(57)【要約】【課題】測定基板に対する測定試料の固定を自動化し、かつ観察時における測定試料の量を、作業者が任意に制御することのできる、相互作用解析装置を提供する。【解決手段】基板と、前記基板に測定試料および反応試薬を提供するための送液機構と、前記基板表面の測定試料を観察するための観察機構と、前記観察機構の観察結果をもとに、前記測定基板上における前記測定試料の固定量を解析する解析機構と、前記基板に対する前記測定試料の固定量を調整する制御機構を有することを特徴とする相互作用解析装置であって、基板表面に前記測定試料を固定し、前記基板表面に固定された前記測定試料の固定量を測定し、前記測定結果をもとに前記基板に対する前記測定試料の固定量を調節することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と
前記基板に測定試料および反応試薬を提供するための送液手段と、
前記基板表面の測定試料を観察するための観察手段と、
前記観察結果をもとに、前記基板において前記測定試料が固定された量に関する情報を解析する解析手段と、
前記情報をもとに、前記基板において前記測定試料が固定される量を調整する制御手段と、
を有することを特徴とする相互作用解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記情報が、前記基板に固定された前記測定試料の粒子数または粒子密度に関する情報であることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記制御手段が、測定試料を提供する工程を停止することにより、前記基板において前記測定試料が固定される量を調整することを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記制御手段が、測定試料を提供する工程の繰り返し回数を制御することにより、前記基板において前記測定試料が固定される量を調整することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記制御手段が、測定試料を含む流体における測定試料の濃度の変更を制御することによって、前記基板において前記測定試料が固定される量を調整することを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記観察手段が、前記基板に対する前記測定試料の結合反応を観察することを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記観察手段が、前記基板に結合した前記測定試料の前記反応試薬に対する応答反応を観察することを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記観察手段が、前記基板に対する前記測定試料の結合反応を観察し、かつ、前記基板に結合した前記測定試料の前記反応試薬に対する応答反応を観察することを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記解析手段が、前記情報をもとに、
前記制御手段に対し、次に行う動作を指示するためのアルゴリズムを備えていることを特徴とする装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記制御手段が、前記送液手段と前記観察手段のいずれかもしくは両方の動作を制御することを特徴とする装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記測定試料が、分子、生体試料、または、細胞であることを特徴とする装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の相互作用解析装置において、
前記観察手段が、前記基板に第一の光を照射するための光源と、照射の結果生じる第二の光を測定する検出器を有することを特徴とする装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の相互作用解析装置において、
第二の光は、第一の光の反射光であることを特徴とする装置。
【請求項１４】
請求項１２に記載の相互作用解析装置において、
表面プラズモン共鳴現象における反射光の強度を測定することを特徴とする装置。
【請求項１５】
請求項１２に記載の相互作用解析装置において、
表面プラズモン共鳴現象における共鳴角変化を測定することを特徴とする装置。
【請求項１６】
請求項１２に記載の相互作用解析装置において、
前記第一の光の照射方法が、エバネッセント光照明、落射光照明、または、透過光照明であることを特徴とする装置。
【請求項１７】
基板と
前記基板に測定試料を提供するための送液手段と、
前記基板表面の測定試料を観察するための観察手段と、
前記基板に固定された前記測定試料の量が、予め設定された所定値以上である場合、測定試料の提供を停止するよう前記送液手段を制御する制御手段と、
を有することを特徴とする相互作用解析装置。
【請求項１８】
測定試料に反応試薬を接触させて、前記測定試料の応答を観察する相互作用解析方法において、
基板表面に前記測定試料を提供し、
前記基板表面に固定された前記測定試料の量に関する情報を測定し、
前記測定結果をもとに、前記基板に固定される前記測定試料の量を調節する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
前記情報が、前記基板に固定された前記測定試料の粒子数または粒子密度であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、
前記調整において、測定試料を提供する工程を停止することにより、前記基板に固定される前記測定試料の量を調節することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法において、
前記調整において、測定試料を提供する工程の繰り返し回数を調整することにより、前記基板に固定される前記測定試料の量を調節することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法において、
前記調整において、測定試料を含む流体の測定試料の濃度の変更により、前記基板に固定される前記測定試料の量を調節することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法において、
前記測定試料が、分子、生体試料、または、細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質や生体の相互作用を解析する装置に関する。特に細胞などの生体試料が、刺激に対してどのような応答を示すかを測定する方法、装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬のため、有効な薬物をスクリーニングするための方法として、細胞が薬物に対して感受性があるか否かを判定する技術（セルベースアッセイ）が広まっている。従来は薬物の効果を簡便に評価する際には、標的分子と対象薬物が物理的に結合するか否かを判定する方法が用いられていた。これに対し、薬物の標的となる細胞の生理的な応答を直接測定することで、薬物の効果をより正確に評価できる。このセルベースアッセイの技術は、創薬のみならず、いろいろな分野に用いられている。例えば、アレルギー検査として、患者が特定のアレルゲンに反応するか判定したり、ある物質がアレルギー反応を引き起こす可能性について判定したりできる。また、抗がん剤などの薬物を投与する際に、最も効果的な薬物を選択して投与する、個別化医療にも適用可能である。
セルベースアッセイの典型的な手順は以下の通りである。まず、測定試料となる細胞を培養したり、被験者から採取する。次に、細胞をセンサーチップなどの基板表面に固定する。そして、反応試薬を添加して測定試料に接触させ、蛍光顕微鏡などの手段を用いて観察、測定し、得られたデータを解析して細胞の変化の有無や大きさを得る。
観察手段としては、生物学では一般的な蛍光観察のほか、近年では表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）を利用した手法が用いられている。
【０００３】
ＳＰＲの原理について説明する。金属に対して光を当てると、金属内部の自由電子が集団的に振動を起こす状態となる。この状態をプラズモン（Ｐｌａｓｍｏｎ）と呼ぶ。この現象は金属表面においても生じており、これを表面プラズモン（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ）と呼ぶ。このとき金属表面には電子の振動によって電場が生じる。いま、上面に金属薄膜が蒸着されたガラス基板があったとする。基板下面よりガラスと金属薄膜の界面で全反射する角度で光を入射した場合、金属薄膜表面にはエバネッセント波が生じる。このエバネッセント波と、先述の表面プラズモンの波数が揃った際に共鳴が生じる。これを表面プラズモン共鳴：ＳＰＲと呼ぶ。ＳＰＲが発生すると入射光のエネルギーが共鳴によって奪われるため、反射光の強度が低下する。なおＳＰＲが生じるときの入射角を共鳴角とよび、その値は金属薄膜表面の誘電率に依存する。
【０００４】
特許文献１では、ＳＰＲを利用して外部刺激に対する細胞の応答を観察している。表面に金薄膜が形成され基板に対し、アミノ基末端を有する自己組織化単分子膜を構築し、センサーチップとする。センサーチップに細胞懸濁液を滴下して細胞を表面に固定する。細胞が固定された基板を装置にセットして、ＳＰＲ観察を行う。このときの入射角は、細胞の誘電率によって共鳴が生じる角度に設定されている。このため反射光の強度は低下している。この状態で刺激物質を添加すると、細胞が応答し、例えばヒスタミン等を遊離する。その結果細胞の誘電率が変化し、共鳴状態が崩れ、反射光の強度が増加する。このような反射光の信号強度変化を測定することによって、細胞の変化を観察する。なお特許文献１のように、ＣＭＯＳなどのイメージセンサを用いることで平面的なＳＰＲ情報を得る手法を、ＳＰＲイメージング（ＳＰＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＳＰＲＩ）と呼ぶ。
【０００５】
しかしながら特許文献１の手法では、反射光の信号強度が細胞数に依存するため、定量的な評価が難しく、また測定ごとの再現性が低いという問題があった。そこで上記課題を解決する手法として特許文献２では、ＳＰＲ測定結果から細胞数を計算し、単位細胞あたりの変化量に換算することで、細胞数による結果のばらつきを補正する手段を提供している。まず細胞が付着可能な領域と、付着不可能な領域を有するＳＰＲ基板を準備し、細胞培養液に浸漬し培養する。基板を洗浄して装置にセットし、入射角を徐々に変化させながらＳＰＲ観察を行う。細胞が付着している領域と細胞が付着していない領域とでは誘電率が異なるため、両者の共鳴角に差が生じる。この角度の差分を、予め求めておいた細胞１個あたりの共鳴角の変動値で除することにより、細胞数を算出する。その後入射角を細胞が固定された領域における共鳴角に設定し、刺激物質を添加し、共鳴角の変動量を測定する。最後に変動量を細胞数で除することにより、単位細胞あたりの変動量として規格化された値を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許３７９５３１２
【特許文献２】特開２００７−３３３６１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献２では、１ｍｍ＾２の領域に細胞１個が固定されたときの共鳴角変動を０．４ｍｄｅｇとして細胞数を計算している。つまり正確に細胞数を計算するためには、共鳴角を設定するための回転軸の角度分解能を０．４ｍｄｅｇ以下に設定する必要があるが、このためには高精度な回転ステージが必要となり、装置コストの増大に繋がる。実際には分解能の低い回転ステージを用いて共鳴曲線を作成した後、カーブフィッティングによって共鳴角を求めているが、この方法では計算結果に誤差が生じることが避けられない。また細胞の大きさや種類によって１細胞あたりの共鳴角変動の値が異なるため、汎用性が低い。
【０００８】
また、特許文献１および特許文献２記載のいずれの手法においても、基板に細胞を固定するプロセスと、ＳＰＲ観察のプロセスが独立しているため、基板上に細胞がどの程度固定されているかという情報は、実際にＳＰＲ観察を行う段階になって初めて明らかになる。ＳＰＲ観察を開始した時点で、仮に基板上の細胞数が観察に適した範囲から外れていた場合、再度固定のプロセスを行わねばならないため、作業者にかかる負担が大きい。
【０００９】
基板などの表面に細胞を固定する場合、基板と細胞懸濁液との接触時間を変化させることで、固定量を制御する手法が一般的である。しかしながら、細胞の種類や環境条件によって基板に付着する速度が変化する。さらに、例えば低倍率で観察する場合、ある程度細胞数が多くても問題ないが、高倍率で１細胞を観察したい場合には細胞同士が離れている必要があるように、観察に最適な細胞数は用途によって異なる。このため、接触時間のパラメータのみで、様々な種類の細胞の固定量を任意に制御することは、極めて困難である。
【００１０】
そこで、本発明は、測定基板に対する測定試料の固定を自動化し、かつ観察時における測定試料の量を、作業者が任意に制御することのできる、相互作用解析装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題解決するために、本発明は、特許請求の範囲に記載の構成を採用する。
【００１２】
ある１つの側面は、
基板と
前記基板に測定試料および反応試薬を提供するための送液手段と、
前記基板表面の測定試料を観察するための観察手段と、
前記観察結果をもとに、前記基板において前記測定試料が固定された量に関する情報を解析する解析手段と、
前記情報をもとに、前記基板において前記測定試料が固定される量を調整する制御手段と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、結果の信頼性が高く、かつ使い勝手の良い相互作用解析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１記載の装置構成である。
【図２】実施例１記載のフローセル周辺の構成である。
【図３】実施例１記載の動作のフローチャートである。
【図４】実施例１記載の解析結果である
【図５】実施例２記載の装置構成である。
【図６】実施例２記載のフローセル周辺の構成である。
【図７】実施例３記載の装置構成である。
【図８】実施例３記載の別の装置構成である。
【図９】実施例４記載の装置構成である。
【図１０】実施例５記載の装置構成である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００１６】
（装置構成）
実施例１の装置構成を図１に示す。解析装置１０１は、照射部１０２、検出部１０３、フローセル１０４、プリズム１０５、送液部１０６、からなる。解析装置１０１の動作は制御ＰＣ１０８によって制御される。制御ＰＣ１０８にはモニタ１０９が接続され、解析結果等を表示する。また、解析装置１０１には温調装置１０７が設けられており、ＣＯ２ガスボンベ１１０から送られるＣＯ２ガスの温度を調整することで、解析装置１０１内部の一部または全体の温度およびＣＯ２濃度を任意に設定可能である。
【００１７】
（照射部・検出部の構造説明）
照射部１０２および検出部１０３について説明する。照射部１０２は、光源１１１、光ファイバ１１２、集光レンズ１１３、偏光素子１１４などの部品で構成される。また検出部１０３は、結像レンズ１１５、イメージセンサ１１６などの部品で構成される。光源１１１はＳＰＲ観察のための励起光光源である。光ファイバ１１２から出射した励起光１１７は集光レンズ１１３によって集光され、平行ビームに成形される。平行ビームとなった励起光１１７は偏光素子１１４によってＳ偏光成分が除去され、Ｐ偏光成分のみとなる。Ｐ偏光となった励起光１１７はプリズム１０５に入射後、フローセル１０４裏側からフローセル１０４内部に侵入し、測定領域１１８に角度θで入射する。その後励起光１１７は角度θで反射して反射光１１８となり、再びフローセル１０４・プリズム１０５を透過し、プリズム１０５外へ出射される。出射された反射光は結像レンズ１１５で集光され、イメージセンサ１１６上に２次元イメージとして結像される。イメージセンサ１１６は、画像を取得して、制御ＰＣ１０８に画像データを送信する。制御ＰＣ１０８には解析部１２１が存在し、イメージセンサ１１６より送られてきた画像データを解析し、その結果をモニタ１０９に表示する。照射部１０２と検出部１０３はプリズムの中心線に対して、線対称に配置されている。なお、照射部１０２と検出部１０３は、フローセル１０４に対して任意の角度をとることができる駆動ステージ上に配置されるが、図１では省略した。また、集光レンズ１１３と偏光素子１１４の間には、励起光の照射範囲を変えるための絞りが設けられているが、図１では省略した。
【００１８】
本実施例では、光源１１１としてＬＥＤ光源（波長６４０ｎｍ）を、光ファイバ１１２として石英コアファイバ（コア径６００μｍ、ＮＡ０．２２）を、集光レンズ１１３として球面アクロマティクレンズ（外径５０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ）を、偏光素子１１４として偏光フィルタ（適応波長４００〜７００ｎｍ）を、結像レンズ１１５として対物テレセントリックレンズ（倍率５倍）を、イメージセンサ１１６として１／２型ＣＭＯＳカメラ（有効画素数１２８０×１０２４（１３０万画素）、画素サイズ５．２μｍ）を、それぞれ用いた。集光レンズ１１３通過後の励起光１１７のスポット径はφ１０ｍｍである。
本実施例では、光源１１１として波長６４０ｎｍのＬＥＤを用いたが、異なる波長の電磁波を発振する装置を用いても良い。選択できる波長の範囲は、例えば３００ｎｍ〜３００μｍである。ＬＥＤの他に、固体レーザやガスレーザ、半導体レーザなどが使用可能である。また、複数波長を発振する１つの光源１１１から、所望の波長成分をバンドパスフィルタ等によって取り出しても良い。光源１１１は、例えばキセノンランプなどである。
本実施例では、偏光素子１１４として市販の偏光フィルタを用いたが、例えば偏光ビームスプリッターや、グラントムソンプリズムなど、同様の機能を有する部品が使用可能である。
【００１９】
本実施例では、結像レンズとして対物テレセントリックレンズを用いたが、市販のマシンビジョンレンズ、ズームレンズ等が使用可能である。結像レンズの種類を交換することで、用途に合わせて低倍率〜高倍率の観察が可能となる。
【００２０】
（送液部の構造説明）
次に、送液部１０６について説明する。送液部１０６は、試薬リザーバ１２３〜１２５、送液用チューブ１２６〜１２７、切り替えバルブ１２８〜１２９、送液ポンプ１３０、廃液タンク１３１によって構成される。各試薬リザーバ１２３〜１２５には送液チューブが接続され、切り替えバルブ１２８〜１２９を介して送液チューブ１２６に統合される。送液チューブ１２６は、フローセル１０４の開口部（導入用）に接続される。フローセル１０４には別の開口部（排出用）が設けられており、こちらにも別の送液チューブ１２７が接続される。送液チューブ１２７の末端部分は廃液タンク１３１に繋がっている。また、送液チューブ１２７には送液ポンプ１３０が取り付けられ、試薬リザーバ１２３〜１２５からフローセル１０４への液の移動を行う。リザーバ１２３〜１２５からフローセル１０４に送られる試薬の種類、液量、送液速度、送液のタイミング等は、制御ＰＣ１０８の送液系制御部１２０が、切り替えバルブ１２８〜１２９と送液ポンプ１３０に対して動作指示を出すことによって行われる。
【００２１】
本実施例では、リザーバ１２３には測定試料を、リザーバ１２４には反応試薬を、リザーバ１２５にはバッファーをそれぞれ満たす。また本実施例では、送液チューブ１２６〜１２７としてＴＹＧＯＮ  Ｒ−３６０３（内径０．８ｍｍ、サンゴバン製）を、切り替えバルブ１２８〜１２９として３方ソレノイドバルブを、送液ポンプ１３０としてペリスタルティックポンプ（最大圧力０．１ＭＰａ）をそれぞれ用いた。なお個々の部品類はこの限りではなく、例えば切り替えバルブとして６方切り替えバルブを用いることで、部品点数を低減することができる。また、送液ポンプ１３０として、シリンジポンプ等の別の送液手段が選択可能である。
【００２２】
（フローセルの構造説明）
フローセル１０４およびプリズム１０５を保持する機構の構成を図２に示す。フローセル１０４は基板２０１、流路部品２０２からなる。フローセル１０４とプリズム１０５は、ホルダ２０３によって保持される。基板２０１は、一般的なＳＰＲ基板同様、ガラス基板の測定試料を固定するための観察面（おもて面・図２における上側）に金の薄膜を形成することによって作製される。流路部品２０２には、表面に流路パターンとしての溝２０４が形成されている。前記基板２０１の金薄膜面と流路部品２０２の溝側平面とを密着させることによって、フローセル１０４として機能する。ホルダ２０３には、送液用チューブ１２６〜１２７を通すための開口部２０９〜２１０が設けられている。送液用チューブ１２６〜１２７はホルダの開口部２０９〜２１０を通り、それぞれ流路部品２０２上の開口部２０７〜２０８に接続される。またホルダ２０３には、温調されたＣＯ２ガス用配管２１１を通すための開口部２１２が設けられている。流路部品２０２として使用するＰＤＭＳは高いガス交換機能を有しており、基板２０１表面の温度およびＣＯ２濃度を一定に保つことが可能である。本実施例では、細胞が最も活発となるよう、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に調節されている。なお、ホルダ２０３には視野の移動やピント調整のための直動ガイドが取り付けられているが、図１では省略した。
【００２３】
本実施例で用いた基板２０１の材質はＯｈａｒａ社製Ｓ−ＬＡＬ１０、形状は縦横２０×２０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの板状である。また表面に形成した金薄膜の厚みは５０ｎｍである。なお、ガラス基板と金薄膜の間には、厚み１ｎｍのクロムが接着層として存在する。また、本実施例で用いた流路部品２０２の材質はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で、形状は縦横１８ｍｍ、厚さ５ｍｍの板状である。溝２０４のサイズは幅２ｍｍ、深さ１ｍｍ、長さ１０ｍｍである。溝２０４の両端からは溝２０４と反対側の面まで伸びる垂直の流路２０５〜２０６が存在し、それぞれの末端には開口部２０７〜２０８が設けられている。また、本実施例で用いたプリズム１０５の材質は基板２０１と同じＯｈａｒａ社製Ｓ−ＬＡＬ１０で、形状は一辺２０ｍｍの正三角形を底面とした高さ２０ｍｍの三角柱状である。基板２０１とプリズム１０５側面（正方形の面）との間には図示されないマッチングオイルによって光学的に接している。本実施例では、マッチングオイルとしてカーギル標準屈折液（屈折率１．７２）を用いている。
【００２４】
基板２０１表面には測定試料の固定を促進するための処理がなされていても良い。例えば、ポリーL−リジンや、測定試料に応じた各種抗体などによって処理されていても構わない。その他、基板２０１表面に微小な凹凸などを設けることで、測定試料を保持しやすくすることも可能である。
【００２５】
本実施例では基板２０１にＰＤＭＳ流路２０２を貼りつけたが、例えば薄いシート状のＰＤＭＳに流路パターンが形成されたものを、基板２０１およびカバーガラス等の部材で挟むような構造としても良い。
【００２６】
フローセル１０４の溝２０４は複数本設けられていて良い。溝２０４の本数や幅、溝２０４同士の間隔等に制限は無いが、測定領域１１８が複数の溝２０４の一部または全部をカバーしており、かつ溝２０４同士がイメージセンサ１１６上で分離可能な条件で結像される条件であることが望ましい。
【００２７】
本実施例ではプリズム１０５と基板２０１の材料としてＳ−ＬＡＬ１０を用いたが、これらは光学的に透明であればどのような材料であっても良く、例えばガラス、サファイア、石英、アクリル樹脂などが使用可能である。またプリズム１０５と基板２０１の材料については、両者間の光の移動の際に界面での反射を防ぐために同じ材質であることが望ましいが、界面で全反射しない条件であれば、異なる材質の組み合わせであっても構わない。プリズム１０５の形状は三角プリズムに限らず、台形や四角形など別の形状としても良い。例えば半円柱状プリズムを用いれば、励起光１１７は入射角によらずプリズム１０５に対して常に垂直に入射するようになり、反射による損失を最小限に抑えることができる。
【００２８】
本実施例では金薄膜を形成した基板２０１を用いたが、プリズム１０５表面に直接金薄膜が形成し、そこで解析を行っても良い。基板２０１とプリズム１０５を一体化することで、両者の界面における光の反射損失を低減できる。また部品点数が低減し、マッチングオイルが不要となるため、操作性が向上する。
【００２９】
本実施例ではホルダ２０３内に温風を導入することで基板２０１表面を温調しているが、装置１０１全体を温調しても良い。また、例えばペルチェ素子などの温調部品を直接または間接的にプリズム１０５側面に接触させてもよい。またプリズム１０５の側面にＩＴＯ等の導電性薄膜を形成し、通電することによって温調してもよい。
【００３０】
本実施例ではホルダ２０３内のＣＯ２濃度を制御しているが、装置１０１全体のＣＯ２濃度を制御しても良い。
【００３１】
（装置動作のフローチャート）
本実施例による一連の観察プロセスについて、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の刺激に対する、ラット好塩基球由来の細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３細胞の応答機能の測定を例に説明する。
【００３２】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はその表面のＩｇＥ受容体が、受容体に結合したＩｇＥを介して抗原と結合することで活性化する。すると、細胞内のヒスタミンやタンパク質分解酵素などを含む顆粒を放出（脱顆粒）する。これがＩ型アレルギーの発症に重要な役割を果たすとされている。この、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の抗原刺激への応答現象は、アレルギー反応の評価方法として広く用いられている。例えば、食品や薬剤、環境中の物質（花粉やハウスダストなど）を抗原（反応試薬）とし、物質の抗原性（アレルギー反応を引き起こすか否か）を評価できる。または、抗原の他に加える物質の抗アレルギー効果を評価してもよい。すなわち、既に応答が見られることが分かっている細胞と抗原の組合せ、例えば（以下に述べるような）抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作したＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原を用いた上で、ここにさらに被験物質を加えることで応答が抑制されるか、または増強されるか、否かを測定すればよい。
【００３３】
図３は、本発明による観察のフローチャートである。以下、本発明による細胞機能観察方法について、図１〜４を用いて説明する。
【００３４】
工程開始前に、測定試料や反応試薬等を準備する。まず、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔ/ｍＬ ペニシリン，１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地で培養（５％ＣＯ２、３７℃）した。次に細胞培養用ディッシュ（ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ、セルシード社）中で、５０ｎｇ/ｍＬのマウスモノクローナル抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を加えた培養液により２４時間培養（５％ＣＯ２、３７℃）することによって細胞を感作させた．その後，感作した細胞をＳｉｒａｇａｎｉａｎバッファー（１１９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ，２５ｍＭ  ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ‘−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ），４０ｍＭ  ＮａＯＨ，ｐＨ７．２）中に濃度１×１０＾６個／ｍＬとなるよう再懸濁し、測定に用いる測定試料とした。装置にセットする前に、１０分間の予備加温（５％ＣＯ２、３７℃）を施した。反応試薬としては、５０ｎｇ/ｍＬ  ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原液を用いた。バッファーとしては、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎバッファーを用いた。
【００３５】
以上の手順によって調整した各種試薬および、フローセル１０４を装置１０１にセットした。なお、基板ホルダ２０３内部は予め温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に制御されている。
【００３６】
工程Ｐ１で、入射角の調整を行う。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送った後、ポンプ１３０を停止し、フローセル１０４内部をバッファーで充填する。本実施例では、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。バッファー充填後、光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、励起光１１７の入射角を連続的に変化させながらＳＰＲ観察を行う。本実施例では、入射角４５〜７０°の範囲を０．５°間隔で連続的変化させながら画像を取得した。イメージセンサ１１６の露光時間０．１秒である。画像データは制御ＰＣ１０８に逐次送信され、解析部１２１は送られた画像から反射光１１９の信号強度の解析を行う。本実施例では反射光１１９の強度として、バッファーが存在する領域の信号強度の和を、画素数で平均した値を用いた。解析部１２１は、励起光１１７の入射角をＸ軸、反射光１１９の信号強度をＹ軸としてプロットを作成し、極小値を示す点を後述の応答観察における入射角とする。本実施例では、入射角は５７．５°であった。
【００３７】
工程Ｐ２で、観察時の細胞固定量の目標値を設定する。細胞固定量の目標値は、作業者が直接入力する。または、作業者が予め装置１０１に記録されている条件（例えば「高倍率観察」など）を選択することによって自動的に設定される。
【００３８】
なお、細胞を１個単位で観察する場合、観察視野内にある程度の細胞が存在し、かつ細胞同士が重ならずに固定されている状態が望ましい。本実施例では、細胞固定量の指標として平均細胞密度を採用した。以下に、平均細胞密度の目標値を設定するための計算方法について説明する。
【００３９】
細胞が基板上にランダムに固定されるものと仮定すると、平均細胞密度δのとき、面積ｓの範囲にｘ個の細胞が存在する確率Ｂ（ｘ）は、ポアソン分布に従って以下の式（１）で表わすことができる。
Ｂ（ｘ）＝（ｓδ）ｘ／ｘ！ｅｘｐ（−ｓδ）      ・・・式（１）
【００４０】
面積ｓは、ある細胞を中心とした半径ｒの範囲（ｓ＝πｒ＾２）である。この範囲内に別の細胞が存在しない確率Ｂ（０）は以下の式（２）で表わすことができる。
Ｂ（０）＝ｅｘｐ（−ｓδ）
＝ｅｘｐ（−πｒ＾２δ）      ・・・式（２）
【００４１】
細胞が円形の場合、面積ｓを細胞の面積とすれば、Ｂ（０）は「細胞同士が重ならずに存在する確率」であると言える。このときのｒは、２個の細胞が接するときのそれぞれの細胞の中心間距離（細胞の直径）に等しい。平均細胞密度δとＢ（０）の関係は、以下の式（３）によって与えられる。
δ＝−｛ｌｏｇＢ（０)｝／（πｒ＾２）      ・・・式（３）
【００４２】
例えば、直径１０μｍの細胞を用いて、５０％以上の細胞が重ならずに存在する条件を満たす平均細胞密度δは、式（３）をδについて解くことで得られる（式（４））。
δ≦−｛ｌｏｇ０．５｝／（πｒ＾２）
≦２２０６個／ｍｍ＾２      ・・・式（４）
【００４３】
平均細胞密度の目標値を２２０６個／ｍｍ＾２以下に設定することで、視野内において重なりの無い細胞の数が過半数となる。すなわち、重なりの無い細胞を選別するための作業量を低減することができ、解析の効率が向上する。好ましい平均細胞密度δは３３５個／ｍｍ＾２以下であり、このとき９０％の細胞が重ならずに存在する条件を満たす。より好ましい平均細胞密度δは１６３個／ｍｍ＾２であり、このとき９５％の細胞が重ならずに存在する条件を満たす。なお、前記条件において、視野内の重なりの無い細胞の数は、それぞれ４２７個、２１９個である。
【００４４】
一方、平均細胞密度の目標値を３３５個／ｍｍ＾２以上に設定すると、重なりのある細胞の割合が１０％を超えるため、重なりの無い細胞の選別に時間を要するが、より多くの細胞を観察することが可能である。すなわち、観察する細胞の絶対数を大きくすることで、ばらつきの少ない解析結果を得ることができる。好ましい平均細胞密度は１１３５個／ｍｍ＾２以上であり、視野内の重なりの無い細胞の数は１１２６個である。より好ましい平均細胞密度は２２０６個／ｍｍ＾２以上であり、視野内の重なりの無い細胞の数は１５６３個である。なお平均細胞密度が３１８２個／ｍｍ＾２を超えると視野内の重なりの無い細胞の数は減少し、重なりのある細胞が多数を占める。このため、主に重なりのある細胞を観察する用途などにおいては、平均細胞密度が３１８２個／ｍｍ＾２以上であることが好ましい。
【００４５】
以上の計算方法により、作業者は観察の用途に合わせ、最適な平均細胞密度を設定することが可能である。例えば、作業者にテキストボックス等から、希望する重なりのない細胞の割合（例えば９０％）を入力させ、これから適する平均細胞密度を算出し、目標値として設定してもよい。本実施例では、視野内に十分な数の細胞が存在し、かつ大部分の細胞が重ならない条件として、平均細胞密度の設定値を１００個/ｍｍ＾２とした。
【００４６】
工程Ｐ３で、基板２０１表面に細胞を固定する。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４に測定試料を送った後、ポンプを１３０停止し、フローセル１０４内部を測定試料で充填する。本実施例では、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。
【００４７】
工程Ｐ４で、基板２０１表面に付着した細胞数のモニタリングを行う。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、本工程開始から一定時間経過後に画像を取得し、制御ＰＣ１０８に画像データを送る。本実施例では、工程開始後１０分で画像を取得するよう設定した。解析部１２１は画像を解析し、そのときの細胞の固定量を計算する。本実施例では、まず測定試料が存在する領域の画像データを切り出し、切り出した画像を二値化し、粒子数解析を行うことで細胞数を求め、切り出した画像データのピクセル数から面積を求め、細胞数を面積で除することによって細胞密度を計算した。そのほか、面積から計算する方法（バックグラウンド以外のピクセル数をカウントし、予め求めておいた細胞１個に相当するピクセル数で除することによって細胞数を求める）など、種々の方法によって計算が可能である。密度の計算を行わず、細胞数のみを固定量として用いても良い。また、固定量の指標として、細胞間の距離を用いてもよい。例えば、取得した画像から細胞同士の距離、例えば中心間距離または細胞同士の輪郭間の距離を算出し、全ての細胞間の距離の最大値、最小値、平均値、中央値などを固定量の指標として、制御してもよい。
【００４８】
工程Ｐ５で、細胞固定量の判定を行う。解析部１２１は、工程Ｐ４で算出した固定量と、工程Ｐ２で設定した目標値を比較し、その結果に応じて送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示を出す。固定量と目標値の比較方法としては、値の大小、両者の差が基準値より大きいか否か、両者の比が基準値より大きいか否か、などを用いてよい。または、当該時点一点の固定量だけでなく、経時変化を用いてもよい。例えば、ある時点での微分値や、ある時間帯での平均的な増減量や増減率、積算値、積分値などを用いてもよい。比較に用いる際の基準値等のパラメータは、装置の製造や調整、設定時にあらかじめ設定しておいてもよく、解析フローの途中、例えば工程Ｐ２の固定量の目標値の設定時に併せて、ＧＵＩやコマンドラインから作業者に入力させたり、設定ファイル等から読み込んだりしてもよい。解析部１２１は、これらの比較方法を用いて、未だ固定量の調整の必要があるか、または固定量の調整が不要なので、次の工程Ｐ６へ進めばよいかを判定する。
【００４９】
例えば、固定量が工程Ｐ２で設定した目標値に達していなかった場合、固定量を調整する必要があるため、解析部１２１は必要な処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示し、再度工程Ｐ４に進む。指示の内容としては、例えば、単に一定時間待機する指示を出すことで、固定反応の進行を促してもよい。また、固定反応を促進するような条件、温度、液の撹拌、流速、その他の物理的な条件の変更を指示してもよい。または、工程Ｐ３の固定反応に進んでもよい。または、これらの指示を組み合わせたり、適宜これらのうちから選択したりしてもよい。
【００５０】
例えば、固定量が工程Ｐ２で設定した目標値に達していた場合、固定量の調整が不要であるため工程６に進むが、必要に応じて固定反応停止のための処理を行う。具体的には、送液系制御部１２０がポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送り、フローセル１０４内部の測定試料をバッファーに置換する。本実施例では、送液量５００μＬ、１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。固定反応の停止処理は本方法に限らず、各種の方法を用いることができる。固定反応を阻害もしくは停止するような薬剤を添加しても良い。温度やｐＨなどその他の物理条件を変えても良い。
【００５１】
工程Ｐ６で、応答観察を行う。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、一定の時間間隔で連続的に画像を取得する（タイムラプス撮影）。本実施例では露光時間０．１秒、撮影間隔を１０秒とした。撮影した画像データは制御ＰＣ１０８に逐次送信され、解析部１２１は送られた画像から反射光１１９の信号強度の解析を行う。本実施例では反射光１１９の信号強度として、バッファーが存在する領域の全画素の信号強度を平均した値を用いて解析を行ったが、例えば流路部品を含む全ての領域の全画素を用いて計算しても良い。また、１つ以上の任意の領域に限定して解析を行っても良い。解析部１２１は、経過時間をＸ軸、反射光の信号強度をＹ軸としてプロットを作成し、リアルタイムでモニタ１０９に表示する。
【００５２】
タイムラプス撮影開始から一定時間経過後に、細胞に対し刺激物質を含む反応試薬を接触させる。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４に反応試薬を送った後、ポンプ１３０を停止し、フローセル１０４内部を反応試薬で充填する。本実施例では、開始から６０秒経過後に、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で反応試薬の送液を行った。
【００５３】
反応試薬充填から一定時間経過後に、タイムラプス撮影を終了する。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、照射部１０２および検出部１０３の動作を停止し、測定が完了した旨をモニタ１０９に表示し作業者に告知する。本実施例では、反応試薬充填から１８００秒経過後に、タイムラプス撮影を終了した。
【００５４】
最後に、送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送り、送液チューブ１２６〜１２７およびフローセル１０４内をバッファーで洗浄した後、ポンプ１３０を停止する。本実施例では、送液量４０００μＬ、送液速度３．２μＬ/秒（２００μＬ/分）で送液を行った。なお、バッファーによる洗浄前に、トリプシンを含む溶液を送液してもよい。前記プロセスを追加することで基板２０１表面に付着した細胞が脱落し、基板２０１表面が測定前の状態に戻るため、基板２０１を交換することなく繰り返し測定することが可能である。
【００５５】
工程Ｐ５の内部または前後にタイムアウトエラーの判定を含んでもよい。この判定のタイミングは、例えば、固定量と目標値の比較の前または後でよく、または、固定反応の調整のための処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示する前や後、または、固定反応の停止処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示する前や後でもよい。タイムアウトエラーの判定基準は、所定の時間を超過した場合や所定の回数を超過した場合でよい。ここで回数とは固定量と目標値の比較、固定量の算出、固定量調整の実行や指示、などの回数を用いてよい。また、時間とは、測定試料の固定反応の開始時点、装置準備、測定試料や反応試薬等の設置や調製時から起算した経過時間を用いてよい。また、ここに挙げた複数の判定基準を組み合わせても良い。また、作業者に、これらの判定基準のいずれを採用するか、または判定を実施しないかを選択させてもよく、選択のタイミングは解析フローの開始前でも開始後（終了前）でもよい。タイムアウトエラーと判定された後の動作としては、解析フローの一時停止や中止、タイムアウトエラー時用の特殊な固定量調整、強制的な工程Ｐ６への移行、などを用いてよく、解析部１２１は送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に対し、適宜これらに必要な動作内容を指示する。解析フローを一時停止した場合は、例えば解析部１２１はその旨をモニタ１０８や音声等を介して作業者に告知し、作業者に次の動作の指示を促し、指示の手段をＧＵＩ、ＣＵＩ、ジェスチャ、音声等を介して提供してよい。動作の選択肢としては、フローの再開、フローの中止や、タイムアウトエラー時用の特殊な固定量調整、強制的な工程Ｐ６への移行、などを含んでよい。装置１０１は、作業者がフローの再開を選ぶ場合に、再開前に測定試料や反応試薬、各種設定値や装置設定を変更できる仕様であっても良い。フローの中止が選択された際は、解析部１２１は、必要に応じて送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に終了処理を指示してよい。
【００５６】
なお、工程Ｐ２の目標値の設定は、工程Ｐ５以前であればよい。工程Ｐ２の目標値の設定は、好ましくは、工程Ｐ１の装置準備のあと、工程Ｐ３の固定反応開始の前である。この場合、例えば、まず実験開始時に測定試料や反応試薬類、装置を準備した後、実験条件としてある固定量の目標値を設定、解析を実施して得られた結果について考察を加え、その考察に基づいて新たな実験条件として固定量の目標値を修正して解析する、というような実験の進め方において、装置準備をやり直す必要がないため実験を効率的に進めることが可能になる。または、工程Ｐ２の目標値の設定を、工程Ｐ１の装置準備の前に実施してもよく、この場合には、ある固定量の目標値を設定した後、装置準備をして解析を進めた結果を見て設定を変更したり、各種試薬を交換、再調製して、改めて解析を実施する、という実験において、目標値設定をやり直す必要がないため、実験を効率的に進めることが可能になる。このようなケースとして、実験結果から、測定試料や反応試薬の不備が推測された場合や、実際に得られた固定量と目標値のかい離（誤差）が期待より大きかった場合や、タイムアウトエラー等で目標とする固定量が得られなかった場合、所望の固定量に到達するまでの時間が想定よりも長くかかりすぎて測定試料や解析結果に悪影響が認められた場合、などが挙げられる。
【００５７】
以上の手段を用いて測定したＲＢＬ−２Ｈ３細胞の抗原応答反応の結果を図４に示す。測定開始から６０秒後に反応試薬の送液を開始し、その約５０秒後から、細胞の応答に伴うＳＰＲ反射光強度の上昇が確認することができた。
【実施例２】
【００５８】
図５に送液部１０６にピペッタ機構５０４を用い、フローセル１０４の代わりにウェル基板６０１を用いた例を示す。その他の構成は実施例１と同等である。ここでピペッタ機構とは、液体を指定した容積だけ吐出できるものである。吐出前に別個の液体リザーバから吸引した液体を吐出する方式や、ピペッタ機構に直結されたリザーバに予め液体を満たしておき必要に応じて断続的に吐出する方式などを用いてよい。
【００５９】
（構造の説明）
本実施例の送液部１０６は、試薬リザーバ５０１〜５０３とピペッタ機構５０４からなる。ピペッタ機構５０４は、ノズル５０５、ロボットアーム５０６、配管５０７、シリンジポンプ５０８、送液ポンプ５０９、切り替えバルブ５１０、水タンク５１１、洗浄槽５１２、廃液タンク５１３からなる。
【００６０】
ノズル５０５はロボットアーム５０６によって保持され、必要に応じて、ウェル基板６０１、試薬リザーバ５０１〜５０３、洗浄槽５１２、廃液タンク５１３などへ移動できる。ノズル５０５は配管５０７を介してシリンジポンプ５０８に接続されており、試薬リザーバ５０１〜５０３やウェル基板６０１などから指定容積の液体を吸引または吐出可能である。試薬リザーバ５０１〜５０３やウェル基板６０１などから吸引された不要な液体は、廃液タンク５０３へと吐出される。シリンジポンプ５０８には、送液ポンプ５０９が接続されており、水タンク５１１の水を充填できる。また、ノズル５０５を廃液タンク５１３に移動した上で、送液ポンプ５０９からシリンジポンプ５０８、ノズル５０５を介して水を吐出することで、流路内やノズル５０５内部を洗浄し、コンタミネーションや吸引吐出される液体のキャリーオーバーを防止、低減できる。さらに、ノズル５０５を洗浄槽５１２へ移動した上で、切り替えバルブ５１０を切り替えて、水を洗浄槽５１０に吐出し、ノズル５０５に水をかけることで、ノズル５０５の外側も洗浄可能であり、同じくコンタミネーションや吸引吐出される液体のキャリーオーバーを防止、低減できる。これらの動作は、本図では省略された送液系制御部からロボットアーム５０６、シリンジポンプ５０８、送液ポンプ５０９、切り替えバルブ５１０に動作指示が送られることによって行われる。
【００６１】
ウェル基板６０１の構成図を図６に示す。ウェル基板６０１は、ウェル部品６０２、基板２０１、プリズム１０５およびこれらを一体に保持するためのホルダ６０３によって構成される。基板２０１、プリズム１０５に関しては、基本的に実施例１と同様の構成を用いることができる。ウェル部品６０２は、１つ以上の液体保持サイト６０４を備える。ウェル部品６０２を基板６０１上に設置することで、前記の液体保持サイト６０４と基板２０１とで、１つ以上のウェル６０５を形成する。ホルダ６０３には、ノズル５０５を通すための開口部６０６が設けられている。開口部６０６にはセプタ６０７が設置されている。ノズル５０５は開口部６０６のセプタ６０７を貫通し、ウェル基板６０１上のウェル６０５に到達する。またホルダ６０３には、温調されたＣＯ２ガス用配管２１１を通すための開口部６０８が設けられている。これにより、ウェル基板６０１表面の温度およびＣＯ２濃度を一定に保つことが可能である。本実施例では、細胞が最も活発となるよう、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に調節されている。なお、ホルダ６０３には視野の移動やピント調整のための直動ガイドが取り付けられているが、図６では省略した。
１つのウェル基板６０１に複数のウェル６０５が存在する場合、一度のウェル基板６０１のセットアップで、複数条件での相互作用解析が可能となる効果がある。特に、照射部１０２および検出部１０３を含む光学系により、複数のウェル６０５を全時間帯または一時的に同時並行して観察可能である場合、複数条件を同時並行的に解析可能になる。各ウェル６０５は、その中または上に液体を保持し、ウェル６０５間の液が意図せず混ざったり移動したりすることを防ぐ機能をもつ。また、各ウェル６０５は、保持される液体を導入可能な開口部を少なくとも１つずつ持つ。ウェル部品６０２としては、このような機能を持つ各種の構造を用いてよい。各ウェル６０５に保持できる液体の量は、用途に応じて適宜変更可能であるが、好ましくは１ｎＬ〜１ｍＬ、より好ましくは１０ｎＬ〜１００μＬ、より好ましくは１００ｎＬ〜１０μＬである。
【００６２】
ウェル部品６０２の別の形態としては、液体保持サイト６０４として貫通穴をもつ厚みを持った板状部材、液体保持サイト６０４として液を囲む壁面を持つ（例えば、マルチウェルプレートの底面をくり抜いたような）部材、保持する液体に対してはっ水性を示すシート状部材に液体保持サイト６０４として貫通穴を設けたシート状部材、または基板２０１表面に施される保持する液体に対してはっ水性や親水性を示す表面処理（および処理によって表面に導入される官能基や分子・原子の配列等）で液体保持サイト６０４として機能するパターンを持つものなどを用いることができる。前記のパターンとして例えば、各液体保持サイト６０４以外ははっ水性表面処理され、各液体保持サイト６０４内は未処理であるパターンや、比較的にはっ水性の基板２０１の表面上に各液体保持サイト６０４の外周だけ親水性表面処理を施したパターン、等を用いることができる。また、ウェル部品６０２の別の例としては、フローセル状の部材で、流路の末端もしくは途中に開口部が設けられたものを用いてもよい。この場合、液体の導入は、液を開口部に滴下したり、ノズル５０５を開口部に差し込んだ上で注入してもよい。各ウェル６０５の液体がウェル部品６０２内部に半ば閉じ込められており、雰囲気に直接触れる表面積が小さくなるため、液体が蒸発しにくく、より正確な解析を実現しやすいという効果がある。
【００６３】
以上の様なピペッタ機構５０４を用いた場合、異なる測定試料や反応試薬が共通して触れる部分はノズル５０５のみ、またはノズル５０５近傍の配管５０４のみとなるため、キャリーオーバーを防止、低減する効果がある。
【００６４】
その他、プリズム１０５および基板２０１の材料、温度およびＣＯ２濃度の制御方法などについては、実施例１に記載したとおり種々の方法が使用可能である。
【００６５】
（動作の概要）
ピペッタ機構５０４とウェル基板６０１の組合せを用いたときの実際の解析例について説明する。ここで解析対象は、実施例１と同じく、ラット好塩基球由来の細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３細胞を測定試料、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応試薬として、細胞の抗原刺激への応答機能の測定を行った。試薬リザーバ５０１には測定試料を、試薬リザーバ５０２には反応試薬を、試薬リザーバ５０３にはバッファーを、それぞれ満たした。ウェル部品６０２として、板状のＰＤＭＳ（縦横１９×１９ｍｍ、厚み５ｍｍ）に、貫通穴（φ４ｍｍ）を開けたものを用い、実施例１と同じく金薄膜を設けた基板２０１の上面（金薄膜の存在する面）側に密着するよう、ホルダ６０３で保持した。
【００６６】
なお、基本的な動作のフローチャートは、実施例１に示したものと同じものを用いることができるため、ここでは実施例１と異なる部分についてのみ、図３を引用しながら説明する。また、全ての動作は、実施例１で示した制御ＰＣ１０８内の送液系制御部１２０および光学系制御部１２２の指示に従って行われる。
【００６７】
工程Ｐ１においてウェル６０５にバッファーを充填し、入射角の調整を行う。ノズル５０５は試薬リザーバ５０３に移動し、バッファーを吸引した後、ウェル基板６０１に移動し、ウェル６０５にバッファーを吐出する。本工程に用いたバッファーの液量は１０μＬである。バッファー吐出後、ノズル５０５は廃液タンク５１３に移動し、少量の水を吐出することにより、内部の洗浄を行う。その後ノズル５０５は洗浄槽５１２に移動し、外部を洗浄する。以上の動作の後、実施例１に示す手法により、入射角を調整する。なおウェル基板６０１に複数個のウェル６０５が存在している場合、特定の一箇所のみにバッファーを充填し、その領域のＳＰＲ反射光強度を測定することによって、入射角の調整が可能である。入射角の調整が完了後、ノズル５０５はウェル基板６０１に移動し、バッファーを吸引し、廃液タンク５１３に吐出する。その後、先程と同様の手順で洗浄動作を行う。
【００６８】
工程Ｐ３において、測定試料の固定反応を行う。反応は、工程Ｐ１と同様の手順で測定試料をウェル６０５に吐出し、そのまま待機することでなされる。本工程に用いた測定試料の液量は１０μＬである。待機中、細胞が重力によってウェル６０５の底に沈む。ウェルの底には金薄膜が露出しており、細胞は生来の性質により金薄膜表面に接着する。その他、測定試料を吸引し、ウェル６０５に吐出した後に、図示されない別のリザーバから固定反応を開始または促進する別の薬剤を吸引し、同じウェル６０５に追加して吐出してもよい。
【００６９】
工程Ｐ５の固定量判定において、固定量が目標値未満であった場合には、ウェル６０５から測定試料を５μＬ吸引し、廃液タンク５１３に廃棄した上で、試薬リザーバ５０１から測定試料５μＬを吸引し、ウェル６０５に吐出した。
【００７０】
固定量が目標値以上であった場合には、まずウェル６０５から測定試料を５μＬ吸引し、廃液タンク５１３に廃棄した。試薬リザーバ５０３からバッファー１０μＬを吸引し、ウェル６０５に吐出し、同ウェル６０５から１０μＬを吸引して廃液タンク５１３に廃棄した。この操作を５回繰り返し、ウェル６０５中の液から、固定していない細胞を取り除き、固定反応を停止した。この操作の繰り返し回数は、あらかじめ決めておいても、また光学系制御部１２２および解析部１２１を用いて固定反応の進行をモニタすることで、固定反応の停止が確認されるまで継続してもよい。また、この際にも、タイムアウトや上限回数の設定により、繰り返しを止める条件を設けてもよい。
【００７１】
工程Ｐ６で応答観察を行う。応答観察の手順は実施例１に示すとおりである。測定試料に対する反応試薬の添加方法については、まず工程Ｐ１と同様の手順で反応試料を吸引し、測定試料が固定されバッファーが充填されたウェル６０５に添加することでなされる。本工程に用いた反応試薬の液量は１０μＬである。反応試薬添加後に、ノズル５０５を用いてピペッティング動作を行うことで、反応試薬の混合を促進しても良い。またはノズル５０５でウェル６０５内部のバッファーを廃棄した後、反応試薬を添加しても良い。
【実施例３】
【００７２】
図７は、実施例３の照射部と検出部周辺の構成である。そのほかの構成は、前記実施例１の構成と同等である。本実施例の特徴は、エバネッセント光を利用して測定試料を観察することである。本実施例による一連の観察プロセスについて、実施例１と同じくＤＮＰ−ＨＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の刺激に対する、ラット好塩基球由来の細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３細胞の応答機能の測定を例に説明する。なお、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、それぞれ事前に標識されていることとする。
【００７３】
（照射部・検出部の構造説明）
波長の異なる２種類の光源７０１〜７０２から出射した励起光をダイクロイックミラー７０３によって同軸に配置し、フィルタユニット７０４によって波長を選択した後、レンズ７０５、プリズム１０５を通して基板２０１上に対し、裏側から全反射する条件で入射することで、基板２０１表面にエバネッセント光照明を形成させる。
一般的にエバネッセント光は、表面から数百ｎｍの範囲に形成される。従って、基板２０１表面のごく近傍に存在する測定試料のみに限定して照射することができる。エバネッセント光照明によって測定試料から生じた光は、対物レンズ７０６によって集光され、ダイクロイックミラー７０７によって波長ごとに分割される。分割された光は、それぞれバンドパスフィルタ７０８〜７０９によって必要な波長成分のみが取り出された後、レンズ７１０〜７１１によってイメージセンサ７１１〜７１３に結像される。
【００７４】
本実施例で用いた基板２０１の材質は合成石英で、形状は縦横２０×２０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの板状である。表面に金薄膜は存在しない。本実施例で用いたプリズム１０５の材質は基板２０１と同じ合成石英で、形状は一辺２０ｍｍの正三角形を底面とした高さ２０ｍｍの三角柱状である。基板２０１とプリズム１０５側面（正方形の面）は、図示されないマッチングオイルによって光学的に接している。本実施例では、マッチングオイルとしてグリセロール（屈折率１．４６）を用いている。基板２０１表面には実施例１と同様のフローセルが形成されているが、図では省略した。
【００７５】
本実施例では、光源７０１に波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザを、光源７０２に波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザをそれぞれ用いた。ダイクロイックミラー７０３は、波長５８０ｎｍ以上の成分を透過し、それ以下の波長成分を反射する波長特性を有するものを用いた。フィルタユニット７０４は、波長５３２ｎｍのレーザのみを透過するバンドパスフィルタｅｘＧと、波長６３３ｎｍのレーザのみを透過するバンドパスフィルタｅｘＲの２種類が、切り替え可能な状態で保持されている。ダイクロイックミラー７０７は、波長６３０ｎｍ以上の成分を透過し、それ以下の波長成分を反射する波長特性を有するものを用いた。バンドパスフィルタ７０８は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の蛍光波長成分を選択的に抽出するものを用いた。またバンドパスフィルタ７０９は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光波長成分を選択的に抽出するものを用いた。イメージセンサ７１２〜７１３は、実施例１と同一である。
【００７６】
（動作の説明）
本実施例の動作について説明する。基本的な動作のフローチャートは、図３に示したものと同じものを用いることができる。また、全ての動作は、実施例１で示した制御ＰＣ１０８内の送液系制御部１２０および光学系制御部１２２の指示に従って行われる。
【００７７】
工程Ｐ１で入射角の調整を行う。実施例１と同様に基板２０１上のフローセルをバッファーで満たした後、励起光を照射し、入射角を連続的に変化させる。ある一定の角度を超えると、励起光は基板２０１とバッファーの界面で全反射するので、そのとき角度（臨界角）を以降の観察における入射角として設定する。
【００７８】
工程Ｐ２で、観察時の細胞固定量の設定を行う。設定の方法および動作は実施例１と同様である。
【００７９】
工程Ｐ３で、基板２０１表面に細胞を固定する。固定の方法および動作は実施例１と同様である。
【００８０】
工程Ｐ４で、基板２０１表面に付着した細胞数のモニタリングを行う。フィルタユニット７０４を操作してバンドパスフィルタｅｘＧに切り替え、蛍光観察を行う。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６によって標識されているため、波長５３２ｎｍのエバネッセント光で励起され、蛍光を発する。検出はイメージセンサ７１２で行う。前述の通りエバネッセント光は基板２０１表面から数百ナノメートルの範囲に限定されるため、実質的に基板２０１表面に付着した細胞のみを検出することができる。
工程Ｐ５で、固定量の判定を行う。判定方法および動作は実施例１と同様である。
工程Ｐ６で、応答の観察を行う。ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原を含む反応試薬の添加方法および動作は、実施例１と同様である。フィルタユニット７０４を操作してバンドパスフィルタｅｘＲに切り替え、蛍光観察を行う。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はエバネッセント光の照射範囲内に存在するため、標識されたＤＮＰ−ＨＳＡ抗原がＲＢＬ−２Ｈ３細胞と結合すると、標識分子であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７が波長６３３ｎｍのエバネッセント光で励起され、蛍光を発する。検出はイメージセンサ７１３で行う。
【００８１】
本実施例では、標識のための蛍光色素としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を用いたが、これらは別の蛍光色素であってもかまわない。蛍光色素は、例えばＣｙ３、Ｃｙ５などである。また異なる波長特性を有する蛍光色素を用いることもできる。この場合、使用する蛍光色素の波長特性に合わせて、光源７０１〜７０２および各種光学部品を選択する。また、蛍光色素の代わりに量子ドットを用いても良い。その他、放射性同位体を含む標識化合物を用いても良い。
【００８２】
本実施例では、波長の異なる２種類の光源７０１〜７０２を用いたが、複数波長を発振する１つの光源から、所望の波長成分をフィルタユニット７０４によって取り出しても良い。光源は例えばキセノンランプなどである。この場合、光源ユニットが１個で済むため、コスト低減の効果がある。
【００８３】
本実施例では、ダイクロイックミラー７０７で波長ごとに分離した蛍光を、それぞれ２台のイメージセンサ７１２〜７１３に結像しているが、例えば透過した蛍光をイメージセンサ７１３の受光素子の左半分に結像し、反射した蛍光を全反射ミラーで折り返してイメージセンサ７１３の受光素子の右半分に結像することができる。この場合、イメージセンサ７１２が不要となり、コスト低減の効果がある。１台のイメージセンサ７１３で２種類の蛍光を検出する他の方式としては、例えばダイクロイックミラー７１２を用いずに、バンドパスフィルタ７０８〜７０９を切り替え可能なフィルタユニットを用いることができる。また、ダイクロイックミラー７１２を用いずに回折格子などを用いて波長分散させ、イメージセンサ７１３上の別の領域に結像させることも可能である。
【００８４】
（蛍光検出方法の別の形態）
蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｏｒｓｔｅｒ／Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用することができる。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を標識するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６をドナー、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原を標識するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７をアクセプターとして用いる。本方式では、ドナーを励起することで、ドナーおよびアクセプターの検出が可能となるため、アクセプターを励起するための光源７０２および各種光学部品類が不要となり、コスト低減の効果がある。ＦＲＥＴは、別の蛍光色素の組み合わせでも構わないし、量子ドットを用いることも可能である。
【００８５】
（エバネッセント照明の別の形態）
図８は、上記以外の別の光学系の模式図である。図７がプリズム型エバネッセント照射方式であったのに対し、図８は対物エバネッセント照射方式を採用した。励起光をレンズ７０５およびマルチエッジダイクロイックミラー８０１を通して、対物レンズ７０６の後側焦点位置に集光させることで、対物エバネッセント照明を実現する。そのほかの構成は、前述のプリズム型エバネッセント照射方式と同様である。なお本方式では、入射角調整のための励起光の光軸調整機構を含むが、図では省略した。本方式はプリズム型エバネッセント照射方式と比較して、光軸調整等が比較的容易である。また、照射部と検出部が一部重複しているため、光学系がコンパクトになり、装置全体のサイズを小さくする効果がある。
【実施例４】
【００８６】
図９は、実施例４の照射部と検出部周辺の構成である。そのほかの構成は、前記実施例１の構成と同等である。本実施例の特徴は、同軸落射照明を利用して、測定試料を観察することである。本実施例においては、被写界深度の浅い対物レンズ７０６を使用することで、基板２０１表面近傍に存在する測定試料に限定して観察することができるという効果がある。被写界深度は好ましくは１００μｍ以下で、より好ましくは１０μｍ以下である。測定の方法は、実施例１と同様である。なお、図９では正立形の配置としたが、倒立型の配置であっても良い。また、マルチエッジダイクロイックミラー８０１通過後の光を、一度レンズで集光し、焦点の位置にピンホールを設置し、再びレンズによって平行光に戻すことで、いわゆる共焦点顕微鏡の構造となり、同様の効果を得ることができる。
その他励起光源の種類や、検出の方式、それらに伴う部品の組み合わせについては、実施例３に記載したとおり種々の方法が使用可能である。
【実施例５】
【００８７】
図１０は、実施例５の照射部と検出部周辺の構成である。そのほかの構成は、前記実施例１の構成と同等である。本実施例の特徴は、透過光照明を利用して、測定サンプルを観察することである。本実施例においては、実施例４と同様に、被写界深度の浅い対物レンズ７０６を使用することで、基板２０１表面近傍に存在する測定試料に限定して観察できるという効果がある。被写界深度は好ましくは１００μｍ以下で、より好ましくは１０μｍ以下である。測定の方法は、実施例１と同様である。なお、図１０では倒立型の配置としたが、正立型の配置であっても良い。また、実施例４と同様に、ダイクロイックミラー７０７通過前の光を、一度レンズで集光し、焦点の位置にピンホールを設置し、再びレンズによって平行光に戻すことで、いわゆる共焦点顕微鏡の構造となり、同様の効果を得ることができる。
【００８８】
その他励起光源の種類や、検出の方式、それらに伴う部品の組み合わせについては、実施例３に記載したとおり種々の方法が使用可能である。
【実施例６】
【００８９】
実施例１〜５では光学的手段を用いて測定試料を観察したが、観察の方法は光学的手段に限らない。例えば、表面弾性波センサ、または電気信号による観察が使用可能である。電気信号による観察基板としては、微小な電極アレイを用いる。このような基板による観察の例は、非特許文献（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，８３，５７１−５７７）に開示されている。より具体的には、ボルタンメトリー、アンペロメトリー、インピーダンスやキャパシタンスの測定などを用いてよい。さらに、粒子状の測定試料に対して、電極間のピッチを十分に小さくとることで、測定試料の粒子１個ずつの変化や、さらには１個の粒子の内部の変化の局在を測定、観察することが可能となる。例えば、直径およそ１０μｍの細胞に対し、電極間ピッチが３０μｍ以下、より好ましくは１０μｍ以下、さらに好ましくは５μｍ以下となる電極アレイを用いることで、細胞１個ずつの状態を測定可能である。また、同様に電極間ピッチが３μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下、さらに好ましくは０．５μｍ以下の電極アレイを用いることで、細胞内の状態の局在を観察可能となる。本実施例の方式によれば、基板表面の測定試料の有無を観察可能であるため、固定量の評価を行うことができる。また、本実施例の方式によれば、基板表面の測定試料の状態変化を観察可能であるため、刺激に対する応答の評価を行うことができる。本実施例の方式によれば、光学的手段を用いずに、測定試料の応答観察を行うことが可能である。また、本方式による観察と、前述の光学的観察とを組み合わせても良い。
【００９０】
以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。
【符号の説明】
【００９１】
１０１  解析装置
１０２  照射部
１０３  検出部
１０４  フローセル
１０５  プリズム
１０６  送液部
１０７  温調装置
１０８  制御ＰＣ
１０９  モニタ
１１０  ＣＯ２ガスボンベ
１１１  光源
１１２  光ファイバ
１１３  集光レンズ
１１４  偏光素子
１１５  結像レンズ
１１６  イメージセンサ
１１７  励起光
１１８  測定領域
１１９  反射光
１２０  送液系制御部
１２１  解析部
１２２  光学系制御部
１２３、１２４、１２５  試薬リザーバ
１２６、１２７  送液チューブ
１２８、１２９  切り替えバルブ
１３０  送液ポンプ
１３１  廃液タンク
２０１  基板
２０２  流路部品
２０３  ホルダ
２０４  溝
２０５、２０６  垂直流路
２０７、２０８、２０９、２１０、２１２  開口部
２１１  ＣＯ２ガス用配管
Ｐ１  装置準備
Ｐ２  固定量の目標値設定
Ｐ３  測定試料の固定反応
Ｐ４  固定量計測
Ｐ５  固定量判定
Ｐ６  応答観察
５０１、５０２、５０３  試薬リザーバ
５０４  ピペッタ機構
５０５  ノズル
５０６  ロボットアーム
５０７  配管
５０８  シリンジポンプ
５０９  送液ポンプ
５１０  切り替えバルブ
５１１  水タンク
５１２  洗浄槽
５１３  廃液タンク
６０１  ウェル基板
６０２  ウェル部品
６０３  ホルダ
６０４  液体保持サイト
６０５  ウェル
６０６、６０８  開口部
６０７  セプタ
７０１、７０２  光源
７０３  ダイクロイックミラー
７０４  フィルタユニット
７０５  レンズ
７０６  対物レンズ
７０７  ダイクロイックミラー
７０８、７０９  バンドパスフィルタ
７１０、７１１  レンズ
７１２、７１３  イメージセンサ
８０１  マルチエッジダイクロイックミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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