(57)【要約】【課題】スキャフォールドの利用頻度の高い骨再生用及び皮膚再生用スキャフォールドであって、細胞のスキャフォールド内部への増殖促進に優れた新たなスキャフォールドを提供する。【解決手段】多孔質スキャフォールドからなる基材、及び前記基材の表面の少なくとも一部へのコーティングである酸化グラフェンを含み、前記酸化グラフェンのコーティング量は、前記基材の質量基準で０．１〜２．５質量％の範囲である、骨再生用又は皮膚再生用スキャフォールド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質スキャフォールドからなる基材、及び前記基材の表面の少なくとも一部へのコーティングである酸化グラフェンを含み、前記酸化グラフェンのコーティング量は、前記基材の質量基準で０．１〜２．５質量％の範囲である、骨再生用又は皮膚再生用スキャフォールド。
【請求項２】
前記多孔質スキャフォールドが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムから成る群から選ばれる少なくとも1種の材料製である請求項１に記載のスキャフォールド。
【請求項３】
前記多孔質スキャフォールドが、５０〜９９％の範囲の気孔率を有し、連続した気孔構造を持つ、請求項１又は２に記載のスキャフォールド。
【請求項４】
５０％変位（測定条件：クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／分）における圧縮強度が、前記多孔質スキャフォールド基材の１．２倍以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項５】
酸化グラフェンのコーティング量が、基材の質量基準で１．０〜２．３質量％の範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項６】
前記酸化グラフェンのコーティングは、厚さが０.４〜１０ｎｍであり、かつ平面方向の大きさが２０ｎｍ以上である薄膜状酸化グラフェン粒子からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項７】
骨再生用である請求項１〜６のいずれかに記載のスキャフォールド。
【請求項８】
再生対象が骨及び軟骨である請求項７に記載のスキャフォールド。
【請求項９】
皮膚再生用である請求項１〜６のいずれかに記載のスキャフォールド。
【請求項１０】
再生対象が表皮および真皮である請求項９に記載のスキャフォールド。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のスキャフォールドの製造方法であって、
酸化グラフェン粒子の分散液を、多孔質スキャフォールドからなる基材の内部に注入し、前記基材の表面の少なくとも一部に酸化グラフェンをコーティングすることを含む、前記製造方法。
【請求項１２】
前記分散液は、水及びＮ−メチル−２−ピロリドンの混合溶液に酸化グラフェン粒子を分散した物である請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記分散液における酸化グラフェン粒子の濃度は０.０００１〜０.０１質量%の範囲である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化グラフェンを用いた骨再生用又は皮膚再生用スキャフォールドに関する。より詳細には、本発明は、コラーゲン生体材料に酸化グラフェンを塗布した、組織再生能を増強した、骨再生用又は皮膚再生用のスキャフォールドに関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は疾病、けが等で失われた組織や器官を機能的にもとの状態に回復させる治療法である。再生医療には細胞、生理活性物質、足場材（スキャフォールド）の３要素からなるティッシュエンジニアリングの原理が取り入れられている。臨床ではスキャフォールドを用いて細胞の増殖を促進する方法（スキャフォールド治療）と、iPS細胞などの培養細胞を直接用いる方法に大別される。
【０００３】
スキャフォールドは、３次元的骨格による適切な生体内強度を有しており、移植、貯留することで再生スペースを確保して細胞が増殖するための足場となる。スキャフォールド内部へ遊走増殖した細胞は、スキャフォールドを足場にして細胞外マトリクスを分泌、また同時に血管網の構築が起こり、自己組織化する。
【０００４】
また生体内での自己細胞の集積が見込まれない場合は、培養細胞を事前にスキャフォールドに播種してから生体内へ移植する方法が考えられている。生体内へ移植された培養細胞も、同様にスキャフォールドを足場にして増殖分化を起こして組織化する。
【０００５】
スキャフォールドにはコラーゲン、フィブリン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸などの高分子、ハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムなどの無機材料が応用され、再生組織に応じた基材選択が必要である。また線維芽細胞増殖因子（FGF-2）、骨誘導タンパク質（BMP-2）、血小板由来増殖因子（PDGF-BB）などの生理活性物質を組み合わせたものもある。
【０００６】
スキャフォールド治療を行う部位としては骨、軟骨等の整形外科領域が最も多く、Medronic社のInfuse Bone Graftやオリンパステルモバイオマテリアル社のオスフェリオンなどが骨再生用スキャフォールドとして市販されており、市場規模も大きい。対象疾患には脊椎固定、腫瘍の骨転移等があげられる。次いで皮膚、並びに歯周組織等が多く、LifeCell社のアロダームやオリンパステルモバイオマテリアル社のテルダーミス、高研のボーンジェクト等が市販されている。対象疾患として皮膚熱傷、乳房再建、歯周炎、インプラント治療等があげられる。
【０００７】
スキャフォールドは生体内に留置しても炎症を惹起せず、生体組織に吸収置換される優れた生体親和性が求められるが、さらに早い自己組織化のために細胞のスキャフォールド内部への増殖（イングロース）促進が求められる。細胞が内部へ早期に増殖できるように完全連通孔を付与する場合や（非特許文献４）、スキャフォールド表面への特異的構造の付与、生理活性物質の内包等が試みられている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lee WC, Lim CH, Shi H, Tang LA, Wang Y, Lim CT, Loh KP. Origin of enhanced stem cell growth and differentiation on graphene and graphene oxide. ACS Nano, 27, 7334-7341, 2011.
【非特許文献２】E Nishida, H Miyaji, H Takita, I Kanayama, M Tsuji, T Akasaka, T Sugaya, R Sakagami, M Kawanami. Graphene oxide coating facilitates the bioactivity of scaffold material for tissue engineering. Jpn J Appl Phys, 53, 1-7, 2014.
【非特許文献３】I Kanayama, H Miyaji, H Takita, E Nishida, M Tsuji, B Fugetsu, L Sun, K Inoue, A Ibara, T Akasaka, T Sugaya, M Kawanami. Comparative study of bioactivity of collagen scaffolds coated with graphene oxide and reduced graphene oxide. Int J Nanomedicine, 9, 3363-3373, 2014.
【非特許文献４】H Miyaji, H Yokoyama, Y Kosen, H Nishimura, K Nakane, S Tanaka, K Otani, K Inoue, A Ibara, I Kanayama, T Yoshida, K Ogawa, E Nishida, M Kawanami. Bone augmentation in rat by highly porous β-TCP scaffolds with different open-cell sizes in combination with fibroblast growth factor-2. J Oral Tissue Engin 10, 172-181, 2013.
【非特許文献５】A Ibara, H Miyaji, B Fugetsu, E Nishida, H Takita, S Tanaka, T Sugaya, M Kawanami. Osteoconductivity and biodegradability of collagen scaffold coated with nano-β-TCP and fibroblast growth factor 2. J Nanomater, 2013, 1-11, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のように早い自己組織化のために細胞のスキャフォールド内部への増殖（イングロース）促進を目的として種々の検討がなされている（非特許文献４,５参照）。しかし、十分満足できるレベルの増殖促進が可能なスキャフォールドは提供されていない。そこで、本発明は、早い自己組織化のために細胞のスキャフォールド内部への増殖促進に優れた新たなスキャフォールドを提供することを目的とする。特に本発明は、スキャフォールドの利用頻度の高い骨再生用及び皮膚再生用スキャフォールドであって、細胞のスキャフォールド内部への増殖促進に優れた新たなスキャフォールドを提供することを目的とする。
【００１０】
近年、ナノカーボンの生物学的応用が検討されている。ナノカーボンには、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノファイバー、フラーレン、グラフェン等がある。グラフェンは炭素の単層ナノシートで、厚さ1ナノメートル程度のナノ物質である。グラフェンに官能基を付与して、分散性を高めたものが酸化グラフェン（GO）である。
【００１１】
GOはin vitroで間葉系幹細胞の増殖分化促進等が報告されている。（非特許文献1）。また、GOは多孔質コラーゲン表面にコーティングをすることができることも知られている（非特許文献2, 3）。さらにGOでコーティングされたコラーゲンスキャフォールドは、気孔率は変化せずに強度が向上すること、コラーゲン表面にGO由来のナノ構造が付与されること、皮下結合組織における細胞のイングロースが促進されることが知られている（非特許文献2）。但し、皮下結合組織における細胞のイングロース促進は、0.01wt％GOコーティングの場合のみ得られ0.1wt％GO及び0.5wt％GOコーティングの場合に観察できなかった。さらに、骨芽細胞様細胞を播種した場合の細胞増殖については、0.01wt％GOコーティングの場合で、コントロール(GOコーティングなし)と同等かやや劣り、0.1wt％GO及び0.5wt％GOコーティングの場合にはコントロールより有意に劣化していた。
【００１２】
非特許文献2に記載の結果は、皮下結合組織における細胞については、0.01wt％ GOコーティングは、イングロースの促進効果はあるが、細胞増殖については効果がなく、GOコーティング量が増すと、細胞増殖は阻害されることを示す物であった。
【００１３】
このような状況であり、コラーゲンスキャフォールドへのGOコーティングは、再生療法に不向きであると考えられたが、本発明者らは、敢えて、GO処理基材の骨の再生療法および皮膚の再生療法についてチャレンジした。
その結果、予想外にも、骨及び皮膚においては、GO処理基材にスキャフォールド治療の効果増強効果があること、この効果は、非特許文献2及び3に記載の場合に比べて、GOのコーティング量を低減した領域で見られることを見出して本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の通りである。
[１]
多孔質スキャフォールドからなる基材、及び前記基材の表面の少なくとも一部へのコーティングである酸化グラフェンを含み、前記酸化グラフェンのコーティング量は、前記基材の質量基準で０．１〜２．５質量％の範囲である、骨再生用又は皮膚再生用スキャフォールド。
[２]
前記多孔質スキャフォールドが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムから成る群から選ばれる少なくとも1種の材料製である［１］に記載のスキャフォールド。
[３]
前記多孔質スキャフォールドが、５０〜９９％の範囲の気孔率を有し、連続した気孔構造を持つ、［１］又は［２］に記載のスキャフォールド。
[４]
５０％変位（測定条件：クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／分）における圧縮強度が、前記多孔質スキャフォールド基材の１．２倍以上である［１］〜［３］のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
[５]
酸化グラフェンのコーティング量が、基材の質量基準で１．０〜２．３質量％の範囲である［１］〜［４］のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
[６]
前記酸化グラフェンのコーティングは、厚さが０.４〜１０ｎｍであり、かつ平面方向の大きさが２０ｎｍ以上である薄膜状酸化グラフェン粒子からなる、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
[７]
骨再生用である［１］〜［６］のいずれかに記載のスキャフォールド。
[８]
再生対象が骨及び軟骨である［７］に記載のスキャフォールド。
[９]
皮膚再生用である［１］〜［６］のいずれかに記載のスキャフォールド。
[１０]
再生対象が表皮および真皮である［９］に記載のスキャフォールド。
[１１]
［１］〜［６］のいずれか１項に記載のスキャフォールドの製造方法であって、
酸化グラフェン粒子の分散液を、多孔質スキャフォールドからなる基材の内部に注入し、前記基材の表面の少なくとも一部に酸化グラフェンをコーティングすることを含む、前記製造方法。
[１２]
前記分散液は、水及びＮ−メチル−２−ピロリドンの混合溶液に酸化グラフェン粒子を分散した物である［１１］に記載の製造方法。
[１３]
前記分散液における酸化グラフェン粒子の濃度は０.０００１〜０.０１質量%の範囲である、［１１］又は［１２］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、骨の再生療法および皮膚の再生療法において特に有効なスキャフォールドを提供できる。本発明によれば、スキャフォールドの利用頻度の高い骨再生用及び皮膚再生用スキャフォールドであって、細胞のスキャフォールド内部への増殖促進に優れた新たなスキャフォールドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】a:コラーゲンスキャフォールド（以下col）、0.001 GOコーティングコラーゲンスキャフォールド（以下GOスキャフォールド）、および0.01GOスキャフォールドの写真。b：col表面の走査型電子顕微鏡（以下SEM）写真。c：0.001GO GOスキャフォールド表面のSEM写真。d：0.01GOスキャフォールド表面のSEM写真。
【図２】0.0003GO，0.001GO，0.003GO，0.01GOスキャフォールドおよびcolの圧縮強度試験結果。
【図３】0.001GO，0.01GO，0.1GOスキャフォールドおよびcol のコラゲナーゼ溶解試験結果。
【図４】a：0.01GO，0.025GO，0.05GO，0.1GOスキャフォールドおよびcolの細胞増殖性試験結果。b: 0.0003GO, 0.001GO, 0.003GO, 0.01GOスキャフォールドおよびcolの細胞増殖性試験結果。
【図５】a：0.001GO，0.01GOコーティングコラーゲンスポンジ（以下GOスポンジ）およびコラーゲンスポンジ（以下cs）の写真。b：0.001GO，0.01GOスポンジおよびcsの細胞増殖性試験結果。
【図６】ラット頭蓋骨モデル術後10日の組織像（ヘマトキシリンエオシン（以下HE）染色）。a：0.01GOスキャフォールド埋植後、b：col埋植後。
【図７】ラット頭蓋骨モデル術後35日の組織像（HE染色）。a：0.01GOスキャフォールド埋植後、b：aの1の拡大像、矢印はマクロファージ様細胞を示す、ｃ：0.001GOスキャフォールド埋植後。
【図８】a: ラット頭蓋骨モデルcol埋植後35日の組織像（HE染色）、b：ラット頭蓋骨モデルコントロール（ctrl）35日の組織像（HE染色）、c：0.001GO，0.01GOスキャフォールド、col埋植後ならびにコントロール（ctrl）の新生骨面積計測結果。
【図９】ラット頭蓋骨モデル術後14日の組織像（ペルオキシターゼ染色）。a：0.01GOスキャフォールド埋植後、b：col埋植後。
【図１０】ラット頭蓋骨モデル術後14日の組織像。a：0.01GOスキャフォールドおよびcol埋植後の抗ED1/抗Galectin-3抗体による重染色（マクロファージの染色）、b：0.01GOスキャフォールドおよびcol埋植後の抗smooth muscle actin抗体による染色（血管平滑筋細胞の染色）。
【図１１】ラット頭蓋骨モデル術後14日目の組織像。a：0.01GOスキャフォールドおよびcol埋植後の抗RECA-1抗体による染色（血管内皮細胞の染色）、b：0.01GOスキャフォールドおよびcol埋植後の抗Prolyl-4-Hydroxylase beta抗体による染色（線維芽細胞の染色）。
【図１２】イヌ抜歯窩における術後14日の組織像（HE染色）a：0.01GOスキャフォールド埋植後、b：aの1の拡大像、c：aの2の拡大像、d：aの3の拡大像。
【図１３】a：イヌ抜歯窩におけるcol埋植後14日の組織像（HE染色）、b：0.01GOスキャフォールドおよびcol埋植後の新生骨形成率の計測結果。
【図１４】ラット皮膚欠損モデル術後10日の組織像（HE染色）。a：0.01GOスキャフォールド埋植後、b：aの1の拡大像、c:aの2の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す、d:aの3の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す。
【図１５】ラット皮膚欠損モデル術後10日の組織像（HE染色）。a：col埋植後、b：aの1の拡大像、c:aの2の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す、d:aの3の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す。
【図１６】ラット皮膚欠損モデル術後10日の組織像（HE染色）。a：コントロール（ctrl）、b：aの1の拡大像、c:aの2の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す、d:aの3の拡大像、矢印は上皮の伸長先端を示す。
【図１７】0.01GOスキャフォールド、col埋植後ならびにコントロール（ctrl）の上皮侵入率の計測結果。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜骨再生用又は皮膚再生用スキャフォールド＞
本発明は、多孔質スキャフォールドからなる基材、及び前記基材の表面の少なくとも一部へのコーティングである酸化グラフェンを含み、前記酸化グラフェンのコーティング量は、前記基材の質量基準で０．１〜２．５質量％の範囲であるスキャフォールドであって、このスキャフォールドは、骨再生に用いられる物であるか、又は皮膚再生に用いられる物である。
【００１８】
多孔質スキャフォールドは、再生療法に用いられるスキャフォールドとして知られ、又は再生療法に用いられている多孔質の生体材料からなるスキャフォールドであれば、特に制限はなく、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸などの高分子材料からなるもの、あるいはハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムなどの無機材料からなるものであることができ、これらの材料の複合体からなる物であっても良い。
【００１９】
多孔質スキャフォールドの多孔質にも特に制限はないが、細胞増殖の良好な足場になり得るという観点からは、比較的高い気孔率を有するものであることが好ましく、例えば、５０〜９９％の範囲の気孔率を有することができる。ここでの気孔率は、気孔率（％）＝100×(1-ρ1/ρ2)、ρ1：スキャフォールドの密度、ρ2：スキャフォールドを構成する材料の真密度、と定義される。また、多孔質の構造は、好ましくは連続した気孔構造であることが好ましく、連続した気孔構造とは、スキャフォールド内の気孔の少なくとも一部が、連通した構造であり、孤立した気孔を有さないことが好ましい。
【００２０】
本発明のスキャフォールドは、多孔質スキャフォールドからなる基材の表面の少なくとも一部、または全面に酸化グラフェンのコーティングを有する。表面のコーティング率は、酸化グラフェンのコーティング量及び多孔質スキャフォールドの表面積、気孔率等により変動する。酸化グラフェンのコーティング量は、基材の質量基準で０．１〜２．５質量％の範囲であり、骨の再生療法および皮膚の再生療法において特に有効なスキャフォールドを提供できるという観点から好ましくは１．０〜２．３質量％の範囲であり、より好ましくは１．４〜２．３質量％の範囲である。実施例において示すように、ＳＥＭ観察において、基材の質量基準で１．８３質量％、２．２２質量％の酸化グラフェンでコーティングしたコラーゲンスキャフォールド（０.００１ＧＯおよび０.０１ＧＯ、気孔率：９７.６０４％および９７.５９７％）では、表面の全面が酸化グラフェンでコーティングされたことが確認できた（図１ｃ、ｄ）。
【００２１】
本発明のスキャフォールドは、酸化グラフェンコーティングを有することで、機械的強度が増強され、５０％変位（測定条件：クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／分）における圧縮強度が、多孔質スキャフォールド基材と有意差がある。具体的には、例えば、５０％変位（測定条件：クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／分）における圧縮強度が、多孔質スキャフォールド基材の１．２倍以上であることができる。実施例1に示すように、多孔質スキャフォールド基材がコラーゲンスキャフォールド基材の場合、５０％変位（測定条件：クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／分）における圧縮強度は、酸化グラフェンコーティングを有さないコントロールに比べて、酸化グラフェンコーティング量に応じて、約1.3倍〜1.9倍の範囲である。
【００２２】
酸化グラフェンのコーティングは、薄膜状酸化グラフェン粒子を多孔質スキャフォールド基材の表面に被覆した層であることができ、薄膜状酸化グラフェン粒子は、例えば、厚さが0.4〜10nmであり、かつ平面方向の大きさが20nm以上であることができ。このように非常に微細な薄膜状酸化グラフェン粒子を用いたコーティングを有する本発明のスキャフォールドは、機械的強度が増強され、かつ骨再生療法及び皮膚再生療法においてはイングロースが促進される効果を有するものと推察される。
【００２３】
本発明のスキャフォールドは、骨再生用であり、再生対象が骨及び軟骨である。
【００２４】
本発明のスキャフォールドは、皮膚再生用であり、再生対象が表皮および真皮である。
【００２５】
<酸化グラフェンコーティングスキャフォールドの製造方法>
本発明のスキャフォールドの製造方法は、酸化グラフェン粒子の分散液を、多孔質スキャフォールドからなる基材の内部に注入し、前記基材の表面の少なくとも一部に酸化グラフェンをコーティングすることを含む。酸化グラフェン粒子の分散液を、例えば、シリンジ等の注入治具を用い、多孔質スキャフォールドの中心部に注射針を差し込み、中心部に差し込んだ注射針の先から、分散液を基材の内部に注入することで、注入された分散液は多孔質スキャフォールドの内部を伝わって基材の外面まで移動する間に、酸化グラフェンのコーティングが、多孔質スキャフォールドの内部の表面及び外面の少なくとも一部または全部に形成される。
【００２６】
この酸化グラフェンのコーティング方法は、基材が多孔質であり、かつ酸化グラフェン粒子が非常に微細であるために可能になり、多孔質スキャフォールドの内部の表面及び外面に均一にコーティングが形成される利点がある。
【００２７】
酸化グラフェン粒子の分散液は、酸化グラフェン粒子、水及びN-メチル-2-ピロリドン(NMP)の混合溶液に分散した分散液であることができる。水及びNMPの混合溶液は、NMPの濃度が、例えば、0.1〜99質量%の範囲である。この範囲のNMPの濃度の分散液を用いることで酸化グラフェンコーティングを良好に形成することができる。但し、NMPの比率が高いほど、酸化グラフェン粒子のスキャフォールド基材表面への付着性は向上する傾向があるので、NMPの濃度は、例えば、10〜99質量%の範囲であり、前記範囲の下限は好ましくは20質量%以上、より好ましくは50質量%以上である。
【００２８】
前記分散液における酸化グラフェン粒子の濃度としては、再生療法用のスキャフォールドとして良好な性質を有するコーティングを形成するという観点からは、例えば、０.０００１質量%以上の範囲であることが適当であり、より好ましくは、０.０００１〜１質量%の範囲であり、さらにより好ましくは０.０００１〜０.０５質量%の範囲が適当である。再生療法用のスキャフォールドにコーティングされる酸化グラフェンの量は、コーティング液の濃度のみならず、スキャフォールドの寸法や内部構造にも依存するので、スキャフォールドの種類に応じて、所望の酸化グラフェン含有量になるように、コーティング液の濃度は適宜設定できる。
【００２９】
水、NMP及び酸化グラフェン粒子を含有する分散液は、市販の酸化グラフェン含有溶液とNMP、又は水及びNMPを任意に混合することで、調製することができる。水及びNMPを混合する場合は、酸化グラフェン含有溶液と水を混合した後にNMPを添加混合しても良いし、酸化グラフェン含有溶液を水とNMPの混合溶液に添加混合しても良い。
【００３０】
一般に、酸化グラフェン含有溶液に含有される酸化グラフェン粒子は黒鉛を特定の方法で酸化することにより製造される黒鉛の層間化合物である。酸化グラフェンを得るための黒鉛の酸化法としては、公知のＢｒｏｄｉｅ法（硝酸、塩素酸カリウムを使用）、Ｓｔａｕｄｅｎｍａｉｅｒ法（硝酸、硫酸、塩素酸カリウムを使用）、Ｈｕｍｍｅｒｓ−Ｏｆｆｅｍａｎ法（硫酸、硝酸ナトリウム、過マンガン酸カリウムを使用）などが利用できる。これらのうち、特に酸化が進行するのはＨｕｍｍｅｒｓ−Ｏｆｆｅｍａｎ法（Ｗ．Ｓ．Ｈｕｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８０，１３３９（１９５８）；米国特許Ｎｏ．２７９８８７８（１９５７））であり、本発明でもこの酸化方法が特に推奨される。なお、層数が多い酸化グラフェンは通常酸化黒鉛と呼ばれるが、本発明では層数が多い場合も含めて酸化グラフェンと呼ぶことにする。
【００３１】
酸化グラフェンを層状に剥離し、層数の少ない酸化グラフェンを得るためには、例えば酸化グラフェンの精製を十分行えばよい。精製操作には、デカンテーション、濾過、遠心分離、透析、イオン交換などの公知の手段を用いればよい。精製時において、多層構造の分離は自発的に生じるが、これに加えて、振とうなどの撹拌操作やせん断力などの物理力を加えると分離がさらに促進されるので望ましい。超音波照射も利用可能であるが、層の分離と共に各層の基本構造が破壊されてアスペクト比が小さくなる傾向がある。以上の方法により、酸化グラフェン含有溶液を作製することができる。酸化グラフェンは単層または複層構造を有する物であることができる。
【００３２】
酸化グラフェン含有溶液中の酸化グラフェンの酸素含有量としては、５質量％以上であることが好ましく１０質量％以上であることがより好ましく、３０質量％以上であることがさらに好ましい。酸素含有量が５質量％未満になると、酸化黒鉛からの層分離が困難になる。また、酸素含有量が３０質量％以上であれば、酸化黒鉛からの層分離が容易になる。十分に酸化された状態として酸素含有量の上限は一般に５０質量％程度までである。酸化グラフェン含有溶液中の酸化グラフェンの酸素含有量は、４０℃で真空乾燥させた酸化グラフェンについて、前記のようにＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）等により評価することができる。
【００３３】
本発明で用いる酸化グラフェン含有溶液中の酸化グラフェン粒子は、厚さが0.4〜10nmであり、平面方向の大きさが20nm以上である薄膜状粒子であることが好ましい。この薄膜状粒子である酸化グラフェンは層構造を有する酸化グラフェンの基本層の層数が20層未満であり、緻密な炭素骨格を持っているにも関わらず、しなやかに変化することができる。そのため、基材表面において基材表面の微細な凹凸形状に沿って密着することができ、その結果、コーティングと基材との強固な密着を実現でき、さらに、比較的薄膜であるために、基材表面に密着中に外力に対する抵抗が比較的小さく基材表面からの剥離に対する耐性も高くなる。加えて、骨再生療法及び皮膚再生療法においてはイングロースが促進される効果を有するものと推察される。
【００３４】
酸化グラフェン含有溶液中の酸化グラフェン粒子の厚みはできるだけ薄いものほど、薄い酸化グラフェン層を形成できるため望ましい。そこで、酸化グラフェン粒子の厚みとしては、5nm以下の厚みの酸化グラフェン粒子を６０％以上含有しているものが好ましく、1.5nm以下の厚みの酸化グラフェン粒子を６０%以上含有するものであるとさらに好ましい。厚みの評価は原子間力顕微鏡を用いて次のような方法で行うことができる。希釈した酸化グラフェン粒子の水分散液を基板（マイカ）の上に滴下し、原子間力顕微鏡により重なりのない孤立した粒子を見つけ、原子間力顕微鏡で測定される基板と孤立粒子の高さの差が粒子の厚みとなる。粒子にしわが形成されている場合、しわの部分は厚さを反映していないので、しわのない部分と基板との高さの差で厚みを評価するようにする。吸着水の影響もあるため、厚みが1.5nm以下は酸化グラフェンの層数が１層と考えられる。一定厚み以下の酸化グラフェンの含有割合は、３０個の粒子について厚みを測定し、３０個中の一定厚み以下の酸化グラフェンの割合で算出することとする。
【００３５】
本発明で用いる酸化グラフェンは、厚さが0.4〜10nmであり、平面方向の大きさが20nm以上であり、比誘電率が15以上の液体に分散可能である薄膜状粒子である酸化グラフェンは、例えば、日本特許第4798411号公報に記載の製造方法を用いて製造することができる。また、上記特性を有する酸化グラフェン分散液としては、酸化グラフェン分散液（nano GRAX(登録商標)、1wt%、三菱瓦斯化学(株)）を用いることもできる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００３７】
製造例１
SEM観察
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録），三菱瓦斯化学）を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.0001，0.001，0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mm(3.7mg)に成形したcol（テルダーミス（商標登録）、オリンパステルモバイオマテリアル）を各濃度のGO溶液0.1mLに浸漬し、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.0001GO, 0.001GO，0.01GOスキャフォールドとした（図1a、0.0001GOは図示せず）。0.0001GO, 0.001GO，0.01GOスキャフォールドのGO含有量(質量%、実施例において以下同様)は、計測の結果、それぞれ1.1%, 1.83%，2.22%であった。0.001GO，0.01GOの各スキャフォールドの表面構造を白金パラジウム蒸着および加速電圧10kVの条件でSEM観察した。またコントロールとしてcolの表面構造を同様に観察した(図1b〜d)。
［結果］
Colではコラーゲンの線維にコラーゲンの架橋周期と一致する横紋様構造を認めた。一方0.001GO，0.01GOではスキャフォールド表面に横紋様構造を認めないことから、スキャフォールド表面は一様にGOで被覆されていると考えられた。また、0.01GOでは一部にGOによる皺様の構造が認められた。0.0001GOのSEM写真は図示しないが、0.001GO，0.01GOと同様にスキャフォールド表面は一様にGOで被覆されていた。
［結論］
スキャフォールドをGO溶液に浸漬処理することで、スキャフォールド表面がGOによってコーティングされた。
【００３８】
実施例１
圧縮強度試験
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録），三菱瓦斯化学）を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.0003，0.001，0.003，0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録）、オリンパステルモバイオマテリアル）を各濃度のGO溶液0.1mLに浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.0003GO，0.001GO，0.003GO，0.01GOスキャフォールドとした。0.0003GO，0.001GO，0.003GO，0.01GOスキャフォールドのGO含有量(質量%)は、計測の結果、それぞれ1.42%、1.83%、2.06%、2.22%である。各スキャフォールドの25％、50％変位量における圧縮強度を万能試験機を用いてクロスヘッドスピード0.5 mm/minで測定した。またコントロールとしてcolの圧縮強度を同様に測定した。
【００３９】
［結果］
圧縮強度は25％、50％変位ともにGOコーティングによってGOの濃度依存性に向上した。50％変位量における測定では低濃度の0.0003GOスキャフォールドにおいても有意に高い値だった。最も大きいのは0.01GOスキャフォールドで、コントロールに比較して、50％変位量で1.7倍、25％変位量で1.8倍であった。（図2）
【００４０】
［結論］
コラーゲンスキャフォールドのGOコーティングによって、濃度依存性に圧縮強度が上昇した。非特許文献２では、0.01wt%以上の濃度のGOコーティング液を用いたGOスキャフォールドにおいて50％変位量における圧縮強度がコントロールに比較して有意に増加することを報告したが、本発明では、特に、GO含有量(質量%)が1.42〜2.22質量%のGOスキャフォールドにおいてもcolに比較して圧縮強度が有意に増加することを見出した。
【００４１】
実施例２
分解性試験
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.001，0.01，0.1wt%GO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））を各濃度のGO溶液0.1mLに浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.001GO，0.01GO，0.1GOスキャフォールドとした。スキャフォールドのGO含有量(質量%)は、それぞれ1.83%、2.22%、4.67%である。各試料の重量を計測後0.1mg/mlのコラゲナーゼに37℃で3時間浸漬した。その後、試料を乾燥させ重量から分解量を算出した。またコントロールとしてcolの分解量を同様に測定した。
【００４２】
［結果］
0.001GO，0.01GO，0.1GOともにコラゲナーゼ分解性はcolに比較して有意に低い値であった。0.1GOは最も低く、0.001GO，0.01GOに対しても有意に低い値であった（図3）。これはGOスキャフォールドが生体内で酵素によって分解されにくいことを示しており、実施例１の圧縮強度の結果と共に生体内での再生の場の確保に有効であることが示唆された。
【００４３】
［結論］
GO含有量(質量%)が1.83〜2.22質量%のGOスキャフォールドにおいてコラゲナーゼ溶解量が有意に減少した。
【００４４】
実施例３
細胞増殖試験１
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.01，0.025，0.05，0.1wt%GO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））を各濃度のGO溶液0.1mLに浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.01GO，0.025GO，0.05GO，0.1GOスキャフォールドとした。スキャフォールドのGO含有量(質量%)は、計測の結果、それぞれ2.22%、1.42%、2.95%、4.67%であった。各試料に骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を50000個ずつ播種し、37℃、5％CO2の条件で培養した。1，3，5，7日目にcell counting kit-8 (CCK-8)を用いて細胞増殖量を測定した。またコントロールとしてcolの細胞増殖量を同様に測定した。
【００４５】
［結果］
0.01GOの細胞増殖量が最も大きく、GOコーティングの濃度が高いほど細胞増殖を抑制した。0.1GOは、1日目、5日目でcolと比較し有意に細胞増殖が抑制されており、0.01GOと比較してすべての期間で有意に抑制されていた。0.025GO，0.05GOも0.01GOに比較して細胞増殖を抑制する傾向があったが3，5，7日目において有意差は認めなかった（図4a）。
【００４６】
［結論］
非特許文献２においては、0.01GOでの細胞(皮下結合組織の細胞)増殖は、col群と同等かそれ以下であった。しかし、骨芽細胞様細胞における結果では、予想外にも0.01GO(GO含有量が2.22質量%)ではcol群と同等かそれ以上の細胞増殖が認められた。
【００４７】
細胞増殖試験2
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.0003, 0.001, 0.003, 0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））を各濃度のGO溶液0.1mLに浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.0003GO，0.001GO，0.003GO，0.01GOスキャフォールドとした。スキャフォールドのGO含有量は、計測の結果、それぞれ1.42%、1.83%、2.06%、2.22%であった。各試料に骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を50000個ずつ播種し、37℃、5％CO2の条件で培養した。1，3，7日目にCCK-8を用いて細胞増殖量を測定した。またコントロールとしてcolの細胞増殖量を同様に測定した。
【００４８】
［結果］
各試料とも経時的な細胞増殖を認めたが、GOコーティングによって3日目、7日目で細胞増殖量が増加し、7日目ではGO含有量(質量%)が1.42〜2.22質量%のGOコーティングスキャフォールにおいてコントロールに比較して有意に高い値を示し、それぞれの群間では有意差はなかった（図4b）。
【００４９】
［結論］
骨芽細胞様細胞では、GO含有量(質量%)が1.42〜2.22質量%のGOコーティングスキャフォールドすべてにおいて、col群より有意に細胞増殖が促進されることを見出した。
【００５０】
実施例４
細胞増殖試験３（アテロコラーゲンスポンジマイティ）
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.001，0.01wt%GO溶液を作製した。コラーゲンスポンジ（φ5×3mm，アテロコラーゲンスポンジマイティ、高研、以下cs）を各濃度のGO溶液0.05mLに浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.001GO，0.01GOスポンジとした（図5a）。スキャフォールドのGO含有量(質量%)は、計測の結果、それぞれ1.05%、1.25%であった。各試料に骨芽細胞様細胞MC3T3-E1を10000個ずつ播種し、37℃、5％CO2の条件で培養した。1，3，7日目にCCK-8を用いて細胞増殖量を測定した。またコントロールとしてcsの細胞増殖量を同様に測定した。
【００５１】
［結果］
GOコーティングによって細胞増殖量はcsに比較して増加傾向にあった。３日目において、0.01GOとcs間において有意差を認めた。7日目において、0.01GOで細胞増殖が最も増加した（図5b）。
【００５２】
［結論］
アテロコラーゲンスポンジマイティにおいてもGO含有量(質量%)が1.05%〜1.25%のGOコーティングにより、cs群に比較し骨芽細胞様細胞の増殖は増加傾向であることが判明した。
【００５３】
実施例５
ラット頭蓋骨モデルにおける骨増生
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.001，0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））を各濃度のGO溶液に浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、それぞれ0.001GO，0.01GOスキャフォールドとした。スキャフォールドのGO含有量(質量%)は、計測の結果、それぞれ1.83%、2.22%であった。
【００５４】
ウィスターラット（10週齢）に全身および局所麻酔を行い、頭蓋骨を露出させ、注水下でラウンドバーにて4×4 mmの範囲の皮質骨を除去（decortication）した。続いてGOスキャフォールドあるいはcolを除去部に設置、皮膚を復位して縫合した。また何も移植しないコントロール(ctrl)を設定した。術後10日目および35日目にラットを安楽死させ、移植部位を周囲組織とともに摘出、ホルマリン固定、EDTA脱灰後、通法に従って組織標本を作製した。光学顕微鏡にて組織学的観察を行い、画像をパーソナルコンピュータに取り込み、NIHイメージソフトウェアにて35日目の新生骨面積を算出した。
【００５５】
［結果］
10日目において、0.01GOスキャフォールド(GO含有量2.22質量%)ではスポンジの網目構造が認められ三次元空間が維持されていたが（図6a）、colでは圧縮されスキャフォールドが潰れているのが観察された（図6b）。GOスキャフォールドは生体内で三次元形態を保持しやすいと考えられた。
【００５６】
35日目において、0.01GOスキャフォールド移植によって骨の増生が観察された（図7a）。新生骨は内部に骨髄様組織を持ち、骨周辺や骨髄内にはGOと思われる黒い凝集塊を含むマクロファージ様細胞（矢印）をしばしば観察した（図7b）。0.001GO(GO含有量1.83質量%)においても骨増生を観察したが、増生量は0.01GOよりも少なかった（図7c）。colを移植した群では、骨増生はわずかであった（図8a）。コントロールでは骨新生はほとんど認めなかった（図8b）。新生骨面積計測の結果を図9cに示す。新生骨面積は0.01GOスキャフォールドで最大値を示し、コントロールに比較して2.7倍、colに比較して2.2倍であり、統計学的に有意差を認めた。0.001GOスキャフォールドも骨増生は促進され、コントロールに比較して有意に大きい値だった。colでは新生骨面積は少なく、コントロールとほぼ同等であった（図8c）。
【００５７】
［結論］
GO含有量(質量%)1.83%〜2.22%の GOスキャフォールドを頭蓋骨上へ移植すると、骨増生が促進された。特に、0.01GOスキャフォールド(GO含有量2.22質量%)においては、骨増生の促進効果が非常に顕著であった。
【００５８】
実施例６
ラット頭蓋骨モデルにおける免疫組織学的評価
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））をGO溶液に浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、0.01GOスキャフォールドとした。計測の結果、スキャフォールドのGO含有量(質量%)は2.22%であった。
【００５９】
ウィスターラット（10週齢）に全身および局所麻酔を行い、頭蓋骨を露出させ、注水下でラウンドバーにて4×4 mmの範囲の皮質骨を除去（decortication）した。続いて0.01GOスキャフォールドあるいはcolを移植した。14日目に試料を摘出して連続凍結切片を作成した。切片は好中球の出現を確認するためにペルオキシターゼ染色を行い炎症の有無を確認した。また、内部にイングロースした細胞を同定するために免疫組織学的観察を行った。抗体には、マクロファージ・単球系細胞のマーカーとして抗ED1抗体と抗Galectin-3抗体、血管平滑筋細胞のマーカーとして抗Smooth muscle actin抗体、血管内皮細胞のマーカーとして抗RECA-1抗体、線維芽細胞のマーカーとして抗Prolyl-4-Hydroxylase beta抗体を選択した。
【００６０】
［結果］
ペルオキシターゼ染色の結果、0.01GOおよびcolともに好中球の出現は認めず、生体親和性が良好であることが示された（図9a,b）。0.01GOではスキャフォールド内部にGOの凝集塊が数多く認められた。また、免疫染色の結果、GOスキャフォールドでは内部にED1-Galectin陽性のマクロファージを数多く同定した（図10a）。したがって0.01GOの内部にマクロファージが侵入して、GOを貪食することでGOの凝集が起こったと推測された。また、Smooth muscle actin陽性の平滑筋細胞（図10b）、RECA-1陽性の血管内皮細胞（図11a）がGOスキャフォールドで多く認められ、血管様の管腔構造を形づくっており、0.01GO内部で血管網の構築が促進されたことが明らかになった。また、GOスキャフォールドではProlyl-4-Hydroxylase beta陽性の線維芽細胞のイングロースを多く認め（図11b）、自己組織化が進行している可能性が示された。一方でColでは各細胞の内部へのイングロースは少なかった（図10a,b,図11a,b）。
【００６１】
［結論］
0.01GOスキャフォールド(GO含有量2.22質量%)は、頭蓋皮質骨の再生においても、生体親和性が良好で、内部への細胞や血管のイングロースを促進した。
【００６２】
実施例７
イヌ抜歯窩での骨再生効果
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.01wt%のGO溶液を作製した。6×6×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））をGO溶液に浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、0.01GOスキャフォールドとした。計測の結果、スキャフォールドのGO含有量(質量%)は2.22%であった。ビーグル犬（メス、12〜16か月齢）に全身および局所麻酔を行い、上顎第三前臼歯を抜歯後、ただちに抜歯窩にGOスキャフォールドあるいはcolの埋植を行い縫合した。7日後に抜糸、14日後に実験部位を摘出後、組織標本を作製して組織学的観察を行った。またソフトウェア（NIHイメージ）にて新生骨面積を計測した。
【００６３】
［結果］
GOスキャフォールドを埋入すると14日目において抜歯窩内は新生骨の形成を多く認め（図12a）、骨梁には骨芽細胞や破骨細胞が配列して、正常な骨組織に類似していた（図12b,c）。抜歯窩の中心部は結合組織が形成されていた（図12d）。Col群では骨形成を認めたがその量は少なく、抜歯窩内の大部分は結合組織で満たされていた（図13a）。2週の組織学的計測の結果、新生骨形成率はcol群の3.1％に対し、0.01GOスキャフォールドは37.2％でcol群の約12倍であった（図13b）。
【００６４】
［結論］
0.01GOスキャフォールド(GO含有量2.22質量%)は、抜歯窩内での新生骨形成においても、良好な生体親和性を示し、非常に顕著な抜歯窩骨新生を促進した。
【００６５】
実施例８
ラット皮膚欠損モデルおける皮膚再生
［材料および方法］
GO分散液（1wt%，nano GRAX（商標登録））を1-メチル2-ピロリドンで希釈して、0.01wt%のGO溶液を作製した。10×10×3 mmに成形したcol（テルダーミス（商標登録））をGO溶液に浸漬して表面にGOコーティングし、エタノールで洗浄脱水後、空気中で乾燥させ、0.01GOスキャフォールドとした。計測の結果、スキャフォールドのGO含有量(質量%)は2.22%であった。
【００６６】
ウィスターラット（10週齢）に全身および局所麻酔を行い、背部皮膚を剃毛後にメスにて10×10 mmの皮膚欠損を作製した。欠損部にGOコーティングスキャフォールドを貼付する方法で移植し、脱落しないように縫合糸にて圧接した。またcol群、および何も移植しないコントロール群(ctrl)を設定した。術後10日目にラットを安楽死させ、移植部位を周囲組織とともに摘出、ホルマリン固定後、通法に従って組織標本を作製した。光学顕微鏡にて組織学的観察を行い、画像をパーソナルコンピュータに取り込み、NIHイメージソフトウェアにて各標本の欠損の長さと欠損部へ伸長した上皮の長さを計測後、上皮再生率（新生上皮長さ/欠損部長さ）を算出した。
【００６７】
［結果］
0.01GOを移植すると、欠損部の痂皮直下に上皮が進入増殖し、欠損部の大部分が上皮の伸長によって被覆され、欠損部の縮小は著しかった（図14a）。残存するGOスキャフォールド内部には多くの細胞のイングロースを認めた（図14b）。またマクロファージ様細胞を認め、貪食されたGOと思われる黒い凝集塊をしばしば観察した（図14b）。特徴的所見として、新生上皮直下にGOスキャフォールドの多孔質構造が認められることから、自己組織化が進んだGOスキャフォールドを直接的に上皮が被覆していると思われ、高い生体親和性があると推測された（図14c,d）。
【００６８】
col群では、0.01GOに比較して上皮の伸長が少なかった（図15a）。残存するcolの内部には細胞のイングロースを認めた（図15b）。Colは新生結合組織で被包されており、上皮はその結合組織を被覆するように伸長していた（図15c,d）。
コントロール（図16a）では痂皮直下の結合組織にはリンパ球等の炎症性細胞浸潤を認めた（図16b）。上皮の伸長（矢印）は欠損両端に若干認める程度で少なかった（図16c,d）。上皮再生率を計測した結果、ctrl群8.4％、col群26.3％、0.01GO群47.8％で、0.01GOの上皮再生率はctrl群の約5倍、col群の約2倍で最も高い値であり、ctrl群、col群に比較して統計学的有意差を認めた（図17）。
【００６９】
［結論］
0.01GOスキャフォールド (GO含有量2.22質量%)を皮膚欠損部に応用すると、上皮再生が促進された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、骨再生療法及び皮膚再生療法の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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