(57)【要約】【課題】血中におけるmiR-1、miR-133a及びmiR-206の放出量を制御して、筋細胞の損傷を抑制する薬剤を開発し、提供する。また、それを有効成分とする筋原性疾患治療剤を提供する。【解決手段】セラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤からなる筋細胞損傷抑制剤、及びその筋細胞損傷抑制剤を有効成分として包含する筋原性疾患治療剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤からなる筋細胞損傷抑制剤。
【請求項２】
前記セラミド合成阻害剤がスフィンゴミエリナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の筋細胞損傷抑制剤。
【請求項３】
前記スフィンゴミエリナーゼが中性スフィンゴミエリナーゼ2である、請求項２に記載の筋細胞損傷抑制剤。
【請求項４】
前記スフィンゴミエリナーゼ阻害剤がGW4869、GW69A、GW554869A、スフィンゴラクトン（Sphingolactone）、スキホスタチン（Scyphostatin）からなる群から選択される、請求項２に記載の筋細胞損傷抑制剤。
【請求項５】
前記セラミド分解剤がスフィンゴミエリン合成酵素又はセラミダーゼである、請求項１に記載の筋細胞損傷抑制剤。
【請求項６】
前記筋細胞が骨格筋細胞又は心筋細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の筋細胞損傷抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の筋細胞損傷抑制剤を有効成分として含む筋原性疾患治療薬。
【請求項８】
前記筋原性疾患が筋ジストロフィー、ミオパチー、炎症性筋疾患、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病及び周期性四肢麻痺からなる群から選択される、請求項７に記載の筋原性疾患治療薬。
【請求項９】
前記筋原性疾患が筋ジストロフィーである、請求項８に記載の筋原性疾患治療薬。
【請求項１０】
筋原性疾患の治療に使用するためのセラミド合成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋細胞損傷抑制剤、及びそれを有効成分とする筋原性疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋原性疾患の一種である筋ジストロフィーは、骨格筋の筋線維が変性又は壊死することにより筋肉の萎縮や筋力低下を生じる進行性の遺伝性疾患である。遺伝形式や臨床症状により、デュシャン型、ベッカー型、肢帯型、顔面肩甲上腕型等の様々な病型が知られている（非特許文献１）。
【０００３】
筋ジストロフィーの診断は、臨床症状、血液検査、診察所見、筋電図検査、筋生検、遺伝子検査等を総合して行なわれる。このうち血液検査は、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）又はアルドラーゼ等の酵素量の測定によって行なわれる。
【０００４】
血液検査方法は、筋細胞に多く含まれるこれらの酵素が、筋ジストロフィー患者では筋細胞の壊死により血液中に漏出して正常状態よりも高値となるという現象に基づくものである。末梢血での検出が可能であるため被験者に対する侵襲性が低く、測定方法も比較的簡便であることから、筋ジストロフィーの診断では広く用いられている。中でも血清中のクレアチンキナーゼ値を測定する方法が一般的である（非特許文献２）。ところが、クレアチンキナーゼをはじめとする前記酵素は、運動負荷による筋細胞の壊死によっても血中に多く漏出することから、被検者の運動負荷の有無で血清中の濃度が大きく変動してしまう。そのため健常者であってもクレアチンキナーゼ値等が高い値を示し、誤判定されてしまう問題や正確な判定のために採血前の被験者を安静状態に置かなければならないという煩わしさがあった。
【０００５】
本発明者らは、3種のマイクロRNA（miRNA）、すなわちmiR-1、miR-133a及びmiR-206の血中量が筋原性疾患、特に筋ジストロフィーの罹患と密接に関係し、かつ運動負荷による影響をほとんど受けない知見を見出し、それに基づいて、前記miRNAをクレアチンキナーゼに代わる新たな筋原性疾患検出用マーカーとする発明を完成させた（特許文献１)。
【０００６】
一般に筋ジストロフィー患者では、血液中の前記miRNA量が健常者と比較して有意に上昇する。これは、クレアチンキナーゼと同様の傾向であり、血液中に過剰放出された前記miRNAは、筋細胞膜が不安定化し、それが筋細胞の損傷、壊死に起因している可能性がある。したがって、これらのmiRNAの放出量を低減し、筋細胞の損傷を抑制することができれば、筋原性疾患の治療薬となり得る。しかし、血液中における前記miRNA放出量を制御し、骨格筋細胞の損傷を抑制することのできる薬剤は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2011/105556
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】杉田秀夫, 小澤▼英▼二郎, 埜中征哉 編集, 1995, 新筋肉病学.南江堂,東京: pp469-550
【非特許文献２】Sugita H., et al, 1959, J. Biochem., 46: 103-104
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、血中におけるmiR-1、miR-133a及びmiR-206の放出量を制御して、筋細胞の損傷を抑制する薬剤を開発し、提供することである。また、それを有効成分とする筋原性疾患治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前述のように、筋ジストロフィー患者では血液中の前記3種のmiRNA量が健常者と比較して有意に上昇する。これらのmiRNAは、RNase活性が非常に高い血液中でさえ高濃度で存在している。これは、循環miRNAがエクソソームに内包されて、又は結合タンパク質との複合体を形成して、安定な形で血液中に存在するためだと考えられている（Mitchell P.S., et al., 2008, PNAS, 105(30): 10513-10518）。
【００１１】
本発明者らは、エクソソームの放出量を抑制することで、前記3種の血液中のmiRNA量を低減すると共にクレアチンキナーゼ活性を低下させることに成功し、エクソソーム放出の抑制剤が筋細胞の損傷を抑制し、筋原性疾患の治療薬となることを見出した。本発明は、当該新たな知見に基づくものであって、以下を提供する。
【００１２】
（１）セラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤からなる筋細胞損傷抑制剤。
（２）前記セラミド合成阻害剤がスフィンゴミエリナーゼ阻害剤である、（１）に記載の筋細胞損傷抑制剤。
（３）前記スフィンゴミエリナーゼが中性スフィンゴミエリナーゼ2である、（２）に記載の筋細胞損傷抑制剤。
（４）前記スフィンゴミエリナーゼ阻害剤がGW4869、GW69A、GW554869A、スフィンゴラクトン（Sphingolactone）、スキホスタチン（Scyphostatin）からなる群から選択される、（３）に記載の筋細胞損傷抑制剤。
（５）前記セラミド分解剤がスフィンゴミエリン合成酵素又はセラミダーゼである、（１）に記載の筋細胞損傷抑制剤。
（６）前記筋細胞が骨格筋細胞又は心筋細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の筋細胞損傷抑制剤。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の筋細胞損傷抑制剤を有効成分として含む筋原性疾患治療薬。
（８）前記筋原性疾患が筋ジストロフィー、ミオパチー、炎症性筋疾患、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病及び周期性四肢麻痺からなる群から選択される、（７）に記載の筋原性疾患治療薬。
（９）前記筋原性疾患が筋ジストロフィーである、（８）に記載の筋原性疾患治療薬。
（１０）筋原性疾患の治療に使用するためのセラミド合成阻害剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の筋細胞損傷抑制剤は、血中におけるmiR-1、miR-133a及びmiR-206の放出量を制御して、筋細胞の損傷を抑制することができる。
【００１４】
本発明の筋原性疾患治療剤は、本発明の筋細胞損傷抑制剤を有効成分として筋原性疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】C2C12細胞の分化過程において放出されたエクソソーム中の各miRNA量の経時的変化を示す。AはmiR-1を、BはmiR-133aを、そしてCはmiR-206を示す。
【図２】無血清培地にGW4869を添加したときのC2C12細胞からのエクソソーム放出量を示す図である。
【図３】無血清培地にDMAPPを添加したときのC2C12細胞からのエクソソーム放出量を示す図である。
【図４】無血清培地にGW4869を添加したときのC2C12細胞から放出されたエクソソーム中及びエクソソームを除いた上清中の各miRNA量を示す図である。
【図５】mdxマウスの腹腔内にGW4869を投与したときの血清中における各miRNA量の変化を示す図である。
【図６】mdxマウスの腹腔内にGW4869を投与したときの血清中のクレアチンキナーゼ活性の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．筋細胞損傷抑制剤
１−１．概要
本発明の第１の形態は、筋細胞損傷抑制剤である。本発明の筋細胞損傷抑制剤は、セラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤からなる。本発明の筋細胞損傷抑制剤は、筋原性疾患と密接に関係する3種のmiRNA（miR-1、miR-133a及びmiR-206）を包含するエクソソームの血中放出量を抑制することによって、エクソソームと共に過剰放出された前記3種のmiRNAによる筋細胞の損傷及び壊死を抑制することができる。
【００１７】
１−２．定義
本明細書で使用する用語について、以下で定義する。
「筋細胞損傷」とは、筋細胞の細胞膜が脆弱化し変性する結果、細胞が壊死することをいう。一般的に筋原性疾患の筋細胞等で認められる現象であるが、運動負荷による刺激を受けた筋細胞でも同様の現象がみられる。筋細胞損傷により、通常は細胞内に包含されているクレアチンキナーゼ等の酵素が血液中に漏出し、正常状態よりも高い数値となる。前述したように、血清中のクレアチンキナーゼ値を測定して筋原性疾患を検出する方法は、前記現象を応用したものである。したがって、筋細胞損傷、筋原性疾患及びクレアチンキナーゼ値は、互いに正の相関関係にある。筋細胞損傷の対象となる筋細胞は、いずれの筋細胞であってもよいが、好ましくは前記3種のmiRNAが関与する筋細胞、すなわち骨格筋又は心筋である。
【００１８】
「筋原性疾患」とは、筋肉が萎縮し、筋力低下を生じる疾患をいう。例えば、筋ジストロフィー（デュシャン型、ベッカー型、エメリ・ドレフュス型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、先天性の各種筋ジストロフィーを含む）、ミオパチー（先天性、遠位型、甲状腺機能低下性、ステロイドミオパチー等を含む）、炎症性筋疾患（多発性節炎、皮膚節炎を含む）、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病、周期性四肢麻痺等が含まれる。
【００１９】
「miRNA」とは、細胞内に存在する長さ21〜23塩基長の一本鎖ノンコーディングRNAである。この小分子RNAは、標的遺伝子のmRNA、及びタンパク質因子と結合して複合体を形成し、RISC（RNA-induced silencing complex）／miRNPの作用によって標的遺伝子の翻訳を阻害することにより、標的遺伝子の発現を調節することが知られている。miRNAは、pri-miRNAと呼ばれる前駆体（前々駆体）状態でゲノムから転写された後、核内でDroshaと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりpre-miRNAと呼ばれる前駆体にプロセシングされ、さらに核外でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって成熟体のmiRNAとなる（Bartel DP, 2004, Cell, 116:281-297）。したがって、細胞内には、通常、前駆体としてのpri-miRNA及びpre-miRNA、並びに成熟miRNAが存在し得る。本明細書におけるmiRNAは、miRNA前駆体及び成熟miRNAのいずれをも包含する。好ましくは、成熟miRNAである。
【００２０】
本発明に関連するmiRNAは、miR-1、miR-133a及びmiR-206の3種である。miR-1及びmiR-133aは心筋、心房及び骨格筋で特異的に発現し、miR-206は骨格筋のみで特異的に発現する（Kim et al., 2006, J. Cell Biochem, 174,677-687）。これらのmiRNAの血清中の量は、クレアチンキナーゼと同様に筋原性疾患と連関して増加するが、運動負荷ではクレアチンキナーゼと異なり変動しない。それ故に、クレアチンキナーゼに代わる好適な筋原性疾患検出用マーカーとして機能し得る。
【００２１】
「エクソソーム（exosome）」とは、脂質二重膜で形成された直径30〜100nmの小胞顆粒で、膜外小胞（EMV:Extra Membrane Vesicle）の一つある。分泌細胞由来の膜タンパク質と膜脂質で構成され、内部には細胞質成分の他、サイトカイン等をはじめとする各種分泌タンパク質、mRNA、及びmiRNAを包含する。エクソソームは、血液、唾液、尿等の様々な体液中に存在し、放出細胞と標的細胞間の血流を介した情報伝達や、アルツハイマー病やプリオン病等の疾患の病態発生に関与することが示唆されている。エクソソームは、細胞内で生産された後、細胞外に放出される。エクソソームの細胞外放出には、いくつかの経路が知られているが、本発明で対象とする経路は、セラミド依存性分泌経路（Ceramide-dependent secretory pathway）を介した放出経路が対象となる。 
【００２２】
「スフィンゴ脂質」とは、スフィンゴ塩基を基本骨格とする脂質である。生体内では、生体膜脂質二重層を構成する両親媒性脂質として機能している。
【００２３】
「セラミド」は、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合したスフィンゴ脂質の一種である。生体膜を構成する脂質二重層の主要な脂質であって、細胞死、増殖、分化等を制御するシグナル分子として機能する。
【００２４】
「スフィンゴミエリン」とは、リン酸基を有するスフィンゴ脂質の一種であって、生体膜においてセラミドのプール分子と考えられている。
【００２５】
「スフィンゴ脂質代謝経路」とは、生体膜において、セラミドを中心としたスフィンゴ脂質の合成及び分解に関与する様々な代謝酵素により制御されている複数の代謝経路をいう。
【００２６】
１−３．構成
本発明の筋細胞損傷抑制は、セラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤で構成される。
「セラミド合成阻害剤」とは、セラミドの合成を阻害する薬剤をいう。好ましくはスフィンゴ脂質代謝経路において、セラミドの絶対量又は相対量の増加を抑制する薬剤である。例えば、セラミドの合成に関与する酵素を阻害する薬剤が挙げられる。
【００２７】
「セラミド分解剤」とは、セラミドを分解可能な薬剤をいう。好ましくはスフィンゴ脂質代謝経路において、セラミドの絶対量又は相対量を減ずる薬剤である。例えば、セラミドを分解する酵素、又はそれを賦活化する薬剤をいう。
【００２８】
本明細書において「薬剤」とは、低分子化合物、ペプチド（酵素及び抗体を含む）、又は核酸（アプタマーを含む）を含む概念である。
【００２９】
生体内において、セラミドの合成経路には、スフィンゴミエリナーゼ経路（Hannun, Y.A. & Obeid, L.M., 2008, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,9: 139-150; Wu, B.X., et al., 2010, NeuromolecularMed.,12: 320-330）、デ・ノボ（de novo）合成経路（Menaldino, D.S., et al., 2003, Pharmacol. Res.,47: 373-381）、及びサルベージ経路（Kitatani, K., et al., 2008, Cell. Signal., 20: 1010-1018）等が知られている。本明細書のセラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤が作用する合成経路は、いずれの経路であってもよい。好ましくはスフィンゴミエリナーゼ経路である。
【００３０】
スフィンゴミエリナーゼ経路は、スフィンゴミエリナーゼ（SMase：Sphingomyelinase）（本明細書では、しばしば「SMase」と表記する）によって、生体膜上のスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドを生合成する経路である。一方、セラミドは、スフィンゴミエリン合成酵素（SMS：Sphingomyelin synthase)（本明細書では、しばしば「SMS」と表記する）によって分解され、スフィンゴミエリンに変換される。つまり、細胞膜上でセラミドとスフィンゴミエリンは、SMaseとSMSによって制御されるスフィンゴミエリンサイクルと呼ばれる相互変換関係にある。
【００３１】
したがって、SMase経路におけるセラミド合成阻害剤には、SMase経路においてスフィンゴミエリンからセラミドへの変換を阻止する薬剤が挙げられる。具体的には、例えば、SMase阻害剤である。SMase阻害剤の具体例としては、限定はしないが、GW4869、GW69A、GW554869A、スフィンゴラクトン、スキホスタチンが挙げられる。SMase阻害剤には、最適pHの異なる酸性SMase（aSMase）、中性SMase(nSMase)、及びアルカリ性SMase(AlkSMase)が存在する。本明細書のセラミド合成阻害剤は、いずれであってもよい。好ましくはnSMase、より好ましくはそのアイソフォームの一つである中性スフィンゴミエリナーゼ2（SMase2）である。
【００３２】
SMase経路以外の経路におけるセラミド合成阻害剤には、例えば、サルベージ経路においてスフィンゴシンからセラミドへの変換を阻止する薬剤が挙げられる。具体的には、例えば、セラミド合成酵素（ceramide synthase)阻害剤である。
【００３３】
一方、SMase経路におけるセラミド分解剤には、SMase経路においてセラミドからスフィンゴミエリンへの変換を促進する薬剤が挙げられる。例えば、セラミド分解酵素やその賦活剤である。具体的には、例えば、SMS及びSMS賦活剤である。
【００３４】
SMase経路以外の経路におけるセラミド分解剤には、サルベージ経路においてセラミドからスフィンゴシンへの変換を促進する薬剤、例えば、セラミド分解酵素やその賦活剤が挙げられる。具体的には、例えば、セラミダーゼ及びセラミダーゼ賦活剤である。
【００３５】
２．筋原性疾患治療薬
２−１．概要
本発明の第２の形態は、筋原性疾患治療剤である。本発明の筋原性疾患治療剤は、これまでにないセラミド合成阻害剤又はセラミド分解剤からなる第１形態の筋細胞損傷抑制剤を有効成分として含み、筋ジストロフィーをはじめとする筋原性疾患の治療用医薬組成物である。
【００３６】
２−２．構成
２−２−１．有効成分
本発明の筋原性疾患治療剤は、前記第１形態に記載の筋細胞損傷抑制剤を有効成分として含む。筋原性疾患治療剤は、第１形態に記載の筋細胞損傷抑制剤を二以上含むことができる。例えば、セラミド合成阻害剤とセラミド分解剤を包含していてもよい。また、第１形態に記載の筋細胞損傷抑制剤以外の公知の筋細胞損傷抑制剤を含むこともできる。公知の筋細胞損傷抑制剤には、例えば、プレドニゾロンが挙げられる。
【００３７】
筋原性疾患治療剤に配合される第１形態に記載の筋細胞損傷抑制剤の量（含有量）は、その筋原性疾患治療剤に包含される筋細胞損傷抑制剤の種類及び／又はその有効量（投与量又は摂取量）、疾患の種類、剤形、並びに後述する担体の種類によって異なり、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。本明細書において「有効量」とは、筋原性疾患治療剤において筋細胞損傷抑制剤がその機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを投与する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。
【００３８】
本明細書において「被験体」とは、筋原性疾患治療剤の投与対象となる生体をいう。例えば、ヒト、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、競走馬、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル等）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）等が該当する。好ましくはヒトである（この場合、特に「被験者」という）。また、「被験体の情報」とは、薬物組成物を投与する生体の様々な個体情報であって、例えば、ヒトの場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。
【００３９】
筋原性疾患治療剤中の筋細胞損傷抑制剤の含有量、及びそれに基づいて算出される投与量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、又は獣医師等の判断によって決定される。このように本発明の筋原性疾患治療剤における筋細胞損傷抑制剤の含有量は、条件より異なる。筋細胞損傷抑制剤の薬理効果を得る上で、筋原性疾患治療剤の大量投与が必要な場合、被験体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。例えば、通常成人1日当たりの筋細胞損傷抑制剤の有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間〜約1年間、好ましくは約1ヶ月〜約12ヶ月にわたり投与してもよい。
【００４０】
２−２−２．溶媒
本発明の筋原性疾患治療剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な溶媒中に溶解することができる。「薬学的に許容可能な溶媒」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒をいう。例えば、水若しくは水溶液、又は有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液には、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。有機溶剤には、エタノールが挙げられる。
【００４１】
２−２−３．担体
本発明の筋原性疾患治療剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分である筋細胞損傷抑制剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
【００４２】
賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４３】
結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
【００４５】
充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
【００４６】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【００４７】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【００４８】
必用であれば、さらに医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
【００４９】
２−２−４．剤形
本実施形態の筋原性疾患治療剤の剤形は、有効成分である第１形態に記載の筋細胞損傷抑制剤又は他の付加的な有効成分を不活化させず、投与後に生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。一般に、筋原性疾患治療剤の剤形は、投与法及び／又は処方条件によって異なる。投与法は、経口投与と非経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
【００５０】
経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
【００５１】
非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されることから、筋原性疾患治療剤もそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、全身又は組織内投与に適した剤形としては、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、坐剤等を挙げることができる。
【００５２】
本形態の筋原性疾患治療剤は、筋原性疾患の治療又は予防用として適用される。したがって、主な適用対象部位は骨格筋又は心筋である。したがって、投与方法は、限定はされないが、循環系を介した全身投与か、骨格筋又は心筋に直接投与する局所投与が好ましい。具体的には、例えば、血管内注射（静脈内注射、動脈内注射を含む）若しくはリンパ管内注射等の循環器内投与又は筋肉内注射による局所投与が挙げられる。注射剤には、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよく、単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。
【００５３】
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、それぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【００５４】
本発明の筋原性疾患治療剤の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
【００５５】
２−３．対象疾患
本発明の筋原性疾患治療剤の治療又は予防の対象となる疾患は、筋原性疾患である。筋原性疾患は、前述の通り筋萎縮と筋力低下を伴う疾患である。具体的には、例えば、筋ジストロフィー（デュシャン型、ベッカー型、エメリ・ドレフュス型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、先天性の各種筋ジストロフィーを含む）、ミオパチー（先天性、遠位型、甲状腺機能低下性、ステロイドミオパチー等を含む）、炎症性筋疾患（多発性節炎、皮膚節炎を含む）、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病、周期性四肢麻痺等が含まれる。本発明において、好ましい筋原性疾患は、筋ジストロフィーである。
【００５６】
本明細書において「治療」とは、罹患した疾患及び／又はそれに伴う症状を緩和又は除去することをいう。また本明細書において「予防」とは、疾患の罹患を未然に防ぐことをいう。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１：筋原性疾患検出用マーカーmiRNAにおけるエクソソーム内包の有無＞
（目的）
筋原性疾患と密接に関係し、筋原性疾患検出用マーカーとなり得る3種のmiRNA（miR-1、miR-133a及びmiR-206）が筋細胞から放出されるエクソソーム中に包含されることを検証した。
【００５８】
（方法）
筋芽細胞であるC2C12細胞を増殖培地（DMEM/10% FBS）に播種し、5％ CO2下、37℃で細胞密度が90%になるまで培養した。次に、培地を分化培地（DMEM/2% HorseSerum）に変更し、引き続き5％ CO2下、37℃で6日間培養した。分化培地は毎日に交換した。分化培地での培養期間中、培地交換時の培養上清からエクソソームを回収した。具体的には、上清容量に対して0.5容量のTotal Exosome Isolation Reagenet（Life technologies）を加えて、ボルテックスした後、4℃で一晩インキュベーションした。翌日、10,000×gで1時間、4℃にて遠心分離し、ペレットを回収した。ペレットをPBS溶液で再溶解し、これをエクソソーム分画とした。続いて、エクソソーム分画からAmbion mirVana microRNA isolation kitを用いて総RNAを抽出した。最後に50μLの溶出液を用いてカラムからRNAを溶出し、これを全RNA溶液とした。RNAの抽出手順については、添付のプロトコルに従った。続いて、リアルタイムPCRにより各miRNAを定量化した。前記全RNA溶液のうち5μLを用いて、当該溶出液中に含まれる各成熟miRNA（mi-R1：配列番号１、mi-R16：配列番号４、mi-R133a：配列番号２、mi-R206：配列番号３）をリアルタイムPCRで定量した。増幅反応には、Applied Biosystems TaqMan microRNA assay kit（Life Technologies社）を使用した。なお、miR-16は、各サンプル中における全RNA量を補正するための内在性コントロールとして用いた。
【００５９】
リアルタイムPCRの方法については、キット添付のプロトコルに従った。具体的には、以下の通りである。
【００６０】
まず、逆転写反応における各種miRNAに特異的なプライマーには、キットに付属の各成熟miRNAを用いた。なお、ヒトとマウスにおける前記成熟miRNA等の塩基配列は、完全同一である。反応試薬には、100mM dNTPs；0.15μL／RTase(Superscript)；1.0μL／10×RT buffer；1.5μL／RNasin；0.188μL／5×前記プライマー；3.0μL／全RNA(2μg/μL)；5.0μLからなる総量15.0μLの反応溶液を用いた。逆転写反応の反応条件は、アニーリング反応を16℃にて30分間、逆転写反応を42℃で30分間、そしてRTaseの失活を85℃で5分間行ない、得られたRT産物を、その後、4℃に置いた。
【００６１】
次に、核酸増幅反応では、TaqMan universal PCR master mix；10.0μl（Life Technologies）／蒸留水 7.5μl／20×プライマーセット；1.0μL／前記RT産物；1.5μLからなる反応組成液を、94℃で2分を1サイクル、及び68℃で15秒と94℃で1分を40サイクルの条件で反応させ、その後、増幅産物を4℃に置いた。増幅産物の検出及び定量には、Applied Biosystems 7900HTリアルタイムPCRシステム（Life Technologies）を使用した。
【００６２】
（結果）
結果を図１に示す。Aは、C2C12細胞の分化過程において放出されたエクソソーム中のmiR-1量の経時的変化を、Bは、C2C12細胞の分化過程において放出されたエクソソーム中のmiR-133a量の経時的変化を、そしてCは、C2C12細胞の分化過程において放出されたエクソソーム中のmiR-206量の経時的変化を示す。これらの図が示すように、筋原性疾患と密接に関係する3種のmiRNAは、いずれも筋細胞から放出されるエクソソーム中に包含されており、その量は分化が進むにつれて著しく増加することが明らかとなった。
【００６３】
＜実施例２：エクソソーム放出におけるセラミドの関与＞
（目的）
C2C12細胞からのエクソソーム放出にセラミドが関与していることを検証した。
【００６４】
（方法）
C2C12細胞を増殖培地（DMEM/10% FBS）に播種し、5％ CO2下、37℃で細胞密度が90%になるまで培養した。次に、培地を無血清培地に移した後、DMSOに溶解したGW4869を5μM、10μM、20μM、及び30μMで添加し、5％ CO2下、37℃で48時間培養した。陰性対照としてDMSOのみを添加したサンプルも調製した。同様に、DMFに溶解したDMAPPを62.5μM、125μM、及び250μMで添加し、5％ CO2下、37℃で2時間培養した。陰性対照としてDMFのみを添加したサンプルも調製した。GW4869は、nSMase阻害剤であり、セラミド合成を阻害する。一方、DMAPPは、セラミド合成誘導剤である。培養後、各サンプルの培養上清を回収し、実施例１と同じ方法でエクソソームを分離した。エクソソームは、アセチルコリンエステラーゼ活性の測定によって定量した。具体的にはエクソソーム分画を800μLのPBSに懸濁した後、1.25mM のアセチルコリン及び0.1mM 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)を加えて、最終容量を1mLとした。その後、37℃で20分間インキュベートして、415nmの吸光度の変動をマイクロプレートリーダーで分析し、定量化した。
【００６５】
また、GW4869を0.5μM、1μM、及び5μMで添加し、5％ CO2下、37℃で24時間培養した後、培養上清からTotal Exosome Isolation Reagenetを用いて分離したエクソソーム、及びエクソソーム分離後のエクソソームの欠失上清から、実施例１と同様の方法でmiR-1、miR-133a及びmiR-206を定量した。
【００６６】
（結果）
結果を図２〜４に示す。図２はGW4869を添加したときの、また図３はDMAPPを添加したときの、C2C12細胞からのエクソソーム放出量を示す。図４は、GW4869を添加したときにC2C12細胞から放出されたエクソソーム中の各miRNA量とエクソソームを除いた上清中の各miRNA量を示す。
【００６７】
C2C12細胞からのエクソソーム放出量は、セラミド合成を阻害するGW4869の添加に対して量依存的に減少したのに対して、セラミド合成を誘導するDMAPPの添加に対しては、125μMまでは逆に量依存的に増加した。この結果からエクソソームの放出にはセラミドが関与していることが立証された。
【００６８】
また、miR-1、miR-133a及びmiR-206の各miRNA量は、GW4869の添加によって、エクソソーム中及び培養上清中のいずれも統計学的に有意に減少した。セラミド合成を阻害することで、細胞外に放出される前記miRNA量は、エクソソームへの内包に関わらず減少することが明らかとなった。
【００６９】
＜実施例３：筋ジストロフィーモデルマウスを用いた筋細胞損傷抑制剤の効果＞
（目的）
筋ジストロフィーモデルマウスに本発明の筋細胞損傷抑制剤を投与したときに、筋細胞損傷が抑制されることを検証した。
【００７０】
（方法）
筋ジストロフィーのモデルマウスには、デュシャン型筋ジストロフィーの疾患モデルであるmdxマウス（Mdx/B10）（雄個体；8週齢）を使用した。デュシャン型筋ジストロフィーは、X染色体連鎖の劣性遺伝によるジストロフィン遺伝子の欠損により発症する。
【００７１】
mdxマウスの腹腔内に100μLのGW4869（100μM/DMSO）を29G注射針と0.5mLシリンジを用いて投与した。投与後、0日、3日、5日、14日及び21日にマウスの大動脈より全血を100μL以上採血した。採取した全血を室温で30分以上放置した後、遠心機（KUBOTA 2410）を用いて3000rpmで10分間遠心し、上清を得、これを血清とした。
【００７２】
血清中におけるmiR-1、miR-133a、miR-206の量は、50μLの血清を分注後、実施例と同様の方法で、定量的PCRにより測定した。また、血清中のは、同様に50μLの血清を分注後、Fuji Dri-chem systemによって測定した。
【００７３】
（結果）
図５及び６に結果を示す。図５は、GW4869投与後のmdxマウス血清における各miRNA量の変化を示す。また、図６は、GW4869投与後のmdxマウス血清におけるクレアチンキナーゼ活性の変化を示す。図５で示すように、mdxマウスにおいて、血清中のmiR-1、miR-133a、miR-206の量は、本発明の筋細胞損傷抑制剤の投与によって経時的に有意に減少した。また、図６から、クレアチンキナーゼ活性も本発明の筋細胞損傷抑制剤の投与によって経時的に有意に減少した。これは、筋細胞損傷抑制剤の投与により筋細胞の損傷が改善又は治癒されたことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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