(57)【要約】【課題】ドーパミン受容体作用物質の簡便且つ効率的なスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞を提供すること。【解決手段】（ａ）ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに（ｂ）ｃＡＭＰ応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域１、及びポリヌクレオチド領域１の３’末端側に配置された分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド領域２を有するポリヌクレオチドが導入された細胞を使用することにより、ドーパミン受容体作用物質を簡便且つ効率的にスクリーニングできる【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリヌクレオチド（ａ）並びに下記ポリヌクレオチド（ｂ）を含むことを特徴とする細胞： 
（ａ）ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
（ｂ）ｃＡＭＰ応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域１、及びポリヌクレオチド領域１の３’末端側に配置された分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド領域２を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド（ａ）が無脊椎動物特異的ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項３】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を含む哺乳類動物細胞である、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記分泌型レポータータンパク質が分泌性胎盤アルカリホスファターゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を含むＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
下記工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法：
（ア）請求項１〜５のいずれかに記載の細胞を被検物質と接触させる工程、
（イ）工程（ア）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程、及び
（ウ）被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をドーパミン受容体作用物質として選択する工程。
【請求項７】
前記工程（ア）における接触時間が８時間未満である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ウ）が、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をドーパミン受容体アゴニストとして選択する工程である、
請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ア）が、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞を、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程であり、
前記工程（イ）が、工程（ア）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程であり、
前記工程（ウ）が、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をドーパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である、
請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン受容体、特に無脊椎動物特異的ドーパミン受容体へ作用する物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミンは、広く生物に存在する生体アミンの１種である。ドーパミンがその受容体であるドーパミン受容体に結合すると、Ｇタンパク質が活性化され、様々な細胞内情報が調節される。例えば、Ｇｓタンパク質が活性化されると、アデニル酸シクラーゼが活性化され、細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇とプロテインキナーゼＡの活性化が起こる。これにより様々なタンパク質のリン酸化が惹起され、あるいは遺伝子転写が調節され、その結果として神経系の情報伝達が調節される。この調節機構を撹乱することにより昆虫の摂食や生育が制御されるので、ドーパミン受容体は殺虫剤又は害虫制御剤の標的となる。そこで、害虫選択的殺虫剤又は制御剤を創製するためには、ドーパミン受容体作用物質（アゴニスト、アンタゴニスト等）をスクリーニングする方法の開発が不可欠となる。
【０００３】
殺虫剤又は害虫制御剤創製を目的として、神経系の情報伝達を調節する物質をスクリーニングする方法は各種知られている。例えば、神経伝達物質の受容体タンパク質と殺虫剤又は害虫制御剤候補物質との結合実験を行い、その結合性を評価することによりスクリーニングする方法や、神経伝達物質の受容体の安定発現細胞株に、殺虫剤又は害虫制御剤候補物質を作用させ、電流応答に及ぼす影響をパッチクランプ法で解析することによりスクリーニングする方法が知られている（特許文献１）
しかしながら、これら従来のスクリーニング方法は、細胞の破砕、標的タンパク質を含む膜画分の調製、放射性物質の使用、又は熟練を要するアッセイ系が必要である等の事情から、操作が複雑であり、多検体を迅速に処理することには向かないものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】Vincenzina RealeらThe expression of a cloned Drosophila octopaminertyramine receptor in  Xenopus oocytes  Brain Research 769 _1997. 309-320
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ドーパミン受容体作用物質の簡便且つ効率的なスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、
ポリヌクレオチド（ａ）：ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
ポリヌクレオチド（ｂ）：ｃＡＭＰ応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域１、及びポリヌクレオチド領域１の３’末端側に配置された分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド領域２を有するポリヌクレオチド
を含むた細胞を使用することにより、ドーパミン受容体作用物質を簡便且つ効率的にスクリーニングできることを見出した。
【０００７】
このスクリーニング方法の原理は以下の通りである。ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を含む細胞を被検物質と接触させた場合、該被検物質がドーパミン受容体に作用する物質であれば、該接触により、ポリヌクレオチド（ａ）から発現されたドーパミン受容体を介して、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化が起こる。そして、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は、ポリヌクレオチド（ｂ）中の、ｃＡＭＰエレメントを有し且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域１によって感知され、ポリヌクレオチド領域２にコードされる分泌型レポータータンパク質の発現を変化させる。こうして、被検物質がドーパミン受容体に与える作用は、分泌型レポータータンパク質の発現量の変化として表れる。従って、細胞を被検物質と接触させた場合の分泌型レポータータンパク質の量と、細胞を被検物質と接触させない場合の分泌型レポータータンパク質の量を比較することにより、被検物質がドーパミン受容体作用物質か否かを判定し、ドーパミン受容体作用物質をスクリーニングすることができる。
【０００８】
また、本発明者等は、当初、細胞と被検物質との接触時間を長くすることで、分泌型レポータータンパク質の検出量を高めることを検討した。ところが、全くの予想外なことに、接触時間を長くすると、本来であれば被検物質の濃度依存的に分泌型レポータータンパク質量が増加していくはずであるところ、被検物質が高濃度の場合には逆に減少してしまうという問題を見出した。本発明のスクリーニング方法においてこのような問題が生じてしまうと、ドーパミン受容体への作用を本来有する物質をスクリーニングできない、或いはその逆の結果に繋がるので、本発明のスクリーニング方法の精度が低下してしまう。このため、よりスクリーニング精度を高めるという観点からは、細胞と被検物質との接触時間はより短い方が好ましい。
【０００９】
上記知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１１】
項１．  下記ポリヌクレオチド（ａ）並びに下記ポリヌクレオチド（ｂ）を含むことを特徴とする細胞： 
（ａ）ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
（ｂ）ｃＡＭＰ応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域１、及びポリヌクレオチド領域１の３’末端側に配置された分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド領域２を有するポリヌクレオチド。
【００１２】
項２．  前記ポリヌクレオチド（ａ）が無脊椎動物特異的ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである、項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【００１３】
項３．  ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を含む哺乳類動物細胞である、項１又は２に記載の細胞。
【００１４】
項４．  前記レポータータンパク質が分泌性胎盤アルカリホスファターゼである、項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【００１５】
項５．  ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を含むＨＥＫ‐２９３細胞である、項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【００１６】
項６．  下記工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法：
（ア）項１〜５のいずれかに記載の細胞を被検物質と接触させる工程、
（イ）工程（ア）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程、及び
（ウ）被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をドーパミン受容体作用物質として選択する工程。
【００１７】
項７．  前記工程（ア）における接触時間が８時間未満である、項６に記載のスクリーニング方法。
【００１８】
項８．  ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ウ）が、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をドーパミン受容体アゴニストとして選択する工程である、
項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【００１９】
項９．  ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ア）が、項１〜５のいずれかに記載の細胞を、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程であり、
前記工程（イ）が、工程（ア）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程であり、
前記工程（ウ）が、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をドーパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である、
項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ドーパミン受容体アゴニスト又はアンタゴニスト等の作用物質を、多検体の被検物質から簡便且つ迅速にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のスクリーニング方法で測定された、被検物質のアゴニスト活性を示す（実施例３−１）。
【図２】本発明のスクリーニング方法で測定された、被検物質のアゴニスト活性を示す（実施例３−２）。
【図３】本発明のスクリーニング方法で測定された、被検物質のアンタゴニスト活性を示す（実施例３−３）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．本発明の細胞
本発明の細胞は、ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を含むことを特徴とする細胞である。
【００２３】
ポリヌクレオチド（ａ）は、ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ａ）は、ドーパミン受容体タンパク質が発現可能な状態で、細胞に含まれる。発現可能な状態とは、ポリヌクレオチド（ａ）が、細胞において、適切な転写調節領域、具体的には適切なプロモーターの制御下に配置された状態である。適切なプロモーターとしては、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を含む細胞においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されず、公知のプロモーターを使用することができる。例えば、哺乳類動物細胞である場合は、CMVプロモーターやSV40プロモーター等のウィルス性のプロモーター、EF-1αプロモーター、UbCプロモーター等を使用することができる。
【００２４】
ポリヌクレオチド（ａ）にコードされるドーパミン受容体タンパク質は、種々の生物由来のものを使用することができ、特に限定されない。例えば、哺乳類等の脊椎動物由来のドーパミン受容体タンパク質、昆虫等の無脊椎動物由来のドーパミン受容体タンパク質等を採用できる。殺虫剤又は害虫制御剤創製を目的とする場合は、これらの中でも無脊椎動物由来のドーパミン受容体タンパク質が好ましく、無脊椎動物特異的ドーパミン受容体タンパク質がより好ましい。無脊椎動物としては、カイコ、ショウジョウバエ、ミツバチ、ゴキブリ、バッタ、ハマダラカ、又はコクヌストモドキ等を挙げることができる。
【００２５】
無脊椎動物特異的ドーパミン受容体タンパク質は、無脊椎動物に特異的存在するタイプのドーパミン受容体タンパク質である限り特に限定されない。このようなタイプのものは、例えば文献1（Insect Biochem Mol Biol. 39 (5-6), 342-7, 2009.）、文献2（Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 59, 103-117, 2005.）等に記載されている。具体的には、カイコ（Bombyx mori）のDopR2（配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のDAMB（配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）のDOP2（配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられ、これらの中でも好ましくはカイコ（Bombyx mori）のDopR2が挙げられる。
【００２６】
配列番号１、２、又は３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ドーパミンの結合によって細胞内cAMP量の増加を引き起こす機能を損なわない限りにおいて、そのアミノ酸配列における１又は複数個、好ましくは１又は２〜２０個、より好ましくは１又は２〜８個、さらに好ましくは１又は２〜５個、特に好ましくは１又は２〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されたものであってもよい。アミノ酸が置換、欠失、又は挿入する部位としては、ドーパミン受容体タンパク質上の、公知の機能ドメイン以外の部位が好ましい。ドーパミン受容体の公知の機能ドメインは、公知のデータベース、例えばNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等のデータベースから公知の検索方法により調べることができる。また、ドーパミン受容体の機能を損なわない限り、アミノ酸が置換、欠失、又は挿入する部位は、公知の機能ドメイン上の部位でもよい。なお、ドーパミンの結合によって細胞内cAMP量の増加を引き起こす機能の有無は、後述する本発明のスクリーニング方法において、被検物質としてドーパミンを用いることにより、簡便に判定することができる。
【００２７】
ポリヌクレオチド（ｂ）は、ポリヌクレオチド領域１、及びポリヌクレオチド領域２を有するポリヌクレオチドである。
【００２８】
ポリヌクレオチド領域１は、ｃＡＭＰ応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域である。
【００２９】
ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）とは、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）が結合し、該エレメントの下流にコードされる遺伝子の発現を活性化できるエレメントである。このような機能を有する限りｃＡＭＰ応答エレメントの由来は特に限定されず、上記機能に影響を与えないことが知られている、公知の変異を有していてもよい。
【００３０】
プロモーター機能を有するとは、ポリヌクレオチド領域１の３’側に配置されるポリヌクレオチド領域２にコードされる分泌型レポータータンパク質を発現する機能を有することを示す。例えば、RNAポリメラーゼが結合して転写を開始することができるために必要な公知の最小プロモーター領域、具体例としてはTATA-likeプロモーター（TAL）を有していることを示す。
【００３１】
ポリヌクレオチド領域２は、ポリヌクレオチド領域１の３’側に配置され、且つ分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００３２】
分泌型レポータータンパク質とは、タンパク質として発現後に細胞外に分泌される性質を有し、且つ定量が容易であるタンパク質であり、このような性質を有するものである限り特に限定されず、公知のタンパク質を挙げることができる。分泌型レポータータンパク質の具体例としては、分泌性胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）や、Metridia longa由来の分泌型ルシフェラーゼ等の、酵素活性を測定することにより定量できる酵素タンパク質が挙げられる。
【００３３】
ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）には、その他の配列が含まれていてもよい。例えば、Hisタグ、Mycタグ、HAタグ、GFPタグ等のタンパク質タグをコードする配列又は種々の抗生物質に対する耐性遺伝子を発現することができるように設計された領域が含まれていてもよい。この様な耐性遺伝子が発現できるように設計された領域を含むポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）を用いることにより、ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）を細胞に導入した後、耐性遺伝子が耐性を示す抗生物質含有培地中で細胞を培養することにより、ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）を含む細胞群のみを選択することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチド（ａ）の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、CMVプロモーター等のプロモーターを含み、且つ該プロモーターの３’側に遺伝子のコーディング配列を挿入するマルチクローニングサイトを有する公知の発現ベクターに、ドーパミン受容体タンパク質をコードする配列を適切な制限酵素サイトを介して挿入することにより調製することができる。ドーパミン受容体のタンパク質をコードする配列の配列情報は、種々のデータベース上で公開されており、例えばNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等のデータベースから公知の検索方法によって得ることができる。目的の配列からなるポリヌクレオチドは、公知の方法、例えばPCRやDNA人工合成技術を利用して得ることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチド（ｂ）の調製もポリヌクレオチド（ａ）と同様に行うことができる。分泌型レポータータンパク質をコードする配列は、公知の情報に基づいて決定することができる。また、ポリヌクレオチド（ｂ）としては、市販品を用いても良い。例えば、Clontech社のpCRE-SEAP Vectorなどがそれに該当する。
【００３６】
細胞は、ドーパミン受容体を介したシグナルをｃＡＭＰ濃度の変化に変換する機構を有する細胞である限り限定されない。このような細胞の具体例としては、真核生物細胞を挙げることができ、好ましくは脊椎動物細胞もしくは無脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳類動物細胞、より好ましくはヒト又はげっ歯類の細胞を挙げることができる。また、細胞内在性のアドレナリン受容体に起因するシグナルバックグラウンドをより低減できるという観点から、腎臓細胞、卵巣由来細胞等が好ましく挙げられ、HEK-293細胞、CHO細胞等がより好ましく挙げられる。また、ポリヌクレオチド（ａ）にコードされるドーパミン受容体タンパク質の機能的発現や高発現がより期待できる、すなわち被検物質由来のシグナルをより高感度に検出できるという観点から、腎臓細胞が好ましく挙げられ、HEK-293細胞がより好ましく挙げられる。
【００３７】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）の細胞への導入は、公知の方法を利用して行うことができる。具体例としては、これらのポリヌクレオチドをカチオン性脂質やポリアミン等を基礎とする導入試薬を用いたトランスフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウィルスを利用する方法等が挙げられる。細胞に導入されたポリヌクレオチド（ａ）及び／又はポリヌクレオチド（ｂ）の状態は特に限定されず、例えばプラスミド状態で一過的に細胞内に存在している状態でも、ゲノムに組み込まれた状態で細胞内に安定的に存在している状態でもよい。本発明のスクリーニング方法において、検出感度をより高められるという観点、及び受容体の発現量を一定にする（ひいては実験間のデータの安定性を高める）という観点からは、ポリヌクレオチド（ａ）は、ゲノムに組み込まれた状態で細胞内に安定的に存在していることが好ましい。
【００３８】
上記本発明の細胞を後述のドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法に使用することにより、ドーパミン受容体作用物質を効率的に且つ簡便にスクリーニングすることができる。
【００３９】
２．本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法である。
【００４０】
２‐１．ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法 
ドーパミン受容体作用物質とは、ドーパミン受容体に作用し、ドーパミン受容体の下流のシグナル伝達を調節する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加又は減少をもたらす作用を有する物質である。この限りにおいて、作用物質には、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、スーパーアゴニスト、アロステリックなリガンド等が包含される。ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、ドーパミン受容体作用物質をスクリーニングすることができる。
【００４１】
工程（ア）は、上記「１．本発明の細胞」で説明した、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を含む細胞を、被検物質と接触させる工程である。
【００４２】
被検物質は、ドーパミン受容体作用物質か否かをスクリーニングする対象物質である。被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。
【００４３】
ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を含む細胞を、被検物質と接触させる態様は、細胞膜上に被検物質が接触することができる限り特に限定されない。例えば、細胞を培養している培養液中に被検物質を溶解する態様や、細胞を培養している培養液を、予め被検物質を溶解した培養液に置換する態様が挙げられる。
【００４４】
細胞と被検物質との接触時間の上限は、スクリーニング精度をより高めるという観点からはより短い方が好ましく、例えば８時間未満、好ましくは６時間以下、より好ましくは４時間以下、よりさらに好ましくは２時間以下であることができる。細胞と被検物質との接触時間の下限は、被検物質の作用が、ドーパミン受容体を介してｃＡＭＰ量に変化を起こし得るのに十分な時間であれば特に限定されず、例えば５分以上、好ましくは１５分以上、より好ましくは３０分以上、よりさらに好ましくは１時間以上であることができる。
【００４５】
培養液は、細胞を培養するための培地である。培養液としては、細胞を培養することができる限り特に限定されず、細胞の種類に応じて公知の培地とそれに添加するFBSなどの血清を広く使用することができる。例えば、多種の細胞の培養に適していることが知られているDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）やHam’s F-12培地培地等に、各細胞に適した血清を添加して培養に使用することができる。培養する細胞の種類に応じて、培養液には種々の成分（糖、アミノ酸、塩類、金属成分等）も加えることができ、その濃度も細胞の培養に適している限り特に限定されない。
【００４６】
培養は、細胞の生存に適切な条件下、例えばCO2濃度5％、37℃、湿潤条件下でインキュベーションすることによって行われる。
【００４７】
工程（ア）の後、必要に応じて、被検物質の非存在下で細胞を培養することが好ましい。これにより、ｃＡＭＰ量の変化が分泌型レポータータンパク質量の変化に反映される時間をより確実に確保することができる。被検物質の非存在下で細胞を培養する時間は、特に限定されないが、例えば１〜４８時間、好ましくは６〜３６時間、より好ましくは１８〜３０時間程度であることができる。
【００４８】
工程（イ）は、工程（ア）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程である。
【００４９】
レポーター活性の測定は、分泌型レポータータンパク質の種類によって公知の適切な方法を採用すればよい。例えば、分泌型レポータータンパク質が分泌性胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）である場合は、SEAP測定用キットとして公知のPhospha-Lightシステム（Applied biosystems社）を使用して、又は該キットの原理を利用して、SEAP活性を測定することが出来る。
【００５０】
被検物質と接触させない場合とは、工程（ア）において被検物質と接触させていない以外は、工程（ア）を経て工程（イ）に供する細胞と同じ又は同等の処理をした場合である。この場合のレポーター活性も、上記した被検物質と接触させた場合のレポーター活性と同様に測定することができる。
【００５１】
活性値の比較は、公知の方法で行うことができ、特に限定されない。例えば、活性値が発光の強さとして表れる場合は、目視で発光の強さを判定して比較してもよいし、発光の強さを発光値として測定し、該発光値の大小を比較してもよい。
【００５２】
工程（ウ）は、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をドーパミン受容体作用物質として選択する工程である。
【００５３】
被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違しているか否かの判断は、工程（イ）における比較の結果、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してＰ値を求め、Ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。判断の結果、有意に相違している場合は、被検物質をドーパミン受容体作用物質として選択する。
【００５４】
このように選択されたドーパミン受容体作用物質は、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【００５５】
２‐２．ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法
ドーパミン受容体アゴニストとは、ドーパミン受容体に作用し、ドーパミン受容体の下流のシグナル伝達を活性化する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加をもたらす作用を有する物質である。ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、ドーパミン受容体アゴニストをスクリーニングすることができる。
【００５６】
ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法は、前記した、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含むドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法と同様に行うことができる。但し、ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法においては、前記工程（ウ）が下記工程（エ）である。
【００５７】
工程（エ）は、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をドーパミン受容体アゴニストとして選択する工程である。
【００５８】
被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高いか否かの判断は、工程（ウ）と同様に行うことができる。判断の結果、有意に高い場合は、被検物質をドーパミン受容体アゴニストとして選択する。
【００５９】
このように選択されたドーパミン受容体アゴニストは、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【００６０】
２‐３．ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法
ドーパミン受容体アンタゴニストとは、ドーパミン及び／又はドーパミン受容体アゴニストによって活性化されたドーパミン受容体に作用し、ドーパミン受容体の下流のシグナル伝達を抑制する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の低下をもたらす作用を有する物質である。ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、ドーパミン受容体アンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００６１】
ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法は、前記した、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含むドーパミン受容体作用物質のスクリーニング方法と同様に行うことができる。但し、ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法においては、前記工程（ア）が下記工程（オ）であり、前記工程（イ）が下記工程（カ）であり、前記工程（ウ）が下記工程（キ）である。
【００６２】
工程（オ）は、上記「１．本発明の細胞」で説明した、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞を、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程である。
【００６３】
ドーパミン受容体アゴニストとしては、ドーパミン受容体に作用し、ドーパミン受容体の下流のシグナル伝達を活性化する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加をもたらす作用を有する物質を使用することができる。具体例としては、ドーパミン受容体の内在リガンドであるドーパミン、又は公知のドーパミン受容体アゴニストである6,7-ADTN、アポモルフィン等を使用することができる。また、上記ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法によって選択された被検物質を、ドーパミン受容体アゴニストとして使用することもできる。
【００６４】
培養液中で接触させる場合、培養液中のドーパミン受容体アゴニストの濃度としては、特に限定されるものではないが、例えば、10−1M〜10−10M、好ましくは10−3M〜10−9M、より好ましくは10−5M〜10−7Mが挙げられる。
【００６５】
その他については、工程（ア）と同様である。
【００６６】
工程（カ）は、工程（オ）の後、細胞から分泌された分泌型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程である。
【００６７】
工程（カ）は、工程（イ）と同様に行うことができる。
【００６８】
工程（キ）は、ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をドーパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である。
【００６９】
ドーパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにドーパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低いか否かの判断は、工程（ウ）と同様に行うことができる。判断の結果、有意に低い場合は、被検物質をドーパミン受容体アンタゴニストとして選択する。
【００７０】
このように選択されたドーパミン受容体アンタゴニストは、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【実施例】
【００７１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７２】
実施例１．ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞の作製1
まず、ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ａ）に相当）が導入された細胞を下記のように作製した。
【００７３】
細胞の培養は、10% FBS、100 unit/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM（10％FBS/DMEM）中、37℃5％CO2濃度の雰囲気下で行った。第1日目にヒト胎児腎細胞HEK293を、35mmディッシュに6×105/3mlになるように播種した。第2日目に、カイコドーパミン受容体2タンパク質（BmDopR2）（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドが発現可能な状態で連結されたpcDNA3ベクターを、3μl GeneJuice（登録商標） Transfection Reagent（Merck社）と100μl OPTI-MEM I減血清培地（Life Technologies社）の混合溶液(予めよく混合し室温で5分間インキュベートしたもの)と混ぜ、室温で15分間インキュベートした。該混合物を、第1日目に播種した細胞の培地に、均一に滴下しながら全て加え、ディッシュを軽く揺すった後に、37℃で24時間インキュベーションした。第2日目に、60mmディッシュに細胞を継代し（1枚あたり5ml 10％FBS/DMEM）、G418 50mg/mlを100μl（最終濃度1.0mg/ml）添加し、セレクションを開始した。その後、3〜5日おきに選択培地を交換し、3〜4週間セレクションを行った。このセレクション後に得られた細胞を、ドーパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ａ））が導入された細胞（BmDopR2細胞）とした。
【００７４】
次に、cAMP応答エレメントを有し、且つプロモーター機能を有するポリヌクレオチド領域1、及びポリヌクレオチド領域1の3’末端側に配置された分泌型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド領域2を有するポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ｂ））が導入された細胞を下記のように作製した。
【００７５】
ポリヌクレオチド（ａ）が導入された細胞であるBmDopR2細胞を、10％FBS/DMEM中、37℃/5% CO2濃度下で培養した。その細胞にレポーター遺伝子含有ベクターpCRE-SEAP（cAMP応答エレメントを有するプロモーターの制御下に分泌性胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）を連結したベクター）を一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションは、上記同様、GeneJuice Transfection Reagent(Merck社)を用いて行った。トランスフェクションから1日後の細胞を、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞（BmDopR2(stable)-pCRESEAP細胞）とした。
【００７６】
実施例２．ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞の作製2
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を同時に一過的にトランスフェクションする以外は、実施例１と同様に細胞を作製した。得られた細胞を、BmDopR2(transient)-pCRESEAP細胞とした。
【００７７】
実施例３．BmDopR-pCREseap細胞を用いた、ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング
ドーパミン受容体作用物質のスクリーニング例として、下記実施例３‐１、及び実施例３−２に、ドーパミン受容体アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング例を示す。
【００７８】
実施例３‐１．ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング1
ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞であるBmDopR2(stable)-pCREseap細胞を、96穴培養プレートに、2×104/ウェル、150μl/ウェルとなるように播種し、1日培養した。一方で、被検物質としてドーパミンや公知のドーパミン受容体アゴニストの他、評価したい物質群を、DMSOに溶解し、該溶解液を、被検物質濃度10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、又は10−4M、及びDMSO濃度1％となるように無血清培地に添加してアゴニスト培地を作製した。播種後1日経過した細胞の培地を捨て、上記アゴニスト培地150μl（/1ウェル）に置換し、4時間培養した。アゴニスト培地を除去し、1×DPBS 150μlで細胞の洗浄を行い、無血清DMEM 150μlを各ウェルに加え、CO2インキュベーター（37℃、5％CO2）で１日培養した。その上清のSEAP活性を、Phospha-Light System（Applied Biosystems社）を用いて測定した。具体的には、1×Dilution Buffer 25μl（/1ウェル）を加えた白色96穴プレートの各ウェルに、培養上清25μlを加え、培地を希釈した。その後、該溶液50μl（/1ウェル）に対して、Assay Buffer 50μl（/1ウェル）を加え、室温で5分間インキュベートした。その後、Reaction Bufferを50μl（/1ウェル）加え、室温で10分間インキュベートした。各ウェルの発光量をWallac 1420 ARVOsxマルチラベルカウンタを用いて1秒/ウェルで測定することにより、SEAP活性を測定した。
【００７９】
上記SEAP活性の測定を4回行った平均値±SEを図１に示す。図１中、横軸は、被検物質濃度を示し、縦軸は相対発光量を示す。ポジティブコントロールとして、アデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリン（Forskolin）を用いた。相対発光量とは、アゴニスト培地の代わりにドーパミンを含まない無血清培地（コントロール）を使用した場合に測定された発光量（図１中「Ba」: Basal level）を1とした時の相対値である。
【００８０】
図１の結果より、被検物質としてリガンドであるドーパミンを使用した場合、ドーパミン濃度10−6〜10−4Mにおいて、Ba値に比べて、濃度依存的に発光量が有意に増加しているのが見られた。このことより、本発明のスクリーニング方法は、ドーパミン受容体のリガンドによるシグナル伝達を検出できることが示された。このことより、本発明のスクリーニング方法は、ドーパミン受容体を介したアゴニストによるシグナル伝達を、正確に、かつ一定程度定量的に検出できることが示された。
【００８１】
実施例３−２．ドーパミン受容体アゴニストのスクリーニング2
BmDopR2(stable)-pCREseap細胞に替えてBmDopR2(transient)-pCRESEAP細胞を用い、アゴニスト培地中での培養時間を1時間とする以外は、実施例３−１と同様に行った。結果を図２に示す。
【００８２】
図２の結果より、アゴニスト培地中での培養時間が1時間の場合でも、ドーパミン受容体のリガンドによるシグナル伝達を検出できることが示された。
【００８３】
実施例３−３．ドーパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング
アゴニスト培地の代わりに、アンタゴニスト培地（リガンドであるドーパミンをDMSOに溶解した溶液をドーパミン濃度10−6Mになるように無血清培地に添加し、さらに被検物質として公知のドーパミン受容体アンタゴニストであるフルペンチキソールおよびクロルプロマジンの他、評価したい物質群をDMSOに溶解した溶液を、被検物質濃度10−9、10−8、10−7、10−6、又は10−5Mになるように無血清培地に添加して、DMSOの濃度を1％に調整した培地）を使用する以外は、実施例３‐１と同様に行った。
【００８４】
SEAP活性の測定を4回行った平均値±SEを図３に示す。図３中、横軸は、使用したアンタゴニスト培地中のクロルプロマジン、又はヨヒンビンの濃度を示し、縦軸は相対発光量を示す。相対発光量とは、アンタゴニスト培地の代わりにコントロール培地１（ドーパミンを濃度10−6Mになるように添加し、DMSO濃度を1％に調整した無血清培地）を使用した場合の発光量から、アンタゴニスト培地の代わりにコントロール培地２（ドーパミン及び被検物質を含まない、DMSO濃度を1％に調整した無血清培地）を使用した場合の発光量を引いた発光量（図3中「DA」）を100％とした値である。
【００８５】
図３の結果より、ドーパミンと共に、クロルプロマジン又はヨヒンビンを共存させると、クロルプロマジン又はヨヒンビンの濃度依存的に発光量が減少することが示された。このことより、本発明のスクリーニング方法は、ドーパミン受容体に対するアンタゴニストの作用、すなわちリガンドによるシグナル伝達の阻害作用を検出できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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