(57)【要約】【課題】移植片対宿主病予防治療剤に代表される免疫抑制剤の提供。【解決手段】カベオリン１阻害剤を有効成分とする免疫抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カベオリン１阻害剤を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項２】
急性又は慢性移植片対宿主病、移植後拒絶反応、自己免疫疾患、特発性肺高血圧症、特発性肺線維症、閉塞性細気管支炎、慢性糸球体腎炎及び特発性ネフローゼ症候群から選ばれる疾患の予防治療剤である請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、混合性結合組織病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、習慣性流産、原因病及び自己免疫性視神経炎から選ばれる疾患である請求項２記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
カベオリン１阻害剤が、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域配列のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種又は２種以上である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな作用機序に基づく免疫抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植は血液悪性疾患や先天性免疫疾患等の血液免疫疾患の最終治療であるが、移植後の免疫反応による移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の合併による治療成績の低下が大きな問題となっている。特に慢性ＧＶＨＤに伴う慢性呼吸器障害や皮膚硬化・関節障害による身体活動の重篤な制限によって、原病は治癒したにも関わらず、日常生活の継続が困難となっている患者が多い。
【０００３】
慢性ＧＶＨＤの標準治療はステロイド剤であるが、発症後２年以上の長期間の免疫抑制療法が必要で、長期投与に伴う副作用も多く、過度の免疫抑制によって日和見感染症や原疾患の再発を誘導し移植治療の限界となっている。
【０００４】
一方、ＣＤ２６は、Ｔ細胞活性化のマーカーであるだけでなく、共刺激分子としてＴ細胞シグナル伝達過程にも関連する（非特許文献１〜４）。実際に、多発性硬化症（ＭＳ）、グレーブス病（ＧＤ）および関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患を有する患者は、炎症組織および末梢血の両方においてＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞の数が増加しており（非特許文献５〜８）、これらの自己免疫疾患では疾患の重症度と相関してＣＤ２６発現が増強することが認められている（非特許文献９）。加えて、本発明者らは以前に、インビトロで内皮細胞単層を通って移動するＴ細胞が高レベルのＣＤ２６を発現することを明らかにした（非特許文献１０）。これらの所見は、ＣＤ２６+  Ｔ細胞がこのような疾患における炎症過程およびその後の組織損傷に重要な役割を果たすことを意味し、ＣＤ２６+  Ｔ細胞がこれらの条件下でエフェクターＴ細胞であり得ることを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２３７２３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Immunol. 1984; 133(3): 1250-6
【非特許文献２】J. Immunol. 1989; 143(11): 3430-6
【非特許文献３】J. Immunol. 1990; 144(11): 4092-100
【非特許文献４】Trends Immunol. 2008; 29(6): 295-301
【非特許文献５】N. Engl. J. Med. 1985; 312(22): 1405-11
【非特許文献６】J. Immunol. 1989; 142(12): 4233-40
【非特許文献７】Clin. Immunol. Immunopathol. 1996; 80(1): 31-7
【非特許文献８】J. Rheumatol. 1996; 23(12): 2022-6
【非特許文献９】Adv. Clin. Chem. 2011; 53: 51-84
【非特許文献１０】J. Immunol. 1992; 148(5): 1367-74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、移植片対宿主病、その合併症、各種自己免疫疾患の有効な治療手段は未だ見出されておらず、新たな作用機序に基づく免疫抑制剤の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、新たな免疫抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、Ｔ細胞活性のマーカーであるＣＤ２６分子に着目して研究してきた。ＧＶＨＤの発症にかかわるドナーＴ細胞の活性化にはレシピエントの抗原が提示されると同時に共刺激分子のシグナルが必要であるが、ＣＤ２６分子はＴ細胞、特に記憶抗原に最も強く反応するＴ細胞共刺激分子であり、本発明者はＣＤ２６の共刺激リガンドがカベオリン１（Ｃａｖ−１）であることを発見した。ヒトＣａｖ−１のＮ末端側領域をヒト免疫グロブリンＧの定常領域に融合した組換えタンパク質（Ｃａｖ−Ｉｇ）を作成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で、記憶抗原、或いは、同種免疫反応を抑制することを見出した。さらに、ヒト免疫化ＧＶＨＤ発症マウスに組換えＣａｖ−Ｉｇを投与したところ、ドナー細胞の生着を妨げることなく免疫寛容を誘導し、ＧＶＨＤを予防した。また、ＧＶＨＤ発症後の投与によっても、ＧＶＨＤの進展を抑制した。さらに、移植片対白血病効果を妨げることなく、免疫抑制効果を発揮することを、腫瘍移植マウスモデルにおいて実証するに至り、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
【００１０】
〔１〕カベオリン１阻害剤を有効成分とする免疫抑制剤。
〔２〕急性又は慢性移植片対宿主病、移植後拒絶反応、自己免疫疾患、特発性肺高血圧症、特発性肺線維症、閉塞性細気管支炎、慢性糸球体腎炎及び特発性ネフローゼ症候群から選ばれる疾患の予防治療剤である〔１〕記載の免疫抑制剤。
〔３〕自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、混合性結合組織病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、習慣性流産、原因病及び自己免疫性視神経炎から選ばれる疾患である〔２〕記載の免疫抑制剤。
〔４〕カベオリン１阻害剤が、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域配列のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種又は２種以上である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の免疫抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のカベオリン１阻害剤を用いれば、移植片対宿主病や種々の自己免疫疾患等を予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトカベオリン１の部分ペプチドと免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質の作製ストラテジーを示す。
【図２】ｐＥＢ６−ＣＡＧ−ＭＣＳベクターの概略図を示す。
【図３】亜致死的に照射し、ヒト臍帯血単核細胞を移植したＮＯＧマウス（ｈｕＣＢ−ＮＯＧ）では慢性ＧＶＨＤが発症することを示す図である。  ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で照射し、翌日、ヒト臍帯血細胞（ｈｕＣＢ）から精製した１×１０5Ｔ細胞除去ＣＤ３４+細胞（ＣＤ３４＋移植）またはｈｕＣＢから単離した１×１０7単核細胞（全ＣＢ移植）を移植した。  （Ａ）全体的生存率および（Ｂ）臨床ＧＶＨＤスコア（平均±ＳＥＭ）。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果である。  （Ｃ）ＣＤ３４+移植の肺、皮膚および肝臓のＨ＆Ｅ染色（パネルａ〜ｃ）（移植後８週目）、ならびに全ＣＢ移植の肺、皮膚および肝臓の連続切片のＨ＆Ｅ染色または抗ヒトＣＤ３+の免疫組織化学（パネルｄ〜ｆまたはｇ〜ｉ）（移植後８週目）。パネルｆの矢じりは、肝臓における脈管周囲浸潤を指し示す。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｄ）ＣＤ３４+移植または全ＣＢ移植群の肺、皮膚および肝臓における病理学的損傷を、半定量的採点システムを用いて検査した。各々の点は個々の値を示し、水平の棒線は平均値を示す。＊、＊＊または＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。  （Ｅ）コラーゲン沈着を、アザン−マロリー染色アッセイを用いて（Ｃ）のパネルａまたはｄの肺組織の連続切片において測定した。コラーゲン沈着を指し示す暗青色の部分は、ＣＤ３４＋移植マウス（パネルａ）と比較して、全ＣＢ移植マウス（パネルｂ）において明瞭に認められた。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｆ）コラーゲン沈着を組織の総面積に対する暗青色面積の比率として定量化した。定量化はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４の解析ツールを用いて実施した。視野あたりの比率の平均数（±ＳＥＭ）を各々１０の代表的な視野から決定した。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果である。＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図４】レシピエントマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５+細胞の生着を示す図である。  ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で照射し、翌日、ヒト臍帯血細胞（ｈｕＣＢ）から精製した１×１０5ＣＤ３４+細胞（ＣＤ３４+移植）またはｈｕＣＢから単離した１×１０7単核細胞（全ＣＢ移植）を移植した。レシピエントの末梢血を表示されている時点で採取し、フローサイトメトリを用いてヒトＣＤ４５+細胞の集団を分析した。データは、全末梢血白血球（ＰＢＬ）中のヒトＣＤ４５+細胞の平均±ＳＥＭとして示している（各々、ＣＤ３４+移植群ではｎ＝１０、ならびに全ＣＢ移植群では０〜６週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）。
【図５】ｃＧＶＨＤ肺におけるＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞の顕著な浸潤を示す図である。  ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスを移植後４、８および１２週目に犠死させ、肺を切除して、次いで単細胞懸濁液を単離した。  （Ａ）ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺あたりのヒトＣＤ４５+、ＣＤ４+またはＣＤ８+細胞の絶対細胞数（平均±ＳＥＭ）をフローサイトメトリによって定量化した。ＣＤ４+  Ｔ細胞は、主としてｃＧＶＨＤを有するマウスの肺に浸潤した。データは３つの独立した実験（４週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）からの累積結果である。＊は、ＣＤ８+細胞に対してＰ＜０．０００１を示す。  （Ｂ）ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺から単離したヒトＣＤ４+細胞におけるヒトサイトカインまたはＣＤ２６／ＤＰＰ４のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。各々の発現をヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）に基準化した。３匹の異なるドナーの新鮮単離したｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を使用して０週目のデータを得た。データは３つの独立した実験（４週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）からの累積結果である。＊または＊＊は、各々０週目に対してＰ＜０．０００１を示す。  （Ｃ）ＣＤ３４+移植または全ＣＢ移植マウスの血清を移植後の表示されている週に採集し、ヒトＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２６および可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４の血清レベルを定量化した。データは３つの独立した実験（各々、ＣＤ３４+移植群ではｎ＝１０、ならびに全ＣＢ移植群では０〜６週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）からの累積結果である。＊または＊＊は、対応するＣＤ３４＋移植群に対してＰ＜０．０００１を示す。  （Ｄ）ＣＤ３４+移植または全ＣＢ移植マウスの肺におけるヒトＩＦＮ−γ+ＣＤ２６+ＣＤ４（パネルａ）、ＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４（パネルｂ）、またはＩＬ−１７Ａ+ＣＤ２６＋ＣＤ４（パネルｃ）細胞の絶対細胞数をフローサイトメトリによって定量化した。データは３つの独立した実験（各々、ＣＤ３４+移植群ではｎ＝１０、ならびに全ＣＢ移植群では４週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）からの累積結果である。＊は、対応するＣＤ３４+移植群に対してＰ＜０．０００１を示し、ＮＳは、有意でないことを示す。パネルａおよびｂについての代表的なフローサイトメトリプロットを図５に示す。  （Ｅ）ＣＤ３４+移植または全ＣＢ移植マウス（移植後８週目）からの肺の連続切片の抗ヒトＣＤ２６、ＩＬ−２６またはＩＬ−１７Ａの免疫組織化学。ＣＤ３４+移植群ではヒトＣＤ２６、ＩＬ−２６およびＩＬ−１７Ａ陽性細胞は検出されず（パネルａ〜ｃ）、一方全ＣＢ移植マウスの肺はヒトＣＤ２６またはＩＬ−２６で明らかに浸潤されていたが（パネルｄまたはｅ）、ＩＬ−１７Ａ陽性細胞では浸潤されていなかった（パネルｆ）。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図６】ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのｃＧＶＨＤ肺におけるヒトＣＤ４  Ｔ細胞の顕著な浸潤を示す図である。  ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウス（全ＣＢ移植）（移植後８週目）の肺組織の連続切片の抗ヒトＣＤ４（パネルａ）またはＣＤ８（パネルｂ）の免疫組織化学。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×または４００×（各々のパネル中の挿入図）である。
【図７】ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺におけるＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベル上昇を示す図である。  ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウス（全ＣＢ移植）を移植後８週目および１２週目に犠死させ、肺を切除して、次いで単細胞懸濁液を単離した。その後細胞を再刺激し、次にフローサイトメトリ分析に供した。ＣＢの単核細胞（ＭＮＣ）を移植前対照として分析した。  （Ａ）全ＣＢ移植マウスの肺におけるヒトＩＦＮ−γ+ＣＤ２６+ＣＤ４または（Ｂ）ＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４細胞を、フローサイトメトリを用いて分析した。３つの独立した実験（各々、移植前ＣＢ  ＭＮＣではｎ＝３、ＣＤ３４+移植群ではｎ＝１０、ならびに全ＣＢ移植群では８週目はｎ＝８および１２週目はｎ＝３）からの代表的な点のプロットを示す。数字は象限ごとの相対的パーセンテージを示す。
【図８】ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのｃＧＶＨＤ皮膚におけるヒトＣＤ２６およびＩＬ−２６細胞の浸潤を示す図である。  全ＣＢ移植マウス（移植後８週目）の皮膚組織の連続切片のＨ＆Ｅ染色（パネルａ）、抗ヒトＣＤ２６（パベルｂ）、ＩＬ−２６（パネルｃ）またはＩＬ−１７Ａ（パネルｄ）の免疫組織化学。ヒトＣＤ２６およびＩＬ−２６陽性細胞による浸潤を認めたが、ＩＬ−１７Ａ陽性細胞は検出されなかった。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×または４００×（パネルｂおよびｃ中の挿入図）である。
【図９】ＩＬ−２６トランスジェニック（Ｔｇ）マウスの骨髄（ＢＭ）細胞および脾細胞を受容したＮＯＧマウスにおいてＩＬ−２６は線維芽細胞を刺激し、ｃＧＶＨＤ肺におけるコラーゲン沈着が誘導される。  （Ａ）パネルａ、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）およびマウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−１０ＲＢの発現を、ヒトとマウスの両方の抗原を認識する抗ＩＬ−２０ＲＡまたは抗ＩＬ−１０ＲＢポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用して、ウェスタンブロット法によって測定した。パネルｂ、ＮＨＬＦまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞をＩＬ−２６（ＰＢＳ中１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、各々の時点で採取した。各溶解物を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＹ−ＳＴＡＴ３）を用いて免疫ブロットして、次いで抗ＳＴＡＴ３  ｐＡｂ（全ＳＴＡＴ３）でストリッピングし、再プローブした。ＮＨＬＦおよびＮＩＨ３Ｔ３におけるＳＴＡＴ３のリン酸化は、外因性ＩＬ−２６の存在によって誘導された。類似の結果を有する３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。  （Ｂ）中和抗ＩＬ−２０ＲＡ  ｐＡｂまたはウサギＩｇ（対照ｐＡｂ）の存在下または不在下に外因性ＩＬ−２６で刺激したＮＨＬＦ（パネルａ）またはＮＩＨ３Ｔ３（パネルｂ）細胞のコラーゲン産生。分泌された可溶性コラーゲンの量は、外因性ＩＬ−２６のレベル上昇と共に用量依存的に増大し（＊対応する対照溶媒に対してＰ＜０．０００１）、コラーゲンの産生は中和抗ＩＬ−２０ＲＡ  ｐＡｂの存在によって阻害された（＊＊対応する対照ｐＡｂに対してＰ＜０．０００１）。データは、三重に実施した３つの独立した実験から生じた、平均±ＳＥＭとして示している。  （Ｃ）親Ｂ６（ＷＴ）（パネルａ〜ｃ）、１９０−ＩＦＮＧ  ＢＡＣ  Ｔｇ（パネルｄ〜ｆ）またはΔＣＮＳ−７７  Ｔｇ（パネルｇ〜ｉ）マウスから単離したＢＭおよび脾細胞の移植後４週目のＮＯＧマウスからの肺の連続切片のＨ＆Ｅ、アザン−マロリー染色および抗ＩＬ−２６の免疫組織化学。１９０−ＩＦＮＧ  ＢＡＣ  Ｔｇマウスのレシピエントの肺は、コラーゲン沈着およびＩＬ−２６+細胞浸潤の領域を示したが、ＷＴまたはΔＣＮＳ−７７  Ｔｇマウスのレシピエントは、コラーゲン沈着またはＩＬ−２６+細胞を伴わずにＢＯおよび中隔浸潤を示した。３つの独立した実験（各々、ｎ＝６）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｄ）（Ｃ）のパネルｂ、ｅまたはｈに示すように、コラーゲン沈着を組織の総面積に対する暗青色面積の比率として定量化した。定量化はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４の解析ツールを用いて実施した。視野あたりの比率の平均数（±ＳＥＭ）を各々１０の代表的な視野から決定した。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝６）からの累積結果である。＊は、ＷＴまたはΔＣＮＳ−７７  Ｔｇマウスのレシピエントにおけるものに対してＰ＜０．０００１を示す。
【図１０】ＣＤ２６共刺激はヒト臍帯血（ｈｕＣＢ）ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−２６産生を増強し、ＣＤ２６リガンドであるカベオリン−１の遮断はＩＬ−２６の産生を低減することを示す図である。  （Ａ）ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を、固定化した抗ＣＤ３（０．０５μｇ／ｍＬ）プラス抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ２６（１０μｇ／ｍＬ）ｍＡｂで刺激した。刺激の７日後、ヒトＩＬ２、ＩＦＮＧ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２６およびＤＰＰ４のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。データは、三重に実施した３つの独立した実験から生じた、平均±ＳＥＭとして示している。＊はＰ＜０．０５；＊＊または＊＊＊はＰ＜０．０００１；ＮＳは有意ではないことを示す。  （Ｂ）ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を、表示濃度のプレートに結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２６  ｍＡｂ、または固定化したＣａｖ−Ｉｇで刺激した。刺激の７日後または１４日後に上清を採取し、ヒトＩＬ−２６のレベルを定量化した。データは、三重に実施した３つの独立した実験から生じた、平均±ＳＥＭとして示している。＊または＊＊は、０日目の対応する試料に対してＰ＜０．０００１を示し、または＊＊＊はＰ＜０．０５を示す。  （Ｃ）ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を表示濃度のブロッキングＣａｖ−Ｉｇ（実線）または対照Ｉｇ（点線）で処理した。ブロッキングＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇと共に１時間インキュベートした後、細胞を固定化抗ＣＤ３（０．０５μｇ／ｍＬ）プラスＣａｖ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８（２０μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ２６（２０μｇ／ｍＬ）ｍＡｂで刺激した。刺激の７日後、上清を採取し、ヒトＩＬ−２６のレベルを定量化した。データは、三重に実施した３つの独立した実験から生じた、平均±ＳＥＭとして示している。＊は、対応する対照Ｉｇに対してＰ＜０．０００１を示す。
【図１１】カベオリン−１のＮ末端アミノ酸配列のアラインメントを示す。  ヒトおよびマウスカベオリン−１のＮ末端アミノ酸（ＡＡ）配列は、ＣＤ２６結合に必要な足場ドメインが種間で保存されていることを示唆する。マウスカベオリン−１中の点は、対応するヒトカベオリン−１と同じアミノ酸残基（赤色の箱）を指し示す。＊または＊＊は、それぞれ本文中の参考文献を指す。
【図１２】ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのｃＧＶＨＤ肺におけるカベオリン−１の発現を示す。  全ＣＢ移植マウス（移植後８週目）の肺の抗カベオリン−１の免疫組織化学。カベオリン−１は、上皮細胞表面（パネルＡ中の黄色の矢印）および細気管支閉塞病変（パネルＡ中のＢＯ）における炎症脈管（パネルＣ）の周囲のマクロファージ様大型細胞（パネルＢ中の矢じり）で検出された。元の倍率：１００×（Ａ）または４００×（Ｂ、Ｃ）。
【図１３】Ｃａｖ−Ｉｇの投与はＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４細胞のレベルを低下させることによってｃＧＶＨＤを予防することを示す図である。  亜致死的に照射したＮＯＧマウスに、ヒト臍帯血から単離した１×１０7単核細胞を移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（各々１００μｇ／投与）を、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回腹腔内投与した。  （Ａ）全体的生存率および（Ｂ）臨床ＧＶＨＤスコア（平均±ＳＥＭ）。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果である。  （Ｃ）対照Ｉｇ群（移植後６週目）についての肺、皮膚および肝臓のＨ＆Ｅ染色または抗ヒトＣＤ３+の免疫組織化学（パネルａ〜ｃまたはｄ〜ｆ）、ならびにＣａｖ−Ｉｇ群（移植後６週目）についての肺、皮膚および肝臓のＨ＆Ｅ染色（パネルｇ〜ｉ）。パネルｃの矢じりは、肝臓における脈管周囲浸潤を指し示す。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｄ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを投与したレシピエントの肺、皮膚および肝臓における病理学的損傷を、半定量的採点システムを用いて移植後６週目に検査した。各々の点は個々の値を示し、水平の棒線は平均値を示す。＊、＊＊または＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。  （Ｅ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ群のレシピエントの血清を移植後の表示されている週に採集し、ヒトＩＬ−２６および可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４の血清レベルを定量化した。データは３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では０〜６週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝９および１２週目はｎ＝２）からの累積結果である。＊は、対応する対照Ｉｇ群に対してＰ＜０．０００１を示す。  （Ｆ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ群のレシピエントの肺におけるヒトＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４細胞の絶対細胞数。データは３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では０〜６週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝９および１２週目はｎ＝２）からの累積結果である。＊は、対応するＣＤ３４+移植群に対してＰ＜０．０００１を示す。＊は、対応する対照Ｉｇ群に対してＰ＜０．０００１を示す。  （Ｇ）対照Ｉｇ群（パネルａ、ｂ）またはＣａｖ−Ｉｇ群（パネルｃ、ｄ）（移植後８週目）のレシピエントの肺の抗ヒトＣＤ２６またはＩＬ−２６の免疫組織化学。３つの独立した実験（各々、ｎ＝６）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｈ）コラーゲン沈着を、アザン−マロリー染色アッセイを用いてＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ群（移植後８週目）のレシピエントの肺組織で測定した。３つの独立した実験（各々、ｎ＝６）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｉ）コラーゲン沈着を組織の総面積に対する暗青色面積の比率として定量化した。定量化はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４の解析ツールを用いて実施した。視野あたりの比率の平均数（±ＳＥＭ）を各々１０の代表的な視野から決定した。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝６）からの累積結果である。＊はＰ＜０．０００１を示す���
【図１４】Ｃａｖ−Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのレシピエントではＧＶＨＤが抑制されることを示す図である。  亜致死的に照射したＮＯＧマウスに、ヒト臍帯血から単離した１×１０7単核細胞を移植し、図５で述べたのと同じ方法によってＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを投与した。移植後４週目に採取したＢＭ細胞および脾細胞を、亜致死的照射の１日後に別のＮＯＧマウス（Ｎｅｗ  ＮＯＧ）に移入した。  （Ａ）全体的生存率および（Ｂ）臨床ＧＶＨＤスコア（平均±ＳＥＭ）。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果である。  （Ｃ）対照Ｉｇ群（移植後２週目）の肺（パネルａもしくはｃ）または肝臓（パネルｂもしくはｄ）のＨ＆Ｅ染色または抗ヒトＣＤ３+の免疫組織化学、ならびにＣａｖ−Ｉｇ群（移植後１２週目）の肺（パネルｅ）または肝臓（パネルｆ）のＨ＆Ｅ染色。パネルｂの矢じりは、肝臓における脈管周囲浸潤を指し示す。３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの代表的な組織学を示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｄ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ群のレシピエントの肺におけるヒトＩＦＮ−γ+ＣＤ２６+ＣＤ４またはＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４細胞の絶対細胞数。データは３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では２週目はｎ＝１０、４週目はｎ＝４および８週目と１２週目はｎ＝０（†として示す）からの累積結果である。＊は、対応する対照Ｉｇ群に対してＰ＜０．０００１を示す。
【図１５】レシピエントマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５+細胞の生着を示す図である。  亜致死的に照射したＮＯＧマウスに、ヒト臍帯血から単離した１×１０7単核細胞を移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（各々１００μｇ／投与）を、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回腹腔内投与した。レシピエントの末梢血を表示されている時点で採取し、ヒトＣＤ４５+細胞の集団をフローサイトメトリによって分析した。データは、全末梢血白血球（ＰＢＬ）中のヒトＣＤ４５+細胞の平均±ＳＥＭとして示している（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では０〜６週目はｎ＝１０、８週目はｎ＝９および１２週目はｎ＝２）。
【図１６】初期ＧＶＨＤ発症の間のＣａｖ−Ｉｇの投与は致死的ＧＶＨＤを防止することを示す図である。  亜致死的に照射したＮＯＧマウスに、ヒト臍帯血から単離した１×１０７単核細胞を移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（各々１００μｇ／投与）を、移植後＋２９日目に開始して＋５６日目まで、週３回腹腔内投与した。  （Ａ）全体的生存率および（Ｂ）臨床ＧＶＨＤスコア（平均±ＳＥＭ）。データは３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果である。  （Ｃ）移植後５週目または１０週目の対照Ｉｇ群（パネルａ〜ｆ）およびＣａｖ−Ｉｇ群（パネルｇ〜ｌ）の肺、皮膚および肝臓のＨ＆Ｅ染色。３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では５週目はｎ＝１０および１０週目はｎ＝５）からの代表的な組織学を示す。パネルｅ、ｆおよびｋの矢じりは肝臓における脈管周囲浸潤を指し示し、パネルｇの矢じりは肺におけるわずかの気管支周囲のカフィングを指し示す。元の倍率は１００×である。スケールバーは１００μｍを示す。  （Ｄ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを投与したレシピエントの肺、皮膚および肝臓における病理学的損傷を、半定量的採点システムを用いて移植後５週目と１０週目に検査した。対照Ｉｇのレシピエントは、ＧＶＨＤ病変の進行を発現した（＊、肺および皮膚ではＰ＜０．０００１、＊、肝臓ではＰ＜０．０５）。これに対し、Ｃａｖ−Ｉｇのレシピエントは、移植後５週目よりも１０週目に（＊＊、Ｐ＜０．０００１）、および１０週目の対照Ｉｇ群のレシピエントと比較しても（＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、ＧＶＨＤ病変の有意の軽減を示した。各々の点は個々の値を示し、水平の棒線は平均値を示す。データは３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では５週目はｎ＝１０および１０週目はｎ＝５）からの累積結果である。  （Ｅ）Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ群のレシピエントの肺におけるヒトＩＦＮ−γ+またはＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４細胞の絶対細胞数。データは３つの独立した実験（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では５週目はｎ＝１０および１０週目はｎ＝５）からの累積結果である。＊、＊＊または＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図１７】Ｃａｖ−ＩｇはＧＶＬ効果を保存することを示す図である。  （Ａ）ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で照射し、翌日、尾静脈を介して１×１０4Ａ２０−ｌｕｃ細胞を接種して、次にその翌日、ヒト臍帯血から単離した１×１０7単核細胞を移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（各々１００μｇ／投与）を、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回腹腔内投与した。全体的生存率を３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果から描画している。ログランク検定により対照Ｉｇのレシピエントに対してＰ＜０．０００１。  （Ｂ）インビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）をパネルＡに記載されている処置後の表示時点で実施した。代表的なマウスを示す。クロス（†）は、腫瘍単独の群または対照Ｉｇ群におけるすべてのマウスの死亡を示す。皮膚ＧＶＨＤと一致する被毛の乱れが、ＣＢ移植後１０週目に対照Ｉｇ群のレシピエントにおいて示されている（真ん中のパネル）。  （Ｃ）亜致死的に照射したＮＯＧマウスにｈｕＣＢから単離したＭＮＣを移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回腹腔内投与した。移植後＋２８日目に尾静脈を介して１×１０5Ａ２０−ｌｕｃ細胞を接種した。全体的生存率を３つの独立した実験（各々、ｎ＝１０）からの累積結果から描画している。ログランク検定により対照Ｉｇのレシピエントに対してＰ＜０．０００１。  （Ｄ）インビボＢＬＩをパネルＣに記載されている処置後の表示時点で実施した。代表的なマウスを示す。クロス（†）は、腫瘍単独の群または対照Ｉｇ群におけるすべてのマウスの死亡を示す。皮膚ＧＶＨＤと一致するわずかな被毛の乱れが、ＣＢ移植後６週目に対照Ｉｇ群のレシピエントにおいて示されている（真ん中のパネル）。
【図１８】二次レシピエントマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５+細胞の生着を示す図である。  亜致死的に照射したＮＯＧマウスに、ヒト臍帯血から単離した１×１０7単核細胞を移植し、図１５で述べたのと同じ方法によってＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを投与した。骨髄（ＢＭ）細胞および脾細胞を移植後４週目に採取し、亜致死的照射の１日後に１×１０６ＢＭ細胞および１×１０7脾細胞を別のＮＯＧマウス（Ｎｅｗ  ＮＯＧ）に移入した。レシピエントの末梢血を表示されている時点で採取し、ヒトＣＤ４５+細胞の集団をフローサイトメトリによって分析した。データは、全末梢血白血球（ＰＢＬ）中のヒトＣＤ４５+細胞の平均±ＳＥＭとして示している（各々、Ｃａｖ−Ｉｇ群ではｎ＝１０、ならびに対照Ｉｇ群では２週目はｎ＝１０、４週目はｎ＝４および６週目はｎ＝１）。
【図１９】各融合タンパク質のリンパ球増殖抑制効果を示す図である。  グラフはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅの平均値（ｃｐｍ）と標準誤差を示した。・Ｐ＜０．０００１  ｖ．ｓ．  コントロールＦｃｇ１（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の免疫抑制剤の有効成分は、カベオリン１阻害剤である。
【００１４】
カベオリン１は、細胞表面の小さな陥没であるカベオラの最も重要な構造タンパク質であるカベオラのうちの一つである。カベオリン１は、ヒト前立腺癌の兆候マーカーになり得ることが知られているが、免疫抑制作用との関係は知られていない（特許文献１）。
【００１５】
また、カベオリン１のアミノ酸配列は知られており、１７８個のアミノ酸配列からなり（配列番号１）、１−１０１番目がＮ末端領域であり、１０２−１３４番目が疎水性の膜貫入部である。また、８２−１０１番目がスキャホールディングドメインである。
【００１６】
カベオリン１阻害剤としては、カベオリン１がＴ細胞、特に記憶抗原に最も強く反応するＴ細胞活性化に対するＣＤ２６の共刺激リガンドであることから、カベオリン１のＴ細胞の活性化の共刺激分子としての機能を阻害するものであればよく、例えば、（１）カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片（配列番号２）；（２）カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片（配列番号３）；（３）カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片（配列番号４）；（４）ＣＤ２６のカベオリン１結合領域配列のペプチド断片（配列番号５）；及び（５）これらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質が挙げられる。
【００１７】
これらのカベオリン１阻害剤は、アミノ酸配列が知られているため、遺伝子組み換えやペプチド合成等種々の方法により製造可能である。また、前記融合タンパク質は、例えば遺伝子組み換え法により製造することができる。
【００１８】
カベオリン１阻害剤の投与は、後述の実施例に示すように、ヒト免疫化ＧＶＨＤ発症マウスにおけるドナー細胞の生着を妨げることなく免疫寛容を誘導し、ＧＶＨＤを予防する。また、ＧＶＨＤ発症後のカベオリン１阻害剤投与によっても、ＧＶＨＤの進展を抑制する。さらに、腫瘍移植マウスモデルに投与することにより、移植片対宿主病効果を妨げることなく免疫抑制効果を発揮する。
従って、カベオリン１阻害剤はヒトを含む動物における免疫抑制剤として有用である。本発明の免疫抑制剤の具体例としては、急性又は慢性移植片対宿主病、移植後拒絶反応、自己免疫疾患、特発性肺高血圧症、特発性肺線維症、閉塞性細気管支炎、慢性糸球体腎炎及び特発性ネフローゼ症候群から選ばれる疾患の予防治療剤が挙げられる。ここで、自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、混合性結合組織病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、習慣性流産、原因病及び自己免疫性視神経炎が含まれる。
【００１９】
本発明の免疫抑制剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、経口又は非経口用に製剤化することができる。
【００２０】
経口投与用の好適な製剤は、カベオリン１阻害剤を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２１】
非経口投与用には、カベオリン１阻害剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、カベオリン１阻害剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、カベオリン１阻害剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、カベオリン１阻害剤を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、カベオリン１阻害剤をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の医薬は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００２２】
カベオリン１阻害剤の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
【００２４】
１．試験方法
（１）抗体、試薬および細胞
共刺激実験のためのヒトＣＤ３、ＯＫＴ３（ＩｇＧ２ｂ）、ＣＤ２６、１Ｆ７（ＩｇＧ１）およびＣＤ２８、４Ｂ１０（ＩｇＧ１）に対するマウスｍＡｂは我々が開発した（非特許文献２）。ヒト組換えＩＬ−２６はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより購入し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬで保存した。Ｃａｖ−Ｉｇおよびその対照Ｆｃタンパク質は、J. Biol. Chem. 2007; 282(13): 10117-31により、我々が作製した。正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）および培地ＦＧＦ−２はＬＯＮＺＡより購入した。マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３およびフィコール密度勾配法でヒト臍帯血から単離したＭＮＣはＲＩＫＥＮ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｓｕｋｕｂａ、Ｊａｐａｎ）より購入した。ｈｕＣＢ由来のＣＤ３４+細胞は、ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてｈｕＣＢのＭＮＣから精製した。
【００２５】
（２）カベオリン１阻害剤の作製
ｉ）図１に示すストラテジーにより、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ−１−ＮＴ−Ｆｃγ１（ＮＴ−Ｆｃ））、カベオリン１Ｎ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ−１−ＮＴΔＳＣＤ−Ｆｃγ１（ＮＴΔＳＣＤ−Ｆｃ））、及びカベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ−１−ＳＣＤ−Ｆｃγ１（ＳＣＤ−Ｆｃ））を作製した。
すなわち、ヒトカベオリン１のＮ端領域の内１番から１０１番目のアミノ酸残基部分（ＮＴ）、１番から８２番目のアミノ酸残基部分（ＮＴΔＳＣＤ）、８２番目から１０１番目のアミノ酸残基部分（ＳＣＤ）をＰＣＲで作成して、図２の融合タンパク質発現ベクターに組込んだ。
ｐＥＢ６−ＣＡＧ−ｈｕＥＣＤＳＰ−Ｆｃγ１ベクターのＨｉｎｄ  IIIサイトに、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１の１−１０１アミノ酸部分（ＮＴ）、１−８２アミノ酸部分（ＮＴΔＳＣＤ）、８２−１０１アミノ酸部分（ＳＣＤ）をＩｎ−ｆｒａｍｄｅでクローニングし、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１−Ｆｃ融合タンパク発現ベクターを構築した。Ｐ  ＣＡＧ，ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｈｕＥＣＤＳＰ，ｈｕｍａｎ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ｈｕＦｃγ１，Ｆｃ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ−Ｈ鎖のｈｉｎｇｅ＋ＣH２＋ＣH３部分（配列番号２８））。
（３）マウス
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃマウス（ＮＯＧマウス）（Ｈ−２ｄ）はＣｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊａｐａｎ）より購入し、Ｂ６マウス（Ｈ−２ｂ）はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、Ｉｎｃ．（Ｙｏｋｏｈａｍａ、Ｊａｐａｎ）から入手した。ヒトＩＦＮＧおよびＩＬ２６遺伝子を有する１９０ｋｂの細菌人工染色体（ＢＡＣ）導入遺伝子（１９０−ＩＦＮＧ  Ｔｇ）ならびにＩＦＮＧ転写開始部位の上流に位置する保存されたコード配列（ＣＮＳ）を欠失しているＢＡＣ  Ｔｇ（ΔＣＮＳ−７７  Ｔｇ）を担持するＢ６マウスは、Ｔｈｏｍａｓ  Ａｕｎｅの研究室で開発された（J. Immunol. 2010; 185(3): 1492-501）。すべてのマウスを特定病原体除去施設においてマイクロアイソレータケージ内に収容した。マウスを８〜１２週目に使用した。動物プロトコルは施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【００２６】
（４）移植およびＧＶＨＤの評価
−１日目に、ＮＯＧマウスに２００ｃＧｙの照射を実施した。０日目に、ｈｕＣＢから精製したＭＮＣ（１×１０7）または１×１０5ＣＤ３４+細胞をマウスに腹腔内注射した。マウスを生存に関して毎日評価し、体重を週に３回測定した。ヒトリンパ球関連末梢Ｔ細胞増殖を記録するため、マウスから採血し（５０〜１００μＬ）、赤血球を溶解して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サブセットをフローサイトメトリによって計測した。ｃＧＶＨＤ予防実験では、マウスに＋１日目から＋２８日目まで週３回（合計１２回の投与）、各投与あたり１００μｇのヒトＣａｖ−Ｉｇまたは対照ヒトＦｃを腹腔内投与した。ｃＧＶＤＨ治療実験では、ｈｕＣＢ移植後２８日目に疾患の最初の臨床徴候が発現した時点で、マウスに、生着の確認後＋２９日目から＋５６日目まで週３回（合計１２回の投与）、各投与あたり１００μｇのヒトＣａｖ−Ｉｇまたは対照ヒトＦｃを腹腔内投与した。ｈｕＣＢの生着は、フローサイトメトリを用いてマウス末梢血中のヒトＣＤ４５+白血球の定量化によって確認した。臨床ＧＶＨＤスコアを、Blood. 1996; 88(8): 3230-9により少なくとも週１回評価した。
【００２７】
Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇのレシピエントを使用する連続移植実験のため、＋１日目から＋２８日目までＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇを投与したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのレシピエントから移植後４週目にＢＭ細胞および脾細胞を採取した。ＢＭをダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でドナーの大腿骨および脛骨から洗い流し、滅菌メッシュ線維に通して単細胞懸濁液を得た。Ｓｐｌｅｅｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて脾細胞をドナー脾臓から単離し、ヒトＣＤ４５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてヒトＣＤ４５+細胞を精製した。次に、亜致死的照射（２００ｃＧｙ）の１日後に１×１０６ＢＭ細胞および１×１０7脾細胞を別のＮＯＧマウス（Ｎｅｗ  ＮＯＧ）に移入した。
【００２８】
Ｔｇマウスを使用した同種ＢＭ移植実験のため、亜致死的に照射した（２００ｃＧｙ）ＮＯＧマウスに、１９０−ＩＦＮＧ  ＢＡＣ、ΔＣＮＳ−７７  Ｔｇまたは親Ｂ６（Ｂ６  ＷＴ）マウスから単離した１×１０7ＢＭおよび１×１０６脾細胞を移植した。レシピエントを移植後４週目に犠死させ、組織学的評価のために肺を切除した。
【００２９】
（５）組織の組織病理学および免疫組織化学
レシピエントの上背部からの皮膚、左肺、肝臓および結腸標本を１０％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、切片にし、スライドガラスに載せて、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、病変を測定した。ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４３顕微鏡に取り付けたＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラＤＰ２１で画像を捕捉した。スライドガラスは、実験群を知らされていない病理学者が採点した。皮膚スライドガラスは、皮膚線維症、脂肪減少、炎症、表皮境界面の変化、および小胞脱落に基づいて採点した（各カテゴリーについて０〜２；最大スコアは１０であった）（Blood. 2004; 104(5): 1565-73）。肺スライドガラスは、管腔周囲の浸潤物、肺炎、および損傷の程度によって採点した（各カテゴリーについて０〜３；最大スコアは９であった）（Blood. 1996; 88(8): 3230-9）。肝臓スライドガラスは、胆管損傷および炎症によって採点した（各カテゴリーについて０〜４；最大スコアは８であった）（J. Immunol. 2004; 173(9): 5467-75）。コラーゲンの検出のため、スライドガラスをアザン−マロリー染色で染色し、コラーゲン沈着を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４解析ツール（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）の使用により総染色面積に対する青色染色の面積の比率としてアザン−マロリー染色切片に関して定量化した。免疫組織化学で使用した抗体は、Ｄａｋｏからの抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（Ｆ７．２．３８、マウスＩｇＧ１）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ヒトＣＤ２６ウサギｐＡｂ（ＡＦ１１８０）、Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ．からの抗ＩＬ−２６ウサギｐＡｂ（ｂｓ−２６２６Ｒ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙからの抗ＩＬ−１７ＡウサギｐＡｂ（Ｈ−１３２）およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗カベオリン−１ウサギｐＡｂ（Ｄ４６Ｇ３）であった。ＣＤ３、ＣＤ２６またはＩＬ−２６についての免疫組織化学染色は、以前に記述されているように（Br J. Haematol. 2013; 162(2):263-77）Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｋｅｉｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で実施された。ＩＬ−１７Ａまたはカベオリン−１についての免疫組織化学染色は、ＭｏｒｐｈｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）の研究室で実施された。
【００３０】
（６）リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
エフェクター分子のｍＲＮＡの発現を評価する実験では、Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺から単細胞懸濁液を単離し、次いでヒトＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてヒトＣＤ４  Ｔ細胞を精製した。ｍＲＮＡの単離および定量化は以前に記述されているように実施した（Immunology 2013; 138(2): 165-72）。ｍＲＮＡの発現レベルを、各遺伝子について作成した標準曲線に基づいて計算し、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）ｍＲＮＡを不変対照として用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列を（表１）に示す。
【００３１】
【表１】
2016069314.tif 000002
【００３２】
（７）フローサイトメトリ
以下の抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからであった：抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔａ、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＣＤ８（ＨＩＴ８ａ、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＣＤ２６（Ｍ−Ａ２６１、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂ２７、マウスＩｇＧ1）、抗ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｎ４９−６５３、マウスＩｇＧ1）抗体、および同じＩｇアイソタイプの関連対照ｍＡｂ。蛍光複合体は、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニン−クロロフィル−Ｃｙ５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）であった。細胞内ＩＬ−２６の抗体染色（クローン５１０４１４、マウスＩｇＧ1）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合させた。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してマウス末梢血の試料中の赤血球を溶解した。肺に浸潤したリンパ球を分析するため、Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単細胞懸濁液を調製し、次いでヒトＣＤ４５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ  Ｋｉｔで精製した。ウサギ／マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との非特異的結合をブロックした後、細胞をＰＢＳプラス１％ＢＳＡで染色した。細胞内サイトカイン分析のために、精製したヒトＣＤ４５＋細胞を、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下に２５ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）プラス１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４時間再刺激した。細胞内フローサイトメトリを、Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造者の指示に従って実施した。２本レーザーのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析を実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）でファイルを解析した。
【００３３】
（８）サイトカインおよび可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４の測定
採集した血清を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２７−Ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて炎症性サイトカイン（ヒトＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）に関して分析した。Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２６  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＣＵＳＡＢＩＯ）を用いてＩＬ−２６を検定した。可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４についてのアッセイを我々の研究室で開発した（Br J. Haematol. 2013; 162(2): 263-77）。すべての試料を３回検定した。
【００３４】
（９）ウェスタンブロット法
ＩＬ−２０ＲＡまたはＩＬ−１０ＲＢの発現を分析するため、ＲＩＰＡ緩衝液を使用してＮＨＬＦおよびＮＩＨ３Ｔ３の溶解物１０μｇを調製し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ヒトとマウスの両方の抗原を認識する抗ＩＬ２０ＲＡ（ａｂ２５９２２、Ａｂｃａｍ）または抗ＩＬ１０ＲＢ（ｂｓ−２６０２Ｒ、Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ．）ウサギｐＡｂを用いて免疫ブロットした。外因性ＩＬ−２６によって誘導されるリン酸化ＳＴＡＴ３の分析のため、１×１０５細胞を９６ウェル平底プレートに接種し、翌日ＩＬ−２６（ＰＢＳ中１０ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。各々の時点で細胞を採取し、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＩＰＡ緩衝液中で細胞溶解物を調製した。各溶解物１０μｇを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ヒトとマウスの両方の抗原を認識する抗リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＹ−ＳＴＡＴ３）（Ｎｏ．１１０４５、ＳＡＢ）で免疫ブロットして、次いでヒトとマウスの両方の抗原を認識する抗ＳＴＡＴ３  ｐＡｂ（全ＳＴＡＴ３）（ＧＴＸ１５５２３、ＧｅｎｅＴｅｘ）でストリッピングし、再プローブした。
【００３５】
（10）インビトロコラーゲン産生アッセイ
ＮＨＬＦまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６ウェル平底プレートに接種し（１×１０5／ウェル）、翌日ＩＬ−２６（ＰＢＳ中０．１、２．０、５．０または１０ｎｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ単独を各ウェルに添加した。中和実験では、中和抗ＩＬ２０ＲＡ  ｐＡｂ（ａｂ２５９２２、Ａｂｃａｍ）または対照ウサギＩｇ（Ａｂｃａｍ）（各々１０μｇ／ｍＬ）を、外因性ＩＬ−２６を添加する１時間前に各ウェルに添加した。ＩＬ−２６を添加した４８時間後に上清を採取し、次いでＳｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を用いて可溶性コラーゲンを測定した。すべての試料を３回検査した。
【００３６】
（11）インビトロ共刺激アッセイ
ｍＲＮＡ発現の分析のため、ＣＤ４  Ｔ細胞をｈｕＣＢ  ＭＮＣから精製・単離して、１×１０５細胞／ウェルを、抗ＣＤ３（０．０５μｇ／ｍＬ）プラス抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ２６（１０μｇ／ｍＬ）ｍＡｂを固定化した９６ウェル平底プレートに接種した。刺激の７日後、細胞を採取し、ｍＲＮＡを調製して、ヒトＩＬ２、ＩＦＮＧ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２６およびＤＰＰ４の転写産物レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。共刺激によるＩＬ−２６産生の分析のため、１×１０５ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を、表示されている濃度のプレートに結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２６  ｍＡｂまたは固定化したＣａｖ−Ｉｇで刺激した。刺激の７日後または１４日後に上清を採取した。阻害アッセイのために、１×１０5細胞／ウェルのｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を、刺激の前に様々な濃度（０、１、５、１０、２０または５０μｇ／ｍＬ）のブロッキングＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇで処理した。１時間のブロッキング期間後、細胞を固定化抗ＣＤ３（０．０５μｇ／ｍＬ）プラスＣａｖ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８（２０μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ２６（２０μｇ／ｍＬ）ｍＡｂで刺激した。刺激の７日後、上清を採取した。ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞をＡＩＭ  Ｖ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
【００３７】
（12）ＧＶＬおよび生物発光イメージング（ＢＬＩ）
Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド（Ｈ−２d）のホタルルシフェラーゼでトランスフェクトしたＡ２０マウスリンパ腫細胞（Ａ２０−ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｘｉａｏ  Ｃｈｅｎ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の好意により提供された（７０）。ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で照射し、翌日、尾静脈を介して１×１０4Ａ２０−ｌｕｃ細胞を接種して、次にその翌日、ｈｕＣＢから単離した１×１０7ＭＮＣを移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（１００μｇ／投与）を、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回（合計１２回の投与）腹腔内投与した。他のＧＶＬ実験のため、ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で照射し、翌日、ｈｕＣＢから単離した１×１０7ＭＮＣを移植した。Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇ（１００μｇ／投与）を、移植後＋１日目に開始して＋２８日目まで、週３回（合計１２回の投与）腹腔内投与した。１×１０5Ａ２０−ｌｕｃ細胞を移植後＋２８日目に尾静脈を介して接種した。以前に文献に記述されているように（Br J. Cancer. 2014; 110(9): 2232-45）インビボＢＬＩを用いて腫瘍の播種を毎週観測した。
【００３８】
（13）統計
データを、２群比較のための両側スチューデントｔ検定によって、または多重比較のためのＡＮＯＶＡ検定とそれに続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック検定によって解析した。Ｐ値≦０．０５を統計的に有意とみなした。生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いてログランク検定によって解析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して計算を実施し、グラフを作成した。
【００３９】
２．結果
（１）ｃＧＶＨＤを経験する全ｈｕＣＢレシピエントにおける肺線維症
マウスモデルにおいてヒト免疫細胞によって誘導されるｃＧＶＨＤの正確な機構を評価するため、ＮＯＧマウスをレシピエントとして、およびｈｕＣＢをドナー細胞として使用した。ＮＯＧマウスを亜致死線量照射で前処理し、次にＴ細胞除去ＣＤ３４陽性ｈｕＣＢ（ＣＤ３４＋移植）または未熟Ｔ細胞を含有する全ｈｕＣＢのいずれかを与えて、早期移植後死亡に結び付かない慢性異種応答を誘導した。ＣＤ３４+移植マウスは、ＧＶＨＤのいかなる徴候または症状も伴わずに５か月間生存した（図３Ａおよび３Ｂ中の実線）。一方、全ＣＢ移植マウス（ｈｕＣＢ−ＮＯＧ）は、移植後４週間で早くも体重減少または被毛の乱れなどのＧＶＨＤの臨床徴候／症状を示すと共に（図３Ｂ中の点線）、有意に低い生存率を明らかにした（図３Ａ中の点線）。ヒト細胞は、図４に示すように両群において同様に生着した。
【００４０】
ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスにおけるｃＧＶＨＤ組織病理学を検討するため、我々は次に、ＧＶＨＤ標的器官の組織学的分析を実施した。ＣＤ３４+移植対照群は、肺、皮膚および肝臓などのＧＶＨＤ標的器官の正常な外観を示し（図３Ｃのパネルａ〜ｃ）、いずれも陽性病変スコアを有していなかった（図３Ｄ）。他方で、ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺の組織学的検査は、線維組織の上皮下拡大と共にヒトＣＤ３+細胞による気管支周囲の浸潤およびカフィングを示し、細気管支の閉塞の開始を示唆した（図３Ｃのパネルｄおよびｇ）。肺病変スコアは、ＣＤ３４+移植対照群よりもｈｕＣＢ−ＮＯＧ群において有意に高かった（図３Ｄの＊）。ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの皮膚組織学は、ヒトＣＤ３＋細胞の浸潤に関連する皮膚萎縮、脂肪減少および小胞脱落を示した（図３Ｃのパネルｅおよびｈ）。肝臓では、胆管を取り囲む組織においてヒトＣＤ３＋細胞による脈管周囲浸潤が認められたが（図３Ｃのパネルｆおよびｉ）、その程度は肺または皮膚で見られるよりも軽度であった。皮膚および肝臓の両所見は、ＣＤ３４+移植対照マウスと比較してｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスにおける病変スコアの有意の上昇をもたらした（それぞれ図３Ｄの＊＊または＊＊＊）。一方、ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスおよびＣＤ３４＋移植対照群の小腸および結腸などの他のＧＶＨＤ標的器官では病変所見を認めなかった。これらの所見は、ｈｕＣＢ移植片中のヒトＣＤ３＋リンパ球が、ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺における生命を脅かす器官損傷を含む、ｃＧＶＨＤを誘導したことを示唆する。
【００４１】
ｃＧＶＨＤは線維増殖性疾患として特性付けられ得るので（Biol Blood Marrow Transplant. 2010; 9(10): 657-66）、我々はまた、疾患の程度の測定としてコラーゲンレベルを定量化するマロリー染色アッセイも実施した。ｃＧＶＨＤ群の肺は、気管支周囲および脈管周囲のコラーゲン沈着の有意の増大を示し（図３Ｅのパネルｂ中の暗青色の部分および図３Ｆの＊）。特に、図３Ｅは、細気管支および血管を取り囲むコラーゲンの組織化を明瞭に示し、コラーゲンレベルの上昇が特定の構造に局在しており、肺全体に均一に分布するわけではないことを明らかにし、ｈｕＣＢ  ＮＯＧマウスが肺ｃＧＶＨＤを発症したことを示唆している。全体として、ＮＯＧマウスへの亜致死的照射とそれに続く全ｈｕＣＢ移植は、特に肺と皮膚において、ｃＧＶＨＤの病態を再現した。ｃＧＶＨＤの病態は、早期の有意の体重減少の不在（J. Clin. Invest. 2000; 105(9): 1289-98）、ならびに移植後の晩期の全体的に軽度の体重減少、ＢＯおよび肺線維症（Best Pract Res Clin Haematol. 2008; 21(2):251-7）によってａＧＶＨＤと区別された。マウスｃＧＶＨＤモデルは以前に報告されているが（Am. J Respir Crit Care Med 2007; 176(7): 713-23）、ヒトリンパ球によって誘導されたｃＧＶＨＤマウスにおける肺病変の文書報告は記述されていない。国立衛生研究所の認定基準によれば、ＢＯだけが肺のｃＧＶＨＤの唯一の特徴的症状発現であるので（Biol Blood Marrow Transplant 2005; 11(12): 945-56、Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12(1): 31-47）、それゆえ、我々の所見は、肺ｃＧＶＨＤの真正なヒト化マウスモデルを示す。
【００４２】
（２）ｃＧＶＨＤマウスの肺におけるＩＬ−２６産生ＣＤ４+  Ｔ細胞の浸潤
このマウスモデルにおけるｃＧＶＨＤに関連した潜在的病因病原機構を解明するため、我々は、ＢＯおよび線維症の存在が実証された、最も深刻な影響を受けるｃＧＶＨＤ器官としての肺にその後の研究の焦点を合わせた。ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの肺にはヒトＣＤ３＋細胞の脈管周囲および気管支周囲浸潤が存在したので（図３Ｃ）、我々は次にｃＧＶＨＤ肺におけるヒトリンパ球の割合を定量化した。ヒトＢ細胞が主にヒト化ＮＯＧマウスの末梢血および脾臓で認められるという報告結果（Int. Immunol. 2009; 21(7): 843-58）とは異なり、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞の存在が主としてｃＧＶＨＤ肺において観察された（図５Ａ）。さらに、ｃＧＶＨＤ肺で認められるヒトＣＤ４５+血液細胞の残りは、ＣＤ８  Ｔ細胞から成ると思われる（図５Ａ）。これらの所見は肺標本の免疫組織化学検査によっても確認された（図６）。我々の所見は、ｃＧＶＨＤマウスの肺の病態生理学がヒトＣＤ３リンパ球、特にＣＤ４  Ｔ細胞を含むことを示唆する。
【００４３】
ｃＧＶＨＤ肺の病態生理学において役割を有する炎症性サイトカインを同定するため、ｃＧＶＨＤ肺から単離したヒトＣＤ４  Ｔ細胞における様々な炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現プロフィールを分析した。図５Ｂに示すように、ＩＦＮＧ、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ２６は全ＣＢ移植後のｃＧＶＨＤ発症の過程で有意に増加し（＊＊）、一方ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＩＬ４、ＩＬ６およびＩＬ１０は減少した（＊）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２６はＴｈ１７細胞によって産生され（Citokine Growth Factor Rev. 2010; 21(5): 393-401）、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２６はＴｈ１細胞によって産生される（Genes Immun 2012; 13(6): 481-8）ことが報告されている。Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞はどちらもＣＤ２６を強く発現するので（Immunol Rev. 1998; 161: 55-70、Immunol 2012; 188(11): 5438-47）、我々は次にＣＤ２６／ＤＰＰ４の発現レベルを分析した。ｃＧＶＨＤ肺に浸潤するヒトＣＤ４  Ｔ細胞におけるＤＰＰ４  ｍＲＮＡ発現は有意に増大したが（図５Ｂ）、共刺激分子ＣＤ２８のｍＲＮＡ発現は増強されなかった。これらのデータは、ヒトＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞がｃＧＶＨＤ肺の病態生理学において重要な役割を果たすことを示唆する。
【００４４】
上記所見をさらに確認するため、我々は次に、関連するサイトカインのタンパク質レベルを検討した。加えて、可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４レベルはＴ細胞ＣＤ２６タンパク質と相関するので（Clin. Chem. Lab Med 1993; 37(8): 839-40、Scand J Immunol 2001; 54(3): 249-64）、マウス血清におけるヒト可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４のタンパク質レベルも検討した。図５Ｃに示すように、ヒトＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２６およびヒト可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４の血清レベルは、ＣＤ３４＋移植対照マウスと比較してｃＧＶＨＤマウスでは有意に上昇していた。これらのサイトカインが浸潤ヒトＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞によって産生されたのかどうかを決定するため、フローサイトメトリを用いてｃＧＶＨＤマウスおよびＣＤ３４+移植対照マウスの肺から単離したリンパ球を分析した。図５Ｄに示すように、ヒトＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルは、ＣＤ３４+移植対照マウスと比較してｃＧＶＨＤマウスでは有意に上昇していたが（それぞれパネルａまたはｂ）、ＩＬ−１７Ａ+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルはｃＧＶＨＤとＣＤ３４+対照群の間で同様であった（パネルｃ）。これらの所見は肺標本の免疫組織化学検査によっても確認された（図５Ｅ）。加えて、ｃＧＶＨＤ肺におけるＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γではなくＩＬ−２６を主として産生した（図７）。さらに、ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスの皮膚組織学は、ＣＤ２６+およびＩＬ−２６+細胞の浸潤に関連する（図８のパネルｂおよびｃ）萎縮、脂肪減少および小胞脱落を示したが（図３Ｃのパネルｅおよび図８のパネルａ）、ＩＬ−１７Ａ+細胞は検出されなかった（図８のパネルｄ）。合わせて考慮すると、これらの所見は、ＩＦＮ−γ+および／またはＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞が肺ならびに皮膚ｃＧＶＨＤの病態生理学において重要な役割を果たすことを強く示唆する。
【００４５】
（３）ＩＬ−２６はｃＧＶＨＤ肺におけるコラーゲン沈着に寄与する
ｃＧＶＤＨの肺の気管支周囲血管において有意のコラーゲン沈着が認められたので（図３Ｅ）（Biol Blood Marrow Transplant 2010; 16(1Suppl); 106-14、Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12(1): 31-47）、我々は、コラーゲン産生がＩＦＮ−γ+および／またはＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のｃＧＶＨＤ肺浸潤によって誘発されたのかどうかを判定しようと試みた。ＩＦＮ−γは細胞性免疫の鍵となる調節因子であるが、ｃＧＶＨＤ肺の発症はＩＦＮ−γと無関係であることが報告されている（Blood 2009; 114(14): 3101-12）。他方で、ｃＧＶＨＤの病態生理学へのＩＬ−２６の作用はまだ解明されていない。それゆえ我々は、肺ｃＧＶＨＤについての潜在的なエフェクターサイトカインとしてＩＬ−２６に焦点を合わせた。ヒトＩＬ−２６遺伝子ＩＬ２６は染色体１２ｑ１５上でＩＦＮＧに隣接して位置し、げっ歯動物にはＩＬ−２６遺伝子は存在しない（Genes Immun 2012; 13(6): 481-8、Int Immunopharmacol. 2004; 4(5):609-13）が、我々は、ヒトＩＬ−２６がマウス細胞を活性化する可能性を正式に排除することはできない。それゆえ、ヒトＩＬ−２６のマウス細胞への作用を測定するインビトロアッセイを実施した。ヒト細胞では、ＩＬ−２６は最初にＩＬ−２０ＲＡに結合し、二元複合体ＩＬ−２６プラスＩＬ−２０ＲＡを形成して、次いでＩＬ−１０ＲＢ鎖を動員し、ＳＴＡＴ３のリン酸化を導く（J. Biol Chem 2004; 279(32): 33343-51）。図９Ａに示すように、ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−１０ＲＢはどちらもマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３ならびに正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）において発現され（パネルａ）、外因性組換えヒトＩＬ−２６はＮＨＬＦとＮＩＨ３Ｔ３の両方でＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導し（パネルｂ）、ヒトＩＬ−２６がＮＨＬＦだけでなくマウス線維芽細胞においても活性であることを示唆した。ＩＬ−２６のマウス線維芽細胞への機能的作用を検討するため、我々は次にコラーゲン合成に関するインビトロアッセイを実施した。図９Ｂに示すように、ＮＩＨ３Ｔ３ならびにＮＨＬＦにおけるコラーゲン産生の増大が外因性ＩＬ−２６の添加後に用量依存的に認められ（パネルａおよびｂ中の＊）、抗ＩＬ−２０ＲＡポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を中和することによってコラーゲン産生が阻害された（パネルａおよびｂ中の＊＊）。これらの結果は、ヒトＩＬ−２６がＩＬ−２０ＲＡを介してヒトおよびマウスの両方の線維芽細胞を活性化し、コラーゲン産生の増大を導くことを強く示唆する。
【００４６】
上記インビトロ結果をインビボ系にさらに拡大するため、ヒトＩＬ２６  Ｔｇマウスを使用してマウスアロ反応性ＧＶＨＤの肺を分析した。このために、ヒトＩＦＮＧおよびＩＬ２６導入遺伝子を担持するマウス（１９０−ＩＦＮＧ  Ｔｇマウス）またはヒトＩＦＮＧ導入遺伝子を担持し、ＩＬ２６転写を欠失しているマウス（ΔＣＮＳ−７７  Ｔｇマウス）を使用した。１９０−ＩＦＮＧ  Ｔｇマウスは、Ｔｈ１またはＴｈ１７分極状態下でＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＬ−２６の産生を示したが、ΔＣＮＳ−７７  ＴｇマウスではＩＬ−２６の発現は完全に排除された（Genes Immun 2012; 13(6): 481-8）。加えて、Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、１９０−ＩＦＮＧ  ＴｇマウスおよびΔＣＮＳ−７７  Ｔｇマウスのどちらにおいても同等であった（J Immunol. 2010; 185(3): 1492-501）。図９Ｃに示すように、親Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６  ＷＴ）マウスに由来するレシピエントＮＯＧマウスまたはΔＣＮＳ−７７  Ｔｇマウスの肺組織学は、ＧＶＨＤを示唆する気管支周囲の浸潤およびカフィングを示したが（パネルａまたはｇ）、コラーゲン沈着はマロリー染色によって検出されず（パネルｂまたはｈ）、ＩＬ−２６＋細胞は検出されなかった（パネルｃまたはｉ）。他方で、１９０−ＩＦＮＧ  Ｔｇマウスに由来するレシピエントＮＯＧマウスの組織学は、ＧＶＨＤを示唆する気管支周囲の浸潤およびカフィング（パネルｄ）と共にコラーゲン沈着およびＩＬ−２６＋細胞の浸潤（パネルｅおよびｆ）を示した。１９０−ＩＦＮＧ  Ｔｇマウスに由来するレシピエントＮＯＧマウスの肺におけるコラーゲン沈着の有意の増大をマロリー染色によって定量化し、図９Ｄに示した。これらの結果は、ヒトＩＬ−２６は肺ｃＧＶＨＤに関連する肺線維症において極めて重要な役割を果たすが、ヒトＩＦＮ−γは重要な役割を果たさないことを示唆する。
【００４７】
（４）ＣＤ２６を介したＴ細胞共刺激によるＩＬ−２６産生
ＩＬ−２６はＴｈ１細胞によってＩＦＮ−γと共発現されること（Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21(5): 393-401）、およびＣＤ２６／ＤＰＰ４はＣＤ２６を介した共刺激によって活性化されるＴｈ１細胞上で選択的に発現されること（Immunol Rev. 1998; 161:55-70）が報告されている。加えて、ｃＧＶＨＤ肺におけるＣＤ２６＋ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γではなくＩＬ−２６を主として産生した（図７）。そこで我々は、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞はＣＤ２６共刺激後にＩＬ−２６を産生するという仮説を立てる。この仮説を調べるため、ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞を使用したインビトロ共刺激実験を実施し、様々な炎症性サイトカインの発現を分析した。図１０Ａに示すように、ＩＬ２６およびＤＰＰ４の発現レベルはＣＤ２８またはＣＤ２６共刺激によって増強されたが（それぞれ＊または＊＊）、ＣＤ２８共刺激よりもＣＤ２６共刺激後にＩＬ２６およびＤＰＰ４のレベルの有意に大きな上昇が認められた（＊＊＊）。他方で、ＩＬ２、ＩＦＮＧおよびＩＬ１７Ａの発現レベルは、以前に報告されたように（Blood 2004; 103(3):1002-10、Hum. Immunol. 2006; 67(11): 874-83）、ｈｕＣＢ  Ｔ細胞の未熟性のために、ＣＤ２６共刺激またはＣＤ２８共刺激後に上昇しなかった（図１０Ａの各パネル中のＮＳ）。我々は次に、ＣＤ２６共刺激リガンドであるＣａｖ−Ｉｇならびに抗ＣＤ２６または抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して用量および時間動態を評価する共刺激実験を実施し、ＥＬＩＳＡを用いて分泌されたＩＬ−２６を検定した。図１０Ｂに示すように、ＩＬ−２６の産生はＣａｖ−Ｉｇまたは抗ＣＤ２６  ｍＡｂとのＣＤ２６共刺激後に用量依存的および時間依存的に増大したが（それぞれ＊または＊＊）、より高い用量のｍＡｂおよびより長い刺激期間でのみＣＤ２８共刺激後にＩＬ−２６レベルのわずかな上昇が認められた（＊＊＊）。次にさらなる確認のためにブロッキング実験を実施し、Ｃａｖ−Ｉｇまたは抗ＣＤ２６  ｍＡｂによって誘導されるＩＬ−２６産生は可溶性Ｃａｖ−Ｉｇでの処理によって用量依存的に明らかに阻害されるが（それぞれ図１０Ｃの左または真ん中のパネル）、ＣＤ２８共刺激では変化が認められない（図１０Ｃの右のパネル）ことを示した。これらの所見は、ｈｕＣＢ  ＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＬ−２６の産生がＣＤ２６を介した共刺激によって調節されることを強く示唆する。さらに、カベオリン−１のＮ末端の機能性配列はヒトとマウスの間で高度に保存されており（図１１）、共刺激リガンドとしてヒトＣＤ２６に結合することが可能であるので、マウスに移入されたドナーｈｕＣＢ  Ｔ細胞がマウスカベオリン−１によってもたらされるＣＤ２６共刺激によって活性化されたことは考えられる。実際に、ヒトおよびマウスカベオリン−１の両方のＮ末端を認識するｐＡｂを使用して、ｃＧＶＨＤ肺におけるＢＯ様病変の内皮細胞およびマクロファージ様細胞でカベオリン−１の発現が検出された（図１２）。図１０の結果と合わせて考慮すると、カベオリン−１によってもたらされるＣＤ２６を介したＩＬ−２産生は、ｈｕＣＢ  ＮＯＧマウスを使用したｃＧＶＨＤにおける可能性のある治療標的として同定される。
【００４８】
（５）ＣＤ２６／ＤＰＰ４の遮断はｃＧＶＨＤおよび付随する肺線維症を予防するのに十分である
上記データは、ＩＬ−２６＋ＣＤ２６＋ＣＤ４  Ｔ細胞がｃＧＶＨＤ肺においてエフェクターの役割を果たすこと、およびＣａｖ−ＩｇによるＣＤ２６共刺激の遮断はＴ細胞の活性化を抑制することを示唆する。ＩＬ−２６産生におけるＣＤ２６共刺激の役割および肺ｃＧＶＨＤにおけるコラーゲン産生のＩＬ−２６調節を考慮して、それゆえ、我々は、ブロッキング試薬Ｃａｖ−ＩｇによるＣＤ２６共刺激の遮断がｃＧＶＨＤの発生率を低下させ、レシピエントマウスの生存を延長させるかどうかを判定しようと試みた。レシピエントマウスを移植後＋１日目から＋２８日目まで週に３回、Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇで処置した。Ｃａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントは、ＧＶＨＤの臨床所見を伴わずに７か月間生存した（図１３Ａおよび１３Ｂ中の実線）。一方、対照Ｉｇで処置したレシピエントマウスの生存率は有意に低下し（図１３Ａ中の点線）、移植後４週間で早くも体重減少または被毛の乱れなどのＧＶＨＤの臨床徴候／症状が認められた（図１３Ｂ中の点線）。ヒト細胞は、図１４に示すように両群で同様に生着した。対照Ｉｇで処置したレシピエントでは、肺、皮膚および肝臓の組織学は、ｃＧＶＨＤの発症に関連するヒトＣＤ３+細胞浸潤を示した（図１３Ｃのパネルａ〜ｆ）。他方で、Ｃａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントは、対照Ｉｇで処置したマウスと比較して、肺、皮膚および肝臓などのＧＶＨＤ標的器官の正常な外観を示し（図１３Ｃのパネルｇ〜ｉ）、いずれも陽性病変スコアを有していなかった（図１３Ｄ）。さらに、ヒトＩＬ−２６およびヒト可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰ４の血清レベルは、対照Ｉｇで処置したレシピエントよりもＣａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントにおいて有意に低かった（図１３Ｅ）。同様に、肺におけるＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞は、対照Ｉｇ処置マウスよりもＣａｖ−Ｉｇ処置レシピエントにおいて減少していた（図１３Ｆ）。これらの所見は肺標本の免疫組織化学検査によっても確認され（図１３Ｇ）、対照Ｉｇ処置マウスの肺は、細気管支および血管周囲のコラーゲン沈着の有意の増大を示した（図１３Ｈのパネルａ中の暗青色の部分および図１３Ｉの＊）。合わせて考慮すると、上記結果は、Ｃａｖ−Ｉｇの投与が、亜致死的照射を伴うｈｕＣＢ移植後のｃＧＶＨＤの発症を、ＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞の数を減少させることによって予防するという概念を裏づける。
【００４９】
（６）Ｃａｖ−Ｉｇによって誘導されるインビボ免疫抑制
我々は以前に、成人末梢Ｔ細胞を使用したインビトロ実験においてＣａｖ−Ｉｇがリコール抗原およびアロ抗原に対する低応答性を誘導することを報告した（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009; 386(2): 327-32）。これらのインビトロ所見をインビボ系にさらに拡大するため、我々は次に、Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇでの処置後に連続移植実験を実施した。Ｃａｖ−Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離した骨髄（ＢＭ）細胞および脾細胞を受容したマウスは、ＧＶＨＤの臨床所見を伴わずに５か月間生存した（図１４Ａおよび１４Ｂ中の実線）。一方、対照Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離したＢＭ細胞および脾細胞を移植されたレシピエントマウスの生存率は有意に低下し（図１４Ａ中の点線）、移植後２週間で早くも体重減少などのＧＶＨＤの臨床徴候／症状を示した（図１４Ｂ中の点線）。ヒト細胞は、図１８に示すように両群で同様に生着した。Ｃａｖ−Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離したＢＭ細胞および脾細胞のレシピエントでは、肺および肝臓の組織学所見は無傷組織を示した（図１４Ｃのパネルｅおよびｆ）。他方で、対照Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離したＢＭ細胞および脾細胞を受容したレシピエントマウスでは、肺の組織学は、異種ａＧＶＨＤにおける所見に類似した（Blood 2009; 114(14): 3101-12）、細気管支および血管の周囲ならびに肺胞間中隔におけるヒトＣＤ３＋細胞の大量浸潤を明らかにした（図１４Ｃのパネルａおよびｃ）。肝臓では、ヒトＣＤ３＋細胞による脈管周囲浸潤が胆管を取り囲む組織中で認められた（図１４Ｃのパネルｂおよびｄ）。重要な点として、肺におけるヒトＩＦＮ−γ＋またはＩＬ−２６＋ＣＤ２６＋ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルは、対照Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離したＢＭ細胞および脾細胞を移植されたレシピエントと比較して、Ｃａｖ−Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスから単離したＢＭ細胞および脾細胞のレシピエントにおいて有意に低かった（図１４Ｄ）。これらの所見は、Ｃａｖ−Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスにおいてインビボ免疫抑制が達成されることを示唆する。
【００５０】
（７）Ｃａｖ−Ｉｇの遅延投与はｃＧＶＨＤの発症を抑制する
ｃＧＶＨＤは数週間から数か月にわたって無痛的に進行するので、患者はしばしばｃＧＶＨＤと診断される以前に臨床所見に侵される（Bone Marrow Transplant. 2008; 42 Suppl 1: S66-S9）。それゆえ我々は、カベオリン−１／ＣＤ２６相互作用の遮断が臨床徴候／症状の出現後にｃＧＶＨＤの発症を有効に抑制するかどうかを判定しようと試みた。このために、レシピエントマウスを移植後＋２９日目から＋５６日目まで、Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇで処置した。処置は、ｃＧＶＨＤ発症の初期段階を示唆する、体重減少およびＧＶＨＤスコアの上昇の出現後＋２９日目に開始した。Ｃａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントは、ＧＶＨＤ症状の寛解を伴って７か月間生存した（図１６Ａおよび１６Ｂ中の実線）。一方、対照Ｉｇで処置したレシピエントの生存率は有意に低下し（図１６Ａ中の点線）、ＧＶＨＤの臨床徴候／症状が進行した（図１６Ｂ中の点線）。ヒト細胞は、図１５に示すように両群で同様に生着した。対照Ｉｇ処置レシピエントでは、肺の組織学は、移植後５週目にＢＯを示し、移植後１０週目にびまん性肺胞損傷を示した（図１６Ｃのパネルａおよびｂ）。皮膚および肝臓では、図３Ｃに示すのと類似のＧＶＨＤの所見を認めた（図１６Ｃのパネルｃ〜ｆ）。他方で、Ｃａｖ−Ｉｇ処置レシピエントでは、細気管支、脈管または胆管の周囲の単核細胞のわずかな浸潤が移植後５週目に観察されたが（図１６Ｃのパネルｇおよびｋ）、移植後１０週目には無傷の組織学的所見が認められた（図１６Ｃのパネルｈおよびｌ）。加えて、図３Ｃに示す皮膚ＧＶＨＤの所見は、移植後５週目と１０週目の両方で観察されなかった（図１６Ｃのパネルｉおよびｊ）。これに対応して、対照Ｉｇ処置レシピエントの病変スコアは、５週目のものと比較して、１０週目では有意に上昇した（図１６Ｄの＊）。一方、Ｃａｖ−Ｉｇ処置レシピエントの病変スコアは、５週目のものと比較して、１０週目では有意に低下し（図１６Ｄの＊＊）、対照Ｉｇ処置レシピエントのものと比較して明らかに低かった（図１６Ｄの＊＊＊）。さらに、対照Ｉｇ処置レシピエントの肺におけるヒトＩＦＮ−γ＋およびＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルは、５週目のものと比較して、１０週目では有意に上昇した（図１６Ｅの＊）。他方で、Ｃａｖ−Ｉｇ処置レシピエントの肺におけるヒトＩＦＮ−γ+およびＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルは、５週目のものと比較して、１０週目では有意に低下し（図１６Ｅの＊＊）、対照Ｉｇ処置レシピエントのものと比較して明らかに低かった（図１６Ｅの＊＊＊）。合わせて考慮するとこれらのデータは、Ｃａｖ−Ｉｇの投与はｃＧＶＨＤの発症を予防するだけでなく、ＩＬ−２６+ＣＤ２６+ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルを調節することによって初期のｃＧＶＤＨのための新規治療アプローチも提供することを示唆する。
【００５１】
（８）Ｃａｖ−Ｉｇでの処置はレシピエントマウスにおけるＧＶＬ能力を保存する
ＧＶＨＤとＧＶＬ効果は高度に関連する免疫反応であるので（Clin. Cancer Res. 2009; 15(14): 4515-17）、我々は、ＧＶＬ効果へのＣａｖ−Ｉｇ処置の潜在的影響を評価した。このために、Ｃａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇで処置したｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのコホートを亜致死線量で照射し、次に腫瘍細胞の播種を可能にするために全ＣＢ移植の１日前にルシフェラーゼでトランスフェクトしたＡ２０（Ａ２０−ｌｕｃ）細胞を静脈内注射した。移植の翌日、週３回のＣａｖ−Ｉｇまたは対照Ｉｇでの処置を＋１日目に開始し、＋２８日目まで実施した。Ａ２０細胞だけを接種したマウスはすべて、６週間以内に腫瘍の進行により死亡した（図１７Ａの青色線および図１７Ｂの左のパネル）。対照Ｉｇで処置したレシピエントは、体重減少および被毛の乱れなどのＧＶＨＤの臨床証拠を示し、１３週間で腫瘍の進行を伴わずにＧＶＨＤのために死亡した（図１７Ａの点線および図１７Ｂの真ん中のパネル）。これに対し、Ｃａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントマウスは、Ａ２０−ｌｕｃ細胞が関与することなく（図１７Ｂの右のパネル）有意に長い生存を示した（図１７Ａの黒色線）。ＧＶＬ効果の有効性をより詳細に特性付けるため、Ｃａｖ−Ｉｇ処置による免疫抑制の獲得を可能にするために全ＣＢ移植後＋２８日目にＡ２０−ｌｕｃ細胞の注射によってこれらの試験を反復した。Ａ２０細胞だけを接種したマウスはすべて、腫瘍接種後２週間以内に腫瘍進行により死亡した（図１７Ｃの青色線および図１７Ｄの左のパネル）。対照Ｉｇで処置したレシピエントマウスは、体重減少および被毛の乱れなどのＧＶＨＤの臨床証拠を明らかにし、移植後１３週間以内に腫瘍の進行を伴わずにＧＶＨＤのために死亡した（図１７Ｃの点線および図１７Ｄの真ん中のパネル）。これに対し、Ｃａｖ−Ｉｇで処置したレシピエントは、Ａ２０−ｌｕｃ細胞が関与することなく（図１７Ｄの右のパネル）有意に長い生存を示した（図１７Ｃの黒色線）。まとめると、これらの結果は、ｈｕＣＢ−ＮＯＧマウスのＣａｖ−Ｉｇ処置がＧＶＬ効果の付随する喪失を伴わずにｃＧＶＨＤの症状を軽減するのに有効であったことを明らかにする。
【００５２】
（９）カベオリン１の部分ペプチドと免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質のリンパ球増殖抑制効果
破傷風トキソイド刺激によるＴ細胞の増殖反応に対するＦｃ融合タンパク処理での抑制効果を検討した。
破傷風トキソイドを免疫された健常成人末梢血からリンパ球を分離し、１０μｇ／ｍＬのＦｃ融合タンパク質またはコントロール免疫グロブリンでブロッキング後、破傷風トキソイドを添加、増殖反応を3Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込みで測定した。結果を図１９に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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