(57)【要約】【課題】アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性が抑えられながらも、美味しい清酒を提供すること。【解決手段】α−グルコシルグリセロールの濃度が２ｍｇ／ｍｌ以下であり、かつ、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である、清酒。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルコシルグリセロールの濃度が２ｍｇ／ｍｌ以下であり、かつ、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である清酒。
【請求項２】
α−グルコシルグリセロールの濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の清酒。
【請求項３】
グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項１又は２に記載の清酒。
【請求項４】
酵素剤を用いて融米を調製する工程と、
融米におけるα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、
前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた融米、米麹、酒母及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程と、
を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の清酒を製造するための方法。
【請求項５】
α−グルコシダーゼ活性のない酵素剤を用いて融米を調製する工程と、
前記融米、米麹、酒母及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程と、
を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の清酒を製造するための方法。
【請求項６】
蒸米又は融米と米麹とを混ぜてデンプンを糖化する工程と、
糖化液のα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、
前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた糖化液、酒母及び仕込み水を混ぜて発酵させる工程と、
を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の清酒を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、清酒及び清酒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−グルコシルグリセロールは、グリセロールにグルコースが結合した構造であり、保水性が強く化粧品原料として利用が検討されている（非特許文献２，４）。α−グルコシルグリセロールは清酒（日本酒）に含まれていることが知られている（非特許文献１〜３）。α−グルコシルグリセロールは清酒の製造工程において、糖源であるマルトースと酵母が産生するグリセロールから麹由来のα−グルコシダーゼ（トランスグルコシダーゼとも呼ばれる）の作用により生成すると考えられている。
【０００３】
一方、消費者の健康志向から糖質の低減された清酒が検討されており、かかる清酒では糖質の一つとしてα−グルコシルグリセロールも低減されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２７９１３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０００，６４（２），３７８−８５．
【非特許文献２】Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０００，６４（９），１８２１−６．
【非特許文献３】Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００１，６５（７），１４５８−６３．
【非特許文献４】Ｓｃｈｗａｒｚ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００９，１０３（５），８６５−７２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
α−グルコシルグリセロールが、清酒に含まれていることはすでに知られていたが、保水性以外の性質はよく知られていなかった。本発明者らは、鋭意研究を行った結果、α−グルコシルグリセロールがアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に対する阻害活性を有していることを見出した。
【０００７】
体内に摂取されたアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によってアセトアルデヒドへ分解され、アセトアルデヒドはＡＬＤＨによって酢酸に分解される。アセトアルデヒドは非常に毒性が強く、フラッシング反応（顔が赤くなる、吐き気がする、動悸がする、眠くなる等の症状）を起こし、二日酔いの原因とも考えられている。したがって、ＡＬＤＨ阻害活性のあるα−グルコシルグリセロールは、アセトアルデヒドの分解を抑制するため、二日酔いの原因物質と考えられる。
【０００８】
上記の通り、α−グルコシルグリセロールの低減された清酒は既に提案されているものの、糖質全体が低減されていることから美味しさの点で不十分であるという問題点があることを本発明者らは見出した。そこで、本願発明は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性が抑えられながらも、美味しい清酒を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、さらに鋭意研究を進めたところ、清酒の製造方法を工夫することで、グルコース及び／又はマルトースの濃度を下げずに、α−グルコシルグリセロールの濃度を下げることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、α−グルコシルグリセロールの濃度が２ｍｇ／ｍｌ以下であり、かつ、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である清酒を提供する。
【００１１】
従来の清酒は、α−グルコシルグリセロールの濃度が２ｍｇ／ｍｌ以上、かつ、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である。また、糖質の低減された清酒では、α−グルコシルグリセロールも、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖も実質的に含まれていない。それに対して、本発明にかかる清酒は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性が抑えられていることで二日酔いし難く、十分な糖質が含まれていることで美味しい味となる。
【００１２】
上記清酒において、α−グルコシルグリセロールの濃度は１ｍｇ／ｍｌ以下であってもよく、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上であってもよい。
【００１３】
また、本発明は、上記清酒を製造する方法をも提供する。
【００１４】
すなわち、本願発明は、酵素剤を用いて融米を調製する工程と、融米におけるα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた融米、米麹、酒母及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程とを備える、上記清酒を製造するための方法を提供する。別の製造方法として、α−グルコシダーゼ活性のない酵素剤を用いて融米を調製する工程と、前記融米、米麹、酒母及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程とを備える、上記清酒を製造するための方法を提供する。
【００１５】
α−グルコシルグリセロールは、清酒の製造工程において、糖源であるマルトースと酵母が産生するグリセロールから麹由来のα−グルコシダーゼの作用により生成すると考えられている。α−グルコシダーゼ活性を失活させた融米を用いることで、又はα−グルコシダーゼ活性のない酵素剤を用いて調製した融米を用いることにより、醪中のα−グルコシダーゼ活性を低下させることが可能となる。そのような状態で酵母と接触させることで、α−グルコシルグリセロールの生成を抑えることが可能である。一方で、かかる手段を採用しても、グルコース及び／又はマルトースの量は、従来の清酒の製造方法と同程度に維持することが可能である。
【００１６】
本願発明は、さらに別の製造方法として、蒸米又は融米と米麹とを混ぜてデンプンを糖化する工程と、糖化液のα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた糖化液、酒母及び仕込み水を混ぜて発酵させる工程と、を備える、上記清酒を製造するための方法を提供する。かかる方法では、α−グルコシダーゼ活性をより低下させた状態で酵母と接触させることが可能となり、α−グルコシルグリセロールの生成をより抑えることが可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性が抑えられながらも、美味しい清酒が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】清酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図２】清酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図３】清酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図４】清酒からＡＬＤＨ阻害物質を同定するための手順を示す図である。
【図５】清酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図６】清酒に含まれる成分のＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図７】清酒に含まれる成分の分子量を示すグラフである。
【図８】合成したα−グルコシルグリセロールのＡＬＤＨ阻害活性を示すグラフである。
【図９】市販の清酒におけるα−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量を示すグラフである。Ａ〜Ｆは糖質が低減されていない清酒であり、Ｇは糖質が低減されている清酒である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態にかかる清酒は、α−グルコシルグリセロールの濃度が２ｍｇ／ｍｌ以下であり、かつ、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上である。各成分がかかる濃度範囲となることで、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性が抑えられながらも、美味しい味となる。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性をより抑えるためには、α−グルコシルグリセロールの濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。より美味しい味とするためには、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００２１】
グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度とは、グルコースの濃度、マルトースの濃度又はグルコース及びマルトースの合計の濃度を意味する。
【００２２】
上記清酒を製造するための方法として、融米造り（液化仕込み）を改良した方法を利用することができる。融米造りとは、慣用されている清酒の製造方法の一種である。通常の清酒の製造方法では、蒸米に、米麹、酒母及び仕込み水を添加して醪を仕込み、醪を糖化及び発酵させた後、醪を圧搾して液体の清酒と固体の酒粕に分離（上槽）する。融米造りは、通常の清酒の製造方法において、蒸米の代わりに液化した融米を用いる方法である。融米は以下の方法で得られる。すなわち、米を精米し、洗米し、水に浸漬して吸水させた後、仕込み水とともにミキサーなどで細かく粉砕し、液状とする。これにデンプンを分解する耐熱性の酵素剤を加えて、高温で蒸すことで、液化した融米が得られる。
【００２３】
上記融米造りを改良することで、上記清酒を製造することが可能である。すなわち、一実施形態にかかる清酒の製造方法は、酵素剤を用いて融米を調製する工程と、融米におけるα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた融米、米麹、酒母及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程とを備える。融米のα−グルコシダーゼ活性を失活させて醪を調製することで、通常の融米造りと比較して醪中のα−グルコシダーゼを低下せることが可能となる。そのため酵母由来のグリセロールが存在しても、α−グルコシルグリセロールの生成を抑えることが可能となる。
【００２４】
酵素剤は、通常の融米造りで使用されているデンプンを分解する酵素剤と同じものが利用可能であり、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ及びα−グルコシダーゼなどを利用可能である。
【００２５】
α−グルコシダーゼ活性を失活させる手段としては、加熱処理、酸処理及びアルカリ処理などがある。
【００２６】
α−グルコシルグリセロールの生成を抑える観点から、上記製造方法において使用する米麹は、α−グルコシダーゼ活性が低い又はα−グルコシダーゼ活性がない米麹であることが望ましい。また、α−グルコシルグリセロールの生成を抑える観点から、上記製造方法において使用する米麹は、糖化力が低い米麹であることが望ましい。糖化力が低いとは、１Ｕ／ｍＬ以下であることを意味し、好ましくは０．５Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．４５Ｕ／ｍＬ以下であることを意味する。米麹の糖化力の測定は、米麹を４−ニトロフェニル  β−マルトシドと反応させて４−ニトロフェニル  β−グルコシドを生成させ、それをβ-グルコシダーゼによって分解して４−ニトロフェノールを生成させ、４−ニトロフェノールを定量することに可能である。例えば、キッコーマン社製の糖化力測定キット及び糖化力分別定量キットなどを利用して、米麹の糖化力を測定することが可能である。
【００２７】
別の実施形態にかかる清酒の製造方法は、α−グルコシダーゼ活性のない酵素剤を用いて融米を調製する工程と、前記融米、酒母、米麹及び仕込み水を混ぜて醪を調製し、醪を発酵させる工程とを備える。酵素剤としてα−グルコシダーゼ活性がないものを使用して醪を調製することで、通常の融米造りと比較して醪中のα−グルコシダーゼを低下させることが可能となる。そのため、酵母由来のグリセロールが存在しても、α−グルコシルグリセロールの生成を抑えることが可能となる。
【００２８】
酵素剤は、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びセルラーゼを利用可能である。
【００２９】
α−グルコシルグリセロールの生成を抑える観点から、上記製造方法において使用する米麹は、α−グルコシダーゼ活性が低い又はα−グルコシダーゼ活性がない米麹であることが望ましい。また、α−グルコシルグリセロールの生成を抑える観点から、上記製造方法において使用する米麹は、糖化力が低い米麹であることが望ましい。糖化力が低いとは、１Ｕ／ｍＬ以下であることを意味し、好ましくは０．５Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．４５Ｕ／ｍＬ以下であることを意味する。米麹の糖化力の測定は、米麹を４−ニトロフェニル  β−マルトシドと反応させて４−ニトロフェニル  β−グルコシドを生成させ、それをβ-グルコシダーゼによって分解して４−ニトロフェノールを生成させ、４−ニトロフェノールを定量することに可能である。例えば、キッコーマン社製の糖化力測定キット及び糖化力分別定量キットなどを利用して、米麹の糖化力を測定することが可能である。
【００３０】
さらに別の実施形態にかかる清酒の製造方法は、蒸米又は融米、米麹を混ぜてデンプンを糖化する工程と、糖化液のα−グルコシダーゼ活性を失活させる工程と、前記α−グルコシダーゼ活性を失活させた糖化液、酒母及び仕込み水を混ぜて発酵させる工程とを備える。融米及び／又は米麹由来のα−グルコシダーゼ活性を酵母と接触させる前に失活させることで、酵母由来のグリセロールが存在しても、α−グルコシルグリセロールの生成を抑えることが可能となる。
【００３１】
下記実施例で示すように、酵素剤としてα−アミラーゼ単独又はα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの組み合わせを利用した場合に、α−グルコシルグリセロールの生成を検出限界以下に抑えることが可能である。よって、この方法で調製した醪を単独で利用することで、あるいは、従来の清酒の製造工程で調製した醪と組み合わせることで、α−グルコシルグリセロールの濃度を所定値（例えば、２ｍｇ／ｍｌ以下）に容易に調節することが可能である。
また、下記実施例で示すように、酵素剤としてα−アミラーゼ単独又はα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの組み合わせを利用した場合でも、グルコース及びマルトースの含有量は、通常の麹を用いた醪における含有量と同程度であり、グルコース及びマルトースからなる群から選択される糖の濃度を所定値（例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ以上）に容易に調節することが可能である。また、必要があれば、所定値となるようにグルコース及び／又はマルトースを添加して調節することも可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実験方法
１．ＡＬＤＨ活性の測定
Ｃ５７／ＢＬ６マウスから肝臓を摘出し、肝臓重量の４倍量の緩衝液（０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ−５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ  ７．４０，０．１ｍＭＤＴＴ）を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを８００ｇにて１５分間遠心して、核及びデブリス（細胞片）を取り除いた。その後、得られた上清を１２０００ｇにて１５分間遠心し、ミトコンドリア画分を沈殿させ回収した。残った上清を再度遠心し、残存するミトコンドリアを回収した。ミトコンドリア画分を上記緩衝液に再浮遊させ、遠心して再沈殿させた後、組織重量の１容量の緩衝液に浮遊させ、０℃において１０秒間、３回超音波粉砕した。超音波粉砕することによって得られたサンプルのタンパク質の定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて行った。得られたミトコンドリア画分（サンプル）は使用するまで−８０℃で保存した。
【００３４】
７０ｍＭ  ピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ピラゾール、０．１ｍＭ  ＮＡＤ＋、及び酵素源であるミトコンドリア画分（約１００ｍｇのタンパク質を含む）及び基質（１０ｍＭ  ２−エチルヘキサナール）を混合することによって反応を開始させた（３７℃）。反応液量は２００μｌとし、サンプルは１０質量％となるように添加した。３４０ｎｍにおける吸光度の増加を５分間記録し、その増加速度からＡＬＤＨ活性を評価した。
【００３５】
２．α−グルコシダーゼによるα−グルコシルグリセロールの合成
酵素は、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製、商品名）を、マルトースの量に対して０．１％使用した。マルトース５０ｇ（１０％），グリセロール１２５ｇ（２５％）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５００ｍｌに溶解し、上記酵素の存在下、４０℃にて一晩反応させた。反応終了後、９５℃にて１０分間加熱することによって上記酵素を失活させた。得られた反応液を配位子カラムＳＰＣ８１０（昭和電工社製、商品名Ｓｈｏｄｅｘ）によって分離し、α−グルコシルグリセロールをフラクションコレクターにて分取した。
【００３６】
３．清酒からのＡＬＤＨ阻害物質の分離及び精製
エバポレーターによって、清酒からアルコール分を除去し、サンプル（清酒サンプル）を得た。この清酒サンプルに含まれるＡＬＤＨ阻害物質の分子量を推定する目的で、分子量７０００カットの透析チューブを用いて上記透析チューブを透過した成分が含まれる低分子画分と、上記透析チューブを透過しなかった成分が含まれる高分子画分とに分画した。得られた低分子画分及び高分子画分のＡＬＤＨ阻害活性を測定した。その結果、低分子画分に阻害活性が認められた（図１）。次に吸着樹脂ＸＡＤ２（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ２）による分画を行った。上記清酒サンプルをＸＡＤ２に通液後、２０％メタノール水溶液、５０％メタノール水溶液、１００％メタノールを順次通液し、それぞれの溶出画分を得た。得られた画分のうち、ＸＡＤ２非吸着画分にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図２）。清酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質はＸＡＤ２への吸着性を示さず、親水性の高い物質であることが予想されたことから、ＸＡＤ２非吸着画分を弱塩基性陰イオン交換樹脂（オルガノ株式会社製、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＥ５８３）又は弱酸性陽イオン交換樹脂（オルガノ株式会社製、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＣ３５００）に通液し、ＡＬＤＨ阻害活性を評価した。その結果、弱塩基性陰イオン交換樹脂への通液によってＡＬＤＨ阻害活性が消失し、弱酸性陽イオン交換樹脂への通液ではＡＬＤＨ阻害活性の消失は認められなかった（図３）。ここまでの清酒の分画のスキームを図４にまとめる。
【００３７】
ＸＡＤ２に非吸着であって、陽イオン交換樹脂ＦＰＣ３５００にも非吸着である上記清酒サンプルの画分について高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって更に分離を行った。上記画分をＯＤＳカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名：Ａｔｌａｎｔｉｓ）によって分離し、フラクションコレクターを用いて３０秒間隔にてフラクション（画分）を得た（分離条件：０−４分  ０％ＣＨ３ＣＮ，４−９分  ０％−１００％ＣＨ３ＣＮ，９−１０分  １００％ＣＨ３ＣＮ、カラム温度：４０℃、流量：１ｍｌ／分）。図５（ｂ）にクロマトグラムを示す。２６０ｎｍの紫外吸収を示した画分２〜５についてＡＬＤＨ阻害活性を測定した結果、画分２にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図５（ａ））。画分２をさらに親水性化合物分離用ＮＨ２カラム（ＴＯＳＯＨ社製、商品名：ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＮＨ２）にて分離し、フラクションコレクターを用いて３０秒間隔にてフラクション（画分）を得た（分離条件：０−１５分  ８０％−２０％  ＣＨ３ＣＮ，１５−１６分  ２０％−０％  ＣＨ３ＣＮ、カラム温度：４０℃、流量：１ｍｌ／分）。図６（ｂ）にクロマトグラムを示す。取得した２２フラクションのうち、溶出時間６．５〜７．０分のフラクション１０にＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図６（ａ））。ＡＬＤＨ阻害率は測定終了時におけるコントロールと試験サンプルとの３４０ｎｍの吸光度の比から算出した。
【００３８】
４．清酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質の同定
ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＮＨ２カラムによる分離にて得られたフラクション１０について、ＬＣ／ＴＯＦ−ＭＳによって精密質量を測定した。Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２カラムを用いた分離でＥＳＩによる検出では３つのピークが得られた（図７（ａ））。それぞれのピークの精密質量と推定分子式はピーク１：１８１．０７０９ｍ／ｚ，Ｃ６Ｈ１４Ｏ６（図７（ｂ））、ピーク２：２５３．０９２９ｍ／ｚ，Ｃ９Ｈ１８Ｏ８（図７（ｃ））、ピーク３：１７９．０５６１ｍ／ｚ，Ｃ６Ｈ１２Ｏ６（図７（ｄ））であった。それぞれのピークについて化合物データベースによる検索と、清酒に含まれるＡＬＤＨ阻害物質の紫外吸収が弱いといった情報から、ピーク１がマンニトール又はソルビトールであり、ピーク２がα−グルコシルグリセロール（α−ＧＧ）であり、ピーク３がグルコース又はガラクトースであると推察された。これらの化合物のうち、標品が市販されているグルコース及びガラクトース（ピーク３）、並びにマンニトール及びソルビトール（ピーク１）については１０ｍｇ／ｍｌの濃度でもＡＬＤＨ活性の阻害は認められなかった。α−グルコシルグリセロール（ピーク２）については標品が市販されていないため、酵素を用いて合成することにした。
【００３９】
５．α−グルコシダーゼによるα−グルコシルグリセロールの合成
α−グルコシルグリセロールは、マルトースとグリセロールとからα−グルコシダーゼによる糖転移反応によって合成できることが知られている。そこで、同様の方法でα−グルコシルグリセロールを合成した後、分離及び精製することによってα−グルコシルグリセロールの標品を調製した。非特許文献２に記載の方法によりマルトースとグリセロールからα−グルコシダーゼの反応により、α−グルコシルグリセロールを合成した。酵素による合成後の反応液には目的産物であるα−グルコシルグリセロール以外に基質であるマルトース、グリセロール及び糖転移反応によって生成するグルコースが含まれている。配位子カラムＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰＯ８１０（昭和電工社製、商品名Ｓｈｏｄｅｘ）により分離し、α−グルコシルグリセロールを精製した（移動相：水、カラム温度：８０℃、流量：０．８ｍｌ／分）。フラクションコレクターを用いて酵素反応液からα−グルコシルグリセロールのみを分取した。分取によって得られた画分はほぼα−グルコシルグリセロールであり（図８（ａ））、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＡＬＤＨ阻害活性が認められた（図８（ｂ））。これら一連の分離及び同定の作業によって清酒に含まれるα−グルコシルグリセロールがＡＬＤＨを阻害する物質であることが明らかとなった。
【００４０】
６．市販の清酒におけるα−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量の測定
市販の清酒Ａ〜Ｇのα−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量を測定した。Ａ〜Ｆは糖質が低減されていない清酒であり、Ｇは糖質が低減されている清酒である。測定はＨＰＬＣ（カラム：昭和電工社製Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＰＯ８１０（Ｐｂ２＋）、内径８ｍｍ×長さ３００ｍｍ、移動相：水、カラム温度：８０℃、流量：０．８ｍｌ／分、検出器：示差屈折計）にて行った。結果を図９に示す。図９から明らかなように、糖質が低減されていない清酒においてはα−グルコシルグリセロールを２ｍｇ／ｍｌ以上含有していた。一方、糖質が低減されている清酒においては、α−グルコシルグリセロール、グルコース及びマルトースのいずれの含量も検出限界以下であった。
【００４１】
７．市販のコウジカビのα−グルコシルグリセロールの産生能の測定
市販のコウジカビのα−グルコシルグリセロール産生能を測定した。市販のコウジカビとして、米麹ＭＫＳ（焼酎用・白麹菌）、ＭＢＳ（焼酎用・黒麹菌）、Ｍ９０Ｌ（清酒用・黄麹菌）及びＴ９０Ｌ（清酒用・黄麹菌）を用いた。コウジカビ１ｇに１０％グリセロール及び１０％マルトースを含む水溶液８ｍｌを添加し、５０℃にて一晩緩やかに振とうした。コウジカビ１ｇに水８ｍｌを添加した試料及びコウジカビ１ｇに１０％グリセロールを含む水溶液８ｍｌを添加した試料も調製し、同様に５０℃にて一晩緩やかに振とうした。ろ紙ろ過により固液分離を行い、上清中のα−グルコシルグリセロールをＨＰＬＣにて定量した。それぞれのコウジカビの糖化力、α−グルコシダーゼ活性及び上清中のα−グルコシルグリセロール含量を表１に示した。なお、糖化力及びα−グルコシダーゼ活性は、キッコーマン社製の糖化力分別定量キットを用いて測定した。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
糖化力はＭＫＳ及びＭＢＳがＴ９０Ｌ及びＭ９０Ｌよりも高かったが、α−グルコシダーゼ活性はコウジカビの種類によって大きな差異は認められなかった。α−グルコシルグリセロール産生量は、糖化力の高いＭＫＳ及びＭＢＳにおいて高かった。α−グルコシルグリセロール生成反応の基質の一つであるマルトースの産生量が増加したことにより、α−グルコシルグリセロール産生量が増加したものと考えられる。この結果から、使用するコウジカビを選択することで、醪中のα−グルコシルグリセロール産生量を調節することができる可能性があることが分かった。
【００４４】
８．α化米及び酵素剤によるα−グルコシルグリセロールの産生量の測定
α化米、酵素剤（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼ）及びグリセロールの混合物におけるα−グルコシルグリセロールの産生量を測定した。１ｇのα化米に１０ｍｌの蒸留水を加え、１００μｌの酵素液（Ｔ４００Ｌ  α−アミラーゼ、アマノ  ＧＡＳ  グルコアミラーゼ０．１ｇ／５ｍｌ及び／又はトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」）を添加した。グリセロールは１０％となるように添加した。５０℃にて２日間反応し、ろ紙ろ過による固液分離後、上清中のα−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量をＨＰＬＣにより測定した。また、比較のために、１ｇの麹に１０％のグリセロールを添加した場合、添加しなかった場合のα−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量も測定した。結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
表２から明らかなように、α−グルコシルグリセロールの生成には、グリセロール及びα−グルコシダーゼの存在が必須であった。この結果から、酵素剤としてα−グルコシダーゼ活性のないものを利用することで、醪中のα−グルコシルグリセロール産生量を低減することができる可能性があることが分かった。
【００４７】
９．糖質ゼロ日本酒への糖類添加物の官能検査
糖質が低減されている清酒Ｇは、図９に示した通り、α−グルコシルグリセロール含量、グルコース含量及びマルトース含量のいずれもが検出限界以下であった。清酒Ｇに一般的な清酒に含まれる主要な糖類であるグルコース及びマルトースを添加し官能検査を実施した。図９に示した通り、糖質が低減されてない清酒のグルコース濃度はおよそ４〜１０ｍｇ／ｍｌ、マルトース濃度はおよそ１〜３．５ｍｇ／ｍｌであったことから、清酒Ｇへの添加濃度をグルコースは０．１，１，１０又は１００ｍｇ／ｍｌとし、マルトースは０．０１，０．１，１又は１０ｍｇ／ｍｌとした。官能検査は３名のパネルで行い、コク及び総合評価を１〜５の５段階で評価した。比較対照として清酒Ａ及びＥを用いた。官能評価結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
グルコース濃度１ｍｇ／ｍｌ以上又はマルトース濃度１ｍｇ／ｍｌ以上で、コク及び総合評価値が増加し、美味しさが改善できることが確認された。
【図４】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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