(57)【要約】【課題】優れた細胞増殖促進作用を奏することができる細胞増殖用足場材料を提供すること。【解決手段】本発明の細胞増殖用の足場材料は、ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材の表面が、プラズマ化した不活性ガス（例えばアルゴンガス）雰囲気下に曝されるプラズマ処理が施されていることを特徴とする。プラズマ処理は、マグネトロンスパッタリング装置を用いて行うことができるが、この場合において、ターゲット電極にはイオンスパッタによるスパッタ粒子の発生しない材料（例えばチタンやステンレス）を用いることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖用の足場材料であって、
ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材の表面が、プラズマ化した不活性ガス雰囲気下に曝されるプラズマ処理が施されていることを特徴とする細胞増殖用足場材料。
【請求項２】
前記不活性ガスはアルゴンガスである請求項１に記載の細胞増殖用足場材料。
【請求項３】
前記プラズマ処理はマグネトロンスパッタリング装置によって行い、ターゲット電極にはイオンスパッタによるスパッタ粒子の発生しない材料が用いられている請求項１又は２に記載の細胞増殖用足場材料。
【請求項４】
フィルム形状とされた請求項１乃至３のいずれか1項に記載の細胞増殖用足場材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生医療等に好適に用いることのできる細胞増殖用足場材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療や生化学等の分野において、細胞増殖に適した足場となる材料（以下「細胞増殖用足場材料」という）の開発は、重要なキーテクノロジーとなる。例えば、皮膚移植や骨再生をする場合、細胞増殖や細胞再生するための足場が必要となることもあり、細胞増殖に適した細胞増殖用足場材料が希求されている。
【０００３】
本発明者らは、これまで骨新生分野についての研究を行い、ポリ塩化ビニリデンフィルムが細胞増殖用足場材料として優れていることを見出している（非特許文献１）。すなわち、ポリ塩化ビニリデンフィルム上でラット大腿骨の骨髄より採取した間葉系幹細胞を培養し、ラット頭蓋骨におけるクリティカルサイズの骨欠損に対して、塩化ビニリデンフィルムを欠損部に覆うように移植すれば、骨新生が促進されることを見出した。また、この結果から、骨組織と塩化ビニリデンフィルムとの間に歯科用ボンディング材を介在させて接着させることにより、移植部位に適した形状付与の可能性が示唆されている。
【０００４】
骨再生の分野に限らず、各種幹細胞の増殖、各種骨補填材や自家骨移植との併用、歯周組織再生療法の遮蔽膜および細胞移植用材料、湿潤療法と呼ばれる褥創の治療等、さまざまな医療分野や生化学分野において細胞増殖用足場材料は便利なツールとなるため、細胞増殖を迅速に促すことのできる優れた細胞増殖用足場材料の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hamajima et.al. Dent Mateials Journal2011;30(5) 707-716
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記従来のポリ塩化ビニリデンフィルムを用いた従来の細胞増殖用足場材料では、培養皿による細胞増殖に比べ細胞増殖が遅く、増殖に時間がかかるという欠点があった。このため、細胞増殖速度の速い足場材料が求められていた。
【０００７】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、細胞増殖速度の速い細胞増殖用足場材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ポリ塩化ビニリデンフィルムを用いた細胞増殖用足場材料における上記従来の課題を解決するために、ポリ塩化ビニリデンフィルムの表面を処理して親水性にすることを考えた。このための手段として、プラズマ化した不活性ガス雰囲気下に曝すといういわゆるプラズマ処理を適用したところ、細胞増殖速度が極めて速くなり、しかも細胞が堅固に固着したフィルムとなることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は細胞増殖用の足場材料であって、ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材の表面が、プラズマ化した不活性ガス雰囲気下に曝されるプラズマ処理が施されていることを特徴とする細胞増殖用足場材料である。
【００１０】
不活性ガスとしては、アルゴンガス、ヘリウムガス、ネオンガス、キセノンガス等を用いることができる。これらのガスの任意の混合ガスを用いてもよい。本発明者らはアルゴンガスを用いることによって、ポリ塩化ビニリデンの表面が確実に親水性となり、細胞増殖速度が極めて速くなり、しかも細胞が堅固に固着することを確認している。
【００１１】
プラズマ処理に用いる装置としては、スパッタリング装置（例えば直流グロー放電や高周波によって発生させたプラズマを利用する２極式のスパッタリング装置や熱陰極を付加する３極式のスパッタリング装置等）を応用して行うことができる。さらに、ターゲット表面近傍に磁界を印加し、２次電子をローレンツ力で捉えてサイクロイドあるいはトロコイド運動させることにより、不活性ガスと加速電子との衝突の頻度を高めたマグネトロンスパッタリング装置を用いることも好ましい。
【００１２】
ただし、本発明においては、スパッタ粒子によるコーティングが目的ではなく、プラズマ化した不活性ガスによるポリ塩化ビニリデンからなる基材の表面処理が目的であるため、ターゲット電極の材料はスパッタ粒子が発生し難い材料（例えばチタンやステンレス等）からなる電極を用いることが好ましい。また、ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材が耐え得る温度となるように処理を行うことが必要となる。このため、高温プラズマよりも低温プラズマの方が好ましく、大気圧プラズマよりも減圧下でのプラズマである方が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】２極式のマグネトロンスパッタ装置の模式断面図である。
【図２】接触角と時間の経過の関係を示すグラフである。
【図３】プラズマ処理前及びプラズマ処理後のPVDCフィルムの表面についてのＦＴ-ＩＲチャートである。
【図４】繊維芽細胞様細胞Ｌ929を用いた細胞接着試験の試験結果を示すグラフである。
【図５】繊維芽細胞様細胞Ｌ929を培養した後の細胞形態のFE-SEM写真である。
【図６】骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いた細胞接着試験結果を示すグラフである。
【図７】L929の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。
【図８】MC3T3-E1の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。
【図９】プラズマ処理PVDCフィルム及び未処理PVDCフィルムについて、ラットを用いた骨欠損部位への移植試験を行った場合の３週間後のμ-Ｘ線ＣＴ写真である。
【図１０】プラズマ処理PVDCフィルム及び未処理PVDCフィルムについて、ラットを用いた骨欠損部位への移植試験を行った場合の３週間後の新生骨体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（原料）
本発明の細胞増殖用足場材料は、ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材を用いる。ポリ塩化ビニリデンの重合度については特に規定はなく、柔軟性、耐熱性等使用目的に応じて適切な重合度のものを適宜選択すればよい。また、本発明の課題達成を阻害しない範囲で、必要に応じて副次的な添加物を加えて様々な改質を行うことが可能である。副次的な添加物の例としては、可塑剤、酸化防止剤、難燃剤、紫外線吸収剤、着色剤、顔料、抗菌剤、安定剤、静電剤、核形成材、各種フィラー等その他の類似のものが挙げられる。
【００１５】
（プラズマ処理）
ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材をプラズマ化した不活性ガス雰囲気下に曝すことにより、本発明の細胞増殖用足場材料となる。プラズマ処理は減圧下で行うことが好ましい。大気圧プラズマではポリ塩化ビニリデンからなる足場基材の耐熱温度を超える恐れがあるからである。低圧プラズマ発生のための装置として、例えばスパッタリング装置（例えば直流グロー放電や高周波によって発生させたプラズマを利用する２極式のスパッタリング装置や熱陰極を付加する３極式のスパッタリング装置等）を用いることができる。さらに、ターゲット表面近傍に磁界を印加し、２次電子をローレンツ力で捉えてサイクロイドあるいはトロコイド運動させることにより、不活性ガスと加速電子との衝突の頻度を高めたマグネトロンスパッタリング装置を用いることも好ましい。
【００１６】
例として、グロー放電を用いた２極式のマグネトロンスパッタ装置を用いて説明する（図１参照）。このスパッタ装置はガラス製の円筒型チャンバー１内の上端近くに円板型のターゲット電極２が配置されており、ターゲット電極２中央に電磁石３が設けられている。一方、円筒型チャンバー１の下端近くには対極４が設けられている。ターゲット電極２及び対極４は交流電源５に、それぞれ接続されている。また、円筒型チャンバー１は図示しない排気制御装置に接続されており、内部の気圧及びガス雰囲気を制御可能としている。
【００１７】
次に、細胞増殖用足場材料の製造方法について述べる。
まず、円筒型チャンバー１を取り外し、対極４上にポリ塩化ビニリデンからなる足場基材を載せる。そして、再び円筒型チャンバー１を設置し、排気制御装置によって排気を行う。円筒型チャンバー１内部が真空に近くなったら、不活性ガスを導入し、大気圧に戻す。以上の操作を繰り返した後、プラズマ処理を行うための不活性ガス圧に調整する。具体的なガス圧は、ポリ塩化ビニリデンからなる足場基材６の耐熱性や処理を行った後の親水性の程度などを勘案して適宜決定すればよいが、通常０．１〜１００Ｐａ、好ましくは１〜１０Ｐａである。
そして、電磁石３に電流を流しつつターゲット電極２及び対極４間に直流電流を流す。電流値は足場基材６の様子（あまり電流が高いと温度上昇の為変形する）やプラズマ発光の様子を観察しながら、適宜調整すればよい。こうして、プラズマ処理を行った後、電流を止め、チャンバー１内に空気を導入し、大気圧に戻した後、チャンバー１を外してプラズマ処理が終了した足場基材６（すなわち細胞増殖用足場材料）を取り出し、作業を終了する。
【００１８】
以上のようにして製造された細胞増殖用足場材料は、プラズマ処理前に比べて水ぬれ性が極めて良好となる。また、細胞接着試験を行った場合、プラズマ処理前に比べて優れた細胞接着性を有する。さらには、ポリ塩化ビニリデンのフィルムを原料として細胞増殖用足場材料を調製し、これを例えば骨欠損部に蔽うように移植すれば、骨新生が促進される。
【００１９】
本発明の細胞増殖用足場材料の用途としては、例えば骨欠損部の骨造成、歯周組織再生療法への細胞移植、火傷等の褥瘡部の被覆等が考えられる。
【実施例】
【００２０】
＜細胞増殖用足場材料の製造＞
（足場基材）
原料となる足場基材として、厚さ20μｍのポリ塩化ビニリデン（以下PVDCという）フィルム（旭化成株式会社製、商品名：サランラップ（登録商標）、柔軟剤として脂肪酸誘導体、安定剤としてエポキシ化植物油が添加されている）を用いた。
【００２１】
（プラズマ処理）
上記PVDCフィルムに対して、マグネトロンスパッタリング装置（日本電子社製、JUC-5000）によってアルゴンプラズマ処理を行った。
まず、マグネトロンスパッタリング装置のチャンバーを開け、陽極上に上記PVDCフィルムを貼り付けたガラス板を載せ、再びチャンバーを載せ、チャンバー内をロータリーポンプで真空にした。その後、チャンバー内にアルゴンガスを6Paとなるように導入した。そして、電流が10ｍAとなるように制御しながら放電を行うことによってチャンバー内にアルゴンプラズマを発生させ、この状態で３分間の処理を行った。その後、空気を導入して大気圧に戻し、チャンバーを開けてプラズマ処理されたPVDCフィルムを取り出した。このプラズマ処理されたPVDCフィルムが細胞増殖用足場材料である。
【００２２】
＜評  価＞
以上のようにして調製したプラズマ処理PVDCフィルムの各種特性を調べた。その評価方法と結果を以下に示す。
【００２３】
（水ぬれ性試験）
プラズマ処理PVDCフィルムの表面の親水性を調べるため、水ぬれ性試験を行った。まず、PVDCフィルムをオートクレーブに入れ、１２０°Ｃ、２０分間処理したものについて、上記のようにして調整したプラズマ処理を行なった。そして、そのフィルム上に水滴を載せ、水滴とプラズマ処理PVDCフィルムとが接触している部分を横からデジタルカメラで撮影し、その画像を基に市販の画像処理ソフトウェア（Adobe社製Photoshop）を使用して水の接触角を測定した。水は脱イオン水を用い、フィルム表面に載せる水滴の体積は１０μＬとした。測定は、プラズマ処理後３０分、１、３、６及び１２時間経過後について行い、径時変化を調べた。また、比較の為、プラズマ処理を行う前のPVDCフィルムについても測定を行った。接触角の算出は、親水性の評価において一般的によく用いられているθ／２メソッドを用いてフィルム上に置かれた水滴の接触角を求めた（下記式１参照）。ここで、ｒは水滴の半径、ｈは水滴の高さを意味する。
【００２４】
【数１】
2016032484.tif 000002
【００２５】
結果を図２に示す。この図において、横軸が０時間のときの値は、プラズマ処理前のPVDCフィルムと水との接触角を示している。その後急激に低下し最低値となっているポイントは、プラズマ処理直後のPVDCフィルムと水との接触角の値を示している。
この図から、プラズマ処理前のPVDCフィルムは接触角が６７°と大きく、親水性に劣っているのに対し、プラズマ処理後のPVDCフィルムは接触角が１０°と小さくなり、優れた親水性の表面となっていることが分かる。そして、その接触角は時間と共に少しずつ大きくなるものの、１２時間経過後においても２２°であり、優れた親水性を維持していた。親水性は細胞の接着が行われやすくなると考えられており、プラズマ処理後のPVDCフィルムは、細胞増殖速度が極めて速くなり、しかも細胞が堅固に固着することとなる。
【００２６】
（赤外分光分析）
プラズマ処理前及びプラズマ処理後のPVDCフィルムの表面について、ＦＴ-ＩＲ(日本電子株式会社製  商品名Diamond-20)による測定を行った。その結果、図３に示すように、プラズマ処理前には明確には認められなかった3200〜3600cm-1付近の水酸基のＯ−Ｈ伸縮に起因すると思われる吸収ピークがプラズマ処理後に表れる一方、プラズマ処理前に存在した2800〜2900cm-1付近のメチル基のＣ−Ｈ伸縮運動に起因すると思われる吸収ピークがプラズマ処理後には不明確になっていた。以上のことから、アルゴンのプラズマ処理によってPVDCフィルムの表面のメチル基が少なくなり、水酸基が生成したことが分かった。前述した水ぬれ性試験において、プラズマ処理したPVDCフィルムの水ぬれ性が良好であったのは、PVDCフィルムの表面に水酸基が生成したことによるものと合理的に理解することが出来る。
なお、本実施例のプラズマ処理PVDCフィルムはアルゴンプラズマ中で処理を行っており、ポリ塩化ビニリデンには酸素は含まれていないことから、水酸基の酸素の供給源について疑問が残るが、恐らくプラズマ処理前のPVDCフィルムに吸着していた酸素、あるいはチャンバー内にわずかに存在していた酸素等が供給源となったのではないかと考えられる。このため、チャンバー内に不活性ガス以外のガスとして酸素ガスを共存させることも可能である。
【００２７】
（繊維芽細胞様細胞Ｌ929を用いた細胞増殖試験）
細胞には、マウス線維芽細胞由来L929(NCTCclone929、大日本住友製薬株式会社)を用いた。培養液はMinimumEssentialMedium(GIBCO)に5wt%ウシ胎仔血清(EQUITECH-BIO)、100U/mlPenicillin(GIBCO)、および100FLg/ml Streptomycin (GIBCO)を添加しろ過滅菌したものを使用した。試料作製のため、前述の方法で作成したPVDCフィルムをφ15mm の円形に成型し、ガラス板にはり付けた状態でオートクレーブにて加熱滅菌した後でプラズマ処理を行なった。また、比較のためにプラズマ処理をしていない未処理のPVDCフィルムも同様に滅菌した。加熱滅菌後、PVDCフィルムを得られた各試料を24ウェルマイクロプレート(Falcon)のウェル底面に気泡が混入しないようにはり付け、滅菌綿棒を用いて圧接した。細胞懸濁液はL929を1.0×105cells/mlとなるように調整し、24ウェルマイクロプレートの各ウェルに400μLずつ播種した。37℃、CO2濃度5%の条件下で培養し、細胞増殖の測定は培養開始3,6および24時間後に行なった。測定にはCellCountingKit-8(同仁化学研究所)を用いた.即ち、測定する各ウェルの培養液を新しい培養液に交換した後、CellCountingKit-8試薬を40μLずつ培養液に添加し撹拌した。マイクロプレートをインキュベーター内に2時間静置後、反応液を96ウェルマイクロプレートに100μLずつ移し、microplatereader(東ソー、MPR-A4i)を用いて450nmにおける吸光度を測定した。測定回数ｎは５回とした。
【００２８】
3時間,6時間及び,24時間後に細胞数を計測した結果を図４に示す。このグラフから、どの時間においても、プラズマ処理PVDCフィルムの方が未処理のPVDCフィルムよりも接着細胞数の方が多いことが分かる。
【００２９】
また、繊維芽細胞様細胞Ｌ929を培養した後の細胞形態をFE-SEM（日本電子（株）製  JSM-5510LV）を用いて観察した。培養２４時間後の結果を図５に示す。左上の写真はアルゴンプラズマ処理したPVDCフィルム上で24時間培養した繊維芽細胞様細胞Ｌ929であり、四角で囲んだ部分の拡大写真が左下の写真である。この図から細胞が扁平に伸展していることが分かり、細胞が糸状仮足を出し、フィルム表面に強固に接着しているのが分かる。一方、右上の写真が未処理のPVDCフィルム上で24時間培養した繊維芽細胞様細胞Ｌ929であり、四角で囲んだ部分の拡大写真が左下の写真である。この図から細胞がさほど伸展していないことが分かり、細胞からの糸状仮足がほとんど出ておらず、フィルム表面に単に載っているだけの弱い接着状態となっていることが分かる。
【００３０】
（骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いた細胞増殖試験）
繊維芽細胞様細胞Ｌ929を培養した方法と同様の方法により、骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いた細胞増殖試験を行った。培養液はα-MinimumEssentialMedium(GIBCO)に5wt%ウシ胎仔血清(EQUITECH-BIO)、100U/mlPenicillin(GIBCO)、および100FLg/ml Streptomycin (GIBCO)を添加しろ過滅菌したものを使用した。CellCountingKit-8試薬を添加した後、24ウェルマイクロプレートを1時間インキュベーター内に静置後、吸光度を測定した。
【００３１】
3,6及び,24時間後に細胞数を計測した結果を図６に示す。このグラフから、どの時間においても、プラズマ処理PVDCフィルムの方が未処理のPVDCフィルムよりも接着細胞数の方が多いことが分かる。
【００３２】
（線維芽細胞様細胞L929および骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を用いた細胞増殖試験）
上記と同様の方法で細胞を播種及び培養し、培養液の交換は毎日行なった。線維芽細胞様細胞L929の培養期間は５日間とし、細胞増殖の測定は毎日行なった。骨芽細胞様細胞MC3T3-E1の培養期間は12日とし、細胞増殖の測定は２日に一回行なった。
【００３３】
＜結  果＞
L929の細胞増殖試験の結果を図７に示す。プラズマ処理PVDCフィルムでは５日目にコンフルエントに達したが、未処理のPVDCフィルムの５日目における吸光度は、有意に低かった。MC3T3-E1の細胞増殖試験の結果を図８に示す。プラズマ処理PVDCフィルムは10日目にコンフルエントに達したのに対し、未処理のPVDCフィルムは吸光度の有意な減少を認めた。
【００３４】
（骨欠損部位への移植試験）
プラズマ処理PVDCフィルム及び未処理PVDCフィルムについて、ラットを用いた骨欠損部位への移植試験を行った。移植には5週齢sprague-Dawleyラット雄(体重130-150g)をソムノペンチル(共立製薬製)腹腔内投与により麻酔し、無痛下にて処置した。頭部手術部位を消毒、剃毛した後にメスを用いて10mm程度の皮膚切開を加え、鈍的に剥離し骨膜を切開した。開創器にて切開部を保持し、頭蓋骨正中に外径5mmのトレフィンバーを用い、注水下、低速回転にて直径5.0mm、深さ0.5mmの骨欠損を形成した。創部をエアーブローした後、φ7mmのプラズマ処理PVDCフィルム（あるいは及び未処理PVDCフィルム）をはり付けた。その上に、PVDCフィルムの形状付与と固定の目的で、歯科用ボンディング材G-BOND+(GC)を塗布したφ10mmのPVDCフィルムを貼り付け光照射にて固定した。そして、3週間後にμ-Ｘ線ＣＴ写真撮影を行った。
その結果、図７に示すように、プラズマ処理PVDCフィルムを張り付けた方は、未処理のPVDCフィルムを張り付けたものより、広い面積にわたって欠損部が新生骨に覆われていた。
【００３５】
これらのμ-Ｘ線ＣＴ写真について、3D画像計測ソフトを用いて新生骨体積を計算した（n数は3）。その結果、図８に示すように、プラズマ処理PVDCフィルムを張り付けた場合には、未処理のPVDCフィルムを張り付けた場合よりも大きな新生骨の増加が認められた。
【００３６】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【符号の説明】
【００３７】
１…円筒型チャンバー、２…ターゲット電極、３…電磁石、４…対極イオン、５…交流電源、６…足場基材
【図１】
2016032484.tif 000003
【図２】
2016032484.tif 000004
【図３】
2016032484.tif 000005
【図４】
2016032484.tif 000006
【図６】
2016032484.tif 000007
【図７】
2016032484.tif 000008
【図８】
2016032484.tif 000009
【図１０】
2016032484.tif 000010
【図５】
2016032484.tif 000011
【図９】
2016032484.tif 000012