(57)【要約】【課題】肥満症、メタボリック・シンドローム、糖尿病、脂質異常症、高血圧症又は動脈硬化の病態解明と診断薬・治療薬のスクリーニングのために必要な培養細胞の提供を目的とする。【解決手段】正常脂肪細胞又は正常脂肪組織、あるいは肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織を圧縮して培養することにより、所望の病態の肥満脂肪細胞と同様の細胞(組織)を作製できることを見出した。その結果、この圧縮脂肪細胞（組織）を用いることにより、メタボリック・シンドローム等を治療できる化合物を、より生体に近い系でスクリーニングできる新しい方法が可能になった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織を圧縮培養して作製される、病的状態の細胞モデルとしての圧縮細胞又は圧縮組織であって、
ａ）上記圧縮培養における加圧が、０．０７〜１．６ｇ／ｃｍ２であるか、
細胞や組織の圧縮率が２〜９０％である、
ｂ）上記圧縮細胞又は圧縮組織は、圧縮前の細胞と同じ容量であり、かつ、
圧縮前より病的状態が亢進している細胞の機能を示すものである
ことを特徴とする、圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項２】
上記細胞又は組織が正常脂肪細胞又は正常脂肪組織であることを特徴とする、請求項１に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項３】
上記病的状態が亢進している細胞の機能が、１００μｍ〜１５０μｍの肥満状態の脂肪細胞と同じ機能を示すものであることを特徴とする、請求項２に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項４】
上記正常脂肪細胞又は正常脂肪組織が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞又は組織、ラット脂肪細胞又は組織、ヒト脂肪細胞又はヒト脂肪組織である、請求項２又は３に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項５】
マウス脂肪組織が、マウス正常脂肪組織である、請求項４に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項６】
上記マウス正常脂肪組織が、マウスの生殖腺脂肪組織である、請求項５に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項７】
上記脂肪細胞又は脂肪組織が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、請求項１に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項８】
上記病的状態が亢進している細胞の機能が、更に病態の悪化した肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織の機能を示すものであることを特徴とする、請求項７に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項９】
上記肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織が、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織である、請求項７に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項１０】
上記加圧が、１．６ｇ／ｃｍ２である、請求項７〜９のいずれかに記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【請求項１１】
上記請求項２〜１０に記載の圧縮脂肪細胞又は圧縮脂肪組織を使用し、
更に評価薬剤との共存下で培養することにより、上記脂肪細胞又は脂肪組織における脂肪細胞機能を評価することによる、肥満症、メタボリック・シンドローム、糖尿病、脂質異常症、高血圧症または動脈硬化の病態、診断、治療に係る化合物の評価方法。
【請求項１２】
上記脂肪細胞機能を評価するための指標としてのアディポサイトカインが、アディポネクチン、ＭＣＰ−１またはＩＬ−１２αである、請求項１１に記載の化合物の評価方法。
【請求項１３】
薬剤と共に脂肪酸が添加されている、請求項１１または１２に記載の化合物の評価方法。
【請求項１４】
上記脂肪酸が、飽和脂肪酸である、請求項１３に記載の化合物の評価方法。
【請求項１５】
上記飽和脂肪酸がパルミチン酸である、請求項１４に記載の化合物の評価方法。
【請求項１６】
細胞と細胞外基質との間に間隙を有することを特徴とする、細胞圧縮において細胞に加圧が掛からない圧縮抵抗性の細胞または組織であって、
上記間隙が細胞外基質タンパクが３０−５０％減少することにより、
加圧により、細胞の生化学的な変化が生じない
ことを特徴とする、圧縮抵抗性の細胞または組織。
【請求項１７】
上記細胞外基質タンパクがコラーゲンである請求項１６に記載の圧縮抵抗性の細胞または組織。
【請求項１８】
上記コラーゲンが、コラーゲンＶＩである、請求項１６に記載の圧縮抵抗性の細胞または組織。
【請求項１９】
圧縮認識機構が阻害されていることを特徴とする、圧縮抵抗性の圧縮細胞または組織であって、
加圧により、細胞の生化学的な変化が生じない
ことを特徴とする、圧縮抵抗性の圧縮細胞または組織。
【請求項２０】
上記圧縮認機構がＮＦ−ｋＢ、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫに関するものである、請求項１８に記載の圧縮細胞または組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工的な圧縮培養条件下で得られた新たな圧縮細胞又は圧縮組織に関するものであり、更には、その圧縮細胞又は圧縮組織を使用した、薬剤の作用若しくは副作用を評価するスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、様々な力学的刺激による影響を受け、機能や形態、運動能が変化することが知られている（非特許文献１、２）。例えば、細胞培養基板の弾性率が間葉系幹細胞の分化に影響を与えることが明らかになっている(非特許文献1)。
また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に代表される再生医療の基礎研究が１９９０年代から急速に進歩し、それらを応用した細胞移植医療（再生医療）の実用化が期待されている。これらの研究の進展に伴って、細胞の増殖だけでなく、分化や３次元化（立体的な組織化）と言った細胞加工（セルプロセッシング）が必要になって来ている（非特許文献３）。
【０００３】
そこで、３次元化した培養方法が検討され、培養培地として市販され始めている（住友ベークライト社製「セルフィーユ」）。しかしながら、一般の簡便な細胞培養方法は、ゲル上での平面（２次元）培養方法であるため、種々の培養培地の力学的影響を評価する場合にも、２次元培養方法の中で評価検討されることが一般的であった（特許文献１，２）。
そのため、培養して得られる細胞や組織は、生体に存在する細胞や組織とは異なった性状のものになるものが多く、それを薬剤のスクリーニングに使用しても、的確な評価を得ることが難しいという状況であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３２１６６号公報
【特許文献２】特開２０１２−１０６００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Engler et al., Cell 126, 677-689, 2006.“Matrixelasticity directs stem cell lineage specification.”
【非特許文献２】水野大介ら、生物物理、５１（１），０１４−０１７（２０１１）「細胞の力学知覚の物理メカニズム」
【非特許文献３】高木睦、生物工学会誌、第９０巻、第１号，２７−２７（２０１２）「新分野セルプロセッシング工学の展開」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、種々の疾患モデルとして薬剤のスクリーニングに使用可能な、人工的に作成された圧縮細胞又は圧縮組織を提供することを目的とする。特に脂肪組織の慢性炎症に基づく肥満症、糖尿病、メタボリック症候群、脂質異常症、高血圧、動脈硬化症などの治療剤のスクリーニング用の圧縮細胞又は圧縮組織を提供すると共に、新たな治療方法として、慢性炎症部位の肥満脂肪組織の細胞外基質タンパク密度を低下させることによる、細胞内圧の緩和・解消方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、既に、間葉系幹細胞を用いて、各種の弾性率を持つ２次元ゲル培地で培養することにより、色々な細胞に分化した培養細胞を作製できることを報告している（特許文献１）。更に、正常脂肪組織と同じ硬さ（２５０Ｐａ）を持つ２次元ゲル培地の上で、パルミチン酸のような飽和脂肪酸の存在下に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を培養すると、脂肪細胞が肥大化するに係らず、２次元ゲル培地の硬さが培養細胞に影響して、インスリン抵抗性が惹起されない（インスリン感受性が維持される）細胞になることを報告してきた（特許文献２）。
【０００８】
上記のように、本発明者は、培養細胞の性状に対して力学的な環境が大きな影響を与えることを明らかにしたが、これまでの２次元ゲル培地の硬さ以外に、更にどのような因子が培養細胞の性状に影響するかを鋭意検討した。その結果、培養時において、細胞に加圧圧縮を行うと、細胞の性状が変化することを見出した。例えば、正常脂肪細胞又は正常脂肪組織を使用して加圧圧縮して培養すると、得られた脂肪細胞は正常の脂肪細胞と同じ容量（肥満脂肪細胞に見られる肥大化を伴わない）であるものの、脂肪細胞の機能は肥満脂肪細胞と同様の機能を示すことが分かった。
このように、正常脂肪細胞を高カロリー状態で膨張させて肥満脂肪細胞に誘導するのではなく、驚いたことに、正常脂肪細胞を圧縮することによって肥満状態の脂肪細胞と同じ機能を示す脂肪細胞・脂肪組織が、初めて作製できた。即ち、正常脂肪細胞や正常脂肪組織の人工的な三次元圧縮によって、肥満状態の脂肪細胞と同じ機能を示す新たな圧縮脂肪細胞・圧縮脂肪組織が生み出された。
それ故、この圧縮培養の脂肪細胞又は脂肪組織は、肥満状態の脂肪細胞と同じ機能を示すことから、肥満脂肪細胞や肥満脂肪組織の代替として、薬剤の作用や副作用の評価スクリーニングに使用できることが分かった。本発明者は、以上の知見に基き本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）細胞又は組織を圧縮培養して作製される、病的状態の細胞モデルとしての圧縮細胞又は圧縮組織であって、
ａ）上記圧縮培養における加圧が、０．０７〜１．６ｇ／ｃｍ２であるか、
細胞や組織の圧縮率が２〜９０％である、
ｂ）上記圧縮細胞又は圧縮組織は、圧縮前の細胞と同じ容量であり、かつ、
圧縮前より病的状態が亢進している細胞の機能を示すものである
ことを特徴とする、圧縮細胞又は圧縮組織。
（２）上記細胞又は組織が正常脂肪細胞又は正常脂肪組織であることを特徴とする、上記（１）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（３）上記病的状態が亢進している細胞の機能が、１００μｍ〜１５０μｍの肥満状態の脂肪細胞と同じ機能を示すものであることを特徴とする、上記（２）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（４）上記正常脂肪細胞又は正常脂肪組織が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞又は組織、ラット脂肪細胞又は組織、ヒト脂肪細胞又はヒト脂肪組織である、上記（２）又は（３）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（５）マウス脂肪組織が、マウス正常脂肪組織である、上記（４）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（６）上記マウス正常脂肪組織が、マウスの生殖腺脂肪組織である、上記（５）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
【００１０】
（７）上記細胞又は組織が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、上記（１）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（８）上記病的状態が亢進している細胞の機能が、更に病態の悪化した肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織の機能を示すものであることを特徴とする、上記（７）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（９）上記肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織が、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織である、上記（７）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（１０）上記加圧が、１．６ｇ／ｃｍ２である、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の圧縮細胞又は圧縮組織。
（１１）上記（２）〜（１０）に記載の圧縮細胞又は圧縮組織を使用し、
更に評価薬剤との共存下で培養することにより、上記細胞又は組織における細胞機能を評価することによる、肥満症、メタボリック・シンドローム、糖尿病、脂質異常症、高血圧症または動脈硬化の病態、診断、治療に係る化合物の評価方法。
（１２）上記脂肪細胞機能を評価するための指標としてのアディポサイトカインが、アディポネクチン、ＭＣＰ−１またはＩＬ−１２αである、上記（１１）に記載の化合物の評価方法。
（１３）薬剤と共に脂肪酸が添加されている、上記（１１）または（１２）に記載の化合物の評価方法。
（１４）上記脂肪酸が、飽和脂肪酸である、上記（１３）に記載の化合物の評価方法。
（１５）上記飽和脂肪酸がパルミチン酸である、上記（１４）に記載の化合物の評価方法。
（１６）細胞と細胞外基質との間に間隙を有することを特徴とする、細胞圧縮において細胞に加圧が掛からない圧縮抵抗性の細胞または組織であって、
上記間隙が細胞外基質タンパクの密度が３０−５０％減少することにより、
加圧により、細胞の生化学的な変化が生じない
ことを特徴とする、圧縮抵抗性の細胞または組織。
（１７）細胞外基質タンパクがコラーゲンである、上記(１６)に記載の圧縮抵抗性の細胞または組織。
（１８）上記コラーゲンが、コラーゲンＶＩである、上記(１６)に記載の圧縮抵抗性の細胞または組織。
（１９）圧縮認識機構が阻害されていることを特徴とする、圧縮抵抗性の圧縮細胞または組織であって、
加圧により、細胞の生化学的な変化が生じない
ことを特徴とする、圧縮抵抗性の圧縮細胞または組織。
（２０）上記圧縮認機構がＮＦ−ｋＢ、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫに関するものである、上記（１８）に記載の圧縮細胞または組織。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で得られる人工的圧縮細胞あるいは圧縮組織（例えば、圧縮脂肪細胞又は圧縮脂肪組織の場合）は、人工的に脂肪細胞あるいは脂肪組織に圧縮ストレスを与えて作製される、所望の病態モデル（肥満脂肪細胞あるいは肥満脂肪組織）になるものである。即ち、正常脂肪細胞又は正常脂肪組織を加圧圧縮して培養することにより、細胞の容量としては脂肪細胞の肥大化がないものの、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織と同様の機能を示すものが作製できる。また、加圧の程度に応じて、所望の病態の肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織と同様の性状のものが簡易に作製できる。
更には、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織を圧縮して培養することにより、所望の病態の肥満脂肪細胞と同様の細胞(組織)を人工的に容易に作製することができる。
以上のことから、本発明の人工的脂肪細胞あるいは脂肪組織を用いて、病態に応じた化合物のスクリーニングが容易に実施できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、２５０Ｐａの硬さを持つ細胞培養培地（２次元ゲル）で培養した場合のＭＣＰ-１の分泌量を示すとともに、上記２次元ゲルを重ねて、２つのゲルに細胞を挟んで（疑似３次元ゲルで）培養した場合のＭＣＰ-１の分泌量を示した図である。ＭＣＰ-１の分泌量は、疑似３次元ゲルの場合に、２次元ゲルの約２倍の分泌量を示すことが明らかになった。このことは、疑似３次元ゲルの場合、培養細胞に負荷されるゲルの重みにより、力学的なストレスが細胞に発生し、ＭＣＰ-１の分泌量がより増大したことが明らかにされた。
【図２】マウスの生殖腺脂肪組織に５．７６ｃｍ２のカバーガラス（０．２ｇ）を乗せ、それぞれ０、３、６、９ｇの重石を置いて、０．２、３．２、６．２、９．２ｇ／５．７６ｃｍ２の４段階の負荷を掛けて培養した。その４段階の場合に生じるＭＣＰ-１の分泌量の変化を示した図である。コントロールとして、痩せ型の野性型マウスの正常脂肪組織を使用し、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織との対比を行った。正常脂肪組織に９．２ｇ／５．７６ｃｍ２の負荷を掛けると、肥満脂肪組織と同様のＭＣＰ-１の分泌量を示すことが明らかとなった。
【図３】マウスの生殖腺脂肪組織の動的剛性率を示した図である。痩せ型の野性型マウスの正常脂肪組織は約１１０Ｐａの値を示し、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織は約２６０Ｐａの値を示すことが明らかとなった。
【図４】ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織をコラゲナーゼで処理し、肥満脂肪組織のコラーゲンを除去した。コラゲナーゼの処理時間により、肥満脂肪組織のコラーゲンの含量が低下する。図４は、肥満脂肪組織のコラーゲンの含量が低下するに従い、肥満脂肪組織の硬さが低下することを示した図である。肥満脂肪組織のコラーゲン含量が低下すれば、肥満脂肪組織の硬さが低下することが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
−本発明の第１態様―
本発明の第一の態様は、圧縮細胞及び圧縮組織に関するものである。
本発明の「細胞又は組織」とは、特に限定されるものではないが、生体から採取される健常または病的な状態の細胞又は組織のことであり、あるいは動物細胞の確立された細胞株のことを言う。例えば、脂肪細胞、筋肉細胞、肝臓細胞等の分化された細胞のことを言う。
本発明の「圧縮培養」とは、加圧して（加重を掛けて）圧縮しながら培養することを言う。
本発明の「病的状態の細胞」とは、正常な細胞又は正常な組織と異なり、正常な代謝機能や形状を示さない細胞のことを言う。なお、病的状態にも軽度、重度と幾つかの段階があるが、細胞や組織の正常値の範囲を逸脱した形状（容量）や性質を示す細胞を病的状態の細胞という。例えば、脂肪細胞の場合、病的状態の細胞とは、肥満脂肪細胞のことをいう。従って、本発明の細胞圧縮により作製された病的状態の細胞は、病態モデルの細胞として、簡易に作製でき、スクリーニング方法に汎用することができる。
本発明の「病的状態が亢進している」とは、細胞の病的状態の程度が進行し、代謝機能や形状の正常域からの逸脱の程度が大きくなったことをいう。
本発明の「圧縮率」とは、圧縮前後の圧縮方向におけるサイズ変化のことをいい、２〜９０％の範囲を挙げることができる。使用する細胞によって、圧縮率の限界は異なるが、例えば正常脂肪細胞又は正常脂肪組織の場合には、２〜２０％が好ましい。
本発明の「正常脂肪細胞」とは、哺乳動物の正常脂肪細胞のことをいい、例えばマウス線維芽細胞由来の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞、ラット脂肪細胞、ヒト脂肪細胞の正常脂肪細胞を挙げることができる。
本発明の「脂肪組織」とは、上記脂肪細胞の集積した組織部分のことを言う。例えば、マウスの場合、皮下脂肪組織または生殖腺脂肪組織のことを挙げることができる。
本発明の「肥満脂肪細胞」とは、中性脂肪の貯蔵を行なって肥大化した成熟脂肪細胞のことを言う。肥大した脂肪細胞の細胞直径は、１００μｍ以上であり、最大でも１３０〜１４０μｍである（杉原甫、第１２４回日本医学会シンポジウム記録集・肥満の科学、７１−８１頁（２００４年））。一方、通常の脂肪細胞（ＢＭＩ２０〜２２の普通体重者）の細胞直径は、７０〜９０μｍであった。このように、通常の脂肪細胞と肥大化した脂肪細胞では、細胞直径が顕著に異なっている。また、形態的にも、肥大化した脂肪細胞では、細胞が多面体の形状を取るが、通常の脂肪細胞では、脂肪細胞は球形で細胞相互間に隙間があり、例えばぶどう型の形状を示している。
本発明の「肥満脂肪組織」とは、例えばｏｂ／ｏｂマウスの生殖腺脂肪組織などのことを言い、肥満脂肪細胞が多数存在する組織のことを言う。
本発明の「コラーゲン」とは、例えばＩ〜ＩＸ型のコラーゲンを挙げることができる。好ましいものとしては、コラーゲンＩおよびＶＩを挙げることができる。
本発明の「加圧」とは、例えば５．７６ｃｍ２のカバーグラス（０．２ｇ）の上に設置される重石として、０〜９ｇの範囲（０．０４〜１．６ｇ／ｃｍ２）であり、好ましくは０．０７〜１．１ｇ／ｃｍ２の範囲を挙げることができる。圧縮としては、２〜９０％の圧縮率の範囲であることが望ましい。より好ましくは２〜２０％の圧縮率を挙げることができる。
更には、カバーグラス、寒天培地や２次元ゲル培地などの固形状の培地を使用し、それを上下のサンドイッチ状にすることにより、その間に挟まれた培養細胞に培地の自重による荷重（圧力）を与えることができる。または三次元培地内で細胞を培養し、培地に加重（圧力）を与えることができる。使用する固形状の培地は、それぞれ目的に応じて、所望の形状と自重を持つものを選択することができる。
【００１４】
本発明の「圧縮脂肪細胞又は圧縮脂肪組織」とは、圧縮培養によって新たに作製された人工的な脂肪細胞・脂肪組織のことをいう。本発明の圧縮脂肪細胞・圧縮脂肪組織では、脂肪細胞あるいは脂肪組織の脂肪細胞が肥満する際に見られる脂肪細胞の肥大化を示すことなく、細胞の機能が肥満後の脂肪細胞又は脂肪組織と同様の機能を示している。即ち、インスリン抵抗性を増大させる単球走化活性因子（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１２α、ＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、レジスチンなどのアディポカインの分泌が、肥満脂肪細胞又は脂肪組織と同様に増大している。
即ち、この人工的な脂肪細胞・脂肪組織は、細胞サイズの肥大化を伴うことがなく、中性脂肪の蓄積も見られない。また、細胞外基質成分も正常脂肪細胞と同じであった。しかし、この人工的な脂肪細胞・脂肪組織の機能に関しては、肥満脂肪細胞・肥満脂肪組織と同様のアディポサイトカインの合成・分泌パターンを示しており、ＮＦkＢの活性化が起きていた。また、低分子量ＧＴＰ結合タンパクＲｈｏ、ＲＯＣＫ、ミオシン軽鎖キナーゼの活性化も起きており、肥満脂肪細胞・肥満脂肪組織と同様の状態であった。
本発明の「培養」とは、通常の細胞培養に用いる培養のことを表わすと共に、生体内環境下で脂肪組織に加圧圧縮を掛けて留置すること、更には寒天培地や２次元ゲル培地などの二次元培養用培地を２枚重ねて（疑似３次元ゲル化し）、その間に細胞を播種して培養すること、あるいは三次元培養培地で細胞を培養することを意味し、特に限定されるものではない。例えば通常の細胞培養の場合では、ＤＭＥＭ培地のような一般的なものであってもよく、また、目的に応じて、脂肪酸などの添加物を加えることができる。
本発明の「圧縮抵抗性」とは、細胞圧縮時において、細胞の機能に影響が表れ難い性質のことを言う。即ち、圧縮抵抗性には、細胞圧縮の力学的刺激の伝達メカニズムが物理的に及ばない場合と、圧縮認識に関わる信号伝達物質間の情報伝達が生化学的に行われない場合の２つの原因がある。例えば、物理的に及ばない状況としては、細胞と細胞周囲の細胞外基質との間に間隙があり、間隙あるいは間隙に存在する液体などの物質が細胞外基質に加えられた圧縮による力学的負荷を吸収する事態で発生する。この場合、細胞外基質に圧縮が加えられても細胞の圧縮認識機構（インテグリン、アクチン、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫ、ＮＦ−ｋＢ）の圧縮による活性化などの生化学的な変化は発生しない。  本発明の「圧縮認識機構が阻害されている」とは、細胞圧縮の力学的刺激が圧縮認識に関わる信号伝達物質間の情報伝達が阻害されることをいう。例えば、ＮＦ−ｋＢ、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫに関する情報伝達メカニズムが阻害されることをいう。その結果、細胞が圧縮されても、圧縮前の細胞と生化学的な変化が発生していない圧縮細胞又は組織となっている。
【００１５】
−本発明の第２態様―
本発明の第２の態様は本発明の圧縮細胞を用いる、糖尿病治療剤等のスクリーニング方法に関するものである。
本発明の「脂肪細胞機能」とは、脂肪細胞の代謝、分泌に関する機能のことを言う。この機能は、脂肪細胞内で発現するｍＲＮＡの発現量の変動や脂肪細胞から分泌される生理活性タンパク質の分泌量の変動を指標にして、脂肪細胞の機能を評価することができる。
本発明の「アディポサイトカイン」とは、脂肪細胞から分泌される生理活性タンパク質のことを言い、例えば動脈硬化を促進させる方向に働くＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、と動脈硬化に予防的に働くレプチン、アディポネクチン等が含まれる。ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）は、マクロファージより分泌される炎症性サイトカインでもあり、肥満脂肪組織から分泌され、インスリン抵抗性をひき起こす要因と見なされている。ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）は肥満脂肪細胞から分泌され、血栓を形成しやすくする。ＨＢ−ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）は肥満脂肪細胞から分泌され、血管平滑筋の遊走・増殖をひき起こす要因となっている。一方、レプチンは白色脂肪細胞から分泌され、視床下部の満腹中枢に働き食欲を抑制する。アディポネクチンは正常脂肪細胞から産生され、インスリン感受性を促進する等の良い要因になっている。
本発明の「化合物の評価方法」とは、培養系中に添加されている薬効成分の影響を受けて、圧縮培養して得られた正常あるいは肥満脂肪細胞由来の人工的な脂肪細胞（肥満型あるいは肥満がさらに悪化した状態に類似した機能を示す脂肪細胞）が分泌するアディポサイトカインの種類と分泌量が変化する様子を測定・評価する方法のことである。このアディポサイトカインの発現変動は、汎用のサイトカインの定量方法を用いて行なうことができる。
本発明の「飽和脂肪酸」とは、飽和高級脂肪酸のことを言い、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸等の炭素数１２以上の飽和脂肪酸を挙げることができる。好ましいものとしては、パルミチン酸を挙げることができる。
なお、本発明の第１態様と共通する用語は、同じ意味を表わす。
【実施例】
【００１６】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
(実施例１)擬似３次元の細胞培養方法と３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞の培養
（１）方法
ａ）２５０Ｐａポリアクリルアミドゲル(ソフトゲル)の作製
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ＰａｒｔＡ  １５（１）：１４７−１５４（２００９）又はＪ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６，１４２−１４９（２００９）に記載の方法に順じて作成される。例えば、２５０Ｐａソフトゲル用としては、ガラス製カバースリップの表面で、３．０％アクリルアミドと０．２％ビスアクリルアミドの溶液にAPS (Ammonium persulfate)およびTEMED (N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine)を加えてポリアクリルアミドゲルを作成する。ゲル表面にＮ−コハク酸イミドあるいはＳｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ(N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)
hexanoate)を用いて架橋する。このガラス製カバースリップ上に形成されたゲルをコラーゲン、フイブリノーゲンまたはその混合物の溶液に浸漬して、ゲル表面を細胞外マトリックス・リガンドで被覆した。
ｂ）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の擬似３次元モデルでの細胞培養
本発明の疑似３次元培養モデルは、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２４，７５６７−７５７７（２００４）の方法に準じて行なわれる。例えば、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞の場合、１０％ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地で２日間培養し、コンフルエントにする。この培養細胞を前項のソフトゲル（２．４Ｘ２．４ｃｍ）に撒き、４８時間培養する。培養培地は、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭＩＢＭＸ (3-isobutyl-1-methylxanthine)、１μＭデキサメタゾン、１．７μＭインスリンを含んでいる。その後、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で７−９日間培養し、脂肪細胞に分化させる。その間、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地は隔日で交換する。
３Ｔ３−Ｌ１細胞が上記ソフトゲル上で脂肪細胞に分化した後、更に上記ａ）のソフトゲル（０．０７ｇ／ｃｍ２）を上記培養細胞に重ねてサンドイッチ状態にした。このサンドイッチ状態の培地のことを、擬似３次元ソフトゲル培地という。更に、この擬似３次元ソフトゲル培地を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に浸漬して細胞培養をする。
【００１８】
（２）結果
ソフトゲル上（２次元モデル）で培養した３Ｔ３−Ｌ１由来の脂肪細胞と、ソフトゲルを重ねてサンドイッチ状（擬似３次元モデル）で培養した３Ｔ３−Ｌ１由来の脂肪細胞を比較すると、図１に示すように、細胞の炎症マーカーであるＭＣＰ−１の分泌量が、擬似３次元モデル培地で培養された脂肪細胞の場合、約２倍高くなることが明らかとなった。即ち、擬似３次元モデル培地での脂肪細胞の培養においては、細胞培養用のゲル培地（ソフトゲル）の硬さが培養細胞に影響するだけでなく、細胞の上にかぶせられたゲル培地（ソフトゲル）による加圧・圧縮も大きな影響を与えることが明らかとなった。
即ち、細胞外マトリックスが２５０Ｐａの弾性を持つ培養基盤（２次元ソフトゲル培地）で培養された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、健常な白色脂肪細胞のモデルとして使用できる。更に、２次元ソフトゲル培地を重ねた本発明の疑似３次元ソフトゲル培地で得られた新たな３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（圧縮脂肪細胞）は、インスリン抵抗性を有する肥満脂肪細胞のモデルとして使用できることが見出された。なお、このインスリン抵抗性を有する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において細胞の肥大化は見られなかった。
【００１９】
(実施例２)圧縮と変形させた脂肪組織の性状の評価
上記実施例１に示されるように、正常脂肪細胞を加圧圧縮することにより、インスリン抵抗性を有する人工的な肥満脂肪細胞が得られた。このように、培養条件によって得られる細胞の機能が異なってくるため、一般的に培養細胞を用いて薬剤の評価を行なう場合には、生体環境と同じような力学的な環境でないと、正当な薬剤の評価が難しいことを示している。
そこで、加圧圧縮時に脂肪細胞機能がどのように影響を受けるかを評価した。そのために、脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインのｍＲＮＡの発現変動とアディポサイトカインの分泌変動を測定、評価することを行なった。まず、正常マウスまたは肥満糖尿病モデルマウスから脂肪組織を採取して圧縮し、脂肪組織に対する加圧とＭＣＰ−１の分泌量について評価した。
ａ）方法
正常なマウスから採取された２００-２５０ｍｇの脂肪組織（コントロール群）と、肥満糖尿病モデルマウス（ｏｂ／ｏｂマウス）から採取された２００-２５０ｍｇの脂肪組織（ｏｂ／ｏｂ群）を、１０％ＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養する。
それらの組織に対して、２．４ｃｍx２．４ｃｍ(0.2 g)のカバーグラスを載せ、更にその上に０ｇ、３ｇ、６ｇ、９ｇの錘を載せる。これらはそれぞれ即ち０．０４ｇ／ｃｍ２、０．５６ｇ／ｃｍ２、１．１ｇ／ｃｍ２、１．６ｇ／ｃｍ２の加圧となる。６時間以上培養後に培地を回収し、その中に含まれるＭＣＰ−１の量を測定する。
【００２０】
ｂ）結果
錘を載せて6時間培養した場合、図２で示されるように、正常マウスに由来するコントロール群の脂肪組織では、加重が負荷されるに従って、ＭＣＰ−１の分泌量が増大することが示された。また、ｏｂ／ｏｂ群の脂肪組織では、１．１ｇ／ｃｍ２の加重を付加させるまでは、ＭＣＰ−１の分泌量が増大したが、それを超えて、１．６ｇ／ｃｍ２の加重を与えると、逆にＭＣＰ−１の分泌量が減少していた。
このことは、正常細胞の組織に加重（負荷）を掛けると、ＭＣＰ−１の分泌量が増大し、組織の性状としては、肥満脂肪細胞の組織に近づいて行くことを示している。更に、肥満脂肪細胞の組織に加重（負荷）を掛けると、ＭＣＰ−１の分泌量が増大するが、１．１ｇ／ｃｍ２の加重を超えると、組織障害が強くなり、肥満細胞の機能が破綻することが明らかになった。従って、このことから、正常な脂肪組織に１．６ｇ／ｃｍ２の加重を掛ければ、肥満脂肪細胞の組織と同様の性状を示し、肥満脂肪細胞の代替として使用できることが分かった。更に、肥満脂肪細胞の組織に１．１ｇ／ｃｍ２以下の加重を掛けることにより、肥満脂肪細胞から更に病態の悪化した脂肪細胞を作製できることが分かった。
【００２１】
更に、圧縮培養の脂肪細胞・脂肪組織について細胞の外観を評価すると、正常脂肪細胞と同様に、細胞サイズの肥大化がなく、中性脂肪の蓄積がないことが分かった。また、細胞外基質成分が正常脂肪細胞と同じであることも分かった。
一方、圧縮培養の脂肪細胞・脂肪組織の機能は、肥満脂肪細胞・組織と同様のアディポサイトカインの合成・分泌パターンを示し、ＮＦkＢの活性化が起こり、低分子量ＧＴＰ結合タンパクＲｈｏ、ＲＯＣＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ等の活性化が起こっていることが示された。
以上のことから、正常な脂肪細胞の組織や肥満脂肪細胞の組織を使用し、加圧（加重）の程度をコントロールすることにより、肥満の重症度に対応した脂肪細胞の組織を作製できることが示された。従って、これらの肥満の病態の進行度に応じた脂肪細胞の組織を使用して、薬剤の効果と副作用が評価できるようになることが分かった。
【００２２】
(実施例３)コラゲナーゼ処理された脂肪組織の性状評価
(1)脂肪組織の動的剛性率（Ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の測定
ａ）方法
特許文献1に記載の方法で測定を行った。即ち、２０週令のｏｂ／ｏｂマウスと痩せた野生型のマウスの生殖腺脂肪を直径８ｍｍ切り取った。その脂肪組織をＲｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  ｆｌｕｉｄｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にセットし、３〜４％の振動ズレ歪（約２．５ｒａｄ／ｓｅｃ、３７℃）を与えて、脂肪組織の動的剛性率を測定した。
ｂ）結果
図3に示されるように、痩せた野生型マウスの脂肪組織の動的剛性率は、約１１０Ｐａであったが、Ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織の動的剛性率は、約２６０Ｐａであった。即ち、痩せた野生型マウスから採取された正常脂肪組織は柔らかく、肥満脂肪組織は正常脂肪組織の約２．４倍硬いことが示された。
なお、上記実施例２によれば、正常脂肪組織に約１．６ｇ／ｃｍ２の負荷（加重)を掛けて培養すると、ＭＣＰ-１の分泌量から、肥満脂肪組織と同じような性状の組織に変化することが示されている。このことは、Ｏｂ／ｏｂマウスを使用しなくても、他の野性型のマウスを使用して、その正常脂肪組織を採取し、例えば約１．６ｇ／ｃｍ２の加重を掛ければ、肥満脂肪細胞モデルが作製でき、これを薬効評価に使用できることを示している。
【００２３】
（２）コラゲナーゼ処理をされた肥満脂肪細胞（肥満脂肪組織）の性状測定
図３に示されるように肥満脂肪細胞(肥満脂肪組織)が硬くなる（動的剛性率が高くなる）理由は、細胞外基質の中にコラーゲンが増加することであると考えられた。そこで、コラーゲンを分解すれば、肥満脂肪細胞(肥満脂肪組織)であっても、柔らかくなる（動的剛性率が低くなる）と考えられた。
ａ）方法
２０週令のｏｂ／ｏｂマウスの生殖腺脂肪（肥満脂肪組織）を直径８ｍｍ切り取り、０．０４％コラゲナーゼで処理を行った。
３７℃にて０分、１０分、３０分の間、コラゲナーゼで処理した。処理後の脂肪組織をクリープメーター（山電製、RE2-3305B）にセットし、レオロジー測定を行い、脂肪組織のヤング率を測定した。
ｂ）結果
図４に示されるように、コラゲナーゼの処理時間が長くなれば、肥満脂肪細胞の組織であっても、組織の硬さ（ヤング率）が低下することが示された。
また、コラゲナーセ処理により、細胞外基質がおよそ３０−５０％減少することが、上記ヤング率から推定された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明の圧縮培養された細胞は、人工的に得られた病的状態の細胞モデルとして、薬剤の評価スクリーニングに使用することができる。例えば、正常脂肪細胞を用いて得られる圧縮脂肪細胞は、生体の肥満脂肪細胞と同じ機能を示すため、薬剤の正当なスクリーニングの評価結果を得ることが出来る。
また、加圧、圧縮条件を変化させることにより、例えば、正常脂肪細胞あるいは肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織を用いて、簡単に所望の病態の肥満脂肪細胞を作製することができる。そのため、本発明の圧縮脂肪細胞を用いて、肥満症、メタボリック・シンドローム、糖尿病、脂質異常症、高血圧症または動脈硬化の病態生理の解明とともに、新たな診断・治療などに関わる化合物の評価が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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