(57)【要約】【課題】１，４−ジオキサンを用いることなく、１，４−ジオキサン分解活性に優れた１，４−ジオキサン分解菌を培養するための技術の提供。【解決手段】１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の培養方法であって、１，４−ジオキサンの非存在下かつリン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する手順を含む方法を提供する。この方法において、前記手順は、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行われることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の培養方法であって、
１，４−ジオキサンの非存在下、かつ、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する手順を含む方法。
【請求項２】
前記手順をマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記手順において、
リン酸イオンがリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で、マグネシウムイオンが硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記手順において、
マンガンイオンが硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、鉄イオンが硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、コバルトイオンが塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、亜鉛イオンが硫酸亜鉛七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記菌がシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群より選択される一以上の属に属する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記菌がシュードノカルディア・ジオキサノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードノカルディア・ベンゼニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｅｎｚｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードノカルディア・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、ロードコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、マイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）からなる群より選択される一以上の種に属する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記菌がシュードノカルディア・ジオキサノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）ＣＢ１１９０、シュードノカルディア・ベンゼニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｅｎｚｅｎｉｖｏｒａｎｓ）Ｂ５、シュードノカルディア・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＤＶＳ  ５ａ１、ロードコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）２１９、マイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）、マイコバクテリウム・エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）ＰＨ−０６からなる群より選択される一以上である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１，４−ジオキサン分解処理方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養方法により得られた菌と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む方法。
【請求項９】
１，４−ジオキサン分解活性を有する菌を含む、１，４−ジオキサン処理用組成物の製造方法であって、
１，４−ジオキサンの非存在下、かつ、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する工程を含む方法。
【請求項１０】
１，４−ジオキサン分解処理方法であって、
請求項９記載の製造方法により得られた１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む方法。
【請求項１１】
１，４−ジオキサン分解活性を有する菌、リン酸イオン及びマグネシウムイオンを含み、１，４−ジオキサンを含まない、１，４−ジオキサン処理用組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む１，４−ジオキサン分解処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，４−ジオキサン分解菌の培養方法及び１，４−ジオキサンの処理方法に関する。より詳しくは、１，４−ジオキサンを用いることなく１，４−ジオキサン分解活性を有する菌を培養するための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、２００２年に発がん作用を有する恐れがあるとしてＷＨＯの環境基準に追加された（グループ２Ｂ：ヒトに対する発がん性が疑われる）。１，４−ジオキサンは、感光性樹脂製造などの化成品工業、エチレンオキサイド及びエチレングリコール製造などの石油化学工業、ポリエステル製造などの化学繊維工業等の事業所からの排水中に含まれている。１，４−ジオキサンは環境中に放出された場合には分解されにくく、除去も困難であるとされている。そのため、廃水中に含まれる１，４−ジオキサンを簡便かつ低コストに分解できる方法の開発が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、廃水中の１，４−ジオキサンを分解除去する廃水処理方法であって、１，４−ジオキサン分解菌を廃水に投入し、廃水中の１，４−ジオキサンを分解除去する廃水処理方法が記載されている（請求項８参照）。当該文献は、増殖速度が極めて小さい１，４−ジオキサン分解菌を効率的に培養するための方法として、「１，４−ジオキサン分解菌を含む種汚泥を、有機物として１，４−ジオキサンのみを含む無機培地で培養した後、寒天培地で前記１，４−ジオキサン分解菌のコロニーを形成させて単離する単離工程と、前記単離した１，４−ジオキサン分解菌のコロニーを、前記１，４−ジオキサン以外の有機物を含む有機物培地で培養する培養工程と、を備えたことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の培養方法」を開示している（請求項１参照）。この方法は、単離工程においては、１，４−ジオキサン分解菌を他の微生物が混入しないように優先的に増殖させるとともに、培養工程では、単離した１，４−ジオキサン分解菌を高速に増殖させるものである。
【０００４】
なお、特許文献１に開示される単離工程で用いられる無機培地は、リン酸二水素カリウムと硫酸マグネシウム七水和物を含むが、１，４−ジオキサンを添加して用いられるものである（例えば、段落０１０５及び表１参照）。また、当該文献に開示される培養工程で用いられる有機物培地は、１，４−ジオキサンを含まないが、リン酸イオンを含まず、マグネシウムイオン等の金属イオンも含まないものである（例えば、段落０１１０及び表２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、１，４−ジオキサン分解菌を１，４−ジオキサン分解活性を有する状態で得るためには、同活性を触媒する酵素を誘導するために１，４−ジオキサン自体の存在下で培養を行う必要があった。特許文献１の試験においても、有機物培地に１，４−ジオキサンを添加して培養を行った場合（表３の試験２参照）には、１，４−ジオキサンの除去率は４８％と比較的高い。しかし、当該文献に係る発明の実施形態であるところの、１，４−ジオキサンの非存在下で有機物培地による培養を行った場合には（表３の試験例３）には、除去率は２５％に留まっている。これは、有機物培地での培養では１，４−ジオキサン分解菌の高速な増殖が達成されるとしても、１，４−ジオキサンの非存在下では、増殖した菌に十分な１，４−ジオキサン分解活性が誘導されないことを示している。
【０００７】
１，４−ジオキサン分解活性の誘導のために１，４−ジオキサンを用いると、好気性微生物である１，４−ジオキサン分解菌の培地から１，４−ジオキサンが環境中に放出されるおそれがある。このために、培地から放出される１，４−ジオキサンを分離し、分解するための設備投資が必要となる。
【０００８】
そこで、本発明は、１，４−ジオキサンを用いることなく、１，４−ジオキサン分解活性に優れた１，４−ジオキサン分解菌を培養するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本発明者らは鋭意検討を行い、所定の組成を有する培地を用いて１，４−ジオキサン分解菌を培養することで、１，４−ジオキサンを用いることなく、高い１，４−ジオキサン分解活性を有する菌が得られることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２５］を提供するものである。
［１］１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の培養方法であって、１，４−ジオキサンの非存在下、かつ、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する手順を含む方法。
［２］前記手順をマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行う［１］記載の方法。
［３］前記手順においてリン酸イオンがリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で、マグネシウムイオンが硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する［１］又は［２］記載の方法。
［４］前記手順においてマンガンイオンが硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、鉄イオンが硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、コバルトイオンが塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、亜鉛イオンが硫酸亜鉛七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する［２］又は［３］記載の方法。
［５］前記菌がシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群より選択される一以上の属に属する［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記菌がシュードノカルディア・ジオキサノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードノカルディア・ベンゼニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｅｎｚｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードノカルディア・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、ロードコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、マイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）からなる群より選択される一以上の種に属する［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］前記菌がシュードノカルディア・ジオキサノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）ＣＢ１１９０、シュードノカルディア・ベンゼニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｅｎｚｅｎｉｖｏｒａｎｓ）Ｂ５、シュードノカルディア・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＤＶＳ  ５ａ１、ロードコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）２１９、マイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）、マイコバクテリウム・エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）ＰＨ−０６からなる群より選択される一以上である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【００１１】
［８］１，４−ジオキサン分解処理方法であって、［１］〜［７］のいずれかに記載の培養方法により得られた菌と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む方法。
［９］１，４−ジオキサン分解処理方法であって、１，４−ジオキサンの非存在下、かつ、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する手順（培養手順）と、得られた菌と１，４−ジオキサンとを接触させる手順と、を含む方法。
［１０］前記培養手順をマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行う［９］記載の方法。
［１１］前記培養手順においてリン酸イオンがリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で、マグネシウムイオンが硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］前記培養手順においてマンガンイオンが硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、鉄イオンが硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、コバルトイオンが塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、亜鉛イオンが硫酸亜鉛七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する［１０］又は［１１］記載の方法。
【００１２】
［１３］１，４−ジオキサン分解活性を有する菌を含む、１，４−ジオキサン処理用組成物の製造方法であって、１，４−ジオキサンの非存在下かつリン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する工程を含む方法。
［１４］前記手順をマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行う［１３］記載の方法。
［１５］前記手順においてリン酸イオンがリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で、マグネシウムイオンが硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する［１３］又は［１４］記載の方法。
［１６］前記手順においてマンガンイオンが硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、鉄イオンが硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、コバルトイオンが塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、亜鉛イオンが硫酸亜鉛七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する［１４］又は［１５］記載の方法。
［１７］１，４−ジオキサン分解処理方法であって、［１３］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法により得られた１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む方法。
【００１３】
［１８］１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の製造方法であって、１，４−ジオキサンの非存在下かつリン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する工程を含む方法。
［１９］前記手順をマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンの存在下で行う［１８］記載の方法。
［２０］前記手順においてリン酸イオンがリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で、マグネシウムイオンが硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する［１８］又は［１９］記載の方法。
［２１］前記手順においてマンガンイオンが硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、鉄イオンが硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、コバルトイオンが塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で、亜鉛イオンが硫酸亜鉛七水和物当量で５〜１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する［１９］又は［２０］記載の方法。
［２２］１，４−ジオキサン分解処理方法であって、［１８］〜［２１］のいずれかに記載の製造方法により得られた菌と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む方法。
【００１４】
［２３］１，４−ジオキサン分解活性を有する菌、リン酸イオン及びマグネシウムイオンを含み、１，４−ジオキサンを含まない、１，４−ジオキサン処理用組成物。
［２４］マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンを含む［２３］記載の１，４−ジオキサン処理用組成物。
［２５］［２４］記載の１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含む１，４−ジオキサン分解処理方法。
【００１５】
本発明において、「１，４−ジオキサンの非存在下」とは、実質的に１，４−ジオキサンが含まれないことを意味する。具体的には、１，４−ジオキサンの濃度が、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー質量分析計による定量法を用いた場合の検出下限値０．００５ｐｐｍ以下であることを意味する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、１，４−ジオキサンを用いることなく、１，４−ジオキサン分解活性に優れた１，４−ジオキサン分解菌を培養するための技術が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１８】
（１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の培養方法）
本発明に係る１，４−ジオキサン分解活性を有する菌の培養方法は、１，４−ジオキサンの非存在下かつリン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する手順を含むことを特徴とする。
【００１９】
培養に用いられる培地は、１，４−ジオキサンを含まず、リン酸イオン及びマグネシウムイオンを含むものであれば、１，４−ジオキサン分解菌の培養のために従来用いられている公知の培地を特に限定されず用いることができる。
【００２０】
培地には、１，４−ジオキサン以外の有機物であって、菌の増殖・生育に必要な有機物が含まれる。１，４−ジオキサン分解菌が資化できる有機物としては、例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類；乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類；オリゴ糖類等、窒素源として酵母エキス等の有機窒素源；アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸類、ビタミン類が挙げられる。
【００２１】
また、培地には、リン酸イオン及びマグネシウムイオンが含まれる。リン酸イオンは、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等の塩；リン酸ナトリウム等のアリカリ金属塩、リン酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩などの種々の形態で培地中に添加され得る。また、マグネシウムイオンも、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の塩又はその水和物；水酸化マグネシウム等の水酸化物、炭酸マグネシウムなどの炭酸塩など種々の形態で培地中に添加され得る。
【００２２】
本発明に係る培養方法では、リン酸イオン及びマグネシウムイオンを含む培地で１，４−ジオキサン分解菌の培養を行うことで、１，４−ジオキサンを培地中に添加することなく、高い１，４−ジオキサン分解活性を有する菌を得ることができる。十分な１，４−ジオキサン分解活性を誘導するため、培地中のリン酸イオン濃度はリン酸二水素カリウム当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜０．８ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．５ｇ／Ｌとされる。同様に、培地中のマグネシウムイオン濃度は硫酸マグネシウム七水和物当量で０．１〜１．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜０．８ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．５ｇ／Ｌとされる。
【００２３】
さらに、培地には、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンが含まれることが好ましい。金属イオンは、硫酸塩、塩化物、硝酸塩、水酸化物などの種々の形態で培地中に添加され得る。
【００２４】
リン酸イオン及びマグネシウムイオンに加えてこれらの金属イオンの存在下で培養を行うことにより、得られる菌の１，４−ジオキサン分解活性をさらに高めることが可能である。１，４−ジオキサン分解活性を十分に増強するため、培地中のマンガンイオン濃度は、硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物当量で１〜３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは５〜１５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約１０ｍｇ／Ｌとされる。同様に、鉄イオン濃度（硫酸鉄（ＩＩ）七水和物当量）、コバルトイオン濃度（塩化コバルト（ＩＩ）六水和物当量）、亜鉛イオン濃度（硫酸亜鉛七水和物当量）も１〜３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは５〜１５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約１０ｍｇ／Ｌとされる。
【００２５】
１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサン分解活性を発現し得る菌であれば特に限定されない。１，４−ジオキサン分解菌は、一般に活性汚泥中に存在していることが知られており、本発明でも、活性汚泥から単離された菌を利用することができる。また、１，４−ジオキサン分解菌を紫外線、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸等で処理することにより遺伝子改変を加えて１，４−ジオキサン分解活性を向上させた変異菌を用いてもよい。さらに、野生型が１，４−ジオキサン分解能を有さない菌であっても、通常の遺伝子工学的手法を用いて１，４−ジオキサン分解能を付与した組換え菌を得ることが可能であり、本発明では、このような組換え菌も利用できる。
【００２６】
１，４−ジオキサン分解菌としては、以下の菌を例示できる。
（１）シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属。特にシュードノカルディア・ジオキサノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードノカルディア・ベンゼニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｅｎｚｅｎｉｖｏｒａｎｓ）及びシュードノカルディア・アンタークティカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）。より具体的には、シュードノカルディア・ジオキサノボランス  ＣＢ１１９０、シュードノカルディア・ベンゼニボランス  Ｂ５、シュードノカルディア・アンタークティカ  ＤＶＳ  ５ａ１。
【００２７】
（２）ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属。特にロードコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）。より具体的には、ロードコッカス・ラバー  ２１９。
【００２８】
（３）マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属。特にマイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）。より具体的には、マイコバクテリウム・エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）ＰＨ−０６。
【００２９】
これらの菌のうちでは、特にシュードノカルディア・ジオキサノボランス  ＣＢ１１９０が、１，４−ジオキサンの分解能に優れるため好ましい。シュードノカルディア・ジオキサノボランス  ＣＢ１１９０は、理化学研究所バイオリソースセンターのＪａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓから入手できる（ＪＣＭ１３８５５）。また、ＤＳＭ株については、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨより入手可能である。ＡＴＣＣ株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【００３０】
培養は、適宜滅菌処理した上記培地に菌を播種することにより行うことができ、従来公知の条件で行えばよい。培地への菌の播種量は、例えば０．１〜１０（ｖ／ｖ）％、好ましくは０．２〜５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１（ｖ／ｖ）％程度とすればよい。培養条件は、ｐＨを５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、温度を２５〜４０℃、好ましくは２８〜３２℃として、好気培養とする。培養時間は、培養液量及び目的とする菌体数などに応じて適宜設定すればよい。
【００３１】
前記培養（本培養）は、必要に応じて、前培養を行った後に行うこともできる。前培養の方法も特に限定されず、例えば、グルコース、フルクトース等の炭素源類、酵母エキス等の窒素源、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸類、ビタミン類、無機塩類を含む培地中で、ｐＨを６．０〜８．０、温度を２８〜３２℃に制御して好気的に培養することが好ましい。
【００３２】
（１，４−ジオキサン処理用組成物の製造方法）
本発明に係る１，４−ジオキサン処理用組成物の製造方法は、１，４−ジオキサンの非存在下かつリン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で菌を培養する工程（すなわち上述の培養方法）を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る培養方法により得られる１，４−ジオキサン分解菌は、高い１，４−ジオキサン分解活性を有するため、当該菌を含む組成物は、１，４−ジオキサンを分解、除去する処理のために有効に用いられ得る。
【００３４】
本発明に係る１，４−ジオキサン処理用組成物の製造方法により得られる１，４−ジオキサン処理用組成物は、菌の培養工程に由来して、組成物中にリン酸イオン及びマグネシウムイオンを含み、１，４−ジオキサンを含まないことを特徴とする。さらに、１，４−ジオキサン処理用組成物は、菌の培養工程に由来して、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンからなる群より選択される一以上の金属イオンを含む場合がある。
【００３５】
（１，４−ジオキサン分解処理方法）
本発明に係る１，４−ジオキサン分解処理方法は、上記の培養方法により得られる１，４−ジオキサン分解菌あるいは上記の製造方法により得られる１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを接触させる手順を含むことを特徴とする。
【００３６】
処理の対象となる１，４−ジオキサンは、感光性樹脂製造などの化成品工業、エチレンオキサイド及びエチレングリコール製造などの石油化学工業、ポリエステル製造などの化学繊維工業等の事業所からの排水中に含まれるものであってよい。
【００３７】
１，４−ジオキサン分解菌及び１，４−ジオキサン処理用組成物と１，４−ジオキサンとを適当な反応溶液中で接触させることにより、１，４−ジオキサンを分解できる。具体的には、上記の培養方法により得られた菌を、培養液のまま組成物として排水中に添加するか、培養液を遠心分離して分離された菌体として排水中に添加するか、あるいは培養液を遠心分離して分離された菌体を乾燥して乾燥菌体として排水中に添加した後、必要に応じて撹拌を行うことで、１，４−ジオキサンの分解反応を進行させる。あるいは、菌又は組成物を担体に定着化又は固定化し、担体を排水中に浸漬するか、担体を排水の流路中の排水と接触可能な位置に配置することで、１，４−ジオキサンの分解反応を生じさせる。本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌及びこれを含有する１，４−ジオキサン処理用組成物は、高い１，４−ジオキサン分解活性を有するため、従来技術に比して高い効率で排水中に含まれる１，４−ジオキサン分解を分解、除去することが可能である。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
（１）前培養
凍結保存していたＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＢ１１９０を３７℃の湯浴中で解凍し、以下に示す前培養培地に０．２６（ｖ／ｖ）％で接種し、３０℃、攪拌数２３０ｒｐｍで５日間振とう培養した。
【００３９】
前培養培地：
グルコース  １０ｇ／Ｌ
酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）  ３ｇ／Ｌ
リン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム七水和物  ０．５ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  １０ｇ／Ｌ
ｐＨ６．０
【００４０】
（２）本培養
前培養後の培養液を以下に示す本培養培地に０．２（ｖ／ｖ）％で接種し、３０℃、攪拌数２３０ｒｐｍで５日間振とう培養した。
【００４１】
本培養培地：
グルコース  １０ｇ／Ｌ
酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）  ３ｇ／Ｌ
リン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム七水和物  ０．５ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  １０ｇ／Ｌ
ｐＨ６．０
【００４２】
＜実施例２：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地に硫酸鉄（ＩＩ）七水和物１０ｍｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４３】
＜実施例３：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地に硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物１０ｍｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４４】
＜実施例４：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地に硫酸亜鉛七水和物１０ｍｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４５】
＜実施例５：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地に塩化コバルト（ＩＩ）六水和物１０ｍｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４６】
＜実施例６：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地に硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物、硫酸亜鉛七水和物、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物をそれぞれ１０ｍｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４７】
＜比較例１：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地からリン酸二水素カリウムと硫酸マグネシウム七水和物を除いた以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４８】
＜比較例２：１，４−ジオキサン分解菌の培養＞
本培養培地からリン酸二水素カリウムと硫酸マグネシウム七水和物を除き、１，４-ジオキサン０．２ｇ／Ｌを添加した以外は、実施例１と同様にして培養を行った。
【００４９】
【表１】
2016202057.tif 000002
【００５０】
＜試験例１：１，４−ジオキサン分解活性の評価＞
実施例１〜６及び比較例１，２で得た培養液を遠心分離して菌体を分離し、０．０５Ｍリン酸バッファーを用いて２回洗浄した。回収した菌体を、菌濃度が８．０ｇ／Ｌとなるように０．０５Ｍリン酸バッファーに再懸濁した。懸濁液に１，４−ジオキサンを１０ｍｇ／Ｌで添加して反応液とし、３０℃、２３０ｒｐｍで３時間振とうした。
【００５１】
３時間の静置前後の反応液について、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー質量分析法により１，４−ジオキサンの濃度を測定した。標準溶液には１，４−ジオキサン標準液（１ｍｇ／ｍｌメタノール溶液、和光純薬工業）を適宜希釈して用い、絶対検量線法により検量線を作製した。
【００５２】
（i）使用機器
装置：Agilent製  GC/MS  6890/5973N
ヘッドスペースサンプラー：Hewlett-Packard製  ヘッドスペースオートサンプラーHP7694
（ii）分析条件
ヘッドスペースサンプラー
シリンジサイズ：2.5ml
インジェクション容量：2.0ml
オーブン：80℃  20分
シリンジ温度：120℃
ガスクロマトグラフィー質量分析装置
カラム：フロンティアラボUltraALLOY-5  30m×0.25mmI.D.  膜厚：0.25μm
注入口温度：180℃
オーブン温度：35℃(5min)→10℃/min-200℃(5min)
ガス流量：2.0ｍl/min
スプリット比：1:10
試料量：0.5ml
イオン化法：EI
検出器モード：SIM (58, 88)
定量イオン：88
【００５３】
３時間の静置前後の１，４−ジオキサンの濃度から１，４−ジオキサン分解菌による１，４−ジオキサンの除去率を算出した。結果を「表１」に示す。
【００５４】
まず、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの非存在下で本培養を行った比較例１で得られた菌体では１，４−ジオキサンの除去率はわずかに１％であり、菌は１，４−ジオキサン分解活性をほとんど有していなかった。
【００５５】
本培養液に１，４−ジオキサンを添加した場合には、除去率は３１．３％となった（比較例２）。これは、１，４−ジオキサンによって菌体に１，４−ジオキサンの分解活性が誘導されたためと考えられた。
【００５６】
これらの比較例に対して、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で本培養を行った実施例１で得られた菌体では１，４−ジオキサンの除去率は４１．０％であった。この結果から、リン酸イオン及びマグネシウムイオンの存在下で培養を行うことで、１，４−ジオキサンを用いることなく、１，４−ジオキサン分解活性に優れた１，４−ジオキサン分解菌が得られることが明らかとなった。
【００５７】
さらに、リン酸イオン及びマグネシウムイオンに加えてマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン及び亜鉛イオンを本培養液に添加した場合には、除去率は顕著に上昇し、約８８％から１００％の範囲であった。実施例５，６で得られた菌体では、３時間静置後の反応液中の１，４−ジオキサンは検出下限値（０．００５ｐｐｍ）以下であった。この結果から、リン酸イオン、マグネシウムイオン及びマンガンイオン等の金属イオンの存在下で培養を行うことで、得られる１，４−ジオキサン分解菌の１，４−ジオキサン分解活性をさらに増強できることが明らかとなった。