(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質、ペプチド、多糖類、及び核酸などの親水性の大きな分子薬の、動物対象の小腸管における放出を高める、ガス生成ミクロスフィア／ナノスフィアまたは発泡剤の医薬組成物を用いる経口薬物送達系の提供。【解決手段】ガス生成剤、加水分解に際してそのガス生成剤にガスを生成させる化合物、随意に賦形剤、及び少なくとも生体活性剤からなる医薬組成物をカプセル化した、動物対象での経口送達用腸溶性コーティングカプセル剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス発生成分および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物であって、腸溶性コーティングカプセル剤内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形される医薬組成物。
【請求項２】
前記ガス発生成分が、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、および重炭酸カルシウムからなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
酸開始剤をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記酸開始剤がコンプレクソンの無水物である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記コンプレクソンが、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸塩）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−四酢酸）、およびＮＯＴＡ（２，２’，２’’−（１，４，７−トリアザナン−１，４，７−トリイル）三酢酸）からなる群から選択される請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記酸開始剤が前記動物対象の腸管で前記ガス発生成分と反応して、水に接触した際にガスを生じ、前記ガスが二酸化炭素である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記カプセル剤が、ゼラチンまたは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、およびメチルセルロース誘導体からなる群から選択されるメチルセルロースで作られる請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの賦形剤をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの賦形剤が、薬理学的に許容される担体、希釈剤、乾燥剤、可溶化剤、界面活性剤、吸収促進剤、および乳化剤からなる群から選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記吸収促進剤が、胆汁酸塩、中鎖脂肪酸、リン酸エステル、キトサン、およびキトサン誘導体からなる群から選択される請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性または非イオン界面活性剤である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの生体活性剤が抗糖尿病化合物であり、前記抗糖尿病化合物が、インスリン、インスリンアナログ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、インスリン抵抗性改善薬、インスリン分泌促進剤、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤、メトホルミン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、アミリンアナログ、２型ナトリウム−グルコース輸送体（ＳＧＬＴ２）阻害剤、ベンフルオレクス、トルレスタット、マイトフュージン１、マイトフュージン２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生体活性剤が、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウィルス物質、抗新生物剤、抗生物質、酸素富化剤、酸素含有剤、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤、抗血友病因子、抗てんかん薬、アルツハイマー型認知症拮抗薬、抗炎症薬、カルシトニン、シクロスポリン、エリトロポイエチン、赤血球生成刺激剤、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、チロトロピン放出ホルモン、卵巣刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、バソプレッシンおよびバソプレッシンアナログ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン−１１、インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子阻害剤、メラニン細胞刺激ホルモン、抗体、ならびにモノクローナル抗体からなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ガス発生成分、界面活性剤、酸開始剤、および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物であって、腸溶性コーティングカプセル剤内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形され、前記界面活性剤の電荷が、前記少なくとも１つの生体活性剤の電荷の反対であって前記少なくとも１つの生体活性剤と前記界面活性剤との間の結合親和力を高める医薬組成物。
【請求項１６】
活性成分を動物対象に経口投与する方法であって、それにより活性成分を含有する複数の泡が対象の小腸において形成され、
核酸、ペプチド、およびタンパク質を含む前記活性成分、
界面活性剤、
酸性構成成分、ならびに
発泡性成分を含む
薬物層、ならびに
前記薬物層をカプセル化する腸溶性コーティング層
を含む医薬組成物の有効量を対象に経口で投与することを含み、それにより前記薬物層の前記酸性構成成分が小腸で溶けて二酸化炭素および活性成分を含有する複数の泡を生成する発泡性成分と反応し、前記活性成分が界面活性剤によって形成される二重層構造の内層と外層の間に形成される間隙に埋め込まれる方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が錠剤またはカプセル剤である請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの生体活性剤およびナノ／マイクロバブル形成剤を含み、経口薬物送達の有効性を高める医薬組成物、系、送達の方法、および動物対象の疾患または障害を治療するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成によって製造される低分子薬物と異なり、生物製剤は細菌細胞または哺乳類細胞を基盤として生体内で合成される。しかし、タンパク質、ペプチド、多糖類、および核酸などの親水性の大きな分子薬は、その構造的な特性および胃酸中での不安定性のために注射調剤として調製しなければならないことが多い。ここに開示するのは、動物対象の小腸管における薬物放出を高める、ガス生成ミクロスフィア／ナノスフィアまたは発泡剤の医薬組成物を用いる経口薬物送達系である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の１つの目的は、媒体としてのナノ／マイクロバブル生成成分を使用することによって活性成分を経口投与し、動物対象、例えばヒトにおける薬物送達、放出、および吸収に効果的に使用できる方法を提供することである。
【０００４】
本発明の幾つかの態様は、少なくとも１つの活性成分を対象に経口投与する方法を提供し、それにより、経口送達後に、活性成分を含有する複数の泡が、標的である対象の小腸で形成される。活性成分を対象に経口投与する方法は、経口で対象に本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。１つの実施形態では、医薬組成物は少なくとも活性成分、および少なくとも発泡性（泡生成）成分を含む。随意に、医薬組成物は、少なくとも界面活性剤成分など、および／または酸性構成成分（本願では酸開始剤としても知られる）などをさらに含む。発泡性成分はまた一般に、発泡剤（ｂｕｂｂｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、泡生成剤、ガス発生剤、ガス生成剤、または発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とも呼ばれる。本明細書の上記の用語はすべて本願において互換可能である。活性成分は、核酸、ペプチド、タンパク質などを含むが、これらに限定されない。活性成分は、親水性薬剤もしくは疎水性活性薬剤のいずれか、または親水性薬剤および疎水性活性薬剤の組み合わせを含む。医薬組成物は腸溶性コーティング層をさらに含んでもよい。１つの実施形態では、腸溶性コーティング層は、腸溶性コーティングカプセル剤であり、固体形態にある医薬組成物の１つ以上の成分をカプセル化する。別の実施形態では、腸溶性コーティング層は、腸溶コーティング錠剤または丸剤であり、その固体錠剤または丸剤の形態にある医薬組成物の成分の塊（ｍａｓｓ）の全表面を覆う。医薬組成物の酸性構成成分が、水または小腸内の液に接触した際に溶解して二酸化炭素を生成する発泡性成分と反応する場合、活性成分を泡の表面に含有する複数の二酸化炭素泡（またはガスコア（ｃｏｒｅ））が形成される。幾つかの実施形態では、活性成分が、二酸化炭素ガスコア上に医薬組成物の界面活性剤成分によって形成される二重層構造の内層と外層の間に形成される間隙に埋め込まれる。別の実施形態では、活性成分は、泡またはガスコア上に吸着または結合される。
【０００５】
本発明の幾つかの態様は、ガス発生成分および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物を提供し、その医薬組成物は腸溶性コーティングカプセル剤内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形される。１つの実施形態では、ガス発生成分は、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、および重炭酸カルシウムからなる群から選択される。１つの実施形態では、医薬組成物は酸開始剤をさらに含み、１つの実施形態では、酸開始剤はコンプレクソンの無水物である。１つの実施形態では、コンプレクソンは、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸塩）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−四酢酸）、およびＮＯＴＡ（２，２’，２’’−（１，４，７−トリアザナン−１，４，７−トリイル）三酢酸）からなる群から選択される。さらなる実施形態では、酸開始剤は動物対象の腸管でガス発生成分と反応して、水に接触した際にガスを生成し、ガスは好ましくは二酸化炭素である。
【０００６】
本発明の幾つかの態様は、ガス発生成分および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物であり、医薬組成物は腸溶性コーティングカプセル内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形され、そこにおいて、カプセルは、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、およびメチルセルロース誘導体からなる群から選択されるメチルセルロースから作られる。１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は少なくとも１つの賦形剤をさら含む。１つの実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、薬理学的に許容される担体、希釈剤、乾燥剤、可溶化剤、界面活性剤、吸収促進剤、および乳化剤からなる群から選択される。１つの実施形態では、吸収促進剤は、胆汁酸塩、中鎖脂肪酸、リン酸エステル、キトサン、およびキトサン誘導体からなる群から選択される。別の実施形態では、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性または非イオン界面活性剤である。
【０００７】
本発明の幾つかの態様は、ガス発生成分および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物を提供し、医薬組成物は腸溶性コーティングカプセル剤内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形され、少なくとも１つの生体活性剤は抗糖尿病化合物であり、抗糖尿病化合物は、インスリン、インスリンアナログ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、インスリン抵抗性改善薬、インスリン分泌促進剤、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤、メトホルミン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、アミリンアナログ、２型ナトリウム−グルコース輸送体（ＳＧＬＴ２）阻害剤、ベンフルオレクス、トルレスタット、マイトフュージン１、マイトフュージン２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。１つの実施形態では、少なくとも１つの生体活性剤は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウィルス物質、抗新生物剤、抗生物質、酸素富化剤、酸素含有剤、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤、抗血友病因子、抗てんかん薬、アルツハイマー型認知症拮抗薬、抗炎症薬、カルシトニン、シクロスポリン、エリトロポイエチン、赤血球生成刺激剤、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、チロトロピン放出ホルモン、卵巣刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、バソプレッシンおよびバソプレッシンアナログ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン−１１、インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子阻害剤、メラニン細胞刺激ホルモン、抗体、およびモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【０００８】
本発明の幾つかの態様は、ガスコア、そのガスコアを囲んで二重層構造を形成する界面活性剤を含む薬物送達バブルを提供し、その二重層構造は、ガスコア上に界面活性剤によって形成される内層および外層を提供する。１つの実施形態では、活性成分（生体活性剤またはＡＰＩとしても知られる）は、二重層泡構造の内層と外層の間に形成される間隙に埋め込まれる。１つの実施形態では、活性成分は親水性または疎水性の物質である。１つの実施形態では、外層は泡ガスコアの一部を覆い、それにより泡ガスコア表面はここでは内層である。１つの実施形態では、外層および／または内層は、泡ガスコア表面の少なくとも一部を覆う。別の実施形態では、活性成分は、ガスコアの表面上、内層上、または外層上に吸着される。１つの実施形態では、界面活性剤は各々、親水性の頭部および疎水性の尾部を有し、内層の界面活性剤の疎水性の尾部はガスコアに面し、外層の界面活性剤の疎水性の尾部は泡の外側に面し、内層の界面活性剤の親水性の頭部および外層の界面活性剤の親水性の頭部は互いに向き合って並んで二重層構造を形成する。別の実施形態では、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性または非イオン界面活性剤を含む。さらに、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート、ラウレス硫酸ナトリウムまたはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む。１つの実施形態では、本発明の泡の直径は、４．５ｎｍ〜１００μｍの範囲にあり、好ましくは１０ｎｍ〜１０μｍの範囲にある。さらなる実施形態では、本発明の泡の直径は４．５ｎｍ以下である。先行技術から、医薬組成物が腸溶性コーティングカプセル剤または錠剤に発泡性成分および少なくとも１つの活性成分を含むことは新規であり、自明でないとみなされる。
【０００９】
本発明の幾つかの態様は、活性成分を動物対象に経口投与する方法を提供し、それによって活性成分を含有する複数の泡が対象の小腸で形成され、該方法は、核酸、ペプチド、およびタンパク質を含む活性成分、界面活性剤、酸性構成成分、ならびに発泡性成分を含む薬物層、ならびに薬物層をカプセル化する腸溶性コーティング層を含む医薬組成物の有効量を対象に経口投与することを含み、それによって、薬物層の酸性構成成分は、小腸で溶けて二酸化炭素および活性成分を含有する複数の泡を生成する発泡性成分と反応し、その活性成分は、界面活性剤によって形成される二重層構造の内層と外層の間に形成される間隙に埋め込まれる。１つの実施形態では、医薬組成物は錠剤またはカプセル剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
添付図面を参照して発明を実施するための形態を読めば、本発明のさらなる目的および特徴がより明らかになり、本開示自体最もよく理解されるであろう。
【００１１】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に係るナノ／マイクロバブルを示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態の実験データである。
【図３】図３は、本発明の実施形態の実験データである。
【図４】図４は、本発明の実施形態の実験データである。
【図５】図５は、各種インスリン製剤で治療された糖尿病ラットの（ａ）対時間血漿インスリン濃度分析結果および（ｂ）対時間血中グルコース変化分析結果を示す。経口：試験カプセル剤経口投与およびＳＣ：皮下注射。
【図６】図６ａは、本発明の１つの実施形態に係るナノ／マイクロバブルを示す模式図である。図６ｂは、図６ａを部分的に拡大した図である。
【図７】図７は、経口投与されたゼラチンカプセル剤から生じた泡担体の形成および増大（副図（ｓｕｂｆｉｇｕｒｅｓ）ａ、ｂ、およびｃを参照されたい）、ならびにその上皮性関門を越えてインスリンを送達する機構を示す略図を示す。ＴＪ：密接結合、ＡＪ：接着結合。
【図８】図８は、（ａ）ＳＢＣの存在または非存在下で、胃腸管内のｐＨ環境を模したさまざまなｐＨレベル下で評価した試験カプセル剤の溶解および崩壊の結果、（ｂ）ＣＯ２泡の生成を示す超音波画像を示す。
【図９】図９は、泡担体の水膜内の（ａ）ＦＩＴＣ−インスリンおよび（ｂ）Ｃｙ３−ＤＴＰＡ双方のカプセル化を明らかにする蛍光画像、（ｃ）水に曝された際に作られた泡担体を示す対応略図、（ｄ）泡の形成および増大の構造的変化を示すＳＡＸＳ分析結果を示す。
【図１０】図１０は、ラットから新たに単離された十二指腸部でのＤＴＰＡまたはＳＤＳの存在または非存在下におけるインスリン分解の結果を示す。Ｎ．Ｓ．：有意でない、＊：統計的に有意（Ｐ＜０．０５）。
【図１１】図１１は、硫酸バリウムおよび１２３Ｉ−インスリン（白い矢印）を含有し、発泡剤も含むカプセル剤または発泡剤は含まないカプセル剤を用いて経口で治療した試験ラットの連続単純Ｘ線およびＸ線／シンチグラフィー画像を示す。
【図１２】図１２は、本発明のナノバブル形成系の主要成分の化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
下記の本発明の好ましい実施形態は、特に、少なくとも発泡剤および薬物または生体活性剤を腸溶性コーティングカプセル剤または錠剤に含む医薬組成物、系、送達の方法、および経口薬物送達のための使用に関する。本明細書はさまざまな実施形態の具体的な詳細を記載するが、その記載は例示にすぎず、決して本発明を限定すると解釈すべきではないことを理解すべきである。さらに、当業者なら想到しうるさまざまな本発明の適用およびそれに対する変更も、下記の一般的な概念によって包含される。
【００１３】
インスリンなどの治療用タンパク質をうまく経口で送達することは、患者のクオリティ・オブ・ライフを大いに向上させる。本発明のこの系は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）二無水物など、発泡剤（重炭酸ナトリウム、ＳＢＣ）など、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）など、およびタンパク質／ペプチド薬物（例えば、インスリン）などの１つ以上の成分を腸溶性コーティングカプセル剤に充填することによる泡生成系を含む。糖尿病の対象への経口投与に続いて、カプセル剤または錠剤の腸溶性コーティングポリマーのｐＨを超えるｐＨの腸液は、腸溶層を通る。次いで、液体はカプセル剤または錠剤内の粉末混合物を浸透および／または飽和し、同時に、ＤＴＰＡ二無水物（または酸開始剤）は酸性の環境と作り出し、ＳＢＣは酸性のｐＨ環境で分解してＣＯ２泡またはガスを形成する。生成されたガスの圧力によりカプセル剤または錠剤がさらに破裂して、腸壁に向けた充填内容物の迅速な放出クイックレリースを高める。
【００１４】
１つの実施形態では、ガス泡は、ＣＯ２の増大および体積増加に起因して、界面活性剤分子（ＳＤＳ）内でナノスケールからマイクロスケールに成長する。ＣＯ２泡の壁または表面は、ナノスケールでコロイド状の担体としての役割を果たして生体活性剤（例えば、インスリンまたはＧＬＰ−１）およびＤＴＰＡを輸送しうる水（または液体）の自己組織化膜からなる。１つの実施形態では、インスリン生体活性剤および／またはＤＴＰＡは、ＳＤＳまたは他の適切な界面活性剤の２つの層の間に挟まれうる。成長したガス泡は腸管を通過する間、壁にぶつかって破裂するまで増大し続け、それが輸送する輸送生体活性剤、ＤＴＰＡ、および／またはＳＤＳを粘膜層に放出する。放出されたＤＴＰＡおよびＳＤＳは、個々にまたは一緒になってプロテアーゼ阻害剤として機能して生物活性のインスリン分子を保護するとともに、吸収促進剤として機能して上皮浸透性および最終的な体循環への吸収を増やす。
【００１５】
本発明の１つの目的は、経口薬物送達系における腸溶性コーティングカプセル剤を介する薬物医薬組成物の迅速で効果的な送達を用いる、新規の、自明でない、独自の系およびタンパク質／ペプチド薬または生体活性剤送達を調製する方法で提供することである。新規の薬物担体系は、酸性の水性環境に曝された際にＣＯ２泡を生成できる発泡剤（例えば、重炭酸ナトリウム、ＳＢＣ）を含む。１つの実施形態では、これらのＣＯ２泡（本願ではガスコアとしても知られる泡）の壁は、タンパク質薬または他の生体活性剤を輸送するコロイド状の担体を形成する界面活性剤分子の２つの層の間に挟まれることができる水のナノスケール自己組織化膜である。吸収は、コロイド状分散内に可溶化構成成分として粉末薬物を配合することによって高めることができる。１つの実施形態では、この泡生成系は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）二無水物、ＳＢＣ、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）、およびタンパク質薬物（インスリン）を混ぜることによって調製される。ＤＴＰＡ二無水物は、水に溶けて酸（例えば、ＤＴＰＡ）溶液を生じる酸性酸化物である。酸と反応したとき、ＳＢＣは泡状のＣＯ２ガスを生じる。
【００１６】
図１を参照すると、該図は本発明の１つの実施形態に係るナノ／マイクロバブルを示す模式図であり、界面活性剤１２はガスコア１１を囲み、二重層構造を形成する。界面活性剤１２は各々、親水性の頭部１２２および疎水性の尾部１２１を有し、二重層構造はガスコア１１の上に界面活性剤１２によって形成される内層および外層からなる。内層の界面活性剤１２はその疎水性の尾部１２１をガスコア１１に面し、外層の界面活性剤１２はその疎水性の尾部１２１をナノ／マイクロバブル１の外側に向ける。二重層構造中の内層の界面活性剤１２および外層の界面活性剤１２は、互いにそれらの親水性の頭部を並べ、二重層構造を形成する。活性成分１３は、二層構造の内層と外層に形成される間隙に埋め込まれる。そこにおいて、二酸化炭素または他のガスのガスコア１１は、界面活性剤１２によってカプセル化されうる。
【００１７】
本発明のナノ／マイクロバブルの粒径は、主にガスコアの大きさに依存し、よって広い範囲でさまざまでありうる。１つの実施形態では、ナノ／マイクロバブルの粒径は、主に４．５ｎｍ〜１００μｍの範囲であり、好ましくは、１０ｎｍ〜１０μｍの範囲でありうる。さらなる実施形態では、本発明の泡の直径は４．５ｎｍ以下である。
【００１８】
本発明のナノ／マイクロバブルにおけるガスコア１１の存在が非常に重要であることに留意すべきである。液体を充填される従来のリポソームまたは細胞膜の中心（ｃｅｎｔｅｒ）と比べて、ガスコアは新規であり、自明でない。したがって、本発明のナノ／マイクロバブルは、従来のリポソームまたは細胞膜と区別されうる。本発明の幾つかの態様は、少なくとも医薬品有効成分、少なくとも発泡性成分、および随意に少なくとも界面活性剤成分、および随意に少なくとも酸性構成成分（または酸開始剤）成分を含む医薬組成物を提供し、そこでは成分の全てが腸溶性コーティングカプセルにカプセル化される。患者の腸管への経口カプセル剤送達およびカプセル剤の腸液との接触の際、複数の泡（ナノ／マイクロバブル）が形成され、泡の内空は気体状態の二酸化炭素で実質的に満たされる。発泡性は水溶液からのガスの流出であり、ガスの放出に由来する泡立ち（ｆｏａｍｉｎｇ）または泡立ち（ｆｉｚｚｉｎｇ）である。発泡性成分または薬剤は、ガスを作って放出することによって発泡現象を引き起こすことができる物質である。
【００１９】
さらに、１つの好ましい実施形態では、界面活性剤１２によって形成されるナノ／マイクロバブルの二重層構造は、従来のリポソームまたは細胞膜において提供される脂質二重層と反対の様式でありうることに留意すべきである。具体的には、界面活性剤１２の疎水性の尾部１２１はガスコア１１に面し、かつナノ／マイクロバブルの外側に向かい、親水性の頭部１２２が互いに向き合って並んで二重層構造を形成し、水に対する疎水性を維持する。しかし、従来の脂質二重層構造の親水性の頭部は中心に面し、かつ外側に向かい、疎水性の尾部が互いに向き合って並んで二重層構造を形成する。
【００２０】
一般的に、界面活性剤１２は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性または非イオン界面活性剤に分類できる。陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウレス硫酸ナトリウムなどを挙げることができるがこれらに限定されない。陽イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルジメチルアミン塩などを挙げることができるがこれらに限定されない。ノンイオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラートなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２１】
図１に示すように、活性成分１３は、互いに向き合って並ぶ界面活性剤の親水性の頭部の間に形成される間隙に埋め込まれうるので、活性成分１３の大きさは特に限定されない。活性成分１３は、小さい分子薬物または大きな生体分子でありうる。好ましい実施形態では、活性成分１３は、核酸、ペプチド、またはタンパク質を含みうる。ここで、核酸はデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）またはリボース核酸（ＲＮＡ）を含む。タンパク質は抗体またはタンパク質薬物を含みうる。タンパク質薬物としては、インスリン、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、またはインターフェロンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２２】
好ましい実施形態では、活性成分１３は活性成分と界面活性剤の親水性の頭部の間の親水性の相互作用を増やすように親水性であってよい。親水性の活性成分１３は、限定されないが、インスリンおよびＤＮＡなどである。好ましい実施形態では、界面活性剤は、活性成分１３の電荷に基づいて選ばれ、活性成分と界面活性剤の間の結合親和力を増やす。例えば、活性成分としてのＤＮＡの場合、ＤＮＡは負に帯電するので、正に帯電する幾つかの陽イオン界面活性剤が選ばれて、活性成分と界面活性剤の間の結合親和力を高める。
【００２３】
好ましい実施形態では、界面活性剤は、活性成分と界面活性剤の間の結合親和力を増加するように活性成分１３の電荷に基づいて選ばれる。例えば、活性成分としてのＤＮＡの場合、ＤＮＡは負に帯電するので、正に帯電する幾つかの陽イオン界面活性剤が選ばれて、活性成分と界面活性剤の間の結合親和力を高める。本発明の幾つかの態様は、ガス発生成分、界面活性剤、酸開始剤、および少なくとも１つの生体活性剤を含む動物対象向け経口送達用医薬組成物を提供し、その医薬組成物は、腸溶性コーティングカプセル剤内に充填されるか、または表面に腸溶性コーティングを有する錠剤として成形され、その界面活性剤の電荷は、少なくとも１つの生体活性剤の電荷と反対であって、少なくとも１つの生体活性剤と界面活性剤の間の結合親和力を高める。
【００２４】
さらに本発明の図６ａおよび６ｂを参照して、該図は本発明のナノ／マイクロバブルを示す模式的分子シミュレーションであり、図６ｂは、図６ａを部分的に拡大した図である。模式図の例に示されるように、二重層構造の内層と外層の間に形成される間隙は約４．５ｎｍ、二重層構造の幅は約７．５ｎｍでありうる。ここで、活性成分１３は形成された間隙に埋め込まれたインスリンでありうる。
【００２５】
医薬組成物は、界面活性剤、発泡性成分、および活性成分を含む。好ましい実施形態では、発泡性成分は酸と反応して二酸化炭素を生成できる。発泡性成分は炭酸塩または重炭酸塩を含み、例えば限定されないが、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または重炭酸アンモニウムなどを含む。本発明の製剤を酸性の環境に曝すことによって、二酸化炭素は不可逆的に発泡性成分と酸の反応によって生成される。二酸化炭素は「爆発（ｂｕｒｓｔ）」的に生成されるので、製剤の界面活性剤は、二酸化炭素ガスコアをカプセル化して、少なくとも二酸化炭素コアの一部に本発明の二重層構造を形成し、活性成分は本発明のナノ／マイクロバブルの間隙または表面に位置する。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は酸性成分をさらに含み、その酸性成分は水中で分離または加水分解されて酸を形成し、それによって発泡性成分は水中で二酸化炭素を生成可能になる。そのような実施形態では、本発明の製剤は上記のように局所的な酸性の環境を作り出すことができ、中性またはアルカリ性の環境で機能して本発明のナノ／マイクロバブルを生成する。酸性成分は固体形態の有機酸または無機酸でありうる。例えば、酸性成分は、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、アスコルビン酸、アミノ酸、グリコール酸、アジピン酸、ホウ酸、酒石酸水素カリウム、およびそれらの無水物からなる群から選択されうる。有機酸は、例えば限定されないが、無水クエン酸、無水コハク酸、無水クエン酸、または他の好適な有機酸無水物などを含む無水物を含んでもよい。
【００２７】
本発明の製剤中の酸性成分、発泡性成分、および界面活性剤の割合は、当業者として容易に変更しうる。例えば、１つの例での酸性成分、発泡性成分、および界面活性剤のモル比は５：２１：６であり、水の存在下での酸性成分と発泡性成分の反応から二酸化炭素ガスを生成する。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明の製剤または医薬組成物は、粉末混合物成分をカプセル化する腸溶性コーティング層をさらに含んでなる。腸溶性コーティング層は、限定されないが、（メチル）アクリル酸共重合体、ヒドロキシプロピルセルロースフタル酸エステル、ヒドロキシプロピルセルロース酢酸エステル、ヒドロキシプロピルセルロース酢酸コハク酸エステル、またはカルボキシメチルエチルセルロースからなる。１つの実施形態では、腸溶性ポリマーは、錠剤、丸剤、またはいずれの圧縮形態の医薬組成物に表面に吹き付けられて、医薬品有効成分、界面活性剤成分、酸性構成成分、発泡性成分、および他の化合物から選択される成分の１つ以上を含有する腸溶コーティング錠剤または丸剤を製造しうる。
【００２９】
例えば、１つの実施形態では、薬物成分は、さらにゼラチンカプセルに充填されうる。次いで、カプセル剤の外面をコーティング技術によってＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）を用いてコーティングし、胃酸によって引き起こされる損傷を回避する。医薬組成物の成分は、小腸に届くまで損なわれることなく、小腸で発泡性成分は水（例えば、腸液）中の酸性成分と反応することによって二酸化炭素を生成する。そのような実施形態では、本発明の製剤または医薬組成物を利用してアルカリ性の環境（例えば、小腸）の中に局所的な酸性の環境を作り出しうる。その結果、上記反応が進んで本発明のナノ／マイクロバブルが生成されうる。
【００３０】
許容可能な賦形剤に関して、医薬組成物は、薬理学的に許容される担体または希釈剤、香料、甘味料、保存剤、抗酸化剤、湿潤剤、緩衝剤、放出制御構成成分、色素、接着剤、懸濁化剤、分散剤、着色剤、崩壊剤、賦形剤、膜形成剤、潤滑剤、可塑剤、油、または上記いずれか２つ以上の組み合わせなどのいずれの随意の添加剤を含みうる。
【００３１】
好適な薬理学的に許容される担体または希釈剤としては、エタノール、水、グリセロール、プロピレングリコールまたはグリセロール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ビタミンＡおよびＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオン酸塩、リン酸カリウム、またはシリカが挙げられるがこれらに限定されない。好適な潤滑剤は、オレイン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ラウリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムでありうる。好適な懸濁化剤は、ベントナイト、エチル、イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質２つ以上の混合物でありうる。好適な分散剤および懸濁化剤は、植物性ゴム、トラガカント、アカシアなどの合成ゴムおよび天然ゴム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよびゼラチンでありうる。好適な膜形成薬剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、およびポリメタクリレートをベースとする。好適な可塑剤としては、さまざまな分子量（例えば２００〜８０００Ｄａ）を有するポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびクエン酸トリエチルが挙げられる。好適な着色剤は、酸化鉄（ＩＩＩ）、二酸化チタン、ならびに天然および合成顔料である。さらなる添加剤としては、例えば、ソルビトール、タルク、またはステアリン酸が挙げられる。カプセル剤に充填される場合または錠剤として形成される場合、医薬組成物の成分は一般的に固体形態である。
【００３２】
１つの好ましい実施形態では、活性成分を対象に経口投与する方法が提供され、その方法によって活性成分を含有する複数の泡が対象の小腸で形成される。活性成分を対象に経口投与する方法は、上記医薬組成物の有効量を対象に経口で投与することを含み、それによって薬物医薬組成物の酸性構成成分は小腸で溶けて、二酸化炭素および活性成分を含有する複数の泡を生成する発泡性成分と反応する。幾つかの実施形態では、活性成分は、界面活性剤によって形成される二重層構造の内層と外層の間に形成される間隙に埋め込まれる。
【００３３】
１つの好ましい実施形態では、本発明の方法は糖尿病を治療するために使用され、活性成分はインスリンである。本明細書で使用される場合、「患者」、「宿主」、「使用者」、および「対象」という用語は、いずれのヒトまたは動物対象を指し、主題発明をヒト患者に使用することは好ましい実施形態を表わしてはいるが、系および方法をヒトへの使用に限定することを意図しない。上記で言及したように、本発明の１つの実施形態では、本発明のナノ／マイクロバブルは腸管で生成される。ナノ／マイクロバブルが腸上皮の上皮細胞と接触すると、界面活性剤は傍細胞経路も経細胞経路も促進でき、本発明の活性成分は体循環の標的部位に送達できる。
【００３４】
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。それらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３５】
ナノ／マイクロバブル製剤の調製  
界面活性剤の１つの例はＳＤＳであり、酸性成分の１つの例はＤＴＰＡ二無水物（ジエチレントリアミン五酢酸二無水物）、発泡性成分の１つの例は重曹（重炭酸ナトリウム、ＳＢＣ）、活性成分の１つの例はインスリン、および腸溶性コーティング材の１つの例はＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５である。調製の１つは以下のように列挙される。
１．ＳＤＳ（７ｍｇ）、ＤＴＰＡ二無水物（１４ｍｇ）、ＳＢＣ（７ｍｇ）、インスリン（５ＩＵ／Ｋｇ）を均一に混ぜ、ゼラチンカプセル剤に詰める。
２．上記にように作製したゼラチンカプセル剤を、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５（１０％）でコーティングし、次に乾燥する。
【００３６】
ナノ／マイクロバブルの検証  
図２を参照して、インスリンをＦＩＴＣで標識し、ＳＤＳの疎水性の尾部を蛍光親油性陽イオン性インドカルボシアニン色素ＤＩＩ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩）で染色した。得られた蛍光画像は、インスリンがまさに本発明のナノ／マイクロバブルに存在し、界面活性剤形成された二重層構造の間隙に位置することを蛍光画像技術によって明らかに示した。このことは活性成分が本発明のナノ／マイクロバブルに良好に埋め込まれていることを示す。
【００３７】
ナノ／マイクロバブルと結合した細胞の細胞画像
図３を参照すると、該図は細胞を各種構成成分と共培養した後の顕微鏡下での画像を示し、細胞はＣｌｄ４（密接結合）、Ｅカドヘリン（接着結合）、およびＤＡＰＩ（核）を用いて染色された。結果は、ＤＴＰＡ二無水物は傍細胞経路を介するＦＩＴＣ−インスリンの伝達を促進でき、ＳＤＳは傍細胞経路と経細胞経路の両方を介するＦＩＴＣ−インスリンの伝達を促進できることを示した。
【００３８】
ナノ／マイクロバブルを含む生体内細胞画像
図４を参照すると、該図は腸管内でのナノ／マイクロバブルの効果を示す。インスリンの分布は、発泡性成分を含まない群では局所的な領域でのみ画像に見られて特定されることができる。本発明の発泡性成分を含む群は、（画像のように）小腸系の中間部分および末端部分でのインスリンの放出を示している。ナノ／マイクロバブルの破裂は、発泡性成分の補助を受けたインスリンの放出を導き、結果として、発泡性成分を含まない対照群と比較して、より良好な放出性能（ならびにそれに続く腸吸収および浸透の向上）をもたらす。
【００３９】
抗糖尿病薬物
本明細書において、抗糖尿病薬物（本発明における生体活性剤）はおおまかにインスリン／インスリンアナログと非インスリン抗糖尿病薬物に分類される。非インスリン抗糖尿病薬物としては、ビグアナイド（例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミンなど）、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ、例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、など）、およびデュアルＰＰＡＲ作動薬（例えば、アレグリタザル、ムラグリタザール、テサグリタザルなど、ＰＰＡＲはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の略語である）などのインスリン抵抗性改善薬を挙げることができるがこれらに限定されない。また、非インスリン抗糖尿病薬物としては、スルホニル尿素（例えば、カルブタミド、クロルプロプアミド、グリクラジド、トルブタミ、トラザミド、グリピジド、グリベンクラミド、グリキドン、グリクロピラミド、グリメピリド、など）、メグリチニド（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド、など）、ＧＬＰ−１アナログ（例えば、エクセナチド、リラグルチド、アルビグルタイド、タスポグルチド、など）、およびＤＰＰ−４阻害剤（例えば、アログリプチン、リナグリプチン、サクサグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチンなど；ＤＰＰ−４は、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤の略語である）などの分泌促進剤も挙げられうるがこれらに限定されない。
【００４０】
さらに、非インスリン抗糖尿病薬物としては、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボースなど）、アミリンアナログ（例えば、プラムリンタイドなど）、ＳＧＬＴ２阻害剤（例えば、ダパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジンなど）、ベンフルオレクス、およびトルレスタットを挙げることができるがこれらに限定されない。ここで、２型ナトリウム−グルコース輸送体（ＳＧＬＴ２）は、近位尿細管のＳ１分節に発現する６７２アミノ酸の高容量低親和性トランスポーターであり、腎臓のグルコース再吸収の大半を媒介すると考えられている。本発明の幾つかの態様は、２つ以上の生物活性医薬品成分および少なくとも１つの発泡性成分を含む配合丸剤、錠剤、またはカプセル剤を提供する。
【００４１】
別の実施形態では、カプセル剤は、可溶化剤、発泡剤、乳化剤、または一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）などの他の薬局方医薬賦形剤を含有しうる。ＧＲＡＳは食品に添加される科学製品または物質が専門家によって安全とみなされているというアメリカ合衆国食品医薬品局（ＦＤＡ）指定であり、したがって通常の連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＦＤＣＡ）食品添加物許容要件を免除される。発泡剤は、カプセル剤を破裂させるか、またはカプセル剤充填物（ｐａｙｌｏａｄ）とカプセル剤外側の周囲材料の密な接触を促進することを目的として液体と接触した際に二酸化炭素ガスを放つ薬剤である。例えば、重炭酸ナトリウムと酸の反応は塩と炭酸を生じ、それは容易に二酸化炭素と水に分解する。発泡剤としては、重炭酸ナトリウム／クエン酸混合物、アクジゾル（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ）などが挙げられる。化学製品アクジゾルは、ＩＵＰＡＣ名が、酢酸，２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサナール，ナトリウムであり、化学式がＣ８Ｈ１６ＮａＯ８である。
【００４２】
乳化剤はその動態安定性を増加することによってエマルションを安定化する物質である。乳化剤の１つの類は、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）として知られる。洗剤は界面活性剤乳化剤の別の類であり、油と水の双方に物理的に相互作用することによって懸濁剤の油滴または水滴の間の界面を安定化することになる。毒性が低いので、最も用いられるエマルションは非イオン性のものである。陽イオン性エマルションもまた、その抗微生物特性のため、本明細書において使用されうる。
【００４３】
下記の本発明の好ましい実施形態は、特に、医薬組成物の調製および腸溶性コーティングカプセル剤内にその組成物を充填する系に関する。本明細書はさまざまな実施形態の具体的な詳細を記載するが、その記載は例示にすぎず、決して本発明を限定すると解釈すべきではないことを理解すべきである。さらに、当業者なら想到しうるさまざまな本発明の適用およびそれに対する変更も、下記の一般的な概念によって包含される。
【００４４】
医薬組成物を有する試験カプセル剤の調製
１つの例では、製造業者の取扱説明書に従って、ハードゼラチンカプセル剤にＳＢＣ（８．０ｍｇ）、ＤＴＰＡ二無水物（８．０ｍｇ）、ＳＤＳ（４．０ｍｇ）、およびインスリン（３０．０ＩＵ／Ｋｇ）の混合物を手作業で充填した。また、発泡性成分を含まない対照カプセル剤と比較して泡補助インスリン放出が同様に高められた他の割合の成分混合物も調べた。ＳＢＣを含まないカプセル剤を対照として使用した。調製したカプセル剤を、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５のメタノール溶液（１５重量／体積％）に浸し、次に送風機を使用して室温で乾燥した。この手順を１つの実施形態で３回繰り返した。例えば、図１２は、本発明のナノバブル形成系用の成分の化学構造の１つの実施形態を示す。
【００４５】
図７は本発明の泡担体系とそれがどのように作用するかの概略図を示す。ゼラチンカプセルを通った水が粉末混合物と接触し飽和するとき、ナノサイズのＣＯ２泡が生成される。ガス圧力がカプセル剤を破裂するので、充填物は圧倒されるほど急速に放出される。ガス泡は界面活性剤分子内で成長し、生じたＣＯ２圧力によって拡張される。ＳＤＳは、親水性の（水を好む）頭部および疎水性の（水を嫌う）尾部からなる陰イオン界面活性剤である。ガス泡が拡張するにつれて、各界面活性剤分子の疎水性の尾部がＣＯ２気相に引き寄せられる一方で、その親水性の頭部は水相に引き寄せられることが示唆された。したがって、１つの実施形態では、インスリンおよびＤＴＰＡを含有する水膜を含む泡担体系は、界面活性剤分子（ＳＤＳ）の二重層の間に自己組織化される。ガス泡は腸壁を覆う粘膜層と接触するまで拡張し続け、最終的には破裂して、充填されたインスリン（この実験におけるモデルＡＰＩ、他のＡＰＩも適用可能）、ＤＴＰＡ、およびＳＤＳを放出する。粘膜層では、ＤＴＰＡは上皮細胞を通してインスリン分子を送達する傍細胞エンハンサーとしての役目を果たし、両親媒性界面活性剤（ＳＤＳ）はその傍細胞および経細胞の浸透性を高める。また、ＤＴＰＡとＳＤＳはともに、プロテアーゼ阻害剤として機能することによってインスリン分子を保護する。
【００４６】
図５ｂに支持されるように、泡担体系は、上皮細胞膜の形態の一時的な変化およびその頂端結合複合体（ＡＪＣ）の一過性の開口を媒介でき、カプセル化されたインスリン分子が上皮性関門を通り、最終的にグルコース調節効果を発揮する体循環に吸収されるのを容易にすると仮定される。
【００４７】
ＤＴＰＡ二無水物、ＳＢＣ（発泡剤の一種）、ＳＤＳ、およびインスリンを完全に混ぜ、ハードゼラチンカプセル剤に充填する。１つの実施形態では、次にカプセル剤を腸溶性ポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５）でコーティングした。該ポリマーは充填内容物を酸性の胃液から保護する５．５を超えるｐＨで溶ける。対照はＳＢＣを含まない腸溶性コーティングカプセル剤である。
【００４８】
試験カプセル剤のインビトロでの溶解
ＳＢＣの有無での腸溶性コーティングカプセル剤の溶解を、胃腸（ＧＩ）管のｐＨ環境を模した条件においてインビトロで評価した。この実験では、トリパンブルーが色素インジケーターとして試験カプセル剤に含まれる。ＣＯ２泡の生成を、超音波装置を使用して調べた。図８（ａ）によれば、試験カプセル剤はともに、ｐＨ２．０（胃の中の酸性環境を模する）では完全な形のままで残り、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５の抗胃酸分解特性が確認された。小腸のｐＨ環境（ｐＨ６．６〜ｐＨ７．４）では、充填物は（ＳＢＣを含有しない）対照カプセル剤の腸溶性ポリマーコーティングがゆっくりと溶けるにつれて発生した細孔を通して放散された。この対照例において超音波信号がなかったことは、泡が生成されなかったことを示唆する。
【００４９】
逆に、腸溶性ポリマーの部分的な溶解およびＤＴＰＡ二無水物およびＳＢＣを含有するゼラチンカプセルへの水の浸透に続いて、ガス泡が直ちに生成された（図８（ｂ））。ＤＴＰＡ二無水物が水に曝されたとき、酸性の環境が作り出され、そこではＳＢＣは分解して高エコー源性であり、超音波画像撮影用コントラスト増強剤として作用しうるＣＯ２泡を形成する。結果として生じたガス圧力はカプセル剤を破裂させ、その充填内容物を急速に放出した。本発明の幾つかの態様は、動物対象に経口送達するカプセル剤を提供し、そのカプセル剤はガス生成剤または発泡剤を含み、加水分解に際しガス生成剤または発泡剤にガスを発生または生成させ、そのガス生成剤は、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、および重炭酸カルシウムからなる群から選択され、ガスは二酸化炭素である。
【００５０】
泡担体の形成
生成されたガス泡内での位置を特定するには、インスリンを緑色蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）で標識し、ＤＴＰＡを赤色蛍光色素（シアニン３、Ｃｙ３）で標識し、次に試験試料を蛍光顕微鏡下で画像撮影した。ガス泡の増大によって引き起こされた構造的変化を透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）およびＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）によって観察した。
【００５１】
逆に、発泡剤を含むカプセル剤の内容物は放出されて水に曝され、ナノスケールのＣＯ２ガス泡が自己組織化された（図２）。得られたＴＥＭおよび蛍光顕微鏡写真は、ガス泡が生成されたＣＯ２の増大のために界面活性剤分子（ＳＤＳ）内でナノスケールからマイクロスケールに成長したことを示す（図９ａおよび９ｂ）。ガス泡は、ＦＩＴＣ−インスリン（図９ａ）およびＣｙ３−ＤＴＰＡ（図９ｂ）の層（厚さ約１５０ｎｍ）によって囲まれた。図９ｃに概略的に示されるように、ガス泡が拡張するにつれて、ＳＤＳの親水性の頭部は水相に溶媒和化されたままで残り、疎水性の尾部は一般的に疎水性であると考えられているＣＯ２または空気相に伸びた。よって、界面活性剤分子の二層の間に挟まれた水の自己組織化膜は、生成されたガス泡を安定化した。自己組織化水膜はまた、コロイド状の担体としての役目を果たして、親水性のインスリンおよびＤＴＰＡ分子を運びうる。泡形成後のインスリンおよびＤＴＰＡの位置は、その後の送達に関する要因でありうる。
【００５２】
図９ｄは、その形成の間のガス泡の構造的変化を明らかにするのに行なった時間分解ＳＡＸＳの結果を示す。粉末形態のＳＤＳが水と接触したとき（ｔ＝０秒、図９ａ〜９ｃの第１列）、ＳＡＸＳ分析結果は１：２の位置比で２つのシャープなピークを示し、粉末の界面活性剤分子が層間の距離が約４．０ｎｍの多層構造に自己組織化したことを意味した。反応の３０秒後、１次ピークはブロードハローに変わり、２次ピークは消えた。この結果は、多層構造が生成されたＣＯ２泡によって乱されて、水膜に囲まれたガス泡からなるオリゴラメラ担体（図９ａ〜９ｃの第２列）が生じたことを示す。ＳＡＸＳ分析結果における１次ピークの進行性の衰退は、反応が進むにつれて界面活性剤分子の層の数が減少したことを示唆した。２４０秒後、ＳＡＸＳピークはもはや見えず、単層の担体の形成を示した（第３列、図９ａ〜９ｃ）。
【００５３】
上皮浸透性の増強
薬物浸透は腸の上皮を通って経細胞経路または傍細胞経路のいずれかによって起こりうる。泡担体系と上皮細胞の間の相互作用およびそれに続く薬物の輸送の正確な機構を解明するには、Ｃａｃｏ−２細胞単層を用いてＤＴＰＡとＳＤＳの上皮浸透性への効果を個々に調べた。ヒト結腸直腸腺がん由来のＣａｃｏ−２細胞の単層は、腸の薬物浸透性を予測するインビトロモデルに広く使用されている。
【００５４】
ＡＪＣは接着結合（ＡＪ）および密接結合（ＴＪ）からなり、腸の細胞構造および上皮性関門機能の重要な調節因子である。ＡＪは細胞膜を結合し、ＴＪの構築を増強する。したがってＡＪの変化はＴＪ構造および上皮浸透性を調節する。クローディン−４（ＣＬＤＮ４）はＴＪタンパク質であり、一方、カルシウム（Ｃａ２＋）依存接着分子であるＥカドヘリンは、ＡＪの主要な膜貫通タンパク質である。したがって、細胞外のＣａ２＋はＡＪＣの形成および細胞間結合の維持に必須である。ＡＪとＴＪはともに、さまざまな細胞外の刺激に応えて急速に解体および再編成する。
【００５５】
タンパク質分解の阻害
腸液および粘膜層においてインスリンのタンパク質分解を阻害することは、その経口生物学的利用能を増加するのに決定的に重要である。ＤＴＰＡおよびＳＤＳの腸のプロテアーゼへの阻害効果を、ラットから新たに単離した小腸の近位部分（すなわち、十二指腸）のインビトロでの実験で個別に調べた。膵臓から十二指腸に分泌されるさまざまな消化酵素が良く認識されている。インスリンへのＤＴＰＡまたはＳＤＳの添加は、腸のプロテアーゼに対する強い保護効果を発揮した。インスリンは、腸液および粘膜層のＣａ２＋依存酵素であるトリプシンおよびキモトリプシンの影響を高感度に受ける。腸のプロテアーゼ作用を阻害する１つの方法は、生体活性剤近傍にＤＴＰＡなどの錯化剤を用いて必須金属イオン（例えば、Ｃａ２＋）を酵素構造から除去することである。これまでの研究から、ＳＤＳは遊離酵素と酵素−基質二元複合体の両方ともに結合親和力有することが示されている。ＳＤＳによるタンパク質分解阻害の分子機構の案としては、ＳＤＳの特異的な結合によって誘発されるプロテアーゼの局所的な立体構造変化または電荷分布の変化が挙げられる。
【００５６】
試験カプセル剤の生体内溶解およびそれに続くインスリンの放出
生体内溶解試験では、ＳＢＣを含むカプセル剤を給餌針用いてラットに経口投与し、ＳＢＣを含有しないカプセル剤を与えられたラットを対照として使った。この実験では、インスリンをヨウ素１２３（１２３Ｉ）で放射性標識し、さらにくわえて造影剤である硫酸バリウムを試験カプセル剤に組み込んだ。単一フォトン放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナーを画像撮影に使用した。ラットの動的単純Ｘ線およびシンチグラフィー画像を、試験カプセル剤の経口投与後１時間、連続して２分間隔で得た。図１１は、カプセル剤が胃を出ると、小腸のｐＨ環境で生成されたＣＯ２は直ちにＳＢＣカプセル剤を崩壊させ、次いで１２３Ｉで標識したインスリンが急速に放出されたこと（白い矢印）を示す。この間、発泡剤を含まないカプセル剤は完全な形のまま残った。
【００５７】
インスリンおよびＤＴＰＡを含有する水膜で形成される泡担体は、ＳＤＳの２つの層の間に挟まれる（図９）。その後、泡担体は腸の内腔中を浮動し、最終的には腸壁にぶつかって破裂し、それに充填されたインスリン、ＤＴＰＡ、およびＳＤＳを粘膜層に放出する（図７）。次いで、放出されたインスリン、ＤＴＰＡ、およびＳＤＳは粘膜層を浸潤し、上皮表面にアクセスする。絨毛の乳び管側の緑色蛍光（ＦＩＴＣ−インスリン）の存在は、ＤＴＰＡおよびＳＤＳはタンパク質分解からインスリン分子を保護し、それらの上皮浸透性および体循環への吸収を高めることを示した。とりわけ、緑色蛍光強度は、ＳＢＣカプセル剤で治療した群で、ＳＢＣを含有しない対照カプセル剤で治療した群と比べて高く、発生した泡担体系は経口投与インスリンの有望な媒体である。
【００５８】
生体内薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性
ＳＢＣを含むカプセル剤または含まないカプセル剤を与えられた糖尿病ラットのＰＫおよびＰＤ特性を分析した。対照群は、皮下注射を介した遊離インスリン溶液、または経口摂取による遊離インスリン粉末のみを含有するカプセル剤を与えられた。図５ａおよび図５ｂは、遊離インスリン溶液の皮下注射は、投与後１時間で最大血漿濃度が得られ、その基礎レベルの戻る前に、１〜３時間内に血中グルコース濃度の急激な減少を引き起こしたことを示す。予想された通りに、遊離インスリン粉末を充填したカプセル剤の経口投与は、低血糖効果を発揮せず、好適な送達系の非存在下においてインスリンの経口吸収は乏しいことを示した。
【００５９】
逆に、プロテアーゼ阻害剤／吸収促進剤（ＤＴＰＡおよびＳＤＳ）を含有するカプセル剤の投与は、血中グルコース濃度をゆっくりではあるが持続して減少させ、吸収されたインスリンの継続的な薬理活性を示唆した。ＳＢＣを含まないカプセル剤を与えた群と比べて、ＳＢＣを含むカプセル剤を与えた群は、インスリンのより速く、より高められた吸収を明らかに示し、結果としてより持続した低血糖効果をもたらした。ＳＢＣを含まない場合および含む場合に関して、表１は、曲線下面積（ＡＵＣ、０〜１０時間）値は、１２３．８±２８．４および２４９．２±３４．１μＩＵｈ／ｍＬであり、対応する相対的生物学的利用能（ＢＡＲ）値は、１０．８±３．１および２１．７±１．７％（Ｐ＜０．０５）であったことを示す。
【００６０】
カプセル剤中のガス生成剤
ガス生成剤（ガス発生剤としても知られることある）は、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸カルシウム、および炭酸を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の幾つかの態様は、ガス生成剤または発泡剤、および随意に賦形剤を有するカプセル剤に関する。加水分解またはカプセル剤への水の浸透の際に、酸開始剤または他から放出されたプロトンが、重炭酸塩構成成分と反応してカプセル剤内でＣＯ２ガスを生成し、カプセル剤を破裂させるか、またはカプセル剤の内容物（カプセル剤充填物）を乱す。ＣＯ２ガスを作り出す化学反応は、参照文献として下記に示されている。
【化１】
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【００６１】
カプセル剤にナノバブル発泡系を含む医薬組成物
図７は、泡またはナノバブル形成系の概略図を示す。カプセル剤または腸溶性コーティングカプセル剤内の本発明の医薬組成物のナノバブル形成組成物で図示されるように、腸溶性コーティングポリマーのｐＨより高いｐＨでの腸液の接触は、腸液が発泡剤に入ることを可能にし、ＣＯ２生成につながり、それに続いて生体活性剤充填ナノバブルに穴をあけたり、破裂させたり、カプセル剤から内容物を即座に押し出す。
【００６２】
図１２は、ガス生成薬剤（例えば、発泡剤）、酸開始剤（すなわち、ガス生成薬剤にガスを作らせる化合物）、および随意にナノバブル形成剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）を含む医薬組成物の化学構造を示す。ＳＤＳなどは、泡構造を維持し、経細胞の浸透および／または傍細胞の浸透を高める役割を果たしうることが示唆された。さらに、ＤＴＰＡ二無水物などの酸開始剤は、傍細胞の浸透を高め、ＧＩＴでの酵素反応を阻害／削減する役割を果たしうることが示唆された。本発明の幾つかの態様は、ガス生成薬剤および加水分解の際にガス生成薬剤にガスを作って放出させる化合物を充填したカプセル剤を含む医薬組成物に関する。１つの実施形態では、カプセル剤内の充填物は、ナノバブル形成剤、ＳＤＳなどの界面活性剤、および生体活性剤をさらに含む。
【００６３】
本発明のナノ泡担体系（動物対象に送達するカプセル剤に充填される）は、泡生成過程とともに自己組織化する特徴を示す。化学反応過程の最初の工程は、ＣＯ２（気体）を作ることである。
【００６４】
本発明の若干の実施形態の具体的な詳細を参照して本発明を説明してきたが、そのような詳細は本発明の範囲上の限定とみなされるべきであることを意図しない。多くの変更および変形が上記開示を踏まえて可能である。
【００６５】
表１  各種インスリン製剤を投与された糖尿病ラットにおけるインスリンのＰＫパラメーター
経口：試験カプセル剤の経口投与、ＳＣ：皮下注射、Ｃｍａｘ：最大血漿濃度、Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに達する時間、ＡＵＣ（０−１０時）：血漿濃度時間曲線下面積、ＢＡＲ：インスリンの相対的生物学的利用能（ｎ＝６）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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