(57)【要約】      （修正有）【課題】HBZ特異的CTLをより効率的に誘導できる、HTLV-1関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチンを提供する。【解決手段】HTLV-1のHBZタンパク質のアミノ酸配列中、ある特定の配列、他の特定の配列、また他の特定の配列、及びさらに他の特定の配列からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、配列長が20〜40である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも２種のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号３で示されるアミノ酸配列、並びに
配列番号１、配列番号２、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列
を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチン。
【請求項７】
前記ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型関連疾患が、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、HTLV-1関連脊髄症（HAM）、HTLV-1関連脊髄症、HTLV-1ぶどう膜炎、HTLV-1関連気管支炎、HTLV-1関連シェーグレン症候群、HTLV-1関連筋炎、又はHTLV-1関連感染性皮膚炎である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドをゲノム内に含むウイルス。
【請求項１１】
前記ウイルスがワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、カナリアポックスウイルス、又はサイトメガロウイルスである、請求項１０に記載のウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチン、及びその有効成分であるペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
HTLV-1はCD4陽性T細胞に感染し、宿主に成人T細胞白血病（ATL）や慢性炎症性疾患などの種々のHTLV-1関連疾患を引き起こす。
【０００３】
HTLV-1関連疾患に対するワクチンとしては、HTLV-1エンベロープ（env）遺伝子が組み込まれたワクシニアウイルス（rVV-env）が報告されている（非特許文献1〜3）。rVV-envに関しては、ウサギやサル等の実験動物に対して抗原特異的免疫記憶を誘導できたこと、接種することによりHTLV-1感染に対する抵抗性を獲得できたこと等が報告されている。
【０００４】
また、HTLV-1のTaxタンパク質は、非常に高い抗原性を示すことが知られており、これを標的としたワクチンに関しても研究が進められている（非特許文献4及び5）。
【０００５】
しかしながら、HTLV-1関連疾患の症例の多くでは、Envタンパク質やTaxタンパク質の発現が消失しているので、上記ワクチンでは、HTLV-1関連疾患の多くの症例での効果は期待できない。
【０００６】
HBZタンパク質は、HTLV-1関連疾患の大半を占めるATLの全ての症例で発現していることが知られている。また、HBZタンパク質は、細胞増殖促進作用及びアポトーシス抑制作用を有しており、HTLV-1関連疾患の発症に重要な役割を持つと考えられている。このため、HBZ特異的CTL（細胞障害性T細胞）を誘導できれば、HTLV-1関連疾患に対する効果的な予防及び治療に繋がることが期待される。
【０００７】
しかしながら、HBZ特異的CTLの誘導は、現在までのところ成功していないのが現状である。例えば、HBZタンパク質のアミノ酸配列よりアルゴリズムにより設計されたペプチドを用いてHBZ特異的CTLの誘導を試みた例があるが、得られたCTLはHTLV-1感染細胞を殺傷する能力が非常に低いものであった（非特許文献6及び7）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】EMBO J. 1987 November; 6(11): 3379-3384.
【非特許文献２】Int J Cancer 1995 Feb 8;60(4):567-70.
【非特許文献３】J Virol. 2001 July; 75(13): 5939-5948.
【非特許文献４】J Virol. 2000 Oct; 74(20):9610-6.
【非特許文献５】Clin Cancer Res. 2006 Jun 15;12(12):3814-22.
【非特許文献６】J Gen Virol. 2009 Aug;90(Pt 8):1806-11.
【非特許文献７】PLoS Pathog 2010 6: e1001117.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、HBZ特異的CTLをより効率的に誘導できる、HTLV-1関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、HBZタンパク質のアミノ酸配列中、特定の20アミノ酸配列（配列番号1〜4）を含むペプチドが、HBZ特異的CTLの誘導、さらには該CTLの殺傷能の向上に重要であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
項１．
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を含むペプチド。
項２．
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、配列長が20〜40である、項１に記載のペプチド。
項３．
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、項２に記載のペプチド。
項４．
配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも２種のアミノ酸配列を含む、項１に記載のペプチド。
項５．
配列番号３で示されるアミノ酸配列、並びに
配列番号１、配列番号２、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列
を含む、項４に記載のペプチド。
項６．
項１〜５のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチン。
項７．
前記ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型関連疾患が、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、HTLV-1関連脊髄症（HAM）、HTLV-1関連脊髄症、HTLV-1ぶどう膜炎、HTLV-1関連気管支炎、HTLV-1関連シェーグレン症候群、HTLV-1関連筋炎、又はHTLV-1関連感染性皮膚炎である、項６に記載のワクチン。
項８．
項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項９．
項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
項１０．
項８に記載のポリヌクレオチドをゲノム内に含むウイルス。
項１１．
前記ウイルスがワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、カナリアポックスウイルス、又はサイトメガロウイルスである、項１０に記載のウイルス。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドはHBZ特異的CTLをより効率的に誘導できる。したがって、これを利用することによりHTLV-1関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチンを提供することができる。HBZタンパク質は、HTLV-1関連疾患の大半を占めるATLの全ての症例で発現しているので、これを標的とする本発明のワクチンによれば、HTLV-1関連疾患の多くの症例において、効果の発揮が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】(A)野生型Taxタンパク質（WT-Tax）とその変異体（WT-Tax M22）とのアミノ酸配列の比較を示す。(B)野生型Taxタンパク質（WT-Tax）とその変異体（WT-Tax S258A）とのアミノ酸配列の比較を示す。(C)野生型HBZタンパク質（WT-HBZ）とその変異体（WT-HBZ LL/AA）とのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】(A)組換えワクシニアウイルス作製方法の概略図を示す。(B)及び(C)組換えワクシニアウイルスからのTax変異体及びHBZ変異体の発現を示す（実施例の例３）。
【図３】(A)及び(B)実施例の例4-2のELISpotの結果を示す。(C)及び(D)実施例の例4-3で測定された、各ペプチドプール（Tax-PA/-PB又はHBZ-PA/-PB）で刺激されたEffector細胞の細胞障害性を示す。
【図４】(A)及び(B)実施例の例5-2のELISpotの結果を示す。(C)及び(D)実施例の例5-3で測定された、各ペプチドプール（Tax-PA/-PB又はHBZ-PA/-PB）のサイトカイン産生誘導能を示す。
【図５】(A)実施例の例6-1で測定された、各ペプチドプール（HBZ-P1、HBZ-P2、HBZ-P3、HBZ-P4）のサイトカイン産生誘導能を示す。(B)実施例の例6-2で測定された、各ペプチドのサイトカイン産生誘導能を示す。(C)HBZ157-176によるCTL誘導を示す（実施例の例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）本発明のペプチド
「配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を含むペプチド」について説明する。
【００１４】
配列番号１〜４はHTLV-1のHBZタンパク質中の20アミノ酸からなる配列であり、詳細は以下のとおりである。
配列番号１：HBZタンパク質の109〜128番目のアミノ酸配列
配列番号２：HBZタンパク質の133〜152番目のアミノ酸配列
配列番号３：HBZタンパク質の157〜176番目のアミノ酸配列
配列番号４：HBZタンパク質の187〜206番目のアミノ酸配列
【００１５】
本発明者等は、HBZタンパク質のアミノ酸配列中の種々のアミノ酸配列の中でも、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、CD8陽性T細胞（CTL）及びCD4陽性T細胞（主にTh1）からのサイトカイン（IFNγ、TNF-α等）産生を誘導し、HBZタンパク質に対する免疫応答を増強することを発見した。このことは、これらのアミノ酸配列の抗原性が他の配列に比べて極めて高いことを示している。したがって、ペプチドが、配列番号１〜４のいずれか1以上のアミノ酸配列を含んでさえいれば、他のアミノ酸配列が含まれていたとしても、HBZタンパク質に対する免疫応答を増強できる蓋然性が高いと考えられる。
【００１６】
また、免疫細胞によって認識されるペプチド領域（最小単位配列）は、例えばCTLの場合は8〜10アミノ酸しかないところ、近年の研究では、この最小単位配列のみからなるペプチドよりも、この配列を含むより長いペプチドの方が、より効率的に抗原に対する免疫応答を増強できることが報告されている。このような知見の観点からも、本発明において、ペプチドが、配列番号１〜４以外のアミノ酸配列を含んでいたとしても、HBZタンパク質に対する免疫応答を増強できる蓋然性は高いといえる。
【００１７】
本発明のペプチドの1つの好ましい態様（態様1）としては、より確実にHBZタンパク質に対する免疫応答を増強できるという観点からは、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、配列長が20〜40であるペプチド」が挙げられる。
【００１８】
態様1において、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、HBZタンパク質に対する免疫応答の増強効果がより高いという観点から、好ましくは配列番号１、又は配列番号３、より好ましくは配列番号３であることができる。
【００１９】
態様1において、本発明のペプチドの配列長は、より確実にHBZタンパク質に対する免疫応答を増強できるという観点から、好ましくは20〜35、より好ましくは20〜30、よりさらに好ましくは20〜25、よりさらに好ましくは20〜23、よりさらに好ましくは20〜21、よりさらに好ましくは20であることができる。
【００２０】
態様1において、配列番号１〜４以外のアミノ酸配列は、HBZに対する免疫応答の増強効果が発揮される限り特に限定されない。例えば人工的に設計したアミノ酸配列、HBZタンパク質のアミノ酸配列中の任意の配列、HBZタンパク質のアミノ酸配列中の、ペプチドに含まれるアミノ酸配列（配列番号１〜４のいずれか）に隣接する配列等を例示することができる。
【００２１】
本発明のペプチドの1つの好ましい態様（態様2）としては、HBZタンパク質に対する免疫応答の増強効果のさらなる向上を図るという観点から、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される少なくとも２種のアミノ酸配列を含むペプチド」が挙げられる。
【００２２】
態様2において、本発明のペプチドに必須で含まれているアミノ酸配列は、HBZタンパク質に対する免疫応答の増強効果がより高いという観点から、好ましくは配列番号１又は配列番号３、より好ましくは配列番号３、よりさらに好ましくは配列番号１及び配列番号３であることができる。
【００２３】
態様2において、本発明のペプチドの配列長は、より確実にHBZタンパク質に対する免疫応答を増強できるという観点から、好ましくは40〜200、より好ましくは40〜150、よりさらに好ましくは40〜100、よりさらに好ましくは40〜80であることができる。さらに、ペプチドが配列番号１〜４のうちの２種を含む場合、配列長は、好ましくは40〜100、より好ましくは40〜70、よりさらに好ましくは40〜50、よりさらに好ましくは40〜45、よりさらに好ましくは40〜42、よりさらに好ましくは40であることができる。また、ペプチドが配列番号１〜４の内の３種を含む場合、配列長は、好ましくは60〜150、より好ましくは60〜120、よりさらに好ましくは60〜90、よりさらに好ましくは60〜70、よりさらに好ましくは60〜65、よりさらに好ましくは60であることができる。また、ペプチドが配列番号１〜４の内の４種全てを含む場合、配列長は、好ましくは80〜200、より好ましくは80〜160、よりさらに好ましくは80〜120、よりさらに好ましくは80〜100、よりさらに好ましくは80〜90、よりさらに好ましくは80〜85、よりさらに好ましくは80であることができる。
【００２４】
態様2において、配列番号１〜４以外のアミノ酸配列は、HBZに対する免疫応答の増強効果が発揮される限り特に限定されない。例えば人工的に設計したアミノ酸配列、HBZタンパク質のアミノ酸配列中の任意の配列、HBZタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列に隣接する配列等を例示することができる。
【００２５】
本発明のペプチドには、合成や精製を促進するための修飾、物理、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾などの修飾が施されていてもよい。このような修飾としては、例えばアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化などが挙げられる。
【００２６】
本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよい。塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２７】
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。当該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、本発明で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００２８】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)法、DCC＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００２９】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００３０】
かくして得られる本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３１】
（２）本発明のポリヌクレオチド、ベクター、及びウイルス
本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ポリヌクレオチドをゲノム内に含むウイルスにも関する。
【００３２】
ポリヌクレオチドの配列は、ペプチドの配列に従って適宜設計することができる。その合成も、公知の化学合成法、HBZタンパク質をコードするポリヌクレオチドをテンプレートとしたPCR法等によって行うことができる。
【００３３】
ベクターは、上記ポリヌクレオチドがコードするペプチドを宿主細胞内で発現することができる限り特に限定されず、種々のベクターを利用することができる。
【００３４】
例えば、原核生物用発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に上記ポリヌクレオチドが発現できるように上記ポリヌクレオチドの上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列を付与した発現プラスミドを挙げることができる。具体的には、PLプロモーター、T7プロモーターおよびlacプロモーターを利用した発現プラスミドを挙げることができる。他の好ましい細菌発現ベクターとしてはtacプロモーター又はtrcプロモーターを利用したプラスミドpKK233−２及びpKK233−３等を挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。
【００３５】
また、真核細胞用発現ベクターとしては、通常、発現しようとする上記ポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。上記ポリヌクレオチドを挿入するのに有用な真核生物ベクターはよく知られている。例えば、適当な真核生物ベクターとしてはpCD及びpCMVを例示することができる。また、これらの他には、必要に応じて、MMTV又はSV40後期プロモーターを利用したpMSG及びpSVLを挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の真核生物及びベクターをも利用できる。
【００３６】
ウイルスは、上記ポリヌクレオチドがコードするペプチドを宿主細胞内で発現することができる限り特に限定されず、種々のウイルスを利用することができる。ウイルスとしては、例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、カナリアポックスウイルス、サイトメガロウイルス等が挙げられる。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドのウイルスゲノム内への導入は、公知の方法（例えば相同組換え法）に従って行うことができる。具体例としては、ウイルスゲノム中の該ウイルスの増殖のために必須でない遺伝子（標的遺伝子）を含有するプラスミドの該遺伝子中に本発明のポリヌクレオチドが挿入されている組換えプラスミドを作製し、このプラスミドとウイルスとの相同性組換えにより、ウイルスのゲノム中の標的遺伝子中に本発明のポリヌクレオチドが挿入された組換えウイルスを作製することができる。
【００３８】
上記ポリヌクレオチド、ベクター、及びウイルスは、本発明のペプチドを適当な宿主細胞内で合成し、後述のワクチンの有効成分として用いるために有用である。また、上記、ベクター、又はウイルスをワクチンとし接種すれば、接種者の体内で本発明のペプチドを生成させることが可能であるので、これらはワクチンとしても有用である。
【００３９】
（３）本発明のワクチン
本発明は、上記本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又はウイルスを有効成分として含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）関連疾患の予防及び／又は治療用ワクチンにも関する。
【００４０】
本発明のペプチドは、HTLV-1のHBZタンパク質を発現する細胞に対する免疫（細胞障害性等）を誘導することができるので、本発明のペプチド、又はこれを発現可能な本発明のポリヌクレオチド、ベクター、若しくはウイルスをワクチンとして用いることによって、HTLV-1関連疾患の治療や予防が可能となる。
【００４１】
治療及び／又は予防対象であるHTLV-1関連疾患は、HTLV-1が原因である疾患であれば特に限定されず、例えば成人Ｔ細胞白血病（ATL）、HTLV-1関連脊髄症（HAM）、HTLV-1関連脊髄症、HTLV-1ぶどう膜炎、HTLV-1関連気管支炎、HTLV-1関連シェーグレン症候群、HTLV-1関連筋炎、HTLV-1関連感染性皮膚炎等であることができる。これらの中でも、より確実に治療及び／又は予防効果を発揮できるという観点からは、好ましくはATLが挙げられる。
【００４２】
本発明のワクチンは、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。本発明のワクチンはペプチドを有効成分とするので、一般的に非経口投与が好ましい。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。
【００４３】
上記の剤型とする製剤技術は公知である。例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、及び滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。
【００４４】
また、本発明のワクチンは、リポソームなどのリン脂質小胞体として投与することも可能である。例えば、本発明のペプチドもしくはベクターを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与することも可能である。
【００４５】
本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により適宜決定される。通常、患者一人当たり、本発明のペプチド（エピトープペプチド）が1〜100mg投与されるような投与量が適当である。また、投与間隔は、対象、目的により適宜設定することができる。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
１．ペプチドの合成
HTLV-1（Japan ATK-1 subtype A株）のTaxタンパク質のアミノ酸配列（配列番号5）、及びHTLV-1で形質転換された細胞株（TLOm1細胞）由来のHBZタンパク質のアミノ酸配列（配列番号6）に基づいて、全長20 merで6 mer offsetのペプチド、すなわちそれぞれのアミノ酸配列の1+6n（nは正の整数）番目のアミノ酸がN末端のアミノ酸である連続する20 merのペプチドを設計し、合成した（クラボウ社、受託合成ペプチド）。合成したペプチドの一部はプールした。プールしたペプチドは以下のとおりである。
Tax-PA：Taxタンパク質の1〜182番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
Tax-PB：Taxタンパク質の169〜353番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
Tax-P1：Taxタンパク質の1〜98番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
Tax-P2：Taxタンパク質の85〜164番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
Tax-P3：Taxタンパク質の151〜266番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
Tax-P4：Taxタンパク質の253〜353番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-PA：HBZタンパク質の1〜110番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-PB：HBZタンパク質の97〜206番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-P1：HBZタンパク質の1〜62番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-P2：HBZタンパク質の49〜104番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-P3：HBZタンパク質の91〜152番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
HBZ-P4：HBZタンパク質の139〜206番目のアミノ酸配列中の連続する20 merのペプチド
【００４８】
２．組み換えワクシニアウイルスの作製
抗原遺伝子としてTaxタンパク質又はHBZタンパク質を発現する、組み換えワクシニアウイルスを作製した（図2A）。具体的には次のように行った。
【００４９】
Taxタンパク質（配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）及びHBZタンパク質（配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）それぞれについて、病原性がない変異体（TaxはTL130/131AS変異（Tax M22）又はS258A変異（Tax S258A）、HBZはLL27/28AA変異（HBZ LL/AA））を設計した。Taxタンパク質又はHBZタンパク質のアミノ酸配列と、これらの変異体のアミノ酸配列との比較を図1に示す。
【００５０】
pBMSF-7cプラスミド（特開平６−２３７７７３）中のヘマグルニチン領域内のプロモーター下流に、上記変異体をコードするDNAを挿入して、プラスミドベクターを作製した。
【００５１】
ワクシニアウイルス弱毒株LC16m8株を、定法に従ってニワトリ胚線維芽細胞（CEF）に感染させた。neon transfection system（インビトロジェン社）用いて、該細胞に上記プラスミドベクターを導入した。導入後、細胞中のLC16m8株の中から、LC16m8株ゲノムのヘマグルニチン領域が、プラスミドベクター中の上記変異体コード領域を含むヘマグルニチン領域と相同組換えを起こしたワクシニアウイルスを、ニワトリ赤血球への吸着の有無を指標として、定法に従って選別した。選別された組換えワクシニアウイルスを定法に従ってRK13細胞に感染させ、該細胞中で増殖させた。得られた組換えワクシニアウイルス（rVV-Tax M22、rVV-Tax S258A、及びrVV-HBZ LL/AA）を以下の実験で使用した。
【００５２】
３．組換えワクシニアウイルスからのTax変異体及びHBZ変異体の発現
組換えワクシニアウイルスが感染したRK13細胞から、定法に従ってタンパク質抽出液を得て、抗Tax抗体（Clone MI 73（J Gen Virol. 1987;68:499-506.））又は抗HBZ抗体（HBZペプチドを免疫したウサギから採取した血清）を用いてウェスタンブロットを行った。
【００５３】
図2Bに抗Tax抗体で検出した結果を示し、図2Cに抗HBZ抗体で検出した結果を示す。図2B及び2C中、「Non」は、ウイルスを感染させていないRK13細胞を用いた場合、「WT-VV」はLC16m8株を感染させたRK13細胞を用いた場合を示し、「rVV」は組換えワクシニアウイルスを感染させたRK13細胞を用いた場合を示す。
【００５４】
図2B及び2Cに示されるように、組換えワクシニアウイルスを用いた場合に、Taxタンパク質又はHBZタンパク質の分子量に一致する特異的なバンドが検出された。このことから、組換えワクシニアウイルスがTax変異体又はHBZ変異体が発現していることが確認された。
【００５５】
４．マウスにおけるTax又はHBZ特異的T細胞誘導
＜4-1．組換えワクシニアウイルスの接種＞
107 PFUの組換えワクシニアウイルスを、二又針を使ってマウス（C56BL/6）の皮膚に接種した。接種は、3〜4週間に1回行い、計6回行った。
【００５６】
＜4-2．Tax又はHBZ特異的T細胞誘導＞
上記4-1で得られたマウスから脾細胞を採取した。得られた脾細胞から、CD4 又はCD8 magnetic beads（BD Bioscience社）を用いて、CD4ポジティブT細胞が除去された細胞群（すなわちCD8ポジティブ細胞が多くを示す細胞群）と、CD8ポジティブT細胞が除去された細胞群（すなわちCD4ポジティブ細胞が多くを示す細胞群）とを作製した。これらの細胞群それぞれについて、1μM pooled peptide（Tax-P1〜Tax-P4又はHBZ-P1〜HBZ-P4）で刺激後のIFN-γの産生をELISpotで測定した。測定後、それぞれのスポット数を合計して、合計数をTax若しくはHBZペプチド刺激の結果とした。なお、ELISpotは、キット（Mabtech社、ELISpot for mouse IFN-γ）を用いて、該キットのプロトコールに従って行った。
【００５７】
図3Aに、上記4-1でTax変異体発現組換えワクシニアウイルスを接種させ、Taxペプチドで刺激した場合の結果（図中、「rVV-Tax M22」及び「rVV-Tax S258A」）を示し、図3Bに、上記4-1でHBZ変異体発現組換えワクシニアウイルスを接種させ、HBZペプチドで刺激した場合の結果（図中、「rVV-HBZ LL/AA」）を示す。図3A及び3B中、「Non」はウイルスを接種させずに、Taxペプチド刺激（3A）又はHBZペプチド刺激（3B）した場合の結果を示し、「WT-VV」はLC16m8株を接種させ、Taxペプチド刺激（3A）又はHBZペプチド刺激（3B）した場合の結果を示し、「CD4-depleted」はCD4ポジティブT細胞が除去された細胞群の結果を示し、「CD8-depleted」はCD8ポジティブT細胞が除去された細胞群の結果を示す。
【００５８】
図3A及び3Bに示されるように、Tax又はHBZ変異体を発現する組換えワクシニアウイルスを接種させた場合に特異的に、Tax又はHBZペプチド刺激によってスポット数（IFN-γ産生細胞数）が増加した。このことから、組換えワクシニアウイルス接種細胞において、抗原（Tax又はHBZ）特異的T細胞が誘導されたことが示された。
【００５９】
＜4-3．ペプチドプール（Tax-PA/-PB又はHBZ-PA/-PB）の細胞障害性誘導能の評価＞
上記4-2で誘導が確認されたCTLの細胞障害性をCTL killingアッセイで評価した。上記4-1で得られたマウスから採取した脾細胞（Ly5.1）を、1μM pooled peptide（Tax-PA/-PB又はHBZ-PA/-PB）で1週間刺激し、得られた細胞をeffector細胞として使用した。一方で、Ly5.2 EL4細胞株を、FCS(-)RPMI中、上記1μM pooled peptideを37℃で1時間パルスし、得られた細胞をtarget細胞として使用した。これらのeffector細胞及びtarget細胞を用いて、定法に従ってCLT killingアッセイを行った。なお、Target細胞に対する細胞障害性は、Target細胞全体に占めるAnnexin V（死細胞マーカー）陽性細胞の割合をフローサイトメーター（BD Bioscience、FACS Verse）によって測定し、該割合を式１に代入して求めた。
【００６０】
【数１】
2016032439.tif 000002
【００６１】
図3Cに、上記4-1でTax変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-Tax M22）を接種させた場合の結果を示す。図3Cに示されるように、Tax-PA/-PBで刺激したeffector細胞はペプチドをパルスしていないtarget細胞（Non）に比べて、Tax-PA又はTax-PBをパルスしたtarget細胞に対する細胞障害性が上昇した。このことから、rVV-Tax M22がTax特異的CTLを誘導出来た事を表している。
【００６２】
図3Dに、上記4-1でHBZ変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-HBZ LL/AA）を接種させた場合の結果を示す。図3Dに示されるように、ペプチドパルスをしない場合（Non）に比べて、HBZ-PBをtarget細胞にパルスした場合の方が、effectorによる細胞障害性が高かった。このことから、rVV-HBZ LL/AA で誘導されたCTLはHBZ-PBに対する細胞障害性を有する事が示された。一方、HBZ-PAパルスした場合については、細胞障害性の上昇は見られなかった。このことから、rVV-HBZ LL/AAで誘導されたCTLは、主にHBZタンパク質のC末端側（97〜206番目のアミノ酸）を認識して細胞を傷害する可能性が示された。
【００６３】
５．アカゲザルにおけるTax又はHBZ特異的T細胞誘導
＜5-1．組換えワクシニアウイルスの接種＞
107 PFUの組換えワクシニアウイルスを、二又針を使ってHTLV-1感染アカゲザルの皮膚に接種した。接種は、4-5週間に1回行った。なお、接種対象であるHTLV -1感染アカゲザルは、アカゲザルの腹腔内にHTLV-1感染細胞（MT-2）を接種することにより作製した。
【００６４】
＜5-2．Tax又はHBZ特異的T細胞誘導＞
採血は組換えウイルス接種後の2週間毎で行い、アカゲザルから末梢血単核細胞（PBMC）を採取した。得られたPBMCを用いて、上記4-2と同様にELISpotを行った。
【００６５】
図4Aに、上記5-1でTax変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-Tax M22）を接種させた場合の結果を示し、図4Bに、上記5-1でHBZ変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-HBZ LL/AA）を接種させた場合の結果を示す。図4A及び4B中、横軸は初回接種からの経過週数を示す。
【００６６】
図4A及び4Bに示されるように、組換えワクシニアウイルス（rVV-Tax M22又はrVV-HBZ LL/AA）の初回接種から8週間後に、抗原（Tax又はHBZ）特異的T細胞が検出され、その後も安定的に検出された。
【００６７】
＜5-3．ペプチドプール（Tax-PA/-PB又はHBZ-PA/-PB）のサイトカイン産生誘導能の評価＞
上記5-1で初回接種から39週間後に、アカゲザルからPBMCを採取した。得られたPBMCを、1μM pooled peptide（Tax-PA、Tax-PB、HBZ-PA、又はHBZ-PB）で1週間前刺激した。これとは別に、該アカゲザルから採取された自己PBMCをCSFEでラベルし、1μM pooled peptide（Tax-PA、Tax-PB、HBZ-PA、又はHBZ-PB）でパルスした。前刺激後のPBMCを、BrefeldinA（BD Bioscience、555029）の存在下（1:1000希釈）で、ペプチドパルスした自己PBMCと共培養した（6時間、前刺激後のPBMC：ペプチドパルスした自己PBMC ＝1:5-10）。共培養後の細胞群から、CD8陽性且つCFSE陰性の細胞画分をフローサイトメーターで分取し、さらに得られた細胞画分全体に占めるIFN-γ陽性細胞の割合と、TNF-α陽性細胞の割合を、フローサイトメーター（BD Bioscience FACS Verse）によって測定した。なお、抗CD8抗体としてはBD Bioscience社製560775を、抗IFN-γ抗体としてはBiolegend社製502527を、抗TNF-α抗体としてはBiolegend社製502913を用いた。
【００６８】
図4Cに、上記5-1でTax変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-Tax M22）を接種させた場合の結果を示し、図4Dに、上記5-1でHBZ変異体発現組換えワクシニアウイルス（rVV-HBZ LL/AA）を接種させた場合の結果を示す。図4C及び4D中、「Pre」は前刺激に用いたペプチドプールを示し、「Post」は自己PBMCのパルスに用いたペプチドプールを示す（「Non」はペプチドをパルスしていないPBMCでの刺激を示す）。
【００６９】
図4Cに示されるように、Tax-PA又はTax-PB刺激により、rVV-Tax M22で誘導されたCTLのIFN-γとTNF-αの両方の産生が向上した。また、図4Dに示されるように、rVV-HBZ LL/AA で誘導されたCTLのサイトカイン産生は、HBZ-PB刺激で両サイトカイン産生が向上したが、HBZ-PA刺激によってはTNF-α産生のみしか向上しなかった。このことから、rVV-HBZ LL/AAで誘導されたCTLは、主にHBZタンパク質のC末端側（97〜206番目のアミノ酸）を認識している可能性が示された。
【００７０】
６．rVV-HBZ LL/AAで誘導されたCTLの認識ペプチドの同定
＜6-1．ペプチドプール（HBZ-P1、HBZ-P2、HBZ-P3、HBZ-P4）のサイトカイン産生誘導能の評価＞
上記4-1で得られたマウスから脾細胞を採取した。得られた脾細胞を、1μM pooled peptide（HBZ-PA及びHBZ-PB）で1週間前刺激した。一方で、C57BL/6マウスから採取された骨髄由来DCを1μM pooled peptide（HBZ-P1、HBZ-P2、HBZ-P3、又はHBZ-P4）でパルスした。前刺激後の脾細胞をBrefeldinA（BD Bioscience、555029）の存在下で、ペプチドパルスした骨髄由来DCと共培養した（6時間、前刺激後の脾細胞：ペプチドパルスした骨髄由来DC＝1：1-4）。共培養後の細胞群から、CD8陽性脾細胞の細胞画分をフローサイトメーターで分取し、さらに得られた細胞画分全体に占めるIFN-γ陽性細胞の割合を、フローサイトメーター（BD Bioscience、FACS Verse）によって測定した。
【００７１】
結果を図5Aに示す。CD8陽性脾細胞の細胞画分全体に占めるIFN-γ陽性細胞の割合（％）を、フローサイトメトリーの結果を示す各図中に示す。図5Aに示されるように、HBZ-P3又はHBZ-P4刺激により、rVV-HBZ LL/AAで誘導されたCTLのサイトカイン産生が顕著に向上した。
【００７２】
＜6-2．各ペプチドのサイトカイン産生誘導能の評価＞
HBZ-P3又はHBZ-P4に含まれる各ペプチドについて、マウスについては上記6-1と同様の方法により、アカゲザルについては上記5-3と同様の方法により、サイトカイン産生誘導能を評価した。
【００７３】
結果を図5Bに示す。縦軸は、ペプチド刺激を行わない場合の、サイトカイン（IFN-γ又はTNF-α）陽性細胞の割合を1とした値である。この結果より、マウスとアカゲザルの両方において、IFN-γ及びTNF-αの産生を誘導したペプチドとして、HBZタンパク質の109〜128番目のアミノ酸からなるペプチド（HBZ109-128）、133〜152番目のアミノ酸からなるペプチド（HBZ133-152）、157〜176番目のアミノ酸からなるペプチド（HBZ157-176）、187〜206番目のアミノ酸からなるペプチド（HBZ187-206）の計4種類のペプチドを同定した。中でも、HBZ157-176は、サイトカイン産生を最も強く誘導した。このことより、これらのペプチドを用いることによって、HBZ特異的免疫応答を誘導できることが示唆された。
【００７４】
７．HBZ157-176によるCTL誘導
ヒトHLA-A2/A24陽性の健常人から採取されたPBMCより、CD8陽性T細胞を、抗ヒトCD8磁気ビーズ（BD Bioscience、557766）を用いて分離した。残ったPBMC中のCD14陽性細胞は上記分離後の磁気ビーズを、GM-CSF（ミルテニーバイオテク社、10μg/ml）及びIL-4（ミルテニーバイオテク社、10μg/ml）の存在下で６日間培養し、DCを誘導した。DCの活性化を誘導する為に培養4日目でOK432(中外製薬 5KE) を0.1KE/ml で加えた。1×105個のDCを10μMのHBZ157-176でパルス（37℃、3時間）した後、45 Gyでirradiationし、得られた細胞を抗原提示細胞として用いた。1×106個のCD8陽性T細胞を、IL-7（ミルテニーバイオテク、10 ng/ml）の存在下で抗原提示細胞（1×105個）と共培養した。共培養開始から3日後にIL-2（Wako）を添加し、6日に1回継代をしながら、計28日間共培養を続けた。共培養物中のCD8陽性T細胞を、5μMのHBZ157-176でパルスした自己Bリンパ芽球様細胞株で、BrefeldinA（BD Bioscience）の存在下で刺激した。CD8陽性T細胞全体に占める、IFN-γ及びTNF-αの両方とも陽性の細胞の割合を、フローサイトメーター（BD Bioscience、FACS Verse）によって測定した。
【００７５】
結果を図5Cに示す。CD8陽性T細胞全体に占める、IFN-γ及びTNF-αの両方とも陽性の細胞の割合を、各図中に示す。図5Cに示されるように、HBZ157-176刺激によってCTLが誘導された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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