(57)【要約】【課題】従来の装置よりもさらに深部からの観察情報を得ることができ、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供すること。【解決手段】試料に可干渉性を有する照明光を照射し、前記照明光に基づく前記試料からの戻り光を検出するように構成された顕微鏡において、  前記照明光を少なくとも２系統に分離し、分離された前記照明光の少なくとも一方に変調を加える変調手段と、  前記分離された照明光を前記試料において同一の焦点を結ばせる対物レンズと、  前記焦点で発生する干渉光によって生じる光を戻り光として前記対物レンズを介して取得し検出する検出手段とを備え、  前記対物レンズを出てから焦点を結ぶまでの照明光の光路と、戻り光のうちの検出器で検出される光の焦点から対物レンズまでの光路が重ならないように異なることを特徴とするもの。【選択図】  図１
2016105126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に可干渉性を有する照明光を照射し、前記照明光に基づく前記試料からの戻り光を検出するように構成された顕微鏡において、
前記照明光を少なくとも２系統に分離し、分離された前記照明光の少なくとも一方に変調を加える変調手段と、
前記分離された照明光を前記試料において同一の焦点を結ばせる対物レンズと、
前記焦点で発生する干渉光によって生じる光を戻り光として前記対物レンズを介して取得し検出する検出手段とを備え、
前記対物レンズを出てから焦点を結ぶまでの照明光の光路と、戻り光のうちの検出器で検出される光の焦点から対物レンズまでの光路が重ならないように異なることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記照明光と戻り光は、前記対物レンズの瞳位置において互いに異なる領域を通過することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記照明光は対物レンズの瞳位置の外周部を通過し、前記戻り光は瞳位置の中心部付近を通過することを特徴とする請求項１または請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記対物レンズの形状は光軸方向から見た場合に１方向に長い扁平形状であり、前記扁平形状の対物レンズの中心領域において戻り光を通過させるとともに、中心領域を挟む長手方向に二つの照明光を通過させる領域を設けたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記対物レンズとして、可変焦点レンズを用いたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関し、特により深部の観察が行える顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡観察において、生体の深部観察を行う際には、焦点面以外からの戻り光の影響により、画像のＳＮ比は劣化する。この現象は、たとえ共焦点顕微鏡を用いたとしても充分取り除くことはできていない。
【０００３】
これを解決するための技術として、一般的に２光子顕微鏡が知られているが、２光子顕微鏡には以下の問題点がある。
・特殊な短パルス光源が必要であり、装置は高価になる。
・低倍率のマクロ観察を行おうとした場合、焦点は十分に小さくならないため２光子励起の効率が悪くなり、深部観察ができない。
【０００４】
これらの問題を解消する技術として、特許文献１として引用する特表２０１０-５３２８７８号公報に記載されているが知られている。
【０００５】
この技術は、走査型レーザ顕微鏡において、レーザ光の空間的に分けられた一部に位相変調を加えて焦点でのみ強度変調を発生させるとともに、戻ってくる蛍光の強度変調成分を抽出することによって、深部の蛍光情報のみを抽出する技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０-５３２８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、この技術を用いても、照明光路の途中で発生する蛍光成分も検出器で検出されてしまう。
【０００８】
この結果、強度変調の成分のみを抽出しようとしても、多大なノイズである直流成分が検出器で検出されると、微弱な深部観察信号はノイズに埋もれてしまって十分な感度で検出することは困難である。すなわち、十分な深部観察が行えないという問題がある。
【０００９】
本発明は、これらの問題点を解決したものであり、その目的は、従来の装置よりもさらに深部からの観察情報を得ることができ、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
試料に可干渉性を有する照明光を照射し、前記照明光に基づく前記試料からの戻り光を検出するように構成された顕微鏡において、
前記照明光を少なくとも２系統に分離し、分離された前記照明光の少なくとも一方に変調を加える変調手段と、
前記分離された照明光を前記試料において同一の焦点を結ばせる対物レンズと、
前記焦点で発生する干渉光によって生じる光を戻り光として前記対物レンズを介して取得し検出する検出手段とを備え、
前記対物レンズを出てから焦点を結ぶまでの照明光の光路と、戻り光のうちの検出器で検出される光の焦点から対物レンズまでの光路が重ならないように異なることを特徴とする。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記照明光と戻り光は、前記対物レンズの瞳位置において互いに異なる領域を通過することを特徴とする。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２記載の顕微鏡装置において、
前記照明光は対物レンズの瞳位置の外周部を通過し、前記戻り光は瞳位置の中心部付近を通過することを特徴とする。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の顕微鏡装置において、
前記対物レンズの形状は光軸方向から見た場合に１方向に長い扁平形状であり、前記扁平形状の対物レンズの中心領域において戻り光を通過させるとともに、中心領域を挟む長手方向に二つの照明光を通過させる領域を設けたことを特徴とする。
【００１４】
請求項５記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置において、
前記対物レンズとして、可変焦点レンズを用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の顕微鏡装置によれば、従来に比べてさらに深部からの観察情報を得ることができ、生体深部の観察に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に基づく第１の実施例の構成を示すブロック図である。
【図２】変調装置３の構成説明図である。
【図３】レーザ光の収束点の走査説明図である。
【図４】フィルタ１３の開口正面図である。
【図５】ＥＯＭを用いた変調装置３の構成説明図である。
【図６】本発明に基づく第２の実施例の構成を示すブロック図である。
【図７】本発明に基づく第３の実施例の構成を示すブロック図である。
【図８】変調装置３３の構成説明図である。
【図９】プローブ先端部３４の構成説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。図１は、本発明に基づく第１の実施例の構成を示すブロック図である。図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置１は、近赤外の波長を有するコリメート光を発するレーザ光源２を有し、その前面には変調装置３が配置されている。
【００１８】
図２は変調装置３の構成説明図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は光軸方向に沿って見た正面図である。（Ｂ）に示すように、変調装置３は４つのＡＯＭ（音響光学素子）の領域３ａ〜３ｄを有し、他の部分は光を遮光する構造となっている。
【００１９】
ここで、ＡＯＭ３ａ、３ｃはたとえば周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで周波数変調を行い、ＡＯＭ３ｂ、３ｄはたとえば周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで周波数変調を行う。
【００２０】
再び図１において、変調装置３の先には、レーザ光の向きを変えるためのダイクロイックミラー４と、レーザ光を走査するための走査光学ユニット５とが配置されている。
【００２１】
ダイクロイックミラー４は、波長により異なる反射性・透過性を示すものであり、レーザ光を反射し、レーザ光により励起された蛍光を透過させる特性を有する。
【００２２】
走査光学ユニット５は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ａと、可変ミラー５ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ｂとを備えている。
【００２３】
さらに、顕微鏡装置１は、光を収束させる瞳投影レンズ６と、レーザ光を偏向するミラー７と、結像レンズ８と、対物レンズ９とを備えている。また、対物レンズ９の先には、試料１２を載せるステージ１１が設けられている。
【００２４】
また、ダイクロイックミラー４の近傍には試料１２から発生した蛍光の一部の領域を選択的に透過するフィルタ１３が設けられている。このフィルタ１３には、特定の蛍光波長のみを透過させる蛍光フィルタ膜が設けられている。
【００２５】
フィルタ１３の光路の先には、蛍光ビームを収束させるレンズ１４と、ピンホールが形成されたピンホール部材１５と、ピンホール部材１５のピンホールを通過した光を検出する検出器１６とが順次設けられている。検出器１６の出力信号は、バンドパスフィルタ１９を介してコントローラ１７に与えられる。
【００２６】
コントローラ１７は、光学走査ユニット４の走査制御や、光検出器１６からの信号の取得や、変調装置３の制御などを実行する。また、表示モニタ１８に情報を出力する。
【００２７】
図１のように構成される顕微鏡装置１の動作を説明する。
レーザ光源２の出力光により励起される蛍光指示薬が導入された試料１２は、ステージ１１上に配置される。
【００２８】
レーザ光源２の出力光は、図２に示すような変調装置３に入射される。レーザ光の領域の一部はＡＯＭ３ａ、３ｃにより周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調され、レーザ光の左側の一部はＡＯＭ３ｂ、３ｄによって周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調される。これらの光はダイクロイックミラー４によって光走査ユニット５へと導かれ、光走査ユニット５によって任意の方向に走査される。
【００２９】
レーザ光はさらに瞳投影レンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を通過して、対物レンズ９に入射される。このレーザ光は対物レンズ９により収束されるとともに、このレーザ光の収束点は光走査ユニット５によって焦点面上を走査される。
【００３０】
図３は、レーザ光の収束点の走査説明図である。図３において、実線および点線は走査されるレーザ光の光束を示している。
【００３１】
図３に示すように、光走査ユニット５によって対物レンズ９に入射するレーザ光の入射角度が変化し、これにより収束点１０が焦点面１０Ａで走査される。周波数ｆ１で変調されたレーザ光と周波数ｆ２で変調されたレーザ光は、対物レンズ９の瞳の外周付近に投影されて互い平行な角度で入射し、対物レンズ９を出てから焦点を結ぶまでの光路は互いに分離されて重ならない。
【００３２】
ここで、すべての光は対物レンズ９によって集光され、焦点においてのみ、それぞれの変調を受けた光が重なる。この領域において、４つの光は干渉を起こし、２つの差の周波数である１００ｋＨｚで強度変調される。この強度変調されレーザ光により試料１２の蛍光指示薬が励起され、蛍光が生じる。
【００３３】
この蛍光は対物レンズ９の全領域で捕らえられてレーザ光とは逆方向に進み、結像レンズ８、反射ミラー７、瞳投影レンズ６、光走査ユニット５を介してダイクロイックミラー４へ導かれる。この蛍光はダイクロイックミラー４を透過して、フィルタ１３によって選択的に特定の場所の蛍光の波長成分が選択的に透過され、レンズ１４とピンホール１５により焦点面からの光のみが選択されて検出器１６に入射される。
【００３４】
図３では、フィルタ１３で選択的に透過される領域を対物レンズ９の瞳位置に投影する状態と、フィルタ１３の開口とを示している。
【００３５】
図４は、フィルタ１３の開口を図３の対物レンズ９の瞳位置における光軸に沿った方向から見た正面図である。このように、励起する光路とは異なる光路で蛍光を回収する。
【００３６】
光検出器１６の出力信号はバンドパスフィルタ１９に送られ、差の周波数１００ｋＨｚ近傍の周波数のみが抽出される。バンドパスフィルタ１９の出力信号はコントローラ１７に入力され、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応した画像データが作成される。この画像データは、画像として表示モニタ１８上に表示されるとともにコントローラ１７内部のメモリに記憶される。
【００３７】
また、図示しないアクチュエータにより対物レンズまたは試料を対物レンズの光軸方向に移動させて、別の深さの画像を観察することもできる。さらに、光走査ユニット５とアクチュエータを連動させて任意の断面画像を観察したり、３次元情報を観察することもできる。
【００３８】
図１のように構成される顕微鏡装置は、焦点の交差領域のみで互いに異なる周波数で変調した光の干渉を発生させ、その差の周波数で交差領域のみで強度変調を加えているので、この領域のみの蛍光がこの差の周波数成分を有することになる。
【００３９】
そして、バンドパスフィルタ１９でこの周波数成分のみを抽出するので、交差領域の蛍光情報をＳＮ比よく検出でき、生体の深部の蛍光情報も得ることができる。
【００４０】
さらに、励起光の光路と蛍光を回収する光路が分離されているため、励起光の光路中に存在する蛍光物質が蛍光を発しても検出器で検出されることはなく、ノイズ成分が低くなることからＳＮ比よく観察が行える。
【００４１】
また、レーザ光の照明光の光路が対物レンズ９の瞳位置の外周付近を通るため、強度変調を起こす焦点領域はほぼ回折限界まで小さくなり、この領域からの変調成分を抽出することで分解能は最良となる。
【００４２】
仮に励起光の光路を対物レンズの瞳の中心付近に配置し、蛍光を回収する光路を瞳位置の外周部に配置した場合を考えると、強度変調を起こす焦点領域が大きくなる。蛍光を回収する光路は理想的には前記強度変調の領域の中の回折限界に近い領域の情報を回収するが、試料における光散乱や回折の影響で周辺部の変調領域の情報も混入するため、分解能は前述の構成ほどには向上しない。
【００４３】
なお、図３に示す焦点領域のみの蛍光がバンドパスフィルタ１９により抽出されることから、ピンホール部材１５を用いなくても共焦点効果は得られるが、ピンホールを挿入することで一層ＳＮ比が向上する。
【００４４】
本実施例では変調装置３をレーザ光前面に配置しているが、その位置は限定されない。たとえばダイクロイックミラー４で反射した後の光路に挿入してもよいし、対物レンズの瞳近傍に挿入してもよい。また、瞳位置がリレーされる、走査光学ユニット５の近傍に挿入してもよい。
【００４５】
また、本実施例ではＡＯＭを用いて周波数変調を行っているが、これに限らずＡＯＭを用いて強度変調を行っても同様の効果が得られる。
【００４６】
また、変調装置３に代えて、２つの電気光学変調素子（ＥＯＭ）によって位相変調もしくは強度変調を加えるように構成しても同様の効果が得られる。
【００４７】
図５は図２のＡＯＭの代わりにＥＯＭを用いた変調装置３の構成説明図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は光軸方向に沿って見た正面図である。
【００４８】
変調装置には二つのＥＯＭ３e、３ｆが配置されており、それぞれ１００KHzで位相変調が加えられている。また領域３ｇ、３ｈは変調を加えない透過領域である。この構成においても図２の構成と同様に焦点領域で１００ｋHzの強度変調が得られる。
【００４９】
一般にＡＯＭの周波数変調は極めて周波数が高いため、二つの差周波数を用いることが多いが、ＥＯＭを用いると一つのＥＯＭでＡＯＭに比べて低い周波数の変調が行えることから、このような構成にすることができる。
【００５０】
また、これらＥＯＭの形状は円形に限るものではなく、図５（Ｃ）に示すように瞳の外周部を囲むように配置することでより分解能の高い画像が得られる。
【００５１】
また、照明の光源としては干渉距離の短い光源がより好ましく、近赤外光のＳＬＤ（スーパールミネッセンスダイオード）や白色光、ＬＥＤなどを用いることによって、焦点付近以外の光路長が異なる領域では干渉が起こらなくなり、さらにＳＮ比が向上する。
【００５２】
また、ＳＬＤの代わりに、極短パルス光を用いても同様の効果が得られる。
【００５３】
また、本実施例では１つの対物レンズを用いて２つの変調光を重ね合わせているが、これに限らず、焦点位置を合わせた複数の対物レンズを用いて変調光を重ねてもよい。
【００５４】
さらに交差領域で変調される励起光によって生じる多光子蛍光を検出してもよく、波長が半分になる２次高調波やより高次の高調波を検出してもよい。
【００５５】
また、光走査手段として可変ミラーを示したが、これに限らず音響光学偏向素子や電気変調偏向素子を用いてもよい。また、試料を走査してもよく、顕微鏡の一部または全体を走査しても構わない。
【００５６】
図１のような構成の顕微鏡装置１によれば、試料１２を照明するレーザ光を対物レンズ９の瞳の別の領域からそれぞれ異なる周波数で変調を加えて投光し、２つの光の集光点が交差する領域で差周波数の強度変調を発生させてその光で励起を行い、そこで発生する蛍光を励起光の光路とは異なる光路で回収検出するとともに変調成分である差周波成分のみを抽出しているので、極めてＳＮ比がよく、組織の深部観察に適している。
【００５７】
図６は本発明に基づく第２の実施例の構成を示すブロック図であり、図１と共通する部分には同一の符号を付けている。第２の実施例の顕微鏡装置は、蛍光ではなく反射、散乱光を検出する。
【００５８】
図６に示す第２の実施例では、光源としてコリメート光を発する近赤外光のＳＬＤ２１（スーパールミネッセンスダイオード）を使用する。また、図１のダイクロイックミラー４の代わりに偏光ビームスプリッタ２２が用いられ、蛍光を透過させるフィルタ１３の代わりに特定の偏光を透過させるフィルタ２４が用いられている。さらに対物レンズ１０の前段には、１/４波長板２３が挿入されている。
【００５９】
変調装置３は、図１で用いるものと同様に構成されていて、レーザ光の一部を周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調するＡＯＭ（音響光学素子）３ａ、３ｃと、レーザ光の一部を周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調するＡＯＭ３ｂ、３ｄとを有している。
【００６０】
図６の動作を説明する。
ＳＬＤ２１の出力光は、直線偏光を有している。変調装置３で変調され偏光ビームスプリッタ２２で反射された後、同様の光路を通り、１/４波長板２３でそれぞれ円偏光に変換され、対物レンズ９によって焦点を結ぶ。
【００６１】
図１の実施例と同様に、焦点の交差領域でのみ干渉を起こして差周波数（１００ｋＨｚ）での強度変調が与えられる。焦点からの反射、散乱光は対物レンズ９で集められてもう一度１/４波長板２３を通過することにより、入射光とは９０度偏光方向の異なる偏光となり、照明光の光路を逆方向に戻る。
【００６２】
今度は偏光ビームスプリッタ２２を透過した後に、フィルタ２４でその偏光成分が選択され、さらにピンホール部材１８を介して検出器１９で検出される。フィルタ２４は、図１の構成と同様に、励起光の光路とは異なる光路の反射光、散乱光のみを通過させる。
【００６３】
光検出器１６の出力信号はバンドパスフィルタ１９に送られ、ここで差の周波数１００ｋＨｚ近傍の周波数のみが抽出される。さらに信号はコントローラ１７へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データが作成される。この画像データは、画像として表示モニタ１８上に表示され、あるいは、コントローラ１７内部のメモリに記憶される。
【００６４】
図６で用いるＳＬＤ２１の出力光は、１０μｍ程度の可干渉距離を有しているため、光路長が等しくなる場合のみ干渉が生じる。ＳＬＤ２１の出力光は試料１２に照射されて様々に散乱するが、干渉は光路長が等しくなる焦点近傍でしか生じない。この焦点近傍の干渉光による戻り光のみを抽出できるので、焦点の情報をＳＮ比よく検出できる。
【００６５】
なお、上記差周波数（１００ｋＨｚ）を抽出する代わりに、非線形現象によって交差領域で発生するｆ１−ｆ２の成分の高調波を検出してもよい。
【００６６】
図６のように構成される顕微鏡装置は、試料を照明する可干渉光を対物レンズの瞳の別の領域からそれぞれ異なる周波数で変調して投光することにより、光の集光点が交差する領域で差周波数に基づく強度変調を発生させ、そこで発生する反射、散乱光の差周波成分のみを抽出するので、生体深部の反射、散乱光を極めてＳＮ比がよい状態で検出でき、組織の深部観察に適している。
【００６７】
さらに、照明光の光路と反射、散乱光を回収する光路が分離されているため、照明光の光路中にある試料の反射、散乱光が検出器で検出されることはなく、ノイズ成分が低くなるためよりＳＮ比よく観察が行える。
【００６８】
また、照明光の光路が対物レンズ９の瞳位置の外周付近を通るため、強度変調を起こす焦点領域はほぼ回折限界まで小さくなり、この領域からの変調成分を抽出することで分解能が最良となる。
【００６９】
図７は、本発明に基づく第３の実施例の構成を示すブロック図である。図７に示す顕微鏡装置３０は、細長いプローブ３４を有する生体内観察に適したものである。レーザ光源３１は、近赤外の波長を有する光を、シングルモードのファイバで構成されるファイバカプラ３２に出力する。ファイバカプラ３２は２系統のファイバ３２a、３２ｂに分岐され、レーザ出力光も等分される。これらファイバ３２a、３２ｂは変調装置３３を通る。
【００７０】
図８は、変調装置３３の構成説明図である。変調装置３３は、一つのファイバ位相変調器３３ａを有している。このファイバ位相変調器３３ａは、たとえばピエゾ素子が円筒状に形成されたものである。ファイバ位相変調器３３ａの外周がピエゾ素子に加えられる電圧によって伸縮することにより、円筒に巻きつけられたファイバ３２ｂを通る光は１０ＭＨｚで位相変調される。他方のファイバ３２aを通る光は変調されない。
【００７１】
変調装置３３を通ったファイバ３２a、３２ｂはプローブ部３４に導入される。また、プローブ３４は、プローブ先端部３４ａで検出される光を伝達する検出用のシングルモードのファイバ３２ｃを有する。
【００７２】
図９はプローブ先端部３４の構成説明図であり、（Ａ）は拡大図、（Ｂ）は可変焦点レンズの正面図である。プローブ３４はアウターシース４０とその内側のインナーシース４１によって構成されている。インナーシース４１は図示しないフレキシブルシャフトによってアウターシース４０に対して図示しないモータによって回転可能に構成され、アウターシース４０のプローブ先端部３４近傍は近赤外光を透過する材質で構成されている。
【００７３】
ファイバ３２a、３２ｂの先端には先端光学系４２ａ、４２ｂが配置されており、ファイバからの光をコリメートするとともにプリズムで反射する構成となっている。また、ファイバ３２ｃの先端にも同様の先端光学系４２ｃが配置されているが、こちらは試料からの光を光ファイバに導入するように作用する。
【００７４】
先端光学系４２a、４２ｂ、４２ｃの近傍には、可変焦点レンズ４３が試料３５と対向するように配置されている。この可変焦点レンズ４３は、図９（Ｂ）に示すように円形のレンズ形状を扁平に切り落とした形状となっており、電気的な信号により内部の屈折率分布が変化することによって、その焦点位置を高速に変えることができる。
【００７５】
可変焦点レンズ４３の中心部には検出用のファイバ３２ｃに入る光が通過する領域が配置され、その領域の両側には励起用のファイバ３２a、３２ｂからの光が通過する領域が配置されている。
【００７６】
検出用の光ファイバ３２ｃは検出器３６に接続されるが、検出器３６の内部には所望の蛍光波長のみを通過させる図示しない蛍光フィルタが配置されている。検出器３６からの信号はバンドパスフィルタ３７を介してコントローラ３８に与えられる。
【００７７】
コントローラ１７は、光検出器１６の出力信号の取得、可変焦点レンズ４３の制御、変調装置３の制御、インナーシースを回転させる図示しないモータの回転制御なども実行する。また、表示モニタ１８に表示すべき情報を出力する。
【００７８】
図７に示す第３の実施例の動作を説明する。
レーザ光源３１の出力光はファイバカプラ３２に導かれ、二つのファイバ３２a、３２ｂに分岐されて変調装置３３に入射される。一方のファイバ３２ｂ内部の光は１０ＭＨｚで位相変調される。
【００７９】
これらファイバファイバ３２a、３２ｂに入射されたレーザ光源３１の出力光はプローブ先端部３４aに導かれ、先端光学系４２ａ、４２ｂにより、平行光に変換された後に直角に向きを変える。これらの光は可変焦点レンズ４３の外側を通過して、試料３５内部で焦点を結ぶ。これら二つの光は焦点において干渉し、１０ＭＨｚの強度変調となる。強度変調されたレーザ光によって試料１２の蛍光指示薬が励起され、蛍光が生じる。
【００８０】
この蛍光は可変焦点レンズ４３の中心部の領域で捕らえられて先端光学系４２ｃによって検出用の光ファイバ３２ｃに導かれる。ファイバ３２ｃに導かれた蛍光から、検出器３６内部の図示しない蛍光フィルタによって所望の蛍光波長のみが検出される。
【００８１】
光検出器３６の出力信号はバンドパスフィルタ３７に送られ、変調周波数１０ＭＨｚ近傍の周波数のみが抽出される。さらに信号はコントローラ１８へ導かれる。また、コントローラは可変焦点レンズ４３をたとえば１０ｋＨｚで駆動し、インナーシースをたとえば１０Ｈｚで回転させる。
【００８２】
この結果、焦点は１０ｋＨｚで深さ方向に走査されるとともに、回転方向には１０Ｈｚで走査される。
【００８３】
検出された信号は、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応した画像データが作成される。この画像データは画像として表示モニタ３９上に表示されるとともに、コントローラ３８内部のメモリに記憶される。
【００８４】
このように、本実施例の顕微鏡装置３０では、焦点の交差領域のみで変調した光の干渉を発生させて位相変調を強度変調に変換するが、焦点の領域のみの蛍光がこの周波数成分を有する。
【００８５】
バンドパスフィルタ３７でこの周波数成分のみを抽出することで、焦点領域の蛍光情報をＳＮ比よく検出でき、生体の深部の蛍光情報も得ることができる。
【００８６】
さらに、励起光の光路と蛍光を回収する光路が分離されているため、励起光の光路中にある蛍光物質が蛍光を発生しても検出器で検出されることはなく、ノイズ成分が低くなることからＳＮ比よく観察が行える。
【００８７】
また、対物レンズとして高速な可変焦点レンズを用いたので高速な深さ方向走査が可能である。
【００８８】
また、可変焦点レンズを１方向に長い扁平形状に構成し、その長手方向外周付近に励起用の二つの光を通すため、１方向だけではあるが強度変調を起こす焦点領域をほぼ回折限界まで小さくできる。
【００８９】
また、可変焦点レンズを１方向に長い扁平形状に構成できることから、プローブを細径にすることができる。
【００９０】
以上説明したように、本発明によれば、従来の装置よりもさらに深部からの観察情報を得ることができ、生体深部の観察に適した顕微鏡装置が実現できる。
【符号の説明】
【００９１】
１  顕微鏡装置
２  レーザ光源
３  変調装置
４  ダイクロイックミラー
５  走査光学ユニット
６  瞳投影レンズ
７  偏向ミラー
８  結像レンズ
９  対物レンズ
１０  焦点位置
１１  ステージ
１２  試料
１３  フィルタ
１４  レンズ
１５  ピンホール部材
１６  検出器
１７  コントローラ
１８  表示モニタ
【図１】
2016105126.tif 000003
【図２】
2016105126.tif 000004
【図３】
2016105126.tif 000005
【図４】
2016105126.tif 000006
【図５】
2016105126.tif 000007
【図６】
2016105126.tif 000008
【図７】
2016105126.tif 000009
【図８】
2016105126.tif 000010
【図９】
2016105126.tif 000011