(57)【要約】【課題】ＧＩＰ受容体阻害物質を肥満抑制剤として使用する場合において、食後過血糖や骨格筋重量減少等のリスクを低減する使用態様の提供。【解決手段】ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤の適用量を設定する方法 であって、以下の工程１）〜４）を含む、前記方法。  １）ＧＩＰ受容体阻害剤を、糖質及び脂質と共に所定の濃度で非ヒト哺乳類に投与する工程、２）血中インスリン濃度を測定し、インスリン分泌量を算出する工程、３）前記２）で算出されたインスリン分泌量を、糖質及び脂質のみを投与した対照群におけるインスリン分泌量と比較する工程、４）前記３）の結果に基づいて、インスリン分泌量を対照群の５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質の投与量の１／８〜１／４量を、肥満抑制剤の適用量として設定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤の適用量を設定する方法であって、以下の工程１）〜４）を含む、前記方法。
１）ＧＩＰ受容体阻害剤を、糖質及び脂質と共に所定の濃度で非ヒト哺乳類に投与する工程、
２）血中インスリン濃度を測定し、インスリン分泌量を算出する工程、
３）前記２）で算出されたインスリン分泌量を、糖質及び脂質のみを投与した対照群におけるインスリン分泌量と比較する工程、
４）前記３）の結果に基づいて、インスリン分泌量を対照群の５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質の投与量の１／８〜１／４量を、肥満抑制剤の適用量として設定する工程。
【請求項２】
ＧＩＰ受容体阻害物質が、４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド及び３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸〔１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）−１Ｈ−インドール−４−イルメチレン〕ヒドラジドから選ばれるメチリデンヒドラジド化合物又は（Ｐｒｏ３）ＧＩＰである請求項１記載の方法。
【請求項３】
非ヒト哺乳類がげっ歯類である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法によって設定された適用量で用いられる、ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤。
【請求項５】
インスリン抵抗性改善作用及び／又は耐糖能改善作用を有する請求項４記載の肥満抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐糖能低下等のリスクが低い肥満抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptideまたはGlucose-dependent insulinotropic polypeptide）は、グルカゴン・セクレチンファミリーに属する消化管ホルモンの１つである。ＧＩＰはＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）と共にインクレチンと称され、脂質や糖質の摂食時に小腸に存在するＫ細胞より分泌されることが報告されている。
【０００３】
ＧＩＰは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られていることから、ＧＩＰの作用が肥満の一要因になっていると考えられている。実際、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）ノックアウトマウスにおいて、食餌依存性の体重増加、及び脂肪蓄積を抑制することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
近年、ＧＩＰの機能を阻害する化合物、例えばＧＩＰ受容体結合阻害剤は、抗肥満作用を有する薬剤として使用できるとされ、例えば、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−Ａ］ピリミジン−７−オール＜ＢＭＰＰ＞（特許文献１）を始め、４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド＜４Ｈ２ＢＨ＞や３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸〔１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）−１Ｈ−インドール−４−イルメチレン〕ヒドラジド等のメチリデンヒドラジド化合物（特許文献２）が報告されている。
【０００５】
一方で、ＧＩＰ産生細胞（Ｋ細胞）ノックアウトマウスにおいては、食餌依存性の肥満を抑制するが、インスリン分泌の低減に伴って耐糖能が悪化することが報告されている（非特許文献２）。また、ＧＩＰヘテロノックアウト（ＧＩＰ半減）マウスでは食餌依存性肥満を抑制すると共に、標準食餌下（肥満誘導前）ではインスリン分泌が半減して食後高血糖を呈し、ＧＩＰホモノックアウト（ＧＩＰ欠損）マウスでは、インスリン分泌の半減と食後高血糖に加え、さらに骨量の減少が認められることが報告されている（非特許文献３）。したがって、糖尿病等の病態においては、インスリン分泌欠乏による悪影響がより顕著に現れ、食後過血糖の惹起は深刻な状態を招くおそれがある。また、インスリン分泌の欠乏は骨格筋重量に影響する可能性が考えられ(非特許文献４)、ＧＩＰの機能阻害は骨粗鬆症を引き起こす可能性が懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００１／８７３４１号
【特許文献２】国際公開第２００３／０９７０３１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Miyawaki K, Yamada Y, Ban N, Ihara Y, Tsukiyama K, Zhou H, et al. Inhibition of gastric inhibitory polypeptide signaling prevents obesity. Nat Med. 2002 Jul;8(7):738-42
【非特許文献２】Althage MC, Ford EL, Wang S, Tso P, Polonsky KS, Wice BM. Targeted ablation of glucose-dependent insulinotropic polypeptide-producing cells in transgenic mice reduces obesity and insulin resistance induced by a high fat diet. J Biol Chem. 2008 Jun 27;283(26):18365-76
【非特許文献３】Nasteska D, Harada N, Suzuki K, Yamane S, Hamasaki A, Joo E, et al. Chronic reduction of GIP secretion alleviates obesity and insulin resistance under high fat diet condition. Diabetes. 2014 Feb 28;1-33
【非特許文献４】Schiaffino S, Mammucari C. Regulation of skeletal muscle growth by the IGF1-Akt/PKB pathway: insights from genetic models. Skelet Muscle. BioMed Central Ltd; 2011 Jan;1(1):4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＩＰ受容体阻害物質を肥満抑制剤として使用する場合において、食後過血糖や骨格筋重量減少等のリスクを低減する使用態様を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討したところ、ＧＩＰ受容体阻害物質を、インスリン分泌量を５０％に低下させる投与量の１／８〜１／４量で適用することより、十分な肥満抑制効果を発揮し、且つ食後過血糖や骨格筋重量減少等のリスクを低減できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）及び（２）に係るものである。
（１）ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤の適用量を設定する方法であって、以下の工程１）〜４）を含む、前記方法。
１）ＧＩＰ受容体阻害剤を、糖質及び脂質と共に所定の濃度で非ヒト哺乳類に投与する工程、
２）血中インスリン濃度を測定し、インスリン分泌量を算出する工程、
３）前記２）で算出されたインスリン分泌量を、糖質及び脂質のみを投与した対照群におけるインスリン分泌量と比較する工程、
４）前記３）の結果に基づいて、インスリン分泌量を対照群の５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質の投与量の１／８〜１／４量を、肥満抑制剤の適用量として設定する工程。
（２）上記（１）の方法によって設定された適用量で用いられる、ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、十分な肥満抑制効果が発揮されるとともに、インスリン分泌の低減に伴って生じる食後過血糖、骨格筋重量減少、骨粗鬆症等のリスクが低減された、肥満抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】４Ｈ２ＢＨがｃＡＭＰ産生に与える影響を示すグラフ。Ａ：ＧＩＰＲ高発現細胞に各濃度の４Ｈ２ＢＨにて３０分間刺激時の発光強度（ｃＡＭＰ産生量）、Ｂ：ＧＩＰＲ高発現細胞に４Ｈ２ＢＨにて１５分間刺激後、ＧＩＰにて３０分間刺激時のｃＡＭＰ産生量。
【図２】４Ｈ２ＢＨ単回投与後の食後インスリン上昇を示すグラフ。＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＨＦ
【図３】４Ｈ２ＢＨ長期摂取の体重／白色脂肪重量への影響を示すグラフ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ ＨＦ
【図４】４Ｈ２ＢＨ長期摂取の骨格筋重量への影響を示すグラフ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ ＨＦ
【図５】４Ｈ２ＢＨ長期摂取の骨密度（骨幹部/骨端幹部）への影響を示すグラフ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ ＨＦ
【図６】４Ｈ２ＢＨ長期摂取のインスリン感受性への影響（３０週目）を示すグラフ。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ ＨＦ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「ＧＩＰ受容体阻害物質」とは、ＧＩＰ受容体がリガンドとの結合によって細胞にシグナルを伝達する受容体機能のいずれかの段階を抑制（ＧＩＰ受容体阻害活性）する化合物を意味する。例えば、リガンド−受容体間の結合を阻害するものが挙げられる。ここで、ＧＩＰ受容体阻害活性は、例えば、シグナル伝達に必要なｃＡＭＰ産生能を測定することにより、把握することができる。
【００１４】
斯かる化合物としては、特に限定されず、例えば食品素材や医薬原体を用いることができ、天然物或いは合成化合物の何れであってもよい。
【００１５】
ＧＩＰ受容体阻害物質は、例えば、以下の方法により選択することができる。
ａ）ＧＩＰ受容体発現細胞を培養した培地に被験物質を添加してインキュベートする
ｂ）ＧＩＰを添加してインキュベートする
ｃ）細胞を溶解後、ｃＡＭＰ量を測定する
ｄ）ｃ）で算出されたｃＡＭＰ量を、被験物質を添加しない対照群におけるｃＡＭＰ量と比較する
ｅ）ｄ）の結果に基いて、ｃＡＭＰ量を減少させる被験物質をＧＩＰ受容体阻害活性を有する物質として選択する
【００１６】
公知のＧＩＰ受容体阻害物質としては、例えば、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−Ａ］ピリミジン−７−オール＜ＢＭＰＰ＞（前記特許文献１）、４−ヒドロキシベンゾイックアシッド（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド＜４Ｈ２ＢＨ＞、３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸〔１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）−１Ｈ−インドール−４−イルメチレン〕ヒドラジド等のメチリデンヒドラジド化合物（前記特許文献２）、（Ｐｒｏ３）ＧＩＰ（Gault V a, O’Harte FPM, Harriott P, Flatt PR. Characterization of the cellular and metabolic effects of a novel enzyme-resistant antagonist of glucose-dependent insulinotropic polypeptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290: 1420-6, 2002.）等が挙げられ、このうち、４Ｈ２ＢＨが好ましい。
【００１７】
本発明は、上記ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤において、その適用量を設定する方法であり、具体的には以下の工程１）〜４）を含むものである。
１）非ヒト哺乳類に、ＧＩＰ受容体阻害剤を糖質及び脂質と共に所定量投与する工程、
２）血中インスリン濃度を測定し、インスリン分泌量を算出する工程、
３）前記２）で算出されたインスリン分泌量を、糖質及び脂質のみを投与した対照群におけるインスリン分泌量と比較する工程、
４）前記３）の結果に基づいて、インスリン分泌量を対照群の５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質の投与量の１／８〜１／４量を、肥満抑制剤の適用量として設定する工程。
【００１８】
工程１）において用いられる糖質としては、インスリン分泌を促すものであればよく、単糖、オリゴ糖、多糖の何れでもよい。単糖としては、例えばグルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の糖や、グリセルアルデヒド、グルコサミン、アセチルグルコサミン等の糖誘導体が挙げられ、オリゴ糖としては、例えばスクロース、マルトース、ラクトース等が挙げられ、多糖としては、例えば、澱粉、デキストリン、グリコーゲン等が挙げられ、これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、斯かる糖類を含有する糊化した米や小麦粉などを用いてもよい。このうち、インスリン分泌量上昇の点から、グルコース、スクロース、マルトース、澱粉及びグリコーゲン等の１種以上を用いるのが好ましく、特にグルコースが好ましい。
【００１９】
また、脂質としては、インスリン分泌を高めるもの、例えばトリアシルグリセロール、１，３−ジアシルグリセロール、１，２−ジアシルグリセロールといった脂肪酸グリセロールエステルや、遊離脂肪酸等やこれらを含有する油脂などが挙げられる。具体的には、トリパルミチン、トリステアリン、トリオレイン、１，３−ジパルミチン、１，３−ジステアリン、１，３−ジオレイン、１，２−ジパルミチン、１，２−ジステアリン、１，２−ジオレイン、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、牛脂、ラード、カカオ脂、バター、コーン油、大豆油、ヒマワリ油、ゴマ油、菜種油、コメ油、オリーブ油、サフラワー油、ヤシ油、パーム油等が挙げられ、このうち、インスリン分泌量上昇の点から、トリオレイン、１，３−ジオレイン、コーン油、菜種油、コメ油、オリーブ油、ゴマ油、及びパーム油等の１種以上を用いるのが好ましく、特にトリオレイン、コーン油、菜種油、オリーブ油が好ましい。斯かる脂質は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２０】
斯かる糖質及び脂質は、同時に投与することでも、時間差を設けて別個に投与することでもよい。また、両者を混合し、レシチンなどの乳化剤を用いて乳化した乳化組成物とすることもできる。
【００２１】
糖質の投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｇ体重、望ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｇ体重、更に望ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｇ体重である。
脂質の投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｇ体重、望ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｇ体重、更に望ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｇ体重である。
【００２２】
ＧＩＰ受容体阻害物質の投与量は、上記糖質もしくは脂質投与時の食後インスリン分泌量を考慮して、適宜設定されるが、例えば、糖質あるいは脂質と同時摂取した際に、食後インスリン分泌量を５０％に低下させる投与量を目安として、その１／８量〜１／４量の範囲で設定することができる。
【００２３】
非ヒト哺乳類としては、血中にインスリンを分泌する非ヒト哺乳類であれば、性別、月齢を問わず、いかなる種類の動物でもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ又はサルを挙げることができるが、入手が容易であり、取り扱い易いラットやマウスなどのげっ歯類が好ましく、更にＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＡＫＲ、ＤＢＡ、Ｃ３Ｈ、ＢＡＬＢ／ｃといったマウス系統を用いるのが望ましい。また、絶食した動物を用いるのが望ましい。
【００２４】
本発明において、糖質及び脂質、並びにＧＩＰ受容体阻害剤を動物に投与する方法としては、例えば、経口投与、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等が挙げられるが、簡便さや侵襲性が低いなどの点から、経口投与する方法が好ましい。
【００２５】
血中インスリンの測定は、投与前、及び投与後１〜３００分、好ましくは５〜２４０分において、経時的（例えば、投与後１０分、３０分、６０分、１２０分後等）に採血し、各時刻における血中インスリン濃度を測定することにより行われる。尚、採血は、眼窩静脈或いは尾静脈など一般的な採血部位から血液を採取すればよい。
インスリンの定量は、採血された血液から、血清或いは血漿を調製後、例えば酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）、或いは高速液体クロマトグラフィー法などにより行うことができる。
【００２６】
インスリン分泌量は、投与後各時刻における血中インスリン濃度から、最大インスリン濃度又は曲線下面積（ＡＵＣ）によって求めることができ、ＧＩＰ受容体阻害物質の投与による当該インスリン分泌量の変化が、糖質及び脂質のみを投与した対照群のそれと比較することにより算出される。
そして、インスリン分泌量を５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質投与量の１／８〜１／４量が、肥満抑制剤の適用量として設定される。
【００２７】
後記実施例に示すように、４Ｈ２ＢＨをマウスに０.１２ｍｇ／ｇ体重（１２０分自由摂食）で投与した場合、顕著な肥満抑制効果が認められるものの、脂肪及び糖質投与による食後血中インスリンの上昇が約５０％抑制される（図２）。そして、４Ｈ２ＢＨの投与量が、当該投与量の１／８〜１／４量である場合には、インスリン分泌の過度な抑制が制御され（図２）、且つ十分な肥満抑制効果が得られることが確認された（図３）。
したがって、ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤において、その適用量は、ＧＩＰ受容体阻害物質としての投与量をインスリン分泌量を５０％に低下させる量の１／８量〜１／４量とすることが、食後過血糖や骨格筋重量減少等のリスクを低減する点で、最適であると云える。また、斯かる適用量の範囲では、インスリン抵抗性改善効果も発揮され（図６）、肥満抑制効果に合わせて、耐糖能改善効果も期待され、糖尿病患者に対する肥満の予防又は改善にも使用することが可能である。
肥満抑制効果及び上記リスクの発症の点から、当該１／８〜１／４量は、好ましくは１／７．５量以上、より好ましくは１／７量以上、より好ましくは１／６.５量以上で、好ましくは１／４．５量以下、より好ましくは１／５量以下、より好ましくは１／５.５量以下である。また、好ましくは１／７．５〜１／４．５量、より好ましくは１／７〜１／５量、より好ましくは１／６.５〜１／５.５量である。
【００２８】
斯くして、ＧＩＰ受容体阻害剤としての有効投与量が設定された肥満抑制剤は、十分な肥満抑制効果が発揮されるとともに、インスリン分泌の過度な抑制が制御され、食後過血糖、骨格筋重量減少、骨粗鬆症等の発症リスクが低減される。
【００２９】
当該肥満抑制剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に、脂肪蓄積予防効果や体脂肪減少効果等の抗肥満効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品、又は飼料となり得る。
また、当該食品には、肥満抑制（肥満の予防又は改善）、身体のスリム化、ダイエットをコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品が包含される。これらの食品は機能の表示を許可された食品であって、一般の食品と区別されるものである。
【００３０】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、各種外用剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の何れでもよい。また投与形態は、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよいが、経口投与が好ましい。
また、このような種々の剤型の製剤は、ＧＩＰ受容体阻害物質を其々単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、脂肪球皮膜成分以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。例えば経口用液体製剤は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により調製することができる。
経口投与用製剤中のＧＩＰ受容体阻害物質の含有量は、一般的に好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、そして好ましくは９８質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％以下である。また、好ましくは０．００１〜９８質量％、より好ましくは０．０１〜５０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．５〜２質量％が挙げられる。
【００３１】
ＧＩＰ受容体阻害物質を含有する上記食品の形態としては、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。
【００３２】
種々の形態の食品は、本発明のＧＩＰ受容体阻害物質を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、本発明以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００３３】
また、病者用食品、例えば適当量の栄養補給が困難な高齢者やベッドレスト状態の病者に対する食品としては、経腸栄養剤等の栄養組成物の形態とすることが可能である。
【００３４】
また、飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。
【００３５】
本発明の肥満抑制剤は、本発明によって設定された適用量で投与される。
例えば、ヒトに経口投与する場合、ＧＩＰ受容体阻害物質として１回あたり、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、１００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ体重以下が挙げられる。また、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。そして、１日に１〜数回投与することが可能である。
投与又は摂取対象としては、それを必要としている若しくは希望しているヒト又は動物であれば特に限定されないが、例えば肥満症の患者、糖尿病を発症又はそのリスクがある肥満症患者、骨粗鬆症を発症又はそのリスクがある肥満症患者、それらの予備軍などが挙げられる。
【００３６】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤の適用量を設定する方法であって、以下の工程１）〜４）を含む、前記方法。
１）ＧＩＰ受容体阻害剤を、糖質及び脂質と共に所定の濃度で非ヒト哺乳類に投与する工程、
２）血中インスリン濃度を測定し、インスリン分泌量を算出する工程、
３）前記２）で算出されたインスリン分泌量を、糖質及び脂質のみを投与した対照群におけるインスリン分泌量と比較する工程、
４）前記３）の結果に基づいて、インスリン分泌量を対照群の５０％に低下させるＧＩＰ受容体阻害物質の投与量の１／８〜１／４量を、肥満抑制剤の適用量として設定する工程。
＜２＞ＧＩＰ受容体阻害物質が、４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド及び３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸〔１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）−１Ｈ−インドール−４−イルメチレン〕ヒドラジドから選ばれるメチリデンヒドラジド化合物又は（Ｐｒｏ３）ＧＩＰである＜１＞の方法。
＜３＞非ヒト哺乳類がげっ歯類である＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞＜１＞又は＜２＞の方法によって設定された適用量で用いられる、ＧＩＰ受容体阻害物質を有効成分とする肥満抑制剤。
＜５＞インスリン抵抗性改善作用及び／又は耐糖能改善作用を有する＜４＞の肥満抑制剤。
＜６＞＜４＞又は＜５＞の肥満抑制剤において、１回あたりの投与量は、ＧＩＰ受容体阻害物質として、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、１００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ体重以下であるか、又は０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。
＜７＞＜４＞又は＜５＞の肥満抑制剤において、投与又は摂取対象は、例えば肥満症の患者、糖尿病を発症又はそのリスクがある肥満症患者、骨粗鬆症を発症又はそのリスクがある肥満症患者である。
【実施例】
【００３７】
参考例１  細胞でのＧＩＰ受容体阻害剤スクリーニング
１．方法
細胞として、ヒトＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）高発現細胞（ＣｈａｎＴｅｓｔ社  ＃Ａ６９５、ＣＨＯ−Ｋ１由来）を用いた。培養培地として、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社  ＃３１７６５−０３５）＋１０％ＦＢＳ＋０．５  ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ロシュ・ダイアグノスティックス社）  ＋  １×ＮＥＡＡ（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いた。対数増殖期の細胞を９６ウェルクリアボトムプレート（ＤｉｓｃｏｖｅＲＸ社）に２０，０００細胞／ウェルで播種し、培養培地にて、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。
４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（４Ｈ２ＢＨ）は、Ling et al., J. Med. Chem. 44: 3141-9, 2001に記載の方法によって製造したものを用いた。４Ｈ２ＢＨはＤＭＳＯを用いて終濃度の１０００倍のストック溶液を作製し、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘにて１０００倍希釈して使用した。ＧＩＰはヒトＧＩＰ（１−４２）（シグマアルドリッチ社  ＃Ｇ２２６９）を用いた。ＧＩＰはＰＢＳを用いて終濃度の１０００倍のストック溶液を作製し、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ＋０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（シグマアルドリッチ社）にて１０００倍希釈して使用した。ｃＡＭＰの定量はｃＡＭＰ定量キットＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰ  ＸＳ＋（ＤｉｓｃｏｖｅＲＸ社  ＃９０−００７５）にて行った。
細胞を一晩培養後、培養培地を吸引除去し、４Ｈ２ＢＨ、または薬剤含有培地で１５分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。その後、ＧＩＰ含有培地で３０分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。その後、キットに付属のＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を溶解し、キットのプロトコールに従って処理後、発光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０）にて発光を検出し、ｃＡＭＰ定量を行った。
【００３８】
２．結果
ｃＡＭＰの定量結果を図１に示す。４Ｈ２ＢＨの単独添加では、ｃＡＭＰ産生に影響を与えないことを確認した（図１Ａ）。ＧＩＰ  １０−９Ｍ添加時、ＧＩＰ無添加に対して有意にｃＡＭＰ産生が増加したが、４Ｈ２ＢＨの共存下では濃度依存的にｃＡＭＰ産生が減少し、４Ｈ２ＢＨ  １０−５Ｍ、及び１０−４Ｍ添加では、４Ｈ２ＢＨ無添加に対して有意にｃＡＭＰ産生が少なかった（図１Ｂ）。この結果より、４Ｈ２ＢＨは、濃度依存的なＧＩＰ受容体シグナル阻害作用を持つことがわかる。
【００３９】
実施例１  食後インスリン分泌に与える影響
１．方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、１２週齢）を各群体重が同等になるように群分けした後（Ｎ＝４／群）、２０時間絶食を行った。その後、３０％のトリアシルグリセロールと０．０５％、０．１％、及び０．４％の４Ｈ２ＢＨを含む高脂肪（ＨＦ）食を１２０分間自由摂食（２９±２．４  ｍｇ／ｇ体重／１２０分）させた。給餌前（０分）、給餌後３０、６０、及び１２０分にイソフルラン麻酔下にて眼窩静脈叢より採血を行い、簡易血糖測定装置（アキュチェックアビバ：ロシュ・ダイアグノスティックス）にて血糖値を測定した後、血液を氷中保存した。採取した血液を遠心分離後、血漿を調製した。血漿中のインスリンは「インスリン測定キット」（森永生科学研究所）を用いて測定した。
【００４０】
２．結果
絶食したマウスに４Ｈ２ＢＨを添加したＨＦ食を１２０分間摂取させた後の食後血中インスリン上昇（最大上昇値）を図２に示す。
食後血中インスリン上昇は、４Ｈ２ＢＨの添加量依存的に低下が認められ、０．４％添加時、ＨＦ群に対して有意な低下が認められ、その上昇量は無添加に比べて約５０％だった（図２）。なお、摂食量については、ＨＦ群と４Ｈ２ＢＨ添加群との間に有意な差は認められなかった。
【００４１】
実施例２  肥満に与える影響
１．方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、８週齢）を各群体重が同等になるように群分けした後（Ｎ＝１２／群）、１ケージあたり４匹飼いで飼育した。食餌組成を下記表１に示す。５％の脂質を含む低脂肪（ＬＦ）食と、３０％のトリアシルグリセロールと各用量の４Ｈ２ＢＨを含む高脂肪（ＨＦ）食をそれぞれの群に解剖時（飼育３７週目）まで給餌した。飼育期間中、体重は週１回、摂食量は週２回測定した。なお、飼育期間中は自由摂食、自由摂水とした。
飼育３７週目における採血、及び採材は非絶食下にて行った。給餌最終日に、イソフルラン麻酔下にて腹大静脈から全血を採取した。また、骨格筋（左脚腓腹筋、ヒラメ筋、及び足底筋）、及び内臓脂肪（副睾丸周囲脂肪、副腎周囲脂肪、後腹膜脂肪、腸間膜脂肪）を摘出し、重量を測定した。更に、マウスの左脚より大腿骨を摘出した後、測定まで７０％エタノール中に保存した。
骨密度測定は、ｐＱＣＴ骨密度測定装置（ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋、キヤノンライフソリューション）を用いて行った。７０％エタノールに浸漬した大腿骨をサンプルホルダーにセットし、一次ＣＴスキャンにより得られた遠位成長板軟骨（遠位間接端より２−３ｍｍ近位側）の位置を基準に、測定位置を決定した。測定部位は遠位成長板軟骨より近位側８ｍｍ部分を骨幹部、１．２ｍｍ部分を骨端幹部として設定し、２箇所の骨密度測定を行った。骨幹部での骨密度測定は、皮質骨（６９０ｍｇ／ｍｍ３以上の領域）の測定を行った。骨端幹部での骨密度測定は、皮質骨（３９５ｍｇ／ｍｍ３以上の領域）、海綿骨（６９０ｍｇ／ｍｍ３未満）、及び全体の３項目の測定を行った。付属の測定用ソフトウェアにより各領域の自動判別を行い、骨密度を定量化した。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
２．結果
ＬＦ食、ＨＦ食、及び４Ｈ２ＢＨ添加ＨＦ食摂取下の飼育３７週目の体重、白色脂肪重量を図３に示す。
飼育３７週目において、ＬＦ群に対し、ＨＦ群で食餌依存性の肥満（有意な体重の増加）が認められた（図３Ａ）。４Ｈ２ＢＨ添加群については、０．０５％、及び０．１％  添加群でＨＦ群に対して体重増加抑制傾向が認められ、０．４％添加群で、ＨＦ群に対して有意な体重増加抑制が認められた。
飼育３７週目に、マウスより採材した皮下脂肪（鼠径部）及び内臓脂肪（副精巣、腸間膜、後腹膜、及び腎周囲）の合算値である白色脂肪の重量を図３Ｂに示す。ＬＦ群に対し、ＨＦ群で白色脂肪重量の有意な増加が認められた。ＨＦへの４Ｈ２ＢＨ添加により、ＨＦ群に対して白色脂肪重量の有意な低減が認められた（図３Ｂ）。以上の結果より、インスリン分泌に影響を与えない４Ｈ２ＢＨ濃度（０．０５％、及び０．１％）においても脂肪蓄積効果を示すことがわかる。
飼育３７週目に、マウスより採材した骨格筋（左脚ヒラメ筋、腓腹筋、及び足底筋）の重量を図４に示す。ＬＦ群に対し、ＨＦ群で骨格筋重量の有意な増加が認められた。ＨＦへの０．４％ ４Ｈ２ＢＨ添加により、ＨＦ群に対して白色脂肪重量の有意な低減が認められたが、０．０５％、及び０．１％においてはＨＦ群に対して有意な差は認められなかった（図４）。以上の結果より、インスリン分泌に影響を与えない４Ｈ２ＢＨ濃度（０．０５％、及び０．１％）においては骨格筋重量の低下は起こらないことがわかる。
飼育３７週目に、マウスより採材した骨（左脚大腿骨）の骨密度を図５に示す。骨幹部における骨密度は、ＬＦ群に対し、ＨＦ群において有意な増加が認められた（図５Ａ）。ＨＦへの０．４％ ４Ｈ２ＢＨ添加により、ＨＦ群に対して有意な骨密度の低下が認められたが、４Ｈ２ＢＨ低濃度（０．０５％、及び０．１％）添加群では、ＨＦ群に対して有意な差は認められなかった（図５Ａ）。骨端幹部における骨密度は、ＬＦ群に対し、ＨＦ群において増加傾向（Ｐ＝０．１）が認められた（図５Ｂ）。ＨＦへの０．４％ ４Ｈ２ＢＨ添加により、ＨＦ群に対して骨密度の低下傾向（Ｐ＝０．０５）が認められたが、４Ｈ２ＢＨ低濃度（０．０５％、及び０．１％）添加群では、ＨＦ群に対して有意な差が認められなかった（図５Ｂ）。以上の結果より、インスリン分泌に影響を与えない４Ｈ２ＢＨ濃度（０．０５％、及び０．１％）においては骨密度の低下は起こらないことがわかる。
なお、飼育期間中の摂食量については、ＨＦ群と４Ｈ２ＢＨ添加群との間に有意な差は認められなかった。
【００４４】
実施例３  インスリン抵抗性への影響
１．方法
表１に示す組成の食餌にて飼育３０週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを５時間絶食後、生理食塩水に溶解した０．５  Ｕ／ｋｇ体重のヒトインスリン（和光純薬工業）を腹腔内より投与した。投与前（０分）、投与後３０、６０、９０、及び１２０分に尾静脈より採血を行い、簡易血糖測定装置（アキュチェックアビバ、ロシュ・ダイアグノスティクス）にて血糖値を測定した。
【００４５】
２．結果
インスリン投与後１２０分の経時的な血糖変化を図６Ａに、１２０分までの血糖曲線下面積（％ＡＵＣ）を図６Ｂに示す。
ＬＦ群に対して、ＨＦ群でインスリン感受性の低下（インスリン投与による血糖値低下の抑制）傾向が認められた。０．０５％、及び０．１％４Ｈ２ＢＨ添加ＨＦ群では、ＨＦ群に対してインスリン感受性の改善（インスリン投与による血糖値低下の亢進）傾向が認められ、０．４％添加ＨＦ群ではＨＦ群に対して有意なインスリン感受性の改善が認められた（図６Ｂ）。なお、インスリン投与後１２０分では、いずれの４Ｈ２ＢＨ濃度においてもＨＦ群に対して有意なインスリン感受性の改善を認めた（図６Ａ）。以上の結果より、インスリン分泌に影響を与えない４Ｈ２ＢＨ濃度（０．０５％、及び０．１％）においてもインスリン感受性の改善効果を示すことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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