(57)【要約】      （修正有）【課題】フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供する。【解決手段】（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールする、配列番号１〜１２に示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
【請求項２】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ａ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｂ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＨＬＡ−Ｃ遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号：１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列番号：１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−Ａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項９】
配列番号：３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１０】
配列番号：５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１１】
配列番号：７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１２】
配列番号：９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１３】
配列番号：１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大量並列シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ）である。
【０００３】
ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ分子のα鎖はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
【０００４】
ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
【０００５】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１以外のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
【０００６】
各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。
【０００７】
ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である。
【０００８】
骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡタイプが４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のＧＶＨＤ頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
【０００９】
ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１１−２１６０００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｉｎｄ  Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３−１０４２頁（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、クラスＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＣならびにクラスＩＩのＨＬＡ分子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の６座について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計し、好適なＰＣＲ条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット（配列番号１〜１２）を準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子の６座位のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のＤＮＡタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているｎｕｌｌアリルや新規アリルの検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。
【図２】（ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁〜第４７頁から引用した。
【図３】ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。
【図４】実施例で増幅したＰＣＲ産物の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット（配列番号１〜１２）を準備する。
ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ分子）の構造との関連も知られている（図１と図２参照）。
【００１８】
即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ分子と言われるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃの遺伝子は７個又は８個のエクソンを含んでおり（図１（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている（図１（ｂ））。
さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ分子と言われるＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図２（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図２（ｂ））。
さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
【００１９】
本発明では、古典的クラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）をＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ｎｕｌｌアリルの有無も正確に検知することができる。
【００２０】
具体的には、下記表１に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
【表１】
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【００２１】
表１における配列番号１及び２は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２２】
配列番号１は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第29,910,189番目から第29,910,212番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号２は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第29,913,562番目から第29,913,586番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約３，３９８塩基（ｂｐ）である。
【００２３】
表１における配列番号３及び４は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２４】
配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から31,321,366  番目から第31,321,392番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第31,325,632番目から第31,325,661番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，２９６塩基（ｂｐ）である
【００２５】
表１における配列番号５及び６は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２６】
配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第31,235,959番目から第31,235,982番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号６は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第31,240,373番目から第31,240,398番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，４４０塩基（ｂｐ）である。
【００２７】
表１における配列番号７及び８は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２８】
配列番号７は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第32,546,220番目から第32,546,247番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第32,558,090番目から第32,558,118番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１１，８９９塩基（ｂｐ）である。
【００２９】
表１における配列番号９と１０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３０】
配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第33,042,795番目から第33,042,823番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第33,056,373番目から第33,056,399番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約１３，６０５塩基（ｂｐ）である。
【００３１】
表１における配列番号１１と１２は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３２】
配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第32,627,718番目から第32,627,743番目に相当する塩基配列を持つフォワード・プライマーである。
配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列列のＨＬＡ領域におけるテロメア側から第32,634,812番目から第32,634,835番目に相当する塩基に相補的な塩基配列を持つリバース・プライマーである。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，１１８塩基（ｂｐ）である。
【００３３】
これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとのセットであれば、配列番号１〜１２に示した塩基配列に、１から数個の塩基の置換、挿入又は欠損を有するものを同様に使用することができる。
【００３４】
（２）ＰＣＲ増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅する。
ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
３．反応条件を設定してＰＣＲ反応を実施する。
例：熱変性ステップ（通常は９２〜９７℃）
アニーリングステップ（通常は５５〜７２℃）
伸長ステップ（通常は６５〜８０℃）
４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
【００３５】
（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス（あるいは超高速シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
【００３６】
例えば、イルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）社のＮｅｘｔｒａ（ＴＭ）ＤＮＡサンプル調製キットでＤＮＡライブラリーを作製し、ゲノムシークエンサーＭｉＳｅｑシステム（イルミナ社）を用いて配列決定する方法などが挙げられる。
この方法では、トランスポソームを解するＤＮＡの断片化とアダプター結合が同時に行われるので、ライブラリーの調製が約９０分以内という短時間で実施できる。得られたサンプルのシークエンシングには、好ましくはペアエンド解析が用いられる。
【００３７】
（４）ＤＮＡタイピングステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られた塩基配列を、既知のＨＬＡ対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡのアリル型（８桁まで）が決定される。
【００３８】
本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、各遺伝子のほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ｎｕｌｌアリルに関する情報を得ることもできる。
すなわち本発明は、配列番号１〜１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むＨＬＡ遺伝子タイピング用キットも提供する。
【実施例】
【００３９】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（実施例１）
［実験方法］
１．既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡ遺伝子特異的プライマーセット（表１参照）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲ増幅はＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用い、以下の組成で実施した。
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（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６８度で１０分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図４に示した。
【００４１】
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
得られたPCR増幅産物をNextera DNA Sample Preparation Kit (illumina)を用いてＤＮＡライブラリーを調整、MiSeq(illumina)により１５０ｂｐペアエンドでシーケンスするという流れである。
Nextera DNA Sample Preparation KitはNextera transposomeを用いることでタグメンテーションと呼ばれるＤＮＡ切断とタグ配列の挿入を同時に行うことにより反応時間を含め９０分と短時間でＤＮＡライブラリーを調整することが可能である。また、２種類のIndexを用いることで最大９６種類(Index1:8種類+Index2:12種類)のサンプルを同時に解析することができるという特徴を持つ。また、他の次世代シーケンサーのＤＮＡライブラリー調整と異なり、開始ＤＮＡ量必要量がわずか５０ｎｇというのも特徴の一つである。
さらに、調整したＤＮＡライブラリーのインサートサイズが２００ｂｐ〜１ｋｂ以上と非常に幅が広いことも、本手法での特徴とメリットとなっている。単一なＰＣＲに由来する良質なシークエンス情報を得た後、データ解析によりＨＬＡタイピングを行うが、このデータ解析が本法の最も独創的な点である。まず得られたシークエンスリードを各ＰＣＲ増幅領域のリファレンス配列にBWAおよび Samtools によってマッピングし、ディプロタイプとしての解析結果を得て、PicardおよびGenome Analysis TKによりリファレンス配列と異なる塩基を検出する。検出された一塩基置換(SNV)および挿入欠失(Indel)のうち、SNVのみをシークエンスリードのペア情報を元に相を分類し、この相を分けられたハプロタイプのSNVを元に２つのＨＬＡ遺伝子配列を作成する。
この相の特定は１つのペアエンドのシークエンスリードによって２つ以上のSNVをつなぐ必要があり、２つ以上のSNV間の距離は様々であるが、ＨＬＡ遺伝子が非常に多様性に富んでいるという特徴とNextera DNA Sample Preparation Kitで調整したＤＮＡライブラリーのインサートサイズが２００ｂｐ〜１ｋｂ以上と非常に幅が広いことが様々な距離の２つ以上のSNVの相の特定を可能としている。
次いで、この２つのハプロタイプのＨＬＡ遺伝子配列にシークエンスリードを再度マッピングすることで相に分けられたSNVの確認とIndelの相を決定する。１度目のマッピング結果で検出されるIndelは偽陽性を含んでいるが２度目のマッピングではSNVのない塩基配列にマッピングするため確実にIndelを決定することが可能である。２度目のマッピングで得られた２つのコンセンサス配列が２つのＨＬＡ遺伝子のシークエンスであり、これをIMGT/HLAデータベースに検索することでＨＬＡアレルが新規か既知か、既知であればＨＬＡアレル番号を得ることができる。
【００４２】
［結果］
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１及びＨＬＡ-ＤＱＢ１において、それぞれ特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計し、前記の条件下でのＰＣＲによって得られた産物のアガロースゲル電気泳動から、各ＨＬＡ遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図４）。
【００４３】
表２に、採用した幾つかのサンプルについて、本願発明の方法で決定したＨＬＡアリル型（実施例）及び従来のＳＳＯ法を用いて決定したＨＬＡアリル型を示す。
ＳＳＯ法では４桁レベルまでしか特定されなかったのに対し、本発明の方法（実施例）では６桁又は８桁レベルまで詳細にアリル型を決定することができた。よって本発明の方法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールであると考えられる。
【００４４】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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