(57)【要約】【課題】安全性が高く、かつ腸内細菌叢のバランスにも影響のない、バイロフィラ属細菌の増殖を抑制する技術を提供すること。【解決手段】ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分とする、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌増殖抑制剤を提供する。また、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として使用する、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌の増殖抑制方法を提供する。前記ビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌を有効成分とする、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌増殖抑制剤。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウム属細菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９である、請求項１に記載のバイロフィラ属細菌増殖抑制剤。
【請求項３】
前記バイロフィラ属細菌は、バイロフィラ・ワーズワーシア（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ）種のバイロフィラ属細菌である、請求項１又は２に記載のバイロフィラ属細菌増殖抑制剤。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌を有効成分として使用する、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、バイロフィラ属細菌増殖抑制剤に関する。より詳しくは、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌増殖抑制剤及びバイロフィラ属細菌増殖抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌は、腸内で嫌気性呼吸により硫化水素を産生する硫化水素産生菌の一種であり、腸管粘膜を破壊し、腸管での炎症誘導に関与していることが示唆されている嫌気性病原菌の一種である。
【０００３】
例えば、非特許文献１では、潰瘍性大腸炎のモデルマウスにおいて、症状スコアが悪化した群でバイロフィラ属細菌の増加が見られたこと（特に、図１参照）、無菌マウスにバイロフィラ属細菌を単独定着させたモデルマウスでは、飽和脂肪酸を含む餌により、潰瘍スコアが悪化することが報告されている。また、非特許文献２では、健常人の虫垂中のバイロフィラ属細菌の割合が０．０７±０．０６％であるのに対し、虫垂炎患者の虫垂中のバイロフィラ属細菌の割合は０．８８±０．２１％と、１０倍程度の割合増加を示すことが報告されている。
【０００４】
腸内細菌の種類やその数は、動物種や個体差、消化管の部位、年齢、食事の内容や体調などによって様々な違いがあることは従来から知られているが、バイロフィラ属細菌についても、近年、食事のスタイルによって、その腸内割合が変化することが分かってきた。
例えば、非特許文献３では、肉、卵のみに制限した食事によって、バイロフィラ属細菌の腸内割合が増殖したことが報告されている。
【０００５】
最近では、日本の食事のスタイルも欧米化しており、肉を中心としたような西洋型となってきている。そのため、病原菌の一種であるバイロフィラ属細菌の腸内割合が増加することが懸念され、ひいては、様々な消化器疾患を誘発する可能性も考えられる。
【０００６】
ところで、バイロフィラ属細菌の増殖を抑制する方法としては、従来から抗生物質を投与する方法が用いられている。
例えば、特許文献１では、キノロン系の抗生物質であるケミフロキサシン化合物が、バイロフィラ属細菌の増殖を抑制することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５３１１０１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dietary-fat-induced taurocholic acid promotes pathobiontexpansion and colitis in Il10-/- mice. Nature 487, 104-108(2012)
【非特許文献２】Culture-Independent Evaluation of the Appendix and Rectum Microbiomes in Children with and without Appendicitis. PLoS One 4, e95414(2014)
【非特許文献３】Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome.  Nature 505, 559-563 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のように、病原菌の一種であるバイロフィラ属細菌の増殖を抑制することは、様々な消化器疾患を予防する上で、非常に重要である。これまでの技術においても、抗生物質の投与により、バイロフィラ属細菌の増殖抑制には一定の効果を示している。しかし、化学物質の投与は、副作用の危険性を有すること、腸内細菌中の有用な菌（所謂、善玉菌）なども殺してしまう可能性があり、腸内細菌叢のバランスを乱すことなど、様々な問題がある。
【００１０】
そこで、本技術は、安全性が高く、かつ腸内細菌叢のバランスにも悪影響のない、バイロフィラ属細菌の増殖を抑制する技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、善玉菌として知られているビフィドバクテリウム属細菌が、バイロフィラ属細菌の増殖の抑制に寄与することを見出し、本技術を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本技術は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌を有効成分とする、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌増殖抑制剤を提供する。
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤に用いる前記ビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を用いることができる。
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤が増殖抑制可能なバイロフィラ属細菌としては、バイロフィラ・ワーズワーシア（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ）種などを挙げることができる。
【００１３】
本技術では、次に、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として使用する、バイロフィラ属（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）細菌の増殖抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本技術によれば、食品や薬剤中に長年使用され、かつ、動物の腸内にも存在するビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として用いるため、生体への安全性が高く、かつ腸内細菌叢のバランスにも悪影響のない、バイロフィラ属細菌の増殖を抑制する技術を提供することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例における試験スケジュールを示す図である。
【図２】実施例において、腸内細菌叢中のバイロフィラ属細菌の数の経時変化を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１７】
＜１．バイロフィラ属細菌増殖抑制剤・バイロフィラ属細菌の増殖抑制方法＞
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤及び増殖抑制方法は、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分とすることを特徴とする。
【００１８】
（１）ビフィドバクテリウム属細菌
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤の有効成分として用いるビフィドバクテリウム属細菌（以下、単に「ビフィズス菌」ともいう）は、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であり、多くの動物の腸内に生息する腸内細菌の一種である。
【００１９】
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤に用いることができるビフィドバクテリウム属細菌の種類は、本技術の効果を損なわない限り、公知のビフィドバクテリウム属細菌を自由に選択して用いることができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）等が挙げられる。
【００２０】
これらの中でも、本技術においては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を用いることが好ましい。ビフィドバクテリウム・ロンガムは、発酵乳等の食品に好適に用いられているビフィズス菌の一つであり、また免疫力の向上という点でも注目されている菌である。
本技術では、ビフィドバクテリウム・ロンガムとして公知の菌株を適宜用いることができる。より具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を好適に用いることができる。同菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。
【００２１】
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤中のビフィドバクテリウム属細菌の含有量は特に限定されず、使用頻度や使用量、摂取者の食事の内容や量、摂取者の年齢等に応じて、自由に設定することができる。本技術では特に、バイロフィラ属細菌増殖抑制剤中のビフィドバクテリウム属細菌の含有量を、１×１０７〜１×１０１２  ＣＦＵ／ｍＬとすることが好ましく、４×１０９〜１×１０１１  ＣＦＵ／ｍＬとすることがより好ましい。なお、前記単位ＣＦＵは、ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓの略であり、コロニー形成単位である。
【００２２】
（２）バイロフィラ属細菌
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤が増殖を抑制することが可能なバイロフィラ属細菌としては、バイロフィラ・ワーズワーシア（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ）種が挙げられる。なお、バイロフィラ・ワーズワーシア種のバイロフィラ属細菌としては、例えば、バイロフィラ・ワーズワーシア  ＡＴＣＣ  ４９２６０、バイロフィラ・ワーズワーシア  ＡＴＣＣ  ５１５８０、及びバイロフィラ・ワーズワーシア  ＡＴＣＣ  ５１５８１等が挙げられる。
【００２３】
以上説明した本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤は、食品や薬剤中に長年使用され、かつ、動物の腸内にも存在するビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として用いるため、生体への安全性が高い。そのため、副作用や依存性が生じる等の危険性がなく、長期間、連続的に摂取することが可能である。
【００２４】
また、ビフィドバクテリウム属細菌は、動物の腸内に所謂、善玉菌として存在する菌の一種である。そのため、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤は、腸内細菌叢のバランスの乱れを誘発することがなく、むしろ、腸内細菌叢のバランス調整作用をも期待することができる。
【００２５】
＜２．バイロフィラ属細菌の増殖に起因した疾患の予防又は治療薬＞
上述した通り、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤は、安全性が高く、かつ腸内細菌叢のバランスにも悪影響がないため、バイロフィラ属細菌の増殖に起因した疾患の予防又は治療のためのヒト若しくは動物用の医薬品として用いることができる。
【００２６】
また、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤は、食品中に長年使用され、かつ、動物の腸内にも存在するビフィドバクテリウム属細菌を有効成分とするため、種々の疾患を罹患した患者に対しても安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００２７】
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤を医薬品に利用する場合、該医薬品は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、直腸投与等が挙げられる。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤等が挙げられる。
【００２８】
また、製剤化に際しては、ビフィドバクテリウム属細菌の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤を含有しているものであれば、公知の又は将来的に見出されるバイロフィラ属細菌の増殖に起因した疾患の予防又は治療の効果を有する成分を、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤と併用することもできる。
【００２９】
さらに、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤等に製剤化することができる。
【００３０】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３１】
なお、製剤担体を配合する場合、バイロフィラ属細菌増殖抑制剤の有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌の含有量は特に限定されず、剤形に合わせて一日あたりの摂取量又は投与量に基づいて適宜選択することができる。なお、ビフィドバクテリウム属細菌の一日の摂取量又は投与量は、１×１０８ＣＦＵ／日〜１×１０１２ＣＦＵ／日の範囲であることが好ましい。
【００３２】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００３３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００３４】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００３５】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００３６】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００３７】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００３８】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００３９】
＜３．飲食品、飼料＞
上述した通り、本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤は、安全性が高く、かつ腸内細菌叢のバランスにも悪影響がないため、バイロフィラ属細菌の増殖に起因した疾患の予防又は治療のためのヒト若しくは動物用の飲食品、飼料等に配合して使用することができる。
【００４０】
（１）飲食品
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤を飲食品に利用する場合、公知の飲食品に添加してバイロフィラ属細菌増殖抑制効果を有する飲食品を調製することもできるし、飲食品の原料中に混合してバイロフィラ属細菌増殖抑制効果を有する新たな飲食品を製造することもできる。
【００４１】
前記飲食品は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００４２】
小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
【００４３】
また、本技術で定義される飲食品は、バイロフィラ属細菌の増殖に起因した疾患の予防又は治療の用途等の保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
【００４４】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００４５】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００４６】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００４７】
なお、飲食品を製造する際に添加するバイロフィラ属細菌増殖抑制剤の有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌の含有量は特に限定されず、一日あたりの摂取量に基づいて適宜選択することができる。なお、ビフィドバクテリウム属細菌の一日の摂取量は、１×１０８ＣＦＵ／日〜１×１０１２ＣＦＵ／日の範囲であることが好ましい。
【００４８】
（２）飼料
本技術に係るバイロフィラ属細菌増殖抑制剤を飼料に利用する場合、公知の飼料に添加してバイロフィラ属細菌増殖抑制効果を有する飼料を調製することもできるし、飼料の原料中に混合してバイロフィラ属細菌増殖抑制効果を有する新たな飼料を製造することもできる。
【００４９】
前記飼料の原料としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。また、前記飼料の形態としては、例えば、愛玩動物用飼料（ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００５０】
なお、飼料を製造する際に添加するバイロフィラ属細菌増殖抑制剤の有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌の含有量は特に限定されず、一日あたりの摂取量に基づいて適宜選択することができる。なお、ビフィドバクテリウム属細菌の一日の摂取量は、１×１０８ＣＦＵ／日〜１×１０１２ＣＦＵ／日の範囲であることが好ましい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００５２】
（１）試験スケジュール
２１名の被験者（２２〜５０才、平均年齢：３９．５才）を、５日間、肉と卵のみの食事（以下「肉食」という）を摂取した群１０名と、５日間、肉食と同時にビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を含有する発酵乳（森永乳業株式会社製、ビヒダス：登録商標、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９：約２×１０７  ＣＦＵ／ｇ含有）とを、朝晩の１日２回、１回１００ｇずつ摂取する群１１名の２群に分けた（図１参照）。肉食期間中及び後観察期間中のメニューは、下記表１の通りとした。なお、肉食期間中は、下記表１に示すパターン１又はパターン２のいずれかの摂取を行い、後観察期間中は、下記表１に示すメニューからなる冷凍弁当の摂取を行った。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
［肉食期間］
朝食：卵料理（卵１個分）＋肉加工品（１００ｇ）
昼食・夕食：メイン食（１５０〜２００ｇ）＋補助食（８０〜１００ｇ）、体格、性別等に応じて、メイン食（１５０〜２００ｇ）でも可能とした。補助食をメインとする場合は、１５０〜２００ｇ以上摂取した。
【００５５】
（２）腸内細菌叢の解析
５日間（１日目〜５日目）の肉食期間中に、摂取開始前（０日目）、３日目、５日目の３点と、１４日間（６日目〜２０日目）の後観察期間中に、８日目、１２日目、１９日目の３点とにおいて、各被験者から糞便サンプルを回収し、腸内細菌叢の解析を行った。腸内細菌叢の解析方法は、以下の通りに行った。
【００５６】
＜ＤＮＡの抽出＞
被験者から回収した糞便サンプルから、ＱＩＡ  ａｍｐ  ＤＮＡ  ｓｔｏｏｌ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＤＮＡの抽出を行った。
糞便サンプルを２０ｍｇ程度測りとり、６００μＬのＡＳＬバッファーに懸濁後、７０℃で５分間加温した。ここに、０．１ｍｍ径のガラスビーズ７００ｍｇ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール（和光純薬株式会社製）を混合し、マルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）にて２７００ｒｐｍ、１８０秒で破砕処理を実施した。ここに、３ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム１００μＬを加えて氷上に５分間放置した。１４０００ｒｐｍで８分間遠心分離後、上清６００μＬにＡＳＬバッファー６００μＬ、ＩｎｈｉｂｉｔＥＸタブレット１錠を加えて混合し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離後、４７１μＬの上清を取得した。これに、４７１μＬのＡＬバッファーと４７１μＬのエタノール溶液（和光純薬株式会社製）を混合し、ＱＩＡ  ａｍｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにアプライして１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、ＱＩＡ  ａｍｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬのＡＷ１バッファーをアプライし、１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、ＱＩＡ  ａｍｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに５００μＬのＡＷ２バッファーをアプライし、１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。更に、ＱＩＡ  ａｍｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎのみで１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。これを１．５ｍＬチューブに移し、ＡＥバッファーを１７１μＬ添加し、室温で１分間放置後、１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して得られた溶液を、各サンプルのＤＮＡ溶液とした。
【００５７】
＜ＤＮＡの増幅＞
次に、各サンプルのＤＮＡ溶液に含まれる菌群のゲノムに対して核酸増幅反応を行った。下記表２〜表４に、本実験例で用いたプライマーの配列を示す。表２に示すプライマーセットは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるためのプライマーである。これらのプライマーについては、便宜的に第１プライマーセットとする。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
表２中、「Ｒ」は、グアニン又はアデニンを意味する。「Ｗ」は、アデニン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｈ」は、アデニン又はシトシン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｖ」は、アデニン又はグアニン又はシトシンを意味する。
【００６０】
また、下記表３及び表４に示すプライマーセットは、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社製））を用いて塩基配列を解析するために必要な配列（アダプター領域及びインデックス領域）を増幅核酸鎖に組み込むためのプライマーセットである。表３に示すプライマーはフォワードプライマーであり、表４に示すプライマーは、リバースプライマーである。これらのプライマーは、便宜的に第２プライマーセットとする。なお、表２〜表４に示すプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスにより得た。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
【表４】
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【００６３】
各サンプルのＤＮＡ溶液及び第１プライマーセットを含む総液量２５μｌの反応液を、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。核酸増幅反応は、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて行い、９４℃−３分の後、９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとし、これを２０回繰り返し、その後７２℃−１０分として、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンにより、増幅核酸鎖を確認した。
【００６４】
続いて、得られたＰＣＲ産物１μＬを鋳型とし、第２プライマーセットを用いて前記と同様の条件にてＰＣＲ反応を行った。但し、サイクル数は８回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した後、ＧｅｎｅＲｅａｄ  Ｓｉｚｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。精製後のＰＣＲ産物については、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【００６５】
＜ＤＮＡのシークエンス＞
各サンプルに由来するＰＣＲ産物を同じ濃度で混合したものを、Ｍｉｓｅｑ  ｖ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
【００６６】
＜菌群の同定及び菌数の算出＞
上記シークエンス解析により得られたペアエンド配列をfastq-join （version.1.1.2-301）（http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqJoin）にて、ＱＩＩＭＥソフトウェア（version 1.6.0）（http://qiime.org/）にて９７％の相同性を有する配列ごとをＯＵＴ（Operational Taxonomy Unit）とした。各ＯＵＴの代表配列を下記データベースに対してＢＬＡＳＴ検索することにより、腸内菌叢の構成を解析した。
データベース：Greengenes database 12_10
(http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/12_10)
【００６７】
（３）結果
前記腸内細菌叢の解析によって得られた腸内細菌叢中のバイロフィラ属細菌の数の経時変化を図２に示す。図２の結果に示す通り、肉食のみの群では、肉食期間中にバイロフィラ属細菌の有意な増加が明らかであった。一方、肉食と同時にビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳（ビヒダス）を摂取した群では、肉食期間中であっても、バイロフィラ属細菌の増加は見られなかった。
【００６８】
以上の結果から、ビフィドバクテリウム属細菌には、バイロフィラ属細菌の増加を抑制する作用があること、また、バイロフィラ属細菌の増加が促進される肉食の食生活下においても、ビフィドバクテリウム属細菌を摂取することで、バイロフィラ属細菌の増加を抑制可能であることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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