(57)【要約】【課題】  本発明は、がん、特にｐ５３を単独で発現させた場合には十分な治療効果が認められないｐ５３治療に抵抗性を示すがんにおいて、その抵抗性を減弱させ、ｐ５３の有するがん治療効果を増強することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて使用するための、ある特定の核酸を含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬を提供する。【選択図】図４
2016023182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて使用するための、配列番号１〜２８のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡを含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬。
【請求項２】
ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と、
配列番号１〜２８のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡ
とを含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬。
【請求項３】
ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質が、ｐ５３タンパク質およびその機能的等価物、これらをコードする核酸、ならびに変異ｐ５３の機能を回復させる物質よりなる群から選択される１以上の物質である、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、
ｓｉＲＮＡを構成する二本鎖ＲＮＡのうちのいずれか一方のＲＮＡ鎖、または
該ＲＮＡ鎖とその相補的ＲＮＡ鎖とがヘアピンループを形成することができる一本鎖ＲＮＡ部分によって連結された構造を有するｓｈＲＮＡ
をコードする、請求項１から３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
前記ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２９に示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされる、請求項４に記載の医薬。
【請求項７】
ｐ５３を活性化する処置とさらに組み合わせて使用される、請求項１から６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
ｐ５３を活性化する処置が、がんの放射線治療または化学療法である、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
ｐ５３を活性化する物質と、請求項１から６のいずれかに記載の医薬とを組み合わせた、組み合わせ医薬。
【請求項１０】
ｐ５３を活性化する物質が、化学療法のための抗がん剤である、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５３および／もしくはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて使用するための、またはｐ５３および／もしくはｐ５３を誘導する物質と組み合わせた、ある特定の核酸を含有する、がんを処置するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抑制因子として知られるｐ５３は、ストレス条件下に置かれた細胞において細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘導する。ヒトに生じる全てのがんの約半数でｐ５３遺伝子の突然変異に起因するｐ５３タンパク質の異常が認められており（非特許文献１）、ｐ５３の欠失および活性を失った変異ｐ５３の存在はがんの進展や治療抵抗性に大きく関与すると考えられている。例えば、ｐ５３の欠失または変異が、発がんを引き起こすのみならず化学療法や放射線治療に対する抵抗性にも関与していることが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ウイルスベクターを用いてｐ５３を発現させることでがんを治療する遺伝子治療は、いくつかが臨床試験段階にあるものの、必ずしも全てのがんにおいて良好な治療成績を示すわけではない（非特許文献３および４）。
【０００４】
近年、ｐ５３を用いたがんの遺伝子治療をより有効なものとするための技術開発が進められている。その１つとして、本発明者らは、ｐ５３の標的遺伝子であってアポトーシス阻害的に働くｐ２１の発現を抑制する人工ｍｉＲＮＡとｐ５３とを共発現するアデノウイルスベクターを開発しており、ｐ５３を単独で発現させた場合よりも強いアポトーシス誘導効果および腫瘍退縮効果を有することを確認している（非特許文献５、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／１２５６０７号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０８（６８１０）：３０７−３１０
【非特許文献２】Ｂｒｏｓｈ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；９（１０）：７０１−７１３
【非特許文献３】Ｒｏｔｈ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９６；２（９）：９８５−９９１
【非特許文献４】Ｔａｚａｗａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；１３（１１）：１５６９−１５８３
【非特許文献５】Ｉｄｏｇａｗａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；１５（１１）：３７２５−３７３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、がん、特にｐ５３を単独で発現させた場合には十分な治療効果が認められないｐ５３抵抗性を示すがんにおいて、その抵抗性を減弱させ、ｐ５３の有するがん治療効果を増強することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ある種の核酸が、ｐ５３抵抗性のがんにおいてもｐ５３にアポトーシス誘導作用を発揮させることを見出し、下記の各発明を完成させた。
【０００９】
（１）ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて使用するための、配列番号１〜２８のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡを含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬。
（２）
ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と、
配列番号１〜２８のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡ
とを含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬。
（３）ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質が、ｐ５３タンパク質およびその機能的等価物、これらをコードする核酸、ならびに変異ｐ５３の機能を回復させる物質よりなる群から選択される１以上の物質である、（１）または（２）に記載の医薬。
（４）前記ＤＮＡが、
ｓｉＲＮＡを構成する二本鎖ＲＮＡのうちのいずれか一方のＲＮＡ鎖、または
該ＲＮＡ鎖とその相補的ＲＮＡ鎖とがヘアピンループを形成することができる一本鎖ＲＮＡ部分によって連結された構造を有するｓｈＲＮＡ
をコードする、（１）から（３）のいずれかに記載の医薬。
（５）前記ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列を含む、（１）から（４）のいずれかに記載の医薬。
（６）前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２９に示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされる、（４）に記載の医薬。
（７）ｐ５３を活性化する処置とさらに組み合わせて使用される、（１）から（６）のいずれかに記載の医薬。
（８）ｐ５３を活性化する処置が、がんの放射線治療または化学療法である、（７）に記載の医薬。
（９）ｐ５３を活性化する物質と、（１）から（６）のいずれかに記載の医薬とを組み合わせた、組み合わせ医薬。
（１０）ｐ５３を活性化する物質が、化学療法のための抗がん剤である、（９）に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、がんのｐ５３抵抗性を減弱させ、ｐ５３のがん治療効果を増強することができる。したがって、従来のｐ５３単独療法では困難であったｐ５３抵抗性がんを効果的に処置することが可能になる。さらに、本発明の医薬はウイルスベクターの使用を必須としないことから、ウイルス治療の欠点や副作用を回避し得るという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング工程を示す概略図である。
【図２】ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング結果を示す図である。（Ａ）ｐ５３を導入したＨｕｈ−７細胞およびＰａｎｃ−１細胞中のｓｈＲＮＡ集団について、ｃＤＮＡマイクロアレイによる定量を行った結果を示す図である。ｐ５３導入細胞における各ｓｈＲＮＡの量を、ＬａｃＺを導入したコントロール細胞におけるｓｈＲＮＡの量に対してプロットした。（Ｂ）Ｈｕｈ−７細胞およびＰａｎｃ−１細胞において選択されたｓｈＲＮＡの重複を表すベン図である。
【図３】ｐ５３誘導性アポトーシスに対するｓｈＲＮＡ−５８３３５の効果を示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＨｕｈ−７細胞にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを感染させ、アドリアマイシン処理を行った場合の、Ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージを示す図である。エラーバーは標準誤差を、＊はｔ−検定でｐ値が＜０．０５であることを表す。（Ｂ）Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを感染させたＨｕｈ−７細胞の代表的なフローサイトメトリーを示す図である。Ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージが図中に示される。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＨｕｈ−７細胞にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを感染させ、アドリアマイシン処理を行った場合の、全細胞溶解液を用いたウェスタンブロット分析の結果を示す図である。（Ｄ）ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＳＷ４８０細胞にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを感染させた場合の、全細胞溶解液を用いたウェスタンブロット分析の結果を示す図である。図中、左から、レーン１：ｓｈＲＮＡ−５８３３５＋Ａｄ−ｐ５３、レーン２：ｓｈＲＮＡコントロール配列＋Ａｄ−ｐ５３、レーン３：ｓｈＲＮＡ−５８３３５＋Ａｄ−ＬａｃＺ、レーン４：ｓｈＲＮＡコントロール配列＋Ａｄ−ＬａｃＺである。
【図４】ｓｈＲＮＡ−５８３３５のがん治療効果を示す図である。ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＨｕｈ−７細胞を移植して腫瘍を形成させたマウスに、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを合計３回（図中の矢印）、腫瘍内注射した。第０日の腫瘍体積に対する相対的な腫瘍体積が図に示される。図中の白丸はＡｄ−ｐ５３注射群、黒丸はＡｄ−ＬａｃＺ注射群である。データは３匹のマウスの平均値である。エラーバーは標準誤差を、＊はｔ−検定でｐ値が＜０．０５であることを表す。
【図５】アデノウイルスによるｐ５３導入に代えて、ＰＲＩＭＡ−１を使用してｐ５３の機能を回復させた場合の、ｐ５３誘導性アポトーシスに対するｓｈＲＮＡ−５８３３５の効果を示す図である。（Ａ）ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＨｕｈ−７細胞に対してＰＲＩＭＡ−１および／またはアドリアマイシン処理を行った場合の、Ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージを示す図である。（Ｂ）ＰＲＩＭＡ−１および／またはアドリアマイシン処理を行ったＨｕｈ−７細胞の代表的なフローサイトメトリーを示す図である。Ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージが図中に示される。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはｓｈＲＮＡコントロール配列を安定発現するＰａｎｃ−１細胞に対してＰＲＩＭＡ−１および／またはＶＰ−１６処理を行った場合の、Ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞のパーセンテージを示す図である。（Ａ）および（Ｃ）において、エラーバーは標準誤差を、＊はｔ−検定でｐ値が＜０．０５であることを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一実施形態は、ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて使用するための、ある特定の核酸を含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬に関する。
【００１３】
（１）ｐ５３
本発明におけるｐ５３とは、正常な機能を有するｐ５３タンパク質、すなわち、野生型のｐ５３タンパク質をいう。かかる正常な機能を有するｐ５３は、ＤＮＡ損傷、低酸素状態などのストレス条件下で活性化され、四量体を形成する。その四量体が標的遺伝子の転写調節領域に特異的に結合することで、それらの遺伝子の発現を誘導し、細胞周期停止、アポトーシス誘導、ＤＮＡ修復などの腫瘍抑制作用を引き起こす。
【００１４】
また、本発明において用いられるｐ５３は、上述の正常な機能を有するｐ５３タンパク質に加えて、これらと機能的に等価である、すなわち細胞または生体内でｐ５３と同等の機能を発揮することができる機能的等価物を包含する。ｐ５３の機能的等価物としては、具体的に、ｐ５３ファミリーのタンパク質、ならびにそれらのアイソフォーム、機能的断片およびキメラタンパク質、ならびにそれらの機能的変異体を挙げることができる。
【００１５】
ｐ５３ファミリーとしては、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３が挙げられる。これらをコードする核酸の塩基配列は、公的に利用可能なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などにおいて開示されており、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０００５４６（ヒトｐ５３）、ＮＭ＿００３７２２（ヒトｐ６３）、ＮＭ＿００５４２７（ヒトｐ７３）、ＮＭ＿００１００３２１０（イヌｐ５３）、ＮＭ＿００１００９２９４（ネコｐ５３）、ＸＭ＿５４５２４９（イヌｐ６３）、ＡＹ０６９９８９（イヌｐ７３）などとして入手することができる。
【００１６】
ｐ５３ファミリーのタンパク質には多数のアイソフォームが存在する。本発明におけるｐ５３ファミリーのタンパク質のアイソフォームとしては、例えば、ｐ５３およびｐ６３についてはα、βおよびγ、ｐ７３についてはα、β、γ、δ、ε、θ、ζ、ηおよびη１を挙げることができる。
【００１７】
さらに、ｐ５３ファミリーのタンパク質は、Ｎ末端側から順に、転写活性およびＭＤＭ２との結合を制御するトランス活性化ドメイン（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ，ＴＡＤ）、標的遺伝子のプロモーター部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ，ＤＢＤ）ならびに四量体形成に関与するオリゴマー形成ドメイン（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ，ＯＤ）という３つのドメイン構造を有している（例えば、Ｗｅｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２０１２；２０１２：６８７３５９などを参照）。したがって、本発明において用いられるｐ５３ファミリーの機能的断片は、これらのドメインを少なくとも１つ含むｐ５３ファミリータンパク質の断片であって、ｐ５３タンパク質と機能的に等価である断片である。
【００１８】
さらに、本発明において用いられるｐ５３ファミリーのキメラタンパク質は、２以上の異なるｐ５３ファミリータンパク質に由来する、または２以上の異なる生物種に由来する上述のドメインを含むタンパク質であって、ｐ５３タンパク質と機能的に等価であるタンパク質である。
【００１９】
ここで、ｐ５３の機能的等価物であるそれぞれのタンパク質は、以下の機能的変異体を包含する。
１）かかるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、最も好ましくは少なくとも約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｐ５３タンパク質と機能的に等価であるタンパク質。
２）かかるタンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸残基を付加し、欠失させまたは置換したタンパク質であって、ｐ５３タンパク質と機能的に等価であるタンパク質。
３）かかるタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質であって、ｐ５３タンパク質と機能的に等価であるタンパク質。
【００２０】
なお、本明細書におけるアミノ酸配列または塩基配列の同一性（％）は、当業者によって通常用いられる適当なソフトプログラム、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などを用い、比較される配列をアラインメントしたときに得られる最大のパーセント配列同一性を意味する。
【００２１】
また、アミノ酸残基の置換は、好ましくは保存的置換である。本明細書中で用いられる用語「保存的置換」とは、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の群としては、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、非極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、分岐側鎖を有するアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシンなど）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）、ヒドロキシル基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、チロシンなど）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（システイン、メチオニンなど）が挙げられる。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」とは、核酸分子の間で特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。かかる条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、ＡｕＳｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）などの標準的なプロトコルに記載されており、例えば、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄である。
【００２３】
上述のｐ５３の機能的等価物は、腫瘍抑制、細胞周期停止、アポトーシス誘導などの活性を、正常なｐ５３が有する活性と比較することで、ｐ５３と機能的に等価であることを確認することができる。かかる活性は、当業者に周知の方法で評価することができ、一例として、アポトーシス誘導活性は、カスパーゼ−３の遺伝子発現量、タンパク質発現量もしくは酵素活性を測定することにより、または細胞集団中のＳｕｂ−Ｇ１期細胞の割合をフローサイトメトリーで測定することにより、評価することができる。
【００２４】
または、ｐ５３による発現制御が知られている因子、例えば、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５、ＸＰ−Ｃ、ＤＤＢ２、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂａｘ、ＭＤＭ２などの遺伝子またはタンパク質発現量を測定することによっても、ｐ５３との機能的等価性を確認することができる。
【００２５】
（２）ｐ５３を誘導する物質
本発明におけるｐ５３を誘導する物質は、生体内で正常なｐ５３タンパク質またはその機能的等価物の発現および／または活性を誘導する能力を持つ物質であり、好ましくは、ｐ５３もしくはその機能的等価物をコードする核酸、または変異ｐ５３の機能を回復させる物質である。
【００２６】
ｐ５３またはその機能的等価物をコードする核酸は、かかる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を包含する。
【００２７】
本明細書中で用いられる用語「変異ｐ５３」とは、ｐ５３遺伝子の変異などに起因して、正常なｐ５３が有する腫瘍抑制活性が喪失または低減したｐ５３タンパク質をいい、これらの中には腫瘍増悪活性を有するものすら存在する。変異ｐ５３の多くは、野生型ｐ５３を構成するアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸残基の置換を有しており、その結果、正常なｐ５３が有する腫瘍抑制活性が損なわれるものと考えられている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２５（３）：３０４−１７；２０１４を参照）。
【００２８】
本発明において用いられる変異ｐ５３の機能を回復させる物質は、処置を受けたがんの細胞内で正常なｐ５３が有する腫瘍抑制活性と同等の腫瘍抑制活性が発揮されるように変異ｐ５３および／またはそのシグナル伝達を変化させる物質であり、例えば、変異ｐ５３の野生型活性を回復させる剤、変異ｐ５３の分解を促進する剤および変異ｐ５３のシグナル伝達下流に作用する剤が知られている（前出のＭｕｌｌｅｒ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。これらとしては、例えば、ｐ５３Ｃ末端ペプチド（例えば、Ｇａｌｉｎａ  Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｙ  １９９９；１９（５）：３３９５−３４０２に記載されるペプチド４６）およびこれをコードする核酸、ＰＲＩＭＡ−１（ＣＡＳ番号５６０８−２４−２）、ＰＲＩＭＡ−１ＭＥＴ（ＡＰＲ−２４６とも呼ばれる、ＣＡＳ番号５２９１−３２−７）、ＣＰ−３１３９８（ＣＡＳ番号２５９１９９−６５−０）、ＳＣＨ５２９０７４（ＣＡＳ番号９２２１５０−１１−６）、ＳＴＩＭＡ−１（ＣＡＳ番号９１６３４−１２−７）、ＮＳＣ３１９２６（ＣＡＳ番号６３１９−８６−４）、ＰｈｉＫａｎ０８３（ＣＡＳ番号８８０８１３−３６−５）、ＰＫ７０８８、ＲＥＴＲＡ（ＣＡＳ番号１０３６０６９−２６−７）、Ｍｉｒａ−３（ＣＡＳ番号７４５０−６８−２）、エリプチシン（ＣＡＳ番号５１９−２３−３）、ＷＲ１０６５（ＣＡＳ番号１４６５３−７７−１）、およびこれらの誘導体、ならびにグリセロールおよびトリメチルアミンＮ−オキシドなどの化学シャペロンを限定することなく挙げることができる。当業者は、処置を受けるがんが有する変異ｐ５３の種類に応じて、これらの物質を適宜選択し、本発明におけるｐ５３を誘導する物質として使用することができる。
【００２９】
本発明におけるｐ５３を誘導する物質は、ｐ５３もしくはその機能的等価物または変異ｐ５３の機能を回復させる物質をコードする塩基配列を含む核酸を包含する。かかる核酸は、一般的な遺伝子工学的方法に従って作成し、適切な発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモーター配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記核酸と機能的に連結され得る。
【００３０】
遺伝子工学的方法としては、当業者に公知または周知の手法、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋらその他の、当該技術分野の教科書またはハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコルおよび／またはパラメータに従うことが好ましい。
【００３１】
本発明におけるｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質がタンパク質である場合、一般的な遺伝子工学的方法に従って、前述の発現ベクターを原核生物または真核生物内に導入して組換えタンパク質を発現させ、これを必要に応じて精製して用いることができる。また、本発明において用いるタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって製造してもよい。
【００３２】
なお、本明細書における「タンパク質」は、「ポリペプチド」と交換可能に用いられる。
【００３３】
（３）核酸
本発明において用いられる核酸は、がんのｐ５３抵抗性を減弱させることができる核酸であり、具体的には、配列番号１〜２９の少なくともいずれか１に示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡである。これらの核酸は、その塩基配列から、ＲＮＡ干渉誘導性核酸であると推定される。
【００３４】
ＲＮＡ干渉誘導性核酸とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる核酸であり、好ましくはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはこれらをコードするＤＮＡをいう。
【００３５】
ＲＮＡ干渉は、ｍＲＮＡと同一の核酸配列またはその部分配列を含む二本鎖構造のＲＮＡが当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象である。ｓｉＲＮＡは、相互に相補的な二本のＲＮＡ鎖から構成される。ｓｈＲＮＡは、ヘアピンループ構造を取ることができる一本鎖ＲＮＡであり、二本鎖構造を形成した後、細胞内のＤｉｃｅｒにより認識、切断されて対応するｓｉＲＮＡを生じる。この二本鎖構造のＲＮＡは、好ましくは少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一の核酸配列またはその部分配列を有する。
【００３６】
本発明における核酸がｓｉＲＮＡである場合、このｓｉＲＮＡは、配列番号１〜２８の少なくともいずれか１に示される塩基配列を含むＤＮＡによりコードされるＲＮＡ鎖と、このＲＮＡ鎖と相補的な塩基配列を有する相補的ＲＮＡ鎖とがアニールして形成される。また、本発明における核酸がｓｈＲＮＡである場合、このｓｈＲＮＡは、配列番号１〜２８の少なくともいずれか１に示される塩基配列を含むＤＮＡによりコードされるＲＮＡ鎖と、このＲＮＡ鎖と相補的な塩基配列を有する相補的ＲＮＡ鎖とが、ヘアピンループを形成することができる一本鎖ＲＮＡ部分によって連結された構造を取り、その一例は配列番号２９に示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるｓｈＲＮＡである。
【００３７】
ここで、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡに由来するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、その配列に基づくＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴサーチによると、ＡＰ−２γ（ＴＦＡＰ２Ｃ）を標的とし、そのｍＲＮＡを特異的にノックダウンすることができるものと推定される。したがって、本発明における核酸は、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡおよびこれによりコードされるＲＮＡのみならず、ＡＰ−２γを標的とするＲＮＡ干渉誘導性核酸をも包含し得るものと理解される。しかしながら、このことは、他の標的分子の存在を排除するものではない。
【００３８】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り長さに特に制限はないが、例えば、１５〜４５塩基の長さ、好ましくは１９〜４０塩基の長さ、より好ましくは２１〜３０塩基の長さである。
【００３９】
ＲＮＡ干渉誘導性核酸は、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または双方の５’末端および／または３’末端において、１または数個（例として１、２または３個）の塩基の付加により形成されるオーバーハング配列を有していてもよい。
【００４０】
上記のように、本発明における核酸は、好ましくは、ＲＮＡ干渉誘導性核酸である。しかしながら、配列番号１〜２９の少なくともいずれか１に示される塩基配列を含むＤＮＡおよび／または該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡであるかぎり、ＲＮＡ干渉を誘導しない核酸もまた本発明に包含される。
【００４１】
さらに、本発明における核酸は、以下のＤＮＡ、および該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡを包含する。
１）配列番号１〜２９の少なくともいずれか１に示される塩基配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、最も好ましくは少なくとも約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、がんのｐ５３抵抗性を減弱させることができるＤＮＡ。
２）配列番号１〜２９の少なくともいずれか１に示される塩基配列において１または複数の塩基を付加し、欠失させまたは置換した塩基配列を含むＤＮＡであって、がんのｐ５３抵抗性を減弱させることができるＤＮＡ。
３）配列番号１〜２９の少なくともいずれか１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、がんのｐ５３抵抗性を減弱させることができるＤＮＡ。
【００４２】
本発明において用いられる核酸は、ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるため、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などの修飾を行ってもよい。また、ＲＮＡ鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラＲＮＡもまた、本発明の範囲内にある。ヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジンまたはシチジン、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン、５‐ブロモウリジンなど；８位修飾アデノシンまたはグアノシン、例えば８‐ブロモグアノシンなど；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンなど；Ｏ−またはＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどを挙げることができる。
【００４３】
本発明において用いられる核酸がＤＮＡである場合、かかるＤＮＡは、一般的な遺伝子工学的方法に従って作成して、適切な発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターなどのプロモーター配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記核酸と機能的に連結され得る。
【００４４】
かかるＤＮＡは生体に投与された後、生体内での転写により生じた２本のＲＮＡ鎖がハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成するか、または一本のＲＮＡ鎖がヘアピンループ構造を有するｓｈＲＮＡを形成する。
【００４５】
本発明において用いられる核酸を含む核酸構築物、およびこれを含むベクターもまた、本発明の範囲内にある。また、本発明において２以上の核酸を用いる場合、これらの核酸は単一の発現ベクターに組み込んでもよく、２以上のベクターに別々に組み込んでもよい。
【００４６】
（４）ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬
本発明の医薬は、任意の腫瘍およびがんの処置に用いることが可能であるが、特に好ましくはｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんの処置に用いられる。
【００４７】
本明細書中で用いられる「ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがん」とは、ｐ５３もしくはその機能的等価物またはこれらをコードする核酸による処置によって、治療効果が全く認められないか、または治療効果が不十分であるがんをいう。かかる抵抗性は、細胞内でＭＤＭ２が正常なｐ５３を分解するため、または変異ｐ５３が有するドミナントネガティブ効果により正常なｐ５３の活性が抑制されるために生ずるものと推測されている。したがって、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんは、ｐ５３の分解が亢進されているがん、および変異ｐ５３を有するがんを包含する。
【００４８】
なお、本明細書において「ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがん」および「ｐ５３抵抗性のがん」は交換可能に用いられる。
【００４９】
本発明の医薬がｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんの処置に用いられる場合、上述の核酸が抵抗性に関与する遺伝子をノックダウンして抵抗性を減弱させ、その結果、ｐ５３の活性が増強されて、がんの治療が達成されるものと考えられる。
【００５０】
本明細書において用いられる「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的および／または治療的介入を包含する。すなわちがんの処置とは、がんの進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００５１】
なお、本明細書における「がん」は、「悪性腫瘍」「腫瘍」と交換可能に用いられる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と上述の核酸とを含有する、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するための医薬を提供する。
【００５３】
処置を受けるがんがｐ５３を十分に発現している場合、核酸は単独で対象に投与することができる。投与された核酸は、対象内でかかる内因性ｐ５３と組み合わされて、がんを処置するための医薬としての効果を発揮する。一方、ｐ５３が存在しないもしくは発現量が減少している、または変異ｐ５３を発現しているがんを処置する場合、核酸は、好ましくは、外因性のｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と組み合わせて対象に投与される。
【００５４】
本発明の医薬は、ｐ５３を活性化する処置とさらに組み合わせて使用することもできる。ｐ５３の活性化は、ＤＮＡ損傷、がん遺伝子の活性化、紡錘体損傷および低酸素状態などの様々な細胞ストレスにより誘導されることが知られている。したがって、かかる処置は、細胞にこのようなストレスを付与する処置であり、例えば放射線治療および抗がん剤を用いた化学療法を挙げることができる。
【００５５】
本発明の医薬と組み合わせることができる放射線治療は、例えば、Ｘ線、γ線、重粒子線、陽子線などの放射線を用いたものである。
【００５６】
また、本発明の医薬と組み合わせることができる化学療法に用いられる抗がん剤は、例えば、アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、ベンダムスチンなど；白金製剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなど；代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル、フルシトシン、メソトレキセート、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、シタラビン、ゲムシタビンなど；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、エトポシド（ＶＰ−１６）、レボフロキサシン、シプロフロキサシンなど；微小管重合阻害剤、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなど；微小管脱重合阻害剤、例えばパクリタキセル、ドセタキセルなど；抗腫瘍性抗生物質、例えばマイトマイシンＣ、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンなどである。
【００５７】
当業者は、ｐ５３を十分に活性化できる処置の条件を、ｐ５３のみによる処置が有効ながんの場合の処置条件を参照することなどにより、適宜設定することができ、例えば、化学療法の場合は使用する抗がん剤の種類、投与量、投与回数などを、放射線治療の場合は使用する核種、照射線量、照射スケジュールなどを、適宜決定することができる。
【００５８】
本発明の医薬は、これらの処置によりｐ５３が活性化されている状態のがんに対して用いられ、その結果、より強い効果が発揮される。
【００５９】
なお、本明細書中で、医薬または処置を組み合わせて投与または使用すると表現する場合、それぞれの医薬または処置を同時に投与または使用すること、および逐次的に投与または使用することのいずれもが包含される。
【００６０】
本発明の他の実施形態は、ｐ５３および／またはｐ５３を誘導する物質と核酸とを組み合わせた医薬の有効量を対象に投与することを含む、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置する方法も提供する。
【００６１】
本明細書中で用いられる「対象」とは、がんに罹患し得る任意の動物を意味し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなどの個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
【００６２】
また「有効量」とは、ｐ５３のみによる処置に抵抗性を有するがんを処置するのに効果的な量を意味する。かかる有効量はがんの種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
【００６３】
本発明の医薬は、経口製剤または非経口製剤のいずれの形態であってもよいが、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いるのが好ましい。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった細胞製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。
【００６４】
本発明の医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００６５】
また、本発明の医薬は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェアおよびナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入および／または固定することもできる。
【００６６】
本発明の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内またはその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明の医薬は、静脈内投与または腫瘍内もしくはその近傍への局所投与により対象に投与される。また、本発明の医薬は、処置されるがんに応じて、その他の医薬と併用して使用してもよい。
【００６７】
また、本発明の医薬に含まれる核酸は、任意の既知の細胞導入手法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることによって、処置されるがんの細胞内に導入され得る。
【００６８】
ウイルスベクターを利用する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３〜１×１０１４、好ましくは１×１０５〜１×１０１２、より好ましくは１×１０６〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０７〜１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。
【００６９】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、本明細
書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種および属、コンストラクトならびに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。
【実施例】
【００７０】
＜方法および材料＞
細胞培養
ヒト肝がん細胞株Ｈｕｈ−７、膵がん細胞株Ｐａｎｃ−１および大腸がん細胞株ＳＷ４８０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。Ｈｕｈ−７細胞、Ｐａｎｃ−１細胞およびＳＷ４８０細胞は、それぞれ、１０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０およびＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地中で培養した。
【００７１】
組換えアデノウイルス
ｐ５３遺伝子またはｌａｃＺ遺伝子を組み込んだ複製欠損組換えアデノウイルス（それぞれＡｄ−ｐ５３、Ａｄ−ＬａｃＺ）の構築、精製および感染は、非特許文献５に記載されるように行った。簡潔には、組換えアデノウイルスは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者のプロトコルに従って作製した。ｐＤＯＮＲ２２１の組換え領域を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え反応で、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴにトランスファーした。このようにしてｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴから生成した組換えアデノウイルスプラスミドで、コンピテントＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換した。選択後、ＤＨ５αの単一のクローンを単離し、拡張した。組換えアデノウイルスプラスミドを精製し、次いで２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。２９３Ａ細胞に十分な細胞変性効果が認められた後、アデノウイルスをＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて精製した。ｐ．ｆ．ｕ．表示でのアデノウイルス力価は、ＨＥＫ２９３細胞の感染後のプラーク形成アッセイで決定した。感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）は、感染した細胞の総数に対する、ｐ．ｆ．ｕ．の総数の比率として定義した。実験の再現性を確認するために、重複サンプルからアデノウイルスを滴定した。
【００７２】
＜実施例１  ｐ５３抵抗性がん細胞におけるゲノム網羅的スクリーニングによるｐ５３誘導性アポトーシスを増強するｓｈＲＮＡの取得＞
がん細胞におけるｐ５３誘導性アポトーシスへの抵抗性を減弱させ得るｓｈＲＮＡを同定するため、肝がん細胞株Ｈｕｈ−７および膵がん細胞株Ｐａｎｃ−１においてアレイべースのゲノム網羅的レンチウイルスｓｈＲＮＡライブラリースクリーニングを行った。スクリーニングの概要を図１に示す。Ｈｕｈ−７細胞株およびＰａｎｃ−１細胞株は変異ｐ５３を有し、野生型ｐ５３導入によって弱いアポトーシス応答を示す。ヒトｓｈＲＮＡライブラリーは、４７，４００個のヒトｍＲＮＡ転写産物を標的とする約２００，０００個のｓｈＲＮＡ配列を含んでおり、レンチウイルス粒子内にパッケージングされ、プールされたものであった。このｓｈＲＮＡライブラリーにおいて、各レンチウイルスベクターｓｈＲＮＡ配列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）上のプローブ配列に対応する。したがって、ｓｈＲＮＡ集団をｃＤＮＡマイクロアレイで定量することで、各ｓｈＲＮＡの発現レベルを決定することができる。
【００７３】
ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニングは、製造者のプロトコルに従って行った。簡潔には、１０ｃｍプレートに３×１０６個のＨｕｈ−７細胞およびＰａｎｃ−１細胞を播種し、２４時間後、ＧｅｎｅＮｅｔ  ｓｉＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のレンチウイルス粒子を細胞に感染させた。レンチウイルス感染から７２時間後、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺをＭＯＩ５０で細胞に感染させた。アデノウイルス感染から４８時間後、ＴＲＩＺｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ビオチン標識したプライマーを用いてＰＣＲを２ラウンド行って、ｓｉＲＮＡインサートをｃＤＮＡから増幅した。次いでλエキソヌクレアーゼでＰＣＲ産物を処理し、ビオチン標識されていないセンス鎖を除去した。１０μｇのビオチン標識試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（ＨＧ−Ｕ１３３＋２．０）にハイブリダイズさせた。取得したデータは、ＧｅｎｅＮｅｔ  ｓｉＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。
【００７４】
マイクロアレイでの定量によって、コントロール細胞と比較してｐ５３導入細胞において顕著に減少したｓｈＲＮＡを同定した。いくつかのｓｈＲＮＡが、ｐ５３誘導性アポトーシスに抵抗性のがん細胞へのｐ５３導入によりアポトーシス性応答を引き起こした。Ｈｕｈ−７細胞では、コントロール細胞と比較してｐ５３導入細胞において４倍より大きく減少したｓｈＲＮＡが５４７個あった。Ｐａｎｃ−１細胞では、コントロール細胞と比較してｐ５３導入細胞において１６倍より大きく減少したｓｈＲＮＡが１４１８個あった（図２Ａ、破線で囲まれた領域）。両細胞株で共通して減少していた２８個のｓｈＲＮＡ（図２Ｂ）について、そのｓｉＲＮＡセンス鎖をコードする塩基配列を表１に示す。
【表１】
2016023182.tif 000003
【００７５】
これらのｓｈＲＮＡのうち、ｓｈＲＮＡ−５８３３５がｐ５３存在下で著しく減少していた（Ｈｕｈ−７細胞で６６倍、Ｐａｎｃ−１細胞で４３６倍）。以下、このｓｈＲＮＡ−５８３３５についてさらなる評価を行った。
【００７６】
＜実施例２  ｓｈＲＮＡ−５８３３５によるｐ５３誘導性アポトーシスの増強＞
ｓｈＲＮＡ−５８３３５を発現するレンチウイルスまたはコントロール配列を発現するレンチウイルスをＨｕｈ−７細胞に感染させて安定発現させ、Ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞集団を評価することでｐ５３誘導性アポトーシスを定量化した。
【００７７】
Ｈｕｈ−７細胞に、ｓｈＲＮＡ−５８３３５（５’−ＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡ−３’（配列番号２９））またはルシフェラーゼコントロールｓｈＲＮＡ（５’−ＧＴＧＣＧＴＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＡＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号３０））を発現するレンチウイルス（ｐＳＩＨ−Ｈ１−ｐｕｒｏ）を感染させた。感染から２４時間後、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含有する培地で細胞を培養し、選択されたピューロマイシン抵抗性細胞をｓｈＲＮＡ安定発現Ｈｕｈ−７細胞として、以下の試験に用いた。
【００７８】
ｓｈＲＮＡ安定発現Ｈｕｈ−７細胞にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺをＭＯＩ２００で感染させた。感染から２４時間後、細胞を０．５μｇ／ｍｌのアドリアマイシン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。処理から４８時間後、細胞をウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーによる分析に供した。
【００７９】
ウェスタンブロット分析のため、アドリアマイシン処理後の細胞を、ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を使用して４℃で抽出し、全細胞溶解液を調製した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーして、ウェスタンブロット分析を行った。ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、カスパーゼ−３（切断型）およびアクチンのそれぞれについて、一次抗体として、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した抗ｐ５３マウス抗体（ＤＯ−１）、抗ＭＤＭ２マウス抗体（ＳＭＰ１４）および抗ｐ２１マウス抗体（Ｆ−５）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した抗アクチンマウス抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した抗カスパーゼ−３ウサギ抗体（８Ｇ１０）を使用して、増強化学発光（ＥＣＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、検出を行った。
【００８０】
フローサイトメトリーによる分析のため、アドリアマイシン処理後の細胞をトリプシン処理により回収し、遠心分離によりペレット化した。ペレット化した細胞を９０％の冷エタノールで固定し、ＲＮアーゼＡ（５００単位／ｍｌ）で処理し、次いでヨウ化プロピジウム（５０ｍｇ／ｍｌ）で染色した。試料を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。実験は少なくとも３反復し、各試料について５０，０００イベントを分析した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。
【００８１】
結果を図３に示す。ｐ５３導入によってｓｈＲＮＡ−５８３３５感染細胞ではコントロール細胞と比べて強いアポトーシス応答が誘導され、さらにアドリアマイシンで処理するとアポトーシス応答は顕著に増強された（図３ＡおよびＢ）。ウェスタンブロッティングにより、別のアポトーシス指標であるカスパーゼ−３切断の増大も観察された（図３Ｃ）。同じく変異ｐ５３を有し、ｐ５３導入によって弱いアポトーシス応答を示す大腸がん細胞株ＳＷ４８０においても、ｓｈＲＮＡ−５８３３５はｐ５３誘導性アポトーシス応答を感作した（図３Ｄ）。したがって、ｓｈＲＮＡ−５８３３５はがん細胞株においてアポトーシス応答を改善することが示された。
【００８２】
なお、ｐ５３の下流に存在するＭＤＭ２およびｐ２１のタンパク質量は、ｐ５３のタンパク質量に対応して増減しており、ｓｈＲＮＡ−５８３３５による影響は観察されなかった。
【００８３】
＜実施例３  ｓｈＲＮＡ−５８３３５存在下でのｐ５３による腫瘍増殖阻害＞
腫瘍形成の異種移植モデルにおいて、ｐ５３導入の腫瘍抑制効果を試験した。
【００８４】
全ての動物は、ＳＰＦ条件下で維持し、札幌医科大学の動物実験委員会によって定められたガイドラインに従って取り扱った。定着腫瘍を処置する効果を評価するため、２４匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはコントロールのレトロウイルスベクターを感染させた２×１０６個のＨｕｈ−７細胞を両脇腹に皮下注射した（ｓ．ｃ．）。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したら、マウスに１×１０９ｐ．ｆ．ｕ（１００マイクロリットルのＰＢＳ中）のＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを、第０日、第１日および第２日（図４中の矢印）の合計３回、直接腫瘍内に注射した。各処置群あたり３匹のマウスを用いた。マウスにおける腫瘍形成を２週までモニターした。腫瘍体積は、式Ｖ（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２（式中、「ａ」は最長径を示し、「ｂ」は垂直直径である）で計算した。
【００８５】
結果を図４に示す。コントロールｓｈＲＮＡを感染させたＨｕｈ−７細胞ではＡｄ−ｐ５３注射は腫瘍体積に影響を及ぼさなかった一方（図４左）、ｓｈＲＮＡ−５８３３５を感染させたＨｕｈ−７細胞ではＡｄ−ｐ５３注射によって腫瘍体積の顕著な減少が認められた（図４右）。したがって、ｐ５３と特定のｓｈＲＮＡとを組み合わせた処置がｉｎ  ｖｉｖｏでのがん治療に効果的であることが示された。
【００８６】
＜実施例４  ｓｈＲＮＡ−５８３３５によるＰＲＩＭＡ−１誘導性アポトーシスの増強＞
アデノウイルスでのｐ５３導入の代わりに、変異ｐ５３タンパク質の配列特異的ＤＮＡ結合能および活性構造を回復させることが知られているＰＲＩＭＡ−１を用いて、実施例２と同様の試験を行った。
【００８７】
ｓｈＲＮＡ安定発現Ｈｕｈ−７細胞を、２００μＭのＰＲＩＭＡ−１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および／または０．５μｇ／ｍｌのアドリアマイシンで処理し、処理から７２時間後にフローサイトメトリーに供した。また、選択培地として４μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する培地を用いて選抜したｓｈＲＮＡ安定発現Ｐａｎｃ−１細胞を、２００μＭのＰＲＩＭＡ−１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および／または３００μＭのＶＰ−１６（Ｓｉｇｍａ）で処理し、処理から４８時間後にフローサイトメトリーに供した。その他の点は実施例２と同様の方法で試験を行った。
【００８８】
結果を図５に示す。Ｈｕｈ−７細胞の場合、ＰＲＩＭＡ−１とアドリアマイシンとを組み合わせた処理により、コントロールｓｈＲＮＡ感染細胞と比べてｓｈＲＮＡ−５８３３５感染細胞において強いアポトーシス応答が誘導された（図５ＡおよびＢ）。
【００８９】
Ｐａｎｃ−１細胞の場合、アドリアマイシン処理ではアポトーシス応答が誘導されなかったことから、アドリアマイシンの代わりにＶＰ−１６（エポキシド）を用いて同様の試験を行った。ＰＲＩＭＡ−１とＶＰ−１６とを組み合わせた処理により、コントロールｓｈＲＮＡ感染細胞と比べてｓｈＲＮＡ−５８３３５感染細胞においてアポトーシス応答の顕著な増強が認められた（図５Ｃ）。
【００９０】
したがって、ｓｈＲＮＡ−５８３３５は、ｐ５３導入によるアポトーシス応答だけでなく、ｐ５３の機能回復によるアポトーシス応答も効果的に増強することが明らかになった。
【００９１】
＜実施例５  ｓｈＲＮＡ−５８３３５による遺伝子発現パターンの変化＞
さらに、ｐ５３誘導性アポトーシスに対するｓｈＲＮＡ−５８３３５の効果を評価するため、以下のマイクロアレイ分析を行って、遺伝子発現パターンの変化を観察した。
【００９２】
ｓｈＲＮＡ−５８３３５またはコントロールｓｈＲＮＡを安定発現するＨｕｈ−７細胞に、Ａｄ−ｐ５３をＭＯＩ２００で感染させた。感染から２４時間後、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）により、製造者のプロトコルに従って抽出した。全ＲＮＡをＣｙ３で標識し、ｃＤＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ）にハイブリダイズさせて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎにより製造者のプロトコルに従ってスキャンした。取得したデータはＬｉｍｍａ（Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ）を用いて正規化した。マイクロアレイデータはＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に登録した（アクセッション番号ＧＳＥ５６１５６）。
【００９３】
マイクロアレイ分析の結果、コントロール細胞と比較してｓｈＲＮＡ−５８３３５感染細胞において２倍以上の発現量の減少が認められた３５０個の遺伝子の一覧を表２に、これらについての遺伝子オントロジー解析の結果を表３に示す。
【表２】
2016023182.tif 000004
【表３】
2016023182.tif 000005
【００９４】
遺伝子オントロジー解析により、ｓｈＲＮＡ−５８３３５は、細胞周期進行および細胞分裂に関与する遺伝子群と関連することが明らかになった。この結果は、ｓｈＲＮＡ−５８３３５が細胞分裂プロセスに関連する遺伝子の発現を調節することでｐ５３導入後のアポトーシス応答を引き起こし得ることを示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の医薬は、がんのｐ５３抵抗性を減弱させ、ｐ５３のがん治療効果を増強することから、従来のｐ５３単独治療では困難であったｐ５３抵抗性がんに対する効果的な処置を提供する。さらに、本発明の医薬は、ウイルスベクターの使用を必須とせず、また従来の放射線治療および化学療法との併用によって一層効果が高められて、多様ながんの処置に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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