(57)【要約】      （修正有）【課題】藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いたラウリン酸の製造方法、及び当該方法に用いる形質転換体を提供する。【解決手段】下記（１）及び（２）の工程を含む、ラウリン酸の製造方法。（１）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に共導入し、形質転換体を得る工程。（Ａ）藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する特定の配列で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｂ）（Ａ）における特定のアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。（２）得られた形質転換体からラウリン酸を採取する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む、ラウリン酸の製造方法。
（１）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に共導入し、形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体からラウリン酸を採取する工程
【請求項２】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である、請求項１又は２記載の製造方法。
（Ｃ）配列番号３の８４位〜３８２位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
前記宿主が微生物又は植物体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が酵母である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が微細藻類である、請求項４記載の製造方法。
【請求項８】
前記微細藻類がナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）に属する藻類である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
宿主にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を共導入して得られる形質転換体。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１０】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換する工程を含む、形質転換体の産生するトリアシルグリセロール中のラウリン酸含有量を向上させる方法。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いたラウリン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラウリン酸は界面活性剤や化学品基材として使用される脂肪酸で、主にヤシ油及びパーム核油から製造されている。しかし、ヤシ油やパーム核油の原料であるココナツやアブラヤシは栽培地域が限られており、十分な量を確保することが難しい。そのため、ココナツやアブラヤシ以外の原料からラウリン酸を製造することが望まれている。
【０００３】
トリアシルグリセロールは、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合してなる化合物である。グリセロールに結合する脂肪酸の種類は多岐にわたり、結合する脂肪酸の組み合わせによって、様々なトリアシルグリセロール化合物が生じる。生体内では、トリアシルグリセロールは主にエネルギー貯蔵物質として働き、動物の脂肪組織や植物の種子等に蓄積されている。また、藻類は、他の生物に比べてトリアシルグリセロール等の脂質蓄積量が多いことが知られている。
生体内においてトリアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールに脂肪酸由来のアシル−ＣｏＡからアシル基が転移して合成される。この転移反応にはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）が関与する。ＤＧＡＴは、哺乳類、植物、真菌などに存在し、ＤＧＡＴ１とＤＧＡＴ２の２タイプが存在することが知られている。藻類では、例えば、Chlamydomonas reinhardtiiではＤＧＡＴ１、および４種類のＤＧＡＴ２（ＤＧＡＴ２−１、２−２、２−３、２−４）が知られている。この内、ＤＧＡＴ２−１〜２−３は窒素欠乏条件下でｍＲＮＡ量が増加することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ＤＧＡＴを利用してトリアシルグリセロールや脂肪酸を生産することも試みられている。例えば、ＤＧＡＴ２を過剰発現させたChlamydomonas reinhardtiiを用いてトリアシルグリセロールを製造する方法が提案されている（特許文献１）。
ＤＧＡＴの基質となる脂肪酸アシル−ＣｏＡの種類は多岐にわたり、どのような炭素数・不飽和度のアシル基がジアシルグリセロールに導入されるかを決めているのがＤＧＡＴであると考えられている。これまでに報告されているＤＧＡＴの多くは、長鎖アシル基を選択的に導入するものである。例えば、Talassiosira psuedonanaのＤＧＡＴ遺伝子を植物に導入することにより、当該植物の超長鎖多価不飽和脂肪酸の量を変化させる方法が提案されている（特許文献２）。また、特許文献３にはNannochloropsis oculata由来のＤＧＡＴが記載され、C18やC22の長鎖又は超長鎖多価不飽和脂肪酸の生産に関わる可能性が示唆されている。一方、中鎖アシル基を選択的に導入するようなＤＧＡＴについてはほとんど報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１５６５２０号
【特許文献２】国際公開第２００９／０８５１６９号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１６１０９３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rachel  Miller  et  al.,  "Changes  in  Transcript  Abundance  in  Chlamydomonas  reinhardtii  following  Nitrogen  Deprivation  Predict  Diversion  of  Metabolism",  Plant  Physiology,  2010,  Vol.154,  p.1737-1752
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いたラウリン酸の製造方法の提供に関する。また、本発明は、藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入し、ラウリン酸含有量の高いトリアシルグリセロールを生産でき、ラウリン酸生産能が向上した形質転換体の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類から、ジアシルグリセロールにラウリン酸を選択的に取り込むジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを見出した。そして、これを用いて宿主を形質転換したところ、形質転換体ではトリアシルグリセロール中のラウリン酸含有量が有意に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含むラウリン酸の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（１）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に共導入し、形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体からラウリン酸を採取する工程
【００１０】
また、本発明は、宿主にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を共導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換する工程を含む、形質転換体の産生するトリアシルグリセロール中のラウリン酸含有量を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の形質転換体は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子が導入され、ラウリン酸の含有量の高いトリアシルグリセロールを産生することができる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、ラウリン酸又はこれを構成脂肪酸とするトリアシルグリセロールの生産性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、誘導培地（ＹＰＧ）で培養したBY4741株（WT株）、Δ4株、+DGA1株、+NoDGAT2-8株、及び+AtDGAT株から抽出した脂質成分をＴＬＣ展開した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、トリアシルグリセロール等の中性脂肪の他に、脂肪酸、脂肪族アルコール類、アルカン等の炭化水素類、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本発明で、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表し、Ｃｘは炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基であることを表す。
また、本発明において、中鎖脂肪酸や中鎖アシル−ＡＣＰにおける中鎖とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
【００１５】
１．ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
本発明で用いるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。具体的に、本発明で用いるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼには、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が包含される。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【００１６】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ、ＤＧＡＴ）は、トリアシルグリセロール合成の最終段階に関与する酵素である。植物や藻類では、葉緑体にある脂肪酸合成系において各種アシル−ＡＣＰが合成され、このアシル−ＡＣＰから酵素アシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって遊離脂肪酸が切り出される。遊離脂肪酸はアシル−ＣｏＡに変換されて、トリアシルグリセロール合成系に供される。トリアシルグリセロール合成系では、アシル−ＣｏＡのアシル基が、グリセロール骨格に導入される。最終段階では、ジアシルグリセロールにアシル−ＣｏＡからアシル基が転移してトリアシルグリセロールが合成される。この反応を触媒する酵素がＤＧＡＴである。
このようにトリアシルグリセロールは、グリセロール骨格に３つのアシル基（脂肪酸残基）が導入されてなるが、導入されるアシル基の種類（炭素数及び不飽和度）は多岐にわたる。グリセロール骨格にどのような炭素数・不飽和度を有したアシル基を導入するかを決めているのは、各反応工程で働くアシルトランスフェラーゼであると考えられている。すなわち、トリアシルグリセロール合成の最終段階では、ＤＧＡＴの基質特異性によって、ジアシルグリセロールに結合する脂肪酸アシル−ＣｏＡの種類が変わると考えられている。
【００１７】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する。本発明において、タンパク質の「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」とは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をアシル化してトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に変換する活性をいう。
なお、タンパク質がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有することは、トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株の一例としては、実施例で用いた酵母のΔdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株（Δ4株）が挙げられる。目的タンパク質をコードする遺伝子を当該欠損株において発現させ、トリアシルグリセロールの生成が確認されれば、当該タンパク質はジアシルグリセロールアシルトランスフェラ−ゼ活性を有すると判断できる。
【００１８】
前記（Ａ）のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、後述の実施例で示されているように、ジアシルグリセロールにＣ１２：０アシル基（ラウロイル基）を優先的に取り込む性質を持つ。すなわち、ラウロイル−ＣｏＡに対して基質特異性を示すジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのラウロイル−ＣｏＡ特異性については、例えば、宿主細胞にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子及びアシル−ＣｏＡを生産するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入し、これらの導入遺伝子が発現する条件で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析する方法、または精製したジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質と、アシル−ＣｏＡ及びジアシルグリセロールとを混合して反応させた溶液から薄層クロマトグラフィー法などによりトリアシルグリセロールを単離し、トリアシルグリセロール中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析する方法により確認することができる。
【００１９】
ラウリン酸の生産性向上の観点から、（Ｂ）のタンパク質も、ラウロイル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であることが好ましい。この観点から、（Ｂ）において配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であることがよりさらに好ましい。
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２０】
（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号１のアミノ酸配列に変異を導入したアミノ酸配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。１又は数個の変異アミノ酸は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、１〜５０個であることが好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
なお、本明細書において、アミノ酸又は塩基の「付加」には、配列の一末端および両末端へのアミノ酸又は塩基の付加が含まれる。
【００２１】
上述したタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス  オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を用いることができる。
アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
【００２２】
２．ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子
本発明で用いるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス  オキュラータ由来の野生型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
【００２３】
（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ａ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２で表される塩基配列と８１％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２４】
後述の実施例に示すように、（ａ）のＤＮＡからなる遺伝子は、ラウロイル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子も、ラウロイル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。この観点から、（ｂ）において、配列番号２で表される塩基配列との同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であることがよりさらに好ましい。
【００２５】
また、（ｂ）の塩基配列として、配列番号２の塩基配列に変異を導入した塩基配列、すなわち、配列番号２の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。１又は数個の変異塩基は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、１〜２０個であることが好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
【００２６】
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２７】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス  オキュラータからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００２８】
３．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明の形質転換体は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子と共に、トリアシルグリセロールやラウリン酸の合成に関与する他の酵素をコードする遺伝子を共導入してなることが好ましい。トリアシルグリセロールやラウリン酸の合成に関与する他の酵素としては、例えば、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが挙げられる。
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロール合成の中間反応を触媒する酵素であり、リゾホスファチジン酸に対して特定のアシル−ＣｏＡからアシル基を転移してホスファチジン酸を合成する。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、脂肪酸合成経路においてマロニルＡＣＰとアシルＡＣＰの脱炭酸縮合反応を触媒する酵素である。脂肪酸合成経路では、マロニル−ＡＣＰを利用して炭素鎖の伸長反応を繰り返し、種々の鎖長のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体）が合成される。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、当該経路においてアシル基の鎖長制御（アシル−ＡＣＰの鎖長をどこまで伸長させるか）を担う因子の一つである。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸合成系で合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
宿主にＤＧＡＴ遺伝子とともにこれらの酵素をコードする遺伝子を導入することで、形質転換体のトリアシルグリセロール生産性やラウリン酸の生産性を一層向上させることができる。
【００２９】
特に、本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が共導入されていることが好ましい。
本発明で用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００３０】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
上述のように、前記（Ａ）のタンパク質は、ジアシルグリセロールにラウロイル基（Ｃ１２：０）を選択的に取り込ませるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるため、共導入するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼも、中鎖アシル−ＡＣＰに特異的なチオエステラーゼ（以下、「中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」という）が好ましく、ラウロイル−ＡＣＰに特異的なチオエステラーゼ（以下、「ラウロイル−ＡＣＰ特異的チオエステラーゼ」ともいう）がさらに好ましい。本発明において「中鎖アシル−ＡＣＰ特異的」なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとは、炭素数６〜１４のアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を選択的に加水分解する活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。このようなアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いることで、ラウリン酸の生産性を一層向上させることができる。
【００３１】
本発明では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして、公知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質を用いることができる。用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1）；Cuphea calophylla  subsp.  mesostemonアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABB71581）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cinnamomum camphoraアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71729）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71730）；Cuphea lanceolataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookerianaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）；Ulumus americanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71731）；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER87824）；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER88593）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Elaeis guineensisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAD42220）；Desulfovibrio vulgarisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ACL08376）；Bacteriodes fragilisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAH09236）；Parabacteriodes distasonisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicronアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAO77182）；Clostridium asparagiformeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEG55387）；Bryanthella formatexigensアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EET61113）；Geobacillus  sp.アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EDV77528）；Streptococcus dysgalactiaeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  BAH81730）；Lactobacillus brevisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABJ63754）；Lactobacillus plantarumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAD63310）；Anaerococcus tetradiusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAE80300）；Clostridium thermocellumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABN54268）；Nannochloropsis oculataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Nannochloropsis gaditanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Nannochloropsis granulataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）；Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１４）、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３２】
上述したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの中でも、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼがより好ましく、具体的には、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４）、Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６）、Nannochloropsis oculataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号７）、Nannochloropsis gaditanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号９）、Nannochloropsis granulataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１１）、Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１３）、又はこれらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、ラウロイル−ＡＣＰに高い特異性を有する、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号３）、Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１３）又は、これらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質がより好ましい。
これらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
【００３３】
上述した各アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列が葉緑体移行シグナル配列を有している場合、当該シグナル配列を削除して宿主に導入してもよい。例えば、宿主に外来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入する場合、当該遺伝子の塩基配列から葉緑体移行シグナル配列に相当する領域の配列を削除した塩基配列からなるＤＮＡを用いることが好ましい。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの葉緑体移行シグナル配列の例として、配列番号３の１〜８３位のアミノ酸配列、又はこれに相当する領域が挙げられる。
本明細書において、アミノ酸配列または塩基配列における「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００３４】
本発明で用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとしてさらに好ましくは、下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である。
（Ｃ）  配列番号３の８４位〜３８２位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ）（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００３５】
前記（Ｄ）において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であることが特に好ましい。
【００３６】
また、（Ｄ）のタンパク質のアミノ酸配列として、（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列に変異を導入したアミノ酸配列、すなわち、（Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。１又は数個の変異アミノ酸は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、１〜５０個であることが好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
【００３７】
前記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子の一例として、下記（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｃ）配列番号４の２５０位〜１１４９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡの塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００３８】
前記（ｄ）において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、（ｃ）のＤＮＡの塩基配列との同一性は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であることが特に好ましい。
また、（ｄ）の塩基配列として、（ｃ）のＤＮＡの塩基配列に変異を導入した塩基配列、すなわち、（ｃ）のＤＮＡの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。１又は数個の変異塩基は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、１〜２０個であることが好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
【００３９】
タンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性又は中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００４０】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びそれらをコードする遺伝子の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、各アミノ酸又は塩基配列に基づいて、人工的に合成することができる。また、生物から通常の方法に従って単離してもよい。遺伝子クローニングは、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００４１】
４．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入してなり、好ましくは、宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子とアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子とを共導入してなる。当該形質転換体では、宿主に比べ、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有するトリアシルグリセロール（ラウロイル基を有するトリアシルグリセロール）の生産能が有意に向上する。そのため、トリアシルグリセロールから得られるラウリン酸の量が増加する。したがって、当該形質転換体を用いることで、ラウリン酸を効率的に製造することができる。
なお、宿主や形質転換体のラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性、トリアシルグリセロールを構成する脂肪酸の組成については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００４２】
本発明の形質転換体は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００４３】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、好ましくは中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入した形質転換体も、同様にして作製することができる。
【００４４】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。ラウリン酸の製造効率や利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
原核生物として、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等を用いることができる。
真核微生物として、酵母や糸状菌等を用いることができ、サッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、又はモルチエラ（Mortierella）属に属する微生物を用いることが好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、またはモルチエラ・アルピナ（Mortierella alpina）がより好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）がさらに好ましい。
【００４５】
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．、等が挙げられる。なかでも、ラウリン酸生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、スナモモ、ダイズ、トウモロコシ、イネ、ヒマワリ、クスノキ、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００４６】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  （PtTE）  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian,  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  Dec  27;108(52),  2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００４７】
発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００４８】
また、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子発現ベクターは、葉緑体移行シグナル配列を備えていることが好ましい。当該葉緑体移行シグナル配列は、宿主細胞で機能する葉緑体移行シグナル配列を用いることが好ましい。例えば、宿主としてナンノクロロプシス属に属する藻類を用いる場合には、Nannochloropsis oculata由来の葉緑体移行シグナル配列（配列番号１８）を用いることができる。葉緑体移行シグナル配列は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の上流に組み込まれることが好ましい。
【００４９】
上記ベクターに前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。宿主が植物の場合、アグロバクテリウムを用いた方法(C.  R.  Acad.  Sci.  Paris.  Life  Science  316,  1194(1993)等)、パーティクルガン法(BioRad社PDS-1000/He等)等を用いることができる。
【００５０】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００５１】
５．ラウリン酸及びトリアシルグリセロールの製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いてラウリン酸、又はラウリン酸を構成成分とするトリアシルグリセロールを生産する。
本発明のラウリン酸の製造方法は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入した形質転換体からラウリン酸を採取する工程を含む。当該工程は、ラウリン酸の生産性向上の観点から、前記形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物からラウリン酸を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養液はもちろん、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
また、形質転換体からラウリン酸を採取する工程は、形質転換体からトリアシルグリセロールを採取する工程、及び得られたトリアシルグリセロールからラウリン酸を含む脂肪酸混合物を採取する工程を含むことが好ましい。本発明の形質転換体では、ラウリン酸は主に、ラウリン酸を構成成分とするトリアシルグリセロールとして得られる。このトリアシルグリセロールに加水分解等の処理を施すことで、ラウリン酸を含む脂肪酸混合物が得られる。脂肪酸混合物からさらにラウリン酸を単離してもよい。
上記観点から本発明は、前記本発明の形質転換体からトリアシルグリセロールを採取する工程を含む、トリアシルグリセロールの製造方法を提供することができる。当該工程は、前記形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物からトリアシルグリセロールを採取する工程を含むことが好ましい。
【００５２】
形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
また、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００５３】
一例として、酵母を宿主として用いた形質転換体の場合、ＹＰＧ培地又はＳＤ培地で、２５〜３２℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。
【００５４】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、ラウリン酸やトリアシルグリセロールを高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、ラウリン酸やトリアシルグリセロールの生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００５５】
次いで、培養物や形質転換体からトリアシルグリセロールを採取する。このトリアシルグリセロールは、構成脂肪酸としてラウリン酸を多く含む。トリアシルグリセロールは、他の脂質成分との混合物として採取されてもよい。
ラウリン酸は、このようにして得られたトリアシルグリセロール又はこれを含む脂質成分から採取することが好ましい。ラウリン酸は、他の脂肪酸との混合物として採取されてもよい。本発明の方法で得られたトリアシルグリセロールにはラウリン酸が豊富に含まれるため、当該トリアシルグリセロールから得られる脂肪酸混合物にもラウリン酸が多く含まれる。
培養物や形質転換体からトリアシルグリセロール又はこれを含む脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、トリアシルグリセロールを得ることができる。
トリアシルグリセロールから脂肪酸成分を得るにも、通常の方法を用いることができ、例えば、トリアシルグリセロールを加水分解することで脂肪酸を得ることができる。具体的には、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。脂肪酸混合物からのラウリン酸の単離も、蒸留等、通常の方法で行うことができる。
【００５６】
本発明の製造方法を用いることで、ラウリン酸及びこれを構成成分とするトリアシルグリセロールを効率的に生産することができる。
【００５７】
本発明の製造方法、形質転換体により得られるラウリン酸やトリアシルグリセロールは、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５８】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体を開示する。
【００５９】
＜１＞  下記（１）及び（２）の工程を含む、ラウリン酸の製造方法。
（１）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に共導入し、形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８１％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体からラウリン酸を採取する工程
【００６０】
＜２＞  前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞  前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
（Ｃ）  配列番号３の８４位〜３８２位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ）  （Ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
＜４＞  前記宿主が微生物又は植物体である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜５＞  前記微生物が酵母である、＜４＞項記載の製造方法。
＜６＞  前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、＜５＞項記載の製造方法。
＜７＞  前記微生物が微細藻類である、＜４＞項記載の製造方法。
＜８＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）に属する藻類である、＜７＞項記載の製造方法。
＜９＞  前記ナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）に属する藻類がナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）である、＜８＞項記載の形質転換体。
＜１０＞  前記工程（２）が、形質転換体からトリアシルグリセロールを採取する工程、及び得られたトリアシルグリセロールからラウリン酸を含む脂肪酸混合物を採取する工程を含む、＜１＞〜＜９＞の何れかに記載の製造方法。
【００６１】
＜１１＞  宿主にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、及び前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を共導入して得られる形質転換体。
【００６２】
＜１２＞  前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、＜１１＞項記載の形質転換体。
＜１３＞  前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが前記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である、＜１１＞又は＜１２＞項記載の形質転換体。
＜１４＞  前記宿主が微生物又は植物体である、＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１５＞  前記微生物が酵母である、＜１４＞項記載の形質転換体。
＜１６＞  前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、＜１５＞項記載の形質転換体。
＜１７＞  前記微生物が微細藻類である、＜１４＞項記載の形質転換体。
＜１８＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）に属する藻類である、＜１７＞項記載の形質転換体。
＜１９＞  前記ナンノクロロプシス属（Nannochloropsis）に属する藻類がナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）である、＜１８＞項記載の形質転換体。
【００６３】
＜２０＞  ＜１１＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体からトリアシルグリセロールを採取する工程を含む、トリアシルグリセロールの製造方法。
【００６４】
＜２１＞  宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換する工程を含む、形質転換体の産生するトリアシルグリセロール中のラウリン酸含有量を向上させる方法。
【００６５】
＜２２＞  ラウリン酸を製造するための、＜１１＞〜＜１９＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６７】
培地組成
ｆ／２培地（７５ｍｇＮａＮＯ３、６ｍｇＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２、０．５μｇビオチン、１００μｇチアミン、１０ｍｇＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、４．４ｍｇＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、３．１６ｍｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１２μｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２１μｇＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８０μｇＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７μｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、７μｇＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ/人工海水１Ｌ）
【００６８】
実施例１  ナンノクロロプシス  オキュラータ由来ＤＧＡＴの基質特異性の検証
１．ナンノクロロプシス  オキュラータ由来ＤＧＡＴ遺伝子の取得
ナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）N-2145株をｆ／２培地で前培養した後、５０ｍＬのｆ／２培地に１０％植菌し、２５℃、二酸化炭素濃度０．３％で人工気象機にて６日間培養した。培養後、回収したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、RNeasy  Plant  Mini  Kit  (Qiagen社製)を用いてRNA精製を行った。得られたTotal  RNAから、SuperScript  III  First-Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR  (Invitrogen社製)を用いてｃＤＮＡライブラリーの作製を行った。
このｃＤＮＡを鋳型として、表１−１に示すプライマー１及び２を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した、得られた遺伝子をNoDGAT2-8遺伝子と名づけた。
【００６９】
【表１−１】
2016054703.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
2016054703.tif 000003
【００７１】
２．トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株の作製
酵母（Saccharomyces cerevisiae）のトリアシルグリセロール合成遺伝子を全て欠損させた株を下記の手順により取得した。トリアシルグリセロール合成遺伝子は、文献（Line  Sandager,  et  al.,  J  Biol  Chem.  Feb  22;277(8):6478-82,  2002）情報を参考に、DGA1、LRO1、ARE1、ARE2遺伝子を標的とした。遺伝子欠損はアミノ酸マーカー遺伝子をＤＮＡ断片として用いた相同組み換えによる一般的な手法で行った。
【００７２】
Saccharomyces cerevisiae  S288C株のコロニーを、YPD培地（Yeast  extract  1%,  Peptone  2%,  D-Glucose  2%）5ml、30℃、160rpmの条件で24時間培養した。得られた菌体に対してGenとるくん（酵母用）High  Recovery(タカラバイオ社製)を用い、ゲノムＤＮＡの抽出及び精製を行った。
【００７３】
トリアシルグリセロール合成遺伝子を破壊するためのプラスミドを構築した。上記で得られたSaccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡを鋳型として、表１−１に示すプライマー３及び４を用いたＰＣＲ反応により、HIS3遺伝子のＯＲＦ上流３５０ｂｐ〜下流２５０ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマー５及び６、又はプライマー７及び８を用いたＰＣＲ反応によりARE1遺伝子上流５００ｂｐの領域、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１−１に示すプライマー９及び１０を用いたＰＣＲ反応によりpUCベクターを増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これらの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ΔARE1プラスミドを得た。
同様に、表１−１に示すプライマー１１及び１２を用いたＰＣＲ反応により、LEU2遺伝子のＯＲＦ上流７００ｂｐ〜下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマー１３及び１４、又はプライマー１５及び１６を用いたＰＣＲ反応によりARE2遺伝子上流５００ｂｐ、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。得られた遺伝子断片を、ΔARE1プラスミドと同様にpUCベクターに接続し、ΔARE2プラスミドを得た。
続いて、表１−１に示すプライマー１７及び１８を用いたＰＣＲ反応により、MET15遺伝子のＯＲＦ上流３００ｂｐ〜下流３００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマー１９及び２０、又はプライマー２１及び２２を用いたＰＣＲ反応によりLRO1遺伝子上流５００ｂｐ、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。得られた遺伝子断片を、ΔARE1プラスミドと同様にpUCベクターに接続し、ΔLRO1プラスミドを得た。
ΔARE1プラスミドを鋳型として、表１−１に示すプライマー５及び８を用いたＰＣＲ反応により、遺伝子断片を取得した。これを用いて、酢酸リチウム法により、Saccharomyces cerevisiae  BY4741ΔDGA1株（ΔDGA1::kanMX  his3Δ1  leu2Δ0  met15Δ0  ura3Δ0）（Yeast  Knock  Out  Strain  Collection：Open  Biosystems）を形質転換した。得られた株を、ΔARE2プラスミドを鋳型とし表１−１に示すプライマー１３及び１６を用いたＰＣＲ反応により取得した遺伝子断片を用いて、上記と同様の手法で形質転換した。得られた株をさらに、ΔLRO1プラスミドを鋳型としてプライマー１９及び２２を用いたＰＣＲ反応により取得した遺伝子断片を用いて、形質転換した。その結果、Saccharomyces cerevisiae  Δdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株（以下、酵母Δ４株という）を得た。
【００７４】
３．酵母Δ４株へのＤＧＡＴ遺伝子導入
（１）ＤＧＡＴ遺伝子発現プラスミドの構築
２．で取得したSaccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡを鋳型として、表１−１に示すプライマー２３及び２４を用いたＰＣＲ反応によりURA3遺伝子のＯＲＦ上流３００ｂｐからＯＲＦ終止コドンまでの領域の遺伝子断片を、プライマー２５及び２６を用いたＰＣＲ反応によりCYC1遺伝子のＯＲＦ下流２００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマー２７及び２８を用いたＰＣＲ反応によりGAL1遺伝子のＯＲＦ上流５００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマー２９及び３０を用いたＰＣＲ反応によりURA3遺伝子のＯＲＦ下流２００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。Saccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１−１に示すプライマー３１及び３２を用いたＰＣＲ反応により、配列番号１５に示す酵母DGA1遺伝子（Saccharomyces cerevisiae由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子）断片をＰＣＲ法にて取得した。得られた遺伝子断片をpUC19ベクターに接続し、酵母DGA1遺伝子発現プラスミドpUC-URAm-GAL1p-DGA1を得た。
DGA1遺伝子のかわりに前記１．で取得したナンノクロロプシス  オキュラータ由来のNoDGAT2-8遺伝子断片を用いた以外は上記と同様にして、NoDGAT2-8遺伝子発現プラスミドpUC-URAm-GAL1p-NoDGAT2-8を得た。
さらに、配列番号１６で示されるシロイヌナズナ由来のDGAT遺伝子（以下、AtDGAT1遺伝子）を人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得し、表１−１に示すプライマー３３及び３４を用いたＰＣＲ反応により、AtDGAT1遺伝子断片を取得した。AtDGAT1遺伝子をDGA1遺伝子のかわりに用いた以外は上記と同様にして、AtDGAT1遺伝子発現プラスミドpUC-URAm-GAL1p-AtDGAT1を構築した。
これらのプラスミドは、URA3プロモーター配列、URA3遺伝子断片、CYC1ターミネーター配列、GAL1プロモーター配列、各種DGAT遺伝子配列、及びURA3ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列とからなる。
【００７５】
（２）形質転換株の取得
プラスミドpUC-URAm-GAL1p-NoDGAT2-8を鋳型とし、プライマー２３及び２８を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅ＤＮＡ断片を用いて、酢酸リチウム法により酵母Δ４株を形質転換し、+NoDGAT2-8株を得た。
同様に、プラスミドpUC-URAm-GAL1p-DGA1を用いて+DGA1株を、プラスミドpUC-URAm-GAL1p-AtDGAT1を用いて+AtDGAT1株をそれぞれ得た。
各形質転換株を、ＹＰＤ液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、脂肪酸含有ＹＰＧ（Yeast  Extract  1  %、Peptone  2  %、D-Galactose  2  %）液体培地（Ｂｒｉｊｉ  ５８（シグマアルドリッチ社製）１％添加、及びラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸のいずれかを２ｍＭ含有、又はラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸を各２ｍＭずつ含有）を植菌した。２４時間、３０℃で培養した後、遠心分離によって菌体を集菌し、水洗後、凍結乾燥した。
【００７６】
（３）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
凍結乾燥菌体を、８ｍＬのクロロホルム・メタノール溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）に懸濁し、薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０  プレート（メルク製）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：蟻酸＝４２：２４：０．３の条件で行った。０．０１％プリムリン（メタノール中に溶解）を噴霧し、ＵＶ照射して脂質を可視化した。結果を図１に示す。
次いで、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）画分のみをかきとり、かきとったシリカ粒子をＫＯＨと３−フッ化ホウ素メタノールによってメチルエステルに誘導し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供し、脂肪酸組成を分析した。ガスクロマトグラフィー解析は下記の条件で行った。
【００７７】
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ２０ｍ×１００μｍ×０．１０μｍ（J＆W  Scientific製）、
移動相：高純度ヘリウム、
カラム内流量：０．３ｍＬ／分、
昇温プログラム：１５０℃（０．５分間）→２０℃／分→３２０℃（２分間）、
平衡化時間：１分間、
注入口：スプリット注入（スプリット比：７５：１），
圧力６２．４ｐｓｉ，２４．５ｍＬ／分，
注入量５μＬ、
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、
検出器温度：３００℃
【００７８】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を比較した。各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。結果を表２、３に示す。
表２は、各形質転換株をラウリン酸（Ｃ１２：０）含有培地で培養し、+DGA1株、+NoDGAT2-8株、+AtDGAT1株から抽出したトリアシルグリセロール中の脂肪酸組成比（％）を示す結果である。
表３は、各形質転換株をラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸（Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０）含有培地で培養し、+DGA1株、+NoDGAT2-8株から抽出したトリアシルグリセロール中の脂肪酸組成比（％）を示す結果である。
【００７９】
【表２】
2016054703.tif 000004
【００８０】
【表３】
2016054703.tif 000005
【００８１】
図１から明らかなように、トリアシルグリセロール合成遺伝子が欠損していないBY4741株（WT株）ではトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のスポットが確認されたが、DGAT遺伝子を欠損させた酵母Δ４株ではトリアシルグリセロールのスポットが見られず、ＴＡＧ合成ができなくなっていることがわかる。
一方、酵母Δ４株に対して酵母DGA1遺伝子、AtDGAT1遺伝子、又はNoDGAT2-8遺伝子を導入した各株では、ＴＡＧのスポットが見られ、ＴＡＧ合成能を回復している。これらの結果から、NoDGAT2-8遺伝子は、AtDGAT1遺伝子等と同様、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素をコードしていることがわかった。
また、表２から明らかなように、NoDGAT2-8遺伝子を導入した株では、DGA1遺伝子又はAtDGAT1遺伝子を導入した株と比べて、トリアシルグリセロール中のラウリン酸（Ｃ１２：０）の含有量が増加していた。また、表３から明らかなように、NoDGAT2-8遺伝子を導入した株は、複数の脂肪酸が存在する条件下でもラウリン酸を特に優先してトリアシルグリセロール中に導入していた。
これらの結果から、NoDGAT2-8遺伝子は、Ｃ１２：０アシル基をジアシルグリセロールに優先的に取込んでトリアシルグリセロールを生成することがわかった。
【００８２】
実施例２  アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとＤＧＡＴを共導入した形質転換体の作製、及び形質転換体によるラウリン酸の生産
１．BTE遺伝子及びNoDGAT2-8遺伝子発現用プラスミドの構築
配列番号４に示すUmbellularia californica由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（以下、BTE遺伝子）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１−２に示すプライマー３５及び３６を用いたＰＣＲ反応により、BTE遺伝子断片を取得した。なお、この遺伝子断片では、葉緑体移行シグナルであるＮ末端の８３アミノ酸に相当する領域を欠損させた。
GenBankに登録されているナンノクロロプシス  エスピー（Nannochloropsis  sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete  cds  配列（Accession  number:  JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号１７）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号１８）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号１９）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１−２に示すプライマー３７及び３８、プライマー３９及び４０、プライマー４１及び４２を用いてＰＣＲ反応を行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、VCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１−１に示すプライマー９及び１０を用いたＰＣＲ反応により、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
上記により得られたBTE遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１の２．と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、BTE遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを構築した。なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００８３】
Nannochloropsis oculata  N2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表１−２に示すプライマー４３及び４４を用いてＰＣＲ反応を行い、NoDGAT2-8遺伝子断片を増幅した。NoDGAT2-8遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1ターミネーター配列を、上記と同様に融合してNoDGAT2-8遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-NoDGAT2-8を構築した。
【００８４】
さらに、ゼオシン耐性遺伝子（配列番号２０）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１−２に示すプライマー４５及び４６を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子断片を取得した。ゼオシン耐性遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1ターミネーター配列を、上記と同様に融合してゼオシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-bleを構築した。
【００８５】
パラモマイシン耐性遺子（配列番号２１）及びRandor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のナンノクロロプシス  ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）CCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号２２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１−２に示すプライマー４７及び４８、プライマー４９及び５０を用いてＰＣＲ反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ取得した。これらの増幅断片と、前記で取得したVCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片を、同様の方法で融合し、パラモマイシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-TUBp-aphVIIIを取得した。
【００８６】
２．BTE遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
BTE発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを鋳型として、表１−２に示すプライマー５１及び５２を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のVCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列からなるBTE遺伝子発現用断片を増幅した。また、pUC-vcp1c-bleを鋳型としてプライマー５１及び５２を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したBTE遺伝子発現用断片及びゼオシン耐性遺伝子発現用断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、BTE遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。
【００８７】
３．NoDGAT2-8遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
NoDGAT2-8遺伝子発現用プラスミドpUC-vcp1c-NoDGAT2-8を鋳型として、表１−２に示すプライマー５１及び５２を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のVCP1プロモーター配列、NoDGAT2-8遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列からなるNoDGAT2-8遺伝子発現用断片を増幅した。また、pUC-TUBp-aphVIIIを鋳型として、表１−２に示すプライマー５３及び５２を用いてＰＣＲ反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
【００８８】
上記の２．で得られたBTE遺伝子を導入したナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）株を約１０９細胞用いて、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoDGAT2-8遺伝子発現用断片及びパラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、１００μｇ／ｍＬのパラモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoDGAT2-8遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。
【００８９】
４．BTE遺伝子及びNoDGAT2-8遺伝子発現株の培養と脂質生産性の評価
３．で選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液１０ｍＬを、４０ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、２．で得られたBTE遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株についても同様に実験を行った。
【００９０】
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて１５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィーの条件、脂肪酸エステルの同定は実施例１と同様に行った。ガスクロマトグラフィー解析の結果をもとに、実施例１と同様にして総脂肪酸量、脂肪酸組成を算出した。結果を表４に示す。
表４は、BTE遺伝子導入株、BTE遺伝子及びNoDGAT2-8遺伝子導入株から抽出した脂質中の総脂肪酸量（μｇ／Ｌ）、及び脂質中の脂肪酸組成（％）を示す。なお、Ｃ１８：ｎは、Ｃ１８：０〜Ｃ１８：３の脂肪酸の総和を表す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
表４から明らかなように、BTE遺伝子及びNoDGAT2-8遺伝子を導入した形質転換株では、BTE遺伝子のみを導入した形質転換株と比較して、脂質中のラウリン酸含有量が増加していた。
【図１】
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【配列表】
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