(57)【要約】【課題】  ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法を与えること。【解決手段】  ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層をインプラント基材上に設ける。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ポリメチルメタクリレートとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有するインプラント。
【請求項２】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとを含有する層が、更にポリ乳酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲で含有する請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液とポリメチルメタクリレートとを含有し、コート液中に含まれるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとの質量比が１０：２〜１０：２０の範囲であるコート液を基材上にコートするインプラントの製造方法。
【請求項４】
メディアミル装置を用いて湿式分散処理する際に、該アパタイトとともに該アパタイトに対して１〜５０質量％の範囲でポリ乳酸を加えて湿式分散処理を行う請求項３に記載のインプラントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストロンチウムイオンは生体内において骨芽細胞の働きを活性化し、一方で破骨細胞の活動を抑制する作用を有するとされ、実際にストロンチウムイオンの適切な濃度範囲において骨粗鬆症の予防に適用可能である。すでに欧州において医薬品として認可されているストロンチウムラネレートなどの投与により破骨細胞による過剰な骨吸収を抑制し、同時に骨芽細胞の増殖を促して骨形成を促進する効果のあることが知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２等）。ストロンチウムイオンの上記のような作用を利用する観点から、例えば骨折や骨欠損部などの修復を目的とした整形外科、形成外科等の分野における臨床用途においても、ストロンチウムイオンの好ましい効果を利用することが想定される。具体的には、例えば生体内において用いられるインプラントからストロンチウムイオンが放出されれば、インプラント表面における新生骨の形成を促し、骨伝導性を飛躍的に向上させることが期待される。インプラントとしては、人工関節などに用いられるチタン及びその合金やステンレス鋼等の種々の金属製インプラントや、人工骨などに利用されるリン酸カルシウム系セラミックス材料やバイオガラス、Ａ−Ｗガラスセラミックなどの生体活性ガラス、あるいは骨接合材に利用されるポリ乳酸や脊椎ケージにおけるポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、あるいは人工靱帯に利用されるポリエステル繊維などのプラスチック材料が挙げられ、これらに対しても、これらのインプラントと骨との接合を促進することが求められる用途においては、ストロンチウムイオンの骨形成促進効果を適用することが期待される。
【０００３】
各種インプラントからストロンチウムイオンを徐放するために利用することのできる方法として、例えば、ストロンチウムを含む層をインプラント表面に形成し、この表面層からのストロンチウムイオンの徐放を利用する方法が挙げられる。ストロンチウムを含む表面層を形成する方法として、従来から知られている方法の一つにストロンチウムイオンを溶解して含む疑似体液からの表面析出方法が挙げられる。これは、体液を模した各種電解質を含む水溶液中に適当な濃度でストロンチウムイオンを溶解した水溶液を作製し、これに該インプラントを浸漬することで該水溶液中からストロンチウムを含む層をインプラントの表面に自発的に析出形成させる方法である。
【０００４】
例えば、特許文献１には、生体適合性を有する基材（例えばチタン合金など）の表面に、カルシウムイオンやリン酸イオンを含む疑似体液中に更にストロンチウムイオンを加えた水溶液から自発的にストロンチウムを含むカルシウムアパタイトの被膜を形成する方法が開示されている。この方法は過飽和状態にあるヒドロキシアパタイトが疑似体液である水溶液中から自発的に基材上に析出する現象を利用するものであり、カルシウムアパタイト中にストロンチウムイオンが容易に置換して導入されることから、ストロンチウムを含むカルシウムアパタイトを基材上に形成する方法として用いることができる。しかしながら、こうした方法では、ストロンチウムを含むアパタイトの被膜形成に長時間を要し、かつ被膜の厚みの制御が困難であることから、ストロンチウムイオンを徐放する機能を付与するには、その放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であるとの問題を有していた。
【０００５】
また、特許文献２には、チタンを含む金属からなるインプラントを用い、その表面に予め酸化物層を形成し、更にその上部にストロンチウムを含む沈着物層を形成することで、ストロンチウムイオンを徐放する機能を有するインプラントを得る方法が開示されている。この場合のストロンチウムを含む沈着物層の形成方法は、硝酸ストロンチウム、塩化ストロンチウム、水酸化ストロンチウムなどの水溶性のストロンチウム化合物を溶解した水溶液中に、酸化物層を形成したチタン金属を浸漬する方法で行われる。この方法においても、ストロンチウムを含むアパタイトの被膜形成に長時間を要し、かつ被膜の厚みや結晶性の制御が困難であることから、ストロンチウムイオンを徐放する機能を付与するには、その放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【０００６】
更に、特許文献３にも同様にストロンチウムイオン以外にも様々な無機成分を含む疑似体液もしくはリン酸緩衝液中にチタン金属基材を浸漬することで、その表面にストロンチウムを含むリン酸カルシウム系アパタイトの層を形成する方法が開示される。
【０００７】
また、非特許文献３には、金属チタン表面に対してストロンチウムイオンを溶解したリン酸水溶液を用いて高温で水熱処理を施すことで、金属インプラント表面にストロンチウムを含む酸化チタン層を形成する方法が示されている。
【０００８】
カルシウムイオンやリン酸イオンを含む疑似体液中から自発的にヒドロキシアパタイトが析出することはよく知られており、上記のような金属チタン以外にも各種プラスチック基板やセラミックスなどの様々な基材表面にヒドロキシアパタイトの層を形成する方法が以前より行われているが、この際に疑似体液中にストロンチウムイオンを導入することで、ストロンチウムに置換されたヒドロキシアパタイトの層を各種基材表面に形成することも行われる。
【０００９】
上記いずれの方法で得られるストロンチウムを含む層も、それらの形成に要する時間に比較的長時間を要し、かつストロンチウムの導入量を制御することが困難である問題があった。更には、形成される層の厚みを制御することが困難であり、その厚みも高々数百ナノメートル程度であり、体内に導入される生体インプラント表面に適用した場合、比較的短時間で該層が溶解消失することで、その効果が失われる問題があった。加えて、基材と該層の界面における接着強度が不十分で、機械的な摩擦により該層が基材との界面から剥離し脱落する問題があった。従って、これらの場合には、ストロンチウムイオンの放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【００１０】
金属製インプラントに対してその表面に良好な生体適合性を付与するよく知られた方法の一つに、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム化合物を高温に加熱して基材表面に溶射し、表面コートを行う方法が挙げられる。例えばプラズマスプレー法やフレーム溶射法等が代表的な方法として挙げられる。非特許文献４にはプラズマスプレー法を利用して、金属チタン表面へストロンチウムをドープしたヒドロキシアパタイトをコートする方法について述べられている。また、特許文献４には、ヒドロキシアパタイトなどの生体活性な層を設けたインプラントに対して、イオンビーム注入法によりストロンチウムをヒドロキシアパタイト層に直接導入する方法が開示されている。これらの方法では比較的厚みの増加したストロンチウムを含む層がインプラント表面に形成されることから、目的に応じて比較的多量のストロンチウムを表面層中に導入することが可能である。しかしながらこうした方法の欠点として、高温の溶射法で形成されるアパタイトの結晶性が乏しく、生体内において溶解速度が高いため、耐久性のある表面層が得られない問題や、更には、高温状態でアパタイトの熱分解が生じ、アパタイト以外に酸化カルシウム等の有害な副生成物がアパタイト中に含まれることから安全性に関する問題があった。
【００１１】
更に、上記のプラズマスプレー法やフレーム溶射法等は、基材としてチタンなどの金属を用いる場合には、基材表面を高温にさらしても特に熱的な変性や変形などの問題は生じないが、耐熱性の低いプラスチック材料に対して適用することが困難であり、特にポリエステルやポリ乳酸などの材料を用いた各種インプラントの表面にストロンチウムを導入するための手段としては適用が困難であった。プラスチックを基材として利用するインプラントの利点として、柔軟性を有することや、軽量で適度の力学的強度を有し、成形加工が比較的容易で、曲げ加工や繊維加工など複雑な形状の加工が比較的容易にできることなどが挙げられる。反面、プラスチック材料の表面は一般的に生体親和性に乏しいため、生体内において免疫的反応を誘起し易いことから改良が求められている。特に人工靱帯や脊椎ケージにおけるように、ポリエステルやＰＥＥＫのような合成樹脂においては、これを用いたインプラントの表面を骨と接合させる目的で使用を行った場合、インプラント表面に骨が結合しがたく（骨伝導性に乏しく）、骨とインプラントの界面の接着が不良になることから、生体親和性と骨伝導性の改良が求められているのが現状である。
【００１２】
ストロンチウムイオンを各種インプラントに導入する別の方法として、アクリル系セメント、リン酸カルシウム系セメントや、バイオガラス、Ａ−Ｗガラスセラミックなどの生体活性ガラスなどの製造の際に、これらを製造するための構成成分中に各種ストロンチウム化合物を導入して製造する方法が知られている。これらいずれの場合も、ストロンチウムイオンの骨再生促進効果を利用することで、各種セメントや生体活性ガラス表面の骨伝導性を促進させることが狙いである。非特許文献５には、ストロンチウムで置換したβ−ＴＣＰ（三リン酸カルシウム）と、これを用いて製造されるリン酸カルシウム系セメントについて述べられている。非特許文献６にはストロンチウムイオンを導入したナノサイズの生体活性ガラスの製法と特性が示されている。これらのセラミックス系材料からはストロンチウムイオンが徐放されることが示されており、生体内においてストロンチウムイオンの供給源として用いることが可能であるが、時間とともに次第に上記のセメントや生体活性ガラスが崩壊し、生体内で比較的速やかにこれらが溶解し消失するため、その機能が発揮される前に生体内から排除される問題があった。従って、これらの場合にも、ストロンチウムイオンの放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−３５８２４９号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３３０１２号公報
【特許文献３】特表２０１２−５２５２０１号公報
【特許文献４】特表２００２−５１２０９０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】P.J.Meunier, et al., New England Journal of Medicine, 350, 459−468 (2004).
【非特許文献２】M.E.Arlot, et al., J.Bone Miner Res, 23(2), 215−222 (2008).
【非特許文献３】J−W.Park, et al., Clinical Oral Implants Research, 21, 398−408 (2010).
【非特許文献４】M.Roy, et al., Journal of Biomedical Materials Research Part B, 99B, 258−265 (2011).
【非特許文献５】M.H.Alkhraisat, et al., Biomaterials, 29, 4691−4697 (2008).
【非特許文献６】A.Hoppe, et al., Journal of Non−Crystalline Solids, 387, 41−46 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法を与えることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記した本発明の課題は、下記に示す手段により本質的には解決される。
１．ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ポリメチルメタクリレートとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有するインプラント。
２．ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとを含有する層が、更にポリ乳酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲で含有する上記１に記載のインプラント。
３．有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液とポリメチルメタクリレートとを含有し、コート液中に含まれるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとの質量比が１０：２〜１０：２０の範囲であるコート液を基材上にコートするインプラントの製造方法。
４．メディアミル装置を用いて湿式分散処理する際に、該アパタイトとともに該アパタイトに対して１〜５０質量％の範囲でポリ乳酸を加えて湿式分散処理を行う上記３に記載のインプラントの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【図２】実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像。
【図３】実施例１で得られた分散剤を使用しないで作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線。
【図４】実施例１で得られた分散剤を使用して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線。
【図５】実施例１で得られたＰＥＥＫフィルム上にコートしたストロンチウムを含む層の走査型電子顕微鏡写真。
【図６】ストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルムから溶出するストロンチウムイオン濃度の、液交換回数毎の測定値。
【図７】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【図８】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトのＦＴ−ＩＲスペクトルチャート。
【図９】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像。
【図１０】実施例２で得られたストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルムから溶出するストロンチウムイオン濃度の、液交換回数毎の測定値。
【図１１】実施例５で作製したストロンチウムを含む層を形成した人工骨の走査型電子顕微鏡による拡大画像。
【図１２】比較例６で得られたストロンチウムを含むアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【図１３】実施例７で得られたストロンチウムを含むアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のインプラント及びその製造方法は、基材上に、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ポリメチルメタクリレート（以下「ＰＭＭＡ」とも記載する。）とを含有する層を設けることが基本である。
【００２０】
本発明のインプラントは、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ポリメチルメタクリレートとを、両者の質量比（アパタイト微粒子：ポリメチルメタクリレート）で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有することを特徴とする。
本発明のインプラントは、基材上に、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ＰＭＭＡとを質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層（以下「ストロンチウムを含む層」とも記載する）が形成されてなるが、通常、上記ストロンチウムを含む層をその表面に有する。つまり本発明のインプラントは、上記ストロンチウムを含む層を表面層として有する。本発明のインプラントにおいては、本発明の効果を損なわない限り、基材と、上記ストロンチウムを含む層との間に、必要に応じて該ストロンチウムを含む層とは別の層が形成されていてもよい。また、インプラントにおいてストロンチウムを含む層が形成されている場所及び範囲は、基材の種類、インプラントの用途等に応じて適宜選択することができる。例えば、ストロンチウムを含む層は、基材の表面全体（インプラントの表面全体）に形成されていてもよく、基材上の一部に形成されていてもよい。
【００２１】
最初にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子について説明を行う。
【００２２】
本発明は、ストロンチウムの前記した骨形成促進作用を利用することで、様々な臨床応用において骨再生を促進する効果を有する生体インプラントを提供することを意図する。そのためには、単に生体インプラントにストロンチウムを導入するだけではなく、生体内におけるストロンチウムイオンの放出濃度を適度な範囲に制御する必要がある。すなわち、ストロンチウムの薬理作用は、量依存性があり、過剰な投与ではむしろ骨の再生に逆効果であることが知られている。従って、骨再生を行うべき生体内の局所的部位において、インプラントから放出されるストロンチウムイオンの濃度は適度な範囲に制御された形で供給されることが好ましい。インプラント表面からストロンチウムイオンが放出される機構として、インプラントの基材上にストロンチウムを含む層を設け、この層からストロンチウムイオンが体液中に徐放される機構が好ましく、かかる層に含まれるストロンチウムを含む物質の量とその溶解性を適度にコントロールすることで、放出されるストロンチウムイオン濃度を適度な範囲に制御することが可能となる。こうしたストロンチウムを含む物質の溶解性を制御するための好適な手段として、本発明においてはストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子が好適であることを見いだした。
【００２３】
本発明において、インプラントの基材上に設けられた層から放出されるストロンチウムイオンの濃度については、目的や用途に応じて様々な範囲に調節が可能である。種々の文献等において記載されるストロンチウムイオンの生体内局所的環境における好ましい濃度範囲としては大略０．０５〜１００ｐｐｍの範囲にあるとされ、これ以下では効果が発揮され難く、また１００ｐｐｍを超えて生体内の局所的部位にストロンチウムイオンが放出された場合、骨再生に関してむしろ逆効果であり、それ以外にも様々な悪影響を及ぼすことが懸念される。従って、好ましい濃度範囲としては０．０５〜１００ｐｐｍの範囲であり、更には０．１〜５０ｐｐｍの範囲においてストロンチウムイオンがインプラントから放出されることが好ましい。また、徐放される期間についても好ましい範囲が想定される。数日間未満の放出期間であれば、骨再生に必要とされる期間に亘ってストロンチウムイオンの効果を持続させることが困難である。あるいは半年から数年もしくはこれ以上の長期において比較的高濃度（５０〜１００ｐｐｍ前後）のストロンチウムイオンの放出が持続した場合、好ましい骨再生促進効果以外に、好ましくない副作用として、例えば骨軟化症を誘起する可能性などが懸念される。従って、最も好ましい徐放期間としては数週間から数ヶ月程度の範囲にあると想定される。このように数週間から数ヶ月程度の長期に亘り、ストロンチウムイオンを濃度０．１〜５０ｐｐｍ程度に制御して徐放することができるインプラントは、本発明のインプラントとして好ましい。本発明においては、これらの好ましい濃度範囲と放出期間を設定し、それらにあわせた層の最適化を実施した。具体的には後述する実施例において詳細に説明を行う。
【００２４】
本発明において用いることの出来るストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子は、明確にアパタイト特有の結晶性を示すことが必要である。具体的には、粉体の状態で広角Ｘ線回折測定を行った場合に、２θが１０〜６０度（°）の範囲においてアパタイトに特徴的なピークが観察されるアパタイトから構成される微粒子である。本発明では特に、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察される場合においてのみ、結晶性を有すると称する。２５度付近の（００２）面からの回折ピークが不明瞭である場合には、結晶性を有しない非晶質のアパタイトであると判断する。
広角Ｘ線解析測定の条件は、後述する実施例に記載する。
【００２５】
本発明において用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子として、該アパタイト中に含まれるストロンチウムの割合には好ましい範囲が存在し、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として、ストロンチウムは１０〜６５質量％の範囲で含まれることが好ましい。つまり本発明におけるアパタイト微粒子は、ストロンチウムを１０〜６５質量％含むことが好ましい。１０質量％より少ない比率でストロンチウムが含まれている場合、ストロンチウムイオンが徐放されず、本発明の効果が認められない場合がある。アパタイト中に含まれる金属イオンが全てストロンチウムイオンである場合は、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２より計算されるストロンチウムの比率の理論値は５９．２質量％である。これよりストロンチウムの比率が多い場合として、アパタイト中に含まれるリン酸基の一部が炭酸イオンに置き換わった炭酸ストロンチウムアパタイトである場合が挙げられる。この場合においては、６５質量％を超える比率でストロンチウムが含まれる場合には、アパタイト以外の構造を有するストロンチウム塩が含まれる場合があり、これらから生体内において放出されるストロンチウムイオンの濃度が上記の好ましい範囲を上回る場合がある。また、アパタイトにストロンチウム以外の金属イオンが含まれる場合、金属イオンの総モル数に対する比率としてストロンチウムイオンは１０〜１００モル％の範囲で含まれる場合が好ましく、更に２０〜１００モル％の範囲で含まれる場合が最も好ましい。これより少ない比率でストロンチウムイオンが含まれている場合、ストロンチウムイオンが徐放されず、本発明の効果が認められない場合がある。上記アパタイト微粒子に含まれるストロンチウム以外の金属イオンとしては、カルシウムイオンが好ましい。
【００２６】
本発明は更に、安全性の高いインプラントを提供することを意図し、上記したインプラント表面のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ＰＭＭＡとを含む層（ストロンチウムを含む層）において、用いる材料の純度を高め、意図しない不純物の混入や加熱等による変性を防止したインプラントとその製造方法を与えることを意図している。具体的な方法については以下に説明を行う。
【００２７】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの製造方法として、例えば、特開平５−３１０４１０号公報には、リン酸水素ストロンチウムと水酸化ストロンチウムまたは炭酸ストロンチウムをポットミルで混合、攪拌しメカノケミカル的な反応によりストロンチウムアパタイトの前駆体を得た後に、これを８００℃程度の温度で仮焼する方法が開示されている。あるいは、特開平１１−３４３１９８号公報には、任意のリン酸アパタイトを出発原料に用い、これに水熱処理を施すことで、処理中にアパタイト中に含まれる任意のイオンを別のイオンにイオン交換する方法が開示されている。また加藤らによる均一沈殿法（加藤千晴、藤田一美、松田恵三、日本化学会誌、No.3、321−327、（2002)）には、尿素を用いて、リン酸ストロンチウム塩の前駆体を経てストロンチウムアパタイトを合成する方法が開示されている。これらの方法で得られるストロンチウムを含むアパタイトはいずれも結晶性を有していることから、本発明において好ましく用いることができる。
【００２８】
あるいは、更に好ましく用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの合成方法として、特開２０１４−１８０４９１号公報及び後述する実施例において示すように、ストロンチウムを含むアパタイトを合成する際に、その前駆体としてリン酸水素ストロンチウム（ＳｒＨＰＯ４）を予め合成し、これをアルカリ条件下で加熱することで、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを得ることができる。更に、前駆体としてストロンチウムとともに種々の割合でカルシウムを含むリン酸水素化合物を合成し、これを用いて同様にアルカリ処理を施すことで、カルシウムとストロンチウムを任意の割合で含む結晶性を有するアパタイトを高純度で得ることができ、これらは本発明に最も好適に用いることができる。
【００２９】
上記のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトにおいて、更にアパタイト中のリン酸基の一部が炭酸イオンに置換したストロンチウムを含む炭酸アパタイトも本発明においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトとして好適に用いることができる。その具体的な合成方法としては、上記のリン酸水素ストロンチウムを原料に用いて、これと炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行うことでストロンチウムを含み結晶性を有する炭酸アパタイトが高純度で得られる。リン酸水素ストロンチウムと、炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行う際、用いる炭酸塩または炭酸水素塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウム等の１０℃の水に対する溶解性が１質量％以上である水溶性の高い炭酸塩または炭酸水素塩が特に好ましい。更に、反応の際の条件として室温（２５℃）もしくは室温以上の温度である場合が好ましく、更に４０℃以上である場合が好ましい。反応の際の温度が室温より低い場合には、リン酸水素ストロンチウムが完全に炭酸ストロンチウムアパタイトに変換されずに生成物中に残存する場合がある。反応温度の上限としては１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは９０℃以下である。
【００３０】
あるいは、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの別の合成方法として、ストロンチウムイオンとリン酸イオンを含む水溶液中から一段階の反応でストロンチウムを含むアパタイト微粒子を合成することもでき、この場合、ストロンチウムイオンとともに種々の割合でカルシウムイオンを共存させて反応を行うことで、カルシウムイオンとストロンチウムイオンを任意の割合で含むアパタイトを得ることができる。これらのアパタイトは結晶性が比較的低いため、本発明に用いるためには熱処理を行うなどの方法である程度結晶性を高めることで好ましく用いることができる。
【００３１】
本発明におけるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子は、上述したような製造方法により製造されるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを用いて製造することができる。なお上記種々の製造方法において、得られるアパタイト中のストロンチウム含量を調製する方法は公知であり、原料の配合を適宜調整することにより、得られる結晶性を有するアパタイト中のストロンチウム含量を調整することができる。
【００３２】
本発明において用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子には、更にアパタイト中に含まれる全金属イオンに対して１０モル％未満の割合でストロンチウムイオンやカルシウムイオン以外にも、マグネシウムイオンや亜鉛、ナトリウム、カリウム等の低濃度において生体に対する安全性が確認されている様々な金属イオンを含んでいてもよく、また、水酸基に換えて該アパタイト組成中にフッ素や塩素を含んでもよい。あるいは前述したような炭酸イオンを含む炭酸アパタイトであってもよく、あるいはケイ酸イオンを含んでいてもよい。特に、本発明においては、ストロンチウムを含む結晶性の炭酸アパタイトを用いた場合に、生体内において適度な溶解性を示すことから極めて好ましく用いることができる。更に、これらアパタイトには生体に対して安全性が懸念される不純物が含まれていないことで、安全性に優れたインプラントを提供できることから、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子が高純度であることが重要である。
【００３３】
本発明において、上記した様々な方法で得られたストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを用いて、これを更に後述する湿式分散処理を施すことで、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子（以下、「アパタイト微粒子」とも記載する。）を製造でき、本発明に好適に用いることができる。
【００３４】
本発明においてアパタイト微粒子は、走査型電子顕微鏡により観察されるアパタイト微粒子の一次粒子（個々の粒子として観察される最小単位）の大きさが数平均粒子径で５００ｎｍ未満であることが好ましい。また、一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上である粗大粒子が存在している場合であっても、全体に対する割合が、個数において１０％未満であることが好ましい。本発明において、数平均粒子径は、走査型電子顕微鏡を用い、少なくとも５０個以上の一次粒子の大きさ（粒子形状が等方性ではなく異方性を有する場合には、最長の軸方向の長さを計測する。）を計測し、その数平均値を求めたものである。アパタイト微粒子の大きさが数平均粒子径で５００ｎｍ以上であったり、あるいは一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上の粗大粒子の割合が個数で１０％以上であったりする場合には、基材上にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む層を形成した場合に、該層の厚みが不均一になり、該層と基材との界面における接着性が不十分となり容易に該層が基材から剥離する場合がある。
【００３５】
アパタイト微粒子の大きさについては、更に走査型電子顕微鏡により観察されるアパタイト微粒子の一次粒子の大きさが数平均粒子径で５０ｎｍ以上であることが好ましい。また、一次粒子の大きさが５０ｎｍ未満である微小粒子が存在している場合であっても、全体に対する割合が、個数において２０％未満である場合が好ましい。一次粒子の大きさが５０ｎｍより小さい微粒子が個数において２０％以上であったり、あるいは一次粒子の数平均粒子径が５０ｎｍ未満であったりする場合にはアパタイト微粒子の溶解性が高くなり、体内において数日〜１週間未満の短期間でインプラント表面からのストロンチウムイオンの放出が停止する場合がある。
【００３６】
更に、アパタイト微粒子が分散した状態で光回折法や光散乱法で測定される体積平均粒子径が５０〜５００ｎｍの範囲にある場合が最も好ましい。分散粒子として一次粒子同士が会合して二次粒子を形成し、５００ｎｍより大きな体積平均粒子径を示す場合には、こうした分散液を用いてインプラント表面にコーティングを行う際に、コート液中に含まれる該アパタイト微粒子が時間とともに次第に沈降し、コート液中に分散したアパタイト微粒子の濃度が減少することで、一定の割合で該アパタイト微粒子を含む層が形成できない場合がある。
【００３７】
該アパタイト微粒子が結晶性を有するアパタイトであることが本発明において重要であり、結晶性を有しない場合には生体内においてストロンチウムを含むアパタイトが容易に溶解し、比較的短期間のうちに生体内から消失してその効果が失われる。本発明では、アパタイトが結晶性であることで、該アパタイト微粒子が長期間安定な状態で存在し、該層中に好ましい範囲で長期間残存することができる。更には、層中に含まれる該アパタイト微粒子からのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前述した適度な範囲に制御することが可能である。
【００３８】
次に、基材上に設けられた層にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とともに含まれるポリメチルメタクリレートについて説明する。本発明においては、アパタイト微粒子を基材上に固定化するためにバインダーとしてＰＭＭＡを用いることが特徴である。Dalbyらは（M. J. Dalby et al., Biomaterials, 23, 569−576 (2002)）においてＰＭＭＡ中にヒドロキシアパタイトを高々８．８体積％まで導入したセメントディスクを用いて、これの表面におけるヒト骨芽細胞様細胞（ＨＯＢ：human osteoblast−like cell）の培養を行った際に、ヒドロキシアパタイトの導入により細胞の初期接着が向上し、引き続く細胞の増殖や活性が相乗的に促進されることを報告している。しかしながら、この方法で得られるＰＭＭＡとヒドロキシアパタイトの複合体は力学的に堅くてもろい性質があり、また、ＰＭＭＡ中に含まれるヒドロキシアパタイトの比率が小さく、更には用いられたヒドロキシアパタイトの粒子径が比較的大きいために、この複合体の表面に露出するヒドロキシアパタイトの比率が小さく、期待される効果としての生体親和性の向上や骨伝導性の向上等の効果が十分に発揮できない問題があった。
【００３９】
本発明において用いることのできるＰＭＭＡは、数平均分子量が少なくとも１万以上であることが好ましく、より好ましくは３万〜１００万の範囲である。用いるＰＭＭＡ中には、ＰＭＭＡ以外に含まれる可能性のある各種低分子量化合物として、モノマーや重合開始剤、その他の不純物を含む場合が考えられるが、本発明においてはＰＭＭＡ中にこれらの低分子量化合物を実質的に含まないことが好ましい。具体的には、水中においてＰＭＭＡから溶出する可溶性の不純物の濃度が高々１ｐｐｍ未満である場合において好ましく用いることができる。
【００４０】
本発明において、上記ストロンチウムを含む層に含まれるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、バインダーとして用いるＰＭＭＡの比率には好ましい範囲が存在し、両者の質量比（上記アパタイト微粒子：ＰＭＭＡ）が１０：２〜１０：２０の範囲で含まれる場合において、基材に対する該アパタイト微粒子を含む層の接着性や耐久性が良好である効果が発揮できる。該アパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率が上記の範囲より少ない場合には、基材上に設けた層が崩壊しやすくなり、生体内で容易に層が剥離しやすく、特に応力や摩擦が加わった場合に簡単に基材表面から剥離する。あるいは、該アパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率が上記の範囲を超えて用いられる場合には、基材上に設けた層中に該アパタイト微粒子が埋没して表面に露出せず、従ってこれから放出されるストロンチウムイオン濃度が極めて小さくなることから本発明の効果が現れない。ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、ＰＭＭＡの比率を上記した範囲に設定することで、ストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが可能となる。
【００４１】
上記ストロンチウムを含む層は、上記アパタイト微粒子及びＰＭＭＡ以外の成分を含有してもよい。例えば、後述する分散剤を含有してもよく、ポリ乳酸を含有することが好ましい。好ましい態様においては、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとを含有する層は、更にポリ乳酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％（より好ましくは５〜３０質量％）の範囲で含有する。ポリ乳酸をこのような範囲で含有することにより、該層を有するインプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を、上記した好適な範囲に制御しやすくなる。
【００４２】
本発明において、上記ストロンチウムを含む層は、本発明の効果を損なわない限り、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子及びＰＭＭＡ以外の成分を含んでもよいが、該層１００質量％におけるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子及びＰＭＭＡの含量が７０質量％以上であることが好ましい。
【００４３】
次に、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子をＰＭＭＡとともに含んで形成される層を設けたインプラントの製造方法について説明する。
本発明のインプラントの製造方法は、有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液とポリメチルメタクリレートとを含有し、コート液中に含まれるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとの質量比（該アパタイト微粒子：ＰＭＭＡ）が１０：２〜１０：２０の範囲であるコート液を基材上にコートすることを特徴とする。このように本発明の製造方法は、有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する工程、及び該分散液（分散されたアパタイト微粒子を含む有機溶媒）とＰＭＭＡを含むコート液を用いて基材上にコートする２つの工程を含む。
本発明の製造方法により、上記した本発明のインプラントを製造することができる。
【００４４】
本発明で用いることのできる有機溶剤としては、ＰＭＭＡを溶解する有機溶剤が好ましく、該有機溶剤として、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランなどの環状エーテル化合物；アセトン、メチルエチルケトンなどの各種ケトン類；クロロホルム、ジクロロメタンなどの含ハロゲン溶剤；エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、メチルセロソルブなどのアルコール系溶剤；及びジメチルホルムアミドなどの極性溶剤を挙げることができ、これらの有機溶剤を単独あるいは複数の種類を組み合わせて用いても良い。
【００４５】
本発明で用いることのできる、有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造するためには、湿式分散処理を行うことが必要である。具体的には、有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトについて、湿式分散処理を行う。これにより、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する。
【００４６】
好ましい湿式分散処理の方法としては、分散処理用のメディアを利用したメディアミル装置を用いた湿式分散処理が特に好ましく、具体的には、先に述べた有機溶剤中にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト粉体を導入し、分散処理用のメディアとしてガラスビーズやアルミナビーズ、その他のセラミックビーズ等を加えて振盪や撹拌を行い、該アパタイト粉体と該ビーズが機械的に衝突し、微粉砕されることで該アパタイトの微粒化を行う方法が好ましい。メディアを用いない装置、例えば超音波照射下で湿式分散処理を行った場合には、分散が十分に進行せず、粗大粒子が混在するため良好な結果が得られない。あるいは、ホモジナイザーなどの高速撹拌装置を使用した場合でも、同様に粗大粒子が混在することから良好な結果が得られない。
【００４７】
メデイアミル装置の具体的な例を挙げると、少量をバッチ方式で湿式分散処理を行う場合には、ペイントコンディショナーを使用して数時間に亘る振盪を行うことで湿式分散処理を行うことができる。またメディアミル装置として、ダイノーミル（ＷＡＢ社製）に代表される横型ビーズミルのような連続方式での湿式分散処理が可能である装置を用いて、これを複数台用いて直列に配置して１パスで湿式分散処理を行っても良く、あるいは１台のメディアミルを用いて複数回処理を繰り返すことも好ましく行うことができる。このような湿式分散処理を行うことで、有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造することができる。メディアミル装置としては、これら以外にも様々な形状、タイプの装置が市販されるが、いずれの場合も、装置がメディアを用いて有機溶剤中において湿式分散処理を行うことのできる装置であれば基本的には使用することができる。
【００４８】
上記したメディアを利用してストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの湿式分散処理を行う場合に、使用するメディアはセラミックビーズを用いることが好ましい。特に、ビーズが研磨されるなどしてビーズ由来の不純物が分散液中に混入することを防止することが好ましく、仮に、微細に粉砕されたビーズ由来の成分が混入した場合であっても、これが生体内において安全性が確認されていることが好ましい。こうした目的で利用できるセラミックビーズとして、具体的にはＺｒＯ、立方晶ジルコニア、イットリウム安定化ジルコニア、ジルコニア強化アルミナなどのジルコニアを含有するセラミックビーズを最も好ましく用いることができる。また、メディアの平均直径は０．０１〜１０ｍｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。こうしたメディアを使用したメディアミルを用いる湿式分散処理の条件は、通常行われる室温での処理であり、特に処理時間や温度等に関する制限は無い。また、パス回数については１回で十分である場合もあるが、２〜７回程度のパス回数で処理を行うことで、より粒子径分布が狭く、かつ分散安定性に優れたストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造することができる。
【００４９】
上記の方法を用いて有機溶剤中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する際に、分散剤として様々な化合物を添加して湿式分散処理を行うこともできる。特に、上記の湿式分散処理を行った後に、得られる分散液を直ちに使用して、後述する基材へのコートを行う場合には、特に分散剤を用いることなくアパタイト微粒子の分散液を製造し、これを用いて本発明のインプラントを製造することも可能であるが、実際には上記の分散液中に含まれる該アパタイト微粒子の沈降や凝集を防止し、安定した分散状態を維持することが好ましく、その場合、分散剤を用いることで分散液中に含まれる該アパタイト微粒子の分散安定性を向上させることができる。安定した分散状態を保つ好ましい期間としては数時間〜数日の範囲において該アパタイト微粒子の沈降や凝集を防止できることが好ましい。この場合、用いる分散剤の該アパタイト微粒子に対する割合は、質量比で該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲が好ましく、５〜３０質量％の範囲が更に好ましい。この比率を超えて分散剤を用いた場合、分散剤の影響によりＰＭＭＡの特質である耐水性及び耐久性が損なわれ、インプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが困難となる場合がある。
【００５０】
上記の目的で使用できる分散剤としては、各種界面活性剤や、有機溶剤に可溶性である様々な合成ポリマー及び天然物由来ポリマーなどを用いることができるが、生体に対する安全性が確認されている素材であり、不純物が含まれず高純度であることが好ましい。用いることのできる分散剤の具体的な例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリトリメチレンカーボネート等の生分解性を有するポリマーや、あるいは各種合成有機溶剤可溶性ポリマーやポリジメチルシロキサン等の生体不活性である合成ポリマーが好ましく用いられる。本発明において最も好ましく用いることのできる分散剤としてのポリマーはポリ乳酸である。特にポリ乳酸として結晶性の高いポリ−Ｌ−乳酸や、あるいはＤ体を任意の割合で含むポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を好ましく用いることができ、Ｄ体とＬ体の比率が２：８〜８：２の範囲でともに含まれるポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を用いた場合に、該アパタイト微粒子の分散安定性をより向上させることができる。ポリ乳酸を用いることで、コート液に含まれる該アパタイト微粒子の体積平均粒子径が５０〜５００ｎｍの範囲で、数時間〜数日の範囲において該アパタイト微粒子の沈降や凝集の無い安定に分散状態を保った分散液を製造することが可能となる。
【００５１】
上記分散剤を使用した場合には、得られるインプラントにおけるストロンチウムを含む層は、該分散剤を含むものとなる。好ましい態様の一例においては、本発明のインプラントが有する、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとを含有する層は、更にポリ乳酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％（より好ましくは５〜３０質量％）の範囲で含有する。
【００５２】
上記のように、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを分散剤を用いて有機溶剤中で湿式分散処理を行うことにより、体積平均粒子径が５０〜５００ｎｍの範囲にある該アパタイト微粒子が安定に分散状態を保った分散液を得ることができる。このようにして作製したアパタイト微粒子の分散液を用いて、コート液を製造する。
【００５３】
本発明のインプラントの製造方法に用いられるコート液は、アパタイト微粒子の分散液及びＰＭＭＡを含有し、該コート液中に含まれるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とポリメチルメタクリレートとの質量比が１０：２〜１０：２０の範囲である。上記コート液は、上記アパタイト微粒子の分散液及びＰＭＭＡを用いて製造されるが、コート液の製造においてさらに有機溶媒を使用してもよい。上記コート液は、上記アパタイト微粒子、ＰＭＭＡ及び有機溶媒を含み、上記分散液の製造の際に分散剤が添加される場合には、該添加剤を含む。
上記コート液の製造方法は特に限定されず、例えば、上記のアパタイト微粒子の分散液とＰＭＭＡとを、該アパタイト微粒子とＰＭＭＡの質量比が上記範囲となるように混合すればよい。上記コート液は、例えば、上記アパタイト微粒子の分散液にＰＭＭＡを添加して混合して製造してもよく、上記アパタイト微粒子の分散液と、ＰＭＭＡと、有機溶媒とを混合してもよい。上記アパタイトの微粒子の分散液と、ＰＭＭＡと、有機溶媒とを混合することによりコート液を製造する場合、これらを混合する順番は特に限定されないが、例えば、ＰＭＭＡを有機溶媒に溶解させた溶液を調製し、上記アパタイト微粒子の分散液と、該ＰＭＭＡを有機溶媒に溶解した溶液と混合することで、本発明に好適に用いることのできるコート液が得られる。
コート液の製造においてこのように有機溶剤を使用すると、ＰＭＭＡを有機溶剤に均一に溶解した状態で、これに該アパタイト微粒子を均一に混合することで、両者を混合して基材上に層を形成した際に、層の厚みや層中に含まれる両者の組成が均一になるため好ましい。
上記湿式分散処理に用いる有機溶媒（すなわち、アパタイト微粒子の分散液に含まれる有機溶媒）と、コート液の製造に使用される有機溶媒とは、同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
【００５４】
上記コート液を用いて基材上にコートすることで、本発明の目的とするストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む層を設けたインプラントが製造できる。本発明の製造方法は、基材にコートしたコート液を乾燥させる乾燥工程等を含んでもよい。
【００５５】
本発明において基材上に形成されるストロンチウムを含む層の厚みには好ましい範囲が存在する。層の厚みを表す尺度として、表面の単位面積あたりにコートされたストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とＰＭＭＡの双方を足し合わせた質量を以て表した場合、好ましい範囲は単位平方メートル当たり０．０５〜５０ｇの範囲にある場合が好ましく、０．５〜５０ｇの範囲にある場合が更に好ましい。このような場合において、ストロンチウムイオンが前記した好ましい濃度範囲を保った状態で徐放されることから極めて好ましく用いることができる。
【００５６】
基材上にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とＰＭＭＡを含むコート液を用いてコートを行う方法としては、基材の大きさや形状にあわせて種々の好適な方法を用いることができる。例えば、一つの方法として、コート液中に基材を浸漬して引き上げ、余分なコート液を除いた後、コート液を乾燥して層を形成する方法や、あるいは該コート液をスプレー噴霧やカーテン塗布などの方法で基材上にコート液を満遍なく付着させてコートを行い、その後に含まれる有機溶剤の乾燥を行って層を形成する方法など、既知の様々なコーティング方法を利用することが可能である。
上記ストロンチウムを含む層を形成する基材の部位及び範囲は、基材の形状、インプラントの用途等に応じて適宜設定することができる。例えば、基材の表面全体に層を形成してもよく、基材の表面の一部に層を形成してもよい。
【００５７】
上記のコート液中に含まれる全体の固形分濃度については好ましい範囲が存在し、０．１〜３０質量％の範囲に含まれることが好ましく、この範囲より低い濃度で固形分を含むコート液を用いて基材上に該アパタイト微粒子を含有する層を形成した場合に、層の厚みを上記した好ましい範囲に制御することが困難である場合がある。また、３０質量％を超えた場合、コート液の粘度が高くなり、基材上に均一にコートすることが困難になる場合があることから、得られるインプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが困難となる場合がある。
【００５８】
本発明のインプラントに使用される基材の構成材料は、医療分野等で使用されるものであればよく、特に限定されない。
本発明のインプラントが有する基材として、例えば人工靱帯などに利用されるポリエステルや、あるいはＰＥＥＫ製の脊椎ケージなどのような様々なプラスチック基材を挙げることができる。これらの基材は、必要に応じて、その表面にガンマ線処理やプラズマ処理、放電処理などの様々な表面加工を施しておくことで、該アパタイト微粒子を含有する層と基材の界面での接着性を一層強固にし、耐久性を高めることができる。プラスチック基材へのコートの際に重要であるのは、コートした後に加熱乾燥を行う場合、乾燥温度としては基材であるプラスチックの軟化点以下の温度で加熱を行うことが好ましく、これ以上の温度で加熱処理を行った場合、基材の変形や変質及び劣化を来す場合がある。
【００５９】
また基材として、例えばリン酸カルシウム系のセラミックスからなる人工骨などの基材に対して、本発明のストロンチウムを含む層を形成することで、安全性に優れ、ストロンチウムイオンを徐放する性質を備えた生体適合性と骨伝導性を改良したインプラントが与えられる。
【００６０】
更に、人工関節などに用いられるチタンなどの金属基材に対して本発明のストロンチウムを含む層を形成することで、安全性に優れ、ストロンチウムイオンを徐放する性質を備えた生体適合性と骨伝導性を改良したインプラントが与えられる。この場合には、チタン基材表面は予め種々の表面処理を施した後にコートを行うことが好ましく、その場合に表面処理方法として、サンドブラストなどで表面を適度に粗面化する方法や、アルカリ処理による表面の活性化や、酸化チタン層の形成などの公知の種々の方法で表面処理を行うことで、本発明のストロンチウムを含む層を強固に基材表面に接着することが可能である。更に好ましくは、チタン等の基材表面に予めプラズマ溶射法やフレーム溶射法などの種々の方法でヒドロキシアパタイトの層を形成しておき、そのヒドロキシアパタイト層の上部に本発明のストロンチウムを含む層を設ける方法も好ましく用いることができる。
【００６１】
本発明のインプラントは、上記した製造方法により製造され、その後に好ましくは滅菌処理されることで安全性の確保された生体インプラントとしての使用が可能である。滅菌方法としては、従来から行われているオートクレーブを用いた加熱滅菌処理や、エチレンオキサイドガスによる化学的滅菌処理、あるいはガンマ線照射や電子線照射による放射線滅菌処理方法など、いずれの方法によっても滅菌処理が可能である。
本発明のインプラントは、例えば、歯科分野、整形外科、形成外科等の外科分野において用いられる、生体内に埋入するインプラントとして好適に使用される。
【００６２】
以下に実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率及び成分の比率は断りのない限り質量基準である。
【実施例】
【００６３】
実施例及び比較例において、広角Ｘ線回折は以下の装置及び条件で行った。
Ｘ線回折装置：リガク社製、型式ミニフレックス
Ｘ線源  ：Ｃｕ−Ｋα線（波長  ０．１５４１８ｎｍ）、Ｋβフィルター使用
スリット系：受光スリット０．３ｍｍ、散乱スリット４．２°、発散スリット可変
測定範囲：２θ＝１０°〜６０°
スキャン速度：２．０°／ｍｉｎ
出力：３０ｋＶ、１５ｍＡ
なお、測定前後の重量を計測して、測定前後の試料粉末の重量変化が０．１質量％以内であることを確認した。
【００６４】
実施例１
（リン酸水素ストロンチウムの合成）
特開２０１４−１８０４９１号公報に記載される方法に従ってストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを合成した。塩化ストロンチウム六水和物２６７ｇ（１モル）を１リッターの三角フラスコ内に秤取り、蒸留水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム１３２ｇ（１モル）を秤取り、蒸留水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウム水溶液を導入した三角フラスコを５０℃に調整した水浴上に移し、攪拌しながら滴下漏斗を用いて、リン酸水素二アンモニウムを溶解した水溶液の全量を１時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。水浴上から三角フラスコを移し、室温まで冷却した後、グラスフィルターを用いて吸引濾過を行った。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返し蒸留水で洗浄を行った後、６０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。この白色の粉体（生成物）を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところ、リン酸水素ストロンチウム（α−ＳｒＨＰＯ４）に由来するピークのみが観察され、それ以外のピークは認められなかった。収量測定より収率９５％で高純度のリン酸水素ストロンチウムが得られていることが判った。
【００６５】
（リン酸水素ストロンチウムのアルカリ処理によるストロンチウムアパタイトの合成）
上記で得られたリン酸水素ストロンチウムの全量を１０００ｍｌ三角フラスコへ移し、純水６００ｇを加えて攪拌を行いながら、水酸化ナトリウムを３５ｇ添加した。反応系のｐＨは１３であった。これをホットプレート上で攪拌しながら反応系の温度を７０℃に上昇し、この温度で３時間加熱攪拌を行った。その後室温まで冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。純水により十分に洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行い白色の粉体を得た。この白色の粉体について広角Ｘ線回折により解析を行い、ストロンチウムを含むアパタイト（ストロンチウムアパタイト）であることを確認した。図１は実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターンを示す。図１に示す回折パターンより、ストロンチウムアパタイト以外の不純物の存在は認められず、また各回折ピークの半値幅も比較的狭い、鋭く高いピーク形状を示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されたことから、高純度で結晶性の良好なストロンチウムアパタイトが得られていることが明らかとなった。図２には、実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像を示す。倍率は１０万倍である。これによりナノメートルサイズの微細な針状のストロンチウムアパタイト微粒子が集合して該粉体を形成していることが明確になった。また、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）による測定により求められたストロンチウムアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は６０．０％であり、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２より計算される値５９．２％にほぼ合致する値が得られた。
【００６６】
（ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の製造と体積平均粒子径の測定結果）
上記で得られたストロンチウムアパタイトを用いて湿式分散処理を行う際に、分散剤を使用せずに湿式分散処理を行った場合（Ａ）と、分散剤としてポリ乳酸を該アパタイトに対して１０質量％添加して湿式分散処理を行なった場合（Ｂ）の両方で得られた各々の微粒子の分散液について両者を比較した。すなわち、上記で得たストロンチウムアパタイト２０ｇを２００ｍｌのポリプロピレン容器に移し、これに１，４−ジオキサンを１２０ｇ及び平均直径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行った（Ａ）。同様に、ストロンチウムアパタイト２０ｇに対し更にポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｄ／Ｌ＝１／１：数平均分子量１２万）を２ｇ添加し、これに１，４−ジオキサンを１１８ｇ及び平均直径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行った（Ｂ）。その後、濾布を使用してそれぞれの分散物からジルコニアビーズを分離し、ストロンチウムアパタイト微粒子の分散液を得た。得られた分散液の固形分濃度は各々（Ａ）が１４．３質量％と（Ｂ）が１５．７質量％であった。得られた分散液を用いて、分散しているストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布を動的光散乱法を利用した粒子径測定装置（レーザー粒径解析システムＰＡＲ−III、大塚電子社製）を用いて測定し、図３及び図４に示す結果を得た。図３及び図４において、縦軸は、左側が頻度（％）、右側が通過分積算（％）をそれぞれ示す。図３は、実施例１の（Ａ）で得られた分散剤を使用しないで作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線を表す。求められた体積平均粒子径は、メジアン径で３８３ｎｍであった。分散液中には５０ｎｍ未満の大きさの粒子と５００ｎｍを上回る大きさの粒子が含まれていたが、どちらの割合も全体に対して１０％未満であった。図４は、実施例１の（Ｂ）で得られた分散剤を使用して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線を表す。求められた体積平均粒子径は、メジアン径で１６９ｎｍであり、粒子径分布として全体の１００％が粒子径の範囲として５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲に含まれていた。上記で得られた分散液に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液を透明ガラス製容器内に入れて２４時間室温で静置しておき、静値後の分散液の様子を目視で観察したところ、分散剤を使用しないで作製した（Ａ）の分散液では容器の底部に沈降物の蓄積が確認されたが、分散剤を用いて作製した（Ｂ）の分散液では沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認された。また、（Ｃ）としてストロンチウムアパタイト２０ｇに対しポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｄ／Ｌ＝１／１：数平均分子量１２万）を０．２ｇ添加して湿式分散処理を行った場合についても同様に評価を行った結果、得られた分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の体積平均粒子径はメジアン径で２５０ｎｍであり、沈殿物の存在はごく僅かに認められたため（Ｂ）の場合に比較して分散液の分散安定性は若干低下していたものの、実用的には問題ないことが確認された。
【００６７】
（ストロンチウムアパタイト微粒子のＰＥＥＫフィルムへのコーティング及びコート層の均一性と粒子サイズの観察）
上記の（Ｂ）でポリ乳酸を２ｇ使用して作製した分散液を用いて、これにＰＭＭＡ（数平均分子量１０万）を２０質量％濃度で溶解した１，４−ジオキサン溶液を加え、ストロンチウムアパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：２になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に、該アパタイト微粒子、ＰＭＭＡ及びポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を合わせた全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分質量が１平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含む層（コート層）を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を得た。乾燥後にコート層を観察したところ、ほぼ完全に透明である均一な塗布膜が形成されていることが確認された。蛍光Ｘ線測定装置を用いて、フィルム表面のコート層中に含まれるストロンチウムの量を定量した結果、１平方メートル当たり１３ｇであり、ほぼストロンチウムアパタイトとＰＭＭＡの比率から計算される値に近い数値であることが確認された。更に、フィルム表面のコート層の様子を共焦点光学顕微鏡を用いて観察した結果、表面粗さは高々０．５μｍ未満の凹凸であり、平滑性の高い均一なコート層が形成されていることが確認された。図５は、実施例１で得られたＰＥＥＫフィルム上にコートしたストロンチウムを含む層の走査型電子顕微鏡写真であり、倍率は１０万倍である。コート層中に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子はバインダーであるＰＭＭＡ中に埋没することなく表面に露出していることが確認された。これより（Ｂ）の分散液を用いてコートして得られた層中に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子の大きさは、その粒子径範囲が５０〜１２０ｎｍの一次粒子から成り、数平均粒子径は６５ｎｍであった。
【００６８】
（表面コートしたＰＥＥＫフィルム試料からのストロンチウムイオンの徐放性）
上記で得られたストロンチウムを含む層を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を蛍光Ｘ線測定装置（蛍光Ｘ線測定装置ＺＳＸ primus、リガク社製）を用いて定量した。すなわち、該フィルム試料を４８時間浸漬した疑似体液を３０μｌ採取し、これを点滴濾紙（マイクロキャリー）の中央部に滴下して乾燥させた試料を用いて蛍光Ｘ線測定を行った。結果を図６に示した。図６はストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルム試料から溶出するストロンチウムイオン濃度の、液交換回数毎の測定値を示す。この結果より、該ＰＥＥＫフィルム試料から少なくとも３０日間０．１〜０．５ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され、その後徐々に放出されるストロンチウムイオン濃度が減少することが明確となった。
【００６９】
（実施例１の細胞培養評価）
上記のストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルム試料を用いて、以下のようにしてＰＥＥＫフィルム試料表面で細胞培養評価を行った。細胞培養評価はｎ＝３で行った。すなわち、１２ウェルの細胞培養容器内に各々１枚ずつ前述のようにして表面コートを行ったＰＥＥＫフィルム試料をコート面を上にしてセットし、培地として、１５質量％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：minimal essential medium、ナカライテスク社製）に抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液２ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞密度は１×１０４個／ｃｍ２で播種し、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記ＰＥＥＫフィルム試料表面に播種した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、培地として、１５質量％ウシ胎児血清含有細胞培養液に上記抗生剤を添加した細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Sigma社製）、アスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Sigma社製）を添加した培養液を用いて細胞培養を継続し、光学顕微鏡を用いて細胞接着及び細胞増殖、石灰沈着の有無を観察した。細胞の増殖の様子は、フィルム試料表面で盛んに増殖する様子が観察された。培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定も行った。更に、この細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、ストロンチウムを含む層を設けたＰＥＥＫフィルム試料から４週間の間０．１〜０．５ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され続けることを確認した。後述するように、ストロンチウムを含む層を設けないＰＥＥＫフィルム試料を使用した比較例１では、培地中にはストロンチウムイオンは検出されなかった。
【００７０】
前記した培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定は、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。
【００７１】
比較例１
（比較例１の細胞培養評価）
比較例１として、上記のストロンチウムを含む層を形成しないＰＥＥＫフィルム試料をｎ＝３で使用し、上記と同様の細胞培養評価を並行して実施した。この場合においても、上記の場合と同様に、細胞播種翌日からＰＥＥＫフィルム試料表面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察できた。この場合も培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００７２】
実施例１及び比較例１において、培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定を行ったところ、培養日数とともにオステオカルシンの分泌量が増大し、特に上記のストロンチウムを含む層を形成した実施例１のＰＥＥＫフィルム試料を細胞培養担体として用いた場合にその分泌量が顕著に増大することが判明した。すなわち、培養日数１４日目において測定された培養液中に分泌されたオステオカルシンの量は、ストロンチウムを含む層を設けた実施例１の場合４０±１０ｎｇ／ｍｌであり、コート層を有しない比較例１の場合の１０±５ｎｇ／ｍｌと比較して約４倍の高い分泌量が測定された。
【００７３】
細胞の増殖の様子は、実施例１の場合にはＰＥＥＫフィルムに形成したストロンチウムを含む層表面で盛んに増殖する様子が観察され、この場合、培養日数２１日目において顕著な石灰化が観察された。一方、比較例１ではＰＥＥＫフィルム表面における石灰化の発現は認められなかった。上記の結果から、実施例１のストロンチウムを含む層を設けたＰＥＥＫフィルム試料は、骨芽細胞前駆体細胞に対して骨芽細胞への分化誘導を行った場合において細胞の増殖と活性化が顕著に生じ、フィルム試料のストロンチウムを含む層表面において骨芽細胞の分泌したアパタイトによる石灰化が積極的に生じることが明らかとなった。本実施例から、ＰＥＥＫフィルム表面に本発明のストロンチウムを含む層を設けることで、表面において骨芽細胞前駆体細胞の増殖と分化誘導が促進され、骨分化マーカーであるオステオカルシンの分泌量も未コートのフィルム表面と比較して顕著に増大し、実際に石灰化の促進が確認された。このことから、ＰＥＥＫ等からなるインプラントに対して、本発明のストロンチウムを含む層を設けることでインプラント表面の骨伝導性を高めることが可能であることが実証された。更には、表面層からストロンチウムイオンが３０日間の長期に亘って安定的に放出され、ストロンチウムを含む層が生体内で長期に亘って安定して存在することが可能であることが実証された。
【００７４】
実施例２
（ストロンチウムを含む炭酸アパタイトの合成）
実施例１と同様にして合成したリン酸水素ストロンチウム（０．５モル）を１０００ｍｌ三角フラスコへ移し、イオン交換水６００ｇを加えて攪拌を行いながら、炭酸ナトリウムを２７ｇ（０．２５モル）添加した。反応系のｐＨは９．５であった。これをホットプレート上で攪拌しながら反応系の温度を８０℃に上昇し、この温度で３時間加熱攪拌を行った。その後室温まで冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。イオン交換水により十分に洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行い白色の粉体を得た。得られた粉体は広角Ｘ線回折により解析を行った。広角Ｘ線回折による解析から、得られた白色の粉末は、ストロンチウムを含む炭酸アパタイト（炭酸ストロンチウムアパタイト）であることを確認した。図７には実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターンを示す。図７に示す回折パターンより、炭酸ストロンチウムアパタイト以外の不純物の存在は認められず、また各回折ピークの半値幅も比較的狭い、鋭く高いピーク形状を示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されたことから、高純度で結晶性の良好な炭酸ストロンチウムアパタイトが得られていることが明らかとなった。図８には、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトのＦＴ−ＩＲスペクトルチャートを示す。図中において矢印で示した１４６０ｃｍ−１、１４０５ｃｍ−１及び８７０ｃｍ−１付近の吸収は何れも炭酸アパタイトに含まれる炭酸イオンに特徴的な吸収であることから、生成物は炭酸ストロンチウムアパタイトであることが分かった。更に、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率（質量％）について、Feathersotone等の方法（J.D.B.Featherstone, Caries Res., 18, 63-66 (1984)）に従い、１００１ｃｍ−１付近のリン酸基に基づく吸収ピーク強度に対する１４０５ｃｍ−１の炭酸イオンに基づく吸収ピーク強度の比率から定量を行った結果、炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率として１０．０質量％の値が得られた。
【００７５】
図９には、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像を示す。拡大倍率は１０万倍である。これにより数平均粒子径として１１０ｎｍであり、５００ｎｍを超える大きさの粗大粒子は認められず、また、大きさが５０ｎｍ未満の微粒子の数も１０％未満であるとの結果を得た。また、ＥＤＳによる測定により求められた炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は６２．９％であり、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）４（ＣＯ３）２（ＯＨ）２より計算される値６２．１％にほぼ合致する値が得られた。
【００７６】
上記で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトを用いて、先の実施例１において（Ｂ）の場合と同様にポリ乳酸を２ｇ使用して、実施例１と同様にして湿式分散処理を行うことで、１，４−ジオキサン中に固形分濃度１５．７％で炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子を含む分散液を製造した。実施例１と同様にして、光散乱回折式粒度分布計を使用して求められた体積平均粒子径は、メジアン径で２５０ｎｍであり、粒子径分布として全体が５０ｎｍから５００ｎｍの範囲に含まれる炭酸ストロンチウム微粒子からなる分散液であることが明らかとなった。また上記で得られた分散液に含まれる炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液を透明ガラス製容器内に入れて２４時間室温で静置しておき、静値後の分散液の様子を目視で観察したが、沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認された。
【００７７】
実施例１と同様にして上記で得た炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子を含む分散液に対してこれにＰＭＭＡ（数平均分子量１０万）を２０質量％濃度で溶解した１，４−ジオキサン溶液を加え、炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：２になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分が平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含む層（コート層）を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を得た。乾燥後にコート層を観察したところ、ほぼ完全に透明である均一な塗布膜が形成されていることが確認された。蛍光Ｘ線測定装置を用いて、フィルム表面のコート層中に含まれるストロンチウムの量を定量した結果、１平方メートル当たり１２ｇであり、ほぼ炭酸ストロンチウムアパタイトとＰＭＭＡの比率から計算される値に近い数値であることが確認された。更に、フィルム表面のストロンチウムを含む層の様子を共焦点光学顕微鏡を用いて観察した結果、表面粗さは０．５μｍ未満の凹凸であり、平滑性の高い均一なコート層が形成されていることが確認された。ＰＥＥＫフィルム上のストロンチウムを含む層を走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果、層中に含まれる炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子の大きさとして数平均粒子径として２００ｎｍの一次粒子から成ることが判明し、先の粒子径分布測定結果と大凡良く一致する結果であった。
【００７８】
（表面コートしたＰＥＥＫフィルムからのストロンチウムイオンの徐放性）
上記で得られたストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子とＰＭＭＡを含むコート層を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量した。すなわち、該フィルム試料を４８時間浸漬した疑似体液を３０μｌ採取し、これを円形濾紙の中央部に点滴し、乾燥した試料を用いて蛍光Ｘ線測定を行った。結果を図１０に示した。図１０は実施例２で得られたストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルム試料から溶出するストロンチウムイオン濃度の、液交換回数毎の測定値を示す。この結果より、該ＰＥＥＫフィルム試料から少なくとも３０日間０．１５〜１．６ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され、その後徐々に放出されるストロンチウムイオン濃度が減少することが明確となった。
【００７９】
（実施例２の細胞培養評価）
上記のストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルム試料を用いて、以下のようにしてＰＥＥＫフィルムのストロンチウムを含む層表面で細胞培養評価を行った。細胞培養評価はｎ＝３で行った。すなわち、１２ウェルの細胞培養容器内に各々１枚ずつＰＥＥＫフィルム試料をコート層が形成された面を上にしてセットし、培地として、１５質量％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：minimal essential medium、ナカライテスク社製）に抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液２ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞密度は１×１０４個／ｃｍ２で播種し、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記ＰＥＥＫフィルム試料表面に播種した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、培地として、１５質量％ウシ胎児血清含有細胞培養液に上記抗抗生剤を添加した細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Sigma社製）、アスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Sigma社製）を添加した培養液を用いて細胞培養を継続し、光学顕微鏡を用いて細胞接着及び細胞増殖、石灰沈着の有無を観察した。細胞培養液は４８時間毎に交換し、培地交換直前に培地のサンプリングを行った。細胞の増殖の様子は、フィルム試料表面で盛んに増殖する様子が観察された。培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定も行った。
【００８０】
上記の細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、ストロンチウムを含む層を設けたＰＥＥＫフィルムから４週間の間０．１〜２ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され続けることを確認した。下記に示す比較例２のストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを表面コート層に設けたＰＥＥＫフィルムを使用した比較例２では、培地中にはストロンチウムイオンは検出されなかった。
【００８１】
比較例２
（比較例２の炭酸アパタイトの合成）
比較例２として、ストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを下記の方法に従い合成し、これを用いて実施例２と同様にして比較例２のストロンチウムを含まない炭酸アパタイト微粒子の層を形成したＰＥＥＫフィルム試料を作製した。すなわち、リン酸水素カルシウム二水和物（以下ＤＣＰＤと略す。和光純薬工業社製）を４３ｇ（０．２５モル）秤量し、還流冷却管とこれに接続した気体のトラップ管を備えた５００ｍｌの三角フラスコへ移し、イオン交換水２００ｇを加えて攪拌を行いながら、炭酸ナトリウムを１６ｇ添加して攪拌を行った。水浴上で攪拌しながら反応系の温度を８０℃に上昇し、この温度で２時間加熱攪拌を行った。反応中炭酸ガスが発生し、トラップ中にバブリングする炭酸ガスの様子を観察することにより、炭酸ガスの発生が停止した時点を反応の終点とした。その後室温まで反応系を冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。イオン交換水により生成物を十分に洗浄した後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行うことで白色の粉体を得た。得られた粉体は広角Ｘ線回折により測定を行い炭酸アパタイトとして予測されるピーク位置に鋭く明瞭な回折ピークを示し、炭酸アパタイト以外の不純物の存在は認められず、高純度で結晶性の良好な炭酸アパタイトが得られていることが明らかとなった。実施例２と同様にして炭酸アパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率を求めた結果、１７．６質量％含まれていることが分かった。得られたストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを用いて、実施例１の（Ｂ）と同様にしてポリ乳酸を分散剤に用いて、１，４−ジオキサン中において湿式分散処理を行い、更にＰＭＭＡ溶液を加えて実施例２と同様にして炭酸アパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：５になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分が平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを含む層を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を得た。
【００８２】
（比較例２の細胞培養評価）
比較例２として、上記のストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを含む層を表面層に設けたＰＥＥＫフィルム試料をｎ＝３で使用し、上記実施例２と同様の細胞培養評価を並行して実施した。この場合においても、実施例２の場合と同様に、細胞播種翌日からＰＥＥＫフィルム試料表面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察できた。この場合も培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００８３】
実施例２及び比較例２において、培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定を行ったところ、培養日数とともにオステオカルシンの分泌量が増大し、特に上記のコート層を形成した実施例２のＰＥＥＫフィルム試料を用いた場合にその分泌量が顕著に増大することが判明した。すなわち、培養日数１４日目において測定された培養液中に分泌されたオステオカルシンの量は、本発明のストロンチウムを含む層を設けた実施例２の場合７０±３０ｎｇ／ｍｌであり、ストロンチウムを含まない炭酸アパタイト層を設けた比較例２の場合の２５±５ｎｇ／ｍｌと比較して約３倍の高い分泌量が測定され、実施例１の場合より更に高いオステオカルシンの分泌量を示した。
【００８４】
細胞の増殖の様子は、実施例２の場合にはＰＥＥＫフィルム試料表面で盛んに増殖する様子が観察され、この場合、培養日数２１日目において顕著な石灰化が観察された。一方、比較例２ではＰＥＥＫフィルム試料表面における石灰化の発現は認めたものの、実施例２の場合より明らかに石灰化の程度は低い結果であった。上記の結果から、実施例２のストロンチウムを含む層を形成したＰＥＥＫフィルムは、骨芽細胞への分化誘導を行った場合において細胞の増殖と活性化が顕著に生じ、該層表面において骨芽細胞の分泌したアパタイトによる石灰化が積極的に生じることが明らかとなった。本実施例から、ＰＥＥＫ表面に本発明のストロンチウムを含む層を設けることで、表面において骨芽細胞前駆体細胞の増殖と分化誘導が促進され、骨分化マーカーであるオステオカルシンの分泌量もストロンチウムを含まない炭酸アパタイトのコート表面と比較して顕著に増大し、実際に石灰化の促進が確認された。このことから、ＰＥＥＫ等からなるインプラントに対して、本発明のストロンチウムを含む層を設けることでインプラント表面の骨伝導性を高めることが可能であることが実証された。更には、表面層からストロンチウムイオンが３０日間の長期に亘って安定的に放出され、ストロンチウムを含む層が生体内で長期に亘って安定して存在することが可能であることが実証された。
【００８５】
実施例３
実施例１の（Ｂ）で作製した、ポリ乳酸を用いて湿式分散処理を行って得られた、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む分散液を用いて、これにＰＭＭＡ（数平均分子量１０万）を２０質量％濃度で溶解した１，４−ジオキサン溶液を加え、ストロンチウムアパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：２０になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に該アパタイト微粒子、ＰＭＭＡ及びポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を合わせた全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分質量が１平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行った。得られたＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量した。その結果、該ＰＥＥＫフィルム試料から３０日間０．１〜０．５ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され、その後徐々に放出されるストロンチウムイオン濃度が減少することが明確となった。更に実施例１と同様にして実施例３のＰＥＥＫフィルム試料表面において細胞培養を行ったところ、実施例１と同様に細胞の増殖とオステオカルシンの分泌が認められ、この場合もストロンチウムイオンの徐放性が確認され、骨芽細胞前駆体細胞の増殖と分化誘導が促進されていることが確認された。
【００８６】
比較例３
実施例１の（Ｂ）で作製した、ポリ乳酸を用いて湿式分散処理を行って得られた、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む分散液を用いて、これにＰＭＭＡ（数平均分子量１０万）を２０質量％濃度で溶解した１，４−ジオキサン溶液を加え、ストロンチウムアパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：１になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に該アパタイト微粒子、ＰＭＭＡ及びポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を合わせた全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分質量が１平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行った。得られたＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置したところ、２日後にＰＥＥＫフィルム試料表面に形成したアパタイト微粒子を含む層が剥離していることが判明し、それ以降の評価は中止した。
【００８７】
比較例４
実施例１の（Ｂ）で作製した、ポリ乳酸を用いて湿式分散処理を行って得られた、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む分散液を用いて、これにＰＭＭＡ（数平均分子量１０万）を２０質量％濃度で溶解した１，４−ジオキサン溶液を加え、ストロンチウムアパタイト微粒子の質量とＰＭＭＡの質量比が１０：２５になるようＰＭＭＡ溶液を添加した。更に該アパタイト微粒子、ＰＭＭＡ及びポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸を合わせた全体の固形分濃度が１０質量％になるよう１，４−ジオキサンで希釈してコート液を作製した。このコート液を用いてＰＥＥＫフィルム上に固形分質量が１平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行った。得られたＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に４８時間静置し疑似体液中に溶出するストロンチウムイオン濃度を定量したところ、検出限界以下の濃度でストロンチウムイオンの溶出は確認できず、それ以降の評価は中止した。
【００８８】
実施例４
（脊椎ケージに対するストロンチウムを含むアパタイト層の形成）
基材として脊椎固定術用椎間スペーサーとして用いられる脊椎ケージを選び、これへのストロンチウムを含む層の生体活性及び接着性、耐摩耗性に関する評価を行った。脊椎ケージとしてＰＥＥＫ製インプラント（滅菌済CAPSTONE PEEK、メドトロニックソファモアダネック社製）を用いて、これを先の実施例１で作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液にＰＭＭＡ（アパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率は２０質量％、つまりアパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率は１０：２とした）を添加したコート液中に浸漬し、引き上げて７０℃の乾燥器内で３時間静置することで乾燥、加熱処理を行い、ストロンチウムを含む層を形成した脊椎ケージを作製した。得られた脊椎ケージはオートクレーブを用いて加熱滅菌処理を行った。尚、実際に脊椎ケージ表面にコートされたアパタイト層の厚みとして、蛍光Ｘ線測定から求めた数値は、固形分質量が１平方メートル当たり約２ｇの塗布量であった。作製した脊椎ケージを用いて、これを疑似体液中に３０日間浸漬し、その間２日ごとに少量の液を採取し、溶出するストロンチウムイオンの濃度を測定した結果、３０日間に亘ってほぼ一定の０．５ｐｐｍである数値が測定された。疑似体液から脊椎ケージ表面にはカルシウムアパタイトの鱗片状の結晶が析出していることが確認され、優れた生体活性を示すことが明らかとなった。
【００８９】
実施例５
（人工骨に対するストロンチウムを含むアパタイト層の形成）
人工骨として、β−ＴＣＰを焼結して作製された人工骨（スーパーポア、５ｍｍφディスク、ホヤテクノサージカル社製）を用いて、これに前記実施例２で作製した炭酸ストロンチウムアパタイトとＰＭＭＡ（ただしアパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率は１０：５とした）を含むコート液中に浸漬し、引き上げて７０℃の乾燥器内に３時間静置することで乾燥を行い、人工骨表面にストロンチウムを含む炭酸アパタイト層を形成した。このようにしてアパタイト層を形成した人工骨はオートクレーブを用いて加熱滅菌処理を行った。尚、人工骨表面にコートされたアパタイト層の厚みとして、蛍光Ｘ線測定から求められた数値は、固形分質量が１平方メートル当たり約３．５ｇの塗布量であった。図１１の（ａ）及び（ｂ）は、実施例５で作製したストロンチウムを含む層を形成した人工骨の走査型電子顕微鏡による拡大画像を示す。拡大倍率は、図１１の（ａ）２００倍、及び（ｂ）２５００倍である。ストロンチウムを含む層は人工骨に形成されている多孔質構造を封鎖することなく多孔質構造を保ったまま人工骨表面に形成されていることが確認された。
【００９０】
（実施例５及び比較例５の細胞培養評価）
実施例５として上記のストロンチウムを含む層を形成した人工骨と、比較例５としてストロンチウムを含む層を形成しない、入手した状態の人工骨を用いて、以下のようにして人工骨表面で細胞培養評価を行った。細胞培養評価は各々ｎ＝３で行った。すなわち、１２ウェルの細胞培養容器内のウェル内に各々１個ずつ人工骨をセットし、培地として、１５質量％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：minimal essential medium、ナカライテスク社製）に抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液１．５ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞は初期培養後にトリプシン処理により作製した１×１０６個／ｃｍ２の細胞浮遊液を人工骨表面上に静置し、オーバーナイトで静置後に人工骨表面に付着した細胞とともに新しい１２ウェルの細胞培養容器内に移設した。人工骨表面の細胞密度は４．５×１０５個／ｃｍ２で播種されており、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記人工骨表面に播種した細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、培地として、１５質量％ウシ胎児血清含有細胞培養液に上記抗生剤を添加した細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Sigma社製）、アスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Sigma社製）を添加した培養液を用いて細胞培養を継続した。細胞培養液は４８時間毎に交換し、培地交換直前に培地のサンプリングを行った。
【００９１】
上記の培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定は、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。更に、この細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、ストロンチウムを含む層を設けた実施例５の人工骨から２週間の間２〜１０ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され続けることを確認した。比較例５のストロンチウムを含む層を形成しない人工骨からのストロンチウムイオンの放出は観察されなかった。オステオカルシンの分泌量測定の結果、培養開始から１４日目で実施例５の人工骨からは平均して７００ｎｇ／ｍｌの分泌量が測定されたが、比較例５の人工骨からの分泌量は平均して５００ｎｇ／ｍｌであり、有意差を以て実施例５の人工骨表面で増殖した細胞からのオステオカルシンの分泌量が多い結果であった。本実施例の結果より、ストロンチウムを含む層を形成した人工骨はストロンチウムイオンを好ましい濃度範囲において徐放する機能を有し、これにより骨系細胞の増殖と活性を促進する効果を示し、生体適合性と骨伝導性を高めた人工骨としての有用性を示唆する結果が得られた。
【００９２】
実施例６
実施例６として、前記実施例１で作製した、アパタイト微粒子分散液とＰＭＭＡ（アパタイト微粒子に対するＰＭＭＡの比率は１０：２）を溶解したコート液を用いて、これに更にポリ乳酸としてポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｄ／Ｌ＝１／１：数平均分子量１２万）をアパタイト微粒子に対して５０質量％の比率で添加してコート液を作製した。実施例１と同様にしてＰＥＥＫフィルム表面にストロンチウムを含む層を形成し、得られたストロンチウムを含む層を表面に形成したＰＥＥＫフィルム試料を用いて、これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したところ、試験開始から３０日後まで０．２ｐｐｍ前後の濃度でストロンチウムイオンが放出されることを確認した。更に実施例１と同様にして実施例６のＰＥＥＫフィルム試料表面において細胞培養を行ったところ、実施例１と同様に細胞の増殖とオステオカルシンの分泌が認められ、この場合もストロンチウムイオンの徐放性が確認され、骨芽細胞前駆体細胞の増殖と分化誘導が促進されていることが確認された。
【００９３】
比較例６
塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）２７ｇ（０．１モル）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）５９ｇ（０．４モル）を１リッターの三角フラスコ内に移し、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ内に移し、０℃に調整した氷浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を３時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に１時間０℃にて攪拌を行った。その後氷浴上から三角フラスコを移し、室温に戻した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、４０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物の収量は、理論収量に対してほぼ５０質量％の収量であった。
【００９４】
生成物（上記白色の粉体）を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところ図１２に示す回折パターンが得られた。これより、生成物はブロードな回折パターンを示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが不明瞭であったことから、非晶質のストロンチウムを含むアパタイトであることが確認された。一方、蛍光Ｘ線測定による生成物の元素分析を行ったところ、ストロンチウムとカルシウムの両方の元素がほぼ仕込み通りの１：４のモル比率で含まれていることが判明した。この場合、ＥＤＳによる測定により求められたアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は１６．０質量％であり、金属イオンとしてストロンチウムとカルシウムが１：４のモル比率で含まれているとした場合の理論値である１５．９質量％と良く一致していた。
【００９５】
上記で得られた非晶質のストロンチウムを含むアパタイトを用いて実施例１の（Ｂ）と同様にしてポリ乳酸を添加して湿式分散処理を行うことで、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を作製した。実施例１と同様にしてＰＭＭＡを添加してコート液を作製し、更にＰＥＥＫフィルム表面に実施例１と同様の厚みでコート層を形成したフィルム試料を作製した。これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したが、ストロンチウムイオン濃度は最初の測定においてのみ０．２ｐｐｍと測定されたが、その後検出限界濃度以下で検出されず、本発明の効果は認められなかった。フィルム試料を引き上げて走査型電子顕微鏡を用いて表面を観察したところ、表面からアパタイト微粒子は消失していた。この比較例６の結果から、アパタイトの結晶性が無くなることで培養液中への溶解性が増加し、ストロンチウムイオンを継続して放出する機能が喪失することが判明した。
【００９６】
実施例７
塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）２７ｇ（０．１モル）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）５９ｇ（０．４モル）を１リッターの三角フラスコ内に移し、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ内に移し、６０℃に調整した水浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を１時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に４時間９０℃にて攪拌を行った。その後水浴上から三角フラスコを移し、室温に戻した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物（白色の粉体）の収量は、理論収量に対してほぼ１００質量％の収量であった。
【００９７】
生成物を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところ図１３に示す回折パターンが得られた。これより、生成物は明確なアパタイトに特徴的な回折パターンを示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されていることから結晶性を有していることが確認された。蛍光Ｘ線測定による生成物の解析を行ったところ、該アパタイトに含まれる全金属イオン中におけるストロンチウムの比率は２０モル％であり、ストロンチウムとカルシウムの両方の元素がほぼ仕込み通りの１：４のモル比率で含まれていることが判明した。この場合、ＥＤＳによる測定により求められたアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は１６．２質量％であり、金属イオンとしてストロンチウムとカルシウムが１：４のモル比率で含まれているとした場合の理論値である１５．９質量％と良く一致していた。
【００９８】
上記で得られたストロンチウムを含むアパタイトを用いて実施例１の（Ｂ）と同様にしてポリ乳酸を添加して湿式分散処理を行うことで、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を作製した。得られた分散液中に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の体積平均粒子径は１４０ｎｍである分散液が得られた。実施例１と同様にしてＰＭＭＡをアパタイト微粒子に対して１０：２（アパタイト微粒子：ＰＭＭＡ）の比率で添加してコート液を作製し、更にＰＥＥＫフィルム表面に実施例１と同様の厚みでコート層を形成したＰＥＥＫフィルム試料を作製した。これを直径１４ｍｍφの円形に裁断し、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてフィルム試料が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したところ、ストロンチウムイオン濃度は３０日間に亘る測定において０．２ｐｐｍから０．５ｐｐｍの濃度範囲内で定常的に放出されていることが確認された。実施例１と同様にしてラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った結果、培養２週目でオステオカルシンの分泌が認められ４週目で表面に顕著な石灰化が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により与えられるストロンチウムを含む層は生体に対して安全性が確保されており、更に高い生体親和性と生体活性を示し、特に骨系細胞の培養に際して、細胞の増殖と活性を高める効果を有することから、本発明に記載される例以外にも各種生体インプラントの表面に該コート層を設けることで、表面において骨系細胞の増殖と活性が増大することが期待される。具体的には歯科材料、整形外科材料、形成外科材料への応用が考えられる。また、ストロンチウムを含むアパタイトへの各種タンパク質やＤＮＡ、その他各種有機物質の吸着を利用することで、本発明のコート層を吸着材料や分離のための材料として利用することも可能である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【図５】
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【図９】
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【図１１】
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