(57)【要約】【課題】腸内細菌叢とその代謝産物との関係を指標として被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法を提供すること。【解決手段】被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法であって、当該方法は、被験動物集団全体について、各動物対象の便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報からなる母集団、及び各動物対象の便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報からなる母集団に対してそれぞれ主成分分析を行うことにより、各動物対象の細菌に係る第一主成分得点、及び代謝産物に係る第一主成分得点を算出すること、当該二種の第一主成分得点から回帰式を算出することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法であって、
前記被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについて、
前記動物対象から採取された便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得するステップと、
前記便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報を取得するステップと、を含む第１工程と、
前記被験動物集団全体について、
前記細菌の種類とその存在比を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の細菌に係る第一主成分得点を算出するステップと、
前記代謝産物の種類とその存在量を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の代謝産物に係る第一主成分得点を算出するステップと、
前記細菌に係る第一主成分得点を第１変量、及び前記代謝産物に係る第一主成分得点を第２変量としたときの回帰式を算出するステップと、
を含む第２工程と、
を備える、データ収集方法。
【請求項２】
前記便が、前記動物対象から排泄された糞便である、請求項１に記載のデータ収集方法。
【請求項３】
前記細菌の種類は、当該細菌の科又は属による分類階級で分類したときの細菌の種類である、請求項１又は２に記載のデータ収集方法。
【請求項４】
前記健康状態が、腸の健康状態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
【請求項５】
前記動物が、ヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
【請求項６】
前記被験動物集団に含まれるある動物対象について算出された前記細菌に係る第一主成分得点、及び前記代謝産物に係る第一主成分得点により特定される座標点が、前記回帰式で特定される回帰直線から乖離していることが、当該動物対象の健康状態が悪化していることを示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデータ収集方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、データ収集方法に関する。より具体的には、本発明は、被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸管内には５００〜１０００種類、総数１００兆個にも及ぶ腸内細菌が共存していると考えられており、この腸内細菌叢は宿主の健康に大きく関与しているといわれている。肥満等の疾病に腸内細菌叢が関与するという報告もある（非特許文献１）。
【０００３】
また、腸内細菌叢とその代謝産物を含めた腸内環境が宿主の健康に大きく関与しているとの報告もある（例えば、非特許文献２）。非特許文献２には、特に代謝産物が直接的な要因として宿主の健康に影響を与えることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４４４，２００６年，ｐｐ．１０２７−１０３１
【非特許文献２】日本細菌学会誌，６０（３），２００５年，ｐｐ．４５９−４６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
代謝産物は、経口摂取された食事成分が腸内細菌の有する酵素により代謝されて生成されると考えられるため、腸内細菌叢との相関があると考えられる。しかしながら、腸内細菌叢とその代謝産物との関係については、これまで知られていない。
【０００６】
本発明は、腸内細菌叢とその代謝産物との関係を指標として被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、便に含まれる腸内細菌叢及びその代謝産物に関し、細菌の種類、及びその存在比を示す情報からなる母集団、並びに代謝産物の種類、及びその存在量を示す情報からなる母集団に対して、それぞれ主成分分析したときの第一主成分得点の間に相関関係があることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法であって、上記被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについて、上記動物対象から採取された便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得するステップと、上記便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報を取得するステップと、を含む第１工程と、上記被験動物集団全体について、上記細菌の種類とその存在比を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の細菌に係る第一主成分得点を算出するステップと、上記代謝産物の種類とその存在量を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の代謝産物に係る第一主成分得点を算出するステップと、上記細菌に係る第一主成分得点を第１変量、及び上記代謝産物に係る第一主成分得点を第２変量としたときの回帰式を算出するステップと、を含む第２工程と、を備える、データ収集方法を提供する。
【０００９】
本発明者らが新規に見出した第一主成分得点間の相関関係を利用することにより、被験動物集団の健康状態を把握することができる。これにより、例えば、被験動物集団の中から当該相関関係が崩れた動物対象（宿主）を健康状態が悪化している動物対象としてスクリーニングすることができる。したがって、本発明のデータ収集方法によれば、腸内細菌叢とその代謝産物との関係を指標として被験動物集団の健康状態を把握するためのデータの提供が可能となる。
【００１０】
上記データ収集方法においては、上記被験動物集団に含まれるある動物対象について算出された上記細菌に係る第一主成分得点、及び上記代謝産物に係る第一主成分得点により特定される座標点が、上記回帰式で特定される回帰直線から乖離していることが、当該動物対象の健康状態が悪化していることを示すものであってもよい。
【００１１】
上記データ収集方法においては、簡便にかつ非侵襲で試験試料の採取が可能であることから、上記便が、動物対象から排泄された糞便であることが好ましい。
【００１２】
上記データ収集方法では、上記細菌の種類が、当該細菌の科又は属による分類階級で分類したときの細菌の種類であることが好ましい。これにより、便に含まれる腸内細菌叢及びその代謝産物との間により強い相関関係が得られることになるため、より精度よく被験動物集団から健康状態が悪化している動物対象（宿主）をスクリーニングすることができる。
【００１３】
便に含まれる腸内細菌叢及びその代謝産物の間の相関関係は、腸管における消化及び吸収能力をより強く反映していると考えられることから、上記健康状態は、腸の健康状態であってもよい。
【００１４】
上記動物は、ヒトであってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、腸内細菌叢とその代謝産物との関係を指標として被験動物集団の健康状態を把握するためのデータ収集方法が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】被験マウス集団における細菌に係る第一主成分得点と代謝産物に係る第一主成分得点をプロットした散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
本発明に係るデータ収集方法は、被験動物集団の健康状態を把握するためのデータを収集する方法に関する。当該データ収集方法は、動物対象から採取された便から、腸内細菌叢及びその代謝産物に関する情報を取得する第１工程と、当該情報を統計的に処理してデータを算出する第２工程とを少なくとも備えるものである。
【００１９】
第１工程は、被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについて、動物対象から採取された便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得するステップと、上記便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報を取得するステップと、を含む。
【００２０】
被験動物集団は、複数の動物対象を含んでいればよく、動物対象の数に特に制限はない。スクリーニング精度を高めるという観点からは、被験動物集団に含まれる動物対象の数は、第２工程での統計的処理に適した数であることが好ましく、例えば５個体以上であってよく、好ましくは１０個体以上であり、より好ましくは１５個体以上であり、更に好ましくは２０個体以上である。被験動物集団に含まれる動物対象の数の上限に特に制限はなく、例えば１０００万個体以下であってよいが、方法の実施をより容易にするという観点から、好ましくは１０万個体以下であり、より好ましくは１万個体以下であり、更に好ましくは１０００個体以下である。
【００２１】
対象となる動物としては、例えば、イヌ及びネコ等のコンパニオン動物、ウマ、ウシ、ブタ及びトリ等の家畜、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、モルモット等を挙げることができる。
【００２２】
試験試料となる便は、動物対象から排泄された糞便であってもよく、腸管（特に、大腸）に存在する排泄前の大腸便であってもよい。排泄前の大腸便は、例えば、解剖、内視鏡等により動物対象から採取することができる。簡便にかつ非侵襲で採取が可能であるとの観点からは、試験試料となる便は、動物対象から排泄された糞便であることが好ましい。
【００２３】
動物対象から採取された便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得するステップは、便又は便から調製された試料を用いて、細菌叢構造解析に汎用されている方法により実施することができる。当該方法としては、例えば、便に含まれる細菌のＤＮＡを用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行う方法が挙げられる。
【００２４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行う方法は、例えば、以下のようにして実施することができる。まず、便から回収した細菌のＤＮＡを鋳型とし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のコンセンサス配列にアニールし、細菌の種類によって塩基配列が異なる領域を増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲを行う。次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、シークエンシングにより塩基配列を決定し、決定した塩基配列を菌叢解析ソフト（例えば、ＱＩＩＭＥ（コロラド大学開発））を用いて解析することにより、便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得することができる。
【００２５】
細菌の種類は、当該細菌の門、綱、目、科、属又は種による分類階級のいずれかで分類したときの種類であってもよい。便に含まれる腸内細菌叢及びその代謝産物との間により強い相関関係が得られることから、当該細菌の種類は、科又は属による分類階級で分類したときの種類であることが好ましい。
【００２６】
細菌の種類としては、これに限定されるものではないが、例えばヒトの場合、以下に例示する細菌が通常検出される。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門、ＴＭ７門、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門に属する細菌。
【００２７】
便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報を取得するステップは、便又は便から調製された試料を用いて、低分子化合物の同定、及びその存在量（相対存在量であってもよい）の決定に汎用されているメタボローム解析法により実施することができる。当該方法としては、例えば、ＮＭＲ、及びガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ、又はキャピラリー電気泳動に質量分析装置を組み合わせる方法等を挙げることができる。
【００２８】
メタボローム解析法は、例えば、以下のようにして実施することができる。まず、便からイオン性低分子代謝物を水性溶媒で抽出する。抽出溶液に内部標準物質を添加して飛行時間型質量分析装置（例えば、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（アジレントテクノロジーズ株式会社製））を用いて測定する。測定されたデータから所定のシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を超えるピーク（例えば、Ｓ／Ｎ≧３のピーク）を抽出する。抽出したピークについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）と泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）の値から化合物を同定する。また、ピーク面積値から各化合物の存在量を算出する。当該存在量は、内部標準物質の面積値で規格化した相対面積値であってもよい。
【００２９】
代謝産物の種類としては、これに限定されるものではないが、例えばヒトの場合、以下に例示する代謝産物が通常検出される。アミノ酸、ペプチド、糖質、脂肪酸、有機酸、ビタミン、ミネラル、核酸。
【００３０】
上記各ステップは、被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについて実施する。すなわち、被験動物集団がｎ個体の動物対象を含む場合、第１工程の実施によりｎセットの「細菌の種類とその存在比を示す情報」及び「代謝産物の種類とその存在量を示す情報」が得られる。
【００３１】
第２工程は、被験動物集団全体について、細菌の種類とその存在比を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の細菌に係る第一主成分得点を算出するステップと、代謝産物の種類とその存在量を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の代謝産物に係る第一主成分得点を算出するステップと、細菌に係る第一主成分得点を第１変量、及び上記代謝産物に係る第一主成分得点を第２変量としたときの回帰式を算出するステップと、を含む。
【００３２】
各動物対象の細菌に係る第一主成分得点は、例えば、被験動物集団がｎ個体の動物対象を含む場合、第１工程の実施により得られたｎ組の「細菌の種類とその存在比を示す情報」からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより算出することができる。これにより、各動物対象にそれぞれ対応するｎ個の細菌に係る第一主成分得点が得られる。
【００３３】
同様に、各動物対象の代謝産物に係る第一主成分得点は、例えば、被験動物集団がｎ個体の動物対象を含む場合、第１工程の実施により得られたｎ組の「代謝産物の種類とその存在量を示す情報」からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより算出することができる。これにより、各動物対象にそれぞれ対応するｎ個の代謝産物に係る第一主成分得点が得られる。
【００３４】
主成分分析は、多くの変数により記述されたデータがあるときに、変数間の相関を排除し、情報量の損失を最小にしつつ、無相関ないくつかの総合的指標に縮約して、分析を行う手法である。ここでの総合的指標を、それぞれ、第１主成分、第２主成分、…と呼ぶ。ここで、主成分は各変数の線形結合となることから、その解釈のためには、主成分と各変数との相関を把握することによって主成分に強く影響を及ぼす変数を特定することが有効である。このときの指標をローディング（因子負荷量：ｆａｃｔｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ）と言い、主成分と変数との相関係数として定義される。すなわち、第１主成分ローディングは、第１主成分と各変数との相関係数である。第１主成分ローディングの算出は、公知の方法で行うことができる。第１主成分得点は、第１主成分ローディングと、「細菌の種類とその存在比を示す情報」又は「代謝産物の種類とその存在量を示す情報」とに基づいて、公知の方法により算出することができる。
【００３５】
主成分分析による第一主成分得点の算出は、公知の解析ソフト（例えば、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＩＢＭ社製）、ＪＭＰ（ＳＡＳ社製）、Ｒ（フリーソフト）を用いて実施することができる。
【００３６】
各動物対象の細菌に係る第一主成分得点を算出するステップ、及び代謝産物に係る第一主成分得点を算出するステップの実施により、例えば、被験動物集団がｎ個体の動物対象を含む場合、ｎセットの（細菌に係る第一主成分得点，代謝産物に係る第一主成分得点）が得られる。各セットは、一の動物対象に対応する第一主成分得点のペアである。
【００３７】
回帰式を算出するステップでは、細菌に係る第一主成分得点を第１変量、及び代謝産物に係る第一主成分得点を第２変量として回帰式を算出する。回帰式の算出は、公知の表計算ソフト（例えば、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＩＢＭ社製）、ＪＭＰ（ＳＡＳ社製）、Ｒ（フリーソフト）等の解析ソフトを用いて実施することができる。
【００３８】
第２工程は、上記のようにして得られた第一主成分得点及び回帰式で表される回帰直線から散布図を得るステップを更に含んでいてもよい。当該散布図は、例えば、横軸を細菌に係る第一主成分得点、縦軸を代謝産物に係る第一主成分得点として、ｎセットの（細菌に係る第一主成分得点，代謝産物に係る第一主成分得点）に対応するｎ個のプロットが記載され、更に上記回帰式で表される回帰直線が記載されたものである。当該散布図により、回帰直線から乖離したプロット（すなわち、そのプロットに対応する動物対象）を視覚を介して直感的に把握することが可能となる。
【００３９】
第２工程の実施により、被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについての（細菌に係る第一主成分得点，代謝産物に係る第一主成分得点）のデータ、当該第一主成分得点から算出された回帰式のデータが提供される。当該データを用いて、被験動物集団の健康状態を把握することが可能となる。例えば、当該データに基づいて、被験動物集団から健康状態が悪化している動物対象をスクリーニングすることができる。
【００４０】
すなわち、細菌に係る第一主成分得点、及び代謝産物に係る第一主成分得点を直行座標軸とした平面空間において、ある動物対象についての（細菌に係る第一主成分得点，代謝産物に係る第一主成分得点）で特定される座標が、上記回帰式で表される回帰直線から乖離している場合は、当該動物対象において腸内細菌叢とその代謝産物との相関関係が崩れていると判断できることから、健康状態が悪化していると判定することができる。
【００４１】
判定の指標となる回帰式からの乖離度は、例えば、上記平面空間において、ある動物対象についての（細菌に係る第一主成分得点，代謝産物に係る第一主成分得点）で特定される座標から上記回帰式で表される回帰直線に直交する直線を引いたときの当該座標から交点までの距離を指標とすることができる。当該距離が所定の長さを超えた場合に乖離していると判定することもできる。また、被験動物集団に含まれる全ての動物対象について当該距離を算出し、その平均値及び標準偏差（ＳＤ）を求め、当該距離が、（平均値＋１ＳＤ）、（平均値＋２ＳＤ）若しくは（平均値＋３ＳＤ）の絶対値、又は（平均値−１ＳＤ）、（平均値−２ＳＤ）若しくは（平均値−３ＳＤ）の絶対値を超えた場合に乖離していると判定することもできる。
【００４２】
健康状態としては、例えば、消化及び吸収、蠕動運動、及び薬物代謝等の状態、並びに日和見感染症、アトピー性疾患、炎症性腸疾患、大腸癌、及び肝性脳症等への罹患状態が挙げられる。便に含まれる腸内細菌叢及びその代謝産物の間の相関関係は、腸管（例えば、小腸、大腸）における消化及び吸収能力をより強く反映していると考えられることから、上記健康状態は、腸（例えば、小腸、大腸）の健康状態であってもよい。
【００４３】
本発明はまた、被験動物集団から健康状態が悪化している動物対象をスクリーニングする方法ということもできる。当該スクリーニング方法は、上記被験動物集団に含まれる動物対象それぞれについて、上記動物対象から採取された便に含まれる細菌の種類とその存在比を示す情報を取得するステップと、上記便に含まれる代謝産物の種類とその存在量を示す情報を取得するステップと、を含む第１工程と、上記被験動物集団全体について、上記細菌の種類とその存在比を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の細菌に係る第一主成分得点を算出するステップと、上記代謝産物の種類とその存在量を示す情報からなる母集団に対して主成分分析を行うことにより、各動物対象の代謝産物に係る第一主成分得点を算出するステップと、上記細菌に係る第一主成分得点を第１変量、及び上記代謝産物に係る第一主成分得点を第２変量としたときの回帰式を算出するステップと、を含む第２工程と、上記被験動物集団に含まれるある動物対象について算出された上記細菌に係る第一主成分得点、及び上記代謝産物に係る第一主成分得点により特定される座標点が、上記回帰式で特定される回帰直線から乖離している場合に、当該動物対象の健康状態が悪化していると判定する第３工程とを備えるものであってもよい。
【００４４】
上述した本発明に係るデータ収集方法、及びスクリーニング方法は、例えば、ヒトを対象とした集団健康診断、ペット（コンパニオン動物）を対象とした集団健康診断、家畜動物を対象とした集団健康診断等において、健康状態の悪化した動物対象をスクリーニングするために好適に用いられる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
〔糞便試料〕
１４カ月齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）７３匹からそれぞれ糞便を回収した。各糞便約５０ｍｇに対し、９倍量のＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加した。糞便をＤＰＢＳによく懸濁した後、懸濁液２００μｌを回収し、１１，０００×ｇ、５分、４℃の条件で遠心分離した。遠心分離後の上清を用いて代謝産物（イオン性低分子代謝物）を測定した。同様に、沈殿物を用いて腸内細菌叢を解析した。
【００４７】
〔代謝産物の測定〕
各糞便中に含まれるイオン性低分子代謝物は、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより測定した。まず、試料（遠心分離後の上清）を、遠心式ろ過フィルターユニット（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ＭＣ−ＰＬＨＣＣ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社製））に通し、微量のタンパク質及び脂質を除去した。その後、試料２０μＬに対し、内部標準物質の水溶液（濃度１０００μＭ）２０μＬ、及び超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）６０μＬを加えて撹拌し、測定用試料を得た。ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（アジレントテクノロジーズ株式会社製）装置のカチオンモード、及びアニオンモードにより、測定用試料の測定を実施した。
【００４８】
測定されたデータを自動積分ソフトウェア（ＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．１６．０．１５（慶應義塾大学開発））を用いて解析し、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が３以上のピークを自動抽出した。抽出したピークそれぞれに対して、質量電荷比（ｍ／ｚ）と泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＭＴ）の値に基づいて代謝物質検索を行い、代謝産物の種類を特定した。各代謝産物の存在量は、ピーク面積値から下記式を用いて変換した相対面積値として算出した。
相対面積値＝ピークの面積値÷（内部標準物質の面積値×試料量）
【００４９】
代謝産物の測定の結果、各糞便試料によりその種類及び存在量は異なるものの、全体として２１６種類の代謝産物が検出された。
【００５０】
〔腸内細菌叢の解析〕
各糞便中に含まれる腸内細菌叢は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析により決定した。まず、各試料（遠心分離後の沈殿物）に対し、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）２００μｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）３５０μｌ、φ０．１ｍｍビーズ３００ｍｇ、１０％ＳＤＳ  ５０μｌ、ＴＥ飽和フェノール５００μｌを添加し、７０℃で１０分間加熱した後、ｍｉｃｒｏ  ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００（株式会社トミー精工）で４０００ｒｐｍ、６０秒間振動撹拌し、菌体を破砕した。これを１５，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離し、上清を回収した。回収した上清に対し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を用いた除タンパク質処理及びエタノール沈殿処理を行い、糞便由来のＤＮＡを回収した。
【００５１】
得られたＤＮＡをテンプレートとし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１及びＶ２領域を増幅させるＰＣＲプライマーセット、及びＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）試薬を用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３分間の変性処理の後、９４℃３０秒（変性）→５５℃４５秒（アニーリング）→６８℃６０秒（伸長）のサイクルを２５回繰り返す、とした。
【００５２】
プライマーセットは、フォーワードプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮ・・・ＮＮＧＴＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）及びリバースプライマー（５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’）の組み合わせである。フォーワードプライマー配列中の「ＮＮ・・・ＮＮ」は、１０〜１２塩基からなる任意のバーコード配列（ＤＮＡシーケンシングシステムで多検体処理する際に各サンプルを識別するための配列）である。各糞便試料について、バーコード配列が異なる７３種類のフォワードプライマーとリバースプライマーとをそれぞれ組み合わせて、計７３サンプルのＰＣＲ産物を得た。当該ＰＣＲ産物は、各糞便試料毎に異なるバーコード配列を含んでいる。
【００５３】
得られたＰＣＲ産物は、それぞれＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で精製した。精製後、Ｑｕｂｉｔ２．０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて濃度を測定した。上記７３サンプルのＰＣＲ産物を、各ＰＣＲ産物量が等量となるように混合した後、２％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行い、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社日本ジーン社製）によりゲル精製を行った。ゲル精製後のＰＣＲ産物混合物を鋳型として、ＤＮＡシーケンシングシステム（Ｉｏｎ  ＰＧＭ（ＬｉｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））により塩基配列の決定を行った。
【００５４】
決定した塩基配列を菌叢解析ソフトＱＩＩＭＥ（コロラド大学開発）を用いて解析し、各糞便に含まれる腸内細菌の門、綱、目、科、属を特定し、更に門、綱、目、科、属の各分類階級を基準とした腸内細菌の存在比率を決定した。
【００５５】
腸内細菌叢の解析の結果、各糞便試料によりその種類及び存在比は異なるものの、全体として１０門、１８綱、２６目、４９科、６５属に亘る腸内細菌が検出された。
【００５６】
〔統計解析〕
全糞便試料に対して得られた代謝産物の種類と存在量（相対面積値）の全データを母集団として、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＩＢＭ社製）を用いて主成分分析を実施し、各糞便試料の第一主成分得点（第２変量）を算出した。同様に、門、綱、目、科又は属の分類階級それぞれについて、全糞便試料に対して得られた細菌の種類と存在比率の全データを母集団として、主成分分析を実施し、各糞便試料における第一主成分得点（第１変量）を算出した。
【００５７】
第１変量と第２変量のデータから、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を用いて回帰式及び相関係数を算出した。
【００５８】
〔結果〕
腸内細菌を門、綱、目、科又は属の各分類階級を基準として分類した際の第１変量と第２変量との相関係数の絶対値を下記表１に示す。
【表１】
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【００５９】
いずれの分類階級を基準とした場合でも、細菌に係る第一主成分得点と代謝産物に係る第一主成分得点との間に相関が認められた。特に、腸内細菌を科又は属の分類階級を基準として分類した際の相関係数（絶対値）はいずれも０．８９であり、より相関が強いことが明らかとなった。
【００６０】
図１は、腸内細菌を属の分類階級を基準として分類した際の細菌に係る第一主成分得点と代謝産物に係る第一主成分得点とをプロットした散布図である。各プロットは、各糞便試料に対応している（すなわち、各マウス個体に対応している）。図１には、回帰直線（回帰式：ｙ＝０．８８８ｘ−２Ｅ−０８）を示している。「Ｒ」は相関係数である。「ｙ」は細菌に係る第一主成分得点、「ｘ」は代謝産物に係る第一主成分得点である。
【００６１】
回帰直線からの乖離度が大きいプロットに対応するマウスは、腸内細菌叢と代謝産物とのバランスが崩れていると考えられる。その原因としては、健康状態の悪化（特には、腸の健康状態の悪化）により、代謝産物の消化・吸収バランスが変化し、糞便中に排泄される代謝産物のバランスが変化したことが考えられる。なお、図１中、破線の丸で囲ったプロット（回帰直線からの乖離度が大きい）に対応するマウスは、本試験の実施後しばらくして死亡した。
【図１】
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【配列表】
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