(57)【要約】      （修正有）【課題】一または複数のRGD（Arg-Gly-Asp）配列を含むアネキシンA5変異体、及び、そのヒトを含む哺乳類における疾患の治療での使用の提供。【解決手段】アネキシンA5変異体は、たとえば、アテローム硬化性斑などの慢性炎症性疾患の治療またはCOPDの治療で使用することができる。アネキシンA5のアミノ酸配列の1〜19の範囲または他の領域内において３個のアミノ酸からなる配列を置換する少なくとも１個のRGD配列；あるいは、Ｎ−末端側で伸長部の一部であってもよい一または複数のRGD配列は、アテローム硬化性斑などの慢性炎症性疾患の治療またはCOPDの治療で使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシン鎖の中に少なくとも１個かつ２０個以下のRGD配列を含む、アネキシンA5変異体。
【請求項２】
２個以上のRGD配列を含み、RGD配列の各ペアが、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから選択される１〜３個のアミノ酸により分離される、請求項１に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項３】
少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-19、46-64、86-89、118-135、157-170、203-219、245-248および280-294の範囲内において３個のアミノ酸からなる配列を置換する、請求項１または２に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項４】
少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-15の範囲内において、好ましくは1-10の範囲内において、３個のアミノ酸からなる配列を置換する、請求項３に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項５】
少なくとも１個のRGD配列が、アネキシンA5分子のＮ−末端にあるアミノ酸配列伸長部に位置する、請求項１または２に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項６】
少なくとも１個のRGD配列が、3〜20個のアミノ酸を含有する環状配列の一部である、請求項１〜２および５の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項７】
16-29、59-74、88-102、135-145、156-169、202-231、259-266、および305-317の位置にあるD、E、K、R、N、Qから選択される少なくとも１個のアミノ酸が、G、A、P、S、TおよびVから選択されるアミノ酸により置換される、請求項１〜６の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項８】
1-19、24、28、46-64、86-89、118-135、149-150、157-170、203-219、245-248および280-294の位置の一つに、システイン残基を更に含有し、前記システイン残基が、診断分子または治療分子に任意に連結される、請求項１〜７の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項９】
Ｎ−末端に2〜10個のヒスチジン残基を更に含み、前記ヒスチジン残基の少なくとも２個が、隣接しているか、またはわずか１個の他のアミノ酸により分離され、任意に放射性核種に結合される、請求項１〜８の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１０】
ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞の食作用を刺激する際に使用するための、請求項１〜９の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１１】
所望の治療効果として食作用の増大を含む、ヒトを含む哺乳類における疾患の治療で使用するための、請求項１０に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１２】
慢性自己免疫疾患を含む慢性炎症性疾患の治療で使用するための、請求項１０または１１に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１３】
アテローム硬化性斑の治療で使用するための、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１４】
COPDの治療で使用するための、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１５】
全身性エリテマトーデスの治療で使用するための、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１６】
慢性関節リウマチの治療で使用するための、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１７】
アポトーシスを受けている細胞および/または組織に治療剤を投与するために使用される組成物であって、請求項１〜１０の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体、並びに薬学的に許容可能な賦形剤、担体および/または希釈剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルセリン露出細胞の食作用を向上させる際に使用するため、たとえば、アテローム性動脈硬化症などの慢性炎症および全身性エリテマトーデス(SLE)などの慢性自己免疫疾患により特徴づけられる疾患の治療のための手段および方法に関する。
【背景】
【０００２】
アポトーシスは、アテローム発生に重要な役割を果たす。斑におけるアポトーシス細胞の数と斑の不安定性との間には、正の相関関係が存在する。アポトーシス細胞の食作用は、不安定な表現型へ向かうアテローム性動脈硬化症の進行と関連がある。食作用障害は、不安定な表現型へ向かうアテローム硬化性斑の加速的進行と関連がある。このため、アテローム性動脈硬化症は、アポトーシス細胞の食作用を向上させる方法で治療することができる。
【０００３】
アポトーシス細胞は、その細胞表面にホスファチジルセリン(PS)を露出する。アネキシンA5 (anxA5) は、アポトーシス細胞表面で発現されるPSに結合する。アポトーシス細胞に結合したAnxA5は、‘私を食べて（eat me）’シグナルとして食細胞により認識されるPSを遮蔽することにより食作用を阻害する (Kenis et al. Exp. Cell Res. 312 (2006) 719-726; およびここで引用される参照文献)。
【０００４】
Asano et al. J. Exp. Med. 200(4), 459-467 (2004) は、RGDモチーフに点突然変異を含有する乳脂肪球の変異体が、マウスに注入されると、アポトーシス細胞の食作用を阻害し、自己抗体の産生を誘導することを示す。
【０００５】
Berat et al., Biointerphases 2(4), 165-172 (2007) は、ラットのアネキシンA5変異体を記載し、ここで、Thr-163はCysにより置換され、RGD (アルギニン-グリシン-アスパルテート) モチーフおよびCys残基を含有する合成オリゴペプチドが、ジスルフィド結合によりアネキシン変異体の当該Cys残基に連結する。これらアネキシン−RGD接合体のマトリクスは、ヒト伏在静脈内皮細胞の接着を促進することが見出された。著者らは、これらの結果が、細胞輸送技術などを切り開くことを示唆する。RGDモチーフがCys-Cys (ジスルフィド) 架橋を介して分子の中心部分に付着しているアネキシン変異体は、種々の環境で不十分な安定性を示すという欠点がある。
【発明の説明】
【０００６】
本発明は、アポトーシス細胞上のPSに結合し、食作用を阻害することなくアポトーシス細胞を飲み込むように食細胞を活性化するanxA5変異体を使用することにより、食作用を向上させる方法を記載する。
【０００７】
AnxA5の三次構造は、４つのドメイン、並びにドメインIおよびIVを接続する分子の凹面側にあるＮ−末端部で配置される。Ｎ−末端部は、Ca2+/リン脂質結合部位をもつanxA5分子の凸面側の反対の位置にある。このため、凹面側、およびとりわけＮ−末端部は、PS−結合能を妨害することなく、変異させ、様々な分子（たとえばタンパク質または糖）に接合することができる。
【０００８】
よって、本発明のanxA5変異体は、Ｎ−末端部の伸長部または凹面側の他の場所に、あるいはＮ−末端部の伸長部または凹面側の他の場所として、食作用誘導シグナルをもつことができる。食作用誘導シグナルは、１個以上、20個までのRGD (アルギニン-グリシン-アスパルテート) モチーフとすることができる。変異体は、食細胞のインテグリン受容体を活性化するＮ−末端部にRGDモチーフを有するanxA5誘導体とすることができる。また、IgGのFc-ドメインまたはその一部をもつanxA5誘導体も、食細胞のIgG-受容体を活性化する。
【０００９】
少なくとも一つまたは好ましくはそれぞれのRGDモチーフは、中性アミノ酸、とりわけ、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから選択されるアミノ酸により隣接される（flank）ことが好ましい。
【００１０】
本発明のanxA5変異体は、アネキシン鎖の中に、すなわちアネキシン分子を構成する直鎖ポリペプチドの中に、少なくとも一つのRGDモチーフを含有する。よって、RGDモチーフは、アネキシンポリペプチド鎖の中に挿入されてもよいし、アネキシン分子の一または複数のアミノ酸を置換してもよいし、あるいはアネキシン分子のＮ−末端側に付着されてもよい。よって、アネキシン変異体は、適切に改変されたDNAで形質転換された宿主細胞を用いて組換え生産により生産することができ、また、かかる組換え生産により生産されることが好ましい。
【００１１】
たとえば、本発明のanxA5変異体は、anxA5タンパク質の凹面に、３個のアミノ酸からなる配列を置換する一または複数のRGD配列をもつことができる。anxA5の凹面にあるアミノ酸は、表１（配列番号１）に示される配列においてイタリック体で示され、アミノ酸の位置1-19、24、28、46-64、86-89、118-135、150、157-170、202-219、245-248、および280-294を含む。よって、一または複数のRGDモチーフは、好ましくは、1-19、46-64、86-89、118-135、157-170、203-219、245-248および280-294の範囲内、より好ましくは、表１に太字のイタリック体で示される1-15、46-58、86-87、118-134、(170)、245-248および280-294の範囲内に位置する。 
とりわけ、本発明のanxA5変異体は、表１（配列番号１）の1-15の範囲内、好ましくは1-10の範囲内に、３個のアミノ酸からなる配列を置換する少なくとも一つのRGD配列を有する。この態様の適切な例は、天然の配列の適切な置換による配列49-51 (QEのGDによる置換)、17-19 (AのGによる置換)、13-15 (GFのRGによる置換) を含み；後半の２つにおいては、16にあるEが、中性アミノ酸により更に置換されることが好ましい。より適切な例は、10-12 (DFPのRGDによる置換)、8-10 (VTのRGによる置換)、1-3 (AQVのRGDによる置換)、とりわけ5-7 (TのDによる置換) を含む。
【表１】
2016040283.tif 000002
【００１２】
択一的または付加的に、本発明のanxA5変異体は、分子のＮ−末端に伸長部を有することができ、この伸長部は、一または複数のRGD配列を含有する。伸長部は、たとえば、X1RGDX2 または (X1RGDX2)nであってもよく、ここで、X1およびX2は、任意の一連のアミノ酸で、末端のアミノ酸は、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから、好ましくはA、G、PおよびSから選択することができ、nは、1-19、好ましくは2-9、たとえば2または3とすることができる。しかし、好ましくは、X1およびX2はそれぞれ、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから、好ましくはA、G、PおよびSから選択される１または２個のアミノ酸である。よって、一つの例は、表１の配列（配列番号１）のＮ−末端(A)に付着した配列ARGDである。更なる例は、anxA5分子のＮ−末端に伸長したRGDAARGD、RGDAARGDAARGDA（配列番号３、４）などを含む。よって、anxA5変異体が、２個以上のRGD配列を含有する場合、RGD配列の各ペアは、好ましくは、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから選択される１〜３個のアミノ酸により分離される。
【００１３】
更なる選択肢として、本発明のanxA5変異体は、アネキシン分子のＮ−末端側において、すなわち配列番号１（表１）の位置1-19の一つにおいて、一つのアミノ酸を置換するシステイン残基に付着される一または複数のRGD配列を含有してもよい。この目的のために、システイン残基は、当該技術分野で公知の方法により、たとえばWO 2006/003488（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるとおり、上記の位置の一つに導入される。一または複数のRGDモチーフは、たとえばリンカーにより、システイン残基のスルフヒドリル基に連結することができる。リンカーは、たとえば、マレイミド含有基、ハロゲン含有基、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、およびスクシンイミジルエステル基から選択することができ、これに、たとえばエチレンジアミンが結合する。よって、とりわけ、リンカーは、アミノ基を含有し、これに、RGDモチーフ、またはX1RGDX2 もしくは (X1RGDX2)n モチーフ (上記参照) が結合することができる。
【００１４】
かかるCys誘導体では、凹面でない位置に、とりわけ表１で下線により示される分子内に埋め込まれた部位に、元々存在する任意のシステインが、別のアミノ酸、たとえばアラニンまたはセリン残基により置換されることが好ましい；WO 2006/003488およびWO 2007/069895を参照。これは、anxA5分子の位置315に元々存在するシステイン残基に具体的に適用される。このため、Cys-315が別のアミノ酸により置換されるかまたは欠失したanxA5変異体が、好ましい。
【００１５】
直鎖のRGD含有配列に対して択一的または付加的に、anxA5変異体は、環状のRGD配列またはその複数を含有してもよい。かかる環状のRGD配列は、環状構造c-X3RGDをもっていてもよく、ここでX3は、RおよびD以外の１、２または３個のアミノ酸を表してもよく、これは、たとえばK、N、Qなどの一つの連結アミノ酸、またはトリアゾール含有アミノ酸、またはanxA5分子（たとえばそのシステイン残基）に連結させる他の合成アミノ酸を含有する。環状RGD誘導体の合成は、たとえば、Kuijpers et al. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1847-1854 およびここで引用される参照文献により記載される。RGDは、たとえば、RGDモチーフの両側にシステインを隣接させ（flank）、そのシステインを酸化してジスルフィド架橋を形成することにより、環状にすることができる。下記式は、隣接システイン残基のジスルフィド架橋形成により環状にした環状RGDを含有する5-20アミノ酸のペプチドの一例を示す。
【００１６】
一つの態様において、RGDまたは環状RGDを含有する3-20アミノ酸のペプチドは、たとえばアネキシンポリペプチドに存在するアミノ基またはスルフヒドリル基への連結などのための標準的技術を用いて、化学的カップリングにより、アネキシンA5またはその変異体に連結される。好ましい態様は、アネキシン分子の凹面側、とりわけＮ−末端側に連結されたRGDまたは環状RGDを含有する3-20アミノ酸のぺプチドを有するアネキシンA5またはその変異体を包含する。
【化１】
2016040283.tif 000003
【００１７】
特別な態様において、RGDモチーフを含有する本発明のアネキシン変異体は、細胞へのインターナリゼーションを阻害するように更に改変される。かかる変異体において、アネキシン分子の間で分子間相互作用に関与するへリックス内の一または複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換される。これらの置換アミノ酸は、アネキシンA5の位置16-29、59-74、88-102、135-145、156-169、202-231、259-266、および305-317に位置し、これらの位置は、表１（配列番号１）に下線を付す。アネキシン変異体が、これらの改変の一または複数を含有する場合、細胞へインターナリゼーションされないアネキシンの特徴が実現される。よって、本発明はまた、a) 一または複数のRGD配列を含有し、かつb) 本明細書に記載されるアミノ酸の改変の一または複数を含有するアネキシン変異体を含む。かかるアネキシン誘導体は、WO 2007/069895に記載され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
インターナリゼーションを阻害する好ましい改変は、置換、とりわけ極性アミノ酸の非極性アミノ酸による置換である。よって、置換のために好ましいアミノ酸は、アルギニン(R)、リジン (K)、アスパルテート (D)、グルタメート (E)、アスパラギン (N) およびグルタミン (Q) を含む。これらは、たとえば、グリシン (G)、アラニン (A)、プロリン (P)、セリン (S)、トレオニン (T) およびバリン (V)、とりわけAまたはGにより、または別のアネキシンの対応する位置に位置する非極性アミノ酸により、置換され得る（表１参照）。置換されたアミノ酸の適切な例は、E21、K25 (たとえばG、Tによる)、R62 (たとえばG、A)、D63 (たとえばG、A、P)、K69、D91、K96、H97、K100、E137 (たとえばA、G、V)、D138、D139、N159 (たとえばA、G、S)、R160、R206、K207、Q219、D225、R226、D264、K308、K309を含む。この特別な態様において、細胞の部位でアネキシンの三量体化を更に減らすために、異なる領域に、たとえばR62A ＋ E137G、またはK69A ＋ K100A ＋ N159Sなどに、少なくとも２つ、または少なくとも３つの置換を有することが好ましい。
【００１９】
anxA5変異体が、凹面の位置1-19、24、28、46-64、86-89、118-135、149-150、157-170、203-219、245-248および280-294の一つに、システイン残基を更に含有する上述の態様において、前記システインは、上述のとおり、一または複数のRGDモチーフへの連結を可能にする。
【００２０】
たとえば適切な置換または伸長により一または複数のRGDモチーフを既に含有する分子において、前記システイン残基は、たとえばWO 2006/003488に記載されるとおり、診断分子または治療分子との連結にとって適切な官能基となり得る。適切な診断剤（diagnostics）は、たとえば可視、近赤外および赤外の領域における蛍光色素などの光学プローブ、並びに、たとえば99mTc、68Ga、64Cu、111In、124Iおよび18Fなどの核プローブである。適切な治療剤は、プロテアーゼ活性を阻害する化合物、たとえばマトリクス金属プロテアーゼを阻害する化合物またはペプチドである。他の適切な治療剤（therapeutics）は、血小板活性化および血液凝固を阻害する化合物、たとえばヘパリンまたはその低分子量誘導体である。また、適切な治療剤は、ベータ放射を有するラジオアイソトープ、たとえば186Reおよび90Yである。これらの例は、指標の目的を果たし、可能性の制限を意味しない。
【００２１】
アネキシン変異体に診断または治療の金属種を提供するための代わりの手段として、本発明のアネキシンA5変異体は、有利には、そのＮ−末端に２〜１０個のアミノ酸残基を更に含み、金属の診断剤（diagnostics）または治療剤（therapeutics）との結びつきを可能にする。かかるアミノ酸は、とりわけヒスチジン残基であり、前記ヒスチジン残基の少なくとも２つは、隣接しているか、またはわずか１個の他のアミノ酸により分離される。金属の診断剤（diagnostics）または治療剤（therapeutics）は、放射性核種、たとえばガリウム67、ガリウム68、インジウム111、テクネチウム99m、レニウム188、銅64およびスズ117mとすることができる。一例は、たとえば、アミノ酸1-15の領域にRGDモチーフを担持するかまたはアミノ酸1-15の領域にRGDモチーフを付着し、更に、１位のアラニンのＮ末端側に付着した3-6個のヒスチジン残基を含有し、それに金属の一つが結びついている、本発明のアネキシン変異体である。ヒスチジン残基およびそれらの金属複合体を含有するアネキシン変異体および用途が、WO 2010/024673に記載される。
【００２２】
本発明のanxA5変異体は、上述の置換および付加のほかに、表１（配列番号１）に示される配列に対して更なる置換、欠失または挿入を含有してもよい。かかる置換、欠失または挿入は、表１のヒトanx5配列を、他の動物種、たとえばラット、マウス、サル、ウシなどのもの、または他のアネキシン、たとえばanxA1、anxA4、anxA8、anxA9などのもの（これら配列は、たとえばhttp://www.structuralchemistry.org/annexins/seq/search.phpにより容易にアクセス可能である）と比較した場合に存在するような保存的置換であり得る。
【００２３】
しかし、本発明のanxA5変異体のアミノ酸配列は、上述のＮ−末端側または側鎖での伸長のほかに、配列番号１の配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性および少なくとも90％のアミノ酸類似性を有することが好ましく、より好ましくは、少なくとも90％のアミノ酸同一性および少なくとも95％のアミノ酸類似性を有し、最も好ましくは、95−99.7％のアミノ酸同一性およびとりわけ97−99.7％のアミノ酸類似性を有する。AnxA5変異体は、ヒトのanxA5に基づいており、すなわち、ヒトの配列（表１、配列番号１）と上記程度の同一性を有することが好ましく、特に凸面領域（表１の非下線部）においてそうであることが好ましく、とりわけ、領域29-45のアミノ酸同一性が、少なくとも90％ (17のうち少なくとも15)、より好ましくは少なくとも95％ (16/17)、最も好ましくは100％ (17アミノ酸のすべてが同一) である。
【００２４】
本明細書に記載されるanxA5変異体は、本明細書に記載されるような薬学的組成物、方法、キット、およびデバイスで使用することができる。本発明の態様は、少なくとも一つの薬学的に許容可能な賦形剤を任意に含有する上記変異体の治療組成物を投与することを含む、疾患の治療を必要とする被検体を治療するための方法に関する。治療組成物の投与および投薬量は、患者の間で変化させることができ、医療分野で周知である。好ましい投薬量は、他のファクターのなかでも、治療される疾患、治療の化合物または化合物の混合物、および患者に依存する。複合体の可能なデリバリールートは、皮下、筋内、腹腔内および静脈内投与である。当業者であれば、他のデリバリールートを知っている。複合体は、ボーラスとして、または長期間にわたって輸液によって連続的に投与することができる。用量は、診断行為において0.1μg/kg〜100 mg/kg (体重あたりのanxA変異体) にわたり、治療行為において1μg/kg〜100 mg/kgにわたる。好ましい範囲は、1μg/kg〜1 mg/kg (診断) および5μg/kg〜50 mg/kg (治療) である。
【００２５】
上述のanxA5変異体は、ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞、特にアポトーシス細胞の食作用を刺激する際に使用するために適している。よって、anxA5変異体は、所望の治療効果として食作用の増大を含む、ヒトを含む哺乳類における疾患の治療で使用することができる。かかる疾患は、アテローム硬化性斑、とりわけ、脈管破裂の増大リスクを有する進行アテローム硬化性斑、たとえばAHA分類タイプII、III、IV、VおよびIVにより示される斑と関連のある疾患を含む。治療効果は、斑の進行のスローダウンおよびそれに伴う破裂リスクの低下である。
【００２６】
エフェロサイトーシス（efferocytosis）の用語（エフェロから(from effero) = 死へ運び葬るまで(to bury, to carry to the grave)）は、アポトーシス細胞の食作用除去について、Henson et alにより作成された (Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, Janssen WJ, Starefeldt A, Murphy-Ullrich JE, et al., Cell 2005; 123: 321-334)。慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、ヒトおよび動物のモデルにおいてエフェロサイトーシスの欠陥と関連がある (S. Hodge et al,, Am. J. Respiratory Cell and Molecular Biology, vol. 37, pp 748-755, 2007; Vandivier et al., Chest, June 2006 vol. 129, No. 6, 1673-1682)。アポトーシス細胞は、二次性壊死を受け、これにより炎症を永続させることができる。マクロライド抗生物質アジスロマイシンのCOPD患者への低用量の投与は、現存の療法を補足するための新規アプローチとして、肺胞マクロファージの食作用能力を改善するために使用された (Hodge et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol. 178, pp 139-148, 2008)。したがって、anxA5変異体は、アポトーシス細胞の除去を刺激することによるCOPDの治療に有効である。
【００２７】
本発明のanxA5変異体は、ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞の食作用を刺激するための方法であって、anxA5変異体を、それを必要とする被検体に、薬学的に許容可能な組成物で投与することを含む方法で使用することができる。かかる組成物は、液剤の静脈内注入により、または薬学的エアロゾルデリバリー製剤の吸入により、投与され得る。
【００２８】
本発明のanxA5変異体は、食作用が欠陥を有し、炎症反応が中心的役割を果たす状態を治療するために特に有効である。このため、本発明は、慢性炎症性疾患、たとえば関節炎、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)（慢性気管支炎および気腫を含む）、並びに慢性自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病を含む）、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、シェーグレン症候群などの治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａは、anxA5-FITCとインキュベートしたMCF-7細胞のフローサイトメトリー分析のヒストグラムを示し；図１Ｂは、例１に従って作成されたRGD-anxA5-FITCとインキュベートしたMCF-7細胞のヒストグラムを示す。MCF-7細胞をRGD-anxA5-FITCとインキュベートすると、RGD-anxA5-FのMCF-7細胞への結合が増大した。
【図２】図２は、AnxA5が、分化THP-1細胞によりアポトーシスJurkat細胞の食作用を阻害し、RGD-anxA5が、分化THP-1細胞によりアポトーシスJurkat細胞の食作用を刺激することを示す。
【実施例】
【００３０】
Ｎ−末端部に食作用誘導シグナルを担持するAnxA5変異体を作成する。変異体は、Ｎ−末端部にシステイン残基を、末端部の伸長部として、または２位のグルタミンの置換により末端部内に、更に含有することができる。
【００３１】
例１：RGDモチーフを有するアネキシンA5変異体の作成
ヒトのアネキシンA5 cDNAを、当該分野で公知の標準技術を用いて、健康なボランティアに由来する白血球cDNAライブラリーから調製した。cDNA配列のコードするアミノ酸配列を表１に示す。7位のACN (N = T, C, AまたはG) によりコードされるT (Thr)が、GAY (Y = TまたはC) によりコードされるD (Asp) によって置換されていることを除いて、得られたcDNAが表１のアミノ酸配列をコードするように、PCR技術によりアネキシンA5を変異させるために、プライマーを設計した。変異体をA5 T7Dと表示し、その配列を配列番号２に示す。
【００３２】
アネキシンA5-T7D cDNAを、当該分野で公知の標準技術を用いて、細菌発現ベクターにクローニングした。得られた細菌発現ベクターで形質転換されたE. coliを、発酵槽で増殖させた。細菌により産生されたアネキシンA5-T7D変異体は、当業者に公知の標準クロマトグラフィー技術を用いて、E. coli溶解物から単離精製した。精製されたアネキシンA5-T7D変異体は、SDS-PAGEにおいて約34kDaの見かけの分子量をもつ均一なバンドとして現れ、BiaCoreシステムを用いたプラズモン表面共鳴技術により測定されるように、完全なカルシウム依存性ホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００３３】
例２：RGDモチーフを有するアネキシンA5変異体の効果
T7D置換が、anxA5の機能的なRGDモチーフにつながることを実証するために、MCF-7細胞(図１) およびTHP-1細胞を、フルオレセイン標識anxA5またはフルオレセイン標識T7D anxA5とインキュベートした。MCF-7細胞およびTHP-1細胞は、αvβ3およびαvβ5を発現する。予備データにより、RGD (アルギニン-グリシン-アスパラギン酸) がanxA5のＮ−末端部へ組込まれると、αvβ3およびαvβ5発現細胞への結合が増大することが確認され、このことは、RGDがインテグリン受容体との相互作用のために露出されていることを示す (図１参照)。
【００３４】
更に、THP-1細胞 (食細胞) およびanti-Fas刺激性Jurkat細胞 (アポトーシス細胞) の混合物にanxA5またはT7D anxA5を添加することにより、アポトーシス細胞の食作用に対するanxA5またはT7D anxA5の効果を調べた。AnxA5は、おそらくアポトーシス表面上で発現されるPSを遮蔽することによりアポトーシス細胞の食作用を阻害する。anxA5のＮ−末端部にRGDを導入することにより、阻害は、食作用の増強へと逆行する (図２参照)。したがって、予備データの全体的な結論は、anxA5のＮ−末端部のRGDが、おそらく食細胞のインテグリン受容体の活性化によりアポトーシス細胞の食作用を刺激するということである。図２は、AnxA5が、分化THP-1細胞によりアポトーシスJurkat細胞の食作用を阻害し、RGD-anxA5が、分化THP-1細胞によりアポトーシスJurkat細胞の食作用を刺激することを示す。
【００３５】
例３：Ｎ−末端にRGDモチーフおよびCys残基を有するアネキシンA5変異体の作成
ヒトのアネキシンA5 cDNAを、例１に記載される手法で変異させ、更に、2位のGAR (R = AまたはG) によりコードされるQ (Gln)を、TGY (Y = TまたはC) によりコードされるC (Cys)によって置換した。変異体をA5 Q2C T7Dと表示する。
【００３６】
この変異体のシステインは、診断剤（diagnostics）または治療剤（therapeutics）を連結するために使用することができる。変異体は、更に、Cys-315をたとえばSerまたはAlaにより置換することによって変異させることができる。
【図１】
2016040283.tif 000004
【図２】
2016040283.tif 000005
【配列表】
2016040283000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月23日(2015.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシン鎖の中に少なくとも１個かつ２０個以下のRGD配列を含む、アネキシンA5変異体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
この変異体のシステインは、診断剤（diagnostics）または治療剤（therapeutics）を連結するために使用することができる。変異体は、更に、Cys-315をたとえばSerまたはAlaにより置換することによって変異させることができる。
本願の出願当初の請求項を、実施の態様として以下に付記する。
［１］  アネキシン鎖の中に少なくとも１個かつ２０個以下のRGD配列を含む、アネキシンA5変異体。
［２］  ２個以上のRGD配列を含み、RGD配列の各ペアが、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから選択される１〜３個のアミノ酸により分離される、［１］に記載のアネキシンA5変異体。
［３］  少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-19、46-64、86-89、118-135、157-170、203-219、245-248および280-294の範囲内において３個のアミノ酸からなる配列を置換する、［１］または［２］に記載のアネキシンA5変異体。
［４］  少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-15の範囲内において、好ましくは1-10の範囲内において、３個のアミノ酸からなる配列を置換する、［３］に記載のアネキシンA5変異体。
［５］  少なくとも１個のRGD配列が、アネキシンA5分子のＮ−末端にあるアミノ酸配列伸長部に位置する、［１］または［２］に記載のアネキシンA5変異体。
［６］  少なくとも１個のRGD配列が、3〜20個のアミノ酸を含有する環状配列の一部である、［１］〜［２］および［５］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［７］  16-29、59-74、88-102、135-145、156-169、202-231、259-266、および305-317の位置にあるD、E、K、R、N、Qから選択される少なくとも１個のアミノ酸が、G、A、P、S、TおよびVから選択されるアミノ酸により置換される、［１］〜［６］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［８］  1-19、24、28、46-64、86-89、118-135、149-150、157-170、203-219、245-248および280-294の位置の一つに、システイン残基を更に含有し、前記システイン残基が、診断分子または治療分子に任意に連結される、［１］〜［７］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［９］  Ｎ−末端に2〜10個のヒスチジン残基を更に含み、前記ヒスチジン残基の少なくとも２個が、隣接しているか、またはわずか１個の他のアミノ酸により分離され、任意に放射性核種に結合される、［１］〜［８］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１０］  ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞の食作用を刺激する際に使用するための、［１］〜［９］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１１］  所望の治療効果として食作用の増大を含む、ヒトを含む哺乳類における疾患の治療で使用するための、［１０］に記載のアネキシンA5変異体。
［１２］  慢性自己免疫疾患を含む慢性炎症性疾患の治療で使用するための、［１０］または［１１］に記載のアネキシンA5変異体。
［１３］  アテローム硬化性斑の治療で使用するための、［１０］〜［１２］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１４］  COPDの治療で使用するための、［１０］〜［１２］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１５］  全身性エリテマトーデスの治療で使用するための、［１０］〜［１２］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１６］  慢性関節リウマチの治療で使用するための、［１０］〜［１２］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
［１７］  アポトーシスを受けている細胞および/または組織に治療剤を投与するために使用される組成物であって、［１］〜［１０］の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体、並びに薬学的に許容可能な賦形剤、担体および/または希釈剤を含む組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月18日(2016.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシン鎖の中に少なくとも１個かつ２０個以下のRGD配列を含み、少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-15、46-58、86-87、118-134、245-248および280-294の範囲内において３個のアミノ酸からなる配列を置換する、ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞のホスファチジルセリンに結合しその食作用を刺激するアネキシンA5変異体。
【請求項２】
２個以上のRGD配列を含み、RGD配列の各ペアが、A、G、I、L、M、P、S、TおよびVから選択される１〜３個のアミノ酸により分離される、請求項１に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項３】
少なくとも１個のRGD配列が、配列番号１の1-10の範囲内において３個のアミノ酸からなる配列を置換する、請求項１または２に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項４】
少なくとも１個のRGD配列が、アネキシンA5分子のＮ−末端にあるアミノ酸配列伸長部に位置する、請求項１または２に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項５】
少なくとも１個のさらなるRGD配列が、3〜20個のアミノ酸を含有する環状配列の一部である、請求項１〜４の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項６】
16-29、59-74、88-102、135-145、156-169、202-231、259-266、および305-317の位置にあるD、E、K、R、N、Qから選択される少なくとも１個のアミノ酸が、G、A、P、S、TおよびVから選択されるアミノ酸により置換される、請求項１〜５の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項７】
1-19、24、28、46-64、86-89、118-135、149-150、157-170、203-219、245-248および280-294の位置の一つに、システイン残基を更に含有する、請求項１〜６の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項８】
Ｎ−末端に2〜10個のヒスチジン残基を更に含み、前記ヒスチジン残基の少なくとも２個が、隣接しているか、またはわずか１個の他のアミノ酸により分離され、放射性核種に結合される、請求項１〜７の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項９】
ホスファチジルセリンを表面に露出する細胞の食作用を刺激する際に使用するための、請求項１〜８の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１０】
所望の治療効果として食作用の増大を含む、ヒトを含む哺乳類における疾患の治療で使用するための、請求項９に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１１】
慢性自己免疫疾患を含む慢性炎症性疾患の治療で使用するための、請求項９または１０に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１２】
アテローム硬化性斑の治療で使用するための、請求項９〜１１の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１３】
COPDの治療で使用するための、請求項９〜１１の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１４】
全身性エリテマトーデスの治療で使用するための、請求項９〜１１の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１５】
慢性関節リウマチの治療で使用するための、請求項９〜１１の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体。
【請求項１６】
アポトーシスを受けている細胞および/または組織に治療剤を投与するために使用される組成物であって、請求項１〜９の何れか１項に記載のアネキシンA5変異体、並びに薬学的に許容可能な賦形剤、担体および/または希釈剤を含む組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載のアネキシンA5変異体の診断分子または治療分子への連結体であって、前記システイン残基が前記診断分子または治療分子に連結される連結体。
【外国語明細書】
2016040283000001.pdf