(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子組換えにより、酵母の発酵能力を高めた発酵効率に優れる酵母細胞の提供。【解決手段】宿主酵母細胞に、以下の（a）〜（e）からなる群より選択される1つ以上の操作を施す工程を含む、高速発酵酵母細胞。（a）ADH3及び/又はADH4を組換え技術により発現させる操作；（b）SSE1を組換え技術により発現させる操作；（c）SNF1を組換え技術により発現させる操作；（d）PGM2遺伝子の発現機能を喪失させる操作；（e）DHH1遺伝子の発現機能を喪失させる操作。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主酵母細胞に、以下の（a）〜（e）からなる群より選択される1つ以上の操作を施す工程を含む、高速発酵酵母細胞の製造方法：
（a）ADH3及び/又はADH4を組換え技術により発現させる操作；
（b）SSE1を組換え技術により発現させる操作；
（c）SNF1を組換え技術により発現させる操作；
（d）PGM2遺伝子の発現機能を喪失させる操作；
（e）DHH1遺伝子の発現機能を喪失させる操作。
【請求項２】
前記（a）〜（c）において発現される遺伝子は発現カセットに組み込まれている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記（d）又は（e）における遺伝子の発現機能の喪失は前記遺伝子のジーンターゲッティングにより行われる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主酵母細胞が、実験室酵母細胞、清酒酵母細胞、ワイン酵母細胞、ビール酵母細胞、焼酎酵母細胞、パン酵母細胞及びバイオエタノール酵母細胞からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法で製造される高速発酵酵母細胞。
【請求項６】
請求項5に記載の高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール飲料の製造方法。
【請求項７】
前記アルコール飲料が、ビール、ワイン又は清酒である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項5に記載の高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール含有材料の製造方法。
【請求項９】
前記アルコール含有材料が、エタノール燃料である、請求項8に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えにより作製される高速発酵酵母細胞、遺伝子組換えによる高速発酵酵母細胞の製造方法、及び同細胞を用いたアルコール飲料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール飲料に含まれるエタノールは、一般にサッカロミセス属に属する酵母の発酵によって生成したものである。アルコール飲料の製造において、酵母のエタノール生産性を高めることは極めて重要である。
【０００３】
アルコールデヒドロゲナーゼは酵母のアルコール発酵の最終段階の反応であるアセトアルデヒドからエタノールへの還元反応を担う重要な酵素である。アルコールデヒドロゲナーゼを高発現させることで醗酵力が向上することは容易に想像できる。しかしながら、非特許文献1では、細胞質型のアルコールデヒドロゲナーゼを高発現させてもエタノール生産性に変化はなかったと報告されている。
【０００４】
SSE1はheat shock protein 70（HSP70）ファミリーに属するシャペロンタンパク質である（非特許文献2）。SSE1はHSP70ファミリーたんぱく質が持つドメイン構造に加えて、HSP110ドメインを持つことから、HSP110クラスに分類される（非特許文献3）。酵母でHSP110に分類されるシャペロンタンパク質はSSE1とそのホモログのSSE2のみである。
【０００５】
Snf1は出芽酵母のグルコース脱抑制に関わるSer/Thrキナーゼである。
グルコースが存在するときには、他の糖を代謝するための遺伝子の発現は低く抑えられている。グルコースが枯渇すると、Snf1はリン酸化し、活性化型となることで、グルコース抑制を受けていた遺伝子の転写を促進する（非特許文献4）。
【０００６】
ホスホグルコムターゼは、glucose-1-phosphateからglucose-6-phosphateへ、またはその逆への変換を行う酵素であり、その酵素反応の方向は、炭素源基質の資化順位や濃度、あるいは生育フェーズ（別案：対数増殖期か定常期か）によって変化する。glucose-1-phosphateは、さらにUDP-glucoseへと変換され、貯蔵糖や、細胞壁成分の合成、タンパクの糖鎖修飾などに用いられる基質となる。ホスホグルコムターゼをコードする遺伝子には、PGM1とPGM2が存在し、PGM2は基本的に構成的に発現し、ホスホグルコムターゼ活性のうちの80−90 %を占めると考えられている。PGM2の発現は、グルコース抑制下での熱ストレス、グルコース枯渇、エタノールストレス、塩ストレスなどで増加する事が知られている。また、ガラクトースを炭素源とした時や、diauxic shiftなどに誘導され、diauxic shiftでの誘導は、主にMsn2p/Msn4pとグリコーゲンシンターゼキナーゼに依存的に増加することがわかっている。
【０００７】
DHH1はDExD/H-box helicaseをコードする遺伝子であり、本ヘリカーゼは細胞質に特徴的にみられる粒子様の構造P-bodyに多く含まれている。P-bodyは、酵母がストレスにさらされた時に、核外に運ばれたmRNAのうち、ストレス対応に関連するもの以外を、一時隔離、保存する構造体であると考えられている。このP-bodyにおいて、Dhh1pはmRNA の脱キャップ化と脱アデニル化を行う複合体に作用して、翻訳抑制やmRNAの分解に関与している。
【０００８】
しかしながら、これまでに上記遺伝子を操作することにより酵母の発酵能力を制御することは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schaaff et al. (1989) Overproduction of glycolytic enzyme in yeast. Yeast 5, 285-290
【非特許文献２】Mukai H et al.  (1993) Isolation and characterization of SSE1 and SSE2, new members of the yeast HSP70 multigene family. Gene 132, 57-66
【非特許文献３】Mukai H et al.  (1993) Isolation and characterization of SSE1 and SSE2, new members of the yeast HSP70 multigene family. Gene 132, 57-66
【非特許文献４】Sanz P. (2003) Snf1 protein kinase: a key player in the response to cellular stress in yeast. Biochem. Soc. Trans. 31, 178-181.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究を遂行した結果、酵母細胞に対し、特定の遺伝子をターゲットとした操作を行うことにより、同酵母細胞の発酵能力を飛躍的に高めることに成功した。本発明は上記知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
宿主酵母細胞に、以下の（a）〜（e）からなる群より選択される1つ以上の操作を施す工程を含む、高速発酵酵母細胞の製造方法：
（a）ADH3及び/又はADH4を組換え技術により発現させる操作；
（b）SSE1を組換え技術により発現させる操作；
（c）SNF1を組換え技術により発現させる操作；
（d）PGM2遺伝子の発現機能を喪失させる操作；
（e）DHH1遺伝子の発現機能を喪失させる操作。
［２］
前記（a）〜（c）において発現される遺伝子は発現カセットに組み込まれている、前記［1］に記載の方法。
［３］
前記（d）又は（e）における遺伝子の発現機能の喪失は前記遺伝子のジーンターゲッティングにより行われる、前記［1］又は［2］に記載の方法。
［４］
前記宿主酵母細胞が、実験室酵母細胞、清酒酵母細胞、ワイン酵母細胞、ビール酵母細胞、焼酎酵母細胞、パン酵母細胞及びバイオエタノール酵母細胞からなる群より選択される少なくとも１種である、前記［1］〜［3］のいずれか1つに記載の方法。
［５］
前記［1］〜［4］のいずれか1つに記載の方法で製造される高速発酵酵母細胞。
［６］
前記［5］に記載の高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール飲料の製造方法。
［７］
前記アルコール飲料が、ビール、ワイン又は清酒である、前記［6］に記載の方法。
［８］
前記［5］に記載の高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール含有材料の製造方法。
［９］
前記アルコール含有材料が、エタノール燃料である、前記［8］に記載の方法。
。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により野生型酵母細胞と比べて発酵能力に優れる酵母細胞を製造することができる。また、本発明の高速発酵酵母細胞を用いることにより効率よくアルコール飲料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で用いたベクターpYCG-TDH3p-tのマップである。
【図２】実施例で用いたベクターpYCG-TDH3pADH3のマップである。
【図３】ADH3遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図４】ADH3遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図５】ADH3遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図６】ADH3遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図７】実施例で用いたベクターpYCG-TDH3pADH4のマップである。
【図８】ADH4遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図９】実施例で用いたベクターpYCG-TDH3pADH1のマップである。
【図１０】ADH1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例で用いたベクターpYCG-TDH3pADH2のマップである。
【図１２】ADH2遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１３】実施例で用いたベクターpYCG-TPI1p-tのマップである。
【図１４】実施例で用いたベクターpYCG-TPI1p-SSE1のマップである。
【図１５】SSE1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１６】SSE1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１７】SSE1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１８】SSE1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例で用いたベクターYCpH-ACT1p-tのマップである。
【図２０】実施例で用いたベクターYCpH-ACT1pSNF1のマップである。
【図２１】SNF1遺伝子高発現株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図２２】本発明で用いた遺伝子破壊方法の略図である。
【図２３】PGM2遺伝子破壊株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図２４】PGM2遺伝子破壊株の連譲発酵試験の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例で用いたベクターpTOPOBIIScDHH1-Linkerのマップである。
【図２６】実施例で用いたベクターpBGIN11-05のマップである。
【図２７】実施例で用いたベクターpdScDHH1_GIN1105のマップである。
【図２８】実施例で用いたベクターp pYRHFLPのマップである。
【図２９】ScDHH1遺伝子破壊株の発酵試験の結果を示すグラフである。
【図３０】ScDHH1遺伝子破壊株の連譲発酵試験の結果を示すグラフである。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１５】
1．高速発酵酵母細胞
本発明は、宿主酵母細胞に、以下の（a）〜（e）からなる群より選択される1つ以上の操作を施す工程を含む、高速発酵酵母細胞の製造方法及び同方法により製造された高速発酵酵母細胞を提供する。
（a）ADH3及び/又はADH4を組換え技術により発現させる操作；
（b）SSE1を組換え技術により発現させる操作；
（c）SNF1を組換え技術により発現させる操作；
（d）PGM2遺伝子の発現機能を喪失させる操作；
（e）DHH1遺伝子の発現機能を喪失させる操作。
【００１６】
ここで、宿主酵母細胞は出芽酵母細胞であれば特に限定されず、実験室酵母細胞、清酒酵母細胞、ワイン酵母細胞、ビール酵母細胞、焼酎酵母細胞、パン酵母細胞及びバイオエタノール酵母細胞などから選択することができる。また、酵母細胞の株は特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエNBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954、X2180-1A (ATCC26786)、CB11 (Berkley Stock Center)、W303-1A (BY4848)、MT8-1（BY2685）、NBRC1440、NBRC1445、X2180-1A株(ATCC26786)、BH96-2-6、Saccharomyces pastrianus BH422-#13、Weihenstephan34-70等の出芽酵母細胞などから選択することができる。
好ましくは、宿主酵母細胞は、BH96-2-6、Saccharomyces pastrianus BH422-#13又はWeihenstephan34-70である。
【００１７】
本発明によれば、野生型酵母細胞（例えば、上記宿主酵母細胞）と比べてアルコール発酵能に優れた高速発酵酵母細胞を得ることができる。ここで、「アルコール発酵」とは、酵母細胞が原料に含まれる糖を資化してアルコールを生成することを意味する。
本発明によれば、野生型酵母細胞と比べてアルコール発酵能が10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、または、50％以上優れた高速発酵酵母細胞を得ることができる。
例えば、野生型酵母細胞と比べてアルコール発酵能が20％以上優れているとは、ある発酵系において糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでの時間が、野生型酵母細胞を用いる場合には100時間を要するが、同一の発酵系において本発明の高速発酵酵母細胞を用いると80時間以下であることを意味する。この際、発酵開始時の酵母細胞濃度は本発明の高速発酵酵母の発酵系と野生型酵母細胞の発酵系とで同一である。  あるいは、野生型酵母細胞と比べてアルコール発酵能が20％以上優れているとは、ある発酵系において一定のエタノール濃度に達するまでの時間が、野生型酵母細胞を用いる場合には100時間を要するが、同一の発酵系において本発明の高速発酵酵母細胞を用いると80時間以下であることを意味する。この際、発酵開始時の酵母細胞濃度は本発明の高速発酵酵母細胞の発酵系と野生型酵母細胞の発酵系とで同一である。通常、糖からエタノールへの変換は、株によって多少の差はあるものの、ほぼ一定の割合でおこるため、最終のアルコール濃度に達する時間は、発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでの時間と等しいと考えられる。つまり、野生型酵母細胞と高速発酵酵母細胞における一定のエタノール濃度に達するまでの時間を比較する場合は、発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでの時間を比較すればよい。
【００１８】
「（a）〜（e）からなる群より選択される1つ以上の操作」は、前記群に含まれる操作の少なくとも1つが行われればよく、2つ以上を行う場合は任意の組合せで行うことができる。
【００１９】
本発明において、「遺伝子」は非コード領域を含むゲノム遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ORF）であってもよく、あるいはコード領域からなるCDSであってもよい。また、「遺伝子」は、DNAから発現したRNA（特にmRNA）であってもよい。
【００２０】
ADH3及びADH4遺伝子は、それぞれADH3タンパク質及びADH4タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエーのADH3及びADH4遺伝子（それぞれ配列番号2及び4に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、それぞれ配列番号1及び3に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド））又はその変異体である。
【００２１】
SSE1遺伝子はSSE1タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエーのSSE1遺伝子（配列番号6に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、配列番号5に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド））又はその変異体である。
【００２２】
SNF1遺伝子はSNF1タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエーのSNF1遺伝子（配列番号8に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、配列番号7に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド））又はその変異体である。
【００２３】
PGM2遺伝子はPGM2タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエーのPGM2遺伝子（配列番号10に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、配列番号9に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド））又はその変異体である。
【００２４】
DHH1遺伝子はDHH1タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエーのDHH1遺伝子（例えば、配列番号12に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、配列番号11に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド））又はその変異体である。
【００２５】
以下、サッカロミセス・セレビシエー由来のADH3、ADH4、SSE1、SNF1、PGM2及びDHH1の各遺伝子を便宜上、「本発明の遺伝子」と称する。  上記本発明の遺伝子の「変異体」とは、種間や株間における遺伝子配列の多様性を反映するものである。
具体的には、本発明の遺伝子の変異体の具体例としては以下の（1）及び（2）が挙げられる。
（1）本発明の遺伝子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明の遺伝子と「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、本発明の遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，  Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００２６】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（1）5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、（2）0.2 x SSC、0.1％ SDS、60℃、（3）0.2 x SSC、0.1％ SDS、62℃、（4）0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃、又は（5）0.1ｘSSC、0.1％ SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、DIG等で標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００２８】
（2）本発明の遺伝子の塩基配列と90％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド
本発明の遺伝子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、本発明の遺伝子の塩基配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２９】
なお、塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227(4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３０】
本発明において「組換え技術により発現させる操作」とは、本発明の遺伝子を適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主酵母細胞（以下、「宿主細胞」という）に遺伝子導入し、同宿主細胞内で発現させる操作（すなわち形質転換）を意味する。
適切な発現ベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。酵母細胞用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ、猪腰淳嗣ら, 生化学, vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
【００３２】
宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００３３】
一方、「遺伝子の発現機能を喪失させる操作」とは、同操作の対象となる遺伝子（以下、「対象遺伝子」という）から本来の生物学的機能を有するタンパク質（以下、「対象タンパク質」という）が発現されないことを意味する。このような状態の例としては、対象遺伝子の発現産物が全く生成されない状態だけでなく、当該遺伝子の発現産物（例えば、hnRNA、mRNA又はタンパク質）は発現されるが、それら発現産物が本来の正常な機能を有しない状態が挙げられる。
【００３４】
このような対象遺伝子の機能喪失は、対象遺伝子又はその転写調節領域若しくはプロモーター領域を含む発現制御領域上における1又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、及び/又は挿入等によって生じさせることができる。なお、前記欠失、置換、及び/又は挿入を行う部位や、欠失、置換、及び/又は挿入される配列は、対象遺伝子の正常な機能が喪失しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、対象タンパク質の活性部位をコードする遺伝子配列の少なくとも1つが欠失していることが好ましい。
【００３５】
「遺伝子の発現機能を喪失させる操作」の別の具体例としては、ジーンターゲティング法が挙げられる。ジーンターゲティングは、相同組換えを利用して染色体上の特定遺伝子に変異を導入する手法である（Capeccchi, M.R. Science, 244, 1288-1292, 1989）。好ましくは、ジーンターゲティング法は、ノックアウト法である。
まず、対象遺伝子の機能を喪失させるためにターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターには、対象遺伝子の正常な機能が損なわれるような変異が組み込まれる。このような変異は対象遺伝子のイントロン領域、エクソン領域又は発現制御領域に存在していてよい。前記変異は、対象遺伝子のエクソン領域に存在することが好ましく、さらに好ましくは、対象遺伝子の少なくとも1つのエクソンが欠失した変異、最も好ましくは全てのエクソンが欠失した変異である。このような変異であれば、確実に対象遺伝子の機能を欠損させることができるからである。
【００３６】
ターゲティングベクターは、変異導入部位の3’及び5’側の相同領域（それぞれ3’アーム及び5’アーム）に加え、組換え体のセレクション用の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは既に述べたとおりである。
【００３７】
このようにして作製したターゲティングベクターを宿主細胞に導入するが、導入は既に述べた形質転換方法によって行うことができる。ターゲティングベクターが導入された細胞は、ベクター中に挿入されたマーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、ジェネチシンを加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがGFP等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、FACS（Fluorescence Activated Cell Sorter）等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。
【００３８】
ターゲティングベクターが導入された細胞では、相同組換えによって、染色体上の対象遺伝子の一部が該ベクターの相同組換え配列で置換され、内因性の対象遺伝子が破壊される。所望の相同組換えが生じたか否かは、サザンブロティングやPCR法等を利用したジェノタイプ解析によって判定できる。サザンブロッティングによるジェノタイプ解析は、組換え細胞のみに含まれる薬剤耐性遺伝子又は蛍光タンパク質遺伝子等の配列をプローブとして用いることにより行うことができる。PCR法によるジェノタイプ解析も、組換え細胞のみに含まれる薬剤耐性遺伝子又は蛍光タンパク質遺伝子等の配列に相補的なプライマーを作製し、これらのプライマーでPCR増幅を行うことで、組換え細胞を検出することができる。対象遺伝子の機能は、染色体上の少なくとも一方の対立遺伝子（ヘテロ接合型）で喪失していれば効果がある場合もあるが、好ましくは、対立遺伝子の両方が喪失していること（ホモ接合型）が好ましい。
【００３９】
「遺伝子の発現機能を喪失させる操作」の更なる具体例としては、対象遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）の発現量を低下させる物質、例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質及び核酸等を宿主細胞の培養系に投与する方法が挙げられ、このような物質の1つの実施態様では、前記対象遺伝子の機能又は発現を抑制する核酸である。このような核酸の例としては、RNA干渉（RNAi）用のsiRNA（small interfering RNAを生じさせる、ヘアピン状のshRNA（Short Hairpin RNA）、二本鎖RNA（Double Stranded RNA: dsRNA）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記対象遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるPGM2遺伝子及びDHH1遺伝子は上記で述べたとおりであり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、対象遺伝子のコード領域のみならず、非コード領域を阻害対象領域として使用することも可能である。
【００４０】
RNA干渉（RNAi）を行う場合、標的配列は、Ui-Tei K. et al.（(2004) Nucleic Acids Res. 32, 936-948）の記載に沿って適宜選択することができる。
RNAi用の発現ベクターは、pMuniH1プラスミド、pSINsiベクター（タカラバイオ）、pSIF1-H1（システムバイオサイエンス社）等をベースに、市販のDNA/RNAシンセサイザー（例えば、Applied  Biosystems394型）を用いて容易に作製することができる。RNAi用の発現ベクターの例としては、例えば、pSPB1876（国際公開公報WO2004/071467）が挙げられるが、これに限定されるものではない。RNAi用の発現ベクターは、コスモ・バイオ株式会社、タカラ・バイオ株式会社、Invitrogen社、Promega社等の第三者機関に作製を委託することもできる。
RNAi用の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換及び形質転換体の選択については上記で述べたとおりである。
【００４１】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００４２】
2．アルコール飲料の製造方法
本発明の高速発酵酵母細胞は、野生型酵母細胞（例えば、上記宿主酵母細胞）と比べてアルコール発酵能に優れている。
従って、本発明は、高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール飲料の製造方法を提供する。
本発明の高速発酵酵母細胞を用いて糖含有物を発酵させると、野生型酵母細胞を用いた場合よりも10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上速くアルコールを製造することができる。
例えば、野生型酵母細胞と比べて20％以上速くアルコールを製造することができるとは、ある発酵系において野生型酵母細胞を用いると目的のアルコール濃度に達するまでに100時間を要するが、同一の発酵系において本発明の高速発酵酵母細胞を用いると80時間以下で前記目的のアルコール濃度に達することを意味する。この際、発酵開始時の酵母細胞濃度は同一である。
【００４３】
本発明の方法によって製造されるアルコール飲料は、酵母細胞による醗酵工程を経て製造される飲料であれば特に限定されるものではなく、ビール、清酒（日本酒）、ワイン、シードル、マッコリ等の醸造酒であってもよく、ウィスキー、ブランデー、ウォッカ、テキーラ、ラム、リキュール、ジン、焼酎、泡盛等の蒸留酒であってもよく、さらにみりん等の調味料であってもよい。また、発泡酒類、低アルコール発酵飲料（例えばアルコール1％以下の醗酵飲料）、雑酒、リキュール類、スピリッツ類などに分類されるビールテイスト飲料でもよい。ビールテイスト飲料とは、炭素源、窒素源、ホップ類などを原料とし、酵母細胞で発酵させた飲料であって、ビールのような風味を有するものをいう。好ましくは、本発明の方法によって製造されるアルコール飲料はビール、清酒、ワインであり、より好ましくはビールである。
【００４４】
ビールまたはビールテイスト飲料であれば、本発明の高速発酵酵母細胞を用いて麦汁を発酵させる工程を経ることにより製造することができる。
【００４５】
清酒であれば、本発明の高速発酵酵母細胞を用いて米、醪、麹からなる混合物を発酵させる工程を経ることにより製造することができる。
【００４６】
ワインであれば、本発明の高速発酵酵母細胞を用いてブドウ果汁を発酵させる工程を経ることにより製造することができる。
【００４７】
3．アルコール含有材料の製造方法
また、本発明は、高速発酵酵母細胞を用いた発酵工程を含む、アルコール含有材料の製造方法を提供する。
この方法では、発酵工程により得られた粗生成物からさらにアルコール成分を抽出・精製する工程が含まれていてもよい。
アルコール含有材料は特に限定されず、接着剤、インク、塗料、農薬、消毒薬等であってもよく、あるいはエタノール燃料であってもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
［実施例1］
＜ADH3遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのADH3遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  ADH3:YMR083W  (Mitochondrial alcohol dehydrogenase isozyme IIIをコード)(配列番号１)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、ADH3遺伝子の5’側の21塩基を含むプライマー、ADH3-F(配列番号13)と、ADH3遺伝子の3’側の25塩基を含むプライマー、ADH3-R(配列番号14)で、ADH3遺伝子ORFを増幅した。取得したADH3断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、StuIで切断したpYCG-TDH3p-t(図1)に挿入し、pYCG-TDH3pADH3 (図2)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（pYCG-TDH3pADH3）と空ベクター(ベクターのみのコントロールとしても使用)(pYCG-TDH3p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ジェネティシン20μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたADH3高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００５０】
＜ADH3遺伝子高発現株の発酵試験  （1）＞
麦汁エキス濃度                   17％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図3に示す。ADH3高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が80 ％以下であった。
【００５１】
＜ADH3遺伝子高発現株の発酵試験  （2）＞
麦汁エキス濃度                   13.9％  （糖濃度（Brix）14.1）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    13.7mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         12℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを12 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図4に示す。ADH3高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、85 ％以下であった。
【００５２】
＜ADH3遺伝子高発現株の発酵試験  （3）＞
麦汁エキス濃度                   13.9％  （糖濃度（Brix）14）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    27.8mg/100ml
麦汁麦芽比率                     100％
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         12℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを12 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図5に示す。ADH3高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、77 ％以下であった。
【００５３】
＜ADH3遺伝子高発現株の発酵試験  （4）＞
麦汁エキス濃度                   17％  
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         2L
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       10g湿菌体/2 L
一日一回サンプリングを行い、エキス濃度をアントンパールで測定した。結果を図6に示す。ADH3高発株は、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、55 ％以下であった。
【００５４】
［実施例2］
＜ADH4遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのADH4遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  ADH4:YGL256W  (Mitochondrial alcohol dehydrogenase isozyme IVをコード)(配列番号3)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、Saccharomyces cerevisiae genome databaseに示されているADH4遺伝子の5’ 側より249bp上流から19塩基を含むプライマー、ADH4-F(配列番号15)と、ADH4遺伝子の3’側の25塩基を含むプライマー、ADH4-R(配列番号16)で、ADH4遺伝子ORFを増幅した。取得したADH4断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、StuIで切断したpYCG-TDH3p-t(図1)に挿入し、pYCG-TDH3pADH4(図7)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（pYCG-TDH3pADH4）と空ベクター(pYCG-TDH3p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ジェネティシン20μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたADH4高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００５５】
＜ADH4遺伝子高発現株の発酵試験  （1）＞
麦汁エキス濃度                   17％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図8に示す。ADH4高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、84 ％以下であった。
【００５６】
［実施例3］
＜ADH1遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのADH1遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  ADH1:YOL086C  (Cytosolic alcohol dehydrogenase isozyme Iをコード)(配列番号17)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、ADH1遺伝子の5’側の21塩基を含むプライマー、ADH1-F(配列番号18)と、ADH1遺伝子の3’側の24塩基を含むプライマー、ADH1-R(配列番号19)で、ADH1遺伝子ORFを増幅した。取得したADH1断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、StuIで切断したpYCG-TDH3p-t(図1)に挿入し、pYCG-TDH3pADH1 (図9)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（pYCG-TDH3pADH1）と空ベクター(pYCG-TDH3p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ジェネティシン20μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたADH1高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００５７】
＜発酵試験  （1）＞
麦汁エキス濃度                   17.2％  （糖濃度（Brix）17.5）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図10に示す。ADH1高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、醗酵が遅くなった。
【００５８】
［実施例4］
＜ADH2遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのADH2遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  ADH2:YMR303C  (Cytosolic alcohol dehydrogenase isozyme IIをコード)(配列番号20)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、ADH2遺伝子の5’側の23塩基を含むプライマー、ADH2-F(配列番号21)と、ADH2遺伝子の3’側の23塩基を含むプライマー、ADH2-R(配列番号22)で、ADH2遺伝子ORFを増幅した。取得したADH2断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、StuIで切断したpYCG-TDH3p-t(図1)に挿入し、pYCG-TDH3pADH2 (図11)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（pYCG-TDH3pADH2）と空ベクター(pYCG-TDH3p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ジェネティシン20μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたADH2高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００５９】
＜発酵試験  （1）＞
麦汁エキス濃度                   17％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図12に示す。ADH2高発現株と空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）の醗酵終了までの期間は変わらなかった。
【００６０】
以上の結果から、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ADH1,ADH2,ADH3,ADH4  の中で、ADH3,ADH4のみが高発現による醗酵促進効果を示すことが明らかになった。
【００６１】
［実施例5］
＜SSE1遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのSSE1遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  SSE1:YPL106C  (Heat shock protein Hsp70をコード)(配列番号5)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、SSE1遺伝子の5’側の21塩基を含むプライマー、SSE1-F(配列番号23)と、SSE1遺伝子の3’側の25塩基を含むプライマー、SSE1-R(配列番号24)で、SSE1遺伝子ORFを増幅した。取得したSSE1断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、StuIで切断したpYCG-TPI1p-t(図13)に挿入し、pYCG-TPI1p-SSE1 (図14)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（pYCG-TPI1p-SSE1）と空ベクター(pYCG-TPI1p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ジェネティシン20μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたSSE1高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００６２】
＜SSE1遺伝子高発現株の発酵試験  （1）＞
麦汁エキス濃度                   17％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図15に示す。SSE1高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、80 ％以下であった。
【００６３】
＜SSE1遺伝子高発現株の発酵試験  （2）＞
麦汁エキス濃度                   13.9％  （糖濃度（Brix）14.1）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    13.7mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         12℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを12 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図16に示す。SSE1高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、85％以下であった。
【００６４】
＜SSE1遺伝子高発現株の発酵試験  （3）＞
麦汁エキス濃度                   13.9％  （糖濃度（Brix）14）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    27.8mg/100ml
麦汁麦芽比率                     100％
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         12℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを12 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図17に示す。SSE1高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、77 ％以下であった。
【００６５】
＜SSE1遺伝子高発現株の発酵試験  （4）＞
麦汁エキス濃度                   17％  
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         2L
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       10g湿菌体/2 L
一日一回サンプリングを行い、エキス濃度をアントンパールで測定した。結果を図18に示す。SSE1高発株は、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、65 ％以下であった。
【００６６】
［実施例6］
＜SNF1遺伝子高発現株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのSNF1遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号  SNF1:YDR477W  (AMP-activated serine/threonine protein kinaseをコード)(配列番号7)。Saccharomyces cerevisiae X2180-1A株(ATCC26786) (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1)のゲノミックDNAを鋳型として、SNF1遺伝子の5’側の21塩基を含むプライマー、SNF1-F(配列番号25)と、SNF1遺伝子の3’側の22塩基を含むプライマー、SNF1-R(配列番号26)で、SNF1遺伝子ORFを増幅した。取得したSNF1断片は、Invitrogen社のGENEART（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを用いて、マニュアルに従って操作を行い、HpaIで切断したYCpH-ACT1p-t(図19)に挿入し、YCpH-ACT1pSNF1 (図20)を得た。挿入したORFの塩基配列はシークエンスによって確認した。この高発現ベクター（YCpH-ACT1pSNF1）と空ベクター(YCpH-ACT1p-t)を、ラガー酵母Saccharomyces pastrianus BH422-#13に形質転換し、ハイグロマイシン10μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布し、生育したコロニーを選択した。得られたSNF1高発現株と、空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）を以下の醗酵試験に供し、醗酵速度を比較した。
【００６７】
＜SNF1遺伝子高発現株の発酵試験＞
麦汁エキス濃度                   17％  （糖濃度（Brix）16.9）
麦汁FAN(遊離アミノ態窒素)濃度    17.4mg/100ml
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
結果を図21に示す。SNF1高発現株は空ベクターを導入した親株（ネガティブコントロール）に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、69 ％以下であった。
【００６８】
［実施例7］
＜PGM2遺伝子破壊株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのPGM2遺伝子(ScPGM2)は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号：YMR105C  (Phosphoglucomutaseをコード)）(配列番号9)。ラガー酵母は、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムとSaccharomyces eubayanusのゲノムを持つナチュラルハイブリッドであり、G3 (Bethesda). 2014 Feb 27;4(5):783-93. doi: 10.1534/g3.113.010090  に報告されている、ラガー酵母、Weihenstephan34-70の全ゲノム配列によると、Saccharomyces cerevisiaeのPGM2遺伝子(ScPGM2) (配列番号9)の他に、Saccharomyces eubayanusのゲノム由来と考えられるPGM2遺伝子(LgPGM2) (配列番号27)（タンパク質のアミノ酸配列は配列番号28）が存在することが確認されている。ラガー酵母のこれら二つの遺伝子の破壊は、Goldstein らの方法に従って行った。  すなわち、図22に示したジェネティシン耐性遺伝子を含むプラスミドpFA6a (KanMX)を鋳型として、ScPGM2遺伝子の５’側の49塩基+TEFプロモーター由来20塩基を繋げたプライマー、ScPGM2(N)TEF1p_F(配列番号29)と、ScPGM2遺伝子の３’側の50塩基+TEFターミネーター由来20塩基を繋げたプライマー、ScPGM2(C)TEF1t_R(配列番号30)を用いてPCRを行い、ScPGM2遺伝子の破壊用断片を作製した。次に、ノーセオスリシン耐性遺伝子を含むプラスミドpAG25 (natMX)を鋳型として、LgPGM2遺伝子の５’側の4950塩基+TEFプロモーター由来20塩基を繋げたプライマー、LgPGM2(N)TEF1p_F(配列番号31)と、LgPGM2遺伝子の５’側の50塩基+TEFプロモーター由来20塩基を繋げたプライマー、LgPGM2(C)TEF1t_R (配列番号32)を用いてPCRを行い、LgPGM2遺伝子の破壊用断片を作製した。
。
【００６９】
Weihenstephan34-70から取得したラガー酵母胞子クローンBH96-2-6は、ビール酵母DNAアレイを用いたアレイCGHの結果から、ほぼ2倍体であり、ScPGM2とLgPGM2が１つずつ存在することが予想される。そこで、まずScPGM2の破壊用断片をラガー酵母胞子クローンBH96-2-6に形質転換し、ジェネティシン10μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布した。生育したコロニー数個から、プライマーScPGM2U_F2(配列番号33)とG418-r1(配列番号39)、あるいはScPGM2D_R(配列番号34)とG418-f1(配列番号40)を使ってPCRを行い、断片が増幅される事で、ScPGM2遺伝子が破壊されている事を確認した。さらにPGM2_F(配列番号35)とScPGM2D_R(配列番号34)をプライマーとして用いてPCRを行い、断片が増幅されないことから、破壊されていないScPGM2が存在しないことを確認した。続いて、作製したLgPGM2の破壊用断片を、上記で得たScPGM2の破壊株に形質転換しジェネティシン20μg/mlとノーセオスリシン 5μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布した。生育したコロニー数個から、プライマーLgPGM2U_F(配列番号36)とnatMX-r2  (配列番号41)、あるいはLgPGM2D_R(配列番号37)とnatMX-f2  (配列番号42)を使ってPCRを行い、断片が増幅される事で、ScPGM2遺伝子に加えて、LgPGM2遺伝子も破壊されている事を確認した。さらにLgPGM2_F(配列番号38)とLgPGM2D_R(配列番号37)をプライマーとしてPCRを行い、断片が増幅されないことから、破壊されていないLgPGM2が存在しないことを確認した。形質転換体はYPGly(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グリセロール 20 g/L)培地に塗布して生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。ここでは、マーカーにジェネティシン耐性マーカー遺伝子とノーセオスリシン耐性遺伝子を用いた例を示したが、宿主の遺伝子型によって、他のマーカー（オーレオバシジン耐性遺伝子や、シクロヘキシミド耐性遺伝子）も使用可能である。
【００７０】
＜PGM2遺伝子破壊株の発酵試験＞
PGM2遺伝子破壊株と親株であるBH96-2-6株を用いて、200 mlスケールで発酵試験を行った。
麦汁エキス濃度                   16.7％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
酵母菌体は湿菌体で1 g測りとり、180 mlの麦汁に懸濁して、珪藻土(セライト545RVS ) 20 mgと共に滅菌した300 mlのシリンダーに入れ、麦汁で正確に200 mlまでメスアップした。シリンダーを15 ℃インキュベートし、一日一回、1 mlの発酵液をサンプリングして遠心後、上澄みの糖濃度をデジタル糖度計（ATAGO  PR101α）で測定した。
その結果を図23に示す。PGM2遺伝子破壊株は、親株BH96-2-6株に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、71 ％以下であった。醗酵液より酵母を回収し、その酵母でもう一度200 mlスケールで発酵試験を行った。その結果を図24に示す。PGM2遺伝子破壊株は、連続して発酵を行ってもやはり親株に比べ優位に発酵が速かった。
【００７１】
［実施例8］
＜ScDHH1遺伝子破壊株の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのDHH1遺伝子(ScDHH1)は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Saccharomyces Genome Database登録番号：YMR105C  (Phosphoglucomutaseをコード)）(配列番号11)。Saccharomyces cerevisiaeX2180-1A株のゲノミックDNAを鋳型として、ScDHH1遺伝子の5’側の21塩基を含むプライマー、pScDHH1_F(配列番号43)と、ScDHH1遺伝子の3’側の21塩基を含むプライマー、pScDHH1_R(配列番号44)で、ScDHH1遺伝子ORFを増幅した。取得したDNA断片は、Invitrogen社のZero Blunt（登録商標） TOPO（登録商標） PCR Cloning Kitを用いて、ベクター、pCR（登録商標）-Blunt II-TOPO（登録商標） Vector(登録商標)に挿入し、DHH1ORF中にある、2か所のMscIサイトを切断し、リンカー (GGGCCCCCATGGTGGCCA) (配列番号45)を挿入することで、pTOPOBIIScDHH1-Linker（図25）を得た。リンカー内のApaIで切断し、プラスミドpBGIN11-05（図26）よりApaIで切り出したGAL1p::GIN11::natMX断片を導入し、プラスミドpdScDHH1_GIN1105（図27）を構築した。プラスミドpdScDHH1_GIN1105からPmeIで切り出したScDHH1破壊用ユニットをラガー酵母胞子クローンBH96-2-6に形質転換し、nourseothricin 5μg/mlを含むYPD(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グルコース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)培地に塗布した。生育したコロニー数個から、プライマーScDHH1U_F(配列番号46)とnatMX-r2(配列番号41)、あるいはScDHH1D_R2(配列番号47)とnatMX-f2(配列番号42)を使ってPCRを行い、断片が増幅される事で、ScPDHH1遺伝子が破壊されていることを確認した。さらにpScDHH1_F(配列番号43)とpScDHH1_R(配列番号44)をプライマーとしてPCRを行い、断片が増幅されないことから、破壊されていないScDHH1が存在しないことを確認した。ScDHH1が破壊された株には、さらにプラスミドpYRHFLP (図28)を形質転換し、hygromycin10μg/mlを含むYPGalactose (イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, ガラクトース＊20 g/L    （ろ過滅菌添加＊）)に塗布した。pYRHFLPは酵母2μプラスミド上にあるリコンビナーゼを、TDH3p制御下で発現する、YRpタイプのプラスミドである。リコンビナーゼを発現すると、FRT配列間で組換えが生じるため、GAL1p::GIN11::natMXは、ゲノムからループアウトされる。GAL1p::GIN11::natMXがループアウトした事は、pScDHH1_FとpScDHH1_RをプライマーとしてPCRを行い、約750bpの断片が得られることと、形質転換体のノーセオスリシン耐性がなくなる事により確認した。さらに、形質転換体はYPGly(イーストエキストラクト  10 g/L,ポリペプトン  20 g/L, グリセロール 20 g/L)培地に塗布して生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。YRpタイプのプラスミドは安定性が悪く、選択圧をかけない状態では、細胞からすぐに脱落してしまうので、ハイグロマイシンの含まない培地で生育させる事により、pYRHFLPも脱落させた。
ここでは、マーカーにジェネティシン耐性マーカー遺伝子とノーセオスリシン耐性遺伝子を用いた例を示したが、宿主の遺伝子型によって、他のマーカー（オーレオバシジン耐性遺伝子や、シクロヘキシミド耐性遺伝子）も使用可能である。
【００７２】
＜ScDHH1遺伝子破壊株の発酵試験＞
ScDHH1遺伝子破壊株と親株であるBH96-2-6株を用いて、200 mlスケールで発酵試験を行った。
麦汁エキス濃度                   16.7％  （糖濃度（Brix）17.2）
麦汁容量                         200ml
麦汁溶存酸素濃度                 10ppm
発酵温度                         15℃
酵母投入量                       1g湿菌体/200ml
結果を図29に示す。ScDHH1遺伝子破壊株は、親株BH96-2-6株に比べて、糖が消費されて発酵液中の糖濃度が下限の定常状態になるまでに要する時間が、84 ％以下であった。醗酵液より酵母を回収し、その酵母でもう一度200 mlスケールで発酵試験を行った。その結果を図30に示す。ScDHH1遺伝子破壊株は、連続して発酵を行ってもやはり親株（ネガティブコントロール）に比べ優位に発酵が速かった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の方法により野生型酵母と比べて発酵能力に優れる酵母を製造することができる。また、本発明の高速発酵酵母を用いることにより効率よくアルコール飲料を製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号13〜16、18、19、21〜26、29〜47：合成DNA
【図１】
2016077160.tif 000002
【図２】
2016077160.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
2016077160.tif 000006
【図６】
2016077160.tif 000007
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2016077160.tif 000018
【図１８】
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【図１９】
2016077160.tif 000020
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2016077160.tif 000024
【図２４】
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【図２５】
2016077160.tif 000026
【図２６】
2016077160.tif 000027
【図２７】
2016077160.tif 000028
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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