(57)【要約】【課題】生物的に安全な微生物を利用した、微生物発酵による経済的な２，３−ブタンジオールの製造方法を提供すること。【解決手段】２，３−ブタンジオールの製造方法は、キシロースなどの五炭糖を含む発酵原料中で、五炭糖を資化する能力を有する、ザイモバクター・パルメなどのザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、および、この工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖を含む発酵原料中で、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、および
該工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項２】
前記工程Ａが通気条件下での培養である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ−１以上の条件での培養である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも１つの酵素をコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程Ａの発酵原料に含まれる五炭糖がキシロースである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵原料中の総糖に対するキシロースの存在比率が５〜１００％である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程Ａが総糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程Ｂが蒸留工程を含む、請求項１から１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脱塩処理工程として少なくともイオン交換処理工程を含む、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，３−ブタンジオールは（以下、「２，３−ＢＤＯ」と呼ぶことがある）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として用いられる有用な化合物であり、具体例として、メチルエチルケトン（非特許文献１）や１，３−ブタジエン（非特許文献２）の原料となりうる。２，３−ＢＤＯは工業的には２−ブテンオキシドを過塩素酸水溶液中で加水分解する方法で製造されている。また、近年では石油資源の枯渇や温暖化問題への対応として持続可能な循環型社会への転換が迫られており、化学産業においても、石油原料からバイオマス由来原料へのシフトが盛んに研究されている中で、微生物発酵法による２，３−ブタンジオールの製造方法が注目されつつある。
【０００３】
微生物発酵の発酵原料としては、従来の可食バイオマス由来の糖の他、非可食バイオマス由来の糖が注目されている。発酵原料として非可食バイオマス由来の糖を使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られる。そのため、五炭糖を含む原料の効率的な発酵技術の開発が求められている。
【０００４】
五炭糖から２，３−ブタンジオールを効率よく発酵生産する微生物にはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ（非特許文献３）などの腸内細菌が知られている。これらの微生物は発酵に特定のビタミンやアミノ酸等を必要としないため、発酵液から２，３−ブタンジオールを精製する際に必要となる工程が少なくすむという利点がある。しかしながら、これらの微生物には病原性があり、呼吸器感染症などを引き起こすことが知られている。そのため産業的な２，３−ブタンジオール製造を目的としてこれらの発酵菌を大量培養しようとした場合には厳重な管理のための設備が必要であり、コストの増大に繋がる。
【０００５】
一方、生物的に安全であり、かつ五炭糖を２，３−ブタンジオールへと発酵する微生物としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（非特許文献４）やＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａなどのバチルス科細菌（非特許文献５）を用いる方法が開示されている。しかしながら、これらの微生物を用いる２，３−ブタンジオール発酵では酵母エキスや動物性タンパク加水分解物などの高価な副原料を使用するため、コストが増大する。
【０００６】
また、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物にキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入され、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター属の形質転換微生物が知られている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、この形質転換微生物が、エタノール生産性を有することは、特許文献１及び２に記載されているが、五炭糖を２，３−ブタンジオールへと発酵する能力については記載も示唆もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-261421号公報
【特許文献２】米国特許出願公開2007/0298476号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａ．Ｎ．Ｂｏｕｒｎｓ，Ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ｓｉｌｉｃａｔｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｒｅｓ．（１９４７年）
【非特許文献２】Ｎａｔｈａｎ  Ｓｈｌｅｃｈｔｅｒ，Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２，３−ｂｕｔｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｔｏ  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ，Ｉｎｄｕ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．９０５（１９４５年）
【非特許文献３】Ｊａｎｓｅｎ  ＮＢ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ  ｂｙ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  ＡＴＣＣ  ８７２４．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  １９８４  Ａｐｒ；２６（４）：３６２−９．
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  Ｑ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｏｒ  ｃｈｉｒａｌ  ｐｕｒｅ  Ｄ−２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１２  Ｊｕｌ；１０９（７）：１６１０−２１．
【非特許文献５】Ｍａｒｗｏｔｏ  Ｂ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｅｔａｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｘｙｌｏｓｅ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  Ｍａｒ；６４（１）：１１２−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のとおり、従来の微生物発酵による五炭糖からの２，３−ブタンジオールの製造方法においては生物的な安全性や副原料のコストが課題であった。そこで本発明は、生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による経済的な２，３−ブタンジオールの製造方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、これまで２，３−ブタンジオール発酵微生物としては知られていなかったザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が２，３−ブタンジオール発酵能を有すること、さらに、該微生物にキシロース資化性を付与することで上記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）の通りである。
（１）五炭糖を含む発酵原料中で、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、および
該工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３−ブタンジオールの製造方法。
（２）前記工程Ａが通気条件下での培養である、（１）に記載の方法。
（３）前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ−１以上の条件での培養である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも１つの酵素をコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、（１）から（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、（４）に記載の方法。
（６）前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記工程Ａの発酵原料に含まれる五炭糖がキシロースである、（１）から（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）前記発酵原料中の総糖に対するキシロースの存在比率が５〜１００％である、（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）前記工程Ａが総糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、（１）から（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（１）から（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）前記工程Ｂが蒸留工程を含む、（１）から（１０）のいずれか1項に記載の方法。
（１２）前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、（１１）に記載の方法。
（１３）前記脱塩処理工程として少なくともイオン交換処理工程を含む、（１２）記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、微生物発酵にて五炭糖を含む発酵原料から２，３−ブタンジオールを製造する方法において、従来技術に比べて安全かつ経済的に２，３−ブタンジオールを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
工程Ａ：２，３−ブタンジオール発酵工程
本発明の方法では、五炭糖を含む発酵原料を含む培地中で、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する。
【００１４】
使用するザイモバクター属細菌は自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。２，３−ブタンジオールの発酵能を有するザイモバクター属細菌の具体例としては、２，３−ブタンジオール発酵能の観点からザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｔｃｅｒ  ｐａｌｍａｅ）が好ましく利用される。ザイモバクター・パルメは通常五炭糖を資化しないが、五炭糖の資化に関わる遺伝子を導入することで付与することができる。
【００１５】
本発明で導入する遺伝子としては、アルドペントースをケトペントースに異性化する酵素遺伝子を用いることができる。用いる遺伝子としては、例えばペントースイソメラーゼ、ペントースレダクターゼおよび／またはペントールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００１６】
ペントースイソメラーゼは、五炭糖（ペントース）のうち構造異性体であるアルドペントースとケトペントースの異性化を触媒する酵素として定義される。本発明に用いられるペントースイソメラーゼは五炭糖の直接的な異性化を触媒する活性を持っていれば特に限定されないが、例えば、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）やアラビノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．３）が挙げられる。この中で、例えばキシロースイソメラーゼはキシロース（アルドペントース）のキシルロース（ケトペントース）への、かつ／またはその逆の直接的な異性化を触媒する酵素であり、キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。直接的な異性化とは、ペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼにより触媒される、糖アルコール中間体を経た２段階転化とは異なり、ペントースイソメラーゼにより触媒される１段階での異性化のことを指す。
【００１７】
ペントースレダクターゼとは、還元酵素のひとつであり、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素としてアルドペントースを糖アルコールに変換する活性を有する酵素を意味する。例えば、キシロースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．３０７やＥＣ１．１．１．２１が該当し、はキシロースをキシリトールに変換する酵素である。アラビノースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．２１が該当し、アラビノースをアラビトールに変換する酵素である。また、前記ＥＣ番号で分類される酵素でなくとも、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントースレダクターゼに含まれる。
【００１８】
ペントールデヒドロゲナーゼとは、脱水素酵素のひとつであり、ＮＡＤ＋を補酵素としてペントールをケトペントースに変換する酵素である。例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．９やＥＣ１．１．１．１０が該当し、キシリトールをキシルロースに変換する酵素である。アラビトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．１１やＥＣ１．１．１．１２が該当し、アラビトールをリボースに変換する酵素である。分類上ペントールデヒドロゲナーゼと異なる酵素であっても、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントールデヒドロゲナーゼに含まれるとする。
【００１９】
ペントースレダクターゼとペントールデヒドロゲナーゼが触媒する反応は、ペントースイソメラーゼと同様に、アルドペントースをケトペントースに異性化する。
【００２０】
上記のアルドペントースとケトペントースの異性化を触媒する酵素のうち、好ましくはペントースのペントースイソメラーゼ用いることができ、より好ましくはキシロースイソメラーゼを用いることができる。
【００２１】
用いるキシロースイソメラーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のキシロースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No. NC_007779 REGION: 3909650..3910972に記載されている。
【００２２】
キシロースイソメラーゼの活性は、キシロース存在下で酵素反応を行い、異性化されたキシルロースをＨＰＬＣなどを用いて測定することで確認することができる。キシロースイソメラーゼ活性は、例えば特開２００８−７９５６４に開示される方法で測定できる。
【００２３】
キシロースイソメラーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科類、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、好ましくはエシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００２４】
また本発明で導入する遺伝子としては、ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素遺伝子を用いることもできる。ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素としては、例えば、キシルロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１７）やリブロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１６）が挙げられるが、キシルロキナーゼを好ましく用いることができる。
【００２５】
用いるキシルロキナーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのキシルロキナーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No. NC_007779 REGION: 3911044..3912498に記載されている。
【００２６】
キシルロキナーゼの活性は、キシルロース存在下で酵素反応を行い、リン酸化されたキシルロース−５−リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADPHの増加などを測定することで確認でき、例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ＳＤ，  Ｓａｈｍ  Ｈ，  Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ＧＡ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｘｙｌｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｘｙｌｕｌｏｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １０３３  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２  Ａｕｇ；２３４（２）：２０１−１０．に開示される方法により測定できる。
【００２７】
キシルロキナーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科細菌、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの乳酸菌類、またアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、に属する微生物を用いることができ、好ましくは、エシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００２８】
さらに、本発明で導入する遺伝子としてはトランスケトラーゼおよび／またはトランスアルドラーゼ活性を有する酵素遺伝子を用いることもできる。トランスケトラーゼは、キシルロース−５−リン酸およびエリスロース−４−リン酸をフルクトースー６−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸へと変換する反応及びその逆反応、および／またはリボース５−リン酸およびキシルロース５−リン酸をセドヘプツロース−７−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸へと変換する反応及びその逆反応を触媒する酵素と定義される。本発明に用いられるトランスケトラーゼは上記の触媒活性を持っていれば特に限定されないが、例えばＥＣ２．２．１．１が該当する。
【００２９】
用いるトランスケトラーゼおよび／あるいはトランスアルドラーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのトランスケトラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No. NC_007779 REGION: complement(3078300..3080291)に記載されている。また、例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのトランスアルドラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No. NC_007779 REGION: 8238..9191に記載されている。
【００３０】
トランスケトラーゼの活性は、キシルロース−５−リン酸およびエリスロース−４−リン酸存在下で酵素反応を行い、生成したグリセルアルデヒド−３−リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADHの減少などを測定することで確認でき、例えば、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ＧＡ，  Ｓｃｈｏｒｋｅｎ  Ｕ，  Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  Ｇ，  Ｓａｈｍ  Ｈ．  Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ  Ａ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９５  Ｊｕｎ  １；２３０（２）：５２５−３２．に開示される方法で測定できる。
【００３１】
トランスアルドラーゼはセドヘプツロース７−リン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸をエリスロース−４−リン酸およびフルクトース−６−リン酸へと変換する反応及びその逆反応を触媒する酵素と定義される。本発明に用いられるトランスケトラーゼは上記の触媒活性を持っていれば特に限定されないが、例えばＥＣ２．２．１．２が該当する。
【００３２】
トランスアルドラーゼの活性は、フルクトース−６−リン酸およびエリスロース−４−リン酸存在下で酵素反応を行い、生成したグリセルアルデヒド−３−リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADHの減少などを測定することで確認でき、例えば、ＧＡ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｕ．Ｓｃｈｏｒｋｅｎ，Ｇ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ＆  Ｈ．Ｓａｈｍ  ＴｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅＢ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２：ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ，ｔａｌＢ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：２０：５９３０−６）により記載される方法により測定され得る。
【００３３】
トランスアルドラーゼおよび／またはトランスアルドラーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科類、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、好ましくはエシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００３４】
ザイモバクター属微生物が、五炭糖を資化する能力を有する限り、上記した各遺伝子の少なくともいずれかを導入したものであってよいが、（１）キシロースイソメラーゼ、（２）キシルロキナーゼ並びに（３）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの少なくともいずれか一方をコードする外来遺伝子が導入されたものが好ましく、さらには、（１）キシロースイソメラーゼ遺伝子、（２）キシルロキナーゼ並びに（３）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの両者をコードする外来遺伝子が導入されたものが好ましい。
【００３５】
上記以外の微生物であって、キシロース分解能を有するもの、さらにはプロモーター部位やリボソーム結合部位の異常などによりキシロース分解能は有しないが、そのＤＮＡ上にキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼまたはトランスケトラーゼ遺伝子をコードする微生物も供与体として用いることができる。
【００３６】
導入する遺伝子は異なる複数の供与体の遺伝子を組み合わせてもよい。またそれらの遺伝子は宿主となるザイモバクター属細菌内のゲノムＤＮＡに取り込まれてもよいし、ベクター上に存在していてもよい。
【００３７】
遺伝子の導入方法としては特に制限されないが、ベクター上に存在する遺伝子の導入方法としては、例えば特許文献１および特許文献２に開示される方法を用いることができる。すなわち、市販の大腸菌用のクローニングプラスミドベクター（例えば、pUC118等）のマルチクローニングサイトに各遺伝子を挿入し、これで大腸菌を形質転換して各遺伝子の産物を産生する形質転換体を増殖させる。増殖させた形質転換体から、プラスミドを回収し、導入された各遺伝子を含む領域を切り出し、広宿主域ベクタープラスミド（例えば、pMFY31 (Agric. Biol. Chem., Vol.49(9), 2719-2724, 1985等）のマルチクローニングサイトに挿入した組換えプラスミドベクターでザイモバクター属細菌を形質転換することにより、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター属形質転換体を作出することができる。なお、広宿主域ベクタープラスミドとしては、市販のものを用いることもできる。形質転換方法自体は周知であり、例えば、特許文献１及び特許文献２に記載されている通り、マグネシウムイオンを含むＴ培地（2.0重量％グルコース、1.0重量％バクト−酵母エキス、1.0重量％リン酸二水素カリウム、0.2重量％硫酸アンモニウム、0.05重量％硫酸マグネシウム七水塩、pH6.0）等の培地中で培養してコンピテントセルとした後、エレクトロポレーション法のような常法により形質転換を行うことができる。キシロースの資化能を有する形質転換体は、キシロースを唯一の炭素源とする培地中で形質転換処理後の細菌を培養して選択することにより得ることができる。
【００３８】
導入遺伝子をゲノムＤＮＡに取り込ませる場合には、例えばＫｉｒｉｌｌ  Ａ．  Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ  Ｌ．  Ｗａｎｎｅｒ．  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  Ｊｕｎ  ６，  ２０００；  ９７（１２）：  ６６４０-６６４５．に開示される方法を用いることができる。
【００３９】
本発明で使用される発酵原料は五炭糖を含むが、五炭糖の他に六炭糖を含んでいてもよい。
【００４０】
五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
【００４１】
六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
【００４２】
五炭糖と六炭糖を含む発酵原料に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法自体は周知であり、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１−５０６９３４号公報、特開２００５−２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３−２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１−９５５９７号公報）、バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
【００４３】
混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率は特に制限はないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９〜９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
【００４４】
本発明に使用する発酵原料に含まれる総糖濃度は特に制限されず、生産効率の観点から、微生物による２，３−ＢＤＯの生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。具体的には、培地である発酵原料中の総糖濃度は、１５〜５００ｇ／ｌが好ましく、２０〜３００ｇ／ｌがより好ましい。総糖濃度が１５ｇ／ｌ以下であると、五炭糖からの収率向上の効果が低下してしまうことがある。また、総糖濃度が低いと２，３−ＢＤＯの生産効率も低下してしまう。
【００４５】
本発明に使用する発酵原料に含まれる六炭糖濃度は、上記の総糖濃度、五炭糖と六炭糖の割合の範囲において特に限定されないが、本発明の２，３−ＢＤＯの製造方法を用いれば、六炭糖を濃度５ｇ／Ｌ以上含む混合糖液においても良好な収率を得ることができる。
【００４６】
発酵原料には、前記糖の他、２，３−ブタンジオール発酵微生物の発酵に好ましく作用するような炭素源、窒素源、無機塩類、並びに必要に応じてアミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有させてもよい。また、発酵を効率よく行うことを目的に適宜消泡剤を含有させてもよい。
【００４７】
窒素源の具体例としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、アミノ酸、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩等を適宜添加使用することができる。五炭糖の発酵により２，３−ブタンジオールを製造するためには、これらのうち、コーンスティープリカー、硫酸アンモニウムやリン酸一水素アンモニウムのようなアンモニウム塩、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸一水素アンモニウムのようなリン酸塩、塩化カルシウムのようなカルシウム塩、硫酸第一鉄のような鉄塩、硫酸マンガンのようなマンガン塩、硫酸亜鉛のような亜鉛塩、硫酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、ＥＤＴＡ２ナトリウムのようなＥＤＴＡ又はその塩を含むことが好ましい。
【００４８】
その他、微生物の生育に応じてニコチン酸を培地に適宜添加使用してもよく、また、消泡剤を適宜添加使用してもよい。
【００４９】
培養温度は、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、温度が２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の範囲で行われる。
【００５０】
培養時の培地ｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８の範囲内に維持されるが、ｐＨ５〜７に調節して培養を行うことが好ましく、ｐＨ５以上６未満がより好ましい。
【００５１】
微生物の培養形態には特に制限はなく、バッチ培養、流加発酵、連続培養などで行うことができる。
【００５２】
本発明では通気条件下で微生物を培養することが好ましい。本発明における通気とは、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。通気方法としては特に制限はないが、例えば、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法のほかに、培養液上の空気層を、酸素を含む気体で置換する上面通気も含まれる。また、上面通気には培養槽に酸素を含む気体を吹き込む方法のほかに、大気開放された状態で培養液を攪拌することで培養液上に空気の流れを生じさせ、培養液中に酸素を供給する方法も含まれる。本発明では、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法によって通気することが好ましい。
【００５３】
微生物の培養における培地への酸素供給条件は、通気と攪拌とを組み合わせることで適宜設定でき、常圧で３０℃の水を対象とした場合の酸素移動容量係数ｋＬａ（ｈ−１）（以下、単にｋＬａと略す。）で表される。ｋＬａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）・・・式（１）。
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、ｋＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。上記式（１）より、下記式（２）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−ｋＬａ×ｔ・・・式（２）。
【００５４】
本発明でのｋＬａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりｋＬａを計算する方法である。
【００５５】
本発明での培養時に設定するｋＬａは特に制限されないが、好ましくは９ｈ−１以上である。ｋＬａの上限は、特に限定されないが、好ましくは２００ｈ−１以下である。
【００５６】
２，３−ブタンジオール発酵工程で得られる培養液には、２，３−ブタンジオールの他、発酵原料由来の不純物や発酵副産物であるエタノールなどが含まれるため、後段のプロセスおいて培養液に含まれる２，３−ブタンジオールを精製する必要がある。
【００５７】
精製工程
２，３−ブタンジオール培養液からの２，３−ブタンジオールの精製工程は特に制限はなく、当業者に公知の手法によって実施すればよいが、本発明では２，３−ブタンジオール培養液を蒸留する工程を含むことが好ましい。
【００５８】
２，３−ブタンジオール培養液の蒸留では、２，３−ブタンジオールは蒸気側から回収される。蒸留法は特に限定されないが、一般的に適応される単蒸留や精密蒸留、常圧蒸留や減圧蒸留のいずれでもよく、薄膜蒸留装置や棚段式蒸留装置、充填式蒸留装置などから選択することができる。また、回分式であっても連続式であっても本発明に適用できる。中でも好ましくは、減圧蒸留であり、沸点を下げることができるため、不純物の発生を抑制することができる。具体的には、加熱温度が６０℃以上１５０℃以下で行うのが好ましい。６０℃未満の場合は減圧度を著しく下げる必要があるため、工業レベルでは装置の維持が非常に困難となる。また、１５０℃より高くなる場合には、２，３−ブタンジオール溶液中に残存する微量の糖などが分解し、着色性物質の副生が起こるため好ましくない。そのため、上記加熱温度範囲で２，３−ブタンジオールが留出するよう、減圧度を調節するのがよい。
【００５９】
なお、２，３−ブタンジオール培養液をそのまま蒸留工程に供してもよいが、蒸留工程に先立ち、脱塩工程や濃縮工程に供することが好ましい。
【００６０】
脱塩工程の具体例としては、イオン交換処理が挙げられる。イオン交換処理は、イオン交換体を用いて２，３−ブタンジオール培養液中のイオン成分を除去する方法である。イオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換繊維、イオン交換紙、ゲルイオン交換体、液状イオン交換体、ゼオライト、炭質イオン交換体、モンモリロン石を用いることができるが、本発明ではイオン交換樹脂を用いた処理が好ましく採用される。
【００６１】
イオン交換樹脂にはその官能基の違いにより、強アニオン交換樹脂、弱アニオン交換樹脂、強カチオン交換樹脂、弱カチオン交換樹脂、キレート交換樹脂などがある。例えば、強アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ４１１、ＩＲＡ９１０ＣＴや三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＵＢＫ５１０Ｌ、ＵＢＫ５３０、ＵＢＫ５５０、ＵＢＫ５３５、ＵＢＫ５５５などから選定される。また、弱アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４７８ＲＦ、ＩＲＡ６７、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９８、ＸＥ５８３や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０などがある。一方、強カチオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２４、２００ＣＴ、２５２の他、三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＫ１０４、ＳＫ１Ｂ、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２１８，ＰＫ２２０、ＰＫ２２８などがあり、弱カチオン交換樹脂としては、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＦＰＣ３５００、ＩＲＣ７６や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＫ１０、ＷＫ１１、ＷＫ１００、ＷＫ４０Ｌなどから選定することができる。
【００６２】
本発明では、イオン交換樹脂としてアニオン交換樹脂およびカチオン交換樹脂を併用することが好ましく、中でも、多様なイオンを除去することができる強アニオン樹脂および強カチオン樹脂を用いる方がよい。また、アニオン交換樹脂は水酸化ナトリウムなどの希アルカリ性水溶液により再生し、ＯＨ型として用いることが好ましく、カチオン交換樹脂の場合は、塩酸などの希酸性水溶液により再生し、Ｈ型として用いることが好ましい。イオン交換樹脂による脱塩方法はバッチ法でもカラム法でもよく、効率的に脱塩出来る方法であれば特に制限はない。しかしながら、製造プロセスにおいては、繰り返し利用が容易なカラム法が好ましく採用される。通液速度は通常、ＳＶ（空間速度）で制御され、ＳＶ＝２〜５０が好ましく、より高度に精製できるＳＶ＝２〜１０で通液することが好ましい。樹脂はゲル型でもポーラス型、ハイポーラス型、ＭＲ型などの種類が市販されており、これらイオン交換樹脂の形状はいずれでもよく、溶液の品質に合わせて最適な形状を選択すればよい。
【００６３】
また、ナノ濾過膜処理も脱塩工程の具体例として挙げられる。２，３−ブタンジオール培養液のナノ濾過膜処理は、例えば特開２０１０−１５０２４８号公報にも開示されているように、２，３−ブタンジオール培養液をナノ濾過膜に通じて濾過することによって透過液側に２，３−ブタンジオール、非透過液側に無機塩、糖類および着色成分を効率的に分離することができる。
【００６４】
ナノ濾過膜の素材としては、ピペラジンポリアミドやポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコール、ポリイミド、ポリエステルなどのポリマー系素材のほか、セラミックスなどの無機材料が用いられている。また、ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントの他、平膜や中空糸膜として使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜は、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。
【００６５】
本発明で用いられるナノ濾過膜エレメントの好ましい具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜の“ＧＥｓｅｐａ”、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、中でも好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００６６】
ナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、２，３−ブタンジオール発酵液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００６７】
ナノ濾過膜に通じて濾過する２，３−ブタンジオール溶液の２，３−ブタンジオールの濃度は特に限定されないが、高濃度であれば透過液中に含まれる２，３−ブタンジオール濃度も高いため、濃縮する際のエネルギー削減ができ、コスト削減にも好適である。
【００６８】
脱塩工程においては、イオン交換処理またはナノ濾過膜処理のいずれかであってもよく、それらを併用してもよいが、少なくともイオン交換処理をすることが好ましい。また、イオン交換処理とナノ濾過膜処理を併用する場合の順序は特に制限はないが、２，３−ブタンジオール培養液をナノ濾過膜処理して透過液側から得られる無機塩が低減した２，３−ブタンジオール培養液をイオン交換処理することが好ましい。これにより、ナノ濾過膜を一部通過する無機塩や有機酸をイオン交換樹脂で除去することで、無機塩類の除去率を上げることができる。
【００６９】
２，３−ブタンジオール培養液の濃縮方法としては当業者が公知の一般的な方法でよく、例えば、逆浸透膜を用いる方法や、エバポレーターによる加熱濃縮などが挙げられるが、逆浸透膜を用いる方法が好ましく適用される。
【００７０】
逆浸透膜を用いる方法は、２，３−ブタンジオール溶液を逆浸透膜に通じて濾過することで透過液側に水を透過させ、２，３−ブタンジオールを膜の非透過液側に保持することで濃縮する方法である。本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
【００７１】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製“ＧＥＳｅｐａ”、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０などが挙げられる。
【００７２】
逆浸透膜による濃縮は、圧力をかけて行うが、その濾過圧は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、２，３−ブタンジオール溶液を効率的に濃縮することができる。膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことから最も好ましくは、２ＭＰａ以上６ＭＰａ以下の範囲である。低濃度の２，３−ブタンジオール溶液においては、逆浸透膜を用いる方法が低コストであるため好ましい。
【００７３】
その他、上記工程に先立ち、２，３−ブタンジオール培養液に含まれる菌体を分離する工程を含むことが好ましい。菌体の分離工程としては、例えば遠心分離、ろ過分離などの方法を用いることができる。これらの方法はどちらか一方のみでもよいし、組み合わせてもよい。
【００７４】
本発明によって製造される２，３−ブタンジオールは高純度であることを特徴とする。２，３−ブタンジオールに含まれる不純物を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による純度測定や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたＵＶ検出による純度測定などを併用して評価することができ、これらは全検出ピーク面積中の２，３−ブタンジオール面積の比率で評価するため、比率が高いほど２，３−ブタンジオールが高純度であることを意味する。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
特許文献１及び特許文献２に記載された形質転換株細胞内での４種の酵素遺伝子の発現を確認した。なお、この形質転換株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき２００４年６月３０日から寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４８である。この形質転換株は、特許文献２が米国特許第7,569,379号となっているため、既に分譲可能となっている。
【００７７】
参考例１    ｋＬａ測定
培養装置（エイブル株式会社製、ジャー容量１．５Ｌ）に溶存酸素電極（エイブル株式会社製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりｋＬａを求めた。まず、培養槽に水１Ｌを投入し、水温を３０℃に調整しながら一定の速度で攪拌して窒素ガスを十分に水中に吹き込み、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行った。そののち通気ガスを窒素ガスから所定の通気速度の空気あるいは窒素ガスに切り替えてからの溶存酸素濃度の経時変化を測定してｋＬａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するｋＬａを表１に示す。
【００７８】
【表１】
2016077262.tif 000002
【００７９】
実施例１〜５：ｋＬａ
＜２，３−ブタンジオール発酵＞
キシロース資化を付与したザイモバクター属微生物としては、特許文献１及び２に開示されているＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］を用いた。Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入された広宿主域組換えプラスミドベクターでＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅを形質転換することにより作出された公知の形質転換体であり、上記の通り、ブダペスト条約に基づきＦＥＲＭ  ＢＰ−１００４８の受託番号で寄託されており、分譲可能となっているものである。Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＸ培地（４０ｇ／Ｌ  Ｘｙｌｏｓｅ，  １０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  １０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、  ２ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、  ０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、  ｐＨ６．０）を５ｍＬ入れた試験管にて３０℃で２４時間静置培養を行った。その培養液を、ＴＸ培地を５０ｍＬ入れた三角フラスコに全量添加したのち、３０℃で２４時間静置培養を行った。その培養液を表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに全量添加し、ｐＨ５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら温度３０℃で表１に記載の通気・攪拌条件にて培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を測定した。
【００８０】
【表２】
2016077262.tif 000003
【００８１】
以下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）によるそれぞれの濃度測定条件を示す。発酵後の２，３−ブタンジオール濃度、糖濃度、発酵収率は以下の測定方法によって求めた。
【００８２】
２，３−ブタンジオール濃度測定
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
カラム温度：６５℃
移動相：０．０５Ｍ  硫酸水溶液、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
【００８３】
糖濃度測定
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ５０  ４Ｅ（昭和電工株式会社製）
カラム温度：３０℃
移動相：水：アセトニトリル＝１：３、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
【００８４】
発酵収率
上述のＨＰＬＣ分析により測定した２，３−ブタンジオール濃度および糖濃度より、下式を用いて算出した。
発酵収率（％）＝１００×｛（培養液中２，３−ブタンジオール濃度）−（培地中２，３−ブタンジオール濃度）｝／｛（培地中糖濃度）−（培養液中糖濃度）｝。
【００８５】
培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表３に示す。得られた２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。
【００８６】
＜２，３−ブタンジオール培養液のイオン交換精製＞
上述の発酵試験により得られた培養液について、イオン交換処理による残留イオンの除去を行った。強アニオン交換樹脂ＩＲＡ１２０Ｊ（株式会社オルガノ製）および強カチオン交換樹脂ＩＲ４１０（株式会社オルガノ製）を用い、それぞれ１Ｎ水酸化ナトリウムおよび１Ｎ塩酸によってＯＨ型およびＨ型に再生して使用した。樹脂量は各種無機塩と有機酸との総量とイオン交換樹脂の交換容量が等量になるように算出した。前述のイオン交換樹脂をカラムに充填し、アニオン交換、カチオン交換の順に通液速度ＳＶ＝５で通液した。
【００８７】
＜２，３−ブタンジオールの蒸留精製＞
イオン交換処理した２，３−ブタンジオール溶液は、薄膜濃縮装置  ＭＦ−１０（東京理化器械株式会社製）によって水を除去した。この時、減圧度は３０ｈＰａ、加熱温度は６０℃で水を蒸発させた。濃縮した２，３−ブタンジオール溶液を減圧蒸留（５ｍｍＨｇ）し、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールの
ＧＣ純度、蒸留収率は以下の測定方法によって求めた。
【００８８】
ＧＣ純度
蒸留後の２，３−ブタンジオールをガスクロマトグラフィー（ＧＣ、株式会社島津製作所製）を用いて分析し、全検出ピーク面積中の２，３−ブタンジオールピーク面積の比率から、下式によって算出した。
ＧＣ純度（％）＝１００×（２，３−ブタンジオールピーク面積）／（全検出ピーク面積）。
ガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
カラム：ＲＴ−ＢＤＥＸＭ（０．２５ｍｍ×３０ｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社製）
カラム温度：７５℃
気化室、検出器温度：２３０℃
キャリアガス：Ｈｅ
線速度：３５ｃｍ／ｓｅｃ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）。
【００８９】
蒸留収率
ＨＰＬＣ分析で測定した２，３−ブタンジオール濃度と仕込み液量から算出した蒸留前の２，３−ブタンジオール仕込み量と、蒸留後の留出液量と上述のＧＣ純度から算出した２，３−ブタンジオール回収量から、下式により計算した。
蒸留収率（％）＝１００×｛（蒸留後の留出液量）×（ＧＣ純度）｝／｛（蒸留前２，３−ブタンジオール濃度）×（蒸留前の仕込み液量）｝。
【００９０】
２，３−ブタンジオール総収率
発酵工程の結果より算出した発酵収率および精製工程の結果より算出した蒸留収率から、下式により計算した。結果を表３に示す。
２，３−ブタンジオール総収率（ｇ／ｇ糖）＝（発酵収率）／１００×（蒸留収率）／１００。
【００９１】
【表３】
2016077262.tif 000004
【００９２】
実施例６〜９：ｐＨ
Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］を、実施例１〜５記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液を表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨがそれぞれ４．５、４．８、６．１、６．５のいずれかとなるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜５記載の方法にて測定した。培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表４に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜５記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜５記載の方法によって求めた結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
2016077262.tif 000005
【００９４】
実施例１０〜１２：糖濃度
Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］を、実施例１〜５記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液をキシロース濃度がそれぞれ５．０、１５、１００ｇ／Ｌのいずれかとなるように調整した表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜５記載の方法にて測定した。培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表５に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜５記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜５記載の方法によって求めた結果を表５に示す。
【００９５】
【表５】
2016077262.tif 000006
【００９６】
実施例１３〜１５：五炭糖比率
Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１−ｘｔ］を、実施例１〜５記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液をキシロースおよびグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）がそれぞれ（４０：２０）、（２０：４０）、（２．５：４０）のいずれかとなるように調整した表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、糖濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜５記載の方法にて測定した。培養液中の糖濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよび糖濃度、発酵収率を表６に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜５記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜５記載の方法によって求めた結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
2016077262.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の方法により得られる２，３−ブタンジオールは（２，３−ＢＤＯ）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として有用な化合物である。