(57)【要約】【課題】  高分子としてＰＶＡを用い、かつ腫瘍組織に到達した後、ＰＶＡとの結合が切断されて、抗腫瘍活性化合物が腫瘍組織中で効率的に放出される抗腫瘍剤を提供する。【解決手段】  アセトアセチル基含有ポリビニルアルコール中のアセトアセチル基の少なくとも１つのカルボニル基に由来する、イミン結合を介して、抗腫瘍活性化合物と結合されているＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体を有効成分として含有する。イミン結合は開裂しやすいので、腫瘍組織に送達された後、開裂してフリーになったＰＶＡは速やかに代謝されるので、副作用を抑制できる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアセチル基含有ポリビニルアルコール中のアセトアセチル基の少なくとも１つのカルボニル基に由来する、イミン結合（下記（１）式）を介して、抗腫瘍活性化合物と結合されているポリビニルアルコール−抗腫瘍活性化合物複合体を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【化１】
2016113374.tif 000011
【請求項２】
前記イミン結合は、下記（２）又は（２’）式で表される有機基団である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【化２】
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【請求項３】
前記イミン結合は、前記アセトアセチル化ポリビニルアルコール分子中のアセトアセチル基の少なくとも１つのカルボニル基と、前記活性化合物に連結されたヒドラジンとの結合により形成されたものである請求項２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記抗腫瘍活性化合物は、ヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する化合物、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、アントラサイクリン系抗腫瘍剤、及び白金系抗腫瘍剤からなる群より選ばれる１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記抗腫瘍活性化合物は、亜鉛プロトポルフィリン化合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
前記抗腫瘍活性化合物の官能基末端にヒドラジンを導入して、ヒドラジン含有抗腫瘍活性化合物を合成する工程：
アセトアセチル化ポリビニルアルコールと前記ヒドラジン含有抗腫瘍活性化合物とを反応させる工程
を含む請求項１に記載のポリビニルアルコール−抗腫瘍活性化合物複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性を有する化合物と生体親和性を有する高分子であるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と称することがある）とが結合した複合体からなる抗腫瘍剤に関し、腫瘍組織集積性に優れるだけでなく、腫瘍組織に到達後、当該抗腫瘍活性化合物の放出性に優れる抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体体親和性の高い高分子物質が選択的に腫瘍部で集積し，かつ正常組織よりも長期間滞留する現象は、ＥＰＲ効果（Enhanced permeability and retention effect）として報告されている（例えば、非特許文献１：Matsumura,H.Maeda，Cancer Res 47, 6387-6392(1986)）。
かかるＥＰＲ効果を利用した局所送達性抗腫瘍剤として、生体親和性の高い高分子に、抗腫瘍活性を有する化合物を結合させた抗腫瘍剤が、種々提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特許４６６９３９３号）では、アントラサイクリン系あるいは白金系等の低分子抗腫瘍剤と、スチレン・マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）とを分子間結合させ、高分子ミセル複合体とした抗腫瘍剤が提案されている。
【０００４】
特許文献２（特許５００００５０号）に、両親媒性または水溶性の高分子に結合したヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する金属ポルフィリン誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤が提案されている。ヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する金属ポルフィリンは難水溶性であるが、両親媒性または水溶性の高分子と結合させることで、水溶液注射剤を提供できるとしている。両親媒性または水溶性の高分子としては、「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）…ポリビニルアルコール…スチレン・マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）」（段落００１１）等の各種水溶性高分子が挙げられており、具体的には、亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）とＰＥＧとを、ジアミド結合を介して結合させた複合体を製造し、その抗腫瘍活性を確認している。
【０００５】
また、特許文献３（ＷＯ２０１３／０３５７５０公報）に、生体親和性高分子として、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体に官能基を付加したものを使用することが提案されており、具体的には、プロトポルフィリン等の光増感剤を、ＨＰＭＡに結合させた抗腫瘍剤が開示されている。
【０００６】
さらに、非特許文献２（H.Nakamura,Journal  of  Controlled  Release  165（2013）191-198）には、水溶性高分子としてＨＰＭＡを使用し、抗腫瘍活性を有するＺｎＰＰとの複合体を合成した例が報告されている。かかる分子は１つのアミド結合を介して結合されている。非特許文献３（Ｙ.Kaneoら,Ｊ.DRUG  DEL.SCI.TEC.,23(2)143-149,2013）には、水溶性高分子としてポリビニルアルコールを使用し、抗腫瘍活性を有するアントラサイクリンとの複合体を合成した例が報告されている。具体的には、ＰＶＡ分子中の水酸基をオクタメチレンジアミンで活性化させた後、スクシニルダウノルビシン（ＳＤＮＲ）又はcis−アコニチルダウノルビシン（ＡＤＮＲ）のカルボキシル基と反応させてＰＶＡ−ＳＤＮＲ複合体又はＰＶＡ−ＡＤＮＲ複合体を合成したもので（Ｆｉｇ１）、いずれも２つのアミド結合を介して結合されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４６６９３９３号公報
【特許文献２】特許５００００５０号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１３／０３５７５０公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Matsumura,H.Maeda，Cancer Res 47, 6387-6392(1986)
【非特許文献２】H.Nakamura,Journal  of  Controlled  Release  165（2013）191-198
【非特許文献３】Ｙ.Kaneoら,Ｊ.DRUG  DEL.SCI.TEC.,23(2)143-149,2013）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のような抗腫瘍剤において、抗腫瘍活性を有する化合物と高分子化合物とは、直接結合又は適当なスペーサ化合物を介して結合されている。
例えば、プロトポルフィリン分子は、２個のカルボキシル基を有しているが、このカルボキシル基の反応性は弱く、高分子との直接結合が容易でないことから、例えば、特許文献１では、プロトポルフィリン分子中のカルボキシル基に、まずエチレンジアミンを反応させてアミノ基を導入した後、当該アミノ基と活性化させた高分子とを反応させている。結果としては、ジアミド結合により、結合されている。
【００１０】
非特許文献２は、ＨＰＭＡがアミド結合を介してＺｎＰＰと結合している。
非特許文献３は、高分子としてＰＶＡを用いているが、やはりジアミド結合を介して、アントラサイクリン系化合物と結合している。
【００１１】
特許文献３では、ＨＰＭＡと活性化合物との結合について、ＨＰＭＡまたはその誘導体に含まれるアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、システイン基、あるいはヒドラジン基などとの化学反応を介して結合させる（段落００３１）との説明があるものの、具体的に開示されている合成は、プロトポルフィリンにカルボジイミドを反応させた後、ＨＰＭＡと結合させて合成したＨＰＭＡ−ＰＰ複合体だけである。このようにして得られた複合体における高分子とプロトポルフィリンとは、エステル結合を介して結合されている。
【００１２】
高分子と抗腫瘍活性化合物とを結合させた複合体は、ＥＰＲ効果に基づき、腫瘍組織に選択的に到達して集積されるという利点を有する一方、腫瘍組織に到達した後は、高分子は不要であることから、抗腫瘍活性化合物と高分子との結合が切断されて、抗腫瘍活性化合物だけが放出されることが望ましい。
【００１３】
しかしながら、上記文献に開示されている抗腫瘍剤は、いずれも高分子と抗腫瘍活性化合物とがアミド結合またはエステル結合を介して結合されている。上記文献に開示されているアミド結合及びエステル結合は、結合力が強く、腫瘍組織に到達した後、切断されにくいことから、抗腫瘍活性増強のためには、さらなる改良余地がある。
また、ＰＶＡは、水溶性高分子としては入手が容易であり、コスト的に優位であるが、ＯＨ基と抗腫瘍活性化合物とは、直接反応して連結することができないため、ＯＨ基を変性して用いる必要がある。かかる点において、高分子−抗腫瘍活性化合物の合成ルートが煩雑になることから、更なる改良余地がある。
【００１４】
本発明は以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、高分子としてＰＶＡを用い、かつ腫瘍組織に到達した後、ＰＶＡとの結合が切断されて、抗腫瘍活性化合物が腫瘍組織中で効率的に放出される抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の抗腫瘍剤は、アセトアセチル基含有ポリビニルアルコール中のアセトアセチル基の少なくとも１つのカルボニル基に由来する、イミン結合（下記（１）式）を介して、抗腫瘍活性化合物と結合されているポリビニルアルコール−抗腫瘍活性化合物複合体を有効成分として含有するものである。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
前記イミン結合は、下記（２）又は（２’）式で表される有機基団であることが好ましく、前記アセトアセチル化ポリビニルアルコール分子中のアセトアセチル基の少なくとも１つのカルボニル基と、前記活性化合物に連結されたヒドラジンとの結合により形成されたものであることが好ましい。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
前記抗腫瘍活性化合物は、ヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する化合物、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、アントラサイクリン系抗腫瘍剤、及び白金系抗腫瘍剤からなる群より選ばれる１種であることが好ましく、特に亜鉛プロトポルフィリン化合物であることが好ましい。
【００２０】
本発明のポリビニルアルコール−抗腫瘍活性化合物複合体の製造方法は、抗腫瘍活性化合物の官能基末端にヒドラジンを導入して、ヒドラジン含有抗腫瘍活性化合物を合成する工程：
アセトアセチル化ポリビニルアルコールと前記ヒドラジン含有抗腫瘍活性化合物とを反応させる工程を含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗腫瘍剤は、高分子としてＰＶＡを使用し、腫瘍組織に選択的に集積することができ、且つ腫瘍組織に送達された後、抗腫瘍活性化合物の担体である高分子との結合が開裂しやすいので、従来の抗腫瘍活性化合物−高分子複合体からなる抗腫瘍剤と比べて、抗腫瘍活性が増強され、しかも副作用を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】S-180担癌マウスにおける各臓器の箇所を説明するための写真である。
【図２】ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体を投与して２１時間後のS-180担癌マウスの各臓器の蛍光イメージングの結果を示すin  vivo蛍光イメージ像である。
【図３】ＰＶＡ−ＺｎＰＰを投与して２１時間後のS-180担癌マウスの各臓器におけるＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の組織内分布量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔抗腫瘍活性化合物〕
本発明の抗腫瘍剤に用いることができる抗腫瘍活性化合物としては、ヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する化合物；Ｄ−アミノ酸酸化酵素；アントラサイクリン系抗腫瘍剤；白金系抗腫瘍剤などを用いることができる。
ヘムオキシゲナーゼ阻害活性を有する化合物とは、活性酸素に対する防御因子を産出するヘムオキシゲナーゼの活性を停止させ、担癌宿主の生体防御力で癌細胞を自滅させることができる化合物で、ポルフィリン化合物、金属ポルフィリン誘導体が挙げられる。これらの化合物は、励起光を照射することで、一重項酸素を生成し、癌細胞を死滅させること（光線力学的療法）が可能となる。好ましくは金属ポルフィリン誘導体、より好ましくはＺｎプロトポルフィリンである。
Ｄ-アミノ酸酸化酵素（ＤＡＯ）は、高分子と結合して複合体となすことにより、血中滞留性を上昇させ、また血管内皮へのＤＡＯの吸着性を低減させ、その結果、腫瘍局所へのＤＡＯの選択的集積性を向上させることができる。ＤＡＯ−高分子複合体の投与数時間後にＤＡＯの基質であるＤ−アミノ酸（例えば、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニンなど）を投与すると、腫瘍局所においてＨ２Ｏ２分子が発生し、優れた抗腫瘍効果を発揮することができる。
白金系抗腫瘍剤としては、シスプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、オルマプラチン、サトラプラチン、イソロプラチン、アロプラチン、ロバプラチンなどが挙げられる。
アントラサイクリン系抗生物質は、ストレプトマイセス属微生物に由来する癌化学療法に用いられる、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシンなどを用いることができる。
【００２４】
以上のような化合物の分子量は、通常１００〜１０,０００であるが、高分子と結合して複合体となることにより、いわゆるＥＰＲ効果により、腫瘍組織に集積されることができる。
【００２５】
〔アセトアセチル基含有ポリビニルアルコール（ＡＡ化ＰＶＡ）〕
アセトアセチル基含有ポリビニルアルコール（ＡＡ化ＰＶＡ）とは、通常、ポリビニルアルコールの側鎖にアセトアセチル基を有するものである。
アセトアセチル基に含まれる２つのカルボニル基は、ヒドラジンと反応してイミン結合を形成することができる。
【００２６】
ＡＡ化ＰＶＡは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）とジケテンとを公知の方法で反応させて得ることができ、例えばＰＶＡを酢酸溶媒中に分散させておき、これにジケテンを添加する方法、ＰＶＡをジメチルホルムアミド、またはジオキサンなどの溶媒にあらかじめ溶解しておき、これにジケテンを添加することにより製造することができる。またＰＶＡにジケテンガスまたは液状ジケテンを直接接触させてＡＡ化ＰＶＡを得る方法やＰＶＡのアルコール溶剤のケン化スラリーに硫酸などの酸触媒を加えてアセト酢酸エステルをエステル交換させて、ＡＡ化ＰＶＡを得ることもできる。
尚、本発明で用いるポリビニルアルコールは、通常一般の水溶性を有する酢酸ビニルエステル重合体のケン化物を意味するが、水溶性を損なわない程度、且つ生体に対する作用に影響を与えない範囲内であれば、他のモノマーにより共重合または後変性された変性ＰＶＡも包含する概念である。
【００２７】
本発明で用いられるＡＡ化ＰＶＡの平均重合度（ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠）は、特に限定しないが、通常５０〜２０００、好ましくは５０〜１,５００、特に好ましくは１００〜１,０００である。平均重合度が小さくなりすぎると、腎糸球体濾過により腎排出を受け、複合体としてのＥＰＲ効果が得られにくくなる。また、正常組織の血管壁から漏れ出し、副作用の原因ともなる。一方、平均重合度が大きくなりすぎると、細網内皮系（ＲＥＳ）により捕捉され、ＥＰＲ効果が得られず、体外へ代謝、排出されやすくなる。
【００２８】
本発明で用いられるＡＡ化ＰＶＡの４重量％水溶液粘度は、通常１．５〜１００ｍＰａ・ｓであり、好ましくは２〜５０ｍＰａ・ｓ、更に好ましくは３〜２０ｍＰａ・ｓである。
なお、本明細書において、ＡＡ化ＰＶＡの４重量％水溶液粘度は、ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定した２０℃における粘度である。
【００２９】
ケン化度は、ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定値において、通常８０〜１００モル％、好ましくは９０〜１００モル％、特に好ましくは９５〜１００モル％である。ケン化度が低くなりすぎると、水溶性が低下し、生体親和性も低下する傾向にある。
【００３０】
ＡＡ化ＰＶＡに含まれるアセトアセチル基の含有量（ＡＡ化度）は、通常０．１〜１０モル％、好ましくは０．１〜７モル％、特に好ましくは０．２〜５モル％である。アセトアセチル基は、抗腫瘍活性化合物との結合形成部分となることから、ＡＡ化度が低すぎると、高分子に担持できる活性化合物量が少なくなる。一方、ＡＡ化度が高くなりすぎると、水溶性が低下する傾向にある。
【００３１】
以上のような構成を有するＡＡ化ＰＶＡとしては、市販品（例えば、日本合成化学工業社製の「ゴーセネックス（商品名）」Ｚシリーズなど）を用いてもよい。
【００３２】
〔ＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体〕
ＰＶＡと抗腫瘍活性化合物との結合は、ＡＡ化ＰＶＡとヒドラジン含有活性化合物とを反応させることにより行う。下記化学反応式は、かかる反応の一例である。
【００３３】
【化３】
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【００３４】
ヒドラジン含有活性化合物は、活性化合物のカルボニルに、ジアゾニウム塩等を作用させることにより合成することができる。
ヒドラジン含有活性化合物のヒドラジンとＡＡ化ＰＶＡのアセトアセチル基に含まれるカルボニルの少なくとも１つと反応し、イミン結合（下記（１）式）を含む下記（２）及び（２’）式で表される有機基団からなる連結部を形成して、ＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体を生成する。
【００３５】
【化１】
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【化２】
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【００３６】
上記（２）及び（２’）式で表される連結部分において、イミン結合部分はメチレンカルボニル基に隣接しているため、通常のカルボニル結合やアミド結合と比べて結合エネルギーが小さく、腫瘍組織部の弱酸性ｐＨにて、より容易に開裂することが可能な部分となる。
腫瘍組織物に到達した後、イミン結合が容易に開裂される結果、開裂されずに高分子−抗腫瘍活性化合物複合体のままで存在し続ける抗腫瘍剤と比べて、抗腫瘍活性が増強され、高分子に起因する副作用を低減することが期待できる。
【００３７】
ＰＶＡにおける活性化合物の導入量（担持量）は、ＡＡ化度に依存し、通常、０．１〜１０モル％、好ましくは０．１〜７モル％、特に好ましくは０．２〜５モル％である。
アセチアセチル基の反応率は、反応条件、ＡＡ化度などにもよるが、一般に、５０〜１００％である。ＡＡ化度が高い場合、アセトアセチル基が残存する場合がある。しかしながら、アセトアセチル基は、生体内における毒性が低く、未置換のＰＶＡ、ＰＥＧなどと比べて、問題となるような毒性は生じにくい。
【００３８】
〔抗腫瘍剤〕
本発明に係る抗腫瘍剤は、以上のようにして合成されるＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体を有効成分として含有するものである。剤型は特に限定しないが、ＰＶＡが水溶性であることから、水溶液、弱アルカリ性溶液として用いることができる。したがって、ＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体は、注射剤、点滴用薬液として用いることができる。
注射用製剤で調製する場合、有効成分であるＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体を含む無菌の水溶液の形に製剤化することができる。液体担体としては、例えば、水、生理食塩水、グルコース水溶液等が好ましく用いられる。
【００３９】
投与量は、抗腫瘍活性化合物の種類、剤型、投与方法等により異なるが、例えば活性化合物として亜鉛プロトポルフィリンを用いる場合、ヒトに対しては亜鉛プロトポルフィリン換算で体表面積（平方メートル）あたり１０〜２００ｍｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇを静脈内に投与することが好ましい。
【００４０】
抗腫瘍活性化合物として、ポルフィリン化合物、金属ポルフィリン誘導体を用いる場合、投与後、目的とする腫瘍組織部位に、該当化合物の吸収帯（例えば、亜鉛−プロトポルフィリンの場合は４２０〜４３０ｎｍ程度の青色光）を含む光線を照射する（光線力学的療法）。照射光源としては、有機ＥＬ照明、ＬＥＤ照明、ハロゲンランプ、キセノンランプ、蛍光灯、レーザーなどが用いられる。レーザとしては、色素レーザ、半導体レーザ、アルゴンレーザなど、励起に必要な波長の光線が得られるものであればよい。
【００４１】
本発明の抗腫瘍剤は、ＥＰＲ効果により、腫瘍組織に選択的に蓄積する。そして、腫瘍組織において、イミン結合が開裂する。抗腫瘍活性化合物単体は複合体の場合よりも高い活性を示すことができる。一方、遊離したＰＶＡは、水溶性の特性に従い、体液、血液に溶解し、体外へ放出される。
以上のように、本発明の抗腫瘍剤の有効成分であるＰＶＡ−抗腫瘍活性化合物複合体は、ＰＶＡと抗腫瘍活性化合物を連結しているイミン結合がメチレンカルボニル基に隣接しているので、ジアミド結合と比べて開裂しやすい。このことは、腫瘍組織に送達された後、早期に開裂し、水溶性高分子であるＰＶＡは体外に排出されることを意味する。これにより、抗腫瘍作用の強い抗腫瘍活性化合物を腫瘍組織に集積させることが可能となる。つまり、ジアミド結合をもつ非開裂型の高分子−抗腫瘍活性化合物と比べて、より高い抗腫瘍効果が期待でき、さらに、高分子に起因する副作用も軽減できる。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、実施例の記載に限定されるものではない。
尚、実施例中、「部」「％」とあるのは、断りのない限り重量基準を意味する。
【００４３】
実施例１：
＜ＡＡ化ＰＶＡの合成＞
ケン化度９７．３モル％（ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定）、平均重合度３００（ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定）のＰＶＡ系樹脂を、ニーダーに１００部仕込み、これに酢酸３０部を入れ、膨潤させ、回転数２０ｒｐｍで撹拌しながら、６０℃に昇温後、ジケテン２部を２時間かけて滴下し、更に３０分間反応させた。反応終了後メタノール６００部で洗浄した後７０℃で８時間乾燥し、アセトアセチル化ＰＶＡ系樹脂を得た。
得られたＡＡ化ＰＶＡ系樹脂のＡＡ化度は０．３モル％、ケン化度は９７．３モル％、４％粘度（ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定した２０℃における粘度）３．５ＭＰａ・ｓ濃度４％、２３℃にて測定したｐＨ４．９であった。
【００４４】
＜ヒドラジン含有亜鉛プロトポルフィリン（ZnPP−ヒドラジン）の合成＞
プロトポルフィリンＩＸ（PP）をテトラヒドロフラン中、氷冷・撹拌下に、トリエチルアミンおよびクロロギ酸エチルを滴下した。１０分間撹拌後、ろ紙で不要物を取り除き、溶媒留去した。テトラヒドロフランに再溶解後、撹拌下にｔ−ブチルカルバゼートを加え、３０分間撹拌した。溶媒留去後、テトラヒドロフランに再溶解した。これを石油エーテル中に加え、撹拌、遠心分離を行いデカンテーションし、プロトポルフィリン−ヒドラジド−ｔ−ブトキシカルボニル（PP-hydrazide-BOC）を得た。
次に、プロトポルフィリン−ヒドラジド−ｔ-ブトキシカルボニル（PP-hydrazide-BOC）をトリフルオロ酢酸に溶解し、２０分間撹拌した。これを石油エーテルに加え、遠心分離を行いデカンテーションし、プロトポルフィリン−ヒドラジン（PP-hydrazine）を得た。
得られたプロトポルフィリン−ヒドラジンをＤＭＳＯに溶解し、５０℃での撹拌下で塩化亜鉛を加えて、３時間撹拌した。これをジエチルエーテルに加えて撹拌し、遠心分離を行いデカンテーション後、蒸留水を加え、凍結乾燥し、ヒドラジン含有Ｚｎ結合ポルフィリン（ＺｎＰＰ−ヒドラジン）を得た。
【００４５】
＜ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の合成＞
上記で合成したＡＡ化ＰＶＡ（４７７ｍｇ）をＤＭＳＯ中、６０℃で完全に溶解し、室温に戻した後、上記で合成したＺｎＰＰ−ヒドラジン（２５ｍｇ）を加え、トリフルオロ酢酸（１０μＬ）を加え、２４時間反応させた。次いで、ＤＭＦを加えた反応液を、ジエチルエーテルに加え、沈殿物を回収する。回収した沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥して粉末（ＰＶＡ-ＺｎＰＰ複合体）を得た。かかる粉末の吸光度から、ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体中のＺｎＰＰ含有量は２．２％であった。
【００４６】
＜ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の評価＞
Ｓ−１８０細胞（マウス肉腫細胞）をマウス背部皮下に移植した担癌マウス（Ｓ−１８０担癌マウス）の背部を剃毛した後に、除毛クリームを用いて除毛した。上記で合成したＰＶＡ−ＺｎＰＰをＰＢＳに溶解し、投与量が１５ｍｇ／ｋｇ  ＺｎＰＰ当量となるように尾静脈より投与した。経時的（０．５ｈ，２ｈ，６ｈ，１５ｈ，２０ｈ）にイソフルランを用い吸入麻酔し、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置（ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ）を用いて蛍光イメージングを行った。励起波長は４３０ｎｍ±３０ｎｍ、蛍光フィルタは６９５−７７０ｎｍのフィルタを使用した。その結果を図２に示す。図１はＳ−１８０担癌マウスを撮像した写真であり、各臓器の箇所を符号で示した。図１中、１は腫瘍、２は肺、３は肝臓、４は心臓、５は腎臓、６は脾臓を示している。図２において、いずれのマウスについても、他の正常臓器と比べて、腫瘍部分の蛍光強度（単位は下記式）が高い（写真において、白い部分ほど、蛍光強度が高い）ことが確認できた。下記式中、ｐは光子数、ｓｒは立体角、μＷは励起光の照射強度を示している。
【００４７】
【数１】
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【００４８】
投与２１時間後にエーテル麻酔により屠殺し、開腹後にＰＢＳを用いてかん流した。各臓器を摘出後に臓器１００ｍｇ当たりに９００μｌのＤＭＳＯを加え、ホモジナイザーで臓器を破砕した。遠心分離（１２０００ｇ，１０ｍｉｎ）後、上清１０μｌをとり、ＤＭＳＯを用いて２００倍希釈し、蛍光分光光度計（励起：４２０ｎｍ、蛍光：５９０ｎｍ）を用いて、ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の定量を行った。結果を図3及び表１に示す。これらの結果から、腫瘍、肝臓にＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体が集積されていることがわかる。
【００４９】
【表１】
2016113374.tif 000009
【００５０】
比較例１：
高分子として、平均重合度（ＪＩＳ  Ｋ６７２６に準拠して測定）１３００、ケン化度９９．８モル％（（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム基準、Ｄ２Ｏ溶媒を用いてＮＭＲにて測定）、アミン変性率８．８モル％のアミン変性ポリビニルアルコール（Ｎ−ＰＶＡ）を用いた。アミン変性ポリビニルアルコールは、ビニルアルコールとビニルアミンとの共重合体に該当し、下記式に示すように、側鎖にビニルアルコール由来のＯＨ基とビニルアミン由来のＮＨ２基を有している。
【００５１】
【化４】
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【００５２】
＜カルボキシル基含有亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ−ＣＯＯＨ）の合成＞
プロトポルフィリンIX（３００ｍｇ）をＤＭＳＯ（１５０ｍｌ）に完全に溶解し、７０℃に加温した。酢酸亜鉛（９ｇ）を添加し、攪拌しながら、２時間反応させた。室温に戻した後、トリフルオロ酢酸（３００μｌ）を添加した。得られた反応物を氷冷した超純水（４５０ｍｌ）に加え、反応生成物であるカルボキシル基含有亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ−ＣＯＯＨ）を沈澱させた。この沈澱物を超純水（１００ｍｌ）で洗浄した。
【００５３】
＜Ｎ−ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の合成＞
アミン変性ＰＶＡ（５００ｍｇ）をＤＭＳＯ（５０ｍl）中、６０℃で完全に溶解し、室温に戻した後、上記で合成したＺｎＰＰ−ＣＯＯＨ（２５ｍｇ）を加えた。これに、トリエチルアミン（３６μｌ）及び水溶性カルボジイミド（５０ｍｇ）を添加し、５０℃にて１２時間処理した。反応物にＤＭＦ（５０ｍｌ）を加え、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）中に攪拌下に滴下して沈殿物を得た。沈殿物をＤＭＦ（２５ｍｌ）で洗浄後に超純水を加え、Ｎ−ＰＶＡ−ＺｎＰＰ水溶液を得た。限外ろ過にて低分子不純物を除き、凍結乾燥によりＮ−ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の粉末を得た。
【００５４】
＜Ｎ−ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体の評価＞
雄性の５週齢ｄｄＹマウスに対し、マウス体重１ｋｇあたりにＺｎＰＰ量換算で、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１５ｍｇを尾静脈より投与した。全投与量において、投与直後から全身状態の悪化がみられ、数時間内に全マウスが死亡した。
アミド結合は結合エネルギーが高いため、Ｎ−ＰＶＡ−ＺｎＰＰ複合体が開裂されず、組織内にとどまったこと、アミノ基は毒性が高いため、アミド結合を形成せずに残存したアミノ基の毒性が作用したためと推測される。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分である高分子−抗腫瘍活性化合物において、高分子としてＰＶＡを使用し、且つＰＶＡと抗腫瘍活性化合物とが、より開裂しやすいイミン結合により結合しているので、腫瘍組織に送達された後、比較的早期に結合が開裂して、活性化合物を放出できる。従って、抗腫瘍活性が高く、副作用が少なくて済むので、抗腫瘍剤として有効である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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