(57)【要約】【課題】  本発明は、サイクルタイムを短縮させても増幅効率が低減することを抑制させることを目的とする。【解決手段】  本発明では、標的核酸の変性温度に加熱される容器１０の第１領域３６Ａに液滴２０を移動させて留める変性段階、および、当該第１領域３６Ａとは異なる容器１０の第２領域３６Ｂに液滴２０を移動させて留める合成段階を経るサイクルが複数回繰り返される。液滴２０には蛍光標識プローブが含有され、当該蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含む。【選択図】    図７
2016214203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴と、前記液滴の比重とは異なり相分離するオイルとが収容される容器を装着する装着部と、
前記装着部に装着される前記容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定する第１ヒーターと、前記第１領域とは異なる前記容器の第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する第２ヒーターと、
前記第１領域から前記第２領域に前記液滴を移動させ、および前記第２領域から前記第１領域に前記液滴を移動させる移動機構と、
前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅装置。
【請求項２】
前記第２領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は２０秒未満とされる、請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
前記第２領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は６秒以下とされる、請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
鋳型核酸を含む溶液の液滴が導入され、前記液滴が移動する流路を有する容器と、
前記容器に収容され、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬と、
を備える核酸増幅用カートリッジであって、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅用カートリッジ。
【請求項５】
前記液滴の体積は、０．２μＬ以上２μＬ以下である、請求項４に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項６】
前記試薬は凍結乾燥され、前記容器内壁に固定される、請求項４または５に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項７】
前記容器に収容され、前記反応液とは比重が異なり、相分離するオイルを有する、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項８】
前記標的核酸における合成反応期間は２０秒未満とされる、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項９】
前記標的核酸における合成反応期間は６秒以下とされる、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１０】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-CGGGACGGAAAGACC-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１１】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-AATGGCAAGGCCGAACGCTTCA-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１２】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA 3’
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA 3’
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-GAGTGCACCAGCCACACCGC-NFQ-MGB 3’
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１３】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴が収容される容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第１領域とは異なる第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する温度調整ステップと、
前記第１領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、
を備え、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は増幅核酸装置、増幅核酸用カートリッジおよび増幅核酸方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ(polymerase chain reaction)法は、核酸における鎖長の違いなどを要因としてその核酸の変性やアニーリングの違いが生じることを利用し、当該核酸に対する温度変化を複数サイクル繰り返して核酸を増幅させる手法である。この手法によって、サイクル数だけ２を累乗したＰＣＲ産物が得られる。
【０００３】
このようなＰＣＲ法を用いた核酸増幅装置として、下記特許文献１のＰＣＲ装置が本出願人により提案されている。下記特許文献１のＰＣＲ装置に装着されるバイオチップには、標的核酸などが含まれる反応液が移動する流路が形成され、その流路には反応液が収容されるとともに、当該反応液よりも比重が小さく反応液とは混和しない液体が充填されている。
【０００４】
下記特許文献１のＰＣＲ装置には、バイオチップが装着される装着部にそのバイオチップを装着した場合において、当該バイオチップに形成される流路の第１領域を加熱する加熱部と、当該第１領域と異なる温度で第２領域を加熱する加熱部が備えられる。また、下記特許文献１のＰＣＲ装置には、装着部および加熱部の配置を、第１の配置と第２の配置との間で切換える駆動機構が備えられる。この駆動機構によって、装着部に装着されるバイオチップの反応液は、互いに異なる温度に加熱される第１の領域と第２の領域との相互に移動される。このような下記特許文献１のＰＣＲ装置によれば、バイオチップ全体の温度を互いに異なる温度に切り替える場合に比べると、増幅反応期間を短縮できるというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上述のＰＣＲ装置におけるＰＣＲ産物の生成時間をより一段と早めるべき要請がある。しかしながら、ＰＣＲ産物を得るために各サイクルタイムを短くし過ぎると増幅効率が低減することが懸念される。
【０００７】
そこで本発明は、サイクルタイムを短縮させても増幅効率が低減することを抑制させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記増幅効率が低減する要因の１つとして、鋳型核酸にプライマーが結合してもプローブが結合できていないことが考えられる。そこで本発明者は核酸の合成反応期間を短縮させてもプローブの結合を強める観点で鋭意検討した結果、本発明の増幅核酸装置、増幅核酸用カートリッジおよび増幅核酸方法に至った。
【０００９】
本発明の核酸増幅装置は、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴と、前記液滴の比重とは異なり相分離するオイルとが収容される容器を装着する装着部と、前記装着部に装着される前記容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定する第１ヒーターと、前記第１領域とは異なる前記容器の第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する第２ヒーターと、前記第１領域から前記第２領域に前記液滴を移動させ、および前記第２領域から前記第１領域に前記液滴を移動させる移動機構と、前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、を備え、前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
【００１０】
また本発明は、鋳型核酸を含む溶液の液滴が導入され、前記液滴が移動する流路を有する容器と、前記容器に収容され、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬と、を備える核酸増幅用カートリッジであって、前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
【００１１】
さらに本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴が収容される容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第１領域とは異なる第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する温度調整ステップと、前記第１領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、を備え、前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】カートリッジの断面を示す図である。
【図２】蛍光標識プローブの構造を模式的に示す図である。
【図３】カートリッジの容器内に鋳型核酸溶液が導入される様子を示す図である。
【図４】鋳型核酸溶液によって凍結乾燥状態の試薬が元の状態に戻った場合の様子を示す図である。
【図５】核酸増幅装置のブロック図である。
【図６】回転機構の様子を示す図である。
【図７】カートリッジが装着部に装着された様子を示す図である。
【図８】熱サイクル処理の様子を示す図である。
【図９】熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。
【図１０】実施例１および比較例１の増幅曲線を示すグラフである。
【図１１】実施例２および比較例２の増幅曲線を示すグラフである。
【図１２】実施例３および比較例３の増幅曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態を添付図面を用いて例示する。以下に例示する実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができる。
【００１４】
（１）実施形態
実施形態として、核酸を増幅させる核酸増幅装置に装着されるカートリッジを説明した後に、当該核酸増幅装置を説明する。
【００１５】
＝＝＝カートリッジ＝＝＝
図１は、カートリッジ１の断面を示す図である。図１に示すように、カートリッジ１は、試薬１１とオイル１２とが収容される容器１０を備える。本実施形態では容器１０の側壁部１０Ａは円筒状とされ、当該容器１０の底壁部１０Ｂは中空半球状とされる。
【００１６】
容器１０の底壁部１０Ｂに対向する端部は開口しており、当該開口にはキャップ１０Ｃが取り付けられる。キャップ１０Ｃは容器１０の開口を塞ぐ蓋部材であり、本実施形態では容器１０に対して着脱自在とされる。また、本実施形態では容器１０内に収容されるキャップ１０Ｃのシール部位ＳＰは円柱状とされる。
【００１７】
このような容器１０内には鋳型核酸溶液が導入される。容器１０内に鋳型核酸溶液を導入するときにはキャップ１０Ｃが容器１０から取り外され、当該導入後にキャップ１０Ｃが再び容器１０に取り付けられる。
【００１８】
なお、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液は、例えば次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によってヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルス粒子などの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて鋳型核酸が検体から抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液（鋳型核酸を含有する溶液）が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液の組成は、例えば水（蒸留水、滅菌水）やＴｒｉｓ-ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）とされる。
【００１９】
試薬１１は、標的核酸の増幅反応に使用される試薬であり、凍結乾燥状態で容器１０に収容される。本実施形態に使用される試薬１１は、凍結乾燥によって容器１０の底壁部１０Ｂに固定される。この試薬１１には、少なくとも、ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ(deoxyribonucleotide triphosphate)、蛍光標識プローブおよび緩衝液が含有される。なお、試薬１１が凍結乾燥された場合、当該試薬１１における水分が消失するため、緩衝液に含有されるマグネシウムやカリウムなどのイオンが容器１０の底壁部１０Ｂに固定される。
【００２０】
標的核酸は、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液中の鋳型核酸において増幅させるべき全部または一部の核酸であり、例えばＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ(complementary  DNA)断片又はＰＮＡ(peptide nucleic acid)である。
【００２１】
蛍光標識プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識物質である。本実施形態の蛍光標識プローブは、図２に示すように、プローブＰ１と、当該プローブＰ１の５´末端側に付加されたレポーター蛍光色素Ｐ２と、当該プローブＰ１の３´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素Ｐ３と、そのクエンチャー蛍光色素Ｐ３に付加されたマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ：minor groove binder）分子Ｐ４とでなる。
【００２２】
なお、鋳型核酸がＲＮＡ(ribonucleic acid)の場合、そのＲＮＡのｃＤＮＡを得るため、逆転写酵素や逆転写酵素用プライマーなども、標的核酸の増幅反応に使用される試薬１１として含有される。
【００２３】
オイル１２は、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液の比重よりも比重が小さく、当該鋳型核酸溶液とは相分離するものであり、例えば２ＣＳシリコーンオイルあるいはミネラルオイルなどとされる。
【００２４】
図３はカートリッジの容器内に鋳型核酸溶液が導入される様子を示す図であり、図４は鋳型核酸溶液によって凍結乾燥状態の試薬が元の状態に戻った場合の様子を示す図である。
【００２５】
図３に示すように、カートリッジ１の容器１０内に鋳型核酸溶液が導入された場合、当該鋳型核酸溶液には界面の表面積を小さくする作用が働くことで、鋳型核酸溶液は容器１０内のオイル１２と相分離し、液滴２０となる。この液滴２０の比重はオイル１２の比重よりも大きいため、当該液滴２０が移動する流路である容器１０の側壁部１０Ａに沿って沈降する。なお、液滴２０の体積は０．２μＬ以上２μＬ以下であることが好ましい。
【００２６】
図４に示すように、液滴２０が容器１０の底壁部１０Ｂにまで沈降した場合、当該液滴２０の水分によって凍結乾燥した試薬１１が元の状態になり、その元の状態になった試薬１１が液滴２０内に取り込まれる。
【００２７】
凍結乾燥状態から元の状態になった試薬１１が液滴２０内に取り込まれた場合、当該液滴２０には鋳型核酸およびその鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１を含むこととなり、当該液滴２０が核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００２８】
なお、容器１０における側壁部１０Ａの内壁は、液滴２０が付着しない程度の撥水性を有することが好ましい。
【００２９】
＝＝＝核酸増幅装置＝＝＝
図５は、核酸増幅装置のブロック図である。図５に示すように、核酸増幅装置５０は、回転機構６０、蛍光測定器７０および制御部８０を有する。
【００３０】
＜回転機構＞
図６は、回転機構の様子を示す図である。図６は回転機構６０の側面図である。以下の核酸増幅装置５０の説明では、図６に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置５０のベース５１を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、カートリッジ１の回転軸ＡＸの軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。
【００３１】
図６に示すように、回転機構６０は、回転体６１およびその回転体６１を回転させる回転用モーター６６（図５）を有する。回転体６１には、カートリッジ１を着脱可能な挿入穴６４を有するヒーター部６５が設けられる。回転体６１は、ヒーター部６５とそのヒーター部６５の挿入穴６４に装着されるカートリッジ１との相対位置を変えずに、ベース５１に固定された支持台５２に支持される回転軸ＡＸを中心として回転する。
【００３２】
なお、本実施形態におけるヒーター部６５の挿入穴６４は、カートリッジ１を出し入れ可能な穴と、当該穴に入れられたカートリッジ１を装着する装着部を兼ねているが、当該穴と装着部とが別々に核酸増幅装置５０に設けられていてもよい。また、装着部が装着可能なカートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でもよい。
【００３３】
回転用モーター６６（図５）は、制御部８０からの指示にしたがって、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着されたカートリッジ１が上下反転するように、回転体６１を回転させる。
【００３４】
図７は、カートリッジが装着された様子を示す図である。図７に示すように、ヒーター部６５は、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱するための第１ヒーター部６５Ｂと、標的核酸の合成反応（アニーリング反応および伸長反応）が進行する温度に加熱するための第２ヒーター部６５Ｃとを有する。
【００３５】
ヒーター部６５の挿入穴６４にカートリッジ１が装着された場合、そのカートリッジ１の容器１０において液滴２０の流路である側壁部１０Ａの一端側にあたる第１領域３６Ａが第１ヒーター部６５Ｂに囲まれる。第１ヒーター部６５Ｂは、第１領域３６Ａを例えば９５〜１００℃に加熱する。
【００３６】
また、ヒーター部６５の挿入穴６４にカートリッジ１が装着された場合、そのカートリッジ１の容器１０において液滴２０の流路である側壁部１０Ａの他端側にあたる第２領域３６Ｂが第２ヒーター部６５Ｃに囲まれる。第２ヒーター部６５Ｃは、第２領域３６Ｂを例えば５０〜７５℃に加熱する。
【００３７】
このようにカートリッジ１における容器１０の第１領域３６Ａが標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱され、当該容器１０の第２領域３６Ｂが標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱される。
【００３８】
なお、第１ヒーター部６５Ｂと第２ヒーター部６５Ｃとの間には、第１ヒーター部６５Ｂと第２ヒーター部６５Ｃとの間の熱伝導を抑制するスペーサー６５Ｄが配置されている。このスペーサー６５Ｄには、第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃの挿入穴６４の長手方向に沿った位置に貫通孔が形成され、挿入穴６４に対してカートリッジ１の容器１０の挿入を妨げることが防止される。
【００３９】
＜蛍光測定器＞
蛍光測定器７０は、カートリッジ１における容器１０に収容される液滴２０の蛍光強度を測定する測定器であり、図６に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着されるカートリッジ１の末端に対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
【００４０】
蛍光測定器７０は、制御部８０からの測定指示に応じて液滴２０に含有される蛍光色素に対応する励起光を照射し、当該液滴２０で発光する蛍光強度を測定する。また蛍光測定器７０は、測定結果として得られる蛍光強度を示すデータを制御部８０に与える。なお、蛍光測定器７０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであっても、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであってもよい。
【００４１】
＜制御部＞
制御部８０は、図５に示すように、記憶部９１を有し、当該制御部８０には入力部９２および表示部９３などが接続される。記憶部９１には、プログラムを格納する領域と、入力部９２から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
【００４２】
制御部８０は、記憶部９１に格納されるプログラムおよび設定データに基づいて回転機構６０および蛍光測定器７０を適宜制御し、熱サイクル処理または増幅解析処理を適宜実行する。
【００４３】
≪熱サイクル処理≫
図８は、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図７の（Ａ）および（Ｂ）は標的核酸の合成段階の様子を示し、図８の（Ｃ）および（Ｄ）は標的核酸の変性段階の様子を示す図である。
【００４４】
すなわち、制御部８０は、例えば熱サイクル処理すべき命令を入力部９２から受けると、回転体６１に設けられた第１ヒーター部６５Ｂを駆動し、カートリッジ１における容器１０の第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱する。また、制御部８０は、回転体６１に設けられた第２ヒーター部６５Ｃを駆動し、カートリッジ１における容器１０の第２領域３６Ｂを、標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱する。これによりカートリッジ１の容器１０に充填されるオイル１２には温度勾配が形成される。
【００４５】
第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃが駆動されてから、第１領域３６Ａにおけるオイル１２が例えば９８℃に達し、第２領域３６Ｂにおけるオイル１２が例えば５４℃に達するまでには所定の期間を要する。この期間に標的核酸の増幅反応は適切に進行しないため、制御部８０は当該期間を待機期間として待機する。
【００４６】
このとき、図８の（Ａ）に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器１０におけるキャップ１０Ｃ側が上側に配置され、当該容器１０における底壁部１０Ｂ側が下側に配置される基準位置に回転体６１が位置している。回転体６１が基準位置に位置している場合、図８の（Ｂ）に示すように、液滴２０は自重により沈降して第２領域３６Ｂに留まる。したがって、液滴２０に含有する標的核酸が１回目の変性段階に移行することはない。
【００４７】
制御部８０は、上述の待機期間を経過した場合、回転体６１を１８０度回転させる。この場合、図８の（Ｃ）に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器１０におけるキャップ１０Ｃ側が下側に配置され、当該容器１０における底壁部１０Ｂ側が上側に配置される反転位置に回転体６１が位置することになる。回転体６１が反転位置に位置している場合、図８の（Ｄ）に示すように、液滴２０は自重により沈降して第１領域３６Ａに移動する。したがって、液滴２０に含有する標的核酸は変性段階に移行することになる。
【００４８】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）から標的核酸の変性段階の期間として設定された変性反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸の変性反応が進行する。なお、変性反応期間は、少なくとも、容器１０において液滴２０の流路となる側壁部１０Ａの一端側にあたる第１領域３６Ａと、当該側壁部１０Ａの他端側にあたる第２領域３６Ｂとの間を液滴２０が移動する期間以上の期間とされる。本実施形態の場合、変性反応期間は、２秒以上５秒未満とされ、一般的な変性反応期間として採用される５秒以上３０秒未満よりも短くされる。
【００４９】
次いで制御部８０は、変性反応期間を経過すると、回転体６１を１８０度回転させて、当該回転体６１を反転位置から基準位置に切り替え、図８の（Ｂ）に示すように、第２領域３６Ｂに液滴２０を移動させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸は合成段階に移行することになる。
【００５０】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）時点から標的核酸の合成段階の期間として設定された合成反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸のアニーリング反応および伸長反応が進行する。なお、合成反応期間は、上述の変性反応期間と同様に、少なくとも第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとの間を液滴２０が移動する期間以上の期間とされる。本実施形態の場合、合成反応期間は、３秒以上２０秒未満とされ、一般的な変性反応期間として採用される２０秒以上６０秒未満よりも短くされる。
【００５１】
このように制御部８０は、上述の反転位置と基準位置とを交互に切り替えて、第１領域３６Ａに液滴２０を移動させて留める変性段階および第２領域３６Ｂに液滴２０を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す。繰り返すべきサイクル数は制御部８０に設定され、例えば５０回とされる。
【００５２】
≪増幅解析処理≫
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部８０は、蛍光測定器７０に対して合成反応期間ごとに測定指示を与え、当該測定指示結果として蛍光測定器７０から与えられる蛍光強度を示すデータを記憶部９１に記憶する。
【００５３】
なお、図８の（Ａ）および（Ｂ）に示したように、合成反応期間では回転体６１が基準位置にあるため、容器１０内の液滴２０は底壁部１０Ｂに向かって沈降していく。しかしながら、回転体６１が基準位置になった直後では、液滴２０が底壁部１０Ｂに到達していない場合がある。したがって、制御部８０が蛍光測定器７０に対して測定指示を与える時期は、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転し終えた時点から所定時間経過した後であることが望ましい。特に、基準位置から反転位置に回転させる直前であることが望ましい。
【００５４】
また制御部８０は、入力部９２から入力される命令に応じて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を示すデータを記憶部９１から読み出し、当該データに基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成する。制御部８０は、増幅曲線を生成した場合、その増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部９３に表示させる。
【００５５】
＜熱サイクル処理手順＞
図９は、熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。図９に示すように、制御部８０は、核酸溶出処理を実行した以降にステップＳＰ１に進んで、核酸増幅用カートリッジ１における容器１０の第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度として設定される変性温度に加熱する。また制御部８０は、容器１０の第２領域３６Ｂを、標的核酸の合成反応が進行する温度として設定される合成温度に加熱し、ステップＳＰ２に進む。
【００５６】
制御部８０は、ステップＳＰ２では、加熱し始めた時点から加熱対象が目的の温度に達するとして設定される待機期間を経過するまで待機し、当該待機期間を経過した場合にはステップＳＰ３に進む。
【００５７】
制御部８０は、ステップＳＰ３では、回転体６１を基準位置から反転位置にまで回転させて容器１０の変性温度領域（第１領域３６Ａ）に液滴２０を移動させる。次いで制御部８０は、回転体６１を反転位置に位置させた時点から変性反応期間を経過するまで、回転体６１を停止させ続けて容器１０の変性温度領域に液滴２０を留める。制御部８０は、変性反応期間を経過した場合にはステップＳＰ４に進む。
【００５８】
制御部８０は、ステップＳＰ４では、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転させて容器１０の合成温度領域（第２領域３６Ｂ）に液滴２０を移動させる。次いで制御部８０は、回転体６１を基準位置に位置させた時点から合成反応期間を経過するまで、回転体６１を停止させ続けて容器１０の合成温度領域に液滴２０を留める。制御部８０は、合成反応期間を経過した場合にはステップＳＰ５に進む。
【００５９】
制御部８０は、ステップＳＰ５では、繰り返すべきサイクル数として設定される繰返数にサイクル終了数が達したかを認識する。ここで、サイクル終了数が繰返数に至っていない場合、制御部８０は、サイクル終了数を１回分だけ増加させた後、ステップＳＰ３に戻って上述の処理を繰り返す。一方、サイクル終了数が繰返数に至った場合、制御部８０は、ステップＳＰ６に進む。
【００６０】
制御部８０は、ステップＳＰ６では、容器１０における第１領域３６Ａおよび第２領域３６Ｂの加熱を停止した後、熱サイクル処理を終了する。
【００６１】
＜小括＞
以上のとおり、本実施形態におけるカートリッジ１の場合、鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１が凍結乾燥された状態で容器１０に収容される。この試薬１１は、容器１０に導入される鋳型核酸溶液（鋳型核酸を含む溶液）の液滴２０によって元に戻されその液滴２０に取り込まれる。このため、容器１０に導入される液滴２０に対して、試薬１１をユーザに調整させることなく添加でき、この結果、試薬１１の調整時間分を短縮することができるとともに、当該調整不良に起因する増幅効率の低減を回避することができる。
【００６２】
この液滴２０は、核酸増幅装置５０によって移動される。具体的には、容器１０の流路である側壁部１０Ａに沿って、変性温度に加熱に加熱される第１領域３６Ａと、合成温度に加熱される第２領域３６Ｂとに交互に液滴２０が移動される。このため、一定の場所で温度を変性温度と合成温度とに切り替える一般的な場合に比べると、増幅反応期間（サイクルタイム）を短縮することができる。特に、液滴２０の体積が０．２μＬ以上２μＬ以下である場合、容器１０の第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとの間を速やかに液滴２０が移動するため、より一段と増幅反応期間（サイクルタイム）を短縮することができる。その一方、合成反応時間が短縮されると増幅効率が低減することが懸念される。
【００６３】
これに対し本実施形態における試薬１１には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有される。この蛍光標識プローブは、図２に示したように、プローブと、プローブの５´末端側に付加されたレポーター蛍光色素と、プローブの３´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素に付加されたＭＧＢ分子とでなる。
【００６４】
このようにＭＧＢ分子が付加された蛍光標識プローブが用いられた場合、一般的に採用される合成反応期間である２０秒よりもその合成反応期間が短縮されても、増幅効率が向上することが見出された。このことは下記の実施例を一例として述べる。
【００６５】
ＭＧＢ分子Ｐ４が付加された蛍光標識プローブは、プローブ長を短くしても特異度が維持されることが知られている。これは、ＭＧＢ分子Ｐ４は鋳型核酸の対応するマイナーグルーブにアプローチし、当該マイナーグルーブにおける塩基配列とＭＧＢ分子Ｐ４に付加されたプローブＰ１とが特異的に相補鎖を形成することでプローブＰ１の結合効率又は結合力が高まるからと考えられる。
【００６６】
すなわち、低温度でも特異性を維持させることが可能な因子としてＭＧＢ分子Ｐ４が知られていた。これに対し、合成反応期間を短くしても特異性を維持させることが可能な因子としてＭＧＢ分子Ｐ４が該当することが明らかにされた。したがって、ある一定の増幅効率を得るための調整要素が増えるのみならずプローブの設計幅が広がり、標的核酸に対する感度および特異度の双方をより向上させることが可能となる。
【００６７】
（２）変形例
上記実施形態では、プローブＰ１と、当該プローブＰ１の５´末端側に付加されたレポーター蛍光色素Ｐ２と、当該プローブＰ１の３´末端側に付加されたクエンチャー蛍光色素Ｐ３と、そのクエンチャー蛍光色素Ｐ３に付加されたマイナーグルーブバインダー分子Ｐ４とでなる蛍光標識プローブが用いられた。しかしながら、マイナーグルーブバインダー分子Ｐ４は、プローブＰ１またはレポーター蛍光色素Ｐ２に付加されていてもよい。
また、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、インターカレーター用の蛍光色素の蛍光標識プローブが用いられてもよい。あるいは、上記実施形態の蛍光標識プローブに代えて、サイクリングプローブといった蛍光色素が結合される蛍光標識プローブが用いられてもよい。この蛍光標識プローブが用いられる場合、例えば蛍光色素にマイナーグルーブバインダー分子Ｐ４が付加されればよい。
要するに、マイナーグルーブバインダー分子Ｐ４が含まれる蛍光標識プローブであればよい。
【００６８】
また上記実施形態では、容器１０の側壁部１０Ａは円筒状とされ、当該容器１０の底壁部１０Ｂは中空半球状とされた。しかしながら、容器１０の形状は種々の形状とすることができる。
【００６９】
また上記実施形態では、容器１０に対してキャップ１０Ｃが着脱自在とされ、当該容器１０からキャップ１０Ｃが取り外された状態で鋳型核酸溶液が導入された。しかしながら、容器１０に対してキャップ１０Ｃが固定され、当該キャップ１０Ｃに貫通される針を介して鋳型核酸溶液が導入されてもよい。なお、キャップ１０Ｃは容器１０と一体に形成されていてもよい。
【００７０】
また上記実施形態では、キャップ１０Ｃのシール部位ＳＰが円柱状とされた。しかしながら、シール部位ＳＰにおいて容器１０の底壁部１０Ｂに対向する部分に半球状や円錐状の窪みが形成されていてもよい。この窪みが、容器１０の側壁部１０Ａから離れるほど先細りとなる場合、液滴２０を定位置に静止させることができるため、より同じ条件で液滴２０を加熱させることが可能となる。なお、容器１０の底壁部１０Ｂが、当該容器１０の側壁部１０Ａから離れるほど先細りとなっていてもよい。
【００７１】
また上記実施形態では、液滴２０の比重がオイル１２の比重よりも大きくされた。しかしながら、液滴２０の比重がオイル１２の比重よりも小さくされていてもよい。このようにしても上記実施形態と同様の効果を奏する。
【００７２】
また上記実施形態では、変性反応期間および合成反応期間の始期が回転体６１を１８０度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点とされたが、当該回転体６１を１８０度回転し始める時点とされてもよい。
【００７３】
また上記実施形態では、カートリッジ１における容器１０内の液滴２０を第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとに交互に移動させる機構として回転機構６０が採用された。しかしながら、容器１０において標的核酸の変性温度にされる第１領域３６Ａと、その第１領域３６Ａとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域３６Ｂとに液滴２０を交互に移動させる機構であれば、上記回転機構６０以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
【００７４】
また上記実施形態では、容器１０内で液滴２０を移動させるべき領域として、標的核酸の変性温度にされる第１領域３６Ａと、その第１領域３６Ａとは異なる領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域３６Ｂとが配置された。しかしながら、例えば特願２０１４−１０７８４４号に記載されているように３つの領域が配置されていてもよい。すなわち、第１領域３６Ａとして、標的核酸の変性温度にされる領域が配置される。また、第２領域３６Ｂとして、互いに異なる２つ領域が配置され、一方の領域は標的核酸の合成反応におけるアニーリング反応が進行する温度として設定されるアニーリング温度にされ、他方の領域は標的核酸の伸長反応が進行する温度として設定される伸長温度にされる。このように、サイクルにおける温度変化が変性段階および合成段階の２段階とされる上記実施形態の場合に限らず、変性段階、アニーリング段階および伸長段階の３段階とされる場合であっても、容器内で液滴２０を移動させることができる。なお、サイクルにおける温度変化が３段階とされる場合であっても、回転機構以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
【００７５】
上記実施形態では、第１ヒーター部６５Ｂおよび第２ヒーター部６５Ｃを備えた核酸増幅装置５０が適用された。しかしながら、容器１０の内部に温度勾配を形成できるのであれば、上記実施形態の核酸増幅装置５０以外の核酸増幅装置が適用されてもよい。例えば、高温側ヒーターのみが備えられていてもよく、第２ヒーター部６５Ｃが冷却器に変更されてもよい。あるいは、回転体６１の外部に高温側ヒーターおよび低温側ヒーターが備えられていてもよい。あるいは、第１ヒーター部６５Ｂを設ける部位と、第２ヒーター部６５Ｃを設ける部位とが逆にされてもよい。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
まず、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１と、ポジティブコントロール（陽性対照）を試験管に投入した後、蒸留水を加えて１０μＬの鋳型核酸溶液を調整した。
【００７７】
鋳型核酸は、Vircell社製における肺炎マイコプラズマのゲノムＤＮＡ（MBC０３５）２５０コピーとし、０．６２５μＬだけ試験管に投入した。
ポジティブコントロールは、タカラバイオ社製における大腸菌のゲノムＤＮＡ（９０６０（７５０ｆｇ／μＬ））とし、０．６２５μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるＤＮＡポリメラーゼは、Life Technologies社製のPlatinumTaqとし、０．４μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるｄＮＴＰは、Roche社製のものを使用し、０．５μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用意した。マイコプラズマ用フォワードプライマーおよびマイコプラズマ用リバースプライマーは、それぞれ、０．８μＬだけ試験管に投入した。また、大腸菌用フォワードプライマーおよび大腸菌用リバースプライマーは、それぞれ、０．８μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有される蛍光標識プローブは、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加されたマイコプラズマ用蛍光標識プローブであり、Life Technologies社製ものを使用し、０．６μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有される緩衝液は、MgCl2が２５ｍＭ、Tris-HCl(PH9.0)が２５０ｍＭ、KClが１２５ｍＭの組成のものとし、２．０μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるマイコプラズマ用蛍光標識プローブは、０．６μＬだけ試験管に投入した。
【００７８】
マイコプラズマ・大腸菌用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、マイコプラズマ用蛍光標識プローブとの配列は、下記の表１に示すものとされる。
【００７９】
【表１】
2016214203.tif 000003
【００８０】
上記表１における“FAM”は、フルオレセインアミノヘキシル（fluorescein aminohexyl）の略語であり、レポーター蛍光色素の１つである。また、上記表１における“NFQ” は、非蛍光クエンチャー（Non-Fluorescent Quencher）の略語であり、クエンチャー蛍光色素の１つである。
【００８１】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００８２】
熱サイクル処理におけるサイクル数は５０回とし、変性反応期間は４秒とし、合成反応期間は６秒とし、第１ヒーター部６５Ｂの温度は１００℃とし、第２ヒーター部６５Ｃの温度は６４℃とした。
【００８３】
（比較例１）
実施例１の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例１と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
【００８４】
比較例１の蛍光標識プローブは、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加されていないマイコプラズマ用蛍光標識プローブである。このマイコプラズマ用蛍光標識プローブの配列は、下記の表２に示すものとされる。
【００８５】
【表２】
2016214203.tif 000004
【００８６】
上記表２における“BHQ”は、ブラックホールクエンチャー（Black Hole Quencher）の略語であり、クエンチャー蛍光色素の１つである。
【００８７】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、実施例１と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００８８】
（実施例１と比較例１との対比）
上述の実施例１および比較例１における増幅曲線を図１０に示す。図１０に示されるように、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図１０に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
【００８９】
（実施例２）
実施例１の鋳型核酸、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例１と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
【００９０】
実施例２の鋳型核酸は、Vircell社製における百日咳のゲノムＤＮＡ（MBC００８）２００コピーとした。
【００９１】
百日咳用プライマーおよび百日咳用蛍光標識プローブの配列は、下記の表３に示すものとされる。
【００９２】
【表３】
2016214203.tif 000005
【００９３】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、実施例１と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００９４】
（比較例２）
実施例２の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例２と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
【００９５】
比較例２の蛍光標識プローブは、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加されていない百日咳用蛍光標識プローブである。この百日咳用蛍光標識プローブの配列は、下記の表４に示すものとされる。
【００９６】
【表４】
2016214203.tif 000006
【００９７】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、実施例２と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【００９８】
（実施例２と比較例２との対比）
上述の実施例２および比較例２における増幅曲線を図１１に示す。図１１に示されるように、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。なお、このような効果は、図１１に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
【００９９】
（実施例３）
実施例１の鋳型核酸、ポジティブコントロール、プライマーおよびプローブとは異なる鋳型核酸、プライマーおよびプローブを用い、当該鋳型核酸、プライマーおよびプローブ以外の条件が実施例１と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
【０１００】
実施例３の鋳型核酸は、Vircell社製におけるアデノウイルスのゲノムＤＮＡ（MBC００１）１００コピーとした。また、実施例３のポジティブコントロールは、培養由来枯草菌のゲノムＤＮＡとした。
【０１０１】
アデノウイルス・枯草菌用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、アデノウイルス用蛍光標識プローブとの配列は、下記の表５に示すものとされる。
【０１０２】
【表５】
2016214203.tif 000007
【０１０３】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【０１０４】
熱サイクル処理におけるサイクル数は５０回とし、変性反応期間は４秒とし、合成反応期間は６秒とし、第１ヒーター部６５Ｂの温度は１００℃とし、第２ヒーター部６５Ｃの温度は５８℃とした。
【０１０５】
（比較例３）
実施例３の蛍光標識プローブとは異なる蛍光標識プローブを用い、当該蛍光標識プローブ以外の条件が実施例３と同じとなる条件のもとで、鋳型核酸溶液を調整した。
【０１０６】
比較例３の蛍光標識プローブは、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加されていないアデノウイルス用蛍光標識プローブである。このアデノウイルス用蛍光標識プローブの配列は、下記の表６に示すものとされる。
【０１０７】
【表６】
2016214203.tif 000008
【０１０８】
次いで、鋳型核酸溶液を容器１０に導入して容器１０内に液滴２０を形成させた後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、実施例３と同じ条件のもとで熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
【０１０９】
（実施例３と比較例３との対比）
上述の実施例３および比較例３における増幅曲線を図１２に示す。図１２に示されるように、ＭＧＢ分子Ｐ４が付加された蛍光標識プローブが用いられると、一般的に採用される合成反応期間よりもその合成反応期間が大幅に短縮されても、増幅効率が低減することを抑制できることが分かった。また、増幅曲線の立ち上がりが数サイクル早まるという相乗効果を有することも分かった。すなわち、プローブの検出感度および特異度の双方を向上させることができるなお、このような効果は、図１２に示されるように、複数のプライマー対が同時に用いられていても良いことが示されている。
【符号の説明】
【０１１０】
１・・・カートリッジ、１０・・・容器、１０Ａ・・・側壁部、１０Ｂ・・・底壁部、１０Ｃ・・・キャップ、１１・・・試薬、１２・・・オイル、２０・・・液滴、５０・・・核酸増幅装置。
【図１】
2016214203.tif 000009
【図２】
2016214203.tif 000010
【図３】
2016214203.tif 000011
【図４】
2016214203.tif 000012
【図５】
2016214203.tif 000013
【図６】
2016214203.tif 000014
【図７】
2016214203.tif 000015
【図８】
2016214203.tif 000016
【図９】
2016214203.tif 000017
【図１０】
2016214203.tif 000018
【図１１】
2016214203.tif 000019
【図１２】
2016214203.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月15日(2016.3.15)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は核酸増幅装置、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
上記増幅効率が低減する要因の１つとして、鋳型核酸にプライマーが結合してもプローブが結合できていないことが考えられる。そこで本発明者は核酸の合成反応期間を短縮させてもプローブの結合を強める観点で鋭意検討した結果、本発明の核酸増幅装置、核酸増幅用カートリッジおよび核酸増幅方法に至った。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【表１】
2016214203.tif 000021
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【表２】
2016214203.tif 000022
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【表３】
2016214203.tif 000023
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
【表４】
2016214203.tif 000024
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
【表５】
2016214203.tif 000025
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
【表６】
2016214203.tif 000026
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴と、前記液滴の比重とは異なり相分離するオイルとが収容される容器を装着する装着部と、
前記装着部に装着される前記容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定する第１ヒーターと、前記第１領域とは異なる前記容器の第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する第２ヒーターと、
前記第１領域から前記第２領域に前記液滴を移動させ、および前記第２領域から前記第１領域に前記液滴を移動させる移動機構と、
前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅装置。
【請求項２】
前記第２領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は２０秒未満とされる、請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
前記第２領域に前記液滴が留められる合成段階の期間は６秒以下とされる、請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
鋳型核酸を含む溶液の液滴が導入され、前記液滴が移動する流路を有する容器と、
前記容器に収容され、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬と、
を備える核酸増幅用カートリッジであって、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅用カートリッジ。
【請求項５】
前記液滴の体積は、０．２μＬ以上２μＬ以下である、請求項４に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項６】
前記試薬は凍結乾燥され、前記容器内壁に固定される、請求項４または５に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項７】
前記容器に収容され、前記反応液とは比重が異なり、相分離するオイルを有する、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項８】
前記標的核酸における合成反応期間は２０秒未満とされる、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項９】
前記標的核酸における合成反応期間は６秒以下とされる、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１０】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’（配列番号1）
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’（配列番号2）
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-CGGGACGGAAAGACC-NFQ-MGB 3’（配列番号5）
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１１】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’（配列番号7）
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’（配列番号8）
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-AATGGCAAGGCCGAACGCTTCA-NFQ-MGB 3’（配列番号9）
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１２】
前記プライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーとを有し、
前記フォワードプライマーの配列は、
5’ GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA 3’（配列番号11）
でなり、
前記リバースプライマーの配列は、
5’ CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA 3’（配列番号12）
でなり、
前記蛍光標識プローブの配列は、
5’ FAM-GAGTGCACCAGCCACACCGC-NFQ-MGB 3’（配列番号15）
でなる、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅用カートリッジ。
【請求項１３】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬を含む液滴が収容される容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に設定するとともに、前記第１領域とは異なる第２領域を前記標的核酸の合成温度に設定する温度調整ステップと、
前記第１領域に前記液滴を移動させて留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップと、
を備え、
前記試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰおよび蛍光標識プローブが含有され、
前記蛍光標識プローブは、マイナーグルーブバインダー分子を含むこと、を特徴とする核酸増幅方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月18日(2016.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
【表４】
2016214203.tif 000027
【手続補正２】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
【表６】
2016214203.tif 000028