(57)【要約】【課題】溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、溶血した試料であっても、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を正確に測定することが出来る測定試薬及び測定方法を提供する。【解決手段】アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬中にキレート剤及び亜鉛イオンを存在させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性ホスファターゼの基質、アルカリ性緩衝液を含む試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有することを特徴とする、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項２】
アルカリ性緩衝液が２−エチルアミノエタノールである、請求項１記載の試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項３】
キレート剤及び亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、請求項１又は２に記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項４】
アルカリ性ホスファターゼの基質、アルカリ性緩衝液を含む試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬と試料を混合し、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法。
【請求項５】
キレート剤及び亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、請求項４記載の試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法。
【請求項６】
４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法において、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を回避する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定するための試薬及び方法に関するものであり、アルカリ性ホスファターゼ活性の測定におけるヘモグロビンの影響を回避するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
アルカリ性ホスファターゼ（以下ＡＬＰと略すこともある）は、アルカリ性下で、基質であるリン酸エステルから無機リンを遊離させる酵素であり、肝臓、腎臓、骨、小腸、胎盤等に高濃度に存在している。血液等の試料中のＡＬＰ活性を測定し、その変動を見ることは、肝疾患、胆道系疾患、骨疾患等の診断、治療、早期発見や予防に不可欠であり、広く実施されている。
この試料中のＡＬＰ活性の測定方法としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸等を基質とする比色測定法が一般的である。
【０００３】
ところで、これらのＡＬＰ活性の比色測定法では、溶血作用により生成したヘモグロビン等の色素により測定値に影響を受けるという問題があった。すなわち、ヘモグロビンが試料中に含まれていると、測定中にそれが分解して、測定波長域における吸光度の経時的な減少を引き起こし、ＡＬＰ活性測定の波長域での吸光度の増加速度を低下させてしまい、負の誤差が生じて、正確な測定値が得られないという問題があった。
【０００４】
そこで、溶血作用により生成したヘモグロビンが測定中に分解するのを防止するため、酵素活性測定試薬にチオ尿素を含有させる方法（例えば、特許文献１参照。）や、ピリジン類、イミダゾール類、ヒスタミン類を含有させる方法（例えば、特許文献２参照。）等が提案されているが、必ずしも完全とは言えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１２９９８号公報
【特許文献２】特公平３−５６４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のように従来の試料中のＡＬＰ活性の測定試薬及び測定方法は、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を受け、測定値に負誤差を生じてしまうという問題があった。このため、例えば、医療の場における臨床検査において、試料中のＡＬＰ活性の測定値を診断に利用しようとする場合、疾患等の診断を誤らせる可能性があった。
【０００７】
従って、本発明の課題は、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、溶血した試料であっても、試料中のＡＬＰ活性を正確に測定することが出来る測定試薬及び測定方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ヘモグロビンの影響を回避する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ＡＬＰ活性測定試薬中にキレート剤及び亜鉛イオンを存在させると上記課題を解決できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  アルカリ性ホスファターゼの基質、アルカリ性緩衝液を含む試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有することを特徴とする、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（２）  アルカリ性緩衝液が２−エチルアミノエタノールである、前記（１）記載の試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（３）  キレート剤及び亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、前記（１）又は（２）に記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（４）  アルカリ性ホスファターゼの基質、アルカリ性緩衝液を含む試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬と試料を混合し、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法。
（５）  キレート剤及び亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、前記（４）記載の試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法。
（６）  ４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法において、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を回避する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、試料中のＡＬＰ活性測定試薬及び測定方法において、ＡＬＰ活性測定試薬中にキレート剤及び亜鉛イオンを含有させることにより、ヘモグロビンの影響を回避し、測定値に誤差が生じるのを防ぐことができるものである。
【００１１】
すなわち、本発明の試料中のＡＬＰ活性の測定試薬、測定方法、及びヘモグロビンの影響を回避する方法においては、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を受けずに、正確な測定値を得ることができるものである。
【００１２】
これにより、本発明の試料中のＡＬＰ活性測定試薬、測定方法、及びヘモグロビンの影響を回避する方法は、例えば、医療の場において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
【００１４】
〔１〕アルカリ性ホスファターゼの基質
本発明において、ＡＬＰの基質としては、グリセロリン酸、４−ニトロフェニルリン酸、フェニルリン酸等のリン酸エステルを使用することができる。
【００１５】
〔２〕アルカリ性緩衝液
本発明におけるアルカリ性緩衝液としては、ＡＬＰの至適ｐＨ域である、ｐＨ７〜１４、特にｐＨ１０付近に緩衝能を有する、従来公知のアルカリ性緩衝液を使用することができる。
【００１６】
このようなアルカリ性緩衝液として使用できるものとしては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）等を挙げることができる。
【００１７】
また、本発明においては、アルカリ性緩衝液が、特に、２−エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）であることが好ましい。
【００１８】
〔３〕キレート剤
本発明においては、ＡＬＰ活性測定試薬にキレート剤を含有させる。この測定試薬に含有させるキレート剤とは、金属イオンに配位する多座配位子であって、金属イオンへの配位により金属を含んだ環状構造（キレート環）を形成する有機化合物をいう。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレン（トリアミン）五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンビスメチレンホスホン酸（ＥＤＤＰＯ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等及びその塩が挙げられる。
【００１９】
また、本発明においては、キレート剤が、特に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）であることが好ましい。
【００２０】
本発明において、溶血した試料における負誤差を回避するために、ＡＬＰ活性測定試薬に含有させるキレート剤の濃度は、特に限定されないが、溶血した試料における負誤差の発生を抑制する効果からすると、１ｍＭ以上であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明のＡＬＰ活性測定試薬において、測定試薬が１試薬よりなる場合には、測定試薬に含有させるキレート剤の濃度は、上記の範囲のものとすればよく、測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬よりなる場合には、この第１試薬及び第２試薬を試料中のＡＬＰ活性を測定する際の各々の添加量の比で混合した際に、この混合後の測定試薬中のキレート剤の濃度が上記の範囲となるように、キレート剤を第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有させればよい。
また、混合後の測定試薬中のキレート剤の濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、キレート剤は第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
なお、測定試薬が３試薬以上の試薬から構成される場合も同様である。
【００２２】
〔４〕亜鉛イオン
本発明においては、ＡＬＰ活性測定試薬に亜鉛イオンを含有させる。この測定試薬に含有させる亜鉛イオンとしては、亜鉛イオンであればどのようなものでもよい。例えば、亜鉛イオンを含む化合物を用いることができる。
具体的には、亜鉛イオンと酸基よりなる化合物、亜鉛イオンの水酸化物、亜鉛イオンの塩等を挙げることができる。
より具体的には、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛、又は塩化亜鉛等の亜鉛塩等を挙げることができる。
【００２３】
本発明において、溶血した試料における負誤差を回避するために、ＡＬＰ活性測定試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度は、特に限定されないが、溶血した試料における負誤差の発生を抑制する効果からすると、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【００２４】
また、本発明においては、ＡＬＰ活性測定試薬に含有させるキレート剤の濃度に応じて、亜鉛イオンの濃度を変化させることができる。この場合、例えば、キレート剤に対し当量比で０．１〜１．０倍となるように亜鉛イオンの濃度を調整することが好ましく、０．４〜０．９倍であることが特に好ましい。
【００２５】
また、本発明のＡＬＰ活性測定試薬において、測定試薬が１試薬よりなる場合には、測定試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度は、上記の範囲のものとすればよく、測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬よりなる場合には、この第１試薬及び第２試薬を試料中のＡＬＰ活性を測定する際の各々の添加量の比で混合した際に、この混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度が上記の範囲となるように、亜鉛イオンを第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有させればよい。
また、混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、亜鉛イオンは第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
なお、測定試薬が３試薬以上の試薬から構成される場合も同様である。
【００２６】
なお、本発明においてキレート剤及び亜鉛イオンをＡＬＰ活性測定試薬に存在させる方法であるが、少なくとも試料と試薬成分との酵素反応が行われる測定反応時に、キレート剤及び亜鉛イオンを存在させることにより、溶血作用により生成したヘモグロビンによる影響を抑制することができる。
従って、本発明のＡＬＰ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンは少なくとも第１試薬または第２試薬のうちいずれかに含有させればよく、第１試薬と第２試薬の両方に含有させることもできる。なお、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を抑制するためには、キレート剤及び亜鉛イオンが第１試薬に含有されていることが好ましい。なお、前述したとおりキレート剤及び亜鉛イオンは、少なくとも試料と試薬成分との酵素反応が行われる測定反応時に存在させる必要があるので、第１試薬にキレート剤を含有させ、第２試薬に亜鉛イオンを含有させることもできるし、第１試薬に亜鉛イオンを、第２試薬にキレート剤を含有させることもできる。
【００２７】
ところで、本発明においては、ＡＬＰ活性測定試薬中の濃度、又は第１試薬、第２試薬等の測定試薬を構成する試薬の混合後の測定試薬中での濃度で、キレート剤及び亜鉛イオンの濃度を規定しているが、これをＡＬＰ活性測定試薬と試料の混合後の濃度、又は第１試薬、第２試薬等の測定試薬を構成する試薬と試料の混合後の濃度、つまりＡＬＰ活性測定反応の最終反応液中の濃度に置き換えても支障はない。
【００２８】
それは、現在行われている試料中のＡＬＰ活性の測定において、試料の添加量をＡＬＰ活性測定試薬の添加量で割った時の比率は、測定試薬の添加量に対する試料の添加量が大変小さいため通常１〜５％の範囲内に収まるものであり、試料の添加量を考慮してもしなくても大差はないからである。
【００２９】
また、本発明においては、ＡＬＰ活性測定試薬にキレート剤及び亜鉛イオンの両方が存在していること（すなわち、試料と試薬成分との酵素反応が行われる測定反応時に、キレート剤及び亜鉛イオンの両方が存在していること）が必要となる。後に実施例で示す通り、ＡＬＰ活性測定試薬に亜鉛イオンのみが存在している場合、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じ、試薬中の硫酸亜鉛濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が急激に下降してしまい、正確な測定結果（測定値）を得ることができない。しかしながら、ＡＬＰ活性測定試薬にキレート剤及び亜鉛イオンの両方が存在している場合には、ＡＬＰの活性測定値の負誤差は殆ど生じず正確な測定結果（測定値）を得ることができる。
すなわち、本発明は、測定試料や測定試薬の原料中に不純物として含まれていた亜鉛イオンが測定反応時に混入することによる、ＡＬＰ活性測定値への負誤差についても、これを抑制することができるものである。
【００３０】
また、本発明はＡＬＰのアイソザイムの活性測定に用いることもできる。
この場合、例えば特定のアイソザイムを阻害する抗体等の阻害剤を試料中のＡＬＰに作用させ、ＡＬＰ活性を測定することにより行うことができる。
【００３１】
〔５〕アルカリ性ホスファターゼ活性測定時のｐＨ
本発明において、ＡＬＰ活性測定時のｐＨは特に限定されないが、ＡＬＰ活性測定時の反応が進む至適ｐＨ域である、ｐＨ７〜１４近辺にすることが好ましい。
【００３２】
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記「〔２〕アルカリ性緩衝液」に記載したアルカリ性緩衝液を適宜使用することができる。
【００３３】
〔６〕試料
本発明において、試料とは、試料中のＡＬＰ活性の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等の抽出液等が挙げられる。
【００３４】
〔７〕アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬
本発明の試料中のＡＬＰ活性測定試薬は、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させることを特徴とするものである。これにより、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、試料中のＡＬＰ活性を正確に測定することができる。
なお、本発明のＡＬＰ活性測定試薬においては、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させること以外は、従来より公知の試料中のＡＬＰ活性を測定する試薬に従えばよい。
【００３５】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよい。
【００３６】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
【００３７】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬においては、前記した成分の他に、測定反応に使用する成分として、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００３８】
また、ＡＬＰが十分な活性を示すためにはマグネシウムイオンが必要であるので、ＡＬＰ活性測定試薬における混合液（最終反応液）には０．２ｍＭ以上、好ましくは０．５ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含有させる必要がある。この条件が満たされる限り、第１試薬及び／又は第２試薬にマグネシウムイオンを含有させる濃度は特に制限されるものではなく、適宜選択すればよい。
【００３９】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【００４０】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
【００４１】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のＡＬＰ活性の測定に使用することができる。
【００４２】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することもできる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【００４３】
また、この本発明のＡＬＰ活性測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
【００４４】
また、本発明のＡＬＰ活性測定試薬の構成としては、例えば、第１試薬にアルカリ性緩衝液を含み、第２試薬にアルカリ性緩衝液と４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含む構成のもの、第１試薬にアルカリ性緩衝液を含み、第２試薬に４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含む構成のもの、又は、第１試薬に４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含み、第２試薬にアルカリ性緩衝液を含む構成のもの等を挙げることができる。
【００４５】
〔８〕アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法
本発明の試料中のＡＬＰ活性測定方法においては、キレート剤及び亜鉛イオンを含有するＡＬＰ活性測定試薬と試料を混合し、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下でＡＬＰの酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定すること以外は、従来より公知のＡＬＰ活性測定方法に従えばよい。
また、本発明の試料中のＡＬＰ活性測定方法は、１ステップ法（１試薬系）からなるものでもよく、複数ステップ法（複数試薬系）からなるものであってもよい。
【００４６】
本発明の試料中のＡＬＰ活性測定方法は、ＡＬＰが基質と反応して生成する物又はこの生成物より導かれる物質の生成速度を４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度の１分間当たりの変化量より算出するか、ＡＬＰが基質と反応して生成する物又はこの生成物より導かれる物質の生成量を４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測ることにより求める測定原理のものであれば、いかなる方法にも用いることができる。例えば、反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）に適用できる。
このような測定方法において、それ自体公知の方法によって、用手法又は自動分析装置による方法によりＡＬＰ活性を測定することができる。
【００４７】
例えば、４−ニトロフェニルリン酸等の基質にＡＬＰが作用して遊離してくる４−ニトロフェノール等の４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を経時的に測定して、その吸光度の増加よりＡＬＰ活性を算出する。
この場合、本発明によれば、試料中のヘモグロビンの分解により生じる誤差を抑制することができる。
【００４８】
〔９〕ヘモグロビンの影響を回避する方法
本発明における、ヘモグロビンの影響を回避する方法は、試料中のＡＬＰ活性の測定方法において、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で測定を行うことによるものである。
この試料中のＡＬＰ活性の測定方法において、キレート剤及び亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、溶血作用によって試料中にヘモグロビンが混在している場合であっても、このヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高いＡＬＰ活性の測定値を得ることができる。
また、本発明における溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避する方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５０】
〔実施例１〕
（ヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するＡＬＰ活性測定試薬を調製し、この第１試薬にキレート剤及び亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００５１】
１．試薬の調製
【００５２】
（１）本発明・ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる１１種類の本発明・ＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００５３】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）  １．０ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｍM、０．１３ｍM、０．２５ｍM、０．３８ｍM、０．５１ｍM、０．６３ｍM、０．７６ｍM、０．８９ｍM、１．０１ｍM、１．１４ｍＭ又は１．２７ｍＭ
【００５４】
なお、上記の１１種類の本発明・ＡＬＰ第１試薬と、上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍM、０．１ｍM、０．２ｍM、０．３ｍM、０．４ｍM、０．５ｍM、０．６ｍM、０．７ｍM、０．８ｍM、０．９ｍＭ又は１．０ｍＭ
【００５５】
（２）対照・ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる５種類の対照・ＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００５６】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｍM、０．１３ｍM、０．２５ｍM、０．３８ｍM、又は０．５１ｍM
【００５７】
なお、上記の５種類の対照・ＡＬＰ第１試薬と、上記のＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍM、０．１ｍM、０．２ｍM、０．３ｍM、又は０．４ｍM
【００５８】
（３）ＡＬＰ第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、ＡＬＰ第２試薬を調製した。
【００５９】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩  ７５．７５ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
【００６０】
２．試料の調製
ヒト血清試料の９容と、ヘモグロビンを含まない水溶液、干渉チェックＡプラスＨｂ〔シスメックス社製〕又はヒト赤血球を溶血させて調製したヘモグロビン濃度が、５０００ｍｇ／ｄＬの水溶液の１容をそれぞれ混合して、ヘモグロビン濃度が各々０、１００、２００、３００、４００、又は５００ｍｇ／ｄＬである血清試料を調製した。
【００６１】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定は日立製作所社製７１８０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料２．５μＬに第１試薬として本発明・ＡＬＰ第１試薬を１６０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬としてＡＬＰ第２試薬を４０μＬ添加し混合液（最終反応液）とし、３７℃で反応を行わせ、第２試薬添加１分１０秒目（２１ポイント）から５分目（３４ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリホスファターゼ活性値の算出を行った。
また、第１試薬を前記１の（２）で調製した対照・ＡＬＰ第１試薬に変えて同様に測定を行った。
【００６２】
なお、本発明においては、酵素キャリブレータ（Ａａｌｔｏ ＥＣ；シノテスト社製）を用いて検量及び校正を行い、アルカリホスファターゼ活性値を算出した。
【００６３】
４．測定結果
測定の結果を表１に示す。
なお、表１において、かっこ内の数値は、各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｍM）を示す。
【００６４】
【表１】
2016073217.tif 000002
【００６５】
５．考察
表１から明らかなように、第１試薬にＥＤＴＡ（キレート剤）を含有させていない対照・ＡＬＰ第１試薬を用いた場合は、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じており、試薬中の硫酸亜鉛濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が急激に下降していることが分かる。更に、ＡＬＰの活性測定値は、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて下降しており、負誤差の程度が更に大きくなっていることが分かる。
すなわち、ＡＬＰ活性測定試薬に亜鉛イオンのみを存在させた場合には、溶血した試料において、ヘモグロビンによるＡＬＰの活性測定値への負誤差が生じることを回避することはできず、正確な測定結果（測定値）を得ることができないものであることが分かる。
【００６６】
これに対して、第１試薬にＥＤＴＡ（キレート剤）及び硫酸亜鉛（亜鉛イオン）の両方を含有させた本発明・ＡＬＰ第１試薬を用いた場合は、ＡＬＰの活性測定値の負誤差は殆ど生じていないことが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなっても、ＡＬＰの活性測定値の下降が生じず、負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できていることが分かる。
【００６７】
これらのことより、試料中のＡＬＰ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高いＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明のＡＬＰ活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確なＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
【００６８】
〔実施例２〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬にキレート剤及び亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００６９】
１．試薬の調製
【００７０】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる９種類のＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００７１】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）  １．０ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｍM、０．１３ｍM、０．２５ｍM、０．３８ｍM、０．５１ｍM、０．６３ｍM、０．７６ｍM、０．８９ｍM又は１．０１ｍM
【００７２】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
前記実施例１の１の（３）で調製したＡＬＰ第２試薬を、第２試薬として用いた。
【００７３】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【００７４】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製した９種類のＡＬＰ第１試薬、及びＡＬＰ第２試薬にて前記実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００７５】
なお、上記の９種類のＡＬＰ第１試薬と、上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍM、０．１ｍM、０．２ｍM、０．３ｍM、０．４ｍM、０．５ｍM、０．６ｍM、０．７ｍM又は０．８ｍM
【００７６】
４．測定結果
測定の結果を表２に示す。
なお、表２において、かっこ内の数値は、９種類の各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｍＭ）を示す。
【００７７】
【表２】
2016073217.tif 000003
【００７８】
５．考察
表２から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第１試薬にＨＥＤＴＡ（キレート剤）及び硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、ＡＬＰの活性測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【００７９】
これらのことより、試料中のＡＬＰ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高いＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明のＡＬＰ活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確なＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
【００８０】
〔実施例３〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００８１】
１．試薬の調製
【００８２】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる１５種類のＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００８３】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  １．１４０ｍＭ
Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）  ２．０ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｍM、０．６３ｍM、０．７６ｍM、０．８９ｍM、１．０１ｍM、１．１４ｍＭ、１．２７ｍＭ、１．３９ｍM、１．５２ｍM、１．６５ｍM、１．７８ｍM、１．９１ｍM、２．０３ｍＭ又は２．１６ｍＭ
【００８４】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、ＡＬＰ第２試薬を調製した。
【００８５】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩  ７５．７５ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
【００８６】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【００８７】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製した１４種類のＡＬＰ第１試薬、及びＡＬＰ第２試薬にて前記実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００８８】
なお、上記の１４種類のＡＬＰ第１試薬と、上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍM、０．５ｍM、０．６ｍM、０．７ｍM、０．８ｍM、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍM、１．２ｍM、１．３ｍM、１．４ｍM、１．５ｍM、１．６ｍM又は１．７ｍM
【００８９】
４．測定結果
測定の結果を表３に示す。
なお、表３において、かっこ内の数値は、１４種類の各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｍＭ）を示す。
【００９０】
【表３】
2016073217.tif 000004
【００９１】
５．考察
表３から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第１試薬にＨＥＤＴＡ（キレート剤）及び硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【００９２】
これらのことより、試料中のＡＬＰ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高いＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明のＡＬＰ活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確なＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
【００９３】
〔実施例４〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００９４】
１．試薬の調製
【００９５】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる２２種類のＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００９６】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  １．７７２ｍＭ
Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸 （ＨＥＤＴＡ） ３．０ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｍM、０．６３ｍM、０．７６ｍM、０．８９ｍM、１．０１ｍM、１．１４ｍＭ、１．２７ｍＭ、１．３９ｍM、１．５２ｍM、１．６５ｍM、１．７８ｍM、１．９１ｍM、２．０３ｍＭ、２．１６ｍＭ、２．２９ｍＭ、２．４１ｍＭ、２．５４ｍＭ、２．６７ｍＭ、２．７９ｍＭ、２．９２ｍＭ、３．０５ｍＭ又は３．１８ｍＭ
【００９７】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、ＡＬＰ第２試薬を調製した。
【００９８】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩  ７５．７５ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
【００９９】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【０１００】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製した２２種類のＡＬＰ第１試薬及びＡＬＰ第２試薬にて前記実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【０１０１】
なお、上記の２１種類のＡＬＰ第１試薬と、上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍM、０．５ｍM、０．６ｍM、０．７ｍM、０．８ｍM、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍM、１．２ｍM、１．３ｍM、１．４ｍM、１．５ｍM、１．６ｍM、１．７ｍM、１．８ｍM、１．９ｍM、２．０ｍM、２．１ｍM、２．２ｍM、２．３ｍM、２．４ｍM又は２．５ｍM
【０１０２】
４．測定結果
測定の結果を表４に示す。
なお、表４において、かっこ内の数値は、２２種類の各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｍＭ）を示す。
【０１０３】
【表４】
2016073217.tif 000005
【０１０４】
５．考察
表４から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。
これに対して、第１試薬にＨＥＤＴＡ（キレート剤）及び硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【０１０５】
これらのことより、試料中のＡＬＰ活性測定試薬において、キレート剤及び亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高いＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明のＡＬＰ活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確なＡＬＰ活性値を得ることができることが確かめられた。