(57)【要約】      （修正有）【課題】光検出器の高温化を防ぐとともに、装置本体部の小型化を図ったレーザ走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】レーザ光を走査させるスキャナ３３と、スキャナ３３により走査されたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓからの蛍光を集光する対物レンズ２３と、対物レンズ２３により集光された蛍光を対物レンズ２３とスキャナ３３との間においてレーザ光の光路から分岐する励起ダイクロイックミラー４１と、励起ダイクロイックミラー４１により分岐された蛍光を導光するリキッドライトガイド７と、リキッドライトガイド７により導光された蛍光を検出するＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂとを備え、標本Ｓを収容するとともに内部の温度および湿度を維持可能な培養空間１０と、対物レンズ２３を収容する光学空間２０とが互いに隣接して配置され、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂを収容する光検出空間５０が、培養空間１０および光学空間２０から離間して配置されている。【選択図】図１
2016071160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を２次元的に走査させる走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、該標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記標本からの光を該対物レンズと前記走査部との間において前記レーザ光の光路から分岐する観察光分岐部と、
該観察光分岐部により分岐された光を導光する観察光導光ファイバと、
該観察光導光ファイバにより導光された光を検出する観察光検出部とを備え、
前記標本を収容するとともに内部の温度および湿度を維持可能な培養空間と、前記対物レンズを収容する光学空間とが互いに隣接して配置され、
前記観察光検出部を収容する光検出空間が、前記培養空間および前記光学空間から離間して配置されているレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記対物レンズを挿入可能な貫通孔を有し、前記培養空間と前記光学空間とを隔てる隔壁部と、
該隔壁部の前記貫通孔に挿入された前記対物レンズの光軸方向の移動を許容しつつ、該対物レンズと前記隔壁部との隙間を閉塞可能なシール部とを備え、
前記対物レンズの一部が前記貫通孔を介して前記培養空間に挿入されている請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
該光検出空間を囲い、該光検出空間の外部から内部への光を遮断する遮光壁を備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記光学空間に、該光学空間内を前記培養空間内の温度とほぼ同等に恒温化する恒温化部を有する請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
光源と、
該光源から発せられた前記レーザ光を前記走査部に導光するレーザ光導光ファイバとを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記観察光分岐部が前記対物レンズに隣接して配置されている請求項１から請求項５のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記光検出空間に、該光検出空間内の温度を冷却する冷却部を有する請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記観察光導光ファイバがリキッドライトガイドである請求項１から請求項７のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記標本を透過したレーザ光および該レーザ光と同方向に前記標本から発せられる蛍光を導光する透過側光ファイバと、
該透過側光ファイバにより導光された前記レーザ光と前記蛍光とを分岐させる透過側分岐部と、
該透過側分岐部において分岐されたレーザ光を検出する透過側レーザ光検出部と、
前記透過側分岐部において分岐された蛍光を検出する透過側蛍光検出部とを備える請求項１から請求項８のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記レーザ光が、前記標本に多光子吸収される特性および前記標本から高調波を発生させる特性の少なくとも一方を有する求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、特定の温度・湿度下で標本を収容する培養空間と、培養空間内の標本を観察するための対物レンズや光検出器等の光学系が配置された光学空間とを備えるレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１０２９７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡は、光学空間内に光検出器が１個設置されているが、多数の光検出器により異なる波長を同時に検出しようとしたり、異なる特性の光検出器を複数採用しようとしたりする場合は、光検出器を含む周辺の構成ユニットが大型化してしまう。また、標本において発生した蛍光を光検出器に損失なく取り込もうとすると、光検出器に蛍光を導光するレンズやバリアフィルタ、分光ダイクロイックミラーなどの光検出光学系も大型化する傾向がある。
【０００５】
また、培養空間は、φ３５ディッシュが数個とマイクロプレートが１個配される程度であり、机上面への投影面積をそれほど大きくする必要がないが、光学空間の大型化の影響で培養空間を含む装置全体が大型化することが危惧される。さらに、光学空間には、対物レンズを光軸に沿って移動させるフオーカス機構や、標本を対物レンズの光軸に交差する方向に移動させるステージ駆動機構などが配置されており、これらの機構がかなりの空間を占有する。
したがって、従来のレーザ走査型顕微鏡では、装置本体部の小型化を図るとともに、光検出器を光学空間から熱的に分離することが困難という問題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光検出器の高温化を防ぐとともに、装置本体部の小型化を図るレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を２次元的に走査させる走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を標本に照射する一方、該標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記標本からの光を該対物レンズと前記走査部との間において前記レーザ光の光路から分岐する観察光分岐部と、該観察光分岐部により分岐された光を導光する観察光導光ファイバと、該観察光導光ファイバにより導光された光を検出する観察光検出部とを備え、前記標本を収容するとともに内部の温度および湿度を維持可能な培養空間と、前記対物レンズを収容する光学空間とが互いに隣接して配置され、前記観察光検出部を収容する光検出空間が、前記培養空間および前記光学空間から離間して配置されているレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、培養空間内が特定の温度および湿度に維持されることで、標本が長時間にわたり健全な状態に保たれる。この標本に対してレーザ光が走査部により走査されて対物レンズにより照射され、標本からの光が対物レンズにより集光されて観察光分岐部によりレーザ光の光路から分岐された後、観察光導光ファイバにより導光されて走査部を介さずに観察光検出部により検出されることで、健全な状態の標本を２光子励起観察することができる。
【０００９】
この場合において、光学空間および培養空間から光検出空間が離間して配置されることで、観察光検出部を光学空間および培養空間から熱的に分離して高温になるのを防止し、暗電流ノイズを抑制することができる。また、光学空間内に観察光検出部を収容する場合と比較して、光学空間を小型化することができる。
したがって、観察光検出部の高温化を防ぐとともに、装置本体部の小型化を図ることができる。
【００１０】
上記発明においては、前記対物レンズを挿入可能な貫通孔を有し、前記培養空間と前記光学空間とを隔てる隔壁部と、該隔壁部の前記貫通孔に挿入された前記対物レンズの光軸方向の移動を許容しつつ、該対物レンズと前記隔壁部との隙間を閉塞可能なシール部とを備え、前記対物レンズの一部が前記貫通孔を介して前記培養空間に挿入されていることとしてもよい。
このように構成することで、先端から標本までの距離が短い対物レンズを使用することができる。
【００１１】
上記発明においては、該光検出空間を囲い、該光検出空間の外部から内部への光を遮断する遮光壁を備えることとしてもよい。
このように構成することで、遮光壁により環境光が遮断されるので、観察光検出部において環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００１２】
上記発明においては、前記光学空間に、該光学空間内を前記培養空間内の温度とほぼ同等に恒温化する恒温化部を有することとしてもよい。
このように構成することで、恒温化部の作動により、光学空間内の光学系および機械系に培養空間の温度に基づく温度勾配が発生するのを防止することができる。これにより、光学系および機械系に歪みが発生するのを防ぎ、得られる画像の低輝度化および不鮮明化を効果的に防止することができる。
【００１３】
上記発明においては、光源と、該光源から発せられた前記レーザ光を前記走査部に導光するレーザ光導光ファイバとを備えることとしてもよい。
このように構成することで、光学空間内に光源を配置しなくて済む。したがって、光学空間内に光源を配置する場合と比較して、光学空間を小型化することができる。また、レーザ光導光ファイバを繋ぎ替えることで、光源を交換することができる。
【００１４】
上記発明においては、前記観察光分岐部が前記対物レンズに隣接して配置されていることとしてもよい。
このように構成することで、標本からの光を対物レンズから出射された直後に観察光分岐部により分岐することができる。対物レンズから出射された標本からの光は走査部によるレーザ光の走査に応じて光束の位置が変動するが、対物レンズから出射された直後の光は光束の位置の変動が比較的小さい。したがって、標本からの光を対物レンズから出射された直後に観察光分岐部により分岐するとともに、分岐した直後に観察光導光ファイバへ入射させれば、対物レンズの近傍にそれほど大きな空間を占有させる必要がない。これにより、対物レンズからの光の検出効率を維持しつつ、光学空間を狭くして光学空間の温度制御を容易にすることができる。
【００１５】
なお、対物レンズから出射された標本からの光を走査部に戻した後に検出すれば、対物レンズ近傍の空間を占有することはないが、標本から発せられた光が散乱し、その散乱光をも検出しようとすると、標本のより広い視野（標本面の光軸からより離れた範囲）からの光を検出する必要がある。この場合、レーザ光よりも大きな光線束を確保するために、結像レンズや瞳投影レンズ、走査部のミラーなど、検出光路全体が大型化してしまい、しいては顕微鏡本体が大型化して好ましくない。
【００１６】
上記発明においては、前記光検出空間に、該光検出空間内の温度を冷却する冷却部を有することとしてもよい。
このように構成することで、冷却部により観察光検出部を冷却して暗電流ノイズを低減することができる。これにより、Ｓ／Ｎ比を向上して標本を観察することができる。
【００１７】
上記発明においては、前記観察光導光ファイバがリキッドライトガイドであることとしてもよい。
このように構成することで、リキッドライトガイドはコア径が比較的大きいので、標本からの光を観察光導光ファイバに効率よく取り込むことができる。また、対物レンズの瞳径が大きい場合も、瞳から観察光導光ファイバに光を入射させるレンズの縮小倍率を大きくする必要がなく、対物レンズから観察光導光ファイバまでの距離も比較的短くすることができる。したがって、光学空間を小型化することができる。さらに、リキッドライトガイドはコア径が大きくても比較的容易に曲げることが可能なため、狭いスペースで観察光導光ファイバを引き回すことができる。
【００１８】
上記発明においては、前記標本を透過したレーザ光および該レーザ光と同方向に前記標本から発せられる蛍光を導光する透過側光ファイバと、該透過側光ファイバにより導光された前記レーザ光と前記蛍光とを分岐させる透過側分岐部と、該透過側分岐部において分岐されたレーザ光を検出する透過側レーザ光検出部と、前記透過側分岐部において分岐された蛍光を検出する透過側蛍光検出部とを備えることとしてもよい。
【００１９】
このように構成することで、標本を透過するレーザ光と標本から透過側に発せられる蛍光とが透過側光ファイバにより導光された後、透過側分岐部によりそれぞれが分岐されて透過側レーザ光検出部または透過側蛍光検出部により検出される。したがって、標本を透過するレーザ光により標本の輪郭などを観察すると同時に、このレーザ光とは異なる波長の蛍光により標本内の微小構造（例えば、細胞内のオルガネラ）などを観察することができる。また、観察光検出部により、透過側蛍光検出部と同一波長の蛍光を検出すれば、より明るい蛍光観察が可能になる。
【００２０】
上記発明においては、前記レーザ光が、前記標本に多光子吸収される特性および前記標本から高調波を発生させる特性の少なくとも一方を有することとしてもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、光検出器の高温化を防ぐとともに、装置本体部の小型化を図ることができるという効果を奏する。さらに、外部からの振動による画像劣化の影響を受けやすい顕微鏡本体のフットプリントを小さくすることができ、顕微鏡本体を積載する除振台も小型化することが可能になる。光源をファイバで顕微鏡本体に接続した場合は、光源自体が振動してもファイバから出射されるレーザ光の角度やパワーの変動は小さく、走査位置がずれたり、走査位置毎にレーザパワーが変動したりする心配が少ない。また、観察光検出部は、走査部で走査された、ある位置（点）での標本から発せられる光の強度を検出しているだけなので、多少の振動を受けても、光路の途中で光がけられなければよく、光線束の大きさに十分に余裕を持たせておけば、振動により光の強度が変化することは少ない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す概略構成図である。
【図２】本発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の透過側検出ユニットを示す概略構成図である。
【図３】本発明の第１，第２実施形態の変形例に係るレーザ走査型顕微鏡の対物レンズ周辺の構成の一例を示す図である。
【図４】本発明の第１，第２実施形態の変形例に係るレーザ走査型顕微鏡の対物レンズ周辺の構成の他の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００は、例えば、図１に示すように、レーザ光を発生するレーザ光源（光源）１と、レーザ光源１から発せられたレーザ光を導光する光ファイバ（レーザ光導光ファイバ）３と、光ファイバ３により導光されたレーザ光を標本Ｓに照射する顕微鏡本体５と、標本Ｓから発せられる蛍光（光）を導光するリキッドライトガイド（観察光導光ファイバ）７と、リキッドライトガイド７により導光された蛍光を検出する光検出ユニット９とを備えている。
【００２４】
レーザ光源１は、例えば、フェムト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光を射出するようになっている。このレーザ光源１は、図示しない温度制御装置により、１５℃程度に温度制御されていることが望ましい。レーザ光源１には光ファイバ３の一端が固定されており、レーザ光源１から発せられたレーザ光は光ファイバ３に入射されるようになっている。
【００２５】
顕微鏡本体５は、断熱材からなる外装カバー（遮光壁）１１により覆われている。この顕微鏡本体５は、図示しない除振台に載置されている。また、顕微鏡本体５は、透明なガラス（隔壁）１３，２１により、外装カバー１１の内部が上方から順に培養空間１０と光学空間２０と常温空間３０との３つの空間に仕切られている。
【００２６】
培養空間１０には、標本Ｓを収容する培養容器１５と、培養容器１５が載置されるステージ１７と、培養空間１０内を加温するヒータ１９とが備えられている。
【００２７】
培養容器１５は、透明なガラス材料により形成されている。
ステージ１７は、板厚方向に貫通する貫通孔（図示略）を有しており、貫通孔の開口を閉塞するように培養容器１５を載置することができるようになっている。
ヒータ１９は、培養空間１０の温度を一定に維持することができるようになっている。また、図示しない加湿器によって湿度を一定に維持することができるようになっている。例えば、培養空間１０は、温度が３７℃、湿度が９０％に設定されている。
【００２８】
光学空間２０は、培養空間１０に隣接して配置されている。この光学空間２０には、対物レンズ２３と、対物レンズ２３を保持し、光学空間１０内で対物レンズ２３を光軸に沿う方向に移動可能なフォーカス駆動部２５と、ステージ１７を支持し、培養空間１０内でステージ１７を対物レンズ２３の光軸に交差する方向に移動可能なステージ駆動部２７と、光学空間２０を加温するヒータ（恒温化部）２９とが備えられている。
【００２９】
対物レンズ２３は、レーザ光源１から発せられたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光してレーザ光の光路に沿って戻すようになっている。
ヒータ２９は、光学空間２０を培養空間１０の温度とほぼ同等の温度に恒温化するようになっている。例えば、光学空間２０は、３７℃に設定されている。
【００３０】
常温空間３０は、光学空間２０に隣接して配置されている。この常温空間３０は、温度制御されておらず、常温（例えば、２０℃）となっている。常温空間３０を形成する外装カバー１１には、光ファイバ３の他端と、リキッドライトガイド７の一端が接続されている。この外装カバー１１には、光ファイバ３により導光されてくるレーザ光を平行光に変換して光学空間２０に入射させるコリメートレンズ３１が固定されている。
【００３１】
また、常温空間３０には、コリメートレンズ３１を介して入射されたレーザ光を２次元的に走査させるガルバノミラーのようなスキャナ（走査部）３３と、スキャナ３３により走査されたレーザ光を集光させて中間像を結像させる瞳投影レンズ３５と、中間像を結像したレーザ光を反射する反射ミラー３７と、反射ミラー３７により反射されたレーザ光を略平行光にして対物レンズ２３に入射させる結像レンズ３９とが備えられている。
【００３２】
また、常温空間３０には、対物レンズ２３により集光されてレーザ光の光路を戻る標本Ｓからの蛍光を光路から反射して分岐させる励起ダイクロイックミラー（観察光分岐部）４１と、励起ダイクロイックミラー４１により反射して分岐された蛍光を集光してリキッドライトガイド７の一端に入射させる集光レンズ４３とが備えられている。
【００３３】
励起ダイクロイックミラー４１は、スキャナ３３と対物レンズ２３との間、より具体的には、結像レンズ３９と対物レンズ２３との間に配置されている。対物レンズ２３と励起ダイクロイックミラー４１との間に他のレンズ等が配されておらず、励起ダイクロイックミラー４１が対物レンズ２３に隣接して配置されていることで、標本Ｓからの蛍光を対物レンズ２３から出射された直後に励起ダイクロイックミラー４１により分岐することができる。
【００３４】
対物レンズ２３から出射された標本Ｓからの蛍光はスキャナ３３によるレーザ光の走査に応じて光束の位置が変動するが、対物レンズ２３から出射された直後の蛍光は光束の位置の変動が比較的小さい。したがって、標本Ｓからの蛍光を対物レンズ２３から出射された直後に励起ダイクロイックミラー４１により分岐するとともに、分岐した直後に集光レンズ４３によりリキッドライトガイド７に入射させることで、対物レンズ２３の近傍にそれほど大きな空間を占有させる必要がない。これにより、対物レンズ２３からの蛍光の検出効率を維持しつつ、光学空間３０を狭くして光学空間３９の温度制御を容易にすることができる。
【００３５】
光検出ユニット９は、遮光性を有する箱状の遮光壁５１により覆われている。遮光壁５１は、光検出ユニット９において、培養空間１０および光学空間２０から離間した光検出空間５０を形成するようになっている。また、遮光壁５１は、光検出空間５０の外部から内部への光（環境光）を遮断するとともに、光検出空間５０内を乾燥状態および密閉状態に維持することができるようになっている。遮光壁５１には、リキッドライトガイド７の他端が接続されている。
【００３６】
光検出空間５０には、リキッドライトガイド７により導光されてきた標本Ｓからの蛍光を平行光に変換するコリメートレンズ５３と、平行光に変換された蛍光を波長に応じて反射または透過して２つの光路に分岐するダイクロイックミラー５５と、ダイクロイックミラー５５により反射された蛍光の光路に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ５７Ａと、バリアフィルタ５７Ａを通過した蛍光を検出するＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、観察光検出部）５９Ａと、ダイクロイックミラー５５を透過した蛍光の光路に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ５７Ｂと、バリアフィルタ５７Ｂを通過した蛍光を検出するＰＭＴ（観察光検出部）５９Ｂとが備えられている。
【００３７】
ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂにより得られた蛍光の輝度情報は、それぞれスキャナ３３によるレーザ光の走査位置に関する走査位置情報と共に図示しないＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）に送られるようになっている。ＰＣにおいては、これら輝度情報と走査位置情報とに基づいて標本Ｓの２次元的な画像が生成される。また、ＰＣにより生成された画像は図示しないモニタに表示される。
【００３８】
また、光検出空間５０には、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂから発せられた熱を外部に排出して光検出空間５０内の温度を冷却するペルチェ素子（冷却部）６１Ａ，６１Ｂが備えられている。光検出空間５０は、例えば、１５℃に設定されている。なお、遮光壁５１により光検出空間５０が乾燥状態および密閉状態に維持されることで、ペルチェ素子６１Ａ，６１Ｂによる冷却時にＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂに結露等が発生するのを防ぐことができる。
【００３９】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００により標本Ｓを観察するには、まず、ヒータ１９，２９およびペルチェ素子６１Ａ，６１Ｂを作動させるとともに、標本Ｓを収容した培養容器１５を培養空間１０内のステージ１７上に貫通孔の開口を閉塞するように載置する。
【００４０】
ヒータ１９の作動により、培養空間１０は、温度が３７℃、湿度が９０％に維持される。これにより、生きている細胞のような標本Ｓを長時間にわたり健全な状態に保つことができる。また、ヒータ２９の作動により、光学空間２０は、培養空間１０と同じ３７℃に維持される。光学空間２０の温度を培養空間１０と同じ温度で一定に保つことで、光学空間２０内の光学系および機械系に培養空間１０の温度に基づく温度勾配が発生するのを防止することができる。これにより、温度変化による対物レンズ２３、フォーカス駆動部２５およびステージ駆動部２７のＸ，Ｙ，Ｚ方向へのドリフトを防止し、鮮明な画像を取得することができる。
【００４１】
また、ペルチェ素子６１Ａ，６１Ｂの作動により、光検出空間５０は１５℃に維持される。これにより、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂを冷却して熱ノイズの発生を防止し、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂによる蛍光の検出精度を向上することができる。
【００４２】
次いで、レーザ光源１からレーザ光を発生させて光ファイバ３により顕微鏡本体５に導光させる。光ファイバ３により導光されたレーザ光は、コリメートレンズ３１により平行光に変換されてスキャナ３３により２次元的に走査される。スキャナ３３により走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ３５、反射ミラー３７および結像レンズ３９を介して励起ダイクロイックミラー４１を透過し、対物レンズ２３により標本Ｓに照射される。
【００４３】
レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ２３により集光されてレーザ光の光路を戻り、励起ダイクロイックミラー４１により反射されて対物レンズ２３とスキャナ３３との間でレーザ光の光路から分岐される。そして、蛍光は、集光レンズ４３により集光されてリキッドライトガイド７に入射する。これにより、標本Ｓから発せられた蛍光がスキャナ３３に戻されずに、励起ダイクロイックミラー４１およびリキッドライトガイド７により光検出ユニット９に導光される。
【００４４】
なお、１光子励起の場合は、共焦点光学系にするために、スキャナ３３（走査部）に蛍光を戻し、その後、コンフォーカルレンズにて、共焦点ピンホール面に蛍光を集光させた後に蛍光を検出しているが、本実施形態では、２光子励起のため、共焦点ピンホールが不要で、前述の光学系となっている。
【００４５】
リキッドライトガイド７により光検出ユニット９に導光された蛍光は、コリメートレンズ５３により平行光に変換されてダイクロイックミラー５５により波長に応じて分岐される。ダイクロイックミラー５５により反射された蛍光は、バリアフィルタ５７Ａを介してＰＭＴ５９Ａにより検出され、ダイクロイックミラー５５を透過した蛍光は、バリアフィルタ５７Ｂを介してＰＭＴ５９Ｂにより検出される。
【００４６】
次いで、図示しないＰＣにより、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂにより得られた蛍光の輝度情報とスキャナ３３によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて標本Ｓの２次元的な画像が生成され、モニタにより表示される。これにより、ユーザは、健全な状態の標本Ｓを２光子励起観察することができる。また、遮光壁５１により環境光が遮断されるので、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂにおいて環境光による影響を排除して安定した観察を行うことができる。
【００４７】
この場合において、温度が３７℃に設定される培養空間１０および光学空間２０から光検出空間５０を離間して配置することで、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂを培養空間１０および光学空間２０から熱的に分離してＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂが高温になるのを防止することができる。また、ペルチェ素子６１Ａ，６１Ｂにより光検出空間５０を冷却することで、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂを冷却して暗電流ノイズを抑制し、Ｓ／Ｎ比を向上して標本Ｓを観察することができる。
【００４８】
また、光学空間２０には、温度変化によるドリフトの影響が大きい対物レンズ２３、フォーカス駆動部２５およびステージ駆動部２７のみを配置し、励起ダイクロイックミラー４１やＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂを他の空間に配置することで、温度制御の対象となる光学空間２０の熱容量を減らして、より精度よく恒温化することができる。また、光学空間２０または常温空間３０内にレーザ光源１や光検出ユニット９を収容する場合と比較して、顕微鏡本体５を小型化することができる。さらに、顕微鏡本体５のフットプリントが小さくなり、これを積載する除振台も小型化できる。
【００４９】
なお、リキッドライトガイドはコア径が比較的大きいので、標本Ｓからの蛍光をリキッドライトガイド７に効率よく取り込むことができる。また、対物レンズ２３の瞳径が大きい場合も、対物レンズ２３の瞳からリキッドライトガイド７に蛍光を入射させる集光レンズ４３の縮小倍率を大きくする必要がなく、対物レンズ２３からリキッドライトガイド７までの距離も比較的短くすることができる。したがって、光学空間２０および常温空間３０を小型化することができる。さらに、リキッドライトガイドはコア径が大きくても比較的容易に曲げることが可能なため、狭いスペースでリキッドライトガイド７を引き回すことができる。
【００５０】
以上説明したように本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００によれば、光検出ユニット９を収容する光検出空間５０を培養空間１０および光学空間２０を有する顕微鏡本体５から離間して配置することで、ＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂの高温化を防ぐとともに顕微鏡本体５の小型化を図ることができる。
【００５１】
また、蛍光を光検出ユニット９へ導光するための励起ダイクロイックミラー４１（観察光分岐部）を対物レンズ２３とスキャナ３３（走査部）の間に配置しているので、蛍光の検出効率を維持しつつ小型化を図ることが可能となる。
【００５２】
なお、本実施形態では、観察光検出部として、互いに異なる波長を検出するＰＭＴ５９ＡおよびＰＭＴ５９Ｂを例示して説明したが、これに限られることはない。例えば、観察光検出部として、高感度のＰＭＴと、低感度だが過大光に対して故障し難いＰＭＴなど、異なる特性の複数のＰＭＴを組み合わせて採用することとしてもよい。さらに、観察光検出部はＰＭＴに限定されることはなく、フォトダイオードなどの他の光検出デバイスを採用することとしてもよい。
【００５３】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００は、図２に示すように、標本Ｓからの光を集光する集光レンズ７５と、集光レンズ７５により集光された光を導光するリキッドライトガイド（透過側光ファイバ）７７と、リキッドライトガイド７７により導光された光を検出する光検出ユニット７９とをさらに備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００５４】
集光レンズ７５は、標本Ｓを透過したレーザ光およびこのレーザ光と同方向に標本Ｓから発せられる蛍光を集光してリキッドライトガイド７７に入射させるようになっている。
リキッドライトガイド７７は、一端が集光レンズ７５を介して培養空間１０の外装カバー１１に接続されている。
【００５５】
光検出ユニット７９は、光検出ユニット９と同様に、遮光性を有する箱状の遮光壁８１により覆われている。遮光壁８１は、光検出ユニット７９において、培養空間１０および光学空間２０から離間された光検出空間８０を形成している。また、遮光壁８１は、光検出空間８０の外部から内部への光（環境光）を遮断するとともに、光検出空間８０内を乾燥状態および密閉状態に維持することができるようになっている。遮光壁８１には、リキッドライトガイド７７の他端が接続されている。
【００５６】
光検出空間８０には、リキッドライトガイド７７により導光されてきたレーザ光および蛍光を平行光に変換するコリメートレンズ８３と、平行光に変換されたレーザ光を反射する一方、蛍光を透過してこれらを分岐させるダイクロイックミラー（透過側分岐部）８５と、ダイクロイックミラー８５により反射されたレーザ光を検出するＩＲ−ＴＤ（透過側レーザ光検出部、近赤外レーザ用の透過検出器）８７と、ダイクロイックミラー８５を透過した蛍光の光路に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタ８９と、バリアフィルタ８９を通過した蛍光を検出するＦＬ−ＰＭＴ（透過側蛍光検出部、蛍光用の検出器）９１とが備えられている。ここで、レーザ光はＩＲ（赤外）波長が利用される場合が多いため、標本Ｓを透過したレーザ光を検出するための光検出部を便宜上、ＩＲ−ＴＤ（透過側レーザ光検出部）としている。なお、本実施形態では、ＩＲ−ＴＤ８７もＦＬ−ＰＭＴ９１もフォトマルチプライヤーであるが、透過側レーザ光検出部および透過側蛍光検出部は、これらに限定されることなく、例えばフォトダイオードなど、光を検出可能なデバイスであればよい。
【００５７】
ＩＲ−ＴＤ８７およびＦＬ−ＰＭＴ９１により得られたレーザ光の輝度情報および蛍光の輝度情報は、走査位置情報と共にＰＣに送られる。そして、ＰＣよりこれら輝度情報と走査位置情報とに基づいて標本Ｓの２次元的な画像が生成され、モニタに表示される。
【００５８】
また、光検出空間８０には、ＩＲ−ＴＤ８７およびＦＬ−ＰＭＴ９１から発せられた熱を外部に排出して光検出空間８０内の温度を冷却するペルチェ素子９３Ａ，９３Ｂが備えられている。これらペルチェ素子９３Ａ，９３Ｂの作動により、光検出空間８０は、例えば、１５℃に設定されている。
【００５９】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡２００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００により標本Ｓを観察するには、ヒータ１９，２９およびペルチェ素子６１Ａ，６１Ｂ，９３Ａ，９３Ｂを作動させる。そして、第１実施形態と同様に、培養空間１０に収容した標本Ｓに対してレーザ光源１からレーザ光を発生させて照射する。
【００６０】
これにより、標本Ｓにおいて発生し対物レンズ２３により集光された蛍光が、励起ダイクロイックミラー４１によりスキャナ３３に戻されずに分岐されてリキッドライトガイド７により導光され、光検出ユニット９のＰＭＴ５９Ａ，５９Ｂにより検出される。
【００６１】
また、レーザ光が照射されることにより標本Ｓを透過したレーザ光と標本Ｓから対物レンズ２３側とは反対側に発せられた蛍光とが集光レンズ７５により集光されてリキッドライトガイド７７により光検出ユニット７９に導光される。
【００６２】
光検出ユニット７９に導光されたレーザ光および蛍光は、コリメートレンズ８３により平行光に変換された後、ダイクロイックミラー８５によりそれぞれの光路に分岐される。ダイクロイックミラー８５により反射されたレーザ光はＩＲ−ＴＤ８７により検出され、ダイクロイックミラー８５を透過した蛍光は、バリアフィルタ８９を介してＦＬ−ＰＭＴ９１により検出される。
【００６３】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００によれば、ＩＲ−ＴＤ８７により検出されるレーザ光の輝度情報に基づいて標本Ｓの輪郭などを観察すると同時に、ＦＬ−ＰＭＴ９１により検出される蛍光の輝度情報に基づいて細胞内のオルガネラのような標本Ｓ内の微小構造などを観察することができる。
また、光検出ユニット９のＰＭＴ５９Ａ，５９ＢとＦＬ−ＰＭＴ９１とで同一波長の蛍光を検出して、得られた輝度情報を加算すれば、より明るい蛍光観察が可能になる。
【００６４】
上記各実施形態は以下のように変形することができる。
上記各実施形態においては、対物レンズ２３の全体を光学空間２０に配置することとしたが、例えば、図３および図４に示すように、対物レンズ２３の先端を培養空間１０内に挿入することとしてもよい。なお、対物レンズ２３の少なくとも一部分（基部）は光学空間２０に収容されていることとする。
【００６５】
この場合、ガラス１３が対物レンズ２３を挿入可能な貫通孔１３ａを有することとすればよい。また、ガラス１３の貫通孔１３ａを介して対物レンズ２３の先端を培養空間１０内に挿入しつつ、フォーカス駆動部２５により、対物レンズ２３を光軸方向に移動可能に保持することとすればよい。また、図３に示すように、Ｏリング９５により、対物レンズ２３の光軸方向の移動を妨げずにガラス１３と対物レンズ２３との隙間を閉塞したり、図４に示すように、伸縮自在の部材からなる蛇腹９７等により、ガラス３１と対物レンズ２３との隙間を閉塞したりすることとすればよい。
【００６６】
この際、培養空間１０内の高湿度の気体が対物レンズ２３の内部に入らないように、対物レンズ２３の培養空間１０内に突出している部分の隙間（例えば、先玉レンズ２３ａとレンズ枠２３ｂとの間、レンズ枠２３ｂが多重構造になっている場合のレンズ枠２３ｂどうしの隙間など）は密閉されている。
このようにすれば、ＷＤ（対物レンズ２３の先端から標本Ｓまでの距離）が短い対物レンズ２３でも使用可能となる。ＮＡ（開口数）の大きい明るく高解像の対物レンズ２３は、一般にＷＤが短いが、前述の構造にすることで、明るく鮮明な画像を取得することができる。
【００６７】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００６８】
例えば、上記各実施形態では、蛍光観用途にて説明したが、標本Ｓから発せられるＳＨＧ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、第二高調波）やＴＨＧ（Ｔｈｉｒｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、第三高調波）を観察してもよい。さらには、上記各実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００，２００は、光の強度の２乗もしくはそれ以上の累乗に比例して標本から光を発生させる非線形効果を利用した様々な観察方法に適用できる。また、上記各実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００，２００は、２光子励起でなく例えば３光子励起などの多光子励起観察を行うこととしてもよい。
【符号の説明】
【００６９】
１    レーザ光源（光源）
３    光ファイバ（レーザ光導光ファイバ）
７    リキッドライトガイド（観察光導光ファイバ）
１０    培養空間
２０    光学空間
２３    対物レンズ
２９    ヒータ（恒温化部）
３３    スキャナ（走査部）
４１    励起ダイクロイックミラー（観察光分岐部）
５１    遮光壁
５９Ａ，５９Ｂ    ＰＭＴ（観察光検出部）
６１Ａ，６１Ｂ    ペルチェ素子（冷却部）
７７    リキッドライトガイド（透過側光ファイバ）
８０    光検出空間
８５    ダイクロイックミラー（透過側分岐部）
８７    ＩＲ−ＴＤ（透過側レーザ光検出部）
９１    ＦＬ−ＰＭＴ（透過側蛍光検出部）
１００，２００    レーザ走査型顕微鏡
【図１】
2016071160.tif 000003
【図２】
2016071160.tif 000004
【図３】
2016071160.tif 000005
【図４】
2016071160.tif 000006