(57)【要約】【課題】多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成するための技術を提供すること。【解決手段】本発明は、哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、Wntシグナル阻害剤、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法を提供する。本発明の製造方法により得られた栄養膜外胚葉様胞状構造体内に多能性幹細胞を注入し、注入した多能性幹細胞を内包する該構造体を偽妊娠非ヒト哺乳動物の子宮内に移植すると、着床し、胚発生が生じる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法。
【請求項２】
培地が更にWntシグナル阻害剤を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
培地が更にヘパリンを含む、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
培地が更にROCK阻害剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
培地が、基底膜調製物のゲル成分を含まない、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、単一細胞又は２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊に分散されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することにより樹立されたものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法により製造された、栄養膜外胚葉様胞状構造体。
【請求項９】
哺乳動物栄養膜幹細胞及び当該栄養膜幹細胞に由来する栄養膜系列細胞からなる、請求項８記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
【請求項１０】
哺乳動物多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する、請求項８又は９記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
【請求項１１】
哺乳動物多能性幹細胞を、請求項８〜１０のいずれか１項記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法。
【請求項１２】
注入した哺乳動物多能性幹細胞又は当該多能性可能性幹細胞に由来する細胞を含む栄養膜外胚葉様胞状構造体を哺乳動物の子宮内に移植し、当該子宮に着床させることを更に含む、請求項１１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養膜外胚葉様構造体及びその製造方法に関する。また、本発明は、当該栄養膜外胚葉様構造体を利用した胚の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物において、胎盤は、子宮における胎仔発生のために重要な臓器（vital organ）である。胎盤は、胎仔と母体環境との間の接合部分として機能し、ガス、栄養、及び排泄産物の交換を促進するのみならず、妊娠関連ホルモン産生及び胎仔の免疫防御を促進している。この組織の主要な構造的及び機能的構成因子は、栄養膜系列の細胞からなる。この系列は、子宮内への着床前に、胚体を形成する内部細胞塊（ICM）系列から分離し、胎盤の胎仔部分の形成に制限される(非特許文献1)。過去数十年にわたり、ICM由来の胚性幹（ES）細胞及び栄養外胚葉（TE）由来の栄養膜幹（TS）細胞は、初期胚及び胎盤発生の分子メカニズムの我々の理解を実質的に進展させてきた。ES細胞が最初に記載されて以来(非特許文献2、3)、ES細胞は、フィーダー細胞、馴化培地、血清、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、及びペプチドの多様な経験的組み合わせを用いて誘導され維持されてきた(非特許文献2〜7)。現在では、膨大なトライ・アンド・エラーの結果、未分化多能性幹細胞を、白血球阻害因子（LIF）及び／又は低分子化合物（即ち、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、CHIR99021等）の存在下、化学的に定義された培養条件下で効率的に誘導し維持することができる(非特許文献8、9)。
【０００３】
TS細胞の樹立及び維持方法として、血清やフィーダー細胞、コンディションドメディウム等組成が化学的に定義されていない培養条件が幾つか報告されている（特許文献1、2；非特許文献10）。また、本発明者らは、化学的定義条件下におけるTS細胞の樹立及び維持方法を近年報告している（非特許文献11）。
【０００４】
いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進されることが報告されている(非特許文献8、9、12)。また、エピブラスト幹細胞（EpiSC）の未分化状態を支持することができる、改変されたEpiSC培養条件が報告されている(非特許文献4)。
【０００５】
特許文献3には、ヒトTS細胞をbFGFで処理すると、Oct4及びfgfr2発現が減少することが記載されている。
【０００６】
マウスES細胞は、初期胚中に移植することにより、キメラにおいて、生殖系列を含む全ての型の胎生細胞に寄与することができ、四倍体キメラ形成によってほとんど全てがES細胞由来の個体を生み出すことができる(非特許文献13)。しかしながら、受精卵又は初期胚を用いずにES細胞から個体を生み出すことについては未だ報告されていない。
【０００７】
この現象は、ES細胞が栄養膜系列を生み出すことができないということで、合理的に説明される。しかしながら、いままでに、ES細胞等の多能性幹細胞とTS細胞の凝集により初期胚を再構成する技術は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US 6,630,349 B1
【特許文献２】US 7,642,091 B2
【特許文献３】US 2006/0211110 A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.
【非特許文献２】Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.
【非特許文献３】Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78(12): 7634-7638.
【非特許文献４】Smith, A. G., Heath, J. K., Donaldson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides', nature 336: 688-690.
【非特許文献５】Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A. and Gough, N. M. (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.
【非特許文献６】Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.
【非特許文献７】Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 9(5): 471-7.
【非特許文献８】Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal', nature 453(7194): 519-23.
【非特許文献９】Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136(19): 3215-22.
【非特許文献１０】Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075.
【非特許文献１１】Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308.
【非特許文献１２】Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. (2009) 'Generation of rat and human inducedpluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4(1): 16-9.
【非特許文献１３】Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E. M., Prideaux, V. R., Ivanyi,E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able tosupport fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、鋭意検討の結果、TS細胞を単一細胞あるいは数個の細胞からなる凝集塊に分散させ、特定の成分を含む培地中で浮遊培養を行うと、TS細胞は浮遊しながら分裂し、球状の上皮構造を高効率に自己組織化することを見出した。形成された球状の立体組織は、胚盤胞の様な内腔を有しており、未分化な栄養膜系列細胞のマーカーであるCdx2を高発現していた。この内腔にES細胞を注入した後、立体組織を偽妊娠マウス子宮に移植すると、高効率に着床させることに成功した。従って、インビトロにおいて、TS細胞から、初期胚の栄養膜外胚葉様の機能的な構造体を効率的に作製可能であり、この構造体を用いれば、ES細胞とTS細胞から初期胚を再構成可能であることが示された。
【００１２】
発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：
【００１３】
［１］哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法。
［２］培地が更にWntシグナル阻害剤を含む、［１］記載の製造方法。
［３］培地が更にヘパリンを含む、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］培地が更にROCK阻害剤を含む、［１］〜［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］培地が、基底膜調製物のゲル成分を含まない、［１］〜［４］のいずれか記載の製造方法。
［６］浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、単一細胞又は２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊に分散されている、［１］〜［５］のいずれか記載の製造方法。
［７］浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することにより樹立されたものである、［１］〜［６］のいずれか記載の製造方法。
［８］［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造された、栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［９］哺乳動物栄養膜幹細胞及び当該栄養膜幹細胞に由来する栄養膜系列細胞からなる、［８］記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［１０］哺乳動物多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する、［８］又は［９］記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［１１］哺乳動物多能性幹細胞を、［８］〜［１０］のいずれか記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法。
［１２］注入した哺乳動物多能性幹細胞又は当該多能性可能性幹細胞に由来する細胞を含む栄養膜外胚葉様胞状構造体を哺乳動物の子宮内に移植し、当該子宮に着床させることを更に含む、［１１］記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、TS細胞から、栄養膜外胚葉様の機能的な胞状構造体を製造することができる。この胞状構造体は、内腔に多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植すると、子宮に着床する活性を有するので、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】GOF18-EGFP (Oct3/4-EGFP)レポーター導入遺伝子を有するE3.5胚盤胞。スケールバー、50μm。
【図２】CDM/LIF/2i（左）及びCDM/FAXY (FGF2、12.5 ng/ml)（右）中で5日目に生じた増殖物。スケールバー、100μm。
【図３】継代1日目（上）、2日目（中）、及び3日目（下）におけるTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。
【図４】E3.5胚盤胞（左）及びE6.5 ExE（右）から誘導されたTS細胞。スケールバー、100μm。
【図５】フィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ上のTS細胞の免疫蛍光染色。スケールバー、100μm。
【図６】CDM/LIF/2i中のES細胞（赤）及びCDM/FAXY 中のE3.5胚盤胞由来TS細胞（青）の増殖。
【図７】ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、ES細胞特異的遺伝子、普遍的に発現している遺伝子、及びTS細胞特異的遺伝子の発現レベルの比較。
【図８】ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、外胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子、及び内胚葉遺伝子の発現レベルの比較。
【図９】12.5 ng/ml、25 ng/ml、及び50 ng/mlにおける、FGF2のTS細胞マーカー遺伝子及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルに対する用量依存的効果。
【図１０】ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGFリガンドファミリー遺伝子の発現レベルの比較。
【図１１】ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGF受容体遺伝子の発現レベルの比較。
【図１２】FGF2 (-F、左から2番目)、アクチビンA (-A、右から2番目)、又はXAV939(-X、右)の除去時のTS細胞の形態学的変化。FAXYはコントロールとして未分化TS細胞を表す（左）。スケールバー、100μm。
【図１３】FGF2 (-F)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１４】アクチビンA (-A)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１５】XAV939 (-X) の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１６】FGF2 (-F)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１７】アクチビンA (-A)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１８】XAV939 (-X) の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。
【図１９】FAM-FLICAによる、蛍光ベースでのポリカスパーゼ陽性細胞の検出。未分化コントロール(FAXY、左)及びY27632除去(-Y、右)。スケールバー、100μm。
【図２０】ポリカスパーゼ陽性細胞の定量、百分率（％）で示す。
【図２１】フィブロネクチン（左）及びマトリゲル（右）上のTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。
【図２２】E14.5胚におけるTS細胞の胎盤特異的寄与。
【図２３】E14.5における胎盤切片のDAPI染色（灰色）及びEGFP蛍光（緑）の共焦点マージイメージ。de、脱落膜；gi、巨細胞；sp、海綿状栄養膜細胞；la、ラビリンス；ch、絨毛膜。スケールバー、200μm。
【図２４】培養したTS細胞の形態を示す。左の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF4及びヘパリンを添加した、従来技術の培地中で培養したTS細胞、右の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した培地中で培養したTS細胞を、それぞれ示す。
【図２５】TS細胞の浮遊培養による、栄養膜外胚葉様構造体の形成。左図は、培養開始時における分散したTS細胞を示す。右図は、培養開始３日後に形成された栄養膜外胚葉様構造体を示す。
【図２６】栄養膜外胚葉様構造体におけるCdx2発現。左：明視野、中：Cdx2、右：核。
【図２７】栄養膜外胚葉様構造体へのES細胞の注入。左写真：注入操作。右写真：左：明視野、中：ES細胞、右：重ね合わせ。
【図２８】ES細胞を注入した栄養膜外胚葉様構造体の着床後の脱落膜形成。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、哺乳動物栄養膜幹細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体を製造する方法を提供する。また、本発明は、当該製造方法により製造された栄養膜外胚葉様胞状構造体を提供する。更に、本発明は、当該栄養膜外胚葉様胞状構造体を用いた哺乳動物胚の製造方法を提供する。
【００１７】
Ｉ．栄養膜幹（TS）細胞
本明細書において、栄養膜幹（TS）細胞は、以下の4つ全ての形質を備える細胞を意味する：
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力。
【００１８】
（1）の自己複製能は、（2）〜（4）の形質を維持したまま、細胞が増殖する能力を意味する。
【００１９】
（2）のTS細胞マーカーとしては、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2、Tcfap2c等が挙げられる。本発明においては、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cからなる群から選択される少なくとも1つのTS細胞マーカーを発現している場合、「TS細胞マーカー遺伝子発現陽性」と判断する。一態様において、本発明において用いられるTS細胞は、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cの全てのTS細胞マーカー遺伝子発現が陽性である。TS細胞マーカー遺伝子の発現は、定量的RT-PCRにより決定することができる。
【００２０】
TS細胞は、他の系列マーカー遺伝子発現陰性により更に特徴付けられてもよい。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4及びKlf4からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）のES細胞マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Nestin、Sox1及びNcamからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の外胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Hoxa1、Hoxb1、Flk1及びTからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の中胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Gata4、Gata6、Afp及びFoxa2からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の内胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。
【００２１】
（3）のインビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力は、インビトロにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜サブタイプへ分化する能力を意味する。各栄養膜サブタイプへの分化は、各栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子発現により確認することができる。栄養膜サブタイプへ分化する能力は、評価対象の細胞を、栄養膜サブタイプへの分化条件化で培養したときに、栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子の発現が誘導されるか否かを指標に評価することができる。栄養膜巨細胞のマーカー遺伝子としては、PL-1、Hand1等を挙げることができる。海綿状栄養膜のマーカー遺伝子としては、Mash2、Tpbp/-4311等を挙げることができる。ラビリンス栄養膜のマーカー遺伝子としては、Esx1、Dlx3等を挙げることができる。特定の栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子のうち少なくとも1つが上昇した場合、当該栄養膜サブタイプへの分化が誘導されたと評価する。栄養膜サブタイプへの分化条件としては、後述する実施例におけるCDM-FAXY条件から、FGF2又はアクチビンAのいずれかを除去した条件を挙げることができる。
【００２２】
ここで、本明細書において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有するTS細胞を「未分化のTS細胞」と称する。一方、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される一部（即ち、1又は2）の栄養膜サブタイプへのみ分化する能力を有するTS細胞を「分化したTS細胞」と称する。本発明において用いられるTS細胞は、好ましくは、未分化のTS細胞である。
【００２３】
（4）のキメラにおいて、胎盤へ寄与する能力は、評価対象の細胞を胚盤胞中へ注入し、偽妊娠動物の子宮角へ移入したときに、評価対象の細胞が発生キメラ子孫動物の胎盤の胎仔部位へ寄与するか否かを試験することにより評価することができる。胎盤の胎仔部位において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜系列への寄与がある場合、評価対象の細胞は、キメラにおいて胎盤へ寄与する能力を有すると評価することができる。
【００２４】
栄養膜外胚葉とは、胚盤胞において、内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞をいう。
【００２５】
胚体外外胚葉とは、胚盤葉のうち胚体域の周辺にあって胚体の形成に寄与しない部位をいう。胚体外外胚葉は着床後に、栄養外胚葉から形成される。
【００２６】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）である。尚、ヒト胚の破壊を伴うプロセスは、倫理的に実施困難であるが、倫理的問題が生じない限り、本発明は、ヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体、及びその製造；並びに、当該ヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体を用いたヒト胚の製造をも包含する。
【００２７】
哺乳動物の系統は特に限定されないが、例えば、マウスの系統としては、純系としてC57BL/6系統、BALB/c系統、C3H系統、FVB系統、DBA2系統など、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、ICR系統などを、ラットの系統としては、Wistar、SDなどを挙げることができる。
【００２８】
本発明に用いられるTS細胞は、自体公知の方法により、栄養膜外胚葉又は胚体外外胚葉より樹立し、維持することが出来る。TS細胞の樹立及び維持方法として、血清やフィーダー細胞、コンディションドメディウム等組成が化学的に定義されていない培養条件が幾つか報告されている（US 6,630,349 B1；US 7,642,091 B2；Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075）。また、化学的定義条件下におけるTS細胞の樹立及び維持方法が報告されている（Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308）。
【００２９】
本発明に用いられるTS細胞は、好ましくは、以下の「TS細胞の製造方法Ｉ」により製造されたTS細胞、又は「TS細胞の培養方法Ｉ」により維持されたTS細胞である。
【００３０】
1．TS細胞の製造方法Ｉ
TS細胞の製造方法Ｉは、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、生体外において、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することを含む。
【００３１】
栄養膜外胚葉とは、胚盤胞において、内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞をいう。
【００３２】
哺乳動物栄養外胚葉は、胚から単離された栄養外胚葉として、又は栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供することができる。単離された栄養外胚葉は、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）から、内部細胞塊（ICM）を除去することにより、得ることができる。胚盤胞から、マイクロカッター等で栄養外胚葉の一部を採取することにより、胚を破壊することなく、栄養膜外胚葉を単離することもできる。従って、胚破壊を要することなくTS細胞を樹立することが可能である。栄養外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養すると良好に増殖しTS細胞が誘導されるのに対して、ICMを同培地中で培養してもほとんど増殖しない。従って、栄養外胚葉及び内部細胞塊を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）を、そのまま培養に供すると、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊から誘導された細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となる。従って、操作容易の観点から、一態様において、栄養外胚葉を、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供するのが好ましい。
【００３３】
胚体外外胚葉とは、胚盤葉のうち胚体域の周辺にあって胚体の形成に寄与しない部位をいう。胚体外外胚葉は着床後に、栄養外胚葉から形成される。
【００３４】
哺乳動物胚体外外胚葉は、胚から単離された胚体外外胚葉として、又は胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚として、培養に供することができる。単離された胚体外外胚葉は、胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚から、エピブラストを除去することにより、得ることができる。胚体外外胚葉と同様に、エピブラストを、FGF2、及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤）を含む培地中で培養すると、良好に増殖し、エピブラスト幹細胞が樹立される。従って、エピブラスト幹細胞の混入を抑制する観点から、胚体外外胚葉を、胚から単離された胚体外外胚葉として、培養に供するのが好ましい。一態様において、エピブラストを含まない、単離された胚体外外胚葉が、培養に供される。
【００３５】
栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、動物種により異なるため、一概に規定することはできないが、各種哺乳動物の胚発生について詳細に報告されているので、当業者であれば、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む適切な胎生日齢の胚を容易に得ることができる。マウスについては、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、通常E2〜10日、好ましくはE3.5〜6.5日である。
【００３６】
FGF2、及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（培地Ｉ）の組成について説明する。培地Ｉは、TS細胞の製造方法Ｉ及び下記のTS細胞の培養方法Ｉにおいて好適に使用され得る。
【００３７】
FGFは、公知のサイトカインであり、ヒト及びマウスにおいては、FGF1〜FGF23が確認されている。ヒトFGF19はマウスFGF15のオルソログであるので、ヒト及びマウスのFGFファミリーは22のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、FGFの呼称はヒトFGFのノメンクラチャに従うものとする。本発明において用いられるFGFは、栄養外胚葉又は胚体外胚葉から栄養膜幹細胞への分化、或いは栄養膜幹細胞の維持培養を可能とするものであれば、特に限定されないが、好ましくは、FGF2又はFGF4である。本発明に用いるFGF（例、FGF2、FGF4）は、通常哺乳動物のFGFである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。FGF（例、FGF2、FGF4）は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）を用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。ここで、例えば、マウスFGF2とは、FGF2が、マウスが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。
【００３８】
FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。マウスFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_032032.1（2014年2月18日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-9）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF2アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。
【００３９】
マウスFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_034332.2（2014年5月26日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-29）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001998.1（2014年4月20日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-30）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。
【００４０】
本発明において使用されるFGF（例、FGF2、FGF4）は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
【００４１】
培地中における、FGF2の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、12.5 ng/ml以上、より好ましくは25 ng/ml以上、更に好ましくは50 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF2濃度を25 ng/ml以上、好ましくは50 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは12.5〜500 ng/ml、より好ましくは25〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜500 ng/mlである。FGF2は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。
【００４２】
アクチビンシグナル経路作用物質としては、アクチビン、作動性抗アクチビン受容体抗体、アクチビン受容体アゴニスト等を挙げることができる。アクチビンは公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるアクチビンは、通常哺乳動物のアクチビンである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。アクチビンは、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のアクチビンを用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のアクチビンが用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のアクチビンが用いられる。アクチビンは、通常二量体構造を有し、これを構成するサブユニット（βサブユニットとよばれる）としては、哺乳動物においては４種類（βA、βB、βC、βE）が知られている。アクチビンとしては、アクチビンA（βA‐βA）、アクチビンAB（βA‐βB）、アクチビンB（βB‐βB）、アクチビンC（βC‐βC）、アクチビンE（βE‐βE）などを挙げることができる。これらのアクチビンは、全てアクチビン受容体を介して細胞へ作用する。尚、本明細書においては、前記の組み合わせ以外のサブユニットの組み合わせであっても、アクチビン受容体を介してその下流のシグナルを活性化できるものは、全てアクチビンに包含されるものとする。アクチビンシグナル経路作用物質は、好ましくはアクチビン（例、アクチビンA）である。
【００４３】
本発明において使用されるアクチビンは、好ましくは単離されている。
【００４４】
培地中における、アクチビンシグナル経路作用物質の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。アクチビンシグナル経路作用物質としてアクチビンAを用いる場合、その培地中濃度は、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。細胞増殖への悪影響がない限りアクチビンA濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のアクチビンA濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、より好ましくは20〜500ng/mlである。アクチビンシグナル経路作用物質は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。
【００４５】
培地Ｉは、好ましくは、Wntシグナル阻害剤を更に含有する。Wntシグナル阻害剤を用いることにより、TS細胞の未分化性が高まる。Wntシグナル阻害剤は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、例えば、XAV939（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、IWR-1-end（4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide）等のタンキラーゼ阻害剤、IWP-2（N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide）、CKI-7（N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide）、D4476（4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受容体阻害剤、可溶型Wnt受容体、Wnt抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、Wntに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、XAV939等のタンキラーゼ阻害剤が好ましい。XAV939は、古典的なWntシグナル阻害剤であり、ポリADPリボシル化酵素であるタンキラーゼ1及びタンキラーゼ2の阻害を介して、アキシンの安定化によるβカテニン分解を活性化する(Huang et al.、2008)。
【００４６】
培地中における、Wntシグナル阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としてXAV939を用いる場合、その濃度は、通常0.1 nM以上、好ましくは3 nM以上、より好ましくは10 nM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りXAV939濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常50μM以下、好ましくは5μM以下、より好ましくは、500 nM以下である。一態様において、培地中のXAV939濃度は、通常0.1 nM〜50μM、好ましくは3 nM〜5μM、より好ましくは10〜500 nMである。Wntシグナル阻害剤は、特に、TS細胞の未分化状態の維持に寄与する。
【００４７】
培地Ｉは、ROCK阻害剤を含んでいても良い。ROCK阻害剤は、特に、誘導されたTS細胞の生存の維持に寄与する。
【００４８】
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y27632（(R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide）（Ishizakiら, Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiyaら, Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine）（Uehataら, Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline）（Sasakiら, Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（[(+)-(R)-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl) benzamide）（Nakajimaら, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もまた使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、1種又は2種以上のROCK阻害剤が使用され得る。ROCK阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、Y27632が好ましい。
【００４９】
培地中における、ROCK阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。ROCK阻害剤としてY27632を用いる場合、その濃度は、通常0.1 μM以上、好ましくは1μM以上、より好ましくは5 μM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りY27632濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常1000 μM以下、好ましくは100 μM以下、より好ましくは、50 μM以下である。一態様において、培地中のY27632濃度は、通常0.1 〜1000 μM、好ましくは1〜100 μM、より好ましくは5〜50 μMである。ROCK阻害剤としてFasudil／HA1077を用いる場合、目安としてY27632の上記濃度の約2倍の濃度で用いることができ、ROCK阻害剤としてH−1152を用いる場合には、目安としてY27632の上記濃度の約1／50倍の濃度で用いることができる。
【００５０】
FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2及びアクチビン（例、アクチビンA）である。
【００５１】
FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。
【００５２】
培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。
【００５３】
培地Ｉは、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham’s F−12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、Neurobasal：DMEM：Ham’s F−12＝2：0．8〜1．2：0．8〜1．2である。
【００５４】
培地Ｉは、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、無血清条件でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００５５】
培地Ｉは、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物としては、N2、B27、KSR等を挙げることができる。N2は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、公知の血清代替用組成物である。B27の組成は、J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993、Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989等に記載されている。KSRは、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。N2、B27及びKSRは、Invitrogen等から購入可能である。培地中に添加される血清代替物の量は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、Invitrogen社製のN2サプリメント及びB27サプリメントであれば、それぞれ、培地全体の容量の1/500〜1/10容量が添加される。好適な態様において、培養に用いられる培地は、N2及びB27を含む。
【００５６】
培地Ｉは、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL−グルタミン等）、還元剤（例えば1−チオグリコレート、2−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
培地Ｉは、好適には、化学的に定義された培地である。「化学的に定義された培地」とは、血清、馴化培地等の組成が化学的に未決定な因子を含まず、化学的に組成が定義された因子のみから構成された培地を意味する。
【００５８】
一態様において、製造方法Ｉにおいて用いられる培地Ｉは、基礎培地中に、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、N2、及びB27（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、N2、及びB27、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、ROCK阻害剤、N2、及びB27）を含む。アクチビンシグナル経路作用物質は、好適にはアクチビン（例、アクチビンA）である。Wntシグナル阻害剤は、好適にはタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。ROCK阻害剤は、好適にはY27632である。基礎培地は、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地でありうる。該培地は、好適には化学的に定義された培地である。
【００５９】
一態様において、製造方法Ｉにおいて用いられる培地Ｉは、FGF4を含有しない。従来、MEF、馴化培地、血清、FGF4、ヘパリンを含む培地中で、TS細胞を樹立し、維持する方法が知られているが、製造方法Ｉにおいては、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、FGF4を含有しない培地中でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００６０】
製造方法Ｉにおいては、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。フィーダー細胞とは、TS細胞と共に培養された際に、TS細胞としての能力を維持した状態でのTS細胞の増殖を補助する環境を提供する、非TS細胞（例、線維芽細胞）をいう。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下での培養が可能となる。製造方法Ｉにおいては、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の樹立及び維持が可能となる。
【００６１】
培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００６２】
TS細胞の製造又は維持における培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。
【００６３】
細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子をいう。細胞外マトリクスとしては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン等が挙げられ、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはフィブロネクチン、ラミニンである。一態様において、細胞外マトリクスとして、基底膜調製物を用いることができる。基底膜調製物としては、その上に未分化なTS細胞を播腫して培養した場合に、未分化状態を維持したまま、その生存を維持する機能を有する基底膜構成成分を含むものであれば、その由来する細胞の種類は特に限定されない。基底膜調製物は、好適には、肉腫細胞由来であり、より好ましくはEngelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来である。基底膜調製物は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、塩析、尿素抽出及び透析に付すことや、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液等を用いて除去することで作成することができる。基底膜調製物としては市販のものが利用でき、例えば、マトリゲル（BD Bioscience）などが挙げられる。マトリゲルは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルの主成分はラミニン、IV型コラーゲン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンである（例えば、タンパク質重量比で、60-85% ラミニン、5-30% IV型コラーゲン, 1-10% ニドゲン、1-10% ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び 1-5% エンタクチン（US patent No. 4829000））が、これらに加えてTGF−β、線維芽細胞増殖因子（FGF）、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子 (PDGF, IGF-1, NGF等) が含まれる。マトリゲルは、US patent No. 4829000に開示された方法により調製することが出来る。一態様において、本発明の製造方法に用いられる基底膜調製物は、US patent No. 4829000に開示された基底膜調製物である。
【００６４】
細胞外マトリクスを培養器にコーティングする方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。例えば、培養器中に、細胞外マトリクスを含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）を加え、静置することにより、細胞外マトリクスを培養器の表面に非共有結合により不溶性担体に結合させることが出来る。
【００６５】
特に、ROCK阻害剤を含まない培地中でTS細胞を誘導する場合には、誘導されたTS細胞の生存維持の観点から、細胞外マトリクスコートされた培養器中で培養を行うことが好ましい。
【００６６】
その他の培養条件は、通常の哺乳動物細胞の培養条件に準じて、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養温度は、通常約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、通常約1〜10％、好ましくは約2〜5％である。湿度は通常約70〜100％の範囲であり、好ましくは約95〜100％である。
【００６７】
TS細胞の製造方法Ｉを、更に詳細に説明すると、以下の通りである。
【００６８】
生体より分離された桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、培養器中に播種し、FGF2及びアクチビンAを含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンA及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養する。該培養器は、通常の細胞培養において使用されるものを用いることができるが、好ましくは、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉、或いはこれから誘導された細胞の容器への接着を促進させるために、細胞接着性の培養器（例、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスでコートされた培養器）が用いられる。以下の培養に用いる培養器も同様である。
【００６９】
当該培養の結果、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉が増殖物（outgrowth）を形成し、初代外植片（primary explant）を得る。培養条件にもよるが、増殖物の形成は、培養の開始から、通常3〜7日後に生じる。
【００７０】
このようにして得られた初代外植片を、そのまま培養することによってもTS細胞を樹立することは可能であるが、好ましくはこの初代外植片を、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。外植片の分散は、適宜な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)又はアキュターゼ(MILLIPORE)等の市販品が入手可能である。分散された細胞を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。
【００７１】
培養を継続すると、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導された細胞は、培養条件によっても異なるが、継代後通常1週間以内に、培養器の底面にコロニーを形成する。このコロニーがTS細胞のコロニーである。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。このコロニーを、回収し、上述と同様に単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、更にFGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導されたTS細胞は、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で良好に増殖するのに対して、ICMに由来する細胞は、ほとんど増殖しない。従って、この継代操作を繰り返すことにより、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊に由来する細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となり、最終的に、ICMに由来する細胞を含まない、TS細胞からなる細胞集団を構成するに至る。
【００７２】
尚、TS細胞コロニーに加えて、エピブラスト幹細胞のコロニーの混入が生じる場合がある。従って、必要に応じて、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去することにより、TS細胞を精製してもよい。一態様において、製造方法Ｉは、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去し、TS細胞を単離する工程を含む。TS細胞コロニーは、コンパクトで、ドーム状の特徴的な形態を呈しているので、エピブラスト幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。従って、このようなTS細胞コロニーに特徴的な形態を指標に、例えば、顕微鏡下でTS細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップすることにより、TS細胞を単離することができる。また、限界希釈法によって、TS細胞のコロニーのみを生じたウェルから細胞を採集することによっても、TS細胞を単離することができる。あるいはTS細胞の細胞表面マーカー等を指標にして、セルソーター等を用いてTS細胞を単離してもよい。「単離されたTS細胞」の純度（総細胞数に占めるTS細胞の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
【００７３】
製造方法Ｉにより製造されるTS細胞は、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、栄養膜幹細胞としての形質を維持しながら増殖する。
【００７４】
製造方法Ｉにより得られた細胞が、TS細胞としての形質、即ち、
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、及び
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力
を維持しているか否か確認してもよい。一態様において、製造方法Ｉは、このような確認工程を含む。確認工程は、得られた細胞から一部の細胞をサンプルとして分離すること、該サンプルがTS細胞としての形質を維持しているか否か試験すること、及び該サンプルがTS細胞としての形質を維持していることが確認された場合、サンプルが由来する細胞をTS細胞として取得することを含む。
【００７５】
確認工程においては、上記形質のうち、（2）〜（4）の全ての形質を、サンプルが有しているか否か試験する。（2）〜（4）の形質の確認方法は、上記「1．用語の定義」の項に記載した通りである。（1）の形質については、継代培養後の細胞について、（2）〜（4）の形質を有していることをもって、サンプルが（1）の形質を有していると判定可能である。
【００７６】
好ましい態様において、製造方法Ｉにより製造されるTS細胞は、未分化であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。
【００７７】
製造方法Ｉにより得られるTS細胞は、理論的には永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該TS細胞は凍結保存・融解後もTS細胞としての形質を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA−IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−80〜−200℃、好ましくは−196℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。
【００７８】
製造方法Ｉにより得られるTS細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。一度起眠した当該TS細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞のTS細胞としての形質は維持される。
【００７９】
2．TS細胞の培養方法Ｉ
培養方法Ｉは、哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地）を含む培地中で培養することを含む。培養方法Ｉは、栄養膜幹細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代又は増殖する方法である。従って、培養方法Ｉは、培養したTS細胞を回収し、これを播種することを含み得る。
【００８０】
培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞には、上記製造方法Ｉにより製造された栄養膜幹細胞のみならず、それ以外の方法により樹立された栄養膜幹細胞も包含される。培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、単離されている。培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。培養方法Ｉによれば、このような未分化な状態を維持したまま、栄養膜幹細胞を継代培養することが可能である。従来の方法（Tanaka, 1998）によると、継代後のコロニーの端に巨細胞が現れるなど、一部の細胞の分化が避けられなかったところ、培養方法Ｉにより、このような巨細胞の出現を回避し、分化したTS細胞や栄養膜サブタイプの混入を抑制しながら、未分化なTS細胞を継代培養することが可能となった。従って、一態様において、培養方法Ｉにより得られる培養物には、巨細胞が含まれず、細胞として栄養膜幹細胞（好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞）のみが含まれる。
【００８１】
培養方法Ｉに用いられる培地（培地ＩＩとする）の態様は、FGFの種類がFGF2に限定されないことを除き、上記培地Ｉの態様と同一である。FGFは、好ましくはFGF2又はFGF4である。FGFとして、FGF2を用いる場合、培地中のFGF2濃度は、培地Ｉの態様と同一である。FGFとして、FGF4を用いる場合、FGF4の濃度は、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したままでの、TS細胞の継代又は増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF4濃度を20 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF4濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、300 ng/ml以下、より好ましくは50 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF4濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜300 ng/ml、より好ましくは20〜50 ng/mlである。
【００８２】
培地ＩＩが、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、培地ＩＩが、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含まない。培地ＩＩが、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、培地ＩＩが、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含まない。
【００８３】
培地ＩＩは、ヘパリンを含んでいてもよい。ヘパリンは、特にTS細胞の未分化性維持に有効である。特に、FGFとしてFGF4を用いる場合、ヘパリンと組み合わせて培地に添加することが好ましい。培地中のヘパリン濃度は、TS細胞の未分化性維持等の所望の効果を達成し得る濃度である限り特に限定されないが、通常、0.1 ng/ml以上、好ましくは1 ng/ml以上である。TS細胞の維持、増殖へ悪影響がない限り、ヘパリン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常、1000 ng/ml以下、好ましくは、100 ng/ml以下である。一態様において、培地中のヘパリン濃度は、通常0.1〜1000 ng/ml、好ましくは1〜100 ng/ml、より好ましくは5〜20 ng/mlである。
【００８４】
培地ＩＩは、好ましくは無血清培地である。該培地は、好ましくは化学的に定義された培地である。
【００８５】
一態様において、培地ＩＩは、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤）に加えて、ROCK阻害剤を含む。
【００８６】
一態様において、培地ＩＩは、ROCK阻害剤を含まない。
【００８７】
培養方法Ｉにおいては、哺乳動物TS細胞を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下でのTS細胞の維持培養が可能となる。培養方法Ｉにおいては、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤）の組み合わせを用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の維持培養が可能となる。
【００８８】
培養に用いる培養器としては、上記製造方法Ｉにおいて用いることができる培養器と同一のものを使用することができる。
【００８９】
TS細胞の維持培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。
【００９０】
ここで、ROCK阻害剤を含む培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしては、上記製造方法Ｉにおいて用いることができる細胞外マトリクス（例、フィブロネクチン）と同一のものを使用することができる。
【００９１】
一方、ROCK阻害剤を含まない培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしてマトリゲル等の基底膜調製物を用いることが好ましい。マトリゲルでコートされた培養器上で、TS細胞を接着培養することにより、ROCK阻害剤がなくても、TS細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代培養することが可能となる。
【００９２】
培養方法Ｉにおけるその他の細胞培養条件は、特に断りのない限り、上記製造方法Ｉにおける、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を培養する際の培養条件、或いはこれらから誘導されたTS細胞を維持する際の培養条件と同様である。
【００９３】
即ち、TS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で培養する。この培養により、TS細胞は、培養器の底面にコロニーを形成する。増殖したTS細胞コロニーを回収し、適宜な細胞解離液により単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散したTS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に再び懸濁し、新たな培養器中で培養する。この操作を繰り返すことにより、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したまま、継代培養することが可能となる。
【００９４】
FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、及びアクチビン（例、アクチビンA）である。
【００９５】
FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。
【００９６】
培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。
【００９７】
培養方法Ｉにより、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、TS細胞としての形質を維持しながらTS細胞を継代培養することが可能である。
【００９８】
培養方法Ｉにより、TS細胞を、長期間にわたって、TS細胞としての形質を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該TS細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入されたTS細胞や、特定の遺伝子を欠損したTS細胞等の遺伝子改変TS細胞を製造することができる。
【００９９】
本項における、用語の定義、培養条件等の態様は、特にことわりのない限り、上記「製造方法Ｉ」の項に記載したものと同一である。
【０１００】
ＩＩ．栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法
本発明は、哺乳動物TS細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地）中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法を提供するものである。
【０１０１】
栄養膜外胚葉様胞状構造体は、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞により構成された上皮からなる略球状の細胞集合体（cell assembly）であり、その内部に当該上皮が取り囲むことにより形成された卵割腔様の空洞を有する。当該空洞は、当該構造体外部に対して閉鎖されている。略球状とは、顕微鏡観察下における構造体の最も長い直径（長径）と最も短い直径（短径）との比（短径／長径）が、１〜２．０の範囲、好ましくは１〜１．５の範囲内であることをいう。哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞により構成された上皮は、単層又は多層であり得るが、好ましくは単層である。
【０１０２】
栄養膜外胚葉様胞状構造体は、胎盤胞に近似した大きさを有しており、その直径（長径）は、通常５０〜１００μｍ、好ましくは７０〜９０μｍである。
【０１０３】
本発明の製造方法に用いられる培地（培地ＩＩＩとする）は、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含むことを除き、上述の培地Ｉ又は培地ＩＩの態様と同一である。即ち、培地ＩＩＩは、上記培地Ｉ又は培地ＩＩに、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を添加することにより調製することができる。
【０１０４】
基底膜調製物は、本発明の製造方法に用いた時に、TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができるものであれば、その由来する細胞の種類は特に限定されない。基底膜調製物としては、上記「Ｉ．栄養膜幹（TS）細胞」の項に記載されたものを使用することができる。基底膜調製物は、好適には、肉腫細胞由来であり、より好ましくはEngelbreth Holm Swarm（EHS）マウス肉腫由来である。例えば、マトリゲル（BD Bioscience）などを市販の基底膜調製物として使用することができる。
【０１０５】
基底膜調製物の非ゲル水溶性成分とは、基底膜調製物からゲル化後のゲル構成成分を除去することにより得られる水溶性の残渣成分を意味する。基底膜調製物の非ゲル水溶性成分は、基底膜調製物を培地に添加し、室温において維持することによりゲル化を誘導した後に、遠心分離を行い、上清を回収し、フィルター（例えば、孔径0.45μm以下、好適には0.22μm以下のもの）によりろ過することにより、得ることが出来る。
【０１０６】
培地中に添加する基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の濃度は、TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができる濃度であり、培地に添加する基底膜調製物自体のタンパク質濃度として、通常0.05 mg/ml以上、好ましくは0.1 mg/ml以上、より好ましくは0.2 mg/ml以上である。TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができる限り、培地中に添加する基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の濃度の上限値は特に限定されないが、費用対効果の観点から、培地に添加する基底膜調製物自体のタンパク質濃度として、通常2 mg/ml以下、好ましくは1 mg/ml以下とすることが望ましい。
【０１０７】
尚、本発明の製造方法においては、培地に基底膜調製物の非ゲル水溶性成分が含まれていれば足りるので、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分として、基底膜調製物自体を培地に添加してもよい。しかしながら、ゲル成分を除去しないと、形成されたゲル成分の浮遊物によって、栄養膜外胚葉様胞状構造体の立体形成が阻害されてしまい、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造効率が低下してしまう。従って、ゲル成分を除去した、単離された基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を用いることが好ましく、培地ＩＩＩには、好適には、基底膜調製物のゲル成分が含まれない。
【０１０８】
培地ＩＩＩにおける、FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、及びアクチビン（例、アクチビンA）である。
【０１０９】
培地ＩＩＩにおける、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。
【０１１０】
培地ＩＩＩにROCK阻害剤が含まれる場合、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。
【０１１１】
培地ＩＩＩには、好適には、ヘパリンが含有される。
【０１１２】
本発明の製造方法においては、分散された哺乳動物栄養膜幹細胞を、上記培地ＩＩＩ中で、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し（即ち、浮遊培養し）、複数の栄養膜幹細胞を集合させて凝集塊を形成し、この凝集塊を培地ＩＩＩにおいて引き続き培養することにより、栄養膜外胚葉様胞状構造体へと誘導する。
【０１１３】
この浮遊培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
【０１１４】
栄養膜幹細胞の凝集塊の形成に際しては、まず、栄養膜幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態（例えば、２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊）にまで分散する。栄養膜幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された栄養膜幹細胞は上記培地ＩＩＩ中に懸濁される。
【０１１５】
分散により誘導される栄養膜幹細胞の細胞死を抑制するために、ＲＯＣＫ阻害剤を培養開始時から培地ＩＩＩに添加することが好ましい。培地ＩＩＩ中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、分散により誘導される栄養膜幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度であり、培地Ｉ及び培地ＩＩにおいて記載したＲＯＣＫ阻害剤の濃度であれば、このような細胞死抑制効果を達成することが出来る。例えば、Ｙ−２７６３２について、このような濃度は、通常約０．１〜２００μＭ、好ましくは約２〜５０μＭである。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。或いは、浮遊培養開始後、一定期間はROCK阻害剤を添加した培地ＩＩＩ中で培養を行い、その後（例えば、栄養膜幹細胞の凝集塊の形成が確認された後）、ＲＯＣＫ阻害剤を培地から除いてもよい。
【０１１６】
分散された栄養膜幹細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた栄養膜幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、栄養膜幹細胞が分裂し、分裂した細胞同士が接着したまま、分離せずに分裂を繰り返すことにより、栄養膜幹細胞の凝集塊を形成する。単一細胞にまで分散した栄養膜幹細胞を用いた場合には、１つの凝集塊に含まれる栄養膜幹細胞は、１個の栄養膜幹細胞に由来するクローナルな集団である。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造が可能である限り、特に限定されないが、細胞密度が高すぎると、分散した複数の栄養膜幹細胞同士が再度凝集してしまうため、このような再凝集を防止する観点から、浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、ある程度低いことが好ましい。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、例えば、1 x 106個/ml以下、好ましくは、5 x 105個/ml以下である。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は低いぶんには特に問題はなく、極端な例として、１つのウェルに１個の栄養膜幹細胞のみを培養する、いわゆるシングルセルカルチャー（例えば、１個／mlの細胞濃度）から浮遊培養を開始してもよい。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、好適には、1 x 105個/ml〜5 x 105個/ml（例、2 x 105個/ml）である。
【０１１７】
本発明の製造方法においては、哺乳動物TS細胞を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで浮遊培養する。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、浮遊培養がフィーダー細胞無しで行われる。本発明の製造方法においては、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、ROCK阻害剤、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ）を用いることにより、フィーダー細胞無しで栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成が可能となる。
【０１１８】
浮遊培養における温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は、哺乳動物細胞の通常の培養条件に準じて、当業者であれば、適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。
【０１１９】
通常、浮遊培養開始から１日後には栄養膜幹細胞からなる凝集塊が形成され、その内部に空洞の形成が認められるようになる。そして、この凝集塊を栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成が確認されるまで引き続き浮遊培養することにより、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体を得ることが出来る。即ち、この浮遊培養の操作により、１個の栄養膜幹細胞から、栄養膜外胚葉様胞状構造体が自己組織化される。栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成に要する浮遊培養の期間は、分散された栄養膜幹細胞の浮遊培養の開始から、通常、３〜４日程度である。４日を超えて浮遊培養を継続すると、徐々に栄養外胚葉様構造が保てなくなる。１個の栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞数は、浮遊培養開始3日目の時点で50-100個程度であり、培養を継続することにより、細胞数は増加する。
【０１２０】
栄養膜外胚葉様胞状構造体が形成されたことは、上皮からなる立体的な球構造体が形成されたことを顕微鏡下で観察することにより行うことが出来る。TS細胞マーカー（例、Cdx2）に対する抗体を用いた免疫組織学的染色を行い、当該構造体が当該マーカーを高発現しており、該構造体を構成する細胞に占めるTS細胞が占める割合が、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上（例えば100%）であることを確認してもよい。更には、得られた構造体に、哺乳動物多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植することにより、子宮に着床する活性を有することを確認してもよい。
【０１２１】
また、本発明は、上記製造方法により製造された栄養膜外胚葉様胞状構造体をも提供する。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞（即ち、TS細胞から分化した栄養膜系列細胞）からなる。TS細胞に由来する細胞としては、栄養膜巨細胞、栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞の多くはTS細胞であり、TS細胞が占める割合は、通常、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上（例えば100%）である。TS細胞が占める割合は、栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞に占めるCdx2（TS細胞マーカー）陽性細胞の割合として定義することができる。好ましい態様において、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、哺乳動物TS細胞からなり、該構造体を構成する細胞に占めるCdx2陽性細胞の割合が100%である。
【０１２２】
本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には単離されており、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞以外の細胞（例、内部細胞塊）を含まない。
【０１２３】
胚盤胞から、マイクロカッター等により内部細胞塊を除去することにより、栄養膜外胚葉様胞状構造体を得ることも可能であるが、内部細胞塊部分の完全な除去は困難であり、内部細胞系列の細胞が、栄養膜外胚葉様胞状構造体内に残存する可能性を完全に排除することが困難である。これに対して、上記製造方法により製造することができる、TS細胞及び当該TS細胞に由来する栄養膜系列細胞のみからなる栄養膜外胚葉様胞状構造体は、決して内部細胞系列の細胞を含まないので、内部細胞系列の細胞の存在が排除できない栄養膜外胚葉様胞状構造体とは、物として異なる。
【０１２４】
本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には、哺乳動物多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する。従って、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体及び哺乳動物多能性幹細胞を用いることにより、子宮内において、当該多能性幹細胞のみに由来する非キメラ胚の形成を誘導することができる。多能性幹細胞の注入及び、哺乳動物の子宮内への移植については後述する。
【０１２５】
ＩＩＩ．哺乳動物胚の製造方法
本発明は、哺乳動物多能性幹細胞を、上記本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法を提供するものである。
【０１２６】
多能性幹細胞とは、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。
【０１２７】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。本発明においては、ES細胞又はiPS細胞が好適に用いられる。
【０１２８】
また、多能性幹細胞に換えて、内部細胞塊を上記本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入してもよい。内部細胞塊は、胚盤胞から栄養外胚葉を除去することにより単離することができる。内部細胞塊を注入する場合には、塊の状態を維持したまま（塊の状態を破壊せずに）注入してもよいし、トリプシン等のタンパク質分解酵素処理により単一細胞またはこれに近い状態にまで分散した後に、分散した内部細胞塊構成細胞を注入してもよい。
【０１２９】
多能性幹細胞又は内部細胞塊が由来する哺乳動物種は、栄養膜外胚葉様胞状構造体が由来する哺乳動物種と同一であることが好ましい。例えば、通常、マウス多能性幹細胞又は内部細胞塊をマウス栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入し、ヒト多能性幹細胞又は内部細胞塊をヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入する。
【０１３０】
栄養膜外胚葉様胞状構造体への多能性幹細胞又は内部細胞塊の注入は、胎盤胞注入法（Gardner R.L. 1968. Mouse chimeras obtained by the injection of cells into blastocyst. Nature 371: 333-336）に準じて実施することが出来る。例えば、キャピラリーを用いて、分散した多能性幹細胞又は内部細胞塊構成細胞を、１つの栄養膜外胚葉様胞状構造体につき、1〜20個程度、栄養膜外胚葉様胞状構造体内の卵割腔様の空洞中へマイクロインジェクションする。
【０１３１】
このようにして得られた、注入された多能性幹細胞又は内部細胞塊を含む本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）をインビトロにおいて培養することにより、多能性幹細胞又は内部細胞塊の体細胞分化が誘導され、胚発生が生じることが期待される。
【０１３２】
上述の様に、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、着床する活性を有するため、胚発生をより確実に生じさせるため、注入された多能性幹細胞又は内部細胞塊、或いは当該多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する細胞を含む、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）を、レシピエント哺乳動物（雌）の子宮又は卵管に移入し、当該子宮に着床させてもよい。
【０１３３】
ホルモン補充を行わない場合、胚の着床を促すため、性周期に合わせて多能性幹細胞又は内部細胞塊、或いは当該多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する細胞を含む、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）を、レシピエント哺乳動物（雌）の子宮又は卵管に移入することが好ましい。例えば、ヒトの場合、排卵後5日目にレシピエントの子宮又は卵管に胚を移入する。あるいは、子宮内膜の状態を整えるため、ホルモン補充周期法を適用し、エストロゲン投与により子宮内膜の肥厚を促し、その後、黄体ホルモンを投与してもよい。例えば、ヒトの場合、ホルモン補充周期法を適用し、生理後19〜20日にレシピエントの子宮又は卵管に胚を移入する。また、レシピエント哺乳動物として、偽妊娠哺乳動物を用いてもよい。偽妊娠哺乳動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。レシピエント哺乳動物の動物種は、多能性幹細胞又は内部細胞塊、及び栄養膜外胚葉様胞状構造体がそれぞれ由来する哺乳動物種と同一であることが好ましい。
【０１３４】
着床の有無は、脱落膜形成を確認することにより確認することが出来る。胚が子宮内に着床すると、脱落膜の形成が生じ、胚発生を良好に支持する。その結果、胎盤を除くすべての部分が移入した多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する胚が形成される。また、この妊娠を維持することにより、移入した多能性幹細胞又は内部細胞塊のみが寄与する子孫哺乳動物を誕生させることも期待できる。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体自体には、内部細胞塊が含まれないので、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に多能性幹細胞又は内部細胞塊を導入することにより、導入した多能性幹細胞又は内部細胞塊のみが寄与する胚及び子孫哺乳動物を、キメラ胚形成無しで、生じさせることが可能となる。
【０１３５】
不妊治療の臨床研究においては胚盤胞の質を決定しているのは内部細胞塊よりも栄養外胚葉であることが示唆されている。例えば、栄養外胚葉やそこから分化する胎盤の機能に不全があることにより、そのままでは妊娠に至らないヒト胚盤胞から内部細胞塊を分離し、正常なTS細胞から製造した本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体中にこれを注入することにより、機能不全のない良質の胚盤胞を得ることが可能である。更に、この胚盤胞をレシピエントの子宮又は卵管に移入し、当該子宮に着床させることにより、正常な妊娠及び分娩に導くことが可能である。従って、本発明は、栄養外胚葉や胎盤の機能不全を原因とする不妊に対する比類のない治療手段を提供する。
【０１３６】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１３７】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【０１３８】
［参考例１］
［材料及び方法］
（TS細胞の誘導）
以下の条件（CDM/FAXYと称す）を、着床前E3.5胚盤胞及び着床後E6.5胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導及び維持に用いた。CDM/FAXYは、250 mlのNeurobasal (Invitrogen)、250 mlのDMEM/F12 (Ham’s) (1:1) (Invitrogen)、2.5 ml N2 サプリメント (Invitrogen)、B27 サプリメント (Invitrogen)、5 ml ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液(Invitrogen)、ウシ血清アルブミン (Sigma、最終濃度0.05%)、1-チオグリコレート(Sigma、最終濃度1.5 × 10-4M)、組み換え型マウスbasic FGF (R&D、最終濃度12.5-50 ng/ml)、組み換え型 ヒトアクチビンA (R&D、最終濃度20 ng/ml)、XAV939 (Calbiochem、最終濃度10 nM)、及びY27632 (Stemgent、最終濃度5 μM)を配合することにより調製した。E3.5胚盤胞及びE6.5胚体外外胚葉を、15 μg/mlヒト血漿フィブロネクチン(Millipore)で37℃にて少なくとも1時間コートした96穴プレート上、CDM/FAXY中にまいた。増殖したTS細胞の初期増殖物は、5日目までには明らかとなった。まいてから5〜8日後に、これらの増殖物をTripLE Select (Invitrogen)により単一細胞へ分散させた。新たに樹立された細胞株をフィブロネクチンコートしたディッシュ上で更にTripLE Selectにより増殖させ、その後、Cellbanker 2 (Mitsubishi Chemical Medience)を用いて凍結させるか、更なる解析に用いた。培地は2日おきに交換した。CDM/FAXYに、KnockOutTM serum replacement (Invitrogen、1% final concentration)を用いることができ、正の細胞接着効果をもたらした。Y27632を加えない場合には、0.2% マトリゲル (BD Biosciences)をコートしたディッシュをTS細胞培養に用いた。
【０１３９】
（定量的PCR (qPCR)解析）
RNeasy Mini kits (Qiagen)を用いて細胞から全RNAを精製した。逆転写のため、ReverTra Ace (Toyobo)及びoligo (dT)20プライマーを用いた。qPCR解析のため、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)及びCFX384 Real-Time System (Bio-Rad)を用いた。転写レベルはトリプリケートの反応で定義し、対応するGapdhに対して規準化した。
【０１４０】
（免疫蛍光染色）
細胞をフィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ(35 mm μ-Dish; ibidi)上で2日間増殖させ、4%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で室温にて1時間固定し、その後0.1% Triton X100/PBSで3回洗浄した。細胞をブロッキング溶液(0.5% 正常ヤギ血清 [Vector]を含むPBS + 0.1% Triton X-100 [PBST])でブロックし、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした。次に、細胞をPBSTにより3回洗浄し、Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1:500; A11036、Invitrogen)とともに室温にて1時間インキュベートし、PBST中で洗浄し、DAPI (1 μg/ml; Invitrogen)により対比染色し、画像化した。ウサギ抗Cdx2抗体(ab76541、Abcam)は、1:500希釈で用いた。
【０１４１】
（アポトーシス解析）
アポトーシス細胞は、FAM-FLICA Poly Caspase Assay Kit (ImmunoChemistry Technologies)を用いて検出し、細胞をHoechst 33342 (200 μg/ml、ImmunoChemistry Technologies)により対比染色した。
【０１４２】
（画像化）
画像は、DP72カメラ(Olympus)を備えたIX71倒立顕微鏡(Olympus)、DP71カメラ(Olympus)を備えたSZX12解剖顕微鏡(Olympus)、又はFV1000倒立共焦点顕微鏡を用いて得た。
【０１４３】
（レンチウイルス産生及び感染）
293FTを100 mmディッシュにつき4 × 106個まき、一晩インキュベートした。細胞を、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、pLV-CAG1.1-EGFP、pMDL g/p、pREV、及びpVSVG ベクター(Okada et al.、2007)でトランスフェクトした。トランスフェクションから48及び72時間後、トランスフェクタントからの培養液を回収し、0.45μm孔セルロースアセテートフィルター(Millipore)を通して濾過し、ろ液をウイルス上清として用いた。トランスダクションの1日前に、TS細胞を6穴プレート(Greiner Bio One)に1ウェルあたり1 × 105個まいた。トランスダクションの日に、培地を4 mg/mlポリブレン(Nacalai Tesque)を添加したウイルス上清に交換し、次に24時間インキュベートした。
【０１４４】
（胚盤胞注入）
キメラマウスを作成するため、TS細胞をC57BL/6 胚盤胞中へ注入し、CD1偽妊娠マウスの子宮角へ移入した。全ての動物試験は、実験動物の管理と使用に関するガイドライン（RIKEN神戸研究所）に適合したものであり、機関の動物実験委員会により承認されたものである。
【０１４５】
［結果］
（化学的に定義された条件におけるTS細胞の樹立及び自己複製）
主要なシグナル経路の活性化（例、BMP、アクチビン、TGFβ、FGF、WNT等）に対する胎盤胞の反応を観察するため、本発明者は、最初に、BMP4、BMP7、LDN-193189、Dorsomorphin、アクチビンA、TGFβs1、GDF3、SB431542、A-83-01、LIF、FGF2、FGF4、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、WNT3、CHIR99021、XAV939、GF109203X、及びY27632の多様な組み合わせを含有する化学的に定義された培地（CDM）中で、マウス胚盤胞を培養した。その結果、CDM中におけるFGF2、アクチビンA、XAV939、及びY27632の組み合わせが、E3.5胎盤胞からの早いTE増殖を引き起こすことが示された。この目的のため、本発明者はOct3/4-EGFPレポーターを内部にもつ、CD1 × B6 F1 GOF18 胚盤胞（図1）(Yoshimizu et al.、1999)を、LIF、PD0325901（MEK阻害剤）、及びCHIR99021（GSK3阻害剤）を含有するCDM（CDM／L2i、ES細胞培養条件）、又はFAXYを含有するCDM（12.5 ng/ml FGF2、20 ng/ml activin A、10 nM XAV939、5 μM Y27632）(CDM/FAXY、TS細胞培養条件)中で培養した。5日後、CDM/L2i中で増殖した内部細胞塊（ICM）は、Oct3/4-EGFP陽性の増殖物（outgrowth）を生じた（図2、左）。対照的に、CDM/FAXY中で増殖した胚盤胞の外層（栄養膜外胚葉、TE）は、Oct3/4-EGFP陰性の増殖物を形成した（図2、右）。これらの初代TE外植片は、マウスES細胞の継代に用いるプロトコールに沿った単一細胞分散により、増殖させることができた。継代した細胞は、最初にコンパクトでドーム状のコロニーを形成し、その後次第に形状が変化し、TS細胞の特徴的形態となった（図3）。次に、本発明者は桑実胚及び胚盤胞（CD1 × B6 F1、CD1 × CD1、or 129 × B6 F1）を採集し、FGF2、FGF4、アクチビンA、XAV939、及びY27632の多様な組み合わせを含むCDM中で培養した。全ての遺伝学的バックグラウンドにおいて、TS細胞株は、FAXYを含有するCDM中でのみ効率的に誘導することができた（表1）。しばしば、エピブラスト幹細胞（EpiSC）(Brons et al.、2007; Tesar et al.、2007)様の非TS細胞が外植片の初期継代物中に現れた（表1）。これらの細胞は、最初にTS細胞と共存するが、TS細胞よりも速く増殖するため、最終的にTS細胞より優勢となった。更に、本発明者は、CDM/FAXY中で培養した、原腸陥入後 (E6.5) 129 × B6 F1胚から切り出した胚体外外胚葉 (ExE)から、TS細胞株を誘導することができた（図4、表1）。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
（TS細胞の分子的特性）
22継代後のTS細胞の免疫蛍光染色の結果、ほとんどすべての細胞において、栄養膜幹細胞マーカーであるcaudal-type homeobox protein 2 (Cdx2)の核局在が認められた（図5）。TS細胞とES細胞の増殖速度を比較するため、本発明者らは、各継代時（即ち、2日間隔）に2 × 105個の細胞をまいた。ES細胞の増殖速度（およそ8．9時間）は、TS細胞のそれ（およそ、9．2時間）よりも速かった（図6）。TS細胞は、少なくとも30継代まで維持することができた。
【０１４８】
分子状態を解析するため、本発明者は、定量的PCR（qPCR）により、TS細胞及びES細胞における遺伝子発現の特徴づけ及び比較を行った。TS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4、及びKlf4を含むES細胞特異的マーカー遺伝子をほとんど発現していなかった（図7）。反対に、それらの細胞は、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、及びCdx2を含むTS細胞マーカー遺伝子を高いレベルで発現していた。これらの遺伝子はES細胞においてはほとんど発現されていなかった（図7）。ES細胞と比較して、TS細胞は、estrogen-related receptor beta (Esrrb)及びtranscription factor activating enhancer-binding protein 2 gamma (Tcfap2c)を高いレベルで発現し、Kruppel-like factor 5 (Klf5)、retinoic acid-regulated zinc-finger gene (Rex1) (Rogers et al.、1991)、E-cadherin (Cdh1)、SRY-related HMG-box 2 (Sox2)、及びT-box transcription factor 3 (Tbx3)を同等のレベルで発現していた（図7）。E3.5 胚盤胞由来TS細胞及びE6.5 ExE由来TS細胞は、これらの遺伝子について極めて類似した発現パターンを示した（図7）。TS細胞及びES細胞の両方とも、外胚葉マーカー(Nestin、Sox1、Ncam)、中胚葉マーカー(Hoxa1、Hoxb1、Flk1、T)、及び内胚葉マーカー(Gata4、Gata6、Afp、Foxa2)をほとんど発現していなかった（図8）。
【０１４９】
（FGF2、アクチビンA、及びXAV939の必要性）
TS細胞を未分化状態で維持するためのFGF2の最適濃度を調べるため、本発明者は、E3.5 胚盤胞由来TS細胞(129 × B6 F1 バックグラウンド)を、12.5、25、又は50 ng/ml FGF2を含有するCDM/FAXY中で培養した。FGF2の濃度はTS細胞マーカー遺伝子 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Klf5、Elf5、及びTcfap2c)の発現レベルに影響を与えなかったが、FGF2は、分化した栄養膜系列マーカー（栄養膜巨細胞 (placental lactogen 1 [PL-1]、及びHomo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 1 [Hand1])、海綿状栄養膜細胞 (mammalian achaete-scute homologous protein 2 [Mash2] 及びtorophoblast specific protein alpha [Tpbp/4311])、及びラビリンス栄養膜(extraembryonic spermatogenesis homeobox 1 [Esx1]、glial cells missing homolog 1 [Gcm1]、及びdistal-less homeobox 3 [Dlx3])）の発現を用量依存的に抑制した（図9）。
【０１５０】
本発明者は、次にTS細胞及びES細胞におけるFGFリガンド類の発現レベルを比較した。脊椎動物においてはFGFファミリーは少なくとも23のメンバーからなる(Itoh and Ornitz、2008)。FGF4のみが、ES細胞において高いレベルで発現していた（図10）。本発明者は、また、TS細胞及びES細胞におけるFGF受容体遺伝子の発現レベルを解析した。TS細胞は、Fgfr1及びFgfr2を高いレベルで発現していた。これらは、二倍体栄養膜において強く発現している(Haffner-Krausz et al.、1999)。TS細胞は、Fgfr3を低いレベルで発現していた（図11）。ES細胞はFgfr1のみを高いレベルで発現していた。
【０１５１】
どの因子が、TS細胞の密な幹細胞様コロニー形態の維持に必要であるかを定義するため、本発明者は、FGF2、アクチビンA、またはXAV939を除いた時のTS細胞における形態変化を観察した。これらの試験の前の5回の継代については、TS細胞の未分化状態をCDM-FAXY (50 ng/ml FGF2)中で維持した。FGF2又はアクチビンAの除去により、劇的に増殖速度が減少し、主に平らな上皮細胞への分化が誘導された（図12）。XAV939の除去により、コロニーの端に分化した細胞の一貫した出現が生じた（図12）。
【０１５２】
次に、本発明者は、TS細胞及びその分化した子孫の特徴づけをqPCRにより行った。特に、本発明者は、各種マーカー（栄養膜幹細胞 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Elf5、Tcfap2c)、栄養膜巨細胞(PL-1、Hand1)、海綿状栄養膜細胞 (Mash2、Tpbp/-4311)、及びラビリンス栄養膜 (Esx1、Gcm1、Dlx3)）の発現を解析した。FGF2又はアクチビンAの除去により、Tcfap2cを除くTS細胞マーカー遺伝子の発現の急速な下方制御（図13、14）、及びラビリンス栄養膜マーカーであるGcm1を除く、全ての栄養膜細胞系列マーカーの急速な上方制御が生じた（図14、17）。XAV939の不在により、Cdx2及びTcfap2cの発現レベルにほとんど影響はなかったが、4日後において、この化合物の除去により、Eomes、Sox2、Esrrb、及びElf5の発現の抑制（図15）；Mash2、Dlx3、及びGcm1の上方制御（図16）；及びPL-1及びTpbp/4311の下方制御（図18）が生じた。
【０１５３】
（Y27632の必要性）
Y27632の必要性について検証するため、Y27632のみを培養から除き、その影響を調べた。Y27632の除去から24時間後において、FGF2、アクチビンA、又はXAV939を除いた時とは対照的に、約60％の細胞がポリカスパーゼ陽性アポトーシス細胞であり、非常に少数の細胞が生存していた（図19、20）。また、本発明者は、Y27632除去後においてもTS細胞の生存を維持できる細胞外マトリクスを検索した。本発明者は、TS細胞がY27632不在下で、マトリゲルコートしたディッシュ上で、少なくとも20継代維持できることを見出した。これらの細胞は、コンパクトでドーム形状をしたコロニー形態を呈した（図21）。
【０１５４】
（キメラマウスにおける胎盤へ寄与する能力）
TS細胞が胎盤へ寄与する能力を解析するため、これらの細胞をC57BL/6 胚盤胞胚(n=100)へ注入した。ドナーTS細胞の可視化のため、注入した細胞は、最初に、レンチウイルス感染によりCAG-EGFPにより標識された(Okada et al.、2007)。ドナーTS細胞は、E14.5のみにおいて、胎盤の胎仔部位へ寄与した(6/69、8.7%)(図22)。TS細胞は全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）へ分化した（図23）。母体の脱落膜又は胚体外中胚葉絨毛膜中には、TE由来細胞はなかった。
【０１５５】
過去の検討では、従来のTS細胞は、初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）のフィーダー層上で、FGF4、ヘパリン、血清、及び馴化培地の存在下で樹立され維持されてきた。この方法は、固い上皮様形態のコロニーの継代を可能にする。この系においては、FGF4、ヘパリン、又はMEFの除去によって、増殖の急速な低下、及びその後の巨細胞様形質を有する細胞への分化を生じる(Tanaka、1998)。この細胞株の継続的な維持のためには、線維芽細胞馴化培地をも要する(Tanaka、1998)。最適条件下でさえ、継代後のコロニーの端にいくつかの巨細胞が常に現れることから、小さいパーセントの細胞が分化していることが示唆される(Tanaka、1998)。一方、新たなTS細胞は、FGF4不在化で、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含有する培地中で樹立し、維持することができる。この条件は、典型的なTS細胞様上皮様形態及び幹細胞性を有するコロニーの継代を可能にした。50 ng/ml FGF4、20 ng/ml アクチビンA、10 nM XAV939、及び5 μM Y27632を含有するCDMは、TS細胞株を生じさせることはできなかった（表1）。
【０１５６】
従来のTS細胞培養条件（即ち、未定義の血清因子及びフィーダー細胞を含有する）からFGF4を除くと、その後、巨細胞様形質を有する細胞への分化が生じる(Tanaka、1998)。対照的に、CDM/FAXYからFGF2又はアクチビンAを除くと、増殖が急速に減少し、その後、全ての栄養膜細胞系列の細胞（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）への分化を生じた(図12、13、14、16、17)。この偏りのない分化能力は、新たなTS細胞がインビトロにおいて実質的に未分化状態を維持していることを示唆する。XAV939の除去により、ゆっくりとした分化、いくつかのTS細胞マーカー遺伝子の下方制御、及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化が生じた(図12、15、18)。これらの結果は、Wntシグナル阻害剤がTS細胞の未分化状態を安定的に維持するために必要であり、この化合物がFGF2及びアクチビンAとは異なる伝達経路を介して作用することを示す。TS細胞生存へのY27632の要求性は、マトリゲルでコートしたディッシュ上で細胞を培養することで回避することができたが、結果として得られた細胞は、典型的なTS細胞のコロニーとは異なるコロニー形態を有していた（図21）。
【０１５７】
いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進される(Ying et al.、2008; Li et al.、2009; Nichols et al.、2009)。対照的に、本発明者の結果は、FGF2によるFgfシグナルの活性化、アクチビンAによるアクチビンシグナルの活性化、及びXAV939によるWntシグナルの抑制によって、化学的に定義された条件中でTS細胞の誘導及び維持を可能とすることを示した。従って、ES細胞とTS細胞は、ICM及びTEの初期胚特性をそれぞれ反映するが、異なるシグナル条件下で誘導及び維持される。
【０１５８】
CDM/FAXYを用いて樹立されたTS細胞は、全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜 巨細胞 (gi)、海綿状栄養膜細胞 (sp)、及びラビリンス栄養膜 (la)）へ寄与することができた（図22、23）。この偏りのない分化能力は、キメラにおけるインビボでの栄養膜系列特異的寄与とともに、TS細胞が実質的に未分化な状態を維持していることを示唆する。
【０１５９】
これらの結果は、樹立されたTS細胞が、未分化栄養膜幹細胞の全ての基準（自己複製能力、マーカー遺伝子発現、全ての栄養膜サブタイプへインビトロにおいて分化する能力、及びキメラにおいて胎盤へ寄与する能力）を満たすことを示す。TS細胞を維持するシグナル経路を定義したことは、初期栄養膜発生に鍵となる洞察を与え、TEとICMとの間の分子相互作用を明らかにし、TS及びES細胞を用いた技術の発展を加速させる。
【０１６０】
［参考例２］
TS細胞の維持培養を、以下の２条件で行い、その形態を比較した。
１．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF4（50 ng/ml）及びヘパリン（10 ng/ml）を添加した、従来の培地（Manipulating mouse embryo third edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 8th chapter, protocol 8-9）。
２．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF2（50ng/ml）、ヘパリン（10 ng/ml）、アクチビンA（20 ng/ml）、XAV939（20 μM）を添加した培地。
【０１６１】
結果を図24に示す。FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した条件（図24、左）においては、未分化なTS細胞の特徴である、滑らかな辺縁を持つコロニーが多く形成され、巨細胞等の分化した細胞の出現が抑制された。この結果から、これらの因子の添加は、血清を含むMEF条件培地中においてもTS細胞の未分化性を維持し、培養することに有効であることが示された。
【０１６２】
［実施例１］
参考例１においてTS細胞の誘導及び維持に用いた培地（CDM/FAXY）に、ヘパリン（10 ng/ml）を添加した。このヘパリン含有CDM/FAXY培地にマトリゲルを2%の濃度で溶解し、室温で保温することにより、マトリゲルをゲル化させた。次に、遠心及びフィルター濾過を行うことによって、形成されたゲルを除去し、マトリゲルの水溶性成分を含むCDM/FAXY培地を得た。参考例１において樹立及び維持したTS細胞を、トリプシンなどの処理を行うことにより単一細胞あるいは数個（２〜５個）の細胞からなる塊に解離させ、この培地中に2 x 105 個/mlの濃度で分散し、接着細胞培養用の処理を行っていないpetri dishに播種することにより、浮遊培養を行った。TS細胞は分裂し、分裂した細胞同士が接着したまま、分離せずに分裂を繰り返すことにより、TS細胞の凝集塊を形成した。
【０１６３】
培養開始1日後には、TS細胞の凝集塊内部に、空スペースが認められるようになり、3日後には、単層の上皮からなる立体的な栄養外胚葉様の球構造が形成された（図25）。培地へのマトリゲル添加後の遠心および濾過によるゲルの除去は必須ではなかったが、本操作を省略した場合は、培地中に浮遊する浮遊物によって栄養外胚葉様の立体構造の形成が阻害され、効率が低くなった。
【０１６４】
形成されたTS細胞からなる栄養外胚葉様構造体は未分化な栄養膜系列細胞のマーカーであるCdx2を高発現していた（図26）。
【０１６５】
栄養外胚葉様構造体は胚盤胞に近似した大きさを有していた。また、この構造体は、胚盤胞の様な内腔を有しており、胚盤胞注入法と同様の方法によってES細胞を内腔中へ注入することができた（図27）。
【０１６６】
ES細胞を注入した栄養外胚葉様構造体は、胚盤胞と同様の方法によって偽妊娠マウス子宮に移植を行うことにより、高効率で着床した。着床後、胚盤胞移植時に酷似した外見上正常な脱落膜が形成された（図28）。
【０１６７】
以上の結果から、TS細胞から初期胚の栄養膜外胚葉様の機能的な立体組織がインビトロにおいて形成されたことが確認された。
【０１６８】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【０１６９】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１７０】
参考文献
Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K. and Lonai, P. (1998) 'Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5082-5087.
Brons, I. G. M., Smithers, L. E., Trotter, M. W. B., Rugg-Gunn, P., Sun, B., Chuva de Sousa Lopes, S. M., Howlett, S. K., Clarkson, A., Ahrlund-Richter, L., Pedersen, R. A. et al. (2007) 'Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos', nature 448(7150): 191-195.
Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.
Feldman, B., Poueymirou, W., Papaioannou, V. E., DeChiara, T. M. and Goldfarb, M. (1995) 'Requirement of FGF-4 for Postimplantation Mouse Development', Science 267: 246-249.
Haffner-Krausz, R., Gorivodsky, M., Chen, Y. and Lonai, P. (1999) 'Expression of Fgfr2 in the early mouse embryo indicates its involvement in preimplantation development', Mechanisms of Development 85: 167-172.
Huang, S. M., Mishina, Y. M., Liu, S., Cheung, A., Stegmeier, F., Michaud, G. A., Charlat, O., Wiellette, E., Zhang, Y., Wiessner, S. et al. (2009) 'Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling', nature461(7264): 614-20.
Itoh, N. and Ornitz, D. M. (2008) 'Functional evolutionary history of the mouse Fgf gene family', Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 237(1): 18-27.
Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. (2009) 'Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4(1): 16-9.
Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78(12): 7634-7638.
Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E. M., Prideaux, V. R., Ivanyi, E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.
Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136(19): 3215-22.
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 9(5): 471-7.
Okada, Y., Ueshin, Y., Isotani, A., Saito-Fujita, T., Nakashima, H., Kimura, K., Mizoguchi, A., Oh-Hora, M., Mori, Y., Ogata, M. et al. (2007) 'Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer', Nature biotechnology 25(2): 233-7.
Rappolee, D. A., Basilico, C., Patel, Y. and Werb, Z. (1994) 'Expression and function of FGF-4 in peri-implantation development in mouse embryos', Development 120: 2259.
Rogers, B. M., Hosler, A. B. and Gudas, J. L. (1991) 'Specific expression of a retinoic acid-regulated, zinc-finger gene, Rex-1, in preimplantation embryos, trophoblast and spermatocytes', Development 113: 815-824.
Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.
Smith, A. G., Heath, J. K., Donaldson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides', nature 336: 688-690.
Sumi, T., Oki, S., Kitajima, K. and Meno, C. (2013) 'Epiblast Ground State Is Controlled by Canonical Wnt/β-Catenin Signaling in the Postimplantation Mouse Embryo and Epiblast Stem Cells', PLoS ONE 8(5): e63378.
Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075.
Tesar, P. J., Chenoweth, J. G., Brook, F. A., Davies, T. J., Evans, E. P., Mack, D. L., Gardner, R. L. and McKay, R. D. G. (2007) 'New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells', nature448(7150): 196-199.
Uehata, M., Ishizaki, T., Satoh, H., Ono, T., Kawahara, T., Morishita, T., Tamakawa, H., Yamagami, K., Inui, J., Maekawa, M. et al. (1997) 'Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension', nature 389: 990-994.
Wilder, P. J., Kelly, D., Brigman, K., Peterson, C. L., Nowling, T., Gao, Q.-S., McComb, R. D., Capecchi, M. R. and Rizzino, A. (1997) 'Inactivation of the FGF-4 Gene in Embryonic Stem Cells Alters the Growth and/or the Survival of Their Early Differentiated Progeny', Developmental Biology 192: 614-629.
Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A. and Gough, N. M. (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.
Xu, X., Weinstein, M., Li, C., Naski, M., Cohen, R. I., Ornitz, D. M., Leder, P. and Deng, C. (1998) 'Fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)-mediated reciprocal regulation loop between FGF8 and FGF10 is essential for limb induction', Development 125: 753-765.
Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.
Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal', nature 453(7194): 519-23.
Yoshimizu, T., Sugiyama, N., Felice, M. D., Yeom, Y. I., Ohbo, K., Masuko, K., Obinata, M., Abe, K., Scholer, H. R. and Matsui, Y. (1999) 'Germline-specific expression of the Oct-4/green fluorescent protein (GFP) transgene in mice', Development Growth & Differentiation41: 675-684.
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明によれば、TS細胞から、栄養膜外胚葉様の機能的な胞状構造体を製造することができる。この胞状構造体は、内腔に多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植すると、子宮に着床する活性を有するので、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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