(57)【要約】【課題】藻体を原料としてエボジアミンを製造する。【解決手段】エボジアミンの製造方法は、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて前記原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて前記原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を有することを特徴とするエボジアミンの製造方法。
【請求項２】
前記抽出工程において得られたエボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する精製工程を有することを特徴とする請求項１に記載のエボジアミンの製造方法。
【請求項３】
前記藻体は、デュナリエラ・サリーナ、デュナリエラ・ターティオレクタ、デュナリエラ・バーダウィル、ノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、ポルフィリディウム・プルプレウム、及びポルフィリディウム・クルエンタムから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のエボジアミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エボジアミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボジアミンは、ミカン科の漢薬ゴシュユ（呉茱萸）の果実中にルテカルピン等とともに含有されるインドールアルカノイドの一種であり、トリプトファンとアントラニル酸から生合成される。エボジアミンの薬理作用としては、体温上昇作用、血流改善作用、鎮痛作用、インスリン抵抗性改善、糖代謝改善作用等が知られている。また、エボジアミンの製造方法としては、ゴシュユから抽出する方法（例えば、特許文献１参照。）や、化学合成により製造する方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−３１２９３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明は、本研究者らによる鋭意研究の結果、特定の藻体中にエボジアミンが含有されていることを見出したことに基づいてなされたものである。その目的は、藻体を原料としてエボジアミンを製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するためのエボジアミンの製造方法は、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて前記原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を有することを特徴とする。
【０００６】
上記エボジアミンの製造方法において、前記抽出工程において得られたエボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する精製工程を有することが好ましい。
上記エボジアミンの製造方法において、前記藻体は、デュナリエラ・サリーナ、デュナリエラ・ターティオレクタ、デュナリエラ・バーダウィル、ノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、ポルフィリディウム・プルプレウム、及びポルフィリディウム・クルエンタムから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、藻体を原料としてエボジアミンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】エボジアミンのＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図２】精製物１のＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図３】精製物２のＭＳ／ＭＳスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を具体化した一実施形態のエボジアミンの製造方法を説明する。
本実施形態のエボジアミンの製造方法は、特定の藻体を原料として、抽出工程を行うことによりエボジアミンを製造するものである。また、必要に応じて、抽出工程の後、エボジアミンを精製する精製工程を更に行うことによりエボジアミンを製造するものである。
【００１０】
[原料]
本実施形態のエボジアミンの製造方法においては、原料として、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、藍藻綱ノストック目ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム（チノリモ）属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）の藻体が挙げられる。
【００１１】
緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属の藻体としては、例えば、デュナリエラ・サリーナ（Ｄ．ｓａｌｉｎａ）、デュナリエラ・ターティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、デュナリエラ・バーダウィル（Ｄ．ｂａｒｄａｗｉｌ）が挙げられる。藍藻綱ノストック目ノストック属の藻体としては、例えば、ノストック・コミューネ（Ｎ．ｃｏｍｍｕｎｅ）、ノストック・スファエリコム（Ｎ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｍ）、ノストック・フラジリフォルメ（Ｎ．ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｅ）が挙げられる。紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム（チノリモ）属の藻体としては、例えば、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、ポルフィリディウム・クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）が挙げられる。これらの藻体の中でも、デュナリエラ・ターティオレクタを用いることが特に好ましい。
【００１２】
上記藻体は、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体（例えば、商業ベースで大量栽培生産されている藻体）であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。また、原料としての上記藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。
【００１３】
[抽出工程]
抽出工程は、原料としての上記藻体から、エボジアミンを含む抽出物を抽出する工程である。
【００１４】
抽出工程に用いる抽出溶媒としては、エボジアミンが可溶な公知の溶媒を用いることができる。上記抽出溶媒としては、例えば、低級アルコール類、アセトニトリル、クロロフォルムが挙げられる。低級アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが挙げられる。が挙げられる。これらの抽出溶媒の中でも、抽出効率の観点からメタノールやエタノール等の低級アルコール類、アセトニトリルを用いることが特に好ましい。
【００１５】
上記抽出溶媒は、一種の溶媒を単独で用いてもよいし、複数種を混合して用いてもよい。また、上記抽出溶媒中に、エボジアミンが不溶又は難溶な溶媒（例えば、水）が少量含有されていてもよいし、添加剤（例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等）が溶解されていてもよい。
【００１６】
抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷却抽出、常温抽出、及び加熱抽出のいずれの方法を用いてもよいが、抽出効率の観点から、抽出溶媒を還流させながら抽出を行う加熱抽出を用いることが特に好ましい。なお、抽出温度は、用いる抽出溶媒等に応じて適宜設定されるものであるが、例えば、室温（２５℃）〜９５℃であることが好ましい。また、抽出時間は特に限定されるものではないが、例えば、６０〜１２０分程度であることが好ましい。
【００１７】
抽出操作としては、抽出溶媒に対して原料を浸漬等の方法により所定時間、接触させることにより行われる。その際、抽出溶媒中における原料の濃度は、溶媒の種類、抽出効率、抽出後の濃縮処理の効率等に応じ適宜設定される。こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の原料に対して一回のみ行ってもよいし、複数回繰り返して行ってもよい。
【００１８】
そして、抽出操作の後に適宜、固液分離操作を行い、原料の残渣と、エボジアミンを含む抽出液（抽出物）とを分離する。固液分離処理の方法としては、ろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、必要に応じて得られた抽出液（抽出物）の濃縮を行う。
【００１９】
なお、濃縮後の抽出液（抽出物）に対して、同様の抽出操作を繰り返し行ってもよい。この場合、例えば、低級アルコール類を用いた抽出操作の後に、低級アルコール類以外のエボジアミンが可溶な溶媒（例えば、アセトニトリル）を用いた抽出操作を行うというように、抽出操作に用いる抽出溶媒を異ならせることが好ましい。また、得られた抽出液、又は濃縮後の抽出液（抽出物）を溶解させた溶液に対して、エボジアミンが不溶又は難溶な溶媒（例えば、水）を用いた洗浄処理を更に行ってもよい。
【００２０】
[精製工程]
精製工程は、抽出工程にて得られた、エボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する工程である。エボジアミンは、上記抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより精製される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法でエボジアミンを分離して精製することができる。なお、精製工程は任意の工程であり、エボジアミンを適用する用途に求められる精製度等に応じて、省略することも可能である。
【００２１】
次に、本実施形態における作用及び効果について以下に記載する。
（１）本実施形態のエボジアミンの製造方法は、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を行うことにより、エボジアミンを製造するものである。
【００２２】
上記の製造方法によれば、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料としてエボジアミンを製造することができる。そのため、ゴシュユから抽出する方法、及び化学合成により製造する方法に加えて、エボジアミンを製造する際の選択肢を広げることができる。
【００２３】
（２）原料として、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を用いている。
【００２４】
従来、エボジアミンを製造する際の原料として用いられていたゴシュユの果実は、薬事法において医薬品として指定されている。そのため、ゴシュユを原料とするエボジアミンについては、その適用範囲が医薬品及び医薬部外品に制限されている。これに対して、上記藻体は、薬事法において医薬品として指定されるものではないため、上記藻体を原料とするエボジアミンは、医薬品及び医薬部外品に制限されることなく、様々な用途（例えば、健康食品等の飲食品、食品用添加剤、及び化粧品）に適用することができる。したがって、本実施形態の製造方法によれば、広範囲の用途に適用可能なエボジアミンを製造することができる。
【００２５】
また、上記藻体は、人工的に培養することが容易である。そのため、ゴシュユを原料としてエボジアミンを製造する方法と比較して、原料の調達に要するコストを抑えることができる。
【００２６】
（３）抽出工程の後、抽出工程において得られたエボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する精製工程を行っている。
上記構成によれば、精製度（純度）の高いエボジアミンを得ることができる。
【実施例】
【００２７】
次に、試験例を挙げて上記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜試験例１＞
（抽出工程）
デュナリエラ・ターティオレクタの乾燥粉末（３ｇ）に７０％メタノール水溶液（５０ｍｌ）を加え、８５〜９５℃にて１時間の還流抽出を行った。還流抽出後の試料を遠心分離処理した後、濾過により上清と残渣とに分離した。得られた上清を５０ｍｌに定容し、ここから４４ｍｌ採取して濃縮乾固した。その後、アセトニトリル（５ｍｌ）を加えて可溶部を回収するとともに、不溶部に対してアセトニトリル（５ｍｌ）を加えて可溶部を回収する処理を２回繰り返した。回収したすべての可溶部を濃縮乾固し、これをアセトニトリル（４ｍｌ）に溶解させた溶液を、０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて濾過することにより抽出物１を得た。
【００２８】
（精製工程）
得られた抽出物１を１０ｍｍｏｌ／ｌアンモニア水・アセトニトリル混合溶液（４：６（ｖ／ｖ））にて１００倍希釈し、これを０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて濾過して試料溶液とした。この試料溶液について、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて精製を行った。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである。そして、溶出時間６．０〜６．９分の画分を回収するとともに、これを濃縮乾固することにより精製物１を得た。なお、市販のエボジアミン（和光純薬工業株式会社製）を用いた予備試験を行うことにより、下記ＨＰＬＣ条件におけるエボジアミンの溶出時間が６．０〜６．９分であることを予め確認している。
【００２９】
[ＨＰＬＣ条件]
カラム    ：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８  （φ２．１ｘ１５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
溶媒      ：溶媒Ａ（１０ｍｍｏｌ／ｌアンモニア水）、溶媒Ｂ（アセトニトリル）
流速      ：２００μｌ／分
溶出条件  ：溶媒Ｂ  ６０％（０〜７分）、９５％（８〜１３分）
注入量    ：５．０μｌ
（分析）
標準試料（市販のエボジアミン）及び精製物１について、ｍ／ｚ３０４のピークのＭＳ／ＭＳ測定を行った。その結果をそれぞれ図１及び図２に示す。また、エボジアミンイオン、及びエボジアミンの代表的な断片化構造を以下に示す。エボジアミンの断片化機構は公知である（例えば、D.Wen et al.,Anal.Bioanal.Chem.,385(6),1075(2006).）。
【００３０】
【化１】
2016150933.tif 000002
図１及び図２に示すＭＳ／ＭＳスペクトルの比較から、精製物１には、標準試料とほぼ同じ断片化パターン（ｍ／ｚ１３４、ｍ／ｚ１４４、ｍ／ｚ１６１）を確認することができる。この結果から、精製物１はエボジアミンであると考えられる。
【００３１】
＜試験例２＞
（抽出工程）
抽出溶媒として、７０％メタノール水溶液に代えて、７０％エタノール水溶液を用いた点を除いて、試験例１と同様にして抽出工程を行うことにより抽出物２を得た。
【００３２】
（精製工程）
得られた抽出物２について、試験例１と同様にして抽出工程を行うことにより精製物２を得た。
【００３３】
（分析）
精製物２について、ｍ／ｚ３０４のピークのＭＳ／ＭＳ測定を行った。その結果を図３に示す。
【００３４】
図１及び図３に示すＭＳ／ＭＳスペクトルの比較から、精製物２には、標準試料とほぼ同じ断片化パターン（ｍ／ｚ１４４、ｍ／ｚ１６１）を確認することができる。この結果から、精製物２はエボジアミンであると考えられる。
【００３５】
＜試験例３＞
緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属の藻体であるデュナリエラ・サリーナ、及び藍藻綱ノストック目ノストック属の藻体であるノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属の藻体であるポルフィリディウム・プルプレウムについて、試験例１と同様の抽出工程及び精製工程を行った。その結果、精製工程において得られたＨＰＬＣクロマトグラム（検出波長：２５４ｎｍ）において、溶出時間６．０〜６．９分に試験例１の場合と同様のエボジアミンと考えられるピークを確認することができた。
【００３６】
次に、上記実施形態及び実施例から把握できる技術的思想について記載する。
（イ）緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体から抽出することにより得られることを特徴とするエボジアミン。
【００３７】
（ロ）前記エボジアミンの製造方法により製造されたエボジアミンを含有する飲食品、食品用添加剤、又は化粧料用添加剤。
【図１】
2016150933.tif 000003
【図２】
2016150933.tif 000004
【図３】
2016150933.tif 000005