(57)【要約】【課題】本発明は、複数の直鎖二重鎖DNAを、同一分子内で環状化させることなく、DNA分子間の結合を促進させ、多量体の直鎖二重鎖DNAを作製する方法を提供する。【解決手段】本発明は、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の存在下において、複数の直鎖二重鎖DNAをDNAリガーゼとインキュベートすることにより、該直鎖二重鎖DNA分子内の両末端の結合を抑制し、かつ、直鎖二重鎖DNA分子間の末端同士の結合を促進し、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の存在下において複数の直鎖二重鎖DNAをDNAリガーゼとインキュベートすることにより、直鎖二重鎖DNA分子間の末端同士の結合を促進し、および、該直鎖二重鎖DNA分子内の両末端の結合を抑制して、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製する方法。
【請求項２】
前記直鎖二重鎖DNA分子の結合される末端が粘着末端であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記直鎖二重鎖DNA分子の結合される末端が平滑末端であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記RecAファミリー組換え酵素が、RecA、Rad51からなるグループから選択され、組換え活性をもつ蛋白質がRad52であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記RecAファミリー組換え酵素が、RecAであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ATP非存在下でインキュベートすることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、ATPおよび分子クラウディング効果を有する分子を添加した条件で、インキュベートすることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記RecAファミリー組換え酵素が、Rad 51であり、かつ、ATP存在下でインキュベートすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え活性を持つ蛋白質が、Rad52であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、分子クラウディング効果を有する分子を添加した条件でインキュベートすることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子クラウディング効果を有する分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項７または１０に記載の方法。
【請求項１２】
RecAファミリー組換え酵素もしくは組換え活性をもつ蛋白質、または、RecAファミリー組換え酵素の発現ベクターもしくは組換え活性をもつ蛋白質の発現ベクターを含むキットであって、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の直鎖二重鎖DNAを直列に連結する際に、同一DNA分子内の環状化を抑え、DNA分子間の連結を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野の技術は、日々、目覚ましい進歩性を遂げており、新たな医薬や食品の開発においては、無くてならないツールを提供している。遺伝子操作の基本となるステップの１つに、所望の配列を有するDNAを作製するステップがある。中でも、複数の異なる直鎖二重鎖DNA分子を連結して、思い通りの配列を有するDNAを構築するためには、所望の順序で、DNA分子が結合していく必要がある。このステップで使用される酵素の１つに、DNAリガーゼ（DNA ligase）がある。DNAリガーゼは、DNA鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素であるが、必ずしも、異なるDNA分子間の末端同士を結合させるだけではなく、同一DNA分子内の末端同士をも結合させる。そのため、DNAリガーゼを用いて、異なるDNA分子を複数連結する場合、DNA分子間の連結によって生成する直鎖DNA以外にも、同一分子の末端同士の結合により環状のDNAも生じてしまう。このようなDNAの環状化は、所望の直鎖DNAの生成効率を低下させる要因の一つになっている。
【０００３】
これまでに、直鎖二重鎖DNAを連結する際生じる、同一DNA分子内における環状化を抑えるために、多くの研究が行われてきた。例えば、分子クラウディング（molecular crowding）を行う高分子化合物の存在下では、DNAリガーゼによる平滑末端および粘着末端のDNA分子の連結を促進することが報告されていた（非特許文献１および非特許文献２）。しかしながら、上記のような分子クラウディングを用いる条件下では、同一分子内の3’末端と5’末端の結合をも促進されてしまい、DNAが環状化する現象を抑えることは困難であった。また、Hayashiらは、ポリエチレングリコール6000（PEG6000）存在下で、高濃度の1価カチオンを加えると、DNAリガーゼによるDNA分子間の結合が促進され、直鎖DNA多量体が生じることを報告した（非特許文献３）。しかしながら、Hayashiらの方法によると、DNA単量体の環状化は防げたとしても、多量体化したDNAの環状化まで防ぎうるかどうかについては、明らかにされていなかった。さらに、Ruscheらは、RecAの存在下において、T4 DNAリガーゼによる直鎖二重鎖DNA同士の結合反応が促進されることを報告している（非特許文献４）。しかし、RecAとT4 DNAリガーゼとを反応させる条件において、T4 DNAリガーゼ自体がATP要求性であることから、RecAによる二重鎖DNAの連結反応におけるATPの要求性については不明である。また、非特許文献４に開示される条件では、せいぜい3量体の直鎖二重鎖DNAが生じるに止まり、4量体以上の直鎖二重鎖DNAを調製することは、困難な状況にある。
【０００４】
以上のように、複数の直鎖二重鎖DNAを、DNA分子内での環状化を防いで、効率的に、多量体直鎖二重鎖DNAを作製するには、さらなる研究開発が必要な状況にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pheifferら, Nucleic Acids Res., 11:7853-7871 1983.
【非特許文献２】Zimmermanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:5852-5856 1983.
【非特許文献３】Hayashiら, Nucleic Acids Res., 13:3261-3271 1985.
【非特許文献４】Ruscheら, J. Biol. Chem., 260:949-955 1985.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、複数の直鎖二重鎖DNAを、同一分子の環状化を防ぎ、DNA分子同士の結合を促進させ、多量体の直鎖二重鎖DNAを作製することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、RecAファミリー組換え酵素であるRecA、Rad51、組換え活性をもつ蛋白質であるRad52存在下において、直鎖二重鎖DNAをDNAリガーゼにより連結させる場合、直鎖二重鎖DNA同士の結合が促進され、かつ、直鎖二重鎖DNA分子内の末端同士が結合することによる該DNA分子の環状化が抑制される条件を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）である。
（１）RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の存在下において複数の直鎖二重鎖DNAをDNAリガーゼとインキュベートすることにより、直鎖二重鎖DNA分子間の末端同士の結合を促進し、および、該直鎖二重鎖DNA分子内の両末端の結合を抑制して、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製する方法。
（２）前記直鎖二重鎖DNA分子の結合される末端が粘着末端であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）前記直鎖二重鎖DNA分子の結合される末端が平滑末端であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（４）前記RecAファミリー組換え酵素が、RecA、Rad51からなるグループから選択され、組換え活性をもつ蛋白質がRad52であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記RecAファミリー組換え酵素が、RecAであることを特徴とする上記（４）に記載の方法。
（６）ATP非存在下でインキュベートすることを特徴とする上記（５）に記載の方法。
（７）さらに、ATPおよび分子クラウディング効果を有する分子を添加した条件で、インキュベートすることを特徴とする上記（５）に記載の方法。
（８）前記RecAファミリー組換え酵素が、Rad 51であり、かつ、ATP存在下でインキュベートすることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（９）前記組み換え活性を持つ蛋白質が、Rad52であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（１０）さらに、分子クラウディング効果を有する分子を添加した条件でインキュベートすることを特徴とする上記（８）または（９）に記載の方法。
（１１）前記分子クラウディング効果を有する分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする上記（７）または（１０）に記載の方法。
（１２）RecAファミリー組換え酵素もしくは組換え活性をもつ蛋白質、または、RecAファミリー組換え酵素の発現ベクターもしくは組換え活性をもつ蛋白質の発現ベクターを含むキットであって、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製するためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、直鎖二重鎖DNAの環状化を抑制し、複数の直鎖二重鎖DNAを連結させることが可能になる。その結果、所望の塩基配列を有する二重鎖DNAを効率よく作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】PEG存在下における、直鎖二重鎖DNAの結合反応の検討結果（従来技術の検討）。PstIで切断した、両端に相補的な4塩基の3’突出単鎖部分をもつpUC119 二重鎖DNAに、大腸菌のDNA ligase (Takara社、4U/20 μL)を37℃、40分間反応させた。 表示濃度のPEG6000を加え、ATPの存在下、非存在下で反応を行い、反応産物をEtidium bromideなし（Ａ）、または、0.06μM Etidium bromide存在下（Ｂ）で、アガロースゲル電気泳動した結果である。図中、Cは、環状DNAであることを、Lは直鎖状DNAであることを示す。
【図２】PEG存在下における直鎖二重鎖DNAの結合反応に対する1価カチオンの影響の検討（従来技術の検討）。Pst1で切断したpUC119 二重鎖DNA（6μM）に、表示濃度のNaClと、3.8, 7.5, 11.3%のPEG6000を加えて、T4 DNA ligase (20U/μL)を37℃、40分間反応させた。反応産物をEtidium bromideなし（Ａ）、または、0.06μM Etidium bromide存在下（Ｂ）で、アガロースゲル電気泳動を行った結果である。図中、Cは、環状DNAであることを、Lは直鎖状DNAであることを示す。なお、上記DNA濃度（6μM）は、DNAを構成するヌクレオチドの濃度のことである（本明細書において、以下同じ）。
【図３】直鎖二重鎖DNAの連結反応に対するRecAの促進効果（PEG6000非存在下）。PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA (6μM)を、NAD依存型大腸菌 DNA ligase (6U/20 μL)を37℃、 40分間反応させた。その後、反応産物を0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲル電気泳動を行った結果である。図中、Cは、環状DNAであることを、Lは直鎖状DNAであることを示す。
【図４】直鎖二重鎖DNAの連結反応に対するRecAの促進効果（PEG6000存在下）。表示される量のPEG6000存在下で、NAD依存型大腸菌DNA ligaseにより、HindIII、または、PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNAを連結させる反応（37℃、40分）に、2 μMのRecAを添加した。反応後、反応産物を、0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲルで電気泳動した。図中、Lは直鎖状DNAであることを示す。
【図５】RecA存在下での直鎖二重鎖DNAの連結反応に対する、Mg2+の影響について調べた結果である。表示濃度のMgCl2とNAD依存型大腸菌DNA ligaseの存在下、および、3.75%(W/V)のPEG6000の存在下において、PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA（6 μM）を連結させる反応（37°C 40分）に、2 μMのRecA、または、2 μMのRecAおよび1.3mMのATPを添加した。反応後、反応産物を0.06μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲルで電気泳動した。
【図６】RecA存在下での直鎖二重鎖DNAの連結反応におけるインキュベーション時間の検討を行った。NAD依存型大腸菌DNA ligaseによる直鎖二重鎖DNAの連結反応に関し、反応液中に、PEGのみを添加（上図）、PEGおよび RecAを添加（中央図）、PEG、RecAおよびATPを添加（下図）した状態で、37℃にて、表示される反応時間インキュベートし、反応産物を0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲル電気泳動した。
【図７】PEG6000, ATP存在下、反応時間40分とし、直鎖二重鎖DNAの濃度とRecAの濃度を変化させた場合の連結反応について調べた結果である。表示の各DNA濃度において、RecAの濃度を図に表示の通り変化させて、反応を行わせた。反応条件は、図の下に記載した。
【図８】直鎖二重鎖DNAの連結反応に対するRad51の影響の検討。PstIで切断した、pUC119 直鎖二重鎖DNA (6 μM)を、ATP依存性のT4 DNA ligaseにより連結させる反応（37℃、40分）に、1.3mM ATPの存在下、7mM MgCl2存在下、3.75%のPEGの存在下または非存在下において、表示濃度のRad51を添加した。反応産物は、0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲル電気泳動した。上図は、アガロースゲル電気泳動の結果、中央の図は、直鎖二重鎖DNA（polymer）のバンドの濃度を定量した結果、下図は、環状二重鎖DNA（supercoil）のバンドの濃度を定量した結果である。バンドの定量は、各レーンのバンド（polymer, linear, supercoil）の総量を100%として表示した。
【図９】Rad51存在下における、直鎖二重鎖DNAの連結反応に対するPEG6000の影響の検討。PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA (6 μM)を、NAD依存型大腸菌DNA ligaseにより連結させる反応（37℃、40分）に、1.3mM ATP存在下または非存在下、7mM MgCl2存在下、表示濃度のPEG6000の存在下において、0.5μMのRad51を添加した。反応後、反応産物を、0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲル電気泳動を行った。
【図１０】Rad52による直鎖二重鎖DNAの連結促進反応の検討。PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA (6 μM)を、ATP依存性のT4 DNA ligase（この場合、1.3mMとなるようにATPを加える）、または、NAD依存型大腸菌DNA ligase（この場合、0.1mMとなるようにNADを加える）により連結させる反応（37℃、40分）に、7mM MgCl2存在下において、表示濃度のRad52を添加した。反応後、反応産物を、0.06 μM Etidium bromide存在下で、アガロースゲル電気泳動した。上図は、アガロースゲル電気泳動の結果、中央の図は、直鎖二重鎖DNA（polymer）のバンドの濃度を定量した結果、下図は、環状二重鎖DNA（supercoil）のバンドの濃度を定量した結果である。バンドの定量は、各レーンのバンド（polymer, linear, supercoil）の総量を100%として表示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態の一つは、RecAファミリー組換え酵素、または組換え活性をもつ蛋白質の存在下において、複数の直鎖二重鎖DNAをDNAリガーゼとインキュベートすることにより、直鎖二重鎖DNA分子間の末端同士の結合を促進し、および、該直鎖二重鎖DNA分子内の両末端の結合を抑制して、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製する方法である。
ここで、RecAファミリー組換え酵素とは、相同DNA 対合反応を触媒する酵素のことで、例えば、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、Dmc1蛋白質、RadA蛋白質などを上げることができる。また、組換え活性をもつ蛋白質とは、相同組み換えの過程において機能することが知られている蛋白質のことで、例えば、Rad51 蛋白質パラログ（Rad51B蛋白質、Rad51C蛋白質、Rad51D蛋白質、Rad51L蛋白質、Rad51L2蛋白質、Rad51D蛋白質、Rad51L3蛋白質、Xrcc2蛋白質またはXrcc3蛋白質）、およびRad52蛋白質などをあげることができる。
【００１２】
本発明に用いられるRecA蛋白質としては、例えば、Karlinら、 "Bacterial classifications derived from RecA protein sequence comparisons," J. Bacteriol., 177,6881-6893 (1995)に記載されている種々のRecA蛋白質を使用してもよく、または、NCBIのデータベースに登録されているアミノ酸配列またはcDNA配列、例えば、アクセッション番号WP_000755731、GI番号446678385で示されるStaphylococcus aureusのRecA蛋白質およびcDNA、あるいは、アクセッション番号BAA04215（アミノ酸配列）、D17392（塩基配列）で示されるThermus thermophiles HB8のRecA蛋白質およびcDNAの他、本実施例で使用した、配列番号１で表されるRecA蛋白質（配列番号２はこれをコードする塩基配列を示す）を使用してもよい。
また、本発明のRad51蛋白質およびRad52蛋白質は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベースに登録されているアミノ酸配列またはcDNA配列、例えば、アクセッション番号CAA45563、GI番号4275で示されるSaccharomyces cerevisiaeのRad51蛋白質およびcDNAの他、本実施例で使用した配列番号３で表されるRad51蛋白質（配列番号４はこれをコードする塩基配列を示す）、配列番号５で表されるRad52蛋白質（配列番号６はこれをコードする塩基配列を示す）を使用してもよい。
【００１３】
さらに、本発明のRecA蛋白質、Rad51蛋白質、および、Rad52蛋白質には、これらの蛋白質と実質的に同一の蛋白質も含まれる。
例えば、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、および、Rad52蛋白質が、各々、配列番号１、配列番号３、および、配列番号５で表される場合、これらの、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、および、Rad52蛋白質と実質的に同一の蛋白質とは、配列番号１、配列番号３、配列番号５で表されるアミノ酸配列と、各々、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、DNAリガーゼによる直鎖二重鎖DNA分子間の末端の結合を促進する活性を有する蛋白質のことである。
【００１４】
あるいは、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、および、Rad52蛋白質が、各々、配列番号１、配列番号３、および、配列番号５で表される場合、これらの、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、および、Rad52蛋白質と実質的に同一の蛋白質とは、配列番号１、配列番号３、配列番号５で表されるアミノ酸中に、各々、１または数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、DNAリガーゼによる直鎖二重鎖DNA分子間の末端の結合を促進する活性を有する蛋白質のことである。
アミノ酸の欠失、付加及び置換は、蛋白質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用しても実施することができる。
なお、本明細書においては、RecA、Rad51、Rad52と記載した場合には、特に断らない限り、各々、RecA蛋白質、Rad51蛋白質、Rad52蛋白質のことを指す。
【００１５】
本発明は、DNAリガーゼによる直鎖二重鎖DNAの分子間の結合を促進して直列に直鎖二重鎖DNAを連結し、かつ、直鎖二重鎖DNA（単量体の直鎖二重鎖DNAの他、直列につながった直鎖二重鎖DNAを含まれる）の環状化を防ぐ方法に関するものである。本発明において使用される直鎖二重鎖DNAの末端の形状は、平滑末端、粘着末端いずれの形状であってもよいが、平滑末端同士、または、粘着末端同士を結合させることが好ましい。
【００１６】
本発明において使用されるDNAリガーゼ（DNA ligase）とは、DNA鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素のことであり、このような活性を有する酵素であれば如何なるものであっても使用可能である。DNAリガーゼの例としては、限定はしないが、例えば、大腸菌（E. coli）由来のDNAリガーゼ、T4ファージ由来のT4 DNAリガーゼ、超好熱性の海生古細菌である Pyrococcus furiosus に由来するPfu DNAリガーゼ、T7ファージ由来のT7 DNA Ligase、Thermus thermophiles HB8由来のDNA ligase（アクセッション番号：AAA27487（アミノ酸配列）、M36417（塩基配列））などを挙げることができる。
【００１７】
本発明において、直鎖二重鎖DNAを直列に連結するときの反応条件は、DNAリガーゼの酵素反応において至適な、一般的に用いられる条件であれば、いかなる条件であってもよく、反応溶液中には、例えば、MgCl2などの２価カチオン、NaClなどの塩の他、DTTなどの還元剤、ATPやNADなどの補酵素を加えてもよい。特に、分子クラウディング効果を有する分子を適宜加えることで、効率よく、直鎖二重鎖DNAの連結を促進し、直鎖二重鎖DNAの環状化を防ぐことができる。
本発明で使用される分子クラウディング効果を有する分子は、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、PEG200, PEG400, PEG6000, PEG8000, PEG20000など、特に限定はしない）、フィコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸、アルブミン、ヘモグロビン、スクロース、デキストラン、エピクロロヒドリン、フェコール、ソルビトール、TMAO(トリメチルアミン-N-オキシド)、トリメチルグリシン、DMSO(ジメチルスルホキシド)、トリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、尿素、アセトアミド、8-mer DNA等が挙げられる。
【００１８】
本発明のRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質として、RecA、Rad51またはRad52を使用する場合の反応条件について記載する。なお、反応溶液中に加えるDNAリガーゼの量は、特に限定されず、使用するDNAリガーゼの至適なユニット数を使用すればよい。なお、RecAファミリー組換え酵素として、RecAを用いる場合には、RecAに比べてDNAリガーゼの活性が過剰になると直鎖二重鎖DNAの環状化が生じやすくなるため、DNAリガーゼの量は、過剰にならない程度が望ましい。また、長い直鎖二重鎖DNA（多量体の直鎖二重鎖DNA）を調製したい場合には、DNAリガーゼの量に対し、RecAの量を上げることが望ましい（図７などを参照のこと）。
【００１９】
本発明のRecAファミリー組換え酵素として、RecAを使用する場合、反応溶液中に加えるRecAの量は、直鎖状二重鎖DNAを構成するヌクレオチドを1モルとした場合、モル比で、RecAは、0.01〜0.1程度が好ましく、0.02〜0.05がより好ましく、0.04程度が最も好ましい。特に、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子およびATPの存在下においては、直鎖二重鎖DNAを構成するヌクレオチドを1モルに対し、RecAは、0.04モル程度が適切で、RecAの量がこれを超えると反応効率が下がる傾向にある。また、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子を添加しない条件においては、ATPは添加しない方が望ましく、例えば、1.3mMのATPの存在下において、直鎖二重鎖DNAの連結は完全に阻害される。
なお、本明細書においては、DNAの濃度に関し、DNAを構成するヌクレオチドの濃度として表示しており、直鎖二重鎖DNA自体のモル濃度では無い点に注意が必要である。
他方、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子を添加する場合には、ATPを例えば、1〜3mM程度、好ましくは、1〜2mM程度加えるとよい。また、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子は、PEG6000を例にすると、例えば、1.0%〜10%（w/v）、好ましくは、2.5%〜5.0（w/v）程度加えてもよい。もちろん、使用する分子クラウディング効果を有する分子によって、至適な濃度等は、当業者であれば適宜決定することができるので、特に、上記数値に限定されるものではない。
PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子とATPの存在下において、RecAによる直鎖二重鎖DNAの連結反応は、非常に効率よく進み（例えば、短い反応時間で効率よく直鎖二重鎖DNAの連結を促進し、かつ、環状化を抑制する）。
また、反応中に、MgCl2を加える場合には、4mM以上、より好ましくは、5mM以上、さらに好ましくは、7mM以上の条件を用いるとよい。
【００２０】
本発明のRecAファミリー組換え酵素として、Rad51を使用する場合、直鎖二重鎖DNA同士の連結を促進し、かつ、直鎖二重鎖DNAの環状化を抑制するためには、反応中に加えるRad51の量は、直鎖二重鎖DNAを構成するヌクレオチドを1モルとした場合、モル比で、0.042〜0.167、好ましくは、0.083〜0.167程度である（1分子のRad51に対して3〜6bp（塩基対）程度）。ATPについては、添加した方が良く、この場合のATP濃度は、例えば、1〜3mM程度、好ましくは、1〜2mM程度加えるとよい。また、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子を添加する場合には、PEG6000を例にすると、例えば、1.0%〜10%（w/v）、好ましくは、2.5%〜5.0（w/v）程度加えてもよいが、使用する分子クラウディング効果を有する分子によって、至適な濃度等は、当業者であれば適宜決定することができので、特に、上記数値に限定されるものではない。また、反応中に、MgCl2を加える場合には、好ましくは、7mM以上の条件を用いるとよい。
【００２１】
本発明の組換え活性をもつ蛋白質として、Rad52を使用する場合、直鎖二重鎖DNA同士の結合を促進し、かつ、直鎖二重鎖DNAの環状化を抑制するためには、反応中に加えるRad52の量は、直鎖状二重鎖DNAを構成するヌクレオチドを1モルとした場合、モル比で、0.033以上が好ましい（15 bp（塩基対）に対してRad52が1分子以上）。ATPについては、添加しても、添加しなくてもよく、用いるDNAリガーゼのATP要求性により、ATPの添加、非添加を決定してもよい。また、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子を添加する場合には、PEG6000を例にすると、例えば、1.0%〜10%（w/v）、好ましくは、2.5%〜5.0（w/v）程度加えてもよいが、使用する分子クラウディング効果を有する分子によって、至適な濃度等は、当業者であれば適宜決定することができので、特に、上記数値に限定されるものではない。また、反応中に、MgCl2を加える場合には、好ましくは、7mM以上の条件を用いるとよい。
【００２２】
本発明の方法を実施するにあたり、反応温度、時間等は、使用するDNAリガーゼ等の特徴を考慮して、当業者において、適宜選択することができる。T4 ligaseまたはE. coli ligaseの場合は、例えば、35℃〜40℃、好ましくは、37℃程度で、数分〜数時間程度である。また、反応液中に加える順番等も特に限定はしないが、例えば、RecAファミリー組換え酵素、直鎖二重鎖DNA、DNAリガーゼの順に加え、各々、添加後、数分〜数時間インキュベートしてもよい。
【００２３】
RecAファミリー組換え酵素および組換え活性をもつ蛋白質は、天然のソースから取得しても、あるいは、組換体として取得してもよい。組換体を取得するためには、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質を発現するために組換えベクターが必要となる。本組換えベクターには、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸が発現可能に挿入されている。ここで、「発現可能」とは、所望のアミノ酸配列を有するRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質が発現されるように、これらをコードする核酸が読み枠を併せて発現用のベクター中に挿入されている状態であって、その他必要な構成要素、例えば、プロモーター、選択マーカーなどが機能するように、当該ベクター中に構築されている状態のことである。
【００２４】
ここで、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸のうち、RecA、Rad51またはRad52をコードする核酸として、各々、配列番号２、４または６で表される塩基配列からなる核酸、ならびに、各々、配列番号２、４または６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、DNAリガーゼによる直鎖二重鎖DNA分子間の末端の結合を促進する活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。配列番号２、４または６で表わされる塩基配列を含有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号２、４または６で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有する核酸等が挙げられる。
【００２５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションのための条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的諸条件のことである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点よりやや低い温度条件下において、再アニールする核酸の能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【００２６】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸は、種々の細胞等から、常法に従い取得することができる。あるいは、すでに公知となっているRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の核酸配列情報をデータベースなどから取得し、その配列情報に基づいて、所望の生物種由来のRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸を得ることも可能である。RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸のクローニングは当該技術分野に常法のスクリーニング方法により取得することができる。
【００２７】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の発現のために使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pCBD-C、pET15b等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5、pC194等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50、YIp30等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２８】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の発現のために用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、GALプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２９】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の発現のための組換えベクターには、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質をコードする核酸配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、発現させるタンパク質またはその一部のＮ末端側、Ｃ末端側等に、精製用のタグ配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴなどを融合させることもできる。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列などが利用可能である。
【００３０】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質を発現するために、これらをコードする核酸を挿入した発現ベクターを、適当な宿主細胞に形質転換する必要がある。形質転換を行うための宿主としては、RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
【００３１】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用可能である。動物細胞または動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等が挙げられる。
【００３２】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質は、形質転換体を培養し、該酵素を発現させ、形質転換体の培養物から該酵素を単離することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３３】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００３４】
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上記培養物からRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
【００３６】
RecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過によりRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれるRecAファミリー組換え酵素または組換え活性をもつ蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３７】
また、本発明には、RecAファミリー組換え酵素もしくは組換え活性をもつ蛋白質、または、RecAファミリー組換え酵素の発現ベクターもしくは組換え活性をもつ蛋白質の発現ベクターを含むキットであって、複数の直鎖二重鎖DNAが直列に連結した二重鎖DNAを作製するためのキットが含まれる。本発明のキットには、RecAファミリー組換え酵素もしくは組換え活性をもつ蛋白質、または、RecAファミリー組換え酵素の発現ベクターの他、本発明の方法を実施するため必要なバッファー、分子クラウディング効果を有する分子（PEG6000など）や使用説明書が含まれていてもよい。
【００３８】
以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
１．実験方法。
１−１．制限酵素処理。
本実施例で使用した、制限酵素、PstI（タカラバイオ株式会社）、HindIII（タカラバイオ株式会社）、HincII（タカラバイオ株式会社）の反応条件は以下の表１の通りである。なお、「bufferM」は、各制限酵素の購入時に添付されているのバッファーのことである。
【表１】
2016077180.tif 000002
制限酵素処理反応は、37℃、15分行い、その後フェノールクロロホルム処理（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25:24:1）後、エタノール沈殿として、DNAを回収した。その後、回収したDNAをTE0.1バッファー（10mM TrisHCl(pH 8.0), 0.1mM EDTA）に溶解し、さらに、TE0.1バッファーに対して透析を行った。
【００４０】
１−２．RecAファミリー組換え酵素存在下におけるDNA リガーゼ反応。
反応条件は以下の通りである。
（Total volume 20μl）
MgCl2： 7mM
DTT： 1.8mM
EDTA  0.1mM
TrisHCl :31mM（pH 7.5）
以上、バッファー条件。これに、RecAファミリー組換え酵素、直鎖二重鎖DNA、T4 ligase またはE.coli ligase (タカラバイオ株式会社)を加えた。
また、以下のものを添加、あるいは、非添加の条件で反応を行った。
±RecA: 2μM、±Rad51: 0.5~0.75 μM、±Rad52: 0.4 μM
±NAD：100 μM（E.coli ligaseの場合）
± ATP： 1.3mM（T4 ligaseの場合）
± PEG6000:0〜10%(w/v)
【００４１】
反応は、以下の表２に示すように行った。
【表２】
2016077180.tif 000003
具体的には、上記バッファーに、RecAファミリー組換え酵素を加え、37℃、3分間インキュベートし、次いで、DNAを加え、37℃、5分間インキュベートした（Rad51またはRad52では、DNAを加えた上記バッファーにRad51またはRad52を氷上で加え、37℃、5分間インキュベートした）。その後、DNAリガーゼを加え、37℃、40分間反応させ、反応産物を、1% SDS、50μg/ml Proteinase K（Pro K）（最終濃度）を加えて、37℃、10分間インキュベートして、反応を停止した。その後、反応産物を、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行った。アガロースゲルにEtidium bromide(EtBr)を加える場合は、最終濃度0.06μMとした。
【００４２】
２．結果。
２−１．従来技術の検討。
まず、非特許文献１および非特許文献２には、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子の存在下において、直鎖に重鎖DNAの連結が促進されることが開示されている。そこで、PEG存在下における、直鎖二重鎖DNAの結合反応について、検討を行った。
PstIで切断した3’突出単鎖部分をもつpUC119 二重鎖DNA（6 μM）に、NAD依存型大腸菌DNA ligase (Takara, 4U/20 μL)を37℃、40分間反応させた。PEG6000を添加するとその量に応じてDNA ligaseによるDNAの多量体形成が促進された。その反応産物のEtidium bromide（EtBr）無しでのゲル電気泳動では、単量体 (1L, 1C)、二量体 (2L, 2C)、3量体 (3L, 3C)、4量体 (4L, 4C)、5量体 (5L, 5C)、6量体以上 (>6L, >6C) のバンド状信号が1つずつ観察された（図１Ａ）。これに対し、アガロースゲルに、0.06 μMのEtBrを添加すると (B)、単量体 (1L)、二量体 (2L)、3量体 (3L)、4量体 (4L)、5量体、6量体以上の直鎖二重鎖DNAの信号の他、それぞれの下に別の信号が観察された。これらのバンドは、それぞれの環状二重鎖DNAの信号である (1C, 単量体; 2C, 二量体; 3C, 3量体(2Lと重なっている); 4C, 4量体)（図１Ｂ）。一番左側のレーンは、反応基質にした直鎖二重鎖DNA (1L)が泳動されている。このレーン（直鎖二重鎖DNAのみが泳動されているレーン）のみ、EtBrの有無に関わらず信号は1つだけである。
以上の結果から、PEGなどの分子クラウディング効果を有する分子のみの存在下での直鎖二重鎖DNAの連結反応では、直鎖DNAの環状化を排除することは困難であることが明かである。
【００４３】
次に、非特許文献３において、PEG6000の存在下において、高濃度の1価カチオン（NaClの場合、150-200mM）を加えることで、T4 DNA ligaseによる分子間の結合だけが促進されるということが報告されているので、この点について、検討した。
Pst1で切断したPstI切断で3’突出単鎖部分をもつpUC119 二重鎖DNA（6 μM）に指示濃度のNaCl と、それぞれの濃度のNaClについて、3.8, 7.5, 11.3%のPEG6000を加えて、T4 DNA ligase (20U/20μL)を37℃、40分間反応させた。その反応産物のEtidium bromideなし（図２Ａ）、または、0.06 μM Etidium bromide存在下（図２Ｂ）でのゲル電気泳動を行った。その結果、環状DNA二量体の信号（2C）が、150mM NaCl, 11.3% polyethylene glycol、200mM NaCl, 7.5% polyethylene glycol存在下の反応でも残っていることが明かとなり、直鎖DNAの環状化を排除することは、難しいことが明かとなった。
以上の従来技術の状況を踏まえ、本発明の実施例を以下に示す。
【００４４】
２−２．RecAによる直鎖二重鎖DNAの連結反応の促進。
まず、RecAファミリー組換え酵素であるRecAによる直鎖二重鎖DNAの連結促進反応について検討を行った。
（１）PEG6000を加えない場合のRecAによる直鎖二重鎖DNAの連結反応の促進。
PstIで切断した、両端に相補的な4塩基の3’突出単鎖部分をもつpUC119 直鎖二重鎖DNA (6 μM)を、NAD依存型大腸菌 DNA ligase (Takara, 6U/20 μL)により連結させる反応（37℃、40分）に、表示濃度のRecAを添加した（図３、RecA）。ATP非存在下において、2〜4μMのRecAで直鎖DNA多量体の形成が促進され、環状単量体の形成が完全に抑制された（図３）。これらの促進と抑制は1.3 mM ATPでほぼ完全に阻害された（図３）。また、過剰量のRecAでは直鎖DNA多量体の形成促進は起こらなかった。なお、基質の直鎖二重鎖DNAと同じ大きさの環状二重鎖DNAとを分離するために電気泳動ゲルには、0.06 μMのEthidium bromideが添加してある。図4と比較すると、RecAによる多量体形成促進の条件下でも環状3量体（3C）、4量体（4C）の形成が若干認められる。
【００４５】
（２）PEG6000を加えた場合のRecAによる直鎖二重鎖DNAの連結反応の促進。
図４ＡおよびＢに表示される量のPEG6000存在下で、NAD依存型大腸菌DNA ligase（Takara, 表示量/20 μL）により、HindIIIで切断してつくった4塩基の5’ 突出単鎖部分をもつpUC119直鎖二重鎖DNA（6 μM）（図４Ａ）、または、PstIで切断してつくった両端に相補的な4塩基の3’突出単鎖部分をもつpUC119 直鎖二重鎖DNA（6 μM）（図４Ｂ）を連結させる反応（37℃、40分）に、2 μMのRecAを添加した。PEG6000存在下では、RecAはATP (1.3 mM) があるときだけ、DNA ligaseの多量体形成反応が促進され、環状単量体、環状多量体の形成が完全に抑制された（直鎖単量体の信号1Lの下、直鎖単・多量体の信号1L, 2L, 3L, 4L, 5Lの間に環状多量体の信号が全く検出されない）。過剰量のRecAでもこの促進が起こる。
なお、基質の直鎖二重鎖DNAと同じ大きさの環状二重鎖DNAとを分離するために電気泳動ゲルには、0.06 μMのEthidium bromideが添加してある。PEGがないときにはATPがない時だけ多量体形成のRecAによる促進がみられる（図３を参照のこと）。
【００４６】
（３）Mg2+による影響の検討。
次に、反応液中に存在するMg2+の影響について調べた。
図５に表示される量のMgCl2とNAD依存型大腸菌DNA ligaseの存在下、および、3.75%(W/V)のPEG6000の存在下において、PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA（6 μM）を連結させる反応（37°C 40分）に、2 μMのRecA、または、2 μMのRecAと1.3mMのATPを添加した。なお、Mg2+濃度の違いは、DNA ligaseの活性にも影響すると考えられるので、RecA等の添加での活性の程度の比較のため、DNA ligase単独での活性が同じ程度になるように、図５に示すMgCl2の濃度条件毎に、DNA ligaseの量を調整した（DNA ligase; 3.5〜7μM）。PEG + RecA (ATPなし）では、直鎖二重鎖DNAの連結促進の程度に対し、Mg2+濃度は、影響を与えなかったが、PEG + RecA + ATP では、1mM MgCl2で、直鎖二重鎖DNAの分子間の結合が完全に阻害された。
【００４７】
（４）反応時間による影響の検討。
直鎖二重鎖DNAを連結させるためのインキュベーション時間に関し検討を行った。
NAD依存型大腸菌DNA ligaseによる直鎖二重鎖DNAの連結反応に関し、反応液中に、PEGのみを添加、PEGおよび RecAを添加 (ATPなし）した状態で、37℃にて、40分間インキュベートすると、反応時間に応じて、未反応の直鎖二重鎖DNAが減少し、DNAの二量体、さらに大きな多量体が生じた（図６、上図および中央の図）。
これに対し、PEG、RecAおよびATPの存在下では、使用するDNAリガーゼの量を、PEGのみ、並びに、PEG+RecAの条件下に用いたDNA リガーゼの量の1/4にしても、他の２つの条件（PEGのみ、PEG+RecA）と同じ程度に、直鎖二重鎖DNAの連結を促進した。さらに、PEG+RecA+ATPの条件では、反応開始後、約２分で、一気に多量体の直鎖二重鎖DNAが生成した。この結果から、PEGおよびATPの存在下で、RecAを加えて、DNAリガーゼによるDNAの連結反応を行わせると、直鎖二重鎖DNAの多量体が効率よく生成されることが分かった。
【００４８】
（５）RecAとDNA濃度（DNAを構成するヌクレオチド濃度）との関係
PEG6000、ATP存在下、反応時間40分とし、直鎖二重鎖DNAの濃度とRecAの濃度を変化させた場合の連結反応について調べた（図７）。図７から、DNA量を変えたときのRecAの必要量として、DNA 12 bp（塩基対）(ヌクレオチド24分子) あたり、1分子のRecAを加えると、ほぼ未反応のDNAが無くなっていることが分かる。また、PEG6000とATPが存在する場合には、DNA 12 bp（塩基対）(ヌクレオチド24分子) あたり、RecAが1分子存在する条件が最適であり、RecAが多すぎるとかえって反応の効率が下がることも明かとなった。
【００４９】
２−３．Rad51による直鎖二重鎖DNAの連結反応の促進。
（１）直鎖二重鎖DNAの連結反応のRad51による促進効果の検討。
PstIで切断した、pUC119 直鎖二重鎖DNA (6 μM)を、ATP依存性のT4 DNA ligase（4U、タカラバイオ株式会社）により連結させる反応（37℃、40分）に、1.3mM ATPの存在下、7mM MgCl2存在下、3.75%のPEGの存在下または非存在下において、表示濃度のRad51を添加した。その結果、Rad51を添加することで、T4 DNA ligaseによる直鎖二重鎖DNA分子内での結合、すなわち、環状化を防ぎ得ることが分かった（図８上図および下図）。ただし、Rad51の量を増加させると、直鎖二重鎖DNAの分子間の結合、すなわち、直鎖二重鎖DNAの連結反応が抑制されることも同時に明らかとなった（図８中央の図）。従って、直鎖二重鎖DNAを構成するヌクレオチド、6μMあたり、Rad51は、0.5〜1.0μM加えるのが適当であると思われる。
【００５０】
（２）Rad51存在下における、直鎖二重鎖DNAの連結促進反応に対するPEG6000の影響。
PstIで切断した、pUC119 直鎖二重鎖DNA (ヌクレオチド濃度として6 μM)を、NAD依存型大腸菌DNA ligaseにより連結させる反応（37℃、40分）に、1.3mM ATP存在下または非存在下、7mM MgCl2存在下、表示濃度のPEG6000の存在下において、0.5μMのRad51を添加した。その結果、2.5〜5.0%（w/v）程度のPEGの量が至適範囲であることが分かった（図９）。
【００５１】
２−４．Rad52による直鎖二重鎖DNAの連結反応の促進。
PstIで切断したpUC119 直鎖二重鎖DNA (ヌクレオチド濃度として6 μM)を、ATP依存性のT4 DNA ligase（この場合、1.3mMとなるようにATPを加える）、または、NAD依存型大腸菌DNA ligase（この場合、0.1mMとなるようにNADを加える）により連結させる反応（37℃、40分）に、7mM MgCl2存在下において、表示濃度のRad52を添加した。その結果、Rad52を添加することで、T4 DNA ligaseおよび大腸菌DNA ligaseによる直鎖二重鎖DNA分子間の連結が、顕著に促進され、直鎖二重鎖DNA分子内での環状化は明かに抑制された（図１０上図、中央図および下図）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、遺伝子クローニングなどの遺伝子操作において、所望の配列を有するDNAコンストラクトを効率的に調製することを可能ならしめる技術に関する。そのため、本発明を使用することにより、遺伝子操作を利用する全ての分野において、その作業効率の改善が期待される。
【図１】
2016077180.tif 000004
【図２】
2016077180.tif 000005
【図３】
2016077180.tif 000006
【図４】
2016077180.tif 000007
【図５】
2016077180.tif 000008
【図６】
2016077180.tif 000009
【図７】
2016077180.tif 000010
【図８】
2016077180.tif 000011
【図９】
2016077180.tif 000012
【図１０】
2016077180.tif 000013
【配列表】
2016077180000001.app