(57)【要約】【課題】より短時間で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片の存在下で、対照サンプル及び前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、前記対照サンプル及び前記被検サンプルの遺伝子増幅速度を比較し、前記被検サンプルの遺伝子増幅速度が前記対照サンプルの遺伝子増幅速度よりも速かった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、を含む方法及びキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、
前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片の存在下又は非存在下で、前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、
前記ペプチド核酸断片の存在下及び非存在下の遺伝子増幅速度を比較し、前記ペプチド核酸の存在下での遺伝子増幅速度と前記ペプチド核酸の非存在下での遺伝子増幅速度とが実質的に変わらなかった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、
前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片の存在下で、対照サンプル及び前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、
前記対照サンプル及び前記被検サンプルの遺伝子増幅速度を比較し、前記被検サンプルの遺伝子増幅速度が前記対照サンプルの遺伝子増幅速度よりも速かった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
前記被検サンプル又は前記対照サンプルは、細胞又は組織をリン酸緩衝液中で煮沸後遠心分離して回収された上清である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象領域がＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド核酸断片が配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記等温増幅法が、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーを用いて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記等温増幅法が、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーを更に用いて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記等温増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するペプチド核酸断片、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーを含む、ＥＧＦＲ遺伝子の変異検出キット。
【請求項９】
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーを更に含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の変異検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子は細胞の増殖や機能獲得に重要な役割を果たしている。上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor；ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ＴＧＦ−α等の成長因子の受容体である。ＥＧＦＲタンパク質は、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域に大別される。細胞内領域にはチロシンリン酸化領域が存在し、腫瘍細胞の分裂や増殖に重要な役割を果たす。
【０００３】
成長因子がＥＧＦＲに結合すると、細胞内領域のチロシンキナーゼ部位がリン酸化し、その刺激がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＲＡＳ経路及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路を経て核内に伝達される。正常な細胞と同様に、癌細胞においても成長因子により細胞の機能が調節され、癌細胞の増殖、アポトーシス抑制、血管新生、浸潤・転移が生じることが知られている。
【０００４】
ＥＧＦＲは近年注目されている分子標的薬のターゲットの１つである。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（一般名「ゲフィチニブ」、商品名「イレッサ（登録商標）」）は、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害するため、成長因子が結合したシグナルが下流へ伝達されなくなり、その機能を低下させる。また、セツキシマブ（商品名「アービタックス（登録商標）」）及びパニツムマブ（商品名「ベクティビックス（登録商標）」）はＥＧＦＲに対する抗体であり、ＥＧＦＲの細胞外領域に結合し、成長因子の結合を阻害するため、ＥＧＦＲの機能を低下させる。
【０００５】
ＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域は、チロシンリン酸化領域に相当し、肺癌をはじめとする種々の癌で変異が報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。上記の領域に変異がある場合、ゲフィチニブの奏功率が高いことが知られている。一方で、ＥＧＦＲの下流に存在するＫ−Ｒａｓに変異がある場合、Ｋ−Ｒａｓが常に活性化された状態となり、抗ＥＧＦＲ抗体薬（セツキシマブ、パニツムマブ等）や、ＥＧＦＲリン酸化阻害剤（ゲフィチニブ等）の奏功率が低下することが知られている。このようなことから、例えば癌患者の治療方針を決定するための情報の１つとして、ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出する需要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pao W. and Miller V.A., Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions., J. Clin. Oncol., 23, 2556-2568, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌患者のＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出する方法として、患者の癌組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡシーケンス法、polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）法を行う方法等が知られている。
【０００８】
ＤＮＡシーケンス法は、目的とする遺伝子の一部を増幅させ、サンガー法によりその塩基配列を決定する方法である。また、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、１本鎖ＤＮＡでは１塩基の違いでも高次構造が変化し、電気泳動による移動度が異なる性質を利用する変異検出法である。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、ＰＣＲにより増幅した２本鎖ＤＮＡ断片を加熱して１本鎖ＤＮＡにし、電気泳動を行って遺伝子の変異を検出する。
【０００９】
しかしながら、ゲノムＤＮＡの抽出は約１時間を要する上に手技の習熟を必要とする。また、変異検出の結果を得るまでに、ＤＮＡシーケンス法では約１週間、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では約３日間を要するのが通常である。
【００１０】
そこで、本発明は、より短時間で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の通りである。
（１）被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片の存在下又は非存在下で、前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、前記ペプチド核酸断片の存在下及び非存在下の遺伝子増幅速度を比較し、前記ペプチド核酸の存在下での遺伝子増幅速度と前記ペプチド核酸の非存在下での遺伝子増幅速度とが実質的に変わらなかった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、を含む方法。
（２）被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片の存在下で、対照サンプル及び前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、前記対照サンプル及び前記被検サンプルの遺伝子増幅速度を比較し、前記被検サンプルの遺伝子増幅速度が前記対照サンプルの遺伝子増幅速度よりも速かった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、を含む方法。
（３）前記被検サンプル又は前記対照サンプルは、細胞又は組織をリン酸緩衝液中で煮沸後遠心分離して回収された上清である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記対象領域がＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ペプチド核酸断片が配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記等温増幅法が、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーを用いて行われる、（４）に記載の方法。
（６）前記等温増幅法が、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーを更に用いて行われる、（５）に記載の方法。
（７）前記等温増幅法がＬＡＭＰ法である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するペプチド核酸断片、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーを含む、ＥＧＦＲ遺伝子の変異検出キット。
（９）配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーを更に含む、（８）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より短時間で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出する方法＞
［第１実施形態］
第１実施形態において、本発明は、被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片（以下、「ロックプライマー」という場合がある。）の存在下又は非存在下で、前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、前記ペプチド核酸断片の存在下及び非存在下の遺伝子増幅速度を比較し、前記ペプチド核酸の存在下での遺伝子増幅速度と前記ペプチド核酸の非存在下での遺伝子増幅速度とが実質的に変わらなかった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００１５】
本実施形態の変異検出方法により、短時間（１時間以内）で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる。このため、小規模診療施設においても遺伝子変異の検査を導入することができる。その結果、効率的にＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の奏功しやすい患者をスクリーニングすることが可能になる。また、遺伝子変異の検出に要する時間及び費用を大幅に低減することができる。また、従来は、効果が期待できない薬剤を処方する事例がみられたが、これを回避することにより、医療費を削減する効果が見込まれる。
【００１６】
（ロックプライマー）
本実施形態の変異検出方法は、ロックプライマーの存在下でＥＧＦＲ遺伝子を等温増幅するものである。ロックプライマーは野生型の塩基配列を有しており、鋳型であるＥＧＦＲ遺伝子にハイブリダイズし、その遺伝子増幅を阻害する。ここで、ＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に変異が存在すると、ロックプライマーがハイブリダイズすることができず、遺伝子増幅が阻害されない。このため、野生型の塩基配列を有するＥＧＦＲ遺伝子は遺伝子増幅が阻害され、変異を有するＥＧＦＲ遺伝子は効率よく遺伝子増幅される。このため、遺伝子増幅速度を測定することにより、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出することができる。
【００１７】
ロックプライマーとしては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いる。ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡに類似した構造を有する分子であり、主鎖にペプチド構造を有する。ＤＮＡやＲＮＡは糖（デオキシリボース又はリボース）を主鎖に有するが、ＰＮＡは糖の代わりにＮ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合したものを主鎖に有する。そして、核酸塩基に相当するプリン環やピリミジン環が、メチレン基とカルボニル基を介して主鎖に結合している。ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡと同様に相補的な塩基配列を有する核酸に対して特異的かつ強力にハイブリダイズする。しかし、核酸ポリメラーゼのプライマーとして機能することができない。また、ＰＮＡ断片に１塩基でもミスマッチがある場合には核酸にハイブリダイズすることができない。このため本実施形態の変異検出方法に好適に用いることができる。
【００１８】
ＰＮＡ断片は、例えば、Hanvey J.C., et al., Antisense and antigene properties of peptide nucleic acids., Science, 258(5087), 1481-1485, 1992.に記載された方法にしたがって合成することができる。また、ＰＮＡ断片の合成を業者に依頼することも可能である。
【００１９】
上述したように、ＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域は、肺癌をはじめとする種々の癌で変異が報告されている。そこで、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の存在を検出する対象領域は、ＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域であってもよい。この場合、ロックプライマーとして、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるペプチド核酸断片を用いるとよい。配列番号１は、野生型のＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域のセンス鎖の塩基配列である。
【００２０】
なお、本実施形態の変異検出方法は、肺癌等の癌に限られず、ＥＧＦＲ遺伝子の変異が関連する様々な疾患にも適用することができる。
【００２１】
（等温増幅法）
等温増幅法としては、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要なループ媒介等温増幅法（Loop-Mediated Isothermal Amplification法、ＬＡＭＰ法；国際公開第００／２８０８２号公報を参照。）を好適に利用することができる。ＬＡＭＰ法は、同じ遺伝子増幅技術であるＰＣＲに比べて増幅効率が高く、ＤＮＡを１５分〜１時間で１０９〜１０１０倍に増幅することができる。また、ＬＡＭＰ法は、最低４種類のプライマーを用いる核酸増幅法であるため、２種類のプライマーを用いるＰＣＲ法と比較して特異性が極めて高い。また、ＬＡＭＰ法は、等温（約６５℃）での遺伝子増幅が可能であることから、従来の機器と比べると小型で安価な反応装置で実施することができる。
【００２２】
ＬＡＭＰ法では、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち、３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域をそれぞれ規定し、これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３と呼ばれる４種類のプライマーを設計する。
【００２３】
ＦＩＰは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。Ｆ３は、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰは、Ｂ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＢ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。Ｂ３は、Ｂ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＢ３領域の塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーは、設計支援ソフト（http://primerexplorer.jp/）等を利用して適宜設計することができる。
【００２４】
本実施形態の変異検出方法において、等温増幅法は、例えば、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＦＩＰに対応する。）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（Ｆ３に対応する。）、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＢＩＰに対応する。）及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（Ｂ３に対応する。）を用いて行ってもよい。
【００２５】
ＬＡＭＰ法においては、上記の４種類のプライマーに加えて、ＬＦ、ＬＢと呼ばれるプライマー（ループプライマー）を用いることができる。ＬＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。ＬＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ＬＦ、ＬＢも、上述した設計支援ソフト等を利用して設計することができる。
【００２６】
本実施形態の変異検出方法において、等温増幅法は、上述したＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３に加えて、例えば、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＬＦに対応する。）及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＬＢに対応する。）を更に用いて行ってもよい。
【００２７】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、ＬＢの各プライマーの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上である。また、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２８】
（被検サンプル）
被検サンプルとしては、例えば、採取された直後の細胞又は組織、エタノール又はホルマリンで固定された細胞又は組織、パラフィンブロックから薄切された細胞又は組織から精製された、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸を用いることができる。
【００２９】
ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の鋳型には、精製された核酸を使用することが一般的である。しかしながら、後述する実施例で示すように、本実施形態の変異検出方法においては、上述の精製されたサンプルだけでなく、細胞又は組織をリン酸緩衝液中で煮沸後遠心分離して回収された上清も、被検サンプル（鋳型）として用いることができる。このため、より短時間で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる。細胞又は組織は、煮沸する前に、例えばボールミル等の粉砕器を用いて破砕してもよい。
【００３０】
（遺伝子増幅速度）
等温増幅法による遺伝子増幅の程度は、例えば、サイバーグリーンＩ等のインターカレーター色素の存在下で遺伝子増幅を行い、増幅された遺伝子の量が、インターカレーター色素が発する蛍光強度と相関することを利用して測定することができる。あるいは、遺伝子増幅が進行するにしたがって等温増幅法の反応溶液が濁ることを利用して、吸光度計又は目視により遺伝子増幅の程度を判断することもできる。
【００３１】
遺伝子増幅速度がより速いとは、より短時間に所定の遺伝子増幅量に到達することを意味する。あるいは、例えば、遺伝子増幅量の変化を、横軸を時間、縦軸を遺伝子増幅量としたグラフに表した場合に、反応開始からグラフが立ち上がり始めるまでの時間がより速いということもできる。
【００３２】
本実施形態の変異検出方法においては、ロックプライマーの存在下及び非存在下の遺伝子増幅速度を比較し、ロックプライマーの存在下での遺伝子増幅速度とロックプライマーの非存在下での遺伝子増幅速度とが実質的に変わらなかった場合に、被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する。
【００３３】
ロックプライマーの存在下及び非存在下の遺伝子増幅速度が実質的に変わらないのは、被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に変異が存在することにより、ロックプライマーがハイブリダイズすることができず、遺伝子増幅が阻害されないためである。
【００３４】
ここで、「遺伝子増幅速度が実質的に変わらない」とは、ロックプライマーの存在下及び非存在下における遺伝子増幅において、所定の遺伝子増幅量に到達するのに要する時間が、例えば１５分未満、例えば１０分未満、例えば５分未満しか違わないことを意味する。あるいは、遺伝子増幅量の変化を、横軸を時間、縦軸を遺伝子増幅量としたグラフに表した場合に、反応開始からグラフが立ち上がり始めるまでの時間が、例えば１５分未満、例えば１０分未満、例えば５分未満しか違わないことを意味する。
【００３５】
逆に、「遺伝子増幅速度に差が認められる」とは、ロックプライマーの存在下及び非存在下における遺伝子増幅において、所定の遺伝子増幅量に到達するのに要する時間に、例えば１５分以上、例えば２０分以上、例えば２５分以上の差が認められることを意味する。あるいは、遺伝子増幅量の変化を、横軸を時間、縦軸を遺伝子増幅量としたグラフに表した場合に、反応開始からグラフが立ち上がり始めるまでの時間に、例えば１５分以上、例えば２０分以上、例えば２５分以上の差が認められることを意味する。
【００３６】
［第２実施形態］
第２実施形態において、本発明は、被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に存在する変異を検出する方法であって、前記対象領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の塩基配列を有するペプチド核酸断片（ロックプライマー）の存在下で、対照サンプル及び前記被検サンプルを鋳型として、等温増幅法により、ＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域を含む領域を増幅する工程と、前記対照サンプル及び前記被検サンプルの遺伝子増幅速度を比較し、前記被検サンプルの遺伝子増幅速度が前記対照サンプルの遺伝子増幅速度よりも速かった場合に、前記被検サンプルのＥＧＦＲ遺伝子の前記対象領域には変異が存在すると判定する工程と、を含む方法を提供する。本実施形態の変異検出方法において、ロックプライマー、等温増幅法、被検サンプル、遺伝子増幅速度については上述したものと同様である。
【００３７】
本実施形態の変異検出方法は、上述した第１実施形態の変異検出方法と原理的には同じであり、変異の有無を判定する基準が異なるものである。本実施形態の変異検出方法では、ロックプライマーの存在下で対照サンプル及び前記被検サンプルを鋳型とした遺伝子増幅を行い、対照サンプル及び被検サンプルの遺伝子増幅速度を比較する。
【００３８】
（対照サンプル）
対照サンプルとしては、上述した被検サンプルと同様な細胞又は組織から精製された、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、細胞又は組織をリン酸緩衝液中で煮沸後遠心分離して回収された上清等であって、ＥＧＦＲ遺伝子の対象領域に変異が存在しないことが予め明らかであるものを用いることができる。
【００３９】
＜変異検出キット＞
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列又は配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するペプチド核酸断片（ロックプライマー）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＦＩＰに対応する。）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（Ｆ３に対応する。）、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＢＩＰに対応する。）及び配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（Ｂ３に対応する。）を含む、ＥＧＦＲ遺伝子の変異検出キットを提供する。本実施形態の変異検出キットは、上述したＥＧＦＲ遺伝子の変異検出方法に好適に用いることができる。
【００４０】
本実施形態の変異検出キットは、上述したロックプライマー、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３に加えて、例えば、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＬＦに対応する。）及び配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＬＢに対応する。）を更に含んでいてもよい。ＬＦ及びＬＢを更に用いることにより、変異検出に要する時間を更に短縮することができる。
【実施例】
【００４１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
［実験例］
（サンプルの調製）
培養した肺腺癌細胞株ＨＣＣ−８２７及び大腸腺癌細胞株ＨＴ−２９をそれぞれ適量ずつマイクロチューブに回収した。続いて、リン酸緩衝液を適量添加し、１分間煮沸した。続いて１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を回収し、サンプルとした。
【００４３】
なお、ＨＣＣ−８２７細胞株はＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域に変異を有していることが知られている。具体的には、コドン７４６〜７５０が欠失している。一方、ＨＴ−２９細胞株のＥＧＦＲ遺伝子は野生型であり、変異を有していないことが知られている。
【００４４】
（等温増幅法による遺伝子増幅）
ロックプライマーとして、配列番号１に示す塩基配列を有するペプチド核酸断片を使用した。また、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３プライマーとして、それぞれ配列番号２〜５に記載の塩基配列からなるプライマーを使用した。
【００４５】
ロックプライマーの存在下及び非存在下で、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３プライマーを用いて、ＨＣＣ−８２７細胞株由来のサンプル及びＨＴ−２９細胞株由来のサンプルをそれぞれ鋳型とした遺伝子増幅を行った。遺伝子増幅の反応液には、市販のキット（型式「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」、ニッポンジーン社）を使用した。遺伝子増幅反応は、蛍光検出遺伝子増幅装置（型式「Ｇｅｎｉｅ（Ｒ）ＩＩ」、ＯｐｔｉＧｅｎｅ社製）を用いて行った。遺伝子増幅量は、反応液中に添加された蛍光物質の蛍光強度に基づいて測定した。
【００４６】
図１（ａ）及び（ｂ）は、実験結果を示すグラフである。横軸は反応時間を表し、縦軸は遺伝子増幅量の相対値を表す。図１（ａ）は、ＨＣＣ−８２７細胞株由来のサンプルを鋳型に用いた結果である。図１（ｂ）は、ＨＴ−２９細胞株由来のサンプルを鋳型に用いた結果である。
【００４７】
その結果、図１（ａ）では、ロックプライマーの存在下及び非存在下における遺伝子増幅量に実質的な差が認められなかった。より具体的には、遺伝子増幅反応の開始からグラフが立ち上がり始めるまでの時間が、ロックプライマーの存在下及び非存在下で約２分間しか違わなかった。
【００４８】
この結果は、ＨＣＣ−８２７細胞株のＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域には変異が存在することを示す。これは、ＨＣＣ−８２７細胞株のＥＧＦＲ遺伝子にロックプライマーがハイブリダイズできなかったため、遺伝子増幅が阻害されなかったことによるものである。
【００４９】
一方、図１（ｂ）では、ロックプライマーの存在下及び非存在下における遺伝子増幅量に顕著な差が認められた。より具体的には、遺伝子増幅反応の開始からグラフが立ち上がり始めるまでの時間に、ロックプライマーの存在下及び非存在下で約１８分間の差が認められた。
【００５０】
この結果は、ＨＴ−２９細胞株のＥＧＦＲ遺伝子のコドン７４６〜７５３の領域には変異が存在しないことを示す。これは、ＨＴ−２９細胞株のＥＧＦＲ遺伝子にロックプライマーがハイブリダイズし、遺伝子増幅が阻害されたことによるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、より短時間で簡便にＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出することができる方法及びキットを提供することができる。
【図１】
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【配列表】
2016214086000001.app