(57)【要約】      （修正有）【課題】荷電粒子顕微鏡法で使用する機能化された試料支持体を提供する。【解決手段】試料支持体は、荷電粒子顕微鏡を用いて試料を調べている間、試料を支持するように構成された試料支持体表面を含む。この試料支持体表面は機能化された部位を有し、機能化された部位はそれぞれ、付着、引力またはそれらの組合せによって、試料を機能化された部位に維持するように構成されている。【選択図】図１０Ｂ
2016035450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電粒子顕微鏡法で使用する機能化された試料支持体であって、荷電粒子顕微鏡を用いて試料を調べている間、前記試料を支持するように構成された試料支持体表面を含み、前記試料支持体表面が機能化された部位を含み、前記機能化された部位が、付着、引力またはそれらの組合せによって、前記試料の位置を、前記機能化された部位に維持するように構成された、機能化された試料支持体。
【請求項２】
前記機能化された部位が第１の機能化された部位であり、前記機能化された試料支持体がさらに、
前記第１の機能化された部位を含む機能化された複数の部位を含み、前記機能化された複数の部位のそれぞれが、前記試料支持体表面の異なる位置に位置し、付着、引力またはそれらの組合せによって、試料の位置を、前記機能化された部位に維持するように構成された、
請求項１に記載の機能化された試料支持体。
【請求項３】
前記機能化された複数の部位のうちの第２の機能化された部位をさらに含み、前記第１の機能化された部位が、第１の特性を有する試料の位置を維持するように構成されており、前記第２の機能化された部位が、第２の特性を有する試料を維持するように構成されており、前記第１の特性が前記第２の特性とは異なる、請求項２に記載の機能化された試料支持体。
【請求項４】
格子構造体および炭素フィルムを備え、前記炭素フィルムが前記試料支持体表面を含み、前記格子によって支持された、請求項３に記載の機能化された試料支持体。
【請求項５】
格子構造体を備え、前記試料支持体表面が前記格子構造体の表面である、請求項３に記載の機能化された試料支持体。
【請求項６】
前記試料と反応し、前記試料が前記機能化された部位に付着するような化学結合を前記機能化された部位と前記試料との間に形成するように構成された化学官能基を、前記機能化された部位が含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の機能化された試料支持体。
【請求項７】
前記機能化された部位が、前記試料が前記機能化された部位に付着するように前記試料の特徴部分と固定的に係合するように構成されたナノスケール・インターロック機構を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の機能化された試料支持体。
【請求項８】
前記機能化された部位が、接着力、分子間力、静電力またはそれらの任意の組合せによって前記試料を前記機能化された部位に引き付け、接着するように構成された、請求項１から７のいずれか一項に記載の機能化された試料支持体。
【請求項９】
電子顕微鏡用の試料プレパラートであって、
その表面が複数の部位を含む試料支持体であり、前記部位がそれぞれ、局所的な引力、付着機構またはそれらの組合せによって試料の位置を前記部位に維持するように機能化されている、試料支持体と、
複数の試料と
を備え、前記試料がそれぞれ、前記部位のうちの１つの部位に接着した
試料プレパラート。
【請求項１０】
複数の標識をさらに備え、前記標識がそれぞれ、前記試料のうちの１つの試料に結合しており、前記標識を持たない前記試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の顕微鏡を用いて検出可能である、請求項９に記載の試料プレパラート。
【請求項１１】
前記試料がそれぞれＤＮＡ鎖を含み、前記複数の標識が発光標識を含む、請求項１０に記載の試料プレパラート。
【請求項１２】
前記顕微鏡が光学顕微鏡である、請求項１１に記載の試料プレパラート。
【請求項１３】
前記標識がそれぞれ、前記標識に結合した前記試料を一意的に識別する情報を含み、前記標識を持たない前記試料を識別するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の顕微鏡によって、前記情報を前記標識から抽出することができる、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項１４】
前記顕微鏡が走査透過電子顕微鏡である、請求項１０、１１および１３のうちのいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項１５】
前記試料のそれぞれについて、
前記試料がＤＮＡ鎖を含み、
前記試料に結合した前記標識が１つまたは複数の重原子タグを含み、前記１つまたは複数の重原子タグがそれぞれ、前記ＤＮＡ鎖の塩基の位置に位置し、前記走査透過電子顕微鏡による前記ＤＮＡ鎖の調査に応答して信号を生成するように構成されており、前記信号が、前記塩基の種を示す強度を有する、
請求項１４に記載の試料プレパラート。
【請求項１６】
前記試料支持体とは別個の可読の非一時的記憶媒体をさらに備え、前記可読の非一時的記憶媒体が、前記部位のうちのそれぞれの部位の座標を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項１７】
前記試料支持体がファインダ格子を含み、前記複数の標識が、前記ファインダ格子の格子メッシュにエッチングされた文字を含み、前記文字が、光学顕微鏡を介して知覚可能である、請求項９から１６のいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項１８】
同じ部位に２つの試料が付着していない、請求項９から１７のいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項１９】
前記部位の総量が前記試料の総量よりも大きい、請求項９から１８のいずれか一項に記載の試料プレパラート。
【請求項２０】
高スループット試料処理用の走査透過電子顕微鏡システムであって、
走査透過電子顕微鏡と、
試料支持体と
を備え、前記試料支持体の表面が複数の場所を含み、前記場所がそれぞれ、試料の一部分の位置を前記場所で前記表面に固定するように機能化された付着部位を含む
走査透過電子顕微鏡システム。
【請求項２１】
前記複数の場所が予め画定されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記予め画定された場所を局所的に走査するように前記走査透過電子顕微鏡の電子ビームを導いて、前記予め画定された場所のうちのどの場所が試料によって占有されているのかを決定し、または前記表面にある試料の位置を決定し、またはそれらの組合せを実行するように構成された制御装置をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記付着部位がそれぞれ、ＤＮＡ鎖の端部を前記表面に固定するように機能化された、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することを含み、前記試料の一部分の位置が、前記予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、方法。
【請求項２５】
前記試料がＤＮＡ鎖を含み、前記荷電粒子ビームが、前記ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することが、前記試料支持体上の前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して、前記予め画定された場所を局所的に画像化することを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記予め画定された場所を局所的に画像化することによって得た画像化情報を処理することによって前記試料の一部分の位置を決定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が標識を含み、試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することが、
前記予め画定された複数の場所を、前記標識の存在を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料支持体上の前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して、前記標識の存在に関して局所的に走査することを含む、
請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識の存在を示している予め画定された場所を、前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して走査することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記予め画定された複数の場所が、第１の予め画定された場所および第２の予め画定された場所を含み、
前記試料が第１の試料であり、前記第１の試料の一部分の位置が、前記第１の予め画定された場所に固定されており、
前記方法が、
前記予め画定された複数の場所を、前記荷電粒子ビームを使用して、第２の試料の存在に関して局所的に走査すること
をさらに含み、前記第２の試料の一部分の位置が、前記第２の予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、
請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の試料が第１のＤＮＡ鎖および第１の標識を含み、
前記第２の試料が第２のＤＮＡ鎖および第２の標識を含み、
前記荷電粒子ビームの分解能が、前記第１の標識と前記第２の標識のうちの少なくとも一方の標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、前記第１のＤＮＡ鎖と前記第２のＤＮＡ鎖のうちの少なくとも一方のＤＮＡ鎖の一部分の表面における位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の標識が、前記第１のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第１の重原子タグを含み、
前記第２の標識が、前記第２のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第２の重原子タグを含み、
前記荷電粒子ビームが、透過走査電子顕微鏡の電子ビームである、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記予め画定された複数の場所を局所的に走査することによって得た情報から、前記予め画定された場所のうちの１つの場所の画像を生成することと、
前記試料の存在の兆候に関して前記画像を評価することと
をさらに含む、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記予め画定された複数の場所が、複数の付着部位を含む前記試料支持体の表面にあり、前記付着部位がそれぞれ、前記予め画定された複数の場所のうちの１つの場所を占有し、前記試料が前記付着部位に曝されたときに、前記試料の前記一部分の前記位置を、前記付着部位の前記予め画定された場所に固定するように機能化されている、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記予め画定された複数の場所が前記試料支持体の表面にあり、前記荷電粒子ビームによって走査される総面積が、前記試料支持体の前記表面の総面積よりも大幅に小さい、請求項２４から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
予め画定された複数の付着場所を含む表面を有する試料支持体を顕微鏡に装填することであって、前記予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所に、発光標識を含む試料が付着していることと、
前記表面の領域の局所画像を取得することであって、前記局所画像がそれぞれ、前記予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所を包含し、前記局所画像がそれぞれ、前記発光標識からの光を検出するのに十分な分解能で取得されることと、
前記発光標識の光シグネチャの存在に関して前記局所画像を評価することによって、前記予め画定された付着場所のうちのどの付着場所が前記試料によって占有されているのかを決定することと
を含む方法。
【請求項３７】
前記分解能が第１の分解能であり、前記第１の分解能が、前記発光標識からの光を検出するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、前記方法が、
前記試料が付着した前記予め画定された付着場所を取り囲む領域の画像を、前記試料の前記位置を決定するのに十分な第２の分解能で取得することと、
前記試料の前記位置を決定するために、前記第２の分解能の前記画像を処理することと
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料がＤＮＡ鎖を含み、前記第２の分解能が、前記ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、前記方法が、
前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な第３の分解能の荷電粒子ビームを用いて前記試料を調べること、
をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記表面の領域の局所画像を取得することが、光学顕微鏡を用いて前記局所画像を取得することを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
標識付けされた試料が配置された試料支持体の表面の画像を取得することであって、前記画像の分解能が、前記標識付けされた試料のうちの１つの試料の標識のおおよその場所を前記画像から決定するのに十分であることと、
前記標識のおおよその位置を決定するために、前記画像を処理することと
を含む方法。
【請求項４１】
前記分解能が第１の分解能であり、前記方法が、
前記標識を取り囲む領域の局所的な画像を、前記標識付けされた試料の位置を前記局所的な画像から決定するのに十分な第２の分解能で取得することと、
前記標識付けされた試料の前記位置を前記局所的な画像から決定するために、前記画像を処理することと
をさらに含み、前記第１の分解能が、前記標識の前記おおよその位置を前記画像から決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料の前記位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記標識付けされた試料がＤＮＡ鎖を含み、前記第２の分解能が、前記ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、前記方法が、
前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な第３の分解能の走査透過電子顕微鏡から放出された電子ビームを用いて、前記標識付けされた試料を調べること
をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記表面の画像を取得することが、光学顕微鏡を使用して前記表面の前記画像を取得することを含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
実行可能命令を含む非一時的機械可読記憶媒体であって、実行されたときに、１つまたは複数の処理装置に、
荷電粒子ビームを導いて、試料支持体の表面の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することを実行させ、前記試料が、前記予め画定された場所のうちの１つの場所に付着している、非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項４５】
前記試料がＤＮＡ鎖を含み、前記荷電粒子ビームが、前記ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである、請求項４４に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項４６】
前記実行可能命令が、実行されたときに、
荷電粒子ビームを導いて、前記予め画定された複数の場所を、前記表面の前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で、局所的に画像化すること
を前記１つまたは複数の処理装置に実行させる、請求項４４または４５に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項４７】
前記実行可能命令が、実行されたときに、前記荷電粒子ビームによって得た前記予め画定された場所の画像を処理して、前記表面の前記試料の一部分の位置を決定することを前記１つまたは複数の処理装置に実行させる、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項４８】
前記試料が標識を含み、
前記実行可能命令が、実行されたときに、前記荷電粒子ビームを導いて、前記予め画定された複数の場所を、前記標識の存在を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記表面の前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で、前記標識の前記存在に関して局所的に走査することを前記１つまたは複数の処理装置に実行させる、
請求項４４から４７のいずれか一項に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項４９】
前記実行可能命令が、実行されたときに、荷電粒子ビームを導いて、前記標識の存在を示している予め画定された場所を、前記表面の前記試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、前記試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で走査することを前記１つまたは複数の処理装置に実行させる、請求項４８に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項５０】
前記予め画定された複数の場所が、第１の予め画定された場所および第２の予め画定された場所を含み、
前記試料が第１の試料であり、前記第１の試料の一部分の位置が、前記第１の予め画定された場所に固定されており、
前記実行可能命令が、実行されたときに、
荷電粒子ビームを導いて、前記予め画定された複数の場所を、第２の試料の存在に関して局所的に走査することを前記１つまたは複数の処理装置に実行させ、前記第２の試料の一部分の位置が、前記第２の予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、
請求項４４から４９のいずれか一項に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項５１】
前記第１の試料が第１のＤＮＡ鎖および第１の標識を含み、
前記第２の試料が第２のＤＮＡ鎖および第２の標識を含み、
前記荷電粒子ビームの分解能が、前記第１の標識と前記第２の標識のうちの少なくとも一方の標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、前記第１のＤＮＡ鎖と前記第２のＤＮＡ鎖のうちの少なくとも一方のＤＮＡ鎖の一部分の前記表面における位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、
請求項４４から５０のいずれか一項に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項５２】
前記第１の標識が、前記第１のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第１の重原子タグを含み、
前記第２の標識が、前記第２のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第２の重原子タグを含み、
前記荷電粒子ビームが、透過走査電子顕微鏡の電子ビームである、
請求項５０または５１に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【請求項５３】
前記実行可能命令が、実行されたときに、
前記予め画定された複数の場所を局所的に走査することによって得た情報から、前記予め画定された場所のうちの１つの場所の画像を生成すること、および、
前記試料の存在の兆候に関して前記画像を評価すること
を前記１つまたは複数の処理装置に実行させる、請求項４４から５２のいずれか一項に記載の非一時的機械可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下は、荷電粒子装置を含む用途において比較的に大きな試料支持体上の試料の位置を特定する方法、装置およびシステムを対象とする。より詳細には、本開示のさまざまな実施形態は、ＳＴＥＭを含むＤＮＡの塩基配列決定用途において試料支持体上のＤＮＡの位置を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前世紀には、荷電粒子顕微鏡（ＣＰＭ）の開発により、光学顕微鏡法で達成することができる拡大倍率よりもはるかに大きな拡大倍率で自然現象を観察することが可能になった。このような１つのＣＰＭが走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）である。ＳＴＥＭでは、高エネルギー電子の集束ビームが薄い試料を走査する。ビーム中の電子は、試料を通過するときに試料と相互作用し、試料の下方で集められる。さまざまな画像化技法および分析技法が、透過電子のさまざまな特性を使用して、試料の画像を形成しまたは試料の特性を決定する。ＳＴＥＭ画像化は、集束電子ビームが試料表面を走査したときに検出器に衝突した電子の数から、試料に関する情報を得ることを含む。ＳＴＥＭ画像化で使用するＳＴＥＭ検出器は、エバーハート−ソーンリー（Ｅｖｅｒｈａｒｔ−Ｔｈｏｒｎｌｅｙ）検出器として知られるシンチレータ−光電子増倍管検出器、ＰＩＮ固体検出器または任意の他の適切な検出器とすることができる。ＳＴＥＭ検出器は通常、１次電子ビームが試料表面の領域を走査するときにデータを集めることを可能にする十分に高速な検出器である。典型的な走査、例えば１列当たり１，０００個の走査点で１，０００列にわたってビームをラスタリングする走査は約１秒かかることがあり、１００万画素を超える情報を生成することもあり、そのため、検出器は、少なくとも１００万画素／秒の速度で検出結果を提供できることが好ましい。典型的な高精度のＳＴＥＭ画像化回路は、数マイクロ秒に１つ、好ましくは１００マイクロ秒未満に１つ、５０マイクロ秒未満に１つ、より好ましくは１０マイクロ秒未満に１つの検出結果を得ることができる。
【０００３】
近年、ＳＴＥＭ技術を高スループット用途に適合させることに対する関心が高まっている。特に、ＤＮＡの高スループット塩基配列決定にＳＴＥＭを使用することに対する関心が高い。現在、開発の第３世代において、ＤＮＡ塩基配列決定技術は、より短い塩基配列決定時間およびより高いスループット能力で単一分子データおよび非常に大きなロングリード能力（ｌｏｎｇ  ｒｅａｄ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）（すなわち２０，０００以上の塩基対からなるＤＮＡ鎖を読む能力）を供給するシステムを提供することを目指している。
【０００４】
ＳＴＥＭベースのＤＮＡ塩基配列決定の効率、および電子顕微鏡による非常に小さな（例えばナノ規模の）一般的な試料の分析に影響を及ぼす１つの因子は、分析すべき試料の位置を特定するのにかかる時間である。典型的なＤＮＡ試料は、直径が約２ナノメートル（ｎｍ）、長さが最長で約１２ミクロン（μｍ）（これは約３０，０００塩基に対応する）のＤＮＡ鎖であり、これは、約２４，０００ｎｍ２未満の縦断面積に対応する。これに対して、従来のＳＴＥＭ分析では試料が通常、直径３ｍｍの顕微鏡格子（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｇｒｉｄ）によって支持された薄い炭素フィルムに載せて分析に供される。これは、７．１×１０１２ｎｍ２の試料支持体面積に対応する。したがって、典型的なＤＮＡ試料はせいぜい、３．４×１０−９倍に対応する直径３ｍｍの格子のごく小さなエリアを占有し、したがって、ＳＴＥＭによるＤＮＡ試料の任意の分析は、最初に、試料よりも９桁も大きいエリア上で試料の位置を特定することを含むことになる。
【０００５】
試料処理時間に対する、ＤＮＡ試料のサイズと試料支持体の面積との比の重要性を例示するため、分解能２ｎｍのＳＴＥＭビームを使用して直径３ｍｍの格子支持体のエリア全体を走査するのにかかる時間の長さを考える。２ｎｍは、ＤＮＡ鎖のおおよその直径であり、ＤＮＡの存在を検出するのに必要な最低分解能を表す。４０ＭＨｚの従来の高速画像化速度を仮定すると、試料格子の１．８×１０１２個の全ての画素を取得するのに約１２．３時間の画像化時間がかかることになる。１２．３時間は、ＤＮＡ試料の位置を特定するための最長時間を表すが、この例は、ＳＴＥＭベースのＤＮＡ塩基配列決定および小さな生体試料を含む他の用途においてより高いスループットを実現することと試料位置特定時間との関連性を例証している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、例えばＳＴＥＭベースのＤＮＡ塩基配列決定などの荷電粒子顕微鏡法用途において、試料格子上のナノ規模の生体試料の位置を特定する、より高速な方法が求められている。例えばＳＴＥＭベースのＤＮＡ塩基配列決定などの荷電粒子顕微鏡法用途において、ナノ規模の生体試料のより高速な位置特定を容易にするシステムおよび装置も求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示のいくつかの実施形態では、荷電粒子顕微鏡法で使用する機能化された（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）試料支持体であって、荷電粒子顕微鏡を用いて試料を調査する間、試料を支持するように構成された試料支持体表面を含み、試料支持体表面が機能化された部位を有し、機能化された部位が、付着、引力またはそれらの組合せによって、試料の位置を、機能化された部位に維持するように構成された機能化された試料支持体が提供される。いくつかの実施形態では、試料がＤＮＡ鎖を含む。いくつかの実施形態では、試料が、発光標識および／または重原子タグ（ｈｅａｖｙ  ａｔｏｍ  ｔａｇ）で標識付けされたＤＮＡ鎖を含む。
【０００８】
本開示のいくつかの実施形態では、電子顕微鏡用の試料プレパラート（ｓｐｅｃｉｍｅｎ  ｐｒａｐａｒａｔｉｏｎ）であって、試料支持体を備え、試料支持体の表面が複数の部位を含み、それぞれの部位が、局所的な引力、付着機構またはそれらの組合せによって試料の位置をその部位に維持するように機能化されており、この試料プレパラートがさらに、複数の試料を備え、それぞれの試料が、それらの部位のうちの１つの部位に接着した試料プレパラートが提供される。いくつかの実施形態では、これらの複数の試料がＤＮＡ鎖を含む。いくつかの実施形態では、これらの複数の試料が、発光標識および／または重原子タグで標識付けされたＤＮＡ鎖を含む。
【０００９】
本開示のいくつかの実施形態では、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することを含み、試料の一部分の位置が、予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている方法が提供される。いくつかの実施形態では、試料がＤＮＡ鎖を含み、荷電粒子ビームが、ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである。
【００１０】
本開示のいくつかの実施形態では、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、予め画定された複数の付着場所を有する表面を有する試料支持体を顕微鏡に装填することであり、予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所に、発光標識を有する試料が付着していることと、表面の領域の局所画像を取得することであり、それぞれの局所画像が、予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所を包含し、それぞれの局所画像が、発光標識からの光を検出するのに十分な分解能で取得されることと、発光標識の光シグネチャ（ｌｉｇｈｔ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の存在に関して局所画像を評価することによって、予め画定された付着場所のうちのどの付着場所が試料によって占有されているのかを決定することとを含む方法が提供される。
【００１１】
本開示のいくつかの実施形態では、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、標識付けされた試料が配置された試料支持体の表面の画像を取得することであり、この画像の分解能が、標識付けされた試料のうちの１つの標識のおおよその場所をこの画像から決定するのに十分であることと、この画像を処理して、標識のおおよその位置を決定することとを含む方法が提供される。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態では、実行されたときに、荷電粒子ビームを導いて、試料支持体の表面の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することを１つまたは複数の処理装置に実行させる実行可能命令を含み、試料が、予め画定された場所のうちの１つの場所に付着している非一時的機械可読記憶媒体が提供される。いくつかの実施形態では、試料がＤＮＡ鎖を含み、荷電粒子ビームが、ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態では、高スループット試料処理用の走査透過電子顕微鏡システムであって、走査透過電子顕微鏡と、試料支持体とを備え、試料支持体の表面が複数の場所を含み、それぞれの場所が、試料の一部分の位置をその場所でこの表面に固定するように機能化された付着部位を有する走査透過電子顕微鏡システムが提供される。
【００１４】
以上では、以下の本発明の詳細な説明をより十分に理解できるように、本発明の特徴および技術上の利点をかなり大まかに概説した。以下では、本発明の追加の特徴および利点を説明する。開示される着想および特定の実施形態を、本発明の目的と同じ目的を達成するために他の構造体を変更しまたは設計するためのベースとして容易に利用することができることを当業者は理解すべきである。さらに、そのような等価の構造は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を逸脱しないことを当業者は理解すべきである。
【００１５】
次に、本発明および本発明の利点のより完全な理解のため、添付図面に関して書かれた以下の説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試料支持体上の試料の位置を特定しそれらの試料を分析する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図２】試料支持体上のＤＮＡの位置を特定しそれらのＤＮＡの塩基配列を決定する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図３】試料の位置を特定しそれらの試料を分析する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図４】試料支持体上のＤＮＡの位置を特定しそれらのＤＮＡの塩基配列を決定する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図５】試料の位置を特定しそれらの試料を分析する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図６】試料支持体上のＤＮＡの位置を特定しそれらのＤＮＡの塩基配列を決定する本開示の一実施形態による方法の流れ図である。
【図７】ロングリードＤＮＡ鎖（ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ）の塩基配列をＳＴＥＭを用いて決定する本開示の一実施形態による方法を示す図である。
【図８】図７のロングリードＤＮＡ鎖の軸上に中心を有するＳＴＥＭによって生成された線走査の高速走査軸に沿って信号強度がどのように変動すると予想されるのかを示す図である。
【図９】図７のロングリードＤＮＡ鎖の軸から外れたＳＴＥＭによって生成された線走査の高速走査軸に沿って信号強度がどのように変動すると予想されるのかを示す図である。
【図１０Ａ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の簡略化された略図である。
【図１０Ｂ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の正方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１０Ｃ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の正方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１０Ｄ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の正方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１１Ａ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の簡略化された模式図である。
【図１１Ｂ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の長方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１１Ｃ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の長方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１１Ｄ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の長方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１２Ａ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の簡略化された模式図である。
【図１２Ｂ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の長方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１２Ｃ】本開示の一実施形態による機能化された試料支持体の単一の長方形格子の簡略化された拡大模式図である。
【図１３Ａ】本開示の実施形態に従って適合させることができる例示的な電子顕微鏡格子を示す図である。
【図１３Ｂ】本開示の実施形態に従って適合させることができる例示的な電子顕微鏡格子を示す図である。
【図１４Ａ】本開示の実施形態に従って適合させることができる直径３ｍｍのギルダー・リファレンス・ロケーター格子（Ｇｉｌｄｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｏｃａｔｅｒ  Ｇｒｉｄ）の画像である。
【図１４Ｂ】本開示の実施形態に従って適合させることができる別のタイプのファインダ格子（ｆｉｎｄｅｒ  ｇｒｉｄ）を示す図である。
【図１４Ｃ】本開示の実施形態に従って適合させることができる別のタイプのファインダ格子を示す図である。
【図１５】本開示の一実施形態による走査透過電子顕微鏡システムのブロック図である。
【図１６】本開示の一実施形態による走査透過電子顕微鏡を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図面および以下の説明では、明細書および図面の全体を通じて、同様の部分には通常、同じ参照符号がそれぞれに付けられている。また、本明細書に開示された異なる実施形態では、同様の参照符号が同様の構成要素を指すことがある。図面は必ずしも原寸に比例して示されていない。本発明のある種の特徴部分は、スケールが誇張されて、またはいくぶん概略的に示されていることがあり、明瞭かつ簡潔にするために従来の要素の一部の詳細が示されていないことがある。本発明は、さまざまな形態の実施形態を受け入れることができる。特定の実施形態が詳細に説明され、図面に示されている。本開示が、本発明を、本明細書に示され記載された実施形態に限定することは意図されていないことを理解されたい。本明細書で論じる実施形態のさまざまな教示を別々に使用してまたは任意の適切な組合せで使用して所望の結果を生み出すことができることを十分に認識されたい。
【００１８】
以下の議論および特許請求の範囲では、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、オープン・エンド（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）型の用語として使用されており、したがって、これらの用語は、「．．．を含むが、それらだけに限定されない」ことを意味すると解釈すべきである。本明細書で特に定義されていない場合、その用語は、その通常の一般的な意味で使用されることが意図されている。さらに、本明細書での用語「および／または」の使用は、「包括的な」「または」として解釈すべきであり、「排他的な」「または」と解釈すべきではない。例えば、本明細書で使用される句「Ａおよび／またはＢ」は、「ＡもしくはＢ、またはＡおよびＢ」を意味する。別の例として、明細書で使用される句「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、「ＡもしくはＢもしくはＣ、またはこれらの任意の組合せ」を意味する。さらに、本明細書において、用語「自動」、「自動化された」または類似の用語が使用されるときには、これらの用語は、自動プロセスもしくは自動ステップまたは自動化されたプロセスもしくは自動化されたステップの手動による開始を含むものと理解される。さらに、本明細書では用語「試料（ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）」が、文脈と矛盾する場合および本開示が単数の場合を別途取り扱っている場合を除いて、単数と複数の両方の意味を伝達するために使用される。例えば、「試料（ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）がビームで走査される」実施形態は、「一つの試料（ａ  ｓｐｅｃｉｍｅｎ）がビームで走査される」実施形態および「複数の試料（ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）がビームで走査される」実施形態の意味を伝達することが意図されている。
【００１９】
本明細書では、試料支持体の比較的に大きな表面にある試料の位置を特定し、次いでそれらの試料を、ＳＴＥＭなどＣＰＭを用いて画像化する方法が開示される。この方法のさまざまな実施形態は、試料支持体の表面の予め画定された異なる場所にある試料の位置を分離することを含む。予め画定されたそれらの場所の累積面積は、試料支持体の総面積よりも小さい。本明細書に開示された方法の実施形態１００、２００、３００、４００、５００、６００などの実施形態は、試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。方法２００、４００および６００によって達成することができる時間節減は特に、ＳＴＥＭベースの高スループットＤＮＡ塩基配列決定を含む第３世代のＤＮＡ塩基配列決定において有利となる可能性がある。第３世代のＤＮＡ塩基配列決定では、塩基配列決定時間の重要性が、塩基配列決定用に試料を準備するのに必要な時間に勝る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、この方法が、予め画定されたそれらの場所を、試料の位置を決定するのに十分な分解能で局所的に走査し、次いで、位置が特定された試料をより高い分解能で再び走査して試料を分析することを含む。図１を参照すると、試料支持体上の試料の位置を特定し、それらの試料を画像化する、本開示の一実施形態による方法１００の流れ図が示されている。方法１００は、試料支持体の表面で試料を準備することによって始めることができる。準備はブロック１１０で始めることができ、ブロック１１０では、試料支持体の表面に試料を曝す。試料支持体の表面は、予め画定された複数の場所を含み、試料の位置を、予め画定されたそれらの場所に固定するように機能化されている。予め画定されたそれらの場所のサイズ（表面積）は、約（２０μｍ）２以下、あるいは約（１０μｍ）２以下、あるいは約（５μｍ）２以下とすることができる。さまざまな実施形態では、試料支持体の表面に試料を曝すことが、付着部位の近くに試料を置いて付着部位による試料の固定を促進することを含む。
【００２１】
本明細書で使用される「予め画定された場所」は、試料支持体の表面にある場所であって、試料支持体を使用して試料の位置を特定する前にわかっている場所を指す。例えば、試料支持体の表面の予め画定された場所の座標を、別個の機械可読記憶装置に記憶することができ、この別個の機械可読記憶装置にアクセスして、本明細書に記載された局所走査ステップのうちの１つまたは複数の局所走査ステップを実行することができる。本明細書では、「予め画定された場所」が、試料支持体の表面にある場所であって、試料支持体の場所マーク付け特徴部分（ｌｏｃａｔｉｏｎ−ｍａｒｋｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅ）の存在によって容易に確認可能な場所を指す目的にも使用される。
【００２２】
さまざまな実施形態では、支持体表面の機能化が、予め画定された場所に位置する付着部位または予め画定された場所の近くに位置する付着部位であって、試料の位置を予め画定されたそれらの場所に固定するように機能化された付着部位の形態をとる。本明細書で使用されるとき、「占有された予め画定された場所」は、試料の位置が固定された予め画定された場所を指す。さまざまな実施形態では、予め画定されたそれぞれの場所を占有することができる試料が１つだけであるように付着部位が構成される。
【００２３】
試料の準備は続いてブロック１２０へ進むことができ、ブロック１２０では、試料の位置を予め画定された場所に固定する。そうではないと示されている場合を除き、本明細書で使用される「試料の位置を固定する」および「試料の位置を維持する」は、試料の一部分の位置を固定すること（例えばＤＮＡ鎖の一端を表面に付着させ、他端を自由端とすること）、試料の位置および向きを固定すること（例えばＤＮＡ鎖の一端を表面に付着させ、そのＤＮＡ鎖を、固定された放射方向に沿って縦方向に向けて付着した端部の位置から延ばすこと）、ならびに場所および／または部位に対する試料の全ての平行移動自由度および配向自由度を排除すること（例えばＤＮＡ鎖のどの部分も表面に対して移動しないようにすること）のうちの任意の１つを指す。
【００２４】
さまざまな実施形態では、試料の位置を予め画定された場所に固定することが、それぞれの試料の位置を予め画定された異なる場所に固定することを含む。いくつかの実施形態では、予め画定された場所が、予め画定された場所に試料の位置を固定するように機能化された付着部位を含む。１つまたは複数の機構に従って試料の位置を固定するようにそれぞれの付着部位を機能化することができる。適切な機構には、限定はされないが、化学的付着（例えば、結合を形成する、付着部位と試料との間の化学反応）、引力の作用（例えば試料の静電荷とは符号が反対の静電場の作用、付着部位の分子と試料の分子との間の分子間力）、接着、および機械的係合（例えば、ナノ規模のインターロック機構を介した係合）などが含まれる。さまざまな実施形態では、これらの機構が、付着部位の近くに試料を置き、および、付着部位によって使用される特定の機構を始動させるのに必要な任意の追加の条件を生み出すことによって実行される。化学反応による付着は、付着部位と試料との間に化学結合を形成するのに必要な付着部位と試料の機能部位との間の反応条件を生み出すことによって達成することができる。別の例として、圧電駆動を含む機械的インターロック機構では、付着部位に電流を流すことが必要となることがあり得る。
【００２５】
方法１００はブロック１３０へ進むことができ、ブロック１３０では、分析のためＣＰＭ内に試料支持体を装着する。方法１００〜６００および本開示の他の方法に適したＣＰＭには、限定はされないが、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＳＴＥＭが含まれる。代替実施形態では、ブロック１１０および１２０をブロック１３０の後に実行することができる。このような実施形態では、試料支持体をＣＰＭ内に装着した後に試料支持体に試料を配置する。
【００２６】
方法１００は続いてブロック１４０へ進むことができ、ブロック１４０では、試料の位置を決定するために、予め画定された複数の場所を局所的に走査する。予め画定された場所を局所的に走査することは、予め画定された場所の領域の全部または一部を走査すること、予め画定された場所に隣接した１つもしくは複数の領域および／または予め画定された場所の近くの１つもしくは複数の領域を走査すること、あるいはそれらの組合せを含むことができる。予め画定された場所のうちの全ての場所を走査することができ、または予め画定された場所のうちの一部の場所を走査することができる。いくつかの実施形態では、予め画定された場所の走査が、ある数の試料の位置を特定した後、もしくは特定の試料の位置を特定し識別した後、またはそれらの組合せの後に終了となる。
【００２７】
予め画定された場所を局所的に走査することは、予め画定された場所を荷電粒子ビームを用いて調べることを含むことができる。走査は、試料の位置を決定するのに十分なビーム分解能の荷電粒子ビームを用いて実行することができる。いくつかの実施形態では、試料の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを用いて予め画定された場所を調べることによって、予め画定された場所の画像を生成する。試料を分析するのに必要な分解能よりも低い分解能を使用して試料の位置を特定することによって、ＣＰＭを用いて試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。
【００２８】
方法１００は続いてブロック１５０へ進むことができ、ブロック１５０では、ブロック１４０で得た荷電粒子ビーム・データを処理して支持体表面の試料の位置を決定する。荷電粒子ビームを用いて画像を得る実施形態では、それらの画像を処理することによって試料の位置を決定することができる。このような実施形態では、例えば目視検査、パターン認識またはそれらの組合せによって、支持体表面の試料の位置を決定することができる。次いで、ブロック１６０で呼び出すため、それらの位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置に記録することができる。
【００２９】
方法１００は続いてブロック１６０へ進むことができ、ブロック１６０では、所望の情報を試料から抽出するのに十分な分解能のＣＰＭからの荷電粒子ビームで試料を走査する。走査を始めることができるように、ブロック１５０で保存した位置を使用して、ＣＰＭの光軸をそれぞれの試料へ誘導することができる。所望の情報の例には、限定はされないが、試料の化学組成、構造体、形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）またはそれらの任意の組合せに関する情報が含まれる。画像化用途では、この荷電粒子ビームの分解能が、試料の画像を所望の鮮明度で生成することができる十分に高いものであるべきである。この方法は次いでブロック１７０へ進むことができ、ブロック１７０では、試料から抽出されたデータを処理して試料に関する所望の情報を得る。それに加えて、またはその代りに、ブロック１６０でビーム・データを取得したときにブロック１７０の処理を実行することもできる。同様に、ブロック１５０の処理も、ブロック１４０の走査中もしくは走査後に、または走査前と走査後の両方で実行することができる。本開示の他の部分に記載された処理ステップも同様に実行することができる。
【００３０】
方法１００はさまざまな用途で実行することができる。そのような１つの用途がＤＮＡの塩基配列決定である。図２を参照すると、試料支持体上のＤＮＡの位置を特定し、そのＤＮＡの塩基配列を決定する方法２００の流れ図が示されている。方法２００は、ＤＮＡ鎖を含む試料の位置を特定し、ＳＴＥＭを使用して塩基配列を決定する、方法１００の実施形態を表す。一本鎖ＤＮＡについて例示されるが、ＤＮＡ塩基配列決定実施形態は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたはそれらの組合せを含む試料に対して実行することができる。
【００３１】
方法２００はブロック２１０で始めることができ、ブロック２１０では、予め画定された複数の場所を有する試料支持体の表面にＤＮＡ鎖を曝す。支持体表面はさらに、機能化された複数の付着部位を含むことができる。これらの機能化された付着部位は、予め画定されたそれぞれの場所または予め画定されたそれぞれの場所の近くに分布し、ＤＮＡ鎖の位置を予め画定された場所に固定するように機能化されている。支持体表面にＤＮＡ鎖を曝すことは例えば、機能化された付着部位の近くにＤＮＡ鎖を置いて、ＤＮＡ鎖による予め画定された場所の占有を促進することを含むことができる。これらのＤＮＡ鎖は、約２０，０００塩基よりも長い、あるいは約３０，０００塩基よりも長いロングリードＤＮＡ鎖とすることができる。
【００３２】
方法２００は続いてブロック２２０へ進み、ブロック２２０で、ＤＮＡ鎖の位置を、支持体表面の予め画定された異なる場所に固定する。ＤＮＡ鎖の位置を固定することは、それぞれのＤＮＡ鎖の一端の位置を、支持体表面の予め画定された異なる場所に固定することを含むことができる。ＤＮＡ鎖の位置を固定することは、ＤＮＡ鎖の端部の位置を予め画定された場所に固定するように構成された付着部位の機能化機構の実行を介して実行することができる。例えば、付着部位は、ＤＮＡ鎖の端部の化学官能基と化学結合を形成する化学基を含むことができる。いくつかの実施形態では、追加のステップを実行して、それぞれのＤＮＡ鎖をまっすぐにし、および／またはＤＮＡ鎖を予め画定された共通の方向に向ける。ＤＮＡ鎖は、例えば米マサチューセッツ州ＷａｋｅｆｉｅｌｄのＺＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって開発された技法に従って、まっすぐにし、および／まは共通の方向に整列させることができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、炭素基板が、予め画定された場所に位置する付着部位を有する支持体表面を含み、付着部位が、ＤＮＡ鎖の端部に化学的に付着するように機能化されている。この炭素基板は薄い炭素フィルムとすることができ、顕微鏡格子によってこの薄い炭素フィルムを支持することができる。ＤＮＡ鎖は、長さが最大３０，０００塩基のＤＮＡ鎖であっても、曝すステップ、付着ステップおよび任意選択の配向ステップの間、実質的に無傷のままでいることができる。理論によって拘束しようとするのではないが、ＤＮＡ鎖の完全性が維持されるのは、ＤＮＡ鎖が物理的に操作されたときに、約０．３４ｎｍの長さがあるＤＮＡ内の塩基間間隔が、少量の伸長を許容するためであると考えられる。
【００３４】
ブロック２３０で、試料支持体をＳＴＥＭ内に、ＳＴＥＭの電子ビームによってＤＮＡ鎖を調べることができるように装着する。あるいは、試料支持体を装着した後で試料を曝し、固定してもよい。
【００３５】
ＳＴＥＭによって調べるためのＤＮＡ鎖の準備が整った後、方法２００は続いてブロック２４０へ進み、ブロック２４０で、ＳＴＥＭの電子ビームを使用して、予め画定された場所を、占有された予め画定された場所にあるＤＮＡ鎖の位置を決定するのに十分な分解能で局所的に画像化する。いくつかの実施形態では、この電子ビームが、ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で、予め画定された場所を局所的に画像化する。塩基配列を決定するのに必要な分解能よりも低い分解能を使用してＤＮＡ鎖の位置を特定することによって、ＣＰＭを用いて試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。
【００３６】
ブロック２５０で、ＳＴＥＭによって取得した予め画定された場所の画像データを処理して、支持体表面のＤＮＡ鎖の位置を決定する。ブロック２５０の画像処理は、ブロック２４０の走査と同時に、および／またはブロック２４０の走査の後に実行することができる。次いで、ブロック２４０で呼び出すため、それらの位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置に記録することができる。
【００３７】
方法２００は次いでブロック２６０へ進むことができ、ブロック２６０では、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な分解能のＳＴＥＭの電子ビームでＤＮＡ鎖を走査する。
【００３８】
ブロック２６０でＤＮＡ鎖の走査を始めることができるように、ブロック２５０で保存した位置を使用して、ＳＴＥＭの光軸をそれぞれのＤＮＡ鎖へ誘導することができる。ブロック２７０で、ＳＴＥＭによって取得したＤＮＡ鎖の走査データを処理してＤＮＡ鎖の塩基配列を決定する。ブロック２７０のデータ処理は、ブロック２６０の走査と同時に、および／またはブロック２６０の走査の後に実行することができる。
【００３９】
さまざまな実施形態において、この方法は、予め画定された場所をビームによって局所的に走査し、または予め画定された場所を光学顕微鏡によって画像化して、予め画定された場所にある試料の存在を検出し、試料によって占有された予め画定された場所を走査して試料の位置を決定し、次いで、位置が特定された試料を走査して試料を分析することを含む。位置が特定された試料は、試料の位置を決定するのに使用する分解能よりも高い分解能で走査することができ、試料の位置を決定するのに使用する分解能は、試料の存在を検出するのに使用する分解能よりも高い。試料に標識付けして、試料の位置特定および／または分析を容易にすることができる。
【００４０】
次に図３を参照すると、試料支持体上の試料の位置を特定し、それらの試料を画像化する、本開示の一実施形態による方法３００の流れ図が示されている。方法３００は、ブロック３０５で始めることができ、ブロック３０５では、標識付けされていない状態の試料を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能の顕微鏡によって検出可能な標識で試料に標識付けする。試料の標識付けは例えば、試料に標識構造体を取り付けること、試料の全体もしくは試料の一部が標識として機能するように試料の構造および／もしくは組成を改変すること、またはそれらの組合せを含むことができる。標識構造体は、個々の試料に取り付けることができる構造体および／または分子を含むことができる。標識付けは、所与の用途の標識および試料に関する当技術分野で公知の適切な技法に従って実行することができる。例えば、蛍光標識を生成し、それらをタンパク質試料に取り付ける方法がよく知られている。
【００４１】
いくつかの実施形態では、特定の試料に関する情報を提供するように標識が構成される。例えば、それぞれの試料を、その試料を支持構造体上の他の試料から一意的に区別する標識に結合させることができる。別の例として、標識は、試料の化学構造に関する情報を符号化することができる。このような１つの例では、化学構造に関する情報であって、顕微鏡を用いて、標識付けされていない状態の試料よりも低い分解能で試料から抽出することができる情報を符号化するように標識が構成される。
【００４２】
方法３００は続いてブロック３１０へ進むことができ、ブロック３１０では、標識付けされた試料を試料支持体の表面に曝し、方法３００は次いでブロック３２０へ進むことができ、ブロック３２０では、標識付けされた試料の位置を、試料支持体の表面の予め画定された場所に固定する。次いで、試料支持体を顕微鏡内に装着することができる（図示せず）。方法３００の曝露、固定および装着は、ブロック１１０、１２０および１３０に関して上で説明したとおりに実行することができる。方法３００の標識付け、曝露、固定および装着は変更することができ、図３に示した順序だけに限定されない。さらに、方法３００の標識付け、曝露、固定および装着ステップのうちの１つまたは複数のステップの実行は重なってもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、標識付けされていない状態の試料の存在を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを用いて検出可能な標識を試料につける。例えば、それらの標識は、標識付けされていない状態の試料の存在を検出するのに必要なビーム分解能よりも低いビーム分解能のＣＰＭの荷電粒子ビームによって検出可能な重原子タグおよび／または発光標識を含むことができる。別の例として、標識は、標識付けされていない状態の試料を検出するのに必要なビーム分解能よりも低いビーム分解能のＣＰＭの電子ビームを用いて検出可能な発光標識を含むことができる。試料を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能で検出可能な標識を利用することは、試料の位置特定を有利に、より高速にすることができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。
【００４４】
このような実施形態では、方法３００が続いてブロック３４０ａへ進むことができ、ブロック３４０ａでは、予め画定された場所の領域を、重原子タグの存在を検出するのに十分な分解能の荷電粒子ビームで局所的に走査する。このような１つの実施形態では、このビーム分解能が、予め画定された場所にある標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、占有された予め画定された場所にある試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。ブロック３５０ａで、ブロック３４０ａに従って取得した予め画定された個々の場所に関するデータを処理し、占有された予め画定された場所を識別するために、標識の存在の兆候に関してそのデータを評価する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、標識付けされていない状態の試料の存在を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能を有する光学顕微鏡によって取得した画像中で検出可能な標識を試料に付ける。例えば、それらの標識は、標識付けされていない状態の試料の存在を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能を有する光学顕微鏡によって取得した画像中で検出可能な強度の光を発するように構成された発光標識を含むことができる。
【００４６】
このような実施形態では、方法３００が続いてブロック３４０ｂへ進むことができ、ブロック３４０ｂでは、予め画定された付着場所の画像を、光学顕微鏡を使用して試料の存在を検出するのに十分な分解能で取得する。このような１つの実施形態では、それらの画像の分解能が、予め画定された場所にある標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、占有された予め画定された場所にある試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。ブロック３５０ｂで、それらの画像を処理し、占有された予め画定された場所を識別するために、標識の存在の兆候に関して評価する。
【００４７】
ブロック３５０ａおよび３５０ｂから、方法３００は続いてブロック３６０へ進むことができ、ブロック３６０では、占有された予め画定された場所を、標識付けされた試料の位置を決定するのに十分なビーム分解能で局所的に走査する。一実施形態では、このビーム分解能が、占有された予め画定された場所にある試料の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い。試料を分析するのに必要な分解能よりも低い分解能を使用して試料の位置を特定することによって、ＣＰＭを用いて試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。
【００４８】
ブロック３７０で、ブロック３６０に従って取得したビーム・データを処理して、標識付けされた試料の位置を決定する。次いで、ブロック３８０で呼び出すため、試料の位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置に記録することができる。試料の走査を始めることができるように、ブロック３７０で保存した位置を使用して、荷電粒子装置の光軸をそれぞれの試料へ誘導することができる。
【００４９】
方法３００は続いてブロック３８０へ進むことができ、ブロック３８０では、標識付けされた個々の試料を、試料を分析するのに十分な分解能の荷電粒子ビームで走査する。ブロック３４０ａ、３６０および３８０の荷電粒子ビームは、同じＣＰＭからまたは異なるＣＰＭから生成することができる。ブロック３９０で、ブロック３８０に従って得た走査データを処理して、標識付けされた試料に関する情報を得る。
【００５０】
方法３００はさまざまな用途で実行することができる。そのような１つの用途がＤＮＡの塩基配列決定である。図４を参照すると、試料支持体上の標識付けされたＤＮＡの位置を特定し、そのＤＮＡの塩基配列を決定する方法４００の流れ図が示されている。方法４００は、ＤＮＡ鎖を含む試料に標識を付け、それらの試料の位置を特定し、それらの試料の塩基配列をＳＴＥＭを使用して決定する、方法３００の実施形態を表す。
【００５１】
方法４００は、ブロック４０５で始めることができ、ブロック４０５では、標識付けされていない状態の試料を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能の顕微鏡によって検出可能な標識を用いてＤＮＡ鎖を符号化する。これらのＤＮＡ鎖は、約２０，０００塩基よりも長い、あるいは約３０，０００塩基よりも長いロングリードＤＮＡ鎖とすることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、標識付けされていないＤＮＡ鎖を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能のＳＴＥＭによって検出可能な重原子タグ（例えばＨｇ）を取り付けることによってＤＮＡ鎖を符号化する。重原子タグは、例えばＤＮＡ鎖を一本鎖から二本鎖に変化させるＤＮＡポリメラーゼ反応中に、ＤＮＡ鎖の塩基に直接に取り付けることができる。ＤＮＡ鎖の塩基へのタグ付けは連続的に、断続的にまたはそれらの組合せで実施することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖のアデニン、チミン、シトシンおよびグアニン塩基に、異なる種の重原子タグで標識付けする。ＳＴＥＭによって画像化すると、重原子タグのそれぞれの種は、特性強度を有する信号を生成し、それらの信号は、標識付けされたＤＮＡ鎖の得られた画像中で区別することができる。したがって、ＳＴＥＭによって取得したＤＮＡ鎖の画像中の重原子タグの発現からＤＮＡ鎖の塩基配列を決定することができる。それに加えて、またはその代わりに、重原子タグの配列中の間隔によって塩基および／または塩基の配列を示すことができるように、ＤＮＡ鎖に、重原子タグで標識付けすることもできる。重原子タグを用いたＤＮＡ鎖の標識付けは、シカゴ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）によって開発され、米マサチューセッツ州ＷａｋｅｆｉｅｌｄのＺＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって改良された技法など、当技術分野で公知の適切な技法に従って実行することができる。
【００５３】
さまざまな実施形態では、標識付けされていない状態のＤＮＡ鎖を検出するのに必要な分解能よりも低い分解能のＳＴＥＭによって検出可能な光シグネチャを発する発光標識でＤＮＡ鎖に標識付けする。発光標識は通常、ＤＮＡの塩基配列決定に必要な画像化走査よりもはるかに粗い画像化走査を使用するＳＴＥＭによって検出することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖を、光学顕微鏡によって検出可能な光シグネチャを発する発光標識に結合させる。発光標識は、そのＤＮＡ鎖の源に関する符号化された情報を追加的に含むことができる。発光標識を用いたＤＮＡ鎖の標識付けは、当技術分野で公知の適切な技法に従って実行することができる。
【００５４】
方法４００は続いてブロック４１０へ進むことができ、ブロック４１０では、試料支持体の機能化された表面に、標識付けされたＤＮＡ鎖を曝し、方法４００は次いでブロック４２０へ進むことができ、ブロック４２０では、標識付けされたＤＮＡ鎖を、試料支持体の表面の予め画定された場所に固定する。次いで、試料支持体を顕微鏡内に装着することができる（図示せず）。方法４００の符号化、曝露、固定および装着は、ブロック１１０、１２０および１３０に関して上で説明したとおりに実行することができる。方法４００の標識付け、曝露、固定および装着は変更することができ、図４に示した順序だけに限定されない。さらに、方法４００の標識付け、曝露、固定および装着ステップのうちの１つまたは複数のステップの実行は重なってもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、炭素基板が、予め画定された場所に位置する付着部位を有する表面を含み、付着部位が、標識付けされたＤＮＡ鎖の端部に化学的に付着するように機能化されている。この炭素基板は薄い炭素フィルムとすることができ、顕微鏡格子によってこの薄い炭素フィルムを支持することができる。標識付けされたＤＮＡ鎖は、長さが最大３０，０００塩基のＤＮＡ鎖であっても、標識付けステップ、曝露ステップ、付着ステップおよび任意選択の配向ステップの間、実質的に無傷のままでいることができる。理論によって拘束しようとするのではないが、ＤＮＡ鎖の完全性が維持されるのは、ＤＮＡ鎖が物理的に操作されたときに、約０．３４ｎｍの長さがあるＤＮＡ内の塩基間間隔が、少量の伸長を許容するためであると考えられる。
【００５６】
重原子タグが付けられたＤＮＡを含む実施形態では、方法４００が続いてブロック４４０ａへ進むことができ、ブロック４４０ａでは、予め画定された場所の領域を、重原子タグの存在を検出するのに十分なビーム分解能のＳＴＥＭの電子ビームで局所的に走査する。一実施形態では、このビーム分解能が、予め画定された場所にある重原子タグの存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、占有された予め画定された場所にあるＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。例えば、ＳＴＥＭを使用して、約１ｎｍから約２ｎｍの範囲のサイズを有する比較的に小さな画素からなる「精細な」画像を生成することができる。このような精細な画像は通常、ＤＮＡ鎖の塩基配列を直接に決定する目的および重原子タグを使用してＤＮＡ鎖の塩基配列を決定する目的には不適切である。これらの目的には通常、約０．４ｎｍよりも小さな画素サイズを含む「塩基配列決定」画像が必要である。しかしながら、重原子タグの精細画像は、予め画定されたそれぞれの場所に鎖が存在するか否かを検出するのには十分であり、これを検出することによって、ＤＮＡ鎖の特定の位置をＳＴＥＭを用いて特定するときに、占有されていない場所をより高い分解能で不必要に走査することを防ぐことができる。予め画定されたどの場所が占有されているのかをより低分解能の走査を使用して識別すると（例えばブロック３４０ａ、３４０ｂ、４４０ａおよび４４０ｂ）、例えば試料が配置された試料付着場所の占有率（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｒａｔｉｏ）が低い状況では、かなりの時間節減につながる可能性がある。本明細書で使用されるとき、「占有率」は、試料と予め画定された場所の数比を指す。占有率は、荷電粒子ビームで最初に走査したときにその予め画定された場所が占有されていない可能性の指標である。
【００５７】
ブロック４５０ａで、ブロック４４０ａに従って取得した予め画定された個々の場所に関するデータを処理し、標識の存在を示しているかどうかに関してそのデータを評価して、占有された予め画定された場所を識別する。重原子タグは、ＤＮＡの塩基配列決定に必要な画像化走査よりもはるかに粗い画像化走査を使用するＳＴＥＭによって検出することができる。そのため、予め画定されたどの場所がＤＮＡ鎖によって占有されているのかを重原子タグを利用して決定すると、ＤＮＡ鎖の位置特定を好都合により高速にすることができる。ＳＴＥＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。ステップ４４０ａおよび４５０ａは、標識付けされていない状態のＤＮＡ鎖を検出するのに必要なビーム分解能よりも低いビーム分解能のＳＴＥＭ電子ビームによって検出可能な重原子タグで標識付けされたＤＮＡ鎖に対して実行することもできる。
【００５８】
光学顕微鏡画像中で検出可能な光を標識が発する実施形態では、方法４００が続いてブロック４４０ｂへ進むことができ、ブロック４４０ｂでは、発光標識の光シグネチャを検出するのに十分な分解能を有する、予め画定された付着場所の画像を、光学顕微鏡を使用して取得する。一実施形態では、それらの画像の分解能が、光シグネチャを検出するのに必要な最低分解能以上であり、予め画定された場所のうちの１つの場所を占有しているＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。ブロック４５０ｂで、予め画定された個々の場所の画像を処理し、光シグネチャの存在に関して評価して、占有された予め画定された場所を識別する。
【００５９】
ブロック４５０ａおよび４５０ｂから、方法４００は続いてブロック４６０へ進むことができ、ブロック４６０では、占有された予め画定された場所を、標識付けされたＤＮＡ鎖の位置を決定するのに十分なビーム分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームで局所的に走査する。一実施形態では、このビーム分解能が、占有された予め画定された場所にあるＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。塩基配列を決定するのに必要な分解能よりも低い分解能を使用してＤＮＡ鎖の位置を特定することによって、ＣＰＭを用いて試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。ブロック４７０で、ブロック４６０に従って取得したビーム・データを処理して、標識付けされたＤＮＡ鎖の位置を決定する。次いで、ブロック４８０で呼び出すため、それらの位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置に記録することができる。
【００６０】
方法４００は続いてブロック４８０へ進むことができ、ブロック４８０では、標識付けされた個々のＤＮＡ鎖を、ＤＮＡ鎖を分析するのに十分な分解能のＳＴＥＭの電子ビームで走査する。ＤＮＡ鎖の走査を始めることができるように、ブロック４７０で保存した位置を使用して、ＳＴＥＭの光軸をそれぞれのＤＮＡ鎖へ誘導することができる。ブロック４４０ａ、４６０および４８０の電子ビームは、同じＳＴＥＭからまたは異なるＳＴＥＭから生成することができる。一実施形態では、重原子タグの配列を決定するのには十分だが、ＤＮＡの塩基配列を直接に決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能でＤＮＡ鎖を走査する。
【００６１】
ブロック４９０で、ブロック４８０に従って得たデータを処理することによってＤＮＡ走査の塩基配列を決定する。ＤＮＡ鎖の塩基を特定の種の重原子タグで符号化する実施形態では、標識付けされたＤＮＡ鎖はＳＴＥＭ画像から、上で説明したとおりに塩基配列を決定することができる。
【００６２】
図１〜４に示されているように、試料の位置を特定する方法の実施形態は、試料の位置を、試料表面の予め画定された異なる場所に固定することを含む。試料が見つかる可能性があるところを予め画定された場所に限定することによって、全ての試料の位置を特定するのに必要な総探索面積が低減される。次いで、このような低減は、支持体表面全体を走査することがあり、全体の走査時間が、走査する領域の全体サイズに直接に依存する従来のラスタリング（ｒａｓｔｅｒｉｎｇ）技法を使用するＣＰＭによって達成される走査時間に比べて、大幅な時間節減につながることがある。したがって、予め画定された場所に試料を固定し、予め画定された場所に対応する領域に走査を限定することによって、方法１００〜４００は、比較的に大きな支持体上の極めて小さな試料の迅速な位置特定を提供することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、予め画定された場所に依存せずに、試料支持体の表面の標識付けされた試料の位置を特定する。このような実施形態では、複数の試料を含む支持体表面の一部分を、試料に結合した標識のおおよその位置を決定するのに十分な分解能の荷電粒子ビームによって走査し、または、試料に結合した標識のおおよその位置を決定するのに十分な分解能の光学顕微鏡によって画像化することができる。これらの分解能は、標識付けされていない状態の試料の位置を検出するのに必要な最低分解能よりも低くすることができる。次いで、支持体表面は、標識のおおよその位置を包含する領域を、標識付けされた試料の位置を決定するのに十分な分解能で局所的に走査することができる。その後、標識付けされた試料を、試料を分析するのに十分な分解能の荷電粒子ビームによって走査する。
【００６４】
図５を参照すると、試料支持体上の標識付けされた試料の位置を特定し、それらの試料を画像化する、別の実施形態による方法５００の流れ図が示されている。この方法は、ブロック５０５で始めることができ、ブロック５０５では、標識付けされていない状態の試料の位置を特定するのに必要な分解能よりも低い分解能で位置を特定することができる標識で試料に標識付けする。適切な標識には、限定はされないが、発光標識および重原子タグが含まれる。ブロック３０５に関して説明した標識付けの方法はブロック５０５に対して適している。
【００６５】
方法５００は続いてブロック５１０へ進み、プロック５１０で、試料支持体の表面に標識付けされた試料を配置する。この表面は、表面の異なる場所に分布した機能化された付着部位を含むことができる。このような場合、ブロック５１０で、それぞれブロック３１０および３２０に関して説明した曝露ステップおよび固定ステップを使用して、表面に試料を配置することができる。それに加えて、またはその代わりに、異なる場所で支持体表面に試料を分布させ、重力および／または化学的な力によって試料をそのままの位置に保持することができる。
【００６６】
方法５００は続いてブロック５３０へ進み、ブロック５３０で、試料の標識を検出し、それらの標識のおおよその位置を決定するのに十分な分解能で試料支持体の表面の画像を取得する。一実施形態では、表面のこの画像の分解能が、標識のおおよその位置を決定するのに必要な最低分解能よりも高く、支持体表面の試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。画像化は、ＣＰＭ、光学顕微鏡またはそれらの組合せを用いて実行することができる。この方法は続いてブロック５４０へ進み、ブロック５４０で、表面の画像を処理して標識のおおよその位置を決定する。
【００６７】
方法５００は続いてブロック５５０へ進み、ブロック５５０で、この表面の標識のおおよその位置の領域を、試料の位置を決定するのに十分な分解能を有する荷電粒子ビームを使用して局所的に画像化する。すなわち、取得されるそれぞれの画像は、標識のおおよその位置のうちの１つの位置を含む、表面の局所的な領域に対応する。一実施形態では、それらの局所画像が、試料の位置を決定するのに十分な分解能以上で、試料を画像化するのに必要な分解能よりも低い分解能で取得される。試料を分析するのに必要な分解能よりも低い分解能を使用して試料の位置を特定することによって、ＣＰＭを用いて試料の位置を特定するのに必要な時間を有利に短縮することができる。ＣＰＭでは、低分解能画像を生成した方が高分解能画像を生成するよりも短時間ですむためである。
【００６８】
ブロック５６０で、それらの局所画像を処理して、表面の試料の位置を決定する。次いで、荷電粒子ビームを適切に配置するためにブロック５７０で呼び出すことができるように、試料の位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置に記憶することができる。
【００６９】
方法５００は続いてブロック５７０へ進み、ブロック５７０で、試料を分析するのに十分な分解能の荷電粒子ビームで試料を走査し、次いでブロック５８０へ進み、ブロック５８０で、荷電粒子ビームの走査データを処理して試料に関する情報を得る。試料の走査を始めることができるように、ブロック５６０で保存した位置を使用して、荷電粒子装置の光軸をそれぞれの試料へ誘導することができる。ブロック５７０および５８０は例えば、ブロック３７０および３８０に関して上で説明したとおりに実行することができる。
【００７０】
方法５００は、さまざまな用途で実行することができる。そのような１つの用途がＤＮＡの塩基配列決定である。図６を参照すると、試料支持体上の標識付けされたＤＮＡの位置を特定し、そのＤＮＡの塩基配列を決定する方法６００の流れ図が示されている。方法６００は、ＤＮＡ鎖を含む試料に標識を付け、それらの試料の位置を特定し、それらの試料の塩基配列をＳＴＥＭを使用して決定する、方法３００の実施形態を表す。
【００７１】
方法６００はブロック６０５から始まり、ブロック６０５で、標識付けされていない状態の試料の位置を特定するのに必要な分解能よりも低い分解能で位置を特定することができる標識でＤＮＡ鎖を符号化する。適切な標識には、限定はされないが、発光標識および重原子タグなどが含まれる。重原子タグは通常、ＤＮＡ鎖の位置を特定するのに必要な画像化走査よりも粗い画像化走査を使用するＳＴＥＭによってその位置を特定することができる。ブロック６０５では、例えばブロック４０５に関して上で説明したとおりに、ＤＮＡ鎖を標識で符号化することができる。
【００７２】
方法６００は続いてブロック６１０へ進み、ブロック６１０で、試料支持体の支持体表面に、標識付けされたＤＮＡ鎖を配置する。そのような場合、ブロック６１０で、それぞれブロック４１０および４２０に関して説明した曝露ステップおよび固定ステップを使用して、標識付けされたＤＮＡ鎖を表面に配置することができる。一実施形態では、この支持体表面が、異なる場所で表面に分布した機能化された付着部位を含む炭素基板を構成する。この炭素基板は、顕微鏡格子によって支持された炭素フィルムとすることができる。代替実施形態では、ＤＮＡ鎖が、異なる場所で支持体表面に分布し、重力および／または化学的な力によってそのままの位置に保持される。
【００７３】
重原子タグで標識付けされたＤＮＡ鎖については、この方法が続いてブロック６３０ａへ進むことができ、ブロック６３０ａでは、重原子標識を検出しそれらの標識の位置を決定するのに十分な分解能で試料支持体の表面の画像を取得する。ステップ６３０ａは、標識付けされていない状態のＤＮＡ鎖を検出するのに必要なビーム分解能よりも低いビーム分解能のＳＴＥＭ電子ビームによって検出可能な発光標識で標識付けされたＤＮＡ鎖に対して実行することもできる。あるいは、発光標識で標識付けされたＤＮＡ鎖が配置された表面をブロック６３０ｂに従って画像化することもできる。ブロック６３０ｂでは、光学顕微鏡を使用して発光標識を検出し、それらの標識の位置を決定する。一実施形態では、ブロック６３０ａまたはブロック６３０ｂに従って取得した画像の分解能が、標識のおおよその位置を決定するのに必要な最低分解能よりも高く、支持体表面の試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い。次いで、ブロック６３０ａ、６３０ｂで取得した画像をブロック６４０で処理して標識のおおよその位置を決定する。
【００７４】
方法６００は続いてブロック６５０へ進み、ブロック６５０で、この表面の標識のおおよその位置の領域を、ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに十分な分解能を有するＳＴＥＭ電子ビームを使用して局所的に画像化する。ブロック６６０で、それらの局所画像を処理して、支持体表面の標識付けされたＤＮＡ鎖の位置を決定する。ブロック６５０では、予め画定された場所に関してブロック４５０で説明した同じ方法で、おおよその標識位置を画像化することができる。ブロック６５０で得た画像は、ブロック４６０で説明した方法で処理することができる。次いで、ＳＴＥＭの電子ビームを適切に配置するためにブロック６７０で呼び出すことができるように、ＤＮＡ鎖の位置を、ハード・ドライブなどの記憶装置のブロック６６０内に記録することができる。
【００７５】
標識付けされた全ての試料を含めるのに十分な大きさの領域を画像化するとしても、ブロック６３０ａでは、試料のおおよその場所を迅速に決定することができる。これは、はるかに粗いラスタ（すなわちより大きな画素）を使用して標識を走査して、試料のおおよその場所を分解することができるためである。これは、標識からの信号が、ＵＶもしくは可視光、または大きな重原子標識のいずれかであるためである。したがって、全ての試料を含む領域の粗い画像をブロック６３０ａで迅速に取得し、次いでその画像をブロック６４０で処理して、ＤＮＡ鎖のおおよその位置を特定することができる。次いで、ブロック６５０および６６０で、おおよその場所の領域を細かい画素サイズで画像化して、ＤＮＡ鎖の実際の位置を決定する。
【００７６】
ＤＮＡ鎖の位置を決定した後、方法６００は続いてブロック６７０へ進み、ブロック６７０で、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な分解能のＳＴＥＭ電子ビームでＤＮＡ鎖を走査し、次いでブロック６８０へ進み、ブロック６８０で、電子ビーム・データを処理してＤＮＡ鎖の塩基配列を決定する。ＤＮＡ鎖の走査を始めることができるように、ブロック６６０で保存した位置を使用して、ＳＴＥＭの光軸をそれぞれのＤＮＡ鎖へ誘導することができる。ブロック６７０および６８０は例えば、ブロック４７０および４８０に関して上で説明したとおりに実行することができる。全てのＤＮＡ位置を決定した後、図７〜９および表Ｉに示した超高分解能画像化プロセス（「塩基配列決定」画像）を実行してＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００７７】
方法２００、４００および６００でＤＮＡ鎖の位置を決定した後、効率的なビーム方法を利用して、ブロック２６０、４８０および６７０で塩基配列決定を実行することができる。この効率的なビーム走査方法の一実施形態を図７〜９に示す。
【００７８】
図７は、本開示の実施形態に従って処理することができる長さＬ、直径Ｄおよび塩基数Ｎの典型的なロングリードＤＮＡ鎖７００の可能な効率的画像化法を示す。ロングリードＤＮＡ鎖７００は例えば約２ｎｍの直径Ｄおよび約３０，０００の塩基数Ｎを有することができ、塩基はそれぞれ、互いから約０．３４ｎｍ離れて位置している。少量の伸長で、ロングリードＤＮＡ鎖７００を、全体にまっすぐな形で（例えば鋭く曲がることなく）、約１２μｍの全長Ｌで、支持体表面に置くことができる。次いで、ＳＴＥＭの電子ビームによってロングリードＤＮＡ鎖７００を、一連の高速線走査に従って調べることができる。この一連の高速線走査は、ロングリードＤＮＡ鎖７００の軸７１０に沿って矢印７２０および７３０の方向に連続的な方法で実行される。それらの高速線走査はそれぞれ、軸７１０の局所方向に対して直角に、示された軸７４０に沿って、走査幅Ｗに対応する長さにわたって実施される。走査線の長さおよび走査幅Ｗは例えば約１０ｎｍとすることができる。
【００７９】
画素を最大限に使用するために、動的走査法を利用することができる。走査する総面積は以下のとおりである。
【００８０】
（１０ｎｍ）×（１２０００ｎｍ）＝１２００００ｎｍ２＝０．１２μｍ２＝（０．３５μｍ）２
画素のサイズをｄ（ｎｍ）とすると画素数は以下のようになる。
【００８１】
（１２００００ｎｍ２）／ｄ２
図８は、図７に示された幅１０ｎｍの高速走査軸７４０のうちの１本の全域にわたって電子ビームの信号強度Ｓを示す。ロングリードＤＮＡ鎖７００の軸７１０は図８の平面に対して垂直に延びており、軸７１０は、信号強度Ｓの軸と高速走査軸７４０との交点の黒丸によって表されている。ＳＴＥＭの走査の中心がロングリードＤＮＡ鎖７００上にあるときには、示されているように、信号ピーク８１０も中心にある。１０ｎｍの走査では、２ｎｍのＤＮＡ鎖が、走査幅の約２０％から約３０％を表す。
【００８２】
図９は、２ｎｍのＤＮＡ鎖の中心から走査がオフセットＯだけずれているときの信号Ｓを示す。この状況は例えば、ロングリードＤＮＡ鎖７００の曲りおよび／または走査電子回路もしくはカラム機械構造の不安定性によって生じることがある。走査信号のピークが中心から（この例では右に）ずれたら、ロングリードＤＮＡ鎖７００の全長に沿ってＳＴＥＭが画像化するときに、走査も右へ移動させ、それによってＤＮＡ走査を追跡することによって、ＳＴＥＭの走査電子回路を補償することができる。基板上でＤＮＡ鎖が方々に曲がるときには、ＤＮＡ鎖７００の局所方向（例えば矢印７２０、７３０）に対して高速走査軸を直角に維持するように走査軸の向きを調整することができる。下表Ｉは、計算された画素数および画像化時間（１０ＭＨｚにおける）を、さまざまな画素サイズについて示す。しかしながら、塩基配列決定時間が、第３世代塩基配列決定の支配的な考慮事項である場合には、次いで本発明の３つの実施形態のうちの１つまたは複数の実施形態が好ましいことがある。総画像化時間は、ブロック２６０、４８０または６７０の実行時間を表す。
【００８３】
【表１】
2016035450.tif 000003
【００８４】
表Ｉ。この表には、画素サイズごとに、総画素数、画像化時間および塩基配列決定速度が示されている。
【００８５】
本明細書ではさらに、機能化された試料支持体が開示される。この機能化された試料支持体は、機能化された試料支持体の比較的に大きな表面に分布した小さな試料を見つけ、それらの試料の位置を特定するのに有用なことがある。この機能化された試料支持体は、図１〜６の方法１００から６００のうちの１つまたは複数の方法に従って使用されたときに、試料の効率的な位置特定を容易にすることができる。
【００８６】
この機能化された試料支持体は、顕微鏡法用途の間試料を支持する表面を含む。この支持体表面は、ＣＰＭを用いて試料を調べる間、試料を支持するように構成されている。この支持体表面は、支持体表面の異なる場所に分布する機能化された部位を含む。それらの機能化された部位はそれぞれ、試料の位置を、機能化された部位の場所に維持するように構成されている。機能化された部位は、付着、引力またはそれらの組合せによって試料の位置を維持することができる。
【００８７】
付着部位は、１つまたは複数の機構に従って試料の位置を固定するように機能化することができる。適切な機構には、限定はされないが、化学的付着（例えば、結合を形成する、付着部位と試料との間の化学反応）、引力の作用（例えば、試料の静電荷とは符号が反対の静電場の作用、付着部位の分子と試料の分子との間の分子間力）、接着、および機械的係合（例えば、試料と固定的に係合するように構成されたナノ規模のインターロック機構を介した係合）などが含まれる。
【００８８】
付着部位は、付着部位の近くに試料が来たときに試料に引力が作用するように構成することができる。例えば、負に帯電した表面を有する試料の分析を含む用途では、機能化された試料支持体内において、正に帯電した表面を有する付着部位を使用することができる。静電力が試料を捕えるのに十分な近さのところで、負に帯電した試料が、正に帯電した付着部位のうちの１つの部位に曝された場合、負に帯電した試料は、正に帯電したその付着部位に引き付けられるであろう。
【００８９】
付着部位の付着機構を始動させるのに必要な条件が生じたときに、付着部位の近くにある試料を付着させるように、付着部位を構成することもできる。例えば、付着部位は、ある種の反応物が存在するときにある種の温度および圧力で試料と共有結合する１つまたは複数の化学官能基を備えることができる。別の例として、圧電性の作動を含む機械的インターロック機構では、付着部位に電流を流すことが必要となることがあり得る。
【００９０】
さまざまな実施形態では、付着部位が、支持体表面の予め画定された複数の場所を占有し、および／または支持体表面の予め画定された複数の場所の近くにある。予め画定された場所は、試料支持体の表面にある場所であって、試料支持体を使用して試料の位置を特定する前にわかっている場所を指す。例えば、支持体表面の予め画定された場所の座標を、機能化された試料支持体とは別個の機械可読の記憶装置に記憶することができる。この機械可読の記憶装置は、機能化された試料支持体によって支持された試料を処理するように構成されたシステムによって予め画定された座標を容易に転送することができ、またはそのようなシステムによって予め画定された座標に容易にアクセスすることができる形式とすることができる。適切な機械可読記憶装置形式の例には、限定はされないが、ＣＤ、ＤＶＤ、ポータブル・フラッシュ・ドライブ、クラウド・アクセスが可能なハード・ドライブなどが含まれる。この機械可読の記憶装置を、１つまたは複数の方法１００〜６００を実行するための実行可能命令に関連した予め画定された場所にアクセスするように構成されたＣＰＭシステムの記憶装置とすることもできる。
【００９１】
別の例として、予め画定された場所の座標を、支持体表面の予め画定された場所の容易な識別を促進する形態で、機能化された試料支持体に物理的に組み込むことができる。例示的な実施形態では、機能化された試料支持体が、予め画定された場所の隣の格子にエッチングされた文字および／または他のマークを含む「ファインダ格子」の形態をとる。
【００９２】
所与の時点において特定の数の試料または最大数の試料によって同時に占有されるように、予め画定された場所を構成することができる。一実施形態では、予め画定されたそれぞれの場所を一度に１つの試料が占有することができるように、支持体表面の付着部位が構成される。支持体表面の予め画定された異なる場所を、異なるタイプの試料の位置を維持するように構成することができる。一実施形態では、機能化された試料支持体が、第１のタイプの試料の位置を維持するように構成された予め画定された場所と、第２のタイプの試料の位置を維持するように構成された予め画定された場所とを備える。
【００９３】
機能化された試料支持体の支持体表面は支持構造体の表面とすることができる。例えば、機能化された試料支持体を、機能化された複数の部位を含むように適合されたＴＥＭ格子の表面とすることができる。
【００９４】
あるいは、支持体表面を、支持構造体によって支持された炭素フィルムなどのフィルムの表面とすることができる。さまざまな実施形態では、支持構造体が薄い炭素フィルムを含む。この薄いフィルムの厚さは、約０．５ｎｍから約１０ｎｍまでの範囲、あるいは約０．５ｎｍから約５ｎｍまでの範囲、あるいは約１ｎｍから約２ｎｍまでの範囲とすることができる。さまざまな実施形態では、機能化された試料支持体が、機能化された複数の付着部位を備えＴＥＭ格子などの格子構造体によって支持された薄いフィルムを含む。支持体表面の予め画定された付着場所の配置、予め画定された付着場所の数、ならびに支持体表面の付着部位の数および配置は、所望のとおりに変更し、および／または特定の用途に合わせることができる。
【００９５】
支持構造体は、試料を直接に支持するのに適した任意の構造体、および／またはＣＰＭ用途において試料が配置された構造体を支持するのに適した任意の構造体とすることができる。さまざまな実施形態では、支持構造体が格子構造体を含む。一実施形態では、機能化された薄いフィルムの支持体表面が、市販の別個のＴＥＭ格子構造体によって支持される。
【００９６】
本明細書ではさらに、試料支持体と複数の試料とを含む試料プレパラートが開示される。試料はそれぞれ、機能化された複数の付着部位のうちの１つの付着部位の試料支持体の表面に固定されており、表面の異なる場所に分布している。この試料プレパラートは、本明細書に開示された任意の試料支持体を含むことができ、試料は、ＤＮＡ鎖などの生体試料とすることができる。試料プレパラートの実施形態は、図１〜６の方法１００から６００のうちの１つまたは複数の方法に従って使用されたときに、付着した試料の効率的な位置特定を容易にすることができる。
【００９７】
試料プレパラートのさまざまな実施形態は、標識付けされた試料および／または標識付けされていない試料が予め配置された、本質的に機能化された試料支持体である。いくつかの実施形態では、試料プレパラートがさらに、予め配置された試料支持体とは別個の可読の非一時的記憶媒体であって、それぞれの付着部位の座標を含む記憶媒体を含む。次いで、この記憶媒体にはＣＰＭシステムがアクセスすることができる。ＣＰＭを予め画定された場所へ導いて、予め画定された場所における標識の存在および／または試料の位置に関して予め画定された場所を走査することができるようにするために、この記憶媒体を使用することができる。いくつかの実施形態では、試料プレパラートの機能化された試料支持体がファインダ格子を含み、ファインダ格子の格子メッシュにエッチングされた文字が、試料を走査する予め画定された個々の場所の位置を示す。いくつかの実施形態では、試料プレパラートの予め画定された場所の占有率が約１．０である。いくつかの実施形態では、予め画定された場所の占有率が約０．７５未満、あるいは約０．５０未満、あるいは約０．２５未満である。
【００９８】
支持体表面の予め画定された付着場所の配置、予め画定された付着場所の数、ならびに支持体表面の付着部位の数および配置は、所望のとおりに変更し、および／または特定の用途に合わせることができる。同様に、標識および試料に標識付けする方法は所望のとおりに選択することができ、および／または特定の用途に合わせることができる。
【００９９】
本開示の機能化された支持体および試料支持体のさまざまな実施形態を図１０Ａ〜１３Ｃに示す。ＤＮＡ鎖とＳＴＥＭベースのＤＮＡ塩基配列決定とを使用して図１０Ａ〜１３Ｃを示すが、図１０Ａ〜１３Ｃの実施形態は、生体試料向けおよび／または荷電粒子顕微鏡法の他の形態向けに構成することができる。図１０Ａ〜１３Ｃのさまざまな実施形態は、例えば方法３００〜６００に関して説明したように光学顕微鏡とともに使用することもできる。
【０１００】
図１０Ａを参照すると、正方形の開口１０２０を備える格子支持構造体１０１０を有する試料支持体１０００の簡略化された略図が示されている。いくつかの実施形態では、格子支持構造体１０１０が顕微鏡格子である。顕微鏡格子の直径は、３ｍｍなど、標準顕微鏡格子の直径とすることができる。顕微鏡格子は、格子を横切る直線１インチ当たりの格子線の数に対応する「メッシュ」サイズによって示される。したがって、「１０００メッシュ」格子の中心−中心の間隔は２５．４μｍである。メッシュ線の幅を考えると、１０００メッシュ格子の開口は通常（Ｘ−Ｙともに）１５〜２０μｍの範囲であり、これは、３００００塩基のＤＮＡ鎖の長さに匹敵する。そのような場合には、１つまたは複数のＤＮＡ鎖が、格子線にわたって引き伸ばされることがあり、その場合には、ＳＴＥＭベースの塩基配列決定においてそれらの越境したＤＮＡ鎖の完全な画像化が妨げられることがある。ＳＴＥＭの電子ビームは格子線を貫通することができないからである。厚さが約１ｎｍの薄い炭素フィルムなどの炭素フィルムが、格子開口にわたって広がって、ＤＮＡ鎖の連続した支持体を提供する。実施形態では、１２μｍのＤＮＡ鎖の全体を画像化するために十分に幅の広い開口が必要であることと、厚さ１ｎｍの自己支持型の炭素フィルムが破れない最大開口との釣合いが取れている。最大約１２μｍの長さを有するロングリードＤＮＡ鎖に対して適切なメッシュ・サイズは約４００から約１０００の範囲である。
【０１０１】
図１０Ｂは、試料支持体１０００の一実施形態の図１０Ａの単一の正方形格子開口Ｘの拡大図を示す。この実施形態では、予め画定された場所１０３１が支持フィルム１０４１上に提供されており、支持フィルム１０４１は、格子支持構造体１０１０によって支持されている。ＤＮＡ鎖１０５１が示されている。予め画定されたそれぞれの場所１０３１の内部の付着部位（図示せず）または予め画定されたそれぞれの場所１０３１の近くの付着部位（図示せず）は、予め画定された異なる場所１０３１の支持フィルム１０４１にＤＮＡ鎖１０５１を付着させるように機能化されている。予め画定された場所１０３１は、付着したＤＮＡ鎖１０５１の存在を示すために黒丸として示されており、ＤＮＡ鎖が配置されていない付着部位１０３１は白丸として示されている。これらの付着部位は例えば、広く公知のナノ・パターン形成プロセスに従って機能化することができる。図１０Ｂに従って構成された機能化された試料支持体１０００の実施形態は例えば、前述の方法２００の試料支持体として使用することができる。
【０１０２】
図１０Ｃは、予め画定された付着部位のない試料支持体１０００の一実施形態の正方形格子開口Ｘの拡大である。標識付けされたＤＮＡ鎖１０６２が支持フィルム１０４２上にランダムに位置しており、標識付けされたＤＮＡ鎖１０６２はＤＮＡ鎖１０５２と標識１０７２とを含む。一実施形態では、ＤＮＡ鎖１０５２が、付着部位によって支持フィルム１０４２に固定される。代替実施形態では、ＤＮＡ鎖１０５２が、重力および／または化学的な力によって支持フィルム１０４２上に維持される。標識１０７２は、標識１０７２が取り付けられたＤＮＡ鎖１０５２に関する符号化された情報を含むことができる。これらの標識１０７２および符号化されたデータは、異なる陰影が付けられた複数の円として示されている。標識１０７２は発光標識とすることができ、ＤＮＡ鎖に発光標識を取り付ける広く公知の方法に従ってＤＮＡ鎖１０５２に取り付けることができる。あるいは、２進符号またはバーコードを有する重原子標識を使用することができる。これらの重原子標識は、原子番号の大きな多くの原子からなるはるかに大きなボールを構成する点で重原子タグとは異なるであろう。このような大きなボールは、単一の重原子を画像化しなければならないＤＮＡの塩基配列決定に必要な画素よりもはるかに大きな画素を用いて画像化することができるであろう。図１０Ｃに従って構成された機能化された試料支持体１０００の実施形態は例えば、前述の方法６００の試料支持体として使用することができる。
【０１０３】
図１０Ｄは、予め画定された場所１０３３と標識付けされたＤＮＡ分子１０６３とを含む試料支持体１０００の一実施形態の正方形格子開口Ｘの拡大である。予め画定されたそれぞれの場所１０３３の内部の付着部位（図示せず）または予め画定されたそれぞれの場所１０３３の近くの付着部位（図示せず）は、予め画定された異なる場所１０３３の支持フィルム１０４３にＤＮＡ鎖１０５３を付着させるように機能化されている。標識付けされたＤＮＡ分子１０６３の標識１０７３は、標識付けされた分子１０６３が予め画定された場所１０３３の支持フィルム１０４３に固定されていることを除き、標識付けされた分子１０６３の標識と同じとすることができる。図１０Ｄに従って構成された機能化された試料支持体１０００の実施形態は例えば、前述の方法４００の試料支持体として使用することができる。方法２００および４００はそれぞれ、図１０Ｂおよび１０Ｄの試料支持体によって提供される支持体表面の特定の部分にＤＮＡ鎖の場所が限定されることを有利に使用して、ＤＮＡ鎖の位置をより高速に特定することができる。
【０１０４】
図１０Ｂ、１０Ｃおよび１０ＤのＤＮＡ鎖は概して単一の方向に配向させることができる。例えば、図１０Ｂ、１０Ｃおよび１０ＤのＤＮＡ鎖は全体に、それぞれの矢印１０８１、１０８２および１０８３の方向に配向させることができる。図１０Ｂ〜１０Ｄ、１１Ｂ〜１１Ｄおよび１２Ｂ〜１２Ｃの薄いフィルムは、それらのそれぞれの格子正方形および格子長方形の後ろに示されているが、実際にはそれらの薄いフィルムは格子の前にあることも留意すべきである。フィルムが後ろに示されているのは単に、図のさまざまな特徴部分を見やすくするためである。
【０１０５】
図１１Ａを参照すると、特注の長方形の開口１１２０を備える格子支持構造体１１１０の簡略化された図が示されている。それらの長方形の開口では、全体にまっすぐなＤＮＡ鎖を装着するプロセスが、長方形の開口の長軸に沿った向きに行われる。いくつかの実施形態では、格子支持構造体１１１０が顕微鏡格子である。顕微鏡格子の直径は、３ｍｍなど、標準顕微鏡格子の直径とすることができる。図１０Ａのように、１つまたは複数のＤＮＡ鎖が、格子線にわたって引き伸ばされることがある。しかしながら、長方形の幅の狭い寸法は、その上に支持された薄いフィルムに改良された支持を提供することができる。従来の正方形の格子と比べたときのこの特注の格子（本発明の部分）の利点は、格子線に重ならない付着したＤＮＡ鎖を、潜在的により高密度で、格子領域内に提供することができる点である。格子線に重なったＤＮＡ鎖の塩基配列を決定することはできない。試料の下方の明視野検出器および／または暗視野検出器への電子の透過を格子線が遮るときにはＳＴＥＭ画像化を実行する方法がないためである。したがって、本開示のさまざまな実施形態は、長方形の開口を有する格子支持構造体を備え、そのような格子支持構造体は、格子線の上になく、したがって塩基配列を決定することができるＤＮＡ鎖の割合を有利に増大させることができる。長方形格子の寸法は、約２５μｍから約１００μｍの範囲とすることができる。
【０１０６】
図１１Ｂは、試料支持体１１００の一実施形態の図１１Ａの単一の長方形格子開口Ｘの拡大を示す。この実施形態では、予め画定された場所１１３１が支持フィルム１１４１上に提供されており、支持フィルム１１４１は、格子支持構造体１１１０によって支持されている。ＤＮＡ鎖１１５１が示されている。予め画定されたそれぞれの場所１１３１の内部の付着部位（図示せず）または予め画定されたそれぞれの場所１１３１の近くの付着部位（図示せず）は、予め画定された異なる場所１１５１の支持フィルム１１４１にＤＮＡ鎖１１５１を付着させるように機能化されている。予め画定された場所１１３１は、付着したＤＮＡ鎖１１５１の存在を示すために黒丸として示されており、ＤＮＡ鎖が配置されていない付着部位１１３１は白丸として示されている。これらの付着部位は例えば、広く公知のナノ・パターン形成プロセスに従って機能化することができる。図１１Ｂに従って構成された機能化された試料支持体１１００の実施形態は例えば、前述の方法２００の試料支持体として使用することができる。
【０１０７】
図１１Ｃは、予め画定された付着部位のない試料支持体１１００の一実施形態の長方形格子開口Ｘの拡大である。標識付けされたＤＮＡ鎖１１６２が支持フィルム１１４２上にランダムに位置しており、標識付けされたＤＮＡ鎖１１６２はＤＮＡ鎖１１５２と標識１１７２とを含む。一実施形態では、ＤＮＡ鎖１１５２が、付着部位によって支持フィルム１１４２に固定される。代替実施形態では、ＤＮＡ鎖１１５２が、重力および／または化学的な力によって支持フィルム１１４２上に維持される。標識１１７２は、標識１１７２が取り付けられたＤＮＡ鎖１１５２に関する符号化された情報を含むことができる。これらの標識１１７２および符号化されたデータは、異なる陰影が付けられた複数の円として示されている。標識１１７２は発光標識とすることができ、ＤＮＡ鎖に発光標識を取り付ける広く公知の方法に従ってＤＮＡ鎖１１５２に取り付けることができる。あるいは、２進符号またはバーコードを有する重原子標識を使用することもできる。これらの重原子標識は、原子番号の大きな多くの原子からなるはるかに大きなボールを構成する点で重原子タグとは異なるであろう。このような大きなボールは、単一の重原子を画像化しなければならないＤＮＡの塩基配列決定に必要な画素よりもはるかに大きな画素を用いて画像化することができるであろう。図１１Ｃに従って構成された機能化された試料支持体１１００の実施形態は例えば、前述の方法６００の試料支持体として使用することができる。
【０１０８】
図１１Ｄは、予め画定された場所１１３３と標識付けされたＤＮＡ分子１１６３とを含む試料支持体１１００の一実施形態の長方形格子開口Ｘの拡大である。予め画定されたそれぞれの場所１１３３の内部の付着部位（図示せず）または予め画定されたそれぞれの場所１１３３の近くの付着部位（図示せず）は、予め画定された異なる場所１１３３の支持フィルム１１４３にＤＮＡ鎖１１５３を付着させるように機能化されている。標識付けされたＤＮＡ分子１１６３の標識１１７３は、標識付けされた分子１１６３が予め画定された場所１１３３の支持フィルム１１４３に固定されていることを除き、標識付けされた分子１１６３の標識と同じとすることができる。図１１Ｄに従って構成された機能化された試料支持体１１００の実施形態は例えば、前述の方法４００の試料支持体として使用することができる。方法２００および４００はそれぞれ、図１１Ｂおよび１１Ｄの試料支持体によって提供される支持体表面の特定の部分にＤＮＡ鎖の場所が限定されることを有利に使用して、ＤＮＡ鎖の位置をより高速に特定することができる。
【０１０９】
図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１ＤのＤＮＡ鎖は概して単一の方向に配向させることができる。例えば、図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１ＤのＤＮＡ鎖は全体に、それぞれの矢印１１８１、１１８２および１１８３の方向に配向させることができる。
【０１１０】
図１２Ａは、特注の長方形の開口１２２０を有する顕微鏡格子１２１０の略図である。顕微鏡格子１２１０は３ｍｍの顕微鏡格子とすることができ、それらの長方形の開口では、全体にまっすぐなＤＮＡ鎖を装着するプロセスが、長方形の開口の長軸に沿った向きに行われる。支持フィルムは、図１１および１２で説明したとおりである。顕微鏡格子１２１０の実施形態は、図１２Ａに関して説明した利点と同じ利点を有することができる。図１１に示した実施形態と図１２に示した実施形態の違いは、図１２では、付着部位を含む予め画定された場所が格子開口の縁に位置し、図１１のように薄いフィルム基板にパターン形成されたものではない点である。長方形格子の寸法は、約２５μｍから約１００μｍの範囲とすることができる。
【０１１１】
図１２Ｂは、付着部位を含む予め画定された場所１２３１が格子線の右縁１２９１にある単一の長方形格子開口Ｚの拡大である。予め画定された場所は円によって概略的に示されている。ＤＮＡ鎖１２５１が示されており、ＤＮＡ鎖はそれぞれ、予め画定された場所１２３１の１つの顕微鏡格子１２１０に、その中に含まれる付着部位の作用によって付着している。これらの付着部位は、本発明の部分ではない広く公知のさまざまなナノ・パターン形成プロセスによって画定することができる。これらのＤＮＡ鎖は、フィルム１２４１によって下から支持されている。図１２Ｂに従って構成された顕微鏡格子１２１０の実施形態は例えば、前述の方法２００の試料支持体として使用することができる。
【０１１２】
図１２Ｃは、付着部位を含む予め画定された場所１２３２が格子線の右縁１２９２にある単一の長方形格子開口Ｚの拡大である。標識付けされたＤＮＡ分子１２５２はそれぞれ、予め画定された場所の１つに、その中に含まれる付着部位の作用によって付着している。標識は、図１０Ｄおよび１１Ｄの標識と同じ標識とすることができる。ＤＮＡ鎖は、フィルム１２４２によって下から支持されている。図１２Ｃに従って構成された顕微鏡格子１２１０の実施形態は例えば、前述の方法４００の試料支持体として使用することができる。
【０１１３】
図１３Ａおよび１３Ｂは、本開示の実施形態に従って適合させることができる例示的な２つの電子顕微鏡格子を示す。これらの２つの電子顕微鏡格子はＴｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．のカタログから転載したものである。図１３Ａは、格子メッシュに文字がエッチングされた「ファインダ」格子である。これらの文字は、光学顕微鏡で見るのに十分な大きさを有するが、電子顕微鏡の典型的な視野に対して大きすぎるということはない。ファインダ格子１３Ｂは直径３ｍｍのファインダ格子とすることができる。したがって、これらの文字は、試料準備ステップ（通常は光学顕微鏡を使用して実行される）と、ＳＴＥＭ位置特定ステップおよび塩基配列決定ステップとをリンクさせることを容易にする。
【０１１４】
図１４Ａ〜１４Ｃは、本開示の実施形態に従って適合させることができる直径３ｍｍのギルダー・リファレンス・ロケーター格子を示す。予め画定された場所を格子上に有する試料の位置特定を支援するため、それぞれの格子正方形は一意の文字−数字符号を有する。（図は、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．のカタログから転載したものである。）
本明細書ではさらに、試料支持体上の試料の位置を特定しそれらの試料を画像化するシステムが開示される。このシステムは、１つまたは複数の荷電粒子顕微鏡を備えることができる。適切な顕微鏡機器は、限定はされないが、ＳＥＭ、ＴＥＭ、ＳＴＥＭ、光学顕微鏡またはそれらの任意の組合せを含む。このシステムは、１つまたは複数の処理装置と、それら１つまたは複数の処理装置のうちの少なくとも１つの処理装置に結合されたコンピュータ可読記憶媒体とを備えることができる。このコンピュータ可読記憶媒体は、実行されたときに、前述の方法１００〜６００のうちの１つまたは複数の方法を誘導することをシステムの構成要素に実行させる第１の実行可能命令を含む。このシステムは、本明細書に記載された１つもしくは複数の機能化された試料支持体、および／または本明細書に記載された試料プレパラートのうちの１つもしくは複数の試料プレパラートを備えることができる。
【０１１５】
図１５を参照すると、一実施形態による試料処理用のＳＴＥＭシステム１５００が示されている。システム１５００は、ＳＴＥＭ１５１０、機能化された試料支持体１５１５および制御システム１５３０を備える。機能化された試料支持体１５１５は、上に開示した機能化された試料支持体のうちの任意の試料支持体を含むことができる。
【０１１６】
制御システム１５３０は、コンピュータ可読記憶媒体１５４０、表示装置１５３２、ヒューマン・インタフェース１５５０および１つまたは複数の処理装置１５３４を備える。コンピュータ可読記憶媒体１５４０は、処理装置がアクセス可能な情報を記憶しており、この情報は、実行可能命令１５６０およびデータ１５４１を含む。データ１５４１は、ＳＴＥＭ１５１０によって取得された画像化データ、位置が特定された試料の座標１５４３、およびＳＴＥＭ１５１０の電子ビームを用いて試料を調べることによって取得された試料データ１５４４を含む。画像化データ１５４１はさらに、予め画定された場所の座標１５４５、占有された予め画定された場所の座標および／または識別１５４６、標識のおおよその位置の座標１５４７、機能化された試料支持体１５１５の位置を追跡するデータ１５４８、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１１７】
コンピュータ可読記憶媒体１５４０は、１つまたは複数の処理装置１５３４が、実行可能命令１５６０を読みその命令を実行することができ、ＳＴＥＭ１５１０、機能化された試料支持体１５１５およびヒューマン・インタフェース１５５０のうちの少なくとも１つから取得したデータを実行可能命令１５６０に従って処理することができ、ＳＴＥＭ１５１０、機能化された試料支持体１５１５およびヒューマン・インタフェース１５５０のうちの少なくとも１つから取得したデータをコンピュータ可読記憶媒体１５４０に書き込むように指示することができるように、１つまたは複数の処理装置１５３４に結合されている。コンピュータ可読記憶媒体１５４０は、情報を、コンピュータによって読み取ることができるフォーマットで、ある期間記憶する能力を有するハード・ドライブなどの装置とすることができる。適切なコンピュータ可読記憶媒体の例には、限定はされないが、ＰＡＴＡ、ＳＡＴＡ、ＳＣＳＩおよびＳＳＤハード・ドライブが含まれる。
【０１１８】
表示装置１５３２は、ＳＴＥＭ１５１０、機能化された試料支持体１５１５およびヒューマン・インタフェース１５５０のうちの１つまたは複数からの情報を表示するように構成することができる。表示装置１５３２は、電子的に生成された画像を投影する。このような画像には例えば、予め画定された場所の画像、付着部位の画像、機能化された試料支持体１５１５上に位置する試料の画像、１つまたは複数の機能化された試料支持体上の占有されたおよび／または占有されていない予め画定された場所の存在を表示するオーバレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）、ならびにそれらの組合せが含まれる。適切な表示装置の例には、限定はされないが、ＬＣＤディスプレイ、プラズマ・ディスプレイ、陰極線管ディスプレイおよびウォール・プロジェクタ（ｗａｌｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ）が含まれる。
【０１１９】
ヒューマン・インタフェース１５５０は、ＳＴＥＭ１５１０および機能化された試料支持体１５１５のうちの１つまたは複数と人間との対話を可能にするように構成された装置１５５５を備える。ＳＴＥＭ１５１０および機能化された試料支持体１５１５と人間との対話には例えば、ＳＴＥＭシステム１５００を制御するための命令および／またはデータ１５５７の操作者による入力が含まれる。ヒューマン・インタフェース１５５０に適した装置の例は、限定はされないが、キーボード、コンピュータ・マウス、タブレット型コンピュータなどのタッチ・インタフェースまたはそれらの任意の組合せを含む。ヒューマン・インタフェース１５５０はさらに、操作者とシステム１５００との対話を管理する実行可能命令を含む。
【０１２０】
１つまたは複数の処理装置１５３４は、コンピュータ可読記憶媒体１５４０上に記憶された実行可能命令１５６０を実行し、それによってＳＴＥＭ１５１０および機能化された試料支持体１５１５を制御する。１つまたは複数の処理装置１５３４はさらに、情報を読み取り、その情報を、操作者および／または観察者が見るために表示装置１５３２へ送る。１つまたは複数の処理装置１５３４はさらに、人間が入力した命令および／またはデータ１５５７を実行可能命令１５６０に従って処理し、ＳＴＥＭ１５１０、機能化された試料支持体１５１５およびヒューマン・インタフェース１５５０から取得したデータのコンピュータ可読記憶媒体１５４０上への記憶を指示する。
【０１２１】
試料の位置を特定する方法の実施形態は、システム１５００によって、システム１５００のコンピュータ可読記憶媒体１５４０上に記憶された実行可能命令１５６０に従って実行することができる。実行可能命令１５６０は、それぞれ方法１００、２００、３００、４００、５００および６００のうちの１つまたは複数の方法を実行するための方法命令１５６１（ａ）〜１５６１（ｇ）を含むことができる。実行可能命令１５６０は、前述のＳＴＥＭ機能の一部または全部を実行するためのＳＴＥＭ制御命令１５６３を含むことができる。
【０１２２】
図１６を参照すると、本開示の方法を実行するのに適した走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）が示されている。図１６は、暗視野電子１６０２と明視野電子１６０４を同時に検出することができるＳＴＥＭ１６００を示す。暗視野電子は、試料中の核から少なくとも一度弾性散乱した１次ビームからの電子であり、したがって軸からの角度が大きい。明視野電子は、全く散乱しなかったかまたは試料中の電子から非弾性散乱しただけの１次ビームからの電子であり、したがって軸からの角度が小さい。顕微鏡１６００は、電子源１６１０および集束カラム１６１２を含み、集束カラム１６１２は、源１６１０からの電子を集束させて小さなスポットとし、そのスポットで薄い試料１６１４（すなわち１次ビーム中の大部分の電子の透過を妨げるだけの十分な厚さを持たない試料）を走査する。このビームは、高エネルギー電子、すなわち典型的には約５０ｋｅＶから１，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する電子からなる。試料１６１４を通過した電子はプロジェクタ（ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ）１６１６に入る。いくつかの実施形態では、プロジェクタ１６１６が別個のレンズではなく、集束カラム１６１２内のレンズからのレンズ野の、試料１６１４の下方の延長部分である。ＳＴＥＭ用途では通常、ごく小さな偏向で試料を通過した明視野電子１６０４が円板形の明視野検出器１６１５に入射し、一方、試料によってより強く偏向した暗視野電子１６０２が環状の暗視野ＳＴＥＭ検出器１６１８によって検出されるように、プロジェクタ１６１６が調整される。環状暗視野ＳＴＥＭ検出器１６１８からの信号は増幅器１６２０によって増幅され、明視野検出器１６１５からの信号は増幅器１６２２によって増幅される。両増幅器からの信号は画像化システム１６２４に送られ、画像化システム１６２４は、検出された電子から試料１６１４の画像を形成することができる。環状ＳＴＥＭ検出器１６１８および明視野検出器１６１５はともに、シンチレータ−光電子増倍管検出器または固体ＰＩＮ検出器とすることができる。制御装置１６３０は、オペレータ命令に応答して手動で、またはコンピュータ記憶装置１６３２に記憶されたコンピュータ命令に従って自動的に顕微鏡１６００の動作を制御することができる。実行されたコンピュータ命令は、本明細書に記載された任意の方法を実行することができる。
【０１２３】
本明細書ではさらに、上に開示した方法（例えば方法１００〜６００）のうちの１つのまたは複数の方法を実行するための命令を含むコンピュータ・プログラム製品が開示される。図示されたさまざまな実施形態の流れ図およびブロック図は、装置、方法およびコンピュータ・プログラム製品の可能ないくつかの実施態様のアーキテクチャ、機能および動作を例示する。この点に関して、流れ図またはブロック図中のそれぞれのブロックは、指定された１つまたは複数の機能を実施するための１つまたは複数の実行可能命令を含む、コンピュータ・プログラム製品のコンピュータが使用可能なプログラム・コードまたはコンピュータ可読のプログラム・コードのモジュール、セグメントまたは部分を表すことがある。
【０１２４】
このコンピュータ・プログラム製品は、上に開示した機能を実施するためのコンピュータが使用可能なプログラム・コードを具体化した１つまたは複数のコンピュータ可読記憶媒体を含むことができる。このコンピュータ・プログラム製品は、データ構造、実行可能命令、およびコンピュータが使用可能な他のプログラム・コードを含むことができる。このコンピュータ・プログラム製品は、非一時的コンピュータ可読媒体で具体化することができる。このコンピュータ・プログラム製品は、取外し可能なコンピュータ記憶媒体および／または取外し不可能なコンピュータ記憶媒体で具体化することができる。取外し可能なコンピュータ可読記憶媒体には、限定はされないが、紙テープ、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク、固体メモリ・チップ、例えばアナログ磁気テープ、コンパクト・ディスク・リード・オンリー・メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ディスク、フロッピー（登録商標）・ディスク、ジャンプ・ドライブ、ディジタル・カード、マルチメディア・カードなどが含まれる。
【０１２５】
このコンピュータ・プログラム製品は、制御システム１５３０を備えるコンピュータ・システム上にロードするのに適していることがある。ロードされた後、１つまたは複数の処理装置１５３４は、この実行可能命令および／またはデータ構造を、一つには、コンピュータ・プログラム製品に直接にアクセスすることによって、例えばコンピュータ・システム１５３４のディスク・ドライブ周辺装置に挿入されたＣＤ−ＲＯＭディスクから読み取ることによって処理することができる。あるいは、１つまたは複数の処理装置１５３４は、この実行可能命令および／またはデータ構造を、コンピュータ・プログラム製品に遠隔アクセスすることによって、例えばネットワーク接続装置を介して遠隔サーバからこの実行可能命令および／またはデータ構造をダウンロードすることによって処理することができる。このコンピュータ・プログラム製品は、コンピュータ・プログラム製品から例えばコンピュータ可読記憶媒体１５４０へのデータ、データ構造、ファイルおよび／または実行可能命令のロードおよび／またはコピーを促進する命令を含むことができる。
【０１２６】
以下は、本開示による非限定的な特定の実施形態である。
【０１２７】
第１の実施形態。この実施形態は、荷電粒子顕微鏡法で使用する機能化された試料支持体であって、荷電粒子顕微鏡を用いて試料を調べている間、試料を支持するように構成された試料支持体表面を含み、試料支持体表面が機能化された部位を含み、機能化された部位が、付着、引力またはそれらの組合せによって、試料の位置を、機能化された部位に維持するように構成された機能化された試料支持体である。
【０１２８】
第２の実施形態。この実施形態は、機能化された部位が第１の機能化された部位であり、機能化された試料支持体がさらに、
第１の機能化された部位を含む機能化された複数の部位を含み、機能化された複数の部位のそれぞれが、試料支持体表面の異なる位置に位置し、付着、引力またはそれらの組合せによって、試料の位置を、その機能化された部位に維持するように構成された、
第１の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１２９】
第３の実施形態。この実施形態は、機能化された複数の部位のうちの第２の機能化された部位をさらに含み、第１の機能化された部位が、第１の特性を有する試料の位置を維持するように構成されており、第２の機能化された部位が、第２の特性を有する試料を維持するように構成されており、第１の特性が第２の特性とは異なる、第２の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３０】
第４の実施形態。この実施形態は、機能化された試料支持体が、格子構造体および炭素フィルムを備え、炭素フィルムが試料支持体表面を含み、格子によって支持された、第３の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３１】
第５の実施形態。この実施形態は、機能化された試料支持体が、格子構造体を備え、試料支持体表面が格子構造体の表面である、第３の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３２】
第６の実施形態。この実施形態は、機能化された部位が、試料と反応し、試料が機能化された部位に付着するような化学結合を機能化された部位と試料との間に形成するように構成された化学官能基を、機能化された部位が含む、第１の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３３】
第７の実施形態。この実施形態は、機能化された部位が、試料が機能化された部位に付着するように試料の特徴部分と固定的に係合するように構成されたナノ規模のインターロック機構を含む、第１の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３４】
第８の実施形態。この実施形態は、機能化された部位が、接着力、分子間力、静電力またはそれらの任意の組合せによって試料を機能化された部位に引き付け、接着するように構成された、第１の実施形態の機能化された試料支持体である。
【０１３５】
第９の実施形態。この実施形態は、電子顕微鏡用の試料プレパラートであって、
その表面が複数の部位を含む試料支持体であり、それぞれの部位が、局所的な引力、付着機構またはそれらの組合せによって試料の位置をその部位に維持するように機能化されている、試料支持体と、
複数の試料とを備え、それぞれの試料が、それらの部位のうちの１つの部位に接着した
試料プレパラートである。
【０１３６】
第１０の実施形態。この実施形態は、複数の標識をさらに備え、それぞれの標識が、試料のうちの１つの試料に結合しており、それぞれの標識が、標識を持たない試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の顕微鏡を用いて検出可能である、第９の実施形態の試料プレパラートである。
【０１３７】
第１１の実施形態。この実施形態は、それぞれの試料がＤＮＡ鎖を含み、複数の標識が発光標識を含む、第１０の実施形態の試料プレパラートである。
【０１３８】
第１２の実施形態。この実施形態は、顕微鏡が光学顕微鏡である、第１１の実施形態の試料プレパラートである。
【０１３９】
第１３の実施形態。この実施形態は、それぞれの標識が、標識に結合した試料を一意的に識別する情報を含み、標識を持たない試料を識別するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の顕微鏡によって、情報を標識から抽出することができる、第１０の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４０】
第１４の実施形態。この実施形態は、顕微鏡が走査透過電子顕微鏡である、第１３の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４１】
第１５の実施形態。この実施形態は、それぞれの試料について、
試料がＤＮＡ鎖を含み、
試料に結合した標識が１つまたは複数の重原子タグを含み、１つまたは複数の重原子タグがそれぞれ、ＤＮＡ鎖の塩基の位置に位置し、１つまたは複数の重原子タグがそれぞれ、走査透過電子顕微鏡によるＤＮＡ鎖の調査に応答して信号を生成するように構成されており、この信号が、塩基の種を示す強度を有する、
第１４の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４２】
第１６の実施形態。この実施形態は、試料支持体とは別個の可読の非一時的記憶媒体をさらに備え、可読の非一時的記憶媒体が、部位のうちのそれぞれの部位の座標を含む、第９の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４３】
第１７の実施形態。この実施形態は、試料支持体がファインダ格子を含み、複数の標識が、ファインダ格子の格子メッシュにエッチングされた文字を含み、それらの文字が、光学顕微鏡を介して知覚可能である、第１０の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４４】
第１８の実施形態。この実施形態は、同じ部位に２つの試料が付着していない、第９の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４５】
第１９の実施形態。この実施形態は、部位の総量が試料の総量よりも大きい、第９の実施形態の試料プレパラートである。
【０１４６】
第２０の実施形態。この実施形態は、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することを含み、試料の一部分の位置が、予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、方法である。
【０１４７】
第の２１実施形態。この実施形態は、試料がＤＮＡ鎖を含み、荷電粒子ビームが、ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである、第２０の実施形態の方法である。
【０１４８】
第２２の実施形態。この実施形態は、試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することが、試料支持体上の試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して、予め画定された場所を局所的に画像化することを含む、第２０の実施形態の方法である。
【０１４９】
第２３の実施形態。この実施形態は、予め画定された場所を局所的に画像化することによって得た画像化情報を処理することによって試料の一部分の位置を決定することをさらに含む、第２２の実施形態の方法である。
【０１５０】
第２４の実施形態。この実施形態は、試料が標識を含み、試料支持体上の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査することが、
予め画定された複数の場所を、標識の存在を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料支持体上の試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して、標識の存在に関して局所的に走査することを含む、
第２０の実施形態の方法である。
【０１５１】
第２５の実施形態。この実施形態は、標識の存在を示している予め画定された場所を、試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能の荷電粒子ビームを使用して走査することをさらに含む、第２４の実施形態の方法である。
【０１５２】
第２６の実施形態。この実施形態は、
予め画定された複数の場所が、第１の予め画定された場所および第２の予め画定された場所を含み、
試料が第１の試料であり、第１の試料の一部分の位置が、第１の予め画定された場所に固定されており、
この方法が、
予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、第２の試料の存在に関して局所的に走査することをさらに含み、第２の試料の一部分の位置が、第２の予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、第２０の実施形態の方法である。
【０１５３】
第２７の実施形態。この実施形態は、
第１の試料が第１のＤＮＡ鎖および第１の標識を含み、
第２の試料が第２のＤＮＡ鎖および第２の標識を含み、
荷電粒子ビームの分解能が、第１の標識と第２の標識のうちの少なくとも一方の標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖のうちの少なくとも一方のＤＮＡ鎖の一部分の表面における位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、第２６の実施形態の方法である。
【０１５４】
第２８の実施形態。この実施形態は、
第１の標識が、第１のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第１の重原子タグを含み、
第２の標識が、第２のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された重原子タグを含み、
荷電粒子ビームが、透過走査電子顕微鏡の電子ビームである、第２７の実施形態の方法である。
【０１５５】
第２９の実施形態。この実施形態は、
予め画定された複数の場所を局所的に走査することによって得た情報から、予め画定された場所のうちの１つの場所の画像を生成することと、
試料の存在の兆候に関してその画像を評価することとをさらに含む、第２０の実施形態の方法である。
【０１５６】
第３０の実施形態。この実施形態は、予め画定された複数の場所が、複数の付着部位を含む試料支持体の表面にあり、それぞれの付着部位が、予め画定された複数の場所のうちの１つの場所を占有し、それぞれの付着部位が、試料が付着部位に曝されたときに、試料の一部分の位置を、付着部位の予め画定された場所に固定するように機能化されている、第２０の実施形態の方法である。
【０１５７】
第３１の実施形態。この実施形態は、予め画定された複数の場所が試料支持体の表面にあり、荷電粒子ビームによって走査される総面積が、試料支持体の表面の総面積よりも大幅に小さい、第２０の実施形態の方法である。
【０１５８】
第３２の実施形態。この実施形態は、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
予め画定された複数の付着場所を含む表面を有する試料支持体を顕微鏡に装填することであって、予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所に、発光標識を含む試料が付着していることと、
表面の領域の局所画像を取得することであって、それぞれの局所画像が、予め画定された付着場所のうちの１つの付着場所を包含し、それぞれの局所画像が、発光標識からの光を検出するのに十分な分解能で取得されることと、
発光標識の光シグネチャの存在に関して局所画像を評価することによって、予め画定された付着場所のうちのどの付着場所が試料によって占有されているのかを決定することとを含む方法である。
【０１５９】
第３３の実施形態。この実施形態は、分解能が第１の分解能であり、第１の分解能が、発光標識からの光を検出するのに必要な最低分解能以上であり、試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、この方法が、
試料が付着した予め画定された付着場所を取り囲む領域の画像を、試料の位置を決定するのに十分な第２の分解能で取得することと、
試料の位置を決定するために、第２の分解能の画像を処理することとをさらに含む、第３２の実施形態の方法である。
【０１６０】
第３４の実施形態。この実施形態は、試料がＤＮＡ鎖を含み、第２の分解能が、ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、この方法が、
ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な第３の分解能の荷電粒子ビームを用いて試料を調べることをさらに含む、第３４の実施形態の方法である。
【０１６１】
第３５の実施形態。この実施形態は、表面の領域の局所画像を取得することが、光学顕微鏡を用いて局所画像を取得することを含む、第３２の実施形態の方法である。
【０１６２】
第３６の実施形態。この実施形態は、試料支持体上の試料の位置を特定する方法であって、
標識付けされた試料が配置された試料支持体の表面の画像を取得することであって、この画像の分解能が、標識付けされた試料のうちの１つの試料の標識のおおよその場所をこの画像から決定するのに十分であることと、
標識のおおよその位置を決定するために、この画像を処理することとを含む方法である。
【０１６３】
第３７の実施形態。この実施形態は、分解能が第１の分解能であり、この方法が、
標識を取り囲む領域の居所的な画像を、標識付けされた試料の位置を局所的な画像から決定するのに十分な第２の分解能で取得することと、
標識付けされた試料の位置を局所的な画像から決定するために、この画像を処理することと
をさらに含み、第１の分解能が、標識のおおよその位置をこの画像から決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、第３６の実施形態の方法である。
【０１６４】
第３８の実施形態。この実施形態は、標識付けされた試料がＤＮＡ鎖を含み、第２の分解能が、ＤＮＡ鎖の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低く、この方法が、
ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに十分な第３の分解能の走査透過電子顕微鏡から放出された電子ビームを用いて、標識付けされた試料を調べることをさらに含む、第３７の実施形態の方法である。
【０１６５】
第３９の実施形態。この実施形態は、表面の画像を取得することが、光学顕微鏡を使用して表面の画像を取得することを含む、第３６の実施形態の方法である。
【０１６６】
第４０の実施形態。この実施形態は、実行されたときに、
荷電粒子ビームを導いて、試料支持体の表面の予め画定された複数の場所を、荷電粒子ビームを使用して、試料の存在に関して局所的に走査すること
を１つまたは複数の処理装置に実行させる実行可能命令を含み、試料が、予め画定された場所のうちの１つの場所に付着している、非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１６７】
第４１の実施形態。この実施形態は、試料がＤＮＡ鎖を含み、荷電粒子ビームが、ＤＮＡ鎖の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、ＤＮＡ鎖の塩基配列を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能を有するＳＴＥＭの電子ビームである、第４０の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１６８】
第４２の実施形態。この実施形態は、実行可能命令が、実行されたときに、
荷電粒子ビームを導いて、予め画定された複数の場所を、表面の試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で、局所的に画像化すること
を１つまたは複数の処理装置に実行させる、第４０の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１６９】
第４３の実施形態。この実施形態は、実行可能命令が、実行されたときに、荷電粒子ビームによって得た予め画定された場所の画像を処理して、表面の試料の一部分の位置を決定することを１つまたは複数の処理装置に実行させる、第４２の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７０】
第４４の実施形態。この実施形態は、試料が標識を含み、
実行可能命令が、実行されたときに、荷電粒子ビームを導いて、予め画定された複数の場所を、標識の存在を決定するのに必要な最低分解能以上であり、表面の試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で、標識の存在に関して局所的に走査することを１つまたは複数の処理装置に実行させる、
第４０の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７１】
第４５の実施形態。この実施形態は、実行可能命令が、実行されたときに、荷電粒子ビームを導いて、標識の存在を示している予め画定された場所を、表面の試料の一部分の位置を決定するのに必要な最低分解能以上であり、試料を分析するのに必要な最低分解能よりも低い分解能で走査することを１つまたは複数の処理装置に実行させる、第４４の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７２】
第４６の実施形態。この実施形態は、
予め画定された複数の場所が、第１の予め画定された場所および第２の予め画定された場所を含み、
試料が第１の試料であり、第１の試料の一部分の位置が、第１の予め画定された場所に固定されており、
実行可能命令が、実行されたときに、
荷電粒子ビームを導いて、予め画定された複数の場所を、第２の試料の存在に関して局所的に走査する
ことを１つまたは複数の処理装置に実行させ、第２の試料の一部分の位置が、第２の予め画定された場所のうちの１つの場所に固定されている、
第４０の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７３】
第４７の実施形態。この実施形態は、
第１の試料が第１のＤＮＡ鎖および第１の標識を含み、
第２の試料が第２のＤＮＡ鎖および第２の標識を含み、
荷電粒子ビームの分解能が、第１の標識と第２の標識のうちの少なくとも一方の標識の存在を検出するのに必要な最低分解能以上であり、第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖のうちの少なくとも一方のＤＮＡ鎖の一部分の表面における位置を決定するのに必要な最低分解能よりも低い、
第４６の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７４】
第４８の実施形態。この実施形態は、
第１の標識が、第１のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第１の重原子タグを含み、
第２の標識が、第２のＤＮＡ鎖に特有の情報を符号化するように構成された第２の重原子タグを含み、
荷電粒子ビームが、透過走査電子顕微鏡の電子ビームである、
第４７の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７５】
第４９の実施形態。この実施形態は、実行可能命令が、実行されたときに、
予め画定された複数の場所を局所的に走査することによって得た情報から、予め画定された場所のうちの１つの場所の画像を生成すること、および、
試料の存在の兆候に関してこの画像を評価すること
を１つまたは複数の処理装置に実行させる、第４０の実施形態の非一時的機械可読記憶媒体である。
【０１７６】
第５０の実施形態。この実施形態は、高スループット試料処理用の走査透過電子顕微鏡システムであって、
走査透過電子顕微鏡と、
試料支持体と
を備え、試料支持体の表面が複数の場所を含み、それぞれの場所が、試料の一部分の位置をその場所でこの表面に固定するように機能化された付着部位を含む
走査透過電子顕微鏡システムである。
【０１７７】
第５１の実施形態。この実施形態は、複数の場所が予め画定されている、第５０の実施形態のシステムである。
【０１７８】
第５２の実施形態。この実施形態は、
１つまたは複数の処理装置と、
この１つまたは複数の処理装置のうちの少なくとも１つの処理装置に結合されたコンピュータ可読記憶媒体と
をさらに備え、このコンピュータ可読記憶媒体が実行可能命令を含み、この実行可能命令が、実行されたときに、予め画定された場所を局所的に走査するように走査透過電子顕微鏡の電子ビームを導いて、予め画定された場所のうちのどの場所が試料によって占有されているのかを決定し、または表面にある試料の位置を決定し、またはそれらの組合せを実行することを、１つまたは複数の処理装置に実行させる、
第５１の実施形態のシステムである。
【０１７９】
第５３の実施形態。この実施形態は、それぞれの付着部位が、ＤＮＡ鎖の端部を表面に固定するように機能化された、第５０の実施形態のシステムである。
【０１８０】
本発明の実施形態を示し説明したが、当業者は、本発明の教示を逸脱することなく本発明に変更を加えることができる。本明細書に記載された実施形態は単なる例であり、限定を意図したものではない。本明細書に開示された発明の多くの変形および変更が可能であり、本明細書に開示された実施形態の特徴部分の結合、統合および／または省略の結果である代替実施形態も本発明の範囲に含まれる。数値範囲または限界が明示されている場合、明示されたそのような範囲または限界は、その明示された範囲または限界内に含まれる同様の大きさの反復範囲（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｒａｎｇｅ）または限界を含むものと理解すべきである（例えば、約１から約１０まで、は、２、３、４などを含み、０．１０よりも大きい、は、０．１１、０．１２、０．１３などを含む）。例えば、下限がＲｌ、上限がＲｕである数値範囲が開示されているときには、この範囲に含まれる任意の数値が明確に開示されている。具体的には、この範囲内の次式の数値は明確に開示されている：Ｒ＝Ｒｌ＋ｋ×（Ｒｕ−Ｒｌ）。この式で、ｋは、１パーセントから１００パーセントまでの１パーセント刻みの変数である。すなわち、ｋは、１パーセント、２パーセント、３パーセント、４パーセント、５パーセント、５０パーセント、５１パーセント、５２パーセント、９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、９９パーセントまたは１００パーセントである。さらに、上で定義した２つのＲ数値によって定義された任意の数値範囲も明確に開示されている。特許請求項の任意の要素に対する用語「任意選択で」の使用は、その主題要素が必要であること、あるいはその主題要素が必要でないことを意味することが意図されている。これらの選択肢はともに、その特許請求項の範囲内であることが意図されている。本開示の実施形態の特徴部分を導入するための用語「〜ことができる（ｍａｙ）」の使用（例えば、「一実施形態では、その部品をはめ歯に接続することができる」）は、特徴部分を記載している実施形態は本発明の範囲内にあるとみなされること、および本明細書は、このような実施形態を肯定的に記載していると解釈すべきであることを意味することが意図されている。しかしながら、実施形態の特徴部分を導入するための用語「〜ことができる」の使用は、特徴部分を記載していない実施形態が本発明の範囲外とみなされることを示しているものではない。さらに、実施形態のさまざまな特徴部分が複数形で記載されるが（例えば、付着表面、局所的な付着部位など）、特徴部分を単数で有する実施形態（例えば、１つの付着表面、１つの局所的な付着部位など）も、単独で、または他の単数もしくは複数の特徴部分と組み合わされて、本発明の範囲内にあることが企図されている。別段明示的に示されていない限り、「備える」、「含む」、「有する」などのより幅広い用語の使用は、「〜からなる」、「本質的に〜からなる」、「実質的に〜からなる」などのより幅の狭い用語の支持を提供すると理解すべきである。
【０１８１】
本発明および本発明の利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態に、さまざまな変更、置換および改変を加えることができることを理解すべきである。さらに、本出願の範囲が、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることは意図されていない。当業者なら本発明の開示から容易に理解するように、本明細書に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行し、または実質的に同じ結果を達成する現在、既存のまたは今後開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを、本発明に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、その範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを含むことが意図されている。
【０１８２】
したがって、保護の範囲は、以上の説明によっては限定されず、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。保護の範囲は、特許請求項の主題の全ての等価物を含む。いずれの特許請求項も、本発明の一実施形態として本明細書に組み込まれている。したがって、特許請求項は追加の説明であり、本発明の実施形態への追加である。発明を実施するための形態の項での参照文献の議論は、特にそれが本出願の優先日後の公告日を有する参照文献である場合、その文献が、本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【符号の説明】
【０１８３】
１６００  ＳＴＥＭ
１６１０  電子源
１６１２  集束カラム
１６１４  試料
１６１５  明視野検出器
１６１６  プロジェクタ
１６１８  暗視野ＳＴＥＭ検出器
１６２４  画像化システム
１６３０  制御装置
１６３２  コンピュータ記憶装置
【図１】
2016035450.tif 000004
【図２】
2016035450.tif 000005
【図３】
2016035450.tif 000006
【図４】
2016035450.tif 000007
【図５】
2016035450.tif 000008
【図６】
2016035450.tif 000009
【図７】
2016035450.tif 000010
【図８】
2016035450.tif 000011
【図９】
2016035450.tif 000012
【図１０Ａ】
2016035450.tif 000013
【図１０Ｂ】
2016035450.tif 000014
【図１０Ｃ】
2016035450.tif 000015
【図１０Ｄ】
2016035450.tif 000016
【図１１Ａ】
2016035450.tif 000017
【図１１Ｂ】
2016035450.tif 000018
【図１１Ｃ】
2016035450.tif 000019
【図１１Ｄ】
2016035450.tif 000020
【図１２Ａ】
2016035450.tif 000021
【図１２Ｂ】
2016035450.tif 000022
【図１２Ｃ】
2016035450.tif 000023
【図１３Ａ】
2016035450.tif 000024
【図１３Ｂ】
2016035450.tif 000025
【図１４Ａ】
2016035450.tif 000026
【図１４Ｂ】
2016035450.tif 000027
【図１４Ｃ】
2016035450.tif 000028
【図１５】
2016035450.tif 000029
【図１６】
2016035450.tif 000030
【外国語明細書】
2016035450000001.pdf
2016035450000002.pdf
2016035450000003.pdf
2016035450000004.pdf