(57)【要約】【課題】  Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】  グルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖とＮ-アセチルスクロサミンを含む培地でスクリーニング対象となるビフィズス菌を培養する工程を含み、当該培養工程において、前記単糖を含まず、Ｎ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で培養した場合と比べて優れた増殖性を示す菌株を選択する。当該選択された菌株は、乳幼児型のビフィズス菌であって、Ｎ-アセチルスクロサミンは、乳幼児型のビフィズス菌の増殖を促進することを期待できる。【選択図】図３
2016154511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で培養する工程を含み、当該培養工程において、前記培地からＮ-アセチルスクロサミンを除いた培地で培養した場合に比べて優れた増殖性を示す菌株を選択するビフィズス菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
グルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で培養する工程を含み、当該培養工程において２段階の増殖相を示す菌株を選択するビフィズス菌のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｎ-アセチルスクロサミンを含む経口用組成物。
【請求項４】
さらにグルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖を含む請求項４に記載の経口用組成物。
【請求項５】
さらに、ビフィズス菌を含む請求項３又は４に記載の経口用組成物。
【請求項６】
前記ビフィズス菌は、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌である請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項７】
前記ビフィズス菌は、請求項１又２の何れかに記載のスクリーニング方法で得られた請求項５に記載の経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌のスクリーニング方法及びＮ-アセチルスクロサミンを含むプレバイオティクスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト母乳の糖質では、乳糖が主体であるが、オリゴ糖（Human milk oligosaccharides： HMOs）も多種・多量で存在する。ヒト母乳の初乳では、HMOsが約２０g/L、ヒト母乳の常乳では、HMOsが約１０g/Lで含まれているが、牛乳の常乳では、乳糖以外の糖質はほとんど含まれていない。母乳栄養児と人工乳栄養児の腸内細菌叢の比較では、前者において、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の細菌（ビフィズス菌）が優勢菌であることが知られている（非特許文献１）。その理由として、ヒト母乳に含まれるHMOsが増殖因子として機能していることが明らかにされている（非特許文献２）。HMOsの多くがGlc、Gal、GlcNAcを構成糖とする１３種のコア構造を持ち（非特許文献３）、タイプ１鎖（Lacto-N-tetraose）を有するものが主成分である。ビフィズス菌によるHMOsの代謝に関して、北岡ら（非特許文献４、５）は詳細な検討を行っており、ビフィズス菌がGalacto-N-biose（ガラクト-Ｎ-ビオース、GNB）及びLacto-N-bioseＩ（ラクト-Ｎ-ビオースＩ、LNB）を選択的に代謝する経路を持つことを報告している。
【０００３】
その後に、Bifidobacterium bifidumでは、膜結合型で菌体外に存在するフコシダーゼとα−シアリダーゼ（それぞれ二種類存在）がHMOsを分解して、コア構造を遊離し、この遊離したコア構造が膜結合型で菌体外に存在するラクト-Ｎ-ビオシダーゼの作用を受けて、LNBを生成することが示された。このLNBは、特異的なトランスポーター（gltA-C）により、菌体内に取り込まれ、次いで、GNB/LNBＩホスホリラーゼ、Ｎ-アセチルへキソサミンキナーゼ、UMP基転移酵素、エピメラーゼなどの作用を受けて代謝されると考えられている（非特許文献６）。
【０００４】
一方、Bifidobacterium infantisでは、HMOs分解酵素が細胞質に局在していることが示され、HMOsは糖トランスポーターにより、そのまま菌体内へ取り込まれ、細胞質にて加水分解酵素の作用を受けて代謝されることが示された（非特許文献７、８）。
【０００５】
これらのことから、HMOsは菌体外で分解を受け、細胞質に運ばれて代謝される系と、そのまま取り込まれ、細胞質において代謝される系が存在し、それは菌種によって異なる場合があることが分かる。
【０００６】
ビフィズス菌は代表的なプロバイオティクスの１つであり、整腸作用などを通じて、健康増進と維持に有効な種々の作用を発揮する。ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、乳オリゴ糖などのオリゴ糖や、ポリデキストロースやイヌリンなどの食物繊維は、プロバイオティクスの働きを促進する物質（プレバイオティクス）として知られている。例えば、ガラクトオリゴ糖の１種である上記のラクト-Ｎ-ビオースＩは、ビフィズス菌を選択的に増殖させることが知られており（特許文献１）、プレバイオティクスはプロバイオティクスと共に摂取されることが好ましい。特に、ビフィズス菌の増殖に関与するプレバイオティクスを、当該プレバイオティクスを資化できるビフィズス菌と共に摂取することがより効果的であると考えられる。
【０００７】
Ｎ-アセチルスクロサミン（SucNAC：β-Ｄ-フルクトフラノシル-（２→１）-α-Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン（Flu（β２→１）GlcNAc））は、ラクト-Ｎ-ビオースＩやＮ-アセチルラクトサミンのように、Ｎ-アセチルグルコサミンを構成糖とする。Ｎ-アセチルグルコサミンを摂取すると、ヒアルロン酸やコンドロイチンなどのムコ多糖の生産を増加させることが知られており、Ｎ-アセチルグルコサミンを構成糖とするオリゴ糖を、当該オリゴ糖を資化するビフィズス菌と共に用いることで、ビフィズス菌を増殖させるだけでなく、Ｎ-アセチルスクロサミンの有用性がより一層高められることが期待される。
【０００８】
Ｎ-アセチルスクロサミンは、コウジ菌の菌糸を用いて合成されるが（特許文献２）、天然に存在しない物質である。しかしながら、これまで、これを資化できるビフィズス菌の存否やプレバイオティックスとしての利用可能性は不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−２９０９７２号公報
【特許文献２】特開２０１３−２５２０５６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Mitsuoka, T., et al., Ecology of the bifidobacteria., Am. J. Clin. Nutr., 30, 1799-1810 (1997)
【非特許文献２】Gauhe, A., et al., Bifidus Factor. IV. Preparations obtained from human milk., Arch. Biochem. Biophys., 48, 214-224 (1954)
【非特許文献３】Ashida, H., et al., Characterizaion of two different endo-α-N-acetylgalactosaminidases from probiotic and pathogenic enterobacteria, Bifidobacterium longum and Clostridium perfringens., Glycobiology, 18, 727-734 (2008)
【非特許文献４】Kitaoka, M., et al., Novel putative galactose operon involving lacto-N-biose phosphorylase in Bifidobacterium longum, Appl., Environ. Microbiol., 71, 3158-3163 (2005)
【非特許文献５】Nishimoto, M., et al., Identification of N-acetylhexosamine 1-kinase in the lacto-N-biose I/ Galacto-N-biose metabolic pathway in Bifidobacterium longum, Appl. Environ. Microbiol., 73, 6444-6449 (2007)
【非特許文献６】Wada, J., et al., Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides with a type Ｉ structure, Appl. Environ. Microbiol., 74, 3996-4004 (2008)
【非特許文献７】Sela, D., et al., Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 α-fucosidases are active on fucosylated human milk oligosaccharide, Appl. Environ. Microbiol., 78, 795-803 (2012)、
【非特許文献８】Garrido, D., et al., Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans, PLoS One, 6, e17315 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌を見いだし、Ｎ-アセチルスクロサミンをプレバイオティックスとして利用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る方法は、Ｎ-アセチルスクロサミンの分解酵素を誘導しえる単糖類として、例えば、ビフィズス菌が資化できる単糖であるグルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で培養することで、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化するビフィズス菌をスクリーニングする方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る方法により、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化するビフィズス菌の菌株が取得される。これらのビフィズス菌は、よく乳幼児から検出されるビフィズス属に属する菌株であることが多く、Ｎ-アセチルスクロサミンとグルコースやフラクトース、ガラクトースと共に摂取することは、乳幼児型のビフィズス菌を腸内において特異的に増殖させる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、GAMブイヨン培地を用いたスクリーニング結果を示す図である。図中、＊印は５％の危険率で、＊＊印は１％の危険率で、それぞれ対照群と有意差があったことを示す。
【図２】図２は、図１の続図である。図中、＊印は５％の危険率で、＊＊印は１％の危険率で、＊＊＊印は０.１％の危険率で、それぞれ対照群と有意差があったことを示す。
【図３】図３は、半合成培地を用いた培養結果を示す図である。
【図４】図４は、糖質濃度が異なる半合成培地を用いた培養結果を示す図である。
【図５】図５は、培養液のｐＨと酸度の経時変化を示す図である。
【図６】図６は、培養液の糖質の残量の経時変化を示す図である。
【図７】図７は、培養液のSucNAc分解活性の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るスクリーニング方法は、Ｎ-アセチルスクロサミンの分解酵素を誘導しえる単糖類として、例えば、ビフィズス菌が資化できる単糖であるグルコース、フラクトース、ガラクトースの何れか１種以上の単糖（以下、本明細書では「グルコース類」という。）の存在下においてＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地、すなわち、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地でビフィズス菌を培養する工程を含み、グルコース類の非存在下においてＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地、すなわち、前記培地からグルコース類を除いた培地で培養した場合に比較して優れた増殖性を示す菌株を選択する方法である。
【００１６】
本発明に係る方法によりスクリーニングされるビフィズス菌は、グルコース類の存在下においてＮ-アセチルスクロサミンを分解する酵素を誘導する。つまり、グルコース類の非存在下において当該ビフィズス菌はＮ-アセチルスクロサミンを資化できず、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンが共存する条件下で誘導された酵素により、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化する。従って、グルコース類が共存する条件下でＮ-アセチルスクロサミンを含む培地で培養した場合の菌濃度と、グルコース類が共存しない条件下でＮ-アセチルスクロサミンを含む培地で培養した場合の菌濃度とを比較することにより、Ｎ-アセチルスクロサミンの資化性を判断できる。両者を比較した結果、グルコース類が共存する条件下で培養した菌濃度が、グルコース類が共存しない条件下で培養した菌濃度に比較して優れた菌株を選択することで、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌をスクリーニングできる。
【００１７】
Ｎ-アセチルスクロサミンを資化するビフィズス菌の培養では、グルコース類が消費された後に、Ｎ-アセチルスクロサミンが消費される。従って、当該ビフィズス菌は、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で増殖させた場合には、いわゆる２段階の増殖相、すなわちグルコース類の消費に伴う増殖段階（第１相の増殖期）と、その後に観察されるＮ-アセチルスクロサミンの消費に伴う増殖段階（第２相の増殖期）を示す。従って、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地で培養した場合に、２段階の増殖相を示す菌株を選択することでも、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化できるビフィズス菌をスクリーニングできる。
【００１８】
本発明においてスクリーニングの対象となるビフィズス菌（被験ビフィズス菌）は、ビフィドバクテリウム属の細菌であれば、菌種などは限定されない。当該対象となるビフィズス菌は、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B. adlescentis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）が例示されるが、これらの菌種に限定されない。また、これらの中でも、よく乳幼児から検出されるビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）を対象にするのが好ましい。Ｎ-アセチルスクロサミンを乳幼児用のプレバイオティスクに用いる場合の指標となり得るからである。
【００１９】
本発明に係るスクリーニング方法に用いる培地は、グルコース類を含まない場合（グルコース類の非存在下）には、Ｎ-アセチルスクロサミンを炭素源とし、グルコース類を含む場合（グルコース類の存在下）には、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地である。ここにおいて、Ｎ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地は、好ましくはＮ-アセチルスクサミンを唯一の炭素源とする培地であり、フルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを炭素源とする培地は、好ましくは、グルコース類とＮ-アセチルスクロサミンを唯一の炭素源とする培地である。これらの培地は、グルコース類やＮ-アセチルスクロサミン以外にビフィズス菌が資化できる炭素源をも含み得るが、その炭素源の含有量はグルコース類やＮ-アセチルスクロサミンの含有量に比較して少なく、スクリーニングに影響を与えない範囲の量である。また、スクリーニングで使用される培地は、Ｎ-アセチルスクロサミンの分解酵素を誘導しえる単糖類の何れか１種類のみを炭素源とすることが好ましいが、例えばグルコースとフラクトース、グルコースとガラクトースなどのように２種類の単糖類を含む培地であっても差し支えない。スクリーニングで使用される培地は、炭素源以外にビフィズス菌の増殖に必要な窒素源、ミネラル分、酵母エキス、ペプトン、Ｌ-システイン又は／及びその塩、ｐＨ調整剤などを含み得る。各成分の含有量は、ビフィズス菌が生育できる量であればよく、当業者により適宜設定され得る。
【００２０】
本発明に係るスクリーニング方法で使用される培地中のＮ-アセチルスクロサミンやグルコース類の含有量も適宜決定されるが、Ｎ-アセチルスクロサミンの含有量は、例えば０.００１％（w/v）〜１０％（w/v）であり、好ましくは０.０１％（w/v）〜５％（w/v）、より好ましくは０.１％（w/v）〜２％（w/v）である。グルコース類の含有量は、Ｎ-アセチルスクロサミンの分解酵素が誘導できる程度であればよく、一方、当該培地のグルコース類の含有量が多いと、Ｎ-アセチルスクロスアミンの分解酵素が誘導される前に、グルコース類の消費により定常期に達するおそれがある。従って、本発明の培地のグルコースの含有量は、例えば０.００１％（w/v）〜５％（w/v）であり、好ましくは０.０１％（w/v）〜２％（w/v）であり、より好ましくは０.１％（w/v）〜１.０％（w/v）である。
【００２１】
本発明におけるビフィズス菌の培養条件は、一般的なビフィズス菌の培養条件であればよく、例えば３７℃の嫌気条件下で培養される。本発明の培養期間は、グルコースの含有量によっても異なるが、第２相の増殖期が観察されればよく、具体的には、少なくとも２４時間以上、好ましくは４８時間、より好ましくは３日程度である。
【００２２】
以上の方法により選択されたビフィズス菌は、Ｎ-アセチルスクロサミンを資化することが可能であり、乳幼児型のビフィズス菌である可能性が高い。従って、Ｎ-アセチルスクロサミンを経口摂取することで、乳幼児型のビフィズス菌が腸管内において増殖を促進し、整腸作用を発揮する。
【００２３】
本発明に係る経口組成物は、Ｎ-アセチルスクロサミンを含み、好ましくは、さらにグルコース類を含む。また、本発明に係る経口組成物は、より好ましくは、Ｎ−アセチルスクロサミンとビフィズス菌、さらにグルコース類を含む。このとき、本発明に係る経口組成物のビフィズス菌は、好ましくは、乳幼児型のビフィズス菌であり、より好ましくは、前記のスクリーニング方法で選抜されたビフィズス菌であり、例えば、平成５年４月２０日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、B. longum No.7として寄託された、受託番号 FERM BP-11242の菌株である。
【００２４】
本発明に係る経口組成物は、これらの成分のみからなる場合だけでなく、これらの成分に加え、各種の添加剤、例えばデンプンや水のような基剤、ショ糖などの甘味剤、保存剤、ｐＨ調整剤、香料なども含み得る。
【００２５】
本発明に係る経口組成物におけるＮ-アセチルスクロサミンやグルコースの含有量は限定されず、適宜設定できる。そして、ビフィズス菌の含有量も限定されず、適宜設定できる。
【００２６】
本発明に係る経口組成物の形態も特に限定されず、例えば粉末状であり、錠剤であり、液体であり、流動物であり得る。また、本発明に係る経口組成物は、食品用途（いわゆる特定保健用食品のように効能を標榜することが可能な食品も含む。）であるか医薬用途であるかを問わず、乳幼児用であるか成人用であるかなど対象年齢層も問われない。当該経口組成物は、例えば、アイスクリームやヨーグルト、チーズ、乳飲料などの乳製品であり、チューイングガムやチョコレート、グミ、清涼飲料水などの嗜好品、粉ミルクや離乳食でもあり得る。
【００２７】
本発明に係る経口組成物は、腸管内におけるビフィズス菌の増殖を促進させるので、主として整腸目的で摂取され得る。
【実施例１】
【００２８】
（１）SucNAc資化性菌のスクリーニング
ビフィズス菌の２１株から、SucNAc資化性菌を選抜（スクリーニング）した。これら２１株の内訳は、表１に示すように、４株のBifidobacterium adlescentis（B. adlescentis）、４株のBifidobacterium pseudocatenulatum（B. pseudocatenulatum）、３株のBifidobacterium bifidum（B. bifidum）、４株のBifidobacterium longum（B. longum）、３のBifidobacterium infantis（B. infantis）、３株のBifidobacterium breve（B. breve）である。これらは、それぞれ株式会社明治の保有株であって、これら菌株のうち、B. longum 21（菌株番号の21）は、上記のとおり、独立行政法人 産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、B. longum No.7として寄託された、受託番号 FERM BP-11242と同一の菌株である。
【００２９】
【表１】
2016154511.tif 000003
【００３０】
これら菌体を解凍（融解）してから、GAMブイヨン培地（日水製薬社製）を用いて、これら菌体を前培養した後に、SucNAc資化性菌を選抜した。このとき、「アネロパック・ケンキ」（三菱ガス化学社製）を所定数で入れて、嫌気条件下において、３７℃、２４時間で前培養した。 次いで、GAMブイヨン培地を生理食塩水で通常濃度の４０％に希釈した培地「GAM(40)」に、SucNAcを１％(w/v)となるように添加した培地「GAM(40)+SucNAc（１％）」を用いて、これら菌体を２％で接種して７日間で培養した。このとき、培養条件は、前培養と同等に設定した。なお、GAM(40)では、グルコースを０.１２％(w/v)で含んでおり、１２１℃、１５分間で滅菌して使用した。また、GAM(40)+SucNAc(１％)では、１２１℃、１５分間で滅菌して使用した。
【００３１】
そして、分光光度計（Mini Photo 518R、TAITEC photometer）を用いて、波長：６６０nmの吸光度（培地の濁度）を測定して、これら菌体量を評価した。なお、これら培地の濁度が０.８を越えた場合には、その培地を希釈してから、その培地の濁度を測定して、これら菌体量を評価した。この結果を図１及び図２に示した。
【００３２】
ここで、B. longum 12（菌株番号の12）、B. infantis 16（菌株番号の16）、B. breve 18（菌株番号の18）、B. longum 21（菌株番号の21）の４菌株は、対照培地のGAM(40)と比べて、GAM(40)+SucNAc（１％）で、菌体の増殖が明らかに良好であった。そこで、B. longum 12とB. longum 21の２菌株のうち、特に増殖が良かった、B.longum 21（寄託菌株： B. longum No.7、 FERM BP-11242）を選ぶと共に、B. infantis 16とB. breve 18を選び、合計３菌株を供試株として検討した。なお、このとき、菌種が同じであっても糖質の資化性に多様性があることが観察され、SucNAc資化性は、それぞれの菌株に固有の特性と考えられた。
【００３３】
（２）SucNAc単独の資化性の検討
糖質を含まない半合成培地（semisynthetic medium：SSM）に、単一の炭素源としてSucNAcを添加した培地を用いて、前記（１）で選抜した３菌株（B. longum 21、B. infantis 16、B. breve 18）を培養し、SucNAc資化性を検討した。ここで、前記（１）で使用した培地「GAM(40)+ SucNAc(１％)」には、GAM(40)由来のグルコースを０.１２％(w/v)で含んでいる。従って、前記（１）のSucNAcの資化性は、グルコースの存在下で発揮されたことになる。そこで、半合成培地を用いて、前記（１）で選抜した ３菌株（B. longum 21、B. infantis 16、B. breve 18）を培養し、SucNAc資化性を検討した。
【００３４】
半合成培地では、０.５gのYeast extract（Bacto社製）、０.５gのbactopeptone（Difco社製）、０.２gの酢酸ナトリウム３水和物、０.０２gのL-システイン塩酸塩、０.３gの硫酸アンモニウム、０.３gのリン酸２水素カリウム、０.４８gのリン酸一水素二カリウム、２０mgの硫酸マグネシウム７水和物、１mgの硫酸マンガン(II）５水和物、１mgの硫酸鉄(II)７水和物、１mgの塩化ナトリウム、５０mgのTween80（商品名）を含む溶液に、最終濃度が０.５％(w/v)となるように、SucNAc水溶液を加えて、全量を１００mLとし、ｐＨを６.８に調整した。そして、半合成培地では、１２１℃、１５分間で滅菌して使用した。なお、L-システイン塩酸塩では、水溶液で無菌濾過してから別途で添加した。このとき、培養条件は、前記（１）と同様に前培養した後に、半合成培地を用いて、これら菌株を２％で接種して７日間で培養した。この結果を図３に示した。
【００３５】
前記（１）で選抜した ３菌株（B. longum 21、B. infantis 16、B. breve 18）共に、単一の炭素源としてSucNAcを利用できず、グルコースの共存下で、SucNAcを資化できることが明らかになった。
【００３６】
（３）菌体の増殖の経時変化
前記（１）で選抜した B.longum 21について、SucNAc資化性の経時変化を調べた。すなわち、半合成培地にグルコースを０.１２％(w/v)で添加した培地（対照培地）、対照培地にSucNAcを０.５％(w/v)で添加した培地（検討培地）、対照培地にグルコースを０.５％(w/v)で添加した（グルコースを合計０.６２％(w/v)で含む）培地（比較培地）の３種類の培地を用いて、B.longum 21を培養し、この菌株の増殖の経時変化を評価した。このとき、培養条件は、前記（１）と同様に前培養した後に、前記の３種類の培地を用いて、B.longum 21を２％で接種して３日間で培養した。この結果を図４に示した。
【００３７】
対照培地では、菌体の増殖が１２時間で定常期になり、比較培地では、菌体の増殖が２４〜３６時間で、ほぼ飽和密度に達した。これに対して、検討培地では、菌体の増殖が２６時間の辺りまで、第１相の増殖期として、対照培地と同じ経過が見られたが、３６時間以降には、新たに第２相の増殖期が見られ、４８時間で定常期になった。
【００３８】
このとき、定常期の菌体量は、比較培地で最も多く、次いで、検討培地で多く、対照培地で最も少なかった。そして、比較培地に比べて、検討培地では、菌体量が明らかに少なく、対照培地に比べて、検討培地では、菌体量が明らかに多かった。このことは、SucNAcが加水分解されると生成するＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が利用（消費、資化）されず（データを省略）、フラクトースが利用された（データを省略）ためである。そして、検討培地では、Escherichia coliをグルコースとラクトースの共存下で培養したときに見られる、diauxie（Loomis, W.F., and Magasanik, B.、Glucose-lactose diauxie in Escherichia coli, J. Bacteriol., 93, 1397-1401(1967)）と同様な培養の経過が見られた。しかしながら、Escherichia coliでは、グルコースもラクトースも単独で利用されるが、グルコースとラクトースの共存下において、グルコースが優先的に利用され、次いで、ラクトースが利用される。一方、B.longum 21では、単独で利用されるグルコースと単独で利用されないSucNAcの共存下において、diauxieが見られ、グルコースが優先的に利用され、次いで、SucNAcが利用された。これらのことから、本発明の菌株では、グルコースにより、SucNAcの加水分解酵素が誘導されたと結論付けられる。
【００３９】
（４）培養液のｐＨと酸度の経時変化
前記（１）で選抜したB.longum 21について、培養液のｐＨと酸度の経時変化を調べた。すなわち、検討培地を用いて、B.longum 21を培養し、この菌株の培養液のｐＨと酸度の経時変化を評価した。このとき、培養条件は、前記（１）と同様に前培養した後に、検討培地を用いて、B.longum 21を２％で接種して３日間で培養した。なお、これら培養液の酸度（酸生成量）は、培養液（上清）をＮａＯＨ（０.１Ｎ）で滴定し、単位培養液当たりの滴定量で評価した。そして、ビフィズス菌では、グルコースから酢酸と乳酸を生成するが、 ここでは、酢酸と乳酸を合わせて、酸度として評価した。この結果を図５に示した。
【００４０】
第１相の増殖期において、培養液のｐＨは一旦低下し、菌体の増殖が停止している誘導期に、培養液のｐＨは変化しなかった。 次いで、SucNAcの消費が始まると、培養液のｐＨは再度低下した。つまり、菌体の増殖に連動して、培養液のｐＨが変化した。一方、グルコース（０.１２％(w/v)）の消費が進んでいる期間には、培養液の酸度は僅かしか変化せず、第２相の増殖期において、培養液の酸度は明確に上昇した。すなわち、培養液のｐＨと酸度は、diauxieを反映する経過を示していた。
【００４１】
（５）培養液の糖質の残量の経時変化
前記（１）で選抜した B.longum 21について、培養液の糖質の残量の経時変化を調べた。すなわち、検討培地を用いて、B.longum 21を培養し、この菌株の培養液の糖質の残量の経時変化を評価した 。このとき、培養条件は、前記（１）と同様に前培養した後に、検討培地を用いて、B.longum 21を２％で接種して３日間で培養した。なお、これら培養液の糖質の残量は、培養液を濾過して、試料を調製してから、イオンクロマト法で評価した。具体的には、イオンクロマトグラフ（Dionex Osaka ICS-3000 （大阪社製）、カラム：Carbo Pac MA-1（大阪社製）、注入量：２５μL、溶離液：ＮａＯＨ（１０ｍＭ）、流速：１.０mL/min、検出器：PAD 、作用電極：Ａｕ）を用いて、各糖質の測定値を検出し、各糖質の検量線から、各培養液の糖質の残量を算出した。この結果を図６に示した。
【００４２】
第１相の増殖期を終了した１２時間後において、グルコースの全部が消費されていた。一方、第２相の増殖期を開始した３６時間後において、SucNAcが消費されて、SucNAcの減少が開始された。そして、定常期になった４８時間後において、SucNAcの残量が４０〜５０％となり、その後の７２時間後において、SucNAcの残量は変化しなかった。すなわち、糖質の残量は、菌体の増殖の様式を反映する経過を示していた。
【００４３】
（６）SucNAc分解活性の経時変化
前記（１）で選抜した B.longum 21について 、SucNAc分解活性の経時変化を調べた。すなわち、対照培地、検討培地、比較培地の３種類の培地を用いて、B.longum 21を培養し、これら菌株のSucNAc分解活性の経時変化を評価した。このとき、培養条件は、前記（１）と同様に前培養した後に、前記の３種類の培地を用いて、B.longum 21を２％で接種して３日間で培養した。具体的には、各培養液を経時的に採取し、それらをチューブ（２mL容）に入れて、遠心分離（10,000g、５分間、４℃）して、菌体を回収した後に、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ：７.０）（以下「ＰＢ」という）に懸濁した。そして、これら菌体の懸濁液を１mLでチューブ（２mL容）に入れて、さらに、ビーズ（φ=０.５μm）を２gで入れてから、菌体の破砕装置（Taitec Bead Crusher、μT-01）を用いて、4600rpm、６０秒間の振とうを５回で繰り返し、菌体を破砕した後に、この菌体の破砕液を遠心分離（10,000g、５分間、４℃）して、上清液（粗酵素液）を調製した。
【００４４】
このとき、SucNAcが加水分解されたときには、新たに還元性が発生することから、ソモギー・ネルソン法で還元糖量を定量し、SucNAc分解活性を測定した。具体的には、SucNAc 溶液（０.５％(w/v)）を２５０μLと、ＰＢを１５０μLで混合し、３７℃、５分間で保持してから 、前記の粗酵素液を１５０μで加えて、６０分間で反応させた。そして、これら粗酵素液を反応させた後に、銅試薬を５５０μLで加えて、遠心分離（10,000g、５分間、４℃）して、上清液を調製した。そして、この上清液を１mLで試験管に入れて、約１００℃（沸騰水）、１０分間で加熱して冷却した後に、ネルソン試薬を５００μLで加えて、よく混和した。そして、これらに純水を１１mLで加えて、１５分間以上で保持した。
【００４５】
そして、分光光度計（Mini Photo 518R 、TAITEC photometer）を用いて、波長：６６０nmの吸光度（上清液の濁度）を測定して、これらSucNAc分解活性を評価した。なお、これらSucNAc分解活性は、単位菌体量（ＯＤ：６６０nm＝１.０）当たりのＯＤ：６６０nmとして表現した。この結果を図７に示した。
【００４６】
検討培地では、菌体の粗酵素液において、SucNAc分解活性が認められた。一方、図示しないが、対照培地と比較培地では、SucNAc分解活性が認められなかった。
【００４７】
以上のように、合成された二糖類であるSucNAcを利用するビフィズス菌を探索したところ、表１に示されるように、よく乳幼児から検出される乳幼児型のB. longum、B. infantis、B. breveなどの菌種からは資化性菌が見出されたのに対して、よく成人から検出される成人型のB. adlescentis、B. pseudocatenulatumなどの菌種からは資化性菌が見出されなかった。これは、ヒト母乳のオリゴ糖が資化される過程において、菌体外で生成された、lacto-N-bioseＩが菌体内へ輸送される系（gltA-C）を有する菌種と類似した傾向であった（Xiao, J.-Z. et al., Distribution of in vitro fermentation ability of lacto-N-bioseＩ, a major building block of human milk oligpsaccharides, in bifidobacterial strains, Appl. Environ. Microbiol., 76, 54-59 (2010)参照）。
【００４８】
また、以上のように、単一の炭素源としてSucNAcを利用できず 、グルコースの共在下において、SucNAcを利用できることから、SucNAc分解酵素は誘導型の酵素であると考えられた。
【００４９】
そして、以上のように、SucNAc資化性菌は何れも、よく乳幼児から検出される乳幼児型のB. longum、B. infantis、B. breve であり、よく成人から検出される成人型のB. adlescentis、B. pseudocatenulatumではなかったことを考えると、SucNAcは、乳幼児型のビフィズス菌を増やすプレバイオティクスとして有効であると言える。
【００５０】
また、ビフィズス菌は、グルコース以外に、ガラクトースやフラクトースも単一の炭素源として利用し、それらの代謝経路もグルコースの代謝経路と同じであると考えられることから、ガラクトースやフラクトースもグルコースと同様にSucNAc資化性菌のスクリーニングに利用できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法は、SucNAcを資化できるビフィズス菌、特に、乳幼児型のビフィズス菌を選抜することができる。また、乳幼児型に好ましいビフィズス菌を増やす新規な組成物が提供され得る。
【図１】
2016154511.tif 000004
【図２】
2016154511.tif 000005
【図３】
2016154511.tif 000006
【図４】
2016154511.tif 000007
【図５】
2016154511.tif 000008
【図６】
2016154511.tif 000009
【図７】
2016154511.tif 000010