(57)【要約】【課題】サポニンの一種であるジンセノサイドの含有量が高い培養人参カルスおよび該カルスから抽出してなる高ジンセノサイド含有培養人参エキス、ならびに食品、医薬品、化粧料を提供するものである。【解決手段】植物組織培養法によって培養してなる細胞塊であって、テクスチャーアナライザーによる硬さが９〜２０Ｎであることを特徴とする培養人参カルスであり、細胞塊としてはオタネ人参を用いることがジンセノサイドを多く含有する。さらに、上記培養人参カルスから抽出してなる高ジンセノサイド含有培養人参エキスも有効成分としてのジンセノサイドを多く含有するものである。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織培養法によって培養してなる細胞塊であって、テクスチャーアナライザーによる硬さが９〜２０Ｎであることを特徴とする培養人参カルス。
【請求項２】
細胞塊が、オタネ人参である請求項１記載の培養人参カルス。
【請求項３】
請求項１記載の培養人参カルスから抽出してなる高ジンセノサイド含有培養人参エキス。
【請求項４】
請求項１または請求項３記載の培養人参カルスまたは高ジンセノサイド含有培養人参エキスを含有してなる食品もしくは医薬品ならびに化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サポニンの一種であるジンセノサイドの含有量が高い培養人参カルスおよび該カルスから抽出してなる高ジンセノサイド含有培養人参エキス、ならびにその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
薬用人参、例えば、オタネ人参(Panax ginseng C.A.Meyer)、チクセツ人参(Panax japonicus C.A.Meyer)、アメリカ人参(Panax quinquefolium L.)、三七人参(Panax notoginseng [Burk] F.H.Chen)、シベリア人参(Eleutherococcus senticosus)の根は、有用漢方薬として珍重されて広く利用されている。また、これらは二次代謝産物としてサポニンやパナキサン、サポゲニンなどの有効成分を含有しているので、これらの成分による薬理効果としては、古くから滋養強壮作用や長生作用、血糖値降下作用、鎮静作用、興奮作用、利尿作用などが明らかになっている。また、これら薬用人参の有効成分としては、パナキサン、サポニン、サポゲニン、ビタミンＢ群、β−シトステロール−Ｄ−ｏ−グルコシドなどが報告されており、このうち薬用人参の有効成分としてのサポニンやパナキサンが特に注目されている。
【０００３】
血糖降下作用などの薬理効果を有するパナキサンについては、薬用人参から効率よく抽出して、多くのパナキサンを含有する薬用人参エキスについての報告がなされている。（特許文献１参照）
【０００４】
一方、上記薬用人参の有効成分として、配糖体の一種であるサポニンは、その主成分としてジンセノサイドを含有しており、疲労回復作用や精神安定作用、血行促進作用、抗炎症作用、癌細胞増殖抑制作用、抗血栓作用、抗糖尿作用、記憶学習機能改善作用などの様々な生体調節作用を有する機能性物質として、健康飲料などに配合される添加剤や、それ自体を医薬品として用いるなど高い利用価値を有する成分として注目されている。
【０００５】
また、人参サポニンとしてのジンセノサイドは、含まれるアグリコンの種類によって種々分類されるが、その分類によってジンセノサイドの組成や含有量が大きく異なることが分かっている。従って、安定的に且つ多量にジンセノサイドを提供するためには、栽培人参から抽出するよりも、培養人参を用いることが好ましいものである。
【０００６】
そこで、植物組織培養法によって人参を培養することによって、未分化状態の細胞塊（カルス）を作製し、これを増殖させることによって培養人参カルスを得、この中からジンセノサイドを抽出することが検討されている。しかしながら、有効量のジンセノサイドを安定的に抽出することはできるが、ジンセノサイドを多く含有する人参カルスの形態などについては未だ不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−２４５４１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、薬用人参などを培養して人参カルスを得る際の上記課題に鑑みて、本発明の目的は培養人参カルス中の有効成分としてのジンセノサイドを多く含有するカルスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、ジンセノサイドを多く含有する培養人参カルスについて検討を重ねた結果、カルスの硬さとジンセノサイド含有量とが相関関係を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は植物組織培養法によって培養してなる細胞塊であって、テクスチャーアナライザーによる硬さが９〜２０Ｎであることを特徴とする培養人参カルスを提供するものであり、その細胞塊としてはオタネ人参を用いることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明は上記培養人参カルスから抽出してなる高ジンセノサイド含有培養人参エキスを提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、上記培養人参カルスまたは高ジンセノサイド含有培養人参エキスを含有してなる食品、医薬品ならびに化粧料を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、薬用人参中の有効成分である人参サポニンの一種であるジンセノサイドを効率よく高含量で有する培養人参カルスを得ることができるので、培養された人参カルスの選別基準として利用することができ、このような培養人参カルスから抽出して得られる培養人参エキスも、健康飲料などの食品や医薬品、化粧料などに効率よく配合できるという効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例にて得られた培養人参カルスを示す写真である。
【図２】表１に示す各種人参株から得られた培養人参カルスの硬さ（Ｎ）とジンセノサイド含量（ｍｇ／ｇ）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明にて用いられる培養人参カルスは、薬用人参などの人参の組織を通常の組織培養法によって得られるものである。
【００１５】
本発明における組織培養法の一例としては、例えば以下のような方法を採用することができる。
まず、組織培養の材料となる植物組織を充分に水洗する。次に、水洗した植物細胞を７０重量％エタノールに１０〜６０秒程度浸漬して材料をアルコール殺菌したのち、さらに、１〜５重量％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液や次亜塩素酸カルシウム水溶液などの殺菌剤にて殺菌処理を行う。殺菌剤による処理時間は、材料の大きさや種類によって異なるが、細胞への悪影響を考慮すると５〜６０分の範囲で行うことが望ましい。
【００１６】
殺菌後の植物組織は、クリーンベンチ内にて滅菌水で充分に水洗したのち、メスなどを用いて適当な大きさ（１０〜２０ｍｍ程度）の切片に切り分け、カルス誘導寒天培地に静置する。カルスの誘導に用いられる寒天培地は、一般的に主要無機成分、微量無機成分、糖を成分とする基本培地に、生長調整物質やビタミン類、アミノ酸類、必要に応じて天然抽出物を添加したものを用いることができる。
【００１７】
培地は固体培地あるいは液体培地を用いることができる。固体培地を調製するときのゲル化剤としては、寒天、ジェランガムなどが挙げられる。
【００１８】
カルスの誘導は、一般的に２０〜３０℃の条件下で行われる。光照射条件としては、暗黒下や弱光下、強光下の何れでも問題はないが、生長速度の観点から暗黒や弱光が望ましい。培養開始後１０〜２０日前後でカルスが観察され、３０〜４０日で継代培養可能なサイズのカルスを得ることができる。
【００１９】
なお、本発明で用いられる培養人参カルスは、人参組織から得られたカルスや、このカルスを液体培養により増殖させたカルスである。また、本発明にて用いられる人参としては、ウコギ科に属する人参であれば、その種類や株などに限定されるものではなく、田七人参（Panax notoginseng）、オタネ人参（Panax ginseng）、チクセツ人参(Panax japonicus C.A.Meyer)、アメリカ人参（Panax quinquefolium）、エゾウコギ（Acanthopanax senticosus）などの自体公知の人参があげられる。
【００２０】
また、通常の植物組織培養法によって得られた培養人参カルスを液体培養に供して増殖させる場合は、このカルスは液体培養により無限に増殖させることができる。液体培養条件は、何ら格別である必要はない。培地としては、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ−スクーグ（Murashige-Skoog） 培地、ホワイト（White）培地、オー．エル．ガンボーグ（O. L. Gamborg）Ｂ５培地、ニッチェ（Nitsch）培地、ヘラー（Heller）培地、モーレル（Morel）培地などを用いることができる。これら培地には必要に応じて、カゼイン分解酵素、大豆粉、コーンスティープリカー、ビタミン類などの添加剤を適宜添加することもできる。
【００２１】
上記液体培養で得られるカルス（細胞群または細胞塊）は、濾別などの公知の手段により集められる。これらの細胞は、最小単位としての単細胞から最大単位としての細胞塊として存在する。得られる細胞塊は、液体培養における振盪または攪拌により、極端に大きくなることはなく、最大直径は１０〜２０ｍｍ程度である。
【００２２】
本発明の培養人参カルスは、上記のようにして得られた状態での硬さであることを特徴とするものである。つまり、培養して得られた含水カルス（生カルス）の硬さと、有効成分として含有するジンセノサイド量とが相関性を有するのである。
【００２３】
培養された人参カルスの硬さは、テクスチャーアナライザーを用いて測定することができ、ジンセノサイドを多く含有する培養人参カルスの硬さは９〜２０Ｎの範囲、好ましくは、９〜１２Ｎの範囲を有するものである。培養人参カルスの硬さが９Ｎに満たない場合は、細胞内の水分含量が増加する傾向を示すので、難溶性であるジンセノサイドの蓄積量が低下すると推定される。また、硬さが２０Ｎを超える場合には、細胞内の水分含量が低下する傾向を示すので、細胞内の各種合成酵素の活性が低下して、ジンセノサイド自体の合成量が低下すると推測され、好ましくない。なお、本発明における硬さ測定は、英弘精機社製のテクスチャーアナライザー（製品名：ＴＡ．ＸＴ ｐｌｕｓ）を用いて行う。
【００２４】
本発明の培養人参カルスを抽出して得られる培養人参エキスには、高含量のジンセノサイドが含まれており、そのジンセノサイドとしては、Ｒｂ１，Ｒｂ２，Ｒｂ３，Ｒｃ，Ｒｄ，Ｒｅ，Ｒｆ，Ｒｆ１，Ｒｇ１，Ｒｇ２，Ｒｇ３，Ｒｇ５，Ｒｋ１，Ｒｋ３，Ｒｈ１，Ｒｈ２，Ｒｈ４，Ｒｇ２，Ｒｏなどが有効成分として含まれている。本発明における培養人参カルスには有効成分としてのジンセノサイドが、培養人参カルス１ｇ当り５〜１５ｍｇ、好ましくは１０〜１５ｍｇの量が含有されている。
【００２５】
本発明の培養人参カルスからエキスを抽出する場合、培養後の人参カルスそのものを使用してもよいが、カルスを天日または加熱乾燥、好ましくは３０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃の温風下で徐々に乾燥させて用いることもできる。乾燥する場合の乾燥温度が８０℃を超える高温下で乾燥を行った場合には、薬用人参特有の香りが失われたり、含有される有効成分が分解する可能性もあり、一方、乾燥温度が３０℃未満の低温下で乾燥を行った場合には、乾燥完了まで長時間を要するために乾燥工程中で腐敗してしまう可能性もあるが、必ずしも３０〜８０℃の乾燥温度に制限されるものではない。
【００２６】
培養人参カルスを乾燥させた場合の乾燥後のカルス（人参そのものを含む）の含水率は、１０重量％以下、特に５重量％以下に調整するが好ましい。その理由としては、含水率が１０重量％を越えると保存性が低下する傾向を示すが、保存性が要求されないなどの場合には、必ずしも含水率を１０重量％以下にする必要はないことは云うまでもない。
【００２７】
このようにして調製された培養人参カルスは、そのまま若しくは粉砕器や石臼などを用いて粉砕したのち、ふるいなどによって粉末粒径に分画して所望の粒度を有するカルス粉末を得ることができる。また、凍結乾燥後に粉砕することによって顆粒状にすることもできる。このようにカルスを粉末や顆粒状にすることによって有効成分を抽出しやすくなり、抽出時間を短縮できるので製造工程上は好ましいものである。
【００２８】
本発明の培養人参エキスは上記のようにして得られた培養人参カルスから抽出して得られるものであって、有効成分としてのジンセノサイドを多く含有するものである。通常、エキス作製の際には上記のようにして培養人参カルスを乾燥させ、必要に応じて粉末化や顆粒化させたのち、抽出溶媒を加えて人参エキスを抽出する。抽出溶媒としては、水および／またはアルコール類が挙げられる。アルコール類としては、好適には炭素数１〜４の低級アルコールが挙げられ、具体的にはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。アルコールは一種もしくは二種以上の混合物として用いてもよく、また水と適当な割合、例えばエタノール／水（５０／５０重量比）で混合して用いてもよい。
【００２９】
抽出溶媒の量は特に限定されないが、粉末状もしくは顆粒状のカルス（乾燥物に換算して）１重量部あたり、通常、３〜２００重量部、好ましくは５〜１００重量部、より好ましくは１０〜５０重量部である。この範囲を下回るとエキスとしての有効成分量の抽出が不充分となり、一方、この範囲を超えるとジンセノサイドの抽出量の増大が望めないだけでなく、後述する濾過や濃縮処理に要する時間が長くなってしまい効率的ではない。
【００３０】
エキスを抽出する際の温度としては、通常、５〜８０℃、好ましくは１５〜７５℃、より好ましくは５０〜７０℃である。５℃未満の低温であっても抽出時間が長くなるが抽出することは可能である。一方、抽出温度が８０℃を超えると、薬用人参特有の香りが失われたり、含有するジンセノサイドが分解するおそれもある。さらに、抽出を行うには、静置条件下で行う方法の他、必要に応じて抽出溶媒を攪拌あるいは振盪させて行う方法を採用することもできる。抽出時間は特に限定されるものではなく、抽出条件（抽出温度など）によっても異なるが、通常は０．５〜２時間である。
【００３１】
このようにして得られる培養人参エキスは、高含有率でジンセノサイドを含有するものであり、エキス固形分１ｇ当たりのジンセノサイド抽出量が通常２０ｍｇ以上であることが好ましい。
【００３２】
本発明の培養人参エキスは、そのまま、あるいは必要に応じて、さらに濾過、遠心分離、濃縮などの任意の処理を施すことによって、高ジンセノサイド含有培養人参エキスとなる。濾過処理としては、例えばメンブレンフィルターを用いた限外濾過、またはケイソウ土濾過などを用いた濾過精製方法などが挙げられる。
【００３３】
本発明によって得られる培養人参カルスや培養人参エキスは、そのままで、または任意の担持体、添加剤と共に製剤化処理や加工処理などを行うことによって、医薬品や化粧品、食品（飲料）などを調製することができる。例えば、担持体や添加剤としては、医薬上許容される崩壊剤、賦形剤、保存量、緩衝剤、膨張剤などや、食品衛生上許容されるもの、化粧品成分として許容されるものなどを用いればよく、液状、乳液状、懸濁状、クリーム状、固体状、粉末状、顆粒状などの何れの形態に調製することも可能である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例および比較例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれらの例示によって何ら限定されるものではなく、技術的範囲を逸脱しない範囲で種々の応用ができるものである。
【００３５】
＜実施例および比較例＞
本発明の培養人参カルスは、以下のように取得した。各種栽培オタネ人参株の根を水道水で充分に洗浄し、７０重量％エタノールに１分間浸漬したのち、１重量％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に３０分間浸漬して殺菌処理を行った。
【００３６】
次に、クリーンベンチ内にて上記殺菌処理した栽培オタネ人参根を滅菌水で充分に洗浄したのち、コルクボーラ―を用いて根の形成層付近を採取した。採取したサンプルは長さ１０ｍｍ程の切片に切り分けてＭＳ寒天誘導培地に静置した。
【００３７】
ＭＳ寒天誘導培地は、基本となるＭＳ培地成分にオーキシンとしての２，４−Ｄを２ｐｐｍ、サイトカイニンとしてのキネチンを０．１ｐｐｍ、ショ糖を３重量％添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５．８に調整した。その後、０．９重量％の寒天を加えて加熱溶解したのち、１００ｍｌ三角フラスコに５０ｍｌ分注し、オートクレーブ（ＴＯＭＹ社製、ＬＢＳ３２５）にて１２１℃で２０分間蒸気滅菌したものを使用した。なお、培養は２５℃、暗黒条件下で約４０日間行い、固形培養カルスを取得した。
【００３８】
得られた固形培養カルスは、目視にて生育が良好なものを選抜し、２５℃、暗黒条件下にて約２８日周期で約１年継代培養を行った。継代培養では、上記ＭＳ寒天誘導培地における２，４−Ｄをインドール酪酸に換えた培地を使用して培養を行った。濃度は同じ２ｐｐｍとした。
【００３９】
上記のように１年間継代培養によって選抜されたカルスは、カルスの量を増やすために液体培地に移行した。液体培地は、ＭＳ培地にインドール酪酸を２ｐｐｍ、キネチンを０．１ｐｐｍ、ショ糖を３重量％添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５．８に調整した。そして、１ｌフラスコに３００ｍｌ分注し、オートクレーブ（ＴＯＭＹ社製、ＬＢＳ３２５）にて１２１℃で２０分間蒸気滅菌したものを使用した。
【００４０】
液体培地３００ｍｌに対してカルス２３ｇ、培養温度は２５℃、暗所、振盪条件は振幅７ｃｍの振盪機にて８０ｒｐｍの条件で培養した。約２８日周期で約１年間継代培養を行い、本発明における培養人参カルスを取得した。
【００４１】
なお、本明細書において用いられるオーキシンとしてはインドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）などが挙げられる。本明細書において用いられるサイトカイニンとしては、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアデニンおよびチジアズロンなどが挙げられる。 
【００４２】
上記のようにして得られた培養人参カルスについて、その硬さおよびジンセノサイドの含有量を以下に示す方法にて測定し、その結果を表１に示した。また、表１における硬さとジンセノサイド含有量との関係を図２に表した。
【００４３】
＜カルスの硬さ測定＞
各人参株から得られた培養人参カルスを水で洗浄したのち、カルス形状が類似し、直径が１０ｍｍ程度のカルスを目視で選抜した。選抜されたカルスをテクスチャーアナライザー（英弘精機社製、製品名：TA.XT plus）を用いてカルス硬さを測定した。なお、測定には２０ｍｍφの円柱型プランジャーを用い、室温（約２５℃）の環境下、１０ｍｍ／秒の速度でカルス厚みの５０％まで押し込んだときの最大荷重値をカルス硬さとした。測定サンプル数は、ｎ＝３とした。
【００４４】
＜ジンセノサイド含有量の測定＞
各人参株から得られた培養人参カルスを７０℃で８時間乾燥し、コーヒーミルで細かく粉砕し、粉末状のカルス（粒径：約０．１〜１ｍｍ）を得た。得られた粉末状のカルス１０ｍｇを秤量し、８０重量％メタノールを１ｍｌ添加したのち、超音波洗浄機（Ｅｌｍａ社製、製品名：Ｔ７８０）発生器を用いて有効成分としてのジンセノサイドを超音波抽出した。抽出条件は、室温（２５℃）で行った。
抽出処理が完了後、メンブレンフィルター（アドバンテック東洋社製、平均膜孔径０．４５μｍ）で濾過したのち、濾液（培養人参エキス）をＬＳ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ）を用いてジンセノサイド含有量を測定した。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１および図２の結果から明らかなように、カルス硬さが小さいＮＫ株やＮＫＷ株、ＮＨＬ２株ではジンセノサイド含有量がきわめて少なく、カルス硬さが９Ｎ以上の他の人参株では、ジンセノサイドが多く含有していることが明らかである。
以上の結果から、培養人参カルスは柔らかいほど、有効成分としてのジンセノサイドの含有量が少なく、硬さが９Ｎ以上の硬いカルスではジンセノサイド含有量が多くなるということが判明した。
【符号の説明】
【００４７】
１  培養人参カルス

【図１】
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【図２】
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