(57)【要約】【課題】  本発明は、生体組織内に存在する好酸球を特異的に検出する方法を提供することを課題とする。また、組織内に好酸球が浸潤する疾患を診断するために特異性の高い検査方法を提供することを課題とする。さらに、当該検出及び検査に必要な装置を提供することを課題とする。【解決手段】  好酸球に特異的に存在する好酸球ペルオキシダーゼを共鳴ラマン分光法を利用して検出することにより、組織内に存在する好酸球を検出する。【選択図】図３
2016137217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（２）前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在していると決定する工程を含む、生体組織内における好酸球の検出方法。
【請求項２】
工程（１）の共鳴ラマン分光法が、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する工程を有する方法であり、かつ
工程（２）において検出されるラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
工程（１）の前に、下記工程を有する請求項１又は２に記載の検出方法：
（０）ラマンスペクトルのノイズを減少させる工程。
【請求項４】
（Ａ）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（Ｂ）前記ラマンスペクトルにおいて好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が浸潤していると決定する工程を含む、組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法。
【請求項５】
工程（Ａ）において、生体組織から得られたラマンスペクトルが、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射して得られたものであり、かつ
工程（Ｂ）において検出するラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
工程（Ａ）の前に、下記工程を有する請求項４又は５に記載の検査方法：
（ａ）ラマンスペクトルのノイズを減少させる工程。
【請求項７】
共鳴ラマン分光法により生体組織のラマンスペクトルを得る取得手段、及び
前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在又は浸潤していると決定する決定手段
を含む、生体組織内における好酸球の検出装置。
【請求項８】
前記取得手段は、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する照射手段を有し、かつ
前記ラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、
請求項７に記載の検出装置。
【請求項９】
前記ラマンスペクトルのノイズを減少させるように、前記照射手段を制御する制御手段をさらに含む、請求項８に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共鳴ラマン分光法を利用した生体組織内好酸球の検出方法、組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法、及び生体組織内好酸球の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、好酸球性食道炎等の生体組織内への好酸球の浸潤に伴って発症する疾患の患者数は、増加傾向にある。この好酸球浸潤に伴う疾患は、消化管等の粘膜内に白血球の一種である好酸球が浸潤し、食物等に含まれる抗原に対して好酸球が反応することによって惹起されるアレルギー性疾患の一つであるといわれている。当該疾患を診断するためには、組織内に浸潤している好酸球を検出することが必要となるが、現在その検出は、好酸球が浸潤していると思われる組織を生検材料として、病理組織学的に好酸球の有無を検出する方法によって行われている。しかしながら、この病理組織学的検査は、病変組織の複数箇所から組織を採取する必要があり、出血を伴うことや、診断結果が分かるまでに数日要する等いくつかの課題を抱えている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、ラマン散乱光は、物質に光を照射した際に生じる振動数の変化した散乱光であり、単色光を照射した場合、その振動数成分の集まり（ラマンスペクトル）は物質に固有のものとなる。このラマン散乱光の特性を利用し、レーザー光を使用したラマン分光法によって化合物の化学構造の解析や、結晶性の解析が行われている。また、近年ラマン分光法を利用した食道癌細胞の検出も試みられている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】木下芳一  編集、好酸球性消化管疾患診療ガイド、南江堂、２０１４年７月
【非特許文献２】Mads Sylvest Bergholt, Gastroenterology, 2014, vol. 146, p27-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生体組織内に浸潤している好酸球を特異的に検出する方法を提供することを課題とする。また、組織内に好酸球が浸潤する疾患を診断するために特異性の高い検査方法を提供することを課題とする。さらに、当該検出及び検査に必要な装置を提供することを課題とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねたところ、好酸球に特異的に存在する好酸球ペルオキシダーゼに光を照射すると特定のラマンスペクトルのピークが得られることを見出した。そして、共鳴ラマン分光法を利用し、当該ピークを検出することにより組織内に存在する好酸球を検出できることを見出した。
【０００７】
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．（１）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（２）前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在していると決定する工程を含む、
生体組織内における好酸球の検出方法。
項２．工程（１）の共鳴ラマン分光法が、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する工程を有する方法であり、かつ
工程（２）において検出されるラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、
項１に記載の検出方法。
項３．工程（１）の前に、下記工程を有する項１又は２に記載の検出方法：
（０）ラマンスペクトルのノイズを減少させる工程。
項４．（Ａ）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（Ｂ）前記ラマンスペクトルにおいて好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が浸潤していると決定する工程を含む、
組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法。
項５．工程（Ａ）において、生体組織から得られたラマンスペクトルが、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射して得られたものであり、かつ
工程（Ｂ）において検出するラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、
項４に記載の検査方法。
項６．工程（Ａ）の前に、下記工程を有する項４又は５に記載の検査方法：
（ａ）ラマンスペクトルのノイズを減少させる工程。
項７．共鳴ラマン分光法により生体組織のラマンスペクトルを得る取得手段、及び
前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在又は浸潤していると決定する決定手段を含む、生体組織内における好酸球の検出装置。
項８．前記取得手段は、６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する照射手段を有し、かつ前記ラマンスペクトルピークが、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークである、項７に記載の検出装置。
項９．前記ラマンスペクトルのノイズを減少させるように、前記照射手段を制御する制御手段をさらに含む、項８に記載の検出装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生体組織内に存在する好酸球を特異的に検出することができ、組織内に好酸球が浸潤する疾患を診断することができる。また、当該検出及び診断に必要な装置を提供することができる。さらに、生体組織内に浸潤した好酸球を被験者に侵襲を与えることなく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の組織内好酸球の検出装置の一例である検出装置の概略構成図である。
【図２】本発明の組織内好酸球の検出装置の他の例である検出装置の概略構成図である。
【図３】白血球に６３３ｎｍの波長のレーザー光を励起光として照射して得られたラマンスペクトルを示す。ラマンスペクトルの横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示し、縦軸は光の強さを示す。（Ａ）好中球のラマンスペクトルを示す。矢印は、好中球ペルオキシダーゼに由来するピークを示す。（Ｂ）好酸球のラマンスペクトルを示す。矢印（７５３ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１及び１６０６ｃｍ−１）は、好酸球ペルオキシダーゼに由来するピークを示す。（Ｃ）リンパ球、好中球、好酸球のラマンシフトを並べて示す。点線で囲んだ部分は、好酸球に特異的なピークが出現する領域を示す。
【図４】（Ａ）は、図３Ｂと同じ図であり、好酸球のラマンシフトを示す。（Ｂ）は、正常食道組織のラマンスペクトルを示す。点線で囲んだ部分は、好酸球に特異的なピークが出現する領域を示す。
【図５】（Ａ）は、正常食道組織から取得した３カ所（（１）〜（３））のラマンスペクトルを示す。点線で囲んだ部分は、好酸球に特異的なピークが出現する領域を示す。（Ｂ）は、上記３カ所の拡大したラマンスペクトルを示す。
【図６】（Ａ）は、マウス好酸球性食道炎の組織から取得した３カ所（（１）〜（３））のラマンスペクトルを示す。点線で囲んだ部分は、好酸球に特異的なピークが出現する領域を示す。（Ｂ）は、上記３カ所の拡大したラマンスペクトルを示す。
【図７】ラマンスペクトルにおいて好酸球が検出されなかったマウスの食道組織（上段）と、好酸球が検出されたマウスの食道組織（下段）のＨＥ染色像を示す。矢頭は好酸球を示す。
【図８】ラマンスペクトルを得る前にレーザー光を前照射した場合の、ラマンスペクトルを示す。図中ａ、ｂ、ｃ、ｄの矢印はそれぞれレーザー光を１０秒間ずつ１〜４回照射した後に得たラマンスペクトルを示す（ａ：１回照射後、ｂ：２回目照射後、ｃ：３回目照射後、ｄ：４回目照射後）。図中（１）、（２）及び（３）は、ラマンスペクトルを取得した３カ所の番号を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．生体組織内における好酸球の検出方法
本発明は、以下の工程を含む生体組織内における好酸球の検出方法を含む：
（１）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（２）前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が浸潤していると決定する工程。
【００１１】
ここで、「生体」とは、生きている生物の体を示す。生物として、好ましくは哺乳動物、鳥類等であり、より好ましくは哺乳動物である。また哺乳動物として好ましくはヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等であり、より好ましくはヒトである。
【００１２】
また、「組織」とは、生物の体の一部を示す。本発明が適用される組織の由来器官としては、口腔、咽頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、膵臓等の消化器系；鼻腔、副鼻腔、喉頭、気管、気管支、肺等の呼吸器系；血管、心臓等の循環器系；腎臓、尿管、膀胱等の泌尿器系；末梢神経、中枢神経等の神経系；骨、軟骨、筋等の骨格系；骨髄、血液、リンパ節等の血液系；皮膚等の外皮系；副腎、下垂体、甲状腺、副甲状腺等の内分泌系；生殖器系；目、耳等の感覚器系が挙げられ、より好ましくは、消化器系、呼吸器系、循環器系、泌尿器系、神経系、外皮系、骨格系等が挙げられる。
【００１３】
さらに、本発明の組織は、生体内に存在していても、生体から採取されたものでもよいが、好ましくは生体から採取されたものである。
【００１４】
本発明では、血管、骨髄等以外の本来であれば好酸球が存在しない組織を検出対象とすることが好ましい。
【００１５】
本発明の生体組織内における好酸球の検出方法において、共鳴ラマン分光法により生体組織のラマンスペクトルを得る方法は、励起光を対象とする生体組織に照射し、得られたラマン散乱光を波長毎に分光し、分光された波長ごとの光の強度を記録する工程を含む。
【００１６】
照射する励起光としては、４００〜５００ｎｍ及び６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光であり、好ましくは６００〜８００ｎｍの範囲、より好ましくは６２０〜６５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは６２５〜６３５ｎｍの範囲、最も好ましくは６３２〜６３３ｎｍである。
【００１７】
共鳴ラマン効果は、励起光として６２０〜６５０ｎｍの範囲、より好ましくは６２５〜６３５ｎｍの範囲、さらに好ましくは６３２〜６３３ｎｍのレーザー光を照射した際に得られるため、この範囲の波長を用いることが特に好ましい。
【００１８】
６００〜８００ｎｍの範囲の波長のレーザー光を照射するためのレーザーとしては、特に制限されず、公知の赤色レーザーを用いることができる。例えばヘリウム−ネオンレーザー、ＡｌＧａＩｎＰ（アルミニウム・ガリウム・インジウム・リン）系赤色半導体レーザー等が挙げられる。
【００１９】
レーザー光を照射する強さは、組織を損傷させない限りにおいて特に制限されないが、０．１〜１０ｍＷであり、好ましくは０．５〜５ｍＷであり、より好ましくは１〜３ｍＷである。また、照射時間も、組織を損傷させない限りにおいて等に制限されないが、１カ所当たり３〜２０秒であり、好ましくは５〜１５秒であり、より好ましくは、８〜１２秒である。
【００２０】
さらに、レーザー光源と組織の光路の間に、特定の波長のレーザー光のみを透過するバンドパスフィルター等の光学フィルターを挟んでもよい。
【００２１】
組織に励起光を照射することによって生じた散乱光は、例えば公知の技術を使用して検出することができる。ここで励起光の照射によって生じる散乱光には、レイリー散乱光とラマン散乱光の２種類が存在する。ラマン散乱光はレイリー散乱光と比較して１００万分の１〜１億分の１程度の強さしかないため、ラマン散乱光を分光するためには、励起光を組織に照射して生じた散乱光を集光器等で取り込む前、又は取り込んだ後に、散乱光に含まれるレイリー散乱光を光学フィルター等で除去した上で、ラマン散乱光を分光器に取り込む必要がある。レイリー散乱光を除去するための光学フィルターとしては、公知のものを使用することができる。例えば、当該光学フィルターとしては、ダイクロイックフィルター；ロングパスフィルターやショートパスフィルター等のエッジフィルター；バンドパスフィルター等が挙げられる。
【００２２】
またラマン散乱には、ストークスラマン散乱とアンチストークスラマン散乱があり、どちらを検出してもよいが、好ましくはストークスラマン散乱である。
【００２３】
レイリー散乱光を除去した後のラマン散乱光を分光させるためには、例えば公知の回折格子等の分光器を使用することができる。分光されたラマン散乱光は、ＣＣＤ検知器等の公知の検知器を用いて検出することができる。また、検出されたラマン散乱光は、波長ごとに光の強度として電算機等に記録され、波長ごとの光の強度をラマンスペクトルとして外部機器又は内部機器に出力又は表示することができる。
【００２４】
ラマンスペクトルを解析する方法は、モニターに表示されたラマンスペクトル、若しくは紙媒体等に印刷されたラマンスペクトルを目視によって解析する方法、又はラマンスペクトルの特定の波長の範囲にピークが現れた場合に、そのことを電算機等を用いて通知又は表示する方法等が含まれる。
【００２５】
好酸球に特異的に存在する好酸球ペルオキシダーゼに上記波長の範囲内の励起光が照射されると、特定のラマンスペクトルのピークが得られる。このピークは、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、好ましくは、１，５００〜１，５５０ｃｍ−１、１，６００〜１，６５０ｃｍ−１及び７３０〜７８０ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、より好ましくは１，５３０〜１，５５０ｃｍ−１、１，６００〜１，６２０ｃｍ−１及び７４０〜７６０ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、さらに好ましくは、１，５４５ｃｍ−１、１，６０６ｃｍ−１、及び７５３ｃｍ−１に検出される少なくとも一つのピークである。これら波長範囲に少なくとも一つのピークが検出されれば、励起光を照射した部位に好酸球ペルオキシダーゼが存在していると決定することができる。好酸球ペルオキシダーゼが存在する部位には好酸球が存在するため、上記ピークの少なくとも一つが検出されれば、励起光を照射した部位の組織に好酸球が存在していると決定することができる。また、好酸球は健常状態では、血管内や骨髄にしか存在しないため、これら以外の組織に、上記ピークの少なくとも一つが検出されれば、当該組織内に好酸球が存在していると決定することができる。
【００２６】
また、好酸球の検出の特異性を上げるために、上記ラマンスペクトルの範囲に少なくとも２つのピークが検出された場合に、好酸球が存在していると決定してもよい。この場合に選択されるラマンスペクトルの２つのピークは、一方が１，５００〜１，５５０ｃｍ−１の範囲内であり、もう一方が１，６００〜１，６５０ｃｍ−１の範囲内；好ましくは一方が１，５３０〜１，５５０ｃｍ−１の範囲内であり、もう一方が１，６００〜１，６２０ｃｍ−１の範囲内；さらに好ましくは、一方が１，５４５ｃｍ−１であり、もう一方が１，６０６ｃｍ−１である。
【００２７】
さらに、本発明の生体組織内における好酸球の検出方法は、組織に励起光を照射した際に発生する、好酸球ペルオキシダーゼ以外のタンパク質、脂質、核酸等の自家蛍光や散乱光等に由来するラマンスペクトルのノイズを減少させる工程を含んでもよい。
【００２８】
ノイズを減少させる方法としては、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマン散乱光を検出するのに先立って、あらかじめ対象とする生体組織にレーザー光を前照射すること等が挙げられる。
【００２９】
前照射に使用されるレーザー光は、特に制限されないが、前記励起光として照射するレーザー光と同じ波長のものを用いることが好ましい。
【００３０】
レーザーの照射条件は、好酸球ペルオキシダーゼのラマン散乱光を得る時と同じであってもよいが、レーザーの強さは、前記ラマン散乱光を得る時の上記１．に記載した条件の１〜１．５倍が好ましく、より好ましくは１〜１．２倍である。
【００３１】
また前照射におけるレーザー光の照射時間も、好酸球ペルオキシダーゼのラマン散乱光を得る時と同じ条件であってもよいが、前照射におけるレーザー光の照射時間は、前記ラマン散乱光を得る時の上記１．に記載した条件の１、２、３、４又は５回分が好ましく、より好ましくは１、２又は３回分である。前照射におけるレーザー照射は、「好酸球ペルオキシダーゼのラマン散乱光を得る時と同じ照射時間」に「１、２、３、４又は５回分」を乗じた時間を連続して照射してもよく、１回ごと上記回数を繰り返して照射してもよい。
【００３２】
このような前処理を行うことにより、組織の自家蛍光や散乱光等の非特異的な光を減少させることができ、結果として、ラマンスペクトルのノイズを減少させることができる。
【００３３】
好酸球の検出は、組織内の一カ所について行ってもよいが、一つの組織内の複数箇所に対して行ってもよい。より検出効率を上げるためには、一つの組織内において０．０５〜１ｍｍ、好ましくは、０．１〜０．５ｍｍ程度の間隔ごとにラマンスペクトルを取得し、好酸球ペルオキシダーゼに由来するピークの有無を確認することが好ましい。
【００３４】
また、本発明の生体組織内における好酸球の検出方法は、後述３．の検出装置を用いて行うことができる。
【００３５】
２．組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法
本発明は、以下の工程を含む組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法を含む：
（Ａ）共鳴ラマン分光法により生体組織から得られたラマンスペクトルを解析する工程、及び
（Ｂ）前記ラマンスペクトルにおいて好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が浸潤していると決定する工程。
【００３６】
ここで「組織内好酸球浸潤性疾患」とは、血管、骨髄等以外の本来であれば好酸球が存在しない組織に好酸球が侵入し、炎症、細胞・組織障害、細胞・組織変性等の症状を来す疾患を示す。「炎症」、「障害」、「変性」の定義は、病理学の定義が適用される。
【００３７】
組織内好酸球浸潤性疾患としては、例えば、消化器系、呼吸器系、循環器系、泌尿器系、神経系、外皮系、骨格等の組織内に好酸球が浸潤し炎症、変性等の症状を来す疾患が挙げられる。より具体的には、好酸球が関与する、喘息；花粉症；アレルギー性鼻炎；アレルギー性結膜炎；アトピー性皮膚炎；アレルギー性皮膚炎；好酸球性食道炎；好酸球性胃腸炎；好酸球性胆管炎；単純性肺好酸球症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎等のPIE （Pulmonary infiltration of eosinophili）症候群；好酸球性気管支炎；好酸球性肉芽腫性多発血管炎；好酸球性心筋炎；尿細管間質性腎炎；好酸球性血管性浮腫；好酸球性筋膜炎；木村病；好酸球性皮膚炎；好酸球性膿疱性毛包炎；好酸球性副鼻腔炎；好酸球増多性鼻炎；好酸球性中耳炎等が挙げられる。
【００３８】
本発明が適用される組織内好酸球浸潤性疾患として好ましくは、上記疾患のうち、喘息；アレルギー性鼻炎；花粉症；アトピー性皮膚炎；アレルギー性皮膚炎；好酸球性食道炎；好酸球性胃腸炎；好酸球性胆管炎； PIE症候群；好酸球性気管支炎；好酸球性肉芽腫性多発血管炎；好酸球性副鼻腔炎；好酸球増多性鼻炎；好酸球性中耳炎等であり、より好ましくは、喘息；アレルギー性鼻炎；花粉症；アトピー性皮膚炎；アレルギー性皮膚炎；好酸球性食道炎；好酸球性胃腸炎；好酸球性胆管炎； PIE症候群；好酸球性気管支炎である。
【００３９】
上記工程（Ａ）の生体組織からラマンスペクトルを得る方法及びラマンスペクトルを解析する方法は特に制限されないが、例えば上記１．で述べた方法によって行うことができる。
【００４０】
ここで、本発明の検査方法は、生体内に存在している組織に適用してもよく、生体から採取された組織に適用してもよい。また組織は、正常組織であっても好酸球浸潤が疑われる組織であってもよいが、好酸球浸潤が疑われる組織が好ましい。「好酸球浸潤が疑われる」とは、目視、内視鏡検査等で炎症等の有無、血中の好酸球数等から好酸球浸潤の可能性があると判断されることをいう。
【００４１】
また、ラマンスペクトルを解析する方法は、モニターに表示されたラマンスペクトル、若しくは紙媒体等に印刷されたラマンスペクトルを目視によって解析する方法、又はラマンスペクトルの特定の波長の範囲にピークが現れた場合に、そのことを電算機等を用いて通知又は表示する方法等が含まれる。
【００４２】
上記工程（Ｂ）では、上記工程（Ａ）の解析において、好酸球ペルオキシダーゼに由来する少なくとも一つのラマンスペクトルピークが検出された場合、当該生体組織内に好酸球が浸潤していると決定することができる。このピークは、１，５００〜１，６５０ｃｍ−１及び７００〜８００ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、好ましくは、１，５００〜１，５５０ｃｍ−１、１，６００〜１，６５０ｃｍ−１及び７３０〜７８０ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、より好ましくは１，５３０〜１，５５０ｃｍ−１、１，６００〜１，６２０ｃｍ−１及び７４０〜７６０ｃｍ−１の範囲内に検出される少なくとも１つのピークであり、さらに好ましくは、１，５４５ｃｍ−１、１，６０６ｃｍ−１、及び７５３ｃｍ−１に検出される少なくとも一つのピークである。これらのピークの少なくとも一つが検出されれば、励起光を照射した部位に好酸球ペルオキシダーゼが存在していると決定することができる。好酸球ペルオキシダーゼが存在する部位には好酸球が存在することを意味するため、上記ピークの少なくとも一つが検出されれば、励起光を照射した部位の組織に好酸球が存在していると決定することができる。また、好酸球は健常状態では、血管内や骨髄にしか存在しないため、これら以外の組織に、上記ピークの少なくとも一つが検出されれば、当該組織内に好酸球が浸潤していると決定することができる。
【００４３】
また、好酸球の検出の特異性を上げるために、上記ラマンスペクトルの範囲に少なくとも２つのピークが検出された場合に、好酸球が浸潤していると決定してもよい。この場合に選択されるラマンスペクトルの２つのピークは、一方が１，５００〜１，５５０ｃｍ−１の範囲内であり、もう一方が１，６００〜１，６５０ｃｍ−１の範囲内；好ましくは一方が１，５３０〜１，５５０ｃｍ−１の範囲内であり、もう一方が１，６００〜１，６２０ｃｍ−１の範囲内；さらに好ましくは、一方が１，５４５ｃｍ−１であり、もう一方が１，６０６ｃｍ−１である。
【００４４】
特に組織内好酸球浸潤性疾患が疑われた被験者の好酸球浸潤が疑われる組織から取得したラマンスペクトルにおいて、上記ピークが検出された場合には、前記被験体が組織内好酸球浸潤性疾患であると決定することができる。
【００４５】
さらに、本発明の組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法は、上記１．で述べたラマンスペクトルのノイズを減少させる工程を含んでもよい。
【００４６】
また本発明の組織内好酸球浸潤性疾患の検査方法は、後述３．の検出装置を使用して行ってもよい。
【００４７】
３．生体組織内における組織内浸潤好酸球の検出装置
本発明の組織内浸潤好酸球の検出装置の実施形態について、図１および図２を参照して説明する。
【００４８】
検出装置１
図１は、本発明の組織内好酸球の検出装置の一例である検出装置１の概略構成図である。検出装置１は、生体内に存在している組織内好酸球を検出するように構成されており、内視鏡２、レーザー光源３、バンドパスフィルター４、エッジフィルター５、分光器６、検知器７、コンピュータ８、モニタ画面９、白色光源１０、光学映像ビデオカメラ１１、及び鉗子操作用ハンドル１２を備えている。
【００４９】
また、内視鏡２は、ラマン分光測定用光ファイバＦ１、照明用光ファイバＦ２、光学モニタ用光ファイバＦ３、及び鉗子用チューブＴを備えている。ラマン分光測定用光ファイバＦ１は、ダブルコア光ファイバであり、一方のコアは、バンドパスフィルター４を介してレーザー光源３に接続され、他方のコアは、エッジフィルター５を介して分光器６及び検知器７に接続されている。照明用光ファイバＦ２及び光学モニタ用光ファイバＦ３は、白色光源１０及び光学映像ビデオカメラ１１にそれぞれ接続されている。鉗子用チューブＴには、鉗子操作用ハンドル１２に接続された鉗子ユニットが挿入される。
【００５０】
レーザー光源３は、４００〜５００ｎｍ及び６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する光源であり、検出装置１では、最も好ましい６３３ｎｍの波長の励起光Ｅを照射する。バンドパスフィルター４は、波長が６３３ｎｍの励起光Ｅのみを通過させる光学フィルターである。
【００５１】
励起光Ｅを生体組織に照射することによって生じる散乱光には、レイリー散乱光とラマン散乱光の２種類が存在するが、ラマン散乱光はレイリー散乱光と比較して１００万分の１〜１億分の１程度の強さしかない。そのため、エッジフィルター５は、レイリー散乱光、及び励起光Ｅの波長である６３３ｎｍの成分をカットする特性を有している。エッジフィルター５としては、ダイクロイックフィルター；ロングパスフィルターやショートパスフィルター等のエッジフィルター；バンドパスフィルター等の公知の光学フィルターを使用することができる。
【００５２】
分光器６は、ラマン散乱光を分光するものであり、例えば公知の回折格子を使用することができる。
【００５３】
検知器７は、分光されたラマン散乱光を検知するものであり、ＣＣＤ検知器等の公知の検知器を用いることができる。
【００５４】
コンピュータ８は、例えば汎用のパーソナルコンピュータで構成されており、制御部８１、取得部８２、及び決定部８３を備えている。制御部８１、取得部８２、及び決定部８３は、コンピュータ８に組織内好酸球検出プログラムをインストールすることにより実現する機能ブロックである。なお、これらの各部を論理回路等によってハードウェア的に構成してもよい。
【００５５】
上述の構成要素のうち、取得部８２は、「共鳴ラマン分光法により生体組織のラマンスペクトルを得る取得手段」に相当し、決定部８３は、「前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在又は浸潤していると決定する決定手段」に相当する。また、レーザー光源３は、「６００〜８００ｎｍの範囲のいずれかの波長のレーザー光を励起光として照射する照射手段」に相当し、制御部８１は、「前記ラマンスペクトルのノイズを減少させるように、前記照射手段を制御する制御手段」に相当する。
【００５６】
検出装置１は、本発明の生体組織内における組織内好酸球の検出方法、及び組織内好酸球浸潤性疾患の各工程を実施するために、例えば、以下のように動作する。
【００５７】
工程（１）
工程（１）は、共鳴ラマン分光法により生体組織のラマンスペクトルを得る工程である。この工程では、内視鏡２を生体内（例えばヒトの食道内）に挿入し、制御部８１によってレーザー光源３を駆動させ、レーザー光源３は励起光Ｅを出射する。励起光Ｅはバンドパスフィルター４を通過して、ラマン分光測定用光ファイバＦ１の端部から食道粘膜Ｃに照射される。これにより、食道粘膜Ｃから散乱光Ｓが発生し、ラマン分光測定用光ファイバＦ１の端部に形成された集光（コレクタ）レンズに入射する。散乱光Ｓはラマン分光測定用光ファイバＦ１を通り、散乱光Ｓのうちレイリー散乱光のみがエッジフィルター５を通過する。レイリー散乱光は分光器６によって分光され、検知器７によって電気信号に変換される。当該電気信号はコンピュータ８の取得部８２に入力される。取得部８２は、検知器７からの電気信号に基づき、レイリー散乱光の波長ごとの強度を解析してラマンスペクトルを得る。
【００５８】
工程（２）
工程（２）は、前記ラマンスペクトルにおいて、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークが検出された場合に、当該生体組織内に好酸球が存在又は浸潤していると決定する工程である。この工程では、決定部８３が、取得部８２によって得られたラマンスペクトル、好酸球ペルオキシダーゼに由来するラマンスペクトルピークである１，５４５ｃｍ−１、１，６０６ｃｍ−１、及び７５３ｃｍ−１のピークの有無を検出する。そして、決定部８３は、これらのピークの少なくとも一つを検出した場合、励起光を照射した食道粘膜Ｃの部位に好酸球ペルオキシダーゼが存在していると決定する。
【００５９】
工程（０）
工程（０）は、ラマンスペクトルのノイズを減少させる工程であり、工程（１）の前に実施される。工程（０）では、制御部８１は、レーザー光源３に対し、ラマンスペクトルを得るための励起光Ｅを出射するのに先立って、当該励起光Ｅよりも強いレーザー光を出射するように制御する。本実施形態では、このレーザー光は、例えば、強さが励起光Ｅの１〜１．５倍であり、照射時間が連続的で又は断続的に１０〜４０秒であり、波長が励起光Ｅと同じ６３３ｎｍである。
【００６０】
検出装置１’
図２は、本発明の組織内好酸球の検出装置の他の例である検出装置１’の概略構成図である。検出装置１’は、生体から採取された組織内の好酸球を検出するように構成されており、図１に示される検出装置１から、内視鏡２、白色光源１０、光学映像ビデオカメラ１１、及び鉗子操作用ハンドル１２を省略した構成である。検出装置１’では、採取された生体組織である食道粘膜Ｃを保持部材１３上に保持し、ラマン分光測定用光ファイバＦ１によって食道粘膜Ｃのラマンスペクトルを得る。得られたラマンスペクトルに基づいて食道粘膜Ｃ内に好酸球が存在又は浸潤していると決定する具体的な方法は、図１に示す検出装置１と同様である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されて解釈されるものではない。
【００６２】
なお、実施例に示される動物実験は、島根大学動物実験規則に則って行った。
【００６３】
実験例１：ヒツジ白血球の共鳴ラマン分光法によるラマンスペクトル解析
白血球のラマンスペクトルを解析するため、ヒツジの全血を抗凝固剤存在下で採血した。採血した血液をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を使用して白血球を分離した。分離方法は、メーカー提供のプロトコールにしたがった。
【００６４】
単離した白血球を共焦点ラマン顕微鏡で観察した。観察条件は、励起光６３３ｎｍ、２ｍＷ、照射時間１０秒／ｐｏｉｎｔである。
【００６５】
得られたラマンスペクトルを図３に示す。
【００６６】
好中球では矢印で示す部分に好中球ペルオキシダーゼに由来すると思われる広範囲のピークが観察された（図３Ａ）。これに対して、好酸球では、７５３ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１及び１６０６ｃｍ−１の３カ所に狭い範囲の好酸球ペルオキシダーゼに由来するピークが認められた（図３Ｂ）。図３Ｃには、リンパ球、好中球、好酸球から上記条件で得られたラマンスペクトルを並べて示した。この結果から、６３３ｎｍの波長のレーザー光を励起光として照射した場合に得られる７５３ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１及び１６０６ｃｍ−１のラマンスペクトルのピークは、好酸球に特異的であることが明らかとなった。
【００６７】
実験例２：正常食道組織の共鳴ラマン分光法によるラマンスペクトル解析
次に、正常の食道組織のラマンスペクトルを解析するため、麻酔下のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー社、６週齢、メス）から、食道組織を採取して上下方向に切開し、粘膜面がラマン顕微鏡の対物レンズ側にくるようにステージにセットした。６３３ｎｍの波長のレーザー光を励起光として、２ｍＷで照射時間１０秒／ｐｏｉｎｔで照射し、ラマンスペクトルを得た。
【００６８】
その結果を、実験例１で得た好酸球のラマンスペクトルと並べて図４に示す。
【００６９】
正常食道組織（図４Ｂ）には、好酸球（図４Ａ）に特徴的な１５４５ｃｍ−１及び１６０６ｃｍ−１にピークは認められなかった。この結果から、６３３ｎｍの波長のレーザー光を励起光として使用する共鳴ラマン分光法によって、組織中に存在する好酸球を検出できる可能性が示された。
【００７０】
実施例１：マウス好酸球性食道炎モデルを用いた共鳴ラマン分光法による組織内好酸球の検出
マウス好酸球性食道炎モデルを用いて、共鳴ラマン分光法によって組織内に浸潤した好酸球の検出を試みた。
（１）方法
マウス好酸球性食道炎モデルは、以下の方法により作成した。
【００７１】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー社、６週齢、メス）にＩＬ−３３を０．０５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。投与後８日後にマウスから食道組織を採取した。陰性対照は、ＩＬ−３３を投与しない正常マウスとした。採取した組織について、実験例２の方法に従って、ラマンスペクトルを取得し解析した。この時、ラマンスペクトルの取得は、０．５ｍｍ×０．４ｍｍの範囲で、０．１ｍｍ間隔で３０カ所について行った。
【００７２】
また、採取した組織はラマンスペクトルを取得した後、ホルマリン固定を行いパラフィン包埋切片を作成しＨＥ染色を行って、好酸球の有無を光学顕微鏡下で観察した。
（２）結果
正常マウスの食道組織のラマンスペクトルを図５に示す。測定した３０カ所のうち３カ所のラマンスペクトルを示した。好酸球が存在していれば、図中の点線で囲んだ領域に好酸球に由来するピークが出現するが、正常マウスの食道組織ではピークは認められなかった。
【００７３】
好酸球性食道炎を起こしたマウスの食道組織のラマンスペクトルを図６に示す。図６Ａには測定した３０カ所のうち３カ所のラマンスペクトルを示した。正常と同様に図６Ａの（１）及び（３）のラマンスペクトルの点線で囲んだ領域にはピークは認められないが、（２）のラマンスペクトルの点線で囲んだ領域にはピークが検出された。図６Ａのラマンスペクトルの点線で囲んだ領域を拡大した図を図６Ｂに示す。（１）及び（３）のラマンスペクトルにピークは認められず陰性対照とおなじスペクトルを示しているが、（２）では、１５４５ｃｍ−１及び１６０６ｃｍ−１にピークが認められた。
【００７４】
ラマンスペクトルで好酸球のピークが検出されなかった組織と、好酸球のピークが検出された組織のＨＥ染色像を図７に示す。図７上段は、ラマンスペクトルで好酸球のピークが検出されなかった組織であり、好酸球の存在は確認できなかった。図７下段は、ラマンスペクトルで好酸球のピークが検出された組織であり、矢頭で示すように多数の好酸球の浸潤が確認された。
【００７５】
この結果から、共鳴ラマン分光法により組織内に浸潤している好酸球を検出できることが示された。
【００７６】
実施例２：ラマンスペクトルのノイズの低減
次に、ラマンスペクトルのノイズを減少させるため、ラマンスペクトルを得る前に、６３３ｎｍの波長のレーザー光を２ｍＷで照射時間１０秒／ｐｏｉｎｔで１〜４回照射し、ラマンスペクトルを得た。照射時間ごとのラマンスペクトルは図８中ａ（１回目照射後）、ｂ（２回目照射後）、ｃ（３回目照射後）、ｄ（４回目照射後）の矢印で示す。図８中（１）、（２）及び（３）は、ラマンスペクトルを取得した３カ所の番号を示す。
【００７７】
図８（１）及び（２）に好酸球が存在している組織のラマンスペクトルを、（３）に正常組織のラマンスペクトルを示した。レーザー光の照射時間を長くするほどバックグラウンドが下がってくることが示された。この結果から、レザー光を前照射することによって、ラマンスペクトルのノイズを減少させることができることが示された。
【符号の説明】
【００７８】
１    検出装置
１’  検出装置
２    内視鏡
３    レーザー光源
４    バンドパスフィルター
５    エッジフィルター
６    分光器
７    検知器
８    コンピュータ
９    モニタ画面
１０  白色光源
１１  光学映像ビデオカメラ
１２  鉗子操作用ハンドル
１３  保持部材
８１  制御部
８２  取得部
８３  決定部
Ｃ    食道粘膜
Ｅ    励起光
Ｆ１  ラマン分光測定用光ファイバ
Ｆ２  照明用光ファイバ
Ｆ３  光学モニタ用光ファイバ
Ｓ    散乱光
Ｔ    鉗子用チューブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2016137217.tif 000008
【図７】
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【図８】
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