(57)【要約】【課題】従来よりも収率が高い、ポリペプチドの製造方法を提供すること。【解決手段】式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。  Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ      （１）  Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ      （２）  Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ      （３）（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｎは１〜１０の整数である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、
前記縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とする
ポリペプチドの製造方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ      （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ      （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ      （３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｎは１〜１０の整数である。）
【請求項２】
前記硫酸イオンがアルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩に由来する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドがコラーゲン様ポリペプチドである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記反応をマイクロ波照射下で行う、請求項１〜３のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造方法により製造されたポリペプチドであって、
式（４）で表されるペプチドフラグメントを有するポリペプチド。
−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ−      （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｍは１００〜１７１の整数である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、及び、ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の一種であるコラーゲンは、汎用的な医用材料として幅広く用いられている。天然の一型コラーゲン分子は三アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しからなる特徴的な一次構造を有する。このポリペプチドが同じ向きに３本寄り集まって形成された三重らせんの三次構造をとり、コラーゲン繊維を形成する。
【０００３】
一方、コラーゲン様ポリペプチド（いわゆる合成コラーゲン）として創出された、三アミノ酸残基Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙ：プロリン又はヒドロキシプロリン）の繰り返し構造からなるポリペプチド分子も、三重らせん構造をとることが報告されている（非特許文献１〜２）。
コラーゲン様ポリペプチドは、天然コラーゲンと異なり、感染症の危険性がないこと、工業的合成により得られるため安定な供給が可能であること、三重らせん構造の熱安定性が高いこと、着色やにおいなどがないことなど、諸々の優れた性質を有するため、様々な機能性材料としての研究がなされている（特許文献１）。
例えば、特許文献２には、コラーゲン様ポリペプチドの製造方法として、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（ＹはＨｙｐ又はＰｒｏ、ｎ＝１〜２０）で示されるペプチドフラグメントを含むペプチドオリゴマーを、ジメチルスルホキシド中やエチレンジアミンを含む水系溶媒等中で縮合反応させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０７５５８９号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−３２１５００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Sakakibara et al., Biochim. Biophys. Acta, 303, 198(1973).
【非特許文献２】T. Kishimoto et al., Biopolymers, 79, 163-172(2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、従来よりも収率が高い、ポリペプチドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題は下記の手段により解決された。
＜１＞式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ      （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ      （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ      （３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｎは１〜１０の整数である。）
＜２＞前記硫酸イオンがアルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩に由来する、上記＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞前記ポリペプチドが、コラーゲン様ポリペプチドである、上記＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞前記反応をマイクロ波照射下で行う、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜５＞上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の製造方法により製造されたポリペプチドであって、式（４）で表されるペプチドフラグメントを有するポリペプチド。
−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ−      （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｍは１００〜１７１の整数である。）
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来よりも収率が高い、ポリペプチドの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のポリペプチドの製造方法は、式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とする。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ      （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ      （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ      （３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｎは１〜１０の整数である。）
以下、本発明について説明する。なお、本明細書において、ａ〜ｂ等は、ａ以上、ｂ以下を意味し、ａ、ｂをその範囲内に含む。
【００１０】
本明細書においては、「コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖」とは、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリン）の繰り返し配列を有するポリペプチドであって、三重らせん等の分子鎖間相互作用による構造をとらずに１本鎖として存在する状態をいう。また、「コラーゲン様ポリペプチド複合体」とは、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造をとった状態を示す。多くの場合において、コラーゲン様ポリペプチド複合体はさらに、三重らせんが分岐構造をとったり、三重らせん分子間で会合したりする高次構造を形成する。なお、三重らせん構造をとっているか否かは円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。
【００１１】
本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
【００１２】
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。
【００１３】
本発明のポリペプチドの製造方法は、式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含む。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ      （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ      （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ      （３）
【００１４】
式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、好ましくはヒドロキシプロリンである。ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。また、ｎは１〜１０の整数であるが、１〜５の整数であることが、ハンドリングの容易さ、縮合反応の効率、ペプチドオリゴマーの入手の容易さや経済性の観点から好ましい。
本発明において、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーはいずれか１種を用いてもよいし、混合物であってもよい。また、ｎは単一の整数であってもよいし、種々の繰り返し数のオリゴマーの混合物であってもよい。
これらのペプチドオリゴマーは、既知の固相合成法又は液相合成法により取得することができる。
【００１５】
また、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーに加えて、他のペプチドオリゴマーを用いてもよい。ただし、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーと他のペプチドオリゴマーとの使用量が質量比において１００：０〜５０：５０の範囲であることが好ましい。他のペプチドオリゴマーの使用量が前記範囲にあることにより、製造されるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造を形成しやすくなる。
【００１６】
他のペプチドオリゴマーとしては、例えば下記式（５）〜（６８）で表されるペプチドオリゴマーが挙げられる。
【００１７】
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）o      （５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）o      （６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）o      （７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）o      （８）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （９）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１０）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１１）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１２）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１３）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１４）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１５）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１６）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１７）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１８）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （１９）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）o      （２０）
【００１８】
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２２）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２３）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２４）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２５）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２６）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２７）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２８）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （２９）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３０）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３２）
【００１９】
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３４）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３６）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３７）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３８）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （３９）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４０）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４１）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４２）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４４）
【００２０】
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４７）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４８）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （４９）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５０）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５１）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５２）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５３）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５４）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５６）
【００２１】
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５８）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （５９）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６０）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６１）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６２）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６３）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６４）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６５）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６６）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）q      （６８）
【００２２】
式（５）〜（２０）中、ｏは１〜１０の整数であり、式（２１）〜（６８）中、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜１０の整数である。ただし、縮合反応の効率及びペプチドオリゴマーの入手の容易さから、ｏ、ｐ、及びｑは独立して１〜５の整数であることが好ましく、特に好ましくは１である。
【００２３】
本発明の製造方法は、式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするものである。
【００２４】
本発明の製造方法は、水系溶媒中で反応を行うため、脱水反応により生じる水以外にも水分子が反応系中に存在するものであるが、これら水分子の存在によって平衡反応の均衡が崩れて反応効率が低下するということがみられない。斯かる作用や機構は必ずしも明らかではないが、硫酸イオンが、アミド結合生成反応の反応場を制御するためであると、本発明者らは推察する。そして、本発明の製造方法は、アミド結合生成反応により大量に水分子が発生しても反応効率が低下しにくく、ポリペプチドの工業的な大量合成に好適に使用される。また、有機溶媒を使用しなくてもポリペプチドを合成することができ、環境負荷が少ない。
【００２５】
本発明の製造方法は、縮合反応を硫酸イオンを含む水系溶媒中で行うものであるが、硫酸イオンとしては、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩に由来する硫酸イオンが好ましい。
ここで、本明細書において、アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム及びフランシウムの総称を意味し、アルカリ土類金属とは、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びラジウムの総称を意味する。
【００２６】
本発明の製造方法において、アルカリ金属の硫酸塩としては、反応効率の観点から、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムが好ましい。また、アルカリ土類金属の硫酸塩としては、反応効率の観点から、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムが好ましい。
これらの中でも、本発明の製造方法で用いる硫酸塩としては、反応効率の観点から、アルカリ金属の硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウムが特に好ましい。
なお、本発明の製造方法で用いる硫酸塩は通常、水系溶媒中では、硫酸イオンとアルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオンとにわかれる。本発明の製造方法においては、硫酸塩は、反応系中で上記のようなイオンとして存在していてよい。
【００２７】
本発明の製造方法で用いる硫酸塩の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１００モル当量であり、好ましくは５〜７５モル当量であり、より好ましくは５〜２５モル当量である。
【００２８】
また、本発明の製造方法は、水系溶媒中で縮合反応を行うものである。
上記水系溶媒としては、水を３０体積％以上含む水系溶媒が好ましく、水を４０体積％以上含む水系溶媒がより好ましく、水を５０体積％以上含む水系溶媒が更に好ましく、水を８０体積％以上含む水系溶媒が更に好ましく、水を９５体積％以上含む水系溶媒が特に好ましい。斯様な多量の水を含む水系溶媒を用いた場合であっても、本発明の製造方法によればポリぺプチドを効率よく得ることができる。
【００２９】
なお、上記水系溶媒に含まれる水以外の媒体としては、例えば、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）が挙げられ、これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
水系溶媒としては、水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液などが好ましく、反応効率の観点から、水がより好ましく、リン酸イオンを含まないものが特に好ましい。
【００３０】
上記水系溶媒の合計使用量は、原料化合物の合計１００質量部に対し、通常、１００〜２００００質量部であり、好ましくは５００〜１００００質量部であり、より好ましくは７５０〜７５００質量部であり、さらに好ましくは１０００〜６０００質量部であり、特に好ましくは２５００〜５０００質量部である。このような多量の水系溶媒を使用した場合でも、本発明の製造方法によればポリペプチドを効率よく得ることができる。
【００３１】
また、本発明の製造方法は、縮合剤、又は、縮合剤及び縮合助剤を用いるものである。
縮合剤はペプチド合成に使用される縮合剤であればよいが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド誘導体；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−［ビス−（ジメチルアミノ）メチリウミル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール［４，５−ｂ］ピリジン−３−オキサイドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）等のベンゾトリアゾール誘導体の他、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等が挙げられ、これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、カルボジイミド誘導体が好ましく、ＷＳＣがより好ましい。
上記縮合剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１０モル当量であり、好ましくは１〜５モル当量である。
【００３２】
縮合助剤としてはヒドロキシルアミン化合物が挙げられる。具体的には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等が挙げられ、これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ＨＯＢｔが好ましい。
上記縮合助剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、０．２５〜１０モル当量であり、好ましくは０．７５〜５モル当量である。
【００３３】
また、本発明の製造方法においては、マイクロ波照射下で上記反応を行ってもよい。マイクロ波を照射することにより速やかに反応が進行し、短時間で収率よく目的とするポリペプチドを得ることができる。
上記マイクロ波の周波数は、好ましくは１〜５ＧＨｚの範囲であり、より好ましくは２〜３ＧＨｚの範囲である。
また、マイクロ波の波長は、通常、１ｍ〜１００μｍの範囲である。
また、マイクロ波の出力は、好ましくは５〜２０００Ｗの範囲であり、より好ましくは１５０〜１５００Ｗの範囲であり、更に好ましくは１７５〜１０００Ｗの範囲である。
上記のようなマイクロ波照射は、μ−ｒｅａｃｔｏｒ  ＥＸ（四国計測工業社製）等の市販のマイクロ波反応装置を用いて行うことができる。
【００３４】
また、反応時間は、マイクロ波照射を行わない場合は、通常、５分間〜２４時間程度であり、好ましくは１０分間〜１０時間であり、より好ましくは２０分間〜８時間であり、更に好ましくは３０分間〜６時間である。一方、マイクロ波照射を行う場合は、通常、１０〜１０００秒間程度であり、好ましくは１０〜３００秒間であり、より好ましくは１０〜１２０秒間である。
また、反応温度は、マイクロ波照射を行わない場合は、通常、０〜２００℃であるが、好ましくは４〜１５０℃であり、より好ましくは１０〜１００℃であり、更に好ましくは２０〜５０℃であり、更に好ましくは２０〜４０℃である。マイクロ波照射を行わない場合、低温領域（４〜５０℃）での反応の後、追加で高温領域（７０〜１００℃）での多段階の加熱を施してもよい。
一方、反応温度は、マイクロ波照射を行う場合は、通常、４０〜１５０℃であるが、好ましくは４０〜１００℃であり、より好ましくは６０〜１００℃である。
【００３５】
本発明の製造方法によれば、水系溶媒中であるにも拘わらず、ポリペプチドを簡便に且つ収率よく合成できる。
【００３６】
なお、上記反応で得られた反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
また、本発明の製造方法により得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。得られたポリペプチドをこの後に加工等に供する場合にこれらの残存試薬が影響する恐れがあるため、除去することが好ましい。残存試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
【００３７】
本発明の製造方法により得られたポリペプチドは、凍結乾燥により粉体にする等して、その後の加工へ供するのに取り扱いやすい形態とすることができる。凍結乾燥する場合は、縮合反応後の反応溶液をナス型フラスコ等適切な容器に入れ、凍結乾燥機（例えば、東京理科機械製；ＥＹＥＬＡ  ＦＤＵ−２０００等）を用いて行う。凍結乾燥は、水分が蒸発して乾燥物が得られるまで実施し、通常は一夜から２日間で完了する。得られた乾燥物を任意の溶媒に所望の濃度で溶解させることにより、ファイバー、ナノファイバー、ゲル等の製造に供する原液を調製することができる。
【００３８】
また、ポリペプチドの安定性及び取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られたポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。
【００３９】
本発明の製造方法で得られるポリペプチドとしては、式（４）で表されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドが好ましい。
−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ−      （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリン又はプロリンであり、ｍは１００〜１７１の整数である。）
【００４０】
また、本発明におけるポリペプチド（単分子）鎖は、天然コラーゲンのように三重らせん構造をとりコラーゲン様ポリペプチド複合体を形成することができる。なお、ポリペプチドが三重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは三重らせん構造をとっていると考えられる。
本発明のポリペプチドは、直線状又は１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に三重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその三重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。また、ポリペプチド単分子鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。
【００４１】
本発明におけるポリペプチド（単分子）鎖は、ポリ（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）のみからなるものであってもよいが、ポリ（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）の他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメント又はアルキレンやポリアルキレングリコール鎖を含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
【００４２】
本発明におけるポリペプチド（単分子）鎖は、ポリＰＹＧと他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメント又はアルキレンとを、質量比においてポリＰＹＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメント又はアルキレン＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有するものが好ましい。
【００４３】
本発明の製造方法により得られたポリペプチドは、皮膚外用組成物の添加剤、化粧品の添加剤、食品添加剤、止血材などの用途に用いることができる。詳細には、特開2009-067727号公報、特開2007-223981号公報、特開2009-067727号公報、特開2007-223981号公報、特開2002-256075号公報、特開2007-137875号公報、特開2007-262087号公報、特開2005-058106号公報、特開2009-132654号公報、特開2005-206542号公報、特開2001-233786号公報、特開2007-223981号公報、特開2003-321500号公報、特開2009-040782号公報、特開2009-209064号公報、特開2009-067727号公報、特開2013-006810号公報、特開2013-116874号公報、特開2013-198559号公報、特開2013-199713号公報、特開2014-009194号公報、特開2014-014596号公報、特開2014-015370号公報、国際公開第2011/158864号パンフレット、国際公開第2013/002311号パンフレット、国際公開第2009/035092号パンフレット、国際公開第2008/114577号パンフレット、国際公開第2011/158864号パンフレット、国際公開第2013/002311号パンフレット、国際公開第2009/035092号パンフレット、国際公開第2008/114577号パンフレット、国際公開第2011/158864号パンフレット、国際公開第2008/075589号パンフレット等に記載された用途を参照することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ１００ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）を超純水５ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）３３５ｍｇ（１．７５ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）５３ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）を加え、更に、Ｎａ2ＳＯ4  ０．７１ｇを添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を室温（２５℃）で１時間、静置した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが３５００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重合体を得た（収率：４８質量％）。
【００４６】
（実施例２）
超純水５ｍＬの代わりに０．０１ＭのＰＢＳバッファー５ｍＬを使用した以外は、実施例１と同様にしてＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重合体を得た（収率：１０質量％）。
【００４７】
（比較例１）
超純水５ｍＬの代わりに０．０１ＭのＰＢＳバッファー５ｍＬを使用し、さらにＮａ2ＳＯ4  ０．７１ｇを使用しなかった以外は、実施例１と同様にしてＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの重合体を得た（収率：５質量％）。
【００４８】
【表１】
2016113403.tif 000002
【配列表】
2016113403000001.app