(57)【要約】【課題】従来の治療薬候補とは異なるメカニズムによる新たな認知症治療薬またはその候補物質をスクリーニングする新たな方法を提供すること。【解決手段】認知症治療薬または認知症治療薬候補のスクリーニング方法。被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択するステップＡ、及びステップＡで選択された被検物質から認知症治療効果を有する物質を選択するステップＢを含む。前記ステップＢは、認知症モデル動物に被検物質を持続投与し、次いで前記認知症モデル動物の行動改善効果を確認する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知症治療薬または認知症治療薬候補のスクリーニング方法であって、
被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択するステップＡ、及び
ステップＡで選択された被検物質から認知症治療効果を有する物質を選択するステップＢを含み、
前記ステップＢは、認知症モデル動物に被検物質を持続投与し、次いで前記認知症モデル動物の行動改善効果を確認することで行う、前記方法。
【請求項２】
前記認知症モデル動物は、少なくとも１種の家族性ＡＤ関連変異遺伝子を導入したモデル動物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記認知症モデル動物は、ホモ接合動物である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記認知症モデル動物は、少なくとも１種の家族性ＡＤ関連変異遺伝子を導入したホモ接合マウスであるである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記家族性ＡＤ関連変異遺伝子は、ＡＰＰＫＭ６７０／６７１ＮＬ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ及びＴＡＵＰ３０１Ｌである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ホモ接合マウスが、３ｘＴｇ−ＡＤモデルマウスである請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記持続投与は、認知症モデル動物の脳脊髄液への投与である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記持続投与は、認知症モデル動物の側脳室への１〜４週間の投与である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記行動改善効果の確認は、新規物体識別試験（ＮＯＲ）およびモリス水迷路試験の少なくとも１つで行う請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症治療薬または認知症治療薬候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の過半はアルツハイマー病である。現在、アルツハイマー病治療薬として複数の候補物質について臨床試験が進んでいる。代表的なものは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤とＮＭＤＡ受容体拮抗薬の配合剤である。この配合剤は、情報伝達物質の細胞内蓄積を高めることにより治療効果を得るものであり、既存薬とメカニズムが類似する。
【０００３】
別のグループの候補物質は、アミロイドβに対する抗体医薬である。この候補物質は、アミロイドβ蓄積→タウタンパク凝集→認知機能低下という仮説に基づいて治療効果を発揮するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamamoto, K. et al., J Neurosci, Vol.31, No.31, Page.11100-9 (2011 Aug 3)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、抗体医薬の候補物質は臨床試験において２剤続けてドロップしている。このことは前記アミロイドβ蓄積→タウタンパク凝集→認知機能低下という仮説が、治療効果を与える定説で無くなった可能性があることを示唆する。
【０００６】
本発明は、従来の治療薬候補とは異なるメカニズムによる新たな認知症治療薬またはその候補物質をスクリーニングする新たな方法を提供することにある。
【０００７】
本発明者らは、アミロイドβ蓄積とある種のＢＫ型カリウムチャネル（large-conductance Ca2+ -activated K+ (BK) channels）オープナー（作動薬）とが関連していることを先に見いだした（非特許文献１）。本明細書においては、以下、ＢＫ型カリウムチャネルをＢＫチャネルと表記する。さらにこの知見に基づいて、ＢＫチャネルの活性化と認知機能改善との関係を検討した。その結果、ある種のＢＫチャネルオープナー（作動薬）によるＢＫチャネルの活性化と認知機能改善との間に正の相関関係があることを見いだし、ＢＫチャネルオープナー（作動薬）の中に、認知症治療薬の候補物質と成り得る物質があるとの知見に基づいて本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、認知症治療薬または認知症治療薬候補のスクリーニング方法であって、被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択するステップＡ、及びステップＡで選択された被検物質から認知症治療効果を有する物質を選択するステップＢを含み、前記ステップＢは、認知症モデル動物に被検物質を持続投与し、次いで前記認知症モデル動物の行動改善効果を確認することで行う、前記方法に関する。
【０００９】
現在認可されているアルツハイマー病薬は、病因とかけ離れたところに作用点があり、治療効果との関係において不透明性が残ると言わざるを得ない。
【００１０】
一方、これまでの研究により、アミロイドβ42が大脳皮質と海馬においてＢＫチャネルを抑制することが解っている(非特許文献1)。ＢＫチャネルの抑制は、神経細胞の活動電位の持続時間（幅）を増大し、細胞内カルシウムが過剰に蓄積しやすい状態を作り、これにより神経細胞死の促進要因となる。アルツハイマー病モデルマウスにおいて、ＢＫチャネルを活性化することによってスパイク幅が正常化することは本発明者らが先に解明した（非特許文献1）。しかし、その行動的意義及び治療的意義に関しては知られていなかった。
【００１１】
本発明者らの検討により、ある種のＢＫチャネルオープナー（作動薬）にはアルツハイマー症を含む種々の認知症状を改善する効果があることがわかった。本発明は、認知症の治療薬またはその候補物質をスクリーニングする方法に関する。このスクリーニング方法で見出される認知症治療薬またはその候補物質は、ＢＫチャネル活性化に基づく治療効果を発揮する物であり、従来上市されている薬物と比べてより根本的な作用機序をもっていると言える。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の認知症治療薬またはその候補物質とは異なるメカニズムであるＢＫチャネル活性化作用に基づく、新たな認知症治療薬またはその候補物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】参考例1に示す、ポンプーカニューレシステムによる脳室内への物質注入の確認試験結果。(A)ポンプにはISOの代わりに、可視化のために青色色素を充填した状態の写真。(B)青色色素溶液を2週間投与した後の脳の写真。(C)脳の背側からの写真。
【図２】実施例1における（A)新規物体識別試験（NOR）の説明図。(B)2回にわたるNORと薬物投与の時系列。(C)1回目(before)と2回目NOR(after)におけるNovelty Indexの遷移。
【図３】実施例2における（A)モリス水迷路試験結果。(B)元々プラットフォームのあった４分円（扇形）に全水泳時間の何パーセント滞在したかの比較試験結果。
【図４】実施例3における（A)スパイク幅の測定結果。5連発させたスパイクの4群における代表例。(B)各スパイクの半値幅を4群での比較結果。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、認知症治療薬または認知症治療薬候補のスクリーニング方法である。
本発明の方法は、
ステップＡ：被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択するステップＡ、及び
ステップＢ：ステップＡで選択された被検物質から認知症治療効果を有する物質を選択するステップＢを含む。
さらに、ステップＢは、認知症モデル動物に被検物質を持続投与し、次いで被検物質を持続投与した前記認知症モデル動物の行動改善効果を確認することで行う。
【００１５】
本発明において「認知症」とは、いったん正常に発達した知能が後天的機能不全により低下した状態をいい、それが器質的障害に起因するか、器質的障害を伴わない機能低下であるかは問わない。認知症の代表例がアルツハイマー病であり、アルツハイマー病以外に前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症や血管性認知症なども含まれる。
【００１６】
ステップＡ
ステップＡでは、被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択する。被検物質は、その時点での既知物質であって物質として入手可能なものであれば特に制限はない。また本願出願時には未知であるが、後日既知となった物質も被検物質に含み得る。被検物質には制限はなく、天然物、合成物、半合成物、あるいはこれらの混合物であることができ、低分子化合物、高分子化合物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリ核酸、無機化合物、有機化合物、生体由来の化合物、又はそれらの修飾物あるいはそれらからの誘導体など種々の物質又はその混合物を制限なく被検物質とすることができる。
【００１７】
ステップＡでは、被検物質が、ＢＫチャネル活性化作用を有するか否かを試験し、試験結果に基づいて、ＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択する。ＢＫチャネル活性化作用を有するか否かの試験方法は既知の方法を利用することができる。ＢＫチャネル活性化作用を有するか否かの試験方法は、例えば、汎用されている培養細胞株（これには例えばHuman Embryonic Kidney(HEK)細胞やChinese Hamster Ovary(CHO)細胞などが含まれる）にプラスミドによって発現させられたBKチャンネルからアウトサイドアウトパッチ法で電流記録を採り、BKチャンネルの開口確率を測定することによって実施できる。また、非特許文献１に記載の帯状回の錐体細胞から全細胞パッチ記録を取り、スパイクを発生させ、スパイク幅を測定する方法で実施できる(実施例3参照)。但し、これらの方法に限定される意図ではない。
【００１８】
ステップＢ
ステップＢでは、ステップＡでＢＫチャネル活性化作用を有する物質として選択された被検物質から認知症治療効果を有する物質を選択する。認知症治療効果を有する物質の選択は、認知症モデル動物に、ステップＡで選択された被検物質を持続投与し、次いで被検物質を持続投与した認知症モデル動物の行動改善効果を確認することで行う。行動改善効果の確認は、被検物質持続投与前の行動と被検物質持続投与後の行動との比較により行うことができる。認知症モデル動物に対する被検物質の持続投与は、例えば、被検物質を充てんした浸透圧ポンプの留置手術により行うことができる。留置手術後、浸透圧ポンプを用いて、被検物質を所定の速度で、例えば、１〜４週間、具体的には２週間、にわたって、例えば、側脳室へ持続注入することができる。被検物質の注入場所は、認知症モデル動物の脳脊髄液へ注入できれば、特に制限はなく、側脳室以外の脳骨髄液に対して注入することもできる。被検物質の注入は、被検物質を適当な溶媒に溶解した溶液として行うことが適当であり、溶媒としては、ジメチルスルフォキサイド(DMSO)などを用いることができる。溶液中の被検物質の濃度は、溶媒及び被検物質の種類や溶解度、被検物質含有溶液の注入速度などを考慮して適宜決定することができる。被検物質含有溶液の注入速度は、モデル動物の種類や被検物質の種類や濃度を考慮して適宜決定できるが、例えば、0.1μl/時間〜10μl/時間の範囲とすることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。また、被験物質の水溶性が高い場合には特に、汎用される腹膜注射、筋肉注射、皮下注射、飲料水や餌に含有された状態での経口服用、または単体での経口服用なども用いることができ、さらに投与方法はこれらに限定されない。
【００１９】
認知症モデル動物は、認知症の症状を示すモデル動物であれば特に制限はない。認知症モデル動物、その中でも特にアルツハイマー病モデルとなる動物は、少なくとも１種の家族性ＡＤ 関連変異遺伝子を導入したモデル動物であることができ、少なくとも１種の家族性ＡＤ 関連変異遺伝子を導入したモデル動物は、ホモ接合動物、例えば、ホモ接合マウスであることができる。アルツハイマー病モデルマウスは、例えば、３ｘＴｇ-ＡＤモデルマウスであることができる。３ｘＴｇ-ＡＤモデルマウスは、ＡＰＰＫＭ６７０／６７１ＮＬ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ及びＴＡＵＰ３０１Ｌの３種類の家族性ＡＤ 関連変異遺伝子を導入したホモ接合マウスであり、約４ヶ月齢より神経細胞内のＡβ蓄積および記憶力低下が生じる。本発明におけるアルツハイマー病モデル動物は、ＡＰＰＫＭ６７０／６７１ＮＬ、ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ及びＴＡＵＰ３０１Ｌの家族性ＡＤ関連変異遺伝子の少なくとも１種を導入したホモ接合マウスであることができる。本発明における被検物質の試験には、例えば、４〜８ヶ月齢の３ｘＴｇ-ＡＤマウスを用いることができる。３ｘＴｇ-ＡＤマウスは、例えば、日本特許４３４３６９５号に記載され、Ｄｒ．Ｆｒａｎｋ  Ｌａｆｅｒｌａ（University of California, Irvine）から入手可能である。
【００２０】
行動改善効果の確認は、被検物質持続投与前の行動と、被検物質を所定期間持続投与した認知症モデル動物の行動とを比較し、被検物質の持続投与により行動に改善効果が見られるかにより行う。行動改善効果の確認は、例えば、新規物体識別試験（ＮＯＲ）およびモリス水迷路試験の少なくとも１つで行うことができる。新規物体識別試験（ＮＯＲ）およびモリス水迷路試験は、公知の方法であり、いずれも公知の方法をそのまま利用することができる。但し、行動改善効果の確認のための試験は、これらの方法に限定される意図ではない。
【００２１】
新規物体識別試験（ＮＯＲ）およびモリス水迷路試験の少なくとも１つの結果において、被検物質を持続投与した認知症モデル動物に行動改善効果が認められた場合に、当該被検物質を、認知症治療効果を有する物質として選択する。新規物体識別試験（ＮＯＲ）およびモリス水迷路試験は、いずれか一方のみを行うこともできるし、両方の試験を行い両者の試験結果から、被検物質が認知症治療効果を有する物質であるかを確認し、選択することもできる。
【００２２】
本発明の方法によれば、ＢＫチャネル活性化に基づく治療効果を発揮する認知症治療薬またはその候補物質をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００２４】
参考例1
A：実施例においては、ＢＫチャネル活性化作用を有する候補物質としてイソピマル酸（ISOと略記）を、浸透圧ポンプ(アルゼ社製)を用いて、試験マウスの左側の側脳室（脳骨髄液）へ投与する。ポンプ本体をポリエチレンチューブでカニューレに接続し、カニューレ先端が左側脳室内に留置できるようにする。本参考例では、このポンプーカニューレシステムによってうまく脳室内に物質が注入できるかを確かめる目的で、被写体のポンプにはISOではなく、青色色素溶液を充填した。結果を図1(A)に示す。
【００２５】
B：ポンプーカニューレシステムにより青色色素溶液を2週間投与し、2週間後に脳を取り出すと、カニューレ刺入部位は目視で同定できた（白矢印）。色素によって濃く染まった部分は、脳室の形状と一致している。右側の淡い染色部位も側脳室の形状に一致し、さらに右側における染色は左右の側脳室間の結合部を色素が通過した結果以外には起こりえないので、カニューレ先端が左側脳室内に留置されたことは明白である。結果を図1(B)に示す。
【００２６】
C：後背側から見ても、第4脳室が濃染されているのが観察される。この部位の色素も、脳室システムを伝う以外にはここまで到達するすべはないので、カニューレ先端の側脳室内留置の証明となる。以後の実験では、色素に代えてISOまたは媒体のみを投与し、アルツハイマー病モデル動物の認知機能に与える影響を調べた。なお薬物の媒体にはジメチルスルフォキサイド(DMSO)を使用した。結果を図1(C)に示す。
【００２７】
実施例1
A：認知機能評価に用いた新規物体識別試験（NOR）の説明図(図2-A)。左、１日目に使う２つの同一な物体、および2日目に取り替える新規物体(縦、横または直径 5cm x 高 10cm)。右、探索のための場（縦 26cm x 横 44cm x 深 20cm)。２物体を設置すべき地点と物体から2cm以内の領域が線で描かれている。
【００２８】
B：2回にわたるNORと薬物投与の時系列(図2-B)。1st NOR、一回目のNORの実施要項。1日目（D1）に3分間の探索を行う。この際、同一物体を左右に設置する。2日目（D2)には一方はD1と同じ旧来の物体を、他方には異なる物体を設置して3分間探索させ、「新規物体の2cm以内に近接した時間」を「新規と旧来物体への近接時間の総和」で除し、Novelty Indexを算出する。一回目のNORの後、ISOを充てんした浸透圧ポンプの留置手術を行った。参考例1で動作を確認した浸透圧ポンプを用いて、0.11μlの速度で２週間にわたって側脳室へISOのDMSO溶液を持続注入した。その後、2回目のNOR（2nd NOR）を行った。ISOのDMSO中の濃度は、1mMである。
【００２９】
C：1回目(before)と2回目NOR(after)におけるNovelty Indexの遷移(図2-C)。アルツハイマー病モデルマウスにISOを投与した群（Tg+ISO)においてのみ、有意な改善が見られた。野生型ではISO投与群とコントロール群（溶媒投与；Vehicle）で違いが見られなかった。ISOがモデルマウスにおいて認知改善効果を発揮したことを意味する。
【００３０】
実施例2
A：認知機能を調べるため第二方法として、モリス水迷路試験を使用した。円形プールで水面下に隠されたプラットフォームへの到達時間を、試験日１から５まで記録した。１日に４回施行してその平均値を算出した。４群間に有意な差は見られなかった(図3-A)。
【００３１】
B：最終のモリス水迷路試験施行の後に、プラットフォームを外した状態で１分間水泳させ、元々プラットフォームのあった４分円（扇形）に全水泳時間の何パーセント滞在したかを比較した。25%がチャンスレベルとなり、この場合は学習不成立を意味する。野生型（WT)では両群とも学習が成立していた。モデルマウスでは、ＩＳＯ投与によって有意に滞在時間が長くなり、25%をはるかに超えた(図3-B)。
【００３２】
図3-A及び図3-Bの結果を総合的に勘案し、モリス水迷路においてもISO投与による何らかの学習改善が検知されたと考えられる。NORの結果も加味し、ISO投与による認知改善効果が明らかとなった。即ち、持続投与による認知改善効果が明らかとなったISOは、アルツハイマー病治療薬またはその候補物質として選択することができる。
【００３３】
実施例3
A：モデルマウス脳から作製したスライス標本において、帯状回の錐体細胞から全細胞パッチ記録を取り、スパイクを発生させ、スパイク幅を測定した(図4-A)。このスパイク幅がBKチャンネル活性の指標として使えることは、非特許文献1から明確である。5連発させたスパイクの4群における代表例を提示した。
【００３４】
B：各スパイクの幅を4群で測定して比較した(図4-B)。5番目スパイクの幅はモデルマウス対照群においてのみ、有意に大きかった。これは、モデルマウスにおいて低く抑えられていたBKチャンネル活性が、ISOによって正常化されたことを意味する。本実験では脳を個体マウスから取り出し、さらにスライス標本にし、ISOを含まないメディウム中で記録している。よって、この結果はISOの2週間における持続投与により、モデルマウスの脳内におけるBKチャンネル抑制が、恒常的・不可逆的に解除され正常化されたことを意味する。
【００３５】
実施例3の方法は、本発明の方法のステップＡでの、被検物質からＢＫチャネル活性化作用を有する物質を選択する方法に用いることができる。即ち、例えば、被検物質を記録漕内に投与することで速やかにスライス標本に作用させ、ＢＫチャネル活性の有無を確認する。次いで、ＢＫチャネル活性化が確認された被検物質について、実施例1及び2に示すステップＢにおける認知改善効果の確認試験を行い、被検物質から認知症治療薬またはその候補物質を選択することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、認知症治療薬の提供に関する分野に有用である。
【図１】
2016040542.tif 000002
【図２】
2016040542.tif 000003
【図３】
2016040542.tif 000004
【図４】
2016040542.tif 000005