(57)【要約】      （修正有）【課題】液滴内でＤＮＡ断片をシークエンサー上で配列決定する方法の提供。【解決手段】（ａ）液滴アクチュエーターを準備する工程；（ｂ）ＤＮＡサンプルの処理のために、トランスポザーゼ液滴及びＤＮＡサンプル液滴を、オイルと接触した液滴操作間隙中に分配する工程；（ｃ）トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端を含む前記トランスポザーゼ液滴を、オイルと接触した前記ＤＮＡサンプル液滴と混合して、標識ＤＮＡ断片を含む結合液滴を生成する工程；（ｄ）標識ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実行する工程；（ｅ）標識ＤＮＡ断片を精製する工程；（ｆ）精製標識ＤＮＡ断片を、サンプル回収出力を介して除去する工程；及び（ｇ）精製標識ＤＮＡ断片をシークエンサー上で配列決定する工程；を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フ
ラグメントを生成する工程；
（ｂ）オイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化
された核酸フラグメントを生成する工程；
（ｃ）オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ
、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；および
（ｄ）オイル中の液滴内で核酸アダプターをＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに
結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを含む核酸ライブラリーを生成する工程、
を含む、オイルと接触した液滴内の核酸ライブラリーの作製方法。
【請求項２】
（ａ）オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フ
ラグメントを生成する工程；
（ｂ）オイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化
された核酸フラグメントを生成する工程；および
（ｃ）オイル中の液滴内で核酸アダプターを平滑末端化された核酸フラグメントに結合
させ、アダプター結合核酸フラグメントを含む核酸ライブラリーを生成する工程、
を含む、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリーの作製方法。
【請求項３】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５％である、請求項１以降のいずれかに記
載の方法。
【請求項４】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１０％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項５】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１５％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項６】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも２０％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項７】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項８】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも７５％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項９】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項１０】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９５％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項１１】
工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力さ
れた核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９９％である、請求項１以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項１２】
単一の液滴内で、工程１（ａ）および工程１（ｂ）が共に行われる、請求項１に記載の
方法。
【請求項１３】
単一の液滴内で、工程１（ｂ）および工程１（ｃ）が共に行われる、請求項１に記載の
方法。
【請求項１４】
単一の液滴内で、工程１（ａ）、工程１（ｂ）および工程１（ｃ）が共に行われる、請
求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程１（ｂ）の開始前に、平滑末端化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、
請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程１（ｃ）の開始前に、リン酸化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請
求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程１（ｄ）の開始前に、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを精製する工程を含
む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記精製工程が、オイル中の液滴内でビーズ上に核酸を捕捉する工程およびオイル中で
前記ビーズを洗浄する工程を含む、請求項１５以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ビーズが、電荷スイッチビーズまたは固相可逆固定ビーズを含む、請求項１８に記
載の方法。
【請求項２０】
前記精製工程が、以下の工程を含む、請求項１８以降のいずれかに記載の方法。
（ａ）洗浄液滴と、前記ビーズを含む液滴とを混合し、混合された液滴を生成する工程
；および
（ｂ）前記ビーズを拘束している間に前記混合された液滴を分割し、前記ビーズを含む
娘液滴と、前記ビーズを実質的に含まない娘液滴とを生成する工程。
【請求項２１】
工程２０（ｂ）でのいかなるビーズ損失も、核酸ライブラリーをその意図された目的に
不適当とするのに十分なものではない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸フラグメントが、５’−突出および／または３’−突出を有する核酸フラグメ
ントを含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
平滑末端化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬
を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
リン酸化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含
む液滴とを混合する工程を含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
Ａ−ｔａｉｌを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、
Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１以降のいずれかに記載
の方法。
【請求項２６】
核酸アダプターを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と
、アダプター結合試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１以降のいずれかに記
載の方法。
【請求項２７】
（ａ）オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化およびリン酸化し、平滑末端
化／リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；
（ｂ）結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記平滑
末端化／リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程；
（ｃ）水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄す
る工程；
（ｄ）オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記平滑末端化／リン酸化され
た核酸フラグメントを溶離する工程；
（ｅ）オイル中の液滴内で前記リン酸化された核酸フラグメントの両末端にＡ−ｔａｉ
ｌを結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；
（ｆ）結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記Ａ−
ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを捕捉する工程；
（ｇ）水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄す
る工程；
（ｈ）オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸
フラグメントを溶離する工程；
（ｉ）オイル中の液滴内で核酸アダプターを前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメン
トに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを生成する工程；
（ｊ）結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で前記アダ
プター結合核酸フラグメントを捕捉する工程；
（ｋ）水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズを洗浄す
る工程；
（ｌ）オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記アダプター結合核酸フラグ
メントを溶離する工程；および
（ｍ）オイル中の液滴内で前記固相可逆固定ビーズから前記アダプター結合核酸フラグ
メントを分離する工程、
を含む、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリー構築を行う方法。
【請求項２８】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも５％である、請求項２７以降のいずれかに記
載の方法。
【請求項２９】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも１０％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３０】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも１５％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３１】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも２０％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３２】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも５０％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３３】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも７５％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３４】
工程２７（ｍ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）に入
力された核酸フラグメントの少なくとも９０％である、請求項２７以降のいずれかに記載
の方法。
【請求項３５】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも９５％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３６】
工程２７（ｍ）からの前記アダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程２７（ａ）
に入力された核酸フラグメントの少なくとも９９％である、請求項２７以降のいずれかに
記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸ライブラリーを増幅する工程をさらに含む、請求項１以降のいずれかに記載の
方法。
【請求項３８】
液滴アクチュエーター上で前記核酸ライブラリーを増幅する工程をさらに含む、請求項
２７以降のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請
求項２７以降のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定
する工程をさらに含む、請求項２７以降のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定
する工程をさらに含む、請求項２７以降のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む１
つ以上の試薬液滴とを混合し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含むプロ
ダクト液滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内での平滑末端化／リン酸化さ
れた核酸フラグメントを作製する方法。
【請求項４３】
前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、捕捉液滴中
で、前記平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請
求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固
定ビーズを洗浄し、前記平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む洗浄された
ビーズを含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性
バッファーからなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端
化／リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求
項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離
し、オイル中に前記平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する
工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
平滑末端化された核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、核酸および結合試薬を含む
１つ以上の試薬液滴とを混合し、結合核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する
工程を含む、オイルと接触した液滴内での平滑末端化された核酸フラグメントに核酸を結
合する方法。
【請求項４８】
前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記結合核
酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固
定ビーズを洗浄し、前記結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成
する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーからなる、請
求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された結合核酸
フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オ
イル中に前記結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項５０
に記載の方法。
【請求項５２】
核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む１つ以上の試薬液
滴とをオイル中で混合し、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴
を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内でＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメン
トを作製する方法。
【請求項５３】
前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記Ａ−ｔ
ａｉｌ化された核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項５２に記載の方法
。
【請求項５４】
洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固
定ビーズを洗浄し、前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズ
を含む液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッフ
ァーからなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたＡ−ｔａ
ｉｌ化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項５４
に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オ
イル中に前記Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに
含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む１つ以上の試薬液
滴とをオイルと接触させて混合し、アダプター結合核酸フラグメントを含むプロダクト液
滴を生成する工程を含む、オイルと接触した液滴内でアダプター結合核酸フラグメントを
作製する方法。
【請求項５８】
前記プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、前記アダプ
ター結合核酸フラグメントを捕捉する工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相可逆固
定ビーズを洗浄し、前記アダプター結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む
液滴を生成する工程をさらに含み、前記洗浄バッファー液滴が実質的に水性バッファーか
らなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたアダプタ
ー結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程をさらに含む、請求項５８に記載
の方法。
【請求項６１】
前記アダプター結合核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、オイル中
に前記アダプター結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程をさらに含む、請求項
５９に記載の方法。
【請求項６２】
オイルと接触させて以下の工程の実行を含む、オイルと接触した液滴内で核酸フラグメ
ントを精製する方法：
（ａ）前記核酸フラグメントを含む液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを
混合し、前記核酸フラグメントを捕捉する工程；
（ｂ）洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて、前記固相
可逆固定ビーズを洗浄し、前記核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生
成する工程；
（ｃ）洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平
滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程；および
（ｄ）前記核酸フラグメントを前記固相可逆固定ビーズから分離し、前記精製された核
酸フラグメントを含む液滴をオイル中に生成する工程。
【請求項６３】
前記洗浄バッファー液滴が、実質的に水性バッファーからなる液滴を含む、請求項６２
以降のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記水性バッファーが、実質的に結合バッファーからなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記水性バッファーが、実質的に有機溶媒を含まない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記水性バッファーが、約１０％以下の有機溶媒を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記水性バッファーが、実質的にエタノールを含まない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記水性バッファーが、約１０％以下のエタノールを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約２５％の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項
６２以降のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約５０％の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項
６２以降のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記洗浄バッファー液滴が、少なくとも約７５％の有機溶媒を含む液滴を含む、請求項
６２以降のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記有機溶媒が、アルコールを含む、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記有機溶媒が、エタノールを含む、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記有機溶媒が、実質的にエタノールからなる、請求項６９以降のいずれかに記載の方
法。
【請求項７５】
前記洗浄バッファー液滴が、塩と混合される、請求項６９以降のいずれかに記載の方法
。
【請求項７６】
前記洗浄バッファー液滴が、ＮａＣｌと混合される、請求項６９以降のいずれかに記載
の方法。
【請求項７７】
前記洗浄バッファー液滴が、約０．０１〜約１００ｍＭの量の塩を含む、請求項６９以
降のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記洗浄バッファー液滴が、約０．１〜約１０ｍＭの量の塩を含む、請求項６９以降の
いずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約０．０１〜約１００ｍＭの量の
正塩と、混合される、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約０．１〜約１０ｍＭの量の正塩
と、混合される、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約０．０１〜約１００ｍＭの量の
単塩と、混合される、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記洗浄バッファー液滴が、洗浄バッファーに可溶な約０．１〜約１０ｍＭの量の単塩
と、混合される、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記洗浄バッファー液滴が、ＮａＣｌと、約０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される
、請求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記洗浄バッファー液滴が、ＮａＣｌと、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される、請
求項６９以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記塩の存在しない前記有機溶媒を含む前記洗浄バッファー液滴に比べて、前記塩が、
１つ以上の電気濡れ液滴操作の再現性を向上させる、請求項６９以降のいずれかに記載の
方法。
【請求項８６】
前記１つ以上の電気濡れ液滴操作が、液滴輸送、液滴分割、および液滴分配からなる群
より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記オイルが、シリコーンオイルを含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記オイルが、フルオロシリコーンオイルを含む、請求項１以降のいずれかに記載の方
法。
【請求項８９】
自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定する工程をさらに含む、請
求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定
する工程をさらに含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサー上で前記核酸ライブラリーを配列決定
する工程をさらに含む、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
前記液滴が、液滴アクチュエーターで制御される、請求項１以降のいずれかに記載の方
法。
【請求項９３】
前記液滴アクチュエーターが、電極媒介液滴操作を含む液滴操作を用いて前記工程を制
御する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
電極媒介液滴操作が、電気濡れ媒介液滴操作を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
電極媒介液滴操作が、光電濡れ媒介液滴操作を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
電極媒介液滴操作が、誘電泳動媒介液滴操作を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記工程が、オペレーターの干渉なしに、単一の液滴アクチュエーター上で一体的に実
行される、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
オイルと接触した前記液滴が、実質的に前記オイルに囲まれている、請求項１以降のい
ずれかに記載の方法。
【請求項９９】
オイルと接触した前記液滴が、前記オイルに浮いている、請求項１以降のいずれかに記
載の方法。
【請求項１００】
オイルと接触した前記液滴が、前記オイルに沈んでいる、請求項１以降のいずれかに記
載の方法。
【請求項１０１】
オイルと接触した前記液滴が、分離した２つの基板の間に挟み込まれて、前記オイルを
含む液滴操作間隙を形成している、請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
オイルと接触した前記液滴が、分離した２つの基板の間に挟み込まれて、前記オイルで
実質的に充填された液滴操作間隙を形成している、請求項１以降のいずれかに記載の方法
。
【請求項１０３】
核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とを、オイルに接触させて
混合し、平滑末端化反応を行い、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程を含
む、核酸フラグメントを平滑末端化する方法。
【請求項１０４】
平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とを、オイ
ルに接触させて混合し、リン酸化反応を行い、リン酸化された核酸フラグメントを生成す
る工程を含む、核酸フラグメントをリン酸化する方法。
【請求項１０５】
平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化およびリン酸化試薬を含
む液滴とを、オイルに接触させて混合し、平滑末端化およびリン酸化反応を行い、平滑末
端化され、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントを
改質する方法。
【請求項１０６】
リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とを、
オイルに接触させて混合し、Ａ−ｔａｉｌ化反応を行い、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラ
グメントを生成する工程を含む、核酸フラグメントをＡ−ｔａｉｌ化する方法。
【請求項１０７】
第１の核酸を含む液滴と、第２の核酸および結合試薬を含む１つ以上の液滴とを、オイ
ルに接触させて混合する工程を含む、核酸フラグメントを結合する方法。
【請求項１０８】
前記第１の核酸が、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸を含み、前記第２の核酸が、アダプター
を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
オイル中の液滴内で前記アダプターを結合し、環状核酸を形成する工程をさらに含む、
請求項１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
オイル中の液滴内で前記環状核酸をフラグメント化する工程をさらに含む、請求項１０
９に記載の方法。
【請求項１１１】
液滴アクチュエーターと、請求項１以降の方法のいずれかを実行するようプログラムさ
れたコントローラーとを含む、システム。
【請求項１１２】
請求項１以降の方法のいずれかを実行するようプログラムされたエンコードされたソフ
トウェアを含む、ストレージ媒体。
【請求項１１３】
請求項１１２のストレージ媒体が装着された液滴アクチュエーター。
【請求項１１４】
以下を備える液滴アクチュエーター：
（ａ）頂部基板および底部基板、当該２つの基板は、高さｈ１を有する液滴操作間隙を
形成するように構成されている；
（ｂ）前記底部基板と前記頂部基板との一方または両方と結合した電極を含み、かつ、
高さｈ１を有する前記液滴操作間隙で液滴操作を実行するために構成された電極通路；お
よび
（ｃ）前記２つの基板の間に高さｈ２を有する空隙を形成するように構成された前記頂
部基板または前記底部基板の一方に形成された陥凹エリア、ここでｈ２はｈ１よりも大き
い。
【請求項１１５】
液滴が存在するとき電極を非活性化すると液滴が前記電極から前記陥凹エリアに流れる
ような液滴操作を実行するために構成された電極に、前記空隙が隣接している、請求項１
１４以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。
【請求項１１６】
液滴のよりエネルギー的に安定なコンホメーションへの変形により引き起こされる移動
の結果として、液滴が前記空隙に入る、請求項１１４以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーター。
【請求項１１７】
前記空隙が、前記電極通路の電極の再活性化時に高さｈ１を有する前記間隙領域に、前
記液滴が再突入するのを防止するように選択された寸法を有する、請求項１１４以降のい
ずれかに記載の液滴アクチュエーター。
【請求項１１８】
前記陥凹エリアの形状が、ｈ１からｈ２への階段形状を含む、請求項１１４以降のいず
れかに記載の液滴アクチュエーター。
【請求項１１９】
前記陥凹エリアの形状が、ｈ１からｈ２へのスロープを含む、請求項１１４以降のいず
れかに記載の液滴アクチュエーター。
【請求項１２０】
前記陥凹エリアが、前記頂部基板、前記底部基板、または両方の基板に形成されている
、請求項１１４以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーター。
【請求項１２１】
前記陥凹エリアが、その頂部で開放されている、請求項１２０以降のいずれかに記載の
液滴アクチュエーター。
【請求項１２２】
液滴を液滴アクチュエーター内の電極頂部から移動する方法であって、当該方法は、電
極を非活性化して、前記液滴を前記液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、前記液
滴が前記電極頂部でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーシ
ョンをとる工程を含む。
【請求項１２３】
液滴アクチュエーター内の初期位置の液滴を移動する方法であって、当該方法は、電極
を非活性化して、前記液滴を前記液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、前記液滴
が初期位置でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションを
とる工程を含む。
【請求項１２４】
（ａ）前記液滴アクチュエーターが、以下を備え：
頂部基板および底部基板、当該２つの基板は、高さｈ１を有する液滴操作間隙を形成す
るように構成されている；
電極を含む電極通路、前記間隙が前記電極の領域で高さｈ１を有する；および
前記２つの基板の間に高さｈ２を有する空隙を形成するように構成された前記頂部基板
または前記底部基板の一方に形成された電極に隣接する陥凹エリア、ここでｈ２はｈ１よ
りも大きい；ならびに
（ｂ）前記移動が、高さｈ１を有する前記間隙領域から、高さｈ２を有する前記間隙領
域までである、
請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記移動が、前記電極の再活性化で前記液滴を前記電極頂部のそれ以前の位置に戻すこ
とができないような永久的なものである、請求項１２３以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１２６】
前記移動が、前記電極の再活性化で前記液滴が前記電極頂部のそれ以前の位置に戻るよ
うな一時的なものである、請求項１２３以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
移動した前記液滴が、第３電極の活性化で前記液滴が第３電極頂部の位置に移動するよ
うな第３電極に隣接する位置にある、請求項１２３以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１２８】
前記陥凹エリアの形状が、ｈ１からｈ２への階段形状を含む、請求項１２４以降のいず
れかに記載の方法。
【請求項１２９】
前記陥凹エリアの形状が、ｈ１からｈ２へのスロープを含む、請求項１２４以降のいず
れかに記載の方法。
【請求項１３０】
前記陥凹エリアが、前記頂部基板、前記底部基板、または両方の基板に形成される、請
求項１２４以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
前記陥凹エリアが、その頂部で開放されている、請求項１２４以降のいずれかに記載の
方法。
【請求項１３２】
（ａ）リザーバ電極の区分けされた通路の端で液滴源を収集する工程；
（ｂ）通路電極と通路側面電極とのセットに沿って液滴源を延伸する工程；
（ｃ）前記通路側面電極を非活性化する工程；および                   
（ｄ）１つ以上の前記通路電極を非活性化し、分配された液滴と、前記液滴源の残余部
分とを生成する工程、
を含む、液滴を分配する方法。
【請求項１３３】
（ａ）前記液滴源が、磁気応答性ビーズを含み；
（ｂ）磁場が、前記磁気応答性ビーズを前記通路電極頂部の液滴領域に引き付ける場所
に供給され；
（ｃ）前記非活性化工程が、前記液滴源から多量の磁気応答性ビーズを有する分配され
た液滴を生成する、
請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも２５％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも５０％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも７５％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３７】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも９０％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３８】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも９５％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３９】
前記非活性化工程が、前記液滴源から少なくとも９９％の磁気応答性ビーズを有する前
記分配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４０】
前記非活性化工程が、前記液滴源から実質的に全ての磁気応答性ビーズを有する前記分
配された液滴を生成する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４１】
前記液滴源が、数千の磁気応答性ビーズを含む、請求項１３３以降のいずれかに記載の
方法。
【請求項１４２】
前記液滴源が、数百万の磁気応答性ビーズを含む、請求項１３３以降のいずれかに記載
の方法。
【請求項１４３】
以下を備える液滴アクチュエーターアセンブリ：
（ａ）１つ以上の基板；
（ｂ）前記１つ以上の基板上の一連の反応レーン、各反応レーンは、電極の通路を有す
る；
（ｃ）前記１つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第１セット、当該第１セット
の各アセンブリは、他のいずれの前記反応レーンも横切ることなく１の前記反応レーン上
にサンプル液滴を分配するように配置されている；
（ｄ）前記１つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第２セット、当該第２セット
の各アセンブリは、１の前記反応レーン上に試薬液滴を分配するように配置されている。
【請求項１４４】
（ａ）前記１つ以上の基板が配置され、液滴操作間隙を形成し；および
（ｂ）前記反応レーンが、前記液滴操作間隙内に位置している、
請求項１４３に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１４５】
流体通路を含み、当該流体通路は、前記液滴操作間隙の外側から前記液滴操作間隙まで
延び、かつ、１つ以上の液滴分配電極の前記第１セット近傍に液体を供給するように配置
されている、請求項１４４以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１４６】
流体通路を含み、当該流体通路は、前記液滴操作間隙の外側から前記液滴操作間隙まで
延び、かつ、１つ以上の液滴分配電極の前記第２セット近傍に液体を供給するように配置
されている、請求項１４４以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１４７】
液滴分配電極アセンブリの前記第１セットの各々が、サンプル流体を含むリザーバと結
合している、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１４８】
少なくとも２つの反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１４９】
少なくとも８つの反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１５０】
少なくとも１６の反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１５１】
少なくとも２４の反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１５２】
少なくとも４８の反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１５３】
少なくとも９６の反応レーンを含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチ
ュエーターアセンブリ。
【請求項１５４】
液滴分配電極アセンブリの前記第２セットの各々が、ライブラリー構築試薬を含むリザ
ーバに位置している、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセン
ブリ。
【請求項１５５】
液滴分配電極アセンブリの前記第２セットが、サブセットに分割されていて、各サブセ
ットが、他のいずれの前記反応レーンも横切ることなく同一の一の前記反応レーン上にサ
ンプル液滴を分配するように配置されている２つ以上の液滴分配電極アセンブリを含む、
請求項１５４に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１５６】
液滴分配電極アセンブリの各サブセット内で、斯かるサブセット内の各アセンブリは、
異なるライブラリー構築試薬を含むリザーバに結合している、請求項１５５に記載の液滴
アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１５７】
前記試薬が、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、およびアダプター
結合試薬から選択される、請求項１５６に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１５８】
前記反応レーン周辺の磁場が、前記反応レーンの１つ以上の領域で液滴中の磁気応答性
ビーズを固定するのに十分な強さを有するように、前記反応レーンに対して配置された磁
石配列をさらに含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液滴アクチュエーターアセン
ブリ。
【請求項１５９】
前記反応レーン周辺の磁場が、前記反応レーンの前記電極により制御された液滴分割反
応の間、液滴中の磁気応答性ビーズを拘束するのに十分な強さを有するように前記反応レ
ーンに対して配置された磁石配列をさらに含む、請求項１４３以降のいずれかに記載の液
滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１６０】
前記磁石配列が、前記磁場の強化された領域を作り出すように配置された磁石を含み、
当該強化された領域が、前記反応レーンにそろって、前記反応レーンで磁気応答性ビーズ
を固定する、請求項１５８に記載の液滴アクチュエーターアセンブリ。
【請求項１６１】
以下の工程を含む、電極媒介液滴操作を用いた液滴系検査を実行する方法：
（ａ）２つ以上のサンプル液滴を分配し、いずれのサンプル液滴も他の液滴の反応レー
ンを横切ることなく、各サンプル液滴を独立した反応レーン上に輸送する工程；および
（ｂ）試薬液滴の第１セットを分配し、試薬液滴の前記第１セットのいずれの液滴もサ
ンプル液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴
の前記第１セットの各液滴を反応レーン上に輸送する工程。
【請求項１６２】
各サンプル液滴と、試薬液滴の前記第１セットの１つとを混合する工程をさらに含む、
請求項１６１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１６３】
各サンプル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程をさらに含む、請求項１
６１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１６４】
試薬液滴の第２セットを分配し、試薬液滴の前記第２セットのいずれの液滴もサンプル
液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴の前記
第２セットの各液滴を反応レーン上に輸送する工程をさらに含む、請求項１６１以降のい
ずれかに記載の方法。
【請求項１６５】
各サンプル液滴と、試薬液滴の前記第２セットの１つとを混合する工程をさらに含む、
請求項１６１以降のいずれかに記載の方法。
【請求項１６６】
各サンプル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程をさらに含む、請求項１
６１以降のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１  関連出願
本出願は、以下の出願に関連し、それらの出願日の優先権を主張する：２０１０年２月
２５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Seque
ncing」の米国特許仮出願第61/307,950号；２０１０年４月２０日に出願された題名「Aut
omated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61
/326,000号；２０１０年７月２６日に出願された題名「Automated Library Construction
for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/367,513号；および２０１０
年１１月５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation
Sequencing」の米国特許仮出願第61/410,646号。上述した出願の開示は、本明細書で引
用される全ての他の文献と共に、全体を参照して本明細書に具体的に援用される。
【０００２】
２  発明の分野
本発明は、概して、オイル中での核酸ライブラリーの構築ケミストリーを実施する新し
い液滴系の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
３  発明の背景
液滴アクチュエーターは、通常、液滴操作を行うための表面または間隙を形成するよう
に構成された１つ以上の基板を含む。基板は、液滴操作を行うために配置された電極を含
んでいてもよい。基板または基板間の間隙は、液滴を形成する液体と混和しない液体で被
覆および／または充填されていてもよい。液滴アクチュエーターは、核酸の増幅（例えば
、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ））および核酸配列決定等の様々な分子手順を行
うために使用されている。最近、核酸配列決定技術のあらゆる側面（例えば、コスト、ス
ピード、処理能力、ワークフロー、精度およびデータアセンブリ）で改良がなされてきた
。これらの改良された技術に基づく、いわゆる「次世代」配列決定プラットフォームは、
しばしば、１０００ゲノム計画、およびヒト体内微生物ゲノム計画等の大規模な配列決定
計画に用いられている。これらの技術の他の用途は、トランスクリプトーム配列決定（Ｒ
ＮＡ配列）、タンパク質−クロマチン相互作用解析（ＣｈＩＰ配列）、全エキソーム配列
決定、メタゲノム解析およびコピー数多型解析を含む。次世代配列決定プラットフォーム
の配列決定手順は、核酸フラグメントライブラリーを利用する。次世代配列決定プラット
フォームの全潜在能力は、フラグメントライブラリーを構築する方法を最適化（例えば、
コスト削減、収率向上、および処理能力向上）することにより認識される。ライブラリー
の構築は、通常、物理処理、酵素反応および精製を含む、多くの労力と時間集約的な工程
を伴う。シークエンスデータの質（例えば、シークエンス範囲の深度、配列決定バイアス
）は、フラグメントライブラリーの構築の質に依存する。
【０００４】
一般的なライブラリー構築手順では、配列決定される核酸サンプルは、はじめに、流体
力学的せん断もしくは機械的な力のいずれかによりランダムに細分化される、または、酵
素消化法もしくは化学消化法によりランダムに細分化される。生成する核酸フラグメント
は、次いで追加修飾にかけられ、その結果、いわゆる「アダプター」シークエンスが、フ
ラグメントの一端または両端に取り付けられる。この方法は、フラグメントがはじめに末
端修復または平滑末端化され、その後任意に、サンプルフラグメントへのアダプターシー
クエンスの結合前にＡ−ｔａｌｉｎｇ工程が行われる。調製された核酸ライブラリーは、
定量化され、そして続く配列決定プロセスの準備がされる。より高度な手順では、長い環
状化工程と、末端修復およびアダプター結合の第２ラウンドとがあってもよい。マルチプ
レックスアイデンティファイアーまたはバーコードの短いシークエンスは、フラグメント
に結合されてもよく、または結合されたアダプターシークエンス内に含めてシークエンス
アセンブリを補助してもよい。
【０００５】
核酸捕捉、洗浄、および様々な酵素反応間における溶離を含む一般的なライブラリーの
構築手順において要求される複数の精製工程は、通常、著しく核酸を損失させる。市販の
ロボットのリキッドハンドラーを伴う自動化は、さらに材料の損失の影響を受けやすく、
それ故、非常に低い収率となる。がんゲノム解析、メタゲノム解析および古生ゲノム解析
等の所定の用途では、しばしば、開始時のライブラリー構築のために処理される核酸の量
が微量で、配列決定前の核酸サンプルを多量に失うことが許されないことがある。ライブ
ラリー構築に対し、高収率、試薬消費の削減、およびユーザーが多重操作の範囲で操作す
ることができる、柔軟で、自動化されたプラットフォームのニーズがある。
【発明の概要】
【０００６】
４  発明の簡単な説明
本発明は、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリーの作製方法を提供し、該方法
は以下の工程を含む：オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化
された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラ
グメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液
滴内でＡ−ｔａｉｌをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化され
た核酸フラグメントを生成する工程；およびオイル中の液滴内で核酸アダプターをＡ−ｔ
ａｉｌ化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントの核酸ラ
イブラリーを生成する工程。
【０００７】
いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントの
モル基準で少なくとも５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメン
トの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１０％である。いくつかの場合で
は、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくと
も１５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸
フラグメントのモル基準で少なくとも２０％である。いくつかの場合では、アダプター結
合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である。
いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモ
ル基準で少なくとも７５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメン
トの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である。いくつかの場合で
は、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくと
も９５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸
フラグメントのモル基準で少なくとも９９％である。
【０００８】
本発明の方法は、平滑末端化された核酸フラグメントを１以上の工程の前または後で精
製する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、開始工程１（ｂ）の前に平滑末端化さ
れた核酸フラグメントを精製する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、開始工程１
（ｃ）の前にリン酸化された核酸フラグメントを精製する工程を含んでいてもよい。本発
明の方法は、開始工程１（ｄ）の前にＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを精製する
工程を含んでいてもよい。精製工程は、例えば、オイル中の液滴内でビーズに核酸フラグ
メントを捕捉する工程およびオイル中でビーズを洗浄する工程を含んでいてもよい。ビー
ズは、例えば、電荷スイッチビーズまたは固相可逆固定ビーズを含んでいてもよい。いく
つかの実施形態では、精製工程は、以下の工程を含む：洗浄液滴を、ビーズを含む液滴と
混合し、混合された液滴を生成する工程；およびビーズを拘束している間に混合された液
滴を分割し、ビーズを含む娘液滴と、実質的にビーズを含まない娘液滴とを生成する工程
。理想的には、分割プロセスの間のいかなるビーズ損失も核酸ライブラリーをその意図さ
れた目的に不適当とするのに十分なものではない。
【０００９】
ライブラリー構築に用いられる核酸フラグメントは、時には、５’−突出および／また
は３’−突出を含んでいてもよい。斯かるフラグメントの平滑末端化工程は、核酸フラグ
メントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでい
てもよい。リン酸化工程は、核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴と
をオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。Ａ−ｔａｉｌを結合させる工程は、核酸
フラグメントを含む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程
を含んでいてもよい。核酸アダプターを結合させる工程は、核酸フラグメントを含む液滴
と、アダプター結合試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明は、オイルと接触した液滴内で核酸ライブラリーの構築を実行する方法を提供し
、該方法は以下の工程を含む：オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、か
つ、リン酸化し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；結合バ
ッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で平滑末端化／リン酸化さ
れた核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で固
相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズから平滑末端
化／リン酸化された核酸フラグメントを溶離する工程；オイル中の液滴内でリン酸化され
た核酸フラグメントの両端にＡ−ｔａｉｌを結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグ
メントを生成する工程；結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液
滴内でＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを用いて
、オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固相可逆
固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを溶離する工程；オイル中の液滴
内でＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに核酸アダプターを結合させ、アダプター結
合核酸フラグメントを生成する工程；結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、
オイル中の液滴内でアダプター結合核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを
用いて、オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固
相可逆固定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを溶離する工程；およびオイル中
の液滴内で固相可逆固定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを分離する工程。い
くつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル
基準で少なくとも５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの
修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１０％である。いくつかの場合では、
アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１
５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラ
グメントのモル基準で少なくとも２０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核
酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である。いく
つかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基
準で少なくとも７５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの
修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である。いくつかの場合では、
アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９
５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラ
グメントのモル基準で少なくとも９９％である。
【００１１】
本発明の方法は、さらに、核酸ライブラリーを増幅する工程を含んでいてもよい。本発
明の方法は、液滴アクチュエーターで核酸ライブラリーを増幅する工程を含んでいてもよ
い。本発明の方法は、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含
んでいてもよい。本発明の方法は、核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサーで核
酸ライブラリーを配列決定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、核酸増幅工程
を行わずに、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含んでいて
もよい。
【００１２】
本発明は、オイルと接触した液滴内での平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメント
の作製方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴
と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む１以上の試薬液滴とを混合し、平滑末端化
／リン酸化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法
は、プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、捕捉液滴に平
滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明
の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆
固定ビーズを洗浄し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビ
ーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質
的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バ
ッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含
む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズか
ら平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを分離し、オイル中の平滑末端化／リン
酸化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明は、オイルと接触した液滴内での平滑末端化された核酸フラグメントに核酸を結
合する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端化された核酸フラグメントを
含むサンプル液滴と、核酸および結合試薬を含む１つ以上の試薬液滴とを混合し、結合核
酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴
と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、結合核酸フラグメントを捕捉する
工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合およ
び分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、結合核酸フラグメントを含む洗浄
されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液
滴は実質的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と
、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生
成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ
化された核酸フラグメントを分離し、オイル中の結合核酸フラグメントを含む液滴を生成
する工程を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明は、オイルと接触した液滴内でのＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを作製
する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴と
、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む１以上の試薬液滴とをオイル中で混合し、Ａ−ｔａｉｌ化さ
れた核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダク
ト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸
フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴
を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、Ａ−ｔａ
ｉｌ化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含ん
でいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。
【００１５】
本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶
離されたＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程を含んで
いてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグ
メントを分離し、オイル中のＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む液滴を生成す
る工程を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明は、オイルと接触した液滴内でのアダプター結合核酸フラグメントを作製する方
法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、Ａ−
ｔａｉｌ化試薬を含む１以上の試薬液滴とをオイル中で混合し、アダプター結合核酸フラ
グメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴と、固
相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、アダプター結合核酸フラグメントを捕捉
する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合
および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、アダプター結合核酸フラグメ
ントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗
浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビー
ズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたアダプター結合核酸フラグ
メントを含む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固
定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを分離し、オイル中のアダプター結合核酸
フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明は、オイルと接触した液滴内での核酸フラグメントの精製方法を提供し、該方法
はオイルと接触した以下の工程の実行を含む；核酸フラグメントを含む液滴と、固相可逆
固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、核酸フラグメントを捕捉する工程；洗浄バッフ
ァー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、
核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程；洗浄されたビーズ
を含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化／リン酸化された
核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程；および固相可逆固定ビーズから核酸フ
ラグメントを分離し、オイル中の精製された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程
。
【００１８】
本明細書に記載のいずれかの方法では、洗浄バッファー液滴は、実質的に水性バッファ
ーからなる液滴を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質
的に結合バッファーからなる。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質的に有
機溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、約１０％以下の有機溶
媒を含む。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質的にエタノールを含まない
。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、約１０％以下のエタノールを含む。いく
つかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約２５％の有機溶媒を含む液滴
を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約５０％の有機溶
媒を含む液滴を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約５
０％の有機溶媒を含む液滴を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アルコールを
含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノールを含む。いくつかの実施形態で
は、有機溶媒は、実質的にエタノールからなる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファ
ー液滴は、塩が混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌ
が混合される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、約０．０１〜約１００ｍＭの量の塩
を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、約０．１〜約１０ｍＭの量の
塩を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な正
塩が、約０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッ
ファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な正塩が、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される
。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な単塩が、約
０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液
滴は、洗浄バッファーに可溶な単塩が、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される。いくつ
かの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌが、約０．０１〜約１００ｍＭの量
で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌが、約０．１
〜約１０ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、塩は、塩の存在しない有機溶
媒を含む洗浄バッファー液滴に比べて、１以上の電気濡れ（electrowetting）液滴操作の
再現性を向上させる。いくつかの実施形態では、１以上の電気濡れ液滴操作は、液滴輸送
、液滴分割、および液滴分配からなる群より選択される。
【００２０】
様々な実施形態で、本発明のライブラリー構築手順の一部または全ての工程は、オイル
中で実行される。例えば、いくつかの実施形態では、オイルは、シリコーンオイルまたは
フルオロシリコーンオイルを含む。ドーピングオイル用の他のオイルおよび界面活性剤が
、本明細書で記載される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、自動化シークエンサーで核酸ライ
ブラリーを配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに
、核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工
程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、核酸増幅工程を行わずに
、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、オイル中の液滴は、本発明の手順を実行するために液滴アク
チュエーターにより制御される。液滴アクチュエーターは、液滴操作を用いる工程を制御
してもよい。例えば、液滴操作は、電気濡れ媒介液滴操作、光電濡れ媒介液滴操作、誘電
泳動媒介液滴操作等の電極媒介液滴操作を含んでいてもよい。液滴操作を実行するための
他の技術が、本明細書で記載される。理想的には、工程は、オペレーターの干渉なしに、
単一の液滴アクチュエーターで一体的に実行される。
【００２３】
本発明の方法で用いられる液滴の一部または全部は、オイルと接触してもよい。例えば
、液滴は、実質的にオイルに囲まれていてもよい。液滴は、オイルに浮いていてもよい。
液滴は、オイルに沈んでいてもよい。液滴とオイルが分離した２つの基板の間に挟み込ま
れて、オイルを含む液滴操作間隙を形成してもよい。オイルと接触した液滴が分離した２
つの基板の間に挟み込まれて、オイルで実質的に充填された液滴操作間隙を形成してもよ
い。
【００２４】
本発明は、核酸フラグメントを平滑末端化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含
む；核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、
平滑末端化反応を行って、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は
、核酸フラグメントをリン酸化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端
化された核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し
、リン酸化反応を行って、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、
核酸フラグメントを改質する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端化され
た核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む液滴とをオ
イル中で混合し、平滑末端化反応およびリン酸化反応を行って、平滑末端化され、リン酸
化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグメントをＡ−ｔａｉｌ
化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；リン酸化された核酸フラグメントを含
む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、Ａ−ｔａｉｌ化反応を
行って、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグ
メントを結合する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；第１核酸を含む液滴と、第
２核酸および結合試薬を含む１以上の液滴とをオイル中で混合する工程。第１核酸は、Ａ
−ｔａｉｌ化された核酸を含み、そして第２核酸は、アダプターを含む。
【００２５】
本発明は、ライブラリー構築方法の工程を制御するシステムを提供する。本発明は、例
えば、（ｉ）液滴アクチュエーターと、（ｉｉ）本発明の方法のいずれかまたは本発明の
個々の工程のいずれかを実行するようにプログラムされたコントローラーとを含む、シス
テムを含む。本発明は、本発明の方法のいずれかを実行するようにプログラムされたエン
コードソフトウェアを含む記憶媒体を含む。
【００２６】
本発明は、液滴アクチュエーターをも提供し、該液滴アクチュエーターは以下を備える
；頂部基板および底部基板、当該２つの基板は、高さｈ１を有する液滴操作間隙を形成す
るように構成されている；底部基板と頂部基板との一方または両方と結合した電極を含み
、かつ、高さｈ１を有する間隙で液滴操作を実行するために構成された電極通路；および
頂部基板と底部基板の２つの基板の間に高さｈ２を有する空隙を形成するように構成され
た頂部基板または底部基板の一方に形成された陥凹エリア、ここでｈ２はｈ１よりも大き
い。いくつかの実施形態では、空隙は、液滴が存在するとき電極を非活性化すると液滴が
電極から陥凹エリアに流れるように、液滴操作を実行するために構成された電極に、隣接
している。いくつかの実施形態では、液滴のよりエネルギー的に安定なコンホメーション
への変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が空隙に入る。いくつかの実施形
態では、空隙は、電極通路の電極の再活性化時に高さｈ１を有する間隙領域に、液滴が再
突入するのを防止するように選択された寸法を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２への階段形状を含む。い
くつかの実施形態では、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２へのスロープを含む。いくつ
かの実施形態では、陥凹エリアは、頂部基板、底部基板、または両方の基板に形成される
。陥凹エリアは、その頂部または底部で開放されていてもよい。
【００２８】
本発明は、液滴アクチュエーターで液滴を電極頂部から移動する方法を提供し、当該方
法は、電極を非活性化して、液滴を液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、液滴が
電極頂部でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションをと
る工程を含む。本発明は、液滴アクチュエーターの初期位置で液滴を移動する方法を提供
し、当該方法は、電極を非活性化して、液滴を液滴アクチュエーターの隣接領域に移動さ
せ、液滴が初期位置でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメー
ションをとる工程を含む。いくつかの場合、電極の再活性化で液滴を電極頂部のそれ以前
の位置に戻すことができないように、移動は永久的なものである。いくつかの場合、電極
の再活性化で液滴が電極頂部のそれ以前の位置に戻るように、移動は一時的なものである
。いくつかの場合、第３電極の活性化で液滴が第３電極頂部の位置に移動するように、移
動した液滴は第３電極に隣接する位置にある。いくつかの場合、陥凹部の形状は、ｈ１か
らｈ２への階段形状を含む。いくつかの場合、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２へのス
ロープを含む。いくつかの場合、陥凹エリアは、頂部基板、底部基板、または両方の基板
に形成される。いくつかの場合、陥凹エリアは、その頂部で開放されている。
【００２９】
本発明は、液滴を分配する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：リザーバ電極の
区分けされた通路の端で液滴源を収集する工程；通路電極と通路側面電極とのセットに沿
って液滴源を延伸する工程；通路側面電極を非活性化する工程；１つ以上の通路電極を非
活性化し、分配された液滴と、液滴源の残余部分とを生成する工程。いくつかの場合、液
滴源は、磁気応答性ビーズを含む。いくつかの場合、開始通路電極は、隣接する側面電極
にはめ込まれていてもよい。磁場は、磁気応答性ビーズを通路電極頂部の液滴領域に引き
付ける場所に位置してもよい。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも
５０％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性
化工程は、液滴源から少なくとも２５％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生
成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも５０％の磁気応答性ビ
ーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から
少なくとも７５％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場
合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも９０％の磁気応答性ビーズを有する分配され
た液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも９５％の磁
気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、
液滴源から少なくとも９９％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。い
くつかの場合、非活性化工程は、液滴源から実質的に全ての磁気応答性ビーズを有する分
配された液滴を生成する。本明細書に記載の全てのビーズ含有液滴と同様に、いくつかの
場合、液滴源は、数十のビーズ、数百のビーズ、数千のビーズ；数百万のビーズ；または
それ以上のビーズを含む。本明細書に記載の全てのビーズ含有液滴と同様に、いくつかの
場合、液滴源は、数十の磁気応答性ビーズ、数百の磁気応答性ビーズ、数千の磁気応答性
ビーズ；数百万の磁気応答性ビーズ；またはそれ以上の磁気応答性ビーズを含む。
【００３０】
本発明は、液滴アクチュエーターアセンブリを提供し、該液滴アクチュエーターアセン
ブリは以下を備える：１つ以上の基板；１つ以上の基板上の一連の反応レーン、各反応レ
ーンは、電極の通路を有する；１つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第１セット
、当該第１セットの各アセンブリは、他のいずれの反応レーンも横切ることなく１の反応
レーン上にサンプル液滴を分配するように配置されている；１つ以上の基板上の液滴分配
電極アセンブリの第２セット、当該第２セットの各アセンブリは、１の反応レーン上に試
薬液滴を分配するように配置されている。１つ以上の基板が、液滴操作間隙を形成するた
めに配置されていてもよい。反応レーンは、液滴操作間隙内に位置していてもよい。液滴
アクチュエーターアセンブリは、流体通路を含んでいてもよく、当該流体通路は、液滴操
作間隙の外側から液滴操作間隙まで延び、かつ、液滴分配電極の第１セットの１つ以上の
近接に液体を供給するように配置されている。液滴アクチュエーターアセンブリは、流体
通路を含んでいてもよく、当該流体通路は、液滴操作間隙の外側から液滴操作間隙まで延
び、かつ、液滴分配電極の第２セットの１つ以上の近接に液体を供給するように配置され
ている。液滴分配電極アセンブリの第１セットの各々は、サンプル流体を含むリザーバと
結合してもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも２つの反応レーンを含
んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも８つの反応レーンを含
んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも１６の反応レーンを含
んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも２４の反応レーンを含
んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも４８の反応レーンを含
んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも９６の反応レーンを含
んでいてもよい。いくつかの場合、液滴分配電極アセンブリの第２セットの各々は、ライ
ブラリー構築試薬を含むリザーバに位置している。いくつかの場合、液滴分配電極アセン
ブリの第２セットは、サブセットに分割されていて、各サブセットは、他のいずれの反応
レーンも横切ることなく同一の一の反応レーンにサンプル液滴を分配するように配置され
ている２以上の液滴分配電極アセンブリを含む。いくつかの場合、液滴分配電極アセンブ
リの各サブセット、斯かるサブセット内の各アセンブリは、異なるライブラリー構築試薬
を含むリザーバに結合している。いくつかの場合、ライブラリー構築試薬は、平滑末端化
試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、およびアダプター結合試薬から選択される。
液滴アクチュエーターアセンブリは、反応レーン周辺の磁場が、反応レーンの１つ以上の
領域で液滴中の磁気応答性ビーズを固定するのに十分な強さを有するように、反応レーン
に対して配置された磁石配列を含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、
反応レーン周辺の磁場が、反応レーンの電極により制御された液滴分割反応の間、液滴中
の磁気応答性ビーズを拘束するのに十分な強さを有するように、反応レーンに対して配置
された磁石配列を含んでいてもよい。磁石配列は、磁場の強化された領域を作り出すため
に配置された磁石を含んでいてもよく、当該強化された領域は、反応レーンにそろって、
反応レーン内の磁気応答性ビーズを固定する。
【００３１】
本発明は、電極媒介液滴操作を用いた液滴系検査を実行する方法を提供し、当該方法は
、以下の工程を含む：２以上のサンプル液滴を分配し、いずれのサンプル液滴も他の液滴
の反応レーンを横切ることなく、各サンプル液滴を独立した反応レーンに輸送する工程；
および試薬液滴の第１セットを分配し、試薬液滴の第１セットのいずれの液滴もサンプル
液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴の第１
セットの各液滴を反応レーンに輸送する工程。本発明の方法は、各サンプル液滴と、試薬
液滴の第１セットの１種とを混合する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、各サン
プル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程を含んでいてもよい。本発明の方
法は、試薬液滴の第２セットを分配し、試薬液滴の第２セットのいずれの液滴もサンプル
液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴の第２
セットの各液滴を反応レーンに輸送する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、各サ
ンプル液滴と、試薬液滴の第２セットの１種とを混合する工程を含んでいてもよい。本発
明の方法は、各サンプル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程を含んでいて
もよい。
【００３２】
５  定義
以下の用語は、本明細書では以下に示された意味を有する。
１つ以上の電極に関して「活性化する」とは、１つ以上の電極の電気状態の変化に影響
を及ぼすことを意味し、液滴の存在下では、液滴操作をもたらす。電極の活性化は、交流
電流または直流電流により達成され得る。適したいずれの電圧を用いてもよい。例えば、
約５０Ｖより大きい、または約１００Ｖより大きい、または約１５０Ｖより大きい、また
は約２００Ｖより大きい、または約２５０Ｖより大きい、または約２７５Ｖ〜約３７５Ｖ
、または約３００Ｖの電圧を用いて電極を活性化してもよい。交流電流を用いる場合、い
ずれの適した周波数を用いてもよい。例えば、約１Ｈｚ〜約１０００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜約
１００Ｈｚ、または約１０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約４０Ｈｚ、または約
３０Ｈｚの周波数を有する交流電流を用いて電極を活性化してもよい。
【００３３】
液滴アクチュエーターでのビーズに関して「ビーズ」は、液滴アクチュエーター上の液
滴または液滴アクチュエーターに近接する液滴に相互作用し得る何らかのビーズまたは粒
子を意味する。ビーズは、球、略球、卵形、ディスク形、立方体、不定形および他の３次
元形状等の多種多様な形状であってもよい。ビーズは、例えば、液滴アクチュエーター上
の液滴内で液滴操作にかけられてもよく、またさもなければ、液滴アクチュエーター上の
液滴が液滴アクチュエーター上のおよび／または液滴アクチュエーター外のビーズに接触
するように輸送されることができるように、液滴アクチュエーターに対して構成されても
よい。ビーズは、液滴中、液滴操作間隙中、または、液滴操作表面に供給されてもよい。
ビーズは、液滴操作間隙の外部のリザーバ内に設けられてもよく、または液滴操作表面か
ら離れた場所に位置するリザーバ内に設けられてもよい。当該リザーバは、ビーズを含む
液滴を液滴操作間隙または液滴操作表面に運ぶことができる流体通路および／または電極
通路と結合していてもよい。ビーズは、例えば、樹脂、およびポリマーを含む多種多様な
材料を用いて製造されてもよい。ビーズは、例えば、マイクロビーズ、マイクロ粒子、ナ
ノビーズおよびナノ粒子を含むいずれの適した大きさであってもよい。いくつかの場合、
ビーズは、磁気応答性であり、他の場合ではビーズはそれほど磁気応答性ではなく、また
は磁気応答性ではない。磁気応答性ビーズでは、磁気応答性材料が実質的にビーズの全て
を構成していてもよく、ビーズの一部を構成していてもよく、またはビーズの一部のみを
構成していてもよい。ビーズの残りは、他のもの、ポリマー材料、コーティング、および
検査試薬を付着させることができる部分を含んでいてもよい。好適なビーズの例は、フロ
ーサイトメトリーマイクロビーズ、ポリスチレンマイクロ粒子およびポリスチレンナノ粒
子、機能化ポリスチレンマイクロ粒子および機能化ポリスチレンナノ粒子、被覆ポリスチ
レンマイクロ粒子および被覆ポリスチレンナノ粒子、シリカマイクロビーズ、蛍光マイク
ロスフェアおよび蛍光ナノスフェア、機能化蛍光マイクロスフェアおよび機能化蛍光ナノ
スフェア、被覆蛍光マイクロスフェアおよび被覆蛍光ナノスフェア、着色ダイマイクロ粒
子および着色ダイナノ粒子、磁気マイクロ粒子および磁気ナノ粒子、超常磁性マイクロ粒
子および超常磁性ナノ粒子（例えば、DYNABEADS（登録商標）粒子、CA, CarlsbadのInvit
rogen Group社から入手可能）、蛍光マイクロ粒子および蛍光ナノ粒子、被覆磁気マイク
ロ粒子および被覆磁気ナノ粒子、強磁性マイクロ粒子および強磁性ナノ粒子、被覆強磁性
マイクロ粒子および被覆強磁性ナノ粒子、および２００５年１１月２４日に公開された題
名「Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase」の
米国特許出願公開第20050260686号明細書；２００３年７月１７日に公開された題名「Enc
apsulation of discrete quanta of fluorescent particles」の米国特許出願公開第2003
0132538号明細書；２００５年６月２日に公開された題名「Multiplexed Analysis of Cli
nical Specimens Apparatus and Method」の米国特許出願公開第20050118574号明細書；
２００５年１２月１５日に公開された題名「Microparticles with Multiple Fluorescent
Signals and Methods of Using Same」の米国特許出願公開第20050277197号明細書；２
００６年７月２０日に公開された題名「Magnetic Microspheres for use in Fluorescenc
e-based Applications」の米国特許出願公開第20060159962号明細書に記載のビーズを含
み、当該明細書のビーズならびに磁気応答性材料および磁気応答性ビーズに関する教示を
参照して、その開示全体が本明細書に援用される。ビーズは、生体分子と、または、生体
分子と結合して錯体を形成し得る他の物質と、予備結合してもよい。ビーズは、抗体、タ
ンパク質もしくは抗原、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブまたは所望の標的への親和性を有する何
らかの他の分子と予備結合してもよい。磁気応答性ビーズおよび／または非磁気応答性ビ
ーズを固定するためのおよび／またはビーズを用いた液滴操作手順を実行するための液滴
アクチュエーター技術の例が、以下に記載されており、その開示全体が参照により本明細
書に援用される：２００６年１２月１５日に出願された題名「Droplet-Based Particle S
orting」の米国特許出願第11/639,566号；２００８年３月２５日に出願された題名「Mult
iplexing Bead Detection in a Single Droplet」の米国特許出願第61/039,183号；２０
０８年４月２５日に出願された題名「Droplet Actuator Devices and Droplet Operation
s Using Beads」の米国特許出願第61/047,789号；２００８年８月５日に出願された題名
「Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads」の米国特許出願第6
1/086,183号；２００８年２月１１日に出願された題名「Droplet Actuator Devices and 
Methods Employing Magnetically responsive beads」の国際特許出願第PCT/US2008/0535
45号；２００８年３月２４日に出願された題名「Bead-based Multiplexed Analytical Me
thods and Instrumentation」の国際特許出願第PCT/US2008/058018号；２００８年３月２
３日に出願された題名「Bead Sorting on a Droplet Actuator」の国際特許出願第PCT/US
2008/058047号；および２００６年１２月１１日に出願された題名「Droplet-based Bioch
emistry」の国際特許出願第PCT/US2006/047486号。本発明の複数の態様でビーズ特性を用
いてもよい。複数の態様に適した特性を有するビーズの例は、斯かるビーズから放出され
る信号を検出および解析する方法と同様に、以下の文献に見出すことができ、それらの斯
かるビーズの組成ならびに斯かるビーズを用いたＤＮＡ等の物質を捕捉および溶離する条
件に関する教示について参照して援用される：２００８年１２月１１日に公開された題名
「Systems and Methods for Multiplex Analysis of PCR in Real Time」の米国特許出願
公開第20080305481号明細書；２００８年６月２６日に公開された題名「Methods and Sys
tems for Dynamic Range Expansion」の米国特許出願公開第20080151240号明細書；２０
０７年９月６日に公開された題名「Methods, Products, and Kits for Identifying an A
nalyte in a Sample」の米国特許出願公開第20070207513号明細書；２００７年３月２２
日に公開された題名「Methods and Systems for Image Data Processing」の米国特許出
願公開第20070064990号明細書；２００６年７月２０日に公開された題名「Magnetic Micr
ospheres for use in Fluorescence-based Applications」の米国特許出願公開第2006015
9962号明細書；２００５年１２月１５日に公開された題名「Microparticles with Multip
le Fluorescent Signals and Methods of Using Same」の米国特許出願公開第2005027719
7号明細書；および２００５年６月２日に公開された題名「Multiplexed Analysis of Cli
nical Specimens Apparatus and Method」の米国特許出願公開第20050118574号明細書；
２００５年７月５日に発行された題名「Isolation of nucleic acids」の米国特許第6,91
4,137号。
【００３４】
「液滴」は、液体の一滴を意味する。通常、液滴は充填流体により少なくとも一部が境
界をつけられる。例えば、液滴は充填流体に完全に覆われていてもよいし、または充填流
体および液滴アクチュエーターの１つ以上の表面により境界をつけられてもよい。他の例
として、液滴は、充填流体、液滴アクチュエーターの１つ以上の表面、および／または大
気により境界をつけられてもよい。他の例として、液滴は、充填流体および大気により境
界をつけられてもよい。液滴は、例えば、水性もしくは非水性であってもよいし、または
水性成分および非水性成分を含む混合物またはエマルションであってもよい。液滴は、多
種多様な形状を取ってもよい；液滴の形状の例はこれらに限定されないが、以下の形状を
含む：略ディスク形、ガラス玉形、平頭球形、楕円体、球形、一部偏平な球、半球、卵形
、円筒形、斯かる形状の組み合わせ、および混合もしくは分割等の液滴操作の間に形成さ
れる様々な形状、または斯かる形状が液滴アクチュエーターの１つ以上の表面と接触する
結果形成される様々な形状。本発明の方法を用いた液滴操作にかけられてもよい液滴流体
の例は、２００６年１２月１１日に出願された題名「Droplet-Based Biochemistry」の国
際特許出願第PCT/US06/47486号を参照されたい。様々な実施形態で、液滴は、全血、リン
パ液、血清、血漿、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄液、羊水、精液、膣排泄物、漿液、滑液、
心膜液、腹水、胸膜液、濾出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞試料、単細
胞または複数細胞を含む液体、細胞小器官を含む液体、流動組織、流動有機体、多細胞生
物を含む液体、生物学的スワブ、生物学的洗浄剤、およびこれらの組み合わせ等の生物学
的なサンプルを含んでいてもよい。さらに、液滴は、水、脱イオン水、食塩水、酸性溶液
、塩基性溶液、清浄液および／またはバッファー等の試薬を含んでいてもよい。液滴内容
物の他の例は、生化学的な手順用の試薬等、核酸増幅手順、親和性に基づく検査手順、酵
素分析手順、配列決定手順、および／または生物学的流体の分析手順等の試薬を含む。平
滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、結合試薬、洗浄バッファー、溶離バッファー、結合
バッファー、およびビーズ溶液（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）等の本発明の試薬液
滴は、通常、界面活性剤を含む。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖの水溶性界面
活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ
／ｖの水溶性界面活性剤を含んでいてもよい。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖ
の水溶性ポリソルベート界面活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性ポリソルベ
ート界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ／ｖの水溶性ポリソルベート界面活性剤を含
んでいてもよい。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖの水溶性ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート界面活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ／ｖの水溶
性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤を含んでいてもよい。好適な
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの例としては、ポリオキシエチレン（２０
）ソルビタンモノラウレートであり、これはPromega社からTWEEN（登録商標）２０として
市販されている。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明の１つ以上の液滴
アクチュエーターカートリッジを、湿潤状態または乾燥状態でカートリッジに保存された
および／またはカートリッジに装填するための別の容器に保存された本発明の１種以上の
試薬と共に含む。
【００３５】
「液滴アクチュエーター」は、液滴操作をするための装置を意味する。液滴アクチュエ
ーターの例は、以下を参照されたい：２００５年６月２８日に発行されたPamulaらによる
題名「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」の
米国特許第6,911,132号明細書；２００６年１月３０日に出願されたPamulaらによる題名
「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」
の米国特許出願第11/343,284号明細書；２００６年１２月１１日に出願されたPollackら
による題名「Droplet-Based Biochemistry」の国際特許出願第PCT/US2006/047486号；She
nderovによる２００４年８月１０日に発行された題名「Electrostatic Actuators for Mi
crofluidics and Methods for Using Same」の米国特許第6,773,566号明細書、および２
０００年１月２４日に発行された題名「Actuators for Microfluidics Without Moving P
arts」の米国特許第6,565,727号明細書；Kimおよび／またはShahらによる２００３年１月
２７日に出願された題名「Electrowetting-driven Micropumping」の米国特許出願第10/3
43,261号明細書、２００６年１月２３日に出願された題名「Method and Apparatus for P
romoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle」の米国特許出願第11
/275,668号明細書、２００６年１月２３日に出願された題名「Small Object Moving on P
rinted Circuit Board」の米国特許出願第11/460,188号明細書、２００９年５月１４日に
出願された題名「Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics」の
米国特許出願第12/465,935号明細書、および２００９年４月３０日に出願された題名「Me
thod and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of 
Droplets on Chip」の米国特許出願第12/513,157号明細書；２００９年６月１６日に発行
されたVelevによる題名「Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid
Surface」の米国特許第7,547,380号明細書；２００７年１月１６日に発行されたSterlin
gらによる題名「Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electr
owetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like」の米国特
許第7,163,612号明細書；BeckerおよびGascoyneらによる２０１０年１月５日に発行され
た題名「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」の米国特許第7,
641,779号明細書、および２００５年１２月２０日に発行された題名「Method and Appara
tus for Programmable fluidic Processing」の米国特許第6,977,033号明細書；Decreら
による２００８年２月１２日に発行された題名「System for Manipulation of a Body of
Fluid」の米国特許第7,328,979号明細書；Yamakawaらによる２００６年２月２３日に公
開された題名「Chemical Analysis Apparatus」の米国特許出願公開第20060039823号明細
書；Wuによる２００８年１２月３１日に公開された題名「Digital Microfluidics Based 
Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes」の国際特許公開第WO/2009/003184
号明細書；Fouilletらによる２００９年７月３０日に公開された題名「Electrode Addres
sing Method」の米国特許公開第20090192044号明細書；Fouilletらによる２００６年５月
３０日に発行された題名「Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a 
Micro-catenary Line by Electrostatic Forces」の米国特許第7,052,244号明細書；Marc
handらによる２００８年５月２９日に公開された題名「Droplet Microreactor」の米国特
許出願公開第20080124252号明細書；Adachiらによる２００９年１２月３１日に公開され
た題名「Liquid Transfer Device」の米国特許出願公開第20090321262号明細書；Rouxら
による２００５年８月１８日に公開された題名「Device for Controlling the Displacem
ent of a Drop Between two or Several Solid Substrates」の米国特許出願公開第20050
179746号明細書；Dhindsaらによる題名「Virtual Electrowetting Channels: Electronic
Liquid Transport with Continuous Channel Functionality」のLab Chip、10号、第832
〜836頁、２０１０年；これらの優先権文献と共に、これらの内容を参照して、その開示
全体が本明細書に援用される。所定の液滴アクチュエーターは、基板間に間隙を有するよ
うに配置された１つ以上の基板と、１つ以上の基板に結合し（例えば、重ねた、取り付け
た、および／または埋め込まれた）、１つ以上の液滴操作を行うよう配置された電極とを
含む。例えば、所定の液滴アクチュエーターは、基部（または底部）基板、基板に結合し
た液滴操作電極、基板および／または電極の頂部の１つ以上の誘電体層、ならびに任意に
基板、誘電体層および／または液滴操作表面を形成する電極の頂部の１つ以上の疎水性層
を含む。頂部基板は、一般に液滴操作間隙と称される間隙により液滴操作表面から分離さ
れて供給されてもよい。頂部および／または底部基板上に配列された様々な電極が、上記
参考特許および出願において説明されており、本明細書の記述では所定の新規な電極配列
が説明されている。液滴操作の間、液滴が、アースまたは参照電極と連続的な接触または
頻繁な接触を保つことが好適である。アースまたは参照電極は、間隙で、間隙に面した頂
部基板、間隙に面した底部基板に結合してもよい。両方の基板上に電極が供給される場合
、電極を制御またはモニターするための、液滴アクチュエーター機器に電極を結合するた
めの電気的な接触は、１または両方の基板に結合してもよい。いくつかの場合、一の基板
上の電極が、他の基板に電気的に結合し、その結果、一の基板のみが液滴アクチュエータ
ーと接続する。一の実施形態では、導電性材料（例えば、エポキシ、ＮＪ、HackensakのM
aster Bond社から入手可能なMASTER BOND（商標）Polymer System EP79等）が、一の基板
上の電極と、他の基板上の電気的通路との間の電気的接続を提供する；例えば、頂部基板
上のアース電極は、斯かる導電性材料により底部基板上の電気的通路に結合してもよい。
複数の基板を用いる場合、スペーサーを基板間に設け、基板間の間隙の高さを決定し、分
配リザーバを規定してもよい。スペーサーの高さまたは間隙の高さは、例えば、約５μｍ
〜約５ｍｍ、または約５μｍ〜約１ｍｍ、または約５μｍ〜約６００μｍ、または約１０
０μｍ〜約４００μｍ、または約２００μｍ〜約３５０μｍ、または約２５０μｍ〜約３
００μｍ、または約２７５μｍであってもよい。スペーサーは、例えば、頂部基板または
底部基板からの突起層、および／または頂部基板または底部基板の間に挿入された材料層
として形成してもよい。流体通路を通じて液体が液滴操作間隙に供給され得る流体通路を
形成するために、１つ以上の開口部が１つ以上の基板に設けられてもよい。いくつかの場
合、１つ以上の開口部を、開口部を通った液体が１つ以上の液滴操作電極と十分近接し、
液体操作が液体を用いた液体操作電極により影響されるような配列等、１つ以上の電極と
の相互作用のために配列してもよい。いくつかの場合、基部（または底部）基板および頂
部基板は、１つの一体化した部材として形成されてもよい。１つ以上の参照電極が、基部
（または底部）基板上および／または頂部基板上および／または間隙内に設けられてもよ
い。参照電極配列の例が、上記参考特許および参考特許出願に開示される。様々な実施形
態では、液滴アクチュエーターによる液滴の操作は、電気濡れ媒介または誘電泳動媒介ま
たはクーロン力媒介等の電極媒介であってもよい。液滴操作を制御するために、本発明の
液滴アクチュエーターで用いてもよい他の技術の例は、機械的原理（例えば、外部シリン
ジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電ポンプ／超音波ポン
プおよび音響力）；電気的原理または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ
、強磁性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁力を利用した引力または斥力、および電磁
流体力学ポンプ）；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相転移体積膨張）；他の種類の表
面湿潤原理（例えば、電気濡れ、および光電濡れと同様に化学的な、熱的な、構造的なお
よび放射性の誘起表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば、毛細管現象）；静電力（例
えば、電気浸透流）；遠心力（コンパクトディスク上に配置され、回転された基板）；磁
力（例えば、振動イオンが流れを引き起こす）；電磁流体力学的な力；および真空差また
は加圧差等に基づき操作するもの等の、流体力学的な流体圧を誘起する装置、の使用を含
む。いくつかの実施形態では、上記技術の２種以上を組み合わせたものを用いて、本発明
の液滴アクチュエーターで液滴操作を行ってもよい。同様に、上述したものの１つ以上を
用いて、例えば、他の装置のリザーバから、または、液滴アクチュエーターの外部リザー
バから（例えば、液滴アクチュエーター基板に結合したリザーバおよび当該リザーバから
液滴操作間隙への流体通路）、液体を液滴操作間隙内に供給してもよい。本発明の所定の
液滴アクチュエーターの液滴操作表面は、疎水性材料でできていてもよく、または、液滴
操作表面を疎水性とするために被覆または処理されていてもよい。例えば、いくつかの場
合、液滴操作表面の一部または全部が、溶液中のポリ−もしくはパーフルオロ化合物、ま
たは、重合性単量体等の化合物を使用した、堆積または自然位合成等により、低界面エネ
ルギー材料または化学的性質により誘導体化されていてもよい。例としては、TEFLON（登
録商標）AF（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）、材料のcytopファミリーの一部
、疎水性のFLUOROPEL（登録商標）ファミリーにおけるコーティングおよび超疎水性コー
ティング（MD、Beltsville、Cytonix社から入手可能）、シランコーティング、フルオロ
シランコーティング、疎水性ホスホン酸誘導体（例えば、Aculon社から販売されている商
品）、およびNOVEC（商標）電気コーティング（MN、St. Paul、3M Company社から入手可
能）、およびプラズマ化学気相成長法（PECVD）用の他のフッ素化された単量体を含む。
いくつかの場合、液滴操作表面は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの厚さを有する疎水性コ
ーティングを含んでいてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、液滴アクチュエータ
ーの頂部基板は、導電性有機ポリマーを含み、頂部基板は、次いで、疎水性コーティング
で被覆され、または、液滴操作表面を疎水性にするために他の処理をされる。例えば、プ
ラスチック基板上に堆積される導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４−エチレンジオキシ
チオフェン）ポリ（スチレンスルホネート）（PEDOT：PSS）であってもよい。導電性有機
ポリマー層および代替の導電層の他の例は、Pollackらによる題名「Droplet Actuator De
vices and Methods」の国際特許出願第PCT/US2010/040705号明細書に記載されており、そ
の開示全体が参照により本明細書に援用される。１つまたは両方の基板が、基板としてプ
リント基板（ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆ガラス、および／
または半導体材料を用いて製造されてもよい。基板がＩＴＯ被覆ガラスの場合、ＩＴＯコ
ーティングは、約２０〜約２００ｎｍの範囲が好ましく、約５０〜約１５０ｎｍの範囲、
または約７５〜約１２５ｎｍ、または約１００ｎｍの厚さが好ましい。いくつかの場合、
頂部基板および／または底部基板は、ポリイミド誘電体等の誘電体で被覆されたＰＣＢ基
板を含み、ＰＣＢ基板は、いくつかの場合、被覆または他の処理がなされて、液滴操作表
面を疎水性にしてもよい。
基板がＰＣＢを含む場合、以下の材料が好適な材料の例である：MITSUI（商標）BN-300
（CA、San Jose、MITSUI Chemical America社から入手可能）；ARLON（商標）11N（CA、S
anta Ana、Arlon社から入手可能）；NELCO（登録商標）N4000-6およびN5000-30/32（NY、
Melville、Park Electrochemical社から入手可能）；ISOLA（商標）FR406（AZ、Chandler
、Isola Group社から入手可能）、特にIS620；フルオロポリマーファミリー（低バックグ
ラウンド蛍光を有するため蛍光検出に適している）；ポリイミドファミリー；ポリエステ
ル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶
ポリマー；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ
）；アラミド；THERMOUNT（登録商標）不織布アラミド補強材（DE、Wilmington、DuPont
社から入手可能）；NOMEX（登録商標）ブランド繊維（DE、Wilmington、DuPont社から入
手可能）；および紙。種々の材料についても、基板の誘電体部材としての使用に適してい
る。例としては以下のものを含む：PARYLENE（商標）C（特にガラス上）およびPARYLENE
（商標）N（TX、Katy、Parylene Coating Services社から入手可能）等の蒸着した誘電体
；TEFLON（登録商標）AFコーティング；cytop；TAIYO（商標）PSR4000シリーズ、TAIYO（
商標）PSRおよびAUSシリーズのような液体光画像形成可能なソルダーマスク（NV、Carson
City、Taiyo America社から入手可能）（熱制御を含む用途に良好な熱特性）、およびPR
OBIMER（商標）8165（熱制御を含む用途に良好な熱特性）（CA、Los Angels、Huntsman A
dvanced Materials Americas社から入手可能）等のソルダーマスク；VACREL（登録商標）
乾燥フィルムソルダーマスク系（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等の乾燥フィ
ルムソルダーマスク；ポリイミドフィルム（例えば、KAPTON（登録商標）ポリイミドフィ
ルム、DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等のフィルム誘電体、ポリエチレン、お
よびフルオロポリマー（例えば、ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン；ポリエステル
；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィ
ンポリマー（ＣＯＰ）；上で列挙した他のＰＣＢ基板材料のいずれか；ブラックマトリッ
クス樹脂；およびポリプロピレン。液滴輸送の電圧と周波数は、個別の検査手順で用いら
れる試薬の性能によって選択してもよい。設計パラメーターは異なっていてもよく、例え
ば、アクチュエーターのリザーバの数と配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの
大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間
隙高さ（頂部基板と底部基板の間）は、個別の試薬、手順、液滴体積等の使用のために異
なっていてもよい。いくつかの場合、本発明の基板は、溶液中のポリ−もしくはパーフル
オロ化合物または重合性単量体等の化合物を使用した、堆積または自然位合成等により、
低界面エネルギー材料または化学的性質により誘導体化されていてもよい。例としては、
浸漬またはスプレーコーティング用のTEFLON（登録商標）AFコーティングおよびFLUOROPE
L（登録商標）コーティング、ならびにプラズマ化学気相成長法（PECVD）用の他のフッ素
化された単量体を含む。加えて、いくつかの場合、液滴操作表面の一部または全部は、Ｐ
ＣＢ基板からのバックグラウンド蛍光等のバックグラウンドのノイズを低減する物質で被
覆されていてもよい。例えば、ノイズ低減コーティングは、日本の東レから入手可能なブ
ラックマトリックス樹脂等のブラックマトリックス樹脂を含む。液滴アクチュエーターの
電極は、通常、コントローラーまたはプロセッサーにより制御され、コントローラーまた
はプロセッサーは、それ自身、システムの一部として提供され、処理機能と同様に、デー
タおよびソフトウェアストレージならびに入力および出力機能を含んでいてもよい。試薬
は、液滴アクチュエーター上であって、液滴操作間隙内、または、液滴操作間隙に流体的
に結合したリザーバ内に供給されてもよい。試薬は、液滴等の液体形態でもよく、または
試薬は、液滴操作間隙内または液滴操作間隙に流体的に結合したリザーバ内で再構成可能
な形態で供給されてもよい。再構成可能な試薬は、通常、再構成のために液体と組み合わ
されてもよい。本発明での使用に好適な再構成可能な試薬の例は、Meathrelらによる２０
１０年６月１日に特許された題名「Disintegratable films for diagnostic devices」の
米国特許第7,727,466号明細書に記載されている試薬を含む。
【００３６】
「液滴操作」は、液滴アクチュエーター上での液滴の何らかの操作を意味する。液滴操
作は、例えば、以下を含む：液滴アクチュエーターへの液滴の装填；液滴源からの１以上
の液滴の分配；一の液滴を２以上の液滴とする分割（splitting）、分離（separating）
または分割（dividing）；一の位置からいずれかの方向の他の位置への液滴の輸送；２以
上の液滴を単一の液滴にする混合（merging）または結合（combining）；液滴の希釈；液
滴の混合（mixing）；液滴の撹拌；液滴の変形；適所での液滴の保持；液滴の保温；液滴
の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の廃棄；液滴の液滴アクチュエーター外への輸送
；本明細書に記載の他の液滴操作；および／または上記の組み合わせ。用語「混合させる
」、「混合」、「混合する」、「結合」等は、２以上の液滴から１の液滴を生成すること
を記載するために用いている。２以上の液滴に関して斯かる用語を使用するときは、２以
上の液滴の結合により１の液滴とするのに十分な何らかの液滴操作の組み合わせを用いて
もよいことが理解される。例えば、「液滴Ａと液滴Ｂとの混合」は、液滴Ａを動かない液
滴Ｂと接触するように輸送すること、液滴Ｂを動かない液滴Ａと接触するように輸送する
こと、または液滴ＡおよびＢを互いに接触するように輸送することにより達成される。用
語「分割」、「分離」および「分割」は、生成する液滴の体積（すなわち、生成する液滴
の体積が同一または異なり得る）または生成する液滴の数（生成する液滴の数が２，３，
４，５またはそれ以上であってもよい）に関して何ら特定の結果を意味することを意図し
たものではない。用語「混合（mixing）」は、液滴中で１つ以上の構成要素をより均一に
分布させる液滴操作をいう。液滴操作の「装填」の例は、微小透析装填、圧力補助装填、
ロボット装填、受動装填（例えば、重力補助装填）、およびピペット装填を含む。用語「
保温（incubating）」または「保温（incubation）」は、一定時間、液滴が特定の温度ま
たは温度プロフィールに保たれることをいう；液滴は、保温の間、静止位置に保たれても
よいし、または常に移動していてもよい、または、分割−混合−分割−混合、もしくは、
前後への輸送、もしくは、ループ等の周期的な液滴操作にかけられてもよい。アクチュエ
ーターで液滴操作を行ってもよいということは、液滴アクチュエーターの液滴操作表面で
、または液滴アクチュエーターの液滴操作間隙内で、液滴操作が行われることを意味し、
いずれの場合でも、液滴は、充填流体によって液滴アクチュエーターの１つ以上の表面か
ら分離していてもよい。液滴操作は、電極媒介されてもよい。いくつかの場合、液滴操作
は、表面上の親水性領域および／または疎水性領域の使用により、および／または物理的
障害により、および／または異なる間隙高さ等の液滴アクチュエーターの形状により、さ
らに促進される。液滴操作の例については、「液滴アクチュエーター」という定義の下で
、上記特許および特許出願文献を参照されたい。いくつかの場合、液滴操作は、液滴アク
チュエーターの間隙高さの差異、または寸法の差異によって媒介されてもよい。また、こ
れに伴い、エネルギー的により安定なコンホメーションに液滴が移動するにつれ、液滴変
形を生ずる。インピーダンスまたは静電容量感知または画像化技術または目視観測を、時
々、液滴操作の結果を決定または確認するために用いてもよい。斯かる技術の例は、Stur
merらによる２００８年８月２１日に公開された題名「Capacitance Detection in a Drop
let Actuator」の国際特許公開第WO/2008/101194号明細書に記載されており、その開示全
体が参照により本明細書に援用される。一般的に言えば、感知または画像化技術は、特定
の電極に液滴が存在するか否かを確認するのに用いてもよい。例えば、ある液滴分配操作
後の目的電極における分配された液滴の存在により、その液滴分配操作が効果的だったこ
とが確認される。同様に、検査手順の適当な工程の検出場所で液滴が存在することにより
、前の一連の液滴操作が検出用液滴を良好に生成したことを確認してもよい。液滴輸送時
間は、かなり早くともよい。例えば、様々な実施形態で、一の電極から隣の電極までの液
滴の輸送は、約１秒、または約０．１秒、または約０．０１秒、または約０．００１秒を
超えてもよい。一の実施形態では、電極は直流モードで操作されるが、画像化するために
交流モードに切り替えられる。電気濡れ領域に類似した液滴の専有領域について液滴操作
を行うことが有用である；換言すると、１倍、２倍、３倍の液滴が、それぞれ、１、２、
および３個の電極を用いて効果的に制御されて操作される。もし、液滴の専有領域が所定
時間に液滴操作を行うために利用可能な電極の数よりも大きい場合、液滴の大きさと電極
の数との差は、通常１より大きくなく、換言すると、２倍の液滴が１個の電極を用いて効
果的に制御され、３倍の液滴が２個の電極を用いて効果的に制御される。液滴がビーズを
含む場合、液滴の大きさは、液滴を輸送する等の液滴を制御する電極の数と等しいことが
有利である。しかしながら、注目すべきことに、界面張力、輸送スピード等を変えること
により、液滴の専有領域よりはるかに小さな専有領域を有する電極または電極のセットを
用いて非常に大きな液滴を輸送できる；したがって、上述の文は、有用な目安を記載して
おり、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００３７】
「充填流体」は、液滴と混合しないまたは実質的に混合しない流体を意味する。いくつ
かの実施形態では、充填流体は、液滴アクチュエーターの液滴操作基板と関連しており、
ここで流体は十分に液滴相と非混和性であり、液滴相を電極媒介の液滴操作に供する。例
えば、液滴アクチュエーターの間隙は、通常、充填流体で充填される。充填流体は、例え
ば、シリコーンオイルまたはヘキサデカン充填流体等の低粘性オイルであってもよい。充
填流体は、液滴アクチュエーターの間隙全体を充填していてもよいし、または液滴アクチ
ュエーターの１つ以上の表面を被覆していてもよい。充填流体は、導電性または非導電性
であってもよい。充填流体は、例えば、界面活性剤または他の添加剤が添加されていても
よい。例えば、添加剤を選択して、液滴操作を改良してもよいし、および／または、液滴
からの試薬もしくは目標物質の損失、微小液滴の形成、液滴間の相互汚染、液滴アクチュ
エーター表面の汚染、液滴アクチュエーター材料の分解等を低減してもよい。界面活性剤
の添加を含む充填流体の組成は、個別の検査手順で用いられる試薬の性能、および、液滴
アクチュエーターの材料との効果的な相互作用または非相互作用、により選択してもよい
。本発明での使用に適した充填流体および充填流体の配合の例は、Srinivasanらによる２
０１０年３月１１日に公開された題名「Droplet Actuators, Modified Fluids and Metho
ds」の国際特許公開第WO/2010/027894号明細書および２００９年２月１２日に公開された
題名「Use of Additives for Enhancing Droplet Operations」の国際特許公開第WO/2009
/021173号明細書；Sistaらによる２００８年８月１４日に公開された題名Droplet Actuat
or Devices and Methods Employing Magnetically responsive beads」の国際特許公開第
WO/2008/098236号明細書；およびMonroeらによる２００７年５月１７日に出願された題名
「Electrowetting Devices」の米国特許出願公開第20080283414号明細書に記載されてお
り、本明細書で引用された他の特許および特許出願文献と同様に、その開示全体が参照に
より本明細書に援用される。注目すべきことに、本明細書に記載の任意のライブラリー作
製方法を、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙を実質的に満たしている充填流体等の充
填流体中で行ってもよい。一の実施形態では、充填流体は、約１〜約６．５ｃＳＴ、また
は約１．５〜約５．５ｃＳＴ、または約２〜約５ｃＳＴの動的粘度を有するシリコーンオ
イルを含む。当該シリコーンオイルに界面活性剤を添加してもよい。一の実施形態では、
ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのオイル
可溶性の界面活性剤、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性
剤、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０
．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤と共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃ
ＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液
滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供す
る。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１
〜約１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エステル、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖ
のソルビタンの脂肪酸エステル、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタン
の脂肪酸エステル、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エス
テルと共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施
形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する
充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するた
めの充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタン
エステル、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタ
ンエステル、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソル
ビタンエステル、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性の
ソルビタンエステルと共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したが
って、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯か
る特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構
築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのソルビタントリオレア
ート、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアートのエステル、
または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアート、または約０．０
０５〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアートのエステルと共に、約２ｃＳＴ〜
約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。ソルビタントリオレアートは、Sigma Aldrich社
から界面活性剤配合SPAN（登録商標）85として入手可能である。したがって、一の実施形
態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充
填流体とを含むキットを提供する。一の実施形態では、ライブラリー構築を実行するため
の充填流体は、約０．０１〜約２％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．１
〜約１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．１〜約０．５％ｖ／ｖのオイ
ル可溶性の界面活性剤と共に、２ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実
施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有す
る充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行する
ための充填流体は、約０．０１〜約２％ｖ／ｖのオイル可溶性のオクチルフェノールエト
キシレート界面活性剤、または約０．１〜約１％ｖ／ｖのオイル可溶性のオクチルフェノ
ールエトキシレート界面活性剤、または約０．１〜約０．５％ｖ／ｖのオイル可溶性のオ
クチルフェノールエトキシレート界面活性剤と共に、２ｃＳＴのシリコーンオイルを含む
。例えば、好適なオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤は、TRITON（登録商標）
X-15であり、当該TRITON（登録商標）X-15は１５のエチレンオキシド単位を有するオクチ
ルフェノールエトキシレートである。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明
の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提
供する。他の実施形態では、界面活性剤は、ブロック共重合体を含む。例えば、ブロック
共重合体は、ポリ（テトラフルオロエチレン）ブロックおよびポリ（ジメチルシロキサン
）を含んでいてもよい。一の実施形態では、ポリ（テトラフルオロエチレン）ブロックは
、約５〜約５０の繰り返し単位を含んでいてもよい。一の実施形態では、ポリ（ジメチル
シロキサン）は、約４００〜約１０，０００ＭＷのＭＷを有していてもよい。他の実施形
態では、界面活性剤は、親水性シリコーンまたは親水性シロキサンを含む。例えば、界面
活性剤は、ジメチルシロキサン主鎖を含んでいてもよく、当該ジメチルシロキサン主鎖で
はメチル基のいくつかが、ポリアルキレンオキシ基またはピロリドン基により、スペーサ
ーとしてのプロピル基に置換されている。好適な界面活性剤のさらなる例は、ポリアルキ
レンオキシドシリコーン、ヒドロキシシリコーンおよびカチオン性シリコーン、ポリ（ア
ルキレンオキシ）官能化金属有機物およびポリ（アルキレンオキシ）官能化金属シラン、
ならびにトリシロキサンを含む。さらなる例は、DBE−712（ジメチルシロキサン−エチレ
ンオキシドブロック共重合体）、DBP−732（ジメチルシロキサン−（６０％プロピレンオ
キシド−４０％エチレンオキシド）ブロック共重合体）、DBE−224（ジメチルシロキサン
−エチレンオキシドブロック共重合体）、QMS−435（３５〜４５％（トリメチルフェネチ
ル）メチルシロキサン−５５〜６５％ジメチルシロキサン共重合体、塩化物塩）、CMS−2
22（（カルビノール官能化）メチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体）、AKT841
（Ｏ−アリルオキシ（ポリエチレンオキシ）トリイソプロポキシチタネート）、SIT8192.
0（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド）、SIM6492
.7（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン）、SIH6185.
0（（ヒドロキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）、SIM6492
.6（（メトキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）、およびSI
A0075.0（（アセトキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）を
含み、全てPA、Morrsiville、Gelest社から入手可能である。
【００３８】
磁気応答性ビーズに関して「固定する」は、ビーズが液滴アクチュエーター上の液滴中
または充填流体中の位置に実質的に拘束されていることを意味する。例えば、一の実施形
態では、固定されたビーズは、液滴中で位置に実質的に拘束され、液滴分割操作の実行が
可能となり、実質的に全てのビーズを有する１の液滴と、実質的にビーズを欠く１の液滴
とを生ずる。
【００３９】
「磁気応答性」は、磁場に対する応答性を意味する。「磁気応答性ビーズ」は、磁気応
答性材料を含むかまたは磁気応答性材料から構成される。磁気応答性材料の例は、常磁性
材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、およびメタ磁性材料を含む。好適な常磁性材料の例
は、鉄、ニッケル、およびコバルトと同様に、Ｆｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ
、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、およびＣｏＭｎＰ等の金属酸化物を含む。
【００４０】
液滴および／または液滴中の磁気応答性ビーズに関して、本明細書で用いられる「磁石
の磁場への輸送」、「磁石への輸送」等は、液滴中の磁気応答性ビーズを実質的に引き付
けることができる磁場領域への輸送についての言及を意図している。同様に、液滴および
／または液滴中の磁気応答性ビーズに関して、本明細書で用いられる「磁石または磁場か
ら離れる輸送」、「磁石の磁場外への輸送」等は、液滴または磁気応答性ビーズが磁場か
ら完全に除去されるか否かに関わらず、液滴中の磁気応答性ビーズを実質的に引き付ける
ことができる磁場領域から離れる輸送についての言及を意図している。本明細書に記載の
斯かる場合のいずれでも、液滴は磁場の所望の領域へ向けてまたは領域外へ輸送されても
よく、および／または磁場の所望の領域が液滴へ向けてまたは遠ざけて移動されてもよい
ことが理解される。磁場「内に（within）」または磁場「内に（in）」ある電極、液滴、
または磁気応答性ビーズ等への言及は、以下の状況の記載を意図している：（ｉ）電極が
、液滴を磁場の所望の領域へまたは領域外へ輸送できる態様で電極が設けられている状況
、または（ｉｉ）液滴または磁気応答性ビーズが、磁場の所望の領域に位置している状況
；各場合に所望の領域内の磁場は、液滴中のいずれかの磁気応答性ビーズを実質的に引き
付けることができる。同様に、磁場「外に（outside of）」または磁場「から離れて（aw
ay from）」ある電極、液滴、または磁気応答性ビーズ等への言及は、以下の状況の記載
を意図している：（ｉ）電極が、液滴を磁場の特定の領域から離れて輸送できる態様で電
極が設けられている状況、または（ｉｉ）液滴または磁気応答性ビーズが、磁場の特定の
領域から離れて位置している状況；各場合に斯かる領域の磁場は、液滴中のいずれの磁気
応答性ビーズも実質的に引き付けることができないか、または、斯かる領域におけるいず
れの残余の引力も、当該領域で行われる液滴操作の有効性を低減しない。本発明の様々な
態様では、システム、液滴アクチュエーター、またはシステムの他の構成要素は、１つ以
上の永久磁石（例えば、単一の円筒状もしくは棒磁石またはHalbach配列等の斯かる磁石
の配列）、または、電磁石もしくは電磁石の配列等の磁石を含み、磁気応答性ビーズまた
は液滴アクチュエーターの他の構成要素と相互作用する磁場を形成してもよい。斯かる相
互作用は、例えば、保存中、または、液滴操作もしくは液滴外への磁気応答性ビーズの引
っ張りの間の液滴中の、磁気応答性ビーズの動きまたは流れを実質的に固定することまた
は拘束することを含む。
【００４１】
ビーズの洗浄に関して「洗浄」は、ビーズに接触している液滴から、ビーズに接触して
いるまたはさらされている１つ以上の物質の量および／または濃度を低減することを意味
する。物質の量および／または濃度の低減は、部分的、実質的に完全、または、完全でも
よい。物質は広範な種類の物質のいずれでもよい；例としては、（ｉ）さらなる分析のた
めの目的物質、および、（ｉｉ）サンプルの成分、汚染物質、および／または過剰な試薬
等の不要な物質を含む。いくつかの実施形態では、洗浄操作は、磁気応答性ビーズに接触
した開始液滴から始まり、ここで当該液滴は、初期量および初期濃度の物質を含む。洗浄
操作は、様々な液滴操作を用いて進めてもよい。洗浄操作は、磁気応答性ビーズを含む液
滴を生成してもよく、ここで、当該液滴は、物質の初期量および／または初期濃度よりも
少ない物質の合計量および／または濃度を有する。好適な洗浄技術の例は、Pamulaらによ
る２００８年１０月２１日に発行された題名「Droplet-Based Surface Modification and
Washing」の米国特許第7,439,014号に記載されており、その開示全体が参照により本明
細書に援用される。
【００４２】
用語「頂部（top）」、「底部（bottom）」、「上（over）」、「下（under）」および
「上（on）」は、液滴アクチュエーターの頂部基板および底部基板の相対的位置等の液滴
アクチュエーターの構成要素の相対的位置に関する説明で用いられている。液滴アクチュ
エーターは、空間での液滴アクチュエーターの配向に関わらず機能してもよいことが理解
される。
【００４３】
いずれの形態（例えば、動いているまたは静止している液滴もしくは連続体）でも液体
が、電極、配列、マトリックスまたは表面「上（on）」、「に（at）」、または「上（ov
er）」にあるとして記載される場合、斯かる液体は、電極／配列／マトリックス／表面に
直接接触するか、または、液体と電極／配列／マトリックス／表面との間に挿置される１
つ以上の層もしくはフィルムに接触するかのいずれでもよい。
【００４４】
液滴が液滴アクチュエーター「上に（on）」、または「に装填されて（loaded on）」
または「内に装填されて（loaded into）」にあるとして記載されるとき、（ｉ）液滴ア
クチュエーターを用いて、液滴への１つ以上の液滴操作を容易にする態様で、液滴が液滴
アクチュエーター上に配置されている、（ｉｉ）液滴の特性または液滴からの信号を感知
するのを容易にする態様で、液滴が液滴アクチュエーター上に配置されている、および／
または、（ｉｉｉ）液滴が液滴アクチュエーターで液滴操作にかけられたことが、理解さ
れる。
【００４５】
化学反応が記載された場合においては、当該化学反応は、記述された結果を達成するい
ずれの温度および時間で、行ってもよいと推定される。
６  図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、核酸ライブラリーの構築についての手順の一例のフローチャートを表す。
【図２】図２は、表３に示されたライブラリー出力データを計算するために用いたアガロースゲルの写真を示す。
【図３】図３は、アクチュエーターでのライブラリー構築手順の７回の追加実行のアガロースゲル分析から計算された収率のプロットを示す。
【図４】図４は、対末端手順の溶離およびＤＮＡ浄化工程の、台上および液滴アクチュエーターでの実行を比較したプロットを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｉ】図５Ｉは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｊ】図５Ｊは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｋ】図５Ｋは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｌ】図５Ｌは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５Ｍ】図５Ｍは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図６】図６は、図６Ａ〜６Ｈに示された核酸調製方法を他の方法で描写したフローチャートを表す。
【図７】図７は、図６Ａ〜６Ｈに示されたアルコール系ビーズ洗浄／溶離方法を他の方法で描写したフローチャートを表す。
【図８Ａ】図８Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。
【図９】図９は、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの一例の平面図を表す。
【図１０】図１０は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１１】図１１は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１２】図１２は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの他の一例の平面図を表す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの他の一例の斜視図を表す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーターの頂部基板の実施の一例の平面図を表す。
【図１４】図１４は、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーターの底部基板の一例の平面図を表し、底部基板は底部基板上に形成された電極配列を有する。
【図１５】図１５は、液滴アクチュエーターの底部基板であり、液滴輸送と作業行程時間とを最適化するために底部基板上にパターン化された電極配列を有する底部基板の一例の平面図を表す。
【図１６】図１６は、図１５の電極配列により支持されたアクチュエーターの流体リザーバを充填するための開口部に関連した、図１５の底部基板の平面図を表す。
【図１７】図１７は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図１８】図１８は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図１９】図１９は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２０】図２０は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２１】図２１は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、磁石アクチュエーターの斜視図を表す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、磁石アクチュエーターの斜視図を表す。
【図２３】図２３は、１つ以上の磁石アクチュエーターと１つ以上の加熱機構とを備えた機械的固定具の一例の平面図を表す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Halbach磁石配列の例の斜視図を表す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Halbach磁石配列の例の斜視図を表す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、例えば、液滴アクチュエーターの電極に対する、図２４ＡのHalbach磁石配列の磁場の関係を表す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、例えば、液滴アクチュエーターの電極に対する、図２４ＡのHalbach磁石配列の磁場の関係を表す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、図２４ＡのHalbach磁石配列に関連した図２５Ａの液滴アクチュエーターの他の図（すなわち、平面図）を表す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、図２４ＢのHalbach磁石配列に関連した図２５Ｂの液滴アクチュエーターの他の図（すなわち、平面図）を表す。
【図２７】図２７は、液滴アクチュエーターでのサンプル濃縮の方法のフローチャートを表す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの側面図を表す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、液滴アクチュエーターの一部の一例の平面図を表し、廃棄する液滴のダンピング方法を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、液滴アクチュエーターの一部の一例の断面図を表し、廃棄する液滴のダンピング方法を示す。
【図３０】図３０は、図２９Ａおよび２９Ｂの液滴アクチュエーターの他の実施形態の断面図を表す。
【図３１】図３１は、電極配列の一例の一部の平面図と２倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３２】図３２は、図３１の電極配列の平面図と１倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３３】図３３は、図３１の電極配列の他の実施形態の平面図と１倍液滴を分配するための他のリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【図３４Ｅ】図３４Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
７  発明の詳細な説明
本発明は、核酸ライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法は、通常、オイ
ル等の非混和性の流体中でサンプル液滴および試薬液滴を使用する。一の実施態様では、
本発明の方法は、入力サンプルとしてフラグメント化された核酸を使用し、核酸配列決定
方法の次の工程のためのアダプター結合核酸ライブラリーにより終了し、核酸配列決定方
法は、F. Hoffmann-La Roche社、Life Technology社、Illumina社、Helicos BioSciences
社およびPacific Biosciences of California社等から入手可能または開発されているプ
ラットフォーム等の次世代配列決定プラットフォームを使用する。本発明の方法の開始及
び終了のいずれにおいても、サイズ分画、核酸フラグメンテーション、逆転写、核酸増幅
、二本鎖ヌクレアーゼ処理、ターゲット濃縮、ターゲット配列捕捉、サイズ選択、および
核酸出力の定量化（例えば、ゲル電気泳動、qPCR、または他の方法による）等の追加の工
程が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化学的な手法は、液滴アクチュ
エーター装置を用いて実行されてもよい。方法全体における収率、特定の工程における収
率、結果までの時間、試薬消費量、およびバイアス等のライブラリー構築のパラメーター
は、当技術分野の現状を超えて非常に向上している。本発明は、核酸ライブラリー構築を
超えた用途を有する新規な装置、手法および検査工程も提供する。
【００４８】
７．１  ライブラリー構築
本発明の典型的なライブラリー構築手順は、いくつかの酵素反応の工程を含む。酵素反
応の工程の一部または全部の後に核酸精製を行ってもよい。酵素反応の工程は、１倍、２
倍、３倍、４倍サイズの液滴等の単位サイズ化された液滴を用いて行ってもよい。酵素反
応の工程は、非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填
された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫され
た液滴のように、液滴が、非混和性または実質的に非混和性の充填流体に浮遊しているま
たは沈降している間、あるいは非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまた
は部分的に囲まれている間に行ってもよい。したがって、本明細書では、液滴操作が記載
されるところのいずれでも、液滴が、（ｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体
内に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは、（ｉｉ）非混和性または実質的に非
混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間、または、（ｉｉｉ）非混和性
または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的
に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫されている間に、液滴操作
を行ってもよいことが理解される。さらに、斯かる充填流体は、本明細書で記載されるよ
うなオイル系充填流体であることが好ましいことが理解される。本発明の方法の液滴操作
の一部または全ては、液滴アクチュエーターで行ってもよい。
【００４９】
本発明のライブラリー作製方法は、フラグメント化された核酸を利用する。フラグメン
ト化された核酸は、物理的せん断方法；超音波処理；制限エンドヌクレアーゼ等の酵素方
法；および他の化学的方法と同様に斯かる方法の組み合わせ等のいずれかの核酸フラグメ
ンテーション方法を用いて調製されてもよい。フラグメントサイズは、ランダムまたは非
ランダムであってもよい。フラグメントはサイズ分画されていてもよいし、サイズ分画さ
れていなくてもよい。核酸のフラグメンテーションは、液滴アクチュエーターでまたは液
滴アクチュエーター外で行われてもよい。液滴アクチュエーターで、非フラグメント化さ
れたサンプルを含む液滴を、フラグメンテーション試薬を含む１つ以上の液滴と共に液滴
操作を用いて混合して、フラグメント化された核酸を含む液滴を生成してもよい。フラグ
メント化された核酸は、次の工程のために液滴アクチュエーターから除去されてもよいし
、またはサンプル調製方法の次の工程にかけられてもよいし、もしくは液滴アクチュエー
ターで次の工程にかけられてもよい。液滴アクチュエーターでの核酸サンプルのフラグメ
ンテーションを促進するために有用な超音波処理の設定の例は、Srinivasanらによる２０
１０年７月１５日に出願された題名「Systems for and Methods of Promoting Cell Lysi
s in Droplet Actuators」の米国特許出願第61/364,645号に記載されており、その開示全
体がを参照により本明細書に援用される。
【００５０】
図１は、フラグメント化された核酸を用いて核酸ライブラリーの構築のための例示的な
手順１００の工程を示すフローチャートである。手順１００は、これらに限定されないが
、以下の工程を含んでいてもよい。
【００５１】
平滑末端化工程１０５では、５’−および／または３’−突出を有する核酸フラグメン
トが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’ポリメラーゼ活性の両方を有する
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化される。液滴アクチュエーターで、平滑末
端化工程は、サンプル液滴と、平滑末端化試薬を有する液滴とを分配および混合する液滴
操作を用いて達成され得る。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビーズ系
洗浄手順）、続く工程に干渉し得る、酵素および組み込まれなかったｄＮＴＰｓを除去し
てもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ
上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次い
で、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末端化工程１０５は、平滑末端化されたフ
ラグメントを調製するフラグメンテーションスキームが用いられる場合は、省略してもよ
い。
【００５２】
リン酸化工程１１０では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、リン酸エステルを
平滑末端化された核酸の５’−ヒドロキシ末端に結合してもよい。液滴アクチュエーター
で、リン酸化工程は、リン酸化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程１０５により
調製された平滑末端化された核酸を含む液滴とを混合する液滴操作を用いて達成され得る
。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、酵素と、続く
工程に干渉し得る過剰な試薬とを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工
程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行
することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末
端化工程１０５とリン酸化工程１１０は、容易に組み合され得る。例えば、ILLUMINA（登
録商標）対末端 DNA サンプル調製キット、およびNEBNEXT（登録商標）DNA サンプル調製
試薬セット１、および他の市販のキット内で、平滑末端化試薬とリン酸化試薬とは一般に
組み合わされている。当該組み合わされた工程のための核酸精製は、個々の工程について
記載したようにビーズ系混合および分割液滴洗浄手順を用いて達成されてもよい。平滑末
端化工程１０５とリン酸化工程１１０とが分けられる場合、当該工程の間に洗浄工程を行
う必要はない。平滑末端化試薬を含む液滴は、液滴操作を用いて、サンプル液滴と、分配
および混合されてもよく；次いで、リン酸化酵素を含む液滴は分配され、液滴操作を用い
て、サンプルおよび平滑末端化試薬を含む液滴に混合されてもよい。この工程により調製
された液滴中の核酸は、次いで、本明細書に記載のように、捕捉され、精製されてもよい
。
【００５３】
Ａ−ｔａｉｌ化工程１１５では、クレノウ（３’→５’）エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを用いて、Ａ−ｔａｉｌを、リン酸化され、平滑末端化された核酸フラグメントの両端
に付けてもよい。その反応は、好適には約３７℃で起こる。ｄＡＴＰの存在下、クレノウ
（３’→５’）エキソ−ＤＮＡポリメラーゼＩは、非テンプレート３’付加に触媒作用を
及ぼす。液滴アクチュエーターで、Ａ−ｔａｉｌ化工程は、液滴操作を用いてＡ−ｔａｉ
ｌ化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程１１０により調製されたリン酸化された
核酸を含む液滴とを混合することにより達成され得る。液滴アクチュエーターで、この反
応は、室温と同程度の低い温度、または、３７℃程度またはいくつかの場合はさらに高い
温度で達成され得る。Ａ−ｔａｉｌ化反応後に、クレノウＤＮＡポリメラーゼＩは、反応
液滴と、不活性化試薬を含む液滴とを混合する液滴操作を行うことにより不活性化（例え
ば、化学的不活性化）される、または反応液滴を所望の活性を達成するために選択した温
度および時間で保温することにより熱不活性化される等、不活性化されてもよい。温度は
、通常、約２０〜６０分間、約３５〜約７５℃等、室温を超えて昇温される。あるいは、
核酸は精製され、ビーズ系洗浄手順を用いて酵素除去されてもよく、当該手順で、核酸は
ビーズ上に捕捉され、当該ビーズは洗浄手順にかけられる。
【００５４】
アダプター結合工程１２０では、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて核酸アダプターをＡ−ｔ
ａｉｌ化された核酸フラグメントに結合してもよい。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、並列５’−
リン酸エステルに存在する付着末端と、二本鎖核酸の３’−ヒドロキシ末端と、の間のリ
ン酸エステル結合の形成に触媒作用を及ぼす。その反応は、所望のアダプター結合を達成
するために選択した温度と時間（例えば、約２０℃で約３０分間）で起こり得る。液滴ア
クチュエーターで、アダプター結合工程は、アダプターと結合試薬とを含む液滴を分配し
、当該液滴と、工程１１５により調製されたＡ−ｔａｉｌ化された核酸を含む液滴と、を
混合する液滴操作を用いて達成され得る。結合工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビ
ーズ系洗浄手順を用いて）、続くＰＣＲ増幅工程に干渉し得る組み込まれなかったアダプ
ターを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のよ
うに、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されて
もよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。いくつかの実施形態では、アダプ
ターの核酸に対する比は、約１０：１モルより大きく、または約１５：１モルより大きく
、または約２０：１モルより大きく、または約２５：１モルより大きく、または約３０：
１モルより大きく、またはより高い。さらに他の実施形態では、アダプターの核酸に対す
る比は、約１：１〜約１０：１である。放出された核酸は、次いで、いずれかの核酸増幅
技術を用いて増幅されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで、例えば、フロースル
ー熱サイクル方法を用いて行ってもよく、または核酸は別の装置で増幅のために液滴アク
チュエーターから除去されてもよい。しかしながら、本発明の一の実施態様では、本出願
人は、本発明の方法が従来のライブラリー構築方法よりもはるかに高い収率をもたらすこ
とを発見した。その結果として、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライブラリ
ー構築後に増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。いく
つかの実施形態では、本発明の方法は、２０以下のサイクル、または１５以下のサイクル
、または１０以下のサイクル、または５以下のサイクル、またはちょうど１または２サイ
クル等の、最小限の増幅で、ライブラリー構築後に、核酸ライブラリーを配列決定する方
法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液滴アクチュエ
ーターからライブラリー液滴を除去する工程と、増幅工程の介在なく、または、最小限の
増幅（例えば、２０以下のサイクル、または１５以下のサイクル、または１０以下のサイ
クル、または５以下のサイクル、またはちょうど１または２サイクル）と共に、当該ライ
ブラリーを配列決定装置上に装填する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明
の方法は、ライブラリー構築後に、濃縮増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決
定する方法を提供する。
【００５５】
一の実施形態では、アダプター結合工程１２０は、約１５〜約２４℃、または約１７〜
約２３℃、または約１９〜約２１℃、または約２０℃等の室温未満の温度で達成され得る
。
【００５６】
他の代わりの実施形態では、平滑末端化工程１０５、リン酸化工程１１０、およびＡ−
ｔａｉｌ化工程１１５は組み合わされてもよい。液滴アクチュエーターで、当該実施形態
は、液滴操作を用いて、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、およびＡ−ｔａｉｌ化試薬を含
む液滴を分配する工程と、分配された液滴と核酸サンプル液滴とを混合する工程とを含み
、サンプル核酸の平滑末端化、リン酸化、およびＡ−ｔａｉｌ化を達成する。核酸は、続
くアダプター結合工程で精製された核酸を提供するために、例えば、本明細書の他の箇所
に記載のように、ビーズに捕捉され、洗浄されてもよい。
【００５７】
他の実施形態では、核酸精製工程は、アダプター結合工程の後のみ行われる。さらに他
の実施形態では、１つ以上の捕捉工程および溶離工程を、ライブラリー構築方法のいずれ
かの工程の後に行ってもよい。例えば、平滑末端化工程、リン酸化工程、および／または
Ａ−ｔａｉｌ化工程の後に、液滴は、核酸捕捉ビーズを含む液滴と組み合わされてもよい
。ビーズは、磁石を用いて拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴
をビーズから離れて輸送することにより「スナップオフ」してもよい。ビーズは、ビーズ
を囲む最小量の液体を残して留置される。他の液滴をそのビーズと接触させるように輸送
して、この最小量の液体と新しい液滴の液体とを混合し、新しく混合された液滴内にビー
ズを懸濁させることにより、そのビーズを捕捉してもよい。したがって、例えば、新しい
液滴は、ビーズから捕捉された核酸を溶離させるための試薬を含んでいてもよい。ビーズ
は、磁石を用いて再度拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴をビ
ーズから離れて輸送することにより「スナップオフ」してもよい。この液滴は、溶離した
核酸を含み、当該核酸は、次いで、ライブラリー作製方法の次の工程にさらされてもよい
。ビーズは、スナップオフプロセスの間、拘束されていてもよく、その後、磁石の移動ま
たは電磁石のスイッチを切ることにより、次の液滴内に、放出されて再度懸濁されてもよ
い。適したスナップオフ技術の例は、本明細書の他の箇所に記載されており、例えば、図
８Ａ、８Ｂ、および８Ｃの記載を参照されたい。
【００５８】
本発明のこの手順および他の手順で要求されるいずれの温度条件も、液滴操作表面、お
よび／または、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙中の充填流体の領域、を加熱もしく
は冷却することにより、形成されてもよい。液滴は、液滴操作を用いて、液滴操作表面ま
たは液滴操作間隙の加熱領域または冷却領域に輸送され、必要な時間当該領域に保持され
てもよい。あるいは、液滴アクチュエーターカートリッジ全体または液滴を含むカートリ
ッジの領域が、必要な保温時間の間、加熱または冷却されてもよい。さらに、液滴操作間
隙の外側または液滴操作表面から離れたところを加熱または冷却するために、液滴を液滴
操作表面または液滴操作間隙に存在する流体通路に移動すること等により、液滴は液滴ア
クチュエーターから除去されてもよい。液滴は、その後、次の工程を行うための冷却後に
液滴操作間隙または液滴操作表面に戻されてもよい。
【００５９】
対末端ライブラリーの構築のための台上（ｏｎ−ｂｅｎｃｈ）手順の一例を表１に示す
。この例では、各酵素工程、すなわち、平滑末端化工程、Ａ−ｔａｉｌ化工程、およびア
ダプター結合工程のための反応キットを用いた（それぞれ、E1210S、M0212SおよびM2200S
、New England Biolabs社）。試薬は、必要に応じて希釈され、検査で使用する最終的な
１倍濃度を供給してもよい。平滑末端、Ａ−ｔａｉｌ、およびアダプター結合混合物は、
（ｉ）改質されて、（ｉｉ）ポリソルベート界面活性剤（例えば、０．０１〜０．１％Tw
een-20（ポリソルベート２０としても公知）、または、他の界面活性剤、等）等の界面活
性剤を、本明細書に記載の濃度で含んでいてもよい。
【００６０】
【表１】
2016127851.tif 000002
【００６１】
核酸フラグメントライブラリー構築手順の他の一例は、インビトロ転位手順にて高密度
である。転位手順では、Ｔｎ５トランスポザーゼの活動亢進誘導体を用いて、合成オリゴ
ヌクレオチド（すなわち、変更トランスポゾン）の高密度でのターゲットＤＮＡへの組み
込みに触媒作用を及ぼしてもよい。この例では、NexteraのTransposome（商標）技術等の
トランスポザーゼを用いて、ランダムｄｓＤＮＡ破壊を作り出してもよい。当該Transpos
ome（商標）錯体は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体
をｄｓＤＮＡと共に保温すると、当該ＤＮＡは、フラグメント化され、トランスポゾン末
端オリゴヌクレオチドの転移鎖は、ＤＮＡフラグメントの５’末端に共有結合する。いく
つかのプラットフォーム固有アプリケーション（例えば、Illumina配列決定プラットフォ
ーム）では、トランスポゾン末端は、配列決定プライマー部位に付加してもよい。バッフ
ァーと反応条件（例えば、Transposome（商標）錯体の濃度）を変えることにより、フラ
グメント化および標識されたＤＮＡライブラリーのサイズ分布を制御してもよい。Nexter
a技術を、Roche/454またはIllumina/Solexa配列決定プラットフォーム等の配列決定プラ
ットフォームと適合する任意のバーコーディングと共に用いて、２標識ライブラリーを作
り出してもよい。
【００６２】
トランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、これらに限定さ
れないが、以下の工程を含んでいてもよい：核酸は、トランスポザーゼおよび遊離トラン
スポゾン末端（例えば、NexteraのTransposome（商標）錯体）を含むトランスポザーゼ酵
素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。いくつかのプラットフォーム固
有アプリケーション（例えば、Illumina配列決定プラットフォーム）では、トランスポゾ
ン末端は、配列決定プライマー部位に付加されてもよい。トランスポゾン組み込みと鎖転
移は、ターゲット核酸内でのねじれ型ｄｓＤＮＡ破壊を経て起こる。ターゲット核酸は、
トランスポゾンシークエンスで５’末端で標識されてもよい。反応は、好ましくは５５℃
で起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）トラ
ンスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分配し、混合する液滴操作を
用いて達成され得る。トランスポザーゼ酵素試薬は、プラットフォーム固有アプリケーシ
ョン（例えば、Illumina適合ライブラリー用のNextera（商標）Enzyme Mix；Roche454適
合ライブラリー用のNextera（商標）Enzyme Mix）のために選択されてもよい。フラグメ
ンテーションと標識化の後、核酸を精製（例えば、ビーズ系洗浄手順）して、続く工程に
干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本
明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行すること
により達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。
【００６３】
４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、プラットフォーム固有オリゴヌクレ
オチドアダプターと任意のバーコードを、フラグメント化され、標識された核酸に付加し
てもよい。結果として生じる２標識ライブラリーは、両方の標識を含むフラグメントにつ
いて濃縮されてもよい。一例では、４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、Ro
che454適合ライブラリー用の付加を行ってもよい。任意のバーコードを、上流ＰＣＲアダ
プターとトランスポゾンとの間に付加してもよい。他の一例では、４つのプライマー反応
と共に抑制ＰＣＲを用いて、Illumina適合アダプターシークエンス（すなわち、ブリッジ
ＰＣＲ適合アダプター；ｂＰＣＲ）を付加してもよい。任意のバーコードを、下流ＰＣＲ
アダプターと付加されたトランスポゾンとの間に付加してもよい。液滴アクチュエーター
で、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）ＰＣＲ試薬とプラットフォーム固有プ
ライマーカクテル（例えば、NexteraのIllumina適合プライマーカクテル、または、Nexte
raのRoche454適合プライマーカクテル）とを含む液滴とを、分配および混合する液滴操作
を用いて達成されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで反応液滴を温度制御ゾーン
の間で限られた数のサイクル（例えば、約５〜約１３サイクル）で熱サイクルすることに
より、行われてもよい。一例では、熱サイクル手順は、７２℃で３分間および９５℃で３
０秒間、次いで９５℃で１０秒間、７２℃で３０秒間、および７２℃で３分間を１３サイ
クルの保温を含んでいてもよい。あるいは、核酸は、別の装置での増幅のために液滴アク
チュエーターから除去されてもよい。
【００６４】
２標識ライブラリーを精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、続くＰＣＲ増幅工程に
干渉し得る、組み込まれなかったアダプターおよびバーコードを除去してもよい。液滴ア
クチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し
、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズ
から放出されてもよい。濃縮された２標識ライブラリーは、例えば、Roche454プラットフ
ォームでのエマルションＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）；Illuminaプラットフォームでのブリッジ
ＰＣＲ（bPCR）；液滴アクチュエーター；または他の増幅方法を用いることにより、増幅
されてもよい。
【００６５】
増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用いて配列決定されてもよい
。他の実施形態では、２標識ライブラリーは、増幅および配列決定の前にサイズ選択（例
えば、＞３００ｂｐサイズ）されてもよい。一例では、２標識ライブラリーは、ゲル電気
泳動により液滴アクチュエーターで区分されてもよい。他の一例では、２標識ライブラリ
ーは、Caliper社の微小流体チップ系自動サイズ選択プラットフォーム等の別の装置での
サイズ分離のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。
【００６６】
Illumina配列決定プラットフォーム用の標準配列決定ライブラリーは、ＰＣＲ増幅の使
用なし（ＰＣＲフリー）で、結合バイアスを低減するために生み出された。同様の手法を
トランスポザーゼ系ライブラリーに用いてもよい。一例では、フローセルブリッジＰＣＲ
プライマー（ｂＰＣＲ）シークエンスは、転位反応の間に加えられるアダプターに含めら
れてもよい。転位後、ニックトランスレーション反応を行って、Illumina準備ライブラリ
ーを生成してもよい。ＰＣＲフリーのトランスポザーゼ系ライブラリー構築手順は、核酸
を配列決定準備フラグメントライブラリーに変換するのに必要な時間を実質的に削減する
。
【００６７】
ＰＣＲフリーのトランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、
これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい：核酸は、トランスポザーゼお
よび遊離トランスポゾン末端（例えば、NexteraのTransposome（商標）錯体）を含むトラ
ンスポザーゼ酵素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。Illumina配列決
定プラットフォームのために、トランスポソームアダプターシークエンスは、フローセル
ｂＰＣＲシークエンスおよび付加した配列決定プライマー部位を含んでいてもよい。トラ
ンスポゾン組み込みと鎖転移は、ターゲット核酸内でのねじれ型ｄｓＤＮＡ破壊を経て起
こる。ターゲット核酸は、トランスポゾンシークエンスで５’末端で標識されてもよい。
反応は、好ましくは５５℃で起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サン
プル液滴と、（ｉｉ）トランスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分
配および混合する液滴操作を用いて達成され得る。ＤＮＡポリメラーゼをニックトランス
レーション反応で用いて、フラグメンテーション反応と標識反応で生じた一本鎖ギャップ
を修復してもよい。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉ
ｉ）ＤＮＡポリメラーゼと反応バッファー（例えば、Epicentre社から入手可能なFailSaf
e PCR Mater MixおよびDNAポリメラーゼ）とを含む液滴とを、混合する液滴操作を用いて
達成され得る。ニックトランスレーション後、ＤＮＡを精製して（例えば、ビーズ系洗浄
手順）、続く工程に干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、
この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄
手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよ
い。Illuminaプラットフォームでの増幅ブリッジＰＣＲ（ｂＰＣＲ）のための２標識ライ
ブラリーを準備してもよい。増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用
いて配列決定されてもよい。
【００６８】
デジタル微小流体ライブラリー構築手順は、メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレ
ウス（MRSA）からの278bp細菌ＤＮＡフラグメントを用いて評価した。ＤＮＡ末端修復（
平滑末端化）、ＤＮＡフラグメントのdA-tail化、およびアダプター結合は、New England
BioLabs社から入手可能なNEBnext DNA サンプル調製Master Mix セット１を用いて行っ
た。そのセットは、NEBnext End Repair、dA-tailingおよびQuick Ligation モジュール
を含む。ＤＮＡサンプル（278bpMRSA  ＤＮＡの1，10，30，100，300，または1000ｎｇ）
および試薬が、台上で調製され、続いて、液滴アクチュエーターの流体分配リザーバ内に
装填された。その実験を４回行い、４つの別の液滴アクチュエーターで実行した。
【００６９】
NEBnext End Repair（２倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、End Repa
ir反応バッファー（3μＬ）、End Repair酵素混合物（1.5μＬ）、0.5%Tween20（1.5μＬ
）、および殺菌水（9μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製した。NEBne
xt dA-tailing（２倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、dA-tailing反応
バッファー（3μＬ）、クレノウフラグメント（エキソ−）（1.8μＬ）、0.5%Tween20（1
.5μＬ）、および殺菌水（8.7μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製し
た。NEBnext Quick Ligation（３倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、Qu
ick Ligation反応バッファー（9μＬ）、Ｑｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（4.5μＬ）
、および0.5％Tween20（1.5μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製した
。磁気応答性ビーズ溶液を、300μＬのAgencourt AMPure XPビーズと3μＬの1％  Tween2
0とを混合することにより調製した。アダプターを、アダプターとＤＮＡのモル比が10：1
で、0.1％  Tween20の最終濃度で調製した。アダプターの濃度をＤＮＡ濃度に応じて変化
させた。
【００７０】
ＤＮＡサンプルを、278bpMRSA  ＤＮＡ(上限２３μＬ)の1，10，30，100，300，または
1000ｎｇ、Agencourt AMPure XPビーズ（1.2μＬ）、ビーズ結合バッファー（25μＬ）、
5％Tween20（1μＬ）、および殺菌水を混合して、最終体積50μＬとすることにより調製
した。ビーズおよびＤＮＡサンプルを、撹拌しながら室温で10分間保温した。
【００７１】
ＤＮＡサンプル（278bpMRSA  ＤＮＡの1，10，30，100，300，または1000ｎｇ）および
調製した試薬を、液滴アクチュエーターのリザーバに装填した。分配および処理工程の前
に、各ＤＮＡサンプルを、単一工程のビーズ濃縮手順を用いてアクチュエーターで濃縮し
た。磁気応答性ビーズ上に結合したＤＮＡを有する磁気応答性ビーズを、サンプル分配リ
ザーバ電極の下に位置する磁石を用いて固定した。上澄み液（約50μＬ）を液滴操作を用
いて分離し、磁場により保持された固定されたビーズから離して輸送した。次いで、ＤＮ
Ａを、１倍ＤＮＡサンプル液滴中で磁気応答性ビーズから溶離した。
【００７２】
ライブラリー結果（収率）を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、液滴アク
チュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて行われた以下の工程を含
んでいた：１倍ＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて１倍NEBnext End Repair液滴と
混合し、２倍反応液滴を生じた。室温で３０分間保温した後、２倍反応液滴を、液滴操作
を用いて、４倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、６倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を
生じた。室温で１０分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、６倍上澄み液を分離
して０倍サンプル／ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。末端修復された
ビーズを、１倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。１倍末端修復されたＤＮＡサンプ
ル液滴を、液滴操作を用いて１倍NEBnext A-tailing液滴と混合し、２倍反応液滴を生じ
た。約３７℃で３０分間保温した後、２倍反応液滴を、液滴操作を用いて４倍磁気応答性
ビーズ含有液滴と混合し、６倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を生じた。室温で１０分間保
温した後、磁石を用いてビーズを固定し、６倍上澄み液を分離して０倍サンプル／ビーズ
液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。A-tail化されたＤＮＡを、１倍サンプル液
滴中のビーズから溶離した。１倍A-tail化されたＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用い
て１倍NEBnext Quick Ligation液滴および１倍アダプター液滴と混合し、３倍反応液滴を
生じた。室温で３０分間保温した後、３倍反応液滴を、液滴操作を用いて２倍磁気応答性
ビーズ含有液滴と混合し、５倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を生じた。室温で１０分間保
温した後、磁石を用いてビーズを固定し、５倍上澄み液を分離して０倍サンプル／ビーズ
液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。ビーズを、液滴系ビーズ洗浄手順を用いて
２倍洗浄バッファー液滴で３回洗浄した。アダプター結合ＤＮＡを、１倍サンプル液滴中
のビーズから溶離した。１倍アダプター結合ＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて液
滴アクチュエーター上のサンプル回収リザーバまで輸送し、ライブラリー構築収率の決定
のために液滴アクチュエーターから除去した。
【００７３】
表２に、アクチュエーターでのライブラリー構築手順のアガロースゲル分析から計算し
た収率の結果を示す。ゲル分析のために、ゲルにサンプルを装填する前に、9μＬの1，10
，30，および100ｎｇの入力サンプル；5μＬの300ｎｇの入力サンプル；および1.5μＬの
1000ｎｇ入力サンプルを、水を用いて10μＬに調整した。MRSA DNA（278bpフラグメント
）が、0.9、9、27、90、および150ｎｇでゲルに装填され、標準として使用された。図２
は、表２に示したライブラリー出力データを計算するために使用されたアガロースゲルの
例示的な写真を示している。ライブラリーサンプルとＭＲＳＡ標準ＤＮＡは、以下の順番
でアガロースゲルに装填された（左から右へ）：1ｎｇ入力サンプル、0.9ｎｇMRSA標準、
10ｎｇ入力サンプル、9ｎｇMRSA標準、30ｎｇ入力サンプル、27ｎｇMRSA標準、100ｎｇ入
力サンプル、90ｎｇMRSA標準、300ｎｇ入力サンプル、150ｎｇMRSA標準、および1000ｎｇ
入力サンプル。
ゲル分析は、Image J ソフトウェアを用いて行い、ライブラリー出力を求めた。
【００７４】
【表２】
2016127851.tif 000003
【００７５】
その実験を７つの別個の液滴アクチュエーターで追加で７回繰り返された。図３は、10
，30，100，300，または1000ｎｇの278bpMRSA DNAを用いたアクチュエーターでのライブ
ラリー構築手順の追加の７回の実行のアガロースゲル分析から計算した収率のプロットを
示している。図３のデータを表３にまとめた。
【００７６】
【表３】
2016127851.tif 000004
【００７７】
液滴操作手順、反応生化学、および他のシステムパラメーターをさらに選択して、自動
化デジタル微小流体ライブラリー構築手順の性能を向上し得る。生化学反応条件の選択は
、例えば、各反応工程の性能評価により容易となり得る。
【００７８】
一の実施形態では、手順の各工程後のＤＮＡの定量的な修復または収率は、アクチュエ
ーターで、組み込まれた放射性リン酸エステルまたは組み込まれたヌクレオチドに結合し
た蛍光標識のいずれかを用いて測定されてもよい。例えば、平滑末端化工程（図１の手順
を参照）では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが、リン酸エステルを平滑末端化されたＤ
ＮＡの５’−ヒドロキシ末端に付加する。キナーゼ反応バッファーの放射性標識されたＡ
ＴＰ（γ−３２Ｐ  ＡＴＰ）を用いることで、平滑末端化されたＤＮＡに付加した末端リ
ン酸エステルは、放射性標識され、容易にモニターされ得る。同様に、A-tail化工程をモ
ニターするため、ｄＡＴＰ中のγ−リン酸エステルは、放射性標識されてもよい。アダプ
ターシークエンスの全てのヌクレオチドは、そのα−リン酸エステルで放射性標識されて
もよく、アダプター結合工程は高感度で定量的にモニターされ得る。
【００７９】
他の実施形態では、アダプター結合シークエンス特性（例えば、分解がない）、バイア
ス（例えば、挿入サイズ、ＧＣ含有量）、および再現性が評価されてもよい。この例では
、ライブラリー構築は、異なるサイズおよびＧＣ含有量のＤＮＡアンプリコンを用いて行
われてもよい。アダプター結合シークエンスの特性は、処理されたフラグメントを回収し
、市販のシークエンサーを用いてＤＮＡシークエンスを評価することにより、評価されて
もよい。ライブラリー構築方法は、同じＤＮＡサンプルについて複数回手順を実行するこ
とにより再現性を評価されてもよい。液滴アクチュエーターの異なるリザーバ間のばらつ
きは、同じＤＮＡサンプルを異なるアクチュエーターリザーバに装填することで評価され
てもよい。
【００８０】
保温時間、洗浄サイクル数、液滴輸送速度、および装填試薬体積等のデジタル微小流体
操作パラメーターは、本開示の観点から当業者により選択されてもよい。台上のシステム
に比べて、デジタル微小流体液滴システムでは、混合長さスケールと体積対表面積比が小
さいため、液滴システムの保温時間は実質的に低減され得る。酵素反応についての実質的
に減少した保温時間と自動化手順（即ち、わずかの時間の操作）との組み合わせにより、
ライブラリー構築方法の全体時間は減少し得る。
【００８１】
７．２  核酸精製
液滴アクチュエーターでのライブラリー構築の手順は、ビーズ系核酸精製工程を含んで
いてもよい。ビーズは、磁気応答性であってもよいし、実質的に磁気応答性でなくともよ
い。一の実施形態では、本明細書に記載の酵素工程のいずれの後に、ビーズ系核酸精製工
程を行ってもよい。核酸精製工程および浄化工程は、しばしば、ライブラリー構築手順に
おける収率を制限する工程である。
【００８２】
一例では、CHARGESWITCH（登録商標）PCR浄化ビーズ（Life TechnologyによりInvitrog
en社から入手可能）等の電荷スイッチビーズを用いてもよい。CHARGESWITCH（登録商標）
PCR浄化ビーズは、常磁性応答ビーズであり、ｐＨ５で通常９０ｂｐ〜４ｋｂｐの核酸を
捕捉することができ、ｐＨ＞８で捕捉した核酸を放出することができる。一例では、デジ
タル微小流体ライブラリー構築手順の浄化工程でのCHARGESWITCH（登録商標）ビーズの使
用は、ビーズから結合したＤＮＡを溶離するために用いる溶離バッファーの緩衝能および
ｐＨを調整することにより選択してもよい。表４および５は、溶離バッファー組成と、洗
浄回数との、核酸修復のパーセントでの効果を示している。バッファーのｐＨは、１２Ｍ
のＨＣｌを用いて調整された。
【００８３】
【表４】
2016127851.tif 000005
【００８４】
【表５】
2016127851.tif 000006
【００８５】
溶離バッファー化学および洗浄回数を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、
液滴アクチュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて実行された以下
の工程を含むものであった：48ｎｇの278bpMRSA dsDNA（138ｎｇ／μＬ）を含む350ｎＬ
以下の液滴を、液滴操作を用いて、緩衝バッファー（ｐＨ５）中にCHARGESWITCH（登録商
標）ビーズ（25ｍｇ／ｍＬ）を含む350ｎＬ以下の液滴と混合して、700ｎＬ以下の液滴を
生じた。室温で１分間保温した後、その700ｎＬ以下の液滴を、700ｎＬ以下の洗浄バッフ
ァー液滴と混合し、磁石を用いてビーズを固定し、そして、液滴を分割してビーズ含有液
滴と上澄み液滴とを生じた。複数の洗浄サイクル（２または６サイクル）を行った後に、
CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを、350ｎＬ以下の洗浄バッファー液滴中で再懸濁した
。次いで、そのビーズ含有液滴を350ｎＬ以下の溶離バッファー液滴と混合して、700ｎＬ
以下の溶離液滴を生じた。２分間の保温後、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを永久磁石
の磁場内に固定し、その700ｎＬ以下の溶離液滴をビーズから離してアクチュエーターの
リザーバ内に輸送した。その700ｎＬ以下の溶離液滴を、リザーバから戻し、水を用いて1
0μＬ体積に調整した。もしＤＮＡの修復が100％だったならば、qPCR検査へのＤＮＡの入
力は、4.8ｐｇのはずである。CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを液滴アクチュエーター
から戻し、台上で２０μＬ溶離バッファーを用いた別の溶離を行い、液滴アクチュエータ
ーで溶離しなかったいずれのＤＮＡも溶離させた。定量的なＰＣＲ（ｑＰＣＲ）検査を行
い、ＤＮＡの修復を評価した。サンプルを１００倍、１０，０００倍および１００，００
０倍に希釈した。各サンプルの5μＬを50μＬのｑＰＣＲ検査で分析した。サンプルは、2
78MRSAアンプリコンの標準曲線に対して分析した。ＤＮＡ修復の効率が100％であったな
らば、ｑＰＣＲ検査への入力ＤＮＡは、240ｐｇ、2.4ｐｇおよび240ｆｇ（それぞれ、100
倍、10,000倍および100,000倍希釈溶液）のはずである。
【００８６】
図４は、台上および液滴アクチュエーターでの溶離工程および核酸浄化工程の実施の比
較のプロット４００を示している。台上および液滴アクチュエーターで行われた完全な対
末端ライブラリー構築手順での溶離条件を用いた。データは、台上と液滴アクチュエータ
ーでの溶離が比較可能であることを示している。
【００８７】
図５Ａ〜５Ｍは、液滴アクチュエーターの電極配列５００の一部の一例の平面図を表し
、ライブラリーの構築用の核酸調製方法を示している。図５Ａ〜５Ｍの方法は、ライブラ
リー構築手順の一例であり、当該一例で核酸は、磁気応答性ビーズに固定され、可動式の
磁石と、一連の混合操作および分割操作とを用いて、ライブラリー構築手順の各工程間で
核酸が精製される。
【００８８】
電極配列５００は、液滴操作電極５１０（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいて
もよい。液滴操作は、液滴操作表面上または液滴操作間隙内の液滴操作電極５１０により
行われる。ビーズ固定ゾーン５１２は、電極配列５００と結合していてもよい。可動式磁
石５１４は、ビーズ固定ゾーン５１２にそろっていてもよく、そしてビーズ固定ゾーン５
１２に向けてまたはビーズ固定ゾーン５１２から移動されてもよい。磁石５１４は、磁気
応答性ビーズを、液滴操作の間、保持するために用いてもよい。特に、磁石５１４は、少
なくとも１つの液滴操作電極５１０、および任意に他の電極もが、磁場内にあるように配
置されてもよい。磁石５１４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。
【００８９】
サンプル液滴５１６は、液滴操作電極５１０に沿った液滴操作を用いて輸送されてもよ
い。サンプル液滴５１６は、例えば、２倍液滴であってもよい。２倍液滴は、液滴操作間
隙での専有面積が、１つの液滴操作電極５１０の領域の約２倍であることを意味する。サ
ンプル液滴５１６は、核酸ライブラリー構築のために処理される核酸５１８を含んでいて
もよい。一の実施形態では、核酸サンプルはせん断されてもよく、そしてせん断された核
酸は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙に装填されてもよい。核酸は、例えば、流体
力学的せん断もしくは機械的な力によりランダムにフラグメント化されてもよく、または
酵素消化によってフラグメント化されてもよい。他の実施形態では、核酸等の核酸サンプ
ルは、液滴アクチュエーターでランダムにフラグメント化されてもよい。一例では、低周
波電流を用いて、サンプル液滴中の核酸がせん断されるようにサンプル液滴を撹拌しても
よい。他の例では、液滴は、交互に膨張と収縮をさせられて、液滴内に、核酸をせん断す
るのに十分な流体パターンを形成してもよい。他の例では、低周波電流の適用と、液滴の
交互の膨張および収縮とを用いて、核酸をせん断してもよい。アクチュエーターでの核酸
のせん断を制御して、予測可能なサイズ範囲のフラグメントを与えてもよい。せん断され
た核酸５１８は、核酸フラグメントライブラリーの構築のための処理の前にサイズ選択を
されてもよい。一例では、せん断された核酸５１８は、ゲル電気泳動により分離されても
よい。液滴アクチュエーターでのライブラリー構築用にせん断された核酸を調製する方法
の一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
【００９０】
図５Ａは、ビーズ固定ゾーン５１２と磁石５１４とから離れて電極通路５１０に位置し
ているサンプル液滴５１６を示している。磁石５１４は、例えば、液滴アクチュエーター
が取り付けられている装置上に位置していてもよく、液滴アクチュエーターそれ自体に取
り付けられていてもよく、液滴操作間隙内に位置していてもよく、または本明細書に記載
のような液滴系ビーズ洗浄手順の実行の間に液滴内のビーズを固定可能ないずれの位置に
あってもよい。図５Ｂおよび５Ｃは、保温方法を示しており、当該方法では、試薬液滴５
２０が液滴操作を用いてサンプル液滴５１６と混合される。図に示したように、試薬液滴
５２０は、その専有面積が、ほぼ１つの液滴操作電極５１０の面積であることを意味する
１倍液滴（例えば、約250〜約500ｎＬ）である。図５Ｃでは、混合されたサンプル液滴５
１６は、いまや３倍液滴である。３倍液滴は、その専有面積が１つの液滴操作電極５１０
の領域の約３倍であることを意味する。試薬液滴５２０は、平滑末端化試薬等の酵素を含
んでいてもよい。混合された液滴５１６は、核酸フラグメントの平滑末端化を促進するた
め選択された温度および時間等、必要な温度および必要な時間保温され、所望の反応が達
成される。
【００９１】
図５Ｄおよび５Ｅは、核酸の捕捉を表している。核酸または所定の核酸のサブセットを
捕捉するように選択された磁気応答性ビーズ５２４を含む１倍試薬液滴５２２が、電極５
１４により制御される液滴操作を用いて３倍混合サンプル液滴５１６と混合される。混合
されたサンプル液滴５１６は、いまや４倍サンプル液滴である。４倍サンプル液滴は、そ
の専有面積が１つの液滴操作電極５１０の領域の約４倍であることを意味する。混合され
たサンプル液滴５１６は、所望の核酸フラグメントが磁気応答性ビーズ５２４と結合する
のに十分な期間、室温で保温される。
【００９２】
図５Ｆ、５Ｇおよび５Ｈは、ビーズ洗浄方法を示しており、当該方法では、磁気応答性
ビーズ５２４および当該ビーズに結合した核酸５１８を有する４倍混合サンプル液滴５１
６が、電極通路５１０に沿った液滴操作を用いて、ビーズ固定ゾーン５１２に輸送される
。磁石５１４は、４倍混合サンプル液滴５１６が、磁石５１４の磁場内に位置するように
、ビーズ固定ゾーン５１２内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１
４の磁場により、固定され、あるいは拘束され、または実質的に固定される。２倍上澄み
液滴５２６が、液滴操作を用いて分割され、２倍混合サンプル液滴を形成する。当該２倍
混合サンプル液滴は、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０で保持される。これ
は、５つの下部電極を活性化して液滴を５つの電極にわたって伸長し、次いで、中央の電
極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビーズが伸長され
た液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが１つの娘液滴に一緒
に残るように、その５つの電極が、磁石と相対的に配置されてもよい。他の娘液滴は、実
質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。同様の操作を他の液滴サイズの分割に
用いてもよく、例えば、４倍液滴の下部の４つの電極の３番目を非活性化して、１つの１
倍液滴および１つの３倍液滴を生成し、その１倍液滴または３倍液滴のいずれかに磁気応
答性ビーズが保持される。図５Ｇでは、２倍洗浄バッファー液滴５２８が、液滴操作電極
５１０に沿って輸送され、液滴操作を用いて２倍混合サンプル液滴５１６と混合され、４
倍混合サンプル／洗浄液滴５１６を形成する。混合されたサンプル／洗浄液滴５１６は、
液滴操作を用いて２つの液滴（例えば、２倍／２倍または１倍／３倍）に分割されてもよ
く：１つの液滴がその液滴中に磁気応答性ビーズ５２４を有し、１つの液滴は実質的に磁
気応答性ビーズ５２４を有しないもの（例えば、上澄み液滴）であってもよい。図５Ｆ、
５Ｇおよび５Ｈに示された工程は、十分な精製の程度が達成されるまで複数回（例えば、
６回）繰り返されてもよい。図５Ｉは、任意の工程を示しており、当該工程では、１倍上
澄み液滴５２６が液滴操作を用いて２倍液滴から分割され、１倍サンプル液滴５１６を形
成し、当該１倍サンプル液滴５１６は、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０に
保持される。これは、２倍液滴を３つの下部電極に沿って伸長し、当該液滴を伸長し、次
いで、中央の電極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビ
ーズが伸長された液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが１つ
の娘液滴に一緒に残るように、その３つの電極は、磁石と相対的に配置されてもよい。他
の娘液滴は、実質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。
【００９３】
図５Ｊおよび５Ｋは、保温方法を示しており、当該方法では、１倍溶離バッファー液滴
５３０が、液滴操作を用いて１倍サンプル液滴５１６と混合される。磁石５１４は、ビー
ズ固定ゾーン５１２から離れて移動される。磁気応答性ビーズ５２４および溶離した核酸
５１８をその中に有するサンプル液滴５１６は、液滴操作を用いて、磁石５１４の磁場内
にある液滴操作電極５１０から離れて輸送され、ビーズ固定ゾーン５１２から離れる。１
倍溶離バッファー液滴５３０は、液滴操作を用いてサンプル液滴５１６と混合され、２倍
混合サンプル／溶離液滴を形成する。混合されたサンプル／溶離液滴５１６は、磁気応答
性ビーズ５２４から結合した核酸５１８が溶離するのに十分な期間（例えば、約１分）、
室温で保温される。
【００９４】
図５Ｌは、磁気応答性ビーズ５２４と、結合した核酸５１８とをその中に有する２倍混
合サンプル／溶離液滴５１６を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて磁石５１４の
磁場内にある液滴操作電極５１０に（すなわち、ビーズ固定ゾーン５１２に）輸送される
。磁石５１４は、２倍混合サンプル／溶離液滴５１６が磁石５１４の磁場内にあるように
、ビーズ固定ゾーン５１２内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１
４の磁場により固定される。
【００９５】
図５Ｍは、２倍サンプル液滴５１６を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて分割
された実質的に全ての平滑末端化された核酸５１８を含み（すなわち、全てのビーズがス
ナップオフされた）、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０から離れて輸送され
、磁石５１４から離れている。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１４の磁場により、磁
石５１４の磁場内にある少なくとも１つの液滴操作電極５１０上に固定されたままである
。平滑末端化された核酸５１８を含むサンプル液滴５１６は、さらなる処理、すなわち、
Ａ−ｔａｉｌ化およびアダプター結合のために輸送されてもよい。他の液滴が輸送され、
残ったビーズに接触し得る。当該ビーズは、通常当該ビーズを囲む少量の液体を有する；
前記液滴は、この少量の液体と混合し、ビーズは輸送され得る。任意に、この操作の間、
ビーズを輸送するために、磁石は、非活性化または離れて移動されてもよい。
【００９６】
図５Ｂ〜５Ｍに示される工程は、ライブラリー構築手順の、Ａ−ｔａｉｌ化およびアダ
プター結合等の次の処理反応のために繰り返されてもよい。図５Ｂおよび５Ｃに関して、
実質的に全ての平滑末端化された核酸５１８を含む２倍サンプル液滴５１６は、液滴操作
を用いて第２の１倍試薬液滴５２０と混合され、３倍混合サンプル液滴を形成する。この
工程では、試薬液滴５２０は、Ａ−ｔａｉｌ化反応のための酵素および反応成分を含む。
混合サンプル液滴５１６の保温は、３７℃で約３０分間行われる。混合サンプル液滴５１
６は、図５Ｄ〜５Ｍに関して記載したように処理（すなわち、酵素およびビーズ保温なら
びにビーズ洗浄）されてもよい。Ａ−ｔａｉｌ化された核酸５１８を含むサンプル液滴５
１６は、さらなる処理、すなわち、アダプター結合のために輸送されてもよい。
【００９７】
図５Ｂおよび５Ｃに関して、実質的に全てのＡ−ｔａｉｌ化された核酸５１８を含む２
倍サンプル液滴５１６は、液滴操作を用いて第３の１倍試薬液滴５２０と混合され、３倍
混合サンプル液滴を形成する。この工程では、試薬液滴５２０は、アダプター結合のため
の酵素および反応成分を含む。混合サンプル液滴５１６の保温は、室温で約５分〜約３０
分間行われる。混合サンプル液滴５１６は、図５Ｄ〜５Ｍに関して記載したように処理（
すなわち、酵素およびビーズ保温ならびにビーズ洗浄）されてもよい。実質的に全てのア
ダプター結合核酸５１８を含むサンプル液滴５１６は、さらなる処理のために輸送されて
もよい。一例では、サンプル液滴５１６の核酸５１８は、ＰＣＲにより増幅されてもよい
。用いられるＰＣＲ増幅サイクルの数は、十分に制限されて（例えば、約８〜１５サイク
ル）、増幅手順のシークエンスバイアスを最小化してもよい。他の例では、サンプル液滴
５１６の核酸５１８は、続く定量ＰＣＲおよびゲル電気泳動による分析のために、そして
、いくつかの実施形態では、次世代配列決定方法への入力用の回収のために、出力リザー
バに輸送されてもよい。
【００９８】
一の実施形態では、充填流体または液滴に、染料を添加して、液滴アクチュエーターの
液滴操作間隙からの除去のために液滴の可視化を容易にしてもよい。一の実施形態では、
処理されたサンプル液滴は、液滴アクチュエーターの開口部を通じて液滴操作間隙から除
去され、斯かる開口部は、ガスケットの開口部を経た流体通路のように、頂部基板、底部
基板、または当該２つの基板の間にあってもよい。
【００９９】
一の実施形態では、本発明のライブラリー作製手順は、第１のｐＨで核酸に結合し、第
２のｐＨで核酸を溶離し得るビーズを利用してもよい。例えば、本発明のライブラリー作
製手順のいずれかの酵素工程から出力される第１の液滴は、第１のｐＨで核酸に結合し得
るビーズを含む第２の液滴と混合され、核酸がビーズに捕捉された混合された第３の液滴
を生成してもよい。必要に応じて、１つ以上の追加の液滴が、第３の液滴と混合され、ビ
ーズ上の核酸の捕捉を確実にしてもよい。第３の液滴は、次いで、液滴系ビーズ洗浄手順
にかけられてもよい。洗浄液滴は、第３の液滴と混合されてもよく；あるいは、第３の液
滴は、洗浄液滴の導入の前に分割され、ビーズ含有液滴と上澄み液滴とを生成してもよく
；そして洗浄液滴は、ビーズ含有液滴と混合されてもよい。いずれの場合でも、ビーズは
固定されてもよく、混合された液滴は、分割され、上澄み液滴とビーズ含有液滴とを生成
してもよい。ビーズ含有液滴は、好適には全てのまたは実質的に全てのビーズを含む。必
要に応じて、混合−固定および分割技術は、繰り返され、好適には当該方法で全てのまた
は実質的に全てのビーズを保持しながら、生成するビーズ含有液滴の異物の所望の低減が
達成されてもよい。洗浄液滴は、ビーズに核酸を保持するのに好ましいｐＨを有するバッ
ファーを含んでいてもよい。洗浄後、洗浄されたビーズを含む液滴は、液滴操作を用いて
、ビーズから核酸を溶離するために選択したｐＨを有する１つ以上の液滴と混合されても
よい。ビーズは拘束され、拘束されたビーズから液滴を離して輸送することにより、囲ん
でいる上澄み液がビーズから引き離されてもよい。別の実施形態では、この方法を用いて
、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、巨大分子、または小さな分子等の他の目的とする分子
が分離されてもよい。重要なことに、発明者らは、この方法がオイルに囲まれた液滴を用
いて効果的に実行され得ることを見出した。一の実施形態では、当該方法を達成するため
に必要な液滴操作の一部または全てが、電気濡れ媒介液滴操作を用いて達成される。物理
的バリアもしくは障害物を用いて、ビーズを拘束してもよく、および／または、磁石を用
いて、ビーズを拘束して、磁気応答性ビーズを拘束してもよい。この方法への使用に好適
なビーズの例は、Bakerによる２００５年７月５日に発行された題名「Isolation of nucl
eic acids」の米国特許第6,914,137号に記載されており、斯かるビーズの組成、ならびに
、斯かるビーズを用いてＤＮＡ等の物質を捕捉および溶離するための条件に関する教示が
、参照して援用される。上述したCHARGESWITCH（登録商標）ビーズが斯かるビーズの一例
である。
【０１００】
他の実施形態では、本発明の核酸精製技術は、精製のための核酸を含む液滴と、可逆的
な方法で核酸分子を吸収（例えば、非共有結合）するビーズを含む液滴と混合する工程を
含む。斯かるビーズの例は、McKernanらによる２００３年３月１８日に特許付与された題
名「Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids」の米国特許第6
,534,262号に記載されたビーズを含み、核酸を捕捉するためのビーズ（当該特許では粒子
といわれている）および斯かるビーズから核酸を溶離するための化学に関する開示を参照
してその開示全体を本明細書に援用する。例えば、SPRI（登録商標）ビーズ（Agencourt 
Nioscience社から入手可能）等の固相可逆固定ビーズを用いてもよい。SPRI（登録商標）
ビーズは、コア−シェル方法を用いて構成され、当該方法は、ポリスチレンコアから始ま
り、ポリスチレンコアがはじめにマグネタイト（鉄）の層で被覆され、次いで最終的にカ
ルボキシル官能基を含むポリマー層でカプセル化される。一の実施形態では、SPRI（登録
商標）ビーズは、約０．０１〜約０．１％Tween-20を含むバッファー液滴、または約０．
０１〜約０．１％Tween-20を含むＴＥバッファー、または約０．０１〜約０．１％Tween-
20を含むトリスバッファーで供給されてもよい。これらのバッファーは、SPRI（登録商標
）ビーズを洗浄するのに用いられてもよい。SPRI（登録商標）ビーズは、（Ｉ）（ｉ）リ
ザーバ内で動き回る試薬液滴の移動、（ｉｉ）リザーバからの試薬液滴の出入り、もしく
は（ｉｉｉ）外部のリザーバから液滴操作間隙に延びる流体通路を通じての前後の試薬液
滴の輸送、を生じる電気濡れ電極の活性化および非活性化等により、リザーバ内で定期的
に混合して懸濁に保たれてもよく、または、（II)液滴を少なくとも部分的に流体通路に
入れる毛管力、および、流体通路から液滴を引っ張り出す電気濡れ力を用いる等、流体通
路の内外に輸送されてもよい。
【０１０１】
本発明のライブラリー構築手順は、当該手順における各精製工程での一貫した、そして
効率的な核酸の修復を提供する。一の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズに固定さ
れ、可動式の磁石と、一連の混合および分割操作とが、ライブラリー構築手順の各工程間
の核酸の精製に用いられる。他の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズ（例えば、SP
RI（登録商標）ビーズ）に固定され、磁石と、アルコール洗浄液滴を用いた一連の液滴混
合および分割洗浄工程とが、ライブラリー構築手順の各工程間の核酸の精製に用いられる
。有機洗浄液滴は、約１〜約１００％、または約１０〜約９０％、または約３０〜約８０
％、または約５０〜約７５％の何らかの極性プロトン性溶媒を含んでいてもよく、残りは
水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質でもよい。一の実施形態では
、液滴の溶媒部分は、アルコールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態では、
溶媒は、１〜８の炭素、または１〜６の炭素を有するアルコールおよび／またはカルボン
酸である。アルコールおよび／またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であっ
てもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパ
ノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。
【０１０２】
洗浄液滴は、少なくとも約５０％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、または８０％ｖ／ｖのアルコ
ールを含んでいてもよい。アルコールは、例えば、１〜８の炭素、または１〜６の炭素を
有していてもよい。アルコールは、環状、直線状、または分岐状であってもよい。好適な
アルコールの例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロ
パノール、エタノール、およびメタノールを含む。
【０１０３】
洗浄液滴は、約０．０１〜約１％ｖ／ｖの界面活性剤、約０．０１〜約０．１％ｖ／ｖ
の界面活性剤を含んでいてもよい。好適な界面活性剤は、胆汁塩等のアニオン性界面活性
剤；四級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤；アルカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ルグルカミド、アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、アルキルグリコシド、シクロアル
カノイルヒドロキシエチルグルカミド、シクロアルキルグリコシド、ポリオキシエチレン
等の非イオン性界面活性剤；およびアルキルベタイン、アルキルホスホコリン、アルキル
スルホベタイン、シクロアルキルホスホコリン、ホスホエタノールアミン、非洗浄スルホ
ベタイン、スルホベタイン等の双性イオン界面活性剤を含む。ポリソルベート界面活性剤
が好ましい。
【０１０４】
洗浄液滴は、任意に、無機塩および／または有機塩等の１つ以上の塩を含んでいてもよ
い。１つ以上の塩は、例えば、１つ以上の、アルミニウム、アンモニウム、バリウム、ベ
リリウム、カルシウム、セシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ルビジウム、ナ
トリウム、またはストロンチウム、の塩を含む。１つ以上の塩は、例えば、１つ以上の、
クロリド、フルオリド、オキシド、オキソアニオン、炭酸塩、重炭酸塩、ヒドロキシド、
硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩を含む。１つ以上の塩は、液滴アクチュエーターでの洗浄液滴
としての使用に対する洗浄液滴溶液の適合性を害さない限り、いかなる濃度の洗浄液滴溶
液で供給されてもよい。例えば、１つ以上の塩は、約０．００１〜約１００ｍＭ、または
約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００１〜約１ｍＭの範囲の濃度の洗浄液滴溶液
で供給されてもよい。
【０１０５】
図６は、核酸ライブラリー作製方法６００のフローチャートを表し、当該方法は、磁気
応答性ビーズ（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）およびアルコール系ビーズ洗浄手順を
用いる手順に応じて、反応液滴体積での単位サイズ化された液滴の数は、異なっていても
よい。せん断された核酸サンプル（例えば、２０〜５０μＬ）は、液滴アクチュエーター
のサンプル入力リザーバに装填されてもよい。核酸サンプルは、処理の前にアクチュエー
ターで濃縮されてもよい。サンプル濃縮は、例えば、リザーバ内濃縮（in-reservoir con
centration）手順または一連の分配濃縮（serial dispensing concentration）手順を用
いて行われてもよい。
【０１０６】
２倍サンプル液滴は、分配され、液滴操作を用いて１倍試薬液滴（例えば、３００ｎＬ
／サンプル）と混合され、３倍混合サンプル液滴を生成してもよく、当該１倍試薬液滴は
、せん断された核酸フラグメントの平滑末端化のための酵素（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ）および試薬を含む。いくつかの実施形態では、この工程で、ポリヌクレオチドキ
ナーゼおよび試薬が、反応液滴に含まれてもよい。混合３倍サンプル液滴は、平滑末端化
反応が完了するのに十分な期間、例えば、約３０分、室温で保温されてもよい。平滑末端
化された核酸は、図７を参照して記載したように、捕捉され（５倍サンプル／SPRI（登録
商標）ビーズ液滴）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ液滴）、および溶離（２倍溶離サ
ンプル液滴）されてもよい。
【０１０７】
実質的に全ての平滑末端化された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用い
て第２の１倍試薬液滴（３００ｎＬ／サンプル）と混合されて、３倍混合サンプル液滴を
形成してもよい。この工程では、１倍試薬液滴は、Ａ−ｔａｉｌ化反応のための酵素およ
び反応（３倍バッファーおよび酵素）成分を含む。混合サンプル液滴の保温は、約３７℃
で約３０分間行われてもよい。処理された核酸は、図７を参照して記載したように、捕捉
され（５倍サンプル／SPRI（登録商標）ビーズ液滴）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ
液滴）、および溶離（２倍溶離サンプル液滴）されてもよい。
【０１０８】
実質的に全てのＡ−ｔａｉｌ化された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を
用いて第３の１倍試薬液滴と混合されて、３倍混合サンプル液滴を形成する。この工程で
は、１倍試薬液滴（３００ｎＬ／サンプル以下）は、アダプター結合のための酵素および
反応成分（例えば、アダプター、リガーゼ、およびリガーゼバッファー）を含む。３倍混
合サンプル液滴の保温は、室温で約５〜約３０分間行われてもよい。処理された核酸は、
図７を参照して記載したように、捕捉され（５倍サンプル／SPRI（登録商標）ビーズ液滴
）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ液滴）、および溶離（２倍溶離サンプル液滴）され
てもよい。
【０１０９】
一の実施形態では、実質的に全ての処理された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液
滴操作を用いて、サンプル回収および除去リザーバに輸送されてもよい。２倍溶離サンプ
ル液滴は、サンプル回収および除去リザーバに約４〜約１０℃で保管されてもよい。他の
実施形態では、処理された核酸（例えば、アダプター結合ＤＮＡ）は、サンプル回収およ
び除去リザーバへのサンプル液滴の輸送前に、ＰＣＲ（例えば、１０〜１５サイクル）を
用いて増幅されてもよい。
【０１１０】
図７は、ビーズ系洗浄／溶離方法７００のフローチャートを表している。３倍液滴（例
えば、その中に核酸を含む３倍サンプル液滴）は、液滴操作を用いて、磁気応答性ビーズ
（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）を含む２倍試薬液滴と混合され、５倍混合サンプル
／ビーズ液滴を生成してもよい。混合サンプル／ビーズ液滴は、核酸フラグメントが磁気
応答性ビーズに結合するのに十分な期間（例えば、約５分）、室温で保温されてもよい。
５倍混合サンプル／ビーズ液滴は、ビーズ洗浄手順を用いて洗浄されてもよいが、液滴操
作を用いて５倍上澄み液滴が分割され、０倍サンプル／ビーズ液滴（すなわち、核酸に結
合したビーズ）を生成することは除く。２倍洗浄液滴（すなわち、エタノール）は、液滴
操作を用いて液滴操作電極に沿って輸送され、結合した核酸を有する０倍サンプル／ビー
ズ液滴を通過してもよい。２倍溶離バッファー液滴（例えば、水液滴）は、液滴操作を用
いて輸送され、洗浄０倍サンプル／ビーズ液滴と混合され、２倍溶離バッファー液滴を生
成してもよい。溶離バッファー液滴は、磁気応答性ビーズから結合した核酸を溶離するの
に十分な期間（例えば、約１分）、室温で保温されてもよい。実質的に全ての分割された
核酸（すなわち、全てのスナップオフビーズ）を含む２倍溶離サンプル液滴。核酸を含む
２倍溶離サンプル液滴は、さらなる処理、すなわち、ライブラリー構築手順でのＡ−ｔａ
ｉｌ化反応およびアダプター結合のために輸送されてもよい。
【０１１１】
本発明の方法は、さらに応用して、大（例えば、約４００ｂｐ〜約１０ｋｂｐ）小（例
えば、約２００ｂｐ）の核酸ライブラリーの全自動化構築を提供してもよい。一の実施形
態では、本発明の方法は、応用して、液滴アクチュエーターでの核酸、すなわち、ＲＮＡ
またはＤＮＡの自動フラグメンテーションを含んでもよい。一例では、本発明の方法は、
応用して、ＲＮＡ系ライブラリー用のＲＮＡのフラグメンテーションおよび逆転写を含ん
でもよい。この例では、核酸フラグメンテーションは、バッファー系フラグメンテーショ
ンを用いて行われてもよい。他の例では、核酸のフラグメンテーション（例えば、細菌性
または真核性）は、酵素系フラグメンテーション反応を用いて行われてもよい。例えば、
NEBNext（商標）dsDNA Fragmentase（商標）等のフラグメンターゼを用いて時間依存手法
によりdsDNA破壊を生じさせ、約１００〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成しても
よい。NEBNext dsDNA Fragmentaseは、２つの酵素を含み、一方の酵素は、dsDNAにランダ
ムに切れ目を生じさせ、他方の酵素は、切れ目部位を認識し、その切れ目から反対のＤＮ
Ａ鎖を切って、dsDNA破壊を作り出す。他の例では、NexteraのTransposome（商標）技術
等のトランスポザーゼを用いてdsDNA破壊を生じさせてもよい。Transposome（商標）錯体
は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体をdsDNAと共に保
温すると、当該ＤＮＡは、フラグメント化され、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチド
の転移鎖は、ＤＮＡフラグメントの５’末端に共有結合する。Transposome錯体の濃度を
変えることにより、フラグメント化され、標識されたＤＮＡライブラリーのサイズ分布が
制御されてもよい。サンプル液滴は、液滴操作間隙でフラグメンテーション試薬を含む液
滴と混合されてもよく、生成する液滴は、保温されてフラグメント化された核酸を生成し
てもよい。必要な液滴操作は、充填流体中で行われてもよい。
【０１１２】
他の実施形態では、本発明の方法は、入力核酸（未処理サンプル）および出力核酸（処
理サンプル）の定量化を含むように適応してもよい。一例では、ｑＰＣＲを用いて各処理
ライブラリーサンプルのＤＮＡ濃度を決定してもよい。ｑＰＣＲデータを用いて、各処理
サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用いて希釈されて、また
はアクチュエーターでのＰＣＲ手順を用いてさらに増幅されて、サンプルの貯蔵前に適切
な濃度範囲を達成してもよい。
【０１１３】
他の実施形態では、本発明の方法は、構築されたライブラリーの品質保証テストを提供
するように適応してもよい。一例では、TaqManまたはMolecular Beacon等のプローブ系ハ
イブリダイゼーション分析を用いて、完了したライブラリーの質を検証してもよい。TaqM
anおよびMolecular Beaconプローブは、リアルタイムまたはＰＣＲ分析の完了点で用いら
れてもよい。
【０１１４】
デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性のため、本発明のライブラリー構築手順
は、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に容易に適応され得る。次世
代配列決定プラットフォームの例は、これらに限定されないが、Illumina、454、SOLiD、
PacBioおよびIon Torrentを含む。
【０１１５】
図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列８００の一部の一例の
平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフ
する方法を示す。電極配列８００は、液滴操作電極８１０（例えば、電気濡れ電極）の配
列を含んでいてもよい。
【０１１６】
液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極８１０頂部で行われる。一例では、電極配
列８００は、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｂ、８１０Ｃ、８１０Ｄ、８１０Ｅ、および
８１０Ｆを含み、これらの電極は、一直線にまたは通路で配置されている。さらに、磁石
８１２は、例えば、液滴操作電極８１０Ａがその磁場内にあるように位置している。磁石
８１２は、永久磁石または電磁石であってもよい。
【０１１７】
本発明のビーズをスナップオフする方法の一態様では、液滴の専有面積よりも大きい電
気濡れ表面領域を使用し、このことが、可能な限り最小量の液体でビーズを留置すること
の鍵となる。一例では、液滴が１倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用さ
れる電気濡れ表面領域は、２倍である。他の例では、液滴が２倍液滴のとき、ビーズをス
ナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、３倍である。他の例では、液滴が
３倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、４倍
、等である。例として、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、３倍電気濡れ表面領域を用いて、
２倍液滴からビーズがスナップオフされるシナリオを示している。この例では、可能な限
り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法は、これらに限
定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１１８】
図８Ａに関して、この工程では、一定量の磁気応答性ビーズ８１６を含む２倍液滴８１
４は、液滴操作電極８１０Ａおよび８１０Ｂの頂部に位置している。これは、この工程で
は、液滴操作電極８１０Ａおよび８１０Ｂがオンになっていて、一方、液滴操作電極８１
０Ｃ、８１０Ｄ、８１０Ｅ、および８１０Ｆがオフになっているからである。液滴操作電
極８１０Ａが磁石８１２の磁場内にあるため、２倍液滴８１４内にある磁気応答性ビーズ
８１６は、液滴操作電極８１０Ａに引き付けられる。
【０１１９】
図８Ｂに関して、この工程では、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｅおよび８１０Ｆがオ
フになっていて、一方、液滴操作電極８１０Ｂ、８１０Ｃおよび８１０Ｄがオンになって
いる。これが、２倍液滴８１４に３つの液滴操作電極８１０にわたって伸びさせる。この
伸びた２倍液滴８１４の末端が、磁石８１２のほぼ端にあり、まだ磁気応答性ビーズ８１
６を保持している。磁石８１２の磁場のため、磁気応答性ビーズ８１６は、この伸びた２
倍液滴８１４の末端に保持される。２倍液滴８１４が３倍電気濡れ表面領域である３つの
液滴操作電極にわたって伸びる動作は、２倍液滴８１４の末端にやや尖った形状をとらせ
る。事実上、磁気応答性ビーズ８１６を保持したまま、磁石８１２の端から液体を引きは
がす。
【０１２０】
図８Ｃに関して、この工程では、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｂおよび８１０Ｆがオ
フになっていて、一方、液滴操作電極８１０Ｃ、８１０Ｄおよび８１０Ｅがオンになって
いる。これが、２倍液滴８１４に、３倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされながら、磁
石８１２からさらに離れる移動を引き起こしている。これが、磁気応答性ビーズ８１６に
、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、磁石８１２のほぼ端にスナップオフ
されることを引き起こしている。未だ３倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされている２
倍液滴８１４は、実質的にビーズがない。
【０１２１】
液滴マイクロアクチュエーターでのライブラリー作製化学ワークにおける重要な挑戦は
、有機溶媒洗浄液滴を用いた液滴操作を行うことに対する特有な要求を伴う。様々な実施
形態では、有機洗浄液滴は、約１〜約１００％、または約１０〜約９０％、または約３０
〜約８０％、または約５０〜約７５％の何らかの極性プロトン性溶媒で構成され、残りは
水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質であってもよい。一の実施形
態では、溶媒は、１つ以上のアルコールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態
では、溶媒は、１〜８の炭素または１〜６の炭素を有する、１つ以上のアルコールおよび
／またはカルボン酸である。アルコールおよび／またはカルボン酸は、環状、直線状、ま
たは分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノ
ール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、
吉草酸を含む。液滴アクチュエーターの改良、分配技術、および、斯かる溶媒を用いた液
滴操作の実行技術は、本明細書の他の箇所で検討される。
【０１２２】
７．３  液滴アクチュエーターの構成およびアセンブリ
液滴アクチュエーターは、例えば、底部基板および頂部基板を含んでいてもよい。電極
は、いずれかまたは両方の基板に供給され、液滴操作の実行のために配置されてもよい。
液滴アクチュエーターは、多重ライブラリー構築および特別なライブラリー構築手順の用
途のために適応してもよい。例えば、充填流体の組成および添加界面活性剤の濃度は、本
開示に基づいて核酸ライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択され
てもよい。液滴輸送電圧および周波数も、本開示に基づいてライブラリー構築手順で用い
られる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。一例では、液滴アクチュエーターは、
並列での１０，２０，３０，４０，５０またはそれ以上の異なるライブラリーの構築のた
めに構成される。アクチュエーターでのリザーバの数および配置、独立した電極接続の数
、異なるリザーバの大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄領域の配置、電極サイズ、電極間
の間隔、および間隙高さ（頂部基板と底部基板との間）等の設計パラメーターは、本開示
の観点から当業者により異なっていてもよい。
【０１２３】
液滴アクチュエーターは、（ｉ）磁気応答性ビーズの固定のための１つ以上の磁石およ
び（ｉｉ）所定の反応ゾーンおよび／または洗浄ゾーン内で温度を制御するための１つ以
上のヒーターアセンブリ等、の液滴アクチュエーターについて有用な所定の部材を囲う装
置のデッキに適合するように設計されてもよい。装置のデッキに結合した磁石は、永久磁
石であってもよい。磁石は、位置固定されていてもよいし、または移動可能であってもよ
い。
【０１２４】
図９は、多重ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーター９０
０の一例の平面図を表している。液滴アクチュエーター９００は、液滴操作間隙（図示せ
ず）により分離された底部基板９１０と頂部基板９１２を含んでいてもよい。底部基板９
１０は、例えば、プリント基板（ＰＣＢ）であってもよい。頂部基板９１２は、例えば、
ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素から作られていてもよい。頂部基板９１２は、導
電性インクまたはインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等の導電体で液滴操作間隙に面した側
面を被覆されていてもよく、さらにフルオロポリマーコーティング等の疎水性のコーティ
ングで被覆されていてもよい。
【０１２５】
図９の頂部基板９１２に関して、頂部基板９１２は、多量の液体を受け入れるようにそ
れぞれ設計された、様々な大きさおよび形状の一連の液体リザーバ９１６を含む。液体は
、例えば、本発明のライブラリー構築手順の実行に必要な様々な試薬を含んでいてもよい
。例は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、洗
浄バッファー、核酸捕捉ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。各リザーバは、リザーバか
ら液滴操作間隙への流体通路を構築する開口部を含む。試薬は、開口部９１５を通って液
滴操作間隙内に流れ、そこで試薬は電気濡れ媒介液滴操作等の電極媒介液滴操作にかけら
れてもよい。電気濡れ媒介液滴操作または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を用いて、
試薬は、サブ液滴に分配され、ライブラリー構築手順等の液滴操作手順に従って輸送され
、他の試薬液滴および／またはサンプル液滴と接触してもよい。頂部基板９１２は、任意
に磁気応答性ビーズに固定されたせん断された核酸等のサンプル液滴のような液体の注入
のための１つ以上のピペット注入開口部９１４も含んでいてもよい。
【０１２６】
底部基板９１０は、電気濡れ電極配列９２２を含む。電極配列９２２は、開口部９１５
またはピペット注入部位９１４を経て液滴操作間隙に流れた液体を受け入れるように配置
された分配電極を含む。電極配列９２２の分配電極は、例えば、液滴操作電極（例えば、
電気濡れ電極）の通路、ライン、および／または配列を通じて相互接続されている。電極
は、電気接点９１０に配線されている。
【０１２７】
一例では、核酸サンプルは、例えば、手動でまたは自動でサンプルをサンプル注入部位
を経て液滴操作間隙に注入する等、サンプル注入部位９１４を経て液滴操作間隙に装填さ
れてもよい。異なる核酸サンプルは、液滴アクチュエーター９００上の異なる電極レーン
で処理され、サンプル間の汚染の可能性を低減してもよい。他の実施形態では、各サンプ
ルは、固有のレーンを含んでいてもよく、そしてサンプルが共通の開口部から抽出される
必要がないように、各レーンは、当該レーンからサンプルを抽出するための開口部を含ん
でいてもよい。したがって、ライブラリー構築手順の終了時には、レーンの各々からのア
ダプター結合核酸は、異なる出口または出口リザーバ（図示せず）で浄化および回収され
てもよい。
【０１２８】
図１０は、核酸ライブラリーの構築用の核酸サンプルを処理するために構成された電極
配列１０００の他の例の平面図を表している。この例では、電極配列１０００は、１２の
異なる核酸ライブラリー構築用に上限１２の異なる核酸サンプルを並行して処理するため
に構成されている。電極配列１０００は、分配電極１０１０および１０１２と同様に、一
連のサンプル回収電極１０１４を含む。液滴操作間隙で、（ｉ）外部リザーバ（例えば、
図９に関して記載したような）に結合した開口部もしくは流体通路から液体を受け入れる
、または、（ｉｉ）当該開口部もしくは流体通路に液体を流すことができるように、分配
電極１０１０および１０１２ならびにサンプル回収電極１０１４は、配列されてもよい。
操作では、分配電極１０１０は、試薬の分配に用いられてもよい。例は、平滑末端化試薬
、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、洗浄バッファー、核酸捕捉
ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。分配電極１０１２は、サンプルを分配するために用
いられ、ここに示すように、１２の核酸サンプルのための１２のサンプル入力分配電極１
０１２である。サンプル出力回収電極１０１４は、サンプル流体を受け入れるために用い
られ、ここに示すように、液滴操作間隙から回収される処理核酸ライブラリーを受け入れ
るための１２のサンプル出力回収電極である。試薬分配電極１０１０、サンプル入力分配
電極１０１２、およびサンプル出力回収電極１０１４は、液滴操作電極１０１８（例えば
、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列を通じて相互接続される。各サンプル入力分
配電極１０１２およびその対応するサンプル出力回収電極１０１４から延びる液滴操作電
極１０１８の通路は、専用電極レーン１０２０（例えば、１２の専用電極レーン１０２０
）を形成する。専用電極レーン１０２０は、異なる核酸サンプルを処理するための別個の
反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーンを使用することにより、異なる核酸
の間での相互汚染が最小化される。各核酸サンプルは、他のいずれのサンプルの通路とも
交差しない液滴操作間隙内の通路を横断するため、相互汚染の可能性が最小化される。さ
らに、試薬液滴がサンプル通路を横断する間に、サンプル液滴が同じ通路を横断する前に
、試薬液滴が常にサンプル通路を横断するように、手順が実行され得るため、試薬液滴が
、サンプルレーン間での核酸汚染の源となり得る可能性を低減する。
【０１２９】
電極配列１０００は、１つ以上の温度制御ゾーン１０２２と共に提供されてもよい。一
例では、３つの温度制御ゾーン１０２２（すなわち、温度制御ゾーン１０２２ａ、１０２
２ｂ、および１０２２ｃ）を用いてもよい。温度制御素子（図示せず）が、温度制御ゾー
ン１０２２での充填流体（図示せず）の領域の温度を定める。他で述べたように、温度制
御素子は、いくつかの実施形態では、デッキに結合されてもよく、当該デッキは、液滴ア
クチュエーターカートリッジを搭載し、液滴操作および検出等のカートリッジの働きを制
御するシステムにカートリッジを電気的に結合させる。温度制御ゾーンは、約３７℃で提
供されてもよく、当該温度は、Ａ−ｔａｉｌ化反応での酵素活動に十分に適した温度であ
る。温度制御ゾーンは、核酸サンプルまたは生成物の増幅を実行するのに適した温度で構
築されてもよい。３つの温度制御ゾーン１０２２が示されたが、他の任意の好適な数の温
度制御ゾーン１０２２が、電極配列１０００と結合されてもよい。
【０１３０】
液滴アクチュエーターは、１つ以上の磁石１０２４(例えば、１２個の磁石１０２４)を
含んでいてもよく、または１つ以上の磁石１０２４に結合されていてもよく、当該磁石は
、磁気応答性ビーズを保持するため個々の専用電極レーン１０２０に近接して位置しても
よい。各磁石１０２４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。一の実施形態
では、磁石１０２４は、対応する専用電極レーン１０２０に近接するようにおよび当該専
用電極レーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石１０２４は、酵素反応間
の洗浄の間の核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去と
を確実にするように位置している。いくつかの実施形態では、混合および保温は、磁石か
ら離れた専用電極レーン１０２０で行われてもよい。
【０１３１】
この筺体では、基板のいずれかまたは両方が、１以上の液滴操作の実行のために配置さ
れた電極を含んでいてもよい。液滴操作は、例えば、電気濡れ媒介液滴操作、誘電泳動媒
介液滴操作、および／または光電濡れ媒介液滴操作であってもよい。液滴操作は、代わり
に、または付加的に、以下の他のメカニズムにより媒介されてもよい：流体力学的な流体
圧を誘起する装置等、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動
膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電ポンプ／超音波ポンプ、および音響力）に基づく操作
を行う装置；電気的原理または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、強磁
性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁力を利用した引力または斥力、および電磁流体力
学ポンプ）に基づく操作を行う装置；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相転移体積膨張
）に基づく操作を行う装置；他の種類の表面湿潤原理（例えば、電気濡れ、および光電濡
れと同様に化学的な、熱的な、構造的なおよび放射性の誘起表面張力勾配）に基づく操作
を行う装置；重力に基づく操作を行う装置；表面張力（例えば、毛細管現象）に基づく操
作を行う装置；静電力（例えば、電気浸透流）に基づく操作を行う装置；遠心力（コンパ
クトディスク上に配置され、回転された基板）に基づく操作を行う装置；磁力（例えば、
振動イオンが引き起こす流れ）に基づく操作を行う装置；電磁流体力学的な力に基づく操
作を行う装置；および真空差または加圧差等に基づく操作を行う装置等。いくつかの実施
形態では、上記技術の２つ以上の組み合わせを用いて、本発明の液滴アクチュエーターで
の液滴操作を行ってもよい。
【０１３２】
図１１は、核酸ライブラリーの構築のために液滴アクチュエーターでの核酸の処理のた
めに構成された電極配列１１００の他の一例の平面図を表している。この例では、試薬分
配電極が、電極配列の中央領域に位置し、１２の各サンプル入力分配電極およびサンプル
処理電極の２セットが各端に位置している。分配電極、液滴操作電極（例えば、サンプル
処理電極）、および回収電極の配列は、試薬液滴が分配され、専用サンプル処理領域（す
なわち、専用ライブラリー構築レーン）に輸送される配列である。反応生成物（すなわち
、処理核酸）および廃棄生成物（例えば、洗浄液滴）は、専用ライブラリー構築レーン上
をそれぞれ、専用サンプル回収リザーバおよび廃棄物回収リザーバに輸送される。電極配
列１１００は、２４の異なる核酸ライブラリー構築のために専用反応レーンで並行して上
限２４の異なる核酸サンプルを処理するために構成されている。各核酸ライブラリーを識
別する固有のアダプターバーコード標識は、ライブラリー作製方法の間に、各核酸サンプ
ルに結合されてもよい。
【０１３３】
電極配列１１００は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列１１００は、１１の試
薬分配電極１１１０等、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬
、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するため
の１つ以上の試薬分配電極１１１０を含んでいてもよい。電極配列１１００は、サンプル
流体を分配するための１つ以上のサンプル入力分配電極１１１２も含んでいてもよい（例
えば、核酸を分配するための２４のサンプル入力分配電極１１１２）。電極配列１１００
は、アダプターバーコード標識を分配するための１つ以上のアダプター分配電極１１１４
（例えば、２４のアダプター分配電極１１１４）も含んでいてもよい。分配電極１１１０
，１１１２，および１１１４の各配列は、専用試薬輸送レーン１１１１，１１１２，およ
び１１１５を含んでいてもよく、当該専用試薬輸送レーンは、試薬が他のいずれの反応レ
ーンを横断する必要なく、分配された試薬液滴を分配電極１１１０，１１１２，および１
１１４から当該分配電極の個々の反応レーン１１２４まで輸送するように配置された電極
を含む。組立液滴アクチュエーターでは、分配電極１１１０，１１１２，および１１１４
は、流体通路と結合され、当該流体通路は、試薬を分配電極の十分近傍に流し、分配電極
は、試薬の液滴を液滴操作表面上または液滴操作間隙内に分配するために用いられてもよ
い。例えば、流体通路は、頂部基板リザーバから液滴操作間隙内への通路であってもよい
。分配電極１１１０は、液滴を配列のいずれかの側から分配するように配置されている。
したがって、独立して、試薬を専用輸送レーン１１１１に沿って２方向に、専用反応通路
１１２４まで供給する。
【０１３４】
電極配列１１００は、複数の回収電極も含んでいてもよい。例えば、電極配列１１００
は、サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回収電極１１１６（例えば
、処理核酸液滴を受け入れるための２４のサンプル出力回収電極１１１６）を含んでいて
もよい。電極配列１１００は、廃棄流体を回収するための１つ以上の廃棄物回収電極１１
１８（例えば、２４の廃棄物回収電極１１１８）も含んでいてもよい。回収電極１１１６
および１１１８の各配列は、それぞれ、専用試薬輸送レーン１１１７および１１１９と接
触していてもよく、当該レーンは、液滴が他のいずれの反応レーンを横断する必要なく、
反応レーン１１２４から回収電極１１１６および１１１８まで分配された試薬液滴を輸送
するように配置された電極を含む。サンプル出力回収電極１１１６および／または廃棄物
回収リザーバ１１１８は、流体通路と結合されてもよく、当該流体通路は、回収のために
試薬を当該回収電極から流体通路またはリザーバまたは液滴アクチュエーター外に流す。
例えば、流体通路は、回収電極から液滴操作間隙外のリザーバまで、または液滴操作間隙
の領域内のリザーバまでの通路であってもよい。
【０１３５】
試薬分配電極１１１０、サンプル入力分配電極１１１２、アダプター分配電極１１１４
、サンプル出力回収電極１１１６、および廃棄物回収電極１１１８は、液滴操作電極１１
２０（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列を通じて相互接続されている。
液滴操作電極１１２０の配列は、反応ゾーン１１２２を提供する。特に、各サンプル入力
分配電極１１１２、アダプター分配電極１１１４ならびにそれらの対応するサンプル出力
回収電極１１１６および廃棄物回収電極１１１８から延びる液滴操作電極１１２０の配列
は、各サンプル入力についての２つの専用電極レーン１１２４等の専用電極レーン１１２
４を形成する。反応ゾーン１１２２内の専用電極レーン１１２４は、（ｉ）異なる核酸サ
ンプルを処理するための別個の反応レーン（すなわち、ライブラリー構築）、および、（
ｉｉ）所定の反応工程（例えば、ビーズ除去工程）の間、反応液滴を往復するための「遮
断」レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試薬分配を用いること
により、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。
【０１３６】
１つ以上の磁石（図示せず）は、磁気応答性ビーズを保持するために専用電極レーン１
１２４近傍に位置されてもよい。磁石は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい
。一例では、磁石は、各専用電極レーン１１２４に近接するようにおよび当該専用電極レ
ーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石は、酵素反応間の洗浄の間の核酸
が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去とを確実にするよう
に位置している。混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン１１２４で行われて
もよい。
【０１３７】
反応ゾーン１１２２は、１つ以上の温度制御ゾーン（図示せず）も含んでいてもよい。
温度制御素子は（例えば、ヒーターまたはヒートシンク、図示せず）、反応ゾーン１１２
２内の専用電極レーン１１２４近傍に位置してもよい。温度制御素子を用いて、温度制御
ゾーン周辺で充填流体（図示せず）の温度を制御してもよい。
【０１３８】
一の実施形態では、サンプル入力分配電極は、小さなサンプル入力体積用に設計されて
もよい。例えば、１μＬサンプル体積は、液滴アクチュエーターに装填され、６６０ｎＬ
液滴として処理されてもよい。
【０１３９】
他の実施形態では、サンプル入力分配電極およびリザーバは、大きなサンプル入力体積
用に設計されてもよい。一例では、ビーズ濃縮手順を用いて、アクチュエーター外のサン
プルリザーバでのサンプル体積から核酸を濃縮および回収してもよい。磁気応答性ビーズ
を、液滴アクチュエーターでサンプルリザーバにサンプルを装填する前に、約１０〜約２
０μＬ等の大きなサンプル体積に添加してもよい。大容量サンプルは、次いで、ビーズ濃
縮手順を用いてアクチュエーターで３３０ｎＬ液滴に処理されてもよい。他の例では、大
きなサンプル体積は、アクチュエーターのサンプルリザーバで濃縮されてもよい。この例
では、一連の６６０ｎＬ液滴が、順次、磁気応答性ビーズと共に、アクチュエーターのサ
ンプルリザーバで保温されてもよい。混合電極を用いてビーズの混合を促進してもよい。
デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性により、サンプル処理手順は、アクチュエ
ーターで、アクチュエーター外で、または、サンプル処理のいずれの組み合わせでも容易
に応用され得る。
【０１４０】
他の実施形態では、各核酸ライブラリー（例えば、図示した電極配列１１００を用いて
上限２４の異なる核酸ライブラリー）は、個々の専用サンプル出力回収電極１１１６で回
収されてもよい。サンプル出力回収リザーバは、例えば、バッファー溶液で満たされて、
リザーバからの処理核酸サンプルの除去を容易にしてもよい。一例では、サンプル出力回
収リザーバは、バッファーを用いて手動で充填（例えば、手動のピペット操作）されても
よい。他の例では、サンプル出力リザーバは、ロボット装置を用いてバッファーで充填さ
れてもよい。サンプル回収は、例えば、各サンプル出力回収リザーバ（図示せず）から処
理サンプルを手動で除去（例えば、手動のピペット操作）することで行われてもよい。他
の例では、サンプル回収は、ロボット装置を用いて行われ、個々の出力回収リザーバ（図
示せず）から各処理サンプルを除去してもよい。
【０１４１】
他の実施形態では、１つ以上の異なる核酸ライブラリーは、当該ライブラリーが、サン
プル出力回収電極での回収前に、液滴アクチュエーターで貯蔵されるように、液滴操作を
用いて混合されてもよい。１つ以上の核酸ライブラリーの貯蔵前に、各サンプルの処理核
酸の量を決定して、貯蔵する全ての個々のサンプルの濃度を等量に確実にしてもよい。一
例では、ｑＰＣＲを用いて各処理サンプルの核酸の濃度を決定してもよい。ｑＰＣＲデー
タを用いて、各処理サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用い
て希釈されて、またはアクチュエーターでのＰＣＲ手順を用いてさらに増幅されて、サン
プルの貯蔵前に適切な濃度範囲を達成してもよい。
【０１４２】
他の例では、核酸サンプルを処理する前に、アクチュエーターでの核酸定量手順を用い
てもよい。この例では、各サンプルについての入力核酸の濃度が、決定され、（必要であ
れば）各サンプルについて核酸ライブラリー構築手順での処理前に調整される。
【０１４３】
図１２は、核酸ライブラリーの構築用に液滴アクチュエーターで核酸を処理をするよう
に構成された電極配列１２００の他の一例の平面図を表している。この例では、電極配列
１２００は、上限２４の異なる核酸ライブラリーのために２つの別個の処理モジュールの
各々で、並行して上限１２の異なる核酸サンプルを処理するように構成されている。一の
実施形態では、処理モジュールは、一の処理モジュールが、他の処理モジュールとは独立
して用いられてもよいように、液滴アクチュエーター上で物理的に分離されている。例え
ば、一のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーターの一部は、充填流体（
例えば、シリコーンオイル）で充填され、上限１２の異なる核酸ライブラリーの処理のた
めに用いられてもよい。第２のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーター
の他の一部は、今後の使用のために未使用のままでもよい。
【０１４４】
一の実施形態では、電極配列１２００は、２つのサンプル処理モジュール１２１０ａお
よび１２１０ｂを含んでいてもよい。２つのサンプル処理モジュール１２１０を示したが
、サンプル処理モジュールは、任意の数および組み合わせで用いられてもよい。各サンプ
ル処理モジュール１２１０は、複数の電極を含む。例えば、各サンプル処理モジュール１
２１０は、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター
結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するために、１２の試
薬分配電極１２１２等の１つ以上の試薬分配電極１２１２を含んでいてもよい。各サンプ
ル処理モジュール１２１０は、サンプル流体を分配するため、１つ以上のサンプル入力分
配電極１２１４（例えば、核酸を分配するための１２のサンプル入力分配電極１２１４）
も含んでいてもよい。各サンプル処理モジュール１２１０は、サンプル流体を受け入れる
ため、１つ以上のサンプル出力回収電極１２１６（例えば、処理核酸液滴を受け入れるた
めの１２のサンプル出力回収電極１２１６）も含んでいてもよい。他の実施形態では、サ
ンプル出力回収電極１２１６は、アダプター分配電極として使用されてもよい。
【０１４５】
試薬分配電極１２１２、サンプル入力分配電極１２１４、およびサンプル出力回収電極
１２１６は、液滴操作電極１２１８（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列
を通じて相互接続されている。各サンプル入力分配電極１２１４およびその対応するサン
プル出力回収電極１２１６から延びる液滴操作電極１２１８の通路は、１２の専用電極レ
ーン１２２０等の専用電極レーン１２２０を形成する。専用電極レーン１２２０は、異な
る核酸サンプル処理のための別個の反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーン
を使用することにより、異なる核酸の間での相互汚染が最小化される。
【０１４６】
電極配列１２００は、１つ以上の温度制御ゾーン１２２２を含んでいてもよい。一例で
は、３つの温度制御ゾーン１２２２（すなわち、温度制御ゾーン１２２２ａ、１２２２ｂ
、および１２２２ｃ）が用いられてもよい。温度制御素子（図示せず）が、温度制御ゾー
ン１２２２近傍での充填流体（図示せず）の温度を制御する。
【０１４７】
１つ以上の磁石（例えば、１２の磁石１２２４）が、磁気応答性ビーズを保持するため
に個々の専用電極レーン１２２０近傍に位置されてもよい。専用電極レーン１２２０に関
する磁石１２２４の位置決めは、所定の反応工程（例えば、ビーズ除去工程）の間、反応
液滴を往復するための「遮断」領域を提供する。各磁石１２２４は、例えば、永久磁石ま
たは電磁石であってもよい。各磁石１２２４は、各専用電極レーン１２２０に近接するよ
うにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動され得る可動式磁石であってもよい
。各磁石１２２４は、酵素反応の間の洗浄時における核酸が付着したビーズの空間的な固
定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去と、を確実にするように位置している。混合および
保温は、磁石から離れた専用電極レーン１２２０で行われてもよい。
【０１４８】
図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に
適した組立液滴アクチュエーター１３００の平面図および斜視図を表している。液滴アク
チュエーター１３００は、液滴操作間隙で分離された底部基板１３１０および頂部基板１
３１２を含んでいてもよい。底部基板１３１０は、例えば、ＰＣＢ、プラスチックまたは
シリコンチップであってもよい。底部基板１３１０は、核酸ライブラリーの構築用の核酸
を処理するために構成された電極配列１３１４を含んでいてもよい。電極配列１３１４の
詳細は、図１４を参照して記載される。液滴操作は、液滴操作表面上の電極配列１３１４
頂部で行われる。好適な実施形態では、底部基板１３１０は、ＰＣＢであり、当該ＰＣＢ
は、厚み約０．０３１２５インチであり、銅フラッドがなく（すなわち、電極間のＰＣＢ
上に銅層がない）製造されており、これにより、底部基板１３１０と頂部基板１３１２と
の間の液滴操作間隙での液滴中の磁気応答性ビーズを制御するために用いられる磁場との
干渉を低減し、底部基板を通じた熱エネルギーの透過を低減する。他の実施形態では、底
部基板１３１０は、厚み約０．０６２５インチのＰＣＢであってもよい。
【０１４９】
頂部基板１３１２は、例えば、ポリカーボネート等の射出材料で形成されてもよい。複
数の流体分配リザーバが頂部基板１３１２に組み込まれてもよい。例えば、頂部基板１３
１２は、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結
合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するための１つ以上の試
薬分配リザーバを含んでいてもよい。一例では、頂部基板１３１２は、試薬分配リザーバ
１３１７Ａ、１３１７Ｂ、１３１７Ｃ、１３１７Ｄ、および１３１７Ｅに沿って、試薬分
配リザーバ１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃ、および１３１６Ｄを含む。頂部基板１
３１２は、サンプル流体を分配するための１つ以上のサンプル入力リザーバを含んでいて
もよい。例えば、頂部基板１３１２は、サンプル入力リザーバ１３１８Ａ〜１３１８Ｆの
第１列（またはカラム）およびサンプル入力リザーバ１３１８Ｇ〜１３１８Ｌの第２列（
またはカラム）を含む。頂部基板１３１２は、アダプターバーコード標識を分配するため
の１つ以上のアダプター分配リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板１３１２は
、アダプター分配リザーバ１３２０Ａ〜１３２０Ｆの第１列（またはカラム）およびアダ
プター分配リザーバ１３２０Ｇ〜１３２０Ｌの第２列（またはカラム）を含む。
【０１５０】
頂部基板１３１２は、複数の回収リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板１３
１２は、処理核酸液滴を受け入れるための２列（またはカラム）の６つのサンプル出力回
収リザーバ１３２２等の処理サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回
収リザーバ１３２２を含んでいてもよい。頂部基板１３１２は、廃棄物回収リザーバ１３
２４Ａおよび１３２４Ｂ等の廃棄流体を回収するための１つ以上の廃棄物回収リザーバ１
３２４も含んでいてもよい。
【０１５１】
試薬分配リザーバ１３１６、サンプル入力リザーバ１３１８、およびアダプター分配リ
ザーバ１３２０は、開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流体通路は、流体
を流体分配電極近傍に流すために配置され、当該電極は図１４を参照して記載したように
底部基板１３１０上に配置されている。サンプル出力回収リザーバ１３２２および廃棄物
回収リザーバ１３２４は、実質的に開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流
体通路は、流体を流体回収電極からサンプル出力回収リザーバ１３２２および廃棄物回収
リザーバ１３２４に流すように配置され、当該電極は図１４を参照して記載したように底
部基板１３１０上に配置されている。
【０１５２】
底部基板１３１０の周辺の少なくとも約１ｃｍの広さの領域は、底部基板１３１０を頂
部基板１３１２に結合するための結合領域を提供する。加えて、底部基板１３１０を頂部
基板１３１２に機械的に取り付けるために、１つ以上の「熱支柱（heat stake）」を用い
られてもよい。熱支柱法（または熱可塑性支柱法）は、周知の機械的結合方法である。一
例では、接着剤層は、幅約１ｃｍ未満および高さ約４２５ミクロンであってもよい。
【０１５３】
図１３Ｃは、液滴アクチュエーター１３００の頂部基板１３１２の一実施例の平面図を
表している。頂部基板１３１２の開口部は、頂部基板にリザーバがないため、ピペット操
作による装填のためのものである。この図は、試薬分配リザーバ１３１６Ａ、１３１６Ｂ
、１３１６Ｃ、および１３１６Ｄ；試薬分配リザーバ１３１７Ａ、１３１７Ｂ、１３１７
Ｃ、１３１７Ｄ、および１３１７Ｅ；サンプル入力リザーバ１３１８Ａ〜１３１８Ｆ；サ
ンプル入力リザーバ１３１８Ｇ〜１３１８Ｌ；アダプター分配リザーバ１３２０Ａ〜１３
２０Ｆ、およびアダプター分配リザーバ１３２０Ｇ〜１３２０Ｌ、の開口部を示している
。図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃに関して、液滴アクチュエーター１３００のリザーバ
のための装填体積および液滴の例を表６に示す。
【０１５４】
【表６】
2016127851.tif 000007
【０１５５】
図１４は、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーター１３００の底部基板１３１０
の一例の平面図を表し、当該底部基板は、当該基板上に形成された電極配列１３１４を有
する。この例では、試薬分配電極は、電極配列１３１４の中央部に位置し、電極配列１３
１４の各側面に６つのサンプル入力分配電極のセットと、６つのサンプル処理電極のセッ
トとが位置している。
【０１５６】
電極配列１３１４は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列１３１４は、異なる試
薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶
液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するための９つの試薬分配電極１４１０等
の１つ以上の試薬分配電極１４１０を含んでいてもよい。電極配列１３１４は、サンプル
流体を分配するための１つ以上のサンプル入力分配電極１４１２を含んでいてもよい（例
えば、核酸を分配するための２列（またはカラム）の６つのサンプル入力分配電極１４１
２）。電極配列１３１４は、アダプターバーコード標識を分配するための１つ以上のアダ
プター分配電極１４１４（例えば、２列（またはカラム）の６つのアダプター分配電極１
４１４）を含んでいてもよい。
【０１５７】
電極配列１３１４は、複数の回収電極を含んでいてもよい。例えば、電極配列１３１４
は、処理サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回収電極１４１６（例
えば、処理核酸液滴を受け入れるための２列（またはカラム）の６つのサンプル出力回収
電極１４１６）を含んでいてもよい。電極配列１３１４は、廃棄流体を回収するための１
つ以上の廃棄物回収電極１４１８（例えば、廃棄物回収電極１４１８ａおよび１４１８ｂ
）を含んでいてもよい。試薬分配電極１４１０、サンプル分配電極１４１２、アダプター
分配電極１４１４、サンプル出力回収電極１４１６、および廃棄物回収電極１４１８は、
実質的に流体リザーバにそろっていて、当該リザーバは、図１３Ａ、１３Ｂ、および１３
Ｃの液滴アクチュエーター１３００の頂部基板１３１２に組み込まれている。
【０１５８】
試薬分配電極１４１０、サンプル入力分配電極１４１２、アダプター分配電極１４１４
、サンプル出力回収電極１４１６、および廃棄物回収電極１４１８は、液滴操作電極１４
２０（例えば、電気濡れ電極）の配列を通じて相互接続されている。例えば、各サンプル
入力分配電極１４１２およびその対応するサンプル出力回収電極１４１６から延びる液滴
操作電極１４２０の通路は、１３の専用電極レーン１４２２等の専用電極レーン１４２２
を形成する。専用電極レーン１４２２は、ライブラリー構築手順での異なる核酸サンプル
処理のための別個の反応レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試
薬分配を用いることにより、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。
【０１５９】
所定の処理工程を行うために１つ以上のビーズ固定ゾーン１４２４（例えば、ビーズ固
定ゾーン１４２４ａおよび１４２４ｂ）が、電極配列１３１４に関連して提供されてもよ
い。例えば、ビーズ固定ゾーン１４２４は、Halbach配列等の磁石の配列により形成され
てもよく、ビーズ固定ゾーンは、液滴アクチュエーターに十分に近接して設置され、その
結果の磁場は、液滴操作間隙内の液滴中の磁気応答性ビーズを、斯かる液滴を用いた液滴
操作の間、実質的に拘束する。磁石により作られる、ビーズ固定ゾーン１４２４での磁場
は、磁気応答性ビーズを保持するのに用いられてもよい。一例では、磁石の配列は、可動
式配列であってもよく、当該可動式配列は図２３Ａ、２３Ｂ、および２４に関して記載し
たように、ビーズ固定ゾーン１４２４に近接するようにまたは離れるように移動されても
よい。磁石配列は、（ｉ）サンプル濃縮、（ｉｉ）酵素反応間の洗浄、および（ｉｉｉ）
処理核酸の溶離後のビーズ除去、等の所定の処理工程の間に、磁気応答性ビーズの保持を
確実にするように位置している。
【０１６０】
いくつかの処理工程を行うために、１つ以上の温度制御ゾーン１４２６（例えば、温度
制御ゾーン１４２６ａ〜１４２６ｄ）が、液滴アクチュエーター内に提供されてもよい。
例えば、加熱棒等の１つ以上の加熱素子（図示せず）が、組立液滴アクチュエーターに近
接して提供され、液滴操作間隙内で１つ以上の温度制御ゾーン１４２６を作り出してもよ
い。加熱棒は、（ｉ）液滴アクチュエーター１３００の液滴操作間隙内の充填流体の温度
制御、および、（ｉｉ）温度制御ゾーン１４２６を通じて液滴アクチュエーターの電極通
路に沿って輸送される液滴の加熱または冷却のために用いられてもよい。１つ以上の加熱
パッド１４２８を用いて温度制御ゾーン１４２６での熱の流れを制御してもよい。
【０１６１】
図１５は、液滴アクチュエーターの底部基板１５００の一例の平面図を表し、当該底部
基板は、最適化された液滴輸送と作業行程時間のための、前記基板上に形成された電極配
列１５１０を有する。液滴アクチュエーターは、ＰＣＢであってもよい底部基板１５００
と結合された頂部基板（図示せず）を用いて形成されてもよく、これらの底部基板１５０
０と頂部基板は間隙によって分離されている。電極配列１５１０は、リザーバ電極および
／または液滴操作電極等の種々の電極で形成されてもよい。
【０１６２】
本発明の電極配列１５１０の主な態様は、当該電極配列が、例えば、他方と電気的に独
立した２つの部分を有する。例えば、図１５は、部分Ａと部分Ｂとに電気的に区分けされ
ていてもよい電極配列１５１０を示している。例えば、電極配列１５１０の部分Ａで液滴
操作が起こり、並行かつ独立して部分Ｂで液滴操作が起こってもよく、逆でもよい。液滴
操作が電極配列１５１０の部分ＡとＢとで並行かつ独立して起こってもよいため、液滴輸
送と作業行程時間が最適化され得る。すなわち、この基板設計は、連続液滴輸送と作業行
程操作を要求してもよい。対照的に、部分ＡとＢとで並行かつ独立して、液滴操作が起こ
り得るため、本発明の底部基板１５００および電極配列１５１０は、液滴輸送と作業行程
時間の最小化を可能とする。
【０１６３】
図１５に示された例では、底部基板１５００が頂部基板（図示せず）と組み合わされて
、液滴アクチュエーターを形成する場合、電極配列１５１０は、様々な容量のアクチュエ
ーターの所定の流体リザーバを支持する。例えば、底部基板１５００の他の流体リザーバ
に関して、電極配列１５１０は、一列になって配置された８つの大容量流体リザーバ１５
１２等の複数の大容量流体リザーバ１５１２を支持してもよい。一例では、大容量流体リ
ザーバ１５１２は、サンプル流体および／または廃棄流体を保持するために用いられても
よい。底部基板１５００の他の流体リザーバに関して、電極配列１５１０は、一列になっ
て配置された７つの中容量流体リザーバ１５１４等の複数の中容量流体リザーバ１５１４
を支持してもよい。一例では、中容量流体リザーバ１５１４は、洗浄試薬、溶離バッファ
ー試薬、バッファー試薬（液滴回収用の）、酵素試薬、所定のビーズ含有試薬等を保持す
るための試薬リザーバであってもよい。底部基板１５００の他の流体リザーバに関して、
電極配列１５１０は、一列になって配置された７つの小容量流体リザーバ１５１６等の複
数の小容量流体リザーバ１５１６を支持してもよい。一例では、小容量流体リザーバ１５
１６は、所定の酵素試薬を保持するための試薬リザーバであってもよい。
【０１６４】
加えて、底部基板１５００の電極配列１５１０は、これらに限定されないが、８つの回
収リザーバ１５１８の列、８つの一時貯蔵リザーバ１５２０の列、および、８つのアダプ
ターリザーバ１５２２の列等の他のリザーバを支持してもよい。一時貯蔵リザーバ１５２
０は、一時液体保持リザーバである。一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０は、一時的な
ビーズ溶液の保持のために用いられる。一例では、アダプターリザーバ１５２２は、アダ
プター溶液の保持のために用いられる。電極配列１５１０により支持されるアクチュエー
ターのリザーバの更なる詳細は、図１６〜２１を参照して記載される。
【０１６５】
液滴操作電極１５２４（例えば、電気濡れ電極）の様々なライン、通路、および／また
は配列が用いられ、大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量
流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、および／ま
たはアダプターリザーバ１５２２を相互接続する。一例では、図１５は、１つ以上の混合
閉回路１５２６を示し、当該閉回路は液滴操作電極１５２４の所定の配列により形成され
る。例えば、８つの混合閉回路１５２６の列が、個々の大容量流体リザーバ１５１２の近
くに実装される。他の例では、図１５は、液滴操作電極１５２４の他の配列により形成さ
れる分配閉回路１５２８を示している。例えば、分配閉回路１５２８は、中容量流体リザ
ーバ１５１４および小容量流体リザーバ１５１６の近傍に実装されている。一例では、溶
離液滴は、分配閉回路１５２８で処理されてもよい。
【０１６６】
一般的に、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダプターリザ
ーバ１５２２は、８つの混合閉回路１５２６と分配閉回路１５２８との間に配置されてい
る。７つの中容量流体リザーバ１５１４および７つの小容量流体リザーバ１５１６が、分
配閉回路１５２８の一方の側面を提供している。８つの大容量流体リザーバ１５１２が、
それぞれ、８つの混合閉回路１５２６を提供している。
【０１６７】
底部基板１５００は、いくつかの入力／出力（Ｉ／Ｏ）パッド１５３０も含む。Ｉ／Ｏ
パッド１５３０は、ＰＣＢに配線することにより電極に電気的に接続されている電気接点
である。一例では、Ｉ／Ｏパッド１５３０は、液滴操作電極１５２４および／または任意
のリザーバ電極に電気濡れ電圧をかけるために用いられる。
【０１６８】
加えて、図１５は、複数の温度ゾーンを含んでいてもよい底部基板１５００を示し、当
該ゾーンは、所定の温度制御素子（図示せず）で制御される。一例では、温度ゾーン１５
４０は、混合閉回路１５２６の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定逆転写（
ＲＴ）ゾーンであってもよい。加えて、温度ゾーン１５４２は、混合閉回路１５２６とア
ダプターリザーバ１５２２の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定加熱ゾーン
であってもよい。さらに、温度ゾーン１５４４は、一時貯蔵リザーバ１５２０と分配閉回
路１５２８の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定装填ゾーンであってもよい
。一例では、温度ゾーン１５４０は、約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよく、温度ゾー
ン１５４２は、約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよく、そして温度ゾーン１５４４は、
約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよい。
【０１６９】
電極配列１５１０の部分Ａおよび部分Ｂに関して、大容量流体リザーバ１５１２および
混合閉回路１５２６が部分Ａにある。中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ
１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、アダプターリザーバ１５
２２、および分配閉回路１５２８が、部分Ｂにある。
【０１７０】
操作では、電極配列１５１０の部分Ａで、酵素および／または結合反応が起こってもよ
い。混合および／またはサンプル濃縮工程が、大容量流体リザーバ１５１２で起こっても
よく、当該リザーバはサンプル流体および／または廃棄流体を保持していてもよい。加え
て、いくつかの保温操作（例えば、上限約３０分の保温時間）が、部分Ａで起こってもよ
い。
【０１７１】
それと同時に、電極配列１５１０の部分Ｂで、いくつかの液滴が、試薬リザーバである
中容量流体リザーバ１５１４および小容量流体リザーバ１５１６から予備分配されてもよ
く、次いで、分配閉回路１５２８での処理を待つ。中容量流体リザーバ１５１４および小
容量流体リザーバ１５１６から予備分配された液滴は、作動するまでの時間を最小化する
（輸送および作業行程時間を最小化する）。
【０１７２】
時々、長期間（例えば、３時間）、ビーズを懸濁に保つことは難しい場合もある。その
ため、電極配列１５１０の部分Ｂを用いて、ビーズの数滴（例えば、８液滴）をいずれか
のリザーバから一時貯蔵リザーバ１５２０まで予備分配してもよい。ビーズの体積が小さ
いほど、懸濁を保つのが容易である。一例では、回収リザーバ１５１８は、検査手順の最
終生成物である処理サンプルの回収のために用いられる。
【０１７３】
頂部基板（図示せず）は、図１５の底部基板１５００に関連して配置され、液滴アクチ
ュエーターを形成する。図１６は、電極配列１５１０により支持されたアクチュエーター
の流体リザーバを充填するための頂部基板（図示せず）の開口部に関連した図１５の底部
基板１５００の平面図を表している。例えば、図１６は、複数の開口部１５５０を示し、
この開口部１５５０は、各流体リザーバに対して１つ設けられる。一例では、大容量流体
リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、および小容量流体リザーバ１５１６の
ための開口部１５５０は、約３ミリメートル（ｍｍ）の直径を有していてもよい。回収リ
ザーバ１５１８およびアダプターリザーバ１５２２のための開口部は、約２ｍｍの直径を
有していてもよい。大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量
流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダ
プターリザーバ１５２２の更なる詳細は、図１７，１８，１９，２０、および２１を参照
して記載される。
【０１７４】
一の実施形態では、全ての操作は、リザーバ空間内で起こってもよい。例えば、全ての
混合および結合は、大容量流体リザーバ１５１２内で起こってもよい。例えば、大容量流
体リザーバ１５１２の前方部を用いて結合および溶離を行ってもよい。斯かる実施形態で
は、各サンプルレーンの混合閉回路１５２６は、追加のユニットセルを装着することがで
きる。
【０１７５】
図１７は、１つの大容量流体リザーバ１５１２を含む底部基板１５００の一部の側面図
および平面図を表している。大容量流体リザーバ１５１２は、複数の別個に制御される電
極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、大容量
流体リザーバ１５１２を形成する。
【０１７６】
例えば、大容量流体リザーバ１５１２の中央に沿って、４つの区分けされたリザーバ電
極１５６０があってもよい。中央のこの４つの区分けされたリザーバ電極１５６０は、そ
の各側面が４つのより小さなリザーバ側面電極１５６２と面するように位置してもよい。
別個に制御される電極のこの配列は、液滴操作電極１５２４（例えば、電気濡れ電極）の
通路、ライン、および／または配列に関連して配置される。加えて、液滴操作電極１５２
４のラインは、各側面が１つ以上の通路側面電極１５６４と面するように位置していても
よい。さらに、装填電極１５６６は、大容量流体リザーバ１５１２の開口部１５５０に関
連して配置されてもよい。
【０１７７】
本発明の大容量流体リザーバ１５１２の一態様では、当該リザーバが複数の別個に制御
される電極に区分けされている。区分けされた電極デザインの利点は、所定の電極活性シ
ークエンスを用いることで、複雑な混合操作を大容量流体リザーバ１５１２の複数のリザ
ーバ電極頂部で起こし得ることである。区分けされた電極デザインの他の利点は、大容量
流体リザーバ１５１２の区分けにより異なる体積の流体を扱う能力を提供することである
。一例では、大容量流体リザーバ１５１２は、約２０マイクロリットル（μＬ）〜約１３
０μＬの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填
電極１５６６は、流体の意図した最小体積（例えば、約２０μＬ）を保持する大きさと形
状である。一例では、大容量流体リザーバ１５１２用の開口部１５５０の直径は、約３ｍ
ｍである。
【０１７８】
図１７の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液
滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側
面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大き
い。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変
移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化
することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０〜
約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。一
例では、Ｈ２は、約１０００〜約５０００μｍ、または約２０００〜約３０００μｍ、ま
たは約２８００μｍであってもよい。
【０１７９】
図１８は、１つの中容量流体リザーバ１５１４を含む底部基板１５００の一部の側面図
および平面図を表している。中容量流体リザーバ１５１４も、複数の別個に制御される電
極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、中容量
流体リザーバ１５１４を形成する。
【０１８０】
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは独特の大きさおよび／または形状となって
いるが、中容量流体リザーバ１５１４も、区分けされたリザーバ電極１５６０、リザーバ
側面電極１５６２、液滴操作電極１５２４、および通路側面電極１５６４を含む。中容量
流体リザーバ１５１４も、開口部１５５０に関連した装填電極１５６６を含む。中容量流
体リザーバ１５１４の区分けされた電極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる
体積の流体を扱う能力）は、図１７の大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したもの
と実質的に同じである。
【０１８１】
一例では、中容量流体リザーバ１５１４は、約８μＬ〜約１００μＬの範囲の体積の流
体を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填電極１５６６は、流体の
意図した最小体積（例えば、約８μＬ）を保持する大きさと形状である。一例では、中容
量流体リザーバ１５１４用の開口部１５５０の直径は、約３ｍｍである。
【０１８２】
図１８の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液
滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側
面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大き
い。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変
移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化
することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０
〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。
一例では、Ｈ２は、約５００〜約１０００μｍ、または約７００〜約９００μｍ、または
約８００μｍであってもよい。
【０１８３】
図１９は、１つの小容量流体リザーバ１５１６を含む底部基板１５００の一部の側面図
および平面図を表している。小容量流体リザーバ１５１６も、複数の別個に制御される電
極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、小容量
流体リザーバ１５１６を形成する。
【０１８４】
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは独特の大きさおよび／または形状となって
いるが、小容量流体リザーバ１５１６も、区分けされたリザーバ電極１５６０、リザーバ
側面電極１５６２、液滴操作電極１５２４、および通路側面電極１５６４を含む。小容量
流体リザーバ１５１６も、開口部１５５０に関連した装填電極１５６６を含む。小容量流
体リザーバ１５１６の区分けされた電極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる
体積の流体を扱う能力）は、図１７の大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したもの
と実質的に同じである。
【０１８５】
一例では、小容量流体リザーバ１５１６は、約６μＬ〜約２０μＬの範囲の体積の流体
を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填電極１５６６は、流体の意
図した最小体積（例えば、約６μＬ）を保持する大きさと形状である。一例では、中容量
流体リザーバ１５１４用の開口部１５５０の直径は、約３ｍｍである。
【０１８６】
図１９の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液
滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側
面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大き
い。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変
移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化
することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０
〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。
一例では、Ｈ２は、約５００〜約１０００μｍ、または約７００〜約９００μｍ、または
約８００μｍであってもよい。
【０１８７】
液滴操作電極１５２４の側面に位置する通路側面電極１５６４は、電気濡れ力を増加さ
せ、電気濡れ領域を増加させることによりリザーバから分配領域まで液体を引く働きをす
る。この例では、液滴操作電極１５２４に関連した通路側面電極１５６４のずれが、液体
が隣接する電極に進行するのを補助する。
【０１８８】
図２０は、１つの回収リザーバ１５１８を含む底部基板１５００の一部の側面図と平面
図を表している。回収リザーバ１５１８は、液滴操作電極１５２４の配列から形成される
。一例では、回収リザーバ１５１８用の開口部１５５０の直径は、約２ｍｍである。図２
０の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液滴操作
電極１５２４に沿って高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面には
段がない。したがって、液滴操作電極１５２４に沿って実質的に均一な間隙高さＨ１があ
る。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または
約３００μｍであってもよい。
【０１８９】
図２１は、１つの一時貯蔵リザーバ１５２０と１つのアダプターリザーバ１５２２とを
含む底部基板１５００の一部の側面図と平面図を表している。一時貯蔵リザーバ１５２０
とアダプターリザーバ１５２２も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当
該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、一時貯蔵リザーバ１５２０とアダ
プターリザーバ１５２２とを形成する。
【０１９０】
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは、独特の大きさおよび／または形状となっ
ているが、一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２も、区分けされ
たリザーバ電極１５６０を含む。この例では、区分けされたリザーバ電極１５６０は、例
えば、Ｔ型、Ｙ型、Ｈ型、および／または他のいずれの形状であってもよいが、電気濡れ
の向上のために、液体が隣接する電極に接触するのを確実にする、または、少なくとも補
助する。一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２の区分けされた電
極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力）は、図１７の
大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したものと実質的に同じである。
【０１９１】
一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２は、約１μＬ
〜約５．５μＬの体積の流体を扱ってもよい。図１７は、アダプターリザーバ１５２２に
関連して、開口部１５５０も示している。一例では、アダプターリザーバ１５２２用の開
口部１５５０の直径は、約２ｍｍである。一時貯蔵リザーバ１５２０についての開口部１
５５０はない。
【０１９２】
図２１の側面図は、頂部基板１５７０と関連した底部基板１５００を示している。液滴
操作電極１５２４に沿って高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面
には段があり、区分けされたリザーバ電極１５６０の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さ
Ｈ１より大きい。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高
さＨ１への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ
電極を活性化することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１
は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであっ
てもよい。一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０でのＨ２は、約５００〜約１０００μｍ
、または約６００〜約７００μｍ、または約６２５μｍであってもよく、アダプターリザ
ーバ１５２２でのＨ２は、約２５０〜約７５０μｍ、または約４００〜約５００μｍ、ま
たは約４２５μｍであってもよい。
【０１９３】
図１５〜２１に関して、開口部１５５０を供給するアクチュエーター外の流体リザーバ
（図示せず）は、底部基板１５００に関連する頂部基板に組み込まれてもよい。したがっ
て、アクチュエーター外の流体リザーバは、これらに限定されないが、大容量流体リザー
バ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ１５１６、回収リザーバ
１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダプターリザーバ１５２２等のアクチュ
エーターの流体リザーバと組み合わせて用いられる。
【０１９４】
他の実施形態では、電気濡れ装置の液滴操作間隙での液滴操作を実行する方法が提供さ
れる。本発明の方法は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）（東京、旭硝子社から入手可能）等のア
モルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域を有する装置を供給する工程、分配領
域で有機溶媒を分配する工程、およびＣＹＴＯＰ（登録商標）で被覆されていない領域に
有機溶媒を輸送する工程を含む。ＣＹＴＯＰ（登録商標）で被覆されていない領域は、例
えば、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、DuPont社から入手可能なTEFLON（登録商標
）コーティング）等のフッ化炭素で被覆されていてもよい。有機溶媒は、いずれの有機溶
媒でもよいが、好適には極性プロトン性溶媒である。一の実施形態では、溶媒は、アルコ
ールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、１〜８の炭素、また
は１〜６の炭素を有するアルコールおよび／またはカルボン酸である。アルコールおよび
／またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノー
ル、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノ
ール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。
【０１９５】
２つの基板は、当該２つの基板間に液滴操作間隙を開けたままにするいずれの方法で共
に結合されていてもよい。通常、液滴操作間隙は、周囲がシールされるが、これは常に必
要ではない。間隙の開口部は、液体を導入または移動するのに有用となり得る。例えば、
基板は機械的に結合されてもよく、液滴操作間隙は、ガスケットで周囲をシールされても
よい。液滴操作間隙の結合とシールは、例えば、接着材料を用いて達成されてもよい。Ｐ
ＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてプラスチック頂部基板に結
合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてアクリ
ル頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタ
ンメタクリレートポリマーを用いてプラスチック頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基
板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてアクリル頂部基板に結
合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタンメタクリレー
トポリマーを用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。ウレタンメタクリレートポリ
マーは、例えば、ＵＶ硬化性接着剤のPERMABOND（登録商標）UV648またはUV632を含む。
ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてガラス頂部基
板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするＵＶ硬化性エポ
キシ樹脂系ポリマーを用いてガラス頂部基板に結合されてもよい。好ましいＵＶ硬化性エ
ポキシ樹脂系ポリマーの例は、NJ、Hackensack、Master Bond社から入手可能な当該ポリ
マー（例えば、MASTER BOND（登録商標）UV15x−5）を含む。ポリマーの接着剤を用いる
場合、ポリマーは、底部基板または頂部基板の周囲のビードラインに堆積され、その後、
他の表面（ＰＣＢまたはプラスチック）の位置決めがされてもよい。ＵＶ硬化性ポリマー
は、次いで、ＵＶ硬化のためにＵＶ光に露光されてもよい。いくつかの実施形態では、接
着剤が、底部基板と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は
、シリコーンオイル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。
【０１９６】
他の実施形態では、頂部基板と底部基板は、アクリル接着剤等の接着剤で被覆されたテ
ープ等の接着テープで結合される。接着テープは、液滴操作間隙の周囲の一部または全て
をシールするのに好適な形状にカットされてもよい。好適な接着テープの例は、布テープ
、ポリエチレン発泡テープ、ウレタンテープ、紙テープ、ポリエステルテープ、ティシュ
ーテープ、およびビニルテープを含む。好ましい例は、３Ｍ（商標）300LSE接着剤の接着
剤転写テープ、：9453FL、9471FL、9472FL、；および３Ｍ（商標）ＶＨＢ（商標）テープ
を含む。これらのおよび他の好適なテープは、TN、Nashville、Can-Do National Tape社
および他の供給業者から入手可能である。いくつかの実施形態では、テープが、底部基板
と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は、シリコーンオイ
ル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。
【０１９７】
一の実施形態では、ＰＣＢ材料で作られた底部基板は、例えば、プラスチック頂部基板
に、PERMABOND（登録商標）UV648ＵＶ硬化性接着剤等のウレタンメタクリレートポリマー
を用いて結合されて、構造を形成してもよい。ポリマーは、底部基板または頂部基板の周
囲のビードラインに堆積され、その後、他の表面（ＰＣＢまたはプラスチック）の位置決
めおよびＵＶ硬化がされてもよい。他の実施形態では、ウレタンメタクリレートポリマー
は、底部基板と頂部基板との間に筺体を形成し、当該筺体はシリコーンオイル等のオイル
を含んでいてもよい。他の実施形態では、当該構造は、さらに基板の１つ以上の表面上に
電極を含み、電気濡れ媒介液滴操作および／または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を
実行するために配置されている。さらに他の実施形態では、当該構造は、微小流体装置を
含む。
【０１９８】
本発明者らは、有機溶媒洗浄液滴は、液滴アクチュエーターで電気濡れ分配技術等を用
いて確実に分配することが困難であることを発見した。斯かる分配を向上させる溶液は、
本明細書に記載の充填流体配合および洗浄液滴配合である。充填流体配合溶液および液滴
配合溶液と別個にまたは一緒に用いてもよい他の溶液は、有機溶媒がＣＹＴＯＰ（登録商
標）コーティング（東京、旭硝子社から入手可能）等のアモルファスフルオロポリマーで
被覆された表面により確実に分散するという発見に起因する。一の実施形態では、分配の
間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面（例えば、液滴分配領域の液滴操作間隙
に面した頂部基板および／または底部基板の表面）は、アモルファスフルオロポリマーで
被覆される一方、他の領域は非フルオロポリマーコーティングで被覆される。他の実施形
態では、分配の間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面は、ＣＹＴＯＰ（登録商
標）フルオロポリマーコーティングで被覆される一方、他の領域は別のフルオロポリマー
コーティングで被覆される。同様に、本発明は、アモルファスフルオロポリマーで被覆さ
れた分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配され
た有機溶媒液滴をアモルファスフルオロポリマーで被覆されていない領域に輸送する工程
を含む。同様に、本発明は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被
覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配
された有機溶媒液滴をＣＹＴＯＰ（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被覆され
ていない領域に輸送する工程を含む。同様に、本発明は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）アモル
ファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴
を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をTEFLON（登録商標）アモルファスフル
オロポリマーで被覆された領域に輸送する工程を含む。TEFLON（登録商標）ポリテトラフ
ルオロエチレンコーティングは、DE、Wilmington、E. I. DuPont de Nemours & Co社から
入手可能である。
【０１９９】
７．４  磁石配列
液滴アクチュエーターは、磁石の配列を含んでもよく、または磁石の配列と結合されて
いてもよい。例えば、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に取り付けられてもよく、
液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に収まるように設計され、当該デッキは、液滴ア
クチュエーターのいくつかの処理ゾーン内で温度を制御するための（ｉ）磁石および、（
ｉｉ）ヒートシンクのヒーター等の温度制御装置、等の追加の機構を収容する。磁石は、
液滴アクチュエーターで磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液
滴アクチュエーターで液滴操作にかけられる液滴の磁気応答性ビーズの固定のために用い
られてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターアセンブリの頂部基板に形成されたリザー
バ等の液滴アクチュエーターのリザーバ内で磁気応答性ビーズの固定のために用いられて
もよい。磁石を用いて、ビーズ洗浄工程の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手
順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよ
い。磁石を用いて、娘液滴の１つにおける全てのまたは実質的に全てのビーズを保持する
ための液滴分割操作の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工
程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明は、可動式磁石を提供する。一例では、可動式磁石は
、サンプル濃縮の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定を確実にするように位置さ
れてもよい。サンプル濃縮は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われても
よい。サンプル濃縮は、一連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。他の例では
、可動式磁石は、酵素反応間のビーズ洗浄の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定
を確実にするように位置されてもよい。他の例では、可動式磁石は、処理核酸の溶離後の
ビーズ除去の間に、ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。液滴操
作（電気濡れプログラム）のシークエンス、温度制御、および磁石位置は、例えば、調整
可能なソフトウェアおよびプログラム可能なソフトウェアインターフェースを用いてプロ
グラムされてもよい。
【０２０１】
一例では、装置デッキは、液滴アクチュエーターの所定の処理ゾーンにそろって位置し
ている１つ以上の可動式磁石配列（例えば、Halbach配列）および１つ以上のヒーターア
センブリ（例えば、加熱棒）と同様に、電極の活性と非活性を制御するための電気的接続
、および液滴アクチュエーターの他の電気的機能（例えば、センサー）も含んでいてもよ
い。この例は、図２２Ａ、２２Ｂ、および２３を参照して記載されている。
【０２０２】
図２２Ａおよび２２Ｂは、磁石アクチュエーター２２００の斜視図を表している。磁石
アクチュエーター２２００は、フレーム構造２２１０を含んでいてもよく、当該フレーム
構造は、立方体磁石２２１４のセットを保持するためにフレーム構造に設置されたスライ
ド可能なプレート２２１２を有する。ソレノイド２２１６が、フレーム構造２２１０に固
定される。フレーム構造２２１０に対するスライド可能なプレート２２１２の位置が、ソ
レノイド２２１６で制御される。すなわち、ソレノイド２２１６のアクチュエーターが、
スライド可能なプレート２２１２の一部に対して圧力をかけ、立方体磁石２２１４をフレ
ーム構造２２１０に対して動かす。スライド可能なプレート２２１２および立方体磁石２
２１４の直線的な運動を制御するために、調整可能なネジ２２１８のセット等の所定の機
構が提供されてもよい。スライド可能なプレート２１２２は、溝形状およびスロット形状
等のフレーム２２１０構成要素と組み合わされてもよく、本明細書に記載の機能を達成す
るためにプレート２１２２の動きが特定の範囲に制約される。
【０２０３】
操作では、スライド可能なプレート２２１２上の立方体磁石２２１４は、液滴アクチュ
エーター２２２０等の液滴アクチュエーターに近接して位置している。ソレノイド２２１
６は、立方体磁石２２１４を液滴アクチュエーターの表面に近づけるまたは遠ざけるため
に用いられる。図２２Ａは、非通電状態のソレノイド２２１６および、液滴アクチュエー
ター２２２０に関して非係合状態の立方体磁石２２１４を有するスライド可能なプレート
２２１２を示している。図２２Ｂは、通電状態のソレノイド２２１６および、液滴アクチ
ュエーター２２２０に関して係合状態の立方体磁石２２１４を有するスライド可能なプレ
ート２２１２を示している。
【０２０４】
図２３は、１つ以上の磁石アクチュエーターおよび１つ以上のヒーター機構を保持する
ための機械的固定具２３００の一例の平面図を表している。機械的固定具２３００は、核
酸ライブラリーの構築のための液滴アクチュエーターでの核酸の処理での使用に好適であ
る。一例では、機械的固定具２３００は、立方体磁石２２１４ａのライン（line)を含む
磁石アクチュエーター２２００ａおよび立方体磁石２２１４ｂのラインを含む磁石アクチ
ュエーター２２００ｂ等の２つの磁石アクチュエーター２２００を含む。立方体磁石２２
１４の各セットまたは各ラインは、例えば、図２４Ａ、２４Ｂ、２５Ａ、および２５Ｂに
関して記載したように、Halbach配列であってもよい。立方体磁石２２１４は、磁石アク
チュエーター２２００の動作で液滴アクチュエーター（図示せず）に接近してまたは近傍
から離れて移動されてもよい。一例では、立方体磁石２２１４は、２．２５ｍｍの立方体
磁石であってもよい。他の例では、立方体磁石２２１４は、４．５ｍｍの立方体磁石であ
ってもよい。
【０２０５】
機械的固定具２３００は、ヒーター２３１０ａ〜２３１０ｄ等の１つ以上のヒーター２
３１０を含んでいてもよい。ヒーター２３１０は、例えば、加熱棒であってもよい。ヒー
ター２３１０を用いて、液滴アクチュエーターの指定温度制御ゾーン内の温度を制御して
もよい。例えば、一の温度制御ゾーンは、Ａ−ｔａｉｌ化反応のために３７℃を提供して
もよく、または、３−温度ＰＣＲの実行のために適切な温度を提供してもよい。コントロ
ーラー（図示せず）を用いて、ヒーター２３１０の出力温度を制御してもよい。
【０２０６】
他の実施形態では、機械的固定具２３００は、（ｉ）ヒートシンク、または、（ｉｉ）
ペルチェ素子等の熱電冷却装置、等の冷却装置を含んでいてもよい。冷却装置は、周囲の
温度よりも低い液滴アクチュエーターの領域の温度を維持するのに用いられてもよい。冷
却装置は、液滴アクチュエーターの他の領域の加熱の間、液滴アクチュエーターのある領
域が過熱するのを防ぐために用いられてもよい。ヒーターと冷却装置とを組み合わせて用
いることで、３−温度ＰＣＲ反応の実行等の液滴アクチュエーターでの所望の温度プロフ
ィールが達成され得る。コントローラー（図示せず）を用いて、ヒーター２３１０および
ペルチェ素子を制御してもよい。
【０２０７】
図２３は、アセンブリ上で液滴アクチュエーターを所定位置に保持するためのクリップ
２３２０も示している。操作の間、液滴アクチュエーターアセンブリを傷つけることなく
、または操作を他に妨げることなく、液滴アクチュエーターアセンブリをしっかりと所定
位置に保持するように配置されている限りは、いずれの種類の拘束要素でも適用可能であ
る。
【０２０８】
磁石を配置して、液滴アクチュエーターのビーズの固定が要求されている領域で磁場を
補強してもよい。磁石を配置して、液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨
げる領域の磁場を取り消してもまたは消滅させてもよい。磁石を配置して、流束分布を作
り出し、液滴アクチュエーター内のビーズの固定が要求されている領域で磁場を補強し、
そして液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨げる領域の磁場を消滅させて
もよい。
【０２０９】
図２４Ａおよび２４Ｂは、Halbach磁石配列２４００の一例の斜視図を表している。図
２４Ａに関して一例では、Halbach磁石配列２４００は、立方体磁石２４１０ａ〜２４１
０ｅ等の複数の立方体磁石２４１０を含んでいてもよい。各立方体磁石２４１０の磁場の
方向が、矢印で示されている。立方体磁石２４１０の配列は、当該配列の一方の側面で磁
場が強められるのに対して、配列の他の側面では磁場がほぼゼロにまで取り消されるもの
である。配列は、任意の回数繰り返されて、任意の長さの磁石配列を提供してもよい。
【０２１０】
図２４Ｂは、集束磁石２４１２として役立つ１つ以上のポストを有するHalbach磁石配
列２４００を表している。集束磁石２４１２は、Halbach磁石配列２４００の特定の位置
に磁場をさらに集束させるために用いられる。例えば、Halbach磁石配列２４００は、集
束磁石２４１２ａおよび２４１２ｂを含む。また、各集束磁石２４１２の磁場の方向が、
矢印で示されている。
【０２１１】
図２５Ａおよび２５Ｂは、例えば、図２４Ａおよび２４ＢのHalbach磁石配列２４００
の、液滴アクチュエーター２５００の電極に対する磁場の関係を表している。液滴アクチ
ュエーター２５００は、間隙２５１４で分離された底部基板２５１０および頂部基板２５
１２を含んでいてもよい。底部基板２５１０は、液滴操作電極２５１６（例えば、電気濡
れ電極）の通路または配列等の電極配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面
上の液滴操作電極２５１６頂部で行われる。
【０２１２】
この例では、Halbach磁石配列２４００は、液滴アクチュエーター２５００の下に位置
している。Halbach磁石配列２４００は、複数の立方体磁石２４１０ａ〜２４１０ｎを含
んでいてもよい。図２５Ａおよび２５Ｂで、立方体磁石２４１０で作られる磁力線は、Ha
lbach磁石配列２４００および液滴アクチュエーター２５００の頂部にかぶせて表現され
ている。立方体磁石２４１０は、例えば、４．５ｍｍ立方体磁石であってもよい。
【０２１３】
図２５Ａおよび２５Ｂの磁力線は、磁場が一つおきの立方体磁石２４１０（例えば、立
方体磁石２４１０ａ、２４１０ｃ、２４１０ｅ、２４１０ｇ、２４１０ｉ、２４１０ｋ、
２４１０ｍ）に集中していることを示している。好ましい実施形態では、これらの集中し
た磁場領域が、例えば、４．５ｍｍ立方体磁石２４１０について約４．５ｍｍピッチで配
置されている周期的な電極レーンに実質的にそろっている。この例では、集中した磁場領
域が、約９ｍｍごとにある。他の例では、２．２５ｍｍ立方体磁石２４１０が用いられる
場合、集中した磁場領域は、約４．５ｍｍごとにある。
【０２１４】
図２６Ａおよび２６Ｂは、図２４Ａおよび２４ＢのHalbach磁石配列２４００に関連し
た図２５Ａおよび２５Ｂの液滴アクチュエーター２５００の他の図（すなわち、平面図）
を表している。例えば、図２６Ａおよび２６Ｂは、液滴操作電極２５１６のいくつかのラ
インに関連したHalbach磁石配列２４００の立方体磁石２４１０を示している。図２６Ａ
は、集束磁石２４１２がないHalbach磁石配列２４００を示す一方、図２６Ｂは、集束磁
石２４１２があるHalbach磁石配列２４００を示す。Halbach磁石配列２４００の配列は、
立方体磁石２４１０の中央が液滴操作電極２５１６のラインにほぼ位置する配列である。
一の用途では、Halbach磁石配列２４００は、サンプル濃縮の間等、所定の処理工程の間
に、磁気応答性ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されている。サンプル濃縮
は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われてもよい。サンプル濃縮は、一
連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。サンプル濃縮方法の一例が図２７に関
して記載される。
【０２１５】
図２７は、液滴アクチュエーターでのサンプル濃縮の方法２７００のフローチャートを
表している。例えば、方法２７００は、図２２Ａ、２２Ｂ、および２３の１つ以上の磁石
アクチュエーター２２００を利用して、液滴アクチュエーターに関連した可動式磁石を提
供してもよい。方法２７００は、アクチュエーター外で上限５０μＬのサンプル体積から
始め、当該サンプルは、約５０〜１００ナノグラムの核酸を含む。次いで、アクチュエー
ター外で、サンプルは、結合バッファー溶液（５０μＬ）中のビーズと混合される。その
結果、１００μＬの流体が、次いで、アクチュエーター外で一定時間（例えば、約１０分
間）保温される。保温期間後に、その１００μＬの流体は、液滴アクチュエーターに装填
される。次いで、磁石（例えば、１つ以上の磁石アクチュエーター２２００の立方体磁石
２２１４）がサンプル流体に近接するように移動される。結果として、実質的に全てのビ
ーズが、１００μＬのサンプル流体から引き抜かれ、立方体磁石２２１４の磁場内に濃縮
される。ビーズは、次いで、洗浄され、溶離される。核酸が溶離され、液滴がビーズをス
ナップオフしてもよい。バッファー液滴を用いて、ビーズを回収し、ビーズを、例えば、
廃棄リザーバまたは電極配列の未使用の領域に除去してもよい。
【０２１６】
７．５  液滴アクチュエーターと共に使用するローラーアセンブリ
本発明のローラーアセンブリは、磁石およびヒーター等の液滴アクチュエーターに関連
した有用な所定の構成を収納する装置デッキ上に収まるように設計されている。本発明の
液滴アクチュエーターは、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に応用
され得るので、異なるライブラリー構築手順のために、装置構成の異なる配列が要求され
得る。
【０２１７】
図２８Ａ〜２８Ｄは、液滴アクチュエーターに関連した有用な他の構成の配列を含むロ
ーラーアセンブリ２８００の側面図および断面図を表している。図２８Ａに関して、ロー
ラーアセンブリ２８００は、ローラー本体２８１０を含んでいてもよい。ローラー本体２
８１０は、例えば、円筒状の形状であってもよい。ローラー本体２８１０は、取り付け棒
（または軸）２８１２で装置（図示せず）に接続されていてもよい。ローラーアセンブリ
２８００の回転（例えば、時計回りまたは反時計回り）は、ステッピングモーター等のモ
ーター（図示せず）で制御されてもよい。図２８Ａおよび２８Ｂに関して、ローラー本体
２８１０は、スロット２８１４ａ〜２８１４ｄ等の１つ以上のスロット２８１４を含んで
いてもよく、当該スロットは、これらに限定されないが、磁石、温度制御装置、および超
音波処理装置等の１つ以上の構成を含んでいてもよい。一の実施形態では、磁石２８１６
ａ〜２８１６ｄは、スロット２８１４ａ〜２８１４ｄに、それぞれ位置されてもよい。各
磁石２８１６は、永久磁石または電磁石であってもよい。一例では、各磁石２８１６は、
棒磁石であってもよい。他の例では、各磁石２８１６は、複数のより小さい磁石（図示せ
ず）であってもよい。他の例では、磁石２８１６は、異なる磁気の強さを有していてもよ
い。単一のローラーアセンブリ２８００は、異なる磁石、異なる磁気の強さ、異なる磁石
の配列等を有する複数の磁石のセットを含んでいてもよい。
【０２１８】
図２８Ｃおよび２８Ｄに関して、ローラーアセンブリ２８００は、液滴アクチュエータ
ー２８１８に近接して位置されてもよい。液滴アクチュエーター２８１８は、底部基板２
８２０を含んでいてもよい。底部基板２８２０は、液滴操作電極２８２２（例えば、電気
濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２８
２２頂部で行われる。一例では、ローラーアセンブリ２８００は、スロット２８１４ａお
よび磁石２８１６ａが所定の液滴操作電極２８２２にそろうように位置されてもよい。
【０２１９】
操作では、磁気応答性ビーズ２８２６を含む液滴２８２４は、所定の液滴操作電極２８
２２上に位置して、ローラーアセンブリ２８００の磁石２８１６ａにそろってもよい。磁
石２８１６ａの磁力のため、磁気応答性ビーズ２８２６は、液滴操作電極２８２２の表面
に保持される。ローラーアセンブリ２８００は、磁石２８１６ａが液滴２８２４から離れ
て移動されるように、例えば、反時計回りに回転されてもよい。ローラーアセンブリ２８
００および磁石２８１６ａが回転して液滴２８２４から離れるので、磁石２８１６ａの磁
力の低減のため、磁気応答性ビーズ２８２６は液滴２８２４内で再び懸濁される。一例で
は、ローラーアセンブリ２８００は、液滴２８２４が磁石２８１６ａおよび２８１６ｂの
間に位置するように回転および停止されてもよい。この位置では、液滴２８２４は、磁石
２８１６ａおよび２８１６ｂの磁場の外にあってもよい（すなわち、磁石２８１６ａおよ
び２８１６ｂの磁場が、基本的に「遮断」されている）。
【０２２０】
他の実施形態では、スロット２８１４内の１つ以上の磁石２８１６は、いくつかの反応
ゾーンおよび／または洗浄ゾーン内の温度を制御するために、ヒーターアセンブリまたは
冷却アセンブリ（例えば、熱電冷却器またはペルチェ素子）に置換されてもよい。他の実
施形態では、スロット２８１４内の１つ以上の磁石２８１６は、細胞分裂および核酸せん
断に用いられる音波処理器等の超音波処理装置に置換されてもよい。他の実施形態では、
磁石、ヒーター、冷却器、音波処理器、および他の構成の任意の組み合わせが、ローラー
アセンブリ２８００内で用いられてもよい。ローラーアセンブリ２８００の回転により、
様々な構成が所定の液滴操作領域に関する位置に対して近づけられ、および離れされ得る
ため、液滴アクチュエーター上の同じ領域が、デジタル微小流体検査で複数の異なる処理
に用いられてもよい。他の実施形態では、異なるローラーアセンブリ２８００が、特定の
検査要求および／またはアクチュエーターサイズおよび構造に適合する特殊化した構成配
列に提供されてもよい。ローラーアセンブリ２８００は、一のローラーアセンブリ２８０
０が、装置から容易に除去され、当該装置に異なるローラーアセンブリ２８００が容易に
挿入されるように設計されていてもよい。
【０２２１】
７．６  廃棄液滴の処分
図２９Ａおよび２９Ｂは、それぞれ、液滴アクチュエーター２９００の一部の一例の平
面図および断面図を表し、液滴を投棄して廃棄する方法を示している。液滴アクチュエー
ター２９００は、間隙２９１４で分離された底部基板２９１０および頂部基板２９１２を
含んでいてもよい。間隙２９１４は、高さｈ１を有する。底部基板２９１０は、例えば、
ＰＣＢであってもよい。頂部基板２９１２は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、
ケイ素、および／またはＩＴＯから作られていてもよい。液滴アクチュエーター２９００
は、液滴操作電極２９１６（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操
作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２９１６頂部で行われる。
【０２２２】
本発明の一態様は、頂部基板および／または底部基板に、および液滴操作電極に隣接し
て、液滴を投棄するための陥凹エリアを含む。一例では、図２９Ａおよび２９Ｂは、陥凹
エリア２９１８をさらに含む頂部基板２９１２を示している。陥凹エリア２９１８で作ら
れる底部基板２９１０と頂部基板２９１２との間の空洞は、高さｈ２を有し、間隙２９１
４の高さｈ１より大きい。配列は、より大きい間隙高さの領域でよりエネルギー的に安定
なコンホメーションへの液滴の変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が陥凹
エリアに入るように構成されていてもよい。
【０２２３】
操作では、いくつかの液滴操作電極２９１６の電源がオンである限り、液滴は電極通路
にとどまる。しかしながら、電源がオンになっている液滴操作電極２９１６がない場合、
液滴にとってエネルギー的に安定な位置は、隣接する陥凹エリアにある。すなわち、毛管
力のために液滴は、この空間に引き込まれる。したがって、液滴は、もはや不要の場合は
、電極通路から投棄され得る。
【０２２４】
例として、図２９Ａおよび２９Ｂは、電極が電源オンになっているときに、所定の液滴
操作電極２９１６頂部に位置している所定の液滴２９２０を示している。図２９Ａおよび
２９Ｂは、通路から投棄され、陥凹エリア２９１８にある液滴２９２２も示している。
【０２２５】
陥凹エリア２９１８の形状は、例えば、階段状またはスロープ状であってもよく、当該
形状が、投棄された液滴が電極通路に干渉しないように、投棄された液滴が電極通路から
十分に離れた位置に保持されるのを補助する。同様に、液滴が容易に陥凹領域に移動し過
ぎる場合、液滴移動を遅くするために、頂部基板および／または底部基板に突起部または
障害物が含まれていてもよい。活性化された電極の存在下では液滴を電極通路に保持する
が、移動の結果として、液滴が陥凹領域に入り得るどのような移行領域であっても適用可
能である。
【０２２６】
図３０は、図２９Ａおよび２９Ｂの液滴アクチュエーター２９００の他の実施形態の断
面図を表している。この実施形態では、陥凹エリア２９１８が開口している（例えば、頂
部基板２９１２の開口部２９３０）。図３０は、液滴アクチュエーター２９００内の充填
流体２９３２も示している。頂部基板２９１２内に開口部２９３０が存在するため、液滴
は、毛管誘電泳動または他の処理のために、例えば、ピペットで、または他の装置もしく
はこの装置の一部に、回収され得る。
【０２２７】
７．７  ＰＣＲ増幅および高分解能融解（ＨＲＭ）分析
１つ以上の目的遺伝子内でのシークエンスバリエーション（例えば、単一ヌクレオチド
多型、ヌクレオチド反復多型、突然変異走査、および核酸メチル化の評価）の検出のため
に、ＨＲＭ分析は、ＰＣＲ増幅と組み合わせて用いられてもよい。ＰＣＲアンプリコンは
、飽和核酸挿入蛍光染料、５’−標識されたプライマー、または標識されたプローブを用
いて、増幅の間、蛍光標識されてもよい。様々な実施形態で、本発明は、液滴アクチュエ
ーター系サンプル調製および同じ液滴アクチュエーターでのシークエンスバリエーション
の検出をも提供する。
【０２２８】
一の実施形態では、本発明の液滴アクチュエーター装置および方法は、（ｉ）核酸の調
製、（ｉｉ）ターゲットＰＣＲ増幅および（ｉｉｉ）脆弱Ｘ症候群の遺伝子型決定をする
ためのＨＲＭ分析、に用いられてもよい。
【０２２９】
目的遺伝子内のシークエンスバリエーション（例えば、多型、突然変異、およびメチル
化）の検出用のデジタル微小流体手順は、ターゲットシークエンスのＰＣＲ増幅と、単一
の液滴アクチュエーターでのターゲットアンプリコンの高分解能溶融（ＨＲＭ）分析とを
組み合わせる。ＨＲＭ分析は、目的遺伝子の二本鎖ターゲットシークエンス（すなわち、
アンプリコン）についての核酸溶融温度の物理的特性に基づいている。生物体の各遺伝子
（個々の）は、通常、２つ（またはそれ以上）のコピー、すなわち、２つの対立遺伝子が
存在する。対立遺伝子は、同一、すなわち同型接合性であってもよく、または異なって、
すなわち異型接合性であってもよい。核酸サンプルの増幅の間、両方の対立遺伝子が増幅
される。増幅された核酸は、変性され、ＰＣＲ後にＨＲＭ分析のために冷却されるので、
アニールされた二本鎖アンプリコンの異なる組み合わせが形成され得る。同型接合性サン
プルは、ホモ二本鎖となる。シークエンスの組成の違いのため、異なる同型接合性サンプ
ルは、異なる溶融曲線をもたらす異なる変性温度を有する。異型接合性サンプルは、２つ
の異なる対立遺伝子を含み、２つの異なる対立遺伝子はホモ二本鎖（すなわち、２つのホ
モ二本鎖生成物）とヘテロ二本鎖（すなわち、２つのヘテロ二本鎖生成物）の両方を形成
する。ヘテロ二本鎖は、核酸の非相補鎖のアニーリングから生じ、核酸の非相補鎖は、例
えば、サンプルの急冷の間に形成する。ヘテロ二本鎖内の誤対合領域のため、二本鎖アン
プリコンは不安定であり、そのため、低温で解離する。低い溶融温度は、異なる溶融曲線
プロフィールを作成する。異なる溶融曲線プロフィールが作成されるため、異型接合性サ
ンプルは、同型接合性サンプルから区別され得る。
【０２３０】
デジタル微小流体手順では、急速なＰＣＲ熱サイクルが、各サイクルで反応液滴がオイ
ルが充填された液滴アクチュエーター内の異なる温度ゾーン間を循環的に輸送されるフォ
ーマットを経たフローで行われてもよい。ＰＣＲ反応のモニターと続くＨＲＭ分析のため
に、ターゲットアンプリコンへの蛍光標識の組み込みを用いてもよい。一の実施形態では
、ターゲットアンプリコンは、LCGreen（UT、Salt Lake City、 Idaho Technology社から
入手可能）、EvaGreen（CA、Hayward、Biotium社から入手可能）、またはSYTO 9（CA、Ca
rlsbad、Life Technology社のInvitrogen（商標）から入手可能）等の飽和二本鎖核酸挿
入染料を用いたＰＣＲ増幅の間、蛍光標識されてもよい。他の実施形態では、５−蛍光標
識されたプライマーを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。他の実施形態で
は、蛍光標識されたプローブを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。最適な
循環パラメーターと試薬濃度とを含む確立されたＰＣＲ手順が、各目的遺伝子のために選
択されてもよく、当該試薬は、Ｔａｑポリメラーゼ、バッファーおよびプライマー（順方
法のプライマーと逆方向のプライマー）を含む。例えば、順方法のプライマーと逆方向の
プライマーのシークエンスおよび長さを選択して、対立遺伝子の正確な識別に十分な長さ
のアンプリコンを作製してもよい。各プライマーの濃度、プライマーアニーリング温度お
よびマグネシウム濃度を選択して、高収率での目的遺伝子の特有の増幅を提供してもよい
。アニーリング時間／延長時間および熱サイクルの数を選択して、高品質アンプリコンと
ＰＣＲ−ＨＲＭ一体手順での迅速な処理能力を提供してもよい。
【０２３１】
対立遺伝子識別のための確立されたＨＲＭ手順は、液滴アクチュエーター１，２での使
用に応用されてもよい。例えば、ＨＲＭ分析の前に、増幅された核酸は、通常、ヘテロ二
本鎖形成を高めるように選択された変性およびアニーリングの最終ラウンドにかけられる
。変性と冷却の速度は、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されてもよい。一例で
は、より高い加熱速度（例えば、０．４℃／秒）および急速な冷却速度（例えば、約０．
１℃／秒より大きく、約５℃／秒未満）を選択して、対立遺伝子のより正確な識別のため
のより多くのヘテロ二本鎖を作製してもよい。他の例では、アニーリングバッファーのイ
オン強度（例えば、低イオン強度）が、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されて
もよい。直接溶融、すなわち、選択した温度遷移速度（例えば、０．０５℃／秒）での約
５０℃〜約９５℃の核酸アンプリコンの正確な加温を用いて、最終ＨＲＭ分析が、二本鎖
核酸アンプリコンについて行われてもよい。
【０２３２】
７．８  液滴分配電極構成
図３１は、電極配列３１００の一例の一部の平面図および２倍液滴分配のためのリザー
バ分配シークエンスを表している。電極配列３１００は、（流体リザーバの）分配電極３
１１０を含んでいてもよく、当該分配電極は、複数の別個に制御される電極に区分けされ
ている。例えば、分配電極３１１０の中心に沿って、区分けされたリザーバ電極３１１２
Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄがあってもよい。より小さなリザーバ側
面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、および３１１４Ｄが、区分けされたリザー
バ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄの一方の側面に配置され
ていてもよい。より小さなリザーバ側面電極３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、３１１４ＣＣ
、および３１１４ＤＤが、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２
Ｃ、および３１１２Ｄの他の側面に配置されていてもよい。分配電極３１１０の区分けさ
れたリザーバ電極３１１２Ｄは、液滴操作電極（例えば、電気濡れ電極）の通路、ライン
、および／または配列に関連して配置されている；以降、通路電極３１１６という。加え
て、通路側面電極３１１８Ａが、通路電極３１１６の一方の側面に配置されてもよく、一
方、通路側面電極３１１８Ｂが、通路電極３１１６の他の側面に配置されてもよい。液滴
操作は、液滴操作表面上のこれら様々な電極頂部で行われる。複数の別個に制御される電
極を含む分配電極３１１０は、複雑な液滴混合操作および／または液滴分配操作を行うよ
う設計された流体リザーバを支持する。
【０２３３】
本発明の区分けされた分配電極３１１０の一態様は、リザーバが十分に充填されていな
いとき、様々な大きさの液滴を分配するために、流体のより小さな体積が、分配電極３１
１０の分配末端に移動され得るというものである。加えて、通路電極３１１６の側面にあ
る通路側面電極３１１８は、活性化されて、分配電極３１１０の液体を引き抜き、電極通
路上に移すのを補助してもよい。次いで、通路側面電極３１１８が非活性化され、次いで
、通路上の中間電極が非活性化され、分配された液滴を生成する。リザーバ分配シークエ
ンスの例が、図３１、３２、および３３を参照して示されている。
【０２３４】
再び図３１に関して、２倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一例は、これ
らに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
【０２３５】
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ
、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１
１２Ｄが活性化される；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性
化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極３１１０の分配末端
に引かれ得る。分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６のラインに最も近い端
である。
【０２３６】
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３
１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けさ
れたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１
１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの４つの通
路電極３１１６が活性化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化
される。結果として、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン
上に引かれ得る。
【０２３７】
工程３では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３
１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けさ
れたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１
１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。ラインの初めの４つの通路電極３
１１６が活性化されたままである。通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活
性化されたままである。加えて、ラインの隣（５番目）の通路電極３１１６が、活性化さ
れ、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれる。
【０２３８】
工程４では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザー
バ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化され
る；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされた
リザーバ電極３１１２Ｄおよび５つの通路電極３１１６のみが活性化されたままである。
これにより、所定体積の流体が、５つの通路電極３１１６のラインに沿って、分配電極３
１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
【０２３９】
工程５では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される
；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活
性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そ
して、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化さ
れる。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが、非活性化されたままである
。さらに、ラインの３番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対し、１番目、２番
目、４番目、および５番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極
３１１６の１つが電源オフになり、２倍液滴（図示せず）が例えば、４番目と５番目の通
路電極３１１６頂部に残されるため、結果として、液滴分割操作が起こる。
【０２４０】
図３２は、図３１の電極配列３１００の平面図および１倍液滴を分配するためのリザー
バ分配シークエンスを表している。１倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一
例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
【０２４１】
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ
、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１
１２Ｄが活性化される；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性
化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極３１１０の分配末端
に引かれ得る。分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６のラインに最も近い端
である。
【０２４２】
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３
１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けさ
れたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１
１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの４つの通
路電極３１１６が活性化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化
される。さらに、ラインの５番目の通路電極３１１６が非活性化される。結果として、所
定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれ得る。
【０２４３】
工程３では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザー
バ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化され
る；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされた
リザーバ電極３１１２Ｄおよび５つの通路電極３１１６のうち初めの４つのみが活性化さ
れたままである。これにより、４つの通路電極３１１６のラインに沿って、所定体積の流
体が、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
【０２４４】
工程４では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される
；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活
性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そ
して、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化さ
れる。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが、非活性化される。ラインの
１番目、２番目、および４番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。さらに、
ラインの３番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対し、ラインの１番目、２番目
、および４番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極３１１６の
２つが電源オフになり、１倍液滴（図示せず）が例えば、４番目の通路電極３１１６頂部
に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。
【０２４５】
図３３は、図３１の電極配列３１００の他の実施形態の平面図および１倍液滴を分配す
るための他のリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列３１００のこの実施形態
では、示したように、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの大きさと、分配電極３
１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに関連した通路電極３１１６の位置が、若
干変更されている。より詳細には、通路電極３１１６に関連した通路側面電極３１１８Ａ
および３１１８Ｂのずれが、液体が隣接する電極に進行するのを補助する。すなわち、１
倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスの他の例は、これらに限定されないが
、以下の工程を含んでいてもよい。
【０２４６】
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される
；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活
性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃ、３１１２Ｄが活性化される；そして
、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化される
。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが非活性化される。さらに、通路電
極３１１６が非活性化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極
３１１０の分配末端に引かれ得て、分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６の
ラインに最も近い端である。
【０２４７】
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ
、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１
１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４
ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの２つの通路電極３１１６が活性
化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化される。結果として、
所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれ得る。
【０２４８】
工程３では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが
非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３
１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；そして、
区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである。リザーバ側面電極３１
１４Ｄおよび３１１４ＤＤが今度は非活性化される。加えて、今度はラインの初めの３つ
の通路電極３１１６が活性化される。これにより、流体（図示せず）が、通路電極３１１
６のラインに集中し、同様に、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄ
上ならびにリザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤ上にも集中する。
【０２４９】
工程４では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザー
バ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化され
る；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされた
リザーバ電極３１１２Ｄおよび初めの３つの通路電極３１１６が活性化されたままである
。これにより、所定体積の流体が、初めの３つの通路電極３１１６に沿って、分配電極３
１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
【０２５０】
工程５では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される
；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活
性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そ
して、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化さ
れる。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが非活性化されたままである。
さらに、通路電極３１１６のラインの２番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対
し、１番目および３番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極３
１１６の１つが電源オフになり、１倍液滴（図示せず）が例えば、３番目の通路電極３１
１６頂部に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。
【０２５１】
図３４Ａ〜３４Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列３４００の一部の一例の平面図
を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別のためのＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析
を一体化する方法を示している。図３４Ａ〜３４Ｅの本発明の方法は、増幅およびＨＲＭ
分析手順の一例であり、ここでターゲットアンプリコンは、LCGreen等の飽和二本鎖核酸
挿入染料を用いたＰＣＲ増幅の間、蛍光標識されてもよい。挿入染料は、二本鎖核酸に特
異的に結合する。挿入染料が二本鎖核酸に結合すると、蛍光シグナルが作られる。ＨＲＭ
分析の間、二本鎖核酸が加熱され、核酸の二本鎖が溶離し、二本鎖核酸の存在が減少し、
その結果として蛍光シグナルが少なくなる。蛍光の減少速度は、通常、ＰＣＲ生成物の溶
融温度（Ｔｍ）近くで最大である。溶融温度は、ＧＣ−含有量（ＴｍはＧＣリッチなＰＣ
Ｒ生成物でより高い）、長さ、およびシークエンス含有量を含むＰＣＲ生成物特性の関数
である。データは、取得し、相対的な蛍光対温度、および／または、派生溶融ピークを示
す溶融曲線としてプロットしてもよい。
【０２５２】
電極配列３４００は、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ分析用に構成された液滴操作電極３４１０の
配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極３４１０頂部で行
われる。温度制御ゾーン３４１２ａおよび３４１２ｂ等の２つの温度制御ゾーン３４１２
は、電極配列３４００と関連してもよい。温度制御素子（図示せず）は、温度制御ゾーン
３４１２ａおよび３４１２ｂ周辺の充填流体（図示せず）の温度を制御する。例えば、温
度制御ゾーン３４１２ａは、約９５℃まで加熱されてもよく、当該温度は、二本鎖核酸の
変性に十分な温度である。温度制御ゾーン３４１２ｂは、例えば、約５５℃まで加熱され
てもよく、当該温度は、プライマーアニーリングと延長に十分な温度である。
【０２５３】
一例では、温度制御ゾーン３４１２ａおよび３４１２ｂは、ＰＣＲ熱サイクルのために
用いられてもよい。他の例では、温度制御ゾーン３４１２ｂの熱条件は、ＨＲＭ分析用の
溶融曲線の取得のために調整されてもよい。２つの温度制御ゾーン３４１２を示したが、
任意の数の温度制御ゾーン３４１２が、電極配列３４１０と関連してもよい。検出スポッ
ト３４１４は、温度制御ゾーン３４１２ｂ内の液滴操作電極３４１０Ｄに近接して配置さ
れてもよい。
【０２５４】
ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の一般的な方法の一例は、これらに限定されないが、以下
の工程を含んでいてもよい。
【０２５５】
一の工程では、図３４Ａは、温度制御ゾーン３４１２ａ内の所定の液滴操作電極３４１
０に位置しているサンプル液滴３４１６を示している。サンプル液滴３４１６は、例えば
、増幅のための核酸テンプレート（核酸ターゲット）を含んでいてもよい。一例では、核
酸テンプレートは、特定遺伝子用の目的変異領域を含んでいてもよい。サンプル液滴３４
１６が温度制御ゾーン３４１２ａ内にあるため、核酸テンプレートは変性（一本鎖）され
る。
【０２５６】
他の工程では、図３４Ｂおよび３４Ｃは、保温方法を示し、当該方法で、試薬液滴３４
１８が、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ａ内のサンプル液滴３４１６と混合さ
れ、反応液滴３４２０を生成する。試薬液滴３４１８は、ターゲット増幅用のプライマー
およびＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰｓ、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ）を含んでい
てもよい。試薬液滴３４１８は、LCGreen等の蛍光飽和ＤＮＡ挿入染料を含んでいてもよ
い。反応液滴３４２０は、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ｂ内の特定の液滴操
作電極３４１０に輸送される。反応液滴３４２０は、温度制御ゾーン３４１２ｂで、プラ
イマーアニーリング／延長および蛍光挿入染料の組み込みに十分な期間保温される。反応
液滴３４２０は、ターゲット核酸のＰＣＲ増幅のために、温度反応ゾーン３４１２ｂおよ
び３４１２ａの間を液滴操作を用いて任意の数のサイクルを前後して繰り返し輸送されて
もよい。
【０２５７】
図３４Ｃに関して、反応液滴３４２０は、液滴操作を用いて液滴操作電極３４１０Ｄに
輸送されてもよく、当該電極は、検出スポット３４１４の範囲内にある。検出スポット３
４１４に近接して配置された画像化装置（例えば、蛍光光度計、図示せず）を用いて、反
応液滴３４２０の蛍光の量を捕捉および定量化してもよい。増幅された核酸は、任意の数
の増幅サイクル後（すなわち、リアルタイムまたは完了点）に検出されてもよい。
【０２５８】
図３４Ｄは、ＰＣＲ増幅の完了後に、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ａ内の
特定の液滴操作電極３４１０に輸送された反応液滴３４２０を示している。この工程では
、反応液滴３４２０内の増幅された核酸の最終変性および冷却が行われ、対立遺伝子のよ
り正確な識別のための多数のヘテロ二本鎖を生成する。一例では、温度制御ゾーン３４１
２ａ内の温度を調整して、ヘテロ二本鎖の形成を高める、より高い加熱速度（例えば、０
．４℃／秒）および急速な冷却速度（例えば、約０．１℃／秒より大きく、約５℃／秒未
満）を提供してもよい。
【０２５９】
図３４Ｅは、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ｂ内の液滴操作電極３４１０Ｄ
に輸送された反応液滴３４２０を示し、当該電極は、検出スポット３４１４の範囲内にあ
る。この工程では、ＨＲＭ分析が行われる。一例では、温度制御ゾーン３４１２ｂ内の温
度は、傾斜速度０．２℃／秒で約５０℃〜約９５℃で調整されていてもよい。検出スポッ
ト３４１４に近接して配置された画像化装置（例えば、蛍光光度計、図示せず）を用いて
、温度の上昇に伴い反応液滴３４２０の蛍光の量を連続して捕捉および定量化する。
【０２６０】
本発明は、液滴アクチュエーターでの脆弱Ｘ症候群の検出用の一体化されたＰＣＲ増幅
およびＨＲＭ分析方法を提供する。脆弱Ｘ症候群は、Ｘ染色体上の脆弱なＸ−精神遅滞１
（ＦＭＲ１）遺伝子の５’−未翻訳領域での単一ＣＧＧトリヌクレオチド反復の延長と関
連している。この遺伝子でエンコードされたＦＭＲ１タンパク質は、正常な神経発達に要
求される。脆弱Ｘ突然変異がない人々の間で、ＣＧＧ反復の数は、６〜約４０まで異なる
。脆弱Ｘ突然変異は、増大したＣＧＧ反復の数を伴う。順列と呼ばれる約５５〜約２００
のＣＧＧ反復の増大が、影響を受けないキャリアで見られる。約４０〜約５５の反復は、
正常な大きさの範囲および順列の大きさの範囲が重なる「グレーゾーン」と考えられる。
完全順列と呼ばれる２００反復を超える増大は、核酸のその領域の増大したメチル化に関
連し、当該メチル化はＦＭＲ１タンパク質の発現を効果的に抑制する。
【０２６１】
一の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ検査の
ための方法を提供する。当該一体化されたＨＲＭ検査は、ＦＲＭ１アンプリコン溶融点と
ＣＧＧ反復ドメインの長さとが相互に関連する。核酸分子の溶融温度は、核酸分子の長さ
と、核酸分子の特定のヌクレオチドシークエンス構成（例えば、より高いＴｍは、より高
いＧＣ含有量と関連する）との両方に依存する。一例では、ＰＣＲプライマーを選択して
、脆弱Ｘ症候群と関連することが示されたＦＭＲ１対立遺伝子のＣＧＧ反復ドメインの領
域を増幅してもよい。プライマー対（順方向のプライマーおよび逆方向のプライマー）を
選択して、多型ＣＧＧ領域内での対立遺伝子の正確な識別のための十分な長さのアンプリ
コンを作製してもよい。ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析は、図１に関して記載したように行
われてもよい。
【０２６２】
他の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ検査用
の方法を提供する。当該一体化されたＨＲＭ検査は、ＦＲＭ１アンプリコン溶融点とＦＲ
Ｍ１対立遺伝子のメチル化とが相互に関連する。メチル化固有溶融曲線分析による、高メ
チル化されたＦＭＲ１対立遺伝子の検出に基づく脆弱Ｘ症候群のための既存の検査は、液
滴アクチュエーター３での使用に適応されてもよい。一般的に、メチル化固有溶融曲線分
析は、ＰＣＲ増幅の前に、分離された核酸の亜硫酸水素ナトリウム処理を用いる。亜硫酸
水素塩処理は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するのに用いられるが、
メチル化されたシトシンは未変化４のままである。続くＰＣＲ増幅の間、ウラシルは、次
いでチミンに変換されるのに対し、メチルシトシンは、シトシンとして増幅される。メチ
ルシトシンの異なる含有量を有する亜硫酸水素塩処理された核酸テンプレートから生成し
たＰＣＲ生成物は、溶融温度で違いを示し、その違いは、溶融分析で解決され得る。溶融
プロフィールを用いて、４つの異なるメチル化状態を区別してもよい：メチル化されてい
ない対立遺伝子は、単一の低い溶融ピークを生成し、完全メチル化対立遺伝子は、単一の
高い溶融ピークを生成し、メチル化されていない対立遺伝子と完全メチル化対立遺伝子と
の混合物は、低い溶融ピークと高い溶融ピークの両方を生成し、そして、不均一にメチル
化された対立遺伝子は、低い溶融ピークと高い溶融ピーク３の間に位置する幅広の溶融ピ
ークを生成する。
【０２６３】
一例では、シリカ超常磁性応答ビーズ（ＳＳＢｓ）５を用いた核酸メチル化の単一チュ
ーブ分析は、液滴アクチュエーター上での使用に適応されてもよい。メチル化固有溶融曲
線分析のためのデジタル微小流体手順の一例は、これに限定されないが、以下を含んでい
てもよい：核酸は、口腔内擦過物からの液滴アクチュエーターで、CHARGESWITCH（登録商
標）ビーズ等の超常磁性応答ビーズを用いて調製されてもよい。磁気応答性ビーズ上の精
製された核酸と共に磁気応答性ビーズを含むサンプル液滴は、液滴操作を用いて、分配さ
れ、温度制御ゾーンまで輸送され、精製された核酸は、例えば、４２℃でのアルカリ処理
（ＮａＯＨ）を用いて変性される。その中に変性された核酸を有するサンプル液滴は、液
滴操作を用いて亜硫酸水素塩試薬液滴と混合され、反応液滴を生成する。反応液滴は、例
えば、５５℃で、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換するのに十分な期間保
温される。亜硫酸水素塩変換の後、反応液滴は、液滴操作を用いて磁石のある所まで輸送
され、混合および分割洗浄手順を用いて洗浄されて、変換された核酸が精製される。精製
された核酸は、次いで、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズから、10mMのトリスHCl、1mMの
EDTAを用いてpH7.4で溶離される。CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを囲む液滴に含まれ
る溶離核酸は、次いで、液滴系の一体化されたＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析を行うために
、ビーズから離して輸送されてもよい。図１に関して記載したように、変換されたサンプ
ル液滴についてＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析が行われてもよい。ＰＣＲ増幅のために、メ
チル化非感受性増幅用またはメチル化感受性増幅用のプライマーが選択されてもよい。
【０２６４】
７．９  システム
ライブラリー構築カートリッジに関して、ユーザーは、カートリッジを再使用しようと
試みることがあり、または、２４のサンプルが入手可能な場合、ユーザーは、いくつかの
サンプルを今実行し、残りのサンプルを後で実行しようとすることがある。このことは、
品質保証等の多くの理由から、望ましいことではない場合がある。一の実施形態では、Ｐ
ＣＢで、またはカートリッジ内でヒューズが飛ぶことがある。ヒューズは、ＰＣＢにはん
だづけされた電子部品であったり、またはＰＣＢ上の配線（例えば、銅以外の材料で形成
された）かもしれない。ヒューズは、例えば、装置全体で物理的に好ましい頂部プレート
への通路に置かれてもよい。装置の物理的な無力化に代わる手段として、ヒューズは少し
のデータを保存するのに用いられることがある。この場合、制御者は、運転を進める前に
、ヒューズの状態を調べる。この場合、「ヒューズ」は、制御者に書かれたまたは読まれ
たその電気状態を有することがあり、例えば、静電容量の変化は、状態を表す開路／ショ
ートの代わりに用いられることがある。他の実施形態では、装置は、金属化されたブリス
ターパックであってもよく、または、他の使い捨ての特徴を有していてもよく、使用状態
またはカートリッジの耐久性を検出するのに用いられる電気的痕跡を生成し得る。この場
合、「書き込み」は、カートリッジの通常の使用を通じて作製され、装置は検出機能のみ
を実行する。他の実施形態では、複数のデータがカートリッジ内でエンコードされてもよ
い。例えば、カートリッジは、他のデータと同様に、カートリッジの使用状態をエンコー
ドするのに用いられＥＥＰＲＯＭを含み得る。一の実施形態では、ＥＥＰＲＯＭ認証シス
テムは、カートリッジの再使用を避けるように設計され、ユーザーの次善策としてのＥＥ
ＰＲＯＭのクローン作製および置換にも抵抗する。使用状態以外の他の多くの種類のデー
タがＥＥＰＲＯＭに含まれ得る。１つの特徴は、バーコードナンバーを含んでいてもよい
。カートリッジのバーコードステッカーは、バーコードリーダーで、研究所の自動システ
ムに対してカートリッジを同定するために用い得る。他の実施形態では、核酸用途につい
て追加の代替策は、再使用を防ぐためにカートリッジ内部表面を意図的に汚染することで
ある。例えば、最終工程として、高濃度の核酸を含む液滴を、以前に未使用の領域も含め
てカートリッジ全体を送ることができる。したがって、意図的にカートリッジ内部表面を
汚染し、再使用を防ぐ。１９９９年８月１９日に出願された題名「Indicator Components
For Microfluidic Sytems」の米国特許第6,495,104号明細書の開示全体を参照して、カ
ートリッジが使用されたか否かを特定するために有用で好適な指示素子に関する教示が参
照により本明細書に援用される。
【０２６５】
本発明の様々な態様が、方法、システム、コンピューターで読み取り可能な媒体、およ
び／またはコンピュータープログラム製品として実施されてもよいことが理解される。本
発明の態様は、ハードウェアの実施形態、ソフトウェアの実施形態（ファームウェア、常
駐ソフトウェア、マイクロコード等を含む）、または通常、本明細書で「回路」、「モジ
ュール」または「システム」として言及した全てのソフトウェアおよびハードウェアの態
様を組み合わせた実施形態を取り得る。さらに、本発明の方法は、コンピューターで使用
可能なストレージ媒体でのコンピュータープログラムプロダクトの形態を取ってもよく、
当該媒体は、当該媒体で実施されるコンピューターで使用可能なプログラムコードを有す
る。
【０２６６】
本発明のソフトウェアの態様について、任意の好適なコンピューターで使用可能な媒体
が利用されてもよい。コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能
な媒体は、例えば、これらに限定されないが、電気的、磁気的、光学的、電磁気的、赤外
線の、もしくは半導体の、システム、機器、装置、または伝播媒質であってもよい。コン
ピューターで読み取り可能な媒体は、一時的および／または持続的実施形態を含んでいて
もよい。コンピューターで読み取り可能な媒体のより詳細な例（非包括的なリスト）は、
以下の一部または全部を含む：１つ以上の配線を有する電気的接続、ポータブルコンピュ
ーターディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオン
リーメモリー（ＲＯＭ）、イレーザブル（消去可能）プログラマブルリードオンリーメモ
リー（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリー）、光ファイバー、ポータブルコンパクトデ
ィスクリードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、光学ストレージデバイス、インターネ
ットまたはイントラネットをサポートする伝送媒体等の伝送媒体、または磁気ストレージ
デバイス。プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学スキャンを経て電子的に保存
され、次いで蓄積され、読み取られ、または好適な手法で他に処理され、必要ならば、次
いでコンピューターのメモリーに保存されるので、コンピューターで使用可能なまたはコ
ンピューターで読み取り可能な媒体は、紙またはプログラムが印刷された他の好適な媒体
であってもよい。本文書の文脈では、コンピューターで使用可能なまたはコンピューター
で読み取り可能な媒体は、指示実行システム、機器、もしくは装置により、または、指示
実行システム、機器、もしくは装置に関連して、使用プログラムを含み、保存し、通信し
、伝搬し、または伝送し得るいずれの媒体であってもよい。
【０２６７】
本発明の操作を実行するためのプログラムコードは、Java、Smalltalk、C++等のオブジ
ェクト指向プログラム言語で書かれていてもよい。しかしながら、本発明の操作を実行す
るためのプログラムコードは、「Ｃ」プログラム言語または同様のプログラム言語等の従
来の手続のプログラム言語で書かれていてもよい。プログラムコードは、プロセッサー、
特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはプログラムコードを実行する他の構成で実行
されてもよい。プログラムコードは、メモリー（上述したコンピューターで読み取り可能
な媒体等）に保存されるソフトウェアアプリケーションと単に呼ばれるものであってもよ
い。プログラムコードは、プロセッサー（または他のプロセッサー制御装置）にグラフィ
カルユーザーインターフェース（「ＧＵＩ」）を生成させてもよい。グラフィカルユーザ
ーインターフェースは、ディスプレイ装置に視覚的に生成されてもよく、さらにグラフィ
カルユーザーインターフェースは、可聴式特徴を有していてもよい。しかしながら、プロ
グラムコードは、コンピューター、サーバー、携帯情報端末、電話、テレビ、またはプロ
セッサーおよび／またはデジタル信号プロセッサーを利用するいずれのプロセッサー制御
装置等のいずれのプロセッサー制御装置内で操作してもよい。
【０２６８】
プログラムコードは、局所的または遠隔的に実行されてもよい。プログラムコードは、
例えば、全体または一部がプロセッサー制御装置のローカルメモリーに保存されてもよい
。しかしながら、プログラムコードは、少なくとも部分的に、プロセッサー制御装置に、
遠隔的に、保存され、アクセスされ、およびダウンロードされてもよい。ユーザーのコン
ピューターは、例えば、プログラムコードを全て実行してもよいし、またはプログラムコ
ードを一部のみ実行してもよい。プログラムコードは、少なくとも一部がユーザーのコン
ピューターにあるスタンドアローンソフトウェアパッケージであってもよく、および／ま
たは、リモートコンピューターで部分的に実行されてもよいし、またはリモートコンピュ
ーターもしくはサーバーで全て実行されてもよい。後者の状況では、リモートコンピュー
ターは、ユーザーのコンピューターにコミュニケーションネットワークを通じて接続され
ていてもよい。
【０２６９】
本発明は、ネットワーク環境に関わらず適用してもよい。コミュニケーションネットワ
ークは、無線周波数ドメインおよび／またはインターネットプロトコル（ＩＰ）ドメイン
のケーブルネットワーク操作であってもよい。しかしながら、コミュニケーションネット
ワークは、インターネット（時々、代替的に「ワールドワイドウェブ」として知られてい
る）、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、および／または広域ネ
ットワーク（ＷＡＮ）等の分散コンピューティングネットワークを含んでいてもよい。コ
ミュニケーションネットワークは、同軸ケーブル、銅線、光ファイバー線、および／また
はハイブリッド同軸線を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電磁気
スペクトルのいずれかの部分およびシグナリング標準（標準のＩＥＥＥ802ファミリー、G
SM/CDMA/TDMAまたはセルラー方式標準、および／またはＩＳＭ帯等）のいずれかを利用す
る無線部分を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電力線部分を含ん
でいてもよく、そこで信号は電気配線を通じて伝えられる。本発明は、物理的構成部品、
物理的構成、またはfunctionコミュニケーション標準に関わらず、いずれの無線／有線コ
ミュニケーションネットワークに適用してもよい。
【０２７０】
本発明のいくつかの態様は、様々な方法および方法の工程を参照して記載されている。
各方法の工程が、プログラムコードにより、および／または機械命令により実施され得る
ことが理解される。プログラムコードおよび／または機械命令は、方法に固有の機能／動
作を実施するための手段を作り出してもよい。
【０２７１】
プログラムコードは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されてもよく、
当該メモリーは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されたプログラムコー
ドが、様々な方法の工程の態様を実施する指示手段を含む製品を作成または変換するよう
に、プロセッサー、コンピューター、または他のプログラム可能なデータを処理する機器
を特定の方法で機能するように指示することができる。
【０２７２】
プログラムコードは、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータを処理する機
器に搭載され、プログラムコードが本発明の方法で規定された様々な機能／動作を実施す
るための工程を提供するように、プロセッサー／コンピューターが実施する処理を生成す
るように行われる一連の操作工程を引き起こしてもよい。
【０２７３】
８  結び
実施形態のこれまでの詳細な説明は、添付の図面を参照し、当該図面は、本発明の特定
の実施形態を表し、説明のためのみのものである。本発明の範囲から逸脱しない異なる構
造および操作を有する他の実施形態は、本記載の観点から当業者に容易に理解される。用
語「発明」等は、本明細書で説明した出願人の発明の多くの代替の態様または実施形態の
いくつかの特定の例を参照して用いられ、その使用または欠如が出願人の発明の範囲また
はクレームの範囲を限定する意図ではない。本明細書は、読者の便宜のためのみにセクシ
ョンに分割されている。見出しは、発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。
定義は本発明の記載の一部として意図されている。本発明の範囲を逸脱することなく本発
明の様々な詳細を変更してもよいことが理解される。
【図１】
2016127851.tif 000008
【図２】
2016127851.tif 000009
【図３】
2016127851.tif 000010
【図４】
2016127851.tif 000011
【図６】
2016127851.tif 000012
【図７】
2016127851.tif 000013
【図９】
2016127851.tif 000014
【図１０】
2016127851.tif 000015
【図１１】
2016127851.tif 000016
【図１２】
2016127851.tif 000017
【図１３Ａ】
2016127851.tif 000018
【図１３Ｂ】
2016127851.tif 000019
【図１３Ｃ】
2016127851.tif 000020
【図１４】
2016127851.tif 000021
【図１５】
2016127851.tif 000022
【図１６】
2016127851.tif 000023
【図１７】
2016127851.tif 000024
【図１８】
2016127851.tif 000025
【図１９】
2016127851.tif 000026
【図２０】
2016127851.tif 000027
【図２１】
2016127851.tif 000028
【図２２Ａ】
2016127851.tif 000029
【図２２Ｂ】
2016127851.tif 000030
【図２３】
2016127851.tif 000031
【図２４Ａ】
2016127851.tif 000032
【図２４Ｂ】
2016127851.tif 000033
【図２５Ａ】
2016127851.tif 000034
【図２５Ｂ】
2016127851.tif 000035
【図２６Ａ】
2016127851.tif 000036
【図２６Ｂ】
2016127851.tif 000037
【図２７】
2016127851.tif 000038
【図２９Ａ】
2016127851.tif 000039
【図２９Ｂ】
2016127851.tif 000040
【図３０】
2016127851.tif 000041
【図３１】
2016127851.tif 000042
【図３２】
2016127851.tif 000043
【図３３】
2016127851.tif 000044
【図５−１】
2016127851.tif 000045
【図５−２】
2016127851.tif 000046
【図５−３】
2016127851.tif 000047
【図８】
2016127851.tif 000048
【図２８】
2016127851.tif 000049
【図３４】
2016127851.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月24日(2016.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）液滴アクチュエーターを準備する工程であり、
液滴アクチュエーターが、
（ｉ）液滴操作間隙を形成するように構成されている１以上の基板、及び
（ｉｉ）１以上の基板の少なくとも１つと結合し、液滴操作間隙で液滴操作を実行するために構成される、電気濡れ電極の配列を含み、
液滴操作間隙間が、オイルを含む、工程；
（ｂ）ＤＮＡサンプルの処理のために、トランスポザーゼ液滴及びＤＮＡサンプル液滴を、オイルと接触した液滴操作間隙中に分配する工程；
（ｃ）トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端を含む前記トランスポザーゼ液滴を、オイルと接触した前記ＤＮＡサンプル液滴と混合して、標識ＤＮＡ断片を含む結合液滴を生成する工程；
（ｄ）標識ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実行する工程；
（ｅ）標識ＤＮＡ断片を精製する工程；
（ｆ）精製標識ＤＮＡ断片を、サンプル回収出力を介して除去する工程；及び
（ｇ）精製標識ＤＮＡ断片をシークエンサー上で配列決定する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
標識ＤＮＡ断片を精製する工程が、
（ａ）標識ＤＮＡ断片を含む液滴を、標識ＤＮＡ断片を捕捉するためのビーズを含むビーズ液滴と混合する工程；
（ｂ）洗浄バッファーを用いる液滴系洗浄手順によりビーズを洗浄し、標識ＤＮＡ断片を含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程；
（ｃ）洗浄されたビーズを含む液滴を溶離バッファー液滴と混合して、溶離された標識ＤＮＡ断片を含む溶離液滴を生成する工程；及び
（ｄ）標識ＤＮＡ断片をビーズから分離して、オイル中に精製標識ＤＮＡ断片を含む液滴を生成する工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液滴系洗浄手順が、液滴系混合および分割洗浄手順を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トランスポザーゼの断片が、ＤＮＡサンプルを標識化して、標識ＤＮＡ断片を生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トランスポゾン末端が、配列決定プライマー部位に付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サンプル回収出力が、出力回収リザーバを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サンプル回収出力での回収前に、液滴アクチュエーターにおいて、液滴操作を用いて、１以上の異なる核酸ライブラリーを有する前記精製標識ＤＮＡ断片を貯蔵する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡサンプルの処理の前に、各サンプルの入力ＤＮＡの濃度を決定するために、ＤＮＡサンプルの定量手順を更に実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標識ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実行する工程が、バーコードを付加するプライマーを用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標識ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実行する工程が、プラットフォーム固有オリゴヌクレオチドアダプターを付加するプライマーを用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標識ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実行する工程が、バーコード及びプラットフォーム固有オリゴヌクレオチドアダプターを付加するプライマーを用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
トランスポザーゼが、Ｔｎ５の活動亢進誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標識ＤＮＡ断片の５’末端が、トランスポゾンシークエンスで標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標識ＤＮＡ断片が、４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、オリゴヌクレオチドアダプターとも標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドアダプターが、トランスポゾンシークエンスから上流である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バーコードが、標識ＤＮＡ断片に、アダプターとトランスポゾンとの間に付加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
標識ＤＮＡ断片が、更に、洗浄手順を用いて精製され、組み込まれなかったアダプター及びバーコードが除去され、それにより、濃縮された２標識ＤＮＡライブラリーを製造する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
洗浄手順が、ビーズ系洗浄手順を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドアダプターが、フローセルブリッジＰＣＲプライマー（ｂＰＣＲ）シークエンスを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドアダプターが、付加した配列決定プライマー部位を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
分配工程及び混合工程が、液滴操作を用いて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
液滴操作が、電気濡れ電極によって実行される、請求項２１に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月7日(2016.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【図１】図１は、核酸ライブラリーの構築についての手順の一例のフローチャートを表す。
【図２】図２は、表３に示されたライブラリー出力データを計算するために用いたアガロースゲルの写真を示す。
【図３】図３は、アクチュエーターでのライブラリー構築手順の７回の追加実行のアガロースゲル分析から計算された収率のプロットを示す。
【図４】図４は、対末端手順の溶離およびＤＮＡ浄化工程の、台上および液滴アクチュエーターでの実行を比較したプロットを示す。
【図５−１】図５Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｄは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５−２】図５Ｆは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｇは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｈは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｉは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図５−３】図５Ｊは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｋは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｌは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。図５Ｍは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、核酸ライブラリー構築用の核酸を調製する方法を示す。
【図６】図６は、図６Ａ〜６Ｈに示された核酸調製方法を他の方法で描写したフローチャートを表す。
【図７】図７は、図６Ａ〜６Ｈに示されたアルコール系ビーズ洗浄／溶離方法を他の方法で描写したフローチャートを表す。
【図８】図８Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。図８Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。図８Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。
【図９】図９は、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの一例の平面図を表す。
【図１０】図１０は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１１】図１１は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１２】図１２は、核酸ライブラリー構築用の液滴アクチュエーター上の核酸の処理用に構成された電極配列の他の一例の平面図を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの他の一例の平面図を表す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーターの他の一例の斜視図を表す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーターの頂部基板の実施の一例の平面図を表す。
【図１４】図１４は、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーターの底部基板の一例の平面図を表し、底部基板は底部基板上に形成された電極配列を有する。
【図１５】図１５は、液滴アクチュエーターの底部基板であり、液滴輸送と作業行程時間とを最適化するために底部基板上にパターン化された電極配列を有する底部基板の一例の平面図を表す。
【図１６】図１６は、図１５の電極配列により支持されたアクチュエーターの流体リザーバを充填するための開口部に関連した、図１５の底部基板の平面図を表す。
【図１７】図１７は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図１８】図１８は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図１９】図１９は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２０】図２０は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２１】図２１は、図１５の電極配列により支持された様々な流体リザーバの図面を表す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、磁石アクチュエーターの斜視図を表す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、磁石アクチュエーターの斜視図を表す。
【図２３】図２３は、１つ以上の磁石アクチュエーターと１つ以上の加熱機構とを備えた機械的固定具の一例の平面図を表す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Halbach磁石配列の例の斜視図を表す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Halbach磁石配列の例の斜視図を表す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、例えば、液滴アクチュエーターの電極に対する、図２４ＡのHalbach磁石配列の磁場の関係を表す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、例えば、液滴アクチュエーターの電極に対する、図２４ＡのHalbach磁石配列の磁場の関係を表す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、図２４ＡのHalbach磁石配列に関連した図２５Ａの液滴アクチュエーターの他の図（すなわち、平面図）を表す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、図２４ＢのHalbach磁石配列に関連した図２５Ｂの液滴アクチュエーターの他の図（すなわち、平面図）を表す。
【図２７】図２７は、液滴アクチュエーターでのサンプル濃縮の方法のフローチャートを表す。
【図２８】図２８Ａは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの側面図を表す。図２８Ｂは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。図２８Ｃは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。図２８Ｄは、液滴アクチュエーターに関して有用な他の構成要素の配列を含むローラーアセンブリの断面図を表す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、液滴アクチュエーターの一部の一例の平面図を表し、廃棄する液滴のダンピング方法を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、液滴アクチュエーターの一部の一例の断面図を表し、廃棄する液滴のダンピング方法を示す。
【図３０】図３０は、図２９Ａおよび２９Ｂの液滴アクチュエーターの他の実施形態の断面図を表す。
【図３１】図３１は、電極配列の一例の一部の平面図と２倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３２】図３２は、図３１の電極配列の平面図と１倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３３】図３３は、図３１の電極配列の他の実施形態の平面図と１倍液滴を分配するための他のリザーバ分配シークエンスを表す。
【図３４】図３４Ａは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。図３４Ｂは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。図３４Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。図３４Ｄは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。図３４Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別用の一体化ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の方法を示す。
【外国語明細書】
2016127851000001.pdf