(57)【要約】      （修正有）【課題】多糖を効率よく生産できる製造方法の提供。【解決手段】特定のリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法であって、前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる反応と、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するウリジン２リン酸にアデノシン３リン酸を作用させてウリジン３リン酸、アデノシン２リン酸及びアデノシン１リン酸を生成する反応とを並行して行い、反応溶液中のアデノシン１リン酸の濃度が前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間が前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間の１０％以上である多糖の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記一般式（１）〜（５）のいずれかで置換されたリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法であって、
前記単糖（ａ）が炭素数３〜７の単糖（ａ１）又は前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホオキシ基及びメトキシカルボニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）であり、
前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる反応と、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するウリジン２リン酸にアデノシン３リン酸を作用させてウリジン３リン酸、アデノシン２リン酸及びアデノシン１リン酸を生成する反応とを並行して行い、
反応溶液中のアデノシン１リン酸の濃度が下記で定義する前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間が前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間の１０％以上である多糖の製造方法。
多糖合成酵素（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）：前記（Ａ）、前記（Ｂ）及び異なる濃度のアデノシン１リン酸を含み、前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の濃度並びに温度及びｐＨが多糖を製造する際の条件と同じである溶液について測定した多糖の生成速度がアデノシン１リン酸を含まない溶液における多糖の生成速度の５０％となるアデノシン１リン酸の濃度。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【請求項２】
アデノシン１リン酸をアデニン、アデノシン、アデノシン２リン酸、アデノシン３リン酸及びポリアデニル酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｃ）に変換する反応を含む請求項１に記載の多糖の製造方法。
【請求項３】
アデノシン１リン酸を前記（Ｃ）に変換する反応に活性を有するアデノシン１リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下でアデノシン１リン酸を前記（Ｃ）に変換する反応を行う請求項２に記載の多糖の製造方法。
【請求項４】
アデノシン１リン酸の生成する速度（ｖ１）に対するアデノシン１リン酸を前記（Ｃ）へ変換する速度（ｖ２）の比率（ｖ２／ｖ１）が０．１以上である請求項３に記載の多糖の製造方法。
【請求項５】
前記（Ｄ）がアデノシン１リン酸をアデノシン２リン酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ−３）である請求項３又は４に記載の多糖の製造方法。
【請求項６】
前記多糖がヒアルロン酸である請求項１〜５のいずれか１項に記載の多糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖としては、アミロース及びセルロース等の植物由来の多糖、キサンタン等の微生物由来の多糖、並びにヒアルロン酸、ヘパリン及びコンドロイチン等の高等生物由来の多糖等が知られている。これらの多糖は、医薬品・食品から一般工業用途まで様々な用途において用いられている。
【０００３】
例えばヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚等の生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合で交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０５〜１０６Ｄａの高分子量のグルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌等の侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤等の医薬品として広範囲に使用される。
【０００４】
ヒアルロン酸の生産方法としては、（１）前記の生体組織から抽出する方法（例えば特許文献１及び特許文献２参照）、（２）グルコース等の糖の存在下で、ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を培養してヒアルロン酸を生産し、回収する微生物培養法（例えば特許文献３及び特許文献４参照）が多く知られている。
【０００５】
しかしながら、（１）の抽出方法により得られたヒアルロン酸には、コンドロイチンサルフェート及びグリコサミノグリカンサルフェート等の不純物が含まれており、これらを除去するには複雑な精製過程を要するという問題がある。
また、（２）の微生物培養法によるヒアルロン酸の生産では、ヒアルロン酸が生産されるのに伴って、培養溶液の粘度が上昇するため、通気攪拌が困難になり、ヒアルロン酸の生産が停止する。したがって、微生物培養法は、ヒアルロン酸の生産効率が非常に低い問題がある。
【０００６】
ヒアルロン酸以外の多糖についても同様に、生体細胞からの抽出では不純物が多く混入してしまう問題があり、微生物培養法では生産効率が低くなる問題というがある。
【０００７】
そこで、生体組織からの抽出や微生物培養によらない第３の多糖の生産方法として、多糖合成酵素を用いた方法（酵素合成法）が検討されている。例えば、ヒアルロン酸合成酵素を用いた方法が知られている（例えば非特許文献１参照）。しかしながら非特許文献１に記載の酵素合成法では、酵素が多量に必要であり、生産効率が低く生産量が少ないという問題があるため、研究レベルに留まっており、工業化の検討はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号明細書
【特許文献３】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献４】国際公開第８６／８６０４３５５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．１４，Ｐ８４５４−８４５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、多糖合成酵素を用いた多糖の製造方法であって、多糖を効率よく合成できる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記一般式（１）〜（５）のいずれかで置換されたリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法であって、
前記単糖（ａ）が炭素数３〜７の単糖（ａ１）又は前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホオキシ基及びメトキシカルボニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）であり、
前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる反応と、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するウリジン２リン酸にアデノシン３リン酸を作用させてウリジン３リン酸、アデノシン２リン酸及びアデノシン１リン酸を生成する反応とを並行して行い、
反応溶液中のアデノシン１リン酸の濃度が下記で定義する前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間が前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間の１０％以上である多糖の製造方法である。
多糖合成酵素（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）：前記（Ａ）、前記（Ｂ）及び異なる濃度のアデノシン１リン酸を含み、前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の濃度並びに温度及びｐＨが多糖を製造する際の条件と同じである溶液について測定した多糖の生成速度がアデノシン１リン酸を含まない溶液における多糖の生成速度の５０％となるアデノシン１リン酸の濃度。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【発明の効果】
【００１２】
本発明の多糖の製造方法は、生産効率が良く、単位酵素あたりの多糖の生産量が多いという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の製造方法はリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）に多糖合成酵素（Ｂ）を作用させて多糖を製造する方法である。
【００１４】
本発明の方法で製造される多糖は、単糖（ａ）が酵素反応によって３〜１０，０００，０００個結合した多糖であり、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キサンタン、セルロース、ヘパリン、アミロース及びデキストラン等が挙げられる。これらの他にも１種の前記（ａ）が結合した多糖、２種以上の前記（ａ）がランダム又は交互に結合した多糖が挙げられる。なかでも多糖の生産効率の観点からヒアルロン酸であることが好ましい。
【００１５】
本発明におけるリボヌクレオシド２リン酸−単糖（Ａ）は、単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が下記一般式（１）〜（５）で置換された糖ヌクレオチドである。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００１６】
前記（ａ）は炭素数３〜７の単糖（ａ１）又は前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホオキシ基及びメトキシカルボニル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）である。
【００１７】
前記（ａ）としてはトリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトースが挙げられる。
【００１８】
トリオースとしては、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロースとしては、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトースとしては、セドヘプツロース等が挙げられる。
【００１９】
前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／又はヒドロキシメチル基が前記の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）としては、１つ以上のヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ２−１）、１つ以上のヒドロキシル基（−ＯＨ）がアミノ基（−ＮＨ２）で置換された単糖（ａ２−２）、１つ以上のヒドロキシル基がＮ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ３）で置換された単糖（ａ２−３）、１つ以上のヒドロキシル基がスルホオキシ基（−ＯＳＯ３Ｈ）で置換された単糖（ａ２−４）、１つ以上のヒドロキシメチル基がメトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ３）で置換された単糖（ａ２−５）及び２つ以上のヒドロキシル基及び／又はヒドロキシメチル基が複数種類の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２−６）等が挙げられる。
【００２０】
前記（ａ２−１）としては、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−２）としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン及びムラミン酸等のアミノ糖等が挙げられる。
前記（ａ２−３）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルムラミン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−４）としては、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
前記（ａ２−５）としては、グルコースメチルエステル及び前記（ａ−６−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
前記（ａ２−６）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、ノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
【００２１】
置換基（Ｅ）がアニオン性基であるカルボキシル基及び／又はスルホオキシ基を有する場合、アニオン性基の水素原子がアルカリ金属（Ｎａ及びＫ等）及び／又はアルカリ土類金属（Ｃａ等）で置換されていてもいい。
【００２２】
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が上記一般式（１）で置換された前記（Ａ−１）としては、アデノシン２リン酸−グルコース、アデノシン２リン酸−ガラクトース及びアデノシン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が上記一般式（２）で置換された前記（Ａ−２）としては、グアノシン２リン酸−マンノース、グアノシン２リン酸−フコース等が挙げられる。
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が上記一般式（３）で置換された前記（Ａ−３）としては、ウリジン２リン酸−キシロース、ウリジン２リン酸−グルコース、ウリジン２リン酸−ガラクトース、ウリジン２リン酸−マンノース、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン及びウリジン２リン酸−イズロン酸等が挙げられる。
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が上記一般式（４）で置換された前記（Ａ−４）としては、シチジン２リン酸−グルコース、シチジン２リン酸−ガラクトース及びシチジン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
単糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が上記一般式（５）で置換された前記（Ａ−５）としては、５−メチルウリジン２リン酸−グルコース、５−メチルウリジン２リン酸−ガラクトース及び５−メチルウリジン２リン酸−マンノース等が挙げられる。
【００２３】
本発明の製造方法における前記（Ａ）は、１種を使用しても良く、２種以上を使用しても良い。
【００２４】
前記（Ａ）は、製造する多糖に応じて適宜選択することができるが、多糖の生産効率の観点から、前記（Ａ−３）が好ましく、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが更に好ましい。
【００２５】
多糖合成酵素（Ｂ）は、上記（Ａ）から多糖を合成する多糖合成活性を有する酵素である。
多糖合成酵素（Ｂ）としては、合成する多糖がヒアルロン酸であるヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）、合成する多糖がコンドロイチンであるコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）、合成する多糖がキサンタンであるキサンタン合成酵素（Ｂ−３）、合成する多糖がセルロースであるセルロース合成酵素（Ｂ−４）、合成する多糖がヘパリンであるヘパリン合成酵素（Ｂ−５）、合成する多糖がアミロースであるアミロース合成酵素（Ｂ−６）及び合成する多糖がデキストランであるデキストラン合成酵素（Ｂ−７）等が挙げられる。また、前記（Ｂ）として、（Ｂ−１）〜（Ｂ−７）以外の単糖から多糖を合成する活性を有する酵素を用いてもよい。
【００２６】
前記（Ｂ−１）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとからヒアルロン酸を合成するヒアルロン酸合成活性を有する酵素である。ヒアルロン酸合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位のβ１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。
前記（Ｂ−１）としては、従来のヒアルロン酸合成酵素等を使用でき、ヒアルロン酸合成活性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、非特許文献（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．５１，Ｐ３６７７７−３６７８１）に記載されているクラスＩ及びクラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素が挙げられる。クラスＩ及びクラスＩＩは、酵素のアミノ酸配列の相同性によって分類されたものである。クラスＩのヒアルロン酸合成酵素には、ストレプトコッカス・ピロジェネシスやストレプトコッカス・エクイシミリス及び藻類ウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等が含まれる。また、クラスＩＩのヒアルロン酸合成酵素には、パスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素等が含まれる。
【００２７】
前記（Ｂ−２）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸とリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンとからコンドロイチンを合成するコンドロイチン合成活性を有する酵素である。コンドロイチン合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルガラクトサミンに結合した二糖単位のβ１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。前記（Ｂ−２）としては、従来のコンドロイチン合成酵素を使用でき、コンドロイチン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、パスツレラ・ムルトシダ由来のコンドロイチン合成酵素等が挙げられる。
【００２８】
前記（Ｂ−３）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸からキサンタンを合成するキサンタン合成活性を有する酵素である。キサンタン合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸を糖供与体としてキサンタンを合成する活性である。前記（Ｂ−３）としては、従来のキサンタン合成酵素を使用でき、キサンタン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、キサンタン・カムペストリスから得られるキサンタン合成酵素等が挙げられる。
【００２９】
前記（Ｂ−４）は、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースをグリコシド結合により直鎖状に結合させたセルロースを合成するセルロース合成活性を有する酵素である。セルロース合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースを供与体としてβ１，４−結合を形成する能力をいう。前記（Ｂ−４）としては、従来のセルロース合成酵素を使用でき、セルロース合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、酢酸菌由来のセルロース合成酵素等が挙げられる。
【００３０】
前記（Ｂ−５）は、リボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸、リボクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンからヘパリンを合成するヘパリン合成活性を有する酵素である。ヘパリン合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−α−イズロン酸、リボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸を糖供与体としてヘパリンを合成する活性である。前記（Ｂ−５）としては、従来のヘパリン合成酵素を使用でき、ヘパリン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、パスツレラ・ムルトシダ由来のヘパリン合成酵素等が挙げられる。
【００３１】
前記（Ｂ−６）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルコースからアミロースを合成するアミロース合成活性を有する酵素である。アミロース合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルコースを糖供与体としてα１，４−結合を形成する能力をいう。前記（Ｂ−６）としては、従来のアミロース合成酵素を使用でき、アミロース合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、イネ由来のアミロース合成酵素等が挙げられる。
【００３２】
前記（Ｂ−７）は、リボヌクレオシド２リン酸−グルコースからデキストランを合成するデキストラン合成活性を有する酵素である。デキストラン合成活性とは、具体的には、リボヌクレオシド２リン酸−グルコースを糖供与体としてα１，６−結合を形成する活性のことをいう。前記（Ｂ−７）としては、従来のデキストラン合成酵素を使用でき、デキストラン合成活性を有するものであれば特に限定されない。具体的には、leuconostoc mesenteroides由来のデキストラン合成酵素等が挙げられる。
【００３３】
前記（Ｂ）は、製造する多糖に応じて適宜選択することができるが、多糖の生産効率の観点から、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）が好ましく、更に好ましくはパスツレラ・ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素である。
【００３４】
本発明の製造方法において、前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の組み合わせは、製造する多糖の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
ヒアルロン酸を製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−１）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ｂ−１）と前記（Ａ）としてのウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとの組み合わせである。
【００３６】
コンドロイチンを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−２）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ｂ−２）と前記（Ａ）としてのウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンとの組み合わせである。
【００３７】
キサンタンを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−３）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−β−グルコース、リボヌクレオシド２リン酸−マンノース及びリボヌクレオシド２リン酸−グルクロン酸との組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ｂ−３）と前記（Ａ）としてのウリジン２リン酸−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース及びウリジン２リン酸−グルクロン酸との組み合わせである。
【００３８】
セルロースを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−４）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−β−グルコースとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−β−グルコースを用いることである。
【００３９】
ヘパリンを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−５）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−イズロン酸、リボクレオシド２リン酸−グルクロン酸及びリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−イズロン酸又はウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いることである。
【００４０】
アミロースを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−６）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−グルコースとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルコースを用いることである。
【００４１】
デキストランを製造する場合は、単位酵素あたりの多糖の生産量の観点から、前記（Ｂ）としての前記（Ｂ−７）と前記（Ａ）としてのリボヌクレオシド２リン酸−グルコースとの組み合わせが好ましく、更に好ましくは前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルコースを用いることである。
【００４２】
本発明の製造方法では、前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる反応と、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するウリジン２リン酸（以下、ＵＤＰと略記する）にアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと略記する）を作用させてウリジン３リン酸（以下、ＵＴＰと略記する）、アデノシン２リン酸（以下、ＡＤＰと略記する）及びアデノシン１リン酸（以下、ＡＭＰと略記する）を生成する反応とを並行して行う。
【００４３】
前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するＵＤＰにＡＴＰを作用させてＵＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰを生成する反応は、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（Ｆ）の存在化でＵＤＰにＡＴＰを作用させることで行うことができる。
【００４４】
前記（Ｆ）は、ヌクレオシド３リン酸からヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移する酵素であり、本発明においてはヌクレオシド３リン酸がＡＴＰであり、ヌクレオシド３リン酸がＡＴＰであヌクレオシド２リン酸がＵＤＰである。
【００４５】
前記（Ｆ）としては、生物由来のもの｛動物由来のもの（例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等）、植物由来のもの（例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等）及び微生物由来のもの［例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等］、生物由来のものを化学修飾したもの（例えば、カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を作用させて化学修飾したもの等）及び生物由来のものを遺伝子的に修飾したもの［例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）を用いて遺伝子を改変して得たもの等］等が挙げられる。
なかでも多糖の生産効率の観点から生物由来のものが好ましく、ラット由来のヌクレオシド２リン酸キナーゼが更に好ましい。
【００４６】
本発明の製造方法における反応溶液中のＡＭＰの濃度は、前記（Ｂ）に対する下記阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である。
本発明において、前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）は、前記（Ａ）、前記（Ｂ）及び異なる濃度のＡＭＰを含み、前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の濃度並びに温度及びｐＨが多糖を製造する際の条件と同じである溶液について、それぞれの１分間当たりの多糖の生成速度を測定して求められる多糖の生成速度が、ＡＭＰを含まない溶液における多糖の生成速度の５０％となるＡＭＰの濃度である。
阻害濃度（ＩＣ５０）は下記測定を行うことにより求められる。
【００４７】
＜多糖合成酵素（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定方法＞
前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させて多糖を製造する際に用いるものと同じ前記（Ａ）及び前記（Ｂ）を、多糖を製造する際の条件と同じ濃度で含むｎ＋１個（ｎは３以上の整数である）の酵素反応水溶液（Ｉ）を作製する。ｎ個の前記（Ｉ）にそれぞれＡＭＰを添加し、ＡＭＰを含まない酵素反応水溶液（Ｉ−０）及びＡＭＰ濃度がそれぞれ異なるｎ個の酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−ｎ）を作製する。酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−ｎ）に含まれるＡＭＰの濃度は、前記（Ｂ）の活性が０になる（多糖の生成が観測できなくなる）ＡＭＰの濃度を上限としてそれぞれ異なるようにする。
なお、酵素反応水溶液（Ｉ）中のＡＭＰの濃度を決定する際には、類似の多糖合成酵素に対するＡＭＰの阻害定数Ｋｉを参考にすることができる。
【００４８】
次いで、ＡＭＰを添加していない酵素反応水溶液（Ｉ−０）及びそれぞれ異なる濃度のＡＭＰを含む酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−ｎ）のｐＨを多糖を製造する際に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）と同じものを用いて多糖を製造する際と同じｐＨに調整した後、酵素反応水溶液の温度を多糖を製造する際と同じにして酵素反応を開始し、反応中の酵素反応水溶液から反応開始後２時間毎にサンプリングを行う。サンプリングした酵素反応水溶液は、それぞれサンプリング後直ぐに１００℃で１分間熱処理して酵素反応を停止し、それぞれを測定用サンプルとする。
それぞれの測定用サンプルについて以下の条件で液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）による分析を行い、酵素反応水溶液に含まれる多糖を測定する。
【００４９】
＜ＨＰＬＣによる多糖の測定条件＞
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
【００５０】
次いで、作製直後の酵素反応水溶液に含まれる多糖のピーク面積（Ｐ０）と反応開始後ｈ時間にサンプリングした酵素反応素溶液に含まれる多糖のピーク面積（Ｐｈ）との差［ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）］を計算し、既知の濃度の多糖を含む溶液を用いて作成した検量線と△Ｐとを用いて、サンプリングした酵素反応水溶液に含まれる酵素反応で生成した多糖の量を算出する。次いで、縦軸を酵素反応で生成した多糖の量、横軸を反応時間としてプロットしたグラフを酵素反応水溶液に含まれるＡＭＰ濃度毎に作成し、グラフの直線部分の傾きをそのＡＭＰ濃度における酵素反応初速度ｖ（μｇ／分）として算出する。
次いで、ＡＭＰを含まない酵素反応水溶液（Ｉ−０）の酵素反応初速度（ｖ０）に対するそれぞれのＡＭＰ濃度における酵素反応初速度ｖの割合（％）を縦軸に、酵素反応水溶液のＡＭＰ濃度を横軸にプロットし、プロットした点を線形近似した直線上で縦軸が５０となるときのＡＭＰの濃度を前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）とする。
【００５１】
本発明において、反応溶液中のＡＭＰの濃度は、通常、前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満であるが、多糖を効率良く製造する観点から、４倍以下であることが好ましい。また、複数種類の前記（Ｂ）を用いる場合は、全ての前記（Ｂ）についての前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）を測定し、ＡＭＰの濃度が複数ある阻害濃度（ＩＣ５０）のうち値が大きい前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満とすることが必要であり、好ましくは４倍以下である。
ＡＭＰの濃度が高くなればなるほど、前記（Ｂ）の活性が抑制される。前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍のＡＭＰが存在すれば前記（Ｂ）の活性は１０分の１に抑制される。したがって、前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍量のＡＭＰが存在した場合に、ＡＭＰが存在しない場合と同程度の反応効率を維持するためには前記（Ｂ）が１０倍量必要となり、反応溶液に含まれる夾雑酵素も同時に反応系に組み込まれる。例えば多糖合成酵素の純度が９０％であり、ＡＭＰが前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍存在する場合に、ＡＭＰが存在しない場合に対して１０倍量の前記（Ｂ）を添加すると、ＡＭＰが存在しない場合と同程度の夾雑酵素が含まれることになり、夾雑酵素による望まない反応が問題になる。前記（Ｂ）の精製度を上げれば解決するが、工業的に酵素の純度９０％以上とする事は非常に困難である。よって、ＡＭＰの濃度は１０倍未満にする必要がある。
【００５２】
また、前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる反応において、ＡＭＰの濃度が前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、通常、前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間（反応時間）の１０％以上であるが、反応効率の観点から、３０〜１００％であることが好ましく、更に好ましくは５０〜１００％であり、特に好ましくは８０〜１００％であり、最も好ましくは９０〜１００％である。ＡＭＰの濃度が前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間が前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間の１０％未満であるとＡＭＰによる前記（Ｂ）の活性阻害によって生産効率が低下し、前記（Ｂ）が多量に必要となる。
【００５３】
本発明の製造方法において、ＡＭＰの濃度を前記（Ｂ）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満にする方法としては、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の方法等が好ましく挙げられるが、化学反応によりＡＭＰを他の化合物に変換する方法を用いても良い。
（ｉ）下記アデノシン１リン酸変換酵素（Ｄ）を用いてＡＭＰをアデニン、アデノシン、ＡＤＰ、ＡＴＰ及びポリアデニル酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｃ）に変換する方法。
（ｉｉ）シリカゲル担体、活性炭及びゼオライト等を用いて反応溶液中のＡＭＰを吸着する方法。
【００５４】
上記方法のうち、反応の基質特異性が高く、前記（Ａ）が分解される問題が少ないという観点から、（ｉ）の方法が好ましい。
【００５５】
（ｉ）の方法としては、ＡＭＰを前記（Ｃ）に変換する活性を有するアデノシン１リン酸変換酵素（Ｄ）の存在下で前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる方法が挙げられる。
【００５６】
前記（Ｄ）としては、ＡＭＰをプリン塩基又はピリミジン塩基に変換する活性を有する酵素（Ｄ−１）、ＡＭＰをアデノシンに変換する活性を有する酵素（Ｄ−２）、ＡＭＰをＡＤＰに変換する活性を有する酵素（Ｄ−３）、ＡＭＰをＡＴＰに変換する活性を有する酵素（Ｄ−４）及びＡＭＰをポリアデニル酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ−５）等が挙げられる。
【００５７】
前記（Ｄ−１）は、リボヌクレオチドとプリン塩基又はピリミジン塩基間の結合を加リン酸分解して、プリン塩基又はピリミジン塩基にする反応を触媒する酵素である。前記（Ｄ−１）としては、ホスホリラーゼ等が挙げられる。
【００５８】
前記（Ｄ−２）は、リボヌクレオチド中の糖とリン酸との間のリン酸エステル結合を加水分解して、ヌクレオシドとリン酸にする反応を触媒する酵素である。前記（Ｄ−２）としては、ヌクレオチダーゼ及びアピラーゼ等が挙げられる。
【００５９】
前記（Ｄ−３）は、リン酸基を有する化合物から、ＡＭＰにリン酸基を転移させてＡＤＰとする反応を触媒する酵素である。前記（Ｄ−３）としては、アデニル酸キナーゼ等が挙げられる。
【００６０】
前記（Ｄ）として前記（Ｄ−３）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ｄ）を同時に用いる。前記（Ｄ−３）と同時に用いるリン酸基含有化合物（ｄ−３）としては、ポリリン酸及びヌクレオチド（例えばＡＴＰ等）等が挙げられる。
【００６１】
前記（Ｄ−４）は、リン酸基を有する化合物から、ＡＭＰにリン酸基を転移させてＡＴＰとする反応を触媒する酵素である。前記（Ｄ−４）としては、アルギニンキナーゼ、アンモニアキナーゼ、ホスフェイトキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェイトキナーゼ等が挙げられる。
【００６２】
前記（Ｄ）として前記（Ｄ−４）を用いる場合、リン酸基含有化合物（ｄ）を同時に用いる。前記（Ｄ−４）と同時に用いるリン酸基含有化合物（ｄ−４）としては、ホスホエノールピルビン酸、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸及びヌクレオチド（例えばＡＴＰ等）等が挙げられる。
【００６３】
前記（Ｄ−５）は、ＡＭＰをモノマーとする共重合物（ポリリボヌクレオチド等）及び無機リン酸とする反応を触媒する酵素である。前記（Ｄ−５）としは、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００６４】
前記（Ｄ）のうち、多糖を効率良く製造する観点及び工業化しやすいという観点から、前記（Ｄ−２）、前記（Ｄ−３）、前記（Ｄ−４）及び前記（Ｄ−５）が好ましい。
【００６５】
本発明の製造方法において前記（Ｄ）を用いる場合、多糖を効率良く製造する観点から、ＡＭＰの生成する速度（ｖ１）対するＡＭＰを前記（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）の比率（ｖ２／ｖ１）が、０．１以上であることが好ましい。
なお、前記ｖ１及び前記ｖ２は下記の測定法により測定できる。
【００６６】
＜ＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）の測定方法＞
前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させて多糖を製造する際に用いるものと同じ前記（Ａ）、前記（Ｂ）及び前記（Ｄ）を多糖を製造する際と同じ濃度で含み、かつ多糖を製造する際と同じ濃度のＡＴＰ及び必要により多糖を製造する際に用いるものと同じリン酸基含有化合物（ｄ）を多糖を製造する際と同じ濃度で含む酵素反応水溶液（ＩＩ）を作製する。
次いで、酵素反応水溶液（ＩＩ）のｐＨを多糖を製造する際に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）と同じものを用いて多糖を製造する際と同じｐＨ（例えば７）に調整した後、酵素反応水溶液の温度を多糖を製造する際と同じ温度（例えば４０℃）にして酵素反応を８時間行い、反応中の酵素反応水溶液（ＩＩ）から５分毎にサンプリングを行う。サンプリングした酵素反応水溶液は、それぞれサンプリング後直ぐに１００℃で１分間熱処理して酵素反応を停止し、それぞれを測定用サンプルとする。
【００６７】
次いで、前記の多糖の測定で用いたＨＰＬＣと同じ測定条件で測定用サンプルそれぞれに含まれるＡＭＰと前記（Ｃ）の量を測定し、既知の濃度のＡＭＰ及び前記（Ｃ）を含む溶液を用いて作成した検量線から測定サンプルそれぞれに含まれるＡＭＰ及び前記（Ｃ）の濃度を算出し、横軸を反応時間、縦軸をＡＭＰ又は前記（Ｃ）の濃度として算出した値をプロットし、縦軸がＡＭＰの濃度であるグラフを線形近似したときの直線の傾きをＡＭＰの生成する速度（ｖ１）とし、縦軸が前記（Ｃ）の濃度であるグラフを線形近似したときの直線の傾きを前記（Ｃ）へ変換する速度（ｖ２）とする。
【００６８】
本発明の多糖の製造方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を行うことにより実施することができる。
工程（ａ）：水、前記（Ａ）、前記（Ｂ）、前記（Ｄ）、ＡＴＰ及び前記（Ｆ）並びに必要により前記（ｄ）を混合した反応水溶液（ＩＩＩ）を作製する反応水溶液調整工程。
工程（ｂ）：反応水溶液（ＩＩＩ）のｐＨを後述のｐＨ調整剤（Ｋ）で所定のｐＨに調整した後、反応水溶液（ＩＩＩ）の温度を所定の温度に調整しながら、所定の時間、前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させて多糖を製造する反応と、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するＵＤＰにＡＴＰを作用させてＵＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰを生成する反応を行う酵素反応工程。
工程（ｃ）：生成した多糖を精製する精製工程。
これらの工程のうち、工程（ａ）及び（ｂ）は同時に行っても良く、工程（ａ）を行ってから工程（ｂ）を行っても良い。
【００６９】
工程（ａ）において、水、前記（Ａ）、前記（Ｂ）、前記（Ｄ）、ＡＴＰ及び前記（Ｆ）並びに必要により添加される前記（ｄ）の混合順序は、一括で水に混合しても良く、水に前記（Ａ）、前記（Ｂ）、前記（Ｄ）、ＡＴＰ及び前記（Ｅ）並びに必要により添加される前記（ｄ）を別々に添加しても良い。別々に添加する場合の添加の順序に制限はないが、前記（Ａ）を最初に添加することが好ましい。
【００７０】
工程（ａ）及び（ｂ）は撹拌しながら行っても無撹拌で行っても良い。工程（ｃ）において多糖を精製する方法としては、適量のアルコール（炭素数１〜１０のアルコール）等の溶剤を加えて沈殿させる方法、多孔質膜（セラミック膜等）を用いて溶液交換をする方法並びに精密ろ過、限外ろ過及び逆浸透等のろ過処理による方法等を用いることができる。
【００７１】
反応水溶液（ＩＩＩ）中の前記（Ａ）の含有量（モル濃度）は、多糖の製造効率の観点から、０．１ｍＭ〜２Ｍが好ましい。複数種類の前記（Ａ）を含む場合は、それぞれの含有量（モル濃度）が０．１ｍＭ〜２Ｍであることが好ましい。
【００７２】
反応水溶液（ＩＩＩ）中の前記（Ｂ）の含有量（Ｕ／Ｌ）は、多糖の製造効率の観点から、０．１〜１０００００Ｕ／Ｌが好ましい。
ここで１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの前記（Ａ）を多糖に変換する酵素量を意味する。例えば、前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる場合、１分間にウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン合計１μｍｏｌを多糖に変換することができる酵素量を意味する。
【００７３】
反応水溶液（ＩＩＩ）中の前記（Ｄ）の含有量（Ｕ／Ｌ）は、多糖の製造効率の観点から、０．１〜１０００００Ｕ／Ｌが好ましい。
１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＡＭＰを前記（Ｃ）に変換する酵素量を意味する。
【００７４】
反応水溶液（ＩＩＩ）中のＡＴＰの含有量（モル濃度）は、多糖の製造効率の観点から、０．１ｍＭ〜２Ｍが好ましい。
【００７５】
反応水溶液（ＩＩＩ）中の前記（Ｆ）の含有量（Ｕ／Ｌ）は、多糖の製造効率の観点から、０．１〜１０００００Ｕ／Ｌが好ましい。
１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＵＤＰをＵＴＰに変換する酵素量を意味する。
【００７６】
前記（Ｄ）として、ＡＭＰをＡＤＰに変換する活性を有する酵素（Ｄ−３）又はＡＭＰをＡＴＰに変換する活性を有する酵素（Ｄ−４）を用いる場合、反応水溶液（ＩＩＩ）はリン酸基含有化合物（ｄ）を含有し、前記（ｄ）の含有量（モル濃度）は、多糖の製造効率のする観点から、０．０１ｎＭ〜１０Ｍが好ましい。
【００７７】
上記工程（ｂ）において反応水溶液（ＩＩＩ）のｐＨは、多糖の製造効率の観点から、３〜１２が好ましく、下記の方法で算出した前記（Ｂ）の最適ｐＨであることが更に好ましい。
【００７８】
＜多糖合成酵素（Ｂ）の最適ｐＨ測定法＞
１０ｍＭの前記（Ａ）及び０．００１〜１０，０００Ｕ／Ｌから選択される濃度の前記（Ｂ）を含む水溶液を作製し、続いて後述のｐＨ調整剤（Ｋ）を用いてｐＨを３〜１２の範囲から選択した複数（ｎ個）のｐＨに調製した酵素反応水溶液（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−ｎ）を作製する。なお、１Ｕとは１分間に１μｍｏｌの前記（Ａ）からリボヌクレオシド２リン酸を生成することができる酵素量を意味する。
ｐＨの異なる酵素反応水溶液（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−ｎ）それぞれについて、５分〜１００時間酵素反応を行い、多糖の合成量を測定し、縦軸を多糖の合成量、横軸をｐＨとしてプロットしたグラフを作成し、多糖の合成量が極大値となるｐＨを最適ｐＨとする。
なお、多糖の合成量は、放射性同位体（例えば１４Ｃ）でラベルした前記（Ａ）を用いて多糖合成を行い、ろ紙を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の前記（Ａ）と多糖を分離することで、多糖の合成量を測定することができる。
【００７９】
前記のｐＨ調整剤（Ｋ）としては、緩衝作用を有するバッファー等を含有した水が挙げられる。緩衝作用を有するバッファー等としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、Ｇｏｏｄバッファー（ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等）、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
なかでも扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましく、ｐＨ調整剤の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであることが好ましい。
【００８０】
上記工程（ｂ）において反応水溶液（ＩＩＩ）の温度は、前記（Ｂ）及び前記（Ｄ）の安定性並びに反応速度の観点から０〜１００℃が好ましい。
【００８１】
上記工程（ｂ）において前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる酵素反応を行う反応時間は、前記（Ｂ）の活性、反応水溶液（ＩＩＩ）の温度、前記（Ａ）及び前記（Ｂ）の濃度等によって異なるが、反応時間が長すぎると、酵素の失活や基質の枯渇という問題があるため、通常５分〜１００時間である。
【００８２】
上記工程（ａ）〜（ｃ）において、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｊ）及び糖類（Ｋ）を用いても良い。
脂質（Ｊ）としては、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｋ）としては、前記の単糖（ａ）として例示したもの、オリゴ糖［二糖類（麦芽糖及び蔗糖等）、三糖類（マルトオリゴ糖等）及び四糖類等］並びに糖アルコール（グリセリン等）等が挙げられる。
【００８３】
反応溶液（ＩＩＩ）に含まれる脂質（Ｊ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（ＩＩＩ）に含まれる糖類（Ｋ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
【００８４】
本発明の多糖の製造方法において、前記（Ａ）としてウリジン２リン酸−グルクロン酸を含む場合、反応水溶液（ＩＩＩ）中に１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ）を含有させることが好ましい。
前記（Ｇ）は、前記（Ａ）への前記（Ｂ）の作用により生成するＵＤＰにＡＴＰを作用させて生成するＵＴＰと１−ホスホ−グルクロン酸から、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を生成する活性を有する酵素である。前記（Ｇ）により生成するウリジン２リン酸−グルクロン酸は本製造方法の前記（Ａ）として多糖が製造に用いることができる。
なお、１−ホスホ−グルクロン酸は、グルクロン酸の１位のヒドロキシル基がリン酸でリン酸エステル化された構造を有する糖である。
【００８５】
前記（Ｇ）は、ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸からウリジン２リン酸−グルクロン酸を生成する活性を有する酵素であれば特に限定されないが、植物起源の植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）、動物起源の動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−２）、微生物起源の微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−３）、（Ｇ−１）〜（Ｇ−３）が化学的に修飾された変異体（Ｇ−４）及び（Ｇ−１）〜（Ｇ−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｇ−５）が挙げられる。前記（Ｇ）は２種以上を併用しても良い。
【００８６】
植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）としては、例えば、シロイヌナズナ由来、エンドウマメ由来及びオオムギ由来のもの等が挙げられる。
【００８７】
動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−２）としては、例えば、ブタ由来のもの等が挙げられる。
【００８８】
微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−３）としては、例えば、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００８９】
化学的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−４）として、例えば上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼにカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００９０】
遺伝子的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００９１】
上記前記（Ｇ）のうち、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を合成する活性の高さの観点から、（Ｇ−１）が好ましく、更に好ましくはシロイヌナズナ由来のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼである。
【００９２】
反応水溶液（ＩＩＩ）が前記（Ｇ）を含む場合、反応水溶液（ＩＩＩ）に含まれる１−ホスホ−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸の生成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、更に好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである。
【００９３】
反応水溶液（ＩＩＩ）が前記（Ｇ）を含む場合、反応水溶液（ＩＩＩ）中の前記（Ｇ）の含有量（Ｕ／ｍＬ）はウリジン２リン酸−グルクロン酸の生成効率を良くする観点から、０．００００１Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬが好ましく、更に好ましくは０．００１Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬである。
１Ｕとは、１μｍｏｌのＵＴＰ及び１μｍｏｌの１−ホスホ−グルクロン酸から１μｍｏｌのウリジン２リン酸−グルクロン酸を１分間で生成することができる酵素量である。
【００９４】
本発明の製造方法において、多糖がヒアルロン酸である場合、前記（Ａ）はウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンであり、前記（Ｂ）はヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）であり、前記（Ｃ）はＡＤＰであり、前記（Ｄ）はアデニル酸キナーゼ（Ｄ−３）であり、前記（ｄ）としてＡＴＰを用いることが好ましい。
【００９５】
本発明の製造方法では、従来から知られていたウリジン２リン酸による酵素活性阻害だけでなく、ＡＭＰによる酵素活性阻害を抑制することができるため、多糖合成酵素（Ｂ）の活性が高くなり従来の生産方法よりも高い効率で不純物を含まない多糖を低い製造コストで生産することが出来る。そのため本発明の製造方法により得られた多糖は、化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器、食品等用として好適に用いることができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９７】
＜製造例１：ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）の製造＞
パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）を含む水溶液（Ｂ−１−Ｓ）を得た。
【００９８】
＜ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ１｛１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１０ｍＭのＡＭＰを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝１ｍＬに、製造例１のヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１）を１０μＬ加えて、反応溶液（ｒ１）とし、３０℃で５、１０、１５、２０分間反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の合成量を算出したところ、それぞれ５分後１．８μｇ、１０分後３．８μｇ、１５分後６．０μｇ、２０分後７．５μｇであった。ヒアルロン酸の合成量から、ヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）の濃度を計算した。その結果、２００Ｕ／Ｌであった。
【００９９】
＜ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
１．５ｍＬ容量のチューブ中で９５０μＬの水溶液ｂ１｛５ｍＭの塩化マグネシウムを含む緩衝液Ｂ［５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、２５℃）］｝に、製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）を０．１５Ｕ／Ｌとなるように溶解した。ここに、基質溶液［１−１］（それぞれ１００ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）を５０μＬ添加し、酵素反応水溶液（Ｉ−０）とした。酵素反応水溶液（Ｉ−０）を作製直後及び２時間おきに１００μＬずつサンプリングし、サンプリングした溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、作製直後と酵素反応開始から２時間おきのヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
以下において、ＨＰＬＣの測定条件は全て同じである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
次いで、０．３ｍＭ、１ｍＭ及び１．５ｍＭのＡＭＰをそれぞれ含み、かつ、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む緩衝液Ｂである水溶液ｂ２〜ｂ４を作製し、水溶液ｂ１に代えて水溶液ｂ２〜ｂ４を用いる以外は同様にして酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）を作製した。酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）についても、酵素反応水溶液（Ｉ−０）の場合と同様にして、作製直後と酵素反応開始から２時間毎のヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」、分子質量：２０００ｋＤａ）を緩衝液Ｂに０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ及び２ｇ／Ｌの濃度となるようにそれぞれ溶解したヒアルロン酸標準溶液（１）〜（４）を作製し、ＨＰＬＣにより分析したヒアルロン酸のピーク面積を縦軸（ｙ軸）とし、ヒアルロン酸標準溶液（１）〜（４）のヒアルロン酸濃度（ｇ／Ｌ）を横軸（ｘ軸）としてプロットし、線形近似して検量線を作成した。
酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）のそれぞれについて、作製直後のヒアルロン酸のピーク面積（Ｐ０）と酵素反応開始からｈ時間にサンプリングした酵素反応素溶液に含まれる多糖のピーク面積（Ｐｈ）とから酵素反応開始から経過した時間毎のピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）を求め、検量線を用いてそれぞれの酵素反応水溶液含まれる酵素反応で生成した多糖の量を算出した。次いで、縦軸を酵素反応で生成した多糖の量、横軸を反応時間としてプロットしたグラフを酵素反応水溶液に含まれるＡＭＰ濃度毎に作成し、グラフの直線部分の傾きをそのＡＭＰ濃度における酵素反応初速度ｖ（μｇ／分）を算出した。
酵素反応水溶液（Ｉ−０）を用いて測定した酵素反応初速度（ｖ０）を１００％とし、酵素反応水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）を用いて測定した酵素反応初速度ｖの相対値（％）を算出した。それぞれの酵素反応水溶液（Ｉ−０）〜（Ｉ−３）に含まれるＡＭＰの濃度を横軸（ｘ軸）、酵素反応水溶液（Ｉ−０）〜（Ｉ−３）における酵素反応初速度ｖのｖ０に対する相対値を縦軸（ｙ軸）にプロットしてグラフを作成した。グラフを線形近似した直線上で縦軸が５０となる時のＡＭＰの濃度［ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）］は０．６ｍＭであった。
【０１００】
＜製造例２：アデニル酸キナーゼ（Ｄ−３）の製造＞
大腸菌由来の配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、アデニル酸キナーゼ（Ｄ−３）を含むアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）を得た。
【０１０１】
＜アデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ２（１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＡＭＰを含む緩衝液Ｂ）１ｍＬに、１００ｍＭのＡＴＰ水溶液１０μＬ及びアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ２）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。
化合物（Ｃ）である反応生成物（ＡＤＰ）の量を薄層クロマトグラフィー（Ｓｉｄｍａ社、ＰＥＩ−Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅプレート、以下ＴＬＣと略記する）で展開（展開溶媒には１ＭのＬｉＣｌと１Ｍのギ酸を含む水溶液を用いた）し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで検出し定量した。前記（Ｃ）の生成量から、アデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）に含まれるアデニル酸キナーゼ（Ｄ−３）の濃度を計算したところ、２００００Ｕ／Ｌであった。
【０１０２】
＜製造例３：ポリリン酸キナーゼ（Ｄ−４）の製造＞
メイオサーマス・ルバー由来の配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３７℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ポリリン酸キナーゼ（Ｄ−４）を含むポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）を得た。
【０１０３】
＜ポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ２（１ｍＬ）に、ポリリン酸０．０５Ｍ水溶液１０μＬ及びポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−１）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ３）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。
化合物（Ｃ）である反応生成物（ＡＴＰ）の量をＴＬＣで展開し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで製造例３と同様に検出し定量した。化合物（Ｃ）の生成量から、ポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）に含まれるポリリン酸キナーゼ（Ｄ−４）の濃度を計算したところ、３６００Ｕ／Ｌであった。
【０１０４】
＜製造例４：ヌクレオチダーゼ（Ｄ−２）の製造＞
アフリカツメガエル由来の配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３７℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ヌクレオチダーゼ（Ｄ−２）を含むヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）を得た。
【０１０５】
＜ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ２（１ｍＬ）に、ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ４）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。
化合物（Ｃ）である反応生成物（アデノシン）の量をＴＬＣで展開し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで製造例３と同様に検出し定量した。化合物（Ｃ）の生成量から、ヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）に含まれるヌクレオチダーゼ（Ｄ−２）の濃度を計算したところ、６０００Ｕ／Ｌであった。
【０１０６】
＜製造例５：ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｄ−５）の製造＞
大腸菌由来の配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３７℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ポリリボヌクレオチドダーゼヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｄ−５）を含むポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）を得た。
【０１０７】
＜ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ２（１ｍＬ）に、ポリアデニン１ｍｇ及びポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−１）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ５）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。
化合物（Ｃ）である反応生成物（ポリアデニル酸）の量をＴＬＣで展開し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで製造例３と同様に検出し定量した。化合物（Ｃ）の生成量から、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）に含まれるポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｄ−５）の濃度を計算したところ、１０００Ｕ／Ｌであった。
【０１０８】
＜製造例６：ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（Ｆ−１）の製造＞
ラットすい臓由来の配列番号６のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３７℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（Ｆ−１）を含むヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）を得た。
【０１０９】
＜ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）の濃度測定＞
緩衝液Ａ（９７０μＬ）に、ＵＤＰ１００ｍＭ水溶液１０μＬ、ＡＴＰ１００ｍＭ水溶液１０μＬ及びヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ６）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。
反応生成物（ＵＴＰ）の量をＴＬＣで展開し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで製造例３と同様に検出し定量した。ＵＴＰの生成量から、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）に含まれるヌクレオシド２リン酸キナーゼ（Ｆ−１）の濃度を計算したところ、０．３Ｕ／μＬであった。
【０１１０】
＜製造例７：ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）の製造＞
シロイヌナズナ由来の配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＥＴ２２ｂに組み込んだプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。続いて３７℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｇ−１）を含むウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）を得た。
【０１１１】
＜ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）の濃度測定＞
緩衝液Ａ（９７０μＬ）に、ＵＴＰ１００ｍＭ水溶液１０μＬ、１−ホスホ−グルクロン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ７）とし、３７℃で５、１０、１５分反応を行った。反応生成物（ウリジル２リン酸−グルクロン酸）の量をＴＬＣで展開し、２６０ｎｍの紫外線を照射することで製造例３と同様に検出し定量した。ウリジル２リン酸−グルクロン酸の生成量から、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）に含まれるウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの濃度を計算したところ、５Ｕ／ｍＬであった。
【０１１２】
＜製造例８：コンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）の製造＞
パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号８のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、コンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）を含むコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）を得た。
【０１１３】
＜コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ３［１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む緩衝液Ｂ］１ｍＬに、製造例８のコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ８）とし、３０℃で５、１０、１５分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とコンドロイチンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からコンドロイチンの合成量を算出したところ、それぞれ５分後１．７μｇ、１０分後３．１μｇ、１５分後４．４μｇであった。コンドロイチンの合成量から、コンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）に含まれるコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）の濃度を計算した。結果は１５０Ｕ／Ｌであった。
【０１１４】
＜コンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
製造例１の「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例８で得たコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−２］（それぞれ１００ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「コンドロイチンナトリウム（和光純薬社製）」を用いた以外は製造例１と同様にして算出したコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）は０．６ｍＭであった。
【０１１５】
＜製造例９：キサンタン合成酵素（Ｂ−３）の製造方法＞
キサンタン・カムペストリスを３０℃で２４時間培養した後、遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いてキサンタン・カムペストリスを回収した。回収したキサンタン・カムペストリスを、緩衝液Ｃ［１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのドデシルマルトシド及び５ｍＭのオレイン酸を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗キサンタン合成酵素抗体カラムで精製を行い、キサンタン合成酵素（Ｂ−３）を含むキサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）を得た。
【０１１６】
＜キサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ４［１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−β−グルコース、１ｍＭのグアノシン２リン酸−マンノース、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのドデシルマルトシド及び５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］１ｍＬに、製造例９のキサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）を１０μＬ加えて、反応溶液（ｒ９）とし、３０℃で１０、２０、３０、４０、５０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とキサンタンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からキサンタンの合成量を算出したところ、それぞれ１０分後０．２２μｇ、２０分後０．４１μｇ、３０分後０．５８μｇ、４０分後０．７５μｇ、５０分後０．９５μｇであった。キサンタンの合成量から、キサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）に含まれるキサンタン合成酵素（Ｂ−３）の濃度を計算した。結果は１０Ｕ／Ｌであった。
【０１１７】
＜キサンタン合成酵素（Ｂ−３）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）の阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例９で得たキサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−３］（それぞれ１００ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩、ウリジン２リン酸−β−グルコース及びグアノシン２リン酸−マンノースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「キサンタンガム（和光純薬社製）」を用いたこと以外は製造例１同様にして算出したキサンタン合成酵素（Ｂ−３）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）は０．４ｍＭであった。
【０１１８】
＜製造例１０：セルロース合成酵素（Ｂ−４）の製造方法＞
酢酸菌由来の配列番号９のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ｃに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、セルロース合成酵素（Ｂ−４）を含むセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）を得た。
【０１１９】
＜セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ５［１ｍＭのウリジン２リン酸−β−グルコース（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−β−グルコース、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び５ｍＭのオレイン酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］１ｍＬに、製造例１０のセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ１０）とし、３０℃で５、１０、２０、３０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からセルロースの合成量を算出したところ、それぞれ５分後４．８μｇ、１０分後１０．１μｇ、２０分後１９．７μｇ、３０分後２９．０μｇであった。セルロースの合成量から、セルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）に含まれるセルロース合成酵素（Ｂ−４）の濃度を計算した。結果は５００Ｕ／Ｌであった。
【０１２０】
＜セルロース合成酵素（Ｂ−４）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例１０で得たセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−４］（１００ｍＭのウリジン２リン酸−β−グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「酢酸菌由来のセルロース（東京化成工業社製）」を用いたこと以外は製造例１と同様にして算出したセルロース合成酵素（Ｂ−３）に対するアデノシン１リン酸の阻害濃度（ＩＣ５０）は０．７ｍＭであった。
【０１２１】
＜製造例１１：ヘパリン合成酵素（Ｂ−５）の製造方法＞
パスツレラ・ムルトシダ由来の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ｃに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、ヘパリン合成酵素（Ｂ−５）を含むヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）を得た。
【０１２２】
＜ヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ６［１ｍＭのウリジン２リン酸−イズロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−イズロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）及び１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルクロン酸、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］１ｍＬに、製造例１１のヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ１１）とし、３０℃で５、１０、２０、３０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたイズロン酸及びグルクロン酸の取り込み量からヘパリンの合成量を算出したところ、それぞれ５分後１．８μｇ、１０分後４．０μｇ、１５分後６．３μｇ、２０分後７．９μｇであった。ヘパリンの合成量から、ヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）の濃度を計算した。その結果、２１０Ｕ／Ｌであった。  
【０１２３】
＜ヘパリン合成酵素（Ｂ−５）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例１１で得たヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−５］（１００ｍＭのウリジン２リン酸−イズロン酸、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「ヒト由来のヘパリンナトリウム」を用いたこと以外は製造例１と同様にして算出したを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ヘパリン合成酵素（Ｂ−５）に対するアデノシン１リン酸の阻害濃度（ＩＣ５０）は０．６ｍＭであった。
【０１２４】
＜製造例１２：アミロース合成酵素（Ｂ−６）の製造方法＞
イネ由来の配列番号１１のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ｃに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、アミロース合成酵素（Ｂ−６）を含むアミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）を得た。
【０１２５】
＜アミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ７［１ｍＭのウリジン２リン酸−グルコース（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルコース、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］１ｍＬに、製造例１２のアミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ１２）とし、３０℃で５、１０、２０、３０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とアミロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からアミロースの合成量を算出したところ、それぞれ５分後２．５μｇ、１０分後４．５μｇ、１５分後７．３μｇ、２０分後８．８μｇであった。アミロースの合成量から、アミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）の濃度を計算した。その結果、３００Ｕ／Ｌであった。  
【０１２６】
＜アミロース合成酵素（Ｂ−６）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例１２で得たアミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−６］（１００ｍＭのウリジン２リン酸−グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「アミロース」を用いたこと以外は製造例１と同様にして算出したを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、アミロース合成酵素（Ｂ−６）に対するアデノシン１リン酸の阻害濃度（ＩＣ５０）は０．４ｍＭであった。
【０１２７】
＜製造例１３：デキストラン合成酵素（Ｂ−７）の製造方法＞
leuconostoc mesenteroides由来の配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子をｐＫＫ２２３−３に組み込んだプラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥに形質転換した。続いて３０℃で５時間培養して濁度が０．５に達した後に発現誘導し、続いて遠心分離機（６０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収した。回収した大腸菌を、緩衝液Ｃに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、デキストラン合成酵素（Ｂ−７）を含むデキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）を得た。
【０１２８】
＜デキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）の濃度測定＞
水溶液ａ７［１ｍＭのウリジン２リン酸−グルコース（１４Ｃでラベルした放射性同位体を含むウリジン２リン酸−グルコース、放射能３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］１ｍＬに、製造例１３のデキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）１０μＬを加えて、反応溶液（ｒ１３）とし、３０℃で５、１０、２０、３０分反応を行った。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とアミロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からデキストランの合成量を算出したところ、それぞれ５分後２．４μｇ、１０分後４．３μｇ、１５分後７．０μｇ、２０分後８．５μｇであった。デキストランの合成量から、デキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）の濃度を計算した。その結果、３００Ｕ／Ｌであった。  
【０１２９】
＜デキストラン合成酵素（Ｂ−７）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定の阻害濃度ＩＣ５０の測定＞
「ヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の測定」において、「製造例１で得たヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）」に代えて「製造例１３で得たデキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）」を用い、「基質溶液［１−１］」に代えて「基質溶液［１−６］（１００ｍＭのウリジン２リン酸−グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液）」を用い、「ヒアルロン酸ナトリウム、鶏冠製」に代えて「デキストラン硫酸ナトリウム（和光純薬工業）」を用いたこと以外は製造例１と同様にして算出したを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、デキストラン合成酵素（Ｂ−７）に対するアデノシン１リン酸の阻害濃度（ＩＣ５０）は０．５ｍＭであった。
【０１３０】
＜実施例１＞
水溶液ａ１（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、１−ホスホ−グルクロン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例１のヒアルロン酸合成酵素水溶液（Ｂ−１−Ｓ）０．７μＬを加えて、反応溶液（Ｈ−１）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、その結果を表１に示す。
なお、ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の合成量を算出した。ヒアルロン酸の合成量は１．６μｇであった。
【０１３１】
＜ＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）の測定＞
反応溶液（Ｈ−１）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−１）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。横軸をＡＭＰ及びＡＤＰのそれぞれの生成量、縦軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前記ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１６．６μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、前記ｖ１に対する前記ｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３２】
＜実施例２＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例３のポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）１０μＬ」を用い、更に「ポリリン酸０．０５Ｍ水溶液１０μＬ」を用いること以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１．４μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
反応溶液（Ｈ−１）において、「製造例２で得たアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）」に代えて「製造例３で得たポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）」を用い、更に「ポリリン酸０．０５Ｍ水溶液１０μＬ」を用いる以外は実施例１と同様にして、ｖ１及びｖ２を決定したところ、ｖ１＝１６．２μＭ／分、ｖ２＝５．２１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３３】
＜実施例３＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例４のヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）１０μＬ」を用いる以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１．４μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
反応溶液（Ｈ−１）において、「製造例２で得たアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）」に代えて「製造例４のヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）を１０μＬ」を用いる以外は実施例１と同様にして、ｖ１及びｖ２を決定したところ、ｖ１＝１５．４μＭ／分、ｖ２＝２０．５μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３４】
＜実施例４＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例５のポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）１０μＬ」を用いて、更に「ポリアデニン１ｍｇ」を用いる以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のアデノシン１リン酸の濃度を測定し、結果を表１に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１．５μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
反応溶液（Ｈ−１）において、「製造例２で得たアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）」に代えて「製造例５のポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）を１０μＬ」を用い、更に「ポリアデニン１ｍｇ」を用いる以外は実施例１と同様にしてｖ１及びｖ２を決定したところ、ｖ１＝１６．４μＭ／分、ｖ２＝４．５５μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３５】
＜実施例５＞
水溶液ａ３（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、１−ホスホ−グルクロン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例８のコンドロイチン合成酵素水溶液（Ｂ−２−Ｓ）０．７μＬを加えて、反応溶液（Ｈ−２）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とコンドロイチンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からコンドロイチンの合成量を算出した。コンドロイチンの合成量は１．４μｇであった。
反応溶液（Ｈ−２）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−２）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量ＡＭＰ及びＡＤＰ｝を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間を横軸として測定値をプロットし、前記速度ｖ１及び前記ｖ２を測定したところ、ｖ１＝１７．８μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３６】
＜実施例６＞
水溶液ａ４（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、１−ホスホ−グルクロン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例９のキサンタン合成酵素水溶液（Ｂ−３−Ｓ）０．７μＬ加えて、反応溶液（Ｈ−３）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がキサンタン合成酵素（Ｂ−３）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して５０％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とキサンタンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からキサンタンの合成量を算出した。キサンタンの合成量は０．１４μｇであった。
反応溶液（Ｈ−３）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−３）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前期ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１５．１μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３７】
＜実施例７＞
水溶液ａ５（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、β−グルコース１リン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例１０のセルロース合成酵素水溶液（Ｂ−４−Ｓ）０．７μＬ加えて、反応溶液（Ｈ−４）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がセルロース合成酵素（Ｂ−４）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からセルロースの合成量を算出した。セルロースの合成量は４μｇであった。
反応溶液（Ｈ−４）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−４）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前期ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１８．９μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３８】
＜実施例８＞
水溶液ａ６（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、１−ホスホ−イズロン酸１００ｍＭ水溶液５μＬ及び１−ホスホ−グルクロン酸１００ｍＭ水溶液５μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例１１のヘパリン合成酵素水溶液（Ｂ−５−Ｓ）０．７μＬ加えて、反応溶液（Ｈ−５）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がヘパリン合成酵素（Ｂ−５）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヘパリンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたイズロン酸及びグルクロン酸の取り込み量からヘパリンの合成量を算出した。ヘパリンの合成量は１．３μｇであった。
反応溶液（Ｈ−５）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−５）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前期ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１４．０μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１３９】
＜実施例９＞
水溶液ａ７（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、グルコースー１リン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例１２のアミロース合成酵素水溶液（Ｂ−６−Ｓ）０．７μＬ加えて、反応溶液（Ｈ−６）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がアミロース合成酵素（Ｂ−６）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とアミロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からアミロースの合成量を算出した。アミロースの合成量は３．０μｇであった。
反応溶液（Ｈ−６）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−６）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前期ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１３．３μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１４０】
＜実施例１０＞
水溶液ａ７（９４０μＬ）に、ＡＴＰ１Ｍ水溶液１０μＬ、グルコースー１リン酸１００ｍＭ水溶液１０μＬ、製造例６のヌクレオシド２リン酸キナーゼ水溶液（Ｆ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例７のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ水溶液（Ｇ−１−Ｓ）１０μＬ、製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ及び製造例１３のデキストラン合成酵素水溶液（Ｂ−７−Ｓ）０．７μＬ加えて、反応溶液（Ｈ−７）とし、３０℃で８時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表１に示す。
ＡＭＰの濃度がデキストラン合成酵素（Ｂ−７）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して７５％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とデキストランを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からデキストランの合成量を算出した。デキストランの合成量は２．８μｇであった。
反応溶液（Ｈ−７）を３０℃で静置し、５分毎に（Ｈ−７）から１００μＬずつ取り出し、３０分酵素反応した。取り出した溶液は、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより生成物量（ＡＭＰ及びＡＤＰ）を測定した。縦軸をＡＭＰ及びＡＤＰの生成量、横軸を反応時間として測定値をプロットし、前記ｖ１及び前期ｖ２を決定したところ、ｖ１＝１７．５μＭ／分、ｖ２＝６０．１μＭ／分となり、ｖ１に対するｖ２の比率が０．１以上であった。
【０１４１】
＜実施例１１＞
実施例１と同様にして反応溶液（Ｈ−１）を作製し、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、その結果を表２に示す。
なお、ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して８３％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヒアルロン酸を分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からヒアルロン酸の合成量を算出した。ヒアルロン酸の合成量は２０８．８μｇであった。
【０１４２】
＜実施例１２＞
実施例２と同様に「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例３のポリリン酸キナーゼ水溶液（Ｄ−４−Ｓ）１０μＬ」を用い、更に「ポリリン酸０．０５Ｍ水溶液１０μＬ」を用いること以外は実施例１と同様にして、３０℃で２４時間反応してヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１６０．１μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して１００％であった。
【０１４３】
＜実施例１３＞
実施例３と同様に「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例４のヌクレオチダーゼ水溶液（Ｄ−２−Ｓ）１０μＬ」を用いる以外は実施例１と同様にして、３０℃で２４時間反応してヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１９５．３μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して３０％であった。
【０１４４】
＜実施例１４＞
実施例４と同様に「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」に代えて「製造例５のポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ水溶液（Ｄ−５−Ｓ）１０μＬ」を用いて、更に「ポリアデニン１ｍｇ」を用いる以外は実施例１と同様にして、３０℃で２４時間反応してヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は１５８．６μｇであった。
ＡＭＰの濃度がヒアルロン酸合成酵素（Ｂ−１）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して３０％であった。
【０１４５】
＜実施例１５＞
実施例５と同様にして反応溶液（Ｈ−２）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がコンドロイチン合成酵素（Ｂ−２）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して６７％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とコンドロイチンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からコンドロイチンの合成量を算出した。コンドロイチンの合成量は１４６．２μｇであった。
【０１４６】
＜実施例１６＞
実施例６と同様にして反応溶液（Ｈ−３）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がキサンタン合成酵素（Ｂ−３）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して５０％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とキサンタンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルクロン酸の取り込み量からキサンタンの合成量を算出した。キサンタンの合成量は１０．４μｇであった。
【０１４７】
＜実施例１７＞
実施例７と同様にして反応溶液（Ｈ−４）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がセルロース合成酵素（Ｂ−４）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して５０％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とセルロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からセルロースの合成量を算出した。セルロースの合成量は３２１．１μｇであった。
【０１４８】
＜実施例１８＞
実施例８と同様にして反応溶液（Ｈ−５）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がヘパリン合成酵素（Ｂ−５）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して４２％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とヘパリンを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたイズロン酸及びグルクロン酸の取り込み量からヘパリンの合成量を算出した。ヘパリンの合成量は１６０．２μｇであった。
【０１４９】
＜実施例１９＞
実施例９と同様にして反応溶液（Ｈ−６）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がアミロース合成酵素（Ｂ−６）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して３３％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とアミロースを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からアミロースの合成量を算出した。アミロースの合成量は３１０．４μｇであった。
【０１５０】
＜実施例２０＞
実施例１０と同様にして反応溶液（Ｈ−７）とし、３０℃で２４時間反応を行った。反応途中でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いて反応溶液中のＡＭＰの濃度を測定し、結果を表２に示す。
ＡＭＰの濃度がデキストラン合成酵素（Ｂ−７）に対する阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間は、反応時間に対して５９％であった。
また、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ＭＭ）を用いたペーパークロマトグラフィー法で未反応の基質とデキストランを分離した後、原点部を切り出し、液体シンチレーションカクテルに浸漬させた後、液体シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体を測定し、１４Ｃでラベルしたグルコースの取り込み量からデキストランの合成量を算出した。デキストランの合成量は３０１．１μｇであった。
【０１５１】
＜比較例１＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は０．５μｇであった。
【０１５２】
＜比較例２＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例５と同様にして、コンドロイチンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例５と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例５と同様にして算出したコンドロイチンの合成量は０．４μｇであった。
【０１５３】
＜比較例３＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかたこと以外は実施例６と同様にして、キサンタンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例６と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例６と同様にして算出したキサンタンの合成量は０．０３μｇであった。
【０１５４】
＜比較例４＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例７と同様にして、セルロースを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例７と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例７と同様にして算出したセルロースの合成量は１．３μｇであった。
【０１５５】
＜比較例５＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例８と同様にして、ヘパリンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例８と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例７と同様にして算出したヘパリンの合成量は０．３μｇであった。
【０１５６】
＜比較例６＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例９と同様にして、アミロースを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例９と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例９と同様にして算出したアミロースの合成量は０．２μｇであった。
＜比較例７＞
「製造例２のアデニル酸キナーゼ水溶液（Ｄ−３−Ｓ）１０μＬ」を用いなかったこと以外は実施例１０と同様にして、デキストランを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１０と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表３に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１０と同様にして算出したデキストランの合成量は０．４μｇであった。
＜比較例８＞
実施例１１と同様にして、ヒアルロン酸を合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１１と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１１と同様にして算出したヒアルロン酸の合成量は４０．５μｇであった。
【０１５７】
＜比較例９＞
実施例１２と同様にして、コンドロイチンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１２と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１２と同様にして算出したコンドロイチンの合成量は３２．２μｇであった。
【０１５８】
＜比較例１０＞
実施例１３と同様にして、キサンタンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１３と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１３と同様にして算出したキサンタンの合成量は１．１μｇであった。
【０１５９】
＜比較例１１＞
実施例１４と同様にして、セルロースを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１４と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１４と同様にして算出したセルロースの合成量は５１．１μｇであった。
【０１６０】
＜比較例１２＞
実施例１５と同様にして、ヘパリンを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１５と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１５と同様にして算出したヘパリンの合成量は３４．１μｇであった。
【０１６１】
＜比較例１３＞
実施例１６と同様にして、アミロースを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１６と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１６と同様にして算出したアミロースの合成量は４５．３μｇであった。
＜比較例１４＞
実施例１７と同様にして、デキストランを合成した。反応途中でサンプリングを行い、実施例１７と同様にしてＨＰＬＣを用いて求めた反応溶液中のＡＭＰの濃度並びにＡＭＰの生成する速度（ｖ１）及びＡＭＰを化合物（Ｃ）に変換する速度（ｖ２）を表４に示す。なお、ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｃ）は検出できなかったため、速度（ｖ２）は０とした。また、実施例１７と同様にして算出したデキストランの合成量は４２．１μｇであった。
【０１６２】
【表１】
2016077298.tif 000012
【０１６３】
【表２】
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【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
反応溶液中のＡＭＰの濃度が前記（Ｂ）の阻害濃度（ＩＣ５０）の１０倍未満である時間が前記（Ａ）に前記（Ｂ）を作用させる時間の１０％以上である本発明の製造方法の実施例１〜２０は、比較例１〜１４と比べて、多糖の合成量が極めて多いことがわかる。したがって、本発明の製造方法は、単位酵素［多糖合成酵素（Ｂ）］あたりの多糖の生産量が多く、多糖の生産性が高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明の多糖の製造方法によれば、多糖を高効率で生産できる。また、本発明の製造方法により得られた多糖は、化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器だけでなく、食品等にも用いることができる。
【配列表】
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