(57)【要約】【課題】侵入器官形成（付着器形成、侵入菌糸形成）、さらには胞子形成（特に、分生子形成）が可能な培地を提供すること。【解決手段】３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造により表面が疎水性を示す固形培地では、病原菌が付着器形成、侵入菌糸形成及び分生子形成を行うことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３価以上の陽イオン及び多糖類を含有する固形培地を含む侵入器官形成用培地又は胞子形成用培地であって、該３価以上の陽イオンと該多糖類の架橋構造により該固形培地の表面が疎水性を示すことを特徴とする培地。
【請求項２】
前記多糖類は、以下のいずれか１以上である請求項１に記載の培地。
（１）カルボキシメチルセルロース
（２）アルギン酸
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム
（４）カルボキシメチルセルロースカリウム
（５）アルギン酸ナトリウム
（６）アルギン酸カリウム
（７）グルクロン酸
（８）ガラクツロン酸
（９）マンヌロン酸
（１０）アラビアゴム
（１１）ペクチン
（１２）カラギーナン
（１３）コンドロイチン硫酸ナトリウム
（１４）ヒアルロン酸ナトリウム
（１５）ヘパリン
（１６）カルボキシメチルキチンナトリウム
（１７）カルボキシメチルデンプンナトリウム
（１８）ポリアクリル酸ナトリウム
【請求項３】
前記３価以上の陽イオンが、以下のいずれか１以上である請求項１又は２に記載の培地。
（１）３価の鉄イオン
（２）３価のアルミニウムイオン
（３）３価のセリウムイオン
（４）３価のクロムイオン
（５）３価のインジウムイオン
（６）３価のチタニウムイオン
（７）４価のスズイオン
（８）４価のマンガンイオン
【請求項４】
前記架橋構造による固形培地表面の疎水性の処理方法は、以下の工程を含む請求項１〜３のいずれか１に記載の培地、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に重層する工程、
又は、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に噴霧する工程。
【請求項５】
前記培地は、侵入菌糸形成用培地である請求項１〜４のいずれか１に記載の培地。
【請求項６】
前記培地は、分生子形成用培地である請求項１〜４のいずれか１に記載の培地。
【請求項７】
以下の工程を含む侵入器官形成用培地又は胞子形成用培地の製造方法。
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に重層する工程、
又は、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に噴霧する工程。
【請求項８】
前記多糖類は、以下のいずれか１以上である請求項７に記載の製造方法。
（１）カルボキシメチルセルロース
（２）アルギン酸
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム
（４）カルボキシメチルセルロースカリウム
（５）アルギン酸ナトリウム
（６）アルギン酸カリウム
（７）グルクロン酸
（８）ガラクツロン酸
（９）マンヌロン酸
（１０）アラビアゴム
（１１）ペクチン
（１２）カラギーナン
（１３）コンドロイチン硫酸ナトリウム
（１４）ヒアルロン酸ナトリウム
（１５）ヘパリン
（１６）カルボキシメチルキチンナトリウム
（１７）カルボキシメチルデンプンナトリウム
（１８）ポリアクリル酸ナトリウム
【請求項９】
前記３価以上の陽イオンが、以下のいずれか１以上である請求項７又は８に記載の製造方法。
（１）３価の鉄イオン
（２）３価のアルミニウムイオン
（３）３価のセリウムイオン
（４）３価のクロムイオン
（５）３価のインジウムイオン
（６）３価のチタニウムイオン
（７）４価のスズイオン
（８）４価のマンガンイオン
【請求項１０】
前記培地は、侵入菌糸形成用培地である請求項７〜９のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記培地は、分生子形成用培地である請求項７〜９のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造による固形培地表面が疎水性を示すことを特徴とする侵入器官形成用培地、胞子形成用培地及びこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの植物寄生菌が宿主植物へ感染する時には、付着した胞子が発芽して付着器を形成し、そこから該植物に貫入して植物組織内で侵入菌糸を作る。付着器と侵入菌糸は、侵入器官であり、植物寄生のための特別な器官である。このため、侵入器官は、植物と植物寄生菌との相互作用を明らかにすることや、植物寄生菌防除のための重要な器官である。
付着器の形成は、植物表面だけでなく様々な人工基質上でもできる。このため、付着器形成の研究は進んでおり、付着器形成のための条件や、付着器形成時の遺伝子発現、タンパク質発現及び発現物質などが明らかになっている。さらには、該研究は、農薬のアッセイなどにも利用されている。
【０００３】
一方で、侵入菌糸の人工基質上での形成は困難であり、セロファン膜やタマネギ表皮細胞を用いた研究のみが行われている。付着器は、セロファン膜上に形成され、さらに該セロファン膜内に貫入するものの、完全な侵入菌糸とはならない。また、セロファン膜の成分の制御などは自由にできないため、植物と植物寄生菌との相互作用を調べるためにも不十分な素材である。
以上により、植物と植物寄生菌との相互作用を調べるためにも人工基質で完全に形成される侵入菌糸を調べる必要がある。
【０００４】
細胞培地に関する報告は以下の通りである。
【０００５】
特許文献１は、「鉄架橋アルギン酸ゲルを含む細胞培養用基質。」を開示している。
しかしながら、特許文献１は、「３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造による固形培地表面が疎水性を示すことを特徴とする侵入器官形成用培地、胞子形成用培地」を開示又は示唆をしていない。
【０００６】
特許文献２は、「鉄架橋アルギン酸ゲルを含む細胞培養用基質の上で細胞を培養する工程、及び鉄架橋アルギン酸ゲルを含む細胞培養用基質を鉄に特異的に結合するキレート剤を用いて溶解し、培養した細胞を細胞シートとして得る工程、を含む細胞シートの製造方法。」を開示している。
しかしながら、特許文献２は、「３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造による固形培地表面が疎水性を示すことを特徴とする侵入器官形成用培地、胞子形成用培地」を開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2009-011215
【特許文献２】特開2012-065632
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、侵入器官形成（付着器形成、侵入菌糸形成）、さらには胞子形成（特に、分生子形成）が可能な培地について検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造により表面が疎水性を示す固形培地を用いて共生菌又は寄生菌（特に、病原菌）を培養すれば、該共生菌又は寄生菌（特に、病原菌）の付着器形成、侵入菌糸形成及び分生子形成に成功することを確認した。
これにより、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
１．３価以上の陽イオン及び多糖類を含有する固形培地を含む侵入器官形成用培地又は胞子形成用培地であって、該３価以上の陽イオンと該多糖類の架橋構造により該固形培地の表面が疎水性を示すことを特徴とする培地。
２．前記多糖類は、以下のいずれか１以上である前項１に記載の培地。
（１）カルボキシメチルセルロース
（２）アルギン酸
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム
（４）カルボキシメチルセルロースカリウム
（５）アルギン酸ナトリウム
（６）アルギン酸カリウム
（７）グルクロン酸
（８）ガラクツロン酸
（９）マンヌロン酸
（１０）アラビアゴム
（１１）ペクチン
（１２）カラギーナン
（１３）コンドロイチン硫酸ナトリウム
（１４）ヒアルロン酸ナトリウム
（１５）ヘパリン
（１６）カルボキシメチルキチンナトリウム
（１７）カルボキシメチルデンプンナトリウム
（１８）ポリアクリル酸ナトリウム
３．前記３価以上の陽イオンが、以下のいずれか１以上である前項１又は２に記載の培地。
（１）３価の鉄イオン
（２）３価のアルミニウムイオン
（３）３価のセリウムイオン
（４）３価のクロムイオン
（５）３価のインジウムイオン
（６）３価のチタニウムイオン
（７）４価のスズイオン
（８）４価のマンガンイオン
４．前記架橋構造による固形培地表面の疎水性の処理方法は、以下の工程を含む前項１〜３のいずれか１に記載の培地、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に重層する工程、
又は、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に噴霧する工程。
５．前記培地は、侵入菌糸形成用培地である前項１〜４のいずれか１に記載の培地。
６．前記培地は、分生子形成用培地である前項１〜４のいずれか１に記載の培地。
７．以下の工程を含む侵入器官形成用培地又は胞子形成用培地の製造方法。
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に重層する工程、
又は、
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程、及び
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に噴霧する工程。
８．前記多糖類は、以下のいずれか１以上である前項７に記載の製造方法。
（１）カルボキシメチルセルロース
（２）アルギン酸
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム
（４）カルボキシメチルセルロースカリウム
（５）アルギン酸ナトリウム
（６）アルギン酸カリウム
（７）グルクロン酸
（８）ガラクツロン酸
（９）マンヌロン酸
（１０）アラビアゴム
（１１）ペクチン
（１２）カラギーナン
（１３）コンドロイチン硫酸ナトリウム
（１４）ヒアルロン酸ナトリウム
（１５）ヘパリン
（１６）カルボキシメチルキチンナトリウム
（１７）カルボキシメチルデンプンナトリウム
（１８）ポリアクリル酸ナトリウム
９．前記３価以上の陽イオンが、以下のいずれか１以上である前項７又は８に記載の製造方法。
（１）３価の鉄イオン
（２）３価のアルミニウムイオン
（３）３価のセリウムイオン
（４）３価のクロムイオン
（５）３価のインジウムイオン
（６）３価のチタニウムイオン
（７）４価のスズイオン
（８）４価のマンガンイオン
１０．前記培地は、侵入菌糸形成用培地である前項７〜９のいずれか１に記載の製造方法。
１１．前記培地は、分生子形成用培地である前項７〜９のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の侵入器官形成用培地及び胞子形成用培地は、植物病原菌の付着器形成、侵入菌糸形成及び分生子形成を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（１）ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の表面図（アルギン酸ナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（２）ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。矢印１〜３は、それぞれ、「付着器」、「胞子（分生子）」及び「侵入菌糸」を示す。
【図２】ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の断面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）
【図３】（１）未染色（明視野）の形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（２）DAPI染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（３）TRITC-ConA染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（４）FITC-WGA染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。
【図４】ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の断面図（栄養塩としてMSを追加添加、カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）
【図５】ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の断面図（栄養塩としてMSを追加添加、カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用、培養１週間程度）。矢印４、５は、それぞれ、「気中菌糸」及び「胞子（分生子）」を示す。
【図６】（１）ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の表面図（アルギン酸ナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（２）ラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（３）未染色の形成用培地の断面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。
【図７】（１）未染色（明視野）の形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（２）DAPI染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（３）TRITC-ConA染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。（４）FITC-WGA染色した形成用培地の表面図（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の３価以上の陽イオンと多糖類の架橋構造により表面が疎水性を示す固形培地を特徴とする侵入器官形成用培地、胞子形成用培地（以後、「本発明の形成用培地」と称する場合がある）及びこれらの製造方法を詳細に説明する。
【００１４】
（３価以上の陽イオン）
本発明の形成用培地で使用する３価以上の陽イオンは、下記を例示することができるが、特に限定されない。
（１）３価の鉄イオン、（２）３価のアルミニウムイオン、（３）３価のセリウムイオン、（４）３価のクロムイオン、（５）３価のインジウムイオン、（６）３価のチタニウムイオン、（７）４価のスズイオン、及び（８）４価のマンガンイオン。
特に、好ましい３価以上の陽イオンは、３価の鉄イオン、３価のアルミニウムイオンである。
３価以上の陽イオン形成用培地中での濃度の範囲は、特に限定されないが、0.01Ｍ〜0.5Ｍ、好ましくは0.05Ｍ〜0.4Ｍ、より好ましくは0.08Ｍ〜0.3Ｍである。
さらに、これらの陽イオンを混合して使用しても良く、例えば、３価の鉄イオン及び／又は３価のアルミニウムイオンに、その他の３価以上の陽イオンを混合して使用することもできる。
【００１５】
（多糖類）
本発明の形成用培地で使用する多糖類は、下記を例示することができるが、特に限定されない。
（１）カルボキシメチルセルロース、（２）アルギン酸、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、（４）カルボキシメチルセルロースカリウム、（５）アルギン酸ナトリウム、（６）アルギン酸カリウム、（７）グルクロン酸、（８）ガラクツロン酸、（９）マンヌロン酸、（１０）アラビアゴム、（１１）ペクチン、（１２）カラギーナン、（１３）コンドロイチン硫酸ナトリウム、（１４）ヒアルロン酸ナトリウム、（１５）ヘパリン、（１６）カルボキシメチルキチンナトリウム、（１７）カルボキシメチルデンプンナトリウム及び（１８）ポリアクリル酸ナトリウム。
特に、好ましい多糖類は、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウムである。
多糖類の形成用培地中での濃度の範囲は、特に限定されないが、1.0％〜4.0％、好ましくは1.5％〜3.5％、より好ましくは1.8％〜3.0％である。
さらに、これらの多糖類を混合して使用しても良く、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はアルギン酸ナトリウムに、その他の多糖類を混合して使用することもできる。
【００１６】
（固形培地）
本発明の形成用培地で使用する固形培地を固形化させる物質の種類は、下記を例示するが、特に限定されない。
（１）寒天、（２）ゼラチン及び（３）カラギーナン（４）ジェランガム（５）キサンタンガム。
特に、好ましい、培地を固形化させる物質の種類は、寒天である。
培地を固形化させる物質の濃度の範囲は、特に限定されないが、0.5％〜10.0％である。
なお、形成用培地の表面が疎水性を示すことは、すべての表面が疎水を有する必要はなく、少なくとも共生菌（特に、病原菌）を播種する場所のみが疎水性を有すれば良い。
加えて、形成用培地の表面を疎水性にするために、３価以上の陽イオンと多糖類とが架橋構造を形成すれば良い。
【００１７】
（侵入器官形成又は胞子形成可能な共生菌又は寄生菌）
本発明の形成用培地で侵入器官形成又は胞子形成（特に、分生子形成）可能な共生菌又は寄生菌（特に、病原菌）は、特に限定されないが、下記の植物病原菌、下記の動物病原菌、下記の昆虫病原菌等を例示することができる。
（植物病原菌）
いもち病菌(Magnaporthe oryzae)、ウリ類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、ごま葉枯れ病菌（Brown spot disease fungus）、炭疽病菌（Anthracnose fugi）、黒穂病菌（Smut fungi）、カンジダ菌（Candida spp.）、さび菌（Rust fungi）、べと病菌（Downy mildew fungi）、うどんこ病菌 (Powdery mildew fungi)、ピシウム病菌（Pythium spp.）、アルタナリア病菌（Alternaria spp.）及び灰色かび病菌（Botrytis cinerea）
（動物病原菌）
Candid菌
（昆虫病原菌）
Metarhizium菌
【００１８】
（侵入器官形成又は胞子形成用培地の用途）
本発明の形成用培地の用途は、特に限定されないが、下記の用途を例示することができる。
共生菌・寄生菌（特に、病原菌）形成培地、共生菌・寄生菌（特に、病原菌）に効果のある薬剤を検査するための培地、共生菌・寄生菌（特に、病原菌）の形成メカニズムの解明のための培地、共生菌・寄生菌（特に、病原菌）の形態形成メカニズム解明のための培地及び共生菌・寄生菌（特に、病原菌）が産生する物質を分析するための培地。
特に、本発明の形成用培地は、侵入器官形成（特に、侵入菌糸形成）及び胞子形成（特に、分生子形成）に適している。
【００１９】
（侵入器官形成又は胞子形成用培地の製造方法）
本発明の侵入器官形成又は胞子形成用培地の製造方法は、３価以上の陽イオンと多糖類とが架橋構造を形成して固形培地表面が疎水性にできれば、特に限定されないが、下記の製造方法を例示することができる。
重層法では、少なくとも下記の工程を含む。
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程。
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に重層する工程。
噴霧法では、少なくとも下記の工程を含む。
（１）多糖類と溶解した培地を混合して、多糖類を含む固形培地を製造する工程。
（２）３価以上の陽イオンを、該多糖類を含む固形培地の表面に噴霧する工程。
【００２０】
（侵入器官形成又は胞子形成用培地の好ましい組み合わせ）
本発明の侵入器官形成又は胞子形成用培地における、好ましい、３価以上の陽イオン、多糖類及び固形培地の組み合わせは、下記実施例２の結果から以下の通りである。
（陽イオン）
３価の鉄イオン：0.01Ｍ〜0.5Ｍ
アルミニウムイオン：0.01Ｍ〜0.5Ｍ
（多糖類）
カルボキシメチルセルロースナトリウム：1.0％〜4.0％
アルギン酸ナトリウム：1.0％〜4.0％
（固形培地）
寒天培地  0.5％〜10.0％
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（侵入器官形成又は胞子形成用培地の製造方法及び病原菌の観察方法）
本実施例では、侵入器官形成又は胞子形成用培地を製造した。さらに、病原菌の観察方法を記載した。詳細は、以下の通りである。
【００２３】
（菌株の調整）
いもち病菌(Magnaporthe oryzae)の菌株例として北１を使用し、ウリ類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）の菌株例として、１０４Ｔを用いた。
北１（いもち病菌）は、オートミール培地で培養し、気中菌糸をブラッシングして25℃ 明暗条件下で４〜５日培養して分生子を出させた。さらに、該培地の表面を蒸留水で洗って、浮き上がってきた分生子を遠心分離して、蒸留水に再懸濁した。
１０４Ｔ（ウリ類炭疽病菌）は、PDA培地プレートで培養して、25℃暗黒条件下で５日間培養した。さらに、蒸留水を該培地の表面に浴びせて、懸濁した分生子をさらに遠心分離して蒸留水に再懸濁した。
【００２４】
（形成用培地の調整）
各多糖類及び各陽イオンを用いて形成用培地を調整した。詳細は、以下の通りである。
【００２５】
（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンの使用）
ビーカーに入れた蒸留水を60℃程度に温め、マグネチックスターラーで撹拌しながら、多糖類としてカルボキシメチルセルロースナトリウム（又は、カルボキシメチルセルロース）の粉末を該蒸留水に添加し、ダマが残らないようになるまでかき混ぜ続けて、２％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を作成した。なお、必要に応じて、電子レンジにより該溶液を温めなおした。保存は、−20℃でおこなった。加えて、冷凍した溶液と未冷凍の溶液では、下記で述べる侵入器官形成又は胞子形成に影響はなかった。
次に、２％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液をマグネチックスターラーで撹拌しながら、0.5％の粉末寒天を添加し、次に、電子レンジで温めて、該寒天を完全に溶解させた。なお、栄養塩を加える場合は、MS（ムラシゲ・スクーグ）塩を該溶解した寒天に添加した。加えて、該寒天をプレートに入れる前に，泡が消えるまでしばらく静置した。なお、必要に応じて、エタノールに溶解した33mg/mlのクロラムフェニコール溶液を該溶解した寒天中に100μg/mlになるように加えた。
次に、前記溶解した寒天を9cmプラスチックペトリ皿に15g入れて、該寒天が固まるまで静置した。
次に、３価以上の陽イオンとして0.1M FeCl3溶液を用意し、該溶液を前記の寒天培地（5mL）に重層し、数回混ぜながら室温で10分間インキュベートした。該重層したFeCl3溶液を該寒天培地の表面から洗い流し、代わりに蒸留水を該寒天培地の表面に重層して蒸留水を変えながら10〜15分間洗浄した。この洗浄操作によって、該培地の表面は疎水性であることを確認した。該培地は、使用するまで、4℃で冷蔵保存した。
これにより、カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価の鉄イオンを含有する寒天培地を調整した。
さらに、追加疎水性処理として、アセチル化処理も行うことができる。詳しくは、0.1Mトリエタノールアミン+0.5％無水酢酸を培地の表面に10分間重層し、その後、蒸留水でよく洗浄する。
【００２６】
（アルギン酸ナトリウムと３価の鉄イオンの使用）
２％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を２％アルギン酸ナトリウムに変更した以外は、上記培地の調整方法（以後、「基本培地調整方法」と称する）により、アルギン酸ナトリウムと３価の鉄イオンを含有する寒天培地を調整した。
【００２７】
（アルギン酸ナトリウムと３価のアルミニウムイオンの使用）
２％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を２％アルギン酸ナトリウムに変更し並びに0.1M FeCl3溶液を0.1M AlCl3溶液に変更した以外は、基本培地調整方法により、アルギン酸ナトリウムと３価のアルミニウムイオンを含有する寒天培地を調整した。
【００２８】
（カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価のアルミニウムイオンの使用）
0.1M FeCl3溶液を0.1M AlCl3溶液に変更した以外は、基本培地調整方法により、カルボキシメチルセルロースナトリウムと３価のアルミニウムイオンを含有する寒天培地を調整した。
【００２９】
（各濃度での多糖類及び３価以上の陽イオンの使用）。
各多糖類の濃度（2.0％〜4.0％）、寒天濃度（0.5％〜1.5％）及び各３価以上の陽イオンの濃度（0.02M〜0.5M）を変更して、上記記載の各培地調整方法に準じて、培地を調整した。
【００３０】
（コントロール培地の調整）
コントロールとして、下記の寒天培地を調整した。
カルボキシメチルセルロースナトリウムとカリウムイオン（１価の陽イオン）を含有する寒天培地
カルボキシメチルセルロースナトリウムとマグネシウムイオン（２価の陽イオン）を含有する寒天培地
カルボキシメチルセルロースナトリウムカルシウムイオン（２価の陽イオン）を含有する寒天培地
【００３１】
（観察方法）
観察方法は、以下の通りである。
上記で調整した分生子懸濁液を、上記で調整した各形成用培地の表面に接種し、さらに静置し、25℃暗黒条件下でインキュベートして、最後に倒立顕微鏡で確認した。
付着器の形成率に関し、カウントする時は形成用培地を切り出して寒天片を作成し、スライドグラスの上に該寒天片を置いて、カバーガラスをかぶせて生物顕微鏡で観察した。
また、寒天片をFAA (ホルマリン：氷酢酸：70％エタノール＝1：1：18)で固定して、エタノール系列で脱水して、パラフィンに包埋して、さらに、ミクロトームで切片を作製して形成用培地断面からの観察もした。
また、形成用培地上の写真撮影のために、ラクトフェノールコットンブルーを形成用培地に滴下して染色した。
さらに、落射蛍光、共焦点レーザー顕微鏡での撮影のために、FITC-WGA、TRITC-ConA及びDAPIを用いて3重染色した。
【実施例２】
【００３２】
（各形成用培地での付着器形成率の確認）
様々な形成用培地での北１（いもち病菌）の付着器形成率を確認した。詳細は、下記の表１の通りである。なお、下記表の「0％」とは、発芽するけれど付着器を形成しないことを意味する。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
表１の結果から明らかなように、１価陽イオン及び２価陽イオンを用いた形成用培地では、付着器が形成できなかった。３価以上の陽イオンとして鉄イオン又はアルミニウムイオンを使用した形成用培地は、付着器形成とさらに侵入菌糸の形成を確認した。
また、好ましい多糖類の濃度、３価以上の陽イオンの濃度及び寒天培地の濃度の組合せは、以下の表２の通りであることを確認した。
【００３５】
【表２】
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【実施例３】
【００３６】
（いもち病菌の付着器形成、侵入菌糸形成及び分生子形成の確認）
本実施例により、いもち病菌の付着器形成、侵入菌糸形成及びび分生子形成を、ラクトフェノールコットンブルー染色並びにFITC-WGA、TRITC-ConA及びDAPIを用いた3重染色をおこなった。
ラクトフェノールコットンブルー染色は、いもち病菌の外形を染色できる。
FITC（Fluorescein isothiocyanate）-WGA（Wheat germ agglutinin）染色は、キチン質を染色することができる。なお、侵入菌には、キチン質（細胞壁）が含まれているので、侵入菌の形成の確認マーカーとなる。
TRITC(Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate)-ConA(Concanavalin A)染色は、マンナンを染色することができる。なお、侵入菌には、マンナンが含まれているので、侵入菌の形成の確認マーカーとなる。
DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色は、生細胞を染色することができる。すなわち、細胞が生きていることを示すマーカーとなる。
【００３７】
（付着器及び侵入菌糸形成の確認）
いもち病菌接種１０時間後のラクトフェノールコットンブルー染色した形成用培地の表面図及び断面図を、それぞれ、図１及び図２に示す。
図１から明らかなように、接種１０時間後において、メラニン化した付着器（矢印１）が観察できた。本発明の形成用培地での分生子の付着器形成時間は、他の人工基質や宿主植物上に接種した分生子の付着器形成時間と変わりがなかったことにより、他の培地や宿主植物上と同様に付着器を形成できることを確認した。
図２から明らかなように、インキュベートを継続すると付着器から寒天培地中に侵入菌糸を貫入していったことを確認した（参照：矢印３）。
【００３８】
いもち病菌接種後のFITC-WGA、TRITC-ConA及びDAPIを用いて3重染色した形成用培地の図面を図３に示す。
図３（２）から明らかなように、いもち病原菌を接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、DAPI染色されていることにより、生細胞でありかつ核が移行していることを確認した。
図３（３）から明らかなように、いもち病原菌を接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、マンナンを含んでいることを確認した。
図３（４）から明らかなように、いもち病原菌を接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、細胞壁のキチン質を含んでいることを確認した。
すなわち、本発明の形成用培地は、いもち病菌が植物宿主に感染して付着器形成及び侵入菌糸形成するのと同様に、付着器形成及び侵入菌糸形成できることを確認した。
【００３９】
（分生子形成の確認）
図４から明らかなように、栄養塩としてMSを追加添加した形成用培地を使用した場合には、膨らんだ侵入菌糸様の菌糸が数珠つなぎで伸びたことを確認した。これは、宿主となる植物の抵抗がないので２次菌糸になりにくいと考えらえる。
図５から明らかなように、さらに、栄養塩としてMSを追加添加した形成用培地を１週間程度培養すると、形成用培地中に膨らんだ侵入菌糸を蔓延させ、一部で気中菌糸（矢印４）が現れ、その先端で分生子（矢印５）を形成したことを確認した。これは、宿主植物で生育したいもち病菌が、ビオトロフ状態が終わり、ネクロトロフ状態でしばらく後に植物体表面に現れて分生子を形成することに対応していると考えられる。すなわち、本発明の形成用培地は、いもち病菌が植物宿主に感染して分生子形成すると同様に、分生子形成できることを確認した。
【実施例４】
【００４０】
（ウリ類炭疽病菌の付着器形成及び侵入菌糸形成の確認）
実施例３と同様に、本発明の形成用培地が、ウリ類炭疽病菌の付着器形成及び侵入菌糸形成が起るかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４１】
図６（１）（２）から明らかなように、ウリ類炭疽病菌の付着器（参照：矢印１）が形成されていることを確認した。
図６（３）から明らかなように、ウリ類炭疽病菌の侵入菌糸（参照：矢印３）が伸長していることを確認した。
図７（２）から明らかなように、接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、DAPI染色されていることにより、生細胞でありかつ核が移行していることを確認した。
図７（３）から明らかなように、接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、マンナンを含んでいることを確認した。
図７（４）から明らかなように、接種した分生子の付着器及び侵入菌糸では、細胞壁のキチン質を含んでいることを確認した。
すなわち、本発明の形成用培地は、ウリ類炭疽病菌が植物宿主に感染して付着器形成及び侵入菌糸形成すると同様に、付着器形成及び侵入菌糸形成できることを確認した。
【００４２】
（総論）
本実施例により、本発明の形成用培地が、いもち病菌及びウリ類炭疽病菌の侵入器官を形成することができることを確認した。この２種の菌は子嚢菌に属するが、系統分類的に全く別のヘミビオトロフィックな植物病原菌である。この２種が、本発明の形成用培地で侵入器官、さらには分生子を形成することから、他の植物病原菌でも該培地を用いることにより侵入器官、さらには分生子を形成することができると考えられる。
本発明のような人工培地で侵入器官を形成させることは、以下のような大きな意義がある。
○付着器から侵入菌糸形成時における遺伝子発現、タンパク質発現及び生理活性物質の発現を明らかにすることができる。
○侵入器官は感染成立における一番重要なステージであることから農薬のアッセイに用いることができる。
○植物と病原菌の相互作用の研究に伸展をもたらことができる。
○人工培地に、様々な物質を添加、変化させることにより、侵入器官の形態変化、発現する遺伝子、生理活性物質等の変化を研究することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明では、植物病原菌の侵入器官形成及び胞子形成を可能な培地を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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