(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の生存率が高く、高効率で遺伝子や薬剤を細胞に導入することができる体内用プラズマ発生装置、遺伝子導入装置、薬剤導入装置及び内視鏡の提供。【解決手段】尖端１２ｃの径が１０〜１０００ｎｍの針状電極１２が、筒状電極１１との間に間隔を開けて、筒状電極１１の内側に配置されており、電源部が、筒状電極１１と針状電極１２の尖端１２ｃとの間でプラズマを発生させるよう、筒状電極１１と針状電極１２との間に、１０Ｈｚ〜１００ｋＨｚで、３００〜６００Ｖの振幅の電圧を印加するよう設けられている体内用プラズマ発生装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筒状電極と、
尖端の径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、前記筒状電極との間に間隔を開けて、前記筒状電極の内側に配置された針状電極と、
前記筒状電極と前記針状電極の尖端との間でプラズマを発生させるよう、前記筒状電極と前記針状電極との間に電圧を印加する電源部とを有することを
特徴とする体内用プラズマ発生装置。
【請求項２】
前記電源部は、１０Ｈｚ乃至１００ｋＨｚで、３００乃至６００Ｖの振幅の電圧を印加するよう構成されていることを特徴とする請求項１記載の体内用プラズマ発生装置。
【請求項３】
前記針状電極は、その尖端が前記筒状電極の先端から突出するよう配置されていることを特徴とする請求項１または２記載の体内用プラズマ発生装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の体内用プラズマ発生装置と、
前記体内用プラズマ発生装置により生体内で前記プラズマを発生させたとき、前記生体内の細胞中に遺伝子を導入可能に、前記針状電極の尖端の近傍に前記遺伝子を供給する供給手段とを、
有することを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の体内用プラズマ発生装置と、
前記体内用プラズマ発生装置により生体内で前記プラズマを発生させたとき、前記生体内の細胞中に薬剤を導入可能に、前記針状電極の尖端の近傍に前記薬剤を供給する供給手段とを、
有することを特徴とする薬剤導入装置。
【請求項６】
少なくとも２つのチャンネルと、請求項４記載の遺伝子導入装置または請求項５記載の薬剤導入装置とを有し、
一方のチャンネルに前記体内用プラズマ発生装置を内蔵し、他方のチャンネルに前記供給手段を内蔵することを
特徴とする内視鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内用プラズマ発生装置、遺伝子導入装置、薬剤導入装置および内視鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子治療の研究やｉＰＳ細胞の作製などに、細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入技術が用いられている。また、生体内の細胞への遺伝子導入を指向して、細胞を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する遺伝子を細胞内に導入する遺伝子導入方法が開発されている。このような方法として、例えば、金属箔の一方の面にその金属の蒸散・プラズマ化を行う吸収性の短パルスエネルギーを印加することにより、金属ガスの急激な膨張によるジェットを発生させて、金属箔の他方の面で衝撃波を発生させ、金属箔の他方の面に配置した遺伝子を付着した微粒子を加速して細胞内に打ち込む方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、細胞にプラズマを照射することにより、プラズマ中に存在するラジカルの作用により、脂質過酸化反応で細胞膜に小孔を開けるとともに、細胞の表面に電界を発生させて、その電界により小孔から細胞内に遺伝子を押し込む方法も開発されている（例えば、特許文献２、３、または非特許文献１参照）。この方法によれば、病気感染の危険性がなく、導入効率も目視で最大６０〜７０％、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）による検討で最大２５〜３０％程度と高くなっている。
【０００４】
なお、体内で使用できるものではないが、本発明者等により、遺伝子とその遺伝子を導入する細胞とを含む遺伝子分散溶液を、１対の電極の間に配置し、一方の電極から他方の電極に向かってプラズマ原料を供給しつつ、各電極間に電圧を印加してプラズマを発生させ、遺伝子分散溶液にそのプラズマを直接当てることにより、細胞に遺伝子を導入する方法が開発されている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２７２４６０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／０６４７６７号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００４／０１５１０１号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１４／２０８４２５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Y. Ogawa, N. Morikawa, A. Ohkubo-Suzuki, et al., “An epoch-making application of discharge plasma phenomenon to gene-transfer”, Biotechnol. Bioeng., 30 December 2005, Volume 92, Issue 7, p.865-870
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の遺伝子導入方法では、衝撃波を利用して遺伝子を細胞内に導入するため、細胞のダメージが大きく、細胞の生存率が低いという課題があった。特許文献２、３および非特許文献１に記載の遺伝子導入方法では、比較的高い導入効率が得られているが、拡散型であるため、遺伝子導入効率を低下させてしまっているという課題があった。また、プラズマの照射時間が長いため、細胞に障害が発生しやすく、細胞の生存率が低いという課題もあった。
【０００８】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、細胞の生存率が高く、高効率で遺伝子や薬剤を細胞に導入することができる体内用プラズマ発生装置、遺伝子導入装置、薬剤導入装置および内視鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明に係る体内用プラズマ発生装置は、筒状電極と、尖端の径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、前記筒状電極との間に間隔を開けて、前記筒状電極の内側に配置された針状電極と、前記筒状電極と前記針状電極の尖端との間でプラズマを発生させるよう、前記筒状電極と前記針状電極との間に電圧を印加する電源部とを有することを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る体内用プラズマ発生装置は、ヘリウムガス等のプラズマ原料を使用しないため、液体の存在する生体内でも使用することができる。本発明に係る体内用プラズマ発生装置は、針状電極の尖端の径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍと非常に細いため、筒状電極と針状電極との間に電圧を印加したとき、筒状電極と針状電極の尖端との間で極微小のプラズマを発生させることができる。生体内で使用したときには、針状電極の尖端近傍の、生体内の液体や気体をプラズマ化することにより極微小プラズマを発生させることができる。このため、生体内で使用したとき、針状電極の尖端の近傍に遺伝子や薬剤を供給し、発生したプラズマを生体内の細胞に照射することにより、生体内の細胞にその遺伝子や薬剤を導入することができる。なお、針状電極の尖端の径は、１００ｎｍ〜３００ｎｍであることがより好ましい。
【００１１】
本発明に係る体内用プラズマ発生装置は、電源部により１０Ｈｚ乃至１００ｋＨｚで、３００乃至６００Ｖの振幅の比較的低い電圧を印加することで、局所的に極微小のプラズマを発生させることができる。このため、生体内でも、生体にほとんどダメージを与えることなく使用することができ、低侵襲である。また、極微小のプラズマを利用することにより、プラズマを照射する細胞へのダメージを小さくすることができ、細胞の生存率を高めることができる。
【００１２】
本発明に係る体内用プラズマ発生装置は、局所的にプラズマを発生させて遺伝子や薬剤の導入を行うことができるため、高効率で遺伝子や薬剤を細胞に導入することができる。また、遺伝子や薬剤の種類によらず、導入することができる。このため、遺伝子治療の効果を高めることができる。また、ｉＰＳ細胞作成時の遺伝子導入に使用することもでき、作成効率を高めることができる。
【００１３】
本発明に係る体内用プラズマ発生装置で、針状電極は、その尖端が筒状電極の先端から突出するよう配置されていてもよく、その尖端が筒状電極の内側に配置されていてもよい。針状電極の尖端を筒状電極の先端から突出させることにより、局所的に発生するプラズマの発生位置を容易に制御することができ、狙った細胞に効率良く遺伝子や薬剤を導入することができる。また、針状電極の尖端を筒状電極の内側に配置することにより、針状電極が細胞に接触して細胞を傷つけるのを防ぐことができる。
【００１４】
本発明に係る遺伝子導入装置は、本発明に係る体内用プラズマ発生装置と、前記体内用プラズマ発生装置により生体内で前記プラズマを発生させたとき、前記生体内の細胞中に遺伝子を導入可能に、前記針状電極の尖端の近傍に前記遺伝子を供給する供給手段とを、有することを特徴とする。また、本発明に係る薬剤導入装置は、本発明に係る体内用プラズマ発生装置と、前記体内用プラズマ発生装置により生体内で前記プラズマを発生させたとき、前記生体内の細胞中に薬剤を導入可能に、前記針状電極の尖端の近傍に前記薬剤を供給する供給手段とを、有することを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る遺伝子導入装置および薬剤導入装置は、本発明に係る体内用プラズマ発生装置により、高効率で遺伝子や薬剤を生体内の細胞に導入することができる。また、遺伝子や薬剤を導入した細胞の生存率も高い。また、生体にほとんどダメージを与えることなく遺伝子や薬剤を導入することができ、低侵襲である。
【００１６】
本発明に係る内視鏡は、少なくとも２つのチャンネルと、本発明に係る遺伝子導入装置または薬剤導入装置とを有し、一方のチャンネルに前記体内用プラズマ発生装置を内蔵し、他方のチャンネルに前記供給手段を内蔵することを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る内視鏡は、本発明に係る体内用プラズマ発生装置および供給手段を生体内に容易に挿入することができ、高効率で遺伝子や薬剤を生体内の細胞に導入することができる。また、遺伝子や薬剤を導入した細胞の生存率も高い。また、生体にほとんどダメージを与えることなく遺伝子や薬剤を導入することができ、低侵襲である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞の生存率が高く、高効率で遺伝子や薬剤を細胞に導入することができる体内用プラズマ発生装置、遺伝子導入装置、薬剤導入装置および内視鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態の体内用プラズマ発生装置を示す（ａ）側面図、（ｂ）針状電極の尖端の拡大側面図である。
【図２】本発明に関し、遺伝子導入実験の実験装置を示す（ａ）回路図、（ｂ）筒状電極、針状電極および収納容器付近の拡大側面図である。
【図３】図２に示す実験装置による筒状電極と針状電極との間の電圧の測定結果を示す、印加するパルスの回数が（ａ）１回、（ｂ）１０回のときのグラフである。
【図４】図２に示す実験装置による、筒状電極と針状電極の尖端との間で発生したプラズマを示す観察図である。
【図５】図２に示す実験装置による、（ａ）コントロール、（ｂ）印加するパルス電圧の回数が１０回、（ｃ）１００回、（ｄ）１０００回のときの遺伝子導入実験の結果を示す明視野の顕微鏡写真である。
【図６】図２に示す実験装置による、（ａ）コントロール、（ｂ）印加するパルス電圧の回数が１０回、（ｃ）１００回、（ｄ）１０００回のときの遺伝子導入実験の結果を示す蛍光の顕微鏡写真である。
【図７】本発明の実施の形態の体内用プラズマ発生装置の、内視鏡に内蔵した使用状態を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面および実験に基づき、本発明の実施の形態について説明する。
図１は、本発明の実施の形態の体内用プラズマ発生装置を示している。
図１に示すように、体内用プラズマ発生装置１０は、筒状電極１１と針状電極１２と電源部１３（図１には図示せず）とを有している。
【００２１】
図１（ａ）に示すように、筒状電極１１は、ステンレス製である。針状電極１２は、ステンレス製の細長い丸棒状の連結部１２ａと、その先端に取り付けられたタングステン製の針状の先端部１２ｂとを有している。針状電極１２は、筒状電極１１との間に間隔を開けて、筒状電極１１の内側に配置されている。また、針状電極１２は、先端部１２ｂの尖端１２ｃが筒状電極１１の先端から突出するよう配置されている。なお、針状電極１２が細胞に接触して細胞を傷つけるのを防ぐよう、針状電極１２は、その尖端１２ｃが筒状電極１１の内側に配置されていてもよい。
【００２２】
具体的な一例では、図１（ａ）に示すように、筒状電極１１の内径は２．１９ｍｍ、針状電極１２の連結部１２ａの外径は５００μｍ、先端部１２ｂの胴体の外径は１０μｍである。また、図１（ｂ）に示すように、先端部１２ｂの尖端１２ｃの外径は２００ｎｍである。
【００２３】
電源部１３は、針状電極１２に＋極、筒状電極１１に−極が接続されており、筒状電極１１と針状電極１２との間に電圧を印加可能に設けられている。電源部１３は、電圧を印加することにより、筒状電極１１と針状電極１２の尖端１２ｃとの間でプラズマを発生可能に構成されている。
以下に、図１に示す体内用プラズマ発生装置１０を用いて、細胞への遺伝子導入実験を行った。
【００２４】
［遺伝子導入実験］
図２に、実験に使用した実験装置を示す。図２（ｂ）に示すように、上部が開口した収納容器２１で遺伝子を導入する細胞２３を培養し、そこに生理食塩水に導入する遺伝子を混ぜた遺伝子分散溶液２２を加えた。その遺伝子分散溶液２２の内部に、筒状電極１１と針状電極１２の先端を挿入して実験を行った。針状電極１２の尖端１２ｃから細胞２３までの距離は、１ｍｍ以下とした。実験では、遺伝子の代わりに、細胞中のＤＮＡに付着すると発光する蛍光物質ＹＯＹＯ−１を用いた。また、細胞２３として、ヒトの乳癌細胞由来のＭＣＦ−７細胞（接着細胞）を使用した。
【００２５】
また、図２（ａ）に示すように、電源部１３として、電源（DC power supply）、抵抗（20MΩ、20kΩ、2kΩ）、コンデンサ（2nF）、ファンクションジェネレータ（Function generator）が接続された電界効果トランジスタのMOS-FETを使用して高電圧パルス回路を構成し、その回路の＋極を針状電極１２に、接地された−極を筒状電極１１に接続した。
【００２６】
電源部１３により筒状電極１１と針状電極１２との間に５０ｋＨｚのパルス電圧を印加して、筒状電極１１と針状電極１２の尖端１２ｃとの間でプラズマを発生させ、遺伝子分散溶液２２に向かってプラズマを照射した。プラズマ噴射後、細胞２３の蛍光の観察を行った。なお、印加電圧は０．５〜１．５ｋＶとした。また、ファンクションジェネレータによりパルス回数を変化させ、パルス回数が１０回（cycle）、１００回、１０００回の場合について、それぞれ実験を行った。
【００２７】
電源電圧が１．５ｋＶのときの、筒状電極１１と針状電極１２との間の電圧を、図２に示すオシロスコープ（Oscilloscope）で測定し、その結果を図３に示す。図３に示すように、パルス電圧の大きさは最大で６００Ｖ、パルスの山部で概ね３００〜４００Ｖ以下であった。
【００２８】
電源電圧が１．５ｋＶのときの、筒状電極１１と針状電極１２の尖端１２ｃとの間で発生したプラズマの状態を、図４に示す。図４に示すように、直径１５０μｍ程度の極微小のプラズマが発生していることが確認された。
【００２９】
電源電圧が１．５ｋＶのときの、パルス回数毎の明視野および蛍光の観察結果を、それぞれ図５および図６に示す。なお、図５および図６中には、比較のため、プラズマを照射しないときの結果（以下、「コントロール（control）」という）も示す。図５に示すように、コントロールのものも、パルス回数を変化させたものも、細胞過疎領域は観察されず、細胞２３は全て生きていることが確認された。このことから、今回の条件でのプラズマの照射では、細胞２３は死なないことがわかる。
【００３０】
また、図６（ｂ）および（ｃ）に示すように、パルス回数が１０回および１００回のものは、局所的に蛍光が認められ、細胞中にＹＯＹＯ−１が導入されていることが確認された。これに対し、コントロールおよびパルス回数が１０００回のものは、ほとんど蛍光が認められず、遺伝子が導入されていないことが確認された。図５および図６の結果から、パルス回数を適切に調節すれば、５０ｋＨｚで、３００乃至６００Ｖ程度の振幅の低いパルス電圧を印加することにより、細胞２３を死なせることなく、細胞２３に遺伝子や薬剤を導入できるといえる。
【００３１】
体内用プラズマ発生装置１０は、ヘリウムガス等のプラズマ原料を使用しないため、液体の存在する生体内でも使用することができる。このため、例えば図７に示すように、内視鏡３０に内蔵して、腸などの体内に挿入して使用することができる。図７に示す例では、内視鏡３０の一つのチャンネルに体内用プラズマ発生装置１０が内蔵され、他のチャンネルに、針状電極１２の尖端１２ｃの近傍に遺伝子を供給する供給手段が内蔵されている。例えば、がん治療などを行う場合、内視鏡３０をがん細胞などの治療部位に接近させ、供給手段により、針状電極１２の尖端１２ｃの近傍に遺伝子や抗がん剤などを供給し、体内用プラズマ発生装置１０により、筒状電極１１と針状電極１２の尖端１２ｃとの間で極微小のプラズマを発生させて、がん細胞などに照射する。これにより、がん細胞などに直接、その遺伝子や抗がん剤などを導入することができ、がん治療などを効果的に行うことができる。
【００３２】
体内用プラズマ発生装置１０は、比較的低い電圧を印加することで、局所的に極微小のプラズマを発生させることができるため、生体内でも、生体にほとんどダメージを与えることなく使用することができ、低侵襲である。また、極微小のプラズマを利用することにより、プラズマを照射する細胞へのダメージを小さくすることができ、細胞の生存率を高めることができる。
【００３３】
体内用プラズマ発生装置１０は、局所的にプラズマを発生させて遺伝子や薬剤の導入を行うことができるため、高効率で遺伝子や薬剤を細胞に導入することができる。また、遺伝子や薬剤の種類によらず、導入することができる。このため、遺伝子治療の効果を高めることができる。また、ｉＰＳ細胞作成時の遺伝子導入に使用することもでき、作成効率を高めることができる。
【００３４】
なお、体内用プラズマ発生装置１０で、針状電極１２は、その尖端１２ｃが筒状電極１１の内側に配置されていてもよい。この場合、針状電極１２が細胞に接触して細胞を傷つけるのを防ぐことができる。
【符号の説明】
【００３５】
１０  体内用プラズマ発生装置
１１  筒状電極
１２  針状電極
１２ａ  連結部
１２ｂ  先端部
１２ｃ  尖端
１３  電源部
２１  収納容器
２２  遺伝子分散溶液
２３  細胞
３０  内視鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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