(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的にタンパク質をリフォールディングする技術の提供。【解決手段】疎水性有機基で修飾された球状構造を有するグルカンデンドリマー（ＧＤ）を担体に担持してなる人工分子シャペロン及び変性タンパク質、変性剤を共存し、変性剤を希釈して前記人工分子シャペロンと変性タンパク質を複合化させ、さらに変性剤濃度を低下して変性タンパク質をリフォールディングする工程を含む、タンパク質のリフォールディング方法。【選択図】図１
2016088862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性有機基で修飾された球状構造を有するグルカンデンドリマー（ＧＤ）を担体に担持してなる人工分子シャペロン。
【請求項２】
疎水性有機基が、Ｒ、ＣＯＲ又はＣＯＮＨＲ（Ｒは炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基、炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルケニル基又はコレステリル基である）である、請求項１に記載の人工分子シャペロン。
【請求項３】
グルカンデンドリマー（ＧＤ）がアクリロイル基（CH2=CH-CO）及び／又はメタクリロイル基（CH2=C(CH3)-CO）で修飾され、末端チオール基を有する多分岐ポリエチレングリコール(多分岐ＰＥＧ−ＳＨ)によりグルカンデンドリマー（ＧＤ）を架橋してなる、請求項１又は２に記載の人工分子シャペロン。
【請求項４】
グルカンデンドリマー（ＧＤ）を構成するグルコース１００ユニットあたり疎水性有機基を０．０１〜５０個含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
【請求項５】
前記担体がリン脂質で被覆された担体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
【請求項６】
前記担体がシリカである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを充填したタンパク質リフォールディング用カラム。
【請求項８】
変性タンパク質、変性剤及び請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを共存し、変性剤を希釈して前記人工分子シャペロンと変性タンパク質を複合化させ、さらに変性剤濃度を低下して変性タンパク質をリフォールディングする工程を含む、タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項９】
変性タンパク質、変性剤及び請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを共存し、変性剤を希釈して前記人工分子シャペロンと変性タンパク質を複合化させる工程、シクロデキストリンを添加して変性タンパク質を人工分子シャペロンから分離し、リフォールディングする工程を含む、タンパク質のリフォールディング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工分子シャペロン、カラム及びタンパク質のリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性を持つ組換えタンパク質の大量合成が行われているが、組換えタンパク質の過剰発現に伴い宿主細胞内でインクルージョンボディと呼ばれる不溶性のタンパク質凝集体が生じてしまう。このような凝集体は細胞から取り出された後、in vitro で尿素や塩酸グアニジン等の変性剤溶液で可溶化され、変性剤を取り除くことで天然状態へリフォールディングされる。しかし、単純な希釈法ではリフォールディング効率が高くないため巻き戻りを補助するシステムが必要である。
【０００３】
生体内ではGroEL に代表されるような熱ショックタンパク質群（分子シャペロン）によってタンパク質の構造が保たれている。分子シャペロン機能は、ポストゲノムでのタンパク質の構造、機能解析のための新規技術開発や新規タンパク質デリバリー開発において重要な概念である。
【０００４】
本発明者らは水溶性の直鎖状多糖であるプルランに疎水性であるコレステリル基を部分的に置換したコレステリル基置換プルラン (CHP) からなるナノゲルが、人工分子シャペロンとして機能することを明らかにしている(非特許文献1,2)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nomura Y., et al. FEBS Lett., 2003, 553, 271-276.
【非特許文献２】Sasaki Y., Akiyoshi K, Current Pharm. Biotechnology,2010, 11, 300-305.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、効率的にタンパク質をリフォールディングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は球状構造を持つグルカンデンドリマーに着目し、疎水性有機基で修飾したグルカンデンドリマーを担体に担持した複合体が変性したタンパク質と疎水性相互作用することでタンパク質同士の凝集を抑制し、その後グルカンデンドリマーから放出されることでタンパク質が天然の状態に巻き戻る分子シャペロン機能を示すことを見出した。
【０００８】
本発明は、以下の分子シャペロン、カラム及びタンパク質のリフォールディング方法を提供するものである。
項１．  疎水性有機基で修飾された球状構造を有するグルカンデンドリマー（ＧＤ）を担体に担持してなる人工分子シャペロン。
項２．  疎水性有機基が、Ｒ、ＣＯＲ又はＣＯＮＨＲ（Ｒは炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基、炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルケニル基又はコレステリル基である）である、項１に記載の人工分子シャペロン。
項３．  グルカンデンドリマー（ＧＤ）がアクリロイル基（CH2=CH-CO）及び／又はメタクリロイル基（CH2=C(CH3)-CO）で修飾され、末端チオール基を有する多分岐ポリエチレングリコール(多分岐ＰＥＧ−ＳＨ)によりグルカンデンドリマー（ＧＤ）を架橋してなる、項１又は２に記載の人工分子シャペロン。
項４．  グルカンデンドリマー（ＧＤ）を構成するグルコース１００ユニットあたり疎水性有機基を０．０１〜５０個含む、項１〜３のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
項５．  前記担体がリン脂質で被覆された担体である、項１〜４のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
項６．  前記担体がシリカである、項１〜５のいずれか１項に記載の人工分子シャペロン。
項７．  項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを充填したタンパク質リフォールディング用カラム。
項８．  変性タンパク質、変性剤及び項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを共存し、変性剤を希釈して前記人工分子シャペロンと変性タンパク質を複合化させ、さらに変性剤濃度を低下して変性タンパク質をリフォールディングする工程を含む、タンパク質のリフォールディング方法。
項９．  変性タンパク質、変性剤及び項１〜６のいずれか１項に記載の人工分子シャペロンを共存し、変性剤を希釈して前記人工分子シャペロンと変性タンパク質を複合化させる工程、シクロデキストリンを添加して変性タンパク質を人工分子シャペロンから分離し、リフォールディングする工程を含む、タンパク質のリフォールディング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の人工分子シャペロンは、変性したタンパク質と疎水性相互作用することでタンパク質同士の凝集を抑制し、その後人工分子シャペロンから放出されることでタンパク質が高効率で天然の状態に巻き戻ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】1 mg/mL CHGD10-0.5溶液 (左図) 及び1 mg/mL C12GD10-2.8溶液(右図)を添加後における化学変性MDH (1.0 μM)のリフォールディングの経時変化
【図２】２段階リフォールディング系(左図)及び１段階リフォールディング系(右図)
【図３】PEG 架橋C12GD-OA のDLS 結果
【図４】ナノボール架橋微粒子の形成
【図５】PEG架橋体でのCAB のリフォールディング（24 時間後）
【図６】C12GD/DOPC 被覆シリカの共焦点画像
【図７】C12GD 被覆シリカの共焦点画像
【図８】C12GD-OA 被覆シリカによる人工分子シャペロン機能
【図９】SpinTrapG-25を用いた本発明のカラムの使用の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で使用する球状構造を有するグルカンデンドリマー(ＧＤ)は、デンプンの部分分解物から３種類の酵素(branching enzyme, sucrose phosphorylase, α-glucan phosphorylase) により合成することができる。得られたＧＤは、α-1,4:α-1,6-グルカン である。ＧＤは極めて分岐性が高く、糖鎖密度の高い球状構造の単分散なナノ粒子を形成し、水への溶解性が高い。ＧＤは、酵素合成の条件を制御することにより分子量、サイズの異なる粒子の形成が可能である。
【００１２】
ＧＤの直径は、好ましくは１〜２００ｎｍ程度、より好ましくは２〜１００ｎｍ程度、さらに好ましくは３〜８０ｎｍ程度、特に好ましくは５〜６０ｎｍ程度である。
【００１３】
ＧＤは、疎水性有機基で修飾されている。疎水性有機基としては、Ｒ、ＣＯＲ又はＣＯＮＨＲで表される基（Ｒは炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基、炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルケニル基又はコレステリル基である）が挙げられる。疎水性有機基（Ｒ、ＣＯＲ又はＣＯＮＨＲ）による修飾は、ＧＤを構成するグルコース残基のＯＨ基と疎水性有機基がエーテル結合（ＯＲ）、エステル結合（ＯＣＯＲ）、ウレタン結合（ＯＣＯＮＨＲ）を形成することで行われる。
【００１４】
炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基としては、オクチル、２−エチルヘキシル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、アイコシル、イソステアリルなどが挙げられる。
【００１５】
炭素数８〜２０の直鎖又は分枝を有するアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、パルミトオレイル、オレイルなどが挙げられる。
【００１６】
疎水性有機基により修飾されたＧＤは、ＧＤとハロゲン化合物（Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉなど）、酸ハロゲン化物（Ｃｌ−ＣＯＲ、Ｂｒ−ＣＯＲなど）、イソシアネート化合物（Ｒ−ＮＣＯ）を適当な非プロトン性溶媒中で必要に応じて塩基の存在下に０℃から溶媒の沸点程度の温度で１〜２４時間程度反応させることにより得ることができる。非プロトン性溶媒としては、テトラヒドロフラン、ピリジン、アセトニトリル、アセトン、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独或いは２種以上を組み合わせて使用することができる。塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属水素炭酸塩、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられる。
【００１７】
ＧＤは、グルコースから構成されている。疎水性有機基は、好ましくはグルコース１００ユニットあたり０．０１〜５０個、より好ましくは０．１〜１０個、さらに好ましくは０．２〜５個、特に０．３〜３個含む。疎水性有機基が少なすぎると変性タンパク質との結合が過度に弱くなり、疎水性有機基が多すぎると変性タンパク質との結合が強固になり、いずれもリフォールディングの効率が低下する。
【００１８】
ＧＤは疎水性有機基とともにアクリロイル基（CH2=CH-CO）及び／又はメタクリロイル基（CH2=C(CH3)-CO）で修飾されていてもよい。アクリロイル基、メタクリロイル基による修飾は、ＧＤとアクリロイルクロリド、メタクリロイルクロリドを非プロトン性溶媒中で必要に応じて塩基の存在下に０℃から溶媒の沸点程度の温度で１〜２４時間程度反応させることにより得ることができる。アクリロイル基／メタクリロイル基は、好ましくはグルコース１００ユニットあたり０．５〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、特に３〜１５個である。アクリロイル基／メタクリロイル基が少なすぎると架橋されないＧＤが生じて担体への結合が弱くなり、アクリロイル基／メタクリロイル基が多すぎるとタンパク質のＳＨ基と反応する可能性が高くなる。
【００１９】
アクリロイル基及び／又はメタクリロイル基で修飾されたＧＤは、末端チオール基を有する多分岐ポリエチレングリコール(多分岐ＰＥＧ−ＳＨ)と反応させることにより架橋することができる。ＧＤを多分岐ＰＥＧ−ＳＨで架橋することで、担体への結合をより強固にすることができる。多分岐ＰＥＧ−ＳＨとしては、２分岐ＰＥＧ−ＳＨ，３分岐ＰＥＧ−ＳＨ、４分岐ＰＥＧ−ＳＨが挙げられ、４分岐ＰＥＧ−ＳＨが好ましい。多分岐ＰＥＧ−ＳＨは市販品を使用することができる。多分岐ＰＥＧ−ＳＨは全てのアクリロイル基／メタクリロイル基と反応する理論量で添加してもよく、理論量より少ない量で添加してもよい。多分岐ＰＥＧ−ＳＨの添加量が少ない場合、多分岐ＰＥＧ−ＳＨと架橋反応の後に残存するアクリロイル基及び／又はメタクリロイル基は、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどと反応させてＳＨ基と反応する基をなくし、タンパク質のＳＨ基との反応を防止するのが好ましい。
【００２０】
ＧＤを担持する担体としては、シリカ、アルミナ、ゼオライト、セピオライト、シリカアルミナ、セルロース、活性炭、珪藻土、セリア、ジルコニア、チタニアなどの微粒子が挙げられ、シリカが好ましい。
【００２１】
担体は、リン脂質などの脂質で被覆し、ＧＤと複合化するのが好ましい。リン脂質としては、特に限定されないが、例えばホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール（ＤＳＰＧ））、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。これらの脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
【００２２】
ＧＤにコレステリル基を部分的に修飾したＣＨＧＤは変性タンパク質を取り込んで凝集を抑制し、コレステリル基に包摂するシクロデキストリンを添加することでタンパク質が解離し、タンパク質が天然の状態に巻き戻る。一方、コレステリル基よりも疎水性度の低いドデシル基を修飾したＣ１２ＧＤでは、タンパク質同士の凝集を抑制しながらも自発的に解離し、シクロデキストリンの添加を必要とせずに天然の状態に巻き戻る、１段階での分子シャペロン機能を示す。シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、アセチル化−β−シクロデキストリン、トリアセチル化−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル化−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル化−β−シクロデキストリンなどが挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質のリフォールディング方法では、変性タンパク質、変性剤及び本発明の人工分子シャペロンを共存させて変性タンパク質を人工分子シャペロンに複合体化し、変性剤濃度を低下させることでリフォールディングする。変性剤濃度の低下は、希釈、透析、カラムを使用することにより実施できる。変性剤は完全に除去してもよい。変性剤の濃度が低下すると、変性タンパク質は巻き戻り、活性を有する天然のタンパク質にリフォールディングされる。
【００２４】
本発明のリフォールディング方法は、カラムを用いるのが好ましい。例えば、本発明の人工分子シャペロンをカラムに充填し、変性剤、変性タンパク質を含む混合物をカラムにかけて変性タンパク質を人工分子シャペロンに付着させる。次にバッファーを加えて変性剤を希釈し、必要に応じてシクロデキストリン溶液を流すことでリフォールディングされた天然型のタンパク質を溶出することができる。カラムとしては、SpinTrapG-25のような公知の遠心分離用カラムを好ましく使用することができる(図９)。
【００２５】
タンパク質の変性剤としては、尿素、グアニジン塩酸塩、2-メルカプトエタノール、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、アセトアミド、ホルムアミドが挙げられる。
【００２６】
リフォールディングされるタンパク質は特に限定されず、任意のタンパク質が挙げられる。具体例としては、酵素、抗体、サイトカイン(インターフェロン、インターロイキンなど)、ケモカイン、ホルモン類(成長ホルモンなど)、ワクチン、構造タンパク質（コラーゲン、ケラチンなど）、輸送タンパク質（ヘモグロビン、アルブミン、アポリポタンパク質など）、貯蔵タンパク質（フェリチン、ヘモシデリンなど）が挙げられる。
【００２７】
タンパク質は、疎水性の程度に応じて本発明の人工分子シャペロンに結合、複合化される。従って、疎水性の程度の異なる複数の分子シャペロンを組み合わせることで任意のタンパク質のリフォールディングが可能である。例えば、疎水性有機基がＯＲ、ＯＣＯＲ，ＯＣＯＮＨＲ（ＲはＣ１０，Ｃ１２，Ｃ１４のアルキル基又はアルケニル基）である人工分子シャペロンを組み合わせることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００２９】
なお、実施例では以下の試薬を用いた。
1. 試薬
・CHGD(コレステリル基で修飾されたＧＤ)
・C12GD（ドデシル基で修飾されたＧＤ）
・C12GD10-OA (ドデシル基 : 2.8/100 glucose unit、アクリロイル基 : 6/100 glucose unit)
・C12GD20-OA(ドデシル基 : 2.8/100 glucose unit、アクリロイル基 : 10/100 glucose unit)
・C12GD20-OA-Rhodamine (ドデシル基：2.3 個/100単糖、アクリロイル基：7 個/100 単糖)
・PTE-100SH（４分岐PEG 鎖、末端チオール基）(４分岐PEG-SH) (日油)
・Methyl-β-cyclodextrin (CD) (関東化学)
・Carbonic Anhydrase II(CAB)(SIGMA)
・Malate Dehydrogenase (MDH) (SIGMA)
・Guanidine Hydrochloride(GdmCl)(WAKO)
・50mM Tris-sulfate (pH7.5)
・p-nitrophenylacetate(SIGMA)
・dry acetonitrile(東京化成)
・2-メルカプトエタノール (東京化成)
・オキサロ酢酸 (WAKO)
・ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）
・ハイプレシカ（直径12 μm）（宇部エクシモ）
・1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)
【００３０】
実施例１
GDとdodecyl isocyanateおよびcholesterol isocyanateから種々の置換度を有する長鎖アルキル基置換GD (C12GD) とコレステリル基置換GD (CHGD) を合成した。合成物の水溶液中の粒径評価をDLSにより行った(表１)。
【００３１】
分子シャペロン活性試験（巻き戻り）として、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）を化学変性剤である6 M塩酸グアニジン(GdmCl)、4 mM 2-メルカプトエタノールで1時間処理することで変性させた。MDHはオキサロ酢酸とNADH からリンゴ酸とNAD+への反応、また逆反応を触媒する酵素である。変性させたMDHを種々の両親媒性GD溶液を添加した溶液で希釈することで両親媒性GDのシャペロン活性を評価した。酵素活性は、nativeのMDHを活性100%とし、NADH (λmax=340 nm) の減少量をUVの時間変化より算出した。
【００３２】
【表１】
2016088862.tif 000003
【００３３】
コレステリル基置換GDは水溶液中で分子間会合によってクラスターナノゲルを形成し、置換度が高いものは凝集、沈殿を生じた。一方、ドデシル基置換体は、いずれの分子量のGDにおいても、比較的安定なナノ微粒子が得られることがわかった (表2)。
【００３４】
【表２】
2016088862.tif 000004
【００３５】
リフォールディング実験においてＧＤ非存在下(spontaneous)では、リフォールディング過程における酵素の凝集のために全く活性回復が見られなかった (0%) 。これに対し、CHGDや高濃度のC12GD存在下では化学変性MDHと疎水性相互作用により複合体を形成し、凝集を抑制した。その複合体にシクロデキストリン(CD)を添加することで酵素活性が回復した（図１左）。これは、二段階の人工分子シャペロン機構である（図２左）。
【００３６】
一方、C12GD存在下では、CDの添加を必要とせず効率よく酵素の活性が回復した（図１右）。タンパク質の凝集と巻き戻りおよび両親媒性GDとの複合化は競争過程である。疎水性の強いCHGDでは疎水的な変性タンパク質と不可逆的な複合化が優先し、疎水性の弱いC12GDでは変性タンパク質と弱く可逆的な相互作用により凝集を抑制し、CDの非存在下でタンパク質の自発的な巻き戻りが生じたものと考えられる（図２右）。
【００３７】
以上より、両親媒性GD はその疎水性基を制御することで、シクロデキストリンの添加を必要とする二段階機構や、混合するだけで変性タンパク質が巻き戻る一段階機構での人工分子シャペロン機能を示すことが明らかとなった。
【００３８】
実施例２
1. 実験
PEG 架橋体によるリフォールディング実験を行う前に、架橋体のDLS 測定を行った。C12GD10-OA とC12GD20-OA に関して、系中のアクリロイル基と等量のチオール基になるように、4 分岐PEG-SH を混合し、16 時間室温で静置した。どちらの合成物も、C12GD-OA が20 mg/mL ではゲル化を起こしていたが、10 mg/mL、2.5 mg/mL ではいずれも溶液状態を保っていたので、DLS(動的光散乱法)で粒径を測定した。
【００３９】
ゲル化しなかった架橋体を用いて、化学変性CA のリフォールディング実験を行った。CAB を6 M GdmCl/50mM Tris-sulfate Bufferに溶解させ、280 nm のUV吸収(1.83 mg protein/mL/cm)から濃度を測定し、6 mg/mL になるように調製した。このCAB 溶液を25℃・16時間以上で変性させた。変性溶液をPEG架橋C12GD-OAおよび、C12GD-OA溶液にて200倍希釈し、希釈時を t = 0 h とした。次にp-ニトロフェニルアセテートを50 mM になるように乾燥アセトニトリルに溶解させた。この溶液50μL を測定試料90μL と50 mM Tris-sulfate 360μL の混合溶液に加え、400 nmのUV吸収の時間変化からp-ニトロフェノレートの濃度を測定した。native CA(カルボニックアンヒドラーゼ) の酵素活性を100%とし、24時間後の活性回復率を測定した。
【００４０】
2. 結果と考察
PEGで架橋したもののうち、ゲル化しなかったサンプルのDLS 測定結果を図３に示す。いずれも原料に比べてサイズは増加し（GD10 : 14.2 d.nm、GD20 : 20.1 d.nm）、多分散な粒子が得られた(図３)。
【００４１】
PEG 架橋を行っていない、C12GD10-2.8 とC12GD20-2.8 に関して化学変性CA のリフォールディングを行い比較した（図４）。いずれも架橋しても大幅にリフォールディング効率が低下することはなかった(図５)。
【００４２】
C12GD では今まで、C12GD10 からC12GD40 では分子量が大きくなるので相対的にモル数が低下し、衝突確率が下がるために酵素の凝集が優先的に起こり、活性回復率が上がらないと考えてきた。しかし、100 nm や200 nm にまで粒径が増大したC12GD 架橋体になってモル分子数が低下しているにもかかわらず、架橋していないものと酵素活性がほとんど変化していないことを考えると、PEG が存在することでのメリットがあると考えられる(図３，図５)。
【００４３】
実施例３
1. C12GD 被覆シリカ微粒子の作製
化学変性タンパク質と混合すると天然の状態に巻き戻るC12GD を、シリカ粒子に被覆する。シリカ粒子にはDOPCリポソームが被覆できることが知られているので、リポソーム被覆後にC12GDを被覆するものと、直接C12GD を被覆するものを作製し比較する。
【００４４】
1-1. Liposome 溶液の作製
20 mM DOPC クロロホルム溶液（１% NBD(nitorobenzoxadiazole) 14:0 含）を10 mL サンプル管に入れアルゴン気流下でDOPC をフィルム化した。１晩減圧乾燥後50 mM Tris-sulfate (pH7.5)をDOPC が20 mM になるように加え、37℃で1時間インキュベートした。この水溶液を超音波処理し（60W、15min）、フィルター (0.22μm、PVDF) により不純物を取り除いた（Liposome 溶液）。
【００４５】
・C12GD/DOPC 被覆シリカの作製
シリカ微粒子を50 mM Tris-sulfate (pH7.5) に35.7 % (w/w) で分散させた（シリカ液）。このシリカ液と上のLiposome 溶液を6：5 で混合し30min 複合化させた。遠心（3,000rpm、25℃、20min）により上清を捨ててから、2.5 mg/mL のC12GD20-OA-Rhodamine を1 mL 添加し1 晩静置した。遠心（3,000rpm、25℃、20min）により上清を捨ててから、バッファーを1 mL 加え100mg/mL PEG-SHを2μL添加した。共焦点レーザー顕微鏡でシリカ表面への被覆を確認した。
【００４６】
1-2. C12GD 被覆シリカの作製
シリカ液40μLとC12GD20-OA-Rhodamine 水溶液40μLを混合し、3000 rpm、30 min、25℃で遠心後、上清を捨てた。そこにバッファー80μLを加え、100 mg/mL PEG-SHを2μL添加した。シリカ表面にC12GD が被覆しているかを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【００４７】
1-3. 結果と考察
・C12GD/DOPC 被覆シリカの作製
共焦点での観察結果を図６に示す。シリカの粒子の外周にDOPCとともにリポソームに取り込ませたNBD 脂質の蛍光が観察され、C12GD-OA に修飾したローダミン由来の蛍光も観察されたことから、C12GD/DOP 被覆シリカの形成を確認した（図６）。
【００４８】
・C12GD 被覆シリカの作製
共焦点での観察結果を図７に示す。シリカの粒子の外周にローダミン由来の蛍光が観察されたことから、リポソームを介することなくC12GD をシリカ粒子に被覆できることが分かった（図７）。
【００４９】
2. C12GD 被覆シリカ微粒子による人工分子シャペロン機能評価
シリカにC12GD が被覆できることが分かったので、人工分子シャペロン機能を持つか確認した。
【００５０】
2-1.実験
1-1. 実験で示した手法で表３の通りC12GD 被覆シリカ・C12GD/DOPC 被覆シリカを作製した。SpinTrap G-25 の空の容器内に650 μL を移し、遠心で分離後、バッファー597 μL で３回洗浄した。また、C12GD 被覆シリカはC12GD10-OA とC12GD20-OA で被覆したものをそれぞれ２本ずつ用意し、それぞれ１本ずつはそのまま使用し、残りの１本ずつは凍結乾燥させた。
【００５１】
CA を6 M GdmCl 水溶液に6 mg/mL で溶解し、25℃で16 時間変性させた。シリカ微粒子を含むものには直接変性CA を添加し、バッファーで200 倍希釈した。Spontaneous はバッファーで直接化学変性CA を200 倍に希釈した。希釈時点をt=0h とし、酵素活性を測定することで活性回復率の測定とした。
【００５２】
酵素活性は、測定試料50 μL とバッファー360 μL を混合し、50 mM pNPA 溶液（acetonitrile）を90 μLを添加し400 nm の吸光度の時間変化から測定した。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
2-2.結果と考察
それぞれのサンプルの酵素活性の変化を図８に示す。シリカ微粒子もC12GD も含まないSpontaneous では15%程度しか活性が回復しないのに対して、シリカ粒子はSpontaneous よりも活性が低下した。これは化学変性CA がシリカ表面に吸着し、天然の状態に巻き戻ることができなかったためであると考えられる。一方、C12GD を被覆したものはいずれも酵素活性が回復し、凍結乾燥処理の有無にかかわらず、50〜60%程度まで酵素活性が回復した。これは、シリカ表面のC12GD によって酵素同士の不可逆な凝集を抑制し、弱い疎水性相互作用により自発的に酵素が解離することで天然の状態に巻き戻ったと考えられる。C12GD/DOPC 被覆シリカはさらに活性回復率が高く、リフォールディング操作20 時間で90%程度まで活性が回復した。これはシリカ表面全体に脂質膜を形成していることで、タンパク質のシリカ表面への吸着を防げたのではないかと考えられる。
【００５５】
以上のように、疎水化GD 吸着シリカ微粒子は、新規なシャペロンカラムとして機能することが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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