(57)【要約】      （修正有）【課題】組合せ抗体ライブラリー及びその使用の提供。【解決手段】ヒト生殖細胞系セグメントから組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、VL鎖をコードする生殖細胞系セグメントから集められた核酸分子のライブラリー及びVH鎖をコードする核酸分子ライブラリー及び得られた抗体ライブラリーも提供する。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質の抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法及び同定又は選択される抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)         各VL鎖が、VK及びJKヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結されて、
ii)       各VH鎖が、ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント並びにVH及びJH生殖細胞系セグメントの間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結され、
a)        抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖又はその十分な部分を含み、並びに
b)       ヒト組み合わせ抗体ライブラリーは、少なくとも凡その或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、
複数の抗体を含有する前記ライブラリー。
【請求項２】
VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びVH鎖をコードする核酸分子のJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメントは、Vkセグメントが、Jkセグメントへ5’であり、又はVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３】
VH及びJH生殖細胞系セグメントの間のヌクレオチド配列が、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長において、又は凡そ5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長である、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４】
VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列がペプチド模倣物をコードする、請求項1−3のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５】
i)         各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結されて、
ii)     各VH鎖は、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又ははその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される、
a)抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が、修飾可変軽(VL)鎖及び／又は修飾可変重(VH)鎖或いはその十分な部分を含み、並びに
b)VL鎖及び／又はVH鎖が、アミノ酸をCDRへ置換又は挿入することにより修飾される、
複数の抗体を含有するヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６】
CDRが、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3から選択される、請求項5に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７】
CDRがCDRH3である、請求項6に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８】
挿入又は置換されるアミノ酸がペプチド模倣物に対応する、請求項5−7のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項９】
ペプチド模倣物が、TPO、EPO、G-CSF、IL-5、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド(hBNP-32)、エキセンディン4、GLP-1、GLP-2、グルカゴン、PACAP-38、CD209L、TNF、VEGF、MMP阻害剤又はCTLA-4ペプチド模倣物から選択される、請求項4又は請求項8に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１０】
ペプチド模倣物が、更に、カルボキシ及び／又はN-末端においてフランキング配列を含む、請求項4又は請求項5に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１１】
フランキング配列がグリシン又はプロリンである、請求項6に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１２】
ペプチド模倣部物が、配列識別番号：891、987−1014から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項4‐7のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１３】
VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、ヒトDHセグメント又はその縮重コドンをである、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１４】
i)      各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結されて、
ii)各VH鎖が、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される、
a)抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が、可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖或いはその十分な部分を含み、並びに
b)ヒト組合せ抗体ライブラリーが、少なくとも大体の或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、
複数の抗体を含有する前記ライブラリー。
【請求項１５】
アドレス可能なライブラリーである、請求項1−14に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１６】
各アドレス内の抗体が同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、請求項15に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１７】
VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJHセグメントは、VHセグメントがDHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項13−16に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１８】
複数の核酸分子がVH鎖をコードし、複数の核酸分子がVL鎖をコードして、並びにVH鎖及びVL鎖をコードする複数の核酸分子は、少なくとも大体或いは50又は100の異なる抗体を生成するのに十分である、請求項1−17のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１９】
全て又は一部の生殖細胞系VHセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結される全て又は一部のDHセグメントと連結され、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成し、及び全て又は一部の生殖系Vkセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jkセグメントと連結され、若しくは全て又は一部の生殖細胞系Vlセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントに連結され、VL鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項18に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２０】
VH生殖細胞系列セグメントが、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−19のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２１】
VHが配列識別番号10−238のいずれかから選択される、請求項20に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２２】
DHセグメントが、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項9−21に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２３】
DHが配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項22に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４】
JHが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−23のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５】
JHが配列識別番号：273−285のいずれかから選択される、請求項24に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２６】
VHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するためV−D結合部で追加又は除去される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−25のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２７】
VHヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項26に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２８】
ヌクレオチドが、VHとDHの間でヌクレオチドを追加するVHヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項27に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２９】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項28に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３０】
DH配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部及び／又はD−J結合部で挿入及び欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−29のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３１】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性を最大化するため選択される、請求項30に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３２】
DHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項30又は請求項31に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３３】
DHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項30−32のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３４】
ヌクレオチドが、DH及びJHであるヌクレオチドを追加するため、DH配列の3’末端で挿入される、請求項30−32のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３５】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項34に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３６】
JHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、D−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−35のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３７】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、JHのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項31に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３８】
JHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項31又は請求項32に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項３９】
JHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項20−33のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４０】
Vk が、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４１】
Vk が、配列識別番号：286−355及び868のいずれかから選択される、請求項40に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４２】
Jkが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−41のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４３】
Jkが、配列識別番号：356−364のいずれかから選択される、請求項42に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４４】
Vkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−43のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４５】
Vkヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項44に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４６】
ヌクレオチドが、VkとJkの間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項44に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４７】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項46に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４８】
Jkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入または欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−47のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項４９】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jkのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項48に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５０】
Jkの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項48又は請求項49に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５１】
Vlが、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５２】
Vlが、配列識別番号：365−441のいずれかから選択される、請求項51に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５３】
Jlが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びに遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39、51及び52のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５４】
Jlが、配列識別番号：442−451のいずれかから選択される、請求項53に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５５】
Vlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−34及び51−54のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５６】
Vlヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項55のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５７】
ヌクレオチドが、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、Vl ヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項55に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５８】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項57に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項５９】
Jlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−39及び51−58のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６０】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jlのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項59に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６１】
Jlの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項54又は請求項55に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６２】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項1−61のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６３】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項62に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６４】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各VH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーからの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項62に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６５】
VH遺伝子ファミリーが、IGHV1-18、 IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及び IGHV7-81から選択され、DH遺伝子ファミリーが、IGHD1-1、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及び IGHD7-27から選択され、並びにJH遺伝子ファミリーが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される、請求項64に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６６】
VL鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項1−65のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６７】
VL鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項66に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６８】
VH鎖でコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のVk及び／又はJk若しくはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び／又はJk若しくはVl及び／或いはJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項66に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項６９】
Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、 IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、及びIGKV1-3から選択され、
Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、 IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びに
Jl 遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、請求項68に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７０】
VH鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項1−69のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７１】
VL鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項1−69のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７２】
VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号：1059−1410のいずれか、若しくはその一部、及び
VL鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号：1411−1422、1424−1439及び1441−1471のいずれか、若しくはその一部から選択される、請求項1−71のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７３】
VH鎖が、配列番号：1475−1826のいずれか、又はその一部から選択されるアミノ酸配列を有し、及び
VL鎖が、配列番号：1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1−72のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７４】
ライブラリーの各メンバー抗体が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を更に含む、請求項1−73のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７５】
ライブラリーの各メンバー抗体が、完全長抗体から、或いは抗原結合部位を形成するのに十分なそのフラグメント又は部分から選択される、請求項1−74のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７６】
フラグメント又はその部分が、Fab、Fab'、F(ab’)2、単一鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、Fd及びFd’フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、 scFvフラグメント及びscFabフラグメントから選択される、請求項75に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７７】
ライブラリーの各メンバー抗体がFabである、請求項1−76のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７８】
大体或いは50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、108、109又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項1−77のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項７９】
103、2 x 103、3 x 103、4 x 103、5 x 103、6 x 103、7 x 103、8 x 103、9 x 103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104又はそれ以上の異なるメンバー を含む、請求項1−78のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８０】
アドレス可能な抗体が、空間アレイで配列される、請求項1−79のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８１】
空間アレイがマルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が様々な抗体メンバーに対応する、請求項80に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８２】
様々な抗体メンバーが、プレートのウェルの表面に固定化される、請求項81に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８３】
様々な抗体メンバーが溶液中に存在する、請求項76に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８４】
アドレス可能な抗体が、固体支持体に付着される、請求項1−79のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８５】
固体支持体が、フィルター、チップ、スライド、ビード又はセルロースで、及び様々な抗体メンバーが、その表面に固定化される、請求項84に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８６】
固体支持体がBiacoreチップである、請求項85に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８７】
抗体が同定可能に標識化される、請求項80−86のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８８】
標識が、有色、発色性、発光性、化学的、蛍光性又は電子的である、請求項87に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項８９】
各VL鎖が、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、並びに各アドレス内の核酸分子が同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる、可変の軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。
【請求項９０】
VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、VlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項89に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９１】
全て又は一部の生殖細胞系Vkセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系Jkセグメントと連結され、或いは全て又は一部の生殖細胞系Vlセグメントが全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントに連結され、VL鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項90に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９２】
Vkが、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−91のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９３】
Vkが、配列識別番号：286−355及び868のいずれかから選択される、請求項92に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９４】
Vkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−93のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９５】
Vkヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項94に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９６】
ヌクレオチドが、VkとJkの間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項94に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９７】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項96に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９８】
Jkが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−97のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項９９】
Jk が、配列識別番号：356−364のいずれかから選択される、請求項98に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１００】
Jkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−99のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０１】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jkのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項100に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０２】
Jkの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項100又は請求項101に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０３】
Vlが、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子の中から選択される、請求項89−91のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０４】
Vlが、配列識別番号：365−441のいずれかから選択される、請求項98に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０５】
Vlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−91及び103−104のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０６】
Vlのヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項105に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０７】
ヌクレオチドが、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、Vl ヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項105に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０８】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項107に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１０９】
Jlが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−91及び105−108のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１０】
Jlが、配列識別番号：442−451のいずれかから選択される、請求項109に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１１】
Jlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−91及び105−110のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１２】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jlのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項111に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１３】
Jlの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項111又は請求項107に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１４】
VL鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群、亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項89−113のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１５】
VL 鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項114に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１６】
VL鎖をコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のVk及び／又はJk若しくはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び／又はJk若しくはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項66に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１７】
Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、及びIGKV1-39から選択され、
Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、
Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、IGLV1-40、IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びに
Jl 遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、請求項116に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１８】
VL鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項89−117のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１１９】
VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号：1411−1422、1424−1439及び1411−1471のいずれか、若しくはその一部から選択される、請求項89−118のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２０】
ライブラリーの各ベクターが様々な核酸分子を含む、請求項89−119にのいずれかに記載の核酸分子を含有するアドレス可能なベクターのライブラリー。
【請求項１２１】
ライブラリーの各細胞が様々なベクターを含む、請求項120のベクターを含有するアドレス可能な細胞のライブラリー。
【請求項１２２】
各VH鎖が、インフレームで連結されるVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によりコードされ、及び
各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる、可変の重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。
【請求項１２３】
VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、DHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結される、請求項122に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２４】
全て又は一部の生殖細胞系VHセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結される全て又は一部の生殖細胞系DHセグメントと連結され、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項123に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２５】
VHが、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項122−124のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２６】
VHが、配列識別番号：10−238のいずれかから選択される、請求項125に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２７】
VHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部で追加又は除去される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−126のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２８】
VHヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項127に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１２９】
ヌクレオチドが、VH及びDHの間でヌクレオチドを追加するため、VHヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項127に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３０】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項129に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３１】
DHが、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項122−130のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３２】
DHが、配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項131に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３３】
DHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部及び／又はD−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−132のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３４】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性を最大化するため選択される、請求項133に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３５】
DHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項133又は請求項134に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３６】
DHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項133−135のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３７】
ヌクレオチドが、DH配列の3’末端で挿入され、DH及びJHであるヌクレオチドを追加する、請求項133−136のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３８】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項137に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１３９】
JHが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子 から選択される、請求項122−139のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４０】
JHが、配列認識番号：273−285のいずれかから選択される、請求項139に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４１】
JH配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、D−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−140のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４２】
ヌクレオチドの挿入又は欠失が、JHのリーディングフレームを維持するために選択される、請求項141に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４３】
JHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項141又は請求項142に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４４】
JHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項141−143のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４５】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項122−145のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４６】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項145に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４７】
遺伝子ファミリーに基づいて選択されるVH鎖をコードする複数の核酸分子が選択され、それによってVH、DH及び／又はJHの各遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVH、DH及び／又はJHの遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項145に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４８】
VH遺伝子ファミリーは、IGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81から選択され、
DH遺伝子ファミリーは、IGHD1-1、IGHD1-14、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6 及びIGHD7-27から選択され、並びに
JH遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される、請求項147に記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１４９】
VH鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項122−149のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１５０】
VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列番号：1059−1410又はその一部のいずれかから選択される、請求項122−149のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。
【請求項１５１】
ライブラリーの各ベクターが様々な核酸分子を含む、請求項122−150のいずれかに記載の核酸分子を含有するアドレス可能なベクターのライブラリー。
【請求項１５２】
ライブラリーの各細胞が様々なベクターを含有する、請求項151に記載のベクターを含むアドレス可能な細胞のライブラリー。
【請求項１５３】
各VL鎖が、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はVl及びJl生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、
各VH鎖が、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、
各位置が、VH鎖をコードする核酸分子及びVL鎖をコードする核酸分子を含み、並びに
各アドレス内のVH核酸分子及びVL核酸分子の組合せが、他の全てのアドレスの核酸分子の組み合せとは異なる、
可変軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子及び可変重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。
【請求項１５４】
a)VH鎖又をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、
b)VH鎖をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はそぼ部分、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、
段階a)及びb)において、VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJl の各部分が、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、
c)複数の異なる核酸分子の配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、
d)第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、並びに第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む2つのライブラリーを作るため核酸分子を合成することと、
e)各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からのVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子を細胞に導入し、これを数回繰り返して細胞のライブラリーを作ることと、並びに
f)ライブラリーの各抗体又はその部分が、様々な組合せのVH及びVL鎖又はその十分な部分を含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成し、複数の抗体又はその部分を産生して、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを産生する方法。
【請求項１５５】
段階d)において、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定されたライブラリーを生成する、合成された核酸配列が個々にアドレス指定され、
段階e)において、細胞がアドレス指定され、各位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーにおける他の全部の細胞から、様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含有する細胞を含み、並びに
段階f)において、複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、ライブラリーのそれぞれの位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及び他の全ての位置でこれらは異なり、並びに
抗体又はその部分の同定が、そのアドレスによって知られる、ライブラリーがアドレス可能なライブラリーである、請求項154に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１５６】
段階a)において、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分が、VHセグメントは、DHへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう組み合わされ、並びに
段階b)において、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメント又はその部分が、VkセグメントはJkセグメントに5’で、或いはVlセグメントはJlセグメントへ5’であるよう連結される、
請求項154又は請求項155に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１５７】
段階a)−b)が、アルゴリズムを実行するようコンピュータプログラムされることによって行われる、請求項154−156のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１５８】
段階a)が、
i)         VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、
ii)       DH生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でVH及び／又はDHの生殖細胞系配列を修飾することによるV−D結合部を生成することと、
iii)      JHのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でDH及び／又はJHの生殖細胞系配列を修飾することによるD−J結合部を生成することと、
iv)      VH鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVH、DH及びJHを組み合わせることとを含む、請求項154−157のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１５９】
V−D結合部が、DHの5’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６０】
V−D結合部が、VHの3’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６１】
V−D結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６２】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項161に記載の方法
【請求項１６３】
D−J結合部が、JHの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６４】
D−J結合部が、DHの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６５】
D−J結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６６】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項165に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６７】
段階b)が、
i)      Vk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、
ii)     Jkのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVk又はJkの生殖細胞系配列を修飾することにより、或いはJlのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVl又はJl の生殖細胞系配列を修飾することにより、V−J結合部を生成することと、並びに
iii)   VL鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVk及びJk又はVl及びJlを組み合わせることとを含む、請求項154−157のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６８】
V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６９】
V−J結合部が、Vk又はVlの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７０】
V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７１】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項170に記載の方法。
【請求項１７２】
段階a)を数回繰り返すことが、
N1、N2及びN3は、全て又は一部のVH、DH又はJH生殖細胞系セグメントであり得る多数の生殖細胞系セグメントであり、並びに
N1、N2及びN3が、同じ又は異なり得て、
N1の異なるVH生殖細胞系セグメントを選択することと、
N2の異なるDH生殖細胞系セグメントを選択することと、
N3の異なるJH生殖細胞系セグメントを選択することとを含み、並びに
VH鎖をコードするN1 x N2 x N3の異なる核酸配列を生成するため、全ての可能なVH、DH及びJHの組合せを組合せる、請求項154−171のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７３】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７４】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：10−238から選択される、請求項173に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７５】
DH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子又はその対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７６】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項175に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７７】
JH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７８】
JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：273−285のいずれかから選択される、請求項177に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７９】
一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項172−178のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項１８０】
一部の生殖細胞系セグメントが遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項179に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。
【請求項１８１】
VH遺伝子ファミリーが、IGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81から選択され、
DH遺伝子ファミリーが、IGHD1-1、IGHD1-14、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及びIGHD7-27から選択され、並びに
JH遺伝子ファミリーが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択され、
各々のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、
一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメント或いは一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子から1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項180に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。
【請求項１８２】
段階b)を数回繰り返すことが、
N1、N2、N3及びN4が、全て又は一部のVl、Jl、Vk、Jk生殖細胞系セグメントになり得る生殖細胞系セグメントの数であり、並びに
N1、N2、N3及びN4が、同じ又は異なり得て、
N1(数)の異なるVl生殖細胞系セグメントを選択すること及びN2の異なるJl 生殖細胞系セグメントを選択することと、又は
N3の異なるVk生殖細胞系セグメントを選択すること及びN4の異なるJk生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに
VL鎖をコードするN1 x N2の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVl又はJlの組み合わせを組み合わせ、或いはVL鎖をコードするN3 x N4の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVk及びJkを組み合わせることとを含む、請求項154−171のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８３】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８４】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：365‐441から選択される、請求項183に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８５】
Jl生殖細胞系セグメントが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び請求項182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８６】
Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：442−451から選択される、請求項185に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８７】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８８】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：283−355及び868から選択される、請求項187に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８９】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子又は対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９０】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：356−364から選択される、請求項189に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９１】
一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、組成、CDR長さ又は組成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項182−190のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９２】
Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、IGKV1-12 、IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 IGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41及びIGKV1-39から選択され、
Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、
Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、IGLV1-40 、IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びに
Jl遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、各Vk及び／又はJk或いはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞セグメントが選択され、或いは一部のVk及び／又はJk若しくはVl及び／又はJl遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、生殖細胞系セグメントが、遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項191に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９３】
生殖細胞系セグメントが、ユーザ作成のデータベースで示される、請求項154−192のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９４】
データベースのJH、Jk及びJl生殖細胞系セグメントの配列が、それらの正しいリーディングフレームで示される、請求項193に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９５】
更に、段階a)及び／又は段階b)において、あらゆる停止コドンを除去することにより、VH鎖又はその部分及び／又はVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾することを含む、請求項154−194のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９６】
停止コドンTAAが、TATに修飾され、停止コドンTAGがTATに修飾され、及び停止コドンTGAがTCAに修飾される、請求項195に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９７】
段階a)及び／又は段階b)において、あらゆる制限酵素部位を除去することにより、VH鎖をコードする核酸分子又はその部分及び／若しくはVL鎖をコードする核酸分子又はその部分を修飾することを更に含む、請求項154−196のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９８】
制限酵素部位が、大腸菌K12でコドン使用を最大にするため修飾される、請求項197に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９９】
VH鎖をコードする複数の異なる核酸分子間及び核酸分子中における配列の類似性並びに／又はVL鎖をコードする複数の異なる核酸分子間又は核酸分子中における配列の類似性を決定することを更に含む、請求項154−198のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２００】
配列の類似性に基づいて、最も類似する又は最も異なるVH鎖をコードする一部の核酸配列及び／又はVL鎖をコードする一部の核酸配列を選択する、請求項199に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０１】
ライブラリーの合成された核酸配列がベクターで含まれる、請求項154−200のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０２】
ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項201に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０３】
細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項154−202のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０４】
細胞が大腸菌細胞である、請求項154−203のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０５】
アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項155−204のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０６】
空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーで、他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項205に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０７】
発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項154−206のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０８】
発現される抗体がFabである、請求項154−206のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０９】
抗体又はその部分を更に精製する、請求項154−208のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２１０】
ライブラリーの精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項209に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２１１】
精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに
各アドレス内の抗体が同じ抗体であり及び他の全てのアドレスの抗体とは異なる、請求項209又は請求項210に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２１２】
請求項154−211のいずれかに記載の方法によって生成される、ヒト組み合わせ抗体ライブラリー。
【請求項２１３】
VH鎖が、配列識別番号：1475−1826又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、並びに
VL鎖が、配列識別番号：1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項212に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。
【請求項２１４】
a)     請求項1−88、212又は213のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを提供することと、
b)     前記ライブラリーの抗体又はその一部を標的タンパク質と接触することと、
c)     抗体又はその部分の標的タンパク質との結合及び／若しくは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びに
d)     標的タンパク質に結合する及び／若しくは標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分がHITであることとを含む、
標的タンパク質に対する結合又は活性のヒト組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２１５】
ヒト組み合わせ抗体ライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、HITの同定がそのアドレスによって知られるよう、接触はアドレス可能なアレイで行われる、請求項214に記載の方法。
【請求項２１６】
標的タンパク質が、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである、請求項214及び請求項215に記載の方法。
【請求項２１７】
膜結合性タンパク質又はCSRが、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、及び細胞接着分子から選択される、請求項216に記載の方法。
【請求項２１８】
標的タンパク質が、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOから選択される、請求項214−217のいずれかに記載の方法。
【請求項２１９】
抗体又はその部分の標的タンパク質への結合を評価することを含む、請求項213−218のいずれかに記載の方法。
【請求項２２０】
抗体又はその部分が、標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうか評価することを含む、請求項213−218に記載の方法。
【請求項２２１】
機能的活性が、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成及びシグナル伝達から選択される、請求項220に記載の方法。
【請求項２２２】
結合が細胞で評価され、及び／又は機能的活性が細胞ベースのアッセイで評価され、及び細胞が標的タンパク質を発現する、請求項214−221のいずれかに記載の方法。
【請求項２２３】
細胞が、一時的又は安定的に標的タンパク質をコードする核酸分子で発現される、請求項222に記載の方法。
【請求項２２４】
第二のライブラリーが、
a)     同定されるHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性によって関連付けられるVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを選択し、並びに様々なVH鎖又はその部分を各々コードする複数の核酸分子の配列を生成するため、全ての可能なVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合せることと、
b)       同定されるHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性によって関連付けられるVk及びJk又はVl及びVlヒト生殖細胞系セグメントを選択し、並びに様々なVL鎖又はその部分を各々コードする複数の核酸分子の配列を生成するため、全ての可能なVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いは全ての可能なVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合せることと、
段階a)及びb)において、VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJlの各部分が、抗原に結合するのに十分であるVH又はVL若しくはその部分を含む抗体を産生するのに十分であり、
c)     第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、並びに第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む、二つのライブラリーを産生する核酸分子を合成することと、
d)     各細胞が、細胞のライブラリーにおける他の全ての細胞とは異なるVH及びVLの組合せをコードする核酸分子を含む、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子を前記細胞に導入し、細胞のライブラリーを産生するためこれを数回繰り返すことと、並びに
e)     ライブラリー内の抗体又はその部分が、ライブラリー内の他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合せを含む、複数の抗体又はその部分を産生して、各細胞で抗体を発現する細胞を成長させることと、
f)      第二のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成するため、抗体又はその部分を更に精製し、ライブラリー内の抗体又はその部分を標的タンパク質と接触して、抗体又はその部分と標的タンパク質との結合及び／又は抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価し、並びに標的タンパク質に結合する、及び／若しくは同定される抗体又はその部分が更にHITである標的タンパク質の活性を調節する、抗体又はその部分を同定することとを含む方法によって生成される、同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することを更に含む、請求項214−223のいずれかに記載の方法。
【請求項２２５】
配列類似性が、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上、或いは約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上である、請求項224に記載の方法。
【請求項２２６】
第二のライブラリーが、
a)        同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVH、DH又はJHヒト生殖細胞系セグメントを含むVH鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、
b)       同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含むVL鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、
c)        VHをコードする複数の核酸分子からの核酸分子及びVLをコードする複数の核酸分子からの核酸分子を細胞に導入し、各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、細胞ライブラリーを産生するため、これを数回繰り返すことと、並びに
d)       ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、ライブラリーの各抗体又はその部分が、VH及びVL鎖又はその十分な部分の様々な組合せを含む複数の抗体又はその部分を産生する、各細胞の抗体を発現するため細胞を成長させることと、並びに
e)        ライブラリーの抗体又はその部分を標的タンパク質と接触する抗体又はその部分を更に精製し、抗体又はその部分を標的タンパク質と結合して、及び／若しくは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価し、並びに標的タンパク質に結合し、及び／若しくは同定された抗体又はその部分が更にHITである標的タンパク質の活性を調節する、抗体又はその部分を同定することとを含む方法により生成される、同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することを更に含む、請求項214−223のいずれかに記載の方法。
【請求項２２７】
第二のヒト組合せライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、それによって、精製された抗体又はその部分はアドレス指定され、各アドレス内の精製された抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なり、接触はアドレス可能なアレイで行われ、並びに更なるHITの同定がそのアドレスによって知られる、請求項224−226のいずれかに記載の方法。
【請求項２２８】
第二の組合せ抗体ライブラリーの各抗体メンバー又はその部分が、一次配列の1つ又はそれ以上のアミノ酸変異によって同定された「HIT」と異なり、第二のライブラリーが、複数の抗体又はその部分を産生するため、アミノ酸変異を「HIT」に導入することによって生成される同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することと、ライブラリーの抗体又はその部分の標的タンパク質と接触することと、抗体又はその部分の標的タンパク質との結合、及び／或いは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びに標的タンパク質に結合し、及び／若しくは同定された抗体又はその部分が、更にHITである標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定することとを更に含む、請求項214-223のいずれかに記載の方法。
【請求項２２９】
アミノ酸変異が、同定されたHITの相補性決定領域(CDR)においてである、請求項228に記載の方法。
【請求項２３０】
「HIT」が、標的タンパク質に対し最適化される結合親和性を有すること及び／又はこの方法の以前の反復で、前回の「HIT」と比較して標的タンパク質に対し最適化される活性を有することが更に同定されるまで反復的に繰り返される、請求項224-229のいずれかに記載の方法。
【請求項２３１】
前記方法が、
(a)   利用可能な全ヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースを評価することと、
(b)   重鎖(5’-VH-DH-JH-3’)をコードする可能な組み換えされた完全長のあらゆる核酸配列の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、
(c)カッパ軽鎖(5’-Vk-Jk-3’)をコードする可能な組み換えされた全長のあらゆる核酸配列及び／又はラムダ軽鎖(5’-Vl-Jl-3’)をコードする可能な組み換えされた完全長の全核酸配列の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、
(d)   得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV-D及び／又はD-J結合部において並びに(c)の核酸配列のV−J結合部ににおいてヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、
(e)   不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、
(f)    各々の組み換えられた核酸配列をアドレス可能な構成の固有の位置に割り当てることと、並びに
(g)   各々の組み換えられた核酸配列のアドレスを識別する出力ファイルを生成することとの段階を含む、ヒト生殖細胞系セグメントを組合せるの方法を実行するためのコンピュータデバイスによって実行できるコンピュータ読み取り可能な指示を含む、コンピュータシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２３２】
前記方法が、
(h)   段階(e)の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の5’及び3’末端においてヌクレオチドを追加することと、
(i)    制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチド置換によって組み換えされた核酸配列を修飾することとの段階を更に含む、請求項231に記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２３３】
前記方法が、細菌発現のコドン使用を最適化する組み換えの核酸配列を修飾することを更に含む、請求項231又は請求項232に記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２３４】
段階(f)の前に、前記方法が、配列の類似性又は相違性に基づいて、組み換えされた核酸配列のライブラリーからの組み換えの核酸配列を選択し、及び選択された配列が、段階(f)で割り当てられる、請求項231−233のいずれかに記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２３５】
組合せヒト生殖細胞系セグメントの方法が、
(a)   利用可能な全てのヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、
(b)   重鎖(5’-VH-DH-JH-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、
(c)   カッパ軽鎖(5’-Vk-Jk-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列及び／又はラムダ軽鎖(5’-Vl-Jl-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、
(d)   得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV-D及び／又はD−J結合部で、並びに(c)の核酸配列のV−J結合部でヌクレオチドを修飾するため、アルゴリズムを適用することと、
(e)   不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、
(f)    各々の組み換えされた核酸配列をアドレス可能な構成の固有の位置へ割り当てることと、
(g)   各々の組み換えれた核酸配列のアドレスを識別する出力ファイルを生成することとの段階を含む、コンピュータデバイスによる組合せヒト生殖細胞系セグメントの方法を行うコンピュータ読み込み可能な指示の実行を含む方法。
【請求項２３６】
重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ軽鎖をコードする組み換えの核酸配列、又は重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ軽鎖をコードする一部の組み換えの核酸配列を合成することを更に含む、請求項235に記載の方法。
【請求項２３７】
a)各メンバー抗体が、抗原結合部位を形成するため、可変の軽(VL)鎖及び可変の重(VH)鎖又はその十分な部分を含み、
i)各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態、或いは、Vl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントがインフレームで連結され、
ii)各VH鎖は、ヒトVH及びヒトVH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態並びにVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントがインフレームで連結され、
b)ライブラリーは、少なくとも大体或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、複数の抗体から成るヒト組み換え抗体ライブラリー。
【請求項２３８】
VH鎖をコードする核酸の、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’であり、それはJHセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結され、並びに、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、又はVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結される、請求項237に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２３９】
VH及びJHの間のヌクレオチド配列並びにJH生殖細胞系が、D−J結合部でペプチドリンカーにより間接的に連結される、請求項238に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４０】
ペプチドリンカーがSYである、請求項239に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４１】
VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその縮重コドンである、請求項237−240のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４２】
VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンであり又は反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項237−241のいずれかに記載のヒト組合せ抗体。
【請求項２４３】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項242に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４４】
反転DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：3462−3488のいずれかから選択される、請求項242に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４５】
DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項237−244のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４６】
JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項237−245のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４７】
修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：3450−3455のいずれかにで示すヌクレオチド配列を有する、請求項246に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４８】
VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号：2070−2759又はその一部のいずれかから選択され、並びにVLをコードする核酸分子が、配列識別番号：1411−1422、1424−1439及び1441−1471又はその一部のいずれかから選択される、請求項237−247のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２４９】
VH鎖が、配列識別番号：2760−3449又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、並びにVL鎖が、配列識別番号：1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項237−248のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５０】
ライブラリーの各メンバー抗体が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を更に含む、請求項237−249のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５１】
ライブラリーの各メンバー抗体が、抗原結合部位を形成するのに十分な完全長抗体或いはフラグメント又はその部分から選択される、請求項237−250のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５２】
フラグメント又はその部分が、Fab、Fab'、F(ab’)2、単一鎖Fvs (scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、Fd及びFd’フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、 scFvフラグメント及びscFabフラグメントから選択される、請求項251に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５３】
ライブラリーの各メンバー抗体がFabである、請求項237−252のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５４】
大体の又は50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、 4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、 108、109又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項237−253のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５５】
103、2 x 103、3 x 103、4 x 103、5 x 103、 6 x 103、7 x 103、8 x 103、9 x 103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、 5 x 104、6 x 104、7 x 104、 8 x 104、9 x 104 又はそれ以上の異なるメンバー を含む、請求項237−254のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５６】
抗体ライブラリーがアドレス可能である、請求項237−255のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２５７】
各VH鎖が、インフレームで連結される、ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾形態並びにVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ、並びに各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスにおける核酸分子とは異なる、可変の重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む、核酸分子ライブラリー。
【請求項２５８】
VH鎖をコードする核酸分子のVH生殖細胞セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列、JH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列は
5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結される、請求項257に記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２５９】
VHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、D−J結合部でペプチドリンカーをコードするヌクレオチドによって間接的に連結される、請求項257又は請求項258に記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６０】
ヌクレオチドがSYであるペプチドリンカーをコードする、請求項259に記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６１】
VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその縮重コドンである、請求項257−260のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６２】
VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンであり、或いは反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項257−261のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６３】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項257−262のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６４】
反転DH生殖細は胞系セグメントが、配列識別番号：3462−3488のいずれかから選択される、請求項257−263のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６５】
DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項257−264のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６６】
JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾体を含む、請求項257−265のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６７】
修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：3450−3455のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、請求項266に記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６８】
配列識別番号：2070−2759又はその一部のいずれかから選択されるVH鎖をコードする複数の核酸分子を含む、請求項257−267のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。
【請求項２６９】
ライブラリーの各ベクターが、異なる核酸分子を含む、請求項257−268のいずれかに記載の核酸分子から成る、アドレス可能ベクターのライブラリー。
【請求項２７０】
ライブラリーの各細胞が、様々なベクターを含有し、請求項269に記載のベクターを含む、アドレス可能な細胞のライブラリー。
【請求項２７１】
a)                    ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、並びにVH鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、インフレームでVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を組合せることと、
b)                   VL鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態をインフレームで組合せることと、
段階a)及びb)において、VHの各部分、VH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列、JH、Vk、Jk、Vl又はJlが、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、並びに、
セグメントは、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びVH鎖をコードする核酸分子のJH生殖細胞系セグメントが、直接的又は間接的に連結されるよう直接的又は間接的に組合わされ、VHセグメントは、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であり、
c)                    複数の様々な核酸分子配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、
d)                   第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、及び第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む、2つのアドレス可能なライブラリーを生成することと、
e)                    第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子をアドレス指定された細胞に導入し、各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、アドレス指定された細胞のライブラリーを生成するため、これを数回繰り返すことと、並びに
f)                    ライブラリーの各抗体又はその部分が、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、VH及びVL鎖の様々な組合せ又はその十分な部分を含み、
複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに
各位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及びあらゆる位置の抗体とは異なり、
抗体又はその部分の同定は、そのアドレスで知られる、複数の抗体又はその部分を産生する、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７２】
VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに／又はVH及びJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、V−D及び／又はD−J結合部でペプチドリンカーをコードするヌクレオチドによって間接的に連結される、請求項271に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７３】
VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに／又はVHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、停止コドンを除去するために修飾される、請求項271又は請求項272に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７４】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：10−238から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−273に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７５】
VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその部分、その縮重コドンまたはその修飾形態である、請求項274に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７６】
VHとJHの間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン或いは反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項271−275のいずれかに記載のヒト組合せライブラリーを生成する方法。
【請求項２７７】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態のいずれかから選択され、或いはその反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項271−276のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７８】
反転DH生殖細胞系セグメントは、配列識別番号：3462−3488のいずれかから選択される、請求項271−277のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７９】
DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項271−278のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８０】
JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：273−285から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−279のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８１】
JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾体を含む、請求項280に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８２】
修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：3450−3455のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、請求項281に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８３】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：365−441又はその部分から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−282のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８４】
Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：442−451から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−283のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８５】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：286−355及び868から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−284のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８６】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：356−364から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−285のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８７】
第一のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで各核酸分子は、別の発現ベクターで含有され、並びに、第二のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで核酸分子は、別の発現ベクターで含有される、請求項271−286のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８８】
ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項287に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２８９】
細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項271−288のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９０】
細胞が大腸菌細胞である、請求項271−289のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９１】
アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項271−290のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９２】
空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、アドレス指定された細胞のライブラリーで他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項291に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９３】
発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項271−292のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９４】
発現される抗体がFabである、請求項3271−293のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９５】
抗体又はその部分を更に精製する、請求項271−294のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９６】
ライブラリーにおける精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項295に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９７】
請求項271−296のいずれかに記載の方法によって産生されるヒト組合せ抗体ライブラリー。
【請求項２９８】
a)請求項237−256又は請求項297のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを提供することと、
b)前記ライブラリーの抗体又はその部分を細胞又は標的タンパク質と接触することと、
c)細胞又は標的タンパク質と抗体又はその部分の結合及び／或いは抗体又はその部分が細胞又は標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びに
d)細胞又は標的タンパク質に結合する及び／或いは細胞又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定し、そこで同定された抗体又はその部分がHITであることとを含む、結合又は標的タンパク質に対する活性のヒト組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２９９】
ヒト組み合わせ抗体ライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、HITの同定がそのアドレスによって知られるよう、接触がアドレス可能なアレイで行われる、請求項298に記載の方法。
【請求項３００】
標的タンパク質が、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである、請求項298又は請求項299に記載の方法。
【請求項３０１】
膜結合性タンパク質又はCSRが、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、及び細胞接着分子から選択される、請求項300に記載の方法。
【請求項３０２】
標的タンパク質が、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン (LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOから選択される、請求項298−301のいずれかに記載の方法。
【請求項３０３】
抗体又はその部分の標的タンパク質又は細胞への結合を評価することを含む、請求項298−302のいずれかに記載の方法。
【請求項３０４】
抗体又はその部分が、細胞又は標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうか評価することを含む、請求項298−303に記載の方法。
【請求項３０５】
機能的活性が、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成及びシグナル伝達から選択される、請求項304に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２００８年１１月７日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／１９８、７６４号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」、並びに２００９年３月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／２１１、２０４号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」に対し、優先権の利益を主張する。上記出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
本出願はまた、米国仮出願番号第６１／１９８、７６４号及び米国仮出願番号第６１／２１１、２０４号に対する優先権を主張する、本明細書と同日に出願された国際ＰＣＴ出願番号（代理人整理番号３８０００１６−０００８７／７０３ＰＣ）、発明の名称「抗ＤＬＬ４抗体及びその使用」に関する。
本出願は、本明細書と同日に出願された米国仮出願番号（代理人整理番号３８０００１６−００００４／ｐ７０２）、発明の名称「親和性成熟に基づく抗体の最適化の方法」にも関する。
上記に関する各出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
【０００２】
電子的に提供される配列表の参照による援用
電子バージョンの配列表は、本明細書で提出されており、その内容は、参照によってそのまま援用される。電子フィルのサイズは２．９２メガバイトで、タイトルは７０１ｓｅｑ．ＰＣ１．ｔｘｔである。
【０００３】
ヒト生殖細胞系セグメントから組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、ＶＬ鎖をコードする生殖細胞系セグメントから蓄積された核酸分子のライブラリー及びＶＨ鎖をコードする核酸分子のライブラリー、並びに得られた抗体のライブラリーも提供される。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法、及び同定される又は選択される抗体を提供する。
【背景技術】
【０００４】
多くの治療用及び診断用モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が、癌及び自己免疫疾患などのヒト疾患を治療及び診断するため臨床現場で使用される。例えば、例示的な診断用抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）及びレミケード（インフリキシマブ）を含む。抗体治療薬の設計において、例えば、目標物の機能的活性を調節する抗体、並びに／又はより高い特異性及び／又は親和性を伴う抗体といった改良された抗体、並びに／又は特に細胞又は組織環境において、更に生物学的に利用可能で、安定性があり又は可溶性である抗体を生成するのが望ましい。
【０００５】
抗体治療薬を生成するため利用可能な方法は限られている。現行の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで望ましい性質を伴う変異体タンパク質を選択するため抗体ライブラリーを使用することを含む。ライブラリーは、標的法及び非標的法（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９１）  ２２２、５８１−５９７、Ｗｉｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３−５５、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１：２２６１１−２２６１８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌｓ  ２０：１７−２９、Ｍｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、  １３：１１１７−１１２９、Ｂｅｎｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、  ７：７６３−７７９及び  Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９６：５７−８６）によって変異的多様性を含むよう生成される。これらの各抗体ライブラリーには、その限界がある。従って、本明細書の対照物においては、抗体ライブラリーを作製する方法及び前記方法によって産生される抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントの再編成によって生成されるヒト組合せ抗体ライブラリーを提供する。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーにおいて、ライブラリーの各メンバー抗体は、抗原結合部位を形成するため、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖又はその十分な部分を含む、複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各ＶＬ鎖は、Ｖk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶl及びＪlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、前記セグメントはインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、ヒトＶＨ及びヒトＪＨ生殖細胞系セグメント並びにＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドのあらゆる配列を含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは５０又は１００又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ライブラリーの各メンバーは、抗原結合部位を含み、機能的及び生産的な抗体である。
【０００７】
ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例で、ＶＨ鎖をコードする核酸分子における、ＶＨ生殖細胞系セグメント、ＶＨとＪＨの間のヌクレオチド配列及びＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＶＨセグメントがＶＨとＪＨの間のヌクレオチド配列へ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう連結され、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶk及びＪk又はＶl及びＪl生殖細胞系セグメントは、ＶkセグメントがＪkセグメントへ５’で、或いはＶlセグメントがＪlセグメントへ５’であるよう連結される。ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００のヌクレオチド長において、或いは約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００のヌクレオチド長である。いくつかの例において、ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、ペプチド模倣物をコードする。
【０００８】
本明細書では、各メンバー抗体が修飾された可変軽（ＶＬ）鎖及び／又は修飾された可変重（ＶＨ）鎖或いはその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するヒト組合せ抗体ライブラリーも提供する。各ライブラリーのＶＬ鎖は、セグメントがインフレームで連結される、Ｖk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶl及びＪlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、セグメントがインフレームで連結される、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメント又は縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。ＶＬ鎖及びＶＨ鎖の得られたタンパク質は、アミノ酸置換又はＣＤＲへのアミノ酸の挿入によって修飾される。前記ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のどれか１つ若しく全ＣＤＲを含むそれ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ３になり得る。挿入又は置換し得るアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応する。
【０００９】
上記の全例において、ペプチド模倣物は、ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ−３２）、エキセンディン４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ−３８、ＣＤ２０９Ｌ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ阻害剤又はＣＴＬＡ−４ペプチド模倣物であり得る。特にペプチド模倣物は、その受容体のＥｐｏ活性を模倣する模倣物である。ペプチド模倣物は、更に、アミノ酸などのカルボキシ及び／又はＮ−末端においてフランキング配列を含むことが可能である。例えば、フランキング配列は、グリシン又はプロリンを含み得る。例示的なペプチド模倣物は、配列識別番号：８９１及び９８７−１０１４のいずれかで示されるどれかである。
【００１０】
上記で提供されるライブラリーにおいて、ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドは、ヒト生殖細胞系ＤＨセグメント又はその縮重コドンである。従って、本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、各メンバー抗体が、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖又はその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各ＶＬ鎖は、Ｖk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶl及びＪlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によりコードされ、そによって前記セグメントは、インフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは５０又は１００又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例において、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントへ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう連結され、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶk及びＪk並びにＶl及びＪl生殖細胞系セグメントは、ＶkセグメントがＪkセグメントへ５’であり、或いはＶlセグメントがＪlセグメントへ５’であるよう連結される。
【００１１】
本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーの全てにおいて、前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供することができる。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各アドレス内の抗体は、同じ抗体であり、他の全てのアドレスの抗体とは異なる。例えば、ライブラリーのアドレス可能な抗体は、空間アレイで配列される。空間アレイは、マルチウェルプレートであり得、前記プレートのそれぞれの各位置は様々な抗体メンバーに対応する。抗体メンバーは、プレートのウェルの表面に固定化され得、又は溶液中に存在し得る。別の例において、アドレス可能な抗体は、固体支持体に付着される。こうした例において、固体支持体は、フィルター、チップ、スライド、ビード又はセルロースで、及び様々な抗体メンバーが、その表面に固定化される。いくつかの例において、固体支持体は、Ｂｉａｃｏｒｅチップである。本明細書で提供されるアドレス可能なあらゆるライブラリーをおいて、メンバーは同定可能に標識化される。例えば、標識は、有色、発色性、発光性、化学的、蛍光性又は電子的であり得る。
【００１２】
本明細書で提供されるヒト組合せライブラリーは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子が、少なくとも大体の、或いは５０又は１００の異なる抗体を生成するのに十分であるよう、複数の核酸分子がＶＨ鎖をコードし、並びに複数の核酸分子がＶＬ鎖をコードするメンバーを含む。従って、本明細書で提供されるライブラリーで、ＶＨ鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系ＶＨセグメントは、全て又は一部のＤＨセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系ＪＨセグメントと連結され、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成し、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系Ｖkセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Ｊkセグメントと連結され、或いは全て又は一部の生殖細胞系Ｖlセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Ｊlセグメントへ連結され、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子を生成する。
【００１３】
本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーのＶＨ鎖は、ヒトＶＨ生殖細胞系セグメント、ＤＨ生殖細胞系セグメント及びＪＨ生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わせれた再編成の核酸配列によってコードされる。ヒトＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：１０−２３８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶ−Ｄ結合部で追加又は除去される１つのヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドは、ＶＨとＤＨの間でヌクレオチドを追加するため、ＶＨヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ＤＨセグメントは、ＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６又はＩＧＨＤ７及び遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２３９−２７２のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＤＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸のＶ−Ｄ結合部及び／又はＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つのヌクレオチドを有することができる。ヌクレオチドの挿入又は欠失が、ＤＨの親水性を最大化するため選択される。例えば、ＤＨの５’末端からヌクレオチドが欠失され、及び／又はＤＨの３’末端からヌクレオチドが欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、ＤＨとＪＨの間でヌクレオチドを追加するため、ＤＨ配列の３’末端で挿入される。追加されたヌクレオチドは、特にグアニン（Ｇ）といったいずれかのヌクレオチドであり得る。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５又はＩＧＨＪ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号２７３−２８５のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＪＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸配列のＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、ＪＨのリーディングフレームを維持するため選択される。１つの例を挙げると、ＪＨの５’末端からヌクレオチドが欠失される。他の例を挙げると、ＪＨの３’末端からヌクレオチドが欠失される。
【００１４】
本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーにおけるメンバーのＶＬ鎖は、ヒトＶ  k生殖細胞系セグメント及びＪ  k生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたカッパ軽鎖をコードする再編成された核酸によってコードされ、又はヒトＶl生殖細胞系セグメント及びＪl生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたラムダ軽鎖をコードする再編成された核酸配列によってコードされる。ヒトＶkは、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５及びＩＧＫＶ６並びに遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２８６−３５５及び８６８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｖk遺伝子セグメントは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドはＶkの３’末端で欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、ＶkとＪkの間でヌクレオチドを追加するため、Ｖkヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトＪkは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４又はＩＧＫＪ５並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３５６−３６４のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｊk遺伝子セグメントは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Ｊkのリーディングフレームを維持するため選択される。いくつかの例を挙げると、Ｊkの５’末端からヌクレオチドが欠失される。ヒトＶlは、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０又はＩＧＬＶ１１並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３６５−４４１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｖlは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。例えば、Ｖlヌクレオチド配列の３’末端からヌクレオチドは欠失される。別の例において、ＶlとＪlの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドが、Ｖlヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトＪlは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６又はＩＧＬＪ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：４４２−４５１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｊlは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つのヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの���入又は欠失は、Ｊlのリーディングフレームを維持するため選択され得る。例えば、Ｊlの５’末端からのヌクレオチドは欠失される。
【００１５】
ヒト組合せ抗体ライブラリーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子及びＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子によって各々コードされる複数メンバーを含む。複数の核酸分子は、全ての組合せ或いは再配列された生殖細胞系セグメント又はその一部の置換に対応することができる。一般的に、本明細書で提供されるライブラリーは、５０、１０２、１０３、１０４、２  ｘ  １０４、３  ｘ  １０４、４  ｘ  １０４、５  ｘ  １０４、６  ｘ  １０４、７  ｘ  １０４、８  ｘ  １０４、９  ｘ  １０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又はそれ以上の異なるメンバー、或いは約５０、１０２、１０３、１０４、２  ｘ  １０４、３  ｘ  １０４、４  ｘ  １０４、５  ｘ  １０４、６  ｘ  １０４、７  ｘ  １０４、８  ｘ  １０４、９  ｘ  １０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９の又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。例えば、本明細書に提供されるライブラリーは、１０３、２  ｘ  １０３、３  ｘ  １０３、４  ｘ  １０３、５  ｘ  １０３、６  ｘ  １０３、４  ｘ  １０３、７  ｘ  １０３、８  ｘ  １０３、９  ｘ  １０３、１０４、２  ｘ  １０４、３  ｘ  １０４、４  ｘ  １０４、５  ｘ  １０４、６  ｘ  １０４、７  ｘ  １０４、８  ｘ  １０４、９  ｘ  １０４又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。
【００１６】
例えば、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸は、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。１つの例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各ＶＨ、ＤＨ及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーからの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶＨ、ＤＨ及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、ＶＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２  ＩＧＨＶ１−２４、  ＩＧＨＶ１−３、  ＩＧＨＶ１−４５、  ＩＧＨＶ１−４６、  ＩＧＨＶ１−５８、  ＩＧＨＶ１−６９、  ＩＧＨＶ１−８、  ＩＧＨＶ２−２６、  ＩＧＨＶ２−５、  ＩＧＨＶ２−７０、  ＩＧＨＶ３−１１、  ＩＧＨＶ３−１３、  ＩＧＨＶ３−１５、  ＩＧＨＶ３−１６、  ＩＧＨＶ３−２０、  ＩＧＨＶ３−２１、  ＩＧＨＶ３−２３、  ＩＧＨＶ３−３０、  ＩＧＨＶ３−３３、  ＩＧＨＶ３−３５、  ＩＧＨＶ３−３８、  ＩＧＨＶ３−４３、  ＩＧＨＶ３−４８、  ＩＧＨＶ３−４９、  ＩＧＨＶ３−５３、  ＩＧＨＶ３−６４、  ＩＧＨＶ３−６６、  ＩＧＨＶ３−７、  ＩＧＨＶ３−７２、  ＩＧＨＶ３−７３、  ＩＧＨＶ３−７４、  ＩＧＨＶ３−９、  ＩＧＨＶ４−２８、  ＩＧＨＶ４−３１、  ＩＧＨＶ４−３４、  ＩＧＨＶ４−３９、  ＩＧＨＶ４−４、  ＩＧＨＶ４−５９、  ＩＧＨＶ４−６１、  ＩＧＨＶ５−５１、  ＩＧＨＶ６−１及びＩＧＨＶ７−８１から選択され、ＤＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−１４、  ＩＧＨＤ１−２０、  ＩＧＨＤ１−２６、  ＩＧＨＤ１−７、  ＩＧＨＤ２−１５、  ＩＧＨＤ２−２、  ＩＧＨＤ２−２１、  ＩＧＨＤ２−８、  ＩＧＨＤ３−１０、  ＩＧＨＤ３−１６、  ＩＧＨＤ３−２２、  ＩＧＨＤ３−３、  ＩＧＨＤ３−９、  ＩＧＨＤ４−１１、  ＩＧＨＤ４−１７、  ＩＧＨＤ４−２３、  ＩＧＨＤ４−４、  ＩＧＨＤ５−１２、  ＩＧＨＤ５−１８、  ＩＧＨＤ５−２４、  ＩＧＨＤ５−５、  ＩＧＨＤ６−１３、  ＩＧＨＤ６−１９、  ＩＧＨＤ６−２５、  ＩＧＨＤ６−６及び  ＩＧＨＤ７−２７；から選択され、並びにＤＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６から選択される。
【００１７】
例えば、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。１つの例を挙げると、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各Ｖk及び／又はＪk或いはＶl及び／又はＪl遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶk及び／又はＪk或いはＶl及び／又はＪl遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Ｖk遺伝子ファミリーは、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１２及びＩＧＫＶ１−３９から選択され、Ｊk遺伝子ファミリーは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、  ＩＧＫＶ１−１６、  ＩＧＫＶ１−１７、  ＩＧＫＶ１−２７、  ＩＧＫＶ１−３３、  ＩＧＫＶ１−３７、  ＩＧＫＶ１−３９、  ＩＧＫＶ１−５、  ＩＧＫＶ１−６、  ＩＧＫＶ１−８、  ＩＧＫＶ１−９、  ＩＧＫＶ１−ＮＬ１、  ＩＧＫＶ１／ＯＲ２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、  ＩＧＫＶ１−Ｄ−１７、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、  ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−８、  ＩＧＫＶ２−２４、  ＩＧＫＶ２−２８、  ＩＧＫＶ２−２９、  ＩＧＫＶ２−３０、  ＩＧＫＶ２−３０、  ＩＧＫＶ２−４０、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、  ＩＧＫＶ２−Ｄ−３０、  ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、  ＩＧＫＶ３−１１、  ＩＧＫＶ３−１５、  ＩＧＫＶ３−２０、  ＩＧＫＶ３−７、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ１、  ＩＧＶ３−ＮＬ２、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ３、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ４、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ５、  ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８、  ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、  ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、  ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、  ｉＧＫＶ３Ｄ−７、  ＩＧＫＶ４−１、  ＩＧＫＶ５−２、  ＩＧＫＶ６−２１、  ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、  ＩＧＫＶ６Ｄ−４１及びＩＧＫＪ５から選択され、Ｖl遺伝子ファミリーは、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、  ＩＧＬＶ１−４１、  ＩＧＬＶ１−４４、  ＩＧＬＶ１−４７、  ＩＧＬＶ１−５０、  ＩＧＬＶ１−５１、  ＩＧＬＶ１０−５４、  ＩＧＬＶ１１−５５、  ＩＧＬＶ２−１１、  ＩＧＬＶ２−１４、  ＩＧＬＶ２−１８、  ＩＧＬＶ２−２３、  ＩＧＬＶ２−３３、  ＩＧＬＶ２−８、  ＩＧＬＶ３−１、  ＩＧＬＶ３−１０、  ＩＧＬＶ３−１２、  ＩＧＬＶ３−１６、  ＩＧＬＶ３−１９、  ＩＧＬＶ３−２１、  ＩＧＬＶ３−２２、  ＩＧＬＶ３−２５、  ＩＧＬＶ３−２７、  ＩＧＬＶ３−３２、  ＩＧＬＶ３−９、  ＩＧＬＶ４−３、  ＩＧＬＶ４−６０、  ＩＧＬＶ４−６９、  ＩＧＬＶ５−３７、  ＩＧＬＶ５−３９、  ＩＧＬＶ５−４５、  ＩＧＬＶ５−８、  ＩＧＬＶ５−５２、  ＩＧＬＶ６−５７、  ＩＧＬＶ７−４３、  ＩＧＬＶ７−４６、  ＩＧＬＶ８−６１、  ＩＧＬＶ８−６１及び���ＧＬＶ９−４９から選択され、並びにＪl  遺伝子ファミリーは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７から選択される。
【００１８】
本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、ライブラリーの各抗体メンバーは、生産的及び機能的である。従って、いくつかの例において、ライブラリーのメンバー抗体は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される核酸分子によってコードされるＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖を含む。
【００１９】
本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、ＶＨ鎖は、配列識別番号：１０５９−１４１０又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされ、並びにＶＬ鎖は、配列識別番号：１４１１−１４２２、１４２４−１４３９及び１４４１−１４７１又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。本明細書で提供される抗体ライブラリーは、ＶＨ鎖が、配列識別番号：１４７５−１８２６又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、並びにＶＬ鎖が、配列識別番号：１８２７−１８３８、１８４０−１８５５及び１８５７−１８８８又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するメンバーを含有するライブラリーを含む。
【００２０】
本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、完全長抗体或いは抗体のフラグメント又はその部分であるメンバーを有するものを含み、抗体のフラグメント又は一部は抗原結合部位を形成するのに十分である。こうして、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかは、定常領域の一部が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分であるよう、全て又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの抗体メンバーのフラグメント又は部分で含まれるのは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、Ｆｄ及びＦｄ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、  ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントである。例えば、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーは、ライブラリーの抗体メンバーがＦａｂのＦａｂライブラリーである。
【００２１】
本明細書では、可変の軽（ＶＬ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＬ鎖は、インフレームで連結されるＶk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント又はＶl及びＪlヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、ＶkセグメントがＪkセグメントへ５’で、又はＶlセグメントがＪlセグメントへ５’で、ＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶk及びＪk又はＶl及びＪl生殖細胞系セグメントが連結されるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全ての組合せの全置換を含み得る複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例を挙げると、複数の核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系Ｖkセグメントが、全て又は一部のＪkセグメントと連結されるよう一部の全生殖細胞系セグメント、或いは全ての又は一部の生殖細胞系Ｖlセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系Ｊlセグメントに連結されるよう、一部の全生殖細胞系セグメントを含む。
【００２２】
本明細書で提供されるＶＬ核酸ライブラリーにおいて、ＶＬ鎖をコードされた核酸分子は、ヒトＶk生殖細胞系セグメント及びＪ  k生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わされる再編成の核酸配列によって生成される。Ｖkは、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５又はＩＧＫＶ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２８６−３５５及び８６８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子メンバーで含有されるＶk生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Ｖkが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、Ｖkヌクレオチド配列の３’末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Ｖk及びＪk生殖細胞セグメント間でヌクレオチドを追加するため、Ｖkヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Ｊk生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４及びＩＧＫＪ５並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３５６−３６４のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪk生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Ｊkが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｖ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Ｊ  kのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Ｊkの５’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。
【００２３】
いくつかの例において、本明細書で提供されるＶＬ核酸ライブラリーは、ＶＬ鎖をコードする核酸分子が、ヒトＶl生殖細胞系セグメント及びＪl生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。Ｖl生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０及びＩＧＬＶ１１並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３６５−４４１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＶl生殖細胞系セグメントにおいて含まれるのは、Ｖlが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Ｖlヌクレオチド配列の３’末端から欠失される。別の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、ＶlとＪlの間でヌクレオチドを追加するため、Ｖlヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Ｊl生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：４４２−４５１のいずれかで示されるどれかである。
本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪl生殖細胞系セグメントにおいては、Ｊlが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Ｊlのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Ｊlの５’末端からヌクレオチドは欠失される。
【００２４】
本明細書で提供されるライブラリーのＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。例えば、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例において、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のＶk及び／又はＪk或いはＶl及び／又はＪl遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のＶk及び／又はＪk或いはＶl及び／又はＪl遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Ｖk  生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１２、  ＩＧＫＶ１−１６、  ＩＧＫＶ１−１７、  ＩＧＫＶ１−２７、  ＩＧＫＶ１−３３、  ＩＧＫＶ１−３７、  ＩＧＫＶ１−３９、  ＩＧＫＶ１−５、  ＩＧＫＶ１−６、  ＩＧＫＶ１−８、  ＩＧＫＶ１−９、  ＩＧＫＶ１−ＮＬ１、  ＩＧＫＶ１／ＯＲ２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、  ＩＧＫＶ１−Ｄ−１７、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、  ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、  ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、  ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、  ＩＧＫＶ１Ｄ−８、  ＩＧＫＶ２−２４、  ＩＧＫＶ２−２８、  ＩＧＫＶ２−２９、  ＩＧＫＶ２−３０、  ＩＧＫＶ２−３０、  ＩＧＫＶ２−４０、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、  ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、  ＩＧＫＶ２−Ｄ−３０、  ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、  ＩＧＫＶ３−１１、  ＩＧＫＶ３−１５、  ＩＧＫＶ３−２０、  ＩＧＫＶ３−７、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ１、  ＩＧＶ３−ＮＬ２、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ３、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ４、  ＩＧＫＶ３−ＮＬ５、  ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８、  ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、  ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、  ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、  ＩＧＫＶ３Ｄ−７、  ＩＧＫＶ４−１、  ＩＧＫＶ５−２、  ＩＧＫＶ６−２１、  ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、  ＩＧＫＶ６Ｄ−４１、  又はＩＧＫＶ１−３９遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Ｊk生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４及びＩＧＫＪ５遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Ｖl生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、  ＩＧＬＶ１−４１、  ＩＧＬＶ１−４４、  ＩＧＬＶ１−４７、  ＩＧＬＶ１−５０、  ＩＧＬＶ１−５１、  ＩＧＬＶ１０−５４、  ＩＧＬＶ１１−５５、  ＩＧＬＶ２−１１、  ＩＧＬＶ２−１４、  ＩＧＬＶ２−１８、  ＩＧＬＶ２−２３、  ＩＧＬＶ２−３３、  ＩＧＬＶ２−８、  ＩＧＬＶ３−１、  ＩＧＬＶ３−１０、  ＩＧＬＶ３−１２、  ＩＧＬＶ３−１６、  ＩＧＬＶ３−１９、  ＩＧＬＶ３−２１、  ＩＧＬＶ３−２２、  ＩＧＬＶ３−２５、  ＩＧＬＶ３−２７、  ＩＧＬＶ３−３２、  ＩＧＬＶ３−９、  ＩＧＬＶ４−３、  ＩＧＬＶ４−６０、  ＩＧＬＶ４−６９、  ＩＧＬＶ５−３７、  ＩＧＬ���５−３９、  ＩＧＬＶ５−４５、  ＩＧＬＶ５−８、  ＩＧＬＶ５−５２、  ＩＧＬＶ６−５７、  ＩＧＬＶ７−４３、  ＩＧＬＶ７−４６、  ＩＧＬＶ８−６１、  ＩＧＬＶ８−６１及びＩＧＬＶ９−４９遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントを含み得、並びに／或いはＪl生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞刑セグメントを含み得る。
【００２５】
本明細書で提供されるＶＬ鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、ＶＬ鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾されることが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号：１４１１−１４２２、１４２４−１４３９及び１４４１−１４７１のいずれか或いはその一部を含む。
【００２６】
本明細書では、可変軽（ＶＨ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＨ鎖は、インフレームで連結されるＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントが連結され、ＶＨセグメントがＤＨセグメントへ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全組合せの全ての置換を含有できる複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例において、複数の核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系ＶＨセグメントが、全て又び一部の生殖細胞系ＤＨセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系ＪＨセグメントと連結されるよう、全生殖細胞系セグメントの一部を含む。
【００２７】
本明細書で提供されるＶＨ核酸ライブラリーにおいて、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。ＶＨは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：１０−２３８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーを含有するＶＨ生殖細胞系セグメントにおいて、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨは、ＶＨをコードする核酸分子のＶ−Ｄ結合部で追加又は除去される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。例えば、ＶＨヌクレオチド配列の３’末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、ＶＨ及びＤＨ生殖細胞系セグメント間でヌクレオチドを追加するため、ＶＨヌクレオチド配列の３’末端で挿入又は追加される。ヌクレオチドは、特にグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６及びＩＧＨＤ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２３９−２７２のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＤＨ生殖細胞系セグメントにおいては、ＤＨが、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｖ−Ｄ及び／又はＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、あらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、ＤＨの親水性を最大化するため選択される。例えば、ＤＨの５’末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、ＤＨの３’末端からヌクレオチドが欠失される。更なる例において、ＤＨとＪＨの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドがＤＨ配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドはあらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、グアニン（Ｇ）である。生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２７３−２８５のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪＨ生殖細胞系セグメントにおいて、ＪＨは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｄ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。通常、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、ＪＨのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、ＪＨの５’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。別の例において、ＪＨの３’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。
【００２８】
本明細書で提供されるライブラリーのＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され得る。例えば、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。
別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各ＶＨ、ＤＨ及び／又はＤＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶＨ、ＤＨ及び／又はＤＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２、  ＩＧＨＶ１−２４、  ＩＧＨＶ１−３、  ＩＧＨＶ１−４５、  ＩＧＨＶ１−４６、  ＩＧＨＶ１−５８、  ＩＧＨＶ１−６９、  ＩＧＨＶ１−８、  ＩＧＨＶ２−２６、  ＩＧＨＶ２−５、  ＩＧＨＶ２−７０、  ＩＧＨＶ３−１１、  ＩＧＨＶ３−１３、  ＩＧＨＶ３−１５、  ＩＧＨＶ３−１６、  ＩＧＨＶ３−２０、  ＩＧＨＶ３−２１、  ＩＧＨＶ３−２３、  ＩＧＨＶ３−３０、  ＩＧＨＶ３−３３、  ＩＧＨＶ３−３５、  ＩＧＨＶ３−３８、  ＩＧＨＶ３−４３、  ＩＧＨＶ３−４８、  ＩＧＨＶ３−４９、  ＩＧＨＶ３−５３、  ＩＧＨＶ３−６４、  ＩＧＨＶ３−６６、  ＩＧＨＶ３−７、  ＩＧＨＶ３−７２、  ＩＧＨＶ３−７３、  ＩＧＨＶ３−７４、  ＩＧＨＶ３−９、  ＩＧＨＶ４−２８、  ＩＧＨＶ４−３１、  ＩＧＨＶ４−３４、  ＩＧＨＶ４−３９、  ＩＧＨＶ４−４、  ＩＧＨＶ４−５９、  ＩＧＨＶ４−６１、  ＩＧＨＶ５−５１、  ＩＧＨＶ６−１及びＩＧＨＶ７−８１遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−１４、ＩＧＨＤ１−２０、  ＩＧＨＤ１−２６、  ＩＧＨＤ１−７、  ＩＧＨＤ２−１５、  ＩＧＨＤ２−２、  ＩＧＨＤ２−２１、  ＩＧＨＤ２−８、  ＩＧＨＤ３−１０、  ＩＧＨＤ３−１６、  ＩＧＨＤ３−２２、  ＩＧＨＤ３−３、  ＩＧＨＤ３−９、  ＩＧＨＤ４−１１、  ＩＧＨＤ４−１７、  ＩＧＨＤ４−２３、  ＩＧＨＤ４−４、  ＩＧＨＤ５−１２、  ＩＧＨＤ５−１８、  ＩＧＨＤ５−２４、  ＩＧＨＤ５−５、  ＩＧＨＤ６−１３、  ＩＧＨＤ６−１９、  ＩＧＨＤ６−２５、  ＩＧＨＤ６−６及びＩＧＨＤ７−２７遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、並びに／或いはＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得る。
【００２９】
本明細書で提供されるＶＨ鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾され得る。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号：１０５９−１４１０のいずれか又はその一部を含む。
【００３０】
本明細書では、可変軽（ＶＬ）鎖又は可変重（ＶＨ）鎖をコードする上記核酸分子のいずれかを含有するアドレス可能なベクターのライブラリーも提供する。また、本明細書では、ライブラリーの各細胞が、上記の異なるベクターのいずれかを含む、アドレス可能な細胞も含む。
【００３１】
本明細書では、可変軽（ＶＬ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子及び可変重（ＶＨ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む（対を成す核酸ライブラリー）。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＬ鎖は、インフレームで連結されるＶk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント或いはＶl及びＪl生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、並びに各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされる。ＶＬ鎖をコードする核酸分子の得られた核酸メンバーは、本明細書で提供されるいずれかであり得、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、本明細書で提供されるいずれかであり得る。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各位置で対を成す核酸分子が異なるなど、各アドレス内のＶＨ核酸分子及びＶＬ核酸分子の組合せが、他の全てのアドレスにおける核酸分子の組合せと異なるよう、各位置は、ＶＨ鎖をコードする核酸分子及びＶＬ鎖をコードする核酸分子を含む。
【００３２】
本明細書では、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を含む。前記方法は、ａ）ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、ｂ）ＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、Ｖk及びＪkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いはＶl及びＪl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとの段階を含む。本明細書で提供される方法において、段階ａ）及びｂ）におけるＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖk、Ｊk、Ｖl又はＪlの各部分は、十分な抗原結合部位を形成するＶＨ又はＶＬ或いはその部分を含有する抗体又はその部分を産生するのに十分である。前記方法において、段階ａ）及びｂ）は、複数の異なる核酸分子の配列を生成するために数回繰り返される。核酸分子は、２つのライブラリーを産生するため合成され、それによって、第一のライブラリーは、ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、第二のライブラリーはＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む。前記方法において、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入される（例えば、同時形質転換によってなどと共に）。核酸を細胞へ導入する段階は、第一のライブラリー及び第二のライブラリーから対を成す異なる核酸分子で数回繰り返し、結果的に、核酸分子が、他のあらゆる細胞からＶＨ鎖及びＶＬ鎖の様々な組合せをコードするよう、ＶＨ鎖をコードする核酸分子並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子を含む。細胞は、各細胞で抗体又はその部分を発現するよう成長させ、それによって複数の抗体又はその部分を産生する。産生された複数の抗体又はその部分は、ＶＨ又はＶＬ或いはその十分な部分を含有し、抗原結合部位を形成して、抗体又はその部分は、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分のものと異なる。
【００３３】
本明細書で提供される方法によって産生されるヒト組合せライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供され得る。こうした方法において、様々な各段階は、前記方法の段階を通して、生殖細胞系セグメントの同一性、組み換えられた核酸配列及び／或いは産生された抗体又はその部分が、それらのアドレスによってわかるよう、アドレス指定された構成で実行することが可能である。例えば、合成された核酸は、個々にアドレス指定され、それによって、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定された核酸ライブラリーを生成する。核酸分子は、アドレス指定された細胞に導入することが可能で、各位置は、細胞のアドレス指定されたライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む細胞を含有する。抗体の発現において、アドレス指定された抗体が産生され、それによって各位置は、抗原結合部位を形成するのに十分なVH鎖及びVL鎖又はその部分を含有する抗体を含む。各位置の抗体又はその部分は同じで、他の各位置及び他の全ての位置のものとは異なる。こうして、抗体又はその部分の同一性は、そのアドレスによってわかる。
【００３４】
本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、段階a)で、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分は、VHセグメントがDHセグメントへ5'で、それはJHセグメントへ5'であるよう組合わされ、並びに段階b)で、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分は、VkセグメントがJkセグメントへ5'で、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5'であるよう連結される。段階a)及び／又はb)は、手作業で行うことが可能で、又はヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するアルゴリズムに基づいたコンピューター読み込み可能な指示を実行することができる若しくは実行するようプログラムされたコンピュータ又はコンピュータシステムなど、コンピュータによって実行することが可能である。
【００３５】
ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階a)は、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、DH生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってVH及び／又はDH生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによりV−D結合部を生成することと、JHのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりDH及び／又はJH生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによってD−J結合部を生成することと、並びにVH鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVH、DH及びJHを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、V−D結合部は、DH生殖細胞系セグメントの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、1つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、V−D結合部は、VH生殖細胞系セグメントの3'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することによって生成され得る。更なる例において、V−D結合部は、DH生殖細胞系セグメントの5'末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することによって生成され得る。例えば、挿入又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン(G)である。更に、D−J結合部は、JHの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、D−J結合部は、DH生殖細胞系セグメントの3'末端からヌクレオチドを挿入することにより生成される。挿入又は追加されるヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン(G)である。
【００３６】
ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階b)は、Vk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、Jk、のリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってVk又はJkの生殖細胞系配列を修飾することにより、又はJlのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりVl又はJlの生殖細胞系配列を修飾することによりV−J結合部を生成することと、並びにVL鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVk及びJk又はVl及びJlを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、V−J結合部は、例えば、Jk及びJl生殖細胞系セグメントの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、1つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、V−J結合部は、Vk又はVl生殖細胞系セグメントの3'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することにより生成され得る。更なる例を挙げると、V−J結合部は、Jk又はJl生殖細胞系セグメントの5'末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することにより生成され得る。例えば、挿入された又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり、特にグアニン(G)である。
【００３７】
本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階a)及びb)を数回繰り返す。段階a)を数回繰り返すことは、様々なVH生殖細胞系セグメントのN1(第1数など）を選択することと、様々なDH生殖細胞系セグメントのN2(第2数など)を選択することと、及び様々なJH配列のN3(第3数など)を選択することとを含む。N1、N2及びN3の数は同じ又は異なり得、全ての個々の生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。一般的に、N1、N2及びN3は、それぞれ、VH、DH又はJH生殖細胞系セグメントの全て又は一部であり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階a)を数回繰り返す方法において、VH、DH及びJH組合わせの可能な全ての組み合わせは、VH鎖をコードするN1 x N2 x N3の様々な核酸配列を生成するため構成される。
【００３８】
例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、VH生殖細胞系セグメント(N1の異なるVH生殖細胞系セグメントを含む)は、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6又はIGHV7の全て又はその一部並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号10−238のいずれかで示されるVH生殖細胞系セグメントから選択され得る。DH生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6又はIGHD7並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：239−272のいずれかで示されるDH生殖細胞系セグメントから選択され得る。JH生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5又はIGHJ6並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：273−285のいずれかで示されるJH生殖細胞系セグメントから選択され得る。
【００３９】
上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階a)で、配列の類似性又は相異性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択し得る。前記方法において、各々のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントが選択され得る。VH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。DH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHD1-1、IGHD1-14、 、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及びIGHD7-27遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。JH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
【００４０】
本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階a)及びb)を数回繰り返す。段階b)を数回繰り返すことは、異なるVl 生殖細胞系セグメントのN1(第1数など)を選択すること及び異なるJl生殖細胞系セグメントのN2(第2数など)を選択し、或いは異なるVk生殖細胞系セグメントのN3(第3数など)を選択して及び異なるJk 生殖細胞系セグメントのN4(第4数など)を選択することを含む。N1、N2、N3及びN4の数は同じ又は異なり得、並びにそれぞれの全ての生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。一般的に、N1、N2、N3及びN4は、それぞれ、全て又は一部のVl、Jl、Vk、Jk生殖細胞系セグメントであり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階b)を数回繰返す方法において、Vl、Jl、Vk、Jkの組合わせの可能な全べての組合わせは、VL鎖をコードするN1 x N2又はN3 x N4の異なる核酸配列を生成するため構成される。
【００４１】
例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、Vl生殖細胞系セグメント(N1の異なるVl生殖細胞系セグメントを含む)は、全て又は一部のIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：365−441のいずれかで示されるVl生殖細胞系セグメントから選択され得る。Jl生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：442−451のいずれかで示されるJl生殖細胞系セグメントから選択され得る。Vk生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：286−355及び868のいずれかで示されるVk生殖細胞系セグメントから選択され得る。Jk生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：356−364のいずれかで示されるJk生殖細胞系セグメントから選択され得る。
【００４２】
上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階b)において、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択され得る。前記方法において、各々のVk及び／又はJk或いはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び／又はJk或いはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントは選択され得る。Vk遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGKV1-12、IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 IGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41 及びIGKV1-39遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。Vl遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含有するIGLV1-36、IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。Jl遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
【００４３】
ヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する上記の方法のいずれかにおいて、生殖細胞系セグメントは、ユーザ作成のデータベースで含まれ得、例えば、こうした配列に便利にアクセスできる。前記方法の実行において、データベースのJH、Jk及びJl 生殖細胞系セグメントの配列は、それらの的確なリーディングフレームで示される(例えば、表13で示されるなど)。
【００４４】
本明細書で提供される方法は、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾すること及び／又はVL鎖又はその部分をコードする核酸配列を修飾することの段階a)及び／又はb)後の段階を更に含み得る。例えば、核酸配列は、あらゆる内部停止コドンを除去することにより修飾されることができる。一般的に、停止コドンの修飾は、核酸配列へ1つ又は2つのヌクレオチドのみを変えることにより行う。停止コドンに対するコドントリプレットは、アミノ酸をコードする他の全てのコドントリプレットに変えることが可能である。例えば、停止コドンTAAは、TATに修飾することができ、停止コドンTAGは、TATに修飾することができ、停止コドンTGAは、TCAに修飾することが可能である。別の例において、核酸配列は、あらゆる内部制限部位を除去することによって修飾され得る。制限酵素によって識別されるヌクレオチドは、目的の制限酵素によって識別されない配列と同様の長さの他の全てのヌクレオチド配列に修飾され得る(後続のクローニング段階で使用されるものなど)。一般的に、1つ又は2つヌクレオチドのみを変える。通常、制限部位の修飾は、大腸菌におけるコドンの使用を最大化するため行われる。
【００４５】
本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、VH鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号：1059−1410のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。VL鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号：1411−1422、1424−1439及び1441−1471のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。
【００４６】
ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法のいずれかにおいて、VH鎖をコードする複数の核酸配列及び／又はVL鎖をコードする複数の核酸配列を位置づけできる。例えば、前記配列は、配列の類似性に基づいて位置づけできる(配列アライメント或いは当業者に周知の及び本明細書に記載の他の方法によって実行など)。VH鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性、並びに／或いはVL鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性を決定できる。VH鎖及び／又はVL鎖をコードする一部の核酸配列は、選択された配列が、最も類似する配列又は選択された他の配列と最も異なる配列を含むよう選択され得る(例えば、合成及び後続の発現に対し)。
【００４７】
組合せ抗体ライブラリーを生成するため本明細書で提供される方法において、アドレス指定されたライブラリーの合成された核酸配列は、ベクターで含有される。従って、VH鎖をコードする核酸配列を含む第一のベクターライブラリーからのベクター及びVL鎖をコードする核酸配列を含む第二のベクターライブラリーからのベクターは、ライブラリーの抗体メンバーの生成及び産生に対し、アドレス指定された細胞に導入される。前記ベクターは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域の全て又は部分を更に含むことが可能である。例えば、前記ベクターは、得られたコードされる抗体がFabであるよう、CH1及びCLを含み得る。本明細書で提供される方法において、細胞は、原核生物の細胞又は真核生物の細胞を含む。例えば、細胞は、大腸菌細胞を含む。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、アドレス指定される細胞は、空間アレイで配列することが可能である。空間アレイは、例えば、細胞のアドレス指定されたライブラリーで他の全ての細胞と比較し、前記プレートの各個々の位置が、VH及びVLの異なる組合せをコードする核酸分子を含む細胞に対応するよう、マルチウェルプレートを含む。
【００４８】
本明細書で提供される方法で発現される抗体及びその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な完全長抗体或いはフラグメント又はその部分を含む。例えば、発現される抗体はFabである。本明細書で提供される方法は、更に、抗体又はその部分を精製する段階を含むことができる。ライブラリーの抗体又はその部分は、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度のものを含む。従って、アドレス可能なライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定されるよう、精製される抗体メンバーを含み、各アドレス内の抗体は、同じ抗体で、ライブラリーの他の全てのアドレスの他の全ての抗体とは異なる。
【００４９】
また、本明細書で提供されるのは、組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法により生成されるアドレス可能な組合せ抗体ライブラリーである。こうした抗体ライブラリーは、配列識別番号：1475−836のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するVH鎖、及び配列識別番号：1827−1838、1840−1855及び1857−1888のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するVL鎖を各々含有するメンバーを含む。
【００５０】
本明細書では、標的タンパク質に結合する抗体又はその部分を同定し、及び／又は標的タンパク質の活性を修飾するため、結合又は標的タンパク質に対する活性に対し、ヒト組合せ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法を提供している。こうした方法において、ヒト組合せ抗体ライブラリーが提供される。前記ライブラリーは、本明細書で提供されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリー、又は本明細書で提供される方法で産生されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリーを含む。こうした方法において、ライブラリーの抗体又はその部分は、標的タンパク質と接触し、抗体又はその部分と標的タンパク質との結合及び／又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の修飾を評価する。標的タンパク質に結合し、及び／又は標的タンパク質の活性を修飾する抗体またはその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を「HIT」として示す。こうした方法において、例えば、ヒト組合せ抗体ライブラリーは、「HIT」の同定がそのアドレスによってわかるよう、アドレス可能なライブラリーであり、アドレス可能なアレイで接触を行う。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートなどの空間アレイで行う。
【００５１】
本明細書で提供されるスクリーニング法において、標的タンパク質は、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである。膜結合性タンパク質又はCSRは、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、又は細胞接着分子を含むが、それらに制限されるものではない。例えば、標的タンパク質は、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOを含むが、それらに制限されるものではない。
【００５２】
いくつかの例において、標的タンパク質への抗体又はその部分の結合を評価する。他の例では、抗体又はその部分により標的タンパク質の機能的活性の調節を評価する。機能的活性は、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成及びシグナル伝達を含むが、それらに制限されるものではない。
【００５３】
本明細書で提供されるスクリーニング法において、結合は、細胞で評価することが可能で、及び／又は機能的活性は細胞ベースの活性で評価できる。こうした例において、細胞は、一般的に、膜結合又は細胞外受容体、リガンド若しくは接着タンパク質としてそれらの表面上で、標的タンパク質を発現する。例えば、細胞は、一時的又は安定的に標的タンパク質をコードする核酸分子で発現することができる。
【００５４】
本明細書では、「HIT」を同定した後に含むスクリーニング法を提供し、例えば、上記で提供されるスクリーニング法の前回の反復において、第二のライブラリーの組合せ抗体ライブラリーを提供する。こうした例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定された「HIT」に基づいている。例えば、同定されたHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに異なるVH鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、及び同定されたHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに異なるVL鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いは可能な全てのVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとによって、第二のライブラリーが生成される。VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJlの一部は、抗原に結合するのに十分なVH又はVL又はその部分を含む抗体を産生するのに十分である。生殖細胞系セグメントの組合わせにおいて、核酸分子は、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第一のライブラリー、及びVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第二のライブラリーを生成するため合成する。第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入し、並びに各細胞が、細胞のライブラリーにおける他の全ての細胞からVH及びVLの異なる組合わせをコードする核酸分子を含有するよう、細胞のライブラリーを産生するため前記の段階を数回繰り返す。細胞は、各細胞で抗体を発現するため成長させ、ライブラリーにおける生成された各抗体又はその部分が、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合わせを含み、ライブラリーにおける他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するよう、複数の抗体又はその部分を産生する。前記抗体は、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成するため、更に精製される。こうした例において、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーは、関連の生殖細胞系セグメント間及び関連の生殖細胞においての配列類似性が、60%、65%7、0%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上である、或いは大体そうであるよう生成される。
【００５５】
別の例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVH、DH又はJHヒト生殖細胞系セグメントを含むVH鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、並びに同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含むVL鎖をコードする複数の核酸分子を選択することとによって生成され、提供される。VLをコードする複数の核酸分子からの核酸分子及びVHをコードする複数の核酸分子からの核酸分子を細胞に導入し、細胞を成長させる。これは数回繰り返されて細胞ライブラリーを生成し、各細胞は、ライブラリーの他の全ての細胞と異なる組合せのVH鎖及びVL鎖をコードする核酸分子を含む。各細胞の抗体の発現において、複数の抗体又はその部分が産生される。ライブラリーの各抗体又はその部分は、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合せを含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成する。抗体又はその部分は、第二の組合せ抗体ライブラリーを生成するため精製する。
【００５６】
更なる例において、第二の組合せライブラリーは、複数の抗体又はその部分を生成するため、アミノ酸変異を「HIT」に導入することによって生成される同定されたHITに基づいて提供する。第二の組合せ抗体ライブラリーの核抗体メンバー又はその部分は、その一次配列における1つ又はそれ以上のアミノ酸変異により、同定された「HIT」とは異なる。こうした例において、アミノ酸変異は、同定されたHITの相補性決定領域(CDR)にある。
【００５７】
上記の各方法において、第二のヒト組合せライブラリーは、標的タンパク質と接触し、抗体及びその部分の標的タンパク質との結合及び／又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の調節を評価する。標的タンパク質に結合し、及び／又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を更なる「HIT」として表す。いくつかの例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、それぞれのアドレス内の精製された各抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、アドレス可能なライブラリーである。こうした例において、接触は、アドレス可能なアレイで行われ、「HIT」の同定は、そのアドレスによってわかる。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートといった空間アレイで行われる。
【００５８】
上記で提供されるスクリーニングの例のいずれかにおいて、前記方法は、その方法の以前の反復法における前回の「HIT」と比較して、標的タンパク質の最適化された結合親和性を有し、及び／又は標的タンパク質に対し最適化される活性を有し、更なる「HIT」を同定するまで、その方法を反復的に繰り返す。
本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVH鎖、並びにVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVL鎖を含む抗DLL4抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1及びIGHV5又はIGHV6或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6及びIGHD5又はIGHD3或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、並びにJH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントはIGKV3で、並びにJκはIGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子で、Vl生殖細胞系セグメントはIGLV8又はIGLV5で、並びにJl生殖細胞系セグメントは、IGLJ1又はIGLJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗DLL4抗体は、DLL4を結合し、及び／又はDLL4の活性を調節する。
【００５９】
いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03或いはIGHV6-1*01又はIGHV6-1*02である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01、IGHD5-18*01、IGHD3-3*01又はIGHD3-3*02である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01、IGHJ4*01、IGHJ4*02又はIGHJ4*03である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGKV3-11*01又はIGKV3-11*02である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。Vλ生殖細胞系セグメントは、IGLV8-61*01、IGLV8-61*02、IGLV8-61*03又はIGLV5-48*01である。Jλ生殖細胞系セグメントは、IGLJ1*01又はIGLJ4*01である。例えば、本明細書で提供される抗DLL4抗体は、IGHV1-46*01、
IGHD6-6*01及びIGHJ1*01から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV3-11*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、IGHV5-51*03、IGHD5-18*01及びIGHJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH並びにIGLV8-61*01及びIGLJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、或いはIGHV6-1*01及びIGHD3-3*01及びIGHJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGLV5-48*01及びIGLJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む抗体又はその部分である。本明細書で提供される抗DLL4抗体は、配列識別番号：1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1850で示されるアミノ酸を有するVL鎖、配列識別番号：1803で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1881で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、或いは配列識別番号：1812で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1884で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに限定されるわけではない。例えば、本明細書で提供される抗DLL4抗体の例は、配列識別番号：1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1850で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含む抗体である。抗DLL4に結合する十分な抗原結合部位を形成し、及び／又はDLL4の活性を調節する、上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。
【００６０】
本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖及びVk及びJk生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含有する抗EpoR抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6又はIGHD3或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントは、IGKV4である。Jκは、IGKJ1である。本明細書で提供される抗EpoR抗体は、EpoRを結合し、及び／又はEpoRの活性を調節する。
【００６１】
いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01、IGHD3-10*01又はIGHD3-10*02である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01、IGHJ4*01、IGHJ4*02又はIGHJ4*03である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGKV4-1*01である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。例えば、本明細書で提供される抗EpoR抗体は、IGHV1-46*01、IGHD3-10*01及びIGHJ4*01から蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVH鎖並びにIGKV4-1*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含み、或いはIGHV1-46*01、IGHD6-6*01及びIGHJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV4-1*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む。抗本明細書で提供される抗EpoR抗体は、配列識別番号：1509で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖並びに配列識別番号：1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、或いは配列識別番号：1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるわけではない。抗EpoRに結合し、及び／又はEpoRの活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含有するいずれかの抗体も提供する。
【００６２】
本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖及びVk及びJk生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む抗ErbB2抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV4又はIGHV1或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6及びIGHD1或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ2或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントは、IGKV3又はIGKV4である。Jκは、IGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、ErbB2を結合し、及び／又はErbB2の活性を調節する。
【００６３】
いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03或いはIGHV4-31*01、IGHV4-31*02、IGHV4-31*03、IGHV4-31*04、IGHV4-31*05、IGHV4-31*06、IGHV4-31*07、IGHV4-31*08、IGHV4-31*09、IGHV4-31*10である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01又はIGHD1-26*01である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01又はIGHJ2*01である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGHV3-20*01、IGHV3-20*02又はIGKV4-1*01である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。例えば、本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、IGHV4-31*02、IGHD1-26*01及びIGHJ2*01から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV3-20*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、或いはIGHV1-46*01、IGHD6-6*01及びIGHJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH並びに配列によりコードされるVL鎖を含む。本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、配列識別番号：1760で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1833で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、又は配列識別番号：1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号：1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるものではない。抗ErbB2に結合する及び／又はErbB2の活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。
【００６４】
本明細書で提供される抗体のいずれかは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。例えば、本明細書で提供される抗体は、Fab抗体を含む。更に、本明細書で提供される抗体のいずれかは、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M又は10-12M又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する抗体を含む。例を挙げると、本明細書で提供される抗体のいずれかは、1 x 10-9M、2 x 10-9M、3 x 10-9M、4 x 10-9M、5 x 10-9M、6 x 10-9M、7 x 10-9M、8 x 10-9M、9 x 10-9M、1 x 10-10M、2 x 10-10M、3 x 10-10M、4 x 10-10M、5 x 10-10M、6 x 10-10M、7 x 10-10M、8 x 10-10M、9 x 10-10M又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する。
【００６５】
本明細書では、本明細書で提供されるスクリーニング法で同定される抗体のいずれかを含む、本明細書で提供される抗体のいずれかを使用する処理方法を提供する。こうした抗体は、標的タンパク質の発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害の治療に用いることができる。一例を挙げると、本明細書では、DLL4の発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗DLL4抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。他の例において、本明細書では、EpoRの発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗EpoR抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。更なる例において、本明細書では、ErbB2の発現及び又は活性と関連するし疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗ErbB2抗体を使用する治療法を提供する。
【００６６】
本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実施するコンピュータデバイスによって実行可能で、コンピューターに読み込み可能な指示を含む、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体を含む。ヒト生殖細胞系セグメントの組合せ方法は、(a)利用可能な全ヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、(b)重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列の集まり(5’-VH-DH-JH-3’)を生成するためアルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vk-Jk-3’)及び／又はラムダ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vl-Jl-3’)の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、(d)得られた核酸配列がインフレームであるよう(b)の核酸配列のV−D及び／又はD−J結合部並びに(c)の核酸配列のV−J結合部でヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに(g)組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体で実行される方法は、(h)段階(e)の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の5'及び3'末端でヌクレオチドを追加することと、並びに(i)制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチドの置換によって組み換えられた核酸配列を修飾することとを更に含むことができる。前記方法は、細菌発現に対するコドン使用を最適化するため、組み換えられた核酸配列を更に修飾することができる。いくつかの例において、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体により実行される方法は、段階(f)の前に、配列の類似性及び相違性に基づいて、組み換えられた核酸配列のライブラリーから組み換えられた核酸配列を選択すること及び段階(f)のアドレス可能な構成における位置へ選択された配列のみを割り当てることを含み得る。
【００６７】
本明細書では、コンピュータデバイスによってヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するため、コンピュータ読み込み可能な指示の実行を含む方法を提供し、前記方法は、(a)利用可能な全てのヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、(b)重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-VH-DH-JH-3’)の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vk-Jk-3’)及び／又はラムダ経鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vl-Jl-3’)の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(d)得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV−D及び／又はD−J結合部並びに(c)の核酸配列のV−J結合部においてヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに(g)組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。前記方法は、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ経鎖をコードする、組み換えられた核酸配列のDNA合成、或いは、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ経鎖をコードする、一部の組み換えられた核酸配列のDNA合成を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】抗体の多様性を生成する方法の模式図。図1は、抗体の多様性がどうやって、組み合わせの多様性、様々組み合わせ、接合の多様性を含むんでいます。
【図２】抗体検出の反復法の模式図。図2aは、様々な可変重鎖および軽鎖をエンコードした拡散の列を生み出す重鎖及び軽鎖セグメントを組み合わせた1）のメソッドの描写です。3）重鎖と軽鎖の表現と関係性によって抗体の多元性を生み出す。抗体を純化する事で（ピッコロとFLPC浄化を使用するなど）そして活動の為の（例えば束縛もしくは機能的な活動）抗体のスクリーニングをする事で抗体の精製を生み出します。図2bは、最適化されている、または活動の改善HITSアルゴリズムを識別するために識別される”HITS”に基づいてメソッドを繰り返し含むその他の関連抗体を識別するために反復法の描写です。
【図３】ベクトルマッププラスミド。図3は、プラスミドAの提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図４】プラスミドDのベクトルマップ。図4は、プラスミド開発、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図５】プラスミドCのベクトルマップ。図5は、プラスミドのC、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図６】プラスミドEベクターマップ。図6はプラスミドメール、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図７】DNA塩基配列編集ソフトウェアの模式図モジュール。図7はDNA塩基配列編集ソフトウェア内に含まれている10モジュールを示しています。示すように、GUI（グラフィカルユーザーインターフェイス）は、GUIコントロール、コンパイルルールとNCBIのツールを含む4つの層があります。加えて、モジュール間の関連が示されている。
【図８】アルゴリズム重鎖および軽鎖の組み合わせ。図8は、生殖細胞のセグメントのエンコーディングから、可変重鎖または可変軽鎖を組換え核酸配列を生成するためのアルゴリズムの模式図である。
【図９】シーケンスをコンパイルするためのアルゴリズム。図9は、組換え核酸配列のエンコード機能可変重鎖または可変軽鎖変更するためのフローチャートである。
【図１０】ランキングシーケンスのためのアルゴリズム。図10はランク組換え変数の多様性のスコアとクラスタ情報に基づいて、重鎖および軽鎖のためのフローチャートである。
【図１１】シーケンスデータベースのファイル形式の模式図。図11は、配列データベースファイルの形式を示しています。財経部I制限部位（配列番号：1900）は、：図解はVH1 - 18（配列番号10）、  VH1-2 (配列番号:13)、 IGHD1-1*01 (配列番号:239)、 IGHJ1*01 (配列番号:273)、 AI (配列番号:330)、 A10 (配列番号:354)、 IGKJ1*01 (配列番号:356)、 V1-11 (配列番号:365)、 V1-13 (配列番号:366)、 IGLJ1*01 (配列番号:442)、 IGLJ2*01 (配列番号:443)、を含む、典型的なシーケンスです。
【図１２】DNA塩基配列編集ソフトウェアの初期起動画面。図12は、DNA塩基配列編集ソフトウェアの最初の起動画面を示しています。イラストは、5'末端配列CCATGGCA（配列番号：1901）、5'端シーケンスCCATGGCG（配列番号：1902）、3'端シーケンスCTAGC（配列番号：1903）および3'端シーケンスGTACT（配列番号番号：1904）。
【図１３】DNA塩基配列編集ソフトウェアのスプラッシュ画面。図13は、アプリケーションの起動時に表示されるスプラッシュ画面を示しています。
【図１４】DNA塩基配列編集ソフトウェア96ウェルプレート画面。図14は、コンパイルされた配列を含むモデルを96ウェルプレートの画面を示しています。 Gnl・Fabrus・V3を- 4_IGLJ7 * 01（配列番号：1906）のシーケンスは、シーケンス情報]ボックスに示されています。
【図１５】DNA塩基配列編集ソフトウェア軽鎖マニュアル編集画面。図15は、ユーザーがいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。 VLのシーケンスボックスで選択されV1が- 11（配列番号：365）。 JLのシーケンスボックスで選択して、IGLJ1 * 01（：442配列番号）です。全長配列（配列番号：1914）のDNA配列のボックスに示されています。
【図１６】DNA塩基配列編集ソフトウェア重鎖マニュアル編集画面。図16は、重鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。 VHのシーケンスボックスで選択されVH1 - 18（配列番号：10）。 DHのシーケンスボックスで選択して、IGHD1 - 1 * 01（：239配列番号）です。公団シーケンスボックスで選択して、IGHJ1 * 01（：373配列番号）です。全長配列（配列番号：1915）のDNA配列のボックスに示されています。
【図１７】DNA塩基配列編集ソフトウェア軽鎖自動コンパイル画面。図17は、モデルの軽鎖の自動コンパイル画面を示しています。イラストは、配列番号:1880 - 1881年、1883年、1905年から1913年と1916年から1940年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
【図１８】ライトチェーンBLASTのグリッド。図18は、軽鎖配列のモデルBLASTのグリッドを示しています。イラストは、配列番号:1880 - 1881年、1883年、1905年から1913年、1916年から1939年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
【図１９】DNA塩基配列編集ソフトウェア重鎖の自動コンパイル画面。図19は、モデルの重鎖の自動コンパイル画面を示しています。 1556、1760、1769、1821、1941年から1973年：図解は、配列番号933に設定された変数の重鎖の典型的なシーケンスです。
【図２０】重鎖BLASTのグリッド。図20は、重鎖配列のBLASTのグリッドのモデルを示しています。図はSEQ ID NOS: 1530、1539、1974-1995の前にある様々な重鎖の典型的な列です。詳細な説明
【００６９】
概要
【００７０】
A定義
B.概観
【００７１】
1アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法
2結果としてのライブラリー
3ライブラリの応用
C.抗体
1抗体ポリペプチド
2抗体の構造と機能ドメイン
3抗体配列と特異
Dコンビナトリアル抗体ライブラリの生成メンバーのメソッド
1機能組換え生殖細胞の可変領域の製造方法
A可変遺伝子セグメント
i.生殖細胞セグメント
ＩＩ変更された生殖細胞の種類別セグメント
B選択生殖細胞の種類別セグメントまたは変更されたセグメント及び
c.シーケンス編集
d.再結合された核酸分子のさらなるシーケンス変更
i.コドン使用
ＩＩ制限酵素のサイトの追加または削除
ＩＩＩリンカー
ＩＶタグまたは検出可能な部分
Ｖ対変異の多様性
ＶＩ監督ペプチド
e大腸菌生成可変重鎖および軽鎖配列および核酸分子
i.貯蓄と収集
ＩＩ収集の決定配列の多様性
核酸アミノ酸配列
ＩＩＩ核酸分子の生成
a）合成
b）組換え技術
f.表現およびその抗体または一部またはライブラリ内のメンバーの結果によるメンバーフラグメント
2オートメーション
a.使用者作成データベース
b.シーケンス編集
c.タンパク質の発現および精製の自動化
Eライブラリ
1 VHの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
2 VLの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
3ペア核酸ライブラリまたはベクトルライブラリ等及び
4抗体ライブラリ
5アドレス指定可能なフォーマット
Aマルチウェルプレートプレート
B固体サポート
6その他の表示方法
Aセル表示
Bファージディスプレイ
c. mRNAの表示とリボソームディスプレイ
d. DNAの表示
F抗体の生産.メソッド
1ベクトル
2細胞発現システム
A原核生物の発現
B酵母
c昆虫
d哺乳動物細胞
e植物
3精製
Gアプリケーションとライブラリの使用
1結合分析
2機能活動
a分化
b遺伝子表現の交代
c細胞毒性活性
3ターゲット
膜結合タンパク質、受容体とリガンドより
iノッチとノッチのリガンド
a）ノッチタンパク質
b）DLL4
ＩＩErbBファミリー
上皮成長因子受容体（EGFR）
b）ヒト上皮成長因子受容体2（HER2/neu）
ＩＩＩIGF - R1が（インスリン様成長因子1受容体）
ＩＶ c - Met
ＶCD20 - Bリンパ球抗原
ＶＩＩエリスロポエチン受容体（Epo- R）
ＶＩＩＩカドヘリン
a）P -カドヘリン（P-cad/CDH3）
ＩＸ CD44
4反復スクリーニング
5指向進化
aランダム突然変異誘発
i飽和突然変異誘発
ＩＩエラーしやすいPCR
ＩＩＩ細胞株
ＩＶ DNAシャフリング/抗体鎖シャッフリング
ＶCDRワーキング
ＶＩフレームワークの安定化
6エピトープのマッピング
7同定された体内での試験
8製造/キットの記事
9製剤/主管庁および抗体およびポリペプチドの使用
H例
【００７２】
A定義
定義されている場合を除き、すべての技術および科学用語は、発明に属す芸術のスキルによって理解されているのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開されたアプリケーションや出版物、遺伝子銀行シーケンス、データベース、ウェブサイトやその他の出版物、全体の開示はここで呼ばれます。イベントではこのセクションでは、これらが優先、ここでの情報開示全体を通じて言及されたその他出版された物、その他はそれら全体に言及により結合された。用語の定義が複数存在するイベントにおいて、このセクションは開示される。参照URLまたはそのような他の識別子またはアドレスにあった場合には、そのような識別子は変更することができますしインターネット上の特定の情報の行き来する事ができます、しかし同等の情報はインターネットを検索して見つけることができます。リファレンスはこのような情報の利用可能性をして公開普及を証拠としている。
【００７３】
ここで使用されるように、”コンビナトリアルライブラリには、”ビルディングブロックの組み合わせに基づいて化合物のコレクションを生成するために交換可能な化学”ビルディングブロック”のさまざまな組み合わせを反応させることにより形成される化合物のコレクションを指します。抗体コンビナトリアルライブラリーについては、ビルディングブロックは、コンポーネントV、D、およびそこから抗体が形成されているJの領域（または変更されたフォームのもの）から出来ている。目的のためにここでは、”ライブラリ”または”コレクション”は同じ意味で使用されます。
【００７４】
ここで使用されるように、結合抗体ライブラリーは、抗体のコレクション（またはファブなどその一部）であり、その抗体は、V、DおよびJ遺伝子セグメント、特にヒューマンV、DおよびJ生殖セグメントの組み合わせによって生成される核酸分子によってコードされています。結合ライブラリーここに典型的に約50の異なった抗体、（または抗体部分またはフラグメント）のメンバーまたは50、100、500、103、2× 103、3 × 103 4 × 103 5 × 103、6 × 103、7 × 103、8 × 103 9 × 103、1 × 104 2 × 104 3 × 104 4 × 104 5 × 104、6 × 104 7 × 104、8 × 104 9 × 104、 1 × 105 2 × 105、3 × 105倍105 5 × 105、6 × 105 7 × 105 8 × 105 9 × 105、106、107、108、109、1010、またはそれ以上の異なるメンバーを含んでいる。結果のライブラリーまたは抗体もしくはその一部のまたは全部のコレクションは、その標的タンパク質や変調機能活動の調整にバインドするためのスクリーニングされることができる。
【００７５】
ここで使用されるように、人間の組み合わせ抗体ライブラリーは、抗体もしくはその一部の集まりで、それにより各メンバーがVLとVH鎖またはヒト生殖細胞のセグメントを含む核酸によってコードされる抗原結合部位を形成するためにまたはその十分な部分を含んでいます。
【００７６】
ここで使用されるように、遺伝子のセグメント（Ig）の可変（V）、多様性（D）と接合部（J）または定数（C）の遺伝子を生殖細胞からのエンコード免疫グロブリン重鎖または軽（カッパとラムダ）鎖免疫グロブリンを参照してください。生殖細胞の中には複数のV、D、JおよびC遺伝子セグメントがあり、しかし遺伝子再構成結果それぞれの機能再編成の遺伝子で発生する唯一の1つのセグメントになる。たとえば、機能的に再編成の重鎖は、1つのV、1つのDと１つのJと機能的に再構成されたVとJを含む軽鎖遺伝子を配置した機能的なVとDを含んでいるそして1つのJそして機能的に配置された軽鎖。ここで、これらの遺伝子のセグメントは、生殖細胞で運ばれるそして機能遺伝子になるまで重鎖と軽鎖に移すことができない。。骨髄のB細胞の分化中に、これらの遺伝子のセグメントがランダムに1010以上の種類を生み出す事ができる特異遺伝子システムの中からシャッフルされます。ここでの目的として、遺伝子のセグメントは組み合わせ、または個々の生殖細胞のセグメントのコンパイルによって試験管内で再配置されます。
【００７７】
B変数生殖セグメントに言及すると、V、DとJのグループ、サブグループ、遺伝子や対立遺伝子そのに関連付けられています。遺伝子断片配列が知られているデータベースからアクセス可能で（例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）、国際的免疫情報システム（R）（IMGT）、KabatデータベースとトムリンソンのVBaseデータベース（Lefranc（2003）核酸解像度、31： 307〜310; Martinら、治療用抗体、ワイリーVCHのハンドブックの抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール（2007）、頁104から107）表3-5リストは典型的な人間の変数生殖セグメントです。典型的な配列VH、DH、JH、V、J、VおよびまたはJ、生殖細胞のセグメントは、
【００７８】
SEQ ID NOS：10-451と868の前にあります。その目的の為にここで、生殖細胞のセグメントは修正された配列を含む生殖細胞、そしてそれは方法の練習をする為に編集の列の法則とともに一致するよう修正された。例えば、生殖細胞の遺伝子セグメントは１つのアミノ酸欠如またはSEQ ID NOS:10-451, 868の前に置かれた核酸のどんな配列と比べても5'または3'への挿入を含んでいる。
【００７９】
ここで使用されるように、ヌクレオチドの配列に言及される生殖細胞セグメントを参照して変更されたフォームは、例えば、ヒト生殖細胞のセグメントの配列の中にある配列と比べて2,3,4,5,6,7,8,9,または10核酸と異なっているように、1つもしくはちょっとした核酸の相違を含む核酸の配列を除く（例えばVH、DH、JH、Vk、Jk、VlそしてJl）ヒューマン生殖細胞セグメントのヌクレオチドの配列と大体同じような核酸の配列に言及されている。いくつかの例では、変更された生殖細胞系列は、終止コドン、制限酵素サイトを削除、リーディング構造を維持する為に追加または削除されたヌクレオチドを移動させる法則を一致させるために修正されている。
【００８０】
ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントのヌクレオチドを参照して反転シーケンスは、遺伝子のセグメントは、逆のヌクレオチドの基準シーケンスの補数であるヌクレオチドの配列を有することを意味します。ここで目的のために、ヌクレオチドの基準シーケンスは生殖細胞のセグメントは、通常のDH生殖セグメントです。
【００８１】
ここで、”編集”、”コンパイル”、”結合”、”組み合わせ”、”配置”、”転位”、または他の類似の用語や文法のバリエーションを使用されるように、そのどのによる生殖細胞セグメントは核酸配列表現遺伝子に注文されるか組み立てられる。たとえば、変数の重鎖の生殖細胞のセグメントはVHのセグメントが5 で、DHセグメントが5で、JHセグメントにつながっている、それをコードする核酸配列VHのチェーンに行き着く。可変軽鎖の生殖細胞のセグメントは、核酸配列をコードするVL鎖の結果、VLのセグメントはJLのセグメントに5'である。。一定の遺伝子セグメントまたはセグメントもコードする核酸VHまたはVL鎖の3'末端に組み立てることができます。
【００８２】
ここで使われたように、”結合した”もしくは”結合”もしくは他の文法上の分類は、それゆえ生殖細胞、そして生殖細胞への参加に言及される。リンケージは、直接または間接的にすることができます。生殖細胞系列のセグメントはセグメントと追加的なヌクリオタイドまたは追加的なヌクリオタイドが枠組み内セグメント全体に影響を与える為加えられたか、ヌクリオタイドが枠組みセグメントの結果を受けて消去されることがありうる。これは、リンカのヌクレオチドの選択は、結果の核酸分子はインフレームになるように、機能と生産性抗体をエンコードしたことが理解される。
【００８３】
ここで使われたように、”フレーム内”や人間の生殖細胞のセグメントの結合を参照した”リンクされた枠”は、5コドン（ATG）ヌクリオタイド酸分子枠とそれにより作られた”生産的な”また機能的な十分な長さのポリペタイドお組み合わせによるヌクリオタイド生殖細胞セグメントの中にあります。ヌクレオチドの選択は、様々なVD、DJやVJのセグメントを結合するジョイント特に生殖細胞のセグメント、またV（D）接合にメソッドを与える規則と共に生殖細胞セグメントから挿入または消去される。たとえば、生殖細胞のセグメントはVHセグメント5からDH5セグメントへ、そしてそこからJHセグメントへ送られる。VHセグメント、例えば接合されたVDJセグメントが5開始コドン（ATG）とフレームであるようなJHセグメントに挿入または消去される。
【００８４】
例えば生殖セグメントはVHセグメント5からDHセグメント5DHへそして、そこからJHセグメントのように送られる。
ここでは”機能的な抗体”または”生産性抗体”を使用しているように本明細書中で説明するコードする核酸抗体またはその一部抗体またはその一部はFabなどの方法によって生成される。機能や生産性の抗体では、V（D）J組生殖細胞のセグメント（つまり、並べ替え）のようなエンコードされた抗体またはその部分は切り捨てられていない/又はアミノ酸の配列が出て枠の外にないものはコンパイルされます。これは、核酸分子が内部終始コドンを含んでいない結果、タンパク質の翻訳機構の結果が途中でタンパク質の集合を終了することにつながる。
ここで使用されるように、抗体の一部は、結合部位の抗原を形成するのに十分なアミノ酸が含まれています。
ここで使用されるように、リーディングフレームは、連続と非オーバーラップの三塩基コドンのDNAまたはRNAの重複を指します。三コドンが1つのアミノ酸をエンコードするために、フレーム1、2または3読んで、特定の塩基配列の3つのリーディングフレームが存在しています。たとえば、シーケンスACTGGTCAはフレーム1を読むことでACTGGTCAになる、AC TGG TCAを読み取る事でフレーム2に、そしてACT GGTCAを読む事でフレーム3になります。
【００８５】
ここで使用されるように、終止コドンは、翻訳中のタンパク質合成の停止を通知する三塩基配列、または黄色の停止を含むシーケンスは（コードするDNA配列のRNAの終止コドン配列など）は任意のシーケンスのエンコーディングを参照するために使用されるコドン（UAGを結またはTAG））、黄土色の終止コドン（UAAもしくはTAA））とオパール終止コドン（UGAまたはTGA））を含む。それは必要がないことをすべてのセルまたはすべての生物の翻訳の終止コドンの信号が止まるという意味で重要ではない。たとえば、少なくともいくつかの時間の1つ以上の終止コドン（アンバーサプレッサー株のオレンジ色の終止コドンなど）を通じて、オレンジ色抑制系統と部分的なアンバーサプレッサー株、翻訳の進行などの抑制ひずみ宿主細胞インチ
【００８６】
抗体の可変ドメインを構成するポリペプチド鎖を参照する変数、（VH）鎖または可変光（VL）チェーン（VHのドメインまたはVLドメインとも呼ばれている）を参照し、様々なドメインの抗体を作ります。ここでの目的は、重鎖生殖セグメントはVH、DHおよびVHチェーンをエンコードした核酸の結果作られる。軽鎖の生殖細胞のセグメントは、VLまたはJLをとして指定され、カッパ及びラムダ軽鎖を含む（VkとJk;VlとJl）とコンパイル、その結果をコードする核酸のVL鎖により作られる。軽鎖チェーンはいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖であることを理解され、しかしVkとJlのコンパイルの効果により、カッパ、ラムダのを含まない。
ここで使用されるように、”縮重コドン”親の塩基配列のコドンと同じアミノ酸を指定する3塩基のコドンを意味する。当業者の一つは、遺伝コードの縮重に精通しているコドンの縮退識別することができます。
【００８７】
ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”グループ”とは、変数（V）遺伝子、多様性（D）遺伝子、結合（J）遺伝子または定数（C）をコードする遺伝子、すなわち免疫グロブリンからコアコーディング領域を参照にしている。生殖セグメントグループの例としては、VH、DH、JH、Vk、Jk、VlおよびJlが含まれています。
【００８８】
ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”サブグループ”は、”塩基配列の類似性またはアイデンティティで定義されている列の集合を意味する。一般的に、サブグループは、特定の種で同じグループが[V、D、JまたはC]に属する遺伝子のセット、および共有している塩基配列レベルで少なくとも75％遺伝子配列です。サブグループは、IMGT命名法に基づいて分類されます（imgt.cines.fr;例えば、ラフランク（2008）バイオインフォマティクスのブリーフィング、9:263-275）。一般的に、サブグループは多重遺伝子族を表します。
【００８９】
ここで使用されるように、遺伝子の対立遺伝子は配列多型をコード領域内の1つまたは複数のヌクレオチドの違いリファレンス遺伝子配列（例えば置換、挿入または削除）と比較してのためにしている配列を生殖細胞を参照してください。したがって、同じサブグループに属しているIGの配列は、非常にそのコード配列で同様のことができるにもかかわらず高多型を示す。サブグループの対立は、2つの図の番号が続くアスタリスク（*）が付いてIMGT命名法に基づいて分類されます。例としては対立表3-5に記載されているVH、DH、JH、Vkは、Jk、VlおよびJlのセグメント生殖細胞の典型的な対立遺伝子。
【００９０】
ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照して”家族”はアミノ酸配列の類似性またはアイデンティティで定義されている生殖セグメント配列のセットを指します。一般的に、生殖細胞の家族は、遺伝子のすべての対立遺伝子が含まれています。
【００９１】
ここで使用されるように、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90または100ヌクレオチドの長さのヌクレオチドの任意の配列を意味する”指定されたDHセグメント”です。ヌクレオチドの配列は、VH鎖のCDR3領域の一部のコードには十分です。
【００９２】
ここで使用されるように、V、Dまたは”生殖細胞のセグメントに由来する”J遺伝子セグメントへの参照は、組換えイベントによっては、V、DまたはJ生殖細胞の遺伝子に由来するVHまたはVLの核酸配列の対応するヌクレオチドをと一致します 。
【００９３】
ここで使用されるように、抗体またはその一部またはその断片のV領域、D領域またはJ領域に言及される事で、対応するV、DまたはJの生殖細胞の種類別セグメントの遺伝子から派生し組換えのイベントによりヌクリオタイドにエンコードされたアミノ酸に一致する。
ここで使われたように、コレクション内の一意のメンバーの数を指し、ここでコレクション内のメンバーに対して”多様性”を使用している。したがって、多様性は、そのコレクションの類似ポリペプチドメンバーの間で、それぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列、の数を指します。たとえば、104の多様性を有するポリヌクレオチドのコレクションは、類似のポリヌクレオチドのメンバーの間で104の異なる核酸配列が含まれています。一例では、ポリヌクレオチドのコレクションを提供する/またはポリペプチドは、少なくともまたは102、103、104、105、106、107、108、109、1010以上の多様性を持っています。
ここで使用されるように、”多様性比は、”ライブラリの総数以上のライブラリ内の別のメンバー数の割合を指します。したがって、他のライブラリよりも多様性比のライブラリには、総数ごとに別のメンバー、全メンバーごとにこのように多くの多様性が含まれています。提供されているライブラリは、ライブラリが約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、または0.99のような、1に近い多様性比などの高度な多様性比を含みます。
【００９４】
ここで使用されるように、”配列の多様性”は、核酸配列の類似性の表現を参照して配列アライメント、多様性のスコア、および/またはシーケンスクラスタリングを使用して決定されます。任意の二つの配列は、配列をサイドバイサイドを敷設し、配列の長さに沿ってすべての位置でヌクレオチド以内に違いを解析することにより、整列することができます。配列アライメントは、基本的なローカル配列検索ツール（ブラスト）、核酸を比較するためのNCBIのツールおよび/またはタンパク質配列使用してインスリコで評価することができる。配列アライメントのブラストの使用は、当業者に知られている。 ブラスト検索アルゴリズムは、2つのシーケンスを比較し、それぞれの統計的有意性が一致して計算されます（ブラストによる）。ほとんどお互いに類似しているシーケンスが最も低ブラスコアを持って変化させ配列に対し、高いブラストスコアが高くなります。
【００９５】
ここで使用されるように、抗体は、自然にまたは部分的または完全に合成、そのような組換えとして、任意の部分は、その抗原を形成するのに十分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するものを含む、生産かどうかを、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの部分を指す結合部位。したがって、抗体またはその部分は、免疫グロブリンの抗原結合部位と相同または実質的に結合ドメインを有する任意のタンパク質が含まれています。たとえば、抗体は、（これはHとHを示すことができる'）は、2つの重鎖を含む抗体を意味すると2つの軽鎖（示すことができるLとL'）、各重鎖はフルレングスの免疫グロブリンできる場所重鎖またはその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な（しかし、重鎖を含む例えば、VHは、これらに限定されない、チェーン電圧VH - CH1の鎖とVH - CH1の- CH2の- CH3の鎖）、および各軽鎖はすることができますフルレングスの軽鎖またはprotionその（ただし、軽鎖を含む、例えば、VLの鎖とVL - CLは鎖に限定されない）抗原結合部位を形成するのに十分な。各重鎖（HとH'）一軽鎖（LとLさんとペアのそれぞれ）。通常、抗体は、最小限の全部又は少なくとも（VH）が鎖および/または可変光（VL）の鎖可変重の部分が含まれています。抗体はまた、すべての定数または領域の一部を含めることができます。
【００９６】
目的のためにここでは、抗体という用語は、完全長抗体およびその一部のような抗体フラグメントを含み、Fab、Fab'、F（ab'）2、単鎖Fvs（scFv）、Fv、dsFv 、diabody、FDおよびFd、'Fabフラグメント、FdフラグメントおよびscFvフラグメントを断片化します。その他の既知の断片は、scFab断片（ハストら、BMCバイオテクノロジー（2007）、7:14）に限定されていないものも含みます。抗体は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを含む任意の免疫グロブリンのクラスのメンバーを含んでいます。
【００９７】
ここで使用されるように、完全長抗体は、2つのフルレングスの軽鎖（例えばVH - CH1- CH2- CH3のまたVH - CH1- CH2の- CH3- CH4）そして、2つのフルレングスの重鎖を有する抗体（VL- Cl）とB細胞と合成生産されて同じドメインを有する抗体を分泌する抗体によって生成されるヒト抗体などのヒンジ領域。
【００９８】
ここで使用されるように、抗体フラグメントまたは抗体部分は、完全な長さよりも小さいですが、抗体いずれかまたは複数の例えば抗原結合部位を形成するのに十分なの可変領域の少なくとも一部が含まれている完全長抗体の任意の部分を参照して（例えば、１つまたはそれ以上のCDR）およびこのようにして結合特異性および/または完全長抗体の活性を保持し、抗体フラグメントは、例えば、全長抗体の酵素処理によって生成される抗体誘導体だけでなく、総合的に含まれて組換え誘導体を作り出した。抗体フラグメントの例としては、以下のものだけに限られないが、Fab、Fab'、F（ab'）2、単鎖Fvs（scFv）、Fv、dsFv、diabody、FDとFd'フラグメント（参照、例えば、メソッドの分子生物学、巻207：がん治療の方法とプロトコル（2003）のための組換え抗体、第1章p 3-25、キプリヤノグ）。フラグメントは、このようなジスルフィド結合とペプチドリンカーそして/またはペプチドリンカーとして一緒にリンクされている複数のチェーンを含めることができます。抗体フラグメントは、一般的に含まれている50アミノ酸および典型的な、少なくとも200アミノ酸を含んでいます。
【００９９】
ここで使用されるように、Fvを抗体フラグメントは、1つの変数重いドメイン（VH）と一つの変数の光非共有結合相互作用によってリンクされている（VL）のドメインで構成されています。
【０１００】
ここで使用されるように、dsFvは、VH - VLのペアを安定化させる人工分子間ジスルフィド結合とFvを指します。
【０１０１】
ここで使用されるように、FDのフラグメントは、可変ドメイン（VH）と抗体の重鎖のいずれかの定常領域ドメイン（CH1）の含有する抗体の断片である。
【０１０２】
ここで使用されるように、”Fab断片”は完全長抗体の一部を含む抗体フラグメントされていることなど、総合的に生産されている同じ構造を持つパパインとの完全な長さの免疫グロブリン、またはその断片の消化からの結果による組換えによるものです。 Fab断片は、（VLとCLの部分を含む）の軽鎖と様々なドメインの重鎖（VH）と重鎖(CH1)のいずれかの定常領域のドメイン部分から可変ドメインを含む別のチェーンが含まれている。；それは組換え製造されることができる。
【０１０３】
ここで使用されるようには、F（ab'）2フラグメントは、総合的にpHが4.0から4.5、またはでペプシンと免疫グロブリンの消化の結果から、例えば、その抗体フラグメントである組換え、抗体と同じ構造を持って製作。のF（ab'）2フラグメントは、2つのFabフラグメントが、ここで、各重鎖部分は、2つのフラグメントを結合ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む追加のいくつかのアミノ酸が含まれ、それが組換え製造することができる。
【０１０４】
Fab'フラグメントはF(ab’)2フラグメントのひとつの重鎖の部分のの含有断片である。
【０１０５】
ここで使用されるように、scFVフラグメントは、共有結合を任意の順序でポリペプチドリンカによって接続された可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）を含む抗体フラグメントを参照する。リンカーは、長さ2の可変ドメインは、実質的な干渉を受けることなくつながれているようです。典型的なリンカーは（グリシン-セリン）からいくつかのグルタミン酸またはLys残基が溶解度を高めるために分散したn個の残基である。
【０１０６】
ここで使用されるように、ダイアボディは二量体scFvです。ダイアボディは、通常、scFvsより短いペプチドリンカーを持っており、それらは優先的に二量体になります。
【０１０７】
本書で使用されるように、hsFvはヘテオダイメリックコイルドコイルドメイン（（2001）Jモル  バイオル7:312： 221-228参照）、に代用されてきた通常Fab断片中に存在する抗体断片に言及される。
【０１０８】
ここで使用されるように、ポリペプチドのドメインは構造的および/または機能的に区別や定義されていること（3つ以上のシーケンス、通常5または7またはそれ以上のアミノ酸）、は構造的に、そして/または機能的に分類、または定義づけできます。典型的なポリペプチドドメインはポリペプチドに一部であり、1つまたは複数の構造モチーフ（αヘリックスの例の組み合わせおよび/またはβ鎖ループ領域で接続）および/から成るポリペプチド内で独立して折返し構造を形成することができるまたはポリペプチドの一部で酵素活性や抗原結合などの特定の機能活動によって認識される。ポリペプチドは、1つ、通常1つ以上持つことができます。例えば、ポリペプチドは、1つまたは複数の構造ドメインと1つまたは複数の機能ドメインを持つことができます。単一のポリペプチドドメインは構造と機能に基づいて区別することができます。ドメインは、アミノ酸の連続した直線配列を包含することができます。また、ドメインは非ポリペプチドのアミノ酸のリニアシーケンスに沿って連続している非連続するアミノ酸の部分は、複数の包含することができます。典型的には、ポリペプチドは、ドメインの複数含まれています。たとえば、各重鎖および抗体分子の軽鎖は、（Ig）のドメインは、長さ各約110個のアミノ酸免疫グロブリンの複数含まれています。
【０１０９】
ここで使用されるように、免疫グロブリンドメインの構造によって区別されるアートによって認識されているドメイン、それはそれぞれに逆平行βストランド2つのβ-プリーツシートが含まれ、免疫グロブリンは、（Ig）の折りと呼ばれるアミノ酸のループによって接続されています。イグ倍の2つのβシートは疎水性相互作用と保存内鎖ジスルフィド結合によって一緒に挟まれています。抗体チェーン内の個々の免疫グロブリンドメインは、さらに機能に基づいて区別することができます。重鎖は、1つの変数領域のドメイン（VH）と3つまたは4つの定常領域ドメイン（CH）を含んでいますが例えば、軽鎖は、1つの可変領域ドメイン（VL）および一定常領域ドメイン（CL）は含まれています。各VL、CLは、VHの、およびCHドメインは免疫グロブリンドメインの例です。
ここで使用されるように、抗体を参照した”変数のドメイン”は別の抗体の間で変化するアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖の特定の免疫グロブリンのドメインです。各軽鎖と、各重鎖（VL、VH）を一つの変数領域のドメインを持っています。可変ドメインは、抗原特異性を提供するため、抗原認識に関与している。各変数の領域は抗原結合部位のドメインとフレームワーク領域（FRS）の一部であるCDRを含んでいます。
【０１１０】
ここで、”可変領域”、”HV”、”相補性決定領域”と”CDR”と”CDR抗体が”一緒に抗原が結合形成する各変数の領域内の複数の部分のいずれかを参照するために交換可能に使用される使用されるように抗体のサイトです。各可変領域ドメインがCDR1、CDR2および、CDR3という名前の3つのCDRが含まれています。3つのCDRは、ノンリニアのアミノ酸配列に沿って連続しているが、折りたたまれたポリペプチドに近接している。 CDRは可変ドメインのβシートの並列鎖を結合ループ内に位置しています。
【０１１１】
ここで使用されるように、フレームワーク領域（FRS）は、βシート内にある抗体可変領域ドメイン内のドメインです。FRの領域は超可変領域よりも、そのアミノ酸配列の用語では、比較的多く保存されています。
【０１１２】
ここで使用されるように、定常領域のドメインは、比較的多くの可変領域ドメインよりも抗体の間で保存されているアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖のドメインです。各軽鎖は、各重鎖は、CH1、CH2、CH3とCH4、1つまたは複数の重鎖定常領域（CH）のドメインを含む単一の軽鎖定常領域（CL）をドメインとしています。 IgEおよびIgM抗体は、CH1、CH2のCH3とCH4が含まれている中にフルレングスIgA、IgDおよびIgG抗体のアイソタイプは、CH1の、CH2のCH3およびヒンジ領域が含まれています。 CH1とのCLのドメインがこのように抗原と回転抗体腕のとの相互作用に貢献し、抗体分子のFabアームを拡張します。抗体の定常領域は、例えば、様々な細胞、生体分子や組織との相互作用を介して特別に結合する抗体である病原体や毒素の抗原の消失のような、とはいうものの、に限ったことではないがに効果的な昨日を持っている。
【０１１３】
ここで使用されるように、ヒト化抗体は、ヒトへの投与に、免疫応答を引き起こすしないようにアミノ酸の”ヒューマン”シーケンスを含むように変更される抗体を参照にしている。このような抗体の調製方法が知られている。たとえば、抗体は、非可変領域のアミノ酸組成物は、ヒト抗体に基づくことができます。コンピュータプログラムは、そのような領域を識別するために設計されています。
ここで使用されるように、”抗原結合部位”は1つ以上の相補性決定領域（可変領域と呼ばれるCDR）によって形成されたインターフェイスに関連付けられています。それぞれの抗原結合部位は重鎖可変領域から3つのCDRと軽鎖可変領域から3つのCDRが含まれています。抗体分子は、2つの抗原サイトと、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分の各々を含む部分サイトを持っています。結合抗原はCDRに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含めることができます。
【０１１４】
ここで使用されるように、”抗原結合部位を形成するのに十分である抗体または部分”への参照する事は、抗体またはその部分が、少なくとも全6 CDRを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する少なくとも1、2、3、4、5または6 CDRのVHとVLが含まれていることを意味します。一般的には、少なくとも十分な抗原結合部位は重鎖（CDRH3）のCDR3が必要です。これは、通常より軽鎖（CDRL3）のCDR3が必要です。ここで説明するように、当業者の一人はKabatまたはChothiaの番号に基づいてCDRを識別することができる事を知っている。（例、Kabat、EAら等（1991）シーケンス免疫インタレスト、第5版、米国保健局との蛋白質のヒューマンサービス、NIHの公報91から3242、およびChothiaの、C.ら（1987）j.Mol.Biol.196:901-917を参照）。たとえば、Kabatの番号に基づいて、CDRは- LIは残りL24を- L34に対応しています。CDRは- L3は、残りL89 - L97に対応しています;CDR - L2は残りL50と- L56に対応しCDR - H1は残りH31 - H35、35aや35b等長さに応じて対応しています；CDR- H2は、残基にH50 - H65を対応し、CDR - H3が残基H95 - H102に対応しています。
【０１１５】
ここで使用されるように、”ペプチド模倣”はポリペプチドの活性を模倣するペプチドである。たとえば、エリスロポエチン（EPO）はペプチド模倣は、このようなEPOの受容体と結合活性化のためにEPOの活性を模倣するペプチドである。
【０１１６】
ここで使用されるように、最適化された抗体は、抗体、またはその一部、およびリファレンス抗体と比較して/または改善された機能的活性を標的タンパク質のための改良結合親和性を有するに関連付けられています。典型的には、抗体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸の変更（アミノ酸の欠失、置換または挿入）は、1つまたは複数のアミノ酸の変更を含むまない親抗体と比較によって最適化されています。一般的に、活動や結合親和性は（例。変更を含んでいないヒット生殖細胞等）親抗体の結合調和と比較され約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8、9、10倍倍-、20倍の倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300、400倍倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍以上に増加しています。
【０１１７】
ここで使用されるように、対応した残りに言及した対応、たとえば、”対応するアミノ酸残基”は、（例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など）連続した関係である2つのポリペプチド間で比較残基に参考した。ポリペプチドの間で対応する残基を識別することが容易にできる芸術の中にあるスキルです。たとえば、ガイドとして保存された同一のアミノ酸を使用して、対応する残基を識別することができる当業者のいずれかでエンコードされた領域の配列を整列があります。当業者の一つは、手動またはシーケンスを整列させることができる多数の整列プログラムを用意し（例えば、BLAST）のいずれかを使用することができます。したがって、アミノ酸残基またはお互いに対応する位置は、指定された基準ポリペプチドと/または構造アラインメントに基づいて対応するように決定されるそれらの残基があります。
【０１１８】
ここで使用されるように、コンセンサス配列は、（例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など）に関連する配列の複雑性が提携したとき、各位置に、最も頻繁に発生する残基である残基を含む統計配列です。したがって、コンセンサス配列は、ほとんどのそれぞれの位置でアライメントの豊富な残基を表しています。目的のためにここでは、例えば、生殖細胞の配列、またはその一部は、コンセンサス生殖細胞系配列を生成するために整列することができます。
【０１１９】
ここで使用されるように、ライブラリ内の軌跡はメンバーまたはライブラリのメンバーを含めることができる場所や位置に関連付けられています。位置が物理的な位置にする必要はありません。たとえば、コレクションが固体支持体上に配列として提供されている場合、支持体は配列のメンバーを表すことができる場所を含みます。
【０１２０】
ここで使用されるように、アドレスは、アドレスのメンバーが（例、抗体など）を識別することができる一意のコレクション内の各遺伝子座の識別子に関連付けられています。アドレス部分は、その軌跡や場所のおかげで識別することができるものです。アドレッシングは、このようなウェルのマイクロプレートのように、表面上の位置で行うことができる。たとえば、マイクロウェーブプレートのたんぱく質の為のアドレスはF9であり、それはマイクロウェルプレートでの列9に配置されていることを意味します。アドレッシングはバーコードやその他の記号、化学タグ、電子、このようなRFタグ、カラータグ、他のそのような識別子を使用してエンコードされたタグなど、他の識別子で行うことができる事にも対応する。
【０１２１】
ここで使用されるように、配列は3つ以上のメンバを含む抗体などの要素のコレクションを指します。
【０１２２】
ここで使用されるように、”空間的配列は、”メンバーが区切られている、または配列内の異なる領域を占めている配列です。したがって、空間的配列は、アドレス指定可能な配列の型があります。空間配列の例としては、プレートの各ウェルには、配列内のアドレスでマイクロタイタープレートが含まれています。例えば、空間配列は前記異なる複数の分子を任意の配置が含まれているような異なった分子の複雑性の中に配列された中に含まれます。配列は48ウェル、96ウェル、144ウェル、192ウェル、240ウェル、288ウェル、336ウェル、384ウェル、432ウェル、480ウェル、576を含めることができます - また、672ウェル、768ウェル、864ウェル、960ウェル、1056ウェル、1152ウェル、1248ウェル、1344ウェル、1440ウェル、または1536ウェルプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または他の適当な実験装置などのマイクロタイタープレートプレートを含みます。
【０１２３】
ここで使用されるように、アドレス指定可能なライブラリは、コレクションの各メンバは、そのアドレスの美徳によって識別された抗体などの核酸分子または蛋白質剤などの分子の集合です。
【０１２４】
ここで使用されるように、アドレス指定可能な配列は、配列のメンバの美徳、またはそのようなもマイクロタイタープレート、固相支持体上に自分のアドレス、空間配列内の位置によって識別される色、蛍光、電気信号（すなわち、高周波、実質的に関心のある分子の相互作用を変更しない電子レンジや他の周波数）、バーコードやその他の記号、化学的又は他のそのようなラベルとして識別または検出可能なラベルです。
したがって、一般的には配列のメンバは、固相の表面上に特定の遺伝子座で配置されている直接または間接的にリンクされているもしくは微小粒子又はその他のサポートに貼付されてなど（以下と呼ばれるビーズ）を、溶液中で休止し、又は表面に広がる添付物のような特定のラベルに関連付けられている。
【０１２５】
ここで使用されるように”アドレスの組み合わせ抗体ライブラリー”は空間配列内の位置などのまたは固体支持体、または化学または識別子、抗体のコレクションを参照するRFタグでのような抗体同一で特定されるのと同じと確認できるすべての抗体です。”アドレスアレイの組み合わせ抗体ライブラリー”への参照は、抗体のメンバーは、配列で扱われることを意味します。
【０１２６】
ここで使用されるように、サポート（行列のサポートマトリックス、不溶性担体または固体支持体ともいう）は任意の固体又は半固体または不溶性のサポートを参照して興味のある分子は、通常生体分子、有機分子や生体特異的リガンドはリンクされているか、結合した。このような材料は、親和性マトリックスとして使用されているか、化学、生体分子の合成などの分析のためにサポートしていますが、これらに限定されない任意の素材が含まれている：ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、固相合成、親和性の分離と精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイ等の用途のための担体として使用される他の材料。ここでは母体は、微粒子やマイクロタイタープレート皿・くぼみ、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のそのような材料などの連続的な表面の形態にすることができます。ときに、通常の粒子が5から10ミリメートルの範囲以下の少なくとも1つのディメンションを持っています。このような粒子は、”ビーズ”と言われ、しばしば、必ずではないですが、球形をしていますこのような参照は、しかし、ランダムな形状、針、繊維を含む、任意の形状とすることができる行列のジオメトリを、制約されず、伸長した。特に、大体球状の”ビーズ”は、液相中で使用することができ、注目されている。 “ビーズは”磁石を使用して分離するために、追加のコンポーネントとして長いメソッドと分析本と干渉しないように（例。ダイナビーズ（R）（ダイナル、オスロ、ノルウェー）などを参照してください）磁性または常磁性粒子のような追加のコンポーネントを含めることができます。
【０１２７】
ここで使用されるように、行列やサポート粒子は離散的な粒子の形態であるマトリックス材料を意味する。粒子は、任意の形状と寸法が、通常は100ミリメートル以下、50ミリメートル以下、10 mm以下、1mm以下、100μm以下、50μm以下、そして典型的なサイズは100立方ミリメートル以下、50立方ミリメートル以下、10立方ミリメートル以下、1立方ミリメートル以下、100μm3以下の大きさであり、立方ミクロンに命令することができます。このような粒子は、総称して”ビーズ”と呼ばれます。
【０１２８】
ここで使用されているように、研究と実験を参照したシリコは、コンピュータを使用して実行を行った。 シリコでの方法は、以下に分子モデリング研究を、生体分子のドッキング実験、分子構造の仮想表現、そして/または、プロセス、分子間相互作用などに限定されない。目的のためにここでは、ライブラリの抗体のメンバーは、コンピュータにそれらの入力の中から成分V、DおよびJの生殖細胞のセグメントを選択し、合成出力するには、フレームに核酸分子のリストを表示して、それらを結合するコンピュータプログラムを使用して設計することができる。したがって、コレクションまたはここて与えられたライブラリ中の抗体のコンポーネントの再結合がそうするための規則が含まれているソフトウェアと一致して、各ビルディングブロックの塩基配列を組み合わせることにより、シリコ内で行うことができる。プロセスは、コンピュータを使わずに手動で実行されるがコンピュータは速度の利便性を提供しています。
【０１２９】
ここで使用されるように、データベースはデータ項目のコレクションに関連付けられています。ここでの目的は、データベースの参照は抗体遺伝子配列の配列と構造情報の収集を提供する抗体のデータベースを参照しています。典型的な抗体のデータベースが含まれ、IMGT （R）、国際的な免疫情報システム（imgt.cines.fr例。レフランクその他（2008）、バイオインフォマティクスのブリーフィング、9:263-275を参考。）、ナショナルセンターバイオテクノロジー情報（NCBI）、カバットデータベースとトムリンソンのVベースデータベース（レフランク（2003）核酸研究所、31:307-310;マーティンら、治療用抗体、ワイリー- VCH(2007),ページ104-107）。データベースは、任意の配列を含むようにユーザーが作成することができます。データベースは、配列は、所望の形式で入力されるように作成することができます。（特にリーディングフレームの例;終止コドンを欠けている。シグナル配列を欠いている。）データベースはまた、抗体の配列に加えて、配列を含むように作成することができます。
【０１３０】
ここで使用されるように、”コンピュータベースのシステム”とは、ハードウェア、ソフトウェアを参照してデータ記憶媒体とメソッドは、生殖細胞のセグメントを再結合に使用されます。コンピュータベースのシステムの最小ハードウェアは、ここでは、中央処理装置（CPU）、入力の平均は、出力手段と記憶手段にデータが含まれて提供されます。熟練の方法およびシステムで使用するために適切なコンピュータベースのシステムを選択することができる職人はここで提供されます。
【０１３１】
ここで使用されるように、”記録”はコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を格納するためのプロセスを参照にします。熟練した当業者は容易に配列の画像データをコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録するための現在知られているのいずれかの方法を採用することができます。データストレージ構造の選択は、一般的にメディアとプラットフォーム格納されている情報にアクセスするために選択に基づいて作成できます。また、データ処理プログラムや様々なフォーマットは、コンピュータ可読媒体上の羅列イメージ情報を格納するために使用することができます。画像情報は、マイクロソフトワード（R）、グラフィックファイルまたはASCIIファイルの形で表されているもの、DB2 （R）、Sybase（R）、Oracle （R）などのデータベースアプリケーションに格納され次のような市販のソフトウェアでフォーマットされたワープロのテキストファイルで表すことができます。熟練した当業者は、情報や指示は、ここに記載記録されたその上を有するコンピュータ可読媒体を得るために、形式（例、テキストファイルまたはデータベース）構造化データプロセッサの任意の数を調整することができます。
【０１３２】
ここで使用されるように、”スクリーニング”がコレクションまたは抗体のライブラリーおよび/またはその部分で、アクティビティまたはプロパティ抗体またはその一部の決定に基づいています。スクリーニングは、例えばターゲットタンパク質の活性の変調を評価する機能評価試験により抗体からターゲットプロテインの評価に直接結びつく（例。結合親和性）抗体の結合を評価します。
【０１３３】
ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および/または標的タンパク質の機能活性の変調、または標的タンパク質に向かった抗体の活動を反映する他の尺度に関連付けられています。
ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および/または標的タンパク質の機能活性の変調、または他の測定標的タンパク質その向かって抗体またはその一部の活動を反映するに関連付けられています。
【０１３４】
ここで使用されるように、期間評価はここで抗体またはその標的タンパク質の割合のおよび/または変調標的タンパク質の活性の抗体まとの結合の絶対値を取得するという意味での定量的および定性的な判断を含むものとする評価用語を使用されるように、インデックス、比、割合、視覚的またはその他の値を結合または活動のレベルの他の価値評価を量的にまた質的に決めることを含む事を意図しています。評価は、直接または間接的にすることができます。たとえば、束縛は直接検出可能なラベルとその抗体またはその一部のラベルを貼ることによって、あるいは自分自身にラベルが付いていることが二次抗体を用いて決定することができます。加えて、機能の活動は当業者に知られている評価の種々のいずれかを使用して決定することができ、例えば、増殖、細胞毒性そして、ここで説明され不在対存在下で標的タンパク質の活性の比較があります。
【０１３５】
ここで使用されるように、”標的タンパク質”は抗体もしくはプローションの理由により調整された活動そして/または特に抗体もしくはその部分の認識されるタンパク質やペプチドに言及されます。標的タンパク質は、任意のペプチドまたはタンパク質抗体の認識エピトープが含まれているものが含まれています。標的タンパク質が病気や障害の発現または活性のおかげでの病因に関与するタンパク質が含まれています。典型的な標的蛋白質はここに記載されています。
【０１３６】
ここで使用されるように”ヒット”はスクリーニング評価の中で活動しているとして認識または選ばれた抗体またはその一部を参照にします。
【０１３７】
ここで使用されるように、スクリーニングに続く”繰り返し”がその活動を最適化されるか、もしくは前の繰り返しと比べ改善されると分かるまで、2、3、4、5回以上繰り返されます。
【０１３８】
ここで使用されるように、”高い情報処理”は大規模な方法、もしくは大きな数の分子を巧みに扱い、一般的に構成の10、100、1000を構成する事を許可する過程に言及されます。
たとえば、精製およびスクリーニングの方法は、高スループットをレンダリングすることができます。ハイスループット法は、手動で実行することができます。しかし、一般に、高スループットの方法は自動化、ロボットやソフトウェアを含みます。
【０１３９】
ここで使用されるように、”構造/活性関係（SAR）”は構造と機能分子の間の関係を指します。目的のためにここで、構造体は、例えば、ヌクレオチドのエンコーディングの配列抗体は、配列を参照しています。ライブラリメンバをアドレスのおかげで、そのアドレスに基づいて知られており、そのシーケンスで各抗体を識別します。したがって、構造が知られている特定のアクティビティに関連付けることができます。したがって、SARは活性構造の変化の影響を評価するために使用することができます。
【０１４０】
ここで使用されるように、”機能的活動が”ポリペプチド（標的タンパク質など）またはその全長（完全）タンパク質に関連付けられている部分の活動を参照します。機能の活動には、以下に具体的には、生物学的活性、触媒や酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合するためのポリペプチドと競合するかに結合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、能力に限定されていない受容体またはリガンドポリペプチドおよびシグナリングと下流のエフェクター機能にバインドします。目的のためにここで、ライブラリ、その中の抗体またはその一部のポリペプチドの機能活性の変調（すなわち、活性化や抑制）本ポリペプチドの機能活性が変更されていること、または抗体の存在下で、変更がない場合と比較して意味抗体またはその部分として、ここでは”調節”や”変調”と、その抗体の効果やその一部、標的タンパク質の機能活性誘導または活性の増強などの活動の増加を意味するのを参照して他の様々な文法形式を使用しても標的タンパク質の1つまたは複数の活動を阻害するとしています。したがって、変調は、アクティビティ（つまり、アップ規制やアゴニスト活性）活性の低下（すなわち、ダウン規制や抑制）や周期、周波数の変化などの活動（任意のその他の変更の増加を含めることができる時間、速度、またはその他のパラメータ）を含んでいます。変調には文脈に依存した、典型的に変調を意味のある文章と比較されることができ、例えば、野生型の蛋白質、構成状態のタンパク質、またはタンパク質が指定されたセルの種類や状態に表される。抗体またはその部分によって標的タンパク質の機能活性の活動に比べて10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以上で調整することができます。
【０１４１】
ここで使用されるように、”アゴニスト”、または誘導するそれ以外の場合は、シグナル伝達活性または受容体の他の機能活性を増強する、抗体またはその部分のシグナル伝達や増強による受容体の他の機能活性を調節ように関連付けられています。アゴニストは、可能な信号伝達又は単独で使用するだけで配位子と比較して受容体によるシグナル伝達を強化する受容体または他の受容体刺激の天然リガンドの存在下でのシグナル伝達やその他の機能活性を変更することができる他の機能活性を調節します。
【０１４２】
ここで使用されるように、”アンタゴニスト”は、抗体またはその一部をブロックしたり減少しシグナル伝達活性または受容体の他の機能活性することによってシグナル伝達や受容体の他の機能活性を調節するを参照します。
【０１４３】
ここで使用されるように、ラベルはラベルを添付するか、または分子またはこれに準ずるに直接または間接的にリンクされている検出可能なマーカーです。検出方法は、当技術分野で知られている任意のメソッドを指定できます。
【０１４４】
ここで使用されるように、結合活性は、例えば、分子の特性を参照にしています。ポリペプチドは、1つまたは複数の結合パートナーをバインドするかどうか、および方法について説明します。バインディングの活動は結合パートナーに結合する能力を含め、（例。高い親和性など）結合パートナーに結合する親和性であり、結合パートナーとの結合の強さ及び拘束力のパートナーと結合する特異性を含んでいます。
【０１４５】
ここで使用されるように、”親和性”または”結合親和性”とは、抗体分子またはその部分を、標的タンパク質または抗原上のエピトープに結合する強さを指します。親和性は、しばしば定数（KA）を、または平衡解離（KD）を一定の平衡協会によって測定されます。低親和性抗体 - 抗原相互作用が弱く、分子が高親和性抗体 - 抗原結合を強いている間分子は長い時間にバインドされたまま、急速に解離する傾向があります。高い抗体親和性抗体は、具体的に平衡結合定数を使用してターゲット蛋白質に結合することを意味する（KA）を大きいか等しい106 M-1, 大きいか等しい 107 M-1, 大きいか等しい 108 M-1, or大きいか等しい109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 or 1012 M-1.抗体はまた 平衡解離定数（KD）によって特徴付けられ、例えば10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M or 10-12 M かそれ以下です。一般的に、抗体は、定数が高親和性抗体とみなされるナノモルまたはサブナノモルディソシエーションを有します。このような親和性は容易にこのような平衡透析により、従来の技術を用いて決定することができます。ラジオイムノアッセイ放射性標識を使用して、ターゲット抗原;または当業者に知られている別の方法でメーカーの説明一般的な手順を使用して、ビアコア2000装置を用いています。親和性のデータがスキャッチャードらの方法により、分析することができます。例。アンニューヨークAcad。SCL、51:660（1949）。
【０１４６】
ここで使用されるように、”エピトープは”抗原またはタンパク質抗体により認識されるの表面にローカライズされた領域を表します。ペプチドエピトープは、連続エピトープまたは不連続エピトープているものが含まれます。エピトープは、一般的に線形のアミノ酸配列とは対照的にタンパク質の立体構造によって決定されます。
【０１４７】
ここで使用されるように、”エピトープマッピング”は、抗体 - 抗原認識の分子決定因子の同定のプロセスです。
【０１４８】
ここで使用されるように、基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）は、例えばアイデンティティの列の上に基づき、それぞれ検索たんぱく質やDNAデータベースにアルスチュルら（1990）によって調査されたものです。例えば、ブラストンは、塩基配列データベース（遺伝子銀行の例）に対して塩基問合せ配列を比較するプログラムです。 ブラストピーは、蛋白質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較するプログラムです。
【０１４９】
ここで使用されるように、BLASTのビットスコアはギャップと各整列順序に関連付けられている置換数から算出した値です。スコアが高いほど、より重要な位置にあります。
【０１５０】
ここで使用されるように、人間のタンパク質は、そのすべての対立遺伝子変異と保守的なバリエーションを含むヒトのゲノム中に存在するDNAなどの核酸分子によってコードされる一つです。変更は、野生型や人間のタンパク質の顕著な配列に基づいている場合はバリアントまたは修正は蛋白質のヒトタンパク質です。
【０１５１】
ここで使用されているように”自然に生じるアミノ酸”はポリペプチドで発生する20 L -アミノ酸を参照にしています。残基はヒューマンの中のその同族mRNAのコドンとtRNAの分子の特異的認識による蛋白質に組み込まれている自然の中で発見された20のα-アミノ酸である。
【０１５２】
ここで使われているように、非天然アミノ酸が遺伝的にエンコードされていないアミノ酸を参照に発生して、使用することはできません。たとえば、非天然アミノ酸は構造を天然アミノ酸に似ている構造と反応性天然アミノ酸を模倣する構造的に変更されている有機化合物です。非天然アミノ酸はこのように、例えば、アミノ酸または20個の自然発生アミノ酸以外のアナログアミノ酸を含みますが、これだけのアミノ酸は、D −イソタレノマーに限定されません。含まれて発生する典型的な非天然アミノ酸は、当業者に知られています。
【０１５３】
ここで使用されるように、核酸、ペプチド核酸（PNA）とそれらの混合物を含む、そのDNA、RNA、および類似体が含まれています。核酸は、単一の二重鎖することができます。プローブまたはプライマー、必要に応じてラベル付けされて、このような蛍光灯や放射性、単一分子が意図されている本などの検出可能なラベルと同じように参照する場合塾考されます。このような分子は、ターゲットが統計的に一意になるように、またはプローブやライブラリをプライミング用の低コピー数（通常5以下、一般的に3未満）の通常の長さのものです。一般的にプローブまたはプライマーは配列の少なくとも14、16または30の連続ヌクレオチドに相補的な、または関心のある遺伝子と同じが含まれています。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100以上の核酸の長さになることがあります。
【０１５４】
ここで使用されるように、ペプチドの長さは2から40個のアミノ酸からポリペプチドを意味する。
【０１５５】
ここで使用されるように、アミノ酸の様々なシーケンスで発生するアミノ酸が知られている、3文字または1文字の略語（表1）に基づいて識別される本サービスに提供。様々な核酸断片で発生するヌクレオチドは、当該技術分野で日常的に使用される標準的な単一の文字の名称と指定されています。
【０１５６】
ここで使用されるように、”アミノ酸”はアミノ基とカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、2つまたはそれ以上のアミノ酸が含まれています。目的のためにここで、アミノ酸が20個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ（すなわち、アミノ酸前記α-炭素は、側鎖を持つ）が発生しています。
【０１５７】
ここで使用されるように、”アミノ酸残基は”そのペプチド結合のポリペプチドの化学的消化（加水分解）に形成されるアミノ酸を指します。アミノ酸残基は、ここでは”L”の異性体であると推定される説明します。よって、指定されている”D”の異性体のアミノ酸残基は、所望の機能プロパティがポリペプチドによって保持されている限り、任意のL -アミノ酸残基に置換することができます。 NH2のポリペプチドのアミノ末端遊離アミノ基の存在を意味します。 COOH基はポリペプチドのカルボキシル末端遊離カルボキシ基の存在を意味します。 jの生物に記載された標準ポリペプチド命名規約に準拠して維持します。化学、243：3557〜3559（1968）、37 CFRを採用・§ §1.821から1.822、アミノ酸残基の略語は、表1に示されています：
【表１】
2016127850.tif 000002
それは、式により本明細書に表されるすべてのアミノ酸残基配列は、カルボキシル末端にアミノ末端の従来の方向に左から右方向を持っていることに留意すべきである。さらに、フレーズ”アミノ酸残基は、”広義など37 CFRで参照されるものとしての対応の表（表1）に記載されていると修飾アミノ酸及び異常アミノ酸を含むように定義されています§ § 1.821から1.822、および参照により本明細書に組み入れられる。さらに、アミノ酸残基配列の先頭または末尾にダッシュなどNH2などのアミノ末端基、またはカルボキシルに、1以上のアミノ酸残基のさらなるシーケンスへのペプチド結合を示すことに注意する必要がありますなどCOOHなどの端末群。その一般的な使用方法、認識可能な省略形、または生化学命名上IUPAC - IUB委員会にあった、特に断らない限り、任意の保護基は、アミノ酸および他の化合物の略語、されている、、（Biochem（1972）、を参照してください。11:1726） 。それぞれの天然に存在するL -アミノ酸はプレフィックス”L -”には、標準の3文字のコード（または単一文字のコード）または標準の三文字コード（または単一文字のコード）によって識別され、接頭辞”D -”ことを示しアミノ酸の立体異性体はDです。 
【０１５８】
本明細書で使用する場合、等速吸引混合物は、アミノ酸のモル比が（例えば、Ostreshら、（1994）生体高分子34:1681）が報告された反応率に基づいて調整されているものです。 
【０１５９】
本明細書で使用する場合、改変は、ポリペプチドまたは核酸分子のヌクレオチドの配列のアミノ酸の配列の改変への参照内にあり、欠失、挿入、及びアミノ酸とヌクレオチドの置換、それぞれ含まれています。ポリペプチドを変更する方法は、そのような組換えDNAの方法論を使用して、当業者にルーチンです。 
【０１６０】
本明細書中で使用される、アミノ酸の適切な保存的置換は、この当業者に知られており、得られた分子の生物活性を変化させることなく、一般的に行うことができます。この分野の技術者は一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、実質的に（例えば、ワトソンらの生物学的活性を変更しない、と認識している。遺伝子の分子生物学、第4版、1987、ベンジャミン/カミングスパブ。CO。、p.224）。このような置換は、次のように表2に定めるものに従って行うことができます:
【表２】
2016127850.tif 000003
その他の置換はまた、許容される経験や既知の保存的置換と一致して決定することができます。
【０１６１】
ここで使用されるように、DNAを組み合わせは単一の二本鎖の、直鎖状または環状DNA分子であり、自然界に存在しない方法の中にDNA結合と並列したセグメントを含んでいます。
【０１６２】
ここで使用されるように、DNAセグメントは、指定された属性を持つ大きなDNA分子の一部です。たとえば、DNAセグメントのエンコーディングが指定されたポリペプチド、方向5'から3'読み取りプラスミドやプラスミドの断片など、もはやDNA分子の一部を、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードします。
【０１６３】
ここで使用されるように、用語”核酸”は、単一および/本鎖または二重デオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RNA）と同様に、アナログまたはいずれかのRNAやDNAの誘導体などのポリヌクレオチド鎖を意味します。また、用語”核酸”に含まれるペプチド核酸（PNA）、ホスホロチオエートDNA、および他のそのような類似体およびその誘導体またはそれらの組み合わせなどの核酸の類似体が含まれています。核酸はデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを参照することができます。この用語はまた、同等物、誘導体、変異体、そしてヌクレオチド類似体、（センスまたはアンチセンス）から作られたRNAまたはDNAを含んでいます。デオキシリボヌクレオチドはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれています。 RNAの為に、ウラシル塩基はウリジンです。
【０１６４】
ここで使用されるように、”コードする核酸分子”とは、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸分子を意味します。核酸配列は、RNAやタンパク質またはペプチドに翻訳されるRNA配列に転写される両方のDNA鎖の配列が含まれています。核酸分子の両方の完全な長さの核酸配列と同様にこのような前駆体の配列を欠いている完全長ポリペプチドの例のように完全な長さの成熟ポリペプチドから派生した非完全な長さの配列が含まれています。目的のためにここで、核酸配列はまた、ネイティブのシーケンスまたはシーケンスの特定のホストのコドンの好みを提供するために導入することができるのコドンの縮退が含まれています。
【０１６５】
ここで使用されるように、用語”ポリヌクレオチド”はDNAまたはRNA誘導体たとえば、オリゴマーまたはポリマーデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）を含む少なくとも2つのリンクされているヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むを参照して、ヌクレオチドのアナログまたはホスホジエステル結合よりも”バックボーン”債券その他の、例えば、ホスホトリエステル結合、ジアルキルホスホルアミダート結合、フォフォロシエイト結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（核酸ペプチド）。用語”オリゴヌクレオチド”はまた、”ポリヌクレオチド”とここで本質的に同義語として使用されています。しかしながらアートの中のそれらはオリゴヌクレオチドを認識し、例えば、PCRプライマーは、一般的に以下の長さ約百ヌクレオチドのために50から100以下です。
【０１６６】
ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体は、例えば、質量ポリヌクレオチドの質量の差別化を可能なヌクレオチドを、変更されたポリヌクレオチドの検出を可能に蛍光、放射性、蛍光または化学発光ラベルなどの検出可能なラベルを含むヌクレオチド、またはヌクレオチドビオチンまたは固体支持体にポリヌクレオチドの固定化を容易にチオール基などの反応性基を含みます。ポリヌクレオチドはまた、酵素的または光分解化学的には、例えば、選択的に切断される1つ以上のバックボーン債を含めることができます。例えば、ポリヌクレオチドは、1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを続けることができる1つまたは複数のリボヌクレオチドに続く1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含めることができ、このような配列は基本的な加水分解によるヌクレオチド配列による配列です。ポリヌクレオチドはまた、比較的切断に耐性を1つまたは複数の結合を含めることができ、例えば、ペプチド核酸結合によってリンクされているヌクレオチドによってリンクされている3'末端に、少なくとも1つのヌクレオチドを含めることができるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ホスホジエステル結合、または他の適当な結合、およびポリメラーゼによって拡張されることができます。ペプチド核酸配列は、周知の方法を使用して調製することができる（例えば、ウェイラーら。核酸研究所25：2792〜2799（1997）を参照）。
【０１６７】
ここで使用されるように、2つのタンパク質や核酸の間の”類似性”はタンパク質や核酸の塩基配列のアミノ酸の配列の間の関連性を指します。類似性は、アイデンティティおよび/または残基の配列の相同性の程度に基づくことができる残基がそこに含まれています。タンパク質や核酸との間の類似度を評価するための方法は人工的な能力として知られています。たとえば、配列類似性を評価する一つの方法では、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、配列間の同一性の最大レベルが得られるように並んでいます。 “アイデンティティ”は、アミノ酸やヌクレオチドは、配列不変される範囲を指します。アミノ酸配列のアラインメント、ある程度の塩基配列も、アミノ酸（またはヌクレオチド）に頻繁に置換および/または保守的な違いを考慮することができます。保守的な違いは関与する残基の物理化学的特性を保持するものです。調整は国際的にも（すべての残基を含む配列の全長にわたって比較された配列の調整）、現場でも（唯一の最も類似した領域または領域を含む配列の部分の位置）にも対応します。
【０１６８】
“同一性”はそれ自体が芸術と意味を認識され技術を用いて計算することができます。（例。計算分子生物, レスク, A.M., 教育., オックスフォード大学雑誌, ニューヨーク、 1988; 生物コンピューター:情報科学と遺伝子のプロジェクトD.W., 教育 教育雑誌,ニューヨーク、1993; 配列データのコンピュータ分析、パート１、グリフィン, A.M., and グリフィン, H.G., 教育., フマナ新聞、ニュージャージー、 1994;分子生物学の配列データのコンピューター分析、ボン  ヘインジェ、 G., 学術新聞, 1987; そして配列科学分析 入門書、 ブリブスコヴ, M. と デエレックス, J., 教育., M ストックン新聞, ニューヨーク, 1991）。一方メソッドの数は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の用語”アイデンティティ”のアイデンティティを測定するために存在しており、熟練した職人（キャリロH.＆リプトンD.、SIAMJ応用数学48:1073（1988））がよく知られている。
ここで使用されるにおいて、ホモログ（核酸およびアミノ酸配列を基準にして）、は25％の配列相同性よりも大きく、25%以上の連続した同属以上に典型的には同等以上または25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％の配列の相同性より大きい。;必要に応じて正確な割合を指定することができます。この場合、本利用規約”相同性”と”アイデンティティ”は、間変更ためによく使用されます。一般的には、パーセント相同性またはIDを決定するため、配列は配列の相同性では、保存アミノ酸の数は、標準的な配置アルゴリズムプログラムによって決定されている各業者によって確立されたデフォルトのギャップペナルティーを使用することができます。実質的に相同の核酸分子は、興味のある核酸の長さに沿ってすべて中等度の厳しさ、または高ストリンジェンシーで一般的にハイブリダイズする。また、企図して、ハイブリダイズ核酸分子のコドンの代わりに、コドンの縮退含まれている核酸分子である。
任意の2つの分子は、塩基配列、または少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％”同一”または”であるアミノ酸配列を持っているかどうかを同たとえば、使用して、FASTAの”プログラム”のような既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる”、ピアソンらと同様に、デフォルトのパラメータを設定します。 （1988）文集。 Natl。 Acad。科学。 。アメリカ85:2444（他のプログラムは、GCGプログラムパッケージ（デブルー、J.ら、核酸研究12（I）：387（1984））、BLASTP、BLASTN、FASTA（アチュール、SFら。JMolec Biol215:403（1990））;巨大なコンピュータへのガイド、マーティンJ.ビショップ、エド、アカデミックプレス、サンディエゴ、1994年とキャリロら（1988）シャム、j応用数学48:1073）。
【０１６９】
たとえば、バイオテクノロジー情報データベースのナショナルセンターのBLAST機能は、IDを決定するために使用することができます。他の市販または公開プログラムでは、DNAStar”MegAlign”プログラム（マディソン、WI）、ウィスコンシン州ジェネティクスコンピューターグループ大学（UWG）”ギャップ”プログラム（マディソンWI）を含まれています。
パーセンテージの相同性やタンパク質とのアイデンティティそして/または核酸分子は、GAPのコンピュータプログラム（例えば、ニードルら（1970）j Mol Biol。48:443スミスとウォーターマンにより改訂（（1981）前売応。数学2:482）。簡潔に、GAPプログラムは、simi-lar-ityに分かれて類似している配置シンボルの数（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）、同様に２つの配列のうち短い方のシンボルの合計数字によって分けられます。GAPプログラムはデフォルトパラメータを含む事ができます。：（1）単項演算子比較行列と重みcom-parisonグリブクソンらのマトリックス（1986）ニュークル酸解像度14:6745、シュワルツとダイホフによる、
タンパク質配列および構造、国立医学研究財団のアトラス頁353358（1979）;（2）各ギャップ3.0のペナルティと各ギャップ中の各シンボルの追加0.10ペナルティ、（3）最後のギャップにはペナルティなし。
【０１７０】
したがって、、用語”同一性”または”相同性”を使用してテストと基準ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの比較を表しています。 、ここで用語を使用されるように”90％と同じ”を参照％のアイデンティティへの参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列〜99.99相対90には、少なくとも。 90％以上のレベルでのアイデンティティは、比較される例示の目的でテストおよび100アミノ酸の基準ポリペプチドの長さと仮定して、という事実を示している。テストポリペプチド中にアミノ酸のない10％以上（すなわち、100のうち10）は、基準ポリペプチドとは異なります。同様の比較は、テストと基準ポリヌクレオチドとの間行うことができます。点突然変異は、ランダムまたはポリペプチドの全長にわたって配布され、それらは、例えば、最大許容最大長さを変えることの1つまたは複数の場所に集合させることができるような違いを表現することができます。ポリペプチドテストの中のアミノ酸の10%以下（例。100分の10）は言及されているポリペプチドとは違います。同様の比較は、テストと基準ポリヌクレオチドとの間行うことができます。点突然変異は、ランダムまたはポリペプチドの全長にわたって配布され、それらは、例えば、最大許容最大長さを変えることの1つまたは複数の場所に集合させることができるような違いを表現することができます。例。100分の10アミノ酸の差（約90％の同一性）。違いは、核酸またはアミノ酸置換、挿入または削除される定義されています。約85から90パーセント以上の相同性やアイデンティティのレベルでは、結果セットをプログラムとのギャップのパラメータの独立していなければならない。アイデンティティのような高レベルのマニュアル調整で多くの場合、容易に評価することができるソフトウェアに依存することがない。
ここで使用されるように、参照ポリペプチドに記載されアミノ酸の指定された割合を含むポリペプチドは、ポリペプチドと基準ポリペプチド間で共有される連続した同一のアミノ酸の割合を指します。たとえば、配列番号を記載設定のアミノ酸配列を有するポリペプチド基準に記載されアミノ酸の70％が含まれていますアイソフォームはSEQ ID NO：XXを持っています、そしてそれは147個のアミノ酸を列挙します、それは基準ポリペプチドが含まれていることを意味し、少なくとも103の連続アミノ酸は配列番号のアミノ酸配列SEQ ID NO：XXの前に置かれます。
【０１７１】
ここで使用されるように、整列順序がヌクレオチド又はアミノ酸の配列の対応する位置を揃えるとの相同性（類似性および/またはID）を使用することを指します。通常、50％以上のIDで関連している2つ以上の配列が整列されます。配列の整列セットは、対応する位置に配置されゲノムDNA配列と整列のESTおよびその他のcDNAなどのRNAから由来する配列を、合わせて含めることができます2つ以上の配列を指します。
【０１７２】
ここで使用されるように、”プライマー”はDNAポリメラーゼなどつの異なるヌクレオシド三リン酸の存在下、重合剤、（例えば、４つの異なったヌクレオタイド隣酸塩の存在、例えばDNAポリメナーゼ、また逆転写酵素）適切なバッファーと適切な温度の中で適切な条件の下テンプレート指向性DNAの開始点として機能することができます。これは、特定の核酸分子が、”プローブ”としてできることとして理解されるであろう”プライマー”プライマー”として保存される。しかし、3'ている拡張機能の水酸基を持っています。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素（RT）が- PCR法は、RNA PCR法、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドルPCR法、キャプチャーPCR、発現PCR法、PCRの中の3'、5'RACE、連結媒介PCRおよびその他の増幅プロトコルを含んでいます。
ここで使用されるように、”プライマーのペアは”（PCRによるなど）および3'（下流）プライマーが増幅されるシーケンスの最後の5'5ハイブリダイズ（上流）プライマーを'が含まれているプライマーのセットを参照してハイブリダイズは、増幅される配列の3'末端の補数を含んでいます。
【０１７３】
ここで使用されるように、”特異的なハイブリダイズ”はアニールを参照して相補的塩基対合、標的核酸分子の核酸分子（オリゴヌクレオチドなど）に言及します。当業者は、試験管内で、長さと特定の分子の組成などの特定のハイブリダイゼーションに影響を与える生体内のパラメータに精通している。 ヴィボでのハイブリダイゼーションのパラメータは、特に関連します。さらにアニーリング温度、バッファー組成と塩濃度も含まれています。典型的な非具体的に高ストリンジェンシーで核酸分子を結合削除するための条件は洗浄0.1 ×脳炎、0.1％のSDS、65℃、中ストリンジェンシーでは0.2 ×脳炎、0.1％SDS、50℃。同等のストリンジェンシー条件は、当該技術分野において知られている。当業者が容易に標的核酸分子、特定のアプリケーションに適切な核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータを調整することができます。
ここで使用されるように、実質的に製品と同じ関心のあるプロパティは、十分に実質的に同一の製品は、製品の代わりに使用することができるように変更されていないように十分に類似したことを意味します。
【０１７４】
ここで使用されるように、それはまた、関連する当業者によって理解される用語は、”実質的に同一”または”類似”コンテキストを使用して変化することが理解されている。
【０１７５】
ここで使用されるように、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異を参照遺伝子と同じ染色体遺伝子座を占めるの2つ以上の代替形式のいずれかです。対立遺伝子変異は、突然変異で自然に発生する集団内表現型多型をもたらすことができます。遺伝子の突然変異、または（エンコードされたポリペプチドの変更なし）サイレントすることができるポリペプチドは、アミノ酸配列を変更したエンコードすることができます。この法律において”対立遺伝子変異体”も遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を表すためにここで使用されています。一般的に遺伝子を参照の形では、野生型形式および/または集団や種の単一のリファレンスメンバーからのポリペプチドの主要な形式をエンコードします。典型的には、間に種亜種が含まれて対立遺伝子変異体は、通常、野生型および/または優勢な形態と同じ種の少なくとも80％、90％以上のアミノ酸同一性があります。アイデンティティの程度は、遺伝子に比較かどうかに依存種間または種内です。一般的には、種内の対立遺伝子変異体がある野生型および/または野生型と96％、97％、98％、99％以上のIDを含め優勢な形態で約80％、85％、90％または95％の同一またはそれ以上、少なくともおよび/またはポリペプチドの優勢な形態です。対立遺伝子変異体への参照は、ここで一般的に同じ種のメンバーの間でタンパク質をn個のバリエーションに関連付けられています。
【０１７６】
ここで使用されるように、”対立遺伝子変異体”と同じ意味でここで使用される”対立遺伝子は、”遺伝子またはその一部の代替形式に関連付けられています。対立遺伝子は相同染色体上の同じ遺伝子座や位置を占めています。主題は遺伝子の2つの同一の遺伝子を持っている場合、件名は、その遺伝子や遺伝子のホモ接合体と言われています。対象は、遺伝子の異なる2つの対立遺伝子を持っている場合は、件名は遺伝子のヘテロ接合体と言われています。特定の遺伝子の対立遺伝子は、それぞれの単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの他とは異なる場合置換、欠失、ヌクレオチドの挿入を含めることができます。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含む遺伝子の形式することができます。
【０１７７】
ここで使用されるように、種の変異体は、マウスやヒトなど、さまざまな動物種を含む、さまざまな種間ポリペプチドの変種を参照してください。
【０１７８】
ここで使用されるように、スプライス変異体は、ゲノムDNAの一次転写産物の差分処理によって生成されるバリアントを参照しているmRNAの複数のタイプの結果です。
【０１７９】
ここで使用されるように、用語のプロモーターは、RNAの結合ポリメラーゼと転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の一部を意味します。プロモーター配列は、常にではありませんが、一般的にされている遺伝子の5'非コード領域にあります。
【０１８０】
ここで使用されるように分離またはポリペプチドまたはタンパク質を精製または生物学的活性部分は、その実質的に細胞材料や、そこからタンパク質が化学的前駆体または他の化学物質から実質的に、あるいは派生した細胞または組織から他の汚染タンパク質の無料です化学的に合成します。準備はもし薄層クロマトグラフィー（TLC）、ゲル電気泳動の技術者によって使用される高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分析の標準的な方法で決定された容易に見つけられた不純を見つける十分に自由になると決定づけられることができます。このような純度を評価したり、十分に純粋なようにさらに精製することは、化合物の精製を生産するための方法は、当事者のスキルとして知られています。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら異性体の混合物である。このような場合には、さらに精製することは、化合物の特定の活性を増加させる可能性があります。
任期は実質的に細胞物質の自由タンパク質が、そこから、または隔離され組換え的に生成細胞の細胞成分から分離されている蛋白質の準備が含まれています。一実施形態では、この期間は、実質的に細胞物質の自由を有するプロテアーゼ蛋白質の準備が含まれています。以下、非プロテアーゼタンパク質の約30％（乾燥重量）非プロテアーゼタンパク質（また混入タンパク質と称する）、一般的に以下の約20％以上の非プロテアーゼタンパク質または非プロテアーゼタンパク質の10％以下、非プロテアーゼ蛋白質の約5％。プロテアーゼタンパク質またはアクティブな部分は、その組換え生産されている場合、それはまた、実質的に培養液、すなわち、培養培地は、以下を表す無料ですより約または20％、10％またはプロテアーゼ蛋白製剤の体積の5％。
【０１８１】
ここで使用されるように、その期間は、実質的に化学的前駆体または他の化学物質の自由なタンパク質がタンパク質の合成に関与している化学前駆体又は他の化学物質から分離されているプロテアーゼ蛋白質の準備が含まれています。その期間は約30％（乾燥重量）20％、10％、5％以下の有するプロテアーゼの蛋白質化学的前駆体または非プロテアーゼの化学物質やプロテアーゼの蛋白質の準備が含まれています。
ここで使用されるように、たとえば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドのような合成体に言及されることは組換え方法および/または化学合成法によって生成される核酸分子またはポリペプチド分子を意味する。
【０１８２】
ここで使用されるように、組換えDNAの方法を使用して組換えによって生産がクローニングされたDNAがコードするタンパク質を表現するための分子生物学のよく知られているメソッドの使用を意味します。
【０１８３】
ここで使用されるように、個別の要素に言及されるベクトル（または、プラスミド）いずれかの式または複製物の細胞の中にある異種核酸を導入するために使用される個別の要素を指します。ベクターは、一般的には、エピソームままゲノムの染色体、そのへの遺伝子またはその一部の統合に影響を与えるように設計することができます。また、意図酵母人工染色体と哺乳動物人工染色体などの人工染色体はベクトルは考慮されます。選択とそのような車の使用は、当業者に知られている。
【０１８４】
ここで使用されるように、発現ベクターはベクトルを作動このようなDNA断片の発現をすることができるプロモーター領域などの調節配列、とリンクされているDNAを発現することができる事が含まれています。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含めることができる任意の複製の1つまたは複数の起源を、1つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含めることができます。発現ベクターは一般的に、またはプラスミドまたはウイルスDNAから誘導される両方の要素を含めることができます。したがって、発現ベクターは、組換えDNAまたはRNA、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクトルなどの構築を参照していることは、適切な宿主細胞導入時に、クローニングされたDNAの発現の結果です。適切な発現ベクターは、当技術分野で当業者に知られており、その真核細胞および/または原核細胞、それらの宿主細胞ゲノムに統合し、又はエピソームままで複製的なものが挙げられます。
【０１８５】
ここで使用されるように、ベクターはまた、”ウイルスベクター”または含まれている”ウイルスベクター”をウイルスベクター作動細胞（車やシャトルなど）に転送するために外来性遺伝子を外来性遺伝子をリンクされている設計のウイルスがあります。
【０１８６】
ここで使用されるように作動または作動DNAセグメントを参照するときにリンクされているセグメントが、彼らは終端にコーディングセグメントを介して、例えば、自分の利用目的のためのコンサートのプロモーター、収益の転写開始を機能するように配置されていることを意味します。
【０１８７】
ここで使用されるように、生物学的サンプルでは、生きているか、またはウイルスのソースから得られた任意のサンプルを参照して、任意のセル型や組織を、そこから核酸やタンパク質、または他の高分子を得ることができる対象の含まれています。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿や汗、組織や動物や植物からの臓器サンプルなどの体液、も含まれますが、（ただしこれらに限定されない）、その土壌と水のサンプルやその他の環境試料、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原生動物およびコンポーネントです。食品と環境のため細菌やウイルスやその他の汚染を評価することができます。方法はここで、生物試料を用いて実施されているようなプロファイリングのためのいくつかの実施形態では、また、任意のサンプルをテストするために使用することができます。
【０１８８】
ここで使用されるように、巨大分子が数百から数百万から最大分子量を有する任意の分子をに言及されます。高分子は、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、一般的に生物学的生物によって合成される他のそのような分子を含む組換えの分子生物学の方法を使用して合成または調製することができます。
【０１８９】
ここで使用されるように、用語”生体高分子”は、2つ以上の単量体サブユニット、またはその誘導体、結合または高分子で結ばれている構成分子を含む生体分子です。生体高分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、または脂質、またはその誘導体またはそれらの組み合わせ、例えば、それぞれペプチド核酸部や糖を含む核酸分子です。生体高分子は、核酸、タンパク質、糖、脂質、およびその他の高分子を含むがこれらに限定されない。核酸は、そのDNA、RNA、およびフラグメントが含まれています。核酸は、ゲノムDNA、RNA、ミトコンドリアの核酸、葉緑体の核酸、別の遺伝物質を持つ他の細胞小器官に由来することができます。
【０１９０】
ここで使用されるように、生体分子の性質はその誘導体で発見された化合物である。生体分子は、これらに限定されない：オリゴヌクレオチド、オリゴニュークリアサイド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプチド核酸（PNAは）、オリゴ糖と糖を含みます。
【０１９１】
ここで使用されるように、生物学的粒子は、使用の有無を含むカプセル化された核酸、単一のセルなしファージベクターまたはファージキャプシドを含む、パッケージ化された核酸、ファージ、なしウイルスベクターまたはウイルスキャプシドなど、ウイルスを参照して真核生物および原核細胞またはそのフラグメント、リポソームまたはミセルエージェントまたはその他の包装粒子、および他のそのような生物材料に言及されます。
【０１９２】
ここで使用されるように、組成物は、任意の混合物を意味する。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水、非またはそれらの任意の組み合わせ水性することができます。
【０１９３】
ここで使用されるように、組み合わせの間または2つ以上の項目間の任意の関連付けを指します。組み合わせは、2つ以上のアイテムを1つの混合物、またはそれらの任意の変化など、その混合物であることができる2つの組成物または2つのコレクションなど、2つ以上の個別の項目に言及することができます。
【０１９４】
ここで使用されるように、キットには、それらの使用のためのパッケージの組み合わせに応じて含む命令および/または試薬を指します。
【０１９５】
ここで使用されるように、流体は流れることができる任意の組成を意味する。流体はこのように半固体、ペースト、ソリューション、水性混合物、ジェル、ローション、クリームなどのような組成物の形態である組成物を包含する。
【０１９６】
ここで使用されるように、抗原手段は、ポリペプチドが、免疫応答を誘導することを確認します。高抗原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発するこれらのことは再現性と予想されます。
【０１９７】
ここで使用されるように、医薬効果や治療効果は効果を指し、病気や障害の治療やその症状の改善のために意図剤の投与時に観察します。
【０１９８】
ここで使用されるように、”病気や障害”は、原因や条件も含めてから得られた生物の病理学的条件を参照して、感染症、これらに限定されない条件を、遺伝的条件、取得し、特定の症状を特徴としています。病気や関心のある障害ここでこれらの者の標的タンパク質とそれらとは、ターゲットタンパク質が病因や病理学の役割を果たしているの仲介など、特定の標的タンパク質を関与しています。典型的な標的蛋白質と関連疾患や障害は、他の場所でここに記載されています。
【０１９９】
ここで、病気や条件で対象を”治療”を使用しているように対象者の症状は、部分的または完全に緩和されていること、または静的次の処理のままを意味します。したがって、治療は予防、治療および/または治療法を網羅しています。予防は/潜在的な病気の予防や症状や病気の進行の悪化の防止に関連付けられています。治療は、変更インターフェロンのいずれかの医薬用途を網羅し、組成物は、ここで提供されます。
【０２００】
ここで使用されるように、治療薬、治療法、保護剤、または当業者に知られているワクチンを含む、化学療法の平均、従来の薬と薬物療法は放射線治療剤は当技術分野でよく知られている。
【０２０１】
ここで使用されるように、治療は、条件は、障害や病気やその他の表示の症状、または改善されるそれ以外の場合は有利に変更どのような方法を意味します。
【０２０２】
ここで用いられる治療効果は変化させるには、典型的に向上することや病気または状態の症状を改善するか、その治療法を疾患または状態の対象の治療に起因する効果を意味するように。治療に有効な量は、組成物、分子または化合物対象に投与後の治療効果をもたらすの量を意味します。
【０２０３】
ここで使用されるように、用語”テーマは”人間のような、哺乳動物など、動物を指します。
ここで使用されるように、患者が被験者に関連付けられています。
【０２０４】
ここで使用されるように、処理することにより、特定の疾病または障害の症状は、このような医薬組成物または治療他の投与によりとしての改善は、任意の軽減を意味するかどうかを永続的または一時的、永続的または一時的なことができる症状に起因する、または組成物または治療薬の投与に関連付けられています。
【０２０５】
ここで使用されるように、予防や予防は、発展途上の疾患または状態のリスクが低減されるメソッドを参照します。
【０２０６】
ここで使用されるように、有効量は治療剤、予防硬化改善、逮捕または部分的に疾病または障害の症状を逮捕するために必要な量です。
【０２０７】
ここで使用されるように、管理は、抗体またはプローションは、その、その標的タンパク質に接触している任意のメソッドに関連付けられています。管理は、ヴィボの中またはヴィボの外あるいはヴィトロの中で行うことができる。たとえば、ヴィボの外での管理のための体液は、血液など、対象から削除され、抗体またはその一部と本体の外側で接触します。 ヴィボの中での投与のためには、抗体またはその一部などの導入、局所、全身ローカルおよび/または他の経路によるとして、体内に導入することができます。 ヴィトロの中での管理は、細胞培養法などの方法を網羅しています。
【０２０８】
ここで使用されるように、単位用量形態は、物理的に分離ユニット人間と動物の対象に適しており、個別に当該技術分野において知られているパッケージに関連付けられています。    
【０２０９】
ここで使用されるように、単一の投与製剤は、直接投与用の製剤を指します。
【０２１０】
ここで使用されるように、”製造の資料では、”作られ、販売されている製品です。このアプリケーションで使用されるように、用語がコンパイル生殖細胞抗体または抗体そこ包装の記事に含まれて得られた包含することを意図しています。
【０２１１】
ここで使用されるように、流体が流れることができる任意の組成を意味します。流体はこのように半固体、ペースト、ソリューション、水性混合物、ジェル、ローション、クリームなどのような組成物の形態である組成物を包含します。
【０２１２】
ここで使用されるように、人間を含む霊長類の全ての動物は、ゴリラやサルなどの霊長類に限定されていません。げっ歯類、マウス、ラットなど、家禽、鶏などの、反芻動物、ヤギ、牛、ヒツジ、鹿などの羊;、ブタなどの動物です。ヒト以外の動物が企図する動物としての人間を除外します。ここに記載して生殖細胞のセグメントは、その結果抗体、任意のソース、動物、植物、原核生物および真菌からです。ほとんどの生殖細胞のセグメントは、その結果抗体は、哺乳動物の起源など、動物由来のものです。
【０２１３】
ここで使用されるように、コントロールが実質的にすることを除いては、テストパラメータで処理されていない、または、それには、サンプルの血漿サンプルされている場合、テストサンプルと同じですが、サンプルを参照するには、罹患していない、通常のボランティアからすることができます関心のある状態です。コントロールは、内部統制することができます。
【０２１４】
ここで使用されるように、文脈が明らかに特記する場合を除いた複数形を含む単数形”a”、”an”と”the”指示が含まれています。したがって、”細胞外ドメイン”を含む、例えば、化合物を参照して、1つを有する化合物または細胞外ドメインが複数含まれています。
【０２１５】
ここで使用されるように、範囲と金額は”約”特定の値または範囲として表現することができます。についても正確な金額が含まれています。したがって、”約5塩基”は”約5拠点”また”5拠点”も意味します。
ここで使用されているように、簡略化した保護基、アミノ酸および他の化合物の略語は、その一般的な使用方法と一致して、特に断らない限り、認識された省略形、または生化学命名に関するIUPAC命名- Iubインタフェース委員会を使用することはできません。（バイオ生物学（1972）11:1726参照）。
B概略
与えられたものは機能抗体のライブラリ（例。コレクション）、と結果としてのライブラリを生成するためのメソッドです。コレクション、またはライブラリは、先験的に知られているが、ここで、各アドレス内の抗体は、同じシーケンスを持っているアドレスの中で、コレクション内の各他のアドレスで抗体とは異なります。コレクションは、分類されることができる修正された物理的な配列またはメンバーとして提供することができる。抗体の配列のコレクションはその組み合わせ生殖部の完全なレパートリー、その選択した部分、またはコレクションの変更フォームの表すことができます。ライブラリのメンバーは個別に設計されており並べられている。このため、図書館は、他のライブラリよりもはるかに少ないメンバーとライブラリの作成を許可するが、より多様性を有し、非常に多岐にわたっています。ライブラリは、本文書に記載された102メンバーとしていくつか含まれており、一般的に含まれているのが、103、104、2 × 104 3 × 104 4 × 104 5 × 104、6 × 104 7 × 104、8 × 104 9 × 104または約106、107、108、109以上のユニークなメンバーを含む105以上のユニークなメンバーです。
【０２１６】
抗体のコレクションは、このような配列やその他のアドレス形式のように、アドレスされるように、各メンバが識別されていることを各遺伝子座が同じであるか、各遺伝子座での同じ結合特異性を有する抗体を持っています。座、または物理的な軌跡をすることができますそれ以外の場合は特定のソート、化学ライブラリの記述方法でバーコード、化学タグに添付ファイルとラベルをRFタグ、添付ファイルのようなことができます。
【０２１７】
対照的に、他の抗体ライブラリーは、遺伝子座での抗体の混合物が含まれているように、またはライブラリの正体不明のメンバが含まれて生産されています。そのようなライブラリの例としては、次のいずれかに記載されている：欧州特許出願第EP0368684およびEP89311731、国際公開特許出願WO92/001047、WO 02/38756、WO 97/08320、WO 2005/023993、WO 07 / 137616及びWO 2007/054816;米国特許第6593081、6989250号;米特許出願公開番号米2002/0102613、米2003/153038、米2003/0022240、米2005/0119455、米、2005/0079574および米2006/0234302およびオルランディらにより出版されます。 （1989）学会国際、教育、科学。 U.S.A.、86:3833-3837;ワードら。 （1989）自然、341:544-546、ヒューズら。 （1989）科学、246:1275-1281、バートンら。 （1991）文集。 国立、教育。科学、U.S.A.、88:10134-10137;マークら。 （1991）jモル、ボル、222:581-591。Hoogenboomら。 （1991）J,モルボル、227:381-388。ニシンら。 （1994）エンボJ13:692-698。Barbasら。 （1992）文集。 国立。 科学。科学、U.S.A.、89:4457-4461;赤松ら。 （1993）jイミュノル、151:4651-1659; グリフィンら。 （1994）エンボJ13:3245-3260。フェロウス（2004）PNA、101:12467-12472。パーソンら。 （2006）jモルボル。 357:607-620。キナピックら。 （2000）jモルボル。 296:57-86;ロザら。 （2008）jモルボル。 376:1182-1200。モンドンら。バイオサイエンス（2008）フロンティア、13:1117-1129、そしてベアール、アイ（2007）エキスパートオピン。生物。、7:763-779。
【０２１８】
これらのライブラリの多くは（108 -1010メンバーなど）のメンバーの多数が含まれていますが、また、すべてのメンバーが機能していることを確認することも、多様性を最大化するために、その生殖細胞系列の完全なレパートリーまたは選択された部分を表すためにメカニズムはありません。したがって、組成物は、多様なライブラリの最適化されていません。たとえば、多くの既存のライブラリは、生殖細胞系列のPCR増幅によって開発されています。 PCR増幅は、結果の増幅産物にエラーが導入されています。加えて、いくつかのメソッドのハイブリッドプライマーは、個々のVの（D）J組セグメントの組換えを容易にするために使用されています。これは、組換えイベントが発生することができる”アウトフレームの”非機能メンバーの結果。また、このような方法を実施する上で、メンバーのいずれか（例えば、チューブ内やファージディスプレイを介して）プールされ、ターゲットへの結合一緒にスクリーンや基板個別に取得され、成長し混合し、植民地として宿主細胞に導入されます。肯定的な相互作用やその他の選択されたイベントの識別時に、任意の”ヒット”は、さらに注文識別することが特徴である必要があります。
【０２１９】
抗体の組み合わせアドレスのライブラリは、これらの問題を共有していない本サービスを提供します。コレクションの各メンバは、アドレス指定される各メンバが占めるようにユニークな軌跡は、例えば、空間的配列または他の配列やその他の個人アドレス（例えば、ウェルプレートでのプレゼンテーション用に、サポートやチップ、バーコーディングにバインドされている、色は、ラベル付きのRFタグをコード化されたサポートやその他のようなアドレス形式）。各メンバーを個別に生成されるため、アドレスを表示していますメンバーは、容易であるため、各メンバーの配列が知られている。メンバーの表示は、関数だけでなく、バインディングものメンバーのスクリーニングが可能任意の形式で達成することができます。 “ヒット”は迅速に審査結果と一致して識別することができます。したがって、コレクションのメンバ間の構造/活性関係（SAR）は特性の間、または特定された”ヒット”の中の配列の類似性を識別するために行うことができます。薬物動態、用量反応はまた、スクリーニングまたはすぐに”ヒット”の識別以下が利用可能です。 “ヒット”のさらなる最適化がこのような変異と反復スクリーニングとして実行することができます。したがって、メソッドは、アドレス指定可能な組合せ抗体のコレクションを生成するためにここに記載して結果のコレクションは、抗体医薬として使用するために、例えば、所望の特異性抗体および/または活動の同定に強力な代替手段を提供しています。
アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法
【０２２０】
のいずれかの方法の例では、本サービスに提供では、ライブラリの変数（VH）が重いと可変光（VL）のチェーンのメンバーが生殖細胞抗体配列を知られているので、またはその配列変更は、DNA合成により組換えまたは合成、生成されます。したがって、メンバーは、ナイーブな生殖細胞の全体のレパートリーを表すことができる”自己”タンパク質に対する選択に基づいて制限されていません。コレクション内の組合せの多様性は可変重鎖および個々のときV（VkまたはVl）とJを構成する個々のV、DおよびJセグメントの組換え（例。ここに記載されたコンピュータソフトウェアによってシリコで実行）から存在している可変軽鎖（図1を参照）を構成するV（D）Jlセグメント。配列は最大組合せの多様性を生成するV（D）Jセグメントのすべての組み合わせのランダムな組換えによって結合することができます。別の方法としては、V（D）Jセグメントは、このような特定のシーケンスまたは配列のサブセットは、ライブラリのメンバーを生成するために使用されていること、または半合理的な合理的なアプローチを使用して再結合することができます。たとえば、生殖細胞のセグメントが配列の類似性や相違点に基づいて選択するか、または共有の特性に基づいて（例えば、V領域の家族、およびCDR3の長さや組成物または他の生化学的属性）。
【０２２１】
本手法では、結果のメンバーの組み合わせの多様性は、完全な長さのポリペプチドをコードする配列に機能するために最適化されています。 Vのすべての組み合わせが、（D）J組セグメントが再結合することができ、異なるV（D）J組配列の間のコンパイルされたシーケンス内の関節は、結果の配列がインフレームになるように選択されています。各機能を備えたメンバーは、コレクションのアドレス（もやチップの位置など）を占めている。ヴィボの中では、しかし、接合部の多様性はヌクレオチドは、しばしば接合で新しいアミノ酸をもたらすことができます接合領域で挿入されているようですV（D）J組換え時に存在しています。したがって、ここでのメソッドのいくつかの例では、結果のフレームメンバーが突然変異を受けることができ、例えば、接合領域（例えば、接合部の多様性）の多様性を紹介しています。このような例では、各遺伝子座は（挿入、削除またはアミノ酸の置換など）を1つまたは複数の突然変異によって同じV（D）Jセグメントを持つ抗体のプールが、異なる互いに含めることができます。
【０２２２】
ナイーブ抗体ライブラリを生成するに加えて、これらのメソッドはここでは、結果のメンバーが知られているターゲットに対して最適化されていることにより抗体ライブラリを生成するために使用することができます提供されます。例えば、重鎖および軽鎖の個々のV（D）Jセグメントの開始シーケンスがターゲットに対して既知の結合ペプチドを含むように生成することができます。そのようなライブラリ形式の目標は、たとえば、成長因子、サイトカイン、ホルモンや他の細胞活性化を治療標的を模倣するアゴニストまたはアンタゴニスト抗体の検出を可能にするプラットフォームを生成することです。
【０２２３】
一般的に、コレクションのメンバは、ここの全部又は可変光（VL）および可変重（VH）がチェーンの部分を含んで提供されるので、得られた抗体に限り、結合部位の抗原を形成するのに十分です。したがって、組み合わせの多様性に加えて、コレクション内の多様性がここに重鎖および軽鎖（図1）を組み合わせることにより、多様性を組み合わせることによって達成が提供される。したがって、個別に再結合VLとVH鎖は、それ自体がそのVLとVH鎖、またはサブセットのすべての可能な組み合わせのスケーラブルなコレクションを生成するために様々な組み合わせで組み合わせることができる上記について討論しました。たとえば、ライブラリは、すべてのメンバは、同じVHのチェーンを持って全部又は個別に再結合VLのメンバーのサブセットと対になっています生成することができます。重鎖および軽鎖のメンバーは、直接的または間接的な結合により組み合わせることができます。重鎖および軽鎖の結果のペアは、完全な抗体は、Fabフォーム、一本鎖（sc）のFvをフォーム、またはそれらの任意の多量フォームなど、任意のライブラリ形式で提示することができます。
【０２２４】
2結果の書庫
【０２２５】
本発明はここで核酸分子のエンコーディングのVL鎖の核酸分子のエンコーディングのVH鎖のライブラリのライブラリです。また、ここで最小まったく含有する抗体ライブラリまたはVLおよびVH鎖の部分は、ペアになっているコンビナトリアル抗体ライブラリです提供など、ライブラリ内の各結果のメンバーは、結合部位の抗原を形成するのに十分であることを確認します。ライブラリ、またはすべて、またはすべての可能な生殖細胞の抗体の一部を表すナイーブなライブラリをすることができ、そのフォームを変更することができます。ペア抗体コレクションの結果メンバーは、以下には、Fab、一本鎖（sc）のFvを、ジスルフィド、ビス- scFv、ディサボディ、トライアボディ、テトラボディ、ミニボディなど多量のフォーマットおよびFv安定化に限定されません。コードする核酸分子は、そのことができる終止コドンを欠いているため、コレクションの個々のメンバーは、ライブラリはここで、既存の抗体のコレクションとは異なり、抗体ライブラリーの場合、各メンバーが”生産”や”機能”が、それ以外完全な長さのポリペプチドを製造することができる前に、得られたタンパク質を切り捨てます。通常、すべてのライブラリは、ライブラリの各メンバーのアイデンティティは、そのローカスまたは”アドレス”に基づいて知られているように、アドレス可能な形式で、ここで提供される。抗体のコレクションの例としてはここでアドレス指定可能な組合せのFabライブラリなどの組み合わせのFabライブラリが提供されます。上記のライブラリのいずれかが102、103、104または105、またはそれ以上の異なるメンバを含めることができます。
3ライブラリの応用
【０２２６】
結果としてのライブラリは、任意のアプリケーションや目的、必要に応じて使用することができます。彼らの多様性、特異性とエフェクター機能のため、抗体は、タンパク質ベースの治療のために魅力的な候補となります。様々な活動は、このような抗体医薬として使用するためのユニークな機能を有する抗体を識別するために、このように、ライブラリは、スクリーニングの方法で使用することができます。たとえば、抗体ライブラリーは、ここで関数に基づいて、または未知の、または、既知のターゲットに対して結合アッセイのスクリーニングに使用することができます。特に、それは結果のライブラリが選択したターゲットに対する新たなモノクローナル抗体（例えば、ファブ）を発見するには、セルベースのアッセイなどの機能アッセイに使用することができることがここで企図されています。したがって、ライブラリはここでは、彼らは、おそらく低親和性結合される抗体の識別を可能にするためのライブラリが、既存の利点を提供して提供される機能の理想的な抗体医薬の候補となります。したがって、両方のアゴニストとアンタゴニスト抗体を容易に発見することができます。
【０２２７】
結果の識別”ヒット”は、さらに抗体の検出（図2）の反復スクリーニング方法によって所望のターゲットに対して最適化することができます。たとえば、アクティビティベースのバインディングのスクリーニング法から同定抗体”ヒット”は、V（D）J組生殖細胞のV（D）Jは（配列同一または類似の例）、生殖細胞のセグメント関連を含み、さらにライブラリを生成するために使用することができるセグメント、ヒット識別されます。コレクションには知られているコレクション内の個々のメンバーのアイデンティティは、反復のアプローチが改善された治療への応用抗体”ヒット”を識別するために”ヒット”の急速な拡大に使用することができるように、配列されているという事実のおかげです。また、抗体”ヒット”は、重鎖および軽鎖を変更生成し、変更のVL鎖の核酸分子のエンコーディングのライブラリの歴代の突然変異誘発のための足場として使用することができ、コードする核酸分子のライブラリはVH鎖抗体ライブラリーを変更最小限のVLおよびVH鎖を変更を含みます。
【０２２８】
最後に、本書および/またはさらなるライブラリから特定された抗体”ヒット”が1つまたは複数のターゲットタンパク質の特異性のおかげで、ビトロ内での様々なおよびビトロ内のアプリケーションで使用することができ、反復スクリーニングおよび/または他の突然変異誘発法により最適化されます。たとえば、抗体は、診断方法で使用することができます。別の例では、抗体は、疾患または障害の発現や活性化、特定のターゲットタンパク質のに関連付けられている治療の治療や他の用途の方法で使用することができる抗体が調節することができます。
【０２２９】
以下のセクションでは、メソッドとライブラリの典型的なコンポーネントが、配列されたライブラリー、結果のライブラリおよびライブラリのアプリケーションを含む組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法について説明します。
【０２３０】
C.抗体
【０２３１】
本発明はアドレス指定可能な組合せの抗体の生成ライブラリ、および結果のライブラリと抗体のメソッドです。ライブラリ中の抗体は、最小限の全部又は可変重鎖（VH）との一部および/または可変軽を含む（VL）のチェーンはとても抗体限り十分な抗体結合部位が含まれています。たとえば、抗体のVH及びVL鎖ここに典型的に抗原結合部位を構成する三つのCDRのすべてに一般的に2つ以上、最大、1つまたは複数含まれて提供されます。いくつかの例では、抗体（フレデリックソンらなどを参照してください。結合および活性化ターゲットの監督に影響することにより既知のターゲットに対してペプチドは可変領域のCDR領域にグラフトされる合成CDRを含むように生成することができます。（ 2006）PNAS103:14307-14312））
必要に応じて、抗体は、すべて、または（CH1の、CH2のCH3とCH4および/または一定の重鎖（CL）のような1つまたは複数のCHドメインなど）を一定の重鎖の一部を含めることができます。したがって、抗体は、ライブラリに含まれてここでは、全長抗体であるまた、フラグメントまたはその一部を含む、例えば、例えばFab、Fab'を、のF（ab'）2、単鎖Fvs（scFv）を含むものが挙げられる将来価値、dsFv、diabody、FDおよびFdは'Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント、およびscFabの断片を断片化します。たとえば、ライブラリ内の抗体は、ここでFabを含んで提供される。
【０２３２】
構造、シーケンス、抗体の機能の説明は、当業者の一つであり、当業者のいずれかの生殖細胞の多様性を生じさせるメカニズムに精通していることが知られている。これは、コンビナトリアル抗体のライブラリーは、B細胞分化に伴う生殖細胞組換えの過程を模倣する生殖細胞のDNA配列の組換えによって行うことができることはここで企図されている。またはここで説明したように、分子生物学の技術を使用して手動で実行することができるような組換え（コンピュータなど）シリコ内で行うことができます。組換え配列を個別に可変重鎖および軽鎖配列のすべての順列を生成するには、このようなDNA合成により、または組換えDNA技術により、生成することができます。抗体は、任意の形式で表現することができるいくつかのインスタンスでは、変数と定数の領域の組み合わせが達成することができます。その結果、組み合わせ抗体のライブラリ全体をナイーブ抗体レパートリーまたはそのサブセットを表すことができる本サービスに提供するということです。
【０２３３】
1抗体ポリペプチド
【０２３４】
抗体は、膜結合型と分泌形でB細胞によって自然に生成されます。抗体は、具体的に同種の相互作用を介して結合する抗原エピトープと認識しています。抗体中和や毒素、病原体やその他の感染症のクリアランスを引き起こす複数のエフェクター機能を開始することができる抗原を同族に結合します。抗体特異性の多様性は、B細胞の開発中に組換えのイベントのために自然に発生します。これらのイベントを通じて、複数の抗体V、Dおよび抗体分子の可変領域をエンコードするJ遺伝子セグメント、様々な組み合わせが多様な抗体の多数の天然の抗体のレパートリーを生成するために一定の領域の遺伝子と結合されています。ヒト抗体のレパートリーは、1010以上の異なる抗原特異性が含まれているため、理論的に具体的に異物抗原を認識することができます。抗体は、すなわち、組換え、抗体フラグメントなどの抗体を生産などの自然に産生される抗体を、同様に総合的に含まれています。
【０２３５】
折り返し抗体ポリペプチドでは、結合特異性はスキップして、および/または軽鎖可変領域ドメイン重いの部分を含む抗原結合部位のドメインにより付与されます。抗体分子の他のドメインはシグナル伝達との相互作用他の細胞、ポリペプチド、生体分子となどのイベントに参加することでエフェクター機能を提供しています。これらのエフェクター機能は、中和および/または抗体によって認識される感染剤のクリアランスが発生します。
【０２３６】
2抗体の構造と機能ドメイン
【０２３７】
フルレングスの抗体は、4つのポリペプチド鎖、2つの同一の重（H）が鎖（それぞれは、通常、約440個のアミノ酸を含む）と2つの同一の光（L）鎖（各約220個のアミノ酸を含む）が含まれています。軽鎖はκ（κ）とラムダ（l）と呼ばれる2つの別個の形で存在しています。各チェーンは、変数（V）と定常（C）領域のドメインを含む免疫グロブリン（Ig）ドメインとして編成ドメインのシリーズで構成されています。軽鎖は、2つのドメインを、Cの領域（CL）とV領域（VL）に対応しています。重鎖は、C領域（CH1、CH2、CH3とCH4）の4つのドメインは、V領域（VH）と、3つまたは4つのドメインを持っており、いくつかのケースでは、ヒンジ領域です。四鎖は（2つの重りと２つの光）と非共有結合共有結合（ジスルフィド）結合の組み合わせによって一緒に保持されます。
【０２３８】
抗体は、フルの長さであるものと、すなわち、そのファブは、Fab'、のF（ab'）2、単鎖Fvs（scFv）、Fvを、dsFv、diabodyのFDとFd'断片を断片的なものが挙げられる。フラグメントは、単一の鎖または二量体のものが挙げられます。唯一のVHおよびVLドメインを含むFv断片、（例。全体の抗原結合部位を保持する最小の免疫グロブリンの断片、分子生物学、巻207のメソッド：組換え抗体癌治療方法およびプロトコルのための抗体（2003 ）;第1章p 3-25、キプリヤノグ）。 FVの安定化は、ペプチドとの連携によりVHおよびそのような例としてのVL鎖の直接リンクによって達成され、ジスルフィド結合やノブに穴変異（単鎖Fvs（scFv）を生成します。 Fabフラグメントは、対照的に、一緒に変数のチェーンを保持CH1とのCLのドメインの存在のために安定している。のみVHのドメインが含まれているFDの抗体は、完全な抗原結合部位を欠いている不溶性することができます。
【０２３９】
3抗体配列と特異
重鎖および軽鎖の可変領域は、-領域、またはイントロンをコーディング以外で区切られた複数の生殖細胞の遺伝子セグメントによってコードされている多くの場合、異なる染色体上に存在しています。遺伝子、27の多様性（DH）の遺伝子、および6への参加（JH）の遺伝子、たとえば、免疫グロブリン重鎖領域の遺伝子は約65変数（VH）が含まれています。カッパ（κ）とラムダ（l）軽鎖はまた、各VLとJL遺伝子セグメント、同様の数によってコードされている任意のD遺伝子セグメントが含まれていません。典型的なVH、DHは、JHとVL（VκまたはVl）とJL（JκまたはJl）遺伝子セグメントは表3-5に記載されている生殖細胞です。
【０２４０】
B細胞の分化生殖細胞のDNAは、1つのDHと重鎖遺伝子座のいずれかのJH遺伝子セグメントが再結合することにより再配置され、VHの鎖をエンコードに替えVDJ遺伝子を形成する1のVH遺伝子セグメントの結合が続いています。転位は、対立遺伝子排除のプロセスによって、単一の重鎖遺伝子でのみ発生します。対立遺伝子排除は、インフレームまたは約1変数重鎖のVDJ再結合の3分の1で発生しVDJセグメントの”生産”組換えによって規制されています。このような生産性の組換えイベントが最初のセルに発生すると、pre - B細胞の表面に発現して取得し、さらに重鎖の再結合を遮断する信号を送信することにより、対立遺伝子の発現を防止するμ重鎖の生産の結果重鎖遺伝子座が生まれます。表面は-μ重鎖もして、転位のカッパ（κ）遺伝子座を有効に機能表明します。 ・組換えは、両方の座に非生産的である場合、ラムダ（l）遺伝子座にのみ再アクティブになります。軽鎖転位のイベントは、VLとJLのセグメントが再結合されていることを除いて、重鎖と類似しています。それぞれの一次転写する前に、対応する定数鎖遺伝子が追加されます。後続の転写とRNAスプライシングはそのまま軽鎖または重鎖に翻訳されてmRNAになります。
【０２４１】
抗体の可変領域は抗原結合および特異性と、それによって得られた組換えをコードする核酸配列の可変領域ドメイン、抗体の間で異なっており、特定の抗体と抗原特異性を付与する個々の生殖細胞V、DおよびJセグメントの組換えのイベントのために付与します。しかし、バリエーション領域を決定する3つの相補（CDR1、CDR2、およびCDR3）に限定されます（H）と（L）重鎖可変領域のN末端ドメイン内にあります。 CDRは、より保存されている地域が点在している”フレームワーク領域”（FR）と呼ばれます。フレームワーク領域およびCDRの程度は正確に確認、（カバット、EAらを参照。（1991）免疫学的興味の、たんぱく質の配列、第5版、保健社会福祉省、米国エネルギー省、NIH公報91-3242、およびチョシア、C.ら（1987）Jモルボル。196:901-917）。 FR1、CDR1、FR2、CDR2および、FR3、CDR3およびFR4：各VHおよびVLは、一般的に3つのCDRと、次の順序でカルボキシ末端にアミノ末端から配置した4つのFRSで構成されています。 VLおよびVHドメイン間でシーケンスの変動は、一般的に抗原結合部位を形成する領域であるCDRは、制限されています。例えば、重鎖は、一般的には、VH遺伝子はN末端3つのフレームワーク領域は、最初の2つの完全なCDRおよび第三CDRの最初の部分をエンコード、DHの遺伝子は第三CDRの中央部とJHをエンコード遺伝子は第三のCDRと4番目のフレームワーク領域の最後の部分をエンコードします。軽鎖については、VL遺伝子は第一のCDRおよび第2のCDRをエンコードします。第三CDRは（CDRL3）VLとJLの遺伝子セグメントの結合することにより形成されている。したがって、CDRの1と2は、排他的に生殖細胞V遺伝子セグメントシーケンスでエンコードされます。 VHおよびVL鎖CDR3sはCDR 1と2の定形外の境界と銀の結合部位の中心を形成し、FRSは、HとLのCDRを配向で足場をサポートしています。平均では、抗原結合部位は、通常、CDRの少なくとも4人が（例、ジャニス  キュービィ、免疫学の変数をされると抗原結合するための特異性に貢献し、重鎖および軽鎖のCDR3と、抗原のエピトープと接触する必要があります。免疫学、第3版、ニューヨーク、WHのフリーマンアンドカンパニー、1998年、頁115から118）。 D遺伝子セグメントのすべて含まれているCDRH3は、AB -結合部位の中で最も多様なコンポーネントであり、通常、Abの特異性を定義する上で重要な役割を果たします。配列変異に加えて、（例12表26を参照）重鎖および軽鎖の間のCDRの長さのばらつきがあります。
【０２４２】
一方、一定の領域は、複数の抗体の間で保存されている配列によりエンコードされます。これらのドメインは、抗体の機能特性を付与します、例えば、能力は注文感染性病原体のクリアランスを引き起こすために免疫系の細胞および血清タンパク質と相互作用します。例えばIgMは、IGD、IgG、IgEとIgAのための抗体の別のクラスが、それらは、異なるエフェクター機能を扱うことができるように、別の定常領域を持っています。
【０２４３】
V、D、およびJのこれらの自然組換えのイベントは、両方の高い親和性と特異性とほぼ2x107異なる抗体を提供することができます。その他の多様性は、V領域の体細胞高頻度変異でも、塩基の挿入や削除を接合セグメント内で導入されています。その結果、約1010抗体個々の抗原特異性が異なる存在であるということです。
【０２４４】
メソッドは、ここでのメカニズムにより、様々な機能や他のプロパティをテストすることができる抗体のコレクションの生成を可能にして、間に生殖細胞抗体の多様性を生成するための責任を利用して提供します。
D.  形容詞抗体ライブラリーの生成会員の身元方法
【０２４５】
本発明はここで組み合わせた抗体ライブラリーの製造方法、結果のライブラリです。典型的には、ライブラリ内の各メンバは、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を抗原結合部位を形成するのに十分含まれています。メソッドは、本サービスに提供では、ライブラリの各抗体のメンバーは、（生殖細胞系列の公開データベースからなど）知られています（D）のJ遺伝子セグメントのシーケンスを組み合わせることにより、自然結合イベントを模倣することによって生成されるか、さまざまな組み合わせで、そのフォームの変更フレームでは、核酸配列をエンコード機能VHとVL鎖を複数生成します。たとえば、メソッドコードする核酸分子可変重のステップで（VH）チェーンが再結合する個々のV、DおよびJセグメントによって生成されます。核酸分子のエンコーディングは、可変光（VL）チェーンは、個々のときV（V κまたはVl）とJ（Jκ、またはJl）を可変軽鎖を構成するセグメント再結合によって生成されます。セグメントは、生殖細胞のセグメントすることができるか、その配列を縮退しました。そのような例では、このメソッドによって生成される結果の抗体はナイーブ抗体です。これは、メソッドは、既知の生殖細胞系列のセグメントの変更されたフォームを使用して実行することができますただし、ここで意図されている、例えば、ライブラリに、さらに多様性を紹介しています。たとえば、このメソッドは、逆（反転IE）の補数のDH生殖セグメントの配列を使用して実行することができます。生殖細胞のセグメントを再結合のプロセスは、フレームの分子生物学の技術やシリコ内で（アルゴリズムを実行するようにプログラムされたコンピュータを使用するなど）を使用して手動で実行することができます。
【０２４６】
方法では、組換えは、各遺伝子のセグメントは、組換え核酸分子を得られた機能VHまたはVLポリペプチドをコードするように、インフレームされるように行われます。また、メソッドでは、各核酸分子は、個別に生成され、合成した方法では、ライブラリの結果のメンバーが表現すると、組み合わせ抗体メンバーは最低限そのVHとVLのチェーン、または一部を含む生成されるように組換え可変領域遺伝子を一緒にコードする核酸分子の共発現によって生産されています。メソッドは、VHおよびVL鎖をコードする遺伝子は、重鎖および軽鎖、リンカによって結合されていることにより、単一の核酸分子として表すことができるコードする核酸分子のいくつかの例です。メソッドは、コードする核酸分子の別の例ではVHとVL鎖が別々に一緒に発現のために提供することができることです。したがって、組換え核酸分子からの発現により、ライブラリの各別のメンバーは、多様性は、V（D）J組セグメントの組み合わせの多様性と重鎖および軽鎖の組み合わせの多様性によって達成されることにより、生殖細胞エンコードされた抗体を表しています。方法では、追加の多様性は、当技術分野で知られているアプローチの数のいずれかを使用して、ライブラリに導入することができる限定されないために、ランダムな突然変異誘発、半や合理的突然変異誘発合理的として紹介されます。
【０２４７】
うち1つ以上の方法のすべてのステップは、プロセス内の各メンバのIDがアドレス遺伝子座で、その場所で知られているように、アドレス指定可能な形式で行うことができます。したがって、ここでコードする核酸配列のVH鎖、核酸配列のエンコーディングのVL鎖を再結合生殖細胞のアドレス指定可能なライブラリを再結合生殖細胞のアドレスライブラリ、およびの核酸分子のエンコーディングのVL鎖の組み合わせとコードする核酸分子VHの鎖によって形成されたアドレスライブラリである提供各遺伝子座です。また、提供されるアドレス細胞は、組換え核酸分子のエンコーディングのさまざまな組み合わせを含む遺伝子座の各セルVLと再結合する核酸VHが与えられています。結果の抗体ライブラリーは、アドレス指定することができます。このようなアドレス抗体ライブラリーは、”ヒット”などの活動の様々なスクリーニングすることができるとの間の中で”ヒット”抗体の結果のライブラリ構造/活性関係の評価の迅速な同定をも可能に結合、増殖、細胞に限定されない低親和性が自己抗原、イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体、新規エピトープ、非タンパク質抗原およびアゴニスト抗体の発見などの困難な抗原に対してリードします。
【０２４８】
1機能組換え生殖細胞の可変領域遺伝子の製造方法
【０２４９】
本発明はここでの生殖細胞系セグメントまたは変更されたフォームその、各コードする核酸分子重鎖または軽鎖のさまざまな機能可変領域の再結合によって生成された核酸分子を生成するためのメソッドです。可変遺伝子セグメントはVH、DHが、JH、Vκ、Jκ、VlおよびJlが含まれています。生殖細胞系列のセグメントはから選択することができるヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ馬、ウサギや犬の生殖細胞のセグメントに限定されません。典型的な生殖細胞のセグメントは、ヒト由来のものです。
【０２５０】
Aの可変遺伝子セグメント
i.生殖細胞セグメント
本方法を実施するには、セグメントのシーケンスは、抗体生殖細胞系遺伝子セグメントを提供する任意のソースから得られる生殖細胞です。これらは、任意のデータベースや生殖細胞の遺伝子セグメントの記載の配列を設定公表されている文献が含まれています。典型的な抗体の生殖細胞のソースは含まれて国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）の、国際的な免疫情報システムのデータベースに限定されていない（R）（IMGT）、カバットのデータベースとトムリンソンのVBaseデータベース（Lefranc（2003）核酸研究所、 31:307-310;マーティンら、治療用抗体、ワイリー- VCH（2007）、頁104から107）のハンドブックの抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール。必要に応じて、非ヒト生殖細胞系列のセグメントのための核酸配列はまた、公表されている文献や公開データベースから取得することができます。たとえば、例示的なマウスの生殖細胞のデータベースがibt.unam.mx/ vir / v_mice.htmlデータベースを利用可能なクローラ式です。配列リストは、ここIMGTデータベースやその他の公共データベースから収集された配列の例示的なヒト生殖細胞のセグメントのシーケンス（例えば、参照配列番号:10 - 451および868）を提供できます。
【０２５１】
たとえば、例示的なヒト重鎖生殖セグメントは、（配列番号10から285）を表3に記載されています。典型的な人間の軽鎖カッパ生殖セグメントは、（配列番号286から364および配列番号868）を表4に記載されています。典型的な人間の軽鎖ラムダ生殖セグメントは、（配列番号365から451）の表5に記載されています。生殖細胞系列のセグメントは、IMGT遺伝子名と、以前はヒトゲノム機構（ヒューゴ）命名法委員会によって承認された定義を使用して記載されています。セグメントは、これにより最初の3文字の軌跡を（IgH、IGKまたはIGL）を示すIMGT命名法を使用して名前が付けられ、4文字目は、遺伝子（VはV遺伝子を、DはD遺伝子を、JはJ遺伝子を表す）、5番目の位置は、遺伝子数の分類を示すハイフンの後にサブグループの数を示しています。対立遺伝子については、IMGT名には、アスタリスクと2つの図番号が続いています。
【０２５２】
ヒトの重鎖V遺伝子、ヒト軽鎖カッパVの遺伝子、それぞれヒト軽鎖ラムダVの遺伝子（例。レフランク、M.-P.経験Clinの免疫遺伝学、18:100-116（2001）、ツァッハウとHG免疫、4:49-54（1996）、Lefranc、M.-P.経験Clinの免疫遺伝学、18:161-174（2000）、川崎ら、ゲノム研究所、7:250-261（1997）、Lefranc、M.-P.経験Clinの免疫遺伝学、18:242-254（2001）。
任意の名前付け規則は、抗体の生殖細胞のセグメントを識別するために使用することができます。任意の名前付け規則を使用している核酸配列を識別することができる当業者の一つ （例。表22、参照）、組換え核酸配列を記述するここで目的のために、VHの生殖細胞のセグメントが識別されるすべての対立せずにIMGT命名法を使用して名前が付けられます。表6に、それぞれの対立遺伝子を有するIMGTの命名法とそれに対応するIMGT命名法を記載してあります。 VKの生殖細胞のセグメントはツァッハウ命名法を使用して名前が付けられます。表7にツァッハウの命名法とそれに対応するIMGTの名称を示しています。 VLの生殖細胞のセグメントは、川崎市の名称を使用して識別されます。表8は、川崎市の命名法とそれに対応するIMGTの名称を示しています。のDH、公団、JKとJLの生殖細胞のセグメントはIMGT命名法を使用して名前が付けられます。
【０２５３】
【表３】
2016127850.tif 000004
2016127850.tif 000005
2016127850.tif 000006
2016127850.tif 000007
2016127850.tif 000008
【０２５４】
【表４】
2016127850.tif 000009
2016127850.tif 000010
【０２５５】
【表５】
2016127850.tif 000011
2016127850.tif 000012
【０２５６】
【表６】
2016127850.tif 000013
【０２５７】
【表７】
2016127850.tif 000014
【０２５８】
【表８】
2016127850.tif 000015
【０２５９】
ii.組み換え生殖細胞系セグメント
本書で、方法の応用は生殖細胞系の配列セグメントに限定されていないことが認められています。従って、組み換えVH, DH, JH, Vk, Jk, Vl および/または Jl の配列セグメント、またはそれに類似した配列は方法の適用に使われます。配列セグメントを組み換え、その種類を増加することによって、ライブラリー、およびコンパイルされたセグメントの並べ替えの多様性を増加することもできます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験的に変更することができます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験によって変更することができます。または/加えて、生殖細胞系セグメントは、リンカー、制限酵素部位、あるいはこの方法の応用に必要な他のヌクレオチド配列（ここで指定された）の使用によって変更され、組み換え完全長核酸分子の生成を容易にすることができます。  
【０２６０】
一般的に、変更された生殖細胞セグメントは、生殖細胞系配列に由来するものを含みます。生殖細胞セグメントは、不規則または経験的に生殖細胞系配列に変異を挿入することによって変更することができるが、また生殖細胞系のコンセンサス配列を生成するために変更することができます。たとえば、変更されたJH生殖細胞系セグメントは配列ＩＤ番号3450-3455にあります。  
【０２６１】
別の例では、生殖細胞セグメントの追加的な変更には、制限部位を提供する個々の生殖細胞系セグメントの5’または 3’のいずれかまたは両方の端末にフランキング配列の追加の例があります。そういった変更は、DNA合成、またはPCRによって生殖細胞系列に組み込むことができます。例えば、制限酵素部位を組み込むことができるプライマーを利用します。後述の一例では、そういった制限部位を組み込むことによって生殖細胞系セグメントの接合を促すことができます。ただし、場合によっては、生殖細胞セグメントの組み換えは制限部位の除去を含みます。   制限部位は、当技術分野で知られているあらゆる制限部位を含めます。典型的な制限部位の配列は表15に記載されています。一般的に、選択される制限部位は、後の生殖細胞セグメントの統合と適合性があり、また平滑末端ライゲーション、あるいは付着末端ライゲーションを容易にするために選択されることがあります。制限酵素の選択は普通であり、当業者のいずれかのレベルの範囲内にあります。
【０２６２】
いくつかの例では、モノクローナル抗体を含み、また特に治療抗体など、既知の抗体を、ここで指定される方法に利用できます。モノクローナル抗体の抗原特異性がすでに承認されていることを踏まえ、由来の配列をこの方法に取り入れることによって、抗原に対して向上した特異性と機能性をもって抗体の識別が可能なります。生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列、例えばVH, DH, JH, Vk, Jk, Vl および/あるいは Jl, の１つあるいはそれ以上に相当する物は、自らで生殖細胞系配列と組み込むことができます。当業者は、生殖細胞系配列から由来する特定の抗体をコードする核酸分子で相当する配列を識別することができます。以下の表９は、由来の生殖細胞系配列に関連する V、DおよびＪの局部を特定します。
【０２６３】
【表９】
2016127850.tif 000016
2016127850.tif 000017
【０２６４】
例によって、組み換えられた生殖細胞系配列は、生殖細胞系配列の一部あるいは全てのヌクレオチドに取って代わるヌクレオチドの配列を含む場合もあります。例えば、ここで、DHと指定された組み替えの生殖細胞系配列は、ヌクレオチドのいかなる配列であると認められています。核酸分子のDHのセグメントはCDRH3部の中部をエンコードし、抗原の特異性と変異性に大きな働きをしています。この局部は、抗体の中で最も変異性の高いだけに、さらに多くの組み換えを耐えることができます。また、抗原特異性を効かせる最も重要な局部です。一般的にはDHと指定されたセグメントは5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含みます。ヌクレオチドの配列は、後述で説明される通り、インフレームでVH およびJHと統合されると、抗原結合部位を十分に含む抗体分子あるいはその一部が生成されるように選択されます。ヌクレオチドは不規則または経験的に選択されます。場合によって、DHと指定されたヌクレオチドのセグメントは、ヌクレオチドの不規則配列を含む例もあります。別例で、ヌクレオチドのセグメントは、特定の抗原を対象するように選択されることもあります。例えば、ヌクレオチドのセグメントは、特定のペプチド模倣物をエンコードすることがあります（表１６に参照）。他の例で、DHと指定されたヌクレオチドのセグメントは、既知のDH生殖細胞系配列に比べると逆の補完物であるヌクレオチドを含むかもしれません。これは、例14に説明されています。
【０２６５】
他の例で、生殖細胞系セグメントは、生殖細胞系セグメントの間のコンセンサス配列を生成するために組み替えられることがあります。一般的に、CDR局部間の変異性のため、コンセンサス配列は、フレームワーク局部で生成されます。そういった変更は、例えば組み合わせた抗体ライブラリーを手動で作っている場合、共通配列の操作を容易にすることによって、この方法の実行に貢献できます。これは、各JHが共通のフレームワーク局部Ｆ４を含むとして例１に例示されています。
【０２６６】
【０２６７】
b.
【０２６８】
生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する組み換え配列の選択
【０２６９】
上記で説明された通り、それぞれのVH鎖およびVL鎖は、遺伝子セグメント、一般生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する物の組み合わせによって生成された核酸分子にエンコードされています。得られたライブラリーに属するものは、再び組み換えられる遺伝子を不規則または経験的に選ぶことによって、選択できます。当業者は、組み替え用のV(D)J遺伝子セグメントまたはそれによるサブセットを選択し、VHあるいはVLをエンコードしながらインフレーム核酸分子を生成することができます。
【０２７０】
一例では、V(D)J配列セグメントは不規則で組み換えられ、あらゆる既知の生殖細胞系配列（例えば、本書の配列一覧に記載された、あるいは公開データベースで利用可能な、あるいは当業者に知られている物、およびそれに由来する物）は全ての可能な並べ替えで組み換えられます。そういった例で、各VH遺伝子セグメントは各DHと組み換えられ、そしてこれは再び各JHと組み換えられます。同様に、各VL(k またはl)は各JL(k またはl)と組み替えられます。そういった例で、組み換えで得られた生殖細胞系核酸分子は単純なVHおよびVLの全ての種類を代表します。例えば、生殖細胞系セグメントは3〜5表に記載された既知の生殖細胞系セグメントと組み換えられる場合は、ＶＨをエンコードする組み換え核酸分子の約１０万種類あるいはそれ以上、ＶＬkをエンコードする組み換え核酸の約６００種類あるいはそれ以上、およびＶＬlをエンコードする組み換え核酸分子の約７００種類あるいはそれ以上が発生されます。したがって、可変重鎖、および軽鎖をエンコードする核酸のライブラリーは、あらゆる組み換え抗体可変領域をエンコードすることができます。加えて、変更、例えば上記に説明された突然変異生成、逆位DH配列の組み入れ、あるいは指向性ペプチドを利用することによって、多様性をさらに増加することができます。
【０２７１】
別の方法としては、V（D）Jセグメントは、使用される特定の生殖細胞系のセグメントの配列、あるいはサブセットがライブラリーの種類の生成に限られるように、合理的または半合理的なアプローチで組み換えられることは可能です。例えば、例１４に説明された通り、ライブラリーのあらゆるメンバーはIGHV3-23*01のVH生殖細胞系セグメントを含みます。他の例では、変更された生殖細胞系セグメント、例えば不規則に生成された（例えば特定のＣＤＲへの部位特異的突然変異生成によって）または試験的に生成された（例えば指向性ペプチド模倣物を含むように組み換えることによって）特定の局部の突然変異を含む物を選択できます。生殖細胞系セグメントの選択を可能にするおかげで、ここで提供されるライブラリーは多目的であり、ライブラリーのアプリケーションに基づいて合理的に設計できます。     
【０２７２】
例えば、得られた核酸配列は配列の類似点、あるいは相違点、あるいはその他の共通点に基づいて制限されている場合は、抗体生殖細胞系セグメントを選択することができます。例えば、生殖細胞系セグメント配列は、セグメントの配列は、配列の類似点、あるいは相違点、あるいはその他の共通点に基づいて選択されることは可能です（例えばV領域族、長さ、CDR3の長さや組成、種類、機能性、特異性、グループ、サブグループ、ＣＤＲ内のパターン、特定のアミノ酸やその他の生化学的属性）。抗体組成データベース(例えばCATHデータベースはcathwww.biochem.ucl.ac.uk/で、SACSデータベースはbioinf.org.uk/abs/sacs/で、IMGT 3D組成データベースはimgt3d.igh.cnrs.fr/でアクセス可能)、あるいはその他のデータベースは、選択可能な基準によって生殖細胞系セグメントを分類することができるように公開されています。あるいは、その選択を、配列アライメントを利用してなど、手動で分類することができます。
【０２７３】
別の例では、生殖細胞系セグメントはその配列における類似点または相違点に基づいて選択されます。当業者は、生殖細胞系配列の間の類似性、または配列において特有の類似性を共有する生殖細胞系セグメントを知っているあるいは識別することができます。一例では、VH, DH, JH, Vk, Jk, Vl および/またはJl, のグループに属する生殖細胞系セグメント配列は、配列相同性に基づいて選択することができます。選択されたセグメント間の配列類似性は、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、あるいはそれ以上を含むことができるが、それに限りません。例えば、同サブグループあるいは同族である生殖細胞系セグメントのサブセットは選択できるが、一般的にこれらはより高い類似性（すなわち70％以上、通常は75％あるいはそれ以上）を共有します。上記の表3〜5表は、同サブグループまたは同遺伝子族に属する生殖細胞系セグメントを特定します。例えば、表３で、IGHV7、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6、およびIGHV7は、それぞれVHセグメントのサブグループを代表するが、グループ内の生殖細胞系セグメントは少なくとも75％の配列類似性を共有します。したがって、IGHV1内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能、IGHV２内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能、IGHV３内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能などになります。別例では、表３でIGHV1-18*01および IGHV1-18*02は、対立遺伝子である生殖細胞系セグメントを有する遺伝子族を表します。したがって、同族である生殖細胞系セグメントは生殖細胞系配列のサブセットとして選択することができます。  
【０２７４】
別の例で、生殖細胞系セグメントは、得られるサブセットが多様な種類の配列を表すように、配列の相違点に基づいて選択されます。当業者は、配列において特有の類似性を共有する生殖細胞系セグメントを知っているあるいは識別することができます。選択されたセグメント間の相違性は、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、あるいはそれ以下の類似性を示す例を含みます。例えば、それぞれ異なったサブグループからの生殖細胞系セグメントのサブセットを選択できます。したがって、例えば、VHセグメントは、IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 およびIGHV7のそれぞれのサブグループから選択できます。そして、一つのサブグループはIGHV1-18*01, IGHV1-26*01, IGHV3-11*01, IGHV4-28*01, IGHV6-1*01, IGHV7-4-1*03を含むことが可能です。別例で、VHセグメントは各遺伝子族から選択できます。例えば、サブセットはIGHV1-18*01, IGHV1-2*01, IGHV1-3*01, IGHV1-45*01, IGHV1-46*01, IGHV1-58*01, IGHV1-69*01, IGHV1-8*01, IGHV1-c*01, IGHV1-f*01, IGHV2-26*01, IGHV2-5*01, IGHV2-70*01, IGHV3-11*01, IGHV3-13*01, IGHV3-15*01, IGHV3-16*01, IGHV3-20*01, IGHV3-21*01, IGHV3-23*01, IGHV3-30*01, IGHV3-33*01, IGHV3-38*01, IGHV3-43*01, IGHV3-48*01, IGHV3-49*01, IGHV3-53*01, IGHV3-64*01, IGHV3-66*01, IGHV3-7*01, IGHV3-72*01, IGHV3-73*01, IGHV3-74*01, IGHV3-9*01; IGHV4-28*01, IGHV4-30-2*01, IGHV4-31*01, IGHV4-34*01, IGHV4-39*01, IGHV4-59*01, IGHV4-61*01, IGHV5-51*01, IGHV6-1*01 および IGHV7-4-1*01を含むことが可能です。当業者は、生殖細胞系の配列における相違点に基づいて、希望の配列のサブセットを選択することができます。他の生殖細胞系セグメントのサブセットも配列における相違点に基づいて選択することができます。表10〜12は、各遺伝子族につき少なくとも一つの生殖細胞系セグメントを代表するVH, DH, JH, Vk, Jk, Vl および/またはJl, の典型的な生殖細胞系セグメントの選択を示しています。
【０２７５】
【表１０】
2016127850.tif 000018
【０２７６】
【表１１】
2016127850.tif 000019
【０２７７】
【表１２】
2016127850.tif 000020
【０２７８】
以上の全ての例では、類似性、相違性、あるいはその他の特徴による生殖細胞系セグメントの選択は、生殖細胞系セグメントの一つのグループだけに限定されることがあるが、(VH, DH, JH, Vk, Jk, Vl および/またはJl,の中から)、2 グループ、3グループ、4グループ、5グループ、6グループ、 あるいは全ての7グループを含む場合もあります。従って、例えば、複数の鎖VHをエンコードするために遺伝子セグメントを組み換えるにあたって、VH生殖細胞系セグメントだけは類似性、相違性、あるいはその他の特徴に基づいて限定され、また、DH およびJHセグメントは既知されている全てのDH とJH の生殖細胞系のセグメントを代表します。別の例で、それぞれのVH, DH およびJHの配列セグメントは、配列の類似性、相違性、あるいはその他の特徴に基づいて選択され、ここでコンパイルするための限定された生殖細胞系セグメント配列のサブセットという結果になります。また別の例で、複数のVH鎖をエンコードするための遺伝子セグメントを組み換えるにあたって、DHセグメントは、特定の対象に対するペプチド模倣物をエンコードするヌクレオチドの含有における変更に基づいて限定されます。そういった例で、VH およびJHのセグメント配列は、限定されたDHの（例えば組み換えられた）サブセットと組み換えられる、知られている全ての生殖細胞系セグメント配列を代表します。ここで挙げられるコンパイル方法に使用される生殖細胞系セグメントの選択は、様々な要因によるが、例えばコンパイル結果のライブラリー、ライブラリー作成の初期的段階で特定の対象に対する生殖細胞系セグメント配列に関して持っている知識（以下のＧ.４で説明される通り）、およびライブラリーのサイズなどです。
【０２７９】
【０２８０】
【０２８１】
c.
【０２８２】
配列編集
【０２８３】
ここで挙げられるコンパイル方法では、可変遺伝子セグメントの配列は、重鎖可変領域(5’-VHDHJH-3’)、カッパ軽鎖可変領域 (5’-VkJk-3’)、およびラムダ軽鎖可変領域(5’-VlJl-3’)を生成するために組み換えられます。遺伝子セグメントは、完全長の可変領域、あるいは完全長以下の可変領域（すなわち完全長の一部）を生成するために組み換えることができるが、その長さは発言すると抗原結合部位を形成するのに十分であることは前提です。核酸配列は、結果の核酸分子がインフレームで機能性VHまたはVLポリペプチド（例えば抗原結合部位を形成するポリペプチド、あるいはそのための十分な部分）をエンコードするように、組み換えられます。
【０２８４】
【０２８５】
ここで提供される編集方法は当業者に知られているいかなる処置によって行うことができます。例えば、手動で、シルコ（すなわちコンピューターソフトウェアー）で、あるいはこれらを組み合わせた方法によって行うことができます。以下で説明された他の例で、この編集方法は配列編集ソフトウェアによって行うこともできます。また、生殖細胞系セグメント配列、あるいはその他の公共バイオインフォマティクスツールを提供する公開データベースもこの方法の執行に使用することができます。  
【０２８６】
一般的に、完全長の可変領域(5’-VHDHJH-3’)、あるいはその一部は、VHセグメントがDHセグメントと、そしてそれがJHセグメントと組み換えられるように、組み換えられます。重鎖セグメントは常に、VHセグメントがDHセグメントの5’で、そしてそれがJHセグメントの5’になるように、組み合わせられます。正確なVHDHJH は、不規則または経験的に選択可能で、上記に述べられた通りに生殖細胞系セグメントまたはそれに由来する物を代表できます。この方法は分子生物学の技術を利用し手動で行う場合、生殖細胞系セグメントの両端に制限酵素を追加しセグメントの結合を容易にすることができると知られています。したがって、例によって、結果のVH鎖では生殖細胞のセグメントの間でより多くのアミノ酸が見られる場合があります。例えば、本書の例で説明された通りに、ＶＨ鎖をエンコードし核酸分子ライブラリーに属する物は、JH領域の5’末端で結合されたDH領域の間でアミノ酸ＳＹを含む配列もエンコードする場合があります。
【０２８７】
この方法の一例では、VHDHJH遺伝子セグメントの全ての置換配列は可変重鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えることができます。したがって、各VHセグメント（例えば配列ＩＤ番号10-238に記載されたいずれもの項目）はそれぞれのDHセグメント（例えば配列ＩＤ番号239-272に記載されたいずれもの項目）と、そしてそれが再びそれぞれのJHセグメント（例えば配列ＩＤ番号273-285に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表３にある典型的な重鎖の生殖細胞系セグメントに基づいて、可変重（ＶＨ）鎖をエンコードする約10万あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例で、VHDHJH遺伝子セグメントは試験的に（例えば、以下に説明される通り、合理的または半合理的なアプローチによって）組み換えられることが可能です。例えば、以下に説明される通りVH, DH および/またはJHのいかなるサブセットは、組み換え核酸分子を生成するために選択可能です。いくつかの例で、個々の遺伝子セグメントは、多様性、同じＶ領域族、CDR3の長さ、組成、あるいはその他の生化学的属性の共通特徴に基づいて選択されます。  
【０２８８】
完全長のカッパ軽鎖可変領域(5’-VkJk-3’)、あるいはその一部は、VkセグメントがJkセグメントと組み合わせられるように、組み換えられます。完全長のラムダ軽鎖可変領域(5’-VlJl-3’)は、特定のVlセグメントがJlセグメントと組み合わせられるように、組み換えられます。軽鎖セグメントは常に、VLセグメントがJLセグメントの5’になるように組み合わせられます。正確なVkJk あるいはVlJlは、不規則または経験的に選択可能で、上記に述べられた通りに生殖細胞系セグメントまたはそれに由来する物を代表できます。この方法は分子生物学の技術を利用し手動で行う場合、生殖細胞系セグメントの両端に制限酵素を追加しセグメントの結合を容易にすることができると知られています。したがって、例によって、結果のＶＬ鎖では生殖細胞のセグメントの間でより多くのアミノ酸が見られる場合があります。
【０２８９】
この方法の一例では、VkJkの全ての置換配列は可変カッパ軽鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えることができます。したがって、各Vk （例えば配列ＩＤ番号286-355、868に記載されたいずれもの項目）は、それぞれのJk（例えば配列ＩＤ番号356-364に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表4にある典型的なカッパ軽鎖に基づいて、可変カッパ軽鎖をエンコードする約６００あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例では、VlJlの全ての置換配列は可変ラムダ軽鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えられます。したがって、各Vl （例えば配列ＩＤ番号365-441に記載されたいずれもの項目）は、それぞれのJl（例えば配列ＩＤ番号442-451に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表5にある典型的なラムダ軽鎖生殖細胞系セグメントに基づいて、可変ラムダ軽鎖をエンコードする約700あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例で、VkJk あるいはVlJlの遺伝子セグメントは本書の以下の説明の通りに試験的に組み換えられます。
【０２９０】
上記のすべての例で、組み換えセグメントは、組み換え完全長核酸が5'の開始コドン（ATG）とフレーム内にあるように結合され、完全長ポリペプチドの発現を可能にします。V(D)Jのいかなるコンビネーション、およびそれに伴う結合の変更は可能で、各配列のリーディングフレームを維持しながらインフレームのコンパイルされたV(D)J 配列を生成します。接合部の変更の選択は、結合されるV(D)Jのコンビネーションと各遺伝子セグメントのリーディングフレームの正確さの機能です。たとえば、可変遺伝子セグメントのいずれかが、コンパイルの時にリーディングフレーム1、2、あるいは３に存在可能です。しかし、一般的に、本書の方法の応用にあたって、V配列(VH, Vk あるいはVl)はいつもリーディングフレーム１に当たります。また、J配列のリーディングフレームは、結果の遺伝子セグメントが適切なアミノ酸を含むように、リーディングフレーム１，２、あるいは３に設定されています。以下の
【０２９１】
【表１３】
2016127850.tif 000021
【０２９２】
重鎖に関しては、選択されたＤ可変遺伝子セグメント配列のリーディングフレームはＶあるいはＪ生殖細胞系セグメントの場合より柔軟です。これは、D遺伝子配列が抗原特異性に重要な役割を果たすCDRH3の中央部をエンコードしているおかげです。したがって、D遺伝子セグメント配列においてアミノ酸の変動が見込まれています。   したがって、たとえば、DH遺伝子セグメントは、いかなるリーディングフレームに属するいかなるDH遺伝子セグメント、あるいはそれに由来する逆位補完、あるいはDHと指定されるいかなるヌクレオチド配列であるかもしれません。しかし、いくつかの例で、D生殖細胞系配列のリーディングフレームは、結果のエンコードされたアミノ酸は主に親水性であるように選択されます。CDR3が抗原結合部位なので、表面が露出した親水性の残基に富んでいます（参照は、Zanetti and Billetta、Antigenized Antibodies from Concepts to Applications (1996年)、Antibodies、Volume 2 (75〜122ページ)、ハーウッドアカデミック出版社、またはPommie et al. (2004年) J Mol. Recognition 17:17〜32）。当業者は、配列における疎水性もしくは親水性を測定する技術に精通しています。たとえば、親水性はタンパク質の水治療法総平均（ＧＲＡＶＹ）を利用することによって測定できるが、これは各残基の疎水性値を加えそして配列の長さで割り算を行うことによって疎水性値を測定できます（参照は、Kyte and Doolittle (1982年）、またはbioinformatics.org/sms2/protein_gravy.html)。ＧＲＡＶＹ値は低ければ低いほど、配列の下の親水性は高いです。  
【０２９３】
いくつかの例で、リーディングフレームを維持しながらインフレームの可変遺伝子セグメントのコンパイルは、組み換えやセグメントの結合などの変更の必要がありません。しかし他の例で、ただV(D)J をコンパイルすることだけではリーディングフレームを維持することができません。したがって、遺伝子セグメント間の接合部が望ましいフレームにない場合、変更はセグメント間の接合部内のヌクレオチドに行われ、その結果は各遺伝子が望ましいセグメントにあり、完全長配列がインフレームにあります。核酸の変更は、ヌクレオチドあるいはそれに由来する合成の交換や置換、挿入、または削除を伴います。たとえば、VD接合部では、1つまたは複数のヌクレオチドがＤの5’末端から除去、Vの３’末端から除去、あるいはＶとＤの間に1つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Ｖ3’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。他の例で、D-J接合部では、1つまたは複数のヌクレオチドがJの5’末端から除去、Dの３’末端から除去、あるいはDとJの間に1つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Dの3’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。さらに他の例で、Ｖ-J接合部では、軽鎖の生成で見られるように、1つまたは複数のヌクレオチドがJの5’末端から除去、Ｖの３’末端から除去、あるいはＶとJの間に1つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Ｖの3’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。ヌクレオチドが挿入される例では、1つ以上のグアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、およびチミン（T）の中からのいかなるヌクレオチド挿入が見られます。いくつかの例で、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)のグアニン残基への微妙な優先傾向のため、グアニン（G）は挿入に選ばれることがあります(Alt et al. 1982年)。
【０２９４】
この方法においては、重鎖セグメントが軽鎖遺伝子セグメント配列と別に組み換えられます。したがって、いずれかの核酸分子は重鎖（VH）、または軽鎖（VL）可変領域をエンコードします。この方法では、VH鎖をエンコードする複数の核酸分子、およびVL鎖をエンコードする複数の核酸分子が生成されます。その配列の数は、組み合わせ可能なV、D、あるいはJ遺伝子セグメントによるいかなる可能な並べ替えの数と同じです。たとえば、既知の全ての生殖細胞がこの方法に使用される場合、完全に単純な抗体のライブラリーが作成されます。他の例で、組み換え遺伝子セグメントもこの方法に使用できます。あるいは、順列の数は、選択されたＶ、D、およびJの機能だが、これは全ての生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する物のサブセットかもしれません。
【０２９５】
核酸配列は、一度コンパイルされら、コドンを削除するためにさらに変更され、出来上がる分子が機能分子（例えば、切断されていないポリペプチドをエンコードする）であることを確保します。たとえば、終止コドンを除去するための変更はヌクレオチドの置換を伴います。そのような変更の典型的な例としては、終止コドンTAAをコドンTATへ、終止コドンＴＧＡをコドンＴＡＴへ、および終止コドンＴＧＡをコドンＴＣＡへの置き換えなどを含みます。 
【０２９６】
d.組み換え核酸配列の追加的な変更
上述のように、生殖細胞系セグメント配列は、本書のコンパイルを行う前に変更することができます。または、変更は直接に組換え核酸配列に行うことができます。したがって、コンパイルの前に後述の変更は個々の生殖細胞系セグメント配列に行うことができるが、リーディングフレームが維持されること、およびインフレームの組み換え核酸配列を生成するにあたって本書で説明されたコンパイルに当てはまるルールが遵守されることは前提です。
したがって、ＶＨ鎖あるいはＶＬ鎖をエンコードする複数の組換え核酸のいずれもがさらに変更されることは可能です。核酸配列の変更は、ヌクレオチドあるいはそれに由来する合成の交換や置換、挿入、または削除を伴います。核酸分子の変更がこの方法のおかげでできたV(D)Jセグメントのリーディングフレームを維持するための接合部に影響を及ぼさない限り、当業者は適切と見なすいかなる核酸分子の変更を行うことができます。結果の完全長核酸が5'開始コドン（ATG）とフレーム内にあり、完全長のＶＨもしくはＶＬの発現、またはそこから抗原結合部位を生成するための十分な部分の発現は可能であることを確保するために、いかなる変更をチェックし、リーディングフレームに影響がないかを確認する必要があります。  
【０２９７】
得られた組換え生殖細胞可変重鎖および軽鎖の核酸配列は、DNA合成によって（例えば、核酸分子の合成によって行われた変更）、または標準分子生物学技術によって、さらに変更できます。したがって、一例で、希望のいかなる変更は、組換え可変重または可変軽鎖をエンコードする核酸分子に行うことができ、そして結果は、核酸分子が下記e.のiiiで説明されるように行われた変更の通りに合成されます。遺伝子コードの退化のために、核酸配列は、不要な制限部位、スプライスドナー部位もしくはスプライス受容部位、あるいは潜在的に悪影響を及ぼすその他のヌクレオチドの有害な配列を含み、不要なヌクレオチド配列を避けるように設計できます。また、生物は場合によって、特定のコドンの使用あるいはＧＣからＡＴへの特定の半径をサポートする生物もあります。したがって、遺伝子コードの退化によって、特定の生物あるいは生物のグループ向けの発現の核酸配列の設計は可能になりました。また、核酸分子は、配列の最適化（または非最適化）によってさまざまな発現のレベルに設計することができます。別の例で、e.iiiで説明された通り、組み換えられた生殖細胞系VHとVL核酸分子は、ＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発法、制限酵素消化、連結反応、クローニングなどの標準分子生物学技術、あるいはその技術の組み合わせによってさらに組み換えることができます。そういった変更をDNA合成中に行うかあるいは分子生物学技術を使用して行うかの決定は、最終使用者によるが、またその変更の目的、程度、およびタイミングなどの要因も影響を及ぼすかもしれません。
【０２９８】
VHもしくはVLをエンコードする組換え生殖細胞核酸分子の変更は、不規則または経験的に行うことができます。たとえば、抗体の特異性および親和性に貢献するいかなるCDRループ領域の変更を代表例として、１つあるいはそれ以上の領域のランダム突然変異はライブラリーの多様性を向上させます。そして、多様性が増加したこのライブラリーは抗体、それに由来する物、あるいはその部分もしくは断片の生成を可能にし、そしてそういった生成物は親和性の高い抗原と束縛される可能性があります。別の例で、変更は合理的または半合理的なアプローチで試験的に行うことができます。本書で見られる鎖とVL鎖をエンコードする核酸分子の試験的な変更のうち、定方向ライブラリーの作成のためのＣＤＲ領域の変更、コドン使用を最適化するための変更、および/または例制限部位もしくは探知可能な分子部分を挿入するための変更なども含まれます。変更は、さらに不規則および経験的な変更の組み合わせも含むことがあります。
【０２９９】
i.コドンの使用
たとえば、核酸配列は、コドン使用を細菌発現などのような発現に適用させるように変更することができます。複数のコドンが同一のアミノ酸をエンコードすることで退化します。このように単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされるが、特定の生物内でコドンの使用はアミノ酸によって異なります。ここで取り上げられる完全長核酸は、稀なコドンを特定の発現系で使用されるより豊富なコドンに換えるために変更されています。一般的に、変更はサイレント突然変異を含むおかげで、置換はコドンの特異性に影響を及ぼしません。コドン使用表は、特に一般的な発現系に関するものが当業者に知られています。例えば、細菌発現に関しては、コドン使用表が知られています（例えば、Grantham, R. et al., Nuc. Acids Res., 8:1892-1912（１９８０年）、Grantham, R. et al., Nuc. Acids Res., 9:r43-r74 (1981年)、および表１４を参考）。   コドン使用表は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ向けの３ヌクレオチドの全ての６４可能なコドン、およびE. coli K12細菌におけるその使用率を記載します。表は、単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされる（冗張）にもかかわらず、このコドンは特定のアミノ酸において同じ使用率で使用されていないことを示します。たとえば、アミノ酸のアルギニンが6つのコドンにエンコードされています：CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、 およびAGG。コドンCGCの使用率は２２％である一方、コドンAGAは％2.0％に過ぎません。  
【０３００】
【表１４】
2016127850.tif 000022
【０３０１】
ii.
【０３０２】
制限酵素部位の追加または除去
別の例で、核酸の追加的な変更は、制限部位を提供する個々の組み換えＶＨまたはＶＬ核酸配列の5’または 3’のいずれかまたは両方の端末にフランキング配列の追加を含みます。そういった変更は、DNA合成中に、またはPCRによって生殖細胞系組み換え核酸分子に組み込むことができます。例えば、制限酵素部位を組み込むことができるプライマーを利用します。いくつかの例で、このような制限部位の追加は、選択されたベクターの方向で核酸のクローニングを容易にします。例えば、制限部位は、当技術分野で知られているあらゆる制限部位を含めます。典型的な制限部位の配列は表15に記載されています。一般的に、選択される制限部位は、発現ベクターと適合性があり、また平滑末端ライゲーション、あるいは付着末端ライゲーションを容易にするために選択されることがあります。制限酵素の選択は普通であり、当業者のいずれかのレベルの範囲内にあります。  
【０３０３】
【表１５】
2016127850.tif 000023
【０３０４】
いくつかの例で、そういった核酸は、核酸配列内における制限部位を除去するように変更されることがあります。特に、制限部位の除去は、後の消化、ライゲーション、およびクローニングの工程に影響を及ぼさないように行われます。例えば、前述に説明された通り、組み換え核酸分子の変更によって、フランキング制限部位の末端を持たせ、発現ベクターの方向でクローニングを容易にします。一般に、そういった制限部位が特別に選ばれ、フランキング末端にしか存在できないようにします。制限部位が特殊ではなければ、核酸分子配列を変更し、相対する制限部位を除去します。当業者は、制限部位に精通しており、その部位を含む核酸配列を特定できます。表15は除去可能な典型的な制限部位を記載します。  
【０３０５】
いくつかの例では、単一のヌクレオチドの変更だけで、制限部位の変更が可能です。他の例では、2つまたは3つのヌクレオチドを変更して初めて制限部位を除去することができます。前述に説明された通り、組み換え核酸分子に存在する制限部位の変更は、一般的に、コドンの使用を考えて行われます。たとえば、Sal I制限部位(GTCGAC、配列ＩＤ番号：1896)の一つが、核酸内に存在するなら、バリン（Ｖ）をコードするGTCコドンは、GTA、GTG、GTT、あるいはGTCに変更することが可能です。単に最後のＣをＧに変更するだけで、コドンＧＴＣ（使用率15.3％）をＧＴＧ（使用率26.3％）に変えることができ、これはコドンの使用率の11％の増加を示します。あるいは、最後のＣをＴに変更することで、アスパラギン（D）をコードするGACコドン（使用率19.2％）をＧＡＴ（使用率32.2％）に変更し、コドンの使用率の13％の増加を示します。   この例で、上記のいずれの変更を行うことができます。一般的に、変更の目的はコドンの使用率の最も高くかつ有益な増加を達成することです。  
【０３０６】
iii.リンカー
追加的な例で、核酸分子はリンカー配列によって変更することができます。例えば、単鎖抗体（例えばscFv抗体）が望ましい場合は、可変重鎖および軽鎖を最初にリンカによって結合することができます。そのつながりは直接またはリンカーを介して行うことができます。たとえば、ペプチドリンカーをエンコードする核酸は、DNA合成中に、あるいは子生物学技術によって、第１配列（例えば可変重鎖）の5’末端、あるいは第２核酸配列（例えば、可変軽鎖）の3'末端に追加することができます。通常に、リンカーは結果のポリペプチドが可溶性があるように十分に長いです。リンカーとして使用される核酸配列は、約２あるいは２〜６０、あるいは約６０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをエンコードすることができます。例えば、約５〜４０、あるいは約１０〜３０、２〜６、７、あるいは８アミノ酸残基。   リンカー部分の例には、(GlymSer)n  、および(SermGly)nなどのペプチドも含まれるが、ここで、ｎは１〜６（１〜４、２〜４も含まれる）であり、ｍは１〜６（１〜４、２〜４も含まれる）です。そういったリンカーの典型的な例は、グリシン・セリン・ポリペプチドなどのペプチドリンカーをエンコードするいかなる物だが、例えば、__Gly-Gly__, GGGGG (配列ID番号:981), GGGGS (配列ID番号:982) あるいは(GGGGS)n (配列ID番号:985), SSSSG (配列ID番号:983) あるいは (SSSSG)n (配列ID番号:1996)。リンクー部分は例えばHuston et al(1988年)PNAS 85:5879-5883、Whitlow et al.（1993年) Protein Engineering 6:989-995、およびNewton et al., (1996年) Biochemistry 35:545-553で見られます。他の適当なリンカーにはペプチドリンカーを含むいかなるものだが、例えば米国特許4751180号、あるいは4935233号などだが、参考として本書に記載しました。希望のペプチドリンカーをエンコードするポリヌクレオチドの挿入に関しては、適切で在来の技術を利用し、可変重鎖もしくは可変軽鎖の配列のどこでも、またはインフレームで末端５’もしくは３’でできます。たとえば、制限部位が重鎖配列の末端5'、および軽鎖配列の末端3'に追加される一方、リンカーセグメントをエンコードする核酸(例えば(Gly4Ser)3  、配列ＩＤ番号:984)が重鎖配列の末端３’に追加され、軽鎖配列の末端５’との接続ができます。発現の上で、そういった核酸分子はscFv抗体をエンコードし、重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に機能的にリンクされています。
【０３０７】
iv.
【０３０８】
タグまたは探知可能な部分
加えて、小さなエピトープタグ、例えばmycタグ、Hisタグ、Flagタグなど、その他の小さなエピトープタグ、および/またはその他の追加的なDNA配列は、結合のために、可変重鎖、あるいは可変軽鎖をエンコードする核酸配列に追加されます(Arnau et al.(2006年) Protein Expression and Purification, 48:1-13)。場合によって、例えば、LPETGタグなど、定着を許すタグは追加され、リガーゼやソルターゼのタンパク質を利用し、領域指定変更を可能にします(Chan et al. (2007年) PLoS ONE, 2:e1164)。したがって、そういったタグの挿入では、定着が可能（例えば、ビアコアチップで）、および/またはソルターゼの存在で選択的な分類が可能になります。一般的に、追加的なDNA配列が核酸分子の3'または5'の末端に追加され、組み換え可変配列が直接的または間接的にリンカーによってエンコードされます。あるいは、追加のDNA配列を希望の発現ベクターに組み込むことによって、発現の時に得られた抗体は、追加の配列を含むようになります。例えば、配列ＩＤ番号：１に記載されたプラスミドは3265-3306のヌクレオチドに属するHis-Flagタグを含みます（Flagは3265-3288のヌクレオチドに、Hisは3289-3306のヌクレオチドに当たります）。別の例で、配列ＩＤ番号：２に記載されているプラスミドDは3265-3288のヌクレオチドに属するFlagタグ、また3289-3303のヌクレオチドに属するLPETGタグを含みます。このように、重鎖が単独であるいは軽鎖と一緒に発現する際に、得られる抗体はFlagタグ反対あるいはHisタグ反対の試薬によって検出することができます。これは、例10に例示されています。当業者は、検出可能な配列あるいは分子部分を、組み換え可変重軽鎖配列をエンコードする核酸分子に追加し、得られる抗体の検出、および/または除去を容易にします。 
【０３０９】
v.
【０３１０】
突然変異多様性
他の例で、変更は得られる核酸分子の突然変異多様性を促すためにも行われます。アミノ酸の置換、除去、あるいは追加などによって、不規則もしくは試験的にいかなる変更が可能です（例えば、組み換え核酸分子のいかなる領域もしくはセグメントの場合）。変更は、DNA合成中にあるいは分子生物学の通常技術、例えば部位特異的突然変異誘発法、制限酵素消化、および/またはクローニングなどを使用して行うことができます。  
【０３１１】
例えば、変更は、VH鎖をエンコードする核酸分子、およびVL鎖をエンコードする核酸分子に組み込むことができます。また、変更はCDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 あるいは FR4の一つあるいは複数の領域に組み込むことができます。.たとえば、変更は特定の可変領域の１つ、２つ、あるいは３つの全てのＣＤＲに組み込むことができます。一例で、変更はCDR1およびCDR2に組み込まれます（例えば重鎖の可変領域の場合）。一般的に、変更は重鎖（CDRH3）のCDR3に組み込まれます。いかなる組み合わせが考えられます。当業者は、ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子のCDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 およびFR4の領域を知っており、識別することができます（例えば、Chothia et al. (1989年) Nature 342:877-883、Al-Lazikani et al. (1997年) J Mol. Biol., 273:927-948、WO/2007/137616、bioinf.org.uk/abs/、bioc.unizh.ch/antibody/Numbering/NumFrame.html、Martin et al., Bioinformatics Tools for Antibody Engineering in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH (2007年), 96-103ページを参考）。たとえば、CDRは、配列アライメントに基づいてKabat番号付けを、または構造トポロジーに基づいてChothia番号付けを利用するＶＨ鎖およびＶL鎖に見られます。Kabat番号付け方式が配列アライメントから考案されて以来、番号付け方式に関連する配列への挿入は文字で (例えば、27、27A、27B、27C、など)、そして除去は相当する省略された数字に示されるようになりました。Kabat番号付けに基づく軽鎖と重鎖の６つのCDRに相当する残基はCDR-L1: L24-L34、CDR-L2: L50-L56、CDR-L3: L89-L97、CDR-H1: H31-H35B、CDR-H2: H50-H65、CDR-H3: H95-H102です。   当業者は、ＣＤＲの長さが変動するものだと了知し、アライメントとKabatの番号付け方式によって、相当する残基を識別することができます。
【０３１２】
vi.
【０３１３】
指向性ペプチド
いくつかの例で、変更は抗体、あるいはその部分もしくは断片の意図的な変更を含むが、その結果は、抗体、あるいはその部分もしくは断片は生物学的に活性なペプチドの対抗性を模倣します（例えば、International published PCT Application No. WO 2004/050017を参考）。受容体結合、活性化、および酵素活性などの重要な生物学的な機能は、アミノ酸残基、一定期間ペプチド、エピトープ、およびミモトープの限られた量を含む大きなタンパク分子の不連続部位に起因しています。ペプチドのこのエピトープとミモトープは、治療薬として使用することができるが、サイズが小さく劣化が早いため、生体内で不安定です。しかし、ペプチドエピトープは、抗体の可変領域に組み込まれ、抗体は生物学的活性ペプチドの活動を模倣することができます。そういった抗体は、より安定で、より長い半減期を見せます。したがって、抗体あるいはその一部は、特定の対象のポリヌクレオチドに属する抗体の可変領域に配列を組み込むことによって、その対象あるいは機能に従って活動するように設定できます。多くの場合は、既知の対象の構造や機能に関する情報は入手可能です。これらのライブラリーは、将来の抗体ライブラリーのためのリード抗体を提供するので重要です。  
【０３１４】
したがって、本書の変更は生殖細胞系組み換えＶＨおよびＶＬをエンコードする核酸配列を含むが、そこで１つあるいはそれ以上のCDRに相当するヌクレオチドは１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基をエンコードするヌクレオチドに置き換えられます。一例で、生殖細胞系組み換えVHおよび/またはVLをエンコードする核酸分子の変更は、ＤＮＡ合成中に起こる可能性があります。あるいは、変更は、生殖細胞系組み換えVHおよび/またはVLをエンコードする核酸分子に、制限酵素消化とその後に次ぐ希望のペプチドとのライゲーションによって組み込むことができます。必要に応じて、制限部位は、部位特異的突然変異誘発法あるいはＰＣＲによって、ＣＤＲに生成され、ペプチドのライゲーションを容易にします。後者は本書の例１２に例示されています。
【０３１５】
ヌクレオチドは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、16、20、25、またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドをエンコードすることができます。有用な特性を表すペプチドは抗体足場への組み込みに適切です。一般的に、ペプチドは具体的に対象の分子に結合されるものです。ペプチドはまた、例えば結合の後でアゴニストまたはアンタゴニストの作用など、特定の活動を表す物を含みます。ペプチドの活動と作用は、受容体、膜結合表面分子、配位子、酵素もしくは構造タンパク質の結合、または受容体、対象の薬物送達、酵素活性の活性化もしくは制限なども含みます。   ペプチドの例としては、サイトカイン、成長因子もしくは成長抑止剤の受容体など、細胞表面の受容体に結合する物が挙げられます。組み換え生殖細胞VHまたはVLに組み込むペプチド模倣物は、米国特許7169905号、米国特許7396917号、米国特許7272508号、米国特許7019017号、U.S. published Patent 出願番号US200701344、published International 出願番号WO2005060642、Johnson et al. (2000年) Nephrol Dial. Transplant, 15:1274-1277.に記載されたいかなる物を含みます。そういったペプチドの典型的な例は表１６にあります。組み換え生殖細胞系核酸にエンコードされるVHとVLに組み込むためのその他のペプチドは分野で既に知られており（例は上記のいかなるの参考へ）、および/または対象によって特定できます。
【０３１６】
【表１６】
2016127850.tif 000024
【０３１７】
組み換え生殖細胞系VHもしくはVLをエンコードする核酸分子は、ペプチドをエンコードするヌクレオチドの置換、またはCDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 あるいはFR4の１つあるいはそれ以上への挿入によって変更されます。たとえば、組み換え生殖細胞系VHもしくはVLをエンコードする核酸分子は、完全なＣＤＲを、ペプチドをエンコードするヌクレオチドに置き換えることによって変更されます。ペプチドによって置き換えられるCDRはCDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, および/またはCDRL3です。たとえば、結果のVH鎖もしくはVL鎖では１つあるいは複数のCDRがペプチドによって置き換えられます。そして、共同のペプチドの可能性もあります。他の例で、組み換えヒト生殖細胞系VHもしくはVLをエンコードする核酸分子は、ＣＤＲの一部を、ペプチドをエンコードするヌクレオチドに置き換えることによって変更されます。ペプチドによって置き換えられるCDRの一部はCDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, および/または CDRL3の一部です。ヌクレオチドによって置き換えられたＣＤＲの一部は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、16、20、25、またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドをエンコードすることができます。他の例で、１つあるいは複数のCDRの１つあるいは複数の部分がペプチドをエンコードするヌクレオチドによって置き換えられます。そして、得られるペプチドは共同、または別々の可能性があります。さらに他の例で、組み換えヒト生殖細胞系VHもしくはVLをエンコードする核酸分子は、抗体のＣＤＲの２つのヌクレオチドの真ん中にペプチドをエンコードするヌクレオチドの挿入によって変更されます。ペプチドを挿入されたCDRはCDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, および/またはCDRL3です。いくつかの例で、結果のVH鎖もしくはVL鎖は１つあるいは複数のCDRに挿入された１つあるいは複数のペプチドを含みます。そして、ＣＤＲに挿入されたペプチドは共同、または別々の可能性があります。 
【０３１８】
ペプチドのカルボキシ、あるいはN末端にフランキング配列を追加することで、足場抗体内のペプチドの存在を変え、生物学的活性を増加できることは証明されています。したがって、核酸分子は、カルボキシあるいはN末端にフランキング配列を追加されたペプチドをエンコードするように変更することができます。フランキング配列は1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸をエンコードすることができます。フランキング配列はいかなるアミノ酸またはアミノ酸のいかなる組み合わせをエンコードすることができます。グリシンは、最も小さく単純なアミノ酸で、側鎖にただ１つの水素原子を含みます。グリシンはサイズが小さいので限られた空間に入り込んだり、他のアミノ酸ができない特定の構造ができます。プロリンは立体的に拘束されているアミノ酸で、ペプチド配列（REF）を隣接するとペプチドの活性を高める効果を表します。一般的に、フランキング配列はグリシンまたはプロリンをエンコードします。普通は、フランキング配列はプロリンをエンコードします。例えば、核酸分子は、配列ＩＤ番号:891に記載されたＥＰＯペプチドのN- あるいはC-末端に追加されたプロリンおよび/またはグリシンを含むペプチドを、エンコードすることができます。フランキング配列を含む核酸分子の典型的な例は配列ＩＤ番号874-895に記載されたＥＰＯペプチドのいずれもをエンコードします。
【０３１９】
e.
【０３２０】
可変重鎖・軽鎖配列、および核酸分子の生成
本書の方法によってコンパイルされたＶＨ鎖およびＶＬ鎖をエンコードする組み換え核酸分子配列は収集、保管されています。収集された配列は、例えば他の組み換え配列との類似性などによって、特定のいかなる特性で分析することができます。そして配列はその多様性に基づいて並べられます。組換え配列の全て、またはそのサブセットは、DNA合成および/または組み換えDNA技術によって、組み換え核酸分子に仕上げることができます。例えば、配列のサブセットは、抗体ライブラリー作成における配列の類似点または相違点に基づいて選択されます。  
【０３２１】
i.
【０３２２】
収集および保存
この方法によって組み換えられた配列は、収集、保存されます。一般的に、収集と保存はアドレス可能な形式で行われ、各配列がそれぞれの遺伝子座によって確認されます。たとえば、配列はデータベースやリストなどで保存できます。さらに、各核酸配列の遺伝子セグメントの個々のコンポーネントが知られており、組換え核酸配列がコンポネントのセグメントによって特定されています。たとえば、VH1-18_IGHD1-26*01_IGHJ2*01と呼ばれる核酸配列は、DH生殖細胞系セグメントIGHD1-26*01、JH生殖細胞系セグメントIGHJ2*01、およびVH生殖細胞系セグメントVH1-18（命名法によってVH1-18*01とも呼ばれる）を含む可変重鎖をエンコードする核酸配列を特定できます。当業者は、希望の命名法によって核酸配列を特定できるが、コンポネントのセグメントの特定は容易であることを前提とします。  
【０３２３】
一般的に、VH鎖をエンコードする配列は、ＶＬ鎖と別に組み換え、収集、保存されます。さらに、ＶＬ鎖の中で、Ｖカッパ軽鎖をエンコードする配列は、Ｖラムダ鎖をエンコードする配列と別に組み換え、収集、保存されます。各遺伝子座の核酸配列のIDは知られており、アドレス可能な形式内の全ての核酸分子の配列を含むアウトプットファイルにマッピングすることは可能です。  
【０３２４】
本書の目的において、配列はアドレスできるように保存され、配列あるいはそのコンポネントを容易に特定することができます。上記の方法を執行することで、VH鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、10, 100, 500, 1000 (103), 2x103, 4x103, 6x103, 8x103, 104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 106, 107 あるいはそれ以上のＶＨ核酸配列の生成が可能です。上記の方法を執行することで、VＬ鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 (103), 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 104, 5x104, 105 あるいはそれ以上のVL核酸配列の生成が可能です。  
【０３２５】
これらの例は、本書の方法によってコンパイルされた配列を、SequenceHistory.txtファイルに収集、保存する例です。そのようなファイルは、例で、例示ソフトウェアによって生成され、ＤＮＡ合成に指令された配列を表しています。配列はまた、スプレッドシートやリストなど、手動で保存することもできます。
【０３２６】
ii.
【０３２７】
収集された核酸配列の多様性の確定
いくつか例で、組み換え核酸分子は配列の多様性によって収集、保存されます。ライブラリーメンバーの配列の多様性に関する知識は、以下に説明される通り、合成および発現のために、VH鎖およびVL鎖をエンコードする核酸配列の制限されたサブセットの選択に用いることができます。したがって、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相違点によって、その配列多様性を増加することができます。あるいは、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相同性によって、その配列多様性を減少することができます。したがって、たとえば、選択された組み換え核酸の配列がライブラリー内のその他の全ての配列と比較し、異なる物（例えば、10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%など７０％以下の相同生の物）は選択されます。別の例で、初期的検索で”ヒット”が見つかったら、全てのメンバーがより高い配列相同性（例えば、70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% あるいはそれ以上）を共有する別のライブラリーを作成することができます。上記の割合はただの例だけです。当業者は、特定のライブラリーに記載する配列を選択するにあたって、配列相同性に希望に従って限度を付けることができます。
【０３２８】
組み換え核酸配列の間で配列相同性あるいは相違性を確定するにあたって、収集された全ての核酸配列に基づいて配列の多様性は判断されます。一般的に、遺伝コードの縮退のため、まず組み換え核酸配列がアミノ酸配列に移動され、アミノ酸に配列を持たせ、そして得られたアミノ酸の配列相同性が確定されます。その移動は遺伝子コードに基づいて行われ、64のコドンが20のアミノ酸、また３つの終止コドンをエンコードする場合に行われます。各配列の移動は、手動で、あるいはコンピューターやその他の自動化法によって行うことができます。当業者は、タンパク質を移動する方法に精通しています。複数の配列はその配列多様性に基づいて分類や保存されます。
【０３２９】
一般的に、配列多様性は、2つあるいはそれ以上の配列の配列相同性をすることによって行われるが、例えばアライメントによって確定することができます。当業者は、配列の間で配列相同性（いわゆるアイデンティティ）を確定するために様々な技術に精通しています。たとえば、配列相同性は、配列の間でヌクレオチドの相違点を確定することなど、手動で確定することができます。ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列の配列類似性や配列相同性は、通常のソフトウェアやコンピュータプログラムを使用し決定することもできます。このようなアルゴリズムは当業者によく知られています。たとえば、最良のセグメントまたは配列の類似性を確定するには、BLAST (Altschul et al (1990年) J. Mol.Biol. 215:403-410 and Lipman et al (1990年) J. Mol. Biol. 215:403-410), FASTA (Lipman et al (1985年) Science 227:1435-1441), あるいはSmith and Waterman (Smith and Waterman (1981年) J. Mol. Biol. 147:195-197) ホモロジー検索プログラムを利用することができます。グローバルアライメントを行うには、利用できるのは、配列アライメントプログラムのCLUSTALW (Thompson et al (1994年) Nucleic Acids Research 22:4673-4680) です。
【０３３０】
例えば、核酸またはアミノ酸配列は、BLASTを使用し、その配列類似性を確定することができます。関係性を決定する十分な類似性のパラメータは、統計的類似度を計算する、よく知られている方法に基づいて計算されます。BLASTアルゴリズムを使用し2つ以上の配列の関連性を決定する典型的なパラメータの例は、以下の通りです。簡単に言えば、アミノ酸の配列アライメントはBLASTP2.0.8バージョン（1999年1月5日）と次のパラメータを使用し行うことができます：Matrix:0 BLOSUM62、gap open: 11、gap extension: 1、x_dropoff: 50、expect: 10.0、wordsize: 3、filter: on.核酸の配列アライメントはBLASTＮ2.0.6バージョン（1998年9月16日）と次のパラメータを使用し行うことができます：Match: 1、mismatch:-2、gap open: 5、gap extension: 2、x_dropoff: 50、expect: 10.0、wordsize: I 1、filter: off.当業者は、上記のパラメータにおいて、例えば比較の厳格さを増強したり緩和したりなど、どの変更を行い、2つ以上の配列の関係性を決定できるかを知っています。BLASTプログラムは、BLASTビットスコア―というアウトプット指標を提供するが、これは整列された各配列に関連するギャップや置換の数で計算される指数です。スコアが高いほど、整列の重要性が高まります。ビットスコアは、他の選択された各配列に対して最少の配列多様性、あるいは最多の配列多様性を表す配列を選択するに利用されます。  
【０３３１】
別の例で、配列多様性は、アライメント方法（例えばCLUSTAL方法）で2つ以上のアミノ酸、または核酸配列を比較することによって確定できます。(例えば、Higgins, D. G. and P. M. Sharp (1988年) Gene 73:237-244を参考)。CLUSTALアルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることによって、配列をクラスターに分類します。クラスターをペアで整列され、そしてグループに分類されます。例えば、配列Aと配列Bなど、2つのアミノ酸配列との間の類似性の割合は、配列Ａの長さ引く配列Ａのギャップ残基の数引く配列Ｂのギャップ残基の数、割る配列ＡとＢの共同の残基の数、その１００回で計算されます。類似性が低い、あるいは類似性がないアミノ酸配列のペアのギャップは類似性の割合決定に計算されません。核酸配列の間の配列類似性（例えば配列相同性）は、例えばJotun Hein方法など、当分野で知られている他の方法でも計算されます。(例えば、Hein, J. (1990年) Methods  Enzymol.183:626-645を参考。)核酸配列の間の相同性は、例えばハイブリダイゼーションの条件を変更することなど、当分野で知られている他の方法でも確定されます。BLASTclustはクラスタ分析に使用できるその他のプログラムです。BLASTclustは、例で説明されたソフトウェアコンパイルプログラムで使用されます。
【０３３２】
多様性とクラスター情報だけでなく、BLASTビットスコア情報も、配列の選択にあたってユーザーに様々なオプションを提供します。たとえば、選択された配列ができる限り多様性がある場合、ユーザーは抗体ライブラリーを作成することができます。こうするために、ユーザーは多様性スコアおよびクラスター情報を使用し、最高の多様性を示す別のクラスターから配列を選択することができます。あるいは、ユーザーは、例えば、選択される配列が既定された配列にできるだけ類似するなど、そういった抗体ライブラリーを作成することもできます。これはBLAST機能を利用することによって行います。ユーザーは、選択された最初の配列をBLASTし、ライブラリー用のその他の配列をBLASTビットスコアによって、最高のスコアおよび最も高い配列類似性を示す配列を選択できます。たとえば、例5はソフトウェアコンパイルプログラムを使用し組み換え配列の間の配列多様性を確定する方法を説明します。例は、BLASTがすべての配列に適用し、BLASTビットスコアが配列の間に配列類似性あるいは相違性を確定するように計算されることを例示します。  
【０３３３】
iii.
【０３３４】
組み換え配列から核酸分子を生成する
【０３３５】
【０３３６】
【０３３７】
a)  合成 
【０３３８】
必要に応じて、配列は個別に核酸分子に合成されます。収集されたすべての配列あるいはそのサブセットは合成する可能です。ＶＨ鎖あるいはＶＬ鎖をエンコードする核酸分子は、合成遺伝子法を利用し、当業者に知られている方法で合成されます(例えば、米国特許4,652,639号、5,132,215号、5,093,251号、6,110,668号、6,472,184号、公開された米国出願US20060281113号、US20070004041号、US20070122817号、および国際PCT公開された出願WO98/15567号、WO99/47536号、WO00/75364号、WO2004035781号、WO2005071077号を参考)。これらは連結されている一本鎖オリゴの合成を含む標準的な固相ポリペプチド合成法を包括します。方法はまた、配列の全ての可能な組み合わせを代表する普遍的なビルディングブロックとして使用される標準的なトリプレットを使用する方法もあり、反応段階で組み合わせることができます（Slonomics （R））。
【０３３９】
核酸が合成され 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 あるいはそれ以上の塩基対を含むようになれます。遺伝子合成は自動化法で行うことができます。核酸分子を生成するには既知のいかなる合成法を利用することができます。たとえば、オリゴヌクレオチドや遺伝子の合成を目的とする企業があります。例えば、Integrated DNA Technologies社（IDT）（コーラルビル、アイオワ州）、TriLink Biotechnologies社 (サンディエゴ、カリフォルニア州)、Blue Heron Gene Synthesis社 (ボセル、ワシントン州)、およびSloning Biotechnology社 (プッフハイム、ドイツ)。
【０３４０】
合成で使用されるヌクレオチドモノマーは、プリンおよびピリミジンのデオキシリボヌクレオチド（アデノシン（A）、シチジン（C）、グアノシン（G）、およびチミジン（T））、またはリボヌクレオチド（A、G、CおよびU（ウリジン））、またはこのヌクレオチドの類似体もしくはその派生物、例えばペプチド核酸（PNA）、ホスホロチオエートDNA、およびそのような類似体および生物またはその組み合わせかもしれません。他のヌクレオチド類似体は、当分野で知られており、ここで記載されるオリゴヌクレオチドの合成に使用することができます。
【０３４１】
ヌクレオチドを変更することによって、核酸分子は合成されます。一例で、各オリゴヌクレオチドは、例えば5'リン酸基など、末端リン酸基を含みます。例えば本書の方法によって、２つのオリゴヌクレオチドを共同で反対のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの後で、隣接する２つのオリゴヌクレオチドのギャップを消えるために、特定のオリゴヌクレオチドの３’末端と結合されるオリゴヌクレオチドの末端5'にリン酸基が追加されます。一例で、5'リン酸基(PO4)は、オリゴヌクレオチド合成中に追加されます。別の例で、5'リン酸基の追加のために、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ(T4 PK)などのキナーゼはオリゴヌクレオチドに追加されます。他のオリゴヌクレオチドの変更は、よく知られており、本書で提供される方法と利用できます。
【０３４２】
合成オリゴヌクレオチドは化学的に合成することができます。オリゴヌクレオチドの化学合成の方法はよく知られており、オリゴヌクレオチドの成長鎖へのヌクレオチド単量体もしくは三量体の添加を含みます。一般的に、合成オリゴヌクレオチドは、保護基を含むヌクレオチド単量体もしくは三量体を化学的に結合することによって生成されます。たとえば、保護基を含む単一ヌクレオチド、つまりホスホルアミダイトは、一度に1つずつ追加することができます。合成は、普通にオリゴヌクレオチドの3'末端から始まります。ホスホルアミダイトを最も含む3’が固体に付着され、合成は５’末端に各ホスホロアミダイトを追加することによって進行します。追加した度に、保護基が５’リン酸基の最後に追加された塩基から除去され、別のホスホロアミダイトの追加が可能になります。例えば、Behlke et al. “Chemical Synthesis of Oligonucleotides” Integrated DNA Technologies社 (2005年), 1-12、Allen et al. “UltramersTM- The Longest Oligonucleotides Available with Mass Spectrometry” Integrated DNA Technologies社 技術報告書 (2007年)、およびMcBride and Caruthers Tetrahedron Lett. 24:245-248を参考できるが、これらは標準シアノエチル化学（ホスホラミダイトモノマーおよびテトラゾール触媒を使用するもの）を使用し、オリゴヌクレオチドの合成を説明します。このような方法は、普通に100〜200の塩基を含むオリゴヌクレオチドの生成につながります。
【０３４３】
したがって、より大きな遺伝子を合成するには、より微細なオリゴヌクレオチド一連をアニーリングする方法もあります。この方法では、特定のアニーリングによって接続、浄化され、標準的なライゲーションやポリメラーゼ反応を利用する自動DNA合成装置などによって、個別に指定されたオリゴヌクレオチドが生成されます。一般的に、オリゴは、アニーリングを可能にする共通配列の重複ストレッチを有するように設計されます。遺伝子合成の様々な方法が説明されたが、例えば、重複するリン酸化オリゴヌクレオチドのライゲーション(Gupta,N.K. et al. (1968年) Studies on  polynucleotides, 88. Enzymatic joining of  chemically synthesized segments corresponding to the gene for alanine-tRNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 60, 1338−1344; Fuhrmann M et al., A synthetic gene coding for the green fluorescent protein (GFP) is a versatile reporter in Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 1999年８月;19(3):353-61) 、ウルトラマーを利用したデノボ遺伝子構成 (Allen et al. “UltramersTM- The Longest Oligonucleotides Avialable with Mass Spectrometry” Integrated DNA Technologies, Technical Report (2007)  、Fok I法  (Mandecki,W. and Bolling,T.J. (1988年) FokI method of gene synthesis. Gene, 68, 101−107)  、遺伝子合成向けの変更系リガーゼ連鎖反応  、完全長分子が重複する累進的な伸長によって生成されるPCR組み立て(Stemmer,W.P., Crameri,A., Ha,K.D., Brennan,T.M. and  Heyneker,H.L. (1995年) Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene, 164, 49−53)  、熱力学的平衡インサイドアウト(Gao X, Yo P, Keith A, Ragan TJ, Harris TK.  Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis: a novel method of primer design for high-fidelity assembly of longer gene sequences. Nucleic Acids Res. 2003年１１月15日;  31(22):e143)  、あるいは組み合わせたアプローチ (Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res. 2004年４月１５日; 32(7):e59) なども含むがこれらに限りません。オリゴヌクレオチドが長いほどエラーの頻度が高くなるため、より短いオリゴヌクレオチド（２００以下の塩基対）の組み合わせを利用する方法は普通です。  
【０３４４】
合成された分子は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、および脱塩など、よく知られている多くの方法によって浄化することができます。  
【０３４５】
一実施形態で、合成された核酸は、マルチウェルプレートに配列され、そこで各プレートはそれぞれの核酸に相当します。具体的には、プレートの各遺伝子座は、重鎖か軽鎖かを問わず抗体可変領域をエンコードする核酸を含みます。マルチウェルプレートの各ウェルに含まれている核酸のアイデンティティは知られているものであり、プレート内の全ての核酸の配列を含むアウトプットファイルにマッピングされます。マルチウェルプレートプレートは、96ウェルプレート、384ウェルプレート、および1536ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限りません。実施例で、核酸は空間的に96ウェルプレートに配列されています。  
【０３４６】
合成時に、結果として得られる核酸分子は、個別に遺伝子座（ウェル、チップ、タグ、およびその他のアドレス可能な形式など）に記載されます。プレートの各遺伝子座は、合成されたおよび組み換えられた別々の核酸分子を含むことができるが、その核酸分子は重鎖可変領域または軽鎖可変領域またはアドレスに対応するその一部をエンコードします。各遺伝子座の核酸分子のIDは知られており、アドレス可能な形式内の全ての核酸分子の配列を含むアウトプットファイルにマッピングすることは可能です。例えば、核酸分子は空間的配列によってマルチウェルプレートプレートにアドレスされ、プレートの個々遺伝子座は個別で1つの核酸分子を含みます。マルチウェルプレートプレートは、12ウェルプレート、24ウェルプレート、96ウェルプレート、384ウェルプレート、および1536ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限りません。  
【０３４７】
b）組換え生成
いくつかの例で、組み換えＶＨ配列および/またはＶＬ配列またはそのサブセットは、組み換えDNA技術を利用し組み換え核酸分子に仕上げることができます。当業者は、例えば、ＰＣＲ、クローニング、および制限酵素消化などをも含み、ＤＮＡ組み換え技術に精通しています。このような技術は、上記に説明された通り、生殖細胞系セグメントを組み合わせ、インフレームで組み換え核酸分子を生成するために利用できます。一般的に、各ベクトルが個別で生み出され、各ベクトルはクローニングプロセスによって配列のＩＤを表します。したがって、組み合わせ抗体ライブラリーの組換え生成はアドレス可能です。 
【０３４８】
DNA組み換え技術を使用し組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法では、生殖細胞系セグメントは、リンカーによって直接または間接的につながっており、得られる核酸分子はインフレームで機能的であり、生産性抗体という結果になります。リンカーは、ペプチド、ポリペプチド、またはアミノ酸です。たとえば、制限酵素などの組み換えＤＮＡ技術を利用することによって、アミノ酸はV-D、D-J、およびV-Jの接合部に挿入され、生殖細胞系セグメントの結合を容易にすることができると知られています。本書の例14にあるいうに、リンカーの典型的な例として、DH生殖細胞系セグメントの3’末端とJH生殖細胞系セグメントの5’末端の間にＳＹをエンコードするヌクレオチド配列が挙げられます。  
【０３４９】
組換えDNA技術によって組み合わせ抗体ライブラリーを作成する方法では、ライブラリーメンバーの間で共同の核酸配列を含む親ベクトルの一つまたは複数が生成されるかもしれません。例えば、ベクトルはライブラリーのメンバーの間で共同であるVH、DH および/またはJH生殖細胞系セグメントの核酸配列、その派生物、あるいはその一部、および/またはVLおよび/またはJLを含むように生成できます。セグメントの挿入は、本書で説明されるように、リーディングフレームに関して行われ、結果として得られるコンパイル核酸分子はインフレームであることは知られています。以下の説明は、組換えDNA技術を使用し組み合わせ抗体ライブラリーを作成する方法の総括的な要約です。参照は例示のためであると知られています。本書の説明を使用することによって、当業者は生殖細胞系セグメントからコンパイルされた核酸、あるいはその派生物を含む類似したベクトルを生成し、インフレームで組み換えのVH鎖またはVL鎖を生成することができます。例えば、VH/DH/ JH あるいはVL/JLセグメントを組み換えベクトルに添加する順番は不規則であることは知られているが、最終的なヌクレオチド配列のクローンはインフレームで組み換えＶＨ鎖もしくはＶL鎖をエンコードすることは前提とします。
【０３５０】
したがって、普通に親ベクトルは、ライブラリーの全てのメンバーに共有される配列を含むように生成されます。たとえば、全てのベクトルが共通の生殖細胞系VHを共有する場合、適切なリーディングフレームにVHを含むベクトルが生成され、これは他の生殖細胞系セグメントの組み込みのために操作できます。例えば、VH生殖細胞系配列は、DH生殖細胞系配列との結合のために、３’末端で制限酵素部位を含むように変更されます。別の例で、ベクトルはVH, DH あるいはJHの生殖細胞系配列の一部を含むように生成されます。たとえば、ベクトルは本書で規定されるように共通フレームワーク配列を含むように生成されます。これは例14で例示されているが、そこで組み換えプラスミドベクトルは、JH生殖細胞系セグメントの共通フレームワーク４領域を含むように生成されました。本書の方法によって組み合わせ抗体ライブラリーを作成するに使用される親ベクトルの典型的な例は配列ID番号：2051に取り上げられるが、そのベクトルは、共通のVH生殖細胞系セグメント（VH3-23（IGHV3-23*01）内部の制限部位を除去し３’末端に追加的な制限部位を加えるように変更できる）、およびＪＨ生殖細胞系セグメントの共通フレームワーク４領域を含みます。
【０３５１】
そこで親ベクトルはさらに残りの生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部を挿入するために使用され、最終的で複数のベクトルはそれぞれ組み換えVH鎖および/またはＶＬ鎖をエンコードする核酸配列を含むように生成されます。親ベクトルから最終的なベクトルまでの生成は段階的に起こることもあるので、したがって、少なくとも1つの中間ベクトルが生み出されます。一般的に、後続の生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部のための核酸配列は、親ベクトルもしくは中間ベクトルへの後続のクローニングに向けて、オリゴヌクレオチドとして生成されます。終止コドンがいかなる段階で挿入される場合、その終止コドンは本書で説明された方法で除去されるか終止コドンを含む特定のセグメントがクローンされないかという結果になると知られています。隣接する核酸配列の結合を容易にするために、オリゴヌクレオチドは3'および/または5'末端で補完的な制限酵素部位を含むように生成されます。  
【０３５２】
たとえば、親ベクトルに含まれるコンポーネントによって、中間ベクトルは生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部を含むように生成されます。例えば、中間ベクトルは上記の親ベクトル（配列ＩＤ番号：2051に記載された）から生成されるが、そこで各ベクトルは適切なリーディングフレームで別々のJHセグメントを含みます。JHセグメントは、生殖細胞系セグメント、あるいはそれによる派生物です。変更されたJH セグメントの典型的な例は配列ID番号：3450-3455、およびJH領域をエンコードする例は配列ID番号：3456-3461に記載されています。.JHセグメントの全体、あるいは一部は既存の親ベクトル、あるいは中間ベクトルに追加されます。例えば、上記に説明された通り、親ベクトルは共通フレームワーク４領域を含むように生成された場合、JHセグメントのCDR3の最終部分に相当するヌクレオチドを含むJHセグメントの一部を挿入することができます。例えば、別々のJHセグメントなど、様々なセグメントを追加することで、ライブラリーの多様性を増加することができます。したがって、複数の中間ベクトルが生成されます。たとえば、例14で6つの中間ベクトルが生成されます（配列ＩＤ番号：2064-2069のいかなる配列）。
【０３５３】
コンパイル生殖細胞系配列のすべてのコンポーネントを含む複数の最終ベクトルが生成されます。上記の通り、ベクトルに挿入される残りのヌクレオチドはオリゴヌクレオチドとして生成され、また普通に3'末端および/または5'末端で補完的な制限酵素部位を含みます。上記に述べられた通り、オリゴヌクレオチドは挿入されたセグメントのための適切なリーディングフレームを提供し、終止コドンを含みません。加えて、オリゴヌクレオチドは親ベクトルもしくは中間ベクトルに含まれるセグメントの既存のリーディングフレームを維持するために生成されます。例えば、説明された通り、DH領域のリーディングフレームは重要ではないと知られています。したがって、DH生殖細胞系セグメントを含むDHセグメントは、いかなるリーディングフレームに挿入したり、不規則なヌクレオチド配列だったりします。例14はDH生殖細胞系セグメント（例えば、配列ID番号: 239-245, 248, 250, 252, 254, 256, 258-272に記載されているもの)、またはそれによる逆位セグメント(例えば、配列ID番号: 3462-3488に記載されているもの）を全ての３つのセグメントに挿入することによって複数の最終ベクトルが生成されるプロセスを例示します。しかし、オリゴヌクレオチドを生成するにあたって、１つまたは複数のヌクレオチドは3’または5’末端から除去され、隣接するJHセグメントのリーディングフレームを維持します。これは例１４で見られるように、リーディングフレームを維持するためにヌクレオチドを追加もしくは除去する条件があります。  
【０３５４】
得られた最終ベクトルは、ＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖をエンコードするコンパイル済みVH/DH/JH あるいはVL/JL生殖細胞系セグメント、あるいはそれに派生する物を含みます。各最終ベクトルは個別であり、個別の組み換えＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖をエンコードする個別の核酸配列を含みます。核酸分子はすでに発現ベクターにクローン化されているので、上記に説明された通り、直接に発現系に変換することができます。  
【０３５５】
f.
【０３５６】
抗体あるいはその一部あるいはその断片の発現および生成
本書の方法では、合成組換え核酸分子、または組み換え生成による組み換え核酸分子などの核酸分子は、発現ベクターにクローン化されます。ポリヌクレオチドは、普通に制限酵素消化およびライゲーションによって、ベクトルに挿入されます。当業者に知られている従来のいかなるベクトルは、真核生物や原核細胞での発現に使用することができます。典型的なベクトルには、以下に記載されている通り、プラスミドA、C、およびDがあります。ベクターは、適合性のある発現系が、核酸の増幅および/またはエンコードされた可変重・可変軽鎖ポリペプチドの発現に利用できるように変更できます。  
【０３５７】
一般的に、ベクターへのライゲーションは、そこで発現される組み換えポリペプチドのアイデンティティを確認できるように、アドレス可能な形式で行われます。例えば、核酸を含むベクトルは空間的にマルチウェルプレートプレートに配列にされ、プレートの個々遺伝子座は個別で1つの核酸を挿入されたベクトルを含みます。具体的には、プレートの各遺伝子座は、重鎖または軽鎖をエンコードするベクトルを含みます。マルチウェルプレートの各ウェルに含まれている核酸のアイデンティティは、例えば上記の合成や編集で収集され保存された配列にマッピングすることによって知られています。たとえば、ベクトルへのライゲーションは、既に上記の核酸分子を含むマルチウェルプレートに直接に行うことができます。マルチウェルプレートプレートは、96ウェルプレート、384ウェルプレート、および1536ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限りません。実施例で、核酸は空間的に96ウェルプレートに配列されています。  
【０３５８】
一般的に、本書の方法を利用するにあたって、可変重鎖をエンコードする核酸分子は最初のベクトルに連結されます。可変軽鎖をエンコードする核酸分子は２番目のベクトルに連結されます。最初のベクトルと２番目のベクトルは、可変重鎖および可変軽鎖の共発現のために、同じ発現宿主に変換することができます。ポリペプチドは、発現時に、可変重鎖と可変軽鎖のポリペプチドの相互作用のおかげで、機能するようになります。いくつかの例で、核酸分子は、発現の前に、リンカーの利用などによって直接に結合することが可能です。そのような例で、単一の核酸分子は、可変重鎖および可変軽鎖をコードし、単一のベクトルに連結し発現することができます。  
【０３５９】
ここで挙げられる全ての方法では、発現した抗体は、最小限に、抗原結合部位を形成するためのVH鎖およびＶＬ鎖、またはその一部を含みます。加えて、必要に応じて、発現のために一定鎖は、可変鎖との効果的なつながりで挿入されます。方法に関する全ての例では、組換え核酸は抗体やその断片をエンコードするが、例えば、IgGを１つ、Fab断片を１つ、F(ab')2断片を１つ、あるいはFv断片（例えば、ジスフィドで結合されたＦｖあるいはＦｖ単一鎖）を１つなども含まれるがこれらに限りません。典型的な抗体の例は、Fab断片です。このような抗体またはその断片は、当業者に知られているいかなる方法で浄化されます。
【０３６０】
セクションFは、抗体またはその断片を発現、浄化させる方法について説明します。
2.オートメーション
【０３６１】
上記の方法におけるいかなる段階は、自動化および/または高生産性および/またはいかなる方法で合理化されることは可能です。当業者は、インシリコデータベースの設置、コンピュータープログラムのアプリケーション、ロボット工学技術、および/またはその他の高生産性化を含み、システムやプロセスの自動化に精通しています。本書の方法におけるプロセスの全体、または特定のステップが自動化できると考えられます。オートメーションの程度はユーザーによります。以下の説明と例は、方法の様々なプロセスの自動化を例示しています。
【０３６２】
a.ユーザーによるデータベース
本書の方法を応用するにあたって、生殖細胞系セグメントまたはそれによる派生物が必要です。そういったセグメントは当業者に知られている物で、上記に挙げられた市販のデータベースで入手できます。そういった生殖細胞系セグメントは上記の表3〜5の配列リストに記載されています。変更されたJH生殖細胞系セグメントの例は配列ＩＤ番号3450-3455にあります。手軽なアクセスのために、配列はユーザーが作成したデータベースにコンパイルすることもできます。配列の全ての情報を含むファイルまたはデータベースの作成によって、この配列への即時アクセスが可能になります。加えて、配列ファイルは他のシステムやプロセスに接続し、方法の応用を容易にすることができます。例えば、図9、例4で見られるように、データベースは、入力ファイルとして配列コンパイルアルゴリズムにリンクされ、配列コンパイルのためのV(D)Jの重鎖および軽鎖配列を特定しています。  
【０３６３】
データベースは生殖細胞系VH, DH, JH, Vk, Jk, Vl およびJlセグメントのための配列を記載しています。.特に、データベースファイルは、配列ＩＤ番号:10-451、868、に記載されている核酸、あるいはそのサブセットの配列を含みます。配列は、FASTA形式で指定され、全ての配列はその間に空白を含むとさらに便利です。本書の方法の応用に当たって、JH, Jk および Jl セグメント配列は、それぞれの最適なリーディングフレーム（表１３に記載）に対応するフレームトリプレットをエンコードしながら、データベースファイルに記載されています。配列は、特定のためにデータベースファイル内で名前を与えられます。例えば、生殖細胞系セグメントは [VH], [DH], [JH], [VK], [JK], [VL], および[JL]のセクションヘッディングで特定されています。そのデータベースファイルは例で（例えば例３で）SequenceDatabase.txt.fileと記載されている。図11は、配列データベースのファイル形式の概略図を示しています。
【０３６４】
加えて、データベースは、方法を応用する際に使用される配列を含むこともあります。たとえば、データベースは、制限部位向けの核酸配列を含む場合に、[制限部位]のセクションヘディングによって示すことができます。これらの配列は、以下に説明されている通り、特定のプログラムプロセスによってアクセスし、また、組み換え核酸分子内に存在する制限部位に対応する核酸配列を特定することができます。データベースに記載されている制限部位配列は配列ID 番号：977-980, 1889-1900にあるいかなる物を含みます。当業者に知られている従来のいかなる制限部位配列は、データベースファイルに記載することができます。たとえば、図11にあるようにデータベースファイルの略図は制限酵素Mfe I向けの配列を含みます。
【０３６５】
データベースファイルは定期的にアップデートされ、内容の配列が増えると見なされています。加えて、データベースファイルは、方法の応用に使用できると見なされる配列を含むように、さらにアップロードできます。たとえば、抗体生殖セグメント以外のタンパク質をエンコードする核酸配列は、FASTA形式を使用して、適切なヘッディングでデータベースに入力することができます。それで、この配列は生殖細胞抗体配列に組み換えられることが可能です。たとえば、セクションタイトル[DH]の下にペプチドをエンコードする核酸配列を追加することによって、抗体のDHにペプチド配列を挿入することは可能です。  
【０３６６】
b.  
配列編集
【０３６７】
配列の編集方法は、例えば以下のソフトウェアを使用し行うことができます 。本書の方法に従って生殖細胞系セグメントを編集する可能なアルゴリズムもしくはプロセスを行うように設定されたいかなるソフトウェア、またはいかなる適切な方法を利用することができます。ソフトウェアープログラミングに精通している当業者は、そういったアルゴリズムもしくはプロセスを行うプログラムを作ることができます。一般的に、そのソフトウェアは、次のいずれかのプロセスを実行するように設計されています：
(a) ユーザーがインシリコで作成した全ての利用可能な生殖細胞系セグメント(VH, DH, JH, Vk, Jk, Vl およびJl)のデータベースへアクセスできます。 
(b) アルゴリズムを利用し、重鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’-VH-DH-JH-3’ の組み合わせ)を生成、カッパ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’-Vk-Jk-3’ の組み合わせ)を生成、およびラムダ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’-Vl-Jl-3’ の組み合わせ)を生成できます。 
（c）アルゴリズムを利用することによって、接合部の核酸配列を変更し、核酸配列がインフレームにある結果を生み出します。 
（d）結合によって得られた核酸配列を変更し、偶然に生成された終止コドンを除去します。 
（e）結果として得られる完全長核酸を変更し、細菌発現に対するコドンの作用を最適化します。 
（d）得られた核酸配列を変更し、不要な制限部位を除去します。 
(g)最適化された完全長核酸配列の5’ および3’末端でクローニングを行うために、制限部位を含むフランキング核酸を挿入します。
(h) 配列多様性に基づいて組み換え核酸配列に順番を付けます。
(g) 組み換え核酸配列のライブラリーから組み換え核酸配列（重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む物）を選択します。 
（h）選択された核酸配列を、アドレス可能な形式の特有の遺伝子座に移動します。 
（i）個別の重鎖または軽鎖の配列を記載するアドレス形式に基づいて、全ての組み換え核酸配列を含むアウトプットファイルを生成し、各遺伝子座がアドレス可能、またアドレスされた形式の遺伝子座であることを確保します。
【０３６８】
本書の方法を本書の説明に従って利用するために、ここで、ソフトウェア、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムを提案しました。例は、典型的なソフトウェア、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムを表します。当業者はそのソフトウェアー、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムの公開後、それぞれを変更することができると認められているが、またその変更の内容をここに記入されると見なされます。
【０３６９】
たとえば、本書に取り上げられる方法の各プロセスは、本書の例に登場する模範的なコンピューターソフトウェアによって実行されます。たとえば、例2、図8、図9は、生殖細胞系セグメント編集の模範的なプロセスを例示します。図9の流れ図は、上記の(a)- (d) および(f)の各ステップのプロセスを例示します。たとえば、例2、および図10は、配列多様性に基づいて配列に順番を付ける模範的なプロセスを例示します。図10の流れ図は、配列多様性スコア確定に次ぐ配列順番づけプロセスを例示します。また、図17はその順番の例を挙げています。
【０３７０】
c.  タンパク質の発現および浄化のオートメーション
タンパク質の発現および浄化を自動化する方法は当業者に知られています(例えば、Lesley et al. (2001年) Protein Expression and Purification, 22:159-164、Acton TB et al. (2005年) Methods Enzymol., 394:210-43、Nguyen et al. (2004年) Journal of Structural and Functional Genomics, 5:23-27を参考)。このようなプロセスは、普通に機械的な方法で行われます。  
【０３７１】
タンパク質の発現および浄化の高生産性自動化の典型的な例はPiccolo(TM)(Wollerton et al. (2006年) JALA, 11:291-303)です。Piccolo(TM)システムは、E.coli、およびバキュロウイルスによる細胞昆虫発現系からのタンパク質の発現と浄化を自動化します。Piccoloは複数で異なるタンパク質の発現と浄化を同時に行うことができます。Piccoloシステムは、複数のサンプルの発現、浄化を同時にサポートする曝気アセンブリによる24位の培養容器ブロック（CVB）を使用します。Piccoloシステムは以下の機能を行う4つのモジュールで構成されています。液体ハンドリングモジュール、CVBインキュベーター、遠心分離機、およびストレージカルーセル。レール取り付け6-軸RX60LSpinal Transferロボット(ST Robot; Staubli, Horgen, スイス)は液体ハンドリングモジュール、CVBインキュベーター、遠心分離機、およびストレージカルーセルの間に実験器具を移動させます。システムは、ユーザーが発現と浄化プロセスの条件を制御できるようにするソフトウェアによって動作します。  
【０３７２】
発現プロセスは細菌培養物などの入力接種材料を伴う適切な増殖培地を含むCVBプレートの接種からはじめることができます。２４培養容器ブロックに対して合計で、576培養物のユニットが同時に生殖することができます。プレートはユーザーが指定した期間内と条件に従って培養されます。典型的な成長および誘導温度は16℃〜37 ℃の範囲で変動し、成長および誘導に最適な温度の選択は当業者の基本的な技術です。細菌増殖は監視する可能です。必要に応じて、CVBプレートの組み立てに誘導物質の適切な量を添加し、そして適切な条件の下で増殖することによって、タンパク質の発現を誘導することができます。タンパク質の発現は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）など、発現ベクターとの適合性のある誘導物質を添加することによって、誘導することができます。発現時間は２〜４８時間です。最適な発現時間の選択は当業者の基本的な技術です。引き続きの発現プレートは冷却条件で保管されます。例えば、例9に説明されている通り、空間的に整列された形質転換細胞は、細胞増殖やタンパク質の発現向けの２４-ウェル培養容器ブロックに位置付られます。形質転換細胞の96-ウェルプレートにつき、培養容器の4つが生成され、それぞれの96-ウェルプレートに対する複数のFabが増殖します。  
【０３７３】
希望のタンパク質の発現の後、Piccolo（TM）システムは得られたタンパク質の残りを浄化するのに精製するために使用できます。Piccolo機は溶解および浄化のプロセスを行うために設定されています。細胞は採取され、浄化技術との適合性のある適切な溶解バッファーを使用し溶解されます。溶解バッファーの選択は当業者の基本的な技術です。そして、得られる浮遊物は、カラムクロマトグラフィーによって、anti-flag樹脂あるいはNi-charged樹脂などの適切な改質樹脂で浄化されます。当業者は、本書で説明された通り、タンパク質浄化に適切な樹脂を特定することができます。樹脂は、実行を開始する前に、適切な洗浄バッファーで手動で平衡化する必要があります。結合タンパク質は、適切な溶出バッファーによって溶離され、そしてその溶出液は出力プレートで収集されます。出力プレートは、オペレータに回収されるまで、冷温（例えば、6℃）で保管されます。  
【０３７４】
純度はゲル電気泳動、染色法、および分光技術など、分野で知られているいかなる方法で判定されます。本書で説明されたように、他の浄化方法はPiccoloと組み合わせることができます。たとえば、タンパク質はタンパク質浄化の直交二次高生産性方法を利用し、さらに浄化できます（例えば、例１０を参考）。また、適合性のある樹脂、Akta浄化装置（GEヘルスケア社）、およびオートサンプラを使用することによってカラムクロマトグラフィーをさらに行うことができます。浄化抗体の典型的な例として、タンパクG樹脂を利用することができます。   
【０３７５】
E.  ライブラリー
ここでライブラリーを紹介します。ライブラリーにはＶＨ鎖およびＶＬ鎖をエンコードする核酸ライブラリー、組み換え核酸分子によって変性したベクトルライブラリー、および抗体ライブラリーがあります。いくつかの例では、各ライブラリーに属するメンバーは、例えばセクションE.2.に取り上げられたいかなるアドレス可能な形式で処理されています。ライブラリーに属するメンバー、そして結果として出来上がるライブラリは上記で挙げられた方法によって作成されます。  
【０３７６】
1.  VH核酸ライブラリー、およびそれによるベクトルライブラリー
ここで、VH鎖をエンコードする組み換え核酸ライブラリーを紹介します。ここで取り上げられるライブラリーは完全にVH, DH およびJH生殖細胞系セグメントあるいはそれに由来する物で構成されている核酸分子を含みます。VH, DH およびJH生殖細胞系セグメントは、上記の表３ｖに記載されているいかなるセグメント、あるいはそれに由来する物を含みます。いかなる置換配列は可能です。ライブラリーの核酸分子は、配列があるが、VHセグメントはDHセグメントの5’で、そしてDHセグメントはJHセグメントの5’です。セグメントは直接的または間接的にペプチドリンカーによって、リンクされています。
【０３７７】
ライブラリー内の核酸分子が生殖細胞系セグメントの派生物なので、そういった核酸ライブラリーに属するメンバーは、VL鎖をエンコードする核酸との共同発現の時に、ナイーブ抗体をエンコードすることができる。ライブラリーはナイーブで、生殖細胞から由来すると見なされるにもかかわらず、本書の方法を利用するにあたって、結合セグメントの接合領域は変更され、核酸分子をエンコードする生成物はインフレームで生み出されます。しかし、このような変更は軽微なものであり、一般的に生殖細胞系セグメントの１つだけの単一ヌクレオチドの様々な挿入、あるいは除去を伴います。加えて、終止コドンや制限酵素部位の除去など、本書で取り上げられる方法によって組み換え核酸配列を変更することも、ナイーブ抗体の生成につながります。
【０３７８】
ライブラリーは、生殖細胞系セグメントを含む配列からコンパイルされ作成されることも可能です。場合によって、ライブラリーには、VH およびJH生殖細胞系セグメントの間のヌクレオチド配列、また完全にVH およびJH生殖細胞系セグメントで構成されている組み換え核酸分子を含むライブラリーもあります。その領域はCDRH3の中部を含むが、CDRH3は結果として得られる抗体の抗原特異性の決定に重要な役を果たしています。ヌクレオチド配列は不規則のいかなるヌクレオチド配列が可能です。いくつかの例で、ヌクレオチド配列は、特定の対象に対するペプチド模倣物をエンコードする配列、例えば細胞表面の受容体などが可能です。典型的なペプチド模倣物は表16に記載されています。一般的に、ヌクレオチド配列は約 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 あるいはそれ以上の長さのヌクレオチドで構成されています。結果として得られる核酸分子は、ライブラリーで、VHセグメントは不規則ヌクレオチド配列の5’で、そして不規則ヌクレオチド配列はJHセグメントの5’という配列を示しています。場合によって、不規則ヌクレオチド配列はDH生殖細胞系セグメントです。
【０３７９】
別の例では、ここで取り上げられるライブラリーは組み換え核酸分子を含むが、そこで含まれるVH, DH およびJH生殖細胞系セグメントの１つあるいは２つあるいは全ては、例えば、アミノ酸の添加あるいは除去、挿入などによって変更されました。たとえば、ライブラリーは指向性ペプチドをエンコードする配列を含有する核酸分子を含みます。ライブラリーはまた、アミノ酸置換（例えば、ＣＤＲの１つあるいはそれ以上のアミノ酸）をエンコードするヌクレオチド突然変異を含む組み換え核酸分子も包括します。さらに他の例で、ここで取り上げられるライブラリーは組み換え核酸分子を含むが、そこで、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子の部分あるいは全部、または少なくとも１つあるいはそれ以上のVH, DH およびJHは既存のモノクローナル抗体（例えば、表９に記載されているいかなる物も含む）から派生します。ここで取り上げられるライブラリーの典型的な例は、例えば、配列ID番号：1043もしくは配列ID番号：1058(末端制限部位配列を含む配列ID番号：453)に記載されているanti-CD20抗体のＶＨ鎖、または配列ID番号：1057 (末端制限部位配列を含む配列ID番号：452)に記載されているハーセプチンをエンコードする核酸分子を含むことは可能です。 
【０３８０】
ここで取り上げられる組み換え核酸分子のライブラリーは、上記の例の１つ、複数、あるいは全てを代表するメンバーを含むことは可能です。また、ここで取り上げられるいかなるライブラリーは、異種配列のメンバーを含むことも可能です。例えば、制限部位配列、リンカー配列、タッグやその他の探知可能な部分を含む配列、あるいはそれ以外の配列などです。
【０３８１】
ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーでは、組み換え核酸分子の各メンバーは生産性があり、VH鎖をエンコードする核酸分子と共同で発現すると、抗原結合部位を形成するために十分な機能性のある抗体あるいはその一部を生成します。加えて、ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーでは、ライブラリーに属する核酸はそれぞれ異なります。ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーは 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000 (104), 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 106 あるいはそれ以上のメンバーを含むことができます。ここで取り上げられる核酸メンバーはアドレス可能な形式で提供され、アドレスされると、配列内の位置によってそのアイデンティティが確認できます。
【０３８２】
たとえば、模範的なＶＨ核酸ライブラリーは、配列ID番号：454-805に記載されているメンバーを含み、各メンバーはVH, DH およびJH生殖細胞系セグメントの別々の組み換え核酸分子を代表します。このようなライブラリーは3’および5’末端で制限部位向けの異種配列を含みます。ライブラリーに属するメンバーは、配列ＩＤ番号：1059-1410に記載されている物のように、異種配列を含まない配列を有するものも含むことができます。  
【０３８３】
他の例で、模範的なＶＨ核酸ライブラリーは、配列ID番号：2070-2759に記載されているメンバーを含み、各メンバーはVH, DH およびJH生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来するものの別々の組み換え核酸分子を代表します。このようなライブラリーは制限部位向けの異種配列を含むメンバーを包括するが、そのメンバーは異種配列の位置によって、CTAGCに相当する３’末端に含むメンバー(配列ID番号：1903に記載された)、およびCCATGGCAに相当する５’末端に含むメンバー(配列ID番号：1901に記載された)です。ライブラリーに属するメンバーには、配列ＩＤ番号：2070-2759に記載されている物のように、3’および5’または両方の末端で異種配列を含まない配列を有するものも含まれると知られています。 
【０３８４】
ＶＨ核酸ライブラリーはここで取り上げられる他のいかなるライブラリーあるいはそのサブセットに属するいずれものメンバーを含むこともできます。例えば、ＶＨ核酸ライブラリーは配列ID番号：454-805 および2070-2759、あるいはそのサブセットに記載されているメンバーをも含みます。ライブラリーに属するメンバーには、3’あるいは5’末端で異種配列を含むメンバー、および/'または異種配列を含まないメンバーも含まれます。 
【０３８５】
いくつかの例では、ここで取り上げられるライブラリーのいかなる核酸配列はベクトルライブラリーを作成するためにベクトルに組み込むことができます。ベクトルライブラリーの例としては、重要なプラスミドＡもしくはプラスミドＢに含まれているＶＨ鎖をエンコードする組み換え核酸分子のライブラリーが挙げられます。  
【０３８６】
2、VLの核酸ライブラリとベクトルライブラリ
本発明は再結合されたVLチェーンを含む核酸ライブラリです。ライブラリは、ラムダ或いはガンマライトチェーン、またはその組み合わせが含まれています。したがって、ここでいうライブラリは完全にVkとJk生殖細胞と・またはVlとJl生殖細胞のセグメントから再結合された核酸分子です。
VkとJkと・或いはVlとJlの生殖細胞セグメントは上記表4-5のすべてまたはそのひとつのサブセットが含まれています。任意の置換が可能です。
【０３８７】
ライブラリ内で形成した核酸分子には、VLセグメント (Vk 或いはVl)が5’対 JL セグメント (Jk或いは Jl)という配列があります。
ライブラリ内の核酸分子は生殖細胞セグメントから得たもので、VHチェーンをエンコードする核酸と共同に表現された場合、この核酸ライブラリはナイーブ抗体をエンコードすることができます。
このライブラリは単純で、かつ生殖細胞から由来すると考えられています。それにもかかわらず、この方法を実施した上で、セグメントの共同領域は、結局にフレーム内にて核酸分子がエンコードされることになります。
【０３８８】
しかし、このような変化は、軽微なものであり、かつ、普通はさまざまな単一の生殖細胞セグメントのヌクレオチドの挿入または削除が含まれています。また、他の組替核酸配列に対する変更も、前記する方法を採用すれば、たとえば、終止コドンと制限酵素部位配列の削除すれば、やはりナイーブ抗体になれます。
【０３８９】
いくつかの例では、ここでいうライブラリは、再結合された核酸分子を含みます。かつ、核酸分子に含まれている最低ひとつ或いは二つのVk,とJk生殖セグメントまたはVl と Jl  生殖セグメントは変更されたものです。アミノ酸の挿入、削除または添加による変更とか挙げられます。
たとえば、ライブラリは主導ペプチド配列がある核酸分子を含みます。ライブラリはまた、再結合されたアミノ酸置換をエンコードする塩基変異がある核酸分子を含みます。CDRの1つまたは複数のアミノ酸とか挙げられます。
【０３９０】
もう一つの例では、ここで言うライブラリは再結合された核酸分子を含みます。当該核酸分子のうちに、少なくとも一部の核酸分子、たとえば、VHチェーン付きの核酸分子全体、或いは少なくとも一つ或いは一つ以上のVk,とJk或いはVl aと Jl  は既存のモノクローナル抗体に由来するもので、表9に掲げるモノクローナル抗体を含むが、これに限りません。
【０３９１】
たとえば、配列番号1423（配列番号：818、端末制限部位配列を含む）に記載されているように、例示的なライブラリはハーセプチンのVLチェーンつきの核酸分子を含めることができます。でなければ、質問番号：1050或いは配列番号：1440（配列番号：835端末制限部位配列を含む）に記載されているように、ライブラリは反CD20抗体のVLチェーンつきの核酸分子を含めることができます。ここでいう組替核酸分子のライブラリは、上記の例の中の一つか一部、あるいはそのすべてを含めることができます。ここでいうライブラリのいずれも、異種配列つきの配列を含むメンバーを含めることができます。たとえば、制限部位の配列、リンカー配列、タグ或いはその他の検出可能な部分をエンコードする配列、またはその他の配列とか挙げられます。
【０３９２】
ここでいうVL核酸ライブラリは、その各組替核酸分子メンバーが生産性あり、また、共同でVHチェーンつきの核酸分子で表す場合は、機能的な抗体またはその一部を生成し、かつ、十分な抗原結合部位が含まれています。
【０３９３】
また、ここにていうVL核酸ライブラリがお互いに異なっています。 VL核酸ライブラリは10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000 (104), 2x 104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 106或いはこれ以上の異なるメンバーを含めることができます。核酸メンバーは、アドレスが指定されたので、配列内でのロケーションは各核酸のアイデンティティを識別できます。
【０３９４】
たとえば、例示的なVL核酸ライブラリには、配列番号806-815, 817, 819-834, 836-867のメンバーが含まれています。それぞれはVk, と Jk生殖セグメントの異なっている組替核酸分子を表します。
【０３９５】
このようなライブラリには、3'末端と5末端に位置する制限部位に対する異種配列メンバーが含まれています。配列番号1411-1422, 1424-1439, 1441-1472のいずれかに記載されているように、ライブラリのメンバーは異種配列がない配列を含めることができると理解されています。
【０３９６】
いくつかの例では、ライブラリ内の核酸配列のいずれかはベクトルに含まれているし、ライブラリを生成することができます。典型的なベクトルライブラリは、再結合されたバックボーンプラスミドC或いはプラスミドEに含まれるVLチェーンつきの組替核酸分子のライブラリです。
3、核酸ライブラリ対或いはベクターライブラリ
【０３９７】
また、ここでいうライブラリは再結合されたVLチェーン付きの組替核酸分子とVHチェーン付きの核酸分子、及びi.e. 核酸ライブラリ対です。このライブラリ対はセクションEにおけるVH核酸ライブラリーのいずれかの核酸メンバーの最初の核酸分子を含めることができます。
【０３９８】
一つ以上と第二核酸分子は、第E.2セクションにおけるVL核酸ライブラリーのいずれかの核酸メンバーです。ライブラリ対における核酸メンバーには、異種配列ありの方も異種配列がない方も含まれています。
いくつかの例では、核酸分子対の一つは、異種配列(タグやその他の検出可能な部分など)を含めることができます。その他のライブラリ内の核酸分子対は異種配列を含みません。
相補的核酸対ライブラリは対処ライブラリとして提供することができます。これらのライブラリには、対応フォマットの各遺伝子座は、あるVHチェーンをエンコードする一本の核酸分子及びあるVLチェーンをエンコードする一本の核酸分子を含みます。他に対応したすべての遺伝子座の核酸対と比較すると、核酸対（すなわちVHチェーンをエンコードする核酸分子とVLチェーンをエンコードする核酸分子の組合）はそれぞれ異なります。
【０３９９】
いくつかの例では、核酸分子はペアベクトルライブラリを生産するベクトルを含めることができます。これらのライブラリには、対応ライブラリの各遺伝子座はVLチェーンをエンコードする核酸分子のベクトルとVHチェーンをエンコードする核酸分子のベクトルを含みます。
【０４００】
いくつかの例では、核酸対ライブラリは共通のVLチェーンをエンコードする（対処ライブラリには、各遺伝子座は同じ核酸分子がある）核酸分子を含めることができます。その他の例では、核酸対ライブラリは共通のVHチェーンをエンコードする（対処ライブラリには、各遺伝子座は同じ核酸分子がある）核酸分子を含めることができます。一般的に、対処ライブラリには1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5,000, 10,000あるいはさらに多い、VLチェーンをエンコードする核酸分子及び、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5,000, 10,000或いはさらに多い、VLチェーンをエンコードする核酸分子が含まれています。その結果、組み合わせたライブラリ対は10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000 (104), 2x 104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 106, 107, 108, 109, 1010或いはさらに多い、異なる分子対が含まれています。
【０４０１】
ここで記述したように、第一核酸分子及び第二核酸分子（例えば、VHチェーンをエンコードする核酸分子とライトチェーンをエンコードする核酸分子）の共同表現を通じて、抗体ライブラリを生成することができます。さらに、核酸分子にはCHをエンコードする配列が含まれる場合、ファブライブラリを生成することもできます。すなわち、ライブラリ内のすべての分子は一つのCHを通じてつながったVHチェーン及びVLチェーンを含有します。
【０４０２】
例えば、典型的な核酸対ライブラリが含んだ第一核酸分子はいずれかの一つ或いは複数の核酸分子の配列番号の表示が454-805 或いは 2070-2759（VHチェーンをエンコードするもの）です。また、第二核酸分子について、配列番号の表示が806-815, 817, 819-834, 及び 836-867（VLチェーンをエンコードするもの）です。上記の配列は制限部位の3’ 及び5’ の末端にある異種配列を含めます。また、核酸ライブラリには異種配列なしでも配列を生成できると知られています。したがって、いくつかの例では、ライブラリのメンバーはそれら異種配列なしの配列を含めることもできます。例えば、典型的な核酸対ライブラリが含んだ核酸分子配列は、配列番号の表示が1059-1410 或いは2070-2759（3’ 及び5’ の制限部位を除く）（VHチェーンをエンコードするもの）である第一核酸分子、及び配列番号の表示が1411-1422, 1424-1439 と 1441-1471である第二核酸分子の制限部位の3’ 及び5’ の末端において、異種配列が含まれていません。このようなライブラリは上記の核酸対の配列のいかなる配列を含めます。したがって、対ライブラリは概ね1.5 x105, 2.1 x 105, 2.5 x 105, 3.5 x 105, 4 x 105, 4.2 x 105, 4.4 x 105, 4.6 x 105, 4.8 x 105, 5 x 105, 5.2 x 105, 5.4 x 105, 5.6 x 105, 5.8 x 105, 6 x 105あるいはさらに大きい分子、若しくは500, 600, 700, 800, 900, 103, 5x103, 104, 5x104, 105或いはさらに大きいサブライブラリを含めることができます。
【０４０３】
テーブル17は典型的な対ライブラリの例を示しています。各行はライブラリの異なる遺伝子座を表示します。テーブルには、核酸分子の配列番号は「RS」（異種制限部位の配列を含む）と、「NO  RS」（異種制限部位の配列を含んでいない）と表示されます。
【０４０４】
【表１７】
2016127850.tif 000025
2016127850.tif 000026
2016127850.tif 000027
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【０４０５】
4抗体ライブラリ
ここで述べている抗体ライブラリはその部分が少なくともVHチェーンとVLチェーンを含み、あるいは、その一部が十分な抗原結合部位を含みます。VHチェーンあるいは抗体ライブラリの一部の抗体全体は上記E1段落で表示した核酸ライブラリの任意核酸分子にエンコードされます。したがって、抗体ライブラリ内の抗体は生殖セグメント配列の全部或いは一部から派生され、及び/或いは変更された配列から派生されます。いくつかの例では、これらのライブラリは対応ライブラリとして提供されています。
【０４０６】
また、抗体ライブラリにおいて、機能多様である十分な抗原結合部位を含んだ抗体の種類は複雑多様です。抗体ライブラリの遺伝子座は他の遺伝子座と異なる抗体を含みます。したがって、本段落で述べている抗体ライブラリは高い抗体の多様性を展示しています。これらの抗体ライブラリは一般的には、概ね103, 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 105及びさらにユニークな、その中には、概ね106, 107,108, 109  及びさらにユニークな、102異なる抗体を含みます。自然再結合過程及び抗体レパートリーの自然構造の多様性を模倣する方法を通じて、ここでのべている抗体ライブラリを生成することができます。
【０４０７】
VHチェーン及びVLチェーン或いは十分な抗原結合部位の一部を除けば、ここで述べているライブラリ内の結果抗体は一部の定常領域を含めることができます。例えば、抗体は一つ或いはいくつかのCH1, CH2, CH3 或いはCL部分を含めることができます。一般的に、抗体或いはその部分は一つのCH1領域を含みます。結果抗体或いはその部分は、完全長抗体に限定しないFab, Fab', F(ab’)2、シングルチェーン Fvs (scFv), Fv, dsFv, diabody, Fd and Fd’ の断片を含みます。ここで述べている典型的な対応抗体ライブラリはFabライブラリです。
【０４０８】
当抗体ライブラリ内の抗体の数は限りがあります。配列の類似性或いは相違点或いは共有の特性（例えば、V領域のファミリ、CDR3の長さ或いはその他の生化学の属性）に基づいて抗体ライブラリの数を選択します。例えば、抗体ライブラリ内の抗体の選択を通じて、結果抗体におけるVLチェーン或いはVHチェーンをエンコードする個々の生殖セグメントは属性（例は同じサブグループ或いは遺伝子ファミリである）を共有し、または、それ以外の場合は類似或いは異なる配列の配列番号を有します。したがって、その他の例では、抗体ライブラリ内の抗体は、VHチェーン或いはVLチェーンの配列の多様性によって、選択されます。抗体ライブラリ内の抗体はその配列の多様性あるいは類似性を代表し選択されます。したがって、いくつかのインスタンスでは、抗体ライブラリ内の抗体は高い多様性の抗体グループを代表するが、その他のインスタンスでは、抗体ライブラリ内の抗体は類似性があり、多様性がない抗体グループを代表します。例えば抗体ライブラリ内の抗体は他の抗体と比べると、VHチェーン或いはVLチェーンにおいて、40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%の配列が類似します。抗体ライブラリの選択はアプリケーションの機能によって、技術レベルの範囲内にて行われます。
【０４０９】
いくつかの例では、当対応ライブラリは人間ナイーブライブラリです。抗体ライブラリ内の抗体全体は人間の生殖セグメントの配列からである、と意味します。例えば、すべての抗体のVHチェーンはVH, DH 及び JH生殖セグメントの組み合わせた核酸分子でエンコードされます。例えば、上記のテーブル３或いはあるサブテーブルの表示によると、このようにできた核酸分子はVHチェーンの5'からDH領域の5'までの配列を有します。すべての抗体のVLチェーンはVk とJk生殖セグメント及び/或いはVl と Jl生殖セグメントが組み合わせてエンコードするものです。例えば、上記のテーブル3-4或いはその中のサブテーブルの表示によると、このようにできた核酸分子はVLチェーンの5'（Vl 及び Jl）からJL領域（Jk 或いはJl）までの配列を有します。
【０４１０】
当ライブラリはナイーブで生殖セグメントから派生されると考えられます。にもかかわらず、実践の方法によると、セグメントの共同領域はフレーム内のコーディングの結果分子を表示するために変更されている。しかし、このような変更は、一般的に軽微またさまざまな生殖セグメントの単一塩基の挿入或いは削除を含みます。また、当方法の実践によると、例えば、終始コドンと酵素制約部位の削除による組換え核酸分子配列のその他の変更は、抗体を生成する原因にもなります。当ナイーブ抗体ライブラリ内のナイーブ抗体の全部或いはその一つのサブ配列を有することができます。例えば、当ナイーブ抗体ライブラリは103, 104, 2 x 104, 3 x 104 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 4 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 105及びさらにユニークな抗体、その中に106あるいは107あるいは、さらに多い抗体を含みます。
【０４１１】
特定の例では、抗体ライブラリ内の抗体のVHチェーンはVHとJHの生殖セグメントのみが組み合わせたヌクレオチドの配列で構成され、VHとJHの生殖セグメントのヌクレオチドの配列でエンコードされます。コーディング核酸分子におけるVHセグメントは5'からJHまでのヌクレオチドのランダムな配列です。したがって、できた抗体ライブラリ内の抗体は当領域のアミノ酸のランダムな配列を含みます。また、当領域はCDRH3の中心部分を含む。それは最大限に抗体の抗原特異性の生成を担当します。当ヌクレオチドの配列はヌクレオチドのランダムな配列である可能性がある。いくつかのインスタントでは、ヌクレオチドの配列は任意のターゲットがペプチド類似物の抑制をエンコードする配列です。例えば、細胞表面の受容体は典型的なペプチド類似物はテーブル16のようです。その他の例では、ランダムなヌクレオチド配列はDH生殖セグメント或いはその中の変更部分です。一般的には、ヌクレオチド配列は概ね5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90或いはさらに多いヌクレオチドです。
【０４１２】
また、抗体ライブラリ内の抗体は少なくともその一部が変更された生殖セグメントの配列から派生されます。いくつかの例では、すべてのコーディング生殖セグメントが変更されました。例えば、ランダムな突然変異。その他の例では、特に生殖セグメントは変更されるターゲットです。例えば、変更された生殖セグメントの配列は変更された、一つ或いは複数のCDRのアミノ酸の突然変異を含めることができます。特に、抗体ライブラリの抗体は変更されたCDR、例えばCDRH3を含めることができます。したがって、ナイーブ抗体と比べると、抗体ライブラリ内の抗体は一つ或いはアルミ酸のCDR置換を含めることができます。
【０４１３】
いくつかの例では、抗体ライブラリ内の抗体は、ナイーブ抗体の可変領域に気になるヌクレオチドターゲットに対する配列の取り込みによって、目的のターゲット或いは機能に向かって導かれることができます。したがって、組換え或いは挿入による結合した配列を除けば、その多の抗体は生殖セグメントの配列を代表します。これらの整合された配列はペプチドのみでなく、モノクロ−ナル抗体の部分も含まれます。
【０４１４】
例えば、抗体は特定ターゲットの模倣として機能するダイレクトペプチドを含めることができます。一般的に、このような抗体は、目標に向かってアゴニストとして機能するいくつかのインスタントでは、拮抗することができます。ペプチドは抗体のいかなる部位に含まれる可能性がある。しかし、一般的には可変部位に含まれます。また、一つ或いは複数のCDRの部位に広く含まれます。特に、ダイレクトペプチドは抗体のCDR3部位に含まれます。抗体ライブラリの抗体は同じダイレクトペプチド及び/或いは異なるダイレクトペプチドに変更されます。
【０４１５】
関連の例では、このような抗体は既知のモノクローナル抗体の配列部分を含めることができます。当部分は既知のモノクローナル抗体に対応する一つ或いは複数のCDR部分も含めることができます。その他のインスタントでは、抗体ライブラリの抗体はモノクローナル抗体可変領域全体（例えばライトチェーン領域或いは重鎖領域）を含めることができます。例えば、抗体ライブラリの抗体は知られているモノクローナル抗体を含めることができます。当抗体は叙述のように、生殖セグメントの派生によってライトチェーン可変領域或いは重鎖可変領域とつながります。上記のテーブル９のように、これは典型的な抗体ライブラリです。当抗体ライブラリ内の一つ或いは複数の抗体は既知の任意のモノクローナル抗体のライトチェーン可変領域或いは重鎖可変領域を有します。
【０４１６】
ここで述べている抗体ライブラリは上記の例の一つ、一部或いは全部を代表する抗体を含みます。ここで述べている抗体ライブラリでは、単一のVLチェーン或いはVHチェーン或いはその一部は当抗体ライブラリの異なる抗体のVLチェーンとVHチェーンと同じである可能性があります。これはVHチェーンとVLチェーンの組み合わせです。この組み合わせは抗体ライブラリの抗体がそれぞれ異なる原因です。例えば、各遺伝子座に対応された抗体。したがって、ライブラリは共通のVHチェーン、及び異なるVLチェーンを含めることができます。そのため、できたライブラリ内の抗体はそれぞれVHチェーンとVLチェーンのコンビネーションを含みます。
【０４１７】
ここで述べている抗体ライブラリは配列番号がいずれか454-805（VHチェーンをエンコードするもの）である核酸にエンコードされる重鎖、及び配列番号がいずれか806-815, 817, 819-834, 及び836-867（VLチェーンをエンコードするもの）である核酸分子にエンコードされるライトチェーン、或いは制限部位の3’ 及び5’ の末端に異種配列なしの配列、及びサブライブラリを含みます。当抗体ライブラリは配列番号がいずれか2070-2759（VHチェーンをエンコードするもの）である核酸にエンコードされる重鎖、及び配列番号がいずれか806-815, 817, 819-834, 及び 836-867（VLチェーンをエンコードするもの）である核酸分子にエンコードされるライトチェーン、或いは制限部位の3’ 及び5’ の末端に異種配列なしの配列、及びサブライブラリも含めることもできます。上記の再組換えの任意のVHチェーン或いはVLチェーンの組み合わせによって、抗体ライブラリを生成できます。当抗体ライブラリのコンビネーション、規模、種類（例えば抗原結合の断片、フルレングス抗体など）も変更される可能性があります。
【０４１８】
テーブル17は核酸分子の配列をエンコードするVHチェーン及びVLチェーンを含める抗体ライブラリを表示します。また、典型的な抗体ライブラリはテーブル17が表示するサブライブラリを含みます。そのサブライブラリにはテーブル22が表示する核酸配列をエンコードするVHチェーンとVLチェーンが含まれます。例えば、配列番号のいずれかが1475-1826を表示するVHチェーンは配列番号のいずれかが1827-1838, 1840-1855, 1857-1888を表示するVLチェーンと、ペアになります。このようにできた抗体ライブラリは、例9のようにCHを表示する場合、抗原結合断片のライブラリです。VHチェーンとVLチェーンのコンビネーションによって、できた抗体ライブラリは概ね2.1.0x105或いはさらに多い抗体、或いはサブライブラリがあります。生殖セグメントにエンエンコードされる一つの抗体は、一つのナイーブ抗体を代表します。
【０４１９】
ここで述べている典型的な抗体ライブラリは上記のテーブル17のように、核酸分子の配列にエンエンコードされるVHチェーンとVLチェーンを含みます。
【０４２０】
5  アドレス指定可能なフォーマット
これらの抗体ライブラリは対応ライブラリを含みます。その対応ライブラリはそれぞれ唯一のアドレスを有し、当ライブラリの他の遺伝子座と比べると、他のアドレスを通じて識別される異なる抗体を含みます。例えば、ある遺伝子座での抗体は改めてその唯一をコピーすること、或いは、唯一のマークから認識されます。対応ライブラリは核酸ライブラリの一種であり、遺伝子座ごとに一つの核酸分子を有します。その分子はその他のすべての遺伝子座の核酸分子と異なります。遺伝子座は一つの抗体ライブラリがあります。遺伝子座ごとには一つの抗体或いはその他と異なる抗体の一部、或いは、抗体ライブラリ内のその他の遺伝子座と異なる抗体を含みます。
【０４２１】
当抗体ライブラリはアドレス指定可能な機能を表示できます。アドレス指定は表面、或いは物理的な奇跡などの影響を受け、或いは、その他の方式及び/或いは並べ替え可能なマーク、例えばバーコード付のラベル或いはその他のラベル、化学品タグ、電子、RFタグ、カラーコード或いはその他の類似な標識。さまざまなアドレス指定機能が精通されています。これらの模範は、一つのアレーとされます。当ライブラリ内の抗体或いは固定或いは付属の陳列を通して、ソリューションを提供することができます。
【０４２２】
任意の核酸分子或いは抗体は重複或いはマルチウェルプレートのような配列をランダムに提供できます。また、抗体ライブラリは空間アレーで現れます。そのため、すべての核酸分子或いは抗体は異なる区域に設けられた、その他のいかなる抗体或いは核酸分子の区域と重複することになりません。当抗体はアドレス指定の機能は既知の抗体に読み取れられます。
【０４２３】
a. マルチウェルプレート
核酸分子或いは抗体はマルチウェルプレートにおいて空間的な配列を行います。このため、軌跡プレートあたりに一つの抗体を対応します。マルチウェルプレートは12、24、48、96、384、及び1436マルチウェルプレートを含みますが、しかし、これらに限りません。こんなインスタントでは、マルチウェルプレートでの抗体のIDは既知です。当抗体はソリューションを解決する、或いは、ソリューションの解決に役立っています。例えば、当技術の長所の一つは抗体がソリューションの解決を提出するので、当ソリューションは完全に折りたたむとともに、機能化させます。タンパク質は濾過器、ベーンの表面、あるいはベーンに置かれる場合に、その活性の損失が消えたことが認知します。また、抗体である場合、当抗体は任意の目標活動をスクリーニングできます。抗体はバイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めます。しかしながら、これらを限定しません。すべての抗体のIDが既知であるので、構造活性相関（SAR）の情報はすぐ利用されます。最後、スクリーニングを行う、或いは、「インパクト」を認識または導いて合成する過程に、薬物動態及び/用量反応実験を行います。
ほかの例では、核酸分子と抗体はマルチウェルプレートに空間的に配列できます。このため、すべての奇跡プレートは抗体対を対応します。こんなインスタントで、任意の特定のマルチウェルプレートにある抗体対のIDは既知です。抗体対は2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，10あるいはさらに多い抗体、或いはさらに多い核酸分子を含めることができます。例えば、抗体或いは核酸分子はランダム或いはニーズに応えて分けられます。例えば、同じVファミリは同じ長さのCDR3のアルミ酸、長さ、或いはその他のすべての生化学属性を有します。抗体である場合、対処した抗体対は目標活動によって、スクリーニングできます。バイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めますが、これらを限定しません。抗体ライブラリのスクリーニングにおいて、指定の時間内に、もっと多い抗体をスクリーニングできます。そのため、大部分の抗体の多様性をカバーしてしまいます。また、「インパクト」認識或いはコンビネーション引導を行います。コンビネーション内のすべての抗体のIDは既知であるので、現有の抗体は単一、個体の抗体はすぐコンビネーション内に認識され、その「活性」を確認できます。
【０４２４】
ii.ソリッドサポート
核酸と抗体アレーは硬い支持体に固定されたそれらの抗体を含みます。例えばベーンに固定された抗体。例えば、付属物或いは硬い支持体に固定された（この限りでなく）濾過機、ベーン表面或いはセルロースの捺印及び親和性タグベーンの使用。いくつかの例では、変異細胞の表現ペプチドは自然にビーズを吸着することができます。これらのビーズあたりに一つのシングル細胞を有します（フリーマンetal.生物工学。Bioeng（2004）86:196-200）。固定ガラスの支持によると、シングル細胞のクローンを培養できます。色または蛍光気質でスクリーニングすることができます。米国特権番号6372483，6352842，6346416及び6242266を参照ください。
【０４２５】
例えば、抗体ライブラリ内の抗体はベーンに固定されると仮定します。ベーンモールドBIAcore用のベーンを含めます。タンパク質は目標分子を指定する能力を確定します。例えば、リアルタイムな生体分子の相互作用の分析（BIA）技術の使用。Sjolander，S.及びUrbaniczkyは（1991）Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin.結構と訳されます。生物学。5:699-705。 Biacoreはタンパク質の相互作用及び親和力を測る方法です。当技術は光学現象のプラズモン共鳴（SPR）の表面によって、リアルタイムに標識なしのタンパク質の相互作用を監視できます。（Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998，酵素方法295 ：268）。性能比生物センサーは生物分子の相互作用をリアルタイムに観測する用であり、両方の親和力と動力学によって、集中、スクリーニング及び認識の積極性を確定します。BIAcore分析は結合速度定数、解離速度定数、親和定数を便利に得られます。
【０４２６】
方法論は、共有カルボキシメチルデキストランの薄層を接続されている長いヒドロキシアルキルチオールの単分子膜で覆われて金膜を有するガラス基板で構成されるセンサーチップの表面に配位子の固定に依存しています。固定手順において、センサーチップと同時に操作し、性能比によって、継続的に観測を行います。未知のサンプルまたはライゲーション溶液を固定されたリガンドで利用して装置に導入されています。リガンドとライゲーションとの間の相互作用は、表面プラズモン共鳴技術とBialogue[ファルマシア]などのプログラムを介してコンピュータに記録された測定によって直接観察されます。
【０４２７】
6.その他の表示方法 
他の表示方法他の非アドレス可能な形式にライブラリも提供できます。 そのようなもので模範的他の非アドレス可能な形式が表示で、特に、いずれもスクリーンするのを容易にする活動か活動のためのライブラリのメンバーの書式を含みます。   一般に、抗体ライブラリーにそのような形式を使用しますが、望んでいるなら、また、核酸かベクトルライブラリに提供できます。  ライブラリ(表現型)とそれらをコード化する遺伝情報(遺伝子型)の個別分子の間の物理的なリンクがあるように、通常、ライブラリは、ディスプレー技術を使用することでスクリーンされます。   これらの方法は、セル表示、ファージ提示法、mRNA表示、リボゾーム表示、およびDNAが表示するということを包含しますが、制限されない。
【０４２８】
a.  セル表示
バクテリアE.coli、イーストS.cerevisiae、および哺乳類細胞を含むセルの表面に細胞表面で急送されるタンパク質でそれらを溶断することによって選別のための抗体ライブラリーを表すことができます。  セル表示は、目標抗原の固定が不要である抗体ライブラリーをスクリーンするのに使用される技術です。  代わりに、希望の抗体を特定するのに、蛍光活性化細胞分類などのテクニック(FACS)を使用できます。  レーザー光線を通り抜けるとき、FACSは彼らの光散乱の特性に基づいてセルの分集団の分離を可能にします。 米国が公開した 特許出願番号の例を参照してください。E.coliの外部の表面で以前に細菌表面に異種タンパク質を向けるために見せられたタンパク質にそれらを溶断することによって、単一のチェーン抗体を表現できます。 (Francisco et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:10444-10448).  イースト菌の表面に単一のチェーンとFab抗体を表示できます、そして、形質転換細胞のライブラリを発生させるのにイーストの相同組換えを利用できます。e36) . (see e.g. Kieke et al., (1997) Prot. Eng., 10:1303-1310; Weaver-Feldhaus et al., (2004) FEBS Lett., 564:24-34; and Swers et al., (2004) Nucleic Acids Res., 32:e36).  哺乳類細胞表示は、免疫グロブリンと同様にscFvライブラリをスクリーンるのに利用されました。(Ho et al., (2005) J. Biol. Chem., 280:07-617). 
【０４２９】
b.  ファージ提示法
ファージ提示法は選別抗体ライブラリーへの特定の抗原に付く彼らの能力に関する広く使用された方法です。   ファージ提示法はタンパク質かペプチドが融合としてファージの表面で個別にコートタンパク質に急送されるセルベースの方法です;   同じファージ粒子がファージのタンパク質かペプチドをコード化するDNAを運ぶ間(スミスG.P.(1985)科学228: 1315-1317).  ファージ選択は、タンパク質かペプチドためのDNAが回復されて、伝播されるか、または表現されるために特定のファージが隔離されて、クローンを作られるのを可能にして、タンパク質かペプチドの認識にかかわる特定の結合反応とを通して達成されます。  ファージ提示法の使用は増幅と伝播のためのE.coliへの依頼ので急速であって、軽快です。  典型的な使用法は、固定された抗原に対してファージライブラリーを撮影することを伴います。
【０４３０】
c.  mRNA表示とリボゾーム表示
mRNA表示とリボゾーム表示の使用は抗体ライブラリーの完全に生体外の建設を許可します。mRNA表示は新生タンパク質がプロマイシンリンクを通してmRNAに電子対を共有して付くことが引き起こされる、タンパク質かペプチドを表示する方法です (Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 64:12297-12302).  プロマイシンは、aminacyl tRNAの物真似として機能して、リボゾームAサイトに入ります、そして、新生タンパク質はリボゾームのペプチジルトランスフェラーゼ活動でそれに電子対を共有して制限されています。  選択がリボゾームの解離の後にこれらのタンパク質-mRNA融合に行われます。  あるいはまた、リボゾーム表示はリボゾームの表面に初期のフォームにタンパク質かペプチドを表示する方法です、コード化するmRNAのある安定の複合体が形成されるように;   複合体がタンパク質かペプチドのために配位子と共に選択されて、遺伝情報が孤立しているmRNAの逆転写によって得られる (United States Patent Nos. US 5,643,768 and US 5,658,754をみてください).  選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾーム表示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。  
【０４３１】
d.  DNA 表示
DNA表示では、ペプチドをコード化するDNAは、ペプチドにリンクされます。  非共有原子価のDNA表示では、それ自身のテンプレートのDNAと統合された複製配列の起源と同様にバクテリアのRepAタンパク質の認識でDNAタンパク質リンケージを促進します (Odegrip et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 101:2806-2810).  あるいはまた、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用できます。.  共有原子価のDNA表示では、抗体フラグメントに遺伝学的に溶かされたバクテリオファージP2タンパク質は、それ自身のDNA配列に固まります(Reiersen et al. (2005) Nucl. 酸Res。 33:e10).  あるいはまた、DNAとペプチドを分類できます、水中油型乳剤などのように。  選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾu12540 ーム表u31034 示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。  例えば、 International Patent Publication No. WO 98/037186.F.を参考してください。  抗体の生成の方法
【０４３２】
当業者に知られているどんな方法でもここに提供されたライブラリの核酸分子と抗体メンバーを作ることができます。  そのような手順は、日常的であり、技能職人にとって、よく知られています。  
彼らは遺伝子合成、PCR、血管結紮、クローニング、移入、および浄化のテクニックを含む通常の分子生物学のテクニックを含んでいます。
そのような手順の記述を以下に提供します。
【０４３３】
例えば、上でここに議論するように、遺伝子合成手法を使用することで核酸配列を構成できます。   ヌクレオチドの効果挿入、削除、添加または交換に遺伝子合成か通常の分子生物学のテクニックも使用できます。   例えば、付加的ヌクレオチド系列を核酸配列に接合できます。   1つの例ので、リンカー配列加えることができます、合成の遺伝子のベクトルにクローンを作る目的のための制限酵素サイトを含む系列などのように、例えば、抗体定常領域コード化DNA配列の増幅のために設計されたタンパク質の発現ベクトルまたはベクトル。    その上、作動的に機能的なDNA 要素を指定する付加的ヌクレオチド系列は核酸分子をコード化する再結合している生殖細胞にリンクできます。  そのような系列の例は、タンパク質分泌を容易にするように設計したプロモーター系列、および細胞内タンパク質の発現を容易にするのを設計したリーダー・ペプチド系列を包含しますが、有限であることではありません。     また、タンパク質結合領域を指定する系列などの付加的ヌクレオチド系列を核酸配列にリンクできます。    そのような領域はが特定の標的細胞の中へ再結合させた抗体かそれの断片を理解力容易にするか、またはそうでなければ、合成の遺伝子の薬物動力学を機能アップする系列を 包含しますが、制限されない。 
【０４３４】
変異体抗体を発生させるように変異誘発などのようにここに説明されるように、さらに核酸配列を設計できます。  遺伝子合成で変異誘発は完全に作用できます。  例えば、統合が変異体抗体をコード化するように、核酸分子は手動かシリコで設計される場合があります。   遺伝子合成法を使用するメリットは変異が作用できるということであるので、得られた核酸分子は上でここに議論するように組み立てになるか「生産的」です。  統合の他の方法は遺伝子合成の間に無作為化を達成できるところに存在しています。  例えば、オリゴヌクレオチドのどの統合が非ネイティブのphosphoramiditesで「ドーピングされるか」によってプロトコルは開発されました、ランダム変異導入法のために狙う遺伝子部のシリコセクションのランダム化をもたらして(ワングとフーバー(1997) J. Bacteriol., 179:5812-9).  この方法はランダム置換率を保有している間、位置の選択のコントロールを許します。  あるいはまた、他の分子生物学のテクニックで変異誘発は作用できます。  一般に、部位特異的変異処理戦略は使うことができます。  
【０４３５】
テンプレート核酸分子か分子から変異体抗体ライブラリーを創設するのに他の現行手法を使用できます、ナイーブ抗体をコードする生殖細胞系列再結合させた核酸分子ように。  そのような方法が、変異性ポリメラーゼ連鎖反応を含んでいますが制限されない(コールドウェルとジョイス(1992); グラムet al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3576-80)。 その内の特定の領域を最適化するカセット突然変異誘発は、総合的突然変異誘発オリゴヌクレオチドと置き換えられます。(Stemmer and Morris (1992) Biotechniques, 13:214-20); Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89:7811-7815; Oliphant et al。 (1986) Gene, 44:177-83; Hermes et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci, 87:696-700); 突然変異頻度を追加するためのホスト細胞のミューテータ緊張の使用 (Greener et al. (1997) Mol. Biotechnol., 7:189-95); DNA shuffling (Crameri et al. (1998) Nature, 391:288-291; U.S. Patent No. 6,177,263; U.S. Patent No. 5,965,408; Ostermeier et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17:1205-1209);  そして、他のランダム変異導入法方法。  
【０４３６】
1.ベクトル
ここに提供しているのは、再結合している抗体をコード化する核酸を含むベクトルかそれの部分です。    抗体ポリペプチドをコード化する核酸は、原核生物のか真核セルの中への変化の前に通常中間的ベクトルにクローンされます。   ベクトルのこの選択は希望のアプリケーション次第であることができます。   例えば、核酸の挿入の後に、ベクトルは、例えば、レプリケーション、そして/または、それの表現のための再結合している抗体の遺伝子を拡張するために宿主細胞を変えるのに通常使用されます。  そのような例では、高い平らな表現に適したベクトルは使用されています。  他の場合では、細胞表面における表現されたポリペプチドの表示と互換性があるベクトルは選ばれています。
【０４３７】
再結合している抗体かそれの部分の式のために、多くの発現ベクターが利用できるか、そして、当業者に知られてます。  ホスト発現系の選択で発現ベクターの選択は影響を及ぼされます。    熟練した職人の技能のレベルのかなり中にそのような選択はあります。    
一般的には、発現ベクターは、転写プロモーターおよび必要に応じエンハンサー、翻訳シグナル、転写および翻訳終止シグナルを含めることができます。
安定な形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択と維持を許す選択可能なマーカーを持ってます。   いくつかのケースでは、レプリケーションの起源は、細胞内のベクトルのコピー数を増幅するために使用することができます。 一般に、ベクトルも連結核酸分子(例えば、彼のタグ、フラグタグ)に手術可能にリンクされた付加的ヌクレオチド系列を含むことができます。  一般に、目的のために、ここに、ベクトルは定常領域をコード化する系列を含んでいます。   したがって、タンパク質融合として再結合している抗体かそれの部分も表現できます。    例えば、溶融は、ポリペプチドに追加機能性を加えるために発生できます。  例えば融合タンパク質は、タンパク質分泌、そして/または、膜結合性を指示するための信号の系列の融合と、ローカライズ、例えば、his6タグ、mycタグ、または浄化のためのタグ、例えば、GST溶融、およびタンパク質分泌、そして/または、膜結合性を指示するための系列を包含しますが、制限されない。
【０４３８】
例えば、当技術分野で知られているどんなプロモーター/エンハンサもタンパク質の表現を制御できます。  適当なバクテリアのプロモーターは、当技術分野でよく知られて、以下でここに説明されます。   哺乳類細胞、イースト菌、および昆虫細胞のための他の適当なプロモーターは芸術でよく知られて、そして、或るものは以下で例示されます。   異種核酸の表現を指示するのに使用されるプロモーターの選択は特定用途によります。    使用できるプロモーターは'SV40早期プロモーター含む真核細胞発現ベクター(304-310 Bernoistとシャンボン、ネイチャー290:(1981))、ラウス肉腫ウイルスの3の'長い末端反復に含まれたプロモーターを含んでいますが、制限されません。(山本 et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子（ (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982));β-ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはTACプロモーターは、（(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983));また、”組換え細菌の有用なタンパク質”を参照してください： サイエンティフィックアメリカン242:79-94（1980））で、ノパリン合成プロモーターを含む植物発現ベクター（Herrara-Estrellaet al、自然303:209-213（1984））またはカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター（Gardner et al., Nucleic Acids Res。 9:2871（1981））、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター）（Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984);酵母GAL4のプロモーターのような他の真菌のプロモーター要素、アルコール脱水素酵素のプロモーター、phosphoglycerolキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、そして、組織特異性を示す、遺伝形質転換動物で使用されました以下の動物転写支配領域： 膵臓腺房細胞でアクティブになっているエラスターゼ I 遺伝子の制御領域（スウィフトら、Cell38:639-646（1984）;。Ornitzet al、コールドスプリングハーバーシンポジウムクアント生物50:399-409（1986）;マクドナルド、消化7:425-515（1987） ）;膵β細胞（ハナハンら、Nature315:115-122（1985）リンパ球系細胞でアクティブになっている）、免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、セル38:647でアクティブになっているインスリン遺伝子制御領域-658（1984）;アダムスet al、自然318:533-538（1985）;アレキサンダーら、モル。. 細胞生物 7:1436-1444（1987））精巣がん、乳がん、リンパ球とマスト細胞でアクティブになっているマウス乳腺腫瘍ウイルスの制御領域、（レダー et al、細胞45:485-495（1986））、肝臓でアクティブになっているアルブミン遺伝子制御領域、（Pinckert et al，遺伝子および開発 1:268-276（1987））肝臓でアクティブになっているα-フェトプロテインの遺伝子の制御領域、（Krumlaufet al、分子細胞生物5:1639-1648（1985年）;ハンマーet al、科学235：53-58 1987））、肝臓でアクティブになっているα-1アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Kelseyさんet al、遺伝子および開発。 1:161-171（1987））骨髄細胞でアクティブになっているβグロビン遺伝子の制御領域（Magramet al、自然315:338-340（1985）;コリアスet al、Cell46:89-94（1986。））、脳のオリゴデンドロサイト細胞でアクティブになっているミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（リード��ッドら、細胞48:703-712（1987））、骨格筋でアクティブになっているミオシン軽鎖- 2遺伝子の制御領域（Shani、自然314:283-286（1985））、および視床下部のgonadotrophsでアクティブになっている性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域（メイソンら、科学234:1372-1378（1986））。  
【０４３９】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞内では、抗体かその一部の発現のために必要なすべての追加要素が含む転写単位または発現カセットを含まれています。  典型的な発現カセットは生殖細胞系列抗体チェーンをコード化する核酸配列に手術可能にリンクされたプロモーターを含みます、そして、信号が転写、リボゾーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要です。   カセットの追加要素はエンハンサを含むことができます。 また、カセットは、通常、転写終結領域を効率的に終端を提供するために構造遺伝子の下流に含まれています。  終端領域をプロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なった遺伝子から得ることができます。
【０４４０】
いくつかの発現系には、チミジンキナーゼやジヒドロ葉酸還元酵素などの遺伝子増幅を提供するマーカーがあります。   あるいはまた、また、遺伝子増幅にかかわらない高い利回り発現系も適当です、昆虫細胞の中でバキュロ・ウイルスベクトルを使用するのなどように、核酸配列が多面体プロモーターか他の強いバキュロ・ウイルスプロモーターの指示に基づき生殖細胞系列抗体チェーンをコード化していて。  
【０４４１】
目的のために、がここに提供したベクトルは、抗体の再結合している可変部をコード化する核酸配列に操作可能にリンクされた抗体の定常領域をコード化するヌクレオチド配列を含んでいます。   ベクトルはCH1かCH2かCH3かCH4、そして/または、CLの1かすべてのための系列を含むことができます。  一般にFabsの表現などのようなベクトルはCH1かCLのための系列を含んでいます。 そのようなベクトルが重鎖定常領域の遺伝子(例えば、CH1)を含むのにおいて模範的であるのは、ここに説明された、核外遺伝子AとDです。   そのようなベクトルが軽いチェーン定常領域の遺伝子を含むのにおいて模範的であるのは、ここに説明された、核外遺伝子CとEです。  
【０４４２】
模範的発現ベクターは例えば、pCMVなどのどんな哺乳類発現ベクトルも含んでいます。    細菌発現のために、そのようなベクトルはMBPや、GSTやLacZなどのpBR322、pUC、pSKF、pET23D、および溶融ベクトルを含んでいます。   そのようなベクトルが模範的であるのは、例、核外遺伝子A、核外遺伝子C、核外遺伝子D、および核外遺伝子Eのためにここに説明されるように、細菌発現ベクトルです。    例えば真核細胞発現ベクターとして真核生物ウイルスからの調節要素を含むいくらの他の真核ベクトルは、使用できます。   これらは、例えば、SV40ベクトル、乳頭腫ウイルスベクトル、およびがエプスタイン-バーウイルスに由来したベクトルを 包含します。  他の模範的真核ベクトルがpMSG、pAV009A+、pMT010A+、pMAMneo-5、バキュロ・ウイルスpDSCE、そして、真核生物に有効表現するCMVプロモーター、SV40早期プロモーター、SV40後期プロモーター、金属結合性蛋白質プロモーター、ネズミ科の乳房の腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多面体プロモーター、または見せられた他のプロモーターの指示に基づき、タンパク質の表現を許容するいかなるの他のベクトルを含んでいます。
【０４４３】
E.coliセルの変換のための模範的核外遺伝子ベクトルは、例えばここに説明されたColE1模写ベクトルを含みます。  これらのすべてのベクトルに共通のいくつかの特徴が(a) pBAD誘導プロモータ。 (b) AraCの遺伝子(それは、pBADプロモーターをコントロールします)。 (c) 効率的な翻訳のための合成のリボソーム結合部位(RBS)。 (d) 高いコピー表現を許容する模写のColE1の起源。 (e) 表現されたタンパク質がペリプラズムに転位されるのを許容するSTIIリーダー・シーケンス。 (f) 模写のf1の起源。 (g) そして、抗生物質耐性を与えるための遺伝子。    そのような核外遺伝子は核外遺伝子A(図3)、核外遺伝子C(図5)、核外遺伝子D(図4)、および核外遺伝子E(図6)を含んでいます。  重鎖可変部のための挿入遺伝子に操作可能にリンクされた重鎖定常領域(CH1)のための遺伝子を含んでいて、核外遺伝子Aとプラスミド Dは重鎖抗体の遺伝子の表現に利用されます。   ベクトルはNheIとここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニングのために許容するNcoI制限サイトを含んでいます。    両方のベクトルはレプリケーションのpUCの起源、レプリケーションのColE1タイプの起源、およびアミノグルコシドのホスホトランスフェラーゼ遺伝子の協議しているカナマイシン耐性を含んでいます。   プラスミドAは、（彼の）6タグタンパク質精製用にフラグを設定するタグが含まれています。  プラスミドDは(彼)の6TagとFlag Tagの両方とsortaseを使用することで得られたタンパク質の共有結合を許容する追加LPETGタグを含んでいます。   軽いチェーン可変部のための挿入遺伝子に操作可能にリンクされた軽いチェーン定常領域(CL)のための遺伝子を含んでいて、核外遺伝子Cとプラスミド Eは中で軽いチェーン抗体の遺伝子の表現に利用されます。    プラスミドCは、カッパの軽いチェーンに特定であり、とここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニング許容するためにNcoI制限サイトとBseWIを含んでいます。    プラスミドEは、カッパの軽いチェーンに特定であり、とここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニング許容するためにNcoI制限サイトとAcrII Iを含んでいます。    両方のベクトルはレプリケーションの3.3の起源、レプリケーションのColE1タイプの起源、および遺伝子の協議しているクロラムフェニコール耐性を含んでいます。  上で説明されたベクトルは、軽いチェーンベクトルに重いチェーンベクトルに共同変成するデュアルなベクター系で利用されるように設計されています。    したがって、それらは二つ異なってコンパチブル、利用したレプリケーションのColE1の起源をを含んでいます、重いチェーンと軽いチェーンのためにの2、1。  ベクトルが共同変えられて、表されるとき、これは、抗体の両方のチェーンの効率的な発現を許容します。
【０４４４】
抗体チェーンをコード化する核酸を含む発現ベクターを構成するのに芸術における技能がベクトルへのDNA断片の挿入でそれらに知られているどんな方法も使用できます。    これらの方法は生体外の組み換えDNA、合成的技法、および生体内の組換え型(遺伝的組換え)を含むことができます。  例えば、補足的な粘着末端を持っているクローニングベクトルにDNA断片を結紮することによって、クローニングベクトルへの挿入を実行できます。   
【０４４５】
DNA断片に使用する相補的な制限部位は、クローニングベクター内に存在しない場合は、DNA分子の両端が酵素変更することができます。 
あるいはまた、ヌクレオチド系列(リンカ)をDNA 末端に結紮することによって、望まれていたどんなサイトも製作できます。 これらの結紮リンカは制限酵素認識配列をコード化する特定の化学的に統合された核酸を含むことができます。
【０４４６】
2.セルと発現系
ベクトルを含むセルも供給します。    一般に異種のDNAを表現するために設計できて、分泌経路を持っているどんな細胞種類も、適当です。  表現ホストは細菌性細胞(例えば、大腸菌)や、イースト菌や、真菌細胞や、古細菌や、植物細胞や、昆虫細胞やヒト細胞を含む動物細胞などの原核生物のと真核有機体を含みます。  表現ホストは表現されたタンパク質に存在している翻訳後修飾のタイプとしてまた、彼らのタンパク質産生レベルにおいて異なることができます。    さらに、表現ホストの選択は、ベクトル、転写、および使用した翻訳要素の選択にしばしば関連します。  例えば、表現ホストの選択はしばしば、しかし、いつもでない系列が利用した先駆の選択に依存しています。   例えば、同じ種の宿主細胞の中に多くの異種のシグナル配列を表すことができるだけです(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞の中に最適に表されます)。    対照的に、他のシグナル配列は、次のような異種のホストで使用することができます、例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞とした組織プラスミノーゲン活性化因子プリ/プロのシーケンスだけで動作するヒト血清アルブミン（hHSA）シグナル配列昆虫および哺乳動物細胞内で機能することが実証され（Tanet a（2002）タンパク質工学。15:337）。  これらと他の要素に基づいて表現ホストの選択をすることができます、浄化のための規定と安全問題や、生産費や、必要性や方法などのように;    したがって、ベクター系は使用される宿主細胞と互換性があるに違いありません。  
【０４４７】
真核生物宿主での発現は、酵母とピキア酵母、ショウジョウバエの細胞と鱗翅目細胞、植物、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類などの植物細胞などの昆虫細胞、ウキクサなどの酵母の式を含めることができます。  真核生物の細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞やベビーハムスター腎臓（牌）細胞などの哺乳動物細胞株が含まれています。  また、例えば、血清、ミルク、および卵にの生産を含んでいて、真核生物発現ホストは遺伝形質転換動物での生産を含みます。  
【０４４８】
遺伝子系列の多くのコピーが発生するように、例えば、変化、移入、感染、電気穿孔法、および微小気泡を通して組み換え分子を宿主細胞に挿入できます。  一般に、標準の移入方法は、バクテリアの、そして、哺乳類のイースト、または大量の抗体チェーンを急送する昆虫細胞株を作り出すのに使用されます、次に標準的方法を使用することで浄化されるもの。(例えば、Coll (1989)  J. Biol. Chem参照してください。., 264:17619-17622;酵素学の方法でタンパク質精製ガイド、Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990)。  真核および原核細胞の形質転換は標準的な手法に応じて実行されます(例えば、Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351;参照してください。; Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362)。  例えば、外国ヌクレオチド系列を宿主細胞の中に紹介するための周知の手順のどれかを用いることができます。  これらはリン酸カルシウム移入、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、バイオリスティクス、リポソーム 、顕微注入法、プラズマベクトル、ウイルス・ベクターの使用、またいかなる他のもクローンのゲノムDNA、cDNA、合成のDNAまたは他の外国産の遺伝子の資料をホストセルに紹介するための他のよく知られている方法を含んでいます。   一般に、宿主細胞は、目的のための、ここに、最初のベクトルが少なくともVHチェーンをコード化している状態でトランスフェクトされていて少なくともVLチェーンをコード化する2番目のベクトルです。
【０４４９】
したがって、それだけで、特定の遺伝子工学的手法が正常に宿主細胞生殖細胞、またはそれらの変更されたフォームを、抗体のポリペプチド発現することができるには少なくとも、両方の遺伝子を導入することができなければ使用されている必要があります。  
【０４５０】
分離された組換え可変領域遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を組み込む組換えDNA分子で宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーを生成することができます。  したがって、遺伝子は形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えDNA分子を分離し、必要な場合、単離された組換えDNAから挿入された遺伝子を取得するによって大量に得ることができます。  一般的に、発現ベクターを細胞に導入された後、トランスフェクトした細胞は、以下に示す標準的な精製技術を用いて培養物から回収される生殖鎖の発現を支持する条件下で培養されます。
【０４５１】
A生体内外の方法を含むタンパク質産生で芸術で知られているどんな方法でも高処理量アプローチを使用することで抗体とそれの部分を生産できます。例えば、再結合している抗体かそれの部分を宿主細胞かホスト動物にコード化する核酸分子の導入そして、生体外に再結合している抗体をコード化する核酸分子からの表現のように。  原始核細胞(特に大腸菌)は、それの多量の再結合している抗体か部分を生産するシステムを提供して、高処理量式のアプリケーションとタンパク質の浄化で特に希望しています。 大腸菌の変化は当業者によく知られている簡単で急速なテクニックです。高処理量表現のための大腸菌宿主株が制限されないcoli、BL21(EMD 生命科学)、およびLMG194(ATCC)含んでいます。  そのような大腸菌宿主株で模範的であるのは、BL21です。  ハイスループット発現ベクターは、pBR322のとpUC系ベクターを含まれますが限定されていません。  そのような模範的ベクトルは、プラスミドAを、表現と浄化のプラスミドC、プラスミドD、およびプラスミドE含む、ここに説明されたベクトルです。表現と浄化のオートメーションは高処理量式を容易にすることができます。  例えば、自動収穫か溶解させるのと浄化ユニットか、他の同様のロボットシステムかまた全自動のシステムに細胞培養を合併するピッコロ（TM）システムの使用は使うことができます。
【０４５２】
a.原核生物の表現
原始核細胞(特に大腸菌)はそれの多量の再結合している抗体か部分を生産するシステムを提供します。   大腸菌の変化は当業者によく知られている簡単で急速なテクニックです。  大腸菌のための発現ベクターは高いレベルのタンパク質の発現を引き起こして、何らかの毒性を宿主細胞に示すタンパク質を急送することの役に立つ誘導プロモータを含むことができます。   誘導性プロモーターの例は、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6のRNAのプロモーターとλPLプロモーター調節温度が含まれています。  
【０４５３】
大腸菌の細胞質環境で再結合している抗体かそれの部分を表現できます。   細胞質は還元環境です、いくつかの分子のために、これは不溶性の封入体の形成をもたらすことができます。   タンパク質を再可溶するのに、ジチオスレイトールやβメルカプトエタノールなどの還元剤と変性剤(例えば、グアニジン-HClや尿素などの)を使用できます。    模範的代替的アプローチは酸化環境と可溶性タンパクの生産につながる分子シャペロンのよう、そして、二硫化異性化元素を供給するバクテリアのペリプラズムスペースの再結合している抗体かそれの断片の表現です。   通常、リーダー・シーケンスはペリプラズムにタンパク質を向ける、表現されるべきタンパク質に溶断されます。   そして、リーダーはペリプラズムにおけるシグナル・ペプチダーゼによって除去されます。  TAT経路に発現したタンパク質を移すに3つの主要な経路があります、すなわちペリプラズム、すなわち秒経路、SRPの経路。  ペリプラズムを狙うリーダー・シーケンスの例はペクチン酸塩リアーゼ遺伝子、StIIリーダー・シーケンス、およびDsbAリーダー・シーケンスからのpelBリーダーを含んでいます。   模範的リーダー・シーケンスはDsbAリーダー・シーケンスです。    いくつかの場合、ペリプラズム表現は表現されたタンパク質の漏出を培地の中に許容します。   タンパク質の分泌は培養上清から迅速で簡単な浄化を許します。  浸透性の病勢減退はペリプラズムから分泌されないタンパク質を入手できます。  細胞表現と同様です、いくつかの場合、タンパク質が解決不能になることができて、変性剤と還元剤は、可溶化を容易にするのに使用されて、リフォールディングすることができます。  誘導の温度と成長も表現レベルと溶解度に影響を及ぼすことができます。   25 oC  と37 oC Cの間の温度は通常、使用されています。  表現されたタンパク質の溶解度を増加させるのに突然変異も使用できます。   通常、バクテリアはaglycosylatedタンパク質を生産します。  したがって、タンパク質が機能のために糖鎖付加を必要とするなら、浄化の後に宿主細胞から糖鎖付加を生体外に加えることができます。
【０４５４】
b.酵母
出芽酵母、分裂酵母、解脂耶氏酵母、マルシアヌスダニ、およびピキア酵母などの酵母は、組換え抗体またはその一部のための便利な表現のホストです。  エピソーム複製ベクターか相同組換えによる安定した染色体の統合で酵母を変えることができます。  通常、誘導プロモータは、遺伝子発現を規制するのに使用されます。   そのようなプロモーターの例はCUP1などのAOX1、GAL1、GAL7、GAL5、および金属結合性蛋白質プロモーターを含んでいます。    表現ベクターはしばしば変成しているDNAの選択とメンテナンスのためのLEU2や、TRP1や、HIS3や、URA3などの選択可能なマーカーを含んでいます。  イーストで表現されたタンパク質は、しばしば可溶性です。  Bipやタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどの分子シャペロンがある共同表現は表現レベルと溶解度を改良できます。   さらに、サッカロミセス酵母から酵母の接合型α-因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合とAga2p嵌合接着受容体などの酵母細胞表面タンパク質またはArxula  adeninivoransグルコアミラーゼとの融合を使用することで酵母で表現されたタンパク質は指示できます。   Kex-2蛋白酵素などの蛋白酵素切断部位、分泌経路を出るとき、表現されたポリペプチドから溶断された系列を取り除くために設計できます。   酵母もAsn-X-Ser/Thrモチーフにグリコシル化することができます。  
【０４５５】
c昆虫 
昆虫特にバキュロウイルス表現を使用して、昆虫細胞は抗体かそれの部分を表現することの役に立ちます。   昆虫細胞は、高いレベルのタンパク質を還表現して、高等真核生物によって使用された翻訳後修飾の大部分ができます。  バキュロ・ウイルスには、安全を改良して、真核生物発現の規定の関心を減少させる制限している宿主域があります。  典型的な発現ベクターはポリヘドリンプロモーターやバキュロ・ウイルスのp10プロモーターなどの高い平らな表現にプロモーターを使用します。   一般的に使用されたバキュロウイルス系はタマナギンウワバ californicaの核多角体病ウイルス(AcNPV)や、カイコガ属のmoriの核多角体病ウイルス(BmNPV)などのバキュロ・ウイルスとSpodoptera frugiperdaから得られたSf9やTrichoplusia Niから得られたTNなどの昆虫細胞株を含んでいます。   高レベルの発現において、表現されるべき分子のヌクレオチド系列はすぐに、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの下流に溶断されます。    人間の抗体を表現できるバキュロ・ウイルス組換え型、pAcUW51などの二重表現転送(PharMingen)を発生させるのは、利用されています。   哺乳類の分泌シグナルを昆虫細胞の中で正確に処理して、培地の中に表現されたタンパク質を分泌するのに使用できます。
【０４５６】
昆虫細胞の代替表現系は安定して形質転換細胞を使用することです。.  Spodoptera frugiperdaからのSf9派生したセルなどの細胞株か、そして、表現にTrichoplusia NiからのTNの派生した細胞株は使用できます。  一貫したレベルの表現を引き起こすのにバキュロ・ウイルス前初期遺伝子プロモーターIE1を使用できます。   典型的な発現ベクターはpIE1-3とpI31-4転送ベクトル(Novagen)を含んでいます。    現ベクターはネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーの使用で通常維持されます。 
【０４５７】
d  哺乳類細胞
抗体かそれの部分を表現するのに哺乳類発現システムを使用できます。    アデノウィルスなどのウイルス感染かダイレクトDNA転送によるリポソーム などの哺乳類細胞、DEAE-デキストランと電気穿孔法や顕微注入法などの物理的な手段によるリン酸カルシウムに表現構造物を移すことができます。  哺乳類細胞のための発現ベクターはmRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始系列(コーザックコンセンサス配列)、およびポリアデニル化要素を通常含んでいます。 そのようなベクトルはしばしば多量発現のための転写プロモーターエンハンサを含んでいます、例えば、SV40のプロモーターエンハンサ、ヒトサイトメガロ・ウイルス(CMV)プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)の長い末端反復など。    これらのプロモーターエンハンサは多くの細胞種類でアクティブです。 表現に組織と細胞種類プロモーターとエンハンサー領域も使用できます。  模範的プロモーター/エンハンサー領域は、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腺腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御エラスターゼなどの遺伝子からのそれらを含んでいますが制限されない。 表現構造物でセルを選択して、維持するのに選択可能なマーカーを使用できます。    選択可能なマーカーの遺伝子の例は、ハイグロマイシンBリン酸、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン- グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシド系リン酸、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼを包含しますが制限されない。  抗体は、NEOR/G418システム、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)システムまたはグルタミン合成酵素(GS)システムを使用することで通常生産されます。  GSシステムは、重鎖と軽いチェーンの両方を表現するのにpEE12/pEE6などの共同表現ベクターを使用します。   細胞表面がTCR-ζやFcεRI-γなどの分子に合図している溶融は細胞表面で活動的な状態のタンパク質の表現を指示できます。  
【０４５８】
多くの細胞株がマウス、ネズミ人間、猿、鶏肉、およびハムスター細胞を含む哺乳類発現に利用可能です。   模範的細胞株はCHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0(非分泌)、他の骨髄腫細胞株、雑種細胞、heterohybridoma細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293、2B8、およびHKBセルを含んでいますが、限られていません。    細胞株もセル培地から分泌タンパク質の浄化を容易にする無血清培地に適合していた状態で利用可能です。   その一例は血清の無料のEBNA-1細胞株(ファム他、 (2003)Biotechno. Bioeng84:332-42)です。 
【０４５９】
e  植物
ここにそれについて説明されたどんな抗体や部分などのタンパク質も表現するのにトランスジェニック植物細胞と植物を使用できます。   プロトプラストにマイクロプロジェクタ衝撃とPEG-仲介転送などの直接的なDNAの転送を使用するか、およびアグロバクテリウム媒介形質転換で表現構造物を植物に通常移します。  表現ベクターはプロモーター、エンハンサー配列、転写終結要素、および翻訳調節要素を含むことができます。   通常、発現ベクターおよび変換技術は、シロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物ホストとトウモロコシや米などの単子葉植物のホスト間で、分割されます。  表現に使用される植物プロモーターの例はカリフラワーモザイクウイルスCaMV35年代のプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、およびトウモロコシユビキチン-1(ubi-1)プロモータープロモーターを含んでいます。   ハイグロマイシンや、phosphomannose異性化元素やネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能なマーカーは、形質転換細胞の選択と維持を容易にするのにしばしば使用されます。  形質転換植物細胞をセル、集合(組織をたこにならせる)として培養で維持するか、または全植物体に作り直すことができます。    遺伝子導入植物セルも蛋白酵素か変更された蛋白酵素を生産するために設計された藻を含むことができます(例えば、メイフィールドet al. (2003) PNAS 100:438-442)を見てください)。.  植物には哺乳類細胞と異なった糖鎖付加パターンがあるので、これはこれらのホストで作り出されたタンパク質の選択に影響を及ぼすことができます。
【０４６０】
3.浄化
抗体とそれの部分は当業者に知られているどんな手順でも浄化されます。 芸術で知られている標準タンパク質浄化のテクニックを使用することで再結合している生殖細胞系列抗体をかなりの純粋さに浄化できます、SDS-ページか粒群とサイズ排除クロマトグラフィーか、硫酸アンモニウム降水量か、はさみ状のクロマトグラフィーか、イオン交換クロマトグラフィーかカラムクロマトグラフィーを含んでいますが限なれない。  例えば、カラムクロマトグラフィーで抗体を浄化できます。  抗体を浄化するための模範的方法は、カラムクロマトグラフィーを使用することです、この中に、高親和性免疫グロブリンを結合するプロテインG、連鎖球菌から細胞表面結合蛋白質にリンクされています。   60%か70%か80%の純度と通常少なくとも90%か、91%か、92%か、93%か、94%か、95%か、96%か、97%か、98%か99%の純度に抗体を浄化できます。  純度は、このようなSDS - PAGEおよびクマシー染色により標準的な方法で評価することができます。
【０４６１】
宿主細胞からの再結合している抗体かそれの部分の浄化のための方法は選ばれた宿主細胞と発現系によります。  一般に、分泌された分子に関しては、セルを取り除いた後に、タンパク質は培地から精製されます。   細胞内発現において、セルを溶解させることができました、そして、タンパク質は抽出から浄化しました。    遺伝子導入植物や動物などのトランスジェニック生物が表現に使用されるとき、溶解させている細胞抽出物をするように材料を始動するとして組織か器官を使用できます。    さらに、トランスジェニック動物生産がミルクか卵におけるポリペプチドの生産を含むことができます、卵を集めることができで芸術の標準方法を使用することでタンパク質を必要ならさらに、抽出して、さらに精製できます。
【０４６２】
抗体が多量で変成しているバクテリアによって表現されるとき、表現は構成している場合がありますが、通常プロモーター誘導の後に、ポリペプチドは不溶性凝集体を形成することができる。  芸術には技能が1つに知られているポリペプチド封入体の浄化に適したいくつかのプロトコルがあります。  多数の変化は当業者に明らかになるでしょう。
【０４６３】
例えば、一般に、1つのメソッドで、セルサスペンションは遠心分離されます,そして、封入体を含むペレットは、溶けませんが、封入体を洗うバッファで再懸濁します。例えば20mM Tris-HCL(ペーハー7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl、および2%でトリトン-X100、非イオン性洗剤。  できるだけ多量の細胞残屑を取り除くために洗濯ステップを繰り返すのが、必要である場合があります。   封入体の残っているペレットは適切なバッファ(例えば、20mMリン酸ナトリウム、ペーハー6.8、150mM NaCl)で再懸濁することができます。    他の適切なバッファは当業者に明らかです。
【０４６４】
あるいはまた、バクテリアペリプラズムから抗体を浄化できます。    ポリペプチドがバクテリアのペリプラズムに輸出されるところに当業者それらに知られている他の方法に加えて、冷たい浸透圧衝撃でバクテリアのペリプラズム部分を遊離させられることができます。例えば、ペリプラズムからの孤立している組換え型のポリペプチドへの1つの方法で、細菌性細胞は、ペレットを形成するために遠心分離されます。   ペレットは20%の蔗糖を含むバッファで再懸濁します。    ペレットは、セルを溶解させるために、バクテリアが遠心分離されて、氷のように冷たい5mM MgSO4で再懸濁して約10分間氷浴に保たれます。   セルサスペンションは遠心分離されます、そして、表面に浮かぶのは、注いで、保存されます。  宿主タンパク質と芸術における技能のものによく知られている標準の分離のテクニックで表面に浮かぶところの現在の組換え型のポリペプチドを切り離すことができます。これらのメソッドは、含まれて、次の手順、これらに限定されない： 
溶解分、サイズの差動濾過、カラムクロマトグラフィー。
【０４６５】
G.  ライブラリのアプリケーションと用途  
ここに提供しているのは、目標の活動を変更するか、または調節する(増減します)抗体か抗体を特定するか、または選択するためのここに提供されたスクリーニングするための抗体ライブラリーを使用する方法です。   上で議論するように、ここに提供された抗体ライブラリーは、ライブラリーに他のすべてのメンバーとそれぞれ異なったメンバー1)そして、それぞれ生産的で機能的な2)を含みます。   これらの特性によって、ライブラリは、スクリーニング機能に多様かつ堅牢です。    例えば、提供されたライブラリを使用して、機能か活動を望んでいて、ここに、小ライブラリー(例えば、1000人以下のメンバーを含む)をスクリーニンして、抗体を特定するのは、可能です。  これは960人のメンバーだけのライブラリが様々な目標に付くのにスクリーニング検定に使用された例13で例示されます、いくつかの高の親近感(ナノモルの親近感)抗体の識別をもたらして。
選別の方法で、ここに、含みますが限られないセルの他の結合、細胞毒性、分化または増殖を含んでいる細胞移動、アポトーシス、新脈管形成、および遺伝子発現変化のためにどんな希望の活動についても検査できます。    例えば、治療標的に対してアゴニストか敵対者抗体の発見のために結果として起こるライブラリをスクリーニンできます、例えば細胞増殖と分化にかかわる目標や、細胞移動や、アポトーシスやangiogeneisなどのように。   このような目標は、成長因子、サイトカイン、リンパ球抗原、他の細胞活性化と受容体をふくみますが限定されない。  
【０４６６】
他の例では、あらかじめ目標に関する特定の知識を必要とせずに興味がある観察可能な生物学的過程を測定するのに”ブラインド”の機能的なスクリーンを使用することでライブラリをスクリーンできます。 例えば、強い機能的活動によって、特定の目標を特定するためにさらに分析評価をスクリーンしながらそのようなもので特定されるどんなヒットも分析できます。 “ブラインド”分析的なアプローチは、任意の観測生物学的結果に適用することができます。   例えば、容易にB細胞のアポトーシスについて検査できます、そして、増加するB細胞アポトーシスのためのスクリーンはB細胞殺害を促進する抗体ヒットをもたらすことができます。  そのような抗体は、CD-20のような知られているB細胞表面タンパクを縛るか、または目新しい目標を縛ることができます。.  別の例では、酵素結合免疫吸着検定法で、骨髄細胞などのセルの人口から特定のサイトカインの増加する(または、減少する)分泌(例えば、インターフェロン・アルファ)について検査できます、これらのタンパク質の分泌を変更する抗体のためにスクリーンするのを許容して。  スクリーンされた結果を獲得するメカニズムに関する先験的などんな知識も必要ではありません、そして、効果が強いなら、後で特定の抗体目標は追求できます。  また、確信している細胞種類で形態変化を引き起こす、または先祖細胞集団で細胞分化を促進しても、抗体がそれであることがわかるためにブラインドの機能分析をハイコンテントスクリーニングアプローチに合併できます。
【０４６７】
ここに提供された選別の方法は、ターゲットプロテイン、ペプチドまたは抗原を表現するターゲットプロテインがここに提供された抗体ライブラリー、ペプチド、抗原またはセルの各器官か単に細胞集団に接触すること、そして、ターゲットプロテインかセルの活動を調節する(増減します)抗体メンバーを特定することを含みます。  例えば、ターゲットプロテインに固まる抗体を特定するためにライブラリのメンバーに接触できます。   別の例では、目標の機能的活動の変調のために抗体をスクリーンできます。  機能分析はアゴニストと敵対者抗体の識別を可能にします。  ここに熟考されて、そのこれほどスクリーンしている分析評価が特に受容体目標や他のシグナリング分子などの膜結合タンパクに対して役に立つということです。
【０４６８】
スクリーンすることを許可する形式でここに提供された抗体ライブラリーは提示できます、例えば空間的なアレイを含むアドレス可能なライブラリ、そして、イースト表示、哺乳類の表示、ファージ提示法、リボゾーム表示を含むmRNA表示、およびDNA表示を含むセル表示ライブラリとして。 例えば、選別はアドレス可能な抗体ライブラリーに実行されます、例えば空間的な整列させられたライブラリのように、場所(例えば、井戸)におけるそれぞれの抗体メンバーは、ターゲットプロテインかタンパク質に対してライブラリの他のすべてのメンバーから別々に接触されて、検査されます。  したがって、”ヒット”の識別のときに、抗体メンバーのアイデンティティはすぐに、アレイの位置から更なる充実、増幅またはそれの配列のための少しも要件なしで知られています。   ライブラリ・スクリーニングは、選別数百から数千に関する高処理量か同じスクリーニング検定で、より多くの抗体であるかもしれません。
ここに抗体スクリーニングが希望の活動を持っている抗体メンバーを特定するのに当業者に知られているどんなテクニックも使用できます。  典型的な高処理量スクリーンに関しては、マイクロタイタープレートのセットは発生されます、それによってマイクロプレートにおける各ウェルは異なったライブラリメンバーを含みます。  例えば、プレートのあらゆるウェルが同じ抗体重鎖を含む抗体を含むところでプレートを作成できますが、各ウェルが異なった軽いチェーンを含むので、各ウェルの対にされた抗体(重くて軽いチェーン)はプレートの他のすべてのウェルの抗体と異なっています。   すべてのウェルに次に、スクリーニング検定(例えば、標的タンパク質かセル、バッファ、分析評価試薬を表現するターゲットプロテイン、)を実行するのに必要な一定の要素に積んで、適切な時期のためにかえされて、選択の読み取りのために検査されます。  シングルの浄化した標的分子またはセルを含む反応が、読み取りを与えるために十分であるところで結合があるか他の機能分析などの活動のための選別にこの方法を使用できます。  
【０４６９】
例えば、そのような方法で、目標(例えばその配位子の存在下で)の効果活性化にセルベースの分析評価を実行できます、そして、活性化(例えばシグナリング、分化、増殖、走化性、アポトーシスまたは他の後続加工を評価などなど)は抗体の存在下で評価されます。
【０４７０】
一般に、このような機能アッセイの性能は、水溶性タンパク質の存在を必要とする。  したがって、それは、彼らが可溶性の形式でスクリーンすることを許可する、ここに提供された抗体ライブラリーの利点です。   例えば、抗体は例えば、多層のプレートのウェルにを対処できます。  各場所におけるそれぞれの抗体は異なっています。  したがって、活動を評価するとき、”ヒット”のアイデンティティはすぐに、決定できます。    
【０４７１】
スクリーンの初期のラウンドに続いて、繰り返しの選別指示された発生法で特定された”ヒット”をさらに最適化できます。  例えば、”ヒット”の識別に続いて、第一のスクリーンライブラリから獲得された情報を使用することで‘集中している'ライブラリを創設できます。 それらが”ヒット”のものに関連する生殖細胞系列セグメントの部品から作成されるので、集中しているライブラリはオリジナルの第一のライブラリの基礎を表します。  彼らは1つに選択された”ヒット”の特性を洗練させることができます、結合があるか関連している機能的活動の親近感を増加させるのなどように。 .  
【０４７２】
抗体のアイデンティティはアドレスによって知られています。   一度特定されていて、抗体Hitsはフルの長さのIgGとしてまたはFab、Fab'を、Fab'の- SHおよびF（ab'）2フラグメントとして発生できます。  組換え型のテクニックと酵素の消化を使用などなどの伝統的な手段でそれの抗体か断片を作成できます。  抗体かそれの断片が、キメラであるか人間化できます。    以下に詳しく説明されるように、診断していて治療法の目的にそれの抗体か断片を使用できます。  
【０４７３】
１．     結合アッセイ
当業者に知られているどんな方法でも選択された目標を縛る彼らの能力のために、ここに提供された抗体ライブラリーはスクリーンできます。  模範的目標抗原は以下で説明されます。   結合アッセイは、溶液、懸濁液または固体支持体上で実行することができます。  例えば、目標抗原を固定票(例えば、炭素、プラスチック表面またはチップ)に固定して、抗体で接触できます。   非結合抗体また標的タンパク質は、洗い流すことができる、結合複合体は、次に検出することができます。   非特異的結合を抑える条件のもとで結合分析を実行できます、非イオン系洗剤(例えば、0.1%のトリトンX-100かトゥイーン20)がある高イオン強度バッファ(例えば、0.3-0.4M NaCl)を使用する、そして/または、タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンかゼラチン)ををブロックするのなどように。    ネガティブコントロールは、背景の尺度の結合などのアッセイを含むことができます。.  結合親和力は、スキャッチャードの分析を使用することで決定している場合があります。(マンソンet al、アナル. 生物化学、107:220（1980））、ビアコアまたは当業者に知られている他の方法。  
【０４７４】
ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA法（免疫測定法をリンクされている酵素）、”サンドイッチ”免疫、メソスケールディスカバリー（MSDは、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、免疫アッセイ、ELISPOTアッ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫アッセイ、などの技術を用いた凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質イムノアッセイなどの技術を使用する模範的結合合アッセイは、競争力か非競争のアッセイシステムなどの免疫学的検定法含みますが限られない。 そのような分析評価は、技術分野（例えば、Ausubel  et al、編、1994年、分子生物学の現在のプロトコル、第1巻、ジョンワイリー＆サンズを、Inc。、ニューヨーク、その全体がここで参考として援用される）で通常であってよく知られています。  他のアッセイ形式は、バインドする特定の分子（例えば、抗体）するように設計さリポソームを使用して、カプセル化された試薬やマーカーを解放するリポソームイムノアッセイ（LIA）を含まれています。 次に、標準的方法によると、リリースされた化学物質は検出されます（Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41を見てください)。  
【０４７５】
一般に、結合は通常目標にまたは、望まれているなら直接ライブラリの抗体メンバーに付く検出可能な半分かラベル(例えば、酵素、放射性核種、蛍光プローブ、「電気-化学発光」ラベル、またはカラー染料)を使用して検出されます。  あるいはまた、結合はラベルされているか、または検出可能の一層の3番目の試薬によって検出されます。  たとえば、ターゲットタンパク質に結合した抗体の検出は、サンドイッチ法の形式でラベルキャプチャ分子を用いて達成することができます。    ラベルエージェントとして明確にタンパク質Aかタンパク質Gなどの免疫グロブリン定常領域を結合することができる他のタンパク質も使用できます。 これらのタンパク質が免疫グロブリン定常領域でさまざまな種から強い非免疫原性の反応性を示します (see, e.g., Kronval et al., (1973) J. Immunol. 111:1401-1406; Akerstrom et al., (1985) J. Immunol. 135:2589-2542)。 ビオチンなどの検出可能な半分で検出エージェントを変更できます、これにストレプトアビジンなどの別の分子が明確に結合することができます。 さまざまな検出可能な半分が当業者によく知られています。
【０４７６】
分析評価に使用されるラベルか検出可能なグループの選択は重要ではありません、分析評価に使用される抗体の特異結合をかなり妨げない限り。 一般に、この選択は必要である感度、化合物がある活用の容易さ、安定性要件、利用可能な計装、および処分条項次第です。   当業者の一つ技能は、ラベルに精通して、使われる分析評価との適当でコンパチブル検出可能なラベルを特定できます。
【０４７７】
検出可能なグループは検出可能な物理的であるか化学の性質があるどんな材料であってもよいです。  そのような検出可能なラベルは免疫学的検定法の分野でよく開発しています、そして、一般に、いずれもそのような方法で役に立つとラベルする大部分を本発明に適用できます。 したがって、ラベルが分光器、そして、光化学、そして、生化学、免疫、電気、光学、または、化学の手段で検出可能な構成のいずれかです。  本発明における役に立つラベルは電磁ビーズ(例えば、ダイナビーズ）、蛍光染料(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサス赤、ローダミン、および同様のもの)、放射(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P);  酵素(例えば酵素結合免疫吸着検定法に一般的に使用される、山葵ペルオキシダーゼ類、アルカリ・ホスファターゼ、および他のもの)か、化学発光ラベル(ルシフェリンと2、3-dihydrophtahlazinediones、例えば、ルミノール)と、コロイド金か色ガラスなどの比色分析のラベルかプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど) を含んでいます。  使用できる様々なラベリングか信号生産システムのレビューに関しては、例えば。合衆国はNo.4,391,904の特許を見てください。
【０４７８】
ラベルを検出する手段は、当業者にによく知られています。 したがって、例えば、ラベルが放射性標識であるところでは、検出のための手段は放射線写真法のようにシンチレーション・カウンタか写真用フィルムを含んでいます。 ラベルが蛍光標識であるところでは、光の適切な波長がある蛍光色素を励起して、結果として起こる蛍光を検出することによって、それを検出できます。  電荷撮像素子(CCDs)か光電子増培管やおよび同様のものなどの電子感知器の使用で目視により蛍光を検出できます。 同様に、適切な基板を酵素に提供して、得られた反応生成物を検出することによって、酵素のラベルは検出できます。 単にラベルに関連している色を観測することによって、最終的に簡単な比色分析のラベルを検出できます。 
【０４７９】
いくつかの分析評価形式はラベルされたコンポーネントの使用を必要としません。 例えば、目標抗体の存在を検出するのに接着分析評価を使用できます。 この場合、抗原でコーティングされた粒子は目標抗体を含むサンプルによって膠着させられています。 この形式では、コンポーネントのどれかはラベルされる必要はありません、そして、目標抗体の存在は簡単な目視検査によって検出されます。
【０４８０】
あるいはまた、セルに付く彼らの能力のためにここに提供された抗体ライブラリーはスクリーンできます、全細胞撮影を使用して、減算の撮影のあるなしにかかわらず。 スクリーニングは生きている細胞に対して、またはそのまま、軽度固定標的細胞に対して行うことができます。  全細胞撮影のための方法は以前に、説明されます (例えば Siegel et al. はここに参照で盛込まれた(1997) J. Immunol.方法 206:73-85 を見てください)。 適用できる選別のための他のテクニックは蛍光活性セルソーティング(FACs)を含んでいます;。 
【０４８１】
ハイスループットスクリーニングのために、アッセイは、多重化することができます。  その結果、多くの異なったターゲットプロテインへの抗体の結合親和力はすぐに、決定できます。  1つの例では、異なるターゲットタンパク質が別々に異なる検出部分ラベルを付けることができます。  例えば、色分けされたビーズと異なった抗原を結合できる、(シュベンクet al (2007) Mol.セル. Prot., 6:125-132).  別の例では、マルチスポットプレートを使用できます、それは最大100個のタンパク質についてプレートの場所で吸収を多重送信する分析評価を許容します(例えば、メソスケールディスカバリーから多アレイか多スポットプレートを使用します; MSD、ゲイザースバーグ(MD)。.  そのような例では、マルチスポットプレートの各ウェルへの異なった抗体メンバーの追加でここに提供された処抗体ライブラリーはスクリーンできます。  アッセイは、容易に多数の標的タンパク質に対する一度に抗体の何千ものスクリーニングを可能にします。  これは例13でここに例示されます。    
【０４８２】
スクリーンの方法で、ここに、抗体の結合親和力は、ターゲットプロテインのために高い親近感を持っている抗体を特定するか、または選択するのために決定しています。    10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12Mに関してある、または低い結合親和力がある抗体は、通常、選択されるか、または特定されます。  一般に、抗体がナノモルかサブナノモル結合親和力を持ちながら特定されるまで、抗体はスクリーンされます。   希望の結合親和力を持っていない選別の最初のラウンドで特定された”ヒット”は、繰り返しの選別、そして/または、指示された発生法で最適化して、高い結合親和力を持っている抗体を特定するために目標抗原に付くようにさらにスクリーンできます。
【０４８３】
当業者に知られている任意のメソッドは、抗体の結合親和性を測定するために使用することができます。  例えば、飽和結合分析評価、例えば飽和酵素結合免疫吸着検定法を実行することによって、抗体の結合特性を評価できます、例えばターゲットプロテインに付くのは酵素結合免疫吸着検定法によって増加する量の抗体で評価されます。    そのような実験では、結合が線量依存性そして/または、可飽和であるかどうか 評価する可能です。  さらに、50%の結合がある信号から結合親和力を推定できます。  その結合定数(ka)か解離定数(Kd)で通常、見かけの結合親和力は測定されます、そしてスキャッチャードの分析を使用することで決定されます(ムンソンet al、Anal 生物化学、107:、220(1980)。  例えば、ラベルされていないタンパク質の増加する濃縮が加えられるところでの競争結合分析でターゲットプロテインへの結合親和力を評価できます、放射線検定法(RIA)やELISAなどのように。  ビアコア動態解析を使用することで結合親和力も分析できます。  これは、それらの表面で固定されたターゲットプロテインを含むチップから抗体メンバーの結合と解離を分析することを含まれます。  ビアコア評価ソフトウェアは、データを相互作用モデルに合わせることによって、KaとKdの値を発生させます。  結合親和性のすべてのアッセイは、大まかな近似をを提供しますが、使われた分析評価と条件によって、抗体の結合親和力が異なることができるのが理解されます。  様々な条件のもとで様々な分析評価を実行することによって、抗体の結合親和力を見積もるのは、可能です。  
【０４８４】
さらに、抗体の構造によって、結合親和力は異なることができます。  一般に二価抗体、例えば、二価のF（ab'）2フラグメントまたは完全な長さのIgGは一価のFab抗体より良い結合親和力を持っています。 したがって、Fabには特定の目標のための指定された結合親和力があるところで結合親和力が二価である完全な長さ免疫グロブリンがさらに大きいのが、除外されているのが理解されます。
【０４８５】
2.機能的活動
当業者が1つに知られているどんな方法による目標の機能的活動も調節する彼らの能力のために、抗体ライブラリーがここに提供した機能的な活動をスクリーンできます。 分析評価は、細胞の表面にある受容体を結合する、そして/または、調節できる抗体を特定するように設計される場合があります。  そのような抗体は、受容体結合の正常な効果をまねるアゴニストか、または受容体結合の正常な効果を抑制する敵対者のどちらかであるかもしれません。 特定関心は受容体に結合して、細胞内合図を調節するエージェントの識別です。
【０４８６】
何らかの例では、そのような分析評価はセルベースの分析評価です。    一般に、分析評価は、興味がある目標を表現するのが知られている細胞株を使用することで実行されます。  .  このような細胞は、当業者のいずれかに知られてます。たとえば、いずれかの細胞を識別するためにATCC受託カタログ（atcc.org）相談することができます 。.  また、そのようなセル、そして/または、彼らの即座に手があいているソースを得るための手段は、特定の細胞種類が望まれているなら当業者に知られています。  科学的文学の分析は容易にセルがどんな希望の目標も表現するのが適当な選択を明らかにすることができます。    表18はここに提供された抗体ライブラリーに対してここに機能的活動でスクリーンできる興味がある目標を表現する模範的セル線を記載します。 
【０４８７】
【表１８】
2016127850.tif 000148
2016127850.tif 000149
【０４８８】
さらに、興味がある目標を急送するセル線は発現ベクターが興味がある目標を表現している一時的であるか安定した移入で発生できます。  
【０４８９】
カウフマンら、トランスフェクションと表現の方法は、当業者が知られている（カウフマンのRJ（1990）酵素学のメソッド185:537-566カウフマン et al.
（1990）酵素学メソッド185:537-566の）。  さらに、特定の目標(例えば、セルの表面マーカー)の表現のためにどんなプライマリセルや細胞株も評価できます。   抗体とFACSとラベルされた蛍光を使用することでセルの表面マーカーについて検査できます。  適当な細胞株はA549(肺)、HeLa、Jurkat、BJAB、Colo205、H1299、MCF7、MDA MB231、PC3、HUMEC、HUVEC、およびPrECを含んでいます。  
【０４９０】
ここに説明されるように、どんな適当な機能的効果も測定できます。 例えば細胞形態学(例えば、細胞体積、核体積、セル周辺、および核周辺)、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性か細胞移動と、細胞表面マーカー式と、細胞増殖と、GFPの陽性と色素希釈分析評価(例えば、細胞膜に固まる染料によるセル追跡者分析評価)、DNA合成アッセイ（FACS分析とBrdUのかHoechst色素など例えば、3H -チミジン、蛍光DNA結合染料）と核巣アッセイなどのすべての適当な分析評価が、セルベースのシステムを使用することで潜在的変調器を特定することになっています。  測定できる他の機能的活動は、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼ、そして/または、エキソヌクレアーゼ活性、両方の知られていると未同定の遺伝的マーカー（例えば、ノーザンブロット）への転写の変更、遺伝子マーカー(例えば、北しみ)を非特殊化しました、細胞の代謝における変化、と変化はヌードネズミ、および他のものにおける細胞増殖とセル表面マーカー表現とDNA統合とマーカーと色素希釈分析評価(例えば、GFPとセル追跡者分析評価)、コンタクトインヒビション、腫瘍の成長ヌードマウス、およびその他を包含します。
【０４９１】
例えば、彼らのターゲットプロテインを表現するのが知られているセルの1つ以上の表現型の変調のためにここに提供されたライブラリの抗体かそれの部分を評価できます。    彼らの使用のための表現型分析、キット、および試薬は、当業者によく知られて、抗体ライブラリーをスクリーンするのにここに使用されます。 いくつかの商業業者のどれかから購入できる代表的な表現型アッセイは細胞の生存を決定するためのそれら、細胞毒性、増殖または細胞生存(分子プローブ、ユージン、オレゴン;パーキンエルマー、ボストン、マサチューセッツ州)(酵素の分析評価(Panvera、LLC、マディソン、ウィスコンシン州; BD 生命科学、フランクリン・レイクス、N.J.; がん遺伝子リサーチ商品、サンディエゴ、カリフォルニア)、細胞調節を含むタンパク質ベースの分析評価)がトランスダクションを示します、炎症;  酸化過程、アポトーシス(分析評価デザイン Inc.、アナーバー、ミシガン州)、トリグリセリド蓄積(σ-オルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)、新脈管形成分析評価、管形成分析評価、サイトカイン、ホルモン分析評価、および新陳代謝の分析評価(ケミコンの国際Inc.、テメキュラ、カリフォルニア; アマーシャム生命科学、ピスキャタウェイ(ニュージャージー州)を含みます。
【０４９２】
特定の表現型分析（すなわち、A549細胞、HeLa細胞、ジャー、BJAB、Colo205、H1299、MCF7、したMDA - MB -231、PC3のHUMEC、HUVECの、とprecと関心の対象を表現するために知られている任意の他）に適切であると決心しているセルは抗体、またコントロール化合物と処理されます。  必要なら、受容体目標のための配位子が含まれているので、受容体の起動は作用しています。  処理の期間の終わりに、扱われて未処置のセルは分析評価が表現型の結果、終点を決定するように特定の1つ以上の方法で分析されます。  
【０４９３】
表現型のエンドポイントはタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類や金属などの細胞成分の濃度の変化か時間や処理量以上の細胞形態の変化を含んでいます。   細胞周期は、吸気または細胞による生物学的指標の排泄の段階をpHが含くむ細胞状態の測定はた、興味のあるエンドポイントです。  
【０４９４】
ターゲットプロテインの上に抗体の直接効果を評価するために分析評価を実行できます。    例えば、ターゲットプロテインが細胞の表面にある受容体であれば、ターゲットプロテインが直接変調するかどうか評価するために抗体を加えることができます、受容体の刺激、活動または機能などのように。    そういった場合には、抗体はアゴニスト抗体であると考えられます。   他の例では、配位子か他の刺激剤の面前でターゲットプロテインが細胞の表面にある受容体であれば、抗体が抗体の作用を調節するかどうか(例えば、禁止します)決定するために抗体の存在か不在で受容体の活動を刺激できます。   例えば、抗体は、配位子が受容体と対話する、そして/または、そうでなければ否定的刺激性シグナルを引き起こす能力を妨げることによって、行動できます。  このような場合では、抗体が受容体拮抗薬と考えられます。    したがって、選別の方法はここに機能的活動でアゴニストと敵対者抗体の識別を可能にします。
【０４９５】
a.  分化
物理的であるか、化学的であるか表現型な変化の検出を許すどんな分析評価も使用することで細胞分化を分析できます。   様々な分析評価は、量的に外部刺激に対応して細胞増殖と起動を決定するのに使用されます。   セル増殖分析は、細胞分裂で新たに統合されたセルのDNAに試薬を組み入れることによって量的に細胞増殖を決定するのに使用されます。   そのような試薬は3H-チミジン、ブロモ-2分の5デオキシウリジン(BrdU)、および蛍光ヘキスト染料に含んでいますが、限られていません。   染料でセルに染色して、染料がいくつのセル理解力を基礎づけたかを測定することによって細胞生存率アッセイは、細胞が染料を除くという事実でサンプルの正常細胞の数を測定するのに使用されます。  そのような染料が3 -（4,5-ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5- diphenyltetrazolium臭化（MTT）、2,3 -ビス（2-メトキシ- 4-ニトロ- 5-スルホフェニル）- 2Hの-テトラゾリウム- 5- carboxanilide内部塩（xtt）、4- [3- （4-ヨードフェニル）-2 - （4-ニトロフェニル）- 2Hの-5- tetrazolio]-1,3-ベンゼンジスルホン（WST - 1）を含みますが限らない。  試薬の取り込みは、いずれかの測色分光光度計を使用するか、またはシンチレーションカウンターで放射を測定することによって測定されます。   これらのメソッドの詳細はよく、当業者に知られています。たとえば、例12は、細胞の増殖を評価するためにMTTの増殖アッセイを例証します。.
【０４９６】
蛍光染料はさまざまなセルベースの分析評価における生細胞と主要な機能的活動の検出に一般的に使用されます。    細胞代謝に依存していないいくつかの非放射性、蛍光ベースのアッセイがあります。  蛍光染料は核酸を結合します、そして、次に、量的または質的に蛍光は測定できます。   このような染料は、ヨウヨウ化とHoechst33342を含みますが限定されない。セル番号が蛍光に基づいて定量することができます。  また、イメージ器具で利用可能なツールを使用することでDNA含量を定量されることができます。   これらのメソッドの詳細については、よく、当業者に知られています。
【０４９７】
異常な細胞増殖と腫瘍成長を抑制できる抗体を特定するのに分析評価としてマトリゲルへの生体内侵入性の度合いかある他の細胞外液母材成分を使用できます。  腫瘍細胞はセルの悪性と生体内侵入性との良い相関関係をマトリゲルlかある他の細胞外液母材成分に示します。 この分析評価では、発癌性細胞は宿主細胞として通常使用されます。  したがって、宿主細胞の間の生体内侵入性のレベルにおける測定変化は潜在的変調器の導入の前後に抗体を特定できます。
【０４９８】
簡潔に、マトリゲルと共にコーティングされたフィルタかある他の細胞外液母材成分を使用することによって、宿主細胞の侵入のレベルを測定できます。   フィルタの遠位側か皿の下部で細胞数と動かされた距離、125Iと共にセルを前ラベルして、または放射能を数えることによってゲル、フィルタの遠位側に突き抜けることへの浸透は、生体内侵入性として評定されて、組織学的であると評定されます。 動物細胞の基本法のマニュアルの、フレッシュニー、文化などを参照してください第3版、ワイリーリスは、ニューヨーク（1994）、ここに引用して援用）。
【０４９９】
b.  遺伝子発現変化
生物反応を検出することによって、抗体による結合の検出、そして/または、目標の変調を実行できます、レポーター遺伝子の例えば、測定するCa2+イオン流出、cAMP、IP3、PIP3または転写などのように。  また、処理の後のセル(レポーター遺伝子分析評価を使用するセルの遺伝子の1つ以上の表現の測定)の遺伝子型の分析は効力のインディケータか抗体の力として使用されます。  ホールマークの遺伝子か、信号変換経路に関連しているように疑われたそれらの遺伝子は、扱われたものと同様に未処置のセルの中で測定されます。
【０５００】
レポーター遺伝子の起動を測定する分析評価は実行できます。 適当なレポーター遺伝子は熟練した職人にとって、身近な標準方法のいずれでもセルに挿入される外来遺伝子と同様に内在性遺伝子を含んでいます、移入や、電気穿孔法や、リポフェクションやウイルス感染などのように。    例えば、組換え受容体を発現する細胞は(例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、蛍ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、およびアルカリ・ホスファターゼ)がレポーター遺伝子をトランスフェクトすることができで作動応答要素にリンクされている。 次に、セルは抗体でかえされます、そして、レポーター遺伝子の表現は表現していませんが、組み換え受容体が本質的にはその他の点では同じ対照細胞の中で表現にたとえられます。  受容体発現細胞におけるレポーター遺伝子発現における統計的に重要な変化は受容体と対話するテスト化合物を暗示しています。    また、目的のタンパク質は、赤や緑色蛍光タンパク質などの第2のレポーターに添付ファイルを介して間接的にレポーターとして使用することができます (例えば、 Mistili & Spector, (1997) Nature Biotechnology 15:961-964参照してください。).  
【０５０１】
構築レポーターは、通常、細胞にトランスフェクトされます。 潜在的な変調器で処理した後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活動の量は当業者に知られている標準技術に準拠して測定されます。ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイを使用すると、STAT5が直接、または実施例12で実証されているサイクリン- Dのプロモーターの誘導活性化を測定します。 
【０５０２】
c.   細胞毒性活動
直接アポトーシスかプログラム細胞死を引き起こすか、または増殖因子受容体、その結果事実上人目についている増殖を妨げることによって間接的にアポトーシスを引き起こす彼らの能力のために抗体をスクリーンできます。   また、補体依存性細胞傷害(CDC)として知られている、ダイレクト細胞毒性に通じて、抗体は補数を結合します。 したがって、補体依存性細胞傷害を評価するために分析評価を実行できます。
【０５０３】
アッセイの様々な評価する。アポトーシスは、当業者のいずれかに知られている。たとえば、アポトーシスアッセイは、アポトーシスに関与する酵素であるカスパーゼの活性化をアッセイするこれらを含まれています。  カスパーゼアッセイは、活性酵素、タンパク分解活性にチモーゲン処理の測定に基づいています。  市販のキットおよび試薬の数は、カスパーゼ関数に基づいて、アポトーシスを評価するために利用可能です、PhiPhiLux（OncoImmunin、Inc。）は、カスパーゼ3活性アッセイ（ロシュアプライドサイエンス）、均質カスパーゼ法（ロシュダイアグノスティックス）、カスパーゼグロアッセイ（Promega）、アポ- ONEの均一カスパーゼ- 3 / 7アッセイ（Promega）を、CaspACE アッセイシステム比色またはFluormetric（メガ）、EnzChekカスパーゼ3アッセイキット（Invitrogen社）、ImagのITライブ緑色のCaspase -3および7の検出キット（Invitrogen）は、Activeカスパーゼ3の検出キット（Stratagene）、カスパーゼによるアポトーシス製品（BioVision）とカスパーゼのアポトーシス測定キット（Genotech）を含みますが限らない。  例11は、カスパーゼ分析評価を使用することでアポトーシスのための含有を例示します。
【０５０４】
アポトーシスのための分析評価はTUNELとヌクレアーゼの起動とDNAのその後の分裂を180-200塩基対の増分に測定するDNA断片化分析評価を含んでいます。   そのような分析評価とキットが商業的に利用可能であり、アポトーシスのDNAラダーキット（科学応ロシュ）、細胞DNAの断片化酵素免疫測定法（応用科学ロシュ）、細胞死検出ELISAPLUS（ロシュダイアグノスティックス）、その場細胞死検出キット（科学応用ロシュ）、デッドエンドFluorometircや色彩TUNELのシステム（Promega）、APO- BrdUのTUNELのアッセイキット（Invitrogen）、およびTUNELアポトーシス検出キット（州北部）包含しますが、限らない。
【０５０５】
アポトーシスを評価する他の分析評価は例えば膜の保全の損失を評価するセル透過性測定を含んでいます。   例えば、抗体が細胞死を引き起こすことができるかどうか決定するために、未処置のセルに比例してプロピジウムヨウ化物(PI)、トリパンブルー、または7-aminoactinomycin Dの摂取によって評価される膜の保全(7AAD)の損失を評価できます。     さらに、アポトーシスを測定するのにAPOPercentage アッセイ(Biocolor アッセイ)などの市販キットを使用できます。   アネキシン V分析評価も使うことができます。  アネキシンVはホスファチジルセリンに結合します、通常、それは、細胞膜の木裏で見つけられます。   アポトーシスの間、ホスファチジルセリンを外表面に転位して、アネキシン V.Forの例で検出できて、蛍光ラベルされたアネキシン Vを使用する標準の結合分析は使用できます(例えば、インビトロジェンからの、アネキシン V、アレックスFluor350Conjugate)。   タンパク質切断を評価して、アポトーシスの他のマーカーの存在を評価するミトコンドリアとATP/ADP分析評価でアポトーシスも測定できます。   このようなアッセイは、ルーチンと当業者に知られています。
例えば、RKO、HCT116、または興味があるターゲットプロテインを急送する他のセルなどのようの細胞株を使用することで機能的抗体を特定するのに分析評価としてアポトーシス分析を使用できます。   細胞が共同緑色蛍光タンパク質、またはセルのトラッカー色素をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含む構築物とトランスフェクトすることができます。  アポトーシス変化は、当技術分野で知られている方法を使用することで決定できます、蛍光顕微鏡を使用する、DAPI汚損やTUNEL分析評価のように。    そして、TUNEL分析評価に、商業的に利用可能なキットを使用できる（例えば、フルオレセインFragELのDNA断片化検出キット（癌遺伝子研究製品、猫＃QIA39）とテトラメチル- ローダミン- 5- dUTPを（ロシュ、猫、 (Cat#1534 378) 。  # 1534 378)).  抗体で接触されたセルは、例えば、対照群に比べ増加したアポトーシスを展示します。 
生体外に、補数と免疫がある効果細胞がないとき抗体依存性細胞傷害(ADCC)か補体依存性細胞傷害(CDC)によって引き起こされた細胞死を区別することを決定できます。 したがって、細胞死のアッセイは、不活化血清（補体の存在下で、すなわち）と免疫エフェクター細胞の非存在下で熱を使用して実行することができます。 
【０５０６】
3.目標
ここに提供された選別法で、抗体はどんな活動のためにもスクリーンされます、結合か他の機能的活動などのように、目標に対して。  活動は、目標のアゴニストかアンタゴニスト活性であるかもしれません。  スクリーニング法は、任意の企図目標に基づいて設計することができます。  このようなターゲットの例は膜結合タンパク質、受容体とリガンド物;イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体、新規なエピトープ、および非タンパク質抗原を含みます。  どんな活動も、評価できて、目標の興味がある機能です。   当業者は、様々な目標の活動になじみ深く、そのような知られている活動に基づくスクリーニング検定を選ぶことができます。   模範的目標のためのこれらの活動の多くが以下でここに例示されます。    すべての目標のために結合活性を評価できます。  
【０５０７】
膜結合タンパク質、受容体とそのリガンド
模範的目標は、特に多細胞生物の構成、分化、および維持における重要な役割を果たすことができる、膜結合タンパクと、受容体とそれの配位子です。 これらの機能を妨げる抗体を特定するのは熟考されます。  例えば、多くの個別細胞の運命(例えば、他のセルとの増殖、移動、分化、または相互作用)は、他のセルから受け取られた情報、そして/または、じかに接する環境によって通常決定されます。  さまざまのセル受容体か膜結合タンパクによって順番に受け取られて、解釈される分泌されたポリペプチド(例えば、マイトジェン因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、およびホルモン)によってこの情報はしばしば伝えられます。 これらの分泌されたポリペプチド、または、シグナリング分子は、通常それらの細胞外環境における動作の場所に達するようにセル分泌経路を通り抜けます。  したがって、そのような目標(受容体か配位子)のいずれか以上に対する抗体の識別は重要な経路疾患を調節できます、その結果、病気を変調して、症状を改善します。  
【０５０８】
このような膜結合タンパク質および細胞受容体はサイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体の脱リン酸化、細胞間相互作用に関与する受容体、カドヘリン、インテグリンのような細胞接着因子の分子、およびそのような受容体のリガンドを含みます限られない。    このようなターゲットの例としては、細胞表面の受容体などの膜結合型受容体が含まれてVEGFR- 1、VEGFR- 2、VEGFR -3（血管内皮細胞増殖因子受容体1、2、4）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、ErbB- 2、ErbB- b3、IGF- R1、C- Met（また、肝細胞増殖因子受容体として知られている。HGFR）、DLL4、DDR1（ディスコイジンドメイン受容体）、キット（c - キットのためrecetpr）、FGFR1、FGFR2、FGFR4（線維芽細胞増殖因子受容体1、2、4）、ロン（（recepteur原産地nantais;また、マクロファージ刺激する1受容体として知られている）、TEK（内皮特異的受容体チロシンキナーゼ）、TIE(免疫グロブリンがあるチロシン・キナーゼとepimermal増殖因子相同ドメイン受容体)、CSF1R(刺激因子1つのcolngly受容体)、PDGFRB （血小板由来増殖因子受容体B）、EPHA1、EPHA2、EPHB1（エリスロポエチン産生細胞受容体A1、A2およびB1）、TNF- R1、TNF- R2、HVEM、LT -βR、CD20、CD3、CD25、ノッチ、 G - CSF- R、GM - CSFの- RおよびEPO- Rを含みますが、これらに限定されない。他のターゲットは、カドヘリン、インテグリン、CD52またはCD44の中から選択のような膜結合タンパク質が含まれています。  ここに選別法の目標であることができる模範的配位子は、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、BTLA、リンホトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF、およびEPOを  包含していますが、限られない。  
【０５０９】
当業者は、活動や様々な標的タンパク質の機能に精通しています。  したがって、スクリーニング検定(例えば、結合があるか機能的な分析評価)は上で説明した結合、増殖またはアポトーシス分析評価のいずれも例のように、ここに抗体ライブラリーをスクリーンするためにそのようなものを選ぶことができます。   表18Aはそのようなターゲットプロテインをスクリーンするのに使うことができる模範的ターゲットプロテインの活動と知られている機能、模範的分析評価の概要および模範的分析評価を提供します。   別の例では、ターゲットプロテインのための結合親和力のために抗体かそれの断片をスクリーニングできます。    ターゲットプロテインの既知のエピトープ、または、目新しいエピトープに結合があることができます、以下でここに説明されるように、特定できます。 表18Bは治療抗体によって認識された模範的ターゲットプロテインに知られているエピトープの例を供給します。   さらにも従うセクションは、ターゲットプロテインの活動と機能を例示します、模範的スクリーニング検定とその結果特定された抗体を含んでいます。  ターゲットプロテインへの高い親近感を示す、そして/または、そうでなければターゲットプロテインの活動を調節する抗体を特定するために興味があるどんなターゲットプロテインに対して同様の分析評価を使うことができるのが理解されます。
【０５１０】
【表１８Ａ】
2016127850.tif 000150
【０５１１】
【表１８Ｂ】
2016127850.tif 000151
【０５１２】
i. ノッチとノッチリガンド
a)ノッチ蛋白質
ノッチ蛋白質（ノッチ１はSEQ ID番号：2002により；ノッチ2はSEQ ID番号：2003により；ノッチ3はSEQ ID番号：2004により；ノッチ4はSEQ ID番号：2005により）は細胞間交流に決定的な役割を果している一方通行の膜貫通レセプター蛋白質であります。ノッチ族の細胞表面レセプターは各種の幹細胞と無差別前駆細胞など多種の細胞の上に、胎芽にせよ、出生後の自己更新組織にせよ、発見されます。Artavanは-Tsakonasなどの (1995) 科学 268:225-32をご参照に。例えば、人初代マクロファージは全てのノッチレセプターを搾り出し、マクロファージ差異化の間にノッチ3を選択的に増やします（Fungなどの(2007) 循環、 115:2948-2956をご参考に）。特に内皮細胞にも発見されたノッチ４は血管新生に役立ちます。ノッチはリンパ細胞の上にも存在します。ここでノッチシグナリングはリンパ細胞の成長や、成熟や、活性化や、転換などに参与します。
【０５１３】
五種類のノッチリガンドがあり、それぞれはデルタ様１、デルタ様3、デルタ様4、ジャグド1、ジャグド2と命名されます。ノッチがリガンドに活性化されるとき、その細胞内ドメインは蛋白分解性に切り裂かれて細胞核に運ばれ、CSL(CBF-1/Su(H)/Lag-1/RBP-JK)転写因子と一緒に下流エフェクターの転移を活性化します。生じたエフェクターは他のジーンエンコーディング転移因子が末端差異化に入るために取る転移活性を抑制します。 
【０５１４】
ノッチシグナリング通路（NSP）は各種の細胞の成長と組織内バランスの期間に、差異化や、細胞運命決定や、幹細胞維持や、細胞活性性や、増殖や、細胞死亡など多数の細胞過程に存在します。ノッチシグナリングは多種の癌の場合に調節不全になるります。間違ったシグナリングは多数の疾患に関わります。例えば、T-ALL （T細胞性急性リンパ性白血病）や、CADASIL（皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症）や、多発性硬化症（MS）や、ファロー四徴症や、アラジール症候群や、多発性骨髄腫や、他の症状などであります。それでノッチは蛋白質治療学の主な目標になります（アメリカパテント番号6083904をご参考に）。  
【０５１５】
ここで提供された抗体ライブラリーは、ノッチレセプターとの結合及び／または功能活性を測定することより、活性調節用にえり分けられます。功能活性は増殖、細胞活性性、細胞死亡などノッチレセプターを発見する活性であります。例13はここでノッチ1と結合する抗体を選択し、または確認するように提供された抗体ライブラリーについての結合測定を例示します。測定はRBP-Jκ/CBF-1蛍光素酵素レポーター測定などを利用するシグナル転換測定をも含みます（Fungなどの(2007)循環、 115:2948-2956をご参考に）。ノッチリガンドがあるにせよ、ないにせよ、測定を行えます。例えば、DLL4をあらわす各細胞のコインキュベーションにより（Fungなどの(2007)循環、115:2948-2956をご参考に）、またはリガンドの固定化により（ Lefortなどの(2003)実験血液学、34:1720-1729をご参考に）測定を行います。例えば、Fungなどの記述によると、細胞は安定的にDLL4を発見した構造により形質移入されることも、ノッチを発見した人初期マクロファージを覆うことも、抗体ライブラリーメンバーがある場合に測定を受けることもできます。
【０５１６】
ノッチレセプター（ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3及び/またはノッチ4）の活性を調節するここで提供されたライブラリーから確認されたその抗体または部分はノッチの発見及び/または活性に関する病気の治療または予防に使用されます。これらの抗体はこの治療に反対抗体または反反対抗体として使われます。例えば、ノッチの反対抗体は癌細胞の成長または増殖を抑制したり減少したりするように使われます。例えば、前立腺癌と白血病などのさまざまの癌の治療に使われます（US6689744をご参考に）。  
【０５１７】
ここで提供された反対抗体はT細胞急性リンパ性白血病、リンパ腫、異常血管分布に関わる肝臓病、糖尿病、卵巣癌、血管細胞運命に関わる病気、関節リウマチ、膵臓癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫やプラズマ細胞白血病や髄外性形質細胞腫などのプラズマ細胞腫瘍、神経芽腫などへの治療にも使われます。多発性骨髄腫などのプラズマ細胞不調、血管新生、乳癌や結腸直腸癌や肺癌や膵臓癌や前立腺癌肝癌や卵巣癌や頭頚部腫瘍や、皮膚腫瘍や脳腫や血液腫瘍などの肉腫や癌への治療にも使われます（US20080226621、WO2008/091641、WO2005/054434をご参考に）。ノッチシグナリングは皮膚と血管と脂肪の発育に関わりますが、活性化されたレセプターは乳腺上皮を変質させます。そのゆえ、ノッチの反対抗体は乳腫瘍の治療に使用されます（US20080206753をご参考に）。  
ここで提供されたのはノッチ１の活性を調節する抗体であるから、ノッチ1の発見や活性に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はノッチ１と結合親和力を持つ抗体を含みます。そのノッチ1は10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 Mまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
ここで提供されたアンチノッチ1抗体はせめて一つのCDRを有する抗体を含み、CDRはCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及び/またはCDRL3であります。例えば、CDRH1はGYTFTSYYMH（アミノ酸26-35、配列同一性番号は1512）であります；CDRH2はIINPSGGSTSYAQKFQG（アミノ酸50-66、配列同一性番号は1512）であります；CDRH3はEGYSSSWYDYFDY（アミノ酸99-111、配列同一性番号は1512）であります；CDRH3はeyyygsgsyyndyfdy（アミノ酸99-114、配列同一性番号は1509）であります；CDRL1はRASQSVSSNLA （アミノ酸24-34、配列同一性番号は1843）であります；CDRL1はRASQSVSSSYLA （アミノ酸24-35、配列同一性番号は1833）であります；CDRL1はRASQSはSWLA（アミノ酸24-34、配列同一性番号は1841）であります；CDRL2はGASTRAT（アミノ酸50-56、配列同一性番号は1843）であります；CDRL2はGASSRAT （アミノ酸51-57、配列同一性番号1833）であります；CDRL2はDASSLES（アミノ酸50-56、配列同一性番号は１８４１）であります；CDRL3はQQYNNWPPWT（アミノ酸8-98、配列同一性番号は1843）であります；CDRL3はQQYGSSPPWT（アミノ酸90-99、配列同一性番号は1833）であります；CDRL3はQQYんSYSPWT（アミノ酸89-98、配列同一性番号は1841）であります。ここで提供されたもう一つのCDRは以上の各CDRと比べて60 %、65 %、70 %、80 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 % またはその以上の配列同一性を発見します。
例えば、ノッチ1の活性を調節する抗体はIGHV1（たとえば、配列同一性番号1-43に規定されたもの）であるVH生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。またはIGHV1（例えば、配列同一性番号268-271に規定されたもの）であるDH生殖細胞セグメント、あるいは IGHJ4（例えば、配列同一性番号278または279に規定されたもの）であるJH生殖細胞セグメントであります。このような抗体はIGKV1（配列同一性番号286-316により規定されたもの）またはIGKV3（配列同一性番号332-350により規定されたもの）であるVκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。またはIGKJ1であるJκ塩基セグメント（配列同一性番号356により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にノッチ1と結合することであり、それに/または機能性活性を調節することであります。
ノッチ1に反する抗体の例はVHチェーンがIGHV1-46（例えば、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02またはIGHV1-46*03）であるVH生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはIGHD3-10（例えば、IGHD3-10*01、IGHD3-10*02）であるDH生殖細胞セグメントであり、IGHJ4(例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)であるJH生殖セグメントであります。VLチェーンはIGKV3-15 (例えば、IGKV3-15*01)や、IGKV3-20 (例えば、IGKV3-20*01、IGKV3-20*02)や、またはIGKV1-5 (例えば、IGKV1-5*01、IGKV1-5*02、IGKV1-5*03)であるVκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはIGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントであります。ノッチ１の活性を調節するここで提供された抗体の例は表18Cにより規定されます。  
【０５１８】
【表１８Ｃ】
2016127850.tif 000152
b)
【０５１９】
DLL4
DLL4（配列同一性番号2010により規定され）はノッチ膜貫通レセプター用の膜貫通蛋白質リガンドであります。それは各種の組織内に幅広く発見されますが、その発見は圧倒的に血管系統に位置しています。DLL4はノッチ１とノッチ４レセプターを活性化します。それは正常の血管発育に対して必要であり、腫瘍血管の上に発見されます。それは腫瘍血管新生の間に血管内に上向き調節され、その発見はVEGFシグナリングを頼りにします。血管新生内皮細胞の上のDLL4発見は血管新生を生産的に進ませることにより血管発育の消極的な調節器のように働きます（Ridgwayなどの(2006)自然、444:1083；Noguera-Troはeなどの(2006)自然、444:1032をご参考に）。それは内皮細胞の増殖を抑制するように働きます。しかしながら、DLL4の妨害は血管の伸ばしや別れを特徴にする血管新生の増加と、血管機能の減少と、その結果としての腫瘍成長の低減に関わります(Ridgwayなどの(2006)自然、444:1083；Noguera-Troはeなどの(2006)自然、444:1032を参考に)。これで、DLL4機能は腫瘍成長と腫瘍血管密度の切離しに関わります。DLL4は炎症誘発刺激物に暴露された活性化マクロファージの上にも発見されます。刺激物はリポ多糖や、インターロイキン-1βや、Toll様レセプター4リガンドや、他の炎症誘発刺激物を含みます。ノッチ通路を通過するDLL4のシグナリングはマクロファージ活性化を特徴としての炎症状況に加担します（Fungなどの(2007)循環、115:2948-2956をご参考に）。  
【０５２０】
ここで提供された抗体ライブラリーはDLL4との結合を測定すること及び/または機能活性を測定することにより活性の調節のためにえり分けられます。例13はDLL4と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合測定を例示します。各測定は抗DLL4抗体が存在する場合にDLL4-ノッチの相互作用への抑制を評価する結合測定をも含みます。このような測定は反対抗体を確認するように使用されます。例17はこれを例示します。機能活性の測定は上述のようなシグナル転換及び/または下流機能活性の測定によりDLL4によるノッチシグナリングの活性化を評価する測定を含みます。ノッチの活性化は、例を挙げれば、DLL4を発見する細胞とのコインキュベーションによりも、DLL4の固定化によりも、抗体成分が存在する場合に行われる測定によりも実現されます。このような測定には、例を挙げれば、DLL4により引き起こされた内皮細胞増殖の抗体の効果が測定できます（Ridgway などの(2006) 自然、444:1083をご参考に）。一部の例には、抗体はノッチを発見する細胞の差異化に対する影響を測定するように使用されます。これらの細胞はDLL4またはJag1などリガンドを表現する細胞と一緒に培養されます。差異化を促進する抗体を確認するためには（例えば、ノッチの活性化を干渉する）、抗体はこの測定に添えられることができます。例示的な測定は例18をご参考になさい。  
【０５２１】
それで、ここで提供されたライブラリーから確認された抗体、またはここで提供された抗体はDLL4と結合し（例えば特別に結合する）、一部の場合にはDLL4関連の効果の一つまたはその以上の方面を調製することができます。これらの方面はノッチレセプター活性化の任意の一つまたはその以上の減少または閉塞や、ノッチレセプター下流分子シグナリングの減少または閉塞や、DLL4と結合するノッチレセプターの中断または閉塞や、内皮細胞増殖の促進や、内皮細胞差異化の抑制や、動脈差異化の抑制や、腫瘍血管注入や、腫瘍の治療と予防や、細胞増殖異常または癌や、DLL4発見関連の障害の治療と予防や、ノッチレセプター発見及び/または活性関連障害の治療と予防などを含みます。一部の場合には、抗体は特別にDLL4と結合します。一部の場合には、抗体は特別にDLL4細胞外ドメイン（ECD）と結合します。一部の場合には、生体内及び/または生体外のDLL4活性を減少し、抑制し、閉塞します。一部の場合には、抗体はDLL4リガンドと結合するために競争します（DLL4と結合するノッチレセプターを減少し、閉塞します）。
【０５２２】
ここで提供されたライブラリーから確認された、DLL4の活性を調節するこの抗体またはその部分は、DLL4の発見及び/または活性と関連する疾患の治療と予防のために使用されます。例えば、増えた発見及び/または活性や、望まれない発見及び/または活性であります（アメリカ発表された応用序列番号US20080175847 と国際発表されたPCT 応用番号WO2008060705、WO2008091222をご参考に）。治療は腫瘍及び非腫瘍異常を含みます。例えば、これらの抗体またはその部分は腫瘍や癌（例えば、結腸癌や肺がんや乳癌や）や、細胞増殖異常や、血管新生（例えば、眼内血管新生疾患）に関連する症状の治療のために使用されます。特別に、これらの抗体またはその部分は抗VEGF治療法との協力及び/または抗VEGF治療に抵抗する治療に使用されます。
【０５２３】
血管新生は多種の障害の病因にかかわります。これらの不調には、固形腫瘍と腫瘍転移や、動脈硬化や、後水晶体線維形成や、血管腫や、慢性炎症や、増殖網膜症（例えば糖尿病網膜症）など眼内血管新生疾患や、加齢黄斑変性（AMD）や、血管新生緑内障や、移植された角膜組織及びほかの組織の免疫拒絶や、関節リウマチや、乾癬などがあります。Folkmanなどの J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992)；Klagsbrunなどの Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991)；Garner A.、 眼疾病理生物学における「血管疾患」、動態方法、Garner A.、Klintworth G K、 eds.、 第二版(Marcel Dekker、 NY、 1994)、 ページ1625-1710。
【０５２４】
腫瘍成長の場合、血管新生は増生から新生物までの推移にも、腫瘍の生長と転移に栄養を提供することにも肝心みたいであります。Folkman などの自然 339:58 (1989)。血管新生は腫瘍細胞が正常細胞と比べて生長優勢と増殖自主性を獲得することを許します。腫瘍は普通単一の異常細胞から始まります。毛細血管床から遠く離れているから、この異常細胞は幾つ立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できなく、生長も散布もなく「睡眠状態」に長い間に渡って留まっています。後で一部の腫瘍細胞は血管新生表現型に変わって内皮細胞を活性化します。これらの内皮細胞は新しい毛細血管まで増殖し成熟します。新しく形成されたこれらの血管は初期腫瘍の引き続ける生長をも、転移性腫瘍細胞の散布と再繁殖をも許します。従って、腫瘍薄片における微小血管の密度と乳癌及びいくつかのほかの腫瘍に掛かる患者の生き残りとの相互関係が分かりました。WeidnerなどのN. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991)；Horakなどのランセット 340:1120-24 (1992)；Macchiariniなどのランセット 340:145-46 (1992)。血管新生のスイッチをコントロールするメカニズムはまだ判明していませんが、多数の血管新生刺激物と抑制物とのネットバランスから腫瘍塊の血管新生が生じると信じられます（Folkman、Nat. Med. 1(1):27-31 (1995))。  
それに加えて、これらの抗体またはその部分は非腫瘍異常の治療に使用されます。非腫瘍異常は望まれないまたは異常肥大や、関節炎や、リウマチ関節炎（RA）や、乾癬や、乾癬性歯垢や、類肉腫症や、動脈硬化や、動脈硬化性歯垢や、心筋梗塞による浮腫や、糖尿病と増殖網膜症（早期網膜症）や、後水晶体線維形成や、血管新生緑内症や、加齢黄斑変性や、糖尿病黄斑浮腫や、角膜血管新生や、角膜移植血管新生や、角膜移植拒絶や、網膜/脈絡血管新生や、隅角血管新生（虹彩）や、眼血管新生疾患や、血管再狭窄や、脳動静脈畸形（AVM）や、髄膜腫や、血管腫や、血管線維腫や、甲状腺肥大や（グレーブス病を含み）や、角膜及びほかの組織移植や、慢性炎症や、肺炎や、急性肺損傷 /ARDSや、敗血症や、初期肺高血圧や、悪性肺液浸出や、脳浮腫（例えば、急性発作/閉塞性頭部損傷/創傷に関わる場合）や、滑膜性炎症や、RA内のパンヌス形成や、骨化性筋炎や、肥大骨形成や、変形性関節症（OA）や、難治性腹水や、多嚢胞性卵巣症候群や、子宮内膜症や、液体病の第三間隔（膵炎や、隔壁腔症候群や、火傷や、大腸疾患や）や、子宮筋腫や、早産や、IBD（クローン病と潰瘍性大腸炎）などの慢性炎症や、同種移植腎拒絶や、炎症性大腸疾患や、ネフローゼ症候群や、望まれないまたは異常組織塊生長（非癌）や、肥満や、脂肪組織塊生長や、血友病関節や、肥大傷跡や、髪成長抑制や、オースラ‐ウェバー症候群や、化膿性肉芽腫後水晶体線維形成や、強皮症や、トラコーマや、血管癒着や、滑膜炎や、皮膚炎や、子癇前症や、 腹水や、心膜液浸出（例えば、芯膜炎に関わり）や、肋膜液浸出などを含みます。   
ここで提供された抗体はDLL4活性を調節しますので、DLL4の発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はDDL4と結合親和力を持つ抗体を含みます。このDDL4は10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 Mまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと合親和力を持っています。
【０５２５】
ここで提供された抗DLL4はCDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2および/またはCDRL3.  例えば、 CDRH1はGYTFTSYYMH (アミノ酸 26-35 配列同一性番号:1513); CDRH1はGYSFTSYWIG (アミノ酸 26-35 配列同一性番号:1803); CDRH1はGDSVSSNSAAWN (アミノ酸 26-37 配列同一性番号:1812); CDRH1はGGSFSGYYWS (アミノ酸 26-35 配列同一性番号:1779);  CDRH1はGYTFTSYAMH (アミノ酸 26-35 配列同一性番号:1494); CDRH1はGYTFTSYDIN (アミノ酸 26-35 配列同一性番号:1537); CDRH1はGGSはSGGYYWS (アミノ酸 26-37 配列同一性番号:1761); CDRH2はIINPSGGSTSYAQKFQG (アミノ酸 50-66 配列同一性番号:1513); CDRH2はIIYPGDSDTRYSPSFQG (アミノ酸 50-66 配列同一性番号:1803); CDRH2はRTYYRSKWYNDYAVSVKS (アミノ酸 52-69 配列同一性番号:1812); CDRH2 は EINHSGSTNYNPSLKS (アミノ酸 50-65 配列同一性番号:1779); CDRH2 は WSNAGNGNTKYSQEFQG (アミノ酸 50-66 配列同一性番号:1494); CDRH2 は WMNPNSGNTGYAQKFQG (アミノ酸 50-66 配列同一性番号:1537);  CDRH2 は (アミノ酸 52-67 配列同一性番号:1761);  CDRH3 は EEYSSSSAEYKQH (アミノ酸 99-111 配列同一性番号:1513); CDRH3 は RGYSYGYDYFDY (アミノ酸 99-110 配列同一性番号:1803); CDRH3 は EYYDFWSGYYTDYFD (アミノ酸 102-117 配列同一性番号:1812); CDRH3 は EGYSSSWYDYFDY (アミノ酸 99-111 配列同一性番号:1512); a CDRH3 は ANWGDYFDY (アミノ酸 89-106 配列同一性番号:1779);  CDRH3 は ANWGYWYFDL (アミノ酸 99-108 配列同一性番号:1514);  CDRH3 は DDYGGNSDYFDY (アミノ酸 99-110 配列同一性番号:1494);  CDRH3 は EGYCSGGSCYSYWYFDL (アミノ酸 99-115 配列同一性番号:1508); CDRH3 は EYYYGSGSYYNDYFDY (アミノ酸 99-114 配列同一性番号:1509); CDRH3 は GGYCSSTSCYADYYYYYGMDV (アミノ酸 99-119 配列同一性番号:1537); CDRH3 は EGYCSGGSCYSYWYFDL (アミノ酸 100-116 配列同一性番号:1761); CDRL1 は RASQSVSSYLA (アミノ酸 24-34 配列同一性番号:1850);  CDRL1 は GLSSGSVSTSYYPS (アミノ酸 23-36 配列同一性番号:1881);  CDRL1 は TLRSGINLGSYRIF (アミノ酸 23-36 配列同一性番号:1884);  CDRL1 は RASQSVSSNLA (アミノ酸 24-34 配列同一性番号:1843);  CDRL1 はRASQGはSWLA (アミノ酸 24-34 配列同一性番号:1849);  CDRL1 は RASQSVSSSYLA (アミノ酸 24-35 配列同一性番号:1833);  CDRL1 は RASQSはSWLA (アミノ酸 24-34 配列同一性番号:1841);  CDRL1 は RSSQSLLDSDDGNTYLD (アミノ酸 24-40 配列同一性番号:1853);  CDRL1 は TGTSSDVGGYNYVS (アミノ酸 23-36 配列同一性番号:1864);  CDRL1 は TLSSDLSVGGKNMF (アミノ酸 23-36 配列同一性番号:1886);  CDRL2 は DASNRAT (アミノ酸 50-56 配列同一性番号:1850);  CDRL2 は STNTRSS (アミノ酸 52-58 配列同一性番号:1881);  CDRL2 は YYSDSSK (アミノ酸 52-58 配列同一性番号:1884);  CDRL2 は GASTRAT (アミノ酸 50-56 配列同一性番号:1843);  CDRL2 は AASSLQS (アミノ酸 50-56 配列同一性番号:1849);  CDRL2 は GASSRAT (アミノ酸 51-57 配列同一性番号:1833);  CDRL2 は DASSLES (アミノ酸 50-56 配列同一性番号:1841);  CDRL2 は TLSYRAS (アミノ酸 56-62 配列同一性番号:1853);  CDRL2 は EVSNRPS (アミノ酸 52-58 配列同一性番号:1864);  CDRL2 は HYSDSDK (アミノ酸 52-58 配列同一性番号:1886);  CDRL3 は QQRSNWPPWT (アミノ酸 89-98 配列同一性番号:1850);  CDRL3 は VLYMGSGはYV (アミノ酸 91-101 配列同一性番号:1881);  CDRL3 は MIWHSSASFV (アミノ酸 97-106 配列同一性番号:1884);  CDRL3 は QQYNNWPPWT  (アミノ酸 89-98 配列同一性番号:1843);  CDRL3 は QQANSFPPWT (アミノ酸 89-98 配列同一性番号:1849);  CDRL3 は QQYGSSPPWT  (アミノ酸 90-99 配列同一性番号:1833);  CDRL3 は QQYNSYSPWT (アミノ酸 89-98 配列同一性番号:1841);  CDRL3 は MQRIEFPSWT (アミノ酸 95-104 配列同一性番号:1853);  CDRL3 は SSYTSSSTLFV (アミノ酸 91-101 配列同一性番号:1864); CDRL3 は QVYESSANFV (アミノ酸 89-98 配列同一性番号:1886) であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。以上の各CDRに対して60%、 65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５２６】
例えば、DLL4の活性を調節する抗体は、VH生殖細胞セグメントやDH生殖セグメントやJH 生殖セグメントなどからなる生殖細胞成分を含めた塩基配列によりコード化されたVHチェーンを含めた抗体を含みます。VH生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。IGHV1（例えば、配列同一性番号10-43により規定されたもの）；IGHV4（例えば、配列同一性番号153-224により規定されたもの）； IGHV5（例えば、配列同一性番号225-232により規定されたもの）またはIGHV6（例えば、配列同一性番号233または234により規定されたもの）。DH 生殖細胞セグメントは以下の物を含みます。 IGHD6（例えば、配列同一性番号268-271により規定されたもの）； IGHD5（例えば、配列同一性番号264-267に規定されたもの）；IGHD4（配列同一性番号260-263により規定されたもの）；IGHD2（配列同一性番号244-251により規定されたもの）；IGHD3（例えば配列同一性番号252-259により規定されたもの）； IGHD6（配列同一性番号268-271により規定されたもの）；IGHD7（配列同一性番号272により規定されたもの）；JH 生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。IGHJ1（配列同一性番号273により規定されたもの）；IGHJ2（配列同一性番号274により規定されたもの）；IGHJ4（配列同一性番号277-279により規定されたもの）；IGHJ6（配列同一性番号282-285により規定されたもの）。これらの抗体はVκ 生殖細胞セグメントや 、Jκ 生殖細胞セグメントや、Vλ 生殖細胞セグメントや、Jλ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含めた塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含めた抗体を含みます。Vκ 生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。IGKV1（例えば、配列同一性番号286-316により規定されたもの）；IGKV2（例えば、配列同一性番号317-331により規定されたもの）；IGKV3（例えば、配列同一性番号332-350により規定されたもの）。 Jκ 生殖細胞セグメントは IGKJ1（例えば、356により規定されたもの）であります。Vλ 生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。 IGLV2（例えば、配列同一性番号380-399により規定されたもの）；IGLV8（例えば、配列同一性番号436-438により規定されたもの）；IGLV11（例えば、配列同一性番号379により規定されたもの）；IGLV5（例えば、配列同一性番号424-431により規定されたもの）。
【０５２７】
Jλ生殖細胞セグメントはIGLJ1（例えば、配列同一性番号442により規定されたもの）またはIGLJ4 （例えば、配列同一性番号446により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にDLL4と結合することであり、それに/または機能活性を調節することであります。
【０５２８】
DLL4に反する典型的な抗体はVHチェーンが以下のVH生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化された場所である抗体を含みます。IGHV1-3(例えば IGHV1-3*01、 IGHV1-3*02)、 IGHV1-8*01、 IGHV1-46 (例えば IGHV1-46*01、 IGHV1-46*02 や IGHV1-46*03)、  IGHV4-31 (例えば IGHV4-31*01、 IGHV4-31*02、 IGHV4-31*03、 IGHV4-31*04、 IGHV4-31*05、 IGHV4-31*06、 IGHV4-31*07、 IGHV4-31*08、 IGHV4-31*09、 IGHV4-31*10)、 IGHV4-34 (例えば IGHV4-34*01、 IGHV4-34*02、 IGHV4-34*03、 IGHV4-34*04、 IGHV4-34*05、 IGHV4-34*06、 IGHV4-34*07、 IGHV4-34*08、 IGHV4-34*09、 IGHV4-34*10、 IGHV4-34*11、 IGHV4-34*12、 IGHV4-34*13)、   IGHV5-51 (例えば、  IGHV1-5-51*01、 IGHV1-5-51*02、 IGHV1-5-51*03、 IGHV1-5-51*04 や IGHV1-5-51*05) や は  IGHV6-1 (例えば IGHV6-1*01 や IGHV6-1*02); であるVH生殖細胞セグメントや、IGHD2-2、 (例えば IGHD2-2*01、 IGHD2-2*02)、   IGHD2-15*01、 IGHD4-23*01、 IGHD6-6 (例えば IGHD6-6*01)、 IGHD6-13*01、IGHD5-18 (例えば IGHD5-18*01)、 IGHD3-3 (例えば IGHD3-3*01 や IGHD3-3*02)、 IGHD3-10 (例えば IGHD3-10*01、 IGHD3-10*02)、 や IGHD7-27*01; とJH生殖細胞系列のセグメントそのは   IGHJ1*01、 IGHJ2*01、 IGHJ4*01、 IGHJ4*02、 IGHJ4*03、 や  IGHJ6 (例えば IGHJ6*01、 IGHJ6*02、 IGHJ6*03、 IGHJ6*04) 。であるDH生殖細胞セグメントや、IGHJ1*01であるJH生殖細胞セグメントであります。VLチェーンは以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGKV1-5(例えば IGKV1-5*01、 IGKV1-5*02、 IGKV1-5*03)、 IGKV1-12 (例えば IGKV1-12*01、 IGKV1-12*02)、 IGKV2-D-40*01、 IGKV3-11 (例えば IGKV3-11*01や IGKV3-11*02)、  IGKV3-15*01、  IGKV3-20 (例えば IGKV3-20*01、 IGKV3-20*02) であるVκ生殖細胞セグメントや、IGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントや、IGLV2-14(例えば IGLV2-14*01、 IGLV2-14*02、 IGLV2-14*03、 IGLV2-14*04)、 IGLV8-61 (例えば IGLV8-61*01、 IGLV8-61*02 やIGLV8-61*03)、 an IGLV5 (例えば  IGLV5-48*01)、 や IGLV11-55*01であるVλ生殖細胞セグメントや、IGLJ1*01又はIGLJ4*01であるJλ生殖細胞セグメントであります。DLL4活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Dにより規定されます。
【０５２９】
【表１８Ｄ】
2016127850.tif 000153
2016127850.tif 000154
【０５３０】
ここで提供された抗DLL4抗体は確認された抗DDL4生殖細胞ヒットと比べて最適化されました。これらの抗体は確認された生殖細胞ヒットと比べて、VHにおける一つまたはその以上の突然変異、及び/またはVLにおける一つまたはその以上の突然変異を含みます。例えば、対応する抗体生殖細胞ヒットと比べて、これらの抗体は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 またはその以上のアミノ酸置換を含めることができます。突然変異はVHチェーンにおいて起こる可能性があります。例えば、VH、DH または JH 域の一つまたはその以上のアミノ酸残留分において。その代わりに、あるいはそれに加えて、突然変異はVLチェーンにおいて起こる可能性があります。例えば、VL または JL 域のひとつまたはその以上のアミノ酸残留物において。一つ又はその以上の突然変異を含めた最適化された抗体は母抗体（例えば、変形を含めない生殖細胞ヒット）と比べて改良された活性を展示します。これらの最適化された抗体はDLL4標的蛋白質に対して改良された作動的なまたは拮抗的な機能活性を展示します。他の例において、最適化された抗体はDLL4との改良された結合親和力を示しました。一般的には、母抗体（例えば、変形を含まない生殖細胞ヒット）と比べて、活性または結合親和力は1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8-倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100-fold倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍まで、またはその以上まで増えます。
【０５３１】
例えば、これらの例に見るように、ここで提供された最適化された抗DLL4抗体は、母抗体と比べて、100倍以上まで向上した結合親和力を示しました。このような抗体はナノモルの親和力を示します。
【０５３２】
例えば、ここで提供された最適化された抗DLL4抗体は抗DLL4ヒットのVHチェーンにおいて一つ又はその以上の変形を含みます。例に挙げれば、配列同一性番号1494、1508-1509、1512-1513、1537、1761、1779、1803、1812により規定されたものであります。一つの例において、一つ又はその以上の変形はDH 域の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗DLL4抗体は、配列同一性番号3736に規定されたアミノ酸残留物に対応する（配列同一性番号1803に規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにより規定されたアミノ酸残留物G100及び/又はG104にも対応する）G1及び/又はG5の位置における変形を含むDH 域をコード化するIGHD5-18*01の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むVHチェーンを含むことができます。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にリシン（K）、アルギニン（R）、トレオニン（T）であります。典型的な変形は配列同一性番号3736により規定されたDH 域におけるアミノ酸置換に対応するG1K、G1R及び/又はG5Tであります（配列同一性番号1803により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにおけるアミノ酸置換G100K、G100R及び/又はG104Tにも対応します）。例えば、ここで提供された抗DLL4抗体は、配列同一性番号3737に規定されたアミノ酸残留物に対応する（配列同一性番号1513に規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにより規定されたアミノ酸残留物S102、S103及び/またはS104にも対応します）S3、S4及び/またはS5の位置における変形を含むDH 域をコード化するIGHD6-6*01の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むVHチェーンを含むことができます。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にアラニン（A）、プロリン（P）、フェニルアラニン （F）であります。このような変形の例は配列同一性番号3737により規定されたDH 域におけるアミノ酸置換に対応するS3A、S4P、S5F 及び/又は S5Aであります（配列同一性番号1513により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにおけるアミノ酸置換S102A、S103P、S104F 及び S104Aにも対応します）。
【０５３３】
それに加えて、ここで提供された最適化された抗DLL4抗体は抗DLL4ヒットのVHチェーンのJH 域における一つ又はその以上の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗DLL4抗体は、配列同一性番号3738に規定されたアミノ酸残留物に対応するH6の位置における変形を含むJH 域をコード化するIGHJ*01の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むVHチェーンを含むことができます（配列同一性番号1513に規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにおけるアミノ酸残留物H111にも対応します）。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にフェニルアラニン （F）又はチロシン(Y)であります。典型的な変形は配列同一性番号3738により規定されたJH 域におけるアミノ酸置換に対応するH6F及びH6Yであります（配列同一性番号1513により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンのJH 域におけるアミノ酸置換H111F及びH111Yにも対応します）。表18Eにリストされたのは抗DLL4ヒットのVHチェーンのJH 域における一つ又はその以上の変形を含む典型的な抗DLL4抗体の変形体であります。 
【０５３４】
ここで提供された最適化された抗DLL4抗体はVLチェーンにおける一つ又はその以上のアミノ酸変形をも含みます。例えば、ここで提供された最適化された抗DLL4抗体は、抗DLL4ヒットのVHチェーンのVκ 域における一つ又はその以上の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗DLL4抗体は、配列同一性番号3739に規定されたアミノ酸残留物に対応するS28、S30 及び/又は S3の位置における変形を含むVκ 域をコード化するIGKV3-11の変形体（例えば、 IGKV3-11*01 又は IGKV3-11*02）からなる生殖細胞セグメントを含むVLチェーンを含むことができます（配列同一性番号1850に規定された抗DLL4ヒットのVLチェーンにおけるアミノ酸残留物S28、S30 及び/又は S31 にも対応します）。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にプロリン(P)、アスパラギン（N）、リシン（K）であります。典型的な変形は配列同一性番号3739により規定されたVκ 域におけるアミノ酸置換に対応するS28P、S30N 及び/又は S31Kであります（配列同一性番号1850により規定された抗DLL4ヒットのVLチェーンのVκ 域におけるアミノ酸置換 S28P、S30N 及び/又は S31K にも対応します）。表18Eにリストされたのは抗DLL4ヒットのVLチェーンのVκ域における一つ又はその以上の変形を含む典型的な抗DLL4抗体の変形体であります。
【０５３５】
【表１８Ｅ】
2016127850.tif 000155
2016127850.tif 000156
【０５３６】
ii.ErbB 族
EGFR (ErbB-1)、HER2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3) 及び Her 4 (ErbB-4)を含むグループIレセプターチロシン・キナーゼは、上皮細胞の、間葉細胞の及び神経細胞の組織において広く発見され、増殖と差異化において根本的な役割をします。彼らは様々にレセプターと結合する一族のリガンドにより活性化されます。例えば、上皮成長因子（EGF）、形質転換成長因子アルファー（TGF−alpha）、アンフィレグリン はErbB1と結合しますが、他のレセプターとは結合しません。ニューレグリンはErbB3 及びErbB4に結合します。最後に、b−セルリン（BTC）、ヘパリン結合EGF、エピレグリンは ErbB1 及び ErbB4に結合します。ErbB2は特徴付けのリガンドを持っていませんが、他のErbB族のメンバーと一緒にヘテロ二量体化により転送される間にホモ二量体化により活性化されることができます。
【０５３７】
a) 上皮成長因子レセプター
(EGFR)
上皮成長因子レセプター（配列同一性番号2000により規定されたEGFR、ErbB-1、人体におけるHER1 ）は、細胞外蛋白質リガンドの上皮成長因子族（EGF族）の成員を受け入れる細胞表面レセプターであります。リガンド上皮成長因子（EGF）と結合したら、EGFRは二量体化し、その固有細胞内蛋白質チロシン・キナーゼ活性を刺激します。この自己リン酸化は幾つかのほかの蛋白質による下流活性化とシグナリングを誘発します。これらの蛋白質は自分のホスホチロシン結合SH2ドメインを通じてリン酸化チロシンに関連します。これらの下流シグナリング蛋白質はMAPKやAktやJNK経路など幾つかのシグナル転換カスケードを始め、DNA合成及び細胞増殖を引き起こします。これらの蛋白質は細胞変形、癒着、増殖など表現型を調節します。そのゆえ、EGFR発見または活性に影響を及ぼした変形は癌を引き起こします。
EGFRの向上調節は間違った癌予知に関連します。ERBITUX（R）(セツキシマブ)は大腸直腸及び/又は頭頚部腫瘍の治療に対して認可されたキメラ型モノクローナル抗体であります。ERBITUX(R)はEGFRに結合し、DNA合成及び細胞増殖に関連する細胞内シグナリングを防止します。VECTIBIX(R)（パニツムマブ）はEGFR発見の転移性結腸直腸癌の治療に対して認可された完全人モノクローナル抗体であります。ERBITUX(R)もVECTIBIX（R）も、単独にせよ、化学療法薬と共同にせよ、使用されます。  
【０５３８】
ここで提供された抗体ライブラリーはえり分けられ、EGFRとの結合及び/又は機能活性の測定により活性を調節することができます。機能活性はシグナル転換や細胞変形や癒着や増殖などを含みます。EGFリガンドが存在してもしなくても、機能測定が行われることができます。例13はEGFRと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。
【０５３９】
ここで提供されたライブラリーから確認された、EGFR活性を調節する抗体又はその部分は、EGFRの発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は、各種類の癌の治療のために使用されることができます。神経膠芽腫や、頭頚部腫瘍や、膵臓癌や、大腸直腸癌や、肺癌や、神経系統癌や、胃腸癌や、前立腺癌や、卵巣癌や、乳癌や、悪性腎臓腫瘍や、網膜癌や、皮膚癌や、肝癌や、泌尿生殖器癌や、膀胱癌や、肺腺癌や肺扁平上皮癌や非小細胞肺癌などの肺癌を含みますがそれらに限りません。
【０５４０】
ここで提供された抗体はEGFR活性を調節しますので、EGFRの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はEGFRと結合親和力を持つ抗体を含みます。このEGFRは10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 Mまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
【０５４１】
ここで提供された抗EGFR抗体はCDRH１、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2及び/又はCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGYTFTSYYMH (配列同一性番号1508によるアミノ酸26-35)であります、CDRH2 は IINPSGGSTSYAQKFQG (アミノ酸 50-66配列同一性番号:1508)、 CDRH3 は EGYCSGGSCYSYWYFDL (アミノ酸 99-115配列同一性番号:1508)、  CDRH3 は EGYSSSWYDYFDY (アミノ酸 99-111配列同一性番号:1512)、  CDRL1 はRASQSVSSNLA (アミノ酸 24-34配列同一性番号:1843)、  CDRL1 は RASQSはSWLA (アミノ酸 24-34配列同一性番号:1841)、  CDRL2 は GASTRAT (アミノ酸 50-56配列同一性番号:1843)、 CDRL2 は DASSLES (アミノ酸 50-56配列同一性番号:1841)、 CDRL3 は QQYNNWPPWT (アミノ酸 89-98配列同一性番号:1843)、 やCDRL3 は QQYNSYSPWT (アミノ酸 89-98配列同一性番号:1841)。以上の各CDRに対して60%、65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５４２】
例えば、EGFR活性を調節する抗体はIGHV1（たとえば、配列同一性番号1-43に規定されたもの）であるVH生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。またはIGHD6（例えば、配列同一性番号268-271に規定されたもの）であるDH生殖細胞セグメント、 IGHD2（例えば、配列同一性番号244-251に規定されたもの）であるJH生殖細胞セグメント、IGHJ2 (例えば、配列同一性番号274により規定されたもの)であるJH 生殖セグメント、 IGHJ4 (例えば、配列同一性番号278または279により規定されたもの)である生殖セグメントであります。このような抗体はIGKV1（配列同一性番号286-316により規定されたもの）またはIGKV3（配列同一性番号332-350により規定されたもの）であるVκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。またはIGKJ1であるJκ塩基セグメント（配列同一性番号356により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。
【０５４３】
異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にEGFRと結合することであり、それに/または機能活性を調節することであります。
EGFRに反する抗体の例はVHチェーンがIGHV1-46（例えば、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02またはIGHV1-46*03）であるVH生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはIGHD2-15（例えば、 IGHD2-15*01）であるDH生殖細胞セグメント、IGHJ2*01またはIGHJ4(例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)であるJH生殖セグメントであります。VLチェーンはIGKV1-5 (例えば、IGKV1-5*01、IGKV1-5*02、IGKV1-5*03)又はIGKV3-15 (例えば、 IGHV3-15*01)であるVκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはIGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントであります。EGFR活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Cにより規定されます。  
【０５４４】
【表１８Ｆ】
2016127850.tif 000157
【０５４５】
b)  人間上皮成長因子レセプター2（HER2/neu）
HER2/neu（配列同一性番号1999により規定されたErbB-2）は、細胞成長及び差異化を引き起こすシグナル転換経路に通常に関わる細胞薄膜表面結合のレセプターチロシンキナーゼであります。ErbB-2 はEGF族の何のものにも活性化されませんので、オーファン・レセプターだと思われています。しかしながら、ErbBレセプターはリガンド結合の上に二量体化しますが、ErbB-2はErbB族のほかのメンバーに対して優先の二量体化パートナーであります。ErbB2はキナーゼ活性化及び細胞増殖を引き起こします。ErbB-2 は乳癌の発病に関わりますから、治療の標的として注意すべきであります。実は、25-30%の初期乳癌にErbB-2蛋白質の過剰発現が見つかりました。HERCEPTIN（R）（トラスツズマブ）は組み合えDNAから得る人モノクローナル抗体であり、選択的にErbB-2の細胞内ドメインに結合する乳癌の治療に使用されます。なので、ErbB-2はもう一つの蛋白質治療法における注目すべき標的であります。Carterなど、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 89:4285-4289；アメリカパテント番号 5、725、856をご参考に。
【０５４６】
ここで提供された抗体ライブラリーはえり分けられ、ErbB-2との結合及び/又は機能活性の測定により活性を調節することができます。機能活性はシグナル転換や細胞変形や癒着や増殖などを含みます。例えば、ErbB-2を発見する細胞は、抗体又はその部分がある場合又はない場合における増殖のために、測定されることができます。その代わりに、レポーターシステム測定は構築されることができます。それにより、蛍光素酵素のようなリポーター蛋白質の発見はErbB2の活性化を頼りにします（例えば、Uedaなど、(2004) J Biol.Chem.、279:24505-24513をご参考に）。測定は、ErbB-2結合パートナーのリガンドである EGF、TGF 又は他の ErbBリガンドがある場合に行われることができます。例13はErbB-2と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。
【０５４７】
ここで提供されたライブラリーから確認された、ErbB-2 活性を調整する抗体又はその部分は、ErbB-2 の発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。  例えば、これらの抗体又はその部分は乳癌や卵巣癌や結腸癌や肺癌や前立腺癌など各種の癌のような増殖疾患の治療に使用されることができます。
ここで提供されたのはErbB-2の行動を調整する抗体であるから、ErbB-2の発見や行動に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基順列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はErbB-2と結合親和力を持つ抗体を含み、または10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 Mまたはその以下で、ナノモルまたはサブナノモルの結合親和力を持っています。
ここで提供された抗ErbB-2抗体はCDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2及び/またはCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGGSはSGGYYWS（配列同一性番号1760によるアミノ酸26-37）であります、CDRH1 は GYTFTSYYMH (によるアミノ酸 26-35 配列同一性番号:1512);  CDRH1 は GFSLSTSGVGVG (によるアミノ酸 26-37 配列同一性番号:1559);  CDRH1 は GGTFSSYAは (によるアミノ酸 26-35 配列同一性番号:1522); CDRH2 は YIYYSGSTYYNPSLKS (によるアミノ酸 52-67 配列同一性番号:1760); CDRH2 は IINPSGGSTSYAQKFQG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:1512); CDRH2 は LIYWNDDKRYSPSLKS (によるアミノ酸 52-67 配列同一性番号:1559); CDRH2 は GIIPIFGTANYAQKFQG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:1522); CDRH3 は EGYSSSWYDYFDY (によるアミノ酸 100-112 配列同一性番号:1760); CDRH3 は GYSGSYYYWYFDL (によるアミノ酸 99-111 配列同一性番号:1512);  CDRH3 は EEYSSSSAEYKQH (によるアミノ酸 99-111 配列同一性番号:1513);  CDRH3 は RPNWGYWYFDL (によるアミノ酸 100-110 配列同一性番号:1559);  CDRH3 は GYNWNDDYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-114 配列同一性番号:1522);  CDRL1 は RASQSVSSSYLA (によるアミノ酸 24-35 配列同一性番号:1833);  CDRL1 は KSSQSVLYSSNNKNYLA (によるアミノ酸 24-40 配列同一性番号:1838);  CDRL1 は RASQSVSSNLA (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1843);  CDRL1 は RSSQSLVYSDGNTYLN (によるアミノ酸 24-39 配列同一性番号:1828);  CDRL2 は GASSRAT (によるアミノ酸 51-57 配列同一性番号:1833);  CDRL2 は WASTRES (によるアミノ酸 56-62 配列同一性番号:1838); CDRL2 は GASTRAT (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1843);  CDRL2 は KVSNDRS (によるアミノ酸 55-61 配列同一性番号:1828);  CDRL3 は QQYGSSPPWT (によるアミノ酸 90-99 配列同一性番号:1833);  CDRL3 は QQYYSTPPWT (によるアミノ酸 95-104 配列同一性番号:1838);  CDRL3 は QQYNNWPPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1843); や CDRL3 は MQGTHWPPWT (によるアミノ酸 94-103 配列同一性番号:1828)。以上の各CDRに対して60%、65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５４８】
例えば、ErbB-2活性を調節する抗体はIGHV4（例えば、配列同一性番号153-224により規定されたもの）やIGHV1（例えば、配列同一性番号10-43により規定されたもの）であるVH 生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。又はIGHD6（例えば、配列同一性番号268-271により規定されたもの）やIGHD1（例えば、配列同一性番号239-243によりきていされたもの）やIGHD7（例えば、配列同一性番号272により規定されたもの）であるDH 生殖細胞セグメントや、IGHJ1 (例えば、配列同一性番号273により規定されたもの)や、IGHJ2 (例えば、配列同一性番号274により規定されたもの)や、IGHJ4 (例えば、配列同一性番号277-279により規定されたもの)や、IGHJ6 (例えば、配列同一性番号282-285により規定されたもの)であります。これらの抗体は、IGKV3 (例えば、配列同一性番号332-350により規定されたもの)や、IGKV4 (例えば、配列同一性番号351により規定されたもの)や、IGKV2 (例えば、配列同一性番号317-331により規定されたもの)である Vκ 生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含む抗体を含みます。又は、 IGKJ1 (例えば、配列同一性番号356により規定されたもの)であるJκ 生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にErbB-2と結合することであり、それに/または機能活性を調整することであります。
【０５４９】
ErbB-2に対する典型的な抗体はVHチェーンが以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体を含みます。IGHV4-31(例えば IGHV4-31*01、 IGHV4-31*02、 IGHV4-31*03、 IGHV4-31*04、 IGHV4-31*05、 IGHV4-31*06、 IGHV4-31*07、 IGHV4-31*08、 IGHV4-31*09、 IGHV4-31*10)、  IGHV1-46 (例えば、IGHV1-46*01、 IGHV1-46*02、 IGHV1-46*03)、 IGHV2-5 (例えば IGHV2-5*01、 IGHV2-5*02; IGHV2-5*03、 IGHV2-5*04、 IGHV2-5*05、 IGHV2-5*06、 IGHV2-5*07、 IGHV2-5*08、 IGHV2-5*09、 IGHV2-5*10) IGHV1-69 (例えば IGHV1-69*01、 IGHV1-69*02、 IGHV1-69*03、 IGHV1-69*04、 IGHV1-69*05、 IGHV1-69*06、 IGHV1-69*07、 IGHV1-69*08、 IGHV1-69*09、 IGHV1-69*10、 IGHV1-69*11、 IGHV1-69*12、 IGHV1-69*13); であるVH生殖細胞系セグメントや、IGHD6-6(例えば IGHD6-6*01)、 IGHD6-13 (例えば IGHD6-13*01)、  IGHD1-26 (例えばIGHD1-26*01)、 IGHD7-27*01、 や IGHD1-1*01; であるDH 生殖細胞セグメントや、IGHJ1*01、  IGHJ2*01、 IGHJ4 (例えば IGHJ4*01、 IGHJ4*02、 IGHJ4*03) や IGHJ6 (例えば IGHJ6*01、 IGHJ6*02、 IGHJ6*03、 IGHJ6*04) 又はIGHJ6であるJH生殖細胞系セグメントであります。VLチェーンは以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGKV3-20(例えば IGHV3-20*01 や IGHV3-20*02)、、IGKV4-1 (例えば、IGKV4-1*01)、IGKV3-15*01、又はIGKV2-30*01であるVκ生殖細胞系セグメントや、IGKJ1*01であるJκ生殖細胞系セグメントであります。ErbB-2活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Gにより規定されます。
【０５５０】
【表１８Ｇ】
2016127850.tif 000158
【０５５１】
iii.
IGF-R1 (インスリン様成長因子1レセプター)
インスリン様成長因子１レセプター（配列同一性番号2007により規定されたIGF-R1）は、インスリン様成長因子1（IGF-1）及びインスリン様成長因子2（IGF-2）により活性化された膜組織貫通レセプターであります。インスリン様成長因子レセプター1の過剰発見は幾つかの癌細胞系及び腫瘍組織に見つかりました。IGFR1の過剰発見は40％の乳癌細胞系に（Pandiniなど、(1999) Cancer Res.5:1935をご参考に）、15％の肺癌細胞系に見つかりました。乳癌腫瘍組織において、IGFR1は6−14倍まで過剰発見され、正常の組織より2−4倍高いキナーゼ活性を示します（Websterなど、(1996) Cancer Res.56:2781 及び Pekonenなど、(1998) Cancer Res.48:1343をご参考に）。それに、報告によりますと、大腸直腸癌組織は強く高まったIGFR1レベルを示します（Weber など、Cancer 95 (10):2086-95 (2002)をご参考に）。正常の子宮膣部細胞と比べて、初期頚部癌細胞培養及び頚部癌細胞系に対する分析はそれぞれ3倍及び５倍の IGFR1過剰発見を示します（Stellerなど、(1996) Cancer Res.56:1762をご参考に）。滑膜肉腫細胞におけるIGFR1の発見は攻撃表現型と関連します（つまり、腫瘍移転及び増殖の高い比率；Xieなど、(1999) Cancer Res.59:3588をご参考に） 
【０５５２】
IGF-R1の活性化は有糸分裂細胞の残存と増殖、それに骨格筋や心筋などの組織の成長を引き起こします。IGF-1レセプターは幾つかの癌に関わります。一番注目すべきのは乳癌であります。IGF-R1は、腫瘍の血管新生促進能力を推測することにより、腫瘍転移の可能性を高めます。それに加えて、IGF-R1の抗細胞死亡の特性の御蔭で、癌細胞は化学療法薬又は放射療法の細胞毒素特性を避けます。IGF-R1 と EGFRとの間に行った相互干渉は、EGFR抑制物がある場合にもEGFRシグナリングを回復させます。IGF-1Rにより伝えられたシグナリングの抑制は、化学療法と他の分子標的療法により、腫瘍成長の速度を減らし、細胞死亡を増やし、腫瘍殺しを増やすことを示します。  
【０５５３】
腫瘍の IGF-1R機能を抑制することを目的に取る実験方法は励みとなりましたが、成功は限られます。その癌治療に対する効果はまだ臨床の確認が必要であります。IGF-R1機能を抑制するという抗体の能力は、IGF-1Rのαサブユニットにおける未知の抗原分子を対象にする鼠のモノクローナル抗体(α-IR3)において初めて見つかりました（Kullなど、(1983) J. Biol. Chem. 258:6561-66をご参考に）。後には、IGF-1Rのαサブユニットまで発展した他の抗体は、さまざまの実験性癌モデルにおいて様々の程度までIGF-R1機能を抑制することが分かりました。癌及び癌転移など各種の腫瘍疾患の治療には、違う、又は改良された結合や効果や安全の特性を持っているIGF-1R抗体が必要であります。 
【０５５４】
ここで提供された抗体ライブラリーはIGF-R1との結合を分析すること及び/または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖であります。IGF-1又はIGF-2がある場合に測定が行われることができます。例13は、IGF-R1と結合する抗体を選択し又は確認するためにここで提供する抗体ライブラリーをえり分ける結合測定を例示します。
【０５５５】
ここで提供されたライブラリーから確認された、IGF-R1活性を調整する抗体又はその部分は、IGF-R1の発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は、リウマチ関節炎や、グレーブス病や、多発性硬化症や、全身性紅斑性狼瘡や、橋本甲状腺疾患や、重症筋無力症や、自己免疫性甲状腺疾患や、ベーチェット病や、先端巨大症や、膀胱癌や、ウィルムス腫瘍や、卵巣癌や、膵臓癌や、良性の前立腺過形成や、乳癌、前立腺癌や、骨癌や、肺癌や、結腸直腸癌や、子宮頚癌や、滑膜肉腫や、転移性癌に関連する下痢や、血管作動性腸管分泌腫瘍や、巨大症や、乾癬や、動脈硬化や、血管の平滑筋再狭窄又は不適当な微小血管増殖などの治療に使われることができます。  
【０５５６】
iv.  C-Met 
C-Met（又は配列同一性番号2001により規定された肝細胞成長因子レセプターHGFR）上皮由来の細胞（幹細胞及び前駆細胞を含み）において見つかった薄膜レセプターであります。c-Metはそのリガンドである肝細胞成長因子（HGF）により刺激される時、幾つかの生物学反応を引き起こし、それは又有糸分裂形成や運動形成や器官形成など侵入成長を誘発します。  
【０５５７】
C-Metは腫瘍細胞系にも、それぞれの人固形腫瘍にも発見されました。癌細胞における異常のc-Met活性は間違った予知に関連し、腫瘍成長や血管新生や転移を誘発します。C-Metは以下のような多数の発癌シグナル転換経路を引き起こします。器官形成を引き起こすRASや、細胞運動性に関連するPI3Kや、分枝形態形成を引き起こすSTATや、複数のジーンの転写制御に参与するベタ・カテニンなどであります。HGFは、c-Metを通じて、特定な細胞種類の分裂促進因子であることが見つかりました。これらの細胞種類は黒色素胞や、尿細管性細胞や、ケラチノサイトや、特定な内皮細胞と上皮細胞を含みます（Matsumotoなど、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:45-51 (1991)； Igawaなど、Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:831-838 (1991)； Hanなど、Biochem.、 30:9768-9780 (1991)；Rubinなど、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:415-419 (1991)をご参考に）。
【０５５８】
幾つかの癌治療法はc-Metシグナリングへの干渉を必要としています。これらの治療法は以下のものを含みます。キナーゼ抑制物はATPがリン酸基転移防止のc-Metと結合することを防ぎます。HGF抑制物はc-MetのHGF活性を防ぎます。デコイMET抑制物はリガンド結合及びホモ二量体化を防ぎます。免疫療法は受動免疫療法と主動免疫療法を含みます。前者はCDC又はADCCを活性化します。後者は細胞因子を利用して免疫細胞の非特定刺激を誘発します。しかしながら、この経路が様々な病理症状の重要な病因になると見れば、治療剤の開発に最適な臨床特性を持つ薬剤が引き続けて必要であることが明らかになります。
【０５５９】
ここで提供された抗体ライブラリーはc-Met との結合を分析すること及び/または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖又は細胞シグナリングであります。HGFがある場合に、測定が行われることができます。例13はc-Met と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。
【０５６０】
ここで提供されたライブラリーから確認された、c-Met 活性を調整する抗体又はその部分は、c-Met の発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は以下の疾患の治療に使われることができます。肺癌や、骨癌や、膵臓癌や、皮膚癌や、頭頚部癌や、皮膚又は眼内黒色腫 や、子宮癌や、直腸癌や、肛門部癌や、胃癌や、結腸癌や、乳癌や、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫や、卵管癌や、子宮内膜癌や、子宮頚部癌や、膣癌や、外陰癌）や、ホジキン病や、食道癌や、小腸癌や、内分泌系癌（例えば、甲状腺や副甲状腺や副腎などの癌）や、軟組織肉腫や、尿道癌や、陰茎癌や、前立腺癌や、慢性又は急性白血病や、小児固形腫瘍や、リンパ性リンパ腫や、膀胱がんや、腎臓又は尿管癌（例えば、腎細胞癌や腎盂癌）や、中枢神経系統新生物（例えば、初期CNSリンパ腫や、脊椎軸腫瘍や、脳幹膠腫や、下垂体腺腫や）などであります。
ここで提供された抗c-Met抗体はCDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2及び/又はCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGFTFSSYAMS（配列同一性番号によるアミノ酸26-35）であります、 CDRH2 は SはGSGGSTYYADSVKG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:3353)、  CDRH3 は EHIVVVIAはYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-118 配列同一性番号:3353)、  CDRH3 は EDIVVVPAAMSYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-119 配列同一性番号:3347)、 CDRH3 は EDIVLMVYAはYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-119 配列同一性番号:3349)、  CDRH3 は EDIVVVVAATSYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-119 配列同一性番号:3351)、  CDRL1 は QGDSLRSYYAS (によるアミノ酸 22-33 配列同一性番号:1870)、 CDRL2 は GKNNRPS (によるアミノ酸 49-55 配列同一性番号:1870)、や CDRL3 は NSRDSSGNHLVV (によるアミノ酸 88-99 配列同一性番号:1870)。以上の各CDRに対して60%、65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５６１】
例えば、c-Met活性を調整する抗体はIGHV3（たとえば、配列同一性番号68-152により規定されたもの）であるVH生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。またはIGHV2（例えば、配列同一性番号244-251により規定されたもの）であるDH生殖細胞セグメンや、IGHJ6（例えば、配列同一性番号282-285により規定されたもの）であるJH生殖細胞セグメントや、又はJH 生殖細胞セグメントの組み換え形式（例えば、配列同一性番号3455により規定されたもの）であります。これらの抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。IGLV3 (例えば、配列同一性番号400-417により規定されたもの)であるVλ 生殖細胞セグメント及びIGLJ2 (例えば、配列同一性番号443により規定されたもの)であるJλ 生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にc-Metと結合することであり、それに/または機能活性を調整することであります。  
【０５６２】
c-Metに反する典型的な抗体はVHチェーンが以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所としての抗体を含みます。IGHV3-23 (例えば、IGHV3-23*01、IGHV3-23*02、IGHV3-23*03、IGHV3-23*04、又は IGHV3-23*05)であるVH 生殖細胞セグメントや、IGHD2-15*01、IGHD2-2 (例えば、IGHD2-2*01、IGHD2-2*02又はIGHD2-2*03)、IGHD2-8 (例えば、IGHD2-8*01又はIGHD2-8*02)、又はIGHD2-21 (例えば、IGHD2-21*01 又は IGHD2-21*02)であるDH 生殖細胞セグメントや、IGHJ6 (例えば、IGHJ6*01、GHJ6*02、GHJ6*03、GHJ6*04)又はその組み換え形式（例えば、配列同一性番号3455により規定されたもの）であるJH生殖細胞セグメントなどであります。VLチェーンはIGLV3-19*01であるVλ 生殖セグメント及びILGJ2*01であるJλ 生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。Epや活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Hにより規定されます。 
【０５６３】
【表１８Ｈ】
2016127850.tif 000159
【０５６４】
v.  CD20 − B-リンパ性抗原
CD20（配列同一性番号2011により規定された人Bリンパ球限定差異化抗原であるBp35）はプレB及び成熟Bリンパ球に位置する恐水病膜組織貫通蛋白質であります。CD20は周辺血液又はリンパ系器官からの90％以上のB細胞の表面に見つかり、早期プレB細胞形成の間に発見され、形質細胞差異化まで止まります。CD20は正常のB細胞にも悪性B細胞にも存在します。特に、CD20は90％以上のB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)に発見されますが（Andersonなど(1984) Blood 63(6):1424-1433）、造血幹細胞や、プレB細胞や、正常の形質細胞や、または他の正常の組織には見つかりません（Tedderなど(1985) J. Immunol.135(2):973-979）。CD20はNHLなどの腫瘍細胞にも発見されます。  
【０５６５】
CD20は細胞周期開始及び差異化の活性過程における早期ステップを制御します。CD20はイオン・チャンネルとして働き、BCRにより引き起こされた細胞内貯蔵所の空虚化に従って細胞内カルシウムの進出を促進するカルシウム貯蔵所として営みます。幹細胞ではなくて、殆ど全てのB細胞において発見されたCD20の原因で、これはmAbにより引き起こした抗体依存性細胞毒性及び補足依存性細胞毒性を通じて抗原調節の標的であります。それに加えて、抗体により引き起こされたら、CD20は成長を制御し腫瘍細胞死亡を誘発するシグナリングを始めます（Teelingなど(2006) J Immunol.、177:362-371）。
【０５６６】
CD20はRITUXAN（R） (Rituximab)により癌細胞標的として証明されました。RITUXAN（R） (Rituximab)は、正常及び悪性のBリンパ球の表面において発見されたCD20抗原に対するジーン組換えのキメラ型鼠/人モノクローナル抗体であります（例えば、アメリカ・パテント番号5、736、137をご参考に）。RITUXAN(R)は細胞死亡や、補足依存性の細胞毒性（CDC）や、ADCCを通じてB細胞溶解を引き起こすことが見つかりました。
【０５６７】
ここで提供された抗体ライブラリーは、CD20との結合及び/又は機能活性の測定による活性調節のためにえり分けられることができます。例えば、補足依存性細胞媒介毒性や、細胞殺しや、CD20発見細胞の細胞死亡測定であります。例13はCD20と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例11は、架橋Fab抗体機能の評価のためのリンパ球細胞死亡測定を例示します。
【０５６８】
ここで提供されたライブラリーから確認された、CD20活性を調整する抗体又はその部分は、CD20の発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体またはその部分はリンパ球や、自己免疫疾患や、移植拒絶などの治療に使われることができます（例えば、自己免疫反応を抑制することにより器官や組織移植の拒絶を防ぐために）。リンパ球は、非ホジキン・リンパ球（高級リンパ球や、中級リンパ球や、低級リンパ球や）や、ホジキン病や、急性リンパ性白血病や、骨髄腫 や、慢性リンパ性白血病や、骨髄芽球性白血病などを含みますが、それらに限りません。自己免疫疾患は、全身性紅斑性狼瘡（SLE）や、リウマチ関節炎や、クローン病や、乾癬や、自己免疫血小板減少性紫斑病や、多発性硬化症や、強直性脊椎炎や、重症筋無力症や、尋常性天疱瘡などを含みますが、それらに限りません。  
【０５６９】
vii.  エリスロポエチン・レセプター（Epo-R）
エリスロポエチン（配列同一性番号2009により規定されたEpo）は赤血球系前駆細胞の増殖及び差異化を引き起こす糖蛋白質ホルモンであります。Epoは成熟赤血球細胞を形成させる赤血球系前駆細胞の成長や差異化や残存を促進するという責任を負います。血液及び組織における酸素レベルの変化に対して反応する時、エリスロポエチンは未熟赤芽球の増殖と差異化を刺激しそうであります。それは、成長因子としても働き、赤血球系前駆細胞の有糸分裂活性（例えば、赤血球激発及び群落を形成させるユニット）を刺激します。これは差異化因子としても働き、赤血球群落を形成させるユニットから前赤芽球への転換を誘発します（Erslev、 A.、 New Eng. J. Med.、 316:101-103 (1987)をご参考に）。 
Epo活性はエリスロポエチン・レセプター（Epや）と呼ぶ細胞表面レセプターの結合と活性化を通じて調節されます。リガンドがない場合に、Epoレセプターは行われた二量体に存在します。Epoがそのレセプターとの結合は構造変化を引き起こします。例えば、細胞質ドメインが互いに近く置かれます。「二量化」がレセプターの活性化に役立つという考えは不十分な理解であります。Epoレセプターの活性化は複数の生物学効果を引き起こします。これらの活性の一部は増殖の刺激や、差異化の刺激や、細胞死亡の抑制やを含みます（U.S. Pat. No. 6、319、499、Liboiなど、PNAS USA、90:11351 (1993)、Koury、Science、248:378 (1990)をご参考に）。エリスロポエチン・レセプターの欠陥は赤白血病と一族性赤血球増加を引き起こすことができます。  
【０５７０】
エリスロポエチンは、赤血球細胞増殖(RBC)の刺激が望まれた各治療法に使われる重要な薬品であります。Epogen（R）（ エポエチン-アルフア ）は組換え糖蛋白質であり、赤血球細胞増殖を刺激し、それにより貧血症を治療するように使われます（例えば、アメリカ・パテント番号4、703、008及び5、955、422をご参考に）。  
【０５７１】
ここで提供された抗体ライブラリーはEpやとの結合を分析すること及び/または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖、細胞死亡又は細胞シグナリングであります。例13はEpやと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例12と例18はEpやにより引き起こされた細胞増殖又は細胞死亡の調節を評価する測定を例示します。その故に、このような分析は主動抗体を確認するように使用されます。
【０５７２】
ここで提供されたライブラリーから確認された、Epや活性を調整する抗体又はその部分は、Epやの発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は低い赤血球のレベル及び/又は減少された血色素レベル（例えば、貧血症）を特徴にする不調の治療に使われることができます。それに加えて、これらの抗体又はその部分は、血液又は組織における低下の又は正常以下の酸素レベルを特徴にする不調の治療に使われることができます。例えば、低酸素血症又は慢性組織低酸素症であります。又は不十分な血液循環又は低下の血流量を特徴にする疾患であります。これらの抗体又は抗原結合部分は、創傷治癒を促進するように、又は脳髄/脊髄損傷や卒中などにより引き起こされた神経細胞及び/又は組織損害を保護するように使われることができます。抗体により治療される症状は、貧血（例えば、化学療法による貧血）や、貧血に関連する癌や、慢性疾患の貧血や、HIV関連貧血や、骨髄移植関連貧血などや、心不全や、虚(乏)血性心臓病や、腎不全などを含みますが、それに限りません。
ここで提供された抗体はEpや 活性を調整しますので、Epや の発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はEGFRと結合親和力を持つ抗体を含みます。このEpやは10-6 M、10-7 M、108 M、10-9 M、10-10 M、10-1 M、10-12 Mまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
【０５７３】
ここで提供された抗Epや抗体はCDRH1及び/又はCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGYTFTSYYMH (配列同一性番号1509によるアミノ酸26-35)であります ． CDRH1 は SGYSはSSNWWG (によるアミノ酸 $26-37 配列同一性番号:1759)、  CDRH1 は GGSはSGGYYWS (によるアミノ酸 26-37 配列同一性番号:1769)、  CDRH1 は GFTFSSYAMS (によるアミノ酸 26-35 配列同一性番号:3359)、 CDRH2 は IINPSGGSTSYAQKFQG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:1509)、  CDRH2 は YIYYSGSTYYNPSLKS (によるアミノ酸 51-66 配列同一性番号:1759)、  CDRH2 は YIYYSGSTYYNPSLKS (によるアミノ酸 52-67 配列同一性番号:1769)、  CDRH2 は SはGSGGSTYYADSVKG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:3359)、  CDRH3 は EYYYGSGSYYNDYFDY (によるアミノ酸 99-114 配列同一性番号:1509)、  CDRH3 は EGYSSSWYDYFDY (によるアミノ酸 99-111 配列同一性番号:1512)、  CDRH3 は TNWGAEYFQH (によるアミノ酸 99-108 配列同一性番号:1759)、  CDRH3 は ANWGDNWFDS (によるアミノ酸 100-109 配列同一性番号:1769)、  CDRH3 は ANWGYWYFDL (によるアミノ酸 99-108 配列同一性番号:1514)、  CDRH3 は EGYCSGGSCYSYWYFDL (によるアミノ酸 99-115 配列同一性番号:1508)、  CDRH3 は GITMVRGVIはYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-119 配列同一性番号:3359)、  CDRL1 は RASQSVSSSYLA (によるアミノ酸 24-35 配列同一性番号:1833)、  CDRL1 は KSSQSVLYSSNNKNYLA (によるアミノ酸 24-40 配列同一性番号:1838)、  CDRL1 は RASQSVSSNLA (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1843)、  CDRL1 は RASQSはSWLA (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1841)、  CDRL1 は RSSQSLLDSDDGNTYLD (によるアミノ酸 24-40 配列同一性番号:1853)、  CDRL1 は RASQSはSYLN (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1854)、  CDRL1 は QGDSLRSYYAS (によるアミノ酸 23-33 配列同一性番号:1870)、 CDRL2 は GASSRAT (によるアミノ酸 51-57 配列同一性番号:1833)、  CDRL2 は WASTRES (によるアミノ酸 56-62 配列同一性番号:1838)、  CDRL2 は GASTRAT (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1843)、  CDRL2 は DASSLES (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1841)、  CDRL2 は TLSYRAS (によるアミノ酸 56-62 配列同一性番号:1853)、  CDRL2 は AASSLQS (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1854)、  CDRL2 は GKNNRPS (によるアミノ酸 49-55 配列同一性番号:1870)、  CDRL3 は QQYGSSPPWT (によるアミノ酸 90-99 配列同一性番号:1833)、  CDRL3 は QQYYSTPPWT (によるアミノ酸 95-104 配列同一性番号:1838)、  CDRL3 は QQYNNWPPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1843)、  CDRL3 は QQYNSYSPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1841)、  CDRL3 は MQRIEFPSWT (によるアミノ酸 95-104 配列同一性番号:1853)、 CDRL3 は QQSYSTPPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1854)、 や CDRL3 は NSRDSSGNHLVV(によるアミノ酸 88-99 配列同一性番号:1870)。以上の各CDRに対して60%、65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５７４】
例えば、Epや活性を調節する抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。IGHV1 (例えば、配列同一性番号10-43により規定されたもの)や、IGHV3 (例えば、配列同一性番号68-152により規定されたもの)や、IGHV4 (例えば、配列同一性番号153-224により規定されたもの)であるVH 生殖細胞セグメントや、IGHD6 (例えば、配列同一性番号268-271により規定されたもの)や、IGHD3 (例えば、配列同一性番号252-259により規定されたもの)や、IGHD7 (例えば、配列同一性番号272により規定されたもの )や、IGHD2 (例えば、配列同一性番号244-251により規定されたもの)であるDH 生殖細胞セグメントや、IGHJ1 (例えば、配列同一性番号273により規定されたもの)や、IGHJ4 (例えば、配列同一性番号277-279により規定されたもの)や、IGHJ5 (例えば、配列同一性番号280 又は 281により規定されたもの)や、IGHJ2 (例えば、配列同一性番号274により規定されたもの)や、IGHJ6 (例えば、配列同一性番号282-285により規定されたもの)であるJH 生殖細胞セグメントや、又はJH 生殖細胞セグメントの組み換え形式（例えば、配列同一性番号3450-3455により規定されたもの）であります。  
【０５７５】
このような抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列により規定されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。 IGKV4 (例えば、配列同一性番号351により規定されたもの)や、IGKV3 (例えば、配列同一性番号332-350により規定されたもの)や、IGKV1 (例えば、配列同一性番号286-316及び868により規定されたもの)や、IGKV2 (例えば、配列同一性番号317-331により規定されたもの)であるVκ 生殖細胞セグメントや、IGKJ1 (例えば、配列同一性番号356により規定されたもの)であるJκ 生殖細胞セグメントや、IGLV3 (例えば、配列同一性番号400-417により規定されたもの)であるVλ 生殖細胞セグメントや、IGLJ2 (例えば、配列同一性番号443により規定されたもの)であるVλ 生殖細胞セグメントであります。
【０５７６】
このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にEpやと結合することであり、それに/または機能活性を調整することであります。  
【０５７７】
Epやに対する典型的な抗体はVHチェーンが以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGHV1-46(例えば IGHV1-46*01、 IGHV1-46*02、 IGHV1-46*03)、IGHV3-23 (例えば IGHV3-23*01、 IGHV3-23*02、 IGHV3-23*03、 IGHV3-23*04、 IGHV3-23*05)、IGHV4-28 (例えば IGHV4-28*01、 IGHV4-28*02、 IGHV4-28*03、 IGHV4-28*04、 IGHV4-28*05)、や IGHV4-31 (例えば IGHV4-31*01、 IGHV4-31*02、 IGHV4-31*03; IGHV4-31*04、 IGHV4-31*05、 IGHV4-31*06、 IGHV4-31*07、 IGHV4-31*08、 IGHV4-31*09、 IGHV4-31*10);であるVH生殖細胞系セグメントや、IGHD6-6(例えば IGHD6-6*01)、 IGHD6-13 (例えば IGHD6-13*01)、  IGHD3-10 (例えば IGHD3-10*01 or IGHD3-10*02)、  IGHD7-27*01、  IGHD2-15*01、 or  IGHD6-13*01であるDH生殖細胞系セグメントや、IGHJ1*01、  IGHJ4 (例えば IGHJ4*01、 IGHJ4*02 or IGHJ4*03)、  IGHJ5 (例えば IGHJ5*01、 IGHJ5*02)、  IGHJ6 (例えば IGHJ6*01、 IGHJ6*02、 IGHJ6*03、 IGHJ6*04)、 であるJH生殖細胞系セグメントや、又はこれらの組替え形式（例えば、配列同一性番号3455により規定されたもの）であります。VLチェーンは以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGKV4-1(例えば IGKV4-1*01)、  IGKV3-15*01、  IGKV3-20 (例えば IGKV3*01、 IGKV3*02)、 IGKV1-5 (例えば IGKV1-5*01、 IGKV1-5*02、 IGKV1-5*03)、  IGKV1-39*01、 or  IGKV2D-40*01; であるVκ生殖細胞系セグメントや、IGKJ1*01であるJκ生殖細胞系セグメントや、IGLV3-19*01であるVλ生殖細胞セグメントや、ILGJ2*01であるJλ生殖細胞セグメントなどであります。Epや活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Iにより規定されます。
【０５７８】
【表１８Ｉ】
2016127850.tif 000160
2016127850.tif 000161
【０５７９】
viii.カドヘリン
カドヘリンは一群のカルシウムによるタイプ1の膜組織貫通の糖蛋白質であり、細胞癒着にかかわり、組織内細胞の相互結合を確保します。多数の群のカドヘリン分子があり、Nカドヘリンや、Eカドヘリンや、Pカドヘリンを含みますが、それらに限りません。この一族のメンバーはカルシウムによる同種親和性相互作用を示し、選択性の細胞間認識及び癒着に責任があります。それは器官形成の間に様々の細胞タイプを適切な位置に配置します。カドヘリンは多細胞構造の統合を維持することに重要な役割をもします。胎芽形態形成の間に、カドヘリン一族の多様なメンバーの発見は空間的に臨時的に制御され、様々の細胞タイプを機能構造へ順序に組み立てることを促進します。カドヘリンは癌の細胞連結及び転移細胞において重大な役割をすると思われます。
【０５８０】
a)  P-カドヘリン (P-cad/CDH3)
P−カドヘリン（配列同一性番号2008により規定されたP-cad）は胎盤において見つかった単スパンタイプ1膜組織貫通糖蛋白質であり、E-カドヘリン（上皮カドヘリン、E-cad）と異形同源であります。P-cadもE-cadもアルファ・カテニンによる細胞骨格と相互に作用します。他のカドヘリンのように、P-カドヘリンは上皮細胞間癒着に役割をします。他の主な役割は細胞表現型の決定及び細胞動態との関連を含みます。細胞動態は腫瘍細胞の移転及び散布を含みます。上皮組織におけるP-cadの発見は細胞群を増殖活性に参与させそうであり、細胞差異化に従って減少します。 
【０５８１】
P-カドヘリン発見は、カルシウムによる細胞癒着蛋白質として、不完全に差異化する侵略膀胱癌細胞に見つかりました。このような膀胱癌細胞は減少したEカドヘリン発見を示します。   (Mialhe  A.など、J. Urol. 164:826 (2000))。Eカドヘリン及びPカドヘリンの下向き調節は培養された腫瘍前立腺細胞にも関連します。(Wang J.など、Urol. Res. 5:308 (2000))。人大腸直腸癌の形成は、Eカドヘリン/カテニン複合体の細胞レベルの低下を、せめて部分的に、引き起こします。(Debruyne P.など、 Acta Gastroenterol. Belg. 62(4):393 (1999)) 。最近の報告によりますと、Pカドヘリンの異常上向き調節は増殖細胞表現型に関連します。増殖細胞表現型は胃腸管組織の腫瘍変形に関わり、特に異形成及び腺腫性ポリープに関わります。(Sanders D.S.など/.、 J. Pathol. 190(5):526 (2000))。その故、特定の癌タイプ、特に一部の消化系統癌タイプ（例えば、結腸癌）は、正常細胞と比べて、Pカドヘリンの上向き調節や過剰発見を特徴にします。Pカドヘリンは癌の診断、予防又は治療の有効標的であります（アメリカ発表のパテント申請番号2003/0194406 と国際発表のパテント申請番号WO 02/097395をご参考に）。
【０５８２】
ここで提供された抗体ライブラリーはpCadとの結合を分析すること及び/または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。機能活性の測定は、増殖や、腫瘍細胞癒着や、ADCC又はCDC活性を評価する測定や、抗細胞死亡測定や、細胞周期チェックポイント測定などを含みます。例13はpCadと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例20はPカドヘリンに引き起こされた細胞間癒着に与えた抗体効果を評価する測定であります。例えば、Pカドヘリン機能を抑制する抗体は、自分がある場合に細胞群生が失敗することにより、確認されます。
【０５８３】
ここで提供されたライブラリーから確認された、pCad活性を調整する抗体又はその部分は、pCadの発見及び/又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は結腸癌や胃癌や肝癌などの消化系癌及び肺癌や乳癌など他の癌の治療に使われることができます。
ここで提供された抗体はPカドヘリン活性を調整しますので、Pカドヘリンの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はPカドヘリンと結合親和力を持つ抗体を含みます。このPカドヘリンは10-6 M、10-7 M、108 M、10-9 M、10-10 M、10-1 M、10-12 Mまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
【０５８４】
ここで提供さ抗Pカドヘリン抗体や抗体はCDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 及び/又はCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。 例えば、CDRH1はGYTFTSYYMH (配列同一性番号1512によるアミノ酸26-35)であります、 a CDRH1 は GFTFSSYAMS (によるアミノ酸 26-35 配列同一性番号:3559)、  CDRH2 は IINPSGGSTSYAQKFQG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:1512)、  CDRH2 は SはGSGGSTYYADSVKG (によるアミノ酸 50-66 配列同一性番号:3359)、  CDRH3 は EGYSSSWYDYFDY (によるアミノ酸 99-111 配列同一性番号:1512)、  CDRH3 は ANWGYWYFDL (によるアミノ酸 99-108 配列同一性番号:1514)、  CDRH3 は EYYYGSGSYYNDYFDY (によるアミノ酸 99-114 of 1509)、 CDRH3 は GITMVRGVIはYYYYYYGMDV (によるアミノ酸 99-119 配列同一性番号:3359)、  CDRH3 は VIITPRTIVはYAFDV (によるアミノ酸 99-114 配列同一性番号:3071、  CDRL1 は RASQSVSSNLA (によるアミノ酸 24-35 配列同一性番号:1843)、  CDRL1 は RASQSVSSSYLA (によるアミノ酸 24-35 配列同一性番号:1833)、  CDRL1 は RASQSはSWLA (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1841)、  CDRL1 は RASQSはSYLN (によるアミノ酸 24-34 配列同一性番号:1854)、  CDRL1 は QGDSLRSYYAS (によるアミノ酸 23-33 配列同一性番号:1870、  CDRL2 は GASTRAT (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1843)、  CDRL2 は GASSRAT (によるアミノ酸 51-57 配列同一性番号:1833)、  CDRL2 は DASSLES (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1841)、  CDRL2 は AASSLQS (によるアミノ酸 50-56 配列同一性番号:1854)、  CDRL2 は GKNNRPS (によるアミノ酸 49-55 配列同一性番号:1870)、  CDRL3 は QQYNNWPPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1843)、  CDRL3 は QQYGSSPPWT (によるアミノ酸 90-99 配列同一性番号:1833)、  CDRL3 は QQYNSYSPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1841)、  CDRL3 は QQSYSTPPWT (によるアミノ酸 89-98 配列同一性番号:1854)、やCDRL3 は NSRDSSGNHLVV (によるアミノ酸 88-99 配列同一性番号:1870) 。  以上の各CDRに対して60%、65 %、 70 %、 80 %、 90 %、 91 %、 92 %、 93 %、 94 %、 95 %、 96 %、 97 %、 98 %、 99 %又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
【０５８５】
例えば、Pカドヘリン活性を調整する抗体は以下の生殖細胞セグメントを含む塩基配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。IGHV1（たとえば、配列同一性番号1-43に規定されたもの）又はIGHV3（例えば、配列同一性番号68-152により規定されたもの）であるVH生殖細胞セグメントや、IGHD3（例えば、配列同一性番号252-259に規定されたもの）や、 IGHD6 (例えば、配列同一性番号268-271により規定されたもの)や、IGHD7 (例えば、配列同一性番号272により規定されたもの)であるDH 生殖細胞セグメントや、 IGHJ2 (例えば、配列同一性番号274により規定されたもの)や、IGHJ3 (例えば、配列同一性番号275又は276により規定されたもの)や、IGHJ4 (例えば、配列同一性番号278又は279により規定されたもの)や、IGHJ6 (例えば、配列同一性番号282-285により規定されたもの)であるJH 生殖細胞セグメントや、又はJH生殖細胞セグメントの組換え形式（例えば、配列同一性番号3450-3455により規定されたもの）であります。
【０５８６】
このような抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列により規定されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。IGKV1 (例えば、配列同一性番号286-316により規定されたもの)や、IGKV3 (例えば、配列同一性番号332-350により規定されたもの)であるVκ 生殖細胞セグメントや、IGKJ1 (例えば、配列同一性番号356により規定されたもの)であるJκ 生殖細胞セグメントや、 IGLV3 (例えば、配列同一性番号400-417により規定されたもの)であるVλ 生殖細胞セグメントや、IGLJ2 (例えば、配列同一性番号443により規定されたもの)であるVλ 生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にPカドヘリンと結合することであり、それに/または機能活性を調整することであります。
Pカドヘリンに対する典型的な抗体は、VHチェーンが以下の生殖セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体を含みます。IGHV1-46 (例えば、IGHV1-46*01、IGHV1-46*01、又はIGHV1-46*03)又はIGHV3-23 (例えば、IGHV3-23*01、IGHV3-23*02、IGHV3-3*03、IGHV3-23*04、IGHV3-23*05)であるVH 生殖細胞セグメントや、IGHD3-10 (例えばIGHD3-10*01、IGHD3-10*02)又はIGHD6-13 (例えば、IGHD6-13*01) 又はIGHD7-27*01であるDH 生殖細胞セグメントや、IGHJ3 (例えば、IGHJ3*01、IGHJ3*02)や、IGHJ4 (例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)や、IGHJ6 (例えば、IGHJ6*01、IGHJ6*02、IGHJ6*03、IGHJ6*04)や、IGHJ2*01であるJH 生殖細胞セグメントや、又は配列同一性番号3458及び3461によりそれぞれに規定されたJH域をコード化するこれらの組換え形式（例えば、配列同一性番号3452及び3455により規定されたもの）であります。VLチェーンは以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGKV1-5 (例えば、IGKV1-5*01、IGKV1-5*02、IGKV1-5*03)、IGKV1-39*01、IGKV3-15(例えば、IGKV3-15*01)、IGKV3-20 (例えば、IGKV3-20*01、IGKV3-20*02)又はIGKV3-11 (例えば、IGKV3-11*01、IGKV3-11*02)であるVκ生殖細胞セグメントや、IGKJ1*01であるJκ 生殖細胞セグメントや、IGLV3-19*01であるVλ生殖細胞セグメントや、ILGJ2*0であるJλ生殖細胞セグメントであります。Pカドヘリン活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Jにより規定されます。  
【０５８７】
【表１８Ｊ】
2016127850.tif 000162
【０５８８】
ix.  CD44
配列ＩＤ番号：2006に記載されているCD44は、細胞間作用、細胞接着、および細胞移動に関与している細胞表面内在性膜糖タンパク質です。CD44遺伝子の転写物は、選択的かつ複雑なスプライシングを経て、様々な機能性アイソフォーム変異を生み出します。CD44は様々なアイソフォームで多種多様な細胞種類の表面で発現されるタンパク質です。最小のアイソフォームである標準CD44 (CD44s)は、様々な細胞で発現されるほか、細胞外基質成分への細胞接着を仲介したり、リンパ球や単球の活性化に共同刺激を与えたりすると見なされます。一方、細胞外領域でv6ドメイン(CD44v6)を含むCD44のスプライス変異の発現は上皮のサブセットに限ります。 
【０５８９】
CD44はリンパ球の活性化、再循環、ホーミング、造血、および腫瘍転移を含み、多種多様な細胞機能に関わっています。CD44は、ヒアルロン酸の受容体で、E -セレクチンおよびL -セレクチンなどの他のリガンドと、またオステオポンチン、コラーゲン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）などの他のリガンドと相互作用することができます。MMPは、血管壁の強度を維持するタンパク質を分解させ、内皮細胞が間質マトリックスに漏れ出、血管形成の発生につながります。MMPを抑制することによって、新生毛細血管の形成が防止されます。CD44はヒアルロン酸と相互作用し、細胞接着を仲介します。この相互作用を混乱させる治療はいくつかの病状の治療に採用できます。
【０５９０】
CD44のいくつかの変異体は乳癌、前立腺癌細胞の細胞表面マーカーの役を果たします。CD44の過剰発現は、特にリンパ腫をはじめ、多様な悪性腫瘍の発生や拡大に関連していると見なされます。CD44v6は、変異エクソン(CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44v10)と同様に、腫瘍関連抗原と見なされ、ヒト腫瘍および正常組織においての良好な発現パターンを示しています(Heider K H et al. Eur. J. Cancer 31A:2385-2391, 1995年、Heider K H et al.Cancer Immunology Immunotherapy 43:245-253, 1996年、Dall et al., 1996年、Beham-Schmid et al., 1998年、Tempfer et al., 1998年、Wagner et al., 1998年)。また、特に腫瘍の放射免疫治療(RIT)をはじめ、抗原に基づいた診断および治療法の対象となりました(Stroomer J W et al.Clin Cancer Res 6(8):3046-55, 2000, WO 95/33771, WO 97/21104)。CD44は抗癌治療開発の対象となりました（米国特許5,990,299号を参考）。
【０５９１】
本書で取り上げられる抗体ライブラリーでは、CD44との結合や機能の活性化を分析することによって、活動の調整を検索することができます。13例は、結合の分析によって、ここで取り上げられる抗体ライバリーを分析し、pCadと結合する抗体を特定または選択する例を示します。  
【０５９２】
ここで取り上げられたライブラリーで特定された、CD44の活性を調整する抗体またはその一部は、CD44あるいはそれによる変異体の発現および/または活性に関連している病状の治療あるいは予防に利用することができます。    たとえば、抗体またはその一部は、頭頸部扁平上皮癌（SCC）、食堂ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚SCC、乳腺腺癌（AC）、肺AC、頸部ＳＣＣ、膵臓AC、コロンAC、あるいは胃ACなどの癌の治療に採用することができます。抗体あるいはその一部はまた、関節リウマチの治療にも採用することができます。
【０５９３】
4.反復検索
“ヒット”が取得された後、セクションCで記述された方法で、本書で取り上げられる分析方法を適用するための新規ライブラリーを作成することができます。抗体がアドレス可能な形式で記載されているおかげで、”ヒット”を取得するだけで活性と構成の関係性をすぐに特定、測定することができます。たとえば、”ヒット”が取得される直後に、エンコードされた抗体のコンポーネント生殖細胞系セグメントが特定されます。その後に、特定された”ヒット”に関連する生殖細胞系セグメントから派生した核酸分子によってエンコードされた抗体を含む新規作成のライブラリーを作ることができます。生殖細胞系セグメントは普通に、配列類似性で関連しているが、その他に、ＣＤＲ、指向性ペプチド、あるいはそれ以外の生化学的性質によって関連していることもあります。  
【０５９４】
一般的に、反復検索で抗体の新規ライブラリーを生成するにあたって、”ヒット”に含まれる生殖細胞系セグメントの遺伝子族が特定されます。VH, DH およびJH遺伝子族セグメントは、あらゆる可能な並べ替え、あるいは希望のサブセット内で組み合わせられ、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子を生成します。Vk およびJk、またはVl およびJl 遺伝子族セグメントは、あらゆる可能な並べ替え、あるいは希望のサブセット内で組み合わせられ、ＶＬ鎖をエンコードする核酸分子を生成します。様々なペアに組まれたVHをおよびVLを表すベクターは、抗体ライブラリー作成のために生成された発現タンパク質、および純化された抗体メンバーです。以降の抗体ライブラリーはアドレス形式で作成されます。以降のライブラリーは上記に説明された通りに、検索を最適化するためにスクリーニング検定に利用することができます。
【０５９５】
加えてライブラリーの各メンバーのアイデンティティが知られている場合に作成されるので、既に特定の関係のあるメンバーが記載されているライブラリーがあることは可と見なされます。したがって、そういったメンバーが、関係のある”ヒット”のサブライブラリに編集され、本書の方法を再びに行わず検索することが可能になります。  
【０５９６】
また、指向進化などによって、”ヒット”や後続のライブラリーのメンバーに突然変異を起こさせ、”ヒット”を最適化することができます。
【０５９７】
5.指向進化 
本書のスクリーニング方法によって特定された抗体の”ヒット”が突然変異生成などによって変更され、変更された抗体のライブラリーを作成することができます。そして、機能性が高まった（例えば向上した結合性や安定性、延長したインビボ安定性、および/また向上した機能的活性の調節性）１つあるいはそれ以上の例を特定するために、変更された抗体を測定します。特定のタンパク質に対する向上した機能性を検索、選択するために、新たに変更された”ヒット”のライブラリーを作成することができます。ライブラリーはアドレス可能な形式、または上記に説明された他の表示形式で検索することができます。たとえば、より厳格かつより高度な結合や洗浄の条件を採択することなどによって、2番目のライブラリーでより高親和性結合タンパク質を特定することができます。その他のスクリーニング技術を利用することもできます。
【０５９８】
突然変異ライブラリーを作るためには様々なアプローチが採択されたが、例えば、チェーンシャフリング(Marks et al. (1992年) Bio/Technology 10:779  および Clackson et al. (1991年) Nature 352:624)、変異性ＰＣＲ（Hawkins et al.  (1992年) J. Mol. Biol. 226:889 および Leung et al. (1989年) Technique 1:11-15)、E. coli 突然変異誘発株の利用 (Low et al. (1996年) J. Mol. Biol. 260,359)、組換え（例えば、米国出版2004-0005709号を参考）、ランダム開裂を利用したDNAシャフリング(Stemmer (1994年) Nature 389-391、termed  ”nucleic acid shuffling”)、RACHITT（R） (Coco et al. (2001年) Nature Biotech. 19:354)、あるいは、抗体分子の相補性決定領域(CDR)への特定のアプローチ、例えばＣＤＲウォーキング(Barbas et al.(1994年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809 and  Yang et al. (1995年) J. Mol. Biol. 254:392)、部位特異的突然変異誘発 (Zoller et al. (1987年) Nucl Acids Res 10:6487-6504)、カセット式変異誘発 (Reidhaar-Olson (1991年) Methods Enzymol. 208:564-586) および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み (Griffiths et al. (1994年) EMBO J 13:3245)。
【０５９９】
取り込みによって、突然変異誘発は既知の領域、あるいは結合界面にある可能性の高い領域を対象とする突然変異生成があります。例えば、突然変異誘発は本書で説明される通り、重鎖または軽鎖のCDR領域に起こさせることができます。また、突然変異誘発はＣＤＲに隣接する、あるいは近くのフレームワーク領域、特にCDRの接合部の１０、５つ、あるいは3つのアミノ酸の間のＣＤＲフレームワーク領域に起こさせます。加えて、突然変異誘発はCDRの１つあるいは限られたＣＤＲに起こさせることができます。
【０６００】
a.  ランダム変異導入法
抗体と抗原がCDRの残基によって結合されます。ですから、CDR突然変異誘発は広く、抗体のFabおよびFv断片の親和性を向上させるのに利用されます。ランダム変異導入法には例えば、E. coli XL1red、UV放射、または脱アミノ化、アルキル化、あるいは塩基類似突然変異原などによる化学修飾、またはＤＮＡシャフリング、カセット式変異誘発、部位特異的なランダム変異導入法、変異性ＰＣＲなどのPCR法(例えば、米国出願2006-0115874号を参考)、あるいはGeneMorph PCRによるランダム変異導入キット(Stratagene)、あるいは多様化ランダム変異導入キット (Clontech)など、市販のランダム突然変異誘発キットを利用する方法があります。多様化ランダム変異導入キットでは、反応混合物のdGTP、およびマンガン（Mn2+）の量を変更することによって、特定のDNA配列の変異率を調整することができます。増加するマンガンの量は当初、突然変異率を引き上げます。これは増加したdGTPの濃度がもたらしたより高い突然変異率によります。ＰＣＲを再び行うことによって突然変異率をさらに高めることができます。以上の全てのアプローチはCDR突然変異の抗体の発現ライブラリーの作成、およびよりいいバインダーの選択が必要です。突然変異生成による指向タンパク進化への様々なアプローチのいずれも採択することができます。このアプローチのいずれも、あるいは組み合わせたアプローチでリード抗原を変更させ、希望の特性を持たせることができます。当分野で知られているいかなる方法でリード抗体を変更、修飾することができます。  
【０６０１】
飽和突然変異誘発
典型的な例で、飽和突然変異誘発法はCDRの残基が可能なアミノ酸の全ての２０個に突然変異を起こさせる場合に利用されます（例えば、the Kunkle method, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa. および米国特許6,562,594号を参考）。この方法では、選択されたアミノ酸をエンコードする希望のコドンでヌクレオチドがランダム化された縮重変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが合成されます。典型的な無作為化方式には、NNS- あるいはNNKNランダム化があるが、ここで、Ｎはいかなるヌクレオチドを、Ｓはグアニン、あるいはシトシン、およびKはグアニン、あるいはチミンを表しています。縮重変異原性プライマーは一本鎖DNAテンプレートにアニールされ、そしてテンプレートの相補鎖を合成するためにDNAポリメラーゼが添加されます。ライゲーション後、二本鎖DNAテンプレートを増幅するためにE. coliに変化されます。また、単一アミノ酸の変更は、QuikChange (Stratagene)など、市販の部位特異的突然変異誘発キットを利用し行われます。他の実施形態では、当分野で一般に知られている部位特異的アミノ酸変異の方法を利用することができます。
【０６０２】
ii.変異性PCR
変異性PCRによって、特定の核酸配列にランダム突然変異を導入することができます(例えば、Hawkins et al., (1992年) J. Mol. Biol. 226(3):889-96を参考)。簡単に言えば、変異性PCRは複製の正確さに悪影響を与える条件の下で行われるので、当業者の能力をもってランダム突然変異が導入されます。生成後、このランダムな変異体を遺伝子表示形式に配置、パンに置かれ、そして評価されます。
【０６０３】
iii.細胞株
E. coli mutD5 またはEpicurian Coli（R） XL1-Red Competent cells(Stratagene, La Jolla, Calif.)などの突然変異誘発株は、プラスミド複製中に、単一ヌクレオチド点変異を含む抗体ライブラリーを作成するのに利用されます。そして、遺伝子表示形式を利用し、生物学的活性に基づいてランダム変異体ライブラリーを分析します。  
【０６０４】
iv.DNAシャフリング/抗体鎖シャッフリング
DNAシャフリングリードによってリード抗体の活性を調節することができます。DNAシャッフルで、変異DNA分子が生成される方法には、インウィトロ相同的組み換え、あるいは親ＤＮＡの不規則分解があり、そしてその後に次ぐＰＣＲを利用した再組み立てによって、不規則点変異の導入という結果につながります(例えば、Stemmer (1994年) Nature 370:389-391、Stemmer (1994年) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:10747-10751、米国特許5,605,793号と5,811,238号と5,830,721号、および国際出版 WO 95/022625号とWO 97/20078号を参考)。対立遺伝子多型、あるいは多種のＤＮＡ分子などの親DNA分子のファミリーを利用することによって、プロセスの機能性を増やすようにこの方法を変更することができます。希望の活性の選択あるいはスクリーニング、またそれに次ぐ突然変異生成の追加的な繰り返しおよび分析では、希望の突然変異誘発を決めながら、有害な変化を裂けて選択することが可能なので、配列の急速な”進化”を促します。
【０６０５】
抗体鎖シャッフルでは、選択された特定のVHが、複数のVL配列と組み合わせられ、新たなVH/VLのペアを生み出します(例えば、Kang et al. (1991年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11120−11123、Collet et al. (1992年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10026-10030、およびMarks et al. (1992年) Bio/Technology 10:779を参考)。
【０６０６】
v.  ＣＤＲウォーキング
別の例では、より高い親和性抗体の生成、あるいは選択は、第三免疫選択プロセスを模倣するCDRウォーキング突然変異によって行われます。たとえば、抗体のCDRの飽和突然変異を介して繊維状バクテリオファージの表面上に表示される１つあるいは複数の抗体断片のライブラリーを作成し、そして固定した抗原を利用して重要な抗体を選択します。そして、逐次および並列最適化戦略によって最も高い親和性の抗体を選択できます(例えば、Barbas et al. (1994年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813、および Yang et al. (1995年) J. Mol. Biol 254(3):392-403を参考)。
【０６０７】
vi.フレームワークの安定化
フレームワーク領域または定常領域で変異を起こさせ、抗体の半減期を延ばすことができます。フレームワーク領域あるいは定常領域で変異を起こすことはまた、抗体の免疫原性を変更するため、特定の分子への共有結合あるいは非共有結合サイトを提供するため、あるいは補体結合やFcR結合や抗体依存性細胞毒性の特性（ADCC）を変更するために行われます。単一抗体は、１つあるいは複数のCDR、あるいは可変領域のフレームワーク領域、あるいは定常領域で変異を持つことが可能です。例えば、PCT公開WO 00/09560号、Ewert et al. (2003年) Biochemistry 42(6):1517-1528、Ewert et al. (2004年) Methods 23(2):184-99、およびKnappik et al. (1995年) Protein  Engineering 8:81-89を参考。 
【０６０８】
6.  エピトープマッピング
“ヒット”が出たら、その結合エピトープを決定することができる。したがって、ここで提供される抗体ライブラリーによって、既知抗原内の未知のエピトープ、あるいは未知抗体内の新たなエピトープ（例えば癌細胞株）など新たなエピトープを特定することができます。エピトープマッピングの方法は当業者に知られています（例えば、Olwyn M.R. Westwood and Frank C. Hay. Epitope Mapping. オックスフォード大学出版局 2001年、Sigma Catalog #  Z373990 Epitope Mapping Protocols: Methods in Molecular Biology, Vol. 66を参考）。抗体によって特定されるエピトープのマッピング方法には、BIAcore あるいは ELISAを利用した結合分析(Reineke et al. 1999年)、ELISPOT、予測ソフトウェア、表面台（例えばタンパク質チップ）でのペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成そしてその後に抗体表面への露出、タンパク抗原配列から由来するペプチドライブラリーのファージ提示法、質量分析法、MALDIを利用した方法、水素重水交換(see e.g. Baerga-Ortiz et al. (2002年) Protein Science, 11:1300-1308)、および表面プラズマ共鳴などの方法があります。
【０６０９】
7.  該当ヒットのインビボ分析
特定の対象の”ヒット”が特定されたら、対象の異常な活性との関係をインビボ分析で判定できます。一般的に、この方法では、非ヒト動物モデルにある疾患や症状に対して抗原を投与し、そしてその生体モデルで 抗体  の効果を評価します。インビボ分析は適切な制御対策としては、 抗体の欠乏に備えてサンプルを用意しておく方法も含まれます。一般的には、様々な抗体の濃度で様々な分析を組み合わせ、並列に実行することによって、 抗体 の各濃度に対してそれぞれの反応が得られます。通常、この濃度から適切なものを負の制御として採択されます（例えば、濃度ゼロあるいは検出レベル以下）。望ましい抗体とは、抗体がない場合と比較すると、動物生態モデルの疾患あるいは症状を、約10％以上、約20％以上、約25％以上、約30％以上、約45％以上、約50％以上、約55％以上、約60％以上、約65％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、またはそれ以上で調節（軽減や増加）できる 抗体です。一般的には、望ましい抗体 は、疾患や症状にかかった動物生態が健康な動物生態になるように貢献します。 
【０６１０】
非ヒト動物モデルには、疾患の進行を監視するために抗体を投与する前に、疾患および/または表現型誘導の物質を注射された非ヒト動物モデルも含まれます。遺伝モデルも利用できます。ネズミなどの動物は、１つあるいはそれ以上の遺伝子の過剰発現、低発現、あるいは無力化によって疾患または状態を模倣するように生成されます。そのような動物は、当分野でよく知られているトランスジェニック動物生成技術、または天然あるいは誘導変異株によって生成されます。当業者は、特定の対象に関する様々な動物モデルに馴染みがあります。
【０６１１】
このような動物モデルには、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、豚、およびヒト以外の霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、サルなども含まれます。当分野でよく知られているいかなる動物生体を使用することができます。プロセスのいくつかの側面は異なる場合があるが、例えば、抗体投与の期間制度（例えば、予防薬および/または治療剤）、抗体が個別投与か併用投与かの投与の様式、および抗体の投与頻度なども含まれます。
【０６１２】
組み換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を生成する標準的な技術を利用して、ここで特定された遺伝子のコーディング部分を希望の動物ゲノムに導入することによって生成されます。こトランスジェニック操作の対象になれる動物モデルには、ネズミ、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、豚、およびヒト以外の霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、およびサルを例外なし含まれます。このような動物にトランス遺伝子を導入する技術には、前核マイクロインジェクション(米国特許4,873,191号)、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入(例えば、Van der Putten et al., (1985年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615)、胚幹細胞における遺伝子標的化(Thompson et al., (1989年) Cell 56:313-321)、胚のエレクトロポレーション(Lo, (1983) Mol. Cel. Biol. 3:1803-1814)、精子媒介遺伝子移入(Lavitrano et al., (1989年) Cell 57:717-73)。例えば、米国特許4,736,866号を参考。
【０６１３】
動物モデルによって、ここで取り上げられる抗体、組成物、あるいは併用療法の効力を評価することができます。肺癌向けの動物モデルには、肺癌動物モデル(例えば、Zhang et al., (1994年) In Vivo 8(5):755-69を参考)、およびp53機能障害を持ったトランスジェニックマウスモデル(例えば、Morris et al., (1998年) J La State Med Soc 150(4):179-85を参考)などのモデルも含まれます。乳癌向けの動物モデルには、サイクリンD1を過剰発現するトランスジェニックマウス（例えば、Hosokawa et al., (2001年) Transgenic Res 10(5):471-8を参考）などのモデルもあります。結腸癌向けの動物モデルには、TCR b およびp53のダブルノックアウトマウス（例えば、Kado et al., (2001年), Cancer Res 61(6):2395-8を参考）などのモデルもあります。膵癌向けの動物モデルには、Panc02マウス膵臓腺癌の転移モデル(例えば、Wang et al., (2001年)皮下膵臓腫瘍で発生したヌーヌーマウス（例えば、Ghaneh et al., (2001年) Gene Ther 8(3):199-208を参考）などのモデルもあります。非ホジキンリンパ腫向けの動物モデルには、重症複合免疫不全症(“SCID”)マウス(例えば、Bryant et al., (2000年) Lab Invest 80(4):553-73参考)、およびIgHmu-HOX11トランスジェニックネズ(例えば、Hough et al., (1998年) Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13853-8を参考)などのモデルも含まれます。食道癌向けの動物モデルには、ヒトパピローマウイルス16 E7型癌遺伝子向けのマウストランスジェニック(例えば、Herber et al., (1996年) J Virol 70(3):1873-81を参考)などのモデルもあります。結腸直腸癌向けの動物モデルには、Ａｐｃマウスモデル(例えば、Fodde & Smits, (2001年) Trends Mol Med 7(8):369-73 およびKuraguchi et al., (2000年) Oncogene 19(50):5755-63を参考)などのモデルもあります。
【０６１４】
関節炎向けの動物モデルには、関節リウマチラット(例えば、Pearson, (1956年) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 91:95-101を参考)、およびマウスやラット生体内におけるコラーゲン誘導関節炎(例えば、Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M.  Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach およびW. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994年を参考)などのモデルもあります。喘息向けの動物モデルには、肺過敏性のマウスモデル(例えば、Riese et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:2351-2363 and Shi, et al. (1999年) Immunity 10:197-206を参考)などのモデルもあります。同種免疫拒絶反応向けの動物モデルには、ラット同種心臓移植モデル（例えば、Tanabe et al. (1994年) Transplantation 58:23-27 およびTinubu et al. (1994年) J. Immunol. 153:4330-4338を参考）、また、拒絶反応153:4330-4338）とラット異種心臓同種移植の拒絶反応(例えば、Jae-Hyuck Sim et al. (2002年) Proc Natl Acad Sci U.S.A.  99(16):10617-10622を参考)などのモデルもあります。ヒト再生不良性貧血のモデルには、鋼マウスが利用されています(例えば、Jones, (1983年) Exp. Hematol., 11:571-580を参考)。貧血向けの動物モデルには、溶血性貧血モルモット肺過敏性のマウスモデル(例えば、Schreiber, et al. (1972年) J. Clin. Invest. 51:575を参考)などのモデルもあります。好中球減少症向けの動物モデルには、好中球減少症の好中球減少性ＣＤラット(例えば、Nohynek et al. (1997年) Cancer Chemother. Pharmacol. 39:259-266を参考)などのモデルもあります。
【０６１５】
8.製造品/キット
選択された抗体あるいは選択された抗体をエンコードする核酸を含む医薬品、またはそれによる派生物あるいは生物学的に活性のある部分は、製造品として包装され、包装材、および疾患や障害の治療に効果がある医薬組成物、および選択された抗体あるいは核酸分子が該当する疾患あるいは障害の治療に使用できることを表示するラベルを含むべきです。
【０６１６】
本書で取り上げられる製造品は包装材を含みます。医薬品に使用される包装材は当業者によく知られているものです。たとえば、米国特許5323907号、5052558号および5033252号を参考。それぞれは本書で全体的に取り上げています。医薬品包装材の例としては、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、小瓶、容器、注射器、ボトル、および選択された処方、投与と治療方法に適切な包装材なども挙げられます。本書で取り上げられる医学品や組成物の多様な処方は、いかなるEPO媒介性疾患あるいは障害、または治療ポリペプチド媒介性疾患あるいは障害の選択的な治療法として認められています。
【０６１７】
抗体および抗体をエンコードする核酸分子はキットとして提供されます。キットにはここで説明された医薬組成物、および投与物を１つ含むキットもあります。たとえば、選択された抗体は、注射、吸入器、投与カップ、点滴器、または塗布器などの投与器具と一緒にキットとして提供される場合もあります。また、選択の上、キットは、用量、投与方式・方法に関する使用方法などの説明書を含む場合もあります。キットにはここで説明された医薬組成物、および診断道具を含むキットもあります。たとえば、キットは生体内の抗体の濃度、量、あるいは活性を測定する道具と一緒に提供される場合もあります。
【０６１８】
9.  抗体およびポリペプチドの調合/投与および用法
ここで取り上げられる抗体は投与のために調合される場合があります。活性成分は単独で投与できるにもかかわらず、調合は医薬製剤として提示する方が好ましいです。製剤は少なくとも1つの活性成分、また１つあるいは複数の適切な担体を含みます。各担体は、他の成分と適合性があり患者に薬学的にも生理学的にも害を与えない物でなければなりません。製剤には、経口投与、経鼻投与、直腸投与、または非経口投与（皮下投与、筋内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む）に相応しい物があります。製剤は状況によって単位剤形で提示され薬学分野で知られている方法調製されます。例えば、Gilman, et al. (eds. 1990年) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press 、および Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990年), マック出版社., Easton, Pa. 、Avis, et al. (eds. 1993年) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY 、Lieberman, et al. (eds. 1990年) Pharmaceutical Dosage Forms:  Tablets Dekker, NY 、およびLieberman, et al. (eds. 1990年) Pharmaceutical Dosage Forms:  Disperse Systems Dekker, NY.を参考。 
【０６１９】
抗体の投与の経路は、当分野で知られている方法に従うが、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入、または病巣内経路、局部または下記の持続放出性システムなどの投与方法があります。抗体は、なるべく注入またはボーラス注射によって継続的に投与されます。抗体は局部投与または全身投与で投与できます。
【０６２０】
ここで取り上げられる抗体は薬剤分野で認められる担体との混合物で調合される場合があります。この製剤の調合、投与の方法に関しては”Remington's Pharmaceutical Sciences”、マック出版社、Easton, Pa. 最新版を参照。この治療組成物はなるべく液体あるいは粉体エアゾール（凍結乾燥）の形で、静脈内経路、経鼻、あるいは経肺で投与できます。そして、この組成物は非経口、または皮下など、希望の経路で投与できます。体系的に投与される場合、治療組成物は消毒された状態、ピロゲンなし、または非経口で投与できる、ｐＨや等張性や安定性に適した水薬でなければなりません。これらの条件は当業者に知られているものです。
【０６２１】
治療製剤は多くの従来の投与量処方で投与できます。簡単に言えば、ここで取り上げられる抗体の製剤は、生理学的に認められる担体、賦形剤、あるいは安定剤と混合し希望の精度を持たせ、投与あるいは保管するために調合されます。このような材料は、指定された投与量および濃度で被投与者にいかなる害を与えることなく、また次の要素を含めます：トリス塩酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸塩、およびその他の有機酸塩などの緩衝剤、および/またはアスコルビン酸などの抗酸化剤、および/またはポリアルギニンなどの低分子量（約10残基未満）ペプチド、および/または血清アルブミン、ゼラチン、あるいは免疫グロブリンなどのタンパク質、および/またはポリビニルピロリドン;などの親水性ポリマー、および/またはグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはアルギニンなどのアミノ酸、および/または単糖類、二糖類、およびセルロースあるいはそれに由来する派生物を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、あるいはデキストリン、および/またはEDTAなどのキレート剤、および/またはマンニトールあるいはソルビトールなどの糖アルコール、および/またはナトリウムなどの対イオン、および/またはＴＷＥＥＮ、PLURONICS、あるいはポリエチレングリコールなどの非イオン性表面活性剤など。
【０６２２】
インビボで投与される場合、抗体製剤は消毒するべきで、従来の方法で調合することができます。これは、消毒された濾過膜の濾過作用のおかげで、凍結乾燥の前後を問わず、容易に行うことができます。抗体は通常、凍結乾燥状態あるいは液剤として保管されます。ゴマ、ピーナツなどのような自然発生油、または綿実油あるいはオレイン酸エチルなどのような合成脂肪酸賦形剤、あるいはそれに類似する物が望ましいです。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などの添加剤は医薬分野で認められる方法で添加できます。
【０６２３】
医薬組成物は、合理的に設計され目的達成のために適切な量で添加された抗体を含んで初めて利用可能になります。当業者は特に本書で公開された詳細を踏まえて、治療に有効な量を測定能力があります。治療的に有効な用量は、インビボやインビトロを利用することによって測定できます。
【０６２４】
治療的に効果のある抗体の量は、例えば、治療目的、投与経路、患者の状態などによります。また、主治医は、疾患の種類や深刻度、体重、性別、食事習慣、投与の経路や時間、併用の薬剤、およびその他の関連する臨床的因子など、様々な要因を考慮しながら薬の作用を変更するができます。したがって、セラピストは最適な治療効果を得るために、投与量を調整し、必要に応じて投与経路を変更する場合もあります。臨床医は通常、希望の効果を生み出す投与量が決まるまで抗体の投与を続けます。この治療の進行は従来の分析によって監視されます。
【０６２５】
ペプチドを含むいかなる抗体に関しては、治療に有効な投与量は細胞培養分析によって事前に推定できます。たとえば、動物モデルでは用量は、細胞培養で指定されるEC50値を含む血中濃度領域を生みさすように処方されます（例えば、細胞の増殖や分化を促進または阻害する試験分子の濃度）。このような情報を踏まえて、人体に効果的な用量をより正確に決定することができます。
【０６２６】
ここで取り上げられる抗体分子の毒性および治療効果性は、細胞培養あるいは実験動物において医学の標準的な方式によって決定されるが、例えば、LD50値（人口５０％に対する致死量）やED50値（人口５０％に治療効果のある用量）を測定する場合。毒性と治療効果性の比率は治療指数と言い、LD50値とED50値の比率として説明することもできます。より高い治療指数を表す分子の方が望ましいです。この細胞培養分析および動物実験から得られたデータはヒト用量の範囲を測定するために利用されます。このような分子の投与量は、ED50値と小量あるいはゼロ毒性を含む血中濃度の範囲内にあります。投与量は範囲内で投与の方法や経路によって変動します。医師は患者の状態に基づいて正確な製剤、投与経路、および投与量を決定することができます。(例えば、Fingl et al., 1975年, “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1, p.1を参考)。
【０６２７】
投与の量と間隔は、細胞の増殖、分化、あるいは最小有効濃度（MEC）を促進あるいは抑制する十分な抗体の血漿中濃度を生み出すために個別に調整することができます。MECは各抗体によって異なりますが、説明された分析によってインビトロデータから推定できます。ＭＥＣを生み出すに必要な投与量は個別の特徴および投与経路によります。しかし、HPLCアッセイまたはバイオアッセイによって血漿中濃度を測定することができます。
【０６２８】
投与間隔もMEC値によって測定できます。抗体分子を投与する制度では血漿中濃度が期間の10〜90％の間にＭＥＣ値を上回るが、これは普通30〜90％の間、また最も一般的に50〜90％の間です。
【０６２９】
局部投与または選択的取り込みの場合、抗体の効果的な局部濃度は血漿中濃度に関連していないものとします。
1日投与量は以上の条件によって一般的に、１μ/kg〜1000 mg/kg以上です。臨床医は通常、希望の効果を生み出す投与量が決まるまで分子の投与を続けます。この治療の進行は従来の分析によって監視されます。
【０６３０】
定期的で複数の投与、あるいは継続的な注入によって患者に投与する可能な投与量に関しては、疾患の種類や深刻度によって、例えば、拮抗薬、あるいはアゴニスト抗体の約0.001 mg / kg〜約1000 mg/kgまで、もっと一般的に約0.01 mg〜100 mg/kgまで、もっと一般的に約0.010〜20 mg/kgまでの用量は初期的な投与に勧められます。数日間あるいは長い期間かけて投与する場合、病状によって、治療は症状が抑制されるまで、あるいは患者が望ましく改善するまで繰り返されます。しかし、他の投薬計画も認められます。
【０６３１】
H.例示
次の例は、例示だけで、本発明の範囲を限定するものではありません。
【０６３２】
例１
材料と方法
1.プラスミドＡおよびC
【０６３３】
図3〜6に挙げられるプラスミドA（配列番号：1）、プラスミドC（配列番号：3）、プラスミドＤ（配列番号：２）、およびプラスミドE（配列番号：4）は、組換えFab抗体を生成するのに使用されます。このプラスミドはE. coliと適合性のある高コピー、ColE1複製起点を含みます。また、プラスミドAとDのColE1複製起点はプラスミドＣとＥのColE1複製起点と適合性があります。さらに、同じE. coli細胞で培養されると同様のコピー数で複製されます。プラスミドは、Fabをペリプラズムに移動させ、より優れた折りたたみ機能を生み出すSTIIリーダー配列、並びにアラビノース誘導性遺伝子発現向けのアラ・プロモーターを含みます。プラスミドAはＦａｂ重鎖の生成向けの重鎖定常領域、およびタンパク質の純化に向けたFlagとHisタグを含みます。プラスミドＤはＦａｂ重鎖の生成向けの重鎖定常領域、並びにタンパク質の純化およびタンパク質のリガーゼやソルターゼを利用する部位特異的修飾に向けたFlag、LPETG、およびHisタグを含みます。プラスミドＣはカッパＦａｂ軽鎖の生成に向けたカッパ軽鎖定常領域を、プラスミドＥはラムダＦａｂ軽鎖の生成に向けたラムダ軽鎖定常領域を含みます。したがって、プラスミドAとDはFab重鎖を、プラスミドCとEはFab軽鎖をエンコードします。Fabは、E. coli が重鎖をエンコードするプラスミドおよび軽鎖をエンコードするプラスミドとの同時形質転換、および重鎖や軽鎖の遺伝子発現のプロモーターの誘導の上で生成されます。
【０６３４】
2.細胞株
E. coli のBL21株(EMD Biosciences) およびLMG194株 (ATCC)はＦａｂの発現に使用されました。RamosBリンパ球細胞（ATCC）およびJurkat Tリンパ球細胞（ATCC）はアポ- ONE相同性カスパーゼ-3 / 7アッセイに使用されました。BaF3マウス末梢血細胞株（Harvey Lodish、マサチューセッツ工科大学）はEPO Ｆａｂライブラリー細胞に基づいたアッセイに使用されました。 
【０６３５】
3.DNA 配列編集ソフトウェア
DNA 配列編集ソフトウェアここで挙げられます。   抗体の生殖細胞系の活性を維持しながら、重鎖V, D, およびJセグメント配列、また軽鎖V およびJセグメントを組み換えるインシリコの方法を導入ソフトウェアです。本ソフトウェアは、組織的にVH, DH および JH および VL および JL生殖細胞系セグメントをエンコードするDNA、あるいはVH, DH および JH および VL および JL生殖細胞系セグメントのサブセット組み合わせ、Ｆａｂライブラリー作成向けの核酸分子の生成のために、組み換え重鎖や軽鎖の可変領域の配列を生み出します。生殖細胞系セグメントはデータベースから入力されます。例２はソフトウェアの説明です。例3は、ソフトウェアの使用方法、例4は、組み換え生殖細胞系配列を編集しDNA合成に使われる配列を出力する説明です。
【０６３６】
4.Piccolo（TM）自動化システム
Piccolo（TM）システムは完全に自動化されたシステムで、”The Automation Partnership” （TAP）によって販売されています(例えば、システムを説明するWollerton et al. (2006年) JALA, 11:291-303を参考)。本システムは細胞培養、自動化収穫、溶解、および純化機を組み合わせるシステムです。例9は、Piccolo（TM）のシステム運用を詳しく説明します。
【０６３７】
例2
DNA 配列編集ソフトウェアデザイン
この例ではDNA 配列編集ソフトウェアについて説明します。 
【０６３８】
A.概要
VH, DH および JH および VL および JL 生殖細胞系セグメントに関しては、配列は例えばSequenceDatabase.txtなどのデータベースファイルを利用して入力されます。ソフトウェアの機能は、1）VH, DH および JH および VL および JLのいかなる可能な組み換えを生成し、可変重（VH）鎖、および可変軽（VＬ）鎖をエンコードする配列を生成すること、2）配列を翻訳、フレームチェックを行うこと、3）配列をSequenceHistory.txtファイルに保存し、ヌクレオチドフォーマットによる配列追跡を可能にすること、および、４）ＤＮＡ合成に向けて整列された９６ウェルのプレートを代表するファイルとして配列を出力することです。出力は様々な重鎖や軽鎖配列を整列として表示する96ウェルプレートファイルの形で出され、また、整列の各遺伝子座に相当する96ウェルプの各レートが指定されます。この出力に基づいてDNA分子は96ウェルプレートで合成されます。加えて、ソフトウェアは配列に順序を付け、多様のスコアを出すことができます。ソフトウェアは自動的にVH鎖とVL鎖（カッパ及びラムダ）をエンコードする組換え核酸配列のいかなる順列を生成します。ユーザーは必要に応じて、ソフトウェアが組み換える生殖細胞系セグメントを予めに選択すること、あるいは順序付け機能を利用して十分に異なる配列を選択することによって、出力ファイルを手動で制限することができます。
【０６３９】
B.ソフトウェアの説明
【０６４０】
DNA配列編集ソフトウェアは、ビジュアルスタディオ（Visual Studio）2005年Professional版開発ツールを使用してC＃プログラミング言語で作られています。DNA配列コンパイルソフトウェアは、Windows XPおよびVistaの32ビット版のオペレーティングシステムでMicrosoft .NET frameworkを実行する必要があります。ソフトウェアは、10モジュールで構成されています（図7を参考）。このモジュールには、本書で挙げられる（a）多様性コンバーターへのBLAST、（b）DNA配列編集GUI、（c）DNA配列編集コントロール、（d）DNA配列編集ルール、および（e）DNA配列編集テストなどがあります。他の５モジュールはパブリックドメインソフトウェアから入手できます。それらは（ｆ）Ｎユニット、（ｇ）フォフォーマットｄｂ、（h）BLAST、（i）ＢＬＡＳＴClust、および（j）XPエクスプローラーバーです。  
【０６４１】
モジュールにはクラスがあります。クラスはオブジェクトの正式的な定義です。クラスは、実行時にオブジェクトの実例が作成されるテンプレートとして機能します。クラスはオブジェクトのプロパティ、およびその動作を制御する方法を特定します。シングルトンクラスは、グローバルに、他のすべてのクラスによってアクセスできるクラスです。この場合、シングルトンクラスは、配列編集に関するあらゆるルールを持つ配列編集モジュルです。静的クラスは、クラスの実例を作成しなくてもアクセスできる機能およびデータを含みます。静的なクラスメンバーは特定のオブジェクトに特有のデータや動作の分類に使用することができます。オブジェクトに変更があっても、このデータや機能は変更しません。  
【０６４２】
また、ソフトウェアは4層に分類されます：1）グラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）、2）GUIコントロール、3）編集のルール、4）NCBIツールです。4層は、
GUI - GUIは、コンピューターオペレータへの情報提示、あるいはコンピューターオペレータとの相互作用です。GUIは多様のコンバーターへのBLAST、DNA配列編集GUI、およびNユニットで構成されています。  
GUIコントロール -ＧＵＩに再使用されるGUIカスタム表示Windowsコントロール。GUIコントロールはＸＰエクスプローラーバー、およびDNA配列編集コントロールで構成されています。  
編集ルール - ＤＮＡ配列編集ルールの導入。編集ルールはDNA配列編集ルール、およびDNA配列編集ルールテストで構成されています。
NCBIツール - NCBIで入手可能、ローカルコンピュータでの検索を可能にするツールのセットです。 
【０６４３】
1.モジュール
a.DNA配列編集GUI
DNA 配列編集ＧＵＩは主なアプリケーションです。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。ＤＮＡ配列編集ＧＵＩは全体的に、配列編集に使われる生殖細胞系セグメントを選択し制限すること、全ての配列を自動的に編集すること、配列多様性、クラスタ、あるいは類似性に基づいて全ての配列に順序を付けること、および96ウェルプレートに配置する編集ＤＮＡ配列を選択することを可能にします。 
DNA 配列編集ＧＵＩは次のクラスに分けられます： 
Program (プログラム) - アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。 
SplashScreen （スプラッシュ画面） -アプリケーションの起動時、終了時にスプラッシュ画面を表示するユーザーコントロールです。 
MainForm (メインフォーム)−ユーザーに利用可能な機能を全て包括する形態です。MainFormはまた、DNA配列編集コントロールモジュルに導入されたユーザーコントロールを表示したり、DNA配列編集規則モジュールで定義された配列編集シングルトンを初期化します。  
【０６４４】
Release （リソース） -スプラッシュ画面の画像を表示するリソースファイル。 
設定 - 自動的に生成されたクラスで、5'制限部位および3'制限部位に関するユーザー設定を含むが、この制限部位はIDT整列を完成するために配列と配置されます。 
AboutBox（オートボックス） - アプリケーションの情報をユーザーに表示する形態です。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。  
a.DNA配列編集コントロール
【０６４５】
DNA配列編集コントロールモジュールは、GUIで使用されるウィンドウカスタムコントロールを含みます。次のクラスが含まれます：
FabrusDataGridView - .NET フレームワーク DataGridViewの導出クラスで、列のヘッダーに列号を表示します。.NETフレームワークはWindowsオペレーティングシステムの一部で、一般的なプログラミング問題に対する既定のソリューションの大規模なライブラリーを提供するほか、フレームワーク専用のプログラム実行を管理します。DataGridViewコントロールは、カスタマイズ可能なデータ表示テーブルを提供します。 
【０６４６】
WellPlateControl（ウェルプレートコントロール） - ９６ウェルプレートの情報を表示するカスタムコントロールです。 
AutoHeavySequenceControl（自動重配列コントロール） - 自動的に編集されたＤＮＡ配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが96ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、V（D）J配列の識別子、およびDNA配列タンパク質配列も表示できます。
AutoLightSequenceControl（自動軽配列コントロール） - 自動的に編集されたＤＮＡ配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが96ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、V（D）J配列の識別子、およびDNA配列タンパク質配列も表示できます。
ManualHeavySequenceControl（手動重配列コントロール） - 重鎖DNA配列を編集するためにVH, DH および JHの配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
ManualHeavySequenceControl（手動軽配列コントロール） - 重鎖DNA配列を編集するためにVH, DH および JHの配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
LightSequenceBlastForm（軽配列BLAST形態） -他の軽鎖に対して軽配列のBLAST結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。
HeavySequenceBlastForm（重配列BLAST形態） -他の重鎖に対して重配列のBLAST結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。
【０６４７】
c.  DNA配列編集規則モジュール 
DNA配列編集規則モジュールは、ＤＮＡ配列編集向けのビジネスロジックを包括します。このモジュールは、編集、接合部の生成、終止コドン除去、および配列順位付けを含み、機能的かつ組み換えVDJ およびVJ抗体配列編集の規則を包括します。
【０６４８】
DNA配列コンパイルモジュールでは、主に6つのクラスがあります：
SequenceCompiler はＤＮＡ配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、V（D）J配列、およびその関連情報から、組み合わせＤＮＡ配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。
BlastTable は多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のBLAST検索を行います。 
SequenceHistorian はDNA合成会社が注文したＤＮＡ配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです(例えば、IDT, Genscript, Invitrogen, およびそれに類似するものです)。SequenceHistory.txtというファイルで持続が可能だが、このファイルはDNA合成会社が注文したＤＮＡの全ての配列をヌクレオチドフォーマットで追跡を続けます。 
SequenceContainer は全てのV(D)J配列情報と制限部位をSequencesDatabase.txtテキストファイルで記載された通りに保存するクラスです。
DnaSequence はHeavyChainDnaSequenceおよびLightChainDnaSequenceクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。
WellPlate_8x12 は９６ウェルプレートを模倣するクラスです。DNA配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。
加えて、DNA配列編集規則には３つの補充クラスがあります：
CodonUsageTable はE. coli K12向けのコドン使用表を包括するクラスです。
Translator は６４のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。
【０６４９】
ProtoParam はGRAVY値を計算する静的クラスです。
次はＤＮＡ配列編集規則モジュールの主要な6つのクラス(i-vi)、および補充の３つのクラス(vii-ix)をそれぞれ分析したものです。
【０６５０】
i. SequenceCompiler (配列編集機能)
SequenceCompiler はＤＮＡ配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、V（D）J配列、およびその関連情報から、組み合わせＤＮＡ配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。SequenceCompilerには次の機能があります。
【０６５１】
1) 自動的ＤＮＡ配列編集向けのアルゴリズム
SequenceCompilerは図8に示されるアルゴリズムを使用し、軽鎖および重鎖の全ての可能なV(D)J配列の組み合わせを計算することによって、編集された配列を生み出します。アルゴリズムはただ、軽鎖および重鎖の全ての可能なV(D)J配列の組み合わせを計算することに同等です。
たとえば、VHが３つ、DHが３つ、およびJHが３つの配列がある場合、アルゴリズムは3*3*3のコンビを計算し、可能な２７コンビを生み出します。同様に、VKが4つ、およびJKが４つの配列がある場合、アルゴリズムは4*4のコンビを計算し、可能な16コンビを生み出します。加えて、アルゴリズムはラムダ軽鎖、およびカッパ軽鎖を別々で計算します。
【０６５２】
2) 配列編集
【０６５３】
実際の配列編集にあたってはまず、SequenceDatabase.txtファイルから、重鎖および軽鎖向けのVH、DH、およびJH配列、またはVL およびJL配列をそれぞれ特定することは第一歩です。個々のセグメントは例4に説明された通りに特定されます。個々のセグメントが特定された後で、V(D)J接合部が生成され、ヌクレオチドの部分（セグメントと結合部）が結合され、配列は編集されます（図9を参考）。接合部の生成、終止コドンの除去、および制限部位に関する規則は、”V(D)J接合部生成”、”終止コドンの除去”、および”コドン使用テーブル”セクションのヘッディングの下に記載されています。
【０６５４】
3) V(D)J 接合部の生成
個々のV(D)J配列の間の組み換え配列の接合部は、結果の配列がインフレームになるように選択されます。SequenceCompilerは以下の３つの規則によってリーディングフレームを特定します。 
【０６５５】
1.V配列は常にリーディングフレーム１です。
2.Ｄ配列は最も負のGRAVY（疎水性総平均）を生み出すフレームを持っています。
3.Ｊ配列はSequenceDatabase.txtで指定されたようなリーディングフレームを持っています（例4.1”V(D)J配列データベースファイル作成”で説明されるように、Ｊ配列はリーディングフレームの特定のために３つのコドンで表示されます。表１３も参考）。
【０６５６】
以上の規則に基づいて、いずれもの配列の塩基を組み換えるだけでコドンが配列の間の接合部で自動的に生成されるわけではありません。   SequenceCompilerは新しいコドンを生成するために、表19に記載されている規則に従います。たとえば、Ｖ配列がリーディングフレーム１、およびＪ配列がリーディングフレーム２にあるという軽鎖V-J接合部を作成する時に、”G”ヌクレオチドがV-J接合部の真ん中に挿入され、セグメント全体のリーディングフレームを保ちます。
【０６５７】
【表１９】
2016127850.tif 000163
【０６５８】
4)  終止コドンの除去
場合によって、V(D)J接合部の生成は終止コドン(TAA, TAG あるいは TGA)を生み出す場合があります。SequenceCompilerは次の規則に従って、有害な終止コドンを除去し、終止コドンをエンコードするヌクレオチドは指定された新しいコドンに置き換えられます： 
2016127850.tif 000164
SequenceCompilerはV(D)J接合部生成、および終止コドン除去の完了した後で、タンパク質配列は完成で機能的です。  
【０６５９】
5) 配列に順位を付けるアルゴリズム
一度配列が編集された後で、各配列が順位づけられ、最高多様性から最低多様性の順番でユーザーに例示されます（表20、図17、図19を参考）。このような配列のランキング表示のおかげで、ユーザーは色々な選択肢から96ウェルプレートの注文書ファイルに配列を選ぶことができます。ユーザーは最も多様な配列、または最も類似性のある配列を選択することができます。  
【０６６０】
ソフトウェアは配列の多様性のスコアとクラスタ番号情報によって、編集された配列に順位をつけます。多様性のスコアは、セクションB.1.eに記載された通りに多様性コンバーターへのBLASTによって、また、クラスタ情報は、B.1.i.に記載された通りにBLASTClustによって生成されます。配列順位のアルゴリズムの流れ図は図10にあります。アルゴリズムは、各クラスターから最も低い多様性のスコアの配列を選び出し、その配列を多様性に基づいて最も低いから最も高い多様性（低い多様性スコアは低い類似性ということで、最も高い多様性を表している）の順番で並べ、その順番に従って配列に順位を付け、その配列をそれぞれのクラスターから削除し、そして全ての配列が順位付けられるまでこのプロセスを繰り返します。 
【０６６１】
アルゴリズムによる順位付けの例は表20にあります。表の配列は最も高いから最も低い多様性の順番で並べてあります。最も多様性の低いスコアの配列は最も高い多様性を表し１位にあります。2番目の配列は同じクラスターに属しているが、64位にあります。配列001および配列002は両方39クラスターにあり、多様性スコアで連続しているので、ユーザーはこのデータを踏まえて特定されたクラスタが合計で６３があると分かります。
【０６６２】
【表２０】
2016127850.tif 000165
【０６６３】
ii.BlastTable  （ＢＬＡＳＴ表）
BlastTable は多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のBLAST検索を行います。 
【０６６４】
iii.SequenceHistorian  （配列歴史）
SequenceHistorian はDNA合成会社が注文したＤＮＡ配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです。SequenceHistory.txt というファイルで持続が可能です。
【０６６５】
iv.SequenceContainer  （配列コンテナ）
SequenceContainerはテキストファイルからV（D）J配列、および制限部位を読み込み、そして、手動でまたは自動的な編集のための将来の検索に向けてメモリーに保存します。
【０６６６】
v.  DnaSequence  （ＤＮＡ配列）
DnaSequence はHeavyChainDnaSequenceおよびLightChainDnaSequenceクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。HeavyChainDnaSequenceとLightChainDnaSequenceクラスの唯一相違点は、配列を編集する方式にあるが、これは各クラスのコンストラクターに実装されています。 
各クラスには、フィールド、プロパティ、およびメソッドがあります。加えて、親DnaSequenceクラスはイベントやネストタイプを含みます。したがって、DnaSequenceは重鎖および軽鎖配列に共通されるすべての機能を実装しています。これには、アミノ酸、クラスター、DiversityScore（多様性スコア）、_SEQ_ID（配列ＩＤ）、名前、注意項目、ヌクレオチド、順位、およびRestrictionSites（制御部位）などのフィールド、並びに制限部位の除去、終止コドンの除去、および制限部位のサイレンシングなどののメソッドがあります。HeavyChainDnaSequenceクラスは、VH, JH と DH配列、VH-JH と JH-DHの接合部、およびVH-JH と JH-DH接合部を生成するメソッドを含みます。LightChainDnaSequenceクラスは、VL と JL配列、VL-JL接合部、およびVL-JL接合部を生成するメソッドのフィールドを含みます。
【０６６７】
vi.WellPlate_8x12  （ウェルプレート_8x12）
WellPlate_8x12 は９６ウェルプレートを模倣するクラスです。DNA配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。
【０６６８】
Vii  CodonUsageTable  （コドン使用表）
CodonUsageTable はE. coli K12向けのコドン使用表を包括するクラスです。ソフトウェアはCodonUsageTableを利用し、リーディングフレームの問題を解決したり、制限部位サイレンシングを解除したりできます。ソフトウェアは希望のプラスミドにＤＮＡを挿入するのに使用される制限部位を特定するように設定されています。DNA配列で制限部位が特定されると、ソフトウェアは適切なアミノ酸配列を維持しながら、不要な制限部位を修正するためにヌクレオチド配列を変更します。上記のコドン重複性はコドンを変更するためです。コドンの変更によって、新しく使用された可能なコドンの使用頻度を有利に増加させることができます。また、コドンの1番、2番目の塩基を変更するより、コドンの最後の塩基を変更する方が望ましいです。  
【０６６９】
viii.Translator  （翻訳機能）
Translator は６４のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。  
【０６７０】
【表２０】
2016127850.tif 000166
【０６７１】
ix.ProtoParam
ProtoParamはＧＲＡＶＹ値を計算する静的クラスです。特定のペプチドあるいはタンパクに対するＧＲＡＶＹ（疎水性総平均）値は、全てのアミノ酸の疎水性を足し配列内の塩基数で割って計算されます。基本的には、ＧＲＡＶＹ値はタンパク質の疎水性残基の相対的な値です。V(D)J接合部生成ソフトウェアは、Ｄ配列のリーディングフレームを計算する時にこの情報を使用します。このリーディングフレームは最も負のＧＲＡＶＹ値で決定されます。  
【０６７２】
【表２１】
2016127850.tif 000167
【０６７３】
d.DNA配列編集規則テストモジュール 
DNA配列編集規則テストモジュールは、自動化されたN単体の複数のテストで、各クラスの単体テストを実行します。このテストによって、個々のモジュールとクラスが正常に動作していることを確認できます。9つのクラスは： 
BlastTableTest;
CodonUsageTableTest; 
HeavyChainDnaSequenceTester;
LightChainDnaSequenceTester;
ProtoParamTest; 
SequenceCompilerTest, 
SequenceContainerTest; 
TranslatorTest; and
TranslatorWrapper.
【０６７４】
e.多様性コンバーターへのBLASTモジュール
多様性コンバーターへのBLASTは、BLASTの出力ファイルによって多様性のスコアを出力できるプログラムです。5つクラスを含みます：
Ｐｒｏｇｒａｍ（プログラム） - アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。
Main Form（メインフォーム） − オペレーターが変更するファイルを選択する時に押すボタンです。
リソース - デフォルトで作成される空のファイルリソースです。
設定 - ユーザの設定を記録する、自動的に生成されたクラスです。
【０６７５】
BlastConverter（BLASTコンバーター） - BLAST出力ファイルを多様性スコアファイルへの変換実装を含むクラスです。  
【０６７６】
i.BLASTコンバーターアルゴリズム
BLASTコンバーターアルゴリズムはBLAST出力ファイルで次の方程式を行い配列多様性スコアを計算します。
【０６７７】
【数１】
2016127850.tif 000168
このアルゴリズムは、個々のBLAST数を、２乗し、その２乗を足し、サンプル（N）の数で規格化し、そして平方根を求めることによって、ＢＬＡＳＴスコアの標準偏差を計算します。
【０６７８】
たとえば、配列多様性スコアは次のBLAST出力ファイルでアルゴリズムを行うことによって計算されました（-m 9BLASTスウィッチ、例えば、コメントライン付き表、配列ビューオプション、B.1.hを参考）。
2016127850.tif 000169
【０６７９】
それぞれの可変鎖配列の多様性スコアを出す次の出力ファイルは生成されます。最も低い多様性スコアは配列と次の最も類似性のある配列との間の類似性を表し、また最も高い多様性を持っています。 
2016127850.tif 000170
【０６８０】
f.Ｎ単体
N単体はすべての.Net言語向けの単体テストフレームワークです。N単体テストツールは、オブジェクトモデルをテストする手段の１つで、そのアプリケーションとロジックが正常に動作する限り、有用なツールです。当初はＪ単体から移植されたが、現在の2.4.2バージョンの発売はMicrosoft .NET向けのx単体ベーステストツールの５番目重要です。完全にC＃で書き込まれました。また、例えば、カスタム属性、およびその他に関連する機能など、様々な.NET言語特徴を取り入れるように再設計されました。N単体はｘ単体をすべての.Net言語に取り入れます。Ｎ単体はＮ単体機関から公衆に無料で公開されています。
【０６８１】
g.  Formatdb
Formatdbは、タンパク質あるいはヌクレオチドのデータベースがblastall, blastpgp あるいは MegaBLASTに検索される前に、そのソースデータベースをフォーマットするために利用されます。ソースデータベースは、FASTAあるいはASN.1形式です。ソースデータベースがformatdbによってフォーマットされたら、BLASTに必要ではなくなります。 
次のコマンドラインオプションはformatdbで出力ファイルを生成する時に利用されます。 
-iフォーマットのファイルを入力
-pファイルの種類 (T − タンパク質、F − ヌクレオチド、デフォルト= T)
-o構文解析オプション
T − 正しい：構文解析配列IDおよびインデックス作成
F − 正しくない：ＩＤの構文解析を行わないインデックスを作成しない
現在、win32-ia32 (2.2.17)バージョンが使われています。Formatdbは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。  
h.  基本的局所配列検索ツール(BLAST)
基本的局所配列検索ツール(BLAST)は、なローカル配列検索ツールは、配列間の局所類似の領域を検索します。このプログラムは、ヌクレオチドあるいはタンパク質の配列を配列データベースと対比し、一致件数の統計的有意性を計ります。BLASTは配列の間で機能的または進化的関係を推測するだけでなく、遺伝子族メンバーの特定にも貢献します。  
次のコマンドラインオプションはblastallで出力ファイルを生成する時に利用されます。 
-pプログラム名 (“blastp”, “blastn”, “blastx”, “tblastn”, あるいは “tblastx”)
-dデータベース
-Iクエリ―ファイル
-oBLAST レポート出力ファイル
-m配列ビューオプション （0 =デフォルト、9 =コメントライン付き表）
-b(B) [Integer]の配列を表示するデータベース配列番号。
現在、win32-ia32 (2.2.17)バージョンが使われています。ＢＬＡＳＴは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。  
【０６８２】
i.BLASTClust
BLASTClustは、タンパク質またはヌクレオチドの配列をクラスターにするためのスタンドアローンBLASTパッケージ内のプログラムの１つです。このプログラムは対マッチで始まり、特定の配列はクラスター内の少なくとも1つの配列と一致する場合、クラスタ内に取り入れられます。ヌクレオチド配列の場合は、Megablastアルゴリズム、タンパク質の場合は、blastpアルゴリズムを利用し、対マッチを計算します。  
最も簡単な例ではBLASTClustは入力として、連結FASTA形式の配列を含むファイルを利用し、各配列は定義線の先頭に特有の識別子を持っています。BLASTClustは入力配列をフォーマットし、一時的BLASTデータベースを作成し、クラスタリングを実行し、そして完了時にデータベースを削除します。したがって、BLASTClustを使用する前に予めにformatdbを実行する必要はありません。BLASTClust出力は、１本線当たりに１つのクラスターが付いた、スペースで区切られた配列識別子のファイルです。クラスターは最大から最小への順番で分別されています。  
次のコマンドラインオプションはblastclustで出力ファイルを生成する時に利用されます。
-d配列データベース名
-oクラスターリストを保存する出力ファイル
-S類似性境界
もし ＜3の場合は、境界はBLASTスコア濃度(0.0〜0.3、デフォルト = 1.75)に設定されます。
もし ＞3の場合は、境界は同一の残基のパーセンテージ(3〜100)で設定されます。 
現在、win32-ia32 (2.2.17)バージョンが使われています。BLASTClustは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。
【０６８３】
j.XPExplorerBar
XPExplorerBarは完全にカストム可能なWindows XP式エキスプローラ―バーで、Windows XPテーマや動画を使った拡大/縮小機能をサポートします。XPエクスプローラバーはパブリックドメインソフトウェアとして無料で入手可能です。
【０６８４】
例3
配列データベース
DNA配列編集ソフトウェアは、配列情報が記録されたファイルが必要で、このファイルを利用して配列編集規則に従って配列編集を実行することができます。このファイルはSequenceDatabase.txtです。全ての組み換え配列はファイル内のは例つデータから生み出されます。したがってファイルは、ソフトウェアが配列編集の実行に使用するすべての配列を含みます。たとえば、ファイルは希望の生殖細胞系セグメント向けのヌクレオチド配列、および制限酵素向けのヌクレオチド認識配列を含みます。データベース内の配列にはあらゆる既知配列が含まれ、また、配列は随時手動で更新することができます。ヒト由来のV、D、およびJ抗体生殖細胞系配列は、NCBI IgBLASTデータベース（国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能）、および国際免疫遺伝情報システム（IMGT）から得られたもので、配列データベースファイルに入力されました。データベースファイルは配列編集ソフトウェアに入力ファイルとして提供されます。
SequenceDatabast.txtファイルのフォーマットは図11で例示されています。SequencesDatabase.txtファイルは次の規則に従って手動で新しい配列を追加するだけで更新できます：
・      すべての配列はFASTA形式で指定するべきです。
・      Jの配列に３文字コドンを指定するべきです。
・      すべての配列の間に”空線”を引くべきです。
・      // は無関係なコメントのある線の先頭に記すべきです。
・セクションのタイトルは次の通りに示すべきです：
o         [VH] − 続きのVH 配列リスト：
o         [DH] − 続きのDH 配列リスト：
o         [JH] − 続きのJH 配列リスト：
o         [VK] − 続きのVK 配列リスト：
o         [JK] − 続きのJK 配列リスト：
o         [VL] − 続きのVL 配列リスト：
o         [JL] − 続きのJL 配列リスト：
o         [Restriction Sites] − 続きの制限部位リスト：
【０６８５】
例4
重鎖と軽鎖ＤＮＡファイル作成、および順位分析
【０６８６】
この例では、DNA配列編集ソフトウェアで使用される組み換え重鎖および軽鎖配列ファイルを作成する方法について説明します。ファイルはソフトウェアがインストールされた直後に作成されました。ファイルは、データベース内の配列の多様性やクラスターに関する情報を計算するために、SequenceDatabase.txtファイルから作成され、NCBIのformatdb、BLAST、およびBLASTclustなどのパブリックドメインソフトウェアによって分析されています。ソフトウェアの順位付け機能は自動的だが、ユーザーはこの機能を任意に利用し、ＤＮＡ合成に使われる配列に順位を付け、選択や並べることができるようにします。
【０６８７】
配列ファイルを作成する前に、希望の全てのV, (D), およびJ可変領域配列のためのＤＮＡ配列を含むデータベースが作成されました（例３を参考）。DNA配列編集ソフトウェアは機械的に、全ての重鎖可変生殖細胞系セグメント、および軽鎖可変生殖細胞系セグメント配列を、データベースに、機能性アミノ酸配列をエンコードする核酸分子に組み換えました。   ソフトウェアは核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、配列ファイルを生成しました。組み換えアミノ酸配列は、各編集配列と他のそれぞれの編集配列の間の類似性を計るために比較され、その類似性は測定されたが、後で多様性スコアの測定にも利用されました。最後に、編集配列は配列類似性によってクラスター化されました。ソフトウェアの様々なステップはソフトウェアを初期化した直後に行われたのだが、そのステープは以下のとおりです。
【０６８８】
1.重鎖と軽鎖の編集
データベースファイルが更新され、全ての必要なV（D）J配列を含んだ後、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは、例２、セクションB.1.cに説明されている通りにＤＮＡ配列編集規則に従って、データベースファイルを入力ファイルとして使用し完全長の重鎖あるいは軽鎖配列を機械的に編集しました。   ソフトウェアは、編集された可変重鎖および軽鎖の生殖細胞系セグメントにエンコードされた完全長のアミノ酸配列を含むファイルを作成しました。次のファイルに含まれています：
・      TempLightChainSequences.txt -このファイルは アミノ酸フォーマットのカッパおよびラムダの全ての軽鎖配列の組み合わせを含みます。
・      TempLightChainSequences.txt -このファイルは アミノ酸フォーマットの全ての重鎖配列の組み合わせを含みます。
編集された軽鎖および重鎖アミノ酸配列は特有のＩＤによって示されています (gnl|Fabrus|V_(D)_J)。その例は以下にあります。
>gnl|Fabrus|V4-2_IGLJ2*01 (SEQ ID NO:2027)
QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGTYRIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSSASVVFGGGTKLTVL
>gnl|Fabrus|VH1-2_IGHD2-21*01_IGHJ1*01 (SEQ ID NO:2028)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREAYCGGDCYSAEYFQHWGQGTLVTVSS
【０６８９】
2.  組み換え可変重鎖と軽鎖の順位付け
ソフトウェアによって、組み換え可変重鎖および軽鎖は、配列類似性で、全ての組み換え配列と比較されました。これは、NCBIユーティリティBLASTで実行されます。Blastビットスコアで多様性スコアを計算します。組み換え可変重鎖および軽鎖はまた、クラスター分析ツール（例えばBLASTclust）によって、配列類似性が分析されました。  
【０６９０】
例２、”配列に順位を付けるアルゴリズム”のヘッディングの下で説明された通り、編集された配列は、多様性スコアとクラスタ番号情報に基づいてソフトウェアによって順位付けられました。順位付けは、プログラムの起動後に自動的に行われ、以下の例５で説明されるように、ユーザーが自動編集機能で観察することができます。たとえば、図17、図19、自動配列後のスクリーンショットを例示し、クラスタ、多様性スコア、模範的な重鎖と軽鎖配列の順位を表示するコラムを示します。
【０６９１】
以下のセクションでは、例２で説明されたアルゴリズムを利用し、多様性スコアやクラスターを特定し配列に順位を付けるための様々なステップを説明します。 
【０６９２】
a.編集された配列の類似性および多様性スコアを計算
編集された配列は、配列の間の類似性を測定するために比較されました。この情報に基づいて多様性スコアが測定されたのです。最初は、TempLightChainSequences.txt と TempHeavyChainSequences.txt のファイルがフォルダ（ユーザーが作成したもの）にコピーされ、DOSコマンドプロンプトウィンドウが開かれました。NCBI DNAユーティリティformatdbによって、まず軽鎖や重鎖にそれぞれ相当する次のコマンドプロンプトを使用し、BLAST用のファイルを準備しました。 
Run formatdb -i TempLightChainSequences.txt -p T -o F 
Run formatdb -i TempHeavyChainSequences.txt -p T -o F
DOSコマンドプロンプトウィンドウを開いたフォルダにFormatdbがインストールされていることは必須条件です。そうでなければ、ユーティリティは見つかりません。また、パスによってDOSコマンドに、formatdbが以前にインストールされたフォルダから直接に利用するように指示できます。例えば、すべてのNCBIユーティリティは”NCBIUtilities”というフォルダにダウンロードされた場合、コマンドプロンプトは次の通りです：
Run NCBIUtilities\bin\formatdb -i TempLightChainSequences.txt -p T -o F
Run NCBIUtilities\bin\formatdb -i TempHeavyChainSequences.txt -p T -o F
そして、BLASTコマンドプロンプトによって、HeavyChainBlastResults.txt と LightChainBlastResults.txt の出力ファイルが生成されました。コマンドプロンプトは以下の通りです：
・  Run blastall -p blastp -d TempLightChainSequences.txt -I TempLightChainSequences.txt -o LightChainBlastResults.txt -m 9 -b 500 
（- b値はBLASTの配列数より大きくなければなりません）、
・  Run blastall -p blastp -d TempHeavyChainSequences.txt -I TempHeavyChainSequences.txt -o HeavyChainBlastResults.txt -m 9 -b 8000 
（- b値はBLASTの配列数より大きくなければなりません）。
BLASTの出力ファイルが生成された後、例２、”BLASTコンバーターアルゴリズム”のサブセクションで示されたアルゴリズム、およびBLASTのビットスコアによって、以下のコマンドに従って、各配列の多様性スコアが計算されました。
(a)            Run BlastToDiversityConverter.exe (ソフトウェアが起動されるとこのファイルは自動的に実行します)。
(b)            LightChainBlastResults.txtファイルを開きます。
(c)            ファイルをAllLightChainSequencesDiversityScores.txt として保存します。
(d)            HeavyChainBlastResults.txtファイルを開きます。
(e)            このファイルをAllHeavyChainSequencesDiversityScores.txtとして保存します。
【０６９３】
b.配列類似性によって編集された配列をクラスターにする
最後に、NCBIユーティリティBLASTClustを使用して対マッチを作り、配列類似性に基づいて配列はクラスタ化されます。BLASTClustによって AllLightChainsBLastClust.txt とAllHeavyChainsBlastClust.txt.の２つの出力ファイルが生成されます。この例では、2つの配列は類似性が95％あるいは96％に達して初めて対マッチとして見なされます。コマンドプロンプトは以下の通りです：
・      Run blastclust -d TempLightChainSequences.txt -o AllLightChainsBlastClust.txt -S 95
・      Run blastclust -d TempHeavyChainSequences.txt -o AllHeavyChainsBlastClust.txt -S 96
BlastClust設定(-S)は必要に応じて変更することができます。  
すべてのファイルが（上記の通りに）生成された後、次のファイルはDNA配列編集ツールのインストールフォルダに手動でコピーされます：
(a)            AllHeavyChainsBlastClust.txt
(b)            AllLightChainsBlastClust.txt
(c)            AllLightChainSequencesDiversityScores.txt
(d)            AllHeavyChainSequencesDiversityScores.txt
例5
ＤＮＡ配列編集ツールソフトウェアのインストールとグラフィカルユーザーインタフェース
【０６９４】
DNA配列編集ソフトウェアによって、重鎖および軽鎖抗体配列を組み換え、そして96ウェルプレート出力ファイルに記載する希望の配列を選択するが、このファイルはDNA合成会社からヌクレオチドフォーマットでDNA配列を購入する際に注文ファイルとして使用されます。この例はまた、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアを利用する時に、メインメニュー、オプション、エクスプローラバーを含んで、ユーザーが接触するソフトウェアの要件や制御を例示します。  
【０６９５】
A.ソフトウェアの概要
ソフトウェアは、オペレーティング・システムとしてWindows XP又はWindows Vistaを使用するコンピュータで実行するよう設計されている。ソフトウェアは、実行ファイルsetup.exeを実行し、ユーザ選択のフォルダーにおけるプログラムを設定することによりインストールされる。インストールすると、ユーザは、メイン・メニュー・オプション及びエクスプローラ・バー・オプションが目に入る。詳細については下記で説明する。
【０６９６】
1  システムの必要条件
DNA配列編集ソフトウェアは、スタンドアロン・アプリケーションとしてローカル・マシンで実行するよう設計されている。
【０６９７】
オペレーティング・システム：Windows XP / Vista 32ビット版
インターネット接続：必要なし
データベース・サーバ：なし
【０６９８】
２  DNA配列編集ツールプログラムのインストール
該プログラムをインストールするため、実行ファイルsetup.exeを実行し、各自で選択するフォルダーのプログラムをインストールする。
【０６９９】
３  メイン・メニュー・オプション（図12を参照）
３つのメイン・メニュー・オプションがある。
ファイル −ファイル・メニューを使用して、アプリケーションを終了させる。
ウェルプレート − ウェルプレート・メニューを使用して、注文を作成し、全プレート又は選択するウェルを消去し、又はウェルプレートの注文作成に対して制限部位を設定する。
ヘルプ − ヘルプ・メニューを使用して、実行中のソフトウェアのバージョンを確認する。
【０７００】
４  エクスプローラ・バー・オプション
3つのエクスプローラ・バー・オプションがある（図12、左欄を参照）：
手動編集 − 手動編集は、生殖細胞系セグメントのユーザ選択を可能にする軽鎖又は重鎖の手動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
自動編集 −自動編集は、軽鎖又は重鎖の自動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
ウェルプレート− ウェルプレートは、ウェルプレート形式を表示するのに使用される項目を含む。
【０７０１】
C.アプリケーションの起動
すべてのプログラムのWindowsメニューでFabrus DNA編集ツールをクリック、又はデスクトップでFabrus DNA編集ツールのショートカットをダブルクリックすることのいずれかにより、ソフトウェアを起動させる。スプラッシュ画面（図13）が、アプリケーションの起動時に現われ、その後目立たなくなる。
【０７０２】
D.  DNA配列編集ソフトウェアを使用して出力プレートを生成
DNA配列編集ソフトウェアを使用し、重鎖及び軽鎖抗体配列を組換え、続いて目的の配列を選択して、DNA Synthesis Companyからヌクレオチド形式でDNA配列を入手するための注文ファイルとして役割りを果たす96ウェルプレートの出力ファイルを生成する。プレートファイルに加え、SequenceHistory.txtファイルを作成し、注文される全配列を把握する。ユーザは、配列を生成し、続いて下記のセクションC.2−4に記載のとおり、96ウェルプレートのグリッドへの含有物に対する個々の配列を選択するため、手動編集又は自動編集のいずれかを選択できる。また、ソフトウェアプログラムは、全配列の多様性スコアも算出する。以下のセクションは、DNA合成の注文に対して可変重鎖及び軽鎖をコードする生殖細胞系配列の選択及び編集するユーザオプションについて説明する。
【０７０３】
1.96ウェルプレート画面
アプリケーションの起動時、96ウェルプレート画面が表示される。図12で示すとおり、96ウェルプレートは、アプリケーションの起動時は空である。メイン・メニューは、DNA配列編集のタイトルの下で、画面上部に沿って横長である。エクスプローラ・バーは、画面の左側で縦長である。ユーザは、手動編集機能又は自動編集機能のいずれかを使用し、本明細書の以下で説明されるとおり、製作用に選択されるだろうDNA配列を空の96ウェルプレートに追加する必要がある。96ウェルプレート画面の追加を可能にする前記プレート内のオペレーティング機能は、以下を含む：
【０７０４】
a.ウェルプレートの制限部位を選択
【０７０５】
ユーザにより、Sequencedatabase.txtファイルから制限酵素配列が選択され、クローニング目的で、5’末端及び3’末端において編集されたDNA配列に追加する。以下のコマンドを使用し、抗体の鎖タイプによってプレートの注文に追加される5’及び3’制限部位を特定する。
重鎖：
・   ウェルプレート> 設定 > 重鎖 > 5’末端 → 選択、及びウェルプレート>設定 > 重鎖> 3’末端→ 選択
カッパ軽鎖：
・   ウェルプレート> 設定> カッパ軽鎖> 5’末端 → 選択、及びウェルプレート> 設定>カッパ軽鎖> 3’末端→ 選択
ラムダ軽鎖：
・   ウェルプレート> 設定> ラムダ軽鎖 > 5’末端→ 選択、及びウェルプレート> 設定>ラムダ軽鎖>3’末端→選択
【０７０６】
これは、注文ファイルの各配列の鎖タイプに前置及び後置される制限部位を定義し、IDT注文ウェルプレート開始／終了制限部位ボックスで見ることができる（図12及び図14を参照）。編集ソフトウェアは、選択される制限部位に対し編集された配列を内部で検索し、クローニング目的に対して非適合であり得る内部のあらゆる制限部位を削除するためコドン使用を踏まえてヌクレオチド配列を修飾する機能を含む。これは、「抑制された制限部位を伴う」こうした配列のみが注文される、注文用のウェルプレートで配列を置く前に完了する。これは、セクションのタイトルが「コドン使用表」の実施例2、及び以下のセクション2で説明される。
【０７０７】
b.ウェルプレートで配列を位置付け
【０７０８】
配列の選択は、以下のセクションC.2及びC.3で説明されるとおり、手動編集又は自動編集のいずれかの画面から実行する。下記のとおり、手動編集又は自動編集画面において、編集後、「選択する」の縦列にチェックマークを付け（自動編集）又は「ウェルプレートに追加する」ボタンをクリック（手動編集）することで、配列を選択する。
c.ウェル配列情報の表示
ウェルで置かれ、編集された配列は、ウェルをクリックして表示する。選択する配列のウェルはハイライトされる。例えば、図14は、ユーザが注文するため選択した編集配列を含む単一の96ウェルプレートに対するモデル画面を示す。前記図の横列Aにおいて、縦列1−3（中間グレーの影）は、編集された重鎖配列のセルを示し、縦列3−6（薄いグレーの影）は、編集された軽鎖配列のセルを示す。ハイライトされたセルは（横列A、縦列5、濃い影で示す）、個々のデータが画面底部の配列情報ボックスのセルを示す。
【０７０９】
次いで、配列情報テキストボックスは、そのウェルに関する配列情報で更新される。配列情報ボックスは、名称を含む特定の配列、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、多様性スコア及びV(D)J組換えの個々の構成要素のタイトルに関する全ての関連情報を列挙する。例えば、図14において、ハイライトされた配列は、VL生殖細胞系セグメントV3-4及びJL生殖細胞系セグメントIGLJ7*01から編集された可変軽鎖である。
【０７１０】
d.注文の生成
96ウェルプレートから注文され得る1から96個の配列など、プレートに入れる試料の数がいくつであっても、注文は96ウェルプレートに対し生成される。注文を生成するためには、ウェルプレート>注文の生成オプションを選択し、ファイル名を必要に応じて入力する。注文ファイルは、カンマ区切り変数(.csv)形式で保存される。実施例4は、ソフトウェア編集のソフトウェアを使用して編集される例示的配列の編集、出力及び注文を説明する。
【０７１１】
e.  ウェルプレートにおいて選択するウェルを消去
プレートにおける特定のウェルを消去するため、選択するウェルをクリックし、次いでウェルプレート> 消去> 選択するウェルを選択し、或いは目的のウェルを右クリックして「選択するウェルの消去」を選ぶ。
【０７１２】
f.  全ウェルプレートから全ての配列を消去
ウェルプレートは、注文が生成されると自動的に消去されるわけではない。全ウェルプレートを消去するためには、ウェルプレート>消去>全プレートを選択する。
【０７１３】
2.配列の手動編集
手動編集オプションを使用するユーザの選択により、編集された配列を手動で生成することができる。
【０７１４】
a.軽鎖の手動編集
軽鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーから手動編集>軽鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図15で示す。手動編集経鎖の画面は、ユーザがラムダ又はカッパ配列のいずれかを編集することを可能にする。このオプションは、ヘディングタイプにおいて利用可能で、画面上部のラムダ又はカッパのいずれかの前にある丸を選択することで選ぶ。該ソフトウェアは、Vl及びJk配列の組合せ又はその逆も認めない。
【０７１５】
i.ラムダ軽鎖の編集
ラムダ経鎖の編集方法を以下の段階で示す。
・   タイプ>ラムダを選択する
・   VL配列コンボ・ボックスから目的のVl配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのVlヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
・   JL配列コンボ・ボックスから目的のJl配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのJlヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
・   「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。
【０７１６】
DNA配列ヘディングにおいて、2つのボックスが見られる。「制限部位の抑制なし」ボックスは、個々のVl及びJlヌクレオチド配列に加え、配列編集規則を踏まえて生成されたあらゆるV−J結合部を表示する。対応のコードされたアミノ酸配列も表示される。例えば、図15において、「制限部位の抑制なし」ボックスで表示される最初の配列は、選択されるVl配列に対応する（この場合はV1−11）。これに続くのは、プロリン（P）をコードする3つのヌクレオチド「cct」の記述で、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成される連結領域に対応する。表示される最後の配列は、選択されるJl配列（この場合はIGLJ1*01）に対応する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、制限部位を抑制する配列に対して必要なあらゆるヌクレオチド修飾を含む編集配列を表示するが、一方でコドン使用を維持する。ソフトウェアによって抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスで表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れられる配列である。
【０７１７】
(ii)カッパ軽鎖の編集
カッパ軽鎖の編集方法を以下の段階で示す。
・   タイプ>カッパを選択する。
・   VK配列コンボ・ボックスから目的のVK配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのVKヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
・   JK配列コンボ・ボックスから目的のJK配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのJKヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
・   「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。編集される全配列は、DNA合成の注文のためウェルプレートに追加される。
上記のラムダ軽鎖配列の編集のとおり、DNA配列ヘディングにおいて、2つのボックスが見られる。「制限部位の抑制なし」ボックスが、個々のVκ及びJκ配列に加え、生成されるあらゆるV−J結合部を表示する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、選択する制限部位を抑制するあらゆる配列の修飾を伴い編集された配列を表示する。ソフトウェアによって抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスに表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。
【０７１８】
b.重鎖の手動編集
重鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーで手動編集>重鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図16で示す。手動編集重鎖画面は、ユーザがVH、DH及びJH配列を連結することを可能にする。以下の段階は、重鎖を編集する方法を示す。
・   VH配列コンボ・ボックスから目的のVH配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルに入れられる利用可能な全VHヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
・   DH配列コンボ・ボックスから目的のDH配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルに入れる利用可能な全DHヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
・   DHリーディング・フレーム・ボックスから目的のDHリーディング・フレームを選択する。GRAVY値は、リーディング・フレームの選択によって更新される。ユーザは、最低のGRAVY値に対応するリーディング・フレームを選択すべきである。
・   JH配列コンボ・ボックスから目的のJH配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルに入れる利用可能な全JHヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
・   「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集配列を追加する。編集される全配列は、DNA合成の注文のためウェルプレートに追加される。
【０７１９】
DNA配列ヘディングにおいて、2つのボックスがある。「制限部位の抑制なし」ボックスは、個々のVH、DH及びJH配列に加え、配列編集規則を踏まえて生成されたあらゆるV−D結合部を表示する。対応のコードされたアミノ酸配列も表示される。例えば、図16において、「制限部位の抑制なし」ボックスで表示される最初の配列は、選択するVH配列に対応する（この場合はV1−18）。これに続くのは、グルタミン酸（E）をコードする3つのヌクレオチド「gag」の記述で、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるV−D連結領域に対応する。表示される次の配列は、選択されるDH配列（この場合はIGLJ1*01）に対応する。その配列は、トレオニン(T)をコードする3つのヌクレオチド「acg」の記述に続き、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるD−J連結領域に対応する。表示される最後の配列は、選択されるJH配列（この場合はIGHJ1*01）に対応する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、現在抑制されるあらゆる制限部位を伴う編集配列を表示する。抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスで表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。
【０７２０】
３  配列の自動編集
編集される鎖は、自動編集オプションを使用することで自動的に生成される。実施例4で説明されるとおり、全配列の編集は、初期化においてコンピュータにより機械的に実行され、ファイルに保存される。自動編集機能は、ユーザがこれらの配列を見ることを可能にする。
【０７２１】
a.軽鎖の自動編集
軽鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集>軽鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図17で表示される。自動編集軽鎖の画面は、VK及びJK並びにVλ及びJλ配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する：
・   選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
・   順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
・   集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
・   多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のBLASTビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
・   V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
・   J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
・   アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
【０７２２】
b. 重鎖の自動編集
重鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集>重鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図19で表示される。自動編集重鎖の画面は、VH、DH及びJH配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する：
・   選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
・   順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
・   集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
・   多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のBLASTビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
・   V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
・   D配列−この縦列は、本配列に対して使用されるD配列識別子を列挙する。
・   J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
・   アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
【０７２３】
４  軽鎖及び重鎖配列の編集と関連する他の機能性
a. 自動編集画面のソート・オプションを変更
自動編集画面で列挙される配列の一覧は、所望の縦列ヘッダをクリックすることで再編成され得る。例えば、多様性スコアに基づいて配列を表示するため、縦列ヘッダの「多様性スコア」をクリックし、配列は、最低から最高の多様性スコアの観点から再注文される。
b.状態指標
自動編集画面は、編集される配列の状態を識別するため色彩規則を使用する。例えば、灰色は、配列がすでに注文されていることを示し、青色は、配列が注文されておらず、96ウェルプレートに入れられていないことを示し、及び濃い青色は、配列が96ウェルプレートに入れられたことを示す。例えば、図17の横列022、023及び024においてボールドの項目は、編集された配列が、注文のため96ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。例えば、図19の横列0103−0107においてボールドの項目は、編集された配列が、注文のため96ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。
c. 96ウェルプレートに複数の配列を入れること
複数の選択する配列のボックスをクリックすることで、複数の配列を96ウェルプレートに入れることが可能である。これは、マウスで最初の配列を選択し、次いでシフト・キーを押さえ、最後に選択された配列のボックスをクリックして行うことができる。或いは、Ctrlキーを押さえ、選択する全ての配列のそれぞれのボックスをクリックすることで、Ctrlキーを使用して個々の配列を選択することができる。一旦VL配列を選択して96ウェルプレートに加えると、列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」を選択する。選択する全ての配列は、DNA合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる
d.  96ウェルプレートに単一配列を入れること
単一配列を96ウェルプレートに入れるため、「選択する」の縦列にあるボックスをクリックし、或いは、配列の列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」をクリックする。選択される配列のみが、DNA合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる。
e.編集における他の全ての配列に対し、選択する配列でBLAST
配列が自動編集で編集されると、ソフトウェアは、ユーザがリストの他の全ての配列に対し、単一配列のBLAST検索を実行するオプションを可能にする。この機能は、出力インジケータ、BLASTビットスコアを提供し、それは整列された各配列と関連するギャップ及び置換の数から算出される値である。スコアが高くなればなるほど、アライメントが重要である。このデータは、ユーザが、他の全ての選択する配列に対し、最も高い多様性、或いは最も低い多様性のいずれかを有する配列を選択しようと試みる場合に有用である。選択するVL配列に対し生成されるデータの例は、図18で説明しており、選択するVH配列に対し生成されるデータの例は、図20で説明している。 
次いで、編集配列は、編集される各配列と他の全ての編集される配列との類似性を決定するため比較し、この情報を使用して、多様性スコアを生成する。例えば、NCBIユーティリティのBLASTを使用して、ヌクレオチド又はタンパク質の配列を比較し、一致配列の統計的有意性を算出することにより、配列間の局所類似性の領域を見つけることが可能である。
BLASTを実行するため、比較する配列は、配列上でクリックすることで選択される。ユーザは、配列を右クリックしてBLASTオプションを選択できる。例えば、VL配列に対し、図18は、手動編集又は自動編集の画面上のV4-2_IGLJ2*01配列で選択することにより、続いて配列を右クリックしてBLASTを選択することにより、生成されるBLASTグリッド形式を例示する。図18で例示される新しいグリッド形式が生成され、選択する配列と整列する他の編集配列のBLASTビットスコアを提供する。例えば、VH配列に対し、図20では、手動編集又は自動編集の画面のVH4-39_IGHD5-24*01_IGHJ6*01配列で選択することにより、次いで配列を右クリックしてBLASTを選択することにより、生成されるBLASTグリッド形式を例示する。図20で例示する新しいグリッドを生成し、選択する配列と整列する他の編集配列のBLASTビットスコアを提供する。配列は、「選択する」の縦列のボックスにチェックマークを付けることにより、DNA合成を注文するため、96ウェルプレート・ファイルへの挿入に対し、この新しいグリッド形式から選択できる。
BLAST形式は、縦列でのグリッドである：
・   選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
・   順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
・   BLASTビットスコア−この縦列は、選択する配列に対し、特にこの配列のBLASTビットスコアを示す。
・   V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
・   J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
・   アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
【０７２４】
実施例6
重鎖及び軽鎖生殖細胞系組換えDNA配列の生成
この実施例では、DNA配列編集ソフトウェアによって、重鎖及び軽鎖DNA配列を生成する方法を説明する。編集の第一段階は、上記の実施例5に記載のとおり、配列の手動編集又は自動編集のいずれかを選択することである。手動編集は、選択する配列においてユーザが完全に制御できるため有用である。これは、全ての配列が、同じ特定のセグメント含むライブラリーを産生し、又は異なる配列を選択することによって多様性をコントロールすることで、ユーザが、希望するあらゆる状況にライブラリーを提供することを可能にする（異なる遺伝子ファミリーなど）。
【０７２５】
手動編集を使用し、生殖細胞系セグメントは、VH、DH、JH、Vκ、Jκ、Vλ又はJλ生殖細胞系セグメントの各遺伝子ファミリーから生殖細胞系セグメントを選ぶことにより、選択された。可変重鎖の編集は、軽鎖とは別に実行された。また、可変カッパ軽鎖の編集は、可変ラムダ鎖とは別に実行された。こうして、別の96ウェルプレート・ファイルは、可変重鎖、可変カッパ軽鎖及び可変ラムダ軽鎖に対し作成された。
【０７２６】
例えば、可変重鎖に対し、例えばIGHV1-18*01などのIGHV1-18遺伝子ファミリーから1つのVH生殖細胞系セグメントが選択され、例えば、IGHV1-2*01などのIGHV1-2遺伝子ファミリーから1つのVH生殖細胞系セグメントが選択される。DH生殖細胞系セグメント及びJH生殖細胞系セグメントに対し、同様の選択を行った。DH生殖細胞系セグメントをリーディングフレームで選択し、可能であれば最も低いGRAVYスコアを提供した。手動編集画面において、VHDHJH生殖細胞系セグメントの組合せを１つずつ産生した。更に、制限酵素部位NcoI及びNheIは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの5'末端及び3'末端における含有物に対し、各々のVHDHJHの組合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例8を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にDNA配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるNcoI又はNheI制限部位が、コドン使用表を用いた修飾により抑制された）。生成されるV−D結合部及びD−J結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、DNA配列ウィンドウで示された（例示的配列を図16で示す）。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。全ての可変重鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。
【０７２７】
Vκ及びJκ生殖細胞系セグメントの組合せを選択することにより、同様の選択もVκ及びJκ軽鎖生殖細胞系に対し行われ（各生殖細胞系セグメントから1つの遺伝子ファミリーのメンバーのみがこれまでに選択された）、手動編集画面において1つずつである。更に、制限酵素部位NcoI及びBsiW Iは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの5'末端及び3'末端における含有物に対し、各々のVκ及びJκの組合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例8を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にDNA配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるNcoI又はBsiW I制限部位が、コドン使用表を用いたヌクレオチド修飾により抑制された）。生成されるV−J結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、DNA配列ウィンドウで示された。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。全ての可変カッパ軽鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。
【０７２８】
Vλ又はJλ生殖細胞系セグメントの組合せを選択することにより、同様の選択もVλ又はJλ軽鎖生殖細胞系セグメントに対し行われ（各生殖細胞系セグメントから1つの遺伝子ファミリーのメンバーのみが、これまでに選択された）、手動編集画面において1つずつであった。更に、制限酵素部位NcoI及びAvr IIは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの5'末端及び3'末端における含有物に対し、各々のVλ及びJλの組合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例8を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にDNA配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるNcoI又はAvr II制限部位が、コドン使用表を用いたヌクレオチド修飾により抑制された）。生成されるV−J結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、DNA配列ウィンドウで示された（例示的選択は、図15で示す）。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。可変ラムダ軽鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。
【０７２９】
Nhe I、Bsi WI及びAvr II部位の選択は、それぞれの重鎖及び軽鎖に対する完全なアミノ酸保存を可能にし、天然ヒトV及びC領域を維持する。
【０７３０】
全配列が選択されると、選択された配列は、96ウェルプレート表示で見れる（図12及び図14を参照）。DNA合成の注文は、注文作成機能を用いて作成した。DNA編集ソフトウェアは、96ウェルフォーマットにマップされるアレイで選択する配列を出力した。このフォーマットでの配列は、合成抗体の可変重鎖及び軽鎖配列を生成するため、DNA合成のベンダー（Genscript Corp.）に送られた。合成された核酸分子が戻り、96ウェル・フォーマットによって同定された。表22は、配列編集ソフトウェアによって作成され、注文されて、合成される配列を列挙している。 
【０７３１】
【表２２】
2016127850.tif 000171
2016127850.tif 000172
2016127850.tif 000173
2016127850.tif 000174
2016127850.tif 000175
2016127850.tif 000176
2016127850.tif 000177
2016127850.tif 000178
2016127850.tif 000179
2016127850.tif 000180
2016127850.tif 000181
【０７３２】
実施例7
異なるリーダー配列によるFab分泌の比較
【０７３３】
この例において、コードされるFabの発現において異なるリーダー配列の影響を評価した。適切に折り畳まれたタンパク質を確実にするため、ジスルフィド結合は、酸化的環境で形成する必要があり、従って、Sec、SRP及びTATなどの経路を用いることにより、Fabタンパク質をペリプラズムに移動する必要がある。SRP経路は、あらゆるタンパク質の折り畳み不全を必要としない。SRPリーダー配列を表23で示す。
【０７３４】
【表２３】
2016127850.tif 000182
【０７３５】
プラスミドA（配列識別番号：1）及びプラスミドC（配列識別番号：3）を修飾し、DsbAリーダー配列（配列識別番号：5）又は変異DsbAリーダー配列（配列識別番号：965）のいずれか、及びリボソーム結合部位（RBS）変異を含有した。RBS変異を含む3つの順方向のプライマー及びDsbA（配列識別番号：966−968で示す）のN−末端に対応する配列並びにDsbA又は変異DsbA（配列識別番号：969−970で示す）のいずれかのC−末端に対応する2つの逆方向プライマーを使用し、オーバーラップPCRを行った。前記PCRは、6つの異なるリーダー配列をもたらした（表24）。次いで、これらのリーダー配列は、開始コドンでATGの上流EcoRI部位とNcoI部位の間でプラスミドA及びプラスミドCに挿入された。RBS変異を伴うDsbAリーダー配列を含むプラスミドA及びプラスミドCは、配列識別番号：1015−1017及び1021−1023でそれぞれ示される。RBS変異を伴う変異DsbAリーダー配列を含むプラスミドA及びCは、配列識別番号：1018−1020及び1024−1026でそれぞれ示される。
【０７３６】
【表２４】
2016127850.tif 000183
【０７３７】
Fab抗体の発現における異なるリーダー配列の影響を評価するため、リツキサンの発現を評価した。リツキサン重鎖（配列識別番号：453）は、それぞれのプラスミドAベクターで存在するCH配列にインフレームでクローン化され、リツキサン軽鎖（配列識別番号：835）は、それぞれのプラスミドCベクターで存在するCκ配列にインフレームでクローン化された。つまり、VH及びVκ鎖は、NheI及びNcoIで（重鎖DNAに対し）又はNcoI及びBsiWI（軽鎖DNAに対し）とのプラスミドの消化、続いてライゲーションにより、プラスミドA及びCベクターにクローン化された（STIIリーダー配列、DsbAリーダー配列又は変異DsbAリーダー配列を含む）。重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドは、以下の実施例8に記載どおり、LMG194細胞に同時形質転換し、0.4%グルコース及び0.008%アラビノースの存在下で、TB培地（Terrific Broth）において、20℃で36時間成長させた。発現されたFabをBugbuster（R） (Novagen)を使用して全細胞から抽出し、Ni2+ 親和性カラム（EMD)を使用して精製し、SDS-PAGEで分析し、続いてウェスタンブロットで行った。結果は、誘導物質の不在下で、皆無かされに近いタンパク質の発現示す。誘導において、DsbAリーダー配列の支配下で、Fabの発現は（3つの各RBS変異に対し）、STIIリーダー配列の支配下の発現と同等であった。変異DsbAは、より低い発現をもたらした。DsbAリーダー配列の様々なRBS変異において、発現に著しい相違はなかった。
【０７３８】
実施例8
合成された可変重鎖及び軽鎖のクローニング及び同時形質転換
【０７３９】
この例では、重鎖又は軽鎖DNAをそれら各々のプラスミドにクローニングし、続いて同時形質転換及びタンパク質の成長／精製により、Fabライブラリーを生成した。実施例6に記載どおり、配列編集ソフトウェアから生成されるDNA分子の合成後、DNA分子は、同時形質転換及び組合わせFabの発現に対し、必要に応じて、定常重鎖又は軽鎖を含むプラスミドへクローン化された。プラスミドA（配列識別番号：1）及びプラスミドD（配列識別番号：2）は、重鎖定常領域配列を含む。プラスミドC（配列識別番号：3）は、カッパ軽鎖定常領域配列を含み、プラスミドE（配列識別番号：4）は、ラムダ軽鎖定常領域配列を含む。
【０７４０】
可変重鎖をコードする合成の組換え核酸は、Hhe I及びNco Iで消化され、標準分子技術を用いてStIIリーダー配列のプラスミドAに結合された。可変カッパ軽鎖をコードする合成の組換え核酸は、NcoI及びBsiWIで消化され、可変ラムダ鎖をコードする合成の組換え核酸は、NcoI及びAvrIIで消化され、標準分子生物学技術を用いるStIIリーダー配列で、プラスミドC又はプラスミドEにそれぞれ結合された。
【０７４１】
可変重鎖及び軽鎖の様々な組合せを各々含む、プラスミドA及びプラスミドC又はプラスミドEのいずれか1つを大腸菌に同時形質転換した。重鎖及び軽鎖の全組合せに対し、その過程を繰り返した。つまり、プラスミドA（Fab重鎖をコードする）及びプラスミドC又はプラスミドE（Fab軽鎖をコードする）は、最終濃度1 ng/μlまでのTE緩衝液中で別々に再懸濁された。1 μLの重鎖プラスミド及び1 μLの軽鎖プラスミドをPCR管又はPCRプレートで混合し、20 μLの氷冷LMG194コンピテント細胞と混合した。形質転換反応は、氷上にて10分間インキュベートし、続いて42℃で45秒間、予熱されたPCRブロックで熱ショックを行った。次いで、前記の管は、氷上で更に2分間静置し、続いて200 μLのSOC培地を添加した。細胞は、37℃で1.5時間、回復させた。100 μLアリコートの形質転換培養物を使用して、0.4% (w/v)グリコース、17 μg/mLカナマイシン（Sigma Aldrich）及び34 μg/mLクロラムフェニコール（Sigma Aldrich）を含む0.9 mLのLB（Luria-Bertani培地）に植菌した。培養物は、30℃にて、20時間激しく振盪して成長させた。形質転換培養物が成長し、実施例9に記載どおり、Piccolo（TM）システムを用いて精製した
【０７４２】
実施例9
Fabライブラリーのハイスループット成長及び精製
【０７４３】
この例において、Fabライブラリーは、ハイスループット技術を使用して生成及び精製される。実施例8に記載どおり、対を成す重鎖（プラスミドA）及び軽鎖（プラスミドC又はE）のハイスループット形質転換を実行するが、96ウェルPCRプレートを個々のPCR管の代わりに使用したことは除く。転換後、細胞は、通気性のあるテープで覆った深底2mlウェルの96ウェル（VWR）ブロックで一晩成長させた。一晩経過した培養物は、Piccolo（TM）で植菌するため直接的に使用した（Wollerton et al. (2006) JALA、11:291-303）。
【０７４４】
抗体Fabフラグメントのハイスループットで、並行の発現及び精製は、Piccolo（TM) (The Automation Partnership (TAP))を使用して行われ、それはタンパク質の発現及び精製を自動化する。Piccolo（TM)に対する発現及び生成パラメータは、Run Composerソフトウェア(TAP)を使用して準備した。「変形ファイル」は、種培養プレートの各クローンの位置をマッピングして作成した。これは、Run Composerソフトウェアに提出され、基本的な機械設定は以下のとおりに行われた：誘導前のインキュベータを30℃で設定、発現インキュベータ1を16℃で設定、遠心分離機を6℃及び5000 x gで設定、TB(Terrific Broth、1リットルにつき12gトリプトン、24g酵母エキス、9.4gリン酸カリウム（二塩基）、及び2.2gリン酸カリウム（一塩基）)、50 μg/mLカナマイシン(Sigma Aldrich)、35 μg/mLクロラムフェニコール(Sigma Aldrich)、0.4% (w/v)グルコース(Sigma Aldrich)及び0.015% (v/v)消泡剤204 (Sigma Aldrich)で準備された培地ポンプ1（EMD Biosciences、カタログ番号71754）、0.2%(w/v)アラビノース(EMD Biosciences)で準備されたインデューサポンプ1、インキュベータのガス発生速度を51%酸素、0.1mL植菌容量を2秒に設定、誘導統計平均を異常値なしで設定（3つの最高及び3つの最低の値を排除した後決定されるブロック平均OD600など）、培養槽ブロック(CVB)の誘導前遅延を1時間20分に設定し、及び発現インキュベータ順化を30分に設定する。
【０７４５】
種培養物を準備し、製造業者が定めるとおり、必要な実験機器とともにPiccolo（TM)中に装填した： 24ウェル培養槽ブロック(CVB、The Automation Partnership)、24ウェルフィルタ・プレート(The Automation Partnership)、24ウェル出力プレート(Seahorse Bioscience)及びピペットチップボックス(MBP)。上記で説明されるとおり補充されたTB培地、アラビノース誘発物質及び関連ポンプを無菌状態下で準備し、機械に取り付けられた。遠心分離機の釣り合いおもりを設定し、遠心分離機内に入れた。最後に、精製試薬を調製し、システムポンプに取り付けた（以下に記載どおり、溶解緩衝液、レジン、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液）。これが完成すると、機械を始動させ、工程を開始した。
【０７４６】
植菌をする前に、接種菌を24ウェルCVBの特定のウェルにマップし、以下の表25で説明されるとおり、発現及び誘導条件を設定した。CVBの各ウェルは、播種プレートから植菌する前に、上記で説明されるとおり補充される10 mLのTB培地で充填した。各CVBのそれぞれのウェルを0.1ｍL種培養物で植菌し、次いで保管カルーセルに戻し、予定される誘導前のインキュベーションが可能になるのを待つ。誘導前のインキュベーションを開始するため、一旦CVBを待ち行列に入れると、それは保管カルーセルから移動させ、通気アセンブリに結合して（攪拌、しっかりと密封、及び酸素／空気の制御された管理方法を提供する）、次いで誘導前のインキュベータに入れた。インキュベーションの開始時にOD600を読み取り、その後、約30分ごとに読み取る。ピッコロ操作制御ソフトウェアが、OD600の測定値を監視し、各CVBが1.0のOD600設定点に達するときを予測する。CVBがOD600設定点に達する約30分前、アセンブリを発現インキュベータに移動して、望ましい発現温度に釣り合わせ、次いでCVBの培養物は、表25で示される既定容量のアラビノースを添加することで誘導された。細胞の成長は、誘導後30分ごとにOD600を測定し、インキュベーションの合計時間に対して吸光度の測定値を示すデータをプロットすることによって監視された。表25からの6つのCVB発現／精製スキームを分析した。CVB01からCVB04は、約1700分後に最大約20となったOD600と同様のパターンを示した。これらのプレートにおいて、プレートの個々の各ウェルにおけるFab培養物の成長は、CVB03及びCVB04の条件で観察される成長速度／ウェルの若干大きな変動性と同様である。CVB05及びCVB06は、OD600が前回の分析時点において依然と上昇しており、すなわち誘導後の合計インキュベーション時間は2300分で、より遅い成長を見せた。Fab培養物の成長は、各プレートのウェル間で変わり、ウェル間の最大OD600は、OD600 =10からOD600=16-18まで変化した。
【０７４７】
【表２５】
2016127850.tif 000184
【０７４８】
培養物のインキュベーション及び培養物の増殖誘導に続いて、細胞を回収し、Fabの精製に対し溶解した。自動化された発現及び全溶媒精製の「ライフサイクル」精製を使用し、発現されたFabタンパク質の精製に対してPiccolo（TM)を用いた。調節された発現の後、溶解前に、保管カルーセルにおいて、CVBを6℃で30分間冷却した。CVBは、液体処理ベッドに移動させ、溶解緩衝液（1：1000 Lysonase(EMD Biosciences)と2.5mLのPopCulture）を混合しながら各ウェルに添加した。溶解は、10分間継続し、次いでCVBを5000 x gで10分間、細胞残屑のペレットに遠心分離した。遠心分離の間、フィルタ・プレートをフィルタ・ベッドに置き、レジン（2mLのNi充填されたHis-Bindレジン（EMD Biosciences)の50%スラリー）を各ウェルへ添加した。可溶性の溶解物が、レジンを含むフィルタ・プレートにおける対応のウェルへ添加し、流し捨てる前に10分間結合させた。洗浄緩衝液（12mLの洗浄緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mM  NaCl、30mMイミダゾール、pH8.0））を二段階で各ウェルに加え、流して捨てた。最後に、出力プレートをフィルタベッドのフィルタプレート下に置き、IMAC溶出緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300 mM  NaCl、500mMイミダゾール）を二段階で出力プレート中に流して添加した。前記出力プレートを他の全ての実験器具と管理カルーセルに戻した。この過程が消化工程で各CVBに対し完了すると、機械を取り外した
【０７４９】
同様のPiccolo（TM) を使用して、同じクローンとの工程が発現のインキュベーション温度、アラビノースの誘発物質の濃度及び発現の時間の最適化を可能にさせた。誘導前の試料が30℃でインキュベートされる二段階温度のインキュベーションを用いることで、広範囲で最適の結果が得られた。誘導に続いて、タンパク質の発現を20℃で行った。最適な発現収率は、0.032%アラビノース誘発物質の使用、続いて45時間の発現で得られた。
【０７５０】
例10
Fab抗体の直交二次純化
Piccolo（TM) プロセス後生じられた部分的に純粋なFabを快速にもっと純化させるために、純化の直交方法が開発されました。Fabは前の例９に説明されたようにPiccolo（TM) 機械により発見し、純化されました。Piccolo（TM)純化から取得されたFabサンプルごとに約1.8mLのIMAC溶出物は、製造者プロトコールに従って、Akta純化装置(GE ヘルスケア)及びA-905オートサンプラー(GE ヘルスケア)により 4 °Cで1mLのHi-Trap蛋白質Gカラムの上にもっと純化されました。この蛋白質サンプルは深型ウェルの96ウェル・ブロック（VWR）に移転されました。後者は、蒸発防止のために、アルミニウム・ホイル・テープで覆われました。オートサンプラーは多段注入（典型として、サンプルごとに450 μLの注入四回）のためにHi-Trap蛋白質Gカラムの上に設置されました。それから、このカラムは2カラム容積の50mMのリン酸ソーダpH7.2及び150mMのNaClで洗われました。Fabは六カラム容積の100mMグリシンpH2.8で溶出されました。溶出ピーク部分（約0.8mL）は深型ウェルの96ウェル・プレート・ブロックの中に収集されました。溶出された蛋白質は直ちに飽和二塩基性リン酸ソーダpH9.0により中和されました。蛋白質濃度は、分子動力プレートリーダーの上のA280における吸収率の測量により測定され、対応するFabの消散係数から計算されました。消散係数は、Fab重鎖と軽鎖におけるチロシン+トリプトファン+フェニルアラニンの総数に基づいて計算されました。Piccolo（TM)システムを利用する以下の純化において発見された蛋白質は一般に20％以下の純度であります。蛋白質Gによる直交純化の後、Fab純度はSDS-PAGEが示したように95%以上の純度であります。
【０７５１】
表17は、Piccoloにより生じられてから二次純化によりもっと純化されたFab抗体を表示します。Fab抗体のアミノ酸配列は、配列同一性番号1475-1826のいずれかにおいて表示された可変重鎖配列、及び配列同一性番号1827-1838、1840-1855、1857-188において表示された可変軽鎖配列を含む配列に対応します。重鎖及び軽鎖Fabライブラリーメンバーの配列はプラスミドA、C、Eに包括された不変地域をも含みます。  
【０７５２】
例11
リンパ球細胞死亡測定
抗体ライブラリーからの独特なFabを確認するために、測定を通して希望の機能、特性又は活性を評価することができます。蛋白質機能測定の例として、架橋抗CD20Fab（配列同一性番号453において表示された重鎖及び配列同一性番号835において表示された軽鎖）は、細胞を基礎にした測定を通して、リンパ腫の細胞死亡を引き起こす能力をテストされました。抗CD20Fabは  抗CD20カッパ軽鎖のさまざまの部分を識別する等しいモル濃度の多クローン性抗人カッパ軽鎖抗体を添加することにより、架橋されました。 
【０７５３】
細胞死亡はApo-ONE同質カスパーゼ-3/7測定（プロメガ）を通して確定されました。ラモスBリンパ球細胞は、10% FBS（ウシ胎児血清）及びP-S（ペニシリン-ストレプトマイシン）を含むRPMI1640媒介において育てられ、クリアな96-ウェル・プレート（ウェルごとにコスター3595、コーニング、2.5x104 細胞）の中に配置されました。ジャーカットTリンパ球細胞、10% FBS及びP-Sを含むRPMI1640において育てられ、クリアな96-ウェル・プレート（ウェルごとにコスター3595、コーニング、2.5x104 細胞）の中に配置されました。架橋抗CD20Fabは、0、25、50、100及び 200 nMの濃度で、人カッパ軽鎖に反する同じ濃度の多クローン性抗体（シグマ）と一緒に、それぞれのウェルに添加されました。抗Fas単クローン性抗体（20-100ng/ml）又はスタウロスポリン(1.0 mM) は、正の制御のために添加されましたが、Fabは負の制御として使用されました。同じ容積のApo-ONEカスパーセ3/7試薬（ローダミン110、bis-(N-CBZ-L-アスパーチル-L-グルタミ-L-バリル-L-アスパラギン酸アミド、Z-DEVD-R110)は添加されましたが、プレートは室温で一時間培養されました。ローダミン110の存在は485nm励起/521nm放出で蛍光プレートリーダーにおける蛍光性を測量することにより検出されました。細胞死亡率の向上は以下の方程式により計算されました。100 x [(Fab用蛍光性)-(背景用蛍光性)]/(背景用蛍光性)
【０７５４】
例12
エリスロポエチン結合Fabライブラリー
【０７５５】
「幼稚な」ライブラリのかわりに、指図されたFabライブラリーは既知の標的に構築されました。この例において、指図されたFabライブラリーは構築されました。その中に、16アミノ酸エリスロポエチン・ペプチド（EPO）は抗体のさまざまなCDRに挿入されて、組み合えEPO（EPOR）の活性化を引き起こしたFabを確定します。CDRにおいて発生したアミノ酸残留分の数量に変化がある（表26をご参考に）ので、大きめな挿入物はEPOペプチドの挿入のために選ばれました。これらのCDRはCDR-H2、CDR-H3、CDR-L1及び CDR-L3を包括します。 
【０７５６】
【表２６】
2016127850.tif 000185
ペプチド挿入物の配向を無作為に抽出してペプチドの活性表面を暴露するために、ほかの二つのアミノ酸残留分（プロリン又はグリシン）はEPOペプチドのN終点及びC終点に加えられ、それぞれのペプチドを十六産出しました（配列同一性番号874-889）。重鎖VH3-23 (配列同一性番号869)及び軽鎖  A17 (配列同一性番号871)を含むFabはEPOペプチド・ライブラリーの母抗体として働きました。BsaI制限部位はEPOペプチドの核酸配列及び重鎖と軽鎖可変地域の核酸配列へ導入されて、EPOペプチドをそれぞれのCDRにコード化するDNAのクローニングを可能にしました。重鎖VH3-23 DNAは組替えられて、CDR2でBsaI部位を含むVH3-23B (配列同一性番号：896)及び CDR3でBsaI部位を含むVH3-23R (配列同一性番号：913)を作りました。軽鎖A17 DNAは組替えられて、CDR1でBsaI部位を含む A17P(配列同一性番号：872)及び CDR3でBsaI部位を含むA17Q (配列同一性番号：873)を作りました。EPOペプチドをコード化する十六のさまざまのジーンは、それぞれの重鎖（CDR2とCDR3）又は軽鎖（CDR1とCDR3）配列へクローンされましたが、結果として生じられたFabは例9に説明されたように発見し、純化されました。表27はFabを含む結果の64EPOをリストします。
【０７５７】
【表２７】
2016127850.tif 000186
2016127850.tif 000187
【０７５８】
EPOレセプター（EPOR配列同一性番号962）の活性化を調節するFabを確定する選り分けはEPORをコード化したCdnaで安定に形質移入されたBaF3細胞において行われました。
【０７５９】
a. MTT細胞増殖測定
【０７６０】
MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)のテトラゾリウム環は生細胞のミトコンドリア酸脱水素酵素により切り裂かれて、水溶液に不溶解の紫MTTホルマザン結晶を生じますが、酸化イソプロパノールに溶解されることができます。BaF3/EpoR細胞(5x103-5x105)はEpo Fabがある場合及びない場合に一、二日か培養されました。MTT溶液（培養容積の10%）は細胞に加えられ、CO2 培養器に37 °C3-4時間培養されました。イソプロパノールにおける0.1 N HClと等しい容積は加えられました。吸収率は570nmで測量されましたが、細胞数は標準曲線に基づいて計算されました。
【０７６１】
b.ルシフェラーゼレポータ―測定
【０７６２】
EPORの活性化はSTAT5転写因子の活性化を引き起こしましたが、後者は引き続いてc-myc、bcl-2、pim-1及びcyclin-Dを包括するジーン転写を引き起こしました。転写は、上述のジーンのいずれのプロモーターをレポータージーンとリンクすることにより検出されることができますが、これによりレポーター・プラスミドを作ります。二つのレポータープラスミドは作り出され、EPORの活性化を評価します。初めのレポーター・プラスミドは、鼠サイクリン-Dプロモーター（配列同一性番号963）をpGL4.70におけるルシフェラーゼ・ジーンの5’端に置くことにより構造されました。簡単に言えば、pGL4.70は制限酵素pGL4.70及びHindIII と消化されましたが、サイクリンDプロモーターは標準分子生物プロトコールによりプラスミドの塩基28-66の間に挿入されました。
【０７６３】
EPORを活性化することができるEPO FabはSTAT5の活性化を引き起こし、それでサイクリン-Dプロモーターを活性化し、ルシフェラーゼ・ジーンの誘導と発見を引き起こしました。その故、第二レポーター・プラスミドはpGL4.23ベクター（プロメガ、配列同一性番号1998）を通してSTAT5のために作られました。このベクターは、プロモーターなき反応要素の活性化が発見を駆動することを許すルシフェラーゼのために翻訳開始部位の5’端で最小プロモーターを含みます。STAT5 結合（配列同一性番号964）のためのDNA元素の六回の繰り返しは最小プロモーターの上流に直接にクローン去れました。簡単に言えば、pGL4.23は制限酵素NheI及びHindIII と消化されましたが、STAT5のDNA元素繰り返しは標準分子生物プロトコールによりプラスミドの塩基28-66の間に挿入されました。
【０７６４】
EPORを活性化することができるEPO FabはSTAT5の活性化及びルシフェラーゼ・ジーンの直接発見を引き起こします。前にEPORをコード化するCdnaにより形質移入されたBaF3細胞は以上のレポーター・プラスミドの一つにより一時的に形質移入されました。結果の細胞はEPO Fabがある場合及びない場合に培養されます。ルシフェラーゼ基質を含む等しい容積の溶解緩衝液は細胞培養に加えられます。相対ルミネッセンスは基質と5分間培養した後、ルミノメーターにより10秒間測量されました。 
【０７６５】
例13
電子化学ルミネッセンス結合測定
【０７６６】
この例には、電子化学ルミネッセンス（ECL）結合測定は九つの違う抗体（人上皮成長因子2レセプター（ErbB2）、上皮成長因子レセプター（EGF R）、肝細胞成長因子レセプター（HGF R/c-Met）、ノッチ-1、CD44、インスリン様成長因子-1溶解可レセプター(IGF-1 sR)、P-カドヘリン、糖蛋白質レセプター（Epo R）及びデルタ様蛋白質4（DLL）を包括します）の一つと結合することができる抗体のために960メンバーFabライブラリーをえり分けます。ECL測定において、抗原-抗体の相互作用は、ルテニウムtri-bispyridine-(4-methysulfone) (Ru(bpy)22+)と標識された検出抗体の添加により検出されます。電流を使用する時、Ru(bpy)22+標識は共反應劑がある場合に酸化還元循環を受けますが、光が放出されます。シグナルはRu(bpy)22+標識が電極の近くにある時にしか生じられなく、洗浄のニーズを除きます。検出された光強度は獲得された蛋白質の量と比例します。
【０７６７】
組み換え人蛋白質はR&Dシステムから取得され、以下のものを包括します。r人 ErbB2/Fc キメラ、CF (Cat# 1129-ER)； r人 EGF R/Fc キメラ、CF (Cat# 344-ER); r人 HGF R/c-MET/Fc キメラ、CF (Cat# 358-MT/CF)；r人ノッチ-1/Fc キメラ、CF (Cat# 3647-TK)； r人 CD44/Fc キメラ、CF (Cat# 3660-CD)；r人IGF-1 sR,(IGF-1 sR)、CF (Cat# 391-GR)；r人 P-カドヘリン/Fc キメラ、CF (Cat# 861-PC); r人エリスロポエチン R/Fc キメラ、CF (Cat# 963-ER)；組替え人DLL4 (Cat# 1506-D4/CF)。これらの蛋白質は各蛋白質（60 μg/mL抗原）の50ナノリトルを96ウェル・マルチスポット10ハイバインド・プレートの表面に配置することにより、10プレートの各ウェルの上に固定されました。スポット10は制御子として空白の状態で残れました。
【０７６８】
トリス緩衝塩水Tween(TBST)における１%ウシ血清アルブミンの 150 μl等分は各ウェルに加えられ、20 °Cで30分間培養されることができました。あとで、洗浄とタップ乾燥化により残留溶液を徹底に取り除きました。それでは、1%BSA TBSTの12.5μl等分は各ウェルに加えられたあと、純化されたFabの12.5 μl等分を加えました。このプレートは封じられ、20 °C で一時間振られながら培養されました。 
【０７６９】
検出抗体は、製造者指示に従って個々に山羊抗人カッパ軽鎖ポリクローン抗体(K3502-1MG, シグマ・アルドリッチ)及び山羊抗人ラムダ軽鎖ポリクローン抗体（L1645-1ML、シグマ・アルドリッチ）をルテニウム (II) トリス・ビピリジン-(4-methylsulfone)-N-hydroxysuccinimide(SULFO-TAG NHS-エステル、 中尺度発見)と接合することにより、準備されました。25でのTAG検出抗体は各ウェルに加えられ、20 °Cで一時間振られながら培養されることができました。最後には、15 μlのリード緩衝溶液Pと界面活性剤(Cat # R92PC-1、中尺度発見) は各ウェルに加えられました。電子化学ルミネッセンスはセクターSector Imager 2400（中尺度発見）により測られました。データは各ウェルの空白に対する抗原用の各ECLシグナルを比べることにより分析されました。空白比率が4又はその以上であるシグナルは「ヒット」Fabだと思われました。  
【０７７０】
それぞれ96の違うFabを含む十個のプレートはECL測定によりえり分けられました。初期選り分けの結果は以下の表28-28Bにおいて表示されました。以下の表28は初期ECL選り分けにおいて「ヒット」だと確認された6のFab（重鎖及び軽鎖）をリストします。「ヒット」はシグナル対空白比率が4以上であるFab抗体でありました。組換え人デルタ様蛋白質4（DLL4）と結合する三つのFabは確認されました。一つのFabは組換え人上皮成長因子2（ErbB2）と結合すると確認され、もう一つのFabは組換え人エリスロポエチン・レセプター（EpoR）と結合すると確認されました。残った一つのFabはErbB2及びEpoRと結合すると確認されました。単一Fab濃度での初期MSD測定の結果は以下の表28Bにおいて表示されます。表28Bは6Fab（Fab番号は表28において確認された各Fabと対応します）、Fab濃度、9組買え人標的/蛋白質抗原、及び既知のFab濃度での初期MSD測定選り分けからのECLシグナルをリストします。   
【０７７１】
初期ECL選り分けからの「ヒット」を確認するために、Fab濃度による滴定は行われて、Fab抗原の結合親和性を確定しました。測定過程は上述と同じであります。ただし、Fab抗体の濃度はウェルにより0.1 nMから2.4 μMまで変化します。データは以下の表29-34において表示されます。データはMicrosoft Excel により図式で表示されましたが、結合親和性は50％結合シグナルから推定されました。表示された通り、結合親和性は測定による可能であります（例16をご参考に）。
【０７７２】
結果によれば、Fab VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01 & L6_IGKJ1*01は低めなナノモル範囲に10 nM又はその以下で特に高い親和性を持つ人 DLL4と結合しますが、Fab VH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01 & V3-4_IGLJ1*01及び VH6-1_IGHD3-3*01_IGHJ4*01 & V4-3_IGLJ4*01はマイクロモルの範囲に人DLL4と結合します。.これらの三つのFabが違う重鎖及び軽鎖を含みますから、結果によれば、抗体により識別されたDL44の上における結合エピトープは違うようになる可能性があります。
【０７７３】
それに加えて、結果によれば、Fab VH4-31_IGHD1-26*01_IGHJ2*01 & A27_IGKJ1*01 は約100 Nmの濃度で人ErbB2/Fcキメラと結合しますが、Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & B3_IGKJ1*01は約100 nMで人 エリスロポエチン R/Fc キメラと結合します。一つのFabのVH1-46_IGHD6-13*01_IGH41*01 & B3_IGKJ1*01は人ErbB2/Fc及び人
【０７７４】
エリスロポエチンR/Fcキメラとの親和性を表します。このFabがキメラ蛋白質のFc地域と結合する可能性が低いであります。理由はFc核融合蛋白質である他の五つの抗原との結合は見つからなかったことにあります。 
【０７７５】
【表２８】
2016127850.tif 000188
【０７７６】
【表２９】
2016127850.tif 000189
【０７７７】
【表３０】
2016127850.tif 000190
【０７７８】
【表３１】
2016127850.tif 000191
【０７７９】
【表３２】
2016127850.tif 000192
【０７８０】
【表３３】
2016127850.tif 000193
【０７８１】
【表３４】
2016127850.tif 000194
【０７８２】
例14
VH3-23重鎖ライブラリー
この例において、重鎖を含む690の違うVH3-23は標準分子生物プロトコールにより生じられました。ライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。(1)6の違うJH セグメントを使用します；(2)各DHセグメントの直接配列及び逆配列（又は逆補足）を包括します；（3)全ての3の読み枠における各直接の及び逆のDH セグメントを翻訳します。これは六つのpF-VH3-23-IGHJプラスミド及び115の違うDHセグメントの初期生成を引き起こしました。各単独 DH セグメントを各pF-VH3-23-IGHJプラスミドに同時にクローンするのは690メンバー重鎖ライブラリーを引き起こしました。それで、このライブラリーは、前に生じられた様々な軽鎖（例8をご参考に）により変質され、3012メンバーFabライブラリーを生じました。
【０７８３】
A.  pF-VH3-23-IGHJ1 to pF-VH3-23-IGHJ6 プラスミドの生成
この例において、それぞれ VH3-23 VH セグメント及び六つのJH セグメントをコード化する6のプラスミドは生じられました。これらのプラスミドが組み替えられることにより、BsaI部位は以下のために融合されました。(1)単独JH セグメント（表35をご参考に）を可能にします；(2)それから、単独DH セグメントの何れも（表37をご参考に）のクローニングを可能にします。このために、プラスミドA（配列同一性番号1）及びVH セグメントVH3-23R (配列同一性番号2050)は始めに組み替えられ、内部BsaI部位（配列同一性番号3719）を取り除きました。それから、VH3-23Rはさらに組み替えられ、以下のように二つのBsaI部位を加えました。(1)VH3-23 VH セグメントの3’端において；(2)JHセグメントの枠組み地域4（アミノ酸WGQGTLVTVSSAS、配列同一性番号3456-3461、以下の表35をご参考に）を高度化する塩基の5’端において。それから、VH3-23R (配列同一性番号2050)は標準DNA合成プロトコールにより合成されました。VH3-23Rは NcoI (配列同一性番号977)及びNheI (配列同一性番号978)により消化され、組換えられたプラスミドAへ縛られ、プラスミドpF-VH3-23R (配列同一性番号2051)を作りました。
【０７８４】
セグメントIGHJ1-IGHJ6（表35、配列同一性番号3450-3455及び配列同一性番号3456-3461をご参考に）をコード化するシリーズの前進の及び後退のオリゴ（以下の表36をご参考に）は標準DNA合成プロトコールにより生じられました。ペアになるオリゴ（特定のIGHJ セグメントをコード化します）はBsaI により消化され、同じように消化されたプラスミドpF-VH3-23R (配列同一性番号2051)へ縛られ、それにより6の新しいプラスミドを生じました: pF-VH3-23-IGHJ1 (配列同一性番号:2064), pF-VH3-23-IGHJ2 (配列同一性番号:2065), pF-VH3-23-IGHJ3 (配列同一性番号:2066), pF-VH3-23-IGHJ4 (配列同一性番号:2067), pF-VH3-23-IGHJ5 (配列同一性番号:2068), やpF-VH3-23-IGHJ6 (配列同一性番号:2069)。それぞれの新しいプラスミドに対して、これは以下のような結果を引き起こしました。BsaI部位が枠組み地域4をコード化する塩基の5’端で取り除かれました。新しいBsaI 部位はJH セグメントの5’ 端で生じられました。これらにより、単独DHセグメントが全ての六つのヴェクターに同時にクローンされて、DH セグメントごとに六つの違うジーンを作りました。
【０７８５】
【表３５】
2016127850.tif 000195
【０７８６】
【表３６】
2016127850.tif 000196
【０７８７】
B.  DH オリゴの生成及びpF-VH3-23-IGHJプラスミドへのクローニング
この例において、ペアになったDH オリゴは生じられ、pF-VH3-23-IGHJプラスミドへクローンされ、以下のように690新しいVH3-23重鎖を生じました。二十七(27)の DH セグメント（以下の表37をご参考に）は組み替えられた各pF-VH3-23-IGHJプラスミドへクローニングするために選ばれました。CDR3地域におけるライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。(1)各DHセグメントの直接配列及び逆配列（又は逆補足）を包括します；（3)全ての3の読み枠における各直接の及び逆のDH セグメントを翻訳します。若し既知のDHセグメント用読み枠の翻訳はストップ・コドンを引き起こせば、その特定な配列及び読み枠はライブラリーから排除されました。以下の表37は各特定なDHセグメントの開けた読み枠を示します。これらのDHセグメントはライブラリーに包括され、115の違うDHセグメントを引き起こしました。
【０７８８】
【表３７】
2016127850.tif 000197
2016127850.tif 000198
以下のルール（表38をご参考に）は以下のように使用されました。六つの違うベクターへクローンするためにペアになったDオリゴをデザインし、結果の重鎖配列が枠におけることを確保します。これらのルールは直接の及び逆のDHセグメントに応用されました。pF-VH3-23-IGHJプラスミドをBsaI部位にクローンすることを容易にするために、以下の塩基はDHセグメントオリゴ塩基に加えられました。
直接の 5’端：CGAAA;
直接の 3’端：T；
間接の 5’端：CGAAA;
間接の 3’端：T．
【０７８９】
それぞれの特定なDHセグメント用結果のオリゴは以下の表39-40においてリストされます。クローニングを容易にするために加えられた塩基は小文字で表示されます。DHセグメントをコード化する塩基は大文字で表示されます。これらのオリゴは標準DNA合成技術により合成されました。ペアになったオリゴ（特定なDHセグメントをコード化します）はBsaIにより消化され、同じように消化されたpF-VH3-23-IGHJ1から pF-VH3-23-IGHJ6までのプラスミドへ縛られ、以下の表41にリストされた690メンバーのVH3-23ライブラリーを生じました。VH3-23重鎖ライブラリーは様々な軽鎖と共に変質され（例8において説明されたように）、3012メンバーのFabライブラリーを作りました。
【０７９０】
【表３８】
2016127850.tif 000199
【０７９１】
【表３９】
2016127850.tif 000200
2016127850.tif 000201
2016127850.tif 000202
2016127850.tif 000203
【０７９２】
【表４０】
2016127850.tif 000204
2016127850.tif 000205
2016127850.tif 000206
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【０７９３】
【表４１】
2016127850.tif 000208
2016127850.tif 000209
2016127850.tif 000210
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【０７９４】
例15
電子化学ルミネッセンス結合測定
【０７９５】
例13において説明された電子化学ルミネッセンス（ECL）結合測定はさらに以下のように使用されました。九つの違う抗体の一つと結合することができる抗体のために、以下の表77の22-36行において表示された5376メンバーのFabライブラリー及び15の組換えFab抗体を選り分けました。例13に説明されたように、データは各ウェルの空白に対する抗原用の各ECLシグナルを比べることにより分析されました。空白比率が4又はその以上であるシグナルは「ヒット」Fabだと思われました。   
【０７９６】
それぞれ96の違うFabを含む五十六(56)のプレートはECL測定によりえり分けられました。三十六(36)のFabには、表42-44に示されたような一つ又はその以上の蛋白質抗原との特定な結合親和性が見つかりました。以下の表42はECL測定の結果を纏めます。組換え人標的/蛋白質抗原、標的ごとの抗体ヒット数、及び標的ごとのヒットパーセント（ヒットの数/選り分けられた5376抗体）を包括します。十一のFabは組換え人デルタ様蛋白質4（DDL4）と結合すると確認されましたが、2だけのヒットは組換え人上皮成長因子2（ErbB2）と結合すると確認されました。十のFabは組換え人エリスロポエチン・レセプター（Epo R）と結合すると確認されましたが、6のFabは組換え人P-カドヘリンと結合すると確認されました。それに加えて、3のFabは組換え人上皮成長因子2（ErbB2）と結合すると確認されましたが、3のFabは組換え人ノッチ1と結合すると確認されました。以下の表43は、初期ECL選り分けにおいて「ヒット」として確認された21のFab（重鎖及び軽鎖を包括します）をリストします。「ヒット」はシグナル対空白の比率が4以上であるFab抗体であります。単一Fab濃度での初期MSD測定選り分けの結果は以下の表44においてリストされます。表44は21Fab（Fab番号は表43において確認された各Fabと対応します）、Fab濃度、9組買え人標的/蛋白質抗原、及び既知のFab濃度での初期MSD測定選り分けからのECLシグナルをリストします。   
【０７９７】
【表４２】
2016127850.tif 000221
【０７９８】
【表４３】
2016127850.tif 000222
【０７９９】
【表４４】
2016127850.tif 000223
【０８００】
初期ECL選り分け（表42-44をご参考に）において確認された「ヒット」を確認するために、Fab濃度による滴定は行われて、Fab抗原の結合親和性を確定しました。測定過程は上述の例13に説明されたようであります。ただし、Fab抗体の濃度はウェルにより0.0628 nMから1.57 μMまで変化します。用量反応測定の結果は以下の表45-61において表示されます。以下の表62-76は15の組み替えられた抗-DLL4抗体（以下の表77の行22-36において表示されます）のための用量反応測定の結果をリストします。組み替えられた抗-DLL4抗体は、前に確認された生殖細胞系抗体と比べて、重鎖又は軽鎖においてせめて一つの変形を持っています。  
【０８０１】
【表４５】
2016127850.tif 000224
【０８０２】
【表４６】
2016127850.tif 000225
【０８０３】
【表４７】
2016127850.tif 000226
【０８０４】
【表４８】
2016127850.tif 000227
【０８０５】
【表４９】
2016127850.tif 000228
【０８０６】
【表５０】
2016127850.tif 000229
【０８０７】
【表５１】
2016127850.tif 000230
【０８０８】
【表５２】
2016127850.tif 000231
【０８０９】
【表５３】
2016127850.tif 000232
【０８１０】
【表５４】
2016127850.tif 000233
【０８１１】
【表５５】
2016127850.tif 000234
【０８１２】
【表５６】
2016127850.tif 000235
【０８１３】
【表５７】
2016127850.tif 000236
【０８１４】
【表５８】
2016127850.tif 000237
【０８１５】
【表５９】
2016127850.tif 000238
【０８１６】
【表６０】
2016127850.tif 000239
【０８１７】
【表６１】
2016127850.tif 000240
【０８１８】
【表６２】
2016127850.tif 000241
【０８１９】
【表６３】
2016127850.tif 000242
【０８２０】
【表６４】
2016127850.tif 000243
【０８２１】
【表６５】
2016127850.tif 000244
【０８２２】
【表６６】
2016127850.tif 000245
【０８２３】
【表６７】
2016127850.tif 000246
【０８２４】
【表６８】
2016127850.tif 000247
【０８２５】
【表６９】
2016127850.tif 000248
【０８２６】
【表７０】
2016127850.tif 000249
【０８２７】
【表７１】
2016127850.tif 000250
【０８２８】
【表７２】
2016127850.tif 000251
【０８２９】
【表７３】
2016127850.tif 000252
【０８３０】
【表７４】
2016127850.tif 000253
【０８３１】
【表７５】
2016127850.tif 000254
【０８３２】
【表７６】
2016127850.tif 000255
【０８３３】
まとめ
以下の表77はMSD測定の結果を纏めます。表77は、組換え人標的/蛋白質抗原及びこれらのFabを、それぞれの重鎖及び軽鎖（配列同一性番号を包括します）により指定されたように、リストします。以下の表77に示されたように、幾つかのFabは多標的と結合すると確認されました。例えば、Fab VH1-46_IGHD2-15*01_IGHJ2*01 & L12_IGKJ1*01はEGF R、Epo R及びDLL4と結合しますが、Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01はノッチ-1、P-カドヘリン及びDLL4と結合します。以下の表77は、DLL4と結合する15の他の組み替えられたFab（行22-36に表示されます）をリストします。
【０８３４】
【表７７】
2016127850.tif 000256
2016127850.tif 000257
【０８３５】
例16
表面プラスモン共鳴
この例において、選ばれたFab（表78-79をご参考に）が組み替えられた人DLL4（R&Dシステム）との結合親和性は、表面プラスモン共鳴（SPR）（バイオセンサー・ツール、ソルトレイクシティ、ユタ州）により分析されました。これらのFab（表78をご参考に）は、初期ECL選り分けにおいてDLL4と結合すると確認された生殖細胞系抗体、及び初期確認された抗-DLL4Fabと比べて重鎖又は軽鎖において一つ又はその以上の変形を含む組み替えられたFabを包括します。
【０８３６】
結果は以下の表79に表示されました。表79はFab (Fab番号により)、ka (M-1s-1)、kd (s-1)、KD (nM) 及び標準偏差（括弧で表示）をリストします。結果によれば、FabがDLL4との結合親和性は48.5 Nmから38 uMまでの範囲におります。清祥細胞系 Fab VH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01 & V3-4_IGLJ1*01は4.8 uMの平均KD を持っていますが、変形Fab VH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01_ G100K_G104T & V3-4_IGLJ1*01は改良された355 nMのKD を持っています。生殖系細胞Fab VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01 & L6_IGKJ1*01は、730 nMの平均KD を持っているDLL4と結合しますが、変形Fabs (以下の表78及び79の行5-6 及び8-10)は70.6 nMから388 nMまでわたる改良されたKDsを持っているDLL4と結合します。生殖系細胞Fab VH6-1_IGHD3-3*01_IGHJ4*01 & V4-3_IGLJ4*01は平均結合親和性が38 Umでありますが、生殖系細胞Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01は平均KD が500 nMであります。
【０８３７】
【表７８】
2016127850.tif 000258
【０８３８】
【表７９】
2016127850.tif 000259
【０８３９】
例17
DLL4-ノッチ相互作用の抑制
【０８４０】
この例において、前にDLL4と結合すると確認された四つのFabは、ノッチ-FcとDLL4との結合を閉鎖する能力のために機能的に選り分けられました。
このELLSA測定において、組み替えられた人DLL4がプレートと結合した後、Fab及びノッチ-Fcが加えられました。抗人FC-HRPと接合した抗体は、検出分子として使用されましたので、ノッチ-FcがDLL4と結合すれば、強いシグナルがA450で観測されます。代わりに、Fabがノッチ-FcとDLL4との結合を閉鎖することができれば、シグナルが観測されません。測定されたFabは、Fab VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F & L6_IGKJ1*01、Fab VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F_H111F & L6_IGKJ1*01、Fab VH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01_G100K_G104T & V3-4_IGLJ1*01、及びFab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01を包括します。
【０８４１】
要約すると、Maxisorp Nunc  96-ウェル・プレートは、0.5 μg/mlの組み替えられた人DLL4細胞外ドメーン（R&Dシステム）により最小2時間塗られていました。ウェルは洗われてから、4％のBSAにより閉鎖されました。閉鎖の後、濃度が0.004から5 μMまでのFabs VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F & L6_IGKJ1*01、VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F_H111F & L6_IGKJ1*01、VH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01_G100K_G104T & V3-4_IGLJ1*01、及びVH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01は、濃度が10 Nmである組み替えられた人Fc-ノッチ細胞外度メーン（R&Dシステム）と一緒に加えられました。一、二時間の培養の後、ウェルは洗われましたが、ノッチ結合は1：1000希釈度で鼠抗人FC-HRPと接合した抗体により測られました。HRP活性はTMB基質（Pierce）により検出された後、酸中和が発生しました。A450はSpectraMaxプラス384の上に測られました。
【０８４２】
結果によると、Fabs VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01 _S102A_S103P_S104F & L6_IGKJ1*01、VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01 _S102A_S103P_S104F_H111F & L6_IGKJ1*01、又はVH5-51_IGHD5-18*01>3_ IGHJ4*01_G100K_G104T & V3-4_IGLJ1*01の添加は、低減したシグナルを引き起こし、ノッチ-FcとDLL4との結合を閉鎖するそれらの能力を示しました。Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01の添加は、活性の損失を引き起こさなく、Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01がノッチ-DLL4の相互作用を閉鎖しないことを示しました。この結果によると、Fabs VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F & L6_IGKJ1*01、VH1-46_IGHD6-6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F_H111F & L6_IGKJ1*01又はVH5-51_IGHD5-18*01>3_IGHJ4*01_G100K_G104T & V3-4_IGLJ1*01は、Fab VH1-46_IGHD3-10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01と比べて、DLL4のそれぞれの抗原分子と結合します。
【０８４３】
例18
レセプター刺激のためのEpoR細胞を基にする測定
【０８４４】
この例において、各Fabは、細胞を基にする測定により、エリスロポエチン・レセプターを刺激するそれらの能力のために分析されました。使用された細胞系は、人エリスロポエチン・レセプター（EpoR）により形質移入されたBa/F3細胞、及びEpoRを欠けた母Ba/F3細胞を包括しました。母Ba/F3細胞はレセプターアゴニストに反応しませんでしたが、二つの細胞系は成長するにはIL-3を必要としていました。
【０８４５】
要するに、Ba/F3細胞（EpoR付き及び付きなし）はRPMI 1640媒介において10% FBS、抗生物質、及び5 ng/Lの組み替えられた鼠IL-3により増殖され、IL-3 を欠けた同量の媒介を洗い、50 μlで5000細胞/ウェルで96のウェル・プレートへめっきされました。めっきの後、細胞は10 μlのFab、アゴニスト制御子EMP16（TYSCHFGPLTWVCKPQ、配列同一性番号3735）、又は媒介により処理されてから、37 °Cで湿度5％のCO2環境において四日間成長しました。 細胞の生育性及び増殖性を測るために、レサズリンを基にする生育性測定試薬がテストウェルに加えられ、24時間続けました。代謝活性細胞による試薬の減少は容易に定量化できる蛍光分子レゾルフィンを生じました。各処理の平均蛍光性は、媒介制御の平均蛍光性により分けられ、倍増増殖を齎しました。  
【０８４６】
結果によると、40 nM Fab VH1-46_IGHD2-15*01_IGHJ2*01 & L2_IGKJ1*01はレセプターによる増殖を示しましたが、54 nM Fab VH1-46_IGHD6-13*01_IGHJ4*01 & O1_IGKJ1*01はレセプター発見の細胞にも母細胞にも媒介の上における増殖を殆ど示しませんでした。2.5 μMの濃度で加えられた既知のレセプター・アゴニスト・ペプチドEMP16 （TYSCHFGPLTWVCKPQ、配列同一性番号3735）は強い細胞増殖を示しました。 
【０８４７】
例19
DLL4/Jag1の抑制
【０８４８】
この例は、ノッチ通路の活性化がC2C12 筋芽細胞差異化を防ぐという細胞測定を説明します（Jarriaultなど、1998 分子及び細胞生物学、18:7423-7431をご参考に）。ノッチ通路を活性化するために、ノッチリガンド（例えば、DLL4又はJag1）は細胞表面の上に全長さ蛋白質として発見されなければなりません。このノッチ活性化を実現するために、ノッチリガンドDLL4又はJag1を自然的にまたは異常的に発見する非粘着性細胞は、C2C12細胞及び選ばれたFabと共同に培養されます。DLL4又はJag1の機能抑制は差異化を促進するというFabの能力により評価され、ノッチ通路の不活性化を示しました。チューブ様構造への差異化は形態上から簡単に識別されますが、トロポニンT（シグマ・アルドリッチ）に反する抗体により検出されることができます。 
【０８４９】
要するに、C2C12鼠筋芽細胞は、IM9細胞(人リンパ球細胞系)及びFabを発見するJag1がある場合及びない場合に培養されます。これらの細胞は、10％のFBS（ウシ胎児血清）における12のウェル皿におけるカバーガラスの上にめっきされます。翌日、附着したC2C12細胞は1％のFBSを含むDMEMの中に移転され、差異化を引き起こします。培養の後、これらの細胞は視覚化されるので、筋管への差異化が発生かどうか観測することができます。低い血清状態は筋管の差異化を引き起こしますが、Jag1を発見するIM9細胞は低い血清状態でC2C12細胞の無差異化状態を維持します。  
【０８５０】
例20
p-カドヘリンの抑制
【０８５１】
この例は、P-カドヘリンを抑制する抗体の能力が細胞群生の失敗により観測されたという細胞測定を説明します。P-カドヘリンは細胞間粘着に関わるので、P-カドヘリンの抑制は細胞分散を引き起こします。
【０８５２】
要するに、A431表皮腫瘍細胞は10％FBSのDMEMにおいて10000細胞/ウェル(96-ウェル)で96-ウェル皿へめっきされます。翌日、Fabは100 μg/mlでウェルに加えられます。p-カドヘリン抗体（Abcam）を閉鎖する機能は正の制御として使用されますが、10％FBSのDMEM自身は負の制御として使用されます（Shimoyama、Y.など、1989 癌研究、49:2128-2133をご参考に）。三時間後細胞は「分散」のために検査され、写真を撮られます。媒介により培養された細胞は重要な「群生」だけを展示しますが、抗-P-カドヘリンFab又は抗体により培養された細胞は分散されます。
【０８５３】
修正必要の所々が専門家から見れば明らかですから、この発明は付録要求の範囲内に限定する希望です。
【図１】
2016127850.tif 000260
【図２Ａ】
2016127850.tif 000261
【図２Ｂ】
2016127850.tif 000262
【図３】
2016127850.tif 000263
【図４】
2016127850.tif 000264
【図５】
2016127850.tif 000265
【図６】
2016127850.tif 000266
【図７】
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【図８】
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【図９】
2016127850.tif 000269
【図１０】
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【図１１】
2016127850.tif 000271
【図１２】
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【図１３】
2016127850.tif 000273
【図１４】
2016127850.tif 000274
【図１５】
2016127850.tif 000275
【図１６】
2016127850.tif 000276
【図１７】
2016127850.tif 000277
【図１８】
2016127850.tif 000278
【図１９】
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【図２０】
2016127850.tif 000280
【配列表】
2016127850000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月4日(2016.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)          ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、並びにVH鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、インフレームでVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を組合せることと、
b)          VL鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態をインフレームで組合せることと、
段階a)及びb)において、VHの各部分、VH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列、JH、Vk、Jk、Vl又はJlが、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、並びに、
セグメントは、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びVH鎖をコードする核酸分子のJH生殖細胞系セグメントが、直接的又は間接的に連結されるよう直接的又は間接的に組合わされ、VHセグメントは、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であり、
c)          複数の様々な核酸分子配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、
d)          第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、及び第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む、2つのアドレス可能なライブラリーを生成することと、
e)          第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子をアドレス指定された細胞に導入し、各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、アドレス指定された細胞のライブラリーを生成するため、これを数回繰り返すことと、並びに
f)          ライブラリーの各抗体又はその部分が、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、VH及びVL鎖の様々な組合せ又はその十分な部分を含み、
複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに
各位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及びあらゆる位置の抗体とは異なり、
抗体又はその部分の同定は、そのアドレスで知られる、複数の抗体又はその部分を産生する、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２】
VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに／又はVH及びJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、V−D及び／又はD−J結合部でペプチドリンカーをコードするヌクレオチドによって間接的に連結される、請求項１に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３】
VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに／又はVHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、停止コドンを除去するために修飾される、請求項271又は請求項２に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：10−238から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−３に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５】
VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその部分、その縮重コドンまたはその修飾形態である、請求項４に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６】
VHとJHの間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン或いは反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項１−５のいずれかに記載のヒト組合せライブラリーを生成する方法。
【請求項７】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態のいずれかから選択され、或いはその反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項１−６のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８】
反転DH生殖細胞系セグメントは、配列識別番号：3462−3488のいずれかから選択される、請求項１−７のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項９】
DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項１−８のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１０】
JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：273−285から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−９のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１１】
JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾体を含む、請求項１０に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１２】
修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：3450−3455のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１３】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：365−441又はその部分から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−１２のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１４】
Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：442−451から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−１３のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１５】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：286−355及び868から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−１４のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１６】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：356−364から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項１−１５のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１７】
第一のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで各核酸分子は、別の発現ベクターで含有され、並びに、第二のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで核酸分子は、別の発現ベクターで含有される、請求項１−１６のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１８】
ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項１７に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項１９】
細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項１−１８のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２０】
細胞が大腸菌細胞である、請求項１−１９のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２１】
アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項１−２０のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２２】
空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、アドレス指定された細胞のライブラリーで他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項２１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２３】
発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項１−２２のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２４】
発現される抗体がFabである、請求項１−２３のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２５】
抗体又はその部分を更に精製する、請求項１−２４のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２６】
ライブラリーにおける精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項２５に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２７】
a)VH鎖又をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、
b)VH鎖をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はそぼ部分、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、
段階a)及びb)において、VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJl の各部分が、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、
c)複数の異なる核酸分子の配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、
d)第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、並びに第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む2つのライブラリーを作るため核酸分子を合成することと、
e)各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からのVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子を細胞に導入し、これを数回繰り返して細胞のライブラリーを作ることと、並びに
f)ライブラリーの各抗体又はその部分が、様々な組合せのVH及びVL鎖又はその十分な部分を含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成し、複数の抗体又はその部分を産生して、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを産生する方法。
【請求項２８】
段階d)において、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定されたライブラリーを生成する、合成された核酸配列が個々にアドレス指定され、
段階e)において、細胞がアドレス指定され、各位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーにおける他の全部の細胞から、様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含有する細胞を含み、並びに
段階f)において、複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、ライブラリーのそれぞれの位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及び他の全ての位置でこれらは異なり、並びに
抗体又はその部分の同定が、そのアドレスによって知られる、ライブラリーがアドレス可能なライブラリーである、請求項２７に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項２９】
段階a)において、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分が、VHセグメントは、DHへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう組み合わされ、並びに
段階b)において、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメント又はその部分が、VkセグメントはJkセグメントに5’で、或いはVlセグメントはJlセグメントへ5’であるよう連結される、
請求項２７又は請求項２８に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３０】
段階a)−b)が、アルゴリズムを実行するようコンピュータプログラムされることによって行われる、請求項２７−２９のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３１】
段階a)が、
i)  VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、
ii)DH生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でVH及び／又はDHの生殖細胞系配列を修飾することによるV−D結合部を生成することと、
iii)       JHのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でDH及び／又はJHの生殖細胞系配列を修飾することによるD−J結合部を生成することと、
iv)VH鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVH、DH及びJHを組み合わせることとを含む、請求項２７−３０のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３２】
V−D結合部が、DHの5’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３３】
V−D結合部が、VHの3’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３４】
V−D結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することによって生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３５】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項３４に記載の方法
【請求項３６】
D−J結合部が、JHの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３７】
D−J結合部が、DHの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３８】
D−J結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項３１に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項３９】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項３８に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４０】
段階b)が、
i) Vk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、
ii)        Jkのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVk又はJkの生殖細胞系配列を修飾することにより、或いはJlのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVl又はJl の生殖細胞系配列を修飾することにより、V−J結合部を生成することと、並びに
iii)       VL鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVk及びJk又はVl及びJlを組み合わせることとを含む、請求項２７−３０のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４１】
V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項４０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４２】
V−J結合部が、Vk又はVlの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項４０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４３】
V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項４０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４４】
ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
段階a)を数回繰り返すことが、
N1、N2及びN3は、全て又は一部のVH、DH又はJH生殖細胞系セグメントであり得る多数の生殖細胞系セグメントであり、並びに
N1、N2及びN3が、同じ又は異なり得て、
N1の異なるVH生殖細胞系セグメントを選択することと、
N2の異なるDH生殖細胞系セグメントを選択することと、
N3の異なるJH生殖細胞系セグメントを選択することとを含み、並びに
VH鎖をコードするN1 x N2 x N3の異なる核酸配列を生成するため、全ての可能なVH、DH及びJHの組合せを組合せる、請求項２７−４４のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４６】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項２７−４５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４７】
VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：10−238から選択される、請求項４６に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４８】
DH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子又はその対立遺伝子から選択される、請求項２７−４５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項４９】
DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：239−272のいずれかから選択される、請求項４８に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５０】
JH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項２７−４５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５１】
JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号：273−285のいずれかから選択される、請求項５０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５２】
一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項４５−５１のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５３】
一部の生殖細胞系セグメントが遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項５２に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５４】
VH遺伝子ファミリーが、IGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81から選択され、
DH遺伝子ファミリーが、IGHD1-1、IGHD1-14、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及びIGHD7-27から選択され、並びに
JH遺伝子ファミリーが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択され、
各々のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、
一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメント或いは一部のVH、DH及び／又はJH遺伝子から1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項５３に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５５】
段階b)を数回繰り返すことが、
N1、N2、N3及びN4が、全て又は一部のVl、Jl、Vk、Jk生殖細胞系セグメントになり得る生殖細胞系セグメントの数であり、並びに
N1、N2、N3及びN4が、同じ又は異なり得て、
N1(数)の異なるVl生殖細胞系セグメントを選択すること及びN2の異なるJl 生殖細胞系セグメントを選択することと、又は
N3の異なるVk生殖細胞系セグメントを選択すること及びN4の異なるJk生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに
VL鎖をコードするN1 x N2の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVl又はJlの組み合わせを組み合わせ、或いはVL鎖をコードするN3 x N4の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVk及びJkを組み合わせることとを含む、請求項２７−４４のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５６】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項３０−４４及び５５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５７】
Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：365‐441から選択される、請求項５６に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５８】
Jl生殖細胞系セグメントが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項３０−４４及び請求項５５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項５９】
Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：442−451から選択される、請求項５８に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６０】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項３０−４４及び５５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６１】
Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：283−355及び868から選択される、請求項６０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６２】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子又は対立遺伝子から選択される、請求項３０−４４及び５５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６３】
Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号：356−364から選択される、請求項６２に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６４】
一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、組成、CDR長さ又は組成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項５５−６３のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６５】
Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、IGKV1-12 、IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 IGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41及びIGKV1-39から選択され、
Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、
Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、IGLV1-40 、IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びに
Jl遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、各Vk及び／又はJk或いはVl及び／又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞セグメントが選択され、或いは一部のVk及び／又はJk若しくはVl及び／又はJl遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、生殖細胞系セグメントが、遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項６４に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６６】
生殖細胞系セグメントが、ユーザ作成のデータベースで示される、請求項２７−６５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６７】
データベースのJH、Jk及びJl生殖細胞系セグメントの配列が、それらの正しいリーディングフレームで示される、請求項６６に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６８】
更に、段階a)及び／又は段階b)において、あらゆる停止コドンを除去することにより、VH鎖又はその部分及び／又はVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾することを含む、請求項２７−６７のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項６９】
停止コドンTAAが、TATに修飾され、停止コドンTAGがTATに修飾され、及び停止コドンTGAがTCAに修飾される、請求項６８に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７０】
段階a)及び／又は段階b)において、あらゆる制限酵素部位を除去することにより、VH鎖をコードする核酸分子又はその部分及び／若しくはVL鎖をコードする核酸分子又はその部分を修飾することを更に含む、請求項２７−６９のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７１】
制限酵素部位が、大腸菌K12でコドン使用を最大にするため修飾される、請求項７０に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７２】
VH鎖をコードする複数の異なる核酸分子間及び核酸分子中における配列の類似性並びに／又はVL鎖をコードする複数の異なる核酸分子間又は核酸分子中における配列の類似性を決定することを更に含む、請求項２７−７１のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７３】
配列の類似性に基づいて、最も類似する又は最も異なるVH鎖をコードする一部の核酸配列及び／又はVL鎖をコードする一部の核酸配列を選択する、請求項７２に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７４】
ライブラリーの合成された核酸配列がベクターで含まれる、請求項２７−７３のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７５】
ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項７４に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７６】
細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項２７−７５のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７７】
細胞が大腸菌細胞である、請求項２７−７６のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７８】
アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項２８−７７のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項７９】
空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーで、他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項７８に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８０】
発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項２７−７９のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８１】
発現される抗体がFabである、請求項２７−７９のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８２】
抗体又はその部分を更に精製する、請求項２７−８１のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８３】
ライブラリーの精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項８２に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【請求項８４】
精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに
各アドレス内の抗体が同じ抗体であり及び他の全てのアドレスの抗体とは異なる、請求項８２又は請求項８３に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。
【外国語明細書】
2016127850000001.pdf