(57)【要約】【課題】培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率を増やして、細胞が生産するタンパク質の量を向上させること。【解決手段】Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＧＥライフサイエンス社製）で動物細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１））を培養する際に、終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるようＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ３又はＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５（ＧＥライフサイエンス社製）を添加して培養する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなることを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項２】
細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ３（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなる、請求項１に記載の動物細胞の培養方法。
【請求項３】
細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなる、請求項１に記載の動物細胞の培養方法。
【請求項４】
培養に使用する培地がＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ（ＧＥライフサイエンス社製）である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物細胞の培養方法に関する。具体的には、動物細胞の培養に使用している基礎培地に栄養を補給してタンパク質の生産量や細胞の生存率などを向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の進歩により、動物細胞を用いてタンパク質を製造することが可能となった。このような製造を工業的規模で行うためには、効率的な細胞培養を行うことが必要となる。細胞を培養してタンパク質を生産する場合、その生産量は、
【０００３】
【数１】
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【０００４】
で表される。そのためこの生産量を上げるためには、（１細胞あたりの生産量）と（生きている細胞の数）を向上させる必要がある。
【０００５】
（１細胞あたりの生産量）を向上させるためには、ＤＨＦＲを用いた遺伝子増幅法などがある（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。しかしこの手法で（１細胞あたりの生産量）を向上させるためには、数か月という長い時間がかかる。一方（生きている細胞の数）を増やすためには、培養中に培地へ栄養分を補給する手法などがある（非特許文献３−非特許文献６）。細胞培養を行うと、培地中の栄養は、細胞によって消費される。細胞が増殖すると、栄養が消費されるペースもこれに応じて早くなる。そして培地中の栄養分が枯渇すると、細胞は死滅していく。そのため培地中で（生きている細胞の数）は、培地に含まれる栄養分に見合った数までしか増えない。培養中に培地の栄養分を補給することは、この栄養不足が原因で起こる細胞の生育阻害を抑制する効果がある。そして、培地中で（生きている細胞の数）を向上させる効果がある。
【０００６】
細胞の培養中に補給する栄養分として、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  １〜６（ＧＥライフサイエンス社製）がある。その使用法はそれぞれ異なるが、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ３では、３．５％溶液を２０〜２００ｍｌ／Ｌとなるよう培地へ添加することが推奨されている。またＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５では、３．５％溶液を２０〜２００ｍｌ／Ｌとなるよう培地へ添加することが推奨されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６４５５２７５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｗｉｇｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３５６７，（１９８０）
【非特許文献２】Ｒａｎｄａｌ  Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５，１７５０，（１９８５）
【非特許文献３】Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ａ．  Ｂｉｂｉｌｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ，１１，１，（１９９５）
【非特許文献４】Ｒｕｄｉｇｅｒ  Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２，１５７，（２０００）
【非特許文献５】Ｊ．Ｓ．Ｂａｌｌｅｚ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４，１０３，（２００４）
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｇ．  Ｗｈｉｔｆｏｒｄ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４，３０，（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率を増やし、タンパク質の生産量を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなることを特徴とする動物細胞の培養方法。
（２）細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ３（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなる、（１）に記載の動物細胞の培養方法。
（３）細胞培養中の培地に添加されるＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５（ＧＥライフサイエンス社製）の終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなる、（１）に記載の動物細胞の培養方法。
（４）培養に使用する培地がＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ（ＧＥライフサイエンス社製）である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の方法では、動物細胞の培養中にＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔを添加する。これは、培養によって不足した栄養分を補うためである。このＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔの使用量に関しては、終濃度が最大でも１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）以下となるよう推奨されている。しかし本発明によれば、１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）を超える終濃度でＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔを添加すると、細胞の生存率や生細胞数、及び／又は生産されるタンパク質量がより一層向上した。
【００１３】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔとしては、細胞の生存率や生細胞数が向上するという観点から、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ３、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５、又はＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６が好ましく、特にＢｏｏｓｔ  ３又はＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５は、それに加えて生産されるタンパク質量がより一層向上するという観点から更に好ましい。
【００１４】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ３の添加量は、終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるよう添加すればよいが、好ましくは１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）を超えて２．４％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）以下であり、さらに好ましくは２．０〜２．４％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）である。
【００１５】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５の添加量は、終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるよう添加すればよいが、好ましくは１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）を超えて２．５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）以下であり、さらに好ましくは１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）を超えて２．０％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）以下である。
【００１６】
Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ６の添加量は、終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるよう添加すればよいが、好ましくは１．３〜３．０％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）であり、さらに好ましくは１．４〜２．７％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅである。
【００１７】
本発明の方法が適応できる細胞の種類は、動物細胞であれば特に限定なく、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞、ヒト胎児の腎臓に由来する細胞であるＨＥＫ細胞、マウスのハイブリドーマ等をあげることができる。より具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などにおいて適応可能である。中でもチャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞が好ましく、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）が更に好ましい。
【００１８】
本発明の方法に用いられる培地の種類も特に限定されるものではない。例えば、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＣＤ  ＣＨＯ−Ａ培地（ＧＩＢＣＯ社）、セリシンＧＩＴ培地（日本製薬社）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＧＥ  ライフサイエンス社）などがあげられるが、中でもＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地が好ましい。
【００１９】
特に本発明の方法は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地で培養する際に、とりわけその効率を発揮するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率を増やし、またタンパク質の生産量を向上させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】抗体の発現量とｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔの種類を示す図である。
【図２】培地中の全細胞数を示す図である。
【図３】培地中で生きている細胞の数を示す図である。
【図４】培地中の細胞の生存率を示す図である。
【図５】抗体の発現量をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す図である。
【図６】クローンＢにｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔを添加した際の抗体の発現量をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す図である。
【図７】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加した際の、培地中の全細胞数を示す図である。
【図８】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加した際の、培地中で生きている細胞の数を示す図である。
【図９】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加した際の、培地中の細胞の生存率を示す図である。
【図１０】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加した際の、抗体の発現量をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す図である。
【図１１】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加した際の、培地中の全細胞数を示す図である。
【図１２】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加した際の、培地中で生きている細胞の数を示す図である。
【図１３】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加した際の、培地中の細胞の生存率を示す図である。
【図１４】ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加した際の、抗体の発現量をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す図である。
【実施例】
【００２２】
以下、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を用いた抗プロゲステロンウサギモノクローナル抗体の生産に関する実験により、本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（１）抗体遺伝子のクローニング
以下の方法により、抗プロゲステロンウサギモノクローナル抗体を取得した（特開２００９−２４０３００号公報、特開２０１３−０８３４４８号公報、特開２０１３−１２４２２４号公報）。まず、プロゲステロンにリンカーを生やしてウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）と結合させた。そしてこのＢＳＡ−プロゲステロンを抗原としてウサギに免疫した。その後、免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離した。そしてこの細胞から抗体遺伝子をクローニングした。
【００２４】
（２）抗体安定発現細胞株の樹立
取得した抗体遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）にトランスフェクションした。そしてこの細胞を４００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように血清含有培地へ懸濁した。この細胞懸濁液を３８４ウエルプレートに５０μＬ／ウエルずつ分注して３７℃・５％  ＣＯ２条件下で１週間培養した。その後培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、各ウエル中のＣＨＯ−Ｋ１細胞によって発現した抗体の量を調べた。尚、ＥＬＩＳＡの実施手順は以下の通りである。
【００２５】
まずヤギ抗ウサギＩｇＧを０．５μｇ／ｍＬとなるように炭酸塩緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ  ９．６）へ溶かした。そしてこれを５０μＬ／ウエルずつＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウエル）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄緩衝液（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、  ｐＨ  ７．４）で各ウエルを３回洗浄した。その後ブロッキング緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１％  スキムミルク、ｐＨ７．５）を１００μＬ／ウエルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを１回洗浄した。
【００２６】
このプレートにインキュベーション緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  スキムミルク、ｐＨ７．５）を４８μＬ／ウエルずつ加え、その後、培養上清を２μＬ／ウエルずつ加えた。次にこのプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを３回洗浄した。そしてこのプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼを含むインキュベーション緩衝液を５０μＬ／ウエルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを３回洗浄した。最後にこのプレートへ５０μＬ／ウエルずつアルカリホスファターゼ緩衝液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）を加えて３０分静置し、蛍光強度を測定して（励起波長  ３６０ｎｍ／測定波長  ４６５ｎｍ）抗体の発現量を調べた。尚、本願実施例及び比較例で行った３８４ウエルプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２７】
ＥＬＩＳＡで強いシグナルを発したウエルを選び、その中の細胞を継代して１週間培養した。その後この培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現が一過性でないことを確認した。尚このＥＬＩＳＡの手順は先程と全く同じだが、９６ウエルプレートを用いて実施した。そのため、各ウエルに分注する緩衝液量を２倍に増やして実験を行った。また培養上清を添加するステップでは、各ウエルに７０μＬずつインキュベーション緩衝液加えた後、培養上清を３０μＬずつ加えた。尚、本願実施例で行った９６ウエルプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２８】
次に、抗体を安定的に発現する細胞の単クローン化に取り組んだ。実験手法は以下の通りである。まず、先程のＥＬＩＳＡで安定的に抗体を発現していることが確認できた細胞群を４０ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように血清含有培地へ懸濁した。次にこの懸濁液を次々と２倍ずつ希釈してゆき、希釈系列を作製した。そしてこれをそれぞれ５０μＬ／ウエルずつ３８４ウエルプレートに分注して３７℃・５％  ＣＯ２条件下で１０日間培養した。その後３８４ウエルプレートでＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現量が高いウエルを調べた。そしてこのウエルを顕微鏡で観察し、ウエル中にある細胞のコロニー数を調べた。観察したウエルの中でコロニー数が１つだけのものを選び、抗体安定発現細胞株として凍結保存した。
【００２９】
尚、本願実施例で使用している血清含有培地は、特に断りがない限り、ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）に１０％のウシ血清（ＦＣＳ）を添加したものである。
【００３０】
（３）無血清培地への馴化
以下の手順により、単離した抗体安定発現細胞株を無血清培地へ馴化した。まず、凍結保存していた細胞を解凍した。そしてこの細胞を血清含有培地へ懸濁してディッシュへ播き、３７℃・５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。その後ディッシュから培地を除去し、ＰＢＳでその表面を洗浄した。そしてここへトリプシン溶液を加えて３７℃で５分間静置し、ディッシュから細胞を剥がした。その後このディッシュへ血清含有培地を加え、剥がれた細胞を懸濁してから回収した。次にこの細胞懸濁液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけた。遠心後は上清を捨て、ペレットとして細胞を回収した。そしてこのペレットに無血清培地を加えてよく懸濁し、遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて細胞を洗った。遠心後は再び上清を捨て、ペレットとして細胞を回収した。そしてこのペレットに無血清培地を加えてよく懸濁し、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整した。その後この溶液を３０ｍｌとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコへ入れた。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。
【００３１】
培養を開始してから１週間後、培養液中の細胞密度を測定した。そしてこの培養液の一部をとり、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ加えて希釈した。その後この細胞希釈液を３０ｍｌとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコへ入れた。そしてこの三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を行った。細胞を植え継いでから１週間後、培養液中の細胞密度を測定した。そして先程と全く同じ様に培養液を希釈して細胞を植え継ぎ、同じ条件で再度培養した。１週間毎にこの細胞の植え継ぎを行い、数週間かけて無血清培地の環境へ細胞を馴らしていった。そして１週間毎に測定する細胞密度が一定になった時点で、細胞が無血清培地へ完全に馴れたと判断し、馴化作業を終えた。
【００３２】
尚、本願実施例で使用している無血清培地は全て、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＧＥライフサイエンス社製）を用いている。
【００３３】
（４）使用するサプリメントの検討
ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  １−ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６（ＧＥライフサイエンス社製）のそれぞれ６％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）ストック溶液を作製し、０．２２μｍのフィルターに通して滅菌した。
【００３４】
無血清培地へ馴化させた細胞を、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ希釈して植え継いだ。そしてこの細胞希釈液を３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコ７本に分注した。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。そして培養を開始してから４日、６日、８日、１１日後に、６本のフラスコにそれぞれｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  １−ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の６％ストック溶液を１．５ｍｌずつ添加した。７本のフラスコの内１本については何も添加せず、コントロールとした。培養を開始してから１３日後、培養液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて上清を回収した。そしてこの上清を用い、抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３を添加したフラスコで抗体の発現量が最も高くなっていた（図１）。そのため今後は、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３を用いて実験を行うことにした。
【００３５】
（５）添加するサプリメント量の検討
無血清培地へ馴化させた細胞を、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ希釈して植え継いだ。そしてこの細胞希釈液を３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコ９本に分注した。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。その後、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３の６％ストック溶液を表１に示した通りの条件で各フラスコへ添加した。尚、培地にｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３の６％ストック溶液を添加する際、その添加量は２０％（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）以下になることがメーカーから推奨されている（Ｎｏ．４のフラスコが概ねこの条件である）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
培養を開始してから４日、６日、８日、１１日、１３日、１５日、１８日後に培養液の一部をサンプリングした。そして培地中の全細胞数、生きている細胞数、細胞の生存率を調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３の添加により、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率が向上することを確認できた（図２−図４、表２）。またこの時、メーカーから推奨されている量以上のｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３を添加したフラスコ（フラスコ５−フラスコ９）では、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率がより一層向上していた。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
続いて、抗体の発現量を以下の方法で調べた。培養を開始してから１３日、１５日、１８日後に各フラスコから培養液の一部をサンプリングした。そしてこの培養液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて上清を回収した。この上清を用い、抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３の添加により、抗体の生産量が向上することを確認できた（図５）。またこの時、メーカーから推奨されている量を超えてｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ３を添加したフラスコ（フラスコ５−フラスコ９）では、抗体の生産量がより一層向上していた。
【００４０】
以上の結果から、培養中に終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるようＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ３を添加すると、生きている細胞の数や細胞の生存率、そして、抗体の生産量が大幅に向上することを確認できた。したがって本発明を用いることにより、タンパク質の生産量を大幅に向上させることが可能になった。
【００４１】
実施例２
（１）抗体安定発現細胞株の樹立
実施例１と同様の手法により、抗体安定発現細胞株を新たに単離した。新たに単離したこの細胞株は、以後クローンＢと呼ぶ。実施例２では全てこのクローンＢを用いて実験を行った。
【００４２】
（２）無血清培地への馴化及び使用サプリメントの検討
実施例１と同様の手法により、クローンＢを無血清培地へ馴化した。また、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  １−ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６（ＧＥライフサイエンス社製）の６％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）ストック溶液をそれぞれ作製し、０．２２μｍのフィルターに通して滅菌した。
【００４３】
無血清培地へ馴化させたクローンＢを、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ希釈して植え継いだ。そしてこの細胞希釈液を３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコ７本に分注した。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。そして培養を開始してから４日、６日、８日、１１日、１３日後に、６本のフラスコにそれぞれｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  １−ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の６％ストック溶液を１．５ｍｌずつ添加した。７本のフラスコの内１本については何も添加せず、コントロールとした。培養を開始してから１５日後、培養液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて上清を回収した。そしてこの上清を用い、抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５またはｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加したフラスコで抗体の発現量が最も高くなっていた（図６）。そのため今後は、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５及びｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を用いて実験を行うことにした。
【００４４】
（３）添加するサプリメント量の検討（ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５）
無血清培地へ馴化させたクローンＢを、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ希釈して植え継いだ。そしてこの細胞希釈液を３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコ７本に分注した。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。その後、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５の６％ストック溶液を表３に示した通りの条件で各フラスコへ添加した。尚、培地にｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５の６％ストック溶液を添加する際、その添加量は２０％（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）以下になることがメーカーから推奨されている（Ｎｏ．２のフラスコが概ねこの条件である）。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
培養を開始してから４日、６日、８日、１１日、１３日、１５日、１８日後に培養液の一部をサンプリングした。そして培地中の全細胞数、生きている細胞数、細胞の生存率を調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５の添加により、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率が向上することを確認できた（図７−図９、表４）。またこの時、メーカーから推奨されている量以上のｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加したフラスコ（フラスコ３−フラスコ７）では、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率がより一層向上していた。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
続いて、抗体の発現量を以下の方法で調べた。培養を開始してから１８日後に各フラスコから培養液の一部をサンプリングした。そしてこの培養液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて上清を回収した。この上清を用い、抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５の添加により、抗体の生産量が向上することを確認できた（図１０）。またこの時、メーカーから推奨されている量を超えてｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ５を添加したフラスコの中には（フラスコ３−フラスコ６）、抗体の生産量がより一層向上しているものもあった。
【００４９】
（４）添加するサプリメント量の検討（ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６）
無血清培地へ馴化させたクローンＢを、細胞密度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように新たな無血清培地へ希釈して植え継いだ。そしてこの細胞希釈液を３０ｍｌずつとり、容量が１２５ｍｌでベントフィルター付の三角フラスコ７本に分注した。この三角フラスコをインキュベータの中に入れ、３７℃・５％ＣＯ２・１２５ｒｐｍの条件下で振とう培養を開始した。その後、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の６％ストック溶液を表３に示した通りの条件で各フラスコへ添加した。尚、培地にｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の６％ストック溶液を添加する際、その添加量は２０％（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）以下になることがメーカーから推奨されている（Ｎｏ．２のフラスコが概ねこの条件である）。
【００５０】
培養を開始してから４日、６日、８日、１１日、１３日、１５日、１８日後に培養液の一部をサンプリングした。そして培地中の全細胞数、生きている細胞数、細胞の生存率を調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の添加により、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率が向上することを確認できた（図１１−図１３、表５）。またこの時、メーカーから推奨されている量以上のｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加したフラスコ（フラスコ３−フラスコ７）では、培地中で生きている細胞の数や細胞の生存率がより一層向上していた。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
続いて、抗体の発現量を以下の方法で調べた。培養を開始してから１８日後に各フラスコから培養液の一部をサンプリングした。そしてこの培養液を遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分）にかけて上清を回収した。この上清を用い、抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べた。実験の結果、ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６の添加により、抗体の生産量が向上することを確認できた（図１４）。しかしメーカーから推奨されている量を超えてｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ  ６を添加しても（フラスコ３−フラスコ７）、抗体の生産量に大きな変化は見られなかった。
【００５３】
以上の結果からクローンＢでは、培養中に終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）より高くなるようＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５又は６を添加すると、生きている細胞の数や細胞の生存率が向上することを確認できた。またこの時終濃度が１．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）を超えて２．５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）以下となるようにＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５を添加すると、抗体の生産量がより一層向上することを確認できた。したがって本発明を用いることにより、タンパク質の生産量を向上させることが可能になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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