(57)【要約】【課題】ｉＰＳ細胞の未分化性を維持したまま大量培養する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の、ｉＰＳ細胞培養における使用であって、中空糸内腔に播種したｉＰＳ細胞が未分化性を維持したまま増殖する細胞培養における、使用に関する。本発明は、また、ｉＰＳ細胞の生産方法であって、容器内に収容された、多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の内腔に、ｉＰＳ細胞を播種する播種工程、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件でｉＰＳ細胞を培養し、増殖させる培養増殖工程、および増殖させたｉＰＳ細胞を回収する増殖細胞回収工程、を含む、ｉＰＳ細胞の生産方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の、ｉＰＳ細胞培養における使用であって、
中空糸内腔に播種したｉＰＳ細胞が未分化性を維持したまま増殖する細胞培養における、使用。
【請求項２】
中空糸が、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートした中空糸である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｉＰＳ細胞が、ヒト由来のｉＰＳ細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ｉＰＳ細胞の生産方法であって、
容器内に収容された、多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の内腔に、ｉＰＳ細胞を播種する播種工程、
ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件でｉＰＳ細胞を培養し、増殖させる培養増殖工程、および
増殖させたｉＰＳ細胞を回収する増殖細胞回収工程、
を含む、ｉＰＳ細胞の生産方法。
【請求項５】
中空糸が、内径２０〜５００μｍ、膜厚１０μｍ〜１００μｍおよび孔径０．０１〜１０μｍを有する、請求項４に記載の生産方法。
【請求項６】
未分化性を維持させるのに有効な条件が、培養増殖工程開始時のｉＰＳ細胞の密度を、中空糸内腔容積１ｍＬ当たり１．０×１０4〜５．０×１０8ｃｅｌｌｓとすることを含む、請求項４または５に記載の生産方法。
【請求項７】
培養増殖工程が少なくとも３日間実施される、請求項４〜６のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項８】
未分化性を維持させるのに有効な条件が、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持するための因子を含有する培地を使用することを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項９】
中空糸が、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートした中空糸である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１０】
ｉＰＳ細胞が、ヒト由来のｉＰＳ細胞である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞の大量培養方法に関する。特に、本発明は、特定の中空糸のｉＰＳ細胞培養における使用および特定の中空糸を用いたｉＰＳ細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞が発明されると、作製が容易なこと、ＥＳ細胞に比べて倫理的な問題が伴わないこと等を背景に、その応用を目指した研究が盛んになった。その大きな流れの一つはｉＰＳ細胞の治療への応用である。患者由来、あるいは、ｉＰＳ細胞バンク由来の未分化のｉＰＳ細胞を分化させ、患者の治療に用いる研究であり、既に、臨床研究が始まっているもの、あるいは、臨床研究が計画されているものがある。もう一つの大きな流れはｉＰＳ細胞の創薬研究への応用である。健常人由来あるいは患者由来のｉＰＳ細胞を分化させ、医薬品候補化合物の毒性の評価を行う、あるいは、疾患モデル細胞への効果を評価する研究であり、既に、数種の細胞が市販されている。そのどちらの流れでも、コストを抑え、ｉＰＳ細胞の応用を拡大するには、ｉＰＳ細胞の安価で大量かつ安定的供給が大きな課題になっている。
【０００３】
細胞を大量に培養する手段としては、ローラーボトル、セルファクトリー、プラスチックバッグ、ラジアルフローリアクター、マイクロキャリヤー、中空糸等が使用されてきており、これらの手段の中には工業的に用いられているものもある。ｉＰＳ細胞の培養に関しては、ディッシュ培養をそのまま拡大、あるいは、自動化した方法が主に用いられているが、ディッシュ培養は大量培養には適していない。そこで、浮遊培養、バッグ培養、キャリヤー培養等を用いたｉＰＳ細胞の大量培養が検討され、専用培養装置の試作も行われているが、未分化性を維持することが難しい、増幅率が低い等の問題を残している。
【０００４】
一方、中空糸を用いる細胞培養方法は、高密度に細胞を培養することができるため、培養システムをコンパクトにすることができ、抗体等有用物質の生産においては工業的に利用されている例もある。中空糸を用いる細胞培養は、典型的には、中空糸の束を封入した円筒形の容器を用い、中空糸の外側の空間で細胞を培養する。そして多くの場合、有用物質生産を目的とし、細胞自体の回収を目的とはしていない。
【０００５】
一方、本発明者らは、中空糸の内腔を用いてマウスＥＳ細胞の大量培養が可能であることを既に見出している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−６０９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｉＰＳ細胞を再生医療あるいは創薬支援の分野に利用するに当たり、品質の安定したｉＰＳ細胞（特に、ヒトｉＰＳ細胞）を大量に確保することは極めて重要な課題の一つである。多種類の細胞に分化できる能力（未分化性）を維持し、かつ自己複製能の高いｉＰＳ細胞を、大量に、安価に、かつ安定的に提供することができる培養方法が望まれている。本発明の課題は、未分化性を維持しつつ、ｉＰＳ細胞を大量に培養する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが既に開示したように、中空糸の内腔を用いることにより、マウスＥＳ細胞を大量に培養することが可能になった（前掲特許文献１参照）。しかし、マウスＥＳ細胞をモデル細胞として原理的な証明は完了したものの、ｉＰＳ細胞（特に、ヒトｉＰＳ細胞）について、中空糸の内腔を用いた培養に関する検討はなされていなかった。マウスＥＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞では性質が異なるところもあるため、本発明者らはヒトｉＰＳ細胞を用いた培養条件の詳細な検討を行った。
【０００９】
その結果、中空糸の内腔を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養には、中空糸の素材が未分化性の維持に決定的な役割を果たすことを見出し、さらに、培地の選択も重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
［１］多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の、ｉＰＳ細胞培養における使用であって、
中空糸内腔に播種したｉＰＳ細胞が未分化性を維持したまま増殖する細胞培養における、使用。
［２］中空糸が、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートした中空糸である、［１］に記載の使用。
［３］ｉＰＳ細胞が、ヒト由来のｉＰＳ細胞である、［１］または［２］に記載の使用。
［４］ｉＰＳ細胞の生産方法であって、
容器内に収容された、多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸の内腔に、ｉＰＳ細胞を播種する播種工程、
ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件でｉＰＳ細胞を培養し、増殖させる培養増殖工程、および
増殖させたｉＰＳ細胞を回収する増殖細胞回収工程、
を含む、ｉＰＳ細胞の生産方法。
［５］中空糸が、内径２０〜５００μｍ、膜厚１０μｍ〜１００μｍ、孔径０．０１〜１０μｍを有する、［４］に記載の生産方法。
［６］未分化性を維持させるのに有効な条件が、培養増殖工程開始時のｉＰＳ細胞の密度を、中空糸内腔容積１ｍＬ当たり１．０×１０4〜５．０×１０8ｃｅｌｌｓとすることを含む、［４］または［５］に記載の生産方法。
［７］培養増殖工程が少なくとも３日間実施される、［４］〜［６］のいずれかに記載の生産方法。
［８］未分化性を維持させるのに有効な条件が、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持するための因子を含有する培地を使用することを含む、［４］〜［７］のいずれかに記載の生産方法。
［９］中空糸が、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートした中空糸である、［４］〜［８］のいずれかに記載の生産方法。
［１０］ｉＰＳ細胞が、ヒト由来のｉＰＳ細胞である、［４］〜［９］のいずれかに記載の生産方法。
【００１１】
本発明は、また、以下にも関する。
［１１］播種工程に先立って、さらに、
ｉＰＳ細胞を前培養する前培養工程、および
前培養したｉＰＳ細胞を回収する前培養細胞回収工程
を含み、増殖細胞回収工程および前培養細胞回収工程の１以上における回収が蛋白質加水分解酵素を用いて行われる、［４］〜［１０］のいずれかに記載の生産方法。
［１２］多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸を容器内に収容した、ｉＰＳ細胞培養器であって、
中空糸内腔に播種したｉＰＳ細胞が未分化性を維持したまま増殖する細胞培養のための、ｉＰＳ細胞培養器。
［１３］多孔質膜からなり内腔が低細胞接着性である中空糸、
中空糸を収容する容器、および
ｉＰＳ細胞の未分化性を維持するための因子を含有する培地
を含む、ｉＰＳ細胞培養のためのキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、再生医療、細胞治療、創薬研究等に用いることのできる未分化性が維持されたｉＰＳ細胞を、安価に、大量に、安定的に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】多孔質膜からなる中空糸の内腔を用いたｉＰＳ細胞の培養法の概略図である。
【図２】実施例１における、各種培養条件での細胞数の経時変化を示すグラフである。
【図３】図２を一部拡大したグラフである。
【図４】実施例１における、各種培養条件でのＯｃｔ３／４発現量の経時変化を示すグラフである。
【図５】実施例２における、前培養細胞回収方法が細胞増殖に与える影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」と略記することがある。）について詳細に説明する。尚、本発明は、以下の本実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１５】
本実施形態において「○〜○」で範囲を表すときは、特に記載した場合を除き、両端をその範囲内に含む。
【００１６】
本実施形態において「ｉＰＳ細胞」とは「人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」の略称であり、「ＥＳ細胞」とは「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」の略称である。
【００１７】
本実施形態において「未分化性」というときは、特に記載した場合を除き、多能性幹細胞が自己複製能力と複数の細胞系譜への分化能とを有することをいう。
【００１８】
本実施形態において「中空糸」というときは、特に記載した場合を除き、中空の筒状の構造を有する繊維であって多孔質膜からなり、その外壁には物質透過を可能にする小孔を有するものをいう。本実施形態において、中空糸の「内腔」とは、外壁に囲まれた内側の空間をいい、中空糸の内腔の容積をいうときは、特に記載した場合を除き、断面が円である中空糸については、内径と長さとに基づいて計算される容積をいい、小孔部分の容積は含まない。
【００１９】
また、本実施形態において「低細胞接着性」とは、特に記載した場合を除き、細胞と材料表面の間の接着力が低いことをいう。細胞と材料表面の接着性に関しては多くの研究があり、基本的に表面の親水性が高い程、細胞との接着力が弱い傾向にあり、分子構造等の多くのパラメーターにも依存することが知られている。細胞と材料表面の接着性に関しては、必ずしも体系化されているとは言えないが、例えば、「バイオマテリアル」（中林宣男、石原一彦、岩崎泰彦、コロナ社、１９９９年）、「バイオマテリアルサイエンス」（石原一彦、畑中研一、山岡哲二、大矢裕一、東京化学同人、２００３年）等を参考にすることができる。
【００２０】
本実施形態においては、多孔質膜からなる中空糸の内腔を用いて、ｉＰＳ細胞を培養する。中空糸の内腔は、細胞同士の接触が保たれ、細胞間での情報伝達も可能であることから、未分化性を維持するのに適した空間であり、また、細胞が増殖できる空間が規定されて、増殖した細胞への栄養や酸素等の供給という面でも問題が生じ難いと考えられる。
【００２１】
本実施形態において、中空糸として、例えば、医療用（例えば、透析（人工透析）、血液浄化療法、二重濾過血漿交換療法（ＤＦＰＰ））もしくは細胞培養用として、またはライフサイエンスの分野でろ過用として許容される種々の素材のものを用いうる。これには、セルロース系（例えば、再生セルロース、セルローストリアセテート）、合成高分子系（例えば、ポリスルホン、ＥＶＡＬ（エチレン・ビニルアルコール共重合体）、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタアクリレート、ポリオレフィン系（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン））が含まれる。
【００２２】
本実施形態において、ｉＰＳ細胞の培養に用いる中空糸の内腔が低細胞接着性であることが好ましい。例えば、セルロース系の中空糸は親水性でありこれを用いることができるが、任意の中空糸（例えば、ポリエチレン製中空糸）にエチレン・ビニルアルコール共重合体（「ＥＶＡＬ」と表記されることもある。）をコートしたものがより親水性が高く、より低細胞接着性であるため、好ましく用いることができる。
【００２３】
中空糸に低細胞接着性を付与するには、例えば、エチレン・ビニルアルコール共重合体で中空糸を作成するといったように、中空糸の原料を親水性の素材とすることもできるし、任意の原料で作成した中空糸（例えば上記で例示した種々の素材の中空糸）にエチレン・ビニルアルコール共重合体をコートするといったように、中空糸表面に親水性の化合物を物理的に結合するか、あるいは、親水性の化合物を化学的に結合することによっても達成することができる。低細胞接着性を付与するコート剤として、例えば、エチレン・ビニルアルコール共重合体、ポリ（２−メチルアクリロイルオキシオキシエチルホスホコリン）、エチレンオキシドと疎水性モノマーの共重合体、ポリエチレングリコールを結合した脂質等が挙げられるが、一般に、材料表面を低細胞接着性に修飾する手法を適用して中空糸に低細胞接着性を付与することが可能である。また、中空糸表面全体に低細胞接着性を付与することも可能であるが、本実施形態においては、中空糸内腔のみが低細胞接着性となるように修飾すれば充分である。
【００２４】
中空糸の内径は、細胞の大きさと細胞への酸素供給の観点から、２０〜５００μｍであることが好ましく、５０〜４００μｍであることがより好ましく、１００〜３５０μｍであることがさらに好ましい。内腔の断面形状は、典型的には円形であるが、目的によって、楕円形、矩形等の多角形、星形等の形状であってもよい。中空糸の膜厚は、構造維持、物質透過性等の観点から設計することができ、例えば、１０μｍ以上であることが好ましく、２０μｍ以上であることがより好ましく、２５μｍ以上であることがさらに好ましい。膜厚が小さすぎる場合、製造中および培養中において、構造維持が困難になる等強度上の問題が生じる場合がある。中空糸の膜厚は、また、１００μｍ以下であることが好ましく、８０μｍ以下であることがより好ましく、６０μｍ以下であることがさらに好ましい。膜厚が大きすぎる場合、物質透過性に劣ることとなり、細胞への酸素、培地成分等の供給が充分でなく、増殖等の面で支障が生じる場合がある。
【００２５】
中空糸の内径および膜厚は、当業者であれば適宜、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて得られた中空糸断面の撮影像から、測定することができる。内径、膜厚は、場合により、中空糸複数本の平均値として表すことができる。
【００２６】
中空糸の内腔と外側をつなぐ外壁上に多数存在する孔の径（孔径）は、細胞への酸素・栄養の必要量の供給と細胞から放出される物質の拡散の防止との双方から適宜決定されうる。例えば、０．０１〜１０μｍであることが好ましく、０．０５〜５μｍであることがより好ましく、０．１〜１μｍであることがさらに好ましい。中空糸の孔径は、二軸平均径、すなわち、短径と長径の平均値として求めることができる。場合により、複数の孔の平均値として表すことができる。中空糸の孔径は、内径および膜厚と同様、例えば、ＳＥＭを用いて得られた中空糸断面の撮影像から測定することができる。
【００２７】
本実施形態においてｉＰＳ細胞の由来は、特に限定されず、例えば、哺乳動物由来であることができる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれ、また実験動物であってもよく、コンパニオンアニマルであってもよい。一態様において、本実施形態のｉＰＳ細胞は、好ましくは霊長類由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【００２８】
本実施形態において、中空糸の内腔へのｉＰＳ細胞の播種は、特許文献１および後述の実施例を参照して行うことができる。例えば、一端に細胞導入口を設置し、もう一端はあらかじめ封止した中空糸の細胞導入口からシリンジ等を用いて細胞懸濁液を内腔に注入後、必要に応じて適宜遠心して、封止端に細胞を集めることにより行うことができる。播種の際の細胞密度は、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、中空糸を収容する容器容積または中空糸内腔容積に基づいて、適宜決定することができる。例えば、中空糸内腔容積に基づき、播種の際の細胞密度が１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが好ましく、５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることがより好ましく、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることがさらに好ましい。また、本実施形態の一態様において、増殖後の細胞数を加味し、播種する細胞数を決定してもよい。例えば、中空糸内腔容積に基づき、播種の際の細胞密度が５．０×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、１．０×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００２９】
本実施形態において、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件で、培養が実施される。未分化性を維持するとの観点からは、低細胞接着性の中空糸内腔を用いることができる。また、未分化性を維持させるのに有効な条件としては、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な既知の条件および以下にあげる条件から選択される１以上の条件を採用することができる。
【００３０】
未分化性を維持させるのに有効な条件の１つとして、培養開始時のｉＰＳ細胞の密度を、上記播種の際の細胞密度として記載した好ましい範囲とすることが挙げられる。
【００３１】
さらに、未分化性を維持させるのに有効な条件の１つとして、適切な培地を用いることが挙げられる。ｉＰＳ細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地組成は、当業者にはよく知られており、また、現在も開発が進められている。例えば、ヒトｉＰＳ細胞の培養のための典型的な培地である、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）またはｈｉＰＳＣ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｗａｋｏ  Ｂ（和光純薬工業）を用いることができ、好ましくはＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８またはｈｉＰＳＣ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｗａｋｏ  Ｂを用いることができる。未分化性を維持するための因子を含有する培地を用いることもできる。この因子としては、多能性幹細胞全般で未分化性を維持するための因子として公知の因子を用いることができ、例えば、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、ＮａＨＣＯ3、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦβおよびＮｏｄａｌの１つ以上を含有する培地を用いることもできる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞を培養する場合、ヒトｉＰＳ細胞の未分化性を維持するための因子として知られているＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を含有する培地を用いることができる。本実施形態における細胞培養では、フィーダー細胞を用いないので、フィーダー細胞フリー培養に適した培地を用いることが好ましい。ヒト由来ｉＰＳ細胞を用いる場合、細胞密度が低い状態では、生存を支持する因子といわれるＲＯＣＫ阻害剤の添加が効果的な場合がある。
【００３２】
本実施形態において、ｉＰＳ細胞の未分化性を維持されたまま増殖させるために、上記中空糸内腔が用いられる。ｉＰＳ細胞の分化状態は、分化状態のマーカーとなる遺伝子の発現の有無または量を解析することで判断することができる。マウス、ヒト等の種々の動物について、未分化細胞マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、間葉系マーカー、神経マーカー、肝マーカー、心筋マーカー等が知られており、またそれらの発現の有無の検出方法および発現量の測定方法は、当業者にはよく知られている。発現レベルは、培養０日目の発現量を基準として判断することができ、また、他の培養手段を用いて同様の条件で培養した場合と比較して判断することができる。当業者であれば、培養目的に応じ、どの発現レベルにあれば未分化性が維持されているといえるか否かを、適宜判断することができる。
【００３３】
ｉＰＳ細胞に関し、未分化性が維持されているか否かは、増殖された細胞のＯｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、等の発現レベルを確認することにより、判断できることが知られている。本実施形態においても、ｉＰＳ細胞に関してＯｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ等のいずれか１以上、好ましくはこれらのいずれも発現レベルを確認することにより、未分化性が維持されているか否かを確認することができる。また、未分化性の指標となる細胞表面抗原、例えば、ヒトｉＰＳ細胞ではＳＳＥＡ−４（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４）やＴＲＡ−１−６０等が発現しているか否かにより、未分化性が維持されているか判断することもできる。
【００３４】
本実施形態においては、多孔質膜からなる中空糸は、複数本が束ねられ、中空糸束として培養に用いられる。中空糸束を含む培養系の形態は、種々のものでありうるが、例えば、本明細書の実施例および特許文献１に示されているような、数本の中空糸からなる束の一方を封止し、かつ他方を細胞の播種が可能なように接着し、細胞播種後は、ディッシュ中の適量の培地中に浸漬した形態とすることができる。
【００３５】
播種後、ｉＰＳ細胞を培養し増殖させる培養増殖工程は、細胞が増殖する公知の方法を用いて行うことができ、例えば、本明細書の実施例および特許文献１に示されている方法に準じて行うことができる。具体的には、播種後、中空糸束の細胞導入口に蓋をし、ディッシュ中に適量の培地とともに配置し、振とう器を用いて培養増殖工程を行うことができる。ｉＰＳ細胞の培養増殖は、所望の細胞数となるまで行うことができるが、ｉＰＳ細胞の未分化性が維持される限り培養増殖を行うことができ、例えば、少なくとも３日間行うことができる。
【００３６】
増殖させた細胞の回収は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば、特許文献１に示されているように、水圧を用いることにより、ヌードル状の細胞組織体（シリンドロイド）として、または、蛋白質加水分解酵素等を用いる処理により、ばらばらの細胞として、容易に回収することができる。具体的には、培養終了後、中空糸束の一端を切断し、他の一端から注射器を用いて培地を注入して細胞を押し出すことにより、細胞をヌードル状の細胞組織体として回収することができる。また、中空糸ごとバッファーで洗浄し、次いで酵素処理等により細胞を剥離後、中空糸束の一端を切断し、他の一端から注射器を用いて細胞を吸引することにより、細胞を回収することもできる。酵素処理には、培養細胞回収に用いられる酵素として公知のものを用いることができるが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アキュターゼ、アキュマックス等を用いることができる。細胞剥離にＥＤＴＡを用いることもできる。
【００３７】
培養した細胞の細胞数の計測は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば、本明細書の実施例および特許文献１に示されている方法に準じて核数計測法により行うことができる。
【００３８】
本実施形態において、中空糸の内腔へのｉＰＳ細胞の播種に先だって、ｉＰＳ細胞を前培養してもよい。前培養の条件は特に限定されず、ディッシュ培養、浮遊培養等、公知の培養方法を適用することができる。
【００３９】
前培養したｉＰＳ細胞を回収する方法も特に限定されず、公知の手法を用いることができ、例えば、蛋白質加水分解酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アキュターゼ、アキュマックス等）や細胞剥離剤（例えば、ＥＤＴＡ等）あるいはそれらの組み合わせ等を用いた処理後、細胞懸濁液として回収することができる。一態様において、本実施形態における前培養したｉＰＳ細胞の回収は、蛋白質加水分解酵素処理を用いて行うことが好ましく、蛋白質加水分解酵素として、アキュターゼ、アキュマックスまたはトリプシンを用いることがより好ましい。一態様において、前培養したｉＰＳ細胞の回収は、アキュターゼを用いて行われる。
【００４０】
本実施形態において、ｉＰＳ細胞の培養増殖時、上記中空糸は容器に収容される。本実施形態は、また、上記中空糸を容器内に収容したｉＰＳ細胞培養器、ならびに上記中空糸、中空糸を収容する容器、および上記ｉＰＳ細胞の未分化性を維持するための培地を含む、ｉＰＳ細胞培養のためのキットにも関する。
【００４１】
中空糸を収容する容器は、特に限定されず、フラスコ、ディッシュ、チューブ、筒状ケーシング、培養バッグ、ローラーボトル等、中空糸を収容することができる任意の容器を用いることができる。例えば、あらかじめ別容器内で中空糸内腔内にｉＰＳ細胞を播種後、中空糸を容器に収容して細胞の培養増殖を行うこともできるし、容器内に収容した中空糸内腔内にｉＰＳ細胞を播種後、そのまま細胞の培養増殖を行うこともできる。
【００４２】
本実施形態の一態様において、上記中空糸を容器内に収容したｉＰＳ細胞培養器（「中空糸型培養器」ということもある。）は、複数本の中空糸からなる中空糸束の一端に細胞導入口を設置し、もう一端はあらかじめ封止した形態でありうる。また、医療用または培養用として用いられているように、中空糸束を封入したモジュールの形態でありうる。このような中空糸型培養器の、具体例としては、筒状ケーシングおよび中空糸束を有し、筒状ケーシングの少なくとも一端（両端であってもよい）に細胞を播種または回収するための細胞ポートを備え、かつ筒部に培養液を供給または排出するための少なくとも一つ（例えば２つ）の培養液ポートを備えるものであって、中空糸束がケーシング内に収容され、かつ両端がポッティング材でケーシング内側に固定されたものが挙げられる。ここで、中空糸束は、少なくとも細胞ポートのある側の端が、中空糸各々の内腔が開口状態で細胞ポートに連通するように固定されている。そのため、細胞ポートから中空糸の内腔へ細胞を播種することができ、かつ培養液ポートからケーシング内であって中空糸の外側へ培養液を流しつつ、中空糸内腔で細胞を培養して増殖させることができる。培養中、細胞ポートは適切なキャップで封止され、また培地は、培養液ポートを用いることにより、適切な速度で循環させたり、供給・排出したりすることができる。本実施形態の中空糸型培養器は、適切な方法で滅菌して（例えば、加圧加熱滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌等）、供給されうる。
【００４３】
上述したような中空糸型培養器に用いるケーシング素材、ポッティング材は、医療用または培養用として許容可能な、既存のものを利用することができる。また、このような中空糸型培養器の製造は、基本的には、既存の医療用中空糸型モジュールまたは既存の中空糸型培養器（中空糸の外側を利用するものでよい。）の製造と同様に、行うことができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
［実施例１：中空糸内腔を用いたヒト由来ｉＰＳ細胞の培養］
ｉＰＳ細胞としてヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）を用い、Ｇｅｌｔｒｅｘ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を底面にコートした培養ディッシュ上で前培養を行った。前培養培地として、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。前培養中の培養培地には、本培養前日より１０μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２、和光純薬）を添加した。
【００４６】
前培養したヒトｉＰＳ細胞を０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を用いて回収した。回収した細胞は遠心洗浄を数回行った後、培養培地に懸濁させた。その後、初期播種細胞数５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／束（中空糸の長さ１．５ｃｍ、６本／束）で中空糸内腔に播種して本培養を行った。中空糸の素材として、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートしたポリエチレン（ＰＥ／ＥＶＡＬ、内径３３０μｍ、膜厚５０μｍ、小孔径０．３μｍ、血漿分離用、旭化成メディカル製。特許第４１８７１６７号参照。）とセルローストリアセテート（ＣＴＡ、内径２８５μｍ、膜厚５１μｍ、小孔径０．２μｍ、血漿分離用、東洋紡製、ＡＰ２５０Ｎ１５タイプ。特開２００４−１６６６０４参照。）の２種類を用いた。６本の中空糸の束を培養ディッシュ内で後述する培地に浸し、５〜１４日間、旋回培養を行った。中空糸培養開始から２日間は培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加した。
【００４７】
なお、実施例を通じ、用いた中空糸束は特許文献１においても用いられているものと同様、一端に細胞導入口を設置し、もう一端はあらかじめ封止したものである。細胞播種は、細胞導入口からシリンジを用いて細胞懸濁液を注入後、２００ｘｇ、１８０秒で遠心して、封止端に細胞を集めることにより播種した。播種後、中空糸束の細胞導入口に蓋をし、直径３５ｍｍのディッシュ中に適量の培地とともに置いて、振とう器（マルチシェーカー）を用いて４５ｒｐｍで旋回培養を行った。細胞懸濁液の注入から培養までの手順を図１に示す。
【００４８】
用いた培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｐｒｏ  ＣＥＬＬ）またはｈｉＰＳＣ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｗａｋｏ  Ｂ（和光純薬工業）の４種類であった。なお培地の交換は毎日実施した。
【００４９】
細胞数は、中空糸内で培養された細胞をクエン酸処理して組織体を構成する細胞を脱核し、得られた細胞の核を計測することにより細胞数とした（核数計数法）。Ｏｃｔ３／４の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。
【００５０】
培養中の細胞数の変化を図２に示す。図３は、図２の拡大図である。Ｏｃｔ  ３／４の発現量の変化を図４に示す。培養５日目の細胞数およびＯｃｔ３／４の発現量を表１に示す。表１中、Ｏｃｔ３／４の発現量は、培養開始時（０日目）の発現量を基準（＝１）とした相対値である。
【００５１】
細胞数の比較から、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８またはｈｉＰＳＣ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｗａｋｏ  Ｂを培地として用いた場合に増殖が良好であり、ヒトｉＰＳ細胞の中空糸を用いた培養に適した培地があることが明らかになった。Ｏｃｔ３／４相対発現量から細胞の分化状態を考えると、ｉＰＳ細胞の未分化能を維持した培養には中空糸の素材によって決定的な違いがあり、エチレン・ビニルアルコール共重合体をコートしたポリエチレンを素材とする中空糸がセルローストリアセテートを素材とする中空糸に優る結果を与えた。このことから、中空糸内腔がより低細胞接着性であることが未分化性に維持に有効に働くと考えられる。
【表１】
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【００５２】
［実施例２：前培養からの細胞回収条件がｉＰＳ細胞の増殖に与える影響］
実施例１における培養条件の検討で良好な結果を与えた、中空糸の素材としてエチレン・ビニルアルコール共重合体をコートしたポリエチレン、培地としてＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を用いる培養条件で、ｉＰＳ細胞の前培養である単層培養から細胞回収する方法として、アキュターゼ、アキュマックス、トリプシンまたはＥＤＴＡを用いた場合の、その後の細胞増殖に与える影響に関して検討を行った。
【００５３】
実施例１における、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液の代わりに、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ、ミリポア、ＳＣＲ００６）、アキュマックス（Ａｃｃｕｍａｘ、ミリポア、ＳＣＲ００６）またはトリプシン液（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｓｏｌｕｓｉｏｎ（×１０）、ＳＩＧＭＡ、Ｔ４５４９。０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ）を用い、中空糸の素材としてエチレン・ビニルアルコール共重合体をコートしたポリエチレン、培地としてＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を用いて、実施例１と同様の手法によりヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）を培養した。
【００５４】
培養中の細胞数の変化を図５に、３日目の細胞数と増幅率の比較を表２に示した。表２中、固定化率および増幅率は、次式により算出した。なお、培養中の細胞数、中空糸内への初期固定化細胞数および培養終了時の中空糸内細胞数は、上記実施例１に記載の核数計数法により計測した。
固定化率（％）＝中空糸内への初期固定化細胞数／播種細胞数
増幅率＝培養終了時の中空糸内細胞数／中空糸内への初期固定化細胞数
【００５５】
細胞の増幅率の比較から、前培養における回収でアキュターゼを用いた場合に良好な結果が得られ、３日間で９倍の細胞数に増殖した。この結果から、前培養から本培養等の植え継ぎを行う場合（例えば、中空糸から中空糸への植え継ぎ等）に細胞の回収条件が影響すると考えられた。
【表２】
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【００５６】
以上の結果は、中空糸の内腔を用いる培養方法は、条件選択により、ヒトｉＰＳ細胞の大量培養にも利用できることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によれば、未分化性が維持されたｉＰＳ細胞を、大量に増殖させる方法を提供することができ、再生医療、細胞治療、創薬研究等に用いることのできる未分化性が維持されたｉＰＳ細胞を、安価に、大量に、安定的に供給することができる。本発明により得られたｉＰＳ細胞は、さらに増殖させるために使用することができ、また分化・誘導させることにより様々な細胞を得るために使用することができる。本発明により得られたｉＰＳ細胞は、例えばｉＰＳ細胞バンクの作成に使用することができる。また、本発明により得られたｉＰＳ細胞は、そのまま、あるいは、分化処理を行った後、医薬品候補物質のスクリーニングまたは哺乳動物の再生医療のために用いることができる。本発明は、ライフサイエンス、再生医療、細胞治療および創薬研究等の分野での産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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