(57)【要約】【課題】誘導性型ディフェンシンの発現促進剤の提供。【解決手段】２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤を有効成分とする誘導性型ディフェンシン発現促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤を有効成分とする誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
【請求項２】
誘導性型ディフェンシンが、ｈＢＤ−２又はｈＢＤ−３である請求項１記載の誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
【請求項３】
皮膚における誘導性型ディフェンシンの発現を促進する請求項１又は２記載の誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導性型ディフェンシンの発現を促進する誘導性型ディフェンシン発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む全ての生物は、外的環境に接して生活しており、体内と外界を分離する組織・器官として皮膚や消化管等を発展させてきた。これらの上皮細胞（組織）器官は、物理的に生体異物の侵入を防御しているのみならず、抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）等による自然免疫機構（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を機能させることで、病原性微生物（細菌、真菌  等）が原因となる感染からの１次防御システムを構築している。加えて、皮膚や大腸等の上皮細胞器官は常在菌と共生器官を形成しており、この関係が間接的に健康的な上皮細胞バリアの構築に役立っている。最近の研究では、常在菌に由来する細胞壁成分がタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の発現に関与していることが報告された（非特許文献１）。共生関係においては、抗菌ペプチドが常在菌による悪影響（日和見感染）を防止する等、上皮細胞器官の共生関係の維持，正常化に重要な役割をしていると理解されている。
【０００３】
ディフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）は当該抗菌ペプチドの中の一分類であり、主に好中球等の貪食細胞に存在するα型と皮膚を含む上皮細胞を中心に存在するβ型が代表的なものである。ヒトにおいては、現在のところ６種のα−ディフェンシン（ｈｕｍａｎ  α−ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、すなわち４種のヒト好中球ペプチド［ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１〜４（ＨＮＰ−１〜ＨＮＰ−４）］と２種のヒトディフェンシン［ｈｕｍａｎ  ｄｅｆｅｓｉｎ−５，−６（ＨＤ−５，ＨＤ−６）］、及びβ−ディフェンシンとして主要な４種［ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１〜４（ｈＢＤ−１〜ｈＢＤ−４）］がよく知られている。健全な皮膚バリアの構築、維持の観点からは、皮膚は上皮細胞（組織）器官であるので、β−ディフェンシン類がより重要となる（以下、「ディフェンシン」と記述した場合は、ヒトβ−ディフェンシンのことを意味する）。
【０００４】
ｈＢＤ−１は定常状態において、十分な発現が認められる常時発現型抗菌ペプチドであるが、他のディフェンシンは生体防御機構が傷害（物理的な上皮細胞組織の破壊や炎症性サイトカインによる刺激  等）された際に発現が高まる誘導性型抗菌ペプチドである。誘導性型の内、ｈＢＤ−４の発現は、精巣や胃洞部等に限局されることから、皮膚を含む上皮細胞組織においてはｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３がより重要な誘導性型抗菌ペプチドであると考えられている。ｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３は、常時発現型のｈＢＤ−１に比較して、抗菌活性が強く、また、抗菌スペクトルも広いので、この点からもｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３の重要度は高い。特に、ｈＢＤ−３は、グラム陽性菌（例えば、黄色ブドウ球菌）、グラム陰性菌（例えば、緑濃菌）及び真菌（例えば、カンジダ菌）に対し強い抗菌活性を示し、汗等に由来する塩類によってその活性が影響されないという好まし性質も有している（非特許文献２、３）。さらに、近年、アトピー性皮膚炎において、ｈＢＤ−３の発現レベルが感染を抑制する上で十分、高まっていないことが報告され、アトピー性皮膚炎の発症あるいは重症度とｈＢＤ−３発現状態の関係が示唆されている（非特許文献４）。
従って、ｈＢＤ−３等、誘導性型ディフェンシンの発現・産生を促進・改善することができれば、自然免疫に基づく上皮細胞組織・器官の生体防御機構を一層強化できると共に、特に、皮膚においては、皮膚バリア機能を増進し、さらにはアトピー性皮膚炎等の皮膚傷害を予防又は改善できること等が期待される。
【０００５】
従来より、ｈＢＤ−３等、誘導性型ディフェンシンの発現を促進する方法として、１５ｄ−プロスタグランジンＪ２及びプロスタグランジンＤ２のプロスタグランジン類の作用が知られている（非特許文献５）。しかしながら、これらは炎症性メディエーターであり、ディフェンシンの発現を促進する手段として、容易かつ現実的に利用できるものではない。このような状況から、一般的な生活の場面においても（例えば、化粧料として）利用可能なｈＢＤ−３等、誘導性型ディフェンシンの発現、産生促進剤の開発が望まれていた。
【０００６】
ＡｈＲ（ａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、芳香族炭化水素受容体）は、ｂＨＬＨ／ＰＡＳ（ｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ／Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ）ファミリーに属する転写因子であり、ダイオキシンレセプターとしても知られている。ＡｈＲはリガンド活性型転写因子であり、リガンドと結合後、細胞核内に移行し、ＡＲＮＴ（ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、芳香族炭化水素受容体核内輸送体）とヘテロダイマーを形成することで、転写因子結合領域に作用する。ＡｈＲの活性化によって、発現が制御されている遺伝子として、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２等のモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）が良く知られており、ＡｈＲは生体異物の除去、解毒に関与している（非特許文献６）。また、近年の研究において、ＡｈＲの活性化がＴｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、制御性Ｔ細胞）への分化を促進することから、免疫寛容を誘導する手段としても大きな注目を集めている（非特許文献７）。
【０００７】
一方、最近になって、エメンタールチーズ由来のプロピオン酸菌の作用で、乳清から生成されるビタミンＫの前駆体で、プレバイティクスとしても知られているＤＨＮＡ（１、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）が、ＡｈＲを介してマウス小腸に抗菌タンパク質、Ｒｅｇ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩＩβ及びＲｅｇＩＩＩγを誘導することが報告された（非特許文献８）。この結果は、マウス小腸におけるＡｈＲの活性化が、自然免疫機構に関係していることを示唆している。
【０００８】
しかしながら、ある抗菌ペプチド又は抗菌タンパク質活性化剤が、他の抗菌ペプチドや抗菌タンパク質の発現を促進できるとは限らない。例えば、皮膚を含む上皮細胞組織における重要な抗菌ペプチドの１つであるＣＡＭＰ（ｈｕｍａｎ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）／ＬＬ−３７は、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）２／６のリガンド、Ｍａｌｐ−２によって誘導されないが、このリガンドはｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３の発現を有意に促進する。また、ＬＬ−３７の効果的な発現促進剤である活性型ビタミンＤ３は、ｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３の発現に対する効果がないことがわかっている（非特許文献５）。
【０００９】
斯様に、誘導性型ディフェンシンの発現にＡｈＲの活性化が関与することはこれまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kuo IH et al. (2013) J Invest Dermatol 133: 988-998
【非特許文献２】Harder J et al. (2001) J Biol Chem 276: 5707-5713
【非特許文献３】Niyonsaba F et al. (2005) J Dermatol Sci 40: 157-168
【非特許文献４】Nomura I et al. (2003) J Immunol 171:3262-3269
【非特許文献５】Bernard JJ et al. (2010) J Immunol 185: 6535-6544
【非特許文献６】Uno S et al. (2004) Mol Pharmacol 65: 1225-1237
【非特許文献７】Singh NP et al. (2011) PLoS ONE 6: e23522
【非特許文献８】Fukumoto S et al. (2014) Immunol Cell Biol 92: 460-465
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、誘導性型ディフェンシンの発現促進剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ディフェンシンの発現制御について鋭意検討した結果、ｈＢＤ−２やｈＢＤ−３のような誘導性型ディフェンシンの発現がＡｈＲの活性化を介して促進されることを発見し、特定のＡｈＲ活性化剤が誘導性型ディフェンシンの発現促進剤となり得ることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤を有効成分とする誘導性型ディフェンシン発現促進剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、皮膚、消化管、呼吸器系器官等，上皮細胞器官における自然免疫機能（主に抗菌作用）を高めることができ、その結果、特に、皮膚においては、そのバリア機能の強化、或いはアトピー性皮膚炎の予防又は改善を図ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「誘導性型ディフェンシン」とは、ヒトの場合、物理的な上皮細胞組織の破壊や炎症性サイトカインの刺激等により、皮膚等の上皮細胞（組織）器官等で発現が高まる抗菌ぺプチドのことであり、具体的にはｈＢＤ−２、ｈＢＤ−３及びｈＢＤ−４を意味する。
ここで、「ｈＢＤ−２」は、ヒトβ−ディフェンシン−２(ｈｕｍａｎ β‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ‐２［Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ＝ＤＥＦＢ４］)として特定されている４１アミノ酸残基からなるペプチドであり、「ｈＢＤ−３」は、ヒトβ−ディフェンシン−３(ｈｕｍａｎ β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３［Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ＝ＤＥＦＢ１０３］)として特定されている４５アミノ酸残基からなるペプチドであり、「ｈＢＤ−４」は、ヒトβ−ディフェンシン−４(ｈｕｍａｎ β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−４［Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ＝ＤＥＦＢ１０４］)として特定されている３７アミノ酸残基からなるペプチドである。
このうち、ｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３は上皮細胞組織を含む皮膚、消化管、気道、口腔等の上皮細胞（組織）器官等で発現している。一方、ｈＢＤ−４は精巣や胃洞部等に限局して発現している。本発明においては、ｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３が好ましく、ｈＢＤ−３がより好ましい。
【００１６】
本発明において、「誘導性型ディフェンシンの発現促進」とは、誘導性型ディフェンシンのｍＲＮＡ及び／又は誘導性型ディフェンシンタンパク質の発現促進を意味する。
尚、誘導性型ディフェンシン発現促進の評価は、例えば、正常ヒト表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）などの細胞系を用い、当該細胞からｍＲＮＡ又タンパク質を抽出し、誘導性型ディフェンシンをコードするｍＲＮＡ量又は誘導性型ディフェンシンタンパク質量を、リアルタイムＰＣＲやノーザンブロッティング、或いはＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティングをそれぞれ用いて、測定することにより行うことができる。
【００１７】
本発明において、ＡｈＲ（Ａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：芳香族炭化水素受容体）とは、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ（Ｂａｓｉｃ  Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ−Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ）ファミリーに属する転写因子を意味し、ＡｈＲ活性化剤は、ＡｈＲに結合して当該受容体を活性化するＡｈＲリガンドを意味する。ここで、「活性化」とは、細胞核内において標的遺伝子の転写誘導を促進することを意味する。
【００１８】
本発明のＡｈＲ活性化剤は、２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル（２−（１’Ｈ−ｉｎｄｏｌｅ−３’−ｃａｂｏｎｙｌ）−ｔｈｉａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ；「ＩＴＥ」）、３，３’−ジインドリルメタン（３，３’−ｄｉｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈａｎｅ；「ＤＩＭ」）、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ；「ＤＨＮＡ」）、及びクルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）から選択される１種又は２種以上である。斯かる化合物は、何れもＡｈＲリガンドとして知られている（Nguyen LP et al. (2008) Chem Res Toxicol 21: 102-116）。
これらの化合物は、公知の化学合成法や植物から及び微生物による発酵産物からの分画・精製により取得することができる。また、市販品も存在し、それらを利用することもできる。
【００１９】
上記ＩＴＥ、ＤＩＭ、ＤＨＮＡ又はクルクミンを正常ヒト表皮角化細胞に添加すると、ｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３のｍＲＮＡの発現量が有意に増加する（表１及び表３）。そして、当該作用はＡｈＲのアンタゴニストの存在により抑制される（表２及び表４）。このことは、当該化合物によるｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３の発現促進には、ＡｈＲの活性化が関与していることを意味している。
【００２０】
本発明の化合物群を始めとする、ＡｈＲの活性化を介した誘導性型ディフェンシン発現促進剤は、１）被験物質と、誘導性型ディフェンシン及びＡｈＲを発現する細胞とを接触させる、２）誘導性型ディフェンシンの発現レベルを増加させる被験物質を選択する、３）ＡｈＲの選択的アンタゴニストにより前記効果が抑制される被験物質を選択する、ことによりスクリーニングできる。
上記１）において、被験物質と接触させる細胞は、誘導性型ディフェンシン及びＡｈＲを発現可能なものである限り、通常の細胞又はそれらを発現するように遺伝子導入された組換え細胞の何れでもよい。好適には正常ヒト表皮角化細胞等のヒト培養細胞が挙げられる。
上記２）において、誘導性型ディフェンシンの発現レベルの測定は、例えば、総ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いて誘導性型ディフェンシンをコードするｍＲＮＡの発現量を測定すること、又は、総タンパク質を抽出し，ウェスタンブロットにより誘導性型ディフェンシンのタンパク質レベルでの発現量を測定すること等が挙げられる。
上記３）において、ＡｈＲの選択的アンタゴニストとしては、例えばＣＨ２２３１９１（１−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［２−ｍｅｔｈｙｌ−４−［２−（２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ］ｐｈｅｎ  ｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−５−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）が挙げられ、当該化合物の存在下、上記の誘導性型ディフェンシンの発現レベルが抑制されるか否かを検討することが挙げられる（Zhao B et al. (2010) Toxicol Sci 117: 393-403）。
【００２１】
斯くして、本発明のＡｈＲ活性剤は、ｈＢＤ−２及びｈＢＤ−３の発現を促進することから、誘導性型ディフェンシン発現促進剤となり得、また、誘導性型ディフェンシン発現促進剤を製造するために使用することができる。すなわち、本発明のＡｈＲ活性化剤は、誘導性型ディフェンシン発現促進のために使用することができる。ここで、ヒトに対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
当該誘導性型ディフェンシン発現促進剤は、それ自体、誘導性型ディフェンシン発現促進のための、化粧品、医薬品部外品、医薬品であってもよく、又は当該化粧品、医薬部外品、医薬品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００２２】
本発明のＡｈＲ活性化剤を含有する化粧品、医薬部外品又は医薬品は、好適には皮膚外用剤の形態で、具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール等の種々の形態で用いることができる。
斯かる製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの化粧品、医薬部外品又は医薬品等には、それぞれの製剤に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００２３】
当該化粧品、医薬部外品又は医薬品中の本発明のＡｈＲ活性化剤の含有量は、一般的に０．００００１質量％、好ましくは０．００１質量％以上であり、そして１０質量％以下、好ましくは１質量％以下である。また、０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．００１〜１質量％とするのがより好ましい。
【００２４】
上記化粧品、医薬部外品又は医薬品の投与量は、効果が得られる量であれば特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の各ＡｈＲ活性化剤として、例えば、好ましくは０．５ｍｇ以上であり、そして１０００ｍｇ以下、好ましくは５００ｍｇ以下である。また、０．５〜１０００ｍｇとするのが好ましく、更に０．５〜５００ｍｇとするのが好ましい。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。このうち、１日３回に分け、６週間以上継続して投与することがより好ましい。
また、上記化粧品、医薬部外品又は医薬品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、皮膚バリアを始めとする上皮細胞器官における自然免疫機能の強化を所望するヒト、アトピー性皮膚炎の予防又は改善を所望するヒトが挙げられる。
【００２５】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤を有効成分とする誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
＜２＞誘導性型ディフェンシンが、ｈＢＤ−２又はｈＢＤ−３である＜１＞の誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
＜３＞皮膚における誘導性型ディフェンシンの発現を促進する、＜１＞又は＜２＞の誘導性型ディフェンシン発現促進剤。
【００２６】
＜４＞誘導性型ディフェンシン発現促進剤を製造するための、２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤の使用。
＜５＞誘導性型ディフェンシンの発現を促進するための、２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤の使用。
＜６＞２−（１’Ｈ−インドール−３’−カルボニル）−チアゾール−４−カルボン酸メチル、３，３’−ジインドリルメタン、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸及びクルクミンから選ばれるＡｈＲ活性化剤を投与又は摂取する、誘導性型ディフェンシン発現促進方法。
＜７＞＜４＞〜＜６＞において、誘導性型ディフェンシンは、ｈＢＤ−２又はｈＢＤ−３である。
＜８＞＜５＞において、使用は非治療的使用である。
＜９＞＜６＞において、方法は非治療的方法である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１  ｈＢＤ−３発現に対する効果（１）
１）細胞培養は、正常ヒト表皮角化細胞を購入し（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ増殖添加剤セット（クラボウ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地（  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、３７℃で行った。実験には、継代数３及び４の細胞を使用した。細胞は、１×１０５個／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌ培養プレートに播種し，ｓｕｂｕｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（約８０％）の状態まで培養した。Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した状態で、細胞培養培地をＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ増殖添加剤（５種類）からヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＧＦ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の添加剤セットを加えたＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地に交換し、２４ｈ培養した。
【００２８】
２）ＡｈＲリガンドとして知られているＩＴＥ（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ）をＤＭＳＯに溶解し、０，０．５，１，１０μＭ濃度となるようにヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＧＦ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の増殖添加剤セットを加えたＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地に添加し、７２ｈ細胞を刺激した（ｎ＝３）。また、ヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＧＦ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の増殖添加剤セットを加えたＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地中のＤＭＳＯ濃度（ｆｉｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は１％（ｖ／ｖ）に調整した。
【００２９】
３）培養細胞からＲＮＡ抽出キット［ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（キアゲン）及びＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）］を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応は、２０００ｎｇスケールで、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬（Ａｐｐｌｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、７５００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。
ｈＢＤ−３遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＰ０（ＲＰＬＰ０）で標準化を行い、対照に対する相対変化量として算出した。
【００３０】
４）結果
ＩＴＥ濃度、１，１０μＭにおいて、ｈＢＤ−３の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表１）。
【００３１】
実施例２  ｈＢＤ−３発現に対する効果（２）
１）ＡｈＲリガンドとして、クルクミン（和光純薬工業）を用い（クルクミンの濃度；０，１０，２０，３０μＭ）、実施例１と同様にして細胞を刺激し、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００３２】
２）結果
クルクミン濃度、３０μＭにおいて、ｈＢＤ−３の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表１）。
【００３３】
実施例３  ｈＢＤ−３発現に対する効果（３）
１）ＡｈＲリガンドとして、ＤＩＭ（東京化成工業）を用い（ＤＩＭ濃度；０，１，５，１０μＭ）、実施例１と同様にして細胞を刺激し、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００３４】
２）結果
ＤＩＭ濃度、１０μＭにおいて、ｈＢＤ−３の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表１）。
【００３５】
実施例４  ｈＢＤ−３発現に対する効果（４）
１）ＡｈＲリガンドとして、ＤＨＮＡ（東京化成工業）を用い（ＤＨＮＡ濃度；０，１，１０μＭ）、実施例１と同様にして細胞を刺激し、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００３６】
２）結果
ＤＩＭ濃度、１０μＭにおいて、ｈＢＤ−３の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表１）。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
実施例５  ＡｈＲアンタゴニスト存在下のＩＴＥのｈＢＤ−３発現に対する効果
１）ＡｈＲの特異的アンタゴニストとして知られている（Zhao B et al. CH223191 is a ligand-selective antagonist of the Ah (Dioxin) receptor. Toxicol Sci 117, 393-401 (2010)）ＣＨ２２３１９１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０μＭ）と、ＩＴＥ（１０μＭ）を用い、実施例１と同様にして細胞を刺激し、ｈＢＤ−３のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００３９】
２）ＣＨ２２３１９１は、有意に（ｐ＜０．０１）ＩＴＥのｈＢＤ−３  ｍＲＮＡ発現促進効果を抑制した（表２）。従って，ＩＴＥのｈＢＤ−３  ｍＲＮＡ発現促進効果はＡｈＲを活性化することで起こっており，ＡｈＲの活性化がｈＢＤ−３  ｍＲＮＡの発現を促進できることを示している。
【００４０】
【表２】
2016150930.tif 000003
【００４１】
実施例６  ｈＢＤ−２発現に対する効果（１）
１）ＡｈＲリガンドとして、ＩＴＥを用い（ＩＴＥの濃度；０，０．５，１，１０μＭ）、実施例１に準じて細胞を刺激し、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００４２】
２）結果
ＩＴＥ濃度、１０μＭにおいて、ｈＢＤ−２の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表３）。
【００４３】
実施例７  ｈＢＤ−２発現に対する効果（２）
１）ＡｈＲリガンドとして、クルクミンを用い（クルクミンの濃度；０，３０μＭ）、実施例２に準じて細胞を刺激し、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００４４】
２）結果
クルクミン濃度、３０μＭにおいて、ｈＢＤ−２の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表３）。
【００４５】
実施例８  ｈＢＤ−２発現に対する効果（３）
１）ＡｈＲリガンドとして、ＤＩＭを用い（ＤＩＭ濃度；０，１，５μＭ）、実施例３に準じて細胞を刺激し、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００４６】
２）結果
ＤＩＭ濃度、１及び５μＭにおいて、ｈＢＤ−２の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表３）。
【００４７】
実施例９  ＡｈＲアゴニストのｈＢＤ−２発現に対する効果（４）
１）ＡｈＲリガンドとして、ＤＨＮＡを用い（ＤＨＮＡ濃度；０，１，１０μＭ）、実施例４に準じて細胞を刺激し、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００４８】
２）結果
ＤＩＭ濃度、１及び１０μＭにおいて、ｈＢＤ−２の相対的ｍＲＮＡ発現量が対照に比較して有意に増加した（表３）。
【００４９】
【表３】
2016150930.tif 000004
【００５０】
実施例１０  ＡｈＲアンタゴニスト存在下のＩＴＥのｈＢＤ−２発現に対する効果
１）実施例５に準じて、ＣＨ２２３１９１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０μＭ）と、ＩＴＥ（１０μＭ）を用い、実施例１と同様にして細胞を刺激し、ｈＢＤ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝３）。
【００５１】
２）ＣＨ２２３１９１は、有意に（ｐ＜０．００１）ＩＴＥのｈＢＤ−２  ｍＲＮＡ発現促進効果を抑制した（表４）。従って，ＩＴＥのｈＢＤ−２  ｍＲＮＡ発現促進効果はＡｈＲを活性化することで起こっており，ＡｈＲの活性化がｈＢＤ−２  ｍＲＮＡの発現を促進できることを示している。
【００５２】
【表４】
2016150930.tif 000005