(57)【要約】      （修正有）【課題】カルバペネム系抗生物質に対して耐性であるカルバペネマーゼ産生耐性菌のみを検出する手段の提供。【解決手段】ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有するカルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物で、特にカルバペネマーゼ産生耐性腸内細菌の検出に有用である。前記２種の抗菌剤以外に、発色剤、栄養成分、ｐH調整剤、カチオンなどを含有させカルバペネマーゼ産生耐性菌選択分離用培地とすることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有するカルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物。
【請求項２】
ファロペネム又はその塩の検出時の濃度が０．５〜８μｇ力価／ｍＬである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クロキサシリン又はその塩の検出時の濃度が１６〜１２８μｇ力価／ｍＬである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
液体微量希釈法によるカルバペネマーゼ産生耐性菌検出に用いるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
さらに発色剤を含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有する培地で被験試料を培養することを特徴とするカルバペネマーゼ産生耐性菌の検出方法。
【請求項７】
ファロペネム又はその塩の検出時の濃度が０．５〜８μｇ力価／ｍＬである請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
クロキサシリン又はその塩の検出時の濃度が１６〜１２８μｇ力価／ｍＬである請求項６又は７に記載の検出方法。
【請求項９】
液体微量希釈法による検出方法である請求項６〜８のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１０】
培地が、さらに発色剤を含有する請求項６〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物及びそれを用いる耐性菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ラクタマーゼはβ−ラクタム系抗生物質のβ−ラクタム環を加水分解する酵素で、これらを産生するグラム陰性菌、グラム陽性菌は、β−ラクタム系抗生物質に対する耐性を有することから、治療上問題となってくる。β−ラクタマーゼは、セリン−β−ラクタマーゼであるクラスＡ−β−ラクタマーゼ、クラスＣ−β−ラクタマーゼ、クラスＤ−β−ラクタマーゼ、及びメタロ−β−ラクタマーゼであるクラスＢ−β−ラクタマーゼの４種に分類されている。これらのβ−ラクタマーゼ産生菌に対する治療あるいは耐性菌検出法としての各種β−ラクタマーゼ阻害剤が知られており、クラスＡ−β−ラクタマーゼに分類されるＥＳＢＬｓに対する阻害剤としては、クラブラン酸やスルバクタムが、クラスＣ−β−ラクタマーゼに対する阻害剤としてはボロン酸化合物やクロキサシリン（特許文献１）が、クラスＢ−β−ラクタマーゼに対する阻害剤としてはメルカプト化合物やキレート化合物（ＥＤＴＡなど）が知られている。
【０００３】
β−ラクタマーゼ産生耐性菌に対する切り札としてカルバペネム系抗生物質が上市された。しかし、当該カルバペネムを加水分解する酵素であるカルバペネマーゼを産生する耐性菌が出現し、問題となっている。カルバペネマーゼは、クラスＡ−β−ラクタマーゼ、クラスＢ−β−ラクタマーゼ、クラスＤ−β−ラクタマーゼに分類されるカルバペネムを加水分解する酵素の総称で、遺伝子的にクラスＡ−β−ラクタマーゼではＫＰＣ遺伝子、クラスＢ−β−ラクタマーゼではＩＭＰ遺伝子、ＮＤＭ−１遺伝子など、クラスＤ−β−ラクタマーゼではＯＸＡ４８遺伝子などが含まれている。
【０００４】
これらのカルバペネマーゼ産生耐性菌の検出手段としては、ファロペネムを含有するディスクを用いる方法、ファロペネムを含有する寒天平板希釈法によりカルバペネマーゼ産生菌の検出ができることが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５０００５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Clin. Microbiol. 2013, 51(6): 1881-1886
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のカルバペネマーゼ産生菌の検出手段では、カルバペネマーゼ産生耐性菌以外の菌も検出してしまったり、一方、カルバペネマーゼ産生耐性菌の生育も抑制してしまうことにより当該耐性菌が検出できない場合がある。
従って、本発明の課題は、正確にカルバペネマーゼ産生耐性菌のみを検出できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、カルバペネマーゼ産生耐性菌を選択的に発育させ、β−ラクタマーゼ生産菌であるが、カルバペネマーゼを産生しない耐性菌を生育させない成分について種々検討した結果、ファロペネムとクロキサシリンとを組み合わせて用い、特に一定濃度で使用することにより、カルバペネマーゼ産生耐性菌のみが選択的に発育できる組成物が得られ、これを用いればカルバペネマーゼ産生耐性菌が簡便かつ正確に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１０〕を提供するものである。
〔１〕ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有するカルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物。
〔２〕ファロペネム又はその塩の検出時の濃度が０．５〜８μｇ力価／ｍＬである〔１〕に記載の組成物。
〔３〕クロキサシリン又はその塩の検出時の濃度が１６〜１２８μｇ力価／ｍＬである〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕液体微量希釈法によるカルバペネマーゼ産生耐性菌検出に用いるものである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕さらに発色剤を含有する〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有する培地で被験試料を培養することを特徴とするカルバペネマーゼ産生耐性菌の検出方法。
〔７〕ファロペネム又はその塩の検出時の濃度が０．５〜８μｇ力価／ｍＬである〔６〕に記載の検出方法。
〔８〕クロキサシリン又はその塩の検出時の濃度が１６〜１２８μｇ力価／ｍＬである〔６〕又は〔７〕に記載の検出方法。
〔９〕液体微量希釈法による検出方法である〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の検出方法。
〔10〕培地が、さらに発色剤を含有する〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の検出方法によれば、カルバペネム系抗生物質に対して耐性であるカルバペネマーゼ産生耐性菌のみを、正確かつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のカルバペネマーゼ産生耐性菌検出用組成物は、ファロペネム又はその塩とクロキサシリン又はその塩とを含有する。
【００１２】
ファロペネムは、（５Ｒ，６Ｓ）−６−〔（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル〕−７−オキソ−３−〔（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル〕−４−チア−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタ−２−エン−２−カルボン酸であり、通常ナトリウム塩２．５水和物として供給されているペネム系抗菌剤である。ファロペネムの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、ナトリウム塩が好ましい。ファロペネムは水和物を使用してもよい。
【００１３】
ファロペネム又はその塩は、検出時の濃度として０．５〜８μｇ力価／ｍＬであるのが好ましく、１〜８μｇ力価／ｍＬであるのがより好ましい。ここで検出時の濃度とは、被験試料添加後の培養時の濃度である。
【００１４】
クロサシリンは、（２Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−[〔３−（２−クロロフェニル）−５−メチルイソキザゾール−４−カルボニル〕アミノ]−３，３−ジメチル−７−オキソ−４−チア−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カルボン酸であり、通常ナトリウム塩１水和物として供給されているペニシリン系抗菌剤である。クロキサシリンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、ナトリウム塩が好ましい。クロキサシリンは水和物を使用してもよい。
【００１５】
クロキサシリン又はその塩は、検出時の濃度として１６〜１２８μｇ力価／ｍＬであるのが好ましく、３２〜１２８μｇ力価／ｍＬであるのがより好ましい。
【００１６】
さらに、本発明においては、ファロペネム又はその塩の検出時の濃度が０．５〜８μｇ力価／ｍＬであり、より好ましくは１〜８μｇ力価／ｍＬであり、クロキサシリン又はその塩の検出時濃度が１６〜１２８μｇ力価／ｍＬであり、より好ましくは３２〜１２８μｇ力価／ｍＬであるのが、カルバペネマーゼ産生耐性菌のみを選択的に生育させ、検出する点から、より好ましい。
【００１７】
本発明の組成物は、カルバペネマーゼ産生性でありカルバペネム系抗菌剤耐性菌を検出するための組成物として用いることができるが、特にカルバペネマーゼ産生耐性腸内細菌の検出に有用である。
【００１８】
本発明の組成物には、前記２種の抗菌剤以外に、必要に応じて、発色剤、栄養成分、pH調整剤、カチオン（ナトリウム、カルシウム、マグネシウムなど）などを含有させることができる。ここで発色剤としては、コロニーを着色する色素、酵素基質、pH指示薬、酸化還元指示薬等が挙げられる。また、本発明の組成物は、前記２種の抗菌剤を含有するカルバペネマーゼ産生耐性菌選択分離用培地とすることもできる。
【００１９】
本発明の組成物を用いてカルバペネマーゼ産生耐性菌を検出するには、ファロペネム又はその塩及びクロキサシリン又はその塩を含有する培地（組成物）で、被験試料を培養すればよい。ここで、ファロペネム又はその塩及びクロキサシリン又はその塩の検出時の濃度は、前記と同様であるのが好ましい。
【００２０】
被験試料としては、細菌感染が疑われる患者の尿、血液、喀痰、便などの臨床材料、あるいは臨床材料から分離されたグラム陰性菌を供試する。
【００２１】
本発明の組成物、好ましくは培地に被験試料を添加し、培養後、生育する菌の有無を観察すれば、カルバペネマーゼ産生耐性菌が検出できる。培養は、３３〜３７℃で、１６〜２０時間が好ましい。生育する菌の観察は、菌の発育による濁度の有無により行ってもよいが、吸光度測定などにより検出しても良い。
【００２２】
さらに、本発明においては、あらかじめファロペネム及びクロキサシリンを分注、乾燥、固定したマイクロプレートを作製し、被検菌をミュラーヒントンブイヨンに懸濁調製し、マイクロプレートに一定量ずつ分注後培養を行い、自動測定装置により菌の発育を観察する液体微量希釈法により検出するのが特に好ましい。自動測定装置としては、ライサスエニー（日水製薬）等が挙げられる。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
ミュラーヒントンブイヨンを用いた液体微量希釈法によりファロペネム（ＦＲＰＭ）に対する各種β−ラクタマーゼ、カルバペネーゼ産生耐性菌の最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
なお、クロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）の添加効果を評価した。
結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2016010399.tif 000002
【００２６】
表１より、カルバペネマーゼ産生性陽性該当菌株ではクロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）の添加０〜１２８μｇ／ｍＬの間でファロペネム（ＦＲＰＭ）のＭＩＣは≧１６（＞８）であった。
クラスＣβラクタマーゼ産生株ではファロペネムの添加量に伴いＭＩＣは低下した。
【００２７】
実施例２
実施例１に引き続き、クロキサシリンの添加濃度を１０２４μｇ／ｍＬまで増やして濃度の影響を確認した。
【００２８】
【表２】
2016010399.tif 000003
【００２９】
表２より、クロキサシリン濃度を１２８μｇ／ｍＬより更に２５６〜１０２４μｇ／ｍＬまで増量すると、クラスＣβラクタマーゼ産生株でファロペネムの添加量に伴いＭＩＣは更に低下したが、カルバペネマーゼ産生性陽性該当菌株でもファロペネムのＭＩＣの低下が見られ、クロキサシリンの添加は１２８μｇ／ｍＬ以下が至適であった。
【００３０】
実施例３
ファロペネム及びクロキサシリンの濃度を変化させて、各種菌のＭＩＣを測定した。表３はＭＩＣであり、表４はＭＩＣから発育性の評価に変換した表である。
【００３１】
【表３】
2016010399.tif 000004
【００３２】
【表４】
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【００３３】
表３及び表４より、ファロペネム濃度４〜８μｇ力価／ｍＬ及びクロキサシリン濃度１６〜１２８μｇ力価／ｍＬがカルバペネマーゼ産生耐性菌の検出に良好であることが判明した。
【００３４】
実施例４
ファロペネム単独と、ファロペネム及びクロキサシリンの併用との効果を対比した。
【００３５】
【表５】
2016010399.tif 000006
【００３６】
表５よりファロペネム（ＦＲＰＭ）８μｇ力価／ｍＬ単独ウェルで発育した株の中にはカルバペネマーゼ産生陽性株以外に、カルバペネマーゼ産生陰性のクラスC β−ラクタマーゼ産生株も含まれている。
一方、クロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）６４μｇ力価／ｍＬとファロペネム（ＦＲＰＭ）８μｇ力価／ｍＬを含むウェルで発育した株は総てカルバペネマーゼ産生陽性株であった。
【００３７】
実施例５
大腸菌群検出用として大腸菌群が産生するβ−ガラクトシダーゼで特異的に分解されるＸ−ＧＡＬ（発色酵素基質）を含有するＸ−ＧＡＬ寒天培地「ニッスイ」を基礎培地とし、ファロペネムとクロキサシリンを終濃度でそれぞれ２〜８μｇ力価／ｍＬ、３２〜１２８μｇ力価／ｍＬを含有させた培地を作製した。各種β−ラクタマーゼ、カルバペネーゼ産生耐性菌の新鮮培養物から菌濃度１０5ｃｆｕ／ｍＬの接種用菌液を調製し、その５μＬをミクロプランターにて被検用培地に接種した。３５℃で２０時間培養後にその発育性を評価した。
結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】
2016010399.tif 000007
【００３９】
表６より、カルバペネマーゼ産生性陽性該当菌株ではクロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）添加濃度３２μｇ／ｍＬでファロペネム（ＦＲＰＭ）添加濃度４〜８μｇ／ｍＬ、クロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）添加濃度６４〜１２８μｇ／ｍＬでファロペネム（ＦＲＰＭ）添加濃度２〜８μｇ／ｍＬで発育対照と同等に発育し、他のβ−ラクタマーゼ産生耐性菌は発育が抑制された。
【００４０】
実施例６
次にＸ−ＧＡＬ寒天培地「ニッスイ」よりもやや選択性が強いマッコンキー寒天培地を基礎培地とし、ファロペネムとクロキサシリンを終濃度でそれぞれ１〜４μｇ力価／ｍＬ、３２〜１２８μｇ力価／ｍＬを含有させた培地を作製した。各種β−ラクタマーゼ、カルバペネーゼ産生耐性菌の新鮮培養物から菌濃度１０5ｃｆｕ／ｍＬの接種用菌液を調製し、その５μＬをミクロプランターにて被検用培地に接種した。３５℃で２０時間培養後にその発育性を評価した。
結果を表７に示す。
【００４１】
【表７】
2016010399.tif 000008
【００４２】
表７より、カルバペネマーゼ産生性陽性該当菌株ではクロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）添加濃度３２〜６４μｇ／ｍＬでファロペネム（ＦＲＰＭ）添加濃度２〜４μｇ／ｍＬ、クロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）添加濃度１２８μｇ／ｍＬでファロペネム（ＦＲＰＭ）添加濃度１〜４μｇ／ｍＬで発育対照と同等に発育し、他のβ−ラクタマーゼ産生耐性菌は発育が抑制された。
【００４３】
Ｘ−ＧＡＬ寒天培地には選択剤としてＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）が０．１５ｇ／Ｌ、マッコンキー寒天培地には選択剤として胆汁酸塩が１ｇ／Ｌ含まれている。いずれもグラム陽性菌の発育抑制を目的に添加されているが、グラム陰性菌においても少なからず発育性には影響があり、添加量や複数の選択剤の添加により選択性は強化される一方グラム陰性菌への抑制性も強まっていく。
Ｘ−ＧＡＬ寒天培地とマッコンキー寒天培地とを基礎培地とした場合の、クロキサシリン（ＭＣＩＰＣ）、ファロペネム（ＦＲＰＭ）の添加濃度、競合効果については、明らかにマッコンキー寒天培地で添加濃度を低下させる必要性が認められた。
【００４４】
実施例７
キサンタンガム、栄養成分及び発色基質などを乾燥させて作製した、ドライタイプの培地であるコンパクトドライＣＦを基礎培地に、ファロペネム及びクロキサシリンを添加しドライタイプの培地を作製した。同時に発育対照として薬剤不含、及びカルバペネム系薬剤としてメロペネムを添加したドライタイプの培地も作製した。なおメロペネムの添加濃度はＣＬＳＩにおける判定区分で非感性であるＭＩＣ ２以上の菌株を検出できるように終濃度１μｇ／ｍＬとした。
各種β−ラクタマーゼ、カルバペネーゼ産生耐性菌の新鮮培養物から菌濃度１０2ｃｆｕ／ｍＬ相当の接種用菌液を調製し、ドライタイプのシャーレにその１ｍＬを接種した。３５℃で２０時間培養後にその発育性を評価した。
結果を表８に示す。
【００４５】
【表８】
2016010399.tif 000009
【００４６】
メロペネムに感受性のカルバペネマーゼ産生耐性菌がクロキサシリン６４μｇ／ｍＬ、ファロペネム８μｇ／ｍＬを含有する本発明組成物には発育し、その有用性が確認できた。