(57)【要約】【課題】生物の増殖と、物質の生産とを適切に制御することができる生物及び物質の製造方法を提供すること。【解決手段】生物の増殖に関する増殖関与領域と、第１の化合物と結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、第２の化合物と結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域と、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域と、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域と、をＤＮＡに備え、前記第１の化合物、及び前記第２の化合物のうちの一方は、緑色光を照射したとき生じるリン酸化したCcaRであり、他方は、赤色光を照射したときに生じるリン酸化したRcaCである生物。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
第１の化合物と結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
第２の化合物と結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域と、
CcaS遺伝子領域と、
CcaR遺伝子領域と、
RcaE遺伝子領域と、
RcaF遺伝子領域と、
RcaC遺伝子領域と、
をＤＮＡに備え、
前記第１の化合物、及び前記第２の化合物のうちの一方は、緑色光を照射したとき生じるリン酸化CcaRであり、他方は、赤色光を照射したときに生じるリン酸化RcaCである生物。
【請求項２】
請求項１に記載の生物であって、
前記CcaS遺伝子領域を発現させるプロモータ領域、前記CcaR遺伝子領域を発現させるプロモータ領域、前記CcaR遺伝子領域、及び前記第１のプロモータ領域のうちいずれか１以上は宿主由来の遺伝子である生物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生物であって、
前記RcaE遺伝子領域を発現させるプロモータ領域、及び前記RcaC遺伝子領域を発現させるプロモータ領域のうちいずれか１以上は宿主由来の遺伝子である生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の生物であって、
前記CcaS遺伝子領域は、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来の遺伝子である生物。
【請求項５】
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
リン酸化CcaRと結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
リン酸化CcaRと結合することを条件に前記物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、
CcaS遺伝子領域と、
CcaR遺伝子領域と、
をＤＮＡに備える生物。
【請求項６】
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
リン酸化CcaRと結合することを条件に前記増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
リン酸化CcaRと結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域と、
CcaS遺伝子領域と、
CcaR遺伝子領域と、
をＤＮＡに備える生物。
【請求項７】
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
リン酸化RcaCと結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
リン酸化RcaCと結合することを条件に前記物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、
RcaE遺伝子領域と、
RcaF遺伝子領域と、
RcaC遺伝子領域と、
をＤＮＡに備える生物。
【請求項８】
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
リン酸化RcaCと結合することを条件に前記増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
リン酸化RcaCと結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域と、
RcaE遺伝子領域と、
RcaF遺伝子領域と、
RcaC遺伝子領域と、
をＤＮＡに備える生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の生物であって、
前記増殖関与領域は、（ａ）カルビン・ベンソン回路の中にある代謝に関連する領域、（ｂ）カルビン・ベンソン回路から、グリコール酸経由して、アミノ酸を合成する経路に炭素を流す代謝に関連する領域、（ｃ）カルビン・ベンソン回路の中にあるフルクトース６リン酸からグルコースを合成する系またはグリコーゲンを蓄積する系に炭素を流す代謝に関わる領域、（ｄ）カルビン・ベンソン回路の中にあるホスホグリセリン酸からピルビン酸を経由して脂肪酸を合成する系に炭素を流す代謝に関わる領域、（ｅ）ペントースリン酸経路または、その代謝物から生産される物質をコードする領域から選択される１以上である生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の生物であって、
前記物質生産関与領域は、イソブチルアルデヒド、及びイソプレノイド系化合物から選択される１以上の生産に関与する領域である生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生物であって、
シアノバクテリアである生物。
【請求項１２】
生物を用いて物質を製造する製造方法であって、
前記生物は、
生物の増殖に関する増殖関与領域と、
第１の化合物と結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域と、
物質の生産に関与する物質生産関与領域と、
第２の化合物と結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域と、
CcaS遺伝子領域と、
CcaR遺伝子領域と、
RcaE遺伝子領域と、
RcaF遺伝子領域と、
RcaC遺伝子領域と、
をＤＮＡに備え、
前記第１の化合物、及び前記第２の化合物のうちの一方は、緑色光を照射したとき生じるリン酸化CcaRであり、他方は、赤色光を照射したときに生じるリン酸化RcaCである物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物及び物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境問題等の観点から、燃料等の用途に使用可能な物質を、生物を用いて生産する技術が注目されている。特許文献１には、独立栄養有機体を用いて、ブタノール等の物質を生産する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１４−５０１１０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生物を用いて物質を効率的に生産するには、生物自体の増殖と、生物による物質の生産とを適切に制御する必要がある。本発明は以上の点に鑑みなされたものであり、上記の制御が容易である生物、及び物質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の局面の生物は、そのＤＮＡに、生物の増殖に関する増殖関与領域と、第１の化合物と結合することを条件に増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、第２の化合物と結合することを条件に物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域と、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域と、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域とを備える。
【０００６】
そして、第１の化合物、及び第２の化合物のうちの一方は、緑色光を生物に照射したとき生じるリン酸化CcaRであり、他方は、赤色光を生物に照射したときに生じるリン酸化RcaCである。
【０００７】
本発明の第１の局面の生物は、緑色光の照射の有無に応じてオン／オフが切り替わる光スイッチの機能と、赤色光の照射の有無に応じてオン／オフが切り替わる光スイッチの機能とを有する。この光スイッチは、遺伝子スイッチである。
【０００８】
本発明の第１の局面の生物は、緑色光の照射の有無に応じてオン／オフが切り替わる光スイッチの機能により、生物の増殖と、物質の生産のうちの一方を促進したり、抑制したりすることができる。また、本発明の第１の局面の生物は、赤色光の照射の有無に応じてオン／オフが切り替わる光スイッチの機能により、生物の増殖と、物質の生産のうちの前記一方とは異なる他方を促進したり、抑制したりすることができる。
【０００９】
よって、本発明の第１の局面の生物は、生物自体の増殖と、物質の生産とを容易に制御することができる。
本発明の第２の局面の生物は、そのＤＮＡに、生物の増殖に関する増殖関与領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とを備える。本発明の第２の局面の生物は、第１の局面の生物と同様の効果を奏する。
【００１０】
本発明の第３の局面の生物は、そのＤＮＡに、生物の増殖に関する増殖関与領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域と、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とを備える。本発明の第３の局面の生物は、第１の局面の生物と同様の効果を奏する。
【００１１】
本発明の第４の局面の生物は、そのＤＮＡに、生物の増殖に関する増殖関与領域と、リン酸化RcaCと結合することを条件に増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、リン酸化RcaCと結合することを条件に物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域とを備える。本発明の第４の局面の生物は、第１の局面の生物と同様の効果を奏する。
【００１２】
本発明の第５の局面の生物は、そのＤＮＡに、生物の増殖に関する増殖関与領域と、リン酸化RcaCと結合することを条件に増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、物質の生産に関与する物質生産関与領域と、リン酸化RcaCと結合することを条件に物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域と、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域とを備える。本発明の第５の局面の生物は、第１の局面の生物と同様の効果を奏する。
【００１３】
本発明の物質の製造方法は、上記の生物のいずれかを用いて、物質を製造する。本発明の物質の製造方法によれば、生物の増殖と、物質の生産とを適切に制御し、物質を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】遺伝子カセット１をＤＮＡに導入する方法を表す説明図である。
【図１Ｂ】遺伝子カセット１が導入されたＤＮＡを表す説明図である。
【図２】増幅断片をpMD20プラスミドのTAクローニングサイトにライゲーションする方法を表す説明図である。
【図３】第１のシアノバクテリアおよび野生株のシアノバクテリアにおける増殖曲線を表すグラフである。
【図４】遺伝子断片をプラスミドライゲーションにより挿入する方法を表す説明図である。
【図５】第３のシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図６】培地中のIBA濃度を表す表である。
【図７】炭素代謝を表す説明図である。
【図８Ａ】遺伝子カセット１をＤＮＡに導入する方法を表す説明図である。
【図８Ｂ】遺伝子カセット１が導入されたＤＮＡを表す説明図である。
【図９】第４のシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図１０】第６のシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図１１】培地中のIBA濃度を表す表である。
【図１２】CcaS/Rシステムの遺伝子コンストラクタを表す説明図である。
【図１３】SycpcG2遺伝子の発現量を表すグラフである。
【図１４】SycpcG2遺伝子の波長依存性を表すグラフである。
【図１５Ａ】遺伝子カセット１０１をＤＮＡに導入する方法を表す説明図である。
【図１５Ｂ】遺伝子カセット１０１が導入されたＤＮＡを表す説明図である。
【図１６Ａ】緑色光下での遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図１６Ｂ】赤色光下での遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図１７】遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図１８】培地中のIBA濃度を表す表である。
【図１９】コンストラクトの作成方法を表す説明図である。
【図２０Ａ】遺伝子カセット２０１をＤＮＡに導入する方法を表す説明図である。
【図２０Ｂ】遺伝子カセット２０１が導入されたＤＮＡを表す説明図である。
【図２１】遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖曲線を表すグラフである。
【図２２】培地中のIBA濃度を表す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
（実施例１）
１．遺伝子組み換えシアノバクテリアの製造
（１）増殖に関する光スイッチの導入
本実施例において光スイッチを導入する宿主には、シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803を用いた。導入する光スイッチは遺伝子スイッチである。本実施例では、改良NpCpeCプロモータ（配列番号１）を作成し、宿主に導入した。この改良NpCpeCプロモータは、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来の、リン酸化CcaRを認識するCpeCプロモータにおけるSD領域の配列をAGGGGATTTからTAGTGGAGGに変更したものである。SD領域の配列を上記のように変更する目的は、蛋白質の翻訳効率を上げるためである。改良NpCpeCプロモータは、光スイッチプロモータとして機能する。
【００１６】
図１Ａに示すように、この改良NpCpeCプロモータの5‘側の上流にカナマイシン薬剤耐
性遺伝子を配置した遺伝子カセット１を作製した。カナマイシン薬剤耐性遺伝子は、pRL161プラスミドからHincII処理により切り出したものである。
【００１７】
そして、図１Ａ、図１Ｂに示すように、Synechocystis sp. PCC 6803におけるピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットとそのプロモータ領域との間に、相同組換えで遺伝子カセット１を導入した。なお、図１Ａ及び図１Ｂにおいて、pdhBはピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットを表し、Kmはカナマイシン薬剤耐性遺伝子を表し、NpCpeC promoterは改良NpCpeCプロモータを表す。
【００１８】
次に、改良NpCpeCプロモータを光スイッチとして働かすために、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaSとCcaR遺伝子をコードする領域をSynechocystis sp. PCC 6803に導
入した。具体的には、（配列番号2）と（配列番号3）とで示したプライマーを用いてNostocpunctiforme ATCC 29133からこの遺伝子領域をPCR増幅した後、得られた約6.2Kbpの増幅断片を、図２に示すように、pMD20プラスミド（TaKaRa製）のTAクローニングサイトにライゲーションした。
【００１９】
そして、プラスミドのMCSにおけるBamHIサイトに、pACYC184由来のクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。引き続き、MCSのPstI/NdeIサイトに、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaS遺伝子の上流の600bp領域を挿入した。また、MCSのKpnI/SacIサイトに、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaR遺伝子の下流の600bp領域を挿入した。
【００２０】
ここで、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaS遺伝子の上流の600bp領域は、配列番号4と配列番号5とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。また、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaR遺伝子の下流の600bp領域は、配列番号6と配列番号7とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。
【００２１】
Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaSとCcaR遺伝子とクロラムフェニコール
耐性遺伝子とを含む領域を相同組換えによりSynechocystis sp. PCC 6803に導入した。
ここで得られた遺伝子組換えSynechocystis sp.（以下では、第１のシアノバクテリア
とする）を、まず、緑色光を照射しながら培養し、次に、赤色光を照射しながら培養した。緑色光を照射するときは、赤色光は照射せず、赤色光を照射するときは、緑色光は照射しなかった。ここで緑色光とは、波長が５００〜５６０ｎｍの光である。また、赤色光とは、波長が６２０〜６８０ｎｍの光である。
【００２２】
図３に、その際の第１のシアノバクテリア及び光スイッチを有してない野生株のシアノバクテリアの増殖曲線を示す。緑色光を照射しながら培養している間は第１のシアノバクテリアが増殖した。一方、赤色光を照射しながら培養している間は、第１のシアノバクテリアの増殖が抑制された。
【００２３】
以上のように、第１のシアノバクテリアは、増殖に関する光スイッチの機能を有する。光スイッチは以下のように働くと推定できる。Ccas遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とは、緑色光を照射したとき、リン酸化CcaRを生じる。そのリン酸化CcaRが改良NpCpeCプロモータと結合し、その改良NpCpeCプロモータが、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットを発現させ、第１のシアノバクテリアの増殖を促進する。一方、緑色光を照射しないときは、上記の機序が働かず、増殖が抑制される。
【００２４】
（２）物質の生産に関する光スイッチの導入
次に、上記のようにして得た第１のシアノバクテリアに、Fremyella diplosiphon由来
のRcaE、RcaF、RcaC遺伝子を導入した。具体的には、RcaC遺伝子を含む領域を配列番号8
および配列番号9のプライマーでPCR増幅させ、pMD20プラスミド（TaKaRa製）のEcoRVクローニングサイトにTAクローニングした。
【００２５】
引き続き、RcaEとRcaF遺伝子を含む領域を配列番号10および配列番号11のプライマーでPCR増幅させ、NdeI制限酵素処理した上記プラスミドにIn-Fusion Advantage PCR Cloning
Kit（クロンテック社製）を用いてライゲーションした。
【００２６】
その後、プラスミドのMCSにおけるBamHIサイトにpRL453由来のスペクチノマイシン耐性カセットを挿入した。そして、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaRにおける3’末端領域をSphI/SpeIサイトに挿入し、CcaR遺伝子における下流の600bp領域をKpnI/SacIサイトに挿入した。
【００２７】
ここで、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaRにおける3’末端領域は、配列番号12と配列番号13とでPCR増幅して得られる564bpの遺伝子断片であり、CcaR遺伝子における下流の600bp領域は、配列番号6と配列番号7とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。
【００２８】
このFremyella diplosiphon由来のRcaE、RcaF、RcaC遺伝子と、スペクチノマイシン耐
性遺伝子とを含む領域を、相同組換えにより、上記のようにして得られた第１のシアノバクテリアに導入した。導入後のシアノバクテリアを第２のシアノバクテリアとする。上記の相同組換えにより、第２のシアノバクテリアはクロラムフェニコール耐性が無く、スペクチノマイシン耐性が付与されている。
【００２９】
そして、この第２のシアノバクテリアに導入するプラスミド（以下ではIBA生産用プラ
スミドとする）を、以下のステップで調製した。なお、このIBA生産用プラスミドは、イ
ソブチルアルデヒド（IBA）を生産させるためのものである。イソブチルアルデヒドは、生産する物質に対応する。
【００３０】
IBA生産用プラスミドの調製に使用したプラスミドは、pKUT1121の薬剤耐性領域（すなわち、制限酵素MluIで挟まれた領域）をストレプロマイシンからクロラムフェニコールに変更したpKUT3121である。なお、pKUT1121は、「光合成研究２２（２）  ２０１２  「代謝工学による新たなクロロフィル分子の合成」  京都大学大学院  人間・環境学研究科  土屋  徹」において開示された、周知のプラスミドである。  
【００３１】
本実施例では、pKUT3121に4つの遺伝子を導入したDNAコンストラクトを作製した。４つの遺伝子は、kdc、alsS、ilvC、ilvDである。このDNAコンストラクトは、kdcとalsS遺伝子については、制限酵素サイトを利用したライゲーションを順次行って挿入し、ilvCとilvD遺伝子については、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて、SpeIサイトに順次挿入することにより作製した。
【００３２】
kdc遺伝子については、（配列番号14）と（配列番号15）で示したプライマーを用いて
、乳酸菌（Lactococcus lactis）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。取得したkdc遺伝子をXbaI-SpeIの制限酵素で切断し、pKUT3121のXbaIサイトに挿入した。
【００３３】
alsS遺伝子については、（配列番号16）と（配列番号17）で示したプライマーを用いて枯草菌（Bacillus subtillus）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。取得したalsS遺伝子をXbaI-SpeIの制限酵素で切断し、kdc遺伝子を導入したpKUT3121のXbaIサイトに挿入した。
【００３４】
ilvC遺伝子については、（配列番号18）と（配列番号19）とで示したプライマーを用いて大腸菌（Escherichia coli）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。
ilvD遺伝子については、（配列番号20）と（配列番号21）とで示したプライマーを用いて大腸菌（Escherichia coli）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。なお、全てのPCR反応は、KOD plus ver.2 (TOYOBO)を用いた。
【００３５】
引き続き、kdcとilvDの3’側にSynechocystis sp. PCC6803におけるpbsA2遺伝子のターミネーターを挿入した。ilvD遺伝子の3’側に挿入する際は、配列番号22で示すDNA合成したターミネーターをNheIとSbfIで切断後、プラスミドのNheIとSbfIサイトにライゲーションにより挿入した。kdc遺伝子の3’側に挿入する際は、配列番号23に示すDNA合成したターミネーターをXbaIとSpeIで切断後、プラスミドのSpeIサイトに挿入した。
【００３６】
引き続き、Fremyella diplosiphon由来の光スイッチとなるCpc2プロモータ（配列番号24）をAlsS遺伝子とilvC遺伝子の5’側にそれぞれ挿入した。AlsS遺伝子の5’側に挿入する場合は、5’側にSacI制限酵素サイト、3’側にXbaI制限酵素サイトをつけたCpc2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより導入した。
【００３７】
ilvC遺伝子の5’側に挿入する場合は、図４に示すように、5’側にSpeI制限酵素サイト、3’側にBamHI制限酵素サイトをつけたCpc2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより挿入した。
【００３８】
以上のステップで調製したIBA生産用プラスミドを、前述した第２のシアノバクテリア
に、接合法により導入した。IBA生産用プラスミドを導入後のシアノバクテリアを第３の
シアノバクテリアとする。
【００３９】
なお、第３のシアノバクテリアは、生物の増殖に関する増殖関与領域として、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットを備える。
また、第３のシアノバクテリアは、緑色光を照射したとき生じるリン酸化CcaRと結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域として、改良NpCpeCプロモータを備える。なお、リン酸化CcaRは第１の化合物に対応する。
【００４０】
また、第３のシアノバクテリアは、IBAの生産に関与する物質生産関与領域として、IBA生産用プラスミドを備える。
また、第３のシアノバクテリアは、赤色光を照射したときに生じるリン酸化RcaCと結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域として、Cpc2プロモータを備える。なお、リン酸化RcaCは、第２の化合物に対応する。
【００４１】
また、第３のシアノバクテリアは、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とを備える。これらは、緑色光を照射したとき、リン酸化CcaRを生じさせる。
また、第３のシアノバクテリアは、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域とを備える。これらは、赤色光を照射したとき、リン酸化RcaCを生じさせる。
【００４２】
２．第３のシアノバクテリアの使用
上記のようにして得られた第３のシアノバクテリアを、まず、緑色光を照射しながら培養し、次に、赤色光を照射しながら培養した。緑色光を照射するときは、赤色光を照射せず、赤色光を照射するときは、緑色光を照射しなかった。
【００４３】
その際の増殖曲線を図５に示す。第３のシアノバクテリアは、緑色光を照射している間は増殖したが、赤色光を照射している間は増殖しなかった。
また、緑色光を照射して培養した場合と、赤色光を照射して培養した場合との、培地中のIBA濃度を図６に示す。緑色光を照射して培養した場合はIBA濃度が０mg/Lであった。すなわち、IBAは生産されなかった。一方、赤色光の照射に切り替えて培養した場合はIBA濃度が高くなった。すなわち、IBAが生産された。
【００４４】
よって、第３のシアノバクテリアは、緑色光の照射により増殖を促進し、緑色光の照射停止により増殖を抑制する光スイッチを備えている。この光スイッチは遺伝子スイッチである。
【００４５】
また、第３のシアノバクテリアは、赤色光の照射により物質生産を促進し、赤色光の照射停止により物質生産を抑制する光スイッチを備えている。この光スイッチは遺伝子スイッチである。
【００４６】
物質生産を制御する光スイッチは以下のように作用すると推測できる。赤色光を照射したとき、RcaE遺伝子領域、RcaF遺伝子領域、及びRcac遺伝子領域は、リン酸化Rcacを生じさせる。このリン酸化RcacがCpc2プロモータと結合し、そのCpc2プロモータがIBA生産用プラスミドを発現させ、IBAを生産する。一方、赤色光を照射しないときは、上記の機序が働かず、物質生産が抑制される。
【００４７】
なお、第３のシアノバクテリアにおいても、増殖を制御する光スイッチは、第１のシアノバクテリアの場合と同様の機序で機能すると推測できる。
第３のシアノバクテリアを用いて、IBAを製造する製造方法を実施することができる。
例えば、まず、緑色光を照射し、赤色光は照射しない条件（すなわち、第３のシアノバクテリアの増殖を促進し、IBAの生産は抑制する条件）で、第３のシアノバクテリアを増殖し、次に、緑色光は照射せず、赤色光を照射する条件（すなわち、第３のシアノバクテリアの増殖を抑制し、IBAの生産は促進する条件）で、第３のシアノバクテリアを用い、IBAを製造することができる。この場合、IBAの製造効率を高くすることができる。
（実施例２）
１．遺伝子組み換えシアノバクテリアの製造
（１）増殖に関する光スイッチの導入
本実施例において光スイッチを導入する宿主には、シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803を用いた。導入する光スイッチは遺伝子スイッチである。本実施例では、改良NpCpeCプロモータ（配列番号1）を作成し、宿主に導入した。この改良NpCpeCプロモータは、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来の、リン酸化CcaRを認識するCpeCプロモータにおけるSD領域の配列をAGGGGATTTからTAGTGGAGGに変更したものである。SD領域の配列を上記のように変更する目的は、蛋白質の翻訳効率を上げるためである。改良NpCpeCプロモータは、光スイッチプロモータとして機能する。
【００４８】
図８Ａに示すように、この改良NpCpeCプロモータの5‘側の上流にカナマイシン薬剤耐
性遺伝子を配置した遺伝子カセット１を作製した。カナマイシン薬剤耐性遺伝子は、pRL161プラスミドからHincII処理により切り出したものである。
【００４９】
そして、図８Ａ、図８Ｂに示すように、Synechocystis sp. PCC 6803における分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ilvE）とそのプロモータ領域との間に、相同組換えで遺伝子カセット１を導入した。なお、図８Ａ及び図８Ｂにおいて、Kmはカナマイシン薬剤耐性遺伝子を表し、NpCpeC promoterは改良NpCpeCプロモータを表す。
【００５０】
次に、改良NpCpeCプロモータを光スイッチとして働かすために、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaSとCcaR遺伝子をコードする領域をSynechocystis sp. PCC 6803に導入した。具体的には、（配列番号2）と（配列番号3）とで示したプライマーを用いてNostocpunctiforme ATCC 29133からこの遺伝子領域をPCR増幅した後、得られた約6.2Kbpの増幅断片を、図２に示すように、pMD20プラスミド（TaKaRa製）のTAクローニングサイトにライゲーションした。
【００５１】
そして、プラスミドのMCSにおけるBamHIサイトに、pACYC184由来のクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。引き続き、MCSのPstI/NdeIサイトに、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaS遺伝子の上流の600bp領域を挿入した。また、MCSのKpnI/SacIサイトに、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaR遺伝子の下流の600bp領域を挿入した。
【００５２】
ここで、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaS遺伝子の上流の600bp領域は、配列番号4と配列番号5とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。また、Synechocystis sp. PCC6803におけるCcaR遺伝子の下流の600bp領域は、配列番号6と配列番号7とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。
【００５３】
Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaSとCcaR遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子とを含む領域を相同組換えによりSynechocystis sp. PCC 6803に導入した。ここで得られた遺伝子組換えSynechocystis sp.（以下では、第４のシアノバクテリアとする）を、まず、緑色光を照射しながら培養し、次に、赤色光を照射しながら培養した。緑色光を照射するときは、赤色光は照射せず、赤色光を照射するときは、緑色光は照射しなかった。ここで緑色光とは、波長が５００〜５６０ｎｍの光である。また、赤色光とは、波長が６２０〜６８０ｎｍの光である。
【００５４】
図９に、その際の第４のシアノバクテリア及び光スイッチを有してない野生株のシアノバクテリアの増殖曲線を示す。緑色光を照射しながら培養している間は第４のシアノバクテリアが増殖した。一方、赤色光を照射しながら培養している間は、第４のシアノバクテリアの増殖が抑制された。
【００５５】
以上のように、第４のシアノバクテリアは、増殖に関する光スイッチの機能を有する。光スイッチは以下のように働くと推定できる。Ccas遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とは、緑色光を照射したとき、リン酸化CcaRを生じる。そのリン酸化CcaRが改良NpCpeCプロモータと結合し、その改良NpCpeCプロモータが、分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現させ、第４のシアノバクテリアの増殖を促進する。一方、緑色光を照射しないときは、上記の機序が働かず、増殖が抑制される。
【００５６】
（２）物質の生産に関する光スイッチの導入
次に、上記のようにして得た第４のシアノバクテリアに、Fremyella diplosiphon由来のRcaE、RcaF、RcaC遺伝子を導入した。具体的には、RcaC遺伝子を含む領域を配列番号8および配列番号9のプライマーでPCR増幅させ、pMD20プラスミド（TaKaRa製）のEcoRVクローニングサイトにTAクローニングした。
【００５７】
引き続き、RcaEとRcaF遺伝子を含む領域を配列番号10および配列番号11のプライマーでPCR増幅させ、NdeI制限酵素処理した上記プラスミドにIn-Fusion Advantage PCR Cloning
Kit（クロンテック社製）を用いてライゲーションした。
【００５８】
その後、プラスミドのMCSにおけるBamHIサイトにpRL453由来のスペクチノマイシン耐性カセットを挿入した。そして、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaRにおける3’末端領域をSphI/SpeIサイトに挿入し、CcaR遺伝子における下流の600bp領域をKpnI/SacIサイトに挿入した。
【００５９】
ここで、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のCcaRにおける3’末端領域は、配列番号12と配列番号13とでPCR増幅して得られる564bpの遺伝子断片であり、CcaR遺伝子における下流の600bp領域は、配列番号6と配列番号7とでPCR増幅して得られる遺伝子断片である。
【００６０】
このFremyella diplosiphon由来のRcaE、RcaF、RcaC遺伝子と、スペクチノマイシン耐性遺伝子とを含む領域を、相同組換えにより、上記のようにして得られた第４のシアノバクテリアに導入した。導入後のシアノバクテリアを第５のシアノバクテリアとする。上記の相同組換えにより、第５のシアノバクテリアはクロラムフェニコール耐性が無く、スペクチノマイシン耐性が付与されている。
【００６１】
そして、この第５のシアノバクテリアに導入するプラスミド（以下ではIBA生産用プラスミドとする）を、以下のステップで調製した。なお、このIBA生産用プラスミドは、イソブチルアルデヒド（IBA）を生産させるためのものである。イソブチルアルデヒドは、生産する物質に対応する。
【００６２】
IBA生産用プラスミドの調製に使用したプラスミドは、pKUT1121の薬剤耐性領域（すなわち、制限酵素MluIで挟まれた領域）をストレプロマイシンからクロラムフェニコールに変更したpKUT3121である。なお、pKUT1121は、「光合成研究２２（２）  ２０１２  「代謝工学による新たなクロロフィル分子の合成」  京都大学大学院  人間・環境学研究科  土屋  徹」において開示された、周知のプラスミドである。  
【００６３】
本実施例では、pKUT3121に4つの遺伝子を導入したDNAコンストラクトを作製した。４つの遺伝子は、kdc、alsS、ilvC、ilvDである。このDNAコンストラクトは、kdcとalsS遺伝子については、制限酵素サイトを利用したライゲーションを順次行って挿入し、ilvCとilvD遺伝子については、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて、SpeIサイトに順次挿入することにより作製した。
【００６４】
kdc遺伝子については、（配列番号14）と（配列番号15）で示したプライマーを用いて、乳酸菌（Lactococcus lactis）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。取得したkdc遺伝子をXbaI-SpeIの制限酵素で切断し、pKUT3121のXbaIサイトに挿入した。
【００６５】
alsS遺伝子については、（配列番号16）と（配列番号17）で示したプライマーを用いて枯草菌（Bacillus subtillus）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。取得したalsS遺伝子をXbaI-SpeIの制限酵素で切断し、kdc遺伝子を導入したpKUT3121のXbaIサイトに挿入した。
【００６６】
ilvC遺伝子については、（配列番号18）と（配列番号19）とで示したプライマーを用いて大腸菌（Escherichia coli）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。
ilvD遺伝子については、（配列番号20）と（配列番号21）とで示したプライマーを用いて大腸菌（Escherichia coli）ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により取得した。なお、全てのPCR反応は、KOD plus ver.2 (TOYOBO)を用いた。
【００６７】
引き続き、kdcとilvDの3’側にSynechocystis sp. PCC6803におけるpbsA2遺伝子のターミネーターを挿入した。ilvD遺伝子の3’側に挿入する際は、配列番号22で示すDNA合成したターミネーターをNheIとSbfIで切断後、プラスミドのNheIとSbfIサイトにライゲーションにより挿入した。kdc遺伝子の3’側に挿入する際は、配列番号23に示すDNA合成したターミネーターをXbaIとSpeIで切断後、プラスミドのSpeIサイトに挿入した。
【００６８】
引き続き、Fremyella diplosiphon由来の光スイッチとなるCpc2プロモータ（配列番号24）をAlsS遺伝子とilvC遺伝子の5’側にそれぞれ挿入した。AlsS遺伝子の5’側に挿入する場合は、5’側にSacI制限酵素サイト、3’側にXbaI制限酵素サイトをつけたCpc2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより導入した。
【００６９】
ilvC遺伝子の5’側に挿入する場合は、図４に示すように、5’側にSpeI制限酵素サイト、3’側にBamHI制限酵素サイトをつけたCpc2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより挿入した。
【００７０】
以上のステップで調製したIBA生産用プラスミドを、前述した第５のシアノバクテリアに、接合法により導入した。IBA生産用プラスミドを導入後のシアノバクテリアを第６のシアノバクテリアとする。
【００７１】
なお、第６のシアノバクテリアは、生物の増殖に関する増殖関与領域として、分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼを備える。
また、第６のシアノバクテリアは、緑色光を照射したとき生じるリン酸化CcaRと結合することを条件に前記増殖関与領域を発現させる第１のプロモータ領域として、改良NpCpeCプロモータを備える。なお、リン酸化CcaRは第１の化合物に対応する。
【００７２】
また、第６のシアノバクテリアは、IBAの生産に関与する物質生産関与領域として、IBA生産用プラスミドを備える。
また、第６のシアノバクテリアは、赤色光を照射したときに生じるリン酸化RcaCと結合することを条件に前記物質生産関与領域を発現させる第２のプロモータ領域として、Cpc2プロモータを備える。なお、リン酸化RcaCは、第２の化合物に対応する。
【００７３】
また、第６のシアノバクテリアは、CcaS遺伝子領域と、CcaR遺伝子領域とを備える。これらは、緑色光を照射したとき、リン酸化CcaRを生じさせる。
また、第６のシアノバクテリアは、RcaE遺伝子領域と、RcaF遺伝子領域と、RcaC遺伝子領域とを備える。これらは、赤色光を照射したとき、リン酸化RcaCを生じさせる。
【００７４】
２．第６のシアノバクテリアの使用
上記のようにして得られた第６のシアノバクテリアを、まず、緑色光を照射しながら培養し、次に、赤色光を照射しながら培養した。緑色光を照射するときは、赤色光を照射せず、赤色光を照射するときは、緑色光を照射しなかった。
【００７５】
その際の増殖曲線を図１０に示す。第６のシアノバクテリアは、緑色光を照射している間は増殖したが、赤色光を照射している間は増殖しなかった。
また、緑色光を照射して培養した場合と、赤色光を照射して培養した場合との、培地中のIBA濃度を図１１に示す。緑色光を照射して培養した場合はIBA濃度が０mg/Lであった。すなわち、IBAは生産されなかった。一方、赤色光の照射に切り替えて培養した場合はIBA濃度が高くなった。すなわち、IBAが生産された。
【００７６】
よって、第６のシアノバクテリアは、緑色光の照射により増殖を促進し、緑色光の照射停止により増殖を抑制する光スイッチを備えている。この光スイッチは遺伝子スイッチである。
【００７７】
また、第６のシアノバクテリアは、赤色光の照射により物質生産を促進し、赤色光の照射停止により物質生産を抑制する光スイッチを備えている。この光スイッチは遺伝子スイッチである。
【００７８】
物質生産を制御する光スイッチは以下のように作用すると推測できる。赤色光を照射したとき、RcaE遺伝子領域、RcaF遺伝子領域、及びRcac遺伝子領域は、リン酸化Rcacを生じさせる。このリン酸化RcacがCpc2プロモータと結合し、そのCpc2プロモータがIBA生産用プラスミドを発現させ、IBAを生産する。一方、赤色光を照射しないときは、上記の機序が働かず、物質生産が抑制される。
【００７９】
なお、第６のシアノバクテリアにおいても、増殖を制御する光スイッチは、第４のシアノバクテリアの場合と同様の機序で機能すると推測できる。
第６のシアノバクテリアを用いて、IBAを製造する製造方法を実施することができる。例えば、まず、緑色光を照射し、赤色光は照射しない条件（すなわち、第６のシアノバクテリアの増殖を促進し、IBAの生産は抑制する条件）で、第６のシアノバクテリアを増殖し、次に、緑色光は照射せず、赤色光を照射する条件（すなわち、第６のシアノバクテリアの増殖を抑制し、IBAの生産は促進する条件）で、第６のシアノバクテリアを用い、IBAを製造することができる。この場合、IBAの製造効率を高くすることができる。
（実施例３）
１．遺伝子組み換えシアノバクテリアの製造
本実施例では、光スイッチを導入する宿主として、シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803を用いた。本実施例において宿主に導入する光スイッチは、CcaS遺伝子領域及びCcaR遺伝子領域を用いる光スイッチである。CcaS遺伝子領域は、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来の遺伝子である。
【００８０】
本実施例では、Synechocystis sp. PCC 6803のCcaS遺伝子におけるORF部位に、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来の遺伝子を相同組換えで導入する。そのために、以下の工程を行った。まず、SyToNpCcaS_1プライマー（配列番号25）とSyToNpCcaS_2プライマー（配列番号26）とにより、Synechocystis sp. PCC 6803における相同組換え箇所の上流域の遺伝子断片を増幅させた。この増幅により得られた遺伝子断片を第１の遺伝子断片とする。
【００８１】
次に、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のNpCcaSのORFを増幅させた。すなわち、SyToNpCcaS_3プライマー（配列番号27）とSyToNpCcaS_4プライマー（配列番号28）とにより、NpCcaSのORF遺伝子領域を増幅させた。この増幅により得られた遺伝子断片を第２の遺伝子断片とする。
【００８２】
次に、SyToNpCcaS_5プライマー（配列番号29）とSyToNpCcaS_6プライマー（配列番号30）とにより、Synechocystis sp. PCC 6803における相同組換え箇所の下流域の遺伝子断片を増幅させた。この増幅により得られた遺伝子断片を第３の遺伝子断片とする。
【００８３】
上記の第１〜第３の遺伝子断片を、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いてpMD19プラスミドにライゲーションした。その後に、制限酵素SmaＩで切り出したpRL453由来のストレプトマイシン遺伝子を、SyToNpCcaS_5プライマーとSyToNpCcaS_6プライマーの増幅断片に含まれる制限酵素サイトApaＩに導入し、遺伝子コンストラクトを得た。
【００８４】
以上の工程により調製した遺伝子コンストラクトを、Synechocystis sp. PCC 6803に相同組換えにより導入して形質転換し、光スイッチ遺伝子導入株を得た。この光スイッチ遺伝子導入株を図１２に示す。図１２、及び後述する図１３、図１４において光スイッチ遺伝子導入株をNpCcaS-Synと表記している。この光スイッチ遺伝子導入株は、遺伝子組み換えシアノバクテリアであり、生物に対応する。
【００８５】
２．遺伝子組み換えシアノバクテリアの評価
上記のように製造した光スイッチ遺伝子導入株に緑色光を照射した際の遺伝子発現量と、赤色光を照射した際の遺伝子発現量とを測定した。その結果を図１３に示す。図１３において、「Ｇ」は、緑色光を照射した際の遺伝子発現量を表す。また、「Ｒ」は赤色光を照射した際の遺伝子発現量を表す。
【００８６】
また、比較例として、野生型のSynechocystis sp. PCC 6803についても同様の測定を行った。その結果を図１３に示す。図１３及び後述する図１４において、野生型のSynechocystis sp. PCC 6803を「S6803WT」と表記する。
【００８７】
光スイッチ遺伝子導入株では、赤色光を照射したとき、遺伝子の発現は完全にオフになっていた。それに対し、野生型のSynechocystis sp. PCC 6803では、赤色光を照射したとき、遺伝子の発現が生じていた。
【００８８】
次に、上記のように製造した光スイッチ遺伝子導入株について、照射する光の波長を変えながら、相対遺伝子発現量を測定した。また、比較例として、野生型のSynechocystis sp. PCC 6803についても同様の測定を行った。それらの結果を図１４に示す。
光スイッチ遺伝子導入株では、遺伝子が発現する波長領域の幅は狭く、その波長領域の外では、遺伝子の発現が完全に抑制されていた。それに対し、野生型のSynechocystis sp. PCC 6803では、遺伝子が発現する波長領域が広かった。
【００８９】
以上の結果より、光スイッチ遺伝子導入株は、照射する光の波長の違いにより、遺伝子発現量が顕著に変化した。すなわち、光スイッチのオン／オフ性能が優れていた。本実施例では、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来のNpCcaSのORFを用いることにより、光スイッチのオン／オフ性能が一層向上したと推測される。
【００９０】
光スイッチ遺伝子導入株は、リン酸化CcaRと結合することを条件に、生物の増殖に関する増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に、物質の生産に関与する物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域とを有することができる。  
【００９１】
また、光スイッチ遺伝子導入株は、リン酸化CcaRと結合することを条件に増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域とを有することができる。  
（実施例４）
１．遺伝子組み換えシアノバクテリアの製造
図１５Ａに示すように、前記実施例３で製造した光スイッチ遺伝子導入株におけるcpcG2プロモータと、その5‘側の上流に配置されたカナマイシン薬剤耐性遺伝子とを備える遺伝子カセット１０１を作製した。カナマイシン薬剤耐性遺伝子は、pRL161プラスミドからHincII処理により切り出したものである。図１５Ａ、図１５Ｂにおいてカナマイシン薬剤耐性遺伝子をKmと表記する。
【００９２】
次に、図１５Ｂに示すように、Synechocystis sp. PCC 6803におけるピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットと、そのプロモータ領域との間に、上記の遺伝子カセット１０１を相同組換えで導入した。図１５Ａ、図１５Ｂにおいて、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットを、pdhBと表記する。以下では、上記の遺伝子カセットを導入したSynechocystisを、光スイッチ機能を有するSynechocystis sp.とする。
【００９３】
次に、光スイッチ機能を有するSynechocystis sp. に導入するプラスミドを、以下の工程で調製した。調製するプラスミドは、イソブチルアルデヒド（IBA）を生産する機能を有するプラスミドである。
【００９４】
前記実施例１と同様に、pKUT3121に、kdc、alsS、ilvC、ilvD を導入したDNAコンストラクトを作製した。また、前記実施例１と同様に、kdcとilvDの3’側にSynechocystis sp. PCC6803のpbsA2遺伝子のターミネーターを挿入した。
【００９５】
引き続き、Synechocystis sp. PCC 6803由来の光スイッチとなるcpcG2プロモータ（配列番号31）をAlsS遺伝子の5’側とilvC遺伝子の5’側とにそれぞれ挿入した。AlsS遺伝子の5’側に挿入する場合は、5’側にSacＩ制限酵素サイト、3’側にXbaＩ制限酵素サイトをつけたcpcG2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより導入した。
【００９６】
ilvC遺伝子の5’側に挿入する場合は、図４に示すように、5’側にSpeＩ制限酵素サイト、3’側にBamHＩ制限酵素サイトをつけたcpcG2プロモータを準備し、遺伝子断片とプラスミドをそれぞれ制限酵素で切断してライゲーションにより挿入した。
【００９７】
以上の工程で調製したプラスミドを、前述した光スイッチ機能を有するSynechocystis sp.に接合法により導入した。その結果、遺伝子組み換えシアノバクテリアが得られた。
２．遺伝子組み換えシアノバクテリアの評価
（２−１）第１の評価
上記のように製造した遺伝子組み換えシアノバクテリアについて、緑色光を照射しながら培養したときの増殖曲線を図１６Ａに示し、赤色光を照射しながら培養したときの増殖曲線を図１６Ｂに示す。また、比較例として、遺伝子導入をおこなっていない野生株のSynechocystis sp.についても同様の試験を行った。図１６Ａ及び図１６Ｂにおいて遺伝子組み換えシアノバクテリアをPcpcG2-pdh1と表記し、比較例をCtrlと表記する。
【００９８】
遺伝子組み換えシアノバクテリアは、赤色光の下では増殖できた。一方、緑色光の下では、遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖が抑制された。それに対し、比較例では、赤色光の下でも、緑色光の下でも増殖した。
（２−２）第２の評価
上記のように製造した遺伝子組み換えシアノバクテリアを、当初は、赤色光を照射しながら培養し、次に、緑色光を照射しながら培養した。なお、赤色光を照射しているときは、緑色光を照射しなかった。また、緑色光を照射しているときは、赤色光を照射しなかった。
【００９９】
上記のように培養したときの増殖曲線を図１７に示す。遺伝子組み換えシアノバクテリアは、赤色光を照射した期間においては増殖し、緑色光を照射した期間においては増殖が抑制された。
【０１００】
また、上記のように培養したときの、培養液中のＩＢＡ濃度を図１８に示す。遺伝子組み換えシアノバクテリアは、赤色光を照射した期間においてはＩＢＡを生産せず、緑色光を照射した期間においてはＩＢＡを生産した。
【０１０１】
本実施例において、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットは増殖関与領域に対応する。また、本実施例において、kdc、alsS、ilvC、ilvDは、物質生産関与領域に対応する。また、本実施例において、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットの5’側に配置したcpcG2プロモータは、リン酸化CcaRと結合することを条件に増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域に対応する。また、本実施例において、AlsS遺伝子の5’側とilvC遺伝子の5’側に配置したcpcG2プロモータは、リン酸化CcaRと結合することを条件に物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域に対応する。
（実施例５）
１．遺伝子組み換えシアノバクテリアの製造
Fremyella diplosiphon由来のFdRcaE、FdRcaF、FdRcaC遺伝子を、Synechocystis sp. PCC 6803に導入した。具体的には、図１９に示すpMD19プラスミドにFdRcaE、FdRcaF、FdRcaC遺伝子を含むコンストラクトを作製し、そのコントラクトを相同組換え法でSynechocystis sp. PCC 6803に導入した。
【０１０２】
次に、PlpAtoRcaEFC-1プライマー（配列番号32）とPlpAtoRcaEFC-2プライマー（配列番号33）とでPCRすることにより、Synechocystis sp. PCC 6803の相同組換え箇所の上流域における遺伝子断片を増幅させた。
【０１０３】
次に、PlpAtoRcaEFC-3プライマー（配列番号34）とPlpAtoRcaEFC-4（配列番号35）とでPCRすることにより、Fremyella diplosiphon由来のFdRcaEとFdRcaFの遺伝子を増幅させた。
【０１０４】
更に、PlpAtoRcaEFC-5プライマー（配列番号36）とPlpAtoRcaEFC-6（配列番号37）とでPCRすることにより、Fremyella diplosiphon 由来のFdRcaC遺伝子を増幅させた。
引き続き、pRL161プラスミドを鋳型にして、PlpAtoRcaEFC-7プライマー（配列番号38）とPlpAtoRcaEFC-8（配列番号39）とでPCRすることにより、プラスミドに含まれるカナマイシン薬剤耐性遺伝子を増幅させた。
【０１０５】
最後に、PlpAtoRcaEFC-9プライマー（配列番号40）とPlpAtoRcaEFC-10プライマー（配列番号41）とでPCRすることにより、Synechocystis sp. PCC 6803の相同組換え箇所の下流域における遺伝子断片を増幅させた。上記により調製した各遺伝子断片をIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて一気に繋いでpMD19プラスミドに導入した。このプラスミドを常法によりSynechocystis sp. PCC 6803に相同組換えすることで、FdRcaE、FdRcaFおよびFdRcaCを生産できる特性を付与した。相同組換え後のSynechocystis sp. PCC 6803は、光スイッチ機能を有するSynechocystis sp.である。
【０１０６】
次に、図２０Ａに示すように、クロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にCpc2プロモータ（配列番号24）を配置した遺伝子カセット２０１を作製した。図２０Ａ、図２０Ｂにおいてクロラムフェニコール耐性遺伝子をCmと表記する。
【０１０７】
次に、図２０Ａ、図２０Ｂに示すように、Synechocystis sp. PCC 6803のピルビン酸脱水素酵素のβサブユニット（pdhB）とそのプロモーター領域との間に相同組換えで遺伝子カセット２０１を導入した。
【０１０８】
更に、前記実施例１と同様に、IBA生産用プラスミドを調製した。このIBA生産用プラスミドを、上記のように製造した、光スイッチ機能を有するSynechocystis sp.に接合法により導入し、遺伝子組み換えシアノバクテリアを得た。
【０１０９】
２．遺伝子組み換えシアノバクテリアの評価
上記のように製造した遺伝子組み換えシアノバクテリアを緑色光下で培養した後、赤色光下でさらに培養した。その際の遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖曲線を図２１に示す。
【０１１０】
また、緑色光下で培養した場合のIBA濃度と、赤色光下で培養した場合のIBA濃度とを図２２に示す。緑色光下で培養した場合、IBAの生産量は少なかった。赤色光下で培養した場合、IBAの生産量は多かった。よって、緑色光から赤色光に変えることで、遺伝子組み換えシアノバクテリアの増殖を抑制し、IBAの生産量を向上させることができる。
【０１１１】
本実施例において、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットは増殖関与領域に対応する。また、本実施例において、kdc、alsS、ilvC、ilvDは、物質生産関与領域に対応する。また、本実施例において、ピルビン酸脱水素酵素のβサブユニットの5’側に配置したCpc2プロモータは、リン酸化RcaCと結合することを条件に増殖関与領域の発現を抑制する発現抑制領域に対応する。また、本実施例において、AlsS遺伝子の5’側とilvC遺伝子の5’側に配置したCpc2プロモータは、リン酸化RcaCと結合することを条件に物質生産関与領域を発現させるプロモータ領域に対応する。
（その他の実施形態）
（１）前記実施例１において、改良NpCpeCプロモータにより、物質生産関与領域を発現させ、Cpc2プロモータにより、増殖関与領域を発現させてもよい。この場合、第３のシアノバクテリアは、赤色光の照射により増殖を促進し、赤色光の照射停止により増殖を抑制する光スイッチを備える。この光スイッチは遺伝子スイッチである。また、上記の場合、第３のシアノバクテリアは、緑色光の照射により物質生産を促進し、緑色光の照射停止により物質生産を抑制する光スイッチを備える。この光スイッチは遺伝子スイッチである。
【０１１２】
（２）前記実施例１〜５において、増殖関与領域は、（ａ）カルビン・ベンソン回路の代謝に関連する領域、（ｂ）カルビン・ベンソン回路から、グリコール酸を経由して、アミノ酸を合成する経路に炭素を流す代謝に関連する領域、（ｃ）カルビン・ベンソン回路の中にあるフルクトース６リン酸からグルコースを合成する系またはグリコーゲンを蓄積する系に炭素を流す代謝に関わる領域、（ｄ）カルビン・ベンソン回路の中にあるホスホグリセリン酸からピルビン酸を経由して脂肪酸を合成する系に炭素を流す代謝に関わる領域、及び（ｅ）ペントースリン酸経路または、その代謝物から生産される物質をコードする領域から選択される１以上とすることができる。
【０１１３】
また、前記実施例１〜５において、増殖関与領域は、図７に示す、生物の増殖に関与する炭素代謝に含まれる反応（例えば図７において×印を付した部分）の進行を左右する物質（例えば酵素等）を生成する領域とすることができる。例えば、増殖関与領域は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDC）、グルコースリン酸イソメラーゼ（GPI）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）、ADPグルコースピロホスホリラーゼ（AGPase）、クエン酸シンターゼ（gltA）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼNAD型（gap1）等を生成する領域とすることができる。
【０１１４】
（３）前記実施例１〜５において、物質生産関与領域はIBA以外の物質、例えば、イソプレノイド系化合物の生産に関与する領域であってもよい。
（４）前記実施例１〜５において、宿主はシアノバクテリア以外の生物であってもよい。例えば、真核細胞の中から宿主を適宜選択することができ、例えば、クロレラ、クラミドモナス等が挙げられる。
【０１１５】
（５）前記実施例１において、改良NpCpeCプロモータの代わりに、同様の機能を奏する他のプロモータを用いてもよい。また、Cpc2プロモータの代わりに、同様の機能を奏する他のプロモータを用いてもよい。そのようなプロモータとして、例えば、nostoc punctiformeのcpeCプロモータ（NpCcaR）等、リン酸化CcaRを認識するプロモータを使用することができる。
【０１１６】
（６）宿主のＤＮＡに所望の遺伝子を組み込む方法は上述したものには限定されず、公知の方法の中から適宜選択して用いることができる。
（７）前記実施例４において、遺伝子組み換えシアノバクテリアは、リン酸化CcaRと結合することを条件に増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、リン酸化CcaRと結合することを条件に物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域とを備えていてもよい。
【０１１７】
（８）前記実施例５において、遺伝子組み換えシアノバクテリアは、リン酸化RcaCと結合することを条件に増殖関与領域を発現させるプロモータ領域と、リン酸化RcaCと結合することを条件に物質生産関与領域の発現を抑制する発現抑制領域とを備えていてもよい。
【符号の説明】
【０１１８】
１、１０１、２０１・・・遺伝子カセット
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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