(57)【要約】【課題】ギラン・バレー症候群など、免疫性末梢神経障害症の患者血清中に存在するガングリオシド結合性の自己抗体を、迅速、簡便に検出できるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子とその検出方法の提供。【解決手段】ガングリオシドＧＭ１等の糖鎖部分を化学合成、または天然物から単離、または市販品を独自開発の蛍光性リンカーと結合させて糖鎖リガンド複合体を作製し、それを固定化したカドミウムとテルルからなる蛍光を発する金属粒子などに固定化し、ガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を作製した。そして、そのガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と末梢神経障害症の患者血清とを混合し、１〜３時間放置、遠心分離することによって、ギラン・バレー症候群の患者血清に特異的な蛍光を発する凝集体を形成させる。その凝集体を目視で観察することによって、迅速、簡便にギラン・バレー症候群の診断をおこなう。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＭ１糖鎖とカドミウム及びテルルからなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項２】
請求項１に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項３】
ガングリオシドＧＭ１糖鎖と亜鉛、銀、インジウム、硫黄からなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項４】
請求項３に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項５】
ガングリオシドＧＤ１ａ糖鎖とカドミウム及びテルルからなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項６】
請求項５に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項７】
ガングリオシドＧＤ１ａ糖鎖と亜鉛、銀、インジウム、硫黄からなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項８】
請求項７に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項９】
ガングリオシドＧＱ１ｂ糖鎖とカドミウム及びテルルからなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項１０】
請求項９に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項１１】
ガングリオシドＧＱ１ｂ糖鎖と亜鉛、銀、インジウム、硫黄からなる蛍光を発する金属ナノ粒子からなるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１１に示すガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清を混合することによって、固定化されているガングリオシド糖鎖に特異的に反応する自己抗体を検出する方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の糖鎖またはナノ粒子を含む、ギラン・バレー症候群をはじめとした免疫性末梢神経障害症の検出試薬または診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシドの糖鎖部分を固定化した蛍光性ナノ粒子およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫性末梢神経障害症であるギラン・バレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ）症候群（ＧＢＳ）は、急性に発症する四肢筋力低下と深部腱反射消失を主徴とする末梢神経疾患である。急性に四肢筋力低下を呈する神経・筋疾患の中で最も頻度が高い。そのほか、ＧＢＳには、Ｆｉｓｈｅｒ症候群（ＦＳ）やＢｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ型脳幹脳炎（ＢＢＥ）など、様々な類縁疾患あるいは亜型が知られている（非特許文献１）。
【０００３】
ガングリオシドはシアル酸を有する酸性糖脂質で、神経細胞膜に豊富に存在する。脂肪酸を有し疎水性を示すセラミドと、親水性のオリゴ糖から成り、主に生理活性を有するのは細胞表面に露出した形で存在するオリゴ糖の部分であるとされている。
【０００４】
ガングリオシドに対する抗体が、ＧＢＳやＦＳを中心に、自己免疫性末梢神経疾患の病因物質として注目されている。ＧＢＳやＦＳでは、血液中に抗ガングリオシド抗体が検出される。発症直後に最も抗体価が高く、経過とともに低下、消失する（非特許文献２）。
【０００５】
先行感染病原体とガングリオシドとの分子相同性が存在することが確認されただけでなく、動物モデルも樹立され、病原体と神経組織の分子相同性による発症機序が証明されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００６】
抗ガングリオシド抗体検索は、すでに臨床的に汎用されている。ＧＢＳではＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ−ＧＤ１ａに対するＩｇＧ抗体が、Ｆｉｓｈｅｒ症候群やＢｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ型脳幹脳炎、急性外眼筋麻痺ではＩｇＧ抗ＧＱ１ｂ抗体が、補助診断として有用である。
【０００７】
抗ガングリオシド抗体の測定法としては、ＥＬＩＳＡ法がある。ＥＬＩＳＡ法とは、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙの略であり、  試料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に用いられる方法である。生体試料中に特定のタンパク質が微量にしか存在しない場合は、特異性の高さ（夾雑物からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（微量であっても検出できる、あるいは低濃度における再現性の良さ）が求められる。ＥＬＩＳＡは特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで上記の条件をクリアしている。
【０００８】
ＧＢＳの効果的な治療法として、血漿交換療法と免疫グロブリンの大量静脈注射療法が確立されている（非特許文献１）。
【０００９】
以上のように、研究レベルではＧＢＳ関連疾患と抗ガングリオシド抗体の関係が解明され、臨床現場で使用できる抗糖脂質抗体の測定方法としてＥＬＩＳＡ法（非特許文献５）が実用化された。
【００１０】
しかし、ＥＬＩＳＡ法は時間と手間がかかり、通常は検査会社へ患者の血清を送り、その結果を１週以上待たねばならない。そのため、迅速診断キットが求められている。本発明は、ガングリオシドの糖鎖を固定化したナノ粒子を用いた迅速簡便な診断法の開発を目的とした。
【００１１】
我々はこのような背景に立脚して研究を開始し、ガングリオシドの「糖鎖」に標的を定め、最新のナノテクノロジーを駆使して迅速簡便な診断法の開発を行ってきた。本発明では、いままでに開発してきた糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の技術（特許文献１、非特許文献７）に基づき、ガングリオシドＧＭ１の糖鎖部分を固定化した蛍光性ナノ粒子を新規に調製し、それを用いて患者血清中のＧＢＳに深く関係する抗体の検出に成功した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特願２０１０−５３０４０、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子、及びその製造方法；発明者：若尾雅広、隅田泰生；出願人：国立大学法人鹿児島大学、株式会社スディックスバイオテック
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎ．  Ｙｕｋｉ、  Ｈ．  Ｐ．  Ｈａｒｔｕｎｇ、  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、  ２０１２；  ３６６：  ２２９４−３０４
【非特許文献２】Ｏｄａｋａ  Ｍ、  Ｋｏｇａ  Ｍ、  Ｙｕｋｉ  Ｎ、  Ｓｕｓｕｋｉ  Ｋ、  Ｈｉｒａｔａ  Ｋ．  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｎｓｅｔ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｏ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．  Ｊ.  Ｎｅｕｒｏｌ.  Ｓｃｉ.  ２００３；２１０：９９−１０３．
【非特許文献３】Ｙｕｋｉ  Ｎ、  Ｔａｋｉ  Ｔ、  Ｉｎａｇａｋｉ  Ｆ、  Ｋａｓａｍａ  Ｔ、  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ、  Ｓａｉｔｏ  Ｋ、  Ｈａｎｄａ  Ｓ、  Ｍｉｙａｔａｋｅ  Ｔ．、Ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｅｌｉｃｉｔｓ  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｈａｓ  ａ  ＧＭ１  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９３；  １７８：  １７７１−１７７５．
【非特許文献４】Ｎ．  Ｙｕｋｉ、  Ｋ．  Ｓｕｓｕｋｉ、  Ｍ．  Ｋｏｇａ、  Ｙ．  Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ、  Ｍ．  Ｏｄａｋａ、  Ｋ．  Ｈｉｒａｔａ、  Ｋ．  Ｔａｇｕｃｈｉ、  Ｔ．  Ｍｉｙａｔａｋｅ、  Ｋ．  Ｆｕｒｕｋａｗａ、  Ｔ．  Ｋｏｂａｔａ、  Ｍ．  Ｙａｍａｄａ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ１  ａｎｄ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃａｕｓｅｓ  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００４；１０１：１１４０４−１１４０９．
【非特許文献５】Ｎ．  Ｙｕｋｉ、  Ｍ．  Ｙａｍａｄａ、  Ｍ．  Ｋｏｇａ、  Ｍ．  Ｏｄａｋａ、  Ｋ．  Ｓｕｓｕｋｉ、  Ｙ．  Ｔａｇａｗａ、  Ｓ．  Ｕｅｄａ、  Ｔ．  Ｋａｓａｍａ、  Ａ．  Ｏｈｎｉｓｈｉ、  Ｓ．  Ｈａｙａｓｈｉ、  Ｈ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ、  Ｍ．  Ｋａｍｉｊｏ、  Ｋ．  Ｈｉｒａｔａ、  Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｘｏｎａｌ  Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＧＭ１  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ．Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２００１；  ４９：  ７１２−７２０．
【非特許文献６】小鷹昌明、  秋山真弓、結城伸泰、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  症候群、Ｆｉｓｈｅｒ  症候群における抗ＧＭ１、抗ＧＱ１ｂ  抗体の臨床的有用性、モダンメディア  ２００８；５４  （３）：８２−８６．
【非特許文献７】Ｈ．  Ｓｈｉｎｃｈｉ、  Ｍ．  Ｗａｋａｏ、  Ｓ．  Ｎａｋａｇａｗａ、  Ｅ．  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ、Ｓ．  Ｋｕｗａｂａｔａ、  Ｙ．  Ｓｕｄａ、  Ｓｔａｂｌｅ  Ｓｕｇａｒ−Ｃｈａｉｎ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｌｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ.  Ｃｈｅｍ．  Ａｓｉａｎ  Ｊ．、  ２０１２；  ７：  ２６７８−２６８２．
【非特許文献８】Ｓａｔｏ、  Ｍ．、  Ｉｔｏ、  Ｙ．、  Ａｒｉｍａ、  Ｎ．、  Ｂａｂａ、  Ｍ．、  Ｓｏｂｅｌ、  Ｍ．、  Ｗａｋａｏ、  Ｍ．、  Ｓｕｄａ、  Ｙ．、  Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ、  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌｉｎｋｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ、  ２００９；  １４６：  ３３−４１．
【非特許文献９】：Ｔ．  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、  Ｙ．  Ｋａｔｏ、Ｎ．  Ｙｕｋｉ、  Ｔ．  Ｙａｂｅ、  Ｈ．  Ｉｓｈｉｄａ、  Ｍ．  Ｋｉｓｏ、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．２００８；  ２５：５４５−５５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＧＢＳ患者血清中に存在するガングリオシドに対する抗体に対して特異的な反応性を有し、かつその検出を３時間以内に可能とする簡便な検査診断ツールを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では以上の知見にもとづき、ＧＢＳの新規検査診断法のための簡便なツールの開発を目指し、ガングリオシドの糖鎖部分を固定化した蛍光性ナノ粒子を調製した。
【００１６】
本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜３）の発明を含むものである。
１）ガングリオシドＧＭ１の糖鎖部分に蛍光性のリンカーを結合させた構造を有する糖鎖リガンド複合体。
２）平均粒径が８．９ｎｍの大きさをもつ、上記糖鎖リガンド複合体が固定化された蛍光性ナノ粒子。
３）蛍光性ナノ粒子には、コアシェル構造を有するカドミウムとテルル、または亜鉛、銀、インディウム、硫黄を構成元素としてもつ半導体ナノ粒子。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、ＧＢＳ患者の血清中に存在する抗ＧＭ１抗体と特異的に結合し、会合体を形成する作用を有する。
【００１８】
ＧＢＳは臨床症状が脳血栓と似ており、迅速な検査法が求められている。本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を用いれば、患者の血清を直接使用し、数時間以内に可視で検査結果を確認できるものであるため、実用化の可能性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ガングリオシドＧＭ１の糖鎖部分にＧｌｃを導入したＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖の化学構造である。
【図２】ＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖を合成する際の中間体の合成経路である。
【図３】ＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖を合成する際に必要な二糖構造の合成経路である。
【図４】ＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖を合成するためのグリコシデーションと脱保護を示す経路である。
【図５】ＧＭ１−Ｇｌｃから調製したＧＭ１糖鎖を含む糖鎖リガンド複合体（ＧＭ１−ｆ−ｍｏｎｏ）の化学構造  である。
【図６】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）の調製法の概略である
【図７】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）のＤＬＳ測定による粒径分布  である。
【図８】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）  のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによる  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  分析の結果である。
【図９】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）  のＮｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによる  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  分析の結果である。
【図１０】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）と糖鎖結合性タンパク質との凝集実験における遠心分離後の沈殿物の蛍光発光の結果である。
【図１１】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）と糖鎖結合性タンパク質との凝集実験における遠心分離後の上澄みの蛍光スペクトルである。
【図１２】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）と免疫性末梢神経障害症の患者の血清との凝集実験における遠心分離後の沈殿物の蛍光発光の結果である。
【図１３】ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＦＮＰ）と免疫性末梢神経障害症の患者の血清との凝集実験におけるインキュベート時間を変えた際の、遠心分離後の沈殿物の蛍光発光の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明について詳述する。ガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、以下のようにして作製することができる。化学合成により、保護基を有するガングリオシド糖鎖構造を得、さらに１、２、３、４位を保護したグルコースを反応させる。最後に、保護基を除去して、還元末端にグルコースを有するガングリオシド糖鎖を合成する。次いで、その糖鎖に、独自開発の蛍光性リンカー化合物（非特許文献８）を還元アミノ化反応によって導入し、リンカーが蛍光を呈する事を利用して精製し、ガングリオシド糖鎖リガンド複合体を得る。そのリガンド複合体を既存の方法（特許文献２、非特許文献７）によってコア／シェル型の蛍光性ナノ粒子に固定化し、遠心限界濾過法によって精製して作製することができる。
【００２１】
作製したガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を緩衝液で希釈し、患者血清を加えてプラスチックチューブ中で混合し、数時間放置した後、遠心分離する。ガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の糖鎖と結合する自己抗体が血清中に存在する場合は、蛍光を発する沈殿物がえられるため、簡便かつ肉眼で検査結果を得ることができる。
【００２２】
蛍光性ナノ粒子に糖鎖が固定化されていることについては、例えば、ナノ粒子をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型の質量分析計で測定すればよい。この際、ナノ粒子と硫黄−金属結合で固定化されているガングリオシド糖鎖リガンド複合体が、硫黄−金属結合で還元的に分解するために、ガングリオシド糖鎖リガンド複合体が固定化されている場合は、それに相当する分子イオンピーク（ｍ／Ｚ）が観測される。
【００２３】
また、ガングリオシド糖鎖を構成している糖鎖と特異的に結合する事が既知であるレクチン（糖鎖結合性蛋白質）を用いて、ガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の凝集と遠心分離による沈殿物生成を調べればよい。
【００２４】
本発明で開示されるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、ガングリオシド糖鎖としてＧＭ１−Ｇｌｃ（非特許文献８）と称する糖鎖を用いているが、その適用はその分子形態に限定されることはない。例えば、ＧＭ１糖鎖そのものを使用したり、ＧＤ１ａやＧＱ１ｂといった別の構造のガングリオシド糖鎖をもちいた場合もその適用範囲に含まれる。
【００２５】
また、本発明で開示されるガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、蛍光性ナノ粒子として、ＣｄとＴｅで構成されるコア／シェル型の量子ドットをその基本構造としているが、Ｚｎ、Ａｇ、Ｉｎ、Ｓから構成されるＺＡＩＳと一般に称されるナノ粒子を用いた場合もその適用範囲に含まれる。
【００２６】
また、これらのガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、固定化した糖鎖の局所密度をオリゴエチレングリコールを共固定化することによって調製した蛍光性ナノ粒子もその適用範囲に含まれる。
【００２７】
本発明のガングリオシド糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、ギラン・バレー症候群などの末端神経麻痺症などの迅速・簡便検出試薬及び診断薬として利用可能である。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００２９】
《実施例１：ＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖の合成》  
目的のＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖１は図１に示す。
まず、図２に示すように、ＧＭ１−コアとなる四糖構造４はＮＩＳとＴｆＯＨの存在下、二糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮ  ２とＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ  ３と縮合させ、８９％の収率で調製した。続いて、四糖構造を対応するグルコシド供与体６として、５ステップで導いた。  
次に、図３に従って、糖受容体となる非還元末端グルコースの４位をフリーとし、かつ、保護基をベンジル基とすることによって、４位の水酸基の反応性を高めたゲンチビオース１１を以下のように調製した。グルコース糖供与体７と糖受容体８をＮＩＳとＴｆＯＨの存在下、ジクロロメタン中０℃で反応させることによって、二糖９を９０％の収率で得た。９の保護基をベンゾイルからベンジルに変換し、１０を２段階、収率８８％で得た。そして、ベンジリデン基を、ジクロロメタン中、トリメチルシランとＢＦ３・ＯＥｔ２  で処理することによって、選択的に開裂させ、１１を８５％の収率で得た。１１のスペクトルデータは以下の通りである。［α］Ｄ＝−１２．９°  （ｃ  １．０、  ＣＨＣｌ３）；  １Ｈ−ＮＭＲ  （６００  ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ  ７．３５−７．２１  （ｍ、  ３５  Ｈ、  ７  Ｐｈ）、  ５．０１−４．６９  （ｍ、  １０  Ｈ、  ５  ＣＨＨＰｈ）、  ４．５９−４．５１  （ｍ、  ３  Ｈ、  Ｈ−１ｆ、  ＣＨＨＰｈ）、  ４．４６  （ｄ、  １  Ｈ、  Ｊ１、２  ＝  ９．６  Ｈｚ、  Ｈ−１ｅ）、  ４．１９  （ｄ、  １  Ｈ、  Ｊｇｅｍ  ＝  １１．０  Ｈｚ、  Ｈ−６ｅ）、  ３．７４−３．５８  （ｍ、  ６  Ｈ、  Ｈ−６’ｅ、  ３ｆ、  ４ｆ、  ５ｆ、  ６ｆ、  ６’ｆ）、  ３．５０−３．３９  （ｍ、  ５  Ｈ、  Ｈ−２ｆ、  ２ｅ、  ３ｅ、  ４ｅ、  ５ｅ）、  ２．５４  （ｓ、  １  Ｈ、  −ＯＨ）；  １３Ｃ−ＮＭＲ  （１５０  ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ  １３８．９、  １３８．７、  １３８．５、  １３８．５、  １３８．２、  １３８．０、  １３７．６、  １２８．６、  １２８．５、  １２８．５、  １２８．４、  １２８．３、  １２８．２、  １２８．１、  １２８．０、  １２８．０、  １２７．９、  １２７．８、  １２７．７、  １０４．１、  １０２．７、  ８４．８、  ８４．２、  ８２．４、  ８１．６、  ７８．４、  ７７．３、  ７５．８、  ７５．４、  ７５．３、  ７５．１、  ７４．９、  ７４．８、  ７４．１、  ７３．８、  ７１．８、  ７１．３、  ６８．８、  ２９．８；  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ：  ｍ／ｚ：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６１Ｈ６４Ｏ１１Ｎａ：  ９９５．４３；  ｆｏｕｎｄ：  ９９５．３８  ［Ｍ＋Ｎａ］＋．
そして図４のように、上記のようにして合成したＧＭ１コア糖供与体６と二糖１１とをジクロロメタン中ＴＭＳＯＴｆの存在下で反応させ、望むβグリコシド１２を６９％の収率で得た。次いで、アシル系の保護基を除去して１３を得、最後にベンジル基を水素化分解してＧＭ１−Ｇｌｃ糖鎖１をほぼ定量的に得た。１のスペクトルデータは以下の通りである。［α］Ｄ＝＋０．１°  （ｃ  １．０、  Ｈ２Ｏ）；  １Ｈ−ＮＭＲ  （６００  ＭＨｚ、  ＣＤ３ＯＤ）  δ  ５．１６  （ｄ、  １  Ｈ、  Ｊ１、２＝３．７  Ｈｚ、  Ｈ−１ｅ）、  ４．７９  （ｄ、  １  Ｈ、  Ｈ−１ｃ）、  ４．５７  （ｄ、  １  Ｈ、  Ｊ１、２＝８．０  Ｈｚ、  Ｈ−１ｄ）、  ４．４９−４．４５  （ｍ、  ３  Ｈ、  Ｈ−１ａ、  １ｂ、  １ｆ）、  ４．１５−３．１９  （ｍ、  ３９  Ｈ、  ｒｉｎｇ  Ｈ）、  ２．６２  （ｄｄ、  １  Ｈ、  Ｈ−３ｂｅｑ）、  １．９９  ａｎｄ  １．９６  （２  ｓ、  ６  Ｈ、  ２  Ａｃ）、  １．８７  （ｍ、  １  Ｈ、  Ｈ−３ｂａｘ）、  １３Ｃ−ＮＭＲ  （１５０  ＭＨｚ、  ＣＤ３ＯＤ）  δ  １７５．０、  １７４．８、  １７４．１、  １０６．１、  １０５．７、  １０５．５、  １０４．１、  １０４．０、  １０３．４、  １０１．８、  ９７．０、  ９５．３、  ９４．２、  ９３．０、  ９１．５、  ８４．４、  ８１．２、  ７８．１、  ７７．６、  ７６．５、  ７５．１、  ７４．８、  ７４．５、  ７４．３、  ７３．９、  ７３．５、  ７３．４、  ７２．６、  ７２．１、  ７１．５、  ７０．８、  ７０．２、  ６８．９、  ６８．０、  ６７．１、  ６１．２、  ６１．０、  ６０．７、  ５９．７、  ５９．３、  ５８．８、  ５２．５、  ５１．６、  ４８．８、  ４７．５、  ２８．７、  ２５．９、  ２３．５；  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ：  ｍ／ｚ：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４３Ｈ７２Ｎ２Ｏ：  １１６０．４０；  ｆｏｕｎｄ：  １１５９．７５  ［Ｍ−Ｈ］−．
【００３０】
《実施例２：ＧＭ１糖鎖リガンド複合体の合成と分画》
実施例１で合成した還元末端に６−グルコースを有するＧＭ１ガングリオシド糖鎖（ＧＭ１−Ｇｌｃ、１．０ｍｇ、０．８６μｍｏｌ）を超純水２０μＬに溶解し、独自開発の蛍光性リンカー化合物（ｆ−ｍｏｎｏ、０．２８ｍｇ、１．１μｍｏｌ）のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド３０μＬ溶液に加え、さらに酢酸６μＬを加えた。４０℃で６時間放置した後、ＮａＣＮＢＨ３（１．５ｍｇ、  ２４μｍｏｌ）を１０μＬの超純水に溶解させた溶液を加え、４０℃で３日間放置し、凍結乾燥した。この凍結乾燥残渣を超純水に溶解させ、ＯＤＳカラムで精製した（溶出溶媒：水／メタノール  １／１（ｖ／ｖ））。溶出画分を凍結乾燥し、図５に示すＧＭ１糖鎖リガンド複合体（ＧＭ１−ｆ−ｍｏｎｏと略）を白色粉末として得た。収量：０．６９ｍｇ（５６％）．  ＭＳ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ：  Ｃ５６Ｈ９２Ｎ５Ｏ３４Ｓ２  ：  １４４２．５１、  Ｆｏｕｎｄ：  ｍ／ｚ  １４４２．７３  ［Ｍ−Ｈ］−．
【００３１】
《実施例３：ＧＭ１糖鎖を固定化した蛍光性ナノ粒子の調製》
図６に示すようにＣｄＣｌ２（９．１７ｍｇ、５０．０μｍｏｌ）  と３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ、５．４５μＬ、６３μｍｏｌ）  を超純水１０ｍＬに溶かし、溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで９に合わせ、撹拌しながらアルゴンガスを３０分間バブリングしたのち、溶液を激しく撹拌しながら１０５℃に加熱した。別のフラスコに、テルル粉体（１６．０  ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）とＮａＢＨ４（１８．９ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）をアルゴン下で脱気した超純水（２ｍＬ）に溶解させ、室温下１．５時間撹拌した。この溶液（ＮａＨＴｅ溶液、２００μＬ）を１０５℃で加熱撹拌している溶液に加え、同温度でさらに２時間撹拌し、室温に戻した。その溶液に、２−プロパノールをくわえて、Ｃｄ／Ｔｅの量子ドット（ＱＤ）を沈殿させ、それをろ別後に再度水を加えて溶解させた。その溶液を４℃で１０時間放置した後、チオアセトアミド（０．２７μＬ、１．３３μＭ）をさらに加えた。そして、１０５℃で５７時間撹拌し、室温に戻すことによってＣｄＴｅ／ＣｄＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ  ＱＤ溶液を得た。実施例２で調製したＧＭ１−ｆ−ｍｏｎｏ  （１ｍＭ、５０μＬ）をＮａＢＨ４の水溶液（１０ｍＭ、５０μＬ）を室温で混合し、１０分間放置した。その後、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ  ＱＤ溶液を５倍に薄めた溶液１００μＬを加え、暗所で室温２４時間撹拌した。未反応の糖鎖リガンド複合体はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０  Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた遠心限外濾過（１４０００×ｇ、５ｍｉｎ）によって除去し、さらに引き続いて超純水で３回洗浄、最後にＰＢＳで懸濁させることによってＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＧＭ１−ＳＦＮＰ）溶液を調製した。図７に示すようにＤＬＳ測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０  、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、  ＵＫ）によれば、このナノ粒子の平均粒径は８．９ｎｍであった。
【００３２】
《実施例４：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる固定化したガングリオシド糖鎖リガンド複合体の確認》
実施例３で調製したＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子溶液１μＬを飽和ＤＨＢＡ溶液（水／メタノール  １／１溶液）１０μＬと混合し、１μＬを測定プレートに載せ、自然乾燥させた。そのプレートをＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＰＲＯ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）の測定部へ入れ、質量分析を行った。図８と図９に示すように、実施例２で調製したＧＭ１糖鎖リガンド複合体と同じ質量数を有するピーク（ｍ／Ｚ値）が得られ、ナノ粒子にＧＭ１糖鎖が固定化されていることが確認された。
【００３３】
《実施例５：ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の蛋白質結合能の確認》
蛋白質Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ）、Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  （ＷＧＡ）、Ｐｅａｎｕｔ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）、Ｒｉｃｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｉ（ＲＣＡ１２０）、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）に対してのＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の結合活性を調べた。ＢＳＡ以外は、糖鎖結合性蛋白質（レクチン）である。各蛋白質をＰＢＳに３．６μＭの濃度で溶解させ、その５μＬを２００μＬの容量のプラスチップチューブに移した。そこに、実施例３で調製したＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の０．２μＭのＰＢＳ溶液を５μＬ加え、ボアテックスミキサーで撹拌後暗所に一定時間放置後、１４０００Ｇで５分間遠心分離を行った。チューブに紫外光を照射し、沈殿物の蛍光を観測して写真撮影を行った後、上清の蛍光スペクトルを測定した。図１０に示すように、ＰＮＡにのみ、目視で判別可能な蛍光を発する沈殿が生じ、また図１１に示すように、ＰＮＡの上澄みの蛍光強度だけが大きく減少し、ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の糖鎖が特異的にＰＮＡと結合し、その結果会合体を形成したことを示した。
【００３４】
《実施例６：  ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と患者血清との反応》
ギラン・バレー症候群の患者を含めた免疫性末梢神経障害症の患者血清５μＬを２００μＬの容量のプラスチップチューブに移した。そこに、実施例３で調製したＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の０．１μＭのＰＢＳ溶液を５μＬ加え、ボアテックスミキサーで撹拌後暗所に一定時間放置後、１４０００Ｇで５分間遠心分離を行った。チューブに紫外光を照射し、沈殿物の蛍光を観測して写真撮影を行った後、上清の蛍光スペクトルを測定した。図１２に示すように、既存のＥＬＩＳＡ法で抗ＧＭ１抗体陽性の血清を使用した場合にのみ、蛍光を発する沈殿物の形成が確認され、そのチューブの上清の蛍光強度は著しく減少した。一方、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性や抗ＧＤ１ｂ抗体陽性の血清の場合には、蛍光を発する沈殿物の形成は確認されず、チューブ中の溶液の蛍光強度にも変化がなかった。この変化は、図１３に示すようにナノ粒子を血清サンプルへ添加して混合後３時間で変化が確認された。
【００３５】
《実施例７：ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と会合体を形成した患者血清中の蛋白質の同定》
実施例６で蛍光を発する沈殿物に、抗体が存在することを、沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って確認した。沈殿物をＰＢＳで再度分散させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル調製用バッファー（還元条件、及び非還元条件）を加え、還元条件では１０％ゲル、非還元条件では８％ゲルにアプライし、泳動後に銀染色した。ＩｇＧの重鎖、軽鎖、Ｆｃに相当する蛋白質バンドが観測され、ＧＭ１糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子が血清中の抗体と選択的に結合したことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上の結果より、ガングリオシドの糖鎖部分を固定化した蛍光性ナノ粒子については、ギラン・バレー症候群やフィッシャー症候群など免疫性末梢神経障害症の迅速・簡便な診断法として、医療現場での利用可能性が大いに期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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