(57)【要約】      （修正有）【課題】化粧料、食品製剤、医薬品として有用であり、特に、化粧料に利用した場合、皮脂の分解、皮膚の水分保持力、皮膚の弾力の改善が期待される、水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体及びその製造方法の提供。【解決手段】ブドウの種子の新芽及び大豆粉末に納豆菌とベニコウジ菌を添加して発酵させた発酵液をプロテアーゼ処理し、イオン交換樹脂等で分離・精製することにより得られるレスベラトロールの４分子を結合した構造を呈する下式（１）で示されるレスベラトロール誘導体。2016088858.tif 000005【効果】前記レスベラトロール誘導体は、分子内は疎水性であり外部は親水性の両親媒性を示し、各々のレスベラトロールの４位の水酸基はフリーであり、この水酸基が水素を発生させ、細胞を還元し、細胞膜を通過し、ケラチン生成酵素の遺伝子を活性化してケラチン産生を増加させ、ケラチンの分解を抑制し、上皮細胞の細胞の増殖を活性化する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示される水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体。
【化１】
2016088858.tif 000004
【請求項２】
ブドウの種子の新芽、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらに紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理する工程からなる水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケラチンは細胞を構成する大切なタンパク質である。皮膚においては皮膚の弾力を増す働きがあり、毛髪においては弾力性を与えている。
【０００３】
ケラチンは皮膚の角質層において角質バリアを構成し、皮膚を細菌感染から保護している。炎症を制御する働きがある機能性タンパク質である。ただし、加齢とともにケラチン含量が低下し、皮膚の弾力の低下やシワの原因となる。
【０００４】
ケラチンを産生させて維持させる発明としてヒト上皮細胞修復で用いるジエン化合物、並びにそれを含有する医薬及び化粧品組成物があるものの、化学物質であり、具体的な物質の同定には至っておらず、産業への利用は限定される（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、ケラチン産生に関する発明として例えば、アカシア属樹皮由来物を含有する血糖降下及び／又は抗肥満組成物がある（例えば、特許文献１参照。）もののその応用は限られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願２０１２−５２９２
【特許文献２】特願２０１１−５３５１２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既存の物質によるケラチン産生作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
【０００８】
そこで、副作用が弱く優れたケラチン産生作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示される水素を発生しケラチン産生作用を有するレスベラトロール誘導体に関するものである。
【００１０】
【化１】
2016088858.tif 000002
【００１１】
上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明は水素を発生しケラチン産生作用を有するレスベラトロール誘導体の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１３】
請求項１に記載のレスベラトロール誘導体は水素を発生しケラチン産生作用に優れている。
【００１４】
請求項２に記載の製造方法によれば、効率良くレスベラトロール誘導体を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。
【００１７】
【化２】
2016088858.tif 000003
【００１８】
前記の式（１）のようにレスベラトロールの４分子が結合した構造を呈し、水酸基を持つことにより水素ガスを発生させる。
【００１９】
もともとレスベラトロールとは有機酸のうちの桂皮酸の誘導体であり、３、４、５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン、または、トランス−１、２−（３、４、５−トリヒドロキシジフェニル）エチレンと称される。
【００２０】
レスベラトロールはブドウ、桂皮、ブルーベリー、アサイーなどの植物に含有されている。
【００２１】
このうち、ブドウの種子には豊富に含まれている。レスベラトロールは抗酸化作用に優れており、遺伝子への作用も確認されている。
【００２２】
このレスベラトロール誘導体はレスベラトロールの４分子がそれぞれの３位と５位の水酸基を介して結合している。この結合により、分子の内部は疎水性となり、一方、外部は親水性であることから両親媒性を呈している。これらの水酸基は水素の発生を促進する。
【００２３】
このレスベラトロール誘導体のそれぞれのレスベラトロールの４位の水酸基はフリーであり、この水酸基が水素を発生し、かつ、ケラチン合成酵素の水酸化反応を活性化する。水素を発生させることにより、細胞が安定することから好ましい。
【００２４】
このレスベラトロール誘導体は有機化学的に合成でき、標準品として利用できる。その構造はＨ−ＮＭＲにより解析され、４００ＭＨｚの測定によりケミカルシフトのピークは１．１４、２．２６〜２．６３、３．９〜４．３、５．６〜６．７７、さらに７．１３ｐｐｍに提示される。
【００２５】
すなわち、このレスベラトロール誘導体は天然由来のものであり、その安全性は確認されていることから、好ましい。さらに、このレスベラトロール誘導体の過剰量と人が接触した場合、または飲んだ場合には、体内のエステラーゼなどの酵素により分解されて、レスベラトロール分子に分解されることから安全性が高い。
【００２６】
このレスベラトロール誘導体は土壌においては微生物により分解されやすく、環境に対する負担もなく、蓄積性もないことから好ましい。
【００２７】
このレスベラトロール誘導体は水素を発生させることにより細胞を還元して細胞膜を通過し、さらに、核膜を通過して遺伝子に働くことから、その作用が直接的で効率的であることから好ましい。
【００２８】
このレスベラトロール誘導体は水素を発生させることによりケラチン生成酵素の遺伝子を活性化し、増幅させることからケラチン生成酵素が誘導され、ケラチン産生が増加する。
【００２９】
このレスベラトロール誘導体は皮膚細胞に働き、ケラチンの分解を抑制することから、ケラチンが維持されることから好ましい。
【００３０】
さらに、このレスベラトロール誘導体は皮膚の上皮細胞の増殖を活性化する。このレスベラトロール誘導体による皮膚細胞の増殖は遺伝子レベルでの刺激作用による。
【００３１】
このレスベラトロール誘導体は水素を発生させることにより細胞を安定化し、皮膚細胞のターンオーバーを活性化し、皮膚細胞の増殖をもたらすことから好ましい。
【００３２】
得られたレスベラトロール誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするレスベラトロール誘導体を分離精製することは、目的とするレスベラトロール誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
【００３３】
医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００３４】
経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００３５】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００３６】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００３７】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００３８】
食品製剤としてケラチン産生と美容を目的とした健康食品、美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００３９】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、ケラチンの産生と皮膚の健康を維持する目的として飼料やサプリメントとして利用される。
【００４０】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
【００４１】
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００４２】
得られた化粧料は水素を発生させ、ケラチン産生により、シワの改善やタルミの防御、アトピー性皮膚炎の角質バリア形成に利用される。
【００４３】
次に、ブドウの種子の新芽、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらに紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理する工程からなる水素を発生しケラチン産生作用を呈するレスベラトロール誘導体の製造方法について説明する。
【００４４】
ここでいうレスベラトロール誘導体とはレスベラトロール４分子が結合した前述の誘導体である。このレスベラトロール誘導体は生体内で酵素により分解されて排泄されるため安全性が高い。
【００４５】
このレスベラトロール誘導体のレスベラトロールは天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。
【００４６】
この誘導体は水素を発生し、皮膚細胞の遺伝子に直接作用し、ケラチン産生作用を発揮する。
【００４７】
この製造方法とはブドウの種子の新芽、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液を、さらに、紅麹本舗製のベニコウジ菌により発酵させた後に、プロテアーゼ処理する工程からなる。
【００４８】
原料となる物質はブドウの種子の新芽、大豆粉末、納豆菌、ベニコウジ菌とプロテアーゼである。
【００４９】
ブドウの種子の新芽とは、ブドウの種子を発芽させたものである。ブドウの種子にはもともとレスベラトロールやプロシアニジンが含有されているものの、食物繊維やタンパク質と結合している。
【００５０】
ブドウの種子の新芽は発芽することにより、レスベラトロールの量が増加し、遊離しやすくなっていることから、レスベラトロールの供給源として好ましい。
【００５１】
ブドウの種子の新芽は、日本産やアジア産のブドウ種子を清浄な容器の中で発芽させて得られる。この種子は低農薬や減農薬で生産されたものは好ましい。
【００５２】
ブドウの種子の新芽は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。
【００５３】
３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。
【００５４】
原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。
【００５５】
このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。
【００５６】
大豆は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。
【００５７】
さらに、ブドウの種子の新芽と大豆は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌の繁殖を防御できることから好ましい。
【００５８】
用いる納豆本舗製の納豆菌は学名バチルス  サブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。用いる納豆菌は納豆本舗製であり、高い発酵性を呈する。
【００５９】
この納豆菌はブドウの種子の新芽の中のレスベラトロールを遊離させる。
【００６０】
前記の発酵に関するそれぞれの添加量はブドウの種子の新芽の乾燥粉末１重量に対し、大豆粉末は０．０２〜７重量及び納豆本舗製の納豆菌は０．００１〜０．０５重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００６１】
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００６２】
また、この発酵は３６〜４２℃に加温され、発酵は２日間から２０日間行われる。目的とするレスベラトロール誘導体をＨＰＬＣやＴＬＣにより定量することならびに、菌体の増殖性を確認しながら、発酵の工程管理を実施することは好ましい。
【００６３】
得られたバチルス発酵液は引き続き、紅麹本舗製のベニコウジ菌によって発酵される。このベニコウジ菌による発酵によりレスベラトロール誘導体が分離され、吸収も促進される。
【００６４】
用いる紅麹本舗製のベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｃ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵効率に優れている。
【００６５】
前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物１重量に対してベニコウジ菌は０．０００１〜０．００５重量が好ましい。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００６６】
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００６７】
また、この発酵は３６〜４３℃に加温され、発酵は１日間から１５日間行われる。
【００６８】
この発酵の工程によってレスベラトロールの４量体が形成される。
【００６９】
プロテアーゼはタンパク質を分解し、ペプチドやアミノ酸を生成する加水分解の酵素であり、食用としても利用されている。アマノ製薬のプロテアーゼＮは酵素活性が高いことから好ましい。
【００７０】
前記の発酵物にプロテアーゼを添加して加温することによりレスベラトロールとタンパク質が分解され、レスベラトロール誘導体になる。
【００７１】
発酵物の１重量に対してプロテアーゼの添加量は０．００１〜０．０７重量が好ましい。加温温度は３６〜４３℃が好ましい。加温時間は１時間から６時間が好ましい。
【００７２】
前記のプロテアーゼ処理した分解物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、プロテアーゼを失活でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。
【００７３】
また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。
【００７４】
前記の還元反応物から、目的とするレスベラトロール誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００７５】
例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするレスベラトロール誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００７６】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００７７】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００７８】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００７９】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００８０】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００８１】
これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００８２】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００８３】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００８４】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００８５】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００８６】
レスベラトロール誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするレスベラトロール誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００８７】
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるレスベラトロール誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。
【００８８】
また、このレスベラトロール誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
【００８９】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００９０】
山梨産のデラウエアの種子を水道水に浸漬し、清浄な培養器に入れ、水分を浸した容器に播種した。これを３８℃で７日間、水道水を浸しながら、培養して発芽させた。このブドウの種子の新芽を採取し、乾燥機に入れて乾燥させてブドウの種子の新芽の乾燥物１．２ｋｇ得た。
【００９１】
北海道産の大豆をミキサー（クイジナート）に供し、大豆の粉砕物１．２ｋｇを得た。前記のブドウの種子の新芽と大豆の粉砕物をオートクレーブに供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。
【００９２】
これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク）に入れ、滅菌された水道水１２ｋｇを添加し、攪拌した。
【００９３】
これとは別に、納豆本舗製の粉末納豆菌の１２ｇを小型発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた培養液を用意した。
【００９４】
前記の前培養した納豆菌の溶液を前記のブドウの種子の新芽の乾燥粉末と大豆を入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４１〜４２℃の温度範囲で加温し、５日間発酵させた。
【００９５】
発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。
【００９６】
このバチルスによる発酵物１ｋｇに対して紅麹本舗製のベニコウジ菌の１０ｇを添加し、３７℃で５日間発酵させた。
【００９７】
得られた発酵物１ｋｇに対してアマノ製薬のプロテアーゼＮを１０ｇ添加し、３９℃で３時間加温した。
【００９８】
この処理物を加温し、エタノールを添加して目的とするレスベラトロール誘導体含有エキス２４１ｇを得た。
【００９９】
前述のレスベラトロール誘導体含有エキスの２００ｇに７％エタノール含有精製水１Ｌを添加し、ダイアイオン（三菱化学製）２００ｇを７％エタノール液に懸濁して充填したカラムに供した。
【０１００】
これに３Ｌの７％エタノール液を添加して清浄し、さらに、５０％エタノール液を２Ｌ添加して目的とするレスベラトロール誘導体を溶出させ、精製した。精製されたレスベラトロール誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これをレスベラトロール誘導体の検体１とした。
【０１０１】
以下に、レスベラトロール誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
【０１０２】
上記のように得られた検体１をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。
【０１０３】
さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。構造解析の結果、検体１からレスベラトロールの４分子が検出された。さらなる構造解析によりこのレスベラトロール誘導体の構造が同定された。
【０１０４】
すなわち、レスベラトロールの４分子は、いずれも３位と５位が結合しており、この位置に水酸基は認められなかった。一方、４位の水酸基は４分子ともに認められた。これにより、４分子の重合体を確認した。
【０１０５】
さらに、４００ＭＨｚのＨ−ＮＭＲにより分析した結果、ケミカルシフトのピークは１．１４、２．２６、２．５６、３．９８、４．２３、６．０８、６．５７、６．７７及び７．５０ｐｐｍに認められた。これはこのレスベラトロール誘導体の標準品の値に一致したことから、このレスベラトロール誘導体の構造を呈した。
【０１０６】
以下にヒト皮膚上皮細胞を用いた確認試験について述べる。
（試験例２）
【０１０７】
クラボウ株式会社より購入したヒト皮膚上皮細胞を用いた。培養液としては、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した、１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに、前記の実施例１で得られた検体１及び対照としてＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）の０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。
【０１０８】
細胞を剥離後、細胞数を計数した後、細胞懸濁液を調製し、細胞内のケラチン量をＥＬＩＳＡ法（和光純薬）にて測定した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
【０１０９】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により皮膚の上皮細胞数が対照群に比して平均値として３２２％に増加した。ＥＧＦでは１５５％の増加であり検体１の方が優れていた。
【０１１０】
ケラチン量については検体１により対照群に比して３１１％に増加した。ＥＧＦでは１５５％となり、検体１による増加が著しかった。なお、細胞には障害はなく、安全性が確認された。
【０１１１】
以下に水素を発生作用の確認試験について述べる。
（試験例３）
【０１１２】
検体１の１ｍｇに精製水１００ｍＬを添加し、溶解させ、直ちに、ガスクロマトグラフィー（島津製作所）により水素ガス濃度を測定した。
【０１１３】
その結果、精製水のみの水素ガス濃度は、０．０１ｐｐｍであったが、検体１を添加した精製水では５．４１ｐｐｍとなり、水素ガスの発生が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明で得られるレスベラトロール誘導体は水素を発生し、ケラチンを増加させることにより、細胞の組織を保護し、組織を保護することから国民の健康維持に貢献する。
【０１１５】
本発明で得られるレスベラトロール誘導体は皮膚の上皮細胞とケラチンを改善する作用を有することから、化粧料として炎症やアトピー、肌トラブルに悩む方の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。
【０１１６】
本発明で得られるレスベラトロール誘導体は食品としても利用できることから、食品業界の発展に寄与する。