(57)【要約】      （修正有）【課題】オリゴ糖について、ＳＥＣ分子量測定とＭＳ配列解析の同時測定が可能な分析方法を提供する。【解決手段】オリゴ糖を含む溶離液をサイズ排除クロマトグラフィーに供給し、サイズ排除クロマトグラフィーから溶出した溶離液の一部を検出器に供給して、オリゴ糖の分子量を分析すると同時に、残りの溶離液を質量分析計に供給して、オリゴ糖の構造を分析することを特徴とするオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖を含む溶離液をサイズ排除クロマトグラフィーに供給し、サイズ排除クロマトグラフィーから溶出した溶離液の一部を検出器に供給して、オリゴ糖の分子量を分析すると同時に、残りの溶離液を質量分析計に供給して、オリゴ糖の構造を分析することを特徴とするオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法。
【請求項２】
前記オリゴ糖が以下の化学式（１）〜（７）で表されるオリゴ糖の群から選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法。
【化１】
2016075507.tif 000008
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【化２】
2016075507.tif 000009
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【化３】
2016075507.tif 000010
（式中、ｎは２〜１０の整数である。）
【化４】
2016075507.tif 000011
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【化５】
2016075507.tif 000012
（式中、ｌ〜ｎはそれぞれ独立に２〜１０の整数である。なお、上記化学式（５）〜（７）に示す化合物において、糖の環の同一の炭素に結合している水素、水酸基、ヒドロキシメチル基及びグリコシド結合が、その位置を交換した異性体であっても差し支えない。）
【請求項３】
溶離液をスプリットバルブにより分割することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法。
【請求項４】
溶離液が、アセトニトリル及び／又はメタノールの有機溶媒、水及び酢酸アンモニウム及び／又はギ酸アンモニウムの揮発性有機塩からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖をサイズ排除クロマトグラフで測定した場合に得られる平均分子量及び分子量分布と、質量分析計で測定した場合に得られるＭＳ２スペクトルから導かれる糖鎖配列を、同時に分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類には１種の単糖から構成されるホモ多糖類、２種以上の単糖から構成されるヘテロ多糖類が存在し、多種多様な化合物群を構成している。多糖類のオリゴマーであるオリゴ糖には生理活性を持つものもあり、食品や化粧品等に利用される（非特許文献１）。
【０００３】
オリゴ糖の糖鎖配列は、食品や化粧品等における機能発現に影響を与える可能性があるが、オリゴ糖は多糖の加水分解によるデポリメリゼーションの過程で官能基の脱離等の副反応が起こることが考えられるため、配列既知のオリゴ糖であっても配列を解析することは重要である。
【０００４】
更に、多糖類の平均分子量及び分子量分布は粘度、浸透圧等の物性に影響を与えるパラメーターである。具体的には、分子量が大きくなると粘度は高くなり、浸透圧は低くなるため、平均分子量及び分子量分布は品質管理の面から監視すべき値である。
【０００５】
上記のような理由から、オリゴ糖混合物の全体像を把握する場合、配列情報とその平均分子量及び分子量分布情報の取得は必須である。しかし、従来の方法ではオリゴ糖のＭＳ（質量分析）配列解析とＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）分子量測定は、ＳＥＣとＭＳを同時に測定することが困難であったため、それぞれ別々に分析する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１８８４０号公報
【特許文献２】特開２００６−２９２６２７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Rapid Communications in Mass Spectrometry, 17, 576-582, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
オリゴ糖の生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングにおいて、配列情報とその平均分子量及び分子量分布情報の取得は重要である。
【０００９】
オリゴ糖の配列解析は、一般的にＮＭＲ（核磁気共鳴分光計）（特許文献１）やＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計）及びＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化−質量分析計）のＰＳＤ（ポストソース分解）法、ＣＩＤ（衝突誘起解離）法等を用いたＭＳ２（二段階質量分析）解析（特許文献２）により行われる。ＮＭＲによる構造解析は、試料を多量に必要とし、混合物であるとバルクの組成を反映した結果しか得られない問題点がある。ＭＳ２解析は、事前にＳＥＣ等のクロマトグラフィーにより分取を行うなどの成分毎の単離が必要など、操作の段階が多く、煩雑である。
【００１０】
通常、オリゴ糖の平均分子量及び分子量分布はＳＥＣから算出されるが、オリゴ糖の多くはＵＶ吸収を持たないため、化合物の構造に依らず検出可能な汎用検出器を選択する必要がある。ＳＥＣの汎用検出器には、リファレンスセルすなわち溶離液との屈折率の差により測定成分を検出するＲＩＤ（示差屈折率検出器）、溶離液を蒸発させ微粒子化した測定成分の散乱光を測定するＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）、溶離液を蒸発させ荷電微粒子化した測定成分の電荷を測定するＣＡＤ（荷電化粒子検出器）等が市販されている。これらの検出器を用いた場合、分子量標準物質を用いた較正曲線から相対分子量を算出する。絶対分子量を求める場合は、ＳＥＣの検出器としてＭＡＬＳ（多角度光散乱検出器）を用い、溶離液中の測定成分の光散乱強度から絶対分子量を算出する。
【００１１】
オリゴ糖の配列と平均分子量及び分子量分布を求める際、上記の分取−ＭＳ測定及びＳＥＣ測定をそれぞれ行う必要があるが、生体由来試料の場合、試料量が極微量しか得られない可能性もあり、測定装置への注入回数を可能な限り少なくしたいことが多い。しかし、現状では１）ＭＳ配列解析のためにクロマトグラフィー分取を少なくとも１回行い、取得した分画をＭＳ測定、また２）分子量測定のためにＳＥＣ測定を少なくとも１回実施する必要があり、オリゴ糖のＭＳ配列解析とＳＥＣ分子量測定を同時に一回の測定で実行することは困難であった。
【００１２】
すなわち、ＳＥＣとＭＳを直接接続することを考えた際、幅広い化合物に感度を持つ汎用検出器であるＲＩＤやＥＬＳＤ、ＣＡＤを用いると、ＲＩＤはセルの耐久性の問題から高い背圧がかかるＭＳ直列接続は困難であり、ＥＬＳＤやＣＡＤは溶離液を噴霧して検出するため、後段のＭＳ接続は不可能である。
【００１３】
ＵＶＤ（紫外可視分光検出器）やＭＡＬＳを検出器として用いる場合は、検出器とＭＳを直列に接続することによりＳＥＣとＭＳの同時測定が可能である。しかしＵＶＤはＵＶ吸収のある化合物にしか感度を持たず、またＭＡＬＳには検出成分の分子量が低いと感度が低くなる特徴があり、どちらもオリゴ糖を満遍なく検出できる検出器とはいえず、使用に適さない。
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、オリゴ糖について、ＳＥＣ分子量測定とＭＳ配列解析の同時測定が可能な分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、酵素による生化学的手法又は酸加水分解などの化学的手法により多糖類を分解したオリゴ糖について、ＳＥＣにスプリットバルブを接続し流路を分岐させて、一方にＳＥＣ用検出器、他方にＭＳを接続することにより定性するもので、平均分子量及び分子量分布、並びに糖鎖配列を同時分析する方法に関するものである。
【００１６】
すなわち、本発明は、オリゴ糖を含む溶離液をＳＥＣに供給し、ＳＥＣから溶出した溶離液の一部を検出器に供給して、オリゴ糖の分子量を分析すると同時に、残りの溶離液をＭＳに供給して、オリゴ糖の構造を分析することを特徴とするオリゴ糖の分子量と構造を同時に分析する方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、オリゴ糖のＭＳ配列解析のための分画精製及びＳＥＣ分子量測定を目的として、少なくとも２回ＳＥＣ分析を行うことなく、１回で測定が可能となる。生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングにおいて、少なくとも１／２の分析時間の短縮及び測定試料量の削減に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１で得られたＨＡ（ヒアルロン酸）オリゴ糖のＳＥＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】実施例１で得られたＨＡ４糖のＭＳスペクトルを示す図である。
【図３】実施例１で得られたＨＡ４糖のＭＳ２スペクトルを示す図である。
【図４】実施例１で得られたＨＡ６糖のＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】実施例１で得られたＨＡ６糖のＭＳ２スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
本発明のオリゴ糖分析方法は、スプリットバルブによってＳＥＣ検出器及びＭＳに流路分岐したＳＥＣを用いることを特徴とする。
【００２１】
被験オリゴ糖は、スプリットバルブによってＳＥＣ検出器及びＭＳに流路分岐したＳＥＣによって分析される。測定液は、オリゴ糖を溶離液で濃度０．１％程度に希釈したものが好ましい。
【００２２】
ＳＥＣに用いる溶離液は、水−有機溶媒混合系に揮発性塩を添加したものが好ましく、水−有機溶媒の混合比が８対２程度のものが特に好ましい。有機溶媒はアセトニトリル及び／又はメタノールが好ましい。揮発性塩は１０ｍＭ程度の酢酸アンモニウム及び／又はギ酸アンモニウムが好ましい。
【００２３】
ＳＥＣの分離カラムは親水性ビニルポリマーを基材とした充填剤を用いた水系ＳＥＣカラムが好ましい。例えばＴＳＫ−ＧＥＬ  ＰＷＸＬシリーズ（東ソー株式会社製）等の一般的な市販の水系ＳＥＣカラムを使用して行うことができる。ＳＥＣにて分子量標準を測定し、較正曲線から算出することで、オリゴ糖の換算平均分子量及び分子量分布を測定することができる。
【００２４】
スプリットバルブは最大０．１ｍｌ単位で流量調節可能であり、内部ボリュームが充分小さなものが好ましい。例えばミクロスプリッターバルブ（ジーエルサイエンス株式会社製）等の一般的な市販のスプリットバルブを使用して行うことができる。
【００２５】
ＳＥＣの検出器は、検出成分（オリゴ糖及び分子量標準試料）の分子構造によらず検出可能な汎用検出器が好ましい。具体的には、ＲＩＤやＥＬＳＤ、ＣＡＤ等の市販装置が使用できる。
【００２６】
ＭＳは、任意の質量分析計、すなわちセクター型ＭＳ、Ｑ−ＭＳ（四重極型質量分析計）、ＴＯＦ−ＭＳ（飛行時間型質量分析計）、ＩＴ−ＭＳ（イオントラップ型質量分析計）、ＦＴ−ＭＳ（フーリエ変換型質量分析計）、タンデム型ＭＳの市販装置が使用できる。イオン化法はＥＳＩが好ましい。ＳＥＣにより分離されたオリゴ糖はスプリットバルブを経由してイオン源でイオン化され、各種原理により質量分離されることでＭＳスペクトルが得られる。
【００２７】
ＭＳ２スペクトルはＣＩＤ法、特にスキマーＣＩＤ法を用いるのが好ましい。スキマーＣＩＤ法はキャピラリーとスキマー間における電位差を利用したＣＩＤ法の一種であり、前駆イオンを選択せずにＭＳ２を行う手法である。本発明の分析方法は１回の測定でＭＳとＭＳ２を同時に行えるという利点がある。
【００２８】
上記のようにして得られたＭＳスペクトルから分子量を、ＭＳ２スペクトルから配列を解析する。つまり、ＭＳ２による前駆イオンと生成イオン、また生成イオンと別の生成イオンとの質量差から、オリゴ糖の構成単位を推定する。
【００２９】
本発明によって分析されるオリゴ糖とは、下記の化学式（１）〜（７）で表されるオリゴ糖である。
【００３０】
化学式（１）で表されるオリゴ糖は、ＨＡを分解して得られるオリゴ糖である。
【００３１】
化学式（２）で表されるオリゴ糖は、コンドロイチンを分解して得られるオリゴ糖である。
【００３２】
化学式（３）で表されるオリゴ糖は、キチンを分解して得られるオリゴ糖である。
【００３３】
化学式（４）で表されるオリゴ糖は、アガロースを分解して得られるオリゴ糖である。
【００３４】
化学式（５）〜（７）で表されるオリゴ糖は、直鎖状ホモグリカンを分解して得られるオリゴ糖である。
【００３５】
【化１】
2016075507.tif 000002
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【００３６】
【化２】
2016075507.tif 000003
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【００３７】
【化３】
2016075507.tif 000004
（式中、ｎは２〜１０の整数である。）
【００３８】
【化４】
2016075507.tif 000005
（式中、ｎは１〜５の整数である。）
【００３９】
【化５】
2016075507.tif 000006
（式中、ｌ〜ｎはそれぞれ独立に２〜１０の整数である。なお、上記化学式（５）〜（７）に示す化合物において、糖の環の同一の炭素に結合している水素、水酸基、ヒドロキシメチル基及びグリコシド結合が、その位置を交換した異性体であっても差し支えない。）
【００４０】
ＨＡ４糖について例を示すと、図２に示すように、ＭＳスペクトルから分子量関連イオン（ｍ／ｚ  ７７５．２）が検出され、分子量７７６のグルクロン酸２分子、Ｎ−アセチルグルコサミン２分子から構成されるＨＡであることが判明した。次に図３に示すように、ＭＳ２スペクトルから分子量関連イオン（ｍ／ｚ  ７７５．２）の他に、ｍ／ｚ  ５７２．２、３９６．１、１９３．０の生成イオンが検出された。これらの質量差は、それぞれｍ／ｚ  ２０３、１７６、２０３であり、その間隔はＮ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸単位に相当する。よって、ＨＡオリゴ糖の配列はＭＳ２スペクトルから解析可能である。また、より長鎖のオリゴ糖に関しても、ＳＥＣにより分離すれば同様にＭＳ２スペクトルから配列を解析可能ということは充分に予測される範囲内である。
【００４１】
本発明により、オリゴ糖のＭＳ配列解析のための分画精製及びＳＥＣ分子量測定を目的として、少なくとも２回ＳＥＣ分析を行うことなく１回の測定でデータ取得が可能となり、少なくとも１／２の分析時間の短縮及び測定試料量の削減に有用である。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例により、本願発明を説明するが、実施例によって本願発明は何等限定されるものではない。
【００４３】
（ＨＡオリゴ糖の上澄み液の調製）
以下の方法で、ＨＡオリゴ糖を調製した。
【００４４】
腺疫菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ由来のヒアルロン酸ナトリウム塩（シグマ）を２０ｍｇ秤量し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）（１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）に溶解した。ここへウシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ）を１２．５ｍｇ添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。
【００４５】
その後、ブロックヒーター（１２０℃）で加熱し反応を停止させた後、沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５℃、３０分）によって除去し、上澄み液を回収した。
【００４６】
実施例１
以下の方法で、上記上澄み液を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー質量分析を実施した。
【００４７】
当該上澄み液を酢酸アンモニウムを添加した水−アセトニトリル系溶離液で１０倍希釈し、測定液とした。
【００４８】
次に、スプリットバルブにて流路を分岐させ一方にＣＡＤ、他方にＴＯＦ−ＭＳを接続したＳＥＣ装置を用いて、表１に記載した条件により測定液を分析した。
【００４９】
【表１】
2016075507.tif 000007
【００５０】
ＣＡＤによる測定結果を図１に示した。デキストラン換算による平均分子量及び分子量分布を図１中に示した。
【００５１】
ＨＡ４ｍｅｒのＭＳスペクトルを図２に、ＨＡ４ｍｅｒのＭＳ２スペクトルを図３に示した。図３に示すように、オリゴ糖の配列を示す規則性の高いスペクトル・パターンが得られた。
【００５２】
また、ＨＡ６ｍｅｒのＭＳスペクトルを図４に、ＨＡ６ｍｅｒのＭＳ２スペクトルを図５に示した。図５に示すように、ＨＡ４ｍｅｒと同様に、オリゴ糖の配列を示す規則性の高いスペクトル・パターンが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により可能となったオリゴ糖のＳＥＣによる平均分子量及び分子量分布測定、並びにＭＳによる配列解析の同時測定方法は、オリゴ糖の新しい分析方法として広範に使用される可能性を有する。
【図１】
2016075507.tif 000013
【図２】
2016075507.tif 000014
【図３】
2016075507.tif 000015
【図４】
2016075507.tif 000016
【図５】
2016075507.tif 000017