(57)【要約】【課題】腸内菌叢について、どの年代の状態にあるかを判定する方法の提供。【解決手段】糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する９３の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して、腸内菌叢が、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定または推定する判定工程を有する、腸内菌叢の年代判定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して、腸内菌叢が、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の年代判定方法であって、
前記判定工程において、
（ａ）下記（１）〜（１４）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には離乳前タイプと判定、
（ｂ）下記（１５）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１０歳代タイプと判定、
（ｃ）下記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には７０歳代タイプと判定、
（ｄ）下記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には８０歳代タイプと判定、
（ｅ）下記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には９０歳代タイプと判定、
（ｆ）下記（８３）〜（９１）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１００歳代タイプと判定、
（ｇ）下記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値未満の場合には離乳前タイプと判定、
から選択されるいずれか一以上の判定を行う方法。
（１）Actinomyces属
（２）Varibaculum属
（３）Rothia属
（４）Bifidobacterium属
（５）Eggerthella属
（６）Slackia属
（７）Gemella属
（８）Granulicatella属
（９）Lactococcus属
（１０）Clostridium属
（１１）Dorea属
（１２）Veillonella属
（１３）Klebsiella属
（１４）Serratia属
（１５）Abiotrophia属
（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（１７）Acidaminococcus属
（１８）Helcococcus属
（１９）Coprobacillus属
（２０）Morganella属
（２１）Proteus属
（２２）Trueperella属
（２３）Adlercreutzia属
（２４）Atopobium属
（２５）Rikenella属
（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（２８）Mucispirillum属
（２９）Lactobacillus属
（３０）Streptococcus属
（３１）Christensenella属
（３２）Candidatus Arthromitus属
（３３）Dehalobacterium属
（３４）Epulopiscium属
（３５）Lachnobacterium属
（３６）Lachnospira属
（３７）Peptococcus属
（３８）Peptostreptococcus属
（３９）Anaerotruncus属
（４０）Faecalibacterium属
（４１）Oscillospira属
（４２）Mogibacterium属
（４３）Parvimonas属
（４４）Allobaculum属
（４５）Bulleidia属
（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（４８）Cetobacterium属
（４９）Fusobacterium属
（５０）Paracoccus属
（５１）Acidocella属
（５２）Achromobacter属
（５３）Desulfovibrio属
（５４）Citrobacter属
（５５）Providencia属
（５６）Trabulsiella属
（５７）Aggregatibacter属
（５８）Acinetobacter属
（５９）Methanobrevibacter属
（６０）Corynebacterium属
（６１）Paludibacter属
（６２）Porphyromonas属
（６３）Butyricimonas属
（６４）Geobacillus属
（６５）Staphylococcus属
（６６）Pseudoramibacter属
（６７）Moryella属
（６８）Desulfitobacter属
（６９）Filifactor属
（７０）Succiniclasticum属
（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（７２）Anaerococcus属
（７３）Finegoldia属
（７４）Gallicola属
（７５）Peptoniphilus属
（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（７７）Holdemania属
（７８）Sneathia属
（７９）Comamonas属
（８０）Janthinobacterium属
（８１）Campylobacter属
（８２）Pyramidobacter属
（８３）Parabacteroides属
（８４）Odoribacter属
（８５）Aerococcus属
（８６）Facklamia属
（８７）Leuconostoc属
（８８）Succinivibrio属
（８９）Pseudomonas属
（９０）Sphaerochaeta属
（９１）Treponema属
（９２）Blautia属
（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
【請求項２】
前記判定工程の（ａ）〜（ｆ）に用いられる基準値が、各年齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判定工程の（ｇ）に用いられる基準値が、離乳前集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１４）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
（１）Actinomyces属：０．１２
（２）Varibaculum属：０．０４
（３）Rothia属：０．０８
（４）Bifidobacterium属：６２．３３
（５）Eggerthella属：０．７７
（６）Slackia属：０．１６
（７）Gemella属：０．０１
（８）Granulicatella属：０．２４
（９）Lactococcus属：１．９０
（１０）Clostridium属：８．８７
（１１）Dorea属：９．４５
（１２）Veillonella属：１．７８
（１３）Klebsiella属：１４．６５
（１４）Serratia属：０．０４
【請求項５】
前記判定工程の（ｂ）における下記（１５）の属に属する菌群に対する前記基準値が下記値である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
（１５）Abiotrophia属：０．０３
【請求項６】
前記判定工程の（ｃ）における下記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０４
（１７）Acidaminococcus属：０．４４
（１８）Helcococcus属：０．０２
（１９）Coprobacillus属：２．５０
（２０）Morganella属：０．０２
（２１）Proteus属：０．０３
【請求項７】
前記判定工程の（ｄ）における下記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
（２２）Trueperella属：０．００
（２３）Adlercreutzia属：０．１７
（２４）Atopobium属：０．０６
（２５）Rikenella属：０．００
（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０７
（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：５．００
（２８）Mucispirillum属：０．０２
（２９）Lactobacillus属：１８．６８
（３０）Streptococcus属：４４．２３
（３１）Christensenella属：０．２９
（３２）Candidatus Arthromitus属：０．０２
（３３）Dehalobacterium属：０．１１
（３４）Epulopiscium属：０．１１
（３５）Lachnobacterium属：２．７６
（３６）Lachnospira属：３．６５
（３７）Peptococcus属：０．８１
（３８）Peptostreptococcus属：０．１７
（３９）Anaerotruncus属：０．１３
（４０）Faecalibacterium属：１９．０１
（４１）Oscillospira属：３．３９
（４２）Mogibacterium属：０．２２
（４３）Parvimonas属：０．１０
（４４）Allobaculum属：０．０９
（４５）Bulleidia属：０．２５
（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１７
（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．００
（４８）Cetobacterium属：０．０２
（４９）Fusobacterium属：１．７４
（５０）Paracoccus属：０．００
（５１）Acidocella属：０．０３
（５２）Achromobacter属：０．００
（５３）Desulfovibrio属：０．９７
（５４）Citrobacter属：１２．５２
（５５）Providencia属：０．００
（５６）Trabulsiella属：０．２５
（５７）Aggregatibacter属：０．１０
（５８）Acinetobacter属：０．０４
【請求項８】
前記判定工程の（ｅ）における下記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
（５９）Methanobrevibacter属：０．０２
（６０）Corynebacterium属：０．０８
（６１）Paludibacter属：０．００
（６２）Porphyromonas属：０．４５
（６３）Butyricimonas属：０．２３
（６４）Geobacillus属：０．００
（６５）Staphylococcus属：２．２５
（６６）Pseudoramibacter属：１．１６
（６７）Moryella属：０．００
（６８）Desulfitobacter属：０．０２
（６９）Filifactor属：０．０２
（７０）Succiniclasticum属：０．０８
（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１６
（７２）Anaerococcus属：０．２９
（７３）Finegoldia属：０．１２
（７４）Gallicola属：０．０１
（７５）Peptoniphilus属：０．４９
（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１５
（７７）Holdemania属：０．２５
（７８）Sneathia属：０．２５
（７９）Comamonas属：０．６０
（８０）Janthinobacterium属：０．０２
（８１）Campylobacter属：０．０７
（８２）Pyramidobacter属：０．０４
【請求項９】
前記判定工程の（ｆ）における下記（８３）〜（９１）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
（８３）Parabacteroides属：１３．４５
（８４）Odoribacter属：１．５６
（８５）Aerococcus属：０．００
（８６）Facklamia属：０．０４
（８７）Leuconostoc属：０．６４
（８８）Succinivibrio属：０．０２
（８９）Pseudomonas属：３．２７
（９０）Sphaerochaeta属：０．００
（９１）Treponema属：０．０１
【請求項１０】
前記判定工程の（ｇ）における下記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
（９２）Blautia属：０．３３
（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０２
【請求項１１】
前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、
選別された前記複数の群のうちの少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の年代判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、腸内菌叢の年代判定方法及び年代判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなど動物の腸内には、多種類の細菌が常在している。これらの常在細菌によって形成される腸内菌叢においては、乳児期にビフィズス菌が増加したり、老人でウェルシュ菌が増加し、ビフィズス菌が減少するなど、成長や加齢に伴い特定の菌群が増減することが知られている。また、宿主の健康状態や宿主が摂取する薬剤、食物等によって腸内菌叢を構成する菌群の種類やその数が変動することも知られている。
【０００３】
このような腸内菌叢については、近年、そのバランスが崩れると腸内環境を悪化させ、便秘症状や下痢症状を発症したり、宿主の免疫機能が低下することなどが明らかとなってきている。これに対し、良好な腸内菌叢の維持や悪化した腸内菌叢を改善する薬剤や飲食物も開発されてきている。例えば、特許文献１には、「ラクトパーオキシダーゼを有効成分とする腸内フローラ改善剤」が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２４６７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１に記載された腸内フローラ改善剤のような腸内菌叢に作用する成分の効能を評価するためには、腸内菌叢の状態が改善しているか否かを判定する必要がある。一方、腸内菌叢を構成する菌群は多様であり、個体差も大きいため、腸内菌叢に含まれる菌群については、未だに同定されていない種もある。このため、腸内菌叢の状態に関してより詳細に判定するために、腸内菌叢の状態と関連する菌群の同定や当該菌群の数の変動を調べることが求められている。特に、老化現象は、多様な症状を含む現象であり、個体差も大きいため、腸内菌叢の状態について、どの位の年代の状態にあるかを判定又は推定するためには、適切な指標を用いることが求められている。そこで、本技術は、腸内菌叢についてどの年代の状態にあるかを判定又は推定する方法等を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討した結果、菌叢全体の菌数に対する各種菌群に属する菌の割合について、各年代において、平均値だけでなく分布範囲についても異なる菌群が存在することを新規に見出し、本技術を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本技術は、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して、腸内菌叢が、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の年代判定方法であって、
前記判定工程において、
（ａ）下記（１）〜（１４）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には離乳前タイプと判定、
（ｂ）下記（１５）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１０歳代タイプと判定、
（ｃ）下記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には７０歳代タイプと判定、
（ｄ）下記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には８０歳代タイプと判定、
（ｅ）下記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には９０歳代タイプと判定、
（ｆ）下記（８３）〜（９１）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１００歳代タイプと判定、
（ｇ）下記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値未満の場合には離乳前タイプと判定、
から選択されるいずれか一以上の判定を行う方法を提供する。
（１）Actinomyces属
（２）Varibaculum属
（３）Rothia属
（４）Bifidobacterium属
（５）Eggerthella属
（６）Slackia属
（７）Gemella属
（８）Granulicatella属
（９）Lactococcus属
（１０）Clostridium属
（１１）Dorea属
（１２）Veillonella属
（１３）Klebsiella属
（１４）Serratia属
（１５）Abiotrophia属
（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（１７）Acidaminococcus属
（１８）Helcococcus属
（１９）Coprobacillus属
（２０）Morganella属
（２１）Proteus属
（２２）Trueperella属
（２３）Adlercreutzia属
（２４）Atopobium属
（２５）Rikenella属
（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（２８）Mucispirillum属
（２９）Lactobacillus属
（３０）Streptococcus属
（３１）Christensenella属
（３２）Candidatus Arthromitus属
（３３）Dehalobacterium属
（３４）Epulopiscium属
（３５）Lachnobacterium属
（３６）Lachnospira属
（３７）Peptococcus属
（３８）Peptostreptococcus属
（３９）Anaerotruncus属
（４０）Faecalibacterium属
（４１）Oscillospira属
（４２）Mogibacterium属
（４３）Parvimonas属
（４４）Allobaculum属
（４５）Bulleidia属
（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（４８）Cetobacterium属
（４９）Fusobacterium属
（５０）Paracoccus属
（５１）Acidocella属
（５２）Achromobacter属
（５３）Desulfovibrio属
（５４）Citrobacter属
（５５）Providencia属
（５６）Trabulsiella属
（５７）Aggregatibacter属
（５８）Acinetobacter属
（５９）Methanobrevibacter属
（６０）Corynebacterium属
（６１）Paludibacter属
（６２）Porphyromonas属
（６３）Butyricimonas属
（６４）Geobacillus属
（６５）Staphylococcus属
（６６）Pseudoramibacter属
（６７）Moryella属
（６８）Desulfitobacter属
（６９）Filifactor属
（７０）Succiniclasticum属
（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（７２）Anaerococcus属
（７３）Finegoldia属
（７４）Gallicola属
（７５）Peptoniphilus属
（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
（７７）Holdemania属
（７８）Sneathia属
（７９）Comamonas属
（８０）Janthinobacterium属
（８１）Campylobacter属
（８２）Pyramidobacter属
（８３）Parabacteroides属
（８４）Odoribacter属
（８５）Aerococcus属
（８６）Facklamia属
（８７）Leuconostoc属
（８８）Succinivibrio属
（８９）Pseudomonas属
（９０）Sphaerochaeta属
（９１）Treponema属
（９２）Blautia属
（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群
前記判定工程の（ａ）〜（ｆ）に用いられる基準値として、各年齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値を用いることができる。
また、前記判定工程の（ｇ）に用いられる基準値として、離乳前集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値を用いることができる。
前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１４）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１）Actinomyces属：０．１２
（２）Varibaculum属：０．０４
（３）Rothia属：０．０８
（４）Bifidobacterium属：６２．３３
（５）Eggerthella属：０．７７
（６）Slackia属：０．１６
（７）Gemella属：０．０１
（８）Granulicatella属：０．２４
（９）Lactococcus属：１．９０
（１０）Clostridium属：８．８７
（１１）Dorea属：９．４５
（１２）Veillonella属：１．７８
（１３）Klebsiella属：１４．６５
（１４）Serratia属：０．０４
前記判定工程の（ｂ）における下記（１５）の属に属する菌群に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１５）Abiotrophia属：０．０３
前記判定工程の（ｃ）における下記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０４
（１７）Acidaminococcus属：０．４４
（１８）Helcococcus属：０．０２
（１９）Coprobacillus属：２．５０
（２０）Morganella属：０．０２
（２１）Proteus属：０．０３
前記判定工程の（ｄ）における下記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、下記の値を用いることができる。
（２２）Trueperella属：０．００
（２３）Adlercreutzia属：０．１７
（２４）Atopobium属：０．０６
（２５）Rikenella属：０．００
（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０７
（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：５．００
（２８）Mucispirillum属：０．０２
（２９）Lactobacillus属：１８．６８
（３０）Streptococcus属：４４．２３
（３１）Christensenella属：０．２９
（３２）Candidatus Arthromitus属：０．０２
（３３）Dehalobacterium属：０．１１
（３４）Epulopiscium属：０．１１
（３５）Lachnobacterium属：２．７６
（３６）Lachnospira属：３．６５
（３７）Peptococcus属：０．８１
（３８）Peptostreptococcus属：０．１７
（３９）Anaerotruncus属：０．１３
（４０）Faecalibacterium属：１９．０１
（４１）Oscillospira属：３．３９
（４２）Mogibacterium属：０．２２
（４３）Parvimonas属：０．１０
（４４）Allobaculum属：０．０９
（４５）Bulleidia属：０．２５
（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１７
（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．００
（４８）Cetobacterium属：０．０２
（４９）Fusobacterium属：１．７４
（５０）Paracoccus属：０．００
（５１）Acidocella属：０．０３
（５２）Achromobacter属：０．００
（５３）Desulfovibrio属：０．９７
（５４）Citrobacter属：１２．５２
（５５）Providencia属：０．００
（５６）Trabulsiella属：０．２５
（５７）Aggregatibacter属：０．１０
（５８）Acinetobacter属：０．０４
前記判定工程の（ｅ）における下記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、下記の値を用いることができる。
（５９）Methanobrevibacter属：０．０２
（６０）Corynebacterium属：０．０８
（６１）Paludibacter属：０．００
（６２）Porphyromonas属：０．４５
（６３）Butyricimonas属：０．２３
（６４）Geobacillus属：０．００
（６５）Staphylococcus属：２．２５
（６６）Pseudoramibacter属：１．１６
（６７）Moryella属：０．００
（６８）Desulfitobacter属：０．０２
（６９）Filifactor属：０．０２
（７０）Succiniclasticum属：０．０８
（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１６
（７２）Anaerococcus属：０．２９
（７３）Finegoldia属：０．１２
（７４）Gallicola属：０．０１
（７５）Peptoniphilus属：０．４９
（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１５
（７７）Holdemania属：０．２５
（７８）Sneathia属：０．２５
（７９）Comamonas属：０．６０
（８０）Janthinobacterium属：０．０２
（８１）Campylobacter属：０．０７
（８２）Pyramidobacter属：０．０４
前記判定工程の（ｆ）における下記（８３）〜（９１）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（８３）Parabacteroides属：１３．４５
（８４）Odoribacter属：１．５６
（８５）Aerococcus属：０．００
（８６）Facklamia属：０．０４
（８７）Leuconostoc属：０．６４
（８８）Succinivibrio属：０．０２
（８９）Pseudomonas属：３．２７
（９０）Sphaerochaeta属：０．００
（９１）Treponema属：０．０１
前記判定工程の（ｇ）における下記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（９２）Blautia属：０．３３
（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０２
本技術に係る判定方法では、前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を行うこともできる。
【０００８】
本技術では、また、前記判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、
選別された前記複数の群のうちの少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の年代判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
なお、本技術で用いる数値は、特に断り書きが無い限り、該数値の下一桁を四捨五入した値である。また、「判定」および「推定」の語句は、本技術においてほぼ同義のものとして用いられるものである。
【発明の効果】
【００１０】
本技術により、腸内菌叢について、どの年代の状態にあるかを判定又は推定する方法等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図２】本技術に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図３】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図４】本技術に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図５】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図６】本技術に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図７】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図８】本技術に係る物質のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
【図９】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図１０】本技術に係る物質のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
【図１１】（１）〜（８）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１２】（９）〜（１４）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１３】（１５）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１４】（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１５】（２２）〜（２９）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１６】（３０）〜（３７）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１７】（３８）〜（４５）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１８】（４６）〜（５３）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図１９】（５４）〜（５８）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２０】（５９）〜（６６）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２１】（６７）〜（７４）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２２】（７５）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２３】（８３）〜（８７）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２４】（８８）〜（９１）の属に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【図２５】（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１３】
＜１．腸内菌叢の年代判定方法＞
本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法では、腸内菌叢について、どの年代の状態にあるかを判定する。図１は、本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法の一例を示すフローチャートである。腸内菌叢の年代判定方法には、少なくとも判定工程Ｓ１２が含まれる。また、本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法では、判定工程Ｓ１２の前に、後述する、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する特定の菌群の割合を測定する測定工程Ｓ１１を有していてもよい。以下、測定工程Ｓ１１と判定工程Ｓ１２について順に説明する。
【００１４】
なお、本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法において、腸内菌叢を構成する菌群の「菌」とは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）及び古細菌（ａｒｃｈａｅａ）を含み、かつ、真菌（ｆｕｎｇｉ）を含まないものである。また、これは、後述する菌群のスクリーニング方法においても同様である。
【００１５】
［ａ．測定工程Ｓ１１］
測定工程Ｓ１１は、糞便検体に含まれる下記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合を測定する工程である。測定対象とする菌群は、（１）Actinomyces属、（２）Varibaculum属、（３）Rothia属、（４）Bifidobacterium属、（５）Eggerthella属、（６）Slackia属、（７）Gemella属、（８）Granulicatella属、（９）Lactococcus属、（１０）Clostridium属、（１１）Dorea属、（１２）Veillonella属、（１３）Klebsiella属、（１４）Serratia属、（１５）Abiotrophia属、（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（１７）Acidaminococcus属、（１８）Helcococcus属、（１９）Coprobacillus属、（２０）Morganella属、（２１）Proteus属、（２２）Trueperella属、（２３）Adlercreutzia属、（２４）Atopobium属、（２５）Rikenella属、（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（２８）Mucispirillum属、（２９）Lactobacillus属、（３０）Streptococcus属、（３１）Christensenella属、（３２）Candidatus Arthromitus属、（３３）Dehalobacterium属、（３４）Epulopiscium属、（３５）Lachnobacterium属、（３６）Lachnospira属、（３７）Peptococcus属、（３８）Peptostreptococcus属、（３９）Anaerotruncus属、（４０）Faecalibacterium属、（４１）Oscillospira属、（４２）Mogibacterium属、（４３）Parvimonas属、（４４）Allobaculum属、（４５）Bulleidia属、（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（４８）Cetobacterium属、（４９）Fusobacterium属、（５０）Paracoccus属、（５１）Acidocella属、（５２）Achromobacter属、（５３）Desulfovibrio属、（５４）Citrobacter属、（５５）Providencia属、（５６）Trabulsiella属、（５７）Aggregatibacter属、（５８）Acinetobacter属、（５９）Methanobrevibacter属、（６０）Corynebacterium属、（６１）Paludibacter属、（６２）Porphyromonas属、（６３）Butyricimonas属、（６４）Geobacillus属、（６５）Staphylococcus属、（６６）Pseudoramibacter属、（６７）Moryella属、（６８）Desulfitobacter属、（６９）Filifactor属、（７０）Succiniclasticum属、（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（７２）Anaerococcus属、（７３）Finegoldia属、（７４）Gallicola属、（７５）Peptoniphilus属、（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、（７７）Holdemania属、（７８）Sneathia属、（７９）Comamonas属、（８０）Janthinobacterium属、（８１）Campylobacter属、（８２）Pyramidobacter属、（８３）Parabacteroides属、（８４）Odoribacter属、（８５）Aerococcus属、（８６）Facklamia属、（８���）Leuconostoc属、（８８）Succinivibrio属、（８９）Pseudomonas属、（９０）Sphaerochaeta属、（９１）Treponema属、（９２）Blautia属、（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群、のうち少なくともいずれかの属に属するものである。
【００１６】
本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法では、糞便検体として動物から得られたものを用いることができる。動物としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。この中でもヒトから得られる糞便検体が好ましい。
【００１７】
本工程Ｓ１１では、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合を求める。全菌数及び上記割合は、例えば、下記の手法により求めることができる。
【００１８】
〔（１）〜（９３）の属に属する菌群の測定〕
糞便検体に含まれる菌のうち、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群に分類される菌の数は、公知の手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、菌の分類については、リボソームを構成する小型のサブユニット（１６Ｓ）に存在するＲＮＡをコードする遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列に基づき、各々の菌を、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する各々の菌群、その他の菌群に分けることができる。また、糞便検体に含まれる各々の菌群の菌数の算出についても、例えば、糞便検体中に含まれる、各々の菌に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量やコピー数を定量することにより行うこともできる。菌数の算出について、以下に例を挙げる。
【００１９】
塩基配列に基づき菌数を算出するためには、先ず、糞便検体に含まれる菌群のＤＮＡを抽出する。糞便検体からのＤＮＡの抽出は、公知の手法を用いて行うことができ、その手法は特に制限されない。例えば、フェノール・クロロホルムを用いる抽出法により、糞便検体からＤＮＡを抽出することができる。本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法においては、フェノール・クロロホルムを用いる抽出方法によりＤＮＡを抽出することが好ましい。
【００２０】
また、フィルターを備えるスピンカラムなどを用いて、糞便検体からＤＮＡを抽出してもよい。なお、本工程Ｓ１１では、ＤＮＡの抽出は必須の工程ではなく、予め糞便検体から抽出されたＤＮＡ溶液を試料とすることもできる。
【００２１】
糞便検体から得られるＤＮＡについては、菌数の測定に必要なＤＮＡ量又はコピー数を得るために、核酸増幅反応を行うことが好ましい。ＤＮＡの増幅については、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等、公知の手法を用いて行うことができ、核酸増幅反応において用いるプライマーについても、公知の設計手法を用いて設計することができる。さらに、核酸増幅反応の際に、ＤＮＡの解析に必要な配列を増幅核酸鎖に組み込ませるように、プライマーを設計してもよい。
【００２２】
上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群に分類される菌の数は、例えば、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡを鋳型とする定量的ＰＣＲ法やＴ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法によって行うことができる。定量的ＰＣＲ法では、各々の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち特異的な配列部分に結合するプライマーを用い、核酸増幅反応を行うことにより、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。またＴ−ＲＦＬＰ法では、末端に標識が付されたプライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各菌群に特異的な配列部分を含む増幅核酸鎖を生成し、得られた増幅核酸鎖を制限酵素で処理し、断片化してサイズの異なるＤＮＡ断片とする。このＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、泳動パターンにおける各々のピークの同定とピーク強度から、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。
【００２３】
また、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡについては、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出してもよい。この他、ＤＮＡマイクロアレイを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出することもできる。
【００２４】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数は、上述した方法の他に、シーケンサーを用いて糞便検体から抽出されたＤＮＡの塩基配列を決定し、特定の配列を解読した回数から求めることもできる。また、シーケンサーを用いる方法の場合、同じ操作によって、糞便検体に含まれる上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子についても解読することができる。このため、糞便検体に含まれる上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数も併せて求めることができる。
【００２５】
シーケンサーを用いる方法としては、例えば、クローンライブラリー法、ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ／Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、メタゲノム解析等がある。クローンライブラリー法では、糞便検体から抽出されたＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の、各々の菌群に特異的な配列部分を増幅して、得られた増幅核酸鎖をプラスミドに挿入して、増幅核酸鎖を含むプラスミドの塩基配列を解読する。ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ法では、クローンライブラリー法と同様にＤＮＡを増幅し、得られた核酸鎖を電気泳動によって核酸鎖の配列に応じて分離し、バンドを切り出して、ゲル内のＤＮＡを回収して当該ＤＮＡの塩基配列を決定する。メタゲノム解析では、糞便検体から得られたＤＮＡを断片化して、必要に応じて核酸増幅反応等を行った後、各々のＤＮＡ断片又は増幅核酸鎖の塩基配列を決定する。
【００２６】
上述した塩基配列の決定は、サンガー法の原理を利用したシーケンサーで行うこともでき、また、次世代シーケンサーで行うこともできる。特にメタゲノム解析は、解読性能がより高い次世代シーケンサーで行うことが好ましい。
【００２７】
シーケンサーを用いて解読された塩基配列から菌群を同定する場合には、解析ソフトウェアやデータベース等を利用する公知の解析方法を利用することができる。データベースとしては、例えば、Genbank、ENA、DDBJ等が挙げられる。また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特化したデータベースであるGreengenes database 等も利用することができる。
糞便検体から得られるＤＮＡの解析結果を、これらのデータベースに蓄積された菌群の塩基配列に対して相同性検索することにより、糞便検体に含まれる菌群を同定することができる。いずれかの菌群に同定された配列のうち、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子として同定された配列のコピー数を、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の数とすることができる。
【００２８】
〔糞便検体に含まれる全ての菌の数の測定〕
糞便検体に含まれる全ての菌の数の測定は、公知の手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、上述したシーケンサーを用いる方法においては、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列中、糞便検体に含まれる菌で共通の塩基配列部分に結合するプライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を解読することにより、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数も算出することができる。このため、糞便検体に含まれる全菌数は、例えば、糞便検体で測定される全ての菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数の和としてもよい。また、顕微鏡等を用いて、糞便検体に含まれる菌を数えることによって、糞便検体に含まれる全ての菌の数を求めることもできる。本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法においては、測定工程Ｓ１１に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解読する工程を有する方法が好ましい。なお、本工程Ｓ１１に用いられる糞便検体は、採取後に培養操作が行われていない検体が望ましい。培養操作において、各々の菌の増殖率が異なることによって、採取時の糞便検体における各菌の割合が変化してしまうおそれがあるためである。
【００２９】
〔割合の算出〕
糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の各々の割合とは、糞便検体に含まれる全菌数を「１」としたときの相対値である。従って、上記割合は、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の各々に分類された菌の数と糞便検体に含まれる全菌数から求めることができる。また、上述したように、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数と、糞便検体に含まれる全て菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数とから上記割合を求めることもできる。なお、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群が検出されなかった場合には、その菌群の割合は０とする。また、算出された割合の小数第３位以下の数値は、本技術の判定に大きく影響するものではないため、例えば、０．００４以下の場合、割合を「０．００」として判定に用いることも可能である。
【００３０】
［ｂ．判定工程Ｓ１２］
判定工程Ｓ１２は、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して、腸内菌叢が、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定または推定する工程である。本技術に係る年代判定方法において、上述した菌群の割合は、測定工程Ｓ１１によって求めることもできし、予め求められた前記割合を用いることも可能である。
【００３１】
判定工程Ｓ１２においては、下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれか一以上の判定または推定を行う。
（ａ）前記（１）〜（１４）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には離乳前タイプと判定、
（ｂ）前記（１５）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１０歳代タイプと判定。
（ｃ）前記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には７０歳代タイプと判定。
（ｄ）前記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には８０歳代タイプと判定。
（ｅ）前記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には９０歳代タイプと判定。
（ｆ）前記（８３）〜（９１）の属に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には１００歳代タイプと判定。
（ｇ）前記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値未満の場合には離乳前タイプと判定。
【００３２】
本工程Ｓ１２で用いる基準値とは、予め定められた値であれば、算出方法等は特に限定されないが、例えば、測定工程Ｓ１１で測定対象として選択した菌群ごとに、下記に記載の基準値を採用することもできる。
判定工程Ｓ１２の（ａ）〜（ｆ）に用いられる基準値を、各年齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値とする。
判定工程Ｓ１２の（ｇ）に用いられる基準値を、離乳前集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値とする。
【００３３】
各年齢集団については、集団の大きさは特に限定されず、少なくとも２以上の糞便検体が、授乳状態及び各年齢に基づいて一つの集団に含まれていればよい。より精度の高い基準値を得るためには、例えば検体数は１００以上、好ましくは２００以上、より好ましくは５００以上である。
【００３４】
前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１４）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１）Actinomyces属：０．１２
（２）Varibaculum属：０．０４
（３）Rothia属：０．０８
（４）Bifidobacterium属：６２．３３
（５）Eggerthella属：０．７７
（６）Slackia属：０．１６
（７）Gemella属：０．０１
（８）Granulicatella属：０．２４
（９）Lactococcus属：１．９０
（１０）Clostridium属：８．８７
（１１）Dorea属：９．４５
（１２）Veillonella属：１．７８
（１３）Klebsiella属：１４．６５
（１４）Serratia属：０．０４
【００３５】
前記判定工程の（ｂ）における下記（１５）の属に属する菌群に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１５）Abiotrophia属：０．０３
【００３６】
前記判定工程の（ｃ）における下記（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（１６）Peptococcaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０４
（１７）Acidaminococcus属：０．４４
（１８）Helcococcus属：０．０２
（１９）Coprobacillus属：２．５０
（２０）Morganella属：０．０２
（２１）Proteus属：０．０３
【００３７】
前記判定工程の（ｄ）における下記（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、下記の値を用いることができる。
（２２）Trueperella属：０．００
（２３）Adlercreutzia属：０．１７
（２４）Atopobium属：０．０６
（２５）Rikenella属：０．００
（２６）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号２に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０７
（２７）Bacteroidale目Paraprevotellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号３に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：５．００
（２８）Mucispirillum属：０．０２
（２９）Lactobacillus属：１８．６８
（３０）Streptococcus属：４４．２３
（３１）Christensenella属：０．２９
（３２）Candidatus Arthromitus属：０．０２
（３３）Dehalobacterium属：０．１１
（３４）Epulopiscium属：０．１１
（３５）Lachnobacterium属：２．７６
（３６）Lachnospira属：３．６５
（３７）Peptococcus属：０．８１
（３８）Peptostreptococcus属：０．１７
（３９）Anaerotruncus属：０．１３
（４０）Faecalibacterium属：１９．０１
（４１）Oscillospira属：３．３９
（４２）Mogibacterium属：０．２２
（４３）Parvimonas属：０．１０
（４４）Allobaculum属：０．０９
（４５）Bulleidia属：０．２５
（４６）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号４に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１７
（４７）Erysipelotrichaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号５に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．００
（４８）Cetobacterium属：０．０２
（４９）Fusobacterium属：１．７４
（５０）Paracoccus属：０．００
（５１）Acidocella属：０．０３
（５２）Achromobacter属：０．００
（５３）Desulfovibrio属：０．９７
（５４）Citrobacter属：１２．５２
（５５）Providencia属：０．００
（５６）Trabulsiella属：０．２５
（５７）Aggregatibacter属：０．１０
（５８）Acinetobacter属：０．０４
【００３８】
前記判定工程の（ｅ）における下記（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、下記の値を用いることができる。
（５９）Methanobrevibacter属：０．０２
（６０）Corynebacterium属：０．０８
（６１）Paludibacter属：０．００
（６２）Porphyromonas属：０．４５
（６３）Butyricimonas属：０．２３
（６４）Geobacillus属：０．００
（６５）Staphylococcus属：２．２５
（６６）Pseudoramibacter属：１．１６
（６７）Moryella属：０．００
（６８）Desulfitobacter属：０．０２
（６９）Filifactor属：０．０２
（７０）Succiniclasticum属：０．０８
（７１）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号６に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１６
（７２）Anaerococcus属：０．２９
（７３）Finegoldia属：０．１２
（７４）Gallicola属：０．０１
（７５）Peptoniphilus属：０．４９
（７６）Clostridiales目Tissierellaceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号７に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．１５
（７７）Holdemania属：０．２５
（７８）Sneathia属：０．２５
（７９）Comamonas属：０．６０
（８０）Janthinobacterium属：０．０２
（８１）Campylobacter属：０．０７
（８２）Pyramidobacter属：０．０４
【００３９】
前記判定工程の（ｆ）における下記（８３）〜（９１）の属に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（８３）Parabacteroides属：１３．４５
（８４）Odoribacter属：１．５６
（８５）Aerococcus属：０．００
（８６）Facklamia属：０．０４
（８７）Leuconostoc属：０．６４
（８８）Succinivibrio属：０．０２
（８９）Pseudomonas属：３．２７
（９０）Sphaerochaeta属：０．００
（９１）Treponema属：０．０１
【００４０】
前記判定工程の（ｇ）における下記（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の各々に対する前記基準値としては、例えば、下記の値を用いることができる。
（９２）Blautia属：０．３３
（９３）Lachnospiraceae科１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号８に記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する菌群：０．０２
【００４１】
判定工程Ｓ１２においては、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうちいずれか一つの菌群の割合について、基準値と比較すれば判定結果を得ることができるが、複数種類の菌群の上記割合の各々と、これらの菌群に対する各基準値と、を比較して判定または推定してもよい。
例えば、離乳前タイプであるか否かの判定に用いられる上記（１）〜（１４）、（９２）及び（９３）の属又は菌群に属する菌群の中から、複数の菌群を選択して、離乳前タイプであるか否かの判定または推定を行ってもよい。また、例えば、各年代毎に、１又は複数の菌群を選択して、腸内菌叢をどの年代の状態にあるかを判定または推定することもできる。
【００４２】
以上説明した本技術に係る腸内菌叢の年代判定方法においては、測定対象とした菌群の前記割合に基づいて、腸内菌叢について、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定することができる。腸内菌叢の年代タイプを判別することによって、例えば、腸内菌叢の状態の把握が容易となり、予防医療や治療方針の決定等に貢献することができる。また、腸内菌叢の年代タイプを判別することは、後述する菌群のスクリーニング方法や物質のスクリーニング方法において、好適に用いられ得る。
【００４３】
＜２．菌群のスクリーニング方法＞
本技術に係る菌群のスクリーニング方法は、腸内菌叢に含まれる菌群のうち、腸内菌叢について、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプに判定するための年代判定マーカーとなる菌群を探索する方法である。
図２は、本技術に係る菌群のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
【００４４】
菌群のスクリーニング方法には、少なくとも選別工程Ｓ２１及び菌群同定工程Ｓ２２が含まれる。なお、年代判定マーカーとは、腸内菌叢について、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれかの状態にあるかを判定するためのマーカーのうち、少なくとも一以上に該当するものである。
［ａ．選別工程Ｓ２１］
【００４５】
選別工程Ｓ２１は、糞便検体について、上述した腸内菌叢の年代判定方法の結果に基づき糞便検体を複数の群に分ける工程である。腸内菌叢の判定については、上述した通りである。選別工程Ｓ２１の一例を図３に示す。
【００４６】
図３に示す選別工程Ｓ２１の一例では、上述した（１）〜（１４）、（９２）及び（９３）の属又は菌群に属する菌群のうちいずれか一つの上記割合を用いて、糞便検体を離乳前タイプに該当するか否かによって分ける。例えば、離乳前タイプに該当する糞便検体を第１群とし、離乳前タイプに該当しない糞便検体を第２群とする。図３では、離乳前タイプに該当するか否かによって糞便検体を２群に分けているが、選別工程Ｓ２１では、上述した（１５）〜（９１）の属又は菌群に属する菌群の前記割合を用いて、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれかのタイプに該当するか否かによって糞便検体を分けてもよい。
なお、図３と後述する図５、図７及び図９における第１群〜第７群は、選別工程Ｓ２１によって分けられる糞便検体の各群に便宜的に付したものにすぎず、各数字に意味はない。
【００４７】
本技術に係る菌群のスクリーニング方法では、選別工程Ｓ２１において、２種類の菌種の上記割合を用いてもよい。この場合、選別工程Ｓ２１は、第１選別工程Ｓ２１−ａと、第２選別工程Ｓ２１−ｂの２工程を含んでいてもよい（図４参照）。図５に、選別工程Ｓ２１が２工程からなる場合の一例を示す。図５に示す選別工程Ｓ２１では、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて、離乳前タイプであるか否かによって糞便検体を２群に分ける。さらに、第２選別工程Ｓ２１−ｂでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて離乳前タイプに該当しないものとして分けられた糞便検体について、１０歳代タイプに該当するか否かで２群に分ける。
【００４８】
このように複数の菌種の上記割合を用いることで、糞便検体を３群に分けることができる。なお、図５においては、離乳前タイプと判定するための菌種と１０歳代タイプと判定するための菌種とを組み合わせているが、本技術に係る菌群のスクリーニング方法では、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群うち、いずれを組み合わせてもよい。また、選別工程Ｓ２１において用いられる菌種の順序は、特に限定されない。これは、後述する図７に示す選別工程Ｓ２１についても同様である。
【００４９】
本技術に係る菌群のスクリーニング方法では、さらに、選別工程Ｓ２１において、２種類の菌種の上記割合を用いて、糞便検体を４群に分けてもよい。この場合、選別工程Ｓ２１は、第１選別工程Ｓ２１−ａ、第２選別工程Ｓ２１−ｂ及び第３選別工程Ｓ２１−ｃの３工程を含んでいてもよい（図６参照）。図７に、選別工程Ｓ２１が３工程からなる場合の一例を示す。図７に示す選別工程Ｓ２１では、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて、離乳前タイプであるか否かによって糞便検体を２群に分ける。
【００５０】
次に、第２選別工程Ｓ２１−ｂでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて離乳前タイプに該当しないものとして分けられた糞便検体について、１０歳代タイプに該当するか否かで２群に分ける。さらに、第３選別工程Ｓ２１−ｃでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて離乳前タイプに該当するものとして分けられた糞便検体について、１０歳代タイプに該当するか否かで２群に分ける。このように複数の菌種の上記割合を用いることで、糞便検体を４群に分けることができる。
【００５１】
本技術に係る菌群のスクリーニング方法では、さらに、選別工程Ｓ２１において、６種類の菌種の上記割合を用いて、糞便検体を７群に分けてもよい。この場合、選別工程Ｓ２１は、第１選別工程Ｓ２１−ａ、第２選別工程Ｓ２１−ｂ、第３選別工程Ｓ２１−ｃ、第４選別工程Ｓ２１−ｄ、第５選別工程Ｓ２１−ｅ及び第６選別工程Ｓ２１−ｆの６工程を含んでいてもよい（図８参照）。図９に、選別工程Ｓ２１が６工程からなる場合の一例を示す。
【００５２】
図９に示す選別工程Ｓ２１では、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて、離乳前タイプであるか否かによって糞便検体を２群に分ける。次に、第２選別工程Ｓ２１−ｂでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて離乳前タイプに該当しないものとして分けられた糞便検体について、１０歳代タイプに該当するか否かで２群に分ける。さらに、第３選別工程Ｓ２１−ｃでは、第２選別工程Ｓ２１−ｂにおいて１０歳代タイプに該当しないものとして分けられた糞便検体について、７０歳代タイプに該当するか否かで２群に分ける。このように、第６選別工程まで順次行うことで、糞便検体を７群に分けることができる。
【００５３】
以上、図３、図５、図７及び図９に選別工程Ｓ２１の具体例を示したが、これらを更に組み合わせて、糞便検体を更に多くの群に分けることも自由である。
【００５４】
更に、上記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち複数種類を、選別工程Ｓ２１において糞便検体を選別する際の指標として組み合わせることもできる。例えば、選別工程Ｓ２１において、離乳前タイプと判定するための菌群を複数種類用いた場合、いずれの菌群についても上記割合が離乳前タイプに該当した糞便検体は、より離乳前タイプに特異的な腸内菌叢の特徴を有している可能性の高い糞便検体である。このように糞便検体を予め選別することにより、より効率的に腸内菌叢の年代判定マーカーを探索することができる。
【００５５】
［ｂ．菌群同定工程Ｓ２２］
菌群同定工程Ｓ２２は、上述した選別工程Ｓ２１によって選別された複数の群のうち、少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する工程である。また、本技術において「菌群を同定する」とは、少なくとも属レベルまで同定されていることを指し、さらに種レベルまで同定することも含まれる。
【００５６】
菌群同定工程Ｓ２２において、糞便検体に含まれる菌群の同定は、公知の手法を用いて行うことができ、その手法は限定されない。例えば、糞便検体に含まれる菌群のゲノムを解読して、塩基配列に基づいて行うこともできる。この場合、菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析して、各々の菌群を同定することができる。以下に、菌群同定工程Ｓ２２の一例を示す。
【００５７】
先ず、糞便検体に含まれる菌群のＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出については、上述した腸内菌叢の年代判定方法における測定工程Ｓ１１と同様の方法で行うことができる。
【００５８】
次に、得られたＤＮＡの塩基配列を解読する。塩基配列の解読は、公知の手法によって行うことができ、その手法は限定されない。塩基配列の決定については、上述した腸内菌叢の年代判定方法における測定工程Ｓ１１と同様に、例えばシーケンサーを用いる方法等によって行うことができる。また、上述した腸内菌叢の年代判定方法における測定工程Ｓ１１と同様の方法により、例えば、解読されたＤＮＡの塩基配列をデータベースに照会することで、菌群を同定することができる。
【００５９】
菌群同定工程Ｓ２２において対象とする群は、選別工程Ｓ２１によって分けられたいずれかの群であれば、その群の内容は特に限定されない。対象とする群は、菌群のスクリーニングの目的に応じて決めることができる。
例えば、離乳前タイプと判定するためのマーカー探索が目的であれば、離乳前タイプに該当する糞便検体に含まれる菌群を同定することが好ましい。また、１０歳代タイプと判定するためのマーカー探索が目的であれば、１０歳代タイプに該当する糞便検体に含まれる菌群を同定することが好ましい。
【００６０】
また、複数の群の各々について、それらの群に含まれる糞便検体を、菌群を同定する対象としてもよい。例えば離乳前タイプに該当する糞便検体と、離乳前タイプに該当しなかった糞便検体の各々から菌群を同定することもできる。
【００６１】
本技術に係る菌群のスクリーニング方法では、例えば、離乳前タイプに該当しなかった糞便検体から同定された菌群やその菌数を、離乳前タイプを判定するためのマーカー検索において、リファレンスとして用いることもできる。このリファレンスにより、離乳前タイプであると判定されなかった糞便検体においても同程度の割合で存在した菌群や菌種を、離乳前タイプを判定するためのマーカー候補から除外することができる。
このように、より効率的に各年代タイプと判定するためのマーカーを探索することができる。
【００６２】
＜３．物質のスクリーニング方法＞
本技術に係る物質のスクリーニング方法は、食餌や物質に含まれる腸内菌叢へ作用するものを探索する方法である。図１０は、本技術に係る物質のスクリーニング方法のフローチャートである。物質のスクリーニング方法には、少なくとも測定工程Ｓ３１、相関算出工程Ｓ３２及び物質同定工程Ｓ３３が含まれる。なお、本技術に係る物質のスクリーニング方法において、腸内菌叢へ作用するものとは、例えば、腸内菌叢の老化を促進したり、あるいは抑制したりするなど、腸内菌叢のバランスを変化させるものである。
【００６３】
［ａ．測定工程Ｓ３１］
測定工程Ｓ３１は、上述した菌群のスクリーニング方法により、年代判定マーカーとして同定された菌群について、動物から得た糞便検体に含まれる全菌数に対する割合を測定する工程である。菌群の割合の測定については、上述した通りである。
【００６４】
本技術に係る物質のスクリーニング方法において、食餌又は物質の動物への摂取は、経口摂取であっても、非経口摂取であってもよい。また、摂取回数は、１回でも複数回でもよい。複数回の場合、同じ食餌又は物質を複数回に渡って摂取してもよい。動物から得られる糞便検体は、食餌又は物質を摂取する前と摂取した後の各々の時点で採取されたものであってもよい。
【００６５】
［ｂ．相関算出工程Ｓ３２］
相関算出工程Ｓ３２は、前記測定工程Ｓ３１で測定された菌群の割合について、その増減と、動物が摂取した食餌又は物質との相関を求める工程である。動物が食餌又は物質を摂取した後、上述した菌群のスクリーニングによって年代判定マーカーとされた菌群の数が糞便検体において変動すれば、その食餌又は物質は腸内菌叢へ作用するものである可能性が高い。また、動物が摂取した食餌又は物質の量に応じて、菌群の割合の変動の程度も変化すれば、その食餌又は物質は腸内菌叢へ作用するものである可能性が高い。相関算出工程Ｓ３２では、このような、動物が摂取した食餌又は物質と、糞便検体の全菌数に対する特定の菌群の割合における相関関係を解析する。
【００６６】
相関算出工程Ｓ３２では、例えば相関係数ｒを算出してもよい。また、例えば、カイ二乗検定やマンホイットニーＵ検定等の検定方法を用いて、食餌又は物質を摂取した群と摂取していない群との間の、年代判定マーカーとした菌群の上記割合の差異について、χ２値やＵ等を求めてもよい。相関について数値で表わすことができれば、その算出方法は特に限定されず、母集団の大きさや測定工程Ｓ３１で測定する菌群の種類の数等に合わせて、公知の統計手法の中から適宜選択できる。
【００６７】
また、相関算出工程Ｓ３２では、任意の統計手法に基づき、年代判定マーカーとして用いた菌群の上記割合の増減と、動物が摂取した食餌又は物質との相関について、計算機等により自動的に相関関係を解析してもよい。
【００６８】
［ｃ．物質同定工程Ｓ３３］
物質同定工程Ｓ３３は、相関算出工程Ｓ３２において算出された値が閾値を満たす場合に、その食餌又は物質を腸内菌叢へ作用するものとして同定する工程である。閾値は、相関算出工程Ｓ３２において相関の算出に用いた方法に合わせて適宜設定できる。
例えば、相関算出工程Ｓ３２において相関係数ｒ、χ２値又はＵを算出するのであれば、本工程Ｓ３３では、これらの数値に対応するｐ値に対して閾値を設定できる。例えば、閾値をｐ＜０．０５とする場合、前記ｐ値がこれに該当すれば、閾値を満たすものとする。また、前記ｐ値がこれに該当しなければ、閾値を満たさないものとする。
【００６９】
上記閾値を満たした場合、その動物が摂取した食餌又は物質は、腸内菌叢へ作用するものとして同定される。
【００７０】
本技術に係る物質のスクリーニング方法では、上述した菌群のスクリーニング方法によって年代判定マーカーとされる菌群の上記割合を指標とすることにより、簡便に腸内菌叢へ作用するものをスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００７１】
＜実験例１＞
本実験例では、糞便検体に含まれる菌群について、各年齢に特徴的な菌群の同定を試みた。
【００７２】
［検体］
本実験例では、健常な３６０名（０〜１０４歳）の日本人から提供された糞便検体を用いた。この３６０名の内訳は、離乳前：９人、離乳中：７人、離乳後〜９歳：３３人、１０歳代：１０人、２０歳代：４０人、３０歳代：８８人、４０歳代：３２人、５０歳代：２５人、６０歳代：２８人、７０歳代：１５人、８０歳代：４８人、９０歳代：１９人、１００歳以上：６人であり、平均年齢は４５．４歳である。
【００７３】
［ＤＮＡの抽出］
本実験例では、先ず、糞便検体からのＤＮＡの抽出を行った。約２０ｍｇの糞便検体に対して、４５０μｌの抽出用溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）を加えて懸濁し、さらに、１０％ＳＤＳ溶液５０μｌ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００μｌのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）を加えて混合した。得られた懸濁液に対しては、ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ  １００Ａ（フナコシ社製）を用いてパワーレベル５で３０秒の破砕処理を実施した後、１４，０００×ｇで５分間遠心して４００μｌの上清を得た。
得られた上清に２５０μｌのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１４，０００×ｇで５分間遠心した後、２５０μｌの上清を回収した。回収した上清に、２−プロパノールを２５０μｌ加え、ＤＮＡを沈殿させ、２００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）に再度溶解させて、これをＤＮＡ溶液とした。
【００７４】
［ＤＮＡの増幅］
次に、上記ＤＮＡ溶液に含まれる菌群のゲノムに対して核酸増幅反応を行った。下記表１〜表３に、本実験例で用いたプライマーの配列を示す。表１に示すプライマーセットは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるためのプライマーである。これらのプライマーについては、便宜的に第１プライマーセットとする。
【００７５】
【表１】
2016214108.tif 000002
【００７６】
表１中、「Ｒ」は、グアニン又はアデニンを意味する。「Ｗ」は、アデニン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｈ」は、アデニン又はシトシン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｖ」は、アデニン又はグアニン又はシトシンを意味する。
【００７７】
また、下記表２及び表３に示すプライマーセットは、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社製））を用いて塩基配列を解析するために必要な配列（アダプター領域及びインデックス領域）を増幅核酸鎖に組み込むためのプライマーセットである。表２に示すプライマーはフォワードプライマーであり、表３に示すプライマーは、リバースプライマーである。これらのプライマーは、便宜的に第２プライマーセットとする。なお、表１〜表３に示すプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスにより得た。
【００７８】
【表２】
2016214108.tif 000003
【００７９】
【表３】
2016214108.tif 000004
【００８０】
上述したＤＮＡ溶液及び第１プライマーセットを含む総液量２５μｌの反応液を、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。核酸増幅反応は、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて行い、９４℃−３分の後、９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとし、これを２０回繰り返し、その後７２℃−１０分として、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンにより、増幅核酸鎖を確認した。
【００８１】
続いて、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、第２プライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲ反応を行った。但し、サイクル数は１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。精製後のＰＣＲ産物については、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【００８２】
［ＤＮＡのシークエンス］
複数の糞便検体に由来するＰＣＲ産物を同じ濃度で混合したものをＭｉｓｅｑ  ｖ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
【００８３】
［菌群の同定及び菌数の算出］
上記シークエンス解析により得られたペアエンド配列をfastq-join （version.1.1.2-301）（http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqJoin）にて、ＱＩＩＭＥソフトウェア（version 1.6.0）（http://qiime.org/）にて９７％の相同性を有する配列ごとをＯＵＴ（Operational Taxonomy Unit）とした。各ＯＵＴの代表配列を下記データベースに
対してＢＬＡＳＴ検索することにより、腸内菌叢の構成を解析した。
データベース：Greengenes database 12_10
(http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/12_10)
【００８４】
［結果］
上述した腸内菌叢の構成の解析の結果、個々の糞便検体について４９８０±１８００の配列が得られた。本実験例では、この配列数を各糞便検体に含まれる全菌数とした。また、これらの配列のうち、個々の属ごとの数を各々の属に属する菌群の数とした。
【００８５】
図１１〜図２５に、（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す。図１１〜図２５に示すグラフの縦軸は割合を示し、横軸は年齢を示す。
【００８６】
［考察］
図１１及び図１２に示す通り、（１）〜（１４）の属に属する菌群の割合を調べると、離乳前の糞便検体では、下記表４に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表４に示す割合以下であった。
【００８７】
【表４】
2016214108.tif 000005
【００８８】
図１３に示す通り、（１５）の属に属する菌群の割合を調べると、１０歳代の糞便検体では、下記表５に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表５に示す割合以下であった。
【００８９】
【表５】
2016214108.tif 000006
【００９０】
図１４に示す通り、（１６）〜（２１）の属又は菌群に属する菌群の割合を調べると、７０歳代の糞便検体では、下記表６に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表６に示す割合以下であった。
【００９１】
【表６】
2016214108.tif 000007
【００９２】
図１５〜図１９に示す通り、（２２）〜（５８）の属又は菌群に属する菌群の割合を調べると、８０歳代の糞便検体では、下記表７に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表７に示す割合以下であった。
【００９３】
【表７】
2016214108.tif 000008
【００９４】
図２０〜図２２に示す通り、（５９）〜（８２）の属又は菌群に属する菌群の割合を調べると、９０歳代の糞便検体では、下記表８に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表８に示す割合以下であった。
【００９５】
【表８】
2016214108.tif 000009
【００９６】
図２３及び図２４に示す通り、（８３）〜（９１）の属に属する菌群の割合を調べると、１００歳代の糞便検体では、下記表９に示す割合を超す場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表９に示す割合以下であった。
【００９７】
【表９】
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【００９８】
図２５に示す通り、（９２）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群の割合を調べると、離乳前の糞便検体では、下記表１０に示す割合未満の場合があったが、それ以外の糞便検体は、全て下記表１０に示す割合以上であった。
【００９９】
【表１０】
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【０１００】
以上の結果から、前記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群について、例えば、前記表４〜１０の割合を基準値と設定し、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する前記（１）〜（９３）の属又は菌群に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、各菌群における基準値とを比較することにより、腸内菌叢が、離乳前タイプ、１０歳代タイプ、７０歳代タイプ、８０歳代タイプ、９０歳代タイプ、及び１００歳代タイプのいずれか一以上のタイプであるかを判定又は推定することが可能となることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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