(57)【要約】【課題】細菌を利用して、内腔を有する多量体を培地中に蓄積させることができる方法を提供すること。【解決手段】内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異種発現単位を含む糸状菌、および糸状菌を培地中で培養して、内腔を有する多量体を培地中に蓄積させることを含む、内腔を有する多量体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異種発現単位を含む糸状菌。
【請求項２】
前記タンパク質が糸状菌に対して異種である、請求項１記載の糸状菌。
【請求項３】
前記タンパク質がフェリチンである、請求項１または２記載の糸状菌。
【請求項４】
糸状菌がアクレモニウム属に属する、請求項１〜３のいずれか一項記載の糸状菌。
【請求項５】
糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカスに属する、請求項４記載の糸状菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の糸状菌を培地中で培養して、内腔を有する多量体を培地中に蓄積させることを含む、内腔を有する多量体の製造方法。
【請求項７】
内腔を有する多量体を培地から回収することを含む、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え糸状菌、およびそれを用いた、内腔を有する多量体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用した機能性タンパク質の生産には細胞内に目的タンパク質を蓄積させる方法と細胞外に目的タンパク質を分泌させる方法がある。異種タンパク質を分泌させる生産方法として、バチルス属細菌（非特許文献１）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のメタノール資化性酵母（非特許文献２）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネ型細菌（特許文献１〜６）、そして糸状菌（非特許文献３、４）等を利用する技術が報告されている。また、糸状菌に分類されるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）やアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、自然界においても各種セルラーゼを分泌することが知られており、その機能はセルラーゼ生産に応用されている（特許文献７、８）。
【０００３】
フェリチンは、分子量約２０ｋＤａの単量体単位からなる２４量体を形成することにより、約７ｎｍの直径の内腔を有する外径１２ｎｍからなるかご状超分子構造を形成する。そして、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。フェリチン様タンパク質は動植物から微生物まで普遍的に存在しており、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっている。それらのフェリチンは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体素材工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４９６５１９７号明細書
【特許文献２】特表平６−５０２５４８号公報
【特許文献３】特許第４３２０７６９号公報
【特許文献４】特開平１１−１６９１８２号公報
【特許文献５】特許第４３６２６５１号公報
【特許文献６】特許第４７３０３０２号公報
【特許文献７】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献８】特開２００８−２７１９２７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｉ．Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７，１０９−１３７（１９９３）
【非特許文献２】Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，９０５−９１０（１９９３）
【非特許文献３】Ｔｏｖｅ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，１４１９−１４２２（１９８８）
【非特許文献４】Ｎｉｇｅｌ  Ｓ．Ｄｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９，９７６−９８１（１９９１）
【非特許文献５】Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１８００，８４６−８５７（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的にタンパク質生産に利用される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞、動物細胞あるいはそれらの抽出液を用いたタンパク質生産系では、目的タンパク質の合成に利用した細胞に含まれる目的タンパク質以外の混入物（例、タンパク質、ＤＮＡ）から目的タンパク質を分離精製する必要があった。
また、細胞内で過剰に蓄積された目的タンパク質は封入体などを形成し、その中から目的タンパク質を回収することは難しかった。
さらに、過剰に蓄積した目的タンパク質は宿主細胞の増力能力やタンパク質生産能力を低下させ、目的タンパク質の蓄積を阻害することも知られている。
このような問題点を回避するためにバチルス属細菌やコリネ型細菌等の細菌を利用したタンパク質分泌生産系が知られているが、このような細菌を利用して、内腔を有する多量体（巨大なタンパク質複合体）を培地中に蓄積させること（内腔を有する多量体の分泌生産）は難しかった。
【０００７】
本発明者らが把握する限り、遺伝子組換え技術により、内腔を有する多量体を糸状菌で発現させることは報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、糸状菌を宿主細胞として用いることにより、内腔を有する多量体（巨大なタンパク質複合体）を培地中に効率良く蓄積させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異種発現単位を含む糸状菌。
〔２〕前記タンパク質が糸状菌に対して異種である、〔１〕の糸状菌。
〔３〕前記タンパク質がフェリチンである、〔１〕または〔２〕の糸状菌。
〔４〕糸状菌がアクレモニウム属に属する、〔１〕〜〔３〕のいずれかの糸状菌。
〔５〕糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカスに属する、〔４〕の糸状菌。
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかの糸状菌を培地中で培養して、内腔を有する多量体を培地中に蓄積させることを含む、内腔を有する多量体の製造方法。
〔７〕内腔を有する多量体を培地から回収することを含む、〔６〕の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、内腔を有する多量体（巨大なタンパク質複合体）を培地中に効率良く蓄積させることができる。したがって、目的多量体の合成に利用した細胞内に含まれる目的多量体以外の混入物（例、タンパク質、ＤＮＡ）から目的多量体を分離精製することを回避できる。また、目的多量体の過剰な細胞内蓄積、ひいては細胞内での封入体の形成を回避できることから、目的多量体をより容易に回収することができる。さらに、目的多量体の過剰な細胞内蓄積に伴う宿主細胞の増力能の低下およびタンパク質生産能の低下を回避できることから、目的多量体の生産効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、遺伝子組換え糸状菌の培養上清に含まれるウマ由来フェリチンタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す図である。
【図２】図２は、遺伝子組換え糸状菌の培養上清に含まれるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来フェリチンタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す図である。
【図３】図３は、遺伝子組換え糸状菌の培養上清に含まれるウマ由来フェリチンタンパク質の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図４】図４は、遺伝子組換え糸状菌の培養上清に含まれるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来フェリチンタンパク質の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異種発現単位を含む糸状菌を提供する。
【００１３】
用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチド（本発明では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド）およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、糸状菌で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００１４】
用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞（本発明では糸状菌）に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが糸状菌に対して異種である。糸状菌に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、糸状菌に対して異種である。したがって、本発明では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、糸状菌以外の生物（例、原核生物および真核生物、または微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物）もしくはウイルスに由来するか、または人工的に合成されたものである。あるいは、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、糸状菌に対して異種であってもよい。好ましくは、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質が、糸状菌に対して異種である。
【００１５】
用語「内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質」とは、内部に空間を有する多量体を、タンパク質の会合によって、形成する能力を有するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなタンパク質としては、内腔を有する２４量体を形成し得るタンパク質（例、フェリチン）、および内腔を有する多量体（例、１２量体）を形成し得るタンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成し、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。さらに、フェリチンでは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体材料工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．）。なお、Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ，  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２０１０  ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、そのＮ末端部および／またはＣ末端部が多量体の表面に露出していてもよい。
【００１６】
内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、原核生物または真核生物に由来するものであってもよい。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はまた、微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物に由来するものであってもよい。
【００１７】
好ましい実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質を産生する微生物に由来するタンパク質であってもよい。このような微生物としては、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質を産生する、哺乳動物等の動物に由来するタンパク質であってもよい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、およびブタが挙げられる。
【００１９】
内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質としては、耐熱性タンパク質を用いることもまた好ましい。このような耐熱性タンパク質としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等のパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌のような好熱性微生物に由来するタンパク質が挙げられる。耐熱性タンパク質を用いることで、内腔を有する多量体の培地からの回収が容易になる。
【００２０】
内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はさらに、天然に生じるタンパク質、または内腔を有する多量体を形成し得るその変異体であってもよい。このような変異体としては、例えば、１または数個（例、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個または１〜５個）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加を有する変異体である。当業者であれば、本願明細書中の開示、および当該分野における技術常識に基づき、このような変異体を容易に作製することができる。
例えば、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、標的物質に結合し得るペプチド部分をそのＮ末端および／またはＣ末端に付加されたものであってもよい。用語「標的物質に結合し得るペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数のペプチドを有していてもよい。標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料、あるいは導体材料、半導体材料および磁性体材料が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属材料（例、チタン、ニオブ等の金属、および金属酸化物等の金属化合物）、シリコン材料（例、シリコン、およびシリコン酸化物等のシリコン化合物）、炭素材料（例、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン等のカーボンナノ材料）、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸、糖質、脂質が挙げられる。
内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はまた、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質のＮ末端に、分泌シグナルを有していてもよい。分泌シグナルとしては、例えば、糸状菌において作用できるものであれば特に限定されないが、糸状菌由来の遺伝子のシグナル配列が好ましい。このようなシグナル配列としては、例えば、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（例、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ）、エンドグルカナーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子などの遺伝子由来のシグナル配列が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質が分泌シグナルを有する場合、分泌シグナルが付加された、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質が糸状菌内で発現するが、分泌過程において分泌シグナルは切断され得るので、培地中には、分泌シグナルを含まない、内腔を有する多量体を蓄積させることができる。
【００２１】
異種発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を糸状菌で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、糸状菌に対して同種であっても異種であってもよい。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、糸状菌で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。糸状菌で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、糸状菌で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。糸状菌で高発現している遺伝子のプロモーターとしては、例えば、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（例、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ）、エンドグルカナーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子などの遺伝子のプロモーターが挙げられる。ウイルス由来のプロモーターとしては、例えば、糸状菌で高発現することが知られている、ＳＶ４０プロモーターおよびＣＭＶプロモーターなどが挙げられる。
【００２２】
糸状菌は、菌糸状態で活動する微生物であり、一般的に「カビ」と呼ばれている。糸状菌は、発酵食品（酒、しょう油）、および抗生物質等の医薬品の生産などで活用されている。本発明で用いられる糸状菌としては、内腔を有する多量体（異種発現単位中のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の複合体）を分泌できるものである限り特に限定されない。このような糸状菌としては、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）／タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、およびハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）に属する細菌が挙げられるが、アクレモニウム・セルロリティカス等のアクレモニウム属細菌が好ましい。糸状菌は、オリジナル株であっても、オリジナル株から誘導された株〔例、外因性遺伝子の導入、ｃｒｅＡ等の内因性遺伝子の変異（例、破壊）などを有する株〕であってもよい。
【００２３】
異種発現単位は、糸状菌のゲノムＤＮＡに組み込まれた形態、または糸状菌のゲノムＤＮＡに組み込まれていない形態（例、発現ベクターの状態）において、糸状菌に含まれる。異種発現単位を含む糸状菌は、従来公知の方法（例、プロトプラスト法）にしたがい、発現ベクターで糸状菌を形質転換することにより得ることができる。発現ベクターが糸状菌のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、異種発現単位は、形質転換により、糸状菌のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが糸状菌のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、異種発現単位は、形質転換により、糸状菌のゲノムＤＮＡに組み込まれず、糸状菌内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。
【００２４】
本発明で用いられる発現ベクターは、異種発現単位として上述した最小単位に加えて、糸状菌で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００２５】
発現ベクターはまた、糸状菌のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、糸状菌のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる異種発現単位が一対の相同領域（例、糸状菌のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。異種発現単位が導入されるべき糸状菌のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、糸状菌において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。このような遺伝子としては、例えば、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（例、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ）、エンドグルカナーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００２６】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、異種発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用される発現ベクターを用いてもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
【００２７】
本発明はまた、内腔を有する多量体の製造方法を提供する。本発明の方法は、本発明の糸状菌を培地中で培養して、内腔を有する多量体を培地中に蓄積させることを含む。
【００２８】
培養は、任意の培地において行うことができるが、液体培地が好ましい。培養温度は、例えば、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃である。糸状菌の培養は、例えば、ｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６〜８で行うことができる。このような条件であれば、糸状菌が十分に増殖するため、内腔を有する多量体を大量に得ることができる。培養は、例えば、１日間〜１週間程度行うことができる。
【００２９】
液体培地は、糸状菌の培養に用いられる任意の液体培地を利用することができる。例えば、液体培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。液体培地はまた、無機もしくは有機窒素源（例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン等）を含んでいてもよい。液体培地はさらに、他の栄養源、例えば、無機塩（例、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例、ビタミンＢ１）、抗生物質を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明の方法はさらに、内腔を有する多量体を培地から回収することを含んでいてもよい。例えば、このような回収は、本発明の糸状菌および内腔を有する多量体を含む培地を遠心分離することにより、本発明の糸状菌を培地から除去した後、内腔を有する多量体を含む培地において行うことができる。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質として耐熱性タンパク質を用いた場合、培地を加熱処理することにより、培地中に含まれる、耐熱性タンパク質以外のタンパク質を変性させることもできる。したがって、このような場合、変性タンパク質の分離法（例、遠心分離）を用いることにより、耐熱性タンパク質から構成される、内腔を有する多量体を、容易に精製することができる。塩析法、および各種クロマトグラフィー（例、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー）等の公知の方法を適宜組み合わせることにより、内腔を有する多量体を高度に精製することができる。
【００３１】
内腔を有する多量体は、例えば、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび材料等の開発に有用である。具体的には、内腔を有する多量体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。本発明の糸状菌、およびそれを用いる本発明の方法は、内腔を有する多量体の生産性を改善することができる。したがって、本発明の糸状菌および方法は、例えば、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび材料等の開発に有用である。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実施例１：糸状菌の染色体組換え用鋳型プラスミドの構築
糸状菌であるアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、別名：タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））の染色体ＤＮＡの組換え鋳型用プラスミドとして、糸状菌であるＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするｐｙｒＦ（ｕｒａ５）遺伝子とＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のセロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）ＩをコードするｃｂｈＩ遺伝子のプロモーター、細胞外分泌シグナルおよびターミネーターが搭載されたプラスミド（ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩ）を構築した。
【００３４】
Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＴＮ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５，特公昭６１−１６２１６７号公報）のコロニーから爪楊枝で菌体を回収し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５０μｌに懸濁した。９５℃で１０分間熱処理されたその溶液とプライマー（配列番号５、６）を混合し、ＰＣＲすることでｐｙｒＦ遺伝子の上下１ｋｂを含む領域を増幅した。ＰＣＲ酵素として、ＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）を用いて増幅を行った。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用い、標準プロトコールに従ってライゲーションを行った。得られたＤＮＡ溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することでコロニーを形成させた。そのコロニーを形成した形質転換株からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社，ＵＳＡ）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに搭載されたＤＮＡの塩基配列を解読した。塩基配列が目的のものであると確認できたプラスミドをＥｃｏＲＩとＤｒａＩで切断し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社，ＵＳＡ）を用いたアガロースゲル切り出し精製によりｐｙｒＦ断片（２．９ｋｂｐ）を得た。尚、ｐｙｒＦ断片はその両端にＥｃｏＲＩの切断サイトを持ち、ｐｙｒＦ断片が搭載されたｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒをＥｃｏＲＩ消化することで、ｐｙｒＦ断片をベクターから切り出すことができる。しかし、そのベクターをＥｃｏＲＩ消化することで得られるｐｙｒＦ断片とｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ断片の大きさは同等であり、アガロースゲル切り出し精製用電気泳動による二者の判別が困難だと予想されたため、ベクター配列のみを断片化するためにＤｒａＩを添加した。
【００３５】
続いて、ＭＯ  Ｂｉｏ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＵＳＡ）を用いて抽出したＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＴＮ株のゲノムＤＮＡ抽出を鋳型として、プライマー（配列番号７、８）を用いたＰＣＲにより、ｃｂｈＩ遺伝子のプロモーターからターミネーターまでの領域（４．６ｋｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ酵素はＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ、日本）を用いた。このＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社、日本）を用い、ｃｌｏｎｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ処理による標準プロトコールに従ってｐＵＣ１９（タカラバイオ社、日本）へのライゲーションを行った。そのライゲーションされたＤＮＡ溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することでコロニーを形成させた。そのコロニーを形成した形質転換株からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社，ＵＳＡ）を用いてプラスミド抽出を行った。そのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して線状化し、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（タカラバイオ社、日本）を用いて脱リン酸化した。そのＤＮＡ断片と同じくＥｃｏＲＩで線状化したｐＵＣ１９−ｃｂｈＩ  （７．３ｋｂｐ）とｐｙｒＦ断片（２．９ｋｂｐ）をモル比１：３となるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（タカラバイオ社、日本）の標準プロトコールに従ってライゲーションを行った。そのＤＮＡ溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することで形質転換体を得た。その形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社，ＵＳＡ）を用いて、ｐｙｒＦ遺伝子、ｃｂｈ１遺伝子およびその制御プロモーターが搭載された発現プラスミド（ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩ）を抽出した。なお、ｐｙｒＦ遺伝子とｃｂｈＩ遺伝子のＯＲＦが逆向きであるものを選択した。このｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩのｃｂｈＩ遺伝子の分泌シグナル下流領域に目的の遺伝子をそれぞれ搭載することで、各目的遺伝子（ｃｂｈＩ遺伝子の分泌シグナル配列が付加されたフェリチン遺伝子）の組換え用鋳型プラスミドを構築した。
【００３６】
実施例２：フェリチン発現用遺伝子組換え糸状菌の構築に向けたＤＮＡ調整
ウマ由来のフェリチン（配列番号１、２）あるいは古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のフェリチン（配列番号３、４）がコードされたＤＮＡが染色体上に挿入された糸状菌Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓを構築すべく、遺伝子組換え用プラスミドを下記の手順によりそれぞれ構築した。
【００３７】
はじめに、ウマ由来のフェリチンタンパク質をコードするｆｅｒ−０遺伝子（配列番号１）が搭載された遺伝子組換え用鋳型プラスミド（ｐＵＣ−ｆｅｒ−０−ｐｙｒＦ）を構築した。ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩを鋳型としてプライマー（配列番号９、１０）を用いて増幅されたＰＣＲ産物とｐＭＫ２−ｆｅｒ−０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｍ．Ｍｕｒａｏｋａ，Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，４４，６３９３．）を鋳型としてプライマー（配列番号１１、１２）で増幅されたＰＣＲ産物を、それぞれＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製した。その精製されたＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、日本）を用いて融合するために、ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲ産物とｐＭＫ２−ｆｅｒ−０を鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲ産物を３：２で混合した溶液に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘを添加し、５０℃で１５分間放置した。そのＤＮＡ溶液でＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することでコロニーを形成させた。そのコロニーを形成した菌からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って、ｐＵＣ−ｆｅｒ−０−ｐｙｒＦを回収した。
【００３８】
また、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のフェリチンタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３。以下、ＰｆＦｎ遺伝子と呼ぶ）が搭載された遺伝子組換え用鋳型プラスミド（ｐＵＣ−ＰｆＦｎ−ｐｙｒＦ）についても構築した。ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩを鋳型としてプライマー（配列番号９、１０）を用いて増幅されたＰＣＲ産物と、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）で全合成されたＰｆＦｎ遺伝子のＤＮＡを鋳型としてプライマー（配列番号１３、１４）で増幅されたＰＣＲ産物を、それぞれＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製した。その精製されたＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、日本）を用いて融合するために、ｐＵＣ−ｐｙｒＦ−ｃｂｈＩを鋳型としたＰＣＲ産物とＰｆＦｎを鋳型としたＰＣＲ産物を９：５で混合した溶液に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘを添加し、５０℃で１５分間放置した。そのＤＮＡ溶液でＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することでコロニーを形成させた。そのコロニーを形成した菌からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って、ｐＵＣ−ＰｆＦｎ−ｐｙｒＦを回収した。
【００３９】
最後に、各フェリチンをコードする遺伝子のＡ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ染色体ＤＮＡへの組み込みに使用するＤＮＡ断片を調整した。具体的には、ｐＵＣ−ｆｅｒ−０−ｐｙｒＦあるいはｐＵＣ−ＰｆＦｎ−ｐｙｒＦを鋳型として、Ｍ１３プライマー（配列番号１５、１６）を用いたＰＣＲを行い増幅した。そのＰＣＲ産物を、それぞれアガロース電気泳動とＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、各々１０ｍｇの精製ＤＮＡを得た。
【００４０】
実施例３：異種タンパク質発現用遺伝子組換え糸状菌の親株の構築
フェリチンなどの異種タンパク質を発現する株の親株Ｆ０９  ΔｃｒｅＡ株は以下の手順で構築された。
【００４１】
Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｓ６−２５株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６８５。以下、Ｓ６−２５株と記載）を、５ｇ／Ｌソルカフロック（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｒｐ，Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｎａｗａｎｄａ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／Ｌ  Ｕｒｅａ、１．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒを含む培地に接種し、３０℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得られたアガーディスク１個を、４０ｇ／Ｌ  ソルカフロック、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ、６ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、２ｇ／Ｌ  Ｕｒｅａ、１．６ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４を含む培地（ｐＨ４．０）に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで１０〜１１日間旋回培養を行なった。次に、培養液５ｍＬをガラス濾過器（ポアサイズ：４０〜１００μｍ）で濾過し、残存するソルカフロックおよび長い菌糸を除去した。得られた濾過液を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）して菌糸を回収し、得られた菌糸を０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％  ＮａＣｌを含む溶液に懸濁し、懸濁液を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）する洗浄操作を２回行った。洗浄後の菌体懸濁液の濁度（ＯＤ  ６６０ｎｍ）が１．０になるように適宜希釈し、１ｍＬをペトリディッシュ（底部径約３５ｍｍ）に分注し、１５Ｗの殺菌灯を用いて紫外線を照射した。照射後の菌体懸濁液を適宜希釈し、１．２ｇ／Ｌ  ５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒａｃｉｌ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅを含む最少培地（１０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０６ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．２６ｍｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２、２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）に播種し、３０℃で培養を行った。ここで、５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄはＵｒａｃｉｌ生合成経路の中間体のアナログであり、Ｕｒａｃｉｌ生合成経路が正常に機能している株に対して毒性を示す。よって、５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄを含む培地で選択することで、Ｕｒａｃｉｌ生合成経路に変異が入り機能しなくなった株を取得することができる。５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄを含む培地で生育した変異株を、１ｇ／Ｌ  Ｕｒａｃｉｌ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅを含む最少培地とこれらを含まない最少培地に植え継ぎ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒａｃｉｌ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅを含む最少培地でのみ生育した株をＦ０９株とした。一般的に、５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ耐性を示す株ではｐｙｒＦ遺伝子またはオロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素をコードするｐｙｒＧ遺伝子に変異が入り機能しなくなっている可能性が高いことが知られていた。そこで���Ｆ０９株の染色体上のこれら領域について塩基配列の決定を行った。その結果、Ｆ０９株では、ｐｙｒＦ遺伝子（配列番号１７）の６２９番目の塩基がＡからＧに変化しており、この変異によりｐｙｒＦ遺伝子産物が機能しなくなっていると推察された。
【００４２】
このＦ０９株を親株として、以下の手順により、ｃｒｅＡ遺伝子（配列番号１８）の破壊株を構築した。ｃｒｅＡ遺伝子は、カタボライトリプレッションに関与する転写因子をコードする遺伝子である。ｃｒｅＡ遺伝子は、糸状菌において、セルラーゼの発現に関与していることが知られている（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｊｕｎ  ２４；２５１（４）：４５１−６０、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９８  Ｄｅｃ；６２（１２）：２３６４−７０）。はじめに、Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのｃｒｅＡ遺伝子上流領域、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｃｒｅＡ遺伝子下流領域の順に連結された配列を持つｃｒｅＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を以下の手順に従って作製した。Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー（配列番号１９、２０）を用いたＰＣＲによりｃｒｅＡ遺伝子の上流領域を、プライマー（配列番号２１、２２）を用いたＰＣＲによりｃｒｅＡ遺伝子の下流領域をそれぞれ増幅した。また、ハイグロマイシン耐性遺伝子が搭載されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型としてプライマー（配列番号２３、２４）を用いたＰＣＲにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社、日本）によりキット付属のｐＵＣ１９プラスミドに組み込み連結した。そのライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換しＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む）で３７℃一晩培養することでコロニーを形成させた。得られた形質転換体からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いｐＵＣ−ｃｒｅＡ：：ｈｙｇプラスミドを得た。ｐＵＣ−ｃｒｅＡ：：ｈｙｇプラスミドを鋳型としてプライマー（配列番号１９、２２）を用いｃｒｅＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を増幅し、エタノール沈殿により濃縮、精製した。
【００４３】
次に、Ｆ０９株を１２ｇ／Ｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を含む培地に接種し、３０℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いたアガーディスク１個を、２４ｇ／Ｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈを含む培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間旋回培養した。菌体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）で回収し、１０ｇ／Ｌ  Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ社、日本）、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．８Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液（ｐＨ６．０）を３０ｍｌ加え振とうしながら３０℃で２時間反応させ、細胞壁を消化しプロトプラスト化した。ガラスフィルターで残渣を除いた後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）でプロトプラストを回収し、１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて１ｍｌに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。このプロトプラスト溶液２００μｌに、先に作製したｃｒｅＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片  １０ｍｇと４００ｇ／Ｌ  ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を５０μｌ加え、氷上で３０分間放置した。その後さらに１ｍｌの４００ｇ／Ｌ  ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え混合し、室温で１５分間放置し形質転換を行った。放置後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により回収したプロトプラストを、１ｇ／Ｌ  Ｕｒａｃｉｌ、１ｇ／Ｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅおよび１Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅを含む最少培地に播種し、３０℃で１日間培養した後０．５ｇ／Ｌ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ、２４ｇ／Ｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ、７ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒを含む培地を重層し、さらに３０℃で３日間培養することで目的の株を選抜した。出現したコロニーを０．５ｇ／Ｌ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂを含む最少培地に接種し３０℃で４日間培養した後、ｃｒｅＡ遺伝子領域がハイグロマイシン耐性遺伝子で置換されていることを確認し、Ｆ０９由来ｃｒｅＡ破壊株（Ｆ０９  ΔｃｒｅＡ株）を得た。
【００４４】
実施例４：フェリチン発現用遺伝子組換え糸状菌の構築
実施例３と同様にＦ０９  ΔｃｒｅＡ株のプロトプラスト溶液を調製し、２００μｌのプロトプラスト溶液に、実施例２で構築されたウマ由来フェリチンが搭載された精製ＤＮＡ  １０ｍｇ、あるいはＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチンが搭載された精製ＤＮＡ  １０ｍｇを用いて、実施例３と同様の操作で形質転換を行った。形質転換反応後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により回収したプロトプラストを１Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅを含む最少培地に播種した。この菌を３０℃で４日間培養し、Ｕｒａｃｉｌを含まない培地で生育できることを指標に目的の株を選抜した。ここで、Ｆ０９  ΔｃｒｅＡ株はｐｙｒＦ遺伝子に点変異を持つためｐｙｒＦ遺伝子産物が機能せず、Ｕｒａｃｉｌを含まない培地では生育できない。しかし、遺伝子組換えに使用されたＤＮＡ断片には各フェリチン遺伝子と共に野生型ｐｙｒＦ遺伝子が搭載されており、このＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに組み入れることでＦ０９  ΔｃｒｅＡ株はＵｒａｃｉｌを含まない培地でも生育できるようになる。出現したコロニーを最少培地に接種し３０℃で４日間培養した後、コロニーＰＣＲを行い形質転換した断片がゲノムＤＮＡ上に挿入されていることを確認し、ウマ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株とＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株を得た。なお、ウマ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株の確認にはプライマー（配列番号２５、２６）、そしてＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株の確認にはプライマー（配列番号２５、２７）の組み合わせでコロニーＰＣＲを行った。得られた糸状菌（Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、ウマまたはＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン（ｃｂｈＩ遺伝子の細胞外分泌シグナルがフェリチンのＮ末端に付加）をコードするＤＮＡ、およびｃｂｈＩプロモーターを含む異種発現単位を含む。
【００４５】
実施例５：フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株を用いたフェリチンタンパク質の生産（ＬＡ６６５２  ｐ１９２、ＬＡ７１５５ｐ８６，８７）
各フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株を１２ｇ／Ｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を含む培地に接種し、３０℃で培養を行った。寒天培地上に伸長させた菌糸の先端付近をストローで打ち抜いて得られたアガーディスク１個を２０ｍＬの５０ｇ／Ｌ  Ｓｏｌｋａ  Ｆｌｏｃ、２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ／Ｌ  Ｕｒｅａ、１ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ８０、１．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含む液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで７日間培養を行なった。得られた培養液を遠心分離（１５０００ｒｐｍで１５分間）し、タンパク質の含まれる上清を回収した。その上清に含まれる夾雑物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）にて除去した後、６０℃で２０分間放置した。その溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を回収した。その熱処理後の可溶性画分に含まれるタンパク質を、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ、１０ｋＤａ、Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を用いて濃縮し、タンパク質溶液の溶媒を水に置換した。そして、遠心分離や熱処理によって得られた各画分に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。また、溶液中のタンパク質濃度をＬｏｗｒｙ法により決定した。
【００４６】
図１にウマ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株を培養した培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。レーン１は培養上清、レーン２は培養上清を遠心分離することで得られた夾雑物、レーン３は夾雑物を除去された培養上清、レーン４は夾雑物を除去された培養上清を加熱処理したサンプルの沈殿物、レーン４は夾雑物を除去された培養上清を加熱処理したサンプルの上清、をそれぞれＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）に懸濁し、９５℃で５分間加熱した後、泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像からウマ由来のフェリチンの単量体の分子量（２０、０００）付近にバンドを確認することができた（図１の矢印）。そして、そのタンパク質は加熱処理後も可溶性画分に存在することが示唆された。また、熱処理後の可溶性画分に存在するタンパク質の濃度は１．９ｍｇ／ｍｌであった。
【００４７】
図２にＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株を培養した培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。レーン１は培養上清、レーン２は培養上清を遠心分離することで得られた夾雑物、レーン３は夾雑物を除去された培養上清、レーン４は夾雑物を除去された培養上清を加熱処理したサンプルの沈殿物、レーン４は夾雑物を除去された培養上清を加熱処理したサンプルの上清、をそれぞれＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）に懸濁し、９５℃で５分間加熱した後、泳動した。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチンの単量体の分子量（２０，３００）付近にバンドを確認することができ（図２の矢印）、そのタンパク質は加熱処理後も可溶性画分に存在することが示唆された。また、熱処理後の可溶性画分に存在するタンパク質の濃度は３．３ｍｇ／ｍｌであった。
【００４８】
実施例６：遺伝子組換え糸状菌を用いたフェリチンタンパク質の評価
熱処理後のタンパク質溶液に含まれるタンパク質がフェリチンならば、内腔を有する多量体（２４量体）を形成し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析により粒子状構造が確認できるはずである。そこで、溶媒を水置換された各タンパク質溶液に含まれるタンパク質の形状を３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）で染色し、ＴＥＭ（ＪＥＭ２２００−ＦＳ、２００ｋＶ）で解析した。
【００４９】
その結果、ウマ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン発現遺伝子組換え糸状菌株の上清には、直径１２ｎｍの粒子状のタンパク質が多数含有されていた。そして、その粒子状タンパク質の中には中心が黒く観察され、タングステン由来と考えられるナノ粒子を内包していると考えられるものも観察された。この結果から、熱処理後の可溶性画分には、内腔を有する多量体を形成するウマ由来のフェリチン（図３）およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来フェリチン（図４）が多数含有されていることが分かった。また、ＴＥＭ像から粒子状タンパク質以外の構造体はほとんど観察されず、その他の夾雑タンパク質の量は少ないことが示唆された。
【００５０】
以上より、遺伝子組換え糸状菌を利用した本手法は、内腔を有する多量体の生産性に優れ、かつ遠心分離、熱処理等の簡便な方法で内腔を有する多量体を容易に精製できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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