(57)【要約】【課題】カオトロピック剤を使用しない場合であっても、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを簡便且つ高純度で単離できる方法を提供すること。【解決手段】ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、ＲＮＡの単離方法。  （Ａ）前記生体試料と、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体とを、酸性条件下、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程  （Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程  （Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体からＲＮＡを溶出させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、ＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体とを、酸性条件下、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体からＲＮＡを溶出させる工程
【請求項２】
カオトロピック剤を使用せずにＲＮＡを単離する方法である、請求項１に記載の単離方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡと結合可能な酸性基が、カルボキシ基またはスルホン酸基である、請求項１または２に記載の単離方法。
【請求項４】
前記担体が、磁性粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項５】
前記リチウム塩が、リチウムの無機塩およびリチウムの有機塩から選ばれる１種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項６】
工程（Ａ）を、ｐＨ６．０以下で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項７】
前記生体試料が、ＤＮＡをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項８】
核酸分解酵素を使用せずにＲＮＡを単離する方法である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの単離方法に関する。より詳細には、生体試料からＲＮＡを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡは生命情報の担い手であり、ＲＮＡはその情報を受け、生体内でタンパク質合成等に関わる重要な役割を担っている分子である。
生化学、遺伝子工学および臨床診断等の分野において、ノザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼチェインリアション等の手法でＲＮＡ解析が行われており、斯かる解析を精度よく行うためには、高純度のＲＮＡを使用することが必要である。
そのため、生体試料からＲＮＡを単離する際にＤＮＡの混入を抑える方法として、リチウム塩やカオトロピック剤等を含有する酸性溶液、シリカ粒子、および生体試料を混合し、生体試料中のＲＮＡをシリカ粒子に吸着させ、その後ＲＮＡを溶出させる方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−７５７８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＲＮＡをシリカ粒子に吸着させる場合には、その吸着性を満足させるためにカオトロピック剤を使用する必要があるため、特許文献１に記載のような方法では、単離したＲＮＡにカオトロピック剤が混入し、単離したＲＮＡをＰＣＲ等に用いる際に酵素反応が阻害される場合がある。
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、カオトロピック剤を使用しない場合であっても、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを簡便且つ高純度で単離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題は以下の手段により解決された。
＜１＞ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、ＲＮＡの単離方法。
（Ａ）前記生体試料と、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体とを、酸性条件下、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体からＲＮＡを溶出させる工程
＜２＞カオトロピック剤を使用せずにＲＮＡを単離する方法である、上記＜１＞の単離方法。
＜３＞前記ＲＮＡと結合可能な酸性基が、カルボキシ基またはスルホン酸基である、＜１＞または＜２＞の単離方法。
＜４＞前記担体が、磁性粒子である、＜１＞〜＜３＞のいずれかの単離方法。
＜５＞前記リチウム塩が、リチウムの無機塩およびリチウムの有機塩から選ばれる１種以上である、＜１＞〜＜４＞のいずれかの単離方法。
＜６＞工程（Ａ）を、ｐＨ６．０以下で行う、＜１＞〜＜５＞のいずれかの単離方法。
＜７＞前記生体試料が、ＤＮＡをさらに含む、＜１＞〜＜６＞のいずれかの単離方法。
＜８＞核酸分解酵素を使用せずにＲＮＡを単離する方法である、＜１＞〜＜７＞のいずれかの単離方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の単離方法によれば、カオトロピック剤を使用しない場合であっても、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを簡便且つ高純度で単離できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の単離方法は、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むものである。
（Ａ）前記生体試料と、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体とを、酸性条件下、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体からＲＮＡを溶出させる工程
【０００９】
〔工程（Ａ）〕
工程（Ａ）は、ＲＮＡを含む生体試料と、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体とを、酸性条件下、リチウム塩が添加された液相中で混合する工程である。斯かる工程（Ａ）により、ＲＮＡが担体に結合し、ＲＮＡ結合担体が形成される。
【００１０】
生体試料は、ＲＮＡの他にＤＮＡを含んでいてもよい。本発明の単離方法によれば、生体試料がＤＮＡを含む場合でも、高純度でＲＮＡを単離できる。
また、生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、糞便、精液、組織液、唾液や、これらから分離した細胞、培養細胞等が挙げられ、微生物やウイルス等でもよい。なお、生体試料は、安定化剤等で前処理したものでもよい。
また、ＲＮＡおよびＤＮＡは、内在性でも外来性でもよく、また、生体外で酵素的に合成されたものでもよい。ＲＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成オリゴＤＮＡ、ＰＣＲ産物等が挙げられる。ＤＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、合成ＲＮＡ等が挙げられる。
生体試料の系中の濃度は、１〜１００（ｗ／ｖ）％とするのが好ましく、１０〜６０（ｗ／ｖ）％とするのがより好ましい。
【００１１】
工程（Ａ）で用いる担体は、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有するものであればよい。例えば、ガラス、珪藻土、金属、金属酸化物等の無機物；樹脂等の有機物；これらの複合体が挙げられるが、非シリカ系担体が好ましい。樹脂は、多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース等）等の天然高分子で構成されていても、スチレン系ポリマー、スチレン−ブタジエン系共重合体、（メタ）アクリル酸エステル系ポリマー、（メタ）アクリロニトリル系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等の合成高分子で構成されていてもよいが、ＲＮＡと結合可能な酸性基を表面に有する樹脂が好ましい。
【００１２】
また、ＲＮＡと結合可能な酸性基としては、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等が挙げられるが、解離定数の観点から、カルボキシ基、スルホン酸基が好ましい。
ＲＮＡと結合可能な酸性基の含有量は、担体の固形分１ｍｇあたり、好ましくは１〜２００ｎｍｏｌ、より好ましくは５〜１００ｎｍｏｌ、特に好ましくは１０〜７５ｎｍｏｌである。なお、酸性基の含有量は、電気伝導度測定法等により測定できる。
【００１３】
また、担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ、粉末、容器、プレート等のいずれでもよいが、取り扱いやすさの観点から、粒子が好ましい。本発明において、担体としては、分離の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、ＲＮＡと結合可能な酸性基を表面に有する樹脂中に磁性体を含む磁性粒子（以下、単に、樹脂中に磁性体を含む磁性粒子という）が好ましい。
磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、集磁や再分散の容易性の観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、または合金が挙げられる。磁性体の含有量は、担体全量に対して、好ましくは５〜８０質量％、より好ましくは１０〜６０質量％、特に好ましくは１５〜４０質量％である。
【００１４】
また、樹脂中に磁性体を含む磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のような粒子が挙げられる。
【００１５】
（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられた粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
なお、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。
【００１６】
また、ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体が粒子の場合の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．１〜５００μｍであり、より好ましくは０．２〜１００μｍであり、特に好ましくは０．３〜５０μｍである。なお、平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
【００１７】
ＲＮＡと結合可能な酸性基を有する担体の使用量は、生体試料１００質量部に対し、通常、０．０１〜１００質量部程度であり、好ましくは０．１〜１０質量部である。
【００１８】
また、工程（Ａ）における液相は、リチウム塩が添加されたものである。
リチウム塩は、液相中にリチウムイオンを生じさせるものであれば特に限定されるものではなく、リチウムの無機塩でも、リチウムの有機塩でもよい。例えば、塩化リチウム、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、炭酸リチウム、水酸化リチウム、ホウ酸リチウム等が挙げられる。リチウム塩は、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
リチウム塩の系中の濃度は、好ましくは３〜８Ｍである。
【００１９】
また、工程（Ａ）における液相としては、上記成分の他に、界面活性剤を含むものが好ましい。
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤等が挙げられ、非イオン性界面活性剤、アニオン界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等）、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ２０等）が挙げられる。
アニオン界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム等の硫酸エステル型アニオン界面活性剤；Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等のカルボン酸型アニオン界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤は、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
界面活性剤の系中の濃度は、好ましくは０．０１〜１（ｗ／ｖ）％である。
【００２０】
また、工程（Ａ）における液相は、上記各成分の他に、水等を含んでいてもよい。
【００２１】
また、本発明の単離方法は工程（Ａ）の混合を酸性条件下で行うものであるが、ｐＨ６．０以下で行うのがより好ましく、ｐＨ４．０〜６．０で行うのがより好ましい。ｐＨの調整は、各種緩衝液を用いて行えばよい。
なお、本明細書においてｐＨは２５℃におけるｐＨを意味する。
【００２２】
工程（Ａ）の混合をする際の温度は、通常１０〜６０℃であり、混合時間は、１〜１０分間程度でよい。
【００２３】
〔工程（Ｂ）〕
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られたＲＮＡ結合担体と上清とを分離する工程である。具体的には、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、上清またはＲＮＡ結合担体を回収するなどすればよい。
【００２４】
工程（Ｂ）で分離したＲＮＡ結合担体は、工程（Ｃ）に先立ち、洗浄しておくのが好ましい（以下、この工程を洗浄工程という）。
洗浄工程の手法は、通常、担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように担体が粒子状である場合には、洗浄液中に粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、担体がプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。
担体が磁性粒子の場合の洗浄工程としては、磁場を利用して磁性粒子を集めて磁性粒子と液相とを分離し、次いで磁性粒子を洗浄液中に再分散させる方法が好ましい。
なお、洗浄工程の回数は、１回でも複数回でもよい。
【００２５】
洗浄液としては、リチウム塩、界面活性剤および低級アルコールから選ばれる１種以上を含む洗浄液が好ましく、リチウム塩および界面活性剤から選ばれる１種以上を含む洗浄液や、低級アルコールを含む洗浄液がより好ましい。
上記リチウム塩、界面活性剤としては、工程（Ａ）で使用できるものと同様のものが挙げられる。また、低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール等が挙げられ、１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。中でも、エタノールが好ましい。
また、洗浄液は、酸性であるのが好ましく、ｐＨ６．０以下であるのがより好ましく、ｐＨ４．０〜６．０であるのが特に好ましい。
【００２６】
〔工程（Ｃ）〕
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体からＲＮＡを溶出させる工程である。工程（Ｃ）は常法の核酸溶出に準じて行えばよい。溶出方法としては、例えば、工程（Ｂ）で分離されたＲＮＡ結合担体を、各種緩衝液や水等の水系媒体中で撹拌する方法が挙げられる。その後、遠心分離や磁場を利用した分離などの常法の固液分離を行い、必要に応じて水系媒体を除去することで、ＲＮＡを高純度で単離することができる。
【００２７】
そして、本発明の単離方法によれば、カオトロピック剤を使用しない場合であっても、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを簡便且つ高純度で単離できる。
また、本発明の単離方法によれば、生体試料がＲＮＡとＤＮＡを含む場合でも、単離されたＲＮＡへのＤＮＡの混入が少なく、核酸分解酵素（デオキシリボヌクレアーゼ）を使用するなどして混入したＤＮＡを分解させなくても、ＲＮＡを高純度で得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕
（１）ＨＴ２９細胞の培養
牛胎児血清を１（ｗ／ｖ）％含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にて、ヒト結腸腺ガン細胞であるＨＴ２９細胞を３７℃で３日間培養した。その後、培地を取り除き、ＥＤＴＡ２ｍＭ含有ＰＢＳを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間静置し、シャーレから細胞を剥がした。剥がした細胞をＤ−ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）に懸濁させた後、この懸濁液中の細胞数を血球計算盤を用いて計測し、マイクロチューブ（チューブＡとする）内で、ＨＴ２９細胞の濃度が１×１０6個／ｍＬとなるようにＤ−ＰＢＳ（−）を用いて希釈した。この細胞希釈液を、細胞希釈液Ａとする。
【００３０】
（２）ＲＮＡの抽出
チューブＡ中で、手順（１）で得た細胞希釈液Ａ（ＨＴ２９細胞１×１０5個相当量）に、溶解液（ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳともいう）：５（ｗ／ｖ）％、酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を２００μＬ加え、細胞を完全に溶解させた。これに、粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｇ含む水懸濁液１００μＬと、８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）２００μＬとを加え、ボルテックスで混合した後、室温で１０分間静置した。
次に、チューブＡを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。
そして、チューブＡに、洗浄液（塩化リチウム：３Ｍ、酢酸−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）：０．２Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：０．１（ｗ／ｖ）％を含む）を５００μＬ加え、磁気スタンドから外し、ボルテックスで撹拌後、再度磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清をマイクロピペットにて除去した。この洗浄作業をもう一度繰り返したのち、７０％エタノール１ｍＬによる洗浄を３回繰り返したのち、液相を完全に除去した。チューブＡに水５０μＬを加え、磁気スタンドから外し、ボルテックスにより磁性粒子を完全に分散させた。その後、チューブＡを磁気スタンドに設置し、磁性粒子を集磁させ、上清（上清Ａとする）をマイクロピペットで回収した。
【００３１】
（３）リアルタイムＰＣＲによる核酸増幅操作
手順（２）で得られた上清Ａに含まれるＲＮＡから、ＨＴ２９細胞に定常的に発現しているｃＤＮＡを合成して、これを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲによりβアクチンｍＲＮＡを増幅させる操作を行った。また、上清Ａを検体とし、リアルタイムＰＣＲによりβアクチンＤＮＡを増幅させる操作を行った。具体的手順を以下に示す。
まず、上清Ａ１０μＬに、逆転写酵素（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター、デオキシヌクレオチドミックス、オリゴ[ｄＴ]18プライマーおよびトランスクリプター反応用バッファーを、Ｒｏｃｈｅ社のマニュアル通りの濃度になるように加え、全量を２０μＬとし、５５℃で３０分間処理した後、８５℃で５分間更に処理し、ｃＤＮＡを合成した後、氷上で冷却した。
次に、βアクチンｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、ｄＮＴＰｓ、反応用緩衝液およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、タカラバイオ社製）に、上記ｃＤＮＡまたは上清Ａを１０μＬ加え、全量を５０μＬにしたのち、サーマルサイクラー（７５００  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。
リアルタイムＰＣＲ条件：（９８℃１０秒間→５５℃３０秒間→７２℃１分間）×３０サイクル
【００３２】
（４）アガロース電気泳動による増幅産物の検出
手順（３）で増幅させたβアクチンｍＲＮＡをアガロース電気泳動法で検出した。また、手順（３）でβアクチンＤＮＡ増幅処理をした上清Ａについて、アガロース電気泳動法によりβアクチンＤＮＡの混入の有無を検証した。具体的手順を以下に示す。
手順（３）にて作製した増幅サンプル１０μＬを２％アガロースゲルに供し、１×ＴＢＥバッファー中で、１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液に３０分間浸漬し、ＵＶ照射下で核酸の蛍光を観察し、ＤＮＡ由来の増幅とＲＮＡ由来の増幅を以下の基準で評価した。結果を表１に示す。なお、ＤＮＡ由来の増幅の評価が−であり、ＲＮＡ由来の増幅の評価が＋または＋＋である場合は、ＤＮＡの混入が少ないＲＮＡが単離できたといえる。
【００３３】
（評価基準）
＋＋：増幅が多く確認できた
＋：増幅が確認できた
−：増幅は確認できなかった
【００３４】
〔実施例２〕
ドデシル硫酸ナトリウムを、ドデシル硫酸リチウム（以下、ＬｉＤＳともいう）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００３５】
〔実施例３〕
ドデシル硫酸ナトリウムを、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（以下、ｓａｒｋｏｓｙｌともいう）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００３６】
〔実施例４〕
ドデシル硫酸ナトリウムを、Ｔｗｅｅｎ２０に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００３７】
〔実施例５〕
塩化リチウムを、酢酸リチウムに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００３８】
〔実施例６〕
塩化リチウムを、クエン酸リチウムに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００３９】
〔実施例７〕
塩化リチウムを、炭酸リチウムに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４０】
〔実施例８〕
塩化リチウムを、水酸化リチウムに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４１】
〔実施例９〕
塩化リチウムを、ホウ酸リチウムに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４２】
〔実施例１０〕
溶解液のｐＨを５．０に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４３】
〔実施例１１〕
溶解液のｐＨを６．０に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４４】
〔実施例１２〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、粒子Ａ−２（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４５】
〔実施例１３〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、粒子Ａ−３（ＳｅｒａＭａｇ  ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４６】
〔比較例１〕
８Ｍ塩化リチウム溶液（溶媒：水）を使用しなかったこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４７】
〔比較例２〕
溶解液のｐＨを７．０に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４８】
〔比較例３〕
溶解液のｐＨを７．０に変更した以外は、実施例１２と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００４９】
〔比較例４〕
溶解液のｐＨを７．０に変更した以外は、実施例１３と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５０】
〔参考例１〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、粒子Ｂ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ−シリカ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に変更し、ドデシル硫酸ナトリウム：５（ｗ／ｖ）％を、カオトロッピック剤であるグアニジン塩酸塩：６Ｍに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５１】
〔合成例１〕スルホン酸基含有磁性粒子の作製
油性磁性流体（Ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ  ＥＭＧ２００１、ＦｅｒｒｏＴｅｃ（株）製）にアセトンを加えて、粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１μｍ）を得た。
次いで、上記超常磁性体４０質量部に、シクロヘキシルメタクリレート９９質量部、メタクリル酸１質量部およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３質量部を添加し、撹拌することにより超常磁性体を均一に分散させて、モノマー組成物を調製した。
一方、ポリビニルアルコール１０質量部、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５質量部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１質量部を、水１０００質量部に溶解させて水溶液を調製した。
得られた水溶液に、上記モノマー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備撹拌した後、超音波分散機で分散処理することにより、平均粒子径１μｍの油滴（油相）が水性媒体（水相）に分散した懸濁液を調製した。
次に、得られた懸濁液を、容量２リットルの撹拌機付き三つ口フラスコに仕込み、７５℃に昇温し、窒素雰囲気下で撹拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合させ、磁性粒子を製造した。この磁性粒子１０質量部を、ドデシル硫酸ナトリウム０．０３質量部を含む水１００質量部に分散させた。これに、スチレン４質量部およびスチレンスルホン酸ナトリウム４質量部を加え、８０℃に加温した後、過硫酸カリウム０．０１質量部を加え１０時間反応させた。
反応終了後、蒸留水と生理食塩水で粒子を順次洗浄し、スルホン酸基を表面に有する磁性粒子を得た。このスルホン酸基含有磁性粒子を、粒子Ａ−４とする。
【００５２】
〔実施例１４〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、合成例１で得た粒子Ａ−４に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５３】
〔比較例５〕
溶解液のｐＨを７．０に変更した以外は、実施例１４と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５４】
〔合成例２〕アミノ基含有磁性粒子の作製
油性磁性流体（Ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ  ＥＭＧ２００１、ＦｅｒｒｏＴｅｃ（株）製）にアセトンを加えて、粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１μｍ）を得た。
次いで、上記超常磁性体４０質量部に、シクロヘキシルメタクリレート９０質量部、トリメチルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０質量部およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３質量部を添加し、撹拌することにより超常磁性体を均一に分散させて、モノマー組成物を調製した。
一方、ポリビニルアルコール１０質量部、ラウリル硫酸ナトリウム０．０５質量部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１質量部を、水１０００質量部に溶解させて水溶液を調製した。
得られた水溶液に、上記モノマー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備撹拌した後、超音波分散機で分散処理することにより、平均粒子径１μｍの油滴（油相）が水性媒体（水相）に分散した懸濁液を調製した。
次に、得られた懸濁液を、容量２リットルの撹拌機付き三つ口フラスコに仕込み、７５℃に昇温し、窒素雰囲気下で撹拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合させることにより、アミノ基を表面に有する磁性粒子を得た。このアミノ基含有磁性粒子を、粒子Ｂ−２とする。
【００５５】
〔比較例６〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、合成例２で得た粒子Ｂ−２に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５６】
〔比較例７〕
粒子Ａ−１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、合成例２で得た粒子Ｂ−２に変更した以外は、比較例２と同様の操作を行い、ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の増幅を確認した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2016158559.tif 000002
【００５８】
表１中の各記号の定義を以下に示す。
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＬｉＤＳ：ドデシル硫酸リチウム
ｓａｒｋｏｓｙｌ：Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
粒子Ａ−１：カルボキシ基含有磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｌｂｏｘｙｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
粒子Ａ−２：カルボキシ基含有磁性粒子（ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
粒子Ａ−３：カルボキシ基含有磁性粒子（ＳｅｒａＭａｇ  ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
粒子Ａ−４：合成例１で得たスルホン酸基含有磁性粒子
粒子Ｂ−１：シリカ系磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ−シリカ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
粒子Ｂ−２：合成例２で得たアミノ基含有磁性粒子
【００５９】
表１に示すとおり、実施例１〜１４の手順（１）〜（２）で得た上清Ａは、ＤＮＡの混入が少ないＲＮＡであり、カオトロピック剤を使用せずに高純度でＲＮＡを単離できた。