(57)【要約】【課題】細胞増殖抑制効果の持続性が高いユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物を提供する【解決手段】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物、によって上記課題が解決される。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、
ｍｉＲ−１４５と、
を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物。
【請求項２】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡと前記ｍｉＲ−１４５とを、１：１〜１：５０（モル比）で含む、請求項１に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物。
【請求項３】
前記ＥＷＳキメラ遺伝子が、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子である、請求項１または２に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物。
【請求項４】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列を含む１９〜２６塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｕｍｏｒｓ：ＥＳＦＴ）は、小児期に最も多く発症する腫瘍である。例えば、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の一種である骨ユーイング肉腫は、主として小児に発症する悪性骨軟部腫瘍である。ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に対しては、化学・手術・放射線療法などの治療が行われているが、５年生存率が約５０％と予後不良な疾患である。
【０００３】
ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者においては、特定の染色体（ヒトであれば、第２２染色体）の特徴的な転座が認められ、転座によって生じるＥＷＳキメラ遺伝子にコードされるタンパク質が疾病の発生原因と考えられている。例えば、ヒトであれば、第２２染色体と第１１染色体の転座ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）によって生じるＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の転写産物では、転写制御ドメインであるＦｌｉ−１タンパク質のＮ末端領域が失われ、このため細胞増殖シグナル伝達経路が活性化されることが疾病発生の原因であると考えられている（非特許文献１）。この他、ＥＷＳキメラ遺伝子としては、ＥＲＧ（ｔ（２１；２２））、ＥＴＶ１（ｔ（７；２２））、Ｅ１Ａ−Ｆ（ｔ（１７；２２））、またはＦＥＶ（ｔ（２；２２））と、ＥＷＳとのキメラ遺伝子が知られている（非特許文献２）。
【０００４】
近年、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療方法として、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする核酸医薬が検討され始めている。例えば、引用文献３では、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡを用いることにより、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を保有するユーイング肉腫細胞株において、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１タンパク質の発現が抑制され、細胞増殖能が低下することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｈｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ；５３，  ５８５９−６３（１９９３）
【非特許文献２】Ｙｏｕｎｇ−Ｈｙｕｃｋ  Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ；６０，  １５３６−１５４０（２０００）
【非特許文献３】Ｔａｋｉｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ；１２８，  ２１６−２２６（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＥＷＳキメラ遺伝子は腫瘍細胞に特異的であるという点において、ＥＷＳキメラ遺伝子を特異的に認識する二本鎖ｓｉＲＮＡは薬理学上の利点がある。しかしながら、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ単独で処理した場合、処理後１日程度は生存細胞数が低下するものの、その後は細胞増殖が再び活発化する（例えば、非特許文献３のＦｉｇｕｒｅ  ３）。それゆえ、細胞増殖抑制効果の持続性が十分ではないという問題があった。
【０００７】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、細胞増殖抑制効果の持続性が高いユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞増殖抑制効果の持続性が高いユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＥＷＳ遺伝子とＦｌｉ−１との転座、および転座によって生じるキメラ遺伝子に対する、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの結合を模式的に表した図である。
【図２】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡによりユーイング肉腫細胞株を処理した場合における、生存細胞数の経時変化を示す。
【図３】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株における、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１タンパク質の発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【図４】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡによりユーイング肉腫細胞株を処理した場合における、細胞周期の解析結果を示す。
【図５】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株における、細胞周期に関わるタンパク質の発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【図６】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株の、電子顕微鏡撮影像である（（Ａ）、（Ｂ）：対照区、（Ｃ）、（Ｄ）：二本鎖ｓｉＲＮＡ処理区）。
【図７】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株における、オートファジーに関わるタンパク質の発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【図８】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ、および３−メチルアデニンによりユーイング肉腫細胞株を処理した場合における、生存細胞数を示す。
【図９】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株における、アポトーシスに関わるタンパク質の発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【図１０】ｍｉＲ−１４５によりユーイング肉腫細胞株を処理した場合における、生存細胞数を示す。
【図１１】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを併用処理したユーイング肉腫細胞株における、生存細胞数の経時変化を示す。
【図１２】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを併用処理したユーイング肉腫細胞株における、生存細胞数の経時変化を示す。
【図１３】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを併用処理したユーイング肉腫細胞株における、生存細胞数の経時変化を示す。
【図１４】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを併用処理したユーイング肉腫細胞株における、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１タンパク質、ｃ−Ｍｙｃ、およびＬＣ３Ｂの発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【図１５】ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを併用処理したユーイング肉腫細胞株における、アポトーシスに関わるタンパク質の発現量をウェスタンブロットにて解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１２】
また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％の条件で測定する。
【００１３】
本発明に係るユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物（以下、「本発明に係るユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物」を、単に「本発明に係る組成物」とも称する。）は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る組成物の作用メカニズムは、以下のものであると推測される。すなわち、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより、ＥＷＳキメラ遺伝子にコードされるタンパク質の発現が、一定程度抑制される。これにより増殖シグナルが弱まり、解糖系からＴＣＡ回路による糖代謝系に移行するため、酸化ストレスが増強されると考えらえる。一方、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理したユーイング肉腫細胞株は、（１）Ｇ０／Ｇ１期で細胞周期が一旦停止すること、（２）オートファジーが誘導されること、（３）処理から７２〜９６時間後に再び活発に増殖を開始することを見出した。この結果から、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡにより処理した細胞が、増殖シグナルの低下により細胞周期がＧ０／Ｇ１期で一旦停止し、この間、酸化ストレスにより障害を受けたミトコンドリア等がオートファゴソーム中で修復を受けているものと推測した。酸化ストレスによる障害の修復が終わると、再び細胞周期が進行するため、処理から７２〜９６時間後に再び増殖が活発化するものと考えられる。一方、本発明者は、詳細な機構は不明ではあるが、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、細胞増殖抑制効果の持続性が増強されることを見出した。Ｊ．Ｂａｎら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ；３０，  ２１７３−２１８０（２０１１））には、ユーイング肉腫細胞株をｍｉＲ−１４５処理することによりＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現が抑制されることが記載されているが、本発明者は、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５との併用により、ＥＷＳキメラ遺伝子の発現が相乗的に抑制されることを初めて見出した。ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用した場合、かような相乗的効果が一因となり、Ｓ期への移行がより強く抑制され、細胞増殖抑制効果の持続性が増強されるのではないかと推測される。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００１５】
本明細書において、「ユーイング肉腫ファミリー腫瘍」は、特定の染色体（ヒトであれば第２２染色体）の転座を伴う疾患であり、例えば、骨ユーイング肉腫、骨外性ユーイング肉腫、未熟神経外胚葉腫瘍（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｔｕｍｏｒ：ＰＮＥＴ）、およびアスキン（Ａｓｋｉｎ）腫瘍を含む。このうち、本発明に係る組成物は、骨ユーイング肉腫に特に有効に用いられる。
【００１６】
本明細書における「ＥＷＳキメラ遺伝子」は、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者において典型的に観察される、上記の染色体の転座によって生じるキメラ遺伝子であり、例えば、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１、ＥＷＳ／ＥＲＧ、ＥＷＳ／ＥＴＶ１、ＥＷＳ／Ｅ１Ａ−Ｆ、およびＥＷＳ／ＦＥＶなどのキメラ遺伝子が挙げられる。
【００１７】
本発明に係る組成物において使用される「二本鎖ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）に関与し、配列特異的に標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを分解し、標的タンパク質の発現を特異的に抑制する活性を備える二本鎖のＲＮＡ分子である。生体内においてｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に組込まれ、パッセンジャー鎖が脱離する。その後、ガイド鎖が標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を認識して結合し、ガイド鎖が結合したｍＲＮＡはＲＩＳＣによって分解される。本発明で用いられる二本鎖ｓｉＲＮＡは、単離されたものである。
【００１８】
なお、本明細書では、二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合する、当該ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（または当該アンチセンス鎖を含むＲＮＡ領域）を「ガイド鎖」と表現する。一方、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（または当該センス鎖を含むＲＮＡ領域）を「パッセンジャー鎖」と表現する。
【００１９】
二本鎖ｓｉＲＮＡは、通常は２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のガイド鎖と、ガイド鎖に相補的な２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基のパッセンジャー鎖とからなる。ガイド鎖は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の連続する１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基に対して相補的な配列を含む（標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の、ガイド鎖と相補的な領域を「標的配列」とも称する。）。また、パッセンジャー鎖は、標的配列と相同な配列を含む。
【００２０】
二本鎖ｓｉＲＮＡの末端構造は、平滑末端でもよいが、オーバーハング（突出）を有していても良い。パッセンジャー鎖とガイド鎖との３’末端が塩基対を形成せず、２〜５塩基、好ましくは２塩基突出したオーバーハング（例えば、ＵＵ、またはｄＴｄＴ）を有することにより、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を抑制する活性が向上することがある。ガイド鎖の塩基配列において標的配列に相補的な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。また、パッセンジャー鎖の塩基配列において標的配列に相同な配列領域以外の領域は、オーバーハングであり得る。
【００２１】
本発明における組成物の有効成分として含まれる、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（以下、「ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ」を、単に「本発明に係るｓｉＲＮＡ」とも称する。）としては、標的配列（１６〜２７塩基、好ましくは２１〜２５塩基）に相補的な配列を含むガイド鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）と、ガイド鎖に相補的な配列を含むパッセンジャー鎖（２１〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基）とがアニールした二本鎖ポリヌクレオチドが用いられても良い。
【００２２】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から誘導されたものが含まれる。ｓｈＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるパッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とが３〜１１塩基程度のループ領域を介して連結された一本鎖のポリヌクレオチドである。生体内で発現されたｓｈＲＮＡは、パッセンジャー鎖相当領域とガイド鎖相当領域とがハイブリダイズしたヘアピン構造を取るが、ＲＮａｓｅの一種（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングを受け、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。ｓｈＲＮＡの塩基長は、例えば４５〜７０塩基であり、好ましくは４５〜６０塩基である。
【００２３】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、分子構造の安定化、酵素耐性の向上、細胞への取り込みやすさの向上等を目的として、当業者に知られた手段によって化学的に修飾されたものであっても良い。化学的修飾の例としては、ＬＮＡ（登録商標）などの架橋化した核酸、ホスホロチオエート化した核酸、２’−Ｏ−メチル化した核酸を用いても良い。また、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖の５’末端および／または３’末端が蛍光色素、コレステロール、ビオチン等で修飾されたものであっても良い。
【００２４】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とするものである。図１に、例として、ＥＷＳ遺伝子とＦｌｉ−１との転座、および転座によって生じるキメラ遺伝子に対する、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの結合を模式的に表す。図１に示すように、本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、転座切断点を含む領域を標的配列とする。これにより、本発明に係るｓｉＲＮＡはＥＷＳキメラ遺伝子を特異的に認識することができる。
【００２５】
標的配列の選定方法は、当業者に知られた手法により行うことができ、例えば、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドがＡまたはＵである、（ｉｉ）センス鎖の５’末端がＧまたはＣである、（ｉｉｉ）ＧＣ含量が３５〜５５％である、（ｉｖ）ＧおよびＣが４塩基以上連続しない、ことを基準として選定することができる（例えば、Ｋ．Ｕｉ−Ｔｅｉら，Ｎｕｃｌｅｃｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，  ９３６−９４８；  Ｍ．ＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉとＨ．Ｐｒｙｄｚ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｓｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００４，  １０５０−１０５８；  Ｄ．Ｍ．Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，  ７１７４−７１８１；  Ａ．Ｋｈｖｏｒｏｖａら，Ｃｅｌｌ  ２００３，  ２０９−２１６も参照される。）。
【００２６】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とするものであるが、例えば、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子、ＥＷＳ／ＥＲＧキメラ遺伝子、ＥＷＳ／ＥＴＶ１キメラ遺伝子、ＥＷＳ／Ｅ１Ａ−Ｆキメラ遺伝子、およびＥＷＳ／ＦＥＶキメラ遺伝子からなる群から選択されるキメラ遺伝子を標的とするものである。本発明における組成物においては、好ましくはＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが用いられる。ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子は、骨ユーイング肉腫やＰＮＥＴ等、多くのユーイング肉腫ファミリー腫瘍において検出されることが知られている。ユーイング肉腫ファミリー腫瘍患者において特に頻繁に観察されるＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子としては、タイプ１（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン６）およびタイプ２（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン５）が知られている。
【００２７】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖の標的配列は、ＥＷＳキメラ遺伝子の転座切断点を含む。好ましくは、本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖は、ＥＷＳキメラ遺伝子の、転座切断点を含む連続した１６〜２７塩基、より好ましくは連続した１９〜２６塩基、更に好ましくは連続した２１〜２５塩基を標的配列とする。標的配列におけるＥＷＳ遺伝子に由来する塩基数と、ＥＷＳ遺伝子との転座を生じた相手方遺伝子（例えば、Ｆｌｉ−１遺伝子、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、Ｅ１Ａ−Ｆ遺伝子、またはＦＥＶ遺伝子）（以降、Ｆｌｉ−１遺伝子等の「ＥＷＳ遺伝子との転座を生じた相手方遺伝子」を、単に「相手方遺伝子」とも称する。）に由来する塩基数との割合は、本発明における目的が達成される限りにおいて特に制限されるものではない。例えば、標的配列は、ＥＷＳ遺伝子由来の連続する３〜２４塩基と、相手方遺伝子由来の連続する３〜２４塩基（ただし、ＥＷＳ遺伝子由来の塩基と相手方遺伝子由来の塩基との合計が、１６〜２７塩基である。）とからなる。好ましくは、標的配列は、ＥＷＳ遺伝子由来の連続する６〜１９塩基と、相手方遺伝子由来の連続する６〜１９塩基（ただし、ＥＷＳ遺伝子由来の塩基と相手方遺伝子由来の塩基との合計が、２１〜２５塩基である。）とからなる。
【００２８】
より好ましくは、本発明に係るｓｉＲＮＡのガイド鎖は、ＥＷＳ遺伝子のエキソン７由来の連続する３〜２４塩基（好ましくは６〜１９塩基）と、Ｆｌｉ−１遺伝子のエキソン５由来またはエキソン６由来の連続する３〜２４塩基（好ましくは６〜１９塩基）とが連結したＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の、転座切断点を含む連続した１６〜２７塩基、より好ましくは連続した１９〜２６塩基、更に好ましくは連続した２１〜２５塩基を標的配列とする。すなわち、本発明に係るｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖が、ＥＷＳ遺伝子のエキソン７由来の連続する３〜２４塩基配列（好ましくは６〜１９塩基）と、Ｆｌｉ−１遺伝子のエキソン５由来またはエキソン６由来の連続する３〜２４塩基配列（好ましくは６〜１９塩基）とが連結したＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子の、転座切断点を含む１６〜２７塩基配列、より好ましくは１９〜２６塩基、更に好ましくは２１〜２５塩基配列、およびオーバーハングからなる。
【００２９】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列（配列：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣ−３’）を含み、パッセンジャー鎖が配列番号２で示される塩基配列（配列：５’−ＧＵＣＡＵＡＡＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＧＣ−３’）を含むことが好ましい。本発明の一実施形態では、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とし、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列を含む１９〜２６塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。
【００３０】
本発明における組成物の有効成分として含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列（配列：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣ−３’）および２〜５塩基のオーバーハングからなり、パッセンジャー鎖が配列番号２で示される塩基配列（配列：５’−ＧＵＣＡＵＡＡＧＡＡＧＧＧＵＵＣＵＧＣ−３’）および２〜５塩基のオーバーハングからなることがより好ましい。すなわち、本発明の一実施形態では、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とし、ガイド鎖が配列番号１で示される塩基配列および２〜５塩基のオーバーハングからなる二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５と、を含む、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物が提供される。当該オーバーハングは、例えば、ＵＵ、またはｄＴｄＴである（ｄＴ：デオキシチミジン）。
【００３１】
本発明で用いられるｍｉＲ−１４５はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の一種である。マイクロＲＮＡはノンコーディングＲＮＡの一種であり、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と相補的な配列領域を有する。生体内においては、ヘアピン構造を有する一本鎖ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから、酵素（Ｄｒｏｓｈａ）によって部分配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が切り出される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが前駆体となり、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ型酵素の一種であるＤｉｃｅｒによって約２０〜２５残基の成熟マイクロＲＮＡが切り出される。一般的に、切り出された成熟マイクロＲＮＡのうち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの５’末端側から発現するものを「−５ｐ」と、３’末端側から発現するものを「−３ｐ」と称する。成熟マイクロＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と結合することにより、当該ｍＲＮＡからの翻訳を阻害し、標的タンパク質の発現を抑制する。一般に、一つのマイクロＲＮＡは、複数のｍＲＮＡを標的とする場合が多い。
【００３２】
本発明で用いられるｍｉＲ−１４５は、単離されたものである。
【００３３】
ｍｉＲ−１４５は、ヒトの他、マウス、ゼブラフィッシュ、ラット、ブタ、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、ウシ、アフリカツメガエル等の多くの生物種においても見出されている。例として、ヒトｍｉＲ−１４５（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、配列番号３）のステムループ構造を以下に示す。太字部分は成熟ｍｉＲ−１４５部分（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−３ｐ（配列番号５））を示す。
【００３４】
【化１】
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【００３５】
本発明において用いられるｍｉＲ−１４５は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡのいずれであっても良いが、好ましくは成熟ｍｉＲＮＡである。また、マイクロＲＮＡは一般的に生物種間での保存性が極めて高いため、ｍｉＲ−１４５が由来する生物種も特に制限されないが、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞が由来する生物種と同一種であることが好ましい。より好ましくはヒト由来のユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞に対して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５が用いられ、さらに好ましくは成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５が用いられる。
【００３６】
二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−１４５は従来公知の核酸合成方法（例えば、核酸合成装置）により合成することができる。
【００３７】
本発明における組成物の有効成分としては、本発明に係るｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲ−１４５（以下、「本発明に係るｓｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ−１４５」を区別せず、両者を含む用語として「本発明に係る核酸分子」とも称する。）の発現ベクターも好ましく用いられる。かような発現ベクターとしては、適切なプロモーターを有するプラスミドベクター、ウイルスベクター等を、ベクターが導入される宿主に合わせて適宜選択し、プロモーターの下流に本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡを従来公知の手法により組込んだものを用いればよい。プロモーターとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が例示できる。
【００３８】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＳＩＮｓｉシリーズ、ｐＢＡｓｉシリーズ、ｐＳＩＲＥＮシリーズ（以上、タカラバイオ株式会社製）等が例示できる。プラスミドには、通常、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれる。
【００３９】
ウイルスベクターとしては、例えば、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が例示できる。
【００４０】
本発明に係るｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、パッセンジャー鎖をコードするＤＮＡとガイド鎖をコードするＤＮＡとが別々にプロモーターの下流にそれぞれ組込まれたもの（タンデム型）でもよく、パッセンジャー鎖相当領域をコードするＤＮＡとガイド鎖相当領域をコードするＤＮＡとがループ領域をコードするＤＮＡを介して連結されてひとつのプロモーターの下流に組込まれた上述のｓｈＲＮＡのようなもの（ショートヘアピン型）でもよい。
【００４１】
ｍｉＲ−１４５をコードするＤＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、および成熟ｍｉＲＮＡのいずれをコードするものであっても良い。
【００４２】
本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡの下流には、ターミネーターが含まれることが好ましい。
【００４３】
本発明に係る核酸分子をコードするＤＮＡのベクターへの組換え方法は、当業者に知られた手段によって行うことができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ９．４７−９．５８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等が参酌される。
【００４４】
本発明に係る組成物に含まれる二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の組成比は、任意の割合で設定できるが、好ましくは１：１〜１：５０（モル比）の比率であり、より好ましくは１：１〜１：３０（モル比）の比率であり、更に好ましくは１：１〜１：１０（モル比）の比率であり、特に好ましくは１：２〜１：１０（モル比）の比率である。上記のような割合で本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを組成物が含むことにより、肉腫細胞の増殖が特に効果的に抑制される。
【００４５】
ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを含むユーイング肉腫ファミリー腫瘍治療用組成物については、細胞増殖抑制効果の持続性をインビトロで確認することもできる。細胞増殖抑制効果の持続性は、例えば、ＴＣ−１３５、Ａ６７３、またはＲＤ−ＥＳのようなＥＷＳキメラ遺伝子を有する細胞株を、本発明に係る二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５にて、例えば実施例に記載の方法により処理し、細胞数を経時で計測することにより確認することができる。上記の細胞株は、例えばＡＴＣＣ等から購入することもできる。
【００４６】
本発明に係る組成物は、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを有効成分として、すなわち、所望の効果を発揮するのに充分な量（有効量）で含む。「有効量」とは、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、所望の治療効果を生じるために有効な作用物質の量を意味する。例えば、本発明に係る組成物の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。組成物が含む二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の量は、例えば組成物全体に対して、それぞれ０．００１重量％以上、好ましくはそれぞれ０．０１重量％以上である。上限は特に制限されず、本発明に係るｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５のみから組成物が構成されても良い（すなわち、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５との合計量が、組成物全体に対して１００重量％）。
【００４７】
本発明に係る組成物は、固体または液体での投与形態に応じて製剤化することができる。経口投与としては、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、カプセル剤、粉末薬、顆粒剤、およびペースト等が例示される。非経口投与としては、例えば、皮下、腹腔内、筋内もしくは静脈内注射のための製剤、または、膣内もしくは直腸内へ投与するための剤形へと製剤化されうる。本発明に係る組成物の有効成分は核酸分子であるため、好ましくは注射剤の形態として製剤化され、なかでもリポソーム−核酸分子が複合体化した形態に製剤化されることがさらに好ましい。
【００４８】
リポソームを用いることで核酸分子の細胞への取り込みが促進され、核酸分子の血中半減期を長期化することもできる。リポソームを調製する方法としては公知のものを採用することができ、例えばＦ．Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；９，  ４６７−５０８（１９８０）等が参酌される。
【００４９】
本発明に係る組成物は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる担体や、他の添加剤などを含んでもよい。また、本発明に係る組成物は、賦形剤などの添加剤と混合して非経口投与、または経口投与に適した形態で使用することができる。
【００５０】
「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。
【００５１】
「製薬上許容されうる担体」とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明に係る組成物を運搬または輸送することに関与する、液体または固体の製薬上許容されうる充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤、カプセル化材料、賦形剤、またはこれらの混合を意味する。製薬上許容されうる担体としては、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；トラガカント；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油脂；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液等が例示できる。
【００５２】
その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた、組成物中に存在してもよい。
【００５３】
製薬上許容されうる酸化防止剤の例には以下のものがある：アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤も必要に応じて含有させることができる。
【００５４】
非経口投与に好適な形態に製剤化された本発明に係る組成物は、本発明に係る核酸分子とともに、１つまたは複数の製薬上許容されうる溶媒、分散剤、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、等張化剤、および／または懸濁剤を含みうる。非経口投与用とする場合には、本発明に係る化合物を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理食塩水、リンガー溶液（リンゲル液）、ロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、グリセリンおよび界面活性剤等と適当に組み合わせた、水溶液、非水溶液、懸濁液、リポソームまたはエマルジョンとして製剤化され得る。好ましくは注射用滅菌水溶液として製剤化され、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内等に投与される。この際、製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨであることが好ましい。また、ローション剤、懸濁剤、乳剤等の液状製剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤、散剤、粉剤（粉状）、用事調製用の固形製剤、または貼付剤などの外用剤として、標的部位およびその周辺部位に経皮的に投与してもよい。さらに、坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。上述したうち、好ましい製剤や投与形態等は、担当の医師によって選択され得る。ローション剤、クリーム剤または軟膏などの半固形製剤は、本発明に係る核酸分子を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤および懸濁剤などからなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。
【００５５】
組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬や、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることもできる。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質を用いることにより、吸収持続性のある製剤になり得る。
【００５６】
本発明に係る組成物が治療対象とするユーイング肉腫ファミリー腫瘍の生物種は特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ等であるが、好ましくはヒトである。
【００５７】
本発明に係る核酸の投与量は、患者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定されうる。本発明においては、少なくとも細胞増殖抑制効果を得るために必要な１日あたりの有効成分の量を投与できるように、１日あたりの投与量を考慮し、組成物中の含有量を適宜設定することが好ましい。なお、本発明による組成物は、有効成分である二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを、成人（６０ｋｇ換算）一人に１日あたり、好ましくはそれぞれ１ｎｇ／６０ｋｇ〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ、より好ましくはそれぞれ１０ｎｇ／６０ｋｇ〜１００ｍｇ／６０ｋｇ、さらに好ましくはそれぞれ１００ｎｇ／６０ｋｇ〜１０ｍｇ／６０ｋｇの範囲で提供される量を含む。
【００５８】
本発明の別の側面においては、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とを使用する、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療方法に関する発明が提供される。本発明の更に別の側面においては、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍の治療用組成物の製造における、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−１４５の使用、が提供される。これらの実施形態においては、本発明に係る組成物に関する上述の説明が、適宜修正されて適用される。
【００５９】
有効成分であるＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５の投与経路は特に制限されず、経口、皮下、腹腔内、筋内、静脈内、膣内または直腸内へ投与されうるが、注射剤の形態で患部へ投与されることが好ましい。本発明に係る治療方法は、外科的治療、化学療法、免疫療法および／または放射線治療と組み合わせて行われても良い。
【００６０】
ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とは、同時に投与されても良く、または別々に投与され得る。患者の負担を考慮し、好ましくは、ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とが同時に投与される。ＥＷＳキメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１４５とが別々に投与される場合、投与経路は互いに異なってもよく、または同一でもよい。
【実施例】
【００６１】
本発明の効果を、以下の実施例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００６２】
＜試験１  二本鎖ｓｉＲＮＡ単独処置の場合＞
（細胞培養）
細胞実験には、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子（ＥＷＳのエキソン７／Ｆｌｉ−１のエキソン６）を保有するユーイング肉腫細胞株であるＴＣ−１３５（岐阜大学大学院連合創薬医療情報研究科創薬科学教室（岐阜市柳戸１番１）保有株）を用いた。ＴＣ−１３５は、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社より購入）中で、３７℃のインキュベーター（９５％空気／５％ＣＯ２）内で培養した。
【００６３】
（統計解析）
統計分析はグラフパッドプリズムソフトウェアシステム（グラフパッドソフトウェア社）を用い、両側スチューデントｔ検定により統計有意性を評価した。値は６〜１２ウェルの細胞を評価した平均±標準偏差として示した。
【００６４】
（トランスフェクション）
ＴＣ−１３５は、トランスフェクションの前日に任意の細胞数で６ウェルプレートに播種した。ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１キメラ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖の配列を、配列番号６に示す（ｓｉＥＦ、配列番号６：５’−ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＵＵＣＵＵＡＵＧＡＣｄＴｄＴ−３’）。なお、ｓｉＥＦは、ダーマコン社より購入した。また、対照区としては製品名：ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １（ダーマコン社製）を用いた。
【００６５】
二本鎖ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにはカチオン性リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭＡＸ、ライフテクノロジーズ社）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。
【００６６】
（細胞増殖）
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションした。ｓｉＥＦをトランスフェクションした時点を０時間目とし、その後、９６時間まで培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を経時で計測した。その結果を図２に示す（＊＊：ｐ＜０．０１  対対照区）。
【００６７】
図２に示す通り、ｓｉＥＦ処理によって生存細胞数は低減した。しかしながら、導入（トランスフェクション）から９６時間後（ｓｉＥＦ処理から９６時間後）には、ｓｉＥＦ処理した試験区においても細胞の有意な増殖が認められた。
【００６８】
（ウェスタンブロット）
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をセルスクレイパーで回収した。
【００６９】
氷冷した溶解バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％（ｗ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ−アルドリッチ社）中で細胞をホモジナイズし、氷上で２０分間静置した。ホモジネートを１３，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離した後、上清を全細胞タンパク質試料として採取した。試料中のタンパク質含有量は、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて測定した。
【００７０】
試料（１０μｇのタンパク質量）を１０．０または１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（パーキンエルマーライフサイエンス社）に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳液（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で調製）中で１時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。その後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ−Ｔで適度に希釈した抗Ｆｌｉ−１抗体（サンタクルズ社）と共に、４℃で膜を一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ−結合抗ウサギ、またはマウスＩｇＧ抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）と共に室温でさらにインキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで膜を３回洗浄した。免疫ブロットは、アマシャムＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。抗β−アクチン抗体（シグマ−アルドリッチ社）を用いて同じ膜を再インキュベートすることにより、β−アクチンを内部標準として用いた。
【００７１】
ウェスタンブロットの結果を図３に示す。ｓｉＥＦ単独処理によってＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現量は一定程度抑制されるものの、依然として強い発現が認められた。
【００７２】
（細胞周期の解析）
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５の細胞周期を、Ｔａｌｉ（登録商標）イメージサイトメーター（インビトロジェン社製）を用いて解析した。導入から４８時間後における、細胞周期の解析結果を図４に示す（＊：  ｐ＜０．０５  対対照区）。図４に示す通り、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、対照区に比べてＧ０／Ｇ１期の細胞が多く、Ｇ２／Ｍ期の細胞が少なかった。
【００７３】
抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（サンタクルズ社）、抗サイクリンＤ１抗体、抗ＣＤＫ６抗体、および抗ｐ２７抗体（以上、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５中に発現している各タンパク質の、導入から４８時間後における発現を、上記方法によりウェスタンブロットにて解析した。その結果を図５に示す。図５において、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現が低下していること、また、ＣＤＫ６およびｐ２７の発現が上昇していることが分かる。従って、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、導入から４８時間後においてＧ０／Ｇ１期で細胞周期が停止し、細胞増殖が一旦停止していることが示された。
【００７４】
（オートファジーおよびアポトーシスの解析）
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、導入から４８時間後に電子顕微鏡（製品名Ｈ−７６５０、日立ハイテクノロジーズ社製）にて観察した結果を図６に示す（Ａ：対照区２０００倍、  Ｂ：対照区４０００倍、  Ｃ：ｓｉＥＦ処理区２５００倍、  Ｄ：ｓｉＥＦ処理区４０００倍）。図６（Ａ）における四角で囲った領域を拡大した像が、図６（Ｂ）である。また、図６（Ｃ）における四角で囲った領域を拡大した像が、図６（Ｄ）である。図６に示す通り、ｓｉＥＦで処理した試験区では、オートファゴソームの存在が確認された。
【００７５】
抗ＬＣ３Ｂ抗体、抗Ａｔｇ３抗体、抗Ａｔｇ５抗体、抗Ａｔｇ７抗体、および抗Ａｔｇ１２抗体（以上、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５中に発現しているオートファジー関連タンパク質の、導入から４８時間後における発現を、上記方法によりウェスタンブロットにて解析した。その結果を図７に示す。図７において、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、ＬＣ３−１に対してＬＣ３−２の割合が増加していること、また、Ａｔｇ３の発現量が低下していることが分かる。従って、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、導入から４８時間後においてオートファジーが誘導されていることが示された。
【００７６】
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、バフィロマイシンＡ１（シグマ−アルドリッチ社）存在下（終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ）で４８時間培養し、細胞数を測定した。バフィロマイシンＡ１はリソソームとオートファゴソームとの融合を阻害する作用がある。ｓｉＥＦ処理した細胞をバフィロマイシンＡ１存在下で培養した場合、細胞増殖が促進されたときは、オートファジーの誘導によって細胞死が引き起こされていると考えられる。一方、ｓｉＥＦ処理した細胞をバフィロマイシンＡ１存在下で培養した場合、細胞増殖の促進が認められないときは、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられる。
【００７７】
解析の結果、バフィロマイシンＡ１存在下で培養した試験区において、細胞増殖の促進は認められなかった。従って、ｓｉＥＦ処理した細胞は、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられた。
【００７８】
ｓｉＥＦ（終濃度２０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、３−メチルアデニン（３ＭＡ、シグマ−アルドリッチ社）の存在下（終濃度１ｍＭ）で４８時間培養し、細胞数を測定した。３ＭＡはオートファゴソーム形成の阻害剤である。対照区（ｓｉＥＦ処理なし、３ＭＡ処理なし）における生存細胞数を１００％として算出した結果を図８に示す。図８より、ｓｉＥＦ処理した細胞を３ＭＡの存在下で培養することにより、生存細胞数が減少することが示された。従って、ｓｉＥＦ処理した細胞においては、オートファジーの誘導によってｓｉＥＦに対して細胞が耐性を獲得しているものと考えられた。
【００７９】
ｓｉＥＦ（終濃度２０ｎＭ）をトランスフェクションしたＴＣ−１３５を、３−メチルアデニンの存在下（終濃度１ｍＭ）で４８時間培養した場合における、アポトーシス関連タンパク質の発現をウェスタンブロットにて確認した。すなわち、抗ＬＣ３Ｂ抗体、抗Ａｔｇ３抗、抗Ａｔｇ５抗体、抗Ａｔｇ７抗体、および抗Ａｔｇ１２抗体（以上、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いて、上記方法によりウェスタンブロットを行った。その結果を図９に示す。図９より、ｓｉＥＦ処理した試験区において、活性型（切断型）カスパーゼ９や８の増加や、ＰＡＲＰの切断亢進は認められなかった。ｓｉＥＦ処理した試験区においては、カスパーゼ３の発現量が減少していた。
【００８０】
以上より、ｓｉＥＦにより処理した試験区では、オートファジーが誘導され、これによって導入から４８時間後においてＧ０／Ｇ１期で細胞周期が停止し、細胞増殖が一旦停止するものと推測された。また、ｓｉＥＦ処理ではアポトーシスは誘導されないため、オートファジーによる細胞器官の修復後、再び細胞が増殖を開始するものと考えられる。
【００８１】
＜試験２  ｍｉＲ−１４５単独処置の場合＞
（細胞増殖）
ｍｉＲ−１４５（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、配列番号４：５’−ＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵ−３’）のトランスフェクションは、試験１におけるｓｉＥＦと同様の方法により行った。なお、ｍｉＲ−１４５は、アプライドバイオシステムズ社より購入したものを用いた。
【００８２】
６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ〜１００ｎＭ）をトランスフェクションした。その後、４８時間培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を計測した。対照区における生存細胞数を１００％として算出した結果を、図１０に示す。図１０に示す通り、ｍｉＲ−１４５処理によって細胞増殖が一定程度抑制されるものの、効果は強くなかった。ｍｉＲ−１４５の濃度を高くした場合、４０ｎＭを上限として、生存細胞数は一定となった。
【００８３】
＜試験３  二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５の併用効果＞
（細胞増殖）
二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１４５のトランスフェクションは、試験１および２と同様の方法により行った。
【００８４】
２〜３×１０４細胞／ｍｌとなるように、６ウェルプレートにＴＣ−１３５を播種し、その翌日、ｓｉＥＦ（終濃度２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ）および終濃度４０ｎＭ  ｍｉＲ−１４５をトランスフェクションした。その後、導入から９６時間まで培養を行い、トリパンブルー染色法により生存細胞数を経時で計測した。その結果を図１１〜１３に示す（＊：ｐ＜０．０５  対ｓｉＥＦ／ｍｉＲ−１４５併用区）。図１１〜１３に示すように、驚くべきことに、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、導入から９６時間培養という長時間培養においても、生細胞数が優位に減少した。このことから、本発明に係るｓｉＲＮＡとｍｉＲ−１４５とを併用することにより、細胞増殖抑制効果の持続性が高くなることが示された。
【００８５】
（ウェスタンブロット）
ｓｉＥＦ（終濃度２ｎＭ）とｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ）とを併用した場合における、導入から１２０時間のＥＷＳ／Ｆｌｉ−１、ｃ−Ｍｙｃ、およびＬＣ３Ｂの発現に対する影響を、上記の方法によりウェスタンブロットにて確認した。その結果を図１４に示す。ｓｉＥＦ単独やｍｉＲ−１４５単独でもＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現は一定程度抑制された。しかしながら、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１の発現抑制効果が、相乗的に増強された。また、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、細胞増殖シグナルであるｃ−Ｍｙｃの発現も顕著に抑制された。ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５との併用によって、ＬＣ３−１に対するＬＣ３−２の割合が増加した。
【００８６】
ｓｉＥＦ（終濃度１０ｎＭ）とｍｉＲ−１４５（終濃度１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ）とを併用した場合における、導入から７２時間後のアポトーシス関連タンパク質発現への影響を、上記の方法によりウェスタンブロットにて確認した。その結果を図１５に示す。ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した試験区においては、カスパーゼの活性化は認められなかった。また、図１５より、ｍｉＲ−１４５単独（特に、終濃度４０ｎＭ）においてはＰＡＲＰの切断が認められたが、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した試験区においては同様の傾向は認められなかった。従って、ｓｉＥＦとｍｉＲ−１４５とを併用した場合、ｍｉＲ−１４５単独処理の場合とは異なる作用機構により細胞増殖が抑制されている可能性が考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
〔配列番号：１〕
ｓｉＲＮＡ。
〔配列番号：２〕
ｓｉＲＮＡ。
〔配列番号：６〕
ｓｉＲＮＡ。
ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子の説明：  １〜１９残基はＲＮＡ；２０〜２１残基はＤＮＡである。
【図１】
2016088884.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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