(57)【要約】      （修正有）【課題】雑菌や異物等の混入を防ぐことができる、新規有用な細胞培養容器を提供する。【解決手段】容器の底部１が通気性ポリエチレンフィルムで形成される細胞培養容器。容器の側壁２に培養液交換用の又は細胞注入用の注入口４と排出口４とを有することにより、容器を開封することなく培養液の交換が可能な細胞培養容器又は細胞の培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されていることを特徴とする、細胞培養容器。
【請求項２】
容器の上部がポリエステルフィルムで封止されている、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの平均孔径が、１〜３０μｍの範囲内である、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍの範囲内であり、該二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍの範囲内である、請求項１〜３のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの厚みが、２５μｍ〜１０００μｍの範囲内である、請求項１〜４のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
容器の側壁に、培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口とを有する、請求項１〜５のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
さらに台座部を有する、請求項１〜６のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されている密封容器を用いることを特徴とする、細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに一に記載の細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞の培養方法。
【請求項１０】
培養液の交換を、容器の側壁に有する注入口と排出口から行うことを特徴とする、請求項８又は９に記載の細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器又は細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体外で細胞を培養する方法として、安価には、ガラス製ないしポリスチレン製のシャーレを用い、この底部に培養液と共に細胞を静置し、蓋をして、３７℃、５％ＣＯ２環境下のインキュベーター内で行う方法が挙げられる。
インキュベーター内は、クリーンな環境ではなく、雑菌や異物等が存在する。そのため、たとえ蓋をして密閉したとしても、僅かな雑菌等の混入は避けられない。僅かな雑菌等の混入は、細胞培養において、一般には実害ではないが、僅かな雑菌等の混入もない方が好ましいことは言うまでもない。
【０００３】
雑菌等の混入を完全に排除するために、培養容器を密封にすることが考えられる。しかしながら、容器を密封にすると、細胞の生育に必要な酸素や二酸化炭素の供給に支障をきたし、細胞が死滅するおそれがある。時折、クリーンベンチなどに、細胞培養中の容器を運び、開放してやることも考えられる。しかしながら、再度、しっかり密封するなどの操作も加わり、煩雑である。従って、通常、容器を密封して培養することは困難である。
【０００４】
また、細胞培養中、２、３日に１回程度の割合で、容器中の培養液の交換を行わなければならない。かかる培養液の交換は、雑菌等の混入を防ぐため、一般には培養容器をクリーンベンチなど無菌な環境へ運び、ピペット等で古い培養液を吸い取り、新しい培養液を入れることにより行われる。これら一連の操作は、煩雑なものがあり、必ずしも容易なものではない。
【０００５】
公知技術として、容器の底部を、連続多孔質構造を有する撥水性膜とした細胞培養容器が知られている（特許文献１参照）。かかる容器では、底部をこのような撥水性膜とすることにより、容器底部の通気性を改善している。具体的な連続多孔質構造として、ノードとフィブリンとからなる構造が挙げられ、そのような撥水性膜として、延伸されたポリテトラフルオロエチレンからなる膜が挙げられている。当該細胞培養容器は、基本的には通常のシャーレと同様な構造を有する、蓋をする密閉タイプの容器である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−７９３６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規有用な細胞培養容器を提供することにあり、特に雑菌や異物等の混入を防ぐことができる細胞培養容器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、容器の底部を通気性ポリエチレンフィルムで形成することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明としては、例えば、下記を挙げることができる。
【００１０】
［１］容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されていることを特徴とする、細胞培養容器。
【００１１】
［２］容器の上部がポリエステルフィルムで封止されている、上記［１］に記載の細胞培養容器。
【００１２】
［３］容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの平均孔径が、１〜３０μｍの範囲内である、上記［１］又は［２］に記載の細胞培養容器。
［４］容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍの範囲内であり、該二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍの範囲内である、上記［１］〜［３］のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【００１３】
［５］容器底部の通気性ポリエチレンフィルムの厚みが、２５μｍ〜１０００μｍの範囲内である、上記［１］〜［４］のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【００１４】
［６］容器の側壁に、培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口とを有する、上記［１］〜［５］のいずれか一に記載の細胞培養容器。
［７］さらに台座部を有する、上記［１］〜［６］のいずれか一に記載の細胞培養容器。
【００１５】
［８］容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されている密封容器を用いることを特徴とする、細胞の培養方法。
【００１６】
［９］上記［１］〜［７］のいずれか一に記載の細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞の培養方法。
【００１７】
［１０］培養液の交換を、容器の側壁に有する注入口と排出口から行うことを特徴とする、上記［８］又は［９］に記載の細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る細胞培養容器によれば、雑菌や異物等の混入を防ぎながら、より簡便な方法で細胞の培養を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る細胞培養容器の一例を示す。（ａ)は平面図である。（ｂ）は正面図である。（ｃ）はＡ−Ａ断面図である。
【図２】本発明に係る細胞培養容器の一例の底面図である。
【図３】本発明に係る細胞培養容器の一例の側面図である。
【図４】本発明に係る細胞培養容器の一例の斜視図である。
【図５】台座部を有する、本発明に係る細胞培養容器の一例を示す。（ａ)は平面図である。（ｂ）は正面図である。（ｃ）はＡ−Ａ断面図である。
【図６】台座部を有する、本発明に係る細胞培養容器の一例の底面図である。
【図７】台座部を有する、本発明に係る細胞培養容器の一例の側面図である。
【図８】台座部を有する、本発明に係る細胞培養容器の一例の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｉ．本発明に係る細胞培養容器について
本発明に係る細胞培養容器（以下、「本発明容器」という）は、容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されていることを特徴とする。以下、図を参照して本発明容器を詳述する。
【００２１】
Ｉ−１．本発明容器の底部に係る通気性ポリエチレンフィルムについて
まず、本発明容器の底部に係る通気性ポリエチレンフィルムについて説明する。ここで、本発明容器の底部は、図面では符号１に相当する。
【００２２】
該通気性ポリエチレンフィルムは、通気性を有し、液体を通さないものであればよく、そのような市販の通気性ポリエチレンフィルムをそのまま使用することができるが、培養する細胞の種類等により、必要に応じて、プラズマ処理等の表面処理を行ってもよい。
【００２３】
該通気性ポリエチレンフィルムは多孔性であるが、その平均孔径は、通常、１μｍ〜３０μｍの範囲内であり、好ましくは５μｍ〜２０μｍの範囲内である。該通気性ポリエチレンフィルムの平均孔径が１μｍ未満であると、容器内の培養液に十分な酸素等が供給されないおそれがあり、該通気性ポリエチレンフィルムの平均孔径が３０μｍより大きいと、容器中の培養液が漏れるおそれがある。
【００２４】
該通気性ポリエチレンフィルムの酸素透過係数としては、約１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍが挙げられ、好ましくは約１１００〜３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、さらに好ましくは約１２５０〜２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数としては、約１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍが挙げられ、好ましくは約３０００〜１１５００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、さらに好ましくは約５０００〜９０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍである。
【００２５】
該通気性ポリエチレンフィルムの厚みとしては、２５μｍ〜１０００μｍの範囲内が適当であり、５０μｍ〜２００μｍの範囲内が好ましく、７０μｍ〜１５０μｍの範囲内がより好ましい。
【００２６】
該通気性ポリエチレンフィルムの色は、培養目的、培養する細胞の種類等により適宜選択することができるが、顕微鏡等での観察がしやすいことから、無色透明であることが好ましい。
【００２７】
Ｉ−２．本発明容器の側壁について
本発明容器の側壁は、図面では符号２に相当する。
【００２８】
本発明容器の側壁の材質は、培養液上に細胞等を培養するのに不活性であれば特に限定されず、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートを挙げることができる。中でも、軽量で、かつ、ガンマ線滅菌等を施しても変色しないことから、ポリスチレンが好ましい。
【００２９】
本発明容器の側壁の色も特に限定されないが、容器内部の観察に適していることから、無色透明であることが好ましい。
【００３０】
本発明容器の側壁の形状は、特に限定されず、例えば、円柱状、角柱状等の柱体を挙げることができる。中でも、容器を持ち運ぶ際、培養液表面が波打つことを軽減できることから、四角柱状が好ましい。
【００３１】
本発明容器の側壁の厚みは、側壁の材質や、容器の使用条件等により当業者が適宜選択すればよく、通常、２ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内であり、５ｍｍ程度が好ましい。
【００３２】
本発明容器の側壁の高さは、特に限定されず、培養液の量等により適宜調整すればよいが、３ｍｍ〜２０ｍｍ程度が適当であり、好ましくは５ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。本発明容器は、底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されており、容器底部を介して酸素等が供給されることから、容器中に空気層を設ける必要はなく、本発明容器の側壁の高さと培養液の高さが同じであってもよい。
【００３３】
本発明容器は、例えば、底部となる通気性ポリエチレンフィルムの縁周に粘着層等を設け、側壁の開口部に貼着し、閉塞することにより作製することができる。
本発明容器は、使用後に底部の通気性ポリエチレンフィルムを剥がし、側壁を十分に洗浄、乾燥した後、新しい通気性ポリエチレンフィルムを貼着して、再構築することもできる。
【００３４】
本発明容器の側壁には、後述する、培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口とを有していてもよい。
【００３５】
Ｉ−３．本発明容器の上部について
本発明容器の上部は、図面では符号３に相当する。本発明容器の上部は、開放されていても閉じられていてもよい。好ましくは、外部からの雑菌等の混入を完全に防止するため、閉じられている（封止されている）密封型が好ましい。本発明容器は、底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されていることから、容器上部が閉じられ、容器が密封されても、容器底部の通気性ポリエチレンフィルムを介して酸素等が培養液に供給され、培養細胞に酸素等を与えることができる。本発明容器の上部が開放されている場合、通常のシャーレと同様に蓋をして細胞を培養することかできる。
【００３６】
上部が閉じられた密封型の形態としては、外部からの雑菌等の混入を防ぐことができれば特に限定されず、例えばシャーレ型や桝型の容器を逆さにしたような、側面と上面が一体となった形態や、上部に適当なフィルム等を貼着し、封止した形態を挙げることができる。中でも、上部から封止又は開封が可能なことからフィルム等を貼着することが好ましい。
【００３７】
上部を封止するフィルム等としては、外部からの雑菌等の混入を防ぐことができ、かつ、培養液上での細胞の培養に不活性であれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムやポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）フィルム等のポリエステルフィルム、ポリエチレンフィルム、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラスを挙げることができる。中でも、シート状で強度があり、形状等の種類が豊富であることから、ポリエステルフィルムが好ましく、その中でもポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムが特に好ましい。
【００３８】
本発明容器の上部の色は、特に限定されないが、顕微鏡等で観察が可能なことから、無色透明であることが好ましい。
【００３９】
培養液又は細胞の注入・排出は、側壁に後述する注入口や排出口を有する本発明容器であれば、該注入口、排出口から行うことができ、また、クリーンベンチ内等、雑菌等が少ない環境で容器上部から注入・排出した後、フィルム等を貼着することにより行うこともできる。
【００４０】
Ｉ−４．培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口について
本発明容器は、側壁に培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口を有することができる。注入口と排出口の実施形態の一例として、例えば、図面に示される符号４のような形態を挙げることができる。側壁に培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口を有することにより、容器の上部を開封することなく、培養液又は細胞の注入や培養液の交換を行うことができる。
なお、注入口と排出口とは、常に区別されるものではない。必要に応じて適宜定めることができる。例えば、容器側壁の対向する２面に各２口あり、同じ形状等である場合、どれを注入口とし、どれを排出口としてもよい。一般には、いずれかの面にある２口を注入口とし、その対面にある２口を排出口とするのが好ましい。
【００４１】
注入口と排出口の数は、注入口と排出口をそれぞれ１個以上有していれば特に限定されず、容器の大きさや形状、用いる培養液の量等により適宜選択すればよい。それぞれ２個ないし３個有するのが好ましい。
【００４２】
注入口及び排出口の側壁における場所は、培養液又は細胞の注入及び培養液の排出ができれば特に限定されないが、注入口及び排出口が全て培養液に浸る位置にあり、できる限り底部に近い位置にあるのが好ましい。また、注入口及び排出口の向きは、容器の形状等によって適宜調整すればよい。図面で示すような四角柱状の容器の場合は、一直線の方向に調製するのが一般的であるが、培養液がムラなく交換できる方向に調製するのが好ましい。
【００４３】
注入口及び排出口の口径としては、培養液又は細胞の注入及び培養液の排出ができる大きさであれば特に限定されないが、例えば、口の形状が円形の場合、直径１ｍｍ〜８ｍｍを挙げることができる。好ましくは直径２ｍｍ〜５ｍｍの範囲内である。
【００４４】
注入口又は排出口からの雑菌等の混入を防ぐため、注入口及び排出口には、開閉可能なジョイントを有することが好ましい。
【００４５】
Ｉ−５．本発明容器の台座部について
本発明容器は、容器底部に空気層を設けるため、台座部を有していてもよい。台座部は、図面では符号５に相当する。また、図５〜８に記載する、台座部を有する一例は、図１〜４に記載する本発明容器の一例に台座部を設けたものである。
【００４６】
台座部を有することにより、通気性のない面の上に本発明容器を置いた場合であっても、容器底部の通気性ポリエチレンフィルムから酸素等を取り入れることが可能になる。これにより、本発明容器を重ねて使用することができる。
【００４７】
台座部は、本発明容器の底部に固定されていてもよく、必要に応じて着脱可能になっていてもよい。
【００４８】
台座部の材質は、特に限定されず、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の樹脂、ガラスを挙げることができる。
【００４９】
台座部は、空気層に酸素等を取り込むための空気穴を有していることが好ましい。空気穴は、図面では空気穴６に相当する。空気穴の形状や数は、容器の大きさ等により、適宜選択することができる。
【００５０】
台座部は、本発明容器内に培養液を充填した際、本発明容器底部の通気性ポリエチレンフィルムが弛むことを防ぐなどの目的で、必要に応じて、支柱部を有していてもよい。支柱部は、図面では符号７に相当する。支柱部の形状は特に限定されないが、台座部をつけた状態のまま顕微鏡での観察ができることから、図５及び図６に示される符号８のように、本発明容器の中央部に、顕微鏡観察用の窓（空気穴にもなる）が設けられていることが好ましい。
【００５１】
本発明容器で培養できる細胞は特に制限されず、ガラス製ないしポリスチレン製のシャーレを用いて培養できる種類の細胞であればいずれでもよい。固定細胞でも浮遊細胞でもよいが、固定細胞の培養に本発明容器は特に適している。本発明容器で培養しうる具体的な細胞としては、例えば、骨芽細胞、象牙芽細胞、歯根膜細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓由来細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を挙げることができる。
【００５２】
ＩＩ．本発明に係る細胞培養方法について
次に、本発明に係る細胞培養方法（以下、「本発明培養方法」という）について詳述する。
本発明培養方法として、例えば、容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されている密封容器を用いることを特徴とする、細胞の培養方法を挙げることができる。
【００５３】
容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されている密封容器としては、例えば、上部が閉じられている密封型の本発明容器を挙げることができる。
【００５４】
培養液としては、培養したい細胞の種類や量等により適宜選択すればよく、例えば、炭素源、ビタミン、無機塩類などの栄養素を含む溶液が好ましい。
【００５５】
本発明培養方法に供しうる細胞は特に制限されず、ガラス製ないしポリスチレン製のシャーレを用いて培養できる種類の細胞であればいずれでもよい。固定細胞でも浮遊細胞でもよいが、本発明培養方法は固定細胞の培養に特に適している。具体的な細胞としては、前記のものを挙げることができる。
【００５６】
ＩＩ−１．培養液と細胞を注入する方法について
容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されている密封容器に培養液と細胞を注入するには、例えば、次のような方法で行うことができる。
１）クリーンベンチなどの無菌空間で容器上部から培養液及び細胞をピペット等で流し込み、その後フィルム等で上部を貼着し、容器を密封することにより培養液と細胞を注入する方法
２）密封容器の側壁に設けた注入口からシリンジや送液ポンプ等により培養液と細胞を注入する方法
中でも、簡便でより雑菌等の混入を防ぐことができる、上記２のような、注入口からシリンジや送液ポンプ等により培養液と細胞を注入する方法が好ましい。そうすることにより、クリーンベンチなどの無菌空間で培養液と細胞の注入を行う必要は必ずしもない。
【００５７】
注入口から培養液と細胞を注入する場合、例えば、培養液及び細胞を入れたシリンジを注入口のジョイントに差し込んだ後、ジョイントを開き、培養液と細胞を注入し、注入後は、ジョイントを閉じ、シリンジを抜き取ればよい。これを手動で行っても、送液ポンプなどを用いて機械的に自動で行ってもよい。
【００５８】
培養液の量は特に限定されないが、容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されていることから、容器内に空気層を設けることは必須でない。細胞の量や濃度は、細胞の種類等により適宜調整すればよい。
【００５９】
ＩＩ−２．培養液の交換方法について
培養液の交換は、例えば、次のような方法で行うことができる。
１）クリーンベンチなどの無菌空間で容器上部を開放し、古い培養液をピペット等で吸い取り、替わって新しい培養液をピペット等で流し込み、その後フィルム等で上部を貼着し、容器を密封することにより培養液を交換する方法
２）密封容器の側壁に設けた注入口から新しい培養液を注入し、排出口から古い培養液を排出する方法
中でも、簡便でより雑菌等の混入を防ぐことができる、上記２のような、注入口と排出口とから培養液の交換を行う方法が好ましい。そうすることにより、クリーンベンチなどの無菌空間で培養液の交換を行う必要は必ずしもない。
【００６０】
培養液の交換を注入口と排出口とから行う場合、注入口に培養液の入ったシリンジを、排出口に空のシリンジを差し込み、次いで、注入口及び排出口のジョイントを開き、培養液の入ったシリンジを押し込むと同時に、空のシリンジを引けばよい。これにより、容器内に新しい培養液が封入され、古い培養液は空のシリンジ中に回収される。最後に、注入口及び排出口のジョイントを閉じ、シリンジを抜けばよい。これを手動で行っても、送液ポンプなどを用いて機械的に自動で行ってもよい。
【００６１】
自動で培養液を交換する場合、送液ポンプ等の培養液を供給する能力を有する装置を注入口に接続し、排出口を廃液タンク等に接続することにより行うことができる。このとき、一定の速度で培養液を供給する能力を有する装置を接続し、連続して培養液の注入と排出を行えば、より人体の環境に近い状態で細胞の培養を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明容器は、容器の底部が通気性ポリエチレンフィルムで形成されており、容器底部を介して培養液や細胞に酸素や二酸化炭素を取り入れることができる。そのため、雑菌等の混入を防ぐのに最適な密封状態で細胞を培養することができることから、本発明容器は細胞の培養を行うのに有用である。また、容器側壁に培養液交換用の又は細胞注入用の注入口と排出口とを設ければ、簡便な方法で培養液と細胞の注入、また培養液の交換を行うことができ、そのような本発明容器は細胞の培養を行うのにより有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１・・・底部
２・・・側壁
３・・・上部
４・・・注入口又は排出口
５・・・台座部
６・・・空気穴
７・・・支柱部
８・・・顕微鏡観察用の窓
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016007170.tif 000009
【図８】
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