(57)【要約】【課題】優れた骨伝導能を有する新規な骨再生材料を提供すること。【解決手段】第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）と、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）とを含む骨再生材料。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）と、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）とを含む骨再生材料。
【請求項２】
ＯＣＰとＡＣＰの総量を基準として、第８リン酸カルシウムを１０質量％〜４０質量％、非晶質リン酸カルシウムを６０質量％〜９０質量％の割合で含有する、請求項１に記載の骨再生材料。
【請求項３】
第８リン酸カルシウムの顆粒と非晶質リン酸カルシウムの顆粒との混合物を含む請求項１に記載の骨再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2：以下「ＨＡ」と略記する）の前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ：以下「ＯＣＰ」と略記する）は、これまでの研究により優れた生体吸収性及び優れた骨再生能を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
また、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ：以下「ＡＣＰ」と略記する）は、骨石灰化における別のＨＡの前駆体であると考えられており、生理的条件下でＯＣＰよりも高い溶解度を有することが報告されている（非特許文献２参照）。ＡＣＰはカルシウム及びリン酸の過飽和溶液から生じる最初の無機固体相であり、これがＯＣＰを経由し、続いてＨＡへと変換される。
【０００４】
特許文献１には、第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）と、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）、リン酸水素カルシウム（第２リン酸カルシウム無水和物）（ＣａＨＰＯ4）、リン酸水素カルシウム二水和物（第２リン酸カルシウム２水和物）（ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）又は低結晶性の第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）からなる混合リン酸カルシウムを含むことを特徴とする人工骨材について記載している。この文献では実施例２においてＯＣＰとＡＣＰを含む混合リン酸カルシウムを含む人工骨材が製造されているが、得られた人工骨材の効果については確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１１０４０４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Suzuki O. et al., Tohoku J. Exp. Med., 1991, 164: 37-50.
【非特許文献２】Meyer JL et al., Calcif. Tissue Res. 1978, 25, 59-68,
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、優れた骨伝導能を有する骨再生材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、高い溶解性を示すＡＣＰをＯＣＰに混合することで、ＯＣＰとＡＣＰとからなる混合物がＡＣＰとＯＣＰを単独で用いた場合と比較して、相乗的な骨伝導能を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）と、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）とを含む骨再生材料。
［２］ＯＣＰとＡＣＰの総量を基準として、第８リン酸カルシウムを１０質量％〜４０質量％、非晶質リン酸カルシウムを６０質量％〜９０質量％の割合で含有する、［１］に記載の骨再生材料。
［３］第８リン酸カルシウムの顆粒と非晶質リン酸カルシウムの顆粒との混合物を含む［１］に記載の骨再生材料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れた骨伝導能を有する骨再生材料が得られる。特に、ＡＣＰの共存下で、インビボにおけるＯＣＰの骨伝導能を強化できる上、ＯＣＰのＨＡへの変換を制御できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＯＣＰ顆粒（Ａ）とＡＣＰ顆粒（Ｂ）の表面のＳＥＭ写真。各写真中のバーは５μｍである。
【図２】試験した骨再生材料のＸＲＤパターン。（ａ）埋入前のＯＣＰ、（ｂ）埋入前のＯＣＰとＡＣＰの混合物、（ｃ）埋入前のＡＣＰ、（ｄ）２週間埋入後のＯＣＰ、（ｅ）２週間埋入後のＯＣＰとＡＣＰの混合物、（ｆ）２週間埋入後のＡＣＰ。
【図３】（ａ）未処理の対照群、（ｂ）ＡＣＰ、（ｃ）ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又は（ｄ）ＯＣＰ埋入８週間後のラット頭蓋冠の骨欠損部におけるＸ線写真。各写真中のバーは３ｍｍを指す。
【図４】ＡＣＰ、ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又はＯＣＰの埋入８週間後のラット頭蓋冠の骨欠損部におけるＸ線不透過率の定量分析。データは平均±標準偏差。＊ｐ＜０．０５。
【図５】ＡＣＰ、ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又はＯＣＰの埋入８週間後のヘマトキシリン−エオシンで染色した組織切片の概観の写真。（ａ）未処理群、（ｂ）ＡＣＰ、（ｃ）ＯＣＰとＡＣＰの混合物、（ｄ）ＯＣＰ。▼骨欠損部の縁部、概観写真のバーは１ｍｍ。
【図６】ＡＣＰ、ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又はＯＣＰの埋入８週間後のラット頭蓋冠の骨欠損部における新生骨の割合の定量分析。データは平均±標準偏差。＊ｐ＜０．０５。
【図７】（ａ）ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又はＯＣＰの埋入１２週間後のラット頭蓋冠の骨欠損部におけるＸ線不透過率の定量分析。データは平均±標準偏差。＊ｐ＜０．０５。（ｂ）ＯＣＰとＡＣＰの混合物、又はＯＣＰの埋入１２週間後のラット頭蓋冠の骨欠損部における新生骨の割合の定量分析。データは平均±標準偏差。＊ｐ＜０．０５。
【図８】擬似体液（ＳＢＦ）浸漬２週間後のＯＣＰ（Ａ）、ＯＣＰとＡＣＰの混合物（Ｂ）、ＡＣＰ（Ｃ）の走査型電子顕微鏡写真。各写真中のバーは５μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ、）と、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）を含む骨再生材料を提供する。以下、第８リン酸カルシウムを「ＯＣＰ」、非晶質リン酸カルシウムを「ＡＣＰ」と略記する。
【００１３】
ＯＣＰは特に限定されず、市販のＯＣＰを用いてもよいし、公知の方法により製造してもよい。ＯＣＰは通常、個々の結晶が凝集した顆粒であり、これをそのまま又は粉砕してさらに細かくして用い得る。ＯＣＰの粒径は、特に限定されず、通常ナノメートルからミリメートルまでの粒径のものが用いられる。一実施形態では、ＯＣＰ顆粒の粒径は１μｍ〜１０００μｍである。別の実施形態では、ＯＣＰ顆粒の粒径は５ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００１４】
ＡＣＰは特に限定されず、市販のＡＣＰを用いてもよいし、公知の方法により製造してもよい。
【００１５】
ＯＣＰとＡＣＰの割合は、特に限定されないが、通常は質量比で、ＯＣＰとＡＣＰの総量を基準として、ＯＣＰを１０質量％〜９０質量％、ＡＣＰを９０質量％〜１０質量％で含有する。一つの実施形態では、ＯＣＰとＡＣＰの総量を基準として、ＯＣＰを１０質量％〜４０質量％、ＡＣＰを６０質量％〜９０質量％で含有し、より好ましい実施形態では、ＯＣＰとＡＣＰの総量を基準として、ＯＣＰを１５質量％〜３５質量％、ＡＣＰを６５質量％〜８５質量％で含有する。
【００１６】
本発明の骨再生材料中は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサン、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β-リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、α-リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ4（ＰＯ4）2Ｏ；ＴＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ4；ＤＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ4・2Ｈ2Ｏ；ＤＣＰＤ）、低結晶性ＨＡ、ナノＨＡ、炭酸含有ＨＡなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。
【００１７】
骨再生材料中のＯＣＰとＡＣＰの合計量は、骨再生材料の質量を１００質量％として６０質量％以上、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５％質量以上、より好ましくは９８％質量以上、最も好ましくは９９％質量以上である。好ましい一つの実施形態では、骨再生材料はＯＣＰとＡＣＰのみからなる複合体であり、他の成分を実質的に含まない。
【００１８】
本発明の骨再生材料は、任意の形態のものを使用可能である。例えば、骨再生材料はＯＣＰ顆粒及びＡＣＰ顆粒を混合したもの、ＯＣＰとＡＣＰの共沈物等であってよく、これを適宜成形して使用する。成形手段としては、特に限定されない。例えば、骨再生材料を適当な型に入れて固める方法、固める際に圧力を加える方法が挙げられる。成形体の形状としては、特に限定されない。例えば、ディスク、ブロック、シートが挙げられる。ディスクの大きさとしては、特に限定されない。例えば、直径は、通常３〜２０ｍｍ、好ましくは５〜１０ｍｍである。例えば、厚みは、通常０．５〜５ｍｍ、好ましく１〜２ｍｍである。ブロックの大きさとしては、特に限定されない。例えば、長さ５〜１５ｍｍ、幅５〜５０ｍｍ、高さ５〜１００ｍｍ、好ましくは、長さ８〜１２ｍｍ、幅１０〜３０ｍｍ、高さ１０〜５０ｍｍである。
【００１９】
成形体は、骨欠損部の形状に応じて適宜整形され、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰあるいはＡＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００２１】
１．実験手順
（１）ＯＣＰとＡＣＰの合成及び調製
ＯＣＰはSuzuki O. et al., Tohoku J. Exp. Med., 1991, 164: 37-50に記載された湿式合成法を参考にして一定のｐＨ５−６及び７０℃の温度でカルシウム溶液とリン酸溶液を混合することにより合成した。反応溶液から沈殿物を回収し、水で数回洗浄し、後の使用のために１０５℃で乾燥させた。
【００２２】
ＡＣＰはEanes E.D., et al., Nature, 1965, 208, 365-7に記載の方法をSuzuki O. et al., Tohoku J. Exp. Med., 1991, 164: 37-50で報告したように改変した方法により合成した。簡単に説明すると、カルシウム溶液（硝酸塩溶液）を室温でリン酸溶液（アンモニウム塩溶液）と迅速に混合し、反応溶液から沈殿物をすぐに回収し、希釈アンモニア水で数回洗浄し、後の使用のために凍結乾燥させた。
【００２３】
乾燥したＯＣＰ及びＡＣＰの塊を乳鉢と乳棒で軽く粉砕し、標準的な試験用篩いに通過させ、それぞれ粒径が３００〜５００μｍのＯＣＰ顆粒及びＡＣＰ顆粒を得た。ＯＣＰ顆粒及びＡＣＰ顆粒を、以下の混合比ＯＣＰ：ＡＣＰ（質量比）で混合した：１００：０、２５：７５、０：１００（表１）。顆粒を互いに分散させるため、混合物はプラスチックチューブ内でロータリーシェーカーにより１時間振動させた。なお、以下の実施例では、ＯＣＰ顆粒及びＡＣＰ顆粒の混合物（ＯＣＰ＋ＡＣＰ顆粒混合物）とは、ＯＣＰ：ＡＣＰの混合比（質量比）が２５：７５である混合物を指す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
（２）ＯＣＰ及びＡＣＰの特徴付け
ＯＣＰとＡＣＰは粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）とフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）により特徴付けた。ＸＲＤパターンはＸ線回折装置（ＭｉｎｉＦｌｅｘ、株式会社リガク製）で線源をＣｕＫα線、３０ｋＶ、１５ｍＡとし、３．０°から８０．０°まで０．０５°の間隔でのステップ走査を用いて記録した。２θの範囲の測定に４．７°のＯＣＰの主ピーク（１００）を含んでいた。ＯＣＰのＪＣＰＤＳ数２６−１０５６Ａ９とＨＡのＪＣＰＤＳ数９−４３２を用いて結晶相を同定した。ＯＣＰのＦＴＩＲスペクトルは、試料をＫＢｒに４，０００−４００ｃｍ-1の範囲にわたり４ｃｍ-1の分解能で希釈し、ＦＴＩＲ分光計（ＦＴ／ＩＲ−６３００、日本分光株式会社）により得た。結晶及び顆粒の形態は、１０ｋＶの加速電圧で動作したＪＥＯＬ分析ＳＥＭ  ＪＳＭ−６３９０ＬＡを用いて検討した。
【００２６】
（３）ＯＣＰ顆粒、ＡＣＰ顆粒、及び混合顆粒の埋入
１２週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー株式会社）を使用した。ラットをエーテル吸入を補足しつつ腹腔内ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。頭蓋の正中部に沿って無菌的に皮膚の切開を施し、頭蓋冠まで切開を続け、骨膜を剥離し、頭蓋冠に直径９ｍｍの頭蓋開口による骨欠損部を形成した。ＯＣＰ顆粒、ＡＣＰ顆粒、又はＯＣＰ＋ＡＣＰ混合顆粒を骨欠損部に埋入した。陰性対照として、骨欠損部の形成後に顆粒の埋入を行わない以外は同様に処理した未処理ラットを用いた。骨欠損部を処理した後、除去した骨膜及び皮膚は再配置し、縫合した。
【００２７】
（４）Ｘ線像での分析
埋入後、ラットから埋入物と周囲の頭蓋冠骨を切除し、摘出した組織を４％パラホルムアルデヒド  ０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液に浸漬、４℃で一晩インキュベートし、得られた組織標本のＸ線写真を標準条件（２０ｋＶ、５ｍＡ、２０秒）下でＸ線フィルム（ＦＲ、富士フィルム株式会社製）で顕微鏡検査装置（Ｓｏｆｔｅｘ  ＣＭＢＷ−２、ソフテックス株式会社製）を用いて撮影した。ＯＣＰ及びＡＣＰはＸ線不透過性を示さなかった。骨欠損部におけるＸ線不透過性の割合（％）を頭蓋開口により最初に形成された骨欠損部の単位面積当たりのＸ不透過性の面積に１００を掛けた値として計算した。Ｘ線不透過率（％）はＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅパブリックドメインソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州所在）を用いてコンピュータで定量化した。
【００２８】
（５）組織の調製
上記でＸ線写真を撮影した後、試料を１０％エチレンジアミン四酢酸  ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で２〜４週間脱灰化させ、段階的な一連のエタノールで脱水し、パラフィン包埋した。頭蓋冠の骨欠損部の中心を取り出し、０．０５μｍの厚みで冠状面に切断し、切片を標準法によりヘマトキシリン−エオジンで染色し、顕微鏡写真機（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３００  ＦＸ、ライカマイクロシステムズ社製）で写真を撮影した。骨欠損部における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）を、頭蓋開口により最初に形成された骨欠損部の単位面積当たりの新生骨の面積に１００を掛けた値として計算した。ｎ−Ｂｏｎｅ％はＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅパブリックドメインソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州所在）を用いてコンピュータで定量化した。
【００２９】
（６）擬似体液（ＳＢＦ）における結晶の構造変化
ＳＢＦ溶液を、Kokubo, T. et al., J. Biomed. Mater. Res. 1990, 24, 721-34に記載されているように、純水に試薬グレードの塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム三水和物、塩化マグネシウム六水和物、及び塩化カルシウム二水和物を溶解させることにより調製した。溶液を次にトリヒドロキシメチルアミノメタンと塩酸で緩衝化し、３７．０℃でｐＨ７．４とした。ＯＣＰ顆粒、ＡＣＰ顆粒及びそれらの混合物（５０ｍｇ）を、３７．０℃の水浴に入れた別個のプラスチックチューブ中で絶えず攪拌させた状態で、５０ｍｌの新しいＳＢＦ中に浸漬させた（固体／液体比、１ｍｇ／１ｍｌ）。浸漬された顆粒を２週間後に収集し、水で洗浄し、ＸＲＤ観察のため凍結乾燥した。浸漬後のＳＢＦ溶液の上澄液中のカルシウムイオン及び無機リン酸イオンの濃度を、それぞれカルシウムＥ−テストワコー及びホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて定量的に決定した。
【００３０】
（７）過飽和度の概算
ＳＢＦの過飽和度(degree of supersaturation, ＤＳ)と、ＯＣＰ、ＯＣＰとＡＣＰの混合物、及びＡＣＰに浸漬させた前後の過飽和度を計算し、溶液中のＯＣＰ及びＨＡの顆粒の溶解度を推定した。ＤＳの値は目的とするリン酸カルシウムに対してイオン積を溶解度積で除して得られる値である。ＤＳは特定のリン酸カルシウム塩に対して溶液が飽和になる時点に相当する。ＤＳ値は、先の報告(Moreno, E.C. et al., Calcif. Tissue Int. 1991, 49, 6-13;Aoba, T. et al., Calcif. Tissue Int. 1987, 41, 86-94; Moreno, E.C., Adv. Dent. Res. 1987, 1, 245-51; Suzuki O et al. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2006, 77, 201-12)によれば、一般にＣａ，Ｍｇ、Ｎａ、Ｋ、Ｐ、Ｃｌ及びＦの分析濃度とｐＨ値を、［Ｃａ］、［Ｐ］、及び［Ｍｇ］に対する３つの質量平衡方程式と組み合わせることにより計算される。溶液中にはＨＣＯ3-が存在すると仮定し、計算にはＣａＨ2ＰＯ4+、ＣａＨＰＯ40、ＭｇＨＰＯ40、ＣａＨＣＯ3+、及びＭｇＨＣＯ3+イオン対を含めた。ＤＳ値はＨＡ及びＯＣＰについての平均イオン活量積に関して定義される。本研究では化学分析により得られたＣａ2+及び無機リン（Ｐi）の濃度をＳＢＦに使用し、ＳＢＦ組成に１４２ｍＭ  Ｎａ、５ｍＭ  Ｋ、及び１．５ｍＭ  Ｍｇのイオン濃度を使用した（Kokubo T., et al, J. Biomed. Mater. Res. 100, 24, 721-34）。７．４のｐＨ値と１．８６％の炭酸の生理学的分圧を計算に用いた。溶解度積定数はＨＡを７．３６×１０-60（Moreno E.C., Nature 1974, 247, 64-65）、ＯＣＰを２．５１×１０-49とした（Tung. M.S., J Res Natl Bur Stand 1988, 93, 613-624）。
【００３１】
（８）統計学的解析
すべての値は平均±標準偏差として示した。実験はすべて少なくとも３回行い、再現性に信頼性があることを示した。標本間の統計学的な差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較分析法により評価した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とみなした。
【００３２】
２．実験結果
（１）ＯＣＰ及びＡＣＰの特徴付け
図１はＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒のＳＥＭ写真を示す。ＯＣＰはSuzuki, O., Cell Mater. 1995, 5, 45-54で以前に報告したのと同様な数μｍ長の板状の形態を示した（図１Ａ）。ＡＣＰは密に充填された球状のナノ結晶から構成されていた（図１Ｂ）。
【００３３】
図２は試験した試料のＸＲＤパターンを示す。図２（ａ）は埋入前のＯＣＰのＸＲＤパターンであり、２θ＝４．９°における（１００）反射及び２θ＝３３．６°における（７００）反射を含む、ＯＣＰに関して観察されるＸＲＤの反射はＯＣＰ構造から予想されるそれらによく一致していた（Suzuki, O. et al., Biomaterials, 2006, 27, 2671-2681）。図２（ｃ）は埋入前のＡＣＰのＸＲＤパターンであり、非晶質状態に特徴的な３０°前後の広いピークを示した（Suzuki O. et al., Tohoku J. Exp. Med., 1991, 164: 37-50）。
【００３４】
ラット頭蓋冠の骨欠損部に埋入する前及び埋入２週間後のＯＣＰ，ＡＣＰ及びそれらの混合物のＸＲＤパターンによると、すべての試料の構造はＨＡの構造へと変換する傾向がみられ、埋入されたＡＣＰと埋入されたＯＣＰ及びＡＣＰの混合物の変換は、埋入されたＯＣＰよりも早く進むと思われた。
【００３５】
（２）埋入８週間後のＸ線写真による検討
図３のＸ線写真に示されるように、未処理群（図３（ａ））では、埋入８週間後に骨欠損部の縁に沿ってＸ線不透過な部分が観察され、試料を埋入した群（図３（ｂ）〜（ｄ））では、隔離された顆粒状のＸ線不透過な部分が骨欠損部中に散在し、区別できる程度のＸ線不透過性を示した。
【００３６】
また、図４に示す骨欠損部におけるＸ線による不透過率の画像による分析結果によると、未処理群、ＡＣＰ群、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群、ＯＣＰ群のＸ線不透過率±標準偏差（％）はそれぞれ３３．６±８．６％、６３．２±１１．８％、７９．３±６．７％、５９．２±３．５％であり、未処理群とすべての埋入群の間には有意差が観察されると共に、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群のＸ線不透過率はＡＣＰ群及びＯＣＰ群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００３７】
（３）埋入８週間後の組織学的及び組織形態学的検討
埋入８週間後の組織切片は、未処理群では新生骨形成が骨欠損部の縁部に限定され、骨欠損部の大部分は線維状組織で満たされていたのに対し（図５（ａ））、ＯＣＰ、ＡＣＰ、またはそれらの混合物で処理したラットでは新生骨形成が埋入されたＯＣＰ又はＡＣＰの周囲で観察され（図５（ｂ）−（ｄ））、これは図３の顆粒状のＸ線不透過性がＯＣＰまたはＡＣＰからアパタイト相への変換による埋入した顆粒周囲の石灰化又は新生骨と一致することを示唆している。
【００３８】
さらに、骨欠損部における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）を図６に示す。未処理群、ＡＣＰ群、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群、ＯＣＰ群の８週目の骨欠損部におけるｎ−Ｂｏｎｅ±標準偏差（％）はそれぞれ１６．９±２．９％、２９．４±７．０％、４８．８±１２．４％、３８．２±４．３％であり、未処理群とすべての埋入群の間には有意差が観察されると共に、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群のｎ−Ｂｏｎｅ％はＡＣＰ群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００３９】
（４）埋入１２週間の骨形成の検討
埋入時間を８週間からさらに長くして、埋入１２週間後のＯＣＰに対するＯＣＰ＋ＡＣＰの効果について調べた。埋入１２週間後の組織切片では、８週後と比較して、隔離されたＸ線不透過な部分の融合に基づく大きなＸ線不透過性がＯＣＰ群及びＯＣＰ＋ＡＣＰ群の両方で観察された（データ非図示）。
【００４０】
図７（ａ）に示す骨欠損部におけるＸ線による不透過率の画像による分析結果によると、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群及びＯＣＰ群のＸ線不透過率±標準偏差（％）はそれぞれ８３．８±７．３％及び６３．５±８．９％であり、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群のＸ線不透過率はＯＣＰ群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００４１】
埋入１２週間後の組織切片での新生骨形成はＯＣＰ＋ＡＣＰ群及びＯＣＰ群のいずれも高く、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群ではＯＣＰ群よりも骨再生を多く誘導し得ることが判明した（データ非図示）。 さらに、図７（ｂ）に示す骨欠損部における新生骨の割合（ｎ−Ｂｏｎｅ％）の組織形態学的知見によると、ＯＣＰ＋ＡＣＰ群ではＯＣＰ群と比較して新生骨形成が有意に増大していることが明らかとなった（それぞれ５４．０±５．１％及び４２．０±３．７％）。これは図７（ａ）に示したＸ線不透過率の結果と一致している。
【００４２】
（５）擬似体液（ＳＢＦ）中の浸漬
ＳＢＦ中に２週間浸漬した後のＯＣＰ顆粒、ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物、及びＡＣＰ顆粒の表面特性の変化をＳＥＭにより観察した（図８Ａ−Ｃ）。ＳＢＦ溶液への浸漬後もＯＣＰの板状の形態は比較的残っていた（図８Ａ）。ＳＢＦ溶液への浸漬後、ＡＣＰの表面は小さく均質な球形の粒子により覆われた（図８Ｃ）。ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物では、元の球状粒子（恐らくＡＣＰ）と板状粒子（恐らくＯＣＰ）の混合物の上に、ＡＣＰで観察されたのと同様の、より小さな球状粒子が堆積しており、ＯＣＰの表面ともＡＣＰの表面とも異なっていた（図８Ｂ）。
【００４３】
(６)ＳＢＦの過飽和度（ＤＳ）の検討
表２は、ＯＣＰ顆粒、ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物、及びＡＣＰ顆粒の浸漬前後のＳＢＦの溶液組成及び過飽和度（ＤＳ）である。ＡＣＰ顆粒のＤＳは、ＨＡに関しては減少したが、ＯＣＰに関しては飽和した。ＯＣＰ顆粒のＤＳは、ＨＡに関しては減少したが、ＯＣＰに関してはわずかに過飽和のままだった。ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物のＤＳは、ＯＣＰに関しては飽和した。これらの結果は、ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物がＡＣＰ顆粒単独の場合と同様にＯＣＰに転換する高い能力を有する一方、ＯＣＰ顆粒ではＯＣＰに関してわずかに過飽和な状態にとどまることを示した。また、ＡＣＰ顆粒と、ＯＣＰ顆粒とＡＣＰ顆粒の混合物とは、溶液の組成の点ではＯＣＰ相が飽和になる傾向があるが、ＸＲＤにより調べたいずれの材料の構造もＨＡに変化した（データ非図示）のに対し、ＯＣＰ顆粒ではＸＲＤにより調べた材料の構造がＨＡに変化した（データ非図示）にもかかわらず、ＯＣＰ相が完全な飽和には到らなかった。これはＯＣＰからＨＡへの転換が溶液の組成の点では完了しなかったことを示している。
【００４４】
以上より、ＡＣＰとＯＣＰの共存が、ＯＣＰからＨＡへの転換プロセスに影響を及ぼすことが明らかとなった。
【００４５】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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