(57)【要約】【課題】細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子を明らかにし、当該標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、細胞中のＤＮＡ−ＰＫ活性の正確な測定方法を提供する。また、ＤＮＡ−ＰＫの標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法及びキットを提供する。【解決手段】ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程を含む、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性の測定方法、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法及びキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程を含む、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性の測定方法。
【請求項２】
放射線照射された生体由来の細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性を測定する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
インビトロで、被検細胞と対照細胞に同量の放射線を照射する工程と、
放射線を照射された被検細胞及び放射線を照射された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、
被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して放射線感受性が高いと判定する工程と、
を含む、被検細胞の放射線感受性の判定方法。
【請求項４】
インビトロで、被検細胞と対照細胞にＤＮＡ二重鎖切断を形成させる同量の刺激を与える工程と、
ＤＮＡ二重鎖切断が形成された被検細胞及びＤＮＡ二重鎖切断が形成された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、
被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して癌罹患性が高いと判定する工程と、
を含む、被検細胞の癌罹患性の判定方法。
【請求項５】
被検物質の存在下及び非存在下において、ＸＲＣＣ４タンパク質とＤＮＡ−ＰＫとを反応させる工程と、
前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、
被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの活性化剤であると判定する工程と、
を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体により測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化レベルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫ活性測定キット。
【請求項９】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、放射線感受性判定キット。
【請求項１０】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、癌罹患性判定キット。
【請求項１１】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングキット。
【請求項１２】
前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体が、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性の測定方法、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法、ＤＮＡ−ＰＫ活性測定キット、放射線感受性判定キット、癌罹患性判定キット、及び、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線は生体の遺伝情報を担うＤＮＡ分子を傷つけることによって、制癌作用、致死作用、発癌作用等の様々な作用を発揮する。放射線によって誘発される様々なＤＮＡ損傷の中で、ＤＮＡ二重鎖切断は最も重篤なものであり、上記の作用に最も密接に関わると考えられている。
【０００３】
ヒトを含む哺乳動物の細胞において、ＤＮＡ二重鎖切断は、主として非相同末端結合と相同組換えによって修復される。非相同末端結合に関与する不可欠の分子は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６（別名Ｋｕ８０）、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ、ＸＬＦ（別名Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ）である。
【０００４】
これらのうち、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、タンパク質リン酸化酵素複合体を形成する。この複合体はＤＮＡ−ＰＫと呼ばれている。ＤＮＡ−ＰＫはＤＮＡ二重鎖切断の認識に重要な役割を担う。Ｋｕ７０とＫｕ８６がＤＮＡ二重鎖切断の切断部位に結合し、ＤＮＡ−ＰＫｃｓがタンパク質リン酸化触媒機能を担う。
【０００５】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのいずれかを欠損する細胞又は動物個体は、放射線感受性及び免疫不全を示す。ヒトにおいても、２００９年と２０１３年にＤＮＡ−ＰＫｃｓ遺伝子に変異を持つ患者が報告され、放射線感受性及び免疫不全が認められている。
【０００６】
このように、ＤＮＡ−ＰＫは重要な生理機能を担う分子であるにもかかわらず、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのリン酸化機能がＤＮＡ二重鎖切断修復になぜ必要か、どのように機能しているのかはほとんど解明されていない。また、細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子の解明も進んでいない。現在、細胞内でＤＮＡ−ＰＫがリン酸化する標的分子として確認されているのは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓそのもののみである。
【０００７】
従来のＤＮＡ−ＰＫ活性の測定方法としては、例えば、細胞抽出液を調製し、試験管内でのリン酸化活性を測定する方法が知られている。この方法は、ＤＮＡ−ＰＫがＤＮＡ依存的にタンパク質リン酸化活性を示すこと、及び、ｐ５３タンパク質のＮ末端から１５番目のセリン残基の周辺のアミノ酸配列を模した合成ペプチドが、特異性の高いＤＮＡ−ＰＫの基質となることを利用するものである。これらの性質を利用し、試験管内で細胞抽出液にＤＮＡ、合成ペプチド基質、放射性標識ＡＴＰ（［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を加えて反応させ、ペプチドに取り込まれた３２Ｐの放射活性を測定することにより、ＤＮＡ−ＰＫ活性を測定する。
【０００８】
しかしながら、この方法では、試験管内にＤＮＡを加えてＤＮＡ−ＰＫを強制的に活性化させているため、細胞内でのＤＮＡ損傷応答を反映しない場合がある。
【０００９】
従来のＤＮＡ−ＰＫ活性の別の測定方法として、細胞内でのＤＮＡ−ＰＫｃｓのリン酸化状態を指標とする方法が知られている。この方法は、ＤＮＡ−ＰＫがＤＮＡ−ＰＫｃｓそのものをリン酸化すること、すなわち、自己リン酸化することを利用するものである。
【００１０】
ＤＮＡ−ＰＫｃｓの自己リン酸化部位は１０ヶ所程度同定されており、中でもＮ末端から２６０９番目のスレオニン残基、Ｎ末端から２０５６番目のセリン残基がよく解析されている。また、これらの部位に対するリン酸化状態特異的抗体が作製され、市販もされている。この方法では、これらのリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング、免疫染色法等によって、上記部位のリン酸化状態を調べることにより、ＤＮＡ−ＰＫの細胞内での活性を評価する。
【００１１】
しかしながら、Ｎ末端から２６０９番目のスレオニン残基については、ＤＮＡ−ＰＫよりも、ＤＮＡ−ＰＫｃｓと構造的に類似性を持つＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ）タンパク質によってリン酸化されている可能性が高いことが指摘されている。このため、この方法によってはＤＮＡ−ＰＫ活性を正確に測定できない可能性がある。
【００１２】
ところで、組換えタンパク質を用いたインビトロの実験結果から、ＤＮＡ−ＰＫがＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から２６０番目のセリン残基又はＮ末端から３１８番目のセリン残基をリン酸化することが報告されている（例えば、非特許文献１、２を参照）。
【００１３】
しかしながら、非特許文献１、２では、これらのセリン残基をアラニン残基に置換した実験等の結果から、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から２６０番目のセリン残基及びＮ末端から３１８番目のセリン残基のリン酸化には生理的に重要な意義はないと結論付けられている。また、非特許文献１、２では、細胞内でＤＮＡ−ＰＫがＸＲＣＣ４タンパク質を実際にリン酸化するか否かの確認はなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Yu Y, et al., DNA-PK phosphorylation sites in XRCC4 are not required for survival after radiation or for V(D)J recombination. DNA Repair, 2(11):1239-52, 2003
【非特許文献２】Lee KJ, et al., Identification of DNA-PKcs phosphorylation sites in XRCC4 and effects of mutations at these sites on DNA end joining in a cell-free system. DNA Repair, 3(3):267-76, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、従来のＤＮＡ−ＰＫ活性の測定方法は正確でない場合があり、また、細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子の解明も進んでいないのが現状である。そこで、本発明は、細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子を明らかにし、当該標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、ＤＮＡ−ＰＫ活性の正確な測定方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明はまた、ＤＮＡ−ＰＫの標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は以下の通りである。
（１）ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程を含む、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性の測定方法。
（２）放射線照射された生体由来の細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性を測定する、（１）に記載の測定方法。
（３）インビトロで、被検細胞と対照細胞に同量の放射線を照射する工程と、放射線を照射された被検細胞及び放射線を照射された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して放射線感受性が高いと判定する工程と、を含む、被検細胞の放射線感受性の判定方法。
（４）インビトロで、被検細胞と対照細胞にＤＮＡ二重鎖切断を形成させる同量の刺激を与える工程と、ＤＮＡ二重鎖切断が形成された被検細胞及びＤＮＡ二重鎖切断が形成された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して癌罹患性が高いと判定する工程と、を含む、被検細胞の癌罹患性の判定方法。
（５）被検物質の存在下及び非存在下において、ＸＲＣＣ４タンパク質とＤＮＡ−ＰＫとを反応させる工程と、前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における前記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの活性化剤であると判定する工程と、を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
（６）前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体により測定される、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化レベルである、（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法。
（８）ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫ活性測定キット。
（９）ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、放射線感受性判定キット。
（１０）ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、癌罹患性判定キット。
（１１）ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングキット。
（１２）前記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体が、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体である、（８）〜（１１）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞中のＤＮＡ−ＰＫ活性の正確な測定方法を提供することができる。本発明はまた、ＤＮＡ−ＰＫの標的分子のリン酸化状態の測定に基づく、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法、ＤＮＡ−ＰＫ活性測定キット、放射線感受性判定キット、癌罹患性判定キット、及び、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実験例２の結果を示す写真である。
【図２】実験例３の結果を示す写真である。
【図３】実験例４の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明者らは、ヒトＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を作製した。後述するように、発明者らは、この抗体を用いたウエスタンブロッティング等の結果から、放射線照射後のＨｅＬａ細胞において、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化が増加することを見出した。
【００２１】
また、発明者らは、ＤＮＡ二重鎖切断を誘発する物質であるＺｅｏｃｉｎで細胞を処理することによってもＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化が増加することを見出した。
【００２２】
更に、発明者らは、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤を作用させると、これらのＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化が顕著に減少することを見出した。
【００２３】
以上の実験的事実を総合すると、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化は、ＤＮＡ損傷に応答して、主としてＤＮＡ−ＰＫによって行われていると考えられる。この結果は、細胞レベルにおいて、ＸＲＣＣ４タンパク質がＤＮＡ−ＰＫによるリン酸化の標的であることを示す初めての結果である。
【００２４】
したがって、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を用いて、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態を調べることにより、細胞内でのＤＮＡ−ＰＫ活性を調べることが可能である。
【００２５】
［ＤＮＡ−ＰＫ活性の測定方法］
１実施形態において、本発明は、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程を含む、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）活性の測定方法を提供する。
【００２６】
上述したように、発明者らは、ＸＲＣＣ４タンパク質が、ＤＮＡ−ＰＫによるリン酸化の標的であることを初めて明らかにした。
【００２７】
したがって、ＤＮＡ−ＰＫとＸＲＣＣ４タンパク質とを反応させた後、当該ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定することにより、ＤＮＡ−ＰＫ活性を測定することができる。
【００２８】
ＤＮＡ−ＰＫ活性の測定は、例えば、細胞を対象として行ってもよい。この場合、上記の細胞は、ＤＮＡ二重鎖切断が形成されるような刺激を受けていてもよい。ＤＮＡ二重鎖切断が形成されるような刺激としては、例えば、放射線照射、Ｚｅｏｃｉｎ等の薬物への暴露等が挙げられる。上記の細胞は、例えば、放射線照射療法を受けた癌患者の血液から抽出されたリンパ球、放射線を照射した実験動物由来の細胞、放射線を照射した培養細胞等であってもよい。
【００２９】
ＤＮＡ−ＰＫ活性の測定は、インビトロで行ってもよい。例えば、試験管内で、ＤＮＡ−ＰＫとＸＲＣＣ４タンパク質とを反応させ、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定することにより、ＤＮＡ−ＰＫ活性を測定してもよい。
【００３０】
本実施形態の方法によれば、細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、ＤＮＡ−ＰＫ活性を測定することができる。したがって、ＤＮＡ−ＰＫ活性を正確に測定することができる。また、本実施形態の方法によれば、３２Ｐ等の放射線同位体を使用しなくてもＤＮＡ−ＰＫ活性を測定することができる。
【００３１】
ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルは、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体により測定されてもよい。ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化部位としては、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から５３番目のセリン残基、Ｎ末端から２６０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２３番目のスレオニン残基、Ｎ末端から３２７番目のセリン残基、Ｎ末端から３２８番目のセリン残基等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体やアプタマー等であってもよい。
【００３２】
１実施形態において、本発明は、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫ活性測定キットを提供する。本実施形態のキットは、上述した、細胞中のＤＮＡ−ＰＫ活性の測定に好適に使用できる。上記のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体であってもよい。
【００３３】
［被検細胞の放射線感受性の判定方法］
１実施形態において、本発明は、インビトロで、被検細胞と対照細胞に同量の放射線を照射する工程と、放射線を照射された被検細胞及び放射線を照射された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して放射線感受性が高いと判定する工程と、を含む、被検細胞の放射線感受性の判定方法を提供する。
【００３４】
（放射線を照射する工程）
本工程において、被検細胞と対照細胞に同量の放射線を照射する。被検細胞としては、放射線感受性を測定する対象となる細胞を使用する。例えば、実験動物由来の細胞、樹立された培養細胞、放射線照射療法を予定している癌患者由来の細胞等が挙げられる。対照細胞としては、例えば、健常人由来の細胞、ＨｅＬａ細胞等の性状が明らかにされている細胞等が挙げられる。
【００３５】
照射する放射線としては、ＤＮＡ二重鎖切断を起こす放射線であれば特に制限されず、Ｘ線、α線、β線、γ線等が挙げられる。放射線の照射量は、例えば０Ｇｙ超５０Ｇｙであり、例えば、１〜２０Ｇｙである。
【００３６】
（リン酸化レベルを測定する工程）
続いて、放射線を照射された被検細胞及び放射線を照射された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する。ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化部位としては、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から５３番目のセリン残基、Ｎ末端から２６０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２３番目のスレオニン残基、Ｎ末端から３２７番目のセリン残基、Ｎ末端から３２８番目のセリン残基等が挙げられる。
【００３７】
リン酸化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により測定してもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体やアプタマー等であってもよい。
【００３８】
（判定する工程）
続いて、被検細胞及び対照細胞におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを比較する。被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合には、被検細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性が対照細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性よりも低いと考えられる。このような場合には、被検細胞は対照細胞と比較して放射線感受性が高いと判定することができる。ここで、放射線感受性が高いとは、放射線照射による影響をより受けやすいことを意味する。
【００３９】
本実施形態の判定方法は、基礎研究に用いることができるほか、例えば、放射線照射療法を予定している癌患者の放射線感受性を判定し、治療に使用する放射線量を決定したり、治療効果を予測したり、副作用を予測したり、治療方針を決定するための判断材料等に用いることもできる。
【００４０】
１実施形態において、本発明は、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、放射線感受性判定キットを提供する。本実施形態のキットは、上述した、被検細胞の放射線感受性の判定に好適に使用できる。上記のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体であってもよい。
【００４１】
［被検細胞の癌罹患性の判定方法］
１実施形態において、本発明は、インビトロで、被検細胞と対照細胞にＤＮＡ二重鎖切断を形成させる同量の刺激を与える工程と、ＤＮＡ二重鎖切断が形成された被検細胞及びＤＮＡ二重鎖切断が形成された対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合に、被検細胞は対照細胞と比較して癌罹患性が高いと判定する工程と、を含む、被検細胞の癌罹患性の判定方法を提供する。
【００４２】
癌患者、特に、子宮頸癌、乳癌、肺癌の患者では、健常者と比べて末梢血リンパ球のＤＮＡ−ＰＫ活性が低いことが報告されている。したがって、被検者由来の細胞を被検細胞とし、当該細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性を、健常者由来の対照細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性と比較することにより、被検細胞の癌罹患性を判定することができる。細胞としては、例えば、末梢血リンパ球を用いることができる。
【００４３】
（ＤＮＡ二重鎖切断を形成させる刺激を与える工程）
ＤＮＡ二重鎖切断を形成させる刺激としては、例えば、放射線照射、Ｚｅｏｃｉｎ等の薬物への暴露等が挙げられる。被検細胞及び対照細胞中のＤＮＡ−ＰＫ活性を比較するため、被検細胞及び対照細胞に与える刺激は同量にする。具体的には、被検細胞及び対照細胞に、同じ線量の放射線を照射したり、同濃度のＺｅｏｃｉｎ等の薬物に暴露させる。
【００４４】
（リン酸化レベルを測定する工程）
続いて、ＤＮＡ二重鎖切断を形成させる刺激が与えられた被検細胞及びＤＮＡ二重鎖切断を形成させる刺激が与えられた対照細胞中の、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する。ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化部位としては、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から５３番目のセリン残基、Ｎ末端から２６０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２３番目のスレオニン残基、Ｎ末端から３２７番目のセリン残基、Ｎ末端から３２８番目のセリン残基等が挙げられる。
【００４５】
リン酸化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により測定してもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体やアプタマー等であってもよい。
【００４６】
（判定する工程）
続いて、被検細胞及び対照細胞におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを比較する。被検細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、対照細胞中のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合には、被検細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性が対照細胞のＤＮＡ−ＰＫ活性よりも低いと考えられる。このような場合には、被検細胞は対照細胞と比較して癌罹患性が高いと判定することができる。ここで、癌罹患性が高いとは、より癌に罹患する確率が高いことを意味する。本実施形態の判定方法は、例えば、癌の発見や予防等に有用である。
【００４７】
１実施形態において、本発明は、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、癌罹患性判定キットを提供する。本実施形態のキットは、上述した、被検細胞の癌罹患性の判定に好適に使用できる。上記のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体であってもよい。
【００４８】
［ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下において、ＸＲＣＣ４タンパク質とＤＮＡ−ＰＫとを反応させる工程と、上記ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する工程と、被検物質の存在下における上記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における上記リン酸化レベルと比較して低かった場合に、上記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における上記リン酸化レベルが、被検物質の非存在下における上記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、上記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの活性化剤であると判定する工程と、を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
（ＸＲＣＣ４タンパク質とＤＮＡ−ＰＫとを反応させる工程）
ＸＲＣＣ４タンパク質としては、タンパク質全長を用いてもよく、ＤＮＡ−ＰＫの基質となるＸＲＣＣ４タンパク質の一部分のみを用いてもよい。例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から５３番目のセリン残基、Ｎ末端から２６０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２３番目のスレオニン残基、Ｎ末端から３２７番目のセリン残基、Ｎ末端から３２８番目のセリン残基等を含む、１０〜２０アミノ酸からなるペプチド断片等を使用することもできる。一例として、例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３１４〜３２６番目のペプチド断片をＸＲＣＣ４タンパク質として使用してもよい。
【００５０】
ＸＲＣＣ４タンパク質は、基板上に固定されていてもよく、固定されていなくてもよい。これについては後述する。また、ＤＮＡ−ＰＫとしては、例えば、細胞抽出液にＤＮＡを添加したものを使用してもよい。
【００５１】
（リン酸化レベルを測定する工程）
続いて、被検物質の存在下及び非存在下における、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定する。ＸＲＣＣ４タンパク質として、ＸＲＣＣ４タンパク質の一部分であるペプチド断片を使用した場合には、例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から５３番目のセリン残基、Ｎ末端から２６０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基、Ｎ末端から３２３番目のスレオニン残基、Ｎ末端から３２７番目のセリン残基、Ｎ末端から３２８番目のセリン残基等に対応する残基のリン酸化レベルを測定する。
【００５２】
リン酸化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により測定してもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体やアプタマー等であってもよい。
【００５３】
例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質が基板に固定されており、上記リン酸化状態特異的抗体が酵素又は蛍光色素で標識されていてもよい。この場合、基板を洗浄後、酵素の基質を反応させて基質の発色若しくは発光を測定することにより、又は蛍光色素の蛍光を測定することにより、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定することができる。
【００５４】
あるいは、ＸＲＣＣ４タンパク質が基板に固定されていない場合、例えば次のような方法によりリン酸化レベルを測定することもできる。例えば、ＸＲＣＣ４タンパク質を、予めＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を起こす１組の蛍光色素の一方で標識しておく。また、上記リン酸化状態特異的抗体を上記の１組の蛍光色素の他方で標識しておく。ＦＲＥＴを起こす色素分子の組としては特に限定されず、例えばＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
【００５５】
この場合、上記リン酸化状態特異的抗体がＸＲＣＣ４タンパク質に結合すると、上記１組の色素分子が互いに近接し、ＦＲＥＴを起こすようになる。この結果、ＦＲＥＴを起こした場合に特異的に検出される蛍光波長を測定することにより、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを測定することができる。
【００５６】
この原理を利用すれば、本工程を終始溶液状態で行う均一系アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）で行うことができる。均一系アッセイでは、測定に洗浄操作が不要であるため、操作が簡便になるという利点がある。なお、ＥＬＩＳＡ法等の、基板上に固定化された抗原等を用いて反応、洗浄が行なわれる検出方法は、不均一系アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）と呼ばれる。
【００５７】
（判定する工程）
続いて、被検物質の存在下及び非存在下におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルを比較する。被検物質の存在下におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、被検物質の非存在下におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して低かった場合には、上記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの阻害剤であると判定することができる。
【００５８】
一方、被検物質の存在下におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルが、被検物質の非存在下におけるＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化レベルと比較して高かった場合には、上記被検物質はＤＮＡ−ＰＫの活性化剤であると判定することができる。
【００５９】
１実施形態において、本発明は、ＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体を含む、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングキットを提供する。本実施形態のキットは、上述した、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニングに好適に使用できる。上記のＸＲＣＣ４タンパク質のリン酸化状態特異的抗体は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基におけるリン酸化状態特異的抗体であってもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６１】
［実験例１］
（抗体の作製）
発明者らは、ヒトＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇにより３１８番目のセリン残基と呼ばれる場合もある）に対するリン酸化状態特異的抗体を作製した。より具体的には、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３１４〜３２６番目のアミノ酸配列のＣ末端にシステインを付加した配列に対応し、上記３２０番目のセリン残基に対応するセリン残基がリン酸化されたペプチド（配列番号１）を合成し、これを抗原としてウサギを免疫し、抗血清を得た。続いて、この抗血清中の抗体を、免疫に使用したペプチドを固定化したアフィニティーカラムで精製した。精製されたポリクローナル抗体中には、上記３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体が含まれていた。
【００６２】
続いて、精製したポリクローナル抗体中に含まれる、目的外の反応性を有する抗体を除去した。具体的には、上記ポリクローナル抗体を、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３１４〜３２６番目のアミノ酸配列のＣ末端にシステインを付加した配列に対応するペプチド（３２０番目のセリン残基に対応するセリン残基はリン酸化されていないペプチド、配列番号２）を固定化したカラムで精製し、目的外の反応性を有する抗体をカラムに吸収させた。以上の操作により、ヒトＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的ポリクローナル抗体を作製した。
【００６３】
［実験例２］
（ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化の検討）
ＣＭＶプロモーターの下流に接続した、ＸＲＣＣ４遺伝子特異的なＳｉ−ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、センス鎖：配列番号３、アンチセンス鎖：配列番号４）又はコントロールＳｉ−ＲＮＡ（センス鎖：配列番号５、アンチセンス鎖：配列番号６）を、ＨｅＬａ細胞に導入して発現させた。これらの細胞に、γ線（２０Ｇｙ）を照射後、全タンパク質を抽出し、上述したＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。
【００６４】
図１はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。「＋」は、Ｓｉ−ＲＮＡを導入したこと又はγ線を照射したことを示し、「−」は、Ｓｉ−ＲＮＡを導入しなかったこと又はγ線を照射しなかったことを示す。また、「α−ＰＳ３２０」は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体で染色したことを示し、「α−ＸＲＣＣ４」は、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色したことを示す。また、各レーンを左から順にレーン１〜８と呼ぶ。
【００６５】
コントロールＳｉ−ＲＮＡを発現させたＨｅＬａ細胞では、γ線を照射した後に、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化が確認された（レーン１及び２）。この結果は、γ線の照射により、細胞内でＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基がリン酸化されることを示す初めての結果である。
【００６６】
また、ＸＲＣＣ４遺伝子特異的なＳｉ−ＲＮＡを発現させたＨｅＬａ細胞では、上記３２０番目のセリン残基がリン酸化されたＸＲＣＣ４タンパク質が減少した（レーン３及び４）。この結果は、ＸＲＣＣ４タンパク質の発現がノックダウンされたことによるものであり、上記バンドが確かにＸＲＣＣ４タンパク質のものであることを示している。
【００６７】
また、ＸＲＣＣ４遺伝子特異的なＳｉ−ＲＮＡを発現させたＨｅＬａ細胞に、更にＸＲＣＣ４遺伝子（Ｗｔ、配列番号７）の発現ベクターを導入し、γ線を照射した。その結果、γ線照射により、上記３２０番目のセリン残基がリン酸化されたＸＲＣＣ４タンパク質が増加したことが確認された（レーン５及び６）。なお、遺伝子導入により発現させたＸＲＣＣ４遺伝子には、ＦＬＡＧタグが付加されていたため、内在性ＸＲＣＣ４タンパク質よりも高分子量側にバンドが検出された。また、非照射時においてもＤＮＡ複製時のエラーや内在性の活性酸素種などによってＤＮＡ損傷が起こりえることに加え、本実験の場合のようにベクターを導入すると、ＤＮＡ損傷応答が惹起されることがあるために、レーン５においてもバンドが認められている。
【００６８】
また、ＸＲＣＣ４遺伝子特異的なＳｉ−ＲＮＡを発現させたＨｅＬａ細胞に、更にＸＲＣＣ４遺伝子（Ｓ３２０Ａ、配列番号８）の発現ベクターを導入し、γ線を照射した。ここで発現させたＸＲＣＣ４タンパク質は、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基がアラニン残基に置換されており、リン酸化されないよう改変されていた。その結果、上記３２０番目のセリン残基がリン酸化されたＸＲＣＣ４タンパク質のバンドは全く検出されなかった（レーン７及び８）。
【００６９】
また、図１下段の写真は、上段のウエスタンブロッティングと同一のサンプルを電気泳動した後に、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色した結果を示す。すべてのレーンにおいて、ＸＲＣＣ４タンパク質の存在が確認された。
【００７０】
以上の結果から、γ線の照射により、細胞内でＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基がリン酸化されることが明らかとなった。
【００７１】
［実験例３］
（阻害剤の検討）
ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤であるＮＵ７４４１（終濃度１０μＭ）、又は、ＡＴＭの阻害剤であるＫＵ５５９３３（終濃度１０μＭ）の存在下又は非存在下のＨｅＬａ細胞にγ線（２０Ｇｙ）を照射後、全タンパク質を抽出し、上述したＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。
【００７２】
図２はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。「＋」は、阻害剤の存在下であること又はγ線を照射したことを示し、「−」は、阻害剤の非存在下であること又はγ線を照射しなかったことを示す。また、「α−ＰＳ３２０」は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体で染色したことを示し、「α−ＸＲＣＣ４」は、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色したことを示す。また、各レーンを左から順にレーン１〜８と呼ぶ。
【００７３】
その結果、阻害剤の非存在下では、γ線照射により、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化の増加が観察された（レーン１及び２）。
【００７４】
また、ＮＵ７４４１の存在下では、上記３２０番目のセリン残基がリン酸化されたＸＲＣＣ４タンパク質が減少した（レーン３及び４）。
【００７５】
また、ＫＵ５５９３３の存在下では、γ線照射により、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化の増加が観察された（レーン５及び６）。
【００７６】
また、ＮＵ７４４１及びＫＵ５５９３３の存在下では、上記３２０番目のセリン残基がリン酸化されたＸＲＣＣ４タンパク質が減少した（レーン７及び８）。更に、減少の程度は、レーン４のＮＵ７４４１のみの存在下よりもより顕著であった（レーン８）。
【００７７】
また、図２下段の写真は、上段のウエスタンブロッティングと同一のサンプルを電気泳動した後に、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色した結果を示す。すべてのレーンにおいて、ＸＲＣＣ４タンパク質の存在が確認された。
【００７８】
以上の結果は、細胞内でＤＮＡ−ＰＫがＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基をリン酸化することを更に補強するものである。また、発明者らは、上記の結果から、γ線照射による上記３２０番目のセリン残基のリン酸化は、大部分がＤＮＡ−ＰＫによって行われており、一部がＡＴＭ／ＡＴＲによって行われていると考えている。
【００７９】
［実験例４］
（放射線照射量の検討）
ＨｅＬａ細胞に、０、１、２、５、１０及び２０Ｇｙのγ線を照射後、全タンパク質を抽出し、上述したＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。
【００８０】
図３はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。「α−ＰＳ３２０」は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基に対するリン酸化状態特異的抗体で染色したことを示し、「α−ＸＲＣＣ４」は、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色したことを示す。
【００８１】
その結果、γ線の照射量が増加するにつれて、Ｎ末端から３２０番目のセリン残基がリン酸化したＸＲＣＣ４タンパク質の存在量が増加することが明らかとなった。このリン酸化ＸＲＣＣ４タンパク質の増加は、少なくとも１Ｇｙから観察可能であった。
【００８２】
また、図３下段の写真は、上段のウエスタンブロッティングと同一のサンプルを電気泳動した後に、抗ＸＲＣＣ４抗体で染色した結果を示す。すべてのレーンにおいて、ＸＲＣＣ４タンパク質の存在が確認された。
【００８３】
以上の結果は、ＸＲＣＣ４タンパク質のＮ末端から３２０番目のセリン残基のリン酸化状態を指標としたＤＮＡ−ＰＫ活性の測定方法の感度が非常に高いことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、細胞内でＤＮＡ−ＰＫにリン酸化される標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、細胞中のＤＮＡ−ＰＫ活性の正確な測定方法を提供することができる。また、ＤＮＡ−ＰＫの標的分子のリン酸化状態の測定に基づいた、被検細胞の放射線感受性の判定方法、被検細胞の癌罹患性の判定方法、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法及びキットを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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