(57)【要約】【課題】本発明は、グルコース抑制が高度に解除された変異株を用いた有用物質の製造方法を提供すること。【解決手段】糸状菌又は酵母のタンパク質リン酸化酵素Ａ（ＰＫＡ）の機能が低下又は欠損する変異が導入されている変異株及を用いた、加水分解酵素若しくは酸化還元酵素の製造方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質リン酸化酵素Ａ（ＰＫＡ）の機能が低下又は欠損する変異が導入されている糸状菌又は酵母の変異株を用いた、酵素類の製造方法。
【請求項２】
前記変異株においてＰＫＡをコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項１に記載の酵素類の製造方法
【請求項３】
糸状菌ＰＫＡ変異株がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する、請求項１又は２に記載の酵素類の製造方法。
【請求項４】
前記アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス リューチューエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）又はアスペルギルス ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）である、請求項３に記載の酵素類の製造方法。
【請求項５】
酵母ＰＫＡ変異株が、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する、請求項１又は２に記載の酵素類の製造方法。
【請求項６】
前記ＰＫＡ変異株が、野生株と比較して、加水分解酵素及び／又は酸化還元酵素をコードする遺伝子の発現が亢進しているか、加水分解酵素活性及び／又は酸化還元酵素活性が増大している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素類の製造方法。
【請求項７】
前記加水分解酵素が多糖分解酵素、タンパク質分解酵素及び／又は脂質分解酵素である、請求項６に記載の酵素類の製造方法。
【請求項８】
前記多糖分解酵素が、セルラーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ及びペクチンリアーゼから成る群から選択される、請求項７に記載の酵素類の製造方法。
【請求項９】
前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡをコードする遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列よりなるか、あるいは配列番号１と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列よりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素類の製造方法。
【請求項１０】
前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡが、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなるか、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列よりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素類の製造方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡをコードする遺伝子が、配列番号３に示す塩基配列よりなるか、あるいは配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％の配列同一性を有する塩基配列よりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素類の製造方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡが、配列番号４に示すアミノ酸配列よりなるか、あるいは配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列よりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素類の製造方法。
【請求項１３】
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の糸状菌又は酵母のＰＫＡ変異株の培養物、又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
【請求項１４】
前記加水分解産物が醤油、味噌、日本酒及び焼酎から成る群から選択される発酵生産物である、請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の変異株を用いた有用物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌が環境の糖類、タンパク質、脂質などの炭素源を資化するために生産する酵素はカーボンカタボライト抑制（資化されやすい炭素源の存在下で資化しにくい炭素源の利用に関わる遺伝子の発現が抑制されること）を受ける。特にアミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼなどの多糖分解酵素の高生産では、カーボンカタボライト抑制の解除は重要な課題である。なぜならば、これらの酵素の生産はその基質であるデンプン、セルロース、キシラン、マンナンにより誘導されるからであり、酵素生産培地にこれら多糖を添加する結果、誘導生産された酵素が誘導基質の多糖を分解し、強力なカーボンカタボライト抑制炭素源であるグルコース、キシロース、マンノースを生成するからである。
【０００３】
また、麹菌をはじめとする糸状菌で異種タンパク質の高生産を行う場合に利用される高発現プロモーターのほとんどは、炭素源資化に関わる遺伝子のプロモーターであるため、この場合に使用する宿主についてもカーボンカタボライト抑制が解除されていることが望ましい。
【０００４】
カーボンカタボライト抑制には、広域制御型転写抑制因子ＣｒｅＡが関与する遺伝子発現制御系が知られている。この制御系は、ＣｒｅＡに加えて脱ユビキチン化因子であるＣｒｅＢ及びＣｒｅＣやアレスチン様アダプターであるＣｒｅＤなどにより構成されており、ＣｒｅＢによるＣｒｅＡの脱ユビキチン化を介してＣｒｅＡが遺伝子発現を抑制すると考えられている（例えば、非特許文献１、２参照）。この実験的検証については、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、並びにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属糸状菌の研究例が挙げられる（例えば、非特許文献３、４、５参照）。なお、トリコデルマ属ではＣｒｅＡ、ＣｒｅＢに相当する因子はそれぞれＣｒｅ１、Ｃｒｅ２と命名されている。ＣｒｅＡに依存しないカーボンカタボライト抑制系も存在することが知られており、実例としてはキシラナーゼやラムノシダーゼの例が挙げられる（例えば、非特許文献６、７、８参照）。このＣｒｅＡ非依存的カーボンカタボライト抑制系に関わる因子群に関しては、未知である。
【０００５】
アミラーゼやセルラーゼをはじめとする多糖分解酵素は、市場性の高い産業用酵素として知られている。これらの酵素の生産性向上の障壁の一つがカーボンカタボライト抑制であり、古くから知られているＣｒｅＡ依存的抑制系だけでなく、メカニズムが未知のＣｒｅＡ非依存的抑制系をも解除することにより、著しい酵素生産性の改善が期待できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lockington and Kelly (2002) The WD40-repeat protein CreC interacts with and stabilizes the deubiquitinating enzyme CreB in vivo in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol 43: 1173-1182.
【非特許文献２】Boase and Kelly (2004) A role for creD, a carbon catabolite repression gene from Aspergillus nidulans, in ubiquitination. Mol Microbiol 53: 929-940.
【非特許文献３】Hunter et al (2013) Deletion of creB in Aspergillus oryzae increases secreted hydrolytic enzyme activity. Appl Environ Microbiol 79: 5480-5487.
【非特許文献４】Narakai-Setala et al (2009) Genetic modification of carbon catabolite repression in Trichoderma reesei for improved protein production. Appl Environ Microbiol 75:4853-4860.
【非特許文献５】Denton and Kelly (2011) Disruption of Trichoderma reesei cre2, encoding an ubiquitin C-terminal hydrolase, results in increased cellulase activity. BMC Biotechnol 11:103.
【非特許文献６】Orejas et al (1999) Carbon catabolite repression of the Aspergillus nidulans xlnA gene. Mol Microbiol 31:177-184.
【非特許文献７】Orejas et al (2001) The wide-domain carbon catabolite repressor CreA indirectly controls expression of the Aspergillus nidulans xlnB gene, encoding the acidic endo-β-(1,4)-xylanase X24. J Bacteriol 183:1517-1523.
【非特許文献８】Tamayo-Ramos et al (2012) L-Rhamnose induction of Aspergillus nidulans α-L-rhamnosidase genes is glucose repressed via a CreA-independent mechanism acting at the level of inducer uptake. Microbial Cell Factories 11:26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、カーボンカタボライト抑制が高度に解除された糸状菌および酵母変異株を用いた、加水分解酵素ならびに酸化還元酵素等の酵素類の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ｃＡＭＰ依存的プロテインキナーゼの一種であるプロテインキナーゼＡ（以下、「ＰＫＡ」という場合がある）をコードする遺伝子の破壊株において、ＣｒｅＡ非依存的カーボンカタボライト抑制が解除され、ＣｒｅＡの破壊株では達成できない高いレベルでのセルラーゼやマンナナーゼ生産が、グルコース存在下だけでなく様々な易資化性炭素源の存在下においても達成できることを見出した。また、グルコース存在下でアミラーゼの生産性が向上することも見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、以下の項に記載の発明を提供する：
項１．タンパク質リン酸化酵素Ａ（ＰＫＡ）の機能が低下又は欠損する変異が導入されている糸状菌又は酵母の変異株を用いた、酵素類の製造方法。
項２．前記変異株においてＰＫＡをコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している、項１の酵素類の製造方法
項３．糸状菌ＰＫＡ変異株がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する、項１又は２の酵素類の製造方法。
項４．前記アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス リューチューエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）又はアスペルギルス ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）である、項３の酵素類の製造方法。
項５．酵母ＰＫＡ変異株が、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する、項１又は２の製造方法。
項６．前記ＰＫＡ変異株が、野生株と比較して、加水分解酵素及び／又は酸化還元酵素をコードする遺伝子の発現が亢進しているか、加水分解酵素活性及び／又は酸化還元酵素活性が増大している、項１〜５の酵素類の製造方法。
項７.前記加水分解酵素が多糖分解酵素、タンパク質分解酵素及び／又は脂質分解酵素である、項６の酵素類の製造方法。
項８．前記多糖分解酵素が、セルラーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ及びペクチンリアーゼから成る群から選択される、項７の酵素類の製造方法。
項９．前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡをコードする遺伝子が、配列番号１に示す塩基配列よりなるか、あるいは配列番号１と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列よりなる、項１〜８の酵素類の製造方法。
項１０．前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡが、配列番号２に示すアミノ酸配列よりなるか、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列よりなる、項１〜８の酵素類の製造方法。
項１１．前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡをコードする遺伝子が、配列番号３に示す塩基配列よりなるか、あるいは配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％の配列同一性を有する塩基配列よりなる、項１〜８の酵素類の製造方法。
項１２．前記ＰＫＡ変異株の野生型におけるＰＫＡが、配列番号４に示すアミノ酸配列よりなるか、あるいは配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列よりなる、項１〜８の酵素類の製造方法。
項１３．有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、項１〜１２のいずれかの糸状菌又は酵母のＰＫＡ変異株の培養物、又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
項１４.前記加水分解産物が醤油、味噌、日本酒及び焼酎から成る群から選択される発酵生産物である、項１３の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に用いるＰＫＡ機能が低下乃至欠損している変異株（ＰＫＡ変異株）は、抑制炭素源の存在下において野生株やＣｒｅＡの機能欠損株よりも有意に高い酵素生産性、特にセルラーゼ、マンナナーゼ生産性を示す。一方、ＣｒｅＡの機能欠損株は、アミラーゼ生産性の著しい向上を示すが、セルラーゼ、マンナナーゼ生産性の向上は微弱である。理論に拘束されることを意図するものではないが、この違いは、ＰＫＡの関与するカーボンカタボライト抑制がＣｒｅＡ非依存的なものであることを示している。従って、ＰＫＡ変異株を利用することにより、セルラーゼ、マンナナーゼの生産を著しく向上させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本願実施例１におけるアスペルギルス ニドランスＰＫＡ遺伝子（ｐｋａＡ）の破壊株構築の設計の概略を示す。
【図２】本願実施例１におけるアスペルギルス オリゼＰＫＡ遺伝子（ｐｋａＡ）の破壊株構築の設計の概略を示す。
【図３】本願実施例２において、グルコースとカルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣとする）を含む寒天最少培地上でのセルラーゼ生産性（Ａ）、グルコースとコンニャクマンナンを含む寒天最少培地上でのマンナナーゼ生産性（Ｂ）、及びグルコースとデンプンを含む寒天最少培地上でのアミラーゼ生産性（Ｃ）を、アスペルギルス ニドランス野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ変異株で比較した結果を示す。
【図４】本願実施例４において、マンノース、キシロース、又はガラクトースを含むＣＭＣ寒天最少培地上でのセルラーゼ生産性をアスペルギルス ニドランス野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ変異株で比較した結果を示す。
【図５】本願実施例４において、グルコース存在下又は不在下で、ＣＭＣを含む寒天最少培地上でのセルラーゼ生産性をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す。
【図６】本願実施例４において、グルコース存在下又は不在下で、セロビオースとＣＭＣを含む寒天最少培地上でのセルラーゼ生産性をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す。
【図７】本願実施例５において、グルコースを含むコンニャクマンナン寒天最少培地上でのマンナナーゼ生産性をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す。
【図８】本願実施例６において、セロビオースとＣＭＣを含む液体最少培地で生産される全セルラーゼ活性、単位菌体あたりのセルラーゼ活性、乾燥菌体重量をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す。
【図９】本願実施例７において、アビセルを含む液体最少培地で生産される全セルラーゼ活性をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す
【図１０】本願実施例８において、コンニャクマンナンを含む液体最少培地で生産される全マンナナーゼ活性、単位菌体あたりのマンナナーゼ活性、乾燥菌体重量をアスペルギルス オリゼ野生株、ｐｋａＡ遺伝子破壊株、ｃｒｅＡ破壊株で比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の機能が低下乃至欠損している変異株を用いた酵素類又は有機性材料の加水分解産物の製造方法を提供する。ＰＫＡは基質タンパク質のセリン／スレオニン残基をリン酸化するｃＡＭＰ依存的プロテインキナーゼである。ＰＫＡをコードする遺伝子としては、糸状菌の場合、例えばアスペルギルス ニドランスのＰｋａＡ（ＡＮ６３０５）、アスペルギルス オリゼのＰｋａＡ（ＡＯ０９００２６０００４２６）、アスペルギルス フミガタスのＰｋａＣ（Ａｆｕ２ｇ１２２００）、アスペルギルス ニガーのＰｋａＣ（Ａｎ０２ｇ０４２７０）、ノイロスポラ クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のＰｋａｃ-１（ＮＣＵ０６２４０）などが挙げられる。アスペルギルス ニドランスのＰｋａＡを配列番号１に、そしてアスペルギルス オリゼのＰｋａＡを配列番号３に示す。
【００１３】
ＰＫＡのアミノ酸配列は、糸状菌の各菌種間で保存されている。例示のため、アスペルギルス ニドランスのＰＫＡを配列番号２に、そしてアスペルギルス オリゼのＰＫＡを配列番号４に示す。
【００１４】
アスペルギルス ニドランスとそれ以外のアスペルギルス属糸状菌との間ではＰＫＡは７１〜７７％程度の同一性がある。ＰＫＡはアスペルギルス間だけでなく、ペニシリウムとも６０％程度の相同性がある。その他、アスペルギルス ニドランスのＰＫＡとの比較で、トリコデルマ リーセイやノイロスポラ クラッサもそれぞれ約５９％及び約５０％の相同性を有している。
【００１５】
糸状菌のみならず酵母にも糸状菌のＰＫＡと相同性の高い配列が存在しており、当該配列で表されるタンパク質はｃＡＭＰ依存的プロテインキナーゼとして機能していると考えられる。
【００１６】
さらに、機能低下乃至欠損変異の対象となるＰｋａＡ遺伝子には、当該遺伝子と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子、及び上記遺伝子と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である配列相同性を示す塩基配列からなる遺伝子であって、プロテインキナーゼＡの生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が含まれる。
【００１７】
ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜１５０ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。
【００１９】
従って、配列番号１又は３に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２０】
また、機能低下乃至欠損変異をされるＰＫＡ遺伝子には、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列よりなるＰＫＡと約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である配列相同性を示すアミノ酸配列をコードするものであって、プロテインキナーゼＡの生産に関与する遺伝子が含まれる。
【００２１】
２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００２２】
上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２３】
上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、機能低下乃至欠損変異を行うＰＫＡ遺伝子は、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２４】
上記の各種方法により得たＰＫＡ遺伝子に対し、公知の方法を用いて機能低下乃至欠損変異させた糸状菌又は酵母を作製し、その変異株を本発明における酵素類の製造に使用することができる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「相同性」は同一性を指す場合がある。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。
【００２６】
本発明にて使用する変異株において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の機能低下乃至欠損とは、易資化性炭素源が存在する条件下において、野生株と比較した場合に加水分解酵素活性を増大させるような変異を意味する。より具体的には、そのような変異として、ゲノム中のＰＫＡ遺伝子のコード領域の全部又は一部が欠失しているもの、コード領域の全部又は一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部又は一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、ＰＫＡの機能低下乃至欠損には、上記コード領域への核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、ＰＫＡが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。
【００２７】
ＰＫＡ変異株の作製方法としては、公知の方法（例えば、非特許文献３〜５に記載の方法）を適宜用いて、ＰＫＡの破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入等により行うことができる。その他、変異の種類や方法は特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の部位特異的に変異を導入する方法、ランダムに変異を導入する方法、変異原となる薬剤を作用させる方法、紫外線照射法、タンパク質工学的手法等を広く用いることができる。
【００２８】
本発明において利用するＰＫＡ変異株の作製に使用する糸状菌としては、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、セファロスポリウム属、アクレモニウム属、ノイロスポラ属、フザリウム属等が挙げられる。これらのうち、アスペルギルス属が好ましい。
【００２９】
本発明において利用するＰＫＡ変異株の作製に用いるアスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス ニドランス、アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ニガー、アスペルギルス リューチューエンシス、アスペルギルス フミガタス、アスペルギルス ソーヤ等が挙げられ、アスペルギルス ニドランス、アスペルギルス オリゼ、又はアスペルギルス ニガーが好ましい。
【００３０】
本発明において利用するＰＫＡ変異株の作製に使用する酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等が挙げられる。
【００３１】
本発明にて使用する、ＰＫＡ変異株は易資化性炭素源が存在する条件下において、糸状菌や酵母が通常産生する種々の酵素、例えばタンパク質分解系加水分解酵素や多糖分解系加水分解酵素、更には酸化還元酵素をコードする遺伝子の発現が有意に亢進しているか、このような加水分解酵素の活性が有意に増大している。限定することを意図するものではないが、ＰＫＡ変異株において活性が増大する加水分解酵素として多糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素などがある。より具体的には、このような加水分解酵素として、アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペプチターゼ、エステラーゼなどが挙げられる。酸化還元酵素の例としては、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）、オキシダーゼ（酸化酵素）、レダクターゼ（還元酵素）、オキシゲナーゼ（酸素化酵素）等がある。
【００３２】
ＰＫＡ変異株の効果、例えば向上した加水分解酵素活性を損なわない限り、培養物の調製の途中又はその前後の工程で変異株以外の菌を添加して培養物を処理してもよい。その他の工程については、所望とする用途に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、ＰＫＡ変異株を用いて加水分解酵素を製造する場合、その製造方法は変異株を培養する工程、加水分解酵素等を菌株に生産させる工程、そして任意に、得られた酵素等を回収する工程、を含んでもよい。
【００３３】
変異株に生産させた酵素等の回収方法としては、特に限定されず、公知の方法（遠心分離、塩析、クロマトグラフィー等）を適宜用いることができる。
【００３４】
本発明における酵素類の製造で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌および酵母の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、ＣＤ最少培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、ＰＤＡ培地、ＳＤ最少培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、デンプン、セルロース、キシラン、マンナン等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、０．５〜１０％、より好ましくは１〜４％の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３７℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、１２〜７２時間、より好ましくは２４〜４８時間の範囲で適宜設定できる。
【００３５】
本発明による酵素類の製造方法は、バイオマスの分解によるバイオエタノールの生産（セルラーゼ等を高生産するよう遺伝子組換えをしたカビを使用するもの等）等にも適用することも可能である。
【００３６】
本発明は更に、ＰＫＡ変異株を用いた、有機性材料の加水分解物の製造方法を提供する。本発明はＰＫＡ変異株を含む培養物又はその抽出物を、タンパク質や多糖を多く含む有機性材料の加水分解工程に使用することを特徴とする。例えば、タンパク質を含む材料として、穀物類、野菜類（例えば、大豆、小麦など）、肉類、魚類などが挙げられる。本明細書で使用する場合、「培養物」は変異株を添加した麹や、更には変異株を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。
【００３７】
本発明にて使用する培養物は、上記変異株と有機性材料とを接触させる工程を含む方法により製造することができる。変異株を添加するタイミングは特に限定されない。
【００３８】
本発明における有機性材料の加水分解物の製造方法は、向上した加水分解酵素活性により処理されることが必要な種々の分野、特に醸造・発酵産業での使用が想定される。例えば、本発明を醤油、味噌、日本酒、及び焼酎等の発酵生産に用いた場合には、原料の分解がより促進され、発酵生産物の生産性を向上させるうることが期待される。
【００３９】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
アスペルギルス ニドランス及びアスペルギルス オリゼのｐｋａＡ破壊株の構築
ＰｋａＡのカーボンカタボライト抑制への関与を調査するために、アスペルギルス ニドランス及びアスペルギルス オリゼのｐｋａＡ遺伝子破壊株を作製した。アスペルギルス ニドランスでは、ｐｙｒｏＡ遺伝子を選択マーカーとして用いたｐｋａＡ破壊のためのＤＮＡフラグメントを構築し、得られたＤＮＡフラグメントを親株に挿入した(図１)。
【００４１】
アスペルギルス オリゼでは、ｐｙｒＧ遺伝子（ＡＯ０９００１１０００８６８）を選択マーカーとして用いたｐｋａＡ破壊のためのＤＮＡフラグメントを構築し、得られたＤＮＡフラグメントを親株に挿入した(図２)。
【００４２】
細胞株及び培地
アスペルギルス ニドランスのｐｋａＡ遺伝子破壊には、ＡＢＰＵ１株（ｂｉＡ１ ｐｙｒＧ８９；ｗＡ３；ａｒｇＢ２；ｐｙｒｏＡ４）を親株として用いた。
アスペルギルス オリゼのｐｋａＡ破壊には、ＲｋｕｐｔｒＰ２−１ΔＡＦ株(ΔｐｙｒＧ,ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ,Δａｆｌａｔｏｘｉｎ ｃｌｕｓｔｅｒ)(Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ, ２００８, Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ７４： ７６８４−７６９３)を親株として使用した。
【００４３】
なお、ＲｋｕｐｔｒＰ２−１ΔＡＦ株は、ゲノム配列が公開されているアスペルギルス オリゼＲＩＢ４０株の誘導体である（Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ, ２００５, Ｎａｔｕｒｅ. ４３８：１１５７−１１６１)。プラスミドＤＮＡの構築には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いた。
【００４４】
アスペルギルス ニドランスの培養のための最少培地（ＭＭ）としては、０．０８５％ＮａＮＯ3、０．０５２％ＫＣｌ、０．１５２％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１５％ ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ (０．００４％Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．０４％ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８％ＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０８％ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０８％Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．８％ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ)を含み、炭素源として２％グルコースを含むｐＨ６．５のものを使用した。
【００４５】
また、菌株の栄養要求性に応じて０．１％ウリジン、０．００１％ビオチン、０．０５２６％アルギニン、０．０００２５％ピリドキシン塩酸塩を添加した。アスペルギルス オリゼの培養のための最少培地としては、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＫＣｌ、０．２％ＮａＮＯ3、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含み、炭素源として２％のグルコースを含むｐＨ５．５のものを使用した。アスペルギルス オリゼの培養のための完全培地には、２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％ＮａＮＯ3、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％カザミノ酸を含むｐＨ６．０のデキストリン‐ペプトン培地を使用した。また、ウラシル要求性株の培養を行う際には、培地に終濃度が１５ｍＭになるようウリジンを添加した。
【００４６】
アスペルギルス ニドランスｐｋａＡ破壊用プラスミドＤＮＡの構築
アスペルギルス ニドランスにおけるｐｋａＡ破壊のためのプラスミドを以下のように構築した。ｐｋａＡの５‘-フランキング領域を配列番号５と配列番号６をプライマーとして用い、テンプレートをアスペルギルス ニドランスＡＢＰＵ１株のクロモゾームＤＮＡとしてＰＣＲで増幅した。これを、ＮｏｔＩとＳｐｅＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＰｓｔＩ-ＢａｍＨ Ｉ部位にアスペルギルス ニドランス由来のｐｙｒｏＡ遺伝子を持つプラスミドｐＰｙｒｏＡのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位に挿入した。
【００４７】
次に、３’-フランキング領域を配列番号７と配列番号８をプライマー、ＡＢＰＵ１株のクロモゾームＤＮＡテンプレートとしてＰＣＲで増幅し、ＣｌａＩとＡｐａＩで切断し、上記で作製したプラスミドのＣｌａＩ−ＡｐａＩ部位に挿入して、ｐｋａＡ破壊カセットを有するプラスミドｐＤｐｋａＡを取得した。
使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
【表１】
2016154483.tif 000003
【００４８】
Ａ. オリゼｐｋａＡ破壊用ベクターのＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲによる構築
Ａ. オリゼのｐｋａＡ破壊用ベクターは、Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ法を用いて調製した。本方法でのベクターの作製手順は、１段階目のＰＣＲ（１ｓｔ ＰＣＲ）にてベクターの構成要素となるＤＮＡフラグメント(ＤＮＡフラグメントＬ、Ｐ及びＲ)をそれぞれ増幅させ精製、混合したのち、これを鋳型としたＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲを行うことで、各フラグメントが結合された形質転換用ベクターを得るというものである。
【００４９】
１ｓｔ ＰＣＲ用酵素にはＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏを、鋳型にはアスペルギルス  オリゼ ＲＩＢ４０株由来のクロモゾームＤＮＡ（１反応あたり２０ ｎｇ）を使用し、全量４０ μＬにて反応を実施した。また、使用したプライマーとしては、ＤＮＡフラグメントＬ（ｌｅｆｔ−ａｒｍ）の増幅には配列番号９と１０を、フラグメントＰ(ＡＯｐｙｒＧマーカー)の増幅には配列番号１１と１２を、そしてフラグメントＲ（ｒｉｇｈｔ−ａｒｍ）の増幅には配列番号１３と１４をそれぞれ使用した。１ｓｔ ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃ ２分間の加熱ののち、９８℃  １０秒間、６０℃  １０秒間、６８℃  ５分間を３５サイクルとした。
【表２】
2016154483.tif 000004
（下線は、Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ用の付加配列を示す）
【００５０】
得られた１ｓｔ ＰＣＲ産物全量を電気泳動後、ＱＩＡＧＥＮ社のゲル抽出キットを用い精製した。この精製ＤＮＡフラグメントを各２０μＬずつ混合し、そのうち１６μＬをＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲ用の鋳型として使用した。Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ実施時のプライマーとしては、配列番号９と配列番号１４を使用した。
ＰＣＲ用酵素は、１ｓｔ ＰＣＲと同様にＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏを使用し、全量３２０μＬで反応を行った。Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃２分間の加熱ののち、９８℃１０秒間、６８℃１０分間を３５サイクルとした。
【００５１】
アスペルギルス ニドランスの形質転換
Ｂａｌａｎｃｅ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ （Ｂａｌａｎｃｅ, Ｄ. Ｊ., ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ, Ｇ. １９８５. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ. Ｇｅｎｅ. ３６：３２１−３３１.)の方法に従い、アスペルギルス ニドランスの形質転換を行った。
形質転換には、ｐＤｐｋａＡプラスミドをＮｏｔＩとＡｐａＩで切断して取得したｐｋａＡ破壊カセットを使用した。
【００５２】
A. オリゼの形質転換
アスペルギルス オリゼの形質転換は、プロトプラスト−ＰＥＧ法により実施した(Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ. ２００４. Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｋｏｊｉ−ｍｏｌｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ. Ｍｏｌ. Ｇｅｎ. Ｇｅｎｏｍｉｃｓ, ２７２：３４４−３２)。形質転換には、Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ法により増幅した３２０μＬのＤＮＡフラグメントを、２−プロパノール沈殿により１０μＬまで濃縮したものを、遺伝子破壊用カセットとして使用した。プロトプラストの再生には、１．２Ｍ のソルビトールを添加したＡ. オリゼ用最少培地を使用した。
【００５３】
形質転換体の確認
Ａ. ニドランス及びＡ. オリゼの形質転換体を培養後、常法にしたがってクロモゾームＤＮＡを抽出した。本クロモゾームＤＮＡを用いたサザンブロット解析を行い、ｐｋａＡ遺伝子破壊が正しく行われ、かつ、核が純化された状態であるかを確認した。その結果、Ａ. アスペルギルス ニドランス及びＡ. オリゼともに、目的とする遺伝子破壊が正しく行われ、かつ、核が純化されている状態の菌株が複数得られていることが確認できた（Ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
【実施例２】
【００５４】
pkaA破壊がアスペルギルス ニドランスのカーボンカタボライト抑制に与える影響
カーボンカタボライト抑制に対するｐｋａＡ遺伝子破壊の影響を調べるため、１％ＣＭＣと１％グルコース、１％コンニャクマンナンと０．５％グルコース、１％デンプンと１％グルコースを含む寒天最少培地上で各株を増殖させ、セルラーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ活性をそれぞれの多糖の解により形成されるクリアゾーン（ハロー）として検出した。
【００５５】
プレートアッセイの実験方法
Ａ. ニドランス のｐｋａＡ破壊株は、実施例１にて作製したものを、ｃｒｅＡ変異株としてはＣＡ４株（ｂｉＡ１ ｃｒｅＡ２０４；ｗＡ３；ａｒｇＢ２）を使用した。また、本実施例においては、ｐｋａＡ破壊株（ΔｐｋａＡ）、ｃｒｅＡ変異株（ｃｒｅＡ２０４）と同一の栄養要求性を持つＡＢＵ株（ｂｉＡ１ ｐｙｒＧ８９；ｗＡ３；ａｒｇＢ２）を野生株 （ＷＴ）とし、これを比較対象として用いた。
【００５６】
セルラーゼアッセイ用のプレートには、実施例1に記載した最少培地のグルコースの代わりに、１％ＣＭＣと０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むものを用いた。
【００５７】
ｐｋａＡ破壊株（ΔｐｋａＡ）、ｃｒｅＡ変異株（ｃｒｅＡ２０４）及びＡＢＵ株（ＷＴ）の分生子懸濁液を、セルラーゼアッセイ用プレートにスポットして３７℃で培養した。培養後、０．１％ Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄを重層して染色し、１Ｍ ＮａＣｌ溶液で脱色することにより、CMC分解活性をハローとして検出した。マンナナーゼのプレートアッセイもセルラーゼのプレートアッセイと同様の手法で行った。ただし、炭素源として０．５％ コンニャクマンナンを用いた。アミラーゼのプレートアッセイでは炭素源として１％可溶性デンプンを用い、培養後ヨードデンプン反応でデンプン分解活性を検出した。
【００５８】
プレートアッセイ結果
野生株（ＷＴ）とｃｒｅＡ変異株（ｃｒｅＡ２０４）は、ＣＭＣ、コンニャクマンナンでハローをほとんど形成せず、ｃｒｅＡ変異株ではデンプンで巨大なハローを形成した。一方、ｐｋａＡ破壊株（ΔｐｋａＡ）は、ＣＭＣ、コンニャクマンナンで巨大なハローを、デンプンでは微小なハローを形成した (図３)。
【００５９】
この結果は、ｐｋａＡの破壊がグルコースによるセルラーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ生産のカーボンカタボライト抑制の緩和を引き起こすこと、その効果はセルラーゼ、マンナナーゼ生産において顕著であること、ＣｒｅＡに依存した抑制とＰｋａＡに依存した抑制は異なることを明確に示している。
【実施例３】
【００６０】
グルコース以外の炭素源によるカーボンカタボライト抑制に対するアスペルギルス ニドランスｐｋａＡ破壊の影響
グルコース以外の炭素源によるカーボンカタボライト抑制に対するｐｋａＡ破壊の影響を調べるために、セルラーゼアッセイ用プレートに各種炭素源を添加した条件にてハロアッセイを実施した。
【００６１】
アッセイ方法
実施例２に記載したセルラーゼプレートアッセイ用の最少培地（１％ＣＭＣと０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む)に、１％グルコース、マンノース、フラクトース、キシロース、あるいはソルビトールを添加し、各菌株の分生子懸濁液をスポットして３７℃で培養した。培養後、０．１％Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄを重層して染色し、１Ｍ ＮａＣｌ溶液で脱色することにより、ＣＭＣ分解活性をハローとして検出した。
【００６２】
ハロアッセイの結果を図４に示す。野生株（ＷＴ）は、ＣＭＣ単独の培地においては明確なハローを形成するのに対し、グルコースだけでなく、マンノース、フラクトース、キシロースの添加によりハロー形成が消失し、ソルビトール添加でハロー径が減少した。ｃｒｅＡ変異株（ｃｒｅＡ２０４）ではグルコースだけでなく、マンノースの添加によりハロー形成が消失し、フラクトース、キシロースで微小なハローを形成、ソルビトールでは顕著なハローを形成した。一方、ｐｋａＡ破壊株（ΔｐｋａＡ）ではグルコースに加えてマンノースで顕著なハローを形成し、他の抑制炭素源ではｃｒｅＡ変異株（ｃｒｅＡ２０４）と同等であった。
【００６３】
以上から、ｐｋａＡ破壊は、グルコースとマンノースによるセルラーゼ生産抑制を高度に解除するとともに、フラクトース、キシロース、ソルビトールによる抑制もｃｒｅＡ変異と同等なレベルで解除することが明らかである。
【実施例４】
【００６４】
pkaA破壊がアスペルギルス オリゼのセルラーゼ生産に与える影響
実施例２に示す通り、アスペルギルス ニドランスではｐｋａＡの破壊が、本菌株のセルラーゼ生産時におけるカーボンカタボライト抑制を顕著に緩和することが明らかとなった。そこで、同様の現象が工業的に利用される菌株であるアスペルギルス オリゼでも見られるか検討を行った。なお、Ａ. オリゼのもともとセルラーゼ生産量は、Ａ.ニドランスと比べ弱いことが知られている。そのため本実施例では、ＣＭＣのみをセルラーゼの誘導物質として使用する実験に加え、ＣＭＣとともにセルラーゼ生産の誘導物質であるセロビオースを添加した条件での検討も実施した。
【００６５】
使用した菌株
アスペルギルス オリゼのｐｋａＡ破壊株(ΔＡＯｐｋａＡ)は実施例１にて作製したものを使用した。ｃｒｅＡ遺伝子破壊株(ΔＡＯｃｒｅＡ)は、配列番号１５〜２０に記すオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、実施例1のＡ. オリゼｐｋａＡ破壊株と同様の方法にて作製したものを用いた。ｃｒｅＡ破壊の親株には、ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株(ΔｐｙｒＧ,ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ, ２００６, Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ. Ｇｅｎｏｍｉｃｓ. ２７５：４６０-４７０)を用いた。また、本実施例では、A. オリゼΔＡＯｐｋａＡ株及びΔＡＯｃｒｅＡ株と同様に、ｋｕ７０がピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）の挿入により破壊され、栄養要求性を持たないＲｋｕｐｔｒＰ２-１ΔＡＦ/Ｐ株 (ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ,Δａｆｌａｔｏｘｉｎ ｃｌｕｓｔｅｒ)（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ, ２０１０, Ｆｕｎｇａｌ. Ｇｅｎｅｔ. Ｂｉｏｌ. ４７：１０-１８）を、Ａ. オリゼの野生株（ＡＯＷＴ）とし、これを比較対象として用いた。
【表３】
2016154483.tif 000005
【００６６】
プレートアッセイの実験方法
セルラーゼのプレートアッセイには、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ ＫＣｌ、０．２％ ＮａＮＯ3、０．０５％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．０％ ＣＭＣ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び２％ Ａｇaｒを含むｐＨ５．５の寒天培地を使用した。
【００６７】
セルラーゼ生産の誘導物資を含むアッセイ条件では、上記培地に終濃度が０．１％となるようセロビオースを添加したものを使用した。ＣＭＣのみ、若しくはＣＭＣにセロビオースを添加したアッセイ用培地に対し、０から１．０％の範囲にてグルコースを添加したものを作製し、これにΔＡＯｐｋａＡ株、ΔＡＯｃｒｅＡ株及び野生株(ＡＯＷＴ株)の分生子懸濁液を接種し、３０℃にて４日間培養した。培養終了後、プレートに０．１２５％のＣｏｎｇｏ−Ｒｅｄを重層し、室温にて１時間染色したのち、１．０ＭのＮａＣｌ溶液にて複数回洗浄し、セルラーゼ活性によって生じるハローを検出した。
【００６８】
セロビオースを含まない条件でのハロアッセイの結果を図５に示す。セルラーゼの誘導物質が存在しない条件での、Ａ. ｏｒｙｚａｅのセルラーゼ生産量は少ないため、いずれの株のハローも小さい状態であるが、ΔＡＯｐｋａＡ株のハローは０〜０．２５％のグルコース濃度の範囲において、野生株よりも若干大きくなり、カーボンカタボライト抑制が緩和される傾向が見られた。一方、ΔＡＯｃｒｅＡではグルコース濃度が上がるごとにハローのサイズは小さくなり、カーボンカタボライト抑制が緩和される傾向は見られなかった。
【００６９】
セロビオースを含む条件でのハロアッセイの結果を図６に示す。０％グルコース条件の野生株において、図５よりもハローが顕著に大きくなっていることが分かる。このことから、本実験条件にて添加したセロビオースが、Ａ . オリゼのセルラーゼ（ＣＭＣ分解酵素）の生産の誘導物質として機能していることが確認できた。また興味深いことに、０％グルコース条件のときのΔＡＯｐｋａＡ株のハローのサイズが、野生株と比較して顕著に大きくなっていることが確認された。
【００７０】
その原因としては、野生株ではグルコースを添加していない条件でも、セルラーゼの反応によって生じたグルコースによりカーボンカタボライト抑制が発生しているが、ΔＡＯｐｋａＡではそのカーボンカタボライト抑制が緩和された状態にあると推察される。また、ΔＡＯｐｋａＡ株では０から０．５％のグルコース存在下で、野生株よりもセルラーゼのハローが明らかに大きくなる傾向が観測された。一方、そのような現象はΔＡＯｃｒｅＡ株では見られなかった。
【００７１】
以上のことから、Ａ. オリゼでもＡ. ニドランスと同様に、セルラーゼ生産におけるカーボンカタボライト抑制には、ＣｒｅＡよりもＰｋａＡのほうが強く関与していることが明らかとなった。
【実施例５】
【００７２】
pkaA破壊がアスペルギルス オリゼのマンナナーゼ生産に与える影響
実施例２に示した通り、アスペルギルス ニドランスではマンナナーゼの生産のカーボンカタボライト抑制についても、ＰｋａＡがＣｒｅＡよりも強く関与することが見出された。そこで、アスペルギルス オリゼでも同様の現象がみられるか検討を行った。
【００７３】
アッセイ方法
マンナンーゼアッセイには、実施例４に記したセルラーゼアッセイ用プレートの１％ＣＭＣを、０．８％コンニャクグルコマンナンに置き換えたものを使用した。本マンナナーゼアッセイ用培地に、０から２．０％の範囲にてグルコースを添加したものを作製し、これにΔＡＯｐｋａＡ株、ΔＡＯｃｒｅＡ株及びコントロールであるＡＯＷＴ株の分生子懸濁液を接種し、３０℃にて３日間培養した。培養終了後、実施例４に示すセルラーゼのプレートアッセイと同様に染色・脱色を行い、ハローを検出した。
【００７４】
マンナナーゼについてのアッセイの結果を図７に示す。ΔＡＯｐｋａA株では、0%グルコース条件において、セルラーゼ程ではないが野生株よりもハローのサイズが大きくなった。
【００７５】
また、ΔＡＯｃｒｅＡ株については、０．２５％のグルコースが存在した時点で、ハローが完全に消失してしまったが、ΔＡＯｐｋａＡ株では０．２５％グルコース条件でもハローのサイズは野生株よりも大きく、その傾向は１．０％グルコース存在下でも維持された。
【００７６】
以上のことから、Ａ. オリゼのマンナナーゼ生産についても、Ａ. ニドランスと同様に、ＰｋａＡのほうがＣｒｅＡよりも強くカーボンカタボライト抑制に関与していることが明らかとなった。
【実施例６】
【００７７】
１％ＣＭＣと０．１％セロビオースを炭素源とした液体培養条件でのアスペルギルス オリゼｐｋａＡ破壊株を用いたセルラーゼ生産試験
実施例４のプレートアッセイに示す通り、Ａ. オリゼのｐｋａＡ破壊株は、グルコース添加していない条件においても、野生株よりセルラーゼ生産が多くなることが確認された。そこで、ｐｋａＡ破壊株を液体培養によるセルラーゼ生産試験に供し、ｐｋａＡ破壊株による酵素生産が液体培養時にも野生株と比べて増加するか検討を行った。なお、本実施例では、１％ＣＭＣと０．１％のセロビオースを炭素源とした条件にて試験を行った。
【００７８】
培養及び粗酵素液の調製方法
セルラーゼ生産試験用培地には、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＫＣｌ、０．２％ ＮａＮＯ3、０．０５％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．０％ＣＭＣ及び０．１％セロビオースを含むｐＨ５．５のものを使用した。２００ｍＬ三角フラスコに、上記培地を２０ｍＬ加え、綿栓をし、オートクレーブにより滅菌した。
【００７９】
これに、ΔＡＯｐｋａＡ株、ΔＡＯｃｒｅＡ株及び野生株の分生子を１×１０7個ずつ接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで４日間培養した。培養終了後、培養液をミラクロス（カルビオケム社製）によりろ過し、培養液と菌体を分離した。得られた培養液の全回収液量を測定したのち、これを酵素活性測定用の粗酵素溶液として用いた。本試験については、各検体とも培養から独立した３連にて実施した。
【００８０】
乾燥菌体重量の測定
ミラクロスを１０ｃｍ角に切ったのち重量を予め測定しておき、これを培養液のろ過に使用した。培養液のろ過後ミラクロス上に回収された菌体を、１５０ｍＬの蒸留水により洗浄したのち、菌体の入ったミラクロスをペーパータオルにはさみ、上から強く押すことで菌体に含まれる水分を出来る限り除去した。これを−８０℃にて１時間以上凍結させたのち凍結乾燥機にて一晩乾燥させた。乾燥終了後、乾燥菌体の入った状態のミラクロスの乾燥物総重量を測定した。
乾燥菌体重量は、以下の式に従い算出した。
乾燥菌体重量 = 乾燥物総重量(ミラクロス＋乾燥菌体)−ミラクロスのみの重量
【００８１】
酵素活性測定法
回収した培養液４００μＬに、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を４００μＬ加えて２倍に希釈するとともにｐＨを調整した。
【００８２】
基質溶液である２．０％ ＡＺＯ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ (ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製のものをｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解)１５０μＬに、緩衝液により２倍希釈した粗酵素溶液(培養液）を１５０μＬ加え、ボルテックスミキサーにより１０秒間撹拌したのち、４０℃にて６０分間反応させた。
【００８３】
反応液に７５０μＬの反応停止液（２％酢酸ナトリウム／０．２％酢酸亜鉛溶液ｐＨ５．０と９９．５％エタノールを１:４で混合したもの）を加えて、ボルテックスミキサーにより撹拌し、１０分間室温で静置したのち、８００ ｘ ｇ で１０分間遠心分離した。この上清の、酵素反応により遊離したアゾ色素の吸収極大である５９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、セルラーゼ活性を定量した。
【００８４】
吸光度測定値のセルラーゼのユニット（ｍＵ/ｍＬ）への換算には、ＭＥＧＡＺＹＭＥ社のＡＺＯ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｌｏｔ９０５０４）の取扱い説明書に記載されている検量線を使用した。全セルラーゼ活性及び単位菌体あたりのセルラーゼ活性の算出には以下の式を使用した。
全セルラーゼ活性 = セルラーゼ活性測定値（ｍＵ/ｍＬ）× 希釈倍率（２．０）×全回収液量（ｍＬ）
単位菌体あたりのセルラーゼ活性 = 全セルラーゼ活性 （ｍＵ） ÷ 乾燥菌体重量 （ｍｇ）
【００８５】
活性測定結果
液体培養でのセルラーゼ生産試験の結果を、図８に示した。ΔＡＯｃｒｅＡ株では、全セルラーゼ活性量が野生株（ＡＯＷＴ株）よりも３．８倍増加していた。ΔＡＯｐｋａＡ株のセルラーゼ生産量はΔＡＯｃｒｅＡ株よりも多くなり、ΔＡＯｃｒｅＡ株の４．２倍、野生株と比較すると１５．９倍もの高い活性が見られた。
【００８６】
また、乾燥菌体重量については、野生株とΔＡＯｃｒｅＡ株とでは有意な差はなかったが、ΔＡＯｐｋａＡ株では野生株よりも約１．８倍、菌体量が多くなった。単位菌体あたりの酵素生産量としては、ΔＡＯｃｒｅＡでは野生株よりも３．８倍上昇していたが、ΔＡＯｐｋａＡ株ではこれをさらに上回り、野生株の８．８倍にまで大幅に増加した。
【００８７】
以上の通り、アスペルギルス オリゼにおけるｐｋａＡの破壊は、液体培養でのセルラーゼ生産においても、ｃｒｅＡ破壊よりも大きな効果が有ることが確認された。
【実施例７】
【００８８】
アビセルを炭素源とした液体培養条件でのアスペルギルス オリゼｐｋａＡ破壊株を用いたセルラーゼ生産試験
実施例６に記したＣＭＣとセロビオースを炭素源とした実験において、アスペルギルス オリゼのｐｋａＡ破壊は、本菌のカーボンカタボライト抑制を緩和し、それにより本菌のセルラーゼ生産の増加を促すことが明らかとなった。そこで本実施例では、酵素産業でのセルラーゼ生産条件に近い状態で試験を行うことを目的とし、結晶性セルロースであるＡｖｉｃｅｌ（登録商標））(シグマ-アルドリッチ社製)を炭素源としたセルラーゼ生産実験を行った。
【００８９】
培養及びアッセイ方法
酵素生産試験用培地には、実施例６に示した液体培地の１．０％ＣＭＣと０．１％セロビオースを、２％Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）(シグマ-アルドリッチ社製)に置換したものを用いた。１５０ｍＬ容三角フラスコに、上記培地を２０ｍＬ加え、綿栓をし、オートクレーブにより滅菌した。滅菌後の培地に、ΔＡＯｐｋａＡ株、ΔＡＯｃｒｅＡ株及び野生株の分生子を1×107個ずつ接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで４日間培養した。培養液をＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＮｏ.５Ａのろ紙によりろ過し、固形物（菌体＋Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））を除去した。
【００９０】
得られたろ液の全回収液量を測定したのち、これを酵素活性測定用の粗酵素溶液として用いた。セルラーゼ活性測定法及び全セルラーゼ活性の計算は、実施例６に記したものと同じ方法を用いた。
【００９１】
また、本実施例における実験条件では、菌体とアビセルを分離することができなかったため、乾燥菌体重量の測定及び単位菌体あたりのセルラーゼ活性の算出は行わなかった。
【００９２】
活性測定結果
セルラーゼ活性測定結果を図９に示す。ΔＡＯｐｋａＡ株の総セルラーゼ活性は、野生株よりも２．５倍上昇していたが、ΔＡＯｃｒｅＡ株の全セルラーゼ活性は野生株よりも１．３倍程度しか上昇していなかった。本実施例では、ΔＡＯｐｋａＡ株及びΔＡＯｃｒｅＡ株と、野生株との差が実施例６に示したデータよりも差が小さくなる傾向が見られた。しかしこれは、野生株のセルラーゼ生産量がＣＭＣとセロビオースを炭素源として使用したとき（実施例６）よりも、大幅に高くなっているためであり（５．３倍Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）培養が高い）、ΔＡＯｐｋａＡ株の全セルラーゼ活性自体は、実施例６と比べて１５％程度減少するにとどまっていた。
【００９３】
以上の結果から、工業的酵素生産条件に近いＡｖｉｃｅｌ（登録商標）を炭素源としたセルラーゼ生産条件でも、Ａ. オリゼｐｋａＡの破壊は、カーボンカタボライト抑制の緩和によるセルラーゼ生産の増加に対して大きな効果があることが分かった。
【実施例８】
【００９４】
アスペルギルス オリゼpkaA破壊株を用いたマンナナーゼ生産試験
実施例２にて示した通り、アスペルギルス ニドランスのＰｋａＡは、マンナナーゼ生産におけるカーボンカタボライト抑制にもＣｒｅＡ以上に関与していた。そこで、本現象がアスペルギルス オリゼのＰｋａＡでも見られるのか検証した。
【００９５】
培養、粗酵素溶液の調製及び乾燥菌体重量測定方法
マンナナーゼ生産試験用培地には、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ ＫＣｌ、０．２％ ＮａＮＯ3、０．０５％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．８％コンニャクグルコマンナン (ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製、Ｌｏｗ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ)を含むｐＨ５．５のものを使用した。２００ｍＬ三角フラスコに、上記培地を２０ｍＬ加え、綿栓をし、オートクレーブにより滅菌した。これに、ΔＡＯｐｋａＡ株、ΔＡＯｃｒｅＡ株及び野生株の分生子を１×１０7個ずつ接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで３日間培養した。培養終了後、実施例６（ＣＭＣとセロビオースを炭素源としたときのセルラーゼ生産試験）と同じ方法にて粗酵素溶液（培養液）の回収を行い、全回収液量の測定を行った。また、乾燥菌体重量の測定についても、実施例６に記したものと同じ方法にて測定した。
【００９６】
マンナナーゼ活性測定法
回収した粗酵素溶液（培養液）５００μＬに、２．０Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ４．５）を２５μＬ加えて、ｐＨを調整した(溶液は１．０５倍希釈されたことになる)。基質溶液である２％ Ａｚｏ-カロブガラクトマンナン(ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製のものをｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解)１５０μＬに、ｐＨ調整を行った粗酵素溶液１５０μＬを加え、ボルテックスミキサーにより１０秒間撹拌したのち、４０℃にて６０分間反応させた。反応液に７５０μＬの９９．５％のエタノールを加えてボルテックスミキサーにより撹拌し、１０分間室温で静置したのち、８００ ｘ ｇ で１０分間遠心分離した。この上清の、酵素反応により遊離したアゾ色素の吸収極大である５９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、マンナナーゼ活性を定量した。
【００９７】
吸光度測定値のマンナナーゼのユニット（ｍＵ/ｍＬ）への換算には、ＭＥＧＡＺＹＭＥ社のＡｚｏ-カロブガラクトマンナン（Ｌｏｔ ００６０１）の取扱い説明書に記載されている検量線を使用した。全マンナナーゼ活性及び単位菌体あたりのマンナナーゼ活性の算出には、以下の式を使用した。
全マンナナーゼ活性 ＝マンナナーゼ活性測定値（ｍＵ/ｍＬ）×希釈倍率（１．０５）×総回収液量（ｍＬ）
単位菌体あたりのマンナナーゼ活性 ＝ 全マンナナーゼ活性（ｍＵ）÷乾燥菌体重量 （ｍｇ）
【００９８】
酵素活性測定結果
コンニャクグルコマンナンを炭素源とした培養では、ΔＡＯｃｒｅＡ株では生育が非常に悪く、乾燥菌体重量が野生株の２０％以下まで低下した。それにともない、ΔＡＯｃｒｅＡ株のマンナナーゼの生産量も極端に低いものとなった。一方、ΔＡＯｐｋａＡ株のコンニャクグルコマンナン上での生育は野生株と変わりは無く、マンナナーゼ生産量は野生株よりも３５％程度増加していた。また、この活性上昇に伴い単位菌体あたりの酵素生産量についても野生株よりも３５％程度増加していた。このように、Ａ. オリゼのマンナナーゼ生産においても、ｐｋａＡの遺伝子破壊は正の効果を示すことが明らかとなった。
【００９９】
実施例２から８に示した通り、ＰｋａＡは、糸状菌アスペルギルス ニドランス及びアスペルギルス オリゼのカーボンカタボライト抑制に大きく寄与していることが明らかとなった。そのため、ｐｋａＡ遺伝子を破壊した糸状菌は、カーボンカタボライト抑制が解除され、各種加水分解酵素類の生産が増強されると考えられる。このような糸状菌は、それを用いた酵素等の製造や有機性材料の加水分解産物の製造に利用することができ、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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