(57)【要約】【課題】遊離脂肪酸を高生産するラン藻を、遺伝子組換えのような煩雑な操作を要することなく、簡便な方法で得ることを課題とする。【解決手段】中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地を用いて供試ラン藻を培養する、複数の試験区であって、培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸の種類が試験区間で異なる、複数の試験区を用意するステップと、前記複数の試験区において、培地に供試ラン藻を添加し、培養するステップと、培養初期にはコロニーが認められず、培養を継続することによりコロニーが出現する試験区を選抜するステップと、選抜した試験区のコロニーからラン藻を回収するステップと、を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（４）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（１）中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地を用いて供試ラン藻を培養する、複数の試験区であって、培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸の種類が試験区間で異なる、複数の試験区を用意するステップ；
（２）前記複数の試験区において、培地に供試ラン藻を添加し、培養するステップ；
（３）培養初期にはコロニーが認められず、培養を継続することによりコロニーが出現する試験区を選抜するステップ；
（４）選抜した試験区のコロニーからラン藻を回収するステップ。
【請求項２】
前記中鎖又は長鎖脂肪酸の炭素数が10〜18である、請求項１に記載の作出方法。
【請求項３】
一つの試験区の培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸が１種類である、請求項１又は２に記載の作出方法。
【請求項４】
前記中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地中の脂肪酸濃度が50μM〜200μMである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項５】
培養温度が25℃〜35℃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項６】
前記ステップ（３）における培養初期の終点が、培養開始後1日目〜培養開始後10日目の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項７】
前記ステップ（３）においてコロニーが出現する時期が、培養開始後5日目〜培養開始後30日目である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項８】
前記複数の試験区が各々、供試ラン藻の濃度が段階的に低下する希釈系列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項９】
前記培地が固体培地である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項１０】
前記供試ラン藻がシネコシスティス属ラン藻、シネココッカス属ラン藻、ミクロシスティス属ラン藻又はアルスロスピラ属ラン藻である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項１１】
前記シネコシスティス属ラン藻がシネコシスティス sp. PCC 6803株であり、前記シネココッカス属ラン藻がシネココッカスsp. PCC 7002株である、請求項１０に記載の作出方法。
【請求項１２】
以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項の作出方法に使用した供試ラン藻を用意し、請求項１のステップ（４）で選抜した試験区に使用した培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸を添加した培地で培養するステップ；
（ｉｉ）出現したコロニーからラン藻を回収するステップ。
【請求項１３】
以下のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（Ｉ）シネコシスティス sp. PCC 6803株又はシネココッカスsp. PCC 7002株を用意し、シネコシスティス sp. PCC 6803株の場合は、長鎖脂肪酸C18:2又はC18:3、或いはこれらの両方を含有する培地を使用し、シネココッカスsp. PCC 7002株の場合は、長鎖脂肪酸C12:0を含有する培地を使用して培養するステップ；
（ＩＩ）出現したコロニーからラン藻を回収するステップ。
【請求項１４】
更に以下のステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の作出方法：
（ａ）回収したラン藻が遊離脂肪酸を放出することを確認するステップ；
（ｂ）回収したラン藻が放出する遊離脂肪酸の種類及び／又は量を特定するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラン藻の改良技術に関する。より詳細には、ラン藻の脂肪酸放出株／脂肪酸耐性株を作出する方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、石油に代替可能なエネルギー物質の生産が必要とされている。そのなかで、食料との競合をしない酸素発生型光合成を行うラン藻（シアノバクテリア）がバイオ燃料（バイオディーゼル）生産のモデル生物として注目されている。ラン藻は遺伝子操作が容易であることから、外来遺伝子の導入を介して新規の代謝経路の構築が進められ、本来のラン藻自身が生産できない化学物質の生産が可能になってきた。これまでに、遺伝子組換えによって、遊離脂肪酸（FFA）生産能が高められたラン藻の作出が試みられている（特許文献１、非特許文献１〜３を参照）。例えば、非特許文献１では、ラン藻シネコシスティスsp. PCC 6803株のacyl-ACP合成酵素遺伝子（aas遺伝子）をターゲットノックアウト法で破壊することにより遊離脂肪酸生産株を作製し、光合成活性への影響を解析している。また、非特許文献２では同様の手法でラン藻シネココッカス sp. PCC 7002株から遊離脂肪酸生産株を作製し、生産効率を高めている。非特許文献３においても、同様の手法でラン藻シネココッカス・エロンガタスPCC 7942株から遊離脂肪酸生産株を作製し、生産効率を高めている。
【０００３】
上記の通り、ラン藻の遊離脂肪酸生産能を高める試みがあるが、従来の方法では遺伝子組換えが必要となる。遺伝子組換えでは、標的遺伝子の同定が前提条件となり、特別の事情（例えば既にゲノム情報が解読されており、標的となる遺伝子が既知の場合）がない限り、遺伝子情報の解読や遺伝子の機能の解析等を行う必要がある。また、標的遺伝子を決定できる保証もない。更には、従来の方法では多段階の遺伝子組換えが必要になり、操作が煩雑となる上に、使用可能なマーカー遺伝子の制約の問題も生ずる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８３８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gao Q et al., Biotechnol for Biofuels. 2012 Mar 21;5(1):17
【非特許文献２】Anne M. Ruffing., Front Bioeng Biotechnol. 2014 May 26;2:17.
【非特許文献３】Anne M. Ruffing and Howland D.T. Jones Biotechnol, Bioeng. 2012 Sep;109(9):2190-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、バイオ燃料の前駆体となるなど、産業上の有用性が高い遊離脂肪酸（FFA）を高生産するラン藻を、遺伝子組換えのような煩雑な操作を要することなく、簡便な方法で得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
遊離脂肪酸はリパーゼを介した膜脂質の分解産物として蓄積する。aas遺伝子にコードされるacyl-ACP合成酵素は遊離脂肪酸を再び脂肪酸合成経路に取り込み脂肪酸残基の再利用に寄与している。この遺伝子を不活化させると脂肪酸残基のリサイクル経路が失活して細胞内に遊離脂肪酸が蓄積する。さらに、その中の一部が細胞外へ排出され培地中に産物が蓄積する（図１）。この実験系を利用して脂肪酸生産株構築の研究が進んでいる。
【０００８】
本発明者らの研究グループは、ラン藻を基盤としたバイオ燃料生産技術の実用化を図るべく、高エネルギー物質である脂肪酸の高生産を目指した研究を進めてきた。その中で、ラン藻３種（シネココッカス sp. PCC 7942, シネコシスティス sp. PCC 6803, シネココッカス sp. PCC 7002）に対してaas遺伝子に変異を導入した株を構築した。それぞれの変異株の培養二週目の培養液中から100〜200μMの遊離脂肪酸が蓄積すること（細胞外におけるFFAの蓄積）を確認した（図２）。しかしながら、これらの細胞は生育阻害を受けやすい。その原因は、細胞内に高濃度に蓄積した遊離脂肪酸が細胞生理機能への傷害を引き起こしているのではないかと考えられた（遊離脂肪酸の蓄積が原因となって産物収量低下をもたらしている可能性も考えられる）。そこで、外部から加えた脂肪酸がラン藻の生育に与える影響について調べた結果、ラン藻３種の野生株が、中鎖飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸に対して高い感受性を示すことを確かめ、これらの結果を報告した（日本植物学会第７７回大会、平成２５年９月１３日。図３）
【０００９】
さらなる脂肪酸収量の増加を目指すために条件検討を行ったが、複数の遺伝子破壊および遺伝子導入（内在遺伝子の発現量の促進）が必要となっており、遺伝子組み換えに必要なマーカーの数に制限があるという課題に直面した。
【００１０】
従来のマーカーレス遺伝子改変方法では、標的遺伝子に一度薬剤マーカーと自殺遺伝子（スクロース存在下で致死効果を生じさせるsacB遺伝子）を組み込み、次に遺伝子の構造を破壊したコンストラクトで形質転換し、ホスト株の致死条件下（sacBの除去ではスクロースを添加する）でスクリーニングする（図４）。ラン藻で自殺遺伝子を介したマーカーレス遺伝子改変の試みも進めていたが、aas遺伝子を含めいくつかの遺伝子に適応することが不可能であった。
【００１１】
そこで、別のアプローチを模索することにした。即ち、不飽和脂肪酸に対する耐性を高めることができれば、安定した遊離脂肪酸生産が可能になるとの考えの下、脂肪酸耐性を獲得した突然変異株のスクリーニングを試みた。具体的には、鎖長及び飽和度の異なる複数の中鎖又は長鎖脂肪酸を各々添加した培地を用意し、ラン藻野生株を培養した。その結果、特定の脂肪酸が添加された培地で培養した場合、培養初期にはコロニーを形成せず、培養を継続することによって僅かな数のコロニーが出現するという、驚くべき現象が認められた（残りの脂肪酸については、培養当初から感受性又は耐性を示した）。この結果は、含有する脂肪酸の種類が異なる、複数の脂肪酸含有培地を用意してラン藻を培養し、培養初期はコロニーを認めないが、培養を継続するとコロニーが出現するものを特定するという方法が、脂肪酸放出株を取得する手段として有効であることを示す。換言すれば、当該方法によれば、有用性の高いラン藻脂肪酸放出株を遺伝子組換えなどの複雑な操作を介することなく作出できる。
【００１２】
一方、詳細な検討の結果、出現した脂肪酸耐性株の耐性が不可逆的に保持されていること、脂肪酸耐性株ではaas遺伝子の変異が高い割合で生じていること、aas遺伝子の変異に依存しない脂肪酸耐性の獲得も認められること等、重要且つ興味深い知見がもたらされた。
【００１３】
以下の発明は主として上記の成果及び考察に基づく。
［１］以下のステップ（１）〜（４）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（１）中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地を用いて供試ラン藻を培養する、複数の試験区であって、培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸の種類が試験区間で異なる、複数の試験区を用意するステップ；
（２）前記複数の試験区において、培地に供試ラン藻を添加し、培養するステップ；
（３）培養初期にはコロニーが認められず、培養を継続することによりコロニーが出現する試験区を選抜するステップ；
（４）選抜した試験区のコロニーからラン藻を回収するステップ。
［２］前記中鎖又は長鎖脂肪酸の炭素数が10〜18である、［１］に記載の作出方法。
［３］一つの試験区の培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸が１種類である、［１］又は［２］に記載の作出方法。
［４］前記中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地中の脂肪酸濃度が50μM〜200μMである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の作出方法。
［５］培養温度が25℃〜35℃である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の作出方法。
［６］前記ステップ（３）における培養初期の終点が、培養開始後1日目〜培養開始後10日目の間にある、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の作出方法。
［７］前記ステップ（３）においてコロニーが出現する時期が、培養開始後5日目〜培養開始後30日目である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の作出方法。
［８］前記複数の試験区が各々、供試ラン藻の濃度が段階的に低下する希釈系列を含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の作出方法。
［９］前記培地が固体培地である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の作出方法。
［１０］前記供試ラン藻がシネコシスティス属ラン藻、シネココッカス属ラン藻、ミクロシスティス属ラン藻又はアルスロスピラ属ラン藻である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の作出方法。
［１１］前記シネコシスティス属ラン藻がシネコシスティス sp. PCC 6803株であり、前記シネココッカス属ラン藻がシネココッカスsp. PCC 7002株である、［１０］に記載の作出方法。
［１２］以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（ｉ）［１］〜［１１］のいずれか一項の作出方法に使用した供試ラン藻を用意し、［１］のステップ（４）で選抜した試験区に使用した培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸を添加した培地で培養するステップ；
（ｉｉ）出現したコロニーからラン藻を回収するステップ。
［１３］以下のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、ラン藻脂肪酸放出株の作出方法：
（Ｉ）シネコシスティス sp. PCC 6803株又はシネココッカスsp. PCC 7002株を用意し、シネコシスティス sp. PCC 6803株の場合は、長鎖脂肪酸C18:2又はC18:3、或いはこれらの両方を含有する培地を使用し、シネココッカスsp. PCC 7002株の場合は、長鎖脂肪酸C12:0を含有する培地を使用して培養するステップ；
（ＩＩ）出現したコロニーからラン藻を回収するステップ。
［１４］更に以下のステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）を含む、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の作出方法：
（ａ）回収したラン藻が遊離脂肪酸を放出することを確認するステップ；
（ｂ）回収したラン藻が放出する遊離脂肪酸の種類及び／又は量を特定するステップ。
【００１４】
本発明は、ラン藻が遊離脂肪酸に感受性を示すことを巧みに利用するものであり、特定の遊離脂肪酸の存在下で培養を継続することにより脂肪酸耐性株が得られ、それが遊離脂肪酸を放出することを発見したことに基づく。即ち、脂肪酸耐性株をスクリーニングすることにより脂肪酸放出株が得られる方法であり、遺伝子組換え操作を必要としない。従って、脂肪酸放出のために破壊が必要な標的遺伝子（典型的にはacyl-ACP合成酵素遺伝子）の同定を必要とせず、マーカーとなる外来遺伝子の導入も回避できる。この点において、従来の遺伝子組換えによる脂肪酸高生産株の作製方法とは一線を画す。本発明を利用すれば、遺伝子組換え生物の使用を回避しつつ、効率的な遊離脂肪酸の生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】遺伝子組換え技術を利用した脂肪酸生産株構築の戦略。aas遺伝子の破壊により遊離脂肪酸が細胞内に蓄積し一部が細胞外へ排出され培地中に蓄積する。
【図２】３種のラン藻のaas遺伝子変異株における遊離脂肪酸生産。左から順に、シネココッカスsp. PCC 7942株の遊離脂肪酸生産量、シネコシスティスsp. PCC 6803.株の遊離脂肪酸生産量、シネココッカスsp. PCC 7002株の遊離脂肪酸生産量。
【図３】シネコシスティスsp. PCC 6803.株の生存率。各種脂肪酸含有培地でシネコシスティスsp. PCC 6803.株を培養した。中鎖飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸に対して高い感受性を示した。
【図４】従来の脂肪酸生産株構築法。
【図５】脂肪酸耐性株のスクリーニングの概要。
【図６】脂肪酸耐性株の各系統のC18:3耐性の確認。
【図７】脂肪酸耐性株の遊離脂肪酸放出能の比較。右のグラフでは、脂肪酸耐性株Res183#1の細胞外遊離脂肪酸量を野生型（WT）及びaas遺伝子変異株（aas::sk）と比較した。
【図８】脂肪酸耐性株に見つかったaas遺伝子変異部位。
【図９】脂肪酸耐性株におけるaas遺伝子に変異が認められた割合。ゲノム配列が確認できたものについて、aas遺伝子の変異の有無を確認した。シネコシスティスsp. PCC 6803.株の結果（上）とシネココッカスsp. PCC 7002株の結果（下）を示した。
【図１０】脂肪酸耐性株で変異が認められた遺伝子。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明はラン藻脂肪酸放出株の作出方法を提供する。換言すると、本発明によればラン藻脂肪酸放出株が得られる。「ラン藻脂肪酸放出株」とは、遊離脂肪酸を産生し、且つ産生した遊離脂肪酸の少なくとも一部を細胞外へ分泌する能力（即ち、遊離脂肪酸放出能）を発揮するラン藻である。本発明によって得られる「ラン藻脂肪酸放出株」は、元になるラン藻（本発明において「供試ラン藻」とも呼ばれる）に比較して遊離脂肪酸放出能が高い。従って、本発明を遊離脂肪酸放出能の高いラン藻を作出する方法と捉えることも可能である。後述の実施例に示す通り、本発明の方法を適用して作出したラン藻脂肪酸産放出株は、作出の際に使用した特定の遊離脂肪酸への耐性を獲得していた。この事実に鑑みると、本発明によれば、特定の遊離脂肪酸への耐性を獲得したラン藻（脂肪酸耐性株）が得られるといえる。
【００１７】
また、本発明者らの詳細な検討の結果、取得されたラン藻脂肪酸放出株の多くは、遊離脂肪酸の生産効率を高めるために標的とされてきたaas遺伝子に変異を有していた。従って、本発明は、遺伝子ターゲッティングなどの複雑な操作を介することなく（このことは、標的遺伝子の同定も不要であることを意味する）、遊離脂肪酸の生産効率に関与する遺伝子に変異を加える方法であるともいえる。一方、取得されたラン藻脂肪酸放出株のいくつかは、機能未知の遺伝子に変異を有していた。この事実をも考慮すれば、脂肪酸に対する耐性の獲得又は遊離脂肪酸の放出に関与する遺伝子を同定するための手法としても、本発明の方法は有用である。
【００１８】
本発明の作出方法では以下のステップ（１）〜（４）をこの順序で行う。
（１）中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地を用いて供試ラン藻を培養する、複数の試験区であって、培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸の種類が試験区間で異なる、複数の試験区を用意するステップ
（２）前記複数の試験区において、培地に供試ラン藻を添加し、培養するステップ
（３）培養初期にはコロニーが認められず、培養を継続することによりコロニーが出現する試験区を選抜するステップ
（４）選抜した試験区のコロニーからラン藻を回収するステップ
【００１９】
ステップ（１）では、複数の試験区（試験群）を用意する。各試験区では、中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地を用いて供試ラン藻を培養する。本発明では、培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸の種類が試験区間で異なるようにする。この点について試験区の数を３とした場合を例に説明すると、例えば、第１試験区に特定の脂肪酸（例えばC12:0の脂肪酸）を使用し、第２試験区では第１試験区に使用するものとは炭素数（鎖長）が異なる脂肪酸（例えばC16:0の脂肪酸）を使用し、第３試験区では第１試験区に使用するものとも第２試験区に使用するものとも炭素数が異なる脂肪酸（例えばC18:1の脂肪酸）を使用する。
【００２０】
試験区の数は特に限定されない。例えば2〜30、好ましくは5〜15の試験区を設ける。試験区の数が少ないことは効率性に影響し、試験区の数が多すぎれば操作が煩雑化する。尚、実験結果の信頼性向上のためには、試験区に加え、脂肪酸を含有しない培地を使用するもの（対照区）を設けることが好ましい。
【００２１】
各試験区で使用する中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地は一又は二種類以上の中鎖又は長鎖脂肪酸を含有する。好ましくは、一つの試験区の培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸を１種類とする。当該条件を採用すれば試験区の構成が簡素となり、効率性が高まる。また、脂肪酸放出株の作製に有用な脂肪酸の特定が容易となる。
【００２２】
一般に、脂肪酸は炭素数の違いにより短鎖脂肪酸（炭素数2〜4）、中鎖脂肪酸（炭素数5〜11）、及び長鎖脂肪酸（炭素数12以上）に分類される。本発明では中鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸を利用する。飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれも使用可能である。また、飽和度の異なる脂肪酸を併用することにしてもよい。好ましい一態様では、炭素数が10〜18の脂肪酸を採用することにより、効率性の向上を図る。本発明で使用可能な中鎖又は長鎖脂肪酸を例示すると、C10:0（カプリン酸）、C12:0（ラウリン酸）、C14:0（ミリスチン酸）、C15:0（ペンタデシル酸）、C16:0（パルミチン酸）、C16:1（パルミトレイン酸）、C17:0（マルガリン酸）、C18:0（ステアリン酸）、C18:1（9）（オレイン酸）、C18:1（11）（バクセン酸）、C18:2（9,12）（リノール酸）、C18:3（9,12,15）（（9,12,15）−リノレン酸）、C18:3（6,9,12）（（6,9,12）−リノレン酸）、C18:3（9,11,13）（エレオステアリン酸）である。
【００２３】
中鎖又は長鎖脂肪酸含有培地中の脂肪酸濃度は例えば50μM〜200μM、好ましくは70μM〜150μM、更に好ましくは90μM〜110μM（具体例は100μM）とする。培地中の脂肪酸濃度が低すぎると、見かけ上で耐性を示す試験区が生じ又は増加し、選抜の効率性や信頼性に影響する。他方、培地中の脂肪酸濃度が高すぎると、供試ラン藻の生育に必要以上の影響が出て、適切な評価ができなくなるおそれがある。
【００２４】
固体培地及び液体培地のいずれを使用することも可能であるが、好ましくは固体培地を採用する。固体培地によればステップ（３）においてコロニーを検出し易く、且つ後ステップ（４）において単一コロニーからのラン藻の回収も容易となる。
【００２５】
供試ラン藻には様々なラン藻を用いることができる。ラン藻（シアノバクテリア）はクロオコッカス目、ネンジュモ目、ユレモ目、プレウロカプサ目、スティゴネマ目等に分類することができる。クロオコッカス目には、アファノカプサ属、アファノテーケ属、カマエシフォン属、クロオコッカス属、クロコスフェラ属、シアノバクテリア属、シアノビウム属、シアノテーケ属、ダクティロコッコプシス属、グロエオバクター属、グロエオカプサ属、グロエオテーケ属、エウハロテーケ属、ハロテーケ属、ヨハネスバプティスチア属、メリスモペディア属、ミクロシスティス属、ラブドデルマ属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テルモシネココッカス属等が含まれる。ネンジュモ目には、コレオデスミウム属、フレミエラ属、ミクロケーテ属、レキシア属、スピリレスティス属、トリポスリックス属、アナベナ属、アナベノプシス属、アファニゾメノン属、アウロシラ属、シアノスピラ属、シリンドロスペルモプシス属、シリンドロスペルムム属、ノデュラリア属、ネンジュモ属、リケリア属、カロスリックス属、グロエオトリキア属、スキトネマ属等が含まれる。ユレモ目には、アルスロスピラ属、ゲイトレリネマ属、ハロミクロネマ属、ハロスピルリナ属、カタグニメネ属、レプトリンビャ属、リムノスリックス属、リンビャ属、ミクロコレウス属、ユレモ属、フォルミディウム属、プランクトトリコイデス属、プランクトスリックス属、プレクトネマ属、リムノスリックス属、シュードアナベナ属、スキゾスリックス属、スピルリナ属、シンプロカ属、トリコデスミウム属、チコネマ属等が含まれる。プレウロカプサ目には、クロオコッキディオプシス属、デルモカルパ属、デルモカルペラ属、ミクソサルキナ属、プレウロカプサ属、スタニエリア属、およびキセノコッカス属等が含まれる。スティゴネマ目には、カプソシラ属、クロログロエオプシス属、フィッシェレラ属、ハパロシフォン属、マスチゴクラドプシス属、マスチゴクラドゥス属、ノストクホプシス属、スティゴネマ属、シンフィオネマ属、シンフィオネモプシス属、ウメザキア属、ウェスティエロプシス属等が含まれる。
【００２６】
好ましくは、シネコシスティス属、シネココッカス属、ミクロシスティス属又はアルスロスピラ属のラン藻を供試ラン藻に採用する。これらのラン藻は研究対象或いは産業目的で頻用されており、汎用性及び産業的有用性が高い。また、容易に入手できるという利点も有する。シネコシスティス属ラン藻の例はシネコシスティス（Synechocystis） sp. PCC 6803株、シネコシスティス（Synechocystis） sp. PCC 6714株である。同様に、シネココッカス属ラン藻の例は、シネココッカス（Synechococcus） sp. PCC 7002株、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus） PCC 7942株であり、ミクロシスティス属ラン藻の例は、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）（例えばNIES-843株）であり、アルスロスピラ属ラン藻の例はアルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）（例えばNIES-39株）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira Maxima）である。アルスロスピラ・プラテンシス及びアルスロスピラ・マキシマは大規模な培養に適し、その利用価値は特に高い。
【００２７】
ステップ（２）では、各試験区で培地に供試ラン藻を添加し、培養する。ラン藻の培養条件（培地、温度条件、照度条件等）は、供試ラン藻の種類を考慮した上で、過去の報告（例えば非特許文献１〜３を参照）や成書（例えば、光合成研究法  低温科学  Vol67. 2008. ISSN1880-7593、藻類ハンドブック（エヌティーエス、渡辺信監修、2012）が参考になる）を参考にして設定すればよい。例えば、培養温度は25℃〜35℃（好ましくは27℃〜32℃）、光条件は連続光又は12時間明期／12時間暗期の明暗サイクル、光強度は30μE/m2/sec〜300μE/m2/secとする。
【００２８】
各試験区に供試ラン藻の濃度（単位量当たりの細胞数）が段階的に低下する希釈系列を設けると良い。当該態様によれば、ステップ（３）での選抜の際の評価が容易になる。ここでの希釈系列は例えば、濃度1×1010個／ml〜1×102個／mlの範囲内で設定することができる。
【００２９】
培養を開始すると、培地中の脂肪酸に対する耐性又は感受性に応じて、供試ラン藻の増殖又は増殖抑制（増殖が認められない）が生ずる。具体的には、供試ラン藻が培地中の脂肪酸に対して本来的に耐性を示す試験区では、供試ラン藻の経時的な増殖が認められる。他方、供試ラン藻が培地中の脂肪酸に対して高い感受性を示す試験区では、供試ラン藻の増殖は認められない。従って、典型的には、供試ラン藻の増殖が認められる試験区と供試ラン藻の増殖を認めない試験区が観察される。ところが、後述の実施例に示す通り、本発明者らが行った実験によって、一部の試験区では培養初期にはコロニーが認められないものの（即ち、見かけ上は培地中の脂肪酸に対して高い感受性を示す）、培養を継続することによりコロニーが出現するという、驚くべき現象が観察された。本願発明は、この予測すらできなかった知見に基づく。即ち、本発明では、培養初期にはコロニーが認められず、培養を継続することによりコロニーが出現する試験区を選抜する（ステップ（３））。当該試験区では、本来は感受性を示す脂肪酸に長時間、曝露されることによって遺伝子変異が起こり、それによって耐性を獲得したラン藻（脂肪酸耐性株）がコロニーを形成する。本発明では、このようにしてコロニーを形成したラン藻（脂肪酸耐性株）を有用なもの、即ち脂肪酸放出株として回収する（ステップ（４））。換言すれば、培養初期からコロニーを形成した試験区及び培養を継続してもコロニーが出現しない試験区が排除される。
【００３０】
選抜すべき試験区において複数のコロニーが出現した場合は、一又は二以上のコロニーから各々ラン藻を回収する。回収したラン藻は通常、更なる培養に供する。目的に応じて適当な培養規模（例えば、実験室での培養に適した小規模、実用化試験に適した中規模、工業的な生産に適した大規模）が採用される。段階的に培養規模を拡大することにしてもよい。
【００３１】
上記の通り、選抜される試験区では培養初期にコロニーが観察されない。「培養初期」とは、培養開始から特定の時点までの間である。培養開始時点から、選抜すべき試験区においてコロニーが出現する時点までを全培養期間とした場合、培養初期は全培養期間の例えば1/3以下（具体例は1/3、1/4、1/5）、好ましくは1/5以下（具体例は1/5、1/7、1/10）、更に好ましくは1/10以下（具体例は1/10、1/20、1/30）である。培養初期の具体例としては、培養開始から培養開始後1日目まで（最も短い培養初期の例であり、培養初期の終点が培養開始後1日目となる）、培養開始から培養開始後10日目まで（最も長い培養初期の例であり、培養初期の終点が培養開始後10日目となる）を挙げることができる。また、全培養期間は例えば5日〜40日、好ましくは10日〜20日である。尚、「培養初期」は、培養条件や供試ラン藻の種類等によって変動し得るが、当業者であれば本願明細書の記載を参考にした上で予備実験を行うことにより、適切ないし最適な「培養初期」を設定できる。
【００３２】
培養を継続することによってコロニーが出現する時期は、培養条件や供試ラン藻の種類等によって変動し得るが、例えば培養開始後5日目〜30日目、好ましくは培養開始後10日目〜30日目である。
【００３３】
本発明の方法で作出したラン藻脂肪酸放出株が放出する脂肪酸は特に限定されない。従って、例えば、ラン藻脂肪酸放出株は、選抜された試験区の培地が含有する遊離脂肪酸、又は選抜されなかった試験区の培地が含有する遊離脂肪酸を放出する。或いは、ラン藻脂肪酸放出株が、いずれの試験区においても使用しなかった遊離脂肪酸を放出するものであってもよい。また、ラン藻脂肪酸放出株が２種類以上の脂肪酸を放出するものであってもよい。
【００３４】
ステップ（１）〜（４）を実施すると、ラン藻脂肪酸放出株の作出とともに、ラン藻脂肪酸放出株の作出に有効な脂肪酸を特定できる。即ち、ラン藻脂肪酸放出株の作出において有益な情報が得られる。本発明の別の態様では当該情報を利用してラン藻脂肪酸放出株を作出する。この態様では、上記ステップ（１）で使用した供試ラン藻を用意し、上記ステップ（４）で選抜した試験区に使用した培地が含有する中鎖又は長鎖脂肪酸を添加した培地で培養する（ステップ（ｉ））。そして、培養を継続することで出現したコロニーからラン藻を回収する（ステップ（ｉｉ））。この方法によれば、効率的にラン藻脂肪酸放出株を取得することができる。また、この方法はラン藻脂肪酸放出株の大量培養に適する。
【００３５】
本発明の更に別の態様では、ラン藻の特定の株を使用した実験（後述の実施例）の結果を利用してラン藻脂肪酸放出株を取得する。具体的には、シネコシスティス sp. PCC 6803株又はシネココッカスsp. PCC 7002株を用意し、シネコシスティス sp. PCC 6803株の場合は長鎖脂肪酸C18:2又はC18:3、或いはこれらの両方を含有する培地を使用し、シネココッカスsp. PCC 7002株の場合は長鎖脂肪酸C12:0を含有する培地を使用して培養する（ステップ（Ｉ））。そして、培養を継続することによって出現したコロニーからラン藻を回収する（ステップ（ＩＩ））。この態様によれば、長鎖脂肪酸C18:2又はC18:3に耐性を示す脂肪酸放出株（シネコシスティス sp. PCC 6803株の変異株）、長鎖脂肪酸C12:0に耐性を示す脂肪酸放出株（シネココッカスsp. PCC 7002株の変異株）が得られる。即ち、学術上に限らず産業的にも有用性の高いラン藻をベースとした脂肪酸放出株が提供されることになる。
【００３６】
本発明では付加的ないし任意のステップとして、以下のステップ（ａ）又は（ｂ）或いはこの両方を行うことができる。
（ａ）回収したラン藻が遊離脂肪酸を放出することを確認するステップ
（ｂ）回収したラン藻が放出する遊離脂肪酸の種類及び／又は量を特定するステップ
【００３７】
ステップ（ａ）を追加で行えば、より確実に目的のラン藻脂肪酸放出株を取得できることになる。ステップ（ａ）は例えば、回収したラン藻の培養液（培養後の試験区の培地、又は回収後に別の培地で培養した後の培養液）中の遊離脂肪酸を定性的又は定量的な方法で検出すればよい。この検出には例えばガスクロマトグラフィー、HPLC、非エステル結合型脂肪酸キット（例えば、NEFA C-テストワコー（商品名））等を利用可能である。一方、ステップ（ｂ）を追加で行うことにすれば脂肪産放出能の詳細が明らかとなり、回収したラン藻を利用、応用する上で有益な情報が得られる。複数のラン藻が回収される場合には、より有用性の高いラン藻を得るため、脂肪酸放出能及び／又は放出する遊離脂肪酸の種類を、回収されたラン藻の間で比較することにしてもよい。遊離脂肪酸の種類の特定（遊離脂肪酸の同定）には薄層クロマトグラフィー、HPLC、質量分析（MS）等を利用可能である。
【実施例】
【００３８】
不飽和脂肪酸に対する耐性を高めることができれば、安定した遊離脂肪酸生産が可能になるとの推定の下、ラン藻をモデルとして脂肪酸耐性を獲得した突然変異株のスクリーニングを試みた。また、脂肪酸を用いたスクリーニング法を応用して、マーカーレスでaas遺伝子に対して変異を導入した脂肪酸放出株の単離を試みた。
【００３９】
１．脂肪酸耐性株のスクリーニング
液体培地BG11 50 mlに細胞（シネコシスティス sp. PCC 6803株）を懸濁し、光強度50μE/m2/secの光照射および2%CO2通気、30℃で生育させた。この条件を通常生育条件とした。通常の生育環境下において108細胞/mlの細胞濃度まで生育させたラン藻の培養液100μLをBG11寒天培地上に滴下した後、1週間生育させると、緑色のコロニーが認められた（図５）。脂肪酸に対する感受性を試験した結果、脂肪酸種によって感受性の高さが異なっていた。そこで、あらかじめ致死濃度を検定した。検定結果を基にして、中鎖脂肪酸含有培地（100μM ラウリン酸）または長鎖脂肪酸含有培地（20μM リノレン酸）を用意し、それぞれ培養液を滴下し静置培養を開始した。培養一週間後ではコロニーは観察されなかった。このように、脂肪酸による致死効果が確かめられた。しかしながら、培養をさらに一週間継続すると、数個（５個程度）の細胞が耐性を獲得しコロニーを形成するという現象を認めた。自然突然変異により外部の脂肪酸に対して耐性を獲得しコロニーを形成したと考えられた。
【００４０】
２．各系統のC18:3耐性の確認
脂肪酸含有培地において出現したコロニーをピックアップし、脂肪酸無添加のBG11寒天培地に移植した。単離した脂肪酸耐性株の各系統について脂肪酸無添加培地で継代を続けた。その後、100μM C18:3添加培地に移植したところ、無添加培地と同様の生育を示した（図６）。このように、脂肪酸耐性が不可逆的に保持されていることが確認された。
【００４１】
３．各株における脂肪酸耐性とaas遺伝子変異の関係
耐性株各系統の液体培養を一週間行った結果、aas変異株（遊離脂肪酸を蓄積する）と同様に培養液の上層に白い析出物が認められた。サンプリングした結果、耐性株の一部に50〜100μMの濃度で培養液中に遊離脂肪酸を蓄積している系統を見つけた（図７）。
【００４２】
「aas遺伝子変異株が脂肪酸耐性を獲得した」という既報の実験結果（日本植物学会第７７回大会）も考慮すると、脂肪酸を蓄積した系統のゲノム配列にはaas遺伝子座に対する変異導入の存在が示唆される。そこで、耐性株のゲノム配列を次世代シーケンサーで解析した。その結果、aas遺伝子座に変異が見つかり（図８、９）、脂肪酸存在下でのスクリーニングによってaas遺伝子の変異が高い割合で生じることが確かめられた。以上の実験結果は、脂肪酸耐性や脂肪酸の放出を指標としてaas変異を持つ株の単離が可能であることを示している。
【００４３】
４．aas変異に依存しない脂肪酸耐性の獲得
脂肪酸耐性株の変異配列を確かめた結果、aas遺伝子変異に加えて、繊毛合成系の遺伝子（pilB遺伝子、pilJ遺伝子）に遺伝子変異が見つかった（図１０）。pilB遺伝子変異とpilJ遺伝子変異は、培養液中の遊離脂肪酸蓄積に影響せず、さらには遊離脂肪酸耐性の獲得にも寄与しなかった。しかしながら、aas遺伝子変異とpilB遺伝子変異が組み合わさると、より高濃度（1 mM C18:3）の耐性を示した。aas遺伝子とpilB遺伝子の二重変異株は、脂肪酸耐性株系統１と同様の遺伝子型である。脂肪酸耐性と脂肪酸放出が２つの遺伝子変異の組み合わせにより生じることが示唆された。
【００４４】
５．他のラン藻種における脂肪酸耐性株の単離と原因遺伝子の同定
海産性ラン藻シネココッカスsp. PCC 7002株において同様の実験を行った。シネココッカスsp. PCC 7002株のスクリーニングの条件を検討した結果、100μMラウリン酸存在下で行うことが適切であることを確かめた。この条件をもとにして、脂肪酸耐性株のスクリーニングを行った結果、処理2週間後にコロニーを検出した。単離した各系統は脂肪酸耐性を有しており、培養液に脂肪酸を蓄積する特徴が見られた。変異遺伝子を解析したところ、主にaas遺伝子（41.2%）が含まれており、一部でplsXに対する変異導入が確かめられた（図９）。
【００４５】
シネコシスティス sp. PCC 6803株を用いた実験、及びシネココッカスsp. PCC 7002株を用いた実験により得られた結果から、脂肪酸耐性を指標にしてaas遺伝子変異株単離が可能であることが判明した。また、遊離脂肪酸を蓄積する表現型はaas変異に由来することが示唆された。脂肪酸放出株の作出方法をシネココッカスsp. PCC 7002株に適用して得られた結果は、本方法が各種ラン藻に適用できる可能性を強く示唆する。
【００４６】
＜まとめ＞
脂肪酸添加培地上で耐性株を選択することにより、耐性株の中からaas遺伝子に変異があり、かつ遊離脂肪酸を排出する株が見つかった。また、aas遺伝子以外に「脂肪酸に対する耐性の獲得」および「脂肪酸の放出」に寄与する付加的な遺伝子の存在が確かめられた。本方法は、自然化合物を用いたスクリーングであり、かつ遺伝子操作を必要としない。よって、マーカーレスの変異株の構築が可能になり、遺伝子操作の軽減につながる。また、遺伝子操作が不可能な生物（バクテリア）への適用が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、遊離脂肪酸を放出するラン藻（ラン藻脂肪酸放出株）を簡便且つ効率的に作出することができる。遊離脂肪酸は例えばバイオ燃料の前駆体となり、産業上の有用性が高い。本発明は、今後の需要の拡大が予想されるバイオ燃料（バイオディーゼル）に関する重要な基盤技術となり得る。遊離脂肪酸はエステル化合物の原材料等にも用いられる。従って、本発明はロウ（ろうそく、表面光沢剤、コーティング剤）、添加剤（食品用、塗料用、医薬品用、化粧品用など）、潤滑剤（金属、ゴム、プラスチック、繊維などの加工工程）、可塑剤、軟化剤、乳化剤等への利用ないし応用も可能である。
【００４８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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