(57)【要約】【課題】破骨細胞分化抑制作用、骨芽細胞分化促進作用を有し、骨粗鬆症に有用な薬剤や飲食物の提供。【解決手段】トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤、骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防または改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤。
【請求項２】
トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、骨形成促進剤。
【請求項３】
トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、骨粗鬆症の予防または改善剤。
【請求項４】
サルカケミカンを原料として用い、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ブタノール、もしくはジエチルエーテル、またはこれらのいずれかの含水物で抽出を行うことを含む、トダクリン（toddaculin）を含有する組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で得られた組成物に対して分取用HPLCにて単一成分にまで精製を行うことを含む、トダクリン（toddaculin）を含有する組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミカン科サルカケミカン属に属する植物であるサルカケミカンから抽出されたトダクリン（toddaculin）を有効成分とし、骨粗鬆症の予防または骨代謝を改善するための健康食品、医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本国内において骨粗鬆症患者は１０００万人を超えており、社会的に大きな問題となっている。また、急速な高齢化により６５才以上の人口が増加し、骨粗鬆症患者が増加の一途を辿ることが推測されている。人体において骨は絶えず骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞である。骨の形成、維持、修復には、これらの細胞の形成と吸収のバランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症などの骨代謝疾患がもたらされることが知られている。よって骨形成が骨吸収を下回らないことが骨量の維持・増強に重要であると考えられている。
【０００３】
骨吸収は破骨細胞によって行なわれるため、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨吸収率は高くなる。一方、骨形成は骨芽細胞によって行なわれ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨形成率は高くなる。そのため、骨吸収率を減少させる骨吸収抑制作用を有し、骨形成率を高める骨形成促進作用を有する組成物が得られれば、骨粗鬆症に有効である。このような効果が報告されているものとして、例えば、生姜の辛味成分である６-ジンゲロールおよび６-ショウガオールを含むしょうがの抽出物を有効成分とする骨代謝改善組成物（特許文献１参照）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2014-043416号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来では、エストロゲン、ビスフォスフォネート、ビタミンＤ、カルシトニンなどの薬剤が臨床応用されてきたが、これらによる治療法は充分とはいえず、より優れた新たな治療薬が求められている。
【０００６】
本発明の目的は、これまでにも食に供された経験があり、破骨細胞分化抑制作用および骨形成促進作用を有し、骨粗鬆症の予防および改善に有用な有効成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、破骨細胞分化抑制作用および骨形成促進作用を有する有効成分について、種々の素材から探索を重ねた結果、ミカン科サルカケミカン属の植物であるサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）が、破骨細胞への分化を抑制し、さらに骨芽細胞の骨形成を促進することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、トダクリン（toddaculin）を含有する破骨細胞分化抑制剤および骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および骨代謝改善剤である。
【０００９】
また、本発明は、トダクリン（toddaculin）を含有する飲食品である。
【００１０】
上記のトダクリンは、サルカケミカンの葉、茎、実、種子、根または全草から抽出精製することができる。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、破骨細胞分化抑制剤。
[２]  トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、骨形成促進剤。
[３]  トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する、骨粗鬆症の予防または改善剤。
[４]  サルカケミカンを原料として用い、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ブタノール、もしくはジエチルエーテル、またはこれらのいずれかの含水物で抽出を行うことを含む、トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する組成物の製造方法。
[５]  [４]の方法で得られた組成物に対して分取用HPLCにて単一成分にまで精製を行うことを含む、トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する組成物の製造方法。 
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨代謝改善剤は、サルカケミカンの抽出成分であるトダクリン（toddaculin）を含有し、破骨細胞への分化抑制作用により骨吸収を抑制し、さらに骨芽細胞の分化促進作用により、骨形成を促し、骨粗鬆症を予防および改善できる。
【００１３】
本発明の飲食品は、サルカケミカンの抽出成分であるトダクリン（toddaculin）を含有し、経口摂取することにより破骨細胞への分化抑制、骨形成を促進し、骨粗鬆症を予防および改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】トダクリン（toddaculin）の抽出プロトコールを示す図である。
【図２】トダクリン（toddaculin）の1H- および13C-NMR スペクトルの帰属データを示す図である。
【図３】トダクリン（toddaculin）の構造式を示す図であり、図中の番号は図２の位置に相当する。
【図４】トダクリン（toddaculin）のRAW264細胞を用いた多核細胞への分化抑制作用を示す図（写真）である。
【図５】トダクリン（toddaculin）のRAW264細胞を用いた骨吸収抑制作用（TRAP活性抑制率）を示す図である。
【図６】トダクリン（toddaculin）のRAW264細胞を用いたNF-κB転写活性抑制率を示す図である。
【図７】トダクリン（toddaculin）のMC3T3-E1細胞を用いた骨形成促進作用（ALP活性促進率）を示す図である。
【図８】トダクリン（toddaculin）のMC3T3-E1細胞を用いたアリザリンレッド染色法による骨形成促進作用を示す図（写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の破骨細胞分化抑制剤、骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および改善剤は、トダクリン（toddaculin）を有効成分として含有する。トダクリンは、下記の式（１）に示す構造式を有し、正式な化合物名は5,7-ジメトキシ-6-(3-メチル-2-ブテニル)-2H-1-ベンゾピラン-2-オン(5,7-Dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1-benzopyran-2-one)である。
【００１６】
トダクリン（toddaculin）は、サルカケミカンの抽出物から分離、精製することにより得ることが可能である。例えば、液液分配、クロマトグラフィーなど汎用的な分画技術を用いることができる。例えば、サルカケミカンの植物体からアセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール等の有機溶媒を用いて抽出し、さらに疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーによりトダクリンを分離、精製することができる。サルカケミン乾燥植物体1 kgから１〜10 g程度のトダクリンを分離、精製することができる。疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーとして、スチレン-ジベニルベンゼン系合成吸着剤であるダイヤイオン（商標）HP20（三菱化学株式会社）等を用いたクロマトグラフィーが挙げられる。
【００１７】
サルカケミカンは、ミカン科サルカケミカン属に属する植物（学名：Toddalia asiatica）で、国内では沖縄地方で生育している。移動規制植物であるため、本州では生植物としての入手は困難であるが、加工されたものが販売されており、加工品として入手することは可能である。サルカケミカンはすでに、沖縄などでは民間薬やお茶として使用されているので、サルカケミカンに含有されるトダクリン（toddaculin）は安全性に優れる。トダクリン（toddaculin）は、トダクリンを含む他種植物からも分離、精製することができる。他種植物としては、例えばコミカンソウ科のAntidesma venosumが挙げられる。
トダクリンの化学式は下記式（１）に示される。
【００１８】
【化１】
2016069355.tif 000002
【００１９】
また、トダクリン（toddaculin）は合成により製造したものでもよい。当業者ならば上記化学式に基づいて容易に合成することができる。
【００２０】
本発明の破骨細胞分化抑制剤、骨芽細胞分化促進剤、骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および改善剤は、サルカケミカンの抽出物であるトダクリン（toddaculin）を含有する。トダクリン（toddaculin）を含有する限りサルカケミカンの抽出物を破骨細胞分化抑制剤、骨芽細胞分化促進剤、骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および改善剤として用いることができる。サルカケミカンの抽出物は、サルカケミカンを未乾燥または乾燥させ、抽出溶媒で抽出することで得ることができる。サルカケミカンの抽出に用いられる抽出溶媒は、トダクリン（toddaculin）を抽出成分として含ませることができる限り、特に限定はないが、例えば、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール等の有機溶媒、有機溶媒の混合溶媒、水と有機溶媒の混合溶媒などを用いることができる。好ましくは、ヘキサンを用いる。例えば、ヘキサンを用いて抽出した抽出物をヘキサン抽出エキスという。抽出は、室温抽出または還流抽出により行うことができる。抽出に用いるサルカケミカンの部位は、トダクリン（toddaculin）が抽出成分として含まれる限り、木部、葉、花、果実、果皮、茎、根、根皮などいずれの部位をも用いることができる。また、トダクリン（toddaculin）を含む限り、他種植物を用いることもできる。他種植物としては、例えばコミカンソウ科のAntidesma venosumが挙げられる。
【００２１】
サルカケミカンの抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、必要に応じて濾過等の処理、濃縮化や粉末化したものを用いることもできる。
【００２２】
トダクリン（toddaculin）は、破骨細胞への分化を抑制するので、骨吸収の抑制に有用である。また、トダクリン（toddaculin）は、骨芽細胞の分化を促進し、骨形成を促進するので骨量の増加に有用である。
【００２３】
トダクリン（toddaculin）が破骨細胞の分化抑制作用を有することは、以下の方法により確認することができる。RAW264細胞等の哺乳動物の単球由来細胞はRANKL刺激を与えることにより、多核細胞を形成しながら、破骨細胞へと分化する。従って、単球由来細胞と分化促進因子であるRANKLおよびトダクリン（toddaculin）を接触させ培養し、単球由来細胞が破骨細胞へ分化するか確認すればよい。破骨細胞への分化は、破骨細胞の分化マーカーである酸性フォスファターゼ（TRAP）活性を確認すればよい。破骨細胞の分化抑制作用を有する場合、単球由来細胞は破骨細胞へ分化しないので、TRAP活性は上昇しない。従って、TRAP活性が上昇しない場合、破骨細胞への分化を抑制していると評価することができる。また、RAW264細胞等の哺乳動物の単球由来細胞が破骨細胞に分化が進むと、NF-κBの転写活性が上昇することが知られている。従って、細胞のNF-κB転写活性を調べることにより破骨細胞への分化促進作用を評価してもよい。
【００２４】
トダクリン（toddaculin）が骨芽細胞の分化を促進し、骨形成の促進活性を有することは、以下の方法により確認することができる。MC3T3-E1細胞とトダクリンを接触させ、MC3T3-E1細胞の分化程度を分化マーカーであるアルカリフォスダターゼ（ALP）活性を確認すればよい。ALP活性が上昇する場合、骨芽細胞への分化が促進されていると評価することができる。また骨芽細胞への分化は、例えば、アリザリンレッド染色法で蓄積したカルシウムの増加量により評価してもよい。
【００２５】
また、破骨細胞の分化抑制作用を、破骨細胞への分化のマーカーである、酸性フォスファターゼ（Acp5）、カテプシンK（Ctsk）、Oscarなどの遺伝子発現上昇を確認してもよい。一方、骨芽細胞の分化促進作用を、骨芽細胞への分化のマーカーである、アルカリフォスファターゼ（Alpl）、オステオカルシン（Bglap）などの遺伝子発現上昇を確認してもよい。
【００２６】
トダクリン（toddaculin）は、破骨細胞分化抑制剤として用いることができる。破骨細胞分化抑制剤は、研究用試薬としても用いることができる。また、トダクリン（toddaculin）は、骨形成促進剤として用いることができる。骨形成促進剤は、研究用試薬としても用いることができる。
【００２７】
また、トダクリン（toddaculin）は、骨粗鬆症に起因する疾患を予防または改善するための医薬として用いることができる。本発明は、トダクリン（toddaculin）またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含む、骨粗鬆症をはじめ、関節リウマチ炎、ページェト病、悪性腫瘍の骨転移、甲状腺機能後進症などを予防または改善や卵巣摘出手術後の治療をするための医薬組成物を包含する。
【００２８】
医薬組成物は、経口で投与しても、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。好ましくは経口で投与する。該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。また、着色料、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、それぞれあげられる。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。
【００２９】
本発明のトダクリン（toddaculin）またはサルカケミカンの抽出物は、サプリメントとして用いることができ、あるいは、飲食物に混合してまたは飲食用組成物として用いることもできる。
【００３０】
サプリメントとして用いる場合、錠剤や顆粒の形態で用いることができ、他の有用成分と混合してもよい。
【００３１】
飲食用組成物として用いる場合、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等として供することが可能である。これらの飲食品は、骨代謝を改善する機能性食品として供することができ、特定保健用飲食品やその他のサプリメント、健康飲食品等には、骨吸収を抑制する、骨形成を促進する、骨粗鬆症を予防または改善する等の機能を表示することができる。
【００３２】
飲食用組成物は、固形物、液状、粉末、顆粒状、ペースト状等の種々の形態であり、具体的には、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ−ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００３３】
トダクリン（toddaculin）を含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物におけるトダクリン（toddaculin）含有量は、その剤型に応じて異なるが、通常トダクリン（toddaculin）が、全組成物中の0.01〜50重量％、好ましくは0.01〜20重量％程度含まれていればよい。トダクリン（toddaculin）の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重、症状の種類、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、一日当たりの摂取量が0.01〜300mg/kg体重になるように、飲食品の形態に合わせて設定するのが好ましい。１日１回または数回に分けて投与、摂食等により摂取すればよい。
【００３４】
本発明のトダクリン（toddaculin）を含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
[実施例１]  トダクリン（toddaculin）の抽出・分離・精製
トダクリン（toddaculin）の抽出には、サルカケミカンの茎部乾燥物を用いた。図１に示すように、乾燥物（乾燥重量 約 500 g）を粉砕し、ヘキサンで還流抽出することにより、ヘキサン抽出エキス（約13 g）を調製した。得られたエキスについて、ダイヤイオン（商標）HP-20(三菱化学)を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、アセトニトリルのグラジエントでFr.1-3の各画分に分離を行った。次に分取HPLCにより、トダクリンの単離・精製を行った。減圧下濃縮後、凍結乾燥で結晶化させることにより、白色板状晶としてトダクリン（toddaculin）を約2 gの収量で単離した。
【００３７】
トダクリン（toddaculin）の1H- および13C-NMR スペクトルの帰属データは図２および図３に示した。図３中の番号は、図２の位置に相当する。
【００３８】
化合物は、無色プリズム状結晶として得られ、GC-MSのマススペクトル中のm/z 274は分子イオンと考えられること、FT-MSのマススペクトルからm/z 275.12がプロトン付加イオンと考えられることから、質量数は274.31と判断され、組成式はC16H18O4と推定された。二次元相関法を用いて、1Hおよび13C-NMRで認められた各シグナルを帰属した(図２)。NMRの結果から本物質の構造は図３に示すような構造であると推察された。構造式をPub Chemで検索したところ，toddaculinと呼ばれる既知成分であった。今回測定した本物質の1H-NMRスペクトルはtoddaculinの文献（藥學雜誌 111(7), 365-375)の帰属データと高い一致性を示した。以上の結果から、本物質はトダクリン（toddaculin）であると同定した。
【００３９】
[実施例２]  破骨細胞分化抑制試験（TRAP活性抑制）
マウスマクロファージ様RAW264細胞（RAW264細胞という）（理研より入手）は、通常培養条件下においては単球細胞様の形態を示す。RAW264細胞は、RANKL刺激を与えることにより、多核細胞を形成しながら、効率的に破骨細胞へと分化するので、化合物による破骨細胞への分化活性を分化マーカーであるTRAP活性を評価することで、破骨細胞への分化誘導抑制作用の評価が可能である。RAW264細胞の破骨細胞への分化誘導は、以下の方法で行った。
【００４０】
RAW264細胞を培地（10%FBS(胎児血清)を含むイーグル培地）を用いて5.0 x 104 細胞/mLとなるよう調整し、これを24ウェルマルチウェルプレートに0.5 mL/wellにて分注した。培養プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルに10 ng/mL RANKLからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を最終濃度が20 μM、10 μM、5 μMおよび2.5 μMになるように添加した。72時間後、20 μMのトダクリンを添加した細胞について顕微鏡観察を行った。結果（顕微鏡観察写真）を図４に示す。図４aはRANKL刺激なし、図４bはRANKL刺激ありの結果であり、図４cはRANKL刺激に加えトダクリンを添加した時の結果を示す。図４bに示すように、RANKL刺激により多核細胞を形成したが、トダクリンを添加した場合、多核細胞の形成は認められなかった(図４c)。この結果は、トダクリンが多核細胞への分化を抑制している事を示す。次いで、培地を抜き取り、生理食塩水で2回洗浄後、細胞溶解液を1000 μL添加し、超音波処理することにより、細胞を溶解した。細胞溶解液を10,000 rpmで3分遠心した後、上清を分取し、酸性フォスファターゼ基質を添加することにより、TRAP活性をプレートリーダーで測定した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図５に示す。図５中、BLはRANKL刺激なしを示し、CNはRANKL刺激ありを示す。図５に示すように、トダクリン（toddaculin）を添加した場合、濃度依存的にTRAP活性が低下した。
【００４１】
図４および図５の結果より、サルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）は、優れた破骨細胞分化抑制作用を有することが分かった。
【００４２】
[実施例３]  破骨細胞分化抑制試験（NF-κB転写活性抑制）
破骨細胞への分化および活性化のメカニズムとして、RANKLによりNuclear factor-κB（NF-κB）が活性化することにより、NF-κBの経路が刺激され、破骨細胞への分化および活性化が促進されることが知られている。NFκB転写活性抑制作用をレポーターアッセイによって評価することで分化誘導抑制作用の評価が可能である。RAW264細胞のレポーターベクターによる形質転換およびルシフェラーゼ活性の測定は、以下の方法で行った。
【００４３】
マウスマクロファージ様RAW264細胞をレポーターベクターにより形質転換し、ルミノメーターにより特定の基質を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。この際、10 ng/mL RANKLからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を20 μM、10 μM、5 μMまたは2.5 μMになるように添加した。形質転換効率は、Renilla luciferaseの活性を測定することにより補正した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図６に示す。図６中、BLはRANKL刺激なしを示し、CNはRANKL刺激ありを示す。図6に示すように、トダクリンがNF-κBの転写活性を抑制していた。
【００４４】
[実施例４]  骨芽細胞分化促進試験（ALP活性促進）
マウス頭蓋骨由来繊維芽細胞MC3T3-E1細胞（MC3T3-E1細胞という）（理研より入手）は、通常培養条件下においては繊維芽細胞様の形態を示す。MC3T3-E1細胞は、アスコルビン酸刺激を与えることにより、骨芽細胞へと分化が誘導されるので、化合物による骨芽細胞への分化活性を分化マーカーであるALP活性を評価することで、骨芽細胞への分化誘導促進作用の評価が可能である。MCT3-E1細胞の骨芽細胞への分化誘導は、以下の方法で行った。
【００４５】
MC3T3-E1細胞を培地（10%FBS(胎児血清)を含むイーグル培地）を用いて1.0 x 106 細胞/mLとなるよう調整し、これを24ウェルマルチウェルプレートに1.0 mL/wellにて分注した。培養プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルに50 μg/mL アスコルビン酸からなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を最終濃度が50 μM、20 μM、10 μMまたは 5μMになるように添加した。144時間後、培地を抜き取り、生理食塩水で2回洗浄後、細胞溶解液を600μL添加し、超音波処理することにより、細胞を溶解した。細胞溶解液を10,000 rpmで3分遠心した後、上清を分取し、アルカリフォスファターゼ基質を添加することにより、ALP活性をプレートリーダーで測定した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図７に示す。図７中、BLは分化誘導刺激なしを示し、CNは分化誘導刺激ありを示す。
【００４６】
図７の結果より、サルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）によりMC3T3-E1細胞において濃度依存的なALP活性の上昇が上昇した。すなわち、骨芽細胞への分化を促進していることが示された。
【００４７】
[実施例５]  骨芽細胞分化促進試験（アリザリンレッド染色）
MC3T3-E1細胞内の石灰化を、アリザリンレッド染色法によって、目視で評価することが可能である。アリザリンレッドは、キレート反応によってカルシウムに吸着するため、石灰化が進んでいるほど、細胞は濃く染色される。MCT3-E1細胞のアリザリンレッド染色は、以下の方法で行った。
【００４８】
MC3T3-E1細胞を培地（10%FBS(胎児血清)を含むイーグル培地）を用いて1.0 x 106 細胞/mLとなるよう調整し、これを24ウェルマルチウェルプレートに1.0 mL/wellにて分注した。培養プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルに50 μg/mL アスコルビン酸および10 mM βグロセロフォスフェートからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を最終濃度が50 μMになるように添加した。以降、2日おきに培地を交換し、１６日経過後に培地を抜き取り、HBSS（-）で細胞を洗浄した後、エタノールで固定後、20 mmol/Lアリザリンレッド染色（pH4.8）液で石灰化マトリックスを染色し、HBSS（-）で洗浄した。プレート内のアリザリンレッド色素を、10%セチルピリジニウムクロライドで溶解し、波長562nmの吸光を測定した。結果を図８に示す。図８aは分化誘導刺激なしの結果、図８bは分化誘導刺激ありの結果、図８cは分化誘導刺激ありにトダクリン（toddaculin）を添加した結果を示す。
【００４９】
図８に示すように、サルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を添加して培養した細胞は、50 μg/mLアスコルビン酸および10 mM βグロセロフォスフェートからなる分化誘導剤のみと比較して、より色が濃くなっていることがわかる。すなわち、骨芽細胞への分化・活性化により、カルシウムの沈着（石灰化）が進んでいることが示された。
【００５０】
[実施例６]  DNAマイクロアレイ解析
次いで、破骨細胞および骨芽細胞の遺伝子発現解析の検討を行った。RAW264細胞に10 ng/mL RANKLからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を最終濃度が20 μMとなるように添加し、3日後のRAW264細胞をTRIzol(商標)（ライフテクノロジーズ・ジャパン）で溶解し、TotalRNAを得た。TotalRNAからBiotin標識aRNAを作製し、三菱レイヨン製フォーカストアレイ・ジェノパール 骨代謝チップにハイブリダイズした。
【００５１】
同様に、MC3T3-E1細胞に50 μg/mL アスコルビン酸からなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）を最終濃度が50 μMとなるように添加し、6日後のMC3T3-E1細胞をTRIzol(商標)（ライフテクノロジーズ・ジャパン）で溶解し、TotalRNAを得た。TotalRNAからBiotin標識aRNAを作製し、三菱レイヨン製フォーカストアレイ・ジェノパール 骨代謝チップにハイブリダイズした。
【００５２】
遺伝子発現解析の結果、破骨細胞ではトダクリン（toddaculin）において、破骨細胞の分化のマーカーである酸性フォスファターゼ(Acp5)、カテプシンK（Ctsk）、Oscarなどの遺伝子発現抑制が顕著であった。骨芽細胞ではトダクリン（toddaculin）において、骨芽細胞の分化のマーカーであるアルカリフォスファターゼ（Alpl）、オステオカルシン（Bglap）などの遺伝子発現上昇が顕著であった。
【００５３】
DNAマイクロアレイの結果より、サルカケミカンに含まれるトダクリン（toddaculin）は遺伝子レベルにおいても、破骨細胞の分化を抑制、骨芽細胞への分化を促進し、優れた骨代謝改善作用を有することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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