(57)【要約】【課題】従来の子宮内膜症の確定診断は患者に対する負担が大きい。【解決手段】  子宮内膜症を診断するための診断キットであって、被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出するためのメチル化検出手段を有する診断キット。【選択図】図１
2016077234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症を診断するための診断キットであって、
被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出するためのメチル化検出手段を有する診断キット。
【請求項２】
前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量を、前記子宮内膜症の病態指標として示す、請求項１に記載の診断キット。
【請求項３】
前記病態指標は、事前に設定したメチル化量の閾値に対する、前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量である、請求項２に記載の診断キット。
【請求項４】
前記閾値は、前記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に基づいて設定される、請求項３に記載の診断キット。
【請求項５】
前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含み、
前記Hyper-メチル化サイトは、
(1)  第一染色体の位置231820076、
(2)  第五染色体の位置65888284、
(3)  第六染色体の位置32552152、
(4)  第六染色体の位置32632694、
(5)  第十四染色体の位置70234741、及び
(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含み、
前記Hypo-メチル化サイトは、
(1)  第二染色体の位置43451868、
(2)  第二染色体の位置108157524、
(3)  第二染色体の位置124971544、
(4)  第四染色体の位置77997420、
(5)  第六染色体の位置32489203、
(6)  第六染色体の位置32522400、
(7)  第六染色体の位置32522872、
(8)  第六染色体の位置32552515、
(9)  第六染色体の位置32554385、
(10)  第六染色体の位置32557970、
(11)  第六染色体の位置32558175、
(12)  第六染色体の位置32607174、
(13)  第六染色体の位置32610971、
(14)  第十二染色体の位置125813494、
(15)  第十五染色体の位置66947066、
(16)  第十五染色体の位置90115219、及び
(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含む、請求項１から４のいずれかに記載の診断キット。
【請求項６】
前記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、前記Hyper-メチル化サイト及び前記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての前記メチル化サイトである、請求項５に記載の診断キット。
【請求項７】
前記メチル化量は、メチル化率である、請求項１から６のいずれかに記載の診断キット。
【請求項８】
前記体液試料は、血液である、請求項１から７のいずれかに記載の診断キット。
【請求項９】
被験体である哺乳動物の体液試料中のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を含む、子宮内膜症を診断するための診断マーカー。
【請求項１０】
前記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物から得られた体液試料中のDNAにおける前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に対する、前記被験体である哺乳動物の体液試料中のDNAにおける少なくとも１つの前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量を含む、請求項９に記載の診断マーカー。
【請求項１１】
前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含み、
前記Hyper-メチル化サイトは、
(1)  第一染色体の位置231820076、
(2)  第五染色体の位置65888284、
(3)  第六染色体の位置32552152、
(4)  第六染色体の位置32632694、
(5)  第十四染色体の位置70234741、及び
(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含み、
前記Hypo-メチル化サイトは、
(1)  第二染色体の位置43451868、
(2)  第二染色体の位置108157524、
(3)  第二染色体の位置124971544、
(4)  第四染色体の位置77997420、
(5)  第六染色体の位置32489203、
(6)  第六染色体の位置32522400、
(7)  第六染色体の位置32522872、
(8)  第六染色体の位置32552515、
(9)  第六染色体の位置32554385、
(10)  第六染色体の位置32557970、
(11)  第六染色体の位置32558175、
(12)  第六染色体の位置32607174、
(13)  第六染色体の位置32610971、
(14)  第十二染色体の位置125813494、
(15)  第十五染色体の位置66947066、
(16)  第十五染色体の位置90115219、及び
(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含む、請求項９又は１０に記載の診断マーカー。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、前記Hyper-メチル化サイト及び前記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての前記メチル化サイトである、請求項１１に記載の診断マーカー。
【請求項１３】
子宮内膜症の病態指標の検出方法であって、
被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出する工程を含む検出方法。
【請求項１４】
事前に設定したメチル化量の閾値に対して、前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が有意に変化しているか否かを判定する工程を更に含む、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記閾値は、前記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に基づいて設定される、請求項１３又は１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含み、
前記Hyper-メチル化サイトは、
(1)  第一染色体の位置231820076、
(2)  第五染色体の位置65888284、
(3)  第六染色体の位置32552152、
(4)  第六染色体の位置32632694、
(5)  第十四染色体の位置70234741、及び
(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含み、
前記Hypo-メチル化サイトは、
(1)  第二染色体の位置43451868、
(2)  第二染色体の位置108157524、
(3)  第二染色体の位置124971544、
(4)  第四染色体の位置77997420、
(5)  第六染色体の位置32489203、
(6)  第六染色体の位置32522400、
(7)  第六染色体の位置32522872、
(8)  第六染色体の位置32552515、
(9)  第六染色体の位置32554385、
(10)  第六染色体の位置32557970、
(11)  第六染色体の位置32558175、
(12)  第六染色体の位置32607174、
(13)  第六染色体の位置32610971、
(14)  第十二染色体の位置125813494、
(15)  第十五染色体の位置66947066、
(16)  第十五染色体の位置90115219、及び
(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、前記Hyper-メチル化サイト及び前記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての前記メチル化サイトである、請求項１６に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症の早期診断のための診断キット、診断マーカー及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性の子宮は、約4週間を1サイクルとする2つの女性ホルモン(エストロゲンとプロゲステロン)の分泌変化により変化が生じる。子宮は袋状の組織であり、その内側は子宮内膜で覆われている。子宮内膜にエストロゲンとプロゲステロンが作用すると、その厚さが増し、受精卵の着床(妊娠)が可能になる。妊娠が起こらない場合は、不要な子宮内膜は血液ととも剥離する(月経)。
【０００３】
子宮内膜は、通常、子宮の内側に存在するが、子宮内膜組織又は子宮内膜類似組織が子宮以外の部位に発生する場合がある。このような病態を子宮内膜症という。子宮内膜は、女性ホルモンにより変化するため、子宮内膜症の病変部位も同様に変化する。女性ホルモによる係る病変部位の変化は、出血、発熱、疼痛、不妊及び組織間の癒着等の症状を引き起こす。
【０００４】
子宮内膜症の発生機序は、明らかになっていない。また、子宮内膜症の根治療法は、確立していないため、子宮内膜症の治療は、対処療法に依存している。子宮内膜症は腹腔鏡手術及び組織診断等の確定診断によって確定されるため、子宮内膜症の診断は患者への負担が大きい。特許文献１には、被験者から採取された子宮内膜嚢胞に由来する上皮細胞を含む組織試料中の卵巣子宮内膜症関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、被験者の卵巣子宮内膜症組織を検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５３７０２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。第一に、子宮内膜嚢胞に由来する上皮細胞を被験者の病変部位から直接採取する必要があるため、上記文献記載の技術は、従来の確定診断同様に、患者に対する負担が大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上述の通り、従来の子宮内膜症の確定診断は患者に対する負担が大きいことに鑑みてなされたものであり、子宮内膜症の診断に有効性の高い診断キット、診断マーカー及び検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者は、従来の診断方法では、患者に対する負担が大きすぎるため、患者への負担が小さい診断マーカーを探索していた。本発明者は、これまで明らかにされていない末梢血DNAのメチル化と子宮内膜症との関係について着目し、子宮内膜症に特異的な末梢血DNAのメチル化領域の存在を想定して、診断分子マーカー候補となるメチル化DNA領域の選別抽出に挑戦した。子宮内膜症患者の末梢血DNAと健常者の末梢血DNAを用いて、網羅的DNAメチル化解析を試みた。DNAメチル化変動比率による絞り込みにより、特異的メチル化DNAの170領域を抽出した。これらの中から、診断分子マーカーとなり得る14遺伝子上に位置する23領域を特定することに成功した。これまで、子宮内膜症組織由来のDNAに基づいた診断マーカーの存在は明らかにされてきたが、本発明者は、末梢血DNAが子宮内膜症の診断マーカーとなり得ることを初めて明らかにした。以上の知見に基づいて、子宮内膜症の診断キット、診断マーカー及び検出方法を開発した。
【０００９】
本発明によれば、子宮内膜症を診断するための診断キットであって、被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出するためのメチル化検出手段を有する診断キットが提供される。体液中の子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量が、子宮内膜症を患う患者においては、変化していることが後述する実施例において実証されている。従って、この診断キットを用いることで、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断が可能になる。
【００１０】
本発明によれば、被験体である哺乳動物の体液試料中のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を含む、子宮内膜症を診断するための診断マーカーが提供される。この診断マーカーは、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断を可能とするマーカーとしての役割を果たすことが可能である。
【００１１】
また、本発明によれば、子宮内膜症の病態指標の検出方法であって、被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出する工程を含む検出方法が提供される。この検出方法によれば、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断が可能になる子宮内膜症の病態指標を検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Aは、解析した４８５５１２箇所のCpG配列を円グラフとして表している。この円グラフのうち、５６６箇所は、健常ボランティアのDNA(対照)と比較してDNAのメチル化率が４倍以上異なる子宮内膜症患者DNAのCpG配列である。図１Bは、図１Aの５６６箇所のCpG配列を円グラフとして表している。この円グラフのうち、２９９箇所はHyper-メチル化CpG配列であり、２６７箇所はHypo-メチル化CpG配列である。
【図２】図２は、コントロールDNAと比較してDNAメチル化率が６倍以上異なる子宮内膜症患者DNAのCpG配列(１７０箇所)を円グラフとして表している。この円グラフのうち、８７箇所はHyper-メチル化CpG配列であり、８３箇所はHypo-メチル化CpG配列である。
【図３】図３Aは、８７箇所のHyper-メチル化CpG配列に対するクラスター解析の結果である。図３Bは、８３箇所のHypo-メチル化CpG配列に対するクラスター解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
子宮内膜症
子宮内膜症は、子宮内膜組織又は子宮内膜類似組織が子宮以外の部位に発生する疾患であり、子宮内膜症の病変には、例えば、腹膜病変、卵巣チョコレート嚢胞及び癒着病変が含まれる。子宮内膜症は、臨床診断（例えば、問診、外診、内診、直腸診、超音波断層撮影及び核磁気共鳴画像診断撮影（MRI））及び確定診断（例えば、腹腔鏡手術及び組織診断）によって診断されている。「子宮内膜症組織」なる用語は、子宮以外の部位に形成された子宮内膜組織又は子宮内膜に類似した組織を指す。「子宮内膜症関連」なる用語は、「少なくても子宮内膜症に関係する」を意味する用語であり、他の疾患を排除するものではない。
【００１４】
メチル化
「メチル化」なる用語は、種々の基質に対するメチル基の修飾を指す。メチル化には、DNAのメチル化、RNAのメチル化及びタンパク質のメチル化が含まれるが、別途指示がない限り、本明細書においてはDNAのメチル化を指す。動物でのDNAのメチル化は、シトシン-リン酸-グアニン(CpG)配列のシトシンが5-メチルシトシンに転換されることによって生じる。植物のDNAでは、CpNpG配列のシトシンがメチル化される。CpG配列は、ヒトゲノム上に約50万箇所存在し、そのほとんどがメチル化されていると考えられている。CpG配列は、遺伝子のプロモーター付近に高頻度に存在しており、CpG配列が高頻度に存在する領域はCpGアイランドと呼ばれている。CpGアイランド」は、（１）０．６を超えた「実測値／期待値の比」に対応するCpGジヌクレオチド頻度を有し、且つ（２）「ＧＣ含量」が０．５を超える基準を満たすゲノムＤＮＡの連続した領域を表す。ＣｐＧアイランドの長さは、典型的には、約０．２ｋｂ〜約１ｋｂ又は約２ｋｂである。プロモーター領域又はその近傍に存在するCpGアイランドがメチル化されると、遺伝子の転写が抑制されると考えられている。
【００１５】
メチル化サイト
「メチル化サイト」なる用語は、本願明細書において、メチル化に関係するゲノム上の位置を意味し、特定の条件下でメチル化されるサイト及びメチル化されないサイトも含まれる。本明細書において、「メチル化サイト」なる用語と「メチル化領域」なる用語は、互いに置換可能である。また、メチル化サイトは、CpG配列のシステインと表現することも可能である。本願明細書において、本来メチル化されるが特定の条件下ではメチル化されないサイトをHypo-メチル化サイトと称し、本来メチル化されないが特定の条件下ではメチル化されるサイトをHyper-メチル化サイトと称する。本明細書において、特定の条件には、子宮内膜症が含まれる。
【００１６】
哺乳動物
「哺乳動物」なる用語は、本願明細書において、任意の哺乳動物をいい、ヒ卜、家畜用動物、ペット用動物、動物園用動物、又はスポーツ用動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブ夕、ウマ、ヒツジ、ウサギ等を含む。哺乳動物は、好ましくはヒ卜である。
【００１７】
定量的に検出
「定量的に検出」なる用語は、本願明細書において、例えば、濃度、強度、泳動度、移動度等の数値データに基づく検出を意昧したり、濃度の調節、検出感度の調節、閾値の設定等による数値データの有無に基づく検出を意昧したりする。
【００１８】
概要
以下、本発明の実施の形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００１９】
＜実施形態１：診断キット＞
本実施形態は、子宮内膜症を診断するための診断キットであって、被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出するためのメチル化検出手段を有する診断キットである。この診断キットを用いることで、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断が可能になる。
【００２０】
本実施形態における「子宮内膜症関連DNAメチル化サイト」は、子宮内膜症を患っている患者においてメチル化の状態が変化するDNA上のサイト（位置）である。かかるサイトは、特定の遺伝子上に存在してもよく、特定の遺伝子のプロモーター上に存在してもよい。かかるサイトは、遺伝子間領域に存在してもよい。後述する実施例において実証されている通り、子宮内膜症を患っている患者においては、体液中の子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が変化している。子宮内膜症に関連するDNAメチル化サイトのメチル化の有無によって、子宮内膜症の可能性が高いと判断される。メチル化の有無は、上記DNAメチル化サイトがHypo-メチル化サイトであれば子宮内膜症の患者はメチル化されておらず、Hyper-メチル化サイトであれば子宮内膜症の患者はメチル化されていることから判断が可能である。しかしながら、これに限られず、子宮内膜症に関する他の症状・状態に関しても、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって測定し、本実施形態に係る診断キットを用いてそれらの病態指標を得ることは容易に可能である。
【００２１】
本実施形態における「メチル化検出手段」は、複数の検出手段であってもよい。複数の検出手段は、例えば多面的な解析のために互いに異なる検出手段、例えば統計学的に信頼性のあるデータを得る目的で同一若しくは類似の検出手段又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００２２】
メチル化の検出には、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、亜硫酸水素塩シークエンシング、ＰＣＲと組み合わせたメチル化感受性制限酵素による消化、混合性亜硫酸水素塩切断解析（ＣＯＢＲＡ）及びメチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ-ＳＮｕＰＥ）のような質的なおよび／または定量的なＰＣＲに基づいた技術を使用してもよい。このような技術を応用した装置は、メチル化検出手段の一例である。
【００２３】
本実施形態における「体液」は、血液、尿、唾液及び滲出液を含むが、検出可能なDNAが含まれていればこれらに限定されない。本実施形態において体液は、好ましくは血液である。
【００２４】
本実施形態の診断キットでは、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量を、上記子宮内膜症の病態指標として示してもよい。ある特定のメチル化サイトにおけるメチル化の状態は、かかる特定のメチル化サイトを複数含むDNAサンプル中におけるメチル化サイトと非メチル化サイトの量的な比率として表すことが可能である。従って、メチル化の状態は、メチル化量的な変化によって判断することが可能である。後述する実施例において実証されている通り、子宮内膜症を患っている患者においては、体液中の子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が変化している。従って、例えば、上記メチル化サイトのメチル化量を定量的に検出して、変化が確認された場合、子宮内膜症の可能性が高いと判断される。
【００２５】
本実施形態における「子宮内膜症の病態指標」とは、例えば、子宮内膜症又は子宮内膜症関連疾患を含めた子宮内膜症の状態に関する指標のことをいう。ここで、子宮内膜症の病態指標とは、例えば、子宮内膜症の発症危険度の予測、子宮内膜症の早期診断・早期予知、子宮内膜症進行度の推定、病態把握、経過の予測、治療結果の観察・評価、予後の予測等の指標を含む。また、子宮内膜症の病態指標は、複数組み合わせることも可能である。これにより、より確実な診断結果を得ることができる。上記症状及びその症状を表すパラメータ一等に関しては、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。
【００２６】
本実施形態における「有意」とは、p値(U検定、両側検定)が好ましくは<0.05、より好ましくは<0.01、最も好ましくは<0.001を意昧する。
【００２７】
本実施形態の診断キットでは、上記病態指標は、事前に設定したメチル化量の閾値に対する、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量であってもよい。閾値と対比することによって、迅速且つ正確に子宮内膜症を診断することが可能になる。
【００２８】
例えば、Hypo-メチル化サイトとしての前記DNAメチル化サイトのメチル化量が閾値より有意に減少している場合は、被験体は子宮内膜症の可能性が高いと診断される。また、Hyper-メチル化サイトとしての前記DNAメチル化サイトのメチル化量が閾値より有意に増加している場合は、被験体は子宮内膜症の可能性が高いと診断される。しかしながら、これに限られず、子宮内膜症に関する他の症状・状態に関しても、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって測定し、本実施形態に係る診断キットを用いてそれらの病態指標を得ることは容易に可能である。
【００２９】
本実施形態における「閾値」は、予測値であってもよく、好ましくは予め測定しておいた値である。予め測定しておいた値を使用する場合は、被験体と同一種の健常な哺乳動物が好ましい。
【００３０】
本実施形態の診断キットでは、上記閾値は、上記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に基づいて設定されてもよい。被験体と同一種の健常な哺乳動物由来の上記メチル化量をコントロールとして採用することで、確実に子宮内膜症を診断することが可能になる。
【００３１】
例えば、Hypo-メチル化サイトとしての上記DNAメチル化サイトのメチル化量が上記健常な哺乳動物由来の上記メチル化量より有意に減少している場合は、被験体は子宮内膜症の可能性が高いと診断される。また、Hyper-メチル化サイトとしての上記DNAメチル化サイトのメチル化量が上記健常な哺乳動物由来の上記メチル化量より有意に増加している場合は、被験体は子宮内膜症の可能性が高いと診断される。なお、閾値は、以前に被験体から取得したメチル化量であってもよい。例えば、被験体が健常であった頃のメチル化量を閾値とすることによって、メチル化量の経時的な変化を検出することが可能になり、より正確に子宮内膜症を診断することが可能になる。しかしながら、これに限られず、子宮内膜症に関する他の症状・状態に関しても、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって測定し、本実施形態に係る診断キットを用いてそれらの病態指標を得ることは容易に可能である。
【００３２】
本実施形態の診断キットでは、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含んでもよい。そして、上記Hyper-メチル化サイトは、(1)  第一染色体の位置231820076、(2)  第五染色体の位置65888284、(3)  第六染色体の位置32552152、(4)  第六染色体の位置32632694、(5)  第十四染色体の位置70234741、及び(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。また、上記Hypo-メチル化サイトは、(1)  第二染色体の位置43451868、(2)  第二染色体の位置108157524、(3)  第二染色体の位置124971544、(4)  第四染色体の位置77997420、(5)  第六染色体の位置32489203、(6)  第六染色体の位置32522400、(7)  第六染色体の位置32522872、(8)  第六染色体の位置32552515、(9)  第六染色体の位置32554385、(10)  第六染色体の位置32557970、(11)  第六染色体の位置32558175、(12)  第六染色体の位置32607174、(13)  第六染色体の位置32610971、(14)  第十二染色体の位置125813494、(15)  第十五染色体の位置66947066、(16)  第十五染色体の位置90115219、及び(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。検出するメチル化サイトを特定することによって、迅速且つ正確な子宮内膜症の診断が可能になる。
【００３３】
本実施形態において、上記メチル化サイトにおけるメチル化の検出は、１箇所のメチル化サイト（位置）に対して実行してもよく、複数箇所のメチル化サイトに対して実行してもよい。上記Hyper-メチル化サイトにおけるメチル化の検出は、1箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所又は６箇所のサイトに対して実行してもよい。上記Hypo-メチル化サイトにおけるメチル化の検出は、1箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、１１箇所、１２箇所、１３箇所、１４箇所、１５箇所、１６箇所又は１７箇所のサイトに対して実行してもよい。また、上記Hyper-メチル化サイトの少なくとも１箇所のサイトに対してメチル化の検出を実行した場合は、上記Hypo-メチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行しても実行しなくてもよい。反対に、上記Hypo-メチル化サイトの少なくとも１箇所のサイトに対してメチル化の検出を実行した場合は、上記Hyper-メチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行しても実行しなくてもよい。例えば、上記Hyper-メチル化サイトに対するメチル化の検出だけで子宮内膜症の診断が可能な場合は、上記Hypo-メチル化サイトに対するメチル化の検出は実行しなくてもよく、その逆も同様である。また、上記Hyper-メチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行した後に、上記Hypo-メチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行してもよく、その逆も同様である。更に、ハイスループット処理を用いて、上記Hyper-メチル化サイトとHypo-メチル化サイトにおけるメチル化の検出を実質的に同時に実行してもよい。
【００３４】
本実施形態において、上記メチル化サイト以外のメチル化サイトを検出してもよい。例えば、上述した６箇所のHyper-メチル化サイト(及び/又は１７箇所のHypo-メチル化サイト)と、上記メチル化サイトとは異なる１又は複数箇所のメチル化サイトに対して、メチル化の検出を行ってもよい。また、上記メチル化サイトにおけるメチル化量と既知マーカーの量とを組み合わせてもよい。既知マーカーとしては、例えば、腫瘍マーカーCA-125が挙げられる。既知マーカーの量は、上記メチル化量と組み合わせることで子宮内膜症を診断することが可能であれば、濃度であってもよく、活性量であってもよい。上記メチル化量と既知マーカーとを組み合わせる場合は、上記診断キットは、既知マーカー検出手段を更に有してもよい。また、上記既知マーカーは、複数の既知マーカーを採用することも可能であり、各既知マーカーに合わせた既知マーカー検出手段を複数用意することも可能である。検出手段としては、例えば、既知マーカー特異的な抗体を用いた酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法、抗体アレイ等をあげることができ、また、複数組み合わせての使用も可能である。
【００３５】
本実施形態の診断キットでは、上記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトが、上記Hyper-メチル化サイト及び上記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての前記メチル化サイトであってもよい。上記23種類のメチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行することによって、初期の子宮内膜症であってもより高精度に子宮内膜症の診断が可能になる。
【００３６】
例えば、被験体における上記6種類のHyper-メチル化サイト全てのメチル化量が、健常な哺乳動物における上記6種類のHyper-メチル化サイト全てのメチル化量よりも有意に増加している、且つ、被験体における上記17種類のHypo-メチル化サイト全てのメチル化量が、健常な哺乳動物における上記17種類のHypo-メチル化サイト全てのメチル化量よりも有意に減少している場合は、被験体は子宮内膜症の可能性が非常に高いと診断される。
【００３７】
本実施形態の診断キットでは、上記メチル化量は、メチル化率であってもよい。一般的なメチル化検出方法を用いれば容易にメチル化率を算出することが可能であることから、容易に子宮内膜症の診断が可能になる。
【００３８】
本実施形態において、たとえば、被験体におけるHyper-メチル化サイトのメチル化率が、健常な哺乳動物における同じHyper-メチル化サイトのメチル化率よりも、好ましくは6倍以上も大きい場合は、被験体におけるHyper-メチル化サイトは、メチル化されていると決定してもよい。また、たとえば、健常な哺乳動物におけるHypo-メチル化サイトのメチル化率が、被験体における同じHypo-メチル化サイトのメチル化率よりも、好ましくは6倍以上も大きい場合は、被験体におけるHypo-メチル化サイトは、メチル化されていないと決定してもよい。
【００３９】
本実施形態の診断キットでは、上記体液試料は、血液であってもよい。子宮内膜症組織を直接採取して検査する従来の子宮内膜症の診断方法に比べて、患者に対する負担が著しく低下した子宮内膜症の診断が可能になる。
【００４０】
本実施形態において、被験体の血液から得られる末梢血DNAは、全血から得られたDNAであってもよく、単離した白血球から取得したDNAであってもよい。血液に関しては、適切な遠心分離操作を行い、リンパ球の存在を無視できる量になるまで減少させた血清を用いることも可能である。本実施形態においては、その血清に対して検出試薬を反応させることも可能である。
【００４１】
ここで、得られた血液、血清等の試料に対し、任意の処理工程を一又は複数追加してもよい。このような処理工程としては、例えば、各種カラムや免疫沈降法による不純物の除去・目的物の精製処理、卜リプシン等によるタンパク質の断片化処理、酵素処理や化学処理による夾雑物の分離、他の酵素処理、各種化学修飾等が挙げられるが、これに限られない。
【００４２】
＜実施形態２：診断マーカー＞
また、本発明の他の実施形態は、被験体である哺乳動物の体液試料中のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を含む、子宮内膜症を診断するための診断マーカーである。この診断マーカーは、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断を可能とするマーカーとしての役割を果たすことが可能である。
【００４３】
後述する実施例において実証されている通り、子宮内膜症を患っている患者においては、体液中の子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が変化している。従って、例えば、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を診断マーカーとして利用することで、そのメチル化量的変化から子宮内膜症の可能性が高いことを示すマーカーとしての役割を果たすことが可能であり、このメチル化量的変化を基に子宮内膜症の診断が可能になる。しかしながら、これに限られず、子宮内膜症に関する他の症状・状態に関しても、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって測定し、本実施形態に係る診断マーカーを用いてそれらを診断することは容易に可能である。
【００４４】
本実施形態の診断マーカーは、上記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物から得られた体液試料中のDNAにおける上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に対する、上記被験体である哺乳動物の体液試料中のDNAにおける少なくとも１つの上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量を含んでもよい。上記哺乳動物と同一種の健常な哺乳動物由来の上記メチル化量をコントロールとして採用することで、確実な子宮内膜症診断に用いることが可能な診断マーカーとなる。
【００４５】
本実施形態の診断マーカーでは、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含んでもよい。そして、上記Hyper-メチル化サイトは、(1)  第一染色体の位置231820076、(2)  第五染色体の位置65888284、(3)  第六染色体の位置32552152、(4)  第六染色体の位置32632694、(5)  第十四染色体の位置70234741、及び(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。また、上記Hypo-メチル化サイトは、(1)  第二染色体の位置43451868、(2)  第二染色体の位置108157524、(3)  第二染色体の位置124971544、(4)  第四染色体の位置77997420、(5)  第六染色体の位置32489203、(6)  第六染色体の位置32522400、(7)  第六染色体の位置32522872、(8)  第六染色体の位置32552515、(9)  第六染色体の位置32554385、(10)  第六染色体の位置32557970、(11)  第六染色体の位置32558175、(12)  第六染色体の位置32607174、(13)  第六染色体の位置32610971、(14)  第十二染色体の位置125813494、(15)  第十五染色体の位置66947066、(16)  第十五染色体の位置90115219、及び(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。特定のメチル化サイトを用いることで、正確な子宮内膜症の診断に用いることが可能な診断マーカーとなる。
【００４６】
本実施形態の診断マーカーでは、上記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、上記Hyper-メチル化サイト及び上記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての上記メチル化サイトであってもよい。上記23種類のメチル化サイトを全て用いることで、初期の子宮内膜症の診断に用いることが可能な診断マーカーとなる。
【００４７】
＜実施形態３：検出方法＞
また、本発明の他の実施形態は、子宮内膜症の病態指標の検出方法であって、被験体である哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトにおけるメチル化量を定量的に検出する工程を含む検出方法である。この検出方法によれば、子宮内膜症の早期診断及び他の疾患との鑑別診断が可能になる子宮内膜症の病態指標を検出することが可能になる。
【００４８】
後述する実施例において実証されている通り、子宮内膜症を患っている患者においては、体液中の子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が変化している。従って、例えば、上記メチル化量を定量的に検出することで、その量の変化を検出することが可能となる。この結果に基づいて子宮内膜症の可能性が高いと判断される材料が得られる。しかしながら、これに限られず、子宮内膜症に関する他の症状・状態に関しても、この技術分野の医師にとってよく知られている日常的手法によって測定し、本実施形態に係る検出方法を用いてそれらの判断とすることは容易に可能である。
【００４９】
また、本実施形態の検出方法は、事前に設定したメチル化量の閾値に対して、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量が有意に変化しているか否かを判定する工程を更に含んでもよい。閾値と対比することによって、迅速且つ正確に子宮内膜症を診断することが可能になる。
【００５０】
また、本実施形態の検出方法では、上記閾値は、上記被験体と同一種且つ健常な哺乳動物の体液試料由来のDNAにおける上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量に基づいて設定されてもよい。被験体と同一種の健常な哺乳動物由来の上記メチル化量をコントロールとして採用することで、確実に子宮内膜症を診断することが可能になる。
【００５１】
また、本実施形態の検出方法では、上記子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、Hyper-メチル化サイト及び/又はHypo-メチル化サイトを含んでもよい。そして、上記Hyper-メチル化サイトは、(1)  第一染色体の位置231820076、(2)  第五染色体の位置65888284、(3)  第六染色体の位置32552152、(4)  第六染色体の位置32632694、(5)  第十四染色体の位置70234741、及び(6)  第十九染色体の位置3771880、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。また、上記Hypo-メチル化サイトは、(1)  第二染色体の位置43451868、(2)  第二染色体の位置108157524、(3)  第二染色体の位置124971544、(4)  第四染色体の位置77997420、(5)  第六染色体の位置32489203、(6)  第六染色体の位置32522400、(7)  第六染色体の位置32522872、(8)  第六染色体の位置32552515、(9)  第六染色体の位置32554385、(10)  第六染色体の位置32557970、(11)  第六染色体の位置32558175、(12)  第六染色体の位置32607174、(13)  第六染色体の位置32610971、(14)  第十二染色体の位置125813494、(15)  第十五染色体の位置66947066、(16)  第十五染色体の位置90115219、及び(17)  第二十二染色体の位置47026467、に位置するメチル化サイトを含んでもよい。検出するメチル化サイトを特定することによって、迅速且つ正確な子宮内膜症の診断が可能になる。
【００５２】
また、本実施形態の検出方法では、上記少なくとも１つの子宮内膜症関連DNAメチル化サイトは、上記Hyper-メチル化サイト及び上記Hypo-メチル化サイトに含まれる全ての前記メチル化サイトであってもよい。上記23種類のメチル化サイトにおけるメチル化の検出を実行することによって、初期の子宮内膜症であってもより高精度に子宮内膜症の診断が可能になる。
【００５３】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５４】
例えば、上記実施の形態では診断キット、診断マーカー及び検出方法としたが、子宮内膜症の診断方法、子宮内膜症組織の検出方法、子宮内膜症の診断を補助する情報を提供する方法としてもよい。このようにすれば、被験者の体液を用いて子宮内膜症を診断すること、子宮内膜症組織を検出すること、子宮内膜症の診断を補助する情報を提供することが可能になる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。機器の操作及びキットの使用は、各メーカーの製造元プロトコールに従った。
【００５６】
＜実施例１＞
子宮内膜症患者末梢血のDNA調製
鳥取大学医学部附属病院女性診療科を受診し、書面上で同意の得られた子宮内膜症患者(4名)と健常ボランティア(4名)から、末梢血を2ml採取した。患者とボランティアの年齢は、38±3歳であった。末梢血DNAは、全血よりDNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を用いて調製した。
【００５７】
＜実施例２＞
Methylation450アレイ解析
調製したDNAを亜硫酸水素塩(Bisulfite)処理後、Infinium HumanMethylation450 BeadChip (illumina)に搭載されているヒト遺伝子２１２３１に含まれるCpGアイランドとその周辺領域に存在する４８５５１２箇所のCpG配列について、メチル化率を測定した。
【００５８】
＜実施例３＞
Methylation450アレイ解析データのGeneSpringGXによる解析
GeneSpringGXを用いてMethylation450アレイのデータを解析した。健常ボランティアのDNA(コントロール)と比較して、DNAのメチル化率が４倍以上異なる子宮内膜症患者DNAのCpG配列を５５６箇所抽出した(図１A)。これらには、Hyper-メチル化CpG配列が２９９箇所、Hypo-メチル化CpG配列が２６７箇所含まれていた(図１B)。
【００５９】
さらに、コントロールDNAと比較して、DNAメチル化率が６倍以上異なる子宮内膜症患者DNAのCpG配列を１７０箇所抽出した。これらには、Hyper-メチル化CpG配列が８７箇所、Hypo-メチル化CpG配列が８３箇所含まれていた(図２)。
【００６０】
子宮内膜症患者DNAにおける１７０箇所のCpG配列についてクラスター解析を行った。その結果、８７箇所のHyper-メチル化CpG配列は、３群のクラスター(１６、２０及び５１箇所のCpG配列)に分類され(図３A)、８３箇所のHypo-メチル化CpG配列は、３群のクラスター(２０、２１及び４２箇所のCpG配列)に分類された(図３B)。
【００６１】
次に、全ての子宮内膜症患者において、コントロールDNAと比較してDNAメチル化率が６倍以上異なる子宮内膜症患者DNAのCpG配列を抽出した。その結果、子宮内膜症患者DNAにおける上記１７０箇所のCpG配列から、１４遺伝子上に位置する２３箇所のCpG配列を診断マーカーの候補として選別した。５つの遺伝子上に位置する６箇所のHyper-メチル化CpG配列と、９つの遺伝子上に位置する１7箇所のHypo-メチル化CpG配列を最終選別した。表１は、Hypo-メチル化CpG配列のゲノム上の位置のリストを示し、表２は、Hyper-メチル化CpG配列のゲノム上の位置のリストを示している。
【００６２】
【表１】
2016077234.tif 000003
【００６３】
【表２】
2016077234.tif 000004
【００６４】
以上の結果から、表１に記載の全てのHypo-メチル化サイトのメチル化率に関して、健常者の各メチル化率は、それぞれ、子宮内膜症患者のメチル化率よりも少なくとも6倍高かった。また、表２に記載の全てのHyper-メチル化サイトのメチル化率に関して、子宮内膜症患者の各メチル化率は、それぞれ、健常者のメチル化率よりも少なくとも6倍高かった。
【００６５】
＜考察＞
本実施例の結果から、子宮内膜症患者の末梢血DNAにおける子宮内膜症関連DNAメチル化サイト（表１及び表２を参照）のメチル化率は、健常者のそれと異なっていることが明らかとなった。体液試料中のDNAにおける子宮内膜症関連DNAメチル化サイトのメチル化量を定量的に検出することで、子宮内膜症の診断が可能になる。
【００６６】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
2016077234.tif 000005
【図２】
2016077234.tif 000006
【図３】
2016077234.tif 000007