(57)【要約】【課題】ＤＮＡおよびＲＮＡを含む生体試料からＤＮＡとＲＮＡの両方を簡便且つ効率良く単離する方法を提供すること。【解決手段】ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。  （Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程  （Ｂ）工程（Ａ）で得られた第１の核酸結合担体と上清とを分離する工程  （Ｃ）工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体から、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を溶出させる工程  （Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程  （Ｅ）工程（Ｄ）で得られた第２の核酸結合担体と上清とを分離する工程  （Ｆ）工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体から、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を溶出させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた第１の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体から、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた第２の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体から、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を溶出させる工程
【請求項２】
ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体から、ＲＮＡを溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを、低級アルコールが添加された液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたＤＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離されたＤＮＡ結合担体から、ＤＮＡを溶出させる工程
【請求項３】
工程（Ａ）を、酸性条件下で行う、請求項２に記載の単離方法。
【請求項４】
前記リチウム塩が、リチウムの無機塩およびリチウムの有機塩から選ばれる１種以上である、請求項２または３に記載の単離方法。
【請求項５】
前記リチウム塩が、塩化リチウム、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、炭酸リチウム、水酸化リチウムおよびホウ酸リチウムから選ばれる１種以上である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項６】
ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを、ポリアルキレングリコールが添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＤＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＤＮＡ結合担体から、ＤＮＡを溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを、低級アルコールまたはリチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離されたＲＮＡ結合担体から、ＲＮＡを溶出させる工程
【請求項７】
前記低級アルコールまたはリチウム塩が、低級アルコールである、請求項６に記載の単離方法。
【請求項８】
前記ポリアルキレングリコールが、重量平均分子量６０００〜１００００のポリアルキレングリコールである、請求項６または７に記載の単離方法。
【請求項９】
第１の核酸結合性担体および第２の核酸結合性担体が、磁性粒子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項１０】
第１の核酸結合性担体および第２の核酸結合性担体が、核酸結合性官能基を有する非シリカ系磁性粒子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項１１】
工程（Ａ）の液相が、カオトロピック剤が添加された液相である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項１２】
前記カオトロピック剤が、グアニジウム塩、尿素、ヨウ化物、過塩素酸塩、チオシアン酸塩およびイソチオシアン酸塩から選ばれる１種以上である、請求項１１に記載の単離方法。
【請求項１３】
前記グアニジウム塩が、塩酸グアニジウム、酢酸グアニジウム、リン酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、硫酸グアニジウムおよび炭酸グアニジウムから選ばれる１種以上である、請求項１２に記載の単離方法。
【請求項１４】
核酸分解酵素を使用せずにＤＮＡとＲＮＡを単離する方法である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法に関する。より詳細には、同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡの両方を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡは生命情報の担い手であり、ＲＮＡはその情報を受け、生体内でタンパク質合成等に関わる重要な役割を担っている分子である。
生化学、遺伝子工学および臨床診断等の分野において、ノザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼチェインリアション等の手法でＲＮＡ解析が行われており、斯かる解析を精度よく行うためには、高純度のＲＮＡを使用することが必要である。
そのため、ＲＮＡを高純度で単離する方法として、リチウム塩やカオトロピック剤等を含有する酸性溶液とシリカ粒子を、ＲＮＡを含む生体試料と混合し、ＲＮＡをシリカ粒子に吸着させ、その後ＲＮＡを溶出させる方法が提案されている（特許文献１）。
【０００３】
また、ＲＮＡとともにＤＮＡも分子生物学の分野において研究および臨床分析のために広く用いられる重要な分子である。ＤＮＡとＲＮＡの両方を生体試料から得る方法として、生体試料を溶解液で処理した後、これを２つにわけて、一方の生体試料をｐＨ７以上の緩衝液等で処理した後、これに含まれるＲＮＡを担体に吸着させるなどしてＲＮＡを得て、他方の生体試料をｐＨ７以上の緩衝液等で処理した後、これに含まれるＤＮＡを担体に吸着させるなどしてＤＮＡを得る方法が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−７５７８４号公報
【特許文献２】特表２００８−５１８６１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献２に記載のような方法では、抽出したＤＮＡにＲＮＡが混入しやすく、ＤＮＡを高純度化するためにはリボヌクレアーゼで処理することが必要であった。また、ＤＮＡとＲＮＡを別々の生体試料から得ようとすると、ＤＮＡ抽出過程におけるＲＮＡのロスやＲＮＡ抽出過程におけるＤＮＡのロスが生じ、ＤＮＡの収量とＲＮＡの収量がいずれも少なくなるという問題もある。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む生体試料からＤＮＡとＲＮＡの両方を簡便且つ効率良く単離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は以下の手段により解決された。
【０００７】
＜１＞ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた第１の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体から、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた第２の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体から、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を溶出させる工程
【０００８】
＜２＞ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体から、ＲＮＡを溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを、低級アルコールが添加された液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたＤＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離されたＤＮＡ結合担体から、ＤＮＡを溶出させる工程
＜３＞工程（Ａ）を、酸性条件下で行う、＜２＞の単離方法。
＜４＞前記リチウム塩が、リチウムの無機塩およびリチウムの有機塩から選ばれる１種以上である、＜２＞または＜３＞の単離方法。
＜５＞前記リチウム塩が、塩化リチウム、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、炭酸リチウム、水酸化リチウムおよびホウ酸リチウムから選ばれる１種以上である、＜２＞〜＜４＞のいずれかの単離方法。
【０００９】
＜６＞ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む、ＤＮＡとＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを、ポリアルキレングリコールが添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＤＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＤＮＡ結合担体から、ＤＮＡを溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを、低級アルコールまたはリチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離されたＲＮＡ結合担体から、ＲＮＡを溶出させる工程
＜７＞前記低級アルコールまたはリチウム塩が、低級アルコールである、＜６＞の単離方法。
＜８＞前記ポリアルキレングリコールが、重量平均分子量６０００〜１００００のポリアルキレングリコールである、＜６＞または＜７＞の単離方法。
【００１０】
＜９＞第１の核酸結合性担体および第２の核酸結合性担体が、磁性粒子である、＜１＞〜＜８＞のいずれかの単離方法。
＜１０＞第１の核酸結合性担体および第２の核酸結合性担体が、核酸結合性官能基を有する非シリカ系磁性粒子である、＜１＞〜＜９＞のいずれかの単離方法。
＜１１＞工程（Ａ）の液相が、カオトロピック剤が添加された液相である、＜１＞〜＜１０＞のいずれかの単離方法。
＜１２＞前記カオトロピック剤が、グアニジウム塩、尿素、ヨウ化物、過塩素酸塩、チオシアン酸塩およびイソチオシアン酸塩から選ばれる１種以上である、＜１１＞の単離方法。
＜１３＞前記グアニジウム塩が、塩酸グアニジウム、酢酸グアニジウム、リン酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、硫酸グアニジウムおよび炭酸グアニジウムから選ばれる１種以上である、＜１２＞の単離方法。
＜１４＞核酸分解酵素を使用せずにＤＮＡとＲＮＡを単離する方法である、＜１＞〜＜１３＞のいずれかの単離方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の単離方法によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む生体試料からＤＮＡとＲＮＡの両方を簡便且つ効率良く単離できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の単離方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む同一の生体試料からＤＮＡとＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含むものである。
（Ａ）前記生体試料と第１の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた第１の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体から、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を溶出させる工程
（Ｄ）工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた第２の核酸結合担体と上清とを分離する工程
（Ｆ）工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体から、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を溶出させる工程
【００１３】
〔工程（Ａ）〕
工程（Ａ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む生体試料と第１の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程である。斯かる工程（Ａ）により、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方が第１の核酸結合性担体に結合し、第１の核酸結合担体が形成される。
【００１４】
生体試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、糞便、精液、組織液、唾液や、これらから分離した細胞、培養細胞等が挙げられ、微生物やウイルス等でもよい。なお、生体試料は、安定化剤等で前処理したものでもよい。
また、ＤＮＡおよびＲＮＡは、内在性でも外来性でもよく、また、生体外で酵素的に合成されたものでもよい。ＤＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成オリゴＤＮＡ、ＰＣＲ産物等が挙げられる。ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、合成ＲＮＡ等が挙げられる。
生体試料の系中の濃度は、１〜１００（ｗ／ｖ）％とするのが好ましく、１０〜６０（ｗ／ｖ）％とするのがより好ましい。
【００１５】
第１の核酸結合性担体は、核酸を結合できる担体であれば特に限定されるものではなく、シリカやガラス、珪藻土、金属、金属酸化物等の無機物；樹脂等の有機物；これらの複合体のいずれでもよいが、非シリカ系担体が好ましい。樹脂は、多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース等）等の天然高分子で構成されていても、スチレン系ポリマー、スチレン−ブタジエン系共重合体、（メタ）アクリル酸エステル系ポリマー、（メタ）アクリロニトリル系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等の合成高分子で構成されていてもよいが、核酸結合性官能基を表面に有する樹脂が好ましい。
【００１６】
また、第１の核酸結合性担体としては、核酸結合性官能基を有するものが好ましい。核酸結合性官能基としては、核酸と結合可能な酸性基が好ましい。具体的には、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等が挙げられるが、解離定数の観点から、カルボキシ基、スルホン酸基が好ましく、カルボキシ基がより好ましい。
核酸結合性官能基の含有量は、単離効率の観点から、担体の固形分１ｍｇあたり、好ましくは１〜２０００ｎｍｏｌ、より好ましくは５〜１０００ｎｍｏｌ、特に好ましくは１０〜１００ｎｍｏｌである。なお、核酸結合性官能基の含有量は、電気伝導度測定法等により測定できる。特に、第１の核酸結合性担体にＤＮＡを結合させてＤＮＡ結合担体とする場合において、核酸結合性官能基の含有量を１０〜１００ｎｍｏｌとすることで、単離効率が大幅に改善される。
【００１７】
また、第１の核酸結合性担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ、粉末、容器、プレート等のいずれでもよいが、取り扱いやすさの観点から、粒子が好ましい。本発明において、第１の核酸結合性担体としては、分離の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、核酸結合性官能基を表面に有する樹脂中に磁性体を含む磁性粒子（以下、単に、樹脂中に磁性体を含む磁性粒子という）が好ましい。
磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、集磁や再分散の容易性の観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、または合金が挙げられる。
【００１８】
また、樹脂中に磁性体を含む磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のような粒子が挙げられる。
【００１９】
（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられた粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
なお、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。
【００２０】
また、第１の核酸結合性担体が粒子の場合の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．１〜５００μｍであり、より好ましくは０．２〜１００μｍであり、特に好ましくは０．３〜５０μｍである。なお、平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
【００２１】
斯様な第１の核酸結合性担体の中でも、磁性粒子が好ましく、核酸結合性官能基を有する非シリカ系磁性粒子がより好ましい。
【００２２】
第１の核酸結合性担体の使用量は、生体試料１００質量部に対し、通常、０．０１〜１００質量部程度であり、好ましくは０．１〜１０質量部である。
【００２３】
工程（Ａ）における液相としては、第１の核酸結合性担体にＲＮＡを結合させてＲＮＡ結合担体とする場合は、リチウム塩が添加されたものが好ましい。また、第１の核酸結合性担体にＤＮＡを結合させてＤＮＡ結合担体とする場合は、ポリアルキレングリコールが添加されたものが好ましい。
リチウム塩は、液相中にリチウムイオンを生じさせるものであれば特に限定されるものではなく、リチウムの無機塩でも、リチウムの有機塩でもよい。例えば、塩化リチウム、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、炭酸リチウム、水酸化リチウム、ホウ酸リチウム等が挙げられ、塩化リチウム、酢酸リチウムが好ましい。リチウム塩は、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
リチウム塩の系中の濃度は、通常１〜１０Ｍであり、好ましくは３〜８Ｍである。
ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プルロニック系界面活性剤のようなポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのＡＢＡ型ブロック共重合体等が挙げられ、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。ポリアルキレングリコールの重量平均分子量としては、１０００〜１０００００が好ましく、６０００〜１００００がより好ましい。斯かる重量平均分子量はＮＭＲ等で測定できる。
ポリアルキレングリコールの系中の濃度は、好ましくは５〜１０（ｗ／ｖ）％である。
【００２４】
また、工程（Ａ）における液相としては、カオトロピック剤が添加されたものが好ましい。カオトロピック剤としては、例えば、グアニジウム塩、尿素、ヨウ化物、過塩素酸塩、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩が挙げられ、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、カオトロピック剤としては、グアニジウム塩が好ましい。グアニジウム塩としては、塩酸グアニジウム、酢酸グアニジウム、リン酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、硫酸グアニジウム、炭酸グアニジウムが挙げられ、塩酸グアニジウム、酢酸グアニジウムが特に好ましい。
カオトロピック剤の系中の濃度は、好ましくは３〜８Ｍである。
【００２５】
また、第１の核酸結合性担体にＲＮＡを結合させてＲＮＡ結合担体とする場合は、工程（Ａ）の混合を酸性条件下で行うのが好ましく、ｐＨ６．０以下で行うのがより好ましく、ｐＨ３．０〜６．０で行うのが更に好ましく、ｐＨ４．０〜５．５で行うのが特に好ましい。一方、第１の核酸結合性担体にＤＮＡを結合させてＤＮＡ結合担体とする場合は、中性条件下またはアルカリ性条件下で行うのが好ましく、ｐＨ６．０〜９．０で行うのがより好ましく、ｐＨ６．５〜７．５で行うのが特に好ましい。ｐＨの調整は、各種緩衝液を用いて行えばよい。
なお、本明細書においてｐＨは２５℃におけるｐＨを意味する。
【００２６】
また、工程（Ａ）における液相は、上記各成分の他に、水、界面活性剤等を含んでいてもよい。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等が挙げられるが、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等）、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ２０等）が挙げられる。なお、界面活性剤は、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
工程（Ａ）の混合をする際の温度は、通常１０〜６０℃であり、混合時間は、１〜１０分間程度でよい。
【００２８】
〔工程（Ｂ）〕
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた第１の核酸結合担体と上清とを分離する工程である。具体的には、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、上清または第１の核酸結合担体を回収するなどすればよい。
また、工程（Ａ）における液相が、リチウム塩が添加されたものである場合は、工程（Ｂ）により、ＲＮＡ結合担体とＤＮＡを含む上清とに分離される。一方、工程（Ａ）における液相が、ポリアルキレングリコールが添加されたものである場合は、工程（Ｂ）により、ＤＮＡ結合担体とＲＮＡを含む上清とに分離される。
【００２９】
工程（Ｂ）で分離した第１の核酸結合担体は、工程（Ｃ）に先立ち、洗浄しておくのが好ましい（以下、この工程を洗浄工程（α）という）。
洗浄工程（α）の手法は、通常、担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように担体が粒子状である場合には、洗浄液中に粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、担体がプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。
担体が磁性粒子の場合の洗浄工程（α）としては、磁場を利用して磁性粒子を集めて磁性粒子と液相とを分離し、次いで磁性粒子を洗浄液中に再分散させる方法が好ましい。
なお、洗浄工程（α）の回数は、１回でも複数回でもよい。
【００３０】
洗浄液としては、リチウム塩、界面活性剤および低級アルコールから選ばれる１種以上を含む洗浄液が好ましい。特に、ＲＮＡ結合担体を洗浄する場合は、リチウム塩および界面活性剤から選ばれる１種以上を含む洗浄液や、低級アルコールを含む洗浄液が好ましく、ＤＮＡ結合担体を洗浄する場合は、低級アルコールを含む洗浄液が好ましい。
上記リチウム塩、界面活性剤としては、工程（Ａ）で使用できるものと同様のものが挙げられる。また、低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール等が挙げられ、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。中でも、エタノールが好ましい。
また、ＲＮＡ結合担体を洗浄する場合、洗浄液は、酸性であるのが好ましく、ｐＨ６．０以下であるのがより好ましく、ｐＨ３．０〜６．０であるのが更に好ましく、ｐＨ４．０〜５．５であるのが特に好ましい。
【００３１】
〔工程（Ｃ）〕
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体から、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を溶出させる工程である。工程（Ｃ）は常法の核酸溶出に準じて行えばよい。溶出方法としては、例えば、工程（Ｂ）で分離された第１の核酸結合担体を、各種緩衝液や水等の水系媒体中で撹拌する方法が挙げられる。その後、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、必要に応じて水系媒体を除去することで、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちいずれか一方を高純度で単離することができる。
また、工程（Ａ）における液相が、リチウム塩が添加されたものである場合は、工程（Ｃ）により、ＲＮＡ結合担体からＲＮＡが溶出する。一方、工程（Ａ）における液相が、ポリアルキレングリコールが添加されたものである場合は、工程（Ｃ）により、ＤＮＡ結合担体からＤＮＡ溶出する。
【００３２】
〔工程（Ｄ）〕
工程（Ｄ）は、工程（Ｂ）で分離された上清と第２の核酸結合性担体とを液相中で混合する工程である。斯かる工程（Ｄ）により、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸（工程（Ｂ）で分離された上清に含まれる核酸）が第２の核酸結合性担体に結合し、第２の核酸結合担体が形成される。
【００３３】
第２の核酸結合性担体としては、第１の核酸結合性担体と同様のものが挙げられる。中でも、磁性粒子が好ましく、核酸結合性官能基を有する非シリカ系磁性粒子がより好ましい。
第２の核酸結合性担体の使用量は、工程（Ｂ）で分離された上清に含まれる核酸が十分に結合できる量であればよく、例えば、上清１００質量部に対し、通常、０．０１〜１００質量部程度であり、好ましくは０．１〜１０質量部である。
【００３４】
工程（Ｄ）における液相としては、第２の核酸結合性担体にＤＮＡを結合させてＤＮＡ結合担体とする場合は、低級アルコールが添加されたものが好ましい。また、第２の核酸結合性担体にＲＮＡを結合させてＲＮＡ結合担体とする場合は、低級アルコールまたはリチウム塩が添加されたものが好ましく、低級アルコールが添加されたものがより好ましい。
【００３５】
リチウム塩としては、工程（Ａ）で使用できるものと同様のものが挙げられる。
リチウム塩を使用する場合、リチウム塩の系中の濃度は、好ましくは３〜８Ｍである。
【００３６】
低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール等が挙げられ、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、エタノール、プロパノール、イソプロパノールが好ましく、イソプロパノールが特に好ましい。
低級アルコールを使用する場合、低級アルコールの系中の濃度は、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％である。
【００３７】
また、工程（Ｄ）における液相は、上記各成分の他に、水等を含んでいてもよい。
【００３８】
工程（Ｄ）の混合をする際の温度は、通常１０〜６０℃であり、混合時間は、１〜１０分間程度でよい。
【００３９】
〔工程（Ｅ）〕
工程（Ｅ）は、工程（Ｄ）で得られた第２の核酸結合担体と上清とを分離する工程である。具体的には、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、上清または第２の核酸結合担体を回収するなどすればよい。
また、工程（Ａ）における液相が、リチウム塩が添加されたものである場合は、工程（Ｂ）で分離された上清中のＤＮＡが、工程（Ｄ）で担体に結合し、工程（Ｅ）により、ＤＮＡ結合担体が分離される。一方、工程（Ａ）における液相が、ポリアルキレングリコールが添加されたものである場合は、工程（Ｂ）で分離された上清中のＲＮＡが、工程（Ｄ）で担体に結合し、工程（Ｅ）により、ＲＮＡ結合担体が分離される。
【００４０】
工程（Ｅ）で分離した第２の核酸結合担体は、工程（Ｆ）に先立ち、洗浄しておくのが好ましい（以下、この工程を洗浄工程（β）という）。
洗浄工程（β）の手法は、通常、担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように担体が粒子状である場合には、洗浄液中に粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、担体がプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。
担体が磁性粒子の場合の洗浄工程（β）としては、磁場を利用して磁性粒子を集めて磁性粒子と液相とを分離し、次いで磁性粒子を洗浄液中に再分散させる方法が好ましい。
なお、洗浄工程（β）の回数は、１回でも複数回でもよい。
【００４１】
洗浄液としては、リチウム塩、界面活性剤および低級アルコールから選ばれる１種以上を含む洗浄液が好ましく、低級アルコールを含む洗浄液が好ましい。
上記リチウム塩、界面活性剤としては、工程（Ａ）で使用できるものと同様のものが挙げられる。また、低級アルコールとしては、洗浄工程（α）で使用できる低級アルコールと同様のものが挙げられる。
【００４２】
〔工程（Ｆ）〕
工程（Ｆ）は、工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体から、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を溶出させる工程である。工程（Ｆ）は常法の核酸溶出に準じて行えばよい。溶出方法としては、例えば、工程（Ｅ）で分離された第２の核酸結合担体を、各種緩衝液や水等の水系媒体中で撹拌する方法が挙げられる。その後、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、必要に応じて水系媒体を除去することで、ＲＮＡおよびＤＮＡのうち工程（Ｃ）で溶出させなかった核酸を高純度で単離することができる。
【００４３】
そして、上記工程（Ａ）〜（Ｆ）を含む本発明の単離方法によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む生体試料からＤＮＡとＲＮＡの両方を簡便且つ効率良く単離できる。
本発明の単離方法で単離されたＤＮＡにはＲＮＡの混入が少なく、また、単離されたＲＮＡへのＤＮＡの混入も少ないため、本発明の単離方法によれば、核酸分解酵素（リボヌクレアーゼやデオキシリボヌクレアーゼ）を使用するなどして混入した核酸を分解させなくても、ＤＮＡとＲＮＡの両方を高純度で得ることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
（１）ＨＴ２９細胞の培養
牛胎児血清を１（ｗ／ｖ）％含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にて、ヒト結腸腺ガン細胞であるＨＴ２９細胞を３７℃で３日間培養した。その後、培地を取り除き、ＥＤＴＡ２ｍＭ含有ＰＢＳを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間静置し、シャーレから細胞を剥がした。剥がした細胞をＤ−ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）に懸濁させた後、この懸濁液中の細胞数を血球計算盤を用いて計測し、マイクロチューブ（チューブＡとする）内で、ＨＴ２９細胞の濃度が１×１０6個／ｍＬとなるようにＤ−ＰＢＳ（−）を用いて希釈した。この細胞希釈液を、細胞希釈液Ａとする。
【００４６】
（２）ＲＮＡ抽出
チューブＡ中で、手順（１）で得た細胞希釈液Ａ（ＨＴ２９細胞１×１０5個相当量）に、溶解液（グアニジン塩酸塩：６Ｍ、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を２００μＬ加え、細胞を完全に溶解させた。これに、磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬと、８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。
次に、チューブＡを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ａとする）をマイクロピペットにて別のマイクロチューブ（チューブＢとする）へと移した。
そして、チューブＡに、洗浄液（塩化リチウム：３Ｍ、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を５００μＬ加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業をもう一度繰り返したのち、７０％エタノール１ｍＬによる洗浄を３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＡに水５０μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＡを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｂとする）をマイクロピペットで回収した。
【００４７】
（３）ＤＮＡ抽出
手順（２）にてチューブＢへと移した上清Ａ５００μＬに、２−プロパノール３００μＬと、磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。次に、チューブＢを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。
そして、チューブＢに、７０％エタノールを１ｍＬ加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業を計３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＢに水１００μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＢを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｃとする）をマイクロピペットで回収した。
【００４８】
（４）逆転写ＰＣＲによるｃＤＮＡの合成
手順（２）で得られた上清Ｂに含まれるＲＮＡから、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して逆転写ＰＣＲによりＨＴ２９細胞に定常的に発現しているｃＤＮＡを合成した。具体的手順を以下に示す。
まず、上清Ｂ１０μＬに、逆転写酵素、ＲＮａｓｅインヒビター、デオキシヌクレオチドミックス、オリゴ[ｄＴ]18プライマーおよびトランスクリプター反応用バッファーを、キットに添付されたマニュアル通りの濃度になるよう加え、液量が２０μＬとなるよう調整し、５５℃で３０分間処理した後、８５℃で５分間更に処理し、ｃＤＮＡを合成した後、氷上で冷却した。
【００４９】
（５）抽出ＲＮＡの解析
手順（４）にて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりβアクチンｍＲＮＡを増幅し、検出を行った。また、手順（２）で得られた上清Ｂを検体とし、リアルタイムＰＣＲによりβアクチンＤＮＡを増幅し、βアクチンＤＮＡの混入の有無を検証した。具体的手順を以下に示す。
まず、ｃＤＮＡ１０μＬまたは上清Ｂ１０μＬと、以下の組成のＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ１５μＬを混合した。そして、７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を算出した。結果を表１に示す。
ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ組成：１０×ＭｇＣｌ含有ＰＣＲバッファー  ２．５μＬ、ＰＣＲグレードｄＮＴＰｓ  １μＬ、Ｆｗプライマー  ０．３μＬ、Ｒｖプライマー  ０．３μＬ、Ｔａｑｍａｎプローブ  ０．０７５μＬ、ＲＯＸ  ｄｙｅ  ０．１２５μＬ、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．１μＬ、１％ＢＳＡ  ２．５μＬ、およびＰＣＲグレード水  ８．１μＬ
リアルタイムＰＣＲ条件：５０℃−２ｍｉｎ→９５℃−１０ｍｉｎ→（９５℃−１５ｓｅｃ、６０℃−１ｍｉｎ）×４０サイクル
【００５０】
（６）抽出ＤＮＡの解析
手順（３）で得られた上清Ｃに含まれるＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりβグロビンＤＮＡを増幅し、検出を行った。また、手順（３）で得られた上清ＣをＤＮａｓｅ処理した後、逆転写ＰＣＲを行い、これを検体とし、リアルタイムＰＣＲによりβグロビンＲＮＡを増幅し、βグロビンＲＮＡの混入の有無を検証した。なお、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲは、使用するプライマーをβグロビン遺伝子を増幅できるプライマーに変更した以外は手順（４）および（５）と同様にして行った。
結果を表１に示す。
【００５１】
〔実施例２〕
実施例１の手順（２）および（３）で使用した磁性粒子をＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ１６０  Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＪＳＲライフサイエンス社製）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００５２】
〔実施例３〕
実施例１の手順（２）および（３）で使用した磁性粒子をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００５３】
〔実施例４〕
実施例１の手順（２）および（３）で使用した磁性粒子をＳｅｒａＭａｇ  ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００５４】
〔実施例５〕
実施例１の手順（２）で使用した８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬを８Ｍ酢酸リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００５５】
〔実施例６〕
（１）ＤＮＡ抽出
マイクロチューブ（チューブＣとする）中で、実施例１の手順（１）と同様にして得た細胞希釈液Ａ（ＨＴ２９細胞１×１０5個相当量）に、溶解液（グアニジン塩酸塩：６Ｍ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を２００μＬ加え、細胞を完全に溶解させた。これに、磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ１６０  Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＪＳＲライフサイエンス社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬと、ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝１０００）３０（ｗ／ｖ）％溶液（溶媒：水）２００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。
次に、チューブＣを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｄとする）をマイクロピペットにて別のマイクロチューブ（チューブＤとする）へと移した。
そして、チューブＣに、７０％エタノール１ｍＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業を計３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＣに水１００μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＣを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｅとする）をマイクロピペットで回収した。
【００５６】
（２）ＲＮＡ抽出
手順（１）にてチューブＤへと移した上清Ｄ５００μＬに、２−プロパノール３００μＬと、磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ１６０  Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＪＳＲライフサイエンス社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。次に、チューブＤを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。
そして、チューブＤに、７０％エタノールを１ｍＬ加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業を計３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＤに水１００μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＤを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｆとする）をマイクロピペットで回収した。
【００５７】
（３）ＤＮＡおよびＲＮＡの検出
手順（１）で得た上清Ｅを用いて、実施例１の手順（６）と同様にして、βグロビンＤＮＡの検出とβグロビンＲＮＡの混入の有無の検証とを行った。また、手順（２）で得た上清Ｆを用いて、実施例１の手順（４）および（５）と同様にして、βアクチンｍＲＮＡの検出とβアクチンＤＮＡの混入の有無の検証とを行った。
これら結果を表１に示す。
【００５８】
〔実施例７〕
実施例６の手順（１）および（２）で使用した磁性粒子をＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に変更した以外は、実施例６と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００５９】
〔実施例８〕
実施例６の手順（１）および（２）で使用した磁性粒子をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）に変更した以外は、実施例６と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００６０】
〔実施例９〕
実施例６の手順（１）および（２）で使用した磁性粒子をＳｅｒａＭａｇ  ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に変更した以外は、実施例６と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００６１】
〔比較例１〕
実施例１の手順（１）で使用した８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）を２−プロパノールに、実施例１の手順（２）で使用した２−プロパノールを８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）にそれぞれ変更した以外は、実施例１と同様の操作を行いＣｔ値を算出した。結果を表１に示す。
【００６２】
以下の表１に示すとおり、実施例１〜９の方法により、ＤＮＡとＲＮＡの両方を簡便且つ効率良く単離できた。
【００６３】
【表１】
2016158558.tif 000002
【００６４】
上記実施例および比較例で用いた各磁性粒子の特性を以下に示す。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）：カルボキシ基含有非シリカ系磁性粒子（平均粒径：１．０μｍ、表面カルボキシ基量：１０００ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｂｅａｄｓ）
Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ１６０  Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＪＳＲライフサイエンス社製）：カルボキシ基含有非シリカ系磁性粒子（平均粒径：１．５μｍ、磁性体含有量：約２８質量％、表面カルボキシ基量：３０ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｂｅａｄｓ）
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）：カルボキシ基含有非シリカ系磁性粒子（平均粒径：１．０μｍ、表面カルボキシ基量：１０００ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｂｅａｄｓ）
ＳｅｒａＭａｇ  ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）：カルボキシ基含有非シリカ系磁性粒子（平均粒径：１．０μｍ、表面カルボキシ基量：１０００ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｂｅａｄｓ）
【００６５】
〔比較例２〕
（１）ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出
特表２００８−５１８６１８号公報の記載を参考にして、ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出を行った。具体的手順を以下に示す。
まず、実施例１の手順（１）と同様にして得た細胞希釈液Ａ（ＨＴ２９細胞１×１０5個相当量）に、溶解液（グアニジン塩酸塩：６Ｍ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を２００μＬ加え、細胞を完全に溶解させた。この細胞溶解液を１００μＬずつ別々のマイクロチューブ（チューブＥおよびＦとする）に分けた。
【００６６】
細胞溶解液１００μＬを含むチューブＥ中に、磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬと、８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。
そして、チューブＥに、洗浄液（塩化リチウム：３Ｍ、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を５００μＬ加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業をもう一度繰り返したのち、７０％エタノール１ｍＬによる洗浄を３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＥに水５０μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＥを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｇとする）をマイクロピペットで回収した。
【００６７】
細胞溶解液１００μＬを含むチューブＦ中に、磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬと、８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。
次に、チューブＦを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｈとする）をマイクロピペットにて別のマイクロチューブ（チューブＧとする）へと移した。
チューブＧへと移した上清Ｈ５００μＬに、２−プロパノール３００μＬと、磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬとを加え、混合した後、室温で１０分間静置した。次に、チューブＧを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。
そして、チューブＧに、７０％エタノールを１ｍＬ加え、磁気スタンドから外し、撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業を計３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＧに水１００μＬを加え、磁気スタンドから外し、撹拌することで磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＧを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ｉとする）をマイクロピペットで回収した。
【００６８】
（２）ＤＮＡおよびＲＮＡの検出
手順（１）で得た上清Ｇを用いて、実施例１の手順（４）および（５）と同様にして、βアクチンｍＲＮＡの検出とβアクチンＤＮＡの混入の有無の検証とを行った。また、手順（１）で得た上清Ｉを用いて、実施例１の手順（６）と同様にして、βグロビンＤＮＡの検出とβグロビンＲＮＡの混入の有無の検証とを行った。
これら結果を表２に示す。なお、ＤＮＡ、ＲＮＡどちらの抽出量も、実施例１〜９の方法で単離した場合と比較して半分以下であった。
【００６９】
〔参考例１〕
（１）ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出
実施例１の手順（１）と同様にして得た細胞希釈液Ａ（ＨＴ２９細胞１×１０5個相当量）に、溶解液（グアニジン塩酸塩：６Ｍ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を２００μＬ加え、細胞を完全に溶解させた。この細胞溶解液を１００μＬずつ別々のマイクロチューブ（チューブＨおよびＩとする）に分けた。
チューブＨに含まれる細胞溶解液１００μＬから、Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出（抽出物Ａとする）した。また、チューブＩに含まれる細胞溶解液１００μＬから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出（抽出物Ｂとする）した。なお、Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔは、ＲＮａｓｅを具備するものである。
（２）ＤＮＡおよびＲＮＡの検出
手順（１）で得た抽出物Ｂを用いて、実施例１の手順（４）および（５）と同様にして、βアクチンｍＲＮＡの検出とβアクチンＤＮＡの混入の有無の検証とを行った。また、手順（１）で得た抽出物Ａを用いて、実施例１の手順（６）と同様にして、βグロビンＤＮＡの検出とβグロビンＲＮＡの混入の有無の検証とを行った。
これら結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
2016158558.tif 000003
【００７１】
表２に示すとおり、比較例２の方法では、抽出したＤＮＡに多量のＲＮＡの混入がみられ、このような方法でＤＮＡを単離するためには参考例１で用いたようなＲＮａｓｅの使用が必要で工程が増える。また、試料を半分に分ける必要があったため、抽出される核酸の量も微量だった。