(57)【要約】【課題】  一定温度でＲＮＡを増幅する方法において、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供すること。【解決手段】  ５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことで、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項２】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項３】
以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）温度を上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）前記（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項４】
標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ（１）の工程の前に、温度を上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする工程を行なう、請求項１から３のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項５】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１から４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項６】
ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、請求項１から５のいずれかに記載の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる標的核酸を特異的に増幅し、検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染症の検査において、試料中に含まれるウイルス核酸を検出する方法を採用する場合、一般に前記試料中に含まれるウイルス核酸が極微量であることから、前記ウイルス核酸を増幅し検出する方法が用いられる。
【０００３】
核酸を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有する一組のプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性−プライマーアニール−伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことによってＤＮＡを増幅する方法である。また標的核酸がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲ法を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が知られている。しかし、ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法は急激に何度も反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００４】
一方、ＲＮＡを標的として一定温度で核酸を増幅する方法としてＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった方法が知られている。これらの方法は、反応温度を昇降させることなく一定温度で核酸が増幅するため、簡便に核酸を増幅することができる。そのため自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化ができる点で好ましい方法といえる。しかしながら標的核酸がＤＮＡの場合、これらの方法による核酸増幅は困難であった。
【０００５】
特許文献５では、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が有する鎖置換活性を用いることで、ＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡの増幅および検出を実現している。しかしながら操作が煩雑（３７℃で２時間保温後、−２０℃に凍結し、その後ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法で検出）であり、最小検出感度も１０６コピー／テストと不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特許第３００２２５９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法において、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことで、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第二の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第三の態様は、以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）温度を上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）前記（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第四の態様は、標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ（１）の工程の前に、温度を上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする工程を行なう、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の増幅方法である。
【００１１】
また本発明の第五の態様は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の増幅方法である。
【００１２】
さらに本発明の第六の態様は、ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明における標的核酸とは、試料中に含まれる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、本発明の増幅方法により増幅される領域のことをいう。
【００１５】
本発明において、相補的な配列を有するとは、標的核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、相同的な配列を有するとは、標的核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。
【００１６】
本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。なお第一または第二のプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合の一例として、配列番号１１に記載の配列からなるＴ７プロモータがあげられる。
【００１７】
本発明ではＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素も用いる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性の全てを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が好ましい。
【００１８】
本発明の核酸増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。温度を上昇させる条件は、二本鎖核酸を解離可能な温度条件とすればよく、二本鎖核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は６０℃以上とすればよいが、８０℃以上とすると好ましく、８５℃以上とするとさらに好ましい。温度を上昇させる操作に特に限定はなく、例えばヒートブロックを用いた温度上昇があげられる。また温度を上昇させる操作を行なう際、さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）といった溶媒の極性を下げる薬剤などを添加することで、二本鎖核酸の解離を促進してもよい。前記薬剤を添加した場合の温度条件は、４０℃以上であればよく、４５℃以上（例えば４６℃）であればさらによい。なお二本鎖核酸の解離は、二本鎖核酸の長さ、二本鎖核酸のＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することで二本鎖核酸の解離を促進してもよい。二本鎖核酸が解離する条件の例として、本明細書の実施例に記載の条件があげられる。
【００１９】
温度を上昇させたままの状態を維持すると、プライマーと一本鎖核酸とがアニールせず、標的核酸の増幅が進まないため、一本鎖核酸とする工程を行なった後は、プライマーと一本鎖核酸とがアニールする条件まで温度まで下降させる。温度を下降させる操作に特に限定はなく、例えば反応容器を氷水につける操作や、等温増幅法を実施する温度に保温したヒートブロックに反応容器を載置する操作があげられる。なおプライマーと一本鎖核酸とのアニールは、反応温度、溶媒の極性、プライマーの長さ、プライマーのＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することでアニールを促進してもよい。
【００２０】
本発明の増幅方法は、鋳型核酸の形態により異なる。鋳型核酸が標的核酸の相補鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ａ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（Ａ−２）温度を上昇させることで、前記（Ａ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ａ−３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ａ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ａ−５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ａ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ａ−７）前記（Ａ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が標的核酸の相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｂ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−２）温度を上昇させることで、前記（Ｂ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｂ−３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｂ−５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｂ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｂ−７）前記（Ｂ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が一本鎖ＲＮＡの相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｃ−１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−４）温度を上昇させることで、前記（Ｃ−３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｃ−５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｃ−７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ−８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−９）前記（Ｃ−８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。
【００２１】
なお標的核酸が二本鎖核酸の場合は、前記二本鎖核酸を含む溶液の温度を上昇させて、一本鎖核酸とする工程を行なった後、当該一本鎖核酸の態様に応じて、前記（Ａ−１）、前記（Ｂ−１）、前記（Ｃ−１）のいずれかの工程を行なえばよい。なお前記工程は、例えば、試料からの標的核酸の抽出工程といった予備操作における最終工程で、標的核酸を含む溶液をヒートブロック上で加温させることで行なってよい。
【００２２】
本発明の増幅方法で増幅した標的核酸（ＲＮＡ転写産物）を検出することで、試料中に含まれる標的核酸の有無を検出することができるが、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。本発明により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法であっても、標的核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に標的核酸を増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）と、実施例で使用したプライマー／プローブの塩基配列との関係を示した図である。図中、Ｆ−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ１は配列番号９の相補鎖、Ｒ−１は配列番号７の相補鎖、Ｆ−２−１は配列番号３、Ｆ−２−２は配列番号５、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号１０の相補鎖、Ｒ−２は配列番号８の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。なお本実施例で使用したプライマー／プローブの、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）における位置関係を図１に示す。
【００２６】
実施例１  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡの調製
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社より購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出することで、ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を得た。以降、抽出試料中に含まれるＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数は、抽出効率を１００％とし、１ＩＵを約６コピーとして計算した。
【００２７】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号９に記載の配列の５’末端から１７番目のＧと１８番目のＡの間、および配列番号１０に記載の配列の５’末端から５番目のＴと６番目のＡの間に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させた、オキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図２）。
【００２８】
実施例３  等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出
下記に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの組合せ（以下、オリゴヌクレオチド組合せという）を用いて、等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて１６７ＩＵ／５μＬ、１６．７ＩＵ／５μＬ、１．６７ＩＵ／５μＬまたは０．１６７ＩＵ／５μＬとなるよう希釈し、これらをウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ溶液５μＬを添加した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、以下の（Ａ）から（Ｃ）に示す組合せを使用した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後の反応液（３０μＬ）における最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
６１．７ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー
１μＭ  第二のプライマー
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）
１０．５％  ＤＭＳＯ
［オリゴヌクレオチド組合せ］
（Ａ）第一のプライマー：配列番号２（配列番号１の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号７、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号９
（Ｂ）第一のプライマー：配列番号４（配列番号３の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号８、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１０
（Ｃ）第一のプライマー：配列番号６（配列番号５の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号８、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１０
（３）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、下記の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
［酵素液の組成］
２５ｗｔ％  グリセロール
４００ｍＭ  トレハロース
２００ｍＭ  塩化カリウム
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００２９】
結果を表１に示す。等温増幅法により、前記（Ａ）の組合せでは１６７ＩＵ／テスト（１０００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを、前記（Ｂ）および（Ｃ）の組合せでは１６．７ＩＵ／テスト（１００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを、それぞれ２０分以内に検出することができた。
【００３０】
【表１】
2016007176.tif 000002
【００３１】
実施例４  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その１）
実施例３において等温増幅法によりＨＢＶ  ＤＮＡの検出が確認できた、前記（Ａ）から（Ｃ）のオリゴヌクレオチド組合せを用いて、ＰＣＲ法と等温増幅法とを組み合わせたＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）１．０μＭの第一のプライマーと１．０μＭの第二のプライマーと０．７５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む１５μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、９４℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で２０秒からなるＰＣＲを１サイクルまたは２サイクル実施した。
（２）以下の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後の反応液（３０μＬ）における最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．４３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１．２μＭ  第一のプライマー
１．２μＭ  第二のプライマー
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（３）（２）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３２】
結果を表２に示す。前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いて、ＰＣＲを１サイクル以上行ない、その後等温増幅を行なうことで、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを１０分以内に検出することができた。すなわち等温増幅を行なう前に温度を上昇させる操作を行なうことで、非常に高感度な検出系を構築できることがわかる。
【００３３】
【表２】
2016007176.tif 000003
【００３４】
実施例５  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その２）
実施例４ではＰＣＲ法（温度サイクル）と等温増幅法とを組み合わせることで、ＨＢＶ  ＤＮＡを高感度に検出することを実現したが、温度サイクルの代わりに一定温度で加熱してもＨＢＶ  ＤＮＡを高感度に検出できるか検討した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いた。
（１）１．０μＭの第一のプライマーと１．０μＭの第二のプライマーと０．７５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む１５μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、ヒートブロックを用いて９４℃で２分間加熱した。
（２）実施例３（２）に記載の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
（３）（２）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３５】
結果を表３に示す。前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いて、９４℃で加熱し、その後等温増幅を行なうことで、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを１０分以内に検出することができた。すなわち温度サイクルの代わりに一定温度で加熱しても、非常に高感度な検出系を構築できることがわかる。
【００３６】
【表３】
2016007176.tif 000004
【００３７】
実施例６  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その３）
実施例５では等温増幅を行なう前に一定温度で加熱する操作を行なうことで、ＨＢＶ  ＤＮＡを高感度に検出することを実現したが、前記操作における好ましい加熱温度の範囲を検討した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）１．０μＭの第一のプライマー（配列番号４）と１．０μＭの第二のプライマー（配列番号８）と０．７５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを含む１０μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、ヒートブロックを用いて９４℃、９０℃、８５℃、８０℃または４６℃で２分間加熱した。
（２）以下の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．４３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１．２μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
１．２μＭ  第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（３）（２）の反応液を、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３８】
結果を表４に示す。８５℃以上で加熱すれば、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを検出できることがわかる。
【００３９】
【表４】
2016007176.tif 000005
【００４０】
実施例７  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その４）
実施例４から６では二本鎖ＤＮＡの合成にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたが、本実施例ではＡＭＶ逆転写酵素が有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて二本鎖ＤＮＡの合成を行なった後、等温増幅法を適用させた。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）以下の組成となるよう反応液１９μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、以下の組成の第一酵素液４μＬを添加した。
［第一酵素液の組成］
２５ｗｔ％  グリセロール
４００ｍＭ  トレハロース
２００ｍＭ  塩化カリウム
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
（３）９４℃で２分間加熱し、４６℃に温度を下げてから２分後、以下の組成の第二酵素液２μＬを添加した。
［第二酵素液の組成］
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００４１】
結果を表５に示す。本発明の増幅方法において、二本鎖ＤＮＡの合成酵素（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）としてＡＭＶ逆転写酵素を用いても、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを１５分以内に検出できることがわかる。
【００４２】
【表５】
2016007176.tif 000006
【００４３】
実施例８  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その５）
実施例７では二本鎖ＤＮＡの合成後、ＡＭＶ逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼを添加して等温増幅させたが、本実施例では、等温増幅させる前にＡＭＶ逆転写酵素をさらに添加した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）以下の組成となるよう反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
（反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例７（２）に記載の組成からなる第一酵素液４μＬを添加した。
（３）９４℃で２分間加熱後、４６℃で２分間保温し、６．４ＵのＡＭＶ逆転写酵素を含む酵素液２μＬを添加して１５分反応させ、さらに実施例７（３）に記載の組成からなる第二酵素液２μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００４４】
結果を表６に示す。本発明の増幅方法において、等温増幅させる前にＡＭＶ逆転写酵素
をさらに添加することで、最小検出感度が０．１６７ＩＵ／テスト（１コピー／テストに相当）と、これまでの実施例と比較し向上した。また１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）の検出時間も、ＡＭＶ逆転写酵素を等温増幅前に添加しない実施例７（１１．１分）（表５）と比較し、向上（６．２分）していることがわかる。
【００４５】
【表６】
2016007176.tif 000007
【図１】
2016007176.tif 000008
【図２】
2016007176.tif 000009
【配列表】
2016007176000001.app