(57)【要約】      （修正有）【課題】膵がんの予後を評価するために有用なマーカーを特定し、当該マーカーを用いた膵がんの予後を予測する方法、及び当該マーカーを用いて膵がんの予後を予測するための検査用キットを提供する。【解決手段】膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定することを特徴とする、膵がんの予後を評価する方法。生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数であり、生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織におけるＥＢＩ３遺伝子の発現量である。ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体、又はＥＢＩ３ｍＲＮＡ若しくはＥＢＩ３遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する予後を評価するための検査用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定することを特徴とする、膵がんの予後を評価する方法。
【請求項２】
以下のａ及びｂの工程を含む、請求項１に記載の方法。
ａ）膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定する工程
ｂ）ＥＢＩ３の発現レベルを対照レベルと比較する工程
【請求項３】
ＥＢＩ３の発現レベルが閾値レベルよりも増加している場合に、予後良好であることを示す請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織におけるＥＢＩ３遺伝子の発現量である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体、又はＥＢＩ３ｍＲＮＡ若しくはＥＢＩ３遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する請求項１〜５記載の方法に用いる膵がんの予後を評価するための検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がんの予後を予測する、膵がんの予後評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵がんは、その発症数と死亡数が殆ど変わらない難治性がんの一つである。すなわち、膵がんは、診断、治療ともに困難で、消化器系悪性腫瘍の中で最も予後が不良である。したがって、膵がんの予後を改善するためには、早期診断のみならず、手術や化学療法などの有効性を評価した上での的確な治療方針の確立が重要である。
がんの予後を予測するマーカーは、これまでに多くの報告が成されているが、膵がんの予後を特異的に予測するマーカーは未だ殆ど報告されておらず、その予後は生死の結果からの判定を待つのが現状である。したがって、個々の膵がん患者に対する治療法の適切な選択を可能とするバイオマーカーの開発は、早期診断のためのマーカーと共に早急に望まれている。
【０００３】
一方、ＥＢＩ３遺伝子（Epstein-Barr virus induced gene 3）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）により形質転換されたＢ細胞株において初めて発現され注目された遺伝子である（非特許文献１）。ＥＢＩ３は、ＩＬ−１２のｐ３５関連サブユニットであるｐ２８とヘテロ二量化することにより形成される、ＩＬ−２７の構成要素である（非特許文献２）。またＥＢＩ３は、ＩＬ−１２  ｐ３５とヘテロ二量化することにより形成される、ＩＬ−３５の構成要素である(非特許文献３)。ＩＬ−２７は、ＩＦＮ−γによって誘導される免疫反応に必要なＴｈ１免疫反応開始において重要な役割を果たすと考えられ、一方でＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２，Ｔｈ１７，ｉＴｒｅｇへの細胞分化を抑制し、ＩＬ−１０を産生する抑制性Ｔ細胞のＴｒ１分化を誘導する(非特許文献４)。
【０００４】
近年、ヒト造血器腫瘍において、ＥＢＩ３遺伝子が過剰発現されていること（非特許文献５）、肺癌患者の血液においてＥＢＩ３のレベルが上昇し、被験体から得た血液試料においてＥＢＩ３遺伝子の発現のレベルの上昇により、被験体が肺癌の診断や肺癌を発症する危険性を判定できることが（特許文献１）等が報告されている。
【０００５】
しかしながら、ＥＢＩ３の発現と膵がんとの関係はこれまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５３６３６６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Devergne O, et al., J Virol 70: 1143-1153 (1996)
【非特許文献２】Pflanz S, et al., Immunity 16: 779-90(2002)
【非特許文献３】Collison LW et al. Nature 450;566-9,2007
【非特許文献４】Awasthi A et al. Nat Immunol 8;1380-9,2007
【非特許文献５】Larousserie, F., et al., Am J Pathol. 166: 1217-1228 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、膵がんの予後を評価するために有用なマーカーを特定し、当該マーカーを用いた膵がんの予後を評価する方法、及び当該マーカーを用いて膵がんの予後を評価するための検査キットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために、膵がん外科切除症例の３つのコホートを用いて、膵がん組織に発現するＩＬ−１２ファミリー・ＩＬ−１２リセプターファミリー遺伝子について、転写レベル・蛋白質レベルでの発現を測定し、解析したところ（図１参照）、ＥＢＩ３遺伝子発現の高い症例群は低い症例群に比べて有意に長い生存期間を示すこと、また、がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数の多い症例群が少ない症例群に比して有意に長い生存を示すことを発見し、ＥＢＩ３遺伝子及びＥＢＩ３が膵がんの予後予測のために有意なマーカーとなり得ることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に係るものである。
（１）膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定することを特徴とする、膵がんの予後を評価する方法。
（２）以下のａ及びｂの工程を含む、（１）に記載の方法。
ａ）膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定する工程
ｂ）ＥＢＩ３の発現レベルを対照レベルと比較する工程
（３）ＥＢＩ３の発現レベルが閾値レベルよりも増加している場合に、予後良好であることを示す（１）又は（２）に記載の方法。
（４）生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織におけるＥＢＩ３遺伝子の発現量である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが、膵がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体、又はＥＢＩ３ｍＲＮＡ若しくはＥＢＩ３遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含有する（１）〜（５）の方法に用いる膵がんの予後を評価するための検査用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、膵がん患者の予後を予測することが可能になる。すなわち、膵がんと診断された患者について、例えば手術等で切除された膵がん組織を、本発明の方法により評価することで予後を予測することができ、これにより、適切な治療方針を立てることが可能になり、また膵がんの状態や進行をモニターすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】目的遺伝子・分子（マーカー）を同定するための手順を示した模式図。
【図２】コホート1を用いたKaplan-Meier生存曲線。左のグラフは生存率(OS)との関係、右のグラフは無再発生存率(DFS)との関係を示したもの。
【図３】(A) リンパ節の免疫組織化学像。茶色：EBI3発現細胞、(B)リンパ節の免疫組織化学二重染色像。赤紫色：EBI3発現細胞、茶色：CD208、倍率：×１００
【図４】コホート3を用いたKaplan-Meier生存曲線。左のグラフは生存率(OS)との関係、右のグラフは無再発生存率(DFS)との関係を示したもの。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「膵がん」は、膵臓から発生した悪性腫瘍を意味する。
【００１４】
本発明において、「予後」とは、膵がんが外科的治療等による腫瘍量の減弱、腫瘍増殖の抑制、軽減後に辿る経過又は結末（例えば、再発・腫瘍増殖の有無、生死等）を意味する。例えば、外科的に腫瘍完全切除後何年或いはそれ以上の時点における生死が挙げられる。
本発明において、「予後良好」とは、患者の外科的治療等による腫瘍量の減弱、腫瘍増殖の抑制又は軽減後の容態が長期間（例えば、２-５年間）致命的とならないことを意味し、生存、非転移、非回帰、又は、非再発等の場合が挙げられる。すなわち、予後良好の状態としては、再発・転移等何らかの疾患が確認されていてもその悪性度が低く、生存可能な状態も包含される。
【００１５】
本明細書において、「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(ＤＮＡ)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。
【００１６】
本発明の膵がんの予後を評価する方法は、膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルを測定するものである。
【００１７】
本発明において、「ＥＢＩ３の発現」とは、ＥＢＩ３遺伝子の発現とＥＢＩ３タンパク質の発現の両者を意味する。
ＥＢＩ３遺伝子（Epstein-Barr virus induced gene 3）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７５５として登録されている公知の遺伝子である。本発明において、「ＥＢＩ３遺伝子」には、当該塩基配列（配列番号１）で示される遺伝子だけでなく、これらによりコードされるタンパク質（「ＥＢＩ３」（配列番号２）と称する）と生物学的活性が等価であるタンパク質をコードする遺伝子が包含される。
具体的には、配列番号１で表されるＥＢＩ３遺伝子の他に、配列番号１で示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡが包含される。
なお、ここでストリンジェントな条件は、例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
ここで、塩基配列の同一性は、例えばリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Science, 227, 1435, （1985）)によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１８】
本発明において用いられる生体試料は、予後の評価対象となる膵がん患者から分離された生体検体であればよく、患者の膵がん組織である。生体試料は、患者から分離・採取された検体をそのままであってもよいが、各種測定に供するために適宜前処理されたものであってもよい。例えば検体を免疫組織化学に供する場合は、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば試料をウェスタンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲに供する場合は、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液又はｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
【００１９】
本発明の方法において、ＥＢＩ３の発現レベルを測定する方法は、生体試料中のＥＢＩ３を確認可能な方法であれば良く、特に限定されない。すなわち、ＥＢＩ３の発現レベルを検出又は定量できる方法であればよく、またＥＢＩ３の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。ＥＢＩ３の発現は、タンパク質レベルで検出又は定量してもよく、また核酸（ｍＲＮＡ）レベルで検出又は定量してもよい。
【００２０】
ＥＢＩ３発現のタンパク質レベルでの検出又は定量は、ＥＢＩ３に特異的に結合する抗体（抗ＥＢＩ３抗体）を用いて、免疫学的に測定する方法が簡便であり好適である。免疫学的測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー等が挙げられる。
また、核酸レベルでの検出又は定量としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザン・ブロッティング法、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡアッセイ、in situ hybridization法等が挙げられる。
【００２１】
ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体は、ＥＢＩ３と結合する限り、その構造、大きさ、イムノグロブリンクラスは何れのものでもよく、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。また、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原（ＥＢＩ３）への結合作用を保持する抗体の断片を用いることもできる。斯かる抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。
【００２２】
抗ＥＢＩ３抗体は、当業者によく知られた方法により得ることができる。例えば、ＥＢＩ３の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。この抗原を用いて動物を免疫後、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原に用いたＥＢＩ３やその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことによりＥＢＩ３に対するモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原で動物を免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
【００２３】
抗体の標識は、当分野において一般的な方法により行うことができ、また市販の標識キットを用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００２４】
免疫組織化学法（免疫組織染色法）は、公知の方法を採用することができる。例えば、患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋をして組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用する。切片試料は、抗体の特性に応じて適宜オートクレーブによる熱処理等で抗原を賦活化し、Vector社ABC法あるいはDAKO社EnVision検出システム等を用いて免疫組織染色を行う。顕微鏡下において、ＥＢＩ３の発色により陽性・陰性の判定を行うことができる。
【００２５】
ＥＢＩ３をｍＲＮＡレベルで検出又は定量する場合、適宜設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ等を利用した公知の方法により核酸を増幅する。このような方法としては、例えば、ＡＲＭＳ（Amplification Refractory Mutation System）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcriptase-PCR）法、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を挙げることができる。そして、増幅された核酸は、当該核酸と相補的な核酸を使用して、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（sequence specific Oligonucleotide）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Amplifiable fragment length polymorphism）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲＳＳＣＰ（single strand conformation polymorphism）法により検出される。
ここで使用されるプライマー等は、公知の情報を基に当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により得ることができる
【００２６】
斯くして、膵がん患者から分離された生体試料中のＥＢＩ３の発現レベルが測定され、当該ＥＢＩ３の発現レベルに基づいて、患者の予後が評価される。具体的には、検出されたＥＢＩ３の発現レベルを対照レベルと比較することによって、評価される。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、予後良好の患者群（予後が不良ではなかった膵がん患者、予後が不良ではないと信じられている膵がん患者）、若しくは膵がんを発症していない健常人群におけるＥＢＩ３の発現レベル、又は予後不良の患者群（予後が不良であった患者、予後が不良であろうことが知られている患者）におけるＥＢＩ３の発現レベルが挙げられる。
例えば、対象患者のＥＢＩ３の発現レベルが、予後良好の患者群又は健常人群における当該ＥＢＩ３の発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより高い場合には、当該患者の予後は良好であると評価できる。
尚、比較対象となる患者におけるＥＢＩ３の発現レベルは、例えば、本発明の方法により、又は既に予後が判明している患者由来の試料におけるＥＢＩ３の発現レベルを測定すること等により知ることができる。
【００２７】
また、本発明における予後の評価は、ＥＢＩ３の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、対照レベルとして、ＥＢＩ３遺伝子又はＥＢＩ３の発現量の中央値を閾値レベル（カットオフ値）に設定し、患者由来の生体試料におけるＥＢＩ３の発現レベルを閾値レベルと比較することにより行うことができる。また、膵がん組織におけるＥＢＩ３の発現レベルの上昇／減少は、膵がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数の増加／減少、或いは発現領域の拡大／縮小を指標とすることができる。そして、患者由来の生体試料におけるＥＢＩ３の発現レベルが閾値レベルより高い場合に、当該患者の予後が良好であると評価できる。
閾値レベルは、例えば、膵がん組織に浸潤するＥＢＩ３発現細胞数の増加（発現領域の拡大）を指標とした場合、ＥＢＩ３発現細胞数の対物レンズ×２０の５視野での合計(例えば３回の平均)が２細胞以上、のように設定することができる。
【００２８】
本発明の膵がんの予後を評価するための検査用キットは、ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体、又はＥＢＩ３ｍＲＮＡ若しくはＥＢＩ３遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含有するものである。
すなわち、当該検査用キットは、患者から分離した生体試料におけるＥＢＩ３の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、ＥＢＩ３と特異的に結合する抗体（抗ＥＢＩ３抗体）を含む、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、イムノクロマト、免疫組織化学用の試薬、又はＥＢＩ３ｍＲＮＡ若しくはＥＢＩ３遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬等が挙げられる。当該キットに包含される抗ＥＢＩ３抗体、ＥＢＩ３遺伝子又はｍＲＮＡと特異的に結合する核酸は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜症例＞
以下に示す膵がん外科切除症例の３つのコホートを用い、実施例１〜２に示す膵がん組織に発現するEBI3の転写レベル及び蛋白質レベルでの発現量の測定、並びに生存解析を行った。
コホート１(スクリーニング用): 2002-2005年国立がん研究センター中央病院で外科的に切除された約120症例。
コホート２(検証用): 2006-2008年国立がん研究センター中央病院で外科的に切除された約150症例。
コホート３(検証用): 1990-2001年国立がん研究センター中央病院で外科的に切除された約120症例)。
【００３０】
実施例１  EBI3遺伝子発現と患者予後の相関
（１）EBI3遺伝子発現量の測定
外科切除された膵がん新鮮凍結組織から全RNAを抽出後、逆転写反応で得られたシングルストランドcDNAを鋳型にして、以下のPCRプライマーを用い、定量的RT-PCR法を用いて遺伝子を増幅し、EBI3遺伝子の発現量を測定した。定量的RT-PCRはロシュ・アプライド・サイエンス社のUniversal ProbeLibraryシステムにより実施し、コントロールとして、ACTB遺伝子の発現量を測定し、比較した。
EBI3: 5' primer, gAAgTACTggATCCgTTACAAgC（配列番号３）
3' primer, gAAggACgTggCTTCAATg（配列番号４）
probe #24
ACTB: 5' primer, CCAACCgCgAgAAgATgA（配列番号５）
3' primer, TCCATCACgATgCCAgTg（配列番号６）
probe #64
PCRの条件：95℃  10秒、[95℃  15秒、60℃  1分]x40サイクル
【００３１】
（２）生存解析  コホート1を用いて、EBI3遺伝子の発現量の中間値を以て、高発現・低発現の２群に患者を分け、Kaplan-Meier法およびCox比例ハザードモデルを用いた生存解析方法により、EBI3遺伝子の発現と患者生命予後との関係を検討した。
コホート1を用いた解析で得られた結果を、同様の方法にてコホート2を用いて検証した。
【００３２】
（３）結果
１）コホート1を用いたKaplan-Meier法による生存解析の結果を図２に示す。
EBI3遺伝子発現の高い症例群は低い症例群に比べて、有意に長い生存率＜overall survival (OS)＞ (P = 0.003)および無再発生存率＜disease-free survival (DFS)＞ (P = 0.016)が示された。また、この結果はコホート2を用いて確認された。[OS, P = 0.0003; DFS, P = 0.003]
【００３３】
２）Cox比例ハザードモデルを用いた単変量・多変量解析の結果を表１及び表２に示す。
表１及び表２より、EBI3遺伝子発現は生存に関わる有意な因子であることが確認された[OS, HR 2.079, 95%CI 1.290-3.349, P = 0.003; DFS, HR 1.659, 95%CI 1.067-2.579, P = 0.025]。また、この結果はコホート2を用いて確認された[OS, HR 2.353, 95%CI 1.484-3.729, P = 0.0002; DFS, HR 1.530, 95%CI 1.016-2.305, P = 0.042]。
【００３４】
【表１】
2016154447.tif 000002
【００３５】
【表２】
2016154447.tif 000003
【００３６】
３）以上より、膵がん組織におけるEBI3遺伝子発現は独立した予後因子と考えられる。
【００３７】
実施例２  EBI3の蛋白質発現と患者予後の相関
（１）EBI3に対するモノクローナル抗体の作成
全長ヒトEBI3を哺乳動物細胞・大腸菌に発現させ、精製したEBI3をマウスに免役し、通常の方法によりハイブリドーマを作成後、ELISA, Western blot, ホルマリン固定パラフィン包埋リンパ節組織に対する免疫組織化学をスクリーニング方法として用いて、EBI3に特異的なモノクローナル抗体(クローンE32-8, IgG1 K; クローンE25-2, IgG1 K)を確立した。
【００３８】
（２）免疫組織化学
免疫組織化学は4ミクロン厚のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を使い、Tris/EDTA(pH8.0)バッファー液中で121℃10分間オートクレーブによる抗原賦活化処理の後、抗EBI3抗体(1000倍希釈)を4℃8時間反応し、ビオチン化抗マウスイムノグロブリン抗体と1時間反応、Vector社ABC試薬と30分間反応後、Diaminobenzidine試薬により発色した。EBI3発現陽性コントロール細胞である非腫瘍部リンパ節内の樹状細胞と対比して染色性の有無を判定した。
【００３９】
（３）生存解析
コホート3を用いて、膵がん組織にEBI3の免疫組織化学を実施した後、腫瘍に浸潤するEBI3発現細胞数を測定し、その中間値を以て、患者をEBI3発現細胞浸潤の多い群・少ない群の２群に分け、Kaplan-Meier法によりEBI3の発現と患者生命予後との関係を検討した。
＜参考カットオフ値＞
腫瘍最大割面  対物レンズx20の5視野合計(3回の平均)
EBI3陽性細胞が2細胞未満：low group
EBI3陽性細胞が2細胞以上：high group
また、Cox比例ハザードモデルを用いた生存解析方法により、EBI3の発現と患者生命予後との関係を検討した。
【００４０】
（４）結果
１）（１）で確立された抗EBI3抗体を用いた免疫組織化学の結果、膵がん組織中でEBI3は樹状細胞に強く発現し、一部のマクロファージに弱く発現していた。一方、EBI3は膵がん細胞に発現していなかった（図３）。図３(A)より、EBI3発現細胞(茶色)は、高発現の樹状細胞と低発現のマクロファージが示唆される。また、図３(B)より、EBI3発現細胞(赤紫色)は、成熟骨髄性樹状細胞を示すCD208(茶色)を発現していた。
【００４１】
２）コホート3を用いたKaplan-Meier法による生存解析の結果を図４に示す。
膵がん組織に浸潤するEBI3発現細胞数と患者予後との関係は、EBI3発現細胞の浸潤の多い群が少ない群に比べて、有意に長いOS (P = 0.006)およびDFS (P = 0.004)を示した（図３）。
【００４２】
３）Cox比例ハザードモデルを用いた単変量・多変量解析の結果を表３及び表４に示す。
表３及び表４より、膵がん組織へのEBI3発現細胞数は生存に関わる有意な因子であることが示された[OS, HR 1.765, 95%CI 1.141-2.728, P = 0.011; DFS, HR 2.041, 95%CI 1.314-3.169, P = 0.002]。
【００４３】
【表３】
2016154447.tif 000004
【００４４】
【表４】
2016154447.tif 000005
【００４５】
４）以上より、膵がん組織における腫瘍に浸潤するEBI3発現細胞数は、独立した予後因子と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の方法によれば、膵がんと診断された患者について、膵がん検体等を用いることにより、予後を予測することができ、適切な治療方針を立てることが可能になる。すなわち、予後不良と評価された患者については、積極的な治療戦略（例えば、強化化学療法や放射線療法）を選択する必要性が判断でき、予後良好と判定された患者はより緩和された治療戦略を選択できる。また、本発明の方法は、膵がんの状態又は進行をモニターすることにも利用できる。すなわち、ＥＢＩ３発現レベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性の変化を評価することができる。例えば、継時的にＥＢＩ３発現レベルを測定することにより、患者の予後予測の変化を知ることができる。
【図１】
2016154447.tif 000006
【図２】
2016154447.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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