(57)【要約】【課題】所望のアミノ酸配列を持つ直鎖状のピロール・イミダゾールポリアミド(PIPA)を、高効率、高純度に大量生産することが可能な、直鎖状のPIPAの製造方法を提供すること。【解決手段】ピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法は、樹脂上でアミノ酸単位を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させることを含む直鎖状のピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法であって、3mer〜6merのサイズを有する１個又は複数の断片を予め別途合成し、該断片を前記樹脂上で脱水縮合させて連結することを含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂上でアミノ酸単位を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させることを含む直鎖状のピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法であって、3mer〜6merのサイズを有する１個又は複数の断片を予め別途合成し、該断片を前記樹脂上で脱水縮合させて連結することを含む、ピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法。
【請求項２】
伸長の初期段階において、前記樹脂上で１個〜３個の遊離のアミノ酸を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
製造する前記ピロール・イミダゾールポリアミドがβ−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基を含み、前記１個又は複数の断片の少なくとも１つの断片のＣ末端がβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
製造するPIPAが、Ｎ末端から３番目〜Ｃ末端から２番目の間に１個又は複数個のβ−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基を含み、該β−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基が、間に２個以上のピロール含有アミノ酸及び／又はイミダゾール含有アミノ酸を挟んで配置されており、前記１個又は複数の断片は、該β−アラニン残基及びγ−アミノ酪酸残基の全てが１個又は複数の断片のＣ末端に位置する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Fmoc固相法により、ポリアミド鎖をＣ末端側から伸長させる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
製造するピロール・イミダゾールポリアミドのサイズが9mer〜29merである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記各断片のサイズが4merである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
製造するピロール・イミダゾールポリアミドが、下記式[I]
Ac-Im-Py-Py-βAla-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-βAla-Py-Py-βAla-Dp    [I]
（ただし、式[I]中、Acはアセチル基、ImはN-メチルイミダゾール残基、PyはN-メチルピロール残基、βAlaはβ−アラニン残基、γAbuは、γ−アミノ酪酸残基、Dpは3-(ジメチルアミノ）プロピルアミン基を示す）
で表される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Fmoc-βAlaが結合された樹脂に、Fmoc-Py-OHとFmoc-Py-OHとをこの順序で連結し、次いで、Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基)で表される構造を有する第１の断片と、Fmoc-Im-Py-Py-(γAbu)-OH (C末端カルボキシル基) で表される構造を有する第２の断片と、Fmoc-Im-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基) で表される構造を有する第３の断片とをこの順序で連結することを含む請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構成単位としてピロール含有アミノ酸残基と、イミダゾール含有アミノ酸残基とを主として含む、直鎖状のピロール・イミダゾールポリアミド（以下、「PIPA」と呼ぶことがある）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
PIPAは、N-メチルピロールやN-メチルイミダゾールをビルディングブロックとしてペプチド鎖に組み込んだ化合物である。PIPAは、元々抗生物質より見いだされた低分子有機化合物で、転写因子よりも強く配列特異的に２本鎖DNAに結合することにより、ターゲット遺伝子の転写活性を強力に抑制することが知られている。DNA二重螺旋構造の表面には深浅２種の溝がありPIPAは浅い方の溝（マイナーグルーブ）に入り込みDNAの各塩基との間で水素結合を介して可逆的に結合する。このようなPIPAとして、ヒトTGF-β1プロモーターのAP-1領域に結合する、一連の化合物が知られており、GB1101、GB1105、GB1106等の開発化合物名が与えられている（特許文献１、非特許文献１）。PIPAは、アミノ酸の縮合物であるのでポリペプチドと考えることができるが、完全な人工物であるので、生体内の種々のタンパク分解酵素による分解を受けず、生体内で安定である。また、生体膜を容易に通過する性質を有しているので、DDS（ドラッグデリバリーシステム）が不要であるという利点を有する。
【０００３】
一般に、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸から構成される、特定のアミノ酸配列を持つ直鎖状のポリペプチドは、遺伝子工学的手法で製造するか、又は液相反応又は固相反応でアミノ酸を１つずつ連結していくことにより化学合成される。化学合成の場合には自動合成装置を用いて行うのが通常である。通常、t-BOC固相法やFmoc固相法により、１つずつアミノ酸を連結していく方法（逐次導入）が採用される。PIPAは、ポリペプチドと考えることができるが、天然のアミノ酸から構成されるものではないので、遺伝子工学的手法により生産することはできず、化学合成する必要がある。薬理活性を発揮するPIPAは、特定の順序でアミノ酸残基を配列させたものであるので、その化学合成は、液相反応又は固相反応でアミノ酸を１つずつ連結していく必要がある。通常のポリペプチドの化学合成と同様に、t-BOC固相法やFmoc固相法により、１つずつアミノ酸を連結していく逐次導入法が知られている（特許文献２）。また、市販のペプチド自動合成装置を用いることにより合成可能であることも知られている（非特許文献２）。一方、分岐したPIPAや、複数のPIPA分子をリンカーで連結したPIPAの合成に、予めPIPAの部分領域断片を別途合成し、目的PIPAの合成時にこの断片を組み込むことも知られている（非特許文献３）。しかしながら、これは、分岐やリンカーによる結合等を伴うために、必然的に導入されたものである。直鎖状のPIPAは、逐次導入法により合成可能であり、ペプチド自動合成装置を用いた逐次導入法により合成するのが化学的な常識である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】JP 4682312 B
【特許文献２】WO 2007/060860 A
【０００５】
【非特許文献１】Matsuda, H et al. (2011)  Kidney Int. 79, 46-56
【非特許文献２】Hirata, A., Miyajima, M., Tominaga, Y. Ueta G. Nokihara, K. Peptide Science 2013, Y. Nishiuchi and T. Teshima (Eds.) The Japanese Peptide Society (2014) pp 145-148.Comparison of Recently Developed Polymer Supports for Assembly of Structured Polyamide in Solid-phase Syntheses
【非特許文献３】Hirata A, Nokihara K, Kawamoto Y, Bando T, Sasaki A, Ide S, Maeshima K, Kasama T, Sugiyama H. J. Am. Chem. Soc. 2014,136:11546-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡとの結合性を有する、特定の配列を有するPIPAを公知の方法で化学合成すると、収率が低く、また、目的生成物の純度が低く、精製に手間がかかり、精製によって収率はさらに低下する。公知の化学合成法では、数mg程度の少量の目的PIPAを得ることは可能であり、この程度の量があれば、研究段階での薬理実験を行うことは可能ではあるが、医薬品として実用化するための治験でさえグラムスケールの目的PIPAが必要であり、医薬品として上市するためには、さらに大量の目的PIPAが必要である。このような大量の目的PIPAを、公知の化学合成法により製造しようとすれば、膨大な手間とコストが必要となり、医薬品として実用化するのは困難である。PIPAを医薬品として実用化するためには、効率的に目的のPIPAを大量生産できる、工業的な化学合成方法が必要である。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、所望のアミノ酸配列を持つ直鎖状のPIPAを、高効率、高純度に大量生産することが可能な、直鎖状のPIPAの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、アミノ酸の逐次導入により、ポリアミド鎖を１アミノ酸残基ずつ伸長していく公知の製造方法により、ＤＮＡとの結合性を有するPIPAを製造しようとすると、ポリアミドの鎖長が長くなるにつれて、次のアミノ酸とのアシル化反応の効率が悪くなり、特に特定のアミノ酸とその次のアミノ酸とのアシル化反応が起きにくく、これによって全体の収率が下がることを見出した。また、反応効率が悪い場合には、未反応のポリアミド等が生成するため、製造される目的のPIPAの純度が低下することを見出した。
【０００９】
この問題を解決すべく鋭意研究の結果、所望のアミノ酸配列を有する目的のPIPAを、技術常識に従ってアミノ酸の逐次導入により１つずつポリアミド鎖を伸長していくのではなく、予め、短い鎖長の断片を作製しておき、これらの断片を連結することにより、高効率、高純度に所望のアミノ酸配列を有する直鎖状PIPAを化学合成可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、樹脂上でアミノ酸単位を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させることを含む直鎖状のピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法であって、3mer〜6merのサイズを有する１個又は複数の断片を予め別途合成し、該断片を前記樹脂上で脱水縮合させて連結することを含む、ピロール・イミダゾールポリアミドの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、所望のアミノ酸配列を有する目的の直鎖状PIPAを、高効率、高純度に化学合成することが可能である。本発明の方法では、１回のロットで数グラムという大量の目的PIPAを製造することができるので、本発明により、所望のアミノ酸配列を有する目的のPIPAの工業的な生産が初めて可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】下記実施例１で合成した断片１の逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】下記実施例１で合成した断片２の逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】下記実施例１で合成した断片３の逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】下記実施例１で製造したGB1101aの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】下記比較例１で製造したGB1101aの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６】下記実施例２で製造したPIPAの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図７】下記比較例２で製造した、実施例２と同じPIPAの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図８】下記実施例３で製造したPIPAの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図９】下記比較例３で製造した、実施例３と同じPIPAの逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法により製造される「ピロール・イミダゾールポリアミド」(PIPA)は、ポリアミドを構成するアミノ酸残基の過半数、好ましくは７０％以上が、N-メチルピロールのようなピロール部分を含有するアミノ酸残基又はN-メチルイミダゾールのようなイミダゾール部分を含有するアミノ酸残基であるポリアミドを意味する。本発明の方法に用いるピロール含有アミノ酸としては、N-メチル-2-カルボキシル-4-アミノピロールが好ましく、イミダゾール含有アミノ酸としては、N-メチル-2-カルボキシル-4-アミノイミダゾールが好ましい。ただし、ポリアミド鎖の伸長に用いるビルディングブロックとしては、これらのアミノ酸のアミノ基がFmoc基（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）により保護されているもの（下記構造式参照）が好ましい。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
PIPAは、通常、このようなピロール含有アミノ酸及びイミダゾール含有アミノ酸以外の他のアミノ酸の残基を含んでいる。このような他のアミノ酸は、通常、PIPAの分子構造の歪みを解消したり、ヘアピン構造等の所望の立体構造を与えるために導入されるものであり、例としてβ-アラニン(βAla)及びγ-アミノ酪酸(γAbu)を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の方法により製造されるPIPAのサイズは、通常、9mer（merはアミノ酸残基数）〜29mer、好ましくは9mer〜20mer程度である。
【００１７】
上記の通り、特定のアミノ酸配列を持つPIPAは、特定の二本鎖DNAの特定領域に結合するので、これを利用して、遺伝子の転写活性を調節可能であることが知られており、これにより様々な薬理効果を発揮することも知られている。例えば、GB1101、 GB1105、 GB1106及びGB1101a（後述）並びにこれらの類縁体を挙げることができる。本発明の方法は、薬理効果を有するこれらのいずれのPIPAの製造にも適用することが可能である。薬理効果を有するPIPAの特に好ましい例として、下記構造式で表されるGB1101aを挙げることができる。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
このGB1101aは、略号で記すと下記式[I]で表すことができる。
Ac-Im-Py-Py-βAla-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-βAla-Py-Py-βAla-Dp    [I]
（ただし、式[I]中、Acはアセチル基、ImはN-メチルイミダゾール残基、PyはN-メチルピロール残基、βAlaはβ−アラニン残基、γAbuは、γ−アミノ酪酸残基、Dpは3-(ジメチルアミノ）プロピルアミン基を示す）。
【００２０】
なお、このGB1101aは、ヒトTGF-β1プロモーターAP-1領域を標的として設計されたPIPAであり、現在、前臨床的研究の段階である(非特許文献１）。これまでの研究では、GB1101aは特異的にTGF-β1発現を抑制する。ラットでの腎障害モデルへの長期投与でも副作用は無く、腎障害を改善することがわかっている。またバルーン傷害血管に一回の投与で血管狭窄を有意に抑制する。さらに局所投与でも皮膚肥厚性瘢痕、角膜炎等を抑制する。当該化合物は１回の全身投与で１週間以上、細胞内の核に結合し、ターゲット遺伝子の転写活性を特異的に抑制する極めてユニークな薬剤である事が確認されている。マウスでの毒性試験では致死量は40 mg/kg以上、20 mg/kgでは副作用は全く無かった。TGF-βは肝硬変、肺線維症など線維化疾患の形成に重要な役割を持つ。皮膚創傷治癒においても、コラーゲンを含む細胞外マトリクスの産生を刺激し、分解を抑制することから肥厚性瘢痕、ケロイドの主因とされている。
【００２１】
本発明の方法では、樹脂上でアミノ酸単位を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させる。樹脂としては、固相法によるペプチド合成に用いられる周知の樹脂を用いることができ、市販品を好ましく用いることができる。なお、β−アラニンのようなアミノ酸を予め結合している樹脂も市販されているので、これらを用いることもできる。本発明の方法では、公知の方法のように、アミノ酸を１個ずつ逐次導入してポリアミド鎖を伸長させていくのではなく、3mer〜6merのサイズを有する１個又は複数の断片を予め別途合成し、該断片を前記樹脂上で脱水縮合させて連結する。断片のサイズは、好ましくは3mer〜5mer、特に好ましくは4mer又は5merである。ポリアミド鎖の伸長自体は、ペプチド合成法として公知であるFmoc固相法により、Ｃ末端側から伸長させていくことが好ましい。なお、Fmoc固相法は、各アミノ酸のアミノ基をFmoc基で保護したアミノ酸誘導体をビルディングブロックとして用いてペプチド鎖を伸長していく方法であり、ペプチド鎖のＮ末端に結合されたアミノ酸残基のアミノ基のFmoc基を脱保護し、次のアミノ酸誘導体（アミノ基がFmoc基で保護されている）でアシル化してＮ末端側に１つアミノ酸残基を伸長させることを繰り返す方法である。
【００２２】
上記の通り、本願発明者らは、DNAとの結合性を有する直鎖状PIPAは、ポリアミド鎖の鎖長が長くなるにつれて、次のアミノ酸との反応効率が低下する傾向にあることを見出した。DNAとの結合性を有するためには、特定の立体構造をとることが必要である。鎖長が長くなるにつれて、PIPAが特定の立体構造をとっていき、分子運動の自由度が低下するために反応性が低くなるものと考えられる。本発明では、１個又は複数個のポリアミド鎖の断片を予め別途合成しておき、これを連結することによりこの問題を大幅に低減できることに想到した。すなわち、鎖長が短い間は、遊離のアミノ酸を１個ずつ逐次導入しても反応効率はそれほど低くはならないので、3mer〜6merのペプチド断片を化学合成する場合には反応効率の低下の問題は小さい。このため、合成効率がそれほど低下しない3mer〜6merのペプチド断片を予め合成しておき、これらを連結することにより、鎖長が長くなってからのアシル化反応の回数を大幅に減少させることができ、これによって、全体の製造効率を大幅に改善することに成功した。さらに、断片を連結する場合には、連結後の反応生成物と未反応の反応物質とは分子量も大きく異なり、生成物の精製が容易であるので、反応回数の少なさと相まって生成物の純度を大きく改善することができる。なお、鎖長が短い間は、遊離のアミノ酸を１個ずつ逐次導入しても反応効率はそれほど低くはならないので、伸長の初期段階において、前記樹脂上で少数、好ましくは１個〜３個の遊離のアミノ酸を脱水縮合させてポリアミド鎖を伸長させてもよい。この際、最初の１個として、予めアミノ酸が結合されている市販の樹脂の該アミノ酸を利用することもできる。なお、製造に用いる各断片は、Fmoc固相法により合成することができる。
【００２３】
さらに、本願発明者らは、鋭意研究の結果、γ−アミノ酪酸や、β−アラニンなどの、ピロール含有アミノ酸及びイミダゾール含有アミノ酸以外のアミノ酸のアシル化効率が、ピロール含有アミノ酸及びイミダゾール含有アミノ酸のアシル化効率よりも低くなることを見出した。このため、これらのアミノ酸のアシル化は、なるべく鎖長の短い段階で行うことが好ましく、したがって、可能な限り、各断片のＣ末端にこれらのアミノ酸が来るように断片を設計することが有利である。すなわち、製造する前記ピロール・イミダゾールポリアミドがβ−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基を含む場合、前記１個又は複数の断片の少なくとも１つの断片のＣ末端がβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基であることが好ましく、可能な限り、目的のPIPAの途中（Ｎ末端から３番目〜Ｃ末端から２番目）に含まれる全てのβ−アラニン残基及びγ−アミノ酪酸残基が断片のＣ末端となるように断片を設計することが好ましい。すなわち、製造するPIPAが、Ｎ末端から３番目〜Ｃ末端から２番目の間に１個又は複数個のβ−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基を含み、β−アラニン残基及び／又はγ−アミノ酪酸残基が、間に２個以上のピロール含有アミノ酸及び／又はイミダゾール含有アミノ酸を挟んで配置されている場合に、これらの全てのβ−アラニン残基及びγ−アミノ酪酸残基が断片のＣ末端となるように断片を設計することが好ましい。
【００２４】
上記したGB1101aの製造に本発明を適用する場合、断片の設定方法には、具体的に種々の方法が考えられるが、本願発明者らは、様々な試行錯誤の結果、最も効率よく、かつ、最も高純度にGB1101aを製造できる方法として、下記実施例に具体的に記載する方法、すなわち、Fmoc-βAlaが結合された樹脂に、Fmoc-Py-OHとFmoc-Py-OHとをこの順序で連結し、次いで、Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基)で表される構造を有する第１の断片と、Fmoc-Im-Py-Py-(γAbu)-OH (C末端カルボキシル基) で表される構造を有する第２の断片と、Fmoc-Im-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基) で表される構造を有する第３の断片とをこの順序で連結することを含む方法を見出した。
【００２５】
なお、断片を結合する場合でも遊離のアミノ酸を結合する場合でも、縮合反応後に洗浄を行って未反応のアミノ酸又は断片を除去し、反応生成物の一部を取り出し、樹脂から切り出してLC-MS（液体クロマトグラフィー−質量分析）などにより、正しく縮合が起きたことを確認して次のステップに移ることが好ましい。
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  GB1101aの製造
１．断片の合成
以下の方法により、下記断片１〜断片３を合成した。
断片１：Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基)
断片２：Fmoc-Im-Py-Py-(γAbu)-OH (C末端カルボキシル基)
断片３：Fmoc-Im-Py-Py-(βAla)-OH (C末端カルボキシル基)
【００２８】
Fmoc-βAla が結合されている市販の樹脂（「レジン」と呼ぶことがある）であるFmoc-βAla-ClTrt resin(商品名）（0.62 mmol/g, 6 g, 3.7 mmol）をジクロロメタン／DMF＝1／1溶液（10 mL）で3時間浸すことで膨潤させた。溶液を濾過により除去後、20% ピペリジン／DMF溶液を10 mL加えて脱Fmoc反応を5 分間処理を二回行った。レジンをDMFで5回洗浄した後、Fmoc-Py-OH（4.0 g, 11 mmol）、PyBOP（5.8 g, 11 mmol）、DIEA（3.9 mL, 22 mmol）のNMP溶液（10 mL）をレジンが充填された反応容器に加えて、60℃で1時間攪拌した。反応溶液を除去した後、レジンをDMFで5回洗浄した。20% ピペリジン／DMF溶液を10 mL加えて脱Fmoc反応を5 分間処理を２回行った。レジンをDMFで５回洗浄した後、Fmoc-Py-OH（4.0 g, 11 mmol）、PyBOP（5.8 g, 11 mmol）、DIEA（3.9 mL, 22 mmol）のNMP溶液（10 mL）をレジンが充填された反応容器に加えて、60℃で1時間攪拌した。反応溶液を除去した後、レジンをDMFで5回洗浄した。20% ピペリジン／DMF溶液を10 mL加えて脱Fmoc反応を5 分間処理を２回行った。レジンをDMFで5回洗浄した後、Fmoc-Py-OH（4.0 g, 11 mmol）、PyBOP（5.8 g, 11 mmol）、DIEA（3.9 mL, 22 mmol）のNMP溶液（10 mL）をレジンが充填された反応容器に加えて、60℃で1時間攪拌した。反応溶液を除去した後、レジンをDMFで5回洗浄した。固相合成により順次カップリングしたので、Fmoc-Py-Py-Py-βAla-ClTrt resin を調製した。レジンを減圧乾燥後、TFE/AcOH/DCM=1/1/3にレジンを浸して1時間攪拌することで、クリーベイジを行った。濾過によりレジンを除去し、濾液はエバポレーターで濃縮し、残渣を10%水−ジオキサン溶液に溶かして凍結乾燥した。Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OH（断片１）を2.63 g（収率97%）のCrudeサンプルを得た。溶出液としてジクロロメタン／メタノール／ジイソプロピルエチルアミン＝20／1／1溶液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OHを2.24g（収率85%）の精製サンプルを得た。伸長の確認はLC-MSにより確認した（計算値: 677.7; 実測値: 678.3 [M+H]+）。精製サンプルを逆相HPLCにかけた結果を図１に示す。図中、矢印は目的物である（他の図でも同様）。
【００２９】
HPLC分析条件  保持時間14.5分  カラム：HiPep-Cadenza 3 x 150 mm, グラジエント  B: 50-80  30分、流速: 0.3 mL/分、210 nm、A: 0.1% TFA: B: 0.1% TFA 90% アセトニトリル
【００３０】
以下、同様にして、上記断片２及び断片３を合成し、LC-MSにより各断片の生成を確認した。断片２及び断片３の製造収率は、それぞれ98%、92%であった。伸長の確認はLC-MSにより確認した（断片２：計算値  693.7  実測値  693.3  [(M+H)+]；断片３：計算値  678.7    実測値  679.3  [(M+H)+]）。これらを上記と同様に、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。精製後の収率は、それぞれ88%、81%であった。上記と同様な逆相HPLCの結果をそれぞれ図２及び図３に示す。
【００３１】
２．GB1101aの合成
下記スキームに従い、GB1101aを合成した。
【００３２】
【化３】
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【００３３】
Fmoc-βAla が結合されている市販の樹脂である合成担体1.25 g（Fmoc-βAla-Wang resin（商品名）, 0.64 mmol/g, 0.8 mmolスケール）を固相反応用リアクターRT50（商品名）に添加し、PetiSyzerII（商品名）を用いて30℃〜35℃の範囲で温調して合成を行った。Fmoc 基の脱保護反応は20%ピペリジン／DMF溶液で5分間処理を２回することにより行った。Fmoc-アミノ酸(5 eq)/PyBOP(5 eq)/DIEA (10 eq)/NMP溶液でカップリング反応を60分間行った。Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-Py-Py-(βAla)-OH（断片１）、Fmoc-Im-Py-Py-(γAbu)-OH（断片２）、Fmoc-Im-Py-Py-(βAla)-OH（断片３）の順にカップリングを行い、N末端は無水酢酸/ピリジンでアセチル化した。アッセンブル後、メタノールでレジンを洗浄し、2時間減圧乾燥後、ナスフラスコにペプチド化レジンを移して3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン（Dp）を20 mL加え、60℃で3時間攪拌した。Dpで洗い込むことでろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。橙色の粘性残渣を10%water-ジオキサン溶液20 mLで均一に溶かしてから凍結乾燥することで高純度の目的物を得た（1.76 g, 0.79 mmol, 収率99%）。
【００３４】
生成物を上記と同様な逆相HPLCで分析した。結果を図４に示す。
HPLCの条件HiPep-Cadenza（商品名）φ3.0 x 150 mm、溶出液A: 0.1% TFA水溶液; 溶出液B: 0.1% TFA, 90% アセトニトリル水溶液, グラジエント30-60%B30分, 0.3 mL/分, 25℃, UV 210 nm
【００３５】
比較例１  GB1101aの合成
断片１〜３を予め合成することなく、Ｃ末端側からアミノ酸を逐次導入すること以外は実施例１と同様な方法により、GB1101aを合成した（収量0.23g、収率：13.2％）。実施例１と同様に逆相HPLC分析した結果を図５に示す。
【００３６】
図５と実施例１の図４を比較すると明らかなように、本発明の方法により合成したGB1101aの純度は、逐次合成した比較例１の場合よりも遥かに純度が高かった。
【００３７】
実施例２    Ac-Im-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの製造
市販の合成担体348mg（Fmoc-Py-oxime resin, 0.23 mmol/g, 0.080 mmolスケール）を固相反応用リアクター（LibraTubeRT3（登録商標）、ハイペップ研究所）に4分割して充填し、PSSM-8（島津製作所）を用いて合成を行った。Fmoc 基の脱保護反応は20%ピペリジン／DMF溶液で5分間処理を２回することにより行った。Fmoc-アミノ酸(5 eq)/HCTU (5 eq)/DIEA (10 eq)/NMP溶液でカップリング反応を60分間行った。Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-OH、Fmoc-Im-Im-Py-Py-(γAbu)-OHの順にカップリングを行い、 N末端は無水酢酸/pyridineでアセチル化した。アッセンブル後、メタノールでレジンを洗浄し、2時間減圧乾燥後、ナスフラスコにペプチド化レジンを移して3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン（Dp）を20 mL加え、60℃で3時間攪拌した。Dpで洗い込むことでろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残渣を10%水-ジオキサン溶液20 mLで均一に溶かしてから凍結乾燥することで高純度の目的物を得た（94.7mg, 0.078mmol, 収率 98%）。実施例１と同様な逆相HLPCの結果を図６に示す。
【００３８】
比較例２    Ac-Im-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの製造
断片（Fmoc-Im-Im-Py-Py-(γAbu)-OH）を予め合成することなく、Ｃ末端側からアミノ酸を逐次導入すること以外は実施例２と同様な方法により、Ac-Im-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpを製造した（収量8.5mg、収率：9.2％）。実施例２と同様に逆相HPLC分析した結果を図７に示す。
【００３９】
図６と図７の比較から、本発明の方法により製造したAc-Im-Im-Py-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの純度は、アミノ酸の逐次導入による比較例２記載の方法により製造したものよりも遥かに純度が高いことがわかる。
【００４０】
実施例３    Ac-Py-Im-Im-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの製造
市販の合成担体261mg（Fmoc-Py-oxime resin, 0.23 mmol/g, 0.060 mmolスケール）を固相反応用リアクター（LibraTubeRT3（登録商標）、ハイペップ研究所）に3分割して充填し、PSSM-8（島津製作所）を用いて合成を行った。Fmoc 基の脱保護反応は20% ピペリジン／DMF溶液で5分間処理を２回することにより行った。Fmoc-アミノ酸(5 eq)/HCTU (5 eq)/DIEA (10 eq)/NMP溶液でカップリング反応を60分間行った。Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-OH、Fmoc-Py-Im-Im-Py-(γAbu)-OHの順にカップリングを行い、 N末端は無水酢酸/ピリジンでアセチル化した。アッセンブル後、メタノールでレジンを洗浄し、2時間減圧乾燥後、ナスフラスコにペプチド化レジンを移して3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン（Dp）を20 mL加え、60℃で3時間攪拌した。Dpで洗い込むことでろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残渣を10%水-ジオキサン溶液20 mLで均一に溶かしてから凍結乾燥することで高純度の目的物を得た（70.3 mg, 0.058 mmol, 収率 97%）。実施例１と同様な逆相HLPCの結果を図８に示す。
【００４１】
比較例３    Ac-Py-Im-Im-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの製造
断片（Fmoc-Py-Im-Im-Py-(γAbu)-OH）を予め合成することなく、Ｃ末端側からアミノ酸を逐次導入すること以外は実施例３と同様な方法により、Ac-Py-Im-Im-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpを合成した（収量5.3mg、収率：7.8％）。実施例２と同様に逆相HPLC分析した結果を図９に示す。
【００４２】
図８と図９の比較から、本発明の方法により製造したAc-Py-Im-Im-Py-γAbu-Py-Py-Py-Py-Dpの純度は、アミノ酸の逐次導入による比較例２記載の方法により製造したものよりも遥かに純度が高いことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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