(57)【要約】【課題】従来の細胞判定装置においては、厚さ０．１ｍｍ程度の隙間を有する専用の計測デバイスが必要であり、さらに専用の染色液を準備する必要があるため、作業者に対して費用と手間が必要であった。【解決手段】本発明の細胞判定方法は、培養容器内を撮影した画像に対して、培養容器内の細胞懸濁液の生細胞と死細胞の特徴を撮像された顕微鏡画像における輝度の違いとして判定することで、全細胞数およびバイアビリティなどの細胞判定を可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の細胞懸濁液を撮像した画像において細胞を認識した後、
認識された前記細胞の輝度が第１閾値よりも高いものを生細胞と判定し、輝度が前記第１閾値よりも低いものを死細胞と判定する、
細胞判定方法。
【請求項２】
認識された前記細胞の輝度が第１閾値よりも高いものを生細胞と判定し、輝度が前記第１閾値よりも低いとともに第２閾値よりも高いものを死細胞と判定し、輝度が前記第２閾値よりも低いものを細胞外物質と判定する、
請求項１に記載の細胞判定方法。
【請求項３】
前記第１閾値が、全体２５６階調のときに１１０階調である、
請求項１または２に記載の細胞判定方法。
【請求項４】
前記第１閾値が、全体２５６階調のときに１１０階調であり、前記第２閾値が、全体２５６階調のときに６０階調である、
請求項２に記載の細胞判定方法。
【請求項５】
請求項１から４いずれか記載の細胞判定方法を用いて生細胞と死細胞を判定した後、判定された生細胞の数を細胞数として表示する、
細胞数計測方法。
【請求項６】
請求項１から４いずれか記載の細胞判定方法を用いて生細胞と死細胞を判定した後、判定された生細胞の数と死細胞の数を表示する、
細胞数計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器に播種された細胞懸濁液に対して、細胞の生死を判定する細胞判定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞判定装置では、厚さ０．１ｍｍ程度の隙間を有する専用の計測容器にトリパンブルー液などの専用の染色液による染色を施した少量の細胞懸濁液を添加し、図５に示すように、細胞の染色の程度より位相差顕微鏡を用いて細胞の生死を判定している（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１７７０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の細胞判定装置においては、専用のデバイスが必要であり、さらに、専用の染色液を準備する必要があった。
【０００５】
そこで、本発明は、染色することなく、細胞の生死を判定する細胞判定方法、細胞数計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の細胞判定方法は、培養容器内の細胞懸濁液を撮像した画像において細胞を認識した後、認識された前記細胞の輝度が第１閾値よりも高いものを生細胞と判定し、輝度が前記第１閾値よりも低いものを死細胞と判定することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
以上のように、本発明の細胞判定方法、細胞数計測方法によれば、染色を行わずに細胞の生死を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる細胞判定装置の概要図
【図２】（ａ）本実施の形態１にかかる顕微鏡画像を示す図、（ｂ）顕微鏡画像の一部拡大図
【図３】本実施の形態１にかかる細胞数計測のフローチャート
【図４】本実施の形態１にかかる識別用の閾値の概要を示す図
【図５】染色液を用いたときの観察画像を示す図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同じ構成要素には同じ符号を付しており、説明を省略する場合もある。また、図面は、理解しやすくするためにそれぞれの構成要素を主体として、模式的に示している。
【００１０】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１における細胞判定装置１００の概要図である。
【００１１】
本実施の形態１の細胞判定装置１００は、図１に示すように、細胞懸濁液１１１が入った培養容器１１０と、培養容器１１０内の細胞の状態を観察する観察装置１１２と、観察装置１１２を所定の位置に移動させる駆動装置１１３と、観察装置１１２により観察した細胞画像を記録する細胞記録装置１１４と、細胞記録装置１１４で記録された細胞画像に対して画像処理を施す演算装置１１５と、演算装置１１５で計算した培養容器内の細胞に関する情報を表示する表示装置１１６と、から構成される。ここで、細胞に関する情報とは、例えば、細胞数や、バイアビリティ（全細胞数に対する生細胞数の割合）である。
【００１２】
演算装置１１５においては、記録された細胞画像に対して、まず第１閾値で２値化および膨張・収縮処理などの各種フィルタ処理を行い、画像内にある生細胞のみを抽出する。その後、演算装置１１５において、記録された細胞画像に対して、第２閾値で２値化などのラプラシアンフィルタなどの各種フィルタ処理を行い、全ての細胞（生細胞および死細胞）を検出する。ここで、本発明においては、第１閾値より明るい細胞を生細胞（生きている細胞）と判定し、第２閾値より明るく第１閾値より暗い細胞を死細胞（死んでいる細胞）と判定し、第２閾値より暗い細胞を埃などの細胞外物質と判定している。例えば、発明者らの実験においては、全体２５６階調のときに、第１閾値は１１０階調、第２閾値は６０階調、と設定した。このように閾値を２つ設けることで細胞の生死が判別可能となるのは、細胞懸濁液内において、生細胞と死細胞とで細胞形状が変わっているためだと考えられる。具体的には、生細胞は、球体形状を維持しており、観察装置１１２内の光源に対して乱反射現象を生じるため、細胞全体の輝度が死細胞に比べて高くなると考えられる。一方、死細胞は、細胞形状が崩れているために乱反射が起こりにくく、生細胞と比較すると輝度が低くなると考えられる。本発明は、このような特徴を活かして、２つの閾値を用いて輝度の差を判別することで、生細胞と死細胞の違いを判定することを可能とするものである。
【００１３】
なお、本実施形態では、輝度の高いものを生細胞と判定すると共に輝度の低いものを死細胞として判定する方法を説明しているが、輝度に加えて、細胞の形状を判別することで、更に精度を向上させることができると考えられる。具体的には、輝度の違いに加えて、画像における細胞の形状が丸に近いとともに外形が曲線のものを生細胞と判定し、画像における細胞の形状が丸から遠いとともに外形に微細な凹凸が有るものを死細胞と判定することで、更に判定精度を向上させることが可能であると考えられる。
【００１４】
図２（ａ）に実際の顕微鏡画像を示し、図２（ｂ）に図２（ａ）の四角部分の拡大図を示す。図２（ｂ）において、白い斑点状に細胞が存在していることが確認できる。さらに、図２（ｂ）において、例えば領域Ａは輝度が高くなっており、領域Ｂは輝度が低くなっていることが判別できる。発明者らは、この現象は、生細胞は球状形状をしているために乱反射を起こして輝度が高くなっており、死細胞は形状が崩れているために乱反射が少なく輝度が低くなっている現象だと推測した。この現象を発見することにより、発明者らは、染色液を用いずに生細胞と死細胞を判定すること、すなわち、染色液を用いずに細胞判定を行う手法を見出した。
【００１５】
従来は、人手により細胞数および生細胞数を計測する際には、トリパンプルー染色液を細胞懸濁液に混ぜ、その一部をヘモサイトメータに添加し、位相差顕微鏡で観察する。そのときに、従来の図５に示すように細胞の内部まで染色されている細胞を死細胞、色が付いていない明るい細胞を生細胞とし、一定領域内に存在する細胞数から、全体細胞数およびバイアビリティ（全体細胞数に占める生細胞数の割合）を算出していた。本実施形態における細胞数計測アルゴリズムにおける２値化の閾値などの各種パラメータの値は、同一サンプルに対してトリパンブルー染色液を用いて人手により計測したときの全体細胞数および生細胞数と本発明における細胞数計測アルゴリズムを用いた計測したときの全体細胞数および生細胞数の相関が最も高くなるように試行錯誤的に調整し、決定している。
【００１６】
細胞判定装置１００を用いて、培養容器１１０内の細胞を判定し、細胞数を計測する細胞計測方法をフローチャートとして図３に示す。
【００１７】
まず事前に設定した培養容器１１０内の複数箇所で観察装置１１２を用いて画像を撮影および記録する（ステップＳ０１）。その後、撮影した画像を読み込み（ステップＳ０２）、各画像に対して細胞の認識と全細胞数の推定を行う（ステップＳ０３）。さらに、認識された細胞の輝度に応じて、生細胞および死細胞の判定、すなわち細胞の生死判定を行う（ステップＳ０４）。ステップＳ０４においては、図４に示すように２段階の閾値を設定することで、生細胞および死細胞の判定を行う。その後、各画像の推定及び判定結果から、培養容器１１０内の全細胞数、細胞密度およびバイアビリティを、表示装置１１６に表示する（ステップＳ０５）。例えば、細胞懸濁液ＡｍｌからＢｍｌのサンプルを用いて、細胞数計測を行った結果、サンプル内に全体細胞数Ｘ個、生細胞数Ｙ個、死細胞数Ｚ（＝Ｘ＋Ｙ）個存在していることがわかったとき、生細胞数Ｙと死細胞数Ｚを表示するとともに、全細胞数を「Ｘ・（Ａ−Ｂ）／Ｂ  ｃｅｌｌｓ」、細胞密度を「Ｙ／Ｂ  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ」、バイアビリティを「Ｙ／Ｘ・１００  ％」と表示装置１１６に表示する。また、例えば、ステップＳ０４の結果から生細胞のみの数を計測し、細胞数として表示しても良い。
【００１８】
なお、ステップＳ０３において、計測する細胞ごとに最小サイズ、最大サイズを設定しておくことで、埃などの細胞以外の物質を除去することもできる。これにより、更に正確な細胞数の計測ができる。
【００１９】
なお、ステップＳ０３において、ある一定以上の大きさとして認識される細胞は、細胞が塊となっている現象であるため、塊の面積に応じて、細胞の個数を振り当てることもできる。これは特に単個細胞になりにくいヒトｉＰＳ細胞などでよく起きる現象であり、塊を複数個の細胞と認識させることで、より正確な細胞数計測ができる。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の細胞培養装置は、再生医療や創薬分野で有用である。
【符号の説明】
【００２１】
１００  細胞判定装置
１１０  培養容器
１１１  細胞懸濁液
１１２  観察装置
１１３  駆動装置
１１４  細胞記録装置
１１５  演算装置
１１６  表示装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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