(57)【要約】【課題】  歯科臨床の現場において簡便かつ安価に齲蝕等の原因細菌を検出する方法及びツールを提供すること。【解決手段】  口腔細菌の検出方法であって、１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列を導入するための第１のプライマーと、標識物質結合物質を導入するための第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、検体中の核酸を増幅する工程、２）増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を含む展開液を用いて、前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体上に展開する工程、及び、３）前記固相担体上に生成した、増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程、を含む方法、並びに前記検出方法のためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔細菌の検出方法であって、
１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列を導入するための第１のプライマーと、標識物質結合物質を導入するための第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、検体中の核酸を増幅する工程、
２）増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を含む展開液を用いて、前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体上に展開する工程、及び
３）前記固相担体上に生成した、増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記第１のプライマーが、前記タグ配列と前記口腔細菌の第１の塩基配列に相補な第１の識別配列とを含み、前記タグ配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有し、前記第２のプライマーが前記口腔細菌の第２の塩基配列に相補な第２の識別配列とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連結部位は、リン酸ジエステル結合を介して前記プライマー中のヌクレオチドに隣接される、Ｃ２〜Ｃ４０のアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
口腔細菌が、Actinomyces oris、Mogibacterium timidum、Enterococcus faecalis、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Veillonella parvula、Olsenella profusa、Olsenella uli、Pseudoramibacter alactolyticus、Parvimonas micra、Treponema denticola、Eubacterium saphenum、Slackia exiguaから選ばれるいずれか２以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標識物質結合物質と標識物質が、ビオチンと標識アビジン、ジゴキシゲニンと標識抗ジゴキシゲニン抗体、又はＦＩＴＣと標識抗ＦＩＴＣ抗体とである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
口腔細菌の検出用キットであって、
１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列と前記口腔細菌の第１の塩基配列に相補な第１の識別配列とを含む第１のプライマーと、標識物質結合物質とを導入するための第２のプライマーからなるプライマー対、
２）前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体、及び
３）前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質又は前記標識物質を含む展開液、
を含むキット。
【請求項７】
前記口腔細菌が、Actinomyces oris、Mogibacterium timidum、Enterococcus faecalis、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Veillonella parvula、Olsenella profusa、Olsenella uli、Pseudoramibacter alactolyticus、Parvimonas micra、Treponema denticola、Eubacterium saphenum、Slackia exiguaから選ばれるいずれか２以上である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
標識物質結合物質と標識物質が、ビオチンと標識アビジン、ジゴキシゲニンと標識抗ジゴキシゲニン抗体、又はＦＩＴＣと標識抗ＦＩＴＣ抗体である、請求項６又は７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸クロマトグラフィー法を利用した口腔細菌の検査方法及び検査キットに関する。より詳細には、核酸クロマトグラフィー法を利用することで、複数細菌の半定量的解析を可能とする口腔細菌の検査方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯科医療の現場では、歯周疾患や齲蝕に関連する口腔細菌の同定が病因の解明と治療のために重要となる。従来、口腔細菌の同定には、検体内の病原菌をＰＣＲ法で増幅し、増幅産物をアガロースゲル上に電気泳動で展開し、判定する方法が採用されてきた（非特許文献１及び２等）。この方法では、ＰＣＲチューブ内の増幅産物をアガロースゲル電気泳動で展開する工程が不可欠であるため、時間と手間を要する。また、特異性や感度も十分ではないという問題がある。
【０００３】
ＤＮＡバイオセンサーを利用することで、より簡便に細菌を検出する方法も開発されている。この方法では、センサー表面に標的とする細菌に特異的なプローブを固定し、検体中の細菌ＤＮＡとの結合により生じる発光を検出することで細菌の検出を行う。例えば、着色ポリスチレンビーズを用いた、目視検出可能なディップスティックタイプのセンサーによる細菌の検出方法も報告されている（非特許文献３）が、これらの方法は１〜２細菌種を検出するものであり、対象も口腔細菌ではない。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲや、ＤＮＡマイクロアレイ、表面プラズモン共鳴を利用した定量的検出方法も開発されている。
【０００４】
一方、ＫａｗａｓｅらはＳＴＨ−ＰＡＳ（Single Tag Hybridization - Printed Array Strip）という簡易迅速なマルチ遺伝子検出方法を開発している（特許文献１）。この方法では、標的とする細菌核酸のＰＣＲプライマーに一本鎖ＤＮＡタグを結合させてＰＣＲ増幅し、その増幅産物を、タグと相補なオリゴＤＮＡをライン上にプリントしたメンブレンストリップ（ＰＡＳ）に展開し、一本鎖タグＤＮＡ同士のハイブリダイゼーション反応でＰＣＲ増幅産物をトラップ検出することで、複数の細菌を同時検出することができる。このＳＴＨ−ＰＡＳを口腔細菌の検出に適用できれば、齲蝕等の原因細菌を歯科医療現場において簡便かつ安価に検出することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０３９２２８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sato T. et al., Lett Appl Microbiol. 2003;37(1):66-69
【非特許文献２】Mayanagi G. et al., Oral Microbiol Immunol. 2004 Dec;19(6):379-385
【非特許文献３】D. P.Kalogianni, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2009; vol. 24, no. 6, pp. 1811-1815
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、歯科臨床の現場において簡便かつ安価に齲蝕等の原因細菌を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、マルチ遺伝子検出方法であるＳＴＨ−ＰＡＳを利用して、齲蝕に関連する５種の口腔細菌に対応したオリゴＤＮＡをプリントした口腔細菌検出用ＰＡＳ（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）を作製し、ＰＣＲチューブ内の増幅産物を直接このストリップに展開することで、検体内の前記口腔細菌の有無を半定量的に検出できることを確認した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］に関する。
［１］口腔細菌の検出方法であって、
１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列を導入するための第１のプライマーと、標識物質結合物質を導入するための第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、検体中の核酸を増幅する工程、
２）増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を含む展開液を用いて、前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体上に展開する工程、及び
３）前記固相担体上に生成した、増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程、を含む方法；
［２］前記第１のプライマーが、前記タグ配列と前記口腔細菌の第１の塩基配列に相補な第１の識別配列とを含み、前記タグ配列と前記第１の識別配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有し、前記第２のプライマーが前記口腔細菌の第２の塩基配列に相補な第２の識別配列とを含む、上記［１］に記載の方法；
［３］前記連結部位は、リン酸ジエステル結合を介して前記プライマー中のヌクレオチドに隣接される、Ｃ２〜Ｃ４０のアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含む、上記［１］又は［２］に記載の方法；
［４］口腔細菌が、Actinomyces oris、Mogibacterium timidum、Enterococcus faecalis、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Veillonella parvula、Olsenella profusa、Olsenella uli、Pseudoramibacter alactolyticus、Parvimonas micra、Treponema denticola、Eubacterium saphenum、Slackia exiguaから選ばれるいずれか２以上である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法；
［５］標識物質結合物質と標識物質が、ビオチンと標識アビジン（標識化されたアビジン）、ジゴキシゲニンと標識抗ジゴキシゲニン抗体（標識化された抗ジゴキシゲニン抗体）、又はＦＩＴＣと標識抗ＦＩＴＣ抗体（標識化された抗ＦＩＴＣ抗体）である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［６］口腔細菌の検出用キットであって、
１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列と前記口腔細菌の第１の塩基配列に相補な第１の識別配列とを含む第１のプライマーと、標識物質結合物質とを導入するための第２のプライマーからなるプライマー対、
２）前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体、及び
３）前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質又は前記標識物質を含む展開液、
を含むキット；
［７］前記口腔細菌が、Actinomyces oris、Mogibacterium timidum、Enterococcus faecalis、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Veillonella parvula、Olsenella profusa、Olsenella uli、Pseudoramibacter alactolyticus、Parvimonas micra、Treponema denticola、Eubacterium saphenum、Slackia exiguaから選ばれるいずれか２以上である、上記［６］に記載のキット；
［８］標識物質結合物質と標識物質が、ビオチンと標識アビジン（標識化されたアビジン）、ジゴキシゲニンと標識抗ジゴキシゲニン抗体（標識化された抗ジゴキシゲニン抗体）、又はＦＩＴＣと標識抗ＦＩＴＣ抗体（標識化された抗ＦＩＴＣ抗体）である、上記［６］又は［７］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アガロースゲル電気泳動等の煩雑な手順を必要とすることなく、複数の口腔細菌の存在を目視検出することができる。本発明の方法は、簡易卓上サーマルサイクラー以外の特別な機器や技術を必要とせず、歯科医療現場で、歯周病や齲蝕等の原因細菌を簡易迅速に検出することができる。また、本発明の方法は、従来のアガロースゲル電気泳動を用いた方法と異なり、病原菌だけでなく非病原菌を含めた複数細菌を半定量的に同時検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の方法で使用するストリップを示す概略図である。Ｔａｇは標的とする細菌ＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチド鎖、ｃＴａｇはその相補鎖を表す。
【図２】図２は、検体由来の増幅産物をストリップ上に展開した結果を示す。１：ネガティブコントロール、２−６：順にStreptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Actinomyces oris、Veillonella parvula。
【図３】図３は、ＳＴＨ−ＰＡＳによる検出限界を検証した結果である。１−５：順に、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ。
【図４】図４は、ＳＴＨ−ＰＡＳによる検出の特異性を検証した結果である。１：５’末端を一本鎖ＤＮＡタグで標識し、３’末端をビオチンで標識した増幅産物、２：５’末端を一本鎖ＤＮＡタグで標識した増幅産物、３：３’末端をビオチンで標識した標的増幅産物、４：標識なしの増幅産物。
【図５】図５は、ＳＴＨ−ＰＡＳによる半定量的解析結果である。１−５：順に、希釈なし、１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．口腔細菌の検出方法
本発明は、２以上の口腔細菌を半定量的に同時検出可能な方法に関する。本発明の口腔細菌の検出方法は、
１）２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列を導入するための第１のプライマーと、標識物質結合物質を導入するための第２のプライマーからなるプライマー対を用いて、検体中の核酸を増幅する工程、
２）増幅産物を、前記標識物質結合物質と反応して検出を可能にする標識物質を含む展開液を用いて、前記タグ配列に相補な配列を含む２種以上のプローブを含む固相担体上に展開する工程、及び
３）前記固相担体上に生成した、増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物を検出する工程、を含む。
【００１３】
１．１  増幅工程
本発明では、まず標的とする口腔細菌の核酸を、前記核酸に特異的なプライマー対を用いて増幅する。この増幅工程では、標的とする口腔細菌の核酸に第１のプライマーによって各口腔細菌に関連付けられたタグ配列を導入し、第２のプライマーにより、後述する標識物質と反応（結合）して検出を可能にする標識物質結合物質を導入する。
【００１４】
（１）口腔細菌
本発明の検出対象である「口腔細菌」は、口腔内、特にヒトの口腔内に存在し、歯周病や齲蝕の原因となる病原菌及び非病原菌を言う。具体的には、例えば、Actinomyces oris、Mogibacterium timidum、Enterococcus faecalis、Porphyromonas endodontalis、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum（以上、病原菌）およびStreptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Scardovia wiggsiae、Veillonella parvula、Olsenella profusa、Olsenella uli、Pseudoramibacter alactolyticus、Parvimonas micra、Treponema denticola、Eubacterium saphenum、Slackia exigua（以上、非病原菌）等を挙げることができる。本発明では、こうした口腔細菌のうち２種類以上を対象としてその同時検出ができる。
【００１５】
（２）検体
本発明で使用される検体は、上記口腔細菌の核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を含む試料であって、例えば口腔内のプラーク（歯垢）、バイオフィルム、歯肉溝滲出液、舌苔、唾液、感染象牙質等を採取し、常法にしたがい、核酸を抽出したものを検体として使用することができる。
【００１６】
（３）プライマー
本発明で使用されるプライマー対は、２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプライマー対であって、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列を導入するための「第１のプライマー」と、標識物質結合物質を導入するための「第２のプライマー」からなるプライマー対からなる。
【００１７】
「タグ配列」は、標的とする口腔細菌核酸の配列とは無関係に、タグ間のクロスリアクションを排除した設計がなされた配列であり、好ましくは、１５塩基以上５０塩基以下、より好ましくは、１５塩基以上２５塩基以下である。オリゴヌクレオチドプローブは、このタグ配列と相補的な配列を含むように設計される。
【００１８】
第１プライマーと第２プライマーは、口腔細菌の核酸にハイブリダイズできるように、各々口腔細菌核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列に相補的な「第１の識別配列」と「第２の識別配列」を有する。前記第１の塩基配列と第２の塩基配列は、前記口腔細菌の核酸に特異的にハイブリダイズし、増幅可能なように適宜選択される。本発明で使用される口腔細菌のＤＮＡ配列はすでに公知であり、前記第１の塩基配列と第２の塩基配列は、当該配列に基づき常法にしたがって、設定される。
【００１９】
なお本発明において用いられる「同一」、あるいは「相補（的）」という用語は、いずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを意味しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してアニールすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でアニールすることができる配列を意味する。
【００２０】
「第１プライマー」において、タグ配列と第１の識別配列とは直接連結されず、その間にＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有することが好ましい。この連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まず、例えば、人工オリゴヌクレオチドから構成され、それゆえＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止させる。これにより、一本鎖領域を有する核酸が増幅され、熱変性なしにプローブとのハイブリダイゼーションが可能となる。なお、タグ配列及び連結部位の導入の詳細については、ＷＯ２０１３／０３９２２８号を参照されたい。
【００２１】
前記連結部位としては、例えば、リン酸ジエステル結合を介して前記プライマー中のヌクレオチドに隣接される、Ｃ２〜Ｃ４０のアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を挙げることができる。
【００２２】
より具体的には、前記連結部位としては、以下のいずれかの式で表されるものを挙げることができる。
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’                    式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）、
又は、
５’−（ＯＣnＨ2n）l−Ｏ−３’                 式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
【００２３】
「第２プライマー」は、第２の識別配列に加えて、増幅された口腔細菌核酸がプローブとハイブリダイズしたときに標識物質と反応して目視確認を可能にする標識物質結合物質を含む。
【００２４】
（４）核酸増幅
核酸の増幅方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法等のいずれの方法を使用してもよいが、典型的にはＰＣＲ法を用いて行う。前述したプライマー対を用いて増幅を行うことで、増幅産物である二本鎖核酸の一方の末端にはタグ配列が導入され、他方の末端には標識物質結合物質が導入される。
【００２５】
１．２  展開・ハイブリダイゼーション工程
次いで、増幅産物を、２以上の口腔細菌に対応した２種以上のプローブを固定化した固相担体上に展開する。増幅産物を含む検体は、固相担体を構成する多孔質材料内にキャピラリー現象によって容易に展開される。
【００２６】
（１）展開液
増幅産物を含む増幅反応液には、固相担体中での核酸増幅物の展開を容易にするように、「展開液」を加える。展開媒体は、特に限定されないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。展開媒体は、好ましくは水を主体とする。
【００２７】
展開媒体は、ｐＨを調整するための緩衝成分を含むことができる。緩衝成分は、意図するｐＨにもよるが、通常は６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは、７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）等である。さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。なお、展開媒体として、増幅反応液をそのまま採用してもよい。また、増幅反応液に対して、界面活性剤や適当な塩等の追加の成分や溶媒を加えたりすることで、組成や濃度の調整をして展開媒体として使用してもよい。展開時間は特に限定されず、固相担体の形態や形状、展開媒体の性質に応じて適宜設定される。
【００２８】
展開液には標識物質を添加しておく。こうすることにより、標識物質が増幅産物である二本鎖核酸に導入された標識物質結合物質に結合した複合産物としての標識物質を有する二本鎖核酸が得られる。
【００２９】
上記のような方法のほか、予め増幅工程において標識物質を加えておいて増幅反応を実施することで、増幅工程後において、標識物質が標識物質結合物質に結合した複合産物としての標識物質を有する二本鎖核酸を得てもよい。また、反応終了後の増幅反応液中の二本鎖核酸に標識物質を添加して、同様に複合産物を得てもよい。そのような変形例もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
（２）固相担体
本発明のデバイスを構成する「固相担体」は、検出対象である口腔細菌に関連付けられたプローブとハイブリダイズしうるプローブを保持する多孔質材料を有する。前記固相担体は、多孔質材料から構成されてもよいし、多孔質材料（多孔質シート）とこれを支持するバッキング部材から構成されてもよい。固相担体を構成する多孔質材料は当該分野で周知であり、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。また、バッキング部材は、水を通さない（蒸発させない）性質を有するものであれば特に限定されず、当該分野で周知の素材を使用することができる。
【００３１】
固相担体の形状は、本発明の目的に適するようにデバイスに応じて適宜設計される。例えば、デバイスが透明フィルムで被覆された固相担体から構成され、容量１．５μl程度のマイクロチューブ内で検出を実施する場合には、当該チューブ内の試験溶液に固相担体の末端が浸漬されるサイズ及び形状に設計される。また、サンプルポート等を介して試験溶液を固相担体にアプライする場合には、試験溶液の展開後、各口腔細菌核酸が識別可能なサイズ及び形状に設計される。限定するものではないが、固相担体のサイズは、典型的には、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下で、厚みは０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下とすることができる。
【００３２】
試験溶液（展開液）は、固相担体の末端にアプライされ、プローブはこの末端部から一定程度離れた位置に、対応する口腔細菌ごとにライン状に平行に固定される。
【００３３】
固相担体上には、複数の口腔細菌を同時に検出する場合においても、各口腔細菌（に関連付けられたタグ配列）に対応するプローブ領域を容易に特定できるように、位置マーカーを配置してもよい。位置マーカーの存在により、目視検出の場合であっても、簡便に標的とする口腔細菌の存在不存在を検出することができる。
【００３４】
（３）プローブ
「プローブ」は、タグ配列と相補な配列を有するように設計される。プローブの長さは、特に限定されないが、各タグ配列に対する特異性とハイブリダイゼーション効率を確保するため、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。より好ましくは、１５塩基以上２５塩基以下である。
【００３５】
プローブの固定化方法は特に限定されず、その３’末端で固相担体に結合されていてもよいし、５’末端で結合されていてもよい。例えば、ニトロセルロース等を固相担体に使用する場合、プローブを固相担体にインクジェット方式でプリントした後、ＵＶ照射などにより固着性を高める。この方法の場合、プローブはＵＶの届く固相担体表面のみに固定化される。
【００３６】
「プローブ」は、各口腔細菌に関連づけられたタグ配列と相補な配列を含むため、検体に標的口腔細菌の核酸が含まれていれば、その増幅産物は対応するプローブとハイブリダイズしてその位置に捕獲される。
【００３７】
（４）標識物質
「標識物質」は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。このような標識物質としては、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００３８】
標識物質は、その一部にラテックス粒子等の粒子を有していてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、２０ｎｍ以上２０μｍ以下、典型的には、４０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下、特に好ましくは０．１μｍ以上５μｍ以下、さらに好ましくは０．１５μｍ以上２μｍ以下である。また、固相担体の孔径によって適宜調整される。
【００３９】
好ましくは、粒子は水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００４０】
標識物質結合物質としては、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。検出に用いられる標識物質は、上記標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）に結合されており、プローブとのハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物の標識物質結合物質と、標識物質結合物質と結合する部位を備える標識物質と結合して、増幅産物の検出を可能にする。
【００４１】
１．３  ハイブリダイゼーション・検出
口腔細菌由来の増幅産物は固相担体中に展開される途中で、各口腔細菌に関連付けられたタグ配列に相補的な配列を有するプローブに捕捉され、標識物質による発光又は発色を生じる。かくして、各口腔細菌核酸に結合したタグに対応するプローブを固定化したラインの発光又は発色により、複数の核酸を一度に目視検出することができる。
【００４２】
標識物質からの発光又は発色は、口腔細菌由来の核酸の量に依存するため、発光又は発色の量（強度）により、口腔細菌を半定量的に検出することができる。
【００４３】
ハイブリダイゼーション後には、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション工程に供される増幅された核酸が標識物質を有しているときには、特別なラベリング工程は不要である。増幅された核酸が標識物質と結合するときはハイブリダイゼーション後にさらに、あるいは先立ち、標識物質と反応させる工程が必要となる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
１．材料及び方法
（１）細菌株
５つの細菌株、Streptococcus mutans NCTC10449、Streptococcus sobrinus 6715、Scardovia wiggsiae F0424、Actinomyces oris WVU627及びVeillonella parvula ATCC10790を、CDC嫌気性5％ヒツジ血液寒天（BD、Flanklin Lakes、NJ）平板で培養し、嫌気性グローブボックス（モデルAZ-Hard、Hirasawa、Tokyo、Japan）中で、80％Ｎ2、10％Ｈ2及び10％ＣＯ2気相下において、37℃で3日間培養した。
【００４６】
（２）対象及びサンプルの採取
１６人の健康な対象者（平均年齢、３１．８±８．９歳；範囲、２３−５４歳）から、インフォームド・コンセントを得て、齲蝕のないエナメル質表面より歯肉縁上のプラーク（1.5mg）をサンプリングした。齲蝕状態を、DMFT指数（未処置齲蝕歯、喪失歯及び齲蝕が原因で処置された歯）を使用して記録した。第３大臼歯は除外した。対象者は、サンプリング前の３か月間は抗生物質を服用していない。プラークサンプルを、滅菌した爪楊枝を使用して採取し、分析まで1.5mLのサンプリングチューブ中に−20℃で保存した。
【００４７】
（３）DNA抽出
歯垢又は３日間の細菌培養物から、InstaGene Matrixキット（Bio-Rad Laboratories、Richmond、CA）を用いて、製品説明書に従いゲノムDNAを抽出した。
【００４８】
（４）PCR増幅
ダイレクトPCRを、表１に列記された、タグ付き種特異的プライマーを使用して行った。各PCR混合物は、21μLのプラークサンプルDNA又は細菌ゲノムDNA、25μLのTaq DNAポリメラーゼ（HotStar Taq PLUS Master Mix;Qiagen GmbH、Hilden、Germany）及び4μLのプライマー混合物を含む。PCR増幅を、95℃、5分間の最初の加熱活性化、95℃、1分の変性、適切なアニーリング温度（表１参照）で、1分のアニーリング及び72℃、1.5分の伸長を30サイクル行い、続けて、72℃、10分の伸長に設定し、PCR Thermal Cycler MP（TaKaRa Biomedicals、Ohtsu、Shiga、Japan）又はiCycler（Bio-Rad Laboratories）を用いて実施した。
【表１】
2016214101.tif 000002
Actinomyces種はA.oris, A.naeslundii, 及びA.odontolyticusを含む。
"X"はスペーサーC3 を示す。
各プライマーの配列は上から順に配列表の配列番号１〜１０に示す。
【００４９】
（５）ディップスティックDNAクロマトグラフィー
ディップスティックDNAストリップ及び試薬は市販のものを使用した（TBA Co．，Sendai、Japan）。表１に示すように、プライマーの各ペアについて、（フォワードプライマーの）5’末端を、５種類のオリゴヌクレオチドでタグ付けし、（リバースプライマーの）5’末端をビオチン化した。各タグとフォワードプライマーとの間にはスペーサーC3を挿入し、DNA合成がこの挿入部位で終了するようにした。なお、スペーサＣ３は、３つの炭素からなるスペーサ、（ＣＨ2）3［ホスホラミドC3スペーサ（Glen Research、Sterling、VA）］を使用した（図１（ｂ）及び表１中「X」で表す）。
【００５０】
ストレプトアビジンでコートした青色ラテックス粒子を、ビオチン化末端を有する増幅物に、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用で結合させた。5’末端タグとのハイブリダイゼーションにより、PCR増幅物を特異的に捕捉するために、ディップスティック・ストリップ（2.5mm×45mm）に5つのタグ相補オリゴヌクレオチドを固定した。ストリップ
上の合計12本の使用可能な試験ラインのうち、最初の５本を、本研究用に選択した。ビオチン固定フローコントロールラインを、ストリップの端部に設定した（図１）。１つのPCR増幅産物を、総量30μLに希釈し、10μLの（界面活性剤、ブロッキング剤、PBS及び塩溶液を含む）希釈液及び2μLのストレプトアビジンコートした青色ラテックス懸濁液（それらは両方とも、TBA Co.より供給された。）と混合した。ついで、DNAストリップを、その混合物内に挿入した。これにより、タグ相補オリゴヌクレオチドに標的DNAが捕捉されると、青色試験ライン（幅0.5mm；互いに1.2mm間隔）により、標的DNA配列の存在が目視で確認できる。
【００５１】
（６）ディップスティックDNAクロマトグラフィーの感度
ディップスティックDNAクロマトグラフィーの感度を確認するために、5つの細菌株からのPCRにより増幅した10ng、1ng、100pg、10pg又は1pgのDNAを含むアリコート（一定分量）を調製し、同時に分析した。各細菌株についてディップスティックDNAクロマトグラフィーの検出限界を、目視検査により決定した。
【００５２】
（７）PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーの特異性及び感度
PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーの特異性を、下記条件：(i)オリゴヌクレオチドを含まないプライマー；(ii)ビオチンを含まないプライマー；及び(iii)ターゲットDNAテンプレートなし、において確認した。
【００５３】
プライマーと他の細菌との交叉反応を、典型的な口腔細菌を使用するin vitro実験により予め試験した。さらに、in silicoにおいて、プライマーの特異性を確認するために、BLASTサーチを行った。S. sobrinusのプライマーはStreptococcus downeiと交叉反応し、Actinomyces種（Actinomyces oris、Actinomyces naeslundii及びActinomyces odontolyticus）はMicromonospora peucetiaと交叉反応することが見いだされたが、S. downei及びM. peucetiaがヒト口腔から分離されたという報告はない。
【００５４】
アッセイの感度を評価するために、各細菌株から精製したDNAの連続10倍希釈液（範囲：10ngから1fg）から、PCR増幅し、2つ（等量）に分割した。一方を、ディップスティックDNAクロマトグラフィーに使用し、検出限界を決定した。他方を、1％アガロースゲル電気泳動（高強度分析グレードのアガロース、Bio-Rad Laboratories）により、つぎのように分析した。PCR産物（各10μL）を、Tris-ホウ酸塩EDTAバッファー（100mM Tris、90mMホウ酸塩、1mM EDTA、pH8.4）において、１％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、UV下において撮影した。100bpのDNAラダー（Invitrogen Corp．，Carlsbad、CA）を、分子サイズマーカーとして使用した。
【００５５】
（８）プラークサンプルについての半定量アッセイ法
臨床サンプルの半定量分析は、正確な最適化及び標準化を必要とする。DNAを、歯垢サンプルから抽出し、各菌種についてPCRにより増幅した（表２）。PCR増幅物を、元の濃度から104倍に10倍希釈した。各菌種について同じ希釈係数での1μLアリコートを混合し、ディップスティックDNAクロマトグラフィーにより検出した。歯垢中の各細菌種の検出限界を、連続的なクロマトグラムから取得し、各細菌種の相対濃度を、上記されたように、PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーの相対感度を用いた補正により、検出限界を希釈倍数に基づいて推定した。
【００５６】
【表２】
2016214101.tif 000003
【００５７】
２．結果及び考察
（１）ディップスティックDNAクロマトグラフィーの原理の検証
反応混合物において、ビオチン標識PCR増幅物は、強力なビオチン−ストレプトアビジンの親和性により、ストレプトアビジンコートした青色ラテックス粒子に直ちに結合して、ハイブリッドを形成した。ディップスティック・ストリップの先端を、混合物に挿入した時点で、PCR増幅物−青色ラテックスハイブリッドは、毛細管作用によりストリップを通って上に移動し、ストリップ上の試験ラインとして固定されたタグ付き相補オリゴヌクレオチドにより捕捉され、青色ラテックスマイクロスフェアを蓄積させ、可視的な青色の試験ラインをもたらした。ストリップの他の先端におけるフローコントロールラインにより、アッセイが適切に機能し、ラテックス粒子の総量が全DNA増幅物を捕捉可能であるとともに、過剰のラテックス粒子をも捕捉するように設定した。種々のDNA増幅物を、単独で5分以内、又は、交叉反応なしに同時に１つのアッセイで5−10分後に検出できた（図２）。以上より、本発明の方法が、複数細菌の同時分析に適切であることが確認された。
【００５８】
ディップスティック・バイオセンサの開発は、複数の対象を同時解析する段階に入っている。２以上の試験ラインを有するバイオセンサにより、複数の対立遺伝子を同時に検出する方法も提案されている。これらのバイオセンサは、アッセイにおいて通常更なる工程、すなわちプライマー伸長（PEXT）又はオリゴヌクレオチドライゲーション反応（OLR）を必要とする。dsDNA（二本鎖DNA）を検出する方法は、ディップスティックDNAバイオセンサの簡易性を維持する。このようなDNAバイオセンサは、レポータと捕捉機構としてのストレプトアビジン−ビオチン系、PCR増幅物と結合するオリゴヌクレオチドを利用するが、１つの標的dsDNA増幅物しか検出できない。これに対し、本発明の方法では、５種類のタグに相補なオリゴヌクレオチドを、１つのストリップに固定することで、１つのアッセイで複数のdsDNA配列が同時検出できる。
【００５９】
（２）ディップスティックDNAクロマトグラフィーの感度
ディップスティックDNAクロマトグラフィーの検出限界を、感度におけるPCR法の影響を除外するために、各細菌株から増幅した、精製DNAを使用して評価した（図３）。５つ全ての菌種について、PCR産物は、100pgのレベルで検出することができた。強度は、DNA濃度に比例して観察された。DNA産物の総量を、飽和濃度を下回る有用な分析範囲において試験した場合、強度は、ターゲットDNAの定量情報を提供した。このことから、本発明の方法により半定量分析が可能であることが確認された。
【００６０】
（３）PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーの特異性及び感度
この研究では、ターゲットDNAハイブリッドにより生じた5つの試験ラインが、予測された場所に現れた。5つのターゲットDNA増幅物を、１つのアッセイで検出した場合、不鮮明又は偽陽性のラインは、ストリップ上で観察されなかった。特異性評価の結果を、図４に示した。オリゴヌクレオチドを含まない又はビオチンを含まないプライマーにより、又は、ターゲットDNAテンプレートの不存在において行った分析は、陽性シグナルが得られなかった。これらの3つの条件下では、ストレプトアビジンコートした青色ラテックス粒子は、試験ゾーンにおける青色シグナルを生じさせるための、オリゴヌクレオチド検出器に結合することができず、最終的に、コントロールラインにおいて捕捉された。同じバイオセンサを使用するディップスティックDNAクロマトグラフィーの特異性も、176の細菌株を検出した別の実験系で確認されている。さらに、他の微生物による交叉反応は、（この研究における）in silico又はin vitroにおいて観察されなかったことから、本発明の方法の高い特異性が示された。
【００６１】
PCRディップスティックDNAクロマトグラフィー及びPCR−アガロースゲル電気泳動を使用して得られた検出感度の比較を、表３に示す。5つの細菌種において差異が存在したが、PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーは、アガロースゲル電気泳動より、少なくとも10倍高い感度を示した。
【００６２】
【表３】
2016214101.tif 000004
【００６３】
（４）歯垢サンプルの半定量
精製した細菌DNAを用いたPCRディップスティックDNAクロマトグラフィーから、この方法の感度は、細菌種間で異なるが（表３）、検出限界は５種すべてについて同じであった（図３）。したがって、検出感度の差異はPCR増幅の効率に由来すると考えられる。S．mutans、S．sobrinus、S．wiggsiae、A．oris及びV．parvulaの相対的なPCR増幅効率（Ｅr）は、表３から、それぞれ、１、10-4、10-3、10-3及び10-2であると推定された。このため、細菌の相対濃度（Ｃr）を、検出限界についての希釈倍率（Ｄ）を掛け、相対的なPCR増幅効率（Ｅr）で割り、下記等式を使用することにより算出した。
Ｃr＝Ｄ／Ｅr    （１）
Ｃrは、歯垢中の所定の細菌の相対濃度であり；Ｄは、検出限界の希釈倍率であり；Ｅrは、相対的なPCR増幅効率である。
【００６４】
PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーアッセイを、16個の歯肉縁上のプラークサンプルに適用した。クロマトグラムを、各サンプルについて取得した（図５）。Actinomyces種は、一致した高いDNA濃度で、16個全てのサンプルで検出された。S．mutans及びV．parvulaは、16個のサンプル中15個に存在した。高頻度に検出されたが、これら2つの種は、サンプル間での量は顕著に異なっていた。S．sobrinusは、最も低い検出頻度で、１つのサンプルのみで検出され、S．wiggsiaeは、16個のサンプル中4個のサンプルで検出された。試験した5菌種中少なくとも2つが、歯肉縁上のプラークサンプル中で検出された。
【００６５】
半定量分析を、上記算出に基づいて行った（表４）。各細菌種の相対濃度から、口腔微生物相の組成を、簡易かつ迅速に検出することができた。例としてサンプル１をとると（図５）、S．sobrinus及びS．wiggsiaeは存在しなかった。3つ陽性で検出された菌種の中でも、V．parvulaが、Actinomyces種及びS．mutansに対して優勢であった。S．mutans、Actinomyces種及びV．parvulaの相対濃度は、１：105：105と推定された。Actinomyces種及びV．parvulaは、試験した全てのサンプル中で、優勢な細菌と観察された。S．mutansは、高い検出頻度を示したが、以前の他の報告と比較した場合、プラーク細菌全体では低い割合であった。このことは、PCRディップスティックDNAクロマトグラフィーの低い検出限界及び（本研究とは）異なったプライマーの使用に起因すると思われる。低値、中等度及び高値のDMFT（表４）を有する対象中で、5つの細菌の検出頻度（及び量）における顕著な差異は存在しなかった。
【００６６】
【表４】
2016214101.tif 000005
【００６７】
以上より、本発明の方法により、複数の口腔内細菌を簡便かつ迅速に同時に半定量的に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、簡易卓上サーマルサイクラー以外の特別な機器や技術を必要とすることなく、口腔細菌を半定量的に検出することができる。したがって、歯科医療現場で、歯周病や齲蝕等の原因細菌を簡易迅速に検出可能な方法・ツールとして有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１：合成ＤＮＡ（Sm1プライマー）
配列番号２：合成ＤＮＡ（Sm2プライマー）
配列番号３：合成ＤＮＡ（SobFプライマー）
配列番号４：合成ＤＮＡ（SobRプライマー）
配列番号５：合成ＤＮＡ（Scar448Fプライマー）
配列番号６：合成ＤＮＡ（Scar619Rプライマー）
配列番号７：合成ＤＮＡ（AcoFプライマー）
配列番号８：合成ＤＮＡ（AcoRプライマー）
配列番号９：合成ＤＮＡ（VP2696Fプライマー）
配列番号１０：合成ＤＮＡ（VP3318Rプライマー）
【図１】
2016214101.tif 000006
【図２】
2016214101.tif 000007
【図３】
2016214101.tif 000008
【図４】
2016214101.tif 000009
【図５】
2016214101.tif 000010
【配列表】
2016214101000001.app