(57)【要約】【課題】簡便かつ安定した方法で細胞培養を行うことができる細胞培養デバイス、並びにこれを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法を提供する。【解決手段】細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイス。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイス。
【請求項２】
前記細胞培養部は気体不透過性である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項３】
前記細胞培養部は流路を有する、請求項１又は請求項２に記載の細胞培養デバイス。
【請求項４】
前記細胞培養部は層流条件で培養液を送液可能な構造を有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
【請求項５】
前記細胞培養部はレイノルズ数が１０以下となる条件で培養液を送液可能な構造を有する、請求項１〜請求項４に記載の細胞培養デバイス。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のデバイスと、前記培養液収容部から前記細胞培養部への前記培養液の送液を制御する送液制御部、前記培養液収容部の温度を管理する温度管理部、前記細胞培養部の内部を観察する観察部、及び前記細胞培養部から排出された培養液を回収する培養液回収部からなる群より選択される少なくとも１つと、を含む細胞培養装置。
【請求項７】
細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイスの前記細胞培養部に細胞を播種する播種工程と、前記細胞培養部に前記培養液収容部から前記培養液を継続的に供給して培養を行う培養工程と、を含む、細胞培養方法。
【請求項８】
前記細胞培養部は気体不透過性である、請求項７に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記細胞培養部は流路を有する、請求項７又は請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
前記培養液は前記細胞培養部において層流条件で送液される、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
前記培養液は前記細胞培養部においてレイノルズ数が１０以下となる条件で送液される、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養デバイス、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞の培養は、培地のｐＨを重炭酸バッファーで緩衝するために雰囲気中の炭酸ガス濃度を５％程度に調整する必要がある。また、培養を大気圧条件下で行うとその酸素濃度が生体内と比べて著しく高いために、培養細胞の生理的機能に影響を与えることが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。そこで、細胞と培地を入れた容器を二酸化炭素、酸素等の濃度が培養に適した条件となるように制御されたインキュベーター内に格納して培養する方法が広く行われている。この方法では、培養した細胞によって消費された分の酸素をインキュベーター内雰囲気から供給したり、産生した二酸化炭素を排出したりするために、気体透過性を有する材質からなる容器が一般に用いられている。
【０００３】
一方、インキュベーターを用いることなく細胞培養を行うことのできるデバイスが提案されている（例えば、特許文献４及び５参照）。
【０００４】
特許文献４には、密閉状態の細胞培養容器内に雰囲気調整剤を入れ、これから放出される炭酸ガスによって容器内を培養に適した条件に制御するデバイスが記載されている。
【０００５】
特許文献５には、気体透過性のある膜を利用して、細胞と培地を密閉した状態に維持することで気体分圧が所望の状態に保たれるデバイスが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５２９３２９号公報
【特許文献２】特表２００２−５３００６７号公報
【特許文献３】特開２００３−１２５７８７号公報
【特許文献４】特開２００９−９５３１５号公報
【特許文献５】特表平１０−５０４７１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献４に記載のデバイスでは、長時間にわたって容器内の環境を制御することは困難である。特許文献５に記載のデバイスも、細胞培養に適した気体分圧条件を作り出すために、気体透過膜により隔てられた透析用チャンバー内の雰囲気を制御する機材が必要である。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑み、簡便かつ安定した方法で細胞培養を行うことができる細胞培養デバイス、並びにこれを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための手段には、以下の実施態様が含まれる。
【００１０】
＜１＞細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイス。
＜２＞前記細胞培養部は気体不透過性である、＜１＞に記載の細胞培養デバイス。
＜３＞前記細胞培養部は流路を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養デバイス。
＜４＞前記細胞培養部は層流条件で培養液を送液可能な構造を有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
＜５＞前記細胞培養部はレイノルズ数が１０以下となる条件で培養液を送液可能な構造を有する、＜１＞〜＜４＞に記載の細胞培養デバイス。
＜６＞＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のデバイスと、前記培養液収容部から前記細胞培養部への前記培養液の送液を制御する送液制御部、前記培養液収容部の温度を管理する温度管理部、前記細胞培養部の内部を観察する観察部、及び前記細胞培養部から排出された培養液を回収する培養液回収部からなる群より選択される少なくとも１つと、を含む細胞培養装置。
＜７＞細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイスの前記細胞培養部に細胞を播種する播種工程と、前記細胞培養部に前記培養液収容部から前記培養液を継続的に供給して培養を行う培養工程と、を含む、細胞培養方法。
＜８＞前記細胞培養部は気体不透過性である、＜７＞に記載の細胞培養方法。
＜９＞前記細胞培養部は流路を有する、＜７＞又は＜８＞に記載の細胞培養方法。
＜１０＞前記培養液は前記細胞培養部において層流条件で送液される、＜７＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
＜１１＞前記培養液は前記細胞培養部においてレイノルズ数が１０以下となる条件で送液される、＜７＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡便かつ安定した方法で細胞培養を行うことができる細胞培養デバイス、並びにこれを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施態様に係る細胞培養装置の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１４】
＜細胞培養デバイス＞
上記実施態様の細胞培養デバイスは、細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む。当該構成を有する細胞培養デバイスは、インキュベーター内部との気体交換によって培養環境を制御する従来の細胞培養デバイスと異なり、細胞培養部に培養液収容部から供給される培養液の条件によって培養環境を制御する。従って、細胞培養デバイス外部の環境を制御する必要がなく、大気環境中でも細胞培養を行うことができる。
【００１５】
細胞培養デバイスは、それぞれ別個に形成された細胞培養部と培養液収容部との組み合わせであっても、細胞培養部と培養液収容部とが一体的に形成された構造を有していてもよい。また、細胞培養部と培養液収容部とが直接に接続していても、ポンプ、バルブ等の別の部材を介して接続していてもよい。
【００１６】
細胞培養デバイスの取り扱い性の観点からは、細胞培養部と培養液収容部とが、互いの位置関係を変更可能な状態で接続されていることが好ましい。例えば、細胞培養部と培養液収容部とが可とう性を有するチューブ等を介して接続されていることが好ましい。
【００１７】
細胞培養部と培養液収容部とは、分離可能であっても、分離不可能であってもよい。細胞培養部と培養液収容部とが分離可能である場合、細胞培養部と培養液収容部とが接続していない状態ではそれぞれが密閉性を有し、細胞培養部と培養液収容部とが接続された状態では相互に連通する構造であることが好ましい。また、細胞培養部と培養液収容部とが分離可能である場合、細胞培養部と培養液収容部とが分離した状態の細胞培養デバイスも本実施態様の細胞培養デバイスに含まれる。
【００１８】
細胞培養部と培養液収容部とは、いずれか一方又は両方が使い捨てであっても、再利用可能であってもよい。細胞培養部又は培養液収容部が複数の部材からなる場合は、その全部又は一部が使い捨てであっても、再利用可能であってもよい。
【００１９】
外部環境の影響を受けずに培養を行う観点からは、細胞培養デバイスは少なくとも細胞培養部が気体不透過性であることが好ましく、細胞培養デバイス全体が気体不透過性であることが好ましい。本明細書において「気体不透過性」には、完全に気体を透過しない状態のみならず、本発明の目的の達成が阻害されない範囲内において気体を透過しうる状態も含まれる。
【００２０】
具体的には、例えば、細胞培養デバイス又は細胞培養部の気体透過性が１００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であることが好ましく、１０ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であることがより好ましく、１ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であることが更に好ましい。
【００２１】
細胞培養デバイス又は細胞培養部を気体不透過性にする方法は特に制限されない。例えば、細胞培養デバイス又は細胞培養部の材質、厚み等を選択することによって細胞培養デバイス又は細胞培養部そのものを気体不透過性にしてもよく、細胞培養デバイス又は細胞培養部を気体不透過性の容器に入れる、気体不透過性の膜で覆う等の方法で気体不透過性にしてもよい。
【００２２】
（細胞培養部）
細胞培養部の形状、材質、大きさ等は特に制限されず、用途等に応じて選択できる。細胞培養部の形状としては、例えば、蓋付容器状、密閉容器状、バッグ状等が挙げられる。細胞培養部は、内部の構造が流路状、中空糸状等であってもよく、単なる空間であってもよい。細胞培養部は可とう性を有していても、可とう性を有していなくてもよい。また、細胞培養部は１つの培養空間を有していても、複数の培養空間を有していてもよい。
【００２３】
細胞培養部の材質としては、樹脂、ガラス、金属、セラミックス、これらの材質の組み合わせ等が挙げられる。樹脂として具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ナイロン、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられる。金属として具体的には、鉄、銅、ニッケル、チタン等が挙げられる。セラミックスとして具体的には、アルミナ、チタニア、ハイドロキシアパタイト、ジルコニア、炭化ケイ素等が挙げられる。
【００２４】
細胞培養部の大きさとしては、例えば、底面積を１０ｍｍ２〜５００００ｍｍ２、高さを０．５ｍｍ〜２００ｍｍとすることができる。
【００２５】
細胞培養部内の細胞のそれぞれに均一に培養液を供給し、均一な条件で培養を行う観点からは、細胞培養部は流路を有していることが好ましい。流路の配置は特に制限されず、用途等に応じて選択できる。例えば、細胞培養部の内部に一本の流路が配置され、その一端から培養液が供給されて他端から排出されるようにしてもよく、複数の流路が配置されてそれぞれに培養液が供給され、排出されるようにしてもよい。細胞培養部が流路を有している場合、例えば、流路内に所定の間隔で細胞を播種し、培養液を一定の方向に送液しながら培養を行うことで、細胞培養部内の播種位置によって細胞が接触する培養液の成分等が異なるのが抑制できる。
【００２６】
細胞培養部内の細胞のそれぞれに均一に培養液を供給し、均一な条件で培養を行う観点からは、細胞培養部は、層流条件で培養液を送液可能な構造を有していることが好ましい。本明細書において「層流条件」とは、培養液の流れが層流となる条件を意味する。具体的には、例えば、レイノルズ数（Ｒｅ）が１０以下である条件で培養液を送液可能な構造を有していることがより好ましく、１以下である条件で培養液を送液可能な構造を有していることが更に好ましい。
【００２７】
レイノルズ数は、下記式で与えられる無次元数であり、Ｒｅ＜２３２０であると層流である（乱流が発生しない）とされている。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
式中、ρは流体の密度（ｋｇ／ｍ３）であり、υ（ｍ／ｓ）は管断面内平均速度であり、ｄ（ｍ）は管内径であり、μ（ｋｇ／ｍｓ）は流体の粘性係数であり、ν（ｍ２／ｓ）は流体の動粘性係数を示す。
【００３０】
上記式において、培養液の密度及び粘性係数が定数であると仮定すると、Ｒｅの値は培養液が通過する管の内径と培養液の供給速度に依存して定まる。従って、例えば、細胞培養部内に流路を設け、流路の内径の大きさと流路内に送液される培養液の流速とを適切に選択することによって、細胞培養部内に層流条件で培養液を送液することができる。
【００３１】
細胞培養部が流路を有している場合、その内径は特に制限されないが、例えば０．１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲内とすることができ、１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内であることが好ましく、５ｍｍ〜５０ｍｍの範囲内であることがより好ましい。流路の断面（送液方向に対して垂直な方向に流路を切断したときの断面）の形状は特に制限されないが、長方形であることが好ましい。流路の断面が長方形である場合の管内径ｄは、当該長方形における重力方向に対して垂直な辺の長さである。
【００３２】
細胞培養部は、その少なくとも一部が透明であることが好ましい。細胞培養部の少なくとも一部が透明であることで、細胞培養部の内部を観察できる。本明細書において「透明」には、完全に可視光を透過する状態のみならず、細胞培養部の内部を観察可能な程度に可視光を透過する状態も含まれる。具体的には、例えば、細胞培養部の全部又は一部の材質を透明な材料から選択することによって細胞培養部の少なくとも一部を透明にすることができる。
【００３３】
（培養液収容部）
培養液収容部の形状、材質、大きさ等は特に制限されず、用途等に応じて選択できる。培養液収容部の形状としては、例えば、蓋付容器状、密閉容器状、バッグ状、シリンジ状等が挙げられる。培養液収容部の材質としては、細胞培養部の材質として例示したもの等が挙げられる。培養液収容部の大きさとしては、例えば、容積を１０００ｍｍ３〜１０００００００ｍｍ３とすることができる。培養液収容部は、細胞の培養に必要な培養液の全量を収容するものであっても、培養中に培養液の減少分を外部から補充するものであってもよい。更には、培養液収容部は、細胞の培養に必要な培養液の全量よりも少ない量を収容し、培養液が所定の量を下回ったときに新しい培養液収容部と交換することができるものであってもよい。培養液収容部は可とう性を有していても、可とう性を有していなくてもよい。また、培養液収容部は、１つの細胞培養部に対して１つであっても、２つ以上であってもよい。
【００３４】
培養液収容部は、内部に収容された培養液を、制御された条件の下で細胞培養部に供給可能な構造を有していることが好ましい。本明細書において「制御された条件」は特に制限されず、例えば、培養液の供給速度、供給間隔、供給温度等が挙げられる。
【００３５】
培養液収容部に収容された培養液を、制御された条件の下で細胞培養部に供給する場合、その方法は特に制限されない。例えば、ポンプ等の動力装置を用いて培養液を供給する方法、培養液収容部を加圧等により変形させて培養液を供給する方法、培養液収容部を細胞培養部よりも高い場所に置いて重力によって培養液を供給する方法、培養液収容部を回転することで得られる遠心力によって培養液を供給する方法等が挙げられる。
【００３６】
培養条件を安定して管理する観点からは、培養液収容部から培養液が継続的に細胞培養部に供給されることが好ましい。本明細書において「継続的」とは、培養液の供給が一定時間継続することを意味し、供給速度が変化しない場合のみならず、供給速度が規則的に又は不規則に変化する場合も含まれる。
【００３７】
培養液収容部から細胞培養部に供給された培養液は、使用後に排出される。細胞培養部から培養液を排出する方法は特に制限されない。例えば、細胞培養部に排出口を設け、培養液回収部を排出口に接続して行うことができる。細胞を常に新しい培養液に接触させる観点からは、細胞培養部内の培養液が順次交換されるように供給及び排出の状態を制御することが好ましい。排出された培養液は廃棄しても、その全部又は一部を培養液収容部に循環させて細胞培養部に再度供給してもよいが、培養条件を一定に維持する観点からは廃棄することが好ましい。
【００３８】
＜細胞培養装置＞
上記実施態様の細胞培養装置は、上述した細胞培養デバイスと、必要に応じて含まれるその他の部材とを含む。その他の部材は特に制限されず、例えば、細胞培養部への培養液の送液を制御するためのポンプ等の送液制御部、細胞の培養温度を管理するためのホットプレート等の温度管理部、細胞培養部の内部を観察するための観察部、細胞培養部から排出された培養液を回収するための培養液回収部等が挙げられる。
【００３９】
図１は本実施態様の細胞培養装置の一例を示す概略図である。図１では、培養液収容部１はチューブ２及び送液制御部としてのポンプ３を介して細胞培養部４に接続している。細胞培養部４の底部には温度調節部としてのホットプレート５が配置されている。さらに、細胞培養部４の下方には、細胞培養部４の内部を観察するための観察部６が設けられている。さらに、細胞培養部４には、使用済みの培養液を回収するための培養液回収部７が接続されている。細胞培養装置は図１の構成に何ら制限されず、上述した部材の全部又は一部を省略してもよく、必要に応じてその他の部材を備えてもよい。
【００４０】
＜細胞培養方法＞
上記実施態様の細胞培養方法は、細胞培養部と、前記細胞培養部に供給される培養液を収容する培養液収容部と、を含む細胞培養デバイスの前記細胞培養部に細胞を播種する播種工程と、前記細胞培養部に前記培養液収容部から前記培養液を継続的に供給して培養を行う培養工程と、を有する。
【００４１】
上記方法では、インキュベーター内部との気体交換によって培養環境を制御する従来の細胞培養方法と異なり、培養液収容部から細胞培養部に継続的に供給される培養液によって培養環境を制御する。従って、細胞培養デバイスの外部の環境を制御する必要がなく、大気環境中でも安定した条件の下で細胞培養を行うことができる。上記方法で使用される細胞培養デバイスの詳細及び好ましい態様は、上述した細胞培養デバイスの詳細及び好ましい態様と同様である。また上記方法では、上述した細胞培養装置を用いてもよい。
【００４２】
培養液は、細胞培養部に供給する前にあらかじめ酸素、二酸化炭素、栄養分等の濃度が所望の値に調節されていることが好ましい。具体的には、例えば、培養細胞による酸素、栄養成分等の消費状態、二酸化炭素、代謝物、指標となるタンパク質等の産生状態、所望の増殖速度、細胞形態等に応じて設定できる。
【００４３】
細胞培養部内の細胞に均一に培養液を供給し、均一な条件で培養を行う観点からは、培養液を層流条件で送液することが好ましく、レイノルズ数（Ｒｅ）が１０以下である条件で培養液を送液することよりが好ましく、１以下である条件で培養液を送液することが更に好ましい。Ｒｅの値は培養液が通過する管の内径と培養液の供給速度に依存して定まる。従って、例えば、細胞培養部内に流路が設けられた細胞培養デバイスを使用し、流路の内径の大きさと流路内に送液される培養液の流速とを適切に選択することによって、層流条件で培養液を送液することができる。
【００４４】
上記方法で培養される細胞の種類は、特に制限されない。中でも、低酸素濃度等の人為的に制御した環境下で行われる哺乳類細胞の培養に好適である。哺乳類細胞としては、各種多能性幹細胞、分化細胞、組織幹細胞、不死化細胞株、初代培養細胞等が挙げられる。
【００４５】
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞、および培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｍｕｓｅ細胞）等が挙げられるがが、これらに限定されない。多能性幹細胞は、種々の生物に由来するものであってよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物由来の多能性幹細胞であり、より好ましくは、マウス由来の多能性幹細胞や霊長類由来の多能性幹細胞である。特に好ましくは、ヒト由来の多能性幹細胞である。
【００４６】
培養工程で供給される培養液の種類は特に制限されず、培養する細胞の種類に応じて選択することができる。例えば、ＥＳ細胞を培養するための培養液としては、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン酸、２０％の血清代替物、及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）を補充したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ−１２培養液が使用される。また、不死化細胞株のための培養液としては、１０％以上１５％以下のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＤＭＥ培養液が用いられる。また、市販の培養液（マウスＥＳ細胞培養用培養液、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液）、無血清培地などが含まれる。
【符号の説明】
【００４７】
１  培養液収容部
２  チューブ
３  ポンプ
４  細胞培養部
５  ホットプレート
６  観察用窓
７  培養液回収部
【図１】
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