(57)【要約】【課題】密度勾配遠心分離法を用いて、血液試料から目的とする細胞を含む画分を有効に効率よく取得することができる細胞の分離方法を提供する。【解決手段】遠沈管の底部に第一媒体を凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度の状態で収容する工程（ステップＳ１２，Ｓ１４）と、第一媒体の上に、第一媒体よりも低密度の第二媒体を積層する工程（ステップＳ１６）と、第二媒体の上に、血液試料を積層する工程（ステップＳ１８）と、第一媒体、第二媒体及び血液試料を遠心分離する工程（ステップＳ２０）と、遠心分離工程を経て得られる第一媒体の層と第二媒体の層との間の層から目的細胞を含む画分を採取する工程（ステップＳ２２）と、を含む、細胞の分離方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
密度勾配遠心分離法を用いて、血液試料から目的細胞の画分を採取する細胞の分離方法であって、
遠沈管の底部に、第一媒体を凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度の状態で収容する第一媒体収容工程と、
前記遠沈管に収容された前記第一媒体の上に、前記第一媒体よりも低密度の第二媒体を積層する第二媒体積層工程と、
前記遠沈管に収容された前記第二媒体の上に、前記血液試料を積層する血液積層工程と、
前記遠沈管に収容された前記第一媒体、前記第二媒体及び前記血液試料を遠心分離する遠心分離工程と、
前記遠心分離工程を経て得られる前記第一媒体の層と前記第二媒体の層との間の層から前記目的細胞を含む画分を採取する採取工程と、
を含む、細胞の分離方法。
【請求項２】
前記血液試料が、妊婦の末梢血であり、
前記目的細胞が、胎児由来の有核赤血球である、請求項１に記載の細胞の分離方法。
【請求項３】
前記第二媒体積層工程において前記第一媒体の上に積層される前記第二媒体の温度が、前記遠沈管の底部に収容されている前記第一媒体の温度よりも高い温度である、請求項１又は２に記載の細胞の分離方法。
【請求項４】
前記第一媒体収容工程が、前記遠沈管の底部に前記第一媒体を入れる第一媒体注入工程と、
前記第一媒体を収めた前記遠沈管を、前記第一媒体の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却する冷却工程と、を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項５】
前記第一媒体収容工程が、前記第一媒体の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却された状態の前記第一媒体を、前記遠沈管の底部に入れる工程を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項６】
前記第二媒体積層工程において、前記第一媒体の温度と前記第二媒体の温度との差が、６℃以上である、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項７】
前記第一媒体収容工程の終了から、前記採取工程の終了までを９０分以内で行う、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項８】
前記遠心分離の回転数が、５００回転毎分以上５０００回転毎分以下であり、
前記遠心分離を１０分以上６０分以下で行う、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項９】
前記第一媒体として、高分子材料が粒子表面に吸着したコロイドの媒体を用いる、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項１０】
前記第一媒体が、ポリビニルピロリドンで被覆されたケイ酸コロイド粒子分散液である、請求項９に記載の細胞の分離方法。
【請求項１１】
前記第一媒体の密度が、１０８０ｋｇ／ｍ３以上１１００ｋｇ／ｍ３以下である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【請求項１２】
前記第二媒体の密度が、１０６０ｋｇ／ｍ３以上１０８０ｋｇ／ｍ３以下である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液試料から目的の細胞を分離する方法に係り、特に密度勾配遠心分離法を用いて、妊婦の末梢血から胎児由来の有核赤血球を分離するのに好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、出生前診断として、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われてきた。羊水検査による出生前診断の方法は、流産の危険性が存在するため、より安全な方法による出生前診断の実施が望まれている。最近の研究によれば、妊婦である母体の血液中に胎児細胞が移行し、胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが知られるようになった。母体の血液中に含まれる胎児細胞中の染色体のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ；deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することが可能となれば、流産の危険性のない安全な方法で、胎児のＤＮＡを分析する確実な出生前診断を実現することができる。
【０００３】
しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞である胎児有核赤血球は、母体の血液の数ミリリットル［ｍＬ］中に１個程度しか存在しないことが理解されるようになり、血液試料中から確実に胎児有核赤血球を取得することが、この安全な出生前診断を実現する上で非常に大きな課題となっている。なお、１ミリリットル［ｍＬ］は、１０−６立方メートル［ｍ３］である。「胎児有核赤血球」は、「胎児由来の有核赤血球」或いは「胎児の有核赤血球」という用語と同義である。
【０００４】
特許文献１には、妊婦の末梢血から希少な細胞を分離する方法が記載されている。特許文献１によれば、溶媒としての水を加えた血液試料から第一遠心分離によって白血球を分離し、その後、第二遠心分離で密度勾配媒体を使用し、赤血球を集合していない状態に維持し、かつ、母親の赤血球を溶血し、その後、密度勾配遠心分離により胎児有核赤血球に富んだ部分を得ることが記載されている。
【０００５】
特許文献２には、血液から単核細胞を分離することができる運搬可能な装置とその使用方法が記載されている。特許文献２によれば、捕集チューブ内の第一層に液体密度勾配物質である比重１．０６５〜１．１００の物質、第二層に比重１．０５のゲル、第三層に多孔質発泡部材を重層する構成が記載されている。
【０００６】
特許文献３には、血液中の希少細胞を定量する方法において、分離媒体の環境によるばらつきを低減するために、内部対照として、既知数の樹脂粒子を血液検体に含有させる技術が記載されている。分離媒体は、密度勾配媒体、密度勾配物質、遠心分離媒体などの用語と同義である。
【０００７】
特許文献４には、二回の密度勾配遠心分離を行うことにより、妊婦の末梢血から胎児有核赤血球を分離する技術が記載されている。特許文献４によれば、第一回目の遠心分離の工程において有核赤血球と等張になる媒体を用いて遠心分離を行うことにより有核赤血球を含む画分を取得し、第二回目の遠心分離の工程で、有核赤血球に対して高張又は低張な媒体を用いて有核赤血球を選択的に取得する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５０９３１２号公報
【特許文献２】特開平３−２６６１号公報
【特許文献３】特許第５３４８３５７号明細書
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１から４はいずれも密度勾配遠心分離法を用いて、胎児有核赤血球を含む画分を取得する技術に関するものである。母体の血液中に存在する胎児有核赤血球は非常に少ないため、胎児有核赤血球を含む画分を極めて効率的に取得する必要がある。しかし、遠沈管内に試薬を重層する試薬準備の段階での作業のばらつきや、胎児有核赤血球を採取するまでの振動等によって、密度勾配遠心分離後の取得すべき画分にばらつきが生じ、効率よく目的の画分を取得できない懸念があった。このような課題は、血液試料から比較的希少な目的細胞を採取する場合に共通する課題である。
【００１０】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、密度勾配遠心分離法を用いて、血液試料から目的とする細胞を含む画分を有効に効率よく取得することができる細胞の分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
課題を解決するため、次の発明態様を提供する。
【００１２】
第１態様に係る細胞の分離方法は、密度勾配遠心分離法を用いて、血液試料から目的細胞の画分を採取する細胞の分離方法であって、遠沈管の底部に、第一媒体を凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度の状態で収容する第一媒体収容工程と、遠沈管に収容された第一媒体の上に、第一媒体よりも低密度の第二媒体を積層する第二媒体積層工程と、遠沈管に収容された第二媒体の上に、血液試料を積層する血液積層工程と、遠沈管に収容された第一媒体、第二媒体及び血液試料を遠心分離する遠心分離工程と、遠心分離工程を経て得られる第一媒体の層と第二媒体の層との間の層から目的細胞を含む画分を採取する採取工程と、を含む、細胞の分離方法である。
【００１３】
第１態様によれば、遠沈管の内部における第一媒体と第二媒体との境界部分の界面の乱れを抑制することができ、目的細胞を含む画分を有効に効率良く取得することが可能である。
【００１４】
第２態様として、第１態様の細胞の分離方法において、血液試料が、妊婦の末梢血であり、目的細胞が、胎児由来の有核赤血球である構成とすることができる。
【００１５】
第３態様として、第１態様又は第２態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第二媒体積層工程において第一媒体の上に積層される第二媒体の温度が、遠沈管の底部に収容されている第一媒体の温度よりも高い温度である構成とすることが好ましい。
【００１６】
第４態様として、第１態様から第３態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第一媒体収容工程が、遠沈管の底部に第一媒体を入れる第一媒体注入工程と、第一媒体を収めた遠沈管を、第一媒体の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却する冷却工程と、を含む構成とすることができる。
【００１７】
第５態様として、第１態様から第３態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第一媒体収容工程が、第一媒体の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却された状態の第一媒体を、遠沈管の底部に入れる工程を含む構成とすることができる。
【００１８】
第６態様として、第１態様から第５態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第二媒体積層工程における、第一媒体の温度と第二媒体の温度との差が、６℃以上である構成とすることができる。
【００１９】
第７態様として、第１態様から第６態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第一媒体収容工程の終了から、採取工程の終了までを９０分以内で行うことが好ましい。
【００２０】
第８態様として、第１態様から第７態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、遠心分離の回転数が、５００回転毎分以上５０００回転毎分以下であり、遠心分離を１０分以上６０分以下で行うことが好ましい。
【００２１】
第９態様として、第１態様から第８態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第一媒体として、高分子材料が粒子表面に吸着したコロイドの媒体を用いる構成とすることができる。
【００２２】
第１０態様として、第９態様の細胞の分離方法において、第一媒体が、ポリビニルピロリドンで被覆されたケイ酸コロイド粒子分散液である構成とすることができる。
【００２３】
第１１態様として、第１態様から第１０態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第一媒体の密度が、１０８０ｋｇ／ｍ３以上１１００ｋｇ／ｍ３以下である構成とすることができる。
【００２４】
第１２態様として、第１態様から第１１態様のいずれか一態様の細胞の分離方法において、第二媒体の密度が、１０６０ｋｇ／ｍ３以上１０８０ｋｇ／ｍ３以下である構成とすることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、密度勾配遠心分離法を用いて、血液試料から目的とする細胞を含む画分を極めて効率的に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は第一実施形態に係る細胞の分離方法の手順を示したフローチャートである。
【図２】図２（Ａ）は遠沈管の底部に第一媒体を収容した様子を示した模式図、図２（Ｂ）は第一媒体の上に第二媒体を積層した様子を示した模式図、図２（Ｃ）は第二媒体の上に血液試料を積層した様子を示した模式図である。
【図３】図３（Ａ）は遠心分離前の遠沈管の状態を示した模式図、図３（Ｂ）は遠心分離後の遠沈管の状態を示した模式図である。
【図４】図４は第二実施形態に係る細胞の分離方法の手順を示したフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、添付図面にしたがって本発明の実施形態について詳述する。
【００２８】
図１は本発明の第一実施形態に係る細胞の分離方法の手順を示したフローチャートである。第一実施形態による細胞の分離方法は、遠沈管の底部に第一媒体を注入する工程（ステップＳ１２）と、第一媒体を収めた遠沈管を冷却する工程（ステップＳ１４）と、遠沈管内の冷却された第一媒体の上に第二媒体を積層する工程（ステップＳ１６）と、遠沈管内の第二媒体の上に血液試料である妊婦の末梢血を積層する工程（ステップＳ１８）と、遠沈管に収容された第一媒体、第二媒体及び血液試料を遠心分離にかける工程（ステップＳ２０）と、遠心分離後の第一媒体と第二媒体の間の層から、胎児有核赤血球を含む画分を採取する工程（ステップＳ２２）と、を含む。
【００２９】
ステップＳ１２は第一媒体注入工程、ステップＳ１４は冷却工程、ステップＳ１６は第二媒体積層工程、ステップＳ１８は血液積層工程、ステップＳ２０は遠心分離工程、ステップＳ２２は採取工程のそれぞれ一形態に相当する。また、ステップＳ１２とステップＳ１４の組み合わせが「第一媒体収容工程」に相当する。
【００３０】
「遠沈管」は、遠心分離機による遠心分離の処理に用いる有底の容器である。「遠沈管」という用語は、遠心分離管、沈殿管、スピッツ管、コニカルチューブ、及び、捕集チューブなどの用語を包括する用語として用いる。
【００３１】
ステップＳ１２では、遠沈管の中に、密度勾配分離用の媒体である第一媒体を注入して、遠沈管の底部に第一媒体を収める。「遠沈管の底部」とは、遠沈管の開放端である開口と反対側の端である閉塞端を「底」とし、遠沈管の内側における底の部分を含む収容空間である。空の遠沈管の中に第一媒体を注入する場合は、第一媒体が遠沈管の最底面に接して遠沈管の底部に収容される。この場合、遠沈管の底部に収容された第一媒体の層が「最下層」となる。遠沈管の底部は、遠沈管の内側の最底面に接する最下層の領域部分とすることができる。
【００３２】
或いはまた、第一媒体を注入する前に、遠沈管の中に別の試薬を入れる場合も想定される。この場合、第一媒体は必ずしも遠沈管の最底面に接するとは限らないが、別の試薬の量が第一媒体に比べて十分に少ない場合、第一媒体は、実質的に遠沈管の底部に収容されるものとして解釈される。遠沈管の底部には、遠沈管の内側の最底面と非接触の領域であっても、実質的に「底部」として扱うことができる下層の領域部分を含むものとする。
【００３３】
図２（Ａ）は、遠沈管１０の底部１２に、第一媒体３０を収容した様子を示した模式図である。遠沈管１０は、図２（Ａ）における下側の端部が閉塞された閉塞端としての底１４を有する。また、遠沈管１０は、図２（Ａ）における上側の端部が開放された開放端としての開口１６を有する。遠沈管１０の材質や形状については、様々な形態があり得る。遠沈管１０は、例えば、ガラス製又はプラスチック製の容器である。図２の遠沈管１０は、底１４の形状が半球形である丸型遠沈管を示しているが、丸型遠沈管に限らず、底の形状が円錐形をしたスピッツ管などでもよい。
【００３４】
遠沈管１０の底部１２に第一媒体３０を注入する作業は、検査室の室内で行われる。「検査室」という用語は、本発明の実施形態に係る細胞の分離方法を実施する作業環境としての場所及び空間を示す。検査室は、検査の業務を実施する場所、施設、機関、会社等の総称として用いる。検査室として、例えば、病院等の医療機関から業務委託を受けて検体検査の業務を専門に取り扱う検査機関、検査センター、検査会社、医療研究所、実験室などが想定される。また、検査室は病院内に併設されていてもよい。検査室の室内の温度が「作業環境の室温」に相当する。
【００３５】
本実施形態では、第一媒体３０を遠沈管１０の底部１２に収容した状態で、第一媒体３０及び遠沈管１０を冷却する冷却工程を含む（図１のステップＳ１４）。冷却工程（ステップＳ１４）では、遠沈管１０内に重層される第一媒体３０と第二媒体３２（図２（Ｂ）参照）との境界部分である界面の乱れを抑制するために、第一媒体３０の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却する。
【００３６】
第一媒体３０の凝固点は、使用する第一媒体３０の種類及び密度によって異なる。第一媒体３０の種類と密度が特定されると凝固点も特定される。第一媒体３０を凝固点よりも低い温度に冷却したとすると、第一媒体３０の流動性が著しく低下して密度勾配遠心分離が困難となる。したがって、第一媒体３０の温度は凝固点以上に維持することが望ましい。
【００３７】
「１４℃以下の温度に冷却する」手段の一態様として、例えば、冷蔵庫、或いは、環境を一定に保つ保温機などの装置を用いて、１４℃以下の環境を作り、その中に保管する、という手段を採用することができる。
【００３８】
検査室の室内の温度は、１５℃から２５℃の範囲の温度に設定されることが好ましい。一例として、検査室の室内の温度は２２℃に設定される。冷却工程（図１のステップＳ１４）において、室温よりも低い１４℃以下の温度に冷却する。
【００３９】
冷却工程（図１のステップＳ１４）における冷却条件は、第一媒体３０の凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却する。好ましくは、第一媒体３０の凝固点以上、かつ、１０℃以下の温度に冷却することが好ましく、更に、第一媒体３０の凝固点以上、かつ、４℃以下の温度に冷却する態様が特に好ましい。冷却工程（ステップＳ１４）は、例えば、指定の温度に温度管理された冷蔵庫の中に、遠沈管１０を静置することによって行うことができる。
【００４０】
ステップＳ１４の第一媒体３０を収容した遠沈管１０の冷却工程が、冷却の効果を十分に発揮するためには、３０分以上静置する工程であることが好ましく、５０分以上静置する工程であることが更に好ましい。
【００４１】
次いで、冷却された遠沈管１０の中の第一媒体３０の上に、第二媒体３２を積層する（図１のステップＳ１６）。図２（Ｂ）は、第一媒体３０の上に第二媒体３２を積層した様子を示した模式図である。「第一媒体３０の上に、」とは、重力方向を「下」の方向として、重力方向と反対側を「上」と表現している。図１のステップＳ１６では、第一媒体３０の層の上に直接重ねて、第二媒体３２を注ぎ入れ、第一媒体３０と第二媒体３２とを重層する（図２（Ｂ）参照）。
【００４２】
図１のステップＳ１４で説明した第一媒体３０を冷却する温度制御に加えて、更に、第一媒体３０の界面の均一性に影響を与えないために、第一媒体３０の上に積層する第二媒体３２は第一媒体３０よりも高い温度設定で使用する態様が好ましい。即ち、遠沈管１０の底部に収められた第一媒体３０は凝固点以上であって１４℃以下の温度に冷却されているため、第二媒体３２の温度は１４℃よりも高い温度であることが好ましい。具体的には、第二媒体３２の温度は１５℃以上とすることすることが好ましい。検査室の室内の温度が２０℃である場合は、第二媒体３２の温度は室温と同等の温度である２０℃とすることができる。また、第二媒体３２の温度は室温よりも高い温度とすることができる。第二媒体３２の温度の上限については、血液試料に熱的なダメージを与えないために、３６℃以下とすることが好ましく、より好ましくは３０℃以下とする。また、第一媒体３０の上に、第二媒体３２を積層する際には、第一媒体３０との界面をなるべく乱さないように、第二媒体３２を少量ずつ静かに注ぎ入れることが望ましい。こうして、第一媒体３０の層の上に接して第二媒体３２の層が積層された状態が得られる。
【００４３】
更に、第一媒体３０の界面の均一性に影響を与えないためには、第二媒体３２を第一媒体３０の上に積層する工程（第二媒体積層工程）における第一媒体３０と第二媒体３２の温度差が大きい態様が好ましい。即ち、遠沈管１０の底部に収められた第一媒体３０の温度と、第二媒体３２の温度との差は、６℃以上が好ましく、より好ましくは８℃以上、更に好ましくは、１６℃以上である。
【００４４】
次いで、遠沈管１０の中の第二媒体３２の上に、血液試料としての妊婦の末梢血を積層する（図１のステップＳ１８）。図２（Ｃ）は、第二媒体３２の上に血液試料４０が積層された様子を示した模式図である。血液試料４０となる妊婦の末梢血は、妊娠中の母親の静脈から採取された静脈血を用いることができ、末梢血を採血する時点で、凝固防止のために、末梢血採血時に、抗凝固剤を混合することが好ましい。好ましい抗凝固剤の種類としては特に制限はなく、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ethylenediaminetetraacetic acid）、ヘパリン、クエン酸ナトリウム等を、抗凝固性能を有する量にて用いることができる。また、本発明の実施形態においては、妊婦の末梢血を希釈せずに用いることも可能であるが、生理食塩水等で希釈して用いる態様も好ましい。この場合の希釈率は、１．５倍、２倍、３倍等、適宜選択をすることができる。
【００４５】
「第二媒体３２の上に、」とは、重力方向を「下」の方向として、重力方向と反対側を「上」と表現している。本例では、第二媒体３２の層の上に直接重ねて血液試料４０を積層するが（図２（Ｃ）参照）、第二媒体３２と血液試料４０との間に別の媒体の層が介在してもよい。
【００４６】
第二媒体３２の上に積層する血液試料４０の温度についても、第二媒体３２と同様に、第一媒体３０の界面の均一性に影響を与えないようにするために、第一媒体３０の温度よりも高い温度設定で使用する態様がより好ましい。更には、血液試料４０の温度は２０℃以上３０℃以下である態様がより好ましい。図１のステップＳ１２からステップＳ１８を経て、図２（Ｃ）に示す重層状態が得られる。
【００４７】
次いで、第一媒体３０、第二媒体３２及び血液試料４０を重層した遠沈管１０を遠心分離機にセットして、遠心分離の処理を行う（図１のステップＳ２０）。
【００４８】
遠心分離（ステップＳ２０）は、密度勾配遠心分離法で行われる。密度勾配遠心分離法は、遠沈管の底部から上部にかけて、媒体の密度を次第に低下させるように各密度の値に応じた層を形成し、分離したい試料を最上部に注入した後に遠心分離を行うと、各密度に応じた画分が同じ密度媒体中にとどまることを利用して、目的の密度を有する画分を採取する方法である。「密度勾配遠心分離法」は、「密度勾配遠心法」という用語と同義である。
【００４９】
遠心分離の回転数は、血球の密度に合わせて、同じ密度の媒体に血球が移動するエネルギーを与える遠心力を付与するものであり、細胞破壊を起こさない範囲で所望のエネルギーを付与できる限りにおいては特に制限はないが、好ましくは、５００回転毎分［ｒｐｍ］以上５０００回転毎分［ｒｐｍ］以下、より好ましくは、１０００回転毎分［ｒｐｍ］以上、３０００回転毎分［ｒｐｍ］以下である。好ましくは、遠心分離（ステップＳ２０）の工程は、１０分以上６０分以下の条件で行うことが好ましく、更に好ましくは、１５分以上６０分以下の条件で行うことが好ましい。
【００５０】
図３（Ａ）は遠心分離前の状態を示す模式図であり、図２（Ｃ）と同図である。図３（Ｂ）は遠心分離後の状態を示す模式図である。
【００５１】
図３（Ｂ）のように、遠心分離後の遠沈管１０の中は複数の層に分かれる。遠心分離後の遠沈管１０における最下層の部分（符号４１）に沈降しているのは、主に母体由来の成熟赤血球である。成熟赤血球が沈降した層４１の上は、密度の大きい白血球の層４２である。密度の大きい白血球の層４２の上に、第一媒体３０の層と、胎児有核赤血球を含む画分４４の層と、第二媒体３２の層と、密度の小さい白血球の層４６と、血漿の層４７と、がこの順で重なっている。第一媒体３０と第二媒体３２との間の層が、目的細胞である胎児有核赤血球を含む画分４４である。胎児有核赤血球を含む画分４４は、第一媒体３０の層と第二媒体３２の層との間に挟まれた層であり、第一媒体３０と第二媒体３２の界面付近の層である。
【００５２】
遠心分離（図１のステップＳ２０）の工程を経て得られる第一媒体３０の層と第二媒体３２の層との間の層から、胎児有核赤血球を含む画分４４を採取する（ステップＳ２２）。この画分４４を採取する場合には、第一媒体３０と第二媒体３２の界面を乱さずに、目的とする画分４４を採取することが必要であり、ピペットや、注射針など、公知の採取具を用いて、回収することができる。
【００５３】
本実施形態では、第一媒体３０と第二媒体３２との境界の界面を乱れなく保持し、目的とする有核赤血球を含む画分４４を確実に採取する方法を提供することを主要な技術課題としている。より確実に、目的の画分４４を採取するためには、第一媒体３０を冷却後、目的の画分４４を採取するまでの時間が短いことが好ましく、第一媒体３０の冷却後、目的の画分の採取終了までを９０分以内で行うことが好ましく、更には６０分以内で行うことが特に好ましい。
【００５４】
［血液試料について］
本実施形態において、血液試料４０である母体血は、妊婦の末梢血をいう。母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、更に、胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断への適用を想定している本実施形態では、妊娠後６週程度以降の妊婦の末梢血を検査する。
【００５５】
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この胎児の赤血球には染色体が存在するため、従来の羊水検査に比べて侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体及び胎児遺伝子の入手が可能となる。胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、妊婦の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
【００５６】
特許文献４には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。特許文献４の記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、好中球は１．０７５〜１．１００グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、好塩基球が１．０７０〜１．０８０グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、リンパ球が１．０６０〜１．０８０グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度、単核球が１．０６０〜１．０７０グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度である。
【００５７】
なお、１ミリリットル［ｍＬ］は１０−６立方メートル［ｍ３］であるから、１グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］は１０３キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］に換算される。
【００５８】
［密度勾配分離媒体について］
本実施形態で用いる第一媒体３０及び第二媒体３２として、例えば、高分子材料が粒子表面に吸着したコロイドの媒体を用いることができる。具体的には、第一媒体３０及び第二媒体３２としてポリビニルピロリドンで被覆された直径１５ナノメートル［ｎｍ］から３０ナノメートル［ｎｍ］の範囲のケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール（「Percoll」は登録商標。）を用いることができる。また、第一媒体３０及び第二媒体３２として、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコール（「Ficoll」と「Ficoll-Paque」は登録商標。）、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック（「Histopaque」は登録商標。）等の媒体を使用することができる。
【００５９】
特に、本実施形態では、パーコール（「Percoll」は登録商標。）、及び／又は、ヒストパック（「Histopaque」は登録商標。）を好ましく使用することができる。
【００６０】
パーコール（「Percoll」は登録商標。）は、比重１．１３０の製品が市販されており、市販の原液を希釈することで目的とする密度の媒体を調製することが可能である。本明細書で「比重」とは、４℃の水を標準物質とする。比重はＣＧＳ単位系のグラム毎立方センチメートル［ｇ／ｃｍ３］単位で表される密度の値とほぼ同じ値である。密度の数値に関して、ＣＧＳ単位系からＳＩ単位系への換算は容易であり、１グラム毎立方センチメートル［ｇ／ｃｍ３］は、１０００キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］である。
【００６１】
ヒストパック（「Histopaque」は登録商標。）は、市販されている比重１．０７７の媒体と、比重１．１１９の媒体とを用いて、これらを適宜の割合で混合することにより、所望の密度である、第一媒体及び第二媒体を調製することが可能である。
【００６２】
胎児由来の有核赤血球の密度は１．０６５〜１．０９５グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］程度である。なお、グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］の単位で表される密度の値は、グラム毎立方センチメートル［ｇ／ｃｍ３］の単位で表される密度の値と同等であり、ＳＩ単位系に換算すると、胎児由来の有核赤血球の密度は１０６５〜１０９５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］である。密度が１０６５〜１０９５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中のほかの血球成分と分離するために、遠沈管内に重層する密度勾配分離媒体の密度が設定される。なお、「密度勾配分離媒体」という用語は、「密度勾配媒体」、「分離媒体」、「密度勾配遠心分離用媒体」、「液体密度勾配物質」、「密度勾配分離液」、又は、「分離液」などの用語で呼ばれる場合がある。
【００６３】
胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１０８０キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］程度であるため、この密度を挟む二つの異なる密度の媒体を作成し、これら２種類の媒体を隣接させて遠沈管内で重層する。
【００６４】
胎児由来の有核赤血球の中心密度である１０８０キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］を挟む二つの異なる密度の媒体のうち、相対的に密度の高い第一密度の媒体が「第一媒体」に相当し、第一密度よりも相対的に密度の低い第二密度の媒体が「第二媒体」に相当する。そして、妊婦から採血した血液試料を遠沈管１０内に加えて、遠心分離を行うことにより、異なる密度の２種類の媒体の界面に、採取目的とする胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。
【００６５】
密度勾配分離媒体に関して、第二媒体は第一媒体よりも低密度であることを条件に、好ましくは、第一媒体の密度を１０８０ｋｇ／ｍ３以上１１００ｋｇ／ｍ３以下、第二媒体の密度を１０６０ｋｇ／ｍ３以上１０８０ｋｇ／ｍ３以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第一媒体の密度を１０８０ｋｇ／ｍ３以上１０００ｋｇ／ｍ３以下、第二媒体の密度を１０６５ｋｇ／ｍ３以上１０８０ｋｇ／ｍ３以下として設定することが好ましい。
【００６６】
具体的な例としては、第一媒体の密度を１０８５ｋｇ／ｍ３、第二媒体の密度を１０７５ｋｇ／ｍ３に設定することにより、血漿成分、及び好酸球、単核球を回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、及びリンパ球の一部も分離することが可能となる。
【００６７】
本実施形態では、第一媒体と第二媒体は密度が異なる限り、同じ種類の媒体であってもよいし、異なる種類の媒体であってもよく、発明の効果を実現できる限りにおいて、媒体の種類の組み合わせについて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
【００６８】
［第二実施形態］
図４は第二実施形態に係る細胞の分離方法の手順を示したフローチャートである。図４において、図１に示したフローチャートと同一の工程には同一のステップ番号を付し、その説明は省略する。
【００６９】
図４に示した第二実施形態による細胞の分離方法は、第一媒体を遠沈管に注入する前に、予め第一媒体を凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却しておく事前冷却工程（ステップＳ１３）と、この冷却した第一媒体を遠沈管の底部に収容する工程（ステップＳ１５）を有する。
【００７０】
ステップＳ１３の事前冷却工程における冷却条件は、図１のステップＳ１４で説明した冷却条件と同様である。図４のステップＳ１３における第一媒体の冷却は、十分に行うことが好ましい。ステップＳ１３において、第一媒体は、３０分以上冷却することが好ましく、５０分以上冷却することが更に好ましい。
【００７１】
ステップＳ１５は、「第一媒体収容工程」の一形態に相当する。ステップＳ１５以降は、図１で説明したステップＳ１６からステップＳ２２と同様である。
【００７２】
第二実施形態の方法においても、第一媒体３０を冷却後、目的の画分４４を採取するまでの時間が短いことが好ましく、事前冷却工程（図４のステップＳ１３）の終了から目的の画分の採取終了までを９０分以内で行うことが好ましく、更には６０分以内で行うことが特に好ましい。
【実施例】
【００７３】
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡのナトリウム塩を１０．５ミリグラム［ｍｇ］添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後に、ボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。こうして得られた血液の希釈液、即ち、希釈された血液が「血液試料」に相当する。
【００７４】
この血液試料について、以下に示す実験１から実験８のそれぞれの条件で密度勾配遠心分離を行い、目的とする有核赤血球を含む画分を採取した。
【００７５】
［実験１］
パーコール液（「Percoll」は登録商標、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用して、密度が１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液と、密度が１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液とを調製した。密度が１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液が「第一媒体」に相当する第一液であり、密度が１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液が「第二媒体」に相当する第二液である。なお、第一液と第二液はそれぞれ、０℃の環境下で液体の状態であり、第一媒体の凝固点と第二媒体の凝固点はそれぞれ０℃よりも低い温度である。
【００７６】
実験を行う部屋の室内温度は２２℃であった。検査室の室内温度が「作業環境の温度」に該当する。第一液及び第二液の調製作業は、２２℃の環境で行われており、調製された第一液及び第二液の温度は室内温度である２２℃と同等である。
【００７７】
かかる作業環境の下で、遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加した。続けて、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液２ミリリットル［ｍＬ］を重層した。
【００７８】
その後、密度１０７５キログラム毎立方メートルの第二液の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ミリリットル［ｍＬ］をゆっくり、遠沈管に添加した。
【００７９】
その後、遠沈管を遠心分離機にセットし、遠心分離を行った。遠心分離の条件は、回転数が２０００回転毎分［ｒｐｍ（rotation per minute）］であり、遠心分離の実施継続時間が２０分間であった。なお、回転数は、単位時間当りの回転の回数を意味し、回転速度と同義である。
【００８０】
その後、遠心分離機から遠沈管を取り出し、界面の乱れを観察した後に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と密度１０７５キログラム毎立方メートルの第二液との間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
【００８１】
遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加してから、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８２】
［実験２］
実験２では、実験１において、遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液２ミリリットル［ｍＬ］を添加した後に、２２℃の環境で６０分間静置した。その他の条件は、実験１と同様にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察した後に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液との間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。実験２において、２２℃の環境での静置が終了した後から、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８３】
［実験３］
実験３では、実験１において、遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液２ミリリットル［ｍＬ］を添加した後に、１４℃の環境下で６０分間静置した状態で冷却した。その後、室温の環境（ここでは室内温度２２℃の環境）に取り出して、界面が乱れないように慎重に、第一液の上に密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液２ミリリットル［ｍＬ］を重層した。第一液の上に積層する第二液の温度は室内温度と同等の温度のものであった。つまり、第一媒体である第一液の上に、第二媒体である第二液を積層する工程における、第一液の温度と第二液の温度との差は８℃であった。その他の条件は、実験１と同様にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察した後に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液との間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。実験３において、１４℃の環境下での静置状態による冷却が終了した後から、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８４】
［実験４］
実験４では、実験１において、遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の液２ミリリットル［ｍＬ］を添加した後に、４℃の環境下で６０分間静置した状態で冷却した。その後、室温の環境（ここでは室内温度２２℃の環境）に取り出して、界面が乱れないように慎重に、第一液の上に密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液２ミリリットル［ｍＬ］を重層した。第一液の上に積層する第二液の温度は室内温度と同等の温度のものであった。つまり、第一媒体である第一液の上に、第二媒体である第二液を積層する工程における、第一液と第二液の温度差は１８℃であった。その他の条件は、実験１と同様にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察した後に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液との間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。実験４において、４℃の環境下での静置状態による冷却が終了した後から、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８５】
［実験５］
実験５では、実験４の手順に対して、遠沈管の底部に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加した後に、４℃の環境下で１０分間静置した状態で冷却した以外は同様にして実験を行った。
【００８６】
［実験６］
実験６では、実験１の手順において、遠沈管の底部に添加する密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を、予め４℃の環境下で６０分間冷却した後に、この４℃に冷却された状態の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を遠沈管の底部に添加した以外は実験１と同等にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察し、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と、密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液の間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加してから、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８７】
［実験７］
実験７では、実験６の手順と同様にして、遠沈管の底部に添加する前に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を、予め４℃の環境下で１０分間冷却し、その後、この４℃に冷却された状態の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を遠沈管の底部に添加した。その他の条件は実験６と同等にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察し、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と、密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液の間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加してから、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８８】
［実験８］
実験８では、実験６の手順と同様にして、遠沈管の底部に添加する前に、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を、予め１４℃の環境下で６０分間冷却し、その後、この１４℃に冷却された状態の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を遠沈管の底部に添加した。その他の条件は実験６と同等にして、遠心分離を行い、界面の乱れを観察し、密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液と、密度１０７５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第二液の間の層に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。遠沈管の底部に密度１０８５キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］の第一液２ミリリットル［ｍＬ］を添加してから、目的とする胎児有核赤血球を含む血液の画分をピペットで採取するまでに要した時間は５０分間であった。
【００８９】
［実験結果のまとめ］
下記に示す［表１］は、実験１から実験８のそれぞれの実験条件と、各実験において界面の乱れを観察した結果をまとめた図表である。界面の乱れは、以下の基準で評価した。
Ａ：界面の乱れがほとんどない。
Ｂ：界面の乱れがわずかにあるが、許容される。
Ｃ：界面の乱れが観察される。
Ｄ：界面の乱れが大きく観察される。
【００９０】
【表１】
2016010333.tif 000003
【００９１】
［実験結果の考察］
実験１は比較例１に相当し、実験２は比較例２に相当する。実験３から実験５は第一実施形態の具体的な実施例であり、それぞれ実施例１から実施例３に相当する。実験６から実験８は第二実施形態の具体的な実施例であり、それぞれ実施例４から実施例６に相当する。
【００９２】
実験１から実験８の結果から、次の事項を把握することができる。
【００９３】
（１）実験４の結果から、第一媒体を遠沈管の底部に収容し、その後当該遠沈管を４℃で６０分間、静置した状態で冷却する工程を経ることで、界面に乱れがほとんどなく、効率よく目的の胎児有核赤血球を含む画分を採取することが可能であった。
【００９４】
また、第一媒体を遠沈管に注入する前に、事前に冷却した実験６から８では、界面の乱れがわずかにあるが許容されるレベルであることがわかり、本発明の効果が確認された。
【００９５】
（２）遠沈管の底部に第一媒体を収めた後に冷却を行った場合（実験３から実験５）、並びに、遠沈管に第一媒体を入れる前に予め第一媒体を冷却しておき、冷却された状態の第一媒体を遠沈管の底部に収めた場合（実験６から実験８）のいずれの場合でも、第二媒体を積層する際には、遠沈管の底部に、第一媒体が凝固点以上、かつ、１４℃以下の温度に冷却された温度の状態で収容されたものとなっている。
【００９６】
そして、実験３から実験８のいずれの場合も、比較例１，２である実験１，２と比べて界面の乱れが抑制されている。このため、目的の画分から効果的に胎児有核赤血球を採取することができる。
【００９７】
本発明の実施形態によれば、胎児有核赤血球を含む画分を採取する過程や、その過程での振動などの環境に左右されずに、目的とする画分を効率よく取得することができる。
【００９８】
（３）第一媒体は１４℃以下に冷却することが好ましい。
【００９９】
（４）実験４と実験５とを比較すると分かるように、遠沈管の底部に第一媒体を注入した後の静置時間を長くすると、界面の乱れはより一層改善される傾向にある。実験６と実験７の界面の乱れに関する評価はともに「Ｂ」であるが、実験６と実験７とを比較すると、第一媒体の静置時間の長い実験６の方が、より良好であった。
【０１００】
（５）第一媒体の上に第二媒体を積層する際の第一媒体の温度と第二媒体の温度との差について、実験３と実験８では第一媒体と第二媒体の温度差が８℃であり、実験４から実験７では第一媒体と第二媒体の温度差が１８℃である。第一媒体と第二媒体の温度差が大きいほど、良好な結果が得られる傾向が認められる。また、実験を行う作業環境の室温を２０℃として、他の条件は実験１から実験８と同様の条件で各実験を実施した場合にも、表１と同様の結果が得られる。したがって、第一媒体の上に第二媒体を積層する工程における、第一媒体の温度と第二媒体の温度との差は６℃以上であることが好ましく、１６℃以上であることが更に好ましい。
【０１０１】
［作用効果が得られる原理について］
遠心分離後の界面の乱れを効果的に抑制できるという作用効果が得られる理由として、次のような技術原理が関係していると考えられる。
【０１０２】
<１>第一媒体を冷却することで、第二媒体との温度差により、媒体内の温度分布等による対流が抑制されるため、重層の際に、互いに混合し難くなる。重層される第一媒体と第二媒体の温度差が大きいほど、より一層、互いに混合し難くなる。
【０１０３】
<２>また、第一媒体の冷却により、その高分子鎖の熱運動が抑制され、第一媒体の流動性の低下、及び／又は、粘度上昇により、第二媒体と互いに混合し難くなる。
【０１０４】
<３>上記の<１>及び<２>の少なくとも一つに記載した現象のため、媒体間の界面が明確になり、理想的な密度勾配が得られる。
【０１０５】
［技術原理に基づく適用可能範囲の拡張性及び一般化について］
上述の技術原理は、実験１〜８に用いた第一媒体及び第二媒体の試薬の種類に限らず、密度勾配遠心分離の分野における技術常識の範囲で理解される代替物にも適用できる。代替物の範囲は、物理的性質の類似性や分子構造の類似性などから、同様の作用効果が得られる範囲である。また、第一媒体及び第二媒体の試薬の量や血液試料の量についても、上述した実験の例に限定されず、当該分野の技術常識の範囲で理解される適宜の量に変更することができる。
【０１０６】
更に、上述の技術原理は、血液試料から胎児有核赤血球を分離する場合に限らず、他の種類の目的細胞を分離する場合にも適用できることは明らかである。
【０１０７】
本発明は以上説明した実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内でこの技術分野における通常の知識を有するものにより、多くの変形が可能である。
【符号の説明】
【０１０８】
１０…遠沈管、１２…底部、３０…第一媒体、３２…第二媒体、４０…血液試料
【図１】
2016010333.tif 000004
【図２】
2016010333.tif 000005
【図３】
2016010333.tif 000006
【図４】
2016010333.tif 000007