(57)【要約】      （修正有）【課題】臨床グレードの間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を安定生産するロバストな製造方法の提供。【解決手段】継代２〜継代９まで培養した間質系間質細胞を塩基性線芽細胞成長因子を含む培養培地の存在下継代５〜継代１０までの範囲で少なくとも２０００倍増大させる間質系培養方法、及び、培養方法が継代３代まで培養した間質系細胞を塩基性線維芽細胞成長因子を含む培養培地の存在下継代５代まで培養し、細胞数が継代３の時点と比較して２０００倍増大する培養方法、及び、前記培養プロセスで得られる細胞を、臨床応用又は治療用途の所定の投与形態に配合する前に、遠心分離プロセスと洗浄プロセスの組み合わせに供してＢＳＡレベルを低減する方法、更に、該細胞を凍結混合物に供しＤＭＳＯを保存剤として貯蔵する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系間質細胞を培養する方法であって、以下の工程：
ａ．第１の所定の継代まで培養した前記間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で第２の所定の継代まで増殖させること、
を含み、前記増殖を前記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と前記培養培地とを接触させることによって行い、該方法によって前記第２の所定の継代の終了時の細胞数が前記第１の所定の継代の時点の細胞数と比較して２０００倍増大する、間葉系間質細胞を培養する方法。
【請求項２】
前記細胞数の増大が最大で２１日間の期間内に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の所定の継代の時点の細胞を前記第２の所定の継代まで連続継代によって増殖させ、該第１の所定の継代が継代２〜継代９の範囲であり、該第２の所定の継代が継代５〜継代１０の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の所定の継代が継代３であり、前記第２の所定の継代が継代５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖用に播種する細胞の数が約６０万細胞〜約７０万細胞の範囲であり、該増殖の後に得られる細胞の数が少なくとも約１８億細胞であり、前記方法により細胞数が少なくとも２０００倍増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地の成分が約７５％〜９５％の範囲の濃度のダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、約５％〜１５％の範囲の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、約０．５％〜２％の範囲の濃度のグルタミン、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌの濃度のペニシリンと約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシンとを含むＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び約０．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地を、体積誤差を回避し、前記培地の複数のアリコートにおけるｂＦＧＦの均一な分布をもたらすように前記成分を主混合するプロセスによって調製し、該プロセスが以下の工程：
ａ．ＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含み、ｂＦＧＦを含まない「Ｘ」リットルの培養培地を調製すること、及び「Ｘ」個の１リットルのコンテナに分注すること、及び該コンテナを１〜「Ｘ」と標識すること、
ｂ．「Ｚ」ｍｌの培地をコンテナＮｏ．１から取り出すこと、及びＮｏ．「Ｘ＋１」と標識した新たな滅菌コンテナに分注すること、
ｃ．所定量のｂＦＧＦをコンテナＮｏ．１の「１リットル−Ｚ」ｍｌの培地に添加すること、及びｂＦＧＦマスターミックスが得られるように、十分に混合すること、
ｄ．等量の培地を２〜「Ｘ」と標識したコンテナの各々から別個に取り出すこと、及びコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の「Ｚ」ｍｌの培地に添加することであって、それによりコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の全培地容量を「Ｂ」ｍｌとすること、並びに、
ｅ．工程（ｃ）で得られた所定量のｂＦＧＦマスターミックスを別個に取り出すこと、及びコンテナ２〜「Ｘ」の各々「Ｂ」ｍｌの培地に添加することであって、それにより該コンテナの各々の容量を等しくするとともに、前記培養培地の複数のアリコートを調製すること、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）におけるｂＦＧＦの所定量が培地１ｍｌ当たり約１ｎｇ〜約３ｎｇ、好まし
くは培地１ｍｌ当たり約２ｎｇである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）において、該工程（ｄ）の完了時に前記コンテナ２〜「Ｘ」及び「Ｘ＋１」の各々が等量の培地を含有するように等量の培地を取り出す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｅ）において、該工程（ｅ）の完了時に前記コンテナ２〜「Ｘ」及び「Ｘ＋１」の各々が１Ｌの培地を含有するように所定量のｂＦＧＦを添加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの所定のコンフルエンシーが約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％及び約６０％〜約７０％、又はそれらの任意の組合せを含むコンフルエンシーの範囲から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、並びに、
ｂ．前記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖により細胞数が少なくとも３０倍増大する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を前記細胞に添加すること、並びに、
ｃ．前記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖により細胞数が少なくとも４０倍増大する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び前記細胞の培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって第２の連続継代まで更に増殖させること、
ｄ．前記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を前記細胞に添加すること、並びに、
ｅ．前記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖により細胞数が少なくとも２０００倍増大する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養後に得られる細胞を、凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物による凍結に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記凍結を約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度又は約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度で行い、前記凍結混合物が約２％〜約１５％の範囲の濃度、好ましくは約５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が保持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が以下の工程：
ａ．継代３まで培養した間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で継代５まで増殖させること、
を含み、前記増殖を前記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と前記培養培地とを接触させることによって行い、前記方法によって継代５の終了時の細胞数が継代３の時点の細胞数と比較して少なくとも２０００倍増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの所定のコンフルエンシーが約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％及び約６０％〜約７０％、又はそれらの任意の組合せを含むコンフルエンシーの範囲から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．継代３まで培養した細胞を、該継代３の細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって継代４まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び前記培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の終了時に得られる細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって継代５まで更に増殖させること、
ｄ．前記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を添加すること、並びに、
ｅ．前記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養プロセスの際に得られる細胞を、臨床用途又は治療用途の所定の投与形態に配合する前に遠心分離プロセスと洗浄プロセスとの組合せに更に供し、該組合せにより前記所定の投与形態に存在するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のレベルが５０ｎｇ／ｍｌ未満の量まで低減し、該ＢＳＡが培養プロセスにおいて前記培養培地中のＦＢＳによって前記細胞に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を培養することによって得られる間葉系間質細胞を含む、臨床用途又は治療用途で配合される投与形態のＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法であって、前記組成物を、該ＢＳＡ量が低減するように遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水での洗浄との組合せに供する工程を含む、ＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法。
【請求項２６】
ウシ起源の成分の使用を含む前記細胞の培養中に５０ｎｇ／ｍｌを超える量のＢＳＡが該細胞に供給され、５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルが前記投与形態中の細胞数に関わらない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が以下の工程：
ａ．前記細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約７分間〜約１０分間の範囲の期間にわたる第１の遠心分離に供すること、
ｂ．遠心分離した細胞を約６０万〜約６００万の範囲の細胞数で約２０ｍｌのＤＰＢＳでの第１の洗浄に供すること、及び洗浄した細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約１０分間の期間にわたって再遠心分離すること、
ｃ．再遠心分離した細胞を約６００〜約６００万の範囲の細胞数で約７ｍｌ〜約９ｍｌのＤＰＢＳでの第２の洗浄に供すること、続いて任意に細胞サンプルをプールすること、並びに、
ｄ．５０ｎｇ／ｍｌ未満のＢＳＡレベルを有する細胞が得られるように、工程（ｃ）の洗浄した細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約５分間〜約７分間の範囲の期間にわたって再遠心分離すること、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
間葉系間質細胞を貯蔵する方法であって、該細胞を凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物に供する工程と、該細胞を約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度又は約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度で貯蔵する工程とを含む、間葉系間質細胞を貯蔵する方法。
【請求項２９】
凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１週間にわたって液体窒素なしに保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１ヶ月にわたって保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記凍結混合物が約４％〜約１１％の範囲の濃度、好ましくは約５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記間葉系間質細胞が該細胞を請求項１に記載の方法により培養することによって得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
それを必要とする被験体への治療目的での投与前の前記細胞の再構成を排除する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、強力な生存幹細胞の組成物が得られるように間葉系間質細胞をプロセシングする方法に関する。特に、本開示は臨床用途及び治療用途のために高細胞収率の一貫性、生存性の増大、低いＨＬＡ−ＤＲ及び間葉系間質細胞の効力を得るプロセスに関する。さらに、本開示は上記用途のための徹底した生産プロセス及び投与前又は投与時の最終組成物の操作の低減にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）は、有核細胞の０．００１％〜０．０１％を占める微量（rare）細胞集団として骨髄中に存在し、培養下でその幹細胞性を失うことなく急速に成長及び増殖することができる。ｈＭＳＣは、（１）単離の容易さ、（２）高い増殖能、（３）遺伝的安定性、（４）再現特性（reproducible characteristics）、（５）組織工学原理との適合性というその特性のために、多くの損傷組織において修復を増進する可能性を有する。
【０００３】
ＭＳＣ及びＭＳＣ様細胞は現在、脂肪組織、羊水、骨膜（periostium）及び胎児組織を含む骨髄以外の様々な組織から単離されており、表現型不均一性を示す。骨髄等のヒト供給源から得られる間葉系間質細胞（ｈＢＭＳＣ）は、骨形成系列、脂肪生成系列及び軟骨形成系列、並びに肝細胞、心筋細胞及びニューロンを含む他の種類の組織又は細胞への比較的容易なアクセス可能性及び分化能のために、広く研究されている。その多能性及び自己複製能（self-renewal）のために、再生医療における用途を有する自己複製細胞源として、この幹細胞への関心が高まっている。加えて、培養基質への接着性に基づくその単離は、非間葉系列を除去する直接的戦略となり、特異的な表面マーカーの発現に左右される複雑な細胞単離法への依存を減らす。
【０００４】
さらに、治療用の接着性間葉系幹細胞は典型的にはプレーナー技術（フラスコ）を用いて生産される。幾つかの同種細胞療法用生成物を初期、中後期の臨床開発へと進めるために１０層のスタック又は容器が使用されてきた。従来の実験室規模のフラスコベースの培養プロセスのスケールアップは通常、CorningのＣｅｌｌ  ＳＴＡＣＫ等の市販の積層プレートシステムを必要とする。これらの多層容器が大規模細胞培養に使用されてきた。従来の１０層Ｃｅｌｌ  ＳＴＡＣＫは製造プロセスに採用され、適正製造基準（ＧＭＰ）に従う治療用の同種間葉系間質細胞の生産においてプラットホームとして使用されている。
【０００５】
間葉系間質／幹細胞を用いる細胞療法は大きな将来性を示すが、骨髄由来ＭＳＣによる制限はその少ない量であり、一方で臨床用途には大量のＭＳＣが必要とされる。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の研究は市販の生成物を生み出すが、細胞ベースの生成物を市場に出す際の別の大きな障害は、ロバストかつ再現可能な生産プロセスの必要性並びに生体系用の低温保存培地及び貯蔵コンテナの品質である。
【０００６】
ＭＳＣは多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞に分化することが可能である。ＢＭ由来ＭＳＣはより広く使用されおり、その臨床安全性及び実践に関する膨大な量のデータが存在する。この臨床需要を満たすために、迅速かつロバストなＭＳＣ増殖方法が均一な既製の生成物の大量の在庫の製造及び貯蔵に必要とされる。従来技術では、特許文献１が、免疫原性が低下した間葉系幹細胞を含む医薬組成物、及び遠心濾過を用いてそれを製造する方法を開示している。特許文献１は遠心濾過を用いて１つ又は複数の精製ＭＳＣ医薬組成物を製造する方法に関するものであるが、細胞収率及びＨＬＡ−ＤＲ等の細胞ベースの生成物の重要な品質パラメーターを開示していない。さらに、精製ＭＳＣ組成物
は５５ｕｇ／ｍｌ未満の残留ＢＳＡを含む。また、特許文献１は細胞収率、生存性並びに低いＨＬＡ−ＤＲ及び純度のような品質パラメーターの増大の達成に関する見解を提示していない。特許文献２は、重要な治療可能性を有し、培養物中で安定した構造的及び機能的表現型を有する間葉系幹細胞の調製、臨床規模の治療調製物を生産するＭＳＣの増殖方法及びその医学的使用を提供する。また、特許文献３は、細胞療法生成物を製造し、後続の手順においてＢＳＡ含量を低減する技術であるＴＦＦを用いた減容によって細胞療法生成物を洗浄する方法及び装置に着目している。しかしながら、ＴＦＦ手順中の細胞損失に関するデータは提示されておらず、更にはＢＳＡレベルが約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり、治療用途に好適でないとみなされる。このため、均一な細胞分布及び増加のための培地への均一な成長因子（ｂＦＧＦ）の分布を確実にするプロセス、不純物を含まない培養期間及び細胞損失の低減と同時に細胞収率、生存性、一貫性を改善するプロセス、並びにその保存期間を改善する細胞生成物を保存する方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３８９１号
【特許文献２】米国特許出願公開第１３／２６７，３６３号
【特許文献３】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２０５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来行われている幹細胞の増殖及び細胞ベースの生成物の最終送達の方法に見られる大きな障害は以下の通りである：
短期間で大きな細胞収率を得る安定生産の欠如、
低い細胞収率及び生存性につながる洗浄及び遠心分離プロセス中の高い細胞損失、
費用のかかる貯蔵及び輸送、
患者に投与する前の低温保存細胞の或る程度の再構成の必要性、及び、
生成物を細胞の損失又は無菌性の喪失を受けやすいものにする院内での低温保存細胞の更なる操作。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は上記の問題を克服するプロセス及び手段を提供する。このため、本開示は、包括的生産プロセス及び最終生成物の貯蔵の開発に関して高まる要求を克服しようと試みるものである。したがって、現在の細胞療法に最も広く使用されている細胞型である細胞療法に即時使用可能な同種間葉系間質／幹細胞を開発するプロセス改善及び戦略に着目する。
【００１０】
本開示は、間葉系間質細胞を培養する方法であって、以下の工程：第１の所定の継代まで培養した間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で第２の所定の継代まで増殖させることを含み、上記増殖を上記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と上記培養培地とを接触させることによって行い、該方法によって第２の所定の継代の終了時の細胞数が第１の所定の継代の時点の細胞数と比較して２０００倍増大する、間葉系間質細胞を培養する方法に関する。
【００１１】
本開示は、細胞を培養することによって得られる間葉系間質細胞を含む、臨床用途又は治療用途で配合される所定の投与形態におけるＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法であって、上記組成物を、該ＢＳＡ量が低減するように遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水での洗浄との組合せに供する工程を含む、ＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法にも関する。
【００１２】
本開示は、間葉系間質細胞を貯蔵する方法であって、該細胞を凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物に供する工程と、該細胞を約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度又は約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度で貯蔵する工程とを含む、間葉系間質細胞を貯蔵する方法にも関する。
【００１３】
本開示が容易に理解され、実用化されるように、ここでは添付の図面を参照して説明される例示的な実施形態に言及する。図面は下記の発明を実施するための形態とともに、本明細書中に引用され、本明細書の一部をなし、本開示に従って実施形態を更に説明し、様々な原理及び利点を明らかにする役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａは、継代４（Ｐ４）でのバッチ当たりの間葉系間質細胞収率を示す図であり、Ｂは、Ａの５つの個々のバッチの平均細胞収率を示す図である。
【図２】種々のバッチのＰ５での全細胞収率を示す図である。
【図３Ａ】本開示の種々のバッチのＰ５採取物の７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）による生存率のグラフ表示である。
【図３Ｂ】解凍後の生存性の顕著な一貫性を示す解凍後の本開示の治験用医薬品（ＩＭＰ）の７ＡＡＤによる生存率のグラフ表示である。
【図３Ｃ】図３Ｂの５つの個々の生産バッチの解凍後のＩＭＰの７ＡＡＤによる生存率の平均を示す図である。
【図４Ａ】顕著に低いＨＬＡ−ＤＲ発現を示す本発明のプロセスの種々の生産バッチにおける採取後ＨＬＡ−ＤＲ発現を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａの５つの個々の生産バッチの採取後ＨＬＡ−ＤＲ発現の平均を示す図である。
【図４Ｃ】本開示のプロセスを用いた種々の生産バッチの解凍後ＨＬＡ−ＤＲ発現を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｃの５つの個々の生産バッチの解凍後ＨＬＡ−ＤＲ発現の平均を示す図である。
【図５Ａ】ｂＦＧＦマスターミックスの調製を示す図である。
【図５Ｂ】種マスターミックスの調製を示す図である。
【図６Ａ】ｂＦＧＦ及び種マスターミックスを組み入れる前（「従来既知」）及び組み入れた後（本開示の「新たなプロセス」）の種々の生産バッチにおける細胞収率の一貫性を示す図である。
【図６Ｂ】ｂＦＧＦ及び種マスターミックスを組み入れる前（「従来既知」）及び組み入れた後（本開示の「新たなプロセス」）の種々の生産バッチにおけるＨＬＡ−ＤＲ発現の一貫性を示す図である。
【図７Ａ】培養を日数に基づいて行う従来既知のプロセス（１）と比較した、コンフルエンシーに基づく本発明のプロセス（２）の種々のバッチの個々の１０Ｃｅｌｌ  ＳＴＡＣＫの細胞収率に対するコンフルエンシーに基づく供給スケジュールの影響を示す図である。
【図７Ｂ】培養を日数に基づいて行う従来既知のプロセス（１）と比較した、コンフルエンシーに基づく本発明のプロセス（２）の種々の生産バッチの個々の１０Ｃｅｌｌ  ＳＴＡＣＫにおけるＨＬＡ−ＤＲ発現を示す図である。
【図８Ａ】従来既知の洗浄工程（すなわち、各々２００ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄Ｉ及び洗浄ＩＩ）を行うことによって得られるＩＭＰにおけるＢＳＡレベルに対する、本開示に示す洗浄工程（すなわち、２００ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄Ｉ及び９０ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄ＩＩ）を行うことによるＩＭＰにおけるＢＳＡレベルの比較を示す図である。
【図８Ｂ】従来既知の洗浄工程（すなわち、各々２００ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄Ｉ及び洗浄ＩＩ）を行うことによって得られる最終生成物の細胞収率に対する、本開示に示す洗浄工程（すなわち、２００ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄Ｉ及び９０ｍｌのＤＰＢＳでの洗浄ＩＩ）を行うことによって得られる本開示の最終生成物における細胞損失の比較を示す図である。
【図８Ｃ】従来既知の洗浄プロセスと比較した、本発明のプロセスによる最終生成物の解凍後の細胞回収率に対する洗浄及び遠心分離の影響を示す図である。
【図９Ａ】Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ５（ＣＳ５）を用いた低温保存後のＢＭ−ＭＳＣの７ＡＡＤによる解凍後の生存性を示す図である。細胞生存性を１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の低温保存齢（時点）でＣＳ５  １ｍｌ当たり５００万細胞、１０００万細胞、１２５０万細胞、１５００万細胞及び２５００万細胞という５つの異なる凍結濃度で評価した。
【図９Ｂ】ＣＳ５を用いた低温保存後のＢＭ−ＭＳＣの解凍後の全細胞回収率（ＴＣＲ）を示す図である。細胞を１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の低温保存齢（時点）でトリパンブルーを用いて染色することによってＴＣＲを評価した。全生存細胞及び非生存細胞の合計をＴＣＲとして計数した。ＣＳ５  １ｍｌ当たり５００万細胞、１０００万細胞、１２５０万細胞、１５００万細胞及び２５００万細胞という５つの異なる凍結濃度でＴＣＲを観察した。
【図１０Ａ】−１９６℃で６ヶ月間貯蔵した２５Ｍ用量、５０Ｍ用量及び７５Ｍ用量という異なる用量のＣＳ５凍結混合物１ｍｌ当たりの２５Ｍ細胞の７ＡＡＤによる生存性を示す図である。
【図１０Ｂ】−１９６℃で６ヶ月間貯蔵した２５Ｍ用量、５０Ｍ用量及び７５Ｍ用量という異なる用量のＣＳ５凍結混合物１ｍｌ当たりの２５Ｍ細胞の細胞回収率を示す図である。
【図１０Ｃ】−１９６℃で１２ヶ月間貯蔵した１億及び２億という異なる用量のＣＳ５凍結混合物１ｍｌ当たりの２５Ｍ細胞の７ＡＡＤによる生存性を示す図である。Ｙ軸は７ＡＡＤ生存性（％）を表す。
【図１１Ａ】混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制する能力によるＩＭＰの免疫抑制特性を示す図である。データは６つの個々のバッチの平均である。
【図１１Ｂ】ＩＭＰ−ＭＬＲ共培養物の上清におけるプロスタグランジン−Ｅ２（ＰＧＥ−２）の推定を示す図である。データは５つの個々のバッチの平均である。
【図１１Ｃ】産生されるＰＧＥ−２の量とＩＭＰの免疫抑制能との相関を示す図である。
【図１２】従来既知のプロセスによって生産される細胞ベースの生成物と比較したＶＥＧＦの産生に関するＩＭＰの血管形成効力を示す図である。
【図１３】従来既知のプロセスによって生産される細胞ベースの生成物と比較したｓＧＡＧの産生に関するＩＭＰの軟骨細胞効力を示す図である。
【図１４Ａ】直接安定性及び加速安定性研究の３ヶ月時点の７ＡＡＤによる解凍後の生存性を示す図である。
【図１４Ｂ】３ヶ月の−８０℃直接安定性（右側）及び加速安定性（左側）研究の解凍後の増加を示す図である。
【図１４Ｃ】−８０℃直接安定性及び加速（対照）安定性研究の解凍後のＣＦＵ−Ｆを示す図である。
【図１４Ｄ】−８０℃直接安定性及び加速安定性研究の三血球系分化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、間葉系間質細胞を培養する方法であって、以下の工程：
ａ．第１の所定の継代まで培養した上記間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で第２の所定の継代まで増殖させること、
を含み、上記増殖を上記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と上記培養培地とを接触させることによって行い、該方法によって上記第２の所
定の継代の終了時の細胞数が上記第１の所定の継代の時点の細胞数と比較して２０００倍増大する、間葉系間質細胞を培養する方法に関する。
【００１６】
本開示の１つの実施形態では、上記細胞数の増大が最大で２１日間の期間内に起こる。
【００１７】
本開示の別の実施形態では、上記第１の所定の継代の時点の細胞を上記第２の所定の継代まで連続継代によって増殖させ、該第１の所定の継代が継代２〜継代９の範囲であり、該第２の所定の継代が継代５〜継代１０の範囲である。
【００１８】
本開示の別の実施形態では、上記第１の所定の継代が継代３であり、上記第２の所定の継代が継代５である。
【００１９】
本開示の別の実施形態では、上記増殖用に播種する細胞の数が約６０万細胞〜約７０万細胞の範囲であり、該増殖の後に得られる細胞の数が少なくとも約１８億細胞であり、上記方法により細胞数が少なくとも２０００倍増大する。
【００２０】
本開示の別の実施形態では、上記培養培地の成分が約７５％〜９５％の範囲の濃度のダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、約５％〜１５％の範囲の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、約０．５％〜２％の範囲の濃度のグルタミン、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌの濃度のペニシリンと約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシンとを含むＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び約０．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。
【００２１】
本開示の別の実施形態では、上記培養培地を、体積誤差を回避し、上記培地の複数のアリコートにおけるｂＦＧＦの均一な分布をもたらすように上記成分を主混合するプロセスによって調製し、該プロセスが以下の工程：
ａ．ＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含み、ｂＦＧＦを含まない「Ｘ」リットルの培養培地を調製すること、及び「Ｘ」個の１リットルのコンテナに分注すること、及び該コンテナを１〜「Ｘ」と標識すること、
ｂ．「Ｚ」ｍｌの培地をコンテナＮｏ．１から取り出すこと、及びＮｏ．「Ｘ＋１」と標識した新たな滅菌コンテナに分注すること、
ｃ．所定量のｂＦＧＦをコンテナＮｏ．１の「Ｘ−Ｚ」ｍｌの培地に添加すること、及びｂＦＧＦマスターミックスが得られるように、十分に混合すること、
ｄ．等量の培地を２〜「Ｘ」と標識したコンテナの各々から別個に取り出すこと、及びコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の「Ｚ」ｍｌの培地に添加することであって、それによりコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の全培地容量を「Ｂ」ｍｌとすること、並びに、
ｅ．工程（ｃ）で得られた第２の所定量のｂＦＧＦマスターミックスを別個に取り出すこと、及びコンテナ２〜「Ｘ」の各々「Ｂ」ｍｌの培地に添加することであって、それにより該コンテナの各々の容量を等しくするとともに、上記培養培地の複数のアリコートを調製すること、
を含む。
【００２２】
本開示の別の実施形態では、上記少なくとも１つの所定のコンフルエンシーが約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％及び約６０％〜約７０％、又はそれらの任意の組合せを含むコンフルエンシーの範囲から選択される。
【００２３】
本開示の別の実施形態では、上記細胞と上記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代
まで増殖させること、並びに、
ｂ．上記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、上記培養培地を交換すること、
を含み、上記増殖全体で用いられる上記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である。
【００２４】
本開示の別の実施形態では、上記増殖により細胞数が少なくとも３０倍増大する。
【００２５】
本開示の別の実施形態では、上記細胞と上記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．上記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく上記培養培地を上記細胞に添加すること、並びに、
ｃ．上記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、上記培養培地を交換すること、
を含み、上記増殖全体で用いられる上記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である。
【００２６】
本開示の別の実施形態では、上記増殖により細胞数が少なくとも４０倍増大する。
【００２７】
本開示の別の実施形態では、上記細胞と上記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．上記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び上記細胞の培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって第２の連続継代まで更に増殖させること、
ｄ．上記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく上記培養培地を上記細胞に添加すること、並びに、
ｅ．上記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、上記培養培地を交換すること、
を含み、上記増殖全体で用いられる上記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である。
【００２８】
本開示の別の実施形態では、上記増殖により細胞数が少なくとも２０００倍増大する。
【００２９】
本開示の別の実施形態では、上記培養後に得られる細胞を、凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物による凍結に供する。
【００３０】
本開示の別の実施形態では、上記凍結を約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度又は約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度で行い、上記凍結混合物が約２％〜約１５％の範囲の濃度、好ましくは約５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである。
【００３１】
本開示の別の実施形態では、上記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が
保持される。
【００３２】
本開示の別の実施形態では、上記方法が以下の工程：
ａ．継代３まで培養した間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で継代５まで増殖させること、
を含み、上記増殖を上記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と上記培養培地とを接触させることによって行い、上記方法によって継代５の終了時の細胞数が継代３の時点の細胞数と比較して少なくとも２０００倍増大する。
【００３３】
本開示の別の実施形態では、上記細胞と上記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．継代３まで培養した細胞を、該継代３の細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって継代４まで増殖させること、
ｂ．上記細胞に約４０％〜約５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び上記培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の終了時に得られる細胞を、該細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、上記培養培地を播種細胞に供給することによって継代５まで更に増殖させること、
ｄ．上記細胞に約３０％〜約４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく上記培養培地を添加すること、並びに、
ｅ．上記細胞に約６０％〜約７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、上記培養培地を交換すること、
を含み、上記増殖全体で用いられる上記培養培地が約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である。
【００３４】
本開示の別の実施形態では、上記培養プロセスの際に得られる細胞を、臨床用途又は治療用途の所定の投与形態に配合する前に遠心分離プロセスと洗浄プロセスとの組合せに更に供し、該組合せにより上記所定の投与形態に存在するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のレベルが５０ｎｇ／ｍｌ未満の量まで低減し、該ＢＳＡが培養プロセスにおいて上記培養培地中のＦＢＳによって上記細胞に供給される。
【００３５】
本開示は、細胞を培養することによって得られる間葉系間質細胞を含む、臨床用途又は治療用途で配合される所定の投与形態のＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法であって、上記組成物を、該ＢＳＡ量が低減するように遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水での洗浄との組合せに供する工程を含む、ＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法にも関する。
【００３６】
本開示の別の実施形態では、ウシ起源の成分の使用を含む上記細胞の培養中に５０ｎｇ／ｍｌを超える量のＢＳＡが該細胞に供給され、５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルが上記投与形態中の細胞数に関わらない。
【００３７】
本開示の別の実施形態では、上記方法が以下の工程：
ａ．上記細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約７分間〜約１０分間の範囲の期間にわたる第１の遠心分離に供すること、
ｂ．遠心分離した細胞を約６０万〜約６００万の範囲の細胞数で約２０ｍｌのＤＰＢＳでの第１の洗浄に供すること、及び洗浄した細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約１０分間の期間にわたって再遠心分離すること、
ｃ．再遠心分離した細胞を約６００〜約６００万の範囲の細胞数で約７ｍｌ〜約９ｍｌのＤＰＢＳでの第２の洗浄に供すること、続いて任意に細胞サンプルをプールすること、
並びに、
ｄ．５０ｎｇ／ｍｌ未満のＢＳＡレベルを有する細胞が得られるように、工程（ｃ）の洗浄した細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲の速度で約５分間〜約７分間の範囲の期間にわたって再遠心分離すること、
を含む。
【００３８】
本開示は、更に、間葉系間質細胞を貯蔵する方法であって、該細胞を凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物に供する工程、及び該細胞を約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度又は約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度で貯蔵する工程を含む、間葉系間質細胞を貯蔵する方法に関する。
【００３９】
本開示の別の実施形態では、凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び約−７５℃〜約−８５℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１週間にわたって液体窒素なしに保持される。
【００４０】
本開示の別の実施形態では、凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び約−１９０℃〜約−２００℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１ヶ月にわたって保持される。
【００４１】
本開示の別の実施形態では、上記凍結混合物が約４％〜約１１％の範囲の濃度、好ましくは約５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである。
【００４２】
本開示の別の実施形態では、上記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が保持される。
【００４３】
本開示の別の実施形態では、上記間葉系間質細胞が該細胞を上記の方法により培養することによって得られる。
【００４４】
本開示の別の実施形態では、上記方法がそれを必要とする被験体への治療目的での投与前の上記細胞の再構成を排除する。
【００４５】
本開示は、一貫した高い生存細胞収率を得るための培養期間が短縮された間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の大規模製造プロセスに関する。
【００４６】
本開示の一実施形態は、ＨＬＡ−ＤＲ発現の低いＭＳＣを生産するプロセスに関する。
【００４７】
本開示の別の実施形態は不純物を除去し、遠心分離中の細胞損失を低減する／最小限に抑える改良された洗浄プロセスを提供する。
【００４８】
本開示の更に別の実施形態は、臨床用途に極めて効果的な最終細胞組成物を調製するために免疫抑制及び免疫増強ＭＳＣ集団を生産するプロセスに関する。
【００４９】
本開示は、解凍後の生存性に影響を与えることなくＭＳＣを低容量、高細胞密度で低温保存する方法を更に提供する。
【００５０】
本開示の別の実施形態では、解凍後の細胞の生存性及び効力に影響を与えることなくＭＳＣを低温保存溶液中、高密度で低温保存する方法を開示する。
【００５１】
本開示の一実施形態は、再構成又は操作の必要なしに最終細胞生成物を貯蔵、輸送及び送達する手段を開示する。
【００５２】
本開示の非限定的な実施形態では、本開示において使用される間葉系間質細胞（ＭＳＣ）という用語は、骨髄、脂肪組織、ホウォートンゼリー、歯髄等を含むが、これらに限定されない様々な供給源に由来する間葉系幹細胞及び成体幹細胞を含むが、これらに限定されない。本開示の一実施形態では、本開示の範囲内のＭＳＣは好ましくは骨髄に由来する間葉系幹細胞を含む。
【００５３】
一実施形態では、本開示で用いられる間葉系間質細胞は骨髄、脂肪組織、ホウォートンゼリー、歯髄等の種々のヒト供給源から当該技術分野において確立されている従来の方法によって単離される。骨髄由来ＭＳＣを用いる本開示の一実施形態では、健常ボランティアから得られる骨髄を、生理食塩水／ハンクス液を用いる代わりにＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを含む希釈培養培地で希釈する。任意の細胞ストレスを低減するために、完全培養培地が単離工程から培養、採取及び低温保存のプロセス全体にわたって使用される。
【００５４】
本開示の更に別の実施形態は、細胞収率の一貫性、優れた細胞生存性、良好な細胞回収率、細胞増加の改善、低いＨＬＡ−ＤＲ発現、臨床試験施設での培養期間の短縮及び操作の低減と同時の純度及び効力を達成するための適切な培養、製造並びに最終細胞生成物の低温保存及び貯蔵を含む最終間葉系間質細胞組成物又はＩＭＰ（治験用医薬品）の徹底した生産プロセスに関する。
【００５５】
本開示は、培養プロセスが完了するまでに最初の培養細胞の数が数倍に増え、それにより高いＭＳＣの収率がもたらされるようにＭＳＣを培養する方法を提供する。本開示の洗浄プロセスは、上記の培養によって得られるＭＳＣに対する有益な効果を更にもたらし、培養プロセスにおけるウシ成分の使用のために存在し得る残留ＢＳＡレベルを細胞から低減又は完全に排除する。続いて、これらのＭＳＣを当該技術分野で既知の好適な低温保存溶液とともに貯蔵するか、又は様々なビヒクル／賦形剤を用いて配合する。本開示の一実施形態では、細胞組成物という用語は、適切なビヒクル／賦形剤とともに本開示の上述の培養プロセスによって得られる同種間葉系間質細胞を含む最終組成物を指す。細胞組成物は治験用医薬品／治験薬とも称される。本明細書で使用される場合、「治験用医薬品（ＩＭＰ）又は治験薬（ＩＰ）又は治療組成物又は組成物」という用語は全て、主に骨髄由来同種間葉系間質細胞、好ましくは間葉系幹細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５及びＣｒｙｏＳｔｏｒ  １０等の市販の即時使用可能な低温保存溶液、又はヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む自家作製低温保存溶液とともに含む組成物を意味する。さらに、本開示の組成物又はＩＭＰ又はＩＰに含まれる同種ＭＳＣは、単一のドナー又は複数のドナーに由来する細胞を含み得る。細胞が２人以上のドナーから提供される場合、細胞はプールされる。細胞組成物／ＩＭＰ／ＩＰがＣＳ５中にプールされたＭＳＣを含むのが好ましい。
【００５６】
一実施形態では、本開示の培養プロセスによって培養したＭＳＣ又は本開示のＭＳＣから配合されたＩＭＰの臨床用途及び／又は治療用途は拡張型心筋症、変形性関節炎（ＯＡ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、肝硬変（ＬＣ）、真性糖尿病及び急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
本開示の別の実施形態では、本開示によって提供されるＭＳＣを培養するプロセスは拡張可能であり、結果は培養を行う規模に関わらず再現可能である。説明及び実験を容易にするために、本開示の範囲内で提示される値は表面積が約６００ｃｍ２〜７００ｃｍ２の
範囲のセルコンテナ又はセルスタックに関するものである。本開示で用いられる播種密度は約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲である。本開示の範囲内の「スタック」という用語は上述の表面積を有し、細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の播種密度で培養するセルコンテナに関する。さらに、各培養段階で供給される培養培地は約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度であるため、培地の量はそのように培養される細胞の量に関わらず細胞の培養に用いられる表面積に従う。したがって、当業者は本開示のプロセスをスケールアップするために、コンテナ又はスタック及びそれぞれの表面積は変化し得るが、本開示において開示される播種密度及び相対細胞数及びそれぞれの培養培地の量がかかるスケールアップと一致する限りにおいて、得られる結果が同じであることを理解するであろう。
【００５８】
本開示は骨髄由来ＭＳＣの治療用途のための大規模増殖の方法を提示する。本開示は、新たに採取した間葉系間質細胞（ＭＳＣ／凍結融解ＭＳＣ）を、移植中／移植前にその生存性及び多能性を特定の期間維持するのに最適な条件で保存／貯蔵する基本的な方法も開示する。本開示は、間葉系間質／幹細胞（ＭＳＣ）をＣＳ５、ＣＳ１０又はヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、並びに臨床用途の細胞組成物に使用される他の薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む組成物にも関する。
【００５９】
本開示の別の実施形態では、骨髄から単離された間質細胞を完全細胞培養培地で培養する。完全細胞培養培地（表２）はＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。骨髄由来単核細胞（ＭＮＣ）は従来技術で確立されているいずれかの方法によって得られる。
【００６０】
【表１】
2016007214.tif 000002
【００６１】
本開示の更に別の実施形態では、Ｐ１での播種密度は好ましくは約６６６６細胞／ｃｍ２であり、Ｐ２〜Ｐ５での播種密度は好ましくは約１０００細胞／ｃｍ２である。細胞がコンフルエントになった時点で断続的に培地を交換しながら細胞を培養し、その後採取する。
【００６２】
細胞増殖のプロセスは概して、各継代での細胞培養、細胞採取及び解凍の工程を含む。これらの工程は細胞を骨髄等の生物学的供給源から吸引し、続いて上記で繰り返されるように細胞培養培地で希釈した後に行われる。希釈の一般的プロセスに続いて下記に開示の培養、採取及び低温保存を継代３まで行う。
【００６３】
細胞培養：
細胞培養プロセスは、細胞を完全培養培地が入った培養プレート／セルスタック／フラスコに播種し、約１０日間〜１４日間という或る特定の期間にわたって増殖させることを含む。培地交換の工程は使用済み培地を断続的に新たな完全培地に交換することによって行われる。細胞が８０％〜８５％のコンフルエンシーを達成した時点で細胞を採取する。
【００６４】
細胞採取：
細胞採取工程は使用済み培地を除去した後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、続いて細胞を０
．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで数分間（２分間〜３分間）処理することを含む。これはトリプシン処理と称される。トリプシン処理した細胞を中和する、又は、言い換えると、細胞に対するトリプシンの作用／効果を、中和培地を用いて中和する。中和培地はダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、約１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、約５０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む。中和の後、中和培地中の細胞懸濁液を遠心分離してＭＳＣペレットを得て、これを更なる継代のために培養培地に懸濁する。この段階で細胞は継代１にあるといえる。一方で低温保存培地を用いてＭＳＣペレットを低温保存することができる。低温保存培地は、約８５％〜約９５％の範囲のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び約５％〜約１５％の範囲のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００６５】
本開示の一実施形態では、低温保存培地はｃｒｙｏｓｔｒｏ−５若しくはｃｒｙｏｓｔｒｏ−１０又はそれらの組合せである。
【００６６】
解凍：
液体窒素中のｃｒｙｏｓｔｏｒの細胞バイアル／バッグを取り出し、３７℃の水浴内で３分間〜４分間回復させる。
【００６７】
【表２】
2016007214.tif 000003
【００６８】
本開示によると、骨髄を複数の健常ドナーから別個に単離するが、継代０（Ｐ０）で骨髄から単離した細胞集団は不均質な細胞集団である。Ｐ０細胞を継代し、主に間葉系間質細胞からなるＰ１細胞を得る。Ｐ１細胞を継代してＰ２を得て、これを更に継代してＰ３細胞を得る。各継代で数個のバイアルを低温保存する。一実施形態では、複数のドナーのＰ１細胞をプールし、同じ割合でＰ２まで継代してプールされたサンプルを得て、これをＰ３まで更に継代する。
【００６９】
本開示のまた別の実施形態では、細胞をプールすることなく継代２に続いて継代３（Ｐ３）まで直接継代してもよい。
【００７０】
継代３で採取した細胞を低温保存するか、又はＰ４まで更に継代することができる。
【００７１】
低温保存したＰ３細胞を解凍し、完全細胞培養培地に播種する。細胞を更に培養し、採取してＰ４を得る。培養及び細胞採取を上記に開示した細胞培養及び採取のプロセスのように行うか、又は更には当該技術分野で既知の任意のプロセスを用いてもよい。Ｐ４細胞を解凍し、更に記載される大規模プロセスを用いて大規模培養して、粒子／不純物等を含まない強力な生存ＭＳＣを含む細胞組成物を得る。
【００７２】
プロセスの最適化は商品原価（ＣＯＧ）を最小限に抑えることにより、製品の全体的な商業的実現性を改善することである。しかしながら、ＩＭＰ製造プロセスの最適化は産業上の要件及び／又はＧＭＰ実務基準に基づく必要がある。治療用の間質／幹細胞生成物の開発及び製造は、細胞の純度を確保するために広範な品質管理（ＱＣ）を必要とする。本開示は細胞を培養及び増殖させ、続いて採取し、ＤＰＢＳで洗浄し、遠心分離して高い生存細胞収率を得るとともに、製造プロセスの更なる最適化を容易にする最終生成物中のＢＳＡレベルを低減することに関する。さらに、細胞を培養及び採取して継代３の細胞を得る上記のプロセスとは別に、従来用いられてきたプロセスを本開示の範囲内で用いてもよい。このため、当業者はＰ３細胞を得て下記に開示される大規模生産へと進めるのに最適な培養プロセスを認識するであろう。
【００７３】
大規模生産：
本開示における大規模生産は、必要な成分を正確な割合で含む完全培養培地を調製し、臨床品質の細胞を大規模で一貫して製造するのに最適な細胞培養培地を達成することから始まる。ｂＦＧＦは細胞培養培地において重要な成分の１つであり、その濃度は細胞増加及びＨＬＡ−ＤＲ発現のプロセスにおいて非常に重要である。正確で均一なｂＦＧＦ濃度を得て、任意の体積誤差を回避するためにｂＦＧＦマスターミックスを調製し、これを他の成分とともに培養培地と混合して、完全培養培地を得る。従来のプロセスでは、ｂＦＧＦが存在する場合、これを各々の培養フラスコ／容器に添加することで細胞品質の大きな変動が生じる。
【００７４】
本発明のプロセスでは、大規模増殖における培地調製、種調製及び培地供給サイクルの重要な意味はＩＭＰの効率及び一貫性を最大化することである。ｂＦＧＦマスターミックスの調製により体積誤差を回避し、培地への均一なｂＦＧＦの分布を得る。さらに、ｂＦＧＦ培地を全てのセルスタックに供給することで、成長特徴及び細胞収率の一貫性を改善する。したがって、ｂＦＧＦマスターミックスは生産プロセスにおいてより高い細胞収率及び細胞品質に関する一貫性の維持に大きく貢献する。
【００７５】
次に重要な工程は、全てのセルスタックへの均一な細胞分布をもたらすことにより、大規模増殖において均一なＭＳＣの増加を向上させ、セルスタック全体の均一なコンフルエンシーを達成する種マスターミックスを調製することである。
【００７６】
大規模増殖の別の重要な態様は培養を行う際の供給スケジュール／供給サイクルである。供給サイクルの頻度は培養容器における細胞コンフルエンシーによって規定される。これにより高い細胞増加、細胞収率の一貫性及び培養期間の短縮が確実となる。
【００７７】
ＩＭＰ投与配合物に必要とされる細胞数に応じて、特定数のＰ３バイアルを任意に回復させ（低温保存時）、計数する。
【００７８】
培養の各段階で供給される培養培地は約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度であるため、培地の量はそのように培養される細胞の量に関わらず細胞の培養に用いられる表面積に応じて与えられる。
【００７９】
次いで、細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種し、培養１日目に細胞に約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の培地を補充し、約４０％〜５０％のコンフルエンシーが達成された時点で細胞に約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の培地を更に補充することによって継代３の細胞を継代４まで増殖させる。この段階での細胞数は、継代３の終了時の細胞数と比較して少なくとも約３０倍増大している。
【００８０】
さらに、細胞を約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種することによって、これらの細胞を継代５まで増殖させる。培養初日にこれらの細胞に約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の培養培地を補充する。約３０％〜４０％のコンフルエンシーが達成された時点で、約０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の培養培地を、使用済み培地を除去せずに添加する（培地追加）。その後、培養物が約６０％〜７０％のコンフルエンシーに達した時点で完全培地交換の工程を行い、使用済み培地を全ＴＣＳから完全に除去し、０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜約０．３５ｍｌ／ｃｍ２の培養培地を添加する。この段階での細胞数は、継代３の終了時の最初の細胞数と比較して少なくとも約２０００倍増大している。
【００８１】
より具体的には、例示的な実施形態として、細胞を１セルスタック（約６３６ｃｍ２の表面積を有する）に約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、培養１日目に細胞に約１５０ｍｌの培地を補充し、約４０％〜５０％のコンフルエンシーが達成された時点で細胞に約１５０ｍｌの培地を更に補充することによって継代３の細胞を継代４まで増殖させる。この段階で得られる収率は１ＣＳ当たり約２５×１０６細胞〜４０×１０６細胞であり、このプロセスに必要とされる全期間は約８日〜９日である（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【００８２】
さらに、細胞を１０セルスタック（約６３６ｃｍ２×１０＝６３６０ｃｍ２の表面積を有する）に１セルスタック当たり約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種することによって、これらの細胞を継代５まで増殖させる。培養初日にこれらの細胞に１セルスタック当たり約１．５Ｌの培地を補充する。約３０％〜４０％のコンフルエンシーが達成された時点で、０．５Ｌの培地を各々のセルスタックに使用済み培地を除去せずに添加する（培地追加）。その後、培養物が約６０％〜７０％のコンフルエンシーに達した時点で完全培地交換の工程を行い、使用済み培地を全ＴＣＳから完全に除去し、約２Ｌの新たな培地を各セルスタックに添加する。この段階で得られる収率は、１０セルスタック当たり約４５０×１０６細胞〜６００×１０６細胞であり、このプロセスに必要とされる全期間は約１０日〜１１日である（図２）。
【００８３】
上述の培養の計算は以下のように表すことができる。
【００８４】
１セルスタックの容量は約６００ｃｍ２〜約７００ｃｍ２である。約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度では、１セルスタックに継代４の初めに播種される全細胞数は約６０００００細胞〜約７０００００細胞、すなわち約６０万細胞〜約７０万細胞である。継代４の終わりまでの細胞増殖により、細胞数は１セルスタック当たり約２５００万細胞〜約４０００万細胞まで増大する。
【００８５】
次いで、これらの細胞を継代５への更なる増殖のために再度約１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で種々のセルスタックに播種する。１セルスタックは約６０万細胞〜約７０万細胞を収容することができるため、約２５００万細胞〜約４０００万細胞を収容するのに必要とされるセルスタックの数は約４０セルスタック〜約７０セルスタックである。ここで上述のように、継代４の終わりから継代５の終わりまでの細胞増殖により１０セルスタック当たり約４５０×１０６細胞〜６００×１０６細胞、すなわち１セルスタック当たり４
５００万細胞〜６０００万細胞の細胞収率が得られるため、約４０セルスタック〜約７０セルスタックの各々についての増殖は１８億細胞〜約４２億細胞の範囲の全細胞数をもたらす。このため、最初の約６０万細胞〜約７０万細胞からの継代４及び継代５における増殖は、約１８億細胞〜約４２億細胞の範囲の全細胞数をもたらし、したがって細胞は少なくとも２０００倍増加する。
【００８６】
しかしながら、細胞は約１０００細胞／ｃｍ２〜約７０００細胞／ｃｍ２の範囲の密度で播種することができる。播種密度が増大する場合、培養期間はそれに応じて変化し、実際には短縮され得る。さらに、より多くの細胞を播種するのに必要とされるセルスタックの数が少なくなるために培地消費も減少し得る。
【００８７】
上述の培地供給プロセスは、約３０％〜４０％のコンフルエンシーでの培地追加がＭＳＣの増加を改善するため、大規模増殖において重要な役割を果たす。さらに、約６０％〜７０％のコンフルエンシーでの完全培地交換（ＣＭＣ）は、大規模培養物の生存性及び品質を損なうことなく増加を向上させる。さらに、ＣＭＣは細胞収率の一貫性を改善し、培養期間を短縮する。
【００８８】
次いで、大規模増殖プロセスから採取された細胞を洗浄プロセスに供し、全ての不純物／粒子、とりわけ細胞培養中のＦＢＳの使用のために採取された細胞中に見られるＢＳＡを除去する。臨床用途及び／又は治療用途に使用される細胞組成物は異種（xeno）成分が全て除かれている必要があり、ＢＳＡレベルは細胞数又はかかる組成物の容量に関わらず、かかる組成物の各々について常に５０ｎｇ未満である必要がある。本明細書で行われる洗浄プロセスは以下の工程を含む：
１．  細胞を初めに約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約１０分間遠心分離する。次いで、細胞を１０セルスタック当たり約２００ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約１０分間再遠心分離する。
２．  二度目の洗浄では、１０セルスタック当たり約７０ｍｌ〜約９０ｍｌの洗浄緩衝液−ＤＰＢＳを添加し、続いて全てのセルスタックから細胞サンプルをプールする。
３．  プールした細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約５分間〜約７分間再び遠心分離する。
４．  最後に、細胞ペレットを約２５Ｍ細胞／ｍｌでＣＳ５に配合し、２ｍｌ、４ｍｌ及び８ｍｌの容量で凍結する。
【００８９】
上記の洗浄工程は、主に骨髄由来同種間葉系間質細胞、ＣＳ５若しくはＣＳ１０、又はヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む組成物である最終生成物の生産プロセスにおいてＢＳＡレベルを最小限に抑え（すなわち５０ｎｇ未満）、良好な生存性を維持し、細胞損失を低減する。ここで、先に示したように本開示のプロトコルに従う細胞の培養及び洗浄後に、細胞を臨床用途及び／又は治療用途に必要とされる投与量に従うＩＭＰ又は細胞組成物として配合することに留意することが重要である。任意のかかるＩＭＰ又は細胞組成物におけるＢＳＡレベルは、細胞数又は組成物の容量に関わらず常に５０ｎｇ未満に維持される。
【００９０】
細胞組成物をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、ＤＭＳＯ及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む凍結ミックス／低温保存ミックスを用いて低温保存することが当該技術分野で知られている。臨床要件では低温保存した細胞を解凍し、臨床投与の投与量の要件に従って再構成する。再構成プロセスは高度に調節された環境を有するクリーンルーム内で行われ、非常に費用及び時間のかかるプロセスを行うために熟練者も必要とされる。
【００９１】
一方、本開示は、臨床投与の場で再構成プロセスを必要とすることなく細胞組成物を容易に投与することができる方法を開示する。これは、比較的少量のＤＭＳＯを含む凍結混
合物中に本開示の培養プロセスによって得られるＭＳＣを直接貯蔵することによって行われる。かかる好適な凍結混合物の１つはＣｒｙｏｓｔｏｒ  ５（ＣＳ５）である。したがって、本開示のＩＭＰは、ＭＳＣをＣｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈバイアル（ＣＺバイアル）内の低ＤＭＳＯ低温保存培地、好ましくはＣｒｙｏｓｔｏｒ  ５（ＣＳ５）に直接保存することによって得られる。この工程はＩＭＰを調製する又は本開示の培養工程によって必要細胞数を得るプロセスに必須ではないが、臨床用及び／又は治療用に市販される細胞生成物の最終送達に重要である。この工程では、細胞の高い凍結密度は凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜２５００万細胞である。
【００９２】
従来既知のプロセスによると、細胞を通常は任意の期間にわたって−１９６℃で低温保存するが、本開示では低容量で高い細胞密度（低温保存混合物／凍結混合物１ｍｌ当たり約５００万細胞〜２５００万細胞）を−８０℃で短期間、−１９６℃でより長期間低温保存する。安定性試験は、生成物の保存期間を検査する直接安定性研究を用いて行われる。
【００９３】
さらに、本開示はＭＳＣをＣＺバイアルにおいてＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５  １ｍｌ当たり２５００万細胞で凍結し、−８０℃で直接貯蔵するＩＭＰの保存期間を改善する「直接安定性」と呼ばれる概念にも関する。この細胞の貯蔵方法は、従来行われるような−１９６℃での液体窒素への曝露を含まない。この手順は、−８０℃で約１ヶ月間にわたるＭＳＣの優れた短期貯蔵をもたらし、有害で費用のかかる液体窒素ベースの低温貯蔵手順を含まない。一方で、ＩＭＰをより長時間、例えば数週間又は数ヶ月超、好ましくは１ヶ月超貯蔵する必要がある場合、本開示の培養及び洗浄プロセスにより得られる細胞を低温保存溶液、好ましくはＣＳ５  １ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞という高い細胞密度で−１９６℃にて低温保存する。高い凍結密度と−１９６℃での貯蔵との組合せは、解凍時の細胞の生存性及び細胞回収率に影響を与えない。
【００９４】
−８０℃又は−１９６℃での貯蔵における高い凍結密度とＣＳ５との組合せは、解凍時の細胞の生存性及び細胞回収率に影響を与えない。このため、ＤＰＢＳ洗浄後に様々な用量のＩＭＰを調製する上記で用いられるプロセスにより得られる細胞は、至適結果の要件に応じてＣＳ５中、−８０℃又は−１９６℃にて高い凍結密度で貯蔵される。
【００９５】
したがって、本開示は、ＭＳＣの全培養及び貯蔵プロセスにおいて複数の最適化を適用することによって様々な臨床用途及び／又は治療用途のための改良された最終組成物を提供する。上記の本開示の最適化は下記のように要約される。
【００９６】
培養段階：
最初の比較的少数の前培養ＭＳＣ（継代３等の所定の継代まで前培養した）を、ｂＦＧＦを含む培養培地を用いる増殖に供する。上記の培養培地は成分を主混合する（master mixing）ことによって調製するが、これは細胞を迅速に増殖させるために培養が複数のコンテナ（セルスタック）で同時に行われることによる成分、特にｂＦＧＦの体積誤差及び不一致を排除する。従来の成分の混合では培地中のｂＦＧＦの等しく一貫した容量は得られず、それにより異なるコンテナにおける細胞の成長差が生じる。したがって、主混合は全培養プロセスに対して利点をもたらす。
増殖プロセスの別の重要な態様は、細胞懸濁液を同様に成分の体積誤差及び不一致並びにバッチ間又はコンテナ間の変動を回避／排除するように播種することである。
培養培地の主混合及び本開示の播種プロトコルを行った後、或る継代から別の継代への細胞の増殖を行い、培養培地を従来既知の培養日数ではなく細胞のコンフルエンシーに基づいて補充又は追加する。
上述の全態様は全体として高いＭＳＣ収率をもたらし、細胞数の初期数からの数倍の増大をもたらすとともに、そのようにして得られるＭＳＣの品質、一貫性、免疫抑制特性及び免疫増強特性が高く、ＨＬＡ−ＤＲ等の陰性マーカーが低いことを確実にする。
【００９７】
貯蔵段階：
細胞を上述の培養プロセスによって得た後、貯蔵のために配合しても又は臨床目的及び／又は治療目的での即時投与のために配合してもよい。
従来、ＭＳＣを貯蔵する目的では、低温保存溶液が細胞の凍結に最も一般的に使用されている。ＭＳＣを低温保存溶液中で凍結し、液体窒素中で貯蔵し、必要となった場合に解凍し、再構成し、臨床目的及び／又は治療目的に使用する。通常は、かかる低温保存溶液は、投与後にヒトに対する毒性を引き起こす可能性があるＤＭＳＯの濃度が高いことに留意することが重要である。したがって、細胞が臨床目的及び／又は治療目的に使用され得る前に、低温保存細胞からＤＭＳＯを希釈するか又は洗浄するか又は完全に除去することによって毒性を低減する必要がある。さらに、従来既知の方法による凍結及び貯蔵は液体窒素の使用を必要とするため、このプロセスはクリーンルーム施設及び熟練者（液体窒素は有害であるため慎重に扱う必要がある）、並びに問題となる高価な装置を必要とする。さらに、これにより細胞を貯蔵すると同時に輸送することも実質的に不可能となり得るため、プロセス全体が不便で冗長で困難なものとなる。
本開示は、ＤＭＳＯ量がより少ない低温保存混合物を用いて細胞を高い凍結密度で凍結し、−８０℃で貯蔵することによって再構成要件を回避／排除し、細胞の安定性、生存性、免疫特性、並びに解凍後の生存性及び回収率を保持することを可能にする。この細胞の凍結プロセスは細胞の短期貯蔵に最適である。
したがって、本開示は、高いＭＳＣの収率を得るための上記に開示のプロトコルに従う細胞の培養を提供する。次いで、これらのＭＳＣをＣｒｙｏｓｔｏｒ  ５（ＣＳ５）中でＣＳ５  １ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞の範囲の高い凍結密度で低温保存し、好ましくはＣＺバイアル内で約１ヶ月間にわたって約−７０℃〜約−８０℃の範囲の温度で凍結する。一方、より長期の貯蔵については、同じ細胞密度及び低温保存溶液を使用して細胞を−１９６℃で貯蔵する。
細胞が臨床用途及び／又は治療用途に必要となった場合に、凍結したバイアルを−８０℃又は場合によっては−１９６℃の貯蔵温度から取り出し、単に解凍する。細胞の再構成は必要とされず、臨床用途及び／又は治療用途のために細胞をＣＳ５とともにそれを必要とする被験体に直接投与することができる。
【００９８】
付加的な洗浄工程：
任意のウシ成分を含む任意の培養培地を用いて培養したＭＳＣには、通常は最終培養段階であっても必ず或る特定量のウシ成分が存在する。言い換えると、任意の段階でのＭＳＣの培養に任意のウシ成分が使用される場合、最終段階での細胞採取で幾らかの残留ウシ成分が細胞に付随する。このため細胞はヒトへの投与に適さず、したがってかかるウシ成分の適当な洗浄及び除去が必要とされる。
本開示の培養プロセスではウシ胎仔血清をプロセス中に使用する。ＦＢＳはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するため、細胞の採取時にかかるＢＳＡを除去する必要がある。従来既知の洗浄プロセスは複数回の遠心分離及び洗浄プロセスを含み、複数回の遠心分離のために細胞損失及び生存性が低減するリスクを有するだけでなく、ＭＳＣに付随するＢＳＡの量を所望のレベルまで低減することが不可能である。本開示の新たな洗浄プロセス及び遠心分離は、複数回の洗浄及び遠心分離における細胞損失の低減及び生存性の増大をもたらすことで、細胞損失を低減し、最終生成物の細胞生存性を増大する。
したがって、本開示は従来既知の技法の上記の欠点を克服し、より少ない遠心分離サイクルでＢＳＡレベルの更なる低減を可能にする洗浄プロセスを提供する。
【００９９】
したがって、本開示のプロセスの利点は以下の通りである：
ｉ．１０セルスタック全てにおける細胞数、生存性及びＨＬＡ−ＤＲ発現に関するバッチ間の一貫性
ａ．細胞収率の増大
ｂ．細胞生存性の増大（図３Ａ〜図３Ｃ）
ｃ．低いＨＬＡ−ＤＲ発現（すなわち５％未満）（図４Ａ〜図４Ｄ）
ｉｉ．生産プロセスにおける細胞損失の低減
ｉｉｉ．最終生成物中の不純物の低減
ｉｖ．臨床試験施設での操作の低減。言い換えると、細胞組成物を再構成／希釈する必要なしに患者に投与されるベンチからベッドサイドへの（bench to bedside）生成物を製造する。
ｖ．最終生成物が医薬品のようにベンチサイドで即時使用可能である。
【０１００】
以下の実施例及び図面によって本開示を更に詳述する。しかしながら、これらの実施例は本開示の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：
骨髄由来ＭＳＣの単離及び継代３（Ｐ３）までの細胞培養：
２０歳〜４０歳の年齢範囲の健常ボランティアの約６０ｍｌ〜７０ｍｌの骨髄を、インフォームドコンセントを得た後、一般手術室において全身麻酔下でヘパリン化注射器を用いて腸骨稜上後部から吸引し、個々の血液バッグに回収する。２０ｍｌ容の注射器を使用して、サンプルをセルストレーナー（１００μｍ）に通して骨片、血餅及び細胞集合体を除去し、遠心分離管に回収する。骨髄を採取する前に、強制スクリーニング試験としてボランティアをヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）についてスクリーニングした。
【０１０２】
骨髄のプロセシング及びその後の培養を医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）で行う。簡潔に述べると、骨髄を８０％のダルベッコ変法イーグル培地ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、ウシ胎仔血清（１０％）、１Ｍのグルタミン、並びに５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む完全培養培地で希釈し（１：１）、約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約１０分間〜約２０分間遠心分離して、抗凝固剤を除去する。上記の希釈に使用する完全培養培地はｂＦＧＦを含まない。上清を除去し、骨髄を、ｂＦＧＦを含まない完全培養培地で再度希釈する。骨髄由来単核細胞（ＭＮＣ）を、５０ｍｌ容の遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ、BectonDickinson）内でＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた密度勾配法によって分離する。このプロセスは別の遠心分離管にｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（密度勾配溶液）を取り、２倍量の希釈骨髄を添加し、約１２００ｒｐｍ〜１８００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、２０℃〜２５℃の室温で遠心分離することを含むものであった。バフィー層界面に蓄積した骨髄ＭＮＣを単離し、ｂＦＧＦを含まない完全培養培地で再度洗浄する。継代０（Ｐ０）の単離単核細胞をＴ−７５培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ、BectonDickinson）にプレーティングし、１０％のウシ胎仔血清（HyClone）、２００ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco-Invitrogen）、５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ−ＫＯ中で培養し、３７℃及び５％加湿ＣＯ２でインキュベートする。非接着性細胞を４８時間後に除去し、培養培地の最初の完全交換を行う。その後培地を４８時間ごとに補充する。頻繁な培地交換によって主にＭＳＣが特有のプラスチック接着特性により表面に付着することを確実にする。約８０％〜８５％という所望のコンフルエンシーで完全培地を吸引し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄する。１つのＴ−７５フラスコにつき約１ｍｌ〜２ｍｌのトリプシンを添加し、３７℃で約２分間〜３分間インキュベートする。トリプシンの作用をＤＭＥＭ
ＫＯ、１０％ＦＢＳ及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含む中和培地で中和し、中和したサンプルを回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。ペレットに完全培地を添加した後、細胞計数を行う。その
後、約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地を用いて、ＭＳＣを１ｍｌ当たり約１００万細胞の濃度でバイアル内において凍結させる。これを継代０（Ｐ０）細胞（すなわち１本又は２本のバイアル）と称する。細胞の残りをセルスタック内で１平方ｃｍ当たり約６６６６細胞の播種密度で培養／増殖させ、７日目又は８日目（培養齢）に完全培地を交換し、１４日目〜１８日目に細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco-Invitrogen）で採取する。トリプシン処理した細胞をＤＭＥＭ  ＫＯ、１０％ＦＢＳ及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含む中和培地で中和し、遠心分離管に回収し、約１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間遠心分離する。ペレットを完全培地に再懸濁して、細胞数を評価する。採取した細胞を、約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結培地中、１ｍｌ当たり約１００万細胞〜３００万細胞の濃度でバイアル内において凍結させる。これを継代１（Ｐ１）細胞と称する。
【０１０３】
継代１のＭＳＣを単一のセルスタック内で１平方ｃｍ当たり約６６６６細胞の播種密度で再プレーティングし、１０％のウシ胎仔血清（HyClone）、２００ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco-Invitrogen）、５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ−ＫＯ中で培養し、３７℃及び５％加湿ＣＯ２でインキュベートする。簡潔に述べると、プロセスは以下の通りである。各々１バイアルのＰ１細胞を取り、計数し、最初の骨髄を２人以上のドナーから吸引した場合に任意に各ドナーについて均等にプールする。ドナー細胞の計数及び任意のプーリングの後、細胞を生存性について確認し、生存細胞を得られた細胞数に従って２個〜１０個のチャンバーにプレーティングする。その後、培養チャンバーを約３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移す。４８時間〜７２時間ごとにセルスタックを顕微鏡下で観察し、２枚の代表的な顕微鏡写真を撮影する。７日〜８日ごとに、完全培養培地にＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む新たに調製した完全培地を補充する。チャンバー内の細胞が約８０％〜８５％コンフルエントになるまで細胞を培養する。
【０１０４】
継代１培養物がコンフルエントになった時点で、コンフルエントな培養物を採取し、１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、１０％のウシ胎仔血清（HyClone）、２００ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco-Invitrogen）、５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ−ＫＯ中で培養し、付加的に２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の成長因子を添加することによって継代３まで更に増殖させ、３７℃及び５％加湿ＣＯ２でインキュベートする。大規模生産については、Ｐ３のＭＳＣを１つの１０セルスタック（Corning Life Sciences）にプレーティングする。簡潔に述べると、プロセスは以下の通りである。Ｐ１細胞が約８０％〜８５％のコンフルエンシーに達した時点で、完全培地を吸引し、セルスタックをＤＰＢＳで２回洗浄する。洗浄後、トリプシンを添加し、細胞を約３７℃で約４分間〜５分間インキュベートした後、中和培地で中和する。中和したサンプルを回収し、約１２００ｒｐｍ〜１８００ｒｐｍで約１０分間〜２０分間、室温で遠心分離する。それにより得られたペレットに完全培地を添加し、細胞を計数する。その後、セルスタック内の細胞を別の継代のために培養／増殖させ、細胞を採取し、遠心分離する。得られたペレットに完全培地を添加し、細胞を計数する。各バイアルが約８５％〜９５％のＦＢＳ及び約５％〜１５％のＤＭＳＯを含む凍結ミックス中に約１００万〜３００万のＭＳＣを含有するようにし、バイアルを約−１９６℃で凍結する。これにより継代３（Ｐ３）の細胞が形成され、これをその後の大規模増殖に使用する。
【０１０５】
ＩＭＰ組成物の調製
継代３の後にＩＭＰ又は骨髄由来間質細胞の最終組成物を調製するプロセス
ＩＭＰ又は骨髄由来ＭＳＣの最終組成物を調製するプロセスは、最初に継代３を超えた細胞を培養し、高い品質及び免疫特性を有する高収率のＭＳＣを得ることから始まる。継代３後のプロセスは、最初に体積誤差のないｂＦＧＦの均一な分布のためのｂＦＧＦマスターミックス及びこのマスターミックスを含む培養培地を調製することから始まる。その後、プロセスは更なる細胞増殖の規定のスケジュールに従う種マスターミックスの調製、続く細胞の播種、培養及び培地交換を含む。次いで、増殖させた培養物を洗浄してＢＳＡを除去し、細胞を所要の臨床用途及び／又は治療用途に従う最終組成物又はＩＭＰの調製へと進める。プロセスは下記で順に更に規定される。
【０１０６】
１．  継代３後の細胞の培養及びプロセシングに使用されるｂＦＧＦマスターミックスを含む培養培地の調製：
ｂＦＧＦマスターミックスの調製により体積誤差を回避し、細胞培養／増殖に使用される完全細胞培養培地への均一なｂＦＧＦの分布をもたらす。このように調製された完全細胞培養培地をセルスタックに添加すると、均一な濃度のｂＦＧＦを細胞に供給することが確実となる。このプロセス（図５Ａ）は全ての１０層スタックにおける成長特徴及び細胞収率の一貫性を改善する。したがって、ｂＦＧＦマスターミックスは生産プロセスにおける一貫性の維持、高い細胞収率及び細胞品質に大きく貢献する。
【０１０７】
２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む培養培地の調製：
１．  ＫＯ−ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むが、ｂＦＧＦを含まない８Ｌの培地を調製し、８つの１Ｌ容Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（滅菌カップ）に分注し、１〜８と標識する。
２．  培地コンテナＮｏ．１から２００ｍｌの培地を取り出し、Ｎｏ．９と標識された滅菌コンテナに分注する。
３．  １６００ｕｌのｂＦＧＦ（すなわち１６０００ｎｇのｂＦＧＦ）をコンテナＮｏ．１の８００ｍｌの培地に添加し、十分に混合し、ｂＦＧＦマスターミックスと標識する。４．  １００ｍｌの培地を２〜８と標識された各々のコンテナから取り出し、２００ｍｌの培地コンテナＮｏ．９に添加し、それによりコンテナＮｏ．９の全培地容量を９００ｍｌにする（コンテナＮｏ．１からの２００ｍｌ＋コンテナＮｏ．２〜Ｎｏ．８の各々のからの１００ｍｌ）。
５．  １００ｍｌのｂＦＧＦマスターミックスを取り、９００ｍｌの培地の各々（すなわちコンテナＮｏ．２〜Ｎｏ．９）に添加し、それにより上記のコンテナの各々の容量を１０００ｍｌにする。
【０１０８】
ここで、２〜９と標識された各々のコンテナは、均一なｂＦＧＦマスターミックスの分布を有する１Ｌの培地を含む（２０００ｎｇのｂＦＧＦを含む１０００ｍｌの培地、すなわち２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ濃度）。
【０１０９】
このプロセスは図５Ａによって表される。
【０１１０】
２．  継代３後の細胞の培養及びプロセシングに使用される種マスターミックスの調製：
種マスターミックスの調製により体積誤差を回避し、全てのセルスタックへの均一な細胞分布をもたらす。種マスターミックス（図５Ｂ）は全ＴＣＳにおける均一な増加のプロセス及び細胞収率の一貫性に大きく貢献する。
【０１１１】
１．  各々の１０ＣＳに６３６万の生存細胞を播種する。５つの１０ＣＳの播種に必要とされる全細胞は３１８０万の生存細胞及び１ｍｌ当たり１００万細胞の細胞懸濁液である。
２．  ２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ培地を含有する１つの培地コンテナを取り、３１．８ｍｌの培地を取り出し、３１．８ｍｌの細胞懸濁液を添加する。２００ｍｌの培地をＮｏ．３
〜Ｎｏ．７と標識されたｂＦＧＦ培地を含む各コンテナから取り出し、滅菌コンテナＮｏ．１０に別個に貯蔵する。
３．  ２００ｍｌの種マスターミックスを回収し、コンテナＮｏ．３〜Ｎｏ．７の各８００ｍｌの培地に移す。
４．  ここで、各コンテナは細胞懸濁液を含む１０００ｍｌの培地を含む。１０００ｍｌの細胞懸濁液を各々１つの１０ＣＳに播種し、１０ＣＳの全コンパートメントに分配させる。
５．  最後に、更に５００ｍｌの培地をコンテナＮｏ．８〜Ｎｏ．１０の各１０ＣＳに添加する。各々の１０ＣＳの最終容量は１．５Ｌである。
【０１１２】
このプロセスは図５Ｂによって表される。
【０１１３】
図６Ａ及び図６Ｂは、大規模生産においてｂＦＧＦ及び種マスターミックスを用いたバッチ一貫性データ及びＨＬＡ−ＤＲ発現の低減の詳細を提示する。これらの図は、かかるｂＦＧＦマスターミックス及び種マスターミックスを含まない従来既知のプロセスとの比較も示す。
【０１１４】
３．  細胞播種、培養及び培地交換のスケジュール：
細胞を１セルスタックに１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、培養１日目に細胞に１５０ｍｌの上記で調製した培地を補充し、４０％〜５０％のコンフルエンシーが達成された時点で細胞に１５０ｍｌの培地を更に補充することによって、継代３の細胞を継代４まで増殖させる。この段階で得られる収率は１ＣＳ当たり約２５×１０６細胞〜４０×１０６細胞であり、このプロセスに必要とされる全期間は約８日〜９日である。
【０１１５】
４．  更なる細胞の増殖：
さらに、細胞を１０セルスタックに１０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種することによって、これらの細胞を継代５まで増殖させる。培養初日にこれらの細胞に１．５Ｌの培地を補充する。約３０％〜４０％のコンフルエンシーが達成された時点で、０．５Ｌの培地を、使用済み培地を除去せずに各セルスタックに添加する（培地追加）。培養物が約６０％〜７０％のコンフルエンシーに達した時点で完全培地交換の工程を行い、使用済み培地を全ＴＣＳから完全に除去し、２Ｌの培地を各セルスタックに添加する。この段階で得られる収率は１０ＣＳ当たり４５０×１０６細胞〜６００×１０６細胞であり、このプロセスに必要とされる全期間は従来既知のプロセスの１４日間に対して約９日〜１０日である。継代４の終了時に得られる全ての細胞を約４０セルスタック〜約７０セルスタックの範囲の異なるセルスタック内で１セルスタック当たり６０万細胞〜約７０万細胞の同じ播種密度で増殖させるため、継代５の終了時に得られる全細胞数は約１８億細胞〜約４２億細胞の範囲である。
【０１１６】
５．  洗浄プロセス：
次いで、これらの細胞を以下の工程を含む洗浄プロセスに供する：
細胞を初めに約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約７分間〜約１０分間遠心分離する。次いで、細胞を１０セルスタック当たり約２００ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約１０分間再遠心分離する。
２回目の洗浄では、１０セルスタック当たり約７０ｍｌ〜約９０ｍｌの洗浄緩衝液−ＤＰＢＳを添加した後、細胞サンプルをプールする。
プールした細胞を約１２００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍで約５分間〜約７分間再び遠心分離する。
【０１１７】
継代３後の細胞増殖に使用する完全細胞培養培地（表２に提示される）ではＦＢＳを補助剤として用いるが、これはウシ起源であるため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を臨床
使用の前に生成物から除去する必要がある。上記の洗浄工程は、主にＣＳ５中の骨髄由来同種ＭＳＣを含む組成物である最終生成物中のＢＳＡレベルを低減する（すなわち５０ｎｇ未満）。また、細胞組成物をＣＳ１０と組み合わせて又はヒト血清アルブミン、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と組み合わせて使用することができる。最終細胞組成物は約１ｍｌ〜約８ｍｌのＣＳ５中に約２５００万〜約２億の間葉系間質細胞を含むのが好ましい。最終組成物の１ｍｌ当たりの細胞密度は１ｍｌのＣＳ５中に２５００万細胞、２ｍｌのＣＳ５中に５０００万細胞、４ｍｌのＣＳ５中に１億細胞、及び／又は８ｍｌのＣＳ５中に２億細胞である。図８Ａは上記で開示した洗浄手順後のＩＭＰにおけるＢＳＡの低減を明らかに示す。
【０１１８】
最終生成物の送達及び貯蔵：
このようにして得られるＩＭＰを、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈバイアル（ＣＺバイアル）において配合培地Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ５（ＣＳ５）中で低温保存する。ＩＭＰはバッグ／バイアル及び細胞保存に使用される任意の他の低温保存培地中でも低温保存することができる。この工程はＩＭＰの調製プロセスに必須ではないが、最終送達に重要である。この工程では、細胞の高い凍結密度は凍結混合物１ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞であり、ＭＳＣを−８０℃で直接貯蔵する。この細胞の貯蔵方法はより短い期間で理想的であり、−１９６℃での液体窒素への曝露を含まない。このプロセスは、解凍時の高い細胞生存性及び細胞回収率を含む優れた細胞の短期貯蔵を確実にする。
【０１１９】
一方で、ＩＭＰをより長時間、例えば数週間又は数ヶ月超、好ましくは１ヶ月超貯蔵する必要がある場合、本開示の培養及び洗浄プロセスにより得られる細胞を、低温保存溶液１ｍｌ当たり約５００万細胞〜約２５００万細胞という高い細胞密度で−１９６℃にて低温保存する。高い凍結密度と−１９６℃での貯蔵との組合せは、解凍時の細胞の生存性及び細胞回収率に影響を与えない。
【０１２０】
上記の手順は主に、即時使用可能なベッドサイド生成物としての市場への最終送達に関する。細胞ベースの生成物の最大の課題は、細胞ベースの生成物を更なる操作なしに使用することができるように送達することである。従来の手順によると、液体窒素中で貯蔵した細胞生成物を解凍し、患者に投与する前に再構成のために処理する。このプロセスはクリーンルーム施設及び熟練者を必要とし、最終市場送達に問題となる。細胞生成物の貯蔵及び輸送への液体窒素の使用は費用のかかる方法であるため、細胞組成物を−８０℃で貯蔵及び輸送する本発明の手順はコスト効率がよい。
【０１２１】
したがって、本開示は細胞組成物を配合、貯蔵及び輸送する手順を提供するが、この場合、多数の細胞を少量の低温保存溶液中で凍結し、細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５  １ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞の細胞密度で低温保存し、これらを短期間要件では−８０℃で直接貯蔵する。
【０１２２】
ＣＳ５中での高い凍結密度と−８０℃での貯蔵との組合せは細胞の生存性及び回収率を低下させない。ＩＭＰはＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５凍結混合物１ｍｌ当たり２５００万細胞の凍結濃度で２５００万細胞〜２億細胞を含み、凍結又は貯蔵の所要期間に応じて−８０℃又は−１９６℃で充填サイズ５ｍｌ〜１０ｍｌのＣＺバイアルに貯蔵される。
【０１２３】
実施例２：
供給サイクルの重要性−培養コンフルエンシーに基づく大規模増殖における追加及び完全培地交換：
３０％〜４０％のコンフルエンシーでの培地追加はＭＳＣの増加を改善するため、培地供給は大規模増殖において重要な役割を果たす。さらに、６０％〜７０％のコンフルエンシーでの完全培地交換（ＣＭＣ）は、大規模培養の生存性及び品質を損なうことなく増加
を向上させる。さらに、ＣＭＣは細胞収率の一貫性を改善し、培養期間を短縮する。
【０１２４】
改善の利点
ｉ）１０セルスタック全てにおける生存性、細胞数及びＨＬＡ−ＤＲに関するバッチ間一貫性
ｉｉ）細胞収率の増大
ｉｉｉ）低いＨＬＡ−ＤＲ発現
【０１２５】
ＨＬＡ−ＤＲ発現の一貫性：
したがって、種々の生産バッチにおける全細胞収率及びＨＬＡ−ＤＲ発現を示す図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、コンフルエンシーに基づく培地交換を行う本開示のプロセスは、日数に基づく従来既知の培地交換プロセスと比較して顕著に良好な結果を示す。
【０１２６】
実施例３：
ＭＳＣの大規模増殖における本開示の洗浄工程の重要性：
不純物／粒子を除去する洗浄プロセスは非常に重要であり、洗浄工程プロセスの微調整は所要の細胞品質を一貫して達成するのに不可欠であり、僅かな変動であっても結果の変化を生じ得る。このため、洗浄及び遠心分離に関する製造プロセスの最適化は細胞損失を最小限に抑える一方で、ＢＳＡレベルを低減し、最終生成物の解凍後の生存性を一貫して改善する。多くの細胞療法剤は静脈内投与され、粒子又は無傷のマイクロキャリアの最終生成物へのキャリーオーバーが深刻な安全性リスクをもたらす。全ての粒子が細胞懸濁液から確実に除去されるようにする大規模培養物のプロセシングに関する広範な最適化及び検証は、システムの有効収率を増大する。ＤＰＢＳでの連続洗浄工程及び遠心分離は細胞分離を容易にし、粒子状物質の除去に有用であり得る。
【０１２７】
本開示の洗浄プロセスの利点
ｉ．洗浄工程はＩＭＰの純度を改善する。
ｉｉ．細胞損失の低減
ｉｉｉ．洗浄工程は最終生成物の生存性及び品質を向上させる。
【０１２８】
最終生成物におけるＢＳＡレベルは、従来既知のプロセスでは２００ｍｌのＤＰＢＳ及び１８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離による第１の洗浄（洗浄−Ｉ）、その後の２００ｍｌのＤＰＢＳ及び１８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離による第２の洗浄（洗浄−ＩＩ）を含む洗浄プロセスを行うことによって最小限に抑えられる。これを、２００ｍｌのＤＰＢＳ、１８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離による第１の洗浄（洗浄−Ｉ）、その後の９０ｍｌのＤＰＢＳ、１８００ｒｐｍで７分間の遠心分離による第２の洗浄（洗浄−ＩＩ）を含む本開示のプロセスに用いられる洗浄プロセスと比較する。本開示の新たな洗浄プロセスを行うと細胞損失が低減し（図８Ｂ）、ＢＳＡレベルが有意に低減することにより最終生成物の生存性が改善する（図８Ａ）ことが観察される（ウシアルブミンＥＬＩＳＡキット（ＢＳＡキット）カタログ番号：８１００、Alpha Diagnostics製により推定した）。さらに、上記の洗浄（洗浄−ＩＩ）工程により細胞損失が最小限に抑えられ、最終生成物の解凍後の生存性／細胞回収率が改善する（図８Ｂ及び図８Ｃ）。従来既知のプロセスでは、細胞損失が高く生存性が低いことから細胞品質に影響があった。本発明の改良／改善された洗浄プロセスは細胞損失を低減することが可能であり、細胞の生存性は該プロセスに影響を受けず、細胞品質が改善する。
【０１２９】
実施例４：
高い凍結密度は臨床試験施設での操作を低減する：
本開示は、解凍後の優れた細胞生存性及び多能性機能を向上させる完全に異種成分を含まない（xenofree）血清無含有凍結培地を用いる高い凍結密度の開発を目的とする。解凍
後の生存性が高い細胞療法生成物の凍結状態での貯蔵（−１９６℃で数年に及ぶ貯蔵）を可能にする。ＭＳＣの種々の凍結濃度を厳密に評価し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５  １ｍｌ当たり２５Ｍ細胞の濃度が最終細胞療法生成物の貯蔵及び送達のための凍結濃度に理想的であることが見出された。
【０１３０】
７ＡＡＤによる生存性及び細胞回収率：
ＢＭ−ＭＳＣをＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５を用いて低温保存培地ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５  １ｍｌ当たり５００万細胞、１０００万細胞、１２５０万細胞、１５００万細胞及び２５００万細胞という種々の濃度で凍結する。解凍後の細胞回収率及び生存性を０、１週間、２週間、４週間、１２週間及び２４週間という種々の時点で分析する。全ての時点で、生存性及び細胞回収率（図９Ａ及び図９Ｂ）は９８％超であると示される。
【０１３１】
さらに、２５Ｍ（１００万）、５０Ｍ（１００万）及び７５Ｍ（１００万）という種々の用量の生成物の安定性を、ＩＭＰを５ｍｌ容のＣＺバイアル内でＣｒｙｏＳｔｏｒ  ５
１ｍｌ当たり２５Ｍ細胞で凍結することによって分析し、−１９６℃で最大１２ヶ月の種々の時点まで貯蔵する。
【０１３２】
１ｍｌ当たり２５Ｍ細胞で凍結した２５Ｍ細胞、５０Ｍ細胞及び７５Ｍ細胞の全ての用量は、最大１２ヶ月の全ての時点まで生存性及び細胞回収率が８５％超であることが示された（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。図１０Ｃは、−１９６℃で貯蔵する１２ヶ月間の１億及び２億の種々の用量のＣＳ５凍結混合物１ｍｌ当たり２５Ｍ細胞についての７ＡＡＤによる生存性を示す。
【０１３３】
本開示のプロセスを用いてそのように製造された細胞は低免疫原性（hypoimmunogenic）及び免疫調節性である。細胞のこれらの特徴を下記の実施例において更に分析する。
【０１３４】
実施例５：
ＩＭＰの低免疫原特性、免疫調節特性及び血管形成特性：
本発明のプロセスによって開発されるＩＭＰのＭＳＣは低免疫原特性、免疫調節特性及び血管形成特性を示す。
【０１３５】
ＩＭＰの免疫原性及び免疫抑制能の推定：
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、その重要な免疫修飾特性のために主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ／ＨＬＡ）障壁を越える既製の治療剤として使用される可能性を有する。ＭＳＣはマイトジェン活性化又は同種（allo-activated）リンパ球の増加を抑制する。したがって、ＭＳＣは同種レシピエントにおけるＴ細胞応答の刺激に非効率的であり、ヒトにおいてＨＬＡ障壁を越えて移植した場合に良好な耐容性を示す。ＭＳＣによる免疫抑制機構は主に免疫調節サイトカインの分泌によるものである。プロスタグランジン−Ｅ２（ＰＧＥ−２）はＭＳＣ媒介免疫抑制の重要な調節因子の１つである。
【０１３６】
最終生成物の免疫抑制能及び最終生成物により産生されるＰＧＥ−２の量がＩＭＰの免疫学的効力を決定することが推定された。
【０１３７】
ＩＭＰの免疫抑制能は以下の方法によって決定した：
本開示のプロセスにより得られるＩＭＰ細胞の免疫抑制特性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制するその能力を試験することによって決定する。ＭＬＲをＨＬＡ不適合ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて確立し、種々のＭＳＣ：ＭＬＲ比の成長停止ＭＳＣの存在下又は非存在下で培養する。免疫抑制アッセイのプロトコルは以下の通りである。
【０１３８】
ＩＭＰのマイトマイシンＣ処理細胞を９６ウェルプレートに１．６×１０５細胞／ウェル〜２．５×１０４細胞／ウェルの範囲の様々な細胞数で播種し、一晩付着させた。次いで、１：２．５の刺激：応答比での一方向ＭＬＲを各ウェルに付加した。ＭＬＲを生じさせるために、２×１０５の応答ＰＢＭＣを２５ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで０．５時間予め処理した８×１０４の同種刺激ＰＢＭＣと混合した。培養物を５日間維持し、最後の２４時間に５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をパルスした。細胞増加を、ＢｒｄＵ取込みの定量化に比色免疫測定キット（Calbiochem）をメーカーの使用説明書に従って用いて測定した。ＩＭＰ細胞の非存在下で培養した一連のＭＬＲウェルを増加対照とみなした。全てのアッセイについて、処理を１０％ＦＢＳ（Hyclone）、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）及び０．０５ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Invitrogen）中、三連で行った。
【０１３９】
結果からＩＭＰがＭＬＲにおける同種リンパ球の増加を用量依存的に抑制することが示される（図１１Ａ）。
【０１４０】
ＰＧＥ−２の推定：
ＭＬＲをＨＬＡ不適合ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて確立し、上記のプロトコルを用いて種々のＭＳＣ：ＭＬＲ比の成長停止ＭＳＣの存在下又は非存在下で培養した。５日間のインキュベーションの終わりに、ＩＭＰ−ＭＬＲ共培養物の上清を９６ウェルプレートのウェルから回収し、回収した培地を１５００ｒｐｍで遠沈し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。上清におけるＰＧＥ−２のレベルを、ＰＧＥ−２の定量的決定のための競合的免疫測定キット（ＰＧＥ−２  ＥＩＡキット、Enzo Lifesciences）を用いてメーカーの使用説明書に従ってアッセイした。
【０１４１】
結果から本開示の細胞を含むＩＭＰがリンパ球の存在下で培養した場合に大量のＰＧＥ−２を産生することが示される（図１１Ｂ）。ＰＧＥ−２の分泌は、ＩＭＰ細胞と同種ＰＢＭＣとの比率によって変化する明らかな用量応答を示す。産生されるＰＧＥ−２の量とＩＭＰの免疫抑制能との間に正相関が見られ、ＰＧＥ−２の量が多いほどより大きな免疫抑制が得られる（図１１Ｃ）。
【０１４２】
したがって、本開示の細胞を含むＩＭＰは強力な免疫抑制能を有し、大量の免疫調節サイトカインＰＧＥ−２を分泌した。これらの特性によりＩＭＰは非関連レシピエントにおける移植、並びに移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）等の免疫関連疾患及び他の自己免疫疾患の治療に好適である。
【０１４３】
最終生成物によって産生されるＶＥＧＦ及びｓＧＡＧの量を、重症虚血肢（ＣＬＩ）及び変形性関節炎（ＯＡ）のそれぞれに対するＩＭＰの効力を分析することによって推定する。
【０１４４】
ＶＥＧＦの推定：
本開示のプロセス（コンフルエンシーに基づく培地交換計画、洗浄−ＩＩの洗浄プロセスを含み、実施例１のマスターミックス及び種ミックスの調製を考慮する）を行うことによって得られるＩＭＰを継代５で解凍し、Ｔ７５フラスコに１００万細胞の密度でプレーティングする。馴化培地を４８時間及び７２時間の時点で回収し、ＶＥＧＦ含量をＥＬＩＳＡによって推定する。これを、プロセス培地交換をコンフルエンシーではなく日数に基づいて行い、洗浄−Ｉの洗浄プロセスを行い、マスターミックス及び種ミックスの調製を行わない従来既知の最終細胞組成物を得るプロセスと比較する。
【０１４５】
ＶＥＧＦレベルの差を示す結果が図１２に提示され、従来既知のプロセス及び本開示のプロセスを行った場合、本開示のプロセスを行うことによって得られる細胞中のＶＥＧＦ
含量が高まる。
【０１４６】
血管形成効力についてＶＥＧＦを推定するプロトコルは以下の通りである：
強力な血管形成マーカーであるＶＥＧＦ及びＢＭ  ＭＳＣによるそれらの放出は、パラクリン機構が患者における長期血管形成の生物学的効果の基礎となるという考えを支持するものであった。ここで、本発明のＩＭＰ（ＢＭ  ＭＳＣ）−Ｐ５培養物の馴化培地におけるＶＥＧＦの量を推定した。ＢＭ  ＭＳＣをＴ−７５フラスコ（ＢＤ）に１×１０６細胞の密度で二連にてプレーティングした。馴化培地を４８時間後及び７２時間後に、ＤＭＥＭ−ＫＯ、１０％のＦＢＳ、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（１００Ｕ／ｍｌ）、Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）及び２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを供給したＴ７５フラスコから回収した。馴化培地を、継代５で８０％〜９０％コンフルエンシーの採取日にセルスタック内で培養した大規模生産バッチからも回収した。回収した培地を１５００ｒｐｍで遠沈し、０．２２μシリンジフィルター（Millipore）で濾過し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【０１４７】
ヒトＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems，Minneapolis，MN）をメーカーの指示に従って使用した。２００μｌの馴化培地をアッセイに使用した。分離標準が各実験で含まれていた。吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ３プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１４８】
ｓＧＡＧの推定：
本開示のプロセス（コンフルエンシーに基づく培地交換計画、洗浄−ＩＩの洗浄プロセスを含み、実施例１のマスターミックス及び種ミックスの調製を考慮する）を行うことによって得られるＩＭＰを継代５で解凍し、軟骨細胞分化を誘導した。２１日間の分化の後、ｓＧＡＧ及びＤＮＡを推定する。最終ＧＡＧ値をＤＮＡ含量に対して正規化する。これを、プロセス培地交換をコンフルエンシーではなく日数に基づいて行い、洗浄−Ｉの洗浄プロセスを行い、マスターミックス及び種ミックスの調製を行わない従来既知の最終細胞組成物を得るプロセスと比較する（図１３）。明らかなように、従来既知のプロセスの値は平均して２２．５４±２．９８３ｕｇ／ｕｇのＤＮＡであり、本開示のプロセスについては、値は平均して３９．３８±５．２１２ｕｇ／ｕｇのＤＮＡであり、値は有意に高まっている。
【０１４９】
軟骨細胞が軟骨の形成及び再生に必要とされるため、軟骨細胞の分化に対するＢＭ  ＭＳＣの効力を測定した。軟骨細胞によって産生されるｓＧＡＧは軟骨構造の安定化を助けるため、本開示の方法によって生産されるＭＳＣが軟骨細胞に分化し、ｓＧＡＧをｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で産生するか否かを決定するのに重要である。重要な軟骨成分の１つであり、全軟骨成分の約３％〜６％を占めるｓＧＡＧを測定する生化学的アッセイを確立する。ＧＡＧ含量を推定するプロトコルは以下の通りである：
１．  細胞を６ウェルプレートに１平方ｃｍ当たり１０００細胞の密度でプレーティングした（対照１セット及び分化用１セット）。
２．  ｓＧＡＧ推定用の２ウェル、ＤＮＡ推定用の２ウェル、ＲＮＡ用の１ウェル及び染色用の１ウェルを含むアッセイを二連で行った。
３．  ７０％のコンフルエンシーで対照ウェルの細胞をトリプシン処理し、ペレットをｓＧＡＧウェルの使用済み培地とともに−８０℃で貯蔵した。
４．  軟骨細胞分化をGIBCOのＳＴＥＭ  ＰＲＯキットを用いて誘導した。培地交換を４８時間ごとに行った。
５．  さらに細胞を２１日間分化させた。２１日目に細胞をトリプシン処理し、回収し、１１００ｒｐｍで遠沈し、アッセイ時まで乾燥ペレットを−８０℃で貯蔵した。
６．  アッセイの日にサンプルを氷上で解凍し、ＢＬＹＳＣＡＮキットのプロトコルを用
いてｓＧＡＧを推定した。このプロトコルに従い、細胞ペレットを、パパインを用いて６５℃で３時間溶解させた後、ジメチルメチレンブルーで染色した。ｓＧＡＧは酸性ｐＨで染料と反応し、５５０ｎｍで吸収極大に差を示すＧＡＧ−染料複合体を生じる。
【０１５０】
ｓＧＡＧレベルの差を示す結果が図１３に提示され、従来既知のプロセス及び本開示のプロセスを行った場合、本開示のプロセスを行うことによって得られる細胞中のｓＧＡＧ含量が高まる。
【０１５１】
実施例６：
−８０℃での直接安定性：
低温保存後の本開示のＭＳＣの効率を、凍結融解生存性、細胞回収率、解凍後の増加、ＣＦＵ−Ｆ及び分化能によって評価する。低温保存ＭＳＣの長期的な安定性は低温保存培地及び低温保存のプロセス又は方法に応じて異なる。
【０１５２】
加速安定性：
加速安定性研究の標準的技法は、加速安定性条件を確立するために速度制御凍結（−８０℃）、及びその後の液体窒素貯蔵への、更に１週間後の液体窒素貯蔵から−８０℃の急速（deep freezing）凍結へのバイアルの移行を含む。通常は速度制御凍結後にＭＳＣを液体窒素中に入れる必要があり、細胞はＣＲＦ後に−８０℃で極めて不安定である。
【０１５３】
直接安定性：
一方で、本開示は、より高いＭＳＣの凍結濃度と安定性のプロセス／条件とが標準的な加速方法よりも優れた性能、効率及び安定性を可能にするという直接安定性の概念を提供する。概して、この研究は、ＣＲＦ後に−１９６℃の液体窒素に曝露しない−８０℃の直接加速条件でＣＺバイアルにおける製剤の活性物質（ＭＳＣ）の保存期間を確立することを可能にする。これらの研究はＣＺバイアルにおいてＣＳ５培地中、１ｍｌ当たり２５００万細胞という高密度でＭＳＣを貯蔵することで行った。
【０１５４】
ＭＳＣは、主に生成物の輸送のための短期貯蔵に関して従来既知の加速安定性研究よりも有望な又は優れた結果を示す。他の細胞療法産業の大半では速度制御凍結は−１３５℃で終わり、その後ＭＳＣは液体窒素へと移される。一方、−８０℃でのＭＳＣの安定化は独特であり、高価な液体窒素を使用しない短期貯蔵及び輸送に対して利点をもたらす。
【０１５５】
加速手順及び直接安定性手順の７ＡＡＤ生存性
プロトコル：
ＢＭ−ＭＳＣを採取し、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で洗浄緩衝液に再懸濁した。洗浄緩衝液は、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなるものであった。細胞生存性を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ、死細胞の細胞膜を貫通することができる）を用いるフローサイトメトリーによって測定した。１００μｌの細胞懸濁液を暗所で１０分間、室温で９６ウェルプレートの１ウェルに３μｌという７ＡＡＤの飽和濃度でインキュベートし、別のウェルの非染色細胞を自己（auto）としてインキュベートする。フローサイトメトリーを初めに自己を用いて行い、電圧及び補償パラメーターがヒストグラムに含まれるように設定及び調整する。試験サンプルを７ＡＡＤとして先の設定に固定しながら実験する。
【０１５６】
結果：
結果（図１４Ａ）から、直接安定性が３ヶ月の時点で８４．５２％の生存性を示し、加速条件が７９．０２％を示すことが示される。
【０１５７】
３ヶ月の時点での解凍後増加
加速安定性培養条件：Ｔ−２５フラスコ（ｎ＝３）、ｐ＝０．０９９１、１Ｋ播種密度、採取培養齢：８日目で行う解凍後増加研究。直接安定性培養条件：Ｔ−２５フラスコ（ｎ＝３）、＊＊ｐ＜０．００１、１Ｋ播種で行う解凍後増加研究。対照は同じバッチのＢＭ−ＭＳＣ（低温バイアル）の１００万細胞バイアルの解凍後増加を表し、通常の標準手順で低温保存する。全体的な結果から、解凍後の増加速度及び収率が加速条件と比較して直接安定性条件で高いことが示される（採取培養齢：８日目）。
【０１５８】
結果：
直接安定性研究の解凍後増加（図１４Ｂ）は加速安定性よりも良好な生存性を示した。
【０１５９】
加速手順及び直接安定性手順でのＣＦＵ−Ｆアッセイ
プロトコル：
ＣＦＵ−Ｆアッセイについては、１００ＭＳＣを直接安定性研究バイアル及び加速安定性バイアル（各条件でｎ＝２）から１００ｍｍ２細胞培養皿にプレーティングした。１４日間のインキュベーション後にプレートをクリスタルバイオレットで染色し、可視コロニーを計数した。
【０１６０】
結果：
加速条件のＣＦＵ−Ｆは２１日目の時点であっても任意のコロニーを示すことができない（図１４Ｃ）。
【０１６１】
三血球系分化能研究
プロトコル：
ＢＭ−ＭＳＣの骨芽細胞分化を、細胞に１０−８Ｍのデキサメタゾン（Sigma-Aldrich）、３０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Sigma-Aldrich）及び１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（Sigma-Aldrich）を３週間添加することによって誘導した。カルシウム蓄積をフォンコッサ染色によって評価した。分化した細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで３０分間固定した。固定した細胞を５％ＡｇＮＯ３とともにＵＶ光下で６０分間インキュベートした後、２．５％チオ硫酸ナトリウムで５分間処理し、画像を取り込んだ。
【０１６２】
プロトコル：
脂肪細胞分化を誘導するために、ＢＭ−ＭＳＣに１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１μｇ／ｍＬのインスリン及び１００μＭのインドメタシン（全てSigma-Aldrich）を２１日間添加した。次いで、上清を吸引し、細胞を１０％ホルマリンで２０分間固定した。さらに、２００μｌのオイルレッドＯ染色溶液を添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を蒸留水で５回リンスし、画像を取り込んだ。
【０１６３】
プロトコル：
軟骨細胞分化を誘導するために、直接安定性及び加速安定性バイアルのＢＭ−ＭＳＣをＳＴＥＭＰＲＯ（Invitrogen）軟骨形成分化培地（軟骨形成補助剤を含む軟骨細胞分化基本培地）中で培養した。軟骨形成分化培地を３日ごとに補充した。染色のために、細胞を４％ホルマリンで３０分間固定した。サフラニンＯ染色溶液を添加し、５分間インキュベートした。細胞を蒸留水でリンスし、画像を取り込んだ。ＢＭ−ＭＳＣは骨形成、軟骨形成及び脂質生成細胞に分化し、画像をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ顕微鏡（株式会社ニコン、日本、www.nikon.com）及びＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Media Cybernetics, Inc，Silver Spring，MD，www.mediacy.com）を用いて取り込んだ。
【０１６４】
概要：
直接安定性研究が、７ＡＡＤ、ＣＦＵ−Ｆ及び多分化能に関する加速安定性と比較して加速条件よりも高い生存性を示すことが観察される。
【０１６５】
結果：
直接安定性研究の解凍後増加（図１４Ｄ）は加速安定性よりも良好である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月3日(2015.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系間質細胞を培養する方法であって、以下の工程：
ａ．第１の所定の継代まで培養した前記間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で第２の所定の継代まで増殖させること、
を含み、前記増殖を前記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と前記培養培地とを接触させることによって行い、該方法によって前記第２の所定の継代の終了時の細胞数が前記第１の所定の継代の時点の細胞数と比較して少なくとも２０００倍増大する、間葉系間質細胞を培養する方法。
【請求項２】
前記細胞数の増大が最大で２１日間の期間内に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の所定の継代の時点の細胞を前記第２の所定の継代まで連続継代によって増殖させ、該第１の所定の継代が継代２〜継代９の範囲であり、該第２の所定の継代が継代５〜継代１０の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の所定の継代が継代３であり、前記第２の所定の継代が継代５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖用に播種する細胞の数が６０万細胞〜７０万細胞の範囲であり、該増殖の後に得られる細胞の数が少なくとも１８億細胞であり、前記方法により細胞数が少なくとも２０００倍増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地の成分が７５％〜９５％の範囲の濃度のダルベッコ変法イーグル培地−ノックアウト（ＤＭＥＭ−ＫＯ）、５％〜１５％の範囲の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．５％〜２％の範囲の濃度のグルタミン、５０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌの濃度のペニシリンと５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシンとを含むＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び０．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地を、体積誤差を回避し、前記培地の複数のアリコートにおけるｂＦＧＦの
均一な分布をもたらすように前記成分を主混合するプロセスによって調製し、該プロセスが以下の工程：
ａ．ＤＭＥＭ−ＫＯ、ＦＢＳ、グルタミン及びＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含み、ｂＦＧＦを含まない「Ｘ」リットルの培養培地を調製すること、及び「Ｘ」個の１リットルのコンテナに分注すること、及び該コンテナを１〜「Ｘ」と標識すること、
ｂ．「Ｚ」ｍｌの培地をコンテナＮｏ．１から取り出すこと、及びＮｏ．「Ｘ＋１」と標識した新たな滅菌コンテナに分注すること、
ｃ．所定量のｂＦＧＦをコンテナＮｏ．１の「１リットル−Ｚ」ｍｌの培地に添加すること、及びｂＦＧＦマスターミックスが得られるように、十分に混合すること、
ｄ．等量の培地を２〜「Ｘ」と標識したコンテナの各々から別個に取り出すこと、及びコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の「Ｚ」ｍｌの培地に添加することであって、それによりコンテナＮｏ．「Ｘ＋１」の全培地容量を「Ｂ」ｍｌとすること、並びに、
ｅ．工程（ｃ）で得られた所定量のｂＦＧＦマスターミックスを別個に取り出すこと、及びコンテナ２〜「Ｘ」の各々「Ｂ」ｍｌの培地に添加することであって、それにより該コンテナの各々の容量を等しくするとともに、前記培養培地の複数のアリコートを調製すること、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）におけるｂＦＧＦの所定量が培地１ｍｌ当たり１ｎｇ〜３ｎｇ、好ましくは培地１ｍｌ当たり２ｎｇである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）において、該工程（ｄ）の完了時に前記コンテナ２〜「Ｘ」及び「Ｘ＋１」の各々が等量の培地を含有するように等量の培地を取り出す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｅ）において、該工程（ｅ）の完了時に前記コンテナ２〜「Ｘ」及び「Ｘ＋１」の各々が１Ｌの培地を含有するように所定量のｂＦＧＦを添加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの所定のコンフルエンシーが３０％〜４０％、４０％〜５０％及び６０％〜７０％、又はそれらの任意の組合せを含むコンフルエンシーの範囲から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、並びに、
ｂ．前記細胞に４０％〜５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖により細胞数が少なくとも３０倍増大する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に３０％〜４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を前記細胞に添加すること、並びに、
ｃ．前記細胞に６０％〜７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及
び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖により細胞数が少なくとも４０倍増大する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．培養細胞を、該細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって連続継代まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に４０％〜５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び前記細胞の培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の細胞を、該細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって第２の連続継代まで更に増殖させること、
ｄ．前記細胞に３０％〜４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を前記細胞に添加すること、並びに、
ｅ．前記細胞に６０％〜７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖により細胞数が少なくとも２０００倍増大する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養後に得られる細胞を、凍結混合物１ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物による凍結に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記凍結を−７５℃〜−８５℃の範囲の温度又は−１９０℃〜−２００℃の範囲の温度で行い、前記凍結混合物が２％〜１５％の範囲の濃度、好ましくは５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が保持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が以下の工程：
ａ．継代３まで培養した間葉系間質細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地の存在下で継代５まで増殖させること、
を含み、前記増殖を前記細胞が少なくとも１つの所定のコンフルエンシーを達成した時点で該細胞と前記培養培地とを接触させることによって行い、前記方法によって継代５の終了時の細胞数が継代３の時点の細胞数と比較して少なくとも２０００倍増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの所定のコンフルエンシーが３０％〜４０％、４０％〜５０％及び６０％〜７０％、又はそれらの任意の組合せを含むコンフルエンシーの範囲から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞と前記培養培地との接触による増殖が、以下の工程：
ａ．継代３まで培養した細胞を、該継代３の細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって継代４まで増殖させること、
ｂ．前記細胞に４０％〜５０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び前記培養培地を交換すること、
ｃ．工程（ｂ）の終了時に得られる細胞を、該細胞を１０００細胞／ｃｍ２〜７０００細胞／ｃｍ２の範囲の播種密度で播種するとともに、前記培養培地を播種細胞に供給することによって継代５まで更に増殖させること、
ｄ．前記細胞に３０％〜４０％の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び使用済み培地を除去することなく前記培養培地を添加すること、並びに、
ｅ．前記細胞に６０％〜７０％の第２の所定のコンフルエンシーを達成させること、及び増殖細胞が得られるように、前記培養培地を交換すること、
を含み、前記増殖全体で用いられる前記培養培地が０．１５ｍｌ／ｃｍ２〜０．３５ｍｌ／ｃｍ２の範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養プロセスの際に得られる細胞を、臨床用途又は治療用途の所定の投与形態に配合する前に遠心分離プロセスと洗浄プロセスとの組合せに更に供し、該組合せにより前記所定の投与形態に存在するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のレベルが５０ｎｇ／ｍｌ未満の量まで低減し、該ＢＳＡが培養プロセスにおいて前記培養培地中のＦＢＳによって前記細胞に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を培養することによって得られる間葉系間質細胞を含む、臨床用途又は治療用途で配合される投与形態のＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法であって、前記組成物を、該ＢＳＡ量が低減するように遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水での洗浄との組合せに供する工程を含む、ＢＳＡ量を５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低減する方法。
【請求項２６】
ウシ起源の成分の使用を含む前記細胞の培養中に５０ｎｇ／ｍｌを超える量のＢＳＡが該細胞に供給され、５０ｎｇ／ｍｌ未満のレベルが前記投与形態中の細胞数に関わらない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が以下の工程：
ａ．前記細胞を１２００ｒｐｍ〜１８００ｒｐｍの範囲の速度で７分間〜１０分間の範囲の期間にわたる第１の遠心分離に供すること、
ｂ．遠心分離した細胞を６０万〜６００万の範囲の細胞数で２０ｍｌのＤＰＢＳでの第１の洗浄に供すること、及び洗浄した細胞を１２００ｒｐｍ〜１８００ｒｐｍの範囲の速度で１０分間の期間にわたって再遠心分離すること、
ｃ．再遠心分離した細胞を６００〜６００万の範囲の細胞数で７ｍｌ〜９ｍｌのＤＰＢＳでの第２の洗浄に供すること、続いて任意に細胞サンプルをプールすること、並びに、
ｄ．５０ｎｇ／ｍｌ未満のＢＳＡレベルを有する細胞が得られるように、工程（ｃ）の洗浄した細胞を１２００ｒｐｍ〜１８００ｒｐｍの範囲の速度で５分間〜７分間の範囲の期間にわたって再遠心分離すること、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
間葉系間質細胞を貯蔵する方法であって、該細胞を凍結混合物１ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞の範囲の細胞密度で該凍結混合物に供する工程と、該細胞を−７５℃〜−８５℃の範囲の温度又は−１９０℃〜−２００℃の範囲の温度で貯蔵する工程とを含む、間葉系間質細胞を貯蔵する方法。
【請求項２９】
凍結混合物１ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び−７５℃〜−８５℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１週間にわたって液体窒素なしに保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
凍結混合物１ｍｌ当たり５００万細胞〜２５００万細胞の範囲の細胞密度、及び−１９０℃〜−２００℃の範囲の温度での凍結混合物における間葉系間質細胞の貯蔵により、生存性及び解凍後の機能性が少なくとも１ヶ月にわたって保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記凍結混合物が４％〜１１％の範囲の濃度、好ましくは５％の低温保存剤を含み、該低温保存剤が好ましくはＤＭＳＯである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞密度での凍結により生存性及び解凍後の機能性が保持される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記間葉系間質細胞が該細胞を請求項１に記載の方法により培養することによって得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
それを必要とする被験体への治療目的での投与前の前記細胞の再構成を排除する、請求項２８に記載の方法。