(57)【要約】【課題】本発明は、L-グリセリン酸の効率的な製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、前記方法に用いる微生物の提供を課題とする。【解決手段】Serratia sp.又はPseudomonas sp.である、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物を用いることにより、L-グリセリン酸を効率的に製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Serratia sp.又はPseudomonas sp.である、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物。
【請求項２】
Serratia sp. GA3R株（受託番号FERM P-01868）、Pseudomonas sp. GA72P株（受託番号FERM P-01869）、及びPseudomonas sp. GA87株（受託番号FERM P-01870）からなる群から選択される、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
Serratia属又はPseudomonas属に属し、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物を、DL-グリセリン酸を含む培地中で培養し、培地中のD-グリセリン酸を消費させ、L-グリセリン酸を培地中に蓄積させることを含む、L-グリセリン酸の製造方法。
【請求項４】
Serratia属又はPseudomonas属に属し、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物がSerratia sp. GA3R株（受託番号FERM P-01868）、Pseudomonas sp. GA72P株（受託番号FERM P-01869）、及びPseudomonas sp. GA87株（受託番号FERM P-01870）からなる群から選択される、請求項３記載のL-グリセリン酸の製造方法。
【請求項５】
培地中のグリセリン酸のL-グリセリン酸の比率が99％(w/v)以上となる、請求項３又は４に記載のL-グリセリン酸の製造方法。
【請求項６】
微生物株及び培養時間を変えることにより、光学異性体比率（D/L)の異なるグリセリン酸を得る、請求項３〜５のいずれか１項に記載のL-グリセリン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の光学異性体に対する選択的な反応を利用したL-グリセリン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性化合物は、医薬品やファインケミカル製品の出発原料や中間体として利用価値の高い重要な化合物である。これまで、化学触媒の改良による光学異性体選択率の向上や、ラセミ体の光学分割技術の高度化により、種々の光学活性化合物が製造可能となっている。
【０００３】
グリセリン酸（GA；2，3-ジヒドロキシプロパン酸）は、天然の植物に見出された有機酸の一種であり、その構造は、D体（D-グリセリン酸）であることが知られている。D-グリセリン酸は、エタノールの代謝促進効果や肝機能の改善効果など、複数の生物活性を有する機能性の化合物として注目されている。一方で、L体のグリセリン酸（L-グリセリン酸）は、希少糖であるL-ヘキソース合成における出発原料として有用であり、医薬品等の高付加価値化学品の原料として工業的に利用価値の高い重要な化合物である（非特許文献１）。
【０００４】
グリセリン酸の製造方法は、グリセリンの化学酸化、又は、微生物酸化により得られることが知られている。特に、酢酸菌によるグリセリンの酸化発酵法では、菌株によりD-グリセリン酸のみを選択的に得る方法が開示されている（特許文献１）。
【０００５】
グリセリンの化学触媒による酸化反応では、一般にラセミ体のグリセリン酸（DL-グリセリン酸）が得られる（非特許文献２、３）。そのため、ラセミ体の光学分割により、D-及びL-グリセリン酸をそれぞれ分離することは可能である。しかし、光学分割の手法としては、カラムクロマトグラフィーを用いたキラル分割等の高価な精製手法を利用するしかなく、効率的なL-グリセリン酸の製造法は知られていない。また、微生物発酵によりL-グリセリン酸を製造する方法が提供されているが、その生産量も1.8 g/Lと低く、実生産規模で利用可能な製造技術ではなかった（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2009-153507号公報
【特許文献２】特開2011-254778号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A. Guaragna et al., J. Org. Chem., 2010, 75, 3558-3568.
【非特許文献２】D. Wang, et al., Chem. Commun., 2006, 1956-1958.
【非特許文献３】A. Tsuji et al., ChemSusChem, 2011, 4, 542-548.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、L-グリセリン酸の効率的な製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、前記方法に用いる微生物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み、ラセミ体のグリセリン酸（DL-グリセリン酸）を原料として、D-グリセリン酸を選択的に消費し、工業的に利用価値の高いL-グリセリン酸を得ることが可能な微生物について検討を行った。その結果、Serratia（セラチア）属細菌及びPseudomonas（シュードモナス）属細菌によりL-グリセリン酸が効率的に得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  Serratia sp.又はPseudomonas sp.である、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物。
[２]  Serratia sp. GA3R株（受託番号FERM P-01868）、Pseudomonas sp. GA72P株（受託番号FERM P-01869）、及びPseudomonas sp. GA87株（受託番号FERM P-01870）からなる群から選択される、[１]の微生物。
[３]  Serratia属又はPseudomonas属に属し、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物を、DL-グリセリン酸を含む培地中で培養し、培地中のD-グリセリン酸を消費させ、L-グリセリン酸を培地中に蓄積させることを含む、L-グリセリン酸の製造方法。
[４]  Serratia属又はPseudomonas属に属し、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物がSerratia sp. GA3R株（受託番号FERM P-01868）、Pseudomonas sp. GA72P株（受託番号FERM P-01869）、及びPseudomonas sp. GA87株（受託番号FERM P-01870）からなる群から選択される、[３]のL-グリセリン酸の製造方法。
[５]  培地中のグリセリン酸のL-グリセリン酸の比率が99％(w/v)以上となる、[３]又は[４]のL-グリセリン酸の製造方法。
[６]  微生物株及び培養時間を変えることにより、光学異性体比率（D/L)の異なるグリセリン酸を得る、[３]〜[５]のいずれかのL-グリセリン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、DL-グリセリン酸を原料にL-グリセリン酸を効率的に製造することができる。また、本発明の微生物は、前記方法に好適に用いることができる。本発明の製造方法により得られたL-グリセリン酸は、医薬品等の多様なキラル化合物原料として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】GA3R株によるDL-グリセリン酸培地中のD-及びL-グリセリン酸濃度の変化を示す図である。
【図２】GA72P株によるDL-グリセリン酸培地中のD-及びL-グリセリン酸濃度の変化を示す図である。
【図３】GA87株によるDL-グリセリン酸培地中のD-及びL-グリセリン酸濃度の変化を示す図である。
【図４】GA3R株によるDL-グリセリン酸からL-グリセリン酸生産の時間変化を示す図である。
【図５】GA72P株によるDL-グリセリン酸からL-グリセリン酸生産の時間変化を示す図である。
【図６】L-GA生産菌3株のL-グリセリン酸の資化能評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において用いる微生物は、DL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物である。
【００１４】
このような微生物として、Serratia（セラチア）属に属する微生物及びPseudomonas（シュードモナス）属に属する微生物が挙げられる。Serratia（セラチア）属に属する微生物として、例えば、Serratia sp. GA3R株が挙げられ、Pseudomonas（シュードモナス）属に属する微生物として、Pseudomonas sp. GA72P株、Pseudomonas sp. GA87株が挙げられる。さらに、Serratia sp. GA29株、Serratia marcescens GA39株、Pseudomonas putida GA83株が挙げられる。
【００１５】
Serratia sp. GA3R株、Pseudomonas sp. GA72P株、及びPseudomonas sp. GA87株は、2014年6月9日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE)  特許微生物寄託センター（NPMD)（日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、それぞれ受託番号FERM P-01868（識別の表示：3R）、FERM P-01869（識別の表示：72P）及びFERM P-01870（識別の表示：87）で寄託した。
【００１６】
上記のSerratia sp.GA3R株、Pseudomonas sp. GA72P株、及びPseudomonas sp. GA87株は、本発明者が土壌等の環境サンプルから単離した菌株であり、DL-グリセリン酸中のD-グリセリン酸を選択的に資化し、消費することを指標に選択した。その細菌学的性質は下記の通りである。
【００１７】
Serratia sp. GA3R株
グラム染色：ネガティブ
細胞形態：短桿菌
コロニーの色調：淡黄色
【００１８】
Pseudomonas sp. GA72P株
グラム染色：ネガティブ
細胞形態：短桿菌
コロニーの色調：淡黄色
【００１９】
Pseudomonas sp. GA87株
グラム染色：ネガティブ
細胞形態：桿菌
コロニーの色調：淡黄色
【００２０】
その他、DL-グリセリン酸を炭素源に生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物として、上記のSerratia sp. GA3R株、Pseudomonas sp. GA72P株、及びPseudomonas sp. GA87株の変種、変異株及び近縁種を挙げることができる。
【００２１】
Serratia sp. GA3R株の近縁種として、例えば、Serratia marcescens subsp. marcescens NBRC102204 (AB681729)、Serratia marcescens subsp. sakuensis KRED (AB061685)、Serratia nematodiphila DZ053SBS1 (EU036987)、Serratia ureilytica NiVa51 (AJ854062)、Citrobacter murliniae CDC2970-59 (AF025369)、Serratia odorifera DSM4582 (AJ233432)、Serratia ficaria DSM4569 (AJ233428)、Serratia entomophila DSM12358 (AJ233427)、Enterobacter aerogenes NBRC13534 (AB680425)及びCitrobacter freundii DSM30039 (AJ233408)が挙げられる。Pseudomonas sp. GA72P株の近縁種として、例えば、Pseudomonas plecoglossicida FPC951 (AB009457)、Pseudomoans monteilii NBRC103158 (AB681966)、Pseudomonas taiwanensis BCRC17751 (EU103629)、Pseudomonas entomophila L48 (AY907566)、Pseudomonas mosselii CIP105259 (AF072688)、Pseudomonas oryzihabitans IAM1568 (D84004)、Pseudomonas parafulva AJ2129 (AB060132)、Pseudomonas fulva NRIC0180 (AB060136)、Pseudomonas putida ATCC12633 (AF094736)及びPseudomonas cremoricolorata IAM1541 (AB060137)が挙げられる。Pseudomonas sp. GA87株の近縁種として、例えば、Pseudomoans monteilii NBRC103158 (AB681966)、Pseudomonas plecoglossicida FPC951 (AB009457)、Pseudomonas taiwanensis BCRC17751 (EU103629)、Pseudomonas entomophila L48 (AY907566)、Pseudomonas mosselii CIP105259 (AF072688)、Pseudomonas oryzihabitans IAM1568 (D84004)、Pseudomonas parafulva AJ2129 (AB060132)、Pseudomonas fulva NRIC0180 (AB060136)、Pseudomonas putida ATCC12633 (AF094736)及びPseudomonas cremoricolorata IAM1541 (AB060137)が挙げられる。これらの類縁種は、それぞれ、Serratia sp.GA3R株、Pseudomonas sp. GA72P株及びPseudomonas sp. GA87株と16S rRNAのDNA配列相同性が97.5％以上の株である。
【００２２】
DL-グリセリン酸を炭素源に生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物は、微生物をDL-グリセリン酸を含む培地中で培養したときに、D-グリセリン酸を選択的に資化することを指標に選択することができる。D-グリセリン酸を選択的に資化することにより、培地中のDL-グリセリン酸中のD-グリセリン酸が選択的に消費され、培養時間が長くなれば、培地中のL-グリセリン酸の存在比が高くなる。用いる微生物がD-グリセリン酸のみを消費する場合は、培養時間が長くなれば、培地中にL-グリセリン酸のみが蓄積される。例えば、DL-グリセリン酸を含む培地で、微生物を培養した場合、微生物がD-グリセリン酸を選択的に資化するため、培地中のD-グリセリン酸濃度は経時的に低下するが、L-グリセリン酸は資化されないため、培地中のL-グリセリン酸濃度は経時的にほとんど変化しない。ここで、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費するとは、D-グリセリン酸とL-グリセリン酸の両方を含むDL-グリセリン酸含有培地で培養した場合に、D-グリセリン酸を選択的に資化し、D-グリセリン酸の消費速度がL-グリセリン酸の消費速度よりも大きいことをいう。培地中のD-グリセリン酸のみ消費し、L-グリセリン酸を消費しない場合も、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費するといい、また、L-グリセリンも消費し得るがD-グリセリン酸の消費速度に比べ低い場合も培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費するという。例えば、D-グリセリン酸の消費速度がL-グリセリン酸の消費速度の1.5倍、好ましくは２倍、さらに好ましくは３倍、特に好ましくは５倍以上の場合、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費するという。L-グリセリン酸は微生物により直接資化される場合もあれば、一旦D-グリセリン酸に変換された後、資化される場合もある。
【００２３】
微生物がDL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得るかどうか、及びD-グリセリン酸とL-グリセリン酸の消費速度の違いは、例えば、DL-グリセリン酸を含む培地中で微生物を数十時間、例えば、40〜80時間培養し、培地中のD-グリセリン酸濃度とL-グリセリン酸濃度を測定することにより決定することができる。
【００２４】
本発明のDL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物を用いて、L-グリセリン酸を製造することができる。本発明の微生物を用いて、高純度のL-グリセリン酸を製造することもできるし、また、D-グリセリン酸とL-グリセリン酸の混合物を製造することもできる。高純度のL-グリセリン酸を製造する場合は、D-グリセリン酸への選択性が高い微生物を用いて、DL-グリセリン酸を処理すればよい。ここで、微生物を用いてDL-グリセリン酸を処理するとは、DL-グリセリン酸を含む培地で微生物を培養することをいう。微生物のD-グリセリン酸への選択性が高い場合、D-グリセリン酸の消費速度が大きく、一方、L-グリセリン酸の消費速度は小さいか、あるいはL-グリセリン酸は消費されないため、培地中のD-グリセリン酸が消費され、培地中にL-グリセリン酸のみ蓄積するので、高純度のL-グリセリン酸を製造することができる。培養期間を長くすることにより、培地中のL-グリセリン酸濃度を高くすることができ、例えば、３日間培養することにより、培地中のグリセリン酸におけるL-グリセリン酸の純度が90％(w/v)以上、さらに好ましくは95％(w/v)以上、さらに好ましくは98％(w/v)以上、さらに好ましくは99％(w/v)以上、特に好ましくは99.9％(w/v)以上になる。
【００２５】
また、微生物のD-グリセリン酸への選択性と培養時間を適宜選択することにより、所望の比率でD-グリセリン酸とL-グリセリン酸を含む混合物を製造することもできる。すなわち、微生物株と培養時間を変えることにより、光学異性体比率（D/L)が異なるグリセリン酸を製造することができる。DL-グリセリン酸を含む培地で、D-グリセリン酸に対する選択性の高い微生物を培養した場合、経時的にD-グリセリン酸が消費され培地中のD-グリセリン酸濃度が低下し、培地中のL-グリセリン酸濃度は変化しない。そこで、D-グリセリン酸が完全に消費されず、培地中にD-グリセリン酸が残存している時点で培養を停止させることにより、D-グリセリン酸とL-グリセリン酸の混合物を製造することができる。用いる微生物及び培養時間をコントロールすることにより所望のD-グリセリン酸とL-グリセリン酸の混合比率を達成することができる。すなわち所望の光学異性体比率（D/L)を有するグリセリン酸を得ることができる。
【００２６】
微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、公知の培地にDL-グリセリン酸を添加すればよい。
【００２７】
原料となるDL-グリセリン酸は、終濃度１〜15％(w/v)、好ましくは５〜10％(w/v)の濃度で添加すればよい。また、培養中に経時的にDL-グリセリン酸を添加してもよい。
【００２８】
培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜40℃、好ましくは28〜32℃、pH5.6〜9.0、好ましくはpH5.6〜8.4で数時間〜数日間、例えば１〜４日間、好ましくは１〜３日間行う。培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００２９】
上記の条件で数日間、例えば３日間以上の培養により、培地中のグリセリン酸におけるL-グリセリン酸の濃度が90％(w/v)以上、好ましくは95％(w/v)以上、さらに好ましくは98％(w/v)以上、さらに好ましくは99％(w/v)以上、特に好ましくは99.9％(w/v)以上になり得る。また、培地中にD-グリセリン酸が残存している時点で培養を停止することにより、任意の比率でD-グリセリン酸とL-グリセリン酸を含む混合物を得ることができる。
【００３０】
D-グリセリン酸及びL-グリセリン酸の定量は、公知の有機酸分離カラム等を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明の微生物を固定化して、L-グリセリン酸を製造することもできる。微生物の固定化には、包括法、架橋法、担体結合法等がある。包括法とは微生物を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、あるいは半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法であり、架橋法とは微生物を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法であり、担体結合法とは水不溶性の担体に酵素を結合させる方法である。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。
【実施例】
【００３２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１  D-グリセリン酸資化菌の単離、同定及びD-グリセリン酸資化能の検討
（１）菌株の取得
茨城県つくば市内の環境サンプル（土壌など）を、5 mLのグリセリン酸培地（5-11%（w/v） DL-グリセリン酸, 0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%リン酸二水素カリウム、0.5%硫酸アンモニウム、0.05%硫酸マグネシウム水和物、pH 7.0）に適量加え、好気的に微生物が増殖するまで30℃、200 rpmで振とう培養した。増殖が見られた培養液10μLを、新しい5%（w/v）DL-グリセリン酸培地に植え継ぎ、再度微生物の増殖が見られるまで30℃で好気的に培養した。これを3回繰り返した後に、適宜希釈した培養液をNB寒天培地（0.3%肉エキス、0.5%ペプトン、0.05%塩化ナトリウム、1.5%寒天）に塗布し単一コロニーを形成させ、これらをグリセリン酸資化菌として得た。得られたグリセリン酸資化菌は、単一コロニーを5mLの7%（w/v）DL-グリセリン酸培地に接種し、30℃、200rpmで振とう培養した。菌株により増殖速度が異なったため、培養時間はそれぞれ条件を変えて7〜15日間行った。
【００３４】
得られた培養液から菌体成分を遠心分離で取り除き、上清を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した。DL-グリセリン酸濃度の分析は、有機酸分離カラムShodex(R) SH1011（昭和電工）を用い、島津製作所製LC-20Avpにて行った。測定条件は、流速1mL/min、溶離液5 mM硫酸水溶液、カラム温度60℃の条件でHPLCを行い、RI検出器（島津製作所）にて分析した。DL-グリセリン酸濃度は、40% DL-グリセリン酸水溶液（東京化成）を用いて作製した検量線を用いて決定した。さらに、D-及びL-グリセリン酸濃度の分析は、キラル分割カラムChiralpak MA(+)（ダイセル化学工業）を用いて行った。DL-グリセリン酸濃度を測定したサンプルを、溶離液である0.45 mM CuSO4水溶液でグリセリン酸濃度が約1 g/Lになるように希釈、0.45μmメンブランフィルターでろ過し、HPLC測定用のサンプルとした。分析条件は、流速1.0 mL/min、カラム温度21℃、検出器はUV/VIS検出器を用いて254 nmの波長で検出した。D-及びL-グリセリン酸濃度の算出には、D-グリセリン酸カルシウム塩（Sigma）及びL-グリセリン酸カルシウム塩（Sigma）を用いて作製した検量線を用いた。
【００３５】
環境サンプルからのグリセリン酸資化菌の取得及びD-及びL-グリセリン酸資化能を調べた結果、単離されたグリセリン酸資化菌の中からD-グリセリン酸を消費しL-グリセリン酸を培養液中に蓄積する菌株3株（GA3R、GA72P、及びGA87）を得た。
【００３６】
（２）菌株の同定
菌株の同定は、株式会社テクノスルガ・ラボに依頼し、形態学的性質及び分類学的性質により行った。形態学的観察は、Nutrient Agar培地（Oxoid）上に30℃、48時間生育した各菌体を、グラム染色法、実体及び光学顕微鏡観察により行った。分類学的性質は、各菌株菌体から抽出したゲノムDNAをテンプレートに16S rRNA領域をコードするDNA配列をPCRで増幅し、得られたDNAフラグメントの塩基配列を決定した後に、配列に基づく遺伝学的解析により行った。Nutrient Agar培地上で生育した菌体を、アクロモペプチダーゼ（和光純薬）を用いて溶菌させ、得られたゲノムDNA溶液をテンプレートにオリゴDNAプライマー9F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号１）及び1510R：5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’（配列番号２）、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて目的の16S rRNA領域のDNA配列をPCRで増幅した。塩基配列の解析は、サイクルシークエンスをBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceing Kit（Applied Biosystems）を用いて行い、ABI PRISM 3130 x1 Genetic Analyzer System（Applied Biosystems）によりシークエンス解析し、塩基配列の決定をChromasPro 1.7（Technelysium Pty Ltd.）により行った。決定したDNAサイクル配列は、アポロン2.0（テクノスルガ・ラボ）を用いて、アポロンDB-BA9.0（テクノスルガ・ラボ）及び国際塩基配列データベース（GemBank/DDBJ/EMBL）を対象にBLAST相同性検索を行った。結果を表1に、それぞれの菌株についての遺伝学的解析結果を表2-4に示す。
【００３７】
【表１】
2016029896.tif 000002
【００３８】
【表２】
2016029896.tif 000003
【００３９】
【表３】
2016029896.tif 000004
【００４０】
【表４】
2016029896.tif 000005
【００４１】
GA3R株は、高い相同性をSerratia属の細菌と示し、S. marcescens subsp. marcescens NBRC102204及びS. marcescens subsp. sakuensis KRED株に対して最も高い99.5%の相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する検索でもSerratia属細菌と高い相同性を示すものの、基準株に由来する16S rRNA配列は検索されなかった。よって、GA3R株は、Serratia属に帰属されると考えられたが種の同定はできなかったため、GA3R株をSerratia sp.であると同定した。
【００４２】
GA72P株は、高い相同性をPseudomonas属の細菌に対して示し、P. plecoglossicida FPC951株に対して最も高い99.8%の相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する検索でもPseudomonas属細菌と高い相同性を示すものの、基準株に由来する16S rRNA配列は検索されなかった。よって、GA72P株は、Pseudomonas属に帰属すると考えられるものの種の同定はできなかったため、GA72P株をPseudomonas sp.であると同定した。
【００４３】
GA87株は、高い相同性をPseudomonas属の細菌に対して示し、P. monteioii NBRC103158株、P. plecoglossicida FPC951株、及びP. taiwanensis BCRC17751株の3株に対して最も高い99.7%の相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する検索でもPseudomonas属細菌と高い相同性を示すものの、基準株に由来する16S rRNA配列は検索されなかった。よって、GA87株は、Pseudomonas属に帰属すると考えられるものの種の同定はできなかったため、GA87株をPseudomonas sp.であると同定した。
【００４４】
（３）グリセリン酸資化菌によるDL-グリセリン酸の光学分割
同定した3株（GA3R、GA72P、GA87）をNB寒天培地に生育させ、単一コロニーを5 mLのYPD培地（0.5%グルコース、0.5%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.1% MgSO4・7H2O）に接種した。30℃、200 rpmで2日間振とう培養し、前培養液1 mLを9%（w/v）DL-グリセリン酸培地30 mLを含む300mL 三角フラスコに接種し、30℃、200 rpmで7日間振とう培養した。培養液を培養開始後1,3,5,7日目で少量採取し、HPLCにより培養液中のD-及びL-グリセリン酸濃度を分析した。
【００４５】
図１に、GA3R株の培養液中でのD-及びL-グリセリン酸濃度の分析結果を示す。培養3日目の培養液中にD-グリセリン酸が検出されなかったことから、菌体の生育にD-グリセリン酸が消費されたと考えられた。一方で、L-グリセリン酸は培養時間によらず培養液中の濃度が変化せず、培養3日目以降では培養液中にはL-グリセリン酸のみが残存していた。これらの結果から、グリセリン酸培地中のDL-グリセリン酸は、GA3R株によってD-グリセリン酸のみが消費され、結果としてL-グリセリン酸を培養液中に蓄積できることが分かった。
【００４６】
図２及び３は、それぞれGA72P株及びGA87株の培養液中でのD-及びL-グリセリン酸濃度の分析結果を示している。GA3R株の場合と同様に、両菌株とも培養3日目以降はD-グリセリン酸がほとんど検出されず、一方でL-グリセリン酸の濃度は培養日数に関わらず変化しなかった。そのため、GA72P株及びGA87株も、菌の生育によってD-グリセリン酸を消費することで、DL-グリセリン酸を炭素源としてL-グリセリン酸のみを培養液中に蓄積できることが分かった。
【００４７】
（４）L-グリセリン酸の製造
上記3菌株の中から、Serratia sp.と同定されたGA3R株及びPseudomonas sp.と同定されたGA72P株を用いて、DL-グリセリン酸から光学分割によるL-グリセリン酸の生産と培養液からのL-グリセリン酸の精製を行った。GA3R株及びGA72P株をNB寒天培地に生育させ、単一コロニーを5 mLのYPD培地に接種した。30℃、200 rpmで2日間振とう培養し、前培養液1 mLを10%（w/v）DL-グリセリン酸培地100 mLを含む1 L 三角フラスコに接種し、30℃、200 rpmで3日間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体成分を除去後、上清を1M NaOH水溶液で活性化した陰イオン交換樹脂（DOWEX 1x8 100-200 Cl FORM、ダウケミカル社製）を充填したカラムに通液し、非吸着画分を純水で溶出させた。その後、1M NaCl水溶液で樹脂に吸着したアニオン成分をNa塩として溶出後、溶出画分をHPLCで分析し、目的のグリセリン酸が溶出したフラクションを回収した。得られたグリセリン酸画分に、1.1当量となるように無水塩化カルシウムを加えて溶解させ、不溶性成分をろ過後、2倍量のエタノールを加えてグリセリン酸カルシウム塩を室温で析出させた。得られた結晶をろ過により回収後、HPLCでL-グリセリン酸の光学純度を算出した。
【００４８】
培養経過時間に伴う培養液中のD-及びL-グリセリン酸濃度の変化を調べたところ、GA3R株では、72時間培養後にD体がほぼ消費されていた（図４）。一方で、GA72P株の培養液中には、72時間培養後に約9 g/LのD体が残存していた（図５）。これらの培養液からイオン交換カラムクロマトグラフで目的成分を濃縮後、カルシウム塩として晶析させた白色固体の光学純度をHPLCで決定した。GA3R株の培養液から単離したグリセリン酸カルシウム塩は、L体を99.9%以上含み、D体は検出限界以下であった。一方、GA72P株の培養液から単離したグリセリン酸カルシウム塩には、L体が87%、D体が13%存在していた。GA72P株から単離したサンプルに関しては、図5に示す通り、72時間培養後に少量のD体が残存しており、その後の分離精製過程では、これら光学異性体の分離濃縮がされないことが分かった。
【００４９】
実施例２  DL-グリセリン酸資化菌として単離した株の同定とDL-グリセリン酸の資化能
DL-グリセリン酸資化菌として単離した株は、16S rRNA遺伝子の部分配列をもとにBLASTXによる相同性検索から簡易的に同定した。その結果、表５に示すようにSerratia属細菌は3株、Pseudomonas属細菌は3株存在した。
【００５０】
次に、これら7株のDL-グリセリン酸資化能を評価するため、7%（w/v）DL-グリセリン酸培地で十分に菌が増殖するまで培養し、培養後の培養液中に残存しているDL-グリセリン酸濃度及びD-グリセリン酸の比率をHPLCで測定した。その結果、Serratia属細菌3株の培養液中に残存しているDL-グリセリン酸は22〜33 g/Lであり、その光学異性体の存在比はL-グリセリン酸が100%であった。また、Pseudomonas属細菌3株ではDL-グリセリン酸が20〜39 g/L培養液中に残存しており、その光学異性体の存在比は、2株でL-グリセリン酸が100%、1株でL-グリセリン酸が64%であった。
【００５１】
【表５】
2016029896.tif 000006
【００５２】
実施例３  L-グリセリン酸生産菌3株のL-グリセリン酸資化能評価
L-グリセリン酸生産菌3株（GA3R、GA72P、GA87）の単一コロニーを、5 mLのYPD培地（グルコース, 0.5 wt%; ポリペプトン, 0.5 wt%; 酵母エキス, 0.5 wt%; 硫酸マグネシウム七水和物, 0.1 wt%）に植菌し、30℃、200 rpmで1日培養した。得られた培養液50μLを、5 mLのグリセリン酸培地（L-グリセリン酸カルシウム, 0.5 wt%; りん酸水素二カリウム, 0.2 wt%; りん酸二水素カリウム, 0.1 wt%; 硫酸アンモニウム, 0.5 wt%; 硫酸マグネシウム七水和物, 0.05 wt%）に植え継ぎ、30℃、200 rpmで3日間培養した。所定時間で培養液500μLを採取し、500μLの1 M塩酸を加え、さらに1 mLの純水を加えた溶液の600 nmの吸光度を分光光度計で測定し、菌の増殖を評価した。図６に結果を示す。図６A、B及びCは、それぞれ培養１日目、２日目及び３日目の結果を示す。図６に示すように、L-グリセリン酸カルシウムを炭素源として加えた培地では、3株とも菌の増殖が見られなかった。一方で、DL-グリセリン酸カルシウムを炭素源として加えた培地では3株とも菌の増殖が見られたことから、L-グリセリン酸生産菌3株は、L-グリセリン酸を資化しないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のDL-グリセリン酸を炭素源として生育可能な微生物であって、DL-グリセリン酸を含む培地で培養したときに、培地中のD-グリセリン酸を選択的に消費し得る微生物を用いることにより、L-グリセリン酸を効率的に製造することができる。
【受託番号】
【００５４】
FERM P-01868
FERM P-01869
FERM P-01870
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１及び２  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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