(57)【要約】【課題】イメージング質量分析データから各生体組織を特徴付ける領域特異的な発現情報を収集する。【解決手段】試料上の任意の測定点を初期的に設定したあと（Ｓ２１）、その測定点に隣接する別の１つの測定点を選定する（Ｓ２２）。その２つの測定点におけるマススペクトルデータを取得し、それらのピーク情報にコモンピーク法を適用して共通する重要なピーク情報を抽出する（Ｓ２３）。共通ピーク情報があれば、これら測定点は同一細胞上に設定されているとみなすことができるから、それら測定点を含むように領域を拡大する（Ｓ２４、Ｓ２６）。これを繰り返すことで共通ピーク情報を有する領域を拡大し（Ｓ２７−Ｓ２８）、最終的に求まった領域を示す画像を画面上に表示する（Ｓ２９）。これにより、光学顕微画像上で識別が困難である同一細胞の占める領域を自動的に求めることができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行する質量分析装置で収集された質量分析データを処理する質量分析データ処理方法であって、
a)試料上の２次元領域内の１つの微小領域と、該微小領域に空間的に隣接する別の微小領域とを選定する処理対象設定ステップと、
b)前記処理対象設定ステップにより選定された２つの微小領域に対する質量分析データを用い、それら２つの微小領域の間で共通性の高いピーク情報を共通発現情報として抽出する共通発現情報抽出ステップと、
を有することを特徴とする質量分析データ処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析データ処理方法であって、
前記質量分析装置は試料上の各微小領域に対する質量分析を実行するとともに該試料上の光学顕微画像を取得可能な装置であり、
前記処理対象設定ステップは、試料上の所定領域について取得された光学顕微画像に対する視覚的判断に基づいて、同一の組成を有する又は同一の性状を示す部位であるとみなせる小領域を指定する小領域指定ステップを含み、その指定された小領域に含まれる全ての微小領域について空間的に隣接する２つの微小領域の組み合わせ全てを選定し、
前記共通発現情報抽出ステップでは、前記処理対象設定ステップにより選定された全ての微小領域の組み合わせについてそれぞれ共通発現情報を抽出することを特徴とする質量分析データ処理方法。
【請求項３】
請求項１に記載の質量分析データ処理方法であって、
前記処理対象設定ステップにより選定された或る２つの微小領域について前記共通発現情報抽出ステップの処理により共通発現情報が抽出された場合に、前記処理対象設定ステップではそれら２つの微小領域のいずれかに空間的に隣接する別の微小領域を選定して２つの微小領域の組み合わせを決め、前記共通発現情報抽出ステップではその２つの微小領域に対する質量分析データを用いて共通発現情報を抽出する、という処理を、元の２つの微小領域に対して選び得る全ての２つの微小領域の組み合わせについて実行し、さらに共通発現情報が抽出できなくなるまでこれを繰り返すことで、共通発現情報が抽出可能な微小領域の集合である領域を確定する特異的領域識別処理を実行することを特徴とする質量分析データ処理方法。
【請求項４】
試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行する質量分析装置で収集された質量分析データを処理する質量分析データ処理装置であって、
a)試料上の２次元領域内の１つの微小領域と、該微小領域に空間的に隣接する別の微小領域とを選定する処理対象設定手段と、
b)前記処理対象設定手段により選定された２つの微小領域に対する質量分析データを用い、それら２つの微小領域の間で共通性の高いピーク情報を共通発現情報として抽出する共通発現情報抽出手段と、
を有することを特徴とする質量分析データ処理装置。
【請求項５】
請求項４に記載の質量分析データ処理装置であって、
前記質量分析装置は試料上の各微小領域に対する質量分析を実行するとともに該試料上の光学顕微画像を取得可能な装置であり、
前記処理対象設定手段は、試料上の所定領域について取得された光学顕微画像に対する視覚的判断に基づいて、同一の組成を有する又は同一の性状を示す部位であるとみなせる小領域を指定する小領域指定手段を含み、その指定された小領域に含まれる全ての微小領域について空間的に隣接する２つの微小領域の組み合わせ全てを選定し、
前記共通発現情報抽出手段は、前記処理対象設定手段により選定された全ての微小領域の組み合わせについてそれぞれ共通発現情報を抽出することを特徴とする質量分析データ処理装置。
【請求項６】
請求項４に記載の質量分析データ処理装置であって、
前記処理対象設定手段により選定された或る２つの微小領域について前記共通発現情報抽出手段により共通発現情報が抽出された場合に、前記処理対象設定手段ではそれら２つの微小領域のいずれかに空間的に隣接する別の微小領域を選定して２つの微小領域の組み合わせを決め、前記共通発現情報抽出手段ではその２つの微小領域に対する質量分析データを用いて共通発現情報を抽出する、という処理を、元の２つの微小領域に対して選び得る全ての２つの微小領域の組み合わせについて実行し、さらに共通発現情報が抽出できなくなるまでこれを繰り返すことで、共通発現情報が抽出可能な微小領域の集合である領域を確定する特異的領域識別手段をさらに備えることを特徴とする質量分析データ処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の２次元領域内の複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行して収集される質量分析データを解析する質量分析データ処理方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織等の試料の形態観察を行うと同時に、その試料上の所定領域に存在する分子の分布を測定する装置として、顕微質量分析装置又はイメージング質量分析装置などと呼ばれる装置が開発されている（非特許文献１、２など参照）。こうした装置によれば、試料をすり潰したり破砕したりすることなく試料の形態をほぼ維持したまま、顕微観察に基づいて指定された試料上の任意の領域に含まれる特定の質量電荷比m/zをもつイオンの分布画像（マッピング画像）を得ることが可能である。そのため、例えば生化学分野などにおいて、生体内細胞に含まれるタンパク質等の分布情報を得るなどの応用が期待されている。また、特に医療・薬学分野においては、癌細胞など特定の細胞に特異的に発現する物質を調べることによる病変分布の把握などの応用が期待されている。
【０００３】
イメージング質量分析装置では、試料上の光学顕微画像と任意の質量電荷比における質量分析イメージング画像とが得ることができるが、一般に、質量分析イメージング画像の空間分解能（解像度）は光学顕微画像の空間分解能に比べて遙かに低い。例えば、特許文献１の記載によれば、光学顕微画像の空間分解能は０．５μmであるのに対し質量分析イメージング画像の空間分解能は３０μm程度である。このような分解能の差異のため、例えば光学顕微画像上では色や模様などによって複数の組織が明確に区別可能な場合であっても、質量分析イメージング画像上ではそれら組織の区別がつかないことがよくある。そのため、質量分析イメージング画像から得られる情報、例えば同画像データに対する統計的解析処理結果について評価や判断を行う際に、光学顕微画像による情報は有用である。
【０００４】
イメージング質量分析結果と光学顕微画像とを組み合わせた解析手法として、特許文献１に記載の分析方法が知られている。該文献に記載の方法では、生体組織切片等の試料上の特定の微小領域に対するマススペクトルが求まったならば、その実測のマススペクトルとデータベース中の基準マススペクトルとの差を計算して差分スペクトルを求め、その差分スペクトルを表示画面上に表示する。この差分スペクトルの表示上では、特定の微小領域にのみ存在する物質のピーク（基準マススペクトルには存在しないピーク）は実線で示され、逆に特定の微小領域には存在せず基準マススペクトルにのみ存在するピークは点線で示される。そして、この差分スペクトルの情報に対し統計的解析を行うことによって、そのスペクトルの導出元である微小領域を複数のクラス（同一組織であるとみなせるグループ）のいずれかに分類する。試料上に設定された各微小領域について同様にしてクラス分けを行うと、試料上の領域がクラスに応じて分類されることになる。ただし、上述したように質量分析イメージングを行う微小領域のサイズは必ずしも小さくないため、分析者が、空間分解能の高い光学顕微画像を用いて上記処理による微小領域のクラス分けの結果を確認することにより、信頼性の高い評価を行うことができるようにしている。
【０００５】
上記の従来技術では、イメージング質量分析で得られた結果と光学顕微画像による情報とを組み合わせてはいるものの、実際には両者を単に比較し、それによってイメージング質量分析で得られた結果の信頼性を評価しているだけである。そのため、両方の情報を十分に活用できているとは言い難い。光学顕微画像をより積極的に活用することにより、具体的には、光学顕微画像による情報を質量分析イメージング結果の抽出や選択に利用することにより、分析者にとって一層有益で利用価値の高い情報が得られるものと思われるが、そうした手法は現在のところ提案されていない。
【０００６】
一方、上記の従来技術では、光学顕微画像上で色や模様などで異なる組織を識別可能な状態でないと、即ち、光学顕微画像に明確に現れている情報でないと、質量分析イメージング結果の解釈や評価には役に立たない。そのため、光学顕微画像による情報に頼らず、質量分析イメージング結果のみから試料上の領域を適切にクラス分けして可視化するデータ処理技術も重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２８９１８４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】小河潔、ほか５名、「顕微質量分析装置の開発」、島津評論、株式会社島津製作所、平成１８年３月３１日発行、第６２巻、第３・４号、ｐ．１２５−１３５
【非特許文献２】原田高宏、ほか８名、「顕微質量分析装置による生体組織分析」、島津評論、株式会社島津製作所、２００８年４月２４日発行、第６４巻、第３・４号、ｐ．１３９−１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、イメージング質量分析により収集された膨大なデータに基づいて、試料上の異なる組織を識別したり特異的な部位を検出したりするために有意であって且つ分析者が直感的にも理解し易い情報を提示することができる質量分析データ処理方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された第１発明に係る質量分析データ処理方法は、試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行する質量分析装置で収集された質量分析データを処理する質量分析データ処理方法であって、
a)試料上の２次元領域内の１つの微小領域と、該微小領域に空間的に隣接する別の微小領域とを選定する処理対象設定ステップと、
b)前記処理対象設定ステップにより選定された２つの微小領域に対する質量分析データを用い、それら２つの微小領域の間で共通性の高いピーク情報を共通発現情報として抽出する共通発現情報抽出ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１１】
また上記課題を解決するために成された第２発明は第１発明に係る質量分析データ処理方法を実施するための装置であって、試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行する質量分析装置で収集された質量分析データを処理する質量分析データ処理装置であって、
a)試料上の２次元領域内の１つの微小領域と、該微小領域に空間的に隣接する別の微小領域とを選定する処理対象設定手段と、
b)前記処理対象設定手段により選定された２つの微小領域に対する質量分析データを用い、それら２つの微小領域の間で共通性の高いピーク情報を共通発現情報として抽出する共通発現情報抽出手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１２】
即ち、第１発明に係る質量分析データ処理方法及び第２発明に係る質量分析データ処理装置では、空間的に隣接する２つの微小領域について、その２つの微小領域に対する質量分析データから共通発現情報の抽出を試みる。共通発現情報が抽出可能であれば、その２つの微小領域は同一の組成を有する又は同一の性状を示す部位に属するとみることができるし、逆に共通発現情報が抽出できなければ、その２つの微小領域は互いに異なる組成を有する又は異なる性状を示す部位にそれぞれ属するとみることができる。
【００１３】
第１発明の第１の実施態様である質量分析データ処理方法では、質量分析装置として試料上の各微小領域に対する質量分析を実行するとともに該試料上の光学顕微画像を取得可能な装置を用い、
前記処理対象設定ステップでは、試料上の所定領域について取得された光学顕微画像に対する視覚的判断に基づいて、同一の組成を有する又は同一の性状を示す部位であるとみなせる小領域を指定する小領域指定ステップを含み、その指定された小領域に含まれる全ての微小領域について空間的に隣接する２つの微小領域の組み合わせ全てを選定し、
前記共通発現情報抽出ステップでは、前記処理対象設定ステップにより選定された全ての微小領域の組み合わせについてそれぞれ共通発現情報を抽出するものとすることができる。
【００１４】
この第１の実施態様では、例えば試料上の所定領域に対する光学顕微画像を表示手段の画面上に表示し、その画像を見ながら分析者が色、模様などの情報に基づいて同一の組成を有する又は同一の性状を示す部位であるとみなせる範囲を判断し、例えばこの範囲内で適宜の大きさの小領域をポインティングデバイスで指示することで指定するものとすることができる。この場合、共通発現情報抽出ステップにより抽出される共通発現情報は、もともと試料上の光学顕微画像に基づく領域の分類の下に行われたものであるから、光学顕微観察による情報と質量分析による情報とを組み合わせたものであると言える。したがって、光学顕微画像上で、例えば異なる生体組織同士或いは同一生体組織内でも正常部と病変部とが識別可能であれば、各部位を的確に特徴付ける共通発現情報を取得することができる。
【００１５】
また第１発明の第２の実施態様である質量分析データ処理方法では、前記処理対象設定ステップにより選定された或る２つの微小領域について前記共通発現情報抽出ステップの処理により共通発現情報が抽出された場合に、前記処理対象設定ステップではそれら２つの微小領域のいずれかに空間的に隣接する別の微小領域を選定して２つの微小領域の組み合わせを決め、前記共通発現情報抽出ステップではその２つの微小領域に対する質量分析データを用いて共通発現情報を抽出する、という処理を、元の２つの微小領域に対して選び得る全ての２つの微小領域の組み合わせについて実行し、さらに共通発現情報が抽出できなくなるまでこれを繰り返すことで、共通発現情報が抽出可能な微小領域の集合である領域を確定する特異的領域識別処理を実行するようにしてもよい。
【００１６】
即ち、この第２の実施態様では試料上の光学顕微画像は必ずしも必要ではなく、質量分析データに基づいて、空間的に隣接する微小領域が共通発現情報を有しているような領域が連鎖的に探索され、その結果、例えば同一の生体組織、或いは或る生体組織内の病変部などが１つの領域として識別可能となる。この探索には光学顕微画像の情報は利用されないため、光学顕微画像上でみると異なる生体組織等の境界が明瞭には現れていないような場合でも、その境界を境に異なる生体組織であることを識別することができる。
【発明の効果】
【００１７】
第１発明に係る質量分析データ処理方法及び第２発明に係る質量分析データ処理装置によれば、イメージング質量分析により収集された膨大なデータに基づいて、試料上の特定の部位において特異的に発現する情報を的確に精度よく収集することができる。それにより、例えばヒトの生体試料に対し、癌などの病変部とそれ以外の正常部とをそれぞれ特徴付ける情報を得ることができるので、これによって病変部の拡がりの判断などに有益な情報を提供することができる。
【００１８】
特に、第１発明の第１の実施態様に係る質量分析データ処理方法及びこの方法を実施する装置によれば、質量分析イメージングに比べて十分に高い空間分解能である光学顕微画像による情報が共通発現情報の取得に利用されているので、例えば異なる生体組織の区別や病変部と正常部との区別が視覚的に容易である場合には、共通発現情報の正確性を大幅に向上させることができる。また、例えば１個の癌細胞における細胞特異的な発現情報の抽出が可能となる。
【００１９】
さらにまた、第１発明の第２の実施態様に係る質量分析データ処理方法及びこの方法を実施する装置によれば、試料の光学顕微画像上で異なる生体組織の色や模様などの形態に差がないような場合やＭＡＬＤＩのためのマトリクス塗布の影響で光学顕微画像が不鮮明である場合でも、特定の生体組織や病変部の範囲を知ることができる。また、試料の光学顕微画像上には現れない未知の空間発現クラスタが存在した場合でも、それを発見することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る質量分析データ処理方法を実施するイメージング質量分析装置の一実施例の概略構成図。
【図２】本実施例のイメージング質量分析装置における領域特異的発現情報抽出のための処理手順を示すフローチャート。
【図３】図２に示した領域特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図。
【図４】本実施例のイメージング質量分析装置における細胞特異的発現情報抽出のための処理手順を示すフローチャート。
【図５】図４に示した細胞特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図。
【図６】本実施例のイメージング質量分析装置における空間特異的発現情報抽出のための処理手順を示すフローチャート。
【図７】図６に示した空間特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図。
【図８】空間特異的発現情報抽出処理を適用した測定対象の光学顕微画像を示す図。
【図９】図８に示したサンプルに対し空間特異的発現情報抽出処理を実施した結果新たに抽出された物質の質量電荷比を平均マススペクトル上に示した図（ａ）、及びその各質量電荷比におけるイオンのマッピング画像（ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る質量分析データ処理方法を実施するためのイメージング質量分析装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例によるイメージング質量分析装置の概略構成図である。
【００２２】
このイメージング質量分析装置は、試料３上の測定対象である２次元測定対象領域３ａ内の各測定点３ｂに対する質量分析をそれぞれ実行するイメージング質量分析部１と、試料３上の２次元測定対象領域３ａの全体又はその一部の光学顕微観察像を撮影する顕微観察部２と、イメージング質量分析部１で収集されたマススペクトルデータを解析処理するデータ処理部４と、マススペクトルデータ等の各種データを記憶しておくデータ記憶部５と、顕微観察部２で撮影された画像信号を処理して光学顕微画像を構成する顕微画像処理部６と、それら各部を制御する制御部７と、制御部７に接続された操作部８及び表示部９と、を備える。
【００２３】
図示しないが、イメージング質量分析部１は例えば非特許文献１、２などに記載のように、ＭＡＬＤＩイオン源、イオン輸送光学系、イオントラップ、飛行時間型質量分析器、イオン検出器などを含み、測定点３ｂに対応するｘ方向、ｙ方向にそれぞれ所定サイズの微小領域に対し所定質量電荷比範囲に亘る質量分析を実行する。イメージング質量分析部１は試料３が載置された図示しない試料ステージをｘ、ｙの２軸方向に高精度で移動させる駆動部を含み、試料３を所定ステップ幅で移動させる毎に質量分析を実行することにより、任意のサイズの領域に対するマススペクトルデータの収集が可能となっている。
【００２４】
データ処理部４は、スペクトルデータ収集部４１、ピーク情報抽出部４２、領域特異的ピーク情報抽出処理部４３、細胞特異的ピーク情報抽出処理部４４、空間特異的ピーク情報抽出処理部４５、を機能ブロックとして備える。データ記憶部５は、仮想的に分離された記憶領域としてスペクトルデータ記憶部５１、領域別ピーク情報記憶部５２、特異的ピーク情報記憶部５３を含む。なお、データ処理部４、データ記憶部５、顕微画像処理部６、制御部７などの機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータに搭載された専用の処理・制御ソフトウエアを実行することにより達成される。
【００２５】
まず本実施例のイメージング質量分析装置において実施される特徴的なデータ処理手法の１つである領域特異的発現情報抽出の処理について、図２、図３を参照して説明する。図２は領域特異的発現情報抽出処理の手順を示すフローチャート、図３は領域特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図である。
【００２６】
データ処理の前提として、制御部７の制御の下に、イメージング質量分析部１は試料３上の所定の２次元測定対象領域３ａに含まれる全ての測定点３ｂについてそれぞれ質量分析を実行する。そして、スペクトルデータ収集部４１は測定点３ｂ毎に所定質量電荷比範囲のマススペクトルデータを収集し、これをスペクトルデータ記憶部５１に格納する。
【００２７】
分析者が操作部８からデータ処理開始を指示すると、制御部７の制御の下に顕微観察部２は試料３上の２次元測定対象領域３ａの全体又はその一部の光学顕微画像を撮影し、顕微画像処理部６はその画像信号から２次元画像を再構成して表示部９の画面上に描出する。分析者は表示された光学顕微画像を観察し、色や模様などの形態から同一生体組織である範囲を判断して、操作部（ポインティングデバイス）８により同一生体組織毎に小領域を指定する（ステップＳ１）。ここでは、例えば図３（ａ）に示すような光学顕微画像に対し図３（ｂ）に示すように３つの小領域Ａ、Ｂ、Ｃが設定されたものとする。ちなみに、この例では、例えば小領域Ａは肝癌部、小領域Ｂは肝正常部、小領域Ｃは間質である。
【００２８】
このように観察対象（つまりは処理対象）の小領域が確定すると、ピーク情報抽出部４２は、或る１つの設定された小領域に含まれる全ての測定点３ｂに対するマススペクトルデータをスペクトルデータ記憶部５１から読み出し、このデータからピーク情報を抽出する（ステップＳ２）。具体的には、或るマススペクトルデータに対し、m/z方向（マススペクトルのＸ軸方向）において所定の微小幅のウインドウを設定し、そのウインドウ内で最も強度（マススペクトルのＹ軸方向）の大きな、つまり発現量の多いm/z値を取り出し、そのウインドウ内での分子イオン発現情報（ピーク）としてそのm/z値と強度値とを記録する。そして、上記ウインドウをm/z方向に移動させながら全m/z範囲に亘って分子イオン発現情報を求めることにより、即ち、１つのマススペクトルについてm/z方向にスキャンすることにより、そのマススペクトルデータに対するピーク情報を抽出する。さらに、各測定点３ｂのマススペクトルデータに対してそれぞれ同様にしてピーク情報を抽出する。
【００２９】
ただし、上記のようにして得られたピーク情報は様々な要因によるノイズ情報を含む。そこで、ノイズ情報をできるだけ排除するために、全てのマススペクトルにおけるピーク情報に対しコモンピーク法を適用し、信頼性の高い重要なピーク情報のみを抽出する（ステップＳ３）。具体的には、コモンピーク法では、設定された領域に属する全ての測定点（又は所定の割合以上の測定点）で強度が所定閾値以上であるピークを抽出するために、得られたm/z値毎に正規分布型のガウシアン・カーネル（Gaussian Kernel）関数を用いて発現量の総和を計算し、その分布の中で所定閾値以上の分子イオン発現情報（ピーク）をコモンピークとして抽出すればよい。こうしてノイズと予想されるピークを除き、選別された測定点３ｂ毎のピーク情報をその領域に対する重要ピーク情報として領域別ピーク情報記憶部５２に保存する。このとき、測定点３ｂの座標位置も併せて記憶させておく。
【００３０】
その後、ステップＳ１において指定された小領域が他にもあるか否かが判定され、もしある場合にはステップＳ４からＳ２へと戻り、ステップＳ２〜Ｓ４を繰り返す。以上のようにして、生体組織毎の発現情報（ピーク情報）が領域別ピーク情報記憶部５２に用意されることになる。
【００３１】
分析者は操作部８により比較したい複数（通常２つ）の生体組織（小領域）を指定する（ステップＳ５）。このときには、例えば表示部９の画面に表示された光学顕微画像上で任意の点を指定することで該点が含まれる小領域を特定し、２つの任意の点の指定によって比較する２つの小領域を指定することが可能である。小領域が決まると、領域特異的ピーク情報抽出処理部４３は領域別ピーク情報記憶部５２に記憶されている各領域毎の発現情報のピーク集合をそれぞれ読み出す（ステップＳ６）。
【００３２】
領域特異的ピーク情報抽出処理部４３は異なる小領域同士の発現情報を比較することで、それらを互いに識別し得るような領域特異的なピークを抽出する（ステップＳ７）。一般に領域特異的なピークは１つとは限らない。そこで、複数のピークの組み合わせにより領域特異的なピーク集合を探索するため、機械学習理論で用いられているアダブースト（AdaBoost）アルゴリズムなどの機械学習アルゴリズムを用い、統計的処理により領域特異的ピーク集合を抽出するとよい。もちろん、特殊な場合として、単一のピークのみが領域特異的であるものも、このアルゴリズムで探索可能である。そして、抽出された領域特異的ピーク集合を、特異的ピーク情報記憶部５３に格納して（ステップＳ８）処理を終了する。なお、領域特異的なピーク集合を探索するために、アダブーストアルゴリズム以外に知られている様々な統計的判別手法を利用できることは当然である。
【００３３】
ステップＳ３で導出される領域毎の重要ピーク情報はもともと光学顕微画像に対する分析者の視覚的判断によって選択された小領域毎に求められたものであるから、質量分析データを利用して発現情報を集めたい部位、例えば肝正常部や肝癌部などが光学顕微画像上で或る程度明瞭に識別可能である場合には、この視覚的判断を活かすことにより、精度の高い領域特異的発現情報を収集することができる。
【００３４】
次に、本実施例のイメージング質量分析装置において実施される特徴的なデータ処理手法の１つである細胞特異的発現情報抽出処理について図４、図５を参照して説明する。図４は細胞特異的発現情報抽出処理の手順を示すフローチャート、図５は細胞特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図である。
【００３５】
分析者が操作部８からデータ処理開始を指示すると、制御部７の制御の下に顕微観察部２は試料３上の２次元測定対象領域３ａの全体又はその一部の光学顕微画像を撮影し、顕微画像処理部６はその画像信号から２次元画像を再構成して表示部９の画面上に描出する。分析者は表示された光学顕微画像を観察し、色や模様などの形態から同一生体組織である範囲を判断して、操作部（ポインティングデバイス）８により同一生体組織内で任意の範囲又は特定の点を指定する（ステップＳ１１）。ここでは、例えば図５に示すように同一生体組織であると判断できる小領域Ａの中で範囲Ａ１が設定されたものとする。
【００３６】
次に、ピーク情報抽出部４２は指定された範囲に含まれる全ての測定点の中で互いに隣接する任意の２つの測定点を選定する（ステップＳ１２）。そして、その２つの測定点に対するマススペクトルデータをスペクトルデータ記憶部５１から読み出して、上記ステップＳ２と同様の手法でピーク情報をそれぞれ抽出し、さらに上記ステップＳ３と同様の手法で共通する重要なピーク情報を抽出する（ステップＳ１３）。なお、共通のピークの発現が全く認められない場合には、その旨を一旦記録する。
【００３７】
次に、始めに指定された範囲（例えばＡ１）に含まれる測定点の中で隣接する２つの測定点の組み合わせが他に存在するか否かが判定され（ステップＳ１４）、存在すればステップＳ１２へと戻り、上記と同様にステップＳ１２〜Ｓ１４の処理を実行する。したがって、ステップＳ１２〜Ｓ１４の繰り返しにより、始めに指定された範囲に含まれる全ての測定点について、隣接する２つの測定点の全ての組み合わせについて共通する重要ピーク情報が抽出される。
【００３８】
それから、細胞特異的ピーク情報抽出処理部４４は指定範囲内の全ての隣接２測定点の共通ピーク情報を収集し、それらが共通している、即ち、指定範囲内の全ての測定点で共通のピーク発現が認められる場合には、これら測定点が同一の細胞に設定されている又は同種の細胞がそれら測定点の位置に存在するものと解釈し、共通のピーク情報を抽出してそれを信頼度の高い細胞特異的発現情報として特異的ピーク情報記憶部５３に格納する（ステップＳ１５、Ｓ１６）。一方、指定範囲内の測定点で共通のピーク発現が認められない場合には、指定範囲は少なくとも２以上の異種の細胞に跨っていると解釈できるから、細胞特異的発現情報は特異的ピーク情報記憶部５３に格納されない。
【００３９】
これにより、或る１つの細胞に特異的な発現情報、つまりm/z値及び強度値を見い出すことができる。したがって、例えば癌細胞について特異的な発現情報を抽出すれば、その癌細胞に関する有益な情報が得られることになる。
【００４０】
上述の細胞特異的発現情報抽出処理では、始めに光学顕微画像を参照して分析者が処理対象の範囲を指定していたが、その範囲を限定せずに共通のピーク情報が見出せる測定点を空間上で連鎖的に探索することにより、共通のピーク発現が認められる範囲を調べることができる。これが、本実施例のイメージング質量分析装置において実施される特徴的なデータ処理手法の１つである空間特異的発現情報抽出処理である。
この処理手順について図６、図７を参照して説明する。図６は空間特異的発現情報抽出処理の手順を示すフローチャート、図７は空間特異的発現情報抽出処理を説明するための概念図である。
【００４１】
まず、空間特異的ピーク情報抽出処理部４５は任意の測定点の座標を初期的に設定する（ステップＳ２１）。この測定点は予め決められたアルゴリズムにより自動的に決められるようにしてもよいし、或いは、分析者による操作部８からの指示に基づいて決められるようにしてもよい。次にピーク情報抽出部４２は、設定された１つの測定点に空間的に隣接する別の１つの測定点を選定する（ステップＳ２２）。そして、その２つの測定点に対するマススペクトルデータをスペクトルデータ記憶部５１から読み出して、上記ステップＳ２と同様の手法でピーク情報をそれぞれ抽出し、さらに上記ステップＳ３と同様の手法で共通する重要なピーク情報を抽出する（ステップＳ２３）。ここで共通のピーク情報が存在しない場合には、ステップＳ２４からＳ２５へと進み、初期設定した測定点の座標を変更してステップＳ２２へと戻る。
【００４２】
２次元表面上で隣接する座標位置にある２つの測定点において共通のピーク情報が存在した場合には、前述したように、これら測定点が同一の細胞に設定されている又は同種の細胞がそれら測定点の位置に存在するものと解釈できる。そこで、空間特異的ピーク情報抽出処理部４５は、ステップＳ２１又はＳ２５により初期設定された測定点を含み、ステップＳ２２で選定された測定点をさらに含むように着目する領域を空間的に拡大する（ステップＳ２６）。そして、その拡大された着目領域に含まれる全ての測定点について、該測定点とそれに空間的に隣接し着目領域外に位置する測定点との組み合わせの全てに関してステップＳ２３、Ｓ２４の処理が実行済みであるか否かを判定する（ステップＳ２７）。もし、未処理である測定点の組み合わせが存在する場合には、上記着目領域をさらに拡大できる可能性があるから、一方が着目領域に含まれた未処理の隣接する２つの測定点を新たに選定し（ステップＳ２８）、ステップＳ２３へと戻る。
【００４３】
即ち、ステップＳ２３、Ｓ２４、Ｓ２６〜Ｓ２８の繰り返しにより、イメージング質量分析が実施された２次元領域上で空間的に隣接する２つの測定点に共通するピーク情報（発現情報）が連鎖的に調べられ、共通ピーク情報が抽出可能であればそれらは同一のグループであるとみなされて該グループが占める着目領域が拡大される。これを模式的に示したのが図７（ａ）であり、この場合には光学顕微画像上で異なる生体組織の区別ができなくても問題ない（それ故に図７（ａ）では異なる生体組織の境界を点線で示している）。
【００４４】
隣接する測定点に共通ピーク情報がある限り、着目領域は拡大されてゆき、その着目領域を囲む境界を挟んでその内側（つまり着目領域内）に位置する任意の測定点とそれに隣接する外側（つまり着目領域外）に位置する測定点との共通ピーク情報が見つからなくなると、ステップＳ２７からＳ２９へと進んで着目領域の拡大は終了し、その領域が確定する。そこで、制御部７を通してその領域を示すような画像を表示部９の画面に表示する。その結果、例えば図７（ｂ）に示すように、同一の生体組織が着目領域として描画されることになる。
【００４５】
なお、図６に示したのは１つの着目領域を抽出する処理であるが、発現情報が共通する複数の領域を抽出する場合には、ステップＳ２９で１つの着目領域が確定した後にステップＳ２１へと戻り、既に確定した着目領域外に新たに初期的な測定点を定め、その測定点から周囲に向かって連鎖的に発現情報が共通する領域を探索すればよい。これを繰り返すことで、イメージング質量分析が実行された試料３上の２次元領域を形態や性状が近い複数の区画に分割することができる。これは純粋に質量分析結果に基づいた分類であるので、光学顕微画像上には現れない情報に基づいた分類を行うことができ、例えば癌部と正常部とが視覚上区別不可能な場合であっても、癌部の占める範囲を調べることが可能である。
【００４６】
上述した空間特異的発現情報抽出処理を適用した一実測例について説明する。図８は測定対象であるマウス網膜切片の光学顕微画像である。マウス網膜切片の質量分析イメージングは装置校正などにおいて頻繁に利用されており、どのような物質が検出されるのかについては、文献（例えば、Hayasaka et.al.,Development of imaging mass spectrometry (IMS) dataset extractor software, IMS convolution Analytical and Bioanalytical Chemistry, pp.183-193, 2011）などで、一般に知られている。
【００４７】
図８に示したサンプルから質量分析イメージングデータを取得し（レーザ径１０μｍ、２５０×２５０ピクセル）、上述した空間特異的発現情報抽出処理を実施した。その結果、従来は知られていなかった１８個の物質を抽出することができた。図９（ａ）は、本方法により新たに抽出された１８個の物質の質量電荷比を、全ピクセルの平均マススペクトルの上に示した図である。図９（ｂ）はその各質量電荷比におけるイオンのマッピング画像である。このように空間特異的発現情報抽出処理によれば、光学顕微画像上では明瞭でない物質の分布を調べることが可能となる。
【００４８】
なお、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４９】
１…イメージング質量分析部
２…顕微観察部
３…試料
３ａ…２次元測定対象領域
３ｂ…測定点
４…データ処理部
４１…スペクトルデータ収集部
４２…ピーク情報抽出部
４３…領域特異的ピーク情報抽出処理部
４４…細胞特異的ピーク情報抽出処理部
４５…空間特異的ピーク情報抽出処理部
５…データ記憶部
５１…スペクトルデータ記憶部
５２…領域別ピーク情報記憶部
５３…特異的ピーク情報記憶部
６…顕微画像処理部
７…制御部
８…操作部
９…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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