(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｈ．ピロリと同様に胃内に生息し、胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫等を引き起すとされている未だ測定（検出）／診断方法が確立されていないＨ．スイスの存在を判定する方法、及び、Ｈ．スイス感染の診断方法、並びに当該方法に用いるための薬剤又はキットの提供。【解決手段】被験者由来のサンプルにおける、（ｉ）特定の配列に記載の塩基配列若しくはその一部を有する核酸、（ｉｉ）特定の配列に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、及び、（ｉｉｉ）（ｉｉ）のタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体からなる群から選択される少なくとも一つを測定することを備える、前記サンプル中のＨ．スイスの存在を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来のサンプルにおける、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有する核酸、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、及び、（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体からなる群から選択される少なくとも一つを測定することを備える、前記サンプル中のＨ．スイスの存在を判定する方法。
【請求項２】
被験者が、鳥肌胃炎患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、胃バイオプシーサンプル又は便、あるいは、血液又は尿である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクト。
【請求項６】
Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド。
【請求項７】
Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片。
【請求項８】
以下の群から選択される少なくとも一つを含有する、Ｈ．スイス検出薬：
（ａ）請求項５に記載の核酸コンストラクト；
（ｂ）請求項６に記載のタンパク質若しくはペプチド；及び、
（ｃ）請求項７に記載の抗体若しくはその免疫反応性断片。
【請求項９】
請求項８に記載の検出薬を備える、Ｈ．スイス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未だ純粋培養法が確立されていないヒトより分離されたヘリコバクター・スイス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｉｓ、以下、「Ｈ．スイス」という）特異的な塩基配列及びアミノ酸配列、当該配列を標的としたＨ．スイスの存在を判定する方法又はＨ．スイス感染の診断方法、及び該方法に用いるための薬剤又はキット等の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８３年にマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｂ，Ｊ，）らによって初めて慢性胃炎患者よりヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、以下、「Ｈ．ピロリ」という）の分離培養が成功した。本発見以降、胃炎、胃潰瘍の一部はＨ．ピロリの感染によって起こることが明らかとなった（非特許文献１）。Ｈ．ピロリは、経口からヒトに感染すると考えられている。開発途上国では小児期に既に７０−８０％以上の高い感染率を示す。一方、先進国では途上国より感染率は低い。疫学的調査の結果から、１９９４年に世界保健機構（ＷＨＯ）によりＨ．ピロリが発がん性物質であると認定され、胃癌との関係が注目されるようになった（非特許文献２）。一方、Ｈ．ピロリ陰性にもかかわらず、胃炎や胃潰瘍となる症例も報告されたため、Ｈ．ピロリ菌以外の類縁の感染菌の動態についても種々の検討が行なわれてきた。ヘリコバクター属細菌は３０種類以上にも分類されるが、１９９４年には、それらのうちヘリコバクター・ハイルマニー（以下、「Ｈ．ハイルマニー」という）が動物の胃内から感染菌として検出された（非特許文献３）。その後、胃のリンパ球の複合組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫（以下、「胃ＭＡＬＴリンパ腫」という）とＨ．ハイルマニーとの関連を示す研究結果が発表され、Ｈ．ピロリ以外にも胃疾患の原因菌としてＨ．ハイルマニーが明らかとなった（非特許文献４）。
【０００３】
Ｈ．ハイルマニーは、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、サルなどの胃に感染し、胃疾患を誘発する人獣共通感染症の病原体である。１６Ｓリボゾーム遺伝子の塩基配列を基にした分類学上、ヒトから分離されるＨ．ハイルマニーは、Ｈ．スイスに再分類されたが（非特許文献５）、２００８年のＩｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌において、ブタより分離されたＨ．スイスＨＳ１株とＨＳ５株のゲノム塩基配列が発表されたため、Ｈ．スイスに菌名が統一された（非特許文献６）。従って、２００８年以前の報告のヒトに感染するＨ．ハイルマニーは、それ以降の報告のＨ．スイスと同じ菌である（以降、本明細書においては、「Ｈ．スイス」との表現で統一する）。
【０００４】
Ｈ．スイスは、ヒトをはじめ多くの哺乳動物の胃内に生息が確認されており、動物からヒトへの感染が疑われている。Ｈ．スイスは、Ｈ．ピロリと同様に胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫などを引き起こし（非特許文献５）、胃ＭＡＬＴリンパ腫の主要な原因菌の可能性が示唆されている（非特許文献７）。Ｈ．スイスは、グラム陰性螺旋型桿菌で、５〜７巻の螺旋を有する。両極に１０〜２０本の鞭毛を有しており運動性が高い（非特許文献５）。Ｈ．ピロリがウレアーゼ陽性であるのに対し、Ｈ．スイスは、ウレアーゼ陽性の株と陰性の株があり、特に動物からの分離菌株はウレアーゼ陽性であるにもかかわらず、ヒトからの分離菌株はウレアーゼ陰性であることが報告されている（非特許文献８）。
【０００５】
また、ヒトから分離されたＨ．スイスの分離培養法は未だ確立されておらず、実験用マウスの胃で継代されている（非特許文献８）。Ｈ．スイスの分離培養について試みたものの、発育が認められなかったという報告もある（非特許文献９）。また、Ｈ．ハイルマニー様菌株（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ’−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＨＨＬＯ）のＰＣＲによるスクリーニング方法が公表されている（非特許文献１０）が、Ｈ．スイス特異的なものではなく、検出感度にも問題があった。
【０００６】
従って、Ｈ．スイス感染と胃疾患との関連性が非常に高いことが示されていながら、現状では、Ｈ．ピロリの診断に用いられる培養法やウレアーゼ活性を指標とした尿素呼気試験（ＵＢＴ）などが適用出来ず、有効な診断法が確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｒｓｈａｌ，  Ｂ．Ｊ．  ＆  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  １，  １２７３−１２７５，  １９８４．
【非特許文献２】ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ，  １２  （１）  １−２３，  １９９４．
【非特許文献３】Ｓｔｏｌｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，  ２９，  １０６１−１０６４，  １９９４．
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｉ，  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６，  ２７−３４，  ２０１０．
【非特許文献５】Ｐｒｉｅｓｔｎａｌｌ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４２，  ２１４４−２１５１，  ２００４．
【非特許文献６】Ｂａｅｌｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５８，  １３５０−１３５８，  ２００８．
【非特許文献７】Ｍｏｎｇｎｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８，８２１−８２８，２０００．
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，  ２０１４年３月２８日ＰｕｂＭｅｄ公開  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｈｅｌ．１２１２７．
【非特許文献９】第３７回関東甲信越地区医学検査学会２０００．１０．１４−１５，「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉの分離培養への試み」
【非特許文献１０】Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，  Ｓ．Ａ．  ＆  Ｏｗｅｎ，  Ｒ．Ｊ．    Ｄｉａｇｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ４６，  １−７，  ２００３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、未だ測定（検出）／診断方法が確立されていないＨ．スイスの存在を判定する方法、及び、Ｈ．スイス感染の診断方法、並びに当該方法に用いるための薬剤又はキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｈ．スイスの測定（検出）及び診断を可能とするため、カニクイサルより分離されたＨ．スイス及びヒトより分離されたＨ．スイスの全ゲノム塩基配列解析と比較ゲノム解析を行った。より具体的には、これらのＨ．スイス感染マウスの胃の粘膜懸濁液からゲノムＤＮＡを調製し、全ゲノム塩基配列を決定した後、決定された全ゲノム配列と、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベース上に公開されている関連のカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属１１菌株及びヘリコバクター属２０菌株の全ゲノム塩基配列とを、ＲＥＣＯＧ  （Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて比較ゲノム解析することにより、Ｈ．スイス特異的塩基配列を２種類同定した。そして、本発明者らは、同定した２種類の塩基配列を標的としたＰＣＲプライマーを考案し、胃バイオプシーから調製したＤＮＡ中からＨ．スイス特異的塩基配列をＰＣＲ法にて測定（検出）できることを見出した。
【００１０】
更に、本発明者らは、同定した塩基配列のうち一方がタンパク質をコードしている可能性があることから、同配列の発現産物を組換えタンパク質として大腸菌にて発現させ、この組換えタンパク質をウェスタンブロッティング法により確認することにより、確かにタンパク質として発現していることを確認した。また、本発明者らは、このタンパク質がこれまでに報告されているタンパク質とは異なることを確認し、新たにＦ２Ｒ２タンパク質と命名した。更に、本発明者らは、Ｈ．スイス感染マウス由来の血液サンプル中にＦ２Ｒ２タンパク質を抗原として認識する抗体が存在することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
よって、本発明は、配列番号１（若しくは図２）又は配列番号２（若しくは図３）に記載の塩基配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を測定（検出）することによるＨ．スイス感染の存在を判定する方法又は診断方法に関する。また、本発明は、前記方法に用いるための、配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列と特異的に結合する核酸、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列と特異的に結合する物質（抗体及びアプタマー等）、並びに、これらを含有するＨ．スイス検出薬又はＨ．スイス感染の診断（検査）薬、並びに、これらを含有するＨ．スイス検出キット又はＨ．スイス感染の診断（検査）キットに関する。より具体的には、本発明は、以下の発明に関する：
（１）  被験者由来のサンプルにおける、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有する核酸、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、及び、（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体からなる群から選択される少なくとも一つを測定（検出）することを備える、前記サンプル中のＨ．スイスの存在を判定する方法。
（２）  被験者が、鳥肌胃炎患者である、（１）に記載の方法。
（３）  サンプルが、胃バイオプシーサンプル又は便、あるいは、血液又は尿である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチド。
（５）  Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクト。
（６）  Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド。
（７）  Ｈ．スイスの存在を判定する方法に用いるための、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片。
（８）  以下の群から選択される少なくとも一つを含有する、Ｈ．スイス検出薬：
（ａ）（５）に記載の核酸コンストラクト；
（ｂ）（６）に記載のタンパク質若しくはペプチド；及び、
（ｃ）（７）に記載の抗体若しくはその免疫反応性断片。
（９）  前記（８）に記載の検出薬を備える、Ｈ．スイス感染判定用キット。
【００１２】
（Ｈ．スイス）
本明細書において、「Ｈ．スイス」とは、Ｈ．ハイルマニー様菌株（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ’−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＨＨＬＯ）、非Ｈ．ピロリヘリコバクター種（ＮＨＰＨＳ）、又は、Ｈ．ｈｅｉｌｉｍａｎｎｉｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏと呼ばれるヘリコバクター分類（以下、「Ｈ．ｈｅｉｌｉｍａｎｎｉｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ」という）に含まれる、Ｈ．ハイルマニータイプ１に属する菌株を意味し、同じく、Ｈ．ｈｅｉｌｉｍａｎｎｉｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏに分類される他の菌株、即ち、Ｈ．ｈｅｉｌｉｍａｎｎｉｉ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏや、Ｈ．ハイルマニータイプ２に属する菌株は含まない。ヘリコバクター分類の系統図を図１に示す。Ｈ．スイスは、ヒト以外にイヌ、ネコ、ブタ、サルなどの胃に感染することが知られているが、本明細書におけるＨ．スイスが感染する哺乳動物は特に限定されるものではない。例えば、本明細書におけるＨ．スイスが感染する哺乳動物は、ヒト又はサルであってもよい。
【００１３】
（Ｈ．スイス特異的塩基配列を有するポリヌクレオチド）
本明細書において、「配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチド」とは、配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列の全てを含むポリヌクレオチドであってもよいし、その一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。ここで、「配列番号１に記載の塩基配列」とは、配列番号１に記載された塩基配列（Ｈ．スイス  ＴＫＹ株から得られた非翻訳領域のＨ．スイス特異的配列）と完全に一致する配列の他、配列番号１に記載の塩基配列において、１〜１００個（又は、１〜８０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個）の核酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列（又は、配列番号１に記載の塩基配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のホモロジーを有する配列、又は、配列番号１に記載された塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列）を含み、例えば、図２に列挙されたいずれかの塩基配列、あるいは、配列番号１６（Ｈ．スイス  ＳＮＴＷ１０１株から得られた非翻訳領域のＨ．スイス特異塩基的配列）、配列番号１７（Ｈ．スイス  ＳＨ８株から得られた非翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）、又は配列番号１８（Ｈ．スイス  ＳＨ１０株から得られた非翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）に記載の塩基配列であってもよい。
【００１４】
同じく、「配列番号２に記載の塩基配列」とは、配列番号２に記載された塩基配列（Ｈ．スイス  ＨＳ１株、又は、Ｈ．スイス  ＨＳ５株から得られた翻訳領域のＨ．スイス特異的配列：Ｆ２Ｒ２遺伝子配列）の他、配列番号２に記載の塩基配列において、１〜１００個（又は、１〜８０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個）の核酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列（又は、配列番号２に記載の塩基配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のホモロジーを有する配列、又は、配列番号２に記載された塩基配列と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列）を含み、例えば、図３に列挙されたいずれかの塩基配列、あるいは、配列番号１９（Ｈ．スイス  ＴＫＹ株から得られた翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）、配列番号２０（Ｈ．スイス  ＳＮＴＷ１０１株から得られた翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）、配列番号２１（Ｈ．スイス  ＳＨ８株から得られた翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）又は配列番号２２（Ｈ．スイス  ＳＨ１０株から得られた翻訳領域のＨ．スイス特異的塩基配列）に記載の塩基配列であってもよい。
【００１５】
本明細書における、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列の一部を有するポリヌクレオチドは、Ｈ．スイス特異的でなければならない。ここで、「Ｈ．スイス特異的」とは、Ｈ．スイス以外のいかなる種においても当該塩基配列と相同性の高い塩基配列を有するポリヌクレオチドが確認されないことを意味し、好ましくは、Ｈ．スイス以外のいかなる種においても当該塩基配列と９０％以上（又は、９５％以上、９８％以上、９９％以上、１００％）の相同性を有するポリヌクレオチドが確認されないことを意味する。候補部分配列がＨ．スイス特異的であるか否かは、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース検索及び配列比較を行うことにより、適宜確認することができる。好ましくは、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列の一部を有するポリヌクレオチドは、オリジナルのポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）の５０％以上の核酸を有するポリヌクレオチドであり、より好ましくは、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００１６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。また、本明細書に記載された塩基配列及びアミノ酸配列のホモロジーは、例えば、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、上述の配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクトに関する。本発明の核酸コンストラクトは、必要に応じて標識化されていてもよい。また、本発明の核酸コンストラクトは、上述の配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列を測定（検出）するためのＰＣＲプライマー、又はプローブ等であってもよい。例えば、本発明の核酸コンストラクトの長さは、１０〜４００ｂｐ、１５〜２００ｂｐ、２０〜１００ｂｐであってもよい。好ましくは、本発明の核酸コンストラクトは、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと相補的な配列を有する。また、前記相補的な配列は、当該核酸コンストラクトが前記ポリヌクレオチドと特異的に結合する機能を保持する限り、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと相補的な配列において１〜３個の核酸が置換、欠失、付加、又は挿入された配列であってもよい。
【００１８】
本明細書において、核酸の「標識化」とは、当該核酸の存在を測定（検出）可能とするための修飾を意味し、例えば、放射性標識（３２Ｐ、３Ｈ，１４Ｃなど）、蛍光標識（ＦＡＭ及びＶＩＣなど）、酵素標識（ビオチンなど）、抗原標識（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）など）等の当業者に周知の方法を用いることができる。
【００１９】
（Ｆ２Ｒ２タンパク質又はその部分ペプチド）
更に別の態様において、本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドに関する。ここで、「配列番号３に記載のアミノ酸配列」とは、配列番号３に記載されたアミノ酸配列と完全に一致する配列の他、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のホモロジーを有する配列、あるいは、配列番号３に記載されたアミノ酸配列をコードするポリペプチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリペプチドによりコードされたアミノ酸配列を含み、例えば、図３に列挙されたいずれかの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列であってもよい。本明細書における、配列番号３に記載のアミノ酸配列の一部を有するペプチドは、Ｈ．スイス特異的でなければならない。ここで、「Ｈ．スイス特異的」とは、Ｈ．スイス以外のいかなる種においても当該アミノ酸配列と相同性の高いポリペプチドが確認されないことを意味し、好ましくは、Ｈ．スイス以外のいかなる種においても当該アミノ酸配列と９０％以上（又は、９５％以上、９８％以上、９９％以上、１００％）の相同性を有するポリペプチドが確認されないことを意味する。候補部分配列がＨ．スイス特異的であるか否かは、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース検索及び配列比較を行うことにより、適宜確認することができる。好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列の一部を有するペプチドは、オリジナルのタンパク質（配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の５０％以上のアミノ酸を有するペプチドであり、より好ましくは、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２０】
例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドとして好ましくは、抗体により認識される（抗原性を有する）タンパク質又はペプチドであり、最も好ましくはＦ２Ｒ２タンパク質である。候補タンパク質又はペプチドが抗体により認識されるか否かは、例えば、既に得られている抗体又は抗体を含有するサンプルと当該候補タンパク質又はペプチドとを接触させ、抗体への当該候補タンパク質又はペプチドの結合を測定（検出）し、結合する場合には候補タンパク質又はペプチドが抗体により認識されると判定することにより決定することができる。
【００２１】
本発明の配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドは、必要に応じて標識化されていてもよい。当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２ｐ３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【００２２】
（抗体又はその断片）
他の態様において、本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片に関する。「抗体の免疫反応性断片」とは、抗体の一部分（部分断片）または抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するものを意味する。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。好ましくは、本発明の抗体若しくはその免疫反応性断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド特異的に認識する。
【００２３】
本明細書全体に亘って、「特異的に認識する」又は、「特異的に結合する」とは、目的の物質と結合するが、その他の物質とは結合しないことを意味する。候補物質が目的の物質と結合するか否か、及び／又は、その他の物質と結合しないか否かは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよい。ウェスタンブロッティングにより確認する場合、例えば、Ｆ２Ｒ２タンパク質を、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して抗Ｈｉｓ抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、又はＥＬＩＳＡにより確認する場合、後述の方法を利用して確認することができる。ここで、「結合しない」又は「認識しない」とは、目的の物質への結合との比較において、結合しない（又は認識しない）とされる核酸、タンパク質又はペプチドへの被検物質の結合が十分区別可能な程度低い場合を含む。例えば、目的の物質と比較した、その他の物質との交差反応率が、１％以下、０．５％以下、０．３％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０３％以下であってもよい。交差反応性は、｛（比較対象となるその他の物質への結合に関する実測値（濃度）／（比較対象となるその他の物質の添加サンプル濃度）×１００％｝として計算して得ることができる。
【００２４】
本発明の抗体は、Ｆ２Ｒ２タンパク質を特異的に認識することができる限り、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」は、単一クローンに由来する抗体であることを意味する。本発明の抗体は、完全抗体の他、抗原との結合活性を保持する限り、バイスペシフィック抗体、及び一本鎖抗体を含む。完全抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどの抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖを入れ替えたヒト型キメラ抗体、動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるＦｖドメイン上の配列であるＣＤＲをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。また、ヒト抗体とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００２５】
（検出薬）
本発明は、前記核酸コンストラクト、前記タンパク質若しくはペプチド、又は、前記抗体又はその免疫反応性断片を含有する、Ｈ．スイス検出薬に関する。言い換えれば、本発明は、Ｈ．スイスの検出に使用するための前記核酸コンストラクト、前記タンパク質若しくはペプチド、又は、前記抗体又はその免疫反応性断片に関する。あるいは、本発明は、Ｈ．スイスの検出薬を製造するための、前記核酸コンストラクト、前記タンパク質若しくはペプチド、又は、前記抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。
【００２６】
（キット）
別の態様において、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクト、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片を含有する、Ｈ．スイス感染の判定用キット、又はＨ．スイス感染症の診断用キットに関する。本発明のキットは、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクト、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片に加えて、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。
【００２７】
配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクトを含有する測定（検出）キットは、核酸を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えばハイブリダイゼーションを利用した方法；ＰＣＲを利用した方法；並びに、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．（１９９９）４：３５３−３６４参照）を挙げることができる。
【００２８】
例えば、本発明のキットは、標識化された配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸コンストラクトが固定化した固相又はハプテンを含むキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
または、本発明のキットは、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと特異的に結合するプライマー（又はプライマーペア）を含んでいてもよい。
【００３０】
あるいは、本発明のキットは、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドと相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【００３１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体若しくはその免疫反応性断片を含有する測定（検出）キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、標識化免疫測定法；イムノブロッティング法；イムノクロマト法；クロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。本発明のキットが、所望の測定を実施することが可能であるか否かは、当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
【００３２】
例えば、本発明のキットは、（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドと（特異的に）結合する抗体若しくはその免疫反応性断片が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）標識化された第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
あるいは、本発明のキットは、（ｉ）標識化された第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドと（特異的に）結合する第二抗体若しくはその免疫反応性断片が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
【００３５】
本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。更に、本発明のキットは、添付文書、説明書、及びキットを格納する容器等を適宜含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明に係るＨ．スイス特異的塩基配列と、その塩基配列を標的としたＰＣＲ診断法を用いることにより、従来のＨ．ピロリの診断法で検出されないＨ．スイス感染を迅速かつ確実な診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヘリコバクター属の系統図を示す。
【図２】非翻訳領域（約５９０塩基対）のＨ．スイス特異的塩基配列を示す。
【図３】翻訳領域（約５５０塩基対）Ｈ．スイス特異的塩基配列（Ｆ２Ｒ２遺伝子領域）を示す。
【図４】Ｈ．スイス特異的な２箇所の配列を標的としたＰＣＲプライマー、及びＨ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子を標的としたプライマーを用いて行ったＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行った写真である。各レーンで用いたサンプルは、以下のとおりである。レーンＭ：１００−塩基対  ＤＮＡ  マーカー；レーン１：非感染マウスからのＤＮＡ  （１００ｎｇ）；レーン２：Ｈ．スイス  ＴＫＹ感染マウスからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン  ３：Ｈ．スイス  ＳＮＴＷ１０１感染マウスからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン４：Ｈ．スイス  ＳＨ８感染マウスからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン５：Ｈ．スイス  ＳＨ１０感染マウスからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン６：Ｈ．スイス  ＨＳ５のＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン７：Ｈ．ハイルマイーｓ．ｓ．  ＡＳＢ１．４からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン８：Ｈ．フェリス  ＡＴＣＣ４９１７９からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン９：Ｈ．バクリフォルミス  Ｍ５０からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１０：Ｈ．ビゾゼロニー  Ｒ１０５１からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１１：Ｈ．シノガストリクス  ＪＫＭ４からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１２：Ｈ．ムステーレ  ＮＣＴＣ１２０３２からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１３：Ｈ．サルモニス  Ｒ１０５３からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１４：Ｈ．ピロリ  ＳＳ１からの（１０ｎｇ）；レーン１５：Ｈ．ピロリ  ＴＮ２ＧＦ４からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン１６：Ｈ．ピロリ  ＮＣＴＣ１１６３７からのＤＮＡ（１０  ｎｇ）；レーン１７：Ｈ．ピロリ  ＡＴＣＣ４３５７９からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン  １８：Ｈ．ピロリ  ＲＣ−１からのＤＮＡ（１０ｎｇ）。また、写真右側の矢印は、以下のバンドを示す。「４１８ｂｐ」：ＶＡＣ３６２４／ＶＡＣ４０４１Ｒプライマーペアにより増幅されたバンド（Ｈ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子）；「３４８ｂｐ」：ＨＨ−Ｆ５／ＨＨ−Ｒ４プライマーペアにより増幅されたバンド（Ｈ．スイスの非翻訳領域）；「２２０ｂｐ」：  ＨＨ−Ｆ２／ＨＨ−Ｒ２プライマーペアにより増幅されたバンド（Ｈ．スイスのＦ２Ｒ２遺伝子）。
【図５】ＨＨ．スイス特異的な２箇所の配列を標的としたＰＣＲプライマー、及びＨ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子を標的としたプライマーを用いて行ったＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行った写真である。各レーンで用いたサンプルは、以下のとおりである。レーンＭ：１００−塩基対  ＤＮＡマーカー；レーン１：Ｈ．  ピロリ  ＳＳ１からのＤＮＡ（１０ｎｇ）；レーン２：Ｈ．スイス  ＴＫＹ感染マウスからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン３、４、５及び１６：ＵＢＴ陰性患者の胃バイオプシーからのＤＮＡ（１００ｎｇ）；レーン６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５：ＵＢＴ陽性患者の胃バイオプシーからのＤＮＡ（１００ｎｇ）。また、写真右側の矢印は、以下のバンドを示す。「４１８ｂｐ」：ＶＡＣ３６２４／ＶＡＣ４０４１Ｒプライマーペアにより増幅されたバンド（Ｈ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子）；「２２０ｂｐ」：ＨＨ−Ｆ２／ＨＨ−Ｒ２プライマーペアにより増幅されたバンド（Ｈ．スイスのＦ２Ｒ２遺伝子）。
【図６】Ｆ２Ｒ２配列にコードされているタンパク質の電気泳動分析の写真である。各レーンで用いたサンプルは、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１、２：形質転換体１；レーン３、４：形質転換体２；レーン５、６：形質転換体３；レーン１、３、５：ＩＰＴＧによる発現誘導なし；２、４、６：ＩＰＴＧによる発現誘導あり。矢印はＦ２Ｒ２タンパク質のバンドを示す。
【図７】Ｈ．スイス感染マウス血清を用いたウエスタンブッロティグ分析の写真である。各レーンで用いたサンプルは、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１、２：分泌タンパク質；レーン３、４、５、６：菌体タンパク質；レーン１、３、５：ＩＰＴＧによる発現誘導なし；２、４、６：ＩＰＴＧによる発現誘導あり。矢印はＦ２Ｒ２タンパク質のバンドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明のポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、タンパク質若しくはペプチド、及び、抗体若しくはその免疫反応性断片は当業者周知の方法により適宜調製することができる。また、本発明の検出薬及び検出用キットは、当該技術分野周知の方法により、適宜製造することができる。
【００３９】
本発明におけるＨ．スイスの存在を判定する方法は、被験者由来のサンプルにおける、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチド、及び、（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体からなる群から選択される少なくとも一つを測定（検出）することを備える。
【００４０】
（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドを測定（検出）することを備える、Ｈ．スイスの存在を判定する方法
ポリヌクレオチドを測定（検出）することによる、Ｈ．スイスの検出は、ハイブリダイゼーションを利用した方法；ＰＣＲを利用した方法；並びに、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．（１９９９）４：３５３−３６４参照）により行うことができる。
【００４１】
ハイブリダイゼーションを利用した方法としては、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＡＳＯ法等の方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるＨ．スイスの存在を判定する方法は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）少なくとも１つの配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部と結合する核酸コンストラクトと被験者由来のサンプルを接触させるステップ；
（ｂ）前記サンプル中のポリヌクレオチドへの該核酸コンストラクトの結合を測定（検出）するステップ；及び、
（ｃ）該核酸コンストラクトが結合するポリヌクレオチドが測定（検出）されたサンプルを、Ｈ．スイスが存在するサンプルとして決定し、かつ、該核酸コンストラクトが結合するポリヌクレオチドが測定（検出）されなかったサンプルを、Ｈ．スイスが存在しないサンプルとして決定することにより、Ｈ．スイスの存在を判定するステップ。
【００４２】
また、ＰＣＲを利用した方法としては、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法等の方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるＨ．スイスの存在を判定する方法は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有する核酸を増幅させるステップ：
（ｂ）前記核酸の増幅量を検出し、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有する核酸の存在を測定（検出）するステップ；並びに、
（ｃ）該核酸の増幅が測定（検出）されたサンプルを、Ｈ．スイスが存在するサンプルとして決定し、かつ、該核酸の増幅が測定（検出）されなかったサンプルを、Ｈ．スイスが存在しないサンプルとして決定することにより、Ｈ．スイスの存在を判定するステップ。
【００４３】
増幅された核酸は、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を挙げることができる。
【００４４】
インベーダー（登録商標）法として知られる方法を用いて行う場合、例えば、本発明の配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドを測定（検出）することを備えるＨ．スイスの存在を判定する方法は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させるステップ：
（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、及び／又は、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｂ）（ａ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させるステップ；
（ｃ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させるステップ；
（ｄ）（ｃ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させるステップ；  
（ｅ）発色した蛍光を検出することにより、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列を有するポリペプチドを測定（検出）するステップ；ここで、蛍光発色が検出されたサンプルを、Ｈ．スイスが存在するサンプルとして決定し、かつ、蛍光発色が検出されなかったサンプルを、Ｈ．スイスが存在しないサンプルとして決定することにより、Ｈ．スイスの存在を判定するステップ。
【００４５】
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを測定（検出）することを備える、Ｈ．スイスの存在を判定する方法
タンパク質若しくはペプチドを測定（検出）することによる、Ｈ．スイスの検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等により行うことができる。
【００４６】
よって、本発明の方法は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）少なくとも１つの配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を認識する抗体若しくはその免疫反応性断片（第１抗体）に被験者由来のサンプルを接触させるステップ；
（ｂ）必要に応じて、更に、前記抗体若しくはその免疫反応性断片とは異なる、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を認識する抗体若しくはその免疫反応性断片（第２抗体）を（ａ）のステップにより得られたサンプルに接触させるステップ；
（ｃ）（標識を利用して）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を有するタンパク質若しくはペプチドの前記抗体若しくはその免疫反応性断片への結合を測定（検出）するステップ；
（ｃ）該抗体若しくはその免疫反応性断片へのタンパク質又はペプチドの結合が測定（検出）されたサンプルを、Ｈ．スイスが存在するサンプルとして決定し、かつ、該抗体若しくはその免疫反応性断片へのタンパク質又はペプチドの結合が測定（検出）されなかったサンプルを、Ｈ．スイスが存在しないサンプルとして決定することにより、Ｈ．スイスの存在を判定するステップ。
前記方法において、必要に応じて、第１抗体及び／又は第２抗体は標識化されていてもよい。
【００４７】
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドを認識する抗体を測定（検出）することを備える、Ｈ．スイスの存在を判定する方法
Ｆ２Ｒ２を認識する抗体を測定（検出）することによる、Ｈ．スイスの検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等により行うことができる。
【００４８】
より具体的には、本発明の方法は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）少なくとも１つの配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはその一部を有するタンパク質若しくはペプチドに被験者由来のサンプルを接触させるステップ、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を有するタンパク質若しくはペプチドへの被験者由来サンプル中の抗体の結合を検出するステップ；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を有するタンパク質若しくはペプチドへの該抗体の結合が測定（検出）されたサンプルを、Ｈ．スイスが存在するサンプルとして決定し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を有するタンパク質若しくはペプチドへの該抗体の結合が測定（検出）されなかったサンプルを、Ｈ．スイスが存在しないサンプルとして決定することにより、Ｈ．スイスの存在を判定するステップ。
【００４９】
配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその一部を有するタンパク質若しくはペプチドへの被験者由来サンプル中の抗体の結合の測定（検出）は、例えば、標識化抗ＩｇＧ抗体、又は抗Ｆｃ抗体等とサンプルを接触させて、当該標識を利用して測定することにより行うことができる。
【００５０】
抗体又はその断片の標識化は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００５１】
Ｈ．スイスは広く哺乳動物に感染することから、本明細書記載のＨ．スイス存在を判定する方法における被験者は、ヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及びウマ等の哺乳動物とすることができ、好ましくは、ヒトであり、より好ましくは、ヒトの鳥肌胃炎患者である。また、本発明の方法は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００５２】
本明細書記載のＨ．スイス存在を判定する方法において用いるサンプルとしては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または被験者から採取した液体を使用することができる。サンプルは、本発明の方法の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、便、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本明細書記載のＨ．スイス存在を判定する方法において核酸を検出対象とする場合には、サンプルとして好ましくは組織（特には胃組織（胃バイオプシーサンプル））又は便である。本明細書記載のＨ．スイス存在を判定する方法において抗体を検出対象とする場合には、サンプルとして好ましくは、血液、血漿、血清、リンパ液である。
【００５３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）Ｈ．スイスの塩基配列の決定
１．塩基配列決定用のＨ．スイスの調製
カニクイサルから分離されたＨ．スイス  ＴＫＹ株、及び、女性の鳥肌胃炎患者の胃バイオプシーから分離されたＨ．スイス  ＳＮＴＷ１０１株、並びに、参照用として胃ＭＡＬＴリンパ腫の男性患者から分離されたＨ．スイス  ＳＨ８株、及び、慢性胃炎の男性患者から分離されたＨ．スイス  ＳＨ１０株を、それぞれ別の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃で経代した。経代は、感染マウスの胃粘膜を０．０１％のゼラチンを含む燐酸緩衝生理食塩水（ＢＳＧ、ｐＨ  ７．４）で懸濁し、４週齢の非感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへ経口感染させることにより行った。１匹の感染マウスから３匹の非感染マウスへ経代し、３〜６ヶ月の間隔で経代を繰り返した。
【００５５】
２．マウス胃粘膜懸濁液からのＨ．スイスのゲノムＤＮＡの調製
感染マウスの胃粘膜の懸濁液からＨ．スイス以外に胃粘膜と共存する腸内細菌からＨ．スイスを抽出した後にゲノムＤＮＡを調製し、次世代ＤＮＡシーケンサー（ＳＯＬｉＤ、  ライフテクノロジー社）を用いて調製したＤＮＡの全塩基配列を決定した。具体的には、Ｈ．スイスを感染させたマウス胃粘膜をガラススライドで削り取り、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で、二つのガラススライドを用いてホモジナイズさせた。粘膜ホモジネートをセルストレーナー（４０μｍ、ナイロン；ＢＤ  ファルコン、ファランクリンレイクス、ＮＪ、米国）でフィルター濾過することにより細胞塊を除去した。非特異的吸着を避けるため、フィルター濾過したものを非免疫ウサギＩｇＧ被覆磁気ビーズ（Ｓｅｐａ−Ｍａｘ  Ｈｐ；和光純薬）で処理した。非吸着上清をウサギ抗Ｈ．ピロリ抗体被覆磁気ビーズ（Ｓｅｐａ−Ｍａｘ  Ｈｐ；和光純薬）で処理して、ヘリコバクター菌を分離した。得られた細菌細胞を蒸留水に懸濁させ、加熱処理（９５℃、５分間）及び遠心（１０、０００ｇ、５分間）した後、上清をＲＮａｓｅ  Ａ処理（１０μｇ／ｍＬ、３７℃、１時間）して、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりＨ．スイスのゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ純度は、ｉＱ  ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、及び、以下のプライマーペアを用いて、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヘルクレス、ＣＡ、米国）による量的リアルタイムＰＣＲで確認した。
【００５６】
【表１】
2016010331.tif 000002
【００５７】
また、各プライマーの配列を以下の表２に示す。
【００５８】
【表２】
2016010331.tif 000003
【００５９】
ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲは、以下のプロトコルで実施した：編成及び熱開始酵素活性化プログラム（９５℃、３分間）、増幅及び定量プログラム（９５℃、１０分間、及び６０℃、１５分間、単一蛍光測定）を５０回反復、及び溶融曲線プログラム（６５〜９５℃、０．５℃／秒の加熱速度、及び、連続的蛍光測定）。標準段階希釈液を各実験プレートにおいて用い、１６Ｓ  ＲＮＡの半定量及びβアクチン遺伝子の正規化は、平均値に基づき行った。標的遺伝子の量は、分離されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＧＡＳ４７２株の染色体ＤＮＡを用いて作製した。細菌ゲノムＤＮＡ（Ｈ．スイスを含む）の収量は、Ｈ．スイスＴＫＹ株又はＨ．スイス  ＳＮＴＷ１０１株を感染させた１匹のマウスから１μｇであり、Ｈ．スイスのＤＮＡの純度は３０〜６０％であった。
【００６０】
３．ゲノム配列決定
全ゲノム配列決定は、ＳＯＬｉＤシーケンサー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ、米国）を用いて、サイクルライゲーション配列決定法（ｃｙｃｌｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により行った。約３〜５μｇの精製細菌ゲノムＤＮＡを、１２０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥバッファーを含むＣｏｖａｒｉｓマイクロチューブ中、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２システム（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｉｎｃ．、ウォバーン、ＭＡ、米国）を用いて、Ｄｕｔｙ  Ｃｙｃｌｅ  ２０％、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ５、  Ｃｙｃｌｅｓ  ｐｅｒ  Ｂｕｒｓｔ  ２００、５℃で６０秒間粉砕することにより、１００〜１５０ｂｐに切断した。得られたＤＮＡ断片は、ＳＯＬｉｄフラグメントライブラリー構築キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＳＯＬｉＤのバーコードが付与されたフラグメントライブラリーに配置した。ＤＮＡ断片ライブラリーを、ライブラリー濃度０．５ｐｍｏｌ／ＬでエマルションＰＣＲ（ｅＰＣＲ）により増幅した。鋳型濃縮ビーズの３’末端を修飾し、ＳＯＬｉＤシーケンサースライド上にデポジットした。スライドをＳＯＬｉＤ４シーケンサー上にロードし、ペアードエンド５０＋３５塩基で２００億塩基（２０Ｇｂ）以上の情報を得た。
【００６１】
４．配列アッセンブリ
ＳＯＬｉＤシーケンサーから得られた色データを、ＳＯＬｉＤデノボアクセサリーツールｖ．２．０（Ｄｅｎｏｖｏ  ２）を用いてアッセンブルした。これは、内部で、エラー修正、ギャップ充填、及び色データから塩基データへの翻訳を含む前後のプロセスと組み合された、アッセンブリ―エンジンとしてのＶｅｌｖｅｔを利用している。デフォルトパラメーターセットでのアッセンブリーでは、非常に短いコンティグしか得られなかった（Ｈ．スイス  ＴＫＹ株  ２．１２Ｍｂ、Ｈ．スイス  ＳＮＴＷ１０１株  １．６２Ｍｂ）。そこで、いくつかのアッセンブリ―パラメーターを試みることにより、最も長い全コンティグサイズを生じる一つの配列を選択した。この配列に用いたパラメーターセットは、ｈｓｉｚｅ＝２３、ｃｏｖ  ｃｕｔｏｆｆ＝０．３、ｍａｘｃｏｖ＝１０００、及びｍｉｎ＿ｐａｉｒ＿ｃｏｕｎｔ＝３であった。
【００６２】
（実施例２）Ｈ．スイス特異的配列の探索
１．Ｈ．スイスゲノム配列の比較分析
アッセンブル解析により得られた多数のコンティグ配列と、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／  ＤＤＢＪデータベース上に登録されているＨ．スイス  ＨＳ１株、及びＨ．スイス  ＨＳ５株（両株ともブタからの分離株）のゲノム塩基配列とを、ＦＡＳＴＡを用いて塩基配列のアライメントを行った。ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベース上に登録されているＨ．スイスのコンティグ塩基配列は以下の通りである。
ＨＳ１株  ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＤＧＹ００００００００
ＨＳ５株  ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＤＨＯ００００００００
【００６３】
また、アッセンブル解析により得られた多数のコンティグ配列について、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースでＢＬＡＳＴＸ検索を行った。その結果、８９．９％のケースで、Ｈ．スイス、他のヘリコバクター種、及び、カンピロバクター種がトップヒット配列であった。よって、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベース上に公開されているカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属１１菌種、及び、ヘリコバクター属２０菌種（表３）の全ゲノム塩基配列について、ＲＥＣＯＧ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ｈｔｔｐ：／／ｍｂｇｄ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＲＥＣＯＧ／）を用いて比較ゲノム解析を行った。
【００６４】
【表３】
2016010331.tif 000004
【００６５】
その結果、Ｈ．スイスに共通して存在し、かつ、類縁のカンピロバクター属、ヘリコバクター属及び腸内細菌属に存在しない、２箇所のＨ．スイス特異的塩基配列を見出した（図２：配列番号１、及び図３：配列番号２）。このうち一つの配列（図２：配列番号１）は、オープンリーディングフレームをコードしない配列であったが、もう一方の配列（図３、配列番号２）はタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、この配列はＨ．スイス以外の他のヘリコバクター種の染色体には存在しない配列であった。この配列に近い配列をデータベース上で検索したが、Ｈ．スイス以外の主に由来する配列で、５０％以上のホモロジーを与える配列は存在しなかった。最も近い配列としては、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅのｃａｒＲ遺伝子の配列と４４％が一致したが、この菌は炭素固定により、植物の成長を助ける土壌にいる細菌であり、ｃａｒＲ遺伝子は、炭素固定に係わる遺伝子の発現の調節遺伝子であった。Ｈ．スイスは炭素固定機能は持たないと考えられることから、本実験により見出されたタンパク質はｃａｒＲとは異なるタンパク質であると考えられる。よって、本発明者らは、本塩基配列によりコードされる遺伝子をＦ２Ｒ２と命名した。
【００６６】
【表４】
2016010331.tif 000005
【００６７】
【表５】
2016010331.tif 000006
【００６８】
（実施例３）ＰＣＲによるＨ．スイスの検出
上述の実施例２において得られた２箇所の配列を標的としたＰＣＲプライマーを構築し、Ｈ．スイス５菌株、Ｈ．ピロリ５菌株、その他のへリコバクター７菌株から調製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、これらの２箇所の標的配列がＨ．スイス特異的であることを確認した。
【００６９】
１．ＰＣＲの鋳型ＤＮＡの調製
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、デュッセルドルフ、ドイツ）を用いて、製造者のプロトコルに従って、以下の表６に記載の菌株及び１４人の鳥肌胃炎患者の胃バイオプシーサンプルからＤＮＡを抽出してＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡを調製した。表６に記載の菌株のうち、調製方法が「培養」とあるものは、培養可能な株であることから、それぞれ後述の方法により培養して鋳型サンプルを調製した。また、表６に記載の菌株のうち、調製方法が「マウス胃粘膜」とあるものは、培養できない株であることから、感染マウスの胃粘膜から実施例１に記載の方法に準じて鋳型サンプルを調製した。
【００７０】
【表６】
2016010331.tif 000007
【００７１】
培養可能な菌株の培養方法は以下のとおりである。
Ｈ．フェリス  ＡＴＣＣ  ４９１７９株、Ｈ．ムステーレ  ＮＣＴＣ１２０３２株、Ｈ．ピロリ  ＳＳ１株、Ｈ．ピロリ  ＴＮ２ＧＦ４株、Ｈ．ピロリ  ＮＣＴＣ１１６３７株、Ｈ．ピロリ  ＡＴＣＣ４３５７９株、及び、Ｈ．ピロリ  ＲＣ−１株は、７％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）不活化子牛血清（ＦＣＳ）を含むブルセラ（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．、ハンプシャー、英国）寒天平板に植菌し、５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２の混合ガス内で、３７℃湿度１００％の条件下で３日間培養した。生じたコロニーを釣菌して液体培地で更に３日間振とう培養を行った。
Ｈ．スイス  ＨＳ５株（ブタより分離）、Ｈ．ハイルマニーｓ．ｓ．  ＡＳＢ１．４株（ネコから分離）、Ｈ．バクリフォルミス  Ｍ５０株、Ｈ．ビゾゼロニー  Ｒ１０５１株、Ｈ．シノガストリクス  ＪＫＭ４株、及び、Ｈ．サルモニス  Ｒ１０５３株は、これまで報告された培養条件に従って培養した（Ｂａｅｌｅ  Ｍら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００８）５８：１３５０−８；Ｖｅｒｍｏｏｔｅ  Ｍら、Ｖｅｔ  Ｒｅｓ（２０１１）４２：５１；Ｊｏｏｓｔｅｎ  Ｍら、Ｖｅｔ  Ｒｅｓ（２０１３）４４：６５；Ｂａｅｌｅ  Ｍら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００８）５８：３５７−６４；Ｂａｅｌｅ  Ｍら、Ｂａｅｌｅ  Ｍら、ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００４）４２：１１１５−２２；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｌｃｋ  Ｋら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００６）５６：１５５９−６４参照）。
【００７２】
２．ＰＣＲ反応
１×ＰＣＲ反応液（全量２５μＬ）は以下の組成とした。
２００μＭ  ｄＮＴＰミックス
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２μＭ  プライマーペア
１０ｎｇ  培養菌株から調製したＤＮＡ、
又は、１００ｎｇ  マウス胃粘膜から調製したＤＮＡ
１ユニット  Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  Ｃａｒｌｓｂａｄ、  ＣＡ、  ＵＳＡ）
プライマーペアは、ＶＡＣ３６２４Ｆ／ＶＡＣ４０４１Ｒ（Ｈ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子検出用）、ＨＨ−Ｆ５／ＨＨ−Ｒ４（Ｈ．スイスの非翻訳領域：図２及び配列番号１）検出用）、Ｆ２Ｒ２２Ｆ／Ｆ２Ｒ２２Ｒ（Ｈ．スイスのＦ２Ｒ２遺伝子検出用：図３及び配列番号２）の組み合わせを使用した。各プライマーの配列を表７に示す。
【００７３】
【表７】
2016010331.tif 000008
【００７４】
ＰＣＲ反応は、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、  Ｈａｍｂｕｒｇ、  Ｇｅｒｍａｎ）を用いて以下の手順で行った。変性及びホットスタートを９４℃で１分間行った後、９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間増幅プログラムを３５回繰り返した。その後、最終伸長として７２℃で１０分間反応させた。得られたＰＣＲ反応液５μＬに１μＬの６×ローディングバッファーを加え、２．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル電気泳動で分離し、得られたＤＮＡバンドをエキジウムブロミドで染色して検出した。
【００７５】
結果を図４に示す。実施例２において見出された２箇所のＨ．スイス特異的配列はＨ．スイスの全ての株（ＴＫＹ株、ＳＮＴＷ１０１株、ＳＨ８株、及びＳＨ１０株）で増幅したが、Ｈ．ピロリ及びその他のへリコバクター７菌株では増幅していなかった。一方、Ｈ．ピロリのｖａｃＡ遺伝子は、Ｈ．ピロリサンプルのみで増幅していた。よって、実施例２において見出された２箇所のＨ．スイス特異的配列が、Ｈ．スイスが共通して有する配列であること、及び、Ｈ．スイスに特異的であることが確認された。
【００７６】
（実施例４）ヒト胃バイオプシーのＰＣＲによる診断
１．ヒト胃バイオプシーサンプルの調製
１４人の鳥肌胃炎患者のヒト胃バイオプシーサンプルを生理食塩水で懸濁後、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ；  Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、添付の説明書に従ってＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡを調製した。
【００７７】
２．ＰＣＲ法によるＨ．スイス感染の診断
反応溶液（全量２５μＬ）は以下のように作成した。
１×ＰＣＲ  反応液
２００μＭ  ｄＮＴＰミックス
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２μＭ  プライマーペア−  （ＶＡＣ３６２４Ｆ／ＶＡＣ４０４１ＲとＨＨ−Ｆ２／ＨＨ−Ｒ２を使用）
１０ｎｇ  培養菌株から調製したＤＮＡ、
又は、１００ｎｇ  マウス胃粘膜から調製したＤＮＡ、
又は、１００ｎｇ  ヒト胃バイオプシーから調製のＤＮＡ
１ユニットＴｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）
【００７８】
ＰＣＲ反応は、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、  Ｈａｍｂｕｒｇ、  Ｇｅｒｍａｎ）を用いて以下の手順で行った。変性及びホットスタートを９４℃で１分間行った後、９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間増幅プログラムを３５回繰り返した。その後、最終伸長として７２℃で１０分間反応させた。得られたＰＣＲ反応液５μＬに１μＬの６×ローディングバッファーを加え、２．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル電気泳動で分離し、得られたＤＮＡバンドをエキジウムブロミドで染色して検出した。
【００７９】
結果を図５に示す。１４人の鳥肌胃炎患者の胃バイオプシーから、Ｈ．ピロリ又はＨ．スイスの感染を検出することができた。ＵＢＴ陽性患者は、全てＨ．ピロリの感染が認められ、ＵＢＴ陰性患者１例（レーン１６）にＨ．スイスの感染が確認された。よって、本発明の方法は、ＵＢＴ陰性患者におけるＨ．スイスの感染を検出できることが示された。
【００８０】
（実施例５）Ｆ２Ｒ２遺伝子の発現確認
上述の実施例２において見出されたＨ．スイス特異的配列のうち、一方の配列（図３、配列番号２）はタンパク質をコードする遺伝子を含んでいることから、このＦ２Ｒ２遺伝子が実際に発現産物としてタンパク質を生成するか否かを確認した。
Ｆ２Ｒ２配列をｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換した。形質転換体を３個選び１ｍＭ（培地の濃度）のｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬｅｎｎｏｘ培地で、３７℃で一夜振とう培養を行い、リコンビナントＦ２Ｒ２タンパク質を調製した。１２％濃度のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とクーマシーブルー染色でタンパク質を分析した。培養中に菌体から分泌されるタンパク質と菌体内タンパク質（それぞれ２０μｇ）を別々にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００８１】
結果を図６に示す。いずれの大腸菌においても、ＩＰＴＧ刺激により菌体内タンパク質としてＦ２Ｒ２を発現していた。よって、Ｆ２Ｒ２が確かにタンパク質レベルで発現する遺伝子であることが確認された。
【００８２】
（実施例６）Ｈ．スイス感染マウス血中の抗Ｆ２Ｒ２抗体の検出
図６の形質転換体１の分泌タンパク質と菌体タンパク質（２０μｇ）を別々にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後に、ＰＶＤＦ膜に転写し、２００倍希釈したＨ．スイス感染１年のマウスから調製した抗血清あるいは非感染マウスから調製した対照血清で反応させ、更に１万倍希釈した二次抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｅ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）と反応させた。最後に化学発光検出試薬を用い、抗体が特異的に認識するタンパク質バンドを検出した。
【００８３】
結果を図７に示す。Ｈ．スイス感染マウス血清中に、ＩＰＴＧ誘導した菌体中のタンパク質（Ｆ２Ｒ２タンパク質）と反応する抗体が存在していた。すなわち、Ｈ．スイス感染動物の血液中（血清中）に、Ｈ．スイス特異的タンパク質であるＦ２Ｒ２を認識する抗体が含まれていることが確認された。よって、被験者の血液（血清）をサンプルとして、当該サンプル内の抗Ｆ２Ｒ２抗体を測定／検出することにより、Ｈ．スイス感染の検査／診断／判定を行うことができることが示された。
【図１】
2016010331.tif 000009
【図２】
2016010331.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2016010331.tif 000014
【図７】
2016010331.tif 000015
【配列表】
2016010331000001.app