(57)【要約】【課題】真皮層内に毛包様組織が形成され、より生体に近い組織が構築された人工皮膚及びその製造方法を提供する。【解決手段】一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と、表皮層とを有し、前記真皮層が毛包様組織を備える人工皮膚に関する。一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞を含む細胞集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の塊とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する、人工皮膚の製造方法に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と、
表皮層とを有し、
前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える、人工皮膚。
【請求項２】
前記真皮層は、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の線維芽細胞を含む、請求項１記載の人工皮膚。
【請求項３】
前記真皮層は、さらに血管内皮細胞を含む管状組織を備え、
前記毛包様組織と前記管状組織とが近接する、請求項１又は２に記載の人工皮膚。
【請求項４】
前記毛包様組織は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と、前記凝集体を覆う表皮角化細胞とを含む、請求項１から３のいずれかに記載の人工皮膚。
【請求項５】
前記真皮層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養することを含む製造方法により製造されたものである、請求項１から４のいずれかに記載の人工皮膚。
【請求項６】
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされ、三次元に配置された細胞と、毛乳頭細胞を含む細胞集合体とを含む細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、
前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する、人工皮膚の製造方法。
【請求項７】
前記細胞集合体を含む細胞層の形成は、
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を配置して細胞層を形成すること、
前記細胞層上に、前記細胞集合体を配置すること、及び
前記細胞集合体を覆うように細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置することを含む、請求項６記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項８】
前記細胞層の形成は、さらに血管内皮細胞を配置することを含む、請求項６又は７に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項９】
前記コートされた細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を含む、請求項６から８のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１０】
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び
前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養すること、を含む人工皮膚の製造方法。
【請求項１１】
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含み、
前記細胞層上に前記毛乳頭細胞を配置して前記毛乳頭細胞層を形成することを含む、請求項１０記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１２】
前記表皮角化細胞の配置後の培養は、半気相暴露培養である、請求項６から１１のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１３】
請求項６から１２のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法により製造された、人工皮膚。
【請求項１４】
請求項１から５及び１３のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛からなる群から選択される少なくとも一つの評価を行うための評価用キット。
【請求項１５】
請求項１から５及び１３のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性からなる群から選択される少なくとも一つの評価行うための評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、人工皮膚及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品、医薬品及び医薬部外品等といったヒトに直接適用される物質の研究開発において、薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった物質の評価試験は重要である。これらの試験は、従来、マウスやラット等の動物を用いて行われているが、近年、動物愛護の観点から動物実験の見直しが求められている。物実験に代わる実験方法の１つとして、人工皮膚モデルを用いたin vitro試験等があり、そのため様々な人工皮膚等の研究が行われている。
【０００３】
特許文献１は、毛乳頭細胞スフェロイド及びそれを含有する発毛誘導剤を開示する。同文献は、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを含む真皮層と表皮層とを有する人工皮膚組織に毛乳頭細胞スフェロイドを移植することを開示する。
特許文献２は、毛乳頭細胞とケラチノサイトとからなるスフェロイドをコラーゲンゲルに播種してさらにコラーゲンゲルを重層した後、ケラチノサイトを播種して培養した人工皮膚を開示する。
特許文献３は、真皮組織層と表皮層とを有する人工皮膚モデルであって、真皮組織層内に組織付属器官を含むことを開示する。
特許文献４は、ヒト又は動物から抜出して得た毛包又はその断片を真皮代用基質に移植することを含む皮膚代用物の製造方法を開示する。
特許文献５は、組織付属器官を構成する細胞をコラーゲンマトリックス層に配置して培養することによって組織付属器官様構造体を含む人工組織及びその製造方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１８０８７８号公報（特許４３２４９８８）
【特許文献２】特開２００８−１２５５４０号公報（特許５０９７３８７）
【特許文献３】特開２０１２−２０５５１６号公報
【特許文献４】特開平１−８９７４号公報（特許２７３３８３８）
【特許文献５】特開２００５−３０５１７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織を備える真皮層を有する人工皮膚及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える人工皮膚に関する。
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞を含む細胞集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する人工皮膚の製造方法に関する。
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む人工皮膚の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、真皮層内に毛包様組織を備える人工皮膚を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ及びＢは、実施例１において毛乳頭細胞の局在位置変化を蛍光顕微鏡で観察した結果の一例であって、図１Ａは三次元組織作製直後の組織上面の蛍光顕微鏡像であり、図１Ｂは一週間半気相暴露培養した三次元組織の上面の蛍光顕微鏡像である。
【図２】図２Ａ及びＢは、実施例１において組織の形態変化を半気相暴露培養した三次元組織のＨＥ組織切片像で観察した結果の一例であって、図２Ａは三次元組織を一週間培養した組織切片像（ＨＥ切片）であり、図２Ｂは二週間、半気相暴露培養した組織切片像（ＨＥ切片）である。
【図３】図３は二重細胞集合体の作製過程を示す画像の一例であって、図３Ａは二重細胞集合体の位相差顕微鏡像であり、図３Ｂは二重細胞集合体の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。
【図４】図４は人工皮膚の作製工程を示す概略図である。
【図５】図５Ａ及びＢは、実施例２において細胞集合体の形態変化観察を行った結果の一例であって、図５ＡはＫＣ播種直後の組織切片（ＨＥ染色）であり、図５ＢはＫＣ播種から一週間半気相暴露培養した組織切片（サイトケラチン（ＣＫ）染色）の顕微鏡像である。
【図６】図６は、参考例２で作製した三次元組織の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。
【図７】図７は、実施例３で作製した人工皮膚の組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示において「人工皮膚」は、真皮層を構成する成分となる細胞外マトリックス成分（以下、「ＥＣＭ成分」ともいう）と線維芽細胞とを含む真皮層と表皮層とを有し、真皮層が毛包様組織を備える。
【００１２】
本開示において「毛包様組織」は、一又は複数の実施形態において、真皮層内に存在し、かつ毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とその凝集体を覆う表皮角化細胞（ケラチノサイト）とを有する。毛包様組織は、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞で覆われた毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体を真皮層内で培養したものを含む。また、毛包様組織は、一又は複数の実施形態において、真皮層内で培養することによって成長したものを含む。毛包様組織の形状は、一又は複数の実施形態において、楕円形及び球根形等が挙げられる。
【００１３】
本開示において「真皮層」は、線維芽細胞を含む細胞とＥＣＭ成分との集合体で構成され、その内部に少なくとも毛包様組織を備える。真皮層は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞以外の細胞を含んでいてもよい。線維芽細胞以外の細胞としては、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、樹状細胞、メラニン細胞、脂肪細胞等が挙げられる。真皮層に含まれる線維芽細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が好ましく、１×１０４〜５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３がさらに好ましく、１×１０６〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が最も好ましい。真皮層は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織以外の組織付属器官及び／又はそれを構成する細胞を含んでいてもよい。ＥＣＭ成分としては、後述の例又は特許４９４１９４６４号及び特開２０１２−１１５２５４号に開示のものが挙げられる。
【００１４】
本開示において「表皮層」とは、一又は複数の実施形態において、真皮層上に形成された表皮角化細胞を含む細胞層をいう。表皮層は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に表皮角化細胞を配置した後、半気相暴露培養して表皮角化細胞を分化誘導させることによって形成することができる。
【００１５】
本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、発毛、育毛及び／又は除毛の評価を行うための皮膚モデルとして使用できる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、発毛等の評価のみならず、被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価に用いることができる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性当の評価に用いることができる。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、脱毛症や火傷等による皮膚損傷の治療のための移植用皮膚として使用できる。
【００１６】
［人工皮膚］
本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、真皮層は毛包様組織を備える人工皮膚（以下、「本開示の人工皮膚」ともいう）に関する。本開示の人工皮膚は、一又は複数の実施形態において、真皮層内に毛包様組織を備え、より生体に近い人工皮膚であるという効果を奏する。本開示の人工皮膚は、後述する本開示の人工皮膚の製造方法により製造できる。
【００１７】
真皮層に含まれる線維芽細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が好ましく、１×１０４〜５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３がさらに好ましく、１×１０６〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３が最も好ましい。
【００１８】
真皮層における毛包様組織の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。
【００１９】
真皮層は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞（以下、「コート線維芽細胞」ともいう）を三次元に配置し培養することを含む製造方法により製造されたものである。
【００２０】
真皮層は、一又は複数の実施形態において、管状組織を備える。管状組織は、一又は複数の実施形態において、毛包様組織と近接していることが好ましい。本開示において「毛包様組織と管状組織とが近接する」とは、毛包様組織と管状組織とが近くに位置していることをいう。「毛包様組織と管状組織とが近接する」としては、一又は複数の実施形態において、毛包様組織と管状組織とが接していること、毛包様組織と管状組織との間で物質等の移動が可能な位置にあること等を含む。管状組織は、一又は複数の実施形態において、１又は複数の分岐部を有する中空構造である。管状組織は、一又は複数の実施形態において、毛細血管網様組織ということができる。管状組織の壁面は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞を含み、実質的に血管内皮細胞によって構成されていることが好ましい。
【００２１】
したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と表皮層とを有し、前記真皮層が管状組織に近接する毛包様組織を備える人工皮膚に関する。本形態の人工皮膚は管状組織に近接する毛包様組織を備えるため、一又は複数の実施形態において、in vitroにおいて生体に近い発毛剤・育毛剤の評価モデルを提供できる。すなわち、発毛剤・育毛剤は毛根部の血行を改善することで効果を発揮するもの（ミノキシジルなど）が多く、本形態の人工皮膚によれば、真皮層に管状組織（血管網）を備え、この管状組織が毛包様組織に近接していることから、血行改善により効果を示す発毛剤・育毛剤の評価を行うことが可能になりうるという効果を奏しうる。
【００２２】
［人工皮膚の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、人工皮膚の製造方法に関する。
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、毛乳頭細胞を含む細胞の集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、前記毛乳頭細胞を含む細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する。
【００２３】
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、真皮層内に毛包様組織を備える人工皮膚を効率よく製造できる。本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞を含む細胞集合体を、ＥＣＭ成分でコートされた細胞の細胞層内に配置し培養することから、より生体に近い真皮層を備える人工皮膚を製造できる。本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、発毛及び／又は育毛作用を奏しうる毛包様組織を備える人工皮膚を製造できるという効果を奏しうる。
【００２４】
毛乳頭細胞を含む細胞集合体（以下、「毛乳頭細胞集合体」ともいう）は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と、それを覆う表皮角化細胞を含む層と有する。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、コアシェル構造（二重細胞集合体）であり、コア部は毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体で形成され、シェル部は表皮角化細胞を含む細胞層（膜）で形成される。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞以外の細胞を含んでいてもよい。毛乳頭細胞以外の細胞としては、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞、毛包上皮幹細胞、メラノサイト（色素細胞）、色素幹細胞、外毛根鞘細胞、内毛根鞘細胞、結合組織鞘細胞、毛母細胞、脂肪幹細胞、等が挙げられる。毛乳頭細胞集合体の大きさは、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、直径が、３０〜５００μｍであることが好ましく、５０〜２００μｍであることがさらに好ましい。毛乳頭細胞集合体の形状は、一又は複数の実施形態において、球状である。毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、特開２００８−１２５５４０号公報に開示された方法及び実施例を参酌して調製できる。
【００２５】
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞（以下、「コート細胞」ともいう）は、細胞と、ＥＣＭ成分を含む被膜（以下、「ＥＣＭ膜」ともいう）とを有する。
細胞としては、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞が挙げられ、その他には、上皮細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等が挙げられ、中でも線維芽細胞が好ましい。細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞、及び人工多能性幹細胞等の由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、培養細胞であってもよい。培養細胞としては、一又は複数の実施形態において、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
ＥＣＭ膜は、ＥＣＭ成分を含みかつ細胞をコートする膜である。ＥＣＭ膜は、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ成分を１種類又は２種類以上含む。ＥＣＭ膜は、一又は複数の実施形態において、物質Ａ、及び物質Ａと相互作用する物質Ｂを含んでいてもよく、好ましくは物質Ａを含む膜と物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含む。なお、ＥＣＭ成分としての物質Ａと物質Ｂについては、［ＥＣＭ成分］の項で、詳しく説明する。
ＥＣＭ膜の厚みは、適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜１×１０３ｎｍが好ましく、２〜１×１０２ｎｍがさらに好ましく、３〜１×１０２ｎｍが最も好ましい。コート細胞は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法を参酌して調製することができる。
【００２６】
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、毛乳頭細胞を含む細胞集合体と、三次元に配置された細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞とを含む細胞層を形成することを含む。
【００２７】
細胞層における毛乳頭細胞集合体の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。
【００２８】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成において、配置するコート細胞の数は、毛乳頭細胞集合体の大きさ及び形成する細胞層の厚みに応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。また、コート細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。
【００２９】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成において、コート細胞は、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞を含むことが好ましい。配置するＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞の数は、毛乳頭細胞集合体の大きさ及び形成する細胞層の厚みに応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
また、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。
【００３０】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞集合体を覆うようにコート細胞を配置することにより形成できる。また、毛乳頭細胞集合体を含む細胞層は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を三次元に配置することによって形成された細胞層内に毛乳頭細胞集合体を導入することにより形成できる。配置する毛乳頭細胞集合体の数は、一又は複数の実施形態において、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、１〜５００個／ｃｍ２が好ましく、２〜２５０個／ｃｍ２がさらに好ましく、３〜１５０個／ｃｍ２が最も好ましい。
【００３１】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、さらに血管内皮細胞を配置することを含む。血管内皮細胞を配置した場合、毛乳頭細胞集合体は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞層上に配置することが好ましい。
【００３２】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を配置して細胞層（ベース層）を形成すること、細胞層上に毛乳頭細胞集合体を配置すること、及び細胞上に配置された細胞集合体を覆うようにコート細胞を三次元に配置することを含む。細胞層（ベース層）の形成の一又は複数の実施形態において、ベースコート細胞層は無くても良く、ベース層を作成する際はコート細胞が１層以上、又は２〜５０層積層されるように配置すればよい。配置するコート細胞は、一又は複数の実施形態において、ベース層を作成する場合は、ヒトの皮膚に近い人工皮膚が得られることから、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
【００３３】
毛乳頭細胞集合体を含む細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、基材上で行うことができる。基材は、一又は複数の実施形態において、多孔質膜を有する。基材としては、一又は複数の実施形態において、トランスウェル（登録商標）、及びセルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。
【００３４】
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、一又は複数の実施形態において、基材上にコート細胞を配置して細胞層（ベース層）を形成することを含んでもよい。
【００３５】
コート細胞の配置後、毛乳頭細胞集合体の配置に先立ち、所定の期間培養を行うことが好ましい。培地は、一又は複数の実施形態において、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培養温度は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、４〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３０〜３７℃が最も好ましい。培養時間は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、１〜２４時間、好ましくは６〜２４時間である。
【００３６】
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法は、細胞集合体を含む細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。表皮角化細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞集合体を含む細胞層の表面を覆うように配置する。表皮角化細胞は、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞の細胞層が１層形成されるように配置することが好ましい。培養は、一又は複数の実施形態において、半気相暴露培養が挙げられる。表面の表皮角化細胞が空気に曝された状態で培養することにより、表皮角化細胞を分化誘導させることによって表皮層を形成することができる。培養温度は、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚が得られることから、４〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃がさらに好ましく、３０〜３７℃が最も好ましい。培養時間は、一又は複数の実施形態において、培養温度よっても異なるが、に３日以上が好ましく、３〜２８日がさらに好ましく、５〜１４日が最も好ましい。培地としては、上述のものが挙げられる。
【００３７】
本開示の第１の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、表皮角化細胞の配置から好ましい培養条件を選択することにより３〜３０日、５〜１４日、さらには７日程度で毛包様組織を備える人工皮膚を製造できる。
【００３８】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、ＥＣＭ成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞（以下、「コート毛乳頭細胞」ともいう）を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。コート毛乳頭細胞は、毛乳頭細胞とＥＣＭ膜とを含む。ＥＣＭ膜は上述の通りである。
【００３９】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、上記所定の量のコート毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞層と表皮角化細胞とを積層することによって、コアシェル構造の毛乳頭細胞集合体を形成できる。本開示の人工皮膚の第２の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛包様組織の前駆体である毛乳頭細胞集合体が形成されるため、好ましくは毛乳頭細胞集合体の準備を別途行わない場合であっても毛包様組織を備える真皮層を有する人工皮膚を製造できる。
【００４０】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、より生体に近い真皮層を形成する点から、一又は複数の実施形態において、コート細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含むことが好ましい。コート細胞は、上述の通りであって、一又は複数の実施形態において、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞が挙げられる。細胞層の形成は、少なくともＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞を含む細胞層を形成することが好ましく、コート線維芽細胞以外のコート細胞を配置することを含んでいてもよい。配置するコート線維芽細胞の数は、一又は複数の実施形態において、４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、６×１０５〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
言い換えると、ＥＣＭ膜でコートされた線維芽細胞が、一又は複数の実施形態において、良好な人工皮膚がえられることから、１〜５００層配置するのが好ましく、２〜１００層積層されるように配置するのがさらに好ましく、５〜５０層積層されるように配置するのが最も好ましい。
【００４１】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、コート毛乳頭細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上配置して毛乳頭細胞層を形成することを含む。コート毛乳頭細胞は、真皮層内に形成される毛包様組織の大きさをより大きくする点から、一又は複数の実施形態において、４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成することが好ましく、６×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましく、６×１０５〜２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、９×１０５〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
言い換えると、コート毛乳頭細胞は、一又は複数の実施形態において、少なくとも複数層積層されるように配置することが好ましく、より好ましくは２〜１０層、さらに好ましくは３〜５層である。
【００４２】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、コート細胞を含む細胞層上にコート毛乳頭細胞を配置することを含む。配置するコート毛乳頭細胞の数は、上述の通りである。
【００４３】
本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法は、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む。表皮角化細胞の配置及び培養は、第１の実施形態と同様である。
【００４４】
［二重細胞集合体の製造方法］
上述の通り、本開示の第２の実施形態における人工皮膚の製造方法によれば、上記所定の量のコート毛乳頭細胞を含む毛乳頭細胞層と表皮角化細胞とを積層することによって、コアシェル構造の毛乳頭細胞集合体を形成できる。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、コート毛乳頭細胞を１×１０２〜１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む二重細胞集合体の製造方法（以下、「本開示の二重細胞集合体の製造方法」ともいう）に関する。本開示の二重細胞集合体の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、毛乳頭細胞の凝集体とそれを覆う表皮角化細胞とを含むコアシェル構造の二重細胞集合体を製造することができる。
【００４５】
コート毛乳頭細胞は、真皮層内に形成される毛包様組織から毛軸の形成が促進される適切なサイズを作製する点から、一又は複数の実施形態において、５００〜５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することが好ましく、又は２，０００〜３，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することがさらに好ましい。
【００４６】
二重細胞集合体の製造は、一又は複数の実施形態において、細胞凝集塊の形成に適した基材上で行うことが好ましい。細胞凝集塊の形成に適した基材としては、一又は複数の実施形態において、細胞低吸着処理が行われたウェルプレート等が挙げられる。
【００４７】
［評価キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の人工皮膚と、本開示の人工皮膚が配置された容器とを含む評価用キット（以下、「本開示の評価用キット」ともいう）に関する。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛等のための被検物質の評価を行うことができる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、発毛等の評価のみならず、被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価に用いることができる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性等の評価に用いることができる。
【００４８】
容器としては、一又は複数の実施形態において、トランスウェル（登録商標）、及びセルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、容器を配置するマルチディッシュ等を含んでいてもよい。
【００４９】
本開示の評価用キットは、一又は複数の実施形態において、所定の検査に用いる試薬、材料、及び用具、並びにその評価についての説明書（取扱説明書）の少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。
【００５０】
［評価方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の人工皮膚を用いた被検物質を評価する方法（以下、「本開示の評価方法」ともいう）に関する。本開示の評価方法は、被検物質を、本開示の人工皮膚に接触させること、及び、被検物質の接触による被検物質による人工皮膚への影響を観察することを含む。本開示の評価方法によれば、一又は複数の実施形態において、従来の方法と比較して生体の皮膚に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。本開示の評価方法は、一又は複数の実施形態において、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。評価としては、一又は複数の実施形態において、育毛、発毛、脱毛、除毛、抑毛、薬剤評価、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性等の評価が挙げられる。
【００５１】
［ＥＣＭ成分］
以下に、ＥＣＭ成分について例を挙げて説明する。
【００５２】
ＥＣＭ成分としての物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有する高分子とＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子（以下、「相互作用を有する高分子」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子との組み合わせが挙げられる。
【００５３】
（ＲＧＤ配列を有する高分子）
ＲＧＤ配列を有する高分子とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列を有する高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、元来ＲＧＤ配列を有しないものにＲＧＤ配列を結合させたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する高分子は、生分解性であることが好ましい。ＲＧＤ配列を有する高分子としては、ＲＧＤ配列を有するタンパク質、ＲＧＤ配列を結合させた天然由来高分子、ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子が挙げられる。
【００５４】
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン等が挙げられる。
【００５５】
ＲＧＤ配列を結合させた天然由来高分子は、元来ＲＧＤ配列を有しない天然由来高分子に、ＲＧＤ配列を結合させた高分子である。元来ＲＧＤ配列を有しない天然由来高分子としては、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、抗体、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン、ε−ポリリジン、キチン、キトサン等が挙げられる。
【００５６】
ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子は、合成高分子にＲＧＤ配列を結合させた高分子である。ＲＧＤ配列を結合させた合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。合成高分子としては、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体；ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００５７】
ＲＧＤ配列を有する高分子は、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、ＲＧＤ配列を結合させたキチン、及びＲＧＤ配列を結合させたキトサンが好ましく、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、及びＲＧＤ配列を結合させたゼラチンがさらに好ましい。
【００５８】
（相互作用する高分子）
相互作用する高分子とは、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子をいい、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する天然由来高分子と、ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する合成高分子が挙げられる。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子とが結合、接着、吸着、又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する高分子は、生分解性であることが好ましい。
【００５９】
ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が挙げられる。
【００６０】
相互作用する高分子としては、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、エラスチンが好ましく、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、コラーゲンがさらに好ましく、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸が最も好ましい。
【００６１】
ＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用を有する高分子との好ましい組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンとコラーゲン又はゼラチン、等が挙げられる。
中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、ラミニンとゼラチンが好ましく、フィブロネクチンとゼラチンがさらに好ましい。なお、ＲＧＤ配列を有する高分子及び相互作用を有する高分子は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００６２】
（正の電荷を有する高分子）
正の電荷を有する高分子とは、正の電荷を有する、天然由来高分子又は合成高分子をいう。正の電荷を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、正の電荷を有する水溶性天然由来高分子が好ましい。正の電荷を有する水溶性天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン、正の電荷を有する水溶性ポリペプチド、正の電荷を有する低分子ペプチド、正の電荷を有するポリアミノ酸、キチン、キトサン等が挙げられる。正の電荷を有するポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン；ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が挙げられる。正の電荷を有する合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。正の電荷を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、正の電荷を有するポリウレタン、ポリアミド、正の電荷を有するポリカーボネート、又はこれらの共重合体；正の電荷を有するポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００６３】
（負の電荷を有する高分子）
負の電荷を有する高分子とは、負の電荷を有する、天然由来高分子又は合成高分子をいう。負の電荷を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、負の電荷を有する水溶性天然由来高分子が好ましい。負の電荷を有する水溶性天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン、負の電荷を有する水溶性ポリペプチド、負の電荷を有する低分子ペプチド、デキストラン硫酸等が挙げられる。負の電荷を有する合成高分子の分子形状は、直鎖状、グラフト状、くし状、樹状、星型状、網目状等のいずれであってもよい。負の電荷を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、負の電荷を有するポリウレタン、負の電荷を有するポリアミド、負の電荷を有するポリカーボネート、及びこれらの共重合体；負の電荷を有するポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００６４】
正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子との好ましい組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ε−ポリリジン塩とポリスチレンスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスチレンスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、良好な人工皮膚が得られることから、これらの中でも、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩が好ましい。ポリスチレンスルホン酸塩としては、一又は複数の実施形態において、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する高分子及び負の電荷を有する高分子は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００６５】
本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ａ１］  線維芽細胞と細胞外マトリックス成分とを含む真皮層と、
表皮層とを有し、
前記真皮層が、さらに毛包様組織を備える、人工皮膚。
［Ａ２］  前記真皮層は、１×１０２〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の線維芽細胞を含む、［Ａ１］記載の人工皮膚。
［Ａ３］  前記真皮層は、さらに血管内皮細胞を含む管状組織を備え、
前記毛包様組織と前記管状組織とが近接する、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の人工皮膚。
［Ａ４］  前記毛包様組織は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体と表皮角化細胞とを含む、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ５］  前記表皮角化細胞は、前記毛乳頭細胞で構成された細胞の凝集体を覆う、［Ａ４］記載の人工皮膚。
［Ａ６］  前記真皮層は、前記毛包様組織を１〜５００個／ｃｍ２含む、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれか記載の人工皮膚。
［Ａ７］前記毛包様組織は、直径が３０〜５００μｍである、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ８］  前記毛包様組織の形状は、楕円形である、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ９］  さらに脂肪層を含み、前記脂肪層上に前記真皮層が形成されている、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ａ１０］  前記真皮層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養することを含む［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載の人工皮膚。
［Ｂ１］  細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされ、三次元に配置された細胞と、毛乳頭細胞を含む細胞集合体とを含む細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含み、
前記細胞集合体は、毛乳頭細胞を含む細胞の凝集体ととそれを覆う表皮角化細胞を含む層と有する、人工皮膚の製造方法。
［Ｂ２］  前記細胞集合体を含む細胞層の形成は、
細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を配置して細胞層を形成すること、
前記細胞層上に、前記細胞集合体を配置すること、及び
前記細胞集合体を覆うように細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置することを含む、［Ｂ１］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ３］  前記細胞集合体は、直径が３０〜５００μｍである、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ４］  前記細胞層の形成は、細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ３］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ５］  前記コートされた線維芽細胞を４×１０５〜１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成することを含む、［Ｂ４］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ６］  前記細胞層の形成は、さらに血管内皮細胞を配置することを含む、［Ｂ１］から［Ｂ５］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ７］  細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を４×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び
前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養すること、を含む人工皮膚の製造方法。
［Ｂ８］  細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた線維芽細胞を三次元に配置し培養して細胞層を形成することを含み、
前記細胞層上に前記毛乳頭細胞を配置して前記毛乳頭細胞層を形成することを含む、［Ｂ７］記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｂ９］  前記表皮角化細胞の配置後の培養は、半気相暴露培養である、［Ｂ１］から［Ｂ８］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［Ｃ１］  ［Ｂ１］から［Ｂ９］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法により製造された、人工皮膚。
［Ｄ１］  ［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、育毛、発毛、脱毛、除毛及び抑毛の少なくとも一つの評価を行う評価用キット。
［Ｄ２］  ［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚と、
前記人工皮膚が配置された容器とを含む、皮膚安全性、皮膚腐食性、皮膚刺激性及び皮膚透過性からなる群から選択される少なくとも一つの評価行うための評価用キット。
［Ｅ１］  人工皮膚を用いた被検物質を評価する方法であって、
前記人工皮膚が、［Ａ１］から［Ａ１０］及び［Ｃ１］のいずれかに記載の人工皮膚であり、
被検物質を、前記人工皮膚に接触させること、及び、被検物質の接触による被検物質による人工皮膚への影響を観察することを含む評価方法。
［Ｆ１］  細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた毛乳頭細胞を５００〜５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２配置して毛乳頭細胞層を形成すること、及び前記毛乳頭細胞層上に表皮角化細胞を配置し培養することを含む二重細胞集合体の製造方法。
［Ｆ２］  前記コートされた毛乳頭細胞を、細胞低吸着処理が行われたウェルプレート配置することを含む。［Ｆ１］の二重細胞集合体の製造方法。
【００６６】
以下に、実施例及び参考例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００６７】
［コート細胞の作製］
特開２０１２−１１５２５４号公報の記載に基づきコート細胞を調製した。
＜正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）＞
細胞はＮＨＤＦ（ＬＯＮＺＡ社製）、細胞外マトリックス成分はフィブロネクチン（ＦＮ）及びゼラチン（Ｇ）を使用した。細胞をＦＮ溶液及びＧ溶液に交互に計９回浸漬させることによって（ＦＮ浸漬操作：５回、Ｇ浸漬操作：４回）、ゼラチンとフィブロネクチンとを含む被膜でＮＨＤＦがコートされたコート細胞（コートＮＨＤＦ）を作製した（被膜の厚み：９ｎｍ）。なお、被膜の厚みは特開２０１２−１１５２５４号公報の実施例に記載の方法により測定した。
＜正常ヒト毛乳頭細胞（ＤＰＣ）＞
細胞として予め蛍光（ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅ）染色したＤＰＣを使用した以外は、同様にしてゼラチンとフィブロネクチンとを含む被膜でＤＰＣがコートされたコート細胞（コートＤＰＣ）を作製した（被膜の厚み：９ｎｍ）。
【００６８】
［人工皮膚の作製（実施例１−１）］
特開２０１２−１１５２５４号公報の記載の方法に基づき、２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製、内直径：６．５ｍｍ、膜面積：０．３３ｃｍ２）に、コートＮＨＤＦを６×１０５ｃｅｌｌｓ播種して真皮組織（６層）を作製した。１日培養後、コートＤＰＣを真皮組織上に４×１０５ｃｅｌｌｓ播種してＤＰＣ層（４層）を作製した。さらに１日培養後、ＤＰＣ層上に正常ヒト表皮角化細胞（ＫＣ）を１．８×１０５ｃｅｌｌｓ播種してＫＣ層（１層）を形成し、所定期間、半気相暴露培養或いは液中培養することで人工皮膚を得た。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。
【００６９】
[人工皮膚の作製（実施例１−２）]
真皮組織を作製しない（コートＮＨＤＦの播種を行わない）こと、及びＤＰＣを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種すること以外は、（実施例１−１）と同様の方法で人工皮膚を作製した。
【００７０】
［人工皮膚の作製（参考例１）］
コートＤＰＣの播種細胞数を１×１０５ｃｅｌｌｓ（ＤＰＣ層：１層）とした以外は、（実施例１−１）と同じ操作で人工皮膚を作製した。
【００７１】
（局在位置変化の確認）
毛乳頭細胞の局在位置変化を蛍光顕微鏡で観察した。その結果の一例を図１に示す。図１は、実施例１の組織上面からの蛍光顕微鏡写真である。図１Ａは組織作製直後の写真、図１Ｂは一週間半気相暴露培養後の写真である。図１Ａに示すように、組織作製直後は赤く染色されたＤＰＣが培養基材全面に均一に分布していた。一方、一週間半気相暴露培養した図１Ｂでは、毛乳頭細胞同士が集まって直径１００μｍ程度の細胞塊（細胞集合体）、毛乳頭組織を形成していた。
【００７２】
（組織の形態変化観察）
組織の形態変化を半気相暴露培養した三次元組織のＨＥ組織切片像で観察した。その結果の一例を図２に示す。図２は、ＮＨＤＦ−ＤＰＣ−ＫＣ（６−４−１）構造の組織切片像である。図２Ａは一週間半気相暴露したＨＥ切片像であり、図２Ｂは二週間半気相暴露したＨＥ切片像である。図２Ａに示すように、一週間半気相暴露培養した組織断片には直径１００μｍ程度の毛乳頭細胞の集合体（矢印）が観察された。これにより、毛乳頭構造が三次元組織内に形成されていることが確認された。また二週間半気相暴露培養することによって、図２Ｂに示すように、培養一週間で観察されていた毛乳頭組織が表皮角化細胞で囲まれ、毛包様組織が形成されたことが確認された。すなわち毛器官構造を有する人工皮膚が得られたことが確認された。
【００７３】
上記組織の形態観察結果をまとめたものを下記表１に示す。真皮体積密度は、ＮＨＤＦ播種数から真皮層体積（ＨＥ切片から求めた真皮層厚みと培養基材底面積から算出）を割った値とした。なお、真皮層の厚みは、ＨＥ切片を光学顕微鏡観察により３箇所測定し、その平均を算出することにより求めた。
【表１】
2016016267.tif 000003
【００７４】
表１に示すように、ＤＰＣが積層されるようにＤＰＣ層を形成し（ＤＰＣ平面密度：１．２×１０６〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、その上にＫＣを積層して培養を行うことによって、三次元組織内に毛包様組織が形成されることが確認できた。一方、参考例１（ＤＰＣ平面密度：３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）では、毛包様組織は形成されなかった。また、ＫＣ播種後の培養を半気相暴露培養とすることによって、形成される毛包様組織の径をより大きくすることができた。
【００７５】
［二重細胞集合体の作製］
低吸着表面処理されたＵ底の９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、ＤＰＣを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１２〜２４時間３７℃でインキュベートして直径１００μｍ程度のＤＰＣ細胞集合体を作製した。次にＤＰＣ細胞集合体が形成されたウェルにＫＣを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１２〜２４時間インキュベートして直径１５０〜２００μｍ程度のコアシェル構造の毛乳頭細胞集合体（二重細胞集合体、ＤＰＣ−ＫＣスフェロイド）を得た。得られた二重細胞集合体を図３Ａ及びＢに示す。図３Ａは位相差顕微鏡像であり、図３ＢはＨＥ切片の顕微鏡像である。
【００７６】
［人工皮膚の作製（実施例２）］
図４に示す手順で人工皮膚を作製した。まず、２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサートにコートＮＨＤＦを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。次に二重細胞集合体をセルカルチャーインサート１つ当り３０個（９０個／ｃｍ２）となるように播種し、１時間インキュベートした。細胞集合体の接着を確認後、ＮＨＤＦコート細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ播種して細胞集合体を完全にＮＨＤＦコートで覆い細胞集合体を含む細胞層を形成した。さらにこの細胞層上にＫＣを２×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、半気相暴露で一週間培養して三次元組織を作製した。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。
【００７７】
組織切片像を確認することによって細胞集合体の形態変化観察を行った。その結果の一例を図５に示す。図５ＡはＫＣ播種直後の組織切片（ＨＥ染色）の顕微鏡像であり、図５ＢはＫＣ播種から一週間半気相暴露培養した組織切片（サイトケラチン（ＣＫ）染色）の顕微鏡像である。図５Ｂに示すように、細胞集合体の外殻（シェル部）はケラチン陽性であり、内部（コア部）には毛乳頭細胞を含む組織があることから、三次元組織内に毛包様組織が導入出来ていることが確認できた。また、図５Ａと図５Ｂとを比較すると細胞集合体の形状が、円形（球形）から楕円形に変化しており、毛器官を有する人工皮膚が作製できた。なお、この人工皮膚における真皮体積密度は、２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であった。
【００７８】
（参考例２）
二重細胞集合体に代えて、ＤＰＣにより構成されたＤＰＣ細胞集合体を用いた以外は実施例２と同様にして三次元組織を作製した。得られた組織切片（ＨＥ切片）の顕微鏡像を図６に示す。図６に示すように、参考例２の三次元組織は一週間組織を培養すると、真皮層と細胞集合体の境界が不明瞭になった（細胞集合体：矢印）。また、細胞集合体の周りにもＫＣが存在せず、毛包様組織を形成していなかった。なお、この人工皮膚における真皮体積密度は、２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であった。
【００７９】
［人工皮膚の作製（実施例３）］
２４ｗｅｌｌセルカルチャーインサートにコートＮＨＤＦを５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。続いてヒト臍帯静脈血管内細胞（ＨＵＶＥＣ）を７×１０４ｃｅｌｌｓ播種し１日培養した。続いて実施例２の二重細胞集合体を、セルカルチャーインサート１つ当り３０個（９０個／ｃｍ２）となるように播種し、１時間インキュベートした。細胞集合体の接着を確認後、ＮＨＤＦコート細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ播種して細胞集合体を完全にＮＨＤＦコート細胞で覆い細胞集合体を含む細胞層を形成した。さらにこの細胞層上にＫＣを２×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、半気相暴露で一週間培養して三次元組織を作製した。なお、培地は毛乳頭細胞用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）とを１：１に混合したものを使用し、培地交換は１日に１回行った。
【００８０】
組織切片像を確認することによって細胞集合体の形態変化観察を行った。その結果の一例を図７に示す。図７は実施例３の組織切片像である。図７Ａは組織作製直後（培養１日目）の切片をＣＤ３１染色した像である。ＣＤ３１陽性のＨＵＶＥＣ細胞が管状組織（血管）を形成し、血管網が毛包様組織に近接している人工皮膚（真皮体積密度：２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３）を得た。図７Ｂは半気相暴露培養１週間後のＨＥ切片の顕微鏡像である。これをみると、細胞集合体から毛軸の形成が確認されていることが確認できた。以上から血管網が近接する毛器官を有する人工皮膚モデルを作製出来た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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