(57)【要約】      （修正有）【課題】気道器官バイオリアクター装置の提供。【解決手段】その上に細胞媒体を灌流させて器官を成長させる器官マトリックス骨格を支持するように構成された器官チャンバー；前記器官へ湿潤換気を供給するように構成された湿潤換気装置系；前記器官へ乾燥換気を供給するように構成された乾燥換気装置系；及び、湿潤換気の送達又は乾燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラ、を包含する気道器官バイオリアクター装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その上に細胞媒体を灌流させて器官を成長させる器官マトリックス骨格を支持するよう
に構成された器官チャンバー；
前記器官へ湿潤換気を供給するように構成された湿潤換気装置系；
前記器官へ乾燥換気を供給するように構成された乾燥換気装置系；および
湿潤換気の送達または乾燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラ、
を包含する気道器官バイオリアクター装置。
【請求項２】
前記器官に接続された第１の分岐、第２の分岐および第３の分岐を含むコネクタ；なら
びに
前記コネクタの第１の分岐および前記コネクタの第２の分岐が前記コネクタの第３の分
岐と接続されており、前記第１の分岐と前記第２の分岐との間で切り替えるように構成さ
れたスイッチを含む第１の三方向分岐合流点、
をさらに包含し、
前記湿潤換気装置系は、前記コネクタの第１の分岐を介して、前記器官に湿潤換気を供
給するように構成され；
前記乾燥換気装置系は、前記コネクタの第２の分岐を介して、前記器官に乾燥換気を供
給するように構成され；および
前記コントローラは、前記第１の三方向分岐合流点のスイッチを制御して、湿潤換気の
送達または乾燥換気の送達を制御するように構成されている、請求項１記載の装置。
【請求項３】
細胞媒体を、入口ラインを介して前記器官に供給する；および
排出物である媒体を、第１の分岐、第２の分岐および第３の分岐を含む出口ラインを
介して前記器官から排出する；
ように構成された容器系：ならびに
前記出口ラインの第１の分岐および前記出口ラインの第２の分岐が前記出口ラインの第
３の分岐と接続されている第２の三方向分岐合流点、
をさらに包含する、請求項１記載の装置。
【請求項４】
前記湿潤換気装置系が: 
湿潤換気ラインを介して前記器官チャンバーに接続された湿潤換気装置；および
前記コネクタの第１の分岐を介して前記器官に接続されたコンプライアンスチャンバー
を包含する、請求項２記載の装置。
【請求項５】
前記コンプライアンスチャンバーの上昇を介して、湿潤呼気陽圧(wPEEP)が前記器官チ
ャンバーに提供される、請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記出口ラインの第２の分岐を介して前記器官チャンバー；および
出口戻りラインを介して前記容器系、
に接続した後負荷チャンバーをさらに包含する、請求項４記載の装置。
【請求項７】
前記容器系が:
入口ラインを介して前記器官チャンバーに接続した第１の容器；ならびに
器官チャンバー排液管を介して前記器官チャンバー、および前記出口戻りラインを介し
て後負荷チャンバー、に接続した第２の容器、
を包含し、
前記第１の容器および前記第２の容器は、容器供給ラインおよび容器排液管を介して媒
体を循環させる、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記乾燥換気装置系が: 
前記コネクタの第２の分岐を介して前記器官に接続された、噴霧器を含む乾燥換気チャ
ンバー；および 
前記器官チャンバーに乾燥呼気陽圧(dPEEP)を提供するように構成され、dPEEPラインを
介して前記乾燥換気チャンバーに接続された、第１の乾燥換気装置、
を包含する、請求項３記載の装置。
【請求項９】
前記乾燥換気装置系が: 乾燥換気装置ラインを介して前記器官チャンバーに接続された
第２の乾燥換気装置をさらに包含する、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
ガス媒体を、前記器官チャンバー、前記乾燥換気チャンバー、および前記容器系に供給
するように構成されたガスタンクをさらに包含する、請求項８記載の装置。
【請求項１１】
前記コントローラがコンピュータにより操作される、請求項１記載の装置。
【請求項１２】
気道および実質的な血管系を含む肺組織マトリックスを提供すること；
前記肺組織マトリックスに細胞を播種すること；
第１の所望の程度の器官成熟が生じるのに十分な時間の間、前記肺組織マトリックスに
湿潤換気を提供して、湿潤成熟した器官を作製すること；ならびに
第２の所望の程度の器官成熟が生じるのに十分な時間の間、前記湿潤成熟した器官に乾
燥換気を提供して、バイオ人工肺を提供すること、
を包含する、バイオ人工気道器官を提供する方法。
【請求項１３】
前記肺組織マトリックスに、前記器官の血管系を介して内皮細胞を播種すること；およ
び
前記肺組織マトリックスに、器官の気道を介して上皮細胞を播種すること、
をさらに包含する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記肺組織マトリックスに、前記器官の血管系を介して幹細胞を播種することをさらに
包含する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、骨髄由来間葉性幹細胞、または人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項
１４記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞は、流体30cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に懸濁され；
前記内皮細胞は、流体10cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に懸濁され；および
前記上皮細胞は、流体5cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に懸濁される、
請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の所望の程度の器官成熟が生じるまで、器官成熟の程度をモニタリングして、
湿潤成熟した器官を作製すること；
前記器官への前記湿潤換気を止めること；
人工サーファクタントを前記器官に適用すること；および
前記器官に対して前記乾燥換気を開始すること、
をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記肺組織マトリックスに湿潤換気を提供することが:
前記気道を、湿潤換気装置ラインを介して、湿潤換気装置に接続すること；
前記器官を、湿潤換気ラインを介して、コンプライアンスチャンバーに接続すること；
前記湿潤換気ラインを介して、湿潤気道圧を上げること；および
前記コンプライアンスチャンバーを上昇させて、前記器官に湿潤呼気陽圧(wPEEP)を提
供すること、
を包含する、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記湿潤換気が生理的一回換気量で提供される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記湿潤成熟した器官に乾燥換気を提供することが:
前記気道を、乾燥換気ラインを介して、乾燥換気チャンバーに接続すること;
前記乾燥換気チャンバーを、乾燥呼気陽圧(dPEEP)ラインを介して、第１の乾燥換気装
置に接続すること；
前記乾燥換気ラインを介して、乾燥気道圧を上げること；
前記湿潤換気ラインを断絶すること；および
前記器官を、乾燥換気装置ラインを介して、第２の乾燥換気装置に接続すること、
を包含する、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
前記肺組織マトリックスが、脱細胞化ヒト肺組織または人工肺マトリックスを包含する
、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオ人工肺が十分な数の細胞を包含して、完全な肺機能またはその一部を提供す
る、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
請求項１１〜２２記載の方法により作製される、バイオ人工肺。
【請求項２４】
前記器官が完全肺またはその一部である、請求項２３記載のバイオ人工肺。
【請求項２５】
肺活量の障害または低下を抱える被験体の処置方法であって、請求項２３記載のバイオ
人工肺を前記被験体に移植することを包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、2009年6月4日に出願された米国仮特許出願第61/184,170号、および2009年10
月29日に出願された米国仮特許出願第61/256,281号の恩典を主張する。これらの内容はそ
の全体が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本明細書は、組織生成に関連する装置および方法を提供する。例えば、本明細書は、ヒ
トまたは動物被験体に移植可能な肺組織を生成するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
肺移植は、とりわけ肺不全、例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、肺癌、
および先天性肺疾患に代表される状態を抱えている多くの患者にとって最後の望みに相当
する。肺移植の典型的な待機期間は2年以上になり得、順番待ちリストに載っている者に
ついて30％の死亡率を生じる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
提示するのは、気道器官バイオリアクター装置である。本装置は、その上に細胞媒体を
灌流させて器官を成長させる器官マトリックス骨格を支持するように構成された器官チャ
ンバーを有する。本装置は、コネクタの第１の分岐を介して器官に湿潤換気を供給するよ
うに構成された湿潤換気装置（ventilator）系をさらに有する。本装置は、コネクタの第
１の分岐を介して器官に乾燥換気を提供する乾燥換気装置系をさらに有する。本装置は、
湿潤換気の送達、または乾燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラをさら
に有する。
【０００５】
本装置は、器官に接続された第１の分岐、第２の分岐、および第３の分岐を含むコネク
タをさらに包含し得る。本装置は、コネクタの第１の分岐およびコネクタの第２の分岐が
コネクタの第３の分岐と接続している第１の三方向分岐合流点（three-way junction）を
さらに有する。スイッチを含む三方向分岐合流点は、第１の分岐と第２の分岐との間を切
り替えるように構成され得る。本装置は、コネクタの第１の分岐を介して器官に湿潤換気
を供給するように構成された湿潤換気装置系をさらに有する。本装置は、コネクタの第２
の分岐を介して器官に乾燥換気を供給するように構成された乾燥換気装置系をさらに有す
る。本装置は、第１の三方向分岐合流点のスイッチを制御して、湿潤換気の送達または乾
燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラをさらに有する。
【０００６】
本装置は、細胞媒体を、入口ラインを介して器官に供給する；および排出物である媒体
（waste media）を、第１の分岐、第２の分岐および第３の分岐を含む出口ラインを介し
て器官から排出する、ように構成された容器系；ならびに出口ラインの第１の分岐および
出口ラインの第２の分岐が出口ラインの第３の分岐と接続されている第２の三方向分岐合
流点、をさらに包含し得る。湿潤換気装置系は、湿潤換気ラインを介して器官チャンバー
に接続した湿潤換気装置；およびコネクタの第１の分岐を介して器官に接続されたコンプ
ライアンスチャンバー、を含み得る。コンプライアンスチャンバーの上昇を介して、湿潤
呼気陽圧（wet positive and expiratory pressure）(wPEEP)を器官チャンバーに提供す
ることができる。本装置は、出口ラインの第２の分岐を介して器官チャンバー；および出
口戻りラインを介して容器系に接続された後負荷チャンバーをさらに包含し得る。容器系
は、入口ラインを介して器官チャンバーに接続した第１の容器；および器官チャンバー排
液管を介して器官チャンバーに接続した第２の容器；ならびに出口戻りラインを介して後
負荷チャンバーを包含し得、ここで第１の容器および第２の容器は、容器供給ラインおよ
び容器排液管を介して媒体を循環させる。乾燥換気装置系は、コネクタの第２の分岐を介
して器官に接続された噴霧器を含む乾燥換気チャンバー；および乾燥呼気陽圧（dry posi
tive and expiratory pressure）(dPEEP)を器官チャンバーに提供するように構成され、d
PEEPラインを介して乾燥換気チャンバーに接続された第１の乾燥換気装置を包含し得る。
乾燥換気装置系は、乾燥換気装置ラインを介して器官チャンバーに接続された第２の乾燥
換気装置をさらに包含し得る。本装置は、ガス媒体を器官チャンバー、乾燥換気チャンバ
ー、および容器系に供給するように構成されたガスタンクをさらに包含し得る。コントロ
ーラは、コンピュータにより操作され得る。
【０００７】
別の態様では、本明細書は、バイオ人工気道器官を提供する方法を特徴とする。本方法
は、肺組織マトリックスおよび実質的な血管系（vasculature）を包含する肺組織マトリ
ックスを提供すること；肺組織マトリックスに細胞を播種すること；第１の所望の程度の
器官成熟が生じるのに十分な時間の間、器官に湿潤換気を提供すること；および第２の所
望の程度の器官成熟が生じるのに十分な時間の間、湿潤成熟した器官に乾燥換気を提供し
て、バイオ人工肺を提供すること、を包含し得る。本方法は、器官の血管系を介して内皮
細胞を肺組織マトリックスに播種すること；および器官の気道を介して上皮細胞を気道肺
組織マトリックスに播種すること、をさらに包含し得る。本方法は、器官の血管系を介し
て幹細胞を肺組織マトリックスに播種することをさらに包含し得る。幹細胞は、骨髄由来
間葉性幹細胞、または人工多能性幹(iPS)細胞であり得る。幹細胞は、流体30cc当たり約1
億個の細胞の濃度で、流体に懸濁され得る。内皮細胞は、流体10cc当たり約1億個の細胞
の濃度で流体に懸濁され得る。上皮細胞は、流体5cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に
懸濁され得る。本方法は、第１の所望の程度の器官成熟が生じるまで器官成熟の程度をモ
ニタリングすること；器官への湿潤換気を提供を止めること；器官に人工サーファクタン
トを適用すること；および器官に乾燥換気を提供し始めること、をさらに包含し得る。肺
組織マトリックスに湿潤換気を提供することは、気道を、湿潤換気装置ラインを介して湿
潤換気装置に接続すること；器官を、湿潤換気ラインを介してコンプライアンスチャンバ
ーに接続すること；湿潤換気ラインを介して湿潤気道圧を上げること；およびコンプライ
アンスチャンバーを上昇させることによって器官に湿潤呼気陽圧(wPEEP)を提供すること
、を包含し得る。湿潤換気は、生理的一回換気量（tidal volume）で提供される。湿潤成
熟した器官に乾燥換気を提供することは、気道を、乾燥換気ラインを介して乾燥換気チャ
ンバーに接続すること；乾燥換気チャンバーを、乾燥呼気陽圧(dPEEP)ラインを介して第
１の乾燥換気装置に接続すること；乾燥換気ラインを介して乾燥気道圧を上げること；湿
潤換気ラインを断絶すること；および器官を、乾燥換気装置ラインを介して第２の乾燥換
気装置に接続すること、を包含し得る。肺組織マトリックスは、脱細胞化ヒト肺組織、ま
たは人工肺マトリックスを包含し得る。バイオ人工肺は、完全な肺機能またはその一部を
提供するのに十分な数の細胞を包含し得る。
【０００８】
別の態様では、本明細書は、本明細書において提供する方法により作製されたバイオ人
工肺を特徴とする。バイオ人工肺は、完全肺、またはその一部であり得る。
【０００９】
さらなる態様では、本明細書は、肺活量の障害または低下を抱える被験体を治療する方
法を特徴とする。本方法は、バイオ人工肺を被験体に移植することを包含し得る。
【００１０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する
技術分野の当業者に一般的に理解されている意味と同様の意味を持つ。本明細書に記載す
る方法および材料と類似または同等の方法および材料が、本発明を実施するために使用で
きるが、以下に適切な方法および材料を記載する。本明細書で言及する全ての文献、特許
出願、特許、およびその他の引用文献は、それらの全体が参照により本明細書に援用され
る。不一致が生じたときは、定義を含めて、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、
および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図したものではない。
【００１１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載に示す。本発明の
その他の特徴、目的、および利点は、明細書、図面、および請求の範囲から明らかになる
であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、例示の肺バイオリアクターの模式図である。
【図２Ａ】図2A、2B、2C、および2Dは、肺バイオリアクターにおいて肺組織を成長させるための例示の方法のフローチャートである。
【図２Ｂ】図2A、2B、2C、および2Dは、肺バイオリアクターにおいて肺組織を成長させるための例示の方法のフローチャートである。
【図２Ｃ】図2A、2B、2C、および2Dは、肺バイオリアクターにおいて肺組織を成長させるための例示の方法のフローチャートである。
【図２Ｄ】図2A、2B、2C、および2Dは、肺バイオリアクターにおいて肺組織を成長させるための例示の方法のフローチャートである。
【図３】図3は、例示の肺脱細胞化ユニットの模式図である。
【図４】図4は、細胞播種モードにある例示の肺バイオリアクターの模式図である。
【図５】図5は、灌流モードにある例示の肺バイオリアクターの模式図である。
【図６】図6は、例示の肺バイオリアクターの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本明細書は、器官生成に関与する方法および材料に関する。本発明は、少なくとも部分
的に、ヒトおよび他の動物へ移植できる状態の機能気道器官を成長させるのにより現実的
な環境を提供するために使用できる、機能肺組織を生成するように構成されたバイオリア
クターの発見に基づいている。肺組織は、所与のマトリックス、例えば、人工または脱細
胞化肺組織マトリックスにわたって生成される。
【００１４】
本明細書で使用する「機能」肺組織は、正常かつ健康な肺の機能(例えば、大気から血
流中への酸素の輸送を可能にすること、および血流から大気中へ二酸化炭素を放出するこ
と)の大部分または全てを行う。吸い込んだ空気を湿らせ、サーファクタントを作って、
肺胞における表面張力を低くし、粘液を生成および輸送して、吸い込んだ微粒子物質を遠
位から近位の気道まで除去する。
【００１５】
本明細書でで使用する「脱細胞化」および「無細胞」という用語は、互換的に使用され
、標準的な組織学的染色手順を使用した際に、組織学的切片において検出可能な細胞内、
内皮細胞、上皮細胞、および核が完全にまたはほぼ完全に不在であると定義される。必ず
ではないが好ましくは、残存している細胞残屑も、脱細胞化器官または組織から除去され
ている。
【００１６】
脱細胞化組織/器官マトリックス
脱細胞化肺組織マトリックスを調製するための方法および材料は当該分野で公知である
。このようなマトリックスを調製するために任意の適切な材料が使用できる。好適な実施
形態では、組織マトリックスは、脱細胞化肺組織から発達した無細胞組織骨格であり得る
。例えば, ヒト肺等の組織またはその一部を適切な方法で脱細胞化して、組織または組織
部分の形態学的完全性および血管系を維持し、かつ細胞外マトリックス(ECM)タンパク質
を保存したままで、組織から天然細胞を除去する。場合によっては、死体肺またはその一
部が使用できる。脱細胞化方法としては、組織(例えば、肺組織)を、液体窒素を使用した
繰り返し凍結融解サイクルに供することが挙げられ得る。他の場合には、組織を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリエチレングリコール(PEG)、またはTritonX-100等のアニオ
ン性またはイオン性細胞破壊媒体に供してもよい。組織はまた、ヌクレアーゼ溶液(例え
ば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ)で処理され、緩やかに攪拌しながら
滅菌リン酸緩衝化生理食塩水中で洗浄されてもよい。場合によっては、脱細胞化は、当該
分野で公知の方法および材料を使用して器官または組織の管、導管、および/または空洞
にカニューレを挿入することによって行うことができる。カニューレ挿入ステップの後、
上述したように、器官または組織に、カニューレを介して細胞破壊媒体を灌流させること
ができる。組織を通る灌流は、順行性であっても、または逆行性であってもよく、方向性
を変更して灌流効率を改善してもよい。器官または組織の大きさおよび重量、特定のアニ
オン性またはイオン性界面活性剤、ならびに細胞破壊媒体中のアニオン性またはイオン性
界面活性剤の濃度に応じて、組織は一般的に、細胞破壊媒体で組織1グラム当たり約2〜約
12時間灌流される。洗浄を含めて、器官は、組織1グラム当たり最大約12〜約72時間灌流
され得る。灌流は、一般的に、流速および圧力を含めて生理的条件に調節される。
【００１７】
脱細胞化組織は、血管樹のECMコンポーネントを含めて、組織の全てまたはほとんどの
領域の細胞外マトリックス(ECM)コンポーネントから本質的に構成され得る。ECMコンポー
ネントは、以下のいずれかまたは全てを含み得る:すなわち、フィブロネクチン、フィブ
リリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー(例えば、コラーゲンI
、III、およびIV)、グリコサミノグリカン、基質（ground substance）、細網繊維、およ
びトロンボスポンジン。これは、基底膜等の定義された構造として組織立ったままであり
得る。好適な実施形態では、脱細胞化肺組織マトリックスは実質的に無傷の血管系を保持
する。実質的に無傷の血管系を保持することで、移植の際に組織マトリックスを被験体の
血管系に接続できる。さらに、脱細胞化組織マトリックスを、例えば、照射(例えば、UV
、ガンマ)でさらに処置して、脱細胞化組織マトリックス上または中に残っているあらゆ
る種類の微生物の存在を減らしたり、無くしたりできる。
【００１８】
物理的、化学的、および酵素的手段を使用して脱細胞化組織マトリックスを得る方法は
当該分野で公知であり、例えば、Liaoら、Biomaterials 29(8): 1065-74(2008)；Gilbert
ら、Biomaterials 27(9):3675-83(2006)；Teebkenら、Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 1
9:381-86(2000)を参照のこと。また、米国特許公開第2009/0142836号；同第2005/0256588
号；同第2007/0244568号；および同第2003/0087428号も参照のこと。
【００１９】
人工器官マトリックス 
人工器官マトリックスを調製するための方法および材料は当該分野で公知である。任意
の適切な材料を使用して、そのようなマトリックスを調製できる。好適な実施形態では、
人工器官マトリックスは、例えば、ポリグリコール酸、Pluronic F-127(PF-127)、ゲルフ
ォームスポンジ、コラーゲン-グリコサミノグリカン(GAG)、フィブリノゲン-フィブロネ
クチン-ビトロネクチンヒドロゲル(FFVH)、およびエラスチン等の多孔性材料から発達し
た骨格（scaffold）であり得る。例えば、Ingenitoら、J Tissue Eng Regen Med. 2009 D
ec 17；Hogansonら、Pediatric Research、May 2008、63(5):520-526；Chenら、Tissue E
ng. 2005 Sep-Oct;l 1(9- 10): 1436-48を参照のこと。場合によっては、人工器官マトリ
ックスは、肺胞単位に似た多孔性構造を有し得る。Andradeら、Am J Physiol Lung Cell 
MoI Physiol. 2007 Feb;292(2):L510-8を参照のこと。場合によっては、埋め込まれた人
工器官マトリックスは、器官特異的マーカー(例えば、クララ細胞、肺細胞、および気道
上皮についての肺特異的マーカー)を発現し得る。場合によっては、埋め込まれた人工器
官マトリックスは、同定可能な構造(例えば、人工肺マトリックス中の肺胞および終末気
管支に似た構造)に組織化し得る。例えば、FFVHを使用した埋め込み人工肺マトリックス
は、インビトロでの細胞接着、拡散、および細胞外マトリックス発現、ならびにインビボ
での明白な生着を促し、周囲組織に対する栄養作用の兆候を示し得る。Ingenitoら、前掲
を参照のこと。また、米国特許第7,662,409号および同第6,087,552号；米国特許公開第20
10/0034791号；同第2009/0075282号；同第2009/0035855号；同第2008/0292677号；同第20
08/0131473号；同第2007/0059293号；同第2005/0196423号；同第2003/0166274号；同第20
03/0129751号；同第2002/0182261号；同第2002/0182241号；ならびに同第2002/0172705号
も参照のこと。
【００２０】
細胞播種
本明細書に記載の方法では、肺組織マトリックス、例えば、脱細胞化肺組織マトリック
スまたは人工肺マトリックスに細胞(例えば、分化または再生細胞)を播種する。
【００２１】
ナイーブまたは未分化細胞型等の任意の適切な再生細胞型を使用して肺組織マトリック
スに播種できる。本明細書で使用する再生細胞としては、親細胞(progenitor cell)、前
駆細胞、ならびに臍帯細胞(例えば、ヒト臍静脈内皮細胞)および胎児幹細胞を含む「成体
」由来幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない。再生細胞としてはまた、分化または
免疫委任（committed）細胞型も挙げられる。本明細書で提供する方法および材料に適し
た幹細胞としては、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)、間葉性幹細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、
多分化能成体親細胞(MAPC)、または胚幹細胞が挙げられる。場合によっては、他の組織に
由来する再生細胞も使用できる。例えば、皮膚、骨、筋肉、骨髄、滑膜、または脂肪組織
に由来する再生細胞を使用して、幹細胞播種型組織マトリックスを発達させることができ
る。
【００２２】
場合によっては、本明細書で提供する肺組織マトリックスはさらに、ヒト上皮細胞およ
び内皮細胞等の分化細胞型を播種され得る。例えば、肺マトリックスは、灌流播種により
、血管系を介して内皮細胞、上皮および間葉性細胞、ならびにヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC
)を播種され得る。
【００２３】
播種用の細胞を単離および回収する任意の適切な方法が使用できる。例えば、人工多能
性幹細胞は、一般的に、Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、およびLin28等の転写因子の
異所性発現により、多能性状態に「再プログラム化」された体細胞から得ることが出来る
。Takahashiら、Cell 131:861-72(2007)；Parkら、Nature 451:141-146(2008)；Yuら、Sc
ience 318:1917-20(2007)を参照のこと。臍帯血幹細胞は、新鮮なまたは冷凍した臍帯血
から単離できる。間葉性幹細胞は、例えば、未加工(raw)かつ未精製の骨髄またはフィコ
ール(ficoll)精製骨髄から単離できる。上皮および内皮細胞は、生存または死体ドナー、
例えば、バイオ人工肺を受ける被験体から、当該分野で公知の方法により単離および回収
できる。例えば、上皮細胞は皮膚組織サンプルから得ることができ、内皮細胞は血管組織
サンプルから得ることができる。一部の実施形態では、タンパク質分解酵素を、血管系に
設置したカテーテルを介して組織サンプルに灌流させる。酵素処理した組織の部分を、さ
らなる酵素的および機械的破壊に供してもよい。このようにして得た細胞の混合物を分離
して上皮および内皮細胞を精製できる。場合により、フローサイトメトリーに基づく方法
(例えば、蛍光活性化細胞分別)を使用して、特異的な細胞表面マーカーの有無に応じて細
胞を分別できる。非自己細胞を使用する場合、免疫型が一致した細胞の選択を考慮して、
器官または組織が被験体に埋め込まれた際に拒絶されないようにするべきである。
【００２４】
単離細胞を緩衝化溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)中で濯いで、細胞培養培地に再
懸濁され得る。細胞の集団を培養し拡散するためには、標準的な細胞培養方法を使用でき
る。細胞を得た後は、組織マトリックスと接触させて、マトリックスに播種する。例えば
、組織マトリックスは、少なくとも1つの細胞型をインビトロで任意の適切な細胞密度で
播種され得る。例えば、マトリックスに播種するための細胞密度は、少なくとも1×103細
胞/グラム(マトリックス)であり得る。使用できる細胞密度は、約1×105〜約1×1010細胞
/グラム(マトリックス)(例えば、少なくとも100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,
000、1,000,000,000、または10,000,000,000個の細胞/グラム(マトリックス))にわたり得
る。
【００２５】
場合により、本明細書で提供するような脱細胞化または人工肺組織マトリックスは、灌
流播種により上記細胞型および細胞密度で播種され得る。例えば、フロー灌流系を使用し
て、組織マトリックスに保持された血管系を介して脱細胞化肺組織マトリックスに播種し
得る。場合により、自動化フロー灌流系を適切な条件下で使用できる。このような灌流播
種方法により、播種効率が改善され、組成全体にわたりより均一な細胞分布が得られる。
定量的な生化学および画像分析技術を使用して、静的または灌流のいずれかの播種方法の
後に播種細胞の分布を評価できる。
【００２６】
場合により、組織マトリックスに1つ以上の成長因子を含浸させて、播種した再生細胞
の分化を促進させることができる。例えば、組織マトリックスには、例えば、血管内皮成
長因子(VEGF)、TGF-β成長因子、骨形態形成タンパク質(例えば、BMP-1、BMP-4)、血小板
由来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(b-FGF)、例えば、FGF-10、インスリン
様成長因子(IGF)、表皮成長因子(EGF)、または成長分化因子-5(GDF-5)等の本明細書で提
供する方法および材料に適した成長因子を含浸させることができる。例えば、Desaiおよ
びCardoso、Respir. Res. 3:2(2002)を参照のこと。
【００２７】
播種された組織マトリックスを、播種後に一定時間(例えば、数時間から約14日以上)イ
ンキュベートして、組織マトリックスにおける細胞の固定および浸透を改善してもよい。
播種された組織マトリックスは、少なくとも再生細胞の一部が、無細胞組織マトリックス
の中および上で増加および/または分化できる条件下で維持され得る。このような条件と
しては、適切な温度および/または圧力、電気的および/または機械的活性(例えば、換気)
、力、適切な量のO2および/またはCO2、適切な量の湿度、ならびに滅菌またはほぼ滅菌条
件が挙げられるがこれらに限定されない。このような条件としてはまた、湿潤換気、湿潤
-乾燥換気、および乾燥換気が挙げられる。場合により、栄養補助剤(例えば、グルコース
等の栄養素および/もしくは炭素源)、外因性ホルモン、または成長因子を、播種された組
織マトリックスに添加してもよい。組織学および細胞染色を行って、播種された細胞の増
殖についてアッセイしてもよい。任意の適切な方法を行って、播種された細胞の分化につ
いてアッセイしてもよい。一般的に、本明細書に記載する方法は、例えば本明細書に記載
するような気道器官バイオリアクター装置において行われ得る。
【００２８】
従って、本明細書に記載する方法を使用して、例えばヒト被験体に移植するために、移
植可能なバイオ人工肺組織を生成できる。本明細書に記載するように、移植可能な組織は
、患者の血管系に接続できる十分に無傷の血管系を保持することが好ましい。
【００２９】
本明細書に記載するバイオ人工肺組織は、製品またはキットを作製するために梱包材料
と組み合わせられ得る。製品を作製するための構成要素および方法は周知である。製品ま
たはキットは、バイオ人工組織に加えて、例えば、1つ以上の接着防止剤、滅菌水、医薬
担体、緩衝剤、ならびに/またはインビトロおよび/もしくは移植後の機能肺組織の発達を
促進するための他の試薬をさらに含み得る。さらに、内包された組成物をどのように使用
できるかを記載した印刷された指示書がそのような製品に含まれ得る。製品またはキット
中の構成要素は、様々な適切な容器に梱包され得る。
【００３０】
バイオ人工肺の使用方法
本明細書はまた、バイオ人工肺組織を使用し、場合により肺機能を促進する方法および
材料も提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法を使用して、肺活量を損
なうかまたは低下させる疾患(例えば、嚢胞性線維症、COPD、気腫、肺癌、喘息、肺外傷
、または他の遺伝的または先天的な肺の異常、例えば、気管支性嚢胞、肺無形成および低
形成、多肺胞葉、肺胞毛細血管異形成、動静脈奇形(AVM)およびシミター症候群を含む分
画症（sequestration）、肺リンパ管拡張症、先天性肺葉性気腫(CLE)、および嚢胞性線腫
様奇形(CAM)、ならびに他の肺嚢胞)を患う患者においていくらかの肺機能を回復させるこ
とができる。本明細書で提供する方法はまた、被験体が特定の定められた治療(例えば、
肺機能の向上、または肺活量の増加もしくは改善)を必要とすると判明している場合も含
む。
【００３１】
バイオ人工肺組織(例えば、全器官またはその部分)は、本明細書で提供する方法により
作製できる。一部の実施形態では、本方法は、本明細書で提供するようなバイオ人工肺組
織をそれを必要とする被験体(例えば、ヒト患者)に移植することを包含する。一部の実施
形態では、バイオ人工肺組織は疾患または損傷した組織部位に移植される。例えば、バイ
オ人工肺組織は、機能していないまたは機能の乏しい肺の代わりに(または併用して)被験
体の胸腔に移植され得る；肺移植を行う方法は当該分野で公知である。例えば、Boasquev
isqueら、Surgical Techniques:Lung Transplant and Lung Volume Reduction, Proceedi
ngs of the American Thoracic Society 6:66-78(2009)；Camargoら、Surgical maneuver
s for the management of bronchial complications in lung transplantation, Eur J C
ardiothorac Surg 2008;34:1206-1209(2008)；Yoshidaら、"Surgical Technique of Expe
rimental Lung Transplantation in Rabbits,"Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11(1):7-11
(2005)；Venutaら、Evolving Techniques and Perspectives in Lung Transplantation, 
Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683(2005)；YangおよびConte、Transplantat
ion Proceedings 32(7):1521-1522(2000)；GaissertおよびPatterson、Surgical Techniq
ues of Single and Bilateral Lung Transplantation in The Transplantation and Repl
acement of Thoracic Organs, 2d ed. Springer Netherlands(1996)を参照のこと。
【００３２】
本方法は、被験体の肺を部分的もしくは完全に除去するための外科的処置の間に、およ
び/または肺切除の間に、本明細書で提供するようにバイオ人工肺またはその一部を移植
することを含む。場合により、本明細書で提供する方法は、被験体(例えば、ヒトまたは
動物被験体)における肺組織および機能を置き換えるかまたは補助するために使用できる
。
【００３３】
移植の前後の肺機能についてアッセイするために、任意の適切な方法を行うことができ
る。例えば、組織治癒を評価するために、機能性を評価するために、および細胞内部成長
を評価するために、方法を行うことができる。場合により、組織部分が回収され、例えば
、中性緩衝化ホルマリン等の定着剤で処理され得る。このような組織部分は、脱水され、
パラフィンに埋め込まれ、組織学的分析のためにミクロトームで薄片化され得る。切片を
ヘマトキシリンおよびエオシン(H＆E)で染色した後、形態および細胞性の顕微鏡評価のた
めにスライドガラス上に載置し得る。例えば、播種された細胞の増殖を検出するために、
組織学および細胞染色を行うことができる。アッセイとしては、移植された組織マトリッ
クスの機能性評価、または画像化技術(例えば、コンピュータ断層撮影(CT)、超音波、ま
たは磁気共鳴画像化(例えば、造影MRI))が挙げられ得る。アッセイとしてはさらに、休止
下および生理的ストレス下での機能性検査(例えば、身体プレスチモグラフィー、肺機能
検査)が挙げられる。細胞を播種されたマトリックスの機能性は、例えば、組織学、電子
顕微鏡法、ならびに(例えば、容量および適合性の)機械的検査等の当該分野で公知の方法
を用いてアッセイされ得る。ガス交換は、別の機能性アッセイとして測定できる。細胞増
殖についてアッセイするために、例えば、チミジン取り込みを検出することにより、チミ
ジンキナーゼ活性が測定できる。場合により、血液検査を行って、血中酸素レベルに基づ
いて肺の機能を評価してもよい。
【００３４】
場合により、RT-PCR等の分子生物学技術を使用して、代謝および分化マーカーの発現を
定量化できる。任意の適切なRT-PCRプロトコールが使用できる。簡単に言えば、生物学的
サンプル(例えば、腱サンプル)を均質化し、クロロホルム抽出を行い、スピンカラム(例
えば、RNeasy(登録商標)Miniスピンカラム(QIAGEN、Valencia、CA))または他の核酸結合
基質でトータルRNAを抽出することにより、トータルRNAを回収してもよい。その他の場合
では、抗体および標準イムノアッセイを用いて、肺細胞型およびそのような細胞型の異な
る分化段階に関連するマーカーを検出してもよい。
【００３５】
気道器官バイオリアクター装置 
例示の気道器官バイオリアクター装置を図1に示す。明細書全体を通して、肺が気道器
官の一例として提案される。他の例としては、例えば、気管が挙げられる。
【００３６】
図lを参照すると、バイオリアクターの構成要素として、肺チャンバー102、気管ライン
124、湿潤換気ライン150および乾燥換気ライン134を含む気道コネクタ、湿潤換気装置系1
20、乾燥換気装置系116および118、気管ライン124、湿潤換気ライン150および乾燥換気ラ
イン134の分岐合流点において三方向コネクタ148、ならびにコントローラ(図示せず)を含
む。コントローラは、コンピュータ操作されるが、手動でも操作される。バイオリアクタ
ーはまた、肺動脈ライン122、肺静脈ライン126、容器系104および106、ローラポンプ114
、ガスタンク122および付随するガスライン、後負荷チャンバー110、肺静脈戻りライン13
6、ならびに肺チャンバー圧力ライン128も含み得る。バイオリアクターはさらに、コンプ
ライアンスチャンバー109およびコンプライアンスチャンバー排液管146を含む。バイオリ
アクターはさらに、還流させる媒体溶液(図示せず)の酸素化および炭酸化を提供するのに
加えてまたはその代わりに、膜酸素供給器を含み得る。
【００３７】
肺チャンバー102は、脱細胞化肺マトリックス骨格（scaffold）を保持する。肺チャン
バー102は、滅菌肺培養環境を提供するために閉じられる。それぞれ血管カニューレを介
して、肺マトリックスの肺動脈は肺動脈ライン122に接続され、肺マトリックスの肺静脈
は肺動脈性静脈126に接続される。肺マトリックスの気管を、気管ライン124を介して気道
コネクタに接続される。
【００３８】
肺チャンバー102内では、肺の成長のために細胞を播種できるように、細胞マトリック
スに順行性に細胞媒体を灌流させる。灌流は、肺動脈ライン122を通り肺動脈まで行う。
そこから、媒体は肺血管系を流れ、容器系(104および106)に流れ出る。
【００３９】
容器系は、第１の容器104および第２の容器106、ならびに容器供給ライン140、および
容器排液管(140)を含む。細胞媒体は、容器供給ライン138および容器排液管140を通り、
容器104および106の間を循環する。滅菌濾過のために、マイクロフィルタを任意に供給ラ
イン140に設置することができる。細胞媒体はまた、容器104および106において酸素処理
される。灌流のために、細胞媒体が、容器104から、ローラポンプ114または重力を介して
肺動脈ライン122を通り、肺動脈まで供給される。
【００４０】
容器106に流れ出る媒体は、肺チャンバー排液管(4)を介して肺チャンバー102から直接
吸引され、肺チャンバー102内の一定の流体レベルを維持する。第３のコネクタ126を介し
て肺を流れ出る媒体は、重力を介して後負荷チャンバー110に排出され、後負荷チャンバ
ー排液管136を介して容器106まで吸引される。後負荷チャンバー110は、肺チャンバー圧
力ライン130を介して肺チャンバー102に、そして肺静脈戻りライン136を介して容器106に
接続される。肺チャンバー圧力ラインは、肺チャンバー102および後負荷チャンバー110内
の圧力を平衡化する。後負荷チャンバー110はまた、三方向分岐合流点156を通り気管およ
び湿潤換気ラインを介しても肺チャンバー102に接続される。
【００４１】
細胞をマトリックスに再導入する方法の一例は、以下の通りである。肺マトリックスの
灌流の間、マトリックスの細胞化が始まる。約30ccの媒体に懸濁した約1億個の間葉性細
胞を、肺動脈ライン122を介して播種する。間葉性細胞は骨髄由来胚幹細胞であるが、例
えば、USSN第12/233,017号の"Generation of Inner Ear Cells"(その内容の全体が参照に
より援用される)に記載のようなiPSまたは造血細胞であってもよい。一部の実施形態では
、播種完了後、灌流を、例えば約60分間止めて、細胞接着させる。灌流停止の間、細胞媒
体は気管および肺静脈から排出される；その後、排出された細胞媒体は容器106に流れる
。60分間の停止の後、媒体のみでの灌流を、例えば約24時間続ける。コンプライアンスチ
ャンバー109において一定の媒体レベルを維持するために、追加のライン(図示せず)を介
して容器104に接続され得る。
【００４２】
次に、内皮細胞の播種のための条件を設定する。気管ライン124を、三方向分岐合流点1
48およびそのコントローラを介して湿潤換気ライン150に接続する。三方向分岐合流点156
を、そのコントローラを使用して回して、湿潤換気ライン150をコンプライアンスチャン
バー109に接続させる。コンプライアンスチャンバー109は、湿潤気道陽圧(wAP)を提供し
て、気道圧を生理的範囲に限定しながら、間質腔および気管を通る媒体の正味の流量を限
定する。wAPは、チャンバー109の調節によって調節される。その結果、細胞媒体の一部は
肺静脈ライン(3)を通り容器106まで排出され、細胞媒体の少量部分はリンパ管を介して肺
チャンバー排液管ライン128を通り容器106に排出される。
【００４３】
約15ccの媒体に懸濁した約1億個の内皮細胞が、約10分間の重力送りを経て、肺動脈ラ
イン122を通って播種される。播種完了の際に、灌流を例えば約60分間停止して、細胞接
着させる。停止後、灌流を、例えば約3〜5日間続けて、内皮細胞単分子層を形成させる。
【００４４】
内皮細胞を播種し内皮細胞単分子層が形成された後、上皮細胞が播種できる状態になる
。上皮細胞の播種のために、三方向分岐合流点156をそのコントローラを用いて回し、湿
潤換気ライン150を閉じる。約15ccの媒体に懸濁した約2億個の上皮細胞を、気管ライン12
4を通して気管内に播種する。一部の実施形態では、上皮細胞は肺細胞である。播種完了
の際、肺動脈を介した灌流を例えば約60分間停止する。
【００４５】
また、いったん肺への細胞播種が完了したら、細胞懸濁液を末梢気道に進めるために湿
潤換気が必要となる。湿潤換気装置系120は、湿潤換気ライン150を介して肺に湿潤換気を
提供する。
【００４６】
三方向分岐合流点156をそのコントローラを用いて回して、湿潤換気ライン150をコンプ
ライアンスチャンバー109に接続する。wAPを上げて、間質腔へ少量の流れを提供し、細胞
接着を増す。湿潤換気を肺に約5分間提供し、約60分間保持した後、肺にさらに約5分間提
供し、約24時間保持する。湿潤換気は、湿潤ピーク吸気および呼気圧力を低く保つために
低い流量で、生理的一回換気量(ヒトについては約500 mL)で提供される。湿潤呼気陽圧は
、コンプライアンスチャンバー109の上昇により提供される。
【００４７】
灌流を再開したら、順行性灌流および湿潤換気を約5日間の間提供して、組織形成を可
能にする。
【００４８】
湿潤から乾燥換気への切り替えは、約5日間の後に、またはモニタ(図示せず)により肺
が十分な成熟に到達したことが判断された後に、行われる。人工サーファクタントは、気
管ライン124を介して投入される。その後、三方向分岐合流点148をそのコントローラを使
って回し、気管ライン124が乾燥換気ライン150ならびに乾燥換気系(116および118)に接続
されるようにする。乾燥換気系は、加湿空気を提供するための噴霧器(図示せず)を有する
乾燥換気チャンバー112、第１の乾燥換気装置116、および第２の乾燥換気装置118を含む
。乾燥換気チャンバー112は、乾燥PEEPライン144を介して第１の乾燥換気装置116に接続
され、乾燥換気ライン150を介して気管ラインに接続される。このように、肺は換気され
て、その気腔を液体ではなくガスでゆっくりと満たす。使用するガスは、ガスタンク122
によりガスラインを介して補給されるカルボゲン（carbogen）である。乾燥換気装置116
は、dPEEPを乾燥換気チャンバー112に提供し、その後肺チャンバー102における流体排出
が可能なように構成される。
【００４９】
次に、湿潤換気系120を中断し、乾燥換気装置118を肺チャンバーに対して開け、換気速
度を生理的速度まで上げ、流体を出して肺チャンバー102を空にし、肺チャンバー102内に
おいて肺を加湿空気で包囲するようにする。約3日間の組織成熟の後、灌流ガス分析を行
って、機能的組織の形成、および肺がバイオリアクターから取り出し可能であることを確
認する。
【００５０】
湿潤換気と乾燥換気との切り替えの際に、肺が自然に発達する条件を模倣した条件下で
肺が発達する。肺発達のためにはこの環境が必要であること、そして記載のバイオリアク
ターが移植用の組織工学肺を生成するのに必要な系および方法を提供すると判断された。
【００５１】
肺マトリックスを細胞化する例示の方法を図2Aに示す。肺マトリックスを肺チャンバー
に置く(210)。次いで、細胞媒体を肺動脈ラインに通して肺マトリックスに灌流させる(22
0)。次に、肺マトリックスに湿潤換気を提供する(230)。最後に、肺マトリックスに乾燥
換気を提供する(240)。
【００５２】
図2Bに示すように、肺マトリックスの灌流220の間、間葉性または他の幹細胞を、肺の
血管系を通して肺マトリックスに播種する(222)。次いで、内皮細胞を、肺の血管系を通
して肺マトリックスに播種する(224)。次いで、上皮細胞を、肺気道を通して肺マトリッ
クスに播種する(226)。
【００５３】
湿潤換気を提供するため、図2Cに示すように、肺気道を、湿潤換気装置ラインを介して
湿潤換気装置に接続する(231)。次いで、肺を、湿潤換気ラインを介してコンプライアン
スチャンバーに接続する(232)。次いで、コンプライアンスチャンバー内の流体の高さを
調節することで、湿潤換気ラインを介して湿潤気道圧を上げる(233)。さらに、コンプラ
イアンスチャンバーを上げることで、湿潤PEEP(wPEEP)が提供される(234)。肺マトリック
ス上で成長させている肺の成熟の程度をモニタリングする(235)。成熟の程度が許容可能
であると判断された場合(236)には、乾燥換気への移行を始める(237)。
【００５４】
乾燥換気を提供するために、図2Dに示すように、気管を介して人工サーファクタントを
適用する(241)。次いで、気管を、乾燥換気ラインを介して乾燥換気チャンバーに接続す
る(242)。乾燥換気チャンバーは、dPEEPラインを介して第１の乾燥換気装置に接続される
(243)。次いで、乾燥換気ラインを介して乾燥気道圧を上げる(244)。湿潤換気ラインを断
絶し(245)、肺チャンバーを第２の乾燥換気装置に接続する(246)。
【００５５】
完全なラット肺のためには、合計で、約2億から約4億個の細胞が必要とされ得る。ヒト
について推定すると、完全な肺のために約200億から約400億個の細胞が推定される。この
ような数の細胞を生成するには、患者が有する時間よりも長い時間を要しうる。仮に20%
の肺機能を必要とする患者は、この数字の約20％しか必要とせず、新しい肺を得るために
それに比例して待つ時間が短いかもしれない。
【００５６】
器官脱細胞化で使用するための例示の気道器官バイオリアクター装置を図3に示す。上
述したように、肺は気道器官の一例として提案するものである。図3を参照すると、バイ
オリアクターの構成要素として、肺チャンバー302、密封された重力容器304、および大容
器306を含む(容器304および306は、肺チャンバー302中の肺への灌流用の脱細胞化溶液を
含む)。脱細胞化溶液は、容器供給ライン314を通り容器304および306の間で循環する。肺
マトリックスの肺動脈は、肺動脈ライン308に接続され、容器304からそこを通って脱細胞
化溶液が、重力流を介して肺組織内まで灌流する。脱細胞化の後、排出物が肺チャンバー
302から除去される。場合により、肺チャンバー302からの溶液は、容器306に供給するポ
ンプ312を介して再循環される。
【００５７】
細胞播種において使用される例示の気道器官バイオリアクター装置を図4に示す。図4を
参照すると、バイオリアクターの構成要素として、肺チャンバー402、密封された重力容
器404、および大容器406を含む(容器404および406は、肺チャンバー402中の肺への灌流用
の細胞媒体を含む)。細胞媒体は、容器供給ライン408を通り、容器404および406の間を循
環する。それぞれ血管カニューレを介して、肺マトリックスの肺動脈は肺動脈ライン410
に接続し、肺マトリックスの肺静脈は肺静脈ライン412に接続する。細胞播種のために、
細胞媒体が、容器404から、ポンプまたは重力を介して、肺動脈ライン410を通り肺動脈ま
で供給される。第３のコネクタ412を介して肺から流れ出る媒体(静脈流出)は、重力を介
して後負荷コンプライアンスチャンバー420に排出され、後負荷チャンバー排液管を介し
て容器406に吸引される。後負荷チャンバー420は、肺チャンバー圧力ラインを介して肺チ
ャンバー402に接続され、肺静脈戻りライン412を介して容器406に接続される。肺チャン
バー圧力ラインは肺チャンバー402および後負荷チャンバー420内の圧力を平衡化する。後
負荷チャンバー420はまた、気管を介して肺チャンバー402に、そして三方向分岐合流点41
4を通り湿潤換気ラインに接続される。
【００５８】
気管ラインは、三方向分岐合流点414およびそのコントローラを介して湿潤換気ライン
に接続される。三方向分岐合流点414はそのコントローラを用いて回され、湿潤換気ライ
ンをコンプライアンスチャンバー420に接続する。コンプライアンスチャンバー420は、湿
潤気道陽圧(wAP)を提供して、気道圧を生理的範囲に限定しながら、間質腔および気管を
通る媒体の正味の流量を限定する。wAPは、チャンバー420の調節によって調節される。そ
の結果、細胞媒体の一部は肺静脈ライン412を通り容器406まで排出され、細胞媒体の少量
部分はリンパ管を介して肺チャンバー排液ラインを通り容器406に排出される。
【００５９】
マトリックス灌流に使用する例示の気道器官バイオリアクター装置を図5に示す。図5を
参照すると、バイオリアクターの構成要素として、肺チャンバー502、密封された重力容
器504、および大容器506を含む(容器504および506は、肺チャンバー502中の肺への灌流用
の灌流溶液(例えば、血液)を含む)。細胞媒体は、容器供給ライン508を通り容器504およ
び506の間を循環する。それぞれ血管カニューレを介して、肺マトリックスの肺動脈は肺
動脈ライン510に接続し、肺マトリックスの肺静脈は肺動脈性静脈512に接続される。細胞
播種の後、細胞懸濁液を末梢気道に進めるために湿潤換気が必要である。湿潤換気装置系
518は、湿潤換気ラインを介して、湿潤換気を肺に提供する。次いで、三方向分岐合流点5
14をそのコントローラを使用して回し、気管ラインを乾燥換気ラインおよび乾燥換気系51
6に接続する。
【００６０】
例示の気道器官バイオリアクター装置を図6に示す。図6を参照すると、バイオリアクタ
ーの構成要素として、肺チャンバー602、密封された重力容器616、および大容器606を含
む(容器616および606は、肺チャンバー602中の肺への灌流用の灌流溶液を含む)。溶液は
、容器供給ラインを通り、容器616および606を循環する。それぞれ血管カニューレを介し
て、肺マトリックスの肺動脈は肺動脈ライン626に接続し、肺マトリックスの肺静脈は肺
動脈性静脈628に接続する。細胞播種のために、媒体が、ポンプを介するか、または重力
を介して、容器616から肺動脈ライン626を通り、肺動脈に供給される。第３のコネクタ62
8を介して肺から流れ出る媒体(静脈流出)は、重力を介して後負荷コンプライアンスチャ
ンバー604に排出され、後負荷チャンバー排液管を介して容器606に吸引される。コンプラ
イアンスチャンバー604において一定の媒体レベルを維持するために、追加のライン(図示
せず)を介して容器606に接続され得る。湿潤換気装置系624は、湿潤換気ラインを介して
肺に湿潤換気を提供する。三方向分岐合流点620をそのコントローラを用いて回し、湿潤
換気ラインをコンプライアンスチャンバー604に接続させる。
【００６１】
湿潤から乾燥換気への切り替えは、約5日間の後か、またはモニタ(図示せず)が肺が十
分に成熟したと判断した後に行う。人工サーファクタントが、気管ライン630を介して投
入される。その後、三方向分岐合流点620をそのコントローラを用いて回し、気管ライン6
30を乾燥換気ラインおよび乾燥換気系622に接続する。肺を換気して、その気腔を流体で
はなくガスでゆっくりと満たす。
【００６２】
本発明を、請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定しない以下の実施例によりさらに
説明する。
【実施例】
【００６３】
灌流脱細胞化マトリックス骨格に基づく肺再生
ヘパリン化成体SDラット(n=20)から肺を単離し、界面活性剤灌流を用いて脱細胞化した
。得られた細胞外マトリックス(ECM)骨格を、組織学、電子顕微鏡法および機械的検査を
使用して分析した。骨格をバイオリアクターに載置し、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC、n=4)、
HUVECおよびヒト肺胞基底上皮細胞(H-A549、n=4)、ならびにHUVECおよびラット胎仔肺細
胞(H-FLC、n=2)を播種した。培養を最長7日間維持した。単離した肺装置において、血液
灌流および換気を用いて肺機能を分析した。正常肺を対照(n=4)とした。
【００６４】
死体肺の灌流脱細胞化により、無傷の気道および血管構造を有する無細胞肺ECM骨格が
産生された。肺骨格は、内皮および上皮細胞で再増殖されて、バイオリアクターにおいて
維持され得た。ガス交換(PaO2/FiO2比)は、正常肺(465.8mmHg)と比較して、H-A549構築物
においては低く(103.6mmHg)、H-FLC構築物においては同等であった(455.1mmHg)。コンプ
ライアンスは脱細胞化肺において低下したが(0.27ml/cmH20/s)、H-FLC構築物(0.67ml/cmH
2O/s)および正常肺(0.69ml/cmH2O/s)において同等であった。
【００６５】
死体肺の灌流脱細胞化により無傷の全肺ECM骨格を産生し、これには上皮および内皮細
胞を播種して、正常肺に匹敵する換気、灌流およびガス交換を有するバイオ人工肺を形成
できる。
【００６６】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明に併せて記載してきたが、上記記載は例示を意図したものであ
り、添付の請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解
されよう。その他の態様、利点、および改変は、以下の請求の範囲内にある。
【図１】
2016039807.tif 000002
【図２Ａ】
2016039807.tif 000003
【図２Ｂ】
2016039807.tif 000004
【図２Ｃ】
2016039807.tif 000005
【図２Ｄ】
2016039807.tif 000006
【図３】
2016039807.tif 000007
【図４】
2016039807.tif 000008
【図５】
2016039807.tif 000009
【図６】
2016039807.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月16日(2015.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その上に細胞媒体を灌流させて器官を成長させる器官マトリックス骨格を支持するように構成された器官チャンバー；
前記器官へ湿潤換気を供給するように構成された湿潤換気装置系；
前記器官へ乾燥換気を供給するように構成された乾燥換気装置系；および
湿潤換気の送達または乾燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラ、
を包含する気道器官バイオリアクター装置。
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月28日(2015.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ人工機能気道器官を提供するためのバイオリアクター装置であって、
気道構造および血管構造を含む脱細胞化された肺組織マトリックスを支持するように構成されたチャンバーと、
前記肺組織マトリックスに内皮細胞または上皮細胞またはこれらの組合せを播種するように構成されたフロー灌流系と、
前記肺組織マトリックスへ湿潤換気を供給するように構成された湿潤換気装置と、
前記肺組織マトリックスへ乾燥換気を供給するように構成された乾燥換気装置と、
湿潤換気の送達または乾燥換気の送達を制御するように構成されたコントローラとを備える、バイオリアクター装置。
【請求項２】
前記コントローラは、
前記血管構造を介して内皮細胞を灌流することにより、前記内皮細胞を前記血管構造の内部に播種し、
前記気道構造を介して上皮細胞を灌流することにより、前記気道構造に前記上皮細胞を播種し、
湿潤成熟した器官が生じるのに十分な時間の間、前記湿潤換気装置から湿潤換気ラインを介して前記気道構造への湿潤換気と、前記血管構造を介する灌流とを、前記肺組織マトリックスに提供しつつ、前記気道構造を介して灌流溶液を提供し、
バイオ人工機能気道器官を提供するに十分な時間の間、前記乾燥換気装置から乾燥換気ラインを介して前記気道構造への乾燥換気と、前記血管構造を介する灌流とを、前記湿潤成熟した器官に提供する
ことを実行する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記上皮細胞が、ヒト肺胞基底上皮細胞である、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記内皮細胞は、流体10cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に懸濁され、および
前記上皮細胞は、流体5cc当たり約1億個の細胞の濃度で流体に懸濁される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記コントローラは、さらに
湿潤成熟した器官を作製するために、所望の程度の器官成熟が生じるまで、器官成熟の程度をモニタリングし、
前記湿潤成熟した器官が作製されたら、前記気道構造への前記湿潤換気を止め、
前記湿潤換気を止めた後、人工サーファクタントを前記気道構造に適用し、
前記人工サーファクタントを適用すると同時または適用した後、前記気道構造に対して前記乾燥換気を開始する、
ことを実行する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記湿潤換気が生理的一回換気量で提供される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記湿潤成熟した器官への乾燥換気の提供が、さらに
前記気道を、前記乾燥換気ラインを介して、乾燥換気チャンバーに接続し、
前記乾燥換気チャンバーを、乾燥呼気陽圧(dPEEP)ラインを介して、前記乾燥換気装置に接続し、
前記乾燥換気ラインを介して、乾燥気道圧を上げ、
前記湿潤換気ラインを断絶し、
前記気道構造を、第２の乾燥換気ラインを介して、第２の乾燥換気装置に接続する、ことを包含する、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
前記肺組織マトリックスが、脱細胞化ヒト肺組織または人工肺マトリックスを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記バイオ人工機能肺が十分な数の細胞を包含して、完全な肺機能またはその一部を提供する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本明細書で使用する「脱細胞化」および「無細胞」という用語は、互換的に使用され、標準的な組織学的染色手順を使用した際に、組織学的切片において検出可能な細胞内、内皮細胞、上皮細胞、および核が完全にまたはほぼ完全に不在であると定義される。必ずではないが好ましくは、残存している細胞残屑も、脱細胞化器官または組織から除去されている。