(57)【要約】【課題】試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる、溶出液として用いられる緩衝液、および、かかる緩衝液を溶出液として用いた試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法を提供すること。【解決手段】少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に吸着した、精製すべき精製タンパク質を、前記担体から選択的に溶出させる際に溶出液として用いられる緩衝液であり、リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に吸着した、精製すべき精製タンパク質を、前記担体から選択的に溶出させる際に溶出液として用いられる緩衝液であって、
リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有することを特徴とする緩衝液。
【請求項２】
当該緩衝液のｐＨは、５．５以上、８．０未満である請求項１に記載の緩衝液。
【請求項３】
前記リン酸およびその塩の合計の含有量は、１．０ｍＭ以上、４００ｍＭ以下である請求項１または２に記載の緩衝液。
【請求項４】
前記カルボキシ基を有する化合物およびその塩の合計の含有量は、０．１Ｍ以上、５Ｍ以下である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の緩衝液。
【請求項５】
前記カルボキシ基を有する化合物は、炭素を２つ以上備える脂肪族カルボン酸である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の緩衝液。
【請求項６】
前記精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の緩衝液。
【請求項７】
前記精製タンパク質を含む複数種のタンパク質を含有する試料液中から、前記精製タンパク質を分離する分離方法であって、
前記担体を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の緩衝液を前記装置内に供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する分画工程とを有することを特徴とする精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中から精製すべき精製タンパク質を精製する際に溶出液として用いられる緩衝液、および、かかる緩衝液を溶出液として用いて試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、血漿中に含まれる抗体（天然の抗体）や、遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される組換え融合タンパク質（人工の抗体）等のタンパク質を試料液中から精製する精製方法として、吸着剤（クロマトグラフィー担体）にハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイトのようなリン酸カルシウム系化合物を用いたハイドロキシアパタイト法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
このハイドロキシアパタイト法では、一般的に、吸着剤に吸着させた精製すべきタンパク質（精製タンパク質）および他のタンパク質（夾雑タンパク質）を含む夾雑物のうち、精製タンパク質のみを溶出液を用いて流出液中に溶出させ、夾雑物を吸着剤に吸着させたままとして、流出液を回収する溶離方法が用いられる。
【０００４】
この溶離方法では、溶出液として、例えば、低濃度のリン酸緩衝液に塩化ナトリウムのような溶離剤を添加した緩衝液が用いられる。しかしながら、塩化ナトリウム（溶離剤）を含む緩衝液を用いると、塩化ナトリウムのナトリウムイオンと、リン酸カルシウム系化合物が備えるリン酸基が有する水素イオンとがイオン交換し、その結果、溶出液のｐＨが急激に低下する。そのため、リン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤が溶解することに起因して吸着剤が変質・劣化し、その結果、吸着剤（担体）としての機能が早期に低下するという問題があった。
【０００５】
なお、ｐＨの低下を抑制するには、溶出液中におけるリン酸濃度を上げることが考えられるが、この場合、精製タンパク質の他に、夾雑物が溶出するようになることから、精製タンパク質の精製率の向上を図るためには好ましくない。また、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のようなグッドバッファーを用いる方法も考えられるが、グッドバッファーは、高価でありコスト高となるため、スケールが小さいラボレベルには適するものの、スケールが大きい工業レベルには適しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−３５４６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる、溶出液として用いられる緩衝液、および、かかる緩衝液を溶出液として用いた試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的は、下記（１）〜（７）の本発明により達成される。
（１）  少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に吸着した、精製すべき精製タンパク質を、前記担体から選択的に溶出させる際に溶出液として用いられる緩衝液であって、
リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有することを特徴とする緩衝液。
【０００９】
この緩衝液を溶出液として用いることにより、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる
【００１０】
（２）  当該緩衝液のｐＨは、５．５以上、８．０未満である上記（１）に記載の緩衝液。
【００１１】
これにより、精製タンパク質の変質（変性）を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。また、担体の変質（溶解等）を好適に防止することができ、吸着装置における分離能の変化を長期に亘って防止することもできるため、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。
【００１２】
（３）  前記リン酸およびその塩の合計の含有量は、１．０ｍＭ以上、４００ｍＭ以下である上記（１）または（２）に記載の緩衝液。
【００１３】
これにより、担体に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
【００１４】
（４）  前記カルボキシ基を有する化合物およびその塩の合計の含有量は、０．１Ｍ以上、５Ｍ以下である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の緩衝液。
【００１５】
これにより、担体に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
【００１６】
（５）  前記カルボキシ基を有する化合物は、炭素を２つ以上備える脂肪族カルボン酸である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の緩衝液。
【００１７】
（６）  前記精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、
または組換え融合タンパク質である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の緩衝液。
【００１８】
本発明の緩衝液および精製方法は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の精製に好適に適用される。
【００１９】
（７）  前記精製タンパク質を含む複数種のタンパク質を含有する試料液中から、前記精製タンパク質を分離する分離方法であって、
前記担体を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の緩衝液を前記装置内に供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する分画工程とを有することを特徴とする精製方法。
【００２０】
これにより、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制しつつ、試料液中から精製タンパク質を精製することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の緩衝液によれば、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる。
【００２２】
したがって、かかる緩衝液を用いた本発明の精製方法によれば、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明で用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。
【図２】実施例１Ａおよび比較例１Ａにおける溶出液の供給にともなうｐＨの変化を示す図である。
【図３】実施例２Ａ、３Ａおよび比較例２Ａにおける溶出液の供給にともなうｐＨの変化を示す図である。
【図４】４ＳＴＤ試料に含まれるタンパク質を、溶離剤として酢酸（実施例１Ｂ）または塩化ナトリウム（参考例１Ｂ）を用いて、吸着装置で分離した際に測定された吸光度曲線である。
【図５】ＢＳＡ試料に含まれるＢＳＡを、溶離剤として酢酸塩（実施例２Ｂ）または塩化ナトリウム（参考例２Ｂ）を用いて、吸着装置で分離した際に測定された吸光度曲線である。
【図６】ＩｇＧ試料に含まれるＩｇＧを、溶離剤として酢酸塩（実施例３Ｂ）または塩化ナトリウム（参考例３Ｂ）を用いて、吸着装置で分離した際に測定された吸光度曲線である。
【図７】ＤＮＡ試料に含まれるＤＮＡを、溶離剤として酢酸塩（実施例４Ｂ）または塩化ナトリウム（参考例４Ｂ）を用いて、吸着装置で分離した際に測定された吸光度曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の緩衝液および精製方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本発明の緩衝液および精製方法を説明するのに先立って、好適な実施形態を説明するにあたり、説明に使用する用語を以下に定義する。
【００２５】
「抗体」とは、タンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン、および少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含むものをいう。また、「抗体」は、一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＣL、ＣH１、ＣH２、ＣH３またはＣH４ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言い、抗体のＦｃ部もこれに含まれる。（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ Ｃａｐｒａ，免疫グロブリン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照。）。
【００２７】
「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＶLまたはＶHドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言う。なお、本発明では、実質的類似性を判定するための免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。
【００２８】
「吸着剤（担体）」とは、固体支持体に固定した少なくとも１種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも１種類の分子で構成され、各種クロマトグラフィーを実施するために用いられるものであり、本発明では、少なくとも表面がリン酸カルシム系化合物で構成される。
【００２９】
次に、本発明の精製方法に用いられる吸着装置、すなわち、本発明の緩衝液を溶出液として用いたタンパク質の精製に用いられる吸着装置（分離装置）の一例について説明する。
【００３０】
＜吸着装置＞
図１は、本発明で用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００３１】
ここで、流入側とは、精製すべき精製タンパク質（目的物質）を精製（分離）する際に、試料液（精製タンパク質を含有する液体）および溶出液としての緩衝液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が流出液として吸着装置内から流出する側のことを言う。
【００３２】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００３３】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００３４】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００３５】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３６】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤（担体）３が充填されている。
【００３７】
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、０．０５〜１００ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１００ｍＬ程度がより好ましく、０．５〜５０ｍＬ程度がさらに好ましい。
【００３８】
また、カラム２では、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００３９】
これらキャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、試料液（液体）が供給される。また、吸着剤３に供給された試料液は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。
【００４０】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ガラス焼結体、金属あるいはポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００４１】
また、吸着装置１は、吸着剤３として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを備えている。
【００４２】
かかる吸着剤３には、試料液中に含まれる、目的とする精製タンパク質が有する固有の吸着（担持）力で特異的に吸着するため、この吸着力の差に応じて、精製タンパク質と、この精製タンパク質とは異なる他の夾雑タンパク質等の夾雑物（不純物）とが分離・精製される。
【００４３】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、ＴＣＰ（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２や、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４４】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。特に、ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、精製タンパク質を吸着・分離する際に、かかる精製タンパク質が変質（変性）するのを好適に防止することができる。さらに、ハイドロキシアパタイトは、それが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものであるのが好ましい。フッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイト（以下、「フッ素アパタイト」と言う）は、その結晶構造中にフッ素原子（フッ素イオン）が存在することにより、カルシウム原子（カルシウムイオン）のフッ素アパタイトからの離脱をより確実に防止することができる。また、かかるフッ素アパタイトで吸着剤３の少なくとも表面付近を構成することにより、吸着剤３の強度がさらに向上する。なお、以下では、ハイドロキシアパタイトおよびフッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイトを、総称して「アパタイト」と言うこともある。
【００４５】
また、少なくとも表面付近をリン酸カルシウム系化合物で構成することにより、高い強度を有する吸着剤３を得ることができる。このため、吸着剤３が自重により容易に変形・崩壊等することを好適かつ長期にわたって防止することができる。したがって、吸着剤充填空間２０内の下部に充填された吸着剤３が崩壊等して、吸着装置１に目詰まりが生じるのを防止することができる。その結果、多量の試料液の処理、すなわち、試料液中から精製すべき精製タンパク質を確実に分離することができるようになる。
【００４６】
以上のような吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒子状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状、モノリス）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒子状とすることにより、その表面積を増大させることができ、タンパク質の分離特性の向上を図ることができる。
【００４７】
粒子状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００４８】
次に、このような吸着装置（分離装置）１を用いて、試料液中に含まれる目的とするタンパク質を精製する精製方法（本発明の精製方法）について説明する。
【００４９】
＜精製方法＞
本実施形態の精製方法は、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤（担体）を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる吸着装置１内に、精製すべき精製タンパク質を含有する試料液を供給する供給工程（第１の工程）と、吸着装置１内に、本発明の緩衝液を供給して、吸着装置１内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、精製タンパク質を分離する分画工程（第２の工程）とを有する。
【００５０】
以下、この精製方法について詳述する。
なお、以下では、目的とする精製タンパク質として、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質を含有する試料液から精製する場合を代表に説明する。
【００５１】
［１］  供給工程
まず、精製すべき精製タンパク質を含有する試料液を用意した後、この試料液を、吸着剤（充填剤）３に供給することで接触させる。
【００５２】
［１−１］まず、精製すべき精製タンパク質（目的物質）を含有する試料液を用意する。
【００５３】
この精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）を有するタンパク質またはそのタンパク質の複合体であり、例えば、かかるタンパク質が産生されるように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される。
【００５４】
この場合、精製タンパク質が産生されるように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｅｙ，ニューヨーク）参照。）。
【００５５】
なお、精製タンパク質は、１以上の免疫グロブリン定常ドメインを有するものであればよく、１個または２個以上の免疫グロブリン可変ドメインを有するものであってもよく、免疫グロブリン可変ドメインを有しないものであってもよい。
【００５６】
さらに、精製タンパク質は、天然タンパク質（天然の抗体）または組換え融合タンパク質であってもよく、組換え融合タンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部を有するものが挙げられ、非抗体タンパク質であってもよい。
【００５７】
組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００５８】
この精製タンパク質としては、例えば、ｆｌｔ３リガンド（国際特許出願ＷＯ９４／２８３９１参照。）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号参照。）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際特許出願ＷＯ９７／０１６３３参照。）、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許Ｎｏ．５８８８１９参照。）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンド）等が挙げられる。
【００５９】
また、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、前記精製タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００６０】
前記受容体としては、両形態のＴＮＦＲ（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、Ｉ型およびＩＩ型インターロイキン−１受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７号および米国特許第５，７６７，０６４号参照。）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ３６７ ５６６および米国特許第５，８５６，２９６号参照。）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号参照。）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４を含む）、ならびにデスドメインを含む受容体、例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）等が挙げられる。
【００６１】
さらに、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）もしくは分化抗原または分化抗原と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００６２】
前記分化抗原としては、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．編，日本，神戸，１９９６）に示されており、具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、など）が挙げられる。
【００６３】
なお、幾つかのＣＤ抗原は、ＴＮＦ受容体ファミリーの１種であり、これには４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０も含まれる。上記リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同様にＴＮＦファミリーの１種である。
【００６４】
その例には、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインと、下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または一部とを含む組換え融合タンパク質が挙げられ、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンドが挙げられる。
【００６５】
さらに、精製タンパク質としては、抗体（天然の抗体）またはその一部、およびキメラ抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常ドメインが１以上のネズミ免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントであってもよいし、抗体と細胞傷害性物質または発光物質とを含む結合体であってもよい。細胞傷害性物質または発光物質としては、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）誘導体（例えば、ＤＭ１）；エンテロトキシン（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（例えば、Ｉ−１２５）；テクニウム同位体（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（例えば、ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓ６））等が挙げられる。
【００６６】
なお、抗体、抗体／細胞毒素結合体、または抗体／発光団結合体としては、例えば、前記タンパク質および／または下記抗原のうちいずれか１種類またはその組合わせを認識するものが挙げられ、抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓癌細胞、および／または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシンＨ鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害薬）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ）等が挙げられる。
【００６７】
このような精製タンパク質を含有する試料液には、この精製タンパク質の他、これ以外の夾雑物（混入物）が含まれ、この夾雑物としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質（精製タンパク質）以外のタンパク質（夾雑タンパク質）等の生体高分子が挙げられる。
【００６８】
より具体的には、夾雑物としては、精製タンパク質が遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される場合、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質（夾雑タンパク質）等が挙げられ、また、タンパク質が天然の抗体である場合、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、αグロブリンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質（夾雑タンパク質）等が挙げられる。
【００６９】
なお、本実施形態で用意する試料液としては、精製すべき精製タンパク質の他、夾雑物が含まれるものであればよく、予め、夾雑物の一部が除去されたものであってもよい。
【００７０】
試料液中から予め夾雑物を除去する方法としては、例えば、プロテインＡ等の結合性タンパク質が固体支持体に固定化された固定化部材を備えるものを吸着剤として用いたアフィニティークロマトグラフィー処理が挙げられる。
【００７１】
なお、本実施形態では、上記のような夾雑物を除去する方法を試料液に適用したとしても、その全てが試料液中から除去されることはなく、夾雑物のうちの少なくとも一部は、試料液中に残存することとする。
【００７２】
［１−２］次に、得られた試料液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（吸着装置１）内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
【００７３】
これにより、吸着剤３に対して吸着能が精製タンパク質（精製すべき目的物質）や、このタンパク質以外の夾雑タンパク質の中でも吸着剤３に対して比較的吸着能の高いものは、カラム２内に保持される。そして、吸着剤３に対して吸着能の低い夾雑タンパク質や、タンパク質以外の夾雑物は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。
【００７４】
［２］  分画工程
次に、吸着装置１の流入管２４からカラム２内に、精製タンパク質を流出させるための溶出液（洗浄液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。これにより、吸着剤３に吸着している目的とする精製タンパク質と、それ以外の夾雑物（夾雑タンパク質等）とは、それぞれが有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収（分離）される。
【００７５】
そのため、目的とする精製タンパク質が溶出した分画を分画液として回収することで、精製タンパク質が精製される。
【００７６】
ここで、カラム２内に供給する溶出液として、例えば、リン酸緩衝液に塩化ナトリウムのような溶離剤を添加したものを用いると、塩化ナトリウムのナトリウムイオンと、吸着剤３を構成するリン酸カルシウム系化合物が備えるリン酸基が有する水素イオンとがイオン交換する。その結果、前述の通り、溶出液のｐＨが急激に低下するため、リン酸カルシウム系化合物が溶解することに起因して吸着剤３が変質・劣化し、その結果、吸着剤（担体）３としての機能が早期に低下するという問題があった。
【００７７】
これに対して、本発明では、カラム２内に供給する溶出液として、リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有する緩衝液が用いられる。すなわち、本発明では、溶離剤として、塩化ナトリウムに代えて、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方を含む緩衝液が用いられる。
【００７８】
このように、溶出液（緩衝液）として、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方を含むものを用いることで、塩化ナトリウムを含む場合と同様に、イオン交換により溶出液のｐＨが低下することとなるが、この際、カルボキシ基を有する化合物（およびその塩）のカルボキシ基が低ｐＨ（４．０〜６．０程度）の領域において緩衝能を有しているため、溶出液のｐＨの低下を抑制することができる。そのため、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤３が溶解することに起因する吸着剤３の変質・劣化を的確に抑制することができることから、吸着剤（担体）３を長期に亘って繰り返し使用することができる。
【００７９】
カルボキシ基を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸の他、アミノ酸等が挙げられる。
【００８０】
また、芳香族カルボン酸としては、フタル酸、トリメリット酸、ピロメリット酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
脂肪族カルボン酸としては、特に限定されないが、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、琥珀酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、ピメリン酸等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８２】
これらの中でも、カルボキシ基を有する化合物としては、炭素を２つ以上備える脂肪族カルボン酸（直鎖状飽和モノカルボン酸）、であることが好ましい。
【００８３】
さらに、炭素を２つ以上備える脂肪族カルボン酸としては、酢酸であることが好ましい。ここで、酢酸の塩（酢酸塩）は、カルボキシ基を１つ有する１価の塩である。この酢酸塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有する溶離剤として機能すると推察されるため、緩衝液中に高濃度に含まれたとしても吸着剤３に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
【００８４】
なお、カルボキシ基を有する化合物の塩としては、例えば、かかる化合物のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００８５】
また、カルボキシ基を有する化合物およびその塩の合計の含有量は、カルボキシ基を有する化合物およびその塩が溶離剤として機能する範囲、すなわち、精製すべき精製タンパク質が吸着剤３から選択的に溶出する範囲内に設定されていればよいが、例えば、好ましくは０．１Ｍ以上、５Ｍ以下に設定され、より好ましくは１Ｍ以上、２Ｍ以下に設定される。これにより、吸着剤３に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
【００８６】
また、リン酸およびその塩のうち、リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。
【００８７】
さらに、リン酸およびその塩の合計の含有量は、特に限定されないが、例えば、好ましくは１．０ｍＭ以上、４００ｍＭ以下に設定され、より好ましくは１０ｍＭ以上、１００ｍＭ以下に設定される。これにより、吸着剤３に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
【００８８】
また、このような溶出液、すなわち、リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有する緩衝液は、そのｐＨが好ましくは５．５以上、８．０未満、より好ましくは６．５以上、７．５以下に設定される。これにより、精製すべき精製タンパク質の変質（変性）を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。また、吸着剤（担体）３の変質（溶解等）を好適に防止することができ、吸着装置１における分離能の変化を長期に亘って防止することもできるため、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。
【００８９】
さらに、溶出液（緩衝液）の温度は、特に限定されないが、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。これにより、精製タンパク質の変質（変性）を防止することができる。
【００９０】
さらに、溶出液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、精製タンパク質の精製を行うことにより、分離操作（精製操作）に長時間を要することなく、精製タンパク質と夾雑物とを確実に分離すること、すなわち、高純度に精製タンパク質を精製することができる。
【００９１】
以上のような操作により、所定の画分に、目的とする精製タンパク質が回収される。また、目的とする精製タンパク質が回収される画分とは異なる画分には、夾雑物が回収される。
【００９２】
以上、本発明の緩衝液および精製方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００９３】
例えば、本発明では、任意の目的で、工程［１］の前工程、各工程［１］、［２］同士の間に存在する中間工程、または工程［２］の後工程を追加するようにしてもよい。
【００９４】
さらに、前記工程［１−１］において挙げた、夾雑物の一部を除去して精製タンパク質を粗精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法を用いるのに代えて、吸着剤として陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂を備えるイオン交換クロマトグラフィー法を用いるようにしてもよい。
【００９５】
また、前記実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質を、精製タンパク質として精製する場合について説明したが、このようなタンパク質に限定されず、フィブリノゲン、ペプシノーゲンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質を、本発明によれば精製タンパク質として精製することができる。
【実施例】
【００９６】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・ハイドロキシアパタイトに対する溶出液の接触によるｐＨの影響
（実施例１Ａ）
−１−  まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ（ＣＨＴ ＴｙｐｅＩ、平均粒径４０μｍ、ＨＯＹＡ  Technosurgical社製）が吸着剤として約０．８ｇ充填された、カラム（サイズφ４．０ｍｍ×１００ｍｍ）を用意した。
【００９７】
−２−  次に、平衡化液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１５ＣＶ供給し、次いで、溶出液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０ＣＶ供給し、その後、洗浄液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で６．４ＣＶ供給して、カラム内から流出する流出液のｐＨを測定した。
【００９８】
なお、平衡化液には、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を、溶出液には、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を、さらに、洗浄液には、４００ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を、それぞれ用いた。
【００９９】
（比較例１Ａ）
溶出液として、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＮａＣｌとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を用いたこと以外は、前記実施例１Ａと同様にして、カラム内から流出する流出液のｐＨを測定した。
【０１００】
その結果、図２に示す通り、比較例１Ａでは、溶出液の供給にともないｐＨの低下が顕著に認められる結果を示したが、これに対して、実施例１Ａでは、溶出液の供給にともなうｐＨの低下が、比較例１Ａと比較して抑制された結果を示した。また、実施例１Ａでは、ｐＨが低下した後、比較例１Ａと比較して少ない溶出液の供給で元のｐＨ付近にまで戻る結果を示した。
【０１０１】
（実施例２Ａ）
−１−  まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ（ＣＨＴ ＴｙｐｅＩ、平均粒径４０μｍ、ＨＯＹＡ  Technosurgical社製）が吸着剤として約０．７ｇ充填された、カラム（サイズ４ｍｍＩ.Ｄ.×１００ｍｍ）を用意した。
【０１０２】
−２−  次に、溶出液を１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０ＣＶ供給して、カラム内から流出する流出液のｐＨを測定した。
【０１０３】
なお、溶出液には、５ｍＭ  ＭＥＳ（2−モルホリノエタンスルホン酸）と、８００ｍＭ  ＮａＣｌと、４００ｍＭ  ヒスチジンとを含む緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。
【０１０４】
（実施例３Ａ）
溶出液として、５ｍＭ  ＭＥＳ（2−モルホリノエタンスルホン酸）と、８００ｍＭ  ＮａＣｌと、１００ｍＭ  ヒスチジンとを含む緩衝液（ｐＨ６．５）を用いたこと以外は、前記実施例２Ａと同様にして、カラム内から流出する流出液のｐＨを測定した。
【０１０５】
（比較例２Ａ）
溶出液として、５ｍＭ  ＭＥＳ（2−モルホリノエタンスルホン酸）と、８００ｍＭ  ＮａＣｌとを含む緩衝液（ｐＨ６．５）を用いたこと以外は、前記実施例２Ａと同様にして、カラム内から流出する流出液のｐＨを測定した。
【０１０６】
その結果、図３に示す通り、比較例２Ａでは、溶出液の供給にともないｐＨの低下が顕著に認められる結果を示したが、これに対して、実施例２Ａ、３Ａでは、溶出液の供給にともなうｐＨの低下が、比較例２Ａと比較して抑制された結果を示し、特にこのような傾向は、４００ｍＭのヒスチジンを含有する実施例２Ａにおいてより顕著に認められた。
【０１０７】
・タンパク質等のハイドロキシアパタイトを用いた溶出液（緩衝液）による精製
［４ＳＴＤの精製］
（実施例１Ｂ）
−１−  まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ（ＣＨＴ ＴｙｐｅＩ、平均粒径４０μｍ、ＨＯＹＡ  Technosurgical社製）が吸着剤として約０．８ｇ充填された、カラム（サイズφ４ｍｍ×１００ｍｍ）を用意した。
【０１０８】
−２−  次に、カラム内に、１０ｍＭのＮａＰＢ（ｐＨ６．５）を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０分間供給することで洗浄して、カラム内を１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した。
【０１０９】
−３−  次に、前記工程−２−で得られたカラムに、ミオグロビン ５ｍｇ／ｍＬ、オバルブミン １０ｍｇ／ｍＬ、α−キモトリプシノーゲンＡ ５ｍｇ／ｍＬ、チトクロムＣ ５ｍｇ/ｍＬとなるように、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた試料（４ＳＴＤ試料）５０μＬを供給した。
【０１１０】
−４−  次に、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で３分間供給し、次いで、溶出液Ａおよび溶出液Ｂを、それらの容量比が溶出液Ｂが０％〜１００％に連続的に変化するように、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１５分間供給し、その後、４００ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で７分間供給して、カラム内から流出する流出液を１ｍＬずつ分画した。
【０１１１】
なお、溶出液Ａには、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を、溶出液Ｂには、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）をそれぞれ用いた。
【０１１２】
（参考例１Ｂ）
前記工程−４−において、溶出液Ｂとして、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＮａＣｌとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、参考例１Ｂにおいて４ＳＴＤ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１１３】
実施例１Ｂおよび参考例１Ｂにおける前記工程−４−において、それぞれ、測定された流出液の２８０ｎｍにおける吸光度を図４に示す。
【０１１４】
図４から明らかなように、実施例１Ｂと参考例１Ｂとの双方において、塩基性タンパク質、中性タンパク質、さらには酸性タンパク質の順でタンパク質が流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。
【０１１５】
［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の精製］
（実施例２Ｂ）
前記工程−３−において、前記工程−２−で得られたカラムに、ウシ血清アルブミン  １０ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた試料（ＢＳＡ試料）５０μＬを供給したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、参考例１ＢにおいてＢＳＡ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１１６】
（参考例２Ｂ）
前記工程−４−において、溶出液Ｂとして、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＮａＣｌとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は、前記実施例２Ｂと同様にして、参考例２ＢにおいてＢＳＡ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１１７】
実施例２Ｂおよび参考例２Ｂにおける前記工程−４−において、それぞれ、測定された流出液の２８０ｎｍにおける吸光度を図５に示す。
【０１１８】
図５から明らかなように、実施例２Ｂと参考例２Ｂとの双方において、溶出液Ａおよび溶出液Ｂによる溶出ではＢＳＡが流出液中には溶出しておらず、４００ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を供給することで初めて流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。
【０１１９】
［人免疫グロブリン（抗体；ＩｇＧ）の精製］
（実施例３Ｂ）
前記工程−３−において、前記工程−２−で得られたカラムに、ＩｇＧ  ２ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた試料（ＩｇＧ試料）５０μＬを供給したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、参考例３ＢにおいてＤＮＡ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１２０】
（参考例３Ｂ）
前記工程−４−において、溶出液Ｂとして、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＮａＣｌとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は、前記実施例３Ｂと同様にして、参考例３ＢにおいてＩｇＧ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１２１】
実施例３Ｂおよび参考例３Ｂにおける前記工程−４−において、それぞれ、測定された流出液の２８０ｎｍにおける吸光度を図６に示す。
【０１２２】
図６から明らかなように、実施例３Ｂと参考例３Ｂとの双方において、溶出液Ａおよび溶出液Ｂによる溶出により、ＩｇＧが流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。
【０１２３】
［サーモンＤＮＡの精製］
（実施例４Ｂ）
前記工程−３−において、前記工程−２−で得られたカラムに、サーモンＤＮＡ１ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた試料（ＤＮＡ試料）５０μＬを供給したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、参考例４ＢにおいてＤＮＡ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１２４】
（参考例４Ｂ）
前記工程−４−において、溶出液Ｂとして、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１Ｍ  ＮａＣｌとを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は、前記実施例４Ｂと同様にして、参考例４ＢにおいてＤＮＡ試料を、吸着装置を用いて精製した。
【０１２５】
実施例４Ｂおよび参考例４Ｂにおける前記工程−４−において、それぞれ、測定された流出液の２８０ｎｍにおける吸光度を図７に示す。
【０１２６】
図７から明らかなように、実施例４Ｂと参考例４Ｂとの双方において、溶出液Ａおよび溶出液Ｂによる溶出ではＤＮＡが流出液中には溶出しておらず、４００ｍＭリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液（ｐＨ６．５）を供給することで初めて流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。
【符号の説明】
【０１２７】
１            吸着装置
２            カラム
２０          吸着剤充填空間
２１          カラム本体
２２、２３    キャップ
２４          流入管
２５          流出管
３            吸着剤
４、５        フィルタ部材
【図１】
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【図２】
2016003192.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
2016003192.tif 000006
【図６】
2016003192.tif 000007
【図７】
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