(57)【要約】【課題】油脂エマルション中の油脂の酸化による劣化を簡便かつ迅速に評価する。【解決手段】ルミノール化学発光法を用いて、油脂及び水を含有する油脂エマルション中の油脂の酸化を評価する油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。化学発光性物質であるルミノールと、油脂の酸化により生成する活性酸素種あるいは脂質過酸化物との反応から得られる化学発光の強度を測定することにより、油脂エマルションの自動酸化による劣化を簡便かつ迅速に評価することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルミノール化学発光法を用いて、油脂及び水を含有する油脂エマルション中の油脂の酸化を評価することを特徴とする、油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
【請求項２】
油脂エマルションが水中油型エマルションである、請求項１に記載の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
【請求項３】
油脂エマルションが食品に用いられる、請求項１または２に記載の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は油脂エマルションの評価方法に関し、詳しくは油脂エマルションに含まれる油脂の酸化による劣化を、ルミノール化学発光法を利用して簡便かつ迅速に評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂は、構成される不飽和脂肪酸の自動酸化により活性酸素種（Reactive  oxygen  species，ＲＯＳ）あるいは脂質過酸化物を生成し、劣化する。食用油脂の主成分であるトリグリセリドは、グリセリンと脂肪酸により構成されており、グリセリン部分はいずれの油脂でも共通の構造をとるが、脂肪酸部分は油脂によって様々である。
【０００３】
脂肪酸は、二重結合を持たない飽和脂肪酸と二重結合を１つ以上持つ不飽和脂肪酸に分類され、後者は油脂の酸化反応に関与している。油脂は構成される不飽和脂肪酸の自動酸化により、ペルオキシラジカル、アルコキシラジカル及びヒドロペルオキシド等の脂質過酸化物を生じるだけでなく、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、過酸化水素及びヒドロキシラジカルなどの活性酸素種（Reactive  oxygen  species，ＲＯＳ）を生成し劣化する。食品中の油脂の酸化は、食品の品質や風味、栄養価の低下をもたらし、生成した過酸化物の毒性は健康障害などの深刻な影響をもたらすことが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
従来、油脂の酸化感受性については、バルク油について広く研究が行われてきたが、油脂が水中に乳化したエマルション系においてはいまだ不明な点が多い。
【０００５】
一方で、油脂を含む食品にあっては、多くの場合、油脂はエマルションを形成している。中でも、油滴が水に乳化したものは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションとして知られ、食品の例として牛乳、コーヒークリーム、スープ、その他の各種飲料などがある。エマルションは、（１）油相に加えて水相を有する、（２）油水界面を有し、これが油相と水相それぞれに分配する成分の相互作用に影響する、という特徴を持つため、その酸化メカニズムは油脂のみで構成されるバルク油とは異なると考えられている（非特許文献２）。
【０００６】
このようなことから、エマルション系における油脂の酸化劣化をモニターすることは、食品の加工や製造、貯蔵条件等を設定、設計する上で極めて重要であり、食の安心・安全にかかわる社会的ニーズも高い。
しかしながら、これまでエマルション中の油脂の酸化を評価する有効な方法は報告されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kiokias  S.,Dimakou  C.,Tsaprouni  I.,Oreopoulou  V.:Effect  of  compositional  factors  against  the  tharmal  oxidative  deterioration  of  novel  food  emulsions.Food  Biophysics,1,115-123(2006)
【非特許文献２】Waraho  T.,  McClements  J.,Decker  E.:Mechanisms  of  lipid  oxidation  in  food  dispersions.  Trends  in  Food  Science&Technology,22,3-13(2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、油脂エマルション中の油脂の酸化による劣化を簡便かつ迅速に評価する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らの検討の結果、化学発光性物質であるルミノールとＲＯＳあるいは脂質過酸化物との反応から得られる化学発光（Chemiluminescence：ＣＬ）強度を測定することにより、油脂エマルション中の油脂の自動酸化による劣化を簡便かつ迅速に評価できることが分かり本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１１】
［１］ルミノール化学発光法を用いて、油脂及び水を含有する油脂エマルション中の油脂の酸化を評価することを特徴とする、油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
［２］油脂エマルションが水中油型エマルションである、［１］に記載の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
［３］油脂エマルションが食品に用いられる、［１］または［２］に記載の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、サンプル量が少なくても油脂エマルション中の油脂の酸化を高感度に検出して評価することができる。また、他の測定法のように油脂エマルションから油分を抽出分離する必要がなく、油脂エマルションをそのままサンプルとすることができ、簡便に実施することができる上に、長時間の反応等の必要もなく迅速に油脂エマルション中の油脂の酸化を評価して、食品等の製造、貯蔵、流通工程における条件管理等に反映させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における５種の油脂エマルションの自動酸化時のＣＬ強度の経時推移を示すグラフである。
【図２】実施例２における鉄添加の有無でのＣＬ強度の経時推移を比較したグラフである。
【図３】対比例１におけるＣＬ法で測定したＣＬ強度の経時推移と、ＰＶ法で測定したＣＨＰ濃度の経時推移とを比較したグラフである。
【図４】対比例２におけるＣＬ法で測定したＣＬ強度の経時推移と、ＴＢＡ法で測定したＴＢＡＲＳ濃度の経時推移とを比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。
【００１５】
本発明の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法は、ルミノール化学発光法を用いて、油脂及び水を含有する油脂エマルション中の油脂の酸化を評価することを特徴とする。
【００１６】
まず、対象とする油脂エマルションについて説明する。
【００１７】
１．油脂エマルション
本発明において、評価対象となる油脂エマルションとは、連続相である水（水相）に分散相である油脂（油相）が液滴となって分散した水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションであることが、ルミノール化学発光法により発光強度を測定する場合に水系溶媒へエマルションを分散させるという観点から好ましい。ここで、水相と油相の境界は界面と呼ばれる。油脂が固体脂を含有する場合は分散相が固体となる場合がある。
【００１８】
油脂エマルションは通常、水と油脂、さらには必要に応じて乳化剤、その他の成分を混合して製造される。
【００１９】
［油脂］
油脂としては、液状の高級脂肪族炭化水素類、動植物性油脂類、高級アルコール、高級脂肪酸、合成エステル油、グリコール高級脂肪酸エステル、シリコン油などが挙げられる。例えば、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−デカン、ｎ−ヘキサデカン、流動パラフィン、スクワラン、ひまし油、ホホバ油、オクチルドデカノール、オクチルドデシルミリカテート、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、カプリン酸シリグリセリド、オレインアルコール、オレイン酸などが挙げられる。
【００２０】
食品用に使用する場合、特に、ナタネ油、コメ油、大豆油、コーン油、サフラワー油、ヒマワリ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、リンシード油などの植物油、乳脂、牛脂、豚脂、鶏脂、魚油などの動物油、それらの水素添加油、それらの１種以上の混合物によるエステル交換油などの食用油脂を使用するのが好ましい。
これらの油脂は、混合物としても使用することもできる。
油脂の融点は４０℃以下、例えば−１０〜３０℃であることが、安定な油脂エマルションを形成し得る点において好ましい。
【００２１】
［乳化剤］
乳化剤としては、次のようなものが挙げられる。
デカグリセリンミリスチン酸エステル、デカグリセリンパルミチン酸エステル、デカグリセリンステアリン酸エステル、デカグリセリンオレイン酸エステルなどのグリセリンの重合度が４以上、好ましくは４〜１２のポリグリセリン脂肪酸エステル；
グリセリンモノミリステート、グリセリンモノパルミテート、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレエートなどのグリセリンモノ脂肪酸エステル；
ジグリセリンミリスチン酸エステル、ジグリセリンパルミチン酸エステル、ジグリセリンステアリン酸エステル、ジグリセリンオレイン酸エステルなどのジグリセリン脂肪酸エステル；
トリグリセリンミリスチン酸エステル、トリグリセリンパルミチン酸エステル、トリグリセリンステアリン酸エステル、トリグリセリンオレイン酸エステルなどのトリグリセリン脂肪酸エステル；
炭素数１２〜２２の飽和若しくは不飽和脂肪酸のモノグリセリドとコハク酸、クエン酸又はジアセチル酒石酸とのエステルなどのモノグリセリド有機酸エステル；
テトラグリセリンリシノレイン酸エステルなどのポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル；
ソルビタンミリスチン酸エステル、ソルビタンパルミチン酸エステル、ソルビタンステアリン酸エステル、ソルビタンオレイン酸エステルなどのソルビタン脂肪酸エステル；
プロピレングリコールミリスチン酸エステル、プロピレングリコールパリミチン酸エステル、プロピレングリコールステアリン酸エステル、プロピレングリコールオレイン酸エステルなどのプロピレングリコール脂肪酸エステル；
ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル；
レシチンなどのリン脂質、レシチン部分加水分解物、リゾレシチンなどの水溶性リン脂質；糖脂質；サポニン；大豆蛋白、カゼインナトリウムなどの蛋白質やその変性物など。
【００２２】
乳化剤のＨＬＢは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションを形成させる観点から好ましくは５〜１８である。
【００２３】
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの乳化剤の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００２４】
［油脂エマルションにその他含まれていてもよいもの］
本発明において、評価対象となる油脂エマルションは、水と上記の油脂及び乳化剤以外に、更に以下の成分が含まれていてもよい。
【００２５】
＜油溶性物質（油脂以外）＞
油脂以外の油溶性物質としては、食品、飼料、化粧品、医薬品及び工業等の分野で利用される任意の油溶性物質が挙げられ、具体的には、脂肪酸、ワックス、炭化水素、テルペン、精油、脂溶性ビタミン、油溶性薬物、油溶性色素等が挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの油溶性物質の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００２６】
＜甘味料＞
甘味料としては、以下のものが挙げられる。
糖：ぶどう糖、果糖、木糖、ソルボース、ガラクトース、異性化糖などの単糖類、蔗糖、麦芽糖、乳糖、異性化乳糖、パラチノースなどの二糖類、フラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、カップリングシュガー、パラチノースなどのオリゴ糖類
糖アルコール：エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マンニトール等の単糖アルコール類、マルチトール、イソマルチトール、ラクチトール等の２糖アルコール類、マルトトリイトール、イソマルトトリイトール、パニトール等の３糖アルコール類、オリゴ糖アルコール等の４糖以上アルコール類、粉末還元麦芽糖水飴など
高甘味度甘味料：アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、ステビアなど
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの甘味料の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００２７】
＜安定剤＞
安定剤としては、ガラクトマンナン、キサンタンガム、カラギーナン、アラビアガム、タマリンドガム、ジェランガム、グルコマンナン、セルロースなどが挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの安定剤の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００２８】
＜乳成分＞
乳成分としては、牛乳、加工乳、脱脂乳、生クリーム、ホエー、バターミルク、加糖練乳、無糖練乳などの液状物、全脂粉乳、脱脂粉乳、調製粉乳、粉末クリーム、粉末ホエーなどの粉末乳製品が挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの乳成分の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００２９】
＜タンパク質＞
タンパク質には、動物性タンパク質と植物性タンパク質とがあり、動物性タンパク質としては、卵由来の卵黄、卵白、全卵、及びこれらより分離されたオボアルブミン、コンアルブミン、オボムコイド、オボグロブリンなどや牛乳由来の乳清タンパク、カゼイン類、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、血清アルブミン、免疫グロブリンなどを挙げることができる。植物性タンパク質としては、大豆由来の脱脂大豆粉、濃縮大豆タンパク、分離大豆タンパク、抽出大豆タンパクなどや、これらから分離された７Ｓグロブリン、１１Ｓグロブリンなどを挙げることができる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらのタンパク質の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００３０】
＜着香料＞
着香料としては、任意のものを用いることができる。例えば、バニラエッセンス、ミルクフレーバー、バターフレーバー等が挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの着香料の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００３１】
＜塩類＞
塩類としては、例えば、食塩、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩、重炭酸ナトリウム等の重炭酸塩、リン酸２ナトリウム、リン酸３ナトリウム、リン酸２カリウム、リン酸３カリウム等のリン酸塩、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等のクエン酸塩、乳酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの塩類の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００３２】
＜有機酸＞
有機酸としては、例えば、フマル酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、ジアセチル酒石酸、リンゴ酸、アジピン酸、グルタル酸、マレイン酸などが挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの有機酸の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００３３】
＜澱粉＞
澱粉としては、例えば、コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、ハイアミロースコーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、さご澱粉、馬鈴薯澱粉、葛澱粉、甘藷澱粉等の天然澱粉、エステル化澱粉、エーテル化澱粉、架橋澱粉、過ヨウ素酸酸化澱粉、ヒドロキシプロピル化澱粉等の化工澱粉、粒状化澱粉、アルファ化澱粉、湿熱処理澱粉などの加工澱粉などが挙げられる。
本発明において、評価対象となる油脂エマルションには、これらの澱粉の１種のみが含まれていてもよく、２種以上が含まれていてもよい。
【００３４】
＜その他＞
本発明において、評価対象となる油脂エマルションは、更に、低分子ゼラチン、ＶＣパルミテート、ビタミン、抗酸化剤などの他の成分の１種又は２種以上を含有していてもよい。
【００３５】
［油脂エマルションの調製方法］
本発明において、評価対象となる油脂エマルションは、通常、以下の方法で製造される。
【００３６】
まず、水に分散しやすい乳化剤を水に溶解させて、水相を調製する。乳化剤が粉末の場合は冷水に攪拌分散し、そのまま６０〜７０℃まで加熱して粉末が完全になくなるまで攪拌する。水相中の乳化剤の含有量は、通常０．１〜２．０重量％である。
また、油に分散しやすい乳化剤を６０〜７０℃で油脂に分散し、油相を調製する。乳化剤の油相中の含有量は通常０．１〜２．０重量％である。
【００３７】
次いで、調製した油相と水相を６０〜７０℃にて混合し、プロペラミキサーなどの低速攪拌機を用いて低せん断力の機械力で予備乳化を行った後に、ホモミキサー、ディスパーミキサー、ウルトラミキサーなどの高速高せん断ミキサーや高圧ホモジナイザー、コロイドミル、超音波照射器などを用いて高せん断力の機械力で本乳化を行い、その後冷却する。粒子径が揃った油脂エマルションを得たい場合は膜乳化やマイクロチャネル乳化を用いることができる。
【００３８】
なお、せん断力を有する乳化装置が無い場合は、転相乳化法やＰＩＴ（ＨＬＢ温度）乳化法、Ｄ相乳化法、液晶乳化法など特定の相状態を利用し、油水の界面張力をゼロに近づけることにより弱い攪拌で乳化する界面化学的乳化方法により油脂エマルションを調製することも可能である。
【００３９】
油脂エマルションはまた、後掲の実施例の項に記載されるように、０〜１０℃に保持した水中に、攪拌下、乳化剤と油脂を順次滴下して上記のように予備乳化、本乳化を行って調製することもできる。この場合、乳化剤は最終エマルションに対して０．００１〜５．０重量％程度用いることが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１．０重量％程度を用いることができる。
【００４０】
油相と水相の比率は、重量比で通常１／１０００〜４／１であり、水中油型エマルション又は油中水型エマルションとなるが、本発明では、前述の通り、水に分散しやすいエマルションをルミノール化学発光法による発光強度の測定に利用するため、水中油型エマルションが好ましい。水中油型エマルションの好ましい油相と水相の比率は、通常、重量比で１／１０００〜１／１であり、１／１０００〜１／４であることが好ましい。
【００４１】
このようにして調製した油脂エマルションは、更に、必要に応じてレトルト殺菌やＵＨＴ殺菌などの加熱による殺菌が施される。
【００４２】
２．ルミノール化学発光法
ルミノールは、ｐＨ７〜１１程度のアルカリ条件下で、油脂を構成する不飽和脂肪酸の酸化で生成するＲＯＳ及び脂質過酸化物と化学反応し、酸化生成物である励起フタル酸ジアニオンを生じる。生成した励起分子は基底状態へと戻る際に発光する。このため、この発光強度を測定することにより、反応により生成した励起フタル酸ジアニオン量を求めることができる。即ち、励起フタル酸ジアニオンの生成のために反応したＲＯＳ及び脂質過酸化物の量を求めることができ、このＲＯＳ及び脂質過酸化物の量から油脂の酸化の程度を評価することができる。
【００４３】
通常、この反応には触媒が使用される。触媒としては、フェリシアン化カリウム（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］）、次亜塩素酸塩（ＣｌＯ−）、重金属、ヘムタンパク質、酵素（ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カタラーゼなど）などを用いることができる。
以下にフェリシアン化カリウムを触媒に用いたルミノール化学発光の反応式を示す。
【００４４】
【化１】
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【００４５】
化学発光強度（ＣＬ強度）の測定はルミノメータを用いたバッチ法により、例えば以下の方法で実施される。
キュベットにルミノール試薬を含有する緩衝溶液、メタノール及び非イオン性界面活性剤から成る混合液と、油脂エマルションとをそれぞれ同量ずつ加え、５秒間振盪攪拌する。続いてキュベットを測定チャンバーにセット後、オートインジェクターを用いて、触媒を含有する緩衝溶液、メタノール及び非イオン性界面活性剤から成る混合液を注入し、発光測定装置（ルミフォトメータ）を用いて注入直後から所定時間、例えば５〜１２０秒の積算発光量を室温にて測定する。
【００４６】
ここで、非イオン性界面活性剤は、発光強度の増強・維持剤および油脂の溶解補助剤として機能するものであり、最終反応液に対して０．０１〜１％程度の範囲で用いられる。なお、非イオン性界面活性剤の他、両性界面活性剤を用いることもできる。メタノール等の低級アルコールは、溶液安定化のために、最終反応液に対して１〜１０％程度の範囲で用いられる。ルミノールは、油脂エマルション中の油脂に対して１０〜１００μＭ程度の範囲で用いることが好ましい。また、触媒は、油脂エマルション中の油脂に対して１０〜１００μＭ程度の範囲で用いることが好ましい。
【００４７】
緩衝溶液としては、ｐＨ７〜１１、好ましくはｐＨ８〜１０に調整できるようなものであればよく、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液などが好ましいものとして挙げられる。
【００４８】
化学発光強度（ＣＬ強度）の測定はルミノメータを用いたバッチ法以外にもフローインジェクション分析−化学発光検出法を用いることが可能であり、この場合はキャリヤー溶液としてルミノール試薬を含有する緩衝溶液、メタノール及び非イオン性界面活性剤から成る混合液を用い、発光試薬として触媒を含有する緩衝溶液、メタノール及び非イオン性界面活性剤から成る混合液を用いる。
【００４９】
油脂の酸化を促進して化学発光強度が増強するまでの立ち上がりの時間を短縮させるために酸化促進剤を用いることができる。酸化促進剤としては、過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、次亜塩素酸イオン、一重項酸素などの活性酸素種、ＲＯＳを発生する次亜塩素酸、ナフタレンエンドペルオキシド、フェントン反応に関与する鉄や銅イオン、一重項酸素発生に関与するポルフィリン、不飽和脂肪酸、紫外線などが挙げられる。
【００５０】
３．用途
本発明によれば、油脂エマルション中の油脂の酸化の程度として、例えば、ＣＬ強度の経時推移の状況から油脂エマルション中の油脂の酸化の進行速度を評価することができる。また、ＣＬ強度から油脂エマルション中の油脂の酸化レベル（酸化により生成したＲＯＳや脂質過酸化物の量や油脂に対する割合）を評価することができる。
【００５１】
従って、本発明の油脂エマルション中の油脂の酸化評価方法を使用することで、油脂エマルションを含有する食品の酸化の程度を評価することができる。なかでも、本発明は、水中油型エマルションを含有する飲料、コーヒークリームやホイップクリーム、アイスクリームなどのクリーム類、ドレッシングやマヨネーズなどの食品に適用可能であり、これらの食品を製造し、貯蔵ないし流通工程において、所定の温度で保管する場合の経時的な酸化の進行度合や、包材種の差異による油脂の酸化状態の差異を評価することで、食品の品質管理を的確に、迅速かつ効率的に実施することができる。
【実施例】
【００５２】
以下に、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。
以下において「％」は特記しない限り「重量％」を示す。
【００５３】
以下の実施例及び比較例で測定試料として用いた油脂エマルションは、基本的には下記（１）の方法で調製し、下記（３）の方法で自動酸化処理して測定試料とした。また、ルミノール化学発光法（ＣＬ法）によるＣＬ強度の測定は、下記（３）の方法で行った。
【００５４】
（１）油脂エマルションの調製
氷浴中のステンレス製ビーカーに蒸留水３９．９ｍＬを加え、Ｑ５５微量超音波ホモジナイザー（出力５５Ｗ，ワケンビーテック株式会社）で超音波処理を行いながら、乳化剤（０．０２％ｗ／ｖ）８ｍｇ、油脂（０．２％ｗ／ｖ）８０ｍｇを順に滴下し、さらに１０分間超音波処理を行ってＯ／Ｗエマルションを得た。
乳化剤としてはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）（ＨＬＢ１７）を用いた。
【００５５】
（２）油脂エマルションの自動酸化処理
上記（１）で得られた油脂エマルションを、３０ｍＬずつバイアル瓶に移し、６０℃の恒温振盪水槽（Ｔｈｏｍａｓｔａｔ  Ｔ−２２Ｓ，トーマス科学器械社）中に保持して自動酸化処理し、所定の経過時間毎に採取して測定試料とした。
【００５６】
（３）ルミノール化学発光法（ＣＬ法）によるＣＬ強度の測定
キュベット（７０×１０ｍｍ，ｉ．ｄ．）に、測定試料、５％メタノール及び０．０２５％非イオン性界面活性剤を含有する２５μＭルミノール／ホウ酸緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ１０．０）を各１００μＬ加え、５秒間攪拌した。キュベットを測定チャンバーにセット後、オートインジェクターを用いて５％メタノール及び０．０２５％非イオン性界面活性剤を含有する７５μＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］／ホウ酸緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ１０．０）１００μＬを注入し、直後から１２０秒間の積算発光量を室温にて測定した。測定結果は３回の繰り返し測定の平均値±標準偏差で表した。
非イオン性界面活性剤としては、シグマアルドリッチジャパン社製特級「トリトンＸ−１００」を用いた。また、ＣＬ強度の測定には発光測定装置「Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ  ＡＢ−２２００」（Ａｔｔｏ社製）を用いた。  
【００５７】
［実施例１］
（Ａ）リンシード油、（Ｂ）コーン油、（Ｃ）ナタネ油、（Ｄ）Ｄ相型自己乳化油脂、（Ｅ）オイル型自己乳化油脂の、５種類の油脂を用いて調製した油脂エマルション中の油脂の酸化の評価を行った。
（Ａ）リンシード油、（Ｂ）コーン油、（Ｃ）ナタネ油の各油脂エマルションは、上記（１）の通り調製し、各油脂（０．２％ｗ／ｖ）と乳化剤（０．０２％ｗ／ｖ）を含む。また、（Ｄ）Ｄ相型自己乳化油脂は、ナタネ油（約４０％）と水相（水＋糖アルコール（ソルビトール）（約５５％）＋乳化剤（Ｔｗｅｅｎ２０）（約５％））を混合してＤｅｔｅｒｇｅｎｔ相に微細な油滴が分散した状態、（Ｅ）オイル型自己乳化油脂は、ナタネ油（約８５％）に乳化剤（Ｔｗｅｅｎ２０）（約１５％）を混合してＤｅｔｅｒｇｅｎｔ相に微細な油滴が分散した状態とした。
【００５８】
表１にリンシード油、コーン油、ナタネ油の一般的な脂肪酸組成を示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
５種の油脂エマルションの自動酸化時のＣＬ強度の経時推移を図１に示す。５種の油脂エマルションはそれぞれ異なる発光挙動を示したが、このうち多価不飽和脂肪酸であるリノール酸又はリノレン酸を多く含むリンシード油及びコーン油では、インキュベート開始初期から経時的にＣＬ強度の増加がみられた。このことから、油脂エマルション中の油脂の酸化劣化速度に、構成脂肪酸の不飽和度との関連がみられること、Ｄ相型自己乳化油脂及びオイル型自己乳化油脂の油脂エマルションについても、油脂のみの場合と同様に、その酸化劣化速度が脂肪酸の不飽和度に依存して速まる可能性があることがわかった。
【００６１】
［実施例２］
上記（１）の通り、油脂（リンシード油）（０．２％ｗ／ｖ）と乳化剤（Ｔｗｅｅｎ２０）（０．０２％ｗ／ｖ）を含む油脂エマルションの調製直後に、１２ｍＭ塩化鉄（ＦｅＣｌ２）水溶液を、Ｆｅ濃度１０μＭとなるよう油脂エマルションに添加して、インキュベートしたものを測定試料とした。ＣＬ強度の経時推移を図２に示す。図２には、塩化鉄を添加していないもののＣＬ強度の経時推移も併記した。
図２に示されるように、鉄を添加した油脂エマルションは、鉄を添加しないものと比較してＣＬ強度が増加するまでの立ち上がりの時間が短縮されることから、より短期間で油脂の劣化を評価するためには、鉄の添加が有効であることがわかった。
【００６２】
［対比例１］
上記（１）の通り調製した油脂（リンシード油）（０．２％ｗ／ｖ）と乳化剤（Ｔｗｅｅｎ２０）（０．０２％ｗ／ｖ）を含む油脂エマルションを測定試料として、本発明によるルミノール化学発光法（ＣＬ法）と過酸化物価（ＰＶ）法との測定結果の比較を行った。
過酸化物価（ＰＶ）法の測定は以下の通りに行った。
【００６３】
＜過酸化物価（ＰＶ）法による測定＞
測定試料３００μＬにイソオクタン／イソプロパノール（３：１，ｖ／ｖ）１５００μＬを加え３０秒間攪拌した後、２分間遠心分離機にかけた。上澄みの有機層２００μＬにメタノール／１−ブタノール（２：１，ｖ／ｖ）２８００μＬ、３．９４Ｍチオシアン酸アンモニウム溶液１５μＬ及び０．０７２ＭのＦｅ２＋溶液１５μＬを加えて攪拌後、２０分間インキュベートした後、波長５１０ｎｍの吸光度を測定した。尚、ＰＶ値は、得られた吸光度とクメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）の検量線を引いて、ＣＨＰ濃度（ｍＭ）として表した。
【００６４】
ＣＬ法で測定したＣＬ強度の推移と、ＰＶ法で測定したＣＨＰ濃度の推移とを比較した結果を図３に示す。ＣＬ強度とＣＨＰ濃度は反応初期において類似した挙動を示し、ＣＬ強度の増加が油脂エマルション中における酸化一次生成物の増加を反映していると考えられた。しかしながら、上記のとおり、ＰＶ法は測定試料を大量に使用する必要があった。
【００６５】
［対比例２］
上記（１）の通り調製した油脂（リンシード油）（０．２％ｗ／ｖ）と乳化剤（Ｔｗｅｅｎ２０）（０．０２％ｗ／ｖ）を含む油脂エマルションを測定試料として、本発明によるルミノール化学発光法（ＣＬ法）とチオバルビツール酸（ＴＢＡ）法との測定結果の比較を行った。
チオバルビツール酸（ＴＢＡ）法の測定は以下の通りに行った。
【００６６】
＜チオバルビツール酸（ＴＢＡ）法による測定＞
測定試料３００μＬに蒸留水７００μＬとＴＢＡ溶液（１５ｇトリクロロ酢酸、０．３７５ｇチオバルビツール酸、１．７６ｍＬの１２Ｍ塩酸、８２．９ｍＬ水）２０００μＬを加え１５秒間攪拌し、１５分間沸騰水浴中で加熱した後、１０分間室温で冷却した。その後１５分間遠心分離機にかけ、波長５３２ｎｍで吸光度を測定した。既知量の１，１，３，３−テトラエトキシプロパン（ＴＥＰ）から生成するチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）をリファレンス試料として検量線を作成し、ＴＢＡＲＳ濃度（μＭ）として表した。
【００６７】
ＣＬ法で測定したＣＬ強度の推移と、ＴＢＡ法で測定したＴＢＡＲＳ濃度の推移とを比較した結果を図４に示す。ＣＬ強度とＴＢＡＲＳ濃度は、反応初期はいずれも速やかに上昇したが、その後ＴＢＡＲＳ濃度が速やかに低下した一方で、ＣＬ強度は緩やかに低下した。ＣＬ強度とＴＢＡＲＳ濃度は、反応初期において類似した挙動を示し、ＣＬ強度の増加が油脂エマルション中の油脂酸化二次生成物の増加を反映していると考えられた。しかしながら、上記のとおり、ＴＢＡ法は測定試料を大量に使用する必要があった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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