(57)【要約】      （修正有）【課題】幅広いｐＨ領域で阻害活性を安定的に維持でき、界面活性剤や還元剤の存在下でも十分な阻害活性を発現できるタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターを提供する。【解決手段】タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）及び前記タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工等）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤等があり、多くの分野で盛んに利用されている。しかし、プロテアーゼは、プロテアーゼ自身や他のタンパク質を加水分解してしまい、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の活性が経時的に著しく低下するという問題がある。
【０００３】
一方、微生物を培養して菌体内に有用タンパク質を生産させるタンパク質の製造方法は従来よく知られている。特に、遺伝子組換え大腸菌を用いて有用タンパク質を高発現量で生産させる場合において、菌体内に目的のタンパク質が蓄積されることが多い。大腸菌を用いて発現したタンパク質を抽出する方法としては、超音波、高圧ホモジナイザー及びフレンチプレス等の物理的破砕法が挙げられ、これらが広く実用化されている。細胞を破砕すると内在性のプロテアーゼが細胞から放出され目的のタンパク質が細胞内のプロテアーゼによって分解されるため、必要量の組み換えタンパク質が発現しない。このため、目的のタンパク質が分解されないようプロテアーゼ活性を阻害する必要がある。
そこで、プロテアーゼ自身や他のタンパク質の加水分解を抑えるために、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼインヒビターの研究が行われている。プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、ストレプトマイセス属由来のストレプトマイセススブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）（例えば、非特許文献１参照）や、オオムギ由来のキモトリプシンインヒビター２（例えば、非特許文献２参照）等が知られている。
【０００４】
大腸菌を用いて発現したタンパク質を抽出・精製する際には、幅広いｐＨ領域で操作を行う場合がある。また、細胞内において生体膜に結合しているタンパク質は、細胞を破砕しただけでは可溶化されないため、抽出・精製するために界面活性剤を使用する場合がある。更に、空気中で不安定なタンパク質もあるため、タンパク質の酸化を防ぐために還元剤を使用する場合がある。
しかし、前記非特許文献１や非特許文献２に記載のインヒビターでは、幅広いｐＨ領域で阻害活性を安定的に維持できず、界面活性剤や還元剤の存在下では十分な阻害活性を発現できない場合があるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２，３６，ｐ１６０−１６３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，１６８，ｐ４４５−４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、幅広いｐＨ領域で阻害活性を安定的に維持でき、界面活性剤や還元剤の存在下でも十分な阻害活性を発現できるタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターであって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）及び前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、幅広いｐＨ領域で阻害活性を安定的に維持でき、界面活性剤や還元剤の存在下でも十分な阻害活性を発現できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）及び（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）である。
【００１０】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）は、配列番号１のアミノ酸配列で表され、プロテアーゼ活性を阻害する能力を有するタンパク質である。（Ａ）としては、コムギ由来スブチリシン／キモトリプシンインヒビターが挙げられる。
【００１１】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ）は、（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターであるが、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換数は、プロテアーゼ活性の抑制の観点から、１〜５個が好ましく、更に好ましくは１〜３個である。
【００１２】
（Ｂ）としては、天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ１）及び宿主生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ２）等が挙げられる。
【００１３】
天然物から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ１）としては、天然物（例えば、植物や動物の細胞、細胞外組織、種子、微生物の菌体内及び菌体外分泌物等）から抽出したタンパク質性プロテアーゼインヒビターが挙げられる。
抽出方法としては、細胞壁や細胞膜の破砕、遠心分離、硫安分画、クロマトグラフィー及び透析等の一般的なタンパク質を天然物から分離する方法等が挙げられる。
【００１４】
（Ｂ１）のアミノ酸配列は、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって決定することができる。また、天然物から抽出したタンパク質が、（Ｂ１）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって抽出タンパク質のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて（Ａ）のアミノ酸配列との相同部分を検索することにより決定できる。
【００１５】
宿主生産したタンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ｂ２）としては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている遺伝子組み換え法により組み換えた遺伝子を用いて、適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得たもの等が挙げられる。具体的には、アミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝子配列をクローニングし、クローニングした遺伝子配列の一部を８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子に置換（以下、「変異」ともいう）して得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主に形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００１６】
遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばｃＤＮＡライブラリ法及び人工合成遺伝子を用いる方法等が挙げられる。遺伝子変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法でよく、具体的には、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）等を用いた方法が挙げられる。
【００１７】
上記変異遺伝子を用いて（Ｂ２）を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記変異遺伝子を組込んだ組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、当該培養液から（Ｂ２）を採取すればよい。
【００１８】
本発明において組換えベクターは、適当なベクターに上記変異遺伝子を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣシリーズ等が挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。適当なベクターに変異遺伝子を挿入し、宿主を形質転換する具体的な方法としては、エレクトロポレーション法及びカルシウム法等が挙げられる。
【００１９】
本発明において宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物及び植物細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌等が挙げられる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌等が挙げられる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属  （Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ラクトコッカス属  （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、エンテロコッカス属  （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、リューコノストック属  （Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、更に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。
【００２１】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２２】
本発明において、培養液から（Ｂ２）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２３】
（Ｂ）の具体例としては、配列番号２〜４のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが挙げられる。
【００２４】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）及び（Ｂ）が活性を阻害する対象となるプロテアーゼとしては、一般的にプロテアーゼとして知られているものが挙げられるが、プロテアーゼ活性阻害の有効性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、更に好ましいのはスブチリシンである。市販されているものとしては、例えばノボザイムス社製のアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、ＰＴＮ及びジェネンコア社のピュラフェクト、ピュラフェクト  ＯＸＰが挙げられる。
【００２５】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、目的タンパク質を培養菌体又は細胞から抽出・精製する際に好適に使用できる。大腸菌を用いて発現したタンパク質を抽出する方法としては、超音波、高圧ホモジナイザー及びフレンチプレス等の物理的破砕法が挙げられる。タンパク質の抽出・精製は、幅広いｐＨ領域で行われる。
また、細胞内において生体膜に結合しているタンパク質は、細胞を破砕しただけでは可溶化されないため、抽出・精製するために界面活性剤を使用する場合がある。一般的にタンパク質精製に用いられる界面活性剤としては、非イオン界面活性剤のＴｒｉｔｏｎＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０、両イオン性界面活性剤のコールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、陰イオン性界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。
更に、空気中で不安定なタンパク質もあるため、タンパク質の酸化を防ぐために２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びジチオエリトロトール（ＤＴＥ）等の還元剤を使用する場合がある。
【００２６】
以下に本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターの使用方法の一例を示す。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ−１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主大腸菌に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
（ｉ−２）目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
（ｉ−３）スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
（ｉ−４）目的とするＤＮＡ配列は合成し、発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
【００２７】
（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）宿主細菌を発現ベクターで形質転換して組み換え細菌を作成し、組み換え細菌を前培養する。前培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）目的タンパク質の生産に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え細菌を培養する。培養は、通常１５〜４３℃で３〜１００時間行う。
（ｉｉｉ）抽出
（ｉｉｉ−１）培養液を遠心することで、上清と沈殿に分ける。上清を除去し、沈殿を細胞破砕用緩衝液［濃度が５０ｍＭとなる量の塩化ナトリウム、濃度が１ｍＭとなる量のエチレンジアミン四酢酸、濃度が１ｍＭとなる量のＤＴＴを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で懸濁する。この懸濁液に、本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターを加える。
（ｉｉｉ−２）上記懸濁液を氷冷しながら、超音波処理を行い、大腸菌を破砕する。目的タンパク質が緩衝液に溶解しにくい場合は、終濃度１重量％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加する。
【００２８】
（ｉｖ）精製
（ｉｖ−１）懸濁液中に可溶化されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｖ−２）可溶化されたタンパク質溶液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
＜製造例１＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１２）（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作製した。このプラスミドと３８位のバリンをアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号６、７）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間過熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７度で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、配列番号２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２）１００μＬを精製した。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。
【００３１】
＜製造例２＞
製造例１の変異導入用プライマー（配列番号６、７）に代えて、変異導入用プライマー（配列番号８、９）を用い、同様の方法で配列番号１の５２位のイソロイシンをアラニンに置換した配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ３）を得た。
【００３２】
＜製造例３＞
製造例１で得たプラスミド（Ｐ２）と５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンをそれぞれアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号１０、１１）を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ２）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ２）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間過熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７度で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、配列番号４のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ４）１００μＬを精製した。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。
【００３３】
＜製造例４＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作製した。
【００３４】
＜製造例５＞
配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１３）（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号５のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ５）を作製した。
【００３５】
＜実施例１〜４＞
製造例１〜４で得られたタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター発現プラスミド（Ｐ１）〜（Ｐ４）をそれぞれ大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に同様の方法で形質転換した。得られたタンパク質性プロテアーゼインヒビター発現株をＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作製し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃、３時間振とう培養を行い７種類の前培養液を作製した。７種類の前培養液をそれぞれ５０ｍＬの培養液［水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、硫酸マグネシウム６．０ｍｇ、微量金属（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、アンピシリン５．０ｍｇ］に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液［グリセリン濃度＝５０重量％、ラクトアルブミン水解物濃度＝５０ｇ／Ｌ、消泡剤（信越シリコーン製「ＫＭ−７０」）濃度＝３３ｇ／Ｌ、アンピシリン濃度＝１００ｍｇ／Ｌ］の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｅ−１）〜（Ｅ−４）を回収した。
得られた培養液（Ｅ−１）〜（Ｅ−４）をＨｉｓ−ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）で分離し、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）を得た。（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）中のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、全て１ｇ／Ｌであった。
また、（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）中のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターについて、相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて相同性を計算したところ、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）である配列番号１との相同性はそれぞれ、１００％、９９％、９９％、９６％であった。
【００３６】
＜比較例１＞
実施例１において、「プラスミド（Ｐ１）」に代えて「プラスミド（Ｐ５）」を用いる以外は同様にして、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター溶液（Ｆ’−１）を得た。（Ｆ’−１）中のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。
また、（Ｆ’−１）中のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターについて、相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて相同性を計算したところ、タンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビター（Ａ）である配列番号１との相同性は６１％であった。
【００３７】
＜実施例５〜８＞及び＜比較例２＞
上記記載の本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターの使用方法の一例で示した抽出時の環境を、簡易的に再現できる条件として、表１に記載の配合処方に基づいて配合し、タンパク質溶液（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）及び比較用のタンパク質溶液（Ｇ’−１）を得た。
【００３８】
尚、表１中、各成分の割合は、重量部で示した。また、表１中のプロテアーゼの溶液として、ノボザイムス社製の「サビナーゼ１６Ｌ」の水溶液［サビナーゼ水溶液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥよりサビナーゼ含量は約１ｇ／Ｌ）］を用いた。
【００３９】
【表１】
2016003227.tif 000002
【００４０】
＜実施例９〜１２＞及び＜比較例３＞
・タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定
実施例５〜８及び比較例２で得られたタンパク質溶液について、作製後直ちにタンパク質溶液（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）、（Ｇ’−１）を５μＬ採取して、９５μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で希釈し、溶液（Ｈ−１）〜（Ｈ−４）及び（Ｈ−１）とした。溶液（Ｈ−１）〜（Ｈ−４）及び（Ｈ−１）１０μＬを、５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］１０００μＬにそれぞれ添加して溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）及び（Ｉ’−１）を作製し、酵素反応を開始した。溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）及び（Ｉ’−１）を作製直後及び１５分ごとに３回、反応溶液のうち１５０μＬを取り出し、１５％トリクロロ酢酸溶液２００μＬと混合した。１５，０００×ｇの条件で５分間遠心し、上清に０．１Ｎ  ＮａＯＨを４００μＬ加え、分光光度計を用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）及び（Ｉ’−１）を作製直後の吸光度をＡλ0及び溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）及び（Ｉ’−１）を作製からｈ分後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈ（分）を横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ1）を求めた。
・ブランクのタンパク質溶液の活性の測定
次に、タンパク質性プロテアーゼインヒビターを含まない以外は上記と同じ溶液を作製し、上記と同様に吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｖ1）を求めた
サビナーゼ溶液（品名「サビナーゼ１６Ｌ」、ノボザイム製）３μＬに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８、２５℃）１０００μＬを混合したタンパク質溶液（Ｊ−１）を作製し、２０分間４０℃で静置した。
上記「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「タンパク質溶液（Ｇ−１）」に代えて「タンパク質溶液（Ｊ−１）」を用いる以外は同様にして溶液を作製し、吸光度を測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈ（分）を横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｖ0）を求めた。
下記数式（１）から、タンパク質溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）及び（Ｉ’−１）のプロテアーゼ活性を求めた結果を表２に示す。
プロテアーゼ活性（％）＝ｖ1／ｖ0×１００          （１）
【００４１】
＜実施例１３〜１６＞及び＜比較例４＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼインナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ５、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ５でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４２】
＜実施例１７〜２０＞及び＜比較例５＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ６でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４３】
＜実施例２１〜２４＞及び＜比較例６＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４４】
＜実施例２５〜２８＞及び＜比較例７＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ８でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４５】
＜実施例２９〜３２＞及び＜比較例８＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ９、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ９でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４６】
＜実施例３３〜３６＞及び＜比較例９＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ１０、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ１０でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表２に示す。
【００４７】
＜実施例３７〜４０＞及び＜比較例１０＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［１重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における界面活性剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００４８】
＜実施例４１〜４４＞及び＜比較例１１＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［１０重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における界面活性剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００４９】
＜実施例４５〜４８＞及び＜比較例１２＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液（１重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における界面活性剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００５０】
＜実施例４９〜５２＞及び＜比較例１３＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［１０重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における界面活性剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００５１】
＜実施例５３〜５６＞及び＜比較例１４＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［１ｍＭのＤＴＴを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における還元剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００５２】
＜実施例５７〜６０＞及び＜比較例１５＞
実施例９の「タンパク質溶液（Ｇ）の活性の測定」において、「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４、２５℃）で溶解］」に代えて「５ｍｇ／ｍＬのアゾカゼイン（ナカライテスク社製）溶液［１０ｍＭのＤＴＴを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、２５℃）で溶解］」を用いる以外は同様にして、ｐＨ７における還元剤存在下でのタンパク質溶液のプロテアーゼ活性を上記数式（１）から求めた結果を表３に示す。
【００５３】
【表２】
2016003227.tif 000003
【００５４】
【表３】
2016003227.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のタンパク質精製用タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、幅広い安定性を有し、プロテアーゼの活性を効率よく阻害できるので、菌体内に生産された目的のタンパク質を単離・精製する際に有効に使用することができる。
【配列表】
2016003227000001.app