(57)【要約】      （修正有）【課題】レブリン酸からトレハロースを生産できる微生物、およびこの微生物を用いたトレハロースの製造方法を提供する。【解決手段】レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有するバークホルデリア・スタビリスに属する微生物。特定の塩基配列との相同性が９９.８％以上の塩基配列で示される16SrDNAを有し、受託番号NITEP-01893で受託された菌株又はこの変異株である微生物。また、トレハロースの製造方法は、レブリン酸を含む培地中でこの微生物を培養する工程を有するトレハロースの製造方法。【選択図】図６
2016041024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有するバークホルデリア スタビリス(Burkholderia stabilis)に属する微生物。
【請求項２】
請求項１において、
配列番号１の塩基配列との相同性が９９.８％以上の塩基配列で示される16S rDNAを有する微生物。
【請求項３】
請求項２において、
配列番号１の塩基配列で示される16S rDNAを有する微生物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかにおいて、
受託番号がNITE P-01893の菌株またはこの変異株である微生物。
【請求項５】
レブリン酸を含む培地中で、請求項１から４のいずれかの微生物を培養する工程を有するトレハロースの製造方法。
【請求項６】
レブリン酸を含む培地中で、請求項３または４の微生物を培養する工程を有するトレハロースの製造方法であって、
前記培地中のレブリン酸の初発濃度が２w/v％以上４w/v％以下であるトレハロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レブリン酸からトレハロースが生産できる新規の微生物と、この微生物を用いてレブリン酸からトレハロースを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我が国の化学品製造分野では、全石油消費量の２３％を使用し、全ＣＯ2排出量の４％を排出しているため、原料を非食用植物由来バイオマスに転換してＣＯ2排出量を削減することが重要である。現在、非食糧系バイオマスから化学品を製造する研究が国内外で行われている。中でも、木質原料の主成分の１つであるリグノセルロースを原料としたセルロース酵素糖化の高効率化を目指した研究が盛んである。しかしながら、酵素糖化には、(１)セルロースの結晶を壊すための前処理が必要、(２)高価なセルラーゼが大量に必要、(３)リグニン等の不純物がセルラーゼ活性を阻害する、といった課題がある。
【０００３】
近年、木質バイオマスの主要３成分であるセルロース、ヘミセルロース、リグニンを分離せず、糖化酵素の代わりにハイブリッド酸触媒を用いて、高効率、低コストでリグノセルロースを直接レブリン酸に変換する革新的な技術が国内で開発された(特許文献１、非特許文献１)。この方法によるレブリン酸メチルの対セルロース収率は７５％にも及ぶ。非食糧のバイオマス資源にはリグノセルロースの割合が多いため、木質系バイオマスの利用にはこの方法が有効である。また、酵素糖化法によって得られる糖化液は、微生物活動を阻害するフルフラールや酢酸等の不純物を多く含むが、このハイブリッド酸触媒で得られるレブリン酸は、蒸留による分離回収によって純度を高くできる。
【０００４】
さらに、このハイブリッド酸触媒は酵素より低コストで、リサイクルできる回数が多いため生産効率がよい。したがって、セルロースから、糖ではなく、レブリン酸を効率よく製造し、これを基幹物質として、化学変換や生物変換によって各種化学品を生産することが可能である。一方、微生物を活用してレブリン酸からトレハロースを生産する研究は、ほとんど知られていない。レブリン酸の微生物代謝に関する情報が非常に少ないことが原因として挙げられる。例えば、濃度１〜２wt％のレブリン酸を資化可能な酵母や細菌が多数単離されているが、代謝経路や代謝産物に関する解析がほとんどされていない(非特許文献２)。
【０００５】
また、キャンディダ属(Candida)酵母の生菌懸濁液を用いたレブリン酸の代謝実験からは、２−オキソグルタル酸が定性的に検出されたと薄層クロマトグラフによって推測されているが、２−オキソグルタル酸が同定されているとはいえない(非特許文献３)。紅色非硫黄細菌ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)細菌の休止菌体を用いたレブリン酸の分解実験からは、ガスクロマトグラフまたは液体クロマトグラフにより、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸が検出されたが、定量的な値は示されていない(非特許文献４)。
【０００６】
レブリン酸を基質として生分解性ポリマーであるポリヒドロキシアルカン酸(ＰＨＡ)共重合体を細胞内に蓄積する細菌のカプリアビダス ネカトール(Cupriavidus necator)におけるレブリン酸代謝系が解析され、レブリン酸がアセチルＣｏＡおよびプロピオニルＣｏＡを経由して、ＰＨＡ共重合体を生産すると推測されたが、細胞外に排出される代謝物に関しては調べられていなかった(非特許文献５)。また、酵素は、立体的、部位特異的な変換反応を引き起こすが、酵素を活用してレブリン酸から有用物質を生産する研究例はほとんどない。近年、クロストリジウム アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のアセト酢酸脱炭酸酵素により、レブリン酸を２−ブタノンへと変換した報告がある(非特許文献６)。
【０００７】
しかしながら、上記の研究は、高くても２wt％程度の濃度のレブリン酸しか原料として利用できていないことから、十分な量の生産物を得ることができない。また、今後循環型資源として、非食糧バイオマス由来リグノセルロースの有効利用をさらに拡大していく上で、前述した以外にもバイオプロセスを用いた新たなレブリン酸変換微生物およびその変換産物を見出していく必要がある。したがって、既知のレブリン酸代謝微生物より高濃度のレブリン酸を変換し、有用化学物質を生産する新規微生物が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１４３８６１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】K. Tomonaga, A. Mori, Y. Fukushima, S. Shimada, K. Sato: Green Chem．，vol.13, p.810-812, 2011年
【非特許文献２】原田: 農化, vol.45, p.538-546, 1970年
【非特許文献３】相田, 山口: 農化, vol.44, p.476-483, 1970年
【非特許文献４】奥山, 篠山, 藤井: 千葉大園学報, vol.49, p.29-35, 1995年
【非特許文献５】M. Jaremko, J. Yu: J. Biotechnol., vol.155, p293-298, 2011年
【非特許文献６】K. Min, S. Kim, T. Yum, Y. Kim, B. Sang, Y. Um: Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.97, p.5627-5634, 2013年
【非特許文献７】杉山ら編：新版微生物学実験法(講談社サイエンティフィック), p.241-242, 1999年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、非食糧バイオマス主成分の１つであるリグノセルロースから触媒変換によって高効率で得られるレブリン酸の有効利用のために、レブリン酸を基質として有用物質を生産できる微生物、特に既知のレブリン酸代謝微生物よりも高濃度のレブリン酸から有用化合物を生産できる新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らは、レブリン酸を炭素源として生育する微生物を各種土壌から単離して同定すべく鋭意検討した結果、従来の微生物で知られていない機能を有する微生物の単離に成功し、本発明に至った。
【００１２】
本発明の微生物は、レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有するバークホルデリア スタビリス(Burkholderia stabilis)に属する。本発明の微生物において、配列番号１の塩基配列との相同性が９９.８％以上の塩基配列で示される16S rDNAを有することが好ましい。本発明の微生物において、配列番号１の塩基配列で示される16S rDNAを有することがより好ましい。本発明の微生物において、受託番号がNITE P-01893の菌株またはこの変異株であることがさらに好ましい。
【００１３】
本発明のトレハロースの製造方法は、レブリン酸を含む培地中で、上記微生物を培養する工程を有する。また、本発明の他のトレハロースの製造方法は、配列番号１の塩基配列で示される16S rDNAを有する微生物、または受託番号がNITE P-01893の菌株もしくはこの変異株である微生物を、レブリン酸を含む培地中で培養する工程を有する方法であって、培地中のレブリン酸の初発濃度が２w/v％以上４w/v％以下である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、付加価値があるトレハロースをレブリン酸から生産できるバークホルデリア スタビラス(Burkholderia stabilis)に属する微生物が得られる。また、本発明によれば、微生物を用いてレブリン酸からトレハロースが生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】培地の光学密度(●)と、培地中のレブリン酸濃度(■)の経時変化を示すグラフである。
【図２】レブリン酸の初発濃度が３w/v％(●)、４w/v％(■)、および５w/v％(▲)のレブリン酸培地における菌株の生育の経時変化を示すグラフである。
【図３】レブリン酸の初発濃度が４w/v％のレブリン酸培地で菌株ＬＡ２０Ｗを１２０時間培養した後の培地の液体クロマトグラフィーのチャートである。
【図４】菌株ＬＡ２０Ｗによって生成された物質のマススペクトルである。
【図５】レブリン酸の初発濃度が４w/v％のレブリン酸培地でＬＡ２０Ｗを培養したときのレブリン酸濃度(■)とトレハロース濃度(●)の経時変化を示すグラフである。
【図６】レブリン酸の初発濃度が４w/v％のレブリン酸培地で高密度のＬＡ２０Ｗを培養したときのレブリン酸濃度(■)とトレハロース濃度(●)の経時変化を示すグラフである。
【図７】レブリン酸の初発濃度が４w/v％のレブリン酸培地で、ジャーファーメンターを用いてＬＡ２０Ｗを培養したときのレブリン酸濃度(■)とトレハロース濃度(●)の経時変化示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、非食糧バイオマス主成分の１つであるリグノセルロースから触媒変換により高効率で得られるレブリン酸の有効利用を研究目的として、濃度２w/v％(２０ｇ／Ｌ)のレブリン酸を資化する微生物を、スクリーニングすることによって茨城県つくば市内の土壌から見出したものである。なお、「w/v％」は、「重量体積パーセント」と同じ数値となる「質量体積パーセント」を意味し、溶液１００ｍＬに含まれる溶質の質量をｇで表したものである。本発明の微生物は、具体的には、レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有するバークホルデリア スタビラス(Burkholderia stabilis)に属する。なお、トレハロースは、食品や化粧品などの原材料として工業的に有用な物質であるが、微生物を利用してレブリン酸をトレハロースに変換する報告はこれまでにない。
【００１７】
今回単離した菌株は、グラム陰性の桿菌で、その菌株の16S rDNA塩基配列の相同性解析の結果、バークホルデリア科(Burkholderiaceae)バークホルデリア属(Burkholderia)に属することが判明した。バークホルデリア科(Burkholderiaceae)バークホルデリア属(Burkholderia)に属する細菌が、レブリン酸を代謝してトレハロースを生産することは、これまでに報告されていない。
【００１８】
本発明の実施形態に係る微生物は、配列番号１の塩基配列との相同性が９９.８％以上の塩基配列で示される16S rDNAを有し、レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有する。配列番号１は、今回単離した菌株の16S rDNAのほぼ全長に相当する領域の塩基配列である。ここで、一般的に16S リボソームRNA遺伝子で９９.８％以上の相同性を有するものが同一の種であると考えられているため(非特許文献７)、配列番号１の塩基配列との相同性が９９.８％以上の塩基配列で示される16S rDNAを有する微生物も、レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有する限り本発明に含まれる。塩基配列の相同性は、ホモロジー検索ソフトBLAST等によって測定される。配列番号１の塩基配列で示される16S rDNAを有する微生物であれば、なお好ましい。
【００１９】
本実施形態の微生物は、バークホルデリア科(Burkholderiaceae)バークホルデリア属(Burkholderia)に属し、２５〜４５℃でレブリン酸を代謝しながら生育し、レブリン酸をトレハロースに変換する能力を有する。また、本実施形態の微生物は、レブリン酸を主な炭素源とした培地の他にも、ＹＰＤ培地(グルコース５ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、MgSO4・7H2O １ｇ／Ｌ、および水を混合したもの)等で生育良好であり、ＹＰＤ培地で継体培養を行なってもレブリン酸の代謝能を失わない絶対好気性の細菌である。そして、２５〜４５℃の温度で、好気条件下で培養できる。
【００２０】
本実施形態の微生物である菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号NITE P-01893として寄託した。したがって、本発明の微生物は、好ましくは受託番号がNITE P-01893の菌株である。また、レブリン酸を基質としてトレハロースを生産する能力を有する限り、この菌株の変異株も本発明に含まれる。菌株の変異は、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって塩基の付加、欠失、置換等を人工的に誘発したものであってもよい。
【００２１】
また、本発明の実施形態に係るトレハロースの製造方法は、レブリン酸を含む培地中で、本発明の微生物を培養する工程を有する。レブリン酸を含む培地の基本的組成は、この技術分野で知られているものを任意に選択することができる。培地中のレブリン酸濃度は当業者が適宜決定できるが、好ましくは１w/v％以上２０w/v％以下(１０ｇ／Ｌ以上２００ｇ／Ｌ以下)、より好ましくは２w/v％以上１０w/v％以下(２０ｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下)、さらに好ましくは２w/v％以上４w/v％以下(２０ｇ／Ｌ以上４０ｇ／Ｌ以下)、例えば４w/v％(４０ｇ／Ｌ)である。培地中にその他の物質、例えば 各種無機塩類や酵母抽出液(Difco社製BactoTM Yeast Extract等)などが含まれていてもよい。培養条件は特に制限がないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃、例えば３０℃の温度で、試験管またはフラスコ中において好気条件下で振とう培養することができる。
【００２２】
トレハロースは当業者が任意の方法により同定できるが、例えば、ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーにて解析を行ない、保持時間およびマススペクトルについて、試料とトレハロース標品サンプルを比較するなどによってトレハロースと同定できる。トレハロースは当業者が任意の方法により分離、精製できるが、例えば、各種クロマトグラフィーを利用して分離、精製することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本実施形態の微生物およびトレハロースの製造方法について、さらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２４】
（１）レブリン酸代謝能を備える微生物の分離
まず、レブリン酸２０ｇと、KH2PO4 ２.０ｇと、(NH4)2SO4 ５.０ｇと、MgSO4・7H2O ０.５ｇを混合し、１０ＭのNaOH水溶液を加えながらｐＨ７.０に調整し、さらに水を加えて、初発濃度２w/v％のレブリン酸培地Ａを１Ｌ作製した。また、レブリン酸２０ｇと、酵母抽出液(Difco社製BactoTM Yeast Extract)５.０ｇと、ポリペプトン５.０ｇと、MgSO4・7H2O １.０ｇを混合し、１０ＭのNaOH水溶液を加えながらｐＨ７.０に調整し、さらに水を加えて、初発濃度２w/v％のレブリン酸培地Ｂ（以下「２w/v％のレブリン酸培地Ｂ」ということがある）を１Ｌ作製した。
【００２５】
つぎに、レブリン酸培地Ａが５ｍＬ入った複数の試験管に、茨城県つくば市内で採取した各種土壌サンプルをそれぞれ薬さじ一杯分入れて、３０℃、２００ｒｐｍで一週間振とう培養した。その後、連続培養しながら、上記の振とう培養を３〜４日経過毎にレブリン酸培地Ａが５ｍＬ入った新しい試験管で植え継ぎし、これを３回繰り返した。こうして得られた培養液を希釈して、ＹＰＤ平面寒天培地に塗布して３０℃で培養した後、生育した細菌のコロニーを、レブリン酸培地Ｂで培養し、レブリン酸培地Ｂ中での菌の生育およびレブリン酸濃度の減少を基準としてレブリン酸代謝能を確認した。
【００２６】
また、前述の方法で土壌からスクリーニングした微生物３菌株(それぞれＬＡ２０Ｗ、ＬＡ２２Ｂ、およびＬＡ２４Ｙと命名)を、ＹＰＤ培地が５ｍＬ入った３本の試験管にそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。そして、こうして得られた各培養液０.５ｍＬを、レブリン酸培地Ｂが３０ｍＬずつ入った３本のフラスコにそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２０時間振とう培養した結果を図１に示す。図１は、培養液の光学密度（ＯＤ）（●、左目盛）と、培養液中のレブリン酸濃度（ｇ／Ｌ）（■、右目盛）の経時変化を示している。培養液の光学密度が大きいほど、菌株が生育していることを示している。図１より、菌株の生育に伴ってレブリン酸濃度が減少しており、３つの菌株がレブリン酸代謝能を有することが明らかとなった。
【００２７】
（２）微生物の同定
ＬＡ２０Ｗの同定を行うため、ＬＡ２０ＷのゲノムＤＮＡを抽出した。細菌の系統学的位置付けの検討に用いられ、菌種の同定に利用されている16S rDNAについてシークエンス解析を行なった。それらの配列をもとにデータベース(GenBank/DDBJ/EMBL)およびホモロジー検索ソフト(BLAST)等を用いてホモロジー検索をしたところ、ＬＡ２０Ｗの菌株の16S rDNAの塩基配列は、”Burkholderia stabilis LMG14294(基準株)”として登録された塩基配列と高い相同性(９９.９％)を示した。
【００２８】
なお、前述の通り、一般的に16S リボソームRNA遺伝子で９９.８％以上の相同性を有するものが同一の種であると考えられているので(非特許文献７)、ＬＡ２０Ｗの属レベルにおける帰属分類群は、バークホルデリア属(Burkholderia)とするのが妥当であり、ＬＡ２０Ｗはバークホルデリア科(Burkholderiaceae)バークホルデリア属(Burkholderia)スタビリス(stabilis)と判定した。ＬＡ２０Ｗを受託番号NITE P-01893として寄託した。
【００２９】
（３）微生物の生育
有用物質を高濃度に生産する観点から、なるべく高濃度のレブリン酸を基質として生育させることが好ましい。そこで、ＬＡ２０Ｗ、ＬＡ２２Ｂ、およびＬＡ２４Ｙの３つの菌株について、生育可能なレブリン酸濃度を以下の方法で確認した。まず、レブリン酸培地Ｂ中のレブリン酸の質量を変えて、３w/v％、４w/v％、および５w/v％の培地をそれぞれ作製した(以下、「３w/v％のレブリン酸培地Ｂ」、「４w/v％のレブリン酸培地Ｂ」、および「５w/v％のレブリン酸培地Ｂ」ということがある)。つぎに、ＹＰＤ培地が５ｍＬ入った３本の試験管に、ＬＡ２０Ｗ、ＬＡ２２Ｂ、およびＬＡ２４Ｙの菌株をそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。そして、こうして得られた各培養液０.５ｍＬを、３w/v％のレブリン酸培地Ｂが３０ｍＬずつ入った３本のフラスコにそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで９６時間振とう培養し、菌株の生育を確認した。
【００３０】
４w/v％のレブリン酸培地Ｂおよび５w/v％のレブリン酸培地Ｂについても、同様にして菌の生育を確認した。これらの結果を図２に示す。図２は、３w/v％のレブリン酸培地Ｂ(●)、４w/v％のレブリン酸培地Ｂ(■)、および５w/v％のレブリン酸培地Ｂ(▲)のレブリン酸を基質とした菌株の生育の経時変化を示している。図２より、ＬＡ２０ＷとＬＡ２２Ｂの２菌株は、３w/v％および４w/v％のレブリン酸培地Ｂで菌株の良好な生育が確認されたが、５w/v％のレブリン酸培地Ｂでは、生育しないか、生育が非常に悪くなることがわかった。一方、ＬＡ２４Ｙの菌株は、５w/v％のレブリン酸培地Ｂだけでなく、３w/v％および４w/v％のレブリン酸培地Ｂでも生育が悪かった。以上より、ＬＡ２０ＷおよびＬＡ２２Ｂの菌株は、レブリン酸の初発濃度が２w/v％以上４w/v％以下の培地中で良好に生育することがわかった。
【００３１】
（４）微生物の代謝物の同定
４w/v％のレブリン酸培地Ｂで培養したＬＡ２０Ｗ、ＬＡ２２Ｂ、およびＬＡ２４Ｙについて、経時的にサンプリングした培養液中の菌株を遠心除去し、上清をフィルターでろ過した後、レブリン酸代謝物が含まれるこのろ液を液体クロマトグラフ解析に供した。液体クロマトグラフは、カラムにAminex(登録商標)HPX-87H(BIO-RAD社)を、検出器にRID-10A(島津製作所)を、移動相として５ｍＭのH2SO4を用い、カラム温度６０℃、流速１.０ｍＬ／分で行った。その結果、３つの菌株でレブリン酸の減少が確認された。図３は、４w/v％のレブリン酸培地ＢでＬＡ２０Ｗを１２０時間培養した後の液体クロマトグラフィーのチャートの一例を示している。図３に示すように、レブリン酸に対応する９.９分のピーク以外に、４.７分の明確なピークが確認された。
【００３２】
また、この１２０時間培養後の培養液から菌株を遠心除去し、さらにフィルターろ過して菌株を完全に除去した後、陰イオン交換樹脂(ダウエックス(ダウ・ケミカル社))を充填したカラムにこの上清液を通すことにより、レブリン酸イオンを吸着除去した。そして、液体クロマトグラフにより、４.７分のピーク成分のみを多く含む画分を確認した後、濃縮して、液体クロマトグラフ質量分析計(ＬＣ−ＭＳ)に供した。ＬＣ−ＭＳ解析は、カラムにSynergiTM 4μm Hydro-RP (島津製作所)を、検出器にLCMS-2020(島津製作所)を、移動相として０.１％ギ酸：アセトニトリル＝９５：５(体積比)を用い、カラム温度４０℃、流速０.２ｍＬ／分で行った。その結果、マススペクトルに基づき、液体クロマトグラフの４.７分のピーク成分物質は分子量が３４２の二糖類であると推測された。
【００３３】
この物質に関して、ショ糖(スクロース)、ラクトース、マルトース、セロビオース、およびトレハロースの二糖類標品のサンプルと比較を行なった。これらの液体クロマトグラフでの保持時間が全て４.７分だったので、どの二糖類か推定できなかった。そこで、ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーにて解析を行ない、保持時間およびマススペクトルに関してこの物質と各二糖類標品サンプルを比較するなどによって、この物質を同定した。
【００３４】
図４は、この物質のマススペクトルを示している。試薬として販売しているショ糖(スクロース)、ラクトース、マルトース、セロビオース、トレハロースのうち、この物質のトリメチルシリル化物の保持時間およびマススペクトルが、トレハロース標品のトリメチルシリル化物の保持時間およびマススペクトルと完全に一致したので、この物質はトレハロースであると同定された。図５に、４w/v％のレブリン酸培地ＢでＬＡ２０Ｗを培養したときのレブリン酸濃度(■、左目盛)とトレハロース濃度(●、右目盛)の経時変化を示している。
【００３５】
（５）微生物のトレハロースの生産能
まず、ＹＰＤ培地が５ｍＬ入った試験管にＬＡ２０Ｗを植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。つぎに、得られた培養液２ｍＬを２w/v％のレブリン酸培地Ｂが１００ ｍＬ入ったフラスコに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振とう培養した。そして、こうして得られた培養液を遠心分離して上清を除去し、４w/v％のレブリン酸培地Ｂ３０ｍＬで懸濁した後、３０℃、２００ｒｐｍで９６時間振とう培養した。図６は、この振とう培養でのレブリン酸濃度(■、左目盛)とトレハロース濃度(●、右目盛)の経時変化を示している。図６に示すように、ＬＡ２０Ｗは７２時間後に最大１.９５ｇ／Ｌのトレハロースを生産した。
【００３６】
また、ＹＰＤ培地が５ｍＬ入った試験管にＬＡ２０Ｗを植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。つぎに、得られた培養液２ｍＬを２w/v％のレブリン酸培地Ｂが１００ｍＬ入ったフラスコに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振とう培養した。そして、こうして得られた培養液１００ｍＬ(全量)を、４w/v％のレブリン酸培地Ｂが２０００ｍＬ入った５Ｌ容ジャーファーメンターに植菌し、３０℃、１ｖｖｍ、５００ｒｐｍで１４４時間培養した。なお、培養中にｐＨを制御しなかった。図７は、この培養でのレブリン酸濃度(■、左目盛)とトレハロース濃度(●、右目盛)の経時変化を示している。図７に示すように、ＬＡ２０Ｗは１２０時間後に最大１.７２ｇ／Ｌのトレハロースを生産した。
【００３７】
また、この１２０時間培養後の培養液から菌体を遠心除去し、さらにフィルターろ過して菌体を完全に除去した後、上清液を陰イオン交換樹脂(ダウエックス(ダウ・ケミカル社))を充填したカラムに通すことにより、レブリン酸イオンを吸着除去した。つぎに、この培養液を活性炭(粒状炭)のカラムを通過させることでトレハロースを吸着させた。そして、エタノール等の適当な溶媒でカラムからトレハロースを溶出させた後、溶出液を濃縮した。つぎに、液体クロマトグラフにて濃縮物の純度を確認した。濃縮物をトリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリーにて解析を行なったところ、トレハロース標品のトリメチルシリル化物の保持時間及びマススペクトルと完全に一致した。
【００３８】
他のバークホルデリア属(Burkholderia)の菌株について、レブリン酸を基質としたトレハロース生産能を確認するため、菌株保存機関(独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ＮＩＴＥ)から各種バークホルデリア属(Burkholderia)に属する基準株(type strain)を７種類(Burkholderia mimosarum NBRC106338、Burkholderia silvatlantica NBRC106337、Burkholderia terrae NBRC100964、Burkholderia caledonica NBRC102488、Burkholderia ferrariae NBRC106233、Burkholderia fungorum NBRC102489、およびBurkholderia ginsengisol NBRC100965)購入した。
【００３９】
ＹＰＤ培地が５ｍＬ入った７本の試験管にこれら７基準株をそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振とう培養した。そして、こうして得られた各培養液０.５ｍＬを、４w/v％のレブリン酸培地Ｂが３０ｍＬ入った７本のフラスコにそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで９６時間振とう培養し、レブリン酸濃度およびトレハロース濃度を確認した。その結果、いずれの基準株も生育が見られず、レブリン酸濃度の減少も確認されなかった。以上から、バークホルデリア属(Burkholderia) に属する菌株であっても、トレハロース生産能を有しているとは限らず、バークホルデリア スタビリス(Burkholderia stabilis)に属する菌株がトレハロース生産能を有していると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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