(57)【要約】      （修正有）【課題】神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及スクリーニングキットの提供。【解決手段】神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニング方法が、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程、を含むスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットであって、前記キットが、ＶＲＫ１を発現している細胞、及び、ＶＲＫ１の機能の抑制を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＶＲＫ１抗体、並びに、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド及び該天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体、から選択される少なくとも１種、を含むキット。【選択図】図２
2016202063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程、
を含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程が、
ＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞に候補物質を投与し、前記ＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞のＶＲＫ１の機能の抑制を測定する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記候補物質を選択する工程が、ＶＲＫ１の機能の抑制に代え、単離したＶＲＫ１と候補物質との結合の有無を指標とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットであって、
前記キットが、
ＶＲＫ１を発現している細胞、及び、
ＶＲＫ１の機能の抑制を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＶＲＫ１抗体、並びに、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド及び該天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体、から選択される少なくとも１種、
を含むキット。
【請求項５】
前記ＶＲＫ１を発現している細胞がＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞である請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記キットが、
酵素活性を有するＶＲＫ１タンパク質、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド、及び該天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体、を含む請求項４に記載のキット。
【請求項７】
神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットであって、
前記キットが、
標識したＶＲＫ１を少なくとも含むキット。
【請求項８】
前記標識したＶＲＫ１に代え、
単離したＶＲＫ１タンパク質、及び候補物質を標識するための標識試薬を少なくとも含む請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットに関する。特に、（１）ＶＲＫ１を発現している細胞、好ましくはＶＲＫ１を強く発現している細胞を用い、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標、又は（２）単離したＶＲＫ１との結合の有無を指標、とした神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は小児がんの一種であり、小児の腹部にできる代表的ながんである。神経芽腫の約２０％の症例においてＭＹＣファミリーに属するＭＹＣＮ遺伝子の増幅（５０−１００コピー）が認められており、このＭＹＣＮ遺伝子の増幅は患者の予後不良と強く相関することが知られている。
【０００３】
ＭＹＣＮ遺伝子を直接ノックダウン等により発現抑制をすると、ガン細胞のみならず正常細胞にも作用してしまう可能性があり、ＭＹＣＮ遺伝子に対して直接作用する薬剤は、副作用を生じるおそれがあると考えられる。そのため、２つの遺伝子の組み合わせで両方に異常があるときにのみ死に至る生命現象である「合成致死」に着目し、治療のための標的となる新たな遺伝子や分子標的の探索をすることが知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２３０１３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経芽腫の治療薬としては、現状では成人がんに対する抗癌剤として開発されたシスプラチンなどが用いられている。ところで、神経芽腫は小児がんという性質上、他の疾患に対する治療薬よりも高い安全性が要求される。そのため、創薬の標的となり得る様々な遺伝子・タンパク質の探索、そして、当該遺伝子・タンパク質を用いた低毒性かつ治療効果の高い分子標的薬の開発が望まれている。
【０００６】
また、上市されている治療薬は、酵素、受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネルなどの限られたクラスの分子種を標的としているケースが多く見られるが、上記特許文献１に記載されているＳｍｃ２やＣＡＰ−Ｄ２等は酵素活性を有するタンパク質ではない。そのため、神経芽腫の治療薬の標的となり得る様々な遺伝子・タンパク質の探索をする際には、創薬標的として好ましい酵素、受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル等に関連する遺伝子・タンパク質を探索することが望ましい。
【０００７】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、ＭＹＣＮ増幅型と単コピー型の二種類の神経芽腫細胞に対して並列で遺伝子ノックダウンスクリーニングを実施することによって、合成致死によりＭＹＣＮ増幅型の細胞増殖を特異的に抑制することのできる指標としてＶＲＫ１（Ｖａｃｃｉｎｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １）を新たに見出した。そして、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標又は単離したＶＲＫ１との結合の有無を指標とすることで、神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングできること、及びスクリーニングするためのキットを提供できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の目的は、神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下に示す、神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットに関する。
【００１０】
（１）神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程、
を含むスクリーニング方法。
（２）前記ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程が、
ＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞に候補物質を投与し、前記ＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞のＶＲＫ１の機能の抑制を測定する、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記候補物質を選択する工程が、ＶＲＫ１の機能の抑制に代え、単離したＶＲＫ１と候補物質との結合の有無を指標とする、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（４）神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットであって、
前記キットが、
ＶＲＫ１を発現している細胞、及び、
ＶＲＫ１の機能の抑制を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＶＲＫ１抗体、並びに、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド及び該天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体、から選択される少なくとも１種、
を含むキット。
（５）前記ＶＲＫ１を発現している細胞がＭＹＣＮ増幅型の神経芽腫細胞である上記（４）に記載のキット。
（６）前記キットが、
酵素活性を有するＶＲＫ１タンパク質、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド、及び該天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体、を含む上記（４）に記載のキット。
（７）神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットであって、
前記キットが、
標識したＶＲＫ１を少なくとも含むキット。
（８）前記標識したＶＲＫ１に代え、
単離したＶＲＫ１タンパク質、及び候補物質を標識するための標識試薬を少なくとも含む上記（７）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標又は単離したＶＲＫ１との結合の有無を指標とすることで、ＭＹＣＮ増幅型の細胞増殖を特異的に抑制（死滅）することのできる分子標的薬をスクリーニングすることが可能となり、また、当該スクリーニングに用いるキットを提供することができる。したがって、神経芽腫を治療する分子標的薬を開発することができる。
【００１２】
また、ＶＲＫ１は創薬標的として好ましい酵素（キナーゼ）であるため、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標とすることで分子標的薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、ＭＹＣＮ単コピー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ）型細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＭＹＣＮ増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）型細胞であるＩＭＲ３２及びＮＢ３９細胞のＶＲＫ１遺伝子をノックダウンした後、３日間放置した時の各細胞の生存率を示すグラフで、図１Ｂは５日間放置した時のＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２の生存率を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２におけるＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２のＶＲＫ１遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３におけるウェスタンブロッティングの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットについて詳しく説明する。
【００１５】
本発明の神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法は、ＭＹＣＮ増幅型の細胞増殖を特異的に抑制（死滅）するが、ＭＹＣＮ単コピー型の細胞には大きな影響を与えないＶＲＫ１に着目している。ＶＲＫ１は、セリン・スレオニンキナーゼの一種であり、これまでの基礎研究からヒストンＨ３やＡＴＦ２などの転写因子をリン酸化することによって細胞周期の進行を制御していることが明らかとなっている。また、天然物化合物ライブラリーからＶＲＫ１阻害剤をスクリーニングした論文（Ｋｉｍ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９（１０），  ｅ１０９６５５，  ２０１４）などが報告されている。しかしながら、ＶＲＫ１の発現抑制がＭＹＣＮ増幅型細胞の合成致死に関与することは、本発明者が初めて見出したものである。
【００１６】
本発明において、「機能の抑制」とはＶＲＫ１の発現自体を抑制することでＶＲＫ１の機能を抑制すること、及びＶＲＫ１は発現するが発現したＶＲＫ１の機能を抑制することを意味する。また、「抑制」とは完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することをも含むことを意味する。なお、ＶＲＫ１の「発現」とは、特に断りのない限り遺伝子及び／又はタンパク質の発現を意味する。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標として候補物質を選択する工程を含んでいる。候補物質としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
【００１８】
ＶＲＫ１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７４４３の遺伝子情報、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３３８４．２に記載のｍＲＮＡ、及びＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００３３７５．１に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法は、ＶＲＫ１の機能の抑制をすることができるか否かを、直接又は間接的に検出しうる系に候補物質を接触させ、接触前後のＶＲＫ１の機能の変化を検出できれば特に制限は無い。例えば、ＶＲＫ１が発現している細胞に候補物質を接触させ、次いで、ＶＲＫ１の機能の抑制を測定すればよい。
【００２０】
ＶＲＫ１が強く発現している細胞としては、ＩＭＲ３２、ＮＢ３９、ＴＮＢ１、ＬＡ−Ｎ−１等のＭＹＣＮ増幅型の細胞が挙げられる。また、ＶＲＫ１が発現している細胞としては、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＨ−ＥＰ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ等のＭＹＣＮ単コピー型の細胞；ＶＲＫ１遺伝子を形質転換した細胞、等が挙げられる。また、ＶＲＫ１が発現している細胞に代え、単離したＶＲＫ１に候補物質を接触させ結合の有無を検出してもよい。なお、候補物質のスクリーニングの観点からは、前記のＭＹＣＮ増幅型の細胞、ＭＹＣＮ単コピー型の細胞、ＶＲＫ１遺伝子を形質転換した細胞、単離したＶＲＫ１の何れでも問題は無いが、ＭＹＣＮ増幅型の細胞を用いるとＶＲＫ１の機能の抑制に加え最終的に細胞の死滅も確認できることから好ましい。
【００２１】
ＶＲＫ１の機能の抑制の検出方法（発現の抑制）としては、例えば、ｍＲＮＡやタンパク質の定量が挙げられる。ｍＲＮＡは定量的ＰＣＲ法によって定量することができ、定量的ＰＣＲ法としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＴ-ＰＣＲ法等、公知の方法を用いることができる。また、タンパク質の定量は、抗ＶＲＫ１抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、ウェスタンブロット（ＷＢ）、免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法、ＬＣ−ＭＳ等の公知の方法を用いることができる。また、単離したＶＲＫ１と候補物質との結合の有無の検出方法も公知の方法を用いることができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＶＲＫ１又は候補物質に標識を付けて結合の有無を検出する方法が挙げられる。
【００２２】
ＶＲＫ１の機能の抑制の検出方法（発現したＶＲＫ１の機能の抑制）としては、精製したＶＲＫ１酵素を用いてもよいし、ＶＲＫ１が発現している細胞を用いてもよい。精製したＶＲＫ１酵素を用いる場合は、先ず、酵素活性を有するＶＲＫ１タンパク質とＶＲＫ１の基質となることが明らかとなっているタンパク質、例えばヒストンＨ３のリン酸化部位付近のアミノ酸配列からなる合成ペプチドを混合する。次に、ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいは時間分解ＦＲＥＴ法等を用いてＶＲＫ１によるリン酸化反応を検出する。この系を用いて候補物質のＶＲＫ１の機能の抑制を検出することができる。なお、酵素活性を有するＶＲＫ１タンパク質は市販されているものを用いればよい。また、ＶＲＫ１の基質は上記のとおり合成ペプチドを用いると効率的であるが、天然ペプチドを用いてもよい。
【００２３】
ＶＲＫ１が発現している細胞を用いる場合は、先ず、ＶＲＫ１を発現している細胞に候補物質を処理し、細胞抽出液を用いたＷＢによってＶＲＫ１の基質となることが明らかとなっているタンパク質、例えばヒストンＨ３のリン酸化部位を特異的に認識する抗体を用いてＶＲＫ１によるリン酸化反応を検出する。あるいは細胞を固定してＶＲＫ１の基質となることが明らかとなっているタンパク質に対するリン酸化抗体を用いてフローサイトメトリーなどの手法によってリン酸化を受けている割合の高い細胞集団を同定、定量化する。これらの系を用いて候補物質のＶＲＫ１の機能抑制を検出することができる。なお、上記と同様、ＶＲＫ１の基質は天然ペプチドを用いてもよい。
【００２４】
後述する実施例のとおり、ＶＲＫ１の機能を抑制することでＭＹＣＮ増幅型の細胞を効果的に死滅できたことから、ＶＲＫ１遺伝子を検出可能なＰＣＲプライマー、ＶＲＫ１タンパク質を検出可能な抗体、ＶＲＫ１に特異的な基質等を含んだＶＲＫ１の機能を抑制するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットを提供することができる。
【００２５】
ＶＲＫ１遺伝子を検出するキットの場合、ＶＲＫ１を発現している細胞、ＶＲＫ１遺伝子の発現量を定量可能なＰＣＲプライマーセットの他に、定量に最適な酵素、試薬等を含んだ構成とすることができる。プライマーはＶＲＫ１を定量的に測定することができれば、どのような配列を用いてもよい。また、発現量を正規化するために、ＧＡＰＤＨを増幅するプライマーのようなコントロールプライマーを含めてもよい。
【００２６】
ＶＲＫ１タンパク質を検出するキットの場合は、ＶＲＫ１を発現している細胞、ＶＲＫ１タンパク質を検出するための抗体の他、アプタマー等のＶＲＫ１タンパク質と結合する分子、検出に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００２７】
精製したＶＲＫ１酵素を用いて発現したＶＲＫ１の機能の抑制を検出するキットの場合は、酵素活性を有するＶＲＫ１タンパク質、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド、天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体の他、検出に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００２８】
ＶＲＫ１を発現している細胞を用いて発現したＶＲＫ１の機能の抑制を検出するキットの場合は、ＶＲＫ１を発現している細胞、ＶＲＫ１の基質となる天然又は合成ペプチド、天然又は合成ペプチド上のリン酸化部位を特異的に認識する抗体の他、検出に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００２９】
また、単離したＶＲＫ１タンパク質と候補物質との結合の有無を検出する場合は、単離したＶＲＫ１、及びＶＲＫ１と候補物質との結合を検出するための試薬を少なくとも含んでいればよい。例えば、
（１）蛍光物質、酵素等で標識した標識ＶＲＫ１タンパク質、及び必要に応じて標識したＶＲＫ１を検出するための試薬、又は、
（２）候補物質を標識するための蛍光、酵素等の標識試薬、単離したＶＲＫ１タンパク質、更に必要に応じて標識を検出するための試薬、
を含んだ構成とすればよい。
【００３０】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３１】
〔合成致死によりＭＹＣＮ増幅型の細胞増殖を特異的に抑制する遺伝子の探索〕
ＭＹＣＮ増幅型の細胞であるＩＭＲ３２は、独立行政法人  医薬基盤研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手した。ＭＹＣＮ単コピー型の細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙは、イタリアのＦＩＲＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙから入手した。ＩＭＲ３２及びＳＨ−ＳＹ５ＹをゲノムワイドｓｈＲＮＡライブラリー（ＳＩＧＭＡ社製：ＳＨＰＨ０１）により網羅的に遺伝子をノックダウンした。次いで、次世代シークエンス技術（ＮＧＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、ＭＹＣＮ増幅型の細胞であるＩＭＲ３２は細胞死する、あるいは細胞増殖が抑制されるが、ＭＹＣＮ単コピー型の細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙの生存には大きな影響を与えない遺伝子の探索を行った結果、候補遺伝子としてＶＲＫ１を選択した。
【００３２】
〔ヒト神経芽腫細胞内におけるＶＲＫ１遺伝子のノックダウンと細胞生存率の測定〕
＜実施例１＞
選択したＶＲＫ１の発現を抑制することで、ＭＹＣＮ増幅型の細胞を合成致死することができるのか、以下の手順により確認を行った。
【００３３】
（１）細胞株及び試薬
・ＮＢ３９：東北大学加齢医学研究所の医用細胞資源センターから入手した。
・ＶＲＫ１に対するｓｉＲＮＡ：Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＨＳＳ１１１３０８）
・ｓｉＲＮＡ導入試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１３７７８１５０）
・ｓｉＲＮＡ希釈用培地：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３１９８５−０７０）
・ＩＭＲ３２用培地：ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ４６５５）
・ＳＨ−ＳＹ５Ｙ用培地：ＭＥＭ＋Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）    ※Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１７６５−０５４）
・ＮＢ３９用培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｒ８７５８）
・ＦＢＳ：Ｂｉｏｓｅｒａ，５１５−９９０５５
・組織培養用プレート：６  ｗｅｌｌ（ＩＷＡＫＩ，３８１０−００６）
・蛍光試薬：Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｒ７０１７）
【００３４】
（２）実験方法
（ａ）ｓｉＲＮＡの希釈、ｓｉＲＮＡ導入試薬との複合体形成
先ず、６  ｗｅｌｌの組織培養用プレートの各々のｗｅｌｌに、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを５００μｌ加えた。次に、各々のｗｅｌｌに５μＭのｓｉＲＮＡを２μｌ加え、更に、各々のｗｅｌｌにｓｉＲＮＡ導入用試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ）を４μｌ加えた。試薬の添加後、プレートを室温で１５分間放置した。
（ｂ）細胞の準備、ＶＲＫ１遺伝子のノックダウン
ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＭＹＣＮ単コピー型）、ＩＭＲ３２（ＭＹＣＮ増幅型）、ＮＢ３９（ＭＹＣＮ増幅型）を、それぞれの適合培地中（１０％ＦＢＳ含有）で、０．０８×１０6  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製した。
次に、上記（ａ）で準備したＶＲＫ１に対するｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ導入試薬を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭに対して、０．０８×１０6  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞懸濁液を２．５ｍｌずつ加えた。組織培養用プレートをＣＯ2インキュベーター内で７２時間（３日間）放置した。また、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２については、１２０時間（５日間）放置したものも実施した。
（ｃ）細胞生存率の測定
Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔをリン酸緩衝生理食塩水に溶かして１２００μＭの溶液を調製した。次に、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ溶液を６  ｗｅｌｌの組織培養用プレートの各々のｗｅｌｌに６００μｌずつ加えた後、組織培養用プレートをＣＯ2インキュベーター内で１時間放置した。次に、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ溶液と培地の混合物を１２０μｌずつ取り、ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ４（ＤＳ  ＰＨＡＲＭＡ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ）を用い、励起波長５６０ｎｍ、検出波長５９０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。生存細胞ではＲｅｓａｚｕｒｉｎが蛍光物質に変換されることから、蛍光強度は生存細胞数に比例する。測定した蛍光強度から、細胞生存率を求めた。
【００３５】
図１Ａは、ＭＹＣＮ単コピー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ）型細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＭＹＣＮ増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）型細胞であるＩＭＲ３２及びＮＢ３９細胞のＶＲＫ１遺伝子をノックダウンした後、３日間放置した時の各細胞の生存率を示すグラフで、図１Ｂは５日間放置した時のＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２の生存率を示すグラフである。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ＶＲＫ１をノックダウンすることで、ＭＹＣＮ増幅型の細胞の生存率を下げることができた。また、図１Ａ及び図１ＢのＩＭＲ３２の生存率から、ＶＲＫ１をノックダウンしても直ぐに細胞が死滅するのではなく、時間をかけて徐々に死滅することが明らかとなった。
【００３６】
なお、ＭＹＣＮ単コピー型のＳＨ−ＳＹ５ＹでもＶＲＫ１をノックダウンすることで細胞の死滅が確認できた。ＶＲＫ１は活発に増殖する細胞では発現しており、細胞周期の進行において何らかの役割を果たしていると考えられるので、ＶＲＫ１抑制によってＭＹＣＮ単コピー型のＳＨ−ＳＹ５Ｙに多少なりとも影響が出たと考えられる。また、ＭＹＣＮ増幅型の細胞の生存率が０％にならなかった理由は、細胞培養時間が７２〜１２０時間ではＶＲＫ１をノックダウンしても死滅するに至らなかった細胞もある、また、ｓｉＶＲＫ１がトランスフェクションしなかった細胞があったためと考えられる。以上の結果より、ＶＲＫ１が合成致死によりＭＹＣＮ増幅型の細胞増殖を特異的に抑制する指標となり得ることが明らかとなった。
【００３７】
〔ヒト神経芽腫細胞内におけるＶＲＫ１遺伝子のノックダウンと遺伝子発現量の測定〕
＜実施例２＞
次に、ヒト神経芽腫細胞内におけるＶＲＫ１遺伝子をノックダウンした際の遺伝子発現量を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。
【００３８】
（１）試薬等
・ＲＮＡ精製試薬：ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ，３１１−０２５０１）
・ｃＤＮＡ合成試薬：ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ，  ＦＳＱ−３０１）
・ｒＰＣＲ用試薬：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  （ＴＯＹＯＢＯ，  ＱＰＳ−２０１）
なお、実施例２の実験方法に用いる細胞株及び試薬に関し、上記以外は実施例１と同様である。
【００３９】
（２）実験方法
細胞株としてＳＨ−ＳＹ５ＹとＩＭＲ３２のみを用いた以外は、実施例１の（２）実験方法の（ａ）及び（ｂ）と同様の手順で細胞のＶＲＫ１遺伝子のノックダウンを行った。
次に、１  ｗｅｌｌあたり５００μｌのＩＳＯＧＥＮを加えて細胞を溶解し、マニュアルに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒを用いて０．５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡサンプルをテンプレートとしてＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用いてリアルタイムＰＣＲを実施し、コントロールサンプルに対するｓｉＶＲＫ１サンプルの遺伝子量を算出した。測定機器はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭｘ３００５Ｐを用いた。遺伝子検出用のプライマー配列は以下の通り。
ＶＲＫ１＿Ｆｗ：  ５’−ＧＣＣＴＣＧＴＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣ（配列番号：１）
ＶＲＫ１＿Ｒｖ：  ５’−ＧＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＧＡＣ（配列番号：２）
ＧＡＰＤＨ＿Ｆｗ：  ５’−ＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＧ（配列番号：３）
ＧＡＰＤＨ＿Ｒｖ：  ５’−ＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号：４）
【００４０】
図２は、実施例２におけるＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２のＶＲＫ１遺伝子の発現量を示すグラフである。図２に示すように、コントロール（ｓｉＮＣ）と比較して、ｓｉＶＲＫ１をトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２では、何れもＶＲＫ１遺伝子の発現が抑制されていたことが明らかとなった。
【００４１】
〔ヒト神経芽腫細胞内におけるＶＲＫ１遺伝子のノックダウンとタンパク質量の測定〕
＜実施例３＞
次に、ヒト神経芽腫細胞内におけるＶＲＫ１遺伝子をノックダウンした際のＶＲＫ１のタンパク質量を、ウェスタンブロット法を用いて測定した。
【００４２】
（１）試薬等
・ＮＥＴ−Ｎバッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．０，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  ＮＰ−４０
・タンパク質濃度測定キット：Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２５）
なお、実施例３の実験方法に用いる細胞株及び試薬に関し、上記以外は実施例１及び２と同様である。
【００４３】
（２）実験方法
実施例２と同様の手順で、細胞のＶＲＫ１遺伝子のノックダウンを行った。次に、回収した細胞をＮＥＴ−Ｎバッファーに溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いてタンパク質濃度を測定した。１０％ポリアクリルアミドゲルの１  ｗｅｌｌあたりの総タンパク質量が１０μｇとなるようにして電気泳動を行った。抗体として、
・Ａｎｔｉ−ＶＲＫ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＳＩＧＭＡ，ＨＰＡ０００６６０
・Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−・−Ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＳＩＧＭＡ，Ａ５４４１
を用い、定法によりウェスタンブロッティングを行った。また、コントロールとしてβ―ａｃｔｉｎを用いた。
次に、イメージアナライザー  ＬＡＳ−４０１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られた画像のバンド強度を付属のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬにより定量化した。
【００４４】
図３は、実施例３におけるウェスタンブロッティングの結果を示している。図３から明らかなように、コントロール（ｓｉＮＣ）と比較して、ｓｉＶＲＫ１をトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＩＭＲ３２では、何れもＶＲＫ１タンパク質量が約半減していた。
【００４５】
上記実施例１〜３の結果より、ＶＲＫ１の発現を抑制することで、ＭＹＣＮ増幅型の細胞のみを特異的に死滅できることが明らかとなった。したがって、ＶＲＫ１の機能の抑制を指標とすることで、神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニングをすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の神経芽腫を治療するための分子標的薬のスクリーニング方法、及び神経芽腫を治療するための分子標的薬をスクリーニングするためのキットを用いることで、神経芽腫を特異的に抑制できる分子標的薬をスクリーニングすることができる。したがって、創薬産業にとって有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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