(57)【要約】【課題】アプタマーによる生体分子検出分子のセンサ感部を固体表面に固定した検出素子で、より正確でより高い感度の検出ができるようにする。【解決手段】生体分子検出素子は、生体分子検出分子１００，グラフェンから構成されたセンサ感部１１１，およびセンサ感部１１１が固定される基体１１２から構成されている。生体分子検出分子１００は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマー１０１と、アプタマー１０１の一端に結合し、出力される蛍光がセンサ感部との距離に対応して変化する蛍光色素分子からなるシグナル分子１０２と、アプタマー１０１の他端に結合してアプタマー１０１とセンサ感部とを接着する接着分子１０３とを備える。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーの一端に結合し、出力される蛍光がセンサ感部との距離に対応して変化する蛍光色素分子からなるシグナル分子と、
前記アプタマーの他端に結合して前記アプタマーと前記センサ感部とを接着する接着分子と、
前記アプタマー，前記シグナル分子，前記接着分子からなる生体分子検出分子が、前記接着分子で接着しているグラフェンから構成されたセンサ感部と、
前記センサ感部が固定される基体と
を備えることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子検出素子において、
前記接着分子は、ピレンが骨格に含まれていることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項３】
請求項２記載の生体分子検出素子において、
前記接着分子は、ピレンブチル酸であることを特徴とする生体分子検出素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする生体分子を検出する生体分子検出分子を備える生体分子検出素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子検出方法には、検出対象となる標的生体分子を選択的に認識する生体分子検出分子を用い、生体分子検出分子と標的生体分子である例えばタンパク質との結合によって起こる分子構造の変化や反応物質の生成などの化学現象を、光や電気などの信号に変換して検出する方法がある。この方法で用いられる生体分子検出分子としては、生体由来の分子（核酸，アミノ酸，抗体，核酸，脂質，糖鎖，イオンチャネルなど）がある。標的生体分子と生体分子検出分子との結合によって起こる生体分子検出分子の特異的な構造変化を利用することで、標的生体分子との高い選択性を確保することができる。
【０００３】
構造変化を利用した生体分子検出分子の例として、標的生体分子との結合により構造変化するアプタマー（標的生体分子に特異的に結合する核酸またはペプチドから構成されるリガンド）を用いることができる。アプタマーは、一般的に、特定の標的生体分子との結合によってある特定の構造へと変化することが知られている、さらに、配列設計により、構造変化後のアプタマーの構造を精密に設計できることも知られている。アプタマーの標的生体分子としては、多岐にわたる生体分子が開示されており、例えば、各種タンパク質，酵素，ペプチド，抗体，レセプター，ホルモン，アミノ酸，抗生物質、また、その他の種々の化合物などが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
アプタマーを利用した生体分子検出法においては、アプタマーの構造変化を検出可能な信号に変換する手法として、アプタマーの予め設計した部位に種々のシグナル分子を修飾（付加）することが有用である。シグナル分子を修飾したアプタマーが標的生体分子との複合体を形成すると、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離が変化して出力される信号が変化するため、検出可能な信号変化として検知することが可能となる。ここで用いられるシグナル分子は、検出方法によって異なる。例えば、蛍光検出を用いる場合、シグナル分子としては各種の蛍光分子を用い、センサ感部には酸化グラフェンなどの蛍光クエンチャー（励起エネルギー吸収物質）を用いることができる（非特許文献２参照）。
【０００５】
蛍光分子は、センサ感部との距離が遠くなると、センサ感部によるクエンチング効率が低下する。この状態は、例えば、蛍光顕微鏡などを用いることで観察（検出）できる。蛍光分子をシグナル分子として用いる構成では、標的生体分子とアプタマーとの複合体形成による、蛍光分子とセンサ感部とが離間したことによる発光強度の増加を用いて検出を行う（非特許文献３参照）。このため、標的生体分子を検出する前の初期段階では、アプタマーに修飾されている（結合している）蛍光分子を可能な範囲でセンサ感部の近傍に配置し、クエンチング効率が最大となっていることが望ましい。一方で、アプタマーが標的生体分子と複合体を形成した後は、クエンチングが起こらない距離に蛍光分子がセンサ感部から遠ざかることが望ましい。
【０００６】
上述した生体分子検出分子による検出方法に対応し、センサ感部としての酸化グラフェンを固体表面に固定化して検出素子とする技術が開発されている（特許文献１参照）。この技術では、酸化グラフェンの小片が分散した水分散液として用いる非特許文献３の技術とは異なり、固体表面に固定化された酸化グラフェンの表面を、接着分子−アプタマー−蛍光色素の順に化学結合した生体分子検出用分子で修飾している。生体分子検出素子が固体表面に固定化されているため、マイクロ流路の搭載が可能であり、複数の試料を同時に検出でき定量的な比較が可能であるなどの利点を持っている。
【０００７】
特許文献１では、酸化グラフェンを固体表面に固定するために、酸化グラフェンの水分散液を固体表面に塗布する方法が用いられている。ここで、このようなセンサ動作は、酸化グラフェン表面のみで行われるため、酸化グラフェンの被覆率とシグナル強度が比例関係にある。また、一層と二層以上が重なった部位とでは、検出感度が異なる。これらのことは、酸化グラフェンの被覆率が異なる場合、検出対象物の定量比較が不可能となることを意味する。従って、より正確な検出のためには、酸化グラフェンが固体表面を高い密度で、理想的には固体表面の露出部位がないように、一層で覆うことが重要である。
【０００８】
しかしながら、通常の酸化グラフェンには寸法のばらつきがあり、最大で約１００μｍ四方、小さいものは数十ｎｍ四方のものが含まれる。酸化グラフェンの形状不均一性および塗布プロセスの不均一性から、酸化グラフェンが敷き詰められておらず固体表面が露出した領域、あるいは酸化グラフェンが二層以上に重なった領域が無い、酸化グラフェン一層での被覆率１００％の固体表面を作製するのは極めて困難である。このため、上述した技術では、より正確な検出ができない場合があるという問題があった。
【０００９】
さらに、特許文献１の方法においては、酸化グラフェンに対する接着分子としてベンゼン環が複数結合した分子、例えばベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）、が用いられている。これらの接着分子は、酸化グラフェンに含まれるグラフェン様構造部位に作用し、生体分子検出用分子を酸化グラフェン表面に固定する役割を担う。
【００１０】
酸化グラフェンは、酸化されたアモルファス構造部位とグラフェン様構造部位とがモザイク状に混在した構造を有している。感度の向上には、より多くの生体分子検出用分子で酸化グラフェンを修飾することが重要となる。しかしながら、酸化グラフェンをセンサ感部として用いると、修飾する分子数密度の最大値が、酸化グラフェン中のグラフェン様構造部位の割合によって制限されるという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−２５３８２５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】T. Hermann and D. J. Patel, "Adaptive Recognition by Nucleic Acid Aptamers", SCIENCE, vol.287, pp.820-825, 2000.
【非特許文献２】E. Treossi et al. , "High-Contrast Visualization of Graphene Oxide on Dye-Sensitized Glass, Quartz, and Silicon by Fluorescence Quenching", J. AM. CHEM. SOC., vol.131, pp.15576-15577, 2009.
【非特許文献３】H. Chang et al. , "Graphene Fluorescence Resonance Energy Transfer Aptasensor for the Thrombin Detection", Analytical Chemistry, vol.82, no.6, pp.2341-2346, 2010.
【非特許文献４】K. S. Novoselov et al. ,"Electric Field Effect in Atomically Thin Carbon Films", SCIENCE, vol.306, pp.666-669, 2004.
【非特許文献５】A. J. van Bommel et al. ,"LEED AND AUGER ELECTRON OBSERVATIONS OF THE SiC(0001) SURFACE",Surface Science, VOL.48, PP463-472, 1975.
【非特許文献６】A. Reina ET AL. ,"Large Area, Few-Layer Graphene Films on Arbitrary Substrates by Chemical Vapor Deposition", Nano Letters, vol.9, no.1, pp.30-35,2009.
【非特許文献７】X. Li et al. ,"Large-Area Synthesis of High-Quality and Uniform Graphene Films on Copper Foils",SCIENCE, vol.324, pp.1312-1314,2009.
【非特許文献８】F. Maeda and H. Hibino , "Thin Graphitic Structure Formationon Various Substrates by Gas-Source Molecular Beam Epitaxy Using Cracked Ethanol", Japanese Journal of Applied Physics, vol.49, 04DH13, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、アプタマーによる生体分子検出分子のセンサ感部に酸化グラフェンを、固体表面に固定して検出に用いる場合、正確な検出ができず、また、高い感度の検出ができないという問題があった。
【００１４】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、アプタマーによる生体分子検出分子のセンサ感部を固体表面に固定した検出素子で、より正確でより高い感度の検出ができるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に係る生体分子検出素子は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーと、アプタマーの一端に結合し、出力される蛍光がセンサ感部との距離に対応して変化する蛍光色素分子からなるシグナル分子と、アプタマーの他端に結合してアプタマーとセンサ感部とを接着する接着分子と、アプタマー，シグナル分子，接着分子からなる生体分子検出分子が、接着分子で接着しているグラフェンから構成されたセンサ感部と、センサ感部が固定される基体とを備える。
【００１６】
上記接着分子は、ピレンが骨格に含まれていればよい。また、接着分子は、ピレンブチル酸であればよい。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したことにより、本発明によれば、アプタマーによる生体分子検出分子のセンサ感部を固体表面に固定した検出素子で、より正確でより高い感度の検出ができるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の作製について説明するフローチャートである。
【図４】図４は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の作製について説明するフローチャートである。
【図５】図５は、実施例１における生体分子検出素子を用いてＰＳＡを検出した結果を示す特性図である。
【図６】図６は、実施例１における生体分子検出素子を用いてＰＳＡを検出したときに蛍光顕微鏡により観察された状態を示す写真である。
【図７】図７は、実施例２における生体分子検出素子を用いてＰＳＡを検出した結果を示す特性図である。
【図８】図８は、実施例３における生体分子検出素子を用いてＰＳＡを検出したときに蛍光顕微鏡により観察された状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。この生体分子検出素子は、生体分子検出分子１００，グラフェンから構成されたセンサ感部１１１，およびセンサ感部１１１が固定される基体１１２から構成されている。
【００２０】
生体分子検出分子１００は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマー１０１と、アプタマー１０１の一端に結合し、出力される蛍光がセンサ感部との距離に対応して変化する蛍光色素分子からなるシグナル分子１０２と、アプタマー１０１の他端に結合してアプタマー１０１とセンサ感部とを接着する接着分子１０３とを備える。なお、「アプタマー」は、検出対象の生体分子と特異的に結合する部分のことを示すものとする。
【００２１】
上述した実施の形態における生体分子検出素子では、グラフェンから構成されたセンサ感部１１１が、蛍光色素分子からなるシグナル分子１０２の蛍光クエンチャーとして機能し、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化が、電気信号の変化として検出できる。
【００２２】
また、接着分子１０３は、センサ感部１１１に物理吸着する分子から構成すればよい。例えば、センサ感部１１１は、炭素材料であるグラフェンから構成されているので、接着分子１０３は、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）が骨格に含まれている分子であればよい。これら分子であれば、炭素材料であるグラフェンに吸着（接着）させることができる。また、接着分子１０３は、グラフェンからなるセンサ感部１１１に化学的に結合する分子であってもよい。
【００２３】
本実施の形態における生体分子検出素子では、図２に示すように、アプタマー１０１が検出対象の生体分子２０１との複合体を形成した場合も、アプタマー１０１は接着分子１０３によりセンサ感部１１１に接着しているので、生体分子検出分子１００が、センサ感部１１１より脱離することがない。この結果、上述したように複合体が形成される状態となっても、シグナル分子１０２より出力される信号は、センサ感部１１１の箇所で検出可能であり、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化によって生じる検出信号は、センサ感部１１１表面近くで検出することができる。
【００２４】
例えば、基体１１２は、チップ型のデバイスの検出面となる基板であり、この検出面において、生体分子検出分子１００を用いた生体分子の検出が可能となる。
【００２５】
ここで、本発明は、発明者らの鋭意の検討により、グラフェンが、酸化グラフェンと同様に、蛍光を高効率にクエンチする効果を有するという知見をもとになし得たものである。蛍光分子（蛍光色素分子）からシグナル分子１０２を構成した生体分子検出分子１００では、センサ感部１１１が、蛍光クエンチャー（励起エネルギー吸収物質）から構成されていることが重要となる。従来では、酸化グラフェンは、蛍光クエンチャーとなることは知られていたが、グラフェンが蛍光クエンチャーとして用いることは知られていなかった。これに対し、発明者らは、グラフェンが、蛍光クエンチャーとして機能することを見いだした。
【００２６】
ここで、グラフェンは、全体が炭素原子の二重結合（ｓｐ2混成軌道）でできた蜂の巣状の構造を有しており、ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネンなどによる接着分子１０３を、表面のいたるところに接着できる。従って、グラフェンは、生体分子検出分子１００の固定に適しており、グラフェンから構成したセンサ感部１１１によれば、センサ感部１１１の全域を、生体分子検出分子１００で修飾することが容易である。
【００２７】
また、グラフェンは、一層のみで大面積に製造することができる。例えば、グラファイトの剥離法によって任意の基板の上にグラフェンが形成可能である（非特許文献４参照）。また、シリコンカーバイト（ＳｉＣ）基板を用い、この表面を熱分解することで、ＳｉＣ基板の表面に単層および多層のグラフェンが形成できる（非特許文献５参照）。また、化学気相成長法によって形成したグラフェンを、所望とする基板の上に転写するようにしてもよい（非特許文献６，７参照）。また、分子線エピタキシー法によってグラフェンを形成することもできる（非特許文献８参照）。
【００２８】
従って、グラフェンをセンサ感部１１１とした生体分子検出素子によれば、グラフェン一層で構成したセンサ感部１１１による被覆率１００％の基体１１２表面を作製することが容易である。
【００２９】
以上のことより、実施の形態の生体分子検出素子によれば、より正確でより高い感度の検出ができるようになる。
【００３０】
以下、実施の形態における生体分子検出素子の製造方法について説明する。シグナル分子および接着分子をアプタマーに化学結合する方法としては、アプタマーの片方の末端にアミノ基などを導入し、ここにシグナル分子または接着分子に導入したカルボキシル基もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を反応させて化学結合を形成する方法が好ましい。
【００３１】
また、グラフェンからなるセンサ感部の表面に上記のアプタマーを接着させる方法としては、種々の方法が可能である。例えば、図３に示すように、ステップＳ３０１で、センサ感部（グラフェン）を作製し、ステップＳ３０２で作製したグラフェンをチップとなる基板に固定した後、ステップＳ３０３で、グラフェンの表面に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を有する接着分子を接着（吸着）させる。一方で、ステップＳ３０４で、アプタマーを合成し、ステップＳ３０５で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端にアミノ基（接着分子結合部位）を導入する。
【００３２】
これらの後、ステップＳ３０６で、シグナル分子が結合してアミノ基が導入されたアプタマーのアミノ基の部分を、センサ感部表面に吸着している接着分子に結合させればよい。一方の末端に蛍光色素分子などが結合し、かつ他方の末端にアミノ基が導入されているアプタマーは、核酸やペプチドのカスタム合成を行う試薬メーカーなどから入手可能である。
【００３３】
ここで、グラフェンの作製形態によってはステップＳ３０２を省略することもできる。例えばＳｉＣ表面を熱分解することでグラフェンを作製すれば、グラフェンはすでにＳｉＣ基板の上に固定された状態として得られる。この場合、作製したグラフェンを、他の基板に固定する必要が無く、ＳｉＣ基板を基体として用いれば、ステップＳ３０２が省略できる。
【００３４】
また、図４に示すように、ステップＳ４０１で、グラフェンを作製し、ステップＳ３０２で作製したグラフェンをチップとなる基板に固定する。一方で、ステップＳ４０３で、アプタマーを合成し、ステップＳ４０４で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端に接着分子を結合させる。これらの後、ステップＳ４０５で、シグナル分子および接着分子が結合したアプタマーの接着分子を、グラフェン表面に接着（吸着）させればよい。
【００３５】
グラフェン表面に接着させるアプタマー（生体分子検出分子）の密度の制御は、固定時間，アプタマーの濃度，反応温度などを制御することで達成される。また、この密度は、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）法など種々の分析方法により確認可能である。
【００３６】
また、生体分子検出分子がグラフェンに接着している生体分子検出素子を固定する基板としては、ガラス基板，石英基板、シリコン基板などを用いることができる。なお、これらの基板に、金属膜などが蒸着されていてもよい。
【００３７】
生体分子検出素子を固定した生体分子検出チップでは、試料溶液を直接検出部に滴下してもよい。また、流路を搭載することによって、生体分子検出素子が固定されている検出部に試料溶液を導入してもよい。流路には様々な材料が適用可能であり、流路の作製には、種々の方法があげられるが、ポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂を、鋳型を用いて作製する方法が好ましい。ポリスチレンなどの樹脂を用いて、射出成型法などで作製してもよい。さらに、ガラス板，石英板，アクリル板などを、ミリング法を用いて加工することで成形してもよい。
【００３８】
流路の幅は、１００μｍ〜１０００μｍ程度、流路の高さは１０μｍ〜５００μｍ程度、流路の長さは１ｍｍ〜１０ｍｍ程度が望ましい。この寸法とした流路では、毛管現象を利用して溶液を簡単に送液することが可能であり、ポンプなどの外部の駆動力を使う必要がない。また、複数本の流路を並列させる場合は、異なる流路からの液漏れを回避するため、隣り合う流路の間隔は１０μｍ以上が望ましい。
【００３９】
［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。グラフェンは、一般的な製造方法で作製したものを用いることができる。例えばグラファイトを剥離する方法、シリコンカーバイドを熱分解する方法、化学気相成長による方法、分子ビームエピタキシー成長による方法などがあげられる（非特許文献４−８参照）。
【００４０】
実施例１では、層厚３００ｎｍの酸化シリコン層が表面に形成されているシリコンウエハ上に、銅箔上に化学気相成長したグラフェンを転写したものを用いる（シリコンプラットフォーム株から購入）。このグラフェンが転写されているシリコンウエハを、１センチメートル角の大きさに分割した基板（グラフェン転写基板）を用いた。
【００４１】
次に、グラフェン表面への接着分子の導入について説明する。接着分子を導入では、ピレンブチル酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブチル酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液中に、グラフェン転写基板を室温で１時間静置する。これをジメチルホルムアミドで洗浄し、この後、風乾する。
【００４２】
次いで、予め３'末端に蛍光色素分子（シグナル分子）を結合させ、５'末端にアミノ基を結合させたアプタマーの水溶液（１００μＭ）をグラフェン上に滴下する。次いで、これらを室温（２３℃程度）で１時間静置し、グラフェンに吸着しているピレンブチル酸のＣＯＯＨ基と、アプタマーの５'末端に結合させたアミノ基とを反応させ、ペプチド結合を介して結合する。これを、超純水で洗浄し、風乾する。これらのことにより、接着分子であるピレンブチル酸とシグナル分子である蛍光色素分子の両者が結合されているアプタマーが、基板上のグラフェン表面に固定される。
【００４３】
アプタマーとしては、例えば前立腺ガンマーカであるＰＳＡに特異的に結合する配列を含んだ、５'−ＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３'を用いることができる。また３'末端には、蛍光色素分子として、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を結合させることができる。このように作製した検出用チップにおいて、グラフェン表面に接着分子が接着している状態は、ＡＦＭ法などの分析方法によって確認できる。
【００４４】
以上の工程によって作製した本発明による生体分子検出素子を、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。まず超純水を滴下してグラフェン表面の蛍光像を測定した。グラフェン表面には、アプタマーと結合しているＦＡＭが配置されているが、蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭとグラフェン（センサ感部）の距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭからの蛍光が消光（クエンチング）していることを示している。
【００４５】
次いで、蛍光像を観察しながら、１００μｇ／ｍｌのＰＳＡ水溶液を滴下した。図５はＰＳＡ滴下前から滴下後にわたって、２０秒おきに蛍光強度をプロットしたグラフである。ＰＳＡは図５の（ｂ）の直前に滴下した。
【００４６】
ＰＳＡは、検出対象の生体分子であり、上述したアプタマーと特異的に結合する。実施例１の素子においては、滴下直後からグラフェン表面の蛍光強度の増加が観測され、図５に示すように、数十秒後に強度が最大となり、徐々に強度が弱くなることが観測された。また、図５の（ａ）に示すＰＳＡ水溶液滴下前は、図６の（ａ）に示すように、検出部において、発光は確認されないが、図５の（ｂ）に示すＰＳＡ水溶液滴下直後は、図６の（ｂ）に示すように、明確に発光が確認された。発光色は、緑色であった。なお、図６は、蛍光顕微鏡観察像を示す写真である。
【００４７】
これらの結果は、アプタマーとＰＳＡとが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに結合しているＦＡＭが、グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に離間して発光したことで説明できる。
【００４８】
以上のことより、実施例１によれば、本発明を用いて、アプタマーが対象とする生体分子と複合体を形成した後も、生体分子検出分子がセンサ感部であるグラフェンの上に存在し、蛍光色素分子が生体分子検出分子と共に、グラフェンから完全に脱離してしまう問題を回避できる。また、蛍光色素分子とグラフェン表面との距離の変化によって生じる検出信号は、グラフェンを固定した基板表面で検出することが可能となるという本発明の効果が示された。これにより、本発明による生体分子検出素子が実現可能なことが示された。
【００４９】
［実施例２］
次に、実施例２について説明する。上述した実施例１と同様にグラフェン表面を生体分子検出分子で修飾した。実施例１と同様に、作製した素子のグラフェン表面の蛍光像を観察しながら、ＰＳＡ水溶液を滴下した。さらに純水を一定時間ごとに滴下し、ＰＳＡの濃度を低下させた。このときの蛍光強度の変化を図７に示す。
【００５０】
はじめに４０μＬの純水を滴下し、作製した素子のグラフェン表面の蛍光像を観察すると、図７の（ａ）に示すように蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭとグラフェンの距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭからの蛍光が消光（クエンチング）していることを示している。
【００５１】
観察開始から１００秒後に、１００μｇ／ｍｌのＰＳＡ水溶液を追加で滴下した。滴下直後から、図７の（ｂ）に示すようにグラフェン表面の蛍光強度の増加が観測された。さらに２００秒経過の後、純水４０μＬの純水をさらに追加で滴下すると、図７の（ｃ）に示すように滴下直後から蛍光強度がさらも減少した。図７の（ｄ）〜（ｆ）に示すように、２００秒経過ごとに純水４０μＬを追加で滴下する操作をさらに３回繰り返すと、純水を追加する都度、蛍光強度が減少する結果が得られた。これは、本発明の素子が、ＰＳＡの濃度に応じた蛍光強度を与えることを示している。
【００５２】
［実施例３］
次に、実施例３について説明する。上述した実施例１と同様にグラフェン表面を生体分子検出分子で修飾した。実施例１と同様に、作製した素子のグラフェン表面の蛍光像を観察しながら、ＰＳＡ水溶液を滴下した。滴下直後からグラフェン表面の蛍光強度の増加が観測された。
【００５３】
次に、測定後の素子を純水流水下で１〜２分さらし、グラフェン表面を洗浄した。洗浄した素子は風乾し、そのまま暗所に保管した。３日間暗所に保管した素子を用い、再び同様の観察を行った。すなわち、保管した素子のグラフェン表面の蛍光像を観察しながら、ＰＳＡ水溶液を滴下した。
【００５４】
この結果、滴下前には、図８の（ａ）に示すように検出部において発光は確認されないが、ＰＳＡ水溶液滴下直後には、図８の（ｂ）に示すように明確に発光が確認された。発光色は、緑色であった。なお、図８は、蛍光顕微鏡観察像を示す写真である。
【００５５】
さらに、測定→洗浄→再使用のサイクルを３回行った後でも、本発明の素子はＰＳＡに対して同様のセンサ応答を示すことを確認した。このことから、グラフェン表面に就職したＦＡＭと結合しているアプタマーは、ＰＳＡに選択的に結合した後も、またこれを洗浄した後も、グラフェン表面から脱離していないことが示された。
【００５６】
以上に説明したように、本発明によれば、蛍光クエンチャーとしてのセンサ感部をグラフェンから構成するようにしたので、アプタマーによる生体分子検出分子のセンサ感部を固体表面に固定した検出素子で、より正確でより高い感度の検出ができるようになる。
【００５７】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、アプタマーは、核酸から構成したものに限らず、ペプチドから構成されたものであってもよい。また、シグナル分子や接着分子が結合しているアプタマーの端部に、さらに、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。
【００５８】
また、接着分子は、ピレンブチル酸などピレンが骨格に含まれているものに限らず、例えば、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）などであってもよい。また、接着分子をアプタマーと結合させる官能基（分子）は、ブチル酸に限るものではなく、「−ＣＯＯＨ」および「−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ」であってもよい。なお、ｎは、好ましくは２〜１０の範囲がよい。
【符号の説明】
【００５９】
１００…生体分子検出分子、１０１…アプタマー、１０２…シグナル分子、１０３…接着分子、１１１…センサ感部、１１２…基体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【図８】
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