(57)【要約】【課題】シリカ形成活性を有する新規タンパク質を見いだし、それを用いてシリカおよびシリカに固定化されたタンパク質を製造する。【解決手段】ガラス海綿類の骨格をフッ化水素処理して抽出することを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法、ならびにシリカ形成活性を有するタンパク質であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が２３ｋＤａであり、シリカ形成の至適ｐＨが６〜８であり、トリプシン消化断片のアミノ酸配列としてＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｐｒｏを生じるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス海綿類の骨格から抽出することを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られるシリカ形成活性を有するタンパク質であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が２２ｋＤａ〜２４ｋＤａであり、シリカ形成の至適ｐＨが６〜８であり、トリプシン消化断片のアミノ酸配列としてＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：１）からなるペプチドを生じるタンパク質。
【請求項３】
下記のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：１０の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
のいずれかを含むポリヌクレオチドであって、シリカ形成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドによりコードされるシリカ形成活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列
のいずれかを含む、シリカ形成活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項２、４または５のいずれか１項記載のタンパク質とケイ酸を反応させることを特徴とする、シリカの製造方法。
【請求項７】
請求項２、４または５のいずれか１項記載のタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を作成し、次いで
融合タンパク質とケイ酸を反応させること
を特徴とする、シリカに固定化されたタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含む、シリカ形成活性を有するタンパク質を発現するベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを宿主に導入し、シリカ形成活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質に関する。詳細には、本発明は、シリカ形成活性を有する新規タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカは二酸化ケイ素またはそれによって構成される物質のことである。地殻で最も多量に存在する物質であり、珪藻類や海綿動物類などの生物が生産するものもある。シリカは多くの分野において用いられている。例えば、シリカを原料として得られるシリカゲルは乾燥剤として医薬品、食品などに用いられている。また、シリカは濾過助剤としても広く用いられている。そのほか、石英ガラス、シリカゲル、アエロゲルなどが建材、絶縁体、研磨剤、充填材、消泡剤、添加剤として建築、エレクトロニクス、材料など幅広い分野で利用されている。
【０００３】
シリカは土壌から大量に採取されている。そのまま利用あるいはさらに加工されて利用される。その工業的製法は、四塩化ケイ素を３０００℃の高温で加熱、ケイ酸アルカリ塩を硫酸で中和する、ケイ酸エステルの加熱または酸やアルカリによる加水分解であり、いずれも少なからず環境に影響を及ぼす。酵素反応によってシリカを生成したという報告はあるが、大量生産には至っていない。
【０００４】
生物が作るシリカには微量の有機物が含まれていて、この有機物がシリカ生産に関わっていることが示されている。珪藻のシリカ骨格中からリジンとセリンに富むペプチドであるシラフィンが見出され、当該ペプチドはシリカ形成を促進することが確認された（非特許文献１）。シラフィンは、リジン残基がポリアミンで修飾され、セリン残基がリン酸化される複雑な構造を有しており、その生産過程はペプチド骨格を合成したのちに２種類の科学修飾を施すなど複雑である。海綿動物のシリカ骨格からはシリカ生成酵素シリカテインが見出されている（非特許文献２）。シリカテインはパパイン様システインプロテアーゼスーパーファミリーに属するタンパク質で、その活性は熱処理により失われることから、高次構造が必須である。このようにシラフィンやシリカテインの利用には課題が多く、実用化が困難である。
【０００５】
海綿動物のうち、六放海綿類ではシリカがガラス繊維として生産され、光ファイバーと同様の構造を有し、実際光を伝播させる性質を有する（非特許文献３）。しかも海綿類のガラス繊維は光ファイバーよりも細く、強度的にも優れている。このような独特かつ優れた物性を有するシリカを生体触媒の作用により低温で製造できれば、環境に優しくエネルギー的にも有利なシリカの製造方法が確立される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nils Kroeger et al. Science, Vol.286, pp.1129-1132 (1999)
【非特許文献２】Katsuhiko Shimizu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.95, pp.6234-6238 (1998)
【非特許文献３】Vikram C. Sundar et al. Nature, Vol.424, pp.899-900 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明が解決しようとする課題は、シリカ形成活性を有する新たなタンパク質を見いだし、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を同定すること、ならびに組換え法によってかかるタンパク質を得て、物性の優れたシリカをエネルギー的にも有利な低温条件で大量生産することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ガラス海綿類であるカイロウドウケツおよびホッスガイのシリカ骨格中にｐＨ６〜８でシリカ形成を促進する新規タンパク質を見いだし、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、このタンパク質をグラシンと命名した（本明細書および図面において、本発明のシリカ形成活性を有するタンパク質をグラシンと称することがある）。
【０００９】
したがって、本発明は以下のものを提供する：
（１）ガラス海綿類の骨格から抽出することを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法。
（２）（１）記載の方法により得られるシリカ形成活性を有するタンパク質であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が２２ｋＤａ〜２４ｋＤａであり、シリカ形成の至適ｐＨが６〜８であり、トリプシン消化断片のアミノ酸配列としてＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：１）からなるペプチドを生じるタンパク質。
（３）下記のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：１０の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
のいずれかを含むポリヌクレオチドであって、シリカ形成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（４）（３）記載のポリヌクレオチドによりコードされるシリカ形成活性を有するタンパク質。
（５）下記のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１個〜約４０個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列
のいずれかを含む、シリカ形成活性を有するタンパク質。
（６）（２）、（４）または（５）のいずれかに記載のタンパク質とケイ酸を反応させることを特徴とする、シリカの製造方法。
（７）（２）、（４）または（５）のいずれかに記載のタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を作成し、次いで
融合タンパク質とケイ酸を反応させること
を特徴とする、シリカに固定化された目的タンパク質の製造方法。
（８）（３）記載のポリヌクレオチドを含む、シリカ形成活性を有するタンパク質を発現するベクター。
（９）（８）記載のベクターを宿主に導入し、シリカ形成活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規タンパク質グラシンを用いることにより、シリカ、およびシリカに固定化されたタンパク質を容易に得ることができる。さらに、本発明によれば、グラシンを組換え法により製造することができ、シリカの大量生産が可能となる。本発明によるシリカの製造法は低温で行うことができ、エネルギー的に有利で環境に優しい方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、カイドウロウケツ（Euplectella aspergillum、レーン１）およびEuplectella sp.（レーン２）のシリカ骨格からのグラシン（やじり）の抽出結果を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２】図２は、グラシンのシリカ形成能（左パネル）および至適ｐＨ（右パネル）を調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、エッペンドルフチューブ中でグラシンを用いてケイ酸からシリカを生産した場合の、チューブ底部にたまったシリカの写真である。
【図４】図４は、グラシン発現ベクターのスキームである。
【図５】図５は、組換え法によって得られたグラシンのシリカ形成活性を示すグラフである。左のバーは天然グラシン、右のバーは組換えグラシンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、ガラス海綿類の骨格から抽出することを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。ガラス海綿類は六放海綿綱ともいい、４つまたは６つのシリカでできた骨針を備えた骨格を有する海綿動物である。ガラス海綿類は２つの亜綱（両盤亜綱および六放星亜綱）、５つの目（両盤目、Aulocalycodia、六放目、Lychniscosidaおよびカイドウロウケツ目）に分類される。これらの目に属する海綿の種類は公知である。例えば、ホッスガイ科の海綿は両盤目に含まれ、カイドウロウケツ科の海綿はカイロウドウケツ目に含まれる。カイロウドウケツ科としては、カイロウドウケツ、オウエンンカイロウドウケツ、ヤマトカイロウドウケツ、マーシャルカイロウドウケツなどの種が挙げられる。
【００１３】
ガラス海綿類の骨格に付着する有機物を次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて除去し、得られた骨格をフッ化水素（例えばＨＦ／ＮＨ４Ｆ水溶液）にて処理してシリカ溶解液を得る。そして、シリカ溶解液を透析して透析内液を得て、必要に応じて透析内液を限外濾過等の手段により濃縮することにより、ガラス海綿類からグラシンを抽出することができる。グラシンの抽出方法は上記方法に限定されないことはいうまでもない。
【００１４】
本発明のシリカ形成活性を有するタンパク質（グラシン）はシリカ形成活性を有する。シリカ形成活性は、ケイ酸からシリカを形成する活性である。シリカ形成活性は、例えば、過飽和ケイ酸水溶液にグラシンを添加して、生成するシリカ沈殿を定量することにより測定することができる。
【００１５】
ガラス海綿類の骨格に由来するグラシンは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約２０〜約２６ｋＤａ、典型的には約２２ｋＤａ〜２４ｋＤａ、例えば２３ｋＤａであり、シリカ形成の至適ｐＨが約５〜約９、典型的には約６〜約８であり、トリプシン消化断片のアミノ酸配列としてＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：１）からなるペプチド、あるいは配列番号：１のアミノ酸配列において１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸残基が置換、付加または欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは配列番号：１のアミノ酸配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを生じるタンパク質であると定義することもできる。
【００１６】
本発明は、さらなる態様において、下記のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号：１０の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して９０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
のいずれかを含むポリヌクレオチドであって、シリカ形成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【００１７】
本発明のグラシンをコードするヌクレオチド配列の典型例は、配列番号：１０に示すヌクレオチド配列の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列であるか、あるいは配列番号：１０に示すヌクレオチド配列の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。かかるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質（グラシン）は、シリカ形成活性を有するものである。
【００１８】
本発明のグラシンは、上記ヌクレオチド配列の変異配列によってコードされていてもよい。上記ヌクレオチド配列の変異配列としては、配列番号：１０に示すヌクレオチド配列の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列に対して実質的なヌクレオチド配列同一性を有するものが挙げられる。本明細書において使用する「実質的なヌクレオチド配列同一性を有する」とは、複数（例えば２つ）のヌクレオチド配列を比較した場合に、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％、９７％、９８％又は９９％以上のヌクレオチド配列同一性を有することをいう。なお、同一性の％は、複数（例えば２つ）のヌクレオチド配列間の同一性を演算する公知のソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。上記の変異ヌクレオチド配列のさらなる例として、配列番号：１０に示すヌクレオチド配列の５５位〜７０２位のヌクレオチド配列の５’末端に１個〜約６０個のヌクレオチドが付加され、３’末端に１個〜約３０個のヌクレオチドが付加されたヌクレオチド配列が挙げられ、その特別な例として、配列番号：１０に示すヌクレオチド配列が挙げられる。これらの変異ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質（グラシン）は、シリカ形成活性を有するものである。
【００１９】
上記ヌクレオチド配列の変異配列のさらなる例としては、上で説明したグラシンをコードするヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、あるいはかかるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列が挙げられる。本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば以下のようなハイブリダイゼーションと洗浄の条件がある。ハイブリダイゼーション条件として、３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間、洗浄条件としては、室温での０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液による室温での操作を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。これらの変異ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質（グラシン）は、シリカ形成活性を有するものである。
【００２０】
本発明は、さらなる態様において、下記のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１個〜約４０個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列
のいずれかを含む、シリカ形成活性を有するタンパク質に関するものである。
【００２１】
本発明のシリカ形成能を有するタンパク質（グラシン）は、典型的には、配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２２】
本発明のグラシンは上記グラシンの変異体であってもよい。かかる変異体は上記アミノ酸配列の変異配列を含んでいてもよく、あるいは上記アミノ酸配列の変異配列からなるものであってもよい。上記アミノ酸配列の変異配列の例としては、配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列に対して実質的なアミノ酸配列同一性を有するものが挙げられる。本明細書において使用する「実質的なアミノ酸配列同一性を有する」とは、複数（例えば２つ）のアミノ酸配列を比較した場合に、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％、９７％、９８％又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を有することをいう。なお、同一性の％は、複数（例えば２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算する公知のソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。かかる変異アミノ酸配列を含む、あるいはかかる変異アミノ酸配列からなる本発明のグラシンは、シリカ形成活性を有するものである。
【００２３】
上記アミノ酸配列のさらなる変異配列の例としては、配列番号：１１の１９位〜２３３位のアミノ酸配列において、１個〜４０個、好ましくは１個〜３０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜数個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列が例示される。上記の変異アミノ酸配列の例として、配列番号：１１に示すアミノ酸配列の１９位〜２３３位のアミノ酸配列のＮ末端に１個〜約２０個のアミノ酸が付加され、Ｃ末端に１個〜約１０個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列が挙げられ、その特別な例として、配列番号：１１に示すアミノ酸配列が挙げられる。かかる変異アミノ酸配列からなる、あるいはかかる変異アミノ酸配列を含むグラシンの変異体もまた、シリカ形成活性を有するものである。なお、アミノ酸配列中のアミノ酸の置換、欠失または付加は、当業者に公知の方法で行うことができる。これらのグラシンの変異体もまた、シリカ形成活性を有するものである。
【００２４】
さらに、本発明のグラシンの変異体として、（ａ）配列番号：１１の１９位〜１０９位のアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１個〜約２０個、好ましくは１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列、からなるあるいはかかるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、シリカ形成活性を有するタンパク質が挙げられる。さらに加えて、本発明のグラシンの変異体として、（ｄ）配列番号：１１の１３２位〜２２７位のアミノ酸配列、（ｅ）（ｄ）のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のアミノ酸配列において１個〜約２０個、好ましくは１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列、からなるあるいは含むタンパク質であって、シリカ形成活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、グラシンまたはグラシン変異体とケイ酸を反応させることを特徴とする、シリカの製造方法を提供する。該方法は、例えば、ケイ酸溶液とグラシン水溶液またはグラシン変異体水溶液を混合して、該酵素の至適ｐＨおよび至適温度にてインキュベーションし、シリカ沈殿を形成させることによって実施されうる。詳細な反応条件の具体例については実施例を参照のこと。
【００２６】
本発明は、さらなる態様において、グラシンまたはグラシン変異体と目的タンパク質との融合タンパク質を作成し、次いで、融合タンパク質とケイ酸を反応させることを特徴とする、シリカに固定化された目的タンパク質の製造方法を提供する。目的タンパク質は、固定化担体としてのシリカに固定化される任意のタンパク質であってよい。融合タンパク質の製造方法は当業者に公知である。本発明のこの方法において、融合タンパク質とケイ酸とを反応させるだけで、シリカに固定化された目的タンパク質を簡単に得ることができる。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、グラシンをコードするポリヌクレオチドまたはその変異体を含むベクターであって、シリカ形成活性を有するタンパク質（グラシン）を発現するベクターを提供する。かかるベクターは、公知の発現ベクター中にグラシンをコードするポリヌクレオチドまたはその変異体を組み込むことによって得てもよい。発現ベクター中へのポリヌクレオチドの組み込み方法も当業者に公知である。
【００２８】
本発明は、さらなる態様において、上記ベクターを宿主に導入し、シリカ形成活性を有するタンパク質を発現させることを特徴とする、シリカ形成活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。宿主としては、細菌細胞、動物細胞、昆虫細胞など、公知の細胞を使用することができる。細胞へのベクターの導入方法も当業者に公知である。かかる方法を用いて、グラシンまたはその変異体を大量生産することも可能である。
【００２９】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１．カイロウドウケツからのグラシンの単離およびその遺伝子配列の決定
１）材料
カイロウドウケツ（Euplectella aspergillum）の骨格はフィリピンで採集されたものを入手して用いた。Euplectella sp.生体およびホッスガイ（Hyalonema sieboldi）の骨格は福江市沖東シナ海においてビームトロールにより採集された。
【００３１】
２）グラシンの抽出
カイロウドウケツ（Euplectella aspergillum）の骨格に付着する有機物を取り除くため、０．１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１晩浸漬し、その後蒸留水で洗浄した。骨格２ｇを２Ｍ  ＨＦ／８Ｍ  ＮＨ４Ｆ水溶液５０ｍＬに浸漬し、シリカを溶解させた。溶解液を１０倍容の水に対し透析し、５〜１０時間おきに７回外液を取り替えた。その後、透析内液を回収して、１０，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離操作により水可溶性画分を得た。さらに水可溶性画分を限外濾過（Amicon Ultra-15 Ultracel (3,000 NMWL)、Millipore社）により０．２ｍＬに濃縮した。DC protein assay kit（Bio-Rad, USA）によりタンパク質の定量を行い、１ｍｇ／ｍＬの水可溶性画分を得た。
【００３２】
３）グラシンの同定
水可溶性画分のタンパク質１μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、クマシーブリリアントブルー染色により可視化すると、２３ｋＤａのタンパク質が主要なタンパク質として認められ、そのほかにはほとんどタンパク質は見られなかった（図１）。カイロウドウケツの骨格に含まれる水可溶性タンパク質はこの２３ｋＤａタンパク質が主要な成分であり、このタンパク質をグラシン（glassin）と命名し、水溶性画分はグラシン水溶液とよぶこととする。Euplectella sp.およびホッスガイの骨格から抽出した水可溶性画分においても、同様の結果を得た。
【００３３】
カイロウドウケツ（Euplectella aspergillum）およびEuplectella sp.のグラシンについて、トリプシン消化断片のアミノ酸配列としてＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏを得た。
【００３４】
４）シリカ形成促進
グラシンを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４、５、６、７または８）に溶解して、グラシン溶液（０．５、１、２．５、５または１２．５μｇ／ｕｌ）を調製した。テトラメトキシシラン１５μＬと１ｍＭ塩酸８５μＬの混合液を５分間撹拌して調製した過飽和ケイ酸溶液１μＬをグラシン溶液に添加し、５分後に遠心分離操作により沈殿を回収した。対照実験として緩衝液のみで同様の操作を実施したところ、いずれのｐＨにおいても沈殿は回収されなかった。沈殿を水で２回洗浄した。沈殿を０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解してケイ酸の定量を行った（Iler RK (1979) The chemistry of silica : solubility, polymerization, colloid and surface properties, and biochemistry (Wiley, New York)に記載の方法に準じて行った）。図２に示す通り、ｐＨ６において、グラシン濃度に比例してシリカの沈殿が増加した（図２左パネル）。また、シリカの沈殿はｐＨ６〜８において見られ（相対活性５０％以上）、ｐＨ４ないし５では見られなかった（図２右パネル）。走査型電子顕微鏡により形態を観察した（図３）。グラシンはｐＨ６〜８においてシリカ形成を促進することがわかった。上記性質は、カイロウドウケツ（Euplectella aspergillum）およびEuplectella sp.のグラシンに共通していた。
【００３５】
５）遺伝子の単離
オーウェンカイロウドウケツ組織より抽出したＲＮＡを鋳型とし、oligo dT-3sites adaptor（タカラバイオ）をプライマーとしてＲＮＡ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。グラシンの部分アミノ酸配列から想定されるＤＮＡ配列に対するプライマー５’−ａｒ  ｃａｙ  ｇａｙ  ｃａｙ  ｃａｙ  ｇａｙ  ｃａｙ  ｃ−３’（プライマー１）（配列番号：２）と５’−ｃａｙ  ｃａｙ  ｃａｙ  ｇａｙ  ｃａｙ  ｇｃｎ  ｃ−３’（プライマー２）（配列番号：３）を設計した。上記の通り合成したｃＤＮＡを鋳型としてプライマー１とoligo dT-3sites adaptorの一部配列をプライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲ法により、ｃＤＮＡ断片ＲＴ−ＰＣＲ１を増幅した。増幅されたｃＤＮＡ断片をｐＣＲ４ベクターに挿入してクローニングし、その塩基配列を決定した（配列番号：４）。得られた配列の一部をプライマーとして、５’−ＲＡＣＥ法により５’部分の増幅を行った。その結果、３種類のクローン（配列番号：５、６、７）を得た。３種類のクローンに共通する配列（５’−ｔｇｇｔｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃｃａｃｔａｃ−３’（配列番号：８））をプライマーとして再度５’−ＲＡＣＥを行い、５’−ＲＡＣＥ２／ｃｌｏｎｅ  １を得た（配列番号：９）。以上により、グラシンをコードするｃＤＮＡ配列を得た。この配列がＰＣＲ法で増幅されることを確認し、得られたクローンをＲＴ−ＰＣＲ２と命名した。ＲＴ−ＰＣＲ２の塩基配列を配列番号：１０に、それがコードするアミノ酸配列を配列番号：１１に示す。なお、すでに得られたトリプシン消化断片のアミノ酸配列はＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  ＰｒｏではなくＬｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：１）であることが判明した。
【実施例２】
【００３６】
実施例２．組換えグラシンの生産
６）組換えタンパク質の生産
ＲＴ−ＰＣＲ２の一部（配列番号：１０の５５位〜７０２位）をｐＥＴ１００に挿入してグラシン発現ベクターを構築した（図４）。このベクターを大腸菌BL2 Star（DE3）株に導入し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ添加培地で３７℃で４時間培養し、菌体を回収した。菌体をFastbreak cell lysis reagent（Promega社）で溶解し、Ｈｉｓ−ｔａｇ  タンパク質アフィニティカラム（HisGraviTrap, GE, USA）により、組換えグラシンを精製した。組換えグラシンは天然グラシンと同等のシリカ形成活性を示した（図５）。
【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲ２のＤＮＡ配列に人工的に変異を導入して（コードするタンパク質の配列に影響はない）、この変異配列を用いて生産した組換えグラシンがシリカ合成活性を有していることを確認した（データ示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、化粧品、医薬品、食品などの広範な分野において利用可能である。
【図２】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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