(57)【要約】【課題】本発明は、人工的な足場（スキャホールド）を特に用いることなく、細胞に自発的に細胞構造体を形成させて、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を提供することが可能な細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体を提供することを目的とする。【解決手段】低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養シートの培養面の一部を被覆して、第一の非被覆細胞培養シート部分を取り囲むように設けられ、第二の非被覆細胞培養シート部分により取り囲まれるように設けられた被覆細胞培養シート部分を有する、部分被覆細胞培養シートを準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で、部分被覆細胞培養シートの培養面上に播種する播種工程と、播種した細胞を培養する培養工程とを備えることを特徴とする、細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体。【選択図】図１
2016059337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養シートの培養面の一部を被覆して、第一の非被覆細胞培養シート部分を取り囲むように設けられ、第二の非被覆細胞培養シート部分により取り囲まれるように設けられた被覆細胞培養シート部分を有する、部分被覆細胞培養シートを準備する準備工程と、
細胞を、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記部分被覆細胞培養シートの前記培養面上に播種する播種工程と、
前記播種した細胞を培養する培養工程と
を備えることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
追加の細胞を、前記播種工程において前記部分被覆細胞培養シートの前記培養面に播種された前記細胞上に追加的に播種する追加の播種工程
を更に備える、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記第一の非被覆細胞培養シート部分と前記被覆細胞培養シート部分との境界をなす線と、前記被覆細胞培養シート部分と前記第二の非被覆細胞培養シート部分との境界をなす線とは、同心円を形成する、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記細胞は、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）であり、前記追加の細胞は、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項２又は３に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
ここで、再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。
【０００３】
一般的に、生体外に取り出された細胞は、その遺伝子制御に乱れを生じさせる様々なストレスを受けて、脱分化してしまうことが多く、また、細胞を増殖させるために脱分化させることが必要となる場合も多い。これにより、患者から採取した細胞を、単純な培養条件で培養しても、細胞は元の遺伝子発現状態を維持できないことが多いため、細胞構造体、ひいては組織を形成させることができず、また、その細胞の高度な機能を発揮することができないという問題がある。例えば、一般的なポリスチレン製の細胞培養皿で細胞培養を行った場合には、細胞が単層状の構造を形成するに留まり、高度に分化した細胞に見られる構造、例えば、軟骨細胞が生体内に存在している場合の形状であるペレット状の構造と同様の構造を有する細胞構造体を形成させることは困難であり、また、軟骨細胞に特異的な多くの機能が消失されてしまう。
【０００４】
上記問題に関して、例えば、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞を作製する細胞培養方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−５２４４５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のスフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養の場合には、機械的応力を印加する操作が含まれるため、細胞がつくる立体的構造の再現性や均質性が良好ではない。すなわち、操作者の技量やさじ加減に依存して、得られる細胞構造体にバラツキが生じる。そのため、この細胞構造体を用いて得られる実験結果が、研究機関ごとに異なってしまう虞がある。
【０００７】
そこで、本発明は、人工的な足場（スキャホールド）を特に用いることなく、細胞に自発的に細胞構造体を形成させて、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を提供することが可能な細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の細胞構造体の製造方法は、
低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養シートの培養面の一部を被覆して、第一の非被覆細胞培養シート部分を取り囲むように設けられ、第二の非被覆細胞培養シート部分により取り囲まれるように設けられた被覆細胞培養シート部分を有する、部分被覆細胞培養シートを準備する準備工程と、
細胞を、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記部分被覆細胞培養シートの前記培養面上に播種する播種工程と、
前記播種した細胞を培養する培養工程と
を備えることを特徴とする。
【０００９】
本発明の細胞構造体の製造方法では、追加の細胞を、前記播種工程において前記部分被覆細胞培養シートの前記培養面に播種された前記細胞上に追加的に播種する追加の播種工程を更に備えることが好ましい。
【００１０】
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記第一の非被覆細胞培養シート部分と前記被覆細胞培養シート部分との境界をなす線と、前記被覆細胞培養シート部分と前記第二の非被覆細胞培養シート部分との境界をなす線とは、同心円を形成することが好ましい。
【００１１】
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記細胞は、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）であり、前記追加の細胞は、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であることが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞構造体は、上記いずれかの細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、人工的な足場（スキャホールド）を特に用いることなく、細胞に自発的に細胞構造体を形成させて、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を提供することが可能な細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ｉ）〜（ｉｘ）は、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法の概要について示す図である。
【図２】図２（ａ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、図１に示す（ｖｉｉｉ）から（ｉｘ）までの細胞の挙動の詳細について示す図であり、図２（ａ）に、図１に示す細胞構造体の斜視図を示し、図２（ｂ）に、図１に示す線Ｉ−Ｉに沿う面により切断したときの図を示す。
【図３】図３は、ＨＵＶＥＣの培養開始から１２時間後の細胞構造体の様子を写した写真を示す図であり、図３（ａ）に、細胞構造体を実体顕微鏡で観察したときの写真を示し、図３（ｂ）に、細胞構造体の短軸切片を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す（図１に示す細胞構造体の線ＩＩ−ＩＩに沿う面により切断したときの図に相当する）。ＡＤＳＣについては恒久的に発現されているＧＦＰを観察し（図中、緑色で示される）、ＨＵＶＥＣについてはセルリンカーキットによる蛍光標識を観察した（図中、赤色で示される）。
【図４】図４は、図３に示す細胞構造体の長軸切片を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真（図１に示す細胞構造体の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿う面により切断したときの図に相当する）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、「ＤＭＡＥＭＡ」ともいう）の重合体は、温度応答性高分子として公知であり、その下限臨界溶解温度（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、以下、「曇点」ともいう。）は３２℃程度である。
先般、発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、室温（２５℃）程度の曇点を有する低曇点型温度応答性ポリマー組成物（以下、単に「温度応答性ポリマー組成物」ともいう）を調製することに成功した。低曇点型温度応答性ポリマー組成物としては、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーからなるもの、混合型温度応答性ポリマー組成物がある。
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の繰り返し単位（後述）、及び該ＤＭＡＥＭＡの加水分解物の繰り返し単位（後述）を含む。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製した。
また、混合型温度応答性ポリマー組成物は、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
【００１６】
（細胞構造体の製造方法）
本発明の細胞構造体の製造方法は、
低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養シートの培養面の一部を被覆して、第一の非被覆細胞培養シート部分を取り囲むように設けられ、第二の非被覆細胞培養シート部分により取り囲まれるように設けられた被覆細胞培養シート部分を有する、部分被覆細胞培養シートを準備する準備工程と、
細胞を、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記部分被覆細胞培養シートの前記培養面上に播種する播種工程と、
前記播種した細胞を培養する培養工程と
を備える。
【００１７】
図１（ｉ）〜（ｉｘ）に、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法の概要について示す。
図２（ａ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）に、図１に示す（ｖｉｉｉ）から（ｉｘ）までの細胞の挙動の詳細について示す。図２（ａ）に、図１に示す細胞構造体の斜視図を示し、図２（ｂ）に、図１に示す線Ｉ−Ｉに沿う面により切断したときの図を示す。
【００１８】
以下、各工程の詳細を記載する。
【００１９】
（調製工程）
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、まず、低曇点型温度応答性ポリマー組成物（温度応答性ポリマー組成物）を調製する（調製工程）。
【００２０】
−温度応答性ポリマー組成物の製造方法−
温度応答性ポリマー組成物は、例えば、下記の通り、一例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法、及び別の例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法により製造することができる。
【００２１】
以下、一例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーからなる。
【００２２】
すなわち、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（混合物調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００２３】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００２４】
重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される分子内イオン複合体型応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の分子内イオン複合体型応答性ポリマーを得ることができる。
【００２５】
次いで、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に紫外線を照射する（紫外線照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００２６】
紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００２７】
反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、分子内イオン複合体型応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００２８】
なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００２９】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００３０】
この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2016059337.tif 000003
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2016059337.tif 000004
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００３１】
なお、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマー組成物の製造方法も、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法に含めることができる。
【００３２】
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーは、上記例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法により製造される。
【００３３】
ここで、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００３４】
この分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００３５】
この分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００３６】
また、この分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器（例えば、細胞培養用プレート、細胞培養用シート等を調製することができる。
【００３７】
更に、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法において用いられる分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００３８】
この分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００３９】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーでは、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００４０】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００４１】
以下、別の例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、ＤＭＡＥＭＡの重合体である温度応答性ポリマーを含む混合型温度応答性ポリマー組成物である。
【００４２】
すなわち、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。
【００４３】
（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【００４４】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【００４５】
ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【００４６】
また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【００４７】
上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加などにより、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【００４８】
上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸などが挙げられる。
【００４９】
また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【００５０】
（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【００５１】
なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【００５２】
ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。
【００５３】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【００５４】
また、上記割合は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００５５】
上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【００５６】
ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。
【００５７】
Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
【００５８】
上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。
【００５９】
（準備工程）
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、次いで、前述の低曇点型温度応答性ポリマー組成物（温度応答性ポリマー組成物）で細胞培養シートの培養面の一部を被覆して、被覆細胞培養シート部分を有する部分被覆細胞培養シートを準備する（準備工程）。
【００６０】
ここで、被覆細胞培養シート部分は、第一の非被覆細胞培養シート部分を取り囲むように設けられ、また、第二の非被覆細胞培養シート部分により取り囲まれるように設けられる。言い換えれば、第一の非被覆細胞培養シート部分は、被覆細胞培養シート部分に囲繞されており、また、被覆細胞培養シート部分は、第二の非被覆細胞培養シート部分に囲繞されている。
【００６１】
この工程は、例えば、図１に示すように、行うことができる。すなわち、まず、細胞が接着しない又は接着しにくいシート１１を準備し、そして、該シート１１のうち、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１となる領域、及び、第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２となる領域を、フィルム１２により覆い、一方、該シート１１のうち、被覆細胞培養シート部分１１ｃとなる領域は、未処理としておく（図１（ｉ）参照）。
次いで、このシート１１上に、前述の温度応答性ポリマー組成物の水溶液１３を加え（図１（ｉｉ）参照）、その後、該水溶液を、前述の「曇点」以上の温度（例えば、４５℃）で、所定時間（例えば、３時間）、乾燥させる（図１（ｉｉｉ）参照）。
そして、乾燥後、上記フィルム１２を剥がす（図１（ｉｘ）参照）。
上記一連の操作により、被覆細胞培養シート部分１１ｃを有する部分被覆細胞培養シート１１ｘを準備することができる（図１（ｉｘ）参照）。
【００６２】
特に、図１に示す本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１と被覆細胞培養シート部分１１ｃとの境界をなす線と、被覆細胞培養シート部分１１ｃと第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２との境界をなす線とは、同心円を形成している（図１（ｉｘ）参照）。
この構成によれば、後述の培養工程において、播種・培養された細胞が管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を形成しやすい。
【００６３】
ここで、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１と被覆細胞培養シート部分１１ｃとの境界をなす線が描く円の半径としては、所望の管腔構造のサイズに合わせて適宜選択されてよく、特に、管腔構造を有する細胞構造体を形成しやすくする観点から、１ｍｍ以上であることが好ましく、３ｍｍ以上であることが更に好ましく、また、１００ｍｍ以下であることが好ましく、８０ｍｍ以下であることが更に好ましい。
また、被覆細胞培養シート部分１１ｃと第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２との境界をなす線が描く円の半径としては、所望の管腔構造のサイズに合わせて適宜選択されてよく、特に、管腔構造を有する細胞構造体を形成しやすくする観点から、２ｍｍ以上であることが好ましく、５ｍｍ以上であることが更に好ましく、また、２００ｍｍ以下であることが好ましく、９０ｍｍ以下であることが更に好ましい。
【００６４】
なお、本発明の細胞構造体の製造方法では、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１と被覆細胞培養シート部分１１ｃとの境界をなす線が描く平面視形状は、円形に限定されることなく、多角形、楕円形等としてもよく、また、被覆細胞培養シート部分１１ｃと第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２との境界をなす線が描く平面視形状も、円形に限定されることなく、多角形、楕円形等としてもよい。
特に、上記境界をなす線が描く平面視形状は、管腔構造をその軸線に関して線対称とする観点から、点対称であることが好ましい。
【００６５】
上記細胞が接着しない又は接着しにくいシート１１の素材としては、当業者に周知の素材が使用可能であり、例えば、接触角が７０°以下の素材、具体的には、親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート製のシート、ポリスチレン製のシート、ポリカーボネート製のシート、ガラスシート、ポリプロピレン製のシート等が挙げられ、特に、細胞培養に使用するために溶出物を少なくする観点から、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクルリルアミドが放射線グラフト重合により導入固定されたポリスチレン製のシート等が好ましい。
【００６６】
上記シート１１の形状、サイズ、厚さ等は、特に限定されない。
特に、図１に示す本発明の一例の細胞構造体の製造方法において用いられる平面視円形のシートでは、半径：１０ｍｍ〜３０ｍｍ、厚さ：０．０５ｍｍ〜２．０ｍｍであることが好ましい。
【００６７】
上記フィルム１２としては、例えば、前述の温度応答性ポリマー組成物（分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーからなるもの、混合型温度応答性ポリマー組成物）が塗布されない表面を作製できる限り特に限定されることなく、例えば、前述のシート１１との密着性の高いパラフィルム等が挙げられる。
【００６８】
（播種工程）
そして、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、準備した部分被覆細胞培養シートに、細胞を、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で、部分被覆細胞培養シートの培養面上に播種する（播種工程）。
この工程は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた部分被覆細胞培養シート１１ｘを、室温のクリーンベンチに取り出し、該シート１１ｘを細胞培養器に入れ、該細胞培養器に細胞Ｃ１及び細胞培養用培地Ｍ１を加えることによって、行うことができる（図１（ｖ）参照）。
上記の部分被覆細胞培養シートのうち、細胞Ｃ１が接着しない又は接着しにくい部分である、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１及び第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２には、細胞Ｃ１は接着せず、被覆細胞培養シート部分１１ｃの上にのみ細胞Ｃ１が接着する（図１（ｖｉ）参照）。
【００６９】
上記細胞密度に関して、例えば、２００ｍｍ2の培養面の面積及び１ｍＬの培地容量を有する２４ウェルプレートに、播種する場合に、１．０×１０3個／ｍｍ2以上の細胞密度で播種を行うためには、２０×１０4個／ｍＬ以上の細胞密度を有する細胞浮遊液を用いる必要がある。
【００７０】
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、特に限定されることなく、軟骨細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の間葉系細胞を好適に用いることができ、特に、アクチンフィラメントが発達し、自己凝集がしやすいものが好ましく、凝集力と合わせて免疫寛容性をも有する脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）が特に好ましい。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。
【００７１】
上記細胞密度で細胞を播種すれば、詳細なメカニズムは不明であるが、下記の培養工程で、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を形成させることができる。この細胞構造体は、その管腔構造内に生存している細胞を有する。
【００７２】
また、上記細胞密度は、培養中の細胞Ｃ１同士の接触による増殖停止などの、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、５．０×１０3個／ｍｍ2以下とすることが好ましい。
【００７３】
そして、上記細胞密度は、１．５×１０3個／ｍｍ2以上とすることが更に好ましく、また、３．０×１０3個／ｍｍ2以下とすることが更に好ましい。上記細胞密度を上記範囲とすれば、下記の培養工程（及び追加の培養工程）で、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００７４】
（培養工程）
最後に、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、播種された細胞を培養する（培養工程）。
この工程は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる（図１（ｉｘ）参照）。
【００７５】
この工程において生じる現象を、図１（特に、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ））、図２を参照しながら、以下に記載する（なお、図では、播種工程において播種された細胞Ｃ１と共に、後述の追加の播種工程において播種された追加の細胞Ｃ２も、示されている）。
すなわち、この工程において、被覆細胞培養シート部分１１ｃに接着した細胞Ｃ１は、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１と被覆細胞培養シート部分１１ｃとの境界付近から、培養皿面から遠ざかり、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１から被覆細胞培養シート部分１１ｃに向かって反り返るように、凝集し始める（図２（ａ）（ｉｉ）、図２（ｂ）（ｉｉ）参照）。同様に、被覆細胞培養シート部分１１ｃに接着した細胞Ｃ１は、被覆細胞培養シート部分１１ｃと第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２との境界付近から、培養皿面から遠ざかり、第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２から被覆細胞培養シート部分１１ｃに向かって反り返るように、凝集し始める（図２（ａ）（ｉｉ）、図２（ｂ）（ｉｉ）参照）。
細胞培養シート１１にシート状に存在していた細胞Ｃ１は、上記の反り返りを徐々に増大させ、遂には、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１と被覆細胞培養シート部分１１ｃとの境界付近に位置していた細胞Ｃ１と、被覆細胞培養シート部分１１ｃと第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２との境界付近に位置していた細胞Ｃ１とが、接着し、管腔構造（チューブ構造）を形成する（図２（ａ）（ｉｉｉ）、図２（ｂ）（ｉｉｉ）参照）。
【００７６】
なお、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法が、追加の播種工程（後述）を含む場合には、上記現象が生じないうちに、追加の播種工程を行うことが好ましい。
【００７７】
また、培養時間、使用される培地等の培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。
【００７８】
（追加の播種工程）
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、任意選択的に、好適に、前述の播種工程後に、追加の細胞を、播種工程において部分被覆細胞培養シートの培養面に播種された細胞上に追加的に播種してもよい（追加の播種工程）。
図１に示す細胞構造体の製造方法は、追加の播種工程を含んでいる。
【００７９】
この場合、前述の播種工程終了から前述の追加の播種工程開始までの時間は、前述の細胞が凝集する現象が進行する前に当該工程を行うことができる限り特に限定されることなく、使用する細胞種に応じて当業者によって適宜調整されてよく、例えば、約６時間〜約２４時間程度としてよい。なお、脂肪組織由来間葉系幹細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞を使用した場合の具体的な時間に関しては、実施例に記載の通りである。当該時間は、播種工程において播種された細胞を接着させるため、通常の培養条件下で培養してよい。
【００８０】
この工程は、前述の播種工程後の部分被覆細胞培養シート（図１（ｖｉ）参照）を、適当な緩衝液を用いて洗浄し、別の細胞培養器に入れ、該細胞培養器に追加の細胞Ｃ２及び細胞培養用培地Ｍ２を加えることによって、行うことができる（図１（ｖｉｉ）参照）。
【００８１】
上記の部分被覆細胞培養シートのうち、細胞が接着しない又は接着しにくい部分である、第一の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ１及び第二の非被覆細胞培養シート部分１１ｂ２には、追加の細胞Ｃ２は接着せず、前述の播種工程において被覆細胞培養シート部分１１ｃに既に接着された細胞Ｃ１の上に、追加の細胞Ｃ２が接着する（図１（ｖｉｉｉ）参照）。
【００８２】
前述の播種工程における細胞Ｃ１と、上記の追加の播種工程における追加の細胞Ｃ２とは、同種であってもよく、異種であってもよい。
なお、細胞密度は、例えば、実施例に記載の通りとすることができる。
【００８３】
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法が、追加の播種工程を含む場合、前述の培養工程において、前述の通り、細胞Ｃ１及び追加の細胞Ｃ２の反り返りが生じ、細胞Ｃ１の層を内側層として追加の細胞Ｃ２の層を外側層として有する管腔構造（チューブ構造）を形成する（図１（ｉｘ）、図２参照）。
【００８４】
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、追加の播種工程において用いる追加の細胞Ｃ２は、高度に分化した（ＣＤ３１陽性である）血管内皮細胞、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であることが好ましい。なお、播種工程において用いる細胞Ｃ１は、前述の通り、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）であることが好ましい。
【００８５】
特に、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法では、播種工程において用いる細胞Ｃ１をＡＤＳＣとし、追加の播種工程において用いる追加の細胞Ｃ２をＨＵＶＥＣとした場合、培養面側にあるＡＤＳＣが、追加のＨＵＶＥＣと比較して、細胞の凝集が生じやすいため、外側層が内側層を包み込むような現象が生じやすい。
そして、この場合、人工血管とし得る細胞構造体を形成することが可能となる。このような細胞構造体は、既に臨床で利用されているｅ−ＰＴＦＥ製やポリエステル製の多孔質チューブ等でできた人工血管と比較して以下の点で有用である。
・上記細胞構造体は、人工材料を含まず、細胞及び細胞間マトリックスのみで構成されているため、コンプライアンスβ値（血管拍動におけるＳＳカーブ追随性）が生体血管に近く、宿主血管との吻合部において発生しやすい血栓を防止できる可能性がある。
・上記細胞構造体は、宿主体内で宿主の成長に合わせて人工血管としてそれ自体も成長する可能性を秘めている。
・上記細胞構造体は、人工材料を含まないので石灰化の危険性を低減できる。
・上記細胞構造体は、宿主に移植した時点で内壁が内皮細胞で覆われているため、移植初期の血栓発生や内膜肥厚の問題が生じにくい。
【００８６】
本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、人工的な足場（スキャホールド）を特に用いることなく、細胞に自発的に細胞構造体を形成させて、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を提供することができる。
そして、本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体の製造の再現性や簡便性が高く、細胞構造体の均質性が良好である。
【００８７】
（細胞構造体）
本発明の実施形態の細胞構造体は、上記本発明の実施形態の細胞構造体の製造方法により製造することができる。
本発明の実施形態の細胞構造体は、構成する細胞の成熟度が高く、細胞間マトリックスが豊富であるため粘着性に富んでいるため、単層培養されたシート状の細胞を単に丸めてなる細胞構造体と比較して、管腔構造（チューブ構造）の物理的強度が高く、シートの端部のシール性が高い。
【実施例】
【００８８】
以下、試験例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の試験例に何ら限定されるものではない。
【００８９】
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
【００９０】
（試験Ａ）分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１６０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．０）と決定した（以下、「試験Ａポリマー」ともいう）。
【００９１】
（試験Ｂ）部分被覆細胞培養シートの準備
図１に示すように、第一の非被覆細胞培養シート部分と被覆細胞培養シート部分との境界をなす線と、被覆細胞培養シート部分と第二の非被覆細胞培養シート部分との境界をなす線とが、同心円を形成するように、第一の非被覆細胞培養シート部分、第二の非被覆細胞培養シート部分、被覆細胞培養シート部分を作製した。
具体的には、下記手順に従った。
親水性基で修飾したポリエチレンテレフタレート製のシート（和光純薬社製、１４ｍｍ径プラスチックシート）を準備し、そして、該シートのうち、第一の非被覆細胞培養シート部分となる領域、及び、第二の非被覆細胞培養シート部分となる領域を、パラフィルム（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ社製）により覆い、一方、該シートのうち、被覆細胞培養シート部分となる領域は、未処理とした。次いで、このシート上に、試験Ａポリマーの水溶液（濃度：３０ｎｇ／μＬ）２０μＬを加え、その後、該水溶液を４５℃で３時間乾燥させた。乾燥後、上記パラフィルムを剥がした。
【００９２】
（試験Ｃ）細胞の播種
上記試験Ｂで準備した部分被覆細胞培養シートを、２４ウェル細胞培養プレートのウェルに敷き、このプレートを、室温条件下において、ＧＦＰ組換えルイルラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ））を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５、ＦＣＳ：インビトロゲン社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させ、細胞密度を４×１０3個／ｍｍ2）に調整した培養液を加えた。
そして、この実験では、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で６時間培養した。
【００９３】
（試験Ｄ）追加の細胞の播種
上記試験Ｃで準備したプレートのウェル中の培地を吸引して、被覆細胞培養シート部分に接着しなかったＡＤＳＣを取り除き、緩衝液（インビトロゲン社製、Ｄ’−ＰＢＳ×１）を用いて、被覆細胞培養シート部分にＡＤＳＣが接着した部分被覆細胞培養シートを洗浄した。そして、洗浄後の部分被覆細胞培養シートをプレートの別のウェルに敷き、このプレートを、室温条件下において、セルリンカーキット（ＳＩＧＭＡ社、ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ  ＲＦＰ  Ｋｉｔ）で蛍光標識したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ））を、ＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ社、ＥＣ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含む＋５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））中に浮遊させ、細胞密度を３種類（５×１０2個／ｍｍ2、２０×１０2個／ｍｍ2、４０×１０2個／ｍｍ2）に調整した培養液を加えた。
【００９４】
（試験Ｅ）細胞及び追加の細胞の培養
（試験Ｄ）の後、これらの細胞（ＡＤＳＣ、ＨＵＶＥＣ）を３７℃の細胞培養インキュベーター中で６時間培養した。
【００９５】
ＨＵＶＥＣの培養開始から６時間後、第一の非被覆細胞培養シート部分と被覆細胞培養シート部分との境界付近のＡＤＳＣｓが、培養面から遠ざかり、第一の非被覆細胞培養シート部分から被覆細胞培養シート部分に向かって反り返るように凝集し始め、管腔構造（チューブ構造）を形成した。
【００９６】
図３に、ＨＵＶＥＣの培養開始から１２時間後の細胞構造体の様子を写した写真を示す。図３（ａ）に、細胞構造体を実体顕微鏡で観察したときの写真を示す。図３（ｂ）に、細胞構造体の短軸切片を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す（図１に示す細胞構造体の線ＩＩ−ＩＩに沿う面により切断したときの図に相当する）。ＡＤＳＣについては恒久的に発現されているＧＦＰを観察し（図中、緑色で示される）、ＨＵＶＥＣについてはセルリンカーキットによる蛍光標識を観察した（図中、赤色で示される）。
【００９７】
図４に、図３に示す細胞構造体の長軸切片を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真（図１に示す細胞構造体の線ＩＩＩ−ＩＩＩに沿う面により切断したときの図に相当する）。
【００９８】
これらの結果から、（試験Ａ）〜（試験Ｄ）により得られた細胞構造体は、ＡＤＳＣｓを外側の細胞層とし、ＨＵＶＥＣを内側の細胞層とする、管腔状の細胞構造体を有するものであることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の細胞構造体の製造方法によれば、人工的な足場（スキャホールド）を特に用いることなく、細胞に自発的に細胞構造体を形成させて、管腔構造（チューブ構造）を有する細胞構造体を提供することができる。
【符号の説明】
【０１００】
１１；シート、１１ｂ１；第一の非被覆細胞培養シート部分、１１ｂ２；第二の非被覆細胞培養シート部分、１１ｃ；被覆細胞培養シート部分、１１ｘ；部分被覆細胞培養シート、１２；フィルム、１３；温度応答性ポリマーの水溶液、Ｃ１；細胞、Ｍ１；細胞培養用培地、Ｃ２；追加の細胞、Ｍ２；細胞培養用培地、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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