(57)【要約】【課題】  生体内で生合成される蛋白質分子中にアミノ酸の類縁体を導入することで蛋白質の機能を損なわせ、それにより細胞を死に至らしめる方法を利用するカウンターセレクション法をさらに効率化することのできる、新規なカウンターセレクションマーカーを開発すること。【解決手段】  変異体ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294Gの提供。  当該PheS変異体は、sacB遺伝子のようにそれ自体が蛋白質毒性を有する遺伝子産物を生産せず、また、YEG培地などの貧栄養培地を使うことなく、LB培地などの通常の栄養培地にフェニルアラニン類縁体を添加した培地中においても効率的に細胞死を誘導できる。  これにより、当該変異体遺伝子を、大腸菌の高感度のカウンターセレクションマーカーとして利用することができる。【選択図】図５
2016032440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列を有するPheS変異体酵素、または、配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列と８５％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有し、当該PheS変異体酵素と同様の活性を有するPheS変異体酵素。
【請求項２】
請求項１に記載のPheS変異体酵素をコードする、PheS変異体酵素遺伝子。
【請求項３】
配列番号１０または１２記載の塩基配列からなる、請求項２に記載のPheS変異体酵素遺伝子。
【請求項４】
配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列において２番目から８７番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する欠失型PheS変異体酵素、または、当該アミノ酸配列と８５％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、当該欠失型PheS変異体酵素と同様の活性を有する欠失型PheS変異体酵素。
【請求項５】
配列番号３１記載のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の欠失型PheS変異体酵素。
【請求項６】
請求項４または５に記載の欠失型PheS変異体酵素をコードする、欠失型PheS変異体酵素遺伝子。
【請求項７】
配列番号３０記載の塩基配列からなる、請求項６に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子。
【請求項８】
請求項２または３に記載のPheS変異体酵素遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
配列番号１０または１２記載のPheS変異体酵素遺伝子を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
配列番号３０記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項２または３に記載のPheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
【請求項１３】
配列番号１０または１２記載のPheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
【請求項１４】
請求項６または７に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
【請求項１５】
配列番号３０記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌で使用可能なカウンターセレクションマーカーに関する。より詳しくは、大腸菌細胞内での蛋白質合成反応において、フェニルアラニルtRNA合成酵素の変異体の特性を利用して、生合成される蛋白質中にフェニルアラニンの類縁化合物を取り込ませることで蛋白質の機能を失活させ、生育不全に導くことを利用したカウンターセレクション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は遺伝子組み換え実験で最も頻用される宿主微生物であり、形質転換方法とベクター開発が極めて発展している。形質転換方法としては、コンピテントセル法、電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、接合伝達法など、化学的、物理的、生物的な方法が種々開発されている。形質転換された細胞とそうでないものとは、ベクター上に搭載されている薬剤耐性や栄養要求性等のマーカー遺伝子に基づき区別される。例えば、薬剤耐性マーカーを含むベクターを用いて宿主を形質転換した際、薬剤存在下で生育可能なものはベクターが導入された細胞であり、生育できないものはベクターが導入されなかった(形質転換されなかった)細胞と判断される。このように、遺伝子導入された宿主を選択する方法はポジティブセレクションと呼ばれ、様々な選択マーカー遺伝子が開発されている。例えば、薬剤耐性遺伝子だけでも、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、テトラサイクリン、トリメトプリムなど様々な抗生物質に対する耐性マーカーが使用可能である。
【０００３】
ポジティブセレクションマーカーは、ベクターを細胞内に導入する際のマーカーとしてのみならず、染色体を加工する際にも有用である。相同組換えなどを利用し、染色体上の特定部位を挿入・欠失・置換する場合などにおいて、目的の組換えが起きたかどうかを判断する際などにポジティブセレクションマーカーを指標とした変異株のスクリーニングが行われている(非特許文献１)。
【０００４】
このように、ポジティブセレクション方法とマーカー遺伝子開発は非常に充実しているのに対し、一度細胞内に導入されたベクターや遺伝子断片を脱落させる技術は、今なお発展途上である。最も古典的な方法としては、細胞に導入する際に用いた選択マーカーに対し、非選択条件で培養を続け、選択マーカーを失ったクローンを選択する方法がある。
【０００５】
例えば、抗生物質耐性マーカーを含むベクターを脱落させる際に、抗生物質を含まない培地で継代培養することでベクターの脱落を待ち、抗生物質感受性株を得るという方法がこれに当たる。しかし、一度導入されたベクターは、細胞内に比較的安定的に維持されるのが一般的であり、非選択条件で細胞を培養し続けた場合でも自然に脱落する頻度は極めて低い。非選択条件での継代培養による脱落は非常に非効率であり、まれに生じるベクター等を脱落した宿主を高効率に選択する技術が求められている。
【０００６】
例えば、あるレポーター遺伝子を発現する宿主を紫外線照射や薬剤などの変異原を利用して変異させて変異株ライブラリーを構築し、レポーターを指標に高発現株をスクリーニングする場合などがある。この場合、発現向上の原因が、宿主のゲノム変異によるものか、ベクター側の変異によるものかを判断する必要がある。この場合、一度宿主から外来遺伝子発現ベクターを脱落せしめ(キュアリング)、再度導入するといった確認作業が必要である。
【０００７】
上述の例では、宿主細胞より一度ベクターを脱落させた後に、同一のベクターを宿主に再導入する例を説明したが、別のレポーターを含むベクターを導入し、高発現効果の遺伝子特異性などを検証する場合などでも必要な技術となる。すなわち、既に導入されているベクターを脱落させるのと同時に、新たなベクターを導入するベクターシャッフリングを行う際にも、ベクター等を脱落した宿主を高効率に選択する技術が重要である。
【０００８】
例に従えば、非特許文献２記載の研究などがこれに該当する。大腸菌染色体から生育必須遺伝子であるrrnオペロンの７種類全てを欠損させると、rRNA遺伝子以外にtRNA遺伝子の一部も欠失される。染色体のrrnオペロンを完全欠損した大腸菌の生育を相補させるには、大腸菌由来のrrnオペロンを供給することに加え、欠失されたtRNA遺伝子も供給する必要がある。これらの遺伝子を一つのベクターで供給することも可能であるが、非特許文献１では、rrnオペロンとtRNA遺伝子を別々のベクターより供給している。さらに、このように複数のベクターを単一宿主に含ませた状態から、例えばrrnオペロンを外来性の遺伝子に置換することを試みるといった機能相補実験を行う場合、外来性rrnオペロン発現ベクターの導入には薬剤耐性マーカーなどを利用してポジティブセレクションすればよいが、大腸菌由来のrrnオペロン発現ベクターを脱落した宿主を高効率に選択するには、何らかの工夫が必要である。
【０００９】
こうした目的では、発現することで細胞を死に至らしめる遺伝子マーカー、即ちカウンターセレクションマーカーがあれば好適である。この方法によれば、生育株は、カウンターセレクションマーカーを脱落した株となる。
【００１０】
現在、大腸菌を宿主としたカウンターセレクションマーカーとしては、枯草菌由来のsacB遺伝子が頻用されている(非特許文献２及び非特許文献３)。sacB遺伝子産物であるレバンシュークラーゼは、ショ糖をレバンに変換する活性を持つ。大腸菌などのグラム陰性菌では、レバンがペリプラズム層に蓄積すると死に至るが、この原理を利用し、sacB遺伝子を保持しない大腸菌を選択的に選択することができる。sacB遺伝子を搭載したベクターを含む宿主株は、ショ糖の添加により死に至る。一方、ショ糖存在下で生育する菌株を選択すれば、sacB遺伝子を脱落した株となる。非特許文献２記載の、外来性rrnオペロン発現ベクターの導入と同時に大腸菌由来のrrnオペロン発現ベクターを脱落させる際などにも、大腸菌由来のrrnオペロン発現ベクターにsacB遺伝子を含ませ、ショ糖の有無による条件的な選択で、外来性rrnオペロンの機能をスクリーニングする試みがなされている。即ち、ショ糖存在下で大腸菌由来のrrnオペロン発現ベクターを脱落せしめた状態で、外来性rrnオペロンが大腸菌内で機能した場合のみ生育株が得られるという仕組みである。
【００１１】
sacB遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用する方法は、大腸菌をはじめとするグラム陰性菌で広く用いられているが(非特許文献２及び非特許文献３)、レバンシュークラーゼが蛋白質毒性を示すことが問題となっている。またショ糖添加により細胞死を誘導する際、5-10%程度の極めて高濃度のショ糖という通常の生育条件から乖離した条件を適用することにより、予期せぬ変異の発生や表現型の変化も懸念されている。また、培地の種類によっては、高いバックグラウンド(擬陽性)が生じてしまうことが報告されている(非特許文献４)。また、固体培地のみならず、液体培地で選択可能であることも望まれるが、ショ糖入り液体培地での選択では擬陽性が多く検出されてしまうこともよく知られている(非特許文献５)。カウンターセレクションマーカーとして頻用されるsacBであるが、このように多くの問題を抱えている。このため、安定的にかつ簡便に利用可能な大腸菌で利用可能なカウンターセレクションマーカー遺伝子の開発が求められている。
【００１２】
一方、上記方法とは異なり、生体内で生合成される蛋白質分子中にアミノ酸の類縁体を導入することで蛋白質の機能を損なわせ、それにより細胞を死に至らしめる方法が知られており、この方法をカウンターセレクションに利用することが提案されている(非特許文献６)。
この方法は、フェニルアラニルtRNA合成酵素のα-サブユニット(PheS)の変異体をカウンターセレクションマーカーとして利用するものである。
野生型PheSは、フェニルアラニンとその類縁体を生体内で厳密に区別するため、類縁化合物が誤って取り込まれる可能性は著しく低く、合成されるポリペプチドも正常なものとなる。一方、PheSの変異体の一部では、フェニルアラニン類縁体である4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを取り込み、正常なポリペプチドが合成されなくなる。その結果、当該PheSの変異体を発現する細胞は4-クロロ-D,L-フェニルアラニンの存在下で死に至る。
【００１３】
しかしながら、この方法は、細胞死を誘導するためにフェニルアラニン類縁体の取り込みを促進するにあたって、フェニルアラニン類縁体を添加する培地として、少量のアミノ酸しか含まないYEG培地(酵母エキス、グルコース、塩化ナトリウムのみを含む培地。非特許文献６)を用いる必要がある。
これは、当該PheSの変異体のフェニルアラニン類縁体の取り込み能力が低く、通常のアミノ酸を含む栄養培地では、フェニルアラニンの取り込みも進行するため、蛋白質の機能阻害を十分に進行させることができないためである。
しかし、YEG培地は貧栄養培地であるため、菌体の生育速度が遅く、通常の遺伝子工学実験で用いられるLB培地などと比較し操作性に劣るという欠点があり、このため、この方法によるカウンターセレクションには時間を要し、効率的でないという欠点がある。
【００１４】
このように、複製開始点や薬剤耐性などの開発に伴い、単一宿主に複数のベクターを共存させることも可能となっているのに対し(非特許文献７)、これと同等の簡便さで宿主よりベクターを脱落する技術は不十分な現状にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Nakashima, N., Miyazaki, K. (2014) Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 15(2):2773-2793.
【非特許文献２】Kitahara, K., Miyazaki, K (2011) Specific inhibition of bacterial RNase T2 by helix 41 of 16S ribosomal RNA. Nat Commun. 2:549.
【非特許文献３】Gay, P., Le Coq, D., Steinmetz, M., Berkelman, T., Kado, C. I. (1985) Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 164:918-921.
【非特許文献４】Li, X. T,, Thomason, L. C., Sawitzke, J. A., Costantino, N., Court, D,L. (2013) Positive and negative selection using the tetA-sacB cassette: recombineering and P1 transduction in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41:e204.
【非特許文献５】Mizoguchi, H., Tanaka-Masuda, K., Mori, H. (2007) A simple method for mμLtiple modification of the Escherichia coli K-12 chromosome. Biosci. Biothechnol. Biochem. 71:2905-2911
【非特許文献６】Kast, P. (1994) pKSS--a second-generation general purpose cloning vector for efficient positive selection of recombinant clones. Gene 138:109-114.
【非特許文献７】Nakashima, N., Tamura, T. (2009) Conditional gene silencing of multiple genes with antisense RNAs and generation of a mutator strain of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 37:e103.
【非特許文献８】Mermershtain, I., Finarov, I., Klipcan, L., Kessler, N., Rozenberg, H., Safro, M. G. (2011) Idiosyncrasy and identity in the prokaryotic PheSystem: crystal structure of E. coli phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanine and AMP. Protein Sci. 20:160-167.
【非特許文献９】Miyazaki, K., Arnold, F. H. (1999) Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis: rapid improvement of protein function, J. Mol. Evol. 49:716-720.
【非特許文献１０】Weiner, M. P., Costa, G. L., Schoettlin, W., Cline, J., Mathur, E., Bauer, J. C. (1994) Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction, Gene 151:119-123.
【非特許文献１１】Miyazaki K, Takenouchi M. (2002) Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid. Biotechniques. 33(5):1033-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、生体内で生合成される蛋白質分子中にアミノ酸の類縁体を導入することで蛋白質の機能を損なわせ、それにより細胞を死に至らしめる方法を利用する、上述のカウンターセレクション法をさらに効率化することのできる、新規なカウンターセレクションマーカーを開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、PheSをコードする遺伝子にランダムな変異を導入し、フェニルアラニン類縁体である4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対する感受性がより高まった変異酵素を獲得することができれば、通常の栄養培地中でも効果的に細胞死を誘導できるのではないかと考えた。
【００１８】
そこで実際に、PheSをコードする遺伝子のランダム変異とスクリーニングを行ったところ、YEG培地を使うことなく、通常の栄養培地であるLB培地にフェニルアラニン類縁体を添加した培地中においても効率的に細胞死を誘導できる変異体ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294Gを見出した(実施例４)。当該変異体は、sacB遺伝子のようにそれ自体が蛋白質毒性を有する遺伝子産物を生産せず(実施例５、図４)、また、LB培地中、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンの添加により、極めて優れた細胞致死性を発揮することが確認された(実施例６、図５)。
【００１９】
ベクターに搭載するマーカー遺伝子の一般的要件として、サイズが小さいことが望ましいとされている。遺伝子の小型化は、PCR増幅の際の反応時間の短縮や、ベクターサイズの小型化による形質転換効率の向上など、種々のメリットを伴う。
そこで、本発明者は、PheS変異体についても、機能を有する最少領域のみを保持する小型遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用できれば、それだけ有利な形質となると考え、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性の向上した変異体をさらに改良する目的で、PheS変異体遺伝子の小型化を試みた。
PheSは複数のドメインから形成され、Ｎ末端から始まるtRNA結合ドメインについてはＸ線結晶構造解析などでは、特定の構造を取っていないことなどが指摘されている(非特許文献８)。一方で、tRNAにアミノ酸をチャージするには、tRNA結合ドメインとアミノ酸をチャージするドメインが同一ポリペプチド鎖に存在しなければ反応全体を遂行できないと考えるのが当然である。このように、一般的にはtRNA結合ドメインを欠失した変異体は正しい反応を成し得ないように思われたが、本発明者は、このような欠失型変異体であっても実際に正しい反応をなし得ることを実験的に検証した。
即ち、本発明者は、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性変異体に対しtRNA結合ドメイン領域を欠失した変異体を作成し、致死活性が出現するかどうかについて検討した結果、tRNA結合ドメイン欠失型PheS変異体についても、全長PheS変異体と同様あるいはそれ以上の高い細胞致死性をもたらすことを見出した(実施例１０、１１、表３)。
【００２０】
本発明によるPheS変異体(ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294G)、および、tRNA結合ドメイン欠失型PheS変異体は、従来の推奨濃度(10mM)(非特許文献６)の1/8(1.25mM)の濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン存在下であっても十分な細胞致死性を示し、カウンターセレクションマーカーとして使用することができる(表２、３)。
【００２１】
本発明者は、さらに、PheS変異体(ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294G)に対しランダム変異を導入したところ、１回の変異ＰＣＲにより、251位および294位以外の部位にさらなる変異が導入され、同様の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を有する変異体を、複数見出した(実施例１２)。
このことは、PheSに高い4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性をもたらす上で、T251AまたはT251Sの変異、並びに、A294Gの変異の組み合わせが重要な役割を果たしていること、そして、これらの変異以外にさらに変異を有するPhes 変異体の中には、これらの変異のみを有する変異体と同様の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を有する変異体が多々存在することを示している。
すなわち、ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294Gのアミノ酸配列である配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有するPheS変異体の中には、ePheST251A/A294GおよびePheST251S/A294G変異体酵素と同様の活性を有する変異体が多々存在し、また、当該配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列においてtRNA結合ドメイン領域に相当する２番目から８７番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有するPheS変異体の中には、上述のtRNA結合ドメイン欠失型PheS変異体酵素と同様の活性を有する変異体が多々存在するといえる。
【００２２】
以上のように、本発明者は、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含む富栄養培地でカウンターセレクションマーカーとして機能することが可能なPheS変異体の発見、当該変異体遺伝子の遺伝子サイズの小型化、更にこれらの変異体が低濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンでカウンターセレクションマーカーとして機能することが可能であることの発見などにより、カウンターセレクション法において様々な操作性を向上させ、効率化することのできる、新規なカウンターセレクションマーカーを開発するという上記課題を解決した。
【００２３】
即ち、本発明は、以下に示すPheS変異体酵素、カウンターセレクションマーカーとして有用な当該PheS変異体の遺伝子、それを搭載したベクター、それを保持した大腸菌株を提供する。また、本発明は、当該PheS変異体遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いるカウンターセレクション方法を提供する。
（１）配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列を有するPheS変異体酵素、または、配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列と85％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有し、当該PheS変異酵素と同様の活性を有するPheS変異体酵素。
（２）(１)に記載のPheS変異体酵素をコードする、PheS変異体酵素遺伝子。
（３）配列番号１０または１２記載の塩基配列からなる、(２)に記載のPheS変異体酵素遺伝子。
（４）配列番号１１または１３に記載のアミノ酸配列において２番目から８７番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する欠失型PheS変異体酵素、または、当該アミノ酸配列と85％以上のアミノ酸同一性を有し、かつ、T251A/A294GまたはT251S/A294G変異を含むアミノ酸配列を有し、当該欠失型PheS変異体酵素と同様の活性を有する欠失型PheS変異体酵素。
（５）配列番号３１記載のアミノ酸配列からなる、(４)に記載の欠失型PheS変異体酵素。
（６）(４)または(５)に記載の欠失型PheS変異体酵素をコードする、欠失型PheS変異体酵素遺伝子。
（７）配列番号３０記載の塩基配列からなる、(６)に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子。
（８）(２)または(３)に記載のPheS変異体酵素遺伝子を含むベクター。
（９）配列番号１０または１２記載のPheS変異体酵素遺伝子を含む、(８)に記載のベクター。
（１０）(６)または(７)に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を含むベクター。
（１１）配列番号３０記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を含む、(１０)に記載のベクター。
（１２）(２)または(３)に記載のPheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
（１３）配列番号１０または１２記載のPheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
（１４）(６)または(７)に記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
（１５）配列番号３０記載の欠失型PheS変異体酵素遺伝子を利用したカウンターセレクション方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のPheS変異体酵素および欠失型PheS変異体酵素は、生体内の蛋白質合成に際し、蛋白質に4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを取り込む能力が高いため、当該変異体酵素遺伝子を、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含む栄養培地において、大腸菌の高感度のカウンターセレクションマーカーとして利用することができる。これにより、カウンターセレクションマーカーを含む遺伝子断片やベクターを脱落した宿主を簡便に同定することができ、相同組換えによるゲノム編集(挿入、欠失など)やプラスミドキュアリング、プラスミドシャッフリングなどを効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】大腸菌PheSの294番目アミノ酸変異体ライブラリーの4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性スクリーニング結果を示す図(100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、1mM 4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むYEG液体培地で37℃、12時間培養後の菌体濁度(OD600)の比較)
【図２】ePheST251A/A294Gのアミノ酸配列
【図３】ePheST251S/A294Gのアミノ酸配列
【図４】大腸菌PheSの各種アミノ酸変異体の蛋白質毒性試験の結果を示す図(100μg/mlアンピシリン、0mM(カラム１-４)または1mM(カラム５-８)のIPTGを含むLB液体培地で37℃、16時間培養後の菌体濁度(OD600)の比較。クローン：カラム１，５はePheS(野生型)；２，６はePheSA294G；３，７はePheST251A/A294G；４，８はePheST251S/A294G)
【図５】大腸菌PheSの各種アミノ酸変異体の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性試験の結果を示す図(100μg/mlアンピシリン、1mM(カラム１-４)または5mM(カラム５-８)の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB液体培地で37℃、16時間培養後の菌体濁度の比較。クローン：カラム１，５はePheS(野生型)；２，６はePheSA294G；３，７はePheST251A/A294G；４，８はePheST251S/A294G)
【図６】Del86ePheST251A/A294Gのアミノ酸配列
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２６】
以下に本発明の実施例を説明するが、ここで挙げる実施例は単なる具体的例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。
【００２７】
実施例１．大腸菌PheS遺伝子の発現系構築
大腸菌PheS(ePheS)をコードする遺伝子は、大腸菌JM109株(RBC Bioscience社製)ゲノムを鋳型にPCR増幅により得た。反応液は、1×PCR緩衝液(東洋紡社製)、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng JM109ゲノムDNA、0.25μM 各プライマー(上流プライマーは配列番号１、下流プライマーは配列番号２、プライマーはシグマ社製)、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、 50℃ 30秒、 68℃ 30秒の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 3分間保温した。増幅産物は0.9% アガロースゲル(ニッポンジーン社製)電気泳動により分離し、約1kbの断片を切り出し、Fast Geneゲルキット(日本ジェネティックス社製)で精製し、水30μlに溶解した。
次に、pCRBluntII Topoキット(インビトロジェン社製)を用いて、マニュアルに従い、PCR断片をpCRBluntIIベクターに挿入した。反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル100μlと混合し、25μg/mlカナマイシン(和光純薬社製)を含むLB寒天培地上でコロニーを選択した。コロニーを25μg/mlカナマイシンを含むLB液体培地で37℃、一晩培養し、プラスミドを調製し、定法に従いDNAシーケンシングによりインサートの配列を決定した(配列番号３)。
次に、プラスミドより制限酵素NdeI、EcoRI(共にNEB社製)を用いてインサートを切り出した。0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、約1kbの断片をFast Geneゲルキットにより精製し、水30μlに溶解した。本制限酵素断片をpJ29b(配列番号４)のNdeI、EcoRI切断断片と混合し、T4 DNAリガーゼ(NEB社製)による連結反応を行った。反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル100μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地(BD社製SOB培地に終濃度20mMグルコース［和光純薬社製］を添加)1mlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリン(和光純薬社製)を含むLB寒天培地(LB培地はメルク社製、寒天は和光純薬社製)で37℃、一晩培養した。生育したコロニーを100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、一晩培養し、HiYield Plasmid Mini Kit(RBC Bioscience社製)を用いてプラスミドを調製し、インサートの配列を定法に従いDNAシーケンシングにより確認し、大腸菌PheS遺伝子の発現ベクターpJePS1(配列番号５)とした。
【００２８】
実施例２．大腸菌PheSの294番目アミノ酸のサチュレーション変異ライブラリーの構築
大腸菌PheSについては、294番目アミノ酸の変異体が基質認識に関わり、その内の一部が4-クロロ-D,L-フェニルアラニン存在下で致死性が高まることが知られている。しかしGly、Cys、Val、Tyr、Trp置換体以外については変異の効果が報告されていない。そこで、サチュレーション変異の手法(非特許文献９)により、294アミノ酸部位のランダムライブラリーを構築した。変異導入には、配列番号６、配列番号７に示す縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用い、非特許文献１０に示すクイックチェンジ法により変異を導入した。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pJePS1、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、50℃ 30秒、68℃ 3分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnI(NEB社製)を添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 100μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地1mlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地上で37℃、一晩培養した。
【００２９】
実施例３．大腸菌PheSの294番目アミノ酸変異体のサチュレーション変異ライブラリーの4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性スクリーニング  100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地上に生育したコロニー96個を爪楊枝で突っつき、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地1mlに植え、マイクロプレートシェーカーM・BR-024(タイテック社製)を用い、37℃、20時間、1200rpmの振盪速度で培養した。培養液のうち1μlを取り、100μg/mlアンピシリン、1mM イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトピラノシド(IPTG、和光純薬社製)、1mM 4-クロロ-D,L-フェニルアラニン(東京化成社製)を含むYEG液体培地(0.5% 酵母エキス(Difco社製)、0.4% グルコース(和光純薬社製)、1% 塩化ナトリウム(和光純薬社製))1mlに植えついだ。菌体をマイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、12時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMax(Molecular Devices社製)で読み取ることにより、培養液の菌体濁度を計測した。OD値の低かった4クローンと、そのOD値を図１に示す。これらのクローンのインサートの配列をDNAシーケンシングにより決定した結果、最も低いOD値を示したクローンの294番目のアミノ酸はGlyであった。この変異体をePheSA294Gと命名した。
【００３０】
実施例４．大腸菌ePheSA294Gの251番目アミノ酸変異体のサチュレーション変異ライブラリーの構築と4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性スクリーニング
大腸菌PheSにおいて、251番目のアミノ酸が基質特異性に関与することが示唆されている(非特許文献８)。しかし、アミノ酸変異が4-クロロ-D,L-フェニルアラニン存在下で致死的に働くかどうかなどについては検討されていない。そこで、251番目の残基に対してサチュレーション変異を適用した。鋳型としては、上述のePheSA294G変異体を利用した。変異導入には、配列番号８、配列番号９に示す縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用い、非特許文献１０に示すクイックチェンジ法により変異を導入した。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pJePheSA294G、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、50℃ 30秒、68℃ 3分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル100μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地1mlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地上で37℃、一晩培養した。
コロニー96個を爪楊枝で突っつき、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地1mlに植え、マイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、20時間、1200rpmの振盪速度で培養した。培養液1μlを取り、100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、1mM 4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB液体培地1mlに植えついだ。菌体をマイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、24時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMaxで読み取った。その結果、OD600の値の低い20個のクローンが同定された。
1mM IPTGの条件では多くの変異体が同定されたため、さらに感受性の高い変異体を同定するために、次に、同じライブラリーを低IPTG濃度条件で再度スクリーニングした。一晩培養液のうち1μlを取り、100μg/mlアンピシリン、0.01mM IPTG、1mM 4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB液体培地1mlに植えついだ。菌体をマイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、24時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMaxで読み取った。その結果、OD600の値の低い10個のクローンが同定された。
インサートの配列をDNAシーケンシングにより決定した結果、251番目のアミノ酸はAla(5クローン)、Ser(5クローン)であった。これらのクローンにおける251番目のアミノ酸のコドンを表１に示す。同一アミノ酸でも異なるコドンを含むクローンが得られ、アミノ酸の種類が4-クロロ-D,L-フェニルアラニン取り込みに深く関与することが確認された。これらの高感受性変異体をePheST251A/A294G及びePheST251S/A294Gと命名した。ePheST251A/A294Gの塩基配列(251番目のアミノ酸のコドンがgctである場合)を配列番号１０に、また、アミノ酸配列を配列番号１１および図２に示し、ePheST251S/A294Gの塩基配列(251番目のアミノ酸のコドンがtctである場合)を配列番号１２に、また、アミノ酸配列を配列番号１３および図３に示す。図２および３においては、これらの高感受性変異体の251番目および294番目の変異箇所がハッチングで示され、また、tRNAとの結合に関与する部分が下線で示されている。
【００３１】
表１．A294G変異を有し、さらに251番目アミノ酸部位に変異を有する4-クロロ-D,L-フェニルアラニン高感受性変異体の、251番目のアミノ酸とそのコドン一覧
【表１】
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【００３２】
実施例５．大腸菌PheS変異体の蛋白質毒性
実施例４までで得られた4-クロロ-D,L-フェニルアラニン高感受性変異体について、まず蛋白質毒性の有無を検証した。ePheS(野生型)、ePheSA294G変異体、ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体の各発現ベクターを含む大腸菌JM109を、それぞれ100μg/mlアンピシリンを含むLB培地で一晩培養後、0または1mM IPTGを含むLB培地1mlに植えついだ。菌体をマイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、16時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMaxで読み取った。その結果を、図４に示す。
図４に示す通り、高濃度のIPTG存在下でも(カラム５-８)、野生型、変異体ともに顕著な細胞濁度の低下は見られず、蛋白質毒性は無視しうると結論された。これは、蛋白質毒性が問題となっているsacB遺伝子産物であるレバンシュークラーゼと比較して有利な形質である。
【００３３】
実施例６．大腸菌PheS変異体の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性
ePheS(野生型)、ePheSA294G変異体、ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体を発現する大腸菌JM109の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対する感受性を種々の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン濃度条件で検証した。
野生型および各発現ベクターを含む大腸菌JM109について、それぞれを100μg/mlアンピシリンを含むLB培地で一晩培養後、100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、1または5mM濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB培地1mlに植えついだ。菌体をマイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、16時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMaxで読み取った。結果を図５に示す。
ePheST251A/A294G変異体(カラム３、７)、ePheST251S/A294G(カラム４、８)においては、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンが1mMであっても、すでに高い致死性を示した(ePheST251S/A294G変異体はカラム３、ePheST251S/A294Gはカラム４)。
これに対し、ePheSA294G変異体は、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン1mM条件では致死的ではなく(カラム２)、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン5mMでも若干の生育阻害しかみられなかった(カラム６)。ePheS(野生型)(カラム１、５)については、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを5mMに増量しても全く生育阻害効果はなかった。
このように、ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体は、従来知られている変異体と比較し、4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対して顕著に感受性が増していることが判明した。
【００３４】
実施例７．ePheST251A/A294Gをコードする遺伝子のpUC18Nベクターへの組み込み
実施例６において高い致死性が示されたePheST251A/A294Gをカウンターセレクションマーカーとして利用するため、配列番号１４記載のpUC18Nベクターに組み込んだ。本ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、colE1 oriを含む一般的なプラスミドベクターである。ePheST251A/A294Gを構成的に発現させるため、アンピシリン耐性遺伝子の直下に挿入した。
配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いて、以下の条件でePheST251A/A294Gをコードする遺伝子をPCR増幅した。PCR反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pJePheST251A/A294G、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し50μlの反応液とした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、 55℃ 30秒、 68℃ 30秒の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 3分間保温した。増幅産物は0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、約1kbの断片をFast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。さらに1×T4キナーゼ緩衝液(NEB社製)3.5μl、10U T4キナーゼ(NEB社製)を加え、5’末端のリン酸化を行った。反応液をFast Gene PCRキットで精製し、水30μlに溶解した。
一方、pUC18Nベクターについては、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを用いて全長プラスミドを増幅した。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pUC18N、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、50℃ 30秒、68℃ 2分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。反応液をFast Gene PCRキットで精製し、水30μlに溶解した。
こうして得られたベクターと5’末端のリン酸化されたインサートを4μlずつ混合し、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液、T4 DNAリガーゼを加え、連結反応を行った。室温にて一晩保温後、反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地500μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地にて培養後、プラスミドを抽出し、DNAシーケンシングにより、目的の方向でインサートの入ったクローン(アンピシリン耐性遺伝子と順向きにePheST251A/A294G遺伝子が入っているもの)を選択し、これをpUC18PAG0と命名した。
次に、アンピシリン耐性遺伝子とePheST251A/A294G遺伝子の間に存在するEcoRI制限酵素サイトを消失させるため、配列番号１７及び配列番号１８記載のプライマーを用いて、クイックチェンジ法により部位特異的な塩基置換を行った。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pUC18PAG0、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 2分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。
反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地500μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地を用いて培養後、プラスミドを抽出し、DNAシーケンシングにより、EcoRIサイトが消失しているクローンを同定し、pUC18PAG1(配列番号１９)と命名した。
さらに、配列番号２０及び配列番号２１のプライマーを用いてpUC18PAG1を鋳型にPCRを行い、全長プラスミドをインバースPCRにより増幅した。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pUC18PAG1、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 2分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。増幅産物は0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、約3.5kbの断片をFast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。さらに1×T4キナーゼ緩衝液(NEB社製)3.5μl、10U T4キナーゼ、T4 DNAリガーゼを加え、5’末端のリン酸化とセルフライゲーション反応を行った。
室温にて一晩保温後、反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地500μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地を用いて培養後、プラスミドを抽出し、DNAシーケンシングによりpUC18PAG2(配列番号２２)を得た。
【００３５】
実施例８．pUC18PAG2の薬剤耐性遺伝子の改変
pUC18PAG2のアンピシリン耐性遺伝子を他の薬剤耐性遺伝子(カナマイシン耐性、ゼオシン耐性)に変更した。配列番号１５及び配列番号２０のプライマーを用いてpUC18PAG2のアンピシリン耐性遺伝子を除いた領域をPCR増幅し、ここに配列番号２３および配列番号２４、または配列番号２５及び配列番号２６を用いて増幅したカナマイシン耐性、ゼオシン耐性遺伝子を挿入した。
まず、pUC18PAG2のアンピシリン耐性遺伝子を除去するためのPCRは以下のとおりに行った。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pUC18PAG2、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 2分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。増幅産物は0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、約3kbの断片を切り出し、Fast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。
一方、薬剤耐性遺伝子については、反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pHSG296(タカラバイオ社製、カナマイシン耐性遺伝子の場合)またはpCRBlunt(インビトロジェン社製、ゼオシン耐性遺伝子の場合)、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。増幅産物は0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、カナマイシン耐性遺伝子については約800bの断片を、ゼオシン耐性遺伝子については約400bの断片を切り出し、Fast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。さらに1×T4キナーゼ緩衝液3.5μl、10U T4キナーゼを加え、5’末端のリン酸化を行った。反応液をFast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。
こうして得られたベクターと5’末端のリン酸化されたインサートを4μlずつ混合し、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液、 T4 DNAリガーゼを加え、連結反応を行った。室温にて一晩保温後、反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地130μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を25μg/mlカナマイシンあるいは50μg/mlゼオシンを含むLB寒天培地にまき、37℃で一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、液体培養後プラスミドを抽出し、定法に従いDNAシーケンシングにより、アンピシリン耐性遺伝子の場合と同方向に薬剤耐性遺伝子及びePheST251A/A294G遺伝子からなる遺伝子カセットが入っているクローンを選択し、それぞれpUC18KPAG2(カナマイシン耐性、配列番号２７)、pUC18ZPAG2(ゼオシン耐性、配列番号２８)と命名した。
【００３６】
実施例９．pUC18KPAG2、pUC18ZPAG2を保持する大腸菌の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性
上述の方法で作成したpUC18KPAG2、あるいは、pUC18ZPAG2を含む大腸菌について、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を検証した。大腸菌JM109株コンピテントセル13μlに対し、各プラスミドを0.5μl(約50ng)、それぞれ加えた。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地130μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液20μlを様々な濃度(0、1.25、2.5、5、10mM)の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養後のコロニー数をカウントした。この結果、従来利用されてきたYEG培地ではなく、LB培地を用いてカウンターセレクションが可能であることが見出された。また、非特許文献７記載の条件(10mM)よりも低濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンで選択可能であり、とくにカナマイシン耐性pUC18KPAG2については、従来法の1/8という低濃度でも選択可能であった。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
実施例１０．ePheST251A/A294G遺伝子の小型化
配列番号２９及び配列番号２４記載のプライマーを用い、pUC18KPAG2またはpUC18ZPAG2を鋳型に用いてPCRを行った。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pUC18KPAG2またはpUC18ZPAG2、0.25μM 各プライマー、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 2分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。
反応産物を0.9% アガロースゲル電気泳動により反応産物を分離した。約3kbの断片を切り出し、Fast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。この内3μlを分取し、水5μl、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液1μl、T4 DNAリガーゼ1μlと混合し、室温にて連結反応を行った。2時間保温後、反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地500μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、50μg/mlカナマイシンを含むLB液体培地で培養後、プラスミドを抽出し、DNAシーケンシングによりePheST251A/A294GのtRNAとの結合に関与する２番目から８７番目までの８６アミノ酸残基が欠失した変異体(Del86ePheST251A/A294G、アミノ酸配列の配列番号３１および図６)をコードするDNA配列(配列番号３０)を有するものを選択し、pUC18KΔPAG2(配列番号３２)、および、pUC18ZΔPAG2(配列番号３３)と、それぞれ命名した。
【００３９】
実施例１１．pUC18KΔPAG2、pUC18ZΔPAG2を保持する大腸菌の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性
上述の方法で作成したpUC18KΔPAG2、pUC18ZΔPAG2を含む大腸菌について、4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を検証した。大腸菌JM109株コンピテントセル13μlに対し、各プラスミドを0.5μl(約50ng)、それぞれ加えた。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地130μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液20μlを様々な濃度(0、1.25、2.5、5、10mM)の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養後のコロニー数をカウントした。この結果、LB培地を用いてカウンターセレクションが可能であることが見出された。また、非特許文献７記載の条件(10mM)よりも低濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンで選択可能であり、とくにカナマイシン耐性pUC18KΔPAG2については、従来法の1/8という低濃度でも選択可能であった。
【００４０】
【表３】
2016032440.tif 000005
【００４１】
実施例１２．大腸菌PheS変異体のランダム変異と4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性変異体の同定
実施例６においてePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体が4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対し高度の感受性を示すことが確認されたことで、T251A/A294G及びT251S/A294G変異が4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対する感受性を示す上で重要な変異であることが示された。また、これらの変異体がカウンターセレクションマーカーとして有用であることは、上述の実施例９，１１などにより証明された。しかしながら、このような優れたカウンターセレクションマーカーとなりうる遺伝子は、上述の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンに対する感受性を示すために重要な変異部位を含んでいるかぎり、上述のePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体そのものに限られるものではない。
すなわち、蛋白質は一般に、活性部位など、アミノ酸変異により大きく機能に影響を及ぼす部位と、それ以外の立体構造形成などに重要な役割を示す領域などに大別される。そのため、活性部位以外の領域に対しては比較的自由に変異を導入することが可能である。したがって、ePheSについても、基質認識などの機能とは関係のない部位の新たな変異により、ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体と同等の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を示す別の変異体が存在することは容易に推定できる。このことをより具体的に示すため、以下の実験を行った。
ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体をコードする遺伝子を鋳型にランダム変異を導入し、ePheST251A/A294G変異体及びePheST251S/A294G変異体と同等の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を示す変異体を選択し、塩基配列を決定した。ランダム変異導入は、pJePS1T251A/A294G、pJePS1T251S/A294Gを鋳型にStratagene社製GeneMorphキットを用いて変異PCRにより行った。
反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、50ng 鋳型プラスミドDNA、0.25μM 各プライマー(上流プライマーは配列番号３４、下流プライマーは配列番号３５)、1μl DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を94℃にて1分間保温後、94℃ 10秒、 55℃ 30秒、 72℃ 1分の温度サイクルを30回繰り返し、最後に72℃ 10分間保温した。増幅産物は0.9% アガロースゲル電気泳動により分離し、約1kbの断片を切り出し、Fast Geneゲルキットで精製し、水30μlに溶解した。
次いで、非特許文献１１記載のMEGAWHOP法により以下の方法により変異ライブラリーを構築した。反応液は、1×PCR緩衝液、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、50ng pJePS1T251A/A294G(またはpJePS1T251S/A294G)、5μl 変異PCR産物、1U KOD-Plus-Neo DNAポリメラーゼを混合し、最終体積50μlとした。反応液を98℃にて2分間保温後、98℃ 10秒、68℃ 2.5分の温度サイクルを25回繰り返し、最後に68℃ 5分間保温した。室温に保温後、反応産物に直接10UのDpnIを添加し、37℃にて4時間反応し、鋳型を切断した。
反応液1μlを大腸菌JM109コンピテントセル 50μlと混合した。氷上に10分間放置後、42℃にて30秒間ヒートショック処理をし、SOC培地500μlを加え、37℃、1時間培養した。培養液を100μg/mlアンピシリン、1mM IPTGを含むLB寒天培地にまき、37℃、一晩培養した。いくつかのコロニーを選択し、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地に植え、マイクロプレートシェーカーM・BR-024を用い、37℃、16時間、1200rpmの振盪速度で培養した。培養液の1μlを100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、1または5mM濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを含むLB液体培地1mlに植え継ぎ、37℃、16時間、1200rpmの振盪速度で培養した。170μlの培養液を抜き取り、OD600の値をマイクロプレートリーダーVersaMaxで読み取った。
1または5mM濃度の4-クロロ-D,L-フェニルアラニン存在下で生育の見られなかった変異体(ePheST251A/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから2個、ePheST251S/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから2個)を100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地にて37℃、16時間振盪培養し、プラスミドを調製した。次いで定法によりインサート配列を決定した。各変異体の変異部位を表４および５に示す。
表４に示すように、ePheST251A/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから同定された変異体については、A70V、S60G、N84G，R281Gなど様々なアミノ酸変異が付加的に存在した場合にも、ePheST251A/A294G変異体と同様に4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を示し、カウンターセレクションマーカーとして機能すると考えられる。
【００４２】
表４．ePheST251A/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから同定された変異体(カッコ内は塩基置換、下線部はアミノ酸置換を伴う変異)
【表４】
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また、表５に示すように、ePheST251S/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから同定された変異体については、E52G、L96Q、R164H，H207N、E87Dなど様々なアミノ酸変異が付加的に存在した場合にも、ePheST251S/A294G変異体と同様に4-クロロ-D,L-フェニルアラニン感受性を示し、カウンターセレクションマーカーとして機能すると考えられる。
【００４３】
表５．ePheST251S/A294G変異体を鋳型とした変異ライブラリーから同定された変異体(カッコ内は塩基置換、下線部はアミノ酸置換を伴う変異)
【表５】
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これらの変異体で見出された変異部位は一次構造上、一箇所に集中することなく散在しており、この他にも様々な変異体が存在しうることが示唆される。このように、カウンターセレクションマーカーとして使用可能なePheS変異体は、T251A/A294G、T251S/A294Gという重要な変異を保持したうえで、加算的にその他のアミノ酸変異を含むものなどが数多く存在すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月29日(2015.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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