(57)【要約】      （修正有）【課題】カロテノイドの生産性を向上させることができる新規なカロテノイド合成酵素及びその利用の提供。【解決手段】オーランチオキトリウム属から単離したカロテノイド合成酵素ＣｒｔＩＢＹ遺伝子は、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、及び、リコペン環化酵素ドメインを含むタンパク質をコードしており、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独の酵素で触媒することができる蛋白質。更にＣｒｔＳ遺伝子を導入して、β−カロテンからアスタキサンチンを製造する方法。【選択図】図１
2016010347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むことを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
上記タンパク質のアミノ末端側から、上記フィトエン不飽和化酵素ドメイン、上記フィトエン合成酵素ドメインおよび上記リコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むことを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質をコードしていることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含むことを特徴とする請求項４に記載の遺伝子：
（ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載の遺伝子が挿入されていることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とするβ−カロテンの製造方法。
【請求項９】
上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることを特徴とする請求項８に記載のβ−カロテンの製造方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含み、
上記形質転換体はβ−カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体であることを特徴とするアスタキサンチンの製造方法。
【請求項１１】
上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＳ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１０に記載のアスタキサンチンの製造方法。
【請求項１２】
上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＲ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１０または１１に記載のアスタキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカロテノイド合成酵素およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンやカロテンなどに代表されるカロテノイドは、食品、化粧品、医薬品および飼料などに広く利用されている。
【０００３】
自然界から天然のカロテノイドを安全かつ安定して得ることは、非常に困難である。それ故に、現在、カロテノイドの生合成に関与する遺伝子を同定し（例えば、非特許文献１〜１４参照）、同定された遺伝子が導入された形質転換体を作製して、当該形質転換体によってカロテノイドを生産する試みがなされている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）のカロテノイドの生合成に関与する遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
【０００５】
特許文献２には、フィトエン合成酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子、フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、ζ−カロテン不飽和化酵素（ζ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、および、リコペン環化酵素（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、リコペン環化酵素（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子、β−カロテンハイドロキシラーゼ（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子、および、β−カロテン−Ｃ（４）−オキシゲナーゼ（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ  Ｃ（４）  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１４９０７７号公報（２００１年  ６月  ５日公開）
【特許文献２】特表２００２−５３７８４１号公報（２００２年１１月１２日公開）
【特許文献３】特開２００６−  ７５０９７号公報（２００６年  ３月２３日公開）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Takashi Maoka, Mar. Drugs, (2011), 9, p278-293
【非特許文献２】Yves Lemoine et al., Photosynth Res, (2010), 106, p155-177
【非特許文献３】Changfu Zhu et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, (2010), 504, p132-141
【非特許文献４】Martine Bertrand, Photosynth Res, (2010), 106, p89-102
【非特許文献５】Chengwei Liang et al., Int. J. Biol. Sci., (2006), 2, p197-207
【非特許文献６】Mauricio Niklitschek et al., Biol Res, (2008), 41, p93-108
【非特許文献７】Vanessa Alvarez et al., Fungal Genetics and Biology, (2006), 43, p261-272
【非特許文献８】Jennifer Alcaino et al., BMC Microbiology, (2008), 8:169
【非特許文献９】Patrick Schaub et al., PLoS ONE, June 2012, Volume 7, Issue 6, p1-15
【非特許文献１０】Ken Ukibe et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov 2009, p7205-7211
【非特許文献１１】Isabell Schmidt et al., Appl Microbiol Biotechnol, (2011), 89, p555-571
【非特許文献１２】L. Campenni et al., Appl Microbiol Biotechnol, (2013), 97, p1383-1393
【非特許文献１３】M.Aguila et al., Carotenoid Biosynthesis in Arabidopsis: A Colorful Pathway, The Arabidopsis Book, First published on January 19, 2012, 1-28
【非特許文献１４】Shinichi Takaichi, Mar. Drugs, (2011), 9, p1101-1118
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述のような従来技術は、カロテノイドの生産性が低いという問題点を有している。
【００１０】
具体的に、上述のような従来技術は、人為的に多くの種類の酵素を同時に発現させた形質転換体を用いて、多段階の酵素反応によってカロテノイドを生産している。
【００１１】
この場合、カロテノイドの生産性（例えば、生産量）は、多くの種類の酵素の中の、最も反応速度の遅い酵素、および／または、最も発現量の少ない酵素などに大きく左右されることになる。
【００１２】
そして、上述のような従来技術は、人為的に多くの種類の酵素を同時に発現させた形質転換体を用いているが故に、これらの酵素の中に、非常に反応速度の遅い酵素や、非常に発現量の少ない酵素が含まれてしまい、その結果、当該酵素を介した酵素反応の段階が、カロノイドの生合成系における律速段階になり、カロテノイドの生産性が低下するという問題点を有している。
【００１３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、カロテノイドの生産性を向上させることができる新規なカロテノイド合成酵素およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の酵素反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素を発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
本発明のタンパク質は、上記課題を解決するために、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明のタンパク質では、上記タンパク質のアミノ末端側から、上記フィトエン不飽和化酵素ドメイン、上記フィトエン合成酵素ドメインおよび上記リコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されていることが好ましい。
【００１７】
本発明のタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むことが好ましい。つまり、
（ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
【００１８】
本発明の遺伝子は、上記課題を解決するために、本発明のタンパク質をコードしていることを特徴としている。
【００１９】
本発明の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含むことが好ましい。つまり、
（ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
本発明のベクターは、上記課題を解決するために、本発明の遺伝子が挿入されていることを特徴としている。
【００２１】
本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、本発明のベクターが導入されていることを特徴としている。
【００２２】
本発明のβ−カロテンの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴としている。
【００２３】
本発明のβ−カロテンの製造方法では、上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることが好ましい。
【００２４】
本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する工程を含み、上記形質転換体はβ−カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体であることを特徴としている。
【００２５】
本発明のアスタキサンチンの製造方法では、上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＳ遺伝子が導入されたものであることが好ましい。
【００２６】
本発明のアスタキサンチンの製造方法では、上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＲ遺伝子が導入されたものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独の酵素で触媒することができるので、カロテノイドの生産性を向上させることができるという効果を奏する。
【００２８】
具体的に、従来知られているゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する生合成経路では、β−カロテンが生成される前に様々な中間体（例えば、フィトエン、ζ−カロテン、リコペン）が形成され、これらの中間体が形質転換体内に蓄積されることになる。そして、蓄積された中間体は、β−カロテン以外の物質を生成するためにも利用され、β−カロテンの生産量が低下する。
【００２９】
一方、本発明では、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独の酵素で触媒し、多段階の反応が連続的に進むことになる。その結果、中間体が形質転換内に蓄積されることを抑制することができる。つまり、本発明では、β−カロテン以外の物質の生成に利用されるゲラニルゲラニルピロリン酸の量を少なくすることができる。それ故に、本発明は、カロテノイドの生産量を増加させることができるという効果を奏する。
【００３０】
また、従来技術では、複数の酵素を同時に発現する形質転換体を作製する必要があったが、本発明であれば、１つの酵素を発現する形質転換体を作製すればよい。それ故に、本発明は、形質転換体の作製工程、更に言えば、カロテノイドの生産工程を簡略化させることができるという効果を奏する。
【００３１】
また、従来技術のような複数の酵素を同時に発現する形質転換体は、その形質が変化し易く、所望の形質を長期間にわたって維持することが難しい。その結果、従来技術では、安定してカロテノイドを生産することが難しい。
【００３２】
一方、本発明では、１つの酵素を発現する形質転換体を用いればよく、このような形質転換体は、所望の形質を長期間にわたって維持することが比較的容易である。それ故に、本発明は、安定してカロテノイドを生産することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のタンパク質中の各ドメインに対して高い相同性を示す酵素を示す図である。
【図２】本発明のタンパク質、および、本発明のタンパク質の部分構造に対して高い相同性を示す酵素の分子系統樹である。
【図３】実施例における、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現解析の試験結果を示す写真である。
【図４】カロテノイドの生合成経路、および、当該生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００３５】
〔１．タンパク質〕
本実施の形態のタンパク質は、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むタンパク質である。なお、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。
【００３６】
本明細書において「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」とは、フィトエン不飽和化酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、フィトエン不飽和化酵素の活性とは、フィトエンをリコペンに変換する活性を意図する。
【００３７】
フィトエン不飽和化酵素の活性は、所望のドメインとフィトエンとを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとフィトエンとを接触させたときにリコペンが生成されれば、当該ドメインを、フィトエン不飽和化酵素ドメインであると判定することができる。
【００３８】
なお、フィトエンからリコペンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとフィトエンとの混合溶液中におけるリコペンの存在を検出すればよい。
【００３９】
フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
【００４０】
周知のフィトエン不飽和化酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのフィトエン不飽和化酵素を挙げることができる（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＬＲ７０６４０、ＣＡＪ５２９７０、ＡＡＡ２０１０９、ＣＢＮ７７３３８またはＡＡＯ５３２５７）。
【００４１】
所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、フィトエン不飽和化酵素ドメインであると判定することができる。
【００４２】
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。
【００４３】
更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
【００４４】
また、フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
【００４５】
本明細書において「フィトエン合成酵素ドメイン」とは、フィトエン合成酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、フィトエン合成酵素の活性とは、ゲラニルゲラニルピロリン酸をフィトエンに変換する活性を意図する。
【００４６】
フィトエン合成酵素の活性は、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにフィトエンが生成されれば、当該ドメインを、フィトエン合成酵素ドメインであると判定することができる。
【００４７】
ゲラニルゲラニルピロリン酸からフィトエンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸との混合溶液中におけるフィトエンの存在を検出すればよい。
【００４８】
フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
【００４９】
周知のフィトエン合成酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのフィトエン合成酵素を挙げることができる。（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＬＲ７０６３９、ＣＡＪ５２９６７、ＡＥＤ９２４００、ＣＢＪ３１３３７またはＡＡＯ４７５７０）。
【００５０】
所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、フィトエン合成酵素ドメインであると判定することができる。なお、アミノ酸配列の相同性は、「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」の場合と同様にして求めることができる。
【００５１】
また、フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
【００５２】
本明細書において「リコペン環化酵素ドメイン」とは、リコペン環化酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、リコペン環化酵素の活性とは、リコペンをβ−カロテンに変換する活性を意図する。
【００５３】
リコペン環化酵素の活性は、所望のドメインとリコペンとを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとリコペンとを接触させたときにβ−カロテンが生成されれば、当該ドメインを、リコペン環化酵素ドメインであると判定することができる。
【００５４】
リコペンからβ−カロテンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとリコペンとの混合溶液中におけるβ−カロテンの存在を検出すればよい。
【００５５】
リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
【００５６】
周知のリコペン環化酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのリコペン環化酵素を挙げることができる。（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＬＲ７０６３４、ＣＡＪ５１１４８、ＡＥＥ７４８７５、ＣＢＮ７８００４またはＡＡＯ４７５７０）。
【００５７】
所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、リコペン環化酵素ドメインであると判定することができる。なお、アミノ酸配列の相同性は、「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」の場合と同様にして求めることができる。
【００５８】
また、リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
【００５９】
本実施の形態のタンパク質内における、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインの位置は特に限定されないが、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置され得る。
【００６０】
ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する場合、従来公知の酵素では、まず、フィトエン合成酵素が機能し、次いでフィトエン不飽和化酵素が機能し、最後にリコペン環化酵素が機能する。
【００６１】
本発明のタンパク質のような３つのドメインを有するタンパク質は未知であるので、当業者が当該３つのドメインの配置を考えること自体あり得ないことではあるが、仮に考えたとすれば、酵素が機能する順番に基づけば、当業者であれば、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン合成酵素ドメイン、フィトエン不飽和化酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されると考えるのが一般的である。
【００６２】
つまり、当業者であれば、フィトエン合成酵素ドメインによって形成された第１の中間体がフィトエン不飽和化酵素ドメインへ受け渡されるためには、フィトエン合成酵素ドメインとフィトエン不飽和化酵素ドメインとが隣接している必要があり、フィトエン不飽和化酵素ドメインによって形成された第２の中間体がリコペン環化酵素ドメインへ受け渡されるためには、フィトエン不飽和化酵素ドメインとリコペン環化酵素ドメインとが隣接している必要があると考える。それ故に、当業者であれば、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン合成酵素ドメイン、フィトエン不飽和化酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されると考える。
【００６３】
しかしながら、後述する実施例にて示すように、驚くべきことに本実施の形態のタンパク質では、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置され得る。当該配置の順番は、従来の技術常識からは決して想到できない、本発明の独自の構成である。
【００６４】
本実施の形態のタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質からなるタンパク質、または、当該タンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
【００６５】
ここで、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、２倍体の生物であるオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株から見出された、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素である。
【００６６】
タンパク質が、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質であるか否かを判定するためには、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにβ−カロテンが生成されるか否かを試験すればよい。つまり、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにβ−カロテンが生成されれば、当該タンパク質を、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質であると判定することができる。
【００６７】
具体的な判定方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを溶液中または細胞中で接触させた後、当該溶液または細胞の抽出物を各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）にて分離して、抽出物中にβ−カロテンが存在するか否かを、色または吸光度などに基づいて確認すればよい。なお、上記抽出には、有機溶媒（例えば、アセトン／メタノール混合液など）を適宜選択して用いればよい。
【００６８】
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
【００６９】
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
【００７０】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００７１】
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
【００７２】
本実施の形態のタンパク質は、以下の（ｅ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質、または、以下の（ｅ）で示されるタンパク質からなるタンパク質であってもよい：
（ｅ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質。
【００７３】
なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。
【００７４】
更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
【００７５】
本実施の形態のタンパク質は、必要に応じて上述したフィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメイン以外の構成を含んでいてもよい。
【００７６】
このような構成としては、例えば、ドメイン同士を繋ぐリンカー、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなど）、タンパク質（例えば、ＧＳＴタンパク質、蛍光タンパク質など）を挙げることができる。
【００７７】
リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー（例えば、１〜２０個、または、１〜１０個のアミノ酸からなるリンカー）であってもよいし、タンパク質同士を連結することが可能な周知の架橋剤であってもよい。リンカーを備えていれば、ドメイン同士の相対的な位置を適切に調節することができるので、より活性の高いタンパク質、および／または、より熱安定性の高いタンパク質を実現することができる。
【００７８】
〔２．遺伝子〕
本実施の形態の遺伝子は、〔１．タンパク質〕の欄にて説明した本発明のタンパク質をコードしている遺伝子である。なお、本明細書において、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
【００７９】
本実施の形態の遺伝子では、タンパク質を構成する各アミノ酸をコードするコドンは限定されず、所望のコドンであり得る。
【００８０】
また、本実施の形態の遺伝子は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の形態であってもよいし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であってもよい。更に、ＤＮＡの形態である場合、二本鎖ＤＮＡであってもよいし、一本鎖ＤＮＡであってもよい。更に、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、タンパク質をコードするセンス鎖であってもよいし、当該センス鎖に対するアンチセンス鎖であってもよい。
【００８１】
本実施の形態の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子、または、当該遺伝子を少なくとも一部分として含む遺伝子であってもよい。つまり、
（ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００８２】
ここで、配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株から見出された、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素をコードするポリヌクレオチドである。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【００８４】
本実施の形態の遺伝子は、必要に応じて上述したフィトエン不飽和化酵素ドメインをコードする領域、フィトエン合成酵素ドメインをコードする領域、および、リコペン環化酵素ドメインをコードする領域以外の構成を含んでいてもよい。
【００８５】
このような構成としては、例えば、ドメイン同士を繋ぐリンカーをコードするポリヌクレオチド（例えば、１〜２０個、または、１〜１０個のアミノ酸からなるリンカー）、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなど）をコードするポリヌクレオチド、タンパク質（例えば、ＧＳＴタンパク質、蛍光タンパク質など）をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８６】
リンカーを備えていれば、ドメイン同士の相対的な位置を適切に調節することができるので、より活性の高いタンパク質、および／または、より熱安定性の高いタンパク質を実現することができる。
【００８７】
〔３．ベクター〕
本実施の形態のベクターは、〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子を含むベクターである。換言すれば、本実施の形態のベクターは、〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子が挿入されたベクターである。
【００８８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、所望の宿主（例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母、糸状菌、真菌、動物細胞、植物細胞）の中で本発明の遺伝子を発現可能なベクターであればよい。それ故に、周知の発現ベクターに対して〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子が挿入されたベクターが、本発明のベクターに包含される。
【００８９】
ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有したものであればよい。宿主が細菌である場合、プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、または、ｌａｃプロモーター等を使用することができ、宿主が酵母である場合、プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、または、ＰＨＯ５プロモーター等を使用することができ、宿主が糸状菌である場合、プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、または、ｔｒｐＣプロモーター等を使用することができ、宿主が動物細胞である場合、プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、または、ＳＶ４０後期プロモーター等を使用することができる。勿論、本発明は、これらの構成に限定されない。
【００９０】
上記発現制御領域は、発現誘導が可能なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ＧＡＬ１プロモーターなど）であってもよい。
【００９１】
当該構成であれば、宿主の生活環の特定のタイミング（換言すれば、宿主内で特定の代謝経路が機能している特定のタイミング）にて本発明のタンパク質の発現を誘導することができる。つまり、当該構成であれば、Ａ）宿主内で本来接触することが無い特定の酵素とβ−カロテンとを接触させる、および／または、Ｂ）宿主内のフィトエン、ζ−カロテンおよびリコペンの量を減少させる、ことができる。その結果、新規なカロテノイドの生産、および／または、特定のカロテノイドの生産効率の向上、を実現することができる。
【００９２】
本実施の形態のベクターは、慣用的な手法に従って作製することができる。本実施の形態のベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００９３】
〔４．形質転換体〕
本実施の形態の形質転換体は、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを含む形質転換体である。換言すれば、本実施の形態の形質転換体は、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを所望の宿主に導入することによって、〔１．タンパク質〕の欄にて説明した本発明のタンパク質を発現可能になった形質転換体である。
【００９４】
上記宿主としては特に限定されず、適宜、所望の宿主（例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母、糸状菌、真菌、動物細胞、植物細胞）を用いることができる。
【００９５】
上記宿主の具体例としては、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸が細胞内に存在し得る宿主（例えば、下記（１）〜（３）など）、および、ゲラニルゲラニルピロリン酸が細胞内に存在し得、かつ、β−カロテンからアスタキサンチンを生成し得る宿主（例えば、下記（４）〜（９）など）を挙げることができる。更に具体的には、
（１）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（２）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（３）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有している宿主；
（４）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）と、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）とを有している宿主；
（５）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有し、かつ、人為的に、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（６）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与され、かつ、元々、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（７）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与され、かつ、人為的に、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（８）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有し、かつ、元々、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（９）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有し、かつ、人為的に、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主。
【００９６】
上記（１）〜（９）の宿主であれば、宿主内にゲラニルゲラニルピロリン酸が存在する。そして、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、ベクターによって発現された本発明のタンパク質と、当該タンパク質の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸とが接触することになる。その結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成することができる。
【００９７】
更に、上記（４）〜（９）の宿主であれば、宿主がβ−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を有しているので、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、本発明のタンパク質によって生成されたβ−カロテンからアスタキサンチンを生成することができる。
【００９８】
人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力を宿主に付与する方法としては特に限定されないが、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸の生合成反応を触媒する酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子を、発現可能に宿主に導入する方法を挙げることができる。
【００９９】
このような遺伝子としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸からゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＧＤＰＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ１７３７６））、ゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＦＤＰＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ０６３１１２））、および、ファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＢＴＳ１遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ３１６３２）、および、ＣｒｔＥ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ０１６５０２））を挙げることができる。
【０１００】
更に具体的には、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子のみを導入してもよいし、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよいし、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とイソペンテニルピロリン酸からゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよい。
【０１０１】
人為的に、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を宿主に付与する方法としては特に限定されないが、例えば、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する生合成反応を触媒する酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子を、発現可能に宿主に導入する方法を挙げることができる。
【０１０２】
このような酵素としては、例えば、β−カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ２０２４０２）、および、ＣｒｔＲ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ８８４１３４））、β−カロテンからカンタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＯ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ２５７２９０）、および、ＣｒｔＷ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＦ０３１０５１））、および、カンタキサンチンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＺ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＦ０３１０５２））を挙げることができる。
【０１０３】
更に具体的には、宿主に対してβ−カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子のみを導入してもよいし、宿主に対してβ−カロテンからカンタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子とカンタキサンチンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよい。
【０１０４】
上述した宿主の更に具体的な例としては、カロテノイド産生が確認されている種々の微生物（例えば、Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ属、Ｐｈａｆｆｉａ属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ属）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属）、Ｎｏｓｔｏｃ属、および、Gloeobacter属）、植物（例えば、カキ、オレンジ、ニンジン、トマト、および、タバコ）を挙げることができる。勿論、本発明は、これらの宿主に限定されない。
【０１０５】
〔５．β−カロテンの製造方法〕
本実施の形態のβ−カロテンの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含んでいる。
【０１０６】
具体的な培養方法（例えば、培養培地、培養時間、培養温度など）は限定されず、形質転換体の作製に用いた宿主などに応じて適宜選択すればよい。
【０１０７】
上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることが好ましい。
【０１０８】
より具体的に、「ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体」としては、〔４．形質転換体〕の欄にて説明した（１）〜（９）の宿主に、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを導入して作製された形質転換体を挙げることができる。
【０１０９】
上記（１）〜（９）の宿主であれば、細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸が存在する。そして、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、ベクターによって発現された本発明のタンパク質と、当該タンパク質の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸とが接触することになる。その結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンを生成することができる。
【０１１０】
本実施の形態のβ−カロテンの製造方法は、形質転換体を培養する工程以外の工程を含んでいてもよい。
【０１１１】
当該工程としては、例えば、β−カロテンを精製する工程を挙げることができる。例えば、各種クロマトグラフィーによって、β−カロテンを精製してもよい。
【０１１２】
〔６．アスタキサンチンの製造方法〕
本実施の形態のアスタキサンチンの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含み、当該形質転換体はβ−カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体である。
【０１１３】
具体的な培養方法（例えば、培養培地、培養時間、培養温度など）は限定されず、形質転換体の作製に用いた宿主などに応じて適宜選択すればよい。
【０１１４】
「β−カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体」としては、〔４．形質転換体〕の欄にて説明した（４）〜（９）の宿主に、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを導入して作製した形質転換体を挙げることができる。
【０１１５】
上記（４）〜（９）の宿主であれば、宿主がβ−カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を有しているので、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、本発明のタンパク質によって生成されたβ−カロテンからアスタキサンチンを生成することができる。
【０１１６】
本実施の形態のアスタキサンチンの製造方法は、形質転換体を培養する工程以外の工程を含んでいてもよい。
【０１１７】
当該工程としては、例えば、アスタキサンチンを精製する工程を挙げることができる。例えば、各種クロマトグラフィーによって、アスタキサンチンを精製してもよい。
【実施例】
【０１１８】
＜１．カロテノイド合成酵素ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の単離＞
オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株（受領番号：：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２６７）のゲノムＤＮＡを、以下のように調製した。
【０１１９】
ＫＨ１０５株をＧＰＹ培地（３％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．６％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．２％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２％  ｓｅａ  ｓａｌｔｓ）中で４日間培養した後、遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、当該菌体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２％  ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）中に懸濁した。
【０１２０】
上記懸濁液に対して平衡化フェノール（フェノールに８−ヒドロキシキノリンを加え、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８．０に平衡化された平衡化フェノール）を等量加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
【０１２１】
上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１，ｖ／ｖ）を加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
【０１２２】
上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１，ｖ／ｖ）を加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
【０１２３】
上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、２．５倍量の冷却エタノールを加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。
【０１２４】
上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿に７０％冷却エタノールを５ｍＬ加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した。
【０１２５】
上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿にＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてゲノムＤＮＡを溶解させた後、当該溶液に１μｇ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｅ  Ａを加えて３７℃で１時間のインキュベートを行った。
【０１２６】
上記溶液に対して等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混液（２５：２４：１，ｖ／ｖ）を加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
【０１２７】
上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１，ｖ／ｖ）を加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
【０１２８】
上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、２．５倍量の冷却エタノールを加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。
【０１２９】
上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿に７０％冷却エタノールを５ｍＬ加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した。
【０１３０】
上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿にＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてゲノムＤＮＡを溶解させた。
【０１３１】
次いで、ＫＨ１０５株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子を、以下のように増幅して単離した。
【０１３２】
ゲノムＤＮＡ  １５０ｎｇ、ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ（東洋紡製）  １ｕｎｉｔ／５０μＬ、ｄＮＴＰ  各０．４ｍＭ、プライマー１  ０．３μＭ、プライマー２  ０．３μＭを含むＰＣＲ反応溶液を作製した。
・プライマー１：5’-CAGTGTGCTGGAATTATGGCGCGCAGGGCGTCG       -3’（配列番号５）
・プライマー２：5’-GATATCTGCAGAATTTCAGGCATTCTTGTACAGCGGGAGC-3’（配列番号６）
上記ＰＣＲ反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１０秒間の変性反応、７０℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、６８℃にて２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０回繰り返した。
【０１３３】
ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ反応溶液をアガロースゲル電気泳動によって分離し、常法にしたがって、増幅されたＣｒｔＩＢＹ遺伝子をアガロースゲルから精製した。
【０１３４】
ＣｒｔＩＢＹ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を解析したところ、異なる塩基配列を有する２種類の遺伝子を確認することができた。ＫＨ１０５株は２倍体の生物であるため、２種類の遺伝子が存在するものと考えられた。
【０１３５】
２種類の遺伝子のＤＮＡ塩基配列の各々を、配列番号３および４に示す（以下、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子とも呼ぶ）。また、２種類の遺伝子がコードする各タンパク質のアミノ酸配列の各々を、配列番号１および２に示す。
【０１３６】
何れの遺伝子も、タンパク質をコードしている領域のＤＮＡの全長は３８０７ｂｐ（停止コドン１個を含む）であり、１２６８個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。
【０１３７】
上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、上記ポリペプチドに対して高い相同性を示すタンパク質をデータベースから検索したところ、上記ポリペプチドは、各種生物由来のフィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）、および、リコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）の各々と高い相同性を示すドメインを有していることが明らかになった。
【０１３８】
具体的に、図１に示すように、上記２種類のポリペプチドは、アミノ末端側から順に、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）と高い相同性を示すドメイン、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）と高い相同性を示すドメイン、および、リコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）と高い相同性を示すドメインを有していた。
【０１３９】
図２に、各種生物由来のタンパク質との相同性をもとにして作成した分子系統樹を示す。なお、当該分子系統樹は、ｃｌｕｓｔａｌｗおよびｓｅａｖｅａｗプログラムを用いて作成した。具体的な作成手順は、当該プログラムに添付のマニュアルにしたがった。図２に示すように、何れの生物に由来するタンパク質も、進化系統的に近い位置にあることが明らかになった。
【０１４０】
＜２．ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現解析＞
本実施例では発現宿主として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Ｄ１  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２／ＭＡＴα  ｈｉｓ３Ｄ１  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２）を用いた。
【０１４１】
また、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現には、２μ  ｏｒｉｇｉｎによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製が可能であり、選択マーカーとしてＵＲＡ３、遺伝子発現制御領域としてガラクトースにて発現誘導可能なＧＡＬ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター、並びに、大腸菌における選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子、を有する酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２（Life Technologies）を用いた。
【０１４２】
ｐＹＥＳ２を制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで消化し、当該消化物をアガロース電気泳動に供し、線状化されたｐＹＥＳ２を、常法にてアガロースゲルから精製した。
【０１４３】
線状化されたｐＹＥＳ２と、前項で得られたＣｒｔＩＢＹ遺伝子の全長を含むＰＣＲ産物  １００ｎｇと、５×Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｅｍｉｘ（Clontech Laboratories, Inc.）  ５μＬと、を混合し、当該混合物を、５０℃で１５分間インキュベートした。
【０１４４】
インキュベート後の混合物  ２μＬに対して、大腸菌コンピテントセルＳｔｅｌｌａＴＭ  Cｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆ−，ｅｎｄＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ１，ｒｅｌＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｐｈｏＡ，Φ８０ｄ  ｌａｃＺΔ  ｍ１５，Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ），ΔｍｃｒＡ，λ−）（Clontech Laboratories, Inc.）を含む溶液を５０μＬ加え、当該菌体懸濁液を、３０分間氷冷した後、４２℃で４５秒間のヒートショックを行い、直ちに氷上で１分間静置した。
【０１４５】
上記菌体懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地（１％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ、２％  ａｇａｒ）に塗布し、３７℃で１２時間培養した。
【０１４６】
ＬＢプレート培地上に現れたコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ）に植菌して３７℃、３００ｒｐｍで１２時間培養し、得られた菌体から、ＰｏｗｅｒＰｒｅｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（OriGene）のプロトコルに従い、プラスミドを抽出した。
【０１４７】
得られたプラスミドを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化し、当該消化物をアガロースゲル電気泳動にて確認したところ、予想されたバンドパターンを示したことから目的のプラスミドが取得されたと判断した。
【０１４８】
目的のプラスミドを有する大腸菌株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌して３７℃、１６０ｒｐｍで１２時間培養し、得られた菌体から、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ（Clontech Laboratories, Inc.）のプロトコルに従い、目的のプラスミド、つまり、発現用プラスミドｐＹＥＳ２−ＣｒｔＩＢＹを取得した。
【０１４９】
上述したｐＹＥＳ２−ＣｒｔＩＢＹおよび陰性対照となるｐＹＥＳ２の各々を用いて、酵母細胞を形質転換した。
【０１５０】
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１を５ｍＬのＹＰＤ培地（２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎe、１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２％  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）中にて２８℃、３００ｒｐｍで１２時間培養した。当該培養液の１ｍＬをマイクロチューブに分取し、当該培養液を１５００ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。
【０１５１】
上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬのリチウム酢酸溶液（１００ｍＭ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５）を加えて懸濁した後、１５００ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。
【０１５２】
上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に２００μＬのＰＥＧ／リチウム酢酸溶液（１００ｍＭ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５、５０％（ｗ／ｖ）  ＰＥＧ４０００）を加えて懸濁した。
【０１５３】
当該懸濁液に５μｇのプラスミド（ｐＹＥＳ２−ＣｒｔＩＢＹ、または、ｐＹＥＳ２）を添加し、３０℃で１時間のインキュベート、続いて４０℃で１０分間のインキュベートを行った。
【０１５４】
インキュベート後の上記懸濁液を、ウラシルを含まないＳＤプレート培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ、２％  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、２％  ａｇａｒ）に塗布し、２８℃で培養した。
【０１５５】
ＳＤプレート培地上に現れた形質転換体を３ｍＬのＳＣＴ  ｗ／ｏ  ｕｒａ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ、４％  Ｄ−ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）に植菌して、２８℃、３００ｒｐｍにて１５時間培養した。
【０１５６】
１ｍＬの培養液を３０ｍＬのＳＣＴ  ｗ／ｏ  ｕｒａ培地に植菌して、２８℃、１６０ｒｐｍにて６時間培養した。当該培養液に対して、最終濃度が２％になるようにフィルター滅菌済みのガラクトース溶液を添加して、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現誘導をかけた後、更に１６時間培養した。
【０１５７】
ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現を誘導した形質転換体から、以下のようにしてカロテノイド色素を抽出した。
【０１５８】
３０ｍＬの培養液を５０ｍＬ容量の試験管に入れ、５０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離した。
【０１５９】
上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体を１ｍＬの蒸留水に懸濁した後、当該懸濁液をネジ口試験管に移して２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離した。
【０１６０】
上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬの３Ｎ  ＨＣｌを加えて激しく懸濁した後、当該懸濁液を沸騰湯浴中で３分間静置した。
【０１６１】
静置後の懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬの蒸留水を加え懸濁した。当該懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬのアセトン／メタノール混合液（７：３，ｖ／ｖ）を加え、激しく懸濁した。
【０１６２】
上記懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して、得られた上清を新しいねじ口試験管に移し、当該上清を、窒素気流下で６０℃のヒートブロックにより蒸発乾固させた。
【０１６３】
乾固物を５０μＬのアセトンに溶解させてバイアル瓶に移し、当該溶解物を、各形質転換体の色素サンプルとした。
【０１６４】
得られた色素サンプルの色素組成を薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）によって確認した。
【０１６５】
展開溶媒としてアセトン／ヘキサン混液（３：７，ｖ／ｖ）を用い、ＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（Merck）上で、暗所にて、各色素サンプル２０μＬを展開した。比較対照として、各１ｍｇ／ｍＬのβ−カロテンおよびアスタキサンチンを１０μＬ、同様に展開した。
【０１６６】
試験結果を図３に示す。具体的に、レーン１は比較対照であるβ−カロテンを示し、レーン２は比較対照であるアスタキサンチンを示している。レーン３はｐＹＥＳ２を導入した酵母の試験結果を示しており、当該酵母では、β−カロテンの生産が認められなかった。一方、レーン４はｐＹＥＳ２−ＣｒｔＩＢＹを導入した酵母の試験結果を示しており、当該酵母では、β−カロテンの生産が認められた。
【０１６７】
図４に、β−カロテンの生合成経路および代謝経路、並びに、当該生合成経路および代謝経路に関与する酵素をコードする遺伝子を示す。なお、図４において、破線にて囲まれている経路は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが元々有している経路であり、その他の経路は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが元々有していない経路である。なお、図４において、ＩＰＰはイソペンテニルピロリン酸を、ＧＰＰはゲラニルピロリン酸を、ＦＰＰはファルネシルピロリン酸、ＧＧＰＰはゲラニルゲラニルピロリン酸を示している。
【０１６８】
図４に示すように、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を生合成できるが、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）を持たないので、フィトエンを生成することはできない。また、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、フィトエン不飽和化酵素／リコペン合成酵素（ＣｒｔＩ）およびリコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）も持たないので、β-カロテンを生成することはできない。
【０１６９】
したがって、上記試験から、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子は、ＧＧＰＰを基質としてβ−カロテンを生成する活性を有する酵素をコードしていることが明らかになった。
【０１７０】
＜３．アスタキサンチンの生産＞
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主としてアスタキサンチンを生産するために、赤色酵母であるＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓにおいてβ-カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードするＣｒｔＳ遺伝子（Ｘ．  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ  ＡＴＣＣ  ２４２０２  ｃＤＮＡ由来）（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）、および、当該酵素の酸化還元反応を補助するシトクロムＰ４５０還元酵素をコードするＣｒｔＲ遺伝子（Ｘ．  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ  Ｙ９８９  ｃＤＮＡ由来）（アミノ酸配列：配列番号９、塩基配列：配列番号１０）の両遺伝子を、既にＣｒｔＩＢＹ遺伝子が導入されている酵母へさらに導入した。
【０１７１】
また、ＧＧＰＰ産生量の増加を目的として、ＧＧＰＰの生成を司る酵素をコードするＢＴＳ１遺伝子（Ｓ.  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃ１  ｇｅｎｏｍｅ由来）（アミノ酸配列：配列番号１１、塩基配列：配列番号１２）も更に導入して、その効果を調べた。以下の試験は、『Ukibe et al. (2009) Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Astaxanthin Production and Oxidative Stress Tolerance. Appl. Environ. Microbiol. 75:7205-7211』に記載の方法に従って行った。
【０１７２】
ＣｒｔＳ遺伝子およびＢＴＳ１遺伝子の酵母への導入には、２μ  ｏｒｉｇｉｎによってＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製可能であり、選択マーカーとしてＨＩＳ３を有する酵母構成発現用プラスミドｐＨＶ１を使用した。より具体的には、ｐＨＶ１内のＡＤＨ１プロモーターの下流にＢＴＳ１遺伝子およびＣｒｔＳ遺伝子がタンデムに挿入された、ｐＨＶ−ＢＴＳ１−ｃｒｔＳを構築した。
【０１７３】
酵母細胞への形質転換は上述した方法で行った。プラスミドを導入した形質転換体の選択には、ＳＤ  ｗ／ｏ  ｕｒａ、ｈｉｓプレート培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ，  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  ｌｅｕｃｉｎｅ，  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ、２％  ａｇａｒ）を使用した。
【０１７４】
得られた形質転換体をそれぞれ、ＳＣＴ  ｗ／ｏ  ｕｒａ、ｈｉｓ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ，  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  ｌｅｕｃｉｎｅ，  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、４％  Ｄ−ｒａｆｆｉｎｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）を用いて上述の方法と同様に培養し、色素組成を調べた。
【０１７５】
試験結果を図３に示す。具体的に、レーン５は、酵母において、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子に加えて、更にＣｒｔＳ遺伝子およびＢＴＳ１遺伝子を発現させたときの試験結果を示している。
【０１７６】
ＣｒｔＩＢＹ遺伝子のみを発現させた酵母（レーン４）と比較して、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子、ＢＴＳ１遺伝子およびＣｒｔＳ遺伝子を発現させた酵母（レーン５）では、β−カロテンの産生量が顕著に増加し、さらにアスタキサンチンの産生がかろうじて観察できる程度に認められた。このことは、ＢＴＳ１遺伝子の作用によってＣｒｔＩＢＹ遺伝子がコードする酵素の基質となるＧＧＰＰの量が増加したこと、および、ＣｒｔＳ遺伝子の作用によってアスタキサンチンが生成したことを示している。
【０１７７】
ＣｒｔＲ遺伝子の酵母への導入には、２μ  ｏｒｉｇｉｎによってＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製可能であり、選択マーカーとしてＬＥＵ２を有する酵母構成発現用プラスミドｐＡＤ４を使用した。より具体的には、ｐＡＤ４内のＡＤＨ１プロモーターの下流にＣｒｔＲ遺伝子が挿入された、ｐＡＤ−ｃｒｔＲを構築した。
【０１７８】
酵母細胞への形質転換は上述した方法で行い、陰性対照として、ｐＹＥＳ２およびｐＨＶ−ＢＴＳ１−ｃｒｔＳのみが導入された酵母へも、ｐＡＤ−ｃｒｔＲを導入した。プラスミドを導入した形質転換体の選択には、ＳＤ  ｗ／ｏ  ｕｒａ、ｈｉｓ、ｌｅｕプレート培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ，  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  ｌｅｕｃｉｎｅ，  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％  ａｇａｒ）を使用した。
【０１７９】
得られた形質転換体をそれぞれ、ＳＣＴ  ｗ／ｏ  ｕｒａ、ｈｉｓ、ｌｅｕ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．１９％  ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／ｏ  ｕｒａｃｉｌ，  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  ｌｅｕｃｉｎｅ，  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、４％  Ｄ−ｒａｆｆｉｎｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）を用いて上述の方法と同様に培養し、色素組成を調べた。
【０１８０】
図３に示すように、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子、ＢＴＳ１遺伝子、ＣｒｔＳ遺伝子およびＣｒｔＲ遺伝子を発現させた酵母（レーン６）ではアスタキサンチンおよび生合成中間体と思われる色素の産生量が顕著に増加したが、ＢＴＳ１遺伝子、ＣｒｔＳ遺伝子およびＣｒｔＲ遺伝子を発現させた酵母（レーン７）ではカロテノイドおよびアスタキサンチンの産生は認められなかった。以上の結果は、ＣｒｔＲ遺伝子の作用によってアスタキサンチン合成酵素をコードするＣｒｔＳ遺伝子の作用が強化されたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明は、カロテノイドを製造する分野に利用することができる。更に具体的に、本発明は、食品、化粧品、医薬品および試料などを製造する分野に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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