(57)【要約】【課題】ガングリオシドGM2含有抽出物のより簡便且つ効率的な製造方法を提供すること。【解決手段】工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法：（ａ）エイ類の筋肉から脂質を抽出する工程、及び（ｂ）工程（ａ）で得られた脂質抽出物をけん化後、中和する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法：
（ａ）エイ類の筋肉から脂質を抽出する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた脂質抽出物をけん化後、中和する工程。
【請求項２】
前記工程（ａ）における抽出溶媒がクロロホルム及びアルコールの混合溶媒である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
さらに、工程（ｃ）：
（ｃ）工程（ｂ）で得られた中和物を、クロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程
を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記分画が、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画、又はこれらの組み合わせによって行われる、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）が、工程（ｃ３−１）及び（ｃ３−２）を含む、請求項４に記載の製造方法：
（ｃ３−１）工程（ｂ）で得られた中和物を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程、及び
（ｃ３−２）工程（ｃ３−１）で得られたガングリオシドGM2含有画分を、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程。
【請求項６】
前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、5〜15 mMの濃度で酢酸アンモニウムを含む溶液を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、クロロホルム／アルコール／水の混合溶媒を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する、請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、アイソクラティック溶出によって行われる、請求項４〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法によって製造された、ガングリオシドGM2含有抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法、及び該方法によって製造されたガングリオシドGM2含有抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、糖としてシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の１種であり、糖鎖配列、シアル酸結合部位等が異なる、種々のものが知られている。例えば、ガングリオシドGM2は、GalNAcβ1→4Galβ1→4［α3→2NeuAc］Glcβ1→1Cerという構造を有している（GalNAcβ1→4Galは、N-アセチル-D-ガラクトサミンの1位のヒドロキシル基と、ガラクトースの4位のヒドロキシル基がβグリコシド結合によって連結されていることを示す。以下同様の表記である。）。また、GM3は、Galβ1→4［NeuAcα2→3］Glcβ1→1Cerという構造を有している。
【０００３】
ガングリオシドは、細胞膜表面の脂質ラフトに集中して存在し、細胞のシグナル伝達を調節することが知られている。中でも、ガングリオシドGM2については、その抗体ががんの診断及び治療に有用であること（特許文献１）や、ガングリオシドGM2をワクチンとして接種すると、黒色腫患者のIgG抗体及びIgM抗体を有意に増産させること（非特許文献１）等の有用性が報告されている。
【０００４】
ガングリオシドGM2は、主にヒト脳由来のものが市販されているものの、非常に高価である。また、哺乳類筋肉にガングリオシドGM2が含まれるという報告はあるが（非特許文献２）、その量は痕跡量程度である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０‐２５７８９３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Res. 49, 7045-7050 (2014)
【非特許文献２】J. Biochem. 94, 1359-1365 (1983)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ガングリオシドGM2含有抽出物のより簡便且つ効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者等は、エイ類の筋肉中にガングリオシドGM2が多く含まれていることを見出した。従来、ガングリオシドGM2は動物の筋肉にはほとんど存在しないと考えられていたところ、この知見は全くの予想外であった。また、特定のカラム精製を採用することにより、エイ類筋肉からガングリオシドGM2を効率的に精製できることを見出した。さらに、ケイ酸カラムを用いて精製する場合、カラムからの溶出をアイソクラティック溶出で行うと、より効率的にガングリオシドGM2を溶出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき、さらに研究を重ねた結果、完成されたものである。すなわち、本発明は、以下の構成を包含する。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１０】
項１．工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法：（ａ）エイ類の筋肉から脂質を抽出する工程、及び（ｂ）工程（ａ）で得られた脂質抽出物をけん化後、中和する工程。
【００１１】
項２．前記工程（ａ）における抽出溶媒がクロロホルム及びアルコールの混合溶媒である、項１に記載の製造方法。
【００１２】
項３．さらに、工程（ｃ）：（ｃ）工程（ｂ）で得られた中和物を、クロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程を含む、項１又は２に記載の製造方法。
【００１３】
項４．前記分画が、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画、又はこれらの組み合わせによって行われる、項３に記載の製造方法。
【００１４】
項５．前記工程（ｃ）が、工程（ｃ３−１）及び（ｃ３−２）を含む、項４に記載の製造方法：（ｃ３−１）工程（ｂ）で得られた中和物を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程、及び（ｃ３−２）工程（ｃ３−１）で得られたガングリオシドGM2含有画分を、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程。
【００１５】
項６．前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、5〜15 mMの濃度で酢酸アンモニウムを含む溶液を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する、項４又は５に記載の製造方法。
【００１６】
項７．前記ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、クロロホルム／アルコール／水の混合溶液を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する、項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
【００１７】
項８．前記ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画において、溶出が、アイソクラティック溶出によって行われる、項４〜７のいずれかに記載の製造方法。
【００１８】
項９．項１〜８のいずれかに記載の製造方法によって製造された、ガングリオシドGM2含有抽出物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、エイ類筋肉を原料とすることにより、ガングリオシドGM2含有抽出物をより簡便且つ効率的に製造することができる。また、筋肉は、エイ類の体の多くを占めることから、原料として十分に確保することが可能である。しかも、本発明によれば、この豊富な原料から、より少ないロスでより効率的にガングリオシドGM2を精製することも可能である。なお、エイ類は、魚介類、頭足類、甲殻類等を捕食したり、また漁網中に入り込むことにより漁獲対象を押しつぶしてしまうことから、漁業被害の原因となる。本発明は、エイ類を有効利用することができるため、これらの漁業被害の軽減に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】粗スフィンゴ糖脂質抽出物のTLC分析結果（実施例１（1-1））を示す。
【図２】イオン交換カラム精製画分のTLC分析結果（実施例１（1-2））を示す。
【図３】ケイ酸カラム精製画分のTLC分析結果（実施例１（1-3））を示す。
【図４】精製ガングリオシドGM2のTLC分析結果（実施例１（1-4））を示す。
【図５】精製ガングリオシドGM2の酵素消化物のTLC分析結果を示す（実施例１（1-5））。
【図６】精製ガングリオシドGM2のESI-MS分析結果を示す（実施例１（1-7））。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法に関する。
【００２２】
工程（ａ）
工程（ａ）は、エイ類の筋肉から脂質を抽出する工程である。
【００２３】
エイ類としては、特に限定されるものではないが、例えばトビエイ目動物、シビレエイ目動物、ノコギリエイ目動物、ガンギエイ目動物等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはトビエイ目動物等が挙げられる。
【００２４】
トビエイ目動物としては、特に限定されるものではないが、例えばツバクロエイ科、トビエイ科、アカエイ科、ウチワザメ科、ムツエラエイ科、ウスエイ科、ヒラタエイ科、ウロトリゴン科、ポタモトリゴン科等に属する動物が挙げられる。これらの中でも、ガングリオシドGM2含有抽出物をより効率的に製造できるという観点からは、好ましくはツバクロエイ科、トビエイ科、アカエイ科等に属する動物が挙げられ、より好ましくはツバクロエイ科等に属する動物が挙げられる。ツバクロエイ科に属する動物としては、例えばツバクロエイ等が挙げられる。トビエイ科に属する動物としては、例えばナルトビエイ、マダラトビエイ、オニイトマキエイ等が例示され、好ましくはナルトビエイ等が挙げられる。アカエイ科に属する動物としては、例えばアカエイ等が挙げられる。
【００２５】
シビレエイ目動物としては、特に限定されるものではないが、例えばヤマトシビレエイ科、タイワンシビレエイ科等に属する動物が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヤマトシビレエイ科等に属する動物が挙げられる。ヤマトシビレエイ科に属する動物としては、例えばヤマトシビレエイ等が挙げられる。
【００２６】
ガンギエイ目動物としては、特に限定されるものではないが、例えばガンギエイ科、シノノメサカタザメ科、トンガリサカタザメ科、サカタザメ科等に属する動物が挙げられる。これらの中でも、好ましくはガンギエイ科等に属する動物が挙げられる。ガンギエイ科に属する動物としては、例えばガンギエイ等が挙げられる。
【００２７】
ノコギリエイ目動物としては、特に限定されるものではないが、例えばノコギリエイ科等に属する動物が挙げられる。ノコギリエイ科に属する動物としては、例えばノコギリエイ等が挙げられる。
【００２８】
上記エイ類は1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００２９】
筋肉は、上記動物の筋肉組織を含むものであれば特に限定されるものではないが、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造がより効率的であるという観点から、筋肉組織を、例えば70重量％以上、好ましくは85重量％以上、より好ましくは95重量％以上、よりさらに好ましくは99重量％以上含有するものであることができる。
【００３０】
エイ類の筋肉は、加工せずにそのまま後述の脂質抽出工程に供してもよいが、ガングリオシドGM2含有抽出物の製造がより効率的であるという観点からは、加工してから脂質抽出工程に供することが好ましい。加工の態様としては、特に限定されるものではなく、例えば常温乾燥、加熱乾燥、凍結乾燥等の乾燥処理（好ましくは凍結乾燥）や、アセトン溶解画分の除去（これにより中性脂質が除去される）等が挙げられる。アセトン溶解画分の除去は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、筋肉乾燥物に対して0.5〜100倍（好ましくは1〜50倍）の重量のアセトンを加え、ポリトロン等でホモジナイズした後、ろ過や遠心等により残渣を得ることによって行うことができる。
【００３１】
筋肉は1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３２】
脂質の抽出は、脂質を溶解させることができる種々の溶媒（抽出溶媒）を用いて抽出することにより行われる。抽出方法としては、特に限定されるものではなく、種々の公知の方法を採用することができるが、例えば抽出溶媒を筋肉に加えてホモジナイズした後、不溶性の残渣を除去する方法が挙げられる。得られた脂質抽出物は下記工程（ｂ）に用いられる。
【００３３】
抽出溶媒としては、例えば有機溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトニトリル、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、エーテル類、ピリジン類、ポリエーテル類、超臨界二酸化炭素等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはクロロホルム及びアルコールの混合溶液が挙げられ、より好ましくはクロロホルム及びメタノールを容量比で1：0.2〜5、より好ましくは1：0.4〜3（クロロホルム：メタノール）で混合した溶液が例示される。抽出溶媒は1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３４】
抽出溶媒の重量としては、特に限定されず、筋肉から脂質を抽出するのに十分な量であればよい。具体的には、例えば筋肉の乾燥重量に対して0.5〜100倍、好ましくは1〜50倍の重量であることができる。抽出の際の温度条件は、抽出溶媒の沸点にもよるが、例えばエタノールを用いた場合では、好ましくは0℃〜80℃がよい。抽出温度がこの範囲以下であれば抽出効率が低下し、またこの範囲以上であれば溶剤の揮発をもたらし、またエネルギー使用量が増えるのみである。抽出時間は、特に限定されないが、抽出効率と作業性の観点から、好ましくは10分〜24時間がよい。
【００３５】
不溶性の残渣の除去は公知の方法に従って行うことができる。例えば吸引濾過、フィルタープレス、シリンダープレス、デカンター、遠心分離器、濾過遠心機等により不溶性残渣を除去することができる。
【００３６】
得られた脂質抽出物は、下記工程（ｂ）におけるけん化反応の効率性の観点から、濃縮乾固することが好ましい。濃縮乾固する方法としては、種々の公知の方法、例えば凍結乾燥、蒸発乾燥等が挙げられる。
【００３７】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた脂質抽出物をけん化後、中和する工程である。
【００３８】
工程（ａ）で得られた脂質抽出物をけん化することにより、脂質抽出物中の中性脂質やタンパク質を破壊し、ガングリオシド以外の脂質成分を除くことができる。
【００３９】
けん化は、種々の公知の方法によって行うことができる。例えば、工程（ａ）で得られた脂質抽出物と、アルカリ溶液を混合し、一定時間静置することにより行われる。
【００４０】
アルカリ溶液は、けん化反応を起こすものであれば特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムをアルコールに溶解させた溶液が挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウムをメタノールに溶解させた溶液が挙げられる。アルカリ溶液は、1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００４１】
アルカリ溶液の添加量としては、脂質抽出物中の中性脂質やタンパク質を破壊することができる限り、特に限定されず、脂質抽出物の量に応じて適宜選択されるものであるが、例えば脂質抽出物とアルカリ溶液の混合液におけるpHが10〜14、好ましくは11〜14、より好ましくは12〜14の範囲となるように添加することが好ましい。
【００４２】
脂質抽出物とアルカリ溶液を混合した後の静置時間は、脂質抽出物中の中性脂質やタンパク質を破壊することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば0.1時間以上、好ましくは1時間以上、より好ましくは10時間以上、さらに好ましくは24時間以上の静置時間が挙げられる。
【００４３】
中和は、種々の公知の方法によって行うことができるが、例えば、けん化後の溶液（けん化溶液）に、酸溶液を加えて混合することにより行われる。得られた中和物は、下記工程（ｃ）に用いられる。
【００４４】
酸溶液は、けん化溶液の中和を行うことができる限り特に限定されるものではないが、例えば酢酸、塩酸、硝酸、硫酸、ギ酸、クエン酸等が挙げられる。酸溶液は、1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００４５】
酸溶液の添加量としては、けん化溶液の中和を行うことができる限り特に限定されるものではなく、けん化溶液のpHに従って適宜選択される。
【００４６】
中和後の溶液は、下記工程（ｃ）の移動相用溶媒の調製が容易であるという観点から、濃縮乾固することが好ましい。濃縮乾固する方法としては、種々の公知の方法、例えば凍結乾燥等が挙げられる。また、中和後の溶液を、濃縮乾固する代わりに、又は濃縮乾固した後に、下記工程（ｃ）のクロマトグラフィーに適した溶媒を選択できる観点から、濃縮乾固物を透析して脱塩することが好ましい。透析方法としては、脱塩することができる限り特に限定されるものではないが、蒸留水に対して透析することが挙げられる。
【００４７】
工程（ｃ）
本発明によれば、さらに工程（ｃ）を組み合わせることによって、ガングリオシドGM2の純度をより高めることが可能である。
【００４８】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた中和物を、クロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程である。
【００４９】
クロマトグラフィーによる分画の方法は特に制限されるものではないが、一例としては、工程（ｂ）で得られた中和物を、移動相用溶媒と混合し、該混合液をクロマトグラフィー用カラム中に流すことにより、該混合液中の成分をカラムの担体に吸着させ、洗浄溶媒でカラムを洗浄した後、該吸着物を溶出液で溶出することにより行われる。分画は、該溶出液で溶出された液を、溶出順に複数画分に分けて回収することにより行われる。
【００５０】
クロマトグラフィー用カラムとしては、ガングリオシドGM2を吸着することができる限り特に限定されず、公知のカラムを適宜選択することができる。このようなカラムとしては、例えば陰イオン交換カラム、ケイ酸カラム、逆相分配カラム、順相分配カラム、シリカゲルを化学修飾した-RP、-CN、若しくは-Diol等が挙げられる。これらの中でも、ガングリオシドGM2をより効率的に精製できるという観点からは、好ましくは陰イオン交換カラム、ケイ酸カラム等が挙げられる。
【００５１】
移動相用溶媒は、ガングリオシドGM2をカラムに吸着させることができるものである限り特に限定されず、カラムの種類に従って適宜選択することができる。カラムが陰イオン交換カラム又はケイ酸カラムである場合は、例えばクロロホルム／アルコール／水の混合溶媒が挙げられる。カラムがケイ酸カラムである場合は、クロロホルム／アルコールの混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、種々のアルコールを使用することができるが、好ましくはメタノールが挙げられる。クロロホルム／アルコール／水の混合溶媒の混合割合は、特に限定されるものではないが、一つの好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：200〜800：20〜90（容量比）である混合割合が挙げられ、より好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：300〜500：40〜70（容量比）である混合割合が挙げられ、さらに好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：350〜450：50〜65（容量比）である混合割合が挙げられる。移動相用溶媒は、1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００５２】
洗浄液は、カラムに吸着したガングリオシドGM2を脱離させないものである限り特に限定されず、カラムの種類に従って適宜選択することができる。カラムが陰イオン交換カラム又はケイ酸カラムである場合は、例えばクロロホルム／アルコール／水の混合溶媒が挙げられる。カラムがケイ酸カラムである場合は、クロロホルム／アルコールの混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、種々のアルコールを使用することができるが、好ましくはメタノールが挙げられる。クロロホルム／アルコール／水の混合溶媒の混合割合は、特に限定されるものではないが、一つの好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：200〜800：20〜90（容量比）である混合割合が挙げられ、より好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：300〜500：40〜70（容量比）である混合割合が挙げられ、さらに好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：350〜450：50〜65（容量比）である混合割合が挙げられる。洗浄液は、1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００５３】
溶出は、公知の方法、例えば、アイソクラティック溶出、リニアグラジエント溶出、又はステップワイズ溶出によって行われる。アイソクラティック溶出は、溶出が、同一組成を有する1種類の溶出液によって行われる。リニアグラジエント溶出は、溶出が、溶出液中の特定成分（1種又は2種以上）の濃度を徐々に変化させながら行われ、通常、ある組成を有するA液と、A液とは別の組成を有するB液とを、A液に対するB液の割合を徐々に増やしながら混合して、溶出が行われる。より具体的には、リニアグラジエント溶出は、例えば100％のA液で溶出し、A液に加えるB液の量を徐々に増やしながらさらに溶出を行い、最終的に100％のB液で溶出を行うことによって行われる。ステップワイズ溶出は、溶出が、溶出液中の特定成分（1種又は2種以上）の濃度が異なる複数種類の溶出液を、順に溶出に用いることにより行われる。より具体的には、ステップワイズ溶出は、第1液、第2液、・・・第n液（n＝2以上）を準備し、まず第1液で溶出し、次に第2液で溶出し、・・・最後に第n液で溶出することにより行われる。
【００５４】
溶出液は、カラムに吸着したガングリオシドGM2を脱離させることができるものである限り特に限定されず、カラムの種類、溶出方法に従って適宜選択することができる。溶出液は、1種単独で採用してもよいが、2種又は3種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００５５】
カラムが陰イオン交換カラムである場合は、溶出液としては、例えば酢酸アンモニウム及び／又は重炭酸アンモニウムを含む溶液であって、該溶液の溶媒がクロロホルム／アルコール／水の混合溶媒である溶液が挙げられる。アルコールとしては、種々のアルコールを使用することができるが、好ましくはメタノールが挙げられる。クロロホルム／アルコール／水の混合溶媒の混合割合は、特に限定されるものではないが、一つの好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：200〜800：20〜90（容量比）である混合割合が挙げられ、より好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：300〜500：40〜70（容量比）である混合割合が挙げられ、さらに好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：350〜450：50〜65（容量比）である混合割合が挙げられる。溶出液中の酢酸アンモニウムの濃度としては、ガングリオシドGM2を溶出することができる濃度である限り特に限定されるものではない。このような濃度は、例えば3〜20 mM、好ましくは5〜15 mM、より好ましくは7〜12mMの濃度が挙げられる。カラムが陰イオン交換カラムである場合、より効率的にガングリオシドGM2を精製できるという観点からは、ガングリオシドGM2以外の不純物を、酢酸アンモニウムが低濃度（0〜3 mM、好ましくは0〜5 mM）の溶出液で除去してから、上記溶出を行うことが好ましい。
【００５６】
カラムがケイ酸カラムである場合は、溶出液としては、例えばクロロホルム／アルコール／水の混合溶媒が挙げられる。カラムがケイ酸カラムである場合は、クロロホルム／アルコールの混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、種々のアルコールを使用することができるが、好ましくはメタノールが挙げられる。クロロホルム／アルコール／水の混合溶媒の混合割合は、特に限定されるものではないが、一つの好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：20〜80：5〜25（容量比）である混合割合が挙げられ、より好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：40〜70：10〜20（容量比）である混合割合が挙げられ、さらに好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：50〜60：12〜18（容量比）である混合割合が挙げられ、よりさらに好ましい態様として、クロロホルム：アルコール：水が100：54〜68：14〜17（容量比）である混合割合が挙げられる。また、カラムがケイ酸カラムである場合、より効率的にガングリオシドGM2を精製できるという観点からは、上記溶出液を用いたアイソクラティック溶出が好ましい。その他の溶出方法（リニアグラジエント溶出やステップワイズ溶出）を採用する場合は、上記溶出液が使用される限りにおいて、溶出方法は特に限定されない。
【００５７】
クロマトグラフィー及び分画のその他の条件（温度、カラムサイズ、移動相の量、洗浄液の量、溶出液の量、各画分の容量等）は、公知の情報に基づき、適宜選択することができる。
【００５８】
ガングリオシドGM2含有画分を取得するとは、クロマトグラフィーによる分画で得られた複数の画分から、ガングリオシドGM2を含有している画分を選別して、取得することである。この選択は、各画分中にガングリオシドGM2が含まれているか否かを、公知の方法によって判定することによって行われる。この判定は、特に限定されるものではなく、画分中の成分を分析することができる種々の手法を用いて行うことができる。このような手法としては、例えば、薄層クロマトグラフィー、MASSスペクトロメトリー、又はNMR等が挙げられる。これらの中でも、手法の容易性の観点から、薄層クロマトグラフィーが挙げられる。
【００５９】
薄層クロマトグラフィーは公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば、各画分の溶液を濃縮乾固して、クロロホルム／メタノール／12 mM MgCl2溶液の混合溶媒（50／40／10、容量比）等の展開溶媒と混合し、該混合液を担体上で展開させた後、糖や脂質を検出する試薬（DPA試薬や硫酸銅試薬）で染色することにより行われる。この際、市販のガングリオシドGM2を同時に展開させ、検出されたバンド位置を比較することにより、各画分中にガングリオシドGM2が含まれているか否かを判定することができる。
【００６０】
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの場合、好ましい一態様として、溶出が、5〜15 mM（好ましくは7〜12 mM）の濃度で酢酸アンモニウムを含む溶液を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する態様が挙げられる。
【００６１】
ケイ酸カラムクロマトグラフィーの場合、好ましい一態様として、溶出がクロロホルム／アルコール／水の混合溶媒を用いて行われ、該溶液で溶出された画分をガングリオシドGM2含有画分として取得する態様が挙げられる。
【００６２】
クロマトグラフィーによる分画は、ガングリオシドGM2の精製度が高まるという観点から、複数回繰り返すこと、すなわちクロマトグラフィーによる分画によって得られた、ガングリオシドGM2含有画分を、さらに次のクロマトグラフィーによって分画することが好ましい。この態様において、クロマトグラフィー用カラムは、同種のカラムを用いても良いし、異なるカラムを用いてもよい。異なるカラムを用いる場合は、陰イオン交換カラムとケイ酸カラムとの組み合わせが好ましい。このような態様のうちの一つの好ましい態様としては、工程（ｃ）が工程（ｃ３−１）及び（ｃ３−２）である態様が挙げられる。
【００６３】
工程（ｃ３−１）
工程（ｃ３−１）は、工程（ｂ）で得られた中和物を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程である。
【００６４】
工程（ｃ３−１）は、クロマトグラフィー用カラムとして、陰イオン交換カラムを用いる以外、上記工程（ｃ）と同様に行われる。
【００６５】
工程（ｃ３−２）
工程（ｃ３−２）は、工程（ｃ３−１）で得られたガングリオシドGM2含有画分を、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによって分画し、ガングリオシドGM2含有画分を取得する工程である。
【００６６】
工程（ｃ３−２）は、クロマトグラフィー用カラムとして、ケイ酸カラムを用いる以外、上記工程（ｃ）と同様に行われる。
【００６７】
ガングリオシドGM2含有抽出物
斯かるガングリオシドGM2含有抽出物の製造方法によれば、より簡便且つ効率的にガングリオシドGM2含有抽出物を得ることができる。本発明の製造方法によれば、エイの生筋肉1 gから、例えば0.1 mg以上、好ましくは0.2 mg以上、より好ましくは0.5 mg以上、より更に好ましくは0.8 mg以上ものガングリオシドGM2を含む抽出物を得ることができる。さらには、他の糖脂質、その他の不純物がほとんど含まれない、ガングリオシドGM2が高純度に含まれた抽出物を得ることができる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６９】
実施例１：ツバクロエイ筋肉からのガングリオシドGM2含有抽出物の製造
＜1-1．粗スフィンゴ糖脂質の抽出＞
ツバクロエイ筋肉の凍結乾燥物50 gに、1000 mlのアセトンを加えてポリトロンでホモジナイズした後、吸引濾過して残渣1を得た。残渣1に1000 mlのクロロホルム/メタノールの混合溶媒（2／1, v／v）を加えてポリトロンでホモジナイズ（室温（20〜25℃）、5分間）した後、吸引濾過して、濾液1及び残渣2を得た。残渣2に1000 mlのクロロホルム/メタノールの混合溶媒（1／2, v／v）を加えてポリトロンでホモジナイズ（室温（20〜25℃）、5分間）した後、吸引濾過して、濾液2を得た。
【００７０】
濾液1及び2を濃縮乾固後、100 mlの0.6 N NaOH/メタノールに溶解し、室温で一晩放置した（この操作により中性脂質やタンパク質を破壊される）。3.5 mlの濃酢酸で中和後、濃縮乾固してメタノールを除いた後、蒸留水に懸濁して蒸留水に対して透析した。透析内液を凍結乾燥して乾燥粉末（粗スフィンゴ糖脂質抽出物）を得た。
【００７１】
得られた粗スフィンゴ糖脂質抽出物の一部を、展開溶媒（クロロホルム／メタノール／12 mM MgCl2溶液の混合溶媒（50／40／10、v／v／v））に溶解させ、TLC（Merck社製、シリカゲル60プラスティックプレート）により該溶解液を展開した。展開パターンをDPA試薬（糖検出用）、硫酸銅試薬（脂質検出用）、又はニンヒドリン試薬（アミノ酸検出用）によって検出した。DPA試薬による検出は文献1（Anal Biochem.,  287, 337 - 339, 2000）に記載の方法に従って行い、硫酸銅試薬による検出は文献2（J. Lipid Res., 5, 126 - 127 , 1964）に記載の方法に従って行い、ニンヒドリン試薬による検出は文献3（J. Liquid Chromatogr., 7, 2793 - 2801, 1984）に記載の方法に従って行った。結果を図１に示す。
【００７２】
図１において、展開溶媒は、下から上に向けて展開されている（以下の図において同様）。GM1と表示されたレーンは、市販のガングリオシドGM1（フナコシ社製、カタログ番号8G16-2b）を展開したレーンである（以下の図において同様）。Gal-Celと表示されたレーンは、市販のガラクトシルセラミド（シグマ−アルドリッチ社製、カタログ番号C4905）を展開したレーンである（以下の図において同様）。
【００７３】
図１中、粗スフィンゴ糖脂質抽出物を展開して糖検出したレーン（DPA）には、GM1よりもやや移動距離が長いバンドが検出された（アスタリスクで示すバンド）。GM2は、GM1からガラクトースを除いた構造を有しており、GM1より分子量が小さいことから、このバンドがGM2である可能性が示唆された。そこでこの画分を材料として更に精製を行った（下記1-2）。
【００７４】
＜1-2．陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製＞
上記1-1で得られた粗スフィンゴ糖脂質抽出物の全てを9 mlのクロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（15／60／8、v／v／v）に溶解し、該混合溶媒で平衡化したQMAカートリッジ（陰イオン交換体、カラム容積3 ml）にサンプリングした。該混合溶媒9 mlで非吸着物を洗い流した。溶出液として、該混合溶媒に酢酸アンモニウムを5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、又は100 mMの濃度で溶解した溶液（各9 ml）を使用し、酢酸アンモニウム濃度を段階的に上げてステップワイズ溶出を行い、1 mlずつ分画した。
【００７５】
得られた画分を6つの画分：
『FT及びWash画分』
『5 mM の1番目〜7番目の画分（5 mM (1)−5 mM (7)）』
『5 mMの8番目〜10 mMの6番目の画分（5 mM (8)−10 mM (6)）』
『10 mMの7番目〜20 mMの2番目の画分（10 mM (7)−20 mM (2)）』
『20mMの3番目〜100 mMの1番目の画分（20 mM (3)−100 mM (1)）』
『100 mMの2番目〜100 mMの9番目の画分（100 mM (2)−100 mM (9)）』
に分け、それぞれの画分の一部を凍結乾燥し、上記1-1と同様にTLCによる展開及び展開パターンの検出を行った。なお、検出は、全てDPA試薬で行った。結果を図２に示す。
【００７６】
図２中、5 mMの8番目〜10 mMの6番目の画分（5 mM (8)−10 mM (6)）を展開したレーンには、GM1よりもやや移動距離が長いバンドがメインバンドとして検出された。これがGM2のバンドであると推測し、この画分を材料として更に精製を行った（下記1-3）。
【００７７】
＜1-3．ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる精製＞
上記1-2で得られた5 mM (8)−10 mM (6)画分から、乾燥処理（40℃、一晩）により酢酸アンモニウム及び有機溶媒を揮発させた。該処理後の画分を、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（180／100／24、v／v／v）で平衡化したケイ酸カラム（カラム容積 3 ml）にサンプリングした。クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（180／100／24、v／v／v）溶液（20 ml）を溶出液として、アイソクラティック溶出を行い、0.3 mlずつ分画した。
【００７８】
得られた画分それぞれについて、一部を凍結乾燥し、上記1-1と同様にTLCによる展開及び展開パターンの検出を行った。なお、検出は、全てDPA試薬で行った。結果を図３に示す。
【００７９】
図３において、GM2と表示されたレーンは、市販のガングリオシドGM2（フナコシ社製、カタログ番号8G16-3b）を展開したレーンである（以下の図において同様）。各番号は、画分番号を示す。
【００８０】
図３中、画分番号26〜45付近を展開したレーンには、GM1よりもやや移動距離が長く、且つGM2と移動距離が一致するバンドがメインバンドとして検出された。このことから、これらの画分、並びにこれらの画分の精製原料となった上記1-1の粗スフィンゴ糖脂質抽出物、及び上記1-2の5 mM (8)−10 mM (6)画分は、GM2を含んでいることが示された。画分番号26〜38をまとめて濃縮乾固し、これを「精製ガングリオシドGM2」として以下の分析に用いた。
【００８１】
＜1-4．TLCによる精製度の評価＞
上記1-3で得られた精製ガングリオシドGM2を、上記1-1と同様にTLCによる展開及び展開パターンの検出を行った。なお、検出は、DPA試薬、硫酸銅試薬、及びニンヒドリン試薬で行った。結果を図４に示す。
【００８２】
図４中、タンパク質等の不純物が検出されるニンヒドリン試薬検出のレーンでは、全くバンドが検出されなかった。また、糖が検出されるDPA試薬検出のレーン、及び脂質が検出される硫酸銅試薬検出のレーンでは、糖脂質であるGM2以外のバンドは検出されなかった。このことから、精製ガングリオシドGM2の精製度は非常に高いことが示唆された。
【００８３】
＜1-5．酵素消化による生成断片の解析＞
Clostridium perfringens由来のシアリダーゼは、コール酸ナトリウムの存在下で、ガングリオシドGM1及びGM2のシアル酸を切り離すことが知られている（FEBS LETTERS, 65, 229-233, 1976）。そこで、上記1-3で得られた精製ガングリオシドGM2についても、コール酸ナトリウムの存在下で上記シアリダーゼによる消化を受けるかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
【００８４】
精製ガングリオシドGM2（100μg）、市販のガングリオシドGM2（100μg）、市販のガングリオシドGM1（100μg）、又は市販のガングリオシドGM3（100μg）（フナコシ社製、カタログ番号8G16-4b）と、コール酸ナトリウム1％溶液（1μl）、Clostridium perfringens由来のシアリダーゼ溶液（0.0125 unit、5μl）、及び0.02 M酢酸緩衝液（pH 5.22、20μl）とを混合して反応溶液を調製した。また、コール酸ナトリウム及びシアリダーゼのいずれも含まない反応溶液、及びコール酸ナトリウムを含まない反応溶液も調製した。これらの反応溶液を40℃で2日間インキュベートした。反応後の溶液を凍結乾燥させ、展開溶媒（n-ブタノール／酢酸／水の混合溶媒（2／1／1、v／v／v））に溶解させ、TLC（Merck社製、シリカゲル60プラスティックプレート）により該溶解液を展開した。展開パターンをDPA試薬（糖検出用）で検出した。結果を図５に示す。
【００８５】
図５において、精製糖脂質とは、上記1-3で得られた精製ガングリオシドGM2を意味する。GM1、GM2、精製糖脂質、又はGM3と表示されたレーンは、コール酸ナトリウム及びシアリダーゼのいずれも含まない場合を示し、＋Eと表示されたレーンはコール酸ナトリウムを含まない場合を示し、＋E＋Cと表示されたレーンはコール酸ナトリウム及びシアリダーゼの両方を含む場合を示す。また、NeuAcと表示されたレーンは、市販のシアル酸（シグマ−アルドリッチ社製、カタログ番号A2388）を展開したレーンを示す。また、EBはEnzyme Blankを示す。
【００８６】
図５中、精製ガングリオシドGM2（精製糖脂質）を用いた3レーン中、コール酸ナトリウム及びシアリダーゼのいずれも含まない場合のレーン（精製糖脂質）で検出されたバンドの移動度は、市販のGM2のバンドの移動度と一致した。また、精製ガングリオシドGM2（精製糖脂質）を用いた3レーン中、コール酸ナトリウムを含まない場合のレーン（＋E）についてはシアル酸が検出されず、コール酸ナトリウム及びシアリダーゼの両方を含む場合のレーン（＋E＋C）でのみシアル酸が検出された。このデータより、精製ガングリオシドGM2を展開した場合に検出されるメインバンド（図４）が、確かにガングリオシドGM2であることが確認された。
【００８７】
＜1-6．ツバクロエイ筋肉中のガングリオシドGM2の割合の測定＞
上記1-3で得られた精製ガングリオシドGM2に含まれるシアル酸重量を、Y. Uchidaらの方法（J. Biochem., 82, 1425-1433, 1977）に従って測定した。測定されたシアル酸重量から、ガングリオシドGM2全体の分子量に対するシアル酸の分子量の割合に基づいて、ガングリオシドGM2重量を算出した。さらに、精製に用いた筋肉の重量（wet重量）に基づいて、ツバクロエイ生筋肉中のガングリオシドGM2の割合を求めた。その結果、該割合は、約0.81 mg／gであった。この割合は、ヒト筋肉の同割合（非特許文献２）の約20倍もの高い割合であった。
【００８８】
また、上記1-1で得られた粗スフィンゴ糖脂質抽出物を用いて、上記と同様の方法により、ツバクロエイ生筋肉中のガングリオシドGM2の割合を求めたところ約1 mg／gであった。この結果より、上記1-2及び1-3のカラム精製工程におけるガングリオシドGM2の回収率は、81％（『0.81 mg／g』／『1 mg／g』）と非常に高いことが示された。
【００８９】
＜1-7．ESI-MS分析＞
精製ガングリオシドGM2をESI-MS分析した。結果及び分析条件を図６に示す。
【００９０】
図６に示されるように、精製ガングリオシドGM2のメインのピーク（1465.0）は、ガングリオシドGM2（C73H130N3O26）の分子量（1464.89）と一致した。
【００９１】
実施例２：ナルトビエイ及びアカエイ筋肉からのガングリオシドGM2含有抽出物の製造
実施例１と同様の方法に従って、ナルトビエイ及びアカエイから精製ガングリオシドGM2を得た。いずれのエイについても、生筋肉中のガングリオシドGM2の割合（上記1-6）は、ツバクロエイの該割合（上記1-6）と同程度であった。また、カラム精製工程におけるガングリオシドGM2の回収率（上記1-6）についても、ツバクロエイの場合と同程度であった。
【００９２】
比較例１：硬骨魚筋肉からのガングリオシドGM2抽出 
実施例１と同様の方法に従って、硬骨魚の筋肉からガングリオシドGM2の抽出を試みた。しかし、硬骨魚の筋肉の抽出物からはガングリオシドGM2は検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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