(57)【要約】【課題】顎骨壊死などに対する予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として利用可能な骨形成促進物質をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】骨形成促進物質のスクリーニング方法であって、下記の工程：(a)被検物質及び陽性対象であるシタフロキサシンをそれぞれ骨芽細胞様細胞に接触させる工程、及び(b) シタフロキサシンにより遺伝子発現が上昇した1又は2以上の遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子発現を上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選択する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成促進物質のスクリーニング方法であって、下記の工程：
(a)被検物質及び陽性対象であるシタフロキサシンをそれぞれ骨芽細胞様細胞に接触させる工程、及び
(b) シタフロキサシンにより遺伝子発現が上昇した1又は2以上の遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子発現を上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
遺伝子発現を遺伝子の転写上昇により測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨芽細胞様細胞がヒト骨肉腫細胞株である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
骨芽細胞様細胞がHOS/TE85細胞又はMG63細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
複数の濃度のシタフロキサシンを組み合わせてスクリーニングを行う請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
複数のシタフロキサシン作用時間を組み合わせてスクリーニングを行う請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
1又は2以上の遺伝子において、シタフロキサシンの濃度及び/又はシタフロキサシン作用時間を変化させた場合に生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜する請求項２ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
6時間、24時間、及び48時間から選ばれる2以上のシタフロキサシン作用濃度、及び100nM、1μM、10μM、及び100μMから選ばれる2以上のシタフロキサシン濃度の組み合わせにおいて1又は2以上の遺伝子で生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜する請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨形成促進物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨破壊のバランスの上に成り立っている臓器である。骨芽細胞では、その分化段階に応じて、種々の遺伝子群が発現することが知られている。例えば、Transforming growth factor βs(TGFβs)、Bone morphogenetic proteins (BMPs)などの刺激により、コラーゲン関連遺伝子群、アルカリフォスファターゼ、オステオカルシンなどの骨関連遺伝子発現が上昇し、破骨細胞とのシグナル伝達分子として、RANKLやOsteoprotegerin（OPG）などの因子の発現も認められる(Ann. N. Y. Acad. Sci., 1092, pp.385-396, 2006)。
【０００３】
また、骨芽細胞分化のマスターレギュレーターとして、Runx2やMSXなどの転写因子(Curr. Pharm. Des., 9(32), pp.2677-2685, 2003)、あるいはその他の核内受容体や転写因子が骨芽細胞の分化や機能に関与するとの報告もある(Trends Endocrinol Metab, 21(10), pp.637-641, 2010; J. Biol. Chem., 278(45), pp.43919-43927, 2003; Mol. Cell Biol., 27(22), pp.7947-7954, 2007; J. Bone Miner. Res., 17(8), pp.1392-1400, 2002)。さらに、種々のgrowth factorやホルモンが骨芽細胞の増殖、分化、機能に影響を及ぼすことも報告されている(Ann. N. Y. Acad. Sci., 1092, pp.385-396, 2006; Cytokine, 57(2), pp.276-281, 2012)。
【０００４】
一方、ビスホスフォネート関連顎骨壊死(BRONJ: Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw)は骨粗鬆症などの治療に際してビスホスフォネート(BP)剤の投与を受けた患者において、抜歯などの歯科治療後に顎骨が壊死して、口腔内に顎骨が露出したまま治癒しなかったり、歯周炎や感染が拡大して歯牙が脱落する疾患である。ビスホスフォネート関連顎骨壊死については明確な診断基準及び確定的な治療指針がないことから、診断基準の確立及び治療薬の提供が切望されている(「ビスホスフォネート系薬剤と顎骨壊死-理解を深めていただくために-」、社団法人日本口腔外科学会監修、2008年1月)。
【０００５】
最近になって、ニューキノロン系の合成抗菌薬であるシタフロキサシンがビスホスフォネート関連顎骨壊死に対して優れた治療効果を発揮することが報告されている(癌と化学療法(Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy), 39, pp.2573-2575, 2012)。シタフロキサシン〔7-[(4S)-4-アミノ-6-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル]-8-クロロ-6-フルオロ-1-[(2S)-2-フルオロシクロプロピル]-4-オキソキノリン-3-カルボン酸(STFX)、「グレースビット」(登録商標)、第一三共株式会社製造及び販売〕は、キノロン系抗菌薬耐性菌を含むグラム陽性菌及びグラム陰性菌のほか、マイコプラズマ及びクラミジアなどの非定型菌などに対して既存のキノロン系抗菌薬のなかで最も高い抗菌活性を有しているが(日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.), 133, pp.43-51, 2009; 「グレースビット錠50mg」及び「グレースビット細粒10%」の医薬品添付文書、第7版、2012年7月改訂、第一三共株式会社)、シタフロキサシンがビスホスフォネート関連顎骨壊死を抑制するメカニズムについてはいまだ解析されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ann. N. Y. Acad. Sci., 1092, pp.385-396, 2006
【非特許文献２】Curr. Pharm. Des., 9(32), pp.2677-2685, 2003
【非特許文献３】Trends Endocrinol Metab, 21(10), pp.637-641, 2010
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 278(45), pp.43919-43927, 2003
【非特許文献５】Mol. Cell Biol., 27(22), pp.7947-7954, 2007
【非特許文献６】J. Bone Miner. Res., 17(8), pp.1392-1400, 2002
【非特許文献７】Cytokine, 57(2), pp.276-281, 2012
【非特許文献８】「ビスホスフォネート系薬剤と顎骨壊死-理解を深めていただくために-」、社団法人日本口腔外科学会監修、2008
【非特許文献９】癌と化学療法(Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy), 39, pp.2573-2575, 2012
【非特許文献１０】日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.), 133, pp.43-51, 2009
【非特許文献１１】「グレースビット錠50mg」及び「グレースビット細粒10%」の医薬品添付文書、第7版、2012年7月改訂、第一三共株式会社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、例えば顎骨壊死に対する予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として利用可能な骨形成促進物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべくシタフロキサシンがビスホスフォネート関連顎骨壊死を抑制するメカニズムについて鋭意研究を行った。本発明者らはシタフロキサシンが骨芽細胞に直接作用させることにより、骨形成関連遺伝子の変動を確認できる可能性があると考えた。その結果、シタフロキサシンにより発現が促進される骨形成関連遺伝子を特定することに成功し、シタフロキサシンによる遺伝子発現を指標として骨形成促進物質をスクリーニングする方法を提供することに成功した。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明により、骨形成促進物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：(a)被検物質及び陽性対象であるシタフロキサシンをそれぞれ骨芽細胞様細胞に接触させる工程、及び(b) シタフロキサシンにより遺伝子発現が上昇した1又は2以上の遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子発現を上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選択する工程を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、遺伝子発現を転写上昇により測定する上記の方法；骨芽細胞様細胞が骨肉腫細胞である上記の方法；骨芽細胞様細胞がヒト骨肉腫細胞株である上記の方法；骨芽細胞様細胞がHOS/TE85細胞又はMG63細胞である上記の方法；骨形成が顎骨形成である上記の方法；及び、骨形成がビスホスフォネート関連顎骨壊死における顎骨形成である上記の方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらに好ましい態様によれば、複数のシタフロキサシン濃度を組み合わせてスクリーニングを行う上記の方法；複数のシタフロキサシン作用時間を組み合わせてスクリーニングを行う上記の方法が提供される。
【００１２】
さらに別の好ましい態様によれば、いずれかの時点、又は複数の時点においてシタフロキサシンにより転写レベルの上昇が認められた1又は2以上の遺伝子において、該遺伝子の転写レベルを上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜する上記の方法；及び、1又は2以上の遺伝子において、シタフロキサシン濃度及び/又はシタフロキサシン作用時間を変化させた場合に生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜する上記の方法が提供される。
【００１３】
本発明の特に好ましい態様によれば、6時間、24時間、及び48時間のうちの少なくとも1つの時点においてシタフロキサシンにより遺伝子の転写が上昇した1又は2以上の遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子の転写を上昇させる被検物質を骨形成物質として選択する上記の方法；陽性対象であるシタフロキサシンを100nM、1μM、10μM、及び100μMのうちの少なくとも1つの濃度で骨芽細胞様細胞に作用させる上記の方法；及び、6時間、24時間、及び48時間から選ばれる2以上のシタフロキサシン作用濃度、及び100nM、1μM、10μM、及び100μMから選ばれる2以上のシタフロキサシン濃度の組み合わせにおいて1又は2以上の遺伝子で生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜する上記の方法が提供される。
【００１４】
別の観点からは、本発明により、上記のスクリーニング方法により選択された物質を有効成分として含む医薬が提供される。上記発明の好ましい態様によれば、骨形成のための上記医薬；顎骨形成のための上記医薬；ビスホスフォネート関連顎骨壊死における顎骨形成のための上記医薬；ビスホスフォネート関連顎骨壊死の予防及び/又は治療のために用いる上記の医薬が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、シタフロキサシンによる遺伝子発現を指標として骨形成促進物質を効率的かつ確実にスクリーニングすることができ、スクリーニングにより選択された骨形成促進物質は骨形成のための医薬の有効成分として使用することができる。上記の医薬は、顎骨形成などの骨形成、好ましくはビスホスフォネート関連顎骨壊死における顎骨形成作用を有する医薬として、好ましくはビスホスフォネート関連顎骨壊死の予防及び/又は治療のための医薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】HOS/TE85細胞にシタフロキサシンを各濃度及び各作用時間で作用させた場合の遺伝子の転写上昇を示した図である。図中、バーの４段階の濃度はSTFXの作用濃度の違いを示す。黒色が100μMであり、以下淡色方向に10μM，1μM，0.1μMを示す。
【図２】MG63細胞にシタフロキサシンを各濃度及び各作用時間で作用させた場合の遺伝子の転写上昇を示した図である。図中、バーの４段階の濃度はSTFXの作用濃度の違いを示す。黒色が100μMであり、以下淡色方向に10μM，1μM，0.1μMを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法は、骨形成促進物質のスクリーニング方法であって、(a)被検物質及び陽性対象であるシタフロキサシンをそれぞれ骨芽細胞様細胞に接触させる工程、及び(b) シタフロキサシンにより遺伝子発現が上昇した1又は2以上の遺伝子のうちの少なくとも1つの遺伝子発現を上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選択する工程を含むことを特徴としている。
【００１８】
本発明の方法において陽性対象として使用するシタフロキサシン〔7-[(4S)-4-アミノ-6-アザスピロ[2.4]ヘプタン-6-イル]-8-クロロ-6-フルオロ-1-[(2S)-2-フルオロシクロプロピル]-4-オキソキノリン-3-カルボン酸(STFX)〕は、「グレースビット」(登録商標)として第一三共株式会社から販売されており、当業者であれば容易に入手可能である。
【００１９】
被検物質の種類は特に限定されず、有機化合物又は無機化合物のいずれであってもよい。有機化合物としては低分子有機化合物のほか、アミノ酸類、オリゴペプチド類、ポリペプチド類、糖類、脂質類、核酸類など任意の有機化合物を被検物質としてスクリーニングを行うことができる。
【００２０】
骨芽細胞様細胞(osteoblast-like-cell)としては、例えば骨肉腫細胞などを用いることができるが、樹立された骨肉腫細胞株を使用することが好ましく、ヒト骨肉腫細胞株を用いることがより好ましい。例えば、MG63細胞(ATCC No. CRL-1427)、HOS/TE85細胞(ATCC No. CRL-1543)、Saos-2(ATCC No. HTB-85)などを用いることができる。MG63細胞及びHOS/TE85細胞は大日本住友製薬株式会社から市販されており、当業者であれば容易に入手可能である。もっとも、本発明のスクリーニング方法に使用可能な骨芽細胞様細胞は上記の特定の細胞株に限定されることはない。
【００２１】
本発明の方法において遺伝子発現を確認する手段は当業者に利用可能なものであれば特に限定されず、任意の手段を採用することができるが、一般的には、遺伝子の転写レベルの増加により発現亢進を確認することができる。転写レベルでの遺伝子発現解析に用いらる方法としては、単離された遺伝子個々の発現を解析する方法としてノーザン・ハイブリダイゼーションやリアルタイム(RT)-PCR法などを利用することができ、網羅的な遺伝子発現解析法としてマクロアレイ法やマイクロアレイ法などを利用することができる。これらの方法は当業者に周知かつ慣用の方法であり、本発明の方法においては、これらの方法のうちの1つ、又は任意の2以上の方法を適宜組み合わせて用いることができる。遺伝子発現については、転写レベルだけではなく、mRNAの転写後の修飾やプロセッシングなどを考慮しつつ、タンパク質レベルでの発現量を確認してもよい。
【００２２】
本発明の方法において遺伝子発現を転写レベルで確認する場合には、例えば、陽性対象であるシタフロキサシンにより遺伝子の転写が上昇した1又は2以上の遺伝子を確認し、被検物質により該遺伝子の転写レベルが上昇しているか否かを確認すればよい。遺伝子転写レベルの上昇は、一般的には無処理の対照細胞との比較において転写レベルが2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、特に好ましくは20倍以上であればよい。
【００２３】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、陽性対象であるシタフロキサシンによる骨芽細胞様細胞での遺伝子発現の上昇、好ましくは遺伝子の転写レベルの上昇は、骨芽細胞様細胞の種類、シタフロキサシンの濃度、又はシタフロキサシンと骨芽細胞様細胞とを接触させてから転写レベルを確認するまでの時間に応じて変化する場合がある。その一例を実施例の表2及び表3に示した。シタフロキサシンによる骨形成促進作用は、カスケード的に進行する複数の遺伝子の転写レベルの上昇の連鎖により引き起こされているものと考えられる。従って、遺伝子の転写レベルの測定にあたり、シタフロキサシン及び被検物質の濃度を適宜変化させ、シタフロキサシン及び被検物質について転写レベルの確認を同じ時点で行うことが望ましい。シタフロキサシンによる骨形成促進関連遺伝子の発現連鎖の開始は極めて短時間に、例えば数分から数十分程度で生じる場合があり、例えば6時間の時点で測定を行う場合には、それまでの間にすでに発現のピークを過ぎて発現が認められなくなる遺伝子も存在する。このような遺伝子に特に注目する場合には、遺伝子発現の確認を1時間の時点、あるいは数十分の時点で行うことが好ましい場合がある。また、個々の遺伝子での比較に加えて、複数の遺伝子からなる遺伝子群について全体としての転写レベルの変動を比較することが好ましい場合もある。
【００２４】
例えば、シタフロキサシンと骨芽細胞様細胞とを接触させてから、例えば、6時間後、24時間後、及び48時間後のうちの少なくとも1つの時点において確認することができ、好ましくは6時間後、24時間後、及び48時間後のうちの2つの時点、さらに好ましくは6時間後、24時間後、及び48時間後のすべての時点において確認することができる。
【００２５】
また、陽性対象であるシタフロキサシンによる遺伝子転写レベルの上昇は、例えば、シタフロキサシン100nM、1μM、10μM、及び100μMのうちの少なくとも1つの濃度で測定することができ、好ましくはそれらの濃度のうちの2以上、さらに好ましくは3以上、特に好ましくはすべての濃度で測定することができる。同様に、被検物質についても適宜の濃度範囲、例えば1nM〜1,000μM程度の濃度範囲において1又は2以上の濃度で転写レベルを測定することができ、好ましくは2以上の濃度での転写レベルを測定することができる。
【００２６】
いずれかの時点において陽性対象であるシタフロキサシンにより転写レベルの上昇が認められた遺伝子について、被検物質によりその遺伝子の転写レベルが上昇しているか否かを確認し、被検物質により該遺伝子の転写レベルが上昇している場合には、被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することができる。好ましくは、シタフロキサシンにより転写レベルの上昇が認められた2以上の遺伝子について、それらの各遺伝子の転写レベルを上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することが好ましく、複数の濃度のシタフロキサシンにより転写レベルの上昇が認められた2以上の遺伝子について、それらの各遺伝子の転写レベルを上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することがさらに好ましく、複数の濃度のシタフロキサシンにより複数の時点において転写レベルの上昇が認められた2以上の遺伝子について、それらの各遺伝子の転写レベルを上昇させる被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することが特に好ましい。
【００２７】
また、先に説明したように、陽性対象であるシタフロキサシンによる骨芽細胞様細胞での遺伝子の転写レベルの上昇は、骨芽細胞様細胞の種類、シタフロキサシンの濃度、又はシタフロキサシンと骨芽細胞様細胞とを接触させてから転写レベルを確認するまでの時間に応じて変化する場合があることから、1又は2以上の遺伝子について、シタフロキサシンの濃度及び/又はシタフロキサシンの作用時間を変化させた場合に生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することがさらに好ましい。
【００２８】
例えば、6時間、24時間、及び48時間から選ばれる2以上、好ましくはこれらのすべてのシタフロキサシン作用濃度、及び100nM、1μM、10μM、及び100μMから選ばれる2以上、好ましくは3以上のシタフロキサシン濃度の組み合わせにおいて、1又は2以上の遺伝子で生じる転写レベルの変動と同一又は類似の変動を惹起する被検物質を骨形成作用を有する物質として選抜することができる。個々の遺伝子の転写レベルの変化に加えて、複数の遺伝子の転写レベルを全体的な変動として確認することが望ましい場合がある。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は骨形成作用を有する物質として医薬の有効成分として利用することができる。シタフロキサシンによる骨形成作用は顎骨において顕著であることから、上記の医薬は顎骨形成のための医薬として用いることができ、特にビスホスフォネート関連顎骨壊死における顎骨形成のための医薬として用いることができるが、この医薬は、例えば、ビスホスフォネート関連顎骨壊死の予防及び/又は治療のために使用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００３１】
例1：ヒト骨芽細胞様細胞を用いたシタフロキサシンによる遺伝子変動確認試験
ヒト骨芽細胞様細胞MG63（ATCC No. CRL-1427）及びHOS/TE85（ATCC No. CRL 1543）は大日本住友製薬株式会社より購入したものを実験に供した。培養メディウムは、αMEM（Invitrogen社、Cat. No. 12571-048）に、 Fetal Bovine Serum Sterile Filtered (Moregate社、Batch No. 42301103)を10%（v/v）、Penicillin-Streptomycin溶液（Invitrogen社、Cat. No. 15140-122）を1%（v/v）添加したものを用いた。本実験の細胞培養は、全てCO2インキュベーター（Thermo Scientific社、Heracell 240i）を用いて、37℃、95％湿度、5％ CO2の条件で培養を行った。
【００３２】
培養メディウムを用いて50,000 cells/mLの細胞懸濁液を調製し、96穴マイクロプレート（SUMILON社、Cat. No. MS-8096F）に5,000 cells/well（100μL/well）になるように細胞懸濁液を分注した。一晩培養後、95μLの新鮮な培養メディウムと交換し、予め調整しておいた2mM、200μM、20μM、2μMのシタフロキサシン（STFX）水溶液を、5μL/wellずつ添加した。その際のSTFX終濃度は100μM、10μM、1μM、及び100nMとなる。対照群には、滅菌水を5μL/wellずつ添加した。各群はn=4とした。
【００３３】
6時間後、24時間後、48時間後に培養メディウムを全量除去し、4℃に冷やしたCa含有PBS（Sigma社、D8662）100μL/wellで1回洗浄した後、Cells-to-CT bulk Lysis Reagents (ライフテクノロジーズ社、Cat. 4391851C)のLysis SolutionおよびDNase Iの10:1(v/v)混合液を50μL/wellずつ分注し、5分室温で処理した後にStop solution (ライフテクノロジーズ社、Cat. 4391851Cに同梱)を5μL/wellずつ添加した。その後、2分間室温で処理してRNA抽出液を作製した。Cells-to Ct Bulk RT Reagents（ライフテクノロジーズ社、Cat. No. 391852C）に含まれるx2 RT Buffer、x20 RT Enzyme Mix、及びNuclease Free Waterを10:1:5(v/v/v)を混合した液を作製し40μL/wellずつPCR tube（ライフテクノロジー社, Cat. No.4306737）に分注した。さらにRNA抽出液10μL/wellを混合した後、LifePro Thermal Cycler(Bioer Technology Co.,Ltd，TC-96/G/H(b)A)を用いて37℃で1時間、95℃で5分間処理した後、Nuclease Free Waterで5倍希釈してcDNA液100μLを調製した。
【００３４】
骨形成関連遺伝子量を検出するために表1に示したTaqMAN probeセットを選抜し、ライフテクノロジーズ社のTaqMAN Custom Arrays Format 96aカード（Cat. No. 4342259）を作製した。
【００３５】
【表１】
2016154446.tif 000002
【００３６】
上記で作製したcDNA液にTaqMAN Fast Advanced Master Mix（ライフテクノロジーズ社、Cat. No. 4444558）を100μL混合し、200μLの混合液を得た。混合液はTaqMAN Custom Arrays Format 96aカードに2レーンに分けて注入し、遠心機CT-6E およびTH2 ロータ（日立工機社製）を用いて、室温にて1,600 rpm, 1分×2回により各アッセイウェルにロードした。TaqMAN PCR反応は、ViiA7 リアルタイムPCRシステム（ライフテクノロジーズ社）を用いて、以下のFast Protocol：95℃/20秒、その後95℃/1秒及び60℃/20秒を1サイクルとして40サイクルを繰り返すことにより実施した。
【００３７】
得られた遺伝子増幅曲線はViiA7プログラムおよびData Assistプログラム（ライフテクノロジーズ社）を用いて、ΔΔCt法により発現量（RQ）を算出した。その際、コントロール遺伝子として
RPLP0-Hs99999902_m1
B2M-Hs99999907_m1
PPIA-Hs99999904_m1
18S-Hs99999901_s1
GAPDH-Hs99999905_m1
を用いて、計算に用いた。また、student's t-testにより有意差検定を実施し、p<0.05を優位な変動とした。
【００３８】
その結果、HOS/TE85細胞ではシタフロキサシンの各濃度及び各作用時間において以下の表2及び図1に示す遺伝子での転写上昇が認められ、MG63については表3及び図2に示す遺伝子での転写上昇が認められた。
【００３９】
【表２】
2016154446.tif 000003
註
1：値は平均値である（n=4）．
2：下線の遺伝子の転写上昇はMG63細胞を用いた実験においても観察されたものである．
3：灰色で囲まれた値は2倍以上の増加（P<0.05）であることを示している．
【００４０】
【表３】
2016154446.tif 000004
註
1：値は平均値である（n=4）．
2：下線の遺伝子の転写上昇はHOS/TE85細胞を用いた実験においても観察されたものである．
3：灰色で囲まれた値は2倍以上の増加（P<0.05）であることを示している．
【図１】
2016154446.tif 000005
【図２】
2016154446.tif 000006