(57)【要約】【課題】簡便かつ効率的に電極表面積を増大させることのできるマイクロ電極の電極表面の処理方法及び表面処理マイクロ電極の製造方法、並びに電極表面積が大きい表面処理マイクロ電極を提供する。【解決手段】マイクロ電極の電極表面の処理方法は、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて１００ｍＭ未満の酸性溶液に浸された、導電性細線を備えるマイクロ電極に対して印加処理する工程を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて１００ｍＭ未満の酸性溶液に浸された、導電性細線を備えるマイクロ電極に対して印加処理する工程を含む、マイクロ電極の電極表面の処理方法。
【請求項２】
前記導電性細線の直径は、５００μｍ以下である、
ことを特徴とする請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
前記印加処理において、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜８００秒間印加し、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を０〜６０秒間印加する、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の処理方法。
【請求項４】
前記酸性溶液は、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液及び硫酸溶液からなる群より少なくとも１つ選択される溶液である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項５】
前記印加処理する工程を、１〜２０回行う、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項６】
前記マイクロ電極は、前記導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の処理方法を用いる、
ことを特徴とする表面処理マイクロ電極の製造方法。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の処理方法によって処理された電極表面を有する表面処理マイクロ電極。
【請求項９】
請求項７に記載の製造方法によって製造された表面処理マイクロ電極。
【請求項１０】
導電性細線を備え、
電極表面には、断面直径１０〜５０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造が形成されている、
ことを特徴とする表面処理マイクロ電極。
【請求項１１】
前記導電性細線の直径は、５００μｍ以下である、
ことを特徴とする請求項１０に記載の表面処理マイクロ電極。
【請求項１２】
前記導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える、
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の表面処理マイクロ電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ電極の電極表面の処理方法、表面処理マイクロ電極の製造方法及び表面処理マイクロ電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）に用いられる電極については、高い空間分解能を得るために、電極の微細化が必須である。しかしながら、電極面積の微小化に伴って検出電流が低下するという問題があり、電極を微細化する上で障壁となっていた。
【０００３】
検出電流を低下させずに電極の微細化を図るには、電極の表面積を増大させることが必要である。
【０００４】
電極表面に微細な構造を形成することで、電極の表面積を増大させる手法がいくつか提案されてきた。
【０００５】
非特許文献１では、金属微粒子やカーボンナノチューブを電極表面に修飾する手法が開示されている。
【０００６】
非特許文献２では、メッキ技術に代表される電析手法により電極表面に金属を析出させる手法が開示されている。
【０００７】
非特許文献３では、マスク処理、露光処理、エッチング処理などの微細加工技術により電極表面にナノ構造を作製する手法が開示されている。
【０００８】
非特許文献４では、電極表面に酸化還元処理を施すことで金属表面に凹凸を形成する手法が開示されており、より具体的には、金基板にナノ構造を形成することにより、ラマン計測の高感度化が達成されたことが記載されている。
【０００９】
非特許文献５でも同様に、電極表面に酸化還元処理を施すことで金属表面に凹凸を形成する手法が開示されており、より具体的には、直径３ｍｍのディスク電極に対して酸化還元処理を行い、酵素固定化電極における機能化を行ったことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｍｉｔｒｙ  Ｐａｎｋｒａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，２０１４，４，３８１６４−３８１６８
【非特許文献２】Ｊｕ−Ｈｙｕｎ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ｆｌａｋｅ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（２０１０）０８５３０３
【非特許文献３】Ｎｉａｎｊｕｎ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｅｒｔｉｃａｌｌｙ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｎａｎｏｗｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，５１８３−５１８５
【非特許文献４】Ｙｕ−Ｃｈｕａｎ  Ｌｉｕ，Ｃｈｅｅ−Ｃｈａｎ  Ｗａｎｇ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｒｇｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｒｏｕｇｈｅｎｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００５，１０９（１２），ｐｐ  ５７７９−５７８２
【非特許文献５】Ｙａｓｕｈｉｒｏ  Ｍｉｅ，Ｍａｓａａｋｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ  Ｙａｓｕｏ  Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．２００９，１３１，６６４６−６６４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、非特許文献１に記載の手法を用いて、ＳＥＣＭ用などの微細な電極表面（例えば、直径５０μｍ以下）に対して微粒子やカーボンナノチューブを固定化すると、電極表面のみならず、電極を被覆するガラス材など電極表面以外の箇所にも、微粒子やカーボンナノチューブが固定化されてしまうため、電極表面に限定して固定化させることができず、電極の表面積を効率的に増大させるのは困難であった。
【００１２】
また、非特許文献２に記載の手法では、電極表面に金属を析出させるために多種類の薬剤を使用する必要がある。このため、簡便に行うことができず、また、高コストとなることが課題であった。
【００１３】
また、非特許文献３に記載の手法では、再現性に優れ、精度の高いナノ構造を作製するのに適しているものの、処理工程が煩雑であるため、上記同様に、簡便に行うことができず、また、高コストとなることが課題であった。
【００１４】
また、非特許文献４、５に記載の手法では、金属表面に微粒子を形成することができるものの、ＳＥＣＭ用などの微細な電極表面（例えば、直径５０μｍ以下）に対して適用した場合に凹凸を形成させるのが困難であった。
【００１５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ効率的に電極表面積を増大させることのできるマイクロ電極の電極表面の処理方法及び表面処理マイクロ電極の製造方法、並びに電極表面積が大きい表面処理マイクロ電極を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るマイクロ電極の電極表面の処理方法は、
遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて１００ｍＭ未満の酸性溶液に浸された、導電性細線を備えるマイクロ電極に対して印加処理する工程を含む。
【００１７】
例えば、前記導電性細線の直径は、５００μｍ以下である。
【００１８】
例えば、前記印加処理において、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜８００秒間印加し、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を０〜６０秒間印加する。
【００１９】
例えば、前記酸性溶液は、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液及び硫酸溶液からなる群より少なくとも１つ選択される溶液である。
【００２０】
例えば、前記印加処理する工程を、１〜２０回行う。
【００２１】
例えば、前記マイクロ電極は、前記導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える。
【００２２】
本発明の第２の観点に係る表面処理マイクロ電極の製造方法は、
本発明の第１の観点に係るマイクロ電極の電極表面の処理方法を用いる。
【００２３】
本発明の第３の観点に係る表面処理マイクロ電極は、
本発明の第１の観点に係るマイクロ電極の電極表面の処理方法によって処理された電極表面を有する。
【００２４】
本発明の第４の観点に係る表面処理マイクロ電極は、
本発明の第２の観点に係る表面処理マイクロ電極の製造方法によって製造される。
【００２５】
本発明の第５の観点に係る表面処理マイクロ電極は、
導電性細線を備え、
電極表面には、断面直径１０〜５０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造が形成されている、
ことを特徴とする。
【００２６】
例えば、前記導電性細線の直径は、５００μｍ以下である。
【００２７】
例えば、前記導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、簡便かつ効率的に電極表面積を増大させることのできるマイクロ電極の電極表面の処理方法及び表面処理マイクロ電極の製造方法、並びに電極表面積が大きい表面処理マイクロ電極を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】導電性細線と、導電性細線を被覆する絶縁材と、を備えるマイクロ電極を概念的に表す図である。
【図２】（ａ）は、印加処理後のマイクロ電極の電極表面の走査型電子顕微鏡イメージの図であり、（ｂ）は、（ａ）の一部を拡大した走査型電子顕微鏡イメージの図である。（ｃ）は、比較例の印加処理後の金細線の電極表面の走査型電子顕微鏡イメージの図であり、（ｄ）は、（ｃ）の一部を拡大した走査型電子顕微鏡イメージの図である。
【図３】（ａ）は、印加処理後のマイクロ電極の電極表面の電子顕微鏡写真の図であり、（ｂ）は、倍率２万倍の電子顕微鏡写真の図であり、（ｃ）は、倍率５万倍の電子顕微鏡写真の図である。（ｄ）は、印加処理前のマイクロ電極の電極表面の電子顕微鏡写真の図であり、（ｅ）は、倍率２万倍の電子顕微鏡写真の図であり、（ｆ）は、倍率５万倍の電子顕微鏡写真の図である。
【図４】電極表面積の測定結果を示す図である。
【図５】電極表面におけるオクタデカンチオールの固定化量の測定結果を示す図である。
【図６】電極表面におけるチオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化量の測定結果を示す図である。
【図７】（ａ）は、印加処理後の直径５０μｍの金細線によるマイクロ電極の電極表面の走査型電子顕微鏡イメージの図であり、（ｂ）は、（ａ）の一部を拡大した走査型電子顕微鏡イメージの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
まず、本発明によるマイクロ電極の電極表面の処理方法について詳細に説明する。
【００３１】
本発明によるマイクロ電極表面の処理方法は、走査型電気化学顕微鏡などに用いられるマイクロ電極（図１）の電極表面に対して印加処理を施すことで、電極表面に三次元の網状構造からなる微細構造（後述）を形成させる方法である。その結果、電極表面積を増大させることができ、酵素、オリゴヌクレオチドなどの固定化量を増加させることが可能となる。なお、本発明によるマイクロ電極表面の処理方法によって電極表面に対して印加処理を施すと、電極表面において酸化還元反応が起こることから、本明細書において、「印加処理」を、「酸化還元処理」又は「ＯＲＣ処理」という場合がある。
【００３２】
本発明の処理方法で用いるマイクロ電極は、導電性細線を備えるが、図１に示すように、導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備えていてもよい。
【００３３】
本明細書において、マイクロ電極又は導電性細線の「先端部」とは、電極として使用する一端を指し、導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える場合、図１に示すように、絶縁材から導電性細線が露出している側をいう。
【００３４】
本明細書において、「電極表面」とは、導電性細線の電極として使用する側の一端の面をいう。導電性細線を被覆する絶縁材を備えない場合、「電極表面」とは、導電性細線の先端面及び先端面近傍の側面をいい、導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える場合、図１に示すように、マイクロ電極の先端部において、絶縁材から露出している導電性細線の一端の面をいう。
【００３５】
導電性細線の素材は、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、タングステン（Ｗ）、ステンレス及びカーボンからなる群より少なくとも１つ選択され、これらの２つ以上からなる合金であってもよい。
【００３６】
絶縁材の素材としては、ガラスであってもよく、例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルエーテルケトンケトン（ＰＥＥＫＫ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、及びポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルケトンエーテルケトン、ポリエーテルニトリル、及びポリアリレートからなる群より少なくとも１つ選択される樹脂であってもよく、これらの２つ以上からなる樹脂であってもよい。
【００３７】
本明細書において、「導電性細線の直径」は、導電性細線の断面直径であり、導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備える場合、図１に示すように、電極表面の直径と略同じであり、図１において「ｄ」で表される。導電性細線の直径は、例えば、５００μｍ以下である。導電性細線の直径が１〜５００μｍの場合、走査型電気化学顕微鏡の探針として利用した場合の解像度が高くなる。また、より高い解像度の観点から、導電性細線の直径は、例えば、１〜４００μｍ、１〜３００μｍ、１〜２００μｍ、好ましくは１〜１５０μｍ、より好ましくは１〜１００μｍ、さらにより好ましくは１〜８０μｍ、１〜７０μｍ、１〜６０μｍ、１〜５０μｍ、１〜４０μｍ、１〜３０μｍ、１〜２０μｍ又は１〜１０μｍである。
【００３８】
本発明のマイクロ電極表面の処理方法は、酸性溶液に浸されたマイクロ電極に対して印加処理する工程を含む。
【００３９】
酸性溶液は、例えば、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液又は硫酸溶液であってもよく、これらの混合溶液であってもよい。酸性溶液の濃度は、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて１００ｍＭ未満であり、この濃度範囲では、直径が１〜５００μｍの導電性細線を備えるマイクロ電極の電極表面に、後述する三次元の網状構造からなる微細構造を形成させることができる。酸性溶液の濃度は、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して、例えば、好ましくは５〜８０ｍＭ、より好ましくは１０〜６５ｍＭ、さらに好ましくは１５〜５５ｍＭである。直径が５０μｍの導電性細線を備えるマイクロ電極の電極表面においては、例えば、１５〜５５ｍＭの塩酸溶液を好適に用いることができる。なお、非特許文献４、５に記載の酸化還元処理では、１００ｍＭの塩酸が使用されているが、本発明のマイクロ電極表面の処理方法は、非特許文献４、５に記載の塩酸よりも低い水素イオンの濃度の酸性溶液を要する。
【００４０】
印加処理においては、例えば、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜８００秒間印加し、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を０〜６０秒間印加するのが好ましい。印加処理は、例えば、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜６００秒間印加し、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を０〜６０秒間印加する処理でもよく、例えば、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜６０秒間印加し、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を１〜６０秒間印加する処理でもよい。印加については、当業者に公知の方法により適宜行うことができるが、例えば、電気化学装置として北斗電工株式会社製のＨＺ−５０００を使用した３極式による印加処理を行ってもよく、例えば、参照電極として銀・塩化銀電極（ＲＥ−１ＣＰ、ＢＡＳ社製）を使用してもよく、例えば、対極電極として白金電極を使用してもよい。
【００４１】
印加処理する工程は、例えば、１〜２０回行われる。回数が多いほど、より良好に電極表面に三次元の網状構造からなる微細構造を形成させることができ、ひいては、電極表面積をより増大させ、酵素、オリゴヌクレオチドなどの固定化量をより増大させることができる。
【００４２】
次に、本発明による表面処理マイクロ電極の製造方法について説明する。
【００４３】
本発明による表面処理マイクロ電極の製造方法は、前述の本発明によるマイクロ電極の電極表面の処理方法を用いるものである。
【００４４】
本発明による表面処理マイクロ電極の製造方法の一例を示す。まず、前述同様の絶縁材をプラーにて細線化し、前述同様の導電性細線を絶縁材内に熱封止する。次に、先端部を、ラッピングフィルムを用いて研磨し平坦化して、マイクロ電極を得る。次に、マイクロ電極の先端部をサイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）により電解洗浄する。次に、マイクロ電極を１０〜５０ｍＭの塩酸溶液に浸し、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜６０秒間印加、次に０Ｖを超えて０．８Ｖ以下の電圧を１〜６０秒間印加を１サイクルとして、１〜２０サイクル行うことで、電極表面に印加処理を施し、表面処理マイクロ電極を得る。このようにして製造された表面処理マイクロ電極の電極表面には、後述する三次元の網状構造からなる微細構造が形成されている。
【００４５】
次に、本発明による表面処理マイクロ電極について詳細に説明する。
【００４６】
本発明による表面処理マイクロ電極は、導電性細線を備えるが、図１に示すように、導電性細線を被覆する絶縁材をさらに備えていてもよい。
【００４７】
導電性細線の素材は、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、タングステン（Ｗ）、ステンレス及びカーボンからなる群より少なくとも１つ選択され、これらの２つ以上からなる合金であってもよい。
【００４８】
絶縁材の素材としては、ガラスであってもよく、例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルエーテルケトンケトン（ＰＥＥＫＫ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、及びポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルケトンエーテルケトン、ポリエーテルニトリル、及びポリアリレートからなる群より少なくとも１つ選択される樹脂であってもよく、これらの２つ以上からなる樹脂であってもよい。
【００４９】
導電性細線の直径は、例えば、５００μｍ以下である。導電性細線の直径が１〜５００μｍの場合、走査型電気化学顕微鏡の探針として利用した場合の解像度が高くなる。また、より高い解像度の観点から、導電性細線の直径は、例えば、１〜４００μｍ、１〜３００μｍ、１〜２００μｍ、好ましくは１〜１５０μｍ、より好ましくは１〜１００μｍ、さらにより好ましくは１〜８０μｍ、１〜７０μｍ、１〜６０μｍ、１〜５０μｍ、１〜４０μｍ、１〜３０μｍ、１〜２０μｍ又は１〜１０μｍである。
【００５０】
本発明による表面処理マイクロ電極の電極表面には、例えば、図２（ａ）、（ｂ）で示されるような、断面直径１０〜５０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造が形成されている。この微細構造は、略円柱状突起物が、三次元的に枝状に分布する網状のナノ構造であり、略円柱状突起物の断面直径は、１０〜５０ｎｍ、好ましくは２０〜４０ｎｍである。電極表面にこのような微細構造が形成されていることで、電極表面積を増大させることができ、その結果、酵素、オリゴヌクレオチドなどの固定化量を増加させることができる。なお、本発明による表面処理マイクロ電極の電極表面に形成されている上記の微細構造は、非特許文献４、５に記載の手法で金属表面に形成される微粒子構造とは、全く異なる形状を有するものである。
【００５１】
本明細書において、「表面処理マイクロ電極」とは、電極表面に上記の微細構造が形成されているマイクロ電極をいう。
【００５２】
本発明による表面処理マイクロ電極の電極表面に形成された微細構造については、例えば、走査型電子顕微鏡、電子顕微鏡等を用いて電極表面を観察することで、確認可能である。
【００５３】
本発明による表面処理マイクロ電極の作製方法については、電極表面に上記の微細構造を形成させることのできる方法であれば、適宜採用することができるが、前述の本発明によるマイクロ電極の電極表面の処理方法を用いて作製してもよく、前述の本発明による表面処理マイクロ電極の製造方法を用いて作製してもよい。
【００５４】
以上説明したように、本発明によるマイクロ電極の電極表面の処理方法及び表面処理マイクロ電極の製造方法は、多種類の薬剤を用いる必要なく処理工程も単純であるため、非常に簡便に、かつ低コストで、マイクロ電極の表面積を増大させるための処理を施すことができる。また、微細領域であるマイクロ電極の電極表面に限局して、確実に処理を施すことができる。また、本発明によるマイクロ電極の電極表面の処理方法及び表面処理マイクロ電極の製造方法によれば、効率的に電極表面に上記の微細構造を形成させることができるため、電極表面積の増大効果が高く、酵素、オリゴヌクレオチドなどの固定化量を確実に増大させることができる。
【００５５】
また、本発明による表面処理マイクロ電極は、電極表面に上記の微細構造が形成されているため、電極表面積が大きく、より多くの酵素、オリゴヌクレオチドなどを電極表面に固定化することができる。このため、本発明による表面処理マイクロ電極を用いることで、走査型電気化学顕微鏡の探針の高性能化及び多機能化を図ることが可能となる。また、マイクロ流路で構成されるＬａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐに用いられる電極に適用することも可能と考えられる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５７】
（実施例１）
絶縁材としてのガラスキャピラリー（１．５／０．８４ｍｍ，ＯＤ／ＩＤ）をプラーにて細線化し、直径５０μｍの金（Ａｕ）細線（導電性細線）をガラス内に熱封止して、マイクロ電極（外径：約１００μｍ）を得た。マイクロ電極の先端を、ラッピングフィルム（＃４，０００、＃１５，０００）を用いて研磨し平坦化して、サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）（硫酸：０．５Ｍ，５０ｍＶ／ｓ，０〜１．６Ｖ，１５サイクル）により電解洗浄した。
【００５８】
前記の通り得られたマイクロ電極を塩酸（２５ｍＭ）電解液に浸し、１．２２Ｖ：３０秒間、続いて０．２８Ｖ：３０秒間を１サイクルとして、１０サイクルの印加処理（酸化還元処理）を行った。印加処理の方法について説明する。電気化学装置として北斗電工株式会社製のＨＺ−５０００を使用した３極式による印加処理を行った。参照電極として銀・塩化銀電極（ＲＥ−１ＣＰ、ＢＡＳ社製）を使用し、対極電極として白金電極を使用した。
【００５９】
比較例として、直径３ｍｍの金細線（ビー・エー・エス株式会社、ＡＵＥ金電極、カタログ番号：００２４２１）を塩酸（１００ｍＭ）電解液に浸し、上記同様の印加条件及び方法にて印加処理を行った。
【００６０】
図２（ａ）、（ｂ）に印加処理後のマイクロ電極の電極表面の走査型電子顕微鏡イメージを示す。図２（ａ）では、三次元の網目構造からなる微細構造が見られる。図２（ａ）の一部を拡大した図２（ｂ）では、三次元の網目構造が断面直径２０〜３０ｎｍの略円柱状突起物によって構成されていることがわかる。
【００６１】
図２（ｃ）、（ｄ）に比較例の印加処理後の金細線（直径３ｍｍ）の電極表面の走査型電子顕微鏡イメージを示す。金属表面に微粒子状構造は形成されているものの、図２（ａ）、（ｂ）の微細構造とは全く形状が異なっていた。このように、直径３ｍｍの金細線を用いて１００ｍＭの塩酸に浸して印加処理を行った比較例では、図２（ａ）、（ｂ）で示されたような三次元の網目構造からなる微細構造は形成されていなかった。
【００６２】
図３（ａ）−（ｃ）に印加処理後のマイクロ電極の電極表面の電子顕微鏡写真（ＦＥ−ＳＥＭ）を示す。高倍率とした図３（ｂ）、（ｃ）では、断面直径２０〜３０ｎｍの略円柱状突起物によって構成された三次元の網目構造からなる微細構造が見られる。
【００６３】
図３（ｄ）−（ｆ）に印加処理を行う前のマイクロ電極の電極表面の電子顕微鏡写真（ＦＥ−ＳＥＭ）を示す。印加処理前では、図３（ａ）−（ｃ）で観察されたような微細構造は見られなかった（電極表面は、＃１５，０００のラッピングフィルムにより研磨しているため平面性が高い）。なお、図３（ｅ）、（ｆ）において左下から右上方向に見られる筋はラッピングフィルムによる研磨跡であり、写真中に見られる小さな穴は、単なる電極のキズ（欠損）である。
【００６４】
（実施例２）
既報の手法を用い、印加処理前後のマイクロ電極の電極表面積を評価した（Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｏｎ  ＧＣ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １５２  （１）  Ｃ１−Ｃ６  （２００５）を参照）。より具体的に以下に説明する。硫酸（０．５Ｍ）を電解液としてサイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）（５０ｍＶ／ｓ，０Ｖ〜１．６Ｖ〜０Ｖ，１サイクル）を適用すると、還元サイクルの０．９Ｖ付近に還元ピークが観察される。このピークの電荷量は、酸化サイクルにおいて金電極表面に形成された１層の酸化被膜が還元される際に流れるもので、この電荷量を基に電極の表面積を評価することができる。
【００６５】
実施例１で行った印加処理の前後において上記の手法を適用し、電極表面積に起因する電荷量の測定を行った。測定結果を図４に示す。印加処理前の電荷量は１．２×１０＋８クーロンであったのに対し、印加処理後では３．２×１０＋９クーロンと約２７倍増加した。これは、マイクロ電極の表面積が印加処理により２７倍増加したことを示している。
【００６６】
（実施例３）
マイクロ電極の印加処理のサイクル数が、オクタデカンチオール固定化量に与える影響について検討した。実施例１と同様の印加処理を、１〜１８サイクル、実施例１と同様にマイクロ電極の電極表面に行い、既報の手法を用いて、印加処理後のマイクロ電極のチオール基の固定化量を評価した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｌｅｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｇｏｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ,  ４９  （２００４）  ２１８９を参照）。より具体的に以下に説明する。金電極をオクタデカンチオール（１ｍＭ，エタノール）に浸漬すると、チオール基と金が金チオール結合によって結合しオクタデカンチオールの単分子膜が形成される。この時、電極に負電圧を印加するとチオール基は金電極から還元脱離し、流れる電荷量からチオール基の脱離量、すなわち電極に固定化されていたオクタデカンチオール量を算出することができる。
【００６７】
電極表面におけるオクタデカンチオールの固定化量の測定結果を図５に示す。図５の横軸の「ＯＲＣ  ｃｙｃｌｅｓ」は、印加処理のサイクル数を表し、縦軸の「ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２」は投影単位面積当たりの固定化量を表す。印加処理のサイクル数の増加に従い、オクタデカンチオールの固定化量が増加した。このことは、印加処理のサイクル数に応じて微細構造の形成が増加し、マイクロ電極の電極表面積が増加したためと考えられる。
【００６８】
（実施例４）
絶縁材として、実施例１で用いたガラスキャピラリーの代わりに、ＰＥＥＫ樹脂（ポリエーテルエーテルケトン，ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｔｈｅｒｋｅｔｏｎｅ）を使用して、実施例１と同様に金線（直径５０μｍ）を封止して、マイクロ電極を作製した。このＰＥＥＫを使用したマイクロ電極に、実施例１と同様に印加処理（１０サイクル）を行った。
【００６９】
上記で得られたＰＥＥＫを使用したマイクロ電極を用いて、実施例３と同様にオクタデカンチオールの投影面積当たりの固定化量を計測したところ、８．５×１０＋１５ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２であり、ガラスキャピラリー製のマイクロ電極とほぼ同等の固定化量であった。本実施例の印加処理は、ガラスキャピラリーを使用したマイクロ電極のみならず、ＰＥＥＫを使用したマイクロ電極にも適用可能であることが示された。
【００７０】
（実施例５）
印加処理したマイクロ電極の電極表面に対するチオール修飾オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）の固定化量を評価した。なお、チオール修飾オリゴヌクレオチドを介して、電極表面に酵素を固定することができる。
【００７１】
実験に用いたチオール修飾オリゴヌクレオチドを以下に示す（配列番号１−４）
【００７２】
【化１】
2016211882.tif 000003
【００７３】
リン酸バッファ（０．５Ｍ，ｐＨ７）に、上記のチオール修飾オリゴヌクレオチド（０．２μＭ）を溶解して、チオール修飾オリゴヌクレオチド溶液を調製した。実施例１で得られた印加処理（１０サイクル）により微細構造を形成したマイクロ電極、及び比較例として印加処理を行う前のマイクロ電極（マイクロフィルム（＃１５，０００）にて研磨）を、各々、上記のチオール修飾オリゴヌクレオチド溶液に１６時間浸漬した。その後、ｍｉｌｌｉＱ水（３０℃）にて１０分間洗浄し、チオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化量を測定した。
【００７４】
チオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化量については、ルテニウム錯体を用いる方法により測定した。より詳細には、ルテニウム錯体溶液（４ｍＭ，Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５）を電解液とし、電解液の溶存酸素をアルゴンガスの置換により脱気し、ボルタモグラム（０  ｔｏ  −０．５Ｖ  ｖｅｒｓｕｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ，５０ｍＶ／ｓ）を計測し、チオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化量を測定した（Ｙｕ，Ｈ．Ｚ．；Ｌｕｏ，Ｃ．Ｙ．；Ｓａｎｋａｒ，Ｃ．Ｇ．；Ｓｅｎ，Ｄ．，Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３，７５，（１５），３９０２−３９０７．）。
【００７５】
電極表面におけるチオール修飾オリゴヌクレオチドの投影面積当たりの固定化量の測定結果を図６に示す。図６中、「Ｆｌａｔ  ＥＬ」は、比較例の印加処理を行う前のマイクロ電極を表し、「ＯＲＣ  ＥＬ」は、本実施例による印加処理により電極表面に微細構造を形成したマイクロ電極を表す。「Ｆｌａｔ  ＥＬ」では３．８５×１０＋１２ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２であるのに対し、「ＯＲＣ  ＥＬ」では４．４×１０＋１３ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２であり、「Ｆｌａｔ  ＥＬ」に比して１１．４倍のチオール修飾オリゴヌクレオチドを固定化することができた。このように、本実施例における印加処理により電極表面に微細構造を形成したマイクロ電極では、電極表面の表面積が増大しているため、より多くのチオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化が可能であることが示された。
【００７６】
さらに、実施例１と同様の直径３ｍｍの金細線を、塩酸（２５ｍＭ）電解液に浸し、実施例１と同様の印加条件及び方法にて印加処理を行い、「印加処理３ｍｍ電極」とした。一方、実施例１と同様の直径３ｍｍの金細線に上記のような処理を行わないものを、「非印加処理３ｍｍ電極」とした。「印加処理３ｍｍ電極」及び「非印加処理３ｍｍ電極」について、前述同様にチオール修飾オリゴヌクレオチドの投影面積当たりの固定化量を比較した。その結果、「非印加処理３ｍｍ電極」では２．８５×１０＋１２ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２、「印加処理３ｍｍ電極」では３．０×１０＋１２ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｃｍ２となり、チオール修飾オリゴヌクレオチドの固定化量は、印加処理を行うことにより１．０５倍増加した。しかしながら、この１．０５倍という増加率は、上記の１１．４倍の増加率とは大きく異なり、直径３ｍｍの電極の場合では、本実施例によるマイクロ電極とは違って、電極表面に微細構造は形成されないと判断された。
【００７７】
（実施例６）
直径５０μｍの金細線からなるマイクロ電極をサイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）（硫酸：０．５Ｍ,  ５０ｍＶ／ｓ，０〜１．６Ｖ，１５サイクル）により電解洗浄し、塩酸（２５ｍＭ）電解液に浸し、１．２２Ｖ：３０秒間、続いて０．２８Ｖ：３０秒間を１サイクルとして、２０サイクルの印加処理（酸化還元処理）を行った。
【００７８】
図７（ａ）、（ｂ）に印加処理後のマイクロ電極の走査型電子顕微鏡イメージを示す。図７（ａ）には金細線の先端面及び側面に微細構造が見られ、図７（ａ）の一部を拡大した図７（ｂ）では、三次元の網目構造が断面直径２０〜３０ｎｍの略円柱状突起物によって構成されていることがわかる。このように、ガラス等の絶縁材によって被覆されていない場合でも、本実施例による印加処理によって電極表面への微細構造の形成が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2016211882000001.app