(57)【要約】      （修正有）【課題】羅漢果の甘味成分として一般に知られるモグロシド類を含み、良好な甘味質を呈し、抗酸化性などの機能性にも優れた羅漢果甘味成分含有組成物等の提供。【解決手段】羅漢果の抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、前記固定化酵素膜の透過液に、甘味料やその他の添加成分を加えルことで調製した、モグロシド類と蛋白質、さらに甘味料を含み、モグロシド類の含量が０．５〜７０％重量％未満であり、蛋白質の含量がモグロシド類１５０重量部に対して１５重量部以下である羅漢果甘味成分含有組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モグロシド類（モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、１１−オキソーモグロシドＶ、シアメノシドＩ）と蛋白質を含み、モグロシド類の含量が０．５重量％以上７０重量％未満であり、蛋白質の含量がモグロシド類１５０重量部に対して１５重量部以下であることを特徴とする羅漢果甘味成分含有組成物。
【請求項２】
さらに甘味料を含む請求項１に記載の羅漢果甘味成分含有組成物。
【請求項３】
前記甘味料が、トレハロース、エリスりトール、キシリトール、ステビア、アセスルファムK、スクラロース、及びアスパルテームから選択される少なくとも１種である請求項２に記載の羅漢果甘味成分含有組成物。
【請求項４】
羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、
前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、
前記固定化酵素膜の透過液に、甘味料やその他の添加成分を加えて、羅漢果甘味成分含有組成物を得る工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。
【請求項５】
羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、
前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液に精製処理を行う工程と、
前記精製工程で得られた羅漢果の抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、
前記固定化酵素膜の透過液に、甘味料やその他の添加成分を加えて、羅漢果甘味成分含有組成物を得る工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。
【請求項６】
前記固定化酵素膜の透過液に、甘味料やその他の添加成分を加えた後、乾燥粉末化する請求項４又は５に記載の羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。
【請求項７】
前記固定化酵素膜の透過液に膜処理を行うことにより、該透過液中の蛋白質を透過除去する工程をさらに含む請求項４〜６のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法。
【請求項８】
前記固定化酵素膜において、蛋白分解酵素を固定化する膜が逆浸透膜又はナノ濾過膜である請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物を有効成分とする甘味料。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物を含む飲食品。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物を含む医薬品又は医薬部外品。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の羅漢果甘味成分含有組成物を含む化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羅漢果甘味成分含有組成物、及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、羅漢果の甘味成分として一般に知られるモグロシド類を含み、良好な甘味質を呈し、抗酸化性などの機能性にも優れた羅漢果甘味成分含有組成物、及び該羅漢果甘味成分含有組成物を工業的に効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然甘味料の１つとして、羅漢果が知られている。羅漢果（Ｌo Han Kuo、学名；Siraitia grosvenori （SwingＬe）C.）は、ウリ科（Cucurbitaceae）に属する、つる性の多年生宿根側植物であり、その草丈は５ｍにも達し、地下部分には塊茎を有する。中国華南地方に分布し、涼しくて昼夜の温度差の大きい霧の多い地方の、柔らかくて腐植質に富んだ山の斜面地などを好んで生育し、中国桂林地の広西チアン族自治区を中心に独占的に栽培されている。日本には羅漢果の生の果実は輸入されておらず、乾燥した羅漢果が輸入されている。
【０００３】
羅漢果は、一般には、乾燥させて砕いたものを煎じて羅漢果茶として飲んだり、羅漢果を水やメタノールなどで抽出したものを料理の甘味料として用いることが多い。また、羅漢果は、気管支炎、へん桃腺炎、咽頭炎、鎮咳、去痰、急性胃炎、便秘などに効能があるため、中国では民間薬用果実として昔より食されてきた。
【０００４】
さらに、近年、羅漢果には、活性酸素（フリーラジカル）を消去する抗酸化作用（老化防止作用、抗ガン作用）や血糖降下作用などの薬理作用があり、高血圧症、糖尿病などの予防・治療に有効であることが次第に明らかにされつつある。
【０００５】
活性酸素は、大気中に含まれる酸素分子がより反応性の高い化合物に変化したものであり、酸素分子が不対電子を捕獲することによって、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素などに変換されたものの総称である。近年、死因のトップに挙げられるガン・脳卒中・心臓病をはじめ、多くの病気の発生に活性酸素が関与していることが報告されている。一般には活性酸素の酸化力によって体の細胞を傷つけ、病気を引き起こすと考えられている。この活性酸素の１つであるスーパーオキシドを無害の酸素に変換する酵素がスーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）であり、この酵素はスーパーオキシドから酸素分子と過酸化水素への変換を触媒する。
【０００６】
生体の酸化防止能を強化すれば、活性酸素が関与する疾病のリスクを低下できる可能性がある。食品中の有効成分には活性酸素の消去作用（superoxide anion scavenging activity；ＳＯＳＡ）を有するものがあり、高い活性を有する食品素材の開発が活発に展開されている。
【０００７】
そのため、羅漢果は、天然系の甘味料としてだけではなく、健康・機能性食品素材としても注目されている。しかし、現在までに羅漢果の機能性に関する詳しい研究は殆どないのが現状である。
【０００８】
羅漢果の甘味特性は、主として各種のトリテルペン配糖体に由来しており、その中でも特にモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、１１−オキソーモグロシドＶ、及びシアメノシドＩ（以下、これらを「モグロシド類」と称する。）が羅漢果の主要な甘味成分とされている。羅漢果に含まれる甘味成分であるモグロシド類は、ショ糖の数百倍の甘味強度とショ糖に近い甘味質を有し、同じ天然系の甘味料に属するステビア抽出物や甘草抽出物に比べて総合的に良好な甘味特性を呈するとともに、体内ではエネルギーとして使用されないことから、ダイエット甘味料などとして用いられている。
【０００９】
現在、市場で流通している羅漢果製品としては、概ね３つのタイプ、すなわち、「羅漢果甘味成分をわずかの量しか含まないタイプ」、「加熱処理したタイプ」、「精製処理したタイプ」の製品がある。
【００１０】
前記「羅漢果甘味成分をわずかの量しか含まないタイプ」の羅漢果製品は、微量のモグロシド類しか含まない製品であり、例えば、モグロシド類含量３３重量％程度の羅漢果甘味成分含有組成物を０．８重量％程度のエリスリトールなどの糖アルコールに添加したものである。このタイプの場合、通常モグロシド類は製品中に０．２６４重量％程度しか存在しておらず、これを甘味料として使用した末端食品でのモグロシド類の濃度は５〜２０ｐｐｍ程度になると推定される。そして、このような微量のモグロシド類では、羅漢果による甘味質向上や機能性を消費者が期待することは難しいと考えられる。
【００１１】
前記「加熱処理したタイプ」の羅漢果製品は、加熱処理を行って調製したものであり、日本国内では主に乾燥果実タイプ又は顆粒タイプで流通している。このタイプの場合、加熱により羅漢果に含まれる蛋白質などの成分が熱変性して茶褐色を呈していることが多く、また、甘味質や機能性が大幅に劣化していると考えられる。
【００１２】
前記「精製処理タイプ」の羅漢果製品は、モグロシド類含量が約５重量％〜５０重量％であり、主に食品添加物として市場に流通しているものである。このタイプの場合、甘味にくせがあり、食品に加えると苦みや漢方薬の臭味のような味になる。また、経時的に品質の劣化（苦み、漢方薬の臭味など）を起こすため、使用用途が限定されているのが現状である。これらの原因は、現在の羅漢果製品の製造方法ではモグロシド類含量が約５重量％〜５０重量％まで精製した製品しか製造できないため、製品にモグロシド類以外の成分が多量に含まれることによるものと考えられる。
【００１３】
以上のように、現在、甘味料として市場で流通している羅漢果製品は、甘味質や機能性が十分に満足できるものではなく、その結果、羅漢果製品の使用用途も限定されていた。
【００１４】
羅漢果製品は、羅漢果の果実を粉砕した後、通常の抽出及び分離方法を用いて一般に製造される。羅漢果製品の具体的な製造方法としては、例えば、モグロサイドＶ、モグロサイドＩＶ、１１−オキソ−モグロサイドＶ及びシアメノサイドＩの合計含量が、３３重量％以上である羅漢果エキスの製造方法として、１）羅漢果の果実をメタノール抽出してメタノールエキスを得る、２）メタノールエキスを水と混合し、Ｎ−ヘキサンで脱脂する、３）脱脂後のメタノールエキスをカラムクロマトグラフィーにかけて８０％メタノール、１００％メタノール、及びアセトンで順次溶出し、粗配糖体画分である８０％メタノール画分を得る、４）得られた粗配糖体画分をメタノールに溶解した後、シリカゲルと混合し、乾燥し、次いでこのシリカゲルをクロロホルム−メタノールの混合溶媒で溶出することにより、配糖体画分を得る、５）得られた配糖体画分を液体クロマトグラフィーにかけることにより、さらに高純度の配糖体画分を入手し得る、ことが報告されている（特許文献１）。
【００１５】
また、甘味及び抗酸化作用を有する羅漢果配糖体を含有する抗酸化組成物の製造方法として、特許文献１に記載された方法と同様の方法が報告されている（特許文献２）。
【００１６】
さらには、羅漢果の生果実果汁又は抽出液をペクチナーゼ系酵素、セルラーゼ系酵素、ヘミセルラーゼ系酵素、キシラナーゼ系酵素、プロテアーゼ系酵素及びアミラーゼ系酵素の中から選択された１種以上の酵素で処理する酵素処理後、残存する酵素活性を加熱失活させた後、通常の遠心分離あるいは圧搾ろ過等により不溶物を除去することを特徴とする羅漢果エキスの製造方法が報告されている（特許文献３）。
【００１７】
その他としては、羅漢果成分特有の甘味質を保持して、常温で腐敗しないで容易に保存可能な性質及び飲用に適するマイルドな味質を有していて、しかも、水への分散性及び溶解性に優れている羅漢果粉末の製造方法として、水易溶性化分岐サイクロデキストリン若しくはそれを６０重量％以上の含有物からなるサイクロデキストリン１重量部に対して羅漢果抽出物０．２〜２．０重量部の比率で存在する水相を混合攪拌処理する包接化処理工程と、混合攪拌処理した水相から急速乾燥により水分を除去してサイクロデキストリンと羅漢果抽出物との粉末にする乾燥工程からなる方法から構成される製造方法が報告されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００１−２１１８５４号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２９３４号公報
【特許文献３】特開平９−２３４０１６号公報
【特許文献４】特開平９−１７３００６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
工業的に生産される従来の羅漢果製品は、上記のとおり、甘味質や機能性が十分ではなく、使用用途範囲も限定されている。そのため、良好な甘味質を呈し、抗酸化性などの機能性に優れた羅漢果製品の開発が顧客や消費者より強く求められているのが現状である。
【００２０】
そこで、本発明は、良好な甘味質を呈し、抗酸化性などの機能性にも優れた羅漢果甘味成分含有組成物、並びに該羅漢果甘味成分含有組成物を工業的に効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、上記課題を解決するため検討したところ、羅漢果製品の甘味質や機能性の低下を招いている原因は、羅漢果製品に含まれる蛋白質含量がモグロシド類の含量に比べて非常に多い点にあることが分かった。そこで、モグロシド類の含量に対して極めて低い割合で蛋白質が存在する羅漢果製品を製造する方法の開発を目標とした。
【００２２】
そのような方法について検討を重ねた結果、実験室レベルではともかく、実製造レベルとなると、現在の羅漢果精製方法の１つである合成吸着樹脂、イオン交換樹脂による精製では、羅漢果の除去目的成分である蛋白質が回収目的成分であるモグロシド類と極性（水に溶解する能力）、分子量などの化学的性質が類似しているなどのために、目標とする羅漢果甘味成分含有組成物を得ることは困難であることが判明した。
【００２３】
また、製造レベルでの分子篩による精製物の製造方法として、膜処理や合成樹脂によるゲルクロマトグラフィーが使用されるが、この方法ではモグロシド類と蛋白質との分子量が非常に近い成分のものも多く有り、モグロシド類のみを分離・精製することは不可能であると考えられる。
【００２４】
さらに、酵素処理により除去目的成分の蛋白質を分解した後に精製する方法も検討したが、添加酵素自身が蛋白質であることで、精製物中に蛋白質の混入を招いてしまう結果となり、目的を達成することは困難であった。
【００２５】
しかしながら、本発明者は、さらに鋭意努力し目的を達成するために検討を重ねた結果、羅漢果抽出液に対して、膜処理方法と酵素処理法を組み合わせた固定化酵素膜法を用いて精製することにより、回収目的成分であるモグロシド類が高度に精製され、最終製品に酵素自身の蛋白質の混入もなく、除去目的成分である蛋白質が効率的に除去されることを発見した。
【００２６】
さらに、羅漢果甘味成分以外の他の甘味料を配合することにより、従来製品に比べて飛躍的に向上した甘味質を呈することも発見した。
【００２７】
本発明者は、以上の知見に基づき、非常に良好な甘味質を呈し、抗酸化性などの機能性にも優れた羅漢果甘味成分含有組成物を完成するに至った。
すなわち、本発明は、モグロシド類（モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、１１−オキソーモグロシドＶ、シアメノシドＩ）と蛋白質を含み、モグロシド類の含量が０．５重量％以上７０重量％未満であり、蛋白質の含量がモグロシド類１５０重量部に対して１５重量部以下であることを特徴とする羅漢果甘味成分含有組成物である。
【００２８】
さらに、本発明は、前記羅漢果甘味成分含有組成物を製造するための方法であって、すなわち、羅漢果を水系溶媒で抽出する工程と、前記抽出工程で得られた羅漢果の抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる工程と、前記固定化酵素膜を透過させた透過液に、甘味料やその他の添加成分を加えて、羅漢果甘味成分含有組成物を得る工程を含むことを特徴とする、前記羅漢果甘味成分含有組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、モグロシド類の含量に対して非常に低い割合で蛋白質が含まれており、そのため、従来の羅漢果甘味成分含有品に比べて飛躍的に改善された良好な甘味質を呈し、かつ、羅漢果に由来する抗酸化性などの機能性を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】羅漢果甘味成分含有組成物中のモグロシド類の濃度と蛋白質成分の割合が抗酸化性に与える影響をＤＰＰＨ法により検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
上述したように、本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、モグロシド類の含量に対して非常に低い割合で蛋白質を含むことが特徴であるが（モグロシド類１５０重量部に対して１５重量部以下）、このような特徴は、羅漢果抽出液に対して固定化酵素膜を用いた処理（固定化酵素膜法）を行うことによってもたらされる。固定化酵素膜法を用いることにより、モグロシド類と化学的性質が類似している除去目的成分である蛋白質が選択的に分離・除去されることは、本発明者が初めて見出したものである。以下、本発明について詳細に説明する。
【００３２】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、モグロシド類を含み、その含量は０．５重量％以上７０重量％未満、好ましくは１重量％〜５０重量％、さらに好ましくは５重量％〜３３重量％である。該羅漢果甘味成分含有組成物の総重量に対し、モグロシド類の含量が０．５重量％よりも少ないと羅漢果に由来する良好な甘味質や抗酸化性などの機能性が得られなくなる場合がある。
【００３３】
また、本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、羅漢果由来の蛋白質を含むが、その含量はモグロシド類１５０重量部に対して１５重量部以下であり、好ましくは１０重量部以下、より好ましくは５重量部以下、さらに好ましくは２重量部以下である。蛋白質の含量が１５重量部よりも多いと甘味質や機能性が大幅に低下する場合がある。
【００３４】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、甘味料を配合させることにより、羅漢果の甘味と該甘味料の甘味が組み合わされ、全体の甘味質をより一層向上させることができる。そのような甘味料は特に限定されるものではなく、例えば、ブドウ糖、果糖、キシロース、オリゴ糖（スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パラチノース等）、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ステビア、甘草抽出物、アマチャ抽出物、ソーマチン、クルクリン、モネリン、モナチン、ハチミツ、メープルシロップ、アガベシロップ、パームシュガー、モラセス、水飴、グリセリン、アセスルファムＫ、スクラロース、アスパルテーム、ネオテーム、サッカリンなど、任意の甘味料を適宜選択して配合することができるが、モグロシドＶと組み合わせた場合に製品全体の甘味質を飛躍的に向上させるという点では、特にトレハロース、エリスリトール、キシリトール、ステビア、アセスルファムＫ、スクラロース、及びアスパルテームから選択される少なくとも１種を配合することが好ましい。
【００３５】
羅漢果甘味成分含有組成物中の甘味料の含量は、所望の効果が得られる限り特には限定されず、用いる甘味料の種類やモグロシド類の含量などに応じて適宜決定されるが、通常、５〜７０重量％、好ましくは１５〜３３重量％である。
【００３６】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、賦形剤（デキストリン、シクロデキストリン、水溶性食物繊維、可溶性澱粉等）、生理活性成分、防腐剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤など、その他の添加成分を任意に配合することができる。
【００３７】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、甘味料の有効成分として利用することができ、各種製品に対し良好な甘味を付与又は増強することができる。
【００３８】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、抗酸化剤の有効成分として利用することができ、各種製品に対し抗酸化作用を付与又は増強することができる。
【００３９】
本発明の羅漢果甘味成分含有組成物は、飲食品（食品添加物、機能性食品、健康補助食品を含む）、医薬品、医薬部外品、化粧品などの、甘味及び／又は機能性を必要とするもの全てに利用することができる。
【００４０】
次に、本発明の製造方法について説明する。本発明の製造方法を利用することにより、羅漢果抽出液中の蛋白質を選択的に除去して、前記羅漢果甘味成分含有組成物を工業的レベルで効率よく製造することができる。
【００４１】
本発明の製造方法を実施するには、まず、羅漢果の抽出液を準備する必要がある。この羅漢果の抽出液を得るには、羅漢果を水系溶媒で抽出すればよく、具体的には、羅漢果の果実と水系溶媒を容器に入れ、８０〜１００℃程度で加熱した後、残渣を除去、濾過することにより調製される。前記水系溶媒としては、水、含水エタノール、含水メタノールなどが例示される。羅漢果の甘味質は収穫時期（完熟度）により大きく異なり、完熟した羅漢果の果実は甘味質が良好であるので完熟果実を用いるのが好ましい。また、羅漢果の果実は乾燥処理を施したものであるか否かは問わないが、未乾燥のものが好ましい。
【００４２】
本発明では、上記のように羅漢果を水系溶媒で抽出した後、得られた抽出液に対し、さらに精製処理を施すことが好ましい。この精製処理を施すことにより、羅漢果抽出液中に含まれる特に糖類、繊維類、灰分及び目的成分であるモグロシド類とは化学的性質の異なる蛋白質の含量を低減させることができる。その結果、最終製品に含まれるモグロシド類の濃度をより上昇させ、蛋白質の含量をより低減させることができる。  
【００４３】
前記精製処理の方法は、羅漢果抽出液中に含まれるモグロシド類とその他の成分を分離・精製できる方法であれば特に限定はなく、現在の製造レベルでの精製方法である合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、膜処理、合成樹脂によるゲルクロマトグラフィー、超臨界処理、疑似移動床法、酵素処理法などの少なくとも１つの方法を用いて行えばよく、それらの方法を組み合わせても構わない。好ましい１例としては、無極性の多孔質合成吸着樹脂、例えば、芳香族系合成吸着樹脂、特にスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤であって、細孔半径が２６０オングストローム程度の非常に大きな細孔を持つもの（例えば、ダイヤイオンＨＰ２０、三菱化学社製、商品名）を用いる方法が挙げられ、上記合成吸着樹脂は極性の高いペプチド、蛋白質、ポリフェノール、灰分、糖類等を除去し、目的成分であるモグロシド類の精製に適している。この合成吸着樹脂を用いる場合、羅漢果抽出液を通液させた後、吸着したモグロシド類を溶出させるためにエタノール等のアルコール類を通液させる。その結果、目的成分であるモグロシド類が濃縮され、蛋白質の含量が低減した羅漢果抽出液が回収される。
【００４４】
次に、上記調製した羅漢果抽出液を、蛋白分解酵素を固定化した固定化酵素膜に供給して、該抽出液中の蛋白質を分解しながら、該固定化酵素膜を透過させる（固定化酵素膜法）。これにより、上記抽出液中に含まれる除去対象成分である蛋白質が選択的に酵素分解され、モグロシド類の含量に比較して蛋白質の含量が極めて低い製品を得ることが可能になる。
固定化酵素膜法（メンブランリアクター）は、膜処理法と酵素処理法を組み合わせて目的とする分子のみを集める方法であり、膜の表面又は内部に酵素が固定された固定化酵素膜を利用して除去目的成分を酵素分解し分離する方法である。すなわち、膜中の分子の拡散と酵素反応を組み合わせて特定の分子のみを集める固定化酵素膜を用いて該膜の片側の溶液に基質分子を投入すると、基質分子が酵素と反応して生成物が形成され、目的とする分子だけを膜を透過させて取り出す方法である。この方法は羅漢果などの天然物の精製物を製造レベルで製造する方法としては未だ用いられておらず、この点において極めてユニークな方法である。この方法では酵素は膜に固定化されているため、酵素由来の蛋白質が最終製品に混入することがなく、膜によって酵素を反応器内に閉じ込めた状態で目的成分を選択的に分離・精製することが可能である。さらに、固定化酵素膜法には、「特別な処理なしに酵素を固定化できる」、「無菌的操作が可能である（今までのバイオリアクターでは無菌的な処理は不可能であった。）」などの利点もある。
【００４５】
本発明の製造方法において、前記固定化酵素膜に固定させる酵素は蛋白分解酵素（プロテアーゼ）である。蛋白分解酵素としては、セリンプロテアーゼ（アルカリ性プロテアーゼ）、チオールプロテアーゼ、金属プロテアーゼ（中性プロテアーゼ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）などが例示されるがこれらに限らない。羅漢果中の蛋白質を効率よく分解する点からは酸性プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、天野エンザイム社製、商品名）を用いるのが好ましい。
【００４６】
固定化酵素膜法で使用される膜は、一般に細孔径の小さいほうから、逆浸透（reverse osmosis、ＲＯ）膜、ナノ濾過（nanofiltration、ＮＦ）膜、限外濾過（ultrafiltration、ＵＦ）膜、精密濾過（microfiltration、ＭＦ）膜に分類されるが、本発明の製造方法では、目的成分であるモグロシド類を透過させ、蛋白質の透過を阻止するために逆浸透膜やナノ濾過膜を用いることが好ましい。特に、細孔による分離（サイズ分離）と膜表面の荷電による静電気的な分離効果が組み合わさり、特徴ある透過性能を発揮することが可能なナノ濾過膜が好ましく、具体的には細孔の大きさが大体１〜５０ｎｍで塩類の阻止率が概ね７０％以下と低いナノ濾過膜（例えば、ＮＦ膜型番；ＮＰ０１０、硫酸ナトリウム阻止率２５％〜４０％、ダイセン・メンブレン・システム社製）を用いることが好ましい。
【００４７】
前記膜の材質としては、例えば、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、芳香族ポリアミド、親水化ポリアミド、及び、それらを複合したもの等が挙げられる。好ましくは、芳香族ポリアミド、親水化ポリアミド、及びそれらを複合したものである。
【００４８】
前記膜の形状については、特に限定されず、スパイラル型、中空糸型、円管型、平板型などが挙げられる。これらのうち、大きな膜面積が確保できるスパイラル型や分離精度の高い中空糸型が適していると考えられる。
【００４９】
前記膜の厚さは、特に限定されず、透水性、耐久性等の点から、好ましくは１〜５００ｎｍ、より好ましくは１〜１０ｎｍである。
【００５０】
前記固定化酵素膜を用いた処理の方式としては、拡散方式、限外濾過方式、接触方式の３方式が挙げられる。
【００５１】
前記拡散方式は、羅漢果抽出液をその供給液側から拡散によって膜を透過させて反対側の酵素溶液側で反応させ、酵素分解生成物やモグロシド類は前記羅漢果抽出液の拡散方向とは逆方向に、酵素溶液側から膜を透過して供給液側へ出てくる方式である。この方式の場合、酵素溶液中の酵素と膜が物理吸着等することにより固定化酵素膜が形成されている。
【００５２】
前記限外濾過方式は、羅漢果抽出液に蛋白分解酵素を加えて精製のための試料とし、該試料を加圧により膜を通して供給液側から透過液側へ移動させ、反応器外へ押し出す方式である。この方式の場合、該試料中の酵素と膜が物理吸着等することにより固定化酵素膜が形成されている。この方式は処理効率が高く最も工業的に望ましい操作方式である。ただし、蛋白分解酵素と反応する基質が低分子の場合、供給液の移動方向に濃度分布が存在すると、未反応基質も透過してしまうので、高い反応率を達成するには完全混合槽のようにリサイクルすることが望ましい。また、膜面への高分子酵素のゲル層形成（ダイナミックフィルター）を少なくするためには、原槽側の循環量を高速にする必要がある。この方式に適しているのはスパイラル膜である。なお、この方式には、供給液の流れの方向と同じ方向に圧力をかけるデットエンド方式と、供給液を膜面に対して水平方向に流通させながら供給液の流れの方向とは垂直方向に圧力をかけるクロスフロー形式とがあるが、膜によって阻止された粒子の膜表面への堆積・目詰まりを防ぐ点からクロスフロー形式が好ましい。
【００５３】
前記接触方式は、前記羅漢果抽出液中の水難溶性基質が膜に固定化された酵素よって界面で反応し、酵素分解生成物は界面から液本体へ拡散する方式である。
【００５４】
前記固定化酵素膜を用いた処理において、使用する酵素の量、接触条件（酵素処理条件（反応温度、時間、ｐＨ、失活方法等）は、通常、酵素の種類、酵素の至適ｐＨ、至適温度範囲、酵素量、酵素反応の進行の程度などを考慮して適宜調整することができ、特に限定されるものではない。なお、蛋白分解酵素は、通常２５〜７０℃の範囲で用いる。
【００５５】
本発明においては、前記固定化酵素膜で処理した後に、その透過液に対し、該固定化酵素膜で用いた膜よりも細孔径が小さく（１〜２ｎｍ程度）、塩類の阻止率等が異なる別の膜を用いて膜処理を行うことにより、該透過液中の蛋白質を透過除去する工程をさらに含むことが好ましい。この場合、例えば、塩類（硫酸ナトリウム）の阻止率が７０％より高いナノ濾過膜（ＮＦ膜型番；ＮＰ０３０、ダイセン・メンブレン・システム社製、硫酸ナトリウム阻止率８５％〜９５％）を用いて処理すると、モグロシド類の透過が阻止され、他の成分が透過除去されて、目的成分であるモグロシド類がさらに濃縮された羅漢果甘味成分含有組成物を得ることができる。
【００５６】
前述した固定化酵素膜による処理、及び該酵素膜処理後の膜処理は適宜繰り返し行うことができる。例えば、第１の反応槽で固定化酵素膜を用いて処理し、その処理液を第２の反応槽に移動させて前記別の膜で膜処理を行い、その後、第２の反応槽から再び第１の反応槽に返液し、連続処理を行う。これにより目的成分であるモグロシド類をさらに濃縮することができる。
【００５７】
本発明の最後の工程として、前記固定化酵素膜を透過させた透過液に、甘味料やその他の添加成分を加え、必要に応じて乾燥粉末化し、これにより液状又は固形状の本発明の羅漢果甘味成分含有組成物を調製する。乾燥粉末化の方法は限定されず、スプレードライ法、真空凍結乾燥法、再結晶法、流動層法、回転円盤法、分子包接法、相分離法、超臨界炭酸ガスを用いた急速膨化法（ＲＥＳＳ法）、結晶変換法、多孔性糖質を用いた吸着法等から適宜選択して行えばよい。なお、ここで重要なことは、本発明の羅漢果甘味成分含有組成物を調製するにあたり、甘味質を改善するための甘味料やその他の添加成分は、乾燥粉末化を行う直前の前記固定化酵素膜の透過液に添加するのであって、該透過液を乾燥粉末化して得た乾燥物に甘味料その他の添加成分を加えるのではない、ということである。このように乾燥粉末化を行う直前の前記透過液に甘味料等を添加することにより、製品の甘味質等をより一層向上させることができる。
【００５８】
前記スプレードライ法を用いる場合、前記固定化酵素膜を透過させた透過液の粘度をスプレードライできるよう適宜調整した後、通常のスプレードライヤー等のスプレードライ機能を有する装置を用いて、前記透過液を噴霧状態で熱風と接触させる。スプレードライにおいて、熱風温度（入口温度）は、１４０〜２２０℃、特には１４０〜１８０℃とするのが好ましい。１４０℃よりも低いと、十分な乾燥ができず、固形化が不十分となる恐れがあり、一方、２２０℃よりも高いと、甘味質や機能性が低下する恐れがある。排風温度（出口温度）は、６５〜１００℃、特には７５〜８５℃とするのが好ましい。スプレードライにおける熱風温度、排風温度以外の条件は適宜決定すればよい。
また、前記真空凍結乾燥法を用いる場合は、真空凍結乾燥機能を有する装置を用いて粉末乾燥を行う。例えば、処理液を−３０℃の温度で３６時間凍結処理を行い、１００パスカル、温度５０℃の条件で真空凍結乾燥する。
また、前記再結晶法を用いる場合は、アルコールなどの有機溶媒を特定濃度になるように添加し、目的成分の溶解度を下げ結晶化を行う。得られた結晶は２０℃〜５０℃程度で乾燥して乾燥粉末を得る。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６０】
［実施例１］
（羅漢果甘味成分含有組成物の調製）
羅漢果乾燥原料１００ｋｇと水道水２０００Ｌをステンレス製タンク（２５００Ｌ容）に投入し、攪拌しながら８０℃、２時間加熱処理し、２５℃まで冷却した。金網ザル（３０メッシュ）にて残渣を取り除き、カートリッジ濾紙フィルター（孔径１μｍ）にて濾過し抽出液１９００Ｌを得た。この抽出液を合成吸着樹脂（三菱化学社製、ダイヤイオンＨＰ２０、５０Ｌ）にて処理した。活性化（４％ＮａＯＨ水５０Ｌを８５０ｍｌ／ｍｉｎの速度で通液した後、水１５０Ｌを用い同速度で水洗する。次に４％Ｈ２ＳＯ４水５０Ｌを８５０ｍｌ／ｍｉｎの速度で通液した後、水１５０Ｌを用い同速度で水洗した）した前記合成吸着樹脂に前記抽出液１９００Ｌを８５０ｍｌ／ｍｉｎの速度で通液し、水１５０Ｌを用い同速度で水洗した。次に羅漢果甘味成分であるモグロシド類成分を当該樹脂より溶出するため、４０％ｖ／ｖエタノール２００Ｌを８５０ｍｌ／ｍｉｎの速度で通液し、溶出液２００Ｌを得た。得られた溶出液のエタノールを除去するため、真空濃縮機で１２０Ｌまで濃縮し濃縮液を得た。この濃縮液に水道水３００Ｌ及び蛋白分解酵素（プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、天野エンザイム社製、商品名）１ｋｇを加え、４５０Ｌにして、これを固定化酵素膜法による精製のための試料液とした。
前記固定化酵素膜法による精製、及びその後に行う固定化酵素膜の透過液の膜処理を、それぞれナノ濾過（ＮＦ）膜（ダイセン・メンブレン・システム社製、ＮＦ膜型番；ＮＰ０１０、硫酸ナトリウム阻止率２５％〜４０％、孔径：約５０ｎｍ）、ナノ濾過（ＮＦ）膜（ダイセン・メンブレン・システム社製、ＮＦ膜型番；ＮＰ０３０、硫酸ナトリウム阻止率８５％〜９５％、孔径：約２ｎｍ）を用いて限外濾過方式にて行った。ＮＰ０１０膜を配置した反応槽（ＮＰ０１０膜反応槽）に前記試料液を添加し、循環圧力０．５ＭＰａ、循環流量２００Ｌ／ｍｉｎ、３５℃の条件で固定化酵素膜法を行い、当該固定化酵素膜からの透過液をＮＰ０３０膜を配置した反応槽（ＮＰ０３０膜反応槽）に移送した。移送されたＮＰ０１０膜透過液は、循環圧力０．５ＭＰａ、循環流量２００Ｌ／ｍｉｎ、３５℃の条件で膜処理し、ＮＰ０３０膜透過液はＮＰ０１０膜反応槽に戻してリサイクル運転を４８時間行った。この時、両膜の透過液が同じ量になるよう循環圧力を微調整しながら行った。この操作により、ＮＰ０１０膜反応槽側で固定化酵素膜法が効率良く行われ、羅漢果より抽出された蛋白質が分離・除去され、低分子蛋白質と羅漢果成分であるモグロシド類がＮＰ０１０膜を透過したと考えられた。また、当該ＮＰ０３０膜透過液は、ＮＰ０１０膜処理で低分子化された蛋白質だけがＮＰ０３０膜より透過した液であり、モグロシド類はＮＰ０３０膜を透過せず、したがって、ＮＰ０３０膜反応槽側にモグロシド類が精製されたと考えられた。
次に、ＮＰ０１０膜での処理を停止させ、ＮＰ０３０膜反応槽液にイオン交換水２０００Ｌを２００Ｌ／ｍｉｎの速度で添加して該反応槽を洗浄し、前記ＮＰ０３０膜反応槽液を外に移した。得られたＮＰ０３０膜反応槽液を精密ろ過（０．４５μｍ）し、そのろ過液２００Ｌに甘味料その他の添加成分としてトレハロース３．１ｋｇを添加・混合し、粉末乾燥機（スプレードライヤー、条件：入口温度１４５℃、出口温度８０℃）で粉末化し、羅漢果甘味成分含有組成物５．０ｋｇを得た（なお、添加した前記甘味料トレハロースの含量は全体の６２重量％）。
得られた羅漢果甘味成分含有組成物について、羅漢果の主甘味成分であるモグロシド類、及び蛋白質の含量測定を行った。そして、得られた結果から、モグロシド類１５０ｐｐｍに対する蛋白質含量（ｐｐｍ）の値を求めた。なお、モグロシド類１５０ｐｐｍは、ショ糖６重量％（飲料添加量に相当）と同等の甘味度を呈する。
モグロシド類の含量測定は、前記羅漢果甘味成分含有組成物約０．０５ｇを化学天秤で正確に秤り、メスフラスコを用い蒸留水にて１００ｍｌにメスアップした溶液をＨＰＬＣ分析試料とした。ＨＰＬＣ分析［分析条件：カラム；ＳＨＯＤＥＸ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）、展開溶媒；７５％ＣＨ３ＣＮ（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、流速；０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出；ＯＤ２１０ｎｍ、フォトダイオードアレー検出器（２００nm〜７００nm；吸光度測定）、チャージ量；２０μＬ］によりモグロシドＶ標準品（和光純薬工業社製）における１００ｐｐｍ〜６００ｐｐｍ濃度での検量線を作成し、試料のモグロシドＶ含量を測定した。次に、ＨＰＬＣ分析のモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、１１−オキソーモグロシドＶ、シアメノシドＩのＨＰＬＣ組成比、吸光度よりモグロシド類の含量を算出した。得られた羅漢果甘味成分含有組成物に含まれるモグロシド類の各成分の組成比は、それぞれモグロシドＶが８０．９重量％、モグロシドＩＶが１．５重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１５．０重量％、シアメノシドＩが２．６重量％であった。一方、蛋白質の含量測定は、ケルダール法により行った。結果を表１に示す。
【００６１】
［実施例２］
甘味料その他の添加成分として、トレハロース３．１ｋｇをエリスリトール３．１ｋｇとし、また乾燥粉末化の方法として、スプレードライ法を真空凍結乾燥法とした以外は、実施例１と同様の条件で羅漢果甘味成分含有組成物５．０ｋｇを調製して、モグロシド類及び蛋白質の含量測定を行った。得られた羅漢果甘味成分含有組成物に含まれるモグロシド類の各成分のモグロシド類に対する組成比は、それぞれモグロシドＶが８０．５重量％、モグロシドＩＶが１．５重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１５．４重量％、シアメノシドＩが２．６重量％であった。結果を表１に示す。
真空凍結乾燥条件としては、エリスリトールを添加・混合した溶液を−３０℃の温度で３６時間凍結処理を行い、１００パスカル、温度５０℃で行った。
【００６２】
［実施例３］
甘味料その他の添加成分として、トレハロース３．３ｋｇをデキストリン８．０ｋｇとした以外は、実施例１と同様の条件で羅漢果甘味成分含有組成物９．９ｋｇを調製して、モグロシド類及び蛋白質の含量測定を行った。得られた羅漢果甘味成分含有組成物に含まれるモグロシド類の各成分のモグロシド類に対する組成比は、それぞれモグロシドＶが８０．８重量％、モグロシドＩＶが１．６重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１５．１重量％、シアメノシドＩが２．５重量％であった。結果を表１に示す。
【００６３】
［比較例１］
市場に流通している羅漢果抽出エキス（モグロシドＶ含量５重量％表示）について、モグロシド類及び蛋白質の含量測定を行った。該羅漢果抽出エキスに含まれるモグロシド類の各成分のモグロシド類に対する組成比は、それぞれモグロシドＶが７８．０重量％、モグロシドＩＶが１．５重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１８．３重量％、シアメノシドＩが２．２重量％であった。結果を表１に示す。
【００６４】
［比較例２］
市場に流通している羅漢果乾燥市販品（モグロシドＶ含量１０重量％表示）について、モグロシド類及び蛋白質の含量測定を行った。該羅漢果乾燥市場品に含まれるモグロシド類の各成分のモグロシド類に対する組成比は、それぞれモグロシドＶが７８．３重量％、モグロシドＩＶが１．５重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１８．１重量％、シアメノシドＩが２．１重量％であった。結果を表１に示す。
【００６５】
［比較例３］
市場に流通している羅漢果乾燥市販品（モグロシドＶ含量２３重量％表示）について、モグロシド類及び蛋白質の含量測定を行った。該羅漢果乾燥市場品に含まれる  モグロシド類の各成分のモグロシド類に対する組成比は、それぞれモグロシドＶが７８．５重量％、モグロシドＩＶが１．５重量％、１１−オキソーモグロシドＶが１８．０重量％、シアメノシドＩが２．０重量％であった。結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
表１の結果から、実施例１〜３で調製した本発明の製品は、比較例１〜３の製品よりも、蛋白質の含量がモグロシド類の含量に比べて格段に低いことが分かった。
【００６８】
［実施例４］
（甘味質評価）
実施例１〜３で調製した羅漢果甘味成分含有組成物、並びに比較例１及び３の羅漢果市販品について甘味強度試験と甘味質評価試験を行った。５種の各試料をモグロシド類濃度が４８０ｐｐｍになるよう蒸留水で希釈した溶液を使用した。コントロールにはグラニュー糖（ショ糖）１０％濃度の水溶液を使用した。甘味質評価は、各羅漢果試料について、甘味質の基本性能である、「まろやかさ、後味、苦み、こく、すっきり感、しつこさ、くせ、渋味、刺激」の項目について行った。甘味質評価は、パネラー１０人にて官能検査を行い、各項目について、該グラニュー糖水溶液と比較して各試料を以下の評価基準に基づき１〜５段階で評価した（グラニュー糖１０％水溶液の評価点を３とした。）。表２にパネラー１０人による全項目の評価結果の平均値（ＳＴＤ）と標準偏差値（ＳＤ）を示す。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
（評価）
表２に示したように、甘味強度の結果については、清涼感を有するトレハロース及びエリスリトールを用いた実施例１、２の結果が若干低い値であったが、全ての実験区の甘味強度は、ほぼ同じであった。
一方、甘味質の結果は、蛋白質含量（ｐｐｍ）/モグロシド類含量（１５０ｐｐｍ）値の高い市販品である比較例１及び比較例３に比べ、蛋白質含量（ｐｐｍ）/モグロシド類含量（１５０ｐｐｍ）値の低い実施例１〜３の甘味質が良好であった。また、清涼感を有するトレハロース及びエリスリトールを用いた実施例１、２においてはショ糖よりも良好な結果であった。以上のことより、本発明に係る羅漢果甘味成分含有組成物は非常に良好な甘味質を有しており、羅漢果に含まれるモグロシド類以外の蛋白質が甘味質評価を低下させていると推察された。
【００７１】
［実施例５］
（抗酸化能測定）
羅漢果甘味成分含有組成物中のモグロシド類の濃度と蛋白質成分の割合が抗酸化性に与える影響を調べるために、実施例１〜３で調製した羅漢果甘味成分含有組成物、並びに比較例１〜３の羅漢果市販品の抗酸化能を、食物の抗酸化測定法として一般的であるＤＰＰＨ法により調べた。
ＤＰＰＨ法に使用した試薬は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）試薬、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）であり、いずれも和光純薬工業社より購入した。また、試験溶液として、ＭＥＳ緩衝液とＤＰＰＨ液を調製した。ＭＥＳ緩衝液は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸１．７２ｇを水４０ｍｌに溶解して調製した（２００ｍＭ、ｐＨ６．０）。ＤＰＰＨ液は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル０．０１２８ｇをエタノールにて４０ｍｌに希釈（８００μＭ）して調製した。また、標準品であるＴｒｏｌｏｘは、２０ｐｐｍ溶液を標準試料溶液とした。
次に、前記羅漢果の各試料をモグロシド類含量の最終濃度が１００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、３００ｐｐｍになるように５０％エタノールで希釈し、それぞれ１．５ｍｌに調製した。その後、これらにＭＥＳ緩衝液０．７５ｍｌとＤＰＰＨ液０．７５ｍｌを試験管で混合し３ｍｌにした。そして、室温で２０分間放置後、分光光度計（島津製作所社製；ＵＶ１８００）で５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。各試料を２０分室温で放置したときの各濃度における５２０ｎｍの吸光度変化を図１に示す。
【００７２】
（ＤＰＰＨ法の説明）
ＤＰＰＨは活性酸素ではないが不対電子を持つラジカルで、活性酸素と同様に他の物質と反応し、酸化させる作用を持っている。ＤＰＰＨは他の物質を酸化する能力を持っているときは「紫色」を示すが、他の物質を酸化する能力がなくなると「紫色」を失う性質を持っている。つまり、ＤＰＰＨの紫色を消し去ることのできる物質は、ＤＰＰＨの酸化能力を奪う＝「抗酸化力を持っている」と理解できるので、図１に示したグラフ中の５２０ｎｍの吸光度強度が低くなればなるほど、添加した物質には抗酸化能が存在することを示す。
【００７３】
（評価）
図１に示したように、羅漢果市販品では蛋白質含量（ｐｐｍ）/モグロシド類含量（１５０ｐｐｍ）値が７７１．７の比較例１、２２７．３の比較例３、１８０．７の比較例２の順に抗酸化性が低い結果となった。また、蛋白質含量（ｐｐｍ）/モグロシド類含量（１５０ｐｐｍ）値が１８０．７の比較例２ではモグロシド類最終濃度３００ｐｐｍでｔｒｏｌｏｘ濃度２０ｐｐｍにおける抗酸化能力と同程度の抗酸化能力であった（標準品であるｔｒｏｌｏｘ最終濃度２０ｐｐｍの時に５２０ｎｍの吸光度が０．９４）。
一方、実施例１、実施例２、実施例３のモグロシド類[蛋白質含量（ｐｐｍ）/モグロシド類含量（１５０ｐｐｍ）値は１．６〜１．７であり、モグロシド類最終濃度３００ｐｐｍではｔｒｏｌｏｘ濃度２０ｐｐｍにおける抗酸化能力の約２倍を有していると考えられた。この結果から、モグロシド類の抗酸化能を蛋白質が阻害していると考えられた。
【図１】
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