(57)【要約】【課題】多層化筋管を用いた、物質の多層化筋管への取り込みに影響を与える候補物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】以下の工程：（１）多層化筋管内に取り込まれる物質を、多層化筋管に接触させる工程、（２）前記（１）の工程とは別に、多層化筋管内に取り込まれる物質と、該物質の取り込みを刺激する候補物質とを、多層化筋管に接触させる工程、及び（３）前記（１）及び（２）において、多層化筋管内に取り込まれた物質を定量的に測定し、前記（１）における測定値と前記（２）における測定値とを比較する工程を含む、多層化筋管内に取り込まれる物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（１）多層化筋管内に取り込まれる物質を、多層化筋管に接触させる工程、
（２）前記（１）の工程とは別に、多層化筋管内に取り込まれる物質と、該物質の取り込みを刺激する候補物質とを、多層化筋管に接触させる工程、及び
（３）前記（１）及び（２）において、多層化筋管内に取り込まれた物質を定量的に測定し、前記（１）における測定値と前記（２）における測定値とを比較する工程
を含む、多層化筋管内に取り込まれる物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記（１）の工程及び前記（２）の工程において、多層化筋管内に取り込まれる物質の濃度を段階的又は連続的に調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（２）の工程において、候補物質の濃度を段階的又は連続的に調整することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記（３）の工程において、多層化筋管内に取り込まれた物質の定量的測定が、標識された多層化筋管内に取り込まれた物質の標識強度測定によるもの、多層化筋管外に残された該物質の電気化学的測定によるもの、又は多層化筋管内に取り込まれた物質の量に応じて生じる、多層化筋管の収縮量のメカノケミカル測定によるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多層化筋管内に取り込まれる物質が、グルコースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多層化筋管内に取り込まれる物質が、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多層化筋管を用いた物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療においては、筋芽細胞や心筋細胞で細胞シートを作製し、それを心不全治療などに利用する研究が進められている。しかし、これらの細胞はいずれも生体から分離するものであって、供給元の問題が少ないＥＳ細胞から作製された移植用細胞シートは無かった。
【０００３】
ＥＳ細胞から作製されたものでは多層化心筋様組織がある。例えば、特許文献１には、心筋様組織を作製する方法であって、分化誘導中の胚様体をスペルミンで短時間処理することによって、１５０マイクロメーターの厚さの多層化筋管を作製する方法が記載されている。
【０００４】
この多層化筋管について遺伝子解析が行われ、その結果、１００種類以上の遺伝子の発現量が上昇しており、その多くは骨格筋関連遺伝子であることがわかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２１８０３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、多層化筋管を用いた、物質の多層化筋管への取り込みに影響を与える候補物質のスクリーニング方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、骨格筋におけるグルコースの取り込みをインスリン等の刺激候補物質で刺激し、取り込み量の変化を測定するのに、多層化筋管が適していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、多層化筋管内に取り込まれる物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）多層化筋管内に取り込まれる物質を、多層化筋管に接触させる工程、
（２）前記（１）の工程とは別に、多層化筋管内に取り込まれる物質と、該物質の取り込みを刺激する候補物質とを、多層化筋管に接触させる工程、及び
（３）前記（１）及び（２）において、多層化筋管内に取り込まれた物質を定量的に測定し、前記（１）における測定値と前記（２）における測定値とを比較する工程
を含む、スクリーニング方法を提供する。
また、前記（１）の工程及び前記（２）の工程において、多層化筋管内に取り込まれる物質の濃度を段階的又は連続的に調整してもよい。
また、前記（２）の工程において、候補物質の濃度を段階的又は連続的に調整してもよい。
また、前記（３）の工程において、多層化筋管内に取り込まれた物質の定量的測定は、標識された多層化筋管内に取り込まれた物質の標識強度測定、多層化筋管外に残された該物質の電気化学的測定で行うことができる。
また、前記（３）の工程において、多層化筋管内に取り込まれた物質の量に応じて、多層化筋管が収縮するので、この収縮量をメカノケミカル測定することによって、収縮量から多層化筋管内に取り込まれた物質を定量することもできる。
多層化筋管内に取り込まれる物質は、例えば、グルコースが挙げられ、更に具体的には、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（以下、「２−ＮＢＤＧ」ということがある。）が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多層化筋管内に取り込まれる物質の取り込み量を変動させることができる、候補物質を探索することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ハンギングドロップの作製と多層化筋管への分化誘導の操作を示す図である。
【図２】インスリン付加後の多層化筋管における２−ＮＢＤＧ／２−ＮＢＤＬＧの相対的蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１２】
＜多層化筋管＞
本発明のスクリーニング方法には、多層化筋管を用いる。「筋管」とは、単核の筋芽細胞が細胞融合して、多核の細長い細胞に分化したものをいう。「多層化筋管」とは、筋管が更に分化して、成熟し、収縮能を持つ筋線維細胞が集合・整列した多層構造体をいう。
【００１３】
（１）多層化筋管の製造方法
多層化筋管の詳細な製造方法は、特開２００６−２１８０３５号公報に記載されている。ここでは、概略を説明する。
【００１４】
まず、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のＥＳ細胞を常法にて培養する。次に、ＥＳ細胞の細胞数を調整して、ＥＳ細胞用培地に懸濁し、培養ディッシュのフィーダー細胞上に播種して培養する。７０％程度コンフルエントになったら、培地を除去してトリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることによってＥＳ細胞（及びフィーダー細胞）を浮遊させる。浮遊物を遠心してＥＳ細胞（及びフィーダー細胞）を回収し、白血病阻止因子（ＬＩＦ）を加えない分化誘導培地（ＥＳ細胞用培地）に懸濁する。次に、ゼラチンでコーティングした培養ディッシュに懸濁した細胞を播種し、静置する。この操作により、接着性の高いフィーダー細胞はディッシュ底面に接着し、ＥＳ細胞は下層に沈んでいるものの完全には接着しないので、ＥＳ細胞をピペッティングなどで回収できる。
【００１５】
回収したＥＳ細胞を分化誘導培地に懸濁し、浮遊培養によって胚様体を形成させる。浮遊培養はハンギングドロップ法にて行う。ハンギングドロップ法による培養は、２〜７日間、好ましくは２〜４日間行う。培養により、球状に凝集・分化した胚様体を、分化誘導培地を添加したゼラチンコート済み２４ウェルディッシュ上に、１ウェルあたり１個の胚様体になるように播種し、約１０日間、培養する。
【００１６】
次に、多層化筋管の形成を効率的に誘導するスペルミンを、好ましくは終濃度が０．５ｍＭになるように調製する。
スペルミンを胚様体の培養培地に添加し、添加２４時間後に胚様体から培養培地を取り除く。胚様体をリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と表記する場合がある。）で洗浄し、約３分間トリプシン処理を行う。ピンセットを用いて胚様体をディッシュから剥がし、ゼラチンコートした２４ウェルディッシュに移す。胚様体が浮き上がらないよう、上からナイロンメッシュを被せ、分化培養培地を添加し、更に培養する（再接着培養）。
【００１７】
前記培養操作を続けると、スペルミンによる分化誘導後２０日目ごろから、筋管及び球形細胞が出現し、多層化筋管が形成される。多層化筋管は１００マイクロメーターオーダーの厚さにすることができ、収縮を行う。形成された多層化筋管は、切り出して移植片としたり、研究用の試料として用いることができる。
【００１８】
なお、ＥＳ細胞及びフィーダー細胞は、細胞バンクから入手可能であり、あるいはコスモバイオ（株）や大日本住友製薬（株）などから市販されている。
【００１９】
＜多層化筋管内に取り込まれる物質＞
細胞膜には、物質の取り込みのため、チャンネル、トランスポーター、エンドサイトシス機構などの輸送手段がある。該輸送手段により、多層化筋管に取り込まれる物質として、例えば、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの各種原子イオン、グルコース、各種アミノ酸、各種有機酸、各種ステロイドホルモン、各種ビタミンなどが挙げられる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において、「多層化筋管内に取り込まれる物質」は任意のものでよく、特に限定されないが、一例としてグルコースが挙げられる。以下、「多層化筋管内に取り込まれる物質」としてグルコースを取り上げ、本発明のスクリーニング方法を説明する。
【００２１】
＜多層化筋管内に取り込まれる物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法＞
該スクリーニング方法は、糖尿病患者におけるグルコースとインスリンの関係をモデルケースとして開発された。
ここで、グルコースは、骨格筋に取り込まれ代謝され、インスリンは、血中のグルコースの取り込みを促進する。健常人は、インスリンの作用により血糖値が常に一定範囲に保たれているが、インスリンの分泌量が少ない糖尿病患者の場合は、外部からインスリンを投与して、血糖値をコントロールする対処療法が行われている。
【００２２】
しかし、インスリンを投与しても効かない、いわゆるインスリン抵抗性ＩＩ型糖尿病患者が多く存在する。このような患者は、インスリンのシグナルを受けるレセプターやその後続の分子が欠損していて、グルコースの取り込みにつながらない。従って、インスリン以外の物質で血糖値を下げるような活性を持った物質を開発することが求められている。
【００２３】
そこで、本発明のスクリーニング方法によれば、グルコースを多層化筋管細胞に接触させ、それとは別に、グルコースと、インスリンに代わる候補物質とを多層化筋管細胞に接触させ、両者の筋管細胞へのグルコースの取り込み量の差を測定することにより、骨格筋へのグルコース取り込みをコントロールし得る新たな物質を探索することができる。
以下、「多層化筋管内に取り込まれる物質」としてグルコースを一例とし、「該物質の取り込みを刺激する候補物質」としてインスリンを一例とし、スクリーニング方法の各工程を説明する。
【００２４】
［（１）多層化筋管内に取り込まれる物質を、多層化筋管に接触させる工程］
多層化筋管内に取り込まれる物質を多層化筋管に接触させる方法は、特に限定されないが、多層化筋管の物質の取り込み能や収縮能に影響を与えない溶媒、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などに物質（グルコース）を溶解又は分散させて接触させることが好ましい。
【００２５】
［（２）前記（１）の工程とは別に、多層化筋管内に取り込まれる物質と、該物質の取り込みを刺激する候補物質とを、多層化筋管に接触させる工程］
本工程において、多層化筋管内に取り込まれる物質（グルコース）と該物質の取り込みを刺激する候補物質（インスリン）を接触させる方法は、特に限定されないが、多層化筋管の物質の取り込み能や収縮能に影響を与えない溶媒、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などにこれらの物質を溶解又は分散させて接触させることが好ましい。
【００２６】
なお、本明細書において「物質の取り込みを刺激する」とは、物質の取り込みの促進、物質の取り込みの抑制の両方を含むものとする。例示のインスリンは、グルコースの取り込みを促進する作用があるが、このような例示により、「物質の取り込みを刺激する」との文言が「物質の取り込みを促進する」という意味に限定されることはない。
【００２７】
ところで、糖尿病患者にインスリンを投与すると、インスリンは一方的に血糖値を下げるだけの作用を有するので、低血糖症になる危険性がある。本発明のスクリーニング方法を用いることによって、グルコースの濃度が低いときはむしろグルコースを取り込まない作用を有する物質が見出せれば、生体に該物質を投与した場合でも低血糖を引き起こす心配がない。そこで、例えば、グルコースの濃度を段階的又は連続的に調整し、候補物質の濃度を一定にすれば、グルコースの血中濃度が低いときは骨格筋にグルコースが取り込まれず、グルコースの血中濃度が高いときにグルコースが取り込まれる候補物質を探索することが可能である。
【００２８】
例えば、グルコースの濃度は、特に限定されないが、例えば、好ましくは０．６〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０〜６ｍｇ／ｍｌである。
前記下限から上限の濃度の範囲で、段階的又は連続的にグルコース濃度を調整して、スクリーニング方法に供することができる。
【００２９】
あるいは、逆に、物質の取り込みを刺激する候補物質（インスリン）の濃度を段階的又は連続的に調整して探索することもできる。
【００３０】
例えば、インスリンの濃度は、特に限定されないが、例えば、好ましくは０．５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０〜１０μｇ／ｍｌである。
前記下限から上限の濃度の範囲で、段階的又は連続的にインスリン濃度を調整して、スクリーニング方法に供することができる。
【００３１】
更には、グルコースの濃度とインスリンの濃度とを、それぞれ段階的又は連続的に調整し、組み合わせて探索することもできる。
【００３２】
［（３）前記（１）及び（２）において、多層化筋管内に取り込まれた物質を定量的に測定し、前記（１）における測定値と前記（２）における測定値とを比較する工程］
「多層化筋管内に取り込まれた物質を定量的に測定する」方法は、特に限定されないが、例えば、標識された多層化筋管内に取り込まれた物質の標識強度測定によるもの、多層化筋管外に残された該物質の電気化学的測定によるもの、又は多層化筋管内に取り込まれた物質の量に応じて生じる、多層化筋管の収縮量のメカノケミカル測定によるものが挙げられる。
【００３３】
（ｉ）標識された多層化筋管内に取り込まれた物質の標識強度測定
物質の標識法は、特に限定されないが、例えば、蛍光標識法、放射性同位体標識法、化学発光法などが挙げられる。ただし、多層化筋管に取り込まれる物質（例えばグルコース）の細胞への取り込みを妨げない標識であることが好ましい。
【００３４】
グルコースの場合ならば、グルコースの２位の水酸基に蛍光発色団(蛍光分子ＮＢＤ)を導入した、２−ＮＢＤＧが好ましい。２−ＮＢＤＧは、（株）ペプチド研究所から入手可能である。
【００３５】
標識強度測定の操作は以下のとおりである。
まず、多層化筋管に２−ＮＢＤＧを接触させる。所望の時間、例えば３０分間インキュベーションし、１０分おきに蛍光顕微鏡にて画像を取得し、該画像から蛍光強度を算出する。これが刺激付与前の対照となる。
一方、多層化筋管に２−ＮＢＤＧとインスリンとを接触させる。そして、前記と同様にして画像を取得し、蛍光強度を算出する。
時間経過による蛍光強度の変化の割合を求め、２−ＮＢＤＧのみ接触させた多層化筋管のデータと２−ＮＢＤＧ及びインスリンを接触させた多層化筋管のデータとを比較し、インスリンによってグルコースの取り込みが促進されたかを判定する。
【００３６】
なお、２−ＮＢＤＧを用いる方法は、放射性同位体で標識したものなどと比べて空間解像度が高く、扱いも容易で、生きた細胞がグルコースを取り込む様子をリアルタイムで連続的に観察することができるという利点がある。
【００３７】
（ｉｉ）多層化筋管外に残された多層化筋管に取り込まれる物質の電気化学的測定
多層化筋管に取り込まれる物質のみに応答し、その濃度に比例した電気信号を生み出す原理を用いて、電気化学的測定を行うことができる。
グルコースを例にすると、グルコースセンサーが挙げられる。グルコースセンサーは、グルコースとＯ２にグルコースオキシダーゼを作用させると、グルコノラクトンとＨ２Ｏ２が生成される反応を利用したもので、消費される酸素濃度を酸素電極で測定するか、あるいは生成する過酸化水素水を過酸化水素電極で測定するものである。グルコースセンサーは、例えばアークレイ（株）から市販されている。
【００３８】
（ｉｉｉ）メカノケミカル測定
メカノケミカル測定は、例えば、圧電素子、好ましくは高分子でできた圧電膜を、多層化筋管に貼り付けて電位変化を測定する方法である。多層化筋管に物質が取り込まれて収縮すると、多層化筋管に密着した圧電膜の高分子フィルムが湾曲あるいは波打ち、それに応じて膜厚の方向の電位が変化し、この電位変化からグルコースの消費速度を推定できる。圧電膜は、例えば（株）東京センサから市販されている。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００４０】
＜多層化筋管の作製＞
（１）材料
［細胞］
フィーダー細胞：ＩＣＲマウス胎仔を用いて常法にしたがって樹立した初代線維芽細胞
ＥＳ細胞：大日本製薬より購入したマウスＥＳ細胞（１２９  ｌｉｎｅ／Ｒ−ＣＭＴＩ−１）
［培養ディッシュ］
フィーダー細胞：１０ｃｍ  ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ）／０．１％ゼラチン（ｆｅｅｄｅｒ）でコーティング
ＥＳ細胞：３．５ｃｍ  ｄｉｓｈ（Ｎｕｎｃ）／０．１％ゼラチンでコーティング
胚様体：２４ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（Ｎｕｎｃ）／０．１％ゼラチンでコーティング
（２）試薬調製
［ＥＤＴＡ−ＰＢＳ］（オートクレーブにて滅菌）
ＰＢＳ：１００ｍｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬工業（株））：０．０１９７ｇ
［０．１％トリプシン・ＥＤＴＡ溶液］
ＥＤＴＡ−ＰＢＳ：９．６ｍｌ
２．５％トリプシン液（ＧＩＢＣＯ）：０．４ｍｌ
［２−メルカプトエタノール液］（フィルター滅菌）
ＰＢＳ：１０ｍｌ
２−メルカプトエタノール：７０μｌ
［０．１％ゼラチン溶液（ｆｅｅｄｅｒ）］（オートクレーブにて滅菌）
ゼラチン（ＴｙｐｅＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：０．４ｇ
ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：２ｔａｂｌｅｔｓ
超純水：４００ｍｌ
［初代胎児線維芽細胞培養培地］
ＤＭＥＭ（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：５００ｍｌ
ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：５０ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）：５ｍｌ
［ＥＳ細胞培養培地］
ＤＭＥＭ（ｗｉｔｈ  １１０ｍｇ／ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：４１ｍｌ
ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）：７．５ｍｌ
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（ＧＩＢＣＯ）：０．５ｍｌ
２−メルカプトエタノール液：５０μｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）：０．５ｍｌ
ＥＳ細胞用ヌクレオシド液（１００×）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）：０．５ｍｌ
ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯＴＭ）（和光純薬工業（株））：５０μｌ
［分化誘導培地］
ＤＭＥＭ（ｗｉｔｈ  １１０ｍｇ／ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）：４１０ｍｌ
ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）：７５ｍｌ
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）：５ｍｌ
２−メルカプトエタノール液：０．５ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン：５ｍｌ
ＥＳ細胞用ヌクレオシド液（１００×）：５ｍｌ
［Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ液］（フィルター滅菌）
Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（メルクミリポア）：２ｍｇ
滅菌水：２ｍｌ
［トリパンブルー液］（２倍液）
トリパンブルー：３０ｍｇ
ＰＢＳ：１０ｍｌ
【００４１】
（３）フィーダー細胞の調製
凍結保存してある初代胎児線維芽細胞を−１５２℃フリーザーから出し３７℃の恒温槽で融解してから、１０ｍｌの分化誘導培地を入れた１０ｃｍディッシュ３枚に８０μｌずつ播種し、培養した。培養３日後に各ディッシュから４ｍｌずつ５０ｍｌチューブに移し、マイトマイシンＣ液を１５０μｌ添加、懸濁し、４ｍｌずつ元のディッシュに戻した。２時間半培養後、培地を除き４ｍｌのＰＢＳでディッシュを洗い、１ｍｌの０．１％トリプシン液を加えて５分間処理した後にディッシュ１枚あたり分化誘導培地８ｍｌを加えることにより反応を止めて細胞を回収した。その後、１０００ｒｐｍにて５分間の遠心をして上清を除いた沈殿を分化誘導培地に懸濁してから生細胞数を数え、０．１％ゼラチンでコーティングした３．５ｃｍディッシュに細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓになるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００４２】
（４）ｍＥＳ細胞の培養
（ｉ）ｍＥＳ細胞の融解
−１５２℃フリーザーにストックしてあるＥＳ細胞を３７℃の恒温槽で融解し、１５ｍｌチューブに移し、１ｍｌのＥＳ細胞培養培地を添加し１分間静置した後に、２ｍｌのＥＳ細胞培養培地を添加し１分間静置した。さらに４ｍｌのＥＳ細胞培養培地を添加し１分間静置後に１０００ｒｐｍで１分遠心した。遠心後、上清を除き、沈査に１ｍｌのＥＳ細胞培養培地を添加し、細胞数を測定し、細胞数４．０×１０５ｃｅｌｌｓになるようにマイトマイシンＣ処理したフィーダー細胞上に播種し、ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。
【００４３】
（ｉｉ）ｍＥＳ細胞の継代
融解したＥＳ細胞は毎日培地交換を行い、３日培養後に培養液を除き、ＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄を行った。０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を１ｍｌ添加して、２０秒静置した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を除いた。２分間静置してＥＳ細胞の剥離を顕微鏡で観察後、培地を２ｍｌ添加し遠心管に移し、ピペッティングを２０回行い、シングルセルにした。１０００ｒｐｍで１分間遠心して、上清を除去した後、沈査に１ｍｌのＥＳ細胞培養培地を添加し、細胞数を測定し、細胞数４．０×１０５ｃｅｌｌｓになるようにフィーダー細胞上に播種し、ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。
【００４４】
（ｉｉｉ）ｍＥＳ細胞の凍結
継代時に回収した細胞を血球計算板を用いて細胞数を測定し、細胞数を２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／４５０μｌ  ＥＳ細胞培養培地に調整した細胞懸濁液を凍結チューブに移し、５０μｌのＤＭＳＯを加えよくピペッティングした。氷上で５分間静置した後、−２０℃で３０分間静置した。溶液が凍結したのを確認した後、−８０℃で一晩静置し、翌日−１５２℃フリーザーに移し凍結保存した。
【００４５】
（５）ハンギングドロップ法による胚様体作製
（ｉ）スペルミン添加の胚様体作製
前記「（４）ｍＭＳ細胞の培養」の「（ｉｉ）ｍＥＳ細胞の継代」の操作と同様にして、培養したＥＳ細胞の培養液を除き、ＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄を行った。０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を１ｍｌ添加して、３０秒静置した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を除いた。２分間静置してＥＳ細胞の剥離を顕微鏡で観察後、培地を２ｍｌ添加し遠心管に移し、ピペッティングを２０回行い、シングルセルにした。１０００ｒｐｍで１分間遠心して、上清を除去した。ＥＳ細胞培養培地からＬＩＦを除いた分化誘導培地を添加し、細胞数を計測した。０．１％ゼラチンでコーティングした１０ｃｍディッシュに細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓになるように播種し、ＣＯ２インキュベーター内で４０分間静置した。この４０分培養で接着性の高いフィーダー細胞をディッシュ底面に接着させている。一方で、ＥＳ細胞はディッシュの下層に沈んではいるが、完全には接着していない状態である。その後、８ｍｌの分化誘導培地を二回に分けてディッシュに添加し、ピペッティングによりＥＳ細胞を回収した。回収した細胞を１０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除去した。分化誘導培地を添加し細胞数を１ｍｌ当たり１×１０５ｃｅｌｌｓに調製した。１０ｃｍディッシュのフタの裏側に２０００ｃｅｌｌｓ／２０μｌのドロップを５０個程つくり、乾燥防止のためにディッシュに８ｍｌのＰＢＳを加えた。この方法をハンギングドロップ（ＨＤ）法と呼ぶ。この状態でＣＯ２インキュベーターにて２日間培養を行い、球状に凝集、分化して直径２５０μｍとなった胚様体を、あらかじめ１ｍｌの分化誘導培地を添加し、ＣＯ２インキュベーターで３０分以上静置したゼラチンコート済み２４ｗｅｌｌディッシュ上に、１ｗｅｌｌあたり１個の胚様体になるように播種した。その後、図１に示す操作により分化誘導を行った。
【００４６】
（ｉｉ）スペルミンの調製・添加 
スペルミン（和光純薬工業（株））１５ｍｇを秤量し、１５ｍｌの分化誘導培地に溶解した後、滅菌フィルターを通して５ｍＭのスペルミン溶液を作製した。スペルミンの終濃度が０．５ｍＭになるように分化誘導培地で希釈した。そして、分化誘導１２日目にｗｅｌｌ内の分化誘導培養培地を取り除き、スペルミン添加分化誘導培養培地と交換した。１日後の分化誘導１３日目に、スペルミン添加分化誘導培地を取り除き、スペルミンを含まない分化誘導培地と交換した。
【００４７】
（６）多層化筋管の形成
分化誘導中にスペルミンに１日間接触させると、分化誘導２０日目ごろから筋管の多層化が起こった。
【００４８】
＜多層化筋管を用いたグルコースの取り込みを刺激する物質のスクリーニング＞
（１）材料
［蛍光染色に用いた試料］
スペルミン処理した分化誘導３０日目の胚様体
［使用した蛍光色素］
２−ＮＢＤＧ（（株）ペプチド研究所）
２−ＮＢＤＬＧ（（株）ペプチド研究所）
【００４９】
（２）試薬調整
［ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）］（オートクレーブにて滅菌）
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：２３８．３ｍｇ
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（関東化学（株））：８７６．６ｍｇ
５ｍＭ  ＫＣｌ（和光純薬工業（株））：３７．２７５ｍｇ
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（米山薬品工業（株））：２０．３３ｍｇ
２ｍＭ  ＣａＣｌ２（関東化学（株））：２２１．９６ｍｇ
超純水：３００ｍｌ
［０．５μｇ／ｍｌインスリン］
１０ｍｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：０．５μｌ
ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）：１０ｍｌ
［２−ＮＢＤＧ］（遮光）
２−ＮＢＤＧ（（株）ペプチド研究所）：０．５ｍｇ
超純水：８００μｌ
［２−ＮＢＤＬＧ］（遮光）
２−ＮＢＤＬＧ（（株）ペプチド研究所：０．５ｍｇ
超純粋：７５０μｌ
【００５０】
（３）多層化筋管の２−ＮＢＤＧ染色
分化誘導３０日目に多層化筋管の形成が見られた胚様体の培地を除去し、ＨＥＰＥＳバッファーで洗浄後、同バッファーにて３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＥＰＥＳバッファーを用いて終濃度５０μＭとした２−ＮＢＤＧ溶液を添加した後、蛍光顕微鏡にて１０分おきに３０分間観察を行なった。その後、染色液を除去して分化誘導培地を添加し再度蛍光顕微鏡にて１０分おきに３０分間観察を行なった。観察時にはステージ用インキュベーターを用いた。撮影終了後、取得した蛍光画像から蛍光強度を算出し、時間経過による蛍光強度の変化の割合を求めた。
【００５１】
（４）インスリン付加後の多層化筋管の２−ＮＢＤＧ染色
分化誘導３０日目に多層化筋管の形成が見られた胚様体の培地を除去し、ＨＥＰＥＳバッファーで洗浄後、同バッファーにて３７℃で２０分間インキュベートした。その後インスリン溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。５０μＭ  ２−ＮＢＤＧ溶液を添加した後、蛍光顕微鏡にて１０分おきに３０分間観察を行なった。その後、染色液を除去して分化誘導培地を添加し再度蛍光顕微鏡にて１０分おきに３０分間観察を行なった。観察時にはステージ用インキュベーターを用いた。インスリン溶液非添加のサンプルをコントロールとした。撮影終了後、取得した蛍光画像から蛍光強度を算出し、時間経過による蛍光強度の変化の割合を求めた。
【００５２】
（５）結果
多層化筋管ではインスリン非添加時に比べ添加時の２−ＮＢＤＧ蛍光強度の上昇率が高くなった（図２）。一方、２−ＮＢＤＧの対照として２−ＮＢＤＬＧを添加した場合（２−ＮＢＤＬＧは、Ｌ−グルコースにＮＢＤを標識したもので、細胞に取り込まれない）には、蛍光強度の変化は見られなかったため（図２のＭＭＴＳ（Ｌ）とｉｎｓｕｌｉｎＭＭＴＳ（Ｌ）のグラフを参照：ＭＭＴＳは多層化筋管シートの意味）、時間経過と共に蛍光グルコースが細胞に非特異的に吸着したのではないことが示された。これらの結果から、多層化筋管はインスリン刺激によりグルコースの取り込みが活性化されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、生物個体を使用せずにｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に取り込まれる物質の取り込みを刺激する候補物質をスクリーニングすることができる。該スクリーニングや、スクリーニングによって特定された物質を、ｉＰＳ細胞等の分野やヒトに応用することが期待できる。更に、ＩＩ型糖尿病に対して多層化筋管を用いた移植治療という新たな治療方法を提供する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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