(57)【要約】【課題】  環境中に現れる揮発性有機化合物の一つであるヘキサナール(Hexanal)特異的暴露有無確認用のバイオマーカーおよびそれを用いた確認方法を提供する。【解決手段】  本発明は、ヘキサナールの暴露濃度によって濃度依存的に遺伝子発現が増加または減少するバイオマーカーおよびそれを用いたヘキサナールに特異的に暴露有無を確認する方法に関するものであり、本発明のバイオマーカーは、ＤＮＡマイクロアレイチップを通じて選別された反応遺伝子をバイオマーカーとして用い、環境試料からヘキサナールの汚染をモニターリングおよび判定するのに有用に用いることができ、ヘキサナールによって特異的に誘発される毒性作用機序を解明するためのツールとして用いることができる。【選択図】図２
2016007213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群から選択されるいずれか一つの遺伝子の核酸配列またはその相補鎖の分子が集積されたヘキサナール（Ｈｅｘａｎａｌ）特異的暴露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップ：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＸＭ＿５７５８０８（ＲＧＤ１５５９８６４、ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｍＫＩＡＡ１０４５  ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号１３）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１、ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０２１６６６（ＴＲＤＮ、ｔｒｉａｄｉｎ）（配列番号１５）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０９３０５（ＴＭＥＭ１８２、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ１８２）（配列番号１６）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＸＭ＿００３７４９７９９（配列番号１７）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０８７２８（ＳＬＣ３９Ａ５、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ３９（ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ｍｅｍｂｅｒ５）（配列番号１９）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０００４２１（ＯＬＲ１０７５、ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１０７５）（配列番号２３）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）；および
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１１５０４３（ＬＯＣ６８４８７１、ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ８ｏｒｆ４（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）（ＴＣ−１））（配列番号２５）。
【請求項２】
１）ヘキサナールを暴露させた実験群と正常対照群の肺組織からそれぞれのＲＮＡを分離する工程；
２）工程１）の実験群と対照群のＲＮＡをｃＤＮＡに合成して、実験群と対照群のｃＤＮＡを蛍光物質で標識する工程；
３）工程２）の蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを、請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションさせる工程；
４）工程３）の反応したＤＮＡマイクロアレイチップを分析する工程；および
５）工程４）の分析したデータから、請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイチップに集積された遺伝子の発現程度を対照群と比較して確認する工程を含む、ヘキサナール暴露有無確認方法。
【請求項３】
前記工程１）の肺組織が、ラットの肺組織であることを特徴とする請求項２に記載のヘキサナール暴露確認方法。
【請求項４】
前記ラットの肺組織が、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットであることを特徴とする請求項３に記載のヘキサナール暴露有無確認方法。
【請求項５】
前記工程３）の蛍光物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ポリ−Ｌ−リジン−フロオレセインイソチオシアネート(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate;FITC)、ＲＩＴＣ(rhodamine-B-isothiocyanate)およびローダミン(rhodamine)からなる群から選択して使用することを特徴とする請求項２に記載のヘキサナール暴露有無確認方法。
【請求項６】
１）ヘキサナールを暴露させた実験群と正常対照群の肺組織からそれぞれのＲＮＡを分離する工程；
２）前記のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)を実行する工程；および
３）工程２）の遺伝子産物を対照群と比較して、発現程度を確認する工程とを含むヘキサナール暴露有無確認方法：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１、ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）；および
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）。
【請求項７】
工程１）のプライマー対が、下記のプライマー対からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項６に記載のヘキサナール暴露有無確認方法：
プライマー対１：配列番号１で表される順方向プライマーおよび配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される順方向プライマーおよび配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される順方向プライマーおよび配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される順方向プライマーおよび配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される順方向プライマーおよび配列番号１０で表される逆方向プライマー；および
プライマー対６：配列番号１１で表される順方向プライマーおよび配列番号１２で表される逆方向プライマー。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイチップを含むヘキサナール暴露有無確認用キット。
【請求項９】
ラットの肺組織をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載のヘキサナール暴露有無確認用キット。
【請求項１０】
ラットの肺組織が、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットであることを特徴とする請求項９に記載のヘキサナール暴露有無確認用キット。
【請求項１１】
下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含むヘキサナール暴露有無確認用キット：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１、ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）；
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）；および
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）。
【請求項１２】
前記プライマー対が、下記のプライマー対からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載のヘキサナール暴露有無確認用キット：
プライマー対１：配列番号１で表される順方向プライマーおよび配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される順方向プライマーおよび配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される順方向プライマーおよび配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される順方向プライマーおよび配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される順方向プライマーおよび配列番号１０で表される逆方向プライマー；と
プライマー対６：配列番号１１で表される順方向プライマーおよび配列番号１２で表される逆方向プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘキサナール(Hexanal)特異的暴露有無を確認するためのバイオマーカーおよびそれを用いたヘキサナールに対する特異的暴露有無を確認する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘキサナールは、揮発性有機化合物類の代表的な物質であるアルデヒド類の一つである。アルデヒドは、室内汚染源の主な物質として知られており(非特許文献１)、実生活で使用する家具、織物、塗料、カーペットをはじめ、食品の調理過程で発生する煙にも多様に含まれていることが知られている。ほとんど呼吸を通じて曝され、呼吸を通じた暴露は、血管を通じて早い速度で全身に伝えられるようになる。
【０００３】
血流に乗って流れる揮発性有機化合物は、肺胞膜の拡散現象によって肺に影響を与えるようになり、ヘキサン、メチルペンタン、イソプロペン、ベンゼンなどは、疾患のマーカーとして使用されており(非特許文献２) 、最近呼気テスト(exhaled breath analysis)を通じて捕集された物質の揮発性有機化合物類の分析結果から、簡単な肺癌診断法が開発され用いられている。揮発性有機化合物類であるアルデヒド類の中でも、ヘキサナールは呼吸器の上気道および粘膜はもちろん、目や皮膚組織に影響を与えることが報告されており、慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease、COPD)および肺癌患者の診断のためのマーカーとして用いられるほど肺疾患と密接な関連がある物質として報告されている。アルデヒド類の中でもホルムアルデヒドとアセトアルデヒドの研究報告は多く行われているが、ヘキサナールを含むその他の低級脂肪族飽和アルデヒドの研究は不十分な状況である。ヘキサナールの人間に対する危害性にもかかわらず、人体での危害性評価データが十分ではなく、暴露に対する検出方法も、ＧＣ−ＭＳ(Gas Chromatography-Mass Spectrometer)またはＨＰＬＣ(High Performance Liquid Chromatography)などの古典的な方法に限定されている。ＧＣ−ＭＳやＨＰＬＣ方法などを用いると定量は可能であるが、分析のための適切な条件を設定しなければならず、高価な装置等が必要である。したがって、より速く、より簡便なスクリーニング方法、例えば、プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)またはＤＮＡマイクロアレイチップなどで、迅速な危害性評価を通じて人体での毒性作用、遺伝子発現有無等を探索することができる分子的指標を発掘し活用して、ヘキサナールの暴露に対する適切な対策と管理を行なうことが重要な課題といえる。
【０００４】
真核生物２３６種、バクテリア２６０２種、古細菌類１６７種などいくつかの種のゲノム塩基配列のプロジェクトが完成し、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)に報告された。このように得られた膨大な量のデータを基に、遺伝子の機能を研究するためのゲノム−ワイドエクスプレッション(genome-wide expression)の研究が行われている。一回の実験で何千個の遺伝子の発現を分析するためにＤＮＡマイクロアレイ分析を行なう（非特許文献３）。
【０００５】
マイクロアレイは、ｃＤＮＡ(complementary DNA)や２０−２５塩基対の長さのオリゴヌクレオチドのセットをガラスに集積化したものである。ｃＤＮＡマイクロアレイは、学校内の研究室やAgilent(アジレント)、Genomic Solutionsなどの会社でチップ上にｃＤＮＡ収集物を機械的に固定化したり、インクジェット方法を用いて生産している（非特許文献４）。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、Affymetrix社の写真エッチング工程を用いて、チップ上で直接合成する方法によって作られており、Agilent社などは合成されたオリゴヌクレオチドを固定化する方法で生産している（非特許文献４）。
【０００６】
遺伝子発現の解析を行うための組織、細胞などの試料からＲＮＡを得て、ＤＮＡマイクロアレイにあるオリゴヌクレオチドと交雑反応を行う。得られたＲＮＡは、蛍光または同位元素で標識化し、ｃＤＮＡに転換させる。マイクロアレイ技術を通じて遺伝子発現を測定する方法としては、大きく分けて２色法と１色法がある。相補結合反応を測定するとき、対照群と実験群の試料にそれぞれ２つの異なる蛍光（例えば、Ｃｙｅ３およびＣｙｅ５）で標識した後、マイクロアレイで反応させて測定する方法を２色法マイクロアレイと呼び、両方の試料に同じ蛍光処理した後、二つの異なるマイクロアレイで反応させて測定する方法を１色法マイクロアレイという（非特許文献５）。最近、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた先端技法である毒性ゲノム学の研究などと組み合わせて、大量に医薬品や新医薬候補物質はもちろん、代表的な環境汚染物質をはじめとするすべての化学物質による特定組織や細胞株で発現する遺伝子の発現様相の分析、量的分析が可能となった。これにより、特定の細胞内で特定の遺伝子の発現頻度を解析することにより、薬物の副作用および環境汚染物質の有害作用と関連する遺伝子の発掘が可能で、これにより、環境汚染物質の有害作用と薬物の作用および副作用による分子的メカニズムを理解できるようになり、さらに毒性および副作用を誘発する物質の検出および確認が可能になるだろう。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ラットの遺伝子４万個余りが集積されたオリゴマイクロアレイを用いてヘキサナールの遺伝子発現プロファイルをＦｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットの肺組織で観察および分析して、環境中のヘキサナール暴露によって濃度依存的に過剰発現あるいは低発現する遺伝子を発掘し、ヘキサナールのみを特異的に検出することができるバイオマーカーおよびそれを用いた暴露有無確認方法を確立して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nigel Bruceら.,Indoor Air Pollution in Developing Countries:A Major Environmental and Public Health Challenge. Bulletin of the World Health Organization,2000年,第78巻,p.9
【非特許文献２】J Vet Sci,2004年,5(1),p.11-18
【非特許文献３】Proc.Natl.Acad.Sci.米国1996年,第93巻,p.10614-10619
【非特許文献４】J.Am.Acad.Dermatol.2004年,第51巻,p.681-692
【非特許文献５】Vivian,G.ら,Nature,1999年,第21巻,p.15-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヘキサナールの暴露によって濃度依存的に過剰発現または低発現するバイオマーカーおよび前記バイオマーカーを用いたヘキサナール特異的暴露有無を確認する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、ヘキサナールの暴露によって濃度依存的に発現変化を引き起こす、ヘキサナール特異的暴露有無確認用バイオマーカーを提供する。
【００１１】
また、本発明は、遺伝子の核酸配列またはその相補鎖の分子が集積されたヘキサナール特異的暴露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップを提供する：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＸＭ＿５７５８０８（ＲＧＤ１５５９８６４，ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｍＫＩＡＡ１０４５  ｐｒｏｔｅｉｎ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１，ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０２１６６６（ＴＲＤＮ，ｔｒｉａｄｉｎ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０９３０５（ＴＭＥＭ１８２，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ１８２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＸＭ＿００３７４９７９９、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０８７２８（ＳＬＣ３９Ａ５，ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ３９（ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ｍｅｍｂｅｒ５）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ，ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ），ｄｅｌｔａ），遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６，ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０００４２１（ＯＬＲ１０７５，ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１０７５）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２，Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１１５０４３（ＬＯＣ６８４８７１，ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ８ｏｒｆ４（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）（ＴＣ−１））。
【００１２】
また、本発明は、
１）ヘキサナールを暴露させた実験群と正常対照群の肺組織からそれぞれのＲＮＡを分離する工程；
２）工程１）の実験群と対照群のＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、実験群と対照群を蛍光物質で標識する工程；
３）工程２）の蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを、本発明のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションさせる工程；
４）反応したＤＮＡマイクロアレイチップを分析する工程；および
５）分析したデータから、本発明のＤＮＡマイクロアレイチップに集積された遺伝子の発現程度を対照群と比較して確認する工程を含む、ヘキサナールに対する暴露有無を確認する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、
１）ヘキサナールを暴露させた実験群と正常対照群の肺組織からそれぞれのＲＮＡを分離する工程；
２）前記のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)を実行する工程：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２,ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４,ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ,ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）,ｄｅｌｔａ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６,ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））；および
３）工程２）の遺伝子産物を対照群と比較して、発現の程度を確認する工程を含む、ヘキサナールに対する暴露有無を確認する方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本発明のＤＮＡマイクロアレイチップを含むヘキサナールに対する暴露有無確認用キットを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含むヘキサナールに対する暴露有無確認用キットを提供する：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２,ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４,ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ,ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）,ｄｅｌｔａ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヘキサナール特異的暴露有無確認用バイオマーカーおよびそれを用いた確認方法は、ＤＮＡマイクロアレイチップを通じて選別された反応遺伝子をバイオマーカーとして用いてヘキサナールのモニターリングおよび危害性を判定するのに有用であり、ヘキサナールによって惹起される特異的な毒性作用機序を解明するためのツールとして有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マイクロアレイチップを用いて、ヘキサナールを処理したＦｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットの肺組織の全体遺伝子発現様相をクラスター分析方法で分析した結果を示した図である。
【図２】マイクロアレイチップを用いて、ヘキサナール暴露によって濃度依存的発現様相を示す遺伝子をクラスター分析方法で示した図である。
【図３】ヘキサナール暴露によって濃度依存的発現様相を示す遺伝子をラインプロット分析方法で示した図である。
【図４】ヘキサナール暴露によって変化した遺伝子の中で、濃度依存的発現様相を示す遺伝子に対して、各遺伝子ごとのマイクロアレイチップとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、対照群と対比して発現の増減を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、ヘキサナールへの暴露によって濃度依存的に特異的発現の変化を引き起こすヘキサナール特異的暴露有無確認用バイオマーカーを提供する。
【００２０】
前記バイオマーカーは、発現が１．５倍以上増加または減少した遺伝子で、ヘキサナールによって濃度依存的に発現が変化する１３種の遺伝子で構成されている。
【００２１】
前記ヘキサナール暴露の程度によって、濃度依存的に発現変化を示すバイオマーカーは、下記の遺伝子であることが好ましいが、これに限定されない：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＸＭ＿５７５８０８（ＲＧＤ１５５９８６４，ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｍＫＩＡＡ１０４５  ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号１３）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１，ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０２１６６６（ＴＲＤＮ，ｔｒｉａｄｉｎ）（配列番号１５）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０９３０５（ＴＭＥＭ１８２，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ１８２）（配列番号１６）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＸＭ＿００３７４９７９９（配列番号１７）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０８７２８（ＳＬＣ３９Ａ５，ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ３９（ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ），ｍｅｍｂｅｒ５）（配列番号１９）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４，ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ，ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６，ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）は、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１０００４２１（ＯＬＲ１０７５，ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１０７５）（配列番号２３）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２，Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１１５０４３（ＬＯＣ６８４８７１，ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ８ｏｒｆ４（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）（ＴＣ−１））（配列番号２５）。
【００２２】
本発明の具体的な実施形態において、本発明者らはヘキサナール特異的暴露有無確認用バイオマーカーを発掘するために、ヘキサナールをＦｉｓｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットに暴露させて、前記物質を処理した肺組織からｍＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成して、蛍光物質（Ｃｙ３）で標識した。前記蛍光標識されたｃＤＮＡを４ｘ４４ｋオリゴマイクロアレイチップＲａｔ  ＧＥ（ｖ３）マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）とハイブリダイゼーションし、蛍光イメージをスキャンして、遺伝子発現様相の違いを分析した（図１参照）。分析時、対照群対比ヘキサナール暴露群の発現変化率が１．５倍以上である場合、発現が増加した遺伝子に分類し、０．６６倍以下の場合、発現が減少した遺伝子に分類した。分析の結果、発現が増加した遺伝子は、低濃度で０．２９％（３０，３６７個の遺伝子のうち８８個）、中濃度で１，７１％（３０，３６７個の遺伝子のうち５１９個）、高濃度で１．２５％（３０，３６７個の遺伝子のうち３７９個）、発現が減少した遺伝子は、低濃度で２．１５％（３０，３６７個の遺伝子のうち６５３個）、中濃度で０．８０％（３０，３６７個の遺伝子のうち２４２個）、高濃度で０．６５％（３０，３６７個の遺伝子のうち１９６個）であることを確認した。ラインプロット分析方法を用いて、濃度依存的発現様相を示す遺伝子１３種を選別し（図２及び図３を参照）リアルタイム定量ＰＣＲを用いて、ヘキサナール暴露によってヘキサナールでのみ濃度依存的に発現が変わった（増加または減少）遺伝子６種を選別した（図４および表４を参照）。前記遺伝子は、既存の他の研究において、異なる化学物質による肺毒性と関連疾病を誘発させるのに関与するとの報告はあるが、本発明で用いたヘキサナールを処理した時、ラットの肺組織において毒性と関連があるという報告はない。
【００２３】
したがって、本発明のバイオマーカーは、ヘキサナールに特異的に遺伝子発現が増加または減少するので、環境試料からヘキサナールの汚染をモニターリングおよび判定するのに有用に用いることができる。
【００２４】
また、本発明は、遺伝子の核酸配列またはその相補鎖分子が集積したヘキサナール特異的暴露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップを提供する：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＸＭ＿５７５８０８（ＲＧＤ１５５９８６４,ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｍＫＩＡＡ１０４５  ｐｒｏｔｅｉｎ）（配列番号１３）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０２１６６６（ＴＲＤＮ,ｔｒｉａｄｉｎ）（配列番号１５）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０９３０５（ＴＭＥＭ１８２,ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ１８２）（配列番号１６）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＸＭ＿００３７４９７９９（配列番号１７）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２,ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１０８７２８（ＳＬＣ３９Ａ５、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ３９（ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）,ｍｅｍｂｅｒ５）（配列番号１９）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）,ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６,ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１０００４２１（ＯＬＲ１０７５,ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１０７５）（配列番号２３）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）、
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）：ＮＭ＿００１１１５０４３（ＬＯＣ６８４８７１,ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ８ｏｒｆ４（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）（ＴＣ−１））（配列番号２５）。
【００２５】
本発明のヘキサナール検出用ＤＮＡマイクロアレイチップは、当業者に既知の方法で製作することができる。
【００２６】
前記マイクロアレイチップを作製する方法は、下記のとおりである。
【００２７】
前記検出されたバイオマーカーをプローブＤＮＡ分子として用いて、ＤＮＡチップの基板上に固定化させるためにピエゾエレクトリック(piezoelectric)方式を用いたマイクロピペッティング(micropipetting)法またはピン(pin)形態のスポッター(spotter)を用いた方法などを用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施形態では、ピン形態のスポッターのマイクロアレイを用いる。
【００２８】
前記ＤＮＡマイクロアレイチップの基板は、アミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルデヒドからなる群から選択される１つの活性基がコーティングされたものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２９】
前記基板は、スライドグラス、プラスチック、金属、シリコン、ナイロン膜、およびニトロセルロース膜からなる群から選択され得るが、これらに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施形態では、アミノシランがコーティングされたスライドグラスを用いる。
【００３０】
また、本発明は、本発明のバイオマーカーを用いたヘキサナール特異的暴露有無を確認する方法を提供する。
【００３１】
本発明は、下記のような工程を含むヘキサナール特異的暴露有無を確認する方法を提供する：
１）ヘキサナールを暴露させた実験群と正常対照群の肺組織からＲＮＡを分離する工程；
２）工程１）の実験群と対照群のＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、実験群と対照群を蛍光物質で標識する工程；
３）工程２）の蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを、本発明のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションさせる工程；
４）反応したＤＮＡマイクロアレイチップを分析する工程；および
５）分析したデータから、本発明の遺伝子の発現程度を対照群と比較して確認する工程。
【００３２】
前記の暴露有無を確認する方法において、工程１）の肺組織は、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットを用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、ラットの肺組織であればすべて使用可能である。
【００３３】
前記の暴露有無を確認する方法において、工程３）の蛍光物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)、ＲＩＴＣ(rhodamine-B-isothiocyanate)とローダミン(rhodamine)からなる群より選択されていることが好ましいが、これに限定されるものではなく、当業者に知られている蛍光物質はすべて使用可能である。
【００３４】
前記の暴露有無を確認する方法において、工程４）のＤＮＡマイクロアレイチップは、Rat GE(v3)4 x 44k oligo microarray(Agilent、米国)等を使用することが好ましいが、これに限定されるものではなく、ラットのゲノム中、本発明では、前記過剰発現もしくは低発現遺伝子（表４）が搭載されたマイクロアレイチップであれば使用可能であり、前記本発明者が作製したＤＮＡマイクロアレイチップを用いることが最も好ましい。
【００３５】
前記の工程４）の分析方法は、Agilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies、ＣＡ、米国）、Agilent GeneSpring GX12.6.1(Agilent technologies、ＣＡ、米国)を用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、当業者に知られている解析ソフトウェアを用いてもよい。
【００３６】
また、本発明は、
１）ヘキサナールを暴露させた実験群および正常対照群の肺組織からそれぞれＲＮＡを分離する工程；
２）前記のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行する工程：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２,ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４,ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６,ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４  ）；および
３）工程２）の遺伝子産物を対照群と比較して、発現程度を確認する工程を含むヘキサナールに対する暴露有無を確認する方法を提供する。
【００３７】
前記の工程２）のプライマー対は、工程２）の遺伝子を増幅することができる、１８〜３０マー（mer）の順方向および逆方向プライマー対であることが好ましく、下記のプライマー対１〜６からなる群から選択されるものがより好ましいが、これに限定されない：
プライマー対１：配列番号１で表される順方向プライマーおよび配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される順方向プライマーおよび配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される順方向プライマーおよび配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される順方向プライマーおよび配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される順方向プライマーおよび配列番号１０で表される逆方向プライマー；および
プライマー対６：配列番号１１で表される順方向プライマーおよび配列番号１２で表される逆方向プライマー。
【００３８】
また、本発明は、本発明で作製したＤＮＡマイクロアレイチップを含むヘキサナール特異的暴露有無確認用キットを提供する。
【００３９】
前記キットは、さらに、ラットの肺組織を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
ラットの肺組織は、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）であることが好ましいが、これに限定されるものではなく、ラットの肺組織であればすべて使用可能である。
【００４１】
前記キットにさらに蛍光物質を含むことができ、前記蛍光物質は、ストレプトアビジンアルカリ脱燐酸化酵素接合材料(strepavidin-like phosphatease conjugate)、化学蛍光物質(chemiflurorensce)、化学発光物質(chemiluminescent)からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施例では、Ｃｙ３を用いた。
【００４２】
前記キットに追加的に反応試薬を含むことができ、前記反応試薬は、ハイブリダイゼーションに使用される緩衝液、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｃＮＴＰｓおよびｒＮＴＰ（事前混合型または分離供給型）、蛍光染色剤の化学的誘導剤のような標識試薬、洗浄緩衝液などで構成され得るが、これに限定されるものではなく、当業者に知られているＤＮＡマイクロアレイチップのハイブリダイゼーション反応に必要な反応試薬はすべて含ませることができる。
【００４３】
また、本発明は、
下記の遺伝子に相補的で、下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含むヘキサナールに対する暴露有無確認用キットを提供する：
遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）（配列番号１４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２,ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）（配列番号１８）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４、ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）（配列番号２０）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）（配列番号２１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６,ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））（配列番号２２）は、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））（配列番号２４）。
【００４４】
前記の確認用キットのプライマー対は、下記のプライマー対１〜６からなる群から選択して使用することが好ましいが、これに限定されるものではなく、前記バイオマーカー遺伝子の増幅産物が１００〜３００ｂｐとなるように設計された１５〜５０マー（mer）、好ましくは１５〜３０マー（mer）、さらに好ましくは１８〜２５マー（mer）の順方向および逆方向プライマー対は、すべて使用可能である：
プライマー対１：配列番号１で表される順方向プライマーおよび配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される順方向プライマーおよび配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される順方向プライマーおよび配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される順方向プライマーおよび配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される順方向プライマーおよび配列番号１０で表される逆方向プライマー；および
プライマー対６：配列番号１１で表される順方向プライマーおよび配列番号１２で表される逆方向プライマー。
【００４５】
前記の確認用キットにさらに、ラットの肺組織を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
前記ラットの肺組織は、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）を用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、ラットの肺組織であればすべて使用可能である。
【００４７】
併せて、前記のキットにさらに反応試薬を含むことができ、前記反応試薬は、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｃＮＴＰｓおよびｒＮＴＰ（事前混合または分離供給型）、蛍光染色剤の化学的誘導剤のような標識試薬、洗浄緩衝液などで構成され得るが、これに限定されるものではなく、当業者に知られているＲＴ−ＰＣＲ反応に必要な反応試薬はすべて含むことができる。
【００４８】
したがって、本発明のバイオマーカーは、ヘキサナールに濃度依存的に遺伝子発現が増加または減少するので、環境試料からヘキサナールの汚染をモニタリングして判定するのに有用に用いることができ、ヘキサナールによって特異的に誘発される毒性作用機序を解明するためのツールとして使用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００５０】
但し、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例により限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞動物モデルの選定、化学物質暴露と肺組織試料採取
＜１−１＞ラットモデル選定
本発明者らは、従来の研究と報告を通じてヘキサナール暴露実験のための適切な動物モデルとしてＦｉｓｃｈｅｒ３４４（ＳＤ系）ラットを選定した。
【００５２】
＜１−２＞暴露濃度選定及び化学物質処理
既存の文献で報告されたアルデヒドを用いたラットモデルの公開実験結果とヘキサナールの物理化学的特性による飽和濃度、ガス発生器の特徴を考慮して、暴露濃度を６００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１，５００ｐｐｍに選定した。暴露の方法は、鼻部暴露吸引装置(Nose-only inhalation chamber)を用いた反復吸入方式を選択して、５週間吸入させた。対照物質はフィルタリングしたクリーンエアーを用いて１日１回、一回当たり約４時間暴露し、試験物質であるヘキサナールもまた、１日１回、一回当たり約４時間、合計２０回暴露させた。
【００５３】
＜１−３＞肺組織試料収得
ラットから摘出した肺組織を重量測定した後、ＲＮＡ抽出に適切な量にカットしてクライオチューブ(cryotube)に得た。得られた肺組織は、液体窒素を用いて、瞬間凍結(snap frozen)した後、−８０℃で保管した。
【００５４】
＜実施例２＞マイクロアレイ実験
＜２−１＞標的ＲＮＡの分離と蛍光物質標識
ヘキサナール暴露群と非暴露群の肺組織からのＲＮＡ抽出は、トリゾール試薬(Invitrogen life technologies、米国)を用いて、メーカーの方法で全体ＲＮＡを分離し、RNeasy mini kit(Qiagen、米国)を用いて精製した。ゲノムＤＮＡは、ＲＮＡ精製中にRNase-free DNase set(Qiagen、米国)を用いて除去した。各全体ＲＮＡ試料の量は、分光光度計で測定し、濃度はND-1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific Inc.,米国)とAgilent2100 Bioanalyzer(Agilent)で確認した。
【００５５】
＜２−２＞標識されたｃＤＮＡの製造
オリゴマイクロアレイ分析のために、前記実施例＜２−１＞で得られたヘキサナール処理群の全体ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを製造した。前記得られた全体ＲＮＡ３０μｇとオリゴ（ｄＴ）プライマー２μｇ（１μｇ／μｌ）と混合し、６５℃で１０分間反応させた後、すぐに氷に入れてアニーリングさせた。前記アニーリングさせたＲＮＡの逆転写反応のために下記の［表１］のように試薬を混合した。ここで、両方の試料は、Microcon ＹＭ−３０カラム（Millipore、米国）を用いて混合、精製した。
【００５６】
【表１】
2016007213.tif 000003
【００５７】
＜２−３＞ハイブリダイゼーション反応
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程は、（株）イバイオジェンの指示方法にしたがって実行した。
【００５８】
具体的には、下記の［表２］のようなTranscription Master Mixを作成しておいてよく混ぜた後、40℃で２時間反応させた後、ラベリングされたｃＤＮＡを精製(purification)する過程を進行した後、精製過程を経たｃＤＮＡ６００ｎｇを６０℃で３０分間反応させて、断片化(Fragmentation)過程を行った。前記のように用意されたｃＤＮＡを２ x GEx Hybridization Buffer ＨＩ−ＲＰＭに入れてよく混ぜた後、チップ(chip)に入れて６５℃で１７時間オーブンでハイブリダイゼーションを行った。１７時間後に洗浄工程（GE Wash Buffer１で１分、GE Wash Buffer２で１分）を経た後、前記チップを３分間８００ｒｐｍで遠心分離して乾燥させた。
【００５９】
【表２】
2016007213.tif 000004
【００６０】
＜２−４＞蛍光イメージの獲得と遺伝子選別
スライド上のハイブリダイゼーションイメージは、Agilent C scanner(Agilent technologies、ＣＡ、米国)でスキャンした。ここで、緑の蛍光イメージは対照群で、赤色蛍光イメージは実験群でのみ特異的に発現される遺伝子の活性度を示し、黄色の蛍光イメージは緑と赤の補色で、両群の発現に大きな差がないことを意味する。スキャンしたイメージは、遺伝子発現率を得るためにAgilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies、ＣＡ、米国)で分析した。抽出されたデータは、Agilent GeneSpring GX12.6.1(Agilent technologies、ＣＡ、米国)を用いて正規化(normalization)を経て、各遺伝子の発現様相を分析した。このようにして得られたデータからヘキサナールに対するマーカー遺伝子を選別した。
【００６１】
その結果、図１に示すようにオリゴチップ上に存在する約４万個余りの遺伝子の中でヘキサナールの濃度別の暴露によって、対照群に比べヘキサナール暴露群の発現率が１．５倍以上に遺伝子発現の増加が見られる遺伝子は、低濃度で０．２９％（３０，３６７個の遺伝子のうち８８個）、中濃度で１，７１％（３０，３６７個の遺伝子のうち５１９個）、高濃度で１．２５％（３０，３６７個の遺伝子のうち３７９個）、発現が減少した遺伝子は、低濃度で２．１５％（３０，３６７個の遺伝子のうち６５３個）、中濃度で０．８０％（３０，３６７個の遺伝子のうち２４２個）、高濃度で０．６５％（３０，３６７個の遺伝子のうち１９６個）であることを確認した（図１）。
【００６２】
また、ヘキサナールで濃度依存的に発現が増加あるいは減少した遺伝子を選別するために、遺伝子発現を比較分析した結果、ヘキサナールで濃度依存的に発現が増加あるいは減少した遺伝子１３種を選別した（図２および図３）。併せて、前記の遺伝子は、本発明で用いたヘキサナールを処理した時、ラットの肺組織での毒性と関連があるという報告はなかった。
【００６３】
【表３】
2016007213.tif 000005
【００６４】
＜実施例３＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量確認
前記のマイクロアレイの結果から、ヘキサナールにより濃度依存的に発現が変化した前記＜実施例２＞遺伝子のうち６種の遺伝子［遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４,ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ、ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）、ｄｅｌｔａ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（ＡＤＨ６,ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））］の発現変化の程度を調査し、定量するために、Ｍｙ  ＩＱリアルタイムＰＣＲ（Ｍｙ  ＩＱ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）（Ｂｉｏ−ｒａｄ,米国）を用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６５】
具体的には、オリゴｄＴプライマーとSuperscript kit(OmnisciptＴＭkit,Qiagen,Co.,米国)を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡ０．２μｌと水３．８μｌ、センスプライマー０．５μｌ、アンチセンスプライマー０．５μｌ、サイバーグリーンＩ染色スーパーミックス（Ｂｉｏ−ｒａｄ、米国）５μｌを混合し、ＰＣＲチューブに入れて、工程１：９５℃、３分；工程２（４５回反復）：工程２−１：９５℃、１０秒；工程２−２：遺伝子ＳＴＥＡＰ１に対する反応は５８．９℃で４５秒、遺伝子ＫＬＦ２に対する反応は、５７．１℃で４５秒、遺伝子ＣＣＬ１２、遺伝子ＤＤＩＴ４、遺伝子ＣＥＢＰＤ、遺伝子ＡＤＨ６に対する反応は、６１．４℃で４５秒；工程３：９５℃、１分；工程４：５５℃、１分；工程５（反復８０回）：５５℃、１０秒にプログラムを設計したＭｙ  ＩＱリアルタイムＰＣＲ機械で反応を行った。ＰＣＲ産物を定量するために、サイバーグリーン(SYBR Green)Ｉ染色(Bio-rad、米国)で染色した。サイバーグリーンＩ染色は、二重らせんＤＮＡに結合する染色法で、ＰＣＲの過程で二重らせんＤＮＡが生成されるほど蛍光強度(fluroscense intensity)が増加することになる。まず、ＰＣＲに用いた標的遺伝子と内在性(endogenous)対照群（ＭＤＨ１）に対するプライマーをサイバーグリーンマスターミックス(Master mix)に添加してＰＣＲを行った後、適切な濃度を選択するプライマー適合化(primer optimization)過程を実施した。合成されたｃＤＮＡ試料と、それぞれのプライマー（表４）を混合し、サイバーグリーンマスターミックスを添加した後、ＰＣＲを実行し、定量ソフトウェアを用いて分析した。
【００６６】
その結果、図４に示すように、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０６６２９（ＳＴＥＡＰ１,ｓｉｘ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ１）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１１０５８２２（ＣＣＬ１２、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１２）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０８０９０６（ＤＤＩＴ４,ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ４）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿０１３１５４（ＣＥＢＰＤ,ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ）,ｄｅｌｔａ）、遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１０１２０８４（  ＡＤＨ６、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ６（ｃｌａｓｓ  Ｖ））および遺伝子登録番号（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）ＮＭ＿００１００７６８４（ＫＬＦ２,Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ２（ｌｕｎｇ））遺伝子の発現様相は、前記実施例＜２−４＞のマイクロアレイチップの結果と非常に類似に現れることを確認した（図４）。
【００６７】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００６８】
前記で説明したように、本発明は、マイクロアレイチップまたはキットを開発し、ヘキサナールのモニターリングと危害性を判定するのに有用に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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