(57)【要約】【課題】クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍の検査方法を提供する。【解決手段】被験者の副腎に存在するmRNAから合成されたPRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片をEcoRIIで処理して、EcoRIIによる切断パターンを調べることにより、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の副腎に存在するmRNAから合成されたPRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片を制限酵素EcoRIIで処理して、EcoRIIによる切断パターンを調べる工程を含む、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法であって、
６１７番目の塩基を含むEcoRII切断部位で切断されない断片が検出された場合には、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍であると判定される、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法。
【請求項２】
前記PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片が、配列番号３の塩基配列を含むプライマーと、配列番号４又は５の塩基配列を含むプライマーとの組合せからなるプライマーセットによるPCRを行って合成されたものである、請求項１に記載のクッシング症候群
を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法。
【請求項３】
PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片を増幅し得る、５’プライマーと３’プライマーからなる、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列を含むプライマーと、配列番号４又は５の塩基配列を含むプライマーとの組合せからなる、請求項３に記載のクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用プライマーセット。
【請求項５】
請求項３または４に記載のプライマーセットを含む、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用キット。
【請求項６】
さらに制限酵素EcoRIIを含む、請求項５に記載のクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子解析を利用したクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍の検査方法およびそれに使用するプライマーセットに関する。また、当該プライマーセットを含む検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
クッシング症候群は、コルチゾールが慢性的に高値となる疾患で、耐糖能異常、高血圧、月経異常などの症状が認められる。通常、コルチゾール産生は視床下部より分泌される副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）により制御されており、ACTHが副腎皮質に作用してコルチゾールの合成と分泌を促している。しかしながら、下垂体腺腫により下垂体からACTHが自律的に過剰分泌されるクッシング病、下垂体以外の腫瘍からACTHが過剰に分泌される異所性ACTH症候群、副腎から自律的にコルチゾールが過剰分泌される副腎性クッシング症候群がある。副腎性クッシング症候群では、血中ACTHとコルチゾール値を測定した場合、典型例では血漿ACTHが低値でコルチゾールが高値となるが、このような検査値を示さない場合も多く、他の検査法が求められていた。
【０００３】
副腎性クッシング症候群は副腎皮質の腫瘍や過形成により起こることが知られているが、コルチゾール産生副腎腺腫の原因はこれまで十分解明されていなかった。しかし最近、副腎性クッシング症候群を呈する副腎腺腫の３７％にPRKACA遺伝子の体細胞変異を認めたことが報告され（非特許文献１）、さらに発明者らも、コルチゾール腺腫の２３％にPRKACA遺伝子の変異があることを発見した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】The New England Journal of Medicine, March 13, 2014, Vol. 370 No. 11, 1019-1028
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、PRKACA遺伝子の変異を検出することによる、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法、およびそれに使用するプライマーセットを提供することを課題とする。また、当該プライマーセットを含む検査用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、副腎に存在するmRNAから合成されたPRKACA遺伝子のcDNA断片に存在する特定の体細胞変異がクッシング症候群に関連しており、また、当該変異はEcoRII（BciT130,MvaI）を使用したRFLP法により簡便に検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。     
［１］被験者の副腎に存在するmRNAから合成されたPRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片を制限酵素EcoRIIで処理して、EcoRIIによる切断パターンを調べる工程を含む、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法であって、
６１７番目の塩基を含むEcoRII切断部位で切断されない断片が検出された場合には、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍であると判定される、クッシング症候群を呈
するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法。
［２］前記PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片が、配列番号３の塩基配列を含むプライマーと、配列番号４又は５の塩基配列を含むプライマーとの組合せからなるプライマーセットによるPCRを行って合成されたものである、［１］に記載のクッシング症
候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法。
［３］PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片を増幅し得る、５’プライマーと３’プライマーからなる、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用プライマーセット。
[４]配列番号３の塩基配列を含むプライマーと、配列番号４又は５の塩基配列を含むプライマーとの組合せからなる、[３]に記載のクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用プライマーセット。
［５］［３］または[４]に記載のプライマーセットを含む、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用キット。
［６］さらに制限酵素EcoRIIを含む、［５］に記載のクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍検査用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の検査方法により、血中ACTHやコルチゾールでは診断に至らなかったクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を正確かつ簡便に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】コルチゾール産生腺腫におけるPRKACAのシークエンス解析結果。上段は野生型の配列、下段がc.617T>Gを有する被験者の配列を示す。左の「Blood」は末梢血から得られたゲノムDNAを解析した結果であり、右の「Tumor cDNA」は腺腫から得られたmRNAから合成されたcDNAを解析した結果である。
【図２】EcoRIIを使用したRFLP法により、c.617T>Gを検出した電気泳動像（写真）。左図はc.617T>Gを有し、右図は野生型である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜１＞PRKACA遺伝子の変異に基づくクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍の検査方法
本発明の検査方法は、被験者の副腎に存在するmRNAから合成されたPRKACA遺伝子の６１７番目の塩基を含むcDNA断片をEcoRIIで処理して、EcoRIIによる切断パターンを調べる工程を含む、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する方法である。当該EcoRII等の制限酵素による切断パターンにより変異を調べる方法は、RFLP法として知られている。
【００１１】
クッシング症候群とは、例えば、J Clin Endocrinol Metab (2008) 93:1526-1540に記
載の基準によって診断される病態をいう。なお、本発明において、「検査」には、クッシング症候群に罹患しているか、そのリスクが高いかどうかの検査を含む。
【００１２】
PRKACA遺伝子は、サイクリック AMP 依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼ A [PKA]）の触媒サブユニットをコードする遺伝子である。PRKACA遺伝子としては、ヒトPRKACA遺伝子が好ましく、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子（cDNA）
を挙げることができる。ただし、該当遺伝子は人種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
【００１３】
本発明の検査方法においては、PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基における変異を解析する。６１７番目の変異とは、PRKACA遺伝子のコード領域である配列番号１の６１７番目に存在する変異である。塩基番号６１７番目の塩基は、野生型ではチミン（T）であるのに
対し、変異型ではグアニン（G）であり、配列番号２の２０６番目のアミノ酸であるロイ
シン（Leu）をアルギニン（Arg）に置換する変異である。
そして、野生型であるチミンの前後２塩基を含めた配列はCCTGGであり、この配列はEcoRIIにより認識され切断される。一方、変異型ではCCGGGとなるため、該配列はEcoRIIで切断されない。
本発明では、上記のように、６１７番目の塩基の種類によって、EcoRIIによる切断パターンが異なることを指標として、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査する。すなわち、６１７番目の塩基を含むEcoRII切断部位で切断されない断片が検出された場合（６１７番目の塩基がGである場合）は、変異型であり、クッシング症候群を呈す
るコルチゾール産生腫瘍であると判定する。
【００１４】
本発明の検査方法において、６１７番目の塩基を含むEcoRII切断部位で切断されていない断片が検出されれば、当該切断部位で切断されている断片が混在していたとしても、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍であると判定する。当該混在は、対立遺伝子の片方のみが変異型であるヘテロ接合体の場合に生じ得る。よって、本発明においては、ヘテロであるかホモであるかは問わず、未切断断片の検出をもってクッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍であると判定する。
【００１５】
本発明において、PRKACA遺伝子の６１７番目の塩基とは、配列番号１の塩基配列の塩基番号６１７番目の塩基のことであり、当該「６１７番目の塩基」には、６１７番目の塩基に相当する塩基も含む。ここで、「相当する」とは、ヒトPRKACA遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列が変異以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することを含む。例えば、ヒトPRKACA遺伝子は配列番号１と完全に一致していなくてもよく、６１７番目の塩基以外で置換や欠失、挿入等があってもよい。なお、配列番号１において６１７番目の塩基の前で一塩基の挿入や欠失があった場合、「６１７番目の塩基」は前後することがある。解析対象はあくまでも配列番号１と対比して、「６１７番目の塩基」に相当する塩基である。
【００１６】
本発明の検査方法においては、上記６１７番目の塩基の種類を調べることによって、クッシング症候群を検査することができる。検査する変異の数は、上記一種類でもよいが、PRKACA遺伝子の他の位置における変異と組み合わせてもよいし、クッシング症候群に相関する他の遺伝子の変異と組み合わせてもよい。
【００１７】
PRKACA遺伝子の変異の解析に用いる試料としては、被験者の副腎に存在するmRNAを含む試料であれば、特に制限されない。
【００１８】
得られたmRNAを含む試料を用いて、まず、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行い、cDNAを合成する。このときに使用するプライマーとしては、PRKACA遺伝子における上記変異部位を増幅するためのPCRに用いることのできる５’プライマーと３’プライマー
からなるプライマーセットが挙げられる。具体的には、配列番号１の塩基配列の６１７番目の塩基を含む領域を増幅することのできる５’プライマーと３’プライマーからなるプライマーセットが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３５塩基がより好ましい。このようなプライマーは、例えば、配列番号１において、該変異部位の上流または下流の位置に設定することができる。
上記変異部位をPCRするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましく
は100〜150塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜70塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。たとえば、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと、配列番号４又は５の塩基配列を有するプライマーとの組合せからなるプライマーセットが好ましい。
なお、本発明における変異の近傍には、他にもEcoRIIの認識配列が点在しているため、
それらの認識配列を避けるようにPCRプライマーセットを設計することが好ましい。たと
えば、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号５の塩基配列を有するプライマーの組合せからなるプライマーセットが好ましい。
【００１９】
次に、合成されたcDNAをEcoRIIで処理する。EcoRIIは、BstOI、BstNI、PspGI、MvaI等
の別名を持つ制限酵素である。本発明におけるEcoRIIには、CCTGGを認識して該配列を切
断する酵素はいずれも含まれる。EcoRIIは、その由来に制限はなく、市販のものを使用してもよいし、大腸菌等の起源から単離してもよい。
また、EcoRIIの処理において使用されるバッファーは、市販の制限酵素に添付されているものを用いてもよいし、適切な塩濃度のものを作製して用いてもよい。
EcoRII処理の時間や温度等の条件は、EcoRIIに適切であることが知られた条件の範囲内で、適宜設定可能である。たとえば、処理時間は１〜２４時間、さらに３〜１８時間が好ましく、温度は３０〜４０℃、さらに３７℃が好ましい。
【００２０】
次いで、EcoRII処理したcDNA断片を電気泳動等で分離し、検出されたcDNA断片の切断パターンによって、変異の有無を判定することができる。野生型であればEcoRIIによりcDNA断片が切断されるため、制限酵素処理前のDNA断片よりも短い断片が検出される。一方、
変異である場合には、EcoRIIによりDNA断片が切断されないため、制限酵素処理前後でDNA断片の長さは変わらない。
【００２１】
＜２＞本発明の検査用キット
本発明はまた、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を検査するためのプライマーセット、及び該プライマーセットを含むクッシング症候群検査用キットを提供する。プライマーセットとしては、PRKACA遺伝子における上記変異部位を増幅するためのPCR
に用いることのできる上述したような、配列番号１の塩基配列の６１７番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーセットが挙げられる。 
【００２２】
なお、本発明の検査用キットは、これらのプライマーセットに加えて、PCR用のポリメ
ラーゼやバッファーなどを含むものであってもよい。また、RFLP法に用いるEcoRII等の制限酵素や該制限酵素用のバッファーを含めてもよい。さらに、DNAの電気泳動用のアガロ
ースゲル、ローディングダイ、泳動用バッファー、及びエチジウムブロマイド等の染色液等を含めてもよい。 
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２４】
＜被験者と臨床データ＞
2007〜2013年の間に群馬大学病院で手術を受けたコルチゾール産生腺腫患者１３人及びアルドステロン産生腺腫患者３３人について、インフォームドコンセントを得た上で解析を行った。なお、クッシング症候群の診断はJ Clin Endocrinol Metab (2008) 93:1526-1540に従った。各被験者の臨床データは表１に記載のとおりである。
【００２５】
＜シークエンスによる変異解析＞
被験者由来の凍結されたコルチゾール産生腺腫サンプル及びアルドステロン産生腺腫サンプルよりISOGEN（ニッポンジーン）を使用してトータルRNAを抽出し、そのトータルRNAからRT-PCRによりcDNAを合成して増幅し、直接シークエンスにより配列解析を行った。PCRに用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
フォワード5-CCTGACCTTTGAGTATCTGCACT -3（配列番号３）
リバース5-CGGCCATTTCATAGATAAGAACC -3（配列番号４）
【００２６】
【表１】
2016010335.tif 000003
PRKACA mutationはc.617T>G(p.L206R)のヘテロ変異を意味する。
M,男性；F,女性；Specific cushingoid signs(特異的なクッシングの兆候)はEndcrine Societyのガイドライン参照。HT,高血圧；DM/IGTは糖尿病及び耐糖機能障害を含む。HL,
高脂血症；1mgDST,1mgデキサメサゾン抑制テストにおける血清コルチゾールレベル。Tumo
r sizeは、CT検査において観察された腫瘍の最大直径である。患者２と１１は8mgデキサ
メサゾン抑制テストを受けた。
＊＊はデータ無しを示す。
患者３は、副腎静脈のサンプリングを行ったところ、コルチゾール産生腺腫の反対側で、原発性アルドステロン症と診断された。
【００２７】
＜PCR-RFLPアッセイ＞
c.617T>G変異を有するコルチゾール産生腺腫サンプルについて、EcoRII（BciT130I、MvaI：Takara）を用いてPCR-RFLP解析を行った。PCRに用いたプライマーの配列は以下のと
おりである。
フォワード5-CCTGACCTTTGAGTATCTGCACT -3（配列番号３）
リバース5-CACCAGTCCACGGCCTTGTTGTA -3（配列番号５）
上記プライマーを用いたPCRにより、c.617T>G変異を含む２１３bpの断片が増幅される
。
【００２８】
上記２１３bpの断片をEcoRIIで切断すると、変異なしの場合は１４３bpと７０bpの断片が生じる。一方、変異がある場合にはEcoRIIで切断されないため、２１３bpのままである。
断片は２％アガロースゲルにて泳動し分離させた。泳動後のバンドはMolecular Imager
FX (Bio-Rad Laboratories, Inc., Tokyo, Japan)にて定量的に測定した。
【００２９】
＜統計解析＞
全ての結果は、平均±SDで表した。統計解析はANOVAとJMP10.0.2を使用したStudent's test（SAS Institute Inc., Cary, NC）により行われた。
【００３０】
＜結果＞
各被験者におけるPRKACA遺伝子の変異について表１に示す。その結果、10名についてはPRKACA遺伝子の変異が見られなかったが、3名については変異が見られた。
また、変異のみられた３名について、末梢血から採取したゲノムDNAを使用して変異を
解析したところ、生殖細胞変異は検出されなかった（図１）。
【００３１】
次に、３３名のアルドステロン産生腺腫から得られたDNAを使用して、PRKACA遺伝子の
変異を解析した。ややムーンフェイスを示した１名を除いて、上記３３名の被験者に、特異的なクッシング様の兆候は見られなかった。変異解析の結果を、表２に示す。
表２が示すとおり、アルドステロン産生腺腫の被験者に、PRKACA遺伝子のc.617T>G変異は見られなかった。
以上から、c.617T>G変異は、クッシング症候群におけるコルチゾール産生腺腫に特異的であることが示唆された。
【００３２】
【表２】
2016010335.tif 000004
PRKACA mutationはc.617T>G(p.L206R)のヘテロ変異を意味する。
M,男性；F,女性；Specific cushingoid signs(特異的なクッシングの兆候)はEndcrine Societyのガイドライン参照。HT,高血圧；DM/IGTは糖尿病及び耐糖機能障害を含む。HL,高
脂血症；1mgDST,1mgデキサメサゾン抑制テストにおける血清コルチゾールレベル。
Mild hypercortisolismは、10pg/ml以下に抑制された血漿ACTHレベル、7.5μg/dlより
高い夜間血清コルチゾールレベル、または、1mgデキサメサゾン抑制テストの結果が3.0μg/dlより高いことのうち、少なくとも一つの異常な結果をもって定義された。
1mgデキサメサゾン抑制テストの結果が3.0μg/dlより高ければYesとした。
＊はデータ無しを示す。
【００３３】
c.617T>G変異を簡便に検出する方法として、RFLP法による検出を試みた。配列番号３及び５のプライマーを使用してcDNAを増幅し、EcoRIIにより切断した結果を、図２に示す。EcoRII処理により、変異なしの場合は１４３bpと７０bpの断片が生じるが、７０bpは短いために図２においては確認ができなかった。一方、変異がある場合には、EcoRIIで切断されないため、２１３bpのままとなる。図２をみると、c.617T>G変異がある場合においては、未切断を示す２１３bpのバンドの他に、切断されたことを示す１４３bpのバンドも検出
されたことから、c.617T>Gは対立遺伝子の片方のみが変異しているヘテロであることが明らかとなった。
よって、配列番号３及び５のプライマーを使用してcDNAを増幅し、EcoRIIにより切断してRFLPを行った場合、２１３bpのバンドの有無によりc.617T>G変異を検出可能であることが明らかとなった。
【００３４】
以上より、PRKACA遺伝子におけるc.617T>G変異は、クッシング症候群被験者のコルチゾール産生副腎腺腫において特異的にみられるものであることが判明した。この変異は血中ACTHやコルチゾール値と関係なく検出することができるため、クッシング症候群を呈するコルチゾール産生腫瘍を正確に検出できる優れたマーカーとなり得る。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
c.617T>G変異を分析することにより、血中ACTHやコルチゾール値と関係なく、正確にクッシング症候群を検査することができる。また、c.617T>G変異の分析方法として、EcoRIIを使用したRFLP法は、迅速かつ簡便に結果が得られる点で優れた方法である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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