(57)【要約】【課題】加齢に伴う皮膚の老化を改善又は防止し、健康な肌を維持することのできる皮膚外用剤等を開発する。【解決手段】グルコシルグリセリン酸又はその塩を有効成分とし、コラーゲン産生細胞のコラーゲン産生量を増加させて、組織のコラーゲン量を維持することのできるコラーゲン産生促進剤を提供する。【選択図】図１
2016003212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシルグリセリン酸又はその塩を有効成分とする、コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
前記グルコシルグリセリン酸が2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸である、請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
作用細胞が線維芽細胞である、請求項１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン産生促進剤を含有し、皮膚真皮層におけるコラーゲン量を増加させるアンチエンジング用化粧品。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン産生促進剤を含有する医薬組成物。
【請求項６】
皮膚真皮層におけるコラーゲン量を増加させ、老化による皮膚劣化の抑制又は改善に使用するグルコシルグリセリン酸及びその塩。
【請求項７】
前記グルコシルグリセリン酸が2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸である、請求項６に記載のグルコシルグリセリン酸及びその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生細胞に作用して、該細胞におけるコラーゲン産生量を促進させることのできる薬剤、及びそれを含有するアンチエンジング用化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本をはじめとする先進諸国では、近年高齢化社会を迎え、中高齢者人口が増加するのに伴い、アンチエイジングに対する意識が高まりつつある。特に加齢に伴う肌の張りや艶の喪失、及び皮膚表面の皺の増加等は、外観上の変化であるため、美容上の観点からその改善方法や進行の抑制方法の開発が強く求められている。
【０００３】
皮膚に見られる上記変化の主な原因は、皮膚真皮層におけるコラーゲンの老化による質的低下及び量的減少である。コラーゲンは、真皮層の約70％を占める線維性タンパクで、真皮内に存在する線維芽細胞によって生産され、皮膚の強度、保水性、及び弾力性等に関与している。真皮層中のコラーゲンは、加齢と共に糖付加、紫外線又は活性酸素等により変性する。また線維芽細胞自体のコラーゲン生産能の低下により、コラーゲンの代謝速度が鈍化する。真皮層中のコラーゲン量の減少は、老化の進行に伴い、コラーゲンの代謝回転において分解量が合成量を上回る結果生じると考えられている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ichihashi M., et. al., 2011, Anti-Aging Medicine 8(3): 23-29
【非特許文献２】Binic I., et al., 2013, Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 827248
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
線維芽細胞あたりのコラーゲン産生量を増加させることができれば老化によって減少した真皮層中のコラーゲンを補充することができる。またそれによってコラーゲン量の減少を原因とする肌の張りの喪失や皺を改善し、皮膚の老化を防止することも可能となる。
【０００６】
そこで、コラーゲン産生細胞のコラーゲン産生量を増加させることのできる剤を開発して、加齢に伴う皮膚の老化を改善又は防止し、健康な肌を維持することのできる皮膚外用剤等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、コラーゲンを産生するヒト皮膚線維芽細胞に様々な化合物を添加して、その効果を調べた。その結果、グルコシルグリセリン酸塩で処理したときにヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン生産量が未処理の細胞のそれと比較して有意に増加することを見出した。また、この機能は、グリセリン酸骨格やグルコースに由来するものではなく、グルコシルグリセリン酸（塩）特有の機能であることも判明した。
グルコシルグリセリン酸は、核酸やタンパク質等の生体分子をラジカル損傷や熱等の外部環境ストレスから保護する機能を有することが知られており、その保護機能がグリセリン酸骨格に由来するものであることも明らかとなっている（特開２０１３−２４５１７５号公報）。しかし、コラーゲン産生細胞に対してコラーゲン産生促進作用を有することはこれまで知られていなかった。本発明は、当該新規知見に基づくもので、以下を提供する。
【０００８】
（１）グルコシルグリセリン酸又はその塩を有効成分とする、コラーゲン産生促進剤。
（２）前記グルコシルグリセリン酸が2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸である、（１）に記載のコラーゲン産生促進剤。
（３）作用細胞が線維芽細胞である、（１）又は（２）に記載のコラーゲン産生促進剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤を含有し、皮膚真皮層におけるコラーゲン量を増加させるアンチエンジング用化粧品。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤を含有し、皮膚真皮層におけるコラーゲン量を増加させる医薬組成物。
（６）皮膚真皮層におけるコラーゲン量を増加させ、老化による皮膚劣化の抑制又は改善に使用するグルコシルグリセリン酸及びその塩。
（７）前記グルコシルグリセリン酸が2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸である、（６）に記載のグルコシルグリセリン酸及びその塩。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、コラーゲン産生細胞におけるコラーゲン産生量を増加させることができる。この効果により、本発明のコラーゲン産生促進剤を含有するアンチエンジング用化粧品は、老化によるコラーゲン量の減少に伴う皮膚の劣化を抑制、又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】GGAナトリウム添加による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量を示す図である。
【図２】GGAナトリウム添加による線維芽細胞の生存率を示す図である。
【図３】GAナトリウム添加による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量を示す図である。
【図４】グルコース添加による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．コラーゲン産生促進剤
１−１．概要
本発明の第１の態様は、コラーゲン産生促進剤である。本態様のコラーゲン産生促進剤は、有効成分が繊維芽細胞等のコラーゲン産生細胞に作用し、コラーゲン産生量を増加させることができる。
【００１２】
１−２．構成
本明細書において「コラーゲン産生促進剤」とは、コラーゲン産生細胞に作用し、無処理のコラーゲン産生細胞と比較してコラーゲン産生量を有意に増加させることのできる薬剤をいう。
【００１３】
本明細書において「コラーゲン産生細胞」とは、コラーゲン合成能を有する細胞をいう。例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、又は骨芽細胞が挙げられる。好ましいコラーゲン産生細胞は、皮膚真皮層に存在する線維芽細胞である。
【００１４】
コラーゲンには様々な種類が存在するが、本発明のコラーゲン産生促進剤によって産生量が増加するコラーゲンの種類は、特に制限はしない。好ましくはI型コラーゲンである
。
【００１５】
本態様のコラーゲン産生促進剤は、有効成分のみで構成され得る。本発明のコラーゲン産生促進剤の有効成分は、グルコシルグリセリン酸又はその塩である。
【００１６】
「グルコシルグリセリン酸」（glucosylglyceric Acid；本明細書ではしばしば「GGA」と表記する）は、グルコースによってグリコシル化されたグリセリン酸である。自然界では、好塩菌やシアノバクテリア等の細菌細胞内に存在し、主として細胞内の浸透圧を調節するオスモライトとして機能している（Roberts M.F., 2006, Method. Microbiol., 35: 615-647、Klahn S., et al., 2010, Environ. Microbiol., 12, 83-94）。
【００１７】
GGAは、構成するグルコース及び／又はグリセリン酸の光学（鏡像）異性体（エナンチ
オマー）、及びグルコースとグリセリン酸がグリコシド結合する位置によっていくつかの異性体が知られる。例えば、D-グルコースとD-グリセリン酸の1位の水酸基がα-グリコシド結合した1-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸、2位の水酸基がα-グリコシド結合した2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸、同様にD-グルコースとL-グリセリン酸の1位、及び2位の水酸基がそれぞれα-グリコシド結合した1-O-α-D-グルコピラノシル-L-グリセリン酸、及び2-O-α-D-グルコピラノシル-L-グリセリン酸、L-グルコースとD-
グリセリン酸の1位、及び2位水酸基がそれぞれα-グリコシド結合した1-O-α-L-グルコピラノシル-D-グリセリン酸、及び2-O-α-L-グルコピラノシル-D-グリセリン酸、及びL-グ
ルコースとL-グリセリン酸の1位、及び2位水酸基がそれぞれα-グリコシド結合した1-O-
α-L-グルコピラノシル-L-グリセリン酸、及び2-O-α-L-グルコピラノシル-L-グリセリン酸が挙げられる。さらに、上記8種類の異性体に対してグルコースとグリセリン酸がβ-グリコシド結合した異性体が挙げられる。本明細書ではいずれの異性体であってもよい。好ましくは以下の式（I）で示される2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸である。
【００１８】
【化１】
2016003212.tif 000003
【００１９】
「その塩」とは、GGAの塩基性付加塩をいう。塩基性付加塩には、例えば、ナトリウム
塩若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩若しくはブロカイン塩のような脂肪族アミン塩、Ｎ,Ｎ-ジベンジルエチレンジアミンのようなアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩若しくはイソキノリン塩のような複素環芳香族アミン塩、アルギニン塩若しくはリジン塩のような塩基性アミノ酸塩、アンモニウム塩又はテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩若しくはテトラブチルアンモニウム塩のような第４級アンモニウム塩が挙げられる。好ましいGGA塩は、ナトリウム塩である。
例えば、GGAが（I）で示される2-O-α-Dグルコピラノシル-D-グリセリン酸の場合、以下
の式（II）で示される2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸ナトリウムが挙げられる。
【００２０】
【化２】
2016003212.tif 000004
【００２１】
GGA又はその塩は、コラーゲン産生促進剤中でプロドラッグの形態であってもよい。こ
こでいう「プロドラッグ」は、生理学的条件下で化学変化を受け、結果的に活性形態であるGGA又はその塩に変化する化合物である。例えば、投与前は、GGA又はその塩とは異なる化合物であるが、皮膚表面に照射された光に含まれる紫外線の作用によって、又は消化管内で消化酵素の作用によって、上記のGGA又はその塩に変換されるものをいう。
【００２２】
１−３．効果
本態様のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生細胞に作用して、コラーゲン産生量を増加させることができる。この効果を利用して、以下の態様に挙げるコラーゲン量の増加を目的としたアンチエイジング用化粧品や医薬組成物の有効成分として利用できる。
【００２３】
２．アンチエンジング用化粧品
２−１．概要
本発明の第２の態様はアンチエイジング用化粧品である。本態様のアンチエイジング用化粧品は、皮膚表面に投与することで真皮層の線維芽細胞に作用し、真皮中のコラーゲン量を増加することができる。それによって、皮膚に保水力と弾力性を付与し、加齢によって生じる皮膚の弛みや皺を予防し、又はそれらを改善することができる。
【００２４】
２−２．構成
本態様のアンチエイジング用化粧品は、第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤を必須成分として含有する。その有効成分は、第１態様に記載のGGA又はその塩である。
【００２５】
本態様のアンチエイジング用化粧品は、2種類以上のGGA又はその塩を組み合わせて含有することもできる。例えば、GGAナトリウムとGGAカリウムの組み合わせや、2-O-α-D-グ
ルコピラノシル-D-グリセリン酸と2-O-α-L-グルコピラノシル-D-グリセリン酸の組み合
わせ等が挙げられる。
【００２６】
本態様のアンチエイジング用化粧品に配合される第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤の含有量は、有効成分の種類及び／又はその有効量、化粧商品の剤形、並びに後述する担体の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。本明細書において「有効量」とは、アンチエイジング用化粧品又は後述する第３態様の医薬組成物においてGGA又はその塩が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつ
それを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。ここで「有効成分としての機能」とは、コラーゲン産生細胞に作用し、コラーゲン産生量を増加させる機能である。この有効量は、被験者の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。ここで「被験者」とは、アンチエイジング用化粧品又は第３態様の医薬組成物の適用対象となる者をいう。また、「被験者の情報」とは、薬物組成物を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の年齢、体重、性別、全身の健康状態、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験者の情報等に応じて決定される。このように本発明のアンチエイジング用化粧品におけるコラーゲン産生促進剤の含有量は、条件より異なるが、通常はアンチエイジング用化粧品の0.001重量％〜30重量％の範囲にあればよい。
【００２７】
本態様のアンチエイジング用化粧品は、第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤に加えて、薬学的に許容可能な担体を包含することができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、化粧品製剤の技術分野において通常使用する添加剤をいう。溶媒及び賦形剤が該当する。
【００２８】
溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、薬学的に許容される油又は薬学的に許容される有機溶剤が挙げられるが、そのいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。薬学的に許容される油としては、小麦胚芽油、杏子油、オリーブオイル、椿油、イブニングプリムローズオイル、アロエベラオイル等の植物油が挙げられる。薬学的に許容される有機溶剤としては、エタノール等が挙げられる。
【００２９】
賦形剤には、例えば、乳化剤、pH調整剤、充填剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００３０】
乳化剤としては、界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、酢酸グリセリル、イソステアラミド、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル）が例として挙げられる。
【００３１】
pH調整剤には、アルカリ剤としての水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、また酸剤としての、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グリコール酸、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００３２】
充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【００３３】
上記の他にも、必要であれば可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、安定剤、吸収促進剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、緩衝剤、等張化剤、ビタミン剤等を適宜含むこともできる。
【００３４】
上記担体は、主として化粧品の剤形形成を容易にし、また剤形及び有効成分の薬効（活性）を維持するために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。
【００３５】
本態様のアンチエイジング用化粧品は、皮膚表面への塗布を通して使用する。したがって、化粧品の剤形は、経表皮投与に適した剤形にすればよい。例えば、液剤、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、ペースト剤（軟膏剤を含む）、ゲル剤、硬膏剤等が挙げられる。
【００３６】
本態様のアンチエイジング用化粧品は、加齢による皮膚の老化防止又はその改善用として適用されることから、適用対象部位は原則皮膚表面（表皮表面）である。したがって、投与方法は、前述したように全身又は局所の皮膚への塗布を介した経表皮投与である。
【００３７】
２−３．用途
本態様のアンチエイジング用化粧品は、有効成分であるGGA又はその塩の線維芽細胞に
対するコラーゲン産生促進効果に基づき、加齢によって減少した皮膚真皮層のコラーゲン量を補充することが原因で生じる皮膚の弛みや皺を改善し、またそれらの発症や再発を防止するアンチエイジングを目的としたスキンケア化粧品として使用することができる。
【００３８】
２−４．効果
本態様のアンチエイジング用化粧品は、皮膚真皮層中のコラーゲン量の減少を補充し、皮膚の弛みや皺を改善し、またそれらの発症や再発を防止することで健康な肌の状態を維持できる。
【００３９】
さらに、本態様のアンチエイジング用化粧品の有効成分であるGGA又はその塩は、前述
のようにオスモライトである。オスモライトは、細胞成分であるタンパク質やDNAを、熱
や光による変性から保護する機能を有していることが報告されており、健康的な肌を保つ効果も有する。したがって、本態様のアンチエイジング用化粧品は、皮膚に対してコラーゲン生産量の向上効果に加えて、オスモライトとしての効果を付与することができる。
【００４０】
３．医薬組成物
３−１．概要
本発明の第３の態様は医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、皮膚表面又は体内に投与することで、コラーゲン産生細胞に作用し、コラーゲン産生量を増加することができる。
【００４１】
３−２．構成
本態様の医薬組成物は、第２態様のアンチエイジング用化粧品と同様に、第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤を必須成分として含有する。その有効成分は、第１態様に記載のGGA又はその塩である。
【００４２】
本態様の医薬組成物は、2種類以上のGGA又はその塩を組み合わせて含有することもできる。例えば、GGAナトリウムとGGAカリウムの組み合わせや、2-O-α-D-グルコピラノシル-D-グリセリン酸と2-O-α-L-グルコピラノシル-D-グリセリン酸の組み合わせ等が挙げられる。
【００４３】
本態様の医薬組成物に配合される第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤の含有量は、有効成分の種類及び／又はその有効量、化粧品の剤形、並びに後述する担体の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤に加えて、必要に応じて製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製薬の技術分野において通常使用される人体に無害な又は毒性の極めて低い添加剤をいう。製薬上許容可能な担体は、前記第２態様のアンチエイジング用化粧品に記載の薬学的に許容可能な担体とほとんど同様なので、ここではその具体的な説明は省略する。
【００４５】
本態様の医薬組成物の剤形は、第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤の有効成分を不活化させず、投与後に生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば、特に限定しない。しかし、その剤形は、医薬組成物の投与法や処方条件等に左右され得る。一般に医薬組成物の投与法は、経口投与と非経口投与に大別できるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、さらに、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。また、非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は組織内投与、前記第２態様のアンチエイジング用化粧品と同じ経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、全身又は組織内投与に適した剤形としては、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、坐剤等を挙げることができる。各剤形の形状、大きさについては、いずれも当該分野で公知の剤型の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【００４６】
本態様の医薬組成物の製剤化は、製薬分野で公知の方法を利用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載の方
法を用いることができる。
【００４７】
本態様の医薬組成物における第１態様に記載のコラーゲン産生促進剤の含有量は、使用する有効成分の種類及び／又はその有効量（前述）、並びに医薬組成物の剤型（形態、大きさを含む）、添加する担体の種類によって異なり、それぞれの条件において適宜選択される。一例として、医薬組成物の剤形が錠剤であれば、1錠重量に対して通常0.001重量％〜30重量％のコラーゲン産生促進剤を含むことができる。
【００４８】
注射剤として調製する場合には、コラーゲン産生促進剤を薬学的に許容可能な担体である溶媒で溶解し、好ましくは血液と等張にした希釈剤を用いて当該分野で慣用されている方法により製造することができる。一投与単位の注射剤中に含有されるコラーゲン産生促進剤の含有量は、一投与単位あたり通常0.001％(w/v)〜30％(w/v)である。
【００４９】
３−３．用途
本態様の医薬組成物は、有効成分であるGGA又はその塩のコラーゲン産生細胞に対する
コラーゲン産生促進効果に基づき、コラーゲン補充用として、加齢や疾患等の様々な原因によって各組織におけるコラーゲン量が減少したことで発症した症状を緩和又は改善させる目的で様々な疾患に対して使用することができる。
【００５０】
３−４．効果
本態様の医薬組成物によれば、コラーゲン量の減少を原因とする疾患又は症状を緩和又は改善させることができる。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１：コラーゲン産生促進剤のコラーゲン産生細胞に対するコラーゲン産生促進作用＞
（目的）
コラーゲン産生細胞に対する本発明のコラーゲン産生促進剤のコラーゲン産生促進作用について検証する。
【００５２】
（方法）
コラーゲン産生促進剤の有効成分であるGGAナトリウムを合成した。GGAナトリウムの合成は、Sawangwan T. et al., 2009, Org. Biomol. Chem., 7, 4267-4270に記載の方法に
従い、スクロースとD-GAカルシウムを原料に、酵素反応により合成した。その後、超純水に50％濃度となるように溶解し、0.22μmフィルターで濾過滅菌した。これをGGAナトリウム溶液とした。
【００５３】
コラーゲン産生細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞初代培養細胞（エーセル）（29歳、日本人女性由来）を用いた。Dulbecco's modified Eagle's培地（DMEM)(ナカライテス
ク）に1% fetal bovine serum (FBS)(life technoligies)を添加した培地を96ウェルプレート（SUMILON）の各ウェルに入れ、1ウェルあたり5 × 103/100μLの前記線維芽細胞を
播種して、37℃、5% CO2下で24時間培養を行った。ウェルの培地を新しい培地（DMEM+1% FBS）に交換し、そこに前記GGAナトリウム溶液を終濃度0.001%、0.01%、0.1%、及び1%と
なるように添加して、37℃、5% CO2下で培養した。陰性対照は、GGAナトリウム溶液無添
加の線維芽細胞とした。
【００５４】
コラーゲンの産生促進効果は、72時間培養後の前記培養液の上清中に含まれるI型コラ
ーゲン量をHuman Collagen Type I ELISA kit (エーセル)を用いて定量した。定量方法は、まず、コラーゲン標準原液(200μg/mL)をもとに、反応緩衝液を用いて10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、及び0.15625μg/mLのコラーゲン標準溶液を調製した。次にコラーゲ
ン標準溶液及び培養上清と、ビオチン標識コラーゲン抗体溶液を9：1の割合になるように15 mL遠心チューブ（Corning）に入れて混合した。続いて、コラーゲン固相化マイクロプレート（SUMILON）を洗浄液で3回洗浄し、コラーゲン標準溶液及び培養上清とビオチン
標識コラーゲン抗体溶液の混合液をそれぞれのウェルに50μLずつ添加した。プレート
ミキサーで振とうしながら室温で60分間反応させた(一次反応）。ウェル内の溶液を除
去し、洗浄液で3回洗浄した後、HRP標識アビジン溶液を各ウェルに50μLずつ添加し、プ
レートミキサーで振とうしながら、室温で60分間反応させた（二次反応）。ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄した後、酵素基質溶液を各ウェルに50μLずつ添加し、遮光、室温下で15分間静置した(発色反応）。反応停止溶液を各ウェルに50μLずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和した後、プレートリーダー（Precision microplate reader; Molecular Devices）で各ウェルの吸光度（OD450)を測定した。標準曲線から培養上清中
のI型コラーゲン濃度を算出した。n=5で試験を行った。
【００５５】
また、各GGAナトリウム濃度における線維芽細胞の生存率を算出した。生細胞数の測定
は、培養24時間後の培養液中の生細胞数をCell Count Reagent SF（ナカライテスク）を
用いて測定した。いずれもn=5で試験を行った。
【００５６】
（結果）
GGAナトリウム処理による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量の結果を図１に、また生存率を図２に示す。いずれもGGAナトリウム無添加の陰性対照を100％としたときの相対量を示している。図１から、GGAナトリウムを0.001%〜1%の範囲で添加した条件ではいずれも
、19〜41%のI型コラーゲンの生産量増加が認められた。また、図２から、これら濃度範囲では陰性対照と線維芽細胞の生存率に有意差は見られず、細胞毒性が無いことが確認された。
【００５７】
＜実施例２：グリセリン酸ナトリウム又はグルコースのコラーゲン産生細胞に対するコラーゲン産生促進作用＞
（目的）
実施例１で用いたコラーゲン産生促進剤の有効成分であるGGAナトリウムのコラーゲン
産生細胞に対するコラーゲン産生促進作用の特異性を検証するために、GGAナトリウムを
構成するグリセリン酸ナトリウム（GAナトリウム）とグルコースのコラーゲン産生細胞に対するコラーゲン産生促進作用について検証する。
【００５８】
（方法）
基本的な方法は、実施例１に準じて行った。ただし、本実施例では、GGAナトリウムに
代えて、線維芽細胞の培養液にGAナトリウム又はグルコースを最終濃度0.001％、0.01％
、0.1％、及び1％で添加した。
【００５９】
（結果）
GAナトリウム処理による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量の結果を図３に、グルコー
ス処理による線維芽細胞のI型コラーゲン生産量の結果を図４にそれぞれ示す。いずれも
陰性対照と線維芽細胞のI型コラーゲン生産量に有意差は見られなかった。この結果は、
グルコースやGA（ナトリウム）には、コラーゲン産生促進作用はなく、実施例１で見られた線維芽細胞のI型コラーゲン産生促進作用が、GGA（ナトリウム）、すなわちGGA又はそ
の塩によることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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