(57)【要約】【課題】本発明の目的は、細胞の培養により細胞シートを得ることができ、かつ得られた細胞シートを容易に剥離することができる細胞培養容器を提供することである。【解決手段】本発明は、親水性処理面を有するプラスチックを含む支持体と、前記支持体の親水性処理面の上に配置された酸化ケイ素層と、該酸化ケイ素層の上に配置された疎水性ポリシロキサン層と、を含む細胞培養容器である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性処理面を有するプラスチックを含む支持体と、
前記支持体の親水性処理面の上に配置された酸化ケイ素層と、
該酸化ケイ素層の上に配置された疎水性ポリシロキサン層と、
を含む細胞培養容器。
【請求項２】
前記疎水性ポリシロキサン層は、下記式（１）で表されるケイ素化合物を用いて形成される、請求項１に記載の細胞培養容器；
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ  ・・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ疎水性基を含む有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。
【請求項３】
疎水性基が、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ビニル基、スチリル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、フェニル基、グリシドキシ基、エポキシ基、又はエポキシシクロヘキシル基である、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記酸化ケイ素層の厚さが１μm以上３５０μm以下である、請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記酸化ケイ素層の厚さが１０μm以上１２０μm以下である、請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記酸化ケイ素層が化学蒸着法により形成される、請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて細胞シートを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器及び該細胞培養容器を用いた細胞シートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療技術の一つとして、細胞を移植する手法がある。移植のための細胞の形態としては、細胞をシート状に培養して得られる細胞シートが挙げられる。細胞シートとは、細胞間結合で細胞同士が少なくとも１層で連結されたシート状の細胞集合体である。細胞シートはシャーレなどの支持体上で細胞培養を行うことにより得られるが、一般的に、支持体上で形成された細胞シートは接着分子などを介して支持体表面と強固に結合しているため、細胞間の結合を壊さずに支持体から細胞シートを剥離することは容易ではない。そこで、細胞シートを容易にかつ細胞のダメージが少なく回収できる技術について研究が行われている。
【０００３】
非特許文献１には、温度応答性ポリマーが表面に塗布された培養用容器が開示されている。非特許文献１では、該培養用容器を用いて細胞を培養した後に低温処理を施して細胞シートを回収する方法が記載されている。この方法では剥離の際に酵素を用いないため、細胞間結合を維持しつつ、かつ治療に有効な細胞外マトリックスを失う事無く細胞シートを得ることができると記載されている。
【０００４】
しかし、非特許文献１に記載の方法では、特に細胞シートを剥離させるための低温処理に長く時間が掛かる場合、細胞にダメージを与えてしまう場合がある。また、接着力の強い細胞では、低温処理で剥離することにより細胞シートを得るためには、継代培養を行って細胞接着力を意図的に弱める必要がある場合がある。
【０００５】
そこで、細胞シートが形成された後に特別な処理を施すことなく容易に細胞シートを剥離できる表面を有する培養用容器の研究が行われている。
【０００６】
特許文献１には、細胞接着性領域及び細胞非接着性領域を有する表面上に細胞を播種することで、特別な処理を必要とせずに容易に剥離可能な細胞シートを得る方法が開示されている。
特許文献２には、高密度播種による細胞シートの形成方法が開示されている。
【０００７】
特許文献３には、支持体である高分子含水ゲル層、及び細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層と該細胞接着性ゲル層との間にアニオン性合成ポリマー及び多価金属イオンを含むゲル層を有する細胞培養担体が開示されている。また、該細胞培養担体の上で細胞を培養して細胞シートを形成する方法が開示されている。
【０００８】
特許文献４には、少なくともキトサンを含むゲル上にアニオン性多糖類、多価金属イオン及び水溶性高分子を含むゲル層を有する細胞培養担体が開示されている。また、該細胞培養担体の上で細胞を培養して得られた細胞シートを、ゲル層を溶解することにより回収する方法が開示されている。
【０００９】
特許文献５には、培養溶液に加えられた細胞に底面方向への遠心力を作用させながら細胞培養を行い、細胞シートを得る方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１４−１３８５５７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１４２３６４号
【特許文献３】特開２００６−２１７８７８号公報
【特許文献４】特開２００７−２５９７３５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１６１９５２号公報
【００１１】
【非特許文献１】日本臨牀、大和ら、６４巻２号、３３５〜３４１ページ、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献１の方法では、細胞接着性領域及び細胞非接着性領域の微細パターンを形成するために、コストが増加する傾向にあり、また、培養容器の品質管理が難しい場合がある。
【００１３】
特許文献２の方法では、細胞の種類が上皮又は内皮細胞に限定されており、汎用性が乏しいという問題がある。
【００１４】
特許文献３の方法では、細胞シートからゲル層を剥離する際に、可溶化処理やピンセットによるゲル層の除去処理が行われており、作業が煩雑になる。また、細胞シートに化学的又は物理的にダメージを与える可能性がある。
【００１５】
特許文献４の方法でも、特許文献３の方法と同様に、ゲル層を溶解させる際に細胞シートにダメージを与える可能性がある。
【００１６】
特許文献５の方法では、細胞を遠心力により容器底面に集積させる前に、培養した細胞をトリプシンなどの酵素で処理する必要があるため、細胞外マトリックスが一旦失われるという問題があり、また、操作が煩雑になる。
【００１７】
そこで、本発明の目的は、細胞の培養により細胞シートを得ることができ、かつ得られた細胞シートを容易に剥離することができる細胞培養容器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（１）親水性処理面を有するプラスチックを含む支持体と、
前記支持体の親水性処理面の上に配置された酸化ケイ素層と、
該酸化ケイ素層の上に配置された疎水性ポリシロキサン層と、
を含む細胞培養容器。
（２）前記疎水性ポリシロキサン層は、下記式（１）で表されるケイ素化合物を用いて形成される、（１）に記載の細胞培養容器；
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ  ・・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ疎水性基を含む有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。
（３）疎水性基が、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ビニル基、スチリル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、フェニル基、グリシドキシ基、エポキシ基、又はエポキシシクロヘキシル基である、（２）に記載の細胞培養容器。
（４）前記酸化ケイ素層の厚さが１μm以上３５０μm以下である、（１）乃至（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）前記酸化ケイ素層の厚さが１０μm以上１２０μm以下である、（１）乃至（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（６）前記酸化ケイ素層が化学蒸着法により形成される、（１）乃至（５）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（７）（１）乃至（６）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて細胞シートを製造する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、細胞の培養により細胞シートを得ることができ、かつ得られた細胞シートを容易に剥離することができる細胞培養容器を提供することができる。また、本発明により、該細胞培養容器を用いた細胞シートの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本実施形態に係る細胞培養容器の構成を説明するための概略断面図である。
【図２】実施例１においてＦＴ−ＩＲ装置を用いて酸化ケイ素層の赤外吸収スペクトルを測定した結果を示す図である。
【図３】実施例１においてＸＰＳ測定により表面分析を行った結果を示すグラフである。
【図４】実施例１及び比較例１〜４で作製した細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ４）の層構成を示す概略断面図である。
【図５】評価１にて、実施例１の細胞培養ディッシュ（Ｅ１）を用いた細胞培養により得られた細胞シートを示す画像である。
【図６】評価１にて、細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ２）を用いた細胞培養により得られた細胞シートにおける細胞状態を示す写真である。
【図７】評価３にて、細胞培養ディッシュ（Ｅ１）を用いた細胞培養により得られた細胞シートを染色した結果を示す画像である。
【図８】評価６におけるＸＰＳ測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［細胞培養容器］
本発明に係る細胞培養容器は、親水性処理面を有するプラスチックを含む支持体と、前記支持体の親水性処理面の上に配置された酸化ケイ素層と、該酸化ケイ素層の上に配置された疎水性ポリシロキサン層と、を含む。
【００２２】
本発明に係る細胞培養容器は、細胞接着性を有するため、細胞を培養することによって細胞シートを得ることができる。また、本発明の細胞培養容器は、適度な細胞接着性を有するため、培養して得られた細胞シートを容易に剥離することができる。具体的には、細胞を培養して得られた細胞シートに、意図的な揺動やピペッティングにより水流を細胞シートに与えることによって細胞シートを接着面から容易に剥離することができる。また、ピンセットなどの器具を用いて細胞シートの端部を摘まんで容易に剥離することもできる。
【００２３】
本実施形態の細胞培養容器は、好ましくは、コンフルエント状態になるまで細胞を培養することができる。また、本実施形態の細胞培養容器は、より好ましくは、コンフルエント状態になるまで細胞を培養することができ、かつコンフルエント状態に達するまで細胞を培養した際に、細胞シートが何の操作もせず又は容器の振とうによって容器の接着面から剥離する。これは、細胞が増殖してコンフルエント状態に達すると、細胞間に働く収縮力が細胞シートと容器の接着面との間の接着力よりも強くなり、細胞シートが接着面から剥離するものと考えられる。そのため、好ましい本実施形態の細胞培養容器によれば、細胞接着が均一に行われて均一なコンフルエント状態が達成され、損傷が極めて少ない細胞シートが得られる。
【００２４】
本実施形態の細胞培養容器の構成について、図１を参照して説明する。図１（Ａ）は、本実施形態の細胞培養容器の層構成を示す概略断面図である。細胞培養容器は、親水性処理面を有するプラスチックを含む支持体３を有し、該支持体３の親水性処理面の上には、酸化ケイ素層２が配置されている。酸化ケイ素層２の上には、疎水性ポリシロキサン層１が配置されている。支持体３は細胞培養容器の外壁の少なくとも一部を構成する部材とすることができる。また、支持体３は、外壁を構成する部材とは異なる部材とすることもできる。図１（Ｂ）は、ディッシュ型の形態を有する本実施形態の細胞培養容器の模式的断面図を示す。図１（Ｂ）では、ディッシュ型のプラスチック製の容器が支持体３として機能している。図１（Ｂ）において、支持体３が外壁の側壁及び底壁を構成しており、支持体３の底壁の上面全体に酸化ケイ素層２が配置され、該酸化ケイ素層２の上面全体に疎水性ポリシロキサン層１が配置されている。疎水性ポリシロキサン層１の上面は、容器内部の培養液が配置される空間（培養部）に接している。また、支持体３の底壁の上面は、親水性処理が施されている。また、図１には図示していないが、細胞培養容器は、適切な大きさの蓋を有することができる。細胞培養容器は、該蓋で閉じられた際に、液密になることが好ましい。なお、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。
以下、本発明の各構成要素について説明する。
【００２５】
（支持体）
支持体３は、細胞と培養液を保持できる構造であることが好ましい。典型的には、図１（Ｂ）に示すように、細胞と培養液を保持することが可能なように、円形の底板と、該底板の周縁から上方に立設された側壁とを備える皿状の形状であってもよいし、細胞及び培養液を保持することが可能な他の形状であってもよい。より具体的には、支持体は、シャーレ、フラスコ、ビーカー、ウェルプレート、又は管などの形状であることができる。また、支持体が支持体単独で細胞と培養液を保持できる構造であることは必須ではない。
【００２６】
支持体は、親水性処理面を有するプラスチックを含んで構成される。プラスチックとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、又はポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。これらのうち、ポリスチレンが好ましい。
【００２７】
支持体は、親水性処理を施して形成された親水性処理面を表面に有する。親水性処理は、プラスチックの表面を親水性に改質できる処理であれば特に制限されるものではない。そのような表面処理としては、例えば、コロナ放電処理、プラズマ処理、ＵＶオゾン処理、電子線照射処理、又はレーザー処理などが挙げられる。
【００２８】
親水性処理面を有する支持体は、市販されているものを用いてもよく、例えば、ＮｕｎｃTM細胞培養ディッシュ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｆａｌｃｏｎセルカルチャーディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、細胞培養用シャーレ（住友ベークライト社製）、又は組織培養用ディッシュ（旭硝子社製）として市販されている。
【００２９】
また、親水性処理面を有する支持体は、例えば、親水性処理が施されていない未処理のプラスチック製の支持体に親水性処理を施すことにより用意することもできる。未処理の支持体としては、例えば、ＮｕｎｃTMペトリディッシュ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｆａｌｃｏｎペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト社製）、又は無処理ディッシュ（旭硝子社製）を用いることができる。
【００３０】
親水性処理により、プラスチック表面に存在する親水性官能基（例えばヒドロキシ基やカルボニル基）が増えるものと考えられる。本実施形態において、プラスチック製の支持体の表面が親水性処理されることにより、細胞の接着性が向上する。本実施形態では、支持体の上に酸化ケイ素層及び疎水性ポリシロキサン層が設けられているため、支持体の親水性処理面が直接培養液に接してはいない。しかし、この支持体の表面が親水性処理されていることにより、培養液中に含まれるタンパク質などの細胞間マトリックスの材料となる栄養素が接着面に集まり易くなり、結果として、未処理の支持体を用いる場合に比べて細胞の接着性が向上するものと考えられる。また、支持体の表面が親水性処理されていることにより、酸化ケイ素層が支持体表面上に付加され易くなるものと考えられる。
【００３１】
親水性処理面の静的水接触角は、７０°未満であることが好ましい。例えば、親水性処理されたポリスチレンの静的水接触角は、６４°である。なお、水接触角は、温度２５℃、湿度３０％、大気圧下で、マイクロシリンジから水を滴下して１分以内に接触角測定器を用いて測定した値を用いることができきる。また、接触角測定器としては例えば、協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型を用いることができる。
【００３２】
（酸化ケイ素層）
酸化ケイ素層は、支持体の親水性処理面の上に配置される。
酸化ケイ素層は、特に制限されるものではないが、例えば、化学蒸着法（ＣＶＤ法）又はスパッタリング法により形成することができ、化学蒸着法により形成することが好ましい。化学蒸着法の中でも、比較的低い温度で酸化ケイ素層を形成することができるプラズマＣＶＤ法を用いることが好ましい。すなわち、有機ケイ素化合物及び不活性ガスを原料として低温真空プラズマＣＶＤ法によって酸化ケイ素層を形成することが好ましい。低温真空プラズマＣＶＤ法は、支持体を加熱する必要がなく、また、例えば１０℃以上７０℃以下の低温で成膜が可能である。低温真空プラズマＣＶＤ法で成膜する場合は、成膜前の成膜室（真空チャンバー）内を１×１０−５Ｐａ以上１×１０−３Ｐａ以下の真空度に一定時間保つことが好ましい。
【００３３】
真空プラズマＣＶＤ法としては、容量結合型プラズマＣＶＤ法、誘導結合型プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲ（電子サイクロトロン共鳴）プラズマＣＶＤ法などが挙げられる。これらの中でも、誘導結合型プラズマＣＶＤ法を用いることが好ましい。誘導結合型プラズマＣＶＤ法は、均一で高密度のプラズマを生成でき、良質な酸化ケイ素層を作製でき、支持体との密着性に優れる良質な酸化ケイ素層を形成することができる。
【００３４】
原料ガスとしての有機ケイ素化合物としては、特に制限されるものではないが、例えば、ヘキサメチルジシロキサン、テトラメチルジシロキサン、トリエチルトリメチルジシロキサンなどが挙げられる。真空プラズマ中で十分に分解されて容易に成膜できるという観点から、比較的低分子量のジシロキサン化合物を用いることが好ましい。また、不活性ガスとしては、例えば、アルゴンガス、ヘリウムガス、ネオンガス、クリプトンガス、又はキセノンガスなどを用いることができる。
【００３５】
有機ケイ素化合物とともに酸素ガスを反応室に供給してプラズマ放電させることにより、支持体の上に酸化ケイ素を蒸着させることができる。
【００３６】
また、スパッタリング法としては、例えば、ＤＣ（直流）スパッタリング方式、ＡＣ（交流）スパッタリング方式、ＲＦ（高周波）スパッタリング方式などを用いることができる。これらのスパッタリング方式は２極スパッタリング法、マグネトロンスパッタリング法のいずれの方法であってもよい。さらに、これらの中でも、ＲＦマグネトロンスパッタリング法又はＡＣスパッタリング法は、プロセスが安定しており、装置構造が簡単な直流電源又は交流電源を使用するので操作し易く、膜厚制御の点で有利である。ターゲットとしては、ケイ素又はケイ素酸化物を主成分とするものが用いられる。
【００３７】
酸化ケイ素層の厚さは、１μｍ以上３５０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以上１２０μｍ以下であることがより好ましく、１５μｍ以上７０μｍ以下であることがさらに好ましい。酸化ケイ素層の膜厚が１μｍ未満の場合、培養により形成される細胞シートと接着面との間の接着力が強くなり、細胞シートが剥離し難くなる傾向がある。また、酸化ケイ素層の膜厚が３５０μｍよりも大きい場合、細胞接着性が低下し、細胞シートが形成され難くなる傾向がある。
【００３８】
酸化ケイ素層の厚さを測定する方法としては、例えば、本実施例で用いた触針式段差計を用いる方法が挙げられる。また、その他にも、光干渉膜厚計を用いる方法、反射率分光法による方法、光学及び電子顕微鏡などの各種顕微鏡を用いる方法、エリプソメトリーによる方法などが挙げられる。酸化ケイ素層の厚さは、例えば３〜１０点での厚さの平均値として示すことが望ましい。
【００３９】
酸化ケイ素層が支持体上に形成されたことを確認する方法としては、例えば、ＦＴ−ＩＲを用いる方法や、Ｘ線光電子分析装置を用いた表面元素解析による方法などが挙げられる。
【００４０】
（疎水性ポリシロキサン層）
疎水性ポリシロキサン層は、酸化ケイ素層の上に配置される。本実施形態において、疎水性ポリシロキサン層の表面が培養時に細胞と接触する領域（接着面）となることが好ましい。本実施形態では、接着面が疎水性となるため、培養により形成された細胞シートと疎水性ポリシロキサン層との間の接着力を適度な範囲とすることができ、細胞シートを容易に剥離することができる。また、疎水性ポリシロキサン層は細胞に対する毒性を持たないため、接着させた状態で細胞をコンフルエント状態に達するまで増殖させることができる。
【００４１】
疎水性ポリシロキサンは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、疎水性基を有するシラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。
【００４２】
本実施形態におけるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ疎水性基を含む有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は、好ましくは、下記式（１）で表される構造を有する。
【００４３】
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（ＯＨ）ｑ  ・・・・（１）
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ疎水性基を含む有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。
【００４４】
ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。
【００４５】
Ｒ１は、好ましくは、ケイ素原子に直結した炭素原子を含む疎水性基からなる有機基であり、又は、ケイ素原子に直結した炭素原子を含むリンカー構造（例えばアルキレン基、アリール基）と該リンカー構造を介してケイ素原子と結合する疎水性基を有する有機基である。Ｒ１の炭素数は、例えば１〜２０であり、好ましくは１〜１５であり、より好ましくは１〜１０であり、特に好ましくは１〜８である。リンカー構造の炭素数は、例えば１〜６であり、好ましくは１〜４である。リンカー構造としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、又はフェニレン基などが挙げられる。疎水性基としては、例えば、炭素数１〜６の置換若しくは無置換のアルキル基、炭素数２〜６の置換若しくは無置換のアルケニル基（例えばビニル基）、炭素数２〜６の置換若しくは無置換のアルキニル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、炭素数６〜１２の置換若しくは無置換のアリール基、グリシドキシ（グリシジルオキシ）基、エポキシ基、エポキシシクロヘキシル基などが挙げられる。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基は直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、又は環状であってもよい。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアリール基の置換基としては、例えば、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数２〜４のアルケニル基（例えばビニル基）、フェニル基などが挙げられる。疎水性基の具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ビニル基、スチリル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、フェニル基、グリシドキシ（グリシジルオキシ）基、エポキシ基、エポキシシクロヘキシル基などが挙げられる。
【００４６】
Ｒ１の特に好ましい態様としては、３−メタクリロキシプロピル基、３−アクリロキシプロピル基、３−グリシドキシプロピル基、又は２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。
【００４７】
Ｒ２は、ケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基であり、好ましくは、炭素数１〜６の置換若しくは無置換のアルキル基、又は炭素数６〜１２の置換若しくは無置換のアリール基である。アルキル基は直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、又は環状であってもよい。Ｒ２は、より好ましくは、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、さらに好ましくはメチル基又はエチル基である。
【００４８】
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を生成可能な基を有するケイ素化合物（以下、シランカップリング剤とも称す）を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は下記式（２）で表される構造を有する。
【００４９】
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ  ・・・・（２）
（Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ２は、上述のシラノール化合物に関してそれぞれ定義したとおりである）。
【００５０】
Ｙとしては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、又はアルキルカルボニルオキシ基などが挙げられる。Ｙは、炭素数１〜６のアルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、又は塩素原子が好ましい。
【００５１】
式（２）のケイ素化合物としては、例えば、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。これらのうち、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、又は３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランが好ましい。
【００５２】
また、その他にも、ケイ素化合物としては、例えば、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、ｎ−プロピルトリメトキシシラン、ｎ−プロピルトリエトキシシラン、イソプロピルトリメトキシシラン、イソプロピルトリエトキシシラン、ｎ−ブチルトリメトキシシラン、ｎ−ブチルトリエトキシシラン、ｎ−ペンチルトリメトキシシラン、ｎ−ヘキシルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、シクロヘキシルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジメトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジエトキシシラン、ジイソプロピルジメトキシシラン、ジイソプロピルジエトキシシラン、ジ−ｎ−ブチルジメトキシシラン、ジ−ｎ−ブチルジエトキシシラン、ジ−ｎ−ペンチルジメトキシシラン、ジ−ｎ−ペンチルジエトキシシラン、ジ−ｎ−ヘキシルジメトキシシラン、ジ−ｎ−ヘキシルジエトキシシラン、ジ−ｎ−シクロヘキシルジメトキシシラン、ジ−ｎ−シクロヘキシルジエトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシランなどを挙げることができる。
【００５３】
式（２）のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができる。また、式（２）のケイ素化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５４】
疎水性ポリシロキサン層を形成する際、式（２）のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式（１）のシラノール化合物を生成することができる。加水分解の条件は、特に制限されるものではないが、例えば次の方法を採用することができる。まず、式（２）のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は例えば２〜４である。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式（１）のシラノール化合物が生成する。次いで、シラノール化合物を酸化ケイ素層の表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサン層を形成する。式（１）のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解させる。シラノール溶液中のシラノール化合物の濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲となるように調整することが好ましい。塩基としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、又は４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができる。シラノール溶液中の塩基の濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲となるように調整することが好ましい。アルコールとしては、例えば、エタノール、２−プロパノール、又はｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどを用いることができる。このシラノール化合物を含むシラノール溶液を酸化ケイ素層の表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は例えば４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）であることが好ましい。以上の方法によって、酸化ケイ素層上に疎水性ポリシロキサン層を形成することができる。疎水性ポリシロキサン層の被覆密度は、例えば、シラノール化合物若しくは塩基の濃度、あるいはシラノール溶液を酸化ケイ素層表面に接触させる時間によって制御可能である。
【００５５】
本実施形態において、疎水性ポリシロキサン層と酸化ケイ素層の間には、共有結合などの化学結合が形成されているものと考えられる。また、疎水ポリシロキサン層は、酸化ケイ素層の表面に、物理吸着により結合していてもよい。物理吸着はファンデルワールス力又は官能基間の相互作用により生じると考えられる。
【００５６】
疎水性ポリシロキサン層中のポリシロキサンの状態は必ずしも明らかではないが、一般的に、無機層の表面に対してポリシロキサンを付加させた場合は、表面（無機層と反対側）に有機基が配向すると考えられている。
【００５７】
疎水性ポリシロキサン層の表面が細胞シートに対して優れた剥離性を有することは、例えば上記非特許文献１に記載される温度応答性ポリマーが表面に塗布された培養容器において、低温処理により表面が疎水性になると、細胞が剥離し易くなる現象からも理解できる。
【００５８】
疎水性ポリシロキサン層の表面における静的水接触角は、好ましくは７０°以上であり、より好ましくは８０°以上である。
【００５９】
シランカップリング剤に関する製品情報から判断すると、無機物の酸化ケイ素層の上に形成される疎水性ポリシロキサン層の膜厚はｎｍオーダーになると考えられる。そのため、μｍオーダーで形成される酸化ケイ素層の膜厚と比較して、疎水性ポリシロキサン層の膜厚は小さく、表面構造（酸化ケイ素層と疎水性ポリシロキサン層）の膜厚は、ほとんど酸化ケイ素層に由来すると考えてよい。
【００６０】
［細胞シートの製造方法］
本実施形態の細胞培養容器を用いることにより、細胞シートを容易に得ることができる。
本実施形態に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし、二種以上の細胞を共培養してもよい。
【００６１】
培養液としては、当該技術分野で一般的に用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地などの、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清など）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）などの市販の無血清培地も用いることができる。最終的に得られる細胞組織体の臨床応用を考えると、動物由来成分を含まない培地を使用することが好ましい。
【００６２】
細胞シートを形成させる観点から、細胞を培養容器内でコンフルエント状態にまで培養させることが好ましい。細胞を培養して細胞シートを形成する際、増殖しなくてもコンフルエント状態を達するのに十分な細胞数を予め播種することにより、コンフルエント状態の細胞シートを得てもよい。
【００６３】
培養して得られた細胞シートは容易に剥離することができるため、ダメージがない若しくはほんどない細胞シートを得ることができる。得られる細胞シートは、再生医療への利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサーなどの検出デバイスへの応用へも展開できる。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００６５】
（実施例１）
蓋を外した状態の培養用ディッシュ（商品名：ＮｕｎｃTM細胞培養ディッシュ、カタログ番号：１５３０６６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、直径：３．５ｃｍ）をＣＶＤ蒸着装置（ＡＮＥＬＶＡ社製、型番：ＰＥＤ−４０１）の中に配置した。該培養用ディッシュは、プラスチック（ポリスチレン）製であり、該ディッシュの底面はコロナ放電処理が施されており、親水性処理面が形成されている。なお、この親水性処理面の静的水接触角は６４°であった。静的水接触角は、接触角測定器（協和界面科学社製、ＣＡ−Ｚ型）を用いて、マイクロシリンジから水滴を滴下してから１分以内に測定することにより求めた。
【００６６】
次いで、気化させたヘキサメチルジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）及び酸素を含む混合ガスを、ＨＭＤＳＯの流量が３ｓｃｃｍ（Standard cubic centimeter per minute）及び酸素の流量が５０ｓｃｃｍとなるようにＣＶＤ蒸着装置（製品名：ＰＥＤ−４０１、ＡＮＥＬＶＡ社製）内に供給し、圧力１５Ｐａ、電力１００Ｗ及び１８℃（チラー表示温度）の条件で、１０分間化学蒸着反応を行い、ディッシュの底面に酸化ケイ素層が形成された培養用ディッシュ（以下、酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）とも称す）を得た。
【００６７】
酸化ケイ素層がディッシュの底面に形成されていることを、ＦＴ−ＩＲ装置（ＤＩＧＩＬＡＢ社製、型番：ＦＴＳ−７０００）を用いて確認した。酸化ケイ素層の赤外吸収スペクトルをＦＴ−ＩＲ装置により測定すると、酸化ケイ素の非対称伸縮に由来するピーク（１０７５ｃｍ−１及び１１５０ｃｍ−１）が検出される。図２（Ａ）は、酸化ケイ素層を形成する前のディッシュ底面を測定した結果であり、図２（Ｂ）は、酸化ケイ素層を形成した後のディッシュ底面を測定した結果である。図２（Ｂ）に示されるように、酸化ケイ素層の存在を示す目的ピークが検出され、ディッシュ底面に酸化ケイ素層が形成されていることがわかる。
【００６８】
また、テープにより仮止めしたシリコンウェハを蒸着装置内に同時に入れておき、蒸着反応後、テープを剥がして現れた蒸着面の段差を触針式段差計ＤｅｋＴａｋII（製品名、アルバック社製）を用いて３点で測定してその平均値を算出することにより、酸化ケイ素層の膜厚を測定した。酸化ケイ素層の膜厚は、６０μｍであった。
【００６９】
次に、酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）の底面に、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（３−ＭＰＴＳ）を用い、以下の手順により、疎水性ポリシロキサン層を形成した。まず、２．０ｍｌのシランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−５０３、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）に１．０ｍｌの塩酸（ｐＨ２．４）を加え、室温にて１０分間撹拌し、加水分解反応を行った。得られた溶液を１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学社製）に加え、さらに５００μｌのトリエチルアミン（関東化学社）をそこに加えて撹拌し、シラノール溶液（１）を調製した。次いで、３ｍｌのシラノール溶液（１）を、酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）の底面に塗布し、室温で１３５分間静置し、縮合反応を行った。ポリシロキサン層を形成した後、純水により表面を洗浄してから窒素エアーブローにより水滴を除去し、その後、８０℃のオーブンにて１５分間乾燥処理を行った。これにより、酸化ケイ素層の上に疎水性ポリシロキサン層が形成された細胞培養ディッシュ（Ｅ１）を作製した。
【００７０】
ポリシロキサン層が形成されているかどうかを確認するために、得られた酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）及び細胞培養ディッシュ（Ｅ１）について、ＸＰＳによる表面分析を以下の手順に従って行った。まず、ディッシュ底面を超音波カッターにより適当な大きさに切ってサンプルを用意した。次いで、該サンプルについて、Ｘ線光電子分析装置（島津製作所社製、製品名：ＥＳＣＡ−３４００）を用いて、Ｃ１ｓ、Ｏ１ｓ、Ｓｉ２ｐのそれぞれのスペクトルを取得した。そして、それぞれのスペクトルの面積を計算した上で、その面積比を算出し、比較を行った。図３に、ＸＰＳ測定による元素比の計算結果を示す。図３に示されるように、Ｃ１ｓ、Ｏ１ｓ、Ｓｉ２ｐの値が酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）及び細胞培養ディッシュ（Ｅ１）の間で差があり、酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）の表面にポリシロキサン層が形成されていることが確認された。なお、図３において、エラーバーは標準偏差を示している。
【００７１】
（比較例１）
酸化ケイ素層を形成する前の製品である培養用ディッシュ（商品名：ＮｕｎｃTM細胞培養ディッシュ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、直径：３．５ｃｍ）を細胞培養ディッシュ（Ｃ１）とした。
【００７２】
（比較例２）
実施例１における酸化ケイ素蒸着ディッシュ（１）を細胞培養ディッシュ（Ｃ２）とした。
【００７３】
（比較例３）
培養用ディッシュ（商品名：ＮｕｎｃTM細胞培養ディッシュ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、直径：３．５ｃｍ）に酸化ケイ素層を形成せずに上述のシラノール溶液（１）を塗布して疎水性ポリシロキサン層を形成したこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養ディッシュ（Ｃ３）を作製した。換言すると、比較例３では、培養用ディッシュの底面に３ｍｌのシラノール溶液（１）を塗布し、室温で１３５分間静置し、洗浄及び乾燥処理を行い、細胞培養ディッシュ（Ｃ３）を作製した。
【００７４】
（比較例４）
表面に親水性処理が施されていない未処理の培養用ディッシュ（商品名：ＮｕｎｃTMペトリディッシュ、未処理ポリスチレン、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、静的水接触角：９０°）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして細胞培養ディッシュ（Ｃ４）を作製した。
【００７５】
実施例１及び比較例１〜４で作製した細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ４）の層構成の概略図を図４に示す。なお、図４（Ａ）が実施例１の細胞培養ディッシュ（Ｅ１）の層構成、図４（Ｂ）が比較例１の細胞培養ディッシュ（Ｃ１）の層構成、図４（Ｃ）が比較例２の細胞培養ディッシュ（Ｃ２）の層構成、図４（Ｄ）が比較例３の細胞培養ディッシュ（Ｃ３）の層構成、図４（Ｅ）が比較例４の細胞培養ディッシュ（Ｃ４）の層構成を示す。符号１はポリシロキサン層、符号２は酸化ケイ素層、符号３は表面が親水性処理された支持体（ポリスチレン製）、符号４は表面が未処理の支持体（ポリスチレン製）を示す。
【００７６】
＜評価１＞
得られた細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ４）を用いて細胞を培養した場合における細胞シートの形成能（細胞増殖能）及び細胞シートの剥離性を以下の手順に従って評価した。
【００７７】
それぞれの細胞培養ディッシュにマウス線維芽細胞であるＨＨ細胞（接着性細胞）を３〜５×１０５個播種し、１０体積％でウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃で７〜１０日間培養した。そして、細胞シートの形成能及びシートの剥離性について評価した。
【００７８】
細胞シートの形成能については、以下の判断基準に従って評価した。
○：細胞が９０％コンフルエント状態に達するまで増殖し、細胞シートを形成する。
×：細胞が９０％コンフルエント状態に達するまで増殖できない。
なお、９０％コンフルエント状態とは、容器の接着面の９０％以上が増殖した細胞で覆われている状態を指し、顕微鏡で接着面を観察することにより判断できる。また、顕微鏡でイメージ画像を取得し、ソフトを用いたイメージ解析によっても定量的に判断することができる。なお、９０％コンフルエント状態にまで細胞が増殖できれば、必然的に細胞シートが形成されていることになる。
【００７９】
細胞が９０％コンフルエント状態まで増殖し、細胞シートを形成した細胞培養ディッシュについて、細胞シートの剥離性を評価した。細胞シートの剥離性については、以下の判断基準に従って評価した。
Ａ：細胞シートが、ディッシュを揺らすことより、接着面から剥離する。
Ｂ：細胞シートをピペッティングによる水流により剥離することができる。
Ｃ：細胞シートをピペッティングによる水流により剥離できないが、ピンセットを用いて把持することにより剥離できる。
Ｄ：細胞シートをピンセットを用いて把持しても剥離できない。
【００８０】
結果を表１に示す。
【００８１】
【表１】
2016214121.tif 000003
【００８２】
実施例１の細胞培養ディッシュ（Ｅ１）では、細胞をコンフルエント状態にまで増殖することができ、ディッシュを揺らしただけで、形成された細胞シートが接着面から剥離した。得られた細胞シートの写真を図５に示す。
【００８３】
比較例１の細胞培養ディッシュ（Ｃ１）において、細胞が底面に接着して増殖し、９０％コンフルエント状態に達したが、細胞シートを接着面から剥離できなかった。
【００８４】
図６に、細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ２）を用いて培養した場合における細胞状態を示す写真を示す。図６の写真に示されるように、実施例１の細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び比較例１の細胞培養ディッシュ（Ｃ１）では細胞が９０％以上のコンフルエント状態に達した。しかし、比較例２の酸化ケイ素層が最表面に存在する細胞培養ディッシュ（Ｃ２）においては、培養途中で細胞が死滅し、９０％のコンフルエントの状態に至らなかった。図６（Ｃ）からも、細胞培養ディッシュ（Ｃ２）では、底面に接着した細胞数が細胞培養ディッシュ（Ｅ１）や細胞培養ディッシュ（Ｃ１）と比較して少ないことがわかる。そのため、最表面に酸化ケイ素層が存在する細胞培養ディッシュは細胞培養に適さないことが示唆された。なお、酸化ケイ素の細胞への毒性を示唆する文献として（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｂｅｒ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ７巻  １  ２０１０年）が挙げられ、該文献ではＳｉＯ２のナノ粒子の毒性について言及されている。
【００８５】
比較例３の細胞培養ディッシュ（Ｃ３）においては、細胞が底面に接着して増殖し、９０％以上のコンフルエント状態に達したが、細胞シートをピンセットを用いても剥離できなかった。そのため、親水性処理面を有するプラスチック製の支持体上に単に疎水性ポリシロキサン層を形成しただけでは、良好な細胞シートの剥離性を得ることができないことがわかる。すなわち、良好な細胞シート剥離性を得るためには、酸化ケイ素層が必要となることがわかる。
【００８６】
この理由の推測は以下の通りである。親水性処理面を有する支持体の上に直接疎水性ポリシロキサン層を形成すると、培養液中に含まれるタンパク質が接着面に比較的多く集まり、接着面に対する接着力が比較的強い細胞シートが形成されてしまう。一方、支持体の親水性処理面と疎水性ポリシロキサン層との間に酸化ケイ素層を配置することにより、親水性処理面と接着面との距離を適度に広げることができ、接着面に集まるタンパク質を比較的少なくすることができる。そのため、接着面に対する接着力が比較的弱い細胞シートを形成することができると考えられる。また、酸化ケイ素層がプライマー層としても機能し、疎水性ポリシロキサン層を効率的に高密度に形成することができるため、接着面の疎水性が向上するものと考えられる。以上の理由により、本実施形態の細胞培養容器は、細胞シート形成能及び優れた細胞シートの剥離性を両立できるものと考えられる。なお、以上の理由は推測であり、本発明を制限するものではない。
【００８７】
比較例４の細胞培養ディッシュ（Ｃ４）においては、細胞が接着しなかった。これにより、細胞が接着して増殖するためには、支持体の表面に親水性処理が施されていることが必要であることがわかる。支持体の表面に親水性処理が施されていると、培養液中に含まれるタンパク質などの栄養素を接着面に引きつけ易くなり、形成される細胞シートの細胞接着性を向上できるものと考えられる。
【００８８】
＜評価２＞
細胞培養ディッシュに播種する細胞数を増やすことにより、細胞を増殖させなくても細胞シートを回収できるかどうかについて、以下の手順により確認した。
【００８９】
上述の評価１と同じ培養条件で、ＨＨ細胞を培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品名：ＮｕｎｃTM細胞培養ディッシュ、直径１０ｃｍ）中で培養した。次いで、ＨＨ細胞をトリプシン処理を施してから回収し、ディッシュの大きさに対して過剰量である２．５×１０６個のＨＨ細胞を、細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ４）のそれぞれに播種した。次いで、HH細胞を播種した細胞培養ディッシュ（Ｅ１）及び（Ｃ１）〜（Ｃ４）を３７℃でインキュベートし、培養をさらに４日間行った。その後、細胞シートの形成能及び細胞シートの剥離性について、上記判断基準に従って評価した。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2016214121.tif 000004
【００９１】
また、比較例２の細胞培養ディッシュ（Ｃ２）を用いた場合においては、細胞が接着せず、細胞シートが形成されなかった。すなわち、酸化ケイ素層が最表面に存在する細胞培養ディッシュ（Ｃ２）を用いた場合は、接着する細胞数が少なくなる傾向が認められた。酸化ケイ素層が最表面に存在する場合は、細胞接着性が低下するものと考えられる。
【００９２】
＜評価３＞
細胞培養ディッシュ（Ｅ１）を用いて評価１で得られた細胞シートについて、該細胞シートを構成する細胞の生死を判定するために、以下の細胞染色による解析を行った。
【００９３】
まず、細胞シートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により洗浄した。その後、ＰＢＳにより希釈した生細胞を濃度１μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（商品名、同仁堂化学社製）で染色し、死細胞を濃度１μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ；同仁堂化学社製）で染色し、細胞核を濃度１／１０００に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）により染色した。染色は、３７℃インキュベーター内で１５分間静置させることにより行った。染色後、ＰＢＳで洗浄し、その後、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて観察し、画像を取得した。
【００９４】
図７に、取得した画像を示す。図７（Ａ）はＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭにより染色した生細胞の画像であり、図７（Ｂ）はＰＩにより染色した死細胞の画像であり、図７（Ｃ）はＨｏｅｃｈｓｔにより染色した細胞核の画像である。図７（Ｄ）はこれら３つの画像を重ね合わせた画像であり、図７（Ｄ）より、図７（Ａ）の生細胞と図７（Ｃ）の細胞核が重なっていることがわかる。この結果より、得られた細胞シートは、多くの生細胞から構成されており、細胞死のために浮遊した構造物では無いことが証明された。
【００９５】
（実施例２）
シランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−５０３、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）の代わりにシランカップリング剤（製品名：Ａ−１８７、３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、モメンティブパフォーマンスマテリアル社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養ディッシュ（Ｅ２）を作製した。
【００９６】
（実施例３）
シランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−５０３、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）の代わりにシランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−５１０３、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養ディッシュ（Ｅ３）を作製した。
【００９７】
（比較例５）
シランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−５０３、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）の代わりにアミノシランであるシランカップリング剤（製品名：ＫＢＭ−９０３、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、信越化学社製）を用いて細胞培養ディッシュ（Ｃ５）を作製した。比較例５では、加水分解処理は行わず、１ｍｌの上記アミノシランを撹拌下の５０ｍｌの２−プロパノールに滴下し、さらに２５０μｌのトリエチルアミンを添加し、シラノール溶液を調製した。次いで、実験例１と同様にして、３ｍｌのシラノール溶液を酸化ケイ素層蒸着ディッシュ（１）の底面に塗布し、室温で１３５分間静置し、縮合反応を行った。反応後、洗浄、乾燥工程を行い、細胞培養ディッシュ（Ｃ５）を作製した。
【００９８】
なお、上記アミノシランにより形成されるポリシロキサン層の表面は親水性となる。
また、細胞培養ディッシュ（Ｅ２）〜（Ｅ３）及び（Ｃ５）において酸化ケイ素層の表面にポリシロキサン層が形成されていることを、実施例１と同じように、ＸＰＳ測定によって確認した。
【００９９】
＜評価４＞
上述の評価１に記載の方法に従い、細胞シートの形成能及び細胞シートの剥離性について評価した。結果を表３に示す。
【０１００】
【表３】
2016214121.tif 000005
【０１０１】
これらの実施例２〜３及び比較例５より、疎水性ポリシロキサン層により細胞シートの剥離性を向上することができることがわかる。
【０１０２】
＜実施例４〜１０＞
ＣＶＤ反応時間を調整して所定の膜厚を有する酸化ケイ素層を形成したこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養ディッシュ（Ｅ４）〜（Ｅ１０）を作製した。なお、実施例８は実施例１に相当する。
＜評価５＞
また、作製した細胞培養ディッシュ（Ｅ４）〜（Ｅ１０）について、上述の評価１に従って細胞シートの形成能及び細胞シートの剥離性について評価した。結果を表４に示す。
【０１０３】
【表４】
2016214121.tif 000006
【０１０４】
以上の結果より、酸化ケイ素層の厚さは、１０μｍ以上１２０μｍ以下であることが好ましく、１５μｍ以上７０μｍ以下であることがより好ましい。
【０１０５】
＜評価６＞
また、別に、実施例４、５及び９の酸化ケイ素層の形成工程まで行ったディッシュをそれぞれ作製し、得られたサンプルについてＸ線光電子分析装置（島津製作所社製、製品名：ＥＳＣＡ−３４００）を用いて、Ｃ１ｓ、Ｏ１ｓ、Ｓｉ２ｐのそれぞれのスペクトルを取得した。図８にその結果を示し、それぞれのサンプル表面において膜組成の有意な差は見られなかった。
【０１０６】
＜実施例１１＞
細胞培養ディッシュ（１）に、ウシ血管内皮細胞のＢ２３細胞（接着性細胞）を３×１０５個播種し、１０体積％でウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃で培養した。その結果、７日間の培養により９０％にコンフルエント状態に達した。形成された細胞シートは容易に剥離できた。
【符号の説明】
【０１０７】
１  疎水性ポリシロキサン層
２  酸化ケイ素層
３  支持体（表面処理済）
４  支持体（表面未処理）
【図１】
2016214121.tif 000007
【図２】
2016214121.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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