(57)【要約】【課題】本発明は、神経細胞の酸化ストレスを軽減することを課題とする。【解決手段】本発明は、γ−リノレン酸を有効成分として含有し、セレンを含有しないことを特徴とする、神経細胞の酸化ストレス軽減剤を提供する。また、当該酸化ストレス酸化ストレス軽減剤を含むアルツハイマー病などの神経疾患の治療用または予防用医薬を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−リノレン酸またはその誘導体を有効成分とし、セレンを含有しない、神経細胞の酸化ストレス軽減剤。
【請求項２】
前記神経細胞が、プレセニリン遺伝子変異を有する神経細胞である、請求項１に記載の酸化ストレス軽減剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酸化ストレス軽減剤を含む、神経疾患に対する治療用または予防用医薬。
【請求項４】
前記神経疾患が、アルツハイマー病である、請求項３に記載の治療用または予防用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−リノレン酸(GLA)またはその誘導体を有効成分とし、セレンを含有しない、神経細胞の酸化ストレス軽減剤に関する。また、当該酸化ストレス軽減剤を含むアルツハイマー病などの神経疾患に対する治療用または予防用医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の原因は未だ不明であるが、脳内でβ-アミロイド（Ａβ）の蓄積がおこるとやがて神経細胞が死滅することが臨床的に知られていることから、Ａβが原因であるとする仮説が有力となっている。Ａβ産生に影響を与える遺伝子の一つとしてプレセニリン遺伝子が知られており、Ａβが沈着しているアルツハイマー動物または細胞モデルを作出するために、プレセニリン遺伝子の変異型が利用されている。
【０００３】
プレセニリン等のアルツハイマー病の遺伝要因や危険因子は、酸化ストレスの増強と関連しており、一方、アルツハイマー病の防御因子は、酸化ストレスの減弱と関連することが知られている。このことから、酸化ストレスはアルツハイマー病の病理に深く関与していると考えられている。また、ビタミンＥ等の抗酸化物質の摂取によるアルツハイマー病の発症率低下も報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
γ-リノレン酸（ＧＬＡ）は、代表的な高価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であるω-6脂肪酸の一つであり、人体において生成できない必須化合物である。脳はリン脂質に富み、その構成脂肪酸はＰＵＦＡが多いため、種々のＰＵＦＡが神経疾患を改善することが臨床医学的に報告されてきた（特許文献１）。また、ＰＵＦＡの一つであるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がβアミロイド蓄積による小胞体ストレスおよび酸化ストレスを軽減したとの報告がある（非特許文献２）。
【０００５】
特許文献２には、リノレン酸とリノール酸を特定の割合で含むアルツハイマー病治療薬剤について記載されているが、リノレン酸とリノール酸を上記特定の割合で含むことを必須としており、リノレン酸単独での効果は記載がなく、また、該リノレン酸がγ−リノレン酸を包含し得るのかについても記載がない。さらに、プレセニリン遺伝子変異に関する記載はない。
【０００６】
また、特許文献３には、γ−リノレン酸及びセレンを含む認知症治療用組成物が記載されているものの、γ−リノレン酸として月見草油を使用して効果を確認しており、γ−リノレン酸自体の効果は示されていない。また、プレセニリン遺伝子変異に関する記載はない。さらに、セレンは人体にとって必須元素のひとつであるが、毒性が非常に強く、継続的な投与は好ましくないため、セレンを含まない医薬の開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４７７１６９７号
【特許文献２】特許第２８１０７２５号
【特許文献３】特許第３００８２１３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日薬理誌, 130, 477-482 (2007)
【非特許文献２】T.Kondo et al., 2013. Cell Stem Cell 12, 487-496
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、神経細胞の酸化ストレスを軽減することを課題とする。また、当該酸化ストレス軽減作用により、アルツハイマー病などの神経疾患を予防・治療することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、γ−リノレン酸が、正常な神経細胞及びプレセニリン遺伝子変異を有する神経細胞に対する酸化ストレスを軽減することを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］γ−リノレン酸またはその誘導体を有効成分とし、セレンを含有しない、神経細胞の酸化ストレス軽減剤。
［２］前記神経細胞が、プレセニリン遺伝子変異を有する神経細胞である、［１］に記載の酸化ストレス軽減剤。
［３］［１］または［２］に記載の酸化ストレス軽減剤を含む、神経疾患に対する治療用または予防用医薬。
［４］前記神経疾患が、アルツハイマー病である、［３］に記載の治療用または予防用医薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明における治療または予防薬は、正常な神経細胞に対してだけでなく、プレセニリン遺伝子変異を有する神経細胞に対しても、酸化ストレス軽減効果を発揮する。当該軽減効果により、神経細胞死を抑制し、アルツハイマー病などの神経疾患の治療または予防をすることができる。さらに、セレンを含まないため、長期的な服用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】CellROXとHoechst33342で染色したプレセニリン１正常遺伝子を導入した神経細胞の顕微鏡像（写真）を示す。a-i: control 活性酸素種染色，a-ii: control 核染色，b-i: γ−リノレン酸5μM添加 活性酸素種染色，b-ii: γ−リノレン酸5μM添加核染色，c-i: γ−リノレン酸50μM添加 活性酸素種染色，c -ii: γ−リノレン酸50μM添加 核染色，d-i: ドコサヘキサエン酸 5μM加 活性酸素種染色，d-ii: ドコサヘキサエン酸 5μM添加核染色，e-i: ドコサヘキサエン酸 50μM添加 活性酸素種染色，e-ii: ドコサヘキサエン酸 50μM添加 核染色。
【図２】CellROXとHoechst33342で染色したプレセニリン１変異遺伝子を導入した神経細胞の顕微鏡像（写真）を示す。a-i: control 活性酸素種染色，a-ii: control 核染色，b-i: γ−リノレン酸5μM添加 活性酸素種染色，b-ii: γ−リノレン酸5μM添加核染色，c-i: γ−リノレン酸50μM添加 活性酸素種染色，c -ii: γ−リノレン酸50μM添加 核染色，d-i: ドコサヘキサエン酸 5μM加 活性酸素種染色，d-ii: ドコサヘキサエン酸 5μM添加核染色，e-i: ドコサヘキサエン酸 50μM添加 活性酸素種染色，e-ii: ドコサヘキサエン酸 50μM添加 核染色。
【図３】プレセニリン１正常遺伝子を導入した神経細胞におけるHoechst33342染色部に対するCellROX染色部のピクセル数の相対値を示す（Error bar: SE, * : p < 0.05）。
【図４】プレセニリン１変異遺伝子を導入した神経細胞におけるHoechst33342染色部に対するCellROX染色部のピクセル数の相対値を示す（Error bar: SE, * : p < 0.005, ** : p < 0.001）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の酸化ストレス軽減剤は、γ−リノレン酸またはその誘導体を有効成分として含
有することを特徴とする。本発明で使用されるγ−リノレン酸は、遊離型γ−リノレン酸またはγ−リノレン酸誘導体のいずれであってもよいが、遊離型γ−リノレン酸が好ましい。
【００１５】
本発明で使用される「遊離型γ−リノレン酸」とは、グリセリド体ではなく、グリセリンから遊離しているγ−リノレン酸を意味する。
本発明で使用される遊離型γ−リノレン酸は、市販のものを使用することができる。遊離型γ−リノレン酸は、CAYMAN CHEMICAL社などより販売されている。本発明で使用される遊離型γ−リノレン酸は、γ−リノレン酸トリグリセリドを酵素処理することによってグリセリンから遊離したγ−リノレン酸を使用してもよいし、月見草の種子などから抽出してもよい。
【００１６】
γ−リノレン酸の誘導体としては、γ−リノレン酸トリグリセリド（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸）（GLA-TG）、γ−リノレン酸ジグリセリド、及びγ−リノレン酸モノグリセリドなどのγ−リノレン酸のエステルが挙げられる。
γ−リノレン酸トリグリセリドは、常法により合成できる。市販品として、NU-CHEK-PREP, Inc社、出光興産株式会社などにより販売されている。また、微生物によって製造されたものでもよい（特開昭63-283589号公報、特開平03-072892号公報、特開平8-214892号公報）。
また、本発明で使用されるγ−リノレン酸は、γ−リノレン酸トリグリセリド、γ−リノレン酸ジグリセリド、及びγ−リノレン酸モノグリセリドのグリセリド混合物であってもよい。
【００１７】
本発明で使用されるγ−リノレン酸のエステルの他の態様としては、γ−リノレン酸と直鎖又は分岐アルコール（グリセロール以外）のエステル体が挙げられ、好ましくは、γ−リノレン酸エチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸エチル）及びγ−リノレン酸メチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸メチル）である。
γ−リノレン酸の誘導体の他の態様としては、γ−リノレン酸の炭素数1〜4の低級アルキル化体も挙げられる。
これらのγ−リノレン酸のエステルやアルキル化体は、例えば、γ−リノレン酸をアルコールと脱水縮合させることにより、または、アルキル化剤で処理することにより得ることができる。
【００１８】
本発明における酸化ストレス軽減剤は、セレンを含有しない。セレンはセレニウムとも呼ばれる原子番号３４の元素である。
セレンは抗酸化作用等の効果が知られているが、適量範囲が狭く、過剰症になると脱毛、嘔吐または疲労感等の症状が出現する。神経細胞死の予防の観点から、何らかの症状が出る前から継続して摂取することが望まれるところ、本発明においては、セレンを含有しないため、安全に継続的な摂取をすることが可能である。
【００１９】
本発明において、酸化ストレスとは、活性酸素種等の種々の酸化物による生体障害作用が、生体が有する抗酸化作用や当該障害の修復作用を上回り、生体にとって好ましくない状態となっていることを指す。本発明において酸化ストレスの軽減とは、活性酸素種の存在量を減少させること、または、前記生体にとって好ましくない状態を緩和することを意味する。本発明においては、神経細胞に対する酸化ストレスを軽減することによって、神経細胞死を抑制し、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経疾患を治療または予防する、あるいは虚血性脳疾患による神経細胞傷害を緩和する。
【００２０】
本発明における神経細胞の酸化ストレス軽減剤において、神経細胞には、プレセニリン遺伝子変異を有さない正常な神経細胞のほか、プレセニリン遺伝子変異を有する神経細胞
を含む。プレセニリン遺伝子には、プレセニリン１（PS１）とプレセニリン２（PS2）が含まれる。プレセニリン１は第１４番染色体（14q24.3）に存在し、４６７のアミノ酸をコードしている。プレセニリン２は第１番染色体（1q42.13）に存在し、４４８のアミノ酸をコードしている。プレセニリン遺伝子は、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として同定され、これら遺伝子における変異がアルツハイマー病発症の原因の一つであると考えられている。
プレセニリン遺伝子の変異としては、アルツハイマー病発症の一因となり得るもの全てを含み、例えば、プレセニリン１におけるP117L、M146L、M146V、S169L、M233T、A246G又はP264L等の変異が挙げられ、また、プレセニリン２におけるR62H、T122P、S130L、N141I、V148I、Q228L、M239I、M239V等の変異が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明における治療用医薬または予防用医薬は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、γ−リノレン酸またはその誘導体を薬理学的に許容される担体と混合することによって製造することができる。なお、セレンは配合しない。
薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。
本発明の医薬の製剤化には、通常製剤化に用いられる各種の成分が任意に使用されるが、その例としては、例えばデンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類などが挙げられる。
【００２２】
本発明の治療用医薬又は予防用医薬の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等が挙げられるが、特定の剤型のものに限定されるものではない。
医薬中のγ−リノレン酸またはその誘導体の好ましい含有量は、医薬全量に対して０．１〜８０質量％であり、より好ましくは５〜４０質量％である。
【００２３】
本発明の医薬の投与方法としては特に制限されないが、経口投与が好ましい。好ましい投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより異なり特に制限されないが、例えば、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.０１〜１０ｇ、好ましくは約０．０５〜５．０ｇ、より好ましくは約０．１〜２．０ｇである。
【００２４】
本発明における医薬は、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に含有させることができる。皮膚外用剤としては、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品等が挙げられる。
また、本発明における医薬には、本発明の効果を損なわない範囲で医薬部外品などの皮膚外用剤に配合される成分、油分、高級アルコール、脂肪酸、界面活性剤、多価アルコール・糖、高分子、生理活性物質、溶媒、酸化防止剤、香料、防腐剤等を配合することができるが、セレンは配合しない。
【実施例】
【００２５】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【００２６】
＜方法＞
以下のヒトiPS細胞由来グルタミン酸作動性神経細胞を用いた。
正常神経細胞モデル：プレセニリン１野生型遺伝子を遺伝子導入したiPS細胞株から分化させたグルタミン酸作動性神経細胞（Reprocell Inc., Cat.No. RCESDG104）。
アルツハイマー病細胞モデル：プレセニリン１変異型（P117L）遺伝子を遺伝子導入したiPS細胞株から分化させたグルタミン酸作動性神経細胞（Reprocell Inc., Cat.No. RCESDG
106）。
【００２７】
上記細胞を、プロダクトマニュアルに従い、推奨培地（Glu Maturation MediumTM, Reprocell Inc.）中に懸濁し、96ウェルプレートに1ウェルあたり2.5×104 細胞となるように播種した。37℃、5% CO2雰囲気下の培養器で2週間培養後、0.25%のエタノールに溶解したGLA（Cayman Chemical Company, Cat.No.90220）とDHA（Cayman Chemical Company, Cat.No.90310）をそれぞれ最終濃度5μM、50μMとなるように培養液中に添加し、同条件下でさらに48時間培養した。その後、細胞中の活性酸素種（ROS）をCellROX Oxidative stress reagents （Life Technologies）にて、また、細胞核をHoechst33342 （株式会社  同仁化学研究所）にて蛍光標識した後、蛍光顕微鏡にて観察し、溶媒（終濃度0.25%のエタノール）のみを加えて培養したcontrol区分の細胞と比較した。
【００２８】
＜結果＞
プレセニリン１正常遺伝子導入細胞の顕微鏡像を図１に、プレセニリン１変異型遺伝子導入細胞の顕微鏡像を図２に示す。ROS反応を定量化するために、細胞数当たりのROS反応量を想定し、画像中の左欄（CellROX染色部）のピクセル数を右欄（Hoechst33342染色部）のピクセル数で除した数値を各条件につき3画像分算出し、その平均値を求めた。さらに各平均値をcontrol区分の平均値で除して相対値を求めた。
プレセニリン１正常遺伝子導入細胞におけるHoechst33342染色部に対するCellROX染色部の相対値を図３に、プレセニリン１変異型遺伝子導入細胞におけるHoechst33342染色部に対するCellROX染色部の相対値を図４に示す。
ドコサヘキサエン酸（DHA）、γ−リノレン酸（GLA）ともコントロールと比較し、CellROX染色部が有意に減少しており、ROSストレスを明らかに減少させていた。また、GLAは同濃度のDHAより、ROSをより強く抑制している傾向があり、特に、プレセニリン１正常遺伝子を導入した細胞では、統計学的に有意な差が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により、神経細胞の酸化ストレスを軽減することができ、当該作用によりアルツハイマー病などの神経疾患の治療または予防のための医薬を提供することができる。また、本発明における治療用医薬または予防用医薬は、セレンを含有しないため、安全に継続的な服用をすることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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