(57)【要約】【課題】本発明は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤及び予防剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、インターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤。
【請求項２】
前記インターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合している、請求項１記載のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤。
【請求項３】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項２記載のＢ
ＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤。
【請求項４】
インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用医薬。
【請求項５】
インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを含み、かつ、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とが同時又は別々に投与されることを特徴とする、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用組み合わせ医薬。
【請求項６】
前記インターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合している、請求項４に記載のメラノーマ治療用医薬。
【請求項７】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項６記載のメラノーマ治療用医薬。
【請求項８】
前記インターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合している、請求項５に記載のメラノーマ治療用組み合わせ医薬。
【請求項９】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、請求項８記載のメラノーマ治療用組み合わせ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマは、悪性黒色腫とも呼ばれ、転移性及び悪性度の高い皮膚がんである。メラノーマ患者は、米国においては全がん患者の５％に過ぎないが、年々増加しており、他のがんと比較して低い年齢層の成人比率が高いことが特徴である（非特許文献１）。
【０００３】
メラノーマに対する治療法としては、抗癌剤であるダカルバジン、インターフェロン−αやインターフェロン−βなどのインターフェロン製剤、抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）や抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）などの免疫チェックポイント阻害薬、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）やダブラフェニブ（ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）などのＢＲＡＦ阻害剤が使用されている。
【０００４】
メラノーマの５０〜６０％が、プロテインキナーゼＢＲＡＦの遺伝子に変異、特に６００番目のバリン残基の置換を引き起こす変異（Ｖ６００変異）を集中的に有しており、その変異発生率は、他のがん種（甲状腺（３０〜５０％）、消化器（１０％）、肺（３％））と比較して高い（非特許文献２）。上記のＢＲＡＦ阻害剤は、このプロテインキナーゼＢＲＡＦのＶ６００変異により恒常的に活性化状態にあるキナーゼ活性を阻害するという特徴を有する薬剤として開発され、ＢＲＡＦにＶ６００変異を有するメラノーマに対して著効を示す。
【０００５】
一方、インターフェロン製剤とＢＲＡＦ阻害剤との併用治療として、ペグ化インターフェロン−αとベムラフェニブとの併用治療によるがん治療（特許文献１）、及びインターフェロン−βとＲＡＳ経路阻害剤との併用治療によるがん治療（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０８０１５１号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０４４６８４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｓｈｅｒ及びＬａｒｋｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅ.  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年、第４巻、ｐ．２４３−２５２
【非特許文献２】Ｌｉｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３年、第１９巻、ｐ．１４０１−１４０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＢＲＡＦ阻害剤はＢＲＡＦにＶ６００変異を有するメラノーマに対して著効を示すものの、その長期間の投与によりＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマが出現し、ＢＲＡＦ阻害剤による治療を受けたほぼすべての患者がメラノーマを再発する（非特許文献２）。したがって、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を克服する薬剤の開発が望まれている。
本発明は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療及び予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、インターフェロン−βが、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマに対して抗腫瘍作用を有すること、及び、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマの出現抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、インターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤を提供する。本発明はまた、インターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤も提供する。
【００１１】
上記のインターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合していることが好ましく、ポリエチレングリコールと共有結合していることがより好ましい。インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、投与された場合、血中半減期が長く、生体に持続的に作用するため、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対するより優れた治療効果又は予防効果を期待できる。
【００１２】
また、本発明は、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用医薬を提供する。
【００１３】
また、本発明は、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを含み、かつ、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とが同時又は別々に投与されることを特徴とする、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用組み合わせ医薬を提供する。
【００１４】
メラノーマ治療用医薬又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬に用いる上記のインターフェロン−βは、ポリアルキレングリコールと共有結合していることが好ましく、ポリエチレングリコールと共有結合していることがより好ましい。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤としてベムラフェニブを好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマに対して抗腫瘍作用を有し、また、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ細胞の出現抑制作用を有する。したがって、本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防に利用できる。
【００１７】
また、本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用医薬は、メラノーマの治療とともにＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞に対する、天然型ヒト・インターフェロン−β又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βによる細胞増殖への作用を示す図である。
【図２】ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞に対する、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βによる細胞増殖への作用を示す図である。
【図３】メラノーマ細胞に対する、天然型ヒト・インターフェロン−β又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＢＲＡＦ阻害剤との併用による細胞増殖への作用を示す図である。
【図４】メラノーマ細胞に対する、天然型ヒト・インターフェロン−β又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βとＢＲＡＦ阻害剤との併用によるＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制作用を示す、被験物質処置開始から１２日後のＡ３７５細胞の写真である。Ａ：コントロール、Ｂ：ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｃ：ＶＭＦ  １．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｄ：ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ、Ｅ：ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ、Ｆ：ＶＭＦ  １．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ、Ｇ：ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １００００Ｕ／ｍＬ、Ｈ：ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １００００Ｕ／ｍＬ、Ｉ：ＶＭＦ  １．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １００００Ｕ／ｍＬ、Ｊ：ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ、Ｋ：ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ、Ｌ：ＶＭＦ  １．５μｍｏｌ／Ｌ＋ＩＦＮ−β  １０００Ｕ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、インターフェロン−βを有効成分として含有する。
【００２０】
上記のインターフェロン−βは、天然に存在するインターフェロン−β（以下、天然型インターフェロン−β）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型インターフェロン−βのアミノ酸配列に１個又は複数個、例えば１個〜２０個、典型的には１個又は数個（２〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インターフェロンとしての生物活性（以下、インターフェロン活性）を有するインターフェロン−βのアミノ酸変異体を包含する。天然型インターフェロン−βは、任意の生物由来であってよいが、本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤の投与対象の生物由来であることが好ましい。そのような生物は、例えば哺乳動物であってよく、例えばマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、又はヒト、ゴリラ、チンパンジーなどの霊長類であってもよいし、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギなどであってもよい。好ましい実施形態では、天然型インターフェロン−βはヒト由来である。天然型ヒト・インターフェロン−βは例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むものであってよい。上記のインターフェロン−βはまた、天然型インターフェロン−βの糖鎖部分が改変されたインターフェロン−β及び糖鎖部分を有しないインターフェロン−βをも包含する。インターフェロン−βとしては、例えば、アミノ末端（Ｎ末端）のメチオニンを欠失し、１４番目のシステインが置換されたインターフェロン−β１ｂ（商品名：ベタフェロン）が挙げられる。
【００２１】
例えば、上記のインターフェロン−βは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン活性を有するポリペプチドであり得る。なお本発明に関して、「配列番号１で示されるアミノ酸配列とＸ％以上の配列同一性を有する」とは、比較対象の配列の全長を、配列番号１で示される配列の全長に対して最も同一性が高くなるようにアラインメントしたときの配列同一性（％）がＸ％以上であることを意味する。
【００２２】
上記のインターフェロン−βは、天然型インターフェロン−βをはじめとするインターフェロン−βのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製された組換え型インターフェロン−βも包含する。インターフェロン−βのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であってよい。
【００２３】
上記のインターフェロン−βは、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、インターフェロン−βを発現する天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得ることができる。また、インターフェロン−βとして、市販のインターフェロン−βも用いることができる。
【００２４】
上記のインターフェロン−βが化学的に修飾されたものを本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤の有効成分として用いることも好ましい。この化学的な修飾は、インターフェロン−βがインターフェロン活性を有することができる限り、任意のものであってよい。例えば、化学的に修飾されたインターフェロン−βは、インターフェロン−βとポリマーとの共有結合体、インターフェロン−βと脂質との共有結合体、及び、インターフェロン−βと他のタンパク質との融合タンパクを包含する。
【００２５】
インターフェロン−βとポリマーとの共有結合体は、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体であることが好ましい。
【００２６】
上記のポリアルキレングリコールは、インターフェロン−βの１分子に対して、１分子又は２分子以上が結合することができる。この場合、インターフェロン−βの１分子に結合するポリアルキレングリコールの分子量の合計は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。なお、インターフェロン−βの１分子に分子量２０，０００のポリアルキレングリコール２分子が共有結合している場合は、インターフェロン−βの１分子に分子量４０，０００のポリアルキレングリコールが共有結合していると表現することがある。
【００２７】
また、上記のポリアルキレングリコールの１分子に対して、インターフェロン−βの１分子又は２分子以上が結合することもできる。この場合、ポリアルキレングリコールの１分子の分子量は、５，０００以上５２０，０００以下が好ましく、１０，０００以上２００，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。
【００２８】
なお、ポリアルキレングリコールは、１個の分子が多数の繰り返しユニットからできており、ポリアルキレングリコールの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるポリアルキレングリコールの「分子量」とは、平均分子量の意味である。
【００２９】
ポリアルキレングリコールとしては、薬物キャリアとして許容される高分子化合物であり、生体に対して不活性又は極めて低活性であり、かつ、無毒又は極めて低毒性であるポリアルキレングリコールが好ましく使用できる。
【００３０】
「インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体」は、インターフェロン−βの１分子に対してポリアルキレングリコールの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、及び、ポリアルキレングリコールの１分子に対してインターフェロン−βの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているもの、を包含する。インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体としては、インターフェロン−βの１分子に対してポリアルキレングリコールの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、インターフェロン活性を有しているものがより好ましい。なお、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとが直接結合したものであっても、リンカー等を介して結合したものであってもよい。
【００３１】
ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する治療又は予防効果をもたらすための、インターフェロン−β、好ましくは化学的に修飾されたインターフェロン−β、例えばインターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体の投与量は、インターフェロン力価（ユニット；以下、Ｕ）又は質量（ｇ）で表すことができる。インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールを共有結合する前のインターフェロン−βの比活性（重量あたりのインターフェロン活性）と比較して、その比活性が１０％以上維持されていることが好ましい。
【００３２】
ここで、タンパク質に高分子化合物を結合させることを、タンパク質を高分子化合物で化学修飾する又は修飾するともいい、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、ポリアルキレングリコールで化学修飾したインターフェロン−β、又は、単に、修飾したインターフェロン−βともいう。特に、インターフェロン−βとポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）との共有結合体は、ＰＥＧ修飾インターフェロン−β、ＰＥＧ化インターフェロン−β又はＰＥＧ結合インターフェロン−βとも呼ばれる。
【００３３】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合部位としては、例えば、インターフェロン−βのアミノ基、チオール基、Ｎ末端、Ｃ末端又は糖鎖が挙げられる。公知の遺伝子組換え技術を用いてインターフェロン−βに導入した非天然型（人工）アミノ酸もポリアルキレングリコールとの共有結合部位とすることができる。例えば、非天然型アミノ酸の種類及びタンパク質に非天然型アミノ酸を導入する方法は、国際公開第２０１１／１５８８９５号に記載されている。
【００３４】
インターフェロン−βのインターフェロン活性は、公知の生物学的測定法により測定できる。具体的には、インターフェロンに感受性の高い細胞（例えば、ＦＬ細胞）に対してインターフェロン−βを含む検体を作用させた後に、これら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）又は水ほう性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶと略される。）等を一定量添加して感染させ、インターフェロン−βにより誘導されたウイルス抵抗性の程度（以下、抗ウイルス活性）を測定することで、インターフェロン活性を測定できる。抗ウイルス活性は、ウイルス増殖の抑制を指標に測定されるものであり、ウイルス増殖の結果として細胞を破壊させる細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥと略される。）を５０％阻止する検体の希釈倍率から、インターフェロン力価（Ｕ）として算出される（小林茂保ら著、「免疫生化学実験法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年、ｐ．２４５）。
【００３５】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、公知の方法で作製することができる。例えば、インターフェロンのアミノ基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第８７／０００５６号に記載されている。インターフェロンのチオール基にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、国際公開第９９／５５３７７号に記載されている。インターフェロンのＮ末端に高分子を共有結合する方法は、国際公開第００／２３１１４号及び特開平９−２５２９８号に記載されている。インターフェロンの糖鎖にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、１９７８年のＭａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第１７９巻、ｐ．３０１）、米国特許第４１０１３８０号又は米国特許第４１７９３３７号に記載されている。インターフェロンに導入した非天然型（人工）アミノ酸にポリアルキレングリコールを共有結合する方法は、２００４年のＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（第１４巻、ｐ．５７４３−５７４５）に記載されている。なお、インターフェロン−βのＣ末端へのポリアルキレングリコールの共有結合は、インターフェロン−βのＣ末端又はその近傍にシステインや非天然型（人工）アミノ酸を導入することで可能となる。
【００３６】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの結合の方法に応じて、共有結合反応に使用するポリアルキレングリコールの末端を活性化する必要がある。例えば、末端がヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたポリアルキレングリコール誘導体を、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合の形成に用いることができ、これらのポリアルキレングリコール誘導体は公知の方法により合成できる。
【００３７】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体は、インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体であることが好ましい。インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体は、１分子のインターフェロン−βに、分子量５，０００以上２４０，０００以下（好ましくは分子量１０，０００以上８０，０００以下、より好ましくは分子量３９，０００以上４５，０００以下）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体であることが好ましい。
【００３８】
インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の好ましい例としては、ヒト・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができ、例えば、国際公開第２００５／０１９２６０号に記載された方法により作製できる。ヒト・インターフェロン−βにおけるＰＥＧの結合部位としては、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の１９番目又は１３４番目のリジンのアミノ基が好ましく、この部位にＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体がより好ましい。具体的には、ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４０，０００以上（好ましくは、分子量４２，０００）のＰＥＧが１分子共有結合した共有結合体を例示できる。
【００３９】
ここで、「ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列の１３４番目のリジン」とは、１６６アミノ酸からなるヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端のアミノ酸（メチオニン）を１番目としたときに、１３４番目に位置するアミノ酸であるリジンを意味する。すなわち、本明細書では、インターフェロン−βのＮ末端のアミノ酸を１番目として、インターフェロン−βのアミノ酸残基の位置を表す。
【００４０】
インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体もインターフェロン−βのアミノ酸配列のリジンのアミノ基にポリアルキレングリコールが結合したものであってよい。ポリアルキレングリコール結合部位となる、インターフェロン−βのアミノ酸配列のリジンは、アミノ酸配列のアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９番目又は１３４番目のリジンと対応する位置にあってもよいし、対応する位置になくてもよい。
【００４１】
「メラノーマ」とは、悪性黒色腫ともいい、表皮のメラニン細胞から発生する皮膚がんの一種である。メラノーマは、抗ビメンチン抗体陽性、抗サイトケラチン抗体陰性を特徴とし、表在拡大型、結節型、末端黒子型及び悪性黒子型の４つの型に分類される。
【００４２】
「ＢＲＡＦ阻害剤」とは、プロテインキナーゼであるＢＲＡＦの遺伝子の変異、特に６００番目のバリン残基にアミノ酸変異（Ｖ６００変異）を引き起こすＢＲＡＦ  Ｖ６００変異により恒常的に活性化状態にある変異型ＢＲＡＦのキナーゼ活性を阻害する薬剤を意味する。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異を有するメラノーマに対して著効を示す。ＢＲＡＦ阻害剤としては、以下に限定するものではないが、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ；商品名：ｚｅｌｂｏｒａｆ）、ダブラフェニブ（ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ；商品名：ｔａｆｉｎｌａｒ）、エンコラフェニブ（ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＰＬＸ−８３９４、ＥＢＩ−９４５、ＢＧＢ−２８３等が挙げられる。ＢＲＡＦ阻害剤としては、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ及びエンコラフェニブが好ましく、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが特に好ましい。
【００４３】
「ＢＲＡＦ阻害剤耐性」とは、ＢＲＡＦ阻害剤治療による腫瘍増殖の抑制に腫瘍細胞が抵抗性を示す状態を意味し、そのような状態を腫瘍細胞が「ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得した」ともいう。ＢＲＡＦ阻害剤耐性の状態では、ＢＲＡＦ阻害剤による治療を開始した時に有効であったＢＲＡＦ阻害剤の投与用量や濃度では、もはや無効であるか又は効果の減弱が認められる。また、「ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ」とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性の状態にあるメラノーマを意味し、「ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ」ともいう。ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマは、典型的には、一定期間にわたりＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ又はダブラフェニブ等）の継続投与を受けた対象において出現する。
【００４４】
「ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤」とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対して治療効果を有する薬剤を意味する。ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する治療とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの細胞増殖を抑制（低減又は阻止）することである。ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用するためのものであってもよい。本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤は有効成分としてインターフェロン−βを含み、場合により、さらにＢＲＡＦ阻害剤を含有してもよい。
【００４５】
「ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤」とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する予防効果を有する薬剤を意味する。ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する予防とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現を抑制（低減又は阻止）することであり、特にＢＲＡＦ阻害剤の投与を受けた又は受けている対象においてＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現を抑制（低減又は阻止）することである。すなわち本発明の「ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤」は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制性を示す。本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤は有効成分としてインターフェロン−βを含む。本発明に関して「ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制性を示す」とは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ細胞の出現を抑制する作用を有することを意味する。したがって本発明は、インターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制剤にも関する。ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤又はＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用するためのものであってよい。あるいは本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤又はＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制剤は、インターフェロン−βに加えて、場合により、ＢＲＡＦ阻害剤をさらに含有してもよい。
【００４６】
上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する治療効果又は予防効果や、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ出現抑制効果は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ又はＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異を有するメラノーマを用いたモデルで評価することができる。このようなモデルとしては、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｏｅｕｔｉｃｓ、２０１２年、第１１巻、ｐ．９０９−９２０）、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ移殖モデルマウス（Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年、第４９４巻、ｐ．２５１−２５５）等が挙げられる。また後述の実施例に従って評価試験を実施することができる。
【００４７】
上記のインターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対して抗腫瘍作用を有し、また、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ細胞の出現抑制作用を有するため、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防（出現抑制）に用いることができる。
【００４８】
上記のインターフェロン−βを有効成分として含有する、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、メラノーマの治療において、特に、ＢＲＡＦ阻害剤が著効を示すメラノーマの治療において、ＢＲＡＦ阻害剤と併用して用いることが好ましい。それにより、ＢＲＡＦ阻害剤の投与によるＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの発症を予防することができる。ＢＲＡＦ阻害剤と併用される、上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と同時投与することができる。言い換えれば、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤とＢＲＡＦ阻害剤とをそれぞれ単独で、すなわちＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤とＢＲＡＦ阻害剤とをそれぞれ別々に単剤として準備し、これらをそのまま又は医薬として許容される担体をさらにそれぞれに配合して、同時に又は連続して対象に投与することができる。あるいは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する治療効果又は予防効果を高めることを目的として、上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤は、ＢＲＡＦ阻害剤投与の前又は後に適当な時間間隔をおいて、ＢＲＡＦ阻害剤とは別に対象に投与することもできる。この場合、上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤とＢＲＡＦ阻害剤それぞれの剤形及び投与経路は同一である必要はなく、それぞれ異なっていても構わない。
【００４９】
ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤と、ＢＲＡＦ阻害剤とを、混合物、すなわち、配合剤として調製し、そのまま投与又は医薬として許容される担体をさらに配合して投与することもできる。本発明は、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを有効成分として含有する、そのようなメラノーマ治療用医薬も提供する。このメラノーマ治療用医薬は、ＢＲＡＦ阻害剤が著効を示すメラノーマ、すなわち、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得していないメラノーマに対して治療効果を有する。このメラノーマ治療用医薬はＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制性を示すことから、メラノーマ治療のためだけでなく、ＢＲＡＦ阻害剤によるメラノーマ治療に伴うＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現を抑制するための医薬として有利に使用できる。
【００５０】
本発明はまた、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを含み、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とが同時又は別々に対象に投与されることを特徴とする、メラノーマ治療用組み合わせ医薬も提供する。このような組み合わせ医薬は、通常は、インターフェロン−βを有効成分として含有する医薬と、ＢＲＡＦ阻害剤を有効成分として含有する医薬とを含み、これら医薬が同時又は別々に対象に投与されることを特徴とする、メラノーマ治療用組み合わせ医薬である。インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とはそれぞれ単独で、すなわちインターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを別々に単剤（医薬）として準備し、これらをそのまま又は医薬として許容される担体をさらにそれぞれに配合して、同時に又は連続して対象に投与することができる。あるいは、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤投与の前又は後に適当な時間間隔をおいて、ＢＲＡＦ阻害剤とは別に対象に投与することもできる。この場合、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤それぞれの剤形及び投与経路は同一である必要はなく、それぞれ異なっていても構わない。このメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、複数の医薬を含む医薬キット、すなわちインターフェロン−β（を有効成分として含有する医薬）とＢＲＡＦ阻害剤（を有効成分として含有する医薬）だけでなく、それ以外の医薬を含む医薬キットであってよい。このメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、メラノーマ治療のためだけでなく、ＢＲＡＦ阻害剤によるメラノーマ治療に伴うＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現を抑制するための医薬として有利に使用できる。
【００５１】
ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制性を示すインターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤とを併用投与することにより、メラノーマに対する治療効果を得ながら、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現を抑制できるため、上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制に使用するためのメラノーマ治療用医薬や上記のメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、優れたメラノーマの治療剤として用いることができる。
【００５２】
上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、上記のメラノーマ治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、任意の投与対象、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル等）、特に好ましくはヒトに対する有用な薬剤として用いることができる。本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤の投与対象は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマを有する対象（患者）であることが好ましい。本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤又はＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤の投与対象は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得していないメラノーマを有する対象（患者）であることが好ましく、さらに、そのような対象であってＢＲＡＦ阻害剤の投与を受けているか若しくは受ける予定である対象であることが特に好ましい。上記のメラノーマ治療用医薬又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬の投与対象は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得していないメラノーマを有する対象であることが好ましい。
【００５３】
上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、メラノーマの治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、経口的又は非経口的に投与することができる。本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、メラノーマの治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬の投与経路は特に限定されず、皮下、皮内、経皮、経粘膜、経肺、経鼻、経腸、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、直腸内、及び腟内投与等の非経口投与であってもよいし、経口投与であってもよい。
【００５４】
本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、又はメラノーマの治療用医薬は、有効成分であるインターフェロン−β、又はインターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤に加えて、医薬として許容される任意の添加剤を含有する医薬組成物であってもよい。本発明のメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、有効成分であるインターフェロン−βに加えて医薬として許容される任意の添加剤を含有する医薬組成物と、ＢＲＡＦ阻害剤に加えて医薬として許容される任意の添加剤を含有する医薬組成物との組み合わせを含んでもよい。添加剤としては、例えば担体、賦形剤、安定化剤、懸濁化剤、乳化剤、増粘剤、分散剤、吸収促進剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明における経口投与のための剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。これらの剤形は、製剤分野において通常用いられる担体又は賦形剤等の添加剤を含有するものである。錠剤用の担体及び賦形剤としては、例えば、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【００５６】
本発明における非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤又は局所徐放剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。溶液製剤は、例えば、インターフェロン−β等の成分を、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解又は抽出液に懸濁及び乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製することができる。固体製剤は、例えば、インターフェロン−βに、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース又はグルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらにこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、例えば、インターフェロン−βを、グリセリン、ＰＥＧ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸若しくはコンドロイチン硫酸等の増粘剤又は多糖に溶解して調製することができる。
【００５７】
いずれの剤形の製剤も、安定化剤として、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクログロブリン又はアミノ酸等を含んでもよく、また、分散剤又は吸収促進剤として、インターフェロン活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤等を含んでもよい。また、微量金属又は有機酸塩も必要に応じて含有してもよい。
【００５８】
本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、メラノーマの治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬は、他の薬理成分をさらに含有してもよい。
【００５９】
インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＰＬＸ−８３９４、ＥＢＩ−９４５、ＢＧＢ−２８３等）との投与量比又は配合比は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状、又は、配合する成分の組み合わせ等により適宜選択することができる。
【００６０】
本発明のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、メラノーマの治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬等の製剤の投与においては、有効成分であるインターフェロン−βを１０，０００Ｕ〜１，８００万Ｕ／回の用量で、１日に１回又は２回の投与間隔で連日投与することができる。これらはまた、２日以上の期間を隔てて１回の投与間隔で投与してもよく、さらに、２日〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与してもよい。また、化学的に修飾したインターフェロン−β（例えば、インターフェロン−βとポリアルキレングリコールとの共有結合体、好ましくは、インターフェロン−βとポリエチレングリコールとの共有結合体）を有効成分とする製剤は、１週間に１回又は２回〜１ヵ月に１回の投与間隔で間歇投与することが好ましく、１週間に１回又は２回の投与間隔で間歇投与することが特に好ましい。
【００６１】
また、インターフェロン−βと組み合わせたＢＲＡＦ阻害剤の投与においては、ＢＲＡＦ阻害剤の１日あたりの投与量は、対象の状態や体重、ＢＲＡＦ阻害剤の種類、投与経路等によって異なるが、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤を経口投与する場合には成人（体重約６０ｋｇ）であればＢＲＡＦ阻害剤を０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で１日１〜３回に分けて投与することが好ましい。
【００６２】
本発明は、インターフェロン−β、上記のＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療若しくは予防剤、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制剤、メラノーマの治療用医薬、又はメラノーマ治療用組み合わせ医薬を上記対象に投与することを含む、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療又は予防方法も提供する。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１）  インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体の調製
組換え型ヒト・インターフェロン−β（配列番号１）は、Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９８０年）  第８巻、ｐ．４０５７−４０７４に記載の方法に従って作製した。
【００６５】
次いで、国際公開第２００５／０１９２６０号の実施例６に記載の方法に従って、組換え型ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」を調製した。具体的には、まず、０．５ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した組換え型ヒト・インターフェロン−β（最終濃度２００μｇ／ｍＬ）に、エチレングリコールを（最終濃度２０％で）添加した後、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調整した。これに、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ＰＥＧ（分子量４２，０００、日油株式会社；品番６１Ｇ９９１２２Ｂ０１）を加え混合し、４℃で一晩、結合反応させた。この結合反応溶液に５倍容の１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ  ６５０（Ｓ）；東ソー株式会社）に供した。下記の展開溶媒で、タンパク質を溶出及び分画した。
【００６６】
＜展開溶媒＞
溶媒Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶媒Ｂ：１ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
【００６７】
上記溶媒Ａ、Ｂの混合液を陽イオン交換カラムの樹脂量に対して４０倍量通液させ、その通液の間に溶媒Ｂの送液比率を０％から６５％に連続的に上昇させることにより溶出を行った。溶出された分画は、さらに、陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（東ソー株式会社）に供し、組換え型ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「ヒト・インターフェロン−βとＰＥＧとの共有結合体」（以下、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」）を単離した。
【００６８】
（実施例２）  ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対するインターフェロン−βの細胞増殖抑制作用
本実施例では、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞をＧｒｅｇｅｒらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｏｅｕｔｉｃｓ、２０１２年、第１１巻、ｐ．９０９−９２０）に従って作製し、インターフェロン−βのＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する細胞増殖抑制作用を評価した。インターフェロン−βとして、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）及び実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βを用いた。
【００６９】
ＢＲＡＦ遺伝子にＶ６００Ｅ変異（６００番目のバリンがグルタミン酸に変異）を有するヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＣＲＬ−１６１９；Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し維持した。なお、被験物質処置による評価時においても、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を培養培地として用いた。
【００７０】
また、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＣＲＬ−１６１９；Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、最終濃度１．５μｍｏｌ／Ｌのベムラフェニブ（ＶＭＦ−１５０；ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて４週間継代培養することにより、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞を樹立した。なお、被験物質処置による評価時にはこの細胞についても１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を培養培地として用いた。
【００７１】
Ａ３７５細胞又は上記で作製したＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞を、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。被験物質としては、ベムラフェニブ（最終濃度：１．５μｍｏｌ／Ｌ；ＶＭＦ処置群）、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）（最終濃度：１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ；ＩＦＮ−β処置群）及びＰＥＧ−ＩＦＮ−β（最終濃度：１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ；ＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置群）を処置に用いた。被験物質処置開始から４８時間後に、生細胞数（相対レベル）を測定した。
【００７２】
生細胞数測定は、下記のとおり実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｇ３５８１；Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を上記の各ウェルに１０μＬずつ添加した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて６０分間静置した後、プレートリーダーにて吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。なお、コントロールとして、被験物質を添加しないウェル（コントロールウェル；無処置群）を４ウェル設けた。
【００７３】
それぞれの測定値から下記式（１）より吸光度補正値を求めた後、被験物質処置の４８時間後の細胞生存率（コントロールに対する％）を、下記式（２）より算出した。なお、コントロールウェルの吸光度補正値は４ウェルの平均値とした。
式（１）：
吸光度補正値＝各ウェルの吸光度測定値−細胞を播種していないウェルの吸光度測定値
式（２）：
細胞生存率（コントロールに対する％）＝（各ウェルの吸光度補正値）／（コントロールウェルの吸光度補正値）×１００
【００７４】
細胞生存率（コントロールに対する％）の値が小さいほど、被験物質処置による細胞増殖抑制効果が高いことを示す。
【００７５】
結果を図１に示す。図１の縦軸は、細胞生存率（コントロールに対する％）を示す（Ｎ＝４、平均値±標準誤差）。図中の「コントロール」は無処置群、「ＶＭＦ」はＶＭＦ（ベムラフェニブ）処置群、「ＩＦＮ−β」はＩＦＮ−β処置群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置群を示す。「Ａ３７５」はＡ３７５細胞、「ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５」はＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞を示す。
【００７６】
ベムラフェニブ処置により、Ａ３７５細胞の細胞生存率は無処置群の生細胞数との比較で３０％程度となったが、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞の細胞生存率は無処置群の生細胞数との比較で７０％程度であり、ベムラフェニブによる細胞増殖抑制作用に対する耐性が認められた（図１、ＶＭＦ処置群）。一方、天然型ヒト・インターフェロン−β（図１、ＩＦＮ−β処置群）及びＰＥＧ−ＩＦＮ−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置群）は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞に対して細胞増殖抑制作用を示し、その細胞増殖抑制作用の強さは親株のＡ３７５細胞に対する細胞増殖抑制作用と同等であった。
【００７７】
この結果より、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対しても細胞増殖抑制作用、すなわち抗腫瘍作用を有することが示された。
【００７８】
（実施例３）  インターフェロン−αとインターフェロン−βのＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対する細胞増殖抑制作用の比較
実施例２で作製したＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞を用いて、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対するインターフェロン−αとインターフェロン−βの細胞増殖抑制作用を比較評価した。インターフェロン−αとしてＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ（商品名：ぺガシス、中外製薬）、インターフェロン−βとして実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βを用いた。なお、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞は、ベムラフェニブ（最終濃度：１．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加した１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し維持した。被験物質処置による評価時においては、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（ベムラフェニブを添加していない）を培養培地として用いた。
【００７９】
ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。被験物質としては、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βを処置に用いた（それぞれ、最終濃度：１００Ｕ／ｍＬ、１，０００Ｕ／ｍＬ又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）。被験物質処置開始から４８時間後に、生細胞数（相対レベル）を測定した。
生細胞数測定及び細胞生存率の算出は、実施例２と同じ方法で実施した。
【００８０】
結果を図２に示す。図２の縦軸は、被験物質処置開始から４８時間後の、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞の細胞生存率（コントロールに対する％）を示す（Ｎ＝４、平均値±標準誤差）。「ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ」はＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ処置群、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置群を示す。
【００８１】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａ及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βはいずれも、濃度増加に伴い、ＢＲＡＦ阻害剤耐性Ａ３７５細胞の増殖をより強く抑制した。しかしながら、その細胞増殖抑制作用は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α２ａと比べてＰＥＧ−ＩＦＮ−βの方が非常に強いことが示された。
【００８２】
この結果より、インターフェロン−βは、インターフェロン−αよりもＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対して優れた細胞増殖抑制作用、すなわち優れた抗腫瘍作用を有することが示された。
【００８３】
（実施例４）  インターフェロン−βとベムラフェニブの併用処置の効果
本実施例では、Ａ３７５細胞を用いて、インターフェロン−βとベムラフェニブとの併用処置による細胞増殖抑制効果への影響を評価した。インターフェロン−βとして、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）及び実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βを用いた。
【００８４】
Ａ３７５細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し維持した。被験物質処置による評価時においても、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を培養培地として用いた。
【００８５】
Ａ３７５細胞を９６ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。被験物質としては、ベムラフェニブ（最終濃度：０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）（最終濃度：１，０００Ｕ／ｍＬ）及びＰＥＧ−ＩＦＮ−β（最終濃度：１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）を用いた。ベムラフェニブと、天然型ヒト・インターフェロン−β又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βとは、単独で添加（単独処置）又は組み合わせて同時に添加（併用処置）した。被験物質処置開始から９６時間後に、生細胞数（相対レベル）を測定した。
生細胞数測定及び細胞生存率の算出は、実施例２と同じ方法で実施した。
【００８６】
結果を図３に示す。図の縦軸は、被験物質処置開始から９６時間後の、Ａ３７５細胞の細胞生存率（コントロールに対する％）を示す（Ｎ＝４、平均値±標準誤差）。図中の「ＶＭＦ（μｍｏｌ／Ｌ）」はベムラフェニブ処置濃度を示し、「−」はベムラフェニブ無処置、「０．５」及び「１．５」はそれぞれ、最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ、１．５μｍｏｌ／Ｌのベムラフェニブでの処置を示す。「インターフェロン−βなし」はインターフェロン−β無処置、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置、「ＩＦＮ−β」は天然型ヒト・インターフェロン−β処置を示す。例えば、最も左側のバーの「インターフェロン−βなし」かつ「ＶＭＦ（−）」は被験物質無処置群（すなわち「コントロール」）を示す。また、左から２番目のバーの「インターフェロン−βなし」かつ「ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ」は最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌでのベムラフェニブ単独処置群を示し、左から４番目のバーの「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」かつ「ＶＭＦ（−）」は最終濃度１，０００Ｕ／ｍＬでのＰＥＧ−ＩＦＮ−β単独処置群を示し、左から５番目のバーの「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」かつ「ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ」は最終濃度１，０００Ｕ／ｍＬのＰＥＧ−ＩＦＮ−βと最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌのベムラフェニブとの併用処置群を示す。
【００８７】
図３に示されるように、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β（１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）又は天然型ヒト・インターフェロンβ（１，０００Ｕ／ｍＬ）単独処置群では、Ａ３７５細胞の細胞生存率は被験物質無処置群の生細胞数との比較で５０〜７０％であり、またベムラフェニブ（最終濃度０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）単独処置群では被験物質無処置群の生細胞数との比較でそれぞれ１３％及び６％であり、各被験物質の単独処置により、Ａ３７５細胞の増殖は抑制されることが確認された。一方で、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β又は天然型ヒト・インターフェロン−βと、ベムラフェニブとの併用処置により、Ａ３７５細胞の細胞生存率は被験物質無処置群の生細胞数との比較で４〜１０％となったが、併用処置による相加的又は相乗的な細胞増殖抑制効果は認められなかった。
【００８８】
この結果から、インターフェロン−βとＢＲＡＦ阻害剤との併用処置は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得していないメラノーマに対して、相加的又は相乗的な細胞増殖抑制作用、すなわち抗腫瘍作用を有しないことが示された。
【００８９】
（実施例５）  インターフェロン−βのＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの出現抑制作用
本実施例では、Ａ３７５細胞を用いて、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現に対するインターフェロン−βの抑制作用を評価した。インターフェロン−βとして、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）及び実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−βを用いた。
【００９０】
Ａ３７５細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し維持した。被験物質処置による評価時においても、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を培養培地として用いた。
【００９１】
Ａ３７５細胞を１２ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。被験物質としては、ベムラフェニブ（最終濃度：０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）、天然型ヒト・インターフェロン−β（フエロン（登録商標）；東レ株式会社）（最終濃度：１，０００Ｕ／ｍＬ）及び実施例１で作製したＰＥＧ−ＩＦＮ−β（最終濃度：１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）を用いた。ベムラフェニブと、天然型ヒト・インターフェロン−β又はＰＥＧ−ＩＦＮ−βとは、単独で添加（単独処置）又は組み合わせて同時に添加（併用処置）した。
【００９２】
被験物質処置開始から１２日後に、位相差顕微鏡を用いてそれぞれの群の細胞の形態を観察し、その様子を画像として取得した。その結果を図４に示す。図４中の「コントロール」は被験物質無処置群を示す。図４中の「ＶＭＦ」はベムラフェニブ処置、「ＩＦＮ−β」は天然型ヒト・インターフェロン−β処置、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置を示す。例えば、「ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ」は最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌでのベムラフェニブ単独処置群を示し、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」は最終濃度１，０００Ｕ／ｍＬでのＰＥＧ−ＩＦＮ−β単独処置群を示し、「ＶＭＦ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ  ＋  ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」は最終濃度１，０００Ｕ／ｍＬでのＰＥＧ−ＩＦＮ−βと最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌでのベムラフェニブとの併用処置群を示す。
【００９３】
図４に示すとおり、被験物質処置開始から１２日後には、被験物質無処置群（すなわち「コントロール」）では、小さな細胞が密集してところどころ細胞塊を形成しており、細胞が活発に増殖する様子が認められた。ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １０，０００Ｕ／ｍＬの単独処置群（「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １０，０００Ｕ／ｍＬ」）、及び天然型ヒト・インターフェロンβ  １，０００Ｕ／ｍＬの単独処置群（「ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」）では、被験物質無処置群と比べて細胞密度が大きく低下し、細胞の形態も肥大化している様子が認められた。また、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬの単独処置群（「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」）では、敷石状に並んだ上皮様細胞が単層を形成しており、分裂中の細胞は殆ど認められなかった。一方、ベムラフェニブ（０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）単独処置群では、密度を保ちながらコロニーを形成して増殖する細胞集団が認められた。さらに、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β（１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）又は天然型ヒト・インターフェロン−β（１，０００Ｕ／ｍＬ）とベムラフェニブ（０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）との併用処置群では、各被験物質の単独処置群と比べて、明らかに細胞数が少なく、肥大化しており、丸くなって接着面から剥がれそうな様子や細胞の内部に空泡様の小器官が形成されている様子も認められた。
【００９４】
また被験物質処置開始から１４日後に、生細胞数を測定した。
生細胞数測定は、下記のとおり実施した。被験物質処置開始から１４日後の細胞をＰＢＳで洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液にてプレートから剥離した。剥離した細胞を洗浄後、培養培地に懸濁して、トリパンブルー溶液で染色し、血球計数板を用いて生細胞数を計測した。被験物質処置群の細胞生存率は、その生細胞数の、被験物質無処置群（すなわちいずれの被験物質でも処置しない「コントロール」）の生細胞数（１００％）に対するパーセンテージ（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）で表す。
【００９５】
被験物質処置開始から１４日後のＡ３７５細胞の生細胞数（ウェルあたり）及び細胞生存率（コントロールに対する％）を表１に示す。表１の、「インターフェロン−βなし」はインターフェロン−β無処置、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β処置、「ＩＦＮ−β」は天然型ヒト・インターフェロン−β処置を示す。「ベムラフェニブ（μｍｏｌ／Ｌ）」はベムラフェニブ処置を示し、「−」はベムラフェニブ無処置、「０．５」及び「１．５」はそれぞれ、ベムラフェニブ最終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ処置、１．５μｍｏｌ／Ｌ処置を示す。例えば、「インターフェロン−βなし」かつ「ベムラフェニブ（−）」は被験物質無処置群（すなわち「コントロール」）を示し、「インターフェロン−βなし」かつ「ベムラフェニブ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ」はベムラフェニブ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ単独処置群を示し、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」かつ「ベムラフェニブ（−）」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ単独処置群を示し、「ＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬ」かつ「ベムラフェニブ  ０．５μｍｏｌ／Ｌ」はＰＥＧ−ＩＦＮ−β  １，０００Ｕ／ｍＬとベムラフェニブ  ０．５μｍｏｌ／Ｌとの併用処置群を示す。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
表１に示すとおり、被験物質処置開始から１４日後には、ベムラフェニブ（０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）単独処置群で、Ａ３７５細胞の細胞生存率は被験物質無処置群（すなわち「コントロール」）の生細胞数との比較で２〜６％程度であったが、生細胞数自体は播種時の細胞数（２×１０３個）よりも増加（０．５μｍｏｌ／Ｌ処置;１６７×１０３個、１．５μｍｏｌ／Ｌ処置;５１×１０３個）していた。この結果から、１４日間にわたるベムラフェニブ単独処置により、ベムラフェニブ耐性を獲得した細胞が出現したことが示された。このことは、被験物質処置開始から１２日後における細胞の観察結果（図４Ｂ、Ｃ）でも確認でき、密度を保ちながらコロニーを形成して増殖する細胞集団が認められ、ベムラフェニブ耐性を獲得した細胞の存在が示された。一方、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β（１，０００又は１０，０００Ｕ／ｍＬ）又は天然型ヒト・インターフェロン−β（１，０００Ｕ／ｍＬ）と、ベムラフェニブ（０．５又は１．５μｍｏｌ／Ｌ）との併用処置群では、Ａ３７５細胞の細胞生存率は被験物質無処置群の生細胞数との比較で０．３％以下であり、さらに、生細胞数は播種時の細胞数（２×１０３個）未満であった。したがって、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β又は天然型ヒト・インターフェロン−β処置により、ベムラフェニブ処置群における腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制され、すなわち、ベムラフェニブ耐性を獲得した細胞の出現が抑制されていることが示された。
【００９８】
この結果から、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を獲得したメラノーマ細胞の出現抑制作用を有することが示された。
【００９９】
実施例４及び実施例５の結果より、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤との併用処置では、メラノーマに対してＢＲＡＦ阻害剤単独処置以上の、相加的又は相乗的な抗腫瘍作用を示さないが、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制作用を有することが示された。すなわち、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの発症に対して予防効果を有することが示された。
【０１００】
上記の実施例から、インターフェロン−βは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマに対して抗腫瘍作用を有すること（すなわち、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療効果を有すること）、及び、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現に対して優れた抑制作用を有すること（すなわち、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防効果を有すること）が示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の剤は、医薬の分野において、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの治療剤又はＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマの予防剤として使用できる。また、本発明の剤は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制性を示すメラノーマの治療剤として、ＢＲＡＦ阻害剤耐性メラノーマ細胞の出現抑制のために使用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１：ヒト・インターフェロン−βのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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