(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオマテリアルの原料となる酸可溶性キシラン及び／又はリグニンの高生産能力を有する植物の提供。【解決手段】対象とする植物において、シロイヌナズナ由来の「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子、又はそのホモログの機能を阻害することでキシラン及び／又はリグニンの生産を増加させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)〜(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を阻害する工程を含む、増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物の生産方法；
（ア）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の生産方法であって、
前記転写因子の機能を阻害する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程である、植物の生産方法；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列が、配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3遺伝子のプロモータである、請求項２に記載の植物の生産方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して硫酸糖化処理を施す工程とを含む、キシロースの製造方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセット；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列が、配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含むキット。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における特定の転写制御因子の機能を阻害することにより、リグニン、特に酸可溶化リグニン及び／又はキシランが高蓄積する植物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、過剰な二酸化炭素の放出による地球温暖化の進行と化石燃料の枯渇に対する危機感、およびそれに伴う化石燃料の価格上昇、などの要因により、再生可能マテリアルの利用が注目を集めている。とくに植物由来バイオマテリアルは廃棄、燃焼によって生じる二酸化炭素を新たな放出と捉える必要がない(カーボンニュートラル)ことから、非常に期待されている。しかし、従来のバイオマテリアルはトウモロコシのデンプンなど食糧になり得るものを原料として生産されており、世界人口の増加により食糧の需給が逼迫しつつある現況から考えて持続可能なものとは言いがたい。そこで、非可食である木質を原料とした第二世代バイオマテリアルの実用化が求められている。ヘミセルロースは木質(二次細胞壁、二次壁)を構成する主要な糖ポリマーのうち、セルロース以外の糖ポリマーの総称であり、たとえばキシランはキシロースが繰り返し結合したポリマーである。菌類などを由来とするキシラナーゼによって処理することによってキシロースが得られる。キシロースは様々な化学物質合成の出発原料となる基幹化合物である。また、木質中の別の主要物質の一つであるリグニンは芳香環を持つ化合物モノリグノールが複雑に重合したものである。モノリグノールは芳香環を持つ様々な化学物質合成の出発原料となる基幹化合物になりえる。したがって、リグニンからモノリグノールもしくは低分子量リグニンを容易に回収することができれば、有用性が高い。このようなことから、ヘミセルロースや低分子量リグニンを増加させることは重要な開発目標となりえる。
【０００３】
ヘミセルロースやリグニンも主要な構成要素である木質全体の形成を制御する遺伝子は、本発明者らが発見したNST転写因子遺伝子がよく知られている(非特許文献１)。NST転写因子は、モデル実験植物シロイヌナズナにおいて発見された遺伝子で、nst1 nst3二重変異体では、導管を除いて木質(二次細胞壁)がまったく形成されなくなる。木質の主要成分のうちリグニンの合成を制御する遺伝子としては、MYB58およびMYB63転写因子遺伝子が知られている(非特許文献２)。しかし、MYB58およびMYB63転写因子遺伝子によって生産が誘導されるリグニンは、酸不溶性の通常の木質に含まれているリグニンであると考えられ、酸可溶性のモノリグノールや低分子量リグニンを取り出すことは容易ではないと推測される。また、ヘミセルロースに関してはその合成を制御する転写因子遺伝子は知られていない。
このように酸可溶性リグニンやヘミセルロースを選択的に増強するのは容易ではなく、未だ確実な方法が確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mitsuda.N et al., The Plant Cell, 2007 19,270-280
【非特許文献２】Zhou.J et al., The Plant Cell, 2009 21,248-266
【非特許文献３】Oshima.Y et al., Plant Biotechnology, 2011 28,201-210,
【非特許文献４】Sakamoto.S and Mitsuda.N, Plant Cell Physiol 2014, doi: 10.1093/pcp/pcu208
【非特許文献５】NREL(NATIONAL RENEWABLE ENERGY LABOLATORY), “Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass (Laboratory Analytical Procedure (LAP)”, 2008, NREL/TP-510-42618
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、植物の作るリグニン、特に酸可溶性リグニン及び／又はキシランの生産能力を増強して、それらの生産量を増やす技術を提供することを目的とする。酸可溶性リグニンは容易に取り出すことができ、芳香環を持つ化合物全般の合成原材料とすることができる。また、キシランを分解して得られるキシロースも五炭糖由来化合物全般の合成原材料とすることができる。これらバイオマテリアルの生産促進により低炭素化社会の実現に向けて貢献できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
二次細胞壁に含まれるヘミセルロースやリグニンを選択的に増強させるためには、それらの生合成を制御する遺伝子を強化するなどして木質繊維細胞で発現させる必要があると考えられる。本発明者らは植物特異的な転写因子であるNACファミリー転写因子群をシロイヌナズナにおいて網羅的に機能解析する過程で、木質形成を根本的に制御する転写因子遺伝子として、NST転写因子群(NST1、NST2、NST3)を発見した(非特許文献１)。
これらのうち、シロイヌナズナのnst1 nst3二重変異体では花茎や胚軸の木質繊維細胞で木質がまったく形成されなくなり、花茎の強度が大幅に低下した結果、直立することができなかった。しかし、同様に木質が形成される導管においては木質の欠損が起こることはなく、植物の生存には影響がなかった(非特許文献１)。
【０００８】
本発明者らは、木質形成を部分的に制御するシロイヌナズナの転写因子遺伝子について広く検討するなかで、C2H2ジンクフィンガー転写因子遺伝子の一つであるLXF1遺伝子の機能を阻害した植物体を作製したところ、キシラン及びリグニンの産生能が増加していることを見出した。
以上の知見から、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
〔１〕対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)〜(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を阻害する工程を含む、増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物の生産方法に関する；
（ア）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００１０】
ここで、〔２〕本発明の植物の生産方法の一実施の形態においては、
前記転写因子の機能を阻害する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程であることを特徴とする；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列が、配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００１１】
また、〔３〕本発明の植物の生産方法の一実施の形態においては、前記木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータであることを特徴とする。
また、別の態様によれば、〔４〕本発明は、前記〔１〕〜〔３〕に記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して硫酸糖化処理を施す工程とを含む、キシロースの製造方法に関する。
【００１２】
また、別の態様によれば、〔５〕本発明は、前記〔２〕又は〔３〕に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットに関する；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列が、配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００１３】
また、別の態様によれば、〔６〕本発明は、前記〔５〕に記載の発現カセットを含むベクターに関する。
また、別の態様によれば、〔７〕本発明は、前記〔６〕に記載のベクターを含むキットに関する。
また、別の態様によれば、〔８〕本発明は、前記〔６〕に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の植物の生産方法によれば、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子又はそのホモログの機能を阻害することでキシラン及び／又はリグニンの産生能が増強した植物を生産することが可能となる。これにより、植物１個体あたりから生産できるキシラン及び／又はリグニンの量を増加することができる。これらを増加できればバイオマテリアル生産量を増やすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、proNST3:LXF1-SRDX nst1 nst3株(LXF1転写因子にSRDX転写抑制化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株)の茎を、それぞれ、モイレ染色した画像(上段)、キシラン抗体により蛍光標識した画像(中段)、結晶化セルロース結合タンパク質により蛍光標識した画像(下段)を示す。  モイレ染色によって茎の横断切片におけるリグニンの分布を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体においてLXF1-SRDXをコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、LXF1-SRDX相補ラインともいう。)では、野生株とは異なる様態でのリグニン沈着が見られた。キシラン抗体によりキシランの分布を観察したところ、リグニンの沈着が見られた部位ではキシランの沈着も観察された。一方で、結晶化セルロースの抗体により結晶化セルロースの分布を観察したところ、LXF1-SRDX相補ラインでは導管以外での結晶化セルロースの沈着は見られなかった。
【図２】図２は、LXF1-SRDX相補ライン(proNST3:LXF1-SRDX nst1 nst3)とネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)とにおけるキシロースの含量を比較したグラフを示す。LXF1-SRDX相補ラインでは鮮重量あたりの茎のキシロース含量が、ネガティブコントロール株に比べて約30％キシロース含量が増えていた。なお、アスタリスク(＊)は、Welch’s t-testによる有意差(p<0.05)を示す。
【図３】図３は、LXF1-SRDX相補ライン(proNST3:LXF1-SRDX nst1 nst3)とネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)とにおける、酸不溶性リグニン含量と酸可溶性リグニン含量とをそれぞれ比較したグラフを示す。LXF1-SRDX相補ラインでは鮮重量あたりの酸不溶性及び酸可溶性リグニン含量がネガティブコントロール株に比べてそれぞれ約60％又は約90％増えていた。なお、アスタリスク(＊)は、Welch’s t-testによる有意差(＊：p<0.05、＊＊：ｐ<0.01)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．本発明におけるキシラン及び／又はリグニンの発現を増強した植物について
（１）本発明におけるキシラン及び／又はリグニンの発現を制御する遺伝子について
本発明において植物に対して高いキシラン及び／又はリグニン生産能を制御する遺伝子は、典型的には、シロイヌナズナ由来の配列番号２で表される「LXF1遺伝子」である。本願明細書において、キシラン及び／又はリグニンの発現を制御する遺伝子として「LXF1遺伝子」を意味する際には、配列番号２で示される「LXF1遺伝子」に限られず、そのオルソログ、パラログなどのホモログやその塩基配列の一部に変異が導入されたものも含まれる。そして、当該「LXF1遺伝子」又はそのホモログによりコードされるタンパク質(転写制御因子)の機能を阻害することで、キシラン又はリグニンの生産能が向上した植物を得ることができる。なお、好ましくは、上記転写制御因子の機能を阻害することにより、キシラン及びリグニンの両方の生産能が向上した植物を得ることができる。
【００１７】
「LXF1遺伝子」は、高等植物全般に広く保存されており、イネにおける相同遺伝子と考えられる「Os03g0610400遺伝子」とは、アライン可能領域内のアミノ酸レベルで約43％の相同性が認められる。このことから、他の植物ゲノム中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子のうちでも「LXF1遺伝子」とアミノ酸レベルで少なくとも50％、好ましくは60％、70％、より好ましくは80％、90％、95％のホモロジーを有する類似遺伝子であれば同様に用いられることが明らかである。また同一機能を保持している限り、そのフラグメントでもよい。そのような遺伝子は、アミノ酸配列では配列番号１とは少なくとも50％、好ましくは60％、70％、より好ましくは80％、90％、95％以上のホモロジーを有する。
【００１８】
（２）本発明におけるキシラン及び／又はリグニン増強形質を有する植物の作出方法
本発明の増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物の生産方法は、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害する工程を含み、当該工程により増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物を得ることができる。
【００１９】
本発明の増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物の生産方法において、機能阻害の対象である「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ア)〜(オ)のように記載することができる；
（ア）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの発現を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、キシラン及び／又はリグニンの発現を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの発現量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２０】
ここで、「アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、2〜50個，好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の変異が存在することを指す。
【００２１】
また、上述のように、機能阻害の対象となる転写制御因子としては、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、かつ、キシラン及び／又はリグニンの発現を制御する活性を有する転写制御因子も含まれる。また、同一の機能を保持している限り、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有する転写制御因子は、そのフラグメントであってもよい。「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に対する同一性は、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％であることが好ましい。
【００２２】
また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号２に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。例えば、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件などである。
【００２３】
また、本発明の対象となる植物としては、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できるが、特にバイオマス資源の観点からは、ポプラ、ユーカリ、アカシアなどの双子葉木本植物が好ましい。ただし、本発明は、これらの植物に限定されるものではなく、ミスカンザス、エリアンサス、ダンチク、ソルガム、ススキなどの単子葉エネルギー植物の育種一般にも適用できる。
【００２４】
本発明によれば、例えば、上記に列挙するような植物について、増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物を得ることができる。また、本明細書において、「植物の子孫」というとき、当該植物の有性生殖または無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本明細書において、「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」というときは、特別な場合を除き、当該植物又はその子孫の植物における、種子(発芽種子、未熟種子を含む)、器官又はその部分(葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む)、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
【００２５】
また、本明細書において、「キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性」とは、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子が本来的に備えているキシラン及び／又はリグニンの生合成に関係する遺伝子の転写制御活性をいう。本明細書においては、とりわけ、当該転写制御因子又はそのホモログや変異体において、その機能を阻害した際に、植物体内においてキシラン及び／又はリグニンの合成が増す場合、当該転写制御因子若しくはそのホモログ、又はそれらの変異体は、キシラン及び／又はリグニンの合成を制御する活性を有しているということができる。なお、キシラン及び／又はリグニンの合成が増すとは、キシラン又はリグニンのいずれか一方の合成が増加する態様を含み、好ましくは、両方の合成が増加する態様をいう。また、当該転写制御因子が本来的に備えている転写の制御活性は、当該転写制御因子の機能と同義で使用される。
【００２６】
また、本明細書において、「転写制御因子の機能を阻害する」とは、転写制御因子としての機能を失わせることを意味する。転写制御因子としての機能の喪失としては、例えば、タンパク質−タンパク質間の相互作用の機能の消失、DNA結合能の消失、又はこれら機能の消失若しくはその他の原因による転写調節機能の消失及び／又は機能の逆転などを挙げることができる。このように、転写制御因子の機能が阻害されることにより、当該転写制御因子の標的遺伝子の発現が抑制又は促進される。あるいは、当該転写制御因子の機能が阻害されることにより、当該転写制御因子の標的遺伝子の発現が抑制又は促進され、そのさらに下流の遺伝子の発現が抑制又は促進される。すなわち、本明細書中において、「転写制御因子の機能を阻害する」とは、「転写制御因子の標的遺伝子の発現を抑制する」、「転写制御因子の下流遺伝子の発現を抑制する」、若しくは「下流遺伝子の機能を抑制する」、又は「転写制御因子の標的遺伝子の発現を促進する」、「転写制御因子の下流遺伝子の発現を促進する」、若しくは「下流遺伝子の機能を促進する」などの意味を含む。そして、本明細書において「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害するという場合、結果的にキシラン及び／又はリグニンの合成が促進されることを意味する。
【００２７】
転写制御因子の機能を阻害する手法は、植物体内における目的の転写因子の遺伝子又はタンパク質の発現を抑制することであってもRNAの合成阻害であってもタンパク質の合成阻害であってもよい。なお、転写制御因子の機能を阻害する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、当該転写制御因子をコードする遺伝子の破壊や機能欠損変異の導入(ノックアウト法やノックイン法)、放射線照射等の変異原処理による当該遺伝子への機能欠損変異の導入、転写産物を分解または翻訳を抑制する核酸の導入(RNAi法やアンチセンスRNA、リボザイムRNAの利用)、CRES-T法などを挙げることができるが、これらに限定されない。
なお、本発明において、転写制御因子の機能を阻害する場合、好ましくは、植物の木質繊維細胞特異的に当該転写因子の機能を阻害する手法である。そのような手法は、当業者であれば、例えば、プロモータとともに核酸を導入する手法において、木質繊維細胞特異的プロモータの利用などにより適宜実施することができる。
【００２８】
なお、以下では、本発明の一実施の形態であるCRES-T法を用いた「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害する方法を、一例として具体的に説明する。しかしながら、本発明は、下記の説明で引用するCRES-T法に限られず、「LXF1遺伝子」又はそのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)によりコードされる転写制御因子の機能を阻害できる方法であれば上記に挙げたものを含めて採用することができる。
【００２９】
本発明の一実施の形態であるCRES-T法を用いた形質転換植物の作出方法では、シロイヌナズナ由来の「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子に「転写抑制化ドメイン」が付加されたポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。
【００３０】
CRES-T法(例えば、国際公開第２００３／０５５９０３参照)とは、転写制御因子に対してインフレームで機能性ペプチド(転写抑制化ドメイン)が付加されたポリペプチドを植物体内で発現させることにより、当該転写制御因子の活性を阻害し、当該転写制御因子の機能解析や、有用な機能を有する転写制御因子の探索を目的として行うことのできる手法である。CRES-T法に使用される機能性ペプチドとしては、SRDX(LDLDLELRLGFA:配列番号３)が好ましく用いられている。
【００３１】
本発明の一実施の形態において、CRES-T法を用いて「LXF1遺伝子」の機能を阻害する場合、キシラン及び／又はリグニン増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列が、配列番号２又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３２】
ここで、「配列番号１に示される第一のアミノ酸配列」とは、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列であるって、第二のアミノ酸配列とインフレームに連結するためにそのＣ末端側の一部を欠いていてもよい。本発明に使用される「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列」としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)または(ii)のいずれかであって、かつ、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ii）当該アミノ酸配列と少なくとも50％、より好ましくは、60％、70％、さらに好ましくは、80％、90％、95％以上の同一性を有するアミノ酸配列。本発明の一実施の形態であるCRES-T法を用いた植物の作出方法において、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドという場合、好ましくは、当該転写制御因子のDNA結合能を有するポリペプチドである。すなわち、当該転写制御因子のDNA結合領域を含むポリペプチドであれば、当該転写制御因子の断片のアミノ酸配列も、本発明に使用される「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列」に含まれる。
【００３３】
また、「配列番号３に示される第二のアミノ酸配列」とは、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害するために付加される「転写抑制化ドメイン」である。本発明に使用される「転写抑制化ドメイン」としては、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ii)のいずれかであって、かつ、第一のアミノ酸配列によりコードされる転写制御因子の機能を阻害可能なポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ii）当該アミノ酸配列と少なくとも80％以上、より好ましくは、90％以上、さらに好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列。このような転写抑制化ドメインとしては、例えば、特開２００５−２９５８７８に機能性ペプチドとして開示されるポリペプチドを具体的に挙げることができる。
【００３４】
また、「第一のアミノ酸配列」と「第二のアミノ酸配列」、又は「第一の塩基配列」と「第二の塩基配列」は、それぞれ、「ポリペプチドリンカー」又は「ポリヌクレオチドリンカー」を介して連結されていてもよい。なお、当該リンカーの使用は必須ではなく、必要に応じて適宜設計・使用することができる。当該リンカーのアミノ酸配列または塩基配列は、当該転写制御因子の機能を阻害可能なポリペプチドを産生できる限りにおいて特に限定されず、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカー又は配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドリンカーを好適に使用することができる。また、リンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じた配列を含ませることもできる。例えば、ゲートウェイLR反応によって生じたattB配列などを含ませることができる。従って、リンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等により、当業者であれば適宜好ましいリンカーを設計可能である。
【００３５】
なお、第一のアミノ酸配列又は塩基配列と、第二のアミノ酸配列又は塩基配列との配置の順序は、どちらがＮ末側又は５’側に配置されてもよい。好ましくは、Ｎ末側又は５’側より、（１）第一のアミノ酸配列又は塩基配列、（２）ポリペプチドリンカー又はポリヌクレオチドリンカー、（３）第二のアミノ酸配列又は塩基配列の順である。なお、(１)と(３)の位置を入れ替える際には、１つのポリペプチドとして翻訳されるように、適宜開始コドンや終止コドンの設計を行う。
【００３６】
また、本明細書において、「発現カセット」とは、そのカセットに内包された核酸(主に、遺伝子又はその断片)を発現することのできる一つの発現系単位をいう。発現カセットは、前記核酸を含む領域の他に、遺伝子発現に必要な発現調節領域を有する。そのような発現調節領域には、例えば、プロモータ及びターミネータが含まれる。また、その他の構成として、エンハンサ、ポリA付加シグナル、5’-UTR(非翻訳領域)、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むことができる。発現カセットには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそのまま取り出したものや、様々な生物由来の発現調節領域等を組み合わせる等して人工的に構築したものが存在する。本発明においては、いずれの発現カセットも利用することが可能である。また、上述する発現調節領域の構成については、本明細書中に記載のない限り、当該分野において公知の構成を適宜選択することが可能である。
【００３７】
本明細書において「発現カセット」は、目的とする植物内の「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の活性を阻害する効果を提供し、その植物においてキシラン及び／又はリグニンの合成量を増加させる機能を有する。
【００３８】
（２−１）CRES-T法によりキシラン及び／又はリグニンの合成が増強された植物の作出方法
CRES-T法において用いられる導入遺伝子を発現させるためのプロモータは、「木質繊維細胞において遺伝子発現を誘導するプロモータ」であり、具体的には、NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータ、NST結合配列(SNBE)を繰り返してコアプロモータの上流に配置した人工プロモータ、二次細胞壁セルロース合成酵素のプロモータ、リグニン合成に関与する酵素類のプロモータ、キシラン合成に関与する酵素類のプロモータである。特に、シロイヌナズナ由来のNST1及びNST3遺伝子のプロモータが、木質繊維細胞特異的に強い発現を促す点において好ましい。
導入遺伝子を木質繊維細胞で発現するプロモータの下流に配置したコンストラクト(組換えベクター)を構築し、野生株もしくはNST転写因子もしくはそのオルソログ転写因子遺伝子の機能が抑制された植物に形質転換して作製する。
【００３９】
本明細書において「ベクター」とは上記発現カセットを含むものであって、上記発現カセットに含まれる塩基配列からなる核酸の増殖に使用される大腸菌等へ導入されるベクターや、植物の形質転換を行うためのベクターを含む。本発明に使用されるベクターとしては、当該分野において公知のベクターを使用でき、導入する植物やベクターの使用する手法・目的に応じて適宜選択すればよい。ベクターとしては、例えば、下記実施例にて使用されるpDEST_NST3p_SRDX_HSP_GWB5などを使用することができるが、これに限定されない。
【００４０】
本発明は、一つの態様として、増加したキシラン及び／又はリグニンを含有する植物を生産するためのキットを提供する。当該キットの具体例としては、「LXF１遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害するために使用されるベクターを挙げることができる。このようなベクターを含むキットとしては、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、下記(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを少なくとも含んでいればよい。
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号３に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、配列番号１及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号４に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、配列番号２及び／又は配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、キシラン及び／又はリグニンの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
また、当該ベクターは植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
【００４１】
遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法が典型的であるが、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等、従来周知の方法が適用できる。
【００４２】
（３）「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が阻害された植物の形質的特徴の評価
（３−１）硫酸糖化処理によるキシロース量の評価
「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が阻害された植物においては、キシランの合成量が増加する。増加したキシランを評価するには、例えば、「硫酸糖化処理」によりキシロースを得て、得られたキシロースの量を測定することにより間接的に評価することができる。
「硫酸糖化処理」は、細胞壁成分から大半の中性糖を抽出するための周知の手法であり、硫酸存在下で加熱炭化した後加水分解して単糖類を取得する。
下記の実施例により得られたLXF1-SRDX相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎の下部10cmをサンプリングして細胞壁精製粉末を得た後、硫酸糖化処理を行い、鮮重量あたりで得られるキシロースの量を比較したところ、LXF1-SRDX相補ラインではネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)よりも約30％も多く得られることがわかった(図２)。なお、VAMP722は植物の液胞膜への膜輸送に関する遺伝子であり、この遺伝子を用いて形質転換したネガティブコントロール株では、元株であるnst1 nst3二重変異体と比較してキシロース量の増加はほとんど見られなかった。
このように、本発明により得られるキシランの発現量が増加した植物は、当該植物の元株であって「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害していない植物体とキシロース量を比較した際に、20％以上、より好ましくは30％以上増加したキシロースを含有する。
【００４３】
（３−２）リグニン量の評価
「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が阻害された植物においては、リグニンの合成量が増加する。リグニンの合成量は、例えば、下記のようにして評価することができる。
LXF1-SRDX相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎の下部10cmをサンプリングしてリグニン量を定量する。
「リグニン量の定量」は、NREL (National Renewable Energy Laboratory)が公開しているLAP (Laboratory analytical procedure、非特許文献５)法でリグニン定量をおこなった。具体的には、アミラーゼ、アミログルコシダーゼによる除デンプン処理後リグニンを酸加水分解し、その際に生じる残渣重を測定し酸不溶性リグニンを、また加水分解後の上清におけるUV吸収を分光光度計で測ることによって酸可溶性リグニン量を測定する。その結果、LXF1-SRDX相補ラインにおいてネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)よりも酸不溶性リグニンで約60％、酸可溶性リグニンで約90％有意に高かった(図３)。
このように、本発明により得られるリグニンの合成量が増加した植物は、当該植物の元株であって「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害していない植物体と酸不溶性リグニン量を比較した際に、40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上増加した酸不溶性リグニンを含有する。また、同様にnst1 nst3二重変異体と酸可溶性リグニン量を比較した際に、70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上増加した酸可溶性リグニンを含有する。
【００４４】
２．その他
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol..1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などに記載の方法により、またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http：//www.arabidopsis.org/またはhttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
（実施例１）ProNST3：LXF1-SRDXで形質転換したnst1 nst3二重変異体シロイヌナズナ植物体の作成
（１−１）形質転換ベクターProNST3：LXF1-SRDXの構築
以下のように形質転換ベクターを構築した。
終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のLXF1タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、かつてインビトロジェン社が販売していたゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクターに、BPクロナーゼによってクローニングした。
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTCTCGACACTCTCAATTCTCCCA-3’ (配列番号７)
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAACACCGACTTTGTTTCTTCACCGGAGAG-3’(配列番号８)
つぎに、pDEST_NST3p_SRDX_HSP_GWB5ベクター(下記に詳細を記述) にLRクロナーゼによって上記LXF1遺伝子のタンパク質コード領域を移し変えることによって、形質転換に使用したベクターを構築した。pDEST_NST3p_SRDX_HSP_GWB5ベクターは以下のように構築した。
非特許文献３に記載のpDEST_35S_SRDX_HSPHの35Sプロモータ・オメガ翻訳エンハンサ・attR1/R2ゲートウェイカセット・SRDX転写抑制ドメイン・HSPターミネータ領域をHindIII制限酵素で切り出し、非特許文献４に記載のpMCS_delHSP_GWB5ベクターのHindIIIサイトに挿入して中間ベクターpDEST_SRDX_HSP_GWB5を構築した。つぎに、シロイヌナズナ由来のNST3プロモータを下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、上記により作成した中間ベクターpDEST_SRDX_HSP_GWB5をKpnI、XhoIで切断して挿入し、pDEST_NST3p_SRDX_HSP_GWB5ベクターを構築した。
5’-AAATTTGGTACCACTATATATAATTTACCCAACAAACAC-3’(配列番号９)
5’-AAATTTCTCGAGTAACGAAGATAGCAATATATTTTTGG-3’ (配列番号１０)
なお、pDEST_NST3p_SRDX_HSP_GWB5ベクターには、NST3プロモータの下流に、LXF1遺伝子のタンパク質コード領域とSRDX転写抑制ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物の木質繊維細胞内では、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
【００４７】
(１−２)フローラルディップ法を用いたProNST3：LXF1-SRDXによるシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体の形質転換
上記実施例(１−１)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200mLの抗生物質(カナマイシン(Km)50mg/L、ゲンタマイシン(Gm)25mg/Lおよびリファンピシリン(Rif)50mg/L)を含むLB培地で2日間培養した。
次いで、培養液から菌体を回収し、500mLの浸潤培地(Infiltration medium；特許文献１を参照)に懸濁し、米国シロイヌナズナバイオリソースセンター(ABRC)から取り寄せたT-DNAタグラインSALK_123077、SALK_149909を掛け合わせて作成したシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体(非特許文献１を参照)を45日間〜60日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに10日間育てた後に2分間浸して感染させた後、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50％ブリーチ、0.02％TritonX-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、30mg/lのハイグロマイシン(Hg)を含むMS選択培地に播種した。
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3、T1)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。
【００４８】
（実施例２）ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で花茎を採取し、地上高約3cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、モイレ試薬でリグニンを染色した。その結果、ネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)では維管束細胞でしか染色が観察されないのに対し、ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナでは繊維細胞領域でも明らかな染色が認められリグニン様物質が蓄積していることがわかった(図１)。また、同横断切片をキシラン抗体で抗体染色したところ、元株であるnst1 nst3二重変異体と同様であるネガティブコントロール株では維管束細胞でしか染色が観察されないのに対し、ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナでは繊維細胞領域でも明らかな染色が認められキシラン様物質が蓄積していることがわかった(図１)。しかし、同横断切片を結晶化セルロース結合タンパク質であるCBM3a(Pant probes社製)を用いて抗体染色したところ、元株であるnst1 nst3二重変異体と同様であるネガティブコントロール株以下の染色しか認められなかった(図１)。このことは、LXF1-SRDX相補ラインにおいて、キシランとリグニンが選択的に生産されていることを示している。
【００４９】
（実施例３）ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（３−１）細胞壁成分の抽出
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で基部より10cmの部分を採取し、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。80℃で10分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、100％エタノール溶液で３回リンスした後、70℃で2日間乾燥させた。
【００５０】
（３−２）硫酸糖化処理によるキシロースの製造及び比較
乾燥した細胞壁残渣はシェイクマスターネオを用いて1500rpm 10分間の粉砕処理を行い、粗細胞壁粉末を得た。粗細胞壁粉末約100mgを1mLの50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4mLの50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500 U α-アミラーゼ(E-PANAA)、0.33 Uアミログルコシダーゼ(E-AMGIF)、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1mL加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解した。デンプン加水分解後の細胞壁粉末懸濁液は、10mLの蒸留水で３回、100％エタノールで２回リンスした後、70℃で2日間乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2mgを0.05mLの72％硫酸溶液で懸濁し、1500rpmで撹拌しながら、1時間室温で細胞壁を炭化させた。その次に、1.4mLの蒸留水を加えて硫酸濃度を4％に希釈した後、120℃、60分間細胞壁の加水分解を行った。加水分解後の懸濁液は、20000×g、5分間遠心し、上清と残渣を分離し、得られた上清は炭酸カルシウムでpHが5から7になるよう調整した後、溶液中に含まれるキシロース量を液体クロマトグラフィーにより調べた。その結果、ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3ではネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)に比べて鮮重量あたり約30％も多くのキシロースを得られることがわかった(図２)。
【００５１】
（３−３）リグニン含量の比較
前記(３−２)と同様の細胞壁精製粉末への加水分解処理により生じた酸不溶性残渣は、蒸留水1mLで２回、100％エタノールで２回リンスした後、70°Cで乾燥させた。乾燥後の残渣の重量を酸不溶性リグニンとして測定した。また、硫酸加水分解後の上清について、分光光度計にて210nmにおける吸光度を測定し、酸可溶性リグニン含量を測定した。その結果、ProNST3：LXF1-SRDX nst1 nst3ではネガティブコントロール株(LXF1-SRDX相補ラインの元株であるnst1 nst3二重変異体を、VAMP722をコードする核酸を含むベクターにより形質転換した株)に比べて鮮重量あたり約60％酸不溶性リグニン量が、約90％酸可溶性リグニンが、それぞれ増加していた(図３)。
【００５２】
なお、上記の実施例においては、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害する対象の植物としてnst1 nst3二重変異体を用いた。これは、部分的に形成された木質を検出しやすくするためである。なお、当業者であれば、「LXF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を阻害することで、野生型の植物内においてもキシラン及び／又はリグニンの合成量を増加させることが可能であると理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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