(57)【要約】【課題】標識物質の選択の是非を速やかに把握することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の是非の判定方法を提供する。【解決手段】本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法は、ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、
ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する、ポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、
ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する、ポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法。
【請求項３】
前記標識物質がサイバーグリーンである、請求項１又は２に記載のポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部と、
ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する判定部とを備える、ＰＣＲ分析装置。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部と、
ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する判定部とを備える、ＰＣＲ分析装置。
【請求項６】
前記標識物質がサイバーグリーンである、請求項４又は５に記載のＰＣＲ分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識物質を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の是非の判定方法、及びＰＣＲ分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に代表される核酸増幅反応は、生物の遺伝子多型（ＳＮＰ）を調べる方法としてのみならず、細胞中への導入遺伝子の発現量を調べる方法としても有用である。また、核酸増幅反応は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、癌細胞など、特別の状態にある細胞の遺伝子発現パターンの把握や、病原体の同定にも用いられている。さらに、核酸増幅反応は、ごく微量の核酸を視覚的に捉えられる量にまで増幅することができるため、核酸増幅反応は、微生物の迅速検出法としても用いられている。例えば、イムノ−ＰＣＲ法のように分子認識試薬に標識した核酸の増幅は、微生物の極微量検出にも有用である。また、近年、核酸増幅反応は、逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡの微量検出にも利用されている。この場合、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後、ｃＤＮＡを核酸増幅反応によって増幅する方法が用いられている。
【０００３】
ＰＣＲを用いた分析方法の一例が、下記の特許文献１に開示されている。特許文献１には、固有ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生をモニターする方法であって、チャンバー中にＰＣＲ出発材料をコレートすること、並びに変性、アニーリング及び伸長のＰＣＲステップを行うこと、その間に、混合物中に紫外光を当てることによって干渉性核酸分子の産生をモニターし、上記分子によって吸収される光の量を測定する方法が記載されている。また、特許文献１には、非干渉性ＰＣＲ混合物からの干渉性核酸分子の産生を、リアルタイムでモニタリングすることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５２８１２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のＰＣＲを用いた分析では、プライマーの選択又は温度サイクルの誤りに気付かず、分析に要した時間と労力とが無駄になることがある。
【０００６】
特に、ＤＮＡ検体の存在を確認する方法として、例えば、ＰＣＲでＤＮＡの増幅を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う方法が広く採用されている。ＰＣＲにおいて、プライマーの選択又は温度サイクルを誤った場合に、電気泳動が終了した後までプライマーの選択又は温度サイクルの誤りに気付かず、分析に要した多大な時間と多大な労力とが無駄になることがある。
【０００７】
本発明の目的は、標識物質の選択の是非を速やかに把握することができるポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法、及びＰＣＲ分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の広い局面によれば、ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する、ポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法が提供される。
【０００９】
本発明の広い局面によれば、ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する、ポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法が提供される。
【００１０】
本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法のある特定の局面では、前記標識物質がサイバーグリーンである。
【００１１】
本発明の広い局面によれば、ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部と、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する判定部とを備える、ＰＣＲ分析装置が提供される。
【００１２】
本発明の広い局面によれば、ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部と、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する判定部とを備える、ＰＣＲ分析装置が提供される。
【００１３】
本発明に係るＰＣＲ分析装置のある特定の局面では、前記標識物質がサイバーグリーンである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法では、ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出しながら、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定するので、標識物質の選択の是非を速やかに把握することができる。
【００１５】
本発明に係るＰＣＲ分析装置は、ポリメラーゼ連鎖反応において、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部と、ポリメラーゼ連鎖反応時の複数のｎサイクル間において、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加した場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ポリメラーゼ連鎖反応時にｎを乗数として増加しなかった場合又は（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する判定部とを備えるので、標識物質の選択の是非を速やかに把握することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、ＤＮＡの二本鎖を一本鎖にする。次に、一本鎖ＤＮＡに、標識物質を結合させる。その後、ＤＮＡポリメラーゼを反応させ、ＤＮＡを伸長させる。この各手順を繰り返すことで、ＤＮＡを増幅させることができる。ＰＣＲでは、例えば増幅反応がサイクル毎に完全に正常に進行した場合には、ＤＮＡ断片は、１サイクル目に２分子、２サイクル目に４分子、３サイクル目に８分子となる。このように、サイクル毎に、ＤＮＡ断片が連続して増加していく。
【００１８】
本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の是非の判定方法は、ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する。本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法では、上記の検出を行いながら、ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間において、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する。あるいは、本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法では、上記の検出を行いながら、ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間において、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する。上記αは１であることが好ましく、１に近いほどよい。
【００１９】
本発明に係るＰＣＲ分析装置は、ＰＣＲにおいて、ＤＮＡにインターカレートした標識物質をリアルタイムで追跡して検出する検出部を備える。本発明に係るＰＣＲ分析装置は、ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間において、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時にｎを乗数として増加した場合を是と判断し、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時にｎを乗数として増加しなかった場合を否と判定する判定部を備える。あるいは、本発明に係るＰＣＲ分析装置は、ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間において、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加した場合を是と判断し、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ＰＣＲ時に（１＋α）ｎ（但し０．８≦α≦１）で増加しなかった場合を否と判定する判定部を備える。
【００２０】
本発明に係るＰＣＲ分析装置は、本発明に係るポリメラーゼ連鎖反応の是非の判定方法に好適に用いることができる。本発明に係るＰＣＲ分析装置を用いて分析を行う際には、上記検出部により検出を行いながら、上記判定部により判定を行うことが好ましい。
【００２１】
本発明では、上述した構成が備えられているので、少量の検体でＰＣＲを行ったとしても、正しい標識物質が選択されているか否かを簡易に把握することができ、最適な標識物質が選択されているか否かも簡易に把握することができる。
【００２２】
ＤＮＡ検体の存在を確認する方法として、ＰＣＲでＤＮＡの増幅を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う方法が広く採用されている。ＰＣＲにおいて、プライマーの選択を誤った場合に、電気泳動が終了した後までプライマーの選択の誤りに気付かず、時間と労力とが無駄になることがある。これに対して、電気泳動の終了に至らなくても、それよりも早く、正しい標識物質が選択されているか否かを簡易に把握することができる。
【００２３】
ＤＮＡのＰＣＲにおいて、例えば増幅反応のサイクル毎に完全に正常に進行した場合には、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、１サイクル毎に２倍になり、ＰＣＲ時に全体として２のｎ乗で増加する。すなわち、ＤＮＡのＰＣＲにおいて、例えば増幅反応のサイクルが完全に正常に進行した場合には、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、ＰＣＲ時に２ｎで増加する（（１＋α）ｎ（但し、α＝１）で増加する）。また、ＤＮＡのＰＣＲにおいて、例えば増幅反応の全サイクルのうち正常に進行しているｎサイクルでは、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、１サイクル毎に２倍になり、２のｎ乗で増加し、２ｎで増加する（（１＋α）ｎ（但し、α＝１）で増加する）。このため、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、ある時点で急速に増加する。本発明では、この増加時の複数のｎサイクル間において、標識物質数の増加を検出する。なお、標識物質が急激に増加した後、標識物質が飽和する。
【００２４】
一方で、ＤＮＡのＰＣＲにおいて、複数サイクルの内の幾つかのサイクルにおいて、増幅反応が良好に進行しないことがある。この場合に、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、１サイクル毎に２倍にはならないときがあり、ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間において、例えば１．８〜２．０のｎ乗で増加することがあり（（１＋α）ｎ（但し、但し０．８≦α≦１）で増加することがあり）、１．８以上２．０未満の数のｎ乗で増加することがある（（１＋α）ｎ（但し、但し０．８≦α＜１）で増加することがある）。この場合でも、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、ある時点で急速に増加するので、ＤＮＡのＰＣＲのｎサイクルにおいて、例えば増幅反応のサイクルは正常に進行しているとみすことができる。本発明では、この増加時の標識物質数の増加を検出する。
【００２５】
これに対して、プライマーの選択が特に誤っている場合に、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、一次関数で増加することがある。例えば、１サイクル目に１個、２サイクル目に２個、３サイクル目に３個、４サイクル目に４個・・・のように増加する傾向がある。このような場合には、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数は、急速に増加しない。この場合には、ポリメラーゼ連鎖反応は否と判別される。
【００２６】
本発明では、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ある時点で特定の増加量で急速に増加する場合を是、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、ある時点で特定の増加量で急速に増加しない場合を否と判別している。ＰＣＲ時の全サイクルではなく、少なくとも複数のｎサイクル間において、ＰＣＲにおけるＤＮＡにインターカレートした標識物質数が、特定の増加量で急速に増加すればよい。
【００２７】
上記標識物質数は、ＣＣＤカメラ、フォトディテクター、光電子倍増管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）による蛍光強度で評価することができる。具体的には、ＣＣＤカメラで伸長反応後の蛍光観察を、各サイクルごとに行うことができる。
【００２８】
「ＰＣＲ時の複数のｎサイクル間」におけるサイクル数ｎは、例えば１０以上であり、例えば４５以下あり、好ましくは１５以上、好ましくは３０以下である。
【００２９】
上記標識物質としては、エチジウムブロマイド、ピコグリーン、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２やＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ及びサイバーグリーン等が挙げられる。感度がより一層良好になることから、上記標識物質はサイバーグリーンであることが好ましい。
【００３０】
以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。本発明は、以下の実施例のみに限定されない。
【００３１】
（実施例１）
表１に示す濃度でＰＣＲの反応溶液を調製した後、表３に示すＰＣＲ温度条件で評価を行った。ＰＣＲは、ヒトのβ−アクチンに関する部分を増幅し、プライマー配列を表２に示した。
【００３２】
【表１】
2016158501.tif 000002
【００３３】
【表２】
2016158501.tif 000003
【００３４】
【表３】
2016158501.tif 000004
【００３５】
（比較例１）
ＰＣＲの温度条件を下記の表４に示すように変更したこと以外は、実施例１の条件で評価を行った。
【００３６】
【表４】
2016158501.tif 000005