(57)【要約】【課題】エイコサペンタエン酸（EPA）を、全脂肪酸の質量パーセント（％TFA）として計測して50質量パーセントより多く含み、EPA  ％TFAの、％TFAとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも4.5である油を産生するヤロウイア・リポリティカ改変株、それを用いてEPAを産生する方法等を提供する。【解決手段】本発明の改変株は、他の異種Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼに加え、少なくとも１つのΔ9エロンガーゼ／Δ8デサチュラーゼマルチザイムを過剰発現し、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、マロニルCoAシンテターゼ及び／又はアシルCoAリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼを過剰発現し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測して少なくとも５０質量パーセントのエイコサペンタエン酸、及び
（ｂ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも４．５であること、
を含む、未濃縮抽出油。
【請求項２】
少なくとも５５質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、請求項１記載の油。
【請求項３】
少なくとも６０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、請求項１または２記載の油。
【請求項４】
エイコサペンタエン酸の産生用に操作された発酵組換えヤロウイア種細胞から抽出され、
前記細胞が、
ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに融合した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを含むポリペプチドを含む少なくとも１つのマルチザイムと、
（ｂ）発現が下方制御された少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質と、
（ｃ）マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換え構築物、
とを含む細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の油。
【請求項５】
細胞がマロニルＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記マロニルＣｏＡシンテターゼが配列番号４０または配列番号４２の配列からなる、請求項４記載の油。
【請求項６】
細胞がアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼが配列番号１５、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３１または配列番号３２の配列からなる、請求項４記載の油。
【請求項７】
マルチザイムがマルチザイムリンカーを含み、前記マルチザイムリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の配列からなる、請求項４記載の油。
【請求項８】
マルチザイムが配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の配列からなる、請求項４記載の油。
【請求項９】
更に、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の油。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の油を含む食品または飼料。
【請求項１１】
エイコサペンタエン酸の産生用に操作された発酵組換えヤロウイア種細胞を培養することを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の油を製造する方法であって、前記細胞が
ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに融合した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを含むポリペプチドを含む少なくとも１つのマルチザイムと、
（ｂ）発現が下方制御された少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質と、
（ｃ）マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換え構築物、
とを含む細胞である、
前記方法。
【請求項１２】
細胞がマロニルＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記マロニルＣｏＡシンテターゼが配列番号４０または配列番号４２の配列からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞がアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼが配列番号１５、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３１または配列番号３２の配列からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
マルチザイムがマルチザイムリンカーを含み、前記マルチザイムリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の配列からなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
マルチザイムが配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の配列からなる、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、各々が２００９年６月１６日に出願され、且つ各々が本明細書によって全体として参照により援用される米国仮特許出願第６１／１８７３６６号明細書、同第６１／１８７３６８号明細書及び同第６１／１８７３５９号明細書の利益を主張する。
本発明はバイオテクノロジーの分野に含まれる。より具体的には、本発明は、ω−３多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］のエイコサペンタエン酸を高濃度で効率的に産生する能力を有する油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変株に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；ω−３］の臨床及び製薬における価値は周知されている（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）。同様に、組換え手段を用いて微生物中でＥＰＡを産生する利点もまた、天然の微生物供給源からの、又は魚油及び海洋プランクトンからの単離を介するＥＰＡ産生に対比されるものとして広く認知されている。
文献に報告される最近の例のいくつかによれば、ＥＰＡ産生に関与するω−３／ω−６多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］生合成経路の様々な部分が植物及び非油性酵母に導入されているが、本出願人の譲受人は、油性酵母のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に主眼を置いて注力してきた（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）。油性酵母は、天然で油を合成及び蓄積する能力を有する酵母として定義され、油の蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％である。
【０００３】
より具体的には、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書は、以下の遺伝子、すなわちΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ及びＣ16/18エロンガーゼの発現により、γ−リノレン酸［「ＧＬＡ」；ω−６］が同時に合成されることなく組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株において全脂肪酸の９％のＥＰＡが産生されることを実証した。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書はＥＰＡ産生に最適化された組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株について記載し、天然ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質（ＰＥＸ１０）の破壊を含む宿主細胞中で以下の遺伝子、すなわちΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ及びジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼを発現させることにより、組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株において全脂肪酸の最大５５．６％のＥＰＡが産生されることを実証した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記に引用する開示はあるものの、ＥＰＡを商業的に生産するためには、最終油産物中のリノール酸［「ＬＡ」；ω−６］などの中間体脂肪酸、及び副産物脂肪酸の生成を最小限に抑える一方で、全脂質含量が高いことに加え、全脂肪酸の質量パーセントとしてのＥＰＡの高産生を可能にし得る株の改良が必要とされている。本出願人は、改良されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株を設計することにより上述の問題を解決しており、この改良は、以下のうちの少なくとも１つを可能にする：全油画分中６１．８％のＥＰＡの産生、乾燥細胞重量の百分率として３９．６％の全脂肪酸の産生、又はＥＰＡ対ＬＡ比が６．１の脂質の産生。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態において、本発明は、
（ａ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測して少なくとも５０質量パーセントのエイコサペンタエン酸
を含む油であって、
（ｂ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも３．１である、
抽出油に関する。
好ましくは、油は微生物由来である。
【０００６】
第２の実施形態において、本発明は、本発明の抽出油であって、前記油がエイコサペンタエン酸の産生について改変された発酵性組換えヤロウイア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）細胞から抽出され、前記細胞が、
ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含む少なくとも少なくとも１つのマルチザイムと、
（ｂ）発現が下方制御された少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質と、
（ｃ）マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換え構築物と、
を含む、抽出油に関する。
好ましくは、マロニルＣｏＡシンテターゼは、配列番号４０及び配列番号４２からなる群から選択される配列から本質的になる。
【０００７】
好ましくは、アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択される配列から本質的になる。
好ましくは、マルチザイムリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される。
好ましくは、マルチザイムは、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３からなる群から選択される配列から本質的になる。
【０００８】
第３の実施形態において、本発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の油又はその誘導体を含むブレンド油に関する。
本発明のブレンド油はまた、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加的な分量の脂肪酸を含むこともできる。
【０００９】
第４の実施形態において、本発明は、本発明の油若しくはその誘導体又は油のブレンド若しくはその誘導体を含む食品又は飼料に関する。
第５の実施形態において、本発明は、本発明の食品であって、食品類似物、機能性食品、医療用食品及び医療用栄養剤からなる群から選択される食品に関する。
第６の実施形態において、本発明は、本発明の油若しくはその誘導体又は油のブレンド若しくはその誘導体を含む製品であって、医薬製品、人工栄養乳、食事サプリメント、及び動物飼料からなる群から選択される製品に関する。
第７の実施形態において、本発明は、本発明の油を含む微生物バイオマスに関する。
第８の実施形態において、本発明は、本発明の微生物バイオマスを含む動物飼料に関する。
第９の実施形態において、本発明は、本発明の動物飼料であって、水産養殖飼料である飼料に関する。
第１０の実施形態において、本発明は、本発明の油であって、有機溶媒による抽出、音波処理及び超臨界流体抽出からなる群から選択される方法を使用して組換えヤロウイア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）宿主細胞から抽出される油に関する。
【００１０】
生物寄託
以下の生物学的材料がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の指定番号、受託番号及び寄託日を有する。
【００１１】
2016101172.tif 000002
【００１２】
上掲の生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」の条項に基づき寄託された。掲載される寄託物は、指定された国際寄託当局において少なくとも３０年間保管され、それを開示する特許の付与に伴い一般に利用可能となる。寄託物を利用可能であることは、政府の措置によって認められる特許権の特例における本発明の実施権をなすものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、以下のこの経路の説明を考察するときに合わせて見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、以下のこの経路の説明を考察するときに合わせて見るべきである。
【図２】全脂質画分中６０．９％より高いＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９４８１株、Ｙ９４９７株及びＹ９５０２株の展開を図示する。
【図３】ｐＹ１１６についてのプラスミドマップを提供する。
【図４Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５。
【図４Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ。
【図５Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＵＭ。
【図５Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ。
【図６Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５。
【図６Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３。
【図７Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＬ４−３９８Ｆ２。
【図７Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ。
【図８Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ。
【図８Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫ１６−ＭＬ。
【図９】全脂質画分中６１．８％より多いＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の展開を図示する。
【図１０Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＺＫＬ２−５ｍ８９Ｃ。
【図１０Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ２０１、キメラＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１１Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ１６８、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１１Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ２０８、キメラＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１２Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ２０７、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１２Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ１７５、キメラＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１３】実施例に記載される株の各々におけるＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、ＬＡ  ％  ＴＦＡ及びＥＰＡ  ％  ＴＦＡのＬＡ  ％  ＴＦＡに対する比の比較を提供する。
【図１４Ａ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ２２２、キメラＹＡＴ１：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１４Ｂ】以下についてのプラスミドマップを提供する：ｐＹ１７７、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【００１４】
本発明は、本願の一部をなす以下の詳細な説明及び添付の配列説明からより十全に理解することができる。
【００１５】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則第５．２条及び第４９．５条（ａ−ｂｉｓ）、及び実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８条及び付属書Ｃ）に則っている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに用いる記号及びフォーマットは、米国特許法施行規則第１．８２２条に規定される規則に準拠する。
配列番号１〜１５６は、表１に確認されるとおりのプロモーター、遺伝子若しくはタンパク質（若しくはその断片）をコードするＯＲＦ又はプラスミドである。
【００１６】
【表１−１】
2016101172.tif 000003
【表１−２】
2016101172.tif 000004
【表１−３】
2016101172.tif 000005
【表１−４】
2016101172.tif 000006
【表１−５】
2016101172.tif 000007
【表１−６】
2016101172.tif 000008
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書には、５０％より多いエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；２０：５ω−３］を産生する能力を有するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の生産宿主株が記載される。この特定の多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の蓄積は、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ及びＣ16/18エロンガーゼ活性を有するタンパク質を含む機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を導入することにより達成され、それによりγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］を最小限としたＥＰＡ油の産生が可能となる。従って本開示は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を改変することによりＥＰＡ及びその誘導体を商業的に生産可能とし得ることを実証する。産生方法、及びそれに由来する油もまた特許請求される。
【００１８】
ＥＰＡなどのＰＵＦＡ（又はその誘導体）は、経静脈栄養を受けている患者向けに、又は栄養失調症の予防若しくは治療のため、食事の代用品、又はサプリメント、特に人工栄養乳として使用されている。或いは、精製ＰＵＦＡ（又はその誘導体）は、通常の使用で摂取者が食事補給に望ましい量を取り込み得るように配合されて調理油、油脂又はマーガリン中に加えられることもある。ＰＵＦＡはまた、人工栄養乳、栄養サプリメント又は他の食製品中に加えられることもあり、抗炎症性又はコレステロール降下性の作用物質としての使用も見られ得る。その組成物は、ヒト又は獣医学の医薬用途に使用されてもよい。
【００１９】
ヒト又は動物が組換え手段により産生されたＰＵＦＡを補給すると、その加えられたＰＵＦＡ、並びにその代謝産物のレベル上昇がもたらされ得る。例えば、ＥＰＡによって治療すると、ＥＰＡのみならず、エイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」；シス−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸；２２：５ω−３］及びドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸；２２：６ω−３］などのＥＰＡの下流産物のレベル上昇ももたらされ得る。調節機序が複雑なため、様々なＰＵＦＡを組み合わせるか、又は種々のＰＵＦＡ共役体を加えることにより、かかる機序を回避し、制御し、又は克服して、個体中に所望レベルの特定のＰＵＦＡを実現することが望ましい。
【００２０】
或いは、ドライ飼料、セミモイスト及びウェット飼料などの動物飼料及び水産養殖飼料の合成において、こうした配合物は概して栄養組成の少なくとも１〜２％がω−３及び／又はω−６  ＰＵＦＡである必要があるため、本明細書に開示される方法論により作製されたＰＵＦＡ、又はその誘導体を利用することができる。
【００２１】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、全体として参照により援用される。
本開示では、多数の用語及び略称が使用される。以下の定義を提供する。
「オープンリーディングフレーム」は「ＯＲＦ」と略される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略される。
「アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は「ＡＴＣＣ」と略される。
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略される。
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略される。
「補酵素Ａ」は「ＣｏＡ」と略される。
「全脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略される。
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略される。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略される。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「発明」又は「本発明」は、特許請求の範囲及び本明細書に記載されるとおりの本発明のあらゆる態様及び実施形態を指すことが意図され、任意の特定の実施形態又は態様に限定されるものとして読まれてはならない。
用語「食製品」は、概してヒトによる摂取に好適な任意の食品を指す。典型的な食製品としては、限定はされないが、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、乳製品、飲料などが挙げられる。用語「食品類似物」、「機能性食品」、「医療用食品」及び「医療用栄養剤」は、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書にあるとおりに定義される。
用語「医薬品」は、本明細書で使用されるとき、米国で販売される場合であればＦｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔの第５０３条又は第５０５条によって規制されることになる化合物又は物質を意味する。
用語「人工栄養乳」は、ヒト母乳を擬製するために専らヒト乳児による摂取用に設計された食品を意味する。人工栄養乳の典型的な市販品の例としては、限定はされないが、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）及びＩｓｏｍｉｌ（登録商標）が挙げられる。
【００２３】
用語「食事サプリメント」は、（ｉ）食事の補足を目的とし、従って従来の食品としての、又は料理若しくは食事の一品としての利用には相当せず；（ｉｉ）１つ又は複数の食物成分（例えば、ビタミン、ミネラル、ハーブ又は他の植物、アミノ酸、酵素及び腺を含む）又はその構成物質を含み；（ｉｉｉ）丸薬、カプセル、錠剤、又は液体として経口摂取されることが意図され；及び、（ｉｖ）食事サプリメントと表示される製品を指す。
用語「動物飼料」は、動物、例えば、ペット、農牧用動物等の家畜による摂取、又は食料生産用に飼育される動物向けに、例えば養魚が専ら意図される飼料を指す。用語「水産養殖飼料」、「海洋飼料」及び「飼料養分」は、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書に定義されるとおりである。
本明細書で使用されるとき、用語「バイオマス」は、具体的には、商業的に有意な量でＥＰＡを産生する組換え生産宿主の発酵により消耗又は使用された酵母細胞物質を指し、ここで好ましい生産宿主は、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株である。バイオマスは、全細胞、全細胞ライセート、ホモジナイズされた細胞、部分的に加水分解された細胞物質、及び／又は部分的に精製された細胞物質（例えば、微生物により産生された油）の形態であってもよい。
【００２４】
用語「脂質」は、脂溶性の（すなわち親油性の）天然に存在する分子を指す。脂質についての概説は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に提供される（その表２を参照のこと）。
用語「グリセロリン脂質」は、脂肪酸がｓｎ−１位及びｓｎ−２位にあり、且つ極性頭部基（例えば、リン酸、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール、セリン、カルジオリピン）がリン酸ジエステル結合を介してｓｎ−３位につながったグリセロールコアを有する幅広い分子クラスを指す。従ってグリセロリン脂質には、ホスファチジン酸［「ＰＡ」］、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］、ホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］、ホスファチジルグリセロール［「ＰＧ」］、ホスファチジルイノシトール［「ＰＩ」］、ホスファチジルセリン［「ＰＳ」］及びカルジオリピン［「ＣＬ」］が含まれる。グリセロリン脂質は、様々なホスホイル（ｐｈｏｓｐｈｏｙｌ）頭部基に起因するのみならず、その脂肪酸の種々の鎖長及び飽和度の結果でもある著しい多様性を有する。概して、飽和脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸はｓｎ−１位でエステル化される一方、多価不飽和脂肪酸はｓｎ−２位でエステル化される。
【００２５】
「リゾリン脂質」は、グリセロリン脂質から、ｓｎ−２位の脂肪酸を脱アシル化することにより誘導される。リゾリン脂質としては、例えば、リゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］、リゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］、リゾホスファチジルエタノールアミン［「ＬＰＥ」］、リゾホスファチジルセリン［「ＬＰＳ」］、リゾホスファチジルグリセロール［「ＬＰＧ」］及びリゾホスファチジルイノシトール［「ＬＰＩ」］が挙げられる。
用語「油」は、２５℃で液体であり、且つ通常は多価不飽和の脂質物質を指す。油性生物においては、油が全脂質の大部分を構成する。「油」は、主としてトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、他の中性脂質、リン脂質及び遊離脂肪酸もまた含み得る。油中の脂肪酸組成と全脂質の脂肪酸組成とは概して同様である；従って、全脂質中のＰＵＦＡ濃度の上昇又は低下は油中のＰＵＦＡ濃度の上昇又は低下に対応し、及び逆も同様であり得る。
「中性脂質」は、一般に脂質体の細胞中に蓄積脂肪として見られる脂質を指し、細胞内ｐＨでは脂質は荷電基を含まないため、このように呼ばれる。概して、中性脂質は完全に非極性であり、水に対する親和性を有しない。中性脂質は、概してグリセロールの脂肪酸とのモノエステル、ジエステル、及び／又はトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールとも、又はまとめてアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出させるには加水分解反応が起こらなければならない。
【００２６】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、グリセロール分子とエステル化された３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖のＰＵＦＡ及び飽和脂肪酸、並びにより短鎖の飽和及び不飽和脂肪酸を含み得る。
本明細書において用語「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマス又は油であってもよい所与の試料において塩基エステル交換法（当該技術分野において公知のとおり）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化され得る全ての細胞脂肪酸の合計を指す。従って、全脂肪酸には、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びＴＡＧを含む）及び極性脂質画分（例えば、ＰＣ及びＰＥ画分を含む）の脂肪酸が含まれ、しかし遊離脂肪酸は含まれない。
細胞の「全脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の百分率としてのＴＦＡの尺度であり、しかしながら全脂質含量は、ＤＣＷの百分率としてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ」］として近似することができる。従って、全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷ当たりの全脂肪酸のミリグラム数と等価である。
【００２７】
全脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、ＴＦＡの質量パーセント［「％  ＴＦＡ」］、例えば１００ミリグラムのＴＦＡ当たりの所与の脂肪酸のミリグラム数として表される。本明細書の開示において特に具体的に指定しない限り、全脂質に対する所与の脂肪酸の百分率を参照するとき、それは％  ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度に等しい（例えば、全脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡに等しい）。
ある場合には、細胞中の所与の１つ又は複数の脂肪酸の含量を、乾燥細胞重量のその質量パーセント［「％  ＤＣＷ」］として表すことが有用である。従って、例えば、ＥＰＡ  ％  ＤＣＷは、以下の式、すなわち（ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）］／１００に従い決定され得る。しかしながら、乾燥細胞重量のその質量パーセント［「％  ＤＣＷ」］としての細胞中の所与の１つ又は複数の脂肪酸の含量は、（ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ）］／１００として近似することもできる。
【００２８】
用語「脂質プロファイル」と「脂質組成」とは同義であり、特定の脂質画分中、例えば全脂質中又は油中に含まれる個別の脂肪酸の量を指し、ここでその量はＴＦＡの質量パーセントとして表される。混合物中に存在する各個別の脂肪酸の合計は１００とならなければならない。
用語「抽出油」は、油が合成された微生物などの他の細胞物質から分離された油を指す。抽出油は種々の方法により得られ、そのうち最も単純な方法は、物理的手段のみが関与する。例えば、様々な加圧構成（例えば、スクリュー、エキスペラー、ピストン、ビーズビーター等）を使用した機械的破砕により、細胞物質から油を分離することができる。或いは、油の抽出は、様々な有機溶媒（例えば、ヘキサン）による処理、酵素抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えば、ＣＯ2抽出）、鹸化及びこれらの方法の組み合わせによって行うことができる。抽出油は、それが必ずしも精製又はさらなる濃縮を必要とするものではない。本明細書に記載される抽出油は、少なくとも５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを含み得る。
【００２９】
用語「ブレンド油」は、所望の組成が得られるよう本明細書に記載される抽出油を任意の組み合わせの、又は個別の油と混ぜ合わせ、すなわちブレンドすることにより得られる油を指す。従って、例えば異なる微生物由来の数種の油を互いに混合して所望のＰＵＦＡ組成を得ることができる。それに代えて又は加えて、本明細書に開示されるＰＵＦＡ含有油を魚油、植物油又は双方の混合物とブレンドして所望の組成物を得ることもできる。
用語「脂肪酸」は、約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族系酸（アルカン酸）を指し、しかしながらより長い鎖長及びより短い鎖長の双方の酸が公知である。大部分の鎖長はＣ16〜Ｃ22である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法により表され、ここではＸが特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、及びＹが二重結合の数である。「飽和脂肪酸」とそれに対する「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」とそれに対する「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、及び「オメガ６脂肪酸」［「ω−６」又は「ｎ−６」］とそれに対する「オメガ３脂肪酸」［「ω−３」又は「ｎ−３」］との違いに関するさらなる詳細は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供される。
本明細書においてＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表２に示す。表題「省略表記」の列に、オメガ参照体系を使用して、炭素数、二重結合数、及びその目的上番号１が付されるオメガ炭素から数えてオメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表のその他の部分では、ω−３及びω−６脂肪酸及びそれらの前駆体の一般名、本明細書全体を通じて使用される略称、並びに各化合物の化学名を要約する。
【００３０】
【表２】
2016101172.tif 000009
【００３１】
用語「ＰＵＦＡ生合成経路」は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ及びＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸並びにＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程については文献に十分な記載がある（例えば、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書を参照のこと）。要約すれば、この過程には、小胞体膜に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特定の伸長酵素及び不飽和化酵素を介した、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長及び二重結合の付加による分子の不飽和化が関わる。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、ＰＵＦＡの生合成に関連する以下の酵素（及び前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ及び／又はＣ20/22エロンガーゼ。
【００３２】
用語「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、最小限として少なくとも１つのΔ９エロンガーゼ及び少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを含み、それによりそれぞれＥＤＡ及び／又はＥＴｒＡを中間体脂肪酸としてＬＡ及びＡＬＡからのＤＧＬＡ及び／又はＥＴＡの生合成が可能なＰＵＦＡ生合成経路を指し得る。他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの発現を伴うことで、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡもまた合成され得る。
用語「デサチュラーゼ」は、対象の脂肪酸又は前駆体が産生されるように１つ又は複数の脂肪酸に不飽和化、すなわち二重結合の導入をもたらすことができるポリペプチドを指す。本明細書全体を通じ、オメガ参照体系を使用して特定の脂肪酸を参照するが、デルタ体系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることによりデサチュラーゼの活性を示すことがより好都合である。本明細書において特に関心対象となるのは、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ及びΔ１２デサチュラーゼである。他の有用なデサチュラーゼとしては、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ及びΔ９デサチュラーゼを挙げることができる。
【００３３】
用語「エロンガーゼ」は、そのエロンガーゼが作用する脂肪酸基質より炭素２個分長い酸が産生されるように脂肪酸炭素鎖を伸長させることのできるポリペプチドを指す。この伸長プロセスは、国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されるとおり、脂肪酸シンターゼと関連した多段階の機序で起こる。エロンガーゼ系により触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの、ＳＴＡからＥＴＡへの、ＡＲＡからＤＴＡへの、及びＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般に、エロンガーゼの基質選択性はいくらか幅が広く、鎖長と不飽和の程度及び種類との双方により区別される。例えば、Ｃ14/16エロンガーゼはＣ14基質（例えば、ミリスチン酸）を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼはＣ16基質（例えば、パルミチン酸）を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、及びＣ20/22エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼ又はＣ２０エロンガーゼとも称される］はＣ20基質（例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的上、２つの異なる種類のＣ18/20エロンガーゼが定義され得る：Δ６エロンガーゼはＧＬＡ及びＳＴＡのそれぞれＤＧＬＡ及びＥＴＡへの変換を触媒し、一方Δ９エロンガーゼはＬＡ及びＡＬＡのそれぞれＥＤＡ及びＥＴｒＡへの変換を触媒することができる。
【００３４】
用語「マルチザイム」又は「融合タンパク質」は、少なくとも２つの独立した分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを指し、ここで第１の酵素活性は、好ましくは第２の酵素活性と連結される（米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）。少なくとも２つの独立した分離可能な酵素活性の間の「連結」又は「結合」は、最小限として単一のポリペプチド結合からなり、しかしながら連結はまた、プロリンなどの１つのアミノ酸残基、又は少なくとも１つのプロリンアミノ酸残基を含むポリペプチドからなってもよい。好ましいリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される。
【００３５】
用語「ＤＧＬＡシンターゼ」は、Δ９エロンガーゼがΔ８デサチュラーゼに連結したマルチザイムを指す。用語「ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ」は、Δ９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）をリンカー配列（すなわち、配列番号１［ＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ］；米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）によってΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（米国特許第７，７０９，２３９号明細書）に連結することにより作られたＤＧＬＡシンターゼ（配列番号８及び９）を指す。同様に、用語「ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ」は、Δ９エロンガーゼ「ＥａＤ９ｅＳ」（米国特許出願公開第２００８−０２５４５２２−Ａ１号明細書）を、配列番号１として示されるリンカー配列によってΔ８デサチュラーゼ「ＥａＤ８Ｓ」（米国特許出願公開第２００８−０２５４５２１−Ａ１号明細書）に連結することにより作られたＤＧＬＡシンターゼ（配列番号１０及び１１）を指す。さらに、用語「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ」は、Δ９エロンガーゼ「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）を、配列番号１として示されるリンカー配列によってΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（上記）に連結することにより作られたＤＧＬＡシンターゼ（配列番号１２及び１３）を指す。
【００３６】
用語「変換効率」及び「基質変換率」は、デサチュラーゼ、エロンガーゼ又はマルチザイムなどの特定の酵素が基質を産物に変換する効率を指す。変換効率は、以下の式：（［産物］／［基質＋産物］）＊１００に従い計測され、式中「産物」は、直接の産物及びそれから誘導された経路中の全ての産物を含む。
用語「Ｃ18からＣ20への伸長変換効率」は、Ｃ18//20エロンガーゼがＣ18基質（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ）をＣ20産物（すなわち、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）に変換することができる効率を指す。このようなＣ18//20エロンガーゼはΔ９エロンガーゼ又はΔ６エロンガーゼのいずれかであり得る。
用語「Δ９伸長変換効率」は、Δ９エロンガーゼがＣ18基質（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ）をＣ20産物（すなわち、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ）に変換することができる効率を指す。
用語「アシルトランスフェラーゼ」は、アシル基をドナー脂質からアクセプター脂質分子に転移させることに関与する酵素を指す。
【００３７】
用語「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」［「ＬＰＬＡＴ」］は、様々なリゾリン脂質基質をｓｎ−２位でアシル化する能力を有する幅広いアシルトランスフェラーゼクラスを指す。より具体的には、ＬＰＬＡＴは、ＬＰＡのＰＡへの変換を触媒する能力を有するＬＰＡアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］、ＬＰＣのＰＣへの変換を触媒する能力を有するＬＰＣアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］、ＬＰＥのＰＥへの変換を触媒する能力を有するＬＰＥアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＥＡＴ」］、ＬＰＳのＰＳへの変換を触媒する能力を有するＬＰＳアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＳＡＴ」］、ＬＰＧのＰＧへの変換を触媒する能力を有するＬＰＧアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＧＡＴ」］、及びＬＰＩのＰＩへの変換を触媒する能力を有するＬＰＩアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＩＡＴ」］を含む。ＬＰＬＡＴ命名法の標準化は正式には行われていないため、当該技術分野では他の様々な呼称が用いられる（例えば、ＬＰＡＡＴはまたアシルＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸２−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ及び／又は１−アシルグリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＡＧＰＡＴ」］とも称されており、及びＬＰＣＡＴは多くの場合にアシルＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼと称される）。加えて、一部のＬＰＬＡＴ、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１（ＯＲＦ  ＹＯＲ１７５Ｃ；配列番号１５）は幅広い特異性を有し、従って単一の酵素が、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ及びＬＰＥＡＴ反応を含むいくつかのＬＰＬＡＴ反応の触媒能を有し得る点に留意することが重要である（Ｔａｍａｋｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：３４２８８〜３４２９８頁（２００７年）；Ｓｔａｈｌ，Ｕ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８２：３０５〜３０９頁（２００８年）；Ｃｈｅｎ，Ｑ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８１：５５１１〜５５１６頁（２００７年）；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：３０８４５〜３０８５５頁（２００７年）；Ｒｉｅｋｈｏｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：２８３４４〜２８３５２頁（２００７年））。
【００３８】
より具体的には、用語「少なくともリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）［「ＬＰＣＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  →  ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの反応の触媒能を有する酵素（ＥＣ  ２．３．１．２３）を指し得る。２つの構造的に異なるタンパク質ファミリー、すなわちＬＰＡＡＴタンパク質ファミリー（Ｈｉｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：２８３０〜２８３５頁（２００８年）；国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット）及びＡＬＥ１タンパク質ファミリー（Ｔａｍａｋｉ，Ｈ．ら、上記；Ｓｔａｈｌ，Ｕ．ら、上記；Ｃｈｅｎ，Ｑ．ら、上記；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ，Ｍ．ら、上記；Ｒｉｅｋｈｏｆら、上記）におけるＬＰＣＡＴ活性について記載がなされている。
【００３９】
用語「ＬＰＣＡＴ」は、１）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１７（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を共有し；及び／又は２）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＭ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号１８）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号１９）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号２０）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］タンパク質ファミリーモチーフを有するＡＬＥ１タンパク質ファミリーのタンパク質を指す。ＡＬＥ１ポリペプチドの例としては、ＳｃＡｌｅ１及びＹｌＡｌｅ１が挙げられる。
【００４０】
用語「ＳｃＡｌｅ１」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離された、配列番号１４として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ（配列番号１５）を指す（ＯＲＦ「ＹＯＲ１７５Ｃ」）。対照的に、用語「ＳｃＡｌｅ１Ｓ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する合成ＬＰＣＡＴ（すなわち、配列番号２２及び２３）を指す。
用語「ＹｌＡｌｅ１」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された、配列番号１６として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ（配列番号１７）を指す。
【００４１】
用語「ＬＰＣＡＴ」はまた、ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２５に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を共有するタンパク質も指す。
用語「ＣｅＬＰＣＡＴ」は、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）から単離された、配列番号２４として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ酵素（配列番号２５）を指す。対照的に、用語「ＣｅＬＰＣＡＴＳ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する合成ＬＰＣＡＴ（すなわち、配列番号２６及び２７）を指す。
【００４２】
用語「少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸  →  ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸の反応の触媒能を有する酵素（ＥＣ  ２．３．１．５１）を指し得る。
用語「ＬＰＡＡＴ」は、１）ＬＰＡＡＴ活性を有し、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２９（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号３１（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号３２（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約４３．９％のアミノ酸同一性を共有し；及び／又は、２）ＬＰＡＡＴ活性を有し、且つＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号３３）及びＥＧＴＲ（配列番号３４）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するタンパク質を指す。ＬＰＡＡＴポリペプチドの例としては、ＳｃＬＰＡＡＴ、ＭａＬＰＡＡＴ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１が挙げられる。
【００４３】
用語「ＳｃＬＰＡＡＴ」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＬＰＡＡＴ（配列番号３２）を指す（ＯＲＦ「ＹＤＬ０５２Ｃ」）。
用語「ＭａＬＰＡＡＴ１」は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）から単離された、配列番号２８として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＡＡＴ（配列番号２９）を指す。対照的に、用語「ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）に由来する合成ＬＰＡＡＴ（すなわち、配列番号３５及び３６）を指す。
用語「ＹｌＬＰＡＡＴ１」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された、配列番号３０として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＡＡＴ（配列番号３１）を指す。
【００４４】
用語「オルソログ」は、系統樹解析の一つのクレードにあることによって明らかなとおり共通の祖先タンパク質から進化した、且つ同じ酵素反応を触媒する異なる種由来の相同タンパク質を指す。
用語「ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ」は、ＣＤＰ−コリン及び１，２−ジアシルグリセロールからのホスファチジルコリンの合成を触媒する酵素（ＥＣ  ２．７．８．２）を指す。この酵素は、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］生合成に関与するＣＤＰ−コリン経路の一部である。
用語「ＹｌＣＰＴ１」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された、配列番号３７によりコードされるジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ酵素（配列番号３８）を指す。ＹｌＣＰＴ１については国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０１７０３（ＹＡＬＩ０Ｃ１０９８９ｇ）もまた参照のこと）。
【００４５】
用語「マロン酸」は、国際純正・応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）［「ＩＵＰＡＣ」］の体系的命名法によればプロパン二酸とも称され、ＣＨ2（ＣＯＯＨ）2として示される化学構造を有するジカルボン酸を指す。マロン酸イオン又はプロパン二酸イオンは、マロン酸から２個の水素イオンが失われることにより誘導される（すなわち、ＣＨ2（ＣＯＯ）22-）。マロン酸の塩及びエステルとしては、限定はされないが、マロン酸ジエチル［（Ｃ2Ｈ5）2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］、マロン酸ジメチル［（ＣＨ3）2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］及びマロン酸二ナトリウム［Ｎａ2（Ｃ3Ｈ2Ｏ4）］が挙げられる。
「マロネート」は、マロン酸のイオン化形態、並びにそのエステル及び塩を指す。これらは全て、本明細書ではまとめて「マロネート」と称される。
「マロニルＣｏＡ」［ＣＡＳ登録番号５２４−１４−１］は、アセチルＣｏＡのマロニルＣｏＡへのカルボキシル化により形成され得るアシルチオエステルを指す。或いは、マロニルＣｏＡは、基質のマロネートからマロニルＣｏＡシンテターゼにより酵素産生される。
【００４６】
「マロニルＣｏＡシンテターゼ」［ＥＣ  ６．２．１．−］は、以下の酵素反応、すなわちマロネート＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ  →  マロニルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸（ＰＰｉ）を触媒する。この酵素は、初めはマロネートで増殖したシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から精製されたが（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．及びＳ．Ｋ．Ｂａｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：５０９８〜５１０４頁（１９８５年））、それ以降、マメ科植物の根粒中のバクテロイドから様々なリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）相同体が単離されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．及びＨ．Ｚ．Ｃｈａｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７３：５１１〜５１６頁（１９９１年）並びにＫｉｍ，Ｙ．Ｓ．及びＳ．Ｗ．Ｋａｎｇ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９７：３２７〜３３３頁（１９９４年）を参照のこと）。
本明細書で使用されるとき、用語「ｒＭＣＳ」は、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１から単離されたマロニルＣｏＡシンテターゼ（配列番号４０）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿７６６６０３）をコードする遺伝子（配列番号３９）を指す。同様に、用語「ＭＣＳ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１に由来するマロニルＣｏＡシンテターゼをコードする合成遺伝子を指す（すなわち、配列番号４１及び４２）。
【００４７】
用語「ペルオキシソーム」は、あらゆる真核細胞に見られる遍在性の細胞小器官を指す。ペルオキシソームは、内容物をサイトゾルから分離し、且つ以下に記載される機能に不可欠な様々な膜タンパク質を含有する単一の脂質二重膜を有する。ペルオキシソームは「拡張シャトル機構」によってタンパク質を選択的に取り込む。より具体的には、ペルオキシンと称される少なくとも３２種の既知のペルオキシソームタンパク質があり、これらがペルオキシソーム膜を介したＡＴＰ加水分解によるタンパク質の取り込みプロセスに関与する。細胞タンパク質は、ペルオキシソームに取り込まれると、典型的には何らかの分解手段に供される。例えば、ペルオキシソームは、細胞に対して毒性の物質を分解することが可能な酸化酵素、例えば、カタラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及び尿酸オキシダーゼを含有する。或いは、ペルオキシソームはβ酸化と称されるプロセスで脂肪酸分子を分解してアセチルＣｏＡの遊離分子を生成し、それらの分子がサイトゾルに送り戻される。
用語「ペルオキシソーム生合成因子タンパク質」、「ペルオキシン」及び「Ｐｅｘタンパク質」は同義であり、ペルオキシソーム生合成に関わり、及び／又はペルオキシソーム膜を介したＡＴＰ加水分解による細胞タンパク質の取り込みプロセスに関与するタンパク質を指す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭字語は「Ｐｅｘ遺伝子」である。命名法の体系については、Ｄｉｓｔｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３５：１〜３頁（１９９６年）によって記載されている。これまで様々な真核生物において少なくとも３２種の異なるＰｅｘ遺伝子が同定されている。ペルオキシソームの機能又は構造に異常を示した突然変異体の分析から、多くのＰｅｘ遺伝子が単離されている。１７種の異なる真菌種のゲノム配列のインシリコ解析を実施したＫｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら（Ｔｒａｆｆｉｃ、７：１２９１〜１３０３頁（２００６年））によるレビューに基づけば、以下のＰｅｘタンパク質が同定された：Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様及びＰｅｘ２６ｐ。まとめて、これらのタンパク質は本明細書では、「Ｐｅｘ遺伝子」によりコードされる「Ｐｅｘタンパク質」と称される。
【００４８】
用語「保存ドメイン」又は「モチーフ」は、進化的に関連性を有するタンパク質のアラインメントされた配列に沿った特定の位置に保存されている一組のアミノ酸を意味する。他の位置にあるアミノ酸は相同タンパク質間で異なり得るが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、又は活性に不可欠なアミノ酸を示す。これらのアミノ酸はタンパク質相同体ファミリーのアラインメントされた配列におけるそれらの高い保存度によって識別されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が既に同定されているタンパク質ファミリーに属するかどうかを判断するための識別子、すなわち「シグネチャ」として用いることができる。
少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質において、又はそれと関連して用語「下方制御された」は、野生型タンパク質の活性と比較したときの天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の活性の低下、又はその消失を指す。下方制御は、典型的には天然Ｐｅｘ遺伝子が、当該遺伝子の一部分に含まれる挿入、欠失、又は標的突然変異を指す「破壊」を有するときに起こり、その結果、遺伝子がゲノムから欠失し、タンパク質が翻訳されない完全な遺伝子ノックアウトか、又は挿入、欠失、アミノ酸置換若しくは他の標的突然変異を有する翻訳されたＰｅｘタンパク質かのいずれかとなる。タンパク質における破壊の位置は、例えば、タンパク質のＮ末端部分の範囲内又はタンパク質のＣ末端部分の範囲内であってもよい。破壊されたＰｅｘタンパク質は、破壊されなかったＰｅｘタンパク質に対して活性が低下し、機能できない可能性がある。Ｐｅｘタンパク質の発現の低下又は不足をもたらす下方制御はまた、調節配列、転写及び翻訳因子及び／又はシグナル伝達経路の操作、又はセンス、アンチセンス若しくはＲＮＡｉ技術の使用等によっても生じ得る。
【００４９】
用語「油性の」は、エネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向を有する生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年所収）。用語「油性酵母」は、油を作ることのできる酵母として分類される微生物を指す。概して、油性微生物の細胞含油量はシグモイド曲線に従い、ここでは脂質の濃度が後期対数増殖期又は初期定常増殖期に最高値に達するまで増加し、次に後期定常期及び死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ及びＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。油性微生物がその乾燥細胞重量の約２５％を上回って油として蓄積することは稀ではない。油性酵母の例としては、何ら限定されるものではないが、以下の属、すなわちヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
用語「発酵性炭素源」は、微生物がエネルギーを得るために代謝する炭素源を意味する。典型的な炭素源としては、限定はされないが、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート及び炭素含有アミンが挙げられる。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」及び「単離核酸断片」は、本明細書では同義的に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってよく、合成の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１つ又は複数のセグメント、又はそれらの混合物からなり得る。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸の形態で存在する）は、以下のとおりの一文字表記により示される：アデニレート又はデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡについて）に対する「Ａ」、シチジレート又はデオキシシチジレートに対する「Ｃ」、グアニレート又はデオキシグアニレートに対する「Ｇ」、ウリジレートに対する「Ｕ」、デオキシチミジレートに対する「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対する「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対する「Ｙ」、Ｇ又はＴに対する「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対する「Ｈ」、イノシンに対する「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドに対する「Ｎ」。
【００５１】
アミノ酸又はヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を、当業者による手動での配列評価によるか、又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを用いるコンピュータにより自動化された配列比較及び同定によって当該のポリペプチド又は遺伝子を推定上同定するのに十分に含む部分である。概して、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定上同定するためには、１０個以上の連続するアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存的な遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離方法、例えば細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーションにおいては、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが用いられ得る。加えて、ＰＣＲでは、１２〜１５塩基の短鎖オリゴヌクレオチドが増幅プライマーとして用いられ、そのプライマーを含む特定の核酸断片が得られ得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を具体的に同定し、及び／又は単離するのに十分な配列を含む。
【００５２】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表して使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列が変化することが可能な遺伝子コードにおける性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が呈する「コドンバイアス」を十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を向上させるために遺伝子を合成するときには、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計することが望ましい。
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチド構成要素はアニールされ、次にライゲートされて遺伝子セグメントを形成し、次にそのセグメントが酵素的に組み立てられて遺伝子全体が構築される。従って遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現に適応したものとされる。当業者は、コドン使用が宿主に好都合なコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができ、配列情報が利用可能である。例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についてのコドン使用プロファイルが米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
【００５３】
「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、これはコード領域のみを指すことも、又はコード配列の前にあり（５’非コード配列）、及びその後ろにある（３’非コード配列）調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」は、その独自の調節配列と共に天然に存在するとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではなく、天然では同時に存在することのない調節配列及びコード配列を含む任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列か、又は同じ供給源に由来するが、天然に存在するものとは異なる形で構成された調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中でその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計された遺伝子である。
【００５４】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンとの間の）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造を挙げることができる。
「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。概して、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子から得られてもよく、又は天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織若しくは細胞型における、又は異なる発生段階での、又は異なる環境若しくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現を誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型においてほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【００５５】
用語「３’非コード配列」及び「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これはポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節シグナルをコードする他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に作用することを特徴とする。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼし得る。
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方によって影響を受けるように単一の核酸断片上において核酸配列が関連付けられていることを指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に作用することが可能なとき、当該コード配列と作動可能に連結されている。すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、調節配列にセンス方向又はアンチセンス方向に作動可能に連結され得る。
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、センス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定的な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００５６】
「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への導入を指す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであってもよく、又は核酸分子は宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換された」生物又は「形質転換体」と称される。
「安定形質転換」は、遺伝学的に安定した遺伝をもたらす、核ゲノム及びオルガネラゲノムの双方を含めた宿主生物ゲノムへの核酸断片の導入を指す（すなわち、核酸断片は「安定的に組み込まれる」）。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込み若しくは安定的な遺伝のない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核、又はＤＮＡを含む細胞小器官への核酸断片の導入を指す。
【００５７】
用語「プラスミド」及び「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部ではない、且つ通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態の遺伝子を有することが多い追加的な染色体エレメントを指す。かかるエレメントは、任意の供給源由来の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの直鎖状又は環状の自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよく、そこでは複数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられて、１つ又は複数の発現カセットを細胞に導入することが可能な固有の構成となっている。
用語「発現カセット」は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要な、コード配列の前にある（５’非コード配列）及びその後ろにある（３’非コード配列）調節配列とを含むＤＮＡの断片を指す。従って、発現カセットは典型的には、１）プロモーター配列；２）コード配列（すなわち、ＯＲＦ）、及び３）真核生物では通常ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（すなわち、ターミネーター）から構成される。１つ又は複数の発現カセットは通常ベクター内に含まれ、クローニング及び形質転換が促進される。各宿主に適切な調節配列が使用される限り、種々の発現カセットを、細菌、酵母、植物及び哺乳動物細胞を含めた種々の生物に形質転換することができる。
【００５８】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  バージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び５）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１〜２０頁、編者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、配列分析ソフトウェアを使用して分析が行われる場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき「デフォルト値」は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味し得る。
【００５９】
本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、刊行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）により記載されている。
【００６０】
概して、油性微生物における脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応答して誘発される。このプロセスは、油性微生物における遊離パルミチン酸（１６：０）のデノボ合成に至るもので、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に詳細に記載されている。パルミチン酸は、より長鎖の飽和及び不飽和脂肪酸誘導体の前駆体であり、エロンガーゼ及びデサチュラーゼの作用により形成される（図１）。
脂肪酸の一次貯蔵単位であるＴＡＧには多岐にわたる脂肪酸（飽和及び不飽和脂肪酸並びに短鎖及び長鎖脂肪酸を含む）が含まれる。本明細書に記載される方法及び宿主細胞では、ＴＡＧにＥＰＡが含まれることが最も望ましく、しかしながらＥＰＡの構造形態は限定されない（従って、例えばＥＰＡは全脂質中に遊離脂肪酸として、又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質若しくは糖脂質などのエステル化形態で存在してもよい）。
多くのＰＵＦＡはＴＡＧに中性脂質として含まれて脂質体に貯蔵されるが、油性生物中の全ＰＵＦＡの計測は、最小限としてＰＣ、ＰＥ及びＴＡＧ画分にあるＰＵＦＡを含まなければならない点に留意することが重要である。
オレイン酸がＥＰＡに変換される代謝過程には、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長及び二重結合の付加による分子の不飽和化が関与する。これは、小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化酵素及び伸長酵素を必要とする。しかしながら、図１で分かるとおり、及び以下に記載するとおり、ＥＰＡの産生には複数の代替的な経路が存在する。
【００６１】
具体的には、図１は以下に記載される経路を示す。全ての経路について、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって１番目のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換される必要がある。次に、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」及び基質としてＬＡを用いて、以下のとおり長鎖ω−６脂肪酸が形成される：１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換される；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換される；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換される；４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換される；及び、５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を用いて、以下のとおり長鎖ω−３脂肪酸を産生することもできる：１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって１番目のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換される；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換される；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換される；５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換される；及び、６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えば、ＥＴＡ及びＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡ及びＡＲＡから産生される。本明細書の目的上有利には、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、γ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］を多量に含まないＥＰＡ油を産生することが可能である。
【００６２】
ω−３／ω−６脂肪酸の代替的な生合成経路はΔ６デサチュラーゼ及びＣ18/20エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、ＬＡ及びＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってそれぞれＧＬＡ及びステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよく；次に、Ｃ18/20エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡに、及び／又はＳＴＡをＥＴＡに変換する。
組換えヤロウイア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）宿主細胞においてＥＰＡを経済的に商業生産するには、ＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］及び全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］を含め、様々な変数を考慮する必要がある。さらに、所望の脂肪酸、すなわちＥＰＡの産生を最大化するため、最終油産物中の中間体脂肪酸及び副産物脂肪酸の産生は低減することが望ましい。
中間体脂肪酸は、他の代謝経路酵素の作用によりＥＰＡにさらに変換され得る脂肪酸（例えば、オレイン酸、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）である。対照的に、副産物脂肪酸（例えば、シアドン酸、ジュニペロン酸）は、ＥＰＡでもなく、又はＥＰＡにさらに変換され得る中間体脂肪酸でもない、任意の産生される脂肪酸を指す。
【００６３】
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、約２３．６未満のＬＡ  ％  ＴＦＡで少なくとも約４３．３ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを含む微生物油（１．８３のＥＰＡ：ＬＡ比）を産生する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株について記載している。好ましい株はＹ４３０５であり、その最大産生量は５５．６ＥＰＡ  ％  ＴＦＡで、ＥＰＡ：ＬＡ比は３．０３であった。概して、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書のＥＰＡ株は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の以下の遺伝子を含んだ：
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｄ）Δ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｆ）Ｃ16/18エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、
ｇ）任意選択で、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子（ＣＰＴ１）。
上記に記載される酵素機能を有する好ましい遺伝子の例を表３に示す（しかしながら、これらの遺伝子は限定を意図するものではない）。
【００６４】
【表３−１】
2016101172.tif 000010
【表３−２】
2016101172.tif 000011
【表３−３】
2016101172.tif 000012
【００６５】
本明細書には、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ及びＥＰＡ：ＬＡ比に基づくとき、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される株と比べて改良された微生物油を産生する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株が提供される。上記に定義されるとおりの、及び米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に詳述されるとおりのω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することに加え、これらの改良株は以下を特色とする：  １）少なくとも１つのマルチザイムを含むこと、ここで前記マルチザイムは、少なくとも１つの脂肪酸Δ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸Δ９エロンガーゼを有するポリペプチド［「ＤＧＬＡシンターゼ」］を含む；
２）マロニルＣｏＡシンテターゼ又はアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよいこと；
３）発現が下方制御された少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質を含むこと；
４）少なくとも約５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生すること；及び、
５）少なくとも約３．１のＥＰＡ：ＬＡ比を有すること。
【００６６】
本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書、特に実施例５５及び５６は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において異種発現させるとき、その個別のΔ９エロンガーゼ及び／又はΔ８デサチュラーゼカウンターパートに対して酵素活性が向上したＤＧＬＡシンターゼについて記載している。特に本明細書の開示に関連して、リンカー配列（すなわち、配列番号１［ＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ］）を用いてΔ９エロンガーゼ（すなわち、ＥｇＤ９ｅＳ、ＥａＤ９ｅＳ又はＥ３８９Ｄ９ｅＳ）がΔ８デサチュラーゼ（すなわち、ＥｇＤ８Ｍ又はＥａＤ８Ｓ）と融合され、それによりＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ（配列番号８及び９）、ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ（配列番号１０及び１１）及びＥ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ（配列番号１２及び１３）が作成された。意外にも、２個の独立した酵素をリンカー領域により分離された１つの融合タンパク質として融合すると、ＬＡからＤＧＬＡへのフラックスが増加したことから、Δ９エロンガーゼの産物が融合タンパク質においてΔ８デサチュラーゼを基質として直接導かれ得ることが示唆される。
以下の表４は、遺伝子融合の結果として、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書における変換効率の顕著な改良の概要を提供する。具体的には、太字で示される数字がエロンガーゼ又はデサチュラーゼ活性の改良率であり、一方、括弧書きで示される詳細が、遺伝子を単独で発現させたときのエロンガーゼ又はデサチュラーゼ変換効率と比べた、遺伝子融合物におけるエロンガーゼ又はデサチュラーゼ変換効率を提供する。
【００６７】
【表４】
2016101172.tif 000013
【００６８】
上記の結果に基づけば、上記のＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ、ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ及びＥ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合物などの少なくとも１つのＤＧＬＡシンターゼの発現は、改良されたＥＰＡ  ％  ＴＦＡをもたらす能力を有する改良型組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株において好ましい。この遺伝子融合物は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に好適な好ましいΔ９エロンガーゼ及びΔ８デサチュラーゼの任意の組み合わせを用いて作成することができ；及び、リンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択することができる。
【００６９】
先行研究では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＰＵＦＡの産生の改変に関連する遺伝子突然変異の多くが、発酵中のマロネートの副次的産生の増加をもたらす（マロネートは蓄積した全有機酸の約４５％を占めた）ことが確認されている。異種マロニルＣｏＡシンテターゼの発現によりこの効果が逆転し、マロネートの副次的産生の実質的な低減がもたらされた。
より具体的には、米国特許出願第１２／６３７８７７号明細書（２００９年１２月１５日に出願され、代理人整理番号ＣＬ４３２３を有する）は、産物の産生において、発酵中にそれ以上利用することのできない有機酸（特にマロネート）「副産物」の蓄積を回避するための一般化した方法について記載している。これにより、生物体内での炭素及びエネルギーの浪費が回避され、発酵プロセス中の最適ｐＨ範囲の維持に必要な塩基量が低減され、及び発酵廃蒸気中の中和が必要な副産物有機酸量が低減される。
マロニルＣｏＡシンテターゼ［ＥＣ  ６．２．１．−］は、以下の酵素反応を触媒する：マロネート＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ  →  マロニルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸（ＰＰｉ）。副産物（すなわち、マロネート）をマロニルＣｏＡに変換することにより、この基質を生物体内での脂肪酸の合成において利用することが可能となる。具体的には、脂肪酸の合成は、以下の式（Ｈ+及び水は無視する）により要約することができる：アセチルＣｏＡ＋７マロニルＣｏＡ＋１４ＮＡＤＰＨ  →  パルミチン酸＋７ＣＯ2＋１４ＮＡＤＰ+＋８ＣｏＡ。
【００７０】
米国特許出願第１２／６３７８７７号明細書において、コドン最適化マロニルＣｏＡシンテターゼが作成され、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で発現された。具体的には、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１由来のマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子（ｒＭＣＳ；配列番号３９及び４０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿７６６６０３に対応）のコード配列に基づきコドン最適化マロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子（「ＭＣＳ」、配列番号４１）が設計された。翻訳開始部位の修飾に加え、１５１５ｂｐのコード領域（終止コドンを含む）のうちの２３３ｂｐが修飾され（１５．４％）、２１９個のコドンが最適化され（４３．４％）、ＧＣ含量が野生型遺伝子（すなわち、ｒＭＣＳ）における６１．４％から合成遺伝子（すなわち、ＭＣＳ）における５５．６％まで低減され、及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）は翻訳開始に「ＧＴＧ」コドンを使用できないため、翻訳開始コドン「ＡＴＧ」がｒＭＣＳ遺伝子（配列番号３９）の前に付加された。コドン最適化ＭＣＳ遺伝子（配列番号４１）は、５０５アミノ酸のペプチド及び終止コドン（配列番号４２）をコードする１５１８ｂｐである。
【００７１】
４９ＥＰＡ  ％  ＴＦＡをもたらすヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株におけるＭＣＳ（配列番号４２）の発現により、脂肪酸プロファイル又は全脂質収率（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）のいずれにも影響が及ぶことなくマロネートの総量（ｇ／ｇ  ＤＣＷ）は約９４％減少した。
上記の結果に基づけば、好ましくない副産物の生成を低減し、それにより製造コストを下げる手段として、改良型組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株において少なくとも１つのマロニルＣｏＡシンテターゼを発現させることが望ましい。好ましいマロニルＣｏＡシンテターゼは配列番号４０及び４２として示されるが、これらは本明細書の開示に限定されるべきではない。当業者は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に好適な代替的な異種マロニルＣｏＡシンテターゼを容易に特定し得る。
生体膜の主成分であるグリセロリン脂質は、ｓｎ−１位及びｓｎ−２位にＲ基として脂肪酸が結合し、且つｓｎ−３位にリン酸ジエステル結合を介して極性頭部基がつながったグリセロールコアを含む。以下の表５は、Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＷｅｉｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２２：１９３〜２１４頁（１９５６年））によって最初に記載されたデノボ生合成経路におけるステップを要約する。
【００７２】
【表５】
2016101172.tif 000014
【００７３】
これらのデノボ合成の後、グリセロリン脂質は、ｓｎ−２位でその脂肪酸アシル組成の急速な代謝回転を受け得る。この「リモデリング」、又は「アシルエディティング」は、グリセロリン脂質の脱アシル化及び得られるリゾリン脂質の続く再アシル化が原因とされている。
【００７４】
Ｌａｎｄｓサイクル（Ｌａｎｄｓ，Ｗ．Ｅ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３１：８８３〜８８８頁（１９５８年））では、リモデリングは、１）ホスファチジルコリンのｓｎ−２位から脂肪酸を遊離させるホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼＡ2と；２）ｓｎ−２位のリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］を再アシル化するアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］、例えばリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］との協調的作用によって起こる。他のグリセロリン脂質もまた、リゾホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＥＡＴ」］活性、リゾホスファチジルセリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＳＡＴ」］活性、リゾホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＧＡＴ」］活性及びリゾホスファチジルイノシトールアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＩＡＴ」］活性を有するＬＰＬＡＴ酵素を含め、そのそれぞれのリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性によりリモデリングに関与し得る。いずれの場合にも、ＬＰＬＡＴは、細胞内アシルＣｏＡプールからのアシルＣｏＡ脂肪酸の除去及びリン脂質プールにおけるｓｎ−２位での様々なリゾリン脂質基質のアシル化に関与する。最後に、ＬＰＬＡＴはまた、ＬＰＡからのＰＡのデノボ生合成に関与するＬＰＡＡＴ酵素も含む。
【００７５】
他の場合、このｓｎ−２位リモデリングは、ＬＰＣＡＴ活性を有する酵素の正反応及び逆反応が原因とされている（Ｓｔｙｍｎｅ  Ｓ．及びＡ．Ｋ．Ｓｔｏｂａｒｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２２３（２）：３０５〜３１４頁（１９８４年））。
Ｓｈｉｎｄｏｕらによるいくつかの最近のレビューに、グリセロリン脂質生合成の概要及びＬＰＬＡＴの役割が提供されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８４（１）：１〜５頁（２００９年）；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、５０：Ｓ４６〜Ｓ５１頁（２００９年））。さらに、保存モチーフの存在に基づき多数のＬＰＬＡＴが一般文献及び特許文献に報告されている。
【００７６】
より具体的には、様々なＬＰＬＡＴモチーフが提案されており、分析されたアラインメントに含まれる特定の種に基づき僅かな違いがある。例えば、Ｓｈｉｎｄｏｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、３８３：３２０〜３２５頁（２００９年））は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来の配列のアラインメントに基づき、以下の膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフがＬＰＬＡＴ活性に重要となることを提案した：ＷＤ、ＷＨＧｘｘｘＧＹｘｘｘＦ（配列番号９９）、ＹｘｘｘｘＦ（配列番号１００）及びＹｘｘｘＹＦｘｘＨ（配列番号１０１）。そのうち、ＷＤ、ＷＨＧｘｘｘＧＹｘｘｘＦ及びＹｘｘｘｘＦモチーフはＳｃＡｌｅ（配列番号１５）及びＹｌＡｌｅ１（配列番号１７）に存在するが、ＹｘｘｘＹＦｘｘＨモチーフは存在しない。Ａｌｅ１相同体の代替的な非植物モチーフもまた、米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７−Ａ１号明細書に記載されている；具体的にそれらとしては、Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号１０２）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号１０３）、ＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号１０４）が挙げられる。
【００７７】
同様に、Ｌｅｗｉｎ，Ｔ．Ｗ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：５７６４〜５７７１頁（１９９９年）及びＹａｍａｓｈｉｔａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１７７１：１２０２〜１２１５頁（２００７年））は、細菌、酵母、線虫及び哺乳動物由来の配列のアラインメントに基づき、以下の１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］ファミリーモチーフがＬＰＬＡＴ活性に重要となることを提案した：ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号３３）、ＧｘｘＦＩ−［Ｄ／Ｒ］−Ｒ（配列番号１０５）、ＥＧＴＲ（配列番号３４）及び［Ｖ／Ｉ］−［Ｐ／Ｘ］−［Ｉ／Ｖ／Ｌ］−［Ｉ／Ｖ］−Ｐ−［Ｖ／Ｉ］（配列番号１０６）又はＩＶＰＩＶＭ（配列番号１０７）のいずれか。ＮＨｘｘｘｘＤ及びＥＧＴＲモチーフはＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号２９）、ＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号３１）及びＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２５）に存在するが、他のＬＰＡＡＴファミリーモチーフは存在しない。
【００７８】
本明細書に記載されるものを含め、公開されているＡｌｅ１、ＬＰＣＡＴ及びＬＰＡＡＴタンパク質配列に基づけば、本明細書における改良型組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株に含められるＬＰＬＡＴは、Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号１８）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号１９）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号２０）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）からなる群から選択されるＭＢＯＡＴファミリーモチーフ、又はＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号３３）及びＥＧＴＲ（配列番号３４）からなる群から選択される１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフのいずれかを有する。
脂肪酸生合成ではアシルＣｏＡプールとリン脂質プールとの間でアシル基が迅速に交換される必要があるため、ＬＰＬＡＴのＰＵＦＡ産生に対する効果が検討されている。具体的には、不飽和化が主にリン脂質のｓｎ−２位で起こる一方、アシルＣｏＡプールにおいて伸長が起こる。
【００７９】
より具体的には、これまでに、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中のＥＰＡ蓄積においてはＬＰＣＡＴが重要であり得るという仮説が立てられている（米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書）。この文献に記載されるとおり、この仮説は以下の研究に基づいた：１）Ｓｔｙｍｎｅ  Ｓ．及びＡ．Ｋ．Ｓｔｏｂａｒｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２２３（２）：３０５〜３１４頁（１９８４年））、アシルＣｏＡプールとＰＣプールとの間の交換がＬＰＣＡＴの正反応及び逆反応に起因し得るという仮説を立てた；２）Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ら（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３５１１５頁（２００３年））、ＰＣのｓｎ−２位にＧＬＡが蓄積されたこと、及び酵母ではＡＲＡを効率的に合成できなかったことが、アシルＣｏＡプール内で起こるＰＵＦＡ生合成に関わる伸長ステップの結果であり、一方、主にＰＣのｓｎ−２位でΔ５及びΔ６不飽和化ステップが起こったことを示唆した；３）Ａｂｂａｄｉ，Ａ．ら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１６：２７３４〜２７４８頁（２００４年））、トランスジェニック油糧種子植物におけるＰＵＦＡ蓄積の制約条件に関する分析に基づき、ＬＰＣＡＴがΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の再構成の成功に重要な役割を果たすことを示唆した；及び、４）国際公開第２００４／０７６６１７  Ａ２号パンフレット及び国際公開第２００４／０８７９０２  Ａ２号パンフレットにおけるＲｅｎｚ，Ａ．らの研究。
【００８０】
より具体的には、国際公開第２００４／０７６６１７  Ａ２号パンフレットが、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（クローンＴ０６Ｅ８．１）からのＬＰＣＡＴ［「ＣｅＬＰＣＡＴ」］の単離について記載し、それぞれ１８：２脂肪酸又はα−リノレン［「ＡＬＡ」；１８：３］脂肪酸を外因的に加えたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の改変株においてＬＰＣＡＴを発現させたときの、それぞれΔ６不飽和化及びΔ６伸長の効率の増加、並びに長鎖ＰＵＦＡエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」；２０：２］及びエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」；２０：４］の生合成の増加を報告している。
国際公開第２００４／０８７９０２  Ａ２号パンフレット（実施例１６）は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ様タンパク質（２８アミノ酸残基のＮ末端伸長部を除いて同じである、それぞれ４１７アミノ酸長又は３８９アミノ酸長を有するタンパク質によりコードされる）の単離について記載し、国際公開第２００４／０７６６１７  Ａ２号パンフレットと同様の方法を用いてこれらのタンパク質の一方を発現させると、ＥＤＡ及びＥＴＡ生合成の同様の改良がもたらされることを報告している。
【００８１】
国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット及び国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットは双方とも、ＥＤＡ及びＥＴＡ生合成の改良がＣｅＬＰＬＡＴ及び一部のＬＰＡＡＴ様タンパク質における可逆的ＬＰＣＡＴ活性に起因する（但し全てのＬＰＡＡＴ様タンパク質がＬＰＣＡＴ活性を有するわけではない）ことを教示している。さらにＲｅｎｚ，Ａ．らは、ＬＰＣＡＴにより、デサチュラーゼがＰＣ共役脂肪酸における二重結合の導入を触媒する一方でエロンガーゼが専らＣｏＡエステル化脂肪酸（アシルＣｏＡ）の伸長を触媒するため、新規に合成された脂肪酸のリン脂質とアシルＣｏＡプールとの間での効率的且つ連続的な交換が可能となったものと結論付けた。
多数の他の参考文献が、概して、トランスジェニック生物の油において所望の脂肪酸の量を増加させたり、全含油量を増加させたり、又は所望の脂肪酸の含量を選択的に増加させたりするためのＬＰＬＡＴのＰＵＦＡ生合成遺伝子との同時発現の利点について記載している（例えば、国際公開第２００６／０６９９３６号パンフレット、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット、国際公開第２００９／０１４１４０号パンフレット）。
【００８２】
本明細書では（及び２００９年６月１６日に出願された、代理人整理番号ＣＬ４３６１ＵＳＰＲＶを有し、全体として参照により援用される、本出願人の譲受人の同時出願された米国仮特許出願第６１／１８７３５９号明細書では）、ＬＰＡＡＴ及びＬＰＣＡＴがヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中におけるＥＰＡ蓄積に実に重要であることが実証される。具体的には、ＬＰＬＡＴの過剰発現によりΔ９エロンガーゼ変換効率の向上をもたらし得ることが分かった。既に定義したとおり、変換効率は、Δ９エロンガーゼなどの特定の酵素が基質（例えば、ＬＡ）を産物（例えば、ＥＤＡ）に変換することのできる効率を指す用語である。従って、ＥＰＡを産生するよう改変された株において、Δ９エロンガーゼ変換効率が向上し、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ及び／又はＥＰＡ  ％  ＤＣＷの増加がもたらされることが実証された。
【００８３】
これらの結果、及びさらなる補足的研究が、ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を向上させるための以下の特許請求される方法の基礎であり、前記方法は、
ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを前記ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え宿主細胞に導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１７（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号１８）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号１９）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号２０）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２５に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２９（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号３１（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号３２（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び
（ｖ）ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号３３）及びＥＧＴＲ（配列番号３４）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率は対照宿主細胞と比べて増加する。
【００８４】
好ましくは、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは安定的に組み込まれ、Ｃ18からＣ20への伸長変換の増加は少なくとも約４％である。
より好ましくは、Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加は、少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡ産生油性微生物宿主細胞において、対照宿主細胞と比較したとき少なくとも約４〜１０％、より好ましくは少なくとも約１０〜２０％、より好ましくは少なくとも約２０〜４０％、及び最も好ましくは少なくとも約４０〜６０％又はそれ以上である。
上記に記載されるＣ18からＣ20への伸長変換効率の改良に基づけば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される株と比べて向上したＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株は、上記の方法に定義されるとおりの少なくとも１つのアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］を含んでもよい。好ましい実施形態において、ＬＰＬＡＴのアミノ酸配列は、配列番号１５（ＳｃＡｌｅ１）、配列番号１６（ＹｌＡｌｅ１）、配列番号２５（ＣｅＬＰＣＡＴ）、配列番号２９（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号３１（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号３２（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択される。
【００８５】
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、組換えヤロウイア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）において有用な様々なノックアウトについて、形質転換体の選択に有用なもの、脂肪酸分解及びＴＡＧ分解を低減するもの、及び表現型上「中性の」突然変異をもたらすように思われるもの（ここでヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞は影響を受けないように見える）を含め、記載している。しかしながら、最も好ましいものは、全脂肪酸に対するＥＰＡの濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］の上昇をもたらす遺伝子ノックアウト（例えば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質［「ＰＥＸ」］遺伝子ノックアウト）である。
より具体的には、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、一部の好ましい組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）産生宿主において、宿主が、Ｐｅｘ１ｐ（配列番号１０８）、Ｐｅｘ２ｐ（配列番号１０９）、Ｐｅｘ３ｐ（配列番号１１０）、Ｐｅｘ３Ｂｐ（配列番号１１１）、Ｐｅｘ４ｐ（配列番号１１２）、Ｐｅｘ５ｐ（配列番号１１３）、Ｐｅｘ６ｐ（配列番号１１４）、Ｐｅｘ７ｐ（配列番号１１５）、Ｐｅｘ８ｐ（配列番号１１６）、Ｐｅｘ１０ｐ（配列番号１１７）、Ｐｅｘ１２ｐ（配列番号１１８）、Ｐｅｘ１３ｐ（配列番号１１９）、Ｐｅｘ１４ｐ（配列番号１２０）、Ｐｅｘ１６ｐ（配列番号１２１）、Ｐｅｘ１７ｐ（配列番号１２２）、Ｐｅｘ１９ｐ（配列番号１２３）、Ｐｅｘ２０ｐ（配列番号１２４）、Ｐｅｘ２２ｐ（配列番号１２５）及びＰｅｘ２６ｐ（配列番号１２６）からなる群から選択されるペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子を欠くことを企図する。より好ましい破壊されるペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ及びＰｅｘ１６ｐであり、しかしながらデータはＰｅｘ１０ｐに関してのみ提供されている。
【００８６】
国際公開第２００９／０４６２４８号パンフレットは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔＰｅｘ１６株、ΔＰｅｘ３株及びΔＰｅｘ１０株を比較することにより、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に提供される仮説及び研究を裏付け、展開している。この明細書における結果は、ＥＰＡ産生について改変された非破壊株と比べてＰｅｘ１０の破壊がＥＰＡ  ％  ＴＦＡの３．３倍の増加及びＣ20  ＰＵＦＡ量の１．７倍の増加に関与することを実証した。同様に、ＤＧＬＡ産生について改変されたΔＰｅｘ１６株において、ＤＧＬＡ  ％  ＴＦＡの１．６５倍の増加及びＣ20  ＰＵＦＡ  ％  ＴＦＡの１．３倍の増加が認められた。ＤＧＬＡ産生について改変されたΔＰｅｘ３株では、ＤＧＬＡ  ％  ＴＦＡの２．０倍の増加及びＣ20  ＰＵＦＡ  ％  ＴＦＡの１．７倍の増加が認められた。
【００８７】
これらの結果、及びさらなる補足的研究が、全脂質含量と全脂質画分と油画分とを有する油性真核生物において全脂肪酸の質量パーセントに対する１つのＰＵＦＡ又はＰＵＦＡの組み合わせの質量パーセントを増加させるための以下の特許請求される方法の基礎であり、前記方法は、
ａ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊であって、それによりＰＥＸ破壊生物が作り出される破壊と；機能的ＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子とを含む油性真核生物を提供するステップと、
ｂ）全脂肪酸の質量パーセントに対する全脂質画分及び油画分における少なくとも１つのＰＵＦＡの質量パーセントが、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない油性真核生物の質量パーセントと比較したとき増加する条件下で、ＰＥＸ破壊生物を成長させるステップと、
を含む。
【００８８】
全脂肪酸の百分率として増加するＰＵＦＡの量は、１）ＰＵＦＡ中間体又は副産物に対照されるものとしての、機能的ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であるＰＵＦＡ；２）Ｃ20からＣ22へのＰＵＦＡ；及び／又は、３）全ＰＵＦＡであり得る。
全脂肪酸の質量パーセントに対するＰＵＦＡの１つ又は組み合わせの質量パーセントを増加させることに加え、ある場合には、細胞の全脂質含量（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）を増加又は減少させてもよい。これは、ＰＥＸ遺伝子における破壊がＰＥＸ破壊細胞中の全脂質量を増加させるか、又は減少させるかに関わらず、破壊によって常に、あるＰＵＦＡ又はＰＵＦＡの組み合わせの質量パーセントの増加が生じることを意味する。
上記に基づけば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される株と比べて改良されたＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生する能力を有する組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株は、発現が下方制御された（すなわち、それによりＰＥＸ破壊生物をもたらす）少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質を含み得る。好ましい株において、下方制御されるペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ３ｐ（配列番号１１０）、Ｐｅｘ１０ｐ（配列番号１１７）、又はＰｅｘ１６ｐ（配列番号１２１）である。
当業者は、天然ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子の破壊を実現する多数の技術を利用することが可能であるが、概して以下の技法、例えば：１）標的遺伝子の全て又は一部の挿入、置換及び／又は欠失による遺伝子の破壊；又は、２）タンパク質の発現を制御する調節配列の操作により、特定の遺伝子の内因性活性を低下又は消失させることができる。これらの技法はいずれも、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、並びに国際公開第２００９／０４６２４８号パンフレットで考察されている。当業者は、既存の文献にこれらの及び他の方法についての十分な記載がなさており、本明細書に記載される方法、宿主細胞、及び産物に限定されないことを理解するであろう。当業者はまた、任意の特定の油性酵母での使用に最も適した技法も理解するであろう。
【００８９】
最適化株は、少なくとも約４０〜５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、好ましくは少なくとも約５０〜５５ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より好ましくは少なくとも約５５〜６０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より好ましくは少なくとも６０〜７０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及び最も好ましくは少なくとも約７０〜８０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し得る。
当業者にはあきらかであろうとおり、少なくとも約５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生する多数の異なる最適化ヤロウイア（Ｙａｒｒｒｏｗｉａ）株が、本明細書に記載される方法論を用いて改変され得る。従って、全脂肪酸の百分率としてのＥＰＡの濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］及び全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］の双方が乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡの細胞内含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］に影響を及ぼすため、商業目的に好ましい株の選択には改変株の全脂質含量もまた考慮され得る。すなわち、ＥＰＡ  ％  ＤＣＷは、（ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）］／１００として計算される。例えば、５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し、且つ２４ＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する株、５５ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し、且つ２１．８２ＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する株、６０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し、且つ２０ＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する株、６５ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し、且つ１８．４６ＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する株及び７０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生し、且つ１７．１４ＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する株は全て、１２ＥＰＡ  ％  ＤＣＷを産生する。好ましい実施形態において、改良型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株は、少なくとも約１０〜１２ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、好ましくは少なくとも約１２〜１４ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約１４〜１６ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約１６〜１８ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約１８〜２０ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約２０〜２２ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約２２〜２４ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、及び最も好ましくは少なくとも約２４〜２６ＥＰＡ  ％  ＤＣＷを産生し得る。
【００９０】
少なくとも約５０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡを有することに加え、改良型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株中、又はそこからの抽出油若しくは未濃縮油中の脂質プロファイルは、少なくとも約３．１のＥＰＡ  ％  ＴＦＡ対ＬＡ  ％  ＴＦＡ比を有し得る。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書（表２３）に実証されるとおり、ＥＰＡ、ＬＡ及びオレイン酸は、４０ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ超を産生するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の脂質プロファイルに存在する脂肪酸の約７６〜８０％を構成した。そのうち、ＬＡ  ％  ＴＦＡはオレイン酸  ％  ＴＦＡと比べて約３倍高かった。この観察結果に基づけば、当業者は、中間体脂肪酸であるＬＡの濃度を最小限に抑える（その結果ＥＰＡ：ＬＡ比が上昇する）ことで、ＰＵＦＡ生合成経路中に「詰め込まれる」炭素が多くなり、ＥＰＡ合成の増加が可能となり得ることを理解するであろう。好ましい実施形態において、ＥＰＡ：ＬＡ比は少なくとも約３．１〜３．５、より好ましくは少なくとも約３．５〜４．５、より好ましくは少なくとも約４．５〜５．５、及び最も好ましくは少なくとも約５．５〜６．５である。
【００９１】
本明細書に記載される改良型最適化組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株により産生される脂質はまた、ＧＬＡ又はＤＨＡが約０．５％未満であり（約０．１％に至るまでの検出可能レベルを有する機器を使用するＧＣ分析によって計測したとき）、且つ飽和脂肪酸含量が約８％未満であることも特色とし得る。この低率の飽和脂肪酸（すなわち、１６：０及び１８：０）は、ヒト及び動物に実質的な健康上の利益をもたらす。
外来性タンパク質の高レベル発現を導く調節配列を含む微生物発現系及び発現ベクターは、当業者に公知である。それらのいずれかを使用して、好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードするキメラ遺伝子を構築することができる。次にそうしたキメラ遺伝子が、標準的な形質転換方法を用いてヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入されることで、コードされる酵素の高レベル発現がもたらされ得る。
【００９２】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞の形質転換に有用なベクター（例えば、構築物、プラスミド）及びＤＮＡ発現カセットは、当該技術分野において公知である。構築物中に存在する配列の具体的な選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、及び形質転換細胞の非形質転換細胞との提案される分離手段に依存する。しかしながら、典型的にはベクターは、少なくとも１つの発現カセットと、選択可能なマーカーと、自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。好適な発現カセットは、典型的には転写開始を制御する遺伝子の領域５’（例えば、プロモーター）と、遺伝子コード配列と、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’（すなわち、ターミネーター）とを含む。双方の制御領域が形質転換宿主細胞の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、制御領域は必ずしも産生宿主（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））にとって天然の遺伝子に由来しなくともよい。
【００９３】
別個の複製ベクターから２個以上の遺伝子を発現させる場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、及び安定した発現を維持し、且つ構築物間でのエレメントの混合を防止するため、他の構築物と相同性を欠くものでなければならない。調節領域、選択手段及び導入した構築物の増殖方法の妥当な選択は、導入された遺伝子の全てが所望の産物の合成を提供するために必要なレベルで発現するように実験的に決定することができる。
１つ又は複数の対象遺伝子を含む構築物又はベクターは、任意の標準的な技術によりヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）などの宿主細胞に導入され得る。それらの技法としては、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、遺伝子銃衝撃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、電気穿孔、マイクロインジェクション、又は１つ又は複数の対象遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法が挙げられる。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に対して本明細書では、米国特許第４，８８０，７４１号明細書及び米国特許第５，０７１，７６４号明細書及びＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年））に記載されるとおりの直鎖化されたＤＮＡ断片に基づく組込み技法がより好ましい。
【００９４】
便宜上、ＤＮＡ配列を取り込むように任意の方法によって操作された宿主細胞（例えば、発現カセット）が、本明細書では「形質転換された」、「形質転換体」又は「組換え」と称される。形質転換宿主は発現カセットの少なくとも１つのコピーを有し、及び発現カセットがゲノムに組み込まれるか、又は複数のコピー数を有する染色体外エレメントに存在するかに応じて、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されるとおり、様々な選択技法により同定することができる。
本明細書で用いられる好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン及びアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、並びにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファン又はヒスチジン欠損培地での増殖能力である。代替的実施形態では、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択に５−フルオロオロチン酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が使用され（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）、又は形質転換体の選択にスルホニル尿素除草剤耐性を付与する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（又はアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．  ４．１．３．１８）（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）が利用される。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書には、部位特異的リコンビナーゼ系を使用することにより、一対の好ましい選択マーカーを再利用してそれらを複数の逐次的な形質転換に使用する独自の方法もまた教示されている。
【００９５】
当業者には周知のとおり、単に遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ、アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ）をクローニングベクターに挿入するだけは、所望の速度、濃度、量等でのその発現は確実とはならない。転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性及びタンパク質位置、酸素制限及び宿主細胞からの分泌の側面を制御する多数の異なる遺伝要素を操作することが求められ得る。より具体的には、遺伝子発現は、以下を変えることにより制御されてもよい：関連する転写プロモーター及びターミネーター配列の性質；クローニングされた遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミドから産生されるか、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるか；合成された外来性タンパク質の最終的な細胞内位置；宿主生物中での翻訳効率；宿主細胞内でのクローニングされた遺伝子タンパク質の固有の安定性；及び、その頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近付くような、クローニングされた遺伝子内でのコドン使用。これらの過剰発現方法のいくつかは以下で考察し、例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１タンパク質、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼの過剰発現手段として、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞において有用である。
【００９６】
所望の１つ又は複数の遺伝子の発現は、より強力なプロモーター（調節性のものであっても、又は構成的なものであっても）を使用して、ｍＲＮＡ又はコードされたタンパク質のいずれかから不安定な配列を除去する／欠失させることによるか、又は安定的な配列をｍＲＮＡに付加することによって発現の増加を生じさせることにより、転写レベルで増加し得る（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞中での異種遺伝子又はその一部の発現を駆動するのに有用な転写開始制御領域又はプロモーターは多数あり、当業者に公知である。発現は、誘導的又は構成的な形で達成され得る。誘導的発現は、対象遺伝子に作動可能に連結された調節性プロモーターの活性を誘導することにより達成することができ、一方、構成的発現は、対象遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを使用することにより実現することができる。事実上、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でのデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を導くことが可能な任意のプロモーター（すなわち、天然、合成、又はキメラ）が好適であり得るが、宿主種由来の転写及び翻訳領域が特に有用である。
【００９７】
概して、終結領域は遺伝子の３’領域に由来することができ、開始領域はそこから得られてもよく、又は異なる遺伝子から得られてもよい。多数の終結領域が公知であり、様々な宿主において、終結領域が由来したものと同じ及び異なる属及び種のいずれで利用されるときにも満足に機能する。終結領域は、通常任意の特定の特性のためというより便宜上の問題として選択される。好ましくは、終結領域は酵母遺伝子に由来する。３’領域はまた、当業者が入手可能な情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列を設計及び合成することができるとおりの、合成のものであってもよい。終結部位はなくてもよいが、極めて好ましい。
限定することは意図されないが、本明細書の開示において有用な好ましいプロモーター領域及び終結領域は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に教示されるものである。
【００９８】
ＰＵＦＡ生合成経路デサチュラーゼ、エロンガーゼ及びＤＧＬＡシンターゼ遺伝子及び／又はＣＰＴ１、マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の追加的なコピー（すなわち、１つより多いコピー）をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入し、それによりＥＰＡ産生及び蓄積を増加させてもよい。具体的には、遺伝子の追加的なコピーが、単一の発現構築物内にクローニングされてもよい；及び／又は、１つ又は複数のクローニングされた遺伝子の追加的なコピーが、プラスミドコピー数を増加させることによるか、又はクローニングされた遺伝子をゲノムに複数組み込むことにより宿主細胞に導入されてもよい（下記）。
本明細書の方法論によりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）最適化株を調製するとき、多くの場合に様々なデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼのコピーが参照される点に留意することが重要である。例えば、Δ９エロンガーゼの２コピーが必要な場合、これは、１）単一の種から単離された特定のΔ９エロンガーゼについての同じコード配列の２つのコピー；又は、２）種「Ａ」から単離されたΔ９エロンガーゼについての１つのコード配列及び種「Ｂ」から単離されたΔ９エロンガーゼについての１つのコード配列であって、ひいては合わせて２つのΔ９エロンガーゼをもたらすコード配列を指し得る。
【００９９】
概して、油性酵母での発現に好適なＤＮＡカセット（例えば、プロモーター、ＯＲＦ及びターミネーターを含むキメラ遺伝子を含む）が得られると、それは宿主細胞中での自己複製能を有するプラスミドベクター内に置かれるか、又は宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム中でランダムに行うことができ、又は宿主遺伝子座との標的組換えに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含む構築物を使用することによって標的化することもできる。本明細書でそれに頼るわけではないが、転写及び翻訳調節領域の全て又は一部は、構築物が内因性遺伝子座に標的化される場合には内因性遺伝子座により提供することができる。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で遺伝子を発現させる好ましい方法は、直鎖状ＤＮＡ断片の宿主ゲノムへの組込みによるものである。ゲノム内の複数の部位に組み込むことが、遺伝子の高レベル発現が望ましい場合に特に有用であり得る。好ましい遺伝子座としては、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に教示されるものが挙げられる。
【０１００】
Ｊｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ、１８：９７〜１１３頁（２００１年））は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容株及び標的化プラットフォームに依存することを指摘している。従って、当業者は、所望の発現レベル及びパターンを呈する株を得るため、複数の形質転換体をスクリーニングしなければならないことを認識するであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタン解析、ＰＵＦＡ産物の表現型分析又はＧＣ分析によって達成され得る。
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１、ＤＧＬＡシンターゼ、マロニルＣｏＡシンテターゼ、アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼをコードする）の発現を最適化し、且つ最大の、及び最も経済的なＥＰＡ収率をもたらす条件下で増殖される。概して培地条件は、炭素源の種類及び量、窒素源の種類及び量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス産生期間の長さ、油蓄積期間の長さ並びに細胞回収の時期及び方法を変更することによって最適化され得る。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、概して、酵母エキス−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］などの複合培地又は増殖に必要な成分が欠けていることにより所望の発現カセットが強制的に選択される限定最少培地（例えば、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））で増殖される。
【０１０１】
本明細書に記載される方法及び宿主細胞用の発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許出願第１２／６４１，９２９号明細書（２００９年１２月１９日に出願された）に教示されるような好適な炭素源を含まなければならない。本発明に利用される炭素源は多種多様な炭素含有供給源を包含し得ることが企図されるが、好ましい炭素源は、糖類、グリセロール及び／又は脂肪酸である。最も好ましくは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース及び／又は脂肪酸である。
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ4）2ＳＯ4）又は有機源（例えば、尿素又はグルタミン酸）から供給され得る。適切な炭素源及び窒素源に加え、発酵培地はまた、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、ビタミン及び当業者に公知の、ＥＰＡ高産生油性酵母の成長及びＥＰＡを産生する酵素経路の促進に好適な他の成分も含まなければならない。特に、脂質及びＰＵＦＡの合成を促進するＦｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2及びＭｇ+2などのいくつかの金属イオンに注意が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ．、Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ及びＲ．Ｃｏｌｉｎ編、６１〜９７頁（１９９２年））。
【０１０２】
本明細書に記載される方法及び宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な市販品として調製済みの培地である。他の限定又は合成増殖培地もまた使用することができ、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖に適した培地は微生物学又は発酵科学の当業者によって判断され得る。発酵に好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、なかでもｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件の範囲として好ましい。発酵は好気性条件下又は嫌気性条件下で行われてもよく、微好気性条件が好ましい。
典型的には、油性酵母細胞での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、増殖と脂肪の合成／貯蔵との間で代謝状態が「平衡」しなければならないため、２段階プロセスを要する。従って、最も好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）でのＥＰＡ産生には二段階発酵プロセスが必要である。この手法は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に、様々な好適な発酵プロセス設計（すなわち、バッチ、フェドバッチ及び連続）及び増殖中の考慮事項として記載される。
本明細書におけるいくつかの態様において、一次産物は油性酵母バイオマスである。そのため、バイオマスからのＥＰＡ含有油の単離及び精製は（すなわち、全細胞バイオマスが産物である場合）、不要のこともある。
【０１０３】
しかしながら、特定の最終用途及び／又は産物形態では、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡをもたらすために、バイオマスからのＥＰＡ含有油の部分的及び／又は完全な単離／精製が必要となり得る。ＥＰＡを含むＰＵＦＡは、宿主微生物（例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ））中で遊離脂肪酸として、又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質若しくは糖脂質などのエステル化された形態で存在し得る。これらの脂肪酸は、当該技術分野において公知の様々な手段によって宿主細胞から抽出され得る。酵母脂質についての抽出技法、品質分析及び許容基準の一つのレビューが、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年））のレビューである。下流プロセシングの簡略なレビューもまた、Ａ．Ｓｉｎｇｈ及びＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１〜３１２頁（１９９７年））によって利用可能となっている。
概して、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマスからのＥＰＡ及び他のＰＵＦＡの精製手段としては、有機溶媒、音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用）、鹸化及び物理的手段、例えばプレス、ビーズビーター、又はそれらの組み合わせによる抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書及び米国特許第５，６４８，５６４号明細書）を挙げることができる。さらなる詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示が参照される。
【０１０４】
純化及び／又は精製されたＥＰＡを含有する油は水素化されてもよく、それにより様々な溶融特性及びテクスチャを有する脂肪がもたらされる。スプレッド、製菓用脂肪、ハードバター、マーガリン、ベーキングショートニング等を含めた多くの加工脂肪は、室温で様々な固形度を必要とし、原料油の物理的特性を変化させることによってのみ生産することができる。これは、最も一般的には、接触水素化により実現される（さらなる詳細及び参考文献については国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照のこと）。
ＥＰＡを含む油性酵母バイオマスを含む食製品、人工栄養乳、機能性食品、医療用食品、医療用栄養剤、食事サプリメント、医薬組成物、動物飼料、及びパーソナルケア製品が、本明細書に提供される。同様に、組換え油性酵母バイオマスから単離されたＥＰＡ又はＥＰＡを含む微生物油を含む食製品、人工栄養乳、機能性食品、医療用食品、医療用栄養剤、食事サプリメント、医薬組成物、動物飼料、及びパーソナルケア製品もまた提供される。
加工及び配合技術分野の当業者は、バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡのどのような量及び組成を、標的種及び／又は最終用途に従い特定の製品に加え得るかを理解し得る。より具体的には、「有効」量が製品配合物に含められなければならず、しかしながらこの量は、食品若しくは飼料製品、その製品による補給が意図される食事、又は医療用食品若しくは医療用栄養剤による補正又は治療が意図される医学的状態に依存し得る。最も望ましくは、ＥＰＡの有効量は、ω−３／ω−６  ＰＵＦＡの摂取に伴う望ましい健康上の特性を提供するのに十分であり得る。典型的には、製品に含められるＥＰＡの量は、いくつか例を挙げれば、加工条件に関連する損失、典型的な取扱い及び保管条件、製品中でのＥＰＡの安定性、及び標的種によるバイオアベイラビリティ／生体吸収効率が考慮される。
【０１０５】
加工及び配合技術分野の当業者は、本明細書に記載される組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）産生宿主細胞から産生された油を濃縮し、それにより全脂質画分が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又はさらには少なくとも約９０％のＥＰＡを含むように、全脂質画分中のＥＰＡの濃度を上昇させる方法に精通しているであろう。本明細書に記載される精製油を他の精製脂肪酸（例えば、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ）と、又は代替的な脂肪酸を好ましい濃度で含有する油とブレンドする手段もまた、当業者には公知である。これらの技法により、個々に合わせて調整された脂肪酸プロファイルを含む油を作り出すことが容易に可能となる。
パーソナルケア製品：パーソナルケア製品との関連においてω−３脂肪酸は、皮膚のコンディショニング効果を亢進するために使用され得る皮膚用配合物に特定の用途を有する。当業者は、有効量の関連する１つ又は複数のω−３脂肪酸又はそれを含む油をスキンケア組成物にどのように提供すればよいかを理解しているであろう。ＰＵＦＡ油又はω−３脂肪酸に加え、スキンケア組成物は化粧品として許容可能なスキンケア組成物用媒体をさらに含んでもよく、その例はＰｈｉｌｉｐｐｅらにより米国特許第６，２８０，７４７号明細書に記載されている。例えば、化粧品として許容可能な媒体は、組成物の総重量に対して概して約１０重量％〜約９０重量％の割合で脂肪物質を含有する無水組成物であってもよく、ここで脂肪相は少なくとも１つの液体、固体又は半固体脂肪物質を含む。脂肪物質としては、限定はされないが、オイル、ワックス、ゴム、及びいわゆるペースト状脂肪物質が挙げられる。或いは、組成物は、油中水型又は水中油型乳剤などの安定的な分散体の形態であってもよい。加えて、組成物は、限定はされないが、抗酸化剤、保存剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡ及び／又はＵＶＢ日焼け防止剤、芳香剤、増粘剤、湿潤剤、アニオン性又は非イオン性又は両性ポリマー、及び色素を含めた１つ又は複数の従来の化粧品用又は皮膚科学的添加剤又は補助剤を含有してもよい。
【０１０６】
食物：現在の市場は、ω−３及び／又はω−６脂肪酸（特にＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ）を取り入れた広範な種類の食品及び飼料製品を抱えている。本明細書に記載される酵母バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡは、食製品中で現在の配合物の健康上の利益を付与する機能を果たし得ることが企図される。
食製品としては、限定はされないが、食品類似物、飲料、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品及び乳製品を挙げることができる。
食品類似物は、当業者に周知の方法を用いて作製され得る。肉類似物、チーズ類似物、乳類似物などを挙げることができる。大豆から作製される肉類似物は、大豆タンパク質又は豆腐、及び共に混合される他の成分を含んで様々な種類の肉を擬製する。これらの肉代替物は、冷凍、缶詰又は乾燥食品として販売される。通常、肉代替物は、それが代わりをする食品と同じ方法で使用され得る。肉類似物の例としては、限定はされないが、ハム類似物、ソーセージ類似物、ベーコン類似物などが挙げられる。
食品類似物は、その機能上及び組成上の特性に応じて模造物又は代用物として分類することができる。例えば、模造チーズは、それが代わりとなるよう設計されるチーズに似ているだけでよい。しかしながら、製品が代わりをするチーズと栄養的に等価であり、且つ当該のチーズについての最小限の組成要件を満たす場合に限り、その製品は概して代用チーズと称され得る。従って、代用チーズは、多くの場合に模造チーズより高いタンパク質レベルを有し、ビタミン及びミネラルが補強されている。
【０１０７】
乳類似体又はノンデイリー食製品としては、限定はされないが、模造ミルク及びノンデイリー冷菓（例えば、大豆及び／又は大豆タンパク質製品から作られるもの）が挙げられる。
肉製品は、幅広い種類の製品を包含する。米国では「肉」は、ウシ、ブタ及びヒツジから生産される「赤身肉」を含む。赤身肉に加え、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、ホロホロチョウ、アヒルを含む家禽品目及び魚介類がある。広範な種類の調味肉及び加工肉製品がある：生、塩漬けしてフライしたもの、及び塩漬けして調理したもの。ソーセージ及びホットドッグが加工肉製品の例である。従って、用語「肉製品」は本明細書で使用されるとき、限定はされないが、加工肉製品を含む。
穀物食製品は、穀物粒の加工から得られる食製品である。穀物粒は、食用の穀粒（種子）を産出する草科の任意の植物を含む。最も一般的な穀粒は、大麦、トウモロコシ、キビ、オート麦、キノア、米、ライ麦、モロコシ、ライ小麦、小麦及び野生米である。穀物食製品の例としては、限定はされないが、全粒、粉砕粒、粗粒、穀粉、ふすま、胚芽、朝食用シリアル、押出し食品、パスタなどが挙げられる。
【０１０８】
ベーカリー品目製品は、上記に挙げた穀物食製品であって、焼き上げられた、又は焼上げと同等の方法で加工された、すなわち熱に供することにより乾燥若しくは硬化させた穀物食品のいずれかを含む。ベーカリー品目製品の例としては、限定はされないが、パン、ケーキ、ドーナツ、バー、パスタ、パン粉、焼き上げたスナック食品、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、及びミニプレッツェルが挙げられる。上述したとおり、組換えＥＰＡ産生宿主細胞由来の油を成分として使用することができる。
スナック食製品は、上記又は下記の食製品のいずれかを含む。
フライド食製品は、フライされている上記又は下記の食製品のいずれかを含む。
飲料は液体又は乾燥粉末形態であり得る。例えば、非炭酸飲料；生の、冷凍の、缶入りの又は濃縮されたフルーツジュース；風味付き又は風味付けされていない乳飲料等を挙げることができる。成人用及び乳児用の栄養配合物は当該技術分野において周知されており、市販されている（例えば、Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）、及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。
乳製品は、乳に由来する製品である。乳類似物又はノンデイリー製品は、上記で考察したとおり乳以外の原料、例えば豆乳に由来する。これらの製品としては、限定はされないが：全乳、脱脂乳、発酵乳製品、例えば、ヨーグルト又は酸乳、クリーム、バター、練乳、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマー、アイスクリーム、チーズ等が挙げられる。
【０１０９】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡを含めることのできるさらなる食製品は、例えば、チューイングガム、糖菓及び糖衣菓、ゼラチン及びプディング、ハード及びソフトキャンデー、ジャム及びゼリー、精製グラニュー糖、砂糖代用品、加糖のソース、トッピング及びシロップ、並びにドライブレンドされた粉末ミックスである。
人工栄養乳：人工栄養乳は、乳児及び幼児に与えられる液体又は再構成粉末である。「人工栄養乳」は、本明細書では、乳児の哺乳においてヒト母乳に代用することのできる腸内栄養製品として定義され、典型的には水溶液中に所望の割合の炭水化物及びタンパク質と混合された所望の割合の脂肪から構成される（例えば、米国特許第４，６７０，２８５号明細書を参照のこと）。全世界的な組成研究、並びに専門家集団により規定されるレベルに基づけば、平均ヒト母乳は、典型的には約０．２０％〜０．４０％の全脂肪酸を含み（脂肪からのカロリーが約５０％であると仮定）；及び、概してＤＨＡ対ＡＲＡ比は約１：１〜１：２の範囲であり得る（例えば、Ｅｎｆａｍｉｌ  ＬＩＰＩＬ（商標）［Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ］及びＳｉｍｉｌａｃ  Ａｄｖａｎｃｅ（商標）［Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］の配合を参照のこと）。人工栄養乳は、多くの場合に乳児にとって唯一の栄養源であるため、乳児の食事において果たすべき特定の役割を有する。乳児にとって母乳による授乳がなお最良の栄養であるが、人工栄養乳はそれにほぼ匹敵する、赤ん坊が生存できるのみならず発育する次善のものである。
【０１１０】
健康食製品及び医薬品：本バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡは、機能性食品、医療用食品、医療用栄養剤及び食事サプリメントを含む健康食製品において健康上の利益を付与するために配合物中に使用されてもよい。加えて、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡは、標準的な医薬組成物に使用されてもよい。本ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）改変株又はそれから産生されるＥＰＡを含む微生物油は、上述の食製品のいずれにも容易に組み込むことができ、それにより例えば機能性食品又は医療用食品がもたらされる。例えば、ＥＰＡを含むより高濃縮の配合物としては、ヒト又はヒト以外の動物において食事サプリメントとして使用することのできるカプセル、粉末、錠剤、ソフトカプセル、ジェルキャップ、濃縮液及び乳剤が挙げられる。
動物飼料製品：動物飼料は、本明細書では、ヒト以外の動物用の飼料としての使用又は飼料中への混合が意図される製品として一般的に定義される。本明細書に記載されるヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＥＰＡは、様々な動物飼料中の成分として使用することができる。
【０１１１】
より具体的には、限定として解釈されてはならないが、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞由来のＥＰＡ産物は、ペット用食製品、反芻動物用及び家禽用食製品並びに水産養殖用食製品中に使用され得ることが予想される。ペット用食製品は、イヌ、ネコ、鳥類、爬虫類、げっ歯類などのペットに給餌されるよう意図された製品である。これらの製品は、上記の穀物及び健康食製品、並びに肉及び肉副製品、大豆タンパク質製品、牧草及び乾草製品（アルファルファ、チモシー、オート麦又はブロムグラスなど）並びに野菜を含むことができる。反芻動物用及び家禽用食製品は、その製品が、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、ウシ及びブタに給餌されるよう意図される場合の食製品である。上記のペット用食品と同様に、これらの製品は、上記に列挙したとおりの穀物及び健康食製品、大豆タンパク質製品、肉及び肉副製品、並びに牧草及び乾草製品を含み得る。水産養殖用食製品（又は「海洋飼料」）は、淡水又は海水中の水生生物及び／又は動物の繁殖、培養又は養殖に関する水産養殖での使用が意図される製品である。
【０１１２】
高濃度のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本改変株は、多くの動物飼料配合物中に含めることが特に有用であろうと考えられる。必要なω−３  ＰＵＦＡを提供することに加え、酵母それ自体が、動物の全般的な健康及び栄養に寄与し、且つ配合物の食味を向上させ得るタンパク質及び他の栄養（例えば、ビタミン、ミネラル、核酸、複合炭水化物等）の有用な供給源である。従って、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）産生宿主を含む酵母バイオマスの添加は、動物飼料配合物中の優れた追加的な飼料栄養源となるであろうことが企図される（さらなる詳細については米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書を参照のこと）。
次に、高濃度のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本改変株は、多くの水産養殖飼料中に含めることが特に有用であろうことは明らかである。必要なω−３及び／又はω−６  ＰＵＦＡを提供することに加え、酵母それ自体が、配合物の美味性を向上させ得る有用なタンパク質源である。代替的実施形態では、本Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株により産生される油は、細胞マスからの抽出及び精製後、水産養殖飼料配合物中に直接添加することができる。
【０１１３】
ＥＰＡがそれ自体として重要なω−３脂肪酸であるという認識が高まっている。結果として、本明細書では、本明細書に記載される組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）産生宿主のＥＰＡ濃縮油が、様々な治療用途、例えば、炎症、心血管疾患、遺伝子発現の栄養制御及び異常脂質血症において、具体的には、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性障害、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、神経性食欲不振症、熱傷、変形性関節症、骨粗鬆症、うつ病、及び注意欠陥傷害／多動性障害を含む臨床病態の治療において極めて広範囲にわたる有用性を有し得ることが予想される。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、ＥＰＡと炎症、ＥＰＡと心血管疾患、ω−３  ＰＵＦＡと遺伝子発現の栄養制御、及びω−３  ＰＵＦＡと異常脂質血症に関するさらなるヒト臨床試験について記載しており、当該明細書中で参照されるべきである。最近になって、１１０人の健常対象者において無作為二重盲検プラセボ対照試験が実施され、ここで対象者には、心血管疾患リスク要因、有害イベント及び安全性パラメータに対する油の効果を評価する手段として、以下のうちの１つが６週間にわたり与えられた：６００ｍｇ／日のＥＰＡ、１８００ｍｇ／日のＥＰＡ、６００ｍｇ／日のＤＨＡ又はオリーブ油（プラセボ）（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｐ．、「Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｏｍｅｇａ−３  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」  Ｔｅｘａｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０年２月；米国仮特許出願第６１／２９２９１５号明細書［２０１０年１月７日出願］及び米国仮特許出願第６１／２９５３４７号明細書［２０１０年１月１５日出願］、Ｅ．Ｉ  ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ及び会社顧問代理人整理番号は、それぞれＣＬ４９３８ＵＳＰＲＶ及びＣＬ４９３８ＵＳＰＲＶ１である）。６００ｍｇＥＰＡ／日を補給することにより、既に正常範囲にある健康なコレステロール値が維持されることが分かった。注目すべきことに、この試験のＥＰＡ油はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変株に由来した。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、あくまでも例示として提供されるに過ぎないことは理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、及びその趣旨及び精神から逸脱することなく本発明の様々な変更及び修正を行い、本発明を様々な利用法及び条件に適合させることができる。
【０１１５】
一般的方法
実施例において用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、及びＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；及び、３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、刊行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）により記載がなされている。
【０１１６】
微生物培養物の維持及び成長に好適な材料及び方法は、当該技術分野において公知である。以下の例における使用に好適な技法は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年））において；又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋにより「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）において示されるとおり見出され得る。微生物細胞の成長及び維持に使用される全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、基本的にはルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］プレートにおいて３７℃で増殖した。
全般的な分子クローニングは標準方法により実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。サブクローニングにＰＣＲ又は部位特異的突然変異誘発が関わった場合、構築物を配列決定し、配列にエラーが導入されていないことを確認した。ＰＣＲ産物は、ＰｒｏｍｅｇａのｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙーベクター（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。
【０１１７】
略称の意味は以下のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ＤＣＷ」は乾燥細胞重量を意味し、及び「ＴＦＡ」は全脂肪酸を意味する。
【０１１８】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここではＸがプロモーター断片を表し、Ｙが遺伝子断片を表し、及びＺがターミネーター断片を表し、これらは全て、互いに作動可能に連結されている。
【０１１９】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換及び培養
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２を購入した。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、以下に示す配合によるいくつかの培地中、２８〜３０℃でルーチン的に増殖した。寒天プレートは、標準方法論に従い、各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加することにより必要に応じて調製した。
ＹＰＤ寒天培地（リットル当たり）：１０ｇの酵母エキス［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、及び２０ｇのグルコース。
基本最少培地［「ＭＭ」］（リットル当たり）：２０ｇのグルコース、アミノ酸を含まない１．７ｇの酵母窒素ベース、１．０ｇのプロリン、及びｐＨ６．１（調整不要）。
最少培地＋ウラシル［「ＭＭ＋ウラシル又はＭＭＵ」］（リットル当たり）：上記のＭＭ培地を調製し、０．１ｇのウラシル及び０．１ｇのウリジンを添加する。
最少培地＋ウラシル＋スルホニル尿素［「ＭＭＵ＋ＳＵ」］（リットル当たり）：上記のＭＭＵ培地を調製し、２８０ｍｇのスルホニル尿素を添加する。
最少培地＋ウラシル＋リジン［「ＭＭＵｒａＬｙｓ」］（リットル当たり）：上記のＭＭ培地を調製し、０．１ｇのウラシル、０．１ｇのウリジン及び０．１ｇのリジンを添加する。
最少培地＋５−フルオロオロチン酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］（リットル当たり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素ベース、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジン及び適当量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）、１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく（供給業者から受け取る各バッチ内でばらつきが生じるため）。
高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（リットル当たり）：８０のグルコース、２．５８ｇのＫＨ2ＰＯ4及び５．３６ｇのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５（調整不要）。
酵母エキス非含有発酵培地［「ＹＥ非含有ＦＭ」］（リットル当たり）：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、６．００ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．００ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５０ｇのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、及び２０ｇのグルコース。
発酵培地［「ＦＭ」］（リットル当たり）：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、６．００ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．００ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５０ｇのＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、２０ｇのグルコース及び５．００ｇの酵母エキス（ＢＢＬ）。
【０１２０】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるとおり実施した。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．及びＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））に記載されるとおり遠心により細胞を回収し、脂質を抽出した。脂質抽出物のナトリウムメトキシドとのエステル交換反応により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．、及びＮｉｓｈｉｄａ  Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣにより分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間維持）から１８５℃とした。
【０１２１】
直接的な塩基エステル交換反応のため、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃにおいて５〜１０分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）及び既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０  ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次に試料をボルテックスにかけ、５０℃で３０分間揺動させた。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌ及び４００μｌヘキサンを添加した後、試料をボルテックスにかけ、回転させた。上層を取り出し、ＧＣにより分析した。
【０１２２】
ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、既知の脂肪酸と比較したときのその滞留時間により特定し、ＦＡＭＥピーク面積について既知量の内部標準（Ｃ１５：０  ＴＡＧ）と比較することにより定量化した。従って、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇ  ＦＡＭＥ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）により計算され、一方、Ｃ１５：０  ＴＡＧの１μｇは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇ  ＦＡ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３により計算される。０．９５０３の変換係数は、０．９５〜０．９６の範囲をとる多くの脂肪酸について決定される値の近似であることに留意されたい。
各個別の脂肪酸の量をＴＦＡの質量パーセントとして要約する脂質プロファイルを、個別のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の合計で除して１００を乗じることにより決定した。
【０１２３】
フラスコアッセイによるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の全脂質含量及び組成の分析
特定のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中の全脂質含量及び組成を詳細に分析するため、以下のとおりフラスコアッセイを実施した。具体的には、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを用いて脂肪酸分析（上記）を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０１２４】
ＤＣＷを決定するため、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、１０ｍＬの培養物を回収した。ペレットを２５ｍＬの水中に再懸濁し、再度上記のとおりに回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中に再懸濁し、予め秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］を計算し、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］、及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を表にまとめたデータと併せて検討する。フラスコアッセイからのデータは、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する表として提供する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定され得る。
【０１２５】
実施例１
全脂肪酸の約４６％のＤＧＬＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ１３５株（Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ−、Δｐｅｘ３）の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により全脂質に対して約４６％のＤＧＬＡを産生する能力を有するＬ１３５株の構築について記載する。
【０１２６】
要約すれば、図２に図解されるとおり、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２から、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自律的突然変異によるＦＯＡ耐性突然変異体）、Ｙ４００１株（１７％ＥＤＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（１８％ＤＧＬＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）及びＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）の構築を介してＬ１３５株を誘導した。Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株及びＹ４０３６Ｕ株の構築に関するさらなる詳細は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書の一般的方法に記載されている。
【０１２７】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ４０３６Ｕ株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴであった（ここでＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＭＥ３Ｓはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ８Ｍは合成突然変異Δ８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であって、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するもの［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］である）。
【０１２８】
Ｐｅｘ３の染色体欠失を有するＬ１３５株の生成
Ｌ１３５株の構築については、本明細書によって参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０４６２４８号パンフレットの実施例１２に記載されている。要約すれば、構築物ｐＹ１５７を使用して、Ｙ４０３６Ｕ株においてペルオキシソーム生合成因子３タンパク質［ペルオキシソーム形成タンパク質ペルオキシン３又は「Ｐｅｘ３ｐ」］をコードする染色体遺伝子をノックアウトし、それによりＬ１３５株（Ｙ４０３６株（Δｐｅｘ３）とも称される）を産生した。Ｌ１３５株における染色体Ｐｅｘ３遺伝子のノックアウトは、Ｙ４０３６株（その天然Ｐｅｘ３ｐがノックアウトされていない）と比較して以下をもたらした：より高い脂質含量（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）（約６．０％、対４．７％）、より高いＤＧＬＡ  ％  ＴＦＡ（４６％、対１９％）、より高いＤＧＬＡ  ％  ＤＣＷ（約２．８％、対０．９％）及びＬＡ  ％  ＴＦＡの低下（１２％、対３０％）。加えて、Δ９エロンガーゼ変換効率が、Ｙ４０３６株における約４８％からＬ１３５株における８３％に増加した。
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＬ１３５株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ−、Ｐｅｘ３−、未知１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴであった。
【０１２９】
実施例２
全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の約１８％〜約４１％のＡＲＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により全脂質に対して約４１％のＡＲＡを産生する能力を有するＹ８００６株の構築について記載する。
Ｙ８００６株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）の構築、並びにＬ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株の構築が必要であった。
【０１３０】
Ｌ１３５Ｕ９（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ３−）株の生成
Ｌ１３５株中のプラスミドｐＹ１１６（図３；配列番号１２７；本明細書によって参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載される）においてＣｒｅリコンビナーゼ酵素を一時的に発現させることによりＬ１３５Ｕ株を作成し、Ｌｅｕ−及びＵｒａ−表現型を産生した。プラスミドｐＹ１１６を使用して、新しく増殖したＬ１３５細胞の形質転換を一般的方法に従い行った。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕＵｒａに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。３つのコロニーを選び取り、３０℃の３ｍＬの液体ＹＰＤ培地に接種して２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪した。培養物を液体ＭＭＬｅｕＵｒａ培地で１：５０，０００希釈し、１００μＬを新しいＹＰＤ培地に播種して３０℃で２日間維持した。３つのプレートの各々から８つのコロニーを選び取り（合計２４コロニー）、ＭＭＬｅｕ及びＭＭＬｅｕＵｒａ選択プレート上に画線した。ＭＭＬｅｕＵｒａプレートで増殖でき、しかしＭＭＬｅｕプレートでは増殖できなかったコロニーを選択し、ＧＣにより分析してＣ２０：２（ＥＤＡ）の存在について確認した。Ｌｅｕ−及びＵｒａ−表現型を有する１つの株をＬ１３５Ｕ９と命名した。
【０１３１】
ＴＦＡの約３２％のＡＲＡを産生するＹ８００２株の生成
構築物ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５（図４Ａ；配列番号１２８）を生成して３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＬ１３５Ｕ９株のＬｙｓ遺伝子座に組み込み、それによりＡＲＡの産生を可能にした。ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５プラスミドは以下の成分を含んだ。
【０１３２】
【表６】
2016101172.tif 000015
【０１３３】
ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＬ１３５Ｕ９株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭＵｒａＬｙｓプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭＵｒａＬｙｓプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭＵｒａＬｙｓに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０１３４】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５の３つのキメラ遺伝子を含む形質転換体にはＡＲＡが存在し、しかし親Ｌ１３５Ｕ９株には存在しないことが示された。ＴＦＡの約３２．２％、３２．９％、３４．４％、３２．１％及び３８．６％のＡＲＡを産生した５個の株（すなわち、＃２８、＃６２、＃７３、＃８４及び＃９５）を、それぞれＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株と命名した。さらなる分析により、ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５の３つのキメラ遺伝子がＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株のＬｙｓ５部位に組み込まれなかったことが示された。全ての株がＬｙｓ＋表現型を有した。
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ−、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔであった。
【０１３５】
ＴＦＡの約４１％のＡＲＡを産生するＹ８００６株の生成
構築物ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４Ｂ；配列番号１２９；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表９に記載される）を生成して３つのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子をＹ８００２株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）に組み込んだ。
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００２株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０１３６】
ＧＣ分析により、ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子を含む選択された９６個の形質転換体のほとんどにＴＦＡの２６％〜３１％のＥＰＡが存在し、しかし親Ｙ８００２株には存在しないことが示された。株＃６９はＴＦＡの約３８％のＥＰＡを産生し、Ｙ８００７と命名した。ＥＰＡを産生せず、しかしＴＦＡの約４１％のＡＲＡを産生した株が１つあった（すなわち、株＃９）。この株はＹ８００６と命名した。Ｙ８００６株におけるＥＰＡ産生の欠如に基づき、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するその遺伝子型は、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、Ｕｒａ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔであると推定された。
【０１３７】
対照的に、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８００７株の最終的な遺伝子型は、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、Ｕｒａ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった（ここでＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり、ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）由来のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼである［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］。
Ｙ８００６株及びＹ８００７株におけるＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）へのｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子の組込みは確認されなかった。
【０１３８】
実施例３
全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の約２４％〜約５６％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により全脂質に対して約５６％のＥＰＡを産生する能力を有するＹ８４１２株の構築について記載する。
Ｙ８４１２株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）、Ｌ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株（実施例２に記載される）、並びにＹ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株及びＹ８２６９Ｕ株の構築が必要であった。
【０１３９】
Ｙ８００６Ｕ６（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用してＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８００６株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。
プラスミドｐＺＫＵＭをＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００６株の形質転換に使用した。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長した合計８個の形質転換体を選び取り、ＭＭプレート及びＭＭ＋５−ＦＯＡプレートに別個に再度画線した。８株全てがＵｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上では増殖できたが、ＭＭプレート上では増殖できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから剥がし取り、一般的方法により脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃２、＃４、＃５、＃６及び＃７に、それぞれ２２．９％、２５．５％、２３．６％、２１．６％、２１．６％及び２５％のＡＲＡが存在することが示された。これらの６個の株は、それぞれＹ８００６Ｕ１株、Ｙ８００６Ｕ２株、Ｙ８００６Ｕ３株、Ｙ８００６Ｕ４株、Ｙ８００６Ｕ５株及びＹ８００６Ｕ６株（まとめて、Ｙ８００６Ｕ株）と命名した。
【０１４０】
ＴＦＡの約３７．５％のＥＰＡを産生するＹ８０６９株の生成
構築物ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４Ｂ；配列番号１２９；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表９に記載される）を使用して３つのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子をＹ８００６Ｕ６株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）に組み込んだ。
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００６Ｕ６株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子を含む形質転換体にＥＰＡが存在し、しかし親Ｙ８００６Ｕ６株には存在しないことが示された。選択した２４個の株のほとんどが、ＴＦＡの２４〜３７％のＥＰＡを産生した。ＴＦＡの３７．５％、４３．７％、３７．９％及び３７．５％のＥＰＡを産生した４つの株（すなわち、＃１、＃６、＃１１及び＃１４）を、それぞれＹ８０６６、Ｙ８０６７、Ｙ８０６８及びＹ８０６９と命名した。ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子の、Ｙ８０６６株、Ｙ８０６７株、Ｙ８０６８株及びＹ８０６９株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）への組込みは確認されなかった。
【０１４１】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８０６６株、Ｙ８０６７株、Ｙ８０６８株及びＹ８０６９株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。
【０１４２】
Ｙ８０６９Ｕ株（Ｕｒａ３−）の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８０６９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計３個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長したｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃２及び＃３に、それぞれ２２．４％、２１．９％及び２１．５％のＥＰＡが存在することが示された。これらの３個の株を、それぞれＹ８０６９Ｕ１株、Ｙ８０６９Ｕ２株、及びＹ８０６９Ｕ３株（まとめて、Ｙ８０６９Ｕ株）と命名した。
【０１４３】
ＴＦＡの約４４．８％のＥＰＡを産生するＹ８１５４株の生成
構築物ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ（図５Ｂ；配列番号１３１）を生成して１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、及び１つのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）をＹ８０６９Ｕ３株のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１４４】
【表７】
2016101172.tif 000016
【０１４５】
ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９ＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８０６９Ｕ３株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどがＴＦＡの約３８〜４４％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４４．７％、４５．２％、４５．４％、４４．８％、４６．１％、４８．６％及び４５．９％のＥＰＡを産出した７個の株（すなわち、＃１、＃３９、＃４９、＃６２、＃７０、＃８５及び＃９２）を、それぞれＹ８１５１株、Ｙ８１５２株、Ｙ８１５３株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５５株、Ｙ８１５６株及びＹ８１５７株と命名した。これらのＥＰＡ株においてＬｉｐ２遺伝子のノックアウトは確認されなかった。
【０１４６】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８１５１株、Ｙ８１５２株、Ｙ８１５３株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５５株、Ｙ８１５６株及びＹ８１５７株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏであった。
【０１４７】
Ｙ８１５４Ｕ１（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８１５４株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃７においてＴＦＡの２３．１％のＥＰＡがあったことが示された。この株をＹ８１５４Ｕ１株と命名した。
【０１４８】
ＴＦＡの約４５．３％のＥＰＡを産生するＹ８２６９株の生成
構築物ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５（図６Ａ；配列番号１３２）を生成して１つのＤＧＬＡシンターゼ、１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子及び１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８１５４Ｕ１株のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ＤＧＬＡシンターゼは、Δ８デサチュラーゼに連結されたΔ９エロンガーゼを含むマルチザイムである。
ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１４９】
【表８】
2016101172.tif 000017
【０１５０】
ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８１５４Ｕ１株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどが全脂質の４０〜４４．５％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４４．８％、４５．３％、４７％、４４．６％及び４４．７％のＥＰＡを産生した５個の株（すなわち、＃４４、＃４６、＃４７、＃６６及び＃８７）を、それぞれＹ８２６８、Ｙ８２６９、Ｙ８２７０、Ｙ８２７１及びＹ８２７２と命名した。Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０１５１】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８２６８株、Ｙ８２６９株、Ｙ８２７０株、Ｙ８２７１株及びＹ８２７２株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏであった。
【０１５２】
Ｙ８２６９Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８２６９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃２、＃３及び＃５において、それぞれＴＦＡの２３．０％、２３．１％及び２４．２％のＥＰＡがあったことが示された。これらの株を、それぞれＹ８２６９Ｕ１株、Ｙ８２６９Ｕ２株及びＹ８２６９Ｕ３株（まとめて、Ｙ８２６９Ｕ株）と命名した。
【０１５３】
ＴＦＡの約５１．２％のＥＰＡ及び５５．８％のＥＰＡを産生するＹ８４０６株及びＹ８４１２株の生成
構築物ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３（図６Ｂ；配列番号１３３）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのＣ16/18エロンガーゼ遺伝子及び１つのマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子をＹ８２６９Ｕ１株のＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１５４】
【表９】
2016101172.tif 000018
【０１５５】
ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８２６９Ｕ１株、Ｙ８２６９Ｕ２株及びＹ８２６９Ｕ３株の別個の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
各ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３形質転換（すなわち、Ｙ８２６９Ｕ１、Ｙ８２６９Ｕ２及びＹ８２６９Ｕ３）により得られた合計９６個の株をＧＣにより分析した。選択した２８８個の株のほとんどがＴＦＡの４３〜４７％のＥＰＡを産生した。ＴＦＡの約５１．３％、４７．９％、５０．８％、４８％、４７．８％、４７．８％及び４７．８％のＥＰＡを産生した７個のＹ８２６９Ｕ１のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃５９、＃６１、＃６５、＃６７、＃７０、＃８１及び＃９４）を、それぞれＹ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株及びＹ８４１０株と命名した。ＴＦＡの約４８．８％、５０．８％、及び４９．３％のＥＰＡを産生したこれらのＹ８２６９Ｕ２のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃４、＃１３及び＃１７）を、それぞれＹ８４１１、Ｙ８４１２及びＹ８４１３と命名した。さらに、ＴＦＡの約４９．３％及び５３．５％のＥＰＡを産生した２個のＹ８２６９Ｕ３のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃２及び＃１６）を、それぞれＹ８４１４及びＹ８４１５と命名した。
【０１５６】
Ｙ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株、Ｙ８４１０株、Ｙ８４１１株、Ｙ８４１２株、Ｙ８４１３株、Ｙ８４１４株及びＹ８４１５株におけるＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）のノックアウトは、ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換によって産生されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０１５７】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株、Ｙ８４１０株、Ｙ８４１１株、Ｙ８４１２株、Ｙ８４１３株、Ｙ８４１４株及びＹ８４１５株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株は２００９年５月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２５を有する。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２株は２００９年５月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２６を有する。
【０１５８】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株、Ｙ８４１０株、Ｙ８４１１株、Ｙ８４１２株、Ｙ８４１３株、Ｙ８４１４株及びＹ８４１５株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。表１０は、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定され得る。
【０１５９】
【表１０】
2016101172.tif 000019
【０１６０】
実施例４
３７．６％の全脂質含量で全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の約５３．６％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６４７株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により３７．６％の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］で全脂質に対して約５３．６％のＥＰＡを産生する能力を有するＹ８６４７株の構築について記載する。Ｙ８６４７株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）、Ｌ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株（実施例２に記載される）、Ｙ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株及びＹ８２６９Ｕ株（実施例３に記載される）、並びにＹ８４１２Ｕ６株の構築が必要であった。
【０１６１】
Ｙ８４１２Ｕ６（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８４１２株（実施例３）のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃４及び＃６において、それぞれＴＦＡの２５．９％及び２６．９％のＥＰＡがあったことが示された。これらの２個の株を、それぞれＹ８４１２Ｕ６株及びＹ８４１２Ｕ８株（まとめて、Ｙ８４１２Ｕ株）と命名した。
【０１６２】
Ｙ８６４７株の生成
構築物ｐＺＫＬ４−３９８Ｆ２（図７Ａ；配列番号１３４）を生成して１つのＣ16/18エロンガーゼ遺伝子、１つのＤＧＬＡシンターゼ、及び１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子をＹ８４１２Ｕ６株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）リパーゼ様遺伝子座（Ｌｉｐ４と命名される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３８２５）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＫＬ４−３９８Ｆ２プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１６３】
【表１１】
2016101172.tif 000020
【０１６４】
ｐＺＫＬ４−３９８Ｆ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８４１２Ｕ６株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、選択した９６個の形質転換体株のほとんどがＴＦＡの５０〜５２．７％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５２．８％、５３．１％、５２．８％、５３．２％、５３．１％、５２．８％、及び５２．９％のＥＰＡを産生した７個の株（すなわち、＃３１、＃３５、＃３８、＃４１、＃６０、＃６１及び＃９５）を、それぞれＹ８６４６、Ｙ８６４７、Ｙ８６４８、Ｙ８６４９、Ｙ８６５０、Ｙ８６５１及びＹ８６５２と命名した。
これらのＥＰＡ株におけるＬｉｐ４遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３８２５）のノックアウトは確認されなかった。
【０１６５】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８６４６株、Ｙ８６４７株、Ｙ８６４８株、Ｙ８６４９株、Ｙ８６５０株、Ｙ８６５１株及びＹ８６５２株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０１６６】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８６４７株、Ｙ８６４８株、Ｙ８６４９株及びＹ８６５０株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。表１２は、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定される。
【０１６７】
【表１２】
2016101172.tif 000021
【０１６８】
実施例５
３９．６％の全脂質含量で全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の約５４．５％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９０２８株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により３９．６％の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］で全脂質に対して約５４．５％のＥＰＡを産生する能力を有するＹ９０２８株の構築について記載する。Ｙ９０２８株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）、Ｌ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株（実施例２に記載される）、Ｙ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株及びＹ８２６９Ｕ株（実施例３に記載される）、Ｙ８４１２Ｕ６株及びＹ８６４７株（実施例４に記載される）、並びにＹ８４６７Ｕ株の構築が必要であった。
【０１６９】
Ｙ８６４７Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８６４７株（実施例４）のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計１２個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃３、＃４及び＃１２において、それぞれＴＦＡの３０．２％、２９．２％、２８．１％及び２９．９％のＥＰＡがあったことが示された。これらの４個の株を、それぞれＹ８６４７Ｕ１株、Ｙ８６４７Ｕ２株、Ｙ８６４７Ｕ３株、及びＹ８６４７Ｕ６株（まとめて、Ｙ８６４７Ｕ株）と命名した。
【０１７０】
株Ｙ９０２８の生成
構築物ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（図７Ｂ；配列番号１３５）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのＤＧＬＡシンターゼ及び１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を、Ｙ８６４７Ｕ３株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１７１】
【表１３】
2016101172.tif 000022
【０１７２】
ｐＺＰ２−８５ｍ９８ＦプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８６４７Ｕ１株、Ｙ８６４７Ｕ２株、Ｙ８６４７Ｕ３株及びＹ８６４７Ｕ６株の個別の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、Ｙ８６４７Ｕ１のｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆによる形質転換株の選択した４８個のほとんどが、ＴＦＡの４９〜５２％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５２．６％及び５２．１％のＥＰＡを産生した２個の株（すなわち、＃３０及び＃３１）を、それぞれＹ９０２４及びＹ９０２５と命名した。
Ｙ８６４７Ｕ２のｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆによる形質転換株の選択した６０個のほとんどが、ＴＦＡの４９〜５１．９％のＥＰＡを産生した。株＃６はＴＦＡの約５２％のＥＰＡを産生し、Ｙ９０２６と命名した。
【０１７３】
Ｙ８６４７Ｕ３のｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆによる形質転換株の選択した６０個のほとんどが、ＴＦＡの５０〜５２．２％のＥＰＡを産生した。ＴＦＡの約５３．２％、５３．７％、５４．０％、５２．９％、５３．４％及び５２．３％のＥＰＡを産生した６個の株（すなわち、＃５、＃６、＃１４、＃１５、＃２０及び＃３４）を、それぞれＹ９０２７、Ｙ９０２８、Ｙ９０２９、Ｙ９０３０、Ｙ９０３１及びＹ９０３２と命名した。
同様に、ＧＣ分析により、Ｙ８６４７Ｕ６のｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆによる形質転換株の選択した４８個のほとんどが、ＴＦＡの５０〜５２．１％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５２．２％及び５２．８％のＥＰＡを産生した２個の株（すなわち、＃２７及び＃４４）を、それぞれＹ９０３３及びＹ９０３４と命名した。
Ｙ９０２４株、Ｙ９０２５株、Ｙ９０２６株、Ｙ９０２７株、Ｙ９０２８株、Ｙ９０２９株、Ｙ９０３０株、Ｙ９０３１株、Ｙ９０３２株、Ｙ９０３３株及びＹ９０３４株におけるＰｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３００）のノックアウトは、ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆによる形質転換によって産生されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０１７４】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するこれらの株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、未知９−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：；Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０１７５】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ９０２８株、Ｙ９０２９株及びＹ９０３１株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
以下の表１４は、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定される。
【０１７６】
【表１４】
2016101172.tif 000023
【０１７７】
実施例６
少なくとも約３５％の全脂質含量で全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の少なくとも約５７％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９４８１株及びＹ９５０２株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来し、且つΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現するＹ９４８１株及びＹ９５０２株の構築について記載する。Ｙ９４８１株は３５％の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］で全脂質に対して約６０．９％のＥＰＡを産生する能力を有し、一方Ｙ９５０２株は、３７．１％のＴＦＡ  ％  ＤＣＷで全脂質に対して約５７％のＥＰＡを産生する能力を有する。
Ｙ９４８１株及びＹ９５０２株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）、Ｌ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株（実施例２に記載される）、Ｙ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株及びＹ８２６９Ｕ株（実施例３に記載される）、Ｙ８４１２Ｕ６株及びＹ８６４７株（実施例４に記載される）、Ｙ８４６７Ｕ株及びＹ９０２８株（実施例５に記載される）及びＹ９０２８Ｕ株の構築が必要であった。
【０１７８】
Ｙ９０２８Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ９０２８株（実施例５）のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃３、＃４、及び＃５において、それぞれＴＦＡの２４．１％、２４．９％、２４．５％及び２４．５％のＥＰＡがあったことが示された。これらの４個の株を、それぞれＹ９０２８Ｕ１株、Ｙ９０２８Ｕ２株、Ｙ９０２８Ｕ３株、及びＹ９０２８Ｕ４株（まとめて、Ｙ９０２８Ｕ株）と命名した。
【０１７９】
組込みベクターｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎの構成要素
構築物ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ（図８Ａ；配列番号１３６）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子、及び１つのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子［「ＬＰＡＡＴ」］をＹ９０２８Ｕ２株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５００９００）に組み込んだ。ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１８０】
【表１５】
2016101172.tif 000024
【０１８１】
組込みベクターｐＺＫ１６−ＭＬの構成要素
構築物ｐＺＫ１６−ＭＬ（図８Ｂ；配列番号１３７）を生成して１つのマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子及び１つのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子［「ＬＰＡＡＴ」］をＹ９０２８Ｕ２株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５００９００）に組み込んだ。ｐＺＫ１６−ＭＬプラスミドの構成要素はｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ（上記）の構成要素と同じである；しかしながら、ｐＺＫ１６−ＭＬ８ＮのキメラＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０遺伝子はない。
【０１８２】
Ｙ９４８１株及びＹ９５０２株の生成
ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎプラスミド及びｐＺＫ１６−ＭＬプラスミドを各々ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで個別に消化し、次に一般的方法によるＹ９０２８Ｕ２株の形質転換に別個に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎを含むＹ９０２８Ｕ２株の選択した９６個のほとんどがＴＦＡの５０〜５５．４％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５８．１％、６１．４％、５６．２％、５８．１％、５７．５％、５７．０％、５５．９％、５７．６％、５７．８％、５５．５％、５７．６％、５８．１％、５７．１％、５６．２％及び５８．６％のＥＰＡを産生した１５個の株（すなわち、＃８、＃１８、＃２１、＃２４、＃２９、＃４８、＃６０、＃６６、＃６８、＃７５、＃７６、＃７８、＃９０、＃９５及び＃９６）を、それぞれＹ９４７２、Ｙ９４７３、Ｙ９４７４、Ｙ９４７５、Ｙ９４７６、Ｙ９４７７、Ｙ９４７８、Ｙ９４７９、Ｙ９４８０、Ｙ９４８１、Ｙ９４８２、Ｙ９４８３、Ｙ９４８４、Ｙ９４８５及びＹ９４８６と命名した。
【０１８３】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するこれらのｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ形質転換体株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、未知９−、未知１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０１８４】
同様に、ＧＣ分析により、ｐＺＫ１６−ＭＬを含むＹ９０２８Ｕ２株の選択した９６個のほとんどがＴＦＡの５１〜５５．５％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５６．５％、５７．４％、５６．８％、５７．０％、５６．４％、５７．３％、５８．２％、５５．６％、５７．８％、５５．６％、５７．６％、５６．８％、５５．８％、５６．４％、５６．１％及び５７％のＥＰＡを産生した１６個の株（すなわち、＃４、＃８、＃１５、＃１６、＃３９、＃４４、＃４６、＃６３、＃６６、＃８０、＃８５、＃８６、＃８８、＃８９、＃９０及び＃９６）を、それぞれＹ９４９６、Ｙ９４９７、Ｙ９４９８、Ｙ９４９９、Ｙ９５００、Ｙ９５０１、Ｙ９５０２、Ｙ９５０３、Ｙ９５０４、Ｙ９５０５、Ｙ９５０６、Ｙ９５０７、Ｙ９５０８、Ｙ９５０９、Ｙ９５１０及びＹ９５１１と命名した。
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するこれらのｐＺＫ１６−ＭＬ形質転換体株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、未知９−、未知１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０１８５】
Ｙ９４７２株、Ｙ９４７３株、Ｙ９４７４株、Ｙ９４７５株、Ｙ９４７６株、Ｙ９４７７株、Ｙ９４７８株、Ｙ９４７９株、Ｙ９４８０株、Ｙ９４８１株、Ｙ９４７８２株、Ｙ９４８３株、Ｙ９４８４株、Ｙ９４８５株、Ｙ９４８６株、Ｙ９４９６株、Ｙ９４９７株、Ｙ９４９８株、Ｙ９４９９株、Ｙ９５００株、Ｙ９５０１株、Ｙ９５０２株、Ｙ９５０３株、Ｙ９５０４株、Ｙ９５０５株、Ｙ９５０６株、Ｙ９５０７株、Ｙ９５０８株、Ｙ９５０９株、Ｙ９５１０株及びＹ９５１１株におけるＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５００９００）のノックアウトは、ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ又はｐＺＫ１６−ＭＬによる形質転換によって産生されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０１８６】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ９４７７株、Ｙ９４８１株、Ｙ９４８６株、Ｙ９４９７株、Ｙ９５０２株、Ｙ９５０４株、Ｙ９５０８株及びＹ９５１０株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
以下の表１６は、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定される。
【０１８７】
【表１６】
2016101172.tif 000025
【０１８８】
実施例７
２６．５％の全脂質含量で全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の約６１．８％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により２６．５％の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］で全脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを産生する能力を有するＹ８６７２株の構築について記載する。Ｙ８６７２株（図９）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株及びＬ１３５株（実施例１に記載される）、Ｌ１３５Ｕ９株及びＹ８００２株（実施例２に記載される）、Ｙ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株（実施例３に記載される）及びＹ８１４５株、Ｙ８１４５Ｕ株、Ｙ８２５９株、Ｙ８２５９Ｕ株、Ｙ８３６７株及びＹ８３６７Ｕ株の構築が必要であった。
【０１８９】
ＴＦＡの約４８．５％のＥＰＡを産生するＹ８１４５株の生成
構築物ｐＺＫＬ２−５ｍ８９Ｃ（図１０；配列番号１３８）を生成して１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、及び１つのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）をＹ８０６９Ｕ３株（実施例３）のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＫＬ２−５ｍ８９Ｃプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０１９０】
【表１７】
2016101172.tif 000026
【０１９１】
ｐＺＫＬ２−５ｍ８９ＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８０６９Ｕ３株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどがＴＦＡの３８〜４４．５％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４５．１％、４５．６％、４５．０％及び４５．６％のＥＰＡを産生した４個の株（すなわち、＃１０、＃５０、＃７０及び＃８９）を、それぞれＹ８１４３、Ｙ８１４４、Ｙ８１４５及びＹ８１４６と命名した。Ｌｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２６３２）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０１９２】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８１４３株、Ｙ８１４４株、Ｙ８１４５株及びＹ８１４６株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。
【０１９３】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８１４３株、Ｙ８１４４株、Ｙ８１４５株及びＹ８１４６株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
【０１９４】
【表１８】
2016101172.tif 000027
【０１９５】
Ｙ８１４５Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８１４５株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃５、＃６及び＃７において、それぞれＴＦＡの２２．５％、２２．６％及び２３．４％のＥＰＡがあったことが示された。これらの３つの株を、それぞれＹ８１４５Ｕ１株、Ｙ８１４５Ｕ２株及びＹ８１４５Ｕ３株（まとめて、Ｙ８１４５Ｕ株）と命名した。
【０１９６】
ＴＦＡの約５３．９％ＥＰＡを産生するＹ８２５９株の生成
構築物ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５（実施例３、図６Ａ；配列番号１３２）を生成して１つのＤＧＬＡシンターゼ遺伝子、１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子及び１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を、Ｙ８１４５Ｕ株のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。
ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ８１５４Ｕ１株のｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＹ８１４５Ｕ１株の形質転換に使用した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、選択した９６株のほとんどが全脂質の４０〜４４．０％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４５．２％、４７％、４４．４％、４４．３％及び４５．２％のＥＰＡを産生した５個の株（すなわち、＃７、＃１４、＃４８、＃５６及び＃６０）を、それぞれＹ８２５５、Ｙ８２５６、Ｙ８２５７、Ｙ８２５８及びＹ８２５９と命名した。Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０１９７】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するこれらの株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｓ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ；  ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９株は、２００９年５月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２７を有する。
【０１９８】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８２５６株及びＹ８２５９株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
【０１９９】
【表１９】
2016101172.tif 000028
【０２００】
Ｙ８２５９Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８２５９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃３においてＴＦＡの２６．６％のＥＰＡがあったことが示された。この株をＹ８２５９Ｕ株と命名した。
【０２０１】
ＴＦＡの約５８．３％ＥＰＡを産生するＹ８３６７株の生成
構築物ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（実施例５、図７Ｂ；配列番号１３５）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのＤＧＬＡシンターゼ、及び１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を、Ｙ８２５９Ｕ株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。
ｐＺＰ２−８５ｍ９８ＦプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ８６４７Ｕ３株のｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ形質転換についての記載（実施例５）と同様の方法によるＹ８２５９Ｕ株の形質転換に使用した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆを含むＹ８２５９Ｕ株の選択した９６個のほとんどがＴＦＡの４１〜４６％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４６．７％、４６．５％、４７．４％及び４６．９％のＥＰＡを産生した４個の株（すなわち、＃２６、＃３３、＃７７及び＃８１）を、それぞれＹ８３６７、Ｙ８３６８、Ｙ８３６９及びＹ８３７０と命名した。Ｐｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３００）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０２０２】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８３６７株、Ｙ８３６８株、Ｙ８３６９株及びＹ８３７０株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。
【０２０３】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８３６７株、Ｙ８３６８株、Ｙ８３６９株及びＹ８３７０株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
【０２０４】
【表２０】
2016101172.tif 000029
【０２０５】
Ｙ８３６７Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８３６７株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃２、＃３及び＃６において、それぞれＴＦＡの２５．６％、２５．５％及び２５．４％のＥＰＡがあったことが示された。これらの３つの株を、それぞれＹ８３６７Ｕ１株、Ｙ８３６７Ｕ２株及びＹ８３６７Ｕ３株（まとめて、Ｙ８３６７Ｕ株）と命名した。
【０２０６】
ＴＦＡの約６１．８％のＥＰＡを産生するＹ８６７２株の生成
構築物ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３（実施例３、図６Ｂ；配列番号１３３）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのＣ16/18エロンガーゼ遺伝子及び１つのマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子をＹ８６３７Ｕ株のＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。
ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ８２６９Ｕ１株のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＹ８３６７Ｕ１株の形質転換に使用した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
ＧＣ分析により、ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３を含むＹ８３６７Ｕ１株の選択した９６個のほとんどがＴＦＡの４６〜５２．５％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約５３．２％、５２．８％、５２．７％、５２．９％、５３．０％、５２．６％、５３．１％及び５２．７％のＥＰＡを産生した８個の株（すなわち、＃８、＃４０、＃４３、＃４４、＃６１、＃６３、＃６８及び＃７０）を、それぞれＹ８６６６、Ｙ８６６７、Ｙ８６６８、Ｙ８６６９、Ｙ８６７０、Ｙ８６７１、Ｙ８６７２及びＹ８６７３と命名した。ＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０２０７】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８６６６株、Ｙ８６６７株、Ｙ８６６８株、Ｙ８６６９株、Ｙ８６７０株、Ｙ８６７１株、Ｙ８６７２株及びＹ８６７３株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、未知８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０２０８】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８６６６株、Ｙ８６６９株、Ｙ８６７９株及びＹ８６７２株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
【０２０９】
【表２１】
2016101172.tif 000030
【０２１０】
実施例８
種々のＬＰＬＡＴ  ＯＲＦを含む様々な発現ベクターの構築
本実施例は、各々がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に好適なＬＰＬＡＴ  ＯＲＦを含む一連のベクターの構築について記載する。ＬＰＬＡＴ  ＯＲＦは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴを含んだ。実施例９は、これらのベクターをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株に形質転換した後に得られた結果について記載する。
【０２１１】
ＬＰＬＡＴの起源
特許及び公開文献において様々なＬＰＬＡＴが同定されているが、それらの遺伝子の機能についてはこれまで直接比較されたことがない。表２２は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に対して異種遺伝子をコドン最適化した後に（下記）本実施例で利用される、公開されているＬＰＬＡＴ（すなわち、ＳｃＡｌｅ１、ＳｃＬＰＡＡＴ、ＭａＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴ）及び本明細書で同定されるＬＰＬＡＴオルソログ（すなわち、ＹｌＡｌｅ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１）を要約する。
【０２１２】
【表２２】
2016101172.tif 000031
【０２１３】
より具体的には、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号３２）及びＳｃＡｌｅ１（配列番号１５）タンパク質配列を問い合わせ配列として使用して、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ、仏国）の公開されているＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースからオルソログを同定した（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）もまた参照のこと）。ベストヒットの分析に基づき、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴオルソログが、本明細書ではそれぞれＹｌＡｌｅ１（配列番号１７）及びＹｌＬＰＡＡＴ（配列番号３１）として同定される。それぞれＳｃＡｌｅ１及びＳｃＬＰＡＡＴのオルソログとしてのＹｌＡｌｅ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１のアイデンティティについて、レシプロカルＢＬＡＳＴ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ＢＬＡＳＴ）を行うことによりさらに確認し、すなわち配列番号１７及び３１をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）公開タンパク質データベースに対する問い合わせ配列として使用して、ベストヒットとしてそれぞれＳｃＡｌｅ１及びＳｃＬＰＡＡＴを求めた。
【０２１４】
ＳｃＡｌｅ１（配列番号１５）、ＹｌＡｌｅ１（配列番号１７）、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号３２）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号２９）、ＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号３１）及びＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２５）として上記で同定されたＬＰＬＡＴタンパク質を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（バージョン８．０．２）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（スロー（ｓｌｏｗ）、アキュレート（ａｃｃｕｒａｔｅ）、Ｇｏｎｎｅｔオプション；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））の方法を用いてアラインメントした。その結果から表２３を作成し、ここでは類似性パーセントが表の上三角部分に示され、一方、分散パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）が下三角部分に示される。
【０２１５】
【表２３】
2016101172.tif 000032
【０２１６】
この方法により明らかにされる同一性パーセントから、ＬＰＡＡＴポリペプチドの各々の間の最小同一性パーセント及びＡｌｅ１ポリペプチドの各々の間の最小同一性パーセントを決定することが可能となった。ＬＰＡＡＴポリペプチド間の同一性の範囲は３４．０％同一性（ＭａＬＰＡＡＴ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１）〜４３．９％同一性（ＳｃＬＰＡＡＴ及びＹｌＬＰＡＡＴ１）であった一方、ＳｃＡｌｅ１及びＹｌＡｌｅ１ポリペプチド間の同一性は４５％であった。
【０２１７】
膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ２．２．２０（タンパク質−タンパク質Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７２：５１０１〜５１０９頁（２００５年））検索を、「ｎｒ」タンパク質データベース（全ての非重複ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ［「ＰＤＢ」］からの三次元構造に由来する配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新の大規模な公開に含まれる配列、ＷＧＳプロジェクトからの環境試料のものを除くＰＩＲ及びＰＲＦを含む）における真菌タンパク質に対する問い合わせ配列としてＳｃＡｌｅ１（配列番号１５）を使用し、デフォルトパラメータ（期待値閾値＝１０；ワードサイズ＝３；スコアリングパラメータ行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在＝１１、伸長＝１）を使用して行うことにより、ＳｃＡｌｅ１タンパク質配列（配列番号１５）のオルソログを同定した。以下のヒットが得られた。
【０２１８】
【表２４−１】
2016101172.tif 000033
【表２４−２】
2016101172.tif 000034
【０２１９】
表２４の酵母及び真菌タンパク質配列を、ＤＮＡＳＴＡＲを使用してアラインメントした。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いて多重配列アラインメント及び同一性パーセント計算を実施した（上記）。
【０２２０】
より具体的には、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いた多重タンパク質アラインメントのデフォルトパラメータは、以下に対応した：ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト（ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ、「スロー−アキュレート（ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）」オプション付き。得られたアラインメントを分析し、米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７−Ａ１号明細書に特定されるとおりの、Ａｌｅ１相同体についての非植物モチーフの存在又は不在を決定した。具体的にそれらとしては、Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号１０２）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号１０３）、ＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号１０４）（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基をコードする）が挙げられる。配列番号１０４のＨｉｓ残基は、タンパク質内における活性部位残基と見られることが報告されている。
【０２２１】
アラインメントを行った３３個の生物全てにおいて完全に保存されていたのは、１つのモチーフ、すなわちＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２１）のみであった。他のＭ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号１０２）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号１０３）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号１０４）モチーフは、部分的にのみ保存されていた。従って、本方法論の目的上、これらのモチーフを適切に切断し、０ミスマッチ（すなわち、ＳＡｘＷＨＧ［配列番号２０］）、１ミスマッチ（すなわち、ＲｘＫＹＹｘｘＷ［配列番号１９］）、又は２ミスマッチ（すなわち、Ｍ（Ｖ／Ｉ）（Ｌ／Ｉ）ｘｘＫ（ＬＶＩ）［配列番号１８］）に適合させた。
【０２２２】
１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］ファミリーモチーフ：ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）及びＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）を含むタンパク質アラインメントの分析から、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフＥＧＴＲ（配列番号２０）がＬＰＡＡＴオルソログの各々に存在することが明らかとなった。これに基づき、ＭａＬＰＡＡＴ１をＬＰＡＡＴ候補として同定し、これは国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットに開示されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ様タンパク質（すなわち、配列番号９３及び９５）とは明確に区別可能なものであった。
【０２２３】
ＥＧＴＲ（配列番号２０）モチーフは、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットではＬＰＣＡＴ配列中にないものの、ＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２）に存在することは注目に値する。他の残基がＬＰＡＡＴ配列及びＬＰＡＡＴ様タンパク質のＬＰＣＡＴ配列を区別しているように思われる。かかる残基の一つは、ＥＧＴＲ（配列番号２０）モチーフの伸長部であり得る。具体的には、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）及びＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）のＥＧＴＲモチーフは直後にセリン残基が続くが、ＣｅＬＰＣＡＴのＥＧＴＲモチーフは直後にアスパラギン残基が続く。対照的に、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットの２つのＬＰＣＡＴは、ＥＧＴＲモチーフにおいてアルギニン残基の代わりにバリンを有し、このモチーフは直後にバリン残基が続く。
【０２２４】
コドン最適化サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１遺伝子を含むｐＹ２０１の構築
「ＳｃＡｌｅ１」（配列番号１４）と命名されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＲＦを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＳｃＡｌｅ１Ｓ；配列番号２２）。ＳｃＡｌｅ１Ｓ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号２３］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号１５］と同じである）。ＳｃＡｌｅ１ＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＳｃＡｌｅ１Ｓを得た。
【０２２５】
ＳｃＡｌｅ１Ｓを含む１８６３ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＳｃＡｌｅ１Ｓから切り取り、それを使用してｐＹ２０１（配列番号１３９；表２５；図１０Ａ）を作成した。キメラＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むことに加え、ｐＹ２０１はまた、必要に応じて、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えにより続いて除去するためのＬｏｘＰ部位が隣接するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３選択マーカーも含む。ＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１キメラ遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子の双方とも、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｏｘ３遺伝子の５’領域及び３’領域との相同性を有する断片が隣接し、それにより二重相同組換えによる組込みが促進されるが、しかしながらＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）への組込みは、通常は相同組換えなしに行われることが知られている。従って、これにより構築物ｐＹ２０１は以下の構成要素を含んだ。
【０２２６】
【表２５】
2016101172.tif 000035
【０２２７】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１遺伝子を含むｐＹ１６８の構築
「ＹｌＡｌｅ１」と命名されるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０５６２４；配列番号１６）をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２  ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲプライマー７９８及び７９９（それぞれ配列番号１４１及び１４２）を使用してＰＣＲ増幅した。加えて、ＹＡＴプロモーターをｐＹ２０１（配列番号１３９）からＰＣＲプライマー８００及び８０１（それぞれ配列番号１４３及び１４４）により増幅した。互いにいくらかの重複を有する２つのＰＣＲ産物が生じるようにプライマー対を設計したため、次にＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１融合断片を、プライマー７９８及び８０１（それぞれ配列番号１４１及び１４４）並びに鋳型としての２つのＰＣＲ断片を使用して重複ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０  ＰＣＲ機（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、製造者の推奨及びＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００３８０）を用いて実行した。増幅は以下のとおり実行した：９５℃で４分間の初期変性、続いて９５℃で３０秒間の変性を３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルを実行した後、４℃で反応を終了させた。
【０２２８】
ＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１融合断片を含むＰＣＲ産物をゲル精製し、ＣｌａＩ／ＮｏｔＩで消化した。このＣｌａ１−Ｎｏｔ１断片を、同様に消化した（それによりＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ断片を除去した）ｐＹ２０１にライゲートし、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むｐＹ１６８（配列番号１４５）を生じさせた。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ａｌｅ１  ＯＲＦのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐＹ１６８（図１０Ｂ；配列番号１４５）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ１６８ではＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＹｌＡｌｅ１は図１０Ｂでは「Ｙｌ  ＬＰＣＡＴ」と表示されることに留意されたい。
【０２２９】
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ２０８の構築
「ＭａＬＰＡＡＴ１」（配列番号２８）と命名されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＯＲＦを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ；配列番号３５）。ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号３６］は野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号２９］と同じである）。ＭａＬＰＡＡＴ１ＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを得た。
【０２３０】
ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを含む９４５ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓから切り取り、それを使用して、ｐＹ２０１（配列番号１３９）の２つの断片との３ウェイライゲーションでｐＹ２０８（配列番号１４６）を作成した。具体的には、ＭａＬＰＡＡＴ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ２０１断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ２０１断片とライゲートしてｐＹ２０８を得た。ｐＹ２０８（図１１Ａ；配列番号１４６）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ２０８ではＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。
【０２３１】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ２０７の構築
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の推定ＬＰＡＡＴ１（本明細書では「ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名される；配列番号３０及び３１）については、米国特許第７，１８９，５５９号明細書及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０４１２７に記載がなされた。このタンパク質は、「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ３３３３３サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＤＬ０５２ｃ  ＳＬＣ１脂肪酸アシルトランスフェラーゼと同様」との注釈が付けられている。
鋳型としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２  ｃＤＮＡライブラリ並びにＰＣＲプライマー８５６及び８５７（それぞれ配列番号１４７及び１４８）を使用して、ＹｌＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦ（配列番号３０）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ｐＹ１６８の合成前のＹＡＴ１：：Ｙｌ  Ａｌｅ１融合断片の増幅についての上記の記載と同じ構成要素及び条件を用いて実行した。
【０２３２】
ＹｌＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦを含むＰＣＲ産物をＰｃｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、次にｐＹ１６８からの２つの断片との３ウェイライゲーションに利用した。具体的には、ＹｌＬＰＡＡＴ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ１６８断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ１６８断片とライゲートし、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むｐＹ２０７を産生した。ＤＮＡ配列決定によりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦを確認した。ｐＹ２０７（図１１Ｂ；配列番号１４９）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ２０７ではキメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＹｌＬＰＡＡＴ１は図１１Ｂでは「Ｙｌ  ＬＰＡＴ１  ＯＲＦ」と表示されることに留意されたい。
【０２３３】
カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴ遺伝子を含むｐＹ１７５の構築
「ＣｅＬＰＣＡＴ」と命名されるカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＯＲＦ（配列番号２４）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｎｃｏ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＣｅＬＰＣＡＴＳ；配列番号２６）。ＣｅＬＰＣＡＴＳ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号２７］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号２５］と同じである）。
ＣｅＬＰＣＡＴＳを含むＮｃｏ１−Ｎｏｔ１断片を使用して、ｐＹ１６８（配列番号１４５）からの２つの断片との３ウェイライゲーションでｐＹ１７５（配列番号１５０）を作成した。具体的には、ＣｅＬＰＣＡＴＳを含むＮｃｏ１−Ｎｏｔ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ１６８断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ１６８断片とライゲートしてｐＹ１７５を得た。ｐＹ１７５（図１２Ａ；配列番号１５０）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ１７５ではＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＣｅＬＰＣＡＴＳは図１２Ａでは「Ｃｅ．ＬＰＣＡＴｓｙｎ」と表示されることに留意されたい。
【０２３４】
実施例９
ＥＰＡ産生ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株における種々のＬＰＬＡＴの機能に関する特性決定
ＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴの過剰発現の効果について、それらをヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主染色体に安定的に組み込んだ後、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＬＡＴ、すなわちＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴ１を含むにもかかわらずであった。
【０２３５】
形質転換及び増殖
Ｕｒａ３遺伝子（実施例３）を破壊するため、構築物ｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号１３０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例３）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８４０６株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。いくつかの形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃４及び＃５においてＦＡＭＥの２６．１％のＥＰＡがあったことが示された。これらの２つの株を、それぞれＹ８４０６Ｕ１株及びＹ８４０６Ｕ２株（まとめて、Ｙ８４０６Ｕ株）と命名した。
次にヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株を、実施例８に記載される組込みベクターの直鎖状ＳｐｈＩ−ＡｓｃＩ断片により個々に形質転換し、ここで各ＬＰＬＡＴはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＴ１プロモーターの制御下にあった。具体的には、ベクターｐＹ２０１（ＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ１６８（ＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ２０８（ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ２０７（ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１）及びｐＹ１７５（ＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１）を一般的方法に従い形質転換した。
【０２３６】
各形質転換混合物をＭＭ寒天プレートに播種した。いくつかの得られたＵＲＡ＋形質転換体を選び取り、アミノ酸を含まない６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇの酵母エキス、６ｇのＫＨ2ＰＯ4、２ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５ｍｇのチアミンＨＣｌ、及び２０ｇのグルコースをＬ当たりに含有する３ｍＬのＦＭ培地（Ｂｉｏｍｙｘカタログ番号ＣＭ−６６８１、Ｂｉｏｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に接種した。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で２日間増殖した後、培養物を遠心により回収し、ｐＨ７．５に調整された、０．６３％リン酸一カリウム、２．７％リン酸二カリウム、８．０％グルコースを含有する３ｍＬのＨＧＭ培地（カタログ番号２Ｇ２０８０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に再懸濁した。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で５日間増殖した後、培養物の１ｍＬアリコートを遠心により回収し、ＧＣにより分析した。具体的には、培養細胞を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心することにより回収し、全脂質を抽出し、エステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し、続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した（一般的方法）（一般的方法）。
【０２３７】
３ｍＬ培養物の脂肪酸組成に基づき、選択した形質転換体をさらに特性決定した。具体的には、発現ベクターｐＹ２０１（ＳｃＡｌｅ１Ｓを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃５及び＃１１を選択し、それぞれ「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５」及び「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１」と命名した；発現ベクターｐＹ１６８（ＹｌＡｌｅ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃１６を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１」と命名した；発現ベクターｐＹ２０８（ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃８を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」と命名した；発現ベクターｐＹ２０７（ＹｌＬＰＡＡＴ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃２１を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名した；及び発現ベクターｐＹ１７５（ＣｅＬＰＣＡＴＳを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃２３を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ」と命名した。加えて、Ｙ８４０６株（Ｙ８４０６Ｕ（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用した。
【０２３８】
各選択した形質転換体及び対照をＭＭ寒天プレートに画線した。次に、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを用いてＧＣ分析（上記）を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
ＤＣＷを決定するため、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、１０ｍＬの培養物を回収した。ペレットを２５ｍＬの水中に再懸濁し、再度上記のとおりに回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中に再懸濁し、予め秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
【０２３９】
脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率
同じ条件下で合計４つの別個の実験を実施した。実験１は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５株と比較した。実験２は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１株と比較した。実験３は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１株、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１株、及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ株と比較した。実験４は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ株、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１株及びＹ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ株と比較した。
【０２４０】
各実験において、対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株の１、２又は３個の同型培養物［「レプリケート」］について、ＤＣＷの百分率として脂質含量、脂肪酸組成及びＥＰＡを定量化した。加えて、各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。以下の表２６は、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡとして特定される。
表２７は、ＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＥＰＡ産生に必要な各デサチュラーゼ及びΔ９エロンガーゼの変換効率を要約する。具体的には、Δ１２デサチュラーゼ変換効率［「Δ１２  ＣＥ」］、Δ８デサチュラーゼ変換効率［「Δ８  ＣＥ」］、Δ５デサチュラーゼ変換効率［「Δ５  ＣＥ」］、Δ１７デサチュラーゼ変換効率［「Δ１７  ＣＥ」］及びΔ９伸長変換効率［「Δ９ｅ  ＣＥ」］が、各対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株について提供される；各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。変換効率は以下の式により計算した：産物／（産物＋基質）＊１００（ここで産物は、産物と産物誘導体との双方を含む）。
【０２４１】
【表２６】
2016101172.tif 000036
【０２４２】
【表２７】
2016101172.tif 000037
【０２４３】
表２６及び表２７の実験１、２及び３に関するデータに基づけば、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１ＳにおけるＬＰＬＡＴの過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の大幅な低下（対照の６７％以下に至る）、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］の増加（対照の少なくとも１２％に上る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも１６％に上る）をもたらす。Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５及びＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１と比較して、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１はより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より良好なΔ９伸長変換効率、並びに僅かに低いＴＦＡ  ％  ＤＣＷ及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷを有する。Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１とＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓとは、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの過剰発現がより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷをもたらしたことを除き、同程度である。
【０２４４】
実験４は、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳにおけるＬＰＬＡＴの過剰発現が、ＬＡ  ％  ＴＦＡの大幅な低下（対照の６７％以下に至る）、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡの増加（対照の少なくとも９％に上る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも１３％に上る）をもたらすことを示す。Ｙ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳと比較して、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの双方が、より低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、及び僅かに良好なＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する。Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１とＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓとは、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの過剰発現がより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、僅かに低いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、並びに僅かに良好なΔ９エロンガーゼ変換効率をもたらすことを除き、同程度である。
【０２４５】
当該技術分野では、ほとんどの不飽和化がリン脂質のｓｎ−２位で起こり、一方脂肪酸伸長がアシルＣｏＡで起こることが公知である。さらに、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹｌＬＰＡＡＴ１は、アシルＣｏＡプールからアシル基のみをリゾリン脂質、例えばリゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］及びリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］のｓｎ−２位に組み込むものと予想された。従って、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、及びＹｌＬＰＡＡＴ１の発現により、リン脂質における基質の利用能が向上するため不飽和化の向上がもたらされ、且つＣｏＡプールにおける基質の利用能の向上を必要とする伸長の向上はもたらされないものと予想された。本発明者らのデータ（上記）は、意外にも、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹｌＬＰＡＡＴ１の発現によって、ＥＰＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株におけるΔ９エロンガーゼ変換効率が大幅に向上し、しかし不飽和化（Δ１２デサチュラーゼ変換効率、Δ８デサチュラーゼ変換効率、Δ５デサチュラーゼ変換効率又はΔ１７デサチュラーゼ変換効率として計測される）は向上しなかったことを示している。
ＣｅＬＰＣＡＴは、ＬＡ又はＧＬＡを供給されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてΔ６伸長変換効率を向上させることが過去に示された（国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット）。これは、リン脂質からＣｏＡプールに脂肪酸を放出するその可逆的なＬＰＣＡＴ活性に起因した。脂肪酸の供給なしに高レベルＬＣ−ＰＵＦＡを産生するよう改変された油性微生物、例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるΔ９伸長変換効率の向上は、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットでは企図されなかった。
【０２４６】
さらに、ＥＰＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株におけるＰＵＦＡの蓄積レベル又は全脂質含量のいずれかが、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴＳの発現によって大きく変化することはなかった。
先行研究は、Δ６伸長及びΔ９伸長の双方が、リン脂質とアシルＣｏＡプールとの間でのアシル基の転移の不足により長鎖ＰＵＦＡ生合成における障害となることを示している。上記に実証される、ＬＰＬＡＴの過剰発現によりもたらされるΔ９エロンガーゼ変換効率の向上に基づけば、本明細書に記載されるＬＰＬＡＴ及びそれらのオルソログ、例えばＳｃＬＰＡＡＴもまたΔ６伸長変換効率を向上させるであろうことが予想される。
【０２４７】
実施例１０
ＬＰＡＡＴ  ＯＲＦ及び自己複製配列を含む発現ベクターの構築
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に組み込まないＬＰＡＡＴ遺伝子発現に好適な、自己複製配列［「ＡＲＳ」］とＬＰＡＡＴ  ＯＲＦとを含むベクターの構築について記載する。ＯＲＦは、配列番号３２をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴと、配列番号３１をコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１とを含んだ。実施例１１は、これらのベクターをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換した後に得られた結果について記載する。
【０２４８】
コドン最適化サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴ遺伝子を含むｐＹ２２２の構築
「ＳｃＬＰＡＡＴ」と命名されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＲＦ（配列番号３２）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＳｃＬＰＡＡＴＳ；配列番号１５１）。ＳｃＬＰＡＡＴＳ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号１５２］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号３２］と同じである）。ＳｃＬＰＡＡＴＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＳｃＬＰＡＡＴＳを得た。
ＳｃＬＰＡＡＴＳを含む９２６ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＳｃＬＰＡＡＴＳから切り取り、ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ１で切断したｐＹＡＴ−ＤＧ２−１にクローニングしてｐＹ２２２（配列番号１５３；表２８；図１４Ａ）を作成した。従って、ｐＹ２２２は以下の構成要素を含んだ。
【０２４９】
【表２８】
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【０２５０】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ１７７の構築
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）セントロメア及び自己複製配列［「ＡＲＳ」］を、プライマー８６９（配列番号１５４）及びプライマー８７０（配列番号１５５）を使用する標準的なＰＣＲにより、プラスミドｐＹＡＴ−ＤＧ２−１を鋳型として増幅した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ消化ｐＹ２０７（配列番号１４９；実施例８）にクローニングしてｐＹ１７７（配列番号１５６；表２９；図１４Ｂ）を作成した。従って、ｐＹ１７７中に存在する構成要素は、ＡｓｃＩとＡｖｒＩＩとの間の３７３ｂｐのｐＹ２０７配列がＡＲＳを含む１３４１ｂｐの配列に置き換えられたことを除き、ｐＹ２０７（図１２Ａ）中に存在するものと同じである。より具体的には、ｐＹ１７７は以下の構成要素を含んだ。
【０２５１】
【表２９】
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【０２５２】
実施例１１
ＥＰＡ産生ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株における種々のＬＰＡＡＴの機能に関する特性決定
ＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株を使用して、自己複製プラスミドに組み込まないサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴＳ（配列番号１５１）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１（配列番号３０）の発現の効果を、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＡＡＴを含むにもかかわらずであった。
【０２５３】
形質転換及び増殖
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株（実施例９）を実施例１０の切断していないプラスミドにより個々に形質転換した。具体的には、ベクターｐＹ１７７（ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１）［配列番号１５６］及びｐＹ２２２（ＹＡＴ１：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ：：Ｌｉｐ１）［配列番号１５３］を一般的方法に従い形質転換した。
【０２５４】
各形質転換混合物をＭＭ寒天プレートに播種した。いくつかの得られたＵＲＡ＋形質転換体を選び取り、３ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｃ８１４０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に接種した。ここでＣＳＭ−Ｕ培地は、ウラシル非含有０．１３％アミノ酸ドロップアウトパウダー、０．１７％酵母窒素ベース、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び２．０％グルコースを含むグルコース含有ウラシル非含有ＣＭブロスを指す。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で２日間増殖した後、培養物を遠心により回収し、３ｍＬのＨＧＭ培地（カタログ番号２Ｇ２０８０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。シェーカーにおいて５日間増殖した後、培養物の１ｍＬアリコートを回収し、実施例９に記載するとおりＧＣにより分析した。
３ｍＬ培養物の脂肪酸組成に基づき、選択した形質転換体をフラスコアッセイによりさらに特性決定した。具体的には、発現ベクターｐＹ２２２（ＳｃＬＰＡＡＴＳを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃５及び＃６を選択し、それぞれ「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−５」及び「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−６」と命名した；発現ベクターｐＹ１７７（ＹｌＬＰＡＡＴ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃１を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名した。加えて、Ｙ８４０６株（Ｙ８４０６Ｕ（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用した。
【０２５５】
各選択した形質転換体及び対照をＭＭ寒天プレートに画線した。次に、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、実施例９に記載されるとおり１ｍＬのアリコートを用いてＧＣ分析を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０２５６】
脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率
対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株の２個の同型培養物［「レプリケート」］について、ＤＣＷの百分率として脂質含量、脂肪酸組成及びＥＰＡを定量化した。加えて、各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。以下の表３０は、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡとして特定される。
表３１は、実施例９の記載と同じ方法で、ＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＥＰＡ産生に必要な各デサチュラーゼ及びΔ９エロンガーゼの変換効率を要約する。
【０２５７】
【表３０】
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【０２５８】
【表３１】
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【０２５９】
上記の表３０及び表３１におけるデータに基づけば、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−５及びＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−６におけるＳｃＬＰＡＡＴＳ及びＹｌＬＰＡＡＴ１の双方の過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の低下（対照の７６％以下に至る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも７％に上る）をもたらした。ＳｃＬＰＡＡＴＳとＹｌＬＰＡＡＴ１とは脂質プロファイルに対して同様の効果を有する。
【０２６０】
次に上記で得られた結果を実施例９で得られた結果と比較したが、ＬＰＬＡＴの特性決定には異なる手段を利用した。具体的には、実施例９では、ベクターがＡＲＳ配列を含まなかったため、ＬＰＬＡＴを有する直鎖化ＤＮＡを染色体に組み込むことにより形質転換した。その結果、安定的な組み込みがもたらされ、前培養及び２日間の増殖の双方の間に比較的高濃度の非選択的ＦＭ増殖培地で株を増殖し、その後ＨＧＭに移した。
実施例１１では、複製プラスミドに対するＹｌＬＰＡＡＴ１及びＳｃＬＰＡＡＴＳの機能に関する特性決定を行った。従って、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株を、各ＬＰＡＡＴ及びＡＲＳ配列を含む環状ＤＮＡにより形質転換した。これらのプラスミドを維持し、組込みなしに遺伝子発現をアッセイするため、ＨＧＭに移す前に、前培養及び２日間の増殖の双方の間に選択培地（すなわち、ＣＳＭ−Ｕ培地）で形質転換体を増殖させる必要があった。
上記に記載されるこれらの違いは、実施例９及び１１においてＹｌＬＰＡＡＴ１の発現により示されるとおり、脂質プロファイル及び含量の違いに寄与し得る。実施例９でＹｌＬＰＡＡＴを発現させたとき、対照と比べたＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びΔ９エロンガーゼ変換効率の変化は、それぞれ６３％、１１５％、及び１１５％であったが、一方、実施例１１でＹｌＬＰＡＡＴを発現させたときの対照と比べたＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びΔ９エロンガーゼ変換効率の変化は、それぞれ７６％、１０１％、及び１０７％であった。従って、実施例１１におけるΔ９伸長及びＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の改良は、実施例９で観察されるものと比較したとき最小限となる。これらの違いは、染色体への組込みの「位置効果」及び／又は異なる増殖条件に起因し得る。
【０２６１】
ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の改良（ＬＡ  ％  ＴＦＡの低下、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡの増加及びΔ９エロンガーゼ変換効率の増加として計測される）は、複製プラスミド上のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株に形質転換されたときのＳｃＬＰＡＡＴＳ及びＹｌＬＰＡＡＴの双方について同程度であるため、双方のＬＰＬＡＡＴとも宿主染色体に安定的に組み込まれた場合には同様に機能し得ると予想される。従って、ＳｃＬＰＡＡＴＳは、宿主染色体に安定的に組み込まれた場合、実施例９での観察と同様に脂質プロファイルを改良する可能性が高い。
【図１Ａ】
2016101172.tif 000042
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2016101172.tif 000048
【図５Ｂ】
2016101172.tif 000049
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2016101172.tif 000052
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2016101172.tif 000060
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月18日(2016.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸の産生用に操作された組換えヤロウイア種細胞を培養することを含む、
（i）全脂肪酸の質量パーセントとして計測して少なくとも５０質量パーセントのエイコサペンタエン酸、及び
（ii）全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも４．５であること、
を含む、未濃縮抽出油、を製造する方法であって、
前記細胞が
（ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに融合した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを含むポリペプチドを含む少なくとも１つのマルチザイムと、
（ｂ）発現が下方制御された少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質と、
（ｃ）マロニルＣｏＡシンテターゼ及びアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換え構築物、
とを含む細胞である、
前記方法。
【請求項２】
細胞がマロニルＣｏＡシンテターゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記マロニルＣｏＡシンテターゼが配列番号４０または配列番号４２の配列からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞がアシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの組換え構築物を含み、前記アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼが配列番号１５、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３１または配列番号３２の配列からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
マルチザイムがマルチザイムリンカーを含み、前記マルチザイムリンカーが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の配列からなる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
マルチザイムが配列番号９、配列番号１１または配列番号１３の配列からなる、請求項１記載の方法。