(57)【要約】【課題】新規な化学構造を有する有効な抗ＨＣＶ薬を提供する。【解決手段】  下記式（Ｉ）：【化１】2016193834.tif 000015（式中、Ａｒは置換又は無置換の芳香族基であり、Ｒは置換又は無置換の炭化水素基、又は置換又は無置換の複素環基である。）で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物、及び前記化合物を含有する抗ＨＣＶ薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2016193834.tif 000014
（式中、Ａｒは置換又は無置換の芳香族基であり、Ｒは置換又は無置換の炭化水素基、又は置換又は無置換の複素環基である。）
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＨＣＶ薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ピラノンカルボキサミド誘導体及びその抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ウイルス化学療法の進歩は、多くのウイルス疾患に対する選択的な抗ウイルス剤の創製を成し遂げ、臨床における有効性も確認されている。しかし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）については、未だ満足な結果が得られていない。ＨＣＶのキャリアは世界に１億人近くいると推定され、また、日本のＨＣＶキャリアの数は約１６０万人で、全人口の１．３％と推定されている。また、毎年約３万人が肝硬変で、約３千人が肝癌で死亡している。
【０００３】
ＨＣＶに対しては、既に、インターフェロンとリバビリン（１−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）との併用療法により、ある程度の治療効果を上げている。しかし、日本に多いウイルスのタイプ（１ｂ）はインターフェロンが効きにくく、また、インターフェロンやリバビリンは高価であり、副作用が強いため治療を中断せざるを得ない場合も多い。したがって、リバビリンよりも副作用が少なく安価である有効な抗ＨＣＶ薬の開発が望まれている。
【０００４】
一方、ピラノンカルボキサミド誘導体としては、特許文献１にＮ−（４−シクロヘキシルフェニル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−６−フェニル−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミドが細菌感染症治療薬として有用であることが記載されており、特許文献２にＮ−（５−ブロモ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−６−フェニル−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミド、４−ヒドロキシ−Ｎ−（５−メチル−２−フリル）−２−オキソ−６−フェニル−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミド、Ｎ−（５−ブロモ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−６−フェニル−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミド等のＮ，６−ジ置換４−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミドが大腸癌、黒色腫、肝癌、乳癌及び前立腺癌等の癌の予防及び治療に有用であることが記載されている。
【０００５】
しかしながら、いずれの文献もＮ，６−ジ置換４−（ヒドロキシアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミドについては言及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５４４７３３号公報、実施例１３
【特許文献２】特表２００４−５３４０９７号公報、請求項９〜１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在、抗ＨＣＶ活性を有する多くの薬剤が開発中であるが、薬剤耐性ウイルスの出現や副作用の問題等から、更に新規な化学構造を有する有効な抗ＨＣＶ薬の創製と開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、培養細胞におけるＨＣＶ遺伝子複製の抑制を指標として、新規化合物の探索及び構造展開研究を遂行することにより、選択的な抗ＨＣＶ活性を有する新規骨格の化合物を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
2016193834.tif 000002
（式中、Ａｒは置換又は無置換の芳香族基であり、Ｒは置換又は無置換の炭化水素基、又は置換又は無置換の複素環基である。）
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
（２）前記（１）に記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＨＣＶ薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の化合物は、高い抗ＨＣＶ活性を有し、抗ＨＣＶ薬として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】４−（ヒドロキシアミノ）−２−オキソ−６−フェニル−Ｎ−（ｐ−トリル）−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミドについてのルシフェラーゼアッセイ及び細胞生存アッセイの測定結果を示すグラフである。
【図２】４−（ヒドロキシアミノ）−２−オキソ−６−フェニル−Ｎ−（ｐ−トリル）−２Ｈ−ピラン−３−カルボキサミドについてのＨＣＶ及びＧＡＰＤＨ  ＲＮＡ定量アッセイの測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、置換又は無置換の芳香族基における芳香族基としては、例えばフェニル基、ナフチル基（１−ナフチル基、２−ナフチル基）、アントリル基（１−アントリル基、２−アントリル基、９−アントリル基）、フルオレニル基（１−フルオレニル基、２−フルオレニル基、９−フルオレニル基）、フェナントリル基、ピレニル基、クリセニル基、ペリレニル基、ピセニル基等の芳香族炭化水素基；フリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基（１，２，３−トリアゾリル基、１，２，４−トリアゾリル基）、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、ピリドチエノピリミジン環基等の芳香族複素環基、好ましくはフェニル基が挙げられる。
【００１２】
前記芳香族基における置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のＣ１−６−アルキル基；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等のＣ１−６−アルコキシ基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、シクロプロピルオキシカルボニル基、シクロブチルオキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基等のＣ１−６−アルコキシ−カルボニル基；水酸基；フェニル基、トリル基、ナフチル基等の芳香族炭化水素基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；ベンジル基、フェネチル基等のアラルキル基；ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基（プロパノイル基）、ブチリル基（ブタノイル基）、バレリル基（ペンタノイル基）、ヘキサノイル基等のＣ１−６−脂肪族アシル基；ベンゾイル基、トルオイル基等の芳香族アシル基（アロイル基）；アラルキルオキシ基、カルボキシル基、Ｃ１−６−アルキルアミノ基、ジＣ１−６−アルキルアミノ基が挙げられる。
【００１３】
置換された芳香族基としては、例えば４−メチルフェニル基（ｐ−トリル基）、３−メチルフェニル基（ｍ−トリル基）、２−メチルフェニル基（ｏ−トリル基）、４−エチルフェニル基、３−エチルフェニル基、２−エチルフェニル基、４−ｎ−プロピルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、２−イソプロピルフェニル基、４−ｎ−ブチルフェニル基、４−イソブチルフェニル基、４−ｓｅｃ−ブチルフェニル基、２−ｓｅｃ−ブチルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、３−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、４−ｎ−ペンチルフェニル基、４−イソペンチルフェニル基、２−ネオペンチルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ペンチルフェニル基、４−ｎ−ヘキシルフェニル基、４−（２−エチルブチル）フェニル基、４−ｎ−ヘプチルフェニル基、４−ｎ−オクチルフェニル基、４−（２−エチルヘキシル）フェニル基、４−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、４−ｎ−デシルフェニル基、４−ｎ−ドデシルフェニル基、４−ｎ−テトラデシルフェニル基、４−シクロペンチルフェニル基、４−シクロヘキシルフェニル基、４−（４−メチルシクロヘキシル）フェニル基、４−（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）フェニル基、３−シクロヘキシルフェニル基、２−シクロヘキシルフェニル基、４−エチル−１−ナフチル基、６−ｎ−ブチル−２−ナフチル基、２，４−ジメチルフェニル基、２，５−ジメチルフェニル基、３，４−ジメチルフェニル基、３，５−ジメチルフェニル基、２，６−ジメチルフェニル基、２，４−ジエチルフェニル基、２，３，５−トリメチルフェニル基、２，３，６−トリメチルフェニル基、３，４，５−トリメチルフェニル基、２，６−ジエチルフェニル基、２，５−ジイソプロピルフェニル基、２，６−ジイソブチルフェニル基、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチルフェニル基、５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジメチルフェニル基、９−メチル−２−フルオレニル基、９−エチル−２−フルオレニル基、９−ｎ−ヘキシル−２−フルオレニル基、９，９−ジメチル−２−フルオレニル基、９，９−ジエチル−２−フルオレニル基、９，９−ジ−ｎ−プロピル−２−フルオレニル基、４−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、４−エトキシフェニル基、３−エトキシフェニル基、２−エトキシフェニル基、４−ｎ−プロポキシフェニル基、３−ｎ−プロポキシフェニル基、４−イソプロポキシフェニル基、２−イソプロポキシフェニル基、４−ｎ−ブトキシフェニル基、４−イソブトキシフェニル基、２−ｓｅｃ−ブトキシフェニル基、４−ｎ−ペンチルオキシフェニル基、４−イソペンチルオキシフェニル基、２−イソペンチルオキシフェニル基、４−ネオペンチルオキシフェニル基、２−ネオペンチルオキシフェニル基、４−ｎ−ヘキシルオキシフェニル基、２−（２−エチルブチル）オキシフェニル基、４−ｎ−オクチルオキシフェニル基、４−ｎ−デシルオキシフェニル基、４−ｎ−ドデシルオキシフェニル基、４−ｎ−テトラデシルオキシフェニル基、４−シクロヘキシルオキシフェニル基、２−シクロヘキシルオキシフェニル基、２−メトキシ−１−ナフチル基、４−メトキシ−１−ナフチル基、４−ｎ−ブトキシ−１−ナフチル基、５−エトキシ−１−ナフチル基、６−メトキシ−２−ナフチル基、６−エトキシ−２−ナフチル基、６−ｎ−ブトキシ−２−ナフチル基、６−ｎ−ヘキシルオキシ−２−ナフチル基、７−メトキシ−２−ナフチル基、７−ｎ−ブトキシ−２−ナフチル基、２−メチル−４−メトキシフェニル基、２−メチル−５−メトキシフェニル基、３−メチル−４−メトキシフェニル基、３−メチル−５−メトキシフェニル基、３−エチル−５−メトキシフェニル基、２−メトキシ−４−メチルフェニル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、２，５−ジメトキシフェニル基、２，６−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、３，５−ジメトキシフェニル基、３，５−ジエトキシフェニル基、３，５−ジ−ｎ−ブトキシフェニル基、２−メトキシ−４−エトキシフェニル基、２−メトキシ−６−エトキシフェニル基、３，４，５−トリメトキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、４−メトキシカルボニルフェニル基、３−メトキシカルボニルフェニル基、２−メトキシカルボニルフェニル基、４−ビフェニリル基、３−ビフェニリル基、２−ビフェニリル基、４−（４−メチルフェニル）フェニル基、４−（３−メチルフェニル）フェニル基、４−（４−メトキシフェニル）フェニル基、４−（４−ｎ−ブトキシフェニル）フェニル基、２−（２−メトキシフェニル）フェニル基、４−（４−クロロフェニル）フェニル基、３−メチル−４−フェニルフェニル基、３−メトキシ−４−フェニルフェニル基、ターフェニル基、３，５−ジフェニルフェニル基、１０−フェニル−９−アントリル基、１０−（３，５−ジフェニルフェニル）−９−アントリル基、９−フェニル−２−フルオレニル基、４−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、２−フルオロフェニル基、４−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、２−クロロフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−ブロモフェニル基、４−クロロ−１−ナフチル基、４−クロロ−２−ナフチル基、６−ブロモ−２−ナフチル基、２，３−ジフルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、２，５−ジフルオロフェニル基、２，６−ジフルオロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、２，３−ジクロロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、２，５−ジクロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、２，５−ジブロモフェニル基、２，４，６−トリクロロフェニル基、２，４−ジクロロ−１−ナフチル基、１，６−ジクロロ−２−ナフチル基、２−フルオロ−４−メチルフェニル基、２−フルオロ−５−メチルフェニル基、３−フルオロ−２−メチルフェニル基、３−フルオロ−４−メチルフェニル基、２−メチル−４−フルオロフェニル基、２−メチル−５−フルオロフェニル基、３−メチル−４−フルオロフェニル基、２−クロロ−４−メチルフェニル基、２−クロロ−５−メチルフェニル基、２−クロロ−６−メチルフェニル基、２−メチル−３−クロロフェニル基、２−メチル−４−クロロフェニル基、３−クロロ−４−メチルフェニル基、３−メチル−４−クロロフェニル基、２−クロロ−４，６−ジメチルフェニル基、２−メトキシ−４−フルオロフェニル基、２−フルオロ−４−メトキシフェニル基、２−フルオロ−４−エトキシフェニル基、２−フルオロ−６−メトキシフェニル基、３−フルオロ−４−エトキシフェニル基、３−クロロ−４−メトキシフェニル基、２−メトキシ−５−クロロフェニル基、３−メトキシ−６−クロロフェニル基、５−クロロ−２，４−ジメトキシフェニル基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
前記式（Ｉ）において、Ｒで表される炭化水素基は、通常、Ｃ１−２５−炭化水素基であり、前記の置換又は無置換の芳香族炭化水素基の他、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基等の直鎖状又は分岐状のＣ１−２５−アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のＣ３−２５−シクロアルキル基；ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オレイル基等のＣ２−２５−アルケニル基；エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル（プロパルギル）基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等のＣ２−２５−アルキニル基；ベンジル基、フェネチル基等のアラルキル基；アダマンチル基等の橋かけ環炭化水素基；スピロ炭化水素基；縮合多環式炭化水素基等が挙げられる。前記炭化水素基は、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等のＣ１−６−アルコキシ基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、シクロプロピルオキシカルボニル基、シクロブチルオキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基等のＣ１−６−アルコキシ−カルボニル基；水酸基；フェニル基、トリル基、ナフチル基等の芳香族炭化水素基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；Ｃ１−６−アシル基、カルボキシル基、アラルキルオキシ基、Ｃ１−６−アルキルアミノ基、ジＣ１−６−アルキルアミノ基で置換されていてもよい。
【００１５】
置換された炭化水素基としては、前記の置換された芳香族炭化水素基の他、例えば２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、メトキシカルボニルメチル基等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
前記式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。また、フェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩として用いることもできる。
【００１７】
前記式（Ｉ）で示される化合物の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。
前記式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、以下に示すようにして製造することができる。なお、以下の反応式は、前記式（Ｉ）において、Ａｒで表される「置換又は無置換の芳香族基」がＺ（Ｈ，Ｆ，Ｃｌ）で置換されたフェニル基である場合を例にとったものである。
【００１８】
【化２】
2016193834.tif 000003
【００１９】
（式中、ＸはＺ（Ｈ，Ｆ，Ｃｌ）で置換されたフェニル基であり、Ｙは前記式（Ｉ）のＲに対応する。）
(i) NaH, THF, CS2, MeI, 0℃-rt, 4h;
(ii) NaH, Diethyl malonate, dioxane, 0-70℃, 6h;
(iii) YNH2, HATU, DMF, rt, 6h;
(iv) NH2OH.HCl, NaHCO3, Ethanol, 80℃, 4h.
【００２０】
出発原料として対応するアセトフェノンを用いて、二硫化炭素と反応させ、中間体としてジメルカプト体を形成させた後、ヨウ化メチルを加えてジチオアセタール体（II）を得る。次いで、水素化ナトリウムの存在下、カルバニオン源としてマロン酸ジエチルを用いて、α−ピロンのカルボン酸誘導体（III）を得る。カップリング試薬として、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル・ウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）を用いて、アミン化合物（ＹＮＨ２）とα−ピロンのカルボン酸誘導体（III）のカルボキシル基を結合させて、対応するアミド化合物（IV）を得る。アミド化合物（IV）をヒドロキシルアミン塩酸塩及び炭酸水素ナトリウムとともにエタノール中で加熱することにより、目的物質（Ｉ）を製造することができる。
【００２１】
前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。
本発明の化合物の具体例を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2016193834.tif 000004
【００２３】
前記の化合物は、抗ＨＣＶ薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２４】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。
【００２５】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００２６】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００２７】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
【００２８】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００２９】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００３０】
注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。前記式（Ｉ）の化合物の注射剤中における割合は、５〜５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。
【００３１】
その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【００３２】
製剤化した抗ＨＣＶ薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。
【００３３】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。
【００３４】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。
【００３５】
また、本発明の化合物は、ＨＣＶ感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、本発明の化合物と組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えば、インターフェロン−α、リバビリン、あるいは、現在臨床試験中の化合物、具体的には、ＨＣＶプロテアーゼインヒビター（例えば、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ−７２２７）、ＭＫ−７００９、ＴＭＣ４３５、Ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ（ＳＣＨ５０３０３４）、Ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ等）、ＲＮＡポリメラーゼインヒビター（例えば、Ｒ７１２８、ＶＣＨ−７５９、Ｖａｌｏｐｉｃｉｔａｂｉｎｅ等）、ＤＥＢＩＯ−０２５（シクロフィリンインヒビター）、Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ（グルコシダーゼＩインヒビター）、ＢＭＳ−７９００５２（ＮＳ５Ａインヒビター）等が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］
（１）ジチオアセタール体（II）の製造
水素化ナトリウム（１６６．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ懸濁液を０℃で撹拌し、対応するアセトフェノン（８３．２ｍｍｏｌ）を滴下した。この懸濁液を０℃で３０分間撹拌した。二硫化炭素（９１．５ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃で更に３０分間撹拌した。ヨウ化メチル（２０８．０ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した後、冷却を止め、反応混合物をゆっくりと室温に戻した。室温で４時間撹拌し、ＴＬＣで反応が終了したことを確認した。反応混合物を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去して、ジチオアセタール体（II）を得た。ジチオアセタール体（II）をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で再結晶して、精製品を得た。
【００３８】
（２）α−ピロンカルボン酸誘導体（III）の製造
水素化ナトリウム（３３．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ懸濁液を撹拌し、マロン酸ジエチル（１４．７ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間撹拌した。ジチオアセタール体（II）（１３．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を７０℃で６時間加熱し、ＴＬＣで反応が終了したことを確認した。反応混合物を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を除去した。水層を１．５Ｎ塩酸で中和し、得られた沈殿物を濾取し、ジクロロメタンに溶解し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去して、α−ピロンカルボン酸誘導体（III）を得た。
【００３９】
（３）アミド化合物（IV）の製造
α−ピロンカルボン酸誘導体（III）（３．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に室温で２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル・ウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（４．１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．４ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌した。アミン化合物（ＹＮＨ２）（３．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌し、ＴＬＣで反応が終了したことを確認した。反応混合物を撹拌しながら氷水に注いだ。得られた沈殿物を濾取し、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で再結晶して、アミド化合物（IV）を得た。
【００４０】
（４）本発明化合物（Ｉ）の製造
アミド化合物（IV）（０．５６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液を撹拌し、室温でヒドロキシルアミン塩酸塩（１．４２ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（１．１３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で４時間還流させた。ＴＬＣで反応が終了したことを確認し、減圧下で溶媒を留去した。残渣に氷水を加え、得られた沈殿物を濾取し、熱気オーブン中５０℃で乾燥した。粗精製物をカラムクロマトグラフィーで精製し、本発明化合物（Ｉ）を得た。
【００４１】
このようにして得られた本発明の化合物の化合物名及び物性を以下に示す。
4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-N-p-tolyl-2H-pyran-3-carboxamide (1)
黄色結晶粉末; 収率 68 %; mp 211-212℃; IR (KBr) (ν, cm-1) 3122 (NH), 1658 (C=O); Mass [M++1]=336.9; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6) : δ 2.27 (s, 3H), 7.14-7.16 (d, J=8.4 Hz, 2H); 7.20 (s, 1H), 7.48-7.50 (d, J=8 Hz, 2H-Ar); 7.57-7.59 (m, 3H-aromatic); 7.93-7.96 (m, 2H-aromatic); 10.59 (s, 1H-OH); 11.26 (s, 1H-NH amide); 12.45 (s, 1H-NH hydroxy); 13C NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 20.8, 82.6, 92.01, 120.27, 126.46, 129.68, 129.77, 130.87, 132.23, 132.97, 136.12, 158.74, 159.95, 163.22, 166.36.
4-(hydroxyamino)-2-oxo-N,6-diphenyl-2H-pyran-3-carboxamide (2)
淡緑色結晶粉末; 収率 80 %; mp 216-217℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3140 (NH-stretching), 1687 (C=O stretching); Mass [M++1]=322.8; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.07-7.11 (m, J=16 Hz, 1H-aromatic), 7.21 (s, 1H-pyranone), 7.32-7.36 (m, J=16 Hz, 2H-aromatic), 7.57-7.62 (m, 5H-aromatic), 7.94-7.95 (m, J=4 Hz, 2H-aromatic), 10.62 (s, 1H-NH amide), 11.35 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.44 (s, 1H-OH).
N-(4-fluorophenyl)-4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (3)
灰白色粉末; 収率 75 %; mp 230-231℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3153 (NH-stretching), 1660 (C=O stretching); Mass [M++1]=340.9; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.15-7.20 (m, J=20 Hz, 3H-aromatic and pyranone), 7.57-7.65 (m, 5H-aromatic), 7.93-7.95 (m, 2H-aromatic), 10.6 (s, 1H-NH amide), 11.31 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.40 (s, 1H-OH).
N-(4-chlorophenyl)-4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (4)
淡緑色粉末; 収率 73 %; mp 239-240℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3122 (NH-stretching), 1664 (C=O stretching); Mass [M+]=356.8; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.21 (s, 1H-pyranone), 7.38-7.40 (d, 2H-aromatic), 7.57-7.66 (m, 5H-aromatic), 7.93-7.95 (d, 2H-aromatic), 10.63 (s, 1H-NH amide), 11.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.37 (s, 1H-OH).
N-(4-bromophenyl)-4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (5)
白色粉末; 収率 70 %; mp 250-251℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3259 (NH-stretching), 1678 (C=O stretching); Mass [M++2]=402.9; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.21 (s, 1H-pyranone), 7.50-7.61 (m, 7H-aromatic), 7.93-7.95 (d, 2H-aromatic), 10.6 (s, 1H-NH amide), 11.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.36 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-(4-hydroxyphenyl)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (6)
淡黄色粉末; 収率 63 %; mp 224-225℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3495 (NH-stretching), 3259 (OH-stretching), 1666 (C=O stretching); Mass [M++1]=339.0; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 6.72-6.74(d, 2H-aromatic), 7.19 (s,1H-pyranone), 7.37-7.39 (d, 2H-aromatic), 7.57-7.66 (s, 3H-aromatic), 7.93 (s, 2H-aromatic), 9.27 (s, 1H-NH amide), 11.08 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.49 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-(4-methoxyphenyl)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (7)
淡黄色粉末; 収率 78 %; mp 194-195℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3516 (NH-stretching), 3199 (OH-stretching), 1670 (C=O stretching); Mass [M++1]=353.0; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.74 (s, 3H-O methyl), 6.90-6.93 (d, 2H-aromatic), 7.20 (s, 1H-pyranone), 7.51-7.58 (m, 5H-aromatic), 7.93-7.95 (d, 2H-aromatic), 10.6 (s, 1H-NH amide), 11.18 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.46 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-N-m-tolyl-2H-pyran-3-carboxamide (8)
灰白色粉末; 収率 78 %; mp 207-208℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3122 (NH-stretching), 1658 (C=O stretching); Mass [M++1]=337.1; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.30 (s, 3H-toluidine methyl), 6.89-6.91 (m, 1H-pyranone), 7.20-7.22 (m, 2H-aromatic), 7.40-7.44 (m, 2H-aromatic), 7.56-7.58 (m, 3H-aromatic), 7.93-7.95 (m, 2H-aromatic), 10.60 (s, 1H-NH amide), 11.31 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.44 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-N-o-tolyl-2H-pyran-3-carboxamide (9)
黄色粉末; 収率 75 % ; mp 229-230℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3055 (OH-stretching), 1664 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=337.0 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.30 (s, 3H-toluidine methyl), 7.00-7.03 (m, 1H-pyranone), 7.17-7.25 (m, 3H-aromatic), 7.56-7.60 (m, 3H-aromatic), 7.94-7.96 (m, 2H-aromatic), 8.14-8.16 (m, 1H-aromatic), 10.60 (s, 1H-NH amide), 11.26 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.48 (s, 1H-OH). 
Methyl 4-(4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamido)benzoate (10)
灰白色粉末; 収率 74 % ; mp 225-226℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3194 (OH-stretching), 1672 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=380.9 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.83 (s, 3H-ester methyl), 7.22 (s, 1H-pyranone), 7.55-7.60 (m, 3H-aromatic), 7.75-7.77 (m, 2H-aromatic), 7.93-7.95 (m, 4H-aromatic), 10.69 (s, 1H-NH amide), 11.63 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.36 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-methyl-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (19) 
淡黄色粉末; 収率 75 %; mp 226-227℃; IR (KBr) (ν, cm-1) 3284 (NH-stretching), 3176 (OH-stretching), 1687 (C=O stretching); Mass[M++1]=260.9; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 2.77-2.78 (d, J=4 Hz, 3H-methyl), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.54-7.58 (m, J=16 Hz, 3H-aromatic), 7.90-7.92 (m, 8 Hz, 2H-aromatic), 8.96-8.97 (q, J=4 Hz, 1H-NH amide), 10.4 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.6 (s, 1H-OH).
N-ethyl-4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (20)
黄色結晶粉末 ; 収率 70 % ; mp 215-216℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3161 (OH-stretching), 1680 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=275.0 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.11-1.12 (t, 3H-methyl), 3.25-3.29(q, 2H-methylene), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.55-7.57 (m, 3H-aromatic), 7.90-7.92 (m, 2H-aromatic), 9.07-9.08 (t, 1H-NH amide), 10.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.64 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-N-propyl-2H-pyran-3-carboxamide (21)
灰白色粉末; 収率 75 % ; mp 188-189℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3068 (OH-stretching), 1680 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=289.1 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.87-0.91 (t, 3H-methyl), 1.47-1.51 (m, 2H-methylene), 3.21-3.22 (t, 2H-methylene), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.54-7.56 (m, 3H-aromatic), 7.90-7.92 (m, 2H-aromatic), 9.11-9.14 (t, 1H-NH amide), 10.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.63 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-isopropyl-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (22)
淡黄色粉末; 収率 75 % ; mp 225-226℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3126 (OH-stretching), 1683 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=289.1 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.14-1.16 (d, 6H-dimethyl), 3.97-4.02 (m, 1H-methine), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.55-7.56 (m, 3H-aromatic), 7.90-7.91 (m, 2H-aromatic), 8.99-9.01 (d, 1H-NH amide), 10.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.64 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-(2-hydroxyethyl)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (23)
淡黄色粉末; 収率 65 % ; mp 200-201℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3219 (OH-stretching), 1678 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=291.0 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.33-3.35 (t, 2H-methylene-NH), 3.50-3.53 (t, 2H-methylene-OH), 4.77-4.79 (t, 1H-OH), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.55-7.57 (m, 3H-aromatic), 7.90-7.92 (m, 2H-aromatic), 9.21-9.24 (t, 1H-NH amide), 10.41 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.62 (s, 1H-OH).
4-(hydroxyamino)-N-(3-hydroxypropyl)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (24)
白色粉末; 収率 68 % ; mp 194-195℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3182 (OH-stretching), 1685 (C=O stretching) ; Mass [M++1]=305.0 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.64-1.67 (m, 2H-methylene), 3.29-3.33 (t, 2H-methylene-NH), 3.45-3.48 (t, 2H-methylene-OH), 4.50-4.52 (t, 1H-OH), 7.12 (s, 1H-pyranone), 7.55-7.57 (m, 3H-aromatic), 7.90-7.92 (m, 2H-aromatic), 9.12-9.14 (t, 1H-NH amide), 10.40 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.62 (s, 1H-OH).
N-benzyl-4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamide (25)
白色粉末; 収率 70 % ; mp 214-215℃; IR (KBr) (ν, cm-1) 3199 (OH-stretching), 1678 (C=O streching); Mass [M++1]=337.1 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6) : δ 4.48-4.49 (d, 2H-benzyl), 7.14 (s, 1H-pyranone), 7.25-7.33 (m, 5H-Ar); 7.55-7.57 (m, 3H-Ar), 7.91-7.92 (m, 2H-aromatic), 9.50 (s, 1H-NH amide), 10.44 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.56 (s, 1H-OH).
Methyl 2-(4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxamido)acetate (26)
灰白色粉末; 収率 70 % ; mp 202-204℃ ; IR (KBr) (ν, cm-1) 3178 (OH-stretching), 1672 (C=O stretching); Mass [M++1]=319.0 ; 1H NMR : (400 MHz, DMSO-d6) : δ 3.65 (s, 3H-methyl ester), 4.06-4.07 (d, 2H-methylene), 7.13 (s, 1H-pyranone), 7.53-7.59 (m, 3H-Ar), 7.91-7.93 (d, J= 4 Hz, 2H-aromatic), 9.35-9.38 (t, J= 6 Hz, 1H-NH amide), 10.46 (s, 1H-NH hydroxyl), 12.42 (s, 1H-OH).
【００４２】
［実施例２］
ルシフェラーゼ遺伝子含有サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡレプリコン細胞（ＬｕｃＮｅｏ＃２、Goto M, Watashi K, Murata T, Hishiki T, Hijikata M, Shimotohno K. "Evaluation of the anti-hepatitis C virus effects of cyclophilin inhibitors, cyclosporin A, and NIM811." Biochem. Biophys. Res. Commun. 343: 879-884, 2006.を参照）を、１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（タンパク質合成阻害剤）を添加したＤＭＥＭ培地に懸濁させた（５０，０００細胞／ｍｌ）。２４時間のインキュベーションの後、各試験化合物を様々な濃度で含有する、Ｇ４１８を含まない新鮮な培養培地で細胞を３日間インキュベートした。
【００４３】
ルシフェラーゼアッセイのため、細胞をＰＢＳで洗い、断続的に振盪させながら溶解液で１０分間処理した。そして、細胞溶解物（２５μｌ）を白色マイクロタイタープレートに移した。各ウェルにルシフェラーゼアッセイ試薬（１００μｌ）を加え、ルシフェラーゼ活性を照度計で測定した。細胞生存アッセイについては、水溶性のホルマザンを生成させるテトラゾリウム塩（2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt:WST-8）を含んだ生細胞数測定試薬(Ｔｅｔｒａ Ｃｏｌｏｒ ＯＮＥ、生化学工業株式会社製)（１０μｌ）を各ウェルに加えた。３７℃、１時間のインキュベーションの後、マイクロプレートリーダーにより比吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。その結果を表２及び図１に示す。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
表２及び図１に示すように、本発明の化合物は、高い抗ＨＣＶ活性を有し、細胞毒性が低い。一方、前記（Ｉ）におけるピラン環の３位の−ＣＯＮＨＲが−ＣＯＯＨに置き換わった陰性対照化合物（4-(hydroxyamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-pyran-3-carboxylic acid）は抗ＨＣＶ活性が確認できなかった。
【００４６】
［実施例３］
フルゲノムＨＣＶ  ＲＮＡレプリコン細胞（ＮＮＣ＃２、Ishii N, Watashi K, Hishiki T, Goto K, Inoue D, Hijikata M, Wakita T, Kato N, Shimotohno K. "Diverse effects of cyclosporine on hepatitis C virus strain replication." J. Virol. 80: 4510-4520, 2006.を参照）を１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（タンパク質合成阻害剤）を添加したＤＭＥＭ培地に懸濁させた（３０，０００細胞／ｍｌ）。２４時間のインキュベーションの後、各試験化合物を様々な濃度で含有する、Ｇ４１８を含まない新鮮な培養培地で細胞を３日間インキュベートした。
【００４７】
細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡ定量アッセイのため、細胞をＰＢＳで洗い、断続的に振盪させながらＤＮＡ分解酵素を含む溶解液で１０分間処理した。そして、細胞溶解物（１０μｌ）について、逆転写反応を行うとともに、引き続きリアルタイムＰＣＲ法を用いて、ＨＣＶ  ＲＮＡ及び細胞生存の指標としてＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの定量を同時に実施した。その結果を図２に示す。
【図１】
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【図２】
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