(57)【要約】【課題】水溶性を向上させることにより、高い蛍光強度を与える蛍光色素を提供すること。【解決手段】本発明の蛍光色素は、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）を有するアゾール誘導体であり、水溶性が向上し、高い蛍光強度を与える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるアゾール誘導体から成る蛍光色素。
【化１】
2016196608.tif 000017
（式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、一般式Ｌ１−Ｍ１で示され、
Ｍ１は、置換または無置換のピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換または無置換のピリジル基、２級アミノ基、３級アミノ基、ピペリジル基、ピペラジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、キノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基又はベンゾオキサゾリル基である窒素含有基を示し、
Ｌ１は、Ｍ１と中心ピリジン環または中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示し、
式（２）のＲ１とＲ４の残部は、水素原子、ハロゲン原子、置換または無置換の芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、
式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、両方または一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）、他方が、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基を示し、
Ｘは置換または無置換の窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、
Ｒ’は芳香環で置換または無置換のアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−又はＰＦ６−を示す。）
【請求項２】
前記Ｒ２および前記Ｒ３が、前記の一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基である請求項１記載の蛍光色素。
【請求項３】
前記Ｌ１が、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−である請求項２記載の蛍光色素。
【請求項４】
前記一般式（１）、（２）、または（３）の前記Ｒ２および前記Ｒ３の一方が、前記の一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり、他方が置換または無置換のピリジル基である請求項１記載の蛍光色素。
【請求項５】
前記Ｌ１が、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−からなる群から選択された１種以上の官能基である、請求項１記載の蛍光色素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる蛍光色素であって、固体状態で発光し、水溶性を有する蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムの全容が明らかにされ、遺伝子治療、遺伝子診断などを目的としたポストゲノム研究が盛んに行われている。例えば、ＤＮＡ解析は、ＤＮＡマイクロアレイ基盤上に固定されたプローブＤＮＡと、蛍光色素等で標識されたサンプルＤＮＡとをハイブリダイズさせて二本鎖を形成させ、サンプルＤＮＡの検出を行っている。これは蛍光色素で標識した核酸をＰＣＲ伸長し、基盤上でハイブリダイゼーションを行った後に測定する手法である。最近では、より多くのアミノ基を有するプライマーを用いた手法、ＤＮＡにアミノ基を導入する手法がとられている。
【０００３】
標識には、蛍光色素が広く使用されており、高い蛍光強度を有すること、乾燥状態（固体状態）でも発光すること、そして水溶性を有することなどが要求されている。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ３やＣｙ５が使用されている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Science 283,1,January,1999,83-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、乾燥状態でも発光する蛍光色素は油溶性であり、水溶性が低いという問題がある。そのため、試料溶液に蛍光色素が十分溶解することができず、標識率が上がらない結果、十分な蛍光強度が得られないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明の一の態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるアゾール誘導体から成ることを特徴とする。
【０００７】
【化１】
2016196608.tif 000003
【０００８】
式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、一般式Ｌ１−Ｍ１で示され、
Ｍ１は、置換または無置換のピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換または無置換のピリジル基、２級アミノ基、３級アミノ基、ピペリジル基、ピペラジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、キノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基又はベンゾオキサゾリル基である窒素含有基を示し、
Ｌ１は、Ｍ１と中心ピリジン環または中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示し、
式（２）のＲ１とＲ４の残部は、水素原子、ハロゲン原子、置換または無置換の芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、
式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、両方または一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）、他方が、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基を示し、
Ｘは置換または無置換の窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、
Ｒ’は芳香環で置換されたまたは無置換のアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−又はＰＦ６−を示す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の蛍光色素は、共役系を有し、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体からなる有機ＥＬ色素であり、ポリオキシアルキレン基を有している。その高い水溶性により、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。これにより使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる。また、有機ＥＬ色素は固体状態（固体及び半固体を含む）で高い量子収率を有しているので、マイクロアレイなどの基盤上、もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、有機ＥＬ色素はＣｙ３やＣｙ５に比べ安価であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことができる。また、Ｃｙ３やＣｙ５は冷凍保存する必要があるのに対し、有機ＥＬ色素は化学的に安定であり、常温での長期保存に耐えることができるので、取り扱いが容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の蛍光色素の蛍光スペクトルの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
実施の形態１．
本実施の形態に係る蛍光色素は、アゾール誘導体からなる蛍光色素であり、以下の一般式（１）、（２）、（３）で示すことができる。
【００１２】
【化２】
2016196608.tif 000004
【００１３】
式（１）および式（３）ではＲ１は、そして式（２）ではＲ１とＲ４の一方は、一般式Ｌ１−Ｍ１で示され、Ｍ１は、置換または無置換のピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換または無置換のピリジル基、２級アミノ基、３級アミノ基、ピペリジル基、ピペラジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、キノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基又はベンゾオキサゾリル基である窒素含有基を示し、Ｌ１は、Ｍ１と中心ピリジン環または中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示し、式（２）のＲ１とＲ４の残部は、水素原子、ハロゲン原子、置換または無置換の芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、式（１）から式（３）のＲ２およびＲ３は、両方または一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）、他方が、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基を示し、Ｘは置換または無置換の窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、Ｒ’は芳香環で置換されたまたは無置換のアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−又はＰＦ６−を示す。リンカーは、発色部と標識対象である生体分子との間の立体障害を緩和させ、結合部と生体分子の標識部位との結合を容易にするので、より高い標識率を与えることが可能である。
【００１４】
Ｒ２およびＲ３の一方または両方は、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基である。一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基は、Ｅが炭素数１から４のアルキル基、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、およびイソブチル基であり、好ましくはメチル基またはエチル基、より好ましくはメチル基である。また、ｐは、１〜４０の整数、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜７の整数である。Ｒ２および／またはＲ３にポリオキシアルキレン基を導入することにより、蛍光色素の水溶性を増大させることが可能となる。
【００１５】
また、Ｒ２およびＲ３の一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基である場合、他方は、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基である。好ましくは、ピリジル基またはイミダゾリル基であり、より好ましくはピリジル基である。ピリジル基はピリジニウム基に変換可能であるので、蛍光色素の水溶性をさらに向上させることができる。なお、置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、または芳香族炭化水素基を挙げることができる。置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。
【００１６】
なお、上記の窒素カチオン含有基または窒素含有基が置換基を含む場合、その置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、または芳香族炭化水素基を挙げることができる。その置換基の具体例としては、前段に記載したものを挙げることができる。
【００１７】
（製造方法）
本実施の形態の蛍光色素は、ヒドロキシル基を有するアゾール誘導体の前駆体またはヒドロキシル基を有するアゾール誘導体とポリエチレングリコールアルキルエーテルとを反応させることで、ポリオキシアルキレン基を導入することができる。また、窒素含有基としてピリジル基を含む場合（以下、ピリジン体という）、アゾール誘導体の前駆体にジケトン体を用い、ジケトン体とピリジン化合物を反応させる方法や、アゾール誘導体の前駆体にハロゲン体を用い、ハロゲン体とピリジン化合物を反応させる方法を用いることができる。また、窒素カチオン含有基として、ピリジニウム基を含む場合には、そのピリジル体と、活性エステルのブロモ体とを反応させて、ピリジニウム塩を得ることにより製造することができる。
【００１８】
上記の方法は、窒素カチオン含有基の場合、活性エステルのブロモ体を用い、以下に述べる結合部となる活性エステルを含むピリジニウム塩を得る方法について説明したが、上記において導入したピリジンにヨウ化メチルなどのハロアルカン類、ハロアルケン類あるいはハロカルボン酸類を反応させることによりピリジニウム塩を製造することもできる。この場合、ハロアルカン類、ハロアルケン類の末端にイソチオシアネート基、無水マレイン酸などの、以下に述べる結合部となる官能基を含む場合、生体分子と結合させることができる。また、ハロカルボン酸類を用いた場合、ピリジンに化学結合させることで末端にカルボン酸を有するピリジニウム体となるため、ヒドロキシスクシンイミドなどの活性エステル基を導入することもできる。
【００１９】
また、本実施の形態の蛍光色素に生体分子に結合する結合部を設けることもできる。結合部は例えば窒素カチオン含有基又は窒素含有基に設けることができる。結合部は、生体分子と結合する反応性基を有し、その反応性基は共有結合又はイオン結合により生体分子と結合する。
【００２０】
共有結合として、例えばアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、又はグアニジン結合を形成する場合、反応性基には、生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基、カルボキシル基又はヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水マレイン酸基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基又は活性エステル化したカルボニル基である。これら反応性基と反応する窒素カチオン含有基の官能基としては、例えばカルボキシル基を用いることができる。例えば、活性エステル化したカルボニル基には、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドを用い、縮合剤としてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いることによりＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子が結合する。また、カルボジイミド基には、ＤＣＣや１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子とを結合させることができる。
【００２１】
また、イオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基やカチオン性基を用いることができる。アニオン性基としては、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。また、カチオン性基としては、４級アンモニウム基やピリジニウム基等の窒素カチオン含有基を用いることができる。これらカチオン性基は、生体分子のアニオン性基、例えばカルボキシル基とイオン結合する。なお、本発明においては、中心ピリジン環または中心ベンゼン環に結合した窒素カチオン含有基が反応性基としてのカチオン性基を兼ねることができる。
【００２２】
本実施の形態によれば、蛍光色素が高い水溶性を有しているので、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。
【００２３】
実施の形態２．
本実施の形態に係る蛍光色素は、アゾール誘導体からなる蛍光色素であり、以下の一般式（４）、（５）、（６）で示すことができる。
【００２４】
【化３】
2016196608.tif 000005
【００２５】
本実施の形態の蛍光色素は、Ｌ１に、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）で表される官能基を用いた以外は、実施の形態１の蛍光色素と同様の構造を有する。ここで、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示す。好ましくは、Ｒ６は、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基であり、より好ましくは置換または無置換のピリジニウム基である。ピリジニウム基を用いることにより、蛍光色素の水溶性をさらに向上させることができる。
【００２６】
（製造方法）
本発明の蛍光色素は、例えば窒素含有基としてピリジル基を含む場合、以下の方法により製造することができる。すなわち、アゾール誘導体のハロアルキル体とトリフェニルホスフィンとを反応させてホスホニウム塩を調製し、このホスホニウム塩とフォルミルピリジンとを用いてウィッティヒ反応により二重結合を介してピリジル基を導入してピリジル体を得る。また、窒素カチオン含有基として、ピリジニウム基を含む場合には、そのピリジル体と、活性エステルのブロモ体とを反応させて、ピリジニウム塩を得ることにより製造することができる。ここで、ハロアルキル体は、アゾール誘導体のヒドロキシ体にハロゲン化剤を反応させる方法を用いることにより得ることができる。ハロゲン化剤には、塩化チオニル、塩化ホスホリル、三塩化リン、五塩化リン、塩化スルフリル、塩素、臭化チオニル、臭素等を用いることができ、好ましくは塩化チオニル又は塩化ホスホリルである。
【００２７】
本実施の形態においても、実施の形態１の場合と同様の効果を有する。すなわち、蛍光色素が高い水溶性を有しているので、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。
【００２８】
実施の形態３
実施の形態１，２では、アゾール誘導体として、ジアゾール誘導体の例を示したが、以下の一般式で表されるトリアゾール誘導体を用いることもできる。トリアゾール誘導体を用いても、ジアゾール誘導体の場合と同様の効果を得ることができる。
【００２９】
【化４】
2016196608.tif 000006
【００３０】
式（７）および式（９）ではＲ１は、そして式（８）ではＲ１とＲ７の一方は、一般式Ｌ２−Ｍ２で示され、Ｍ２は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換基を有してもよいピリジル基、２級アミノ基、３級アミノ基、ピペリジル基、ピペラジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、キノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基又はベンゾオキサゾリル基である窒素含有基を示し、Ｌ２は、Ｍ２と中心ピリジン環または中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示し、式（８）のＲ１とＲ７の残部は、水素原子、ハロゲン原子、置換または無置換の芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、式（７）から式（９）のＲ２およびＲ３は、少なくとも一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）、他方が、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基を示し、Ｘは置換または無置換の窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、Ｒ’は芳香環で置換されたまたは無置換のアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−又はＰＦ６−を示す。
【００３１】
なお、置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、または芳香族炭化水素基を挙げることができる。置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。
【００３２】
本実施の形態においても、実施の形態１の場合と同様の効果を有する。すなわち、蛍光色素が高い水溶性を有しているので、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。
【００３３】
参考形態
本参考形態に係る蛍光色素は、イミダゾール誘導体から成る蛍光色素であり、以下の一般式（１０）〜（１３）で示すことができる。イミダゾール誘導体を用いても、実施の形態１の場合と同様の効果を得ることができる。
【化５】
2016196608.tif 000007
【００３４】
ここで、式（１０）、（１２）および（１３）のＲ１とＲ４の一方、そして式（１１）のＲ１、Ｒ４およびＲ５のいずれか一つは、一般式Ｌ３−Ｍ３で示され、Ｍ３は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換基を有してもよいピリジル基、２級アミノ基、３級アミノ基、ピペリジル基、ピペラジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、キノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基又はベンゾオキサゾリル基である窒素含有基を示し、Ｌ３は、Ｍ３と中心ピリジン環または中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、あるいは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１から４の整数）、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ（Ｒはアルキル基）、−Ａｒ−（Ａｒは芳香族炭化水素基）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、−（ＣＨ＝ＣＲ６）ｍ−（ｍは１から５の整数）からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ６は、水素原子、置換または無置換の炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基、置換または無置換のスルホ基、置換または無置換のイミダゾリウム基、ピリジニウム基およびフラン基からなる群から選択された１種の複素環基、置換または無置換の２級アミノ基、３級アミノ基および４級アミノ基からなる群から選択されたアミノ基、置換または無置換のヒドロキシ基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアルデヒド基、置換または無置換のカルボキシル基、および置換または無置換の芳香族基からなる群から選択される１種を示し、式（１０）、（１２）および（１３）のＲ１とＲ４の残部、そして式（１１）のＲ１、Ｒ４およびＲ５の残部は、水素原子、ハロゲン原子、置換または無置換の芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、式（１０）から式（１３）のＲ２およびＲ３は、少なくとも一方が、一般式Ｅ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−で表されるポリオキシアルキレン基であり（Ｅは炭素数１から４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数）、他方が、置換または無置換のチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基を示し、Ｘは置換または無置換の窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−又はＰＦ６−を示す。また、Ｒ’、Ｒ”は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、その脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
【００３５】
なお、置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、または芳香族炭化水素基を挙げることができる。置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。
【００３６】
本参考形態においても、実施の形態１の場合と同様の効果を有する。すなわち、蛍光色素が高い水溶性を有しているので、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。
【００３７】
（用途）
本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするＤＮＡマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるＰＣＲ法に用いることができる。
【００３８】
また、タンパク質を検出対象とする場合、通常、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を浸透させてタンパク質を染色し、ＵＶを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が１００ｎｇ程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いると高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。
【００３９】
ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の蛍光色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、ＴＯＦ−Ｍａｓｓ等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、本発明の蛍光色素を用いてコラーゲンを標識することにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。
【００４０】
また、タンパク質と特異的に結合する抗体を本発明の蛍光色素で標識することにより、タンパク質を標識することもできる。例えば、ＩｇＧ抗体をペプシンで処理するとＦ（ａｂ’）２と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとＦａｂ’と呼ばれるフラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは1つもしくは２つのチオール基（−ＳＨ）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、本発明の蛍光色素に反応性基としてマレイミド基を導入し、フラグメントのチオール基と反応させることにより抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。
【００４１】
なお、本発明の蛍光色素でアプタマーを標識することもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、本発明の蛍光色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検出物質との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検出物質を検出することができる。
【００４２】
また、本発明の蛍光色素を用いて金属イオンの検出を行うこともできる。体内のＤＮＡやタンパク質などの安定性や高次構造の維持、機能発現、そして生体内のすべての化学反応を司る酵素の活性化など、生体内で起こるあらゆる生命現象に金属イオンは関与している。そのため、生体内での金属イオンの動きをリアルタイムで観察できる金属イオンセンサは医療分野を初めとしてその重要性が叫ばれている。従来、生体分子に蛍光色素を導入した金属イオンセンサが知られている。例えば、Ｋ＋イオン存在化において、Ｋ＋イオン取り込んで特殊な構造をとる配列を有する核酸を利用する金属イオンセンサが提案されている（J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 14286-14287）。エネルギートランスファーを起こす蛍光色素を核酸の両端に導入する。通常は色素間距離があるためエネルギートランスファーは起きない。しかし、Ｋ＋イオン存在下では核酸が特殊な形をとる結果、蛍光色素がエネルギートランスファーを起こす距離に近接することで、蛍光を観察することができる。また、ペプチドに蛍光色素を導入した亜鉛イオンセンサも提案されている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3053-3054）。これらの従来の蛍光色素に代えて本発明の蛍光色素を用いることにより、従来に比べ高感度で取り扱いが容易な金属イオンセンサを提供することが可能となる。なお、生体内に存在する金属イオンであれば、すべての金属イオンを検出することが可能である。
【００４３】
また、本発明の蛍光色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このＣａ２＋依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。
【００４４】
ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではＧ−タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の有機EL色素からなる標識色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。
【００４５】
また、本発明の蛍光色素を、組織又は細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織又は細胞の染色色素としても用いることができる。すなわち、本発明の染色色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ソリゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。
【００４６】
また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Ｃｙ色素及びＡｌｅｘａ色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ本発明の蛍光色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。
【００４７】
また、ガンや感染症等の診断には、抗体の特異的認識能を利用したイムノアッセイが用いられている。イムノアッセイは、標識抗体を用いて目的の抗原を検出する方法であり、標識物質に酵素を用いる酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）や標識物質に蛍光色素を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）等が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、最終的な検出は標識物質である酵素の反応によって生じるさまざまなシグナル（発色、発光、化学発光等）を検出及び定量することにより行う。一方、ＦＩＡ法は、標識物質である蛍光色素に励起光を照射し、それによる蛍光を検出及び定量することにより行う。ＦＩＡ法は蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し定量性に優れ、またＥＬＩＳＡ法に比べ、より短時間での検出が可能でかつ操作も簡便であるという特徴を有している。しかしながら、従来の蛍光色素は標識率が低いという問題がある。例えば、抗体に対して２００倍モル程度の蛍光色素を用いているが、この条件下においても標識率は５０−６０％程度であった。そのため、蛍光色素を大量に使用する必要があるため検出費用が高コストになったり、未反応の蛍光色素を除去するための処理工程が必要となり検出に長時間を要するという問題があった。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、標識率を向上させることができるので、より高感度の検出を行うことが可能となる。
【００４８】
また、本発明の蛍光色素を化粧用組成物に用いることもできる。蛍光色素を含む化粧用組成物は、夜間や室内における演出用の化粧としてだけでなく、蛍光色素の明色化効果を利用して、ファンデーションや毛髪の染色剤等に用いられている。ここで、明色化効果とは、蛍光色素が紫外光を吸収して可視光を放出して、皮膚や毛髪に明るさや鮮やかさを与える効果をいう。日本の室内照明には、昼光色や白色の蛍光灯が使われているが、これらの蛍光灯からの光は、青や緑が主であり赤が少ない。そのため、女性の化粧肌は青白くくすんで見えるという問題がある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、例えば、橙色の光を放出する蛍光色素を用い、鮮やかな赤味の色を発色させてくすみの解消を図ることが可能である。また、毛髪の染色に用いると、蛍光色素は可視領域の放出光線により毛髪の色を変えるだけでなく、毛髪の輝きを増加させることも可能である。
【００４９】
また、本発明の蛍光色素をマーキング剤に用いることもできる。本発明の蛍光色素を含むマーキング剤は、通常の可視光下では不可視であるが、紫外線等の励起光を照射することにより蛍光色素を発光させて視認することができる。この性質を利用し、犯罪防止や犯罪捜査を目的として、物品や人体等の識別や物質の検出等に使用することができる。マーキング剤の対象物には、偽造や盗難等の犯罪の防止や犯罪捜査の対象となる物品や人体が含まれる。例えば、紙幣、小切手、株券、各種証明書等の重要文書や、自動車、オートバイ、自転車、美術品、家具、ブランド品、衣服等の物品、人体の皮膚、頭髪、爪等の身体表面部分、潜在指紋等の遺留物質等を挙げることができる。さらに、対象物を構成する材料に関しては、上質紙、ＯＣＲ紙、ノーカーボン紙、アート紙等の紙や、塩化ビニル、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等のプラスチックや、金属や、ガラスや、セラミックスや、羊毛、木綿、絹、麻等の天然繊維や、再生セルロース繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリアミド繊維、ポリエステル繊維等の合成繊維や、人体皮膚や体液中のタンパク質等を挙げることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例により限定されるものではない。
【００５１】
合成例１
以下に、４−フェニル−７−ピリジル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールのポリオキシアルキレン置換体の合成例を示す。
【００５２】
【化６】
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【００５３】
（１）化合物（２）の合成
５０ｍＬの三口フラスコに４，７−ジブロモ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール（１）１．０ｇ（３．４ｍｍｏｌ）、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル)ピリジン０．７ｇ（３．４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。その後、２Ｍ炭酸カリウム水溶液を２．６ｍＬ、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(ＩＩ)ジクロリド５０ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）を加え、その後、窒素雰囲気下にて２４時間、１００℃で撹拌した。水を加えて反応を止め、クロロホルムで抽出を行った。食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。その後シリカゲルカラム（酢酸エチル）で精製を行い、化合物（２）を０．５２ｇ（収率５２％）で得た。
【００５４】
（２）化合物（３）の合成
５０ｍＬの三口フラスコにモノブロモ体（２）０．２ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシフェニルボロン酸０．０９４ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）をエタノール４ｍＬ、トルエン１０ｍＬの混合溶媒に溶解させた。２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．７ｍＬ、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（０）７２ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）を加え、その後、窒素雰囲気下にて２４時間，８５℃で撹拌した。水を加えて反応を止め、クロロホルムで抽出を行った。食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。その後シリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル=３:７）で精製を行い、化合物（３）を０．１４ｇ(収率６８％)で得た。
【００５５】
（３）化合物（４）の合成
窒素雰囲気下にて、５０ｍＬの三口フラスコに化合物（３）０．１１ｇ（０．３６ｍｍｏｌ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル０．０９ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン０．１９ｇ（０．７２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ２０ｍＬに溶解させた。その後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル０．１５ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり滴下した。その後、室温にて終夜撹拌させた。水を加えて反応を止め、クロロホルムで抽出を行った。食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。その後シリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル=８:２）で精製を行い、化合物（４）を０．１０ｇ(収率６２％)で得た。
【００５６】
（４）化合物（５）の合成
５０ｍＬの三口フラスコに化合物（４）０．０５ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジル０．０５２ｇ（０．２２ｍｍｏｌ）を無水トルエン５ｍＬに溶解させた。その後、窒素雰囲気下にて２４時間加熱還流を行った。得られた沈殿物をエーテルおよびヘキサンで洗浄し、化合物（５）を０．０１８ｇ(収率２４％)で得た。
【００５７】
合成例２
以下に、４，７−ジフェニル−ピリジル−２，１，３−オキサジアゾロピリジンのポリオキシアルキレン置換体の合成例を示す。
【００５８】
【化７】
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【００５９】
【化８】
2016196608.tif 000010
【００６０】
【化９】
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【００６１】
スキーム２に示すように、４−メトキシアセトフェノン（１１）を出発原料とし酢酸中、亜硝酸ナトリウムを用いて化合物（１２）を得た。次に、アセトニトリル中、塩化第一銅により化合物（１３）を得た。化合物（１３）を酢酸中、ＨＢｒを用いて化合物（１４）を得た。次にスキーム３に示すように、ジエチレングリコールモノメチルエーテル（１５）をピリジン中、塩化パラトルエンスルホニルを用いて化合物（１６）を得た。次に、ＤＭＳＯ中、塩化アンモニウムを用いてアルキレングリコールモノメチルエーテルのクロロ体（１７）を得た。次にスキーム４に示すように、化合物（１４）をＤＭＦ中、エチレングリコールモノメチルエーテルを用いて化合物１８ａを得た。次に、エタノール中、４−ピコリルアミンを用いて化合物１９ａを得た。さらに、ジクロロメタン中、活性エステル基を導入し、化合物２０ａを得た。
【００６２】
合成例３
以下に、４，７−ジフェニル−ピリジル−２，１，３−オキサジアゾロピリジンのポリオキシアルキレン置換体の別の合成例を示す。以下のスキーム５に示すように、アルキレングリコールモノメチルエーテルにジエチレングリコールモノメチルエーテルを用いた以外は、合成例２と同様の方法により合成した。
【００６３】
【化１０】
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【００６４】
合成例４（比較例）
４−メトキシフェニル−７−ピリジル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールの合成例を示す。
【００６５】
【化１１】
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【００６６】
（１）化合物（６）の合成
５０ｍＬの三口フラスコにモノブロモ体（２）０．２ｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、４−メトキシフェニルボロン酸０．１１ｇ（０．７５ｍｍｏｌ）をエタノール４ｍＬ、トルエン１０ｍＬの混合溶媒に溶解させた。２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．７ｍＬ、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（０）７２ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）を加え、その後、窒素雰囲気下にて２４時間、８５℃で撹拌した。水を加えて反応を止め、クロロホルムで抽出を行った。食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。その後シリカゲルカラム（酢酸エチル）で精製を行い、化合物（６）を０．１５ｇ(収率７０％)で得た。
【００６７】
（２）化合物（７）の合成
５０ｍＬの三口フラスコに化合物（６）０．０７ｇ（０．２２ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジル０．１ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）を無水トルエン５ｍＬに溶解させた。その後、窒素雰囲気下にて２４時間加熱還流を行った。得られた沈殿物をエーテルおよびヘキサンで洗浄し、化合物（７）を０．０３１ｇ(収率２５％)で得た。
【００６８】
合成例５（比較例）
４，７−ジ（メトキシフェニル）−１，２，５−オキサジアゾロピリジンのピリジニウム体の合成例を示す。
【００６９】
【化１２】
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【００７０】
４−メトキシアセトフェノンを出発原料として用いて、酢酸中、硝酸と亜硝酸ナトリウムの存在下、３０℃で２日間反応を行い、化合物１２を収率７８％で得た。次に、アセトニトリル中、塩化第一銅次亜リン酸ナトリウムの存在下、８０℃で１４時間の還元反応を行い化合物１３を収率６２％で得た。さらに、エタノール中、４−ピコリルアミンの存在下、８０℃で２日間の反応を行い、化合物２１を収率７０％で得た。トルエン中、１００℃で３日間、５−ブロモペンタン酸スクシンイミジンエステルと反応させ、化合物２２を収率７８％で得た。
【００７１】
（吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
合成した蛍光色素を溶媒に水またはＤＭＳＯを用いて濃度１０−４Ｍ程度の溶液を調製し、蛍光波長の測定および吸収波長の測定を行った。スペクトル例を図１に示す。また、数値結果を表１に示す。なお、合成例１と合成例４の蛍光色素には溶媒に水を用いた。それ以外の場合、溶媒にはＤＭＳＯを用いた。なお、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を比較に用いたが、水には溶解しなかったので、蛍光測定は行わなかった。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
（水への溶解度測定）
合成例２、３および５の蛍光色素を用い、既知濃度の水溶液を調製し、各濃度の溶液の吸光度を測定して検量線を作成した。飽和状態の試料溶液を調製し、その試料溶液を濾過し、濾液の吸光度を測定した。作成した検量線を用いて、濾液中の蛍光色素の濃度から溶解度を算出した。結果を表２に示す。ポリオキシアルキレン基を導入した合成例と合成例３の蛍光色素は、導入していない合成例５と比べて、水に対する溶解度が、それぞれ、約６．６倍と約１７倍に増加した。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
（結果）
ベンゾチアジアゾール系の蛍光色素では、ポリオキシアルキレン基を導入した合成例１は、導入していない合成例４と比べて蛍光強度が約１．３倍に増加した。また、オキサジアゾロピリジン系の蛍光色素では、ポリオキシアルキレン基を導入した合成例２および合成例３は、導入していない合成例５と比べて、蛍光強度がそれぞれ、約３９倍と約３０倍に増加した。以上の通り、本発明の蛍光色素は、１００ｎｍを超えるストークスシフトを維持しながら、高い蛍光強度を有している。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の蛍光色素は、その高い水溶性により、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。また、使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる。
【図１】
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