(57)【要約】【課題】安定で安価なホスホリパーゼおよびその生産菌を提供する【解決手段】Tuberibacillus属細菌の近縁である新種細菌であり、ホスホリパーゼ生産能を有し、受託番号NITE P-02030で特定される、微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼ生産能を有し、受託番号NITE P-02030で特定される、微生物。
【請求項２】
受託番号NITE P-02030で特定される、ホスホリパーゼ生産菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼを生産する微生物およびその生産菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質（グリセロリン脂質）は細胞膜の主要な構成成分であり、グリセロールのsn-1位とsn-2位にそれぞれ脂肪酸（R1, R2） が結合し、sn-3位にはリン酸が結合し、さらにリン酸にアルコール（X） が結合した構造をもつ。従って、リン脂質を加水分解する酵素であるホスホリパーゼ（PL）はその作用部位の違いによって、PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLDの５つに分類される（図1）。
【０００３】
一方、脂肪酸（アシル基）を１本しか持たないリン脂質（リゾリン脂質）は、リン脂質より乳化作用に優れるため、食品や化粧品などに広く使用されている。現在、リゾリン脂質製造には、ブタ膵臓由来PLA2が広く利用されている。しかし、宗教上の問題（イスラム教徒やユダヤ教徒がブタを忌避すること）や感染症リスクなどから、安定性の優れた代替酵素が望まれている。これまで、様々な微生物由来のPLAが見出されているが、精製効率や安定性などに問題がある。これまで多くのPLAに関する報告はあるが、微生物由来PLA1で、精製標品を用いて生化学的解析が行われているものはそれほど多くない（非特許文献1,2(参考文献1,2)）。現在までに、好熱性細菌・アーキア由来のPLA1は報告されておらず、PLA2は好熱性アーキアPyrococcus horikoshii とAeropyrum premix で報告されているのみである。好熱性真菌由来ではThermomyces lanuginosus とFusarium oxysporumの酵素のキメラPLA1が報告されているのみである。従って、PLAを生産する好熱菌を単離することは、PLの利用や機能特性の理解の上で、重要な知見を与えると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】De Maria, L., Vind, J., Oxenboll, K. M., Svendsen, A., & Patkar, S. （2007）. Phospholipases and their industrial applications. Applied microbiology and biotechnology, 74（2）, 290-300.
【非特許文献２】Aloulou, A., Ali, Y. B., Bezzine, S., Gargouri, Y., & Gelb, M. H. （2012）. Phospholipases: an overview. In Lipases and Phospholipases （pp. 63-85）. Humana Press.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ホスホリパーゼを生産する微生物及びホスホリパーゼ生産菌を提供することを目的とする。
【０００６】
ホスホリパーゼを生産する微生物を単離することは、PLの利用や機能特性の理解の上で、重要な知見を与える。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の微生物、ホスホリパーゼ生産菌を提供するものである。
項１．  ホスホリパーゼ生産能を有し、受託番号NITE P-02030で特定される、微生物。
項２．  受託番号NITE P-02030で特定される、ホスホリパーゼ生産菌。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、安定で安価な耐熱性ホスホリパーゼを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】リン脂質の構造とホスホリパーゼ(PL)の作用部位。R1, 脂肪酸(飽和脂肪酸が多い)、R2, 脂肪酸(不飽和脂肪酸が多い)
【図２】培養上清を用いたPC(ホスファチジルコリン)分解活性
【図３】酵素反応により生じた遊離脂肪酸の同定：基質として卵黄PCおよび大豆レシチンを用い、pH7.0、60℃で酵素反応を行い、1時間後と18時間後の酵素反応液をTLC解析に供した。得られた遊離脂肪酸をメチルエステル化し、GC（ガスクロマトグラフ）解析により遊離脂肪酸を同定した。
【図４】酵母より抽出した脂質を基質として用いたときの酵素反応。基質として卵黄PCおよび大豆レシチンを用い、pH7.0、60℃で酵素反応を行い、1，3，18時間後の酵素反応液をTLC解析に供した。各スポット量をImage Jを用いて解析した。酵素反応前の脂質量を100%として、分解量を算出した。TAG：トリアシルグリセロール、PE：ホスファチジルエタノールアミン、PG：ホスファチジルグリセロール、PC：ホスファチジルコリン。
【図５】B157株および近縁種の16S rRNA遺伝子における系統樹
【図６】B157株の細胞形態
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者は、アシドロコンポストを菌源として注目し、耐熱性PLA(ホスホリパーゼA)を生産する好熱菌をスクリーニングした。好熱性細菌は病原性の報告がなく、耐熱性に優れた酵素を生産するために注目した。アシドロコンポストは、東北大学大学院工学研究科西野徳三名誉教授らによって開発されたものであり、乳酸菌が主となって、高温・酸性条件下で機能し、臭気がほとんど発生しない有機性廃棄物処理システムである（参考文献3-7）。近年、コンポストより新規細菌が数多く報告されているが、アシドロコンポストを菌源とした研究は多くない。そこで、本研究では、茨城県大洗水族館のアシドロコンポストより耐熱性PLを生産する好熱性細菌のスクリーニングを行った。その結果、耐熱性PLA1を生産するグラム陽性有胞子好熱菌B157株を単離した。次に、B157株のPLA1を高生産する最適培地及び培養条件の検討を行った。その後、培養上清を酵素液として用い、酵素の位置特異性と基質特異性を調査した。また、当該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジー検索・系統樹作成を行った結果、新属新種であることが示唆された。そこで、B157株の分類学的解析を行い、新属新種であることを確認した。B157株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号1に示す。配列番号１中の「N」はC/Gであるが、Cの可能性が高い。
【００１１】
本発明において、耐熱性ホスホリパーゼを生産する微生物は、Tuberibacillus属細菌の近縁である新種細菌B157株であり、この株は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2015年3月30日に受託番号NITE P-02030として寄託している。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００１３】
実施例１
1.  B157株の単離
茨城県大洗水族館で長期稼働しているアシドロコンポスト分解方式の生ごみ処理機からサンプルを採取し、5 mlの80本のB培地（0.1%（w/v）酵母エキス、0.2%（w/v） NaCl、0.3%（w/v） KH2PO4、0.5%（w/v） 卵黄レシチン、0.05%（w/v） MgSO4・7H2O、0.3%（w/v）Tween 80、20 mM CaCl2、pH 5.0）に植菌し、60°Cで静置培養（1%植菌、3-4日間間隔で継代）し、5回植え継ぎを繰り返した。その後、強い増殖を指標に選抜した。選抜したサンプルについて、それぞれ培養液を0.9% （w/v） NaClで希釈し、ジェランガム（1.0%）を含む固体B培地に100 μlを塗布後、60℃で4日及び3日間培養を行なった。
【００１４】
その後、得られた菌株を、1.0%  ジェランガムを含むLGel培地 （0.1%（w/v）酵母エキス, 0.1%（w/v）KH2PO4, 0.05%（w/v） MgSO4・7H2O，0.1%（w/v）（NH4）2SO4, 1.0%（w/v） 卵黄レシチン, 0.05%（w/v）タウロコール酸,  20 mM CaCl2, pH 5）に植菌し、60°C、3日間培養し、ハロ形成により選別した。さらに、培養上清や細胞破砕液を用いた酵素活性測定や16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定による菌株の重複の削除などにより、耐熱性PLA1を生産するB157株を得た。
【００１５】
2.  B157株のPLA1を高生産する最適培地及び培養条件の検討
X培地 （0.3%（w/v） 大豆レシチン、0.2%（w/v）酵母エキス、0.1%（w/v） カザミノ酸、0.2%（w/v） CaCl2、水道水、pH 6.4-6.5） を基本培地とし、2 L坂口フラスコに培養液500 mLを入れてB157株の最適培地及び培養条件の検討を行った。酵素活性測定は基質として卵黄ホスファチジルコリン （PC、4.4 mM 卵黄由来PC in 6.6 mM タウロコール酸Na溶液） を用いて、50 mM PIPES（pH 7.0）と2.5 mM CaCl2を含む反応混合液を用いて、酵素反応（60℃、3時間、pH 7.0）を行い、薄層クロマトグラフィー （TLC） で解析した。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝65：25：4を用い、ヨウ素蒸気発色で可視化、さらにImage Jにより数値化した。
【００１６】
B157株は60℃で単離されたため、当初培養温度60℃で培養条件の検討を行ったところ、X培地、pH 6.4-6.5、10時間振盪培養で酵素活性が最大となった。しかし、培養や活性の再現性が得られにくいため、55℃で再検討することとした。レシチン濃度0%（w/v）、0.05%（w/v）、0.1%（w/v）、0.3%（w/v）、0.5%（w/v）の5条件で培養を行った結果、レシチン濃度0.3%（w/v）と0.5%（w/v）の培養上清に大きな活性が見られ、両者には活性に差がないことを確認したため、培地のレシチン濃度を0.3%（w/v）に決定した。また、培養上清の容量あたり及びタンパク量あたりの比活性は共に培養12時間で最大であった。続いて培養量を100 mLとして培養を行ったところほとんど活性が得られなかったため、培養量を500 mLとした。初発pHの検討ではpH 6.1、pH 6.3、pH 6.5、pH 7.8の4条件で培養を行い酵素活性の比較を行ったところ、pH 6.5の培地で活性が最大であった。また、Ca濃度の検討ではCa濃度0%（w/v）、0.2%（w/v）、0.5%（w/v）の3条件で培養を行ったところCa濃度0.2%（w/v）の培地で最大活性を得た。
【００１７】
上記の通り、B157株を500 mLのX培地 （0.3%（w/v）大豆レシチン、0.2%（w/v） 酵母エキス、0.1%（w/v） カザミノ酸、0.2%（w/v） CaCl2、水道水、pH 6.4-6.5） を含む2 L坂口フラスコで、55℃、12時間の振盪培養での培養上清においてPLA活性が最も高かった。
【００１８】
3.  培養上清を酵素液として用いた位置特異性と基質特異性
B157株の培養上清を酵素液とし、基質としてPCを用いて酵素反応を行った。酵素活性測定は、培養上清を酵素液として、上記２と同様の方法で行った。その結果、経時的にPCが分解・消失し、リゾホスファチジルコリン（LPC）が生成され、さらには、LPCも分解されることが明らかとなった（図２）。この結果は、本酵素が、PLAであることを示唆している。従って、次に、B157株が生産するPLの位置特異性を調査することした。卵黄PCと大豆レシチンでは、sn-1位には飽和脂肪酸が、sn-2位には不飽和脂肪酸が多く存在することが知られている（参考文献8,9, 表１）。
【００１９】
【表１】
2016202052.tif 000002
【００２０】
そこで、卵黄PCと大豆レシチンを基質に用いて、B157株が生産するPLAの位置特異性を調査した。
【００２１】
図３に示す通り、酵素反応１時間では、両基質を用いた場合、飽和脂肪酸のみしか検出できなかった。従って、B157株が生産するPLは、sn-1位に特異性の高いPLA1であることが強く示唆された。酵素反応１８時間で、生成される不飽和脂肪酸は、活性の低いPLA2またはPLB活性、または、脂肪酸側鎖の非酵素的なsn-2位からsn-1位への転移後の加水分解の結果であると考えられるが、詳細については今後検討する必要があるであろう。
【００２２】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）からの脂質抽出液を基質として、酵素反応を行った結果、本酵素は、PCだけでなくて、他のリン脂質や中性脂質も分解することが明らかとなった（図４）。
【００２３】
これらの結果より、B157株の培養上清を酵素液として用いた場合、sn-1位への位置特異性が高いが、基質特異性が広いPLが存在することが示された。しかしながら、PL活性やリパーゼ活性を持つ酵素が複数以上存在する可能性があるため、精製標品を用いて詳細な検討を行う必要があると考えられる。
【００２４】
4.  B157株の分類学的性質
B157株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を1,490bp(配列番号１)決定し、相同性検索を行った。その結果、既知種の中で最も高いTuberibacillus calidus 607T （=DSM 17572T=JCM 13397T） でも相同性が94.8%しかなく、B157株は新属新種である可能性が高いことが判った。さらにB157株の分類学的同定を行うため、本研究ではB157株と607T （=DSM 17572T=JCM 13397T）株の基本培地としてYC培地（0.2%（w/v）酵母エキス、0.6%（w/v） カザミノ酸、0.2%（w/v） NaNO3、0.05%（w/v） KCl、0.05%（w/v） magnesium glycerophosphate、0.001%（w/v） FeSO4、0.035%（w/v） K2SO4、pH 7.0）を用いて55°Cで培養を行った。Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol. 3に基づき（参考文献10）、種々の表現形質を調べ、比較検討した（表２）。
【００２５】
T. calidus 607T （=DSM 17572T=JCM 13397T）は、コンポストより単離された好熱菌であり、Sporolactobacillus科に属する（参考文献11）。B157株および近縁種の系統樹解析は、B157株もSporolactobacillus科に属する新属新種であることが示唆された（図５）。      
【００２６】
B157株が新属新種であることが強く示唆されたため、次に、分類学的性質を調査した。
【００２７】
B157株は、細胞内に、膨潤型胞子をもつ桿菌であり（図６）、グラム陽性の好気性菌であった（表２）。生理学的・生化学的試験の結果からは、T. calidus 607T（=DSM 17572T=JCM 13397T） 株と総じて良く類似するものであったが、異なる一つとして、B157株は硝酸還元活性を持たないことが分かった。また、糖の代謝においても、単糖や糖アルコールの資化性について差がみられた。B157株は、セルビオース（二糖）以外の二糖や多糖類を資化できかなかった。B157株はGC含量が51.5%であり、Tuberibacillus 属細菌の特徴として、ゲノムDNAのGC含量が、46.0-47.3%であり（参考文献11）、B157株は新属新種であることが強く示唆された。図５に示すように、B157株は、Sporolactobacillus科に属することが示唆されたが、好気性で乳酸生産能がないことやB157株以外の菌株のゲノムDNAのGC含量が50%未満であることから（表２）、典型的なSporolactobacillus科細菌とは異なった性質を持っていた。いずれにせよ、B157株は、耐熱性PLA1を生産する新規好熱細菌であることが示された。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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