(57)【要約】      （修正有）【課題】ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａの多糖生産遺伝子群、それを含むベクター、形質転換体及び多糖の提供。【解決手段】特定の配列で表される遺伝子配列からなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターにより形質転換した形質転換体として乳酸菌と酵母を取得。形質転換体の培養で産出する多糖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される遺伝子配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３】
前記組換えベクターが乳酸菌または酵母に導入しうる組換えベクターである、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記組換えベクターが、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属、サッカロマイセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属 （Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属 （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ジゴサッカロマイセス属 （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属 （Ｐｉｃｈｉａ）ヤロウィア属（ Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属 （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属 （Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属 （Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属 （Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）、またはスポロボロマイセス属 （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群に属する微生物に導入しうる組換えベクターである、請求項２または３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかの組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
前記形質転換体が乳酸菌、もしくは酵母である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記形質転換体が、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属、サッカロマイセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属 （Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属 （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ジゴサッカロマイセス属 （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属 （Ｐｉｃｈｉａ）ヤロウィア属（ Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属 （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属 （Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属 （Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属 （Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）、もしくはスポロボロマイセス属 （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群に属するものである、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７の形質転換体を培養することにより得られる、多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム属が産生する多糖の生産方法に関する。より詳しくはビフィドバクテリウム属の多糖生産遺伝子群、多糖生産遺伝子群を含むベクター、形質転換体および産生された多糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム・ロングムに属する菌種において、種々多糖を産生することが知られている（特許文献１、２および非特許文献１〜５）。
【０００３】
その中で、ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａが産生する多糖の生産には多数の遺伝子が関わっていると考えられており、具体的にどの遺伝子が関与しているかは不明であった。そのため、遺伝子操作により、大量生産したり、他の宿主に遺伝子群を導入して該多糖を生産させることができなかった。
【０００４】
そこで、ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａの多糖生産遺伝子群を同定し、他の宿主において該多糖を生産する技術が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０２３１７８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／００７５６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２００３， ６９， ５０９６．
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９９５， ７８， ４６３．
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９５， ２７４， ２４５．
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２００９， ７７， ３５１〜３５７．
【非特許文献５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９， １３５， ２６０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａの多糖生産遺伝子群、それを含むベクター、形質転換体および多糖を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、鋭意研究の結果、多糖生産に関与する遺伝子群が含まれるポリヌクレオチド断片を見出し、ベクターに挿入して宿主生物に形質転換することで多糖が生産されることを確認し、本発明を完成させた。本明細書によれば以下の発明が提供される。
（１）配列番号１で表される遺伝子配列からなるポリヌクレオチド。
（２）（１）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（３）前記組換えベクターが、ビフィズス菌、乳酸菌または酵母を形質転換しうる組換えベクターである、（２）に記載の組換えベクター。
（４）前記組換えベクターが、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属、サッカロマイセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属 （Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属 （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ジゴサッカロマイセス属 （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属 （Ｐｉｃｈｉａ）ヤロウィア属（ Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属 （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属 （Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属 （Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属 （Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）、またはスポロボロマイセス属 （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群に属する微生物に導入しうる組換えベクターである、（２）または（３）に記載の組換えベクター。
（５）（２）〜（４）のいずれかの組換えベクターを導入された形質転換体。
（６）前記形質転換体がビフィズス菌、乳酸菌、もしくは酵母である（５）に記載の形質転換体。
（７）前記形質転換体が、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属、サッカロマイセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属 （Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属 （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ジゴサッカロマイセス属 （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属 （Ｐｉｃｈｉａ）ヤロウィア属（ Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属 （Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属 （Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属 （Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属 （Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）、もしくはスポロボロマイセス属 （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群に属するものである、（６）に記載の形質転換体。
（８）（５）〜（７）の形質転換体を培養することにより得られる、多糖。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多糖を同種または異種生物において生産させることができるという効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、多糖生産遺伝子群を同定し、該多糖生産遺伝子群をベクターに連結し、他の宿主に導入して発現させ、元の宿主では生産できなかった多糖を生産可能にするものである。
【００１１】
本明細書において、多糖生産遺伝子群とは、ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａの多糖生産遺伝子群をいい、より好ましくは、Bifidobacterium longum DNA, complete genome, strain: 105-A（DDBJ ACCESSION番号: AP014658）の、４７８０７６〜５０８２０２位のポリヌクレオチド（配列番号１）からなる配列に含まれる、多糖生産に関連する遺伝子群をいう。この３０１２７塩基のヌクレオチド配列を配列番号１と名付けた。
【００１２】
本発明によれば、ビフィドバクテリウム・ロングム１０５Ａの多糖生産遺伝子群が提供される。本発明により生産される多糖としては、ガラクトース、グルコース、およびラムノースを３〜５：１〜３：１のモル比で含まれる多糖をいう。
【００１３】
本発明の発明者らは、ゲノム中の上記配列の一部ＣｐｓＤ遺伝子（galactosyl transferase CpsD: locus tag=”BL105A_0405, gene 478076-479551）全体を二重交叉組換え（Appl. Environ. Microbiol. 2012,  78（14）,p.4984-4994）によりスペクチノマイシン耐性遺伝子と置き換えて欠失させたところ、多糖生産能が失われることを見出し、上記領域に多糖生産に関連する遺伝子群がコードされていることを確認した。
【００１４】
ＣｐｓＤ遺伝子以外の遺伝子についても同様の手法を用いることで、配列番号１内にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を１つずつ、または複数を同時に欠失させることができ、どのＯＲＦが多糖生産に関与しているかを確認することができる。多糖生産に関与する遺伝子と関与しない遺伝子がわかれば、多糖生産に関与する遺伝子のみをベクターに連結して導入することにより、より効率よく多糖を生産させることができる。
【００１５】
また、多糖生産に関与する遺伝子がわかれば、その上流域のプロモータをビフィドバクテリウム属以外の生物において効率よく発現するプロモータに置換することで、異種生物においてもより強力に多糖生産遺伝子を発現させることができ、多糖生産量を増加させることができる。
【００１６】
次に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを宿主生物に適したベクターに挿入し、宿主生物に形質転換することで、元々は多糖を生産する能力のない宿主生物に対しても多糖生産能を付与することができた。すなわち、配列番号１からなる配列は多糖生産に必要な遺伝子群を含むことが確認された。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドを導入し、発現させる宿主生物としては、特に制限されないが、例えば、乳酸菌および酵母が挙げられる。乳酸菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属が挙げられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）、またはスポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）などが挙げられる。
【００１８】
上記宿主生物に対し、導入・発現に適したベクターを選択し、適当な制限酵素、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩなどにより切断し、本発明のポリヌクレオチドの末端も同じ酵素の組合せで切断し、ＤＮＡリガーゼにより、連結することで本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターが構築できる。
【００１９】
構築した組換えベクターを、多糖を発現させたい宿主生物に導入することで、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が発現し、多糖を生産することができる。
【００２０】
宿主生物によっては、プロモータ、ターミネータを付け替えた方が発現効率がよくなるので、律速となる遺伝子などについては、より強いプロモータを本発明のポリヌクレオチドに機能するように連結して形質転換することで該遺伝子をより効率的に発現させ、全体としての多糖生産量を増やすことも可能である。
【００２１】
以下実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００２２】
プラスミドをエレクトロポレーションにより形質転換する菌としては以下の４種を用いた。
１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４
２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＪＣＭ １１３２
３）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＪＣＭ１２１７
４）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＪＣＭ ７２５５
【００２３】
(相同組換え）
Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５ＡのクロモソームＤＮＡはＡｐｐｌ.  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１２，  ７８（１４），４９８４に記載された方法により調製した。すなわち、培養したビフィドバクテリウムを２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ショ糖溶液中で３０ｍｇ／ｍLのリゾチームで３７℃、１時間処理し、その後ＩｓｏｐｌａｎｔＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いてクロモソームＤＮＡを調製した。
【００２４】
ｐＫＯ４０３−ΔＣｐｓＤの遺伝子情報はレプリカーゼを用いて１０５Ａクロモゾームと相同性組換えを行いＢ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａにエレクトロポレーションにて形質転換しＢ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａ-ΔＳｐＤ（ＣｐｓＤゲノム遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子で置換したＢ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａ）を得た。
【００２５】
形質転換後、スペクチノマイシン５０μｇ/ｍLを含むＭＲＳ寒天培地で嫌気性条件下培養した。
【００２６】
１白金耳を５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３７℃で３０時間嫌気下で培養したところ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａでは粘性が見られたが、１０５Ａ−ΔＳｐＤでは粘性が見られず、ＣｐｓＤ遺伝子が多糖産生に必須であることがわかった。
【００２７】
３８６領域（ACCESSION番号AP014658, locus tag=”BL105A_0414, gene 490611-491408），３８７領域（AP014658, locus tag=”BL105A_0415, gene 491412-492512）についても同様にｐＫＯ４０３−Δ３８６、Δ３８７を作成しＢ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａ-Δ３８６、１０５Ａ-Δ３８７を作成した。
【００２８】
１白金耳を５ｍＬのＭＲＳ培地に植菌し、３７℃で３０時間嫌気下で培養したところ、１０５Ａでは粘性が見られたが、３８６領域、３８７領域をそれぞれ破壊した１０５Ａ−Δ３８６、１０５Ａ−Δ３８７では粘性が見られず、３８６領域、３８７領域が多糖産生に必須であることがわかった。
【００２９】
プラスミドは以下のプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して用いた。
ｐＬＣ４９４  (Ｐｌａｓｉｍｉｄ, ２００６， ５５， １２８、ＪＰＢ４９６７１３８) 
ｐＢＬＥＳ１００（Ｂｉｏｓｃｉ.  Ｂｉｏｔｅｃｈ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ., １９９７，６１，１２１１）
【００３０】
（乳酸菌）
Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  １０５Ａから抽出したクロモソームＤＮＡを、ＰＣＲ反応キット（アプライドバイオシステムズ社製）の取扱説明書に従って、０．５ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅させた。プライマーとして、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを入れたＦおよびＲを用いてＰＣＲを行った。
【００３１】
Ｆ:５’−ＣＧＣＣ”ＡＡＧＣＴＴ”ＧＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号２）
（””で囲んだ５位から１０位までのＡＡＧＣＴＴはＨｉｎｄＩＩＩ切断部位である）
Ｒ:５’−ＣＧＣＧ”ＧＡＴＣＣＴ”ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴＴＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧ−３’（配列番号３）
（””で囲んだ４位から９位までのＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ切断部位である）
９４℃２分→（９４℃５秒→５４℃３０秒→６８℃６０秒）×３０回→７２℃２分のＰＣＲ後、ＰＣＲ産物およびｐＬＣ４９４を，それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＯＲＦ１部分に挿入した３０１２７ｂｐ部分を分取し、組換え用プラスミドｐＪＬｂＣ３０１２７を作成した。
【００３２】
Ｌｂ．ｃａｓｅｉ  ＪＣＭ  １１３４を、ＭＲＳブロス培地に植菌し、３７℃にて１２時間、対数増殖期中期まで振盪培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、ＰＢＳ（塩化ナトリウムを８ｇ、塩化カリウムを０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウムを１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇを１Ｌの蒸留水で希釈しｐＨ７．４としたもの）で、３回洗浄した。次いで、５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳを加えて、Ｌｂ．ｃａｓｅｉの懸濁液を得た。この懸濁液５０μＬ中に、上記で調製したｐＪＬｂＣ３０１２７を５μＬ（１μｇＤＮＡ／５μＬ）加え、これを０．２ｃｍ幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れて、５μｓ、１０００Ｖの条件にて形質転換を行った。
【００３３】
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＭＲＳ寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）で、３７℃にて炭酸ガス１０％を含む窒素ガス環境中で培養することにより、形質転換されたＬｂ．ｃａｓｅｉ ＪＬＣ３０１２７を得た。同様にＬｂ. ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＪＣＭ  １１３２についても形質転換を行い、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＪＬＡ３０１２７を得た。
【００３４】
（ビフィズス菌）
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＢＬＥＳ１００を、それぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、組換え用プラスミドｐＪＢｌ３０１２７を作成した。
【００３５】
Ｂ.ｌｏｎｇｕｍ  ＪＣＭ１２１７を、ＭＲＳブロス培地に植菌し、３７℃にて１２時間、嫌気性条件にて対数増殖期中期まで静置培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、ＰＢＳ（塩化ナトリウムを８ｇ、塩化カリウムを０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウムを１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇを１Ｌの蒸留水で希釈しｐＨ７．４としたもの）で、３回洗浄した。次いで、５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳを加えて、Ｂ．ｌｏnｇｕｍの懸濁液を得た。この懸濁液５０μＬ中に、上記で調製したｐＪＢｌ３０１２７を５μＬ（１μｇＤＮＡ／５μＬ）加え、これを０．２ｃｍ幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れて、５μｓ、１０００Ｖの条件にて形質転換を行った。スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＭＲＳ寒天培地で、３７℃にて炭酸ガス１０％を含む窒素ガス環境中で培養することにより、形質転換されたＢ．ｌｏｎｇｕｍ  ３０１２７を得た。
【００３６】
ＭＲＳブロス２０ｍＬを用いて各々２白金耳３７℃３０時間培養し、粘度（Ｂ型粘度計、１０℃）を測定した結果、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ.ｌｏｎｇｕｍそれぞれ３６、４２、３９  ｃＰ(組換え前同様培養後それぞれ２、３、２  ｃＰ)となり、多糖の産生が見られた。
【００３７】
（酵母）
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物およびプラスミドｐ４Ｘ３（GENE, 1955, 156, 119）を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、組換え用プラスミドｐＪＳＣ３０１２７を作成した。
【００３８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＪＣＭ  ７２５５を、ＹＭブロス培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に植菌し、３０℃にて１２時間、０．５ＶＶＭ空気吹き込み条件にて対数増殖期中期まで振盪培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、ＰＢＳ（塩化ナトリウムを８ｇ、塩化カリウムを０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウムを１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇを１Ｌの蒸留水で希釈しｐＨ７．４としたもの）で、３回洗浄した。次いで、５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％グリセロール液を加えて、Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの懸濁液を得た。この懸濁液５０μＬ中に、上記で調製したプラスミドを５μＬ（１μｇＤＮＡ／５μＬ）加え、これを０．２ｃｍ幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れて、５μｓ、１５００Ｖの条件にて形質転換を行った。
【００３９】
ヒスチジン３（５０μｇ／ｍｌ）含有ポテトデキストロース寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）で、３７℃で培養することにより、形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３０１２７を得た。
【００４０】
ＹＭブロス２０ｍLを用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３０１２７を２白金耳接種し、３７℃で３０時間培養し、粘度（Ｂ型粘度計、１０℃）を測定した結果、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３０１２７は４３ｃＰ(組換え前の菌は同様に培養後４ｃＰ)となり、多糖の産生が見られた
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、食品産業において利用できる。
【配列表】
2016168011000001.app