(57)【要約】      （修正有）【課題】ベータセクレターゼの活性を阻害する新規な物質（クルクミン２）が天然由来の植物中において含有量が少ないため，栽培法の改良によって当該物質の濃度を高める方法を提供する。また本物質は水に対する溶解性が非常に低いため，認知症予防食品として実用化するために溶解性を高めて体内吸収率を向上させた認知症予防食品を提供する。【解決手段】ベータセクレターゼの活性を阻害する新規な物質（クルクミン２）の含有量を高めるために，特に最低気温と温度差を制御した植物の栽培法を改良した。また本物質を認知症予防食品として実用化するために，本物質を酒類及びまたは動物性油脂及びまたは植物性油脂に溶解させた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータセクレターゼの酵素活性を阻害する式１で表されるクルクミン２を含有する植物の栽培方法であり、当該植物が地表における各月の平均最高気温と平均最低気温との気温差が栽培期間を通じて５℃以上で栽培され，かつ栽培期間を通じて各月の平均最低気温が２０℃以下の場所で栽培されることを特徴とするクルクミン２を含有する植物の栽培方法。
【請求項２】
ベータセクレターゼの酵素活性を阻害する天然由来のクルクミン２を含有する認知症予防食品であり，当該予防食品にはアルコール類及びまたは動物性油脂及びまたは植物性油脂が少なくとも１種類以上含まれていることを特徴とする認知症予防食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベータセクレターゼの酵素活性を阻害する天然由来の阻害物質を含有する植物の培養方法と、その天然由来の阻害物質を含有する認知症予防食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年高齢化社会への加速化が進むにつれて認知症患者、特にアルツハイマー症（ＡＤと略記する）患者が増加している。このＡＤ患者の増加は、我が国のような長寿命国家のみだけではなく世界的にも増加傾向にある。このためＡＤ患者に有効な治療薬あるいは治療法の開発が望まれているところである。
【０００３】
ＡＤ発症のメカニズム解明や治療薬の開発はさかんに行われているが、発症のメカニズムについてはまだ不明の部分が多いようである。また治療薬については、従来の低分子化合物を主体とした医薬品やワクチンを用いるものなどが開発されつつあるが、有効なものは未だ実用化されていない。ＡＤ発症のメカニズムについては、ＡＤ患者の脳にはペプチドの一種であるベータアミロイドの蓄積が非常に多く見られることから、このベータアミロイドの産生がＡＤ発症に関与していると考えられている。これまでの研究から、ベータアミロイドはアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰと略記)の分解産物であることが判っている。ＡＰＰは７７０個のアミノ酸配列のＣ末端側に１回の膜貫通部位を有する膜結合蛋白質である。ベータアミロイドはこの前駆体蛋白質であるＡＰＰ から、２段階の切断を受けて生成されると考えられている。
【０００４】
すなわちＡＰＰに存在する約４３アミノ酸残基のＡbドメインのＮ末端側がＡＰＰ切断酵素の一つであるベータセクレターゼにより切断される過程と、さらにその後、Ｃ末端側が同じくＡＰＰ切断酵素の一つであるガンマセクレターゼにより切断される過程を経て産生される。従ってＡＤ発症を防ぐためには、これらのＡＰＰ切断酵素の活性を阻害する物質が有効であると考えられている。しかしこれらの酵素を阻害する有効な候補化合物およびそれらを基本構造とした医薬品は未だ実用化されていない。
【０００５】
ＡＤ発症患者に特徴的に見出されているＡbの産生は蛋白質の変性過程と同様に不可逆反応であるため、ＡＤの発症と病状も不可逆的に進行するものと考えられる。すなわちＡbはひとたび産生されれば、出発物質であるＡＰＰの分子に再構築されて戻ることができない。いったんＡＤが発症してしまえば、進行を遅らせることができたとしても根本的な治療とはならず、長い年月をかけてＡＤの病状が進行してしまうものと思われる。このようなＡＤの発病を未然に予防するための予防薬あるいは機能性食品についても未だ実用化されていないのが現状である。
【０００６】
発明者らはこれまでにベータセクレターゼの酵素活性を阻害する天然由来の物質として植物のウコンに含まれる図１で表されるクルクミン２（ｄｅｓｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）が有効であることを発見している。また同時にクルクミン誘導体中の主成分であり一般的にクルクミンと呼ばれている図２で表されるクルクミン１
（１，  ７−ｂｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｈｅｐｔａｎｅ
−１，６−ｄｉｅｎｅ−３，５−ｄｉｏｎｅ）
およびウコン中の含有量が最も少ない図３で表されるクルクミン３（ｂｉｓ−ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）にはベータセクレターゼに対する酵素阻害活性は全く存在しないことも明らかにしている。これらの内容を記載した発明者らの文献を次に示す。（１）特願２００８−２８８３８６，  （２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  
Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４  （２０１４）  ６８５−６９０
【０００７】
以上のように発明者らは，ウコンに含まれるクルクミン誘導体の中でクルクミン２のみがベータセクレターゼに対して有意な酵素阻害活性を有することを初めて見出した。しかしこのものをＡＤ予防のための素材とし利用しようとする場合，栽培されたウコン中での含有量が少ないのが問題となっている。すなわちウコンに含まれる３種類の天然由来のクルクミン誘導体の含有量は，クルクミン１が約８０％と最も多く，クルクミン２は１０〜２０％，クルクミン３は１０％以下である。そのため，ウコン中でのクルクミン２の含有量を増やしてより効果の高いＡＤ予防のための天然物由来の素材を提供することが今後の課題となっている。さらにクルクミン誘導体は水に対する溶解性が一般に低く，そのままでは体内に吸収されにくいことが分かっている。そこで体内での吸収率を高めるための方法を確立することも今後の課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献２】ＰＣＴ ＷＯ ０１／０００６６５  Ａ３
【特許文献３】ＰＣＴ ＷＯ ０１／００６６３  Ａ２
【特許文献４】特願２００６−３２３６９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする第一の課題は、ベータセクレターゼを阻害する有効な天然由来の素材であるクルクミン２を栽培によって，より高濃度で取得する方法を確立することである。さらに本発明が解決しようとする第二の課題は，高濃度で取得されたクルクミン２を，溶解性を高めて認知症予防食品に適用するための方法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上のような課題を解決するために本発明はなされたものであり、以下詳細にその内容を説明する。
クルクミンを含有する植物であるウコンは通常は高温多湿な亜熱帯地方で栽培されている。このような環境下で栽培されたウコンではクルクミン1の含有量が圧倒的に多くなるが，クルクミン２の含有量は低くなるのが一般的である。発明者はウコンを栽培する際の環境（気温，水分，土壌成分など）がクルクミン２の含有量に影響を及ぼしているのではないかと推察し，特に栽培時の気温を変えることで含有量への影響を調べた。発明者は栽培地として昼間時は平均的な気温であるが夜間の気温が低い長野県の山間部を選びウコンの試験栽培を行った。なおウコンは春先の５月に定植し１１月下旬に収穫を行った。１１月下旬に収穫されたウコンは水洗後，数日間乾燥させ，さらに表皮部分を除去してから根を薄く輪切りにして１週間ほど乾燥させた。乾燥後のウコンは微粉砕して１００％エタノール溶媒を粉末１ｇ当たり５０ｍL加えて２４時間揺動して後に抽出を行った。抽出後のエタノール溶液を遠心分離して上清を回収し，さらにフイルターろ過を行って高速液体クロマトグラフイーにより成分分析を実施した。なお分析に際しては参照用のサンプルとして亜熱帯地方で栽培された市販の粉末状のクルクミンを用いた。
【００１１】
前述したようにクルクミンは水に対する溶解性が非常に低い。そのためこの素材そのままではクルクミンは体内に十分に吸収されないと考えられる。そこでクルクミン２の認知症予防食品への適用を目指してクルクミンを液体状の各種食品にあらかじめ添加して溶解させておき，これを摂取することを想定した認知症予防食品の検討を行った。このような認知症予防食品の有効性を確認するため，高速液体クロマトグラフイーによりクルクミン２の溶解成分量の分析評価を行った。具体的には液体状の食品として，（１）アルコール含有量が５〜５０％程度の酒類，（２）魚油などの動物性油脂，（３）オリーブオイル，サラダオイル，ゴマ油などの植物性油脂についてクルクミン２を含むクルクミンの混合粉末１ｇ当たり各５０ｍLを加えて２４時間揺動して抽出を行った。抽出後の各溶液を遠心分離して上清を回収し，さらにフイルターろ過を行って高速液体クロマトグラフイーにより成分分析を実施した。
【発明の効果】
【００１２】
ウコン栽培時の気温及び土壌成分がクルクミン２の含有量に及ぼす影響を検討した結果，土壌成分よりも気温の方が大きな影響を及ぼすことが判明した。表１は今回栽培を行ったビニールハウス内と露地における土壌分析の結果を示したものである。ビニールハウス内では土壌に堆肥や化成肥料等の養分を与えているため，肥沃な土壌となっている。一方，露地では肥料等を何も施していないため痩せた土壌になっている。次に図４は長野県山間部で露地栽培を行った際の栽培期間中における気温の変化を示した図である（この栽培条件を栽培条件−１と記す）。図４でPF値とは土壌中における水分量の指標となる値で，この値が大きいほど土壌の水分量が少ないことを表している。図５は長野県山間部でビニールハウス内栽培を行った際の栽培期間中における気温の変化を示した図である（この栽培条件を栽培条件−２と記す）。図６は沖縄県那覇市の気温（１９８１年から２０１０年までの平均）を示した図である。また図７，図８，図９はそれぞれ図４，図５，図６の条件下で栽培されたウコン中のクルクミンを高速液体クロマトグラフーにより分析を行った結果である。図９より亜熱帯地方で栽培されたウコンではクルクミン１の含有量が圧倒的に多く，クルクミン２とクルクミン３の含有量は非常に少なくなっていることが分かる。また図６の気温のデータから，亜熱帯地方では平均最高気温と平均最低気温との温度差が栽培期間を通じて約４．９℃と少なく，かつ期間中ほぼ一定の値である。クルクミンの生合成はクルクミン３→クルクミン２→クルクミン１のように進むと考えられることから，亜熱帯地方では栽培期間中は昼間と夜間で気温差が少ないため常にクルクミン１の合成が活発に行われることで，最終的にクルクミン1の含有量が非常に多くなるものと推察される。
【００１３】
次に図５に示すように長野県山間部でビニールハウス内栽培を行った場合には，栽培期間中の平均最高気温は３５℃前後から４０℃となり高温状態が続く。しかし平均最低気温は９月頃から急激に低下する。このため栽培期間中の温度差は１８℃から３０℃まで推移して非常に差が大きくなる。しかし図８の分析結果を見ると，依然としてクルクミン１の含有量が多いことが分かる。この結果から，長野県山間部でビニールハウス内栽培を行った場合には非常に温度差は大きいものの，平均最高気温が栽培期間中３５℃前後から４０℃の高温の状態で推移しているため，依然としてクルクミン１の合成が活発に行われるものと推察される。次に図４に示すように長野県山間部で露地栽培を行った場合には，８月で平均最高気温が３０℃前後，平均最低気温が２０℃以下となっている。また温度差は栽培期間中では約８℃から約１２℃の間で推移している。このように平均最高気温，平均最低気温ともに高温ではなく，かつ温度差が亜熱帯地方と比較して約５℃以上高いような気候では，寒暖差がありかつ夜間は低温の状態が続くため，亜熱帯地方で主に生育するウコンには不利な環境であると考えられる。しかしこのような植物にとって生育上不利な環境であると考えられる場合でも，図４に示すようにクルクミン２の含有量がクルクミン１の約５０％にまで増加することが分かった。以上の分析結果をまとめて表２に示す。また表１に示すようにクルクミン２の含有量を増やすためには，栽培時の土壌は肥沃である必要は無いことが分かる。
【００１４】
以上のようにして栽培されたウコンから得られるクルクミン２は水に対する溶解性が低いため，予防食品として供するめには溶解度を高めて体内で吸収されるようにしなくてはならない。そこでクルクミン２を多く含んでいる長野県山間部で露地栽培されたウコンを用いて，日常的に食用に供される酒類と油脂に対する溶解性の評価を行った。用いた酒類と油脂はアルコール含有量が５〜５０％程度の酒類，オリーブオイル，およびごま油の植物性油脂である。高速液体クロマトグラフイーにより得られた成分分析の結果を表３に示す。表３から，３種類のクルクミンは酒類と植物性油脂のいずれに対しても高い溶解性を示しており，その抽出液はそのまま予防食用として供することが可能であることが分かった。この結果より本発明の予防食品は、上記の酒類や油脂に配合した組成を有するもののほかに、我々が通常食する種々の食物、菓子類、飲料、調味料、料理、食品添加剤などに添加して利用することも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ベータセクレターゼに対する酵素阻害効果の高いクルクミン２の化学構造式
【図２】クルクミン１の化学構造式
【図３】クルクミン３の化学構造式
【図４】ウコンの栽培条件−１（長野県山間部で露地栽培を行った際の栽培条件）
【図５】ウコンの栽培条件−２（長野県山間部でビニールハウス内栽培を行った際の栽培条件）
【図６】沖縄県那覇市の気温（１９８１年から２０１０年までの平均値）
【図７】ウコンの栽培条件−１（長野県山間部で露地栽培されたクルクミンの高速液体クロマトグラフイーによる分析結果）
【図８】ウコンの栽培条件−２（長野県山間部でビニールハウス内栽培されたクルクミンの高液体クロマトグラフイーによる分析結果）
【図９】亜熱帯地方で栽培された市販品クルクミンの高速液体クロマトグラフイーによる分析結果
【００１６】
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（表１）
【００１７】
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（表２）
【００１８】
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（表３）
【実施例１】
【００１９】
長野県山間部でのウコンの露地栽培
５月上旬に種ウコンの栽培を行った。小粒の根は数個ずつ，大きな根は1個ずつ土中に埋めて約
５０株を定植した。散水は１週間毎に行った。毎日，最高気温，最低気温およびPF値を記録した。定植してから約２ヶ月後の７月初めに全ての根が発芽して約２０ｃｍ程度の茎と葉が成長した。
そのまま栽培を続け，11月下旬に収穫した。なおウコンは８月中旬から下旬にならないと新しい根が成長しない。栽培期間中のウコンの根１個の平均的な重量は，９月初旬で約１７０ｇ，９月末で約４００ｇ，１０月末で５００ｇ，11月末で約７５０ｇであった。収穫した根は水洗して
数日間天日で乾燥後，表皮を取り除いて薄く輪切りにし，温風乾燥室で約１週間乾燥させた。乾燥後のウコンは粉砕機で微粉化し，異物を除去してから冷暗所に保存した。
【実施例２】
【００２０】
ベータセクレターゼの酵素活性を阻害するクルクミン２を含有する認知症予防食品の試作１
長野県の山間部で露地栽培されたクルクミン２を０．３９ｍM含有する（１００％エタノールでは抽出後の濃度）ウコンの粉末を用いて認知症予防食品の試作を行った。飲食用に用いられるホワイトリカー（甲種酒類３５％）５００ｍLに対してウコン粉末を１０ｇ加えて２４時間，室温で揺動を行いクルクミンの抽出を行った。抽出したアルコール溶液を遠心分離して不溶性画分を除去し，さらにフイルタリングして上清部分を回収した。以上のように製造されたクルクミン２を含むホワイトリカーは黄色であり，そのまま飲料用として供するか，あるいはさらに他の果実酒の製造に用いることができる。
【実施例３】
【００２１】
ベータセクレターゼの酵素活性を阻害するクルクミン２を含有する認知症予防食品の試作２
長野県の山間部で露地栽培されたクルクミン２を０．３９ｍM含有する（１００％エタノールでは抽出後の濃度）ウコンの粉末を用いて認知症予防食品の試作を行った。調理用に用いられるオリーブオイル５００ｍLに対してウコン粉末を１０ｇ加えて２４時間，室温で揺動を行いクルクミンの抽出を行った。抽出したアルコール溶液を遠心分離して不溶性画分を除去し，さらにフイルタリングして上清部分を回収した。以上のように製造されたクルクミン２を含むオリーブオイルはわずかに淡黄色を呈している。そのまま調理用として供することができる。
【実施例４】
【００２２】
ベータセクレターゼの酵素活性を阻害するクルクミン２を含有する認知症予防食品の試作３
長野県の山間部で露地栽培されたクルクミン２を０．３９ｍM含有する（１００％エタノールでは抽出後の濃度）ウコンの粉末を用いて認知症予防食品の試作を行った。調理用に用いられるごま油５００ｍLに対してウコン粉末を１０ｇ加えて２４時間，室温で揺動を行いクルクミンの抽出を行った。抽出したアルコール溶液を遠心分離して不溶性画分を除去し，さらにフイルタリングして上清部分を回収した。以上のように製造されたクルクミン２を含むごま油は色調に変化は無く，しかもクルクミン独特の臭いが無い。このものをそのまま調理用として供することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上説明したとおり本発明による培養法によれば、Ａbの産生を引き起こす原因となる酵素であるベータセクレターゼの活性を効果的に阻害するクルクミン２を，これまでの亜熱帯地域で栽培されたものと比較して約１０倍含有しており，有効な栽培方法であることが明かとなった。また本発明による認知症予防食品によれば，これまでは溶解性が低く体内での吸収が困難であった
クルクミン２を効果的に溶解して，さらに食品として供することができることから日常的な食事を通した予防効果が期待でいることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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