(57)【要約】【課題】二本鎖ＲＮＡウイルスを効率よく逆転写及び逆転写産物の増幅が可能な方法を提供する。【解決手段】二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、
試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする相補的ＤＮＡの合成方法。
【請求項２】
前記工程（１）における加熱温度が、９５℃以上１１０℃未満である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）における加熱温度が、５０℃以上９０℃未満である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
下記（１）〜（４）の工程を含む試料中の二本鎖ＲＮＡを検出する方法。
（１）試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する工程
（２）前記工程（１）で得られた二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷し、次いで９０℃未満の温度で加熱した後急冷し、次いで逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程
（３）前記工程（２）で得られた一本鎖ＤＮＡを増幅する工程
（４）前記工程（３）で得られた増幅産物を検出する工程
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相補的ＤＮＡの合成方法、より詳細には二本鎖ＲＮＡから効率的に相補的ＤＮＡを合成する相補的ＤＮＡの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＲＶ（avian Orthoreovirus）などレオウイルス科に分類されるウイルスは、そのゲノム遺伝子が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）という特有の構造を有する。二本鎖ＲＮＡウイルスを鋳型とした相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成は、鋳型ＲＮＡ間で水素結合が形成されているためプライマーがゲノムの標的部位に効率よく結合することができず、相補的ＤＮＡの合成効率が低くなる。そのため、サーベイランス（流行状況調査）や検査に、二本鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子検査（ゲノム検出）を応用する場合には、合成効率の低下に伴う検出感度の低下や見逃し（偽陰性）に繋がるおそれがある。その問題を解決するためには、二本鎖ＲＮＡウイルスを鋳型とした相補的ＤＮＡの合成において、一本鎖ＲＮＡの場合とは異なる処理（変性処理）によりプライマーの結合を促す、若しくはウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮することにより、鋳型となるゲノム濃度を増加させて、相補ＤＮＡ合成効率の低下を補う必要がある。
【０００３】
このような変性処理として、非特許文献１には、ウイルスゲノム溶液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、ウイルスゲノムの水素結合の結合力を低下させた後に、９７℃で加熱処理及び急冷する手法が記載されている。
【０００４】
しかしながら、ＤＭＳＯの添加は、相補的ＤＮＡの合成反応やその後のＰＣＲ反応において、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの活性に対して抑制等の影響を及ぼす可能性がある。また、ＤＭＳＯは細胞毒性等を有する可能性があるため、その使用を控えることが好ましい。
【０００５】
非特許文献２には、抽出したウイルスゲノム溶液にForward primerを加えて、９９℃にて加熱処理した後に、急冷する手法が記載されているが、当該手法では相補的ＤＮＡ鎖の合成効率の向上が望まれた。
【０００６】
また、ウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮してＤＮＡ合成効率の低下を補うことにより、鋳型となるゲノム濃度を増加させる手法がある。当該手法では、ウイルス又は抽出したウイルスゲノムを濃縮する工程が労力を要するとともに、ウイルスゲノムの濃縮で一般的に用いられる有機溶媒の沈殿ではウイルスゲノムを減損する懸念される。また、検量体が低用量である場合には、濃縮効率が低下するおそれがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ウイルス下痢症検査マニュアル（第三版）
【非特許文献２】J. Virol Method 177 (2011) 75-79
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＭＳＯ添加やウイルスゲノム溶液の濃縮操作を用いることなく、レオウイルスゲノムのような二本鎖ＲＮＡを鋳型とした相補的ＤＮＡ合成（逆転写）及び逆転写産物の増幅が、効率的に行われる相補的ＤＮＡ合成方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは二本鎖ＲＮＡの解離及びプライマーの結合条件を検討した結果、加熱による鋳型二本鎖ＲＮＡの変性には高温、長時間の方が、効果が高いと考えられる予想に反し、二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷した後、より低温の９０℃未満で再度加熱後急冷するという変性条件を用いることにより、驚くべき事に、当該ＲＮＡへのプライマーの結合が促進され、相補的ＤＮＡの合成効率を向上させることができることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）に係るものである。
（ｉ）二本鎖ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する方法であって、試料から抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする相補的ＤＮＡの合成方法。
（ｉｉ）前記工程（１）における加熱温度が、９５℃以上１１０℃未満である（ｉ）に記載の方法。
（ｉｉｉ）前記工程（２）における加熱温度が、５０℃以上９０℃未満である（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の方法。
（ｉｖ）二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の方法。
（ｖ）下記（１）〜（４）の工程を含む試料中の二本鎖ＲＮＡを検出する方法。（１）試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する工程、（２）前記工程（１）で得られた二本鎖ＲＮＡとプライマーの混合液を、９５℃以上の温度で加熱した後急冷し、次いで９０℃未満の温度で加熱した後急冷し、次いで逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成する工程、（３）前記工程（２）で得られた一本鎖ＤＮＡを増幅する工程、（４）前記工程（３）で得られた増幅産物を検出する工程
（ｖｉ）二本鎖ＲＮＡが、レオウイルスゲノムである（ｖ）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の合成方法では、ＤＭＳＯ等の添加や濃縮操作を行うことなく、加熱及び急冷処理のみで二本鎖ＲＮＡの変性処理によりプライマーの結合を促して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成効率を向上させることができる。更に加熱及び急冷の処理のみを行うため、ウイルスゲノムの減損が生じるおそれがない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】増幅産物原液による電気泳動の結果を示す図である。
【図２】増幅産物１０倍希釈溶液による電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、鋳型として用いられるＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡであり、例えば二本鎖ＲＮＡをゲノムに持つレオウイルス科に分類されるウイルスの当該ゲノム等が挙げられる。なおレオウイルス科のウイルスとしては、レオウイルス属、ロタウイルス属、オルビウイルス属、コルチウイルス属、オルトレオウイルス属等のウイルスが挙げられる。
【００１４】
本発明において用いられる試料としては、二本鎖ＲＮＡを含有するものであれば特に限定されない。このような試料として、生体試料（血液、リンパ液、尿、細胞、組織等）、生体由来試料、環境試料、環境由来試料、排泄物試料、排泄物由来試料などが挙げられる。
【００１５】
試料から二本鎖ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、例えばフェノール、クロロホルム等の変性剤を試料に添加し、遠心分離等により抽出することが挙げられる。また、市販のＲＮＡ抽出・精製キット、例えばＲＮａｉｄ法（ＢＩＯ１０１０，Ｉｎｃ．フナコシ株式会社）、ＩｓｏｇｅｎＬＳ法（ニッポンジーン社）等のＲＮＡ抽出キットを用いることができる。
【００１６】
本発明の方法では、上記により抽出した二本鎖ＲＮＡとプライマーを混合して混合液とし、（１）９５℃以上の温度で加熱した後急冷する工程、（２）９０℃未満の温度で加熱した後急冷する工程、を順次行った後、逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡが合成される。
【００１７】
ここで、二本鎖ＲＮＡと混合するプライマーは、対象となるＲＮＡに対してアニーリングするようにデザインされたもの、好ましくは相補的ＤＮＡを鋳型としてこれを増幅可能なように設計されたものであることが好ましい。
【００１８】
上記（１）工程
本工程の加熱処理は、プライマーの存在下９５℃以上の温度で行われる。
加熱温度は好ましくは９７℃以上であり、温度範囲としては好ましくは９５℃以上１１０℃未満、より好ましくは９７〜１００℃である。処理時間は、例えば１〜６０分程度、好ましくは３〜３０分、より更に好ましくは５〜１０分とすることができる。
【００１９】
加熱処理した混合物を急冷処理する。
本発明において、「急冷」とは除熱をして所定の温度まで速やかに下げることであり、いずれの方法を用いても良いが、例えば氷上、目的の温度に冷却した溶媒若しくは金属ブロックに、反応容器を直接接触させることで行うことができる。
冷却温度は好ましくは１０℃以下の凍結しない温度、より好ましくは４℃以下の凍結しない温度であり、温度範囲としては好ましくは１０〜０℃、より好ましくは４〜１℃である。処理時間は、例えば１〜６０分程度、好ましくは３〜３０分、より更に好ましくは５〜１５分とすることができる。
【００２０】
本工程（１）の加熱処理により、二本鎖ＲＮＡを解離させ、急冷処理により解離した部分にプライマーを効率的に結合させることができる。
【００２１】
上記（２）工程
本工程の加熱処理は、９０℃未満の温度で行われる。
加熱温度は好ましくは７０℃以下であり、温度範囲としては好ましくは５０℃以上９０℃未満、より好ましくは６０〜７０℃である。処理時間は、例えば１〜６０分程度、好ましくは３〜３０分、より更に好ましくは５〜１５分とすることができる。
上記温度にすることにより、９５℃以上の加熱による鋳型ＲＮＡの分解を防ぎ且つ鋳型となるＲＮＡの高次構造を変性して逆転写効率を向上させることができる。
【００２２】
加熱処理後の抽出した抽出物を急冷処理する。
冷却温度は好ましくは１０℃以下、より好ましは４℃以下であり、温度範囲としては好ましくは１０〜０℃、より好ましくは４〜１℃である。処理時間は、例えば１〜６０分程度、好ましくは３〜３０分、より更に好ましくは５〜１５分とすることができる。
上記急冷処理により、変性したＲＮＡの高次構造が元の構造に戻ることなく、変性した状態を維持することができる。
【００２３】
本工程（２）の加熱・急冷処理により、穏やかな条件でＲＮＡの高次構造の変性を実施することができることで効率的な逆転写反応を達成できる。
【００２４】
相補的ＤＮＡの合成反応は、特に限定されないが、例えば上記処理したＲＮＡに対して、ｐＨ緩衝液、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、及び逆転写酵素等の逆転写反応液を添加して、約３７℃の湯浴等で３０〜９０分間インキュベートすることにより合成を行うことができる。
なお逆転写酵素としては、例えばMoloney Murine Leukemia Virus（Ｍ−ＭＶＬ）、Avian Myeloblastosis Virus（ＡＭＶ）、Rous associated virus（ＲＡＶ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素等を挙げることができる。
【００２５】
本発明における試料中の二本鎖ＲＮＡの検出方法においては、上述した相補的ＤＮＡの合成に続いて、得られた相補的ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡがＰＣＲ等により増幅されるが、相補的ＤＮＡの合成及びＤＮＡの増幅は、別々の反応系又は同一の反応系で行ってもよい。
【００２６】
なおＰＣＲ反応液には、例えばｐＨ緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことできる。ＰＣＲに使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを基点としてＤＮＡを合成する耐熱性にすぐれたポリメラーゼであり、例えばThermus aquaticus由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。
また、プライマーは、相補的ＤＮＡの合成に使用したものを用いることができ、その場合には、プライマーの枯渇を防ぐためにＰＣＲ反応溶液中に追添することができる。
【００２７】
増幅されたＤＮＡの検出方法としては、特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルの電気泳動、エチジウムブロマイド染色やサイバーグリーン染色等を用いた既知の方法で行うができ、例えば電気泳動では既知分子量のマーカーの移動度に対してのそれの移動度に基づいて、目的の増幅産物を同定することができる。
【００２８】
本発明の検出方法では、相補的ＤＮＡの合成効率を向上させることができ、レオウイルスの核酸検出法及び遺伝子タイピング等に広く応用可能である。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３０】
ＣＫ細胞にて増殖したトリレオウイルスより、QIAamp MinElute Virus Spin kit（QIAGEN社）を用いてウイルスゲノムを抽出した。
抽出方法は、まず滅菌チューブ（１．５ｍＬ）に検体０．２ｍＬを入れ、等量のLysis Buffer及び２５μＬのQIAGEN Proteaseを加えてボルテクスミキサーにて１５秒間攪拌した後、５６℃の湯浴中にて１５分間静置した。１５分間の静置後、更に０．２５ｍＬの１００％エタノール（和光純薬工業社）を加えて、室温で５分間静置して、この全量をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬのBuffer AW1をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬのBuffer AW2をスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、５００μＬの１００％エタノールをスピンカラムに加えて、６，０００×ｇにて１分間遠心分離した。フロースルー溶液を取り除き、１５，０００×ｇにて３分間遠心分離によりメンブレンを乾燥させた。５０μＬのBuffer AVEをスピンカラムに加えて室温にて１分間静置した後、１４，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離により得られた抽出液を回収して、これをウイルスゲノムとした。
【００３１】
抽出したウイルスゲノムに、S2 gene領域に結合するForward Primer（5’-ACT TCT TYT CTA CGC CTT TCG-3’）及びReverse Primer（5’-ATY AAW DCW CGC ATC TGC TG-3’）を添加して、下記の条件１）〜６）の処理によるｃＤＮＡの合成効率を比較した。
【００３２】
実施例
１）９９℃５分間→４℃２分間→６５℃５分間→４℃２分間
比較例
２）９９℃５分間→４℃２分間
３）９９℃５分間→４℃２分間→９９℃５分間→４℃２分間
４）９９℃１０分間→４℃２分間
５）１０％ＤＭＳＯ添加９７℃５分間→４℃２分間
６）非処理（対照）
なおＤＭＳＯ添加条件の場合５）は、加熱急冷処理後にForward Primer及びReverse Primerを添加した。ＤＭＳＯ添加加熱急冷処理により二本鎖ＤＮＡを解離させて、解離した状態のＲＮＡにプライマーを添加して逆転写反応を行った。
【００３３】
上記１）〜４）の処理溶液及び５）、６）の対照溶液を鋳型として、SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）にてＲＴ−ＰＣＲでｃＤＮＡ合成反応を行った。
【００３４】
逆転写反応は、まず上記溶液に、下記ＲＴ−ＰＣＲ反応液を加えた。なお、反応条件は５５℃、６０分でｃＤＮＡ合成反応を行い、その後９４℃、２分で逆転写酵素を不活化した。
【００３５】
【表１】
2016010316.tif 000002
【００３６】
その後、Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社）にてｃＤＮＡの増幅反応を行った。
なお、反応条件は９４℃２分間処理後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の処理を４０サイクル行い、最後に７２℃７分間のポリメライゼーションを行った。
【００３７】
【表２】
2016010316.tif 000003
【００３８】
ｃＤＮＡ増幅反応後、１．５％アガロースゲルにより約９０分間の電気泳動及びサイバーグリーン(Invitrogen社)染色にて、各条件の増幅産物を比較した。その結果を図１、２に示す。
電気泳動は、1.5% Agarose（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用し、Tris Acetate-EDTA buffer（0.04M Tri-004M Acetic acid -0.001M EDTA, pH8）で１００Ｖ約９０分間電気泳動後，ルミノイメージアナライザーＬＡＳ−３０００（ＧＥヘルスケア社）にてバンドのサイズを確認した。
【００３９】
図１、２の結果より、実施例は、比較例に対して６２６ｂｐのバンドが最も明確に確認でき、従来の方法であるＤＭＳＯ添加及び９７℃の加熱処理の条件５）に比べても、ｃＤＮＡ合成量が向上することが判る。
【図１】
2016010316.tif 000004
【図２】
2016010316.tif 000005