(57)【要約】【課題】  核酸クロマトグラフィーを利用した検査法で問題となる非特異的シグナル（非特異的ハイブリダイゼーション）の発生要因を突き止め、遺伝子検査におけるフォールスポジティブ誤検査を抑制すること。【解決手段】  核酸クロマトグラフィーにおける試験溶液の展開及び検出（ハイブリダイゼーション）工程を、固相担体と外部環境との間の気体の流通が妨げられ、固相担体表面の気密性が維持された条件下で行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸検出用デバイスであって、
標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体と、
前記固相担体と外部環境との間の気体の流通を妨げ、固相担体表面の気密性を維持する被覆部材とを含む、デバイス。
【請求項２】
前記被覆部材が固相担体の表面を被覆する透明フィルムである、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項３】
前記透明フィルムが、ポリエステル素材で構成される、請求項２記載の核酸検出用デバイス。
【請求項４】
前記被覆部材が固相担体の全体を被覆し、少なくとも一部が透明な外装部材である、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項５】
さらにサンプルポートを有する、請求項４記載の核酸検出用デバイス。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがＵＶ照射により前記固相担体表面に固定化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項７】
前記固相担体が、複数の標的核酸に各々結合する複数のオリゴヌクレオチドプローブを保持する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項８】
前記固相担体が、多孔性シートとバッキング部材からなる、請求項１〜７のいずれか1項に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項９】
核酸検出方法であって、
標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体上に標的核酸を含む試験溶液を適用し、展開させる工程と、
前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション産物を検出する工程とを含み、
前記展開及び検出工程が、固相担体と外部環境との間の気体の流通が妨げられ、前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性が維持された条件下で行われることを特徴とする検出方法。
【請求項１０】
前記固相担体の表面が透明フィルムで被覆されているか、前記固相担体の全体が少なくとも一部が透明なデバイス外装によって被覆されている、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプローブがＵＶ照射により前記固相担体表面に固定化されている、請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸検出用デバイス及び核酸検出方法に関する。より詳細には、非特異的ハイブリダイゼーションが低減された核酸検出用デバイス及び核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出方法として、核酸クロマトグラフィー法が知られている。核酸クロマトグラフィーでは、通常標的核酸に結合するプローブをあらかじめ固定した多孔性シートを含む試験片（ストリップ）に、増幅した核酸を含む試験溶液を展開し、発色反応等を利用して標的核酸を検出する。
【０００３】
核酸クロマトグラフィー法については、核酸増幅工程において両末端に一本鎖領域を有する二本鎖核酸を合成することで検出精度を高める方法や（特許文献１）、核酸増幅用プライマーにポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位を導入することで検出感度を向上させる方法（特許文献２）等の出願がある。
【０００４】
また、核酸クロマトグラフィー用のデバイスについては、検体液採取部に吸水性の柔軟剤を使用し、その一部をバッキング部材より突出させることで操作性を向上させたストリップや（特許文献３）、表示部の輪郭部分を向上させるとともに、視認性を向上させた検査具（特許文献４）に関する出願がある。
【０００５】
一方、核酸クロマトグラフィーと同様のクロマト検査技術に、抗体を使用したイムノクロマトグラフィーがあり、抗体をライン状に固相化した各種イムノクロマトストリップが市販されている。イムノクロマトストリップについて、表面をテープで被覆する方法が知られているが、これは、脱離しやすいメンブレンの保護を目的としたものであり、サンプル溶液からの水分揮散の抑制を狙ったものではない。
【０００６】
核酸クロマトグラフィーでは、特定の標的遺伝子とストリップ上の複数種類のキャプチャーＤＮＡ（通常ライン状に固相化）間の非特異的なハイブリダイゼーションによる誤信号（フォールスポジティブ）発生が問題となっていた。しかしながら、従来技術はいずれも操作性や検出感度の改善を目的としたものであり、非特異ハイブリダイゼーションの抑制については検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０７０６１８号
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０３９２２８号
【特許文献３】特開２０１０−１４５０７号
【特許文献４】特開２０１４−１８１５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、核酸クロマトグラフィーでしばしば問題となる非特異的シグナル（非特異的ハイブリダイゼーション）の発生要因を突き止め、遺伝子検査におけるフォールスポジティブ誤検査を抑制することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは非特異的なハイブリダイゼーションの起こる要因を鋭意検討し、その要因が、試験溶液が核酸クロマトストリップ上に展開される段階での水分蒸発に伴う塩濃度の上昇にあることを突き止めた。
【００１０】
そして、表面を透明フィルムで被覆し水分蒸発を抑制したストリップを作成し、同じ環境下での非特異ハイブリダイゼーションの発生具合を通常のクロマトストリップと比較検証した。その結果、透明フィルムで被覆したストリップでは、顕著な非特異ハイブリダイゼーション抑制効果が検証された。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１１］を提供する。
［１］核酸検出用デバイスであって、
標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体と、
前記固相担体と外部環境との間の気体の流通を妨げ、固相担体表面の気密性を維持する被覆部材とを含む、デバイス；
［２］前記被覆部材が固相担体の表面を被覆する透明フィルムである、上記［１］に記載の核酸検出用デバイス；
［３］前記透明フィルムが、ポリエチレンテレタレート等のポリエステル素材で構成される、上記［２］に記載の核酸検出用デバイス；
［４］前記被覆部材が固相担体の全体を被覆し、少なくとも一部が透明な外装部材である、上記［１］に記載の核酸検出用デバイス；
［５］さらにサンプルポートを有する、上記［４］に記載の核酸検出用デバイス；
［６］前記オリゴヌクレオチドプローブがＵＶ照射により前記固相担体表面に固定化されている、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸検出用デバイス；
［７］前記固相担体が、複数の標的核酸に各々結合する複数のオリゴヌクレオチドプローブを保持する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸検出用デバイス；
［８］前記固相担体が、多孔性シートとバッキング部材からなる、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸検出用デバイス；
［９］核酸検出方法であって、
標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体上に標的核酸を含む試験溶液を適用し、展開させる工程と、
前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション産物を検出する工程とを含み、
前記展開及び検出工程が、固相担体と外部環境との間の気体の流通が妨げられ、前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性が維持された条件下で行われることを特徴とする検出方法；
［１０］前記固相担体の表面が透明フィルムで被覆されているか、前記固相担体の全体が少なくとも一部が透明なデバイス外装によって被覆されている、上記［９］に記載の方法;
［１１］前記オリゴヌクレオチドプローブがＵＶ照射により前記固相担体表面に固定化されている、上記［９］又は［１０］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、核酸クロマトグラフィーにおける非特異的シグナル（非特異的ハイブリダイゼーション）の発生を簡便に抑制でき、標的核酸を高感度に検出することができる。本発明は、とくに核酸検出用プローブが固相担体表面に固定化され、それゆえ担体表面における塩濃度が検出感度に重要な影響を及ぼす核酸検出用デバイス（核酸クロマトストリップ）において、特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の核酸検出デバイスの一実施形態を示す（透明フィルム）。透明フィルムは、試験溶液アプライ（浸漬）部位を除く、固相担体の表面、又は表面と背面の少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは全体を被覆するように設置される。
【図２】図２は、本発明の核酸検出デバイスの一実施形態を示す（外装部材）。
【図３】図３は、実施例で使用したストリップのデザインを示す。
【図４】図４は、実施例の実験状況（標的遺伝子を含むサンプル溶液のクロマトストリップ上への展開）を示す。
【図５】図５は、ハイブリダイゼーション後の各ストリップの発色を示す（左：透明テープなし、右：透明テープあり）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．核酸検出用デバイス
本発明の核酸検出用デバイスは、核酸クロマトグラフィーを利用した標的核酸の検出用デバイスであって、標的核酸と結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体と、前記固相担体と外部環境との間の気体の流通を妨げ、前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性を維持する被覆部材とを含む。
【００１５】
（１）標的核酸
「標的核酸」とは、検出対象となる核酸であって、天然に存在するものでも人工的に合成されたものでもよい。通常検体中の標的核酸は微量であることが多いため、公知の方法により標的核酸を増幅して検出に供する。よって、検出に使用される「試験溶液」は、核酸増幅後の試料を含む。
【００１６】
前記標的核酸は１種類でも２種類以上であってもよい。後述するように、本発明の一実施形態では、各標的核酸は増幅工程において、プライマーにより、オリゴヌクレオチドプローブに相補的となる。
【００１７】
（２）固相担体
本発明のデバイスを構成する「固相担体」は、検出対象である標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する多孔質材料を有する。前記固相担体は、多孔質材料から構成されてもよいし、多孔質材料（多孔質シート）とこれを支持するバッキング部材から構成されてもよい。固相担体を構成する多孔質材料は当該分野で周知であり、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。また、バッキング部材は、水を通さない（蒸発させない）性質を有するものであれば特に限定されず、当該分野で周知の素材を使用することができる。
【００１８】
固相担体の形状は、本発明の目的に適するようにデバイスに応じて適宜設計される。例えば、デバイスが透明フィルムで被覆された固相担体から構成され、容量1.5μl程度のマイクロチューブ内で検出を実施する場合には、当該チューブ内の試験溶液に固相担体の末端が浸漬されるサイズ及び形状に設計される。また、サンプルポート等を介して試験溶液を固相担体にアプライする場合には、試験溶液の展開後、各標的核酸が識別可能なサイズ及び形状に設計される。限定するものではないが、固相担体のサイズは、典型的には、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下で、厚みは０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下とすることができる。
【００１９】
試験溶液（展開液）は、固相担体の末端にアプライされ、オリゴヌクレオチドプローブはこの末端部から一定程度離れた位置に、対応する標的核酸ごとにライン状に平行に固定される。
【００２０】
固相担体上には、複数の標的核酸を同時に検出する場合においても、標的核酸に対応するプローブ領域を容易に特定できるように、位置マーカーを配置してもよい。位置マーカーの存在により、目視検出の場合であっても、簡便に標的核酸の存在不存在を検出することができる。
【００２１】
（３）オリゴヌクレオチドプローブ
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、周知の方法に従い、標的核酸と特異的にハイブリダイズしうる配列を有するように設計される。上記配列の長さは、特に限定されないが、各標的核酸に対する特異性とハイブリダイゼーション効率を確保するため、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。より好ましくは、１５塩基以上２５塩基以下である。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化方法は特に限定されず、その３’末端で固相担体に結合されていてもよいし、５’末端で結合されていてもよい。例えば、ニトロセルロース等を固相担体に使用する場合、プローブを固相担体にインクジェット方式でプリントした後、ＵＶ照射などにより固着性を高める。この方法の場合、プローブはＵＶの届く固相担体表面のみに固定化される。
【００２３】
（４）被覆部材
本発明のデバイスを構成する「被覆部材」は、前記固相担体と外部環境との間の気体の流通を妨げ、前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性を維持するものであれば、その形態や形状は特に限定されない。
【００２４】
一実施形態において、上記被覆部材は固相担体の表面を被覆する透明フィルムである。この場合、デバイスは透明フィルムで被覆された核酸クロマトストリップ（固相担体）として構成される（図１参照）。透明フィルムは、固相担体と外部環境との間の気体の流通を妨げ、固相担体表面の気密性を維持するように、固相担体上に設置される。例えば、試験溶液アプライ部位（前述のようにマイクロチューブにストリップを浸漬させる場合には試験溶液への浸漬部位）を除く試験溶液展開部の少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは全体を被覆するように張り付けられる。透明フィルムは、固相担体が水分を通さない支持体を有する場合には、その表面を覆うように設置されればよいが、そのような支持体を有さない場合には、表面と背面の双方を上記のように被覆するよう設置されることが望ましい。
【００２５】
透明フィルムを構成する素材は、固相担体表面の気密性を維持し、展開溶媒の蒸発を妨げるものであればとくに限定されない。例えば、ポリエチレンテレフタレート等のポリエチレン素材を挙げることができる。デバイスは試験溶液が入った容量1.5μl程度のマイクロチューブ内に直接挿入され、その末端を試験溶液に浸漬させ、展開させることで検出を行う。
【００２６】
別な実施形態において、上記被覆部材は固相担体の全体を被覆し、少なくとも一部が透明な外装部材である。この場合、デバイスは核酸クロマトストリップ（固相担体）とこれを覆う外装部材から構成されるデバイスとして構成される（図２参照）。外装部材は、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした標的核酸を目視検出できるように、少なくとも一部は透明でなければならない。デバイスの末端には、気密性を維持しつつ、試験溶液をアプライするサンプルポートを設けることができる。
【００２７】
２．核酸検出方法
本発明の核酸酸出方法は、（i）標的核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体上に標的核酸を含む試験溶液を適用し、展開させる工程と、（ii）前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション産物を検出する工程とを含み、前記展開及び検出工程が、固相担体と外部環境との間の気体の流通が妨げられ、固相担体表面の気密性が維持された条件下で行われることを特徴とする。
【００２８】
（１）核酸増幅
通常検体中の標的核酸は微量であるため、検出に先立って、標的核酸は増幅することが好ましい。核酸の増幅方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法等のいずれの方法を使用してもよい。
【００２９】
複数の標的核酸を一度に検出する場合には、クロスリアクションを防止するために、増幅工程において各標的核酸に検出用の「タグ配列」を導入してもよい。タグ配列は、増幅用プライマーの一方にあらかじめタグ配列を付加することで標的核酸に導入することが出来る。以下、増幅用プライマーペアの一方を「第１プライマー」、他方を「第２プライマー」と呼ぶ。
【００３０】
「タグ配列」は、標的核酸の配列とは無関係に、タグ間のクロスリアクションを排除した設計がなされた配列であり、好ましくは、１５塩基以上５０塩基以下、より好ましくは、１５塩基以上２５塩基以下である。オリゴヌクレオチドプローブは、このタグ配列と相補的な配列を含むように設計される。
【００３１】
第１プライマーと第２プライマーは、標的核酸にハイブリダイズできるように、各々標的核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列に相補的な「第１の識別配列」と「第２の識別配列」を有する。前記第１の塩基配列と第２の塩基配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、増幅可能なように適宜選択される。なおＤＮＡ上の変異を検出する場合、第１の塩基配列と第２の塩基配列は、いずれか一方のプライマーにのみ変異部位が含まれるように選択してもよいし、あるいは双方に変異部位が含まれるように選択してもよい。
【００３２】
「第１プライマー」がタグ配列を有する場合は、タグ配列と第１の識別配列とは直接連結されず、その間にＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有することが好ましい。この連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まず、例えば、人工オリゴヌクレオチドから構成され、それゆえＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止させる。これにより、一本鎖領域を有する核酸が増幅され、熱変性なしにオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションが可能となる。なお、タグ配列及び連結部位の導入の詳細については、ＷＯ２０１３／０３９２２８号を参照されたい。
【００３３】
「第２プライマー」は、第２の識別配列に加えて、増幅された標的核酸がオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたときに目視確認可能な標識物質、又は標識物質導入材料を含む。標識物質導入材料は、標識物質と結合するための材料であり、例えば、アビジンコートした標識物質と結合するためのビオチン等を含み、標識物質の標的核酸への導入を可能にする。
【００３４】
「標識物質」は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。このような標識物質としては、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。まさらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００３５】
標識物質は、その一部にラテックス粒子等の粒子を有していてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、２０ｎｍ以上２０μｍ以下、典型的には、４０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下、特に好ましくは０．１μｍ以上５μｍ以下、さらに好ましくは０．１５μｍ以上２μｍ以下である。また、固相担体の孔径によって適宜調整される。
【００３６】
好ましくは、粒子は水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００３７】
標識物質結合材料としては、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。検出に用いられる標識物質は、上記標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）であり、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物の標識物質結合物質と、標識物質結合物質と結合する部位を備える標識物質と結合して、増幅産物の検出を可能にする。
【００３８】
（２）試験溶液の適用・展開
増幅された標的核酸を含む試験溶液は、固相担体の末端を試験溶液に浸漬させることで、あるいは、サンプルポート等を介して固相担体に適用される。適用された試験溶液は、固相担体を構成する多孔質材料内にキャピラリー現象によって展開される。
【００３９】
試験溶液は、固相担体中での標的核酸の展開を容易にするように、「展開媒体」を含むことが好ましい。展開媒体は、特に限定されないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒はとしては、例えば、炭素数１〜４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。展開媒体は、好ましくは水を主体とする。
【００４０】
展開媒体は、ｐＨを調整するための緩衝成分を含むことができる。緩衝成分は、意図するｐＨにもよるが、通常は６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは、７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）等である。さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。なお、展開媒体として、増幅反応液をそのまま採用してもよい。また、増幅反応液に対して、界面活性剤や適当な塩等の追加の成分や溶媒を加えたりすることで、組成や濃度の調整をして展開媒体として使用してもよい。展開時間は特に限定されず、固相担体の形態や形状、展開媒体の性質に応じて適宜設定される。
【００４１】
増幅された部分二本鎖核酸が、標識物質結合物質を備えている場合には、予め増幅工程において標識物質を加えておいて増幅反応を実施してもよい。こうすることで、増幅工程後において、標識物質が標識物質結合物質に結合した複合産物としての標識物質を有する部分二本鎖核酸が得られるる。また、反応終了後の増幅反応液中の部分二本鎖核酸に標識物質を添加しても、同様に複合産物が得られる。さらに、展開媒体用液（増幅反応液を展開媒体として用いる場合の添加液を展開媒体用液という。）に標識物質を添加して、その後、増幅反応液とこの展開媒体用液とを混合しても、同様の複合産物が得られる。
【００４２】
（３）ハイブリダイゼーション・検出
標的核酸は固相担体中に展開される途中で、標的核酸あるいは標的核酸に導入されたタグ配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブに捕捉され、標識物質による発色を生じる。かくして、各標的核酸、プライマーあるいはプライマーに結合したタグに対応するオリゴヌクレオチドプローブを固定化したラインの発色により、複数の核酸を一度に目視検出することができる。
【００４３】
ハイブリダイゼーション後には、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション工程に供される増幅された標的核酸が標識物質を有しているときには、特別なラベリング工程は不要である。増幅された標的核酸が標識物質と結合するときはハイブリダイゼーション後にさらに、あるいは先立ち、標識プローブと反応させる工程が必要となる。
【００４４】
ハイブリダイゼーション工程では、オリゴヌクレオチドプローブ間の非特異的なハイブリダイゼーションによる誤信号（フォールスポジティブ）がしばしば見られる。発明者らは、非特異的ハイブリダイゼーションの原因が、試験溶液が核酸クロマトストリップ上に展開される段階での水分蒸発に伴う塩濃度の上昇にあることを確認した。
【００４５】
本発明においては、展開及び検出（ハイブリダイゼーション）工程が、固相担体と外部環境との間の気体の流通が妨げられ、前記オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性が維持された条件下で行われるようにすることで、固相担体表面での塩濃度の上昇を防止し、非特異ハイブリダイゼーションを顕著に抑制する。固相担体表面の気密性が維持する手段は特に限定されず、前述のように、固相担体表面を透明フィルムで被覆する方法、固相担体全体を外装部材で被覆する方法などを利用することができる。
【００４６】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプローブが、ＵＶ照射等により固相担体表面に固定化されたデバイス（ストリップ）においてとくに有用である。本発明の方法は、極めて安価かつ簡便に非特異ハイブリダイゼーションを抑制し、検出感度を向上させることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００４８】
１．クロマトストリップの作製
メルクミリポア製Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に以下の表に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、以下に示す２種の配列をプローブとして使用し、固相担体上に配置した。なお、プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端に20merのチミン（T）を結合させた。
F1:5'-ACAACCCGCAATAATATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号１）
F2:5'-TTTAAGTAAGCCCAATCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号２）
【００４９】
プローブは、スポット後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２００〜５００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化した。ストリップのデザインを図３に示す。
【００５０】
上記のようにして作製したストリップについて、試験溶液に浸漬する末端を除いてストリップ表面を透明テープ（ARcare 7759、Adhesives Research社製）で被覆したものと被覆しないものを準備した。
【００５１】
２．標的遺伝子の準備
本実施例では、上記ストリップの表面に固相化したオリゴヌクレオチドプローブと相補なオリゴDNA(タグDNA)を標的遺伝子として使用した。合成した標的遺伝子の配列を下表に示す。なお、この標的遺伝子の3'末端側には、アビジンコートラテックスを結合するためのビオチン修飾を実施した。
標的遺伝子F1'：5'-GATATTATTGCGGGTTGT-3' （配列番号３）
【００５２】
３．標的遺伝子サンプルの調整
上記標的遺伝子溶液にクロマト展開液(藤倉化成株式会社製)等を加え、終濃度100nMの標的遺伝子サンプルとした。なお、サンプル溶液には終濃度150mMになるようにNaClを加えた。組成を以下に示す。
【００５３】
（標的遺伝子サンプル組成）
標的遺伝子(1μM)F1'    4.2μl
TE（新品Lot.1268853）  15.8μl
展開液（藤倉化成製）    20.0μl
Latex  TBA(ZL18)         2.0μl
合計                    42.0μl 
【００５４】
上記標的遺伝子サンプル溶液内のLatexはその内部に青色の染料を含有し、その表面はストレプトアビジンで表面コートされている。従って、上記サンプル溶液を調整した段階で、標的遺伝子の3'末端に修飾されたビオチンとLatexの表面コートストレプトアビジンとの結合反応が進行し、標的遺伝子はLatexの青色にラベル化される。
【００５５】
４．クロマトストリップ上への展開
上記標的遺伝子サンプル溶液42μlが入ったエッペンドルフチューブを2本用意し、そこに、１．で作成したクロマトストリップ（テープ貼り、テープ無し）を挿入しクロマト展開させた。実験状況を図４に示す。
【００５６】
５．標的遺伝子の検出
増幅した遺伝子を含むサンプル溶液に展開液等を加え、サンプル終濃度が100nmとなるように、ハイブリダイズサンプルを調整した。
【００５７】
（ハイブリダイズサンプル組成）
サンプル（1μM）F-3                  4.2μｌ
ＴＥ（新品Lot.1240354）            15.8μｌ
展開液（W4A2200但し、遠沈管のもの）20.0μｌ
Latex  TBA（ZL18）                   2.0μｌ    
合計                                42.0μｌ
【００５８】
クロマトストリップの先端をチューブ内に浸漬させ、調製したハイブリダイズサンプル各200μlを変性等のために加熱することなく添加し、温度25.3℃、湿度30.0％で75分反応させた。
【００５９】
ハイブリダイゼーション反応終了後、クロマトストリップを洗浄液（0.1％Tween20−1mM EDTA-TBS）入り0.2mlチューブに移し、37℃のヒートブロック内で洗浄作業（37℃ x 1min、37℃ x 10min、37℃ x 1min）を行った。
【００６０】
洗浄済みのクロマトストリップをビオチン-HRPとストレプトアビジンとの混合液が入った0.2mlチューブに移して室温下で20分間の反応を行った。
【００６１】
反応終了後、クロマトストリップを洗浄液（0.1％Tween20-1mM EDTA-TBS）入り0.2mlチューブに移し、洗浄作業（室温x 1min、室温x 10min、室温x 1min）を行った。
【００６２】
洗浄済みクロマトストリップをVector Laboratories社製TMB Peroxidase Substrate Kit，3,3', 5,5'-tetramethylbenzidineを用いて室温下で5分程度の発色反応を行った。
【００６３】
６．結果（検出判定）
クロマトストリップの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図５に示す。図５に示すように、通常のストリップでは明確に見えていた非特異シグナルが、透明テープで保護したストリップではまったくみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、核酸クロマトグラフィーを利用したマルチ核酸クロマトグラフィー検査法に有用である。本発明は、とくに核酸検出用プローブが核酸クロマトストリップ表面に固定化され、それゆえストリップ表面における塩濃度が検出感度に重要な影響を及ぼす核酸クロマトストリップを用いた検査法において、特に有用である。
【符号の説明】
【００６５】
101：固相担体、102：透明フィルム、103：プローブ固定ライン、104：標識核酸検出ライン（発色により標的核酸が検出されたライン）、105：試験溶液アプライ（浸漬）部位、201：サンプル溶液チューブ、202：サンプルポート、203：サンプル溶液ポート、204：透明プラスチック円筒、205：クロマトストリップ
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：F1プローブ
配列番号２：F2プローブ
配列番号３：標的遺伝子F1'
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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