(57)【要約】【課題】病的状態の細胞を簡便に作製する方法に関する。【解決手段】細胞又は組織に負荷（加重）を掛けて培養するという、細胞圧縮培養方法により、正常状態または病的状態の細胞又は組織を用いて、病的状態の細胞や組織モデルを作製できること、または、更なる悪化モデルを作製できることを見出した。その結果、この病的状態の細胞又は組織を用いることにより、より生体の病態細胞又は組織に近い系で、各種治療剤の新たなスクリーニングを行うことが可能になった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織を圧縮培養することを特徴とする、細胞又は組織の病的状態（病態モデルの細胞又は組織）を作製する方法であって、
ａ）上記細胞や組織の圧縮率が２〜９０％であるか、
ｂ）圧縮の加圧が、０．０７〜１．６ｇ／ｃｍ２である
ことを特徴とする、病的細胞又は組織の作製方法。
【請求項２】
上記細胞又は組織が、正常脂肪細胞又は正常脂肪組織であることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
上記圧縮率が２〜２０％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
上記圧縮培養の培地が、溶液培地または１５０〜３５０Ｐａの硬さの２次元ゲル培地であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項５】
上記溶液培地が、ＤＭＥＭ培地である、請求項４に記載の作製方法。
【請求項６】
上記２次元ゲル培地の硬さが２５０Ｐａである、請求項４に記載の作製方法。
【請求項７】
上記２次元ゲル培地がコラーゲン及び／又はフィブロネクチンでゲル上を被覆していることを特徴とする、請求項４又は６に記載の作製方法。
【請求項８】
上記脂肪細胞又は脂肪組織が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞又は組織、ラット脂肪細胞又は組織、ヒト脂肪細胞又はヒト脂肪組織である、請求項２に記載の作製方法。
【請求項９】
マウス脂肪組織が、マウス正常脂肪組織である、請求項８に記載の作製方法。
【請求項１０】
上記細胞又は組織の病的状態が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、請求項２に記載の作製方法。
【請求項１１】
上記細胞又は組織が、病的細胞または病的組織であり、病態が更に悪化した病的細胞又は組織の作製方法であることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
【請求項１２】
上記病的細胞又は組織が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、請求項１１に記載の作製方法。
【請求項１３】
上記肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織が、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、請求項１２に記載の作製方法。
【請求項１４】
圧縮により細胞機能に障害が生じないように、組織の細胞外基質タンパクの密度を低下させ、細胞と細胞外基質の間に間隙を有する細胞又は組織を作製する方法。
【請求項１５】
上記細胞外基質タンパクの密度を低下させることが、コラゲナーゼ処理を行うことである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞圧縮又は細胞加圧に起因して、病的状態にある細胞又は組織において、圧縮又は加圧環境を解消することにより、細胞又は組織の病的状態を軽減あるいは解消する方法。
【請求項１７】
上記圧縮又は加圧環境を解消することが、細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することが、コラーゲン、アクチンフィラメント、インテグリンの間の信号伝達阻害またはＮＦ−ｋＢ、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫ阻害によるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することが、コラーゲン６の産生を阻害することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤スクリーニング用の病態モデルを作製するための新たな細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、様々な力学的刺激による影響を受け、機能や形態、運動能が変化することが知られている（非特許文献１、２）。例えば、細胞培養基板の弾性率が間葉系幹細胞の分化に影響を与えることが明らかになっている（非特許文献１）。
また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に代表される再生医療の基礎研究が１９９０年代から急速に進歩し、それらを応用した細胞移植医療（再生医療）の実用化が期待されている。これらの研究の進展に伴って、細胞の増殖だけでなく、分化や３次元化（立体的な組織化）と言った細胞加工（セルプロセッシング）が必要になって来ている（非特許文献３）。
【０００３】
そこで、３次元化した培養方法が検討され、培養培地として市販され始めている（住友ベークライト社製「セルフィーユ」）。しかしながら、一般の簡便な細胞培養方法は、ゲル上での平面（２次元的）培養方法である（特許文献１，２）ため、培養細胞に対する種々の培養培地の力学的影響を評価しても、その結果が生体を反映しているものとは言い難いものであった。
そこでどうすれば、生体に近い３次元の細胞培養が可能になるかについて、多くの研究がなされているが、適切であると考えられるものは、まだ見出されていない状況である。従って、薬剤スクリーニング用の適切な病態モデルを作製することはほとんど行われていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３２１６６号公報
【特許文献２】特開２０１２−１０６００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １２６，  ６７７−６８９，  ２００６．“Ｍａｔｒｉｘ  ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”
【非特許文献２】水野大介ら、生物物理、５１（１），０１４−０１７（２０１１）「細胞の力学知覚の物理メカニズム」
【非特許文献３】高木睦、生物工学会誌、第９０巻、第１号，２７−２７（２０１２）「新分野セルプロセッシング工学の展開」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、病態モデルとして使用できる細胞や組織を簡易に作製し、それを薬剤スクリーングに提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、既に、間葉系幹細胞を用いて、各種の弾性率を持つ２次元ゲル培地で培養することにより、色々な細胞に分化した培養細胞を作製できることを報告している（特許文献１）。更に、正常脂肪組織と同じ硬さ（２５０Ｐａ）を持つ２次元ゲル培地の上で、パルミチン酸のような飽和脂肪酸の存在下に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を培養すると、脂肪細胞が肥大化するに係らず、２次元ゲル培地の硬さが培養細胞に影響して、インスリン抵抗性が惹起されない（インスリン感受性が維持される）細胞になることを報告している（特許文献２）。
【０００８】
本発明者は、培養細胞の性状に対して影響する力学的な因子を解明するため、２次元ゲル培地の硬さ以外の因子を探索した。その結果、細胞に圧縮を与えることにより、培養細胞の機能をコントロールできることを見出し、本発明を完成させた。即ち、細胞を加圧圧縮して培養することにより、種々の細胞機能を有する圧縮培養細胞を作製できることを見出した。例えば、生体から採取した正常脂肪細胞（組織）を加圧圧縮し培養することにより、人工的に肥満脂肪細胞の機能を持つ細胞を作製することができた。そして、この人工的肥満脂肪細胞（組織）は、細胞の形状としては正常脂肪細胞と同様の形状を示すもの（肥満脂肪細胞に見られる肥大化を伴うことなく）であるが、機能としては肥満脂肪細胞と同じ機能を示すことが明らかになった。本発明者は、以上の知見に基き本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）細胞又は組織を圧縮培養することを特徴とする、細胞又は組織の病的状態（病態モデルの細胞又は組織）を作製する方法であって、
ａ）上記細胞や組織の圧縮率が２〜９０％であるか、
ｂ）圧縮の加圧が、０．０７〜１．６ｇ／ｃｍ２である
ことを特徴とする、病的細胞又は組織の作製方法。
（２）上記細胞又は組織が、正常脂肪細胞又は正常脂肪組織であることを特徴とする、上記（１）記載の作製方法。
（３）上記圧縮率が２〜２０％であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の作製方法。
（４）上記圧縮培養の培地が、溶液培地または１５０〜３５０Ｐａの硬さの２次元ゲル培地であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の作製方法。
（５）上記溶液培地が、ＤＭＥＭ培地である、上記（４）に記載の作製方法。
（６）上記２次元ゲル培地の硬さが２５０Ｐａである、上記（４）に記載の作製方法。
（７）上記２次元ゲル培地がコラーゲン及び／又はフィブロネクチンでゲル上を被覆していることを特徴とする、上記（４）又は（６）に記載の作製方法。
（８）上記脂肪細胞又は脂肪組織が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞又は組織、ラット脂肪細胞又は組織、ヒト脂肪細胞又はヒト脂肪組織である、上記（２）に記載の作製方法。
（９）マウス脂肪組織が、マウス正常脂肪組織である、上記（８）に記載の作製方法。
（１０）上記細胞又は組織の病的状態が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、請求項２に記載の作製方法。
（１１）上記細胞又は組織が、病的細胞または病的組織であり、病態が更に悪化した病的細胞又は組織の作製方法であることを特徴とする、上記（１）に記載の作製方法。
（１２）上記病的細胞又は組織が、肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、上記（１１）に記載の作製方法。
（１３）上記肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織が、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織であることを特徴とする、上記（１２）に記載の作製方法。
（１４）圧縮により細胞機能に障害が生じないように、組織の細胞外基質タンパクの密度を低下させ、細胞と細胞外基質の間に間隙を有する細胞又は組織を作製する方法。
（１５）細胞外基質タンパクの密度を低下させることが、コラゲナーゼ処理を行うことである、上記（１４）に記載の方法。
（１６）細胞圧縮又は細胞加圧に起因して、病的状態にある細胞又は組織において、圧縮又は加圧環境を解消することにより、細胞又は組織の病的状態を軽減あるいは解消する方法。
（１７）上記圧縮又は加圧環境を解消することが、細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することである、上記（１６）に記載の方法。
（１８）上記細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することが、コラーゲン、アクチンフィラメント、インテグリンの間の信号伝達阻害またはＮＦ−ｋＢ、Ｒｈｏ、ＲＯＣＫ、ＭＬＣＫ阻害によるものである、上記（１７）に記載の方法。
（１９）上記細胞外基質による力学的刺激の伝達を解消することが、コラーゲン６の産生を阻害することを特徴とする、上記（１７）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞圧縮培養方法は、正常細胞又は正常組織に、力学的な負荷を与えて圧縮し、所望の病態モデル細胞を作製する方法である。そのため、例えば、脂肪細胞を用いた場合であれば、正常脂肪細胞又は正常脂肪組織から、本発明方法により簡便に肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織と同様の機能を有する細胞（組織）を作製することができる。また、加圧圧縮の程度に応じて、所望の病態の肥満脂肪細胞又は肥満脂肪組織と同様の機能の細胞を簡易に作製できる。そのため、それを用いて、病態に応じた薬剤のスクリーニングが容易に実施できるようになった。
更には、肥満脂肪細胞を使用して、本発明の細胞圧縮培養方法を用いることにより、より病態の悪化した肥満脂肪細胞を作製することが可能である。
このように、本発明の細胞圧縮培養方法により、色々な病態モデル細胞や病態モデル組織を作製し、適切な薬剤をスクリーニングすることが可能になった。
また細胞圧縮の力学的刺激の伝達メカニズムの検討から、圧縮に伴って生じている病的状態を解消するに適した薬剤をスクリーニングすることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、２５０Ｐａの硬さを持つ細胞培養培地（２次元ゲル）で培養した場合のＭＣＰ−１の分泌量を示すとともに、上記２次元ゲルを重ねて、２つのゲルに細胞を挟んで（疑似３次元ゲルで）培養した場合のＭＣＰ−１の分泌量を示した図である。ＭＣＰ−１の分泌量は、疑似３次元ゲルの場合に、２次元ゲルの約２倍の分泌量を示すことが明らかになった。このことは、疑似３次元ゲルの場合、培養細胞に負荷されるゲルの重みにより、力学的なストレスが細胞に発生し、ＭＣＰ−１の分泌量がより増大したことが明らかにされた。
【図２】マウスの生殖腺脂肪組織に５．７６ｃｍ２のカバーガラス（０．２ｇ）を乗せ、それぞれ０、３、６、９ｇの重石を置いて、０．２、３．２、６．２、９．２ｇ／５．７６ｃｍ２の４段階の負荷を掛けて培養した。その４段階の場合に生じるＭＣＰ−１の分泌量の変化を示した図である。コントロールとして、痩せ型の野性型マウスの正常脂肪組織を使用し、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織との対比を行った。正常脂肪組織に９．２ｇ／５．７６ｃｍ２の負荷を掛けると、肥満脂肪組織と同様のＭＣＰ−１の分泌量を示すことが明らかとなった。
【図３】マウスの生殖腺脂肪組織の動的剛性率を示した図である。痩せ型の野性型マウスの正常脂肪組織は約１１０Ｐａの値を示し、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織は約２６０Ｐａの値を示すことが明らかとなった。
【図４】ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織をコラゲナーゼで処理し、肥満脂肪組織のコラーゲンを除去した。コラゲナーゼの処理時間により、肥満脂肪組織のコラーゲンの含量が低下する。図４は、肥満脂肪組織のコラーゲンの含量が低下するに従い、肥満脂肪組織の硬さが低下することを示した図である。肥満脂肪組織のコラーゲン含量が低下すれば、肥満脂肪組織の硬さが低下することが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、細胞及び組織を加圧圧縮して、人工的に細胞の病態モデルを作製する細胞圧縮培養方法に関するものである。
本発明の「細胞又は組織」とは、特に限定されるものではないが、生体から採取される健常または病的な状態の細胞又は組織のことであり、あるいは動物細胞の確立された細胞株のことを言う。例えば、脂肪細胞、筋肉細胞、肝臓細胞等の分化された細胞のことを言う。
本発明の「圧縮培養」とは、加圧して（加重を掛けて）圧縮しながら培養することを言う。
本発明の「細胞又は組織の病的状態」とは、正常な細胞又は正常な組織と異なり、正常な代謝機能や形状を示さないことを言う。なお、病的状態にも軽度、重度と幾つかの段階があるが、細胞や組織の正常値の範囲を逸脱した形状(容量)や性質を示すものを病的状態という。例えば、脂肪細胞の場合、病的状態とは、肥満脂肪細胞の状態を表わすものである。
本発明の「病的細胞又は組織」とは、本発明の細胞圧縮により作製された病的状態を持つ細胞や組織のことを言う。それ故、本発明の「病的細胞又は組織」は、「病態モデルの細胞又は組織」として、簡易に作製でき、スクリーニング方法に汎用することができる。
本発明の「圧縮率」とは、圧縮前後の圧縮方向におけるサイズ変化のことをいい、２〜９０％の範囲を挙げることができる。使用する細胞によって、圧縮率の限界は異なるが、例えば正常脂肪細胞又は正常脂肪組織の場合には、２〜２０％が好ましい。
本発明の「加圧」とは、負荷（加重）を掛けることをいい、０．０７〜１．６ｇ／ｃｍ２の範囲を挙げることができる。好ましくは、０．０７〜１．１ｇ／ｃｍ２を挙げることができる。使用する細胞によって、加圧の限界は異なるが、例えば正常脂肪細胞又は正常脂肪組織の場合には、カバーグラス（０．２ｇ、２．４×２．４ｃｍ）を脂肪細胞（組織）に設置し、その上に０．２〜９ｇの加重を掛けることが好ましい。
更には、カバーグラス、寒天培地や２次元ゲル培地などの固形状の培地を使用し、それを上下のサンドイッチ状にすることにより、その間に挟まれた培養細胞に培地の自重による荷重（圧力）を与えることができる。また三次元培養培地で細胞培養を行い、三次元培養培地に圧縮を加えることができる。使用する固形状の培地は、それぞれ目的に応じて、所望の形状と自重を持つものを選択することができる。
【００１３】
本発明の「脂肪細胞」とは、例えばマウス線維芽細胞由来の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、マウス脂肪細胞、ラット脂肪細胞、ヒト脂肪細胞のことを挙げることができる。
本発明の「脂肪組織」とは、上記脂肪細胞の集積した組織部分のことを言う。例えば、マウスの皮下脂肪組織またはマウスの生殖腺脂肪組織のことを挙げることができる。
本発明の「溶液培地」とは、細胞培養に使用される一般的な溶液培地のことであり、特に限定されるものではない。例えばＤＭＥＭ培地を挙げることができる。
本発明の「２次元ゲル培地」とは、例えば特許文献１に記載の方法で作製されたポリアクリルアミドゲル、あるいは市販のチオール化ヒアルロン酸ゲル（ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓａｎ．ｃｏｍ）の樹脂、例えばポリアミド・ナノファイバー、多孔質のポリビニルフォーマル（ＰＶＦ）樹脂等のことをいう。
本発明の「肥満脂肪細胞」とは、中性脂肪の貯蔵を行なって肥大化した成熟脂肪細胞のことを言う。非特許文献５の記載によれば、肥大した脂肪細胞の細胞直径は、１００μｍ以上であり、最大でも１３０〜１４０μｍである。一方、通常の脂肪細胞（ＢＭＩ２０〜２２の普通体重者）の細胞直径は、７０〜９０μｍであった。このように、通常の脂肪細胞と肥大化した脂肪細胞では、細胞直径が顕著に異なっている。また、形態的にも、肥大化した脂肪細胞では、細胞が多面体の形状を取るが、通常の脂肪細胞では、脂肪細胞は球形で細胞相互間に隙間があり、例えばぶどう型の形状を示している。
なお、正常脂肪細胞（組織）から、本発明の圧縮培養方法で得られた人工的な肥満脂肪細胞（組織）は、正常脂肪細胞と同様の容量で、細胞サイズの肥大化がなく、中性脂肪の蓄積も見られない。また、細胞外基質成分も正常脂肪細胞と同じである。一方、この人工的な脂肪細胞・脂肪組織の機能に関しては、一般的な肥満脂肪細胞・肥満脂肪組織と同様のアディポサイトカインの合成・分泌パターンを示しており、ＮＦkＢの活性化が起きている。また、低分子量ＧＴＰ結合タンパクＲｈｏ、ＲＯＣＫ、ミオシン軽鎖キナーゼの活性化も起きており、一般的な肥満脂肪細胞・肥満脂肪組織と同様の状態である。そして、インスリン抵抗性を増大させる単球走化活性因子（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１２α、ＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、レジスチンなどのアディポカインの分泌が、肥満脂肪細胞と同様に増大している。
【００１４】
本発明の「肥満脂肪組織」とは、例えばｏｂ／ｏｂマウスの生殖腺脂肪組織などのことを言い、肥満脂肪細胞が多数存在する組織のことを言う。
本発明の「コラーゲン」とは、例えばＩ〜ＩＸ型のコラーゲンを挙げることができる。好ましいものとしては、コラーゲンＩおよびＶＩを挙げることができる。
本発明の「細胞圧縮培養方法」とは、例えば上記２次元ゲル培地を２枚重ねて（疑似３次元ゲル化し）、その間に細胞を播種して２次元ゲル培地の自重で圧縮培養する方法、採取した組織（例えば正常脂肪組織）を加圧して圧縮し、溶液培地にて培養する方法などが挙げられる。更には、生体内環境下で脂肪組織に加圧圧縮を掛けて留置する方法を挙げることができる。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）擬似３次元の細胞培養方法と３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞の培養
（１）方法
ａ）２５０Ｐａポリアクリルアミドゲル（ソフトゲル）の作製
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ＰａｒｔＡ  １５（１）：１４７−１５４（２００９）又はＪ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６，１４２−１４９（２００９）に記載の方法に順じて作成される。例えば、２５０Ｐａソフトゲル用としては、ガラス製カバースリップの表面で、３．０％アクリルアミドと０．２％ビスアクリルアミドの溶液にＡＰＳ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）およびＴＥＭＥＤ  （Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈａｎｅ−１，２−ｄｉａｍｉｎｅ）を加えてポリアクリルアミドゲルを作成する。ゲル表面にＮ−コハク酸イミドあるいはＳｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（４’−ａｚｉｄｏ−２’−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）  ｈｅｘａｎｏａｔｅ）を用いて架橋する。このガラス製カバースリップ上に形成されたゲルをコラーゲン、フイブリノーゲンまたはその混合物の溶液に浸漬して、ゲル表面を細胞外マトリックス・リガンドで被覆した。
ｂ）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の擬似３次元モデルでの細胞培養
本発明の疑似３次元培養モデルは、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２４，７５６７−７５７７（２００４）の方法に準じて行なわれる。例えば、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞の場合、１０％ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地で２日間培養し、コンフルエントにする。この培養細胞を前項のソフトゲル（２．４×２．４ｃｍ）に撒き、４８時間培養する。培養培地は、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、１μＭデキサメタゾン、１．７μＭインスリンを含んでいる。その後、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で７−９日間培養し、脂肪細胞に分化させる。その間、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地は隔日で交換する。
３Ｔ３−Ｌ１細胞が上記ソフトゲル上で脂肪細胞に分化した後、更に上記ａ）のソフトゲル（０．０７ｇ／ｃｍ２）を上記培養細胞に重ねてサンドイッチ状態にした。このサンドイッチ状態の培地のことを、擬似３次元ソフトゲル培地という。更に、この擬似３次元ソフトゲル培地を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に浸漬して細胞培養をした。
【００１７】
（２）結果
ソフトゲル上（２次元モデル）で培養した３Ｔ３−Ｌ１由来の脂肪細胞と、ソフトゲルを重ねてサンドイッチ状（擬似３次元モデル）で培養した３Ｔ３−Ｌ１由来の脂肪細胞を比較すると、図１に示すように、細胞の炎症マーカーであるＭＣＰ−１の分泌量が、擬似３次元モデル培地で培養された脂肪細胞の場合、約２倍高くなることが明らかとなった。即ち、擬似３次元モデル培地での脂肪細胞の培養においては、細胞培養用のゲル培地（ソフトゲル）の硬さが培養細胞に影響するだけでなく、細胞の上にかぶせられたゲル培地（ソフトゲル）による加圧・圧縮も大きな影響を与えることが明らかとなった。
即ち、細胞外マトリックスが２５０Ｐａの弾性を持つ培養基盤（２次元ソフトゲル培地）で培養された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、健常な白色脂肪細胞のモデルとして使用できる。更に、２次元ソフトゲル培地を重ねた本発明の疑似３次元ソフトゲル培地で得られた新たな３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（圧縮脂肪細胞）は、インスリン抵抗性を有する肥満脂肪細胞のモデルとして使用できることが見出された。なお、このインスリン抵抗性を有する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において細胞の肥大化は見られなかった。
【００１８】
（実施例２）圧縮と変形させた脂肪組織の性状の評価
上記実施例１に示されるように、正常脂肪細胞を加圧圧縮することにより、インスリン抵抗性を有する人工的な肥満脂肪細胞が得られた。このように、培養条件によって得られる細胞の機能が異なってくるため、一般的に培養細胞を用いて薬剤の評価を行なう場合には、生体環境と同じような力学的な環境でないと、正当な薬剤の評価が難しいことを示している。
そこで、加圧圧縮時に脂肪細胞機能がどのように影響を受けるかを評価するために、脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインのｍＲＮＡの発現変動とアディポサイトカインの分泌変動を測定、評価することを行なった。まず、正常マウスまたは肥満糖尿病モデルマウスから脂肪組織を採取して圧縮し、脂肪組織に対する加圧とＭＣＰ−１の分泌量について評価した。
ａ）方法
正常なマウスから採取された２００−２５０ｍｇの脂肪組織（コントロール群）と、肥満糖尿病マモデルウス（ｏｂ／ｏｂマウス）から採取された２００−２５０ｍｇの脂肪組織（ｏｂ／ｏｂ群）を、１０％ＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養する。
それらの組織に対して、２．４ｃｍｘ２．４ｃｍ（０．２ｇ）のカバーグラスを載せ、更にその上に０ｇ、３ｇ、６ｇ、９ｇの錘を載せる。これらはそれぞれ即ち０．０４ｇ／ｃｍ２、０．５６ｇ／ｃｍ２、１．１ｇ／ｃｍ２、１．６ｇ／ｃｍ２の加圧となる。６時間以上培養後に培地を回収し、その中に含まれるＭＣＰ−１の量を測定する。
【００１９】
ｂ）結果
錘を載せて６時間培養した場合、図２で示されるように、正常マウスに由来するコントロール群の脂肪組織では、加重が負荷されるに従って、ＭＣＰ−１の分泌量が増大することが示された。また、ｏｂ／ｏｂ群の脂肪組織では、１．１ｇ／ｃｍ２の加重を付加させるまでは、ＭＣＰ−１の分泌量が増大したが、それを超えて、１．６ｇ／ｃｍ２の加重を与えると、逆にＭＣＰ−１の分泌量が減少していた。
このことは、正常細胞の組織に加重（負荷）を掛けると、ＭＣＰ−１の分泌量が増大し、組織の性状としては、肥満脂肪細胞の組織に近づいて行くことを示している。更に、肥満脂肪細胞の組織に加重（負荷）を掛けると、ＭＣＰ−１の分泌量が増大するが、１．１ｇ／ｃｍ２の加重を超えると、組織障害が強くなり、肥満細胞の機能が破綻することが明らかになった。従って、このことから、正常な脂肪組織に１．６ｇ／ｃｍ２の加重を掛ければ、肥満脂肪細胞の組織と同様の性状を示し、肥満脂肪細胞の代替として使用できることが分かった。更に、肥満脂肪細胞の組織に１．１ｇ／ｃｍ２以下の加重を掛けることにより、肥満脂肪細胞から更に病態の悪化した脂肪細胞を作製できることが分かった。
【００２０】
更に、圧縮培養の脂肪細胞・脂肪組織について細胞の外観を評価すると、正常脂肪細胞と同様に、細胞サイズの肥大化がなく、中性脂肪の蓄積がないことが分かった。また、細胞外基質成分が正常脂肪細胞と同じであることも分かった。
一方、圧縮培養の脂肪細胞・脂肪組織の機能は、肥満脂肪細胞・組織と同様のアディポサイトカインの合成・分泌パターンを示し、ＮＦkＢの活性化が起こり、低分子量ＧＴＰ結合タンパクＲｈｏ、ＲＯＣＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ等の活性化が起こっていることが示された。
以上のことから、正常な脂肪細胞の組織や肥満脂肪細胞の組織を使用し、加圧（加重）の程度をコントロールすることにより、肥満の重症度に対応した脂肪細胞の組織を作製できることが示された。従って、これらの肥満の病態の進行度に応じた脂肪細胞の組織を使用して、薬剤の効果と副作用が評価できるようになることが分かった。
【００２１】
（実施例３）コラゲナーゼ処理された脂肪組織の性状評価
（１）脂肪組織の動的剛性率（Ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の測定
ａ）方法
特許文献１に記載の方法で測定を行った。即ち、２０週令のｏｂ／ｏｂマウスと痩せた野生型のマウスの生殖腺脂肪を直径８ｍｍ切り取った。その脂肪組織をｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  ｆｌｕｉｄｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にセットし、３〜４％の振動ズレ歪（約２．５ｒａｄ／ｓｅｃ、３７℃）を与えて、脂肪組織の動的剛性率を測定した。
ｂ）結果
図３に示されるように、痩せた野生型マウスの脂肪組織の動的剛性率は、約１１０Ｐａであったが、Ｏｂ／ｏｂマウスの肥満脂肪組織の動的剛性率は、約２６０Ｐａであった。即ち、痩せた野生型マウスから採取された正常脂肪組織は柔らかく、肥満脂肪組織は正常脂肪組織の約２．４倍硬いことが示された。
なお、上記実施例２によれば、正常脂肪組織に約１．６ｇ／ｃｍ２の負荷（加重）を掛けて培養すると、ＭＣＰ−１の分泌量から、肥満脂肪組織と同じような性状の組織に変化することが示されている。このことは、Ｏｂ／ｏｂマウスを使用しなくても、他の野性型のマウスを使用して、その正常脂肪組織を採取し、例えば約１．６ｇ／ｃｍ２の加重を掛ければ、肥満脂肪細胞モデルが作製でき、これを薬効評価に使用できることを示している。
【００２２】
（２）コラゲナーゼ処理をされた肥満脂肪細胞（肥満脂肪組織）の性状測定
図３に示されるように肥満脂肪細胞（肥満脂肪組織）が硬くなる（動的剛性率が高くなる）理由は、細胞外基質の中にコラーゲンが増加することであると考えられた。そこで、コラーゲンを分解すれば、肥満脂肪細胞（肥満脂肪組織）であっても、柔らかくなる（動的剛性率が低くなる）と考えられた。
ａ）方法
２０週令のｏｂ／ｏｂマウスの生殖腺脂肪（肥満脂肪組織）を直径８ｍｍ切り取り、０．０４％コラゲナーゼで処理を行った。
３７℃にて０分、１０分、３０分の間、コラゲナーゼで処理した。処理後の脂肪組織をクリープメーター（山電製、ＲＥ２−３３０５Ｂ）にセットし、レオロジー測定を行い、脂肪組織のヤング率を測定した。
ｂ）結果
図４に示されるように、コラゲナーゼの処理時間が長くなれば、肥満脂肪細胞の組織であっても、組織の硬さ（ヤング率）が低下することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の加圧圧縮下での細胞培養方法により、例えば正常脂肪細胞を使用して、肥満状態の脂肪細胞と同様の性状を持った細胞に変換できることを見出した。これにより、正常脂肪細胞を用いて、簡単に所望の病態を示す人工的な肥満脂肪細胞を作製できるようになった。本発明の人工的な圧縮培養脂肪細胞（組織）を用いて、肥満症、メタボリック・シンドローム、糖尿病、脂質異常症、高血圧症または動脈硬化の病態生理の解明とともに、新たな診断・治療などに関わる化合物の評価が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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