(57)【要約】【課題】オートインデューサーをトラップできるクオラムセンシング制御用担体の製造方法、クオラムセンシング制御用担体、及びクオラムセンシング制御方法を提供する。【解決手段】少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒中に存在させる工程と、前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、を含むクオラムセンシング制御用担体の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒中に存在させる工程と、
前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、
を含む、クオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項２】
さらに、前記重合体を物理架橋させる工程を含む、請求項１に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項３】
前記吸着部は、複数の前記疎水性部分が相互作用することにより形成される、請求項１又は２に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項４】
前記重合体は、前記疎水性部分を含むモノマーと前記親水性部分を含むモノマーとを共重合して得られるものであって、前記親水性部分を含むモノマーと前記疎水性部分を含むモノマーの共重合割合が、モル比において、９９／１〜５０／５０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項５】
前記疎水性部分を含むモノマーが、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、Ｎ−ドデシルアクリルアミドからなる群から選択され、
前記親水性部分を含むモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項６】
前記重合体はセルロース誘導体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたことを特徴とするクオラムセンシング制御用担体。
【請求項８】
微生物の周囲に請求項７に記載のクオラムセンシング制御用担体を存在させることによってクオラムセンシングを制御することを特徴とするクオラムセンシングの制御方法。
【請求項９】
前記クオラムセンシングの制御が、前記クオラムセンシング制御用担体がオートインデューサーをトラップすることによって行われる、請求項８に記載のクオラムセンシングの制御方法。
【請求項１０】
前記微生物がグラム陰性細菌であり、前記オートインデューサーがＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンであり、前記クオラムセンシング制御用担体を用いて前記グラム陰性細菌のクオラムセンシングを抑制する、請求項９に記載のクオラムセンシングの制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物間情報伝達機構のひとつである、グラム陰性細菌のクオラムセンシングを制御するクオラムセンシング制御用担体の製造方法、クオラムセンシング制御用担体、及びクオラムセンシングの制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クオラムセンシングは、細胞密度依存性の遺伝子発現機構である。クオラムセンシングは、例えば、バイオフィルム形成、日和見感染症の病原性因子の生産、活性汚泥菌叢における硝化過程や脱窒過程の促進等、同一のメカニズムで多様な微生物機能を制御する。したがって、多様な微生物機能を制御するためにクオラムセンシングを制御する方法が提案されている。例えば、非特許文献１，２及び特許文献１，２には、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。
【０００３】
非特許文献１には、グラム陰性細菌のクオラムセンシングにおいて、シグナル伝達物質として合成されるオートインデューサーであるＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を、ヒドロゲルによって固定化したシクロデキストリンに吸着させて、クオラムセンシングを抑制する方法が提案されている。シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等を用いている。
【０００４】
特許文献１には、所定の置換基で修飾したシクロデキストリン誘導体によってＡＨＬを再現性よく、高い選択率でトラップし、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。
【０００５】
特許文献２には、イタコン酸、架橋剤（ＥＧＤＭＡ）及び１，１−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）を含むイタコン酸系の高分子化合物によってＡＨＬを吸着させ、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。
【０００６】
非特許文献２には、ＡＨＬをトラップすることでクオラムセンシングを抑制する共重合ポリマーについて開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−２８０７３６号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０８７４５４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎ．Ｋａｔｏ，Ｔ．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ａｎｄ  Ｔ．Ｉｋｅｄａ，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕｏｒｕｍ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ｂｙ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−Ａｃｙｌｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  Ｌａｃｔｏｎｅｓ  ｏｎ  Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｇｅｌ”Ｔｒａｎｓ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３０，８１５−８１８，２００５
【０００９】
【非特許文献２】Ｅ．Ｃａｖａｌｅｉｒｏ，Ａ．Ｓ．Ｄｕａｒｔｅ，Ａ.Ｃ.Ｅｓｔｅｖｅｓ,  Ａ.Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｍ．Ｊ．Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｅ.Ｖ.Ｐｉｌｅｔｓｋａ，Ｓ.Ａ.Ｐｉｌｅｔｓｋｙ,Ｉ.Ｃｈｉａｎｅｌｌａ  “Ｎｏｖｅｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｂｌｅ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｑｕｏｒｕｍ  Ｓｅｎｓｉｎｇ”Ｍａｃｒｏｍｏｌ.  Ｂｉｏｓｃｉ.  ２０１５,ＤＯＩ:１０．１００２／ｍａｂｉ.２０１４００４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非特許文献１，２及び特許文献１，２で提案された技術では、グラム陰性細菌のクオラムセンシングを効率よく阻害するために、高濃度の、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体、イタコン酸系の高分子化合物等の水溶液を用いて、グラム陰性細菌に阻害剤を効率よく接触又は作用させなければならないという課題がある。
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、グラム陰性細菌等のクオラムセンシングを効率よく制御することができる担体、その製造方法及びクオラムセンシングの制御方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の特徴を有する。
（１）少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒中に存在させる工程と、
前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、
を含む、クオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（２）さらに、前記重合体を物理架橋させる工程を含む、（１）に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（３）前記吸着部は、複数の前記疎水性部分が相互作用することにより形成される、（１）又は（２）に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（４）前記重合体は、前記疎水性部分を含むモノマーと前記親水性部分を含むモノマーとを共重合して得られるものであって、前記親水性部分を含むモノマーと前記疎水性部分を含むモノマーの共重合割合が、モル比において、９９／１〜５０／５０である、（１）〜（３）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（５）前記疎水性部分を含むモノマーが、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、Ｎ−ドデシルアクリルアミドからなる群から選択され、
前記親水性部分を含むモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（６）前記重合体はセルロース誘導体を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法により製造されたことを特徴とするクオラムセンシング制御用担体。
（８）微生物の周囲に（７）に記載のクオラムセンシング制御用担体を存在させることによってクオラムセンシングを制御することを特徴とするクオラムセンシングの制御方法。
（９）前記クオラムセンシングの制御が、前記クオラムセンシング制御用担体がオートインデューサーをトラップすることによって行われる、（８）に記載のクオラムセンシングの制御方法。
（１０）前記微生物がグラム陰性細菌であり、前記オートインデューサーがＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンであり、前記クオラムセンシング制御用担体を用いて前記グラム陰性細菌のクオラムセンシングを抑制する、（９）に記載のクオラムセンシングの制御方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法によれば、オートインデューサーを高い選択率でトラップし得るクオラムセンシング制御用担体を提供できる。また、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法によれば、グラム陰性細菌等のクオラムセンシングを効率よく制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）はポリアクリル酸（ｐｏｌｙＡＡｃ）鎖を示す模式図であり、（ｂ）は本発明に係るクオラムセンシング制御用担体において、疎水性部分を導入することにより物理架橋による３次元網目構造が形成されることを示す模式図である。
【図２】本発明に係るクオラムセンシング制御用担体に使用される親水性モノマー及び疎水性モノマー、セルロース誘導体の例を示す図である。
【図３】疎水性モノマーとしてＮ−ドデシルアクリルアミド、親水性モノマーとしてアクリル酸を使用し、共重合割合を変化させた場合の、本発明に係るクオラムセンシング制御用ビーズへのオートインデューサーのトラップ性能の変化（左縦軸、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（右縦軸、折れ線グラフ）を示す図である。
【図４】疎水性モノマーとしてＮ−ドデシルアクリルアミド、親水性モノマーとしてアクリル酸を使用し、クオラムセンシング制御用担体の添加濃度を変化させた場合の、本発明に係るクオラムセンシング制御用ビーズへのオートインデューサーのトラップ性能の変化（左縦軸、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（右縦軸、折れ線グラフ）を示す図である。
【図５】本発明に係るクオラムセンシング制御方法において、グラム陰性細菌としてセラチア菌を用い、プロディジオシン生産量によりクオラムセンシングの制御度合いを見積もる場合の制御効果の説明図である。
【図６】本発明に係るクオラムセンシング制御方法において、グラム陰性細菌としてクロモバクテリウム菌を用い、ビオラセインの生産量によりクオラムセンシングの制御度合いを見積もる場合の制御効果の説明図である。
【図７】実施例１において、グラム陰性細菌としてセラチア菌を使用し、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体としてＨＰＭＣＰフィルムを菌体中へ添加したときの、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能の変化（下図、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（上図、折れ線グラフ）を示す図である。
【図８】実施例２において、ＨＰＭＣＰビーズの粒子分布を示す分布図である。
【図９】実施例２において、グラム陰性細菌としてセラチア菌を使用し、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体としてＨＰＭＣＰビーズを菌体中へ添加したときの、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能の変化（下図、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（上図、折れ線グラフ）を示す図である。
【図１０】実施例３において、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）の粒子分布を示す分布図である。
【図１１】実施例３において、グラム陰性細菌としてセラチア菌を使用し、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体としてｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを菌体中へ添加したときの、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能の変化（下図、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（上図、折れ線グラフ）を示す図である。
【図１２】実施例４において、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの粒子分布を示す分布図である。
【図１３】実施例４において、グラム陰性細菌としてセラチア菌を使用し、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体としてｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを菌体中へ添加したときの、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能の変化（下図、棒グラフ）及びセラチア菌の菌体濁度の変化（上図、折れ線グラフ）を示す図である。
【図１４】実施例５において、グラム陰性細菌としてクロモバクテリウム菌を使用し、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体としてｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを菌体中へ添加したときの、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能の変化（下図、棒グラフ）及びクロモバクテリウム菌の菌体濁度の変化（上図、折れ線グラフ）を示す図である。
【図１５】実施例６において、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ６ＨＳＬ）水溶液に、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ)フィルム又はビーズ、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）フィルム又はビーズを浸漬し、Ｃ６ＨＳＬの吸着量を、溶液中のＣ６ＨＳＬ平衡濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対し両対数プロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体、その製造方法、及びクオラムセンシングの制御方法について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実験例に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１６】
［クオラムセンシング制御用担体の製造方法］
本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法は、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒に添加する工程と、前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、「クオラムセンシング」について説明する。
微生物間情報伝達機構、いわゆるクオラムセンシングでは、微生物はオートインデューサーと呼ばれる化学物質を介して周囲の菌体密度を感知し、菌体密度がある一定値を超えたことを感知すると、様々な遺伝子の転写・発現が活性化される。
例えば、グラム陰性細菌はオートインデューサーとしてアシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）類を生産することが知られている。
【００１８】
グラム陰性細菌例であるセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ−１株は、２種類のＡＨＬ、すなわちＮ−ヘキサノイル、Ｎ−３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトンを、同一の細胞内で生産する。
セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株が増殖し菌体密度が増大すると、ＡＨＬはそれぞれの菌から放出されるため、累積してセラチア・マルセッセンスＡＳ−１株の周囲のＡＨＬ濃度が増大する。
【００１９】
一方、菌の内部にはＡＨＬと複合体を形成するレセプタータンパク質が存在する。菌体数が定足数（ｑｕｏｒｕｍ）に達したとき、クオラムセンシング関連遺伝子が発現し、ＡＨＬ−レセプター複合体が形成され安定に存在できるようになる。このＡＨＬ−レセプター複合体は、クオラムセンシング関連遺伝子のプロモーター領域と相互作用し、その下流にある遺伝子の転写活性が増大する。
【００２０】
セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株の場合、Ｎ−ヘキサノイル、Ｎ−３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトンのいずれか１種類又は２種類以上が、セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株のレセプターと複合体を形成すると、プロディジオシン合成酵素が生産され、この酵素により赤色色素プロディジオシンが生産される。すなわち、赤色色素プロディジオシンにより、クオラムセンシングの活性化を確認することが可能となる。
【００２１】
なお、オートインデューサーとしては、グラム陰性細菌の反応においては主にアシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）類が挙げられる。また、グラム陽性細菌の反応ではペプチドが、放線菌の反応ではＡ−ファクター等が挙げられる。
【００２２】
本実施形態においては、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成し得るクオラムセンシング制御用担体の製造方法、及び、クオラムセンシング制御用担体にオートインデューサーを吸着させ、微生物の周囲からオートインデューサーを排除することにより、クオラムセンシングを制御する方法を説明する。
【００２３】
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体の製造方法においては、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を、溶媒中に存在させる工程を有する。
すなわち本実施形態において、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有する重合体は、図１（ｂ）に示すような物理架橋による３次元網目構造を形成する。この３次元網目構造は、相互に連通する多数の空孔を構成する。前記物理架橋点は、溶媒中における疎水性部分の凝集又は集積や、親水性部分における水素結合が挙げられる。例えば、親水性部分における水素結合による物理架橋点の例として、二分子のカルボキシル基は水素結合により二量体を形成し物理架橋点となり得る。
【００２４】
前記空孔は、親水性部分の接近により形成されたものであり、大きさとしても、化学構造としても、オートインデューサーの取り込みに適したものであることが本発明者らにより見いだされた。すなわち、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体の製造方法はさらに、前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程を有する。この場合、前記空孔がオートインデューサーを吸着するための吸着部であることが好ましい。またこの場合、前記空孔の大きさは、前記オートインデューサーを収容し得る大きさであることが好ましい。
【００２５】
吸着部を形成させる工程として具体的な工程は、例えば、時間の付与、外部エネルギーの付与、等が挙げられる。すなわち、溶媒中に重合体を溶解した場合に、物理架橋が形成されるための時間を付与したり、溶媒中で共重合を行う場合には、重合体が形成されるまでの時間を付与したりすることが挙げられる。さらには、前記溶媒中において、攪拌・加熱・光照射等の外部エネルギーを付与することにより、前記吸着部が好適に形成されると考えられる。
本実施形態においては、この吸着部にオートインデューサーを吸着させることにより、菌体周囲からオートインデューサーを排除し、微生物間情報伝達機構であるクオラムセンシングを制御することが可能となる。
【００２６】
なお、本実施形態において「オートインデューサーを吸着する」とは、例えば、前記吸着部にオートインデューサーが捕捉（トラップ）されることを意味する。言い換えると、オートインデューサーは、前記吸着部において、重合体のカルボキシル基等と、水素結合、疎水性相互作用、又は、イオン結合により結合し、保持されていると考えられる。
さらには、前記吸着部は、重合体の疎水性部分がオートインデューサーと、水素結合、疎水性相互作用、又は、イオン結合により結合し、保持されていると考えられる。
【００２７】
本実施形態において、さらに前記重合体を物理架橋させる工程を含んでいてもよい。この場合、前記重合体を物理架橋させる工程として具体的には、上記吸着部を形成させる工程と同様、例えば、時間の付与、外部エネルギーの付与、等が挙げられる。
本実施形態において、物理架橋により形成された空孔がオートインデューサーを吸着するための吸着部として作用することが好ましいが、必ずしもこの形態に限定される必要はなく、例えば、重合体において、オートインデューサーが結合し得る官能基等を吸着部としてもよい。
【００２８】
本実施形態において、「親水性部分」は、水によって溶媒和されることによって安定的な分散状態を維持させることができる性質を有する部分をいい、「疎水性部分」はそのような性質を有さない部分をいう。
この場合、「親水性部分」としては例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、チオール基、スルホ基、アミド結合、リン酸基、イミダゾール基、グアニジノ基、エステル結合等が挙げられる。
また、「疎水性部分」としては例えば、炭素数１以上２０以下のアルキル基又はアルケニル基、フェニル基、フェノキシ基、コレステリル基、フタリル基、スクシニル基等が挙げられる。
【００２９】
本実施形態における重合体は、例えば図２に示すような、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させて得ることができる。
【００３０】
又は、本実施形態における重合体は、多糖類であってもよい。多糖類としては、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）、ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ＨＰＭＣＰ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）等のセルロース誘導体；ヒドロキシプロピルグアーガム、キサンタンガム、スクレログルカンガム等のグアーガムおよびその誘導体；等を挙げることができる。
また、本実施形態における重合体は、一つの繰り返し単位中に疎水性部分と親水性部分を共に有する重合体であってもよい。この場合、例えば、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体；ポリビニルメチルエーテル類；等を挙げることができる。
【００３１】
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、疎水性部分を有するモノマー（疎水性モノマー）は、例えば、メチルアクリレート（アクリル酸メチル、ＭＡ）、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート（アクリル酸ブチル、ＢＡ）、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート（アクリル酸２−エチルヘキシル、ＥＨＡ）、オクチルアクリレート、ラウリルアクリレート、ステアリルアクリレート（アクリル酸ステアリル、ＳＡ）等のアルキルアクリレート（アクリル酸アルキル）、フェニルアクリレート、フェノキシエチルアクリレート、アクリロニトリル、グリシジルアクリレート、ｐ−トリルアクリレート、ソルビルアクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、置換スチレン、ベンジルメタクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、オクチルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート等のアルキルメタアクリレート（メタアクリル酸アルキル）、フェニルメタクリレート、フェノキシエチルメタクリレート、メタクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、ｐ−トリルメタクリレート、ソルビルメタクリレート、Ｎ−ドデシルアクリルアミド等のＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、酢酸ビニル、酪酸ビニル、および安息香酸ビニル等が挙げられる。
【００３２】
上記の場合、重合性、入手のし易さ、使用形態等の観点から、疎水性モノマーとしては、アクリル酸（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル又はＮ−アルキルアクリルアミドが好ましく、メチルアクリレート（アクリル酸メチル、ＭＡ）、ブチルアクリレート（アクリル酸ブチル、ＢＡ）、２−エチルヘキシルアクリレート（アクリル酸２−エチルヘキシル、ＥＨＡ）、ステアリルアクリレート（アクリル酸ステアリル、ＳＡ）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、がさらに好ましく使用される。
【００３３】
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、親水性部分を有するモノマー（親水性モノマー）としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ヒドロキシアルキルアクリレート、アルコキシアルキルアクリレート、アミノアルコキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アルコキシアルキルメタクリレートおよびアミノアルコキシアルキルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。
【００３４】
上記の場合、疎水性モノマーと同様の観点で、親水性モノマーとしてはアクリル酸、メタクリル酸、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸が好ましく使用される。
【００３５】
疎水性部分を有するモノマー（疎水性モノマー）と、親水性部分を有するモノマー（親水性モノマー）とを共重合させる場合、疎水性モノマーと親水性モノマーの種類の選択方法は特に制限されるものではない。疎水性モノマーの種類により、クオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能が異なるため、所望のトラップ性能により適宜疎水性モノマーと親水性モノマーの種類を選択可能である。
【００３６】
疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、共重合方法は特に限定されないが、共重合反応後の残存モノマーの量が少ないことから、本実施形態においてはラジカル重合法が特に好ましく使用される。当該方法では、疎水性モノマーと親水性モノマーを溶媒中で混合し、当該混合物を、緩衝作用を有する水溶液及び２５℃で水と任意の割合で混和する水性溶媒との混合溶媒中でラジカル重合する。
【００３７】
この方法で用いる、前記緩衝作用を有する水溶液としては、通常使用される緩衝溶液であれば特に限定されないが、具体的には、塩化カリウム−塩酸溶液、フタル酸水素カリウム−塩酸溶液、リン酸二水素カリウム−リン酸水素二ナトリウム溶液、クエン酸水素カリウム−クエン酸溶液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム酸溶液等が例示できる。
【００３８】
さらに、この方法で用いる、２５℃で水と任意の割合で混和する水性溶媒としては、具体的にはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜３のアルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール等のジオール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエチレングリコールモノアルキルエーテル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【００３９】
これらの水性溶媒の中では、重合反応が進行しやすいことから、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の炭素数１〜３のアルコールが特に好ましい。
【００４０】
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、共重合の割合は、クオラムセンシング制御用担体が有効なオートインデューサー吸着性能を有する観点から、モル比において、親水性モノマー／疎水性モノマー＝９９／１〜５０／５０であることが好ましい。
図３に示すように、共重合割合を変化させることにより本実施形態のクオラムセンシング制御用担体のオートインデューサーのトラップ性能を向上させることが可能となるが、使用形態等によって適宜共重合割合を選択することが可能である。
【００４１】
なお、疎水性モノマーが５０ｍｏｌ％を超えると、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体が良好なオートインデューサーのトラップ性能を有しなくなるため、好ましくない。
【００４２】
本実施形態において、重合体として多糖類を使用する場合、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）、ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ＨＰＭＣＰ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）等のセルロース誘導体を使用することが好ましい。該セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピル基、メトキシ基、フタリル基、アセチル基、スクシニル基、ヘキサヒドロフタリル基、カルボキシベンゾイル基、テトラヒドロフタロイル基、マレイル基又はトリメリロイル基を有していてもよい。この場合、１グルコースあたりの置換された水酸基の平均数（平均置換度）は０．０１以上であることが好ましい。
【００４３】
本実施形態において、重合体として一つの繰り返し単位中に疎水性部分（疎水性官能基）と親水性部分（親水性官能基）を共に有する化合物を用いる場合、疎水性官能基と親水性官能基との割合は、樹脂粒子が、水溶液中において分散体として安定に存在する観点から、モル比において、親水性官能基／疎水性官能基＝９９．９／０．１〜０／１００であることが好ましい。
【００４４】
本実施形態において、疎水性モノマーと親水性モノマーとの共重合は、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル等のラジカル重合開始剤の存在下に行なわれる。
【００４５】
その他、必要に応じて、酸化防止剤、紫外線安定剤、可塑剤、熱安定剤、滑剤、帯電防止剤、難燃剤、流滴剤、抗菌剤、防臭剤、充填材、着色剤等の添加剤を加えることもできる。
【００４６】
［クオラムセンシング制御用担体］
次に、本実施形態におけるクオラムセンシング制御用担体について以下に説明する。
本実施形態におけるクオラムセンシング制御用担体は、上述した重合体の組成物より得られる。
本実施形態において、クオラムセンシング制御用担体の形状は特に限定されないが、取り扱い易さの観点から、例えばビーズ状やフィルム状が挙げられる。
ビーズ状にする場合には、クオラムセンシング制御用担体用の重合体の種類によっては、ただ液体中に溶解するだけで数十ｎｍ程度以上のビーズが得られる。
また、スプレー等の液滴吐出装置を用いて重合体溶液を蒸留水等の液体中に噴霧・吐出することにより、ビーズ状とすることが可能である。
さらに、スプレードライヤー等を使用して重合体溶液を空気等の気体中に噴霧乾燥し、ビーズ状とすることも可能である。この場合、得られたビーズ状のクオラムセンシング制御用担体を水等の溶媒に分散させて使用することができる。
【００４７】
一方で、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体をフィルム状とする場合の製造方法も特に限定されるものではないが、例えば重合体溶液をガラスシャーレ等の容器に注いだ後に溶媒を蒸発させ、キャストフィルムとしてもよいし、重合体溶液を押出機から押し出して、押し出しフィルムとしてもよい。
【００４８】
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体は、少なくともその表面にオートインデューサーを吸着するための吸着部を含むことが好ましい。クオラムセンシング制御用担体の形状をビーズ状やフィルム状とした場合、少なくともその表面に吸着部が存在することにより、オートインデューサーがトラップされ易くなるためである。
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体のオートインデューサーのトラップ性能の観点から、上記表面の厚さは、０．１μｍ以上であることが好ましい。
【００４９】
［クオラムセンシングの制御方法］
次に、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法について説明する。
上記クオラムセンシング制御用担体を使用したクオラムセンシングの制御方法としては、微生物周囲に上記クオラムセンシング制御用担体を存在させることによって行う。これにより、上記クオラムセンシング制御用担体が微生物周囲のオートインデューサーを高い選択率でトラップするので、クオラムセンシング関連遺伝子の発現が抑制され、結果としてクオラムセンシングの制御を行うことが可能となる。
【００５０】
すなわち、微生物周囲に上記クオラムセンシング制御用担体を存在させる方法として、例えばクオラムセンシング制御用担体を微生物を含む液体中へ浸漬させてオートインデューサーをトラップさせることが可能である。
この場合、図４に示すように、クオラムセンシング制御用担体の添加濃度を変化させることによりオートインデューサーのトラップ性能を調節することが可能である。添加濃度としては、特に制限はされないが、好ましいトラップ性能を付与するためには、クオラムセンシング制御用担体の質量濃度（ｗｔ％）として、少なくとも０．０１ｗｔ％以上を添加することが好ましい。
【００５１】
本実施形態のクオラムセンシングの制御方法においては、微生物がグラム陰性細菌であり、オートインデューサーがＡＨＬ（Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン）であることが好ましい。これにより、オートインデューサーのトラップがさらに高い効率で行われるようになり、その結果、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法を適用する意義が大きくなる。
【００５２】
グラム陰性細菌としては、例えば、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌等を挙げることができる。
【００５３】
より具体的には、セラチア属細菌としては、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ−１株、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＵＵ−３株等のセラチア・マルセッセンス等を挙げることができる。
【００５４】
また、シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１株等のシュードモナス・エルギノーサや、シュードモナス・クロロラフィス・サブエスピー・オーランティアカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＵＵ−1５株等のシュードモナス・クロロラフィス等を挙げることができる。
【００５５】
エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、例えば、エロモナス・エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＵＵ−６株、エロモナス・エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＵＵ−７株、等のエロモナス・エスピー等を挙げることができる。
【００５６】
クロモバクテリウム属細菌としては、例えば、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ１２４７２株等のクロモバクテリウム・ビオラセウム等を挙げることができる。
【００５７】
シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌としては、シノリゾビウム・エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＵＵ−１２株、シノリゾビウム・エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＵＵ−１３株等のシノリゾビウム・エスピー等を挙げることができる。
【００５８】
グラム陰性細菌としてセラチア菌を用いる場合のクオラムセンシング制御の確認方法について図５を用いて説明する。
セラチア菌は、室温で培養すると鮮やかな赤色色素（Ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ）を生産することが知られている。このため、赤色色素の生産量を測定することにより、クオラムセンシングの制御度合いを見積もることができる。
すなわち、セラチア菌のオートインデューサーであるＡＨＬを、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体でトラップすることにより、セラチア菌が各細胞間の情報伝達（クオラムセンシング）をすることができなくなり、その活性が落ちて、赤色色素の生産量が減少する。
【００５９】
すなわち、クオラムセンシングの阻害度合いが大きければ大きいほど赤色色素の生産量が少なくなる。このため、セラチア菌を培養した場合に生産される赤色色素の量を測定することによりクオラムセンシングの阻害度合いを見積もることができる。そして、赤色色素の生産量は、所定の波長における吸光度を利用して測定することができる。
【００６０】
また、グラム陰性細菌としてクロモバクテリウム菌を用いる場合、図６に示す方法でクオラムセンシング制御の確認を行うこともできる。
すなわち、クロモバクテリウム菌は、室温で培養すると鮮やかな紫色色素（ｖｉｏｌａｃｅｉｎ）を生産し、菌体外へ放出することが知られている。このため、紫色色素の生産量を測定することにより、クオラムセンシングの制御度合いを見積もることができる。
クロモバクテリウム菌のオートインデューサーであるＡＨＬを、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体でトラップすることにより、クロモバクテリウム菌が各細胞間の情報伝達（クオラムセンシング）をすることができなくなり、その活性が落ちて、紫色色素の生産量が減少する。
【００６１】
この場合、クオラムセンシングの阻害度合いが大きければ大きいほど紫色色素の生産量が少なくなる。このため、クロモバクテリウム菌を培養した場合に生産される紫色色素の量を測定することによりクオラムセンシングの阻害度合いを見積もることができる。そして、紫色色素の生産量は、所定の波長における吸光度を利用して測定することができる。
【００６２】
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法の効果の一つは、微生物を殺菌することなく、病原性を抑制できる点にある。従来から使用されている抗生物質は、殺菌を行うことによって病原性の抑制を行うという手法を採用しているが、薬剤耐性菌の出現を避けることができないという問題がある。
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法では、薬剤耐性菌の出現を考慮しなくてよい上、細菌毒性を低く抑えることが可能となる。
【００６３】
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法においては、クオラムセンシング制御用担体を液体中へ浸漬させてオートインデューサーをトラップさせることが可能である。
また、クオラムセンシング制御用担体がフィルム状の場合には、クオラムセンシングの制御が要求される箇所に上記フィルムを貼付して使用することも可能である。
さらには、クオラムセンシング制御用担体の重合体溶液を、クオラムセンシングの制御が要求される箇所に塗布して乾燥させ、クオラムセンシング制御用担体の層を形成させてもよい。例えば、医療用のチューブ内部等にクオラムセンシング制御用担体の層を形成させることにより、チューブ内部に細菌が混入した場合でも、細菌毒性を低く抑えることが可能となる。
【００６４】
以上説明した、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法、クオラムセンシング制御用担体、及びクオラムセンシング制御方法を用いることによって、ＡＨＬのようなオートインデューサーを、再現性よく高い選択率でトラップすることができるようになる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例等によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１］
（ＨＰＭＣＰキャストフィルムの調製）
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステル（ＨＰＭＣＰ、アルドリッチ製）をアセトンに溶解し１０ｗｔ％溶液とした。この溶液１０ｇを直径９ｃｍのガラスシャーレに静かに注ぎ、２４時間かけて室温でアセトンを蒸発させると透明なキャストフィルムが形成した。ガラスシャーレから取り出し、縦１０ｍｍ・横１０ｍｍに切断した後に蒸留水に浸漬することで、未固定のＨＰＭＣＰを除去し洗浄した。
【００６７】
（セラチア菌の培養）
ＬＢ寒天プレートで培養したセラチア  マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＳ−１）をＬＢ液体培地４ｍＬに植菌し、３０℃で６時間前培養した。その４０μＬを分取し、ＬＢ液体培地と混合し全量を４ｍＬとなるように植菌し本培養した。
次いで、ＨＰＭＣＰキャストフィルム（縦１０ｍｍ・横１０ｍｍ）の１から４枚を、ただちに本培養液４ｍＬに添加した。振盪しながら２５℃で１５時間本培養した。添加するキャストフィルムはあらかじめ電子天秤で秤量し、添加量を質量濃度（ｗｔ％）として解析した。
【００６８】
（ＡＨＬトラップ性能評価）
マイクロチューブに本培養液１００μＬを採取し蒸留水で１５倍希釈した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、得られた値を１５倍することで培養液の菌体密度の指標である菌体濁度（ＯＤ６００）とした。
次に、遠心分離で得られた菌体ペレット全量に、４％の１Ｍ塩酸を含むエタノールを１ｍＬを加え、ボルテックスで菌体を破砕しプロディジオシンを抽出した。
再び１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、別のマイクロチューブに上清２００μＬ、蒸留水８００μＬを加えて５倍希釈した。この試料の５３４ｎｍにおける吸光度を上記と同様に測定し、得られた値を５倍してプロディジオシン量の指標（Ａ）とした。
単位菌体量当たりのプロディジオシン総生産量（Ｐ）をＰ＝Ａ／ＯＤ６００として求めた。ＨＰＭＣＰキャストフィルム未添加におけるプロディジオシン生産量（Ｐ０）で規格化し、それぞれのＨＰＭＣＰキャストフィルム添加条件における相対プロディジオシン生産量Ｐ／Ｐ０を求めた。結果を表１及び図７に示す。
【００６９】
【表１】
2016214126.tif 000003
【００７０】
（結果）
ＨＰＭＣＰキャストフィルムを０．９９ｗｔ％添加することで、プロディジオシン生産量は１３％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。また、表１における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ＨＰＭＣＰキャストフィルムの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
【００７１】
［実施例２］
（ＨＰＭＣＰビーズの調製）
１０ｗｔ％となるようにヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステル（ＨＰＭＣＰ、アルドリッチ製）をアセトンに溶解した。ピペッターを用いてこの溶液１ｇをアセトン／水（５０／５０ｗｔ％）混合溶液１０ｇに一気に添加すると、ただちにＨＰＭＣＰの析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、アセトンを除去しＨＰＭＣＰビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ＨＰＭＣＰビーズを得た。このＨＰＭＣＰビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径１μｍの粒子径が観測された。結果を図８に示す。
【００７２】
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体０．０１〜０．０４ｇを培養液４ｍＬに添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
【００７３】
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表２及び図９に示す。
【００７４】
【表２】
2016214126.tif 000004
【００７５】
（結果）
ＨＰＭＣＰビーズを０．９９ｗｔ％添加することで、プロディジオシン生産量は２８％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表２における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ＨＰＭＣＰビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
【００７６】
［実施例３］
（ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズの調製）
アクリル酸（ＡＡｃ）、ドデシルアクリルアミド（ＤＡＡｍ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）をエタノールに溶解し、それぞれの濃度が１．６ｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌとなる混合溶液を１０ｍＬ調製した。５５℃で２４時間反応し共重合ポリマーｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）を得た。得られたポリマー溶液の全量をエタノール／水[エタノール／水＝５０／５０ｗｔ％]混合溶液１００ｍＬに、激しく撹拌しながら一気に混合すると、ただちにｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）の析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、エタノールを除去しｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを得た。このｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径１μｍの粒子径が観測された。結果を図１０に示す。
【００７７】
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体を０．０５〜０．２０ｗｔ％となるように培養液へ添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
【００７８】
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表３及び図１１に示す。
【００７９】
【表３】
2016214126.tif 000005
【００８０】
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを０．１５ｗｔ％添加することで、プロディジオシン総生産量は３％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表３における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
【００８１】
［実施例４］
（ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの調製）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、アクリル酸ステアリル（ＳＡ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）をエタノールに溶解し、それぞれの濃度が０．８ｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０１ｍｏｌ／Ｌとなる混合溶液を１０ｍＬ調製した。５５℃で２４時間反応し共重合ポリマーｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）を得た。得られたポリマー溶液の全量を蒸留水１００ｍＬに、激しく撹拌しながら一気に混合すると、ただちにｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡの析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、エタノールを除去しｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを得た。このｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径０．８μｍの粒子径が観測された。結果を図１２に示す。
【００８２】
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体を０．０２５〜０．１５ｗｔ％となるように培養液へ添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
【００８３】
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表４及び図１３に示す。
【００８４】
【表４】
2016214126.tif 000006
【００８５】
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを０．１５ｗｔ％添加することで、プロディジオシン総生産量は８％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表４における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
【００８６】
［実施例５］
（ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの調製）
上記実施例４と同様に行った。
【００８７】
（クロモバクテリウム菌の培養）
ＬＢ寒天プレートで培養したクロモバクテリウム  ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＡＴＣＣ１２４７２）をＬＢ液体培地４ｍＬに植菌し、３０℃で７時間前培養した。この培養液にＬＢ液体培地を添加して６００ｎｍの濁度を紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製Ｖ−５５０）で計測した値を０．７に調整した後に、その４０μＬを分取し、ＬＢ液体培地と混合し全量を４ｍＬとなるように植菌し本培養した。
次いで、クオラムセンシング制御用担体を０．０２５〜０．１５ｗｔ％となるように培養液へ添加し、振盪しながら３０℃で１１時間本培養した。
【００８８】
（ＡＨＬトラップ性能評価）
マイクロチューブに本培養液１００μＬを採取し蒸留水で１５倍希釈した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、得られた値を１５倍することで培養液の菌体密度の指標である菌体濁度（ＯＤ６００）とした。
マイクロチューブに培養液２００μＬを採取し、１０ｗｔ％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を１００μＬ加え、さらに水飽和ブタノール９００μＬ添加して混合した。マイクロタイタープレートに上層１５０μＬを採取し、ビオラセインの極大吸収波長である５８５ｎｍにおける吸光度（Ａ）を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＰＬＵＳ）を用いて測定した。
単位菌体量当たりのビオラセイン生産量（Ｐ）をＰ＝Ａ／ＯＤ６００として求めた。ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ未添加におけるビオラセイン総生産量（Ｐ０）で規格化し、それぞれのｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ添加条件における相対ビオラセイン生産量Ｐ／Ｐ０を求めた。結果を表５及び図１４に示す。
【００８９】
【表５】
2016214126.tif 000007
【００９０】
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）を０．１５ｗｔ％添加することで、ビオラセイン総生産量は２２％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表５における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）の添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用樹脂粒子がクロモバクテリウム菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＡＴＣＣ１２４７２株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
【００９１】
［実施例６］
（ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）キャストフィルム、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルムの調製）
実施例３に示す方法で、エタノールを溶媒としてｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）をラジカル重合した。スライドガラスにポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ製ルミラー１０Ｓ）を密着させその上にシリコンゴム製ガスケット（４×６×０．５ｃｍ）を重ね、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）エタノール溶液で満たした。これを恒温乾燥機の内部に静置し６０℃で保持し溶媒を除去すると、透明なキャストフィルムが得られた。実施例４に示す方法で、エタノールを溶媒としてｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）をラジカル重合した。上記ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）と同様に、透明なｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルムを調製した。
【００９２】
（フロイントリッヒ吸着等温式による解析）
１．２５、０．６２７、０.３１４、０．１５７、０．０７８４ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ６ＨＳＬ）水溶液それぞれに、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）キャストフィルム又はｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルム０．０１ｇを浸漬し、２５℃で２４時間静置した。
同様に、実施例３で調製したｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズ、又は実施例４で調製したｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ０．０１ｇを上記濃度のＣ６ＨＳＬ水溶液に添加し、２５℃で２４時間撹拌した。
それぞれの試料のＣ６ＨＳＬ濃度を高速液体クロマトグラフィーシステム（日本分光製ポンプＰＵ−２０８０ｐｌｕｓ、島津製作所製示差屈折率検出器ＲＩＤ６Ａ、島津製作所製クロマトパックＣ−Ｒ８Ａ）にサイズ排除カラム（島津製作所製Ｄｉｏｌ−１５０）を接続し定量した。
【００９３】
図１５に示すフロイントリッヒ吸着等温式により、Ｃ６ＨＳＬの吸着量ｑ（μｍｏｌ／ｇ−ｐｏｌｙｍｅｒ）を溶液中のＣ６ＨＳＬ平衡濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対しプロットすると、どの試料でも直線が得られたことがわかる。得られた直線の傾きと切片から求めた吸着容量（Ｋｆ）と親和力（１／ｎ）を表６に示す。
【００９４】
【表６】
2016214126.tif 000008
【００９５】
ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）とＣ６ＨＳＬの親和力は０．６〜０．７程度、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）とＣ６ＨＳＬの親和力は０．６〜０．７程度と求まり、担体の形状やポリマーの組成に依存しないことが明らかとなった。
吸着容量は、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）で約０．２〜０．７、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）で約１〜２と求まることから、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）担体には、Ｃ６ＨＳＬの吸着サイトが多いことが示された。
【図１】
2016214126.tif 000009
【図２】
2016214126.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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