(57)【要約】【課題】セマフォリン３Ａ遺伝子発現増強剤及びセマフォリン３Ａタンパク産生亢進剤を提供する。【解決手段】オウゴン、アルニカ及びそれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オウゴン、アルニカ及びそれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするセマフォリン３Ａ遺伝子発現増強剤。
【請求項２】
オウゴン、アルニカ及びそれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするセマフォリン３Ａタンパク産生亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セマフォリン３Ａ遺伝子発現増強剤、及びセマフォリン３Ａタンパク産生亢進剤に関する。なお、本明細書ではセマフォリン３Ａを単に「Ｓｅｍａ３Ａ」と称する場合がある。
【背景技術】
【０００２】
セマフォリンは発生期の神経回路網形成に重要な役割を果たしていると考えられる分子群であり、その中で最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（非特許文献１）である。
【０００３】
Ｓｅｍａ３Ａは、神経突起伸長阻害活性を示し、また数ｎｇ／ｍｌの濃度で強い神経突起の成長円錐退縮を起こすことが知られており、神経回路網の形成時には反発性の抑制因子として機能していると考えられている（非特許文献２）。
【０００４】
近年の研究で、健常人の皮膚において主に表皮真皮境界部に分布する知覚神経線維がアトピー性皮膚炎やドライスキン等の過敏性肌では皮膚の表皮内まで伸長しており、この知覚神経線維の表皮内への侵入・増生が老人性掻痒症、並びにアトピー性皮膚炎やドライスキンにおける激しい痒みの発生の一因であると指摘されている（特許文献１）。こうした中で、アトピー性皮膚炎の患者は健常人よりもＳｅｍａ３Ａの遺伝子発現量が低下すること、治療後の患者ではＳｅｍａ３Ａの遺伝子発現量が健常人レベルまでに回復すること(特許文献２)、またＳｅｍａ３Ａタンパク質をアトピー性皮膚炎のモデルマウスに投与すると皮疹が改善し掻痒性も低減することが報告されており（特許文献３）、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの産生を亢進させることで、こうした皮膚疾患を予防または改善することが提案されている（特許文献４）。
【０００５】
また最近、Ｓｅｍａ３Ａが、破骨細胞の分化抑制と骨芽細胞の分化促進とを同時に行うことで骨量を増加する作用（骨保護作用）を示すことが明らかとなり、骨吸収抑制と骨形成促進の２つの側面を兼ね備えた薬剤としての治療への応用が期待されている（非特許文献３及び４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cell, 97，551（1999）
【非特許文献２】Neutron, 14，941（1995）
【非特許文献３】Nature, 485, 69-74,（2012）
【非特許文献４】ライフサイエンス新着論文レビュー  2012年5月17日（http://first.lifesciencedb.jp/archives/4789）
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３５０４１２号公報
【特許文献２】特開２００８−１０７２７５号公報
【特許文献３】特開２００８−２９７２４３号公報
【特許文献４】特開２０１１−１１１４１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前述する種々の有用な生理作用を有するＳｅｍａ３Ａの遺伝子発現を増強する作用を有するＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤を提供することを目的とする。また、Ｓｅｍａ３Ａの遺伝子発現を増強し、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの産生を亢進させる作用を有するＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねていたところ、オウゴン、及びアルニカに、上記Ｓｅｍａ３Ａの遺伝子発現を増強し、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの産生を亢進させる作用を有する成分が含まれていることを見出し、オウゴン、アルニカ、並びにそれらの加工物がＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤またはＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤の有効成分として有用であることを確認した。
【００１０】
本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであり、下記の態様を包含するものである。
項１．オウゴン、アルニカ、及びこれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤。
項２．上記加工物が、オウゴンの溶媒抽出エキス、またはアルニカの花を含む部位の溶媒抽出エキスである、項１記載のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤。
項３．オウゴン、アルニカ、及びこれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤。
項４．上記加工物が、オウゴンの溶媒抽出エキス、またはアルニカの花を含む部位の溶媒抽出エキスである、項３記載のＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤及びＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤によれば、Ｓｅｍａ３Ａの遺伝子発現を増強することで、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの産生を亢進することができるため、Ｓｅｍａ３ＡやＳｅｍａ３Ａタンパクが有する種々の生理作用（例えば、神経突起伸長阻害活性、神経突起の成長円錐退縮、破骨細胞の分化抑制作用、及び骨芽細胞の分化促進作用）を増強することができる。このため、Ｓｅｍａ３Ａの遺伝子発現の増強またはＳｅｍａ３Ａタンパクの産生の増量が必要若しくは有効とされる皮膚疾患や皮膚症状（例えばアトピー性皮膚炎やドライスキン等の過敏性肌）の予防や改善、または骨量減少による疾患や症状（例えば、骨粗鬆症）の予防および改善に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例１でクローニングしたＳｅｍａ３Ａ遺伝子上流のプロモーター領域の塩基配列を示す。
【図２】各種の植物エキスについてＳｅｍａ３Ａ遺伝子の転写活性（Ｓｅｍａ３Ａ発現増強作用）をルシフェラーゼアッセイで評価した結果を示す（実験例１）。
【図３】オウゴンエキス及びアルニカエキスについてＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用をリアルタイムRT-PCR法で評価した結果を示す（実験例２）。植物エキス添加から３時間後の結果を（Ａ）に、６時間後の結果を（Ｂ）に示す。
【図４】オウゴンエキス及びアルニカエキスについてＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進作用をＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す（実験例３）。
【図５】３次元表皮モデルを用いてオウゴンエキス（100 μg/ml、500 μg/ml）についてＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進作用をＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す（実験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤
本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤は、オウゴン、アルニカ、及びそれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
【００１４】
（１−１）オウゴン及びその加工物
オウゴンは、シソ科（Labiatae）のコガネバナ（Scutellaria baicalensis Georgi）の根の周皮を除いて乾燥したものであり、従来から、抗菌作用、解熱、利尿、抗アレルギー、解毒作用、及び肝機能の活性化などに効果があるとされ、また生薬（日本薬局方）として主に腸粘膜の炎症修復（健胃）や肺熱をさます目的で使用されている。収穫時期、加工及び調製方法の別によって、堅（丸軸、条ゴン、枝ゴン、子ゴン）、老根（枯ゴン、平ゴン）、及び破片（片ゴン）などの呼び名があるものの、本発明では、これらの別なく、全てをＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤の有効成分として用いることができる。
【００１５】
オウゴンは、本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤の形態や目的とする剤型に応じて種々の加工処理に供され、オウゴン加工物として調製することができる。ここで加工処理としては、粉砕処理、抽出処理、濃縮処理、乾燥処理、及び造粒処理などを挙げることができる。かかる処理によって調製されるオウゴン加工物として、粉砕加工物（粗粉砕物、粗粉末、細粒、細粉末などを含む）、溶媒で抽出して調製される抽出物（エキス）、その乾燥物（乾燥抽出物［乾燥エキス］）、さらにこれを粉末にした粉末乾燥エキスなどを挙げることができる。好ましくは、抽出物（エキス）、その乾燥物（乾燥エキス）、並びに粉末乾燥エキスを挙げることができる。
【００１６】
これらのオウゴン加工物は、当業界の慣用の加工方法に従って調製することができる。
【００１７】
例えば抽出物（エキス）は、オウゴン（コガネバナの周皮を除いた根の乾燥物）を、そのまま或いは必要に応じて、乾燥、細切、破砕、または圧搾処理したものを水（温水や熱水を含む）若しくは有機溶媒、あるいは水と有機溶媒の混合液等の抽出溶媒で抽出することにより取得することができる。この抽出に使用される有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ペンタン、ヘキサン、及びヘプタン等を挙げることができる。これらの有機溶媒は、１種単独または２種以上を組み合わせて用いることができ、さらにこれらを水と組み合わせて用いることもできる。上記抽出溶媒の中で、好ましくは水；メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール（より好ましくはエタノール）；あるいは水とこれらの低級アルコールとの混合液を挙げることができる。
【００１８】
かかる抽出物（エキス）の調製方法は、特に制限されるものではなく、常法に従って行うことができる。一例として、オウゴン粉砕物１重量部に対して１〜５００重量部、好ましくは５０〜２００重量部の水を加え、室温〜１００℃程度、好ましくは５０〜８０℃程度で撹拌しながら１〜３００分程度、好ましくは３０〜１８０分程度抽出を行った後、濾過により固形分を取り除く方法を挙げることができる。
【００１９】
斯くして得られる抽出物（エキス）は、オウゴンの可溶性成分が抽出溶媒に溶解した液状物である。これを乾燥して乾燥エキスを得る方法としては、減圧蒸留等により抽出溶媒を除去する方法、または減圧乾燥や凍結乾燥等の乾燥処理を施して抽出溶媒を除去する方法、噴霧乾燥処理などを挙げることができる。
【００２０】
なお、抽出物（エキス）は、必要に応じて、公知の分離方法（例えば、ゲル濾過、吸着処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等）に供して、より活性の高い画分として調製してもよいし、また公知の精製方法に供して脱臭または脱色されてもよい。
【００２１】
オウゴン及びその粉砕物は、市販されており、誰でも商業的に入手することができる。従って、抽出エキスを始めとするオウゴンの加工物は、市販のオウゴン及びその粉砕物を原料として調製することができる。
【００２２】
（１−２）アルニカ及びその加工物
アルニカ（Arnica、学名：Arnica montana）は、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であり、古くから打撲、捻挫、及び外傷等の治療、並びに静脈炎、関節炎、リウマチ及び虫刺されなどの炎症に対して効果があるとされている。
【００２３】
本発明において、その使用部位は特に制限されず、例えば全草、またはその一部（花、花穂、花弁、果皮、果実、根、根茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮又は種子）を広く用いることができる。好ましくは花、花穂、花弁、及びそれを含む部位である。
【００２４】
アルニカのこれらの部位は、前述するオウゴンと同様に、通常、乾燥後、本発明の    Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤の形態や目的とする剤型に応じて、種々の加工処理（粉砕処理、抽出処理、濃縮処理、乾燥処理、及び造粒処理など）に供され、アルニカ加工物として調製される。
【００２５】
かかる加工処理によって調製されるアルニカ加工物としては、例えば粉砕加工物（粗粉砕物、粗粉末、細粒、細粉末などを含む）、有機溶媒、水またはこれらの混合液などの溶媒で抽出した抽出物（エキス）、その乾燥物（乾燥エキス）、さらにこれを粉末にした粉末乾燥エキスなどを挙げることができる。好ましくは、抽出物（エキス）、その乾燥物（乾燥エキス）、並びに粉末乾燥エキスを挙げることができる。これらのアルニカ加工物は、オウゴン同様、当業界の慣用の加工方法に従って調製することができる。例えば、抽出物（エキス）の場合、その詳細は、前述するオウゴンエキスの調製方法の記載を参考にすることができる。
【００２６】
一例として、アルニカの花を含む部位の乾燥粉砕物１重量部に対して１〜５００重量部、好ましくは５０〜２００重量部の水を加え、室温〜１００℃程度、好ましくは５０〜８０℃程度で撹拌しながら１〜３００分程度、好ましくは３０〜１８０分程度抽出を行った後、濾過により固形分を取り除く方法を挙げることができる。
【００２７】
斯くして得られる抽出物（エキス）は、アルニカの可溶性成分が抽出溶媒に溶解した液状物である。これを乾燥して乾燥エキスを調製することもできる。具体的な乾燥方法は、オウゴンエキスに関して前述した通りである。
【００２８】
また、オウゴンと同様に、抽出物（エキス）は、必要に応じて、公知の分離方法（例えば、ゲル濾過、吸着処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等）に供して、より活性の高い画分として調製してもよいし、また公知の精製方法に供して脱臭または脱色されてもよい。
【００２９】
なおアルニカの植物（花部を含む）、及びその乾燥物若しくは乾燥粉砕物は、市販されており、誰でも商業的に入手することができる。従って、抽出物（エキス）はこれらの市販のアルニカ及びその乾燥粉砕物を原料として調製することができる。
【００３０】
（１−３）Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤
本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤は、前述するオウゴン、アル二カ、及びこれらの加工物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするものであり、斯くしてＳｅｍａ３Ａ遺伝子に対してその発現を増強する作用を発揮する（実験例１及び２参照）。オウゴン、アル二カ、及びこれらの加工物は１種単独で使用しても、また２種以上を任意に組み合わせて併用してもよい。
【００３１】
本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤は、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用を発揮し、そのＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用が有効に利用できるものであればよく、上記有効成分の含有量、形態、使用方法（適用対象）、及び投与方法（投与形態）などを特に問うものではない。例えば、経口的に投与（摂取）されるものに応用する場合は、例えば飲食物または経口医薬品などの経口組成物の形態に調製することができる。また経皮的に投与されるものに応用する場合は、例えば化粧料、または外用の医薬品若しくは医薬部外品等の外用組成物の形態に調製することができる。また、経皮以外に非経口的に投与されるものに応用する場合は、例えば注射剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などの形態に調製することができる。これらの形態を有するＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤は、オウゴン、アル二カ、及びこれらの加工物といった有効成分だけからなるものであってもよいし、また形態や用途に応じて、通常使用される添加剤などを配合して調製することができる。この場合、上記有効成分の含有量は、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用を発揮することを限度として１〜９９質量％の範囲から適宜選択調整することができる。
【００３２】
一例として、本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤を経口組成物に応用する場合、制限されないものの、錠剤、丸剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、散剤（粉末剤）、および顆粒剤（ドライシロップを含む）などの各種の固形製剤；または内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液状製剤などの、製剤で使用される通常の剤型に調製することができる。成分の安定性から、好ましくは固形製剤の形態（剤型）である。この場合、必要に応じて、製剤化のための添加物、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤などを配合することができ、また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にすることもできる。ペースト状の膠剤とすることもできる。
【００３３】
経口組成物にした場合の１日の目安摂取量（投与量）は、対象者の年齢、性別、体重、症状に応じて、適宜設定調整することができるが、例えば、成人（体重６０ ｋｇ）を対象とする場合、オウゴンエキス（乾燥物）またはアルニカエキス（乾燥物）の量に換算して、各々通常１０〜１００００ ｍｇの量を挙げることができる。
【００３４】
また本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤を化粧料や外用医薬品または医薬部外品などの外用組成物に応用する場合、上記の有効成分をそのまま外用組成物として使用してもよいし、また必要に応じて、下記の添加剤を配合して液状、乳液状、クリーム状、軟膏状、ゲル状、パック、エアゾールなどの各種の外用剤の剤型にすることができる。
【００３５】
製剤化は、皮膚外用剤（化粧品などを含む）の分野で採用されている通常の製剤化手法を適用することができる。さらに、必要に応じて、製剤化のための添加物、例えば、賦形剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤、顔料、香料などを配合することができ、また、保湿剤や美白剤そのほかの栄養成分を配合することもできる。
【００３６】
かかる本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤を外用組成物に応用する場合、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤に配合する植物加工物の割合としては、オウゴン加工物（乾燥物に換算）の場合は０．０００１〜１質量％、好ましくは０．０００２〜０．４質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％となるように、またアルニカ加工物（乾燥物に換算）の場合は０．００００７５〜０．７５質量％、好ましくは０．０００１５〜０．３質量％、より好ましくは０．０００７５〜０．１５質量％となるように調整することが望ましい。
【００３７】
Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤を外用組成物にした場合の１日の目安使用量（投与量）は、対象者の年齢、性別、体重、症状に応じて、適宜設定調整することができる。例えば、オウゴン加工物を固形物換算で０．０００１〜１質量％含むＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤の場合、１平方センチメートルあたり０．００５〜５０ ｍｇとなるように、対象の皮膚に適用することが好ましい。またアルニカ加工物を固形物換算で０．０７５〜０．７５質量％含むＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤の場合、１平方センチメートルあたり０．００３〜３８ ｍｇとなるように、対象の皮膚に適用することが好ましい。なお、外用組成物形態を有するＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤は、１日１回〜複数回、１週間以上、より好ましくは１０日以上皮膚などに提供することが好ましい。
【００３８】
（２）Ｓｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤
本発明のＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤は、オウゴン、アルニカ及びこれらの加工物よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
【００３９】
ここで使用するオウゴン、アルニカ及びこれらの加工物の種類や形態、並びにＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤の用量及び用法などの使用方法については、前述する（１）に記載した通りであり、当該記載を援用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実験例に限定されるものではない。また、特に記載のない限り「部」とは「重量部」を、「％」とは「重量％」を意味するものとする。
【００４１】
実施例１  オウゴンエキスの調製
オウゴンの根を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出を行い、得られた抽出液を濾過して、オウゴンエキスを得た。得られたオウゴンエキス中の固形物は2.28％であった。
【００４２】
実施例２  アルニカエキスの調製
アルニカの花を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液1リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、アルニカエキスを得た。得られたアルニカエキス中の固形物は1.63％であった。
【００４３】
比較例１  エイジツエキス
ノイバラの果実を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、エイジツエキスを得た。得られたエイジツエキス中の固形物は1.96％であった。
【００４４】
比較例２  エンメイソウエキス
ヒキオコシの地上部を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、エンメイソウエキスを得た。得られたエンメイソウエキス中の固形物は0.89％であった。
【００４５】
比較例３  ゲンチアナエキス
ゲンチアナの根を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、ゲンチアナエキスを得た。得られたゲンチアナエキス中の固形物は2.66％であった。
【００４６】
比較例４  ジオウエキス
ジオウの根を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、ジオウエキスを得た。得られたジオウエキス中の固形物は3.64％であった。
【００４７】
比較例５  シャクヤクエキス
シャクヤクの根を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、シャクヤクエキスを得た。得られたシャクヤクエキス中の固形物は5.06％であった。
【００４８】
比較例６  チョウジエキス
チョウジの花蕾を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、チョウジエキスを得た。得られたチョウジエキス中の固形物は0.33％であった。
【００４９】
比較例７  フキタンポポエキス
フキタンポポの花を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、フキタンポポエキスを得た。得られたフキタンポポエキス中の固形物は1.98％であった。
【００５０】
比較例８  ローズマリーエキス
ローズマリーの葉を乾燥させて細切したもの100 gを、50容量％濃度のエタノール水溶液１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら7日間抽出をおこない、得られた抽出液を濾過して、ローズマリーエキスを得た。得られたローズマリーエキス中の固形物は1.41％であった
実験例１  Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用（プロモーターアッセイ）
植物エキスとして、上記実施例１及び２で調製したオウゴンエキス及びアルニカエキスの他、上記比較例１〜８で調製したエイジツエキス、エンメイソウエキス、ゲンチアナエキス、ジオウエキス、シャクヤクエキス、チョウジエキス、フキタンポポエキス、及びローズマリーエキスを用いて、これら植物エキスのＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用をプロモーターアッセイによって評価した。
【００５１】
（１）試験方法：プロモーターアッセイ
（１−１）ヒトＳｅｍａ３Ａ遺伝子プロモーターの単離
ヒトＳｅｍａ３Ａ遺伝子のコード領域の既知のヌクレオチド配列に基づいて、5’-フランキング領域を、遺伝子特異的プライマー１(GSP1: 5’-TCTGATAGTTTGCTCTTGCTGTAAG-3’：配列番号１）と遺伝子特異的プライマー2 (GSP2：5’-AAGACAGACAATCCTAGTTAACCAG-3’：配列番号２)を使用して、Genome walker kit(Clontech, Mountain View)を用いて、そのマニュアルにしたがって増幅した。増幅後にPCR産物をpGEM-T-Easyベクター（Promega）内にクローン化し、ABI Prism310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて配列決定した。今回、クローニングしたＳｅｍａ３Ａ遺伝子上流のプロモーター領域の塩基配列（配列表の配列番号３）を図１に示す。
【００５２】
（１−２）Ｓｅｍａ３Ａプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物作成
Ｓｅｍａ３Ａプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を作成のため、PCRを以下の条件下、最初の変性９４℃にて４分間、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間を３０サイクル、そして最後に伸長７２℃にて５分間、鋳型であるpGEM-T-Ｓｅｍａ３Ａ-1444/-1ならびにKpnＩまたはHindIIIの為の制限酵素部位を含む1組の特異的なＳｅｍａ３Ａプライマー（Ｓｅｍａ３Ａ-1444 KpnＩおよびSema3A+1 HindIII）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物はKpnＩ及びHindIIIで消化し、そしてpGL3-Basicベクター（Promega）内にクローニングした。なお、pGL3-Basicべクターは、ホタルルシフェラーゼを含んでいる。構築物は、QIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN)を使用して調製した。
【００５３】
（１−３）NHEKを用いたＳｅｍａ３Ａプロモーターのルシフェラーゼアッセイ
正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）をKGM-GoldTM ケラチノサイト 増殖培地 BulletKitTM（Lonza）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で前培養した。２４well組織培養プレートに細胞播種後、７０〜８０％の細胞密度まで培養し、X-treamGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）と構築物0.5μgを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション効率を補正するために、全ての細胞にHSV-TKプロモーターの制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むpRK-TKベクター（Promega）を同時にトランスフェクションした。さらに培養し、トランスフェクションから２４時間後、試験試料（植物抽出エキス）を終濃度50 μg/mLで添加した。さらに培養し２４時間経過した後、各ウェルにPassive Lysis Buffer（Promega）を添加し、細胞を溶解した。ルシフェラーゼアッセイは、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用い、マニュアルに従って行った。得られた発光値をコントロールベクターの発光値で補正して、ルシフェラーゼ活性値を算出し、さらに無添加コントロールに対する活性比をＳｅｍａ３Ａ遺伝子の転写活性の指標として評価した。
【００５４】
（２）試験結果
結果を図２に示す。図２からわかるように、試験した植物エキスのうち、オウゴンエキスとアルニカエキスのルシフェラーゼ活性が強く、このことから、これらの植物エキスには、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子の転写活性を増強する作用があることが確認された。
【００５５】
実験例２  Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
上記実験例１の結果から植物エキスとして、上記実施例１及び２で調製したオウゴンエキス及びアルニカエキスを用いて、これら植物エキスのＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強作用をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって評価した。
【００５６】
（１）試験方法
正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）をKGM-GoldTM ケラチノサイト 増殖培地 BulletKitTM（Lonza）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で前培養した。１２ wellプレートにNHEK細胞を播種し、細胞密度が９０％程度まで培養し、各試験試料（オウゴンエキス、アルニカエキス）を添加した。さらに継続培養し、添加３時間、６時間後にNHEK細胞のtotal RNAを精製し、Ｓｅｍａ３Ａ、およびＲＰＳ１８についてリアルタイムRT-PCR解析を行った。またコントロール（無添加コントロール）として、植物エキスを添加しない系についても同様に解析を行った。なお、ＲＮＡ精製には、RNeasy mini kit（キアゲン社）を使用し、リアルタイムRT-PCR解析には、One Step SYBR（登録商標）PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit（タカラバイオ(株)）を用いた。データはＳｅｍａ３Ａを内在性コントロールであるＲＰＳ１８で標準化し、最終的に無添加コントロールに対する遺伝子発現比（相対値）として示した。
【００５７】
（２）試験結果
各試験試料（オウゴンエキス、アルニカエキス）をそれぞれ添加し３時間後、及び６時間後に測定したＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ量（無添加コントロールに対する相対値）を、それぞれ図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【００５８】
図３からわかるように、実施例１で測定したように、オウゴンエキス、及びアルニカエキスにはいずれもＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現量を増強する作用があることが確認された。またその作用は、オウゴンエキスのほうがアルニカエキスよりも強いことが確認された。
【００５９】
実験例３  Ｓｅｍａ３Ａタンパク産生亢進作用
植物エキスとして、上記実施例１及び２で調製したオウゴンエキス及びアルニカエキスを用いて、これら植物エキスのＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進作用をＥＬＩＳＡ法によって評価した。
【００６０】
（１）試験方法
正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）をKGM-GoldTM ケラチノサイト 増殖培地 BulletKitTM（Lonza）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で前培養した。NHEK細胞を１２ wellプレートに播種し、細胞密度が９０％程度まで培養し、試験試料（オウゴンエキス、アルニカエキス）を添加した。さらに培養を継続し、添加２４時間後に培養上清を回収した。培養上清中のＳｅｍａ３Ａタンパク濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した。またコントロール（無添加コントロール）として、植物エキスを添加しない系についても同様にＥＬＩＳＡ法を行った。なお、ＥＬＩＳＡ測定は、ELISA Kit for Semaphorin 3A（Cloud-Clone Corp.）を用い、そのマニュアルに従って行った。
【００６１】
（２）試験結果
各試験試料（オウゴンエキス、アルニカエキス）をそれぞれ添加し２４時間後に測定した培養上清中のＳｅｍａ３Ａタンパク濃度を図４に示す。図４からわかるように、オウゴンエキス、及びアルニカエキスにはいずれもＳｅｍａ３Ａタンパク産生量を増大する作用があることが確認された。またその作用は、オウゴンエキスのほうがアルニカエキスよりも強いことが確認された。
【００６２】
実験例４  ３次元表皮モデルを用いた評価
３次元表皮モデルを用いて実施例１及び２で調製したオウゴンエキスのＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進作用（用量依存性）をＥＬＩＳＡ法によって評価した。
【００６３】
（１）試験方法
3次元表皮モデル（SkinRthicTM RHE、以下RHE、Episkin社）をSkinEthic Growth Medium（Episkin社）を用い、マニュアルにしたがって培養した。馴化後、RHEの角層側から、試験試料として、PBS（溶媒コントロール）、オウゴンエキス（100μg/mL, 500μｇ/mL)をそれぞれ100 μL適用し、さらに継続培養した（各検体ｎ=3)。試料適用48時間後に培養液を回収し、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの定量に用いた。培養液中のＳｅｍａ３Ａタンパク濃度はELISA法によって測定した。測定にはELISA Kit for Semaphorin 3A（Cloud-Clone Corp.）を用いた。
【００６４】
（２）試験結果
結果を図５に示す。図５からわかるように、オウゴンエキスには用量依存的にＳｅｍａ３Ａタンパク産生量を増大する作用があることが確認された。
【００６５】
処方例
本発明のＳｅｍａ３Ａ遺伝子発現増強剤及びＳｅｍａ３Ａタンパク産生亢進剤の応用例として、下記の処方を示す。
【００６６】
処方例１：化粧水
グリセリン                                        ５（質量％）
エチルアルコール                                  ５
1,3-ブチレングリコール                            ３
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）  ０.５
パラオキシ安息香酸エチル                          ０.１
オウゴンエキス（実施例１）または
アルニカエキス（実施例２）                        １
精製水                                            残  量
合  計                                        １００.０。
【００６７】
処方例２：乳液
モノステアリン酸ポリオキシエチレン（20E.O.）ソルビタン  １（質量％）
トリオレイン酸ポリオキシエチレン（20E.O.）ソルビタン    ０.５
グリセリルモノステアレート                              １.５
ステアリン酸                                            ０.５
ベヘニルアルコール                                      ０.５
スクワラン                                              ５
ホホバオイル                                            ２
オリーブオイル                                          １
ヒアルロン酸ナトリウム                                  ０.５
カルボキシビニルポリマー                                ０.１
パラオキシ安息香酸メチル                                ０.１５
水酸化ナトリウム                                        ０.０５
オウゴンエキス（実施例１）または
アルニカエキス（実施例２）                              １
精製水                                                  残  量    
合  計                                              １００.０。
【００６８】
処方例３：クリーム
BG                                                        ７（質量％）
ステアリン酸PEG-40                                        ２
ステアリン酸グリセリル                                    ５
ステアリン酸                                              ２
セタノール                                                ２
スクワラン                                              １２
マカダミアナッツ油                                        ４
酢酸トコフェロール                                        ０.１
プロピルパラベン                                          ０.１
メチルパラベン                                            ０.２
オウゴンエキス（実施例１）または
アルニカエキス（実施例２）                                １
精製水                                                    残  量
合  計                                                １００.０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2016193863.tif 000005
【図５】
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【配列表】
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