(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＴＮＦＲ１ポリペプチド、抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、アンタゴニストおよび多重特異性リガンド、ならびにこれらの方法および使用を提供する。【解決手段】抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、特定のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、抗体単一可変ドメイン。該抗体単一可変ドメインと、任意に、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、多重特異性リガンド。該抗体単一可変ドメインまたは該多重特異性リガンドを含む、ＴＮＦＲ１アンタゴニスト。該抗体単一可変ドメイン、該アンタゴニストおよび該多重特異性リガンドは、炎症性疾患（関節炎またはＣＯＰＤ等）の治療および／もしくは予防ならびに肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）投与、経口投与、患者の肺（ｌｕｎｇ）送達および消化管送達のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、単一可変ドメイン。
【請求項２】
抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記単一可変ドメインは、以下の変異（Ｋａｂａｔによるナンバリング）；
３０位が、ＬもしくはＦであり、
５２位が、ＡもしくはＴであり、
５２ａ位が、ＤもしくはＥであり、
５４位が、ＡもしくはＲであり、
５７位が、Ｒ、ＫもしくはＡであり、
６０位が、Ｄ、Ｓ、ＴもしくはＫであり、
６１位が、Ｅ、ＨもしくはＧであり、
６２位が、ＡもしくはＴであり、
１００位は、Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＳもしくはＶである、ならびに
１０１位は、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、ＨもしくはＫである
を１つまたは複数含む、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４（配列番号１０）の変異体である、単一可変ドメイン。
【請求項３】
１０１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にバリンを含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン重鎖単一可変ドメイン。
【請求項４】
可変ドメインが請求項１に定義されている、請求項３に記載の単一可変ドメイン。
【請求項５】
３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項６】
３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであり、前記単一可変ドメインのアミノ酸配列はその他の点ではＤＯＭ１ｈ−５７４（配列番号１１；図５）のアミノ酸配列と等しい、単一可変ドメイン。
【請求項７】
４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む、請求項５または６に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項８】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２（配列番号７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５（配列番号８）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号９）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項９】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３（配列番号１２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３（配列番号１３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５（配列番号１４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９（配列番号１６）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７（配列番号１８）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０（配列番号１９）のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１０】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５（配列番号１４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５（配列番号８）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９（配列番号２０）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５（配列番号２１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１１】
単一可変ドメインが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号２２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号１０９）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号２５）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号２６）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号２７）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列によりコードされる、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に対して結合する抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１２】
単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）５００ｐＭ以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１３】
単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離速度定数（Ｋｏｆｆ）２×１０−４ｓ−１以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１４】
単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１に特異的に結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１５】
単一可変ドメインが、マウスＴＮＦＲ１と結合する、請求項１４に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１６】
単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）への結合を阻害する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１７】
単一可変ドメインが、ヒト、マウス、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）への結合を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１８】
単一可変ドメインが、標準的ＭＲＣ５アッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項１９】
単一可変ドメインが、標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定したＮＤ５０約１５０ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項２０】
単一可変ドメインが、標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項２１】
単一可変ドメインが、ＴＮＦＲ１の非競合阻害剤である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項２２】
単一可変ドメインが、ヒトＴＮＦＲ１のドメイン１に特異的に結合する、請求項２１に記載の単一可変ドメイン。
【請求項２３】
単一可変ドメインが、ヒトＴＮＦＲ１のＰＬＡＤドメインに対して特異的である、請求項２１または２２に記載の単一可変ドメイン。
【請求項２４】
単一可変ドメインが、末端、任意にＣ末端にシステイン残基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２５】
単一可変ドメインが、ポリアルキレングリコール部分、任意にポリエチレングリコール部分に結合している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２６】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２７】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２８】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２９】
前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を含む、請求項２６に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３０】
前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む、請求項２６に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３１】
前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む、請求項２７に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３２】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を含む、請求項３１に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３３】
プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
（ｉ）少なくとも１０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ）、３７℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）、または
（ｉｉ）少なくとも４０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ’）、３０℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）
でインキュベート時にプロテアーゼ耐性であり、
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含み、任意選択として、１０１位（Ｋａｂａｔナンバリング）にバリンを含む、単一可変ドメイン。
【請求項３４】
単一可変ドメインが、少なくとも５０℃のＴｍを有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗体定常ドメイン、任意に抗体Ｆｃ領域、ここで任意にＦｃのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（任意に直接結合）している、を含むポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意に血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項３７】
抗ＳＡ単一可変ドメインが、ＤＯＭ７ｈ−１１（配列番号２８）、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号３０）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３１）、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号３２）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８（配列番号３４）またはＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号３５）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の多重特異性リガンド。
【請求項３８】
リンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む、請求項３６または３７に記載の多重特異性リガンド。
【請求項３９】
（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意に、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項４０】
（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意に、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを含む、ＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項４２】
経口送達、患者の消化管送達、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）送達、患者の肺（ｌｕｎｇ）への送達または全身送達のための請求項３３に記載の可変ドメインを含む、ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４３】
アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４４】
アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４５】
アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合する、ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４６】
前記選択された配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有する、請求項４３に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４７】
前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、請求項４３に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４８】
前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、請求項４６に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項４９】
前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、請求項４４に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項５０】
アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）から選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項５１】
炎症状態の治療および／または予防のための、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項５２】
炎症状態の治療および／または予防のための医薬品の製造における、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
【請求項５３】
前記状態が関節炎、多発性硬化症、炎症腸疾患および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される、請求項５１に記載のアンタゴニストまたは請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記の関節炎が関節リウマチまたは若年性関節リウマチである、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５５】
前記の炎症腸疾患がクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５６】
前記の慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎、慢性閉塞気管支炎および気腫からなる群から選択される、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５７】
前記の肺炎が細菌性肺炎である、請求項５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５８】
前記の細菌性肺炎がブドウ球菌性肺炎である、請求項５７に記載のアンタゴニストまたは使用。
【請求項５９】
呼吸疾患の治療および／または予防のための、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項６０】
呼吸疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造における、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
【請求項６１】
前記呼吸疾患が、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、浸潤性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスＸ、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈の閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択された、請求項５９に記載のアンタゴニスト、または請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンド。
【請求項６３】
請求項５１〜６２のいずれか１項に指定の状態または疾患を治療および／または予防するための、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、請求項６２に記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンド。
【請求項６４】
患者のＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを患者に投与することを含む、請求項５１〜６２のいずれか１項に指定の患者の状態または疾患を治療および／または予防する方法。
【請求項６５】
核酸が、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列を含み、核酸がＴＮＦＲ１に特異的に結合する、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離、または組換え型核酸。
【請求項６６】
抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインおよび血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドであり、
（ａ）抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｍ−１５−１２（配列番号３６）またはＤＯＭ１ｍ−２１−２３（配列番号３７）のアミノ酸配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸を含み、
（ｂ）抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号３０）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈ（配列番号３８）のアミノ酸配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸を含み、
（ｃ）リガンドは、前記可変ドメイン間にリンカーを含み、前記リンカーはアミノ酸配列ＡＳまたはＡＳＴを含む、
多重特異性リガンド。
【請求項６７】
ＤＭＳ５５３７（配列番号３９）、ＤＭＳ５５３８（配列番号４０）、ＤＭＳ５５３９（配列番号４１）またはＤＭＳ５５４０（配列番号４２）を含むまたはそれらからなる、多重特異性リガンド。
【請求項６８】
請求項６６または６７に記載の多重特異性リガンドをコードする核酸。
【請求項６９】
ＤＭＳ５５３７（配列番号４３）、ＤＭＳ５５３８（配列番号４４）、ＤＭＳ５５３９（配列番号３８）またはＤＭＳ５５４０（配列番号９）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項７０】
請求項６８または６９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項７１】
請求項７０に記載のベクターを含む、宿主細胞、任意に非ヒト胚細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍壊死因子１（ＴＮＦＲ１、ｐ５５、ＣＤ１２０ａ、Ｐ６０、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦα受容体１型）ポリペプチド、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインおよびこれらを含むアンタゴニストに関する。本発明はさらに、このような抗ＴＮＦＲ１リガンドを含むかまたは使用する、方法、用途、製剤、組成物および機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦＲ１
ＴＮＦＲ１は、リガンドに結合する細胞外領域と、内在性のシグナル伝達活性を欠くがシグナル伝達分子と結合可能な細胞内ドメインを含む膜貫通型受容体である。ＴＮＦＲ１と結合ＴＮＦとの複合体は３つのＴＮＦＲ１鎖および３つのＴＮＦ鎖を含む（Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ７３（３）  ４３１−４４５  （１９９３））。ＴＮＦリガンドは、３つのＴＮＦＲ１鎖により結合している三量体として存在する（同書）。３つのＴＮＦＲ１鎖は受容体リガンド複合体中で互いに凝集しており、この凝集は、ＴＮＦＲ１媒介性シグナル伝達にとって必須である。実際、ＴＮＦＲ１に結合する多価剤（抗ＴＮＦＲ１抗体等）は、ＴＮＦの不在下でＴＮＦＲ１凝集およびシグナル伝達を誘発し得、一般にＴＮＦＲ１アゴニストとして使用されている（例えば、Ｂｅｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ，  １４（６）：１１５６−１１６５  （１９９５）；  Ｍａｎｄｉｋ−Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６７：１９２０−１９２８  （２００１）を参照のこと）。したがって、ＴＮＦＲ１に結合する多価剤は、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合をブロックするとしても、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストとして一般に有効ではない。
【０００３】
本段落の配列番号はＷＯ２００６０３８０２７に使用されるナンバリングを表す。ＴＮＦＲ１の細胞外領域は、１３個のアミノ酸のアミノ末端セグメント（配列番号６０３のアミノ酸１〜１３（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸１〜１３（マウス））、ドメイン１（配列番号６０３のアミノ酸１４〜５３（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸１４〜５３（マウス））、ドメイン２（配列番号６０３のアミノ酸５４〜９７（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸５４〜９７（マウス））、ドメイン３（配列番号６０３のアミノ酸９８〜１３８（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸９８〜１３８（マウス））、およびドメイン４（配列番号６０３のアミノ酸１３９〜１６７（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸１３９〜１６７（マウス））であり、これらの後に膜近位領域（配列番号６０３のアミノ酸１６８〜１８２（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸１６８〜１８３（マウス））が続く（Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３（３）  ４３１−４４５  （１９９３）およびＬｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６１（２）  ３５１−３５９  （１９９０）を参照のこと）。ドメイン２および３は結合リガンド（ＴＮＦβ、ＴＮＦα）と接触する（Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ７３（３）  ４３１−４４５  （１９９３））。ＴＮＦＲ１の細胞外領域はプレリガンド結合会合ドメインまたはＰＬＡＤドメイン（配列番号６０３のアミノ酸１〜５３（ヒト）；配列番号６０４のアミノ酸１〜５３（マウス））として称される領域も含む（米国政府、ＷＯ０１／５８９５３；  Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｍ１３０４  （２００５））。ＴＮＦＲ１は、ドメイン４または膜近位領域（配列番号６０３のアミノ酸１６８〜１８２；配列番号６０４のアミノ酸１６８〜１８３）におけるＴＮＦＲ１のタンパク質分解を含む過程を介してインビボで細胞表面から剥がれ、ＴＮＦＲ１の溶解形態を産生する。溶解性ＴＮＦＲ１は、ＴＮＦαへの結合力を保持し、その結果、ＴＮＦα活性の内生阻害剤として機能する。
【０００４】
ＷＯ２００６０３８０２７、ＷＯ２００８１４９１４４およびＷＯ２００８１４９１４８は、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインおよびこれらを含むアンタゴニストについて開示している。これらの文書は、ＴＮＦαに媒介される状態の治療および／または予防のためのこのようなドメインおよびアンタゴニストの使用についても開示している。ＷＯ２００６０３８０２７は、ＴＡＲ２ｈ−２０５（ＷＯ２００６０３８０２７における配列番号６２７）と呼ばれる免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）について開示しており、これはヒトＴＮＦＲ１に対して適度の効能を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００６０３８０２７
【特許文献２】ＷＯ０１／５８９５３
【特許文献３】ＷＯ２００８１４９１４４
【特許文献４】ＷＯ２００８１４９１４８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ７３（３）  ４３１−４４５  （１９９３）
【非特許文献２】Ｂｅｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ，  １４（６）：１１５６−１１６５  （１９９５）
【非特許文献３】Ｍａｎｄｉｋ−Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６７：１９２０−１９２８  （２００１）
【非特許文献４】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６１（２）  ３５１−３５９  （１９９０）
【非特許文献５】Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｍ１３０４  （２００５）
【発明の概要】
【０００７】
改善された抗ヒトＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、リガンドおよびこれらを含む生成物を提供することが望まれる。これらの目的は、試料中のヒトＴＮＦＲ１を検出するために改善された診断試薬を提供すること、ならびにまたは代替的にヒトもしくは他の哺乳動物のＴＮＦＲ１媒介性状態および疾患の治療および／もしくは予防のため改善された治療薬を提供することである。（ＴＡＲ２ｈ−２０５よりも）ＴＮＦＲ１、特にヒトＴＮＦＲ１の強力な中和剤であり；ヒトＴＮＦＲ１と少なくとも１つの他種（創薬および試験用モデルとして一般に使用される種、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタまたは非ヒト霊長類等）由来のＴＮＦＲ１間に交差反応性があり；プロテアーゼ（例えば、患者の体内で接近する可能性があるプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、ペプシンまたはロイコザイム等）に対して耐性であり；良好な薬物動態（例えば、好ましい半減期）を有し；ならびに／またはＴＮＦＲ１、例えば、ヒトＴＮＦＲ１への高い結合親和性を示す、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、リガンドおよびこれらを含む生成物を提供することが特に望ましい。本文中で、ＴＡＲ２ｈ−２０５は、ＤＯＭ１ｈ−５７４（配列番号１１）と呼ぶ（図５も参照されたい）。
【０００８】
本発明の様々な態様がこれらの所望の特性を満たす。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、以下の変異（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を１つもしくは複数含む、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４の変異体である：
３０位は、ＬもしくはＦである、
５２位は、ＡもしくはＴである、
５２ａ位は、ＤもしくはＥである、
５４位は、ＡもしくはＲである、
５７位は、Ｒ、ＫもしくはＡである、
６０位は、Ｄ、Ｓ、ＴもしくはＫである、
６１位は、Ｅ、ＨもしくはＧである、
６２位は、ＡもしくはＴである、
１００位は、Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＳもしくはＶである、ならびに
１０１位は、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、ＨもしくはＫである。
【００１１】
任意選択として、単一可変ドメインは、以下の変異（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を１つもしくは複数含む、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４の変異体である：
３０位は、ＬもしくはＦである、
５２位は、ＡもしくはＴである、
５２ａ位は、Ｄである、
５４位は、Ａである、
５７位は、Ｒである、
６０位は、Ｄ、ＳもしくはＴである、
６１位は、Ｈである、
６２位は、Ａである、
１００位は、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｇ、ＮもしくはＫである、ならびに
１０１位は、Ｅ、Ｖ、Ｋ、Ａ、ＱもしくはＮである。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、１０１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にバリンを含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを提供する。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインのアミノ酸配列はその他の点ではＤＯＭ１ｈ−５７４のアミノ酸配列と等しい。一実施形態では、可変ドメインは、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合するために提供される。
【００１４】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、細胞アッセイ法においてＴＮＦＲ１（例えば、少なくともヒトＴＮＦＲ１）の強力な中和剤である可変ドメインを提供する。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７、またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、タンパク質分解に対して安定な可変ドメインを提供する。
【００１６】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２、またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、ヒトＴＮＦＲ１と高い親和性で結合し、任意にマウスＴＮＦＲ１に対しても所望の親和性を示す可変ドメインを提供する。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合する抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、下表１２に示すＤＯＭ１ｈ−５７４を除くＤＯＭ１ｈ配列の任意の１つのヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％等しいヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合する抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％等しいヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいか、選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を含む。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変は、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいか、選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を含む。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいか、選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、
（ｉ）少なくとも１０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ）、３７℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）；または
（ｉｉ）少なくとも４０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ’）、３０℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）
でインキュベート時にプロテアーゼ耐性であり、
ここで可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含み、任意選択として、１０１位（Ｋａｂａｔナンバリング）にバリンを含む。
【００２３】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗体定常ドメイン、任意に抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関し、ここで任意にＦｃのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（任意に直接結合）している。
【００２４】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび任意に血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドに関する。驚くべきことに、本発明者らは、本発明による抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインの抗ＳＡ単一可変ドメインへの融合は、（抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ単量体単独より）改善された半減期という利点を提供するが、ＴＮＦＲ１結合親和性（ＫＤ）改善という便益も付加するということを見出した。この所見は、従来技術においてこれまで開示されていない。一実施形態では、多重特異性リガンドは、本明細書に開示の「ＤＭＳ」と標識した任意の構築物、例えば、ＤＭＳ０１１１、０１１２、０１１３、０１１４、０１１５、０１１６、０１１７、０１１８、０１２１、０１２２、０１２３、０１２４、０１３２、０１３３、０１３４、０１３５、０１３６、０１６２、０１６３、０１６８、０１６９、０１７６、０１７７、０１８２、０１８４、０１８６、０１８８、０１８９、０１９０、０１９１、０１９２、５５１９、５５２０、５５２１、５５２２、５５２５および５５２７（配列番号：４５〜９２）の任意の１つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列であるかまたはそれらを含む。一実施形態では、多重特異性リガンドは、本明細書に開示の任意のＤＭＳのヌクレオチド配列、例えば、ＤＭＳ０１１１、０１１２、０１１３、０１１４、０１１５、０１１６、０１１７、０１１８、０１２１、０１２２、０１２３、０１２４、０１３２、０１３３、０１３４、０１３５、０１３６、０１６２、０１６３、０１６８、０１６９、０１７６、０１７７、０１８２、０１８４、０１８６、０１８８、０１８９、０１９０、０１９１、０１９２、５５１９、５５２０、５５２１、５５２２、５５２５および５５２７の任意の１つのヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列であるかまたはそれらを含む。一実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗ＳＡ単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドをコードする核酸を提供し、この核酸は、本明細書に開示の任意のＤＭＳのヌクレオチド配列、例えば、ＤＭＳ０１１１、０１１２、０１１３、０１１４、０１１５、０１１６、０１１７、０１１８、０１２１、０１２２、０１２３、０１２４、０１３２、０１３３、０１３４、０１３５、０１３６、０１６２、０１６３、０１６８、０１６９、０１７６、０１７７、０１８２、０１８４、０１８６、０１８８、０１８９、０１９０、０１９１、０１９２、５５１９、５５２０、５５２１、５５２２、５５２５および５５２７の任意の１つのヌクレオチド配列を含む。このような核酸を含むベクター、ならびにこのようなベクターを含む宿主細胞（例えば、非ヒト宿主細胞）を提供する。
【００２５】
１つの態様では、本発明は、以下を含む多重特異性リガンドを提供する、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しい（任意に少なくとも９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％等しい）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、この抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１１−３配列と少なくとも８０％（任意に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％）等しいアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）任意にここでリンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、このリンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、以下を含む多重特異性リガンドを提供する、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しい（任意に少なくとも９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％等しい）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、この抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０配列と少なくとも８０％（任意に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％）等しいアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）任意にここでリンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、このリンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、先に述べた本発明のいずれかの態様の単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを含むＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、経口送達、患者の消化管送達、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）送達、患者の肺（ｌｕｎｇ）への送達または全身送達のための本発明のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供する。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有する。
【００３０】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有する。
【００３１】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する。
【００３２】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０から選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
【００３３】
１つの態様では、本発明は、炎症状態の治療および／または予防のための本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。
【００３４】
１つの態様では、本発明は、炎症状態の治療および／または予防のための医薬品の製造における本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。
【００３５】
１つの態様では、本発明のいずれかの態様の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とするために提供される。
【００３６】
１つの態様では、本発明のいずれかの態様の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、上述の任意の状態または疾患を治療および／または予防するためのＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とするために提供される。
【００３７】
１つの態様では、本発明は、患者における上述の任意の状態または疾患を治療および／または予防する方法を提供し、この方法は、患者におけるＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする本発明の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを患者に投与することを含む。
【００３８】
本発明の１つの態様では、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインおよび血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドを提供し、ここで
（ａ）抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｍ−１５−１２またはＤＯＭ１ｍ−２１−２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（任意に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％）等しいアミノ酸を含む；ならびに
（ｂ）抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈのアミノ酸配列と少なくとも８０％（任意に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％）等しいアミノ酸を含む；ならびに
（ｃ）リガンドは、前記の可変ドメイン間にリンカーを含み、このリンカーはアミノ酸配列ＡＳまたはＡＳＴを含む。本発明の別の態様は、ＤＭＳ５５３７、ＤＭＳ５５３８、ＤＭＳ５５３９またはＤＭＳ５５４０を含むかまたはそれらからなる多重特異性リガンドを提供する。本発明の１つの態様では、多重特異性リガンドのいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の別の態様は、ＤＭＳ５５３７、ＤＭＳ５５３８、ＤＭＳ５５３９またはＤＭＳ５５４０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（任意に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいか、または１００％）等しいヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明はさらに、核酸を含むベクター、ならびにベクターを含む宿主細胞、任意に非ヒト胚細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ナイーブ選択由来のｄＡｂのヒトＴＮＦＲ１に対するＢＩＡｃｏｒｅ結合。ビオチン化ヒトＴＮＦＲ１をＳＡ  ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に被覆した。ナイーブ選択由来の４つの精製したｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５０９、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４９およびＤＯＭ１ｈ−５７４）をヒトＴＮＦＲ１上に注入して結合を測定した。各ｄＡｂに対応する曲線を矢印で示す。
【図２】ナイーブ選択由来のｄＡｂのヒトＴＮＦＲ１に対するＭＲＣ５細胞アッセイ。ナイーブ選択由来の４つの精製したｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５０９、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４９およびＤＯＭ１ｈ−５７４）および対照ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１）のＴＮＦα媒介性ＩＬ−８放出の機能的阻害について、ＭＲＣ５細胞アッセイ法で解析した。記載のようにアッセイを実施し、各ｄＡｂに対応する曲線を矢印で示す。グラフは、観察された中和パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットしている（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用）。
【図３】ナイーブ選択由来のｄＡｂのヒトＴＮＦＲ１に対する受容体結合アッセイ。ナイーブ選択由来の４つの精製したｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５０９、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４９およびＤＯＭ１ｈ−５７４）および陽性対照ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１）を受容体結合アッセイにおいてアッセイし、ＴＮＦαとの競合を測定した。陽性対照ｄＡｂは、ＴＮＦαと競合して完全な阻害曲線を示すことが知られている。選択された抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂは、ＴＮＦαの受容体への結合を阻害しない。記載のようにアッセイを実施し、各ｄＡｂに対応する曲線を矢印で示す（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用）。ｙ軸上の「中和％」はＴＮＦα結合阻害を示す。
【図４】ヒトＴＮＦＲ１に対するエラープローン試験成熟（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｔｅｓｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）からのｄＡｂのＭＲＣ５細胞アッセイ。ナイーブ選択由来の３つの精製したｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１０）および対照ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１）をＭＲＣ５細胞アッセイ法においてＴＮＦα媒介性ＩＬ−８放出の機能的阻害について解析した。記載のようにアッセイを実施し、各ｄＡｂに対応する曲線を矢印で示す。グラフは、観察された中和パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットしている（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用）。図２に示す親ＤＯＭ１ｈ−５７４に比べ、これらのｄＡｂは、ＭＲＣ５細胞アッセイ法において増大した効能を示す。
【図５Ａ】ＤＯＭ１ｈ−５７４のエラープローンライブラリから同定されたｄＡｂおよびそれらの続く組換え体のアミノ酸配列アライメント。改善されたＤＯＭ１ｈ−５７４  ｄＡｂのエラープローン試験成熟選択により、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１３における親和性改善に関与する位置を特定した。これらの変異の組換え（Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）によりＤＯＭ１ｈ−５７４−１４〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９が得られた。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図５Ｂ】ＤＯＭ１ｈ−５７４のエラープローンライブラリから同定されたｄＡｂおよびそれらの続く組換え体のアミノ酸配列アライメント。改善されたＤＯＭ１ｈ−５７４  ｄＡｂのエラープローン試験成熟選択により、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１３における親和性改善に関与する位置を特定した。これらの変異の組換え（Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）によりＤＯＭ１ｈ−５７４−１４〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９が得られた。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図５Ｃ】ＤＯＭ１ｈ−５７４のエラープローンライブラリから同定されたｄＡｂおよびそれらの続く組換え体のアミノ酸配列アライメント。改善されたＤＯＭ１ｈ−５７４  ｄＡｂのエラープローン試験成熟選択により、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１３における親和性改善に関与する位置を特定した。これらの変異の組換え（Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）によりＤＯＭ１ｈ−５７４−１４〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９が得られた。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図６】ヒト、カニクイザル、イヌおよびマウス由来のＴＮＦＲ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列アライメント。アライメントによりヒトＴＮＦＲ１およびマウスＴＮＦＲ１間の配列保存が限られていることが強調される。ヒトＥＣＤ  ＴＮＦＲ１に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。
【図７】Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６のイヌＴＮＦＲ１への結合のモニタリング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化イヌＴＮＦＲ１で被覆した。続いて、精製したｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６、各１００ｎＭをイヌＴＮＦＲ１上に注入した。トレース（ｔｒａｃｅ）から、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６では有意な結合が示され、対してＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６では限られた結合のみが観察されたことが明らかである。
【図８】Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した、精製したＤＯＭ１ｈ−５７４−１６のマウスＴＮＦＲ１への結合のモニタリング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化マウスＴＮＦＲ１で被覆した。続いて、精製したｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６、１μＭをマウスＴＮＦＲ１上に注入した。トレースから、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６のマウスＴＮＦＲ１への結合がはっきりと示される。
【図９】マウスＬ９２９細胞アッセイにおけるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の機能活性。アクチノマイシンの存在下で、ＴＮＦαの細胞毒作用からマウスＬ９２９細胞を保護する能力を試験することにより、精製したＤＯＭ１ｈ−５７４−１６（黒線、三角）とマウスＴＮＦＲ１との機能的交差反応性をアッセイした。陽性対照として、マウスＴＮＦＲ１結合ｄＡｂ、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３（灰色線、四角）を含み、これらは活性であることが示された。グラフは、ＴＮＦα活性の中和パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットしている（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用）。実施例に記載のようにアッセイを実施した。
【図１０】カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞アッセイにおけるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の機能活性。精製したＤＯＭ１ｈ−５７４−１６（灰色点線、三角）のカニクイザルＴＮＦＲ１との機能的交差反応性を、ＴＮＦαへの反応においてＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞からのＩＬ−８放出を阻害する能力を試験することによりアッセイした。実施例に記載のようにアッセイを実施した。陽性対照として、ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１（黒線、四角）を含んだ。両ｄＡｂは完全な中和を示した。グラフは、ＴＮＦα活性の中和パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットしている（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用）。
【図１１Ａ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最も強力なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。ＭＲＣ５細胞アッセイ法において最高効能のｄＡｂのアミノ酸配列を親ＤＯＭ１ｈ−５７４、親和性成熟開始のために用いた鋳型（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４）および増大した効力が同定された初期ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）と共に列挙する。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１１Ｂ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最も強力なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。ＭＲＣ５細胞アッセイ法において最高効能のｄＡｂのアミノ酸配列を親ＤＯＭ１ｈ−５７４、親和性成熟開始のために用いた鋳型（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４）および増大した効力が同定された初期ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）と共に列挙する。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１１Ｃ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最も強力なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。ＭＲＣ５細胞アッセイ法において最高効能のｄＡｂのアミノ酸配列を親ＤＯＭ１ｈ−５７４、親和性成熟開始のために用いた鋳型（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４）および増大した効力が同定された初期ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）と共に列挙する。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１２Ａ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最もプロテアーゼに安定なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。最もトリプシン消化耐性であることが示されたｄＡｂのアミノ酸配列を親和性成熟後に同定した。アライメント目的のため、親ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４も含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１２Ｂ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最もプロテアーゼに安定なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。最もトリプシン消化耐性であることが示されたｄＡｂのアミノ酸配列を親和性成熟後に同定した。アライメント目的のため、親ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４も含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１２Ｃ】親和性成熟中に同定したＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来の最もプロテアーゼに安定なｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。最もトリプシン消化耐性であることが示されたｄＡｂのアミノ酸配列を親和性成熟後に同定した。アライメント目的のため、親ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４も含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１３Ａ】詳細な特性決定のために選択したｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。アライメントには、詳細な特性決定のために選択した１２のｄＡｂならびにＤＯＭ１ｈ−５７４（親ｄＡｂ）および系統の特性決定のため早くから用いたＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１３Ｂ】詳細な特性決定のために選択したｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。アライメントには、詳細な特性決定のために選択した１２のｄＡｂならびにＤＯＭ１ｈ−５７４（親ｄＡｂ）および系統の特性決定のため早くから用いたＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１３Ｃ】詳細な特性決定のために選択したｄＡｂのアミノ酸配列アライメント。アライメントには、詳細な特性決定のために選択した１２のｄＡｂならびにＤＯＭ１ｈ−５７４（親ｄＡｂ）および系統の特性決定のため早くから用いたＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を含んだ。ＤＯＭ１ｈ−５７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、「．」で示す。ＣＤＲは下線および太字で示す（第一の下線の配列はＣＤＲ１、第二の下線の配列はＣＤＲ２および第三の下線の配列はＣＤＲ３）。
【図１４】ＢＩＡｃｏｒｅによるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１のエピトープマッピング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化ヒトＴＮＦＲ１で被覆した。この表面全体にＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入した（各２００ｎＭ、続いて再生注入（提示せず））。各ｄＡｂに対して結合したＲＵ数（反応単位）を測定した。続いて、同一濃度のＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１を注入し、直後にＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入した。はっきりと見られるように、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の第二の注入の結合単位数は第一の注入と同じであり、ｄＡｂは非競合エピトープと結合することを示す。
【図１５】ＢＩＡｃｏｒｅによるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＭＡＢ２２５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）のエピトープマッピング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化ヒトＴＮＦＲ１で被覆した。表面全体にＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入して結合を定量化した。再生後（提示せず）、ＭＡＢ２２５を注入し、続いてＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を再注入した。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６に対する結合レベルは、ＭＡＢ２２５の不在下で見られたものに近似し、結合エピトープはＭＡＢ２２５と競合しないことを示す。
【図１６】ＢＩＡｃｏｒｅによるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびｍＡｂクローン４．１２のエピトープマッピング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化ヒトＴＮＦＲ１で被覆した。表面全体にクローン４．１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｚｙｍｅｄ）を注入して結合を定量化した。再生後（提示せず）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入し、続いてクローン４．１２を再注入した。第二のクローン４．１２注入にて観察された結合レベルは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の不在下で観察されたレベルより約２０％少ない。この結果は、ヒトＴＮＦＲ１上の結合エピトープに対する競合は限られていることを示す。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびクローン４．１２はわずかに重複したエピトープを有し得る。注入直前直後のＲＵシグナルの跳躍は緩衝液の跳躍であり、これは差し引いていない。
【図１７】ＢＩＡｃｏｒｅによるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＤＯＭ１ｈ−５１０のエピトープマッピング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化ヒトＴＮＦＲ１で被覆した。表面全体にＤＯＭ１ｈ−５１０を注入して結合を定量化した。続いて、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入してからＤＯＭ１ｈ−５１０を再注入した。明らかに、第二のＤＯＭ１ｈ−５１０注入は、はるかに弱い結合を示し、ＤＯＭ１ｈ−５１０が競合エピトープに結合していることを示す。
【図１８】ＢＩＡｃｏｒｅによるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６およびＤＯＭ１ｍ−２１−２３のエピトープマッピング。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップをビオチン化マウスＴＮＦＲ１で被覆した。表面全体にＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を注入して結合を定量化した。続いて、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３を注入してからＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を再注入した。第二の注入後のＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の結合ＲＵ数はＤＯＭ１ｍ−１２−２３の不在下で観察されたものに近似する。これは、マウスＴＮＦＲ１上の結合エピトープはＤＯＭ１ｍ−２１−２３とＤＯＭ１ｈ−５７４−１６で異なることを示す。
【図１９】ＢＩＡｃｏｒｅによるＴＮＦＲ１の線型ペプチド断片へのＤＯＭ１ｈ−５７４−１６のエピトープマッピング。４チャンネルのＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップを４つのビオチン化ペプチドの１つでそれぞれ被覆した。ペプチドは以下であった：１）ＦｏｒｔｅＢｉｏ上で結合を示さず、陰性対照としての役割を果たすヒトＴＮＦＲ１のペプチド断片、Ａ３（ＳＧＳＧＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣ）、２）ドメイン−１ペプチドＤ２（ＳＧＳＧＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ）、３）ドメイン−３ペプチドＤ５（ＳＧＳＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦ）および４）重複ドメイン−３ペプチドＥ５（ＳＧＳＧＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦ）。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６（２．５μＭ）を全４つのペプチド上に流し、結合量を測定した。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の結合は対照ペプチドＡ３上で観察されず、対してｄＡｂは３つの他のペプチドに結合した。図において、異なるペプチドに対応するトレースはペプチド識別子で示す。
【図２０】ＢＩＡｃｏｒｅによるＴＮＦＲ１の４つの線型ペプチド断片へのＤＯＭ１ｍ−２１−２３の結合の評価。４チャンネルのＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップを４つのビオチン化ペプチドの１つでそれぞれ被覆した。ペプチドは以下であった：１）ＦｏｒｔｅＢｉｏ上でＤＯＭ１ｈ−５７４−１６への結合を示さず、陰性対照としての役割を果たすヒトＴＮＦＲ１のペプチド断片、Ａ３（ＳＧＳＧＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣ）、２）ドメイン−１ペプチドＤ２（ＳＧＳＧＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ）、３）ドメイン−３ペプチドＤ５（ＳＧＳＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦ）および４）重複ドメイン−３ペプチドＥ５（ＳＧＳＧＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦ）。ＤＯＭ１ｍ−２１−２３もこれらのペプチドに結合するかどうかを確立するために、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３（２．５μＭ）を全４つのペプチドに注入した。図に見ることができるように、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３は４つのペプチドのいずれへの結合も示さなかった。曲線は互いに重なっている。
【図２１】ＢＩＡｃｏｒｅによるＴＮＦＲ１の線型ペプチド断片へのＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１のエピトープマッピング。４チャンネルのＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップを４つのビオチン化ペプチドの１つでそれぞれ被覆した。ペプチドは以下であった：１）ＦｏｒｔｅＢｉｏ上でＤＯＭ１ｈ−５７４−１６への結合を示さず陰性対照としての役割を果たすヒトＴＮＦＲ１のペプチド断片、Ａ３（ＳＧＳＧＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣ）、２）ドメイン−１ペプチドＤ２（ＳＧＳＧＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ）、３）ドメイン−３ペプチドＤ５（ＳＧＳＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦ）および４）重複ドメイン−３ペプチドＥ５（ＳＧＳＧＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦ）。ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１（２．５μＭ）を全４つのペプチド上に流し、結合量を測定した。図に見ることができるように、ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１は４つのペプチドのいずれへの結合も示さなかった。曲線はほぼ重なり、矢印および対応するペプチド番号で示される。
【図２２】マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）へのＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ直列融合物の結合のＢＩＡｃｏｒｅ解析。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によりＭＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造メーカーの説明書に従って用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に被覆した。続いて、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ−リンカー−ＡｌｂｕｄＡｂ（Ｎ末端からＣ末端方向）からそれぞれなり、表６に特定されたＤＭＳ構築物を１μＭでＭＳＡ表面に注入し、結合をモニタリングした。ＢＩＡｃｏｒｅトレースに見ることができるように、ＤＭＳ０１９２およびＤＭＳ０１８８の全体の動態は最高であり、対してＤＭＳ０１８２およびＤＭＳ０１８４はＭＳＡに対して最も弱い結合剤であった。各ＤＭＳクローンに対応するＢＩＡｃｏｒｅトレースを矢印で示す。
【図２３】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へのＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ直列融合物の結合のＢＩＡｃｏｒｅ解析。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によりＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造メーカーの説明書に従って用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に被覆した。続いて、それぞれ抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ−リンカー−ＡｌｂｕｄＡｂ（Ｎ末端からＣ末端方向）からなり、表６に特定されたＤＭＳ構築物を１μＭでＨＳＡ表面に注入し、結合をモニタリングした。ＢＩＡｃｏｒｅトレースに見ることができるように、ＤＭＳ０１８９およびＤＭＳ０１９０の全体の動態は最高であり、対して図に示す他のＤＭＳクローン（ＤＭＳ０１８２、ＤＭＳ０１８４、ＤＭＳ０１８６およびＤＭＳ０１８８）は近似し、これらのＨＳＡへの親和性は有意に弱かった。各ＤＭＳクローンに対応するＢＩＡｃｏｒｅトレースを矢印で示す。
【図２４】マウスにおけるＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ融合物のＰＫ。マウスにＤＭＳ０１６８（２．５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、ＤＭＳ０１６９（２．５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）またはＤＭＳ０１８２（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した。各時点（０．１７、１、４、１２、２４、４８および９６時間）でマウス３匹を屠殺し、それぞれＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ融合物のレベルについて血清を解析した。各ＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の平均量を各時点で測定して時間に対してプロットした、ＤＭＳ０１６８（灰色点線）、ＤＭＳ０１８２（黒点線）およびＤＭＳ０１６９（黒線）（対応する線を矢印でも示す）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（例えばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、マウンテンビュー、カリフォルニア９４０４０、米国から入手可能）のノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いて、各分子の終末半減期を測定した。終末半減期は、ＤＭＳ０１８２で５．９時間、ＤＭＳ０１６８で１５．４時間およびＤＭＳ０１６９で１７．８時間であった。腹腔内投薬の故に、ＤＭＳ０１８２曲線はＤＭＳ０１６８およびＤＭＳ０１６９で観察された形と異なる（示した曲線はＢＩＡｃｏｒｅによる）。
【図２５】生理食塩水およびＤＭＳ０１６９で処理中のＴｇ１９７／ｈｐ５５ＫＩマウスの関節炎スコア。本試験に用いた遺伝子導入マウス系統は、Ｔｇ１９７（ヒトＴＮＦα過剰発現）とｈｐ５５（ヒトＴＮＦＲ１のノックイン、ｐ５５としても知られている）の交配種であり、これは自然に関節炎を発現する。６週目から１５週目まで、各群１２匹のマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ０１６９または生理食塩水のいずれかで週２回処理した。各週で、マウス１匹当たり後肢２本の関節の関節炎スコア、平均関節炎スコア、および標準誤差を測定し、マウス１２匹を時間でプロットした。明らかに、ＤＭＳ０１６９で処理した動物における関節炎の発現は少なかった。
【図２６】生理食塩水およびＤＭＳ０１６９で処理中のＴｇ１９７／ｈｐ５５ＫＩマウスの体重。本試験に用いた遺伝子導入マウス系統は、Ｔｇ１９７（ヒトＴＮＦα過剰発現）とｈｐ５５（ヒトＴＮＦＲ１のノックイン、ｐ５５としても知られている）の交配種であり、これは自然に関節炎を発現する。６週目から１５週目まで、各群１２匹のマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ０１６９または生理食塩水のいずれかで週２回処理した。各週でマウスを測量し、平均データをプロットした（エラーバーは、標準誤差を示す）。図から、ＤＭＳ０１６９が生理食塩水で処理した動物に比べて、統計的に有意ではないが重い傾向にあることが明らかである。
【図２７】生理食塩水およびＤＭＳ０１６９で処理後、１５週目のＴｇ１９７／ｈｐ５５ＫＩマウスの組織学および関節炎スコア。本試験に用いた遺伝子導入マウス系統は、Ｔｇ１９７（ヒトＴＮＦα過剰発現）とｈｐ５５（ヒトＴＮＦＲ１のノックイン、ｐ５５としても知られている）の交配種であり、これは自然に関節炎を発現する。６週目から１５週目まで、各群１２匹のマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ０１６９または生理食塩水のいずれかで週２回処理した。１５週目、マウスを屠殺して関節炎スコア（黒棒）と関節の組織学（白棒）の両方をスコア化した（Ｋｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ．  Ｊ．  １０，  ｐ４０２５  （１９９１））。各群は１２匹の動物からなり、標準誤差を算出した。処理群間の差は統計的に有意であることが示される（ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書において本発明は実施形態を参照しながら簡明な明細書記述がなされるように記述されている。実施形態は、本発明を逸脱することなく種々に組み合わせまたは分離してしてもよいことは意図されており、また、理解されるべきである。
【００４１】
別に定義されていなければ、本明細書に使われているすべての技術と科学の用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、および生化学の分野）により共通に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子、遺伝、および生化学の手法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照されたい。これらは参照して本明細書に組み込まれる）および化学的手法で使われている。
【００４２】
本明細書に記述されている免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲとフレームワーク（ＦＲ）領域の位置とナンバリング方式は、Ｋａｂａｔ等により決定されてきた（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ  （１９９１））。本明細書で開示しているＶＨとＶＬ（Ｖκ）ｄＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、よく知られたＫａｂａｔのアミノ酸ナンバリング方式とＣＤＲの定義に従えば当業者は容易にわかるであろう。Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って可変長、挿入を有する重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ１００とＨ１０１の間でＫまでの文字でナンバリングされる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ．．．．Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。あるいは、ＡｂＭまたは次のＣｏｎｔａｃｔ方法に従って、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ方式を用いて決定してもよい（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ；Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ｐ８７７−８８３）。適切なＣＤＲ決定方法についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照。
【００４３】
一旦各残基がナンバリングされれば、続くＣＤＲ定義に適用できる（「−」はＫａｂａｔで示されるのと同じ残基番号を意味する）：
Ｋａｂａｔ−配列多様性に基づいて最もよく使われる方法
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：３１−３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲＨ２：５０−６５
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
【００４４】
Ｃｈｏｔｈｉａ−構造的ループ領域の位置に基づく
（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３２
ＣＤＲＨ２：５２−５６
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
【００４５】
ＡｂＭ−ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）：  （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３５／３５Ａ／３５Ｂ      ２６−３５
ＣＤＲＨ２：５０−５８                        −
ＣＤＲＨ３：９５−１０２                      −
ＣＤＲＬ１：２４−３４                        −
ＣＤＲＬ２：５０−５６                        −
ＣＤＲＬ３：８９−９７                        −
【００４６】
Ｃｏｎｔａｃｔ−結晶構造と抗原との接触残基予測に基づく
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）：  （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：３０−３５／３５Ａ／３５Ｂ      ３０−３５
ＣＤＲＨ２：４７−５８                        −
ＣＤＲＨ３：９３−１０１                      −
ＣＤＲＬ１：３０−３６                        −
ＣＤＲＬ２：４６−５５                        −
ＣＤＲＬ３：８９−９６                        −
本明細書で使われている用語「腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）アンタゴニスト」または「抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト」等は、ＴＮＦＲ１に結合しＴＮＦＲ１の機能（すなわち、１つまたは複数の機能）を阻害し得る薬剤（例えば分子、化合物）を指す。例えば、ＴＮＦＲ１アンタゴニストはＴＮＦＲ１へのＴＮＦαの結合を阻害し、および／または、ＴＮＦＲ１に媒介されるシグナル伝達を阻害することができる。したがって、ＴＮＦＲ１媒介過程と細胞反応（例えば、標準的Ｌ９２９細胞毒アッセイにおけるＴＮＦα誘発性細胞死）はＴＮＦＲ１アンタゴニストにより阻害され得る。
【００４７】
本明細書で使われている「ペプチド」は、ペプチド結合で結合した約２〜約５０アミノ酸を指す。
【００４８】
本明細書で使われている「ポリペプチド」は、ペプチド結合で結合した少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポリペプチドは通常三次構造を含み、折り畳まれて機能ドメインを形成している。
【００４９】
本明細書で使われている「プロテアーゼ分解に耐性がある」ペプチドまたはポリペプチド（例えばドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性好適条件下でプロテアーゼとインキュベートした場合プロテアーゼにより実質的に分解されない。プロテアーゼ活性好適温度（例えば３７または５０℃）で約１時間プロテアーゼとインキュベート後に、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下のタンパク質がプロテアーゼにより分解される場合、または、実質的にタンパク質がプロテアーゼにより分解されない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されていないことになる。タンパク質分解は本明細書に記載の任意の適切な方法を用いて、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または機能的アッセイ（例えば、リガンド結合）により評価できる。
【００５０】
本明細書で使われている「ディスプレイシステム」は、物理的、化学的または機能特性等の所望特性を基準にして選択する目的で、ポリペプチドまたはペプチドのコレクションにアクセス可能なシステムを指す。ディスプレイシステムはポリペプチドまたはペプチドの適切なレパートリー（例えば、溶液の形で、適切な担体上に固定されて）であってもよい。また、ディスプレイシステムは、細胞発現システム（例えば、形質転換、感染、核酸導入、または形質導入等を行った細胞の核酸発現ライブラリ、および細胞表面へのコード化ポリペプチドのディスプレイ）あるいは、無細胞発現システム（例えば、エマルジョン分画とディスプレイ）を採用してもよい。代表的なディスプレイシステムでは、核酸のコード機能および核酸によりコードされたポリペプチドもしくはペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性を関連付ける。このようなディスプレイシステムが採用されると、所望の物理的、化学的、および／または、機能特性を有するポリペプチドまたはペプチドが選択でき、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸が容易に単離または回収できる。核酸のコード機能およびポリペプチドもしくはペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性を関連付ける多くのディスプレイシステムが当技術分野において知られており、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えばファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルジョン分画とディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、共有結合ディスプレイ等（例えば、ＥＰ  ０４３６５９７  （Ｄｙａｘ）、米国特許第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，４８９，１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．）参照））がある。
【００５１】
本明細書で使われている「レパートリー」は、アミノ酸配列の多様性で特徴付けられるポリペプチドまたはペプチドのコレクションを指す。レパートリーのそれぞれのメンバーは、共通の構造特性（例えば、共通のコア構造）、および／または共通の機能特性（例えば、共通のリガンド（例えば、リガンド属（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｌｉｇａｎｄ）または標的リガンド、ＴＮＦＲ１）に結合する能力）等の共通の特徴を有し得る。
【００５２】
本明細書で使われている「機能的」は、特異的結合活性等の生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドの特徴を説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」は、抗原結合部位により標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００５３】
本明細書で使われている「リガンド属」は、所与のレパートリーの機能的メンバーの実質的一部（例えば、実質的に全部）に結合するリガンドを指す。リガンド属（例えば、共通リガンド属）は、メンバーが共通標的リガンドに対し結合特異性を持っていなくても、所与のレパートリーの多くのメンバーと結合可能である。通常、ポリペプチド上の機能的リガンド属結合部位が存在する（リガンド属に結合する能力で示されるように）と、ポリペプチドは正しく折り込まれ、機能する。リガンド属の適切な例には、超抗原や、レパートリーの機能的メンバーの実質的一部上に発現したエピトープに結合する抗体等を含む。
【００５４】
「超抗原」は、これらタンパク質の標的リガンド結合部位から離れた部位で、免疫グロブリン超分子群のメンバーと相互作用するリガンド属を指す技術用語である。ブドウ球菌エンテロトキシンは、Ｔ細胞受容体と相互作用する超抗原の例である。抗体と結合する超抗原には、ＩｇＧ定常領域と結合するプロテインＧ（Ｂｊｏｒｃｋ  ａｎｄ  Ｋｒｏｎｖａｌｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：９６９  （１９８４））、ＩｇＧ定常領域およびＶＨドメインと結合するプロテインＡ（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｓｊｏｑｕｉｓｔ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９７：８２２  （１９６６））、およびＶＬドメインと結合するプロテインＬ（Ｂｊｏｒｃｋ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０：１１９４  （１９８８））が含まれる。
【００５５】
本明細書で使われている「標的リガンド」は、ポリペプチドまたはペプチドが特異的にまたは選択的に結合するリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片である場合、標的リガンドは、任意の所望の抗原またはエピトープであり得る。標的抗原への結合は、機能的ポリペプチドまたはペプチドに依存する。
【００５６】
本明細書で使われている抗体は、天然に産生する抗体の任意の種から誘導されるものであろうと、または組換え型ＤＮＡ技術により作製されるものであろうと；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞、酵母、またはバクテリアから単離されるものであろうと、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤやＩｇＥ、または断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）を指す。
【００５７】
本明細書で使われている「抗体フォーマット」、「フォーマットされた」またはその類似形は、その構造上の抗原に対する結合特異性を与えるために１つまたは複数の抗体可変ドメインが組み込まれている任意の適切なポリペプチド構造を指す。多様な好適抗体フォーマットが当技術分野において知られており、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／もしくは軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、上記いずれかの抗原結合断片（例えばＦｖ断片（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ等）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および上記いずれかの改変型（例えば、ポリエチレングリコール、または他の適切なポリマーやヒト化ＶＨＨの共有結合による改変）がある。
【００５８】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、他のＶ領域またはドメインと独立に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変部位または可変ドメインを伴ったフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在してもよく、ここで単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に他の領域またはドメインは必要でない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインと独立に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）、テンジクザメ、およびラクダ科動物のＶＨＨ  ｄＡｂ等の他の種からの単一抗体可変ドメインも含有する。ラクダ科動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等の種から得られた免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドで、生来軽鎖が欠けている重鎖抗体を産生する。ＶＨＨは、ヒト化可能である。
【００５９】
「ドメイン」は、タンパク質の他とは独立に三次構造を有する折り畳みタンパク質構造である。一般的には、ドメインはタンパク質個々の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質、および／またはドメインの残りの機能を失うことなく他のタンパク質への付加、削除、または移動が可能である。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む折り畳みポリペプチドドメインを意味する。したがって、これは、抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメインの全体を含むが、例えば１つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特徴でない配列により置換され、あるいは、切断された、またはＮまたはＣ末端拡張を含む抗体可変ドメイン、ならびに、少なくとも全長ドメイン時の結合活性および特異性を保持している可変ドメインの折り畳み断片、により置換された場合が含まれる。
【００６０】
用語「ライブラリ」は、異種ポリペプチド、または異種核酸の混合物を指す。ライブラリは、単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成されている。この点では、ライブラリはレパートリーの同義語である。ライブラリメンバー間の配列の差はライブラリに存在する多様性によるものである。ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、または、核酸のライブラリで形質転換した生物または細胞の形、例えばバクテリア、ウイルス、動物または植物等の形を取ってもよい。一実施形態では、各生物または細胞が、１つまたは限定された数のみのライブラリメンバーを含むようにする。一実施形態では、核酸は発現ベクター中に組み込まれ、核酸によりコードされたポリペプチドを発現させる。したがって、１つの態様では、ライブラリは、宿主生物の集団の形を取って、各生物が発現して対応するポリペプチドメンバーを産生する核酸の形でライブラリの単一メンバーを含有する発現ベクターの１つまたは複数のコピーを含んでもよい。このように、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
【００６１】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）による配列に保存されている抗体の領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、または、ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋにより定義（（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９１０−９１７）されているヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーもしくは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列を指す。ライブラリおよびレパートリーは単一フレームワークまたは一連の当該フレームワークを使用し得る。これを使って超可変領域のみを変化させることにより実質的にほとんどの結合特異性を導出可能であることが明らかになっている。
【００６２】
本明細書で使われている用語「用量」は、被験者に一度に全投与（単位用量）するか、または２回以上の回数にわけ一定の時間間隔で投与するリガンドの量を指す。例えば、用量は１日（２４時間）（１日量）、２日、１週、２週、３週、または１ヶ月または２ヶ月以上にわたって（例えば、１回投与、または２回以上の投与で）で被験者に投与するリガンドの量（例えば、リガンドは、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン）を指してもよい。投与間隔は任意の所望間隔とすることができる。
【００６３】
本明細書で使われている「流体力学的サイズ」は、水溶液中の分子の拡散から求めた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけ上の大きさを指す。溶液中のタンパク質の拡散または運動を適切に処理してタンパク質の見かけ上の大きさを導き出すことができ、この方式ではタンパク質粒子の大きさが「ストークス半径」または「流体力学的半径」として得られる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量と形状（立体配座）に依存する。すなわち、同じ分子質量の２つのタンパク質がその全立体配座に依存して異なる流体力学的サイズを持ち得るということである。
【００６４】
本明細書で使われている用語「競合する」は、第一標的のその同種標的結合ドメインへの結合が、同種標的に対し特異的な第二結合ドメインが存在する場合に、阻害されることを意味する。例えば、結合ドメインの物理的ブロックにより、または標的に対する親和性やアビディティが低下するような結合ドメインの構造もしくは環境の変化により、結合が立体的に阻害され得る。競合的ＥＬＩＳＡ法および競合的ＢＩＡｃｏｒｅ法の実験により第一と第二の結合ドメインの間での競合を測定する方法の詳細ついては、ＷＯ２００６０３８０２７を参照されたい。
【００６５】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（本明細書ではこれらの用語は同義的に使われている）の計算は次のように行う。最適な比較のために配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較のために非相同配列を無視することができる）。一実施形態では、比較のためにアライメントされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置で同一である（本明細書で使われているアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、これら２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、これらの配列により共有される同一位置の数の関数である。本明細書で定義されるアミノ酸およびヌクレオチド配列のアライメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより作製し、決定してもよい  （Ｔａｔｕｓｏｖａ，  Ｔ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，  １７４：１８７−１８８  （１９９９））。
【００６６】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１９である。一実施形態では、この態様による可変ドメインは、本発明の他の任意の態様の特徴を１つまたは複数有し得、本文の開示により、（例えば本明細書の特許請求の範囲に組み込むために）このような特徴を組み合わせることができるものと解釈される。
【００６７】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４３またはＤＯＭ１ｈ−５４９のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４３またはＤＯＭ１ｈ−５４９である。一実施形態では、この態様による可変ドメインは、本発明の他の任意の態様の特徴を１つまたは複数有し得、本文の開示により、（例えば本明細書の特許請求の範囲に組み込むために）このような特徴を組み合わせることができるものと解釈される。
【００６８】
１つの態様では、本発明は、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、以下の変異（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を１つもしくは複数含む、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４の変異体である：
３０位は、ＬもしくはＦである、
５２位は、ＡもしくはＴである、
５２ａ位は、ＤもしくはＥである、
５４位は、ＡもしくはＲである、
５７位は、Ｒ、ＫもしくはＡである、
６０位は、Ｄ、Ｓ、ＴもしくはＫである、
６１位は、Ｅ、ＨもしくはＧである、
６２位は、ＡもしくはＴである、
１００位は、Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＳもしくはＶである、ならびに
１０１位は、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、ＨもしくはＫである。
【００６９】
この態様の一実施形態では、変異アミノ酸配列はＤＯＭ１ｈ−５７４のアミノ酸配列と少なくとも９８または９９％等しい。一実施形態では、変異アミノ酸配列は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４のアミノ酸配列と等しいか、または少なくとも９８もしくは９９％等しい。一実施形態では、この態様による可変ドメインは、本発明の他の任意の態様の特徴を１つまたは複数有し得、本文の開示により、（例えば本明細書の特許請求の範囲に組み込むために）このような特徴を組み合わせることができるものと解釈される。
【００７０】
１つの態様では、本発明は、１０１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にバリンを含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを提供する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｖ１０１はＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）結合における高いＫＤと高頻度で関連していることを見出した。一実施形態では、この態様による可変ドメインは、本発明の他の任意の態様の特徴を１つまたは複数有し得、本文の開示により、（例えば本明細書の特許請求の範囲に組み込むために）このような特徴を組み合わせることができるものと解釈される。
【００７１】
１つの態様では、本発明は、１０１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にバリンを含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを提供する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｖ１０１はタンパク質分解に対する安定性と高頻度で関連していることを見出した。タンパク質分解に対する安定性およびタンパク質分解に対して安定な免疫グロブリン単一可変ドメインの詳細については、ＷＯ２００８１４９１４４およびＷＯ２００８１４９１４８（これらの開示全体は参照により本明細書に組み込まれる）で見つけることができ、これらは特に可変ドメインおよび他の抗ＴＮＦＲ１リガンド、アンタゴニストおよび結合ドメインのプロテアーゼ安定性を決定する試験を提示している。一実施形態では、この態様による可変ドメインは、本発明の他の任意の態様の特徴を１つまたは複数有し得、本文の開示により、（例えば本明細書の特許請求の範囲に組み込むために）このような特徴を組み合わせることができるものと解釈される。
【００７２】
一実施形態では、いずれかの態様による単一可変ドメインは、３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む。一実施形態では、可変ドメインは、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、４５Ｐ、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、３０Ｇ、４４Ｄ、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。
【００７３】
１つの態様では、本発明は、３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインのアミノ酸配列はその他の点ではＤＯＭ１ｈ−５７４のアミノ酸配列と等しい。一実施形態では、可変ドメインは、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合するために提供される。一実施形態では、可変ドメインは、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、４５Ｐ、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。一実施形態では、可変ドメインは、３０Ｇ、４４Ｄ、５５Ｄ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む。
【００７４】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と等しいか、あるいは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、細胞アッセイ法、例えば標準的ＭＲＣ５アッセイ法において、ＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定した；または標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定した；標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定した、ＴＮＦＲ１（例えば、少なくともヒトＴＮＦＲ１）の強力な中和剤である可変ドメインを提供する。ＴＮＦＲ１アンタゴニストのための標準的アッセイの詳細については、当技術分野、例えばＷＯ２００６０３８０２７、ＷＯ２００８１４９１４４およびＷＯ２００８１４９１４８において知られている。詳細については以下の実施例でも提示する。一実施形態では、本発明は、下表１１に示すＤＯＭ１ｈ−５７４を除くＤＯＭ１ｈ可変ドメインの任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８９〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１７９の任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００７５】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０のアミノ酸配列と等しいか、あるいは少なくとも９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、タンパク質分解に対して安定な可変ドメインを提供する。プロテアーゼ安定性に関しては、上の議論を参照されたい。
【００７６】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と等しいか、あるいは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この態様は、ヒトＴＮＦＲ１と高い親和性で結合し、任意にマウスＴＮＦＲ１に対しても所望の親和性を示す可変ドメインを提供する。
【００７７】
単一可変ドメインは、例えば、ＴＮＦＲ１の非競合阻害剤である。一実施形態では、本発明のいずれの態様の抗ＴＮＦＲ１単一可変も、（例えば、標準的な受容体結合アッセイ法において）ＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に結合するが、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合と競合または阻害しない（または実質的に競合もしくは阻害しない）。この実施形態では、１例では、可変ドメインはＴＮＦＲ１、例えば、ヒトＴＮＦＲ１のドメイン１に特異的に結合する。この実施形態では、１例では、可変ドメインはＴＮＦＲ１、例えば、ヒトＴＮＦＲ１のＰＬＡＤに特異的に結合する。
【００７８】
一実施形態では、本発明のいずれの態様の抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインも、
（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）が５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、もしくは１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）でヒトＴＮＦＲ１に；または
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）が５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、もしくは１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）で非ヒト霊長類ＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザル、アカゲザルもしくはヒヒＴＮＦＲ１）に；または
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）が７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、もしくは１ｎＭ以下（または約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、もしくは約１ｎＭ以下）でマウスＴＮＦＲ１に
特異的に結合する結合部位を含む。１例では、可変ドメインは（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）により特異的に結合する。
【００７９】
一実施形態では、本発明のいずれの態様の単一可変ドメインも、
（ａ）表面プラズモン共鳴で測定した解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｆｆ）が２×１０−４Ｓ−１以下、もしくは１×１０−４Ｓ−１以下、もしくは１×１０−５Ｓ−１以下（または約２×１０−４Ｓ−１以下、もしくは約１×１０−４Ｓ−１以下、もしくは約１×１０−５Ｓ−１以下）でヒトＴＮＦＲ１に；
（ｂ）表面プラズモン共鳴で測定した解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｆｆ）が２×１０−４Ｓ−１以下、１×１０−４Ｓ−１以下、もしくは１×１０−５Ｓ−１以下（または約２×１０−４Ｓ−１以下、約１×１０−４Ｓ−１以下、もしくは約１×１０−５Ｓ−１以下）で非ヒト霊長類ＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒＴＮＦＲ１）に；または
（ｃ）表面プラズモン共鳴で測定した解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｆｆ）が１×１０−３Ｓ−１以下、もしくは１×１０−４Ｓ−１以下（または約１×１０−３Ｓ−１以下、もしくは約１×１０−４Ｓ−１以下）でマウスＴＮＦＲ１に、
特異的に結合する結合部位を含む。１例では、可変ドメインは（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、または（ｂ）および（ｃ）により特異的に結合する。
【００８０】
一実施形態では、本発明のいずれの態様の単一可変ドメインも、
（ａ’）表面プラズモン共鳴で測定した会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｎ）が５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、３×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、４×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上（または約５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、約１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約３×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約４×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは約５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上）でヒトＴＮＦＲ１に；
（ｂ’）表面プラズモン共鳴で測定した会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｎ）が５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、３×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、４×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上（または約５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上、約１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約３×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約４×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは約５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上）で非ヒト霊長類ＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒＴＮＦＲ１）に；または
（ｃ’）表面プラズモン共鳴で測定した会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）定数（Ｋｏｎ）が０．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上（または約０．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、約１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、もしくは約２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上）でマウスＴＮＦＲ１に、
特異的に結合する結合部位を含む。１例では、可変ドメインは、（ａ’）および（ｂ’）；（ａ’）および（ｃ’）；（ａ’）、（ｂ’）および（ｃ’）、または（ｂ’）および（ｃ’）により特異的に結合する。
【００８１】
一実施形態では、本発明のいずれの態様の単一可変ドメインも、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１に特異的に結合する。特異的結合は、１０μＭ以下の解離定数Ｋｄで表され、１μＭ以下のＫｄも任意に選択可能である。抗原結合タンパク質の抗原、またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）等のスキャッチャード解析、および／または競合的結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、およびサンドイッチ競合的アッセイ、およびこれらの様々な変種、を含む適切なアッセイによって測定可能である。１例では、可変ドメインはマウスＴＮＦＲ１にも特異的に結合する。
【００８２】
本発明のいずれかの態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、例えば標準的細胞アッセイ法（例えば、本明細書またはＷＯ２００６０３８０２７、ＷＯ２００８１４９１４４もしくはＷＯ２００８１４９１４８に記載のもの）において、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０への結合を阻害する。本発明のいずれかの態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、例えば標準的な受容体結合アッセイ（例えば、本明細書またはＷＯ２００６０３８０２７、ＷＯ２００８１４９１４４もしくはＷＯ２００８１４９１４８に記載のもの）において、ヒト、マウス、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０への結合を阻害する。１例では、これらの実施形態における「阻害する」とは、全阻害（１００％阻害）であっても実質的（少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％）な阻害であってもよい。
【００８３】
本発明のいずれかの態様の一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンドまたはポリペプチドは、標準的ＭＲＣ５アッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０が５、４、３、２または１ｎＭ以下（または約５、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下）でＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）を中和する。
【００８４】
本発明のいずれかの態様の一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンドまたはポリペプチドは、標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定したＮＤ５０が１５０、１００、５０、４０、３０もしくは２０ｎＭ以下；または（約）１５０〜１０ｎＭ；または（約）１５０〜２０ｎＭ；または（約）１１０〜１０ｎＭ；または（約）１１０〜２０ｎＭでＴＮＦＲ１（例えば、マウスＴＮＦＲ１）を中和する。
【００８５】
本発明のいずれかの態様の一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンドまたはポリペプチドは、標準的カニクイザルＫＩアッセイにおいてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０が５、４、３、２もしくは１ｎＭ以下；または（約）５〜（約）１ｎＭでＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザルＴＮＦＲ１）を中和する。
【００８６】
本発明のいずれかの態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、末端、任意にＣ末端に、システイン残基を含む。例えば、システイン残基は、例えば、マレイミド結合を用いてＰＥＧを可変ドメインに結合させるために使用できる（例えば、ＷＯ０４０８１０２６を参照のこと）。本発明のいずれかの態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、ポリアルキレングリコール部分、任意にポリエチレングリコール部分に結合している。適切なＰＥＧ部分ならびに接合方法および試験については、例えば、ＷＯ０４０８１０２６を参照されたい。これらの開示は、（例えば以下の特許請求の範囲に含まれる特異性ＰＥＧの）開示を提供するために本明細書に組み込まれる。
【００８７】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいか、あるいは選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５、２０、１５、１０もしくは５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ１配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列を含む。
【００８８】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同じか、あるいは選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５、２０、１５、１０もしくは５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ２配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ２配列を含む。さらに、または代替的に、一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列を含む。さらに、または代替的に、一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ１配列を含む。
【００８９】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいか、あるいは選択されたアミノ酸配列とアミノ酸位置が２５、２０、１５、１０もしくは５以下異なり、選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００９０】
１つの態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、
（ｉ）少なくとも１０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ）、３７℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）；または
（ｉｉ）少なくとも４０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ’）、３０℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）
でインキュベート時にプロテアーゼ耐性であり、
ここで可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３のアミノ酸配列と少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含み、任意選択として、１０１位（Ｋａｂａｔナンバリング）にバリンを含む。別の態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この単一可変ドメインは、
（ｉ）少なくとも１０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ）、３７℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）；または
（ｉｉ）少なくとも４０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ’）、３０℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）
でインキュベート時にプロテアーゼ耐性であり、
ここで可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０のアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％等しいアミノ酸配列を含み、および任意選択として、１０１位（Ｋａｂａｔナンバリング）にバリンを含む。
【００９１】
これらの態様の一実施形態では、プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦＲ１可変ドメインは非競合可変ドメインである（すなわち、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合を（実質的に）阻害しない）。非競合可変ドメインに関する上の議論（これらの実施形態にも適用される）を参照のこと。
【００９２】
これらの態様の一実施形態では、濃度（ｃまたはｃ’）は少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌプロテアーゼである。一実施形態では、時間（ｔ）は１、３もしくは２４時間または一晩である。１例では、可変ドメインは、（ｉ）および濃度（ｃ）が１０または１００μｇ／ｍｌプロテアーゼであり、時間（ｔ）が１時間である条件下で耐性である。１例では、可変ドメインは、（ｉｉ）および濃度（ｃ’）が４０μｇ／ｍｌプロテアーゼであり、時間（ｔ）が３時間である条件下で耐性である。一実施形態では、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される。一実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。一実施形態では、可変ドメインはトリプシン耐性であり、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも１つの他のプロテアーゼに耐性である。一実施形態では、可変ドメインは、（ｉ）または（ｉｉ）条件下でインキュベート後、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する。一実施形態では、（ｉ）または（ｉｉ）条件下でインキュベート後、ＥＬＩＳＡで読みとった可変ドメインのＯＤ４５０は少なくとも０．４０４である。一実施形態では、（ｉ）または（ｉｉ）条件下でインキュベート後、可変ドメインはプロテインＡまたはプロテインＬに特異的に結合する。一実施形態では、（ｉ）または（ｉｉ）条件下でインキュベート後、可変ドメインはゲル電気泳動において実質的に単一のバンドを示す。一実施形態では、単一可変ドメインのＴｍは少なくとも５０℃である。プロテアーゼ耐性に関する詳細については、ＷＯ２００８１４９１４４およびＷＯ２００８１４９１４８で見つけることができる。
【００９３】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびエフェクター基または抗体定常ドメイン、任意に抗体Ｆｃ領域（任意にＦｃのＮ末端が、可変ドメインのＣ末端に結合（任意に直接結合）している）を含むポリペプチドに関する。ＷＯ０４０５８８２０に記載の任意の「エフェクター基」を本発明のこの態様に使用でき、ＷＯ０４０５８８２０のエフェクター基の説明、およびその刊行物に開示されている可変ドメインへのそれらの結合方法は参照により明示的に本明細書に組み込まれ、（例えば、本明細書の特許請求の範囲に）使用できる本明細書の説明を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２のＦｃ融合物を含む。
【００９４】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび任意に血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドに関する。驚くべきことに、本発明者らは、本発明による抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインの抗ＳＡ単一可変ドメインへの融合は、（抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ単量体単独より）改善された半減期という利点を提供するが、ＴＮＦＲ１結合親和性（ＫＤ）改善という便益も付加するということを見出した。この所見は、従来技術においてこれまで開示されていない。この観点から、本発明は、可変ドメイン単量体として提供時（すなわち、抗ＴＮＦＲ１可変ドメインがフォーマットされない、例えば、ＰＥＧ化しないかまたは抗体定常領域（Ｆｃ領域等）に融合せず、任意の他のドメインに融合しない場合）、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインよりも半減期が長く、ＴＮＦＲ１結合（例えば、ヒトＴＮＦＲ１結合）におけるＫＤの低いリガンドを提供するため、本発明の抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗ＳＡ（例えば、抗ヒトＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドを提供する。一実施形態では、多重特異性リガンドはＴＮＦＲ１の単量体のＫＤより少なくとも２倍低いＫＤでＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に結合する。さらにまたは代替的に、一実施形態では、多重特異性リガンドは単量体の半減期の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０または１００倍の半減期を有する。さらにまたは代替的に、一実施形態では、例えば抗ＳＡドメインがヒトＳＡと動物由来のＳＡ間で交差反応する場合、多重特異性リガンドは、ヒトにおいて、（例えばヒト志願者において経験的に測定するかまたは動物系（マウス、イヌおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、ヒヒ、アカゲザル）等のリガンドの半減期から推定することにより、当業者が精通している従来の技術を用いて算出される）少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日間の終末半減期を有する。
【００９５】
本発明の多重特異性リガンドの一実施形態では、リガンドはＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）、任意にＴＮＦＲ１の媒介性シグナル伝達のアンタゴニストである。
【００９６】
一実施形態では、本発明は、ｔβ半減期が２．５時間以上（または約２．５時間以上）の範囲内の本発明による可変ドメイン、多重特異性リガンドまたはアンタゴニストを提供する。一実施形態では、範囲の下端は３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、または１２時間（または約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、もしくは約１２時間）である。加えて、または代替的に、ｔβ半減期は２１日間または２５日間以内（または約２１日間もしくは約２５日間以内）である。一実施形態では、範囲の上端は１２時間、２４時間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、１９日間、２０日間、２１日間または２２日間（または約１２時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約５日間、約１０日間、約１５日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間もしくは約２２日間）である。例えば、本発明による可変ドメインまたはアンタゴニストは１２〜６０時間（または約１２〜約６０時間）の範囲内のｔβ半減期を有する。さらなる一実施形態では、ｔβ半減期は１２〜４８時間（または約１２〜約４８時間）の範囲内に収まる。さらなる一実施形態では、ｔβ半減期は１２〜２６時間（または約１２〜約２６時間）の範囲内に収まる。
【００９７】
２区画モデリング使用の代替法として、終末半減期を測定するために使用できる無隔壁モデリングの使用に当業者は精通するであろう（この観点から、本明細書で使われている用語「終末半減期」とは、無隔壁モデリングを用いて測定した終末半減期を意味する）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ、例えばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、マウンテンビュー、カリフォルニア９４０４０、米国から入手可能）を、例えば、この方法で曲線をモデリングするために使用できる。この場合、一実施形態では、単一可変ドメイン、多重特異性リガンドまたはアンタゴニストは、少なくとも（または少なくとも約）８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２８時間、２０時間、１日間、２日間、３日間、７日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間または２５日間の終末半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上端は、２４時間、４８時間、６０時間または７２時間または１２０時間（または約２４時間、約４８時間、約６０時間もしくは約７２時間もしくは約１２０時間）である。例えば、終末半減期は、例えば、ヒトで８時間〜６０時間、または８時間〜４８時間または１２〜１２０時間（または約８時間〜約６０時間、もしくは約８時間〜約４８時間もしくは約１２〜約１２０時間）である。
【００９８】
上の基準に加えて、または上の基準と代替的に、本発明による可変ドメインまたはアンタゴニストは、１ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ以上（または約１ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ以上）の範囲内のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一実施形態では、範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ（または約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００もしくは約３００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ）である。加えて、または代替的に、本発明による可変ドメイン、多重特異性リガンドまたはアンタゴニストは、最大（または最大約）６００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌの範囲内のＡＵＣを有する。一実施形態では、範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ（または約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５もしくは約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ）である。有益に可変ドメインまたはアンタゴニストは以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、および１５〜５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ（または約１５〜約１５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、および約１５〜約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ）。
【００９９】
１つまたは複数の本明細書に引用したｔα、ｔβおよび終末半減期ならびにＡＵＣは、ヒトおよび／または動物（例えば、マウスまたは非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル）において、ＰＥＧ、あるいは血清アルブミン、例えばマウスおよび／またはヒト血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する単一可変ドメイン（または結合部分）のいずれかに結合した１つまたは複数の抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメイン（または本明細書に定義した他の結合部分）を提供することにより得ることができる。ＰＥＧサイズは、少なくとも（または少なくとも約）２０ｋＤａ、例えば、３０、４０、５０、６０、７０または８０ｋＤａであり得る。一実施形態では、ＰＥＧは４０ｋＤａ、例えば２×２０ｋＤａ  ＰＥＧである。一実施形態では、本明細書に引用したｔα、ｔβおよび終末半減期またはＡＵＣを得るため、抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインに結合した抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むアンタゴニストを提供する。一実施形態では、ＰＥＧは、４０ｋＤａ、例えば２×２０ｋＤａ  ＰＥＧである。例えば、アンタゴニストは、わずか１つのこのような抗ＴＮＦＲ１可変ドメイン、例えばわずか１つの抗ＳＡ可変ドメインに結合した１つのこのようなドメインを含む。一実施形態では、本明細書に引用したｔα、ｔβおよび終末半減期もしくはＡＵＣを得るために、ＰＥＧ、例えば、４０〜８０ｋＤａ  ＰＥＧ、例えば、４０ｋＤａ  ＰＥＧに結合した抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むアンタゴニストを提供する。例えば、アンタゴニストは、わずか１つのこのような抗ＴＮＦＲ１可変ドメイン、例えば４０ｋＤａ  ＰＥＧに結合した１つのこのようなドメインを含む。
【０１００】
本発明の多重特異性リガンドの一実施形態では、リガンドは、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８またはＤＯＭ７ｍ−１６の配列と等しいか、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）単一可変ドメインを含む。代替的にまたは追加的に、一実施形態では、多重特異性リガンドは、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーを含み、このリンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。例えば、リガンドは、（Ｎ末端からＣ末端方向で）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１；またはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２−ＡＳＴＳＧＰＳ−ＤＯＭ７ｍ−１６；またはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２−ＡＳＴＳＧＰＳ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２を含む。
【０１０１】
１つの態様では、本発明は、以下を含む多重特異性リガンドを提供する、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と等しいか、少なくとも９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン、（ｉｉ）抗血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、この抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１１−３の配列と等しいか、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む、および（ｉｉｉ）任意にここでリンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、このリンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。例えば、リガンドは、任意にＡＳＴまたはＡＳＴＳＧＰＳにより結合するＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６およびＤＯＭ７ｈ−１１−３を含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。この例または態様では、リガンドは、患者への血管内、皮下、筋肉内、腹腔内または吸入投与用に任意に適用される。１例では、リガンドは、（投与前に、任意に希釈剤と混合する）乾燥粉末剤または凍結乾燥組成物として提供される。
【０１０２】
１つの態様では、本発明は、以下を含む多重特異性リガンドを提供する、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と等しいか、少なくとも９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン、（ｉｉ）抗血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであり、この抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０の配列と等しいか、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％等しいアミノ酸配列を含む、および（ｉｉｉ）任意にここでリンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、リンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。例えば、リガンドは、ＡＳＴまたはＡＳＴＳＧＰＳにより任意に結合したＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６およびＤＯＭ７ｈ−１４−１０を含む。あるいは、リンカーはＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎであり、式中ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。この例または態様では、リガンドは、任意に患者への血管内、皮下、筋肉内、腹腔内または吸入投与用に適応する。１例では、リガンドは、（投与前に、任意に希釈剤と混合する）乾燥粉末剤または凍結乾燥組成物として提供される。
【０１０３】
本発明は、本発明のいずれかの態様または実施形態の単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを含むＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。例えば、本発明のアンタゴニストまたは可変ドメインは、ＴＮＦＲ１結合１価である。例えば、本発明のアンタゴニストまたは可変ドメインは、標準的ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した１価または実質的に１価である。実質的１価は、標準的ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した非１価形態で存在する可変ドメインまたはアンタゴニストが５、４、３、２または１％以下であることにより示される。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のアンタゴニストは、第一および第二の抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、この各可変ドメインは本発明のいずれかの態様または実施形態による。第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは、１例では同一である。別の例ではそれらは異なる。
【０１０５】
１例では、本発明のアンタゴニストまたはアンタゴニストにおける各抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインのアミノ酸配列は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−７２と同じアミノ酸配列である。
【０１０６】
１つの態様では、本発明は、経口送達、患者の消化管送達、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）送達、患者の肺（ｌｕｎｇ）への送達または全身送達のための、本発明のいずれかの態様による、抗ＴＮＦＲ１可変ドメインを含むＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供する。別の態様では、本発明は、経口送達のための医薬品の製造における本発明のいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。別の態様では、本発明は、患者の消化管送達のための医薬品の製造における本発明のいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニストまたは可変ドメインの１例は、トリプシン、エラスターゼおよび／またはパンクレアチン耐性である。
【０１０７】
１つの態様では、本発明は、肺送達のための医薬品の製造における本発明のいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、患者の肺への送達のための医薬品の製造における本発明のいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。１例では、アンタゴニストまたは可変ドメインはロイコザイム耐性である。
【０１０９】
１つの態様では、本発明は、経口送達、あるいは患者の消化管または患者の肺（ｌｕｎｇ）もしくは肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）組織への医薬品の送達方法を提供し、この方法は、製薬的有効量の本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストを患者に投与することを含む。
【０１１０】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ１配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ１配列を有する。任意選択として、アンタゴニストは、選択された配列のＣＤＲ２配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ２配列も有する。任意選択として、さらにまたは代替的に、アンタゴニストは、選択された配列のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列も有する。
【０１１１】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ２配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ２配列を有する。任意選択として、アンタゴニストは、選択された配列のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列も有する。
【０１１２】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のＣＤＲ３配列と等しいか、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％等しいＣＤＲ３配列を有する。
【０１１３】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供し、このアンタゴニストは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０から選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
【０１１４】
本発明は、炎症状態の治療および／または予防のためのいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。本発明は、炎症状態の治療および／または予防のための医薬品の製造におけるいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニストまたは使用の一実施形態では、状態は、関節炎、多発性硬化症、炎症腸疾患および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される。１例では、関節炎は、関節リウマチまたは若年性関節リウマチである。１例では、炎症腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される。１例では、慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎、慢性閉塞気管支炎および気腫からなる群から選択される。１例では、肺炎は細菌性肺炎である。１例では、細菌性肺炎はブドウ球菌性肺炎である。
【０１１５】
本発明は、呼吸疾患の治療および／または予防のためのいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。本発明は、呼吸疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造におけるいずれかの態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。１例では、呼吸疾患は、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、浸潤性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスＸ、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈の閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。
【０１１６】
１つの態様では、本発明のいずれかの態様の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦを標的とするために提供される。１例では、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドは、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦを標的とするために提供される。１例では、このような標的は上述の任意の状態または疾患を治療および／または予防するためである。１つの態様では、本発明は、患者における上述の任意の状態または疾患を治療および／または予防する方法を提供し、この方法は、先に述べたいずれかの実施形態に記載のとおり、ＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする本発明の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを患者に投与することを含む。
【０１１７】
ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニスト
ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、リガンドまたはアンタゴニストは、大腸菌またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種（例えば、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ））に発現し得る。一実施形態では、リガンドまたはｄＡｂ単量体は大腸菌またはピキア種（例えば、Ｐ．パストリス）中に発現時、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書に記載のリガンドおよびｄＡｂ単量体は、大腸菌またはピキア種（例えば、Ｐ．パストリス）中に発現時に分泌し得るが、それらは大腸菌またはピキア種を用いない任意の適切な方法（化学合成法または生物学的産生法等）を用いて産生し得る。
【０１１８】
一部の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、リガンドまたはアンタゴニストはラクダ科免疫グロブリン可変ドメイン、またはラクダ科生殖系列抗体遺伝子セグメント、例えば１０８位、３７位、４４位、４５位および／もしくは４７位によりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに独特な１つもしくは複数のフレームワークアミノ酸を含まない。一実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲ１可変ドメインは、Ｋａｂａｔによる４４位にＧ残基を含み、任意に他の位置、例えば３７位または１０３位に１つまたは複数のラクダ科特異性アミノ酸を含む。
【０１１９】
本発明によるＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、１価であっても多価であってもよい。一部の実施形態では、アンタゴニストは１価であり、ＴＮＦＲ１と相互作用する１つの結合部位、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供された結合部位を含む。１価アンタゴニストは１つのＴＮＦＲ１と結合し、受容体の活性化およびシグナル伝達に至り得る細胞表面上のＴＮＦＲ１の架橋または凝集を誘発しなくてもよい。
【０１２０】
他の実施形態では、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは多価である。ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストはＴＮＦＲ１の特定の結合部位のコピーを２つ以上含んでもよく、ＴＮＦＲ１と結合する２つ以上の異なる結合部位、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供された少なくとも１つの結合部位を含んでもよい。例えば、本明細書に記載のように、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１と結合する本発明の特定のポリペプチドもしくはｄＡｂのコピーを２つ以上、またはＴＮＦＲ１と結合する本発明の異なるポリペプチドもしくはｄＡｂを２つ以上含む二量体、三量体もしくは多量体であり得る。一実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは標準的細胞アッセイ法においてＴＮＦＲ１を実質的に刺激しない（ＴＮＦＲ１のアゴニストとして作用しない）（すなわち、アッセイ法において、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭまたは５，０００μＭの濃度で存在時、ＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍｌ）により誘発されるＴＮＦＲ１媒介性活性は約５％以下である）。
【０１２１】
特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストはＴＮＦＲ１の所望のエピトープまたはドメインの結合部位を２つ以上含む。例えば、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストはＴＮＦＲ１のドメイン１の同一エピトープに結合する結合部位を２つ以上含み得る。
【０１２２】
他の実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１の異なるエピトープまたはドメインに結合する本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供された結合部位を２つ以上含む。一実施形態では、このような多価アンタゴニストはＷＯ２００６０３８０２７に記載の標準的Ｌ９２９細胞毒アッセイまたは標準的ＨｅＬａ  ＩＬ−８アッセイにおいて約１ｎＭ、または約１０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１μＭ、または約１０μＭの濃度で存在時にＴＮＦＲ１を刺激しない。
【０１２３】
ＴＮＦＲ１の他のアンタゴニストは、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合を阻害しない。このようなリガンド（およびアンタゴニスト）は、試料中ＴＮＦＲ１と結合し検出するため、定量化もしくは測定するために使用することができ、ＴＮＦＲ１への結合について試料中ＴＮＦと競合しないため、診断薬としての用途を有し得る。したがって、試料中のＴＮＦＲ１が存在するかどうか、またはＴＮＦＲ１がどの程度存在するかについて正確に測定することができる。
【０１２４】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストはＴＮＦＲ１と結合し、標準的細胞アッセイ法においてＴＮＦＲ１活性とＮＤ５０≦１００ｎＭで拮抗し、ｄＡｂは当該アッセイ法において≦１０μＭの濃度でＴＮＦＲ１活性を≦５％刺激する。
【０１２５】
具体的な実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、標準的細胞アッセイ法において、ＴＮＦＲ１を実質的に刺激しない（ＴＮＦＲ１のアゴニストとして作用しない）（すなわち、当該アッセイ法において、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭまたは５，０００μＭの濃度で存在時、ＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍｌ）により誘発されるＴＮＦＲ１媒介性活性は約５％以下である）。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、有効量を投与時、慢性炎症性疾患モデルにおいて効果的である。一般に有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ）である。慢性炎症性疾患モデル（ＷＯ２００６０３８０２７に記載のものを参照のこと）はヒトにおける治療的有効性を予測することが当業者により認識されている。
【０１２７】
具体的な実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、標準的マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて効果的である（モデルの詳細については、ＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）。例えば、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、標準的マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて４肢加重の平均関節炎スコアを、例えば、適切な対照に比べ約１〜約１６、約３〜約１６、約６〜約１６、約９〜約１６、または約１２〜約１６減らし得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、標準的マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて、関節炎症状の発現を、例えば、適切な対照に比べ約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間または約２８日間遅延化し得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与により、標準的マウスコラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて４肢加重の平均関節炎スコアは０〜約３、約３〜約５、約５〜約７、約７〜約１５、約９〜約１５、約１０〜約１５、約１２〜約１５、または約１４〜約１５となり得る。
【０１２８】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、マウスΔＡＲＥの関節炎モデルにおいて効果的である（モデルの詳細についてはＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）。例えば、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥの関節炎モデルにおいて、平均関節炎スコアを、例えば、適切な対照に比べ約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、または約２〜約２．５減らし得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥの関節炎モデルにおいて、関節炎症状の発現を、例えば、適切な対照に比べ約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間または約２８日間遅延化し得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥの関節炎モデルにおいて、平均関節炎スコアは０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、または約２〜約２．５となり得る。
【０１２９】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、マウスΔＡＲＥの炎症腸疾患（ＩＢＤ）モデルにおいて効果的である（モデルの詳細についてはＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）。例えば、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥのＩＢＤモデルにおいて、平均急性および／または慢性炎症スコアを、例えば、適切な対照に比べ約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、または約２〜約２．５減らし得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥのＩＢＤモデルにおいて、ＩＢＤ症状の発現を、例えば、適切な対照に比べ約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間または約２８日間遅延化し得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスΔＡＲＥのＩＢＤモデルにおいて、平均急性および／または慢性炎症スコアは０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、または約２〜約２．５となり得る。
【０１３０】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性ＩＢＤモデルにおいて効果的である（モデルの詳細についてはＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）。例えば、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスＤＳＳのＩＢＤモデルにおいて、平均重症度スコアを、例えば、適切な対照に比べ約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、または約２〜約２．５減らし得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスＤＳＳのＩＢＤモデルにおいて、ＩＢＤ症状の発現を、例えば、適切な対照に比べ約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間または約２８日間遅延化し得る。別の例では、有効量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの投与は、マウスＤＳＳのＩＢＤモデルにおいて、平均重症度スコアは０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、または約２〜約２．５となり得る。
【０１３１】
具体的な実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストは、マウス喫煙の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデルにおいて効果的である（モデルの詳細についてはＷＯ２００６０３８０２７およびＷＯ２００７０４９０１７を参照のこと）。例えば、有効量のリガンドの投与は、ＣＯＰＤ症状の発現を適切な対照に比べ減らし得るかまたは遅延化し得る。
【０１３２】
ＴＮＦＲ１のアンタゴニスト（例えば、リガンド、抗体またはその結合タンパク質）の疾患に対する保護または疾患の治療における有効性をスクリーニングするために使用できる動物モデル系が入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の試験方法は当技術分野において知られている（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １４７：  １６５３；  Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ２９９：  ５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて別の種由来の溶解性ＡｃｈＲタンパク質によって疾患を誘発することにより試験される（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４２：  ２３３）。関節炎は、感受性系統マウスにＩＩ型コラーゲンを注入することにより誘発される（Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４２：  ２３３）。感受性ラットにマイコバクテリア熱ショックタンパク質を注入することによりアジュバント関節炎が誘発されるモデルについて記載されている（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３１：  １７１）。甲状腺炎は、記載されているようにマウスにチログロブリンを投与して誘発される（Ｍａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １５２：  １１１５）。インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Ｋａｎａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ２７：  １１３に記載されているもの等、ある系統のマウスにおいて自然に発現するかまたは誘発することができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトのＭＳモデルとしての役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  （１９８６）  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｍｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｇｒｕｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １７９−２１３；  ＭｃＦａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １７９：  ４７８：およびＳａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８：  １７９を参照のこと）。
【０１３３】
一般的には、当該リガンド（例えば、アンタゴニスト）は、薬学的に適切なキャリアと共に精製形態で使用する。典型的に、これらのキャリアとしては、水性もしくはアルコール性／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水および／もしくは緩衝液を含む任意のものが挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンガーが挙げられる。必要な場合、懸濁液中にポリペプチド複合体を保つため、生理学的に許容可能な適切なアジュバントを増粘剤（カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネート等）から選択できる。
【０１３４】
静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液および電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくもの等）を含む。保存料および他の追加剤（抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性気体等）も存在し得る（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版）。徐放製剤を含む様々な適切な製剤を使用できる。
【０１３５】
本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト）は、他剤と別々に投与する組成物として用いても他剤と配合して用いてもよい。他剤としては、様々な免疫治療剤（シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン等）、および免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、投与前に貯蔵されていたかどうかを問わず、本発明のリガンドと併用した様々な細胞毒もしくは他剤の「混合物」を含んでもよいし、異なる特異性を有する本発明によるリガンド（異なる標的抗原またはエピトープを用いて選択されたリガンド等）の組み合わせさえも含んでよい。
【０１３６】
本発明による医薬組成物の投与経路は当業者に一般に知られている任意のものでよい。療法（免疫療法が挙げられるが、これに限定されない）において、標準的な技術に従い、本発明のその選択されたリガンドを任意の患者に投与できる。
【０１３７】
投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、経肺、または適切に、カテーテルによる直接注入を含む任意の適切な方法であってよい。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬剤の同時投与、禁忌ならびに臨床医が考慮する他の変数に依存する。投与は、適応があれば、局所投与（例えば、肺投与（例えば、鼻腔内投与）による肺への局所送達）であっても全身投与であってもよい。
【０１３８】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥して使用前に適切なキャリア中で再構成できる。この技術は有効であることが従来の免疫グロブリンで示されており、当技術分野で知られている凍結乾燥および再構成技術を用いてよい。凍結乾燥および再構成により様々な程度で抗体活性が損失する可能性があり（例えば従来の免疫グロブリンであるＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性損失度が大きい傾向がある）、これを補うために使用レベルを上方調整する必要がある場合があることが当業者により理解されるであろう。
【０１３９】
当該リガンド（例えば、アンタゴニスト）またはその混合物を含む組成物は、予防的および／または治療的処置において投与できる。ある治療的適応では、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅化、または他のいくつかの測定可能な変数を達成するための適量は、「治療的有効量」として定義する。この投与量に達するために必要な量は疾患の重症度および患者自体の免疫系の全体状態に依存するが、一般に０．００５〜１０．０ｍｇのリガンド、例えばｄＡｂまたはアンタゴニスト／ｋｇ体重の範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回の用量がより一般に使用される。予防的適応では、当該リガンドまたはその混合物を含む組成物は、疾患の発現を予防、阻害または遅延化するため（例えば、寛解もしくは静止状態を持続するため、または急性期を予防するため）類似したまたはわずかに低い投与量で投与してもよい。熟練臨床医は疾患を治療、抑制または予防するために適切な投薬間隔を決定できるであろう。慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防するためにＴＮＦＲ１のリガンド（例えば、アンタゴニスト）を投与時、１日当たり最大４回、週２回、週１回、隔週、月１回、または隔月で、例えば、約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。具体的な実施形態では、慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防するためにＴＮＦＲ１のリガンド（例えば、アンタゴニスト）を隔週または月１回、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与する。
【０１４０】
本明細書に記載の組成物を用いて実施した治療または療法は、治療前に存在するこのような症状と比較して、またはこのような組成物で治療しない個体（ヒトまたはモデル動物）もしくは他の適切な対照のこのような症状と比較して、１つまたは複数の症状が（例えば、少なくとも１０％または臨床評価尺度の少なくとも１点）低減した場合、「効果的」であるとみなされる。症状は当然、標的の疾患または障害に応じて変わるが、熟練臨床医または専門家により測定できる。このような症状は、例えば、疾患または障害の１つまたは複数の生化学的指標レベル（例えば、疾患と相関する酵素または代謝産物レベル、患部細胞数等）をモニタリングすることにより、物理的徴候（例えば、炎症、腫瘍サイズ等）をモニタリングすることにより、または承認された臨床評価尺度、例えば、拡大障害状態尺度（多発性硬化症向け）、アービン炎症腸疾患質問票（腸機能、全身症状、社会的機能および感情状態に関する生活の質を評価する３２点評価、スコア範囲３２〜２２４点、スコアが高いほど良好な生活の質を示す）、生活の質関節リウマチ尺度、または当技術分野で知られている他の承認された臨床評価尺度により測定できる。疾患または障害症状の少なくとも１０％または所与の臨床尺度の１点以上の持続した（例えば、１日以上、またはより長い）低減は、「効果的」治療の指標である。同様に、本明細書に記載の組成物を用いて実施した予防は、１つまたは複数の症状の発現または重症度がこの組成物で治療しない類似した個体（ヒトまたは動物モデル）のこのような症状と比較して遅延化、低減または根絶した場合、「効果的」である。
【０１４１】
本発明によるリガンド（例えば、アンタゴニスト）またはその混合物を含む組成物を、哺乳動物内で選択する標的細胞集団の改変、不活性化、死滅化または除去を補助するための予防的および治療的処置において使用できる。加えて、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは、細胞のヘテロ集団由来の標的細胞集団を死滅させる、枯渇させるかあるいは効果的に除去するために体外またはインビトロで選択的に使用できる。哺乳動物由来の血液は、体外でリガンドと組み合わせ、それによって標準的な技術に従い哺乳動物に戻すために血液中の望ましくない細胞を死滅させるかあるいは除去できる。
【０１４２】
本発明によるリガンド（例えば、アンタゴニスト）を含む組成物は、哺乳動物内で選択する標的細胞集団の改変、不活性化、死滅化または除去を補助する予防的および治療的処置において使用できる。
【０１４３】
リガンド（例えば、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、ｄＡｂ単量体）は、１つまたは複数の追加の治療薬または活性剤と共に投与およびまたは製剤化できる。リガンド（例えば、ｄＡｂ）は、追加の治療薬と投与時、追加薬の投与前、投与と同時または投与後に投与できる。一般的には、リガンドと追加薬は、治療効果の重複をもたらすように投与する。
【０１４４】
一実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む慢性炎症性疾患を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎）を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む乾癬を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む炎症腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞気管支炎、気腫）を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む肺炎（例えば、細菌性肺炎（ブドウ球菌性肺炎等））を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１５０】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患、および肺炎に加えて他の肺疾患を治療、抑制、または予防する方法を提供する。本発明に従い治療、抑制または予防し得る他の肺疾患は、例えば、嚢胞性線維症および喘息（例えば、ステロイド耐性喘息）を含む。したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、喘息）を治療、抑制、または予防する方法である。
【０１５１】
具体的な実施形態では、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内点滴）等の肺送達または全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）で投与される。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂまたはアンタゴニストの治療的有効量または投与量を、それらが必要な哺乳動物へ投与することを含む敗血性ショックを治療、抑制、または予防する方法である。
【０１５３】
本発明のさらなる態様では、本発明によるポリペプチド、リガンド、ｄＡｂもしくはＴＮＦＲ１のアンタゴニストならびに薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含む組成物を提供する。
【０１５４】
さらに、本発明は、本発明によるポリペプチド、リガンド、ｄＡｂもしくはＴＮＦＲ１のアンタゴニストまたは組成物を用いる疾患の治療方法を提供する。一実施形態では、疾患は癌または炎症性疾患、例えば関節リウマチ、喘息もしくはクローン病である。
【０１５５】
本発明のさらなる態様では、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンドもしくはアンタゴニストならびに薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含む組成物を提供する。
【０１５６】
具体的な実施形態では、ポリペプチド、リガンド、単一可変ドメイン、アンタゴニストまたは組成物は吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内点滴）等の肺送達または全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）で投与される。
【０１５７】
本発明のある態様では、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物、またはアンタゴニストを含む肺送達機器を提供する。この機器は、吸入器、または鼻腔内投与機器であってもよい。
【０１５８】
他の実施形態では、本明細書に記述されたいずれのリガンド（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）もポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンまたはこれらの断片のような半減期延長部分、トランスフェリン受容体またはそれのトランスフェリン結合部分、もしくはインビボで半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分、をさらに含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、インビボで半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分である。このポリペプチドは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、およびアビマーからなる群から選ばれる。
【０１５９】
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分である。一実施形態では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分（任意選択として、部分の大きさが約２０〜約５０ｋＤａ、任意選択として約４０ｋＤａ直鎖、または分岐ＰＥＧである）に結合している本発明の単一可変ドメインを含む（成分として含有を選択してもよい）。ｄＡｂと結合部分のＰＥＧ化に関する詳細についてはＷＯ０４０８１０２６を参照されたい。一実施形態では、アンタゴニストはＰＥＧに結合したｄＡｂ単量体から成る。ここで、ｄＡｂ単量体は本発明による単一可変ドメインである。このアンタゴニストは、炎症性疾患、肺疾患（例えば、喘息、インフルエンザ、またはＣＯＰＤ）、または癌の治療用に提供されるが、任意選択で静脈内投与用としてもよい。
【０１６０】
他の実施形態では、半減期延長部分は抗体または抗体断片（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）で、血清アルブミンまたは新生児ＦＣ受容体のための結合部位を含む。
【０１６１】
また、本発明は、本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）および生理学的に受容可能なキャリアを含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。一部の実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、硬腔内、関節内、皮下投与、肺、鼻腔内、膣、または直腸への投与、のためのビヒクルを含む。
【０１６２】
また、本発明は、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）を含む薬剤送達機器に関する。一部の実施形態では、薬剤送達機器は、複数の治療的有効量のリガンドを含む。他の実施形態では、薬剤送達機器は、非経口送達機器、静脈内送達機器、筋肉内送達機器、腹腔内送達機器、経皮的送達機器、肺送達機器、動脈内送達機器、硬腔内送達機器、関節内送達機器、皮下送達機器、鼻腔内送達機器、膣送達機器、直腸内送達機器、注射器、経皮送達機器、カプセル、タブレット、噴霧器、吸引器、霧吹き、エアロゾル投与器、噴霧器（ミスター）、ドライパウダー吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量噴霧器（定量ミスター）、定量霧吹き、およびカテーテル、からなる群より選択される。
【０１６３】
本発明のリガンド（例えば、単一可変ドメイン、アンタゴニストまたは多重特異性リガンド）は、本明細書で記載されているようなフォーマットにすることができる。例えば、本発明のリガンドはインビボ血清半減期を調整するフォーマットにできる。本明細書に記載されているように、必要に応じ、リガンドがさらに毒素、または毒素部分を含むことも可能である。一部の実施形態では、リガンドは、フリーラジカル生成剤（例えば、セレニウム含有毒素）または放射性核種等の表面活性毒素を含む。他の実施形態では、毒素、または毒素部分は、細胞内標的に対し結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えばｄＡｂ）である。特定の実施形態では、リガンドは、ＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に対する結合特異性を有するＩｇＧ様フォーマットである。
【０１６４】
ある態様では、本発明は、本発明の単一可変ドメインを含む融合タンパク質を提供する。可変ドメインは、例えばペプチドやポリペプチド、またはタンパク質と融合できる。一実施形態では、可変ドメインは、例えばモノクローナル抗体等の抗体、または抗体断片と融合する。一般的に、融合は、単一核酸配列から融合産物を発現させるか、または、単一可変ドメインを含むポリペプチドを発現させ、次いで従来の技術を使って、このポリペプチドをより大きなタンパク質または抗体のフォーマットに組みあげることにより達成される。
【０１６５】
一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体定常ドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体ＦＣを含み、この場合、ＦＣのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（直接結合も任意選択できる）していることも任意に選択可能である。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、半減期延長部分を含む。半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミンまたはその断片、トランスフェリン受容体またはそれのトランスフェリン結合部、あるいはインビボ半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む抗体または抗体断片であってもよい。半減期延長部分は、血清アルブミン、または新生児ＦＣ受容体に対する結合部位を含む抗体もしくは抗体断片であってもよい。半減期延長部分は、ｄＡｂ、抗体または抗体断片であってもよい。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、可変ドメイン（または、アンタゴニストもしくは融合タンパク質に含まれる可変ドメイン）がさらに、ポリアルキレングリコール部分を含むように作られている。ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分であってもよい。これ以上のことは後で議論される。
【０１６６】
１つの態様では、本発明は、下記のうちの１つまたは複数の内容（明確な下記の目的の２つ以上の組み合わせが本明細書に開示され、特許請求の範囲の対象となり得る）を提供するために、本発明のいずれかの態様または実施形態の単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、組成物、または機器を提供する：
（ｉ）ヒトＴＮＦＲ１との強力な結合（例えば、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉ）非ヒト霊長類ＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒＴＮＦＲ１）との強力な結合（例えば、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉｉ）ヒトＴＮＦＲ１との強力な結合（例えば、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、もしくは１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）ならびに、非ヒト霊長類ＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒＴＮＦＲ１）との強力な結合（例えば、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｖ）ヒト、カニクイザル、およびマウスＴＮＦＲ１との強力な結合（例えば、ヒトＴＮＦＲ１とは、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で；カニクイザルＴＮＦＲ１とは、表面プラズモン共鳴で測定した５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１５０ｐＭ以下（または約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３５０ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、もしくは約１５０ｐＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）；ならびに、マウスＴＮＦＲ１とは、表面プラズモン共鳴で測定した７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下（または約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、もしくは約１ｎＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｖ）患者のヒトＴＮＦＲ１に対する強力な中和、例えば、標準的ＭＲＣ５アッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０が５、４、３、２または１ｎＭ以下（または約５、約４、約３、約２もしくは約１ｎＭ以下）でヒトＴＮＦＲ１を中和する本発明の単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、または組成物を用いた中和；
（ｖｉ）患者のヒトＴＮＦＲ１に対する強力な中和、例えば、標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０が５、４、３、２もしくは１ｎＭ以下；または（約）５〜（約）１ｎＭでカニクイザルＴＮＦＲ１を中和する本発明の単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｖｉｉ）患者のヒトＴＮＦＲ１に対する強力な中和、例えば、標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定したＮＤ５０が１５０、１００、５０、４０、３０もしくは２０ｎＭ以下；または（約）１５０〜１０ｎＭ；または（約）１５０〜２０ｎＭ；または（約）１１０〜１０ｎＭ；または（約）１１０〜２０ｎＭでマウスＴＮＦＲ１を中和する本発明の単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｖｉｉｉ）患者のヒトＴＮＦＲ１に対する強力な中和、例えば、標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０が５、４、３、２もしくは１ｎＭ以下；または（約）５〜（約）１ｎＭでカニクイザルＴＮＦＲ１を中和し；ならびに標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定したＮＤ５０が１５０、１００、５０、４０、３０もしくは２０ｎＭ以下；または（約）１５０〜１０ｎＭ；または（約）１５０〜２０ｎＭ；または（約）１１０〜１０ｎＭ；または（約）１１０〜２０ｎＭでマウスＴＮＦＲ１を中和する単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｉｘ）２種以上の霊長類ＴＮＦＲ１（任意選択として、ヒトとカニクイザル、および／またはアカゲザルＴＮＦＲ１、および／またはヒヒＴＮＦＲ１、例えば、ヒトとカニクイザルＴＮＦＲ１）および任意でマウスＴＮＦＲ１間の交差反応の提供；ならびに
（ｘ）プロテアーゼ安定性の提供（任意選択として、トリプシン安定性）。
【０１６７】
１つの態様では、本発明は、直前の段落の（ｉ）〜（ｘ）のうちの１つまたは複数を提供するために、本発明のいずれかの態様または実施形態の単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンド、組成物、または機器の使用を提供する。また、本発明は対応する方法も提供する。
【０１６８】
ここで、ＷＯ２００６０３８０２７を参照するが、これは抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを開示している。本文書の開示はその全体が本明細書に組み込まれ、特に使用、フォーマット、選択方法、製造法、製剤化方法、および抗ＴＮＦＲ単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニスト等のアッセイを提供する。これにより、これらの開示が、本明細書の特許請求の範囲に組み込まれる明確な記述を与えることを含め、本発明の内容に具体的かつ明確に適用できる。
【０１６９】
本発明の抗ＴＮＦＲ１は免疫グロブリン単一可変ドメインであり、任意選択として、ヒト可変ドメインであっても、またはヒトフレームワーク領域（例えばＤＰ４７またはＤＰＫ９フレームワーク領域）を含むか、もしくは、それから派生した可変ドメインである。特定の実施形態では、本明細書記載の可変ドメインはユニバーサルフレームワークを基準にしている。
【０１７０】
特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１に対して結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、凝集性に抵抗し、可逆的にアンフォールディングする（ＷＯ０４１０１７９０を参照されたい。この教示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７１】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本明細書記載のリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンドおよび多重特異性リガンド）をコードする単離された、および／または、組換え型の核酸分子を提供する。
【０１７２】
１つの態様では、本発明は、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離、または組換え型核酸を提供する。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３のヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
１つの態様では、本発明は単離された、または組換え型核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％等しいヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの態様では、本発明は単離された、または組換え型核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％等しいヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの態様では、本発明は単離された、または組換え型核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％等しいヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの態様では、本発明は単離された、または組換え型核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％等しいヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの態様では、本発明は単離された、または組換え型核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％等しいヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。
【０１７４】
１つの態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。１つの態様では、本発明は、本発明の核酸、またはベクターを含む宿主細胞を提供する。核酸またはベクターの発現に適切な条件下で宿主細胞を維持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが産生されることを含む、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生する方法が提供される。任意選択として、この方法がさらにポリペプチドを単離するステップを含み、また、任意選択として、標準的ＭＲＣ５、Ｌ９２９またはカニクイザルＫＩアッセイにおいて、単離ポリペプチドよりも改善された親和性（ＫＤ）やＴＮＦＲ１中和のＮＤ５０を有する変異体（例えば突然変異体）を産生するステップを含む。
【０１７５】
本明細書で「単離された」と呼んでいる核酸は、それらの元（例えば、細胞中に、またはライブラリのように核酸の混合物中にある状態）のゲノムＤＮＡまたは細胞性ＲＮＡの核酸から分離された核酸であり、本明細書に記載された方法、または他の適切な方法により得られた核酸を含み、また、本質的に純粋な核酸、化学的合成により作られた核酸、生物学的および化学的方法の組み合わせにより作られた核酸、および単離された組換え型核酸（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｂ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９（９）：  ２４７１−２４７６  （１９９１）；Ｌｅｗｉｓ，  Ａ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．  Ｃｒｏｗｅ，  Ｇｅｎｅ，  １０１：  ２９７−３０２  （１９９１）を参照のこと）を含む。
【０１７６】
本明細書で「組換え型」と呼んでいる核酸は、組換えＤＮＡ手法により作られた核酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使ってベクターにクローニングする等の人工組換え法による手順により生成した核酸を含む。
【０１７７】
特定の実施形態では、単離された、および／または組換え型核酸は本明細書に記載されたリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、リガンドは、本明細書で開示のＴＮＦＲ１に結合するｄＡｂのアミノ酸配列、例えば、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列の同一性は、選択した抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂをコードするヌクレオチド配列全長にわたり決定可能である。
【０１７８】
また、本発明は、本発明の組換え型核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、本発明の組換え型核酸に機能的に連結された１つまたは複数の発現制御因子、または配列を含む。また、本発明は、本発明の組換え型核酸分子、またはベクターを含む組換え型宿主細胞を提供する。適切なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現制御因子、宿主細胞および本発明の組換え型宿主細胞を産生する方法は当技術分野においてよく知られており、実施例を本明細書で詳述する。
【０１７９】
適切な発現ベクターはいくつかの成分、例えば、複製起点、選択可能なマーカー遺伝子、１つもしくは複数の発現制御因子、転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、ならびに／または１つもしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列、またはリーダー配列、等を含むことが可能である。発現制御因子およびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源により提供できる。例えば、抗体鎖をコードするクローン核酸の転写、および／または翻訳調節配列は直接発現に使用できる。
【０１８０】
プロモーターは所望の宿主細胞での発現に供することができる。プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよい。例えば、プロモータ−は、抗体、抗体鎖、またはこれらの一部をコードする核酸に機能的に連結されていて、核酸を直接転写することができる。種々の適切なプロモーターが、原核生物宿主用（例えば、大腸菌用ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主用（例えば、サルウイルス４０の初期や後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）として入手可能である。
【０１８１】
さらに、通常、発現ベクターはベクターを持っている宿主細胞を選別するために選択可能なマーカーを含み、さらに複製可能な発現ベクターの場合には、複製起点を含む。抗生物質耐性や薬剤耐性を与える産物をコードする遺伝子は、よく用いられる選択マーカーであり、原核生物細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で使用できる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、多様な宿主中のメトトレキサートの選択を可能とする。宿主の栄養要求性マーカー（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）の遺伝子産物をコードする遺伝子は、酵母の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）、またはファージベクターの使用、および、レトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノムへ統合可能なベクターの使用もまた意図されているものである。哺乳動物細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエ  シュナイダーＳ２細胞、Ｓｆ９）および酵母（Ｐ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｐ．パストリス、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））での発現に適切な発現ベクターは、当技術分野においてよく知られている。
【０１８２】
適切な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌等の細菌性細胞、および／または他の適切な細菌を含む原核生物細胞であってもよく、また、真菌細胞や酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、または他の下等真核細胞および昆虫由来（例えば、ショウジョウバエ  Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ  Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（ＷＯ９４／２６０８７（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ））のような高等真核生物の細胞、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）等のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  ＬＡ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｃ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７（７）：４２１６−４２２０  （１９８０）））、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ５４：７３９−７４９  （１９８５），  ３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ，  Ｗ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９０：８３９２−８３９６  （１９９３））ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ  ７８細胞等、または植物（例えば、たばこ）を含む真核生物細胞であってもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．  （１９９３）を参照のこと）。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。特定の実施形態では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１８３】
また、本発明は、組換え核酸の発現に適切な条件下で、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞の維持を含み、これにより、組換え核酸が発現し、リガンドが産生される、本発明のリガンド（例えば、二重特性リガンド、多重特異性リガンド）の製造法を提供する。一部の実施態様では、この方法がさらにリガンドの単離を含む。
【０１８４】
本発明の実施形態に適用可能な開示詳細に関しては、ＷＯ２００６０３８０２７を参照されたい。例えば、関連開示は、免疫グロブリン単一可変ドメインベースリガンドの調製、ライブラリベクターシステム、ライブラリ構築、単一可変ドメインの結合、リガンドの特性決定、リガンドの構造、骨格、タンパク質足場、正規配列（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の多様性、アッセイおよび治療と診断用組成物とその使用法、ならびに定義「機能的に連結された」、「ナイーブ」、「予防」、「抑制」、「治療」および「治療的有効量」に関する。
【０１８５】
フォーマット
半減期の延長は、免疫グロブリンのインビボ適用において有用である。サイズが小さい抗体では特に、また、抗体断片では殊更に有用である。このような断片（ＦＶ、ジスルフィド結合ＦＶ、Ｆａｂ、ＳＣＦＶ、ｄＡｂ）は身体から急速な除去作用を受ける。このように、それが身体の大抵の部分に早く到達できて、素早く産生でき、容易に扱えても、インビボでの短い持続性だけのためにそのインビボでの適用には、限界があった。本発明の一実施態様では、インビボでのリガンドの半減期延長、および、その結果、体内でのリガンドの機能活性のより長い持続時間を提供することによりこの問題が解決されている。
【０１８６】
薬物動態解析およびリガンドの半減期の測定方法は当業者によく知られている。詳細については、Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９９６）で見られるであろう。また、ｔα、ｔβ半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）等の薬物動態パラメーターについて記述されている次の文献を参照のこと：“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，  Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ  ＆  Ｄ  Ｐｅｒｒｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  改訂第２版（１９８２）。半減期およびＡＵＣの定義を上に提示する。
【０１８７】
一実施形態では、本発明は、１５分以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンド（例えば、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、多重特異性リガンド）またはリガンドを含む組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。さらに追加して、または、その代わりに、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２時間までの範囲のｔα半減期を有することになる。一実施形態では、前記範囲の上端が１１、１０、９、８、７、６、または５時間である。適切な範囲の実施例は、１〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、本発明による約２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有するリガンド（例えば、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、多重特異性リガンド）またはリガンドを含む組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間である。さらに追加して、またはその代わりに、本発明によるリガンドまたは組成物が２１日までの範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１５日、または約２０日である。一実施形態では、本発明によるリガンドまたは組成物は、約１２〜約６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる実施形態では、その範囲は、約１２〜約４８時間の範囲である。またさらなる実施形態では、その範囲は約１２〜約２６時間の範囲である。
【０１８９】
上記基準に追加して、またはその代わりに、本発明は、約１ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、前記範囲の下端が約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、または約３００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。追加して、またはその代わりとして、本発明によるリガンドまたは組成物が約６００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５、または約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。一実施態様では、本発明によるリガンドは、下記の事項からなる群から選ばれた範囲のＡＵＣを有する：約１５〜約１５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、および約１５〜約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ。
【０１９０】
本発明のポリペプチドとｄＡｂ、およびこれらを含むアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそれのトランスフェリン結合部、抗体ＦＣ領域の付加により、または、抗体ドメインへの接合により、さらに大きな流体力学的サイズを持つようにフォーマットすることが可能である。例えば、より大きな抗体の抗原結合断片として、または抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた）としてフォーマットされたポリペプチドｄＡｂおよびアンタゴニスト。
【０１９１】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体、多量体）の流体力学的サイズは、当技術分野においてよく知られた方法により求めることができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使ってリガンドの流体力学的サイズを求めてもよい。架橋アガロースマトリックスのようなリガンドの流体力学的サイズ測定に適したゲル濾過マトリックスはよく知られ、容易に入手可能である。
【０１９２】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂ単量体に結合したＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途に依存して変わり得る。例えば、リガンドが血液循環から抜け出て周辺細胞組織に入ることが意図されている場合、流体力学的サイズを小さく保ち、血流からの溢出を促進することが望ましい。あるいは、リガンドを体循環中に長時間残すことが望まれる場合は、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより、リガンドサイズを増大させることが可能である。
【０１９３】
インビボで半減期を延長する抗原またはエピトープを標的にすることによる半減期の延長
本明細書で記載されているように、本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを、インビボで半減期を延長する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）に接合または会合させることにより、リガンドの流体力学的サイズおよびその血清中半減期も増加させることができる。例えば、ＴＮＦＲ１結合薬剤（例えばポリペプチド）は、抗血清アルブミンまたは抗新生児ＦＣ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児ＦＣ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは、抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児ＦＣ受容体アフィボディ、または抗ＳＡアビマー、または、これに限定されるものではないが、以下に示す群から選択された足場を含む抗ＳＡ結合ドメインへ接合または結合することができる：ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチン（これらの結合ドメインの開示については、ＷＯ２００８０９６１５８を参照されたい。ここに示されたドメインと配列は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を形成する）。接合とは、血清アルブミンに結合する結合ドメインに結合（共有結合的あるいは非共有結合的に）した本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１９４】
インビボでの血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、例えば、トランスフェリン受容体特異的なリガンド神経医薬剤融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号を参照されたい。この中の教示は参照により本明細書に組み込まれる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インシュリン、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体、インシュリン受容体、血液凝固第Ｘ因子、α１抗トリプシン、およびＨＮＦ１αが含まれる。さらに、血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、α１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、α１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ  Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ  Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１  ＩＮＨ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、およびリューマチ因子（ＲＦ）が含まれる。
【０１９５】
細胞外マトリックスからの適切なタンパク質には、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン、およびフィブロネクチンが含まれる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が現在知られており、身体の別々の部位で見つかっている。例えば、骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓器官で見つかったＩ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％に達する）または、軟骨、椎間板、脊索、および眼球ガラス体液で見つかったＩＩ型コラーゲン。
【０１９６】
血液からの適切なタンパク質には、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲン（例えば、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ）、血清アミロイドタンパク質Ａ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ２ミクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α１抗トリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））等の免疫システムタンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α１ミクログロブリン）、ディフェンシン（例えば、βディフェンシン１、好中球ディフェンシン１、好中球ディフェンシン２、および好中球ディフェンシン３）等が含まれる。
【０１９７】
血液脳関門または神経組織で認めらる適切なタンパク質には、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸塩トランスポーター等が含まれる。
【０１９８】
また、インビボでの血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、腎臓に局在化したタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機アニオン輸送体Ｋ１、ハイマン抗原）、肝臓に局在化したタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０）、肺に局在化したタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在化したタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関連したＨＳＰ２７）、皮膚に局在化したタンパク質（例えばケラチン）、形質転換増殖因子βスーパーファミリータンパク質（骨形成活性を示す（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８））のサブセットである形態形成タンパク質（ＢＭＰ）等の骨特異的タンパク質、腫瘍特異性タンパク質（例えば、トロホブラスト抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓と脾臓で認められるカテプシンＢ））が含まれる。
【０１９９】
適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ；Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，  ３０４−３０９  （１９９９）参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーで、活性化Ｔ細胞上で発現しヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に発現上昇している；Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５  （１）：２６３−７０  （２０００）参照）を含む活性Ｔ細胞上にのみ発現する抗原が含まれる。また、適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ショウジョウバエＣＧ６５１２、ヒトパラプレギン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨを含む金属プロテアーゼ（関節炎／癌に関連）；および血管新生増殖因子、例えば酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、アンギオジェニン、インターロイキンー３（ＩＬ−３）、インターロイキンー８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ）、およびフラクタルカインも含まれる。
【０２００】
また、インビボでの血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のようなストレスタンパク質も含まれる。ＨＳＰは、通常は、細胞内で見つかる。それが細胞外で見つかる場合は、細胞が死滅し内容物をはき出したという指標になる。このプログラムにない細胞の死（壊死）は外傷、疾患、傷害のとき起こり、細胞外ＨＳＰは免疫系からの反応を誘発する。細胞外ＨＳＰに対する結合により本発明の組成物の疾患部位への局在化が生じる可能性がある。
【０２０１】
ＦＣ輸送にかかわる適切なタンパク質には、例えば、ブランベル（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）受容体（ＦＣＲＢとしても知られている）が含まれる。このＦＣ受容体は送達に潜在的に有用な２つの機能を有する。その機能は（１）胎盤経由で母から子供へＩｇＧの移送、（２）ＩｇＧの分解からの保護と、その結果の血清中半減期の延長、である。受容体はエンドソームからＩｇＧを再生利用すると考えられている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（７）：６３２−６  （１９９７）参照）。
【０２０２】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ
一実施形態で本発明は、ＴＮＦＲ１に結合するリガンド、ポリペプチドまたはアンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂ（第一のｄＡｂ）を含む二重特異性リガンド）および血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二のｄＡｂを提供し、第二のｄＡｂが表面プラズモン共鳴で測定したＫＤ値の、約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、もしくは約５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、もしくは約５μＭでＳＡに結合する。例えば、表面プラズモン共鳴により測定して約３０〜約７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）はＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と表面プラズモン共鳴で測定したＫＤ値の約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭ、または、約１、約２、もしくは約３μＭで結合する。一実施形態では、第一の抗ＳＡ  ｄＡｂと第二のＴＮＦＲ１に対するｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、第二のｄＡｂのその標的に対する親和性（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ等を使って表面プラズモン共鳴で測定したＫＤおよび／またはＫｏｆｆ）が、ＳＡに対する第一のｄＡｂの親和性の約１〜約１０００００倍（例えば、約１００〜約１０００００、または約１０００〜約１０００００、または約１００００〜約１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一のｄＡｂはＳＡと約１０μＭの親和性で結合し、他方第二のｄＡｂはその標的と約１００ｐＭの親和性で結合する。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一のｄＡｂはＳＡ（例えばＨＳＡ）とＫＤ値約５０、例えば、約７０、約１００、約１５０、または約２００ｎＭで結合する。二重特異性リガンドの詳細については、ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ２００８０９６１５８およびＷＯ０４０５８８２１で見つけることができる。
【０２０３】
一実施形態で、本発明のリガンドは、表面プラズモン共鳴で測定してＫＤ値約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５μＭで血清アルブミン（ＳＡ）と結合するｄＡｂを含む。例えば、表面プラズモン共鳴で測定して約３０〜約７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴で測定してＫＤ値約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭまたは約１、約２または約３μＭでＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と結合する。一実施形態では、第一および第二のｄＡｂはリンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３のアミノ酸、または３を超えるアミノ酸、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０を超えるアミノ酸のリンカー、で結合されている。一実施形態では、より長いリンカー（アミノ酸が３を超える）が有効性（アンタゴニストの１つあるいは両方のｄＡｂのＫＤ）を高めるために使われる。
【０２０４】
リガンドとアンタゴニストの具体的な実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されたｄＡｂとアルブミンへの結合において競合する：ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８およびＤＯＭ７ｍ−１６。
【０２０５】
リガンドとアンタゴニストの具体的な実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されたｄＡｂとアルブミンへの結合において競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６（この配列の開示についてはＷＯ０４００３０１９参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号：４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号：４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号：４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この配列の開示についてはＷＯ２００７０８０３９２参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。本項の配列番号はＷＯ２００７０８０３９２中に記載されている）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ１５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）、およびｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）（この配列の開示についてはＷＯ２００８０９６１５８参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）。代替名をｄＡｂの後に括弧で示している。例えば、ｄＡｂ８には代替名ｄＡｂ１０があり、表記はｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）となる。
【０２０６】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８およびＤＯＭ７ｍ−１６からなる群から選択されたｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２０７】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されたｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（本項の配列番号はＷＯ２００７０８０３９２中に記載されている）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１、およびｄＡｂ７ｐ２。
【０２０８】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、ＤＯＭ７ｈ−１１−３またはＤＯＭ７ｈ−１４−１０と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０９】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）もしくはＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はＷＯ２００７０８０３９２中に記載されている）、または、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３もしくはｄＡｂ７ｈ１４と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１０】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されたｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はＷＯ２００７０８０３９２中に記載されている）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０２１１】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（本項の配列番号はＷＯ２００７０８０３９２中に記載されている）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０２１２】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されたアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。
【０２１３】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。一例では、ｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１１−３である。別の例では、ｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１４−１０である。
【０２１４】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンド、またはアンタゴニストはヒト血清アルブミンに結合し、前出のいずれかのアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、例えば、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【０２１５】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ科動物ＶＨＨとしては、ＷＯ２００４／０４１８６２（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．社）およびＷＯ２００７０８０３９２（これらに開示されているＶＨＨ配列および対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）で開示されたものが含まれ、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）がある。これらの配列番号はＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ２００４／０４１８６２（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．社）で引用されたものに対応する。特定の実施形態では、ラクダ科動物ＶＨＨはヒト血清アルブミンに結合し、ＷＯ２００７０８０３９２で開示されたＡＬＢ１、または、配列番号５１８〜５３４のいずれかと少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの配列番号はＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ２００４／０４１８６２で引用されたものに対応する。
【０２１６】
一部の実施形態では、リガンドまたはアンタゴニストは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合を目指して本明細書で開示されたいずれかの抗血清アルブミンと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０２１７】
別の実施態様では、アンタゴニストまたはリガンドは、ＳＡ（例えば、ヒトＳＡ）に対し特異的な結合部分を含み、ここで、この部分はＷＯ２００８０９６１５８で記載されているように非免疫グロブリン配列を含む。これらの結合部分、その製造法と選択法（例えば、多様なライブラリからの）および配列の開示は、参照により本明細書の開示の一部として本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
半減期延長部分（例えばアルブミン）への接合
一実施形態では、１つまたは複数の半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンとそれらの断片および類似体）が、本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストと接合または会合する。ＴＮＦＲ１結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体の実例は、ＷＯ２００５０７７０４２に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれ本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体は本発明に使用できる：
・配列番号１（ＷＯ２００５０７７０４２に記載。この配列は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）；
・ＷＯ２００５０７７０４２に記載の配列番号１のアミノ酸１〜３８７を成分とするか、または含むアルブミン断片または変異体；
・アルブミン、または、これらのアルブミン断片もしくはアルブミン変異体で、次の配列からなる群より選択したアミノ酸配列を含む：（ａ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）ＷＯ２００５０７７０４２記載の配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６。
【０２１９】
ＴＮＦＲ１結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、および類似体の実例はＷＯ０３０７６５６７に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、断片または変異体は本発明に使用できる：
・ＷＯ０３０７６５６７記載のヒト血清アルブミン（この配列情報は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。図３に一例を示す；
・５８５アミノ酸の単一非グルコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）で分子式量６６、５００（Ｍｅｌｏｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６  （１９７５）；Ｂｅｈｒｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．  ３４：５９１  （１９７５）；Ｌａｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４  （１９８１）；Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：６７４７  （１９８６）参照）；
・アルブミンの多型変異体または類似体または断片（Ｗｅｉｔｋａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３７：２１９  （１９７３）に記載されている）；
・アルブミン断片または変異体（ＥＰ３２２０９４に記載されている）。例えば、ＨＡ（１〜３７３）、ＨＡ（１〜３８８）、ＨＡ（１〜３８９）、ＨＡ（１〜３６９）、およびＨＡ（１〜４１９）ならびに、１〜３６９と１〜４１９の間の断片；
・アルブミン断片または変異体（ＥＰ３９９６６６に記載されている）。例えば、ＨＡ（１〜１７７）およびＨＡ（１〜２００）、および、ＨＡ（１〜Ｘ）間の断片。ここでＸは１７８〜１９９の任意の数字。
【０２２０】
（１つまたは複数の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンとその断片および類似体）が、本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニストをフォーマットするために使われる場合は、ＴＮＦＲ１結合部分（例えば、抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂ）に任意の適切な方法を使って接合可能である。接合法としては、例えば、融合タンパク質をコードしている単一ヌクレオチド構築物を使って直接融合する等の方法があり、この場合、融合タンパク質は、ＴＮＦＲ１結合部分のＮまたはＣ末端位置に半減期延長部分をもつ単一ポリペプチド鎖としてコードされている。あるいは、接合は、部分間でペプチドリンカーを使って達成可能である。例えば、ペプチドリンカーは、ＷＯ０３０７６５６７またはＷＯ２００４００３０１９に記載されている（このリンカーの開示は、参照により本開示に組み込まれ本発明での使用のための実例を提供する）。通常、インビボ血清中半減期を延長するポリペプチドは本来インビボで発生するもので、生体（例えばヒト）から望ましくない物質を除く内因性機構による分解または除去に抵抗性をしめす。例えば、インビボで血清中半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血液中で見つかったタンパク質、血液脳関門で見つかったタンパク質、または神経組織中、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に局在化しているタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異性タンパク質、または、ＦＣ輸送に関わるタンパク質から選択可能である。
【０２２１】
本発明の本開示全体に記載の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンド中の抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメイン（「ｄＡｂ」）を使用する代わりに、手慣れた受け取り側が、ＴＮＦＲ１に結合する本発明のｄＡｂの１つ以上、または全３つのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場や骨格上にグラフトしたＣＤＲ、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、またはＥＧＦドメイン）を含むポリペプチドまたはドメインを使用できるということが意図されている。したがって、本開示は全体としてｄＡｂの代わりにこのドメインを使ったアンタゴニストの開示を提供すると理解されるべきである（この点に関しては、タンパク質足場に基づく多様なライブラリの産生、ならびにこのようなライブラリ由来ドメインの選択および特性決定法の詳細について、ＷＯ２００８０９６１５８を参照されたい。この開示は参照により組み込まれる）。
【０２２２】
したがって、一実施形態では、本発明のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１または適切なフォーマットのこのｄＡｂの相補性決定領域に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。アンタゴニストはこのｄＡｂからなる、または、基本的にこのｄＡｂからなるポリペプチドであってもよい。アンタゴニストは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）等の適切なフォーマットのｄＡｂ（またはｄＡｂのＣＤＲ）を含むポリペプチドであっても、ＴＮＦＲ１に結合するｄＡｂ、および他の標的タンパク質、抗原、またはエピトープ（例えば血清アルブミン）に結合する第二のｄＡｂを含む二重特異性リガンドであってもよい。
【０２２３】
本発明によるポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニストは、当技術分野において知られている多様な適切な抗体フォーマットとしてフォーマットされていてもよい。これらの抗体フォーマットの例としては、次のものがある。ＩｇＧ様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体とヘテロ二量体、前出のいずれかの抗原結合断片（例えば、ＦＶ断片（例えば、単鎖ＦＶ（ＳＣＦＶ）、ジスルフィド結合ＦＶ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一可変ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ）、ｄＡｂ、および前出のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）、または他の適切なポリマーの共有結合により修飾された）。
【０２２４】
一部の実施形態では、本発明は、ＩｇＧ様フォーマットのリガンド（例えば、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト）を提供する。このようなフォーマットは、通常のＩｇＧ分子４鎖構造（２つの重鎖と２つの軽鎖）を有し、１つまたは複数の可変領域（ＶＨおよび／またはＶＬ）が本発明のｄＡｂで置換されている。一実施形態では、各可変領域（２ＶＨ領域と２ＶＬ領域）はｄＡｂまたは単一可変ドメインで置換されており、そのうちの少なくとも１つが本発明による抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂである。ＩｇＧ様フォーマットで含まれているｄＡｂまたは単一可変ドメインは、同じ特異性でも異なる特異性でも持つことが可能である。一部の実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットは４価であり、１つ（抗ＴＮＦＲ１のみ）、２つ（例えば、抗ＴＮＦＲ１と抗ＳＡ）、３つ、または４つの特異性を有することが可能である。例えば、ＩｇＧ様フォーマットは、モノ特異性であり、同じ特異性の４つのｄＡｂを含む；二重特異性であり、同じ特異性の３つのｄＡｂと、異なる特異性の別のｄＡｂを含む；二重特異性であり、同じ特異性の２つのｄＡｂと、共通するが異なる特異性を有する２つのｄＡｂを含む；三重特異性であり、同じ特異性の第一のｄＡｂおよび第二のｄＡｂと、異なる特異性の第三のｄＡｂ、ならびに第一、第二および第三のｄＡｂとは異なる特異性の第四のｄＡｂを含む；または四重特異性であり、それぞれ異なる特異性の４つのｄＡｂを含むことができる。ＩｇＧ様フォーマット（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦＶ）の抗原結合断片は調製できる。一実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットまたは抗原結合断片はＴＮＦＲ１に対して１価であり得る。補体活性化および／または抗体依存性細胞毒（ＡＤＣＣ）機能が所望される場合、リガンドは、ＩｇＧ１様フォーマットであってよい。所望の場合、ＩｇＧ様フォーマットは、Ｆｃ受容体との結合および／または補体との結合能を最小限に抑えるために変異定常領域（変異型ＩｇＧ重鎖定常領域）を含んでよい（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、英国特許第２，２０９，７５７  Ｂ号；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ８９／０７１４２；  Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ９４／２９３５１、１９９４年１２月２２日を参照のこと）。
【０２２５】
本発明のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニスト）は第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む融合タンパク質としてフォーマットし得る。所望の場合、このようなフォーマットは、さらに半減期延長部分を含み得る。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した、第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。
【０２２６】
一般的には、標的に対する結合特異性を有する結合部位のあるポリペプチドドメインの方向、およびリガンドがリンカーを含むかどうかは設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの方向は、リンカーの有無を問わず、他の方向よりも優れた結合特性を提供し得る。本発明により包含されるすべての方向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）は、所望の結合特性を提供する方向を含むリガンドであり、スクリーニングにより容易に特定できる。
【０２２７】
本発明によるポリペプチドおよびｄＡｂ（ｄＡｂ単量体、二量体および三量体を含む）は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの一方または両方、および任意にヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域に結合し得る。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に結合したリガンドをコードするベクターをこのようなポリペプチドを調製するために用いてよい。
【０２２８】
本発明はさらに、前述のｄＡｂ単量体の二量体、三量体およびポリマーを提供する。
【実施例】
【０２２９】
抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂのナイーブ選択
ＴＮＦ受容体１（ｐ５５）のシグナル伝達を阻害するための２つの異なる機序について記載されている（ＷＯ２００６０３８０２７）。第一の機序は、ＴＮＦαのその受容体への結合と直接競合するエピトープにてドメイン抗体のＴＮＦＲ１への結合によるシグナル伝達の阻害からなる。この競合は、例えば受容体を固体支持体に被覆するインビトロ受容体結合アッセイ法において測定し得、受容体への結合におけるビオチン化ＴＮＦαとドメイン抗体との競合を、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて残りのビオチン化ＴＮＦα結合の測定値を介して測定する。競合ＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦαシグナルを残さずにＴＮＦαのその受容体への結合をブロックする。逆に、非競合ＴＮＦＲ１阻害剤はＴＮＦαの受容体への結合に対してほとんど影響を与えず、μＭ濃度の阻害ｄＡｂの存在下でさえビオチン化ＴＮＦαの継続した読み出しに至る。しかしながら、機能的細胞アッセイ法、例えば低レベルのＴＮＦα（１０〜２００ｐｇ／ｍｌ、１８時間）で刺激時、ＩＬ−８を放出するヒトＭＲＣ５線維芽細胞系では、競合阻害剤と非競合阻害剤の両方とも、ＩＬ−８分泌を用量依存的に減らす。後者は、細胞ベース系において両種類の阻害剤の機能活性を示す。したがって具体的な目的は細胞アッセイ法においてＴＮＦＲ１に結合してその機能活性を阻害するドメイン抗体を単離することであったが、これらのドメイン抗体はＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合と（実質的に）競合すべきではない。
【０２３０】
非競合ＴＮＦＲ１結合ｄＡｂを単離するため、このサブクラスのｄＡｂを豊富にするように選択戦略を設計した。アプローチは、Ｄｏｍａｎｔｉｓ社の４Ｇおよび６Ｇナイーブファージライブラリ、４ＧのためのＧＡＳ１リーダー配列から発現する抗体単一可変ドメインを提示するファージライブラリ（ＷＯ２００５０９３０７４を参照のこと）および追加で６Ｇのための熱／冷却前選択（ＷＯ０４１０１７９０を参照のこと）の使用からなる。これらのファージライブラリを、第１ラウンドで、２００ｎＭビオチン化ヒトＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号６３６−Ｒ１／ＣＦ、ＥＺ−ＬＩＮＫ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社カタログ番号２１３４３）を製造メーカーの説明書に従って用いてビオチン化）でインキュベートし、続いてストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上でプルダウンした。第２および第３ラウンドにて、ファージをＴＮＦＲ１（２００ｎＭ−第２ラウンド、７５ｎＭ−第３ラウンド）で前インキュベートし、次いでビオチン化ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社カタログ番号３００−０１Ａ）（２００ｎＭ−第２ラウンド、７５ｎＭ−第３ラウンド）で前インキュベートし、続いてストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上でプルダウンした。全ラウンドにおいて、増幅前に、ビーズを洗浄して結合の弱いファージを除去し、結合ファージをトリプシン消化により溶離した。理論的には、ＴＮＦαの存在下でＴＮＦＲ１に結合できるｄＡｂは、ＴＮＦαの競合物質をプルダウンせずに特に豊富化される。なぜなら、このエピトープは、ＴＮＦαの磁気ビーズへの結合に必要とされるからである。この実験設計を用いて、ファージ選択を３ラウンド行い、第２ラウンドと第３ラウンドの両方をｐＤＯＭ５大腸菌発現ベクター中にクローン化し（ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７７８９；ＷＯ２００９／００２８８２を参照のこと）、続いてｄＡｂ発現およびＢＩＡｃｏｒｅＴＭ上に結合するＴＮＦＲ１結合についてのスクリーングを行った。ｐＤＯＭ５ベクターは、ｐＵＣ１１９ベースベクターである。タンパク質の発現はＬａｃＺプロモーターにより促進される。ＧＡＳ１リーダー配列（ＷＯ２００５／０９３０７４を参照のこと）は大腸菌の周辺質および培養上清への単離された、溶解性ｄＡｂの分泌を確実にする。ｄＡｂはこのベクター中でＳａｌＩ／ＮｏｔＩにクローン化し、ｄＡｂのＣ末端にｍｙｃタグを付加する。結合ｄＡｂを５０ｍＬ尺度で発現させ、機能的特性決定のために親和性精製した。これはＭＲＣ５細胞アッセイ（下記）におけるＴＮＦα媒介性シグナル伝達阻害の測定ならびに受容体結合アッセイ（下記）におけるＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合阻害からなる。６０００上清スクリーニングにより、多くのＴＮＦＲ１結合剤が得られた。しかしながら、大部分は、無関係なエピトープに結合して、その結果、細胞アッセイもしくは受容体結合アッセイのいずれにおいても活性を有さないか、または受容体結合アッセイにおいて示されるように競合するかのいずれかであった。それにもかかわらず、この大部分は、１）ＢＩＡｃｏｒｅ上でＴＮＦＲ１と結合する（図１）、２）ＭＲＣ５細胞アッセイ法においてＴＮＦαを阻害する（図２）、一方で３）受容体結合アッセイにおいてＴＮＦα競合を示さない（図３）、ｄＡｂの配列解析により５つの独特なｄＡｂが特定された（ＤＯＭ１ｈ−５４３データに関する図なし）。これら５つのｄＡｂは以下であった：ＤＯＭ１ｈ−５０９、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４３、ＤＯＭ１ｈ−５４９およびＤＯＭ１ｈ−５７４。
【０２３１】
選択されたｄＡｂのエラープローン変異導入による試験成熟
ＤＯＭ１ｈ−５０９、ＤＯＭ１ｈ−５１０、ＤＯＭ１ｈ−５４３、ＤＯＭ１ｈ−５４９およびＤＯＭ１ｈ−５７４の成熟度を決定するために、Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（サンディエゴ、米国）カタログ番号２００５５０）を製造メーカーの説明書に従って用いてｄＡｂ変異体のエラープローンＰＣＲライブラリを生成した。配列解析により、これらのライブラリの平均変異率はアミノ酸レベルで約２％であることが示された。これらのライブラリをファージベクターｐＤＯＭ４中にクローン化し、ファージ上に発現させた。ｐＤＯＭ４は、線維状ファージ（ｆｄ）ディスプレイベクターであり、これはｍｙｃタグ付きｆｄベクターに基づき、タンパク質配列は、制限部位間でクローン化してタンパク質遺伝子ＩＩＩ融合物を得ることができる。ｄＡｂをコードする遺伝子をＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片としてクローン化した。
【０２３２】
減量ビオチン化ヒトＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）（５０ｎＭ（第１ラウンド）、５ｎＭ（第２ラウンド）および０．５ｎＭ（第３ラウンド））とのインキュベートの連続３ラウンド中、改善された結合剤を選択した。３ラウンドの選択後、ｄＡｂ遺伝子を大腸菌発現ベクターｐＤＯＭ５中にクローン化し、発現させ、結合動態の改善のため上清をＢＩＡｃｏｒｅによりスクリーニングした。全５つの親系統から誘導される変異型をスクリーニングした；ＤＯＭ１ｈ−５７４系統由来のｄＡｂは、ＢＩＡｃｏｒｅ上でスクリーニング時、解離率の有意な改善を示した。ＭＲＣ５細胞アッセイ法において解離率が最も顕著に改善したｄＡｂを精製して特性決定した（表１および図４）。最良のｄＡｂは以下である：ＤＯＭ１ｈ−５７４−７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１３。これらのｄＡｂ評価から、本発明者らは判断力を働かせて親和性改善に特に関与し得る位置および変異を特定した：Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ（Ｋａｂａｔナンバリング）。付加的な効果を模索し、本発明者らはこれらの特異的変異を単一ｄＡｂ中に一体化した新規ｄＡｂ変異型を生成した。ＤＯＭ１ｈ−５７４鋳型を用いて遺伝子操作した新規変異型は以下であった：ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４（Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５（Ｇ５５ＤおよびＫ９４Ｉ）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６（Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１７（Ｌ４５Ｐ、Ｇ５５ＤおよびＫ９４Ｉ）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８（Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｇ５５Ｄ、Ｈ５６ＲおよびＫ９４Ｉ）およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１９（Ｖ３０Ｇ、Ｇ４４Ｄ、Ｇ５５ＤおよびＫ９４Ｉ）（図５）。ＭＲＣ５細胞アッセイ法における効能およびＢＩＡｃｏｒｅ上のＴＮＦＲ１親和性のためのこれらの変異型の特性決定により、さらなる改善を特定した（表１）。最も強力なｄＡｂはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６であった。
【表１】
2016007218.tif 000002
【０２３３】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の種間交差反応
抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの有意な利点は異種間の交差反応である。マウス、イヌ、カニクイザルおよびヒト間のＴＮＦＲ１細胞外ドメイン配列の限られた保存（図６）を考慮し、任意の抗体または単一可変ドメインが類似した親和性でこれら異種のＴＮＦＲ１を認識することは例外的であろう。したがって、本発明者らはＢＩＡｃｏｒｅ上でマウスＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号４２５−Ｒ１−０５０／ＣＦ）、イヌＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号４０１７−ＴＲ−０２５／ＣＦ）およびヒトＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）に対するＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の結合能を試験した。マウス実験において、ＥＺ−ＬＩＮＫ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社カタログ番号２１３４３）を製造メーカーの説明書に従って用いてＴＮＦＲ１をビオチン化し、続いてビオチン化ＴＮＦＲ１をストレプトアビジン被覆ＢＩＡｃｏｒｅチップへ結合させた（マウス実験）。ヒトおよびイヌＴＮＦＲ１において、アミン結合したＴＮＦＲ１を使った。続いて、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６をヒト、マウスおよびイヌＴＮＦＲ１上に注入し、ＢＩＡｃｏｒｅ上で結合をモニタリングした。異種への結合例を図７および８に示し、結果の概要を表２に示す。明らかに、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６は、本発明者らの先に記載された（ＷＯ２００８１４９１４８）競合抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６（マウスＴＮＦＲ１への結合は事実上なく、イヌＴＮＦＲ１へは非常に弱い結合のみを示した）とは対照的に、異種のＴＮＦＲ１へ高親和性結合を示した。
【表２】
2016007218.tif 000003
【０２３４】
次に、マウス細胞（Ｌ９２９）のＴＮＦα媒介性細胞毒を阻害し、カニクイザル細胞（ＣＹＮＯＭ−Ｋ１）のＴＮＦα媒介性ＩＬ−８放出を阻害するＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の効能を評価した。標準的マウスＬ９２９およびＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞アッセイの両方を、既報（ＷＯ２００６０３８０２７）および下記のとおり実施した。簡単に述べると、マウスＬ９２９細胞を１００ｐｇ／ｍｌマウスＴＮＦαで、アクチノマイシンＤの存在下、および用量範囲のＤＯＭ１ｈ−５７４−１６で一晩インキュベートした。１８時間後、細胞生存能を確認してＤＯＭ１ｈ−５７４−１６濃度に対してプロットした。カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞アッセイ法において、用量範囲のＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の存在下、細胞をＴＮＦα（２００ｐｇ／ｍｌ）で１８時間刺激した。インキュベート後、培地を除去してＩＬ−８レベルを測定した。中和パーセンテージをＤＯＭ１ｈ−５７４−１６濃度に対してプロットした。両細胞種類において、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６はＴＮＦα媒介性作用を効果的に阻害できた。その効能はマウス標準的Ｌ９２９細胞ベースアッセイにおいて約２５０ｎＭ、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１アッセイにおいて約１０ｎＭであった（図９および１０）。これらの結果は、細胞ベースアッセイにおいてＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の機能的、種間交差反応性を示す。
【０２３５】
ＤＯＭ１ｈ−５７４の親和性成熟
本試験成熟および組み合わせ変異体の結果に基づき、さらなる親和性成熟の鋳型としてＤＯＭ１ｈ−５７４−１４を用いることを決定した。この特定のｄＡｂは最も強力ではなかったが、生殖系列ＤＰ４７フレームワークに比べていかなるフレームワーク変異も有さなかったために選択された。親和性成熟のため、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４のＣＤＲを以下のオリゴヌクレオチドを用いてＣＤＲを増幅することにより無作為化した：ＡＳ１０２９およびＡＳ３３９（ＣＤＲ１）、ＡＳ１０３０およびＡＳ３３９（ＣＤＲ２）ならびにＡＳ１０３１およびＡＳ３３９（ＣＤＲ３）。以下のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて各ライブラリの第二のＰＣＲ断片を作製した：ＡＳ１０３１’およびＡＳ９（ＣＤＲ１）、ＡＳ１０３２およびＡＳ９（ＣＤＲ２）、ＡＳ１０３３およびＡＳ９（ＣＤＲ３）。ＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ，  ７７，  ｐ６１  （１９８９））を用いて、２つのＣＤＲ１  ＰＣＲ生成物を組み合わせてＣＤＲ１ライブラリを作製し、ＣＤＲ２生成物を組み合わせてＣＤＲ２ライブラリを作製し、ＣＤＲ３生成物を組み合わせてＣＤＲ３ライブラリを作製した。すべての反応においてＳＯＥ生成物をネステッドプライマーＡＳ６３９とＡＳ６５で増幅し、ＷＯ２００６０１８６５０に記載のｐＩＥ２ａＡ２ベクター中のＳａｌＩ／ＮｏｔＩに連結させた。無作為化オリゴヌクレオチド（ＡＳ１０２９、ＡＳ１０３０およびＡＳ１０３１）は固定位置（大文字で示す、オリゴヌクレオチドの１００％が指定のヌクレオチドをこの位置に有する）および混合したヌクレオチド組成物（小文字で示す、オリゴヌクレオチドの８５％がこの位置に優性ヌクレオチドを有し、１５％が他の３つのヌクレオチド間に同等の分割を有する）からなる。ＤＮＡ−ディスプレイ構築物ｐＩＥ２ａＡ２を用いて３つの異なるライブラリを調製した。ライブラリのアリコートを用いて大腸菌を形質転換して配列決定した。親クローンと比較して、親和性成熟ライブラリはＣＤＲ全体に多くの変異を含んだ。インビトロのエマルジョン中の区画化およびｓｃＡｒｃ  ＤＮＡ結合タンパク質を介したＤＮＡディスプレイを用いて選択を実施した（ＷＯ２００６０１８６５０を参照のこと）。計１３ラウンドの選択を実行する間、ライブラリは別々に保った。２０、２０、１０および１０ｎＭビオチン化ヒトＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の均衡選択の４ラウンド後、７ラウンドの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択を１３０ｎＭ非ビオチン化ｈＴＮＦＲ１および５ｎＭビオチン化ｈＴＮＦＲ１の存在下で最大１５０分間行った。非標識ｈＴＮＦＲ１は競合物質であった。選択は貯蔵したライブラリも用いて行った（貯蔵ライブラリのための選択、計１４ラウンド）。選択過程中のライブラリ適応度はリアルタイムＰＣＲによりアッセイした。使用した方法の原理は以下のとおりである：ｑＰＣＲによるポリクローナル集団適応度のインビトロタイトレーションは、溶液状態におけるインビトロ発現反応後に表面結合抗原により捕獲したｄＡｂ−ｓｃＡｒｃタンパク質との複合体中のコード化ＤＮＡ量を測定することによりポリクローナルｄＡｂ集団の平均親和性の半定量的測定値を提供する（遺伝型−表現���の関連なし）。回収したインプットＤＮＡの分画が高いほど、ポリクローナルｄＡｂ集団はより強力である。適切な基準点は、親クローンの非関連抗原で被覆した非特異性表面への結合レベルであり、標的抗原で被覆した表面へ特異的結合するレベルである。異なる段階の選択中にＤＮＡ鋳型を回収し、０．１ｍｇ／ｍｌＲＮＡ溶液で１．７ｎＭ濃度に希釈した。インビトロ発現反応を０．３μｌの１００ｍＭ酸化グルタチオン、０．０５μｌの３４０ｎＭ抗ＨＡ  ｍＡｂ  ３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ社から入手）および０．５μｌの１．７ｎＭ  ＤＮＡ鋳型を補充したＥｃｏＰｒｏ  Ｔ７大腸菌抽出物１０μｌ容積中で実施した。Ｓｔｒｅｐ  ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔプレートウェルをビオチン化ｈＴＮＦＲ１標的抗原（０．１μｌの３０μＭストック／ウェル）またはＢＳＡ陰性対照（０．１μｌの２ｍｇ／ｍｌストック／ウェル）で室温で１時間被覆し、続いて緩衝液Ｃ（１０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。インビトロ発現反応を２５℃で３時間インキュベートし、次いで緩衝液Ｃを用いて１００μｌに希釈し、先にビオチン化ｈＴＮＦＲ１またはＢＳＡで被覆したＳｔｒｅｐ  ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔプレートウェル（ＡＢｇｅｎｅ、英国）に２つの５０μｌアリコートとして適用し、室温でさらに１時間インキュベートし、緩衝液Ｃで３回洗浄して、結合していないＤＮＡを除去した。オリゴヌクレオチドＡＳ７９およびＡＳ８０ならびにｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１７０−８８８０）を製造メーカーの説明書に従って用いて結合ＤＮＡ分子を増幅した。増幅サイクルは以下であった：２分９４℃、続いて１５秒９４℃、３０秒６０℃および３０秒７２℃の４０サイクル。ＤＮＡ量をＢｉｏＲａｄ  ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムＰＣＲ機械（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）上で定量化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供されたＯｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒバージョン３．１．３２（２００５）ソフトウェアを用いて解析した。既知のＤＮＡ濃度の試料からの標準曲線は、５００〜５×１０８分子／反応の範囲を網羅した。選択の第１０ラウンドまで、各ラウンドが先行ラウンドより多くのＤＮＡを回収するにつれライブラリ適応度は増したが、これは平均結合ｄＡｂ数が増加したことを示唆した。この時点以降、リアルタイムＰＣＲにより測定したＤＮＡ回収レベルに上昇は見られず、選択の追加ラウンドはｄＡｂ親和性においてさらなる改善を有意に生じなかったことが示唆された。第９および第１４ラウンドの選択された集団をｐＤＯＭ１３ベクター中にクローン化し（ＷＯ２００８／１４９１４８を参照のこと）、配列決定し、発現させて、未精製形態の解離速度定数をＢＩＡｃｏｒｅでアッセイした。
【０２３６】
ライブラリの多様性は大いに低減し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ｄＡｂ上清スクリーニングにより測定した改善された（２〜３倍の）解離速度定数を示すいくつかのクローンが見出された。これらの改善されたｄＡｂのＤＮＡシークエンシングによりＤＯＭ１ｈ−５７４−２５〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−４０を特定した。
【０２３７】
これらのｄＡｂに基づき特定された有益な変異を下にＣＤＲごとに分けて列挙する（Ｋａｂａｔによるナンバリング）：
ＣＤＲ１：Ｖ３０は、Ｉ、ＬまたはＦに有益に変異している、
ＣＤＲ２：Ｓ５２は、ＡまたはＴに有益に変異している、
Ｎ５２ａは、ＤまたはＥに有益に変異している、
Ｇ５４は、ＡまたはＲに有益に変異している、
Ｔ５７は、Ｒ、ＫまたはＡに有益に変異している、
Ａ６０は、Ｄ、Ｓ、ＴまたはＫに有益に変異している、
Ｄ６１は、Ｅ、ＨまたはＧに有益に変異している、
Ｓ６２は、ＡまたはＴに有益に変異している、
ＣＤＲ３：Ｅ１００は、Ｑ、Ｖ、Ａ、ＤまたはＳに有益に変異している、
Ｄ１０１は、Ｅ、Ｖ、ＨまたはＫに有益に変異している。
【０２３８】
第一に、クローンＤＯＭ１ｈ−５７４−３０、−３１、−３８および−３９のＣＤＲ１＋２をクローンＤＯＭ１ｈ−５７４−２５、−２７、−２８、−２９および−３２のＣＤＲ３とミニライブラリ中で組換えた。これらのｄＡｂは、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性の改善が最も大きいｄＡｂを代表し、したがってこれらのｄＡｂの組み合わせが親和性の向上した新規配列を特定する最適な機会であるため、これらのｄＡｂを選択した。生成した組換えｄＡｂはＤＯＭ１ｈ−５７４−６５〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−７９およびＤＯＭ１ｈ−５７４−８４〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−８８であり、このうちＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）が最も強力であった。続いて、−７２を鋳型として用いて、アミノ酸変化を誘発してクローンＤＯＭ１ｈ−５７４−８９〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４９、およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１５１〜ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０を産生することにより、個別のアミノ酸変異の有用性を評価するためにこのｄＡｂを使用した。これらのクローンのほとんどを発現させ、精製して、ＢＩＡｃｏｒｅ上の結合、ＭＲＣ５細胞アッセイ法における効能およびトリプシン消化耐性により測定したプロテアーゼ安定性についてアッセイした。プロテアーゼ安定性は、ｄＡｂ  １ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を減量トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｖ５１１Ａトリプシン）とインキュベートすることにより測定した。５つの異なる濃度のトリプシン（３４、１７、８．５、４．２５および２．１３μｇ／ｍｌ）ならびにトリプシンを欠く対照でインキュベートを実施した。３７℃で３時間インキュベート後、ローディング色素を添加することによりタンパク質分解反応を停止し、ＬａｂＣｈｉｐ  ９０システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で残った非切断ｄＡｂ量を測定した。最も改善されたクローンの効能は、親和性成熟のために使用される開始ｄＡｂであるＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の約３０倍改善された。ＭＲＣ５細胞アッセイ法において最も強力であったものは以下である：ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（図１１）。
【０２３９】
驚くべきことに、一方の親和性／効能の構造決定因子と他方のプロテアーゼ安定性は異なることを見出した。列挙した変異のほとんどは親和性をＢｉａｃｏｒｅにより測定したｎＭ以下の範囲で改善した一方、トリプシン耐性も低減した（ｄＡｂのプロテアーゼ安定性を決定するために適したアッセイの詳細については、ＷＯ２００８１４９１４３およびＷＯ２００８１４９１４８を参照のこと）。他方、変異Ｄ１０１Ｖ（Ｋａｂａｔナンバリング）は、ｄＡｂ親和性が他に試験した任意の配列に比べて約２倍低減したにもかかわらず、最良のプロテアーゼ安定性と非常に高頻度で関連した。最もプロテアーゼ安定性のあるｄＡｂは以下である：ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０（図１２）。
【０２４０】
最も有望なＤＯＭ０１００  ｄＡｂの特性決定
ＢＩＡｃｏｒｅ結合およびＭＲＣ５細胞アッセイ効力データに基づき、１２個のＤＯＭ０１００  ｄＡｂ部分集合をＴＮＦＲ１への結合動態、細胞アッセイにおける効能および生物物理学的特性のさらなる特性決定のために選択した。これらすべての実験において、ｄＡｂを大腸菌中で発現させ、プロテインＡ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅを使用し、続いてＰＢＳ溶液中で透析して精製した。この特性決定のために用いた１２個のｄＡｂは以下であった：ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０。ある実験において、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６を参照として含んだ（図１３）。
【０２４１】
結合特性ＤＯＭ０１００  ｄＡｂ（抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ）
ＢＩＡｃｏｒｅにより異なるｄＡｂの会合および解離速度を測定し、このようにしてヒトＴＮＦＲ１とマウスＴＮＦＲ１の両方に対する結合親和性を確立した。実験を行い、それぞれの種のビオチン化ＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ストレプトアビジン被覆ＢＩＡｃｏｒｅチップにカップリング後、濃度範囲のｄＡｂを注入した。結果を表３に要約する。すべてのｄＡｂがヒトＴＮＦＲ１への高い結合親和性（ＫＤ＜３５０ｐＭ）ならびにマウスＴＮＦＲ１への良好な親和性（ＫＤ＜７ｎＭ）を示す。ヒトＴＮＦＲ１とマウスＴＮＦＲ１間のｄＡｂ親和性差が約２０倍であることはマウスＴＮＦＲ１とヒトＴＮＦＲ１間の限定的な配列相同を考慮すると非常に驚くべきことであり、受容体において高度に保存されたモチーフの標的化が示唆され得る。
【表３】
2016007218.tif 000004
【０２４２】
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂの生物物理学的特性
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂの生物物理学的特性（プロテアーゼ安定性、熱安定性および溶液中状態等）についてさらに特性決定した。プロテアーゼ安定性は、ｄＡｂ  １ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を減量トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｖ５１１Ａトリプシン）とインキュベートすることにより測定した。５つの異なる濃度のトリプシン（３４、１７、８．５、４．２５および２．１３μｇ／ｍｌ）ならびにトリプシンを欠く対照でインキュベートを実施した。３７℃で３時間インキュベート後、ローディング色素を添加することによりタンパク質分解反応を停止し、ＬａｂＣｈｉｐ  ９０システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で残った非切断ｄＡｂ量を測定した。量は、対照反応において存在する量のパーセンテージとして定量化した。これを表４に要約する。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）機器（Ｍｉｃｒｏｃａｌ社、マサチューセッツ）を用いてＤＯＭ０１００  ｄＡｂの熱安定性を測定した。ｄＡｂ  １ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を機器中でインキュベートして融点を測定した。結果を表４に要約する。最終的に、サイズ排除クロマトグラフィーおよびマルチアングルレーザ光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）を用いてｄＡｂの溶液中状態を測定した。ｄＡｂをＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ  １ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に注入して主要ピークの質量を測定した。ＤＯＭ０１００  ｄＡｂは、それらの溶液中状態に基づき単量体または二量体のいずれか２群に分割できた。概要については表４を参照されたい。
【表４】
2016007218.tif 000005
【０２４３】
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂの機能的特性決定
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂの機能活性および種間交差反応性について、下記のヒトＭＲＣ−５細胞アッセイ、マウスＬ９２９細胞系およびカニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞系を用いて特性決定した。ヒトＴＮＦＲ１シグナル伝達の機能的阻害のため、ヒト線維芽細胞系ＭＲＣ−５を用量範囲のｄＡｂでインキュベートしてから、２００ｐｇ／ｍｌ  ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（Ｌ９２９アッセイに用いた２０ｐｇ／ｍｌマウスＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を除く）で１８時間刺激した。この刺激後、培地を除去して、ＴＮＦαへの反応中に細胞により産生された、培地中ＩＬ−８レベルをＡＢＩ８２００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。ｄＡｂのＩＬ−８分泌ブロック能は、ｄＡｂがいかにうまくＴＮＦＲ１媒介性シグナル伝達を阻害するかの機能的読み出しである。ＭＲＣ５細胞アッセイ法における１２個のＤＯＭ０１００  ｄＡｂの試験結果を表５に示す。マウスＬ９２９細胞系を用いて機能的マウス交差反応性を決定し、１２個のＤＯＭ０１００  ｄＡｂによるＴＮＦα誘発性細胞毒からの保護レベルを評価した。このアッセイでは、細胞を用量範囲のｄＡｂで再インキュベートし、続いてアクチノマイシンの存在下でＴＮＦαを刺激する。一晩インキュベート後、細胞の生存能を測定し、ｄＡｂ濃度に対してプロットする。ＤＯＭ０１００  ｄＡｂはＴＮＦα細胞毒から保護し、ＮＤ５０値は２０〜４０ｎＭの範囲となった。ヒトＭＲＣ５細胞とマウスＬ９２９細胞間で観察されたＤＯＭ０１００  ｄＡｂの効能差は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した親和性差と類似した桁数である。
【０２４４】
最後に、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞系を用いてｄＡｂのカニクイザル交差反応性を試験した。簡単に述べると、ｄＡｂを平底細胞培養プレート中、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞（ＥＣＡＣＣ  ９００７１８０９）（５×１０３細胞／ウェル）で３７℃で１時間インキュベートした。組換えヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を添加し（最終濃度２００ｐｇ／ｍｌ）、プレートを１８〜２０時間インキュベートした。次いで培養上清中に分泌されたＩＬ−８レベルをＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＤＹ２０８）を製造メーカーの説明書（文書番号７５０３６４．１６バージョン１１／０８）に従って用いて測定した。ＩＬ−８分泌阻害パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットすることによりＮＤ５０を測定した。ＤＯＭ０１００  ｄＡｂの結果を表５に示す。
【表５】
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【０２４５】
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂのエピトープマッピング
ＤＯＭ０１００  ｄＡｂのＴＮＦＲ１上の結合エピトープが活性機序と相関し得るため、ＴＮＦＲ１中のどの残基がＤＯＭ０１００  ｄＡｂにより認識されるかを確立するために複数の試みが行われた。２つの実験アプローチ：１）ＢＩＡｃｏｒｅエピトープ競合および２）部分的に重複するペプチドを用いたペプチドスキャン、を選択してエピトープを確立した。
【０２４６】
１）ＢＩＡｃｏｒｅエピトープ競合：
ＴＮＦＲ１上の単一エピトープにおいて、２つの異なる抗体または抗体断片間で競合が存在するかを決定するための定性的アプローチは、ＢＩＡｃｏｒｅにより行い得る（Ｍａｌｍｂｏｒｇ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３，  ｐ７  （１９９５））。この目的のため、ビオチン化ＴＮＦＲ１は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップ上に被覆し、続いて任意の競合抗体（断片）の不在下で異なるｄＡｂまたは抗体を連続注入して各抗体結合レベルを確立する。続いて、同じ濃度の抗体（断片）を用いて反復注入するが、今度は抗体の注入直後に競合を決定する。結合抗体（断片）は、共鳴単位（ＲＵ）において定量化し、第二の抗体の存在および不在下で比較する。２つの抗体（断片）間で競合しない場合、ＲＵ結合数は他の抗体の存在および不在下で同一となる。逆に、競合する場合、第二の抗体（断片）注入中にＲＵ結合はほとんどないかまたはない。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６において、ＴＮＦα競合ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１（ＷＯ２００８１４９１４４を参照のこと））およびｍＡｂ（ｍＡｂ２２５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；カタログ番号ＭＡＢ２２５）の存在および不在下で共鳴単位結合数は変化せず、記載のｄＡｂおよびｍＡｂにとって新規のエピトープを示す（図１４および１５）。ＴＮＦＲ１は、４つのシステイン豊富ドメインからなる多ドメイン受容体である。ドメイン２および３はＴＮＦα結合に関与し（Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ７３，  ｐ４３１  （１９９３））、対してプレリガンド会合ドメイン（ＰＬＡＤ）としても知られている第一ドメインは、ＴＮＦα結合前に受容体の前会合を促進する（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ  ２８８，  ｐ２３５１  （２０００））。ＢＩＡｃｏｒｅ上の既知のＰＬＡＤ結合ｍＡｂクローン４．１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｚｙｍｅｄ  ３３−０１００により供給）との競合は非常に制限され、クローン４．１２結合ＲＵ数は、ＤＯＭ０１００  ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６）の存在下で非存在下に比べて最大２０％減少することを示す（図１６）。これは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６により認識された大部分のエピトープはクローン４．１２により認識されないことを示す。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６との完全な競合を示したｄＡｂは、選択中に単離された別のＤＯＭ０１００  ｄＡｂ：ＤＯＭ１ｈ−５１０のみであった（図１７）。ＤＯＭ０１００  ｄＡｂがマウスＴＮＦＲ１への交差反応結合を示すため、ＢＩＡｃｏｒｅチップに被覆したマウスＴＮＦＲ１上で同一実験を施行して、抗マウスＴＮＦＲ１、非競合的ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｍ−２１−２３と競合するかどうかを確立できた（ＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）。際立つことに、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３とＤＯＭ０１００  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６間には競合が見られなかった（図１８）。マウスと交差反応するＤＯＭ１ｈ−５７４  ｄＡｂの独特な特性は、上記ｄＡｂまたは抗体（ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１、ｍＡＢ２２５、クローン４．１２およびＤＯＭ１ｍ−２１−２３）が任意の有意なマウス／ヒト交差反応を示さないため、新規エピトープを認識する必要があることも強調する。
【０２４７】
２）ＴＮＦＲ１のペプチドスキャン
ＴＮＦＲ１上の任意の線型エピトープが本発明者らのＤＯＭ１ｈ−５７４  ｄＡｂ系統により認識されるかどうかを確立するため、１５ｍｅｒペプチドスキャン（３残基でそれぞれ補正）を合成してＴＮＦＲ１の完全な細胞外ドメインを覆った。これらのペプチドはそれぞれビオチン基を含み、これらはＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ機器（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、カリフォルニア、米国）の異なるセンサーチップにカップリングするために使用した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ機器は分子の相互作用のリアルタイム測定を可能とするバイオレイヤー インターフェロメトリー（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ））、非標識、バイオセンサー技術を用いる。Ｏｃｔｅｔ機器はバイオセンサーまで白色光を下に放ち、反射光を収集する。バイオセンサーチップに結合した分子数の変化はいずれも反射光のこの干渉パターンをシフトさせ、リアルタイムで測定される。本発明者らの実験では、各チップを異なるペプチドで被覆し、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６  ｄＡｂでインキュベートしてｄＡｂの各チップへの結合をモニタリングした。チップの大部分は確実な結合を示さなかった。３つのペプチドは、いかなる結合も示さない陰性対照ペプチドと共にＢｉｏＦｏｒｔｅ  Ｏｃｔｅｔ上で、ストレプトアビジン被覆ＢＩＡｃｏｒｅチップにカップリングさせ、これらのペプチドに対するＤＯＭ１ｈ−５７４−１６、ＤＯＭ１ｈ−１３１−５１１およびＤＯＭ１ｍ−２１−２３の結合を測定した（図１９、２０および２１）。ＤＯＭ０１００  ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６）のみが任意の３つの特異性ペプチドへの結合を示し、残りのｄＡｂはいずれの結合も示さなかった。陰性ペプチド対照上では、いずれのｄＡｂに対する結合も観察されなかった。３つのＴＮＦＲ１ペプチドは２群：１）ドメイン１に位置するペプチド１（ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ）と、２）ＴＮＦＲ１のドメイン３で重複しているペプチド２（ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦ）および３（ＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦ）に分割できた。特にペプチド１については、注目に値することに、一番最後の残基を除き、この配列はマウスとヒトＴＮＦＲ１間で十分に保存されているＴＮＦＲ１中の１５の連続アミノ酸残基のストレッチのみに対応する（この保存されているストレッチは配列：ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬを有する）。このエピトープへの結合はＤＯＭ１ｈ−５７４系統において観察されたマウス交差反応性を説明する。
【０２４８】
インビボ半減期延長のためのＤＯＭ０１００  ｄＡｂのフォーマット化
慢性炎症障害（例えばＲＡおよび乾癬等）の治療において有用であるＤＯＭ０１００  ｄＡｂについて、ｄＡｂが全身に送達されて長期間活性化することが望ましい。これを達成するために多くの異なるアプローチ（例えばＰＥＧ部分のｄＡｂへの付加、血清アルブミン結合ｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂＴＭ）との遺伝的融合物としてのｄＡｂ発現、またはＩｇＧのＦｃ部分との遺伝的融合を含む）が利用可能である。ＤＯＭ０１００（抗ＴＮＦＲ１）ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６において、ＰＥＧとＡｌｂｕｄＡｂ融合物の両方を試験した。
【０２４９】
１）４０Ｋ（４０ＫＤａ）線型ＰＥＧとの接合による半減期延長
この目的のため、ｄＡｂのＣ末端に遊離システインを有するＤＯＭ１ｈ−５７４−１６の変異型を作製した（Ｃ末端のセリンをシステインに置換した）。大腸菌中で変異型を発現させ、プロテインＡ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅを用いて精製した。マレイミド化学（ＷＯ０４０８１０２６を参照のこと）を用いて、４０Ｋ線型ＰＥＧ（ＤＯＷｐｈａｒｍａ社）をこのＤＯＭ１ｈ−５７４−１６変異型のＣ末端に接合させ、反応物をＦＰＬＣカラム上に流して清浄した。この分子をＤＭＳ０１６２と名付けた。ＰＥＧ接合によるＤＭＳ０１６２の半減期延長効果をラットＰＫ試験において評価した。３匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに標的用量２．５ｍｇ／ｋｇタンパク質を静脈内投与した。血液試料を投与後０．１７、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１６８時間にラットから採取し、アッセイして血中ＤＭＳ０１６２量を測定した。ＤＭＳ０１６２試料をＴＮＦＲ１−捕獲およびヤギ抗ｈｆＡｂ検出ＥＬＩＳＡで試験した。アッセイの生データを各血清試料中の薬剤濃度に変換した。各時点の平均μｇ／ｍＬ値を次いでノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ、例えばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、マウンテンビュー、カリフォルニア９４０４０、米国から入手可能）で解析した。これらのデータにより、ラットにおけるＤＭＳ０１６２の平均終末半減期は２０．４時間であった。
【０２５０】
２）ＡｌｂｕｄＡｂＴＭとの遺伝的融合を介した半減期延長
ａ）ＡｌｂｕｄＡｂと融合した抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの機能的特性決定
既に本発明者らはｄＡｂのＰＫ半減期をインビボで延長するためにアルブミン結合ｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ）との遺伝的融合の使用について記載済みである（例えば、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ２００６０３８０２７、ＷＯ２００８１４９１４８を参照のこと）。これらの融合の所望の態様は以下である：
１）ＡｌｂｕｄＡｂの融合は、ＴＮＦＲ１結合ｄＡｂの結合親和性に実質的に影響を与えるべきではない、
２）異種由来のアルブミンに対するＡｌｂｕｄＡｂの親和性は、ＰＫ半減期延長が期待できるものであるべきである。
【０２５１】
異なるＡｌｂｕｄＡｂとＤＯＭ１ｈ−５７４−１６との対合を評価するために、表６に対合を列挙した（構築物はＮ末端からＣ末端方向で、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ（すなわち、ＤＯＭ０１００  ｄＡｂ）−リンカー−ＡｌｂｕｄＡｂ−ｍｙｃであった）。ＤＭＳ０１８４を除いたすべてが、検出目的のために恐らく使用し得るｍｙｃタグをＣ末端に含む。
【表６】
2016007218.tif 000007
【０２５２】
すべてのＡｌｂｕｄＡｂの配列を以下に示す。ＤＯＭ７ｈ−１１およびＤＯＭ７ｍ−１６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については本明細書に開示している。
【０２５３】
発現および精製後、ＢＩＡｃｏｒｅ上ですべての構築物のマウス血清アルブミンとヒト血清アルブミンの両方への結合について試験した。解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を測定してＡｌｂｕｄＡｂ間の融合分子の半減期延長における適応性を識別するために用いた。リンカーはＡｌｂｕｄＡｂのアルブミンに対する親和性に対してほとんど影響を与えないのに対し、ｄＡｂとそれらのアルブミンの親和性間には有意差があった。マウス結合のために最良のＡｌｂｕｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１１−１５であり、ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｈ−１１−１２が続いた（図２２）。しかしながら、ＤＯＭ７ｍ−１６は、ヒトアルブミンに対して結合を示さず、対してＤＯＭ７ｈ−１１−１５とＤＯＭ７ｈ−１１−３はヒトアルブミン結合において最良の対合であった（図２３）。アッセイ法には変動が見られたが、一般に、ヒトＭＲＣ−５細胞アッセイ法における親和性には、ＤＯＭ７ｈ−１１系統の任意のＡｌｂｕｄＡｂとの融合時、単量体ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６と同じｄＡｂにおいて得られたＮＤ５０値の低下は限られていた。しかしながら、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２との対合時およびＤＯＭ７ｈ−１１−１２との比較時、ＡｌｂｕｄＡｂ  ＤＯＭ７ｍ−１６の影響が見られた。ＤＯＭ７ｍ−１６対合は、ＭＲＣ−５細胞アッセイにおいて、融合物の抗ＴＮＦＲ１部分における効能を有意に低下し、これは同じ抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂをＤＯＭ７ｈ−１１−１２と対合時には見られなかった。これらの結果は、ＤＯＭ７ｈ−１１系統由来のＡｌｂｕｄＡｂとの対合の利点を強調する（例えば、抗血清アルブミンｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０または９５％等しいアミノ酸配列を有する）。
【０２５４】
ｂ）異なるＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ融合のためのマウスおよびラットＰＫ
ＰＥＧの代替法は、血清アルブミンを認識するドメイン抗体（ＡｌｂｕｄＡｂ）との遺伝的融合物としてのＤＯＭ０１００  ｄＡｂの発現である。このアプローチを評価するために、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６、アラニンセリントレオニン（ＡＳＴ）リンカーおよびＤＯＭ７ｈ−１１、続いてｍｙｃタグ（ＤＭＳ０１８２）からなる遺伝的構築物を作製した。この構築物を大腸菌発現ベクターｐＤＯＭ５に連結させ、大腸菌株ＨＢ２１５１に形質転換して発現させた。固体支持体にカップリングしたプロテインＬを用いてＤＭＳ０１８２を上清から精製してから、プロテインＡ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅにより任意の遊離単量体を除去した。ＤＭＳ０１８２を３匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに用量５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。投与後０．１７、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１６８時間に血液試料を採取した。血清試料を調製してから、これらを３つの別々のＥＬＩＳＡにおいて試験した：１）ウサギ抗ヒトκ鎖検出を用いたヤギ抗ｍｙｃ捕獲、２）ＴＮＦＲ１−Ｆｃ検出を用いたヤギ抗ｍｙｃ捕獲および抗ヒト−Ｆｃ／ＨＲＰを介した読み取り、ならびに３）ヤギ抗ｆＡｂ検出を用いたＴＮＦＲ１捕獲および抗ヤギＨＲＰを介した読み取り。アッセイの生データを各血清試料中の薬剤濃度に変換した。各時点の平均μｇ／ｍＬ値を次いでノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析した。ＤＭＳ０１８２を３つの記載のアッセイで試験し平均終末半減期５．２〜６．４時間であった。同じＤＭＳ０１８２を用いてＰＫ追加試験を行い、今回はマウスに１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。マウス３匹を以下の各時点で出血させた：０．１７、１、４、１２、２４、４８および９６時間。前述のアッセイ選択肢２を用いた血清解析により、マウスにおけるＤＭＳ０１８２の血清半減期は約５．９時間であることが特定された（図２４）。明らかにＡｌｂｕｄＡｂ  ＤＯＭ７ｈ−１１の付加は、ｄＡｂの半減期を、これまでに遊離ｄＡｂをマウスおよびラットに注入時に見られた半減期（Ｔ１／２約２０分、例えば、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ０４００３０１９を参照のこと）よりも延長した。しかしながら、半減期のさらなる改善は有益である。ラットおよびマウスアルブミンのＤＯＭ７ｈ−１１の結合親和性試験により、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６に融合時、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した１μＭ超の親和性を特定した。したがって、これらの直列融合のために使用されるＡｌｂｕｄＡｂならびにリンカーの両方を変化させた。異なるＤＯＭ０１００  ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）、異なるリンカー（ＡＳＴＳＧＰＳ）、２つの異なるＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｈ−１１−１２）（両方ともｍｙｃタグが続く）からなる２つの新規遺伝的構築物、それぞれＤＭＳ０１６８およびＤＭＳ０１６９を作製した（構築物はＮ末端からＣ末端方向で、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ（すなわち、ＤＯＭ０１００  ｄＡｂ）−リンカー−ＡｌｂｕｄＡｂ−ｍｙｃであった）。これらの構築物をｐＤＯＭ５中にクローン化し、大腸菌中で発現させ、プロテインＬおよびプロテインＡを用いて精製した。ＭＳＡへの結合について両方をＢＩＡｃｏｒｅ上で解析し、有意な改善を観察した（両構築物において約２００ｎＭのマウスアルブミン結合親和性に至る）。半減期延長に対する改善されたアルブミン結合の効果を決定するため、ＤＭＳ０１６８およびＤＭＳ０１６９をマウスに２．５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与し、続いてマウス３匹を以下の各時点で出血させた：０．１７、１、４、８、２４、４８、９６および１６８時間。これら両分子の血清半減期はＥＬＩＳＡベース方法における血清中の融合タンパク質の定量化により測定した；ＤＭＳ０１６８において、ヤギ抗ｍｙｃを捕獲のために使用し、続いてＴＮＦＲ１−Ｆｃで検出し、抗ヒト−Ｆｃ／ＨＲＰを介して読みとった。ＴＮＦＲ１−Ｆｃを用いてＤＭＳ０１６９を捕獲し、続いてヤギ抗Ｆａｂで検出し、抗ヤギＨＲＰを介して読みとった。この方法の他に、高密度のヒトＴＮＦＲ１で被覆したチップへの結合を介したＤＭＳ０１６９のＢＩＡｃｏｒｅ定量化を用いてデータをプロットし、マウスの終末半減期を算出した。ＤＭＳ０１６８の終末半減期は１５．４時間（ＥＬＩＳＡ）であり、ＤＭＳ０１６９の終末半減期は１７．８時間（ＥＬＩＳＡ）または２２．０時間（Ｂｉａｃｏｒｅ社）のいずれかであった（図２４）。これらの半減期は両方とも、ＤＯＭ０１００  ｄＡｂをＤＯＭ７ｈ−１１に融合時の半減期に比べて有意に延長し、ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の終末半減期に対するアルブミンの増大した親和性の影響を強調する。
【０２５５】
ＤＯＭ０１００−ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の機能的特性決定および生物物理学的特性
抗アルブミンｄＡｂに融合した抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの最適フォーマットを決定するため、単一抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂを取得し（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）、３つの異なるリンカー（ＡＳＴ、ＡＳＴＳＧＰＳおよびＡＳ（ＧＧＧＧＳ）３）を用いて４つの異なるＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０およびＤＯＭ７ｈ−１４−１８）と対合させた。これらの構築物はいずれもｍｙｃタグを含まなかった。全１２の構築物を大腸菌中に発現させ、プロテインＬ後のプロテインＡ精製の２つのステップ過程を用いて精製し、発現レベルを定量化した。加えて、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを用いて分子の溶液中状態を測定した。結果を表７に要約する。結果の解析によりいくつかの際立つ事項が観察された：１）ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２とＤＯＭ７ｈ−１１系統ｄＡｂとの対合ではＤＯＭ７ｈ−１４系統対合時に比べて発現レベルが有意に高かった、２）ＤＯＭ７ｈ−１１対合では単量体溶液中状態が観察され、対してＤＯＭ７ｈ−１４対合では単量体／二量体の均衡に至った。単量体溶液中状態は、これらの分子は受容体架橋を誘発して、その結果、受容体を活性化する（アゴニズム）かまたは阻害剤活性を中和する可能性が低いため、好ましい。さらに、単量体溶液中状態は、これらの分子はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による解析時に凝集が少なく、より不純物のない傾向にあるため、開発観点からも望ましい。ＤＯＭ７ｈ−１１  ＡｌｂｕｄＡｂとの対合はＤＯＭ７ｈ−１４  ＡｌｂｕｄＡｂ対合に比べ、高い発現レベルおよび単量体溶液中状態の高いパーセンテージに至るという所見から、ＤＯＭ７ｈ−１１対合の方が好ましい。
【表７】
2016007218.tif 000008
【０２５６】
さらに、精製した融合分子の親和性および効能を、それぞれＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００およびＭＲＣ５細胞アッセイを用いて測定した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００は、高感度のＢＩＡｃｏｒｅバージョンであり、理想的には高い親和性結合剤の決定に適している（Ｐａｐａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５９，  ｐ１１２  （２００６））。ビオチン化ヒトＴＮＦＲ１をチップに被覆し、各１２のＡｌｂｕｄＡｂ融合物をこの表面上に４つの異なる濃度（２、１０、５０および２５０ｎＭ）で通過させた。本目的は、対合が抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ（ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２）の標的に対する結合親和性に対して任意の有意な効果を有するかどうか確立することである。下表８に見ることができるように、対合間およびそれらのＢＩＡｃｏｒｅによる親和性に対する効果に有意差はなかった。他の対合の３倍高い親和性を示したＤＯＭ７ｈ−１４−１８対合（ＤＭＳ０１１８およびＤＭＳ０１２４）を除き、すべての組み合わせの親和性は類似した。しかし、驚くべきことに、すべてのＡｌｂｕｄＡｂ融合分子中のＤＯＭ１ｈ−５７４−７２にて、非融合ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２  ｄＡｂに比べ少なくとも２〜３倍の親和性（ＫＤ）改善が観察された。この改善は、対合のために用いたＡｌｂｕｄＡｂにかかわらず観察され、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８との対合で最も大きかった。異なる対合が抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの機能活性に影響を与えるか確立するために用いた第二の実験は、ＭＲＣ５細胞アッセイであった（表８）。ＭＲＣ５アッセイでは、より著しい対合間差が観察され、最良の効能はＤＯＭ７ｈ−１１−３およびＤＯＭ７ｈ−１１−１２対合において観察され、対してＤＯＭ７ｈ−１４−１０（ＤＭＳ０１１７）対合は効力を有意に減少した。
【表８】
2016007218.tif 000009
【０２５７】
両単量体ＤＯＭ１ｈ−５７４抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂおよびＡｌｂｕｄＡｂとの対合の生物物理学的および機能的特性決定結果を用いて、５つの融合分子の部分集合を構築し、発現させ、精製して、特性決定した。これら５つのそれぞれは以下の抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの１つを含む：ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０、それぞれＡＳＴリンカーを用いてＤＯＭ７ｈ−１１−３と対合した。構築物は、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂであった（すなわち、Ｎ末端からＣ末端方向でＤＯＭ０１００  ｄＡｂ−リンカー−ＡｌｂｕｄＡｂ、これらの構築物のいずれもタグを含まなかった）。発現した分子の溶液中状態についてＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ上で、熱安定性についてＤＳＣ上で、ヒトＴＮＦＲ１およびマウスＴＮＦＲ１に対する親和性についてＢＩＡｃｏｒｅ上で、ならびに機能活性についてＭＲＣ５細胞アッセイ法で特性決定した。
【０２５８】
これら５つの直列融合分子の生物物理学的特性決定により、すべての融点が５５℃                                          超であり、溶液中単量体であることが示された（表９）。高い融点は、分子の下流プロセシング中および保存中の両方で有益である分子の増大した安定性の指標である。さらに、患者においてインビボ医薬品として機能時、分解に対して感度を弱くすることにより分子の安定に有益であり得、その結果、その終末半減期が延長される。
【表９】
2016007218.tif 000010
【０２５９】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗ＴＮＦＲ１親和性の特性決定ならびにヒトＭＲＣ５および標準的マウスＬ９２９細胞アッセイにおける機能活性（表１０）により、ｄＡｂ間差が限定的であることが示された。しかしながら、融点、溶液中状態、発現、ＢＩＡｃｏｒｅ、ヒトＭＲＣ５細胞アッセイおよび標準的マウスＬ９２９細胞アッセイから全データを総合した結果、ＤＭＳ０１３３およびＤＭＳ０１３４が好ましい組み合わせとして明らかになった。これら２つの融点が最も高く、これらはヒト細胞およびマウス細胞の機能的アッセイにおいて最も強力な組み合わせに属す。細胞アッセイにおける機能活性は、好ましい分子決定のための主要な駆動体である。
【表１０】
2016007218.tif 000011
【０２６０】
マウスの関節リウマチモデルにおけるＤＯＭ０１００のインビボ有効性の実証
記載の抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの活性は有用であり、疾患を改変し得ることを示すため、マウスの関節リウマチモデルを、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２−ＡＳＴＳＧＰＳ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２−ｍｙｃタグ（Ｎ末端からＣ末端方向）に融合したＤＭＳ０１６９で処理した。このマウスモデルは、ヒトＴＮＦαが過剰発現し（Ｔｇ１９７）、マウスＴＮＦＲ１をコードする遺伝子がヒトＴＮＦＲ１（ｈｐ５５）遺伝子と置換されている遺伝子導入マウスモデルである。経時的に、これらのマウスは自然発生関節炎を発現し、これは処理中に関節サイズを測定することによりスコア化し（臨床スコア）、１５週後に関節の組織学的解析を実施する（Ｋｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ．Ｊ．，  １０，  ｐ４０２５  （１９９１））。加えて、マウスの全身の健康は週１回測定する体重から推測し得る。６週目以降、マウス１２匹を週２回１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ０１６９または週１回生理食塩水注射（対照群）のいずれかで処理した。６週目から１５週目まで週１回、各マウスの臨床スコアと体重の両方をスコア化した（図２５および２６）。１５週間後、マウスを屠殺して関節炎症の組織学的解析を行った（図２７）。両臨床および組織学スコアに対するＤＭＳ０１６９の効果は非常に有意であり（ｐ＜０．００１）、対してＤＭＳ０１６９で処理したマウスの体重は生理食塩水で処理した対照動物に比べて好ましく、関節リウマチにおけるＤＭＳ０１６９の治療的便益の可能性が示された。
【０２６１】
標準的細胞アッセイ
標準的ＭＲＣ−５  ＩＬ−８放出アッセイ
以下のＭＲＣ−５細胞アッセイにおいて、ヒトＴＮＦＲ１と結合するあるｄＡｂの活性を評価した。アッセイはＭＲＣ−５細胞中のＴＮＦαによるＩＬ−８分泌の誘発に基づき、ＨＵＶＥＣ中のＩＬ−１によるＩＬ−８誘発について説明しているＡｌｃｅｓｏｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：３０５１７−３０５２３  （１９９６）に記載の方法から適用される。ＨＵＶＥＣ細胞系の代わりにＭＲＣ−５細胞を用いてヒトＴＮＦαによるＩＬ−８誘発を評価することによりｄＡｂ活性をアッセイした。簡単に述べると、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１７１）をマイクロタイタープレート（５×１０３細胞／ウェル）中にプレートし、プレートを用量範囲のｄＡｂおよび固定量（２００ｐｇ／ｍｌ）のヒトＴＮＦαで一晩インキュベートした。インキュベート後、培養上清を吸引してＩＬ−８  ＡＢＩ  ８２００細胞検出アッセイ（ＦＭＡＴ）を用いてＩＬ−８放出を測定した。ＩＬ−８  ＦＭＡＴアッセイには、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社からの検出および捕獲試薬を用いた。ビーズ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）被覆したポリスチレン粒子０．５％ｗ／ｖ６〜８μｍ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社、カタログ番号ＭＰ−６０−５）を、捕獲抗体マウスモノクローナル抗ヒトＩＬ−８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＭＡＢ２０８）で被覆した。検出のため、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ−８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＢＡＦ２０８）およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ３２３５７）を用いた。組換えヒトＩＬ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２０８−ＩＬ）を標準として用いた。抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ活性は、ＴＮＦαのみでインキュベートした対照ウェルと比べて上清中へのＩＬ−８分泌を低減した。
【０２６２】
標準的カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１アッセイ
ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞アッセイにおいて、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの効能を試験した。簡単に述べると、ｄＡｂを平底細胞培養プレート中、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞（ＥＣＡＣＣ  ９００７１８０９）（５×１０３細胞／ウェル）で３７℃で１時間インキュベートした。組換えヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を添加し（最終濃度２００ｐｇ／ｍｌ）、プレートを１８〜２０時間インキュベートした。次いで、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＤＹ２０８）を製造メーカーの説明書（文書番号７５０３６４．１６  バージョン１１／０８）に従って用いて、培養上清中で分泌したＩＬ−８レベルを測定した。ＩＬ−８分泌の阻害パーセンテージに対してｄＡｂ濃度をプロットすることによりＮＤ５０を測定した。
【０２６３】
標準的Ｌ９２９細胞毒アッセイ
抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの、マウスＬ９２９線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）上でＴＮＦαの細胞毒活性を中和する能力についても試験した（Ｅｖａｎｓ，  Ｔ．  （２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，  ２４３−２４８）。簡単に述べると、マイクロタイタープレート（１×１０４細胞／ウェル）中にプレートしたＬ９２９細胞を抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ、１００ｐｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ、プール、英国）で一晩インキュベートした。［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）でインキュベート後、４９０ｎｍで吸光度を読みとって細胞生存能を測定した。抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ活性は、ＴＮＦα単独の対照に比べて、ＴＮＦα細胞毒を低減し、したがって吸光度は増大する。
【０２６４】
標準的な受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイ法において、ヒトＴＮＦＲ１に対するｄＡｂの効能を測定した。このアッセイでＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合および溶解性ｄＡｂによるこの相互作用ブロック能を測定する。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）で前被覆したビーズ上でＴＮＦＲ１−ＦＣ融合物を捕獲する。受容体被覆したビーズをＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｄＡｂ、ビオチン接合体抗ＴＮＦαおよびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７で黒色側面透明底３８４ウェルプレートでインキュベートした。６時間後、プレートをＡＢＩ  ８２００細胞検出システムで読み取り、ビーズ結合蛍光を測定した。ｄＡｂがＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合をブロックする場合、蛍光強度は低減する。
【０２６５】
ＡＢＩ  ８２００解析ソフトウェアを用いてデータを解析した。濃度効果曲線および効力（ＥＣ５０）値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍおよび可変傾斜のＳ字形用量反応曲線を用いて測定した。
【０２６６】
インビボ有効性試験のためのＤＯＭ７ｈ−１１−１２との融合物の構築および精製
異なる抗ＴＮＦＲ１および対照ｄＡｂとインビボ有効性試験を実施するため、ｄＡｂ間にＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒリンカーを用いて異なるｄＡｂのＡｌｂｕｄＡｂ（抗血清アルブミンｄＡｂ）ＤＯＭ７ｈ−１１−１２の遺伝的融合物をクローン化した。この目的のために４つの構築物を作製した：ＤＭＳ５５３７（ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２）、ＤＭＳ５５３８（ＶｈＤ２−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２）、ＤＭＳ５５３９（ＤＯＭ１ｍ−１５−１２−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈ）およびＤＭＳ５５４０（ＤＯＭ１ｍ−２１−２３−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２）。
【０２６７】
これら４構築物のそれぞれの構築は以下のとおりである：
ＤＭＳ５５３７：Ｖｈ  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６をプライマーＡＳ９およびＺＨＴ３０４を用いてＤＭＳ０１２６からＰＣＲ増幅した。Ｖｋ  ｄＡｂ  ＤＯＭ７ｈ−１１−１２をプライマーＰＡＳ４０およびＡＳ６５を用いてＡＳＴリンカーを添加し、ｐＤＯＭ５ベクター中のＤＭＳ０１６９（タグなし）からＰＣＲ増幅した。反応生成物をＳＯＥ−ＰＣＲにより結合し、プライマーＪＡＬ１０２およびＺＨＴ３２７を用いて再増幅した。再増幅した反応生成物をＮｄｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで切断し、Ｎｄｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ−切断ｐＥＴ３０ａ（Ｍｅｒｃｋ）中にクローン化する。発現のため、構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４５０）。
【０２６８】
ＤＭＳ５５３８：Ｖｈ  ｄＡｂＶｈＤ２、特異性抗原認識のないいわゆる「ダミーｄＡｂ」を、プライマーＡＳ９およびＺＨＴ３０４を用いてＰＣＲ増幅した。Ｖｋ  ｄＡｂ  ＤＯＭ７ｈ−１１−１２をプライマーＰＡＳ４０およびＡＳ６５を用いてＤＭＳ０１６９タグなしからＰＣＲ増幅した。両生成物をゲル精製し、ＳＯＥ−ＰＣＲを用いて再会合させる。プライマーＪＡＬ１０２およびＺＨＴ３２７を用いてＳＯＥ生成物を再増幅する。再増幅した反応生成物をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断し、ゲル精製して、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断したｐＥＴ３０に連結する。発現のため、構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
【０２６９】
ＤＭＳ５５３９：抗マウスＴＮＦＲ１  Ｖｋ  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｍ−１５−１２をプライマーＡＳ９およびＺＨＴ３３４を用いてｐＤＯＭ５／Ｖｋ（ＤＯＭ１ｍ−１５−１２）からＰＣＲ増幅した。抗ＴＮＦＲ１および抗アルブミンｄＡｂであるＤＯＭ７ｈ−１１−１２は両方ともＶｋであるため、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２の標準的ＤＮＡ脱ホモログ化アプローチを実施し、すなわちアミノ酸配列に影響を与えないサイレント変異をＤＮＡレベルで導入した。これらの変異は、ＤＮＡ増幅およびタンパク質発現中に相同組換えの機会を減らしプラスミド安定性を高める。加えて、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２  ｄＡｂは、直列融合のプロテインＬへの結合を減らして精製を促進するために１２位のＳｅｒからＰｒｏへの変異も含む。Ｖｋ  ＤＯＭ７ｈ−１１−１２  Ｓ１２Ｐ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈ  Ｓ１２Ｐ）の脱ホモログ化バージョンは、プライマーＺＨＴ３３３およびＡＳ６５を用いてｐＤＯＭ５／Ｖｋ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈ）からＰＣＲ増幅する。両生成物をＳＯＥ−ＰＣＲによりゲル精製して再会合させる。ＳＯＥ生成物は、プライマーＺＨＴ３３２＋ＺＨＴ３２７を用いて再増幅する。反応生成物をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断し、ゲル精製して、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断したｐＥＴ３０に連結する。発現のため、構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
【０２７０】
ＤＭＳ５５４０：抗マウスＴＮＦＲ１  Ｖｈ  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｍ−２１−２３（ＷＯ２００６０３８０２７を参照のこと）は、プライマーＡＳ９およびＺＨＴ３３５を用いてＤＭＳ０１２７からＰＣＲ増幅する。Ｖｋ  ｄＡｂ  ＤＯＭ７ｈ−１１−１２は、プライマーＰＡＳ４０およびＡＳ６５を用いてＤＭＳ０１６９からＰＣＲ増幅する。ＳＯＥ−ＰＣＲにより両生成物をゲル精製して再会合させる。ＳＯＥ生成物を、プライマーＪＡＬ１０２およびＺＨＴ３２７を用いて再増幅する。反応生成物をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断し、ゲル精製してＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断したｐＥＴ３０に連結する。発現のため、構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
【０２７１】
次いで以下の条件を用いて、全４つの構築物を発酵槽内で発現させた：誘発後温度すべて２７℃、０．０２５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発したＤＭＳ５５４０を除き、０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧ。発酵はすべて、５Ｌの最小培地で高密度な細胞で行われた。
【０２７２】
プロテインＬへのバッチ結合、続いて溶離、中和および第二のステップのプロテインＡへのバッチ結合により上清から精製した。溶離したタンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換して機能的特性決定前に濃縮した。ＤＭＳ５５３９をプロテインＬにより精製してから、さらにＳＥＣにより精製して同時に緩衝液をＰＢＳに交換した。次いですべての分子の内毒素を枯渇させた。
【表１１】
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【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年8月21日(2015.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単一可変ドメイン。
【請求項２】
単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）５００ｐＭ以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、請求項１に記載の単一可変ドメイン。
【請求項３】
単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離速度定数（Ｋｏｆｆ）２×１０−４ｓ−１以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、請求項１または２に記載の単一可変ドメイン。
【請求項４】
単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１に特異的に結合する、請求項１、２または３に記載の単一可変ドメイン。
【請求項５】
単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）への結合を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項６】
単一可変ドメインが：
ｉ．標準的ＭＲＣ５アッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する；
ｉｉ．標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒性の阻害により測定したＮＤ５０約１５０ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する；
ｉｉｉ．標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する；および／または
ｉｖ．ＴＮＦＲ１の非競合阻害剤である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単一可変ドメイン。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意に、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項８】
抗ＳＡ単一可変ドメインが、ＤＯＭ７ｈ−１１（配列番号２８）、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号３０）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３１）、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号３２）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８（配列番号３４）またはＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号３５）の配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の多重特異性リガンド。
【請求項９】
リンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む、請求項７または８に記載の多重特異性リガンド。
【請求項１０】
（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）の配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意に、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単一可変ドメインまたは多重特異性リガンドを含む、ＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項１２】
炎症状態の治療および／または予防のための、請求項１１に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項１３】
炎症状態の治療および／または予防のための医薬品の製造における、請求項１１に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
【請求項１４】
前記状態が関節炎、多発性硬化症、炎症腸疾患および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される、請求項１２に記載のアンタゴニストまたは請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
核酸が、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号２２）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含み、核酸が、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする、単離、または組換え型核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
本発明はさらに、前述のｄＡｂ単量体の二量体、三量体およびポリマーを提供する。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、単一可変ドメイン。
２．抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記単一可変ドメインは、以下の変異（Ｋａｂａｔによるナンバリング）；
３０位が、ＬもしくはＦであり、
５２位が、ＡもしくはＴであり、
５２ａ位が、ＤもしくはＥであり、
５４位が、ＡもしくはＲであり、
５７位が、Ｒ、ＫもしくはＡであり、
６０位が、Ｄ、Ｓ、ＴもしくはＫであり、
６１位が、Ｅ、ＨもしくはＧであり、
６２位が、ＡもしくはＴであり、
１００位は、Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｄ、ＳもしくはＶである、ならびに
１０１位は、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、ＨもしくはＫである
を１つまたは複数含む、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１４（配列番号１０）の変異体である、単一可変ドメイン。
３．１０１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にバリンを含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン重鎖単一可変ドメイン。
４．可変ドメインが上記１に定義されている、上記３に記載の単一可変ドメイン。
５．３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む、上記１〜４のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
６．３０Ｇ、４４Ｄ、４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）のうち１つまたは複数を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであり、前記単一可変ドメインのアミノ酸配列はその他の点ではＤＯＭ１ｈ−５７４（配列番号１１；図５）のアミノ酸配列と等しい、単一可変ドメイン。
７．４５Ｐ、５５Ｄ、５６Ｒ、９４Ｉおよび９８Ｒ（ナンバリングはＫａｂａｔによる）を含む、上記５または６に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
８．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３２（配列番号７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５（配列番号８）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号９）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
９．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−９３（配列番号１２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２３（配列番号１３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５（配列番号１４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１２９（配列番号１６）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３７（配列番号１８）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１６０（配列番号１９）のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
１０．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２５（配列番号１４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３５（配列番号８）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３９（配列番号２０）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５５（配列番号２１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％等しいアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
１１．単一可変ドメインが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号２２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号１０９）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号２５）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号２６）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号２７）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列によりコードされる、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に対して結合する抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
１２．単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離定数（ＫＤ）５００ｐＭ以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、上記１〜１１のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１３．単一可変ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定した解離速度定数（Ｋｏｆｆ）２×１０−４ｓ−１以下でヒトＴＮＦＲ１に特異的に結合する結合部位を含む、上記１〜１２のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１４．単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１に特異的に結合する、上記１〜１３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１５．単一可変ドメインが、マウスＴＮＦＲ１と結合する、上記１４に記載の単一可変ドメイン。
１６．単一可変ドメインが、ヒト、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）への結合を阻害する、上記１〜１５のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１７．単一可変ドメインが、ヒト、マウス、カニクイザルおよび任意にイヌＴＮＦＲ１のＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）への結合を阻害する、上記１〜１６のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１８．単一可変ドメインが、標準的ＭＲＣ５アッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、上記１〜１７のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
１９．単一可変ドメインが、標準的Ｌ９２９アッセイ法においてＴＮＦα誘発性細胞毒の阻害により測定したＮＤ５０約１５０ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、上記１〜１８のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
２０．単一可変ドメインが、標準的カニクイザルＫＩアッセイ法においてＴＮＦα誘発性ＩＬ−８分泌の阻害により測定したＮＤ５０約５ｎＭ以下でＴＮＦＲ１を中和する、上記１〜１９のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
２１．単一可変ドメインが、ＴＮＦＲ１の非競合阻害剤である、上記１〜２０のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
２２．単一可変ドメインが、ヒトＴＮＦＲ１のドメイン１に特異的に結合する、上記２１に記載の単一可変ドメイン。
２３．単一可変ドメインが、ヒトＴＮＦＲ１のＰＬＡＤドメインに対して特異的である、上記２１または２２に記載の単一可変ドメイン。
２４．単一可変ドメインが、末端、任意にＣ末端にシステイン残基を含む、上記１〜２３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２５．単一可変ドメインが、ポリアルキレングリコール部分、任意にポリエチレングリコール部分に結合している、上記１〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２６．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２７．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２８．ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と等しいアミノ酸配列を含むか、または選択されたアミノ酸配列と２５以下のアミノ酸位置が異なり、前記の選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有するアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２９．前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を含む、上記２６に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
３０．前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む、上記２６に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
３１．前記選択されたアミノ酸配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を含む、上記２７に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
３２．ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を含む、上記３１に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
３３．プロテアーゼ耐性抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
（ｉ）少なくとも１０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ）、３７℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）、または
（ｉｉ）少なくとも４０μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度（ｃ’）、３０℃で、少なくとも１時間の時間（ｔ）
でインキュベート時にプロテアーゼ耐性であり、
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１２６（配列番号１５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３（配列番号１７）のアミノ酸配列と少なくとも９４％等しいアミノ酸配列を含み、任意選択として、１０１位（Ｋａｂａｔナンバリング）にバリンを含む、単一可変ドメイン。
３４．単一可変ドメインが、少なくとも５０℃のＴｍを有する、上記１〜３３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
３５．上記１〜３４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび抗体定常ドメイン、任意に抗体Ｆｃ領域、ここで任意にＦｃのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（任意に直接結合）している、を含むポリペプチド。
３６．上記１〜３５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意に血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、多重特異性リガンド。
３７．抗ＳＡ単一可変ドメインが、ＤＯＭ７ｈ−１１（配列番号２８）、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号３０）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３１）、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号３２）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８（配列番号３４）またはＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号３５）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む、上記３６に記載の多重特異性リガンド。
３８．リンカーが抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供され、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む、上記３６または３７に記載の多重特異性リガンド。
３９．（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号２９）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意に、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む、多重特異性リガンド。
４０．（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）のアミノ酸配列と少なくとも９３％等しいアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）の配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意に、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメイン間に提供されたリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む、多重特異性リガンド。
４１．上記１〜４０のいずれかに記載の単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを含む、ＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
４２．経口送達、患者の消化管送達、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）送達、患者の肺（ｌｕｎｇ）への送達または全身送達のための上記３３に記載の可変ドメインを含む、ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４３．アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ１配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ１配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１と結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４４．アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４５．アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合する、ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４６．前記選択された配列のＣＤＲ２配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ２配列を有する、上記４３に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４７．前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、上記４３に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４８．前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、上記４６に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
４９．前記選択された配列のＣＤＲ３配列と少なくとも５０％等しいＣＤＲ３配列を有する、上記４４に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
５０．アンタゴニストが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）およびＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）から選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ヒト、マウスまたはカニクイザルＴＮＦＲ１に結合するＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
５１．炎症状態の治療および／または予防のための、上記４１〜５０のいずれかに記載のＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
５２．炎症状態の治療および／または予防のための医薬品の製造における、上記４１〜５０のいずれかに記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
５３．前記状態が関節炎、多発性硬化症、炎症腸疾患および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択される、上記５１に記載のアンタゴニストまたは上記５２に記載の使用。
５４．前記の関節炎が関節リウマチまたは若年性関節リウマチである、上記５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
５５．前記の炎症腸疾患がクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、上記５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
５６．前記の慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎、慢性閉塞気管支炎および気腫からなる群から選択される、上記５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
５７．前記の肺炎が細菌性肺炎である、上記５３に記載のアンタゴニストまたは使用。
５８．前記の細菌性肺炎がブドウ球菌性肺炎である、上記５７に記載のアンタゴニストまたは使用。
５９．呼吸疾患の治療および／または予防のための、上記４１〜５０のいずれかに記載のＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
６０．呼吸疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造における、上記４１〜５０のいずれかに記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
６１．前記呼吸疾患が、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、浸潤性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスＸ、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈の閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択された、上記５９に記載のアンタゴニスト、または上記６０に記載の使用。
６２．ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、上記１〜５０のいずれかに記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンド。
６３．上記５１〜６２のいずれかに指定の状態または疾患を治療および／または予防するための、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、上記６２に記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンド。
６４．患者のＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹ、ＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬ、ＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦおよびＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦからなる群から選択されるＴＮＦＲ１のエピトープ配列の１つまたは複数を標的とする、上記１〜５０のいずれかに記載の抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、単一可変ドメイン、ポリペプチドまたは多重特異性リガンドを患者に投与することを含む、上記５１〜６２のいずれかに指定の患者の状態または疾患を治療および／または予防する方法。
６５．核酸が、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２（配列番号２）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９（配列番号３）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８（配列番号４）、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２（配列番号５）またはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０（配列番号６）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列を含み、核酸がＴＮＦＲ１に特異的に結合する、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離、または組換え型核酸。
６６．抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインおよび血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドであり、
（ａ）抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（配列番号１）、ＤＯＭ１ｍ−１５−１２（配列番号３６）またはＤＯＭ１ｍ−２１−２３（配列番号３７）のアミノ酸配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸を含み、
（ｂ）抗ＳＡ単一可変ドメインは、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号３０）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２ｄｈ（配列番号３８）のアミノ酸配列と少なくとも８０％等しいアミノ酸を含み、
（ｃ）リガンドは、前記可変ドメイン間にリンカーを含み、前記リンカーはアミノ酸配列ＡＳまたはＡＳＴを含む、
多重特異性リガンド。
６７．ＤＭＳ５５３７（配列番号３９）、ＤＭＳ５５３８（配列番号４０）、ＤＭＳ５５３９（配列番号４１）またはＤＭＳ５５４０（配列番号４２）を含むまたはそれらからなる、多重特異性リガンド。
６８．上記６６または６７に記載の多重特異性リガンドをコードする核酸。
６９．ＤＭＳ５５３７（配列番号４３）、ＤＭＳ５５３８（配列番号４４）、ＤＭＳ５５３９（配列番号３８）またはＤＭＳ５５４０（配列番号９）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％等しいヌクレオチド配列を含む、核酸。
７０．上記６８または６９に記載の核酸を含む、ベクター。
７１．上記７０に記載のベクターを含む、宿主細胞、任意に非ヒト胚細胞。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
プロテインＬへのバッチ結合、続いて溶離、中和および第二のステップのプロテインＡへのバッチ結合により上清から精製した。溶離したタンパク質の緩衝液をＰＢＳに交換して機能的特性決定前に濃縮した。ＤＭＳ５５３９をプロテインＬにより精製してから、さらにＳＥＣにより精製して同時に緩衝液をＰＢＳに交換した。次いですべての分子の内毒素を枯渇させた。
【表１１】
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【表１２】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016007218000001.app
【外国語明細書】
2016007218000001.pdf