(57)【要約】【課題】生体などの被検体の細胞を死滅させることなく保持し、被検体から放出された物質のラマンスペクトルなどの経時変化を高精度に測定することができる光電場増強デバイス、その使用方法、光測定装置および光測定方法を提供する。【解決手段】光電場増強基板２０と、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５上に液体を保持する液体保持部２と、液体保持部２内の金属微細凹凸構造２５上に、金属微細凹凸構造２５との間に隙間を空けて対向配置された、被検体Ｓを支持し、被検体Ｓから放出された物質を透過させる支持部材４と、液体保持部２内の隙間により構成される流路５に液体保持部２の外部から液体を流入させる液体流入管６、および流路５から液体保持部２の外部へ液体を流出させる液体流出管８とを備える。【選択図】図１
2016153740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板と、該透明基板の表面に形成された金属微細凹凸構造とを備え、該金属微細凹凸構造に照射された光により、該金属微細凹凸構造の表面に誘起された局在プラズモンの光電場増強効果によって、該表面に増強された光電場を発生する光電場増強基板と、
該光電場増強基板の前記金属微細凹凸構造上に液体を保持する液体保持部と、
該液体保持部内の前記金属微細凹凸構造上に、該金属微細凹凸構造との間に隙間を空けて対向配置された、被検体を支持する支持部材であって、前記被検体から放出された物質を透過させる支持部材と、
前記液体保持部内の前記隙間により構成される流路に前記液体保持部の外部から液体を流入させる液体流入管、および該流路から前記液体保持部の外部へ液体を流出させる液体流出管とを備えた光電場増強デバイス。
【請求項２】
前記液体流入管から前記流路へ流入させる液体の流量、および該流路から前記液体流出管へ流出させる液体の流量を調整する流量調整機構を備えた請求項１記載の光電場増強デバイス。
【請求項３】
前記流量調整機構として、前記液体流入管から前記流路へ液体を流入させる送液ポンプと、前記流路から前記液体流出管へ液体を流出させる吸引ポンプとを備えている請求項２記載の光電場増強デバイス。
【請求項４】
前記流量調整機構として、さらに、前記液体流入管および前記液体流出管の少なくともいずれか一方に、管路断面積を調整する断面積調整具を備えた請求項３記載の光電場増強デバイス。
【請求項５】
請求項１から４いずれか１項記載の光電場増強デバイスの前記支持部材上に前記被検体として生体試料を載置して培養保存し、
前記生体試料から放出された物質が前記金属微細凹凸構造上に付着した状態で、該金属微細凹凸構造に対して励起光を照射させ、該励起光の照射により発生して前記光電場増強デバイスの前記透明基板側から射出された光を検出することにより前記物質に関する情報を取得する光測定に供する光電場増強デバイスの使用方法。
【請求項６】
前記光測定の後、前記流路へ前記液体流入管から液体を第１の流量で流入させ、該流路に存在する液体を前記第１の流量よりも大きい第２の流量で前記液体流出管へ流出させることにより前記金属微細凹凸構造の表面を洗浄する請求項５記載の光電場増強デバイスの使用方法。
【請求項７】
請求項１から４いずれか１項記載の光電場増強デバイスと、
前記光電場増強基板の前記金属微細凹凸構造に対して励起光を照射する励起光照射部と、
前記光電場増強基板への前記励起光の照射により発生し、前記透明基板側から射出された光を検出する光検出部とを備えたことを特徴とする光測定装置。
【請求項８】
前記励起光によって前記光電場増強基板の金属微細凹凸構造上を２次元状に走査させる走査機構を備えた請求項７記載の光測定装置。
【請求項９】
請求項１から４いずれか１項記載の光電場増強デバイスの前記光電場増強基板の前記金属微細凹凸構造に対して励起光を照射し、
該励起光の照射により発生し、前記透明基板側から射出された光を検出する光測定方法。
【請求項１０】
前記励起光の照射および前記射出された光の検出による光測定を、前記光電場増強デバイスの前記流路へ液体の流入出をさせることなく実施し、
該光測定の後、前記液体流入管から前記流路へ液体を第１の流量で流入させ、該流路に存在する液体を前記液体流出管から前記第１の流量よりも大きい第２の流量で流出させることにより前記金属微細凹凸構造の表面を洗浄し、
該洗浄の後、前記流路への前記液体流入管からの液体の流入および該流路から前記液体流出管への液体の流出を停止した状態で、再度、前記光測定を実施する請求項９記載の光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局在プラズモンを誘起する微細な金属凹凸構造を備えた光電場増強デバイス、その使用方法、光電場増強デバイスを用いて増強された光を測定する光測定装置および光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、金属表面における局在プラズモン共鳴現象による光電場増強効果を利用したセンサデバイスやラマン分光用デバイスなどの光電場増強デバイスが知られている。ラマン分光法は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を得る方法であり、このスペクトルを解析することによって物質の同定などを行うことができる。
【０００３】
上述したラマン分光法として、微弱なラマン散乱光を増強するために局在プラズモン共鳴によって増強された光電場を利用した、いわゆる表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ: Surface Enhanced Raman Spectroscopy）と呼ばれる方法がある（特許文献１、２など参照。）。
【０００４】
この方法は、金属体、特に表面にナノオーダの凹凸を有する金属体に物質を接触させた状態で光を照射すると、局在プラズモン共鳴による光電場増強が生じ、金属体表面に接触された試料のラマン散乱光強度が増強されるという原理を利用するものである。具体的には、たとえば表面に金属微細凹凸構造を備えた基板が用いられ、この基板の金属微細凹凸構造上に被検体を設置し、その被検体設置箇所に向かって励起光を照射することによって表面増強ラマン分光法を実施することができる。
【０００５】
一方で、たとえば細胞などの生体試料から放出される代謝物などのラマンスペクトルを測定する際、金属微細凹凸構造上に生体試料を直接設置した場合には、たとえば銀などの殺菌作用によって細胞が死滅して生体試料が破壊されるおそれがある。また、金属微細凹凸構造上に直接設置された生体試料自身が障害となって生体試料から放出された代謝物が金属微細凹凸構造上に十分に拡散および付着せず、代謝物のラマンスペクトルを高精度に測定することができない問題があった。この問題を解決するため、本出願人は特許文献３において、生体試料を死滅させることなく保持し、生体試料から放出される代謝物などのラマンスペクトルを測定することを可能とした光電場増強デバイスを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００６−５１４２８６号公報
【特許文献２】特開２０１２−２１１８３９号公報
【特許文献３】特開２０１４−５５９３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらに、生体試料から代謝物が放出されたり、放出が止まったりといった代謝変動の経時変化を観察したいという要求が新たに生じてきた。
しかしながら、特許文献３に記載の光電場増強デバイスでは、被検体から一旦放出された物質は金属微細凹凸構造上にとどまり続けるので、被検体からの放出が止まった後でも、その後の測定において信号が検出され続けてしまうため、経時変化を精度よく観察することが難しいという問題があることがわかってきた。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑み、細胞などの生体試料である被検体を死滅させることなく保持し、被検体から放出された物質のラマンスペクトルなどを高精度に測定することができる光電場増強デバイスであって、被検体の代謝変動の経時変化の観察にも適用可能な光電場増強デバイスを提供することを目的とする。また、本発明は、その光電場増強デバイスの使用方法、光電場増強デバイスを用いた光測定装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の光電場増強デバイスは、透明基板と、その透明基板の表面に形成された金属微細凹凸構造とを備え、その金属微細凹凸構造に照射された光により、金属微細凹凸構造の表面に誘起された局在プラズモンの光電場増強効果によって、表面に増強された光電場を発生する光電場増強基板と、
光電場増強基板の金属微細凹凸構造上に液体を保持する液体保持部と、
液体保持部内の金属微細凹凸構造上に、金属微細凹凸構造との間に隙間を空けて対向配置された、被検体を支持する支持部材であって、被検体から放出された物質を透過させる支持部材と、
液体保持部内の金属微細凹凸構造と支持部材との隙間により構成される流路に液体保持部の外部から液体を流入される液体流入管、および流路から液体保持部の外部へ液体を流出させる液体流出管とを備えたことを特徴とする。
【００１０】
金属微細凹凸構造は、励起光の照射により局在プラズモンを生じる金属からなり、その励起光の照射により局在プラズモンを生じる形状の凹凸構造を有するものである。なお、金属微細凹凸構造は、照射する励起光の波長よりも小さいピッチおよび／または深さを有していれば局在プラズモンを誘起することができる。凸部頂点から隣接する凹部の底部までの深さの平均、および凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士のピッチの平均が励起光の波長よりも小さければよく、凹凸の平均的なピッチおよび平均的な深さが３００ｎｍ以下、さらには、２００ｎｍ以下であることがより好ましい。凹凸の平均的なピッチは、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）で微細凹凸構造の表面画像を撮影し、画像処理をして２値化し、統計的処理によって求めるものとする。凹凸の平均的な深さは、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）により表面形状を測定して統計的処理によって求めるものとする。
【００１１】
本発明の光電場増強デバイスにおいては、液体流入管から流路へ流入させる液体の流量、および流路から液体流出管へ流出させる液体の流量を調整する流量調整機構を備えることが好ましい。
【００１２】
上記流量調整機構としては、液体流入管から流路へ液体を流入させる送液ポンプと、流路から液体流出管へ液体を流出させる吸引ポンプとを備えることができる。
【００１３】
流量調整機構としては、さらに、液体流入管および液体流出管の少なくともいずれか一方に、管路断面積を調整する断面積調整具を備えてもよい。
【００１４】
本発明の光電場増強デバイスの使用方法は、上記本発明の光電場増強デバイスの支持部材上に被検体として生体試料を載置して培養保存し、
生体試料から放出された物質が金属微細凹凸構造上に付着した状態で、金属微細凹凸構造に対して励起光を照射させ、励起光の照射により発生して光電場増強デバイスの透明基板側から射出された光を検出することにより物質に関する情報を取得する光測定に供する光電場増強デバイスの使用方法である。
【００１５】
本発明の光電場増強デバイスの別の使用方法は、流量調整機構を備えた光電場増強デバイスの使用方法であって、光電場増強デバイスの支持部材上に被検体として生体試料を載置して培養保存し、
生体試料から放出された物質が金属微細凹凸構造上に付着した状態で、金属微細凹凸構造に対して励起光を照射させ、励起光の照射により発生して光電場増強基板の透明基板側から射出された光を検出することにより物質に関する情報を取得する光測定に供し、
光測定の後、流路へ液体流入管から液体を第１の流量で流入させ、流路に存在する液体を第１の流量よりも大きい第２の流量で液体流出管へ流出させることにより金属微細凹凸構造の表面を洗浄する光電場増強デバイスの使用方法である。
【００１６】
本発明の光測定装置は、上記光電場増強デバイスと、光電場増強基板の金属微細凹凸構造に対して励起光を照射する励起光照射部と、光電場増強基板への励起光の照射により発生し、透明基板側から射出された光を検出する光検出部とを備えたことを特徴とする。
【００１７】
また、上記本発明の光測定装置においては、励起光によって光電場増強基板の金属微細凹凸構造上を２次元状に走査させる走査機構を設けることができる。
【００１８】
本発明の光測定方法は、上記光電場増強デバイスの光電場増強基板の金属微細凹凸構造に対して励起光を照射し、励起光の照射により発生し、透明基板側から射出された光を検出することを特徴とする。
【００１９】
本発明の光測定方法においては、励起光の照射および射出された光の検出による光測定を、光電場増強デバイスの流路へ液体の４をさせることなく実施し、
その光測定の後、液体流入管から流路へ液体を第１の流量で流入させ、流路に存在する液体を液体流出管から第１の流量よりも大きい第２の流量で流出させることにより金属微細凹凸構造の表面を洗浄し、
洗浄の後、流路への液体の流入出を停止した状態で、再度光測定を実施することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の光電場増強デバイスは、光電場増強基板の金属微細凹凸構造上に液体を保持する液体保持部と、液体保持部内の金属微細凹凸構造上に、金属微細凹凸構造との間に隙間を空けて対向配置された、被検体を支持する支持部材であって、被検体から放出された物質を透過させる支持部材と、液体保持部内の上記隙間により構成される流路に液体保持部の外部から液体を流入される液体流入管、および流路から液体保持部の外部へ液体を流出させる液体流出管とを備えている。係る構成によれば金属微細凹凸構造と支持部材との間の流路に任意のタイミングで液体を流すことができ、適宜流路に液体を送液して、金属微細凹凸構造に沿って液体を流すことにより、金属微細凹凸構造上に付着している物質を除去することができ、被検体の代謝変動の経時変化の観察を高精度に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の光電場増強デバイスの概略構成を示す図
【図２Ａ】図１に示すラマン分光測定装置が備える光電電場増強デバイスに設けられた光電場増強基板を示す斜視図
【図２Ｂ】図２Ａに示した光電場増強基板の側面の一部IIＢの拡大図
【図３】光電場増強基板の作製方法を示す各工程における断面図
【図４】本実施形態の光電場増強デバイスにおける洗浄操作を説明するための図
【図５】光電場増強デバイスにおける流量調整機構の他の実施形態を示す図
【図６】本発明の光電場増強デバイスおよび光測定装置の一実施形態を用いたラマン分光測定装置の概略構成を示す図
【図７】図１に示すラマン分光測定装置に対して光電場増強デバイスを移動させる移動ステージを設けた図
【図８】実証実験において取得した第１の光測定時および第２の光測定時のラマン信号の経時変化を示す図
【図９Ａ】図８の期間Ａにおけるラマンスペクトルを示す図
【図９Ｂ】図８の期間Ｂにおけるラマンスペクトルを示す図
【図９Ｃ】図８の期間Ｃにおけるラマンスペクトルを示す図
【図９Ｄ】図８の期間Ｄにおけるラマンスペクトルを示す図
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の光電場増強デバイスの一実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の光電場増強デバイス１の概略構成を示す図である。
【００２３】
本実施形態の光電場増強デバイス１は、図１に示すように、透明基板２２とその表面に形成された金属微細凹凸構造２５とを備えた光電場増強基板２０と、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５上に溶液（液体）Ｌを保持する液体保持部２と、液体保持部２内に設けられ、被検体Ｓを支持するとともに被検体Ｓから放出された物質を透過する支持部材４とを備えている。
【００２４】
図１に示すように、支持部材４は、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５との間に隙間ＳＰを空けて金属微細凹凸構造２５に対向して配置されている。支持部材４と金属微細凹凸構造２５との間の隙間ＳＰは、金属微細凹凸構造２５の表面に沿って液体を送液する際の流路５を構成するものである。光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５と支持部材４との隙間ＳＰを流路５として用いるためには、金属微細凹凸構造２５と支持部材４との間隔は１μｍ〜５ｍｍとすることが好ましい。
【００２５】
そして、光電場増強デバイス１は、この流路５に対して、液体保持部２の外部から液体を流入させるための液体流入管６と、流路５から液体を液体保持部２の外部へ流出させるための液体流出管８とを備えている。すなわち、流路５の一端に液体流入管６が接続され、他端に液体流出管８が備えられており、液体流入管６から流路５へ液体を流入させ、流路５に存在する液体を液体流出管８から流出させることにより、流路５に金属微細凹凸構造２５に沿って液体を送液できるように構成されている。
【００２６】
また、本実施形態においては、液体流入管６から流路５へ流入させる液体の流量、および流路５から液体流出管８へ流出させる液体の流量を調整する流量調整機構１０として、液体流入管６に接続された送液ポンプ１１と、液体流出管８に接続された吸引ポンプ１２と、液体流入管６中において管路断面積を調整する断面積調整具であるバルブ１３とを備えている。ここで、送液ポンプ１１は、洗浄液１５を貯留する貯留タンク１７から洗浄液１５を流路５へと送液するものであり、吸引ポンプ１２は流路５に存在する液体を吸引して廃液用タンク１８へと排出させるものである。
【００２７】
送液ポンプ１１および吸引ポンプ１２は、いずれも液体を安定的に流入および流出させる機能を有するものであればよい。チューブ式のローラポンプであってもよいし、スクリュー型のポンプであってもよい。また、加圧式もしくは減圧式のポンプであってもよい。
ここで「安定的に」とは、バルブ１３などの管路の断面積調整具により管路断面積を変化させた場合にも、液体保持部を介することなく断面積調整具に直接接続されたポンプ以外のポンプの送液能または吸引能（吐出または吸引圧力）は影響を受けないことを意味する。
【００２８】
液体流入管６に備えられているバルブ１３は、備えられた位置における液体流入管６の管路断面積を変化させる断面積調整具の一実施形態であり、管路断面積を変化させることにより結果として流量を変化させるものである。液体流入管６がタイゴンチューブなどのフレキシブルなやわらかい素材のものであれば、断面積調整具としてバルブ１３に代えて、点滴の際に点滴液の滴下量を調整するために一般に使用されるクレンメを備えてもよい。クレンメを用いた場合にはチューブの押しつぶし量を変化させることにより、管路の断面積を変化させて流量を変化させることができる。
【００２９】
光電場増強基板２０は、既述の通り透明基板２２上に金属微細凹凸構造２５を備えるものである。ここで、「透明」とは励起光およびラマン散乱光に対して透明であることを意味し、これらの光に対して６０％以上の透過率を示すものとする。例えば、励起光としての波長７８５ｎｍの光を使用する場合、少なくとも７８５ｎｍ〜1μｍの波長域の光に対して透明とする。金属微細凹凸構造２５は、透明基板２２上に励起光の照射により局在プラズモンを生じる金属からなるものであり、その表面に誘起された局在プラズモンの光電場増強効果によって、表面に増強された光電場を生じる形状の微細凹凸構造を有する、所謂ＳＥＲＳ基板として機能するものであればよい。
【００３０】
図２Ａは、光電場増強デバイス１における光電場増強基板２０の特に好ましい形態を示す斜視図であり、図２Ｂは、図２Ａに示した光電場増強基板２０の側面の一部IIＢの拡大図である。
【００３１】
図２Ａおよび図２Ｂに示す光電場増強基板２０は、透明基板２２とその表面に設けられた透明な微細凹凸構造２３と、その透明な微細凹凸構造２３の表面に形成された金属膜２４とからなるものである。金属膜２４が透明な微細凹凸構造２３に沿って形成されることによって金属微細凹凸構造２５が構成されている。
【００３２】
この光電場増強基板２０は、金属膜２４が形成された微細凹凸構造２３（金属微細凹凸構造２５）に励起光Ｌ１が照射されることによって、局在プラズモン共鳴が誘起され、この局在プラズモン共鳴により、表面に増強された光電場を発生するものである。
【００３３】
そして、本実施形態における微細凹凸構造２３は、ベーマイトから形成されるものである。微細凹凸構造２３は、その表面に金属膜２４を形成して形成される金属微細凹凸構造２５の凸部の深さの平均およびピッチの平均が、励起光Ｌ１の波長より短くなるように形成されるものであるが、金属微細凹凸構造２５の表面に局在プラズモンを生じさせうるものであればよい。特に、微細凹凸構造２３は、凸部頂点から隣接する凹部の底部までの深さの平均が２００ｎｍ以下、凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士のピッチの平均が２００ｎｍ以下であることが望ましい。
【００３４】
金属膜２４は、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる金属からなるものであればよいが、たとえば、Ａｕ（金）、Ａｇ（銀）、Ｃｕ（銅）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｐｔ（白金）、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属からなるものである。主成分とは全成分の９０％以上を占める成分をいうものとする。特には、ＡｕあるいはＡｇが好ましい。
【００３５】
金属膜２４の膜厚は、微細凹凸構造２３の表面に形成されたときに、金属微細凹凸構造２５として励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる凹凸形状を維持することができる程度の厚みであれば特に制限はないが、１０〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００３６】
ここで、図３を用いて、本実施形態における光電場増強基板２０の作製方法について説明する。図３は光電場増強基板２０の各作製工程における断面図を示すものである。
【００３７】
まず板状の透明基板２２を用意する。透明基板２２を純水洗浄する。その後、透明基板２２の表面にスパッタ法によりアルミニウム２３ａを数十ｎｍ程度成膜する。
【００３８】
その後、純水を沸騰させた中に、アルミニウム２３ａ付き透明基板２２を浸水させ、数分（５分程度）後に取り出す。この煮沸処理（ベーマイト処理）により、アルミニウム２３ａは透明化し、微細凹凸構造２３が形成される。微細凹凸構造２３上に金属膜２４を蒸着させる。以上の処理により光電場増強基板２０を作製することができる。
【００３９】
なお、金属膜２４は、蒸着に限らず、たとえば金属の微粒子を固定化して形成するようにしてもよい。
【００４０】
また、上述した煮沸処理による微細凹凸構造作製工程において温水処理させる金属としては、上述したアルミニウムに代えてアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）のような金属酸化物を用いてもよい。アルミニウムおよびアルミナは、温水処理により、バイヤーライト（Ａｌ（ＯＨ）３）またはベーマイト（ＡｌＯＯＨ）のいずれか、または両方からなる複雑な三角錐構造を有する微細凹凸構造を基板上に形成することができる。なお、アルミニウムの他、チタン（Ｔｉ）など、同様に温水処理により微細凹凸構造を形成する金属も用いることができる。
【００４１】
また、金属あるいは金属酸化物を透明基板２２に成膜する方法は、スパッタ法に限らず、加熱蒸着法やゾルゲル法を用いてもよい。
【００４２】
また、温水処理としては、煮沸処理に限らず、金属または金属酸化物が成膜された基板を高温の水蒸気に曝して金属または金属酸化物を高温の水蒸気と反応させる処理を行ってもよい。
【００４３】
なお、上記実施形態においては、光電場増強基板２０の透明基板２２における微細凹凸構造２３をベーマイトにより構成するようにしたが、ベーマイト以外の透明な材料により構成されていてもよい。たとえばアルミニウム基体に対して、陽極酸化処理を施してその上層部に多数の微細孔を有する陽極酸化アルミナを作製し、陽極酸化されていないアルミニウム部分を除去した陽極酸化アルミナを微細凹凸構造２３とし、これをガラスなどの透明基板２２上に固定してもよい。
【００４４】
また、微細凹凸構造は透明基板と異なる材料により構成されたもののみならず、透明基板の表面を加工することにより透明基板と同一の材料により構成されていてもよい。たとえばガラス基板の表面をリソグラフィーとドライエッチング処理することにより、表面に微細凹凸構造を形成してもよい。
【００４５】
また、光電場増強基板としては、例えば、透明基板の表面に、金属ナノ粒子あるいは金属ナノロッドを多数分散配置して固定したものや、透明基板上に例えば５０ｎｍ以下の幅の金属細線が複数網目状、格子状あるいはストライプ状に配列形成されたものであってもよい。
【００４６】
光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５上に液体を保持する液体保持部２は、光電場増強基板２０を底面とする容器状を構成するための側壁部を有する。液体保持部２は、細胞などの生体試料からなる被検体Ｓを死滅させないように維持するとともに、被検体Ｓから放出された代謝物などの物質を拡散するための溶液Ｌが貯留され、これを保持するものである。液体保持部２に保持される溶液Ｌとしては、たとえばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate buffered saline）などがある。
【００４７】
また、液体保持部２内に設けられて被検体Ｓを支持する支持部材４は、生体試料を死滅させることなく維持できる材料から形成されるとともに、生体試料から放出された物質を透過して光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５まで到達させるものであれば如何なるものでもよい。たとえばミクロンオーダーまたはサブミクロンオーダーの多数の孔を有する多孔質フィルタから構成されるものである。
【００４８】
支持部材４上に設置された被検体Ｓは、たとえば液体保持部２に保持された溶液Ｌに被検体刺激物が添加された際に代謝物を放出する。被検体Ｓから放出される代謝物としては、たとえばＡＴＰ（アデノシン三リン酸）やＣａ（カルシウム）などがある。
【００４９】
また、被検体Ｓとなる細胞の大きさは一般に１μｍ〜１００μｍ程度の範囲である事から、多孔質フィルタの細孔径の好ましい範囲は上限が１μｍ以下であることが好ましく、上述したＡＴＰやＣａなどの代謝物が容易に通過できる点で２ｎｍ以上が好ましい。細孔径は０.０３μｍ〜１μｍの範囲が入手性の点でより好ましい。
【００５０】
このような多孔質フィルタは、たとえば、その厚さは数１０μｍ〜数１００μｍ程度であり、ポリスチレンなどの樹脂やセラミックなどの材料から形成されるものである。具体的には、たとえば、無機酸化アルミ製のアノディスク（商品名）や、メルクミリポア社製の各種メンブレンフィルターである、ポリカーボネート製のISOPORE（登録商標）、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）製のオムニポア（登録商標）、セルロース混合エステル製のＭＦ-ミリポア（商品名）あるいは親水性ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフロライド）製のデュラポア（商品名）などを好適に用いることができる。
【００５１】
特に、支持部材４の上で細胞を培養するためには、オートクレーブ処理などの滅菌処理を施したものが好ましい。
【００５２】
また、多孔質フィルタからなる支持部材４は、被検体Ｓから放出される物質以外のゴミなどを留める機能も果たすものである。
【００５３】
上記光電場増強デバイス１の使用方法としては、支持部材４上に被検体Ｓとして生体試料を載置して培養保存すること、生体試料から放出された物質が金属微細凹凸構造２５上に付着した状態で、金属微細凹凸構造２５に対して励起光を照射させ、励起光の照射により発生して光電場増強デバイス１の透明基板２２側から射出された光を検出することにより物質に関する情報を取得する光測定に供することが挙げられる。また、さらには、光測定の後、流路５へ液体流入管６から液体を第１の流量で流入させ、流路５に存在する液体を第１の流量（流入流量Ｑin）よりも大きい第２の流量（流出流量Ｑout）で液体流出管８へ流出させることにより金属微細凹凸構造２５の表面を洗浄することもでき、洗浄後には、さらに生体試料の培養保存を続けたり、再度の光測定に供したりすることができる。
【００５４】
本実施形態の光電場増強デバイス１における洗浄操作について、図４を参照して説明する。
流路５において、金属微細凹凸構造２５の表面に沿って液体を効率よく送液して洗浄効果を高めるためは、洗浄時に、支持部材４の流路５側の水圧を、支持部材４の被検体Ｓ側の水圧に対して陰圧となるように維持することが望ましい。以下において、「流路側を陰圧にする」とは、支持部材４の被検体Ｓ側の水圧に対して流路５側の水圧を陰圧にすることを意味する。
【００５５】
洗浄液としては、特に制限されるものではないが、測定対象となる、被検体から放出される物質Ａに対して、この物質Ａと結合しやすい液体もしくは物質Ａと結合しやすい物質が溶解した液体を用いれば、洗浄効果が高く好ましい。
例えば、物質Ａが、尿酸（Uric acid）であるとき、洗浄液として、物質Ａが溶解しやすい水酸化ナトリウム水溶液など、あるいは、物質Ａと結合しやすい物質として糖タンパクが溶解した液体を用いればよい。また、洗浄液として、両性界面活性剤のGly-HCl（グリシン塩酸）溶液、アルカリ性の炭酸ナトリウム水溶液やアンモニア水、酸性の蟻酸、希塩酸、クエン酸溶液、有機溶剤系のエタノール、メタノールなども好適に使用することができる。
なお、洗浄液は１種に限らず、複数の液体を逐次送液するようにしてもよい。
【００５６】
また、生体試料である被検体Ｓを支持部材４に支持した状態で洗浄液を送液して金属微細凹凸構造２５の表面を洗浄する場合、支持部材４の多数の孔から被検体Ｓ側へ洗浄液１５が流入しないように制御することが望まれる。これは、被検体Ｓから放出される物質を効率よく洗浄するための洗浄液は、生体試料である被検体Ｓに対して悪影響を及ぼす可能性があるからである。流路５から支持部材４の生体試料側に洗浄液１５が流入しないようにするためにも、洗浄時に、流路５側を陰圧にすることが望ましい。
【００５７】
流路５側を陰圧にするためには、液体の送液時において、液体流入管６から流路５への液体の流入流量Ｑinを、流路５から液体流出管８への液体の流出流量Ｑoutよりも小さくすればよい。ここで、流入流量Ｑinは液体流入管６の流路５への接続部分の断面積Ａinおよび流入流速Ｖinの積で表され、流出流量Ｑoutは液体流出管８の流路５への接続部分の断面積Ａoutおよび流出流速Ｖoutの積で表される。流入流量Ｑin＜流出流量Ｑoutの関係とすることにより、流路５側を陰圧に維持することができ、流路５中を送液される液体が生体試料側に流入されない状態を維持できる。なお、液体流入管６と液体流出管８との管径が同一の場合には、流入の流速Ｖinよりも流出の流速Ｖoutを速くすることと、流入流量Ｑinよりも流出流量Ｑoutを大きくすることとは等価である。
【００５８】
バルブ１３を全開とした状態で送液ポンプ１１による送液能および吸引ポンプ１２による吸引能を流入流量Ｑinと流出流量Ｑoutが同等（Ｑin＝Ｑout）となるように各ポンプを設定しておき、洗浄液の送液時には液体流入管６に備えられたバルブ１３を閉める方向、すなわち液体流入管６の断面積を小さくする方向に調節することにより、液体流入管６からの流入流量Ｑinを液体流出管８への流出流量Ｑoutよりも小さくすることができ、流路５側を陰圧とすることができる。
【００５９】
また、バルブ１３を液体流入管６に備えず、液体流出管８側に備えた場合、たとえばバルブ１３を半開とした状態で送液ポンプ１１による送液能および吸引ポンプ１２による吸引能を流入流量Ｑinと流出流量Ｑoutが同等となるように各ポンプを設定しておき、洗浄液の送液時には、液体流出管８に備えられたバルブ１３を開く方向、すなわち液体流出管８の断面積を大きくする方向に調整することにより、液体流出管への流出流量Ｑoutを液体注入管からの流入流量Ｑinよりも大きくすることができ、流路５側を陰圧とすることができる。
【００６０】
このように、バルブ１３の開閉によりバルブ位置で局所的に管の断面積を変化させることにより、バルブ位置での流量を変化させることができるので、結果として流路５への流入流量Ｑinあるいは流路５からの流出流量Ｑoutを変化させることができる。
【００６１】
なお、光電場増強デバイス１は、図５に示すようにバルブ１３等の断面積調整具を備えていなくてもよい。この場合、送液ポンプ１１による送液能を吸引ポンプ１２による吸引能を、流入流量Ｑinよりも流出流量Ｑoutが大きくなるように設定すれば流路５側を陰圧とすることができる。例えば、液体流出管８の管の断面積と液体流入管６の管の断面積とを同一とし、送液ポンプ１１による送液の流速よりも吸引ポンプ１２による吸引の流速を大きく設定すればよい。あるいは、液体流出管８の管の断面積を液体流入管６の管の断面積よりも大きくし、送液ポンプ１１による送液の流速と吸引ポンプ１２による吸引の流速とを同一に設定すればよい。
【００６２】
上記においては、流路５側を陰圧として、洗浄液１５を金属微細凹凸構造２５の表面上を送液させて金属微細凹凸構造２５の表面を洗浄する場合の操作について説明したが、本実施形態の光電場増強デバイス１においては、流路５側の水圧を支持部材４の被検体Ｓ側の水圧に対して陽圧となるように制御することも可能である。流路側を陽圧にするためには、液体流入管６から流路５へ流入する液体の流入流量Ｑinを流路５から液体流出管８へ流出する液体の流出流量Ｑoutよりも小さくすればよい。この場合、流路５内の液体は、被検体Ｓ側へも流入することとなる。例えば、生体試料を培養する際には薬剤あるいは栄養剤などを含む液体を液体流入管６から流入させて、さらに生体試料側へと流入させることにより生体試料に薬剤あるいは栄養剤などを与える際などに適宜用いることができる。
【００６３】
なお、液体流入管６から薬剤あるいは栄養剤などを含む液体を流入させる場合には、吸引ポンプ１２は作動させず、送液ポンプ１１のみ作動させて液体流入管６から流路５へ液体を流入させてもよい。この手法によれば、より効率よく流路５中の液体を支持部材４の多数の孔から生体試料側へ流入させることができる。
【００６４】
このように、本光電場増強デバイス１は流路、液体流入管、液体流出管および送液ポンプ、吸引ポンプを備えているので、流路側を陰圧、あるいは陽圧に適宜制御することが可能である。
【００６５】
光電場増強デバイス１において生体試料を培養するにあたり、生体試料から放出される物質や液体中を浮遊するごみなどにより、支持部材４の孔は目詰まりを生じる場合がある。このような場合にも、流路５側を陰圧あるいは陽圧とする制御手法は支持部材４の目詰まりの除去に有用である。
【００６６】
支持部材４の目詰まりの除去は、生体試料を光電場増強デバイス１から別途の容器を移し替える等行い、液体保持部２中に生体試料が存在しない状態で行う。例えば、吸引ポンプ１２を作動させず、送液ポンプ１１のみを作動させて液体流入管６から流路５へ洗浄液を流入させる。吸引ポンプ１２は作動していないので、栄養剤等を与える場合と同様に、流路５側が陽圧となり流路５中の洗浄液が支持部材４の孔から上方へと流出する。この際、送液ポンプ１１による送液の圧力を適宜設定すれば、流路５側からの水圧により支持部材４の目詰まりを除去することができる。あるいは、液体保持部２に支持部材４の上の方まで洗浄液を溜めた状態で送液ポンプ１１は作動させず、吸引ポンプ１２のみを作動させて流路５から液体流出管８へ洗浄液を流出させる。送液ポンプ１１は作動していないので、流路５側が陰圧となり支持部材４の上方の洗浄液が流路５側へ引き込まれることとなる。この際、吸引ポンプ１２による吸引力を適宜設定すれば、支持部材４の目詰まりを除去することができる。
【００６７】
次に、本発明の光測定装置および光測定方法の一実施形態を用いたラマン分光測定装置について説明する。図６は、本実施形態のラマン分光測定装置５０の概略構成を示す図である。
【００６８】
ラマン分光測定装置５０は、図６に示すように、上述した光電場増強デバイス１と、光電場増強デバイス１の光電場増強基板２０の裏面側（透明基板側）から励起光Ｌ１を照射する励起光照射部３０と、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍の物質から発せられ光電場増強基板２０の作用により増強されたラマン散乱光Ｌ２を、光電場増強基板２０の裏面側から検出するための光検出部４０とを備えている。
【００６９】
励起光照射部３０は、励起光Ｌ１を射出する半導体レーザ光源３１と、この半導体レーザ光源３１から射出された励起光Ｌ１を平行光化するレンズ３２と、励起光Ｌ１を透過し、かつその励起光Ｌ１の照射により光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍の物質から射出されたラマン散乱光Ｌ２を含む光を光検出部４０側へ反射するハーフミラー３３と、ハーフミラー３３を透過した励起光Ｌ１を光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍に集光するとともに、ラマン散乱光Ｌ２を平行光化するレンズ３４とを備えている。
【００７０】
光検出部４０は、ハーフミラー３３により反射されてきた光のうち励起光Ｌ１を除去し、それ以外の光を透過するノッチフィルタ４１と、ノイズ光を除去するためのピンホール４３ａを備えたピンホール板４３と、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍の物質から発せられ、レンズ３４およびノッチフィルタ４１を透過した増強ラマン散乱光Ｌ２を、ピンホール４３ａへ集光するためのレンズ４２と、ピンホール４３ａを通過したラマン散乱光Ｌ２を平行光化するレンズ４４と、ラマン散乱光Ｌ２を検出する分光器４５とを備えている。
【００７１】
次に、本実施形態のラマン分光測定装置５０を用いて、被検体Ｓから放出された代謝物などのラマンスペクトルを測定する方法について説明する。
【００７２】
光電場増強デバイス１においては支持部材４上に被検体Ｓが設置されるとともに、液体保持部２内に被検体Ｓが浸かるように溶液Ｌが貯留されている。光測定を行う間は、流路５は溶液Ｌにより満たされており、液体流入管６から流路５への液体の流入、流路５から液体流出管８への液体の流出は行わない。
【００７３】
励起光照射部３０の半導体レーザ光源３１から励起光Ｌ１が射出され、励起光Ｌ１はハーフミラー３３を透過してレンズ３４で集光されて、光電場増強基板２０上の金属微細凹凸構造２５近傍に照射される。
【００７４】
励起光Ｌ１の照射によって光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５において局在プラズモン共鳴が誘起され、金属微細凹凸構造２５表面に増強された光電場が発生する。金属微細凹凸構造２５近傍の物質から発せられ、光電場により増強されたラマン散乱光Ｌ２は、レンズ３４を透過して、ハーフミラー３３によって分光器４５側に反射される。なお、このとき、光電場増強基板２０で反射された励起光Ｌ１もハーフミラー３３によって反射されて分光器４５側に反射されるが、励起光Ｌ１はノッチフィルタ４１によって除去される。
【００７５】
一方、励起光Ｌ１とは波長が異なる光はノッチフィルタ４１を透過し、レンズ４２によってピンホール４３ａに集光され、ピンホール４３ａを透過した光はレンズ４４によって平行光化され、分光器４５へ入射される。なお、本実施形態におけるラマン分光測定装置５０においては、レーリー散乱光あるいはミー散乱光などは、その波長が励起光Ｌ１と同じであるため、ノッチフィルタ４１によってカットされ、分光器４５へ入射することはない。ラマン散乱光Ｌ２は、分光器４５に入射してラマンスペクトル測定が行われる。
【００７６】
上記実施形態のラマン分光測定装置５０によれば、光電場増強デバイス１が、金属微細凹凸構造２５の表面から間隔をあけた位置で被検体Ｓを支持し、かつその被検体Ｓから放出された物質を透過する支持部材４を備えているので、被検体Ｓが金属微細凹凸構造２５に直接接触することがないので生体試料からなる被検体Ｓが死滅してしまうのを防止することができ、さらに、被検体から放出された物質が支持部材４を透過して金属微細凹凸構造２５の表面まで到達することができるので、その放出された物質のラマンスペクトルなどを高精度に測定することができる。
【００７７】
また、既述の通り、ラマンスペクトル等の光測定時には、金属微細凹凸構造２５と支持部材４の隙間ＳＰには溶液Ｌが満たされているが、測定終了後、この隙間ＳＰを流路５として、この流路５に洗浄液等の液体を送液、すなわち、金属微細凹凸構造２５の表面に沿って洗浄液を送液させることができるので、金属微細凹凸構造２５の表面に付着している、被検体Ｓから放出された物質を容易に洗浄除去することができる。
光電場増強デバイス１における洗浄操作は既述の通りであり、洗浄時に洗浄液により被検体Ｓにダメージを与えることなく、金属微細凹凸構造２５の表面を洗浄することができる。
【００７８】
このように光電場増強デバイス１を用いれば、１）ラマンスペクトルの測定などの光測定、２）送液による洗浄操作および３）送液停止の１）〜３）のステップを繰り返すことにより、生体試料からの代謝物あるいは代謝物の量などの経時変化を容易に、かつ精度よく観察することができる。送液停止後に引き続き行われる光測定は、送液を停止後、任意の時間経過後に行えばよい。なお、１）における光測定は、１回に限らず、複数回の測定を行うものであってもよい。
【００７９】
また、上記実施形態のラマン分光測定装置５０において、励起光Ｌ１によって被検体Ｓ上を２次元状に走査し、被検体Ｓ上の励起光Ｌ１の各走査点についてラマンスペクトル測定を行うようにしてもよい。
【００８０】
具体的には、たとえば、図７に設計変更例のラマン分光測定装置５１として示すように、光電場増強デバイス１を保持するとともに、図７に示すＸ方向およびＹ方向（紙面奥行方向）に光電場増強デバイス１を移動させる移動ステージ１００（走査機構に相当する）を設け、この移動ステージ１００によって光電場増強デバイス１を移動させることによって、光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍を励起光Ｌ１によって２次元状に走査するようにしてもよい。
【００８１】
なお、励起光Ｌ１を２次元状に走査する走査機構としてはこれに限らず、光電場増強デバイス１は固定した状態とし、たとえばガルバノミラーなどを用いることによって光電場増強基板２０の金属微細凹凸構造２５近傍を励起光Ｌ１によって２次元状に走査するようにしてもよい。
【００８２】
本発明の光測定装置および方法の一実施形態として、上記においてはラマン分光測定装置および方法について説明したが、本発明の光測定装置および方法は、プラズモン増強蛍光検出法および蛍光検出装置に適用することもできる。蛍光検出装置において、上述の光電場増強デバイス１を用い、支持部材４上に被検体Ｓを載置し、透明基板２２側から励起光を照射することにより、裏面側から増強された蛍光を検出することができる。
【００８３】
さらには、ラマン散乱光、蛍光の測定のみならず、励起光Ｌ１の照射を受けた金属膜２４近傍の物質から生じるレーリー散乱光、ミー散乱光、あるいは第２高調波などの光測定装置および方法においても、上述の光電場増強デバイス１を用いることができ、上記と同様に、支持部材４上に被検体Ｓを載置し、透明基板２２側から励起光を照射することにより、裏面側から増強された光を検出することができる。
【００８４】
[検証実験]
以下、本発明の光電場増強デバイスの効果を検証するために行った実験について説明する。液体保持部２に保持された溶液Ｌに被検体刺激物が添加された際に被検体から代謝物が放出される様子を模擬し、図６に示すラマン分光測定装置５０において、光電場増強デバイス１中に被検体Ｓを備えていない状態で、所定の時刻にローダミン６Ｇを溶液Ｌ中に滴下することとし、第１の光測定として、ローダミン６Ｇの滴下時刻ｔ１の前後のラマンスペクトルを取得した。
その後、流路５に洗浄液を送液する洗浄操作を行った。洗浄操作は一次および二次の二段階に分けて実施した。一次洗浄液としてローダミン６Ｇを溶かす作用のあるエタノールを用い、さらに、二次洗浄液として超純水を用いた。
洗浄操作の後、送液は停止した状態で、第２の光測定として第１の光測定と同様に、ローダミン６Ｇの滴下時刻ｔ２の前後のラマンスペクトルを取得した。
【００８５】
図８のａは第１の光測定、図８のｂは第２の光測定において得られたラマン信号強度の経時変化を示すものである。図８においては、ローダミン６Ｇに特徴的なラマンシフト１３６０ｃｍ−１におけるラマン信号強度の経時変化を示している。
図８のａに示すように、第１の光測定では、約１分間に亘り、測定開始時刻から３秒毎にラマンスペクトルを測定した。このとき、測定開始時刻から２４秒後の時刻ｔ１においてローダミン６Ｇを滴下した。また、図８のｂに示すように、第２の光測定においても同様に約１分間に亘り、３秒毎にラマンスペクトルを測定した。第２の光測定では、測定開始時刻から２７秒後の時刻ｔ２においてローダミン６Ｇを滴下した。
【００８６】
図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ第１の光測定において時刻ｔ１の前（図８のａにおける領域Ａ）に取得したラマンスペクトルおよび時刻ｔ１の後（図８のａにおける領域Ｂ）に取得したラマンスペクトルである。図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ第２の光測定において時刻ｔ２の前（図８のｂにおける領域Ｃ）に取得したラマンスペクトルおよび時刻ｔ２の後（図８のｂにおける領域Ｄ）に取得したラマンスペクトルである。
【００８７】
図８および図９Ａ〜図９Ｄに示す通り、時刻ｔ１以前の何も検出されていな領域Ａから、時刻ｔ１において生じた一度目の物質の放出後の領域Ｂにおける第１の光測定により、一度目の物質の放出をとらえることができ、その後、洗浄操作を実施したことにより光電場増強基板上の物質が洗浄されて、第２の光測定の時刻＜ｔ２においては、再び何も検出されない状態（領域Ｃ）となっていることが分かる。また、第２の光測定において、時刻ｔ２において生じた二度目の物質の放出をとらえることができた。
このように、第１の光測定の後に洗浄操作を行うことにより、第１の光測定後、時刻＜ｔ２の間は放出現象が生じていないという情報を取得することができ、さらに、二度目の放出による信号を、一度目の放出の信号に上乗せするのではなく、一旦信号値をリセットした状態で取得することができるので、代謝物変動を精度よく測定することができることが証明された。
【符号の説明】
【００８８】
１    光電場増強デバイス
２    液体保持部
４    支持部材
５    流路
６    液体流入管
８    液体流出管
１０   流量調整機構
１１   送液ポンプ
１２   吸引ポンプ
１３   バルブ
１５  洗浄液
２０   光電場増強基板
２２   透明基板
２３   微細凹凸構造
２４   金属膜
２５   金属微細凹凸構造
３０   励起光照射部
３１   半導体レーザ光源
４０   光検出部
４５   分光器
５０、５１  ラマン分光測定装置
１００ 移動ステージ
【図１】
2016153740.tif 000003
【図２Ａ】
2016153740.tif 000004
【図２Ｂ】
2016153740.tif 000005
【図３】
2016153740.tif 000006
【図４】
2016153740.tif 000007
【図５】
2016153740.tif 000008
【図６】
2016153740.tif 000009
【図７】
2016153740.tif 000010
【図８】
2016153740.tif 000011
【図９Ａ】
2016153740.tif 000012
【図９Ｂ】
2016153740.tif 000013
【図９Ｃ】
2016153740.tif 000014
【図９Ｄ】
2016153740.tif 000015