(57)【要約】【課題】  一定温度でＲＮＡを増幅する方法において、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供すること。【解決手段】  標的核酸の増幅に用いる、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の添加順を最適化することにより、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、
前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモータ配列を付加しており、かつ以下の（１）、（２）の順に酵素を添加する、前記方法。
（１）ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素
（２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
【請求項２】
標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、
前記第一のプライマーには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモータ配列を付加しており、かつ以下の（１）、（２）の順に酵素を添加する、前記方法。
（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素
（２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
【請求項３】
（１）に記載の酵素を添加した後、温度またはｐＨを上昇させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（１）に記載の酵素を添加し、温度またはｐＨを上昇させた後、さらに（１）に記載の酵素を添加する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ請求項１から４のいずれかに記載の方法を行なう前に、温度またはｐＨを上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする、標的核酸の増幅方法。
【請求項６】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、かつ請求項１から６のいずれかに記載の方法で増幅した標的核酸を前記プローブを用いて検出する、標的核酸の検出方法。
【請求項８】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の構成を少なくとも含む、標的核酸の増幅試薬。
（ｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ｄＮＴＰと、ＮＴＰとを含む基質試薬（ただし、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）
（ｉｉ）ＡＭＶ逆転写酵素を含む第一の酵素試薬
（ｉｉｉ）ＡＭＶ逆転写酵素と、前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを含む第二の酵素試薬
【請求項９】
請求項８に記載の試薬における（ｉ）の構成に、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んでなる、標的核酸の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる標的核酸を特異的に増幅する方法、および前記方法を利用した標的核酸を増幅する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染症の検査において、試料中に含まれるウイルス核酸を検出する方法を採用する場合、一般に前記試料中に含まれるウイルス核酸が極微量であることから、前記ウイルス核酸を増幅し検出する方法が用いられる。
【０００３】
核酸を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有する一組のプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性−プライマーアニール−伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことによってＤＮＡを増幅する方法である。また標的核酸がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲ法を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が知られている。しかし、ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法は急激に何度も反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００４】
一方、ＲＮＡを標的として一定温度で核酸を増幅する方法としてＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった方法が知られている。これらの方法は、反応温度を昇降させることなく一定温度で核酸が増幅するため、簡便に核酸を増幅することができる。そのため自動化の際の反応装置省力化や低コスト化ができる点で好ましい方法といえる。しかしながら標的核酸がＤＮＡの場合、これらの方法による核酸増幅は困難であった。
【０００５】
特許文献５では、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が有する鎖置換活性を用いることで、ＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡの増幅および検出を実現している。しかしながら操作が煩雑（３７℃で２時間保温後、−２０℃に凍結し、その後ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法で検出）であり、最小検出感度も１０６コピー／テストと不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特許第３００２２５９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法において、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、標的核酸の増幅に用いる、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の添加順を最適化することにより、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、
前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモータ配列を付加しており、かつ以下の（１）、（２）の順に酵素を添加する、前記方法である。
（１）ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素
（２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
また本発明の第二の態様は、
標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、
前記第一のプライマーには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモータ配列を付加しており、かつ以下の（１）、（２）の順に酵素を添加する、前記方法である。
（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素
（２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
また本発明の第三の態様は、前記（１）に記載の酵素を添加した後、温度またはｐＨを上昇させる、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第四の態様は、前記（１）に記載の酵素を添加し、温度またはｐＨを上昇させた後、さらに前記（１）に記載の酵素を添加する、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第五の態様は、標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法を行なう前に、温度またはｐＨを上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする、標的核酸の増幅方法。
【００１３】
また本発明の第六の態様は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の方法である。
【００１４】
さらに本発明の第七の態様は、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、かつ前記第一から第六の態様のいずれかに記載の方法で増幅した標的核酸を前記プローブを用いて検出する、標的核酸の検出方法である。
【００１５】
そして本発明の第八の態様は、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の構成を少なくとも含む、標的核酸の増幅試薬である。
（ｉ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ｄＮＴＰと、ＮＴＰとを含む基質試薬（ただし、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）
（ｉｉ）ＡＭＶ逆転写酵素を含む第一の酵素試薬
（ｉｉｉ）ＡＭＶ逆転写酵素と、前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを含む第二の酵素試薬
また本発明の第九の態様は、前記第八の態様に記載の試薬における（ｉ）の構成に、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んでなる、標的核酸の検出試薬である。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明における標的核酸とは、試料中に含まれる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、本発明の増幅方法により増幅される領域のことをいう。
【００１８】
本発明において、相補的な配列を有するとは、標的核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、相同的な配列を有するとは、標的核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。
【００１９】
本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。なお第一または第二のプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合の一例として、配列番号５に記載の配列からなるＴ７プロモータがあげられる。
【００２０】
本発明ではＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素も用いる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性の全てを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が好ましい。
【００２１】
本発明の核酸増幅方法は、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーおよび標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ただし、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）と、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素と、前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて標的核酸を増幅させる際、前記四種類の酵素の添加順を、鋳型核酸の態様により最適化することを特徴としている。
【００２２】
一例として鋳型核酸が標的核酸の相補鎖である場合は、第一のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加し、以下の（Ａ−１）、（Ａ−２）の順に酵素を添加すればよい。
（Ａ−１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素（鋳型核酸がＲＮＡの場合）またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（鋳型核酸がＤＮＡの場合）を有する酵素
（Ａ−２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、および前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
別の例として鋳型核酸が標的核酸の相同鎖である場合は、第二のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加し、前記（Ａ−１）、前記（Ａ−２）の順に酵素を添加すればよい。
【００２３】
さらに別の例として鋳型核酸が一本鎖ＲＮＡの相同鎖である場合は、第一のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加し、以下の（Ｂ−１）、（Ｂ−２）の順に酵素を添加すればよい。
（Ｂ−１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素
（Ｂ−２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、および前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
なお前記（Ａ−１）または前記（Ｂ−１）に記載の酵素を添加した後、温度またはｐＨを上昇させる工程を実施すると、前記酵素による反応で合成された標的核酸の二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡが容易に生成されるため好ましい。温度を上昇させる条件は、二本鎖核酸を解離可能な温度条件とすればよく、二本鎖核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は６０℃以上とすればよいが、８０℃以上とすると好ましく、８５℃以上とするとさらに好ましい。温度を上昇させる操作に特に限定はなく、例えばヒートブロックを用いた温度上昇があげられる。ｐＨを上昇させる条件は、二本鎖核酸を解離可能なｐＨ条件とすればよく、二本鎖核酸が二本鎖ＤＮＡの場合はｐＨ約９．２以上とすればよいが、ｐＨを１２以上とするとさらによい。ｐＨを上昇させる方法に特に限定はなく、例えば塩基性薬剤を添加すればよい。塩基性薬剤の一例として、水酸化カリウム水溶液があげられる。なお二本鎖核酸の解離は、二本鎖核酸の長さ、二本鎖核酸のＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することで二本鎖核酸の解離を促進してもよい。二本鎖核酸が解離する条件の例として、本明細書の実施例に記載の条件があげられる。
【００２４】
温度またはｐＨを上昇させたままの状態を維持すると、プライマーと一本鎖核酸とがアニールせず、標的核酸の増幅が進まないため、一本鎖核酸とする工程を行なった後は、プライマーと一本鎖核酸とがアニールする条件まで温度またはｐＨまで下降させる。温度を下降させる操作に特に限定はなく、例えば反応容器を氷水につける操作や、等温増幅法を実施する温度に保温したヒートブロックに反応容器を載置する操作があげられる。ｐＨを下降させる方法に特に限定はなく、例えば酸性薬剤を添加すればよい。酸性薬剤の一例として、塩酸があげられる。なおプライマーと一本鎖核酸とのアニールは、反応温度、溶媒の極性、プライマーの長さ、プライマーのＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することでアニールを促進してもよい。
【００２５】
なお前述した温度またはｐＨを上昇させる工程を行なった後、さらに前記（Ａ−１）または前記（Ｂ−１）に記載の酵素を添加すると、標的核酸の増幅効率が向上する（すなわち鋳型核酸が低コピー数であっても増幅できる）ため、好ましい。
【００２６】
本発明の核酸増幅方法において、標的核酸が二本鎖核酸の場合は、前記二本鎖核酸を含む溶液の温度またはｐＨを上昇させて、一本鎖核酸とする工程を行なった後、本発明の核酸増幅方法を適用させればよい。
【００２７】
本発明の増幅方法で増幅した標的核酸を検出することで、試料中に含まれる標的核酸の有無を検出することができるが、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の増幅方法は、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーおよび標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ただし、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）と、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素と、前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて標的核酸を増幅させる際、前記四種類の酵素の添加順を、鋳型核酸の態様により最適化することを特徴としている。本発明により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法であっても、標的核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に標的核酸を増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）と、実施例で使用したプライマー／プローブの塩基配列との関係を示した図である。図中、Ｆ−２−１は配列番号１、Ｐｒｏｂｅ２は配列番号４の相補鎖、Ｒ−２は配列番号３の相補鎖である。なお便宜上、第一のプライマーまたは第二のプライマーに付加される、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を除く。
【図２】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。なお本実施例で使用したプライマー／プローブの、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）における位置関係を図１に示す。
【００３１】
実施例１  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡの調製
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社より購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出することで、ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を得た。以降、抽出試料中に含まれるＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数は、抽出効率を１００％とし、１ＩＵを約６コピーとして計算した。
【００３２】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号４に記載の配列の５’末端から５番目のＴと６番目のＡの間に、リンカーを介してオキサゾールイエローを結合させた、オキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図２）。
【００３３】
実施例３  等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出
等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて１６７ＩＵ／５μＬ、１６．７ＩＵ／５μＬ、８．４ＩＵ／５μＬまたは１．６７ＩＵ／５μＬとなるよう希釈し、これらをウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後の反応液（３０μＬ）における最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
６１．７ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２（配列番号１の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号５）を付加したもの））
１μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（配列番号４）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、下記の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
［酵素液の組成］
２５ｗｔ％  グリセロール
４００ｍＭ  トレハロース
２００ｍＭ  塩化カリウム
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３４】
結果を表１に示す。等温増幅法により、１６．７ＩＵ／テスト（１００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ  ＤＮＡを１０分以内に検出することができた。
【００３５】
【表１】
2016007175.tif 000002
実施例４  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その１）
等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出において、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加する前に、ＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させた。
（１）以下の組成となるよう反応液１９μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度］
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（配列番号４）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、以下の組成の第一酵素液４μＬを添加した。
［第一酵素液の組成］
２５ｗｔ％  グリセロール
４００ｍＭ  トレハロース
２００ｍＭ  塩化カリウム
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
（３）４６℃で１５分間保温し、以下の組成の第二酵素液２μＬを添加した。
［第二酵素液の組成］
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３６】
結果を表２に示す。ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加する前に、ＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させることで、最小検出感度が８．４ＩＵ／テスト（５０コピー／テストに相当）と、実施例３と比較し向上した。
【００３７】
【表２】
2016007175.tif 000003
実施例５  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その２）
実施例４に記載の方法において、ＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させた後、温度を上昇させた。
（１）実施例４（１）に記載の組成となるよう反応液１９μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例４（２）に記載の組成からなる第一酵素液４μＬを添加した。
（３）９４℃で２分間加熱し、４６℃に温度を下げてから２分後、実施例４（３）に記載の組成からなる第二酵素液２μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００３８】
結果を表３に示す。ＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させた後、温度を上昇させることで、最小検出感度が１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）と、実施例３および４と比較し向上した。
【００３９】
【表３】
2016007175.tif 000004
実施例６  本発明の増幅方法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その３）
実施例５に記載の方法において、温度を上昇させた後、さらにＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させた。
（１）以下の組成の反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
（反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（配列番号４）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例４（２）に記載の組成からなる第一酵素液４μＬを添加した。
（３）９４℃で２分間加熱後、６．４ＵのＡＭＶ逆転写酵素を含む酵素液２μＬを添加して２分間保温し、さらに実施例４（３）に記載の組成からなる第二酵素液２μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
【００４０】
結果を表４に示す。本発明の増幅方法において、温度を上昇させた後、さらにＡＭＶ逆転写酵素を単独に添加し反応させることで、最小検出感度が０．１６７ＩＵ／テスト（１コピー／テストに相当）と、これまでの実施例と比較し向上した。また１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）の検出時間も、実施例５（１１．１分）（表３）と比較し、向上（６．２分）した。
【００４１】
【表４】
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【図１】
2016007175.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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