(57)【要約】      （修正有）【課題】生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着の少ない医療用粒子、および目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、非特異的吸着の少ない分析用粒子を提供する。【解決手段】核となる粒子と、該粒子の表面に高分子化合物を含む層とを有する医療用粒子であって、式（１）を満たす。式（１）Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル、Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）、Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核となる粒子と、該粒子の表面に高分子化合物を含む層とを有する医療用粒子であって、下記式（１）を満たす、医療用粒子。
式（１）  Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
【請求項２】
前記核となる粒子が無機材料を含む、請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記無機材料が酸化ケイ素である請求項２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記高分子化合物が、シランカップリング剤を介して核となる粒子に結合している請求項１ないし３に記載の医療用粒子。
【請求項５】
前記高分子化合物が、側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットとを有する、請求項１ないし４に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記第１ユニットが、アルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含む請求項５に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記第１ユニットが下記（化１）で表される、請求項５または６に記載の医療用粒子。
【化１】
2016180716.tif 000007
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。  ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。）
【請求項８】
前記第１ユニットが、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコル（メタ）アクリレート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンいずれかに由来する、請求項５ないし７のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項９】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である請求項８に記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記第２ユニットが下記（化２）で表される、請求項５ないし９に記載の医療用粒子。
【化２】
2016180716.tif 000008
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。  Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。）
【請求項１１】
前記生理活性物質を固定化しうる基が、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、アミノオキシ基、ヒドラジド基及びビオチニル基から選ばれる少なくとも一つの官能基を有する請求項５ないし１０に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項１１に記載の医療用粒子。
【請求項１３】
請求項１ないし１２いずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法。
【請求項１４】
更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む請求項１３に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項１５】
前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする請求項１４に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項１６】
請求項２ないし１２に記載の医療用粒子に、その生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子。
【請求項１７】
前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖脂質、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項の１６に記載の分析用粒子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の分析用粒子の製造方法であって、請求項２ないし１２に記載の医療用粒子に、生理活性物質をリン酸塩水溶液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法。
【請求項１９】
前記リン酸塩水溶液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である請求項１８に記載の分析用粒子の製造方法。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療用粒子、生体分子の相互作用を分析するための分析用粒子、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーでさまざまな粒子を被覆したポリマー被覆粒子は、工業分野で広く用いられてきただけでなく、近年においては基礎的な生物学や医療の分野においてその重要性が高まっている。例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体への応用、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）、創薬用途などへの応用に対する関心が高まっている。創薬用途への応用例としては、例えば様々な粒子（担体）に固定されたリガンドと呼ばれる生理活性物質を介して特定のタンパク質などの生体分子を捕捉し、これを分離精製するものがある。
【０００３】
粒子を担体として用いる際に求められる条件は、主には（１）穏和な条件下でリガンド、又はスペーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固定化量が大きいこと、（２）粒子自体がタンパク質などの生体物質一般に対して非特異的吸着をしないこと、（３）目的・用途に応じた機械的強度を有すること、である。しかし、これらの条件を満たす粒子は未だ開発されていない。
【０００４】
特に、リガンドの固定化量は担体の性能を左右する大きな要因であり、できるだけ大きな固定化量が要求される。リガンドの固定化量が大きくなれば、それに伴い捕捉するタンパク質の総量が増加するからである。特に、目的とするタンパク質がリガンドに捕捉されるタンパク質の中でもマイナーな成分である場合、固定化量が少ないとそれを発見できなくなる恐れもあるため、なおさらリガンド固定化量の大きな粒子が求められている。
【０００５】
一方、捕捉したいタンパク質以外の成分の非特異的吸着を抑制することも極めて重要である。従来の粒子のうち、無機系のシリカゲル粒子は物理的強度の強い粒子で、多孔質であることから分離には良いとされているが、非特異的吸着の度合が高いという欠点があるため実際に使用されている例は極めて少ない。また、合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒子が開発されているが、これらの高分子も生体関連物質の非特異的吸着が起こり易いという欠点がある。
【０００６】
上記のように、粒子を医療用担体又は分析用担体として用いる場合には、非特異的吸着も問題になることが多い。そのため、それを回避するために様々な手法が検討されている。例えば、表面に目的の生理活性物質をつけたあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させておくブロッキングの手法などがあるが、効果は十分ではない。また、表面がエポキシ基からなる粒子に特定のタンパク質と特異的に結合するＤＮＡを結合させ、タンパク質の精製用途に用いる例もある（例えば特許文献１）。この方法では、タンパク質の非特異吸着性が少ないという理由から、粒子表面へのエポキシ基導入にグリシジルメタクリレートなどを用いている。しかし、エポキシ基にＤＮＡ等生理活性物質を直接結合させる方法は、アルカリ条件下や高温条件下で反応させる必要があるなど相当厳しい反応条件を必要とする。このため、固定化させる生理活性物質がアルカリや高温で不安定な場合、固定化プロセスで生理活性物質が変質してしまう恐れがあるので不適当である。
【０００７】
その他、粒子の非特異吸着低減方法としては、非特異吸着の少ないポリマー粒子を乳化重合法などで合成する例がある。例えば、特許文献２には、生理活性物質と反応可能な反応基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ポリオキシアルキレン側鎖を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び疎水性を付与するエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーを乳化重合法、又は懸濁重合法にて共重合し、粒子を得る方法が記載されている。しかし、このような方法では、得られる粒子径の制御が困難である。一般に、乳化重合法では、比較的均一な粒径を有する粒子が得られるものの、粒子径がサブミクロン程度のものしかできない。一方、懸濁重合法で得られる粒子は、粒子径分布が広く、例えばカラム用充填剤として用いるためには粒子を分級する必要があるが、特別な装置のない場合にはポリマー粒子を高度に分級することが難しい。しかも、得られる粒子のサイズが数十ミクロンから数百ミクロンであり、それよりも小さい径の粒子を合成することが難しい。さらに、重合で得られる粒子は、高分子であるがために担体としての強度に自ずと限界がある。粒子強度が求められる用途に使用する場合には、高分子中のエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーの比率を上げるなど強度を上げるための処方を余儀なくされ、そのことは逆に非特異的吸着に不利であった。
【０００８】
【特許文献１】特許第２７５３７６２号公報
【特許文献２】特許第３２１５４５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
粒子強度を確保しつつ、非特異吸着の少ない医療用粒子を得るには、物理的強度の強いシリカゲル粒子など、核となる粒子に高分子化合物を含む層を形成することで非特異吸着を抑制し、さらにはその高分子化合物で標的分子を捕捉する生理活性物質を固定化することが有効であると考えられる。そこで、本発明の第一の課題は、生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着の少ない医療用粒子を提供することである。また、本発明の第二の課題は、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、非特異的吸着の少ない分析用粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の通りである。
（１）核となる粒子と、該粒子の表面に高分子化合物を含む層とを有する医療用粒子であって、下記式〔１〕を満たす、医療用粒子。
式〔１〕  Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
（２）  前記核となる粒子が無機材料を含む、（１）に記載の医療用粒子。
（３）  前記無機材料が酸化ケイ素である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）  前記高分子化合物が、シランカップリング剤を介して核となる粒子に結合している（１）ないし（３）に記載の医療用粒子。
（５）前記高分子化合物が、側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットとを有する、（１）ないし（４）に記載の医療用粒子。
（６）  前記第１ユニットが、アルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含む（５）に記載の医療用粒子。
（７）前記第１ユニットが下記（化１）で表される、（５）または（６）に記載の医療用粒子。
【化１】
2016180716.tif 000002
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。  ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。）
（８）  前記第１ユニットが、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンいずれかに由来する、（５）ないし（７）のいずれかに記載の医療用粒子。
（９）  前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（８）に記載の医療用粒子。
（１０）  前記第２ユニットが下記の（化２）で表される、（５）ないし（９）のいずれかに記載の医療用粒子。
【化２】
2016180716.tif 000003
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。  Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。
（１１）  前記生理活性物質を固定化しうる基が、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、アミノオキシ基、ヒドラジド基及びビオチニル基から選ばれる少なくとも一つの官能基を有する（５）ないし（１０）に記載の医療用粒子。
（１２）  前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、（１１）に記載の医療用粒子。
（１３）（１）（１２）いずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法。
（１４）  更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む（１３）に記載の医療用粒子の製造方法。
（１５）  前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする（１４）に記載の医療用粒子の製造方法。
（１６）  （２）ないし（１２）に記載の医療用粒子に、その生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子。
（１７）  前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖脂質、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである（１６）に記載の分析用粒子。
（１８）（１６）または（１７）に記載の分析用粒子の製造方法であって、（２）ないし（１２）に記載の医療用粒子に、生理活性物質をリン酸塩水溶液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法。
（１９）  前記リン酸塩水溶液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（１８）に記載の分析用粒子の製造方法。
（２０）（１６）または（１７）に記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法。
【発明の効果】
【００１１】
前記のとおり、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量を前記量に規定することにより、生理活性物質を効率的に固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した粒子を簡便に作製し、提供することが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の医療用粒子、分析用粒子、およびそれらの製造方法および使用方法について説明する。
【００１３】
本発明の医療用粒子は、生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着の少ない医療用粒子であって、核となる粒子に高分子化合物を含む層を形成がされている。ここで、筆者らは、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量を一定の値以上にすることで、効果的に非特異吸着を抑制し、Ｓ／Ｎ比を高めることができ、さらにはその高分子化合物で生理活性物質を固定化することができることを見出した。
【００１４】
具体的には、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量は、下記式〔１〕を満たすとよい。
式〔１〕  Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
ここでいうＴＧ測定とは、物質および基準物質の温度を調節されたプログラムに従って変化させながら、その物質の質量を温度の関数として測定する技法である。温度のプログラムは、典型的には室温から５００℃まで１０℃／ｍｉｎで上昇させた後、５００℃で１時間維持することなどが挙げられる。測定は空気を２００／ｍｉｎで供給しながら行われるのが好ましい。核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量は、前記ＴＧ測定において、初期重量と測定終了時の重量の差を、粒子表面に存在する高分子化合物を含む層の重量とみなすことで算出できる。
【００１５】
一方、核となる粒子１ｇあたりの表面積は、粉体粒子の表面に吸着占有面積のわかったガス分子を吸着させ、その量から試料の比表面積を求めるＢＥＴ法で求めることができる。吸着占有面積のわかったガス分子とは典型的には窒素である。
【００１６】
核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が前記式〔１〕を満たすことにより、効果的に非特異吸着を抑制し、さらにはその高分子化合物で生理活性物質を固定化することが可能となる。これを実現する方法としては、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を吸着させる方法、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を化学的に結合させる方法などが挙げられるが、中でも、高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成する方法が好ましい。高分子化合物を生成するための官能基としては、重合性官能基や連鎖移動基が挙げられ、ラジカル反応性の面から、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、メルカプト基であることがより好ましい。核となる粒子にこれらの官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、たとえばシリカ粒子に、これらの官能基を導入する場合、これらの官能基を有するシランカップリング剤をシリカ粒子表面に反応させることで達成できる。
なお、高分子化合物の吸着量は、Ａ／Ｂ≦５．０ｍｇ／平方メートルであることがさらに好ましい。５．０ｍｇ／平方メートルを超えても、十分な非特異吸着抑制能を担保できない。
【００１７】
前記高分子化合物は、生理活性物質が捕捉する標的生体物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制しうる第１ユニットと、官能基として側鎖の末端に生理活性物質を固定化する機能を有する第２ユニットと、を有することが好ましい。
【００１８】
第１ユニットが、後述の生理活性物質によって捕捉可能な標的生体物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制する役割を果たす。
【００１９】
また、第２ユニットが、側鎖の末端に生理活性物質を固定化する機能を有することにより、さまざまな生理活性物質を効率良く、かつ簡易に担体に結合することを可能とする。これにより、該標的生体物質を特異的に捕捉できるようになる。
【００２０】
生理活性物質によって捕捉可能な物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制しうる第１ユニットとしては、例えば、側鎖にアルキレングリコール残基、水酸基、ベタイン構造などを有するユニットが挙げられ、特に非特異吸着性が高いという観点からアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を有するものが好ましい。
【００２１】
第１ユニットは、さらには、（化１）で表わされる構造のものが好ましい。
【化１】
2016180716.tif 000004
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。  ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。）
【００２２】
アルキレングルコール残基を有する第１ユニットを構成するための、由来元のモノマーとしては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコールメタクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類；グリセロールモノ（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート；２−メトキシエチル（メタ）アクリレート；２−エトキシエチル（メタ）アクリレート；メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、アッセイ時の非特異的吸着の少なさ及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレート又はエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２３】
前記メトキシポリエチレングリコールメタクリレート又はエトキシポリエチレングリコールメタクリレートの、エチレングリコール残基の平均繰り返し数は、モノマーの入手性と反応性の観点から、３〜１００が好ましい。
【００２４】
ベタイン構造を有する第１ユニットを構成するための、由来元のモノマーとしては、例えばカルボキシベタイン系モノマー、スルホベタイン系モノマー、ホスホベタイン系モノマー、ホスホリルコリン系モノマーなどが挙げられる。
【００２５】
カルボキシベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００２６】
スルホベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００２７】
ホスホベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００２８】
また、ホスホリルコリン系モノマーの具体例としては、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。
【００２９】
これらの中でも、アッセイ時の非特異的吸着の少なさ及び入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００３０】
側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットとしては、例えば、下記（化２）で示されるように、生理活性物質を固定化しうる捕捉部が−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を介して結合した化合物であることが挙げられる。
【化２】
2016180716.tif 000005
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。  Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。
【００３１】
前記（化２）中のＹがアルキレン基である場合、ｑは１〜１００の整数であり、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、最も好ましくは１〜６である。ｑの値が前記範囲内であることにより、タンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。      
【００３２】
前記（化２）中のＹがアルキレングリコール残基である場合、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特にタンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特にタンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。
【００３３】
前記（化２）中の生理活性物質を固定化しうる基Ｗは、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、アミノオキシ基、ヒドラジド基及びビオチニル基から選ばれる少なくとも一つの官能基が好ましい。なお、これらの基は保護基で保護されていてもよく、生理活性物質を固定化する際に脱保護して使用しても構わない。
【００３４】
本発明の使用する「活性エステル」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステルとして知られている。
【００３５】
このような活性エステルとしては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、コハク酸イミド活性エステル、フタル酸イミド活性エステル、5−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル等が挙げられるが、保存安定性と反応性のバランスからｐ−ニトロフェニル活性エステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが好ましい。
【００３６】
これら活性エステルは、活性エステルを有するモノマーを重合することで高分子化合物に組み込んでもよいし、あるいは、活性エステルを導入しうる官能基を有する高分子化合物をあらかじめ合成しておき、後から活性エステルを導入してもよい。
【００３７】
前記高分子化合物の第１ユニットと、第２ユニットとの共重合比（第１ユニット／第２ユニット）は、特に限定されないが、例えば９７／３〜５／９５であることが挙げられ、特に９０／１０〜１０／９０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、生理活性物質を固定化する効果に優れる。
【００３８】
また、前記高分子化合物は第１ユニットと、第２ユニットの他に、核となる粒子に該高分子化合物を吸着させやすくする部分を有するユニットや化学的に結合させるための官能基を有するユニットと含んでいてもよい。これらは、核となる粒子の組成や表面に存在する官能基に応じて適宜選択することができる。
【００３９】
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００４０】
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどの形態であることが挙げられ、なかでも、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在する活性エステルが分散するために、有効に作用することができる。
【００４１】
前記高分子化合物の重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば５０００〜１００００００であることが挙げられ、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００４２】
前記粒子の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料等が挙げられる。また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、アルミニウムおよびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。
これらの中でも無機材料が粒子自体の強度が高い点で好ましく、さらに酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。また、酸化ケイ素を担体として用いると、Si-O結合が疎水性低分子化合物の吸着を抑制することが知られており好ましい（文献 特開2008-107310参照）。
【００４３】
本発明の医療用粒子の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
【００４４】
具体的に、本発明の分析用担体に用いる粒子の粒径としては、用途によっても異なるが、一般的に平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが挙げられ、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、１μｍ〜４０μｍがさらに好ましい。前記担体の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の固定化量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。また、形状が多孔質になると、比表面積が大きくなり、表面に含まれる高分子化合物の量を増加させることが出来る。この孔径の大きさは、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。この範囲にあることで、    、十分な比表面積を担保し、かつ標的生体分子を効果的に捕捉することが可能となる。
【００４５】
前にも述べたように、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が前記式〔１〕を満たすようにするには、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を吸着させる方法、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を化学的に結合させる方法などが挙げられる。このような高分子化合物は、核となる粒子に吸着しやすい成分や、核となる粒子表面に存在する反応性官能基と反応しうる官能基を有する成分を、合成する際に共重合体として組み込むことで得られる。核となる粒子表面に存在する反応性官能基と反応しうる官能基としては、シランカップリング剤を加水分解して得られるシラノール基が、反応性が高く好ましい。
【００４６】
前記高分子化合物を粒子表面に塗布することで、高分子化合物が粒子表面に吸着または化学的に結合させることができる。塗布方法としては、高分子化合物の溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法が挙げられる。塗布後、室温下ないしは加温下にて乾燥させるのが好ましい。化学結合を行う場合は、さらにそれぞれに応じた反応条件で実施するとよい。
【００４７】
前述の高分子化合物の溶液濃度は特に制限されるものではないが、一例として０．０５重量％以上であることが挙げられ、好ましくは０．１〜３０重量％、より好ましくは０．１〜２０重量％、さらに好ましくは０．３〜１０重量％であることが挙げられる。
【００４８】
また、高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成する方法によっても前記式〔１〕を満たすようにすることができる。高分子化合物を生成するための官能基としては、重合性官能基または連鎖移動基がよく、例えばビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、メルカプト基が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、または２種以上組合せてもよい。これらの基を担体に導入するには、これらの基を有するシランカップリング剤と粒子を結合させる方法が挙げられる。
【００４９】
前記シランカップリング剤としては、例えばメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジエトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルメトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルエトキシシラン、メルカプトエチルトリエトキシシラン、ＡＬＬＹＬＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＳ（2-ＭＥＴＨＯＸＹＥＴＨＯＸＹ）ＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＳ（ＭＥＴＨＹＬＥＴＨＹＬＫＥＴＯＸＩＭＩＮＯ） ＳＩＬＡＮＥ、ＡＬＬＹＬＯＸＹＵＮＤＥＣＹＬＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＡＬＬＹＬＴＲＩＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ 3-（ＴＲＩＥＴＨＯＸＹＳＩＬＹＬ）-1-ＰＲＯＰＥＮＥなどが挙げられる。
【００５０】
高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成した粒子の製造方法としては、例えば、
（１）重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性溶液中で加水分解する工程、
（２）前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、
（３）重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程
を含むことが挙げられる。
【００５１】
本発明の医療用粒子の作製方法は、製造の容易さから、例えば粒子表面に、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を化学結合させ、タンパク質等の非特異吸着を抑制しうるモノマーと、生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する重合性モノマーおよび該粒子を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中で重合することが挙げられる。こうすることで粒子表面にシランカップリング剤を介して結合した高分子化合物を生成することができる。
【００５２】
重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、前述のシランカップリング剤を好適に用いることができる。
【００５３】
重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を、粒子表面に化学結合させる際のシランカップリング剤濃度については、例えば０．０１〜２０wt%であることが挙げられ、０．１〜１０wt%が好ましく、３〜１０wt%であることがより好ましい。また、シランカップリング剤の使用量は、細孔内を含めた粒子の表面積を被覆できる量以上を用いることが好ましい。この値は、細孔内を含めた粒子の表面積とシランカップリング剤の最小被覆面積から算出するとよい。
【００５４】
溶媒は、シランカップリング剤が溶解すればよいが、例えば、ｐ Ｈ ２ 〜 ５ の酸性水溶液または、これと有機溶媒との混合物が、シランカップリング剤が加水分解しやすく、また、加水分解により生成したシラノール基が安定して存在できるようになるので好ましい。この処理に用いられる酸としては各種公知の無機酸及び／又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、フッ酸等が挙げられ、また有機酸としては蟻酸、酢酸、安息香酸等が挙げられるが、なかでも取り扱いが比較的容易な酢酸がより好適である。有機溶媒としては２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリルなどが好ましい。
【００５５】
シランカップリング剤がアルコキシシランの場合、加水分解により生成されたシラノール基が、粒子表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、これを介して粒子表面に固定化された重合体は容易に溶解したり、核となる粒子から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
【００５６】
その後、さらに粒子を乾燥させ、加熱することでよりシランカップリング剤と粒子との結合が促進される。例えば、８０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
【００５７】
前記のようにして得られた重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子は、重合性モノマーと溶媒中で混合し、重合反応を進行させる工程をおこなうことで、その表面に高分子化合物を含む層を形成できる。重合性モノマーとしては、側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットの由来元となるモノマーと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットの由来元となるモノマーが好ましく、必要に応じて、他の重合性モノマーや重合開始剤を加えてもよい。また、撹拌しながら重合を行うと粒子表面にムラなく高分子化合物を形成できるので好ましい。
【００５８】
重合する際の条件としては、例えば温度が４０℃〜１００℃、重合時間は１時間〜４８時間であることが挙げられる。
【００５９】
また、溶媒としてはそれぞれのモノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００６０】
重合終了後は、粒子に吸着した高分子化合物などを洗浄により除去し、乾燥するとよい。乾燥する方法は特に限定されない。加熱することで溶媒を揮発させてもよいし、真空乾燥してもよいし、それらを組み合わせてもよい。
【００６１】
前記重合反応は、ラジカル重合が簡便で好ましい。重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
【００６２】
また、本発明の医療用粒子の作製方法は、担体表面に重合開始基を共有結合させ、前記側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットの由来元となるモノマーと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットの由来元となるモノマーおよび該粒子を含む混合物を、溶媒中でリビングラジカル重合してもよい。
【００６３】
リビングラジカル重合には様々な方法があるが、特に制限を受けるものではなく、原子移動ラジカル重合、可逆的付加-開裂連鎖移動重合、ニトロキシドを介したラジカル重合などを好適に用いることができる。
【００６４】
前記のようにして得られた医療用粒子は、官能基を介して生理活性物質を固定化することにより、免疫沈降法やプルダウンアッセイ等に用いる分析用粒子として利用できる。該医療用粒子を、生理活性物質を溶解した液体と接触させ、粒子上の捕捉部と生理活性物質とを反応させることで、生理活性物質を粒子に固定化することができる。
【００６５】
前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖脂質、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００６６】
医療用粒子に活性エステル基が存在する場合、生理活性物質を溶解した液体のｐＨは７．０〜１２．０であることが好ましく、ｐＨ７．５〜１１がより好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、固定化を効率よく行うことができるとともに、生理活性物質の変性・分解を抑制することが可能となる。このような液体としては、リン酸塩水溶液が好ましい。あるいは、生理活性物質を溶解した液体はトリエチルアミンなど触媒を含有する有機溶媒でもよいし、これとリン酸塩水溶液との混合物でもよい。
【００６７】
前記リン酸塩は特に限定されるものではないが、リン酸２水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、又はリン酸水素２ナトリウムが生理活性物質への影響が少なく、特に好ましい。
【００６８】
前記リン酸塩水溶液のリン酸塩濃度は０．１Ｍ以上５Ｍ以下であることが好ましい。この範囲にあることで、効率的に生理活性物質を粒子に固定化することができる。
【００６９】
生理活性物質付着後は、２−アミノエタノール等のアミノ基を有する低分子物質で担体を処理し未反応の活性エステル基を失活させてしまうことが好ましい。
【００７０】
前記のように作製した分析用担体は、免疫沈降法やプルダウンアッセイ等に用いる分析用粒子として利用できる。例えば、該分析用担体に、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより、標的生体物質の捕捉が可能となる。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７２】
＜実施例１＞
【００７３】
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の重合）
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００（ｎ＝４）、日本油脂（株）製）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬（株）製）及びクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈ反応させた後、さらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が平均４．５単位含まれていることを確認した。
【００７４】
（粒子表面へのシランカップリング剤の導入）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液１００ｍＬとエタノール１００ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００７５】
（粒子表面への、高分子化合物を含む層の形成）
メトキシポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量Ｍｎ＝４６８、エチレングリコール残基数は平均９単位、新中村化学株式会社製）と先に重合したＭＥＯＮＰを、エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を１５０ｍL作製した。総モノマー濃度は０．４ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００８ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で６時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、真空乾燥させた。これを４ロット繰り返し合成した。
【００７６】
＜実施例２＞
実施例１の粒子表面への、高分子化合物を含む層の形成において、総モノマー濃度を０．２ｍｏｌ／Ｌにしたものを実施例２とした。
【００７７】
＜比較例＞
実施例２の担体表面へのシランカップリング剤の導入において、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランの処方量を５．０ｇにしたものを比較例とした。
【００７８】
（粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量の測定）
粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量は、ＴＧＡ装置（セイコーインスツルメント社製ＴＧ／ＤＴＡ６２００）を用いて、空気雰囲気中、室温から５００℃へ１０℃／分で昇温し、さらに５００℃を１時間維持した後の重量減少率を測定した。この値と、別途ＢＥＴ法で求めた単位重量当たりの粒子の表面積から、粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量を算出した。
【００７９】
（粒子に対する非特異吸着量の測定）
・  粒子の不活性化
実施例および比較例の粒子それぞれ２０ｍｇをエッペンチューブに採取し、０．１Ｍ２−エタノールアミンのｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ９．５）１ｍＬを投入、１時間転倒混和することで、ＭＥＯＮＰのｐ−ニトロフェニル基を不活性化した。その後ｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）で洗浄した。
【００８０】
（２）粒子へのタンパク質吸着および回収
不活性化した粒子２ｍｇ分を新たなエッペンチューブに移し、遠心分離後、上清を除去した。そこに０．３ｍｇ／ｍＬに調整したＨｅＬa細胞ライセート１ｍＬを添加し、４℃で２時間転倒混和し、粒子にタンパク質を吸着させた。その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）で粒子を洗浄した。遠心分離後、上清を除去し、グリシン‐ＨＣｌバッファを３０μＬ加え、ボルテックスミクサーで混合、再度遠心分離し、粒子に吸着したタンパク質が溶解した上清を回収した。
【００８１】
・  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色
（２）で得た上清および既知量のＢＳＡを用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、さらに銀染色を実施した。
【００８２】
・  非特異吸着量の測定
染色後のゲルをスキャナで読み取り、画像処理を行いバンドの濃さを数値化した。数値化においてはフリーソフトＩｍａｇｅＪを利用した。ＢＳＡのバンドの濃さから検量線を作成し、これに基づき、単位重量あたりに非特異吸着していたタンパク質の量を算出した。
【００８３】
（抗体を固定した粒子の抗原捕捉能）
・  １次抗体固定化
実施例および比較例で得られた粒子各２０ｍｇに対し、５０μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）の１．２Ｍりん酸水素二カリウム溶液１ｍＬを加え、室温にて１晩転倒混和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。さらに０．１Ｍ２−エタノールアミンのｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ９．５）で室温下、１時間処理し、粒子に残存しているＭＥＯＮＰのｐ−ニトロフェニル基の不活性化を行った。
【００８４】
・  ＣＲＰとの反応
ＣＲＰ抗体を固定化した粒子５ｍｇに３μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰのＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
【００８５】
・  ２次抗体との反応
ＣＲＰを反応させた粒子に、１μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）溶液を１ｍＬ加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
【００８６】
・  ＣＲＰ捕捉量の定量
ＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによりＣＲＰの捕捉量を見積もった。
【００８７】
また、実施例および比較例の粒子にＣＲＰ抗体を固定化せずに不活化のみを行ったものに対して、上記と同様にＣＲＰとの反応、２次抗体との反応を実施し、ＣＲＰの非特異吸着量の定量を行った。
【００８８】
単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量、タンパク質の非特異吸着量、ＣＲＰ抗体を固定した粒子の抗原捕捉能をまとめて表１に示す。
【００８９】
【表１】
2016180716.tif 000006
【００９０】
単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量の増加に伴い、タンパク質の非特異吸着量が減少する傾向が認められる。タンパク質の非特異吸着量は約５０ｎｇ／ｍｇ以下でなければ、Ｓ／Ｎの低下など実用上問題が発生することから、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量は０．８ｍｇ／ｍ２以上が望ましいといえる。また、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が多いほど、抗体固定化粒子が標的である抗原を多く捕捉する傾向が認められ、０．８ｍｇ／ｍ２以上では十分にシグナルを検出できていることが分かる。以上より、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が０．８ｍｇ／ｍ２以上になると、分析用粒子としての性能が十分に発揮できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明により、生理活性物質を効率的に固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した粒子を提供することが可能となった。さらには、生理活性物質を固定化した粒子で目的とする生体分子を効率的に捕捉できるようになった。