(57)【要約】【課題】本発明は、物質の変異原性を評価するための方法、並びに、該方法の実施に使用される組換えベクターを提供する。【解決手段】  本発明は、終始コドンを含まず、３の倍数個の塩基からなる変異原性検出配列を含む組換えベクターであって、開始コドン、変異原性検出配列、開始コドンを含まないレポーター遺伝子配列の順に配置され、該レポーター遺伝子が発現可能に挿入された組換えベクター、および該組換えベクターを用いた変異原性試験法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
終始コドンを含まず、３の倍数個の塩基からなる配列である変異原性検出配列を含む組換えベクターであって、
開始コドン、変異原性検出配列、開始コドンを含まないレポーター遺伝子配列の順に配置され、該レポーター遺伝子が発現可能に挿入された組換えベクター。
【請求項２】
前記変異原性検出配列が50塩基以上で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記変異原性検出配列において、そのアンチセンス鎖中の一部の配列が、チミンおよびシトシンのみで構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記レポ−ター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記変異原性検出配列の一部の配列が、配列番号１で表される配列であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の組換えベクターで形質転換した細胞。
【請求項７】
前記細胞が動物細胞であることを特徴とする請求項６に記載の細胞
【請求項８】
下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む変異原性試験法。
（ａ）請求項６または７に記載の細胞を被験物質に接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量を比較し、被験物質がレポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすか否かを判定する工程
【請求項９】
少なくとも請求項１ないし５のいずれかに記載の組換えベクターを含む、請求項８に記載の変異原性試験法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の変異原性を評価するための方法（変異原性試験法）、並びに、該方法に使用される組換えベクター、および、形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の科学技術の発達に伴い、様々な新規化学物質が開発されている。これらすべての化学物質が環境や人体等に悪い影響を及ぼすわけではないが、中には、がんやその他の遺伝性疾患の発症の要因となるような突然変異を引き起す物質も存在する。そのため、化学物質の変異原性を確認することは重要であり、特に、新規に開発される化学物質の変異原性を迅速、かつ正確に試験を行うことが必要となっている。
【０００３】
現在普及している変異原性試験の１つにAmes試験がある（非特許文献１）。Ames試験は、サルモネラ菌属ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のヒスチジン要求性突然変異株が、変異原と接触することによって誘導される復帰突然変異により、ヒスチジン非要求株に変わることを指標にして変異原性の評価を行う方法で、現在、最も信頼性が高く広く普及している試験方法である。この試験は、塩基対置換や塩基対の挿入・欠失などによって引き起こされるフレームシフト型突然変異を含む様々な変異を検出することができる。また、この方法によると、変異原性の強さに依存して、生じるコロニー数が変動するため、コロニー数をカウントするだけで変異原性の評価ができる点において簡便な方法といえる。しかしながら、サルモネラ菌などの細菌と動物などに由来する高等真核生物細胞では代謝系に大きな違いがあることから、必ずしもAmes試験の結果を動物などに外挿できないことが危惧されている。
【０００４】
一般的には細菌などの微生物には薬物代謝酵素（CYP酵素等）が少ないことから、試験物質の代謝物に対する変異原性を検出する場合には、肝臓ホモジネートの9,000 × gの上清（S9）と試験物質を事前にインキュベートした後に微生物を利用した試験に用いられる。この様な事情から、微生物ではなく、哺乳動物の培養細胞を用いた試験方法である小核試験法（非特許文献２）、あるいは、コメットアッセイ法 （非特許文献３）などもよく用いられている。その他、ラムダファージのレポーター遺伝子を含む遺伝子を導入したトランスジェニックラットを用いた変異原性試験も報告されている（特許文献１）。
これらの試験は、哺乳動物細胞を利用している点において、Ames試験に比べ、被験物質のヒトに対する影響を評価しやすいと考えられる。しかしながら、これらの方法は細胞の形態異常などを検出する点、トランスジェニック動物を作製する必要がある点において、試験実施者の熟練した技術が要求される。従って、より操作が簡便で、評価が容易な新しい試験方法が求められている。
【０００５】
哺乳動物細胞を用いた簡便な方法として、p53による転写調節機構を利用した変異原性試験法が報告されている（特許文献２、特許文献３）。この方法は、哺乳動物細胞に対する変異原の影響を簡便に評価する方法として優れているが、p53の転写調節機能を介して変異原性を評価するものであるため、別途、染色体DNAへの直接的なダメージを検出する簡便な評価法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2003-52276
【特許文献２】特開2005-   24
【特許文献３】WO2013/054846
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Amesら, Mutation Research., 31:347-364, 1975
【非特許文献２】Hayashiら, J Agric Food Chame. 54:6881-3887, 2006
【非特許文献３】Oliveら, Radiat Res., 122 : 86-94, 1990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明者らは、従来法よりも簡便な変異原性試験法の開発を試みた。
すなわち、本発明は、真核生物細胞を用いた変異原性試験法、並びに、該方法に使用される組換えベクター、および、該ベクターを含む形質転換細胞の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、蛍光タンパク質（GFP）遺伝子の開始コドン（ATG）の直下に、DNA損傷を検出するための標的配列（以下、変異原性検出配列とする）を挿入した改変GFP遺伝子が、発現可能に挿入された組換えベクターを作製し、このベクターを用いて形質転換した動物細胞に対する被験物質の変異原性を評価したところ、簡便かつ感度良く変異原性の評価が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）である。
（１）終始コドンを含まず、３の倍数個の塩基からなる変異原性検出配列を含む組換えベクターであって、
開始コドン、変異原性検出配列、開始コドンを含まないレポーター遺伝子配列の順に配置され、該レポーター遺伝子が発現可能に挿入された組換えベクター。
（２）前記変異原性検出配列が50塩基以上で構成されていることを特徴とする上記（１）に記載の組換えベクター。
（３）前記変異原性検出配列において、そのアンチセンス鎖中の一部の配列が、チミンおよびシトシンのみで構成されていることを特徴とする上記（１）または（２）のいずれかに記載の組換えベクター。
（４）前記レポ−ター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードするものであることを特徴とする上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の組換えベクター。
（５）前記変異原性検出配列の一部の配列が、配列番号１で表される配列であることを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の組換えベクター。
（６）上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の組換えベクターを含む細胞。
（７）前記細胞が動物細胞であることを特徴とする上記（６）に記載の細胞
（８）下記（ａ）および（ｂ）の工程を含む変異原性試験法。
（ａ）上記（６）または（７）に記載の細胞を被験物質に接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量を比較し、被験物質がレポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすか否かを判定する工程
（９）少なくとも上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の組換えベクターを含む、上記（８）に記載の変異原性試験法を実施するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明にかかる組換えベクターを使用した変異原性試験法を使用することで、煩雑な操作を行うことなく、真核生物に影響を及ぼす可能性のある変異原の評価を迅速に行うことができる。また、被験物質以外の物質を培養液に添加する必要がない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】変異原性検出配列（配列番号１）が挿入されているベクター中の挿入位置の塩基配列を示した図である。
【図２】暴露実験の手順を示した図である。
【図３】変異原性試験用に作出した細胞の顕微鏡写真である。Ａは遺伝子を導入していない293細胞、ＢはGFP遺伝子のみを導入した293細胞（GFP293細胞）、並びにＣは変異原性検出配列およびGFP遺伝子を導入した293細胞（T-GFP293細胞）である。Ａ、Ｂ、Ｃ、それぞれ左が明視野による観察像、右が蛍光観察した像である。
【図４】セルアナライザーによる解析で使用したGFP強度領域を示した図である。
【図５】被験物質に暴露した後のT-GFP293細胞からの蛍光の減少割合を示したグラフである。各グラフの縦軸はT-GFP293細胞からの蛍光の減少割合（%）、横軸は暴露した被験物質の濃度である。
【図６】変異原の検出限界濃度について、本発明の変異原性試験法で得られる結果と他の試験方法で得られる結果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、終始コドンを含まず、３の倍数個の塩基からなる変異原性検出配列を含む組換えベクターであって、
５’側から、開始コドン、変異原性検出配列、開始コドンを含まないレポーター遺伝子配列の順に配置され、該レポーター遺伝子が発現可能に挿入された組換えベクターである。
本発明の第１の実施形態においては、「変異原性検出配列」を開始コドンに隣接して連結させ、その直後に開始コドンを含まないレポーター遺伝子（つまり、レポーター遺伝子単独で発現可能となるような開始コドンを含まない遺伝子）を連結させたDNA構築物を、該レポーター遺伝子が機能し得る状態で発現可能に挿入した組換えベクターが提供される。「変異原性検出配列」は、被験物質によって惹起される変異、例えば、置換、挿入、欠失、あるいは、ダイマー形成などの塩基の修飾を検出するための配列である。変異が生じていない状態の変異原性検出配列は、塩基の数が３の倍数であり、かつ、終始コドンを含まない（変異原性検出配列中に、タンパク質の翻訳フレーム枠に合うTAA、TAGおよびTGAを含まない）ため、この配列に続くレポーター遺伝子は、正常に発現することができる（つまり、GFP遺伝子を用いた場合、緑色蛍光が得られる）。しかし、被験物質によって変異原性検出配列中に変異が引き起こされると、置換、挿入、欠失などにより、読み枠にずれが生じ、その結果、変異原性検出配列中に終始コドンが生じたり、あるいは、レポーター遺伝子のアミノ酸配列とは異なる配列を有するポリペプチドが発現するなど、レポーター遺伝子が正常に発現することができなくなり、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が変動することになる（つまり、GFP遺伝子を用いた場合、緑色蛍光は得られない）。また、変異原性検出配列にダイマー形成などの塩基修飾が誘導されると、転写の工程が修飾された部分で停止してしまい、レポーター遺伝子が発現されなくなる（つまり、GFP遺伝子を用いた場合、緑色蛍光は得られない）。
開始コドンと変異原性検出配列、および、変異原性検出配列とレポーター遺伝子とは直接連結しても、制限酵素サイトなどの塩基配列を挿入して間接的に連結してもよい。間接的に連結する場合には、レポーター遺伝子が発現可能となるような塩基数の塩基配列を挿入する必要がある。
【００１４】
すなわち、変異原性検出配列は、被験物質による様々な変異を、終止コドンの生成、フレームのずれ、あるいは、塩基修飾として検知し、レポーター遺伝子の発現の変化として、検出可能にするための機能を担っている。そのため、変異原性検出配列の長さ（構成する塩基の数）は、長い程、検出感度は上昇することになるが、変異原性検出配列から翻訳されるタンパク質は、レポーター遺伝子から翻訳されるタンパク質と融合して発現されることになるため、レポーター遺伝子から発現されるタンパク質の本来の活性を損なうことなく、また、細胞に悪影響を及ぼすことのないタンパク質が発現されるように、変異原性検出配列の構成、および、長さを決定することが望ましい。当業者であれば、予備的な実験として、作製した組換えベクターを予め所望の細胞内で発現させ、変異原性検出配列から発現されるタンパク質の影響を事前に知ることで、変異原性検出配列の利用可能性を容易に判定することができる。ただし、変異原性検出配列が短すぎると、被験物質によって誘導される変異を検出することが難しくなると予想されるため、例えば、50塩基以上で構成される配列が望ましい。後述の実施例で示してあるように、配列番号１の配列を変異原性検出配列として使用する場合には、変異原性の評価を簡便かつ感度良く実施することができる。従って、限定はしないが、配列番号１の配列を一部に含む配列を変異原性検出配列の一例として挙げることができる。
【００１５】
また、変異原性検出配列のアンチセンス鎖には、塩基修飾、特に、チミジンのダイマー形成を検出するために、チミンおよびシトシンのみで構成され配列を一部に含んでもよい。塩基修飾やチミジンダイマーなどが、アンチセンス鎖に生じることで転写への影響が生じ、タンパク質が翻訳できなくなる。その結果、レポーター遺伝子の発現が減少し、被験物質の変異原性を評価することが可能となる。
【００１６】
「レポーター遺伝子」は、本発明の実施形態にかかる組換えベクターに挿入可能な遺伝子であって、変異原が存在しない条件下において、導入した宿主細胞内で発現し、何らかの方法で、その発現を定性的または定量的に検出できるものであれば、いかなるものであっても使用可能である。本発明の実施形態の組換えベクターに挿入されるレポーター遺伝子の配列は、該レポーター遺伝子がコードするタンパク質の翻訳開始のための開始コドンを含まない。レポーター遺伝子は、その発現産物の量の変化を指標として、変異原の影響を調べるために使用するものであるから、変異原検出配列よりも下流にレポーター遺伝子の翻訳開始コドンが存在すると、変異原検出配列にいかなる変異が導入された場合でも、レポーター遺伝子の発現が誘導されてしまう可能性がある。
【００１７】
レポーター遺伝子としては、限定はしないが、例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、基質と反応することによって発光を生じる酵素をコードする遺伝子、抗生物質耐性遺伝子などを挙げることができる。レポーター遺伝子は、これがコードするタンパク質が何らかの活性を発揮するものであればいかなるものでも使用可能であるから、必ずしも遺伝子全長を含んでいる必要はない。例えば、レポーター遺伝子として蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、蛍光を発する機能を有する限り、当該蛍光タンパク質の全長をコードするDNAをレポーター遺伝子として使用する必要はなく、一部のDNAをレポーター遺伝子として使用してもよい。
蛍光タンパク質をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用する場合には、レポーター遺伝子の翻訳産物からの蛍光を測定することで（例えば、セルアナライザーなどにより測定可能）その発現を定量的に検出可能である。本発明の実施形態において使用可能な蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、特に限定はされず、当業者によって選択し得る如何なるものも使用可能である。本実施形態で使用可能な蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子として、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP：Green Fluorescent Protein）およびその誘導体（例えば、BFP、CFP、YFP、RFPなど）などのクラゲ由来の蛍光タンパク質の他、サンゴ由来、イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
また、基質と反応することによって発光を生じる酵素をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用する場合には、該レポーター遺伝子から発現した酵素を基質と反応させ、生じる発光を、例えば、ルミノメーターなどで測定することで、レポーター遺伝子からの発現量を検出することができる。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどをコードする遺伝子を挙げることができる。
その他、場合によっては、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性付与遺伝子、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子など）なども、レポーター遺伝子として使用可能である。
【００１８】
本実施形態の組換えベクターには、上述の構成要素の他に、タンパク質発現用のプロモーターが存在する。
ここで使用可能なプロモーターは、特に限定されるものではなく、本発明にかかる組換えベクターを導入する宿主細胞に対応して適切なプロモーターを使用すればよい。例えば、宿主が動物細胞である場合は、CMVプロモーター、SRαプロモーター、CAGプロモーター、SV40プロモーターなどが、宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが使用可能である。
【００１９】
本発明の第２の実施形態は、第１の実施形態である組換えベクターで形質転換した細胞（形質転換細胞）である。本発明にかかる組換えベクターで形質転換した細胞としては、真核細胞が好ましく、特に、動物細胞などの高等真核生物細胞が好ましい。ここで使用可能な動物細胞は、特に限定されず、動物由来の細胞であれば、如何なるものであっても使用可能である。あえて使用可能な細胞を例示すると、例えば、ヒト由来のHEK293細胞、マウス由来のNIH3T3細胞、ハムスターの由来のCHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル由来のCOS-1細胞、COS-7細胞、Vero細胞などを挙げることができる。
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、当業者において実施可能な如何なる方法を選択してもよい。例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133 1990）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 1987）などが使用可能である。
本実施形態の形質転換細胞には、レポーター遺伝子が一過的に発現する細胞、および、安定的に発現する細胞のいずれも含まれるが、安定的に発現する細胞の方が望ましい。
本実施形態にかかる形質転換細胞は、変異原の存在しない環境において培養を行い、レポーター遺伝子が当該細胞内において正常に発現することを確認しておくことが望ましい。
【００２０】
本発明の第３の実施形態は、
次の（ａ）および（ｂ）の工程；
（ａ）第２の実施形態にかかる細胞（第１の実施形態にかかる組換えベクターを含む細胞）を被験物質に接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量を比較し、被験物質がレポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすか否かを判定する工程、
を含む変異原性試験法である。
【００２１】
被験物質は、特に限定されず、１種類であっても、複数種の物質の混合物であってもよい。
第１の実施形態の組換えベクターにより変異原検出用レポーター遺伝子が導入された細胞（以下、形質転換細胞とする）は、被験物質と接触させる前に、継代をし、限定はしないが、約8時間〜一晩程度培養を行ったものを使用してもよい。培養温度は、使用する形質転換細胞に適した温度を使用すればよく、また、播種する細胞数も特に限定されないが、例えば、24ウェルプレートの1ウェルに対し、1.0×104〜1.0×105個程度にしてもよい。
次に、被験物質を形質転換細胞の培地に添加する。被験物質は、その物質の物性に応じて、そのまま、または、適当な溶媒に溶解させて添加してもよい。用いる溶媒は、形質転換細胞に影響を及ぼさないものが望ましく、限定はしないが、例えば、水、PBSなどの緩衝液の他、DMSO、エタノール、メタノールなどの有機溶媒も培地に添加される濃度によっては、使用可能である。添加する被験物質の量も、用いる被験物質の至適濃度により異なるが、例えば、最終的に0.1〜1.0重量%程度になるように添加することができる。
被験物質を形質転換細胞の培地に添加後、適当な時間、例えば、12〜72時間程度、好ましくは、24〜48時間程度培養する。
【００２２】
その後、被験物質を接触させた形質転換細胞中のレポーター遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない形質転換細胞中のレポーター遺伝子の発現量を比較する。
レポーター遺伝子の発現量は、その特性に応じて、公知の方法などを使用して測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする遺伝子である場合には、形質転換細胞内の蛍光タンパク質が発する蛍光の強度をセルアナライザーなどを使用して測定し、その発現量を定量することができる。また、レポーター遺伝子が、酵素反応の結果発光物質を生じさせるルシフェラーゼなどの場合には、形質転換細胞の細胞溶解物に酵素基質であるルシフェリンを添加し、ルシフェリンの分解による発光量をルミノメーターで測定し、その発現量を定量することができる。
【００２３】
被験物質を接触させた形質転換細胞中のレポーター遺伝子の発現量が、被験物質を接触させていない形質転換細胞中のレポーター遺伝子の発現量に対する割合が、添加する被験物質の濃度依存的に、統計的有意差があると判断される程度に変動する場合に、当該被験物質を変異原性物質であると判定することができる。
【００２４】
本発明の第４の実施形態は、本発明に係る変異原性試験法を実施するためのキットである。
本実施形態のキットには、少なくとも、第１の実施形態にかかる組換えベクターが含まれる。また、当該組換えベクターで形質転換された細胞が含まれていてもよい。その他、組換えベクターを細胞に導入するために必要な試薬類、当該キットの使用説明書なども含まれていてもよい。
【００２５】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
１．実験方法
１−１． 試薬
本実施例においては、特記しない限り和光純薬社製の特級試薬を用いた。また、酵素類は、特記しない限り宝酒造社製を使用した。
【００２７】
１−２．変異原性検出配列および組換えベクターの構築
変異原を検出するための組換えベクターの構築には、CMVプロモーターと緑色蛍光タンパク質遺伝子（AcGFP1）を有する哺乳動物用発現ベクターであるpAcGFP1-N1（Clontech）を使用した。
まず、このベクター中のマルチクローニングサイトを除くために、下記のプライマーセットを使用し、pAcGFP1-N1をテンプレートとしてPCRを行った。
AcGFP1_del_F1；5’-ATCCCCCGGGAGATCTGTGAGCAAGGGCGCCGA-3’（配列番号２）
AcGFP1_del_R2；5’-CACGTCAGATCTCGATAGCGCGGATCCCATGGTGGCGATC  CTCCTGAATTCGAGTCCGGTAGCGCTAGC-3’（配列番号３）
得られたPCR産物をBamHIおよびBglIIで消化後、セルフライゲーションすることでプラスミドpMC-Gを構築した。
また、このプラスミドのAcGFP1遺伝子の直下に存在する制限酵素XbaIの認識配列は、dam methylase の影響によりメチル化が生じ、XbaIで消化できない。従ってこのpMC-Gを、XbaIで消化できるよう脱メチル化する目的でメチル化を引き起こさないコンピテントセルであるHST04 E. coli（TaKaRa）に導入し、脱メチル化されたpMC-Gを精製し、BamHIおよびXbaIで消化し、アガロース電気泳動後、AcGFP1遺伝子を含むゲルを切り出し、AcGFP1遺伝子の精製を行った。
【００２８】
一方、dam methylase の影響を受けてもXbaIが消化できるよう、除去する目的でpMC-G のXbaIの認識配列に続くTCの配列をCCに変えるために、次の様な操作を行った。
まず、pMC-Gをテンプレートとし、下記のプライマーセットを使用してPCRを行った。
pMC-TBG-dAcGFP_F1；5’-GAGCTCTAGACCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAG-3’（配列番号４）
pMC-TBG-dAcGFP_R1；5’-TGAACAGCTCGGCGCCCTTG-3’（配列番号５）
得られたPCR産物は、XbaI認識配列がTCTAGACCに置換されており、かつ、AcGFP1遺伝子が除かれている。このPCR産物をBamHIおよびXbaIで消化し、先のAcGFP1遺伝子と連結させ、プラスミドpMC-G2を構築した。
【００２９】
次に、ピリミジン塩基に二量体を形成するDNA損傷を検出し得る配列（Thymine Dimer Target Site; TDTS）を設計した（図１）。このTDTS配列は、アンチセンス鎖が、チミンおよびシトシンのみで構成される59塩基の配列となるように設計した。センス鎖としてTDTS_U（配列番号６）を、アンチセンス鎖としてTDTS_L（配列番号７）を合成し、TDTS配列を持つDNA断片を作製した。
TDTS_U；5’-GATCCCTCGAGGAAGAAGAGGAGGGAAAAGGGAAAAAGAAAAGAAAAGAAAAAAGGAAAGAGAAAGGTACCA-3’
TDTS_L；5’-GATCTGGTACCTTTCTCTTTCCTTTTTTCTTTTCTTTTCTTTTTCCCTTTTCCCTCCTCTTCTTCCTCGAGG-3’
まず、0.1 μg/μl TDTS_U及び0.1 μg/μl TDTS_Lを10 μl ずつ1.5 ml のマイクロチューブに加え、96℃のヒートブロックで30秒加温し、室温で1時間静置した。得られた二本鎖DNAは、BamHIおよび BglIIによって切断した場合に生じる粘着末端配列を有している。この末端配列を利用して、得られた二重鎖DNAをpMC-G2に挿入し、変異原検出用の組換えベクター（pMC-TG）を作製した（図１）。
【００３０】
１−３．変異原性試験用培養細胞
本実施例で使用した細胞は、ヒト腎細胞由来の細胞（HEK 293 cells）にFlp-In システムが組込まれた安定株である付着性細胞のFlp-InTM 293 T-REx cell lines（Life Technologies ;以下「293細胞」とする）を用いた。細胞の培養には、293細胞の添付マニュアルに記載されている完全培地を用いた。また、細胞の継代は、60 mmディッシュ、24穴プレートあるいは48穴プレートを用いた。
70〜80%コンフルエントとなった細胞のディッシュおよびプレートから完全培地を取り除き、1×PBS（pH=7.4）を300 μl〜4 mlを加えて、ゆっくりと撹拌し、上清を除く工程を２回行った。その後、トリプシン／EDTA（T4049-500ML、GIBCO）を300 μl〜4 ml加えて、CO2インキュベーター（RCO3500TABB、Revco Technologies）で、5分間インキュベートを行い、倒立顕微鏡（TS100、Nikon）を用いて細胞の剥離を確認後、完全培地を300 μl〜500 μl加えて、4 ℃、1,000 rpmで5分間、遠心分離を行った。その後、上清を除き、細胞に完全培地を5 ml加えて再懸濁し、新しい60 mmディッシまたは24穴プレートあるいは48穴プレートに細胞の懸濁液を各ウェルに添加し、植え替えを行った。
【００３１】
細胞の形質転換は、リポフェクション法を用いて、以下のように行った。
1.5 ml マイクロチューブに50 μl ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、GIBCO）とLipofectamine（登録商標）2000 Transfection Reagent（Life Technologies）を1 μl 混和させた（リポフェクション溶液）。また、異なる1.5 ml マイクロチューブにDMEM 50 μlと1 μg/μlのプラスミドを1 μl混和させた（プラスミド溶液）。これらのリポフェクション溶液及びプラスミド溶液は、室温で5分間インキュベートを行い、これら全量を混合し、室温で更に20分間のインキュベートを行った。この溶液を、抗生物質の入っていない培地を使用して12 穴プレート（NUNC）で培養した293細胞に全量滴下し、4時間後に培地を取り除き、新しい培養液で交換した。その後、3〜4日間、CO2インキュベーターで培養した。形質転換細胞は、アミログリコシド系の抗生物質のG418（Geneticin（登録商標）、 Life Technologies）を選択薬剤として長期間のスクリーニングを行うことで、野生株と一過性発現株を除去した。12穴プレート１穴中の形質転換細胞が大半を占めるようになった後に、ペニシリンカップ法を用いて形質転換体を分取し、その細胞を96 穴プレート（NUNC）に移してクローニングを行った。倒立顕微鏡（TE300、Nikon）でクローン化した細胞の蛍光観察を行い、蛍光を発している細胞株を継代し、pAcGFP1-N1及びpMC-TGを導入した細胞をそれぞれGFP293細胞及びT-GFP293細胞とし、使用するまで常法に従って-80℃または液体窒素中に保存した。
【００３２】
１−４．被験物質
被験物質としてDNAを直接標的とし変異原性試験の陽性対象試薬として汎用されているmitomycin C（MMC）、5-fluorouracil（5-FU）、methyl methanesulfonate（MMS）、ethyl methanesulfonate（EMS）、N-methyl-N-nitrosourea（MNU）、およびN-ethyl-N-nitrosourea（ENU）に加え、発がん性の疑いのある物質として認識されている1-nitropyrene（1-NP）を用いた。これらの被験物質に関する情報を表１に示す。
各被験物質は適切な溶媒に溶解させた後に、MILLEX（登録商標） GV Filter Unit 0.22 μm（Millipore）で濾過滅菌し、使用するまで-20 ℃で保存した。これらの被験物質は用時に抗生物質を含まない培地に加えて暴露実験に用いた。ただし、溶媒にdimethyl sulfoxide （DMSO）を用いた場合、培養液中のDMSO濃度が終濃度0.5 %となるように被験物質を添加した。
【表１】
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【００３３】
１−５．暴露実験
変異原性検出配列（配列番号１）とGFP遺伝子が染色体上に挿入されているT-GFP293細胞と、GFP遺伝子のみが染色体上に挿入されているGFP293細胞を用いて、暴露実験を行った。
60 mmディッシュで80 %コンフルエントになった細胞を、トリプシン／EDTAを用いて剥離後、24ウェルプレートの１ウェルに対し7.5×104 個になるように培地とともに播種し、CO2インキュベーター内で1日インキュベーションを行った。インキュベーション後、培地を全量取り除き、段階的に濃度を変えた被験物質を400 μlずつ加え、再びCO2インキュベーター内で3日間暴露を行った（図２）。なお、実験は、一つの濃度に対して6試料を用いて行った。
【００３４】
１−６．セルアナライザーによる分析
被験物質を3日間暴露した細胞は、蛍光顕微鏡を用いて細胞の状態を観察した。次に各ウェルの培地を全量取り除き、PBSで洗浄を行った後、洗浄液をすべて取り除いた。続いて、トリプシン／EDTA 100 μlを加え、CO2インキュベーター内で10分間インキュベートした。プレートから細胞が遊離したことを確認し、任意の割合でホルムアルデヒドを含むPBS溶液を400 μl加え再懸濁させ、1.5 ml マイクロチューブに移した。この細胞懸濁液を氷上で1時間遮光し、その後、細胞懸濁液から、41 μmのナイロンメッシュ（NY41-HC、NYTAL）とディスポーザブルテストチューブ(93-5001-6、三商)を用いて細胞を単離し、各細胞のGFP強度をセルアナライザー（EC800、Sony）で測定した。変異原性の評価は、細胞のサイズおよび内部構造が一定の状態にある細胞であって、GFP蛍光が消失した細胞数の割合を調べることで行った。
【００３５】
１−７．統計解析
得られたデータは、各群の平均値（mean）± 標準偏差（S.D.）を算出し、Bartlett検定（Snedecor and Cochran, 1989a）により各群の分散の均一性の検定を行った（有意水準 : 両側 1 %）。分散が均一の場合にはDunnett検定（Dunnett, 1955, 1964）を用いて対照群と各暴露群との平均値の差の検定（有意水準 : 両側5および1 %）を、分散が均一でない場合にはSteel検定（Steel, 1959）を用いて、対照群と各暴露群との平均順位の差の検定（有意水準 : 両側5及び1 %）を、それぞれ行った。
【００３６】
２．結果
２−１．変異原性試験用細胞の作出
まず、GFP293細胞およびT-GFP293細胞から緑色蛍光が生じるかを確認した。GFP293細胞については、蛍光顕微鏡の一視野で観察される全ての細胞が、均一で強い緑色蛍光を発していた（図３Ｂ）。このことから、FP293細胞は遺伝的に均一なGFPを発現できたと考えられる。同様に、変異原性検出配列が導入されているT-GFP293細胞について緑色蛍光を観察したところ、一様に緑色蛍光を発していることがわかった（図３Ｃ）。従って、の開始コドン直下に変異原性検出配列（配列番号１）から翻訳される24アミノ酸長のペプチドが付加されたGFPは、緑色蛍光を発するタンパク質であることが確認できた。
【００３７】
２−２．暴露実験
各被験物質を細胞に暴露させた後、GFPからの蛍光が消失した細胞数の割合を調べるために、まず正常なGFP蛍光強度範囲を定義した。
293細胞、GFP293細胞およびT-GFP293細胞を用いて、FSおよびSSの値が200以上の細胞の内、その50%が存在している領域の面積が最小となるような領域に対してゲーティングして測定結果を得た。その結果を図４に示す。293細胞はGFP蛍光を持たないため、その正規分布しているヒストグラムの蛍光強度が強い方の裾野がベースラインに接する点付近を境に、蛍光強度が弱い領域を無蛍光領域とし、強い領域を正常蛍光領域とした（図４）。この定義に従って、各被験物質を添加した暴露実験の結果の評価を行った。
【００３８】
T-GFP293細胞の有用性を調べるために、T-GFP293細胞とGFP293細胞を用い、MMCに対する感受性の違いを調べた。MMCの濃度を25から250 nMまで25 nMの等差数列的に変更して実験を行った。その結果、T-GFP293細胞は、コントロールに対して125 nM以上の濃度で有意の差を持って無蛍光領域の細胞数の割合が増加することがわかった（表２）。他方、GFP293細胞は、250 nMのMMCを添加した場合においてのみコントロールに対して有意の差を持って増加していた（表２）。従って、T-GFP293細胞は、GFP293細胞より高感度に変異原性を検出できることが確認できた。他の被験物質の暴露実験では、T-GFP293細胞のみを用いて実験を行った。
【表２】
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【００３９】
次に、T-GFP293細胞のMMCに対する変異原性の検出限界濃度を求めるために、無蛍光領域の細胞数が濃度依存的に増加していない領域の値で求めた回帰直線式と、濃度依存的に増加していく領域の値で得られた回帰直線式との交点の濃度を検出限界濃度とすると、117 nMであることがわかった（図５）。同様に、5-FUも濃度依存的に無蛍光領域の細胞数の割合が減少し、その検出限界濃度は 13.6 μMと算出された。さらに、EMS、MNU、ENU、及び1-NPも濃度依存的な変化を示し、その検出限界濃度はそれぞれ2.1 mM、2.1 mM、2 mM、及び20 μMだった（図５）。
なお、MMSは50、100、125、200、500及び1,000 μMの濃度で暴露した場合、濃度依存的な増加を示した（図６）。
【００４０】
変異原性物質の検出限界濃度について、本発明にかかる変異原性試験法により得られた結果と他の方法により得られる結果を比較したところ、ほぼ同等の検出感度を有していることが確認できた（表３、図６）。図６は、本発明に係る試験法の結果と、文献に示されている他の方法の結果をグラフ化したものである。ここで示した他の方法は、Ames試験、小核試験（Micronucleus test）、姉妹染色分体交換試験（Sister chromatid exchange test）、Umu試験、染色体異常試験（Chromosomal aberration test）および不定期DNA合成試験（Unscheduled DNA synthesis test）である。
【表３】
2016202044.tif 000004
なお、表３中の参考文献は以下の通りである。
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Eddy et al;Eddyら,Cancer Research 47:3163-3168 1987
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、動物細胞などの真核細胞に対する変異原性を簡便に検出する方法を提供するものであり、変異原性の評価が行われるあらゆる産業分野において利用可能な技術である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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