのレーザ光の波長に対応して複数備えられ、これらの回折光学素子を択一的に光路上に配置する素子選択機構を備えていてもよい。
このようにすることで、光源からのレーザ光の波長に合わせて、素子選択機構により適切な回折角度を有する回折光学素子を光路上に配置することにより、レーザ光の波長を変えても、同じ対物レンズの瞳を過不足なく満たすような光束径に設定して、波長の異なるレーザ光を用いた高分解能の観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、スキャナやリレーレンズを大型化させることなく、大きな標本を高分解能で観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置において、スキャナの作動によりレーザ光を走査させた状態を示す全体構成図である。
【図３】図１の顕微鏡装置の回折光学素子による（ａ）回折の方向、（ｂ）回折パターンをそれぞれ示す図である。
【図４】図１の顕微鏡装置において、（ａ）回折光学素子を光路から抜去した状態、（ｂ）そのときの対物レンズの瞳に入射されレーザ光の光束の横断面、（ｃ）回折光学素子を光路上に挿入した状態、（ｄ）そのときの対物レンズの瞳に入射されレーザ光の光束の横断面をそれぞれ示す図である。
【図５】（ａ）リレー光学系に入射するレーザ光の光束径を拡大させた場合のレーザ光の強度分布、（ｂ）図１の顕微鏡装置において回折光学素子を挿入した場合のレーザ光の強度分布をそれぞれ示す図である。
【図６】図１の顕微鏡装置の変形例であって、複数の回折光学素子を択一的に光路上に配置するターレットを説明する図である。
【図７】回折パターンの例（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１および図２に示されるように、図示しない光源から発せられる極短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光という。）Ｌを走査するスキャナ２と、該スキャナ２により走査されたレーザ光Ｌをリレーするリレー光学系３と、該リレー光学系３によりリレーされたレーザ光Ｌを標本Ａに照射し、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ４と、該対物レンズ４により集光された蛍光Ｆをレーザ光Ｌの光路から分岐するダイクロイックミラー５と、該ダイクロイックミラー５により分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ６と、該集光レンズ６により集光された蛍光Ｆを検出する光検出器７とを備えている。また、本実施形態に係る顕微鏡装置１は、レーザ光Ｌの光束径を回折によって拡大させる回折光学素子（ＤＯＥ）８を備えている。
【００１６】
スキャナ２は、例えば、非平行な軸回りに揺動する２枚のガルバノミラー２ａ（図では１枚のみ表示）を備え、ガルバノミラー２ａの揺動角度の組み合わせにより、レーザ光Ｌを光軸に交差する２次元方向に走査させることができるようになっている。
【００１７】
リレー光学系３は、図１に示す例では、光軸方向に間隔を空けて配置された２枚一対の第１レンズ３ａと第２レンズ３ｂとを備えている。スキャナ２に近い側の第１レンズ３ａの前側焦点位置は、スキャナ２から離れた側の第２レンズ３ｂの後ろ側焦点位置と一致しており、略平行光の形態で入射されたレーザ光Ｌを一旦結像させた後に略平行光の形態で射出するようになっている。
【００１８】
ダイクロイックミラー５は、対物レンズ４の後ろ側に近接して、対物レンズ４の光軸に対して４５°の角度をなして配置されている。ダイクロイックミラー５はレーザ光Ｌを透過し、蛍光Ｆを反射する透過率特性を有している。これにより、光源からのレーザ光Ｌはダイクロイックミラー５を透過して対物レンズ４に入射される一方、対物レンズ４により集光された蛍光Ｆはダイクロイックミラーによって９０°偏向されて集光レンズ６により集光され光検出器７により検出されるようになっている。
【００１９】
光検出器７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。スキャナ２により走査されるレーザ光Ｌの各走査位置と、その走査位置にレーザ光Ｌが照射されることにより発生した蛍光Ｆの強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を取得することができる。
【００２０】
回折光学素子８は、リレー光学系３の中間結像位置、すなわち、第１レンズ３ａの後ろ側焦点位置近傍かつ第２レンズ３ｂの前側焦点位置近傍の光路上に挿脱可能に配置され、光路上に挿入されたときには、該前側焦点位置から第２レンズ３ｂに向かって拡散するレーザ光Ｌの拡散角度を回折によって広げるようになっている。
具体的には、回折光学素子８は、図３に示されるように、透過するレーザ光Ｌを回折させることにより、光軸に対して、例えば、ＮＡ０．０４５の角度および、ＮＡ０．０９の角度をなして、それぞれ周方向に等間隔を開けた１２の方向に回折させるようになっている。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、図２に示されるように、光源からのレーザ光Ｌをスキャナ２によって２次元的に走査し、リレー光学系３によってリレーし、ダイクロイックミラー５を透過したレーザ光Ｌを対物レンズ４によって標本Ａに集光する。これにより、レーザ光Ｌの集光位置において標本Ａ内に存在する蛍光物質が多光子励起効果によって励起され蛍光Ｆが発生する。
【００２２】
発生した蛍光Ｆは、対物レンズ４によって集光され、ダイクロイックミラー５によって反射されて集光レンズ６により集光され、光検出器７によって検出される。スキャナ２によるレーザ光Ｌの走査位置と光検出器７によって検出された蛍光Ｆの強度とを対応づけて記憶しておくことにより、蛍光画像を取得することができる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、図４（ａ）に示されるように、この回折光学素子８を光路上から抜去した場合には、リレー光学系３の第１レンズ３ａにより、例えば、ＮＡ０．０３の角度で集光され、中間像を結像したレーザ光Ｌは同じＮＡ０．０３で拡散し、第２レンズ３ｂによって略平行光に変換される。
【００２４】
第１レンズ３ａの焦点距離を５０ｍｍ、第２レンズ３ｂの焦点距離を１５０ｍｍとすると、リレー倍率は３となり、第２レンズ３ｂから射出される略平行光の光束径は、図４（ｂ）に示されるように、例えば、φ９となる。対物レンズ４の瞳径をφ３６とすると、レーザ光Ｌの光束が瞳に占める割合である瞳充足率は６．２５％となる。
【００２５】
一方、図４（ｃ）に示されるように、この回折光学素子８を光路上に挿入した状態では、リレー光学系３の第１レンズ３ａにより、ＮＡ０．０３の角度で集光され、中間像を結像したレーザ光Ｌは、回折光学素子８によって、図３に示されるように、ＮＡ０．０４５およびＮＡ０．０９の角度方向に回折されるので、第２レンズ３ｂによって集光された略平行光の光束径は、例えばφ３６となる。
この略平行光束は、図４（ｄ）に示されるように、回折光学素子８によって複数方向に回折された複数の光束の集合であり、瞳充足率は９０％より大きくなる。
【００２６】
すなわち、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、第２レンズ３ｂの後ろ側焦点位置に回折光学素子８を挿入するだけで、他の光学系を変更することなく、対物レンズ４に入射するレーザ光Ｌが瞳を満たすように光束径を拡大させることができる。これにより、対物レンズ４から標本Ａに照射されるレーザ光ＬのＮＡを十分に大きくすることができ、焦点位置近傍に集光されるレーザ光Ｌの光子密度が高められる光軸方向の範囲を短くして、光軸方向の空間分解能を向上することができる。
【００２７】
特に、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、スキャナ２のガルバノミラー２ａとの関係で、十分に大きな照野を確保し得るリレー倍率のままで、リレー倍率とは無関係に回折光学素子８によって光束径を拡大させることにより、照野を確保しながら空間分解能を向上することができる。これにより、大きな標本Ａを高分解能で観察することができる。また、リレー倍率を調整しないので、スキャナ２、リレー光学系３および対物レンズ４を変更せずに済み、スキャナ２やリレー光学系３の大型化を防止することができるという利点がある。
【００２８】
また、ガルバノミラー２ａの大型化を許容した場合、リレー光学系３を変更することなく、かつ、回折光学素子８を用いることなく、対物レンズ４に入射させるレーザ光Ｌの光束径を拡大させる方法として、走査するレーザ光Ｌの光束径自体を大きくすることが考えられる。しかし、そのような方法を採用した場合に図５（ａ）に示されるように、対物レンズ４に入射されるレーザ光Ｌの光束は通常のガウシアン分布の強度分布を有している。したがって、分解能や明るさに寄与する高ＮＡ成分、すなわち、光束の外周部分の強度は相対的に低く、例えば、光束の中心の強度の１０％程度である。
【００２９】
これに対し、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、回折光学素子８によって光束径が拡大された光束は、図５（ｂ）に示されるように、複数の方向に回折されたレーザ光Ｌの各々がガウシアン分布の強度分布を有しているため、高ＮＡ成分の相対的な強度を劇的に向上させることができ、例えば、光束の外周部分近傍においても、光束の中心の強度と同等の強度を有するようにすることができる。その結果、照明強度や空間分解能のさらなる向上を図ることができるという利点がある。
【００３０】
また、本実施形態においては、回折光学素子８を光路上に挿脱可能に設けることとしたので、瞳径の小さい対物レンズ４に交換して観察を行う場合等に、回折光学素子８を光路上から抜去して、対物レンズ４に入射するレーザ光Ｌの光束径を瞳径に合うように縮小することができる。
【００３１】
なお、本実施形態に係る顕微鏡装置においては、各レンズ３ａ，３ｂ，４の焦点距離や、レーザ光Ｌの光束径を例示したが、これに限定されるものではなく、任意のレンズ３ａ，３ｂ，４や任意の光束径のレーザ光Ｌを使用することができる。
【００３２】
また、本実施形態においては、単一の回折光学素子８を挿脱可能に設けたが、これに代えて、図６に示されるように、複数の回折光学素子８と該回折光学素子８を択一的に光路上に配置することを可能とするターレット（素子選択機構）９とを備えることにしてもよい。
上記のように、瞳径の異なる複数の対物レンズ４に対応して、各対物レンズ４の瞳を満たす光束径のレーザ光Ｌを入射させるようにしてもよい。また、レーザ光Ｌの波長が変化すると回折角度が変化することを考慮して、使用するレーザ光Ｌの波長に対応づけた複数の回折光学素子８を用意し、レーザ光Ｌの波長が変化するごとに、ターレット９を回転させて光路上に挿入する回折光学素子８を切り替え、対物レンズ４の瞳を常に満たすようにレーザ光Ｌの光束径を調節することにしてもよい。
【００３３】
また、回折光学素子８として、ＮＡ０．０４５およびＮＡ０．０９の２つの角度方向で周方向に等間隔に１２の方向にレーザ光Ｌを分割して回折させる回折パターンのものを例示したが、回折の角度方向や数、あるいは、周方向の光束の分割数については任意のものを採用することができる。
【００３４】
また、回折のパターンとしては、図７に示されるように、（ａ）上記実施形態のパターンの他、（ｂ）周方向に連続するリング状に回折させるものや、（ｃ）正方配列される光束に回折させるもの等、任意のパターンを採用してもよい。
また、回折光学素子８を第２レンズ３ｂの前側焦点位置近傍に配置することとしたが、精度よく前側焦点位置に配置されている場合の他、第２レンズ３ｂの焦点深度の範囲内に配置されている場合も含まれる。このようにすることで、対物レンズに発散光や集光光が入射されることを防止して、フォーカスずれや収差の発生を低減することができる。
【符号の説明】
【００３５】
Ａ  標本
Ｌ  レーザ光
１  顕微鏡装置
２  スキャナ
２ａ  ガルバノミラー
３  リレー光学系
３ａ  第１レンズ（レンズ）
３ｂ  第２レンズ（レンズ）
４  対物レンズ
８  回折光学素子
９  ターレット（素子選択機構）
【図１】
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【図２】
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【図３】
2016045427.tif 000005
【図４】
2016045427.tif 000006
【図５】
2016045427.tif 000007
【図６】
2016045427.tif 000008
【図７】
2016045427.tif 000009