(57)【要約】【課題】感染防御能が高く、免疫賦活効果の長い結核ワクチンを提供することを目的とする。【解決手段】ウレアーゼ欠損ＢＣＧを宿主にして、ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を発現するプラスミドを遺伝子導入して、新たに組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）を作製した。本発明の組換えＢＣＧは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験やｉｎ  ｖｉｖｏの結核菌の暴露試験において、これまでのＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株や公知の組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＤＨＴＭ等）と比較して、作用効果が優れており、感染防御能が高く、免疫賦活効果の長い結核ワクチンになることが示された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子が、ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子のＮ側とＣ側に融合していることを特徴とする、蛋白発現プラスミド。
【請求項２】
上記プラスミドのプロモーターがＨＳＰ６０プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の蛋白発現プラスミド。
【請求項３】
上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、請求項１又は２に記載の蛋白発現プラスミド。
【請求項４】
上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、請求項１又は２に記載の蛋白発現プラスミド。
【請求項５】
更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白発現プラスミド。
【請求項６】
ウレアーゼ欠損ＢＣＧに、請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することで得られる組換えＢＣＧ。
【請求項７】
ウレアーゼ欠損が、ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトすることである、請求項６に記載の組換えＢＣＧ。
【請求項８】
ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌が、カナマイシン及びハイグロマイシン感受性である、請求項６又は７に記載の組換えＢＣＧ。
【請求項９】
ファゴ-ライソゾームの中でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌する、請求項６〜８のいずれかに記載の組換えＢＣＧ。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の組換えＢＣＧを用いることを特徴とする、結核ワクチン。
【請求項１１】
ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトしたウレアーゼ欠損ＢＣＧに、以下の蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することを特徴とする、組換えＢＣＧの製造方法；
a）ＨＳＰ６０プロモーターの下流に、
b）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子の両端（Ｎ末側とＣ末側）に、ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子を結合した融合遺伝子（ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ）が挿入されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なリコンビナントＢＣＧ菌とそれを用いた結核ワクチンに関するものである。特に、結核菌のＭＭＰ−ＩＩとＰＥＳＴ配列が導入されたリコンビナントＢＣＧ菌とそのワクチン用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の１／３が感染し、毎年８８０万人が新たに発症し、１００万人が死亡する結核は、２０世紀最大の恐怖を与えた細菌感染症であり、エイズ・マラリアとともにＷＨＯにより世界３大感染症として数えられている。さらに、多剤耐性結核菌の出現・拡散は地球規模の恐怖となっており、世界の如何なる国もこの恐怖から逃れられないと考えられている。これまでＷＨＯが中心となって、より効果の高い次世代結核ワクチンの開発を進めてきた。しかし、現在結核の発症を的確に予防できるワクチンは存在せず、新しい結核ワクチンの開発は世界的に切望されている。
何故なら、従来のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ菌（以下ＢＣＧと略す）は、成人あるいは高齢者の肺結核の発症を的確に予防し得ないものであった。即ち、従来のＢＣＧでは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する力が弱く、インターフェロンガンマの産生を十分誘導し得るものではなかった。
【０００３】
ＢＣＧが有効に作用しない最大の理由は、ＢＣＧには固有の欠点、即ち抗原提示細胞（ＡＰＣ）に感染した際にファゴゾーム中に局在し、ファゴゾームとライソゾームとの融合を阻止し免疫応答を抑制することに起因している。そこで、この問題を解決するためにＢＣＧに対して色々な改良が加えられてきた（特許文献１〜３、非特許文献１〜４）。
ＢＣＧはウレアーゼを保有するため、尿素からアンモニアを産生し、ファゴゾームのｐＨをアルカリ側に傾けることで、ファゴゾームの酸性化を抑制し、ライソゾームとの融合を阻止している。そこで、ＢＣＧからウレアーゼをコードするＵｒｅＣ遺伝子を除去した組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を作製すると、この組換えＢＣＧは容易にファゴ−ライソゾームを形成した。その結果、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を強く活性化することが報告されている（非特許文献1）。
【０００４】
また、抗原提示細胞やＴ細胞を活性化するためには、ＢＣＧの中で病原性抗酸菌の主要な表面抗原を分泌させることが重要であることが見出され、そこで、らい菌のＭＭＰ−ＩＩ（Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を分泌でき、更にウレアーゼが欠損した組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−Ｄ７０Ｍ）を作製した。この組換えＢＣＧは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化し、インターフェロンγの産生を誘導した (非特許文献２)。  
そこで、結核菌に対する免疫効果を高めるために、結核菌のＭＭＰ−ＩＩを発現できるウレアーゼ欠損型の組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＤＨＴＭ）が作製された（非特許文献３）。この組換えＢＣＧは、メモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を効果的に産生することが報告されている。
【０００５】
更に効果を高めるために、結核菌の活動期に強く発現する遺伝子であるＣｙｓＯをＭＭＰ−ＩＩに融合させた組換えＢＣＧ（ＢＣＧ-ｄＨＣＭ）が作製された（非特許文献４）。この組換えＢＣＧは、未感作Ｔ細胞の多クローン性活性化を惹起することが報告されている。
しかし、結核菌の噴霧感染試験においては、まだ十分なものではなく、ヒトに対する結核ワクチンとしては更なる効果のあるものが求められている状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１２１９５９号
【特許文献２】特表２００８−５４３８９０号
【特許文献３】特表２００７−５２４３６７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｕｋａｉ  ｔ．  ｅｔ  ａｌ：  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３：  ９６−１０６  （２００８）
【非特許文献２】Ｍｕｋａｉ  ｔ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５：  ６２４３−６２４３  （２０１０）
【非特許文献３】Ｍｕｋａｉ  ｔ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：  １−１１  （２０１４）
【非特許文献４】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ：  ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １４：  １７９−１９０  （２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、結核ワクチンとして実用可能な高い効果を有する組換えＢＣＧの作製を目的とする。特に、本発明の結核ワクチンでは、ヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を強く活性化し、インターフェロンγの産生を十分誘導すると共に、生体内でメモリーＴ細胞を効率的に産生することによって、生体内での結核菌の肺内増殖を強く抑制することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、これまでの知見（非特許文献１〜４）に基づき、新たな組換えＢＣＧの作製を検討した。その際の指標として、組換えＢＣＧがヒト末梢血未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいは未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を強く活性化してインターフェロンγを産生し、かつＣ５７ＢＬ／６マウス生体内でメモリーＴ細胞を効率的に産生し、その結果として空気感染させた各種結核菌の肺内増殖を抑制することを目指した。
そこで、これまでの知見から、抗原提示細胞やＴ細胞を活性化するためには、ＢＣＧの中で結核菌のＭＭＰ−ＩＩを分泌させることが重要であるので、分泌されたＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白の分解を加速させることを検討した。そのために、蛋白の不安定化配列として知られているＰＥＳＴ配列（蛋白質分解シグナルとして作用するＰ；プロリン、Ｅ；グルタミン酸、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニンを多く含む配列、本発明ではＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列）を用いて、上記融合蛋白のN側とC側に更に融合した蛋白を分泌できるようにした。この目的のために即ち、ウレアーゼ欠損型ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を宿主ＢＣＧとして用い、ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合遺伝子をＨＳＰ６０プロモーターの制御のもとに導入して組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）を作製した。
【００１０】
本発明の組換えＢＣＧの機能、効果を評価すると、次のことが見出された。
ａ）組換えＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）が樹状細胞に感染しファゴゾームを形成した際、アンモニアが産生されないためファゴゾームが酸性となり、容易にライソゾームと融合してファゴ‐ライソゾームを形成する。更に、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはファゴ‐ライソゾームの中でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌する。
ｂ）ファゴ‐ライソゾームの中で分泌された融合蛋白のうち一部はライソゾーム由来の酵素によって分解され、またＰＥＳＴ配列の作用により分解を促進されＴ細胞を刺激する際に必要なエピトープとなる。一方、ライソゾームの酵素によって分解されなかった蛋白は融合蛋白のＰＥＳＴ配列の作用によってファゴ-ライソゾームから細胞質へ放出され、やがてプロテアゾームへ取り込まれ、プロテアゾーム内の酵素によって分解されエピトープを作る。
ｃ）そのため、ＢＣＧ−ＰＥＳＴから分泌された融合蛋白はファゴ-ライソゾームおよびプロテアゾームの両者で分解され多種類のエピトープを産生し、強力にヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞および未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化しインターフェロンγを産生するとともに、Ｃ５７ＢＬ／６マウス生体内でメモリータイプＴ細胞を効率的に産生し、その結果として空気感染した結核菌の肺内増殖を抑制する効果を発揮する。
本発明者らは、以上の知見により本発明を完成した。
【００１１】
本願発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子のＮ末端とＣ末端に、４つのアミノ酸（P：プロリン、E：グルタミン酸、S：セリン、T：スレオニン）の直列連結ペプチドＰＥＳＴをコードする遺伝子を結合させた融合遺伝子を含有する蛋白発現プラスミドで、
ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトしたウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌を形質転換して得られる組換えＢＣＧ菌。
（２）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（１）記載の組換えＢＣＧ菌。
（３）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（１）又は（２）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（４）上記プラスミドのプロモーターがＨＳＰ６０プロモーターであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（５）上記ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来のものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（６）更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（７）ＰＥＡＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白が分泌されることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（８）融合蛋白の分泌がファゴ‐ライソゾームの中であることを特徴とする、上記（７）に記載の組換えＢＣＧ菌。
【００１２】
（９）ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子が、
ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子のＮ側とＣ側に融合していることを特徴とする、蛋白発現プラスミド。
（１０）上記プラスミドのプロモーターがＨＳＰ６０プロモーターであることを特徴とする、上記（９）に記載の蛋白発現プラスミド。
（１１）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（９）又は（１０）に記載の蛋白発現プラスミド。
（１２）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の蛋白発現プラスミド。
（１３）更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、（９）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白発現プラスミド。
【００１３】
（１４）ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌に、上記（９）〜（１３）のいずれかを満たす一つの蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することで得られる組換えＢＣＧ菌。
（１５）ウレアーゼ欠損は、ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトすることである、上記（１４）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（１６）ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌は、カナマイシン及びハイグロマイシン感受性である、上記（１４）又は（１５）に記載の組換えＢＣＧ菌。
（１７）ファゴ-ライソゾームの中でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌する、上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の組換えＢＣＧ菌。
（１８）上記（１４）〜（１７）のいずれか一つの組換えＢＣＧ菌を用いることを特徴とする、結核ワクチン。
（１９）上記組換えＢＣＧ菌を、リン酸バッファー生理食塩水に、１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬ含有する、上記（１８）に記載の結核ワクチン。
【００１４】
（２０）ＵｒｅＣ遺伝子をノックアウトしたウレアーゼ欠損ＢＣＧに、以下の蛋白発現プラスミドを遺伝子導入することを特徴とする、組換えＢＣＧの製造方法；
a）ＨＳＰ６０プロモーターの下流に、
b）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合蛋白をコードする遺伝子の両端（Ｎ末側とＣ末側）に、ＰＥＳＴ配列をコードする遺伝子を結合した融合遺伝子（ＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ）が挿入されている。
（２１）上記ＨＳＰ７０蛋白をコードする遺伝子が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来である、上記（２０）記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２２）上記ＭＭＰ−ＩＩ蛋白をコードする遺伝子が、結核菌Ｈ３７Ｒｖである、上記（２０）又は（２１）に記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２３）上記蛋白発現プラスミドは、更に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載の組換えＢＣＧの製造方法。
（２４）上記ウレアーゼ欠損ＢＣＧ菌が、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株由来のものである、上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載の組換えＢＣＧの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組換えＢＣＧ菌は、従来のＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株に比し結核菌の肺内増殖を強く抑制し、結核の発症を予防できることが分かった。更に、公知の組換えＢＣＧ菌であるＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも有効に結核菌（Ｈ３７Ｒｖ株）の増殖を抑制することを示した。
また、本発明の組換えＢＣＧ菌は、ワクチン接種後６ヶ月においても、結核菌の増殖を抑制できることから、本発明の組換えＢＣＧ菌のワクチン効果は、長期持続することが分かった。
本発明の組換えＢＣＧ菌が、公知のものより効果が強く、長期の効果持続性を有するものであることから、本発明の組換えＢＣＧ菌を用いて、結核の発症を予防できる抗結核組換えＢＣＧワクチンが提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２種類のコントロールＢＣＧ；ベクターコントロールＢＣＧ（ＢＣＧ−２６１Ｈ）とＢＣＧ−ＤＨＴＭおよびＢＣＧ−ＰＥＳＴが分泌した蛋白のウェスタンブロット解析の結果を示した図である。なお、コントロールリコンビナントＢＣＧは、次のものである。１）実質遺伝子を欠きベクターのみを導入したＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株（ベクターコントロール：ＢＣＧ−２６１Ｈ）、２）ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ融合遺伝子をウレアーゼ欠損ＢＣＧに導入して作製したＢＣＧ−ＤＨＴＭ。
【図２】（ａ）は、各種リコンビナントＢＣＧ（上記３種）のヒト末梢単球由来樹状細胞からのサイトカイン産生誘導能の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、各種リコンビナントＢＣＧが樹状細胞に感染した際の細胞表面抗原の発現程度の解析の結果を示した図である。
【図３】各種リコンビナントＢＣＧのヒト末梢単球由来マクロファージからのサイトカイン産生誘導能の解析の結果を示した図である。
【図４】（ａ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴ感染樹状細胞のヒト末梢血未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩおよびＣＤ８６抗原依存的活性化の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴによるヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化に及ぼすクロロキニンとラクトシスティンの効果の解析の結果を示した図である。
【図５】ＢＣＧ−ＰＥＳＴ感染マクロファージによるヒトメモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化機構の解析の結果を示した図である。
【図６】（ａ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴ感染樹状細胞によるヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩおよびＣＤ８６抗原依存的活性化の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴによるヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化に及ぼすクロロキニン・ブレフェルティンＡおよびラクトシスティンの効果の解析の結果を示した図である。
【図７】（ａ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴをＣ５７ＢＬ／６マウスに６週間感染させた際のメモリータイプＴ細胞の産生能の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴをＣ５７ＢＬ／６マウスに１２週間感染させた際のメモリータイプT細胞の産生能の解析の結果を示した図である。
【図８】（ａ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴの結核菌Ｈ３７Ｒｖ株の肺内増殖抑制の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴの臨床分離結核菌北京株の肺内増殖の抑制の解析の結果を示した図である。（ｃ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴとＢＣＧ−ＤＨＴＭのワクチン効果の比較検討の結果を示した図である。
【図９】（ａ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴ皮下接種３ヶ月後のワクチン効果（肺内での結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖抑制）の解析の結果を示した図である。（ｂ）は、ＢＣＧ−ＰＥＳＴ皮下接種６ヶ月後のワクチン効果（肺内での結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖抑制）の解析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「ＰＥＳＴ」とは、Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列(４つのアミノ酸Ｐ：プロリン、Ｅ：グルタミン酸、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニンを多く含む配列)のことを言う。
本発明の「ＨＳＰ７０」とは、７０ｋＤの分子量を持ち、シャペロン効果を有するｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）７０のことである。ＨＳＰ７０は、タンパク質のフォールディングに関与し、熱に対する耐性を形成させる。タンパク質のミトコンドリアや葉緑体などへの翻訳後輸送に関与している蛋白である。抗酸菌には、それぞれ対応するＨＳＰ７０が存在し、好ましいものとしては、ＢＣＧ-Ｔｏｋｙｏ株由来のＨＳＰ７０を挙げることができる。
本発明の「ＭＭＰ−ＩＩ」とは、細胞膜に主に存在する膜タンパクＭａｊｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＭＰ）−ＩＩのことを言う。ＭＭＰ−ＩＩは、トールライクリセプター（ＴＬＲ）２に結合する能力を有し、ＮＦ−κＢを活性化する。このため、ＭＭＰ−ＩＩをパルスした樹状細胞（ＤＣ）は抗原特異的に未感作及びメモリータイプＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する。ＭＭＰ−ＩＩとしては、各種のものを使用可能であるが、らい菌由来のＭＭＰ−ＩＩと結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩを挙げることができる。好ましくは結核菌（Ｈ３７Ｒｖ株）由来のＭＭＰ−ＩＩを挙げることができる。
【００１８】
本発明の「蛋白発現プラスミド」とは、抗酸菌の菌体内でプラスミドとして維持されるものであって、好ましくはｐＭＶ２６１に蛋白をコードする遺伝子が組み込まれたものを言う。遺伝子を組み込む位置としては、ｈｓｐ６０のプロモーター領域の下流に挿入する。更に、本発明では、菌体内でのプラスミドの安定性を維持するために、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されている。
本発明の「ｈｓｐ６０プロモーター」とは、６０ｋＤの熱ショック蛋白（ＨＳＰ）を発現させるプロモーターのことを言う。
本発明の「ウレアーゼ欠損ＢＣＧ」とは、ウレアーゼがノックアウトされたＢＣＧ菌のことを言う。ウレアーゼをノックアウトするために、ＵｒｅＣ遺伝子のノックアウトを行った。このために、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挟むようにＵｒｅＣ遺伝子の上流及び下流の塩基配列をプラスミドｐＹＵＢ８５４へ導入した。このプラスミドを導入した組換えファージを作製し、このファージとＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株とを反応させて、ウレアーゼ欠損ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１）を作製した。更に、ゲノムに組み込まれたハイグロマイシン耐性遺伝子を切り出し、親株と同じカナマイシン、ハイグロマイシン感受性のウレアーゼ欠損ＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を作製した。
【００１９】
本発明の「結核ワクチン」とは、結核に対して充分なワクチン効果を上げるために、本発明の組換えＢＣＧを有効量含有し、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、または他のビヒクルを必要に応じて含有する組成物である。本発明のワクチンは、公知の方法で作製することができ、通常、液状溶液又は懸濁溶液として調製される。担体としては、水、生理食塩水、デキストロース、ラフィノース等が挙げられ、ｐＨ緩衝剤、等張剤、界面活性剤等の助剤を必要に応じて添加することができる。
本発明のワクチンは、アジュバントを含むことができ、その適切な例は、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ）、クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）、アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）等を含むが、それらに限定されることはない。
本発明のワクチンにおける組換えＢＣＧの含量は、免疫応答を惹起するために、約１×１０３〜約１×１０６菌／１回の範囲にあり、最も好適には約１×１０４〜約１×１０５菌／１回の範囲を挙げることができる。また、本発明のワクチンは、適切な手段で投与することができ、それらには、注射、経口投与、鼻腔投与等が含まれるがそれらに限定されない。好適な態様においては、皮内、皮下または筋肉内への注射が望ましい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２１】
実施例１：新規なリコンビナントＢＣＧ菌（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）の作製
（１）ウレアーゼをコードするＵｒｅＣ遺伝子を欠損するリコンビナントＢＣＧ（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）の作製：
公知方法（Med. Microbiol.  ５３：９６−１０６）に基づき、ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株より作製した。まず、抗酸菌に感染するファージの中で温度感受性変異株を使用し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挟むようにＵｒｅＣ遺伝子の上流及び下流の塩基配列をプラスミドｐＹＵＢ８５４へ導入した。更に、迅速発育抗酸菌Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓを用いて、ＵｒｅＣ破壊用ファージの調整を行った。
上記組換えファージをＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株に感染させ、ハイグロマイシンを含む平面培地に撒き３０℃で培養を行った。約３週間後、形成されたコロニーを培養し、ウレアーゼ試験が陰性であることを確認した。このようにして、ＵｒｅＣ遺伝子欠損の組換えＢＣＧ株（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１）を得た。
更に、ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１に含有されるハグロマイシン遺伝子カセットを削除するため、γδリゾルバーゼ（γδｔｎｐＲ）をコードするｐＹＵＢ８７０を使用して削除した。そして、親株と同じカナマイシン、ハイグロマシン感受性のＢＣＧ株（ＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３）を選択した。
【００２２】
（２）２種類のコントロールＢＣＧ（ベクターコントロールＢＣＧ（ＢＣＧ−２６１Ｈ）とＢＣＧ−ＤＨＴＭ）の作製：
公知方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２１（１）、  １−１１（２０１４））に準じて作製した。ＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株と結核菌Ｈ３７Ｒｖ株からゲノムＤＮＡを得た。ＢＣＧ由来のｈｓｐ７０遺伝子を増幅するため、オリゴヌクレオチドのプライマーとして、Ｆ−Ｍｂ７０Ｂａｌ（５‘−ａａａＴＧＧＣＣＡｔｇｇｃｔｃｇｔｇｃｇｇｔｃｇｇｇ−３’）とＲ−Ｍｂ７０Ｅｃｏ（５‘−ａａａＧＡＡＴＴＣｃｔｔｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｃｇ−３’）を使用した。結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩの遺伝子を増幅するため、プライマーとして、Ｆ−ＭＭＰＴＢＥｃｏ（５‘−ａａｔｔＧＡＡＴＴＣａｔｇｃａａｇｇｔｇａｔｃｃｃｇａｔｇｔ−３’）とＲ−ＭＭＰＴＢＳａｌ（５‘−ａａｔｔＧＴＣＧＡＣｔｃａｇｇｔｃｇｇｔｇｇｇｃｇａｇａ−３’）を使用した。なお、プライマーの大文字部分は、制限酵素での切断面を表す。増幅されたものは、適切な制限酵素で切断され、ｐＭＶ２６１プラスミドに導入された。ハイグロマシン抵抗性の遺伝子カセットをカナマイシン抵抗性の遺伝子と置換するため、ｐＹＵＢ８５４プラスミドのＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を、ｐＭＶ２６１プラスミドのＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片に挿入した。
ＢＣＧのｈｓｐ７０と結核菌のＭＭＰ−ＩＩの融合蛋白を発現するベクターをエレクトロポレーションによってＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３に導入した。ｐＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩを核外プラスミドとして含有するＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３をＢＣＧ−ＤＨＴＭと名付けた。ｐＭＶ−２６１−ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを含有するＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株をＢＣＧ−２６１Ｈ（ＢＣＧベクターコントロール）と名付けた。これらの組換えＢＣＧは、１０８ＣＦＵ／ｍＬ、−８０℃で保存された。なお、これら組換えＢＣＧの間で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養に関して大きな相違は見られなかった。
【００２３】
（３）結核菌のＭＭＰ−ＩＩとＰＥＳＴ配列を含有し、ＵｒｅＣ遺伝子を欠損するリコンビナントＢＣＧ（ＢＣＧ−ＰＥＳＴ）の作製：
ＨＳＰ６０プロモーター制御の下、ＢＣＧ由来のＨＳＰ７０遺伝子と結核菌由来ＭＭＰ−ＩＩ遺伝子を連結し、そのＮ側とＣ側にＰＥＳＴ配列（Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ｈｌｙ遺伝子に存在するＰＥＳＴ配列）を融合し、細胞内でＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴ融合蛋白を分泌させるためのリコンビナントＢＣＧを次のように作製した。
まず、公知方法（ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０１４、  １４：１７９）に準じて作製した。ＢＣＧ由来のｈｓｐ７０遺伝子と結核菌由来のＭＭＰ−ＩＩの遺伝子は、上記（２）の方法で取得した。ＰＥＳＴ配列は、エムエステクノシステムズ社に依頼し人工合成遺伝子として合成した。
ＰＥＳＴ配列遺伝子をＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ配列に組み込むために、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット（クローンテック研究所製）を使用した。カナマイシン抵抗性の遺伝子をハイグロマイシン抵抗性の遺伝子カセットに置換するために、ｐＹＵＢ８５４のＸｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を、ｐＭＶ２６１のＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片に挿入した。
ＰＥＳＴ−ＢＣＧＨＳＰ７０-結核ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴの融合蛋白を発現するベクターをエレクロトポレーションでＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３に導入した。ｐＰＥＳＴ−ＨＳＰ７０−ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴを核外プラスミドとして含有するＢＣＧ−ΔＵＴ−１１−３をＢＣＧ−ＰＥＳＴと名付けた。この組換えＢＣＧは、１０８ＣＦＵ／ｍＬ、−８０℃で保存された。
なお、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは、菌体培養液中にＰＥＳＴ−ＢＣＧｈｓｐ７０-結核ＭＭＰ−ＩＩ−ＰＥＳＴの融合蛋白を分泌することを、ウェスタンブロット法を用いて確認した。
【００２４】
試験例１：ＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用効果の評価
（１）樹状細胞（ＤＣ）を用いたＢＣＧ−ＰＥＳＴの効果：
ＢＣＧ−ＰＥＳＴを感染させたＤＣとマクロファージによるＴ細胞の増殖能が、自家のＡＰＣ−Ｔ細胞を用いて評価された（Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０：５１６７−５１７６（２００２））。
ＣＤ４陽性とＣＤ８陽性のＴ細胞の精製は、ネガテイブ単離キット（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ４５０）を使用して行なった。ナイーブなＣＤ４陽性とＣＤ８陽性Ｔ細胞は、これらのＴ細胞をＣＤ４５ＲＯに対する抗体で更に処理し、次いで、ヒツジの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で被覆したビーズで処理することによって得られる。９８％以上のＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞は、ＣＣＲ７分子の発現が陽性になっている。メモリーＴ細胞は、細胞をＣＤ４５ＲＡ抗原に対する抗体で同様に処理をすることによって得られる。精製されたナイーブあるいはメモリータイプＴ細胞（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）が９６穴の丸底細胞培養皿に入れられた。そして組換えＢＣＧで感作させたＤＣとマクロファージを添加すると、ＡＰＣ／Ｔ細胞の比が出ることになる。ＡＰＣとＴ細胞の共培養の上澄みを４日間集めて、サイトカインの濃度レベルを測定した。
ある場合には、組換えＢＣＧを感染させたＤＣとマクロファージを更にＨＬＡ−ＡＢＣに対する抗体（Ｗ６／３２、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ）や、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｌ２４３、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ）又はＣＤ８６に対する抗体（ＩＴ２．２、マウスＩｇＧ２ｂ、カッパ；ＢＤバイオサイエンス製）又は通常のマウスＩｇＧで処理する。
【００２５】
（２）ＢＣＧ−ＰＥＳＴに関するサイトカインの産生能の評価：
次のサイトカインの産生能が測定された。ＣＤ４陽性とＣＤ８陽性のＴ細胞から産生されるインターフェロンガンマ、インターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、及び組換えＢＣＧを２４時間又は４８時間感染させたＤＣ又はマクロファージから産出されるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１βである。これらサイトカインの濃度は、酵素アッセイキット（Ｏｐｔ  ＥＩＡ  ＥＬＩＳＡキット：ＢＤバイオサイエンス製）を用いて定量された。
【００２６】
（３）ＢＣＧ−ＰＥＳＴに関する動物感染防御試験の評価：
生きている菌の濃度を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天プレートに植えることで決定した。1グループ３匹の５週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１×１０３又は１×１０４の組換えＢＣＧを含有するリン酸バッファー食塩水又はリン酸バッファーの０．１ｍＬを皮下接種した。マウスは特定の病原体のいない条件で飼育され、滅菌した食料と水を供給した。接種後４週間後又は１２週間後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を２×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように培地に分散させる。脾臓細胞は、９６穴の丸底マイクロプレートの中で、組換えＭＭＰ−ＩＩ蛋白、組換えＨＳＰ７０又はＨ３７Ｒｖ由来の細胞蛋白質の指定された濃度で刺激を行った。刺激後の３〜４日の個々の培養上清を集めた。
結核感染に関するＢＣＧワクチンの効果を観察するために、１グループ５匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭ、ＢＣＧ−ＰＥＳＴを、それぞれ１×１０４又は１×１０５ＣＦＵ／マウスを用いて接種した。６週間後、結核菌Ｈ３７Ｒｖ株を用いて、自動吸入暴露装置（０９９ｃ  Ａ４２１２型、グラス−コール社製）でのエアロゾル感染を行った。６週間後、肺と脾臓での細菌負荷を、ＰＢＳ溶液中で組織破砕し、コロニーアッセイによって計算した。動物実験は、国立感染研究所の実験動物に関する動物研究委員会によってチェックされ、承認を得て、ガイドラインに従って実施されている。
【００２７】
（４）ＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用および効果のまとめ：
図１〜図９に基づいてＢＣＧ−ＰＥＳＴの作用と効果を次に説明する。
図1においては、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭおよびＢＣＧ−ＰＥＳＴを試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養した際得られた培養上清をＨＳＰ７０あるいはＭＭＰ−ＩＩに対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは両抗体と反応する９０ｋＤａの蛋白を分泌していることが判明した。
図２においては、ＢＣＧ−２６１Ｈ、ＢＣＧ−ＤＨＴＭあるいはＢＣＧ−ＰＥＳＴで、ヒト末梢血単球由来（ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて産生する）樹状細胞を刺激すると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強くＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βを産生した。また、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強く樹状細胞表面のＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３抗原の発現を増強させた。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは強く樹状細胞を活性化し得ることが判明した。
図３においては、各種ＢＣＧ（上記３種）を用いヒト末梢単球よりＭ−ＣＳＦを用いて分化誘導したマクロファージを刺激すると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴが最も強くＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦを産生した。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴは強くマクロファージを活性化し得ることが判明した。
【００２８】
図４においては、上記の各種ＢＣＧのヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強く未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導した。その活性化は樹状細胞をＨＬＡ−ＤＲあるいはＣＤ８６抗原に対するモノクローナル抗体で処理した場合や樹状細胞をクロロキニンやラクトシスティンで処理した場合阻害された。以上より、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはヒト未感作ＣＤ４陽性Ｔ細胞を強く活性化する能力を有し、その活性化は抗原特異的であり、かつファゴゾームの成熟化（ファゴ-ライソゾームの形成）やプロテアゾームでの蛋白分解に依存していることが判明した。
図５においては、上記の各種ＢＣＧのマクロファージを介したメモリータイプＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強くＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導し、その活性化はＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６抗原に依存した抗原特異的反応であり、またマクロファージを予めクロロキニンで処理することにより阻害されることから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化はファゴゾームの成熟化に依存していることが判明した。
【００２９】
図６においては、上記の各種ＢＣＧの樹状細胞を介したヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化能および活性化機構を解析した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは最も強くヒト未感作ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化してインターフェロンガンマの産生を誘導した。その活性化はＨＬＡ−ＡＢＣおよびＣＤ８６抗原依存性であり抗原特異的であった。さらに、樹状細胞を予めクロロキニン、ブレフェルディンＡあるいはラクトシスティンで処理することで阻害されたことから、本活性化にはファゴゾームの成熟化および樹状細胞内のクロスプレゼンテーション回路の活性化が強く関与していることが判明した。
図７においては、上記ＢＣＧによるＣ５７ＢＬ／６マウス生体内でのメモリーＴ細胞産生能を解析した。図に示すＢＣＧをマウスに皮下接種し６週間後（図７（ａ））あるいは１２週間後（図７（ｂ））にマウス脾Ｔ細胞を調整し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＭＰ−ＩＩ、ＨＳＰ７０あるいは結核菌Ｈ３７Ｒｖ由来の細胞質蛋白あるいは膜蛋白で再刺激を加えると、ＢＣＧ−ＰＥＳＴを感染させたマウスから得たＴ細胞が上記再刺激蛋白に最も強く反応してインターフェロンガンマを産生した。ＢＣＧ−ＰＥＳＴは効率的にメモリーＴ細胞を産生し、かつ産生期間は長いことが判明した。
【００３０】
図８においては、ＢＣＧ−ＰＥＳＴの抗結核ワクチン効果を検討した。図に示す量のＢＣＧをＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種し、６週間後に図に示す結核菌を空気感染させ、その４週間後に肺を取り出し、肺内に存在する結核菌の数をコロニーアッセイで産出したものである。図８（ａ）では、ＢＣＧ−ＰＥＳＴはＢＣＧ−２６１Ｈに比し結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖を抑制することを示し、図８（ｂ）ではＢＣＧ−ＰＥＳＴは臨床分離株である北京株の増殖を抑制することを示し、図８（ｃ）ではＢＣＧ−ＰＥＳＴはＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも有効に結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖を抑制することを示した。
図９においては、ＢＣＧ−ＰＥＳＴのワクチン効果が長期持続するか解析した。ワクチン接種３ケ月後には、ＢＣＧ−２６１ＨもＢＣＧ−ＰＥＳＴも結核菌Ｈ３７Ｒｖの肺内増殖を抑制し得るものの、その効果はＢＣＧ−ＰＥＳＴの方が強いことを示している（図９（ａ））。しかし、ワクチン接種後６ヶ月に達するとＢＣＧ−２６１Ｈのワクチン効果は認められず、ＢＣＧ−ＰＥＳＴのみが結核菌の増殖を抑制することを示している。ＢＣＧ−ＰＥＳＴのワクチン効果は長期持続することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の組換えＢＣＧ（特にＢＣＧ−ＰＥＳＴ）は、公知のＢＣＧ−Ｔｏｋｙｏ株やＢＣＧ−ＤＨＴＭよりも、感染防御能が高く、免疫賦活効果の長い結核ワクチンになることが分かった。それ故本発明の組換えＢＣＧを用いて、結核の発症を予防できる有効な抗結核組換えＢＣＧワクチンが提供できるようになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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