(57)【要約】【課題】簡便かつ正確なセルラーゼ活性の検定方法、セルラーゼ活性を有する酵素および微生物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法を用いて選別された高性能セルラーゼ生産菌を提供すること。【解決手段】同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ以上調整する工程Ａと、  前記基質溶液に酵素液を添加し、それぞれ同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂと、  前記基質溶液の酵素反応後の吸光度を測定する工程Ｃと、  前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値を計算する工程Ｄと、  前記吸光度減少値を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅと、を含み、  前記工程Ｅの検定は、前記吸光度減少値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断することを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａと、
前記基質溶液に種類の異なる酵素液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂと、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度を測定する工程Ｃと、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値を計算する工程Ｄと、
前記吸光度減少値を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅと、
を含み、
前記工程Ｅの検定は、前記吸光度減少値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断することを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項２】
検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率の異なる希釈液を６つ以上調製する工程Ｊと、
同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を６つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａ’と、
前記基質溶液に前記希釈液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂ’と、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度をそれぞれ測定する工程Ｃ’と、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値をそれぞれ計算する工程Ｄ’と、
前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅ’と、
を含み、
前記工程Ｅ’の検定は、前記酵素液の希釈率と前記吸光度減少値の相関曲線を作成する工程Ｋと、
前記相関曲線において、前記希釈率と前記吸光度減少値が比例関係にある範囲を抽出する工程Ｌと、
前記範囲における前記相関曲線を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程であって、前記吸光度減少値の前記範囲における最大値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する工程Ｆと、
を含むことを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項３】
検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率が８０％、１００％の希釈液を調製する工程Ｊ’と、
同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａ’’と、
前記基質溶液に前記２つの希釈液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂ’と、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度をそれぞれ測定する工程Ｃ’と、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値をそれぞれ計算する工程Ｄ’と、
前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅ’’と、
を含み、
前記工程Ｅ’’の検定は、前記酵素液の希釈率が８０〜１００％における吸光度減少値の変化率が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する工程Ｇを含むことを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項４】
さらに請求項２の構成を含み、前記工程Ｆ及び前記工程Ｇにおいて、セルラーゼ活性が高い酵素液であると判断された酵素液を、セルラーゼ活性がより高い酵素液であると判断する請求項３に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項５】
前記酵素反応を行う工程の後、且つ前記酵素反応後の吸光度を測定する工程の前に、前記基質溶液に反応停止剤を添加し分散させて、酵素反応を停止させる工程Ｍを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項６】
前記反応停止剤が、０．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌの強アルカリ溶液である請求項５に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項７】
前記基質溶液の酵素反応前後の吸光度を、５００ｎｍ〜７００ｎｍのいずれか１つの波長で測定する請求項１〜６のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項８】
前記基質溶液の吸光度を測定する工程において、測定された前記基質溶液の酵素反応前の吸光度が、０．１〜１．５である請求項７に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項９】
前記基質溶液の吸光度を測定する工程において、セルロースの濃度が、前記基質溶液に対して、０．１〜３０質量％のいずれか１つである請求項１〜８のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１０】
前記酵素反応が、反応温度を３０〜６０℃、反応時間を１５分〜６時間に設定して行われる請求項１〜９のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１１】
前記基質溶液が、支持体により固定されている請求項１〜１０のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１２】
前記支持体が、寒天、ゼラチン、ゲランガム、グルコマンナンから選ばれる少なくとも１つである請求項１１に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１３】
前記セルロースが、リン酸膨潤セルロースである請求項１〜１２のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１４】
前記酵素反応の反応容器が、マイクロプレートである請求項１〜１３のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法を用いて、酵素液の活性を比較する酵素液のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法を用いて、微生物培養液の活性を比較するセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
セルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法において、選抜されたセルラーゼ生産微生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属である請求項１６に記載のセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＤ１７４５）ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９９２株である請求項１７に記載のセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
セルラーゼ活性を有するアクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＤ１７４５）ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９９２株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ活性の検定方法、及び該検定方法を用いるスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法を用いて選別された高性能セルラーゼ生産菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオエタノールは化石資源の代替策として注目されている。バイオエタノールの原料としては、可食のデンプンに加え、非可食のセルロース含有バイオマスを用いることが検討されている。セルロース含有バイオマスの主成分はセルロースであり、分子内及び分子間で水素結合を形成した高結晶性のポリマーである。このため、セルロース含有バイオマスはデンプンよりも糖化しづらい点が課題となっていた。
【０００３】
糖化性能向上の手段としては、高生産微生物を用いて、糖化性能の高いセルラーゼを生産することが挙げられる。ここで、糖化性能の高いセルラーゼを選別するために、セルラーゼ活性を簡便に測定する方法が必要となる。
【０００４】
セルラーゼ活性を簡便に測定する方法としては、マイクロフィブリルセルロースを活性測定用基質に用いることにより、セルラーゼ活性を比濁法で測定する方法が知られている（特許文献１）。
また、高性能セルラーゼ生産菌のスクリーニングとしては、水に分散したセルロースをチオシアン酸塩で処理し脱塩調製したセルロースゲルに培養液を浸透させて作製した検定用培養基材に、セルラーゼ生産菌を生育させて、培地上に形成された溶解穴の直径を測定する方法が報告されている（特許文献２）。
また、セルラーゼの成分酵素の組合せに着目したバイオマス分解用酵素タンパク質のスクリーニング方法として、バイオマスを含有する固相体に成分酵素やそれらを組み合わせた被験タンパク質を反応させて、形成されたハロー（固相体においてバイオマスの分解により淡色化または無色化する領域）の大きさをバイオマス分解活性として検出することにより、酵素の組合せの相乗効果を評価する方法が知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−２０２０００号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０５７０６４号
【特許文献３】特開２００９−７２１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１、２に記載の方法は、セルラーゼ活性量の評価はできるものの、成分酵素の組成比まで考慮した酵素あたりの糖化性能を評価することはできない。
特許文献３に記載の方法は、無細胞タンパク質合成系で取得した各成分酵素の変異タンパク質を評価すること想定しており、各成分酵素比が未知である変異生産菌の培養液の評価することはできない。
糖化性能の高いセルラーゼを生産することができる微生物（以下、「高性能セルラーゼ生産菌」と略記する。）のスクリーニングを効率化、迅速化するために、より簡便かつ正確なセルラーゼ活性の検定方法が望まれていた。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決することを課題とする。具体的には、簡便かつ正確なセルラーゼ活性の検定方法、セルラーゼ活性を有する酵素および微生物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法を用いて選別された高性能セルラーゼ生産菌を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ね、課題解決に至った。
即ち、本発明では、以下に記載のセルラーゼ活性の検定方法、セルラーゼ活性を有する酵素および微生物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法を用いて選別された高性能セルラーゼ生産菌を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【０００９】
［１］同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａと、
前記基質溶液に種類の異なる酵素液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂと、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度を測定する工程Ｃと、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値を計算する工程Ｄと、
前記吸光度減少値を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅと、
を含み、
前記工程Ｅの検定は、前記吸光度減少値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断することを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
［２］検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率の異なる希釈液を６つ以上調製する工程Ｊと、
同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を６つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａ’と、
前記基質溶液に前記希釈液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂ’と、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度をそれぞれ測定する工程Ｃ’と、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値をそれぞれ計算する工程Ｄ’と、
前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅ’と、
を含み、
前記工程Ｅ’の検定は、前記酵素液の希釈率と前記吸光度減少値の相関曲線を作成する工程Ｋと、
前記相関曲線において、前記希釈率と前記吸光度減少値が比例関係にある範囲を抽出する工程Ｌと、
前記範囲における前記相関曲線を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程であって、前記吸光度減少値の前記範囲における最大値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する工程Ｆと、
を含むことを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
［３］検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率が８０％、１００％の希釈液を調製する工程Ｊ’と、
同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する工程Ａ’’と、
前記基質溶液に前記２つの希釈液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う工程Ｂ’と、
前記基質溶液の酵素反応後の吸光度をそれぞれ測定する工程Ｃ’と、
前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値をそれぞれ計算する工程Ｄ’と、
前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する工程Ｅ’’と、
を含み、
前記工程Ｅ’’の検定は、前記酵素液の希釈率が８０〜１００％における吸光度減少値の変化率が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する工程Ｇを含むことを特徴とするセルラーゼ活性を検定する方法。
［４］さらに［２］の構成を含み、前記工程Ｆ及び前記工程Ｇにおいて、セルラーゼ活性が高い酵素液であると判断された酵素液を、セルラーゼ活性がより高い酵素液であると判断する［３］に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［５］前記酵素反応を行う工程の後、且つ前記酵素反応後の吸光度を測定する工程の前に、前記基質溶液に反応停止剤を添加し分散させて、酵素反応を停止させる工程Ｍを含む［１］〜［４］のいずれか一項に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［６］前記反応停止剤が、０．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌの強アルカリ溶液である［５］に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［７］前記基質溶液の酵素反応前後の吸光度を、５００ｎｍ〜７００ｎｍのいずれか１つの波長で測定する［１］〜［６］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［８］前記基質溶液の吸光度を測定する工程において、測定された前記基質溶液の酵素反応前の吸光度が、０．１〜１．５である［７］に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［９］前記基質溶液の吸光度を測定する工程において、セルロースの濃度が、前記基質溶液に対して、０．１〜３０質量％のいずれか１つである［１］〜［８］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１０］前記酵素反応が、反応温度を３０〜６０℃、反応時間を１５分〜６時間に設定して行われる［１］〜［９］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１１］前記基質溶液が、支持体により固定されている［１］〜［１０］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１２］前記支持体が、寒天、ゼラチン、ゲランガム、グルコマンナンから選ばれる少なくとも１つである［１１］に記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１３］前記セルロースが、リン酸膨潤セルロースである［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１４］前記酵素反応の反応容器が、マイクロプレートである［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法。
［１５］［１］〜［１４］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法を用いて、酵素液の活性を比較する酵素液のスクリーニング方法。
［１６］［１］〜［１５］のいずれか一つに記載のセルラーゼ活性を検定する方法を用いて、微生物培養液の活性を比較するセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
［１７］セルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法において、選抜されたセルラーゼ生産微生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属である［１６］に記載のセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
［１８］前記アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＤ１７４５）ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９９２株である［１７］に記載のセルラーゼ生産微生物のスクリーニング方法。
［１９］セルラーゼ活性を有するアクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＤ１７４５）ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９９２株。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡便かつ正確にセルラーゼ活性を検定することができる。また、前記検定を用いたスクリーニングにより、高性能セルラーゼ生産菌を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のセルラーゼ活性の検定方法の第一実施形態を説明したフローチャートである。
【図２】本発明のセルラーゼ活性の検定方法の第二実施形態を説明したフローチャートである。
【図３】本発明のセルラーゼ活性の検定方法の第三実施形態を説明したフローチャートである。
【図４】本発明のセルラーゼ活性の検定方法の第四実施形態を説明したフローチャートである。
【図５】本発明のセルラーゼ活性の検定方法の第五実施形態を説明したフローチャートである。
【図６】実施例１における、基準酵素液、調製酵素液の希釈率と吸光度減少値の関係を示すグラフである。
【図７】実施例２におけるハロー径とＦＰＵ活性の関係を示すグラフである。
【図８】実施例２における吸光度減少値とＦＰＵ活性の関係を示すグラフである。
【図９】実施例３における、基準酵素液、Ｓ１７４５株、Ｓ１７８９株の希釈率と吸光度減少値の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
≪セルラーゼ活性の検定方法≫
［第一実施形態］
本発明の第一実施形態のセルラーゼ活性の検定方法について、図１を参照して説明する。まず、同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を２つ以上調製し、その基質溶液の吸光度を測定する（工程Ａ）。次に、前記基質溶液に種類の異なる酵素液をそれぞれ添加し、同じ条件で酵素反応を行う（工程Ｂ）。その後、前記基質溶液の酵素反応後の吸光度を測定し（工程Ｃ）、前記基質溶液の酵素反応前後での吸光度減少値を計算する（工程Ｄ）。最後に、前記吸光度減少値を元に前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する（工程Ｅ）。工程Ｅの検定は、吸光度減少値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する。
なお、本発明において、吸光度を測定する波長、酵素反応前の吸光度、工程Ａのセルロース濃度、酵素反応の反応条件は、サンプルごとに統一してセルラーゼ活性の検定を行う。ただし、検定に影響を与えない程度の、わずかなずれはあってもよい。
【００１３】
本発明において、「基質溶液」とは、基質としてセルロースを用い、該セルロースを緩衝液や水で分散させた溶液を示す。
セルロースは、基質溶液中に均一に分散して吸光度を有し、酵素反応により吸光度が低下するものであれば限定されない。例えば、粉末結晶セルロースのアビセル、セルロースナノファイバー、粉末化したセルロース系バイオマス等を用いることができる。
セルロースを分散させる溶液として緩衝液を用いる場合、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを用いることができ、好ましくは酢酸緩衝液である。
【００１４】
セルロースは、リン酸やアルカリ水溶液により膨潤させることが好ましい。すなわち、セルロースは、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロースが好ましい。リン酸膨潤セルロースは、セルロースの分散性が良く、沈殿が生じにくく、吸光度をより正確に測定できるため、より好ましい。
セルロースの濃度は、基質溶液に対して、好ましくは０．１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．１〜１０質量％である。
【００１５】
セルロースを分散させた基質溶液は、支持体により固定されていることが好ましい。支持体により固定すると、セルロースの沈降を防ぎ、酵素反応を好適に進行させることができる。このような効果がある支持体としては、例えば、寒天、ゼラチン、グランガム、グルコマンナンを用いることができる。
支持体の割合は、基質溶液に対して、好ましくは１〜１５質量％、より好ましくは１〜１０質量％、さらに好ましくは１〜５質量％である。
【００１６】
本発明において、「吸光度」とは、一般的な吸光度計により測定したものである。例えば、マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００、ＴＥＣＡＮ社製）などにより測定することができる。測定する波長は、好ましくは５００〜７００ｎｍ、より好ましくは５００〜６００ｎｍ、さらに好ましくは５００〜５５０ｎｍである。波長が上記範囲であれば、可溶成分の吸光感度が適切な値となり、吸光度を正確に測定することができる。吸光度を測定する際、ブランクとしては基質溶液に酵素液と同容量の水を加えた溶液等を用いることができる。
【００１７】
基質溶液の酵素反応前の吸光度は、測定の精度の観点から、好ましくは０．１〜１．５、より好ましくは０．２〜１．０、さらに好ましくは０．４〜０．８である。なお、基質溶液の酵素反応前の吸光度は、酵素液を加える前にあらかじめ測定しておくことが好ましい。
【００１８】
本発明において、「酵素液」とは、微生物培養液、酵素製剤水溶液、酵素処理工程液、酵素精製工程液など、セルラーゼを含有するものであれば特に限定されない。分析精度の観点からは、不溶物や沈殿物を除去した上清を用いることが好ましい。酵素液の添加量は、セルロースを分散させた基質溶液１００μＬに対して、好ましくは１〜１５μＬ、より好ましくは、１〜１０μＬ、さらに好ましくは１〜５μＬである。
酵素液の濃度は、特に限定されない。吸光度減少値の測定が困難な場合は酵素液を希釈したり、セルロース濃度を調整したりすればよい。
また、サンプルの一部の成分酵素の濃度をそろえて検定を行ってもよい。一部の成分酵素の濃度をそろえることで、他の成分酵素の活性をより正確に検定することができる。この場合、例えば、一部の成分酵素の濃度を０〜２０Ｕ／Ｌにそろえることが好ましい。より好ましくは１〜１５Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは５〜１０Ｕ／Ｌである。なお、成分酵素としては、βグルコシダーゼ（ＢＧＬ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）などが挙げられる。
【００１９】
セルロースを分散させた基質に酵素液を添加するとき、緩衝液を用いてｐＨを保持してもよい。緩衝液は酵素活性を阻害する成分がなく、ｐＨを最適値に保持できる機能を有するものであれば特に限定されない。緩衝液の具体例は前述の通りである。
【００２０】
本発明において、「酵素反応」とは、公知の方法に従って実施したものである。例えば、反応温度に設定した恒温槽やオーブンなどに反応容器を入れ、振盪する等の方法により実施することができる。
酵素反応の温度は、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは４０〜６０℃、さらに好ましくは４０〜５０℃である。
酵素反応の時間は、好ましくは１５分〜６時間、より好ましくは３０分〜２時間、さらに好ましくは５０〜７０分である。
【００２１】
酵素反応における反応容器としては、試験官、フラスコ、ビーカー、シャーレ、マイクロプレートなどを用いることができる。同時に多数の酵素反応を行うことができ、かつ同じ容器で吸光度測定ができるため、マイクロプレートを用いることが好ましい。
【００２２】
また、本発明において、「吸光度減少値」とは、基質溶液の酵素反応前に対する酵素反応後の吸光度の減少値を示しており、例えば、酵素反応後の吸光度からから酵素反応前の吸光度を差し引くことにより算出することができる。
【００２３】
本発明において、前記吸光度減少値が大きい酵素液ほど、セルラーゼ活性が高いと判断することができる。このことは、吸光度減少値とフィルターペーパー分解活性（ＦＰＵ活性）には、概ね比例関係が認められることから支持される。
一方、従来用の簡易な検定方法の一つとして、ハロー径による検定が挙げられる。この検定方法は、ＦＰＵ活性の低いサンプルを除く一次スクリーニングでは有用だが、ハロー径の大きさとＦＰＵ活性には比例関係が見られない。
よって、本発明の検定方法は、簡易な操作で、ＦＰＵ活性を正確に検定することができる点で優位性があるということができる。
本発明のセルラーゼ活性の検定において、基準となるサンプルを作製せず、成分酵素が未知のサンプルについて活性比較を行うこともできる。ただし、基準となるサンプルを作製して、活性の目安としてもよい。
【００２４】
［第二実施形態］
本発明の第二実施形態のセルラーゼ活性の検定方法について、図２を参照して説明する。まず、検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率の異なる希釈液を６つ以上調製する（工程Ｊ）。次に、同じ波長で測定し吸光度が等しいセルロースを同じ濃度で分散させた基質溶液を６つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する（工程Ａ’）。次に行う工程Ｂ’〜工程Ｄ’は第一実施形態の工程Ｂ〜Ｄと同様である。さらに、前記酵素液のセルラーゼ活性を検定する（工程Ｅ’）。
【００２５】
工程Ｅ’の検定では、前記酵素液の希釈率と前記吸光度減少値の相関曲線を作成し（工程Ｋ）、前記相関曲線において、前記希釈率と前記吸光度減少値が比例関係にある範囲を抽出し（工程Ｌ）、前記範囲における前記相関曲線を元に、前記吸光度減少値の前記範囲における最大値が大きいものほどセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する（工程Ｆ）。
【００２６】
本発明において、「酵素の希釈液」とは、セルラーゼ活性を検定したい酵素液を、濃度の異なるように希釈した溶液であり、６つ以上用意する。各希釈液の希釈率の間隔は１０〜３０％とすることが好ましく、例えば、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％とすることができる。ただし、０％の希釈液とは、酵素液を加えていない溶液を示す。
希釈率は、希釈後の容量に対する希釈前の容量の百分率として算出することができる。
【００２７】
本発明において、「相関曲線」とは、酵素液の希釈率と吸光度減少値の相関関係を曲線状に示したものであり、見やすさの観点から、横軸を希釈率、縦軸を吸光度減少値とすることが好ましい。
基準となる相関曲線は作成せず、成分酵素が未知のサンプルについて相関曲線を作成し、セルラーゼ活性の検定に用いることもできる。ただし、基準となる相関曲線を作成して、活性の目安としてもよい。
また、サンプルの一部の成分酵素の活性をそろえて相関曲線を作成してもよい。
【００２８】
本発明において、「比例関係にある範囲」は、相関曲線において、視覚的に直線であると判断することができる領域を示す。
【００２９】
比例関係となる範囲の抽出にあたり、グラフの傾きが大きすぎたり小さすぎたりして抽出が困難な場合、希釈率を変更してグラフを作り直してもよい。
【００３０】
希釈率と吸光度減少値が比例関係にある範囲における、吸光度減少値の最大値が大きいものほどセルラーゼ活性が高いと判断することができる。さらに具体的には、βグルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性が高いと判断することができる。
【００３１】
ＢＧＬ活性が高いと、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）の生成物であるセロビオースのグルコースへの分解が加速し、ＣＢＨの生成物阻害が解除される傾向になる。ＣＢＨの生成物阻害が解除されると、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の生成物であるセロオリゴ糖のセロビオースへの分解が加速し、ＥＧの生成物阻害が解除される傾向になる。よって、セルラーゼ全体のセルロース分解性が向上する。
【００３２】
［第三実施形態］
本発明の第三実施形態のセルラーゼ活性の検定方法について、図３を参照して説明する。まず、検定の対象となる種類の異なる酵素液について、同一の酵素液ごとに希釈率８０％、１００％の酵素液の希釈液を調製する（工程Ｊ’）。次に、同じ波長で測定した吸光度が等しい、セルロースを同じ濃度で分散させた同じ濃度の基質溶液を２つ以上調製し、前記基質溶液の吸光度を測定する（工程Ａ’’）。次に行う工程Ｂ’〜Ｄ’は第一実施形態の工程Ｂ〜Ｄおよび第二実施形態の工程Ｂ’〜Ｄ’と同様である。
工程Ｅ’’の検定では、前記酵素液の希釈率が８０〜１００％における吸光度減少値の変化率が大きいものほどセルラーゼ活性が高いと判断する（工程Ｇ）。さらに具体的には、ＣＢＨ活性が高いと判断することができる。
【００３３】
ＣＢＨ活性が高いと、ＥＧの生成物であるセロオリゴ糖のセロビオースへの分解が加速し、ＥＧの生成物阻害が解除される傾向になる。これに伴って、セルラーゼ全体のセルロース分解性が向上する。
【００３４】
［第四実施形態］
本発明の第四実施形態のセルラーゼ活性の検定方法について、図４を参照して説明する。本形態では、第二実施形態および第三実施形態の構成を含み、第二実施形態の工程Ｆにおいてセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断され、かつ第三実施形態の工程Ｇにおいてセルラーゼ活性が高い酵素液であると判断される酵素液を、セルラーゼ活性が最も高い酵素液であると判断する。本形態でセルラーゼ活性が高いと判断された酵素液は、糖化性能にも相関がある。
なお、第二実施形態と第三実施形態とでセルラーゼ活性が高いと判断される酵素液が異なる場合は、希釈率１００％における吸光度減少値が大きい方が、セルラーゼ活性が高い酵素液であると判断する。
【００３５】
［第五実施形態］
本発明の第五実施形態のセルラーゼ活性の検定方法について、図５を参照して説明する。前記酵素反応を行う工程である前記工程Ｂ又は前記工程Ｂ’の後、且つ前記酵素反応後の吸光度を測定する工程である前記工程Ｃ又は工程Ｃ’の前に、前記基質溶液に反応停止剤を添加し分散させて、酵素反応を停止させる（工程Ｍ）。
酵素反応は、基質上に反応停止剤を分散させて停止させることが好ましい。反応を停止することにより、その後の吸光度測定等の作業が効率よく行える。
なお、検定は先に述べた第一〜第四実施形態と同様に行うことができる。
【００３６】
反応停止剤は、例えば強アルカリ溶液、具体的にはＮａＯＨ、ＫＯＨを使用することができる。
反応停止剤の濃度は、好ましくは０．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７５〜１．２５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．７５〜１．０ｍｏｌ／Ｌである。当該範囲であると、反応を確実に停止することができ、かつ吸光度測定値に影響を与えないので好ましい。
反応停止剤の添加量は、セルロースを分散させた基質溶液１００μＬに対して、好ましくは１〜１５μＬ、より好ましくは１〜１０μＬ、さらに好ましくは１〜５μＬである。
【００３７】
≪スクリーニング≫
［第一実施形態］
前記セルラーゼ活性の検定方法の第一実施形態、又は、第二〜第五実施形態を用いて、一度に大量のサンプルをスクリーニングすることができる。具体的には、酵素液や微生物培養液の活性比較を行うことができる。
【００３８】
≪微生物の選別≫
［第一実施形態］
前記スクリーニング方法を用いて、高性能セルラーゼ生産菌を選別することができる。具体的には、下記の手順を用いることができる。
（１）親株とする微生物の培養、および変異処理
（２）ハロー径測定による一次スクリーニング
（３）吸光度減少値測定による二次スクリーニング
なお、上記（１）、（２）、（３）をそれぞれ繰り返してもよく、（１）〜（３）のセットを繰り返してもよい。また、状況に応じて、（２）を飛ばしてもよい。各手順について、以下に詳細に説明する。
【００３９】
（１）親株とする微生物の培養、および変異処理
親株とする微生物は、セルラーゼ活性を示す微生物であれば特に限定されない。例えば、アクレモニウム(Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ラミコラ（Ｒａｍｉｃｏｌａ）属等に属する微生物を用いることができる。セルラーゼ生産能が高いという観点からアクレモニウム属、トリコデルマ属が好ましく、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株の突然変異株として得られたアクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株またはその変異株がより好ましい。
【００４０】
親株とする微生物の培養方法は、選択した微生物を培養できれば特に限定されない。培養に用いる培地成分は、公知のものを使用することができる。培養温度は、ｐＨ、培養時間は公知の条件を設定することができる。
【００４１】
変異処理は、一般に知られている任意の方法を用いることができる。例えば、紫外線を照射したり、Ｎ−メチル−Ｎ‘−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異処理剤を作用させたりすることが挙げられる。もしくは、遺伝子組み換え操作によって行ってもよい。操作手順は、「分子生物学実験プロトコールI, II, III」丸善株式会社発行（１９９７）等を参考にすることができる。
【００４２】
（２）ハロー径測定による一次スクリーニング
「（１）親株とする微生物の培養、および変異処理」で得た培養液に対して、公知のハロー径測定方法に従って実施すればよい。ハロー形成培地には、例えば、微結晶セルロースのアビセル、酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、セルロースナノファイバー、セルロースに青色色素Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｂｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒを結合させた色素結合セルロースのＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ａｚｕｒｅ（シグマ社製）などを基質として、培地中に分散させたものを用いることができる。
【００４３】
スクリーニングにおいては、形成されるハロー径が、親株により形成されるハロー径よりも大きいものを選別すればよい。
【００４４】
（３）吸光度減少値測定による二次スクリーニング
「（２）ハロー径測定による一次スクリーニング」で選別した微生物の培養液にて、≪セルラーゼ活性の検定方法≫の第一実施形態又は第二〜第五実施形態の手順にてセルラーゼ活性の検定を実施する。第二〜第五実施形態の手順にてセルラーゼ活性の検定を行い、糖化性能の高い微生物を選別することが好ましい。
【００４５】
≪アクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株≫
本発明において、前記微生物の選別方法を用いて、糖化性能の高いセルラーゼ活性を有するアクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株を選別した。ポテトデキストロース平板培地（ポテトデキストロース（Ｄｉｆｃｏ）：２４ｇ／Ｌ、寒天：１５ｇ／Ｌ、ｐＨ：５．６±０．２）を用いて１４日間培養し、その形態を観察した。
アクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株の微生物学的性質は以下のとおりである。
【００４６】
（形質的性質）
（１）アクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株の栄養菌糸（好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態の菌糸）は、隔壁を有し、無色であり、表面は平滑な形状であった。
（２）アクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株のコロニーは直径約４０〜６０ｍｍ、黄白色〜白色、平坦で中心部に白い丘を呈するビロード状であり、培地下部への浸潤も認められた。
【００４７】
（生殖様式）
（１）二分裂による増殖を行う。
【００４８】
（生理学・生化学性状）
（１）生育温度域：１５℃〜４３℃（至適温度３０℃付近）。
（２）生育ｐＨ域：ｐＨ３．５〜６．０（至適ｐＨは４．０付近）。
【００４９】
以上の点から、アクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５株は、形態観察その他よりアクレモニウム属の子嚢菌と同定した。
アクレモニウム・セルロリティカスＳ−１７４５株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
近縁であるアクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（アクセッションＮｏ．ＡＢ４７４７４９）の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子と比較したところ、相同率は９９．３％であったが、アクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５株は、同一種ではない新規の子嚢菌株と判断した。
なお、アクレモニウム・セルロリティカスＳＤ１７４５株は、平成２７年１月１４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にプタベスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９９２として国際寄託されている。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
≪実施例１：相関曲線による検定≫
１−１．基準酵素液の作製
アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＮ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０８；以下、ＴＮ株と記載）を、液体培地５ｍＬを入れたφ１８ｍｍ試験管で、３０℃で６日間好気培養した。培養後、遠心分離して菌体除去し、上清を取得して基準酵素液とした。なお、液体培地の組成は下記の通りである。
（液体培地）
アビセル：５０ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２４ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム：５ｇ／Ｌ
酒石酸カリウム１／２Ｈ２Ｏ：４．７ｇ／Ｌ
尿素：４ｇ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ８０：１ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．２ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／Ｌ
【００５２】
１−２．調製酵素液の作製
メイセラーゼ（ＭＥＩＪＩ製セルラーゼ原末）の濃度が１５．６ｍｇ／ｍＬになるように、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）で溶解した。この溶液を、基準酵素液と容積比１：１で混合した酵素液を作製した。得られた酵素液を調製酵素液１とした。
次に、基準酵素液にＢＧＬ原末（β−グルコシダーゼ、製品番号３０６−５０９８１、和光純薬社製）の濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように溶解した調製酵素液を作製した。この酵素液を調製酵素液２とした。
次に、調製酵素液１にＢＧＬ原末を濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように溶解した調製酵素液を作製した。この酵素液を調製酵素液３とした。
【００５３】
１−３．基準酵素液、調製酵素液におけるＦＰＵ活性の測定
ＦＰＵ活性は、セルラーゼによるろ紙の分解活性であり、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１ユニット（ＦＰＵ：Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｕｎｉｔ）と定義される。
測定には、米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）のＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）を用いた。１×６ｃｍにカットしたろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１）を入れたキャップ付き試験管に、クエン酸ナトリウムバッファーと１−１および１−２にて調製した酵素液を添加し、酵素反応を行った。反応後の溶液ジニトロサリチル酸試薬を加えて１００℃で加熱発色した。その後、氷水で冷却し、発色液を純水で希釈した。得られた溶液の波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線よりＦＰＵ活性を算出した。
【００５４】
基準酵素液、調製酵素液１〜３におけるＦＰＵ活性の測定結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2016154469.tif 000002
【００５６】
１−４．基準酵素液、調製酵素液のＦＰＵ活性統一
基準酵素液、調製酵素液１〜３のＦＰＵ活性を統一するために、調製酵素液２は体積比が１．１倍になるように、調製酵素液３は体積比が１．１５倍になるように、それぞれ酢酸緩衝液で希釈した。
【００５７】
１−５．ＦＰＵ活性を統一した基準酵素液、調製酵素液による相関曲線の作成
（１）リン酸膨潤セルロースの作製
氷冷したリン酸にアビセルを添加して溶液を調製し、氷冷水１９００Ｌに前記溶液を添加してリン酸膨潤セルロースの懸濁液を作製した。懸濁液を吸引ろ過し、ろ過面に回収されたセルロースケーキに対して純水洗浄を４回、ＮａＨＣＯ３水溶液による中和洗浄を２回、さらに純水洗浄を行った。洗浄後、セルロースを回収し、日本精機製作所社製  エクセルオートホモジナイザーＥＤ−７（５００ｍＬＳＵＳ）により、１２，００００ｒｐｍの６０分間ホモジナイズ処理をしてリン酸膨潤セルロースとした。リン酸膨潤セルロースに対するセルロースの固形分濃度は、３３質量％であった。
【００５８】
（２）希釈率の異なる酵素液の作製
続いてＦＰＵ活性を統一した基準酵素液、調製酵素液を、それぞれ５０ｍＭ酢酸緩衝液で希釈して、希釈率０％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、１００％（未希釈）の希釈液を作製した。なお、希釈率は希釈後の容量に対する希釈前の容量の百分率である。０％の希釈液は、緩衝液のみの溶液である。
【００５９】
（３）酵素反応
反応にはリン酸膨潤セルロース（基質溶液）に寒天（支持体）を加えたものを用いた。セルロース、寒天は、基質溶液に対してそれぞれ３．３質量％、１．２質量％になるよう酢酸緩衝液で調製し、加熱し寒天を一度溶解させた。これを、９６穴マイクロプレートに１００μＬになるように加えた。そこに前述の基準酵素液および調製酵素液の希釈液をそれぞれ２μＬずつ添加した。その後、５０℃で６０分間、酵素反応を行った。
なお、反応前の基質の吸光度（波長５４０ｎｍ）は０．５７であった。
【００６０】
（４）吸光度減少値の測定
酵素反応後、０．７５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを２μＬ添加して反応を停止させた。得られた溶液の吸光度（波長５４０ｎｍ）を測定し、その値を反応前の値から差し引いて値を反応時の吸光度減少値を算出した。吸光度の測定には、マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、マイクロプレートのウェルにセットしたサンプルの吸光度を測定した。吸光度の測定にあたり、ブランクとしては基質溶液に酵素液と同容量の水を加えた溶液を用いた。
【００６１】
（５）相関曲線の作成
横軸を酵素の希釈率（％）、縦軸を吸光度減少値としてそれぞれ相関曲線を作成した。相関曲線は図６に示す。
【００６２】
１−６．検定
基準酵素液、調製酵素液１〜３における比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値、および、希釈率８０〜１００％における吸光度減少値の変化率を表２に示す。なお、比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値を抽出するために、図６を用いた。
また、検定の精度を確認するため、各酵素のＢＧＬ活性、ＣＢＨ活性、ＥＧ活性、ＢＭ（ボールミル）粉砕アビセルの糖化率を測定した。結果を表２に併記する。なお、ＢＧＬ活性、ＣＢＨ活性、ＥＧ活性、ＢＭ粉砕アビセルの糖化率は、次に示す方法で算出、測定した。
【００６３】
（ＢＧＬ活性）
ＢＧＬ活性は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を基質とした酵素反応で遊離したｐ−ニトロフェノールを定量して算出した。具体的には、酢酸緩衝液に溶解したｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド溶液を入れた試験管に酵素液を添加して反応させ、炭酸ナトリウム水溶液、純水を添加した後、波長４００ｎｍで吸光度を測定した。続いて、検量線を基に、反応液のｐ−ニトロフェノールを定量し、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットとして活性を算出した。
【００６４】
（ＣＢＨ活性、ＥＧ活性）
ＣＢＨ活性はアビセル、ＥＧはカルボキシセルロースを基質とした酵素反応で遊離した還元糖を定量して算出した。具体的には、酢酸緩衝液に溶解したアビセル溶液またはカルボキシセルロース溶液を試験官に入れ、酵素液を添加して反応させ、ジニトロサリチル酸試薬を加えて１００℃で加熱発色をした。その後、発色液を氷冷し、純水で希釈して波長５４０ｎｍで吸光度を測定した。続いて、検量線を基に反応液のグルコースを定量し、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１ユニットとして活性を算出した。
【００６５】
（ＢＭ粉砕アビセルの糖化率）
基質としてＢＭ粉砕アビセルを用い、酢酸緩衝液の存在下、各酵素液を４０℃で７２時間反応させた後の糖化率を測定した。具体的には、得られた糖化液について、グルコースアナライザー、高速液体クロマトグラフィー、グルコース測定キットなどの公知の方法により分析を行ってグルコースを定量し、糖化率を次の数式により算出した。
糖化率＝（反応液のグルコース濃度［％］）×０．９／（反応前のセルロース濃度［％］）
【００６６】
【表２】
2016154469.tif 000003
【００６７】
１−７．検定結果の考察
表２より、調製酵素液２、３は比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値が大きい。よってＢＧＬ活性が高い判断することができる。調製酵素液１、３は希釈率８０〜１００％における濁度減少値の変化率が大きい。よってＣＢＨが高いと判断することができる。調製酵素液３は、比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値が高く、希釈率８０〜１００％における吸光度減少値の変化率が大きい。よって糖化性能が高いと判断することができる。
一方、別途測定したＢＧＬ活性は調製酵素液２、３で高い値を示している。ＣＢＨ活性は調製酵素液１、３で高い値を示している。ＢＭ粉砕アビセルの糖化率は、調製酵素液３において高い値を示している。
【００６８】
以上より、本発明の検定方法と実際の成分酵素の活性、糖化性能に相関性があることを確認することができた。
【００６９】
≪実施例２：吸光度減少値によるスクリーニング≫
２−１．変異株作製
親株としてＴＮ株を用い、ポテトデキストロース（Ｄｉｆｃｏ社製）２４ｇ／Ｌの液体培地にて、３０℃で２４時間培養を行った。得られた培養液をシャーレに分注して、紫外線を１〜６分照射して変異処理株液を作製した。
【００７０】
２−２．ハロー径測定による一次スクリーニング
変異処理液を、菌体濃度が寒天培地あたり２０〜２００コロニー／ｍｌになるように生理食塩水で希釈し、３０℃で５日間、ハロー培地で培養した。セルロースの白濁が透明化したハローを観察し、ハロー径が８ｍｍ以上のものを選抜した。
ハロー培地は下記組成のものを用いた。なお、リン酸膨潤セルロースは実施例１と同様のものを用いた。
（ハロー培地）
リン酸膨潤セルロース：５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム：１．４ｇ／Ｌ
酒石酸カリウム１／２Ｈ２Ｏ：４．７ｇ／Ｌ
オキシガル（Ｄｉｆｃｏ社製）１５ｇ／Ｌ
ペプトン（Ｄｉｆｕｃｏ社製）：１ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．４ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．３ｇ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ８０：０．２ｇ／Ｌ
尿素：０．４ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ・１０ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ／Ｌ
寒天：２０ｇ／Ｌ
【００７１】
２−３．吸光度減少値測定による二次スクリーニング
一次スクリーニングで選抜した株をそれぞれ培養した。培養条件は「２−２．ハロー径測定による一次スクリーニング」にて行った培養と同様の条件にて行った。培養後、遠心分離して菌体を除去し、上清を取得した。各上清について、希釈率１０％の吸光度減少値を測定した。希釈率は希釈後の容量に対する希釈前の容量の百分率である。吸光度減少値の測定は実施例１と同様の方法にて行った。なお、吸光度減少値を測定する溶液を希釈率１０％とした理由は、希釈率１０％にすると親株のＦＰＵ活性が１Ｕ／ｍＬとなり、活性の比較がしやすいと判断したためである。
【００７２】
２−４．検定
表３に、親株、および１次スクリーニングにおいてハロー径が８ｍｍ以上であった株の吸光度減少値を示す。また、検定の精度を確認するため、ＦＰＵ活性を測定した。結果を表３に併記する。なお、ＦＰＵ活性は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００７３】
【表３】
2016154469.tif 000004
【００７４】
２−５．検定結果の考察
表３より、吸光度減少値が０．０３８を示した株が、セルラーゼ活性が最も高いと判断することができる。
一方、別途測定したＦＰＵ活性は、吸光度減少値が０．０３８を示した株が最も高い値を示している。よって、本発明の検定方法により、セルラーゼ活性の高いものを正確に判断できることを確認することができた。
【００７５】
また、図７にハロー径とＦＰＵ活性値の関係を、図８に吸光度減少値とＦＰＵ活性の関係を示す。
図７より、ハロー径の大きさとＦＰＵ活性値の間にはあまり相関が見られない。一方、図８より、吸光度減少値とＦＰＵ活性には概ね比例関係が見られる。このことより、ハロー径による検定は、活性の低い株を排除する一次スクリーニングには適するものの、ＦＰＵ活性の高い株を正確な選別には適さないことがわかる。これに対し、吸光度減少値による検定は、その大小を調べることによりＦＰＵ活性を検定することができ、二次スクリーニングとして適していることがわかった。
【００７６】
≪実施例３：微生物の選別≫
３−１．変異株作製、ハロー径測定による一次スクリーニング、吸光度減少値測定による二次スクリーニング
実施例２で吸光度減少値が最大値（０．０３８）を示した菌株をＦ１７株と名付けた。Ｆ１７株に対して、実施例２と同様に変異株作製、ハロー径測定による一次スクリーニング、吸光度減少値による二次スクリーニングを行った。
スクリーニングの結果、吸光度減少値が最も大きいＳ１７４５株（吸光度減少値：０．０５９）、２番目に大きいＳ１７８９株（吸光度減少値：０．０５２）を選別した。
【００７７】
３−２．相関曲線の作成
親株であるＴＮ株、およびスクリーニングにより選別したＳ１７４５株、Ｓ１７８９株について、実施例１と同様に相関曲線を作成した。結果を図９に示す。
【００７８】
３−３．微生物の選別
親株のＴＮ株と、Ｆ１７４５株、Ｆ１７８９株における比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値、および希釈率８０〜１００％における吸光度減少値の変化率を表４に示す。なお、比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値を抽出する際は、図９を用いた。
また、検定の精度を確認するため、各株のＦＰＵ活性、ＢＧＬ活性、ＣＢＨ活性、ＥＧ活性、ＢＭ粉砕アビセルの糖化率、水熱微粉砕バガス糖化率を測定した。結果を表４に併記する。なお、ＦＰＵ活性、ＢＧＬ活性、ＣＢＨ活性、ＥＧ活性、ＢＭ粉砕アビセルの糖化率は、実施例１と同様の方法にて測定した。水熱微粉砕バガスは、原料を水熱微粉砕バガスとした点以外はＢＭ粉砕アビセルの糖化率と同様の方法にて測定した。
【００７９】
【表４】
2016154469.tif 000005
【００８０】
３−４．考察
表５より、Ｓ１７４５株は、Ｓ１７８９株よりも比例関係の範囲における吸光度減少値の最大値が高く、希釈率８０〜１００％における吸光度減少値の変化率が大きい。このことより、本発明の検定方法によれば、高性能セルラーゼ生産菌としてＳ１７４５株を選別することができる。
一方、別途測定したＦＰＵ活性、ＢＧＬ活性、ＣＨ活性、ＥＧ活性は、Ｓ１７４５株において高い値を示している。また、ＢＭ粉砕アビセルの糖化率、水熱微粉砕バガスはＳ１７４５株において高い値を示している。
【００８１】
以上より、本発明の検定方法により、高性能セルラーゼ生産菌を正確に選別できることを確認することができた。
【図１】
2016154469.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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