(57)【要約】【課題】皮膚におけるセラミド量を増大させる。【解決手段】グリコーゲンからなるセラミド産生促進剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲンからなるセラミド産生促進剤。
【請求項２】
皮膚に塗布することで皮膚におけるセラミドの産生を促進する、請求項1に記載のセラミド産生促進剤。
【請求項３】
セラミド合成酵素の発現量を増大し、及び／又は、セラミド分解酵素の発現量を減少させることでセラミド量を増大させる、請求項1又は2に記載のセラミド産生促進剤。
【請求項４】
前記グリコーゲンが酵素合成グリコーゲン（ESG）であることを特徴とする請求項１〜３に記載のセラミド産生促進剤。
【請求項５】
グリコーゲンを含む、皮膚においてセラミド産生を促進するための皮膚外用剤。
【請求項６】
グリコーゲンを0.2重量％〜2重量％含む、請求項５に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
前記グリコーゲンがESGであることを特徴とする請求項５又は６に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミド産生促進剤及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のセラミドは強力な保湿作用及び皮膚のバリア機能を改善することが知られている。皮膚セラミドを増やすためは、１）セラミド本体を配合した化粧品などの皮膚外用剤を皮膚に塗布すること、２）皮膚内でセラミド産生の促進効果が期待できる物質を含む皮膚外用剤を皮膚に塗布すること、３）セラミド本体を経口で摂取することなどが提案されている（非特許文献１〜５）
セラミド本体が皮膚から吸収されることは難しく、経口によるセラミド摂取方法は、消化管内で分解されるため皮膚におけるセラミド量の増加にはつながらないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Newsl. Chem. Soc. Japam Dov. Colloid Surf Chem. Vol. 32 No. 4 p. 2-6, 2007
【非特許文献２】J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. Vol. 43, No. 4 2009
【非特許文献３】JATAFF J. Vol. 2 No. 3 p.24-27, 2014
【非特許文献４】Cosmetic Stage Vol. 7 No. 5 p. 46-50, 2013
【非特許文献５】皮膚 Vol. 31 No. Suppl 6 p. 107-119, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、皮膚におけるセラミド産生を促進し、セラミド量を増大させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下のセラミド産生促進剤及び皮膚外用剤を提供するものである。
項１．  グリコーゲンからなるセラミド産生促進剤。
項２．  皮膚に塗布することで皮膚におけるセラミドの産生を促進する、項1に記載のセラミド産生促進剤。
項３．  セラミド合成酵素の発現量を増大し、及び／又は、セラミド分解酵素の発現量を減少させることでセラミド量を増大させる、項1又は2に記載のセラミド産生促進剤。
項４．  前記グリコーゲンが酵素合成グリコーゲン（ESG）であることを特徴とする項１〜３に記載のセラミド産生促進剤。
項５．  グリコーゲンを含む、皮膚においてセラミド産生を促進するための皮膚外用剤。
項６．  グリコーゲンを0.2重量％〜2重量％含む、項５に記載の皮膚外用剤。
項７．  前記グリコーゲンがESGであることを特徴とする項５又は６に記載の皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００６】
皮膚表皮脂質の主要構成成分であるセラミドは、皮膚の水分保持とバリア機能の両面で重要な役割を担っている細胞間脂質である。セラミドは、アトピー性皮膚炎などバリア機能が低下した乾燥性皮膚疾患での皮膚表皮で減少していることや、加齢にともなって減少することがこれまで報告されている。このような乾燥性皮膚疾患における皮膚表皮でのバリア機能の改善には、セラミドが有効であることが報告されている。本発明により、角化細胞のセラミド合成を促進し、セラミド量を増大させることができる。グリコーゲンを皮膚（皮膚三次元モデル）に塗布すれば角質内に浸透するので、グリコーゲンを含む皮膚外用剤を塗布することにより、角化細胞へ到達したグリコーゲンが角化細胞を刺激し、皮膚内のセラミド産生を促す。結果として皮膚内部でセラミド産生量が高まり、肌の潤いや肌バリア機能が向上し、乾燥肌、肌荒れなどに有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】培養したケラチノサイトにおける、ESGによるセラミド合成促進効果
【図２】培養した皮膚３次元モデルにおける、ESGによるセラミド合成促進効果
【図３】グリコーゲンによるセラミド代謝関連遺伝子の検出量。（A)セラミド分解系（スフィンゴミエリン合成酵素（SMS1, SMS2））；(B) セラミド合成系（スフィンゴミエリン分解酵素（aSＭase））
【図４】セラミド代謝図
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明で使用するグリコーゲンは、天然グリコーゲン、および、酵素を用いて砂糖やデンプンから合成されたグリコーゲンからなる群から選ばれる少なくとも１種である。天然グリコーゲンは、動物においては肝臓や筋肉に多く含まれ、その他にも、カキやホタテ、ホヤなどの貝類、スウィートコーンなどの植物、シアノバクテリアなどの微生物など、非常に幅広く存在している。産生生物種や抽出方法、また、季節や由来によってもグリコーゲンの物理化学的特徴および含有量が多少異なる。一方、ESGは、天然のグリコーゲンと比べると純度が高く、分子量の大きさも揃っているため、本発明に用いるグリコーゲンとしては、ESGがより好ましい。
【０００９】
ESGは、例えば砂糖にスクロースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.7）とα-グルカンホスホリラーゼ（EC 2.4.1.1）を作用させる方法（Ryoyama, K.; Kidachi, Y.; Yamaguchi, H.; Kajiura, H.; Takata, H. (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68, 2332-2340）、および短鎖のアミロースにブランチングエンザイム（EC 2.4.1.18）を作用させる方法（Kajiura, H.; Kakutani, R.; Akiyama, T.; Takata, H.; Kuriki, T. (2008) Biocatal. Biotransform., 26, 133-140）により製造できる。これらの方法で合成したESGは、天然グリコーゲンと類似した化学的構造、および物理的構造を持つことが知られており（Takata, H.; Kajiura, H.; Furuyashiki, T.; Kakutani, R.; Kuriki, T. (2009) Carbohydr. Res., 344, 654-659., Kajiura, H.; Takata, H.; Kuriki, T.; Kitamura, S. (2010) Carbohydr. Res., 345, 817-824）、これらの酵素合成グリコーゲンも本発明のグリコーゲンとして使用することができる。グリコーゲンの分子量は、1×106〜2×107程度のものが好ましく使用できるが、これよりも高分子量或いは低分子量のものも広く使用できる。
【００１０】
グリコーゲンはグルコースが主にα-1,4結合により連結し、部分的にα-1,6結合で枝分かれした構造をしている。このESGは主に分子量100〜1000万の成分を多量に含む。また天然由来成分であるうえに人体のさまざまな臓器に存在しているため、安全性が高く、長期間、連続的な使用が可能であるため、皮膚外用剤等に用いる医薬品組成物や化粧料に用いる化粧料組成物に好適に用いることができる。
【００１１】
セラミド産生促進剤の有効成分は、グリコーゲンである。グリコーゲンは経口投与すると消化管で分解されるので、非経口が望ましい。皮膚におけるセラミド産生を促進するためには、グリコーゲンを皮膚外用剤として適用するのが望ましいが、皮下又は皮内に注射により投与することで、皮膚におけるセラミド産生を促進することもできる。
【００１２】
皮膚外用剤としては、乳液、化粧水、クリーム、ファンデーション、エアゾール、パック、口紅、ボディパウダー、頭皮用トリートメントなどの化粧料の形態であってもよく、貼付剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、クリーム剤、テープ剤、パッチ剤、ローション剤、液剤、チック剤、ゲル剤などの医薬もしくは医薬部外品の形態であってもよい。
【００１３】
本発明の皮膚外用剤は、グリコーゲンを含有する。グリコーゲンの配合量は、皮膚外用剤全量に対し、０．０１重量％〜２０重量％、より好ましくは、０．１重量％〜１０重量％、さらに好ましくは、０．２〜２重量％含有することが好ましい。
【００１４】
セラミドは、ヒトの皮膚に対する保湿、柔軟、美白、抗炎症、抗酸化、血行促進等の効果を有し、本発明の皮膚外用剤及びセラミド産生促進剤は、セラミドに基づくこのような効果が期待できる。
【００１５】
本発明のセラミド産生促進剤及び皮膚外用剤で産生されるセラミドとしては、セラミド1、セラミド2、セラミド3、セラミド6などが挙げられ、特にセラミド2が挙げられる。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤にはグリコーゲンの他に、通常化粧料や医薬品／医薬部外品などに用いられる他の成分、例えば低級アルコール類・シリコーン類・油脂類・エステル油剤・ステロール類及びその誘導体・炭化水素類等の油性成分、油分、酸化防止剤、界面活性剤、保湿剤、湿潤材、香料、水、色剤、粉末、薬剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化・可溶化剤、増粘・ゲル化剤、防腐剤、殺菌剤、酸・アルカリ、紫外線吸収剤、抗炎症剤、美白剤、溶剤、角質剥離・溶解剤、消炎剤、清涼剤、収瞼剤、高分子粉体、ヒドロキシ酸・ビタミン類及びその誘導体類、糖類及びその誘導体類、有機酸類、酵素類、無機粉体類、などを必要に応じて適宜配合することができる。さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
（１）ケラチノサイトの培養方法
ケラチノサイトを以下のプロトコールに従い培養した。
【００１８】
なお、ケラチノサイトはヒト由来正常表皮ケラチノサイトを用いた。
・Day0  6well plate に1.5x 105 cells/wellのケラチノサイト播種
・Day3  ESGサンプルを培養液に添加（0.2重量％又は2重量％）
・Day10  脂質抽出
・培養培地:gibco EpiLife 成長因子(+)
・（一日おきに培地交換）
【００１９】
（２）脂質抽出方法
セラミドを含む脂質は、以下のプロトコールに従い上記（１）で培養したDay10のケラチノサイトから抽出した。
・PBS- 1mLで洗浄 (2回)
・蒸留水300μL添加後、スクレイパーで細胞を剥ぎとり回収。
・さらに蒸留水 300μL添加して残りを回収。計600μL
・MeOH 1500μL, CHCl3 750μL → 2分ボルテックス → CHCl3 750μL → ボルテックス → H2O 750μL →ボルテックス→ 2000rpm, 5min → クロロホルム層(下層)採取
・NOを充満させて脂質を固化する
【００２０】
（３）薄層クロマトグラフィー方法(セラミド分離法）
上記（２）で抽出された脂質について、以下の薄層クロマトグラフィー方法によりセラミドを分離した。
・薄層板  Merck Silica Gel60 HPT LC Plates (10x10)
・展開溶液  クロロホルム:メタノール:酢酸(190:9:1) ２回展開（30-35min x2)
・呈色方法:10%硫酸銅-8%リン酸の混合水溶液を噴霧し、乾燥後、180℃ 15min オーブンで焼析
・Std3調整: Ceramide2,3,6の混合物(10 mg/mLを等量混合） Std2: Std3を3倍希釈 Std1: Std2を3倍希釈
・試料調整: Control, ESG添加群の試料: クロロホルム:メタノール(2:1)溶液に上記（２）で抽出された脂質25μL添加してボルテックスしたもの
・スポット量: 3μL
【００２１】
結果を図1に示す。controlはESG不添加を意味する。図1の結果から、ケラチノサイト内のセラミドはESGの培地への添加により濃度依存的に増大することが明らかになった。
【００２２】
実施例２
（１）３次元モデル皮膚培養方法
３次元モデル皮膚はMatTek Corporation社製のEpi 200を使用した。Epi200は生きたヒト皮膚組織類似であり、表皮基本構造の基底層から顆粒層、有棘層、角層を有し、ヒト皮膚と類似の細胞間脂質組成を持つ。ヒト皮膚よりも高い再現性が報告されている。
【００２３】
以下のプロトコールに従い、３次元モデル皮膚培養を行った。
・Day0  培養開始
・Day1  1h 37℃でpre-incubateしたのち、カップ内にESGサンプル添加（0.2重量％又は2重量％）
・Day2  サンプル回収、脂質回収
脂質回収は、実施例１の（２）、（３）と同様にして行い、セラミドを分離した。結果を図２に示す。
【００２４】
セラミドは３次元モデル皮膚培養においても実施例１の培養ケラチノサイトと同様にESGの培地への添加によりESG不添加のcontrolと比較して濃度依存的に増大することが明らかになった。2%ESGの添加24時間後に、３次元皮膚におけるセラミド合成が約1.5倍に増加した。
【００２５】
実施例３
（１）培養方法
ケラチノサイトを以下のプロトコールに従い培養した。
【００２６】
なお、ケラチノサイトはヒト由来正常表皮ケラチノサイトを用いた。
・ケラチノサイトの培養  培地:gibco EpiLife 成長因子(+)
・Day3  ESG（2重量％）をサンプル添加
・Day10  RNA抽出
・培地:gibco EpiLife 成長因子(+)
・（一日おきに培地交換）
【００２７】
（２）RNA抽出方法
上記（１）で得られたケラチノサイトについて、以下の手順に従いRNAを抽出した。
Kit使用:QIAGEN RNeasy Mini Kit(250)
PBSでwash x1
Buffer RLT 350 μLを加えて細胞を剥がす
エッペンに移し、VoltexまたはPipetで懸濁
QIAshredderに移し、13000 rpm x 2min
濾液回収。70 % EtOH 350 μLを添加しPipetting後、RNeasy spin columnに滴下。
遠心したカラムにRW1 700 μLを滴下し遠心。カラムにRPE 500 μLを滴下し遠心。再度カラムにRPE 500 μLを滴下し遠心した後、最終的に蒸留水を添加し遠心後回収した。
得られたRNAはHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (ABI) を用いてDNAに変換した。リアルタイムPCRは、変換したDNAを用い、Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems), 各種プライマー（Forward, Reverse）, 蒸留水を懸濁させて、Applied Biosystems社の7500 Fast Real-Time PCR Systemを用いて解析した。
【００２８】
セラミド分解系（スフィンゴミエリン合成酵素（SMS1, SMS2））、セラミド合成系（スフィンゴミエリン分解酵素（aSＭase））について、mRNAの発現量を比較した。各発現量は、GAPDHを内部標準として補正した。結果を図３に示す。図３の結果から、ESGはセラミド分解系の発現量を抑制し、セラミド合成系の発現量を増大することで細胞内のセラミド量を増大することが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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