(57)【要約】【課題】優れたＭＭＰ阻害効果を有し、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防・治療に有用なマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を提供すること。【解決手段】環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【化１】
2016003206.tif 000010
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｘ及びＹはそれぞれ独立に、酸素原子、又はメチレン基を示すが、Ｘ及びＹが同時にメチレン基になることはない。Ｍは、水素原子又はアルカリ金属原子である。）
【請求項２】
式（１）において、Ｘ及びＹが酸素原子である、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
式（１）において、Ｘ又はＹの一方が酸素原子であり、他方がメチレン基である、請求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
式（１）で示される化合物が、１−オレオイル環状チジン酸又は１−パルミトオレオイル環状ホスファチジン酸及びそれらの誘導体のカルバ環状ホスファチジン酸である、請求項１から３の何れか1項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を有効成分とする、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項６】
下記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進を有する細胞にインビトロで投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ活性をインビトロで阻害する方法。
【化２】
2016003206.tif 000011
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｘ及びＹはそれぞれ独立に、酸素原子、又はメチレン基を示すが、Ｘ及びＹが同時にメチレン基になることはない。Ｍは、水素原子又はアルカリ金属原子である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ホスファチジン酸又はカルバ環状ホスファチジン酸を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、ＭＭＰという）は、ほとんどの哺乳類に見出される亜鉛含有プロテアーゼであり細胞外マトリックスの分解に関与する。このためＭＭＰの過剰発現及び活性化、あるいはＭＭＰとＭＭＰ阻害蛋白（ＴＩＭＰ）間の不均衡は、細胞外マトリックス又は結合組織の破壊に関連した疾患の病原因子として示唆されている。ＭＭＰは現在３０種以上知られている。大別すると、コラゲナーゼタイプ（ＭＭＰ−１、８、１３、１８）、ゼラチナーゼタイプ（ＭＭＰ−２、９）、ストロームライシンタイプ（ＭＭＰ−３、１０、１１）、膜結合タイプ（ＭＭＰ−１４、１５、１６、１７）及びマトリライシンタイプ（ＭＭＰ−７）などがある。これらの酵素は、結合組織の破壊に起因する多数の疾患、例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎若しくは歯肉炎等の炎症性疾患、骨粗鬆症、角膜上皮潰瘍、多発性硬化症、歯周病及び胃潰瘍、アテローム硬化症、再狭窄及び虚血性心不全を生じる新生内膜増殖、血管新生ならびに癌の転移、浸潤、増殖のような疾患に関連づけられてきた。またこうした疾患を予防もしくは治療するための方法は、マトリックスメタロプロテアーゼ酵素を抑制し、それにより疾患状態を生じる結合組織の破壊を縮小、もしくは阻害することにより可能と考えられ、様々なＭＭＰ阻害剤が開発されている（非特許文献１）。例えば、リン脂質とグリコサミノグリカンとの結合体（特許文献１）、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体とＭＭＰ２阻害剤を含有する皮膚外用剤（特許文献２）が知られている。
【０００３】
本発明者らは、特定の環状ホスファチジン酸誘導体及びそれらの塩が、間接リウマチや変形性関節等の関節症（特許文献３）、アトピー性皮膚炎（特許文献４）、及び癌の転移及び浸潤の抑制（特許文献５）等に優れた予防・治療効果を有することを見出しているが、環状ホスファチジン酸誘導体及びそれらの塩が、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することは知られていなかった。また、特許文献２には、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体とＭＭＰ２阻害剤との併用により、肌の弾力・張りの向上やシワの改善等の効果を発揮できることが記載されているが、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体のＭＭＰ活性阻害効果については全く記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１２−５２６７９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−２０２６６７号公報
【特許文献３】特許第５４６５８１５号公報
【特許文献４】特開２０１２−０５６８５３号公報
【特許文献５】特許第４１６３００７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．１１  ｐ２９１１−２９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、優れたＭＭＰ阻害効果を有し、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防・治療に有用なマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特定の環状ホスファチジン酸誘導体及びそれらの塩が、変形関節症モデル動物において細胞外マトリックス又は結合組織の破壊を顕著に抑制することに着目し鋭意研究を続けた結果、培養した滑膜細胞において、ＭＭＰ活性を顕著に阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、下記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤が提供される。
【０００９】
【化１】
2016003206.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｘ及びＹはそれぞれ独立に、酸素原子、又はメチレン基を示すが、Ｘ及びＹが同時にメチレン基になることはない。Ｍは、水素原子又はアルカリ金属原子である。）
【００１１】
好ましくは、式（１）において、Ｘ及びＹが酸素原子である。
好ましくは、式（１）において、Ｘ又はＹの一方が酸素原子であり、他方がメチレン基である。
好ましくは、式（１）で示される化合物は、１−オレオイル環状ホスファチジン酸又は１−パルミトオレオイル環状ホスファチジン酸及びそれらの誘導体のカルバ環状ホスファチジン酸である。
【００１２】
本発明によればさらに、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進を有する細胞にインビトロで投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ活性をインビトロで阻害する方法が提供される。
本発明によればさらに、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進を有する患者に投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ活性の阻害方法が提供される。
本発明によればさらに、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩を、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患を有する患者に投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防及び／又は治療方法が提供される。
【００１３】
本発明によればさらに、マトリックスメタロプロテアーゼ活性の阻害において使用するための、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩が提供される。
本発明によればさらに、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防及び／又は治療において使用するための、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩が提供される。
本発明によればさらに、マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤の製造のための、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩の使用が提供される。
本発明によればさらに、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、上記式（１）で示される環状ホスファチジン酸誘導体又はその塩の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞外マトリックス又は結合組織の破壊を抑制し、マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患に対し予防・治療効果の高いマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＭＭＰ−３の発現比を示す。各欄において左側はサイトカインのみを示し、右側がサイトカインとｃＰＡを投与した場合（サイトカイン後にｃＰＡを添加、又はサイトカインとｃＰＡを同時添加）を示す。
【図２】図２は、ＡＤＡＭＴＳ４及びＡＤＡＭＴ５の発現比［サイトカイン（２４時間）＋ｃＰＡ（２４時間）：合計４８時間］を示す。各欄において左側はサイトカインのみを示し、右側がサイトカインとｃＰＡを投与した場合を示す。
【図３】図３は、ＡＤＡＭＴＳ４及びＡＤＡＭＴ５の発現比［サイトカイン＋ｃＰＡ（２４時間）］を示す。各欄において左側はサイトカインのみを示し、右側がサイトカインとｃＰＡを投与した場合を示す。
【図４】図４は、ＴＩＭＰ−３の発現比を示す。各欄において左側はサイトカインのみを示し、右側がサイトカインとｃＰＡを投与した場合（サイトカイン後にｃＰＡを添加、又はサイトカインとｃＰＡを同時添加）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について更に具体的に説明する。
用語「マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤」は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）がその生理作用を有するのを低下、制限及び／又は抑制する物質又は化合物を意味するものとして本明細書で使用する。即ち、阻害剤は、ＭＭＰによる細胞外マトリックス分子の酵素的消化を低下、制限及び／又は抑制する。「マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤」はまた、ＭＭＰの産生又は分泌を抑制又は低下し、ＭＭＰを変性し、ＭＭＰを局在させる物質又は化合物、あるいは上記したＭＭＰ活性の負の調節物質を意味する。好ましいＭＭＰ活性阻害剤は、細胞によるＭＭＰ産生を抑制する。例えば、阻害剤は、ＭＭＰ遺伝子の発現を抑制し、ＭＭＰが発現した細胞からＭＭＰの分泌をなくし、あるいはチモーゲンからの活性ＭＭＰの形成を防止する。
【００１７】
本明細書で言うマトリックスメタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼと称されるプロテアーゼの何れか１以上を意味し、例えば、コラゲナーゼタイプ（ＭＭＰ−１、８、１３、１８）、ゼラチナーゼタイプ（ＭＭＰ−２、９）、ストロームライシンタイプ（ＭＭＰ−３、１０、１１）、膜結合タイプ（ＭＭＰ−１４、１５、１６、１７）及びマトリライシンタイプ（ＭＭＰ−７）などを挙げることができ、上記の中でも特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３などを挙げることができ、一例としてはＭＭＰ−３を挙げることができるが、特にこれらに限定されない。
【００１８】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤は、骨粗鬆症、角膜上皮潰瘍、多発性硬化症、歯周病及び胃潰瘍、アテローム硬化症、再狭窄及び虚血性心不全を生じる新生内膜増殖等のマトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防及び／又は治療のために使用することができ、環状ホスファチジン酸誘導体（環状ホスファチジン酸又はカルバ環状ホスファチジン酸）又はそれらの塩を有効成分として含む。環状ホスファチジン酸誘導体（環状ホスファチジン酸又はカルバ環状ホスファチジン酸）又はそれらの塩としては本発明の効果を示すものであれば特に限定されないが、好ましくは、下記式（Ｉ）で示される化合物を使用することができる。
【００１９】
【化２】
2016003206.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｘ及びＹはそれぞれ独立に、酸素原子、又はメチレン基を示すが、Ｘ及びＹが同時にメチレン基になることはない。Ｍは、水素原子又はアルカリ金属原子である。）
【００２１】
式（Ｉ）において、置換基Ｒが示す炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基などが挙げられる。
【００２２】
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。
【００２３】
置換基Ｒが示す炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。
【００２４】
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、1個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。
【００２５】
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。
【００２６】
従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。
【００２７】
置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジ
ル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。
【００２８】
Ｒは、好ましくは、炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基である。Ｒは、さらに好ましくは、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又は炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である。Ｒは、特に好ましくは、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である。
【００２９】
一般式(１)で示される化合物中のＸ及びＹはそれぞれ独立に、酸素原子（−Ｏ−）又はメチレン基（−ＣＨ2−）を示すが、Ｘ及びＹが同時にメチレン基になることはない。即ち、Ｘ及びＹの組み合わせは以下の３通りである。
（１）Ｘが酸素原子であり、Ｙが酸素原子である。
（２）Ｘが酸素原子であり、Ｙがメチレン基である。
（３）Ｘがメチレン基であり、Ｙが酸素原子である。
【００３０】
式（Ｉ）で示される環状ホスファチジン酸誘導体中のＭは、水素原子又はアルカリ金属原子である。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、ナトリウムが特に好ましい。
【００３１】
本発明で用いられる式（１）で示される化合物の具体例としては、１位アシル基として、Ｒが炭素原子数１７のアルケニル基であるオレオイル基（Ｃ１８：１と略す）、 Ｒが炭素原子数１５のアルケニル基であるパルミトオレオイル基（Ｃ１６：１と略す）を有する環状ホスファチジン酸及びカルバ環状ホスファチジン酸誘導体が特に好ましい。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物はその置換基の種類に応じて、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が存在する場合があるが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内のものである。
【００３３】
また、式（Ｉ）の化合物は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の範囲内のものである。さらに、式（Ｉ）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の範囲内のものである。
【００３４】
一般式(１)で示される化合物のうちＸ及びＹが酸素原子である化合物は、例えば、特開平５−２３００８８号公報、特開平７−１４９７７２号公報、特開平７−２５８２７８号公報、特開平９−２５２３５号公報に記載の方法等に準じて化学的に合成することができる。
【００３５】
また、一般式(１)で示される化合物のうちＸ及びＹが酸素原子である化合物は、特開２００１−１７８４８９号公報に記載の方法に準じてリゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによって合成することもできる。ここで用いるリゾ型リン脂質は、ホスホリパーゼＤを作用しうるリゾ型リン脂質であれば特に限定されない。リゾ型リン脂質は多くの種類が知られており、脂肪酸種が異なるもの、エーテル又はビニルエーテル結合をもった分子種などが知られており、これらは市販品として入手可能である。ホスホリパーゼＤとしては、キャベツや落花生などの高等植物由来のものやStreptomyces chromofuscus, Actinomadula sp.などの微生物由来のものが市販試薬として入手可能であるが、Actinomadula sp. No.362由来の酵素によって極めて選択的に環状ホスファチジン酸が合成される（特開平１１−３６７０３２号明細書）。リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されないが、例えば、塩化カルシウムを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５〜６程度）中で室温から加温下（好ましくは３７℃程度）で１から５時間程度反応させることにより行う。生成した環状ホスファチジン酸誘導体は、常法に準じて、抽出、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより精製することができる。
【００３６】
また、  一般式(１)で示される化合物のうちＸが酸素原子であり、Ｙがメチレン基である化合物は、文献記載の方法（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４，４０４７−４０５０（１９９３））に準じて合成することができ、また国際公開ＷＯ２００２／０９４２８６号公報に記載の方法により合成することができる。具体的な合成経路の一例を以下に示す。
【００３７】
【化３】
2016003206.tif 000004
【００３８】
上記においては、先ず、市販の(R)-ベンジルグリシジルエーテル(1)をBF3・Et2Oで活性化させ、メチルホスホン酸ジメチルエステルにn-BuLiを作用させて得られるリチオ体を反応させることでアルコール(2)を得る。
得られたアルコールを、トルエン中で過剰のp-トルエンスルホン酸のピリジニウム塩を用いて80℃で反応させることにより、環化体(3)を得る。この環化体を、水素雰囲気下で20% Pd(OH)2-Cを用いて加水素分解し、脱ベンジル化を行う(4)。縮合剤として1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を用いて、脂肪酸と反応させてカップリング体(5)を得る。次に、求核剤としてブロモトリメチルシランを用いて、メチル基だけを位置選択的に除去し、環状ホスホン酸(6)を得る。これをエーテルを用いて分液ロートに移しこみ、少量の0.02Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、分液操作を行い、ナトリウム塩(7)として目的化合物を抽出、精製する。
【００３９】
また、一般式(１)で示される化合物のうちＸがメチレン基であり、Ｙが酸素原子である化合物は、特開２００４−０１０５８２号公報又は国際公開ＷＯ０３／１０４２４６号公報に記載の方法により合成することができる。
【００４０】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤は、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である式（１）で示される化合物とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
【００４１】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤は、種々の形態で投与することができるが、好適な投与形態としては、経口投与でも非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）でもよい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の剤形はこれらに限定されることはない。さらに、公知の技術によって持続性製剤とすることもできる。
【００４２】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、pH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
【００４３】
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、D-マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００４４】
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、界面活性剤等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン,等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のpH調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
【００４５】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤はヒトなどの哺乳動物に投与することができる。
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μg／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与してもよい。
【００４６】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【００４７】
（１）被験化合物
被験化合物としては、（９Ｚ）−９−オクタデセン酸−（２−ヒドロキシ−２−オキシド−１，２−オキサホスホラン−４−イル）メチルエステルナトリウム塩：C18:1-cPA（以下、ｃＰＡと略記する）を使用した。
【化４】
2016003206.tif 000005
【００４８】
（２）細胞の処理
変形性膝関節症の患者より人工膝関節置換術時に除去採取した関節硝子軟骨を用いた。関節軟骨片は洗浄後、プロナーゼ・コラゲナーゼ酵素処理により軟骨基質を分解、細胞を採取し培養、凍結保存した。また、滑膜細胞も採取した。本実施例ではそのような変形性関節症患者の関節軟骨細胞及び滑膜細胞を用い、形質変化を避けるために単層高密度にて培養し実験に用いた。培地はDMEM + 10%FBS+1%antibiotics/antifungusを用い、confluent後無血清培地に代えた。
滑膜細胞を１２ウエルプレートに播種し、ウシ胎児血清を含む培養液にてコンフルエントになるまで培養した後、ｃＰＡ、ＩＬ−１β、及びＴＮＦαの何れか１以上を含む各培養液にて一定時間培養した。ｃＰＡの濃度は２５μＭであり、ＩＬ−１βの濃度は１ｎｇ／ｍＬであり、ＴＮＦαの濃度は１０ｎｇ／ｍＬである。ＩＬ−１β及び／又はＴＮＦα
を含む培養液にて２４時間培養した後、ｃＰＡを含む培養液にて２４時間培養行う実験（ｓｙｔｏｋｉｎｅ後ｃＰＡ）と、ＩＬ−１β及び／又はＴＮＦαとｃＰＡを含む培養液にて２４時間培養を行う実験（同時添加）とを行った。コントロールとしては、ｃＰＡ、ＩＬ−１β、及びＴＮＦαの何れも含まない培養液にて実験を行った。
【００４９】
上記した所定時間の培養後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いて細胞よりＲＮＡを抽出した。細胞より抽出したＲＮＡを用いて、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ法により、ＭＭＰ−３、ＡＤＭＴＳ４、ＡＤＭＴＳ５、及びＴＩＭＰ−３の発現量を定量した。定量の結果を、表１から表４、及び図１から図４に示す。表１から４に記載の各結果をグラフにしたものが図１から図４である。
【００５０】
表１から表４及び図１から図４に示す通り、サイトカインにより誘導されるＭＭＰ−３、ＡＤＭＴＳ４、ＡＤＭＴＳ５、及びＴＩＭＰ−３の発現亢進がｃＰＡの投与により抑制されることが示された。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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